(57)【要約】  ニューロキニンＢシグナル遮断剤からなるＩＬ−３１介在性疾患の予防又は治療剤。
2020101017.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ニューロキニンＢシグナル遮断剤からなるＩＬ−３１介在性疾患の予防又は治療剤。
【請求項２】
前記ＩＬ−３１介在性疾患が、アトピー性皮膚炎、アトピー性皮膚炎における掻痒症、皮膚筋炎、皮膚筋炎における掻痒症、慢性皮膚炎、アレルギー性接触皮膚炎、疱疹状皮膚炎、皮膚Ｔ細胞性リンパ腫における掻痒症、結節性痒疹、多形慢性痒疹、色素性蕁麻疹又は水疱性類天疱瘡である、請求項１に記載の予防又は治療剤。
【請求項３】
前記ＩＬ−３１介在性疾患が、アトピー性皮膚炎である、請求項１に記載の予防又は治療剤。
【請求項４】
前記ニューロキニンＢシグナル遮断剤が、ニューロキニン３受容体アンタゴニストである、請求項１〜３のいずれか一項に記載の予防又は治療剤。
【請求項５】
前記アンタゴニストが、下式一般式（１）、（２）又は（３）で表される化合物若しくはその塩又はそれらの溶媒和物である、請求項４に記載の予防又は治療剤。
【化１】
2020101017.tif 000021
［式（１）中、
Ａｒは、ピペリジニル基；ピリジン−２−イル基；フェニル基；又は、ハロゲン原子、メチル基若しくは炭素数１〜４のアルコキシ基で置換されたフェニル基を表し；
Ｒ１はメチル基を表し；Ｒ１１は水素原子を表すか；又は、Ｒ１及びＲ１１は一緒になって−（ＣＨ２）３−基若しくは−（ＣＨ２）２Ｏ−基を表し；
Ｒ２は、ヒドロキシル基；Ｃ１−７アルコキシ基；Ｃ１−７アシロキシ基；シアノ基；−ＮＲ６Ｒ４基；−ＮＲ３ＣＯＲ４基；−ＮＲ３ＣＯＯＲ８基；−ＮＲ３ＳＯ２Ｒ９基；−ＮＲ３ＣＯＮＲ１０Ｒ１２基；Ｃ１−７アシル基；Ｃ１−７アルコキシカルボニル基；−ＣＯＮＲ１０Ｒ１２基；−ＣＨ２ＯＨ基；Ｃ１−７アルコキシメチル基；Ｃ１−７アシロキシメチル基；Ｃ１−７アルキルアミノカルボニルオキシメチル基；−ＣＨ２ＮＲ１３Ｒ１４基；−ＣＨ２ＮＲ３ＣＯＲ４基；−ＣＨ２ＮＲ３ＣＯＯＲ８基；−ＣＨ２ＮＲ３ＳＯ２Ｒ９基；若しくは−ＣＨ２ＮＲ３ＣＯＮＲ１０Ｒ１２基を表すか；又は、Ｒ２は、それが結合している炭素原子及びその隣のピペリジン環の炭素原子との間で二重結合を形成するか；又は、Ａｒ及びＲ２は、これらが結合しているピペリジン環と一緒になって下記式（１ａ）若しくは（１ｂ）で表される基を形成し；
【化２】
2020101017.tif 000022
Ｒ３は、水素原子又はＣ１−４アルキル基を表し；Ｒ４は、水素原子、Ｃ１−７アルキル基、フェニル基、ベンジル基、ピリジル基、無置換のＣ３−７シクロアルキル基、又は１以上のメチル基で置換されたＣ３−７シクロアルキル基を表すか；又は、Ｒ３及びＲ４は一緒になって−（ＣＨ２）ｎ−基（ここで、ｎは３又は４である。）を表し；
Ｔは、メチレン基、カルボニル基、−ＣＯＯ−基、又は−ＣＯＮＲ５−基を表し；Ａは、単結合、メチレン基、エチレン基、プロピレン基、又はビニレン基を表すか；又は−Ｔ−Ａ−が−ＳＯ２−基を表し；
Ｚは、フェニル基、又は、１個以上の、ハロゲン原子、Ｃ１−４アルキル基、Ｃ１−４アルコキシ基若しくはニトロ基で置換されたフェニル基を表し；
Ｒ５は、水素原子又はＣ１−４アルキル基を表し；
Ｒ６は、水素原子又はＣ１−７アルキル基を表し；Ｒ７は、水素原子、Ｃ１−７アルキル基、Ｃ３−７シクロアルキルメチル基、ベンジル基又はフェニル基を表すか；又は、Ｒ６及びＲ７は、これらが結合している窒素原子と一緒になって、アゼチジン基、ピロリジン基、ピペリジン基、モルホリン基、チオモルホリン基及びペルヒドロアゼピン基からなる群より選択されるヘテロ環を構成し；
Ｒ８は、Ｃ１−７アルキル基又はフェニル基を表し；
Ｒ９は、Ｃ１−７アルキル基；アミノ基又は１若しくは２つのＣ１−７アルキル基で置換されたアミノ基；フェニル基；ハロゲン原子、Ｃ１−７アルキル基、トリフルオロメチル基、ヒドロキシル基、Ｃ１−７アルコキシ基、カルボキシル基、Ｃ１−７アルコキシカルボニル基、Ｃ１−７アルキルカルボニルオキシ基、シアノ基、ニトロ基、アミノ基、及び、１又は２つのＣ１−７アルキル基で置換されたアミノ基からなる群より選択される１又は複数の基（ここで、選択される基が複数である場合、複数の基のそれぞれは互いに同一であっても異なっていてもよい。）により置換されたフェニル基を表し；
Ｒ１０は、水素原子又はＣ１−７アルキル基を表し；Ｒ１２は、水素原子、Ｃ１−７アルキル基、Ｃ３−７シクロアルキル基、Ｃ３−７シクロアルキルメチル基、ヒドロキシル基、Ｃ１−４アルコキシ基、ベンジル基又はフェニル基を表すか；又はＲ１０及びＲ１２は、これらが結合している窒素原子と一緒になって、アゼチジン基、ピロリジン基、ピペリジン基、モルホリン基、チオモルホリン基及びペルヒドロアゼピン基からなる群より選択されるヘテロ環を構築し；
Ｒ１３は、水素原子又はＣ１−７アルキル基を表し；
Ｒ１４は、水素原子、Ｃ１−７アルキル基、Ｃ３−７シクロアルキルメチル基又はベンジル基を表し；
ｎ３は２又は３である。
但し、Ａｒがフェニル基であり、Ｒ２がヒドロキシル基であり、−Ｔ−Ａ−Ｚがベンゾイル基である場合、Ｒ１はメチル基ではなく；Ａｒがフェニル基であり、Ｒ２が−ＮＨＣＯＣＨ３基であり、−Ｔ−Ａ−Ｚがベンゾイル基である場合、Ｒ１及びＲ１１が一緒になって−（ＣＨ２）３−基を形成することはなく；Ａｒがフェニル基であり、Ｒ２がヒドロキシル基であり、−Ｔ−Ａ−Ｚが３−メトキシベンジル基である場合、Ｒ１及びＲ１１が一緒になって−（ＣＨ２）３−基を形成することはなく；Ａｒがフェニル基であり、Ｒ２が−ＮＨＣＯＣＨ３基であり、−Ｔ−Ａ−Ｚがベンジルオキシカルボニル基である場合、Ｒ１はメチル基ではない。］
【化３】
2020101017.tif 000023
［式（２）中：
Ｙは、下記式（２ａ）又は（２ｂ）で表される基であり；
【化４】
2020101017.tif 000024
Ａｒ２は、所望により置換されていてもよいフェニル基、ナフチル基若しくはＣ５−７シクロアルカジエニル基、又は所望により置換されていてもよい芳香族特性を有し、５〜１２個の環原子を含み、硫黄原子、酸素原子及び窒素原子から選択される４個までのヘテロ原子を環中若しくは各環中に含む単又は縮合ヘテロ環基を表し；
Ｒ１００は、直鎖又は分岐鎖のＣ１−８アルキル基、Ｃ３−７シクロアルキル基、Ｃ４−７シクロアルキルアルキル基、所望により置換されていてもよいフェニル基又はフェニルＣ１−６アルキル基、所望により置換されていてもよい、酸素原子及び窒素原子から選択される４個までのヘテロ原子を含む５員ヘテロ芳香族環、ヒドロキシＣ１−６アルキル基、アミノＣ１−６アルキル基、Ｃ１−６アルキルアミノアルキル基、ジＣ１−６アルキルアミノアルキル基、Ｃ１−６アシルアミノアルキル基、Ｃ１−６アルコキシアルキル基、Ｃ１−６アルキルカルボニル基、カルボキシ基、Ｃ１−６アルコキシカルボニル基、Ｃ１−６アルコキシカルボニルＣ１−６アルキル基、アミノカルボニル基、Ｃ１−６アルキルアミノカルボニル基、ジＣ１−６アルキルアミノカルボニル基、又はハロゲノＣ１−６アルキル基を表すか；又は、Ａｒ２に環化した場合には、基−（ＣＨ２）ｐ−（ここで、ｐは２又は３である。）を形成し；
Ｒ１０１及びＲ１０２は、同一又は異なっていてもよく、独立して、水素原子、Ｃ１−６直鎖若しくは分岐鎖のアルキル基、又は一緒になって−（ＣＨ２）ｎ１−基（ここで、ｎ１は３、４又は５である。）を形成するか；又は、Ｒ１０１はＲ１００と一緒になって基−（ＣＨ２）ｑ−（ここで、ｑは２、３、４又は５である。）を形成し；
Ｒ１１０は、Ｒ１０３又は（Ｒ４０５）ｑ１であり；
Ｒ１１１は、Ｒ１０４又は下記式（２ｃ）若しくは（２ｇ）で表される基であり；
【化５】
2020101017.tif 000025
Ｒ１１２は、Ｒ１０５又は下記式（２ｄ）で表される基であり；
【化６】
2020101017.tif 000026
Ｒ４０１は、水素原子、Ｃ１−４アルキル基、Ｃ３−６シクロアルキル基及びＣ１−４アルキルＯＣ（Ｏ）−から選ばれ；
Ａ２は、フェニル基又はＣ３−７シクロアルキル基であり；
Ｒ４０２は各々独立して、水素原子、−ＯＨ、−ＮＨ２、−ＣＮ、ハロゲン原子、Ｃ１−６アルキル基、Ｃ３−７シクロアルキル基、Ｃ１−６アルコキシ基及びＣ１−６アルコキシＣ１−６アルキル基から選ばれ；
ｎ２は１、２又は３であり；
Ｒ４０３は各々独立して、水素原子、−ＯＨ、−ＮＨ２、−ＮＯ２、−ＣＮ、ハロゲン原子、Ｃ１−６アルキル基、Ｃ１−６アルコキシ基及びＣ１−６アルコキシＣ１−６アルキル基から選ばれ；
ｍは１、２又は３であり；
ｒ１は０、１、２又は３であり；
ｒ２は１、２又は３であり；
Ｒ４０４及びＲ４０９、はＣ１−４アルキル基、Ｃ１−６アルコキシＣ１−６アルキル基、Ｃ３−７シクロアルキル基及びＥ−（ＣＨ２）ｂ−から選ばれ、ここでＥは、−ＮＲ４０６Ｒ４０７、−ＳＲ４０６、−ＳＯＣ１−６アルキル基、−ＳＯ２Ｃ１−６アルキル基、Ｎ＋（Ｏ−）Ｒ４０６Ｒ４０７、−ＮＲ４０６ＳＯ２Ｒ４０７、アリール基、及び１、２、３若しくは４個の窒素原子を有するＮ−若しくはＣ−結合５−若しくは６−員芳香族若しくは非芳香族の複素環式環又はそのＮ−オキシドから選ばれ、そしてｂは０、１、２、３、４又は５であり；
Ｒ４０５は各々独立して、水素原子、−ＯＨ、−ＣＮ、ハロゲン、−Ｒ４０６、−ＯＲ４０６、−ＮＲ４０６Ｒ４０７、−ＳＲ４０６、−ＳＯＲ４０６及び−ＳＯ２Ｒ４０６から選ばれ；
ｑ１は１、２又は３であり；
ここで、
Ｒ４０６及びＲ４０７は各々独立して、水素原子、Ｃ１−６直鎖又は分岐鎖アルキル基、Ｃ２−６直鎖若しくは分岐鎖アルケニル又はアルキニル基、及び０、１若しくは２個の二重又は三重結合を有するＣ３−７炭素環式基から選ばれ、ここで該基は非置換であるか、又は−ＯＨ、＝Ｏ、−ＮＨ２、−ＣＮ、ハロゲン原子、アリール及びＣ１−３アルコキシ基から選ばれる１個若しくはそれ以上の基で置換されており；
Ｒ４０８は、水素原子、Ｃ１−５直鎖若しくは分岐鎖アルキル基、及びＣ３−５シクロアルキル基から選ばれ、該基は非置換であるか、又は−ＯＨ、＝Ｏ、−ＮＨ２、−ＣＮ、ハロゲン、アリール基及びＣ１−３アルコキシ基から選ばれる１個又はそれ以上の基で置換されており；
そしてＲ４０４がＥ−（ＣＨ２）ｂ−であり、そして該ＥがＮ若しくはＣ結合５−若しくは６−員の芳香族若しくは非芳香族の複素環式環又はそのＮ−オキシドである場合、該Ｅは非置換であるか、又は独立して−ＯＨ、＝Ｏ、−ＮＨ２、−ＣＮ、ハロゲン原子、Ｃ１−４アルキル基、Ｃ１−４アルコキシ基、Ｃ１−４アルキル−ＣＯ−、−ＮＲ４０６Ｒ４０７、アリール及び１、２、３若しくは４個の窒素原子を有するＮ−若しくはＣ−結合５−若しくは６−員芳香族若しくは非芳香族の複素環式環若しくはそのＮ−オキシドから選ばれ；
そしてＲ４０１、Ｒ４０２、Ｒ４０３又はＲ４０４がアルキル基、シクロアルキル基、アルコキシ基又はアルコキシアルキル基である場合、該基は非置換であるか、又は各々独立して−ＯＨ、−ＮＨ２、−ＣＮ、フェニル及びハロゲンから選ばれる１、２、３、４若しくは５個の置換基を有し；
Ｒ１０３及びＲ１０４は、同一又は異なっていてもよく、独立して、水素原子、Ｃ１−６直鎖若しくは分岐鎖のアルキル基、Ｃ１−６アルケニル基、アリール基、Ｃ１−６アルコキシ基、ヒドロキシ基、ハロゲン原子、ニトロ基、シアノ基、カルボキシ基、カルボキシアミド基、スルホンアミド基、Ｃ１−６アルコキシカルボニル基、トリフルオロメチル基、アシルオキシ基、フタルイミド基、アミノ基、モノ−及びジ−Ｃ１−６アルキルアミノ基、−Ｏ（ＣＨ２）ｒ−ＮＷ２基（ここで、ｒは２、３又は４であり、Ｗは水素原子又はＣ１−６アルキル基であるか、又は、それは隣接する窒素と基：
【化７】
2020101017.tif 000027
［式（２ｅ）又は（２ｆ）中、Ｖ及びＶ１は、独立して、水素原子又は酸素原子を表し、ｕは０、１又は２である。］を形成する。）、−Ｏ（ＣＨ２）ｔ−ＯＥ２基（ここで、ｔは２、３又は４であり、Ｅは水素原子又はＣ１−６アルキル基である。）、ヒドロキシアルキル基、アミノアルキル基、モノ−若しくはジ−アルキルアミノアルキル基、アシルアミノ基、アルキルスルホニルアミノ基、アミノアシルアミノ基、並びにモノ−若しくはジ−アルキルアミノアシルアミノ基から選ばれ；４個までのＲ１０３置換基がキノリン核中に存在し得；又は、アリールとしてのＲ１０５に環化した場合、Ｒ１０４は−（ＣＨ２）ｅ−基（ここで、ｅは１、２又は３である。）を形成し；
Ｒ１０５は、分岐鎖若しくは直鎖のＣ１−６のアルキル基、Ｃ３−７のシクロアルキル基、Ｃ４−７のシクロアルキルアルキル基、所望により置換されていてもよいアリール基、又は所望により置換されていてもよい芳香族特性を有し、５〜１２個の環原子を含み、硫黄原子、酸素原子及び窒素原子から選択される４個までのヘテロ原子を環中若しくは各環中に含む単又は縮合ヘテロ環基を表し；
Ｘは、酸素原子、硫黄原子又は＝Ｎ−Ｃ≡Ｎを表す。］
【化８】
2020101017.tif 000028
［式（３）中、
Ｒ３０１は、水素原子、フッ素原子又はメチル基であり、
Ｒ３０１’は、水素原子であり、
Ｒ３０２は、水素原子、フッ素原子、塩素原子又はメトキシ基であり、
Ｒ３０２’は、水素原子又はフッ素原子であり、
Ｒ３０３は、水素原子、フッ素原子、塩素原子、メチル基、トリフルオロメチル基又はニトリル基であり、
Ｒ３０４は、メチル、エチル、ｎ−プロピル、ヒドロキシエチル、メトキシエチル、トリフルオロメチル、ジフルオロメチルまたはフルオロメチルであり、
Ｒ３０５は、メチル、エチル、メトキシメチル、トリフルオロメチル、ジフルオロメル、フルオロメチル、１−フルオロエチル、１，１−ジフルオロエチルまたは２，２，２−トリフルオロエチルであり、
Ｘ１が窒素原子かつＸ２が硫黄原子若しくは酸素原子であるか、またはＸ１が硫黄原子かつＸ２が窒素原子であり、
【化９】
2020101017.tif 000029
は、Ｘ１およびＸ２に応じて単結合または二重結合を表し、
【化１０】
2020101017.tif 000030
は、（３）式の化合物の（Ｒ）−鏡像異性体またはラセミ化合物を表す。］
【請求項６】
前記式（１）で表される化合物が、オサネタントである、請求項５に記載の予防又は治療剤。
【請求項７】
前記式（１）で表される化合物が、ＳＳＲ−１４６９７７である、請求項５に記載の予防又は治療剤。
【請求項８】
前記式（１）で表される化合物が、ＳＳＲ−２４１５８６である、請求項５に記載の予防又は治療剤。
【請求項９】
前記式（１）で表される化合物が、ＣＳ−００３である、請求項５に記載の予防又は治療剤。
【請求項１０】
前記式（２）で表される化合物が、タルネタントである、請求項５に記載の予防又は治療剤。
【請求項１１】
前記式（２）で表される化合物が、パヴィネタントである、請求項５に記載の予防又は治療剤。
【請求項１２】
前記式（２）で表される化合物が、ＳＢ−２３５３７５である、請求項５に記載の予防又は治療剤。
【請求項１３】
前記式（３）で表される化合物が、フェゾリネタントである、請求項５に記載の予防又は治療剤。
【請求項１４】
前記ニューロキニンＢシグナル遮断剤が、タキキニンプロセシング酵素の阻害剤又はタキキニンプロセシング酵素の分解促進剤である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の予防又は治療剤。
【請求項１５】
前記阻害剤が、Ｐｒｏｐｒｏｔｅｉｎ  ｃｏｎｖｅｒｔａｓｅ  ｓｕｂｔｉｌｉｓｉｎ／ｋｅｘｉｎ  １、Ｐｒｏｐｒｏｔｅｉｎ  ｃｏｎｖｅｒｔａｓｅ  ｓｕｂｔｉｌｉｓｉｎ／ｋｅｘｉｎ  ２、ｃａｒｂｏｘｙｐｅｐｔｉｄａｓｅ  Ｅ、又はＰｅｐｔｉｄｙｌｇｌｙｃｉｎｅ  ａｌｐｈａ−ａｍｉｄａｔｉｎｇ  ｍｏｎｏｏｘｙｇｅｎａｓｅの阻害剤である、請求項１４に記載の予防又は治療剤。
【請求項１６】
前記ニューロキニンＢシグナル遮断剤が、ニューロキニンＢ（ＮＫＢ）、ニューロキニン３受容体、タキキニンプロセシング酵素、ｇａｓｔｒｉｎ−ｒｅｌｅａｓｉｎｇ  ｐｅｐｔｉｄｅ（ＧＲＰ）又はＧＲＰ受容体の発現抑制剤である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の予防又は治療剤。
【請求項１７】
前記ニューロキニンＢシグナル遮断剤が、ニューロキニン３受容体又はＧＲＰ受容体を発現する神経細胞の除去剤である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の予防又は治療剤。
【請求項１８】
前記除去剤が、細胞毒性物質を結合した、ＧＲＰ、ＧＲＰ受容体に対する特異的結合物質、ＮＫＢ又はニューロキニン３受容体に対する特異的結合物質である、請求項１７に記載の予防又は治療剤。
【請求項１９】
前記細胞毒性物質が、リボソーム不活性化タンパク質又はジフテリア毒素である、請求項１８に記載の予防又は治療剤。
【請求項２０】
前記リボソーム不活性化タンパク質が、サポリン、リシン又はアブリンである、請求項１９に記載の予防又は治療剤。
【請求項２１】
請求項１〜２０のいずれか一項に記載の予防又は治療剤及び薬学的に許容可能な担体を含む、ＩＬ−３１介在性疾患の予防又は治療用医薬組成物。
【請求項２２】
請求項１〜２０のいずれか一項に記載の予防又は治療剤及び薬学的に許容可能な担体を含む、アトピー性皮膚炎の予防又は治療用医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＩＬ−３１介在性疾患の予防又は治療剤及び医薬組成物に関する。
本願は、２０１８年１１月１５日に日本に出願された特願２０１８−２１５０１７号、及び、２０１９年８月６日に日本に出願された特願２０１９−１４４９１３号に基づき優先権を主張し、それらの内容をここに援用する。
【背景技術】
【０００２】
Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−３１（ＩＬ−３１）は、種々のヒト組織で発現するサイトカインであり、アトピー性皮膚炎等の慢性皮膚掻痒症と関連することが報告されている（例えば、非特許文献１及び２を参照）。【０００３】
アトピー性皮膚炎とは、痒みのある湿疹が悪化と軽快を繰り返す慢性疾患である。その患者の多くは、アレルゲンに対する反応が亢進している。近年、アトピー性皮膚炎の患者数は増加しており、また、アトピー性皮膚炎は著しく患者の生活の質を損なうことから、アトピー性皮膚炎の治療方法の開発は急務となっている。【０００４】
さらに、マウスの皮内にＩＬ−３１を投与すると、掻破行動が引き起こされる。マウスの掻破行動は、アトピー性皮膚炎における、痒みにより引き起こされる掻破行動のモデルとして利用することができる。【０００５】
アトピー性皮膚炎の重症度は、血清ＩＬ−３１のレベルと相関することが知られている。また、抗ＩＬ−３１受容体抗体の投与は、アトピー性皮膚炎の痒みを抑制することが報告された。これらの知見から、アトピー性皮膚炎において、痒みを引き起こす原因物質は、ＩＬ−３１であると考えられている。【０００６】
また、ＩＬ−３１は、掻痒の誘発以外にも、他の炎症性サイトカインの発現を誘導することにより、様々な疾患の病態に介在することも報告されている。ＩＬ−３１が介在する疾患として、アトピー性皮膚炎、アトピー性皮膚炎における掻痒症、皮膚筋炎、皮膚筋炎における掻痒症、慢性皮膚炎、アレルギー性接触皮膚炎、疱疹状皮膚炎、皮膚Ｔ細胞性リンパ腫における掻痒症、結節性痒疹、多形慢性痒疹、色素性蕁麻疹及び水疱性類天疱瘡等が報告されている（例えば、非特許文献１〜８を参照）。皮膚筋炎は、皮疹を伴う自己免疫性の炎症性筋疾患であり、皮膚症状の重症度と痒みが相関し、痒みを伴う病変皮膚では、ＩＬ−３１及びＩＬ−３１受容体の発現が亢進していることが報告されている（非特許文献３）。皮膚Ｔ細胞性リンパ腫（ｃｕｔａｎｅｏｕｓ  Ｔ  ｃｅｌｌ  ｌｙｍｐｈｏｍａ；ＣＴＣＬ）は、皮膚に生じる悪性リンパ腫の一群であり、腫瘍の由来となる細胞がＴ細胞である疾患である。ＣＴＣＬでは、疾患の進行度及び掻痒症の重症度が、病変皮膚におけるＩＬ−３１及びＩＬ−３１受容体の発現量及び血清ＩＬ−３１のレベルと相関することが報告されている（非特許文献４）。結節性痒疹及びアレルギー性接触皮膚炎では、皮膚組織においてＩＬ−３１の発現亢進が認められること（非特許文献５及び６）、また、色素性蕁麻疹では、血清ＩＬ−３１レベルが、疾患重症度及び掻痒症と相関することが報告されている（非特許文献７）。さらに、疱疹状皮膚炎患者及び水疱性類天疱瘡患者では、血清及び組織におけるＩＬ−３１レベルが増していること、また、これらの患者の病変部位の皮膚組織において、ＩＬ−３１陽性細胞が多数認められることが報告されている（非特許文献８）。【０００７】
発明者らは、以前に、Ｄｅｄｉｃａｔｏｒ  ｏｆ  ｃｙｔｏｋｉｎｅｓｉｓ  ８（Ｄｏｃｋ８）遺伝子を欠損し、再編成したＴ細胞受容体（ＴＣＲ）が遺伝子導入されたマウスにおいて、ＣＤ４＋Ｔ細胞からのＩＬ−３１の産生が亢進することを明らかにした（例えば、非特許文献９を参照）。【０００８】
ここで、再編成したＴＣＲとしては、ＡＮＤを利用することができる。ＡＮＤは、ＭＨＣクラスＩＩ  Ｉ−Ｅκ分子と複合体を形成した、ｍｏｔｈ  ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ（ＭＣＣ）の第８８番目〜１０３番目のアミノ酸からなるペプチド（配列番号１）を認識するＴＣＲである。一方、ＡＮＤを発現したＴ細胞は、Ｉ−Ａｂ分子を発現するマウス胸線において正常に分化・成熟するが、ＡＮＤ  ＴＣＲはＩ−Ａｂ分子に対して、比較的高い自己反応性を示す。【０００９】
Ｉ−Ａｂ分子を発現するＣ５７ＢＬ／６マウスの遺伝背景において、Ｄｏｃｋ８ノックアウトＡＮＤトランスジェニック（Ｄｏｃｋ８−／−  ＡＮＤ  Ｔｇ）マウスは、亢進した掻破行動及び皮膚炎の症状を示す。このことから、Ｄｏｃｋ８−／−  ＡＮＤ  Ｔｇマウスは、アトピー性皮膚炎等のＩＬ−３１介在性疾患モデル非ヒト動物として用いることができる。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Furue M, et al. Emerging role of interleukin-31 and interleukin-31 receptor in pruritus in atopic dermatitis. Allergy 73:29-36, 2018.
【非特許文献２】Bagci IS, Ruzicka T. IL-31: A new key player in dermatology and beyond. J Allergy Clin Immunol. 141:858-866, 2018.
【非特許文献３】Kim HJ, et al. Itch in dermatomyositis: the role of increased skin interleukin-31. Br J Dermatol. 179:669-678, 2018.
【非特許文献４】Nattkemper LA. et al. Cutaneous T-cell Lymphoma and Pruritus: The Expression of IL-31 and its Receptors in the Skin. Acta Derm Venereol. 96:894-898, 2016.
【非特許文献５】Sonkoly E, et al. IL-31: a new link between T cells and pruritus in atopic skin inflammation. J Allergy Clin Immunol. 117:411-417, 2006.
【非特許文献６】Neis MM, et al. Enhanced expression levels of IL-31 correlate with IL-4 and IL-13 in atopic and allergic contact dermatitis. J Allergy Clin Immunol. 118:930-937, 2006.
【非特許文献７】Lange M, et al. Interleukin-31 polymorphisms and serum IL-31 level in patients with mastocytosis: correlation with clinical presentation and pruritus. Acta Derm Venereol. 97:47-53, 2017.
【非特許文献８】Bonciani D, et al. Serum levels and tissue expression of interleukin-31 in dermatitis herpetiformis and bullous pemphigoid. J Dermatol Sci. 87:210-212, 2017.
【非特許文献９】Yamamura K et al., The transcription factor EPAS1 links DOCK 8 deficiency to atopic skin inflammation via IL-31 induction. Nature Communications 8:13946, 2017.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
このように、ＩＬ−３１は、アトピー性皮膚炎等の炎症性疾患における、痒みを引き起こす代表的な因子であると考えられる。しかしながら、ＩＬ−３１が痒みを引き起こすメカニズムについては十分に解明されているとはいえない。そこで、本発明は、ＩＬ−３１が痒みを引き起こす分子機構を明らかにし、アトピー性皮膚炎等のＩＬ−３１介在性疾患を予防又は治療する技術を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明は、以下の態様を含む。
［１］ニューロキニンＢシグナル遮断剤からなるＩＬ−３１介在性疾患の予防又は治療剤。
［２］前記ＩＬ−３１介在性疾患が、アトピー性皮膚炎、アトピー性皮膚炎における掻痒症、皮膚筋炎、皮膚筋炎における掻痒症、慢性皮膚炎、アレルギー性接触皮膚炎、疱疹状皮膚炎、皮膚Ｔ細胞性リンパ腫における掻痒症、結節性痒疹、多形慢性痒疹、色素性蕁麻疹又は水疱性類天疱瘡である、［１］に記載の予防又は治療剤。
［３］前記ＩＬ−３１介在性疾患が、アトピー性皮膚炎である、［１］に記載の予防又は治療剤。
［４］前記ニューロキニンＢシグナル遮断剤が、ニューロキニン３受容体アンタゴニストである、［１］〜［３］のいずれかに記載の予防又は治療剤。
［５］前記アンタゴニストが、下式一般式（１）、（２）又は（３）で表される化合物若しくはその塩又はそれらの溶媒和物である、［４］に記載の予防又は治療剤。
【化１】
2020101017.tif 000003
［式（１）中、
Ａｒは、ピペリジニル基；ピリジン−２−イル基；フェニル基；又は、ハロゲン原子、メチル基若しくは炭素数１〜４のアルコキシ基で置換されたフェニル基を表し；
Ｒ１はメチル基を表し；Ｒ１１は水素原子を表すか；又は、Ｒ１及びＲ１１は一緒になって−（ＣＨ２）３−基若しくは−（ＣＨ２）２Ｏ−基を表し；
Ｒ２は、ヒドロキシル基；Ｃ１−７アルコキシ基；Ｃ１−７アシロキシ基；シアノ基；−ＮＲ６Ｒ４基；−ＮＲ３ＣＯＲ４基；−ＮＲ３ＣＯＯＲ８基；−ＮＲ３ＳＯ２Ｒ９基；−ＮＲ３ＣＯＮＲ１０Ｒ１２基；Ｃ１−７アシル基；Ｃ１−７アルコキシカルボニル基；−ＣＯＮＲ１０Ｒ１２基；−ＣＨ２ＯＨ基；Ｃ１−７アルコキシメチル基；Ｃ１−７アシロキシメチル基；Ｃ１−７アルキルアミノカルボニルオキシメチル基；−ＣＨ２ＮＲ１３Ｒ１４基；−ＣＨ２ＮＲ３ＣＯＲ４基；−ＣＨ２ＮＲ３ＣＯＯＲ８基；−ＣＨ２ＮＲ３ＳＯ２Ｒ９基；若しくは−ＣＨ２ＮＲ３ＣＯＮＲ１０Ｒ１２基を表すか；又は、Ｒ２は、それが結合している炭素原子及びその隣のピペリジン環の炭素原子との間で二重結合を形成するか；又は、Ａｒ及びＲ２は、これらが結合しているピペリジン環と一緒になって下記式（１ａ）若しくは（１ｂ）で表される基を形成し；
【化２】
2020101017.tif 000004
Ｒ３は、水素原子又はＣ１−４アルキル基を表し；Ｒ４は、水素原子、Ｃ１−７アルキル基、フェニル基、ベンジル基、ピリジル基、無置換のＣ３−７シクロアルキル基、又は１以上のメチル基で置換されたＣ３−７シクロアルキル基を表すか；又は、Ｒ３及びＲ４は一緒になって−（ＣＨ２）ｎ−基（ここで、ｎは３又は４である。）を表し；
Ｔは、メチレン基、カルボニル基、−ＣＯＯ−基、又は−ＣＯＮＲ５−基を表し；Ａは、単結合、メチレン基、エチレン基、プロピレン基、又はビニレン基を表すか；又は−Ｔ−Ａ−が−ＳＯ２−基を表し；
Ｚは、フェニル基、又は、１個以上の、ハロゲン原子、Ｃ１−４アルキル基、Ｃ１−４アルコキシ基若しくはニトロ基で置換されたフェニル基を表し；
Ｒ５は、水素原子又はＣ１−４アルキル基を表し；
Ｒ６は、水素原子又はＣ１−７アルキル基を表し；Ｒ７は、水素原子、Ｃ１−７アルキル基、Ｃ３−７シクロアルキルメチル基、ベンジル基又はフェニル基を表すか；又は、Ｒ６及びＲ７は、これらが結合している窒素原子と一緒になって、アゼチジン基、ピロリジン基、ピペリジン基、モルホリン基、チオモルホリン基及びペルヒドロアゼピン基からなる群より選択されるヘテロ環を構成し；
Ｒ８は、Ｃ１−７アルキル基又はフェニル基を表し；
Ｒ９は、Ｃ１−７アルキル基；アミノ基又は１若しくは２つのＣ１−７アルキル基で置換されたアミノ基；フェニル基；ハロゲン原子、Ｃ１−７アルキル基、トリフルオロメチル基、ヒドロキシル基、Ｃ１−７アルコキシ基、カルボキシル基、Ｃ１−７アルコキシカルボニル基、Ｃ１−７アルキルカルボニルオキシ基、シアノ基、ニトロ基、アミノ基、及び、１又は２つのＣ１−７アルキル基で置換されたアミノ基からなる群より選択される１又は複数の基（ここで、選択される基が複数である場合、複数の基のそれぞれは互いに同一であっても異なっていてもよい。）により置換されたフェニル基を表し；
Ｒ１０は、水素原子又はＣ１−７アルキル基を表し；Ｒ１２は、水素原子、Ｃ１−７アルキル基、Ｃ３−７シクロアルキル基、Ｃ３−７シクロアルキルメチル基、ヒドロキシル基、Ｃ１−４アルコキシ基、ベンジル基又はフェニル基を表すか；又はＲ１０及びＲ１２は、これらが結合している窒素原子と一緒になって、アゼチジン基、ピロリジン基、ピペリジン基、モルホリン基、チオモルホリン基及びペルヒドロアゼピン基からなる群より選択されるヘテロ環を構築し；
Ｒ１３は、水素原子又はＣ１−７アルキル基を表し；
Ｒ１４は、水素原子、Ｃ１−７アルキル基、Ｃ３−７シクロアルキルメチル基又はベンジル基を表し；
ｎ３は２又は３である。
但し、Ａｒがフェニル基であり、Ｒ２がヒドロキシル基であり、−Ｔ−Ａ−Ｚがベンゾイル基である場合、Ｒ１はメチル基ではなく；Ａｒがフェニル基であり、Ｒ２が−ＮＨＣＯＣＨ３基であり、−Ｔ−Ａ−Ｚがベンゾイル基である場合、Ｒ１及びＲ１１が一緒になって−（ＣＨ２）３−基を形成することはなく；Ａｒがフェニル基であり、Ｒ２がヒドロキシル基であり、−Ｔ−Ａ−Ｚが３−メトキシベンジル基である場合、Ｒ１及びＲ１１が一緒になって−（ＣＨ２）３−基を形成することはなく；Ａｒがフェニル基であり、Ｒ２が−ＮＨＣＯＣＨ３基であり、−Ｔ−Ａ−Ｚがベンジルオキシカルボニル基である場合、Ｒ１はメチル基ではない。］
【化３】
2020101017.tif 000005
［式（２）中：
Ｙは、下記式（２ａ）又は（２ｂ）で表される基であり；
【化４】
2020101017.tif 000006
Ａｒ２は、所望により置換されていてもよいフェニル基、ナフチル基若しくはＣ５−７シクロアルカジエニル基、又は所望により置換されていてもよい芳香族特性を有し、５〜１２個の環原子を含み、硫黄原子、酸素原子及び窒素原子から選択される４個までのヘテロ原子を環中若しくは各環中に含む単又は縮合ヘテロ環基を表し；
Ｒ１００は、直鎖又は分岐鎖のＣ１−８アルキル基、Ｃ３−７シクロアルキル基、Ｃ４−７シクロアルキルアルキル基、所望により置換されていてもよいフェニル基又はフェニルＣ１−６アルキル基、所望により置換されていてもよい、酸素原子及び窒素原子から選択される４個までのヘテロ原子を含む５員ヘテロ芳香族環、ヒドロキシＣ１−６アルキル基、アミノＣ１−６アルキル基、Ｃ１−６アルキルアミノアルキル基、ジＣ１−６アルキルアミノアルキル基、Ｃ１−６アシルアミノアルキル基、Ｃ１−６アルコキシアルキル基、Ｃ１−６アルキルカルボニル基、カルボキシ基、Ｃ１−６アルコキシカルボニル基、Ｃ１−６アルコキシカルボニルＣ１−６アルキル基、アミノカルボニル基、Ｃ１−６アルキルアミノカルボニル基、ジＣ１−６アルキルアミノカルボニル基、又はハロゲノＣ１−６アルキル基を表すか；又は、Ａｒ２に環化した場合には、基−（ＣＨ２）ｐ−（ここで、ｐは２又は３である。）を形成し；
Ｒ１０１及びＲ１０２は、同一又は異なっていてもよく、独立して、水素原子、Ｃ１−６直鎖若しくは分岐鎖のアルキル基、又は一緒になって−（ＣＨ２）ｎ１−基（ここで、ｎ１は３、４又は５である。）を形成するか；又は、Ｒ１０１はＲ１００と一緒になって基−（ＣＨ２）ｑ−（ここで、ｑは２、３、４又は５である。）を形成し；
Ｒ１１０は、Ｒ１０３又は（Ｒ４０５）ｑ１であり；
Ｒ１１１は、Ｒ１０４又は下記式（２ｃ）若しくは（２ｇ）で表される基であり；
【化５】
2020101017.tif 000007
Ｒ１１２は、Ｒ１０５又は下記式（２ｄ）で表される基であり；
【化６】
2020101017.tif 000008
Ｒ４０１は、水素原子、Ｃ１−４アルキル基、Ｃ３−６シクロアルキル基及びＣ１−４アルキルＯＣ（Ｏ）−から選ばれ；
Ａ２は、フェニル基又はＣ３−７シクロアルキル基であり；
Ｒ４０２は各々独立して、水素原子、−ＯＨ、−ＮＨ２、−ＣＮ、ハロゲン原子、Ｃ１−６アルキル基、Ｃ３−７シクロアルキル基、Ｃ１−６アルコキシ基及びＣ１−６アルコキシＣ１−６アルキル基から選ばれ；
ｎ２は１、２又は３であり；
Ｒ４０３は各々独立して、水素原子、−ＯＨ、−ＮＨ２、−ＮＯ２、−ＣＮ、ハロゲン原子、Ｃ１−６アルキル基、Ｃ１−６アルコキシ基及びＣ１−６アルコキシＣ１−６アルキル基から選ばれ；
ｍは１、２又は３であり；
ｒ１は０、１、２又は３であり；
ｒ２は１、２又は３であり；
Ｒ４０４及びＲ４０９は、Ｃ１−４アルキル基、Ｃ１−６アルコキシＣ１−６アルキル基、Ｃ３−７シクロアルキル基及びＥ−（ＣＨ２）ｂ−から選ばれ、ここでＥは、−ＮＲ４０６Ｒ４０７、−ＳＲ４０６、−ＳＯＣ１−６アルキル基、−ＳＯ２Ｃ１−６アルキル基、Ｎ＋（Ｏ−）Ｒ４０６Ｒ４０７、−ＮＲ４０６ＳＯ２Ｒ４０７、アリール基、及び１、２、３若しくは４個の窒素原子を有するＮ−若しくはＣ−結合５−若しくは６−員芳香族若しくは非芳香族の複素環式環又はそのＮ−オキシドから選ばれ、そしてｂは０、１、２、３、４又は５であり；
Ｒ４０５は各々独立して、水素原子、−ＯＨ、−ＣＮ、ハロゲン、−Ｒ４０６、−ＯＲ４０６、−ＮＲ４０６Ｒ４０７、−ＳＲ４０６、−ＳＯＲ４０６及び−ＳＯ２Ｒ４０６から選ばれ；
ｑ１は１、２又は３であり；
ここで、
Ｒ４０６及びＲ４０７は各々独立して、水素原子、Ｃ１−６直鎖又は分岐鎖アルキル基、Ｃ２−６直鎖若しくは分岐鎖アルケニル又はアルキニル基、及び０、１若しくは２個の二重又は三重結合を有するＣ３−７炭素環式基から選ばれ、ここで該基は非置換であるか、又は−ＯＨ、＝Ｏ、−ＮＨ２、−ＣＮ、ハロゲン原子、アリール及びＣ１−３アルコキシ基から選ばれる１個若しくはそれ以上の基で置換されており；
Ｒ４０８は、水素原子、Ｃ１−５直鎖若しくは分岐鎖アルキル基、及びＣ３−５シクロアルキル基から選ばれ、該基は非置換であるか、又は−ＯＨ、＝Ｏ、−ＮＨ２、−ＣＮ、ハロゲン、アリール基及びＣ１−３アルコキシ基から選ばれる１個又はそれ以上の基で置換されており；
そしてＲ４０４がＥ−（ＣＨ２）ｂ−であり、そして該ＥがＮ若しくはＣ結合５−若しくは６−員の芳香族若しくは非芳香族の複素環式環又はそのＮ−オキシドである場合、該Ｅは非置換であるか、又は独立して−ＯＨ、＝Ｏ、−ＮＨ２、−ＣＮ、ハロゲン原子、Ｃ１−４アルキル基、Ｃ１−４アルコキシ基、Ｃ１−４アルキル−ＣＯ−、−ＮＲ４０６Ｒ４０７、アリール及び１、２、３若しくは４個の窒素原子を有するＮ−若しくはＣ−結合５−若しくは６−員芳香族若しくは非芳香族の複素環式環若しくはそのＮ−オキシドから選ばれ；
そしてＲ４０１、Ｒ４０２、Ｒ４０３又はＲ４０４がアルキル基、シクロアルキル基、アルコキシ基又はアルコキシアルキル基である場合、該基は非置換であるか、又は各々独立して−ＯＨ、−ＮＨ２、−ＣＮ、フェニル及びハロゲンから選ばれる１、２、３、４若しくは５個の置換基を有し；
Ｒ１０３及びＲ１０４は、同一又は異なっていてもよく、独立して、水素原子、Ｃ１−６直鎖若しくは分岐鎖のアルキル基、Ｃ１−６アルケニル基、アリール基、Ｃ１−６アルコキシ基、ヒドロキシ基、ハロゲン原子、ニトロ基、シアノ基、カルボキシ基、カルボキシアミド基、スルホンアミド基、Ｃ１−６アルコキシカルボニル基、トリフルオロメチル基、アシルオキシ基、フタルイミド基、アミノ基、モノ−及びジ−Ｃ１−６アルキルアミノ基、−Ｏ（ＣＨ２）ｒ−ＮＷ２基（ここで、ｒは２、３又は４であり、Ｗは水素原子又はＣ１−６アルキル基であるか、又は、それは隣接する窒素と基：
【化７】
2020101017.tif 000009
［式（２ｅ）又は（２ｆ）中、Ｖ及びＶ１は、独立して、水素原子又は酸素原子を表し、ｕは０、１又は２である。］を形成する。）、−Ｏ（ＣＨ２）ｔ−ＯＥ２基（ここで、ｔは２、３又は４であり、Ｅは水素原子又はＣ１−６アルキル基である。）、ヒドロキシアルキル基、アミノアルキル基、モノ−若しくはジ−アルキルアミノアルキル基、アシルアミノ基、アルキルスルホニルアミノ基、アミノアシルアミノ基、並びにモノ−若しくはジ−アルキルアミノアシルアミノ基から選ばれ；４個までのＲ１０３置換基がキノリン核中に存在し得；又は、アリールとしてのＲ１０５に環化した場合、Ｒ１０４は−（ＣＨ２）ｅ−基（ここで、ｅは１、２又は３である。）を形成し；
Ｒ１０５は、分岐鎖若しくは直鎖のＣ１−６のアルキル基、Ｃ３−７のシクロアルキル基、Ｃ４−７のシクロアルキルアルキル基、所望により置換されていてもよいアリール基、又は所望により置換されていてもよい芳香族特性を有し、５〜１２個の環原子を含み、硫黄原子、酸素原子及び窒素原子から選択される４個までのヘテロ原子を環中若しくは各環中に含む単又は縮合ヘテロ環基を表し；
Ｘは、酸素原子、硫黄原子又は＝Ｎ−Ｃ≡Ｎを表す。］
【化８】
2020101017.tif 000010
［式（３）中、
Ｒ３０１は、水素原子、フッ素原子又はメチル基であり、
Ｒ３０１’は、水素原子であり、
Ｒ３０２は、水素原子、フッ素原子、塩素原子又はメトキシ基であり、
Ｒ３０２’は、水素原子又はフッ素原子であり、
Ｒ３０３は、水素原子、フッ素原子、塩素原子、メチル基、トリフルオロメチル基又はニトリル基であり、
Ｒ３０４は、メチル、エチル、ｎ−プロピル、ヒドロキシエチル、メトキシエチル、トリフルオロメチル、ジフルオロメチル又はフルオロメチルであり、
Ｒ３０５は、メチル、エチル、メトキシメチル、トリフルオロメチル、ジフルオロメル、フルオロメチル、１−フルオロエチル、１，１−ジフルオロエチル又は２，２，２−トリフルオロエチルであり、
Ｘ１が窒素原子かつＸ２が硫黄原子若しくは酸素原子であるか、又はＸ１が硫黄原子かつＸ２が窒素原子であり、
【化９】
2020101017.tif 000011
は、Ｘ１およびＸ２に応じて単結合又は二重結合を表し、
【化１０】
2020101017.tif 000012
は、（３）式の化合物の（Ｒ）−鏡像異性体又はラセミ化合物を表す。］
［６］前記式（１）で表される化合物が、オサネタントである、［５］に記載の予防又は治療剤。
［７］前記式（１）で表される化合物が、ＳＳＲ−１４６９７７である、［５］に記載の予防又は治療剤。
［８］前記式（１）で表される化合物が、ＳＳＲ−２４１５８６である、［５］に記載の予防又は治療剤。
［９］前記式（１）で表される化合物が、ＣＳ−００３である、［５］に記載の予防又は治療剤。
［１０］前記式（２）で表される化合物が、タルネタントである、［５］に記載の予防又は治療剤。
［１１］前記式（２）で表される化合物が、パヴィネタントである、［５］に記載の予防又は治療剤。
［１２］前記式（２）で表される化合物が、ＳＢ−２３５３７５である、［５］に記載の予防又は治療剤。
［１３］前記式（３）で表される化合物が、フェゾリネタントである、［５］に記載の予防又は治療剤。
［１４］前記ニューロキニンＢシグナル遮断剤が、タキキニンプロセシング酵素の阻害剤又はタキキニンプロセシング酵素の分解促進剤である、［１］〜［３］のいずれかに記載の予防又は治療剤。
［１５］前記阻害剤が、Ｐｒｏｐｒｏｔｅｉｎ  ｃｏｎｖｅｒｔａｓｅ  ｓｕｂｔｉｌｉｓｉｎ／ｋｅｘｉｎ  １、Ｐｒｏｐｒｏｔｅｉｎ  ｃｏｎｖｅｒｔａｓｅ  ｓｕｂｔｉｌｉｓｉｎ／ｋｅｘｉｎ  ２、ｃａｒｂｏｘｙｐｅｐｔｉｄａｓｅ  Ｅ、又はＰｅｐｔｉｄｙｌ−ｇｌｙｃｉｎｅ  ａｌｐｈａ−ａｍｉｄａｔｉｎｇ  ｍｏｎｏｏｘｙｇｅｎａｓｅの阻害剤である、［１４］に記載の予防又は治療剤。
［１６］前記ニューロキニンＢシグナル遮断剤が、ニューロキニンＢ（ＮＫＢ）、ニューロキニン３受容体、タキキニンプロセシング酵素、ｇａｓｔｒｉｎ−ｒｅｌｅａｓｉｎｇ  ｐｅｐｔｉｄｅ（ＧＲＰ）又はＧＲＰ受容体の発現抑制剤である、［１］〜［３］のいずれかに記載の予防又は治療剤。
［１７］前記ニューロキニンＢシグナル遮断剤が、ニューロキニン３受容体又はＧＲＰ受容体を発現する神経細胞の除去剤である、［１］〜［３］のいずれかに記載の予防又は治療剤。
［１８］前記除去剤が、細胞毒性物質を結合した、ＧＲＰ、ＧＲＰ受容体に対する特異的結合物質、ＮＫＢ又はニューロキニン３受容体に対する特異的結合物質である、［１７］に記載の予防又は治療剤。
［１９］前記細胞毒性物質が、リボソーム不活性化タンパク質又はジフテリア毒素である、［１８］に記載の予防又は治療剤。
［２０］前記リボソーム不活性化タンパク質が、サポリン、リシン又はアブリンである、［１９］に記載の予防又は治療剤。
［２１］［１］〜［２０］のいずれかに記載の予防又は治療剤及び薬学的に許容可能な担体を含む、ＩＬ−３１介在性疾患の予防又は治療用医薬組成物。
［２２］［１］〜［２０］のいずれかに記載の予防又は治療剤及び薬学的に許容可能な担体を含む、アトピー性皮膚炎の予防又は治療用医薬組成物。
【発明の効果】
【００１３】
本発明によれば、アトピー性皮膚炎等のＩＬ−３１介在性疾患を予防又は治療する技術を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】（ａ）は、実験例１における、ｇａｓｔｒｉｎ−ｒｅｌｅａｓｉｎｇ  ｐｅｐｔｉｄｅ（ＧＲＰ）−サポリン又はｎａｔｒｉｕｒｅｔｉｃ  ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ  ｂ（Ｎｐｐｂ）−サポリンを、それぞれ野生型Ｃ５７ＢＬ／６マウスの髄腔へ注射した後、ＩＬ−３１をこれらマウスに投与し、これらマウスの掻破行動を解析した結果である。（ｂ）は、実験例１における、ＧＲＰ−サポリンを、野生型Ｃ５７ＢＬ／６マウスの髄腔へ注射した後、脊髄におけるＧＲＰＲ  ｍＲＮＡの発現量を解析した結果である。（ｃ）は、実験例１における、Ｎｐｐｂ−サポリンを、野生型Ｃ５７ＢＬ／６マウスの髄腔へ注射した後、脊髄におけるＮＰＲＡのｍＲＮＡの発現量を解析した結果である。（ｄ）は、実験例１における、ＧＲＰ−サポリン又はＮｐｐｂ−サポリンを野生型Ｃ５７ＢＬ／６マウスの髄腔へ注射した後、脊髄を摘出し、抗ＧＲＰＲ抗体及び抗ＮＰＲＡ抗体を用いて免疫染色した結果である。
【図２】（ａ）は、実験例２における、野生型Ｃ５７ＢＬ／６マウスのＩＬ−３１遺伝子の構造、ターゲティングベクターの構造、相同組換えによりｎｅｏカセットを挿入した後の遺伝子構造及びフリッパーゼによりｎｅｏカセットが除去された後の構造を示した図である。（ｂ）は、実験例２における、各ＰＣＲ産物を２％のアガロースゲルにより電気泳動した図である。野生型Ｃ５７ＢＬ／６マウスのゲノムを鋳型としたＰＣＲ産物の長さは３００ｂｐであり、ノックインマウスのゲノムを鋳型としたＰＣＲ産物の長さは５５０塩基対である。
【図３】（ａ）は、実験例３における、ヘマトキシリン染色により、各遺伝子型のマウスの皮膚組織を解析した図である。（ｂ）は、実験例３における、各遺伝子型のマウスの掻破行動を解析した図である。（ｃ）は、実験例３における、各遺伝子型のマウスの血清中のＩＬ−３１の濃度を解析した結果である。（ｄ）は、実験例３における、各遺伝子型のマウスの後根神経節（ＤＲＧ）における、Ｔａｃ２のｍＲＮＡの発現量を解析した結果である。
【図４】（ａ）は、実験例４における、ＤＲＧ神経細胞をＩＬ−３１で刺激後、各遺伝子のｍＲＮＡの発現量を解析した結果である。（ｂ）は、実験例４における、ＤＲＧ神経細胞をＮＫＢで刺激後、各遺伝子の発現量を解析した結果である。
【図５】実験例５における、Ｄｏｃｋ８−／−  ＡＮＤ  ＴｇマウスのＤＲＧにおける、抗ＮＫＢ抗体及び抗ＩＬ−３１ＲＡ抗体による免疫染色の結果である。（ｂ）は、実験例５における、Ｄｏｃｋ８−／−  ＡＮＤ  ＴｇマウスのＤＲＧにおける、抗ＮＫＢ抗体及び抗ＴＲＰＶ１抗体による免疫染色の結果である。
【図６】（ａ）は、実験例６における、マウスＴａｃ２遺伝子と、それにコードされるＮＫＢタンパク質とを模式的に示した図である。（ｂ）は、実験例６における、ＰＣＲと電気泳動により、Ｔａｃ２遺伝子変異マウスΔ４及びΔ１５のＴａｃ２遺伝子型を判別した図である。（ｃ）は、実験例６における、２種の変異のゲノム配列と、転写されたｍＲＮＡがコードするアミノ酸配列を示した図である。
【図７】（ａ）は、実験例７における、Ｔａｃ２−／−（Δ４）マウスに対してヒスタミンを投与した後の、掻破行動を解析した結果である。（ｂ）は、実験例７における、Ｔａｃ２−／−（Δ４）マウスに対してクロロキンを投与した後の、掻破行動を解析した結果である。（ｃ）は、実験例７における、Ｔａｃ２−／−（Δ４）マウスに対してＰＡＲ２アゴニストを投与した後の、掻破行動を解析した結果である。（ｄ）は、実験例７における、Ｔａｃ２−／−（Δ４）マウスに対してＩＬ−３１を投与した後の、掻破行動を解析した結果である。
【図８】（ａ）は、実験例７における、Ｔａｃ２−／−（Δ１５）マウスに対してヒスタミンを投与した後の、掻破行動を解析した結果である。（ｂ）は、実験例７における、Ｔａｃ２−／−（Δ１５）マウスに対してＩＬ−３１を投与した後の、掻破行動を解析した結果である。
【図９】実験例７における、Ｔａｃを発現した、又はＴａｃを発現しない（Ｔａｃ２−／−（Δ４））Ｄｏｃｋ８−／−  ＡＮＤ  Ｔｇマウスを樹立し、（ａ）は皮膚の組織を、（ｂ）は掻破行動を、（ｃ）は血清中のＩＬ−３１レベルを比較した結果である。
【図１０】（ａ）は、実験例８における、Ｔａｃ２−／−（Δ４）マウスに対してＮＫＢを髄腔内に注射し、掻破行動を解析した結果を示す。（ｂ）は、実験例８における、ＧＲＰ−サポリン又はＮｐｐｂ−サポリンを注射し、ＧＲＰＲ又はＮＰＲＡを発現する神経細胞を除去した後、ＮＫＢを注射し、掻破行動を解析した結果を示す。
【図１１】（ａ）は、実験例９における、脊髄後角を、抗ＮＫ３Ｒ抗体および抗ＴＲＰＶ１抗体により免疫染色した結果である。（ｂ）は、実験例９における、ＩＬ−３１をＣ５７ＢＬ／６マウスに投与した後、抗ＮＫ３Ｒ抗体および抗ｃ−ｆｏｓ抗体で免疫染色した結果である。（ｃ）は、実験例９における、オサネタント注射後にＩＬ−３１を投与し、掻破行動を解析した結果である。（ｄ）は、実験例９における、オサネタント注射後にヒスタミンを投与し、掻破行動を解析した結果である。（ｅ）は、実験例９における、オサネタント注射後にクロロキンを投与し、掻破行動を解析した結果である。図中の白丸及び黒丸は、各マウスにおける測定値をプロットしたものである。
【図１２】（ａ）は、実験例９における、フェゾリネタント投与後にＩＬ−３１を投与し、掻破行動を解析した結果である。（ｂ）は、実験例９における、フェゾリネタント投与後にヒスタミンを投与し、掻破行動を解析した結果である。（ｃ）は、実験例９における、フェゾリネタント投与後にクロロキンを投与し、掻破行動を解析した結果である。図中の白丸及び黒丸は、各マウスにおける測定値をプロットしたものである。
【図１３】（ａ）は、実験例９における、タルネタント投与後にＩＬ−３１を投与し、掻破行動を解析した結果である。（ｂ）は、実験例９における、タルネタント投与後にクロロキンを投与し、掻破行動を解析した結果である。図中の黒丸、黒四角及び黒三角は、各マウスにおける測定値をプロットしたものである。
【図１４】（ａ）は、実験例９における、パヴィネタント投与後にＩＬ−３１を投与し、掻破行動を解析した結果である。（ｂ）は、実験例９における、パヴィネタント投与後にクロロキンを投与し、掻破行動を解析した結果である。図中の黒丸、黒四角及び黒三角は、各マウスにおける測定値をプロットしたものである。
【図１５】（ａ）は、実験例９における、ＳＳＲ−１４６９７７投与後にＩＬ−３１を投与し、掻破行動を解析した結果である。（ｂ）は、実験例９における、ＳＳＲ−１４６９７７投与後にクロロキンを投与し、掻破行動を解析した結果である。図中の黒丸、黒四角及び黒三角は、各マウスにおける測定値をプロットしたものである。
【図１６】（ａ）は、実験例９における、ＳＳＲ−２４１５８６投与後にＩＬ−３１を投与し、掻破行動を解析した結果である。（ｂ）は、実験例９における、ＳＳＲ−２４１５８６投与後にクロロキンを投与し、掻破行動を解析した結果である。図中の黒丸、黒四角及び黒三角は、各マウスにおける測定値をプロットしたものである。
【図１７】（ａ）は、実験例９における、ＣＳ−００３投与後にＩＬ−３１を投与し、掻破行動を解析した結果である。（ｂ）は、実験例９における、ＣＳ−００３投与後にクロロキンを投与し、掻破行動を解析した結果である。図中の黒丸、黒四角及び黒三角は、各マウスにおける測定値をプロットしたものである。
【図１８】（ａ）は、実験例９における、ＳＢ−２３５３７５投与後にＩＬ−３１を投与し、掻破行動を解析した結果である。（ｂ）は、実験例９における、ＳＢ−２３５３７５投与後にクロロキンを投与し、掻破行動を解析した結果である。図中の黒丸、黒四角及び黒三角は、各マウスにおける測定値をプロットしたものである。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
［予防又は治療剤］
１実施形態において、本発明は、ニューロキニンＢシグナル遮断剤からなるＩＬ−３１介在性疾患の予防又は治療剤を提供する。１実施形態において、本発明は、ニューロキニンＢシグナル遮断剤を有効成分とする、ＩＬ−３１介在性疾患の予防又は治療剤を提供することもできる。
【００１６】
（ＩＬ−３１介在性疾患）
本発明においてＩＬ−３１介在性疾患とは、ＩＬ−３１が疾患の発症又は疾患の進展に関与する疾患である。ＩＬ−３１介在性とは、ＩＬ−３１の直接的な作用により、疾患の発症又は疾患の進展に関与する場合だけではなく、ＩＬ−３１が体組織又は体細胞に作用した結果、新たに生体分子が産生、発現若しくは遊離又は活性化され、該生体分子により疾患が発症又は進展する場合も含まれる。
【００１７】
ＩＬ−３１介在性疾患としては、例えば、アトピー性皮膚炎、アトピー性皮膚炎における掻痒症、皮膚筋炎、皮膚筋炎における掻痒症、慢性皮膚炎、アレルギー性接触皮膚炎、疱疹状皮膚炎、皮膚Ｔ細胞性リンパ腫における掻痒症、結節性痒疹、多形慢性痒疹、色素性蕁麻疹および水疱性類天疱瘡等が挙げられるが、これらに限定されない。これらの疾患においては、病変組織においてＩＬ−３１及びＩＬ−３１受容体の発現が亢進すること、血清ＩＬ−３１のレベルが健常人より高いこと、またこれらの現象が疾患症状と相関することが報告されている。
【００１８】
ＩＬ−３１介在性疾患は、生体内におけるＩＬ−３１の産生を抑制することにより、また、ＩＬ−３１の産生後ではＩＬ−３１の作用を打ち消すことにより、該疾患又は該疾患に伴う症状の予防又は治療が可能となる。ＩＬ−３１の作用は、ＩＬ−３１とＩＬ−３１受容体との結合により細胞内に刺激が伝達されることにより発揮される。そのため、ＩＬ−３１とＩＬ−３１受容体との結合を阻害することにより、ＩＬ−３１の作用を打ち消すことができる。そのためには、例えば、抗ＩＬ−３１抗体又は抗ＩＬ−３１受容体抗体を使用することができる。ＩＬ−３１受容体は、ＩＬ−３１受容体ＡとオンコスタチンＭ受容体とのヘテロダイマーを形成することにより機能するが、抗ＩＬ−３１受容体Ａ抗体は、アトピー性皮膚炎およびアトピー性皮膚炎における掻痒症を抑制することが報告されている（Kabashima K, et al. Nemolizumab in patients with moderate-to-severe atopic dermatitis: Randomized, phase II, long-term extension study. J Allergy Clin Immunol. 142:1121-1130, 2018）。
【００１９】
ＩＬ−３１の作用を打ち消すためには、ＩＬ−３１受容体刺激により、ＩＬ−３１介在性疾患に関与する生体分子の産生、発現若しくは遊離又は活性化を阻害することによっても達成される。かかる活性化には、不活性又は低活性の生体分子が、活性化又は高活性化し、該生体分子の機能が増強する場合が含まれる。
【００２０】
（ニューロキニンＢシグナル）
これまでに、発明者らは、Ｄｏｃｋ８−／−  ＡＮＤ  Ｔｇマウスが亢進した掻破行動を示し、血中のＩＬ−３１の濃度が上昇していることを明らかにした。また、実施例において詳述するように、発明者らは、このマウスの後根神経節において、Ｔａｃｈｙｋｉｎｉｎ２（Ｔａｃ２）遺伝子の発現量が約２３倍に上昇していることを明らかにした。
【００２１】
Ｔａｃ２遺伝子は、神経ペプチドの前駆体であるｐｒｅｐｒｏｔａｃｈｙｋｉｎｉｎ−３（ＰＰＴ−３）をコードする。ＰＰＴ−３は、プロセシング酵素により翻訳後修飾を受けて、成熟型のニューロキニンＢ（ｎｅｕｒｏｋｉｎｉｎ  Ｂ、ＮＫＢ）となる。ＮＫＢは、ｎｅｕｒｏｋｉｎｉｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ３（ＮＫ３Ｒ）により受容される。
【００２２】
発明者らは、ＩＬ−３１の濃度上昇により、ＮＫＢの発現量が上昇し、ＮＫＢがＮＫ３Ｒを発現する神経細胞を活性化し、続いて、ｇａｓｔｒｉｎ−ｒｅｌｅａｓｉｎｇ  ｐｅｐｔｉｄｅ（ＧＲＰ）を発現する神経細胞が活性化し、さらにＧＲＰ受容体を発現する神経細胞が活性化することにより、マウスの掻破行動が引き起こされることを明らかにした。
【００２３】
本明細書において、ＮＫＢが掻破行動を引き起こす過程において、機能する分子及び神経回路を、ニューロキニンＢシグナルと呼ぶ。
【００２４】
上述のニューロキニンＢシグナルを遮断することにより、ＩＬ−３１の濃度上昇により引き起こされる掻破行動を抑制することができる。また、ニューロキニンＢシグナルを遮断することにより、ＩＬ−３１介在性疾患を予防又は治療することができる。
【００２５】
ニューロキニンＢシグナル遮断剤は、ＰＰＴ−３、プロセシング酵素、ＮＫＢ、ＮＫ３Ｒ、ＧＲＰ、ＧＲＰ受容体等の機能を抑制する薬剤であってもよい。
【００２６】
また、ニューロキニンＢシグナル遮断剤は、ＰＰＴ−３、プロセシング酵素、ＮＫＢ、ＮＫ３Ｒ、ＧＲＰ、ＧＲＰ受容体等の発現量を抑制する薬剤であってもよいし、ＮＫ３Ｒ受容体又はＧＲＰ受容体を発現する神経細胞を除去する薬剤であってもよい。
【００２７】
（アンタゴニスト）
ニューロキニンＢシグナル遮断剤は、ＮＫ３Ｒのアンタゴニスト（拮抗薬）であってもよい。ニューロキニンＢシグナル遮断剤は、ＮＫ３Ｒシグナル遮断剤ということもできる。また、ＮＫ３Ｒアンタゴニストは、ＮＫ３Ｒブロッカー（遮断薬）ということもできる。
【００２８】
ＮＫＢはＮＫ３Ｒに対して最も親和性が高く、ＮＫ３Ｒは、主にＮＫＢが結合することにより活性化される。
【００２９】
実施例において後述するように、発明者らは、ＩＬ−３１の投与が、ＮＫＢの発現を上昇させ、掻破行動を引き起こすことを明らかにした。また発明者らは、この掻破行動が、ＮＫ３Ｒのアンタゴニストである、オサネタント、フェゾリネタント、タルネタント、パヴィネタント、ＳＳＲ−１４６９７７、ＳＢ−２３５３７５、ＳＳＲ−２４１５８６及びＣＳ−００３により抑制されることを明らかにした。
【００３０】
すなわち、ＮＫ３Ｒの活性化を阻害することにより、ＩＬ−３１の濃度上昇により引き起こされる掻破行動を抑制することができる。また、ＮＫ３Ｒの活性化を阻害することにより、ＩＬ−３１介在性疾患を予防又は治療することができる。
【００３１】
ＮＫ３Ｒの活性化を阻害する因子としては、低分子化合物、ペプチド及びＮＫ３Ｒに対する抗体等が挙げられる。
【００３２】
１実施形態において、本発明は、上述のＮＫ３Ｒアンタゴニストが、上記式（１）、（２）又は（３）で表される化合物若しくはその塩又はそれらの溶媒和物である、ＩＬ−３１介在性疾患の予防又は治療剤を提供する。
【００３３】
上記式（１）中、アルキル基又はアルコキシ基は、直鎖状であってもよく、分岐鎖状であってもよい。また、ハロゲン原子は、フッ素原子、塩素原子、臭素原子又はヨウ素原子を意味し、好ましくはフッ素原子、塩素原子又はヨウ素原子である。
【００３４】
また、アシル基は、ホルミル基又は炭素数１〜６のアルキルカルボニル基であってよい。
【００３５】
上記式（１）、（２）又は（３）で表される化合物の塩としては、無機酸の塩及び有機酸の塩であって、上記式（１）、（２）又は（３）で表される化合物の分離又は結晶化に適切な塩があげられる。上記式（１）で表される化合物の塩としては、より具体的には、例えば、ピクリン酸塩及びオキザル酸塩；光学的に活性な酸との塩、例えばマンデル酸塩及びカンファースルホン酸塩；薬学的に許容しうる塩等が挙げられる。
【００３６】
上記式（１）、（２）又は（３）で表される化合物の薬学的に許容しうる塩としては、塩酸塩、臭素酸塩、硫酸塩、硫酸水素塩、リン酸二水素塩、メタンスルホン酸塩、メチル硫酸塩、マレイン酸塩、フマル酸塩、２−ナフタレンスルホン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、グリコール酸塩、グルコン酸塩、クエン酸塩、イセチオン酸塩、パラ−トルエンスルホン酸塩等が挙げられる。
【００３７】
上記式（１）、（２）又は（３）で表される化合物は、ラセミ体であってもよく、純粋なエナンチオマーであってもよい。
【００３８】
上記式（１）で表される化合物は、オサネタント（Ｏｓａｎｅｔａｎｔ）であってもよい。オサネタントは、Ｎ−［１−［３−［（３Ｒ）−１−ベンゾイル−３−（３，４−ジクロロフェニル）ピペリジン−３−イル）プロピル）−４−フェニルピペリジン−４−イル］−Ｎ−メチルアセタミドの国際一般名（ＩＮＮ）であり、下記式（４）で表される化学構造を有する化合物である。また、下記式（４）の化合物のＣＡＳ番号は１６０４９２−５６−８である。
【００３９】
【化１１】
2020101017.tif 000013
【００４０】
上記式（１）で表される化合物は、ＳＳＲ−１４６９７７であってもよい。ＳＳＲ−１４６９７７は、Ｎ−［１−［３−［１−ベンゾイル−３（Ｒ）−（３，４−ジクロロフェニル）ピペリジン−３−イル］プロピル］−４−フェニルピペリジン−４−イル］−Ｎ’，Ｎ’−ジメチルウレアであり、下記式（５）で表される化学構造を有する化合物である。また、下記式（５）の化合物のＣＡＳ番号は２６４６１８−４４−２である。
【００４１】
【化１２】
2020101017.tif 000014
【００４２】
上記式（１）で表される化合物は、ＳＳＲ−２４１５８６であってもよい。ＳＳＲ−２４１５８６は、（＋）−１’−［２−［４−ベンゾイル−２（Ｒ）−（３，４−ジクロロフェニル）モルホリン−２−イル］エチル］−Ｎ，Ｎ−ジメチル−１，４’−ビピペリジン−４’−カルボキサミドであり、下記式（６）で表される化学構造を有する化合物である。また、下記式（６）の化合物のＣＡＳ番号は１２３９２７９−３０−１である。
【００４３】
【化１３】
2020101017.tif 000015
【００４４】
上記式（１）で表される化合物は、ＣＳ−００３であってもよい。ＣＳ−００３は、１’−［２−［２−（Ｒ）−（３，４−ジクロロフェニル）−４−（３，４，５−）トリメトキシベンゾイル］モルホリン−２−イル］エチル］スピロ［ベンゾ［ｃ］チオフェン−１（３Ｈ）−４’−ピペリジン］２（Ｓ）−オキシドであり、下記式（７）で表される化学構造を有する化合物である。また、下記式（７）の化合物のＣＡＳ番号は１９１６７２−５２−３である。
【００４５】
【化１４】
2020101017.tif 000016
【００４６】
上記式（２）で表される化合物は、タルネタント（Ｔａｌｎｅｔａｎｔ）であってもよい。タルネタントは、Ｎ−（α−エチルベンジル）−３−ヒドロキシ−２−フェニルキノリン−４−カルボキサミドであり、下記式（８）で表される化学構造を有する化合物である。また、下記式（８）で表される化合物のＣＡＳ番号は１７４６３６−３２−９である。
【００４７】
【化１５】
2020101017.tif 000017
【００４８】
上記式（２）で表される化合物は、パヴィネタント（Ｐａｖｉｎｅｔａｎｔ）であってもよい。パヴィネタントは、３−（メタンスルフォンアミド）−２−フェニル−Ｎ−［１Ｓ］−１−フェニルプロピル］キノリン−４−カルボキサミドであり、下記式（９）で表される化合物である。また、下記式（９）で表される化合物のＣＡＳ番号は９４１６９０−５５−７である。
【００４９】
【化１６】
2020101017.tif 000018
【００５０】
上記式（２）で表される化合物は、ＳＢ−２３５３７５であってもよい。ＳＢ−２３５３７５は、２−［２−フェニル−４−［Ｎ−［１（Ｓ）−フェニルプロピル］カルバモイル］キノリン−３−イルオキシ］酢酸であり、下記式（１０）で表される化合物である。また、下記式（１０）で表される化合物のＣＡＳ番号は２２４９６１−３４−６である。
【００５１】
【化１７】
2020101017.tif 000019
【００５２】
上記式（３）で表される化合物は、フェゾリネタント（Ｆｅｚｏｌｉｎｅｔａｎｔ）であってもよい。フェゾリネタントは、（４−フルオロフェニル）−［（８Ｒ）−８−メチル−３−（３−メチル−１，２，４−チアジアゾール−５−イル）−６，８−ジヒドロ−５Ｈ−［１，２，４］トリアゾロ［４，３−ａ］ピラジン−７−イル］−メタノンであり、下記式（１１）で表される化合物である。また、下記式（１１）で表される化合物のＣＡＳ番号は１６２９２２９−３７−３である。
【００５３】
【化１８】
2020101017.tif 000020
【００５４】
（タキキニンプロセシング酵素）
マウスＴａｃ２遺伝子は、プレプロタキキニン−３（ＰＰＴ−３）をコードしている。ＰＰＴ−３は、翻訳後修飾を受け、ｎｅｕｒｏｋｉｎｉｎ  Ｂ（ＮＫＢ）が合成される。
【００５５】
この翻訳後修飾は、次の様に進むと考えられている。前駆体であるＰＰＴ−３は、リジン残基又はアルギニン残基が２個連続した位置で切断される。この切断は、Ｐｒｏｈｏｒｍｏｎｅ  ｃｏｎｖｅｒｔａｓｅ（ＰＣ）によって、触媒される。
【００５６】
ＰＣは、Ｐｒｏｐｒｏｔｅｉｎ  ｃｏｎｖｅｒｔａｓｅ  ｓｕｂｔｉｌｉｓｉｎ／ｋｅｘｉｎ（ＰＣＳＫ）ファミリーを構成している。ＰＣＳＫファミリーは、ＰＣＳＫ１〜９から構成される。そのうち、ＰＣＳＫ１及びＰＣＳＫ２は、生体内ペプチドをプロセシングする主要な酵素である。
【００５７】
ＰＣＳＫ１及びＰＣＳＫ２の発現量が低下したマウスの神経組織においては、ｎｅｕｒｏｋｉｎｉｎ  Ａの濃度が低下する。
【００５８】
切断されたペプチドのＣ末端にある、リジン残基及びアルギニン残基は、ｃａｒｂｏｘｙｐｅｐｔｉｄａｓｅにより、除去される。このうち、この反応に主にかかわる酵素は、ｃａｒｂｏｘｙｐｅｐｔｉｄａｓｅ  Ｅ（ＣＰＥ）である。
【００５９】
塩基性ペプチドが除去されたペプチドは、Ｃ末端にグリシン残基を有する。このＣ末端のグリシン残基のα位のアミノ基は、Ｐｅｐｔｉｄｙｌ−ｇｌｙｃｉｎｅ  ａｌｐｈａ−ａｍｉｄａｔｉｎｇ  ｍｏｎｏｏｘｙｇｅｎａｓｅ（ＰＡＭ）により、アミド化される。
【００６０】
ヒトにおいては、ＰＡＭはＰＡＭ遺伝子にコードされている。ＰＡＭは、ｐｅｐｔｉｄｙｌｇｌｙｃｉｎｅ  ａｌｐｈａ−ｈｙｄｒｏｘｙｌａｔｉｎｇ  ｍｏｎｏｏｘｙｇｅｎａｓｅ（ＰＨＭ）ドメインと、ｐｅｐｔｉｄｙｌ−ａｌｐｈａ−ｈｙｄｒｏｘｙｇｌｙｃｉｎｅ  ａｌｐｈａ−ａｍｉｄａｔｉｎｇ  ｌｙａｓｅ（ＰＡＬ）ドメインから構成されている。
【００６１】
ＰＨＭドメインは、ペプチドのＣ末端にあるグリシン残基を水酸化する。続いて、ＰＡＬドメインは、水酸化されたグリシン残基を除去する。一連の反応により、グリシンは切断され、ペプチドのＣ末端はアミド化されることになる。
【００６２】
ヒトＰＰＴ−３及びマウスＰＰＴ−３は、配列番号２に示される、ＮＫＢのアミノ酸配列を有している。また、ヒトＰＰＴ−３及びマウスＰＰＴ−３は、プロセシングに関わる上述の塩基性アミノ酸残基とグリシン残基を有している。
【００６３】
このことから、ヒトＰＰＴ−３及びマウスＰＰＴ−３の翻訳後修飾は、同一の機構により進行すると考えられる。
【００６４】
ＰＣＳＫ及びＣＰＥによる切断、並びにＰＡＭによるアミド化は、ＮＫＢが活性を持つために必要である。すなわち、これら酵素の活性を阻害することにより、ＮＫＢの作用を抑制することができる。
【００６５】
ニューロキニンＢシグナル遮断剤は、タキキニンプロセシング酵素の阻害剤又はタキキニンプロセシング酵素の分解促進剤であってもよい。タキキニンプロセシング酵素の阻害剤又はタキキニンプロセシング酵素の分解促進剤は、ＮＫＢの作用を抑制することにより、ＩＬ−３１の濃度上昇による掻破行動を抑制することができる。したがって、タキキニンプロセシング酵素の阻害剤は、ＩＬ−３１介在性疾患を予防又は治療するために用いることができる。
【００６６】
タキキニンプロセシング酵素としては、例えば、Ｐｒｏｐｒｏｔｅｉｎ  ｃｏｎｖｅｒｔａｓｅ  ｓｕｂｔｉｌｉｓｉｎ／ｋｅｘｉｎ  １（ＰＣＳＫ１）、Ｐｒｏｐｒｏｔｅｉｎ  ｃｏｎｖｅｒｔａｓｅ  ｓｕｂｔｉｌｉｓｉｎ／ｋｅｘｉｎ  ２（ＰＣＳＫ２）、ｃａｒｂｏｘｙｐｅｐｔｉｄａｓｅ  Ｅ（ＣＰＥ）、Ｐｅｐｔｉｄｙｌ−ｇｌｙｃｉｎｅ  ａｌｐｈａ−ａｍｉｄａｔｉｎｇ  ｍｏｎｏｏｘｙｇｅｎａｓｅ（ＰＡＭ）等が挙げられるが、これに限定されず、タキキニンのプロセシングに関わる酵素であれば何であってもよい。
【００６７】
タキキニンプロセシング酵素の阻害剤は、低分子化合物であってもよく、ペプチドであってもよく、またタキキニンプロセシング酵素に対する抗体等であってもよい。
【００６８】
（発現抑制剤）
１実施形態において、本発明は、ニューロキニンＢシグナル遮断剤であって、ニューロキニンＢ、ニューロキニン３受容体、タキキニンプロセシング酵素、ＧＲＰ又はＧＲＰ受容体の発現抑制剤である、ＩＬ−３１介在性疾患の予防又は治療剤を提供する。
【００６９】
発現抑制剤としては、例えば、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ等が挙げられる。ＮＫＢシグナルに関わるタンパク質をコードする遺伝子に対する発現抑制剤を投与することにより、上記のいずれかの因子の発現量を低下させて、ＮＫＢシグナルを遮断することができる。その結果、ＩＬ−３１の濃度上昇により引き起こされる掻破行動を抑制することができる。また、これらの発現抑制剤の投与により、ＩＬ−３１介在性疾患を予防又は治療することができる。
【００７０】
（神経細胞の除去）
１実施形態において、本発明は、ニューロキニン３受容体又はＧＲＰ受容体を発現する神経細胞の除去剤である、ＩＬ−３１介在性疾患の予防又は治療剤を提供する。
【００７１】
上記の神経細胞の除去剤は、細胞毒性物質を結合した、ＧＲＰ、ＧＲＰ受容体に対する特異的結合物質、ニューロキニンＢ又はニューロキニン３受容体に対する特異的結合物質であってもよい。
【００７２】
細胞毒性物質としては、例えば、リボソーム不活性化タンパク質（ｒｉｂｏｓｏｍｅｉｎａｃｔｉｖａｔｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ、ＲＩＰ）、ジフテリア毒素等が挙げられる。ＲＩＰとしては、例えば、サポリン、リシン、アブリン等が挙げられる。
【００７３】
細胞毒性物質と結合したＧＲＰは、ＧＲＰ受容体発現神経細胞に捕捉され、エンドサイトーシスにより細胞内に取り込まれる。同様に、細胞毒性物質と結合したニューロキニンＢは、ニューロキニン３受容体（ＮＫ３Ｒ）発現神経細胞に捕捉され、エンドサイトーシスにより細胞内に取り込まれる。続いて、細胞毒性物質を取り込んだ神経細胞は死滅し、除去される。
【００７４】
実施例において後述するように、発明者らは、サポリンをＧＲＰにコンジュゲートさせた、ＧＲＰ−サポリンをマウスに投与し、ＧＲＰ受容体を発現する神経細胞に細胞死を誘導することにより、神経細胞を除去した。その結果、ＧＲＰ受容体を発現する神経細胞を除去したマウスにおいては、ＩＬ−３１及びＮＫＢの投与により引き起こされる掻破行動が抑制されることを明らかにした。
【００７５】
すなわち、ＧＲＰ受容体又はＮＫ３Ｒを発現する神経細胞を除去することにより、ニューロキニンＢシグナルを遮断することができる。その結果、ＩＬ−３１の濃度上昇により引き起こされる掻破行動を抑制することができる。
【００７６】
また、上述の神経細胞の除去剤は、標的神経細胞の表面に特異的に捕捉されるタンパク質に、細胞毒性物質を結合したものであってもよい。標的神経細胞の表面に捕捉されるタンパク質としては、例えば、標的神経細胞特異的に発現する受容体に結合するリガンドでもよいし、標的神経細胞特異的に発現しかつ細胞表面に存在するタンパク質に対する特異的結合物質であってもよい。特異的結合物質としては、抗体、抗体断片、又はアプタマー等が挙げられる。抗体としては、例えば、抗ＧＲＰ受容体抗体、抗ＮＫ３Ｒ抗体等が挙げられる。
【００７７】
［医薬組成物］
１実施形態において、本発明は、上述したＩＬ−３１介在性疾患の予防又は治療剤及び薬学的に許容可能な担体を含む、ＩＬ−３１介在性疾患予防又は治療用医薬組成物を提供する。
【００７８】
本実施形態の医薬組成物は、経口的に使用される剤型であってもよく、非経口的に使用される剤型であってもよい。経口的に使用される剤型としては、例えば錠剤、カプセル剤、エリキシル剤、マイクロカプセル剤等が挙げられる。非経口的に使用される剤型としては、例えば注射剤、吸入剤、坐剤、皮膚外用剤、貼付剤等が挙げられる。
【００７９】
薬学的に許容される担体としては、例えば、滅菌水、生理食塩水等の溶媒；ゼラチン、コーンスターチ、トラガントガム、アラビアゴム等の結合剤；結晶性セルロース等の賦形剤；アルギン酸等の膨化剤等が挙げられる。
【００８０】
医薬組成物は添加剤を更に含んでいてもよい。添加剤としては、ステアリン酸マグネシウム等の潤滑剤；ショ糖、乳糖、サッカリン等の甘味剤；ペパーミント、アカモノ油等の香味剤；ベンジルアルコール、フェノールの安定剤；リン酸塩、酢酸ナトリウム等の緩衝剤；安息香酸ベンジル、ベンジルアルコール等の溶解補助剤；酸化防止剤；防腐剤等が挙げられる。
【００８１】
医薬組成物は、上記の担体及び添加剤を適宜組み合わせて、一般に認められた製薬実施に要求される単位用量形態で混和することによって製剤化することができる。
【００８２】
患者への投与は、例えば、髄腔内注射、動脈内注射、静脈内注射、皮下注射等のほか、鼻腔内的、経気管支的、筋内的、経皮的、又は経口的に当業者に公知の方法により行いうる。投与量は、患者の体重や年齢、患者の症状、投与方法等により変動するが、当業者であれば適当な投与量を適宜選択することが可能である。
【００８３】
ＩＬ−３１介在性疾患、例えばアトピー性皮膚炎の予防又は治療剤の投与量は、アトピー性皮膚炎の予防又は治療剤の種類、患者の症状等により変動するが、経口投与の場合、一般的に成人（体重６０ｋｇとして）においては、１日あたり約０．１〜５００ｍｇ、好ましくは約１．０〜２５０ｍｇ、より好ましくは約１．０〜１００ｍｇ程度を、１日１回、又は数回に分けて投与することが適切であると考えられる。
【００８４】
非経口的に投与する場合、その投与量は、ＩＬ−３１介在性疾患、例えばアトピー性皮膚炎の予防又は治療剤の種類、患者の症状、投与部位、投与方法等により変動するが、全身投与を行う場合は、一般的に成人（体重６０ｋｇとして）においては、１日あたり約０．１〜５００ｍｇ、好ましくは約１．０〜２５０ｍｇ、より好ましくは約１．０〜１００ｍｇ程度を、１日１回、又は数回に分けて投与することが適切であると考えられる。局所投与を行う場合は、一般的に成人（体重６０ｋｇとして）においては、１日あたり約０．００１〜１０ｍｇ、好ましくは約０．０１〜５ｍｇ、より好ましくは約０．０２〜２ｍｇ程度を、１日１回、又は数回に分けて投与することが適切であると考えられる。
【００８５】
［その他の実施形態］
１実施形態において、本発明は、ニューロキニンＢシグナル遮断剤の有効量を、治療を必要とする患者に投与することを含む、ＩＬ−３１介在性疾患の予防又は治療方法を提供する。
【００８６】
１実施形態において、本発明は、ＩＬ−３１介在性疾患の予防又は治療のためのニューロキニンＢシグナル遮断剤を提供する。
【００８７】
１実施形態において、本発明は、ＩＬ−３１介在性疾患の予防又は治療剤を製造するためのニューロキニンＢシグナル遮断剤を提供する。
【００８８】
上記の各実施形態において、上記ニューロキニンＢシグナル遮断剤は、ニューロキニン３受容体アンタゴニストであってもよい。上記ニューロキニンＢシグナル遮断剤は、タキキニンプロセシング酵素の阻害剤又はタキキニンプロセシング酵素の分解促進剤であってもよい。上記ニューロキニンＢシグナル遮断剤は、ニューロキニンＢ（ＮＫＢ）、ニューロキニン３受容体、タキキニンプロセシング酵素、ｇａｓｔｒｉｎ−ｒｅｌｅａｓｉｎｇ  ｐｅｐｔｉｄｅ（ＧＲＰ）又はＧＲＰ受容体の発現抑制剤であってもよい。上記ニューロキニンＢシグナル遮断剤は、ニューロキニン３受容体又はＧＲＰ受容体を発現する神経細胞の除去剤であってもよい。
【００８９】
上記、ニューロキニン３受容体アンタゴニストは、上記一般式（１）、（２）又は（３）で表される化合物若しくはその塩又はそれらの溶媒和物であってもよい。上記一般式（１）で表される化合物は上記式（４）、（５）、（６）又は（７）で表される化合物であってもよく、上記一般式（２）で表される化合物は上記式（８）、（９）又は（１０）で表される化合物であってもよく、上記一般式（３）で表される化合物は上記式（１１）で表される化合物であってもよい。
【００９０】
上記阻害剤は、Ｐｒｏｐｒｏｔｅｉｎ  ｃｏｎｖｅｒｔａｓｅ  ｓｕｂｔｉｌｉｓｉｎ／ｋｅｘｉｎ  １、Ｐｒｏｐｒｏｔｅｉｎ  ｃｏｎｖｅｒｔａｓｅ  ｓｕｂｔｉｌｉｓｉｎ／ｋｅｘｉｎ  ２、ｃａｒｂｏｘｙｐｅｐｔｉｄａｓｅ  Ｅ、又はＰｅｐｔｉｄｙｌｇｌｙｃｉｎｅ  ａｌｐｈａ−ａｍｉｄａｔｉｎｇ  ｍｏｎｏｏｘｙｇｅｎａｓｅの阻害剤であってもよい。
【００９１】
上記除去剤は、細胞毒性物質を結合した、ＧＲＰ、ＧＲＰ受容体に対する特異的結合物質、ＮＫＢ又はニューロキニン３受容体に対する特異的結合物質であってもよい。上記細胞毒性物質は、リボソーム不活性化タンパク質又はジフテリア毒素であってもよい。上記リボソーム不活性化タンパク質は、サポリン、リシン又はアブリンであってもよい。
【実施例】
【００９２】
以下、実施例により本発明を説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。【００９３】
［材料及び方法］
（マウス）
Ｔａｃ２−／−マウスは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムによるゲノム編集により作製した。ＣＨＯＰＣＨＯＰウェブデザインツール（https://chopchop.rc.fas.harvard.edu/）を用いて、マウスＴａｃ２遺伝子のエクソン４内に、標的部位を選択した。配列番号３と配列番号４に示されるオリゴヌクレオチドと、ＢｂｓＩライゲーションアダプターを合成した。配列番号５と配列番号６で示される配列が、ガイド配列である。ｓｇＲＮＡとＣａｓ９タンパク質を共発現させるために、これらふたつのヌクレオチドを合成し、アニールさせ、ライゲーションにより、ＢｂｓＩにより消化したｐｘ３３０ベクターに挿入した。作製したｐｘ３３０ベクター（濃度  ５ｎｇ／μＬ、ダルベッコＰＢＳ）を、Ｍ２培地（ｓｉｇｍａ社）中で、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで受精させたＣ５７ＢＬ／６マウス受精卵の前核にインジェクションした。インジェクションされた生殖細胞を、ＣＺＢ培地中、３７℃、５％ＣＯ２の環境下で、２細胞期の胚が成熟するまで生育させた。引き続いて、２４個〜３６個の胚を、メスのＩＣＲマウスの卵管に移植した。仔マウスの遺伝子型を、配列６と配列７に示されるプライマーを用いて、ＰＣＲを行い、ＴＡクローニング、ＤＮＡシークエンシングによって、同定した。所望の変異（Δ４及びΔ１５）を持つ仔マウスを、Ｃ５７ＢＬ／６マウス又はＤｏｃｋ８−／−  ＡＮＤ  Ｔｇマウスと交配させた。【００９４】
ＩＬ３１−／−マウスの作製については、まず、ｐＮＴ１．１ベクターをもとに、ｅｎｈａｎｃｅｄ  ｇｒｅｅｎ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ（ＥＧＦＰ）とｆｌｉｐｐａｓｅ  ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ  ｔａｒｇｅｔ（ＦＲＴ）−ｆｌａｎｋｅｄ  ｎｅｏｍｙｃｉｎ  ｒｅｓｉｓｔａｎｔ  ｃａｓｓｅｔｔｅ（ｎｅｏ）を、開始コドンの直後に挿入し、ターゲティングベクターを作製した。このターゲティングベクターを、エレクトロポレーションにより、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）に導入した。正しくベクターが導入されたＥＳクローンを、マイクロインジェクションにより胚盤胞へ注入し、得られたオスのキメラ個体を、メスのＣ５７ＢＬ／６マウスと交配させた。変異のヘテロ接合マウスを、ＣＡＧ−ＦＬＰｅトランスジェニックマウス（ＲＢＲＣ０１８３４）と交配し、ｎｅｏを除去した。ｎｅｏが除去された変異マウスは、Ｄｏｃｋ８＋／−  ＡＮＤ  Ｔｇマウス又はＤｏｃｋ８＋／−  Ｏｓｍｒ＋／−マウスと交配する前に、Ｃ５７ＢＬ／６マウスと５回以上戻し交雑した。Ｏｓｍｒは、オンコスタチンＭ受容体（Ｏｎｃｏｓｔａｔｉｎ  Ｍ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ、ＯＳＭＲ）をコードする遺伝子であり、ＯＳＭＲはＩＬ−３１受容体αとヘテロダイマーを構成してＩＬ−３１シグナルを細胞内に伝える。【００９５】
全てのマウスは、九州大学の動物施設内の、特別な、病原体のない環境において飼育された。実験のコントロールとしては、週齢、性別が一致する同腹仔を用いた。動物実験の手法は、九州大学の動物実験倫理委員会により認可された。【００９６】
（神経の除去）
ＧＲＰ−サポリン、Ｎｐｐｂ−サポリン及びサポリンのみ（それぞれ、２μｇ／５μＬ、Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）を、Ｌ３／４部位に髄腔内投与することにより、ＧＲＰ受容体とＮｐｐｂ受容体を発現する脊髄の神経細胞の除去を行った。毒物を注射した２週間後に、マウスは実験に用いられた。【００９７】
（掻破行動の計測）
実験の前に、環境に慣れさせるために、マウスは、最低１時間、アクリル製ケージ（１１ｃｍ×１４ｃｍ×２０ｃｍ）に入れられた。引き続いて、５０μＬの、滅菌した生理食塩水に溶解させた掻痒惹起物質を、マウスの肩に皮内注射し、これらマウスの行動をビデオ撮影した。指定された時間内の掻破行動の合計回数を、ビデオを再生して決定した。マウスの掻破行動時には、マウスは後脚を痒い箇所に伸ばし、頭部を後脚へ傾け、すばやく後脚を数回動かし、後脚を地面にもどす。これら一連の動作を、一回の掻破行動としてカウントした。掻痒惹起物質としては、ＩＬ−３１（１μｇ／５０μｌ；ペプロテック）、ＳＬＩＧＲＬ−ＮＨ２（１００μｇ／５０μｌ；ＢＡＣＨＥＭ）、クロロキン（１００μｇ／５０μｌ；和光純薬）及びヒスタミン（１００μｇ／５０μｌ；和光純薬）を使用した。【００９８】
いくつかの実験では、マウスの掻破行動に対するＮＫ３Ｒアンタゴニストの作用を検討した。ＮＫ３Ｒアンタゴニスト又はＮＫ３Ｒアンタゴニストとしての活性を有する化合物として、オサネタント（Ａｘｏｎ  Ｍｅｄｃｈｅｍ）、タルネタント（ナミキ商事）、パヴィネタント（ナミキ商事）、フェゾリネタント（Ｈａｏｙｕａｎ  ＣｈｅｍＥｘｐｒｅｓｓ）、ＳＳＲ−１４６９７７（Ｔｏｃｒｉｓ）、ＳＳＲ−２４１５８６（ＷｕＸｉ  ＡｐｐＴｅｃ）、ＳＢ−２３５３７５（ＷｕＸｉ  ＡｐｐＴｅｃ）およびＣＳ−００３（ＷｕＸｉ  ＡｐｐＴｅｃ）を使用した。これらの化合物は、掻痒惹起物質を皮内注射する４５分前に、マウスに対して、マウスの体重あたりの所定量を投与した。オサネタントは、０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０を含むリン酸緩衝液（ＰＢＳ）に溶解させて、５ｍｇ／ｋｇで腹腔内注射した。タルネタント及びパヴィネタントは、１０％ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、４０％ポリエチレングリコール３００、５％Ｔｗｅｅｎ−８０及び４５％生理食塩水の混合液に溶解させて、３０ｍｇ／ｋｇで腹腔内注射した。フェゾリネタントは、１０％ＤＭＳＯを含むＰＢＳに溶解させて、１０ｍｇ／ｋｇで経口投与した。ＳＳＲ−１４６９７７は、０．１％エタノールを含むＰＢＳに溶解させて、０．３ｍｇ／ｋｇで腹腔内注射した。ＳＳＲ−２４１５８６は、０．０１％Ｔｗｅｅｎ−８０水溶液に溶解させて、３ｍｇ／ｋｇで腹腔内注射した。ＳＢ−２３５３７５は、ＰＢＳに溶解させて、３ｍｇ／ｋｇで経口投与した。ＣＳ−００３は、５％グルコースを含むＰＢＳに溶解させて、３ｍｇ／ｋｇで静脈内注射した。【００９９】
（組織学と免疫組織化学）
皮膚組織は、４％（ｗ／ｖ）のパラホルムアルデヒドで固定し、パラフィンブロックに包埋した。３μｍの厚さの切片を、ヘマトキシリンとエオシンにより染色し、光学顕微鏡で観察した。ｄｏｒｓａｌ  ｒｏｏｔ  ｇａｎｇｌｉｏｎ（ＤＲＧ、後根神経節）と脊髄の免疫組織化学的解析では、マウスをイソフルランで麻酔後に、心臓からＰＢＳ及び４％パラホルムアルデヒドを順次かん流した。ＤＲＧと脊髄組織を回収し、４℃で一晩固定した後に、３０％スクロース−ＰＢＳに浸漬して、組織の凍害を防いだ。組織サンプルをＯＣＴコンパウンド（Ｓａｋｕｒ  Ｆｉｎｔｅｃｈ）により包埋し、ドライアイス上で凍結させた。クライオスタットを用いて、１０μｍの厚さの切片を作製し、室温で３０分間、Ｇ−ｂｌｏｃｋ（Ｇｅｎｏｓｔａｆｆ、ＧＢ−０１）により、切片をブロッキングし、４℃で一晩、一次抗体とインキュベートした。一次抗体は、蛍光色素とコンジュゲートした二次抗体（サーモフィッシャーサイエンティフィック）で検出した。各染色には、ＤＡＰＩ（１：５０００、同仁化学研究所）を用いた。全ての画像は、共焦点レーザー顕微鏡（ＦＶ３０００、Ｏｌｙｍｐｕｓ）を用いて取得した。一次抗体としては、ウサギ抗ｎｅｕｒｏｋｉｎｉｎ  Ｂ抗体（１：５００；ＮＯＶＵＳ，ＮＢ３００−２０１）、ウサギ抗ＮＫ３Ｒ抗体（１：５０；ＮＯＶＵＳ，ＮＢ３００−１０２）、ウサギ抗ＴＲＰＶ１抗体（１：５００；Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，ＡＢ９５５４）、抗ＩＬ−３１ＲＡ抗体（１：１００；Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，ＡＦ２１０７）、マウス抗ｃ−ｆｏｓ抗体（１：１０００；ＥｎＣｏｒ，ＭＣＡ−２Ｈ２）、ウサギ抗ＧＲＰＲ抗体（１：５０；ＬＳＢｉｏ，ＬＳ−Ａ８３１−５０）及びウサギ抗ＮＰＲＡ抗体（１：５０；ＬＳＢｉｏ，ＬＳ−Ｃ１６４５０６）を用いた。【０１００】
（マイクロアレイ解析）
全ＲＮＡはＩＳＯＧＥＮ（ニッポンジーン）を用いて分離し、Ｌｏｗ  Ｉｎｐｕｔ  Ｑｕｉｃｋ  Ａｍｐ  Ｌａｂｅｌｉｎｇ  Ｋｉｔ（アジレントテクノロジーズ）を用いて、ｃＲＮＡを増幅し、標識した。ｃＲＮＡを４４Ｋ  ６０−ｍｅｒ  ｏｌｉｇｏｍｉｃｒｏａｒｒａｙ（Ｗｈｏｌｅ  Ｍｏｕｓｅ  Ｇｅｎｏｍｅ  ｏｌｉｇｏ  ＤＮＡ  Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ  Ｋｉｔ  Ｖｅｒ  ２．０；  アジレントテクノロジーズ）にハイブリダイズさせた。Ａｇｉｌｅｎｔ  ｓｃａｎｎｅｒを用いて、ハイブリダイズさせたマイクロアレイスライドをスキャンした。Ｆｅａｔｕｒｅ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  ｖｅｒｓｉｏｎ  ９．５．１．１（アジレントテクノロジーズ）を用いて、ハイブリダイゼーションの相対強度と、ハイブリダイゼーションのバックグラウンド値を算出した。アジレントテクノロジーズが推奨する手法に従って、シグナル強度の生データと、プローブのフラグ値は、ハイブリダイゼーション強度とスポット位置から算出した。実験サンプル中の、発現量が上昇又は減少した遺伝子を同定するために、それぞれのプローブの規格化したシグナル強度をもとに、Ｚ−スコアと比率を算出した。Ｚ−スコアが２．０より大きく、比率が１．５より大きい遺伝子を、発現量が上昇した遺伝子と判断し、Ｚ−スコアが−２．０より小さく、比率が０．６６より小さい遺伝子を、発現量が低下した遺伝子と判断した。【０１０１】
（統計処理）
ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍを用いて、統計処理を行った。まず、Ｋｏｌｍｏｇｏｒｏｖ−Ｓｍｉｒｎｏｖ  ｔｅｓｔにより、データが正規分布に従うか検討した。パラメトリックなデータは、ふたつの集団のデータを比較する場合には、ｔｗｏ−ｔａｉｌｅｄ  ｕｎｐａｉｒｅｄ  Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ  ｔ  ｔｅｓｔを用いて、解析した。パラメトリックなデータは、複数の集団のデータを比較する場合には、ｏｎｅ−ｗａｙ  ＡＮＯＶＡを用いた後、Ｂｏｎｆｅｒｒｏｎｉ  ｐｏｓｔ  ｈｏｃ  ｔｅｓｔを用いて、解析した。ノンパラメトリックなデータは、ふたつの集団のデータを比較する場合には、Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ  ｔｅｓｔを用いて、解析した。０．０５以下のＰ値を、有意であると考えた。【０１０２】
（リアルタイムＰＣＲ）
ＩＳＯＧＥＮ（ニッポンジーン）を用いて、それぞれの組織から、全ＲＮＡを分離した。ＲＮａｓｅ−ｆｒｅｅ  ＤＮａｓｅＩ（サーモフィッシャーサイエンティフィック）により全ＲＮＡを処理した。このＲＮＡサンプルを、オリゴ（ｄＴ）プライマー（サーモフィッシャーサイエンティフィック）とＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＩＩＩ逆転写酵素（サーモフィッシャーサイエンティフィック）を用いて逆転写し、ＰＣＲにより増幅した。リアルタイムＰＣＲは、ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（アプライドバイオシステムズ）を用いて、Ｃｆｘ  Ｃｏｎｎｅｃｔｔｍ  Ｔｈｅｒｍａｌ  Ｃｙｃｌｅｒ（バイオラッド）により行った。標的遺伝子の発現量は、Ｈｐｒｔ遺伝子の発現量で規格化した。解析には、装置に付属のＣＦＸ  Ｍａｎａｇｅｒ（ｖｅｒ３．１）を用いた。【０１０３】
［実験例１］
（痒みを伝達する神経回路）
ＩＬ−３１により活性化される、掻痒の感覚を伝達する神経回路について解析した。多くの痒みを誘起する物質は、脊髄神経において、ｎａｔｒｉｕｒｅｔｉｃ  ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ  ｂ（Ｎｐｐｂ）、又はｇａｓｔｒｉｎ−ｒｅｌｅａｓｉｎｇ  ｐｅｐｔｉｄｅ（ＧＲＰ）を介して、掻痒感覚を伝達する。【０１０４】
ＧＲＰ受容体又はＮｐｐｂ受容体を発現する神経細胞を除去するために、サポリンをコンジュゲートさせたＧＲＰ又はＮｐｐｂ（ＧＲＰ−サポリン、Ｎｐｐｂ−サポリン）を、それぞれ野生型のＣ５７ＢＬ／６マウスの髄腔へ注射し、２週間後にＩＬ−３１をこれらのマウスに投与して、各マウスの掻破行動を解析した。【０１０５】
サポリンは、リボソーム不活性化タンパク質（ｒｉｂｏｓｏｍｅ−ｉｎａｃｔｉｖａｔｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ、ＲＩＰ）のひとつである。【０１０６】
標的神経細胞に発現する受容体のリガンドとＲＩＰをコンジュゲートしたタンパク質は、標的神経細胞に捕捉され、エンドサイトーシスにより細胞内に取り込まれる。取り込まれた、ＲＩＰとコンジュゲートされたタンパク質は、翻訳を阻害し、標的神経細胞を死滅させる。【０１０７】
図１（ａ）は、ＧＲＰ−サポリン又はＮｐｐｂ−サポリンを、それぞれ野生型Ｃ５７ＢＬ／６マウスの髄腔へ注射した後、ＩＬ−３１をこれらマウスに投与し、これらマウスの掻破行動を解析した結果である。図１（ａ）中、Ｂｌａｎｋはサポリンのみを髄腔へ注射した結果を示す。ＩＬ−３１（−）はＩＬ−３１非投与群の結果を示し、ＩＬ−３１（＋）は、ＩＬ−３１投与群の結果を示す。図１（ａ）〜（ｃ）中、「＊」はｐ＜０．０５で有意差があることを示し、「＊＊」はｐ＜０．０１で有意差があることを示す。【０１０８】
髄腔内注射実験の結果から、ＧＲＰ−サポリンの注射により、ＩＬ−３１により誘導される掻破行動は抑制されることが明らかになった。しかし、Ｎｐｐｂ−サポリンを注射した場合には、掻破行動は抑制されなかった。【０１０９】
次に、ＧＲＰ受容体（ＧＲＰＲ）又はＮＰＰ受容体Ａ（ＮＰＲＡ）のｍＲＮＡ及びタンパク質の発現量を解析することにより、ＧＲＰ−サポリン及びＮｐｐｂ−サポリンが、それぞれ、ＧＲＰＲ及びＮＰＲＡを発現する神経を除去したか否かを確認した。【０１１０】
ＧＲＰＲ及びＮＰＲＡ遺伝子のｍＲＮＡの発現量は、次のように解析した。まず、注射後の脊髄をマウスから摘出し、摘出した脊髄から全ＲＮＡを分離し、全ＲＮＡを鋳型にして逆転写反応を行った。引き続いて、定量ＰＣＲを行って、各遺伝子の発現量を解析した。【０１１１】
図１（ｂ）及び（ｃ）は、ＧＲＰ−サポリン又はＮｐｐｂ−サポリンを、それぞれ野生型Ｃ５７ＢＬ／６マウスの髄腔へ注射した後、脊髄におけるＧＲＰＲ及びＮＰＲＡのｍＲＮＡの発現量を解析した結果である。【０１１２】
ＧＲＰＲ及びＮＰＲＡのｍＲＮＡの発現量を解析した結果から、ＧＲＰ−サポリン又はＮｐｐｂ−サポリンの注射により、脊髄におけるＧＲＰＲ及びＮＰＲＡ  ｍＲＮＡの発現量が低下していることが確認された。【０１１３】
ＧＲＰＲ及びＮＰＲＡのタンパク質の発現量は、次のように解析した。注射後の脊髄をマウスから摘出し、摘出した脊髄から切片を作製した。作製した切片を、抗ＧＲＰＲ抗体及び抗ＮＰＲＡ抗体を用いて、免疫組織化学により解析した。【０１１４】
図１（ｄ）は、ＧＲＰ−サポリン又はＮｐｐｂ−サポリンを髄腔へ注射した後、脊髄を摘出し、抗ＧＲＰＲ抗体及び抗ＮＰＲＡ抗体を用いて免疫染色した結果である。図１（ｄ）中、スケールバーは１０μｍを示す。【０１１５】
ＧＲＰＲタンパク質及びＮＰＲＡタンパク質の発現量を解析した結果から、ＧＲＰ−サポリン又はＮｐｐｂ−サポリンの注射により、脊髄におけるＧＲＰＲ及びＮＰＲＡタンパク質の発現量が低下していることが確認された。【０１１６】
以上の結果を小括すると、ＧＲＰ−サポリン又はＮｐｐｂ−サポリンを注射することにより、ＧＲＰＲ及びＮＰＲＡを発現する神経細胞が除去されることが確認された。また、ＩＬ−３１の投与により惹起される掻破行動は、Ｎｐｐｂを介さず、ＧＲＰを介することが明らかになった。【０１１７】
［実験例２］
（ＩＬ−３１変異マウスの作製）
ＩＬ−３１の機能を解析するために、ＩＬ−３１遺伝子を欠損するマウスを作製した。上述したように、ＦＲＴに挟まれたｎｅｏカセットを、ＩＬ−３１遺伝子のエクソン１の直後に挿入した。図２（ａ）は、ＩＬ−３１遺伝子、ターゲティングベクター及び組換え後の遺伝子構造を模式的に示した図である。【０１１８】
図２（ａ）中、ＷＴ  ａｌｌｅｌｅは、野生型Ｃ５７ＢＬ／６マウスのＩＬ−３１の遺伝子構造の模式図であり、Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｖｅｃｔｏｒは、ターゲティングベクターの構造の模式図であり、Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ａｌｌｅｌｅは、相同組換え後の遺伝子構造の模式図であり、ＫＩ  ａｌｌｅｌｅは、フリッパーゼによりｎｅｏカセットが除去された後の遺伝子構造の模式図である。【０１１９】
野生型Ｃ５７ＢＬ／６マウスと、ｎｅｏが除去されたマウスの遺伝子型は、配列番号９、１０及び１１に示されるプライマーを用いて、ＰＣＲにより判別した。図２（ｂ）は、各ＰＣＲ産物を２％のアガロースゲルにより電気泳動した図である。図２（ｂ）中、ｗ／ｗは野生型ａｌｌｅｌｅの遺伝子型を示し、ＫＩ／ｗは野生型ａｌｌｅｌｅとＫＩ  ａｌｌｅｌｅのヘテロ接合の遺伝子型を示し、ＫＩ／ＫＩはＫＩ  ａｌｌｅｌｅホモ接合の遺伝子型を示す。【０１２０】
野生型Ｃ５７ＢＬ／６マウスのゲノムを鋳型としたＰＣＲ産物の長さは３００ｂｐであり、ＩＬ−３１遺伝子が除去された、ノックインマウスのゲノムを鋳型としたＰＣＲ産物の長さは５５０塩基対であった。この結果から、ノックインマウスが得られたことが確認された。【０１２１】
［実験例３］
（Ｄｏｃｋ８−／−  ＡＮＤ  Ｔｇマウスの解析）
Ｄｏｃｋ８−／−  ＡＮＤ  Ｔｇマウスの皮膚炎及び掻破行動を解析した。また、Ｄｏｃｋ８−／−  ＡＮＤ  Ｔｇマウスの後根神経節において発現量が上昇する遺伝子を解析した。【０１２２】
まず、Ｄｏｃｋ８＋／−Ｏｓｍｒ＋／＋ＩＬ３１＋／＋、Ｄｏｃｋ８−／−Ｏｓｍｒ＋／−ＩＬ３１＋／＋、Ｄｏｃｋ８−／−Ｏｓｍｒ-／−ＩＬ３１＋／＋及びＤｏｃｋ８−／−Ｏｓｍｒ＋／＋ＩＬ３１−／−の遺伝子型を有するＡＮＤ  Ｔｇマウスの皮膚組織をＨＥ染色により解析した。図３（ａ）は、ヘマトキシリン染色により、各遺伝子型のマウスの皮膚組織を解析した図である。Ｏｓｍｒは、オンコスタチンＭ受容体（Ｏｎｃｏｓｔａｔｉｎ  Ｍ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ、ＯＳＭＲ）をコードする遺伝子であり、ＯＳＭＲはＩＬ−３１受容体αとヘテロダイマーを構成してＩＬ−３１シグナルを細胞内に伝える。【０１２３】
皮膚組織を解析した結果から、Ｄｏｃｋ８遺伝子を欠損するＡＮＤ  Ｔｇマウスは、アトピー性皮膚炎様の皮膚炎を起こすが、この皮膚炎は、Ｏｓｍｒ又はＩＬ３１遺伝子の欠損により消失することが明らかになった。【０１２４】
次に、Ｄｏｃｋ８＋／−Ｏｓｍｒ＋／＋ＩＬ３１＋／＋、Ｄｏｃｋ８−／−Ｏｓｍｒ＋／−ＩＬ３１＋／＋、Ｄｏｃｋ８−／−Ｏｓｍｒ-／−ＩＬ３１＋／＋及びＤｏｃｋ８−／−Ｏｓｍｒ＋／＋ＩＬ３１−／−の遺伝子型を有するＡＮＤ  Ｔｇマウスの、掻破行動を解析した。図３（ｂ）は、各遺伝子型のマウスの掻破行動を解析した図である。【０１２５】
掻破行動を解析した結果から、Ｄｏｃｋ８遺伝子を欠損するＡＮＤ  Ｔｇマウスは、掻破行動を示すが、この掻破行動は、Ｏｓｍｒ又はＩＬ３１遺伝子の欠損により消失することが明らかになった。【０１２６】
さらに、Ｄｏｃｋ８＋／−Ｏｓｍｒ＋／＋ＩＬ３１＋／＋、Ｄｏｃｋ８−／−Ｏｓｍｒ＋／−ＩＬ３１＋／＋、Ｄｏｃｋ８−／−Ｏｓｍｒ-／−ＩＬ３１＋／＋及びＤｏｃｋ８−／−Ｏｓｍｒ＋／＋ＩＬ３１−／−の遺伝子型を有するＡＮＤ  Ｔｇマウスの血清中の、ＩＬ−３１の濃度を解析した。図３（ｃ）は、各遺伝子型のマウスの血清中の、ＩＬ−３１の濃度を解析した結果である。【０１２７】
ＩＬ−３１の濃度を解析した結果から、Ｄｏｃｋ８遺伝子を欠損するＡＮＤ  Ｔｇマウスの血清中のＩＬ−３１の濃度は上昇するが、この濃度の上昇は、ＩＬ−３１遺伝子の欠損により消失した。【０１２８】
次に、Ｄｏｃｋ８−／−  ＡＮＤ  Ｔｇマウスの後根神経節（ｄｏｒｓａｌ  ｒｏｏｔ  ｇａｎｇｌｉｏｎ、ＤＲＧ）における発現量が、Ｄｏｃｋ８＋／−  ＡＮＤ  ＴｇマウスのＤＲＧにおける発現量よりも高い遺伝子を、マイクロアレイを用いて解析した。【０１２９】
マイクロアレイの解析結果から、既知のシグナル伝達因子及び神経伝達物質等のｍＲＮＡの発現量が上昇していることが明らかになった。そのうちのひとつは、ニューロキニンＢをコードするＴａｃ２であった。【０１３０】
次に、Ｄｏｃｋ８＋／−Ｏｓｍｒ＋／＋ＩＬ３１＋／＋、Ｄｏｃｋ８−／−Ｏｓｍｒ＋／−ＩＬ３１＋／＋、Ｄｏｃｋ８−／−Ｏｓｍｒ-／−ＩＬ３１＋／＋及びＤｏｃｋ８−／−Ｏｓｍｒ＋／＋ＩＬ３１−／−の遺伝子型を有するＡＮＤ  Ｔｇマウスの、ＤＲＧにおける、Ｔａｃ２のｍＲＮＡの発現量を解析した。図３（ｄ）は、各遺伝子型のマウスのＤＲＧにおける、Ｔａｃ２のｍＲＮＡの発現量を解析した結果である。図３（ｂ）〜（ｄ）中、Ｄｏｃｋ８＋／−Ｏｓｍｒ＋／＋ＩＬ３１＋／＋のデータと比較して、「＊」はｐ＜０．０５で有意差があることを示し、「＊＊」はｐ＜０．０１で有意差があることを示す。【０１３１】
Ｔａｃ２のｍＲＮＡの発現量は、次のように解析した。まず、各遺伝子型のマウスのＤＲＧから全ＲＮＡを分離して、全ＲＮＡを鋳型にして逆転写反応を行った。続いて、定量ＰＣＲを行い、Ｔａｃ２遺伝子のｍＲＮＡの発現量を解析した。【０１３２】
その結果、Ｄｏｃｋ８遺伝子を欠損するＡＮＤ  ＴｇマウスのＤＲＧにおいて、Ｔａｃ２のｍＲＮＡの発現量は２３倍に上昇することが明らかになった。また、この発現量の上昇は、Ｏｓｍｒ又はＩＬ３１遺伝子の欠損により消失することが明らかになった。【０１３３】
以上の結果を小括すると、Ｄｏｃｋ８−／−  ＡＮＤ  Ｔｇマウスにおいては、ＩＬ−３１タンパク質の産生量が上昇し、ＩＬ−３１タンパク質はＯＳＭＲを含むＩＬ−３１受容体タンパク質を介して、Ｔａｃ２遺伝子の発現量を上昇させることが明らかになった。【０１３４】
［実験例４］
（ＩＬ−３１及びＮＫＢ刺激による遺伝子発現変化）
ＩＬ−３１又はＮＫＢの投与による、Ｔａｃ２、Ｇｒｐ及びＮｐｐｂの発現量変化を解析した。まず、野生型のＣ５７ＢＬ／６マウスより単離したＤＲＧ神経細胞を、インビトロにおいて、ＩＬ−３１タンパク質の投与により刺激し、Ｔａｃ２、Ｇｒｐ及びＮｐｐｂのｍＲＮＡの発現量を解析した。図４（ａ）は、ＩＬ−３１を投与後、各遺伝子のｍＲＮＡの発現量を解析した結果である。【０１３５】
Ｔａｃ２、Ｇｒｐ及びＮｐｐｂのｍＲＮＡの発現量を解析した結果から、ＩＬ−３１の投与により、Ｔａｃ２とＧｒｐのｍＲＮＡの発現量は上昇するが、Ｎｐｐｂの発現量は上昇しないことが明らかになった。【０１３６】
次に、野生型のＣ５７ＢＬ／６マウスより単離したＤＲＧ神経細胞を、インビトロでニューロキニンＢ（ＮＫＢ）により刺激し、Ｇｒｐ及びＮｐｐｂのｍＲＮＡの発現量を解析した。図４（ｂ）は、ＮＫＢの投与後、各遺伝子の発現量を解析した結果である。【０１３７】
Ｇｒｐ及びＮｐｐｂのｍＲＮＡの発現量を解析した結果から、ＮＫＢによる刺激により、ＧｒｐのｍＲＮＡの発現量が上昇することが明らかになった。この結果から、ＮＫＢがＧＲＰの上流において機能すると考えられる。【０１３８】
［実験例５］
（Ｄｏｃｋ８−／−  ＡＮＤ  ＴｇマウスのＤＲＧにおけるＮＫＢの発現）
Ｄｏｃｋ８−／−  ＡＮＤ  ＴｇマウスのＤＲＧにおけるＮＫＢとＩＬ−３１  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  Ａ（ＩＬ−３１ＲＡ）の発現を免疫染色により解析した。【０１３９】
Ｄｏｃｋ８−／−  ＡＮＤ  ＴｇマウスからＤＲＧを単離して、切片を作製した。作製した切片を、抗ＮＫＢ抗体及び抗ＩＬ−３１ＲＡ抗体を用いて、免疫組織化学により解析した。図５（ａ）は、抗ＮＫＢ抗体及び抗ＩＬ−３１ＲＡ抗体による免疫染色の結果である。【０１４０】
図５（ａ）中、「ＤＡＰＩ」は、ＤＡＰＩ染色の結果を示し、「ＮＫＢ」は、抗ＮＫＢ抗体による免疫染色の結果を示し、「ＩＬ−３１ＲＡ」は、抗ＩＬ−３１ＲＡ抗体による免疫染色の結果を示し、「Ｍｅｒｇｅ」は、抗ＮＫＢ抗体による免疫染色、抗ＩＬ−３１ＲＡ抗体による免疫染色及びＤＡＰＩ染色を重ね合わせた結果を示す。スケールバーは１００μｍを示す。【０１４１】
免疫染色の結果から、Ｄｏｃｋ８−／−  ＡＮＤ  ＴｇマウスのＤＲＧおいて、ＩＬ−３１ＲＡタンパク質が発現する細胞において、ＮＫＢが発現することが明らかになった。【０１４２】
次に、Ｄｏｃｋ８−／−  ＡＮＤ  ＴｇマウスのＤＲＧにおける、ＮＫＢとＴｒａｎｓｉｅｎｔ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ｃａｔｉｏｎ  Ｃｈａｎｎｅｌ  ｖａｎｉｌｌｏｉｄ  ｓｕｂｔｙｐｅ  １（ＴＲＰＶ１）タンパク質の発現を免疫染色により解析した。【０１４３】
ＴＲＰＶ１は、痒みを感知する感覚神経細胞において発現し、その感覚神経細胞は、脊髄後角のｏｕｔｅｒ  ｌａｙｅｒ  ｌａｍｉｎａ  Ｉへ軸索を伸ばす。【０１４４】
ＮＫＢ及びＴＲＰＶ１の発現は、次のように解析した。Ｄｏｃｋ８−／−  ＡＮＤ  ＴｇマウスからＤＲＧを単離して、切片を作製した。作製した切片を、抗ＮＫＢ抗体及び抗ＴＲＰＶ１抗体を用いて、免疫組織化学により解析した。図５（ｂ）は、Ｄｏｃｋ８−／−  ＡＮＤ  ＴｇマウスのＤＲＧにおける、ＮＫＢとＴＲＰＶ１の発現を示す図である。【０１４５】
図５（ｂ）中、「ＤＡＰＩ」は、ＤＡＰＩ染色の結果を示し、「ＮＫＢ」は、抗ＮＫＢ抗体による免疫染色の結果を示し、「ＴＲＰＶ１」は、抗ＴＲＰＶ１抗体による免疫染色の結果を示し、「Ｍｅｒｇｅ」は、抗ＮＫＢ抗体による免疫染色と、抗ＴＲＰＶ１抗体による免疫染色とを、重ね合わせた結果を示す。【０１４６】
免疫染色の結果から、Ｄｏｃｋ８−／−  ＡＮＤ  ＴｇマウスのＤＲＧおいて、ＴＲＰＶ１が発現する細胞の一部において、ＮＫＢが発現することが明らかになった。【０１４７】
［実験例６］
（Ｔａｃ２遺伝子変異マウスの作製）
Ｔａｃ２遺伝子の機能を解析するために、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ヌクレアーゼを用いて、Ｔａｃ２遺伝子を欠損するマウス（Ｔａｃ２−／−）を作製した。【０１４８】
図６（ａ）は、マウスＴａｃ２遺伝子と、それにコードされるタンパク質とを模式的に示した図である。成熟型であり、活性のあるＴａｃ２タンパク質は、エクソン６にコードされ、これは前駆体ペプチドからプロセシングを経て合成される。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムによるゲノム編集に用いるガイドＲＮＡは、エクソン４の内部に設計した。【０１４９】
上述のゲノム編集により、２系統の変異マウス（Δ４及びΔ１５）を作製した。ＰＣＲにおいては、配列番号７と配列番号８に示される配列のプライマーを用いた。電気泳動は、ＭｕｌｔｉＮＡマイクロチップ電気泳動システム（ＭＣＥ−２０２、島津製作所）を用いて行った。図６（ｂ）は、ＰＣＲと電気泳動により、Ｔａｃ２遺伝子欠損マウスのＴａｃ２の遺伝子型（Δ４及びΔ１５）を、判別した図である。【０１５０】
図６（ｃ）は、２種の変異のゲノム配列と、転写されたｍＲＮＡがコードするアミノ酸配列を示した図である。欠失部位は、Δ４（４塩基欠損）及びΔ１５（１５塩基欠損）で示した。図６（ｃ）中、コーディング配列を実線で、スプライスドナー配列をボックスで示した。【０１５１】
転写されたｍＲＮＡの配列を次のように決定した。まず、それぞれの変異マウスのＤＲＧ神経細胞から全ＲＮＡを分離し、逆転写反応によりｃＤＮＡを得た。これらｃＤＮＡを、配列番号１２と配列番号１３に示されるプライマーを用いて、ＰＣＲにより増幅させた。増幅産物をＴＡクローニングによりクローニングし、ｃＤＮＡ配列を解析した。【０１５２】
２種の変異は、共に、エクソン４に欠失変異があり、アミノ酸配列にフレームシフトを引き起こす。そのため、変異した遺伝子は、成熟型ペプチド配列をコードしないことが明らかになった。【０１５３】
［実験例７］
（Ｔａｃ２変異マウスの解析）
Ｔａｃ２変異マウス（Δ４及びΔ１５）を用いて、ＩＬ−３１の投与により誘起される痒みの伝達において、Ｔａｃ２遺伝子がコードするＮＫＢタンパク質の果たす役割を解析した。【０１５４】
Ｔａｃ２−／−（Δ４）マウスとＴａｃ２＋／−マウスに対して、掻痒惹起物質である、ヒスタミン、クロロキン、ＳＬＩＧＲＬ−ＮＨ２（ＰＡＲ２アゴニスト）又はＩＬ−３１を皮内注射した。結果を図７に示す。【０１５５】
図７（ａ）は、Ｔａｃ２−／−（Δ４）マウスに対して、ヒスタミンを投与した後の、掻破行動を解析した結果である。図７（ｂ）は、Ｔａｃ２−／−（Δ４）マウスに対してクロロキンを投与した後の、掻破行動を解析した結果である。図７（ｃ）は、Ｔａｃ２−／−（Δ４）マウスに対してＰＡＲ２アゴニスト（ＳＬＩＧＲＬ−ＮＨ２）を投与した後の、掻破行動を解析した結果である。図７（ｄ）は、Ｔａｃ２−／−（Δ４）マウスに対してＩＬ−３１を投与した後の、掻破行動を解析した結果である。図７（ａ）〜（ｄ）中、「＊」はｐ＜０．０５で有意差があることを示す。【０１５６】
ヒスタミン、クロロキン及びＰＡＲ２アゴニスト（ＳＬＩＧＲＬ−ＮＨ２）の投与は、過去に報告された通り、Ｔａｃ２−／−（Δ４）マウスとＴａｃ２＋／−マウスに対して、掻破行動を引き起こした。ＩＬ−３１の投与は、Ｔａｃ２＋／−マウスに対して掻破行動を引き起こしたが、Ｔａｃ２−／−（Δ４）マウスに対しては、掻破行動をほとんど引き起こさないことが明らかになった。【０１５７】
上述と同様の実験を、Ｔａｃ２−／−（Δ１５）マウスとＴａｃ２＋／−マウスに対して行った。掻破行動を解析した結果を図８に示す。図８（ａ）は、Ｔａｃ２−／−（Δ１５）マウスに対してヒスタミンを投与した後の、掻破行動を解析した結果である。図８（ｂ）は、Ｔａｃ２−／−（Δ１５）マウスに対してＩＬ−３１を投与した後の、掻破行動を解析した結果である。【０１５８】
Ｔａｃ２−／−（Δ４）マウスの場合と同様に、ヒスタミンの投与は、Ｔａｃ２−／−（Δ１５）マウスに対して掻破行動を引き起こしたが、ＩＬ−３１の投与は、掻破行動をほとんど引き起こさないことが明らかになった。【０１５９】
Ｔａｃ２−／−（Δ４）マウスをＤｏｃｋ８−／−  ＡＮＤ  Ｔｇマウスと交配することにより、Ｔａｃ２を発現した、又はＴａｃ２を発現しない（Ｔａｃ２−／−（Δ４））Ｄｏｃｋ８−／−  ＡＮＤ  Ｔｇマウスを樹立し、皮膚組織、掻破行動及び血清中のＩＬ−３１レベルを解析した。結果を図９に示す。【０１６０】
図９（ａ）は皮膚組織を、（ｂ）は掻破行動を、（ｃ）は血清ＩＬ−３１レベルを、Ｔａｃ２を発現した、又はＴａｃ２を発現しないＤｏｃｋ８−／−  ＡＮＤ  Ｔｇマウス間で比較した結果である。図９（ａ）〜（ｃ）中、「＊」はｐ＜０．０５で有意差があることを示す。Ｔａｃ２がなくてもＩＬ−３１のレベルに変化はないが、皮膚炎および掻破行動が顕著に改善することがわかる。【０１６１】
［実験例８］
（ニューロキニンＢの作用機序）
次に、ＮＫＢが機能する部位を特定するために、Ｔａｃ２−／−（Δ４）マウスに対してＮＫＢを髄腔内注射し、掻破行動を解析した。図１０（ａ）は、Ｔａｃ２−／−（Δ４）マウスに対してＮＫＢを髄腔内注射し、掻破行動を解析した結果である。【０１６２】
Ｔａｃ２−／−（Δ４）マウスに対してＮＫＢタンパク質を髄腔内注射すると、掻破行動を引き起こすことが明らかになった。この結果は、ＮＫＢは、末梢神経を活性化せずに、掻破行動を引き起こすことを示している。【０１６３】
次に、ＮＫＢ投与による掻破行動を引き起こす神経回路を解析した。ＧＲＰ−サポリン又はＮｐｐｂ−サポリンを野生型Ｃ５７ＢＬ／６マウスの髄腔内へ注射し、２週間後に、ＮＫＢを注射し、掻破行動を解析した。【０１６４】
図１０（ｂ）は、ＧＲＰ−サポリン又はＮｐｐｂ−サポリンを注射後、ＮＫＢを注射し、掻破行動を解析した結果である。図１０（ａ）、（ｂ）中、「＊」はｐ＜０．０５で有意差があることを示し、「＊＊」はｐ＜０．０１で有意差があることを示す。【０１６５】
ＧＲＰ受容体を発現する神経細胞が除去されたマウスは、ＮＫＢの投与後に掻破行動を示さないが、Ｎｐｐｂ受容体を発現する神経細胞が除去されたマウスは、ＮＫＢの投与後に掻破行動を示した。この結果から、ＮＫＢは、ＧＲＰの上流で機能し、ＩＬ−３１により誘起される痒みを伝達する、神経伝達物質であることが明らかになった。【０１６６】
［実験例９］
（ＮＫ３Ｒの解析）
ＮＫ３Ｒの機能と局在を解析した。【０１６７】
ＮＫ３Ｒ及びＴＲＰＶ１の発現は、次のように解析した。脊髄後角をマウスから摘出し、摘出した脊髄後角から切片を作製した。作製した切片を、抗ＮＫ３Ｒ抗体及び抗ＴＲＰＶ１抗体を用いて、免疫組織化学により解析した。図１１（ａ）は、脊髄後角におけるＮＫ３Ｒ及びＴＲＰＶ１の発現を解析した結果である。図１１（ａ）中、スケールバーは１００μｍを示す。【０１６８】
ＮＫ３Ｒは、主に脊髄後角のｏｕｔｅｒ  ｌａｙｅｒ  ｌａｍｉｎａ  Ｉにある神経細胞において発現することが明らかになった。【０１６９】
次に、ＩＬ−３１により誘起される痒みが、Ｎｅｕｒｏｋｉｎｉｎ  ３  ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＮＫ３Ｒ）を介するか否かについて、解析した。【０１７０】
ＩＬ−３１を投与した後、脊髄後角にあるＮＫ３Ｒを発現する神経細胞において、ｃ−ｆｏｓの活性化を解析した。結果を図１１（ｂ）に示す。【０１７１】
図１１（ｂ）中、「ＤＡＰＩ」は、ＤＡＰＩにより染色した図であり、「ＮＫ３Ｒ」は、抗ＮＫ３Ｒ抗体により免疫染色した図であり、「ｃ−ｆｏｓ」は、抗ｃ−ｆｏｓ抗体により免疫染色した図であり、「Ｍｅｒｇｅ」は、ＤＡＰＩ、抗ＮＫ３Ｒ抗体、及び抗ｃ−ｆｏｓ抗体による免疫染色を重ね合わせた図である。その結果、ＮＫ３Ｒを発現する神経細胞において、ＩＬ−３１の投与により、ｃ−ｆｏｓが活性化することが明らかになった。スケールバーは１０μｍを示す。【０１７２】
次に、ＮＫ３Ｒの選択的アンタゴニストであり、抗精神病薬である、オサネタントを、野生型Ｃ５７ＢＬ／６マウスの腹腔内へ注射した後、ＩＬ−３１、ヒスタミン又はクロロキンにより誘起される掻破行動に及ぼす影響を解析した。【０１７３】
図１１（ｃ）は、オサネタント注射後にＩＬ−３１を投与し、掻破行動を解析した結果を示す。図１１（ｄ）は、オサネタント注射後にヒスタミンを投与し、掻破行動を解析した結果を示す。図１１（ｅ）は、オサネタント注射後にクロロキンを投与し、掻破行動を解析した結果を示す。図１１（ｃ）、（ｄ）及び（ｅ）中、「＊」はｐ＜０．０５で有意差があることを示し、「＊＊」はｐ＜０．０１で有意差があることを示す。【０１７４】
その結果、オサネタントの投与は、ＩＬ−３１による掻破行動の頻度を低下させたが、ヒスタミン及びクロロキンによる掻破行動の頻度は低下させないことが明らかになった。【０１７５】
オサネタントと同様に、ＮＫ３Ｒの選択的アンタゴニストであるフェゾリネタントを、野生型Ｃ５７ＢＬ／６マウスに経口投与した後、ＩＬ−３１、ヒスタミン又はクロロキンにより誘起される掻破行動に及ぼす影響を解析した。【０１７６】
図１２（ａ）は、フェゾリネタントを経口投与後にＩＬ−３１を投与し、掻破行動を解析した結果を示す。図１２（ｂ）は、フェゾリネタント投与後にヒスタミンを投与し、掻破行動を解析した結果を示す。図１２（ｃ）は、フェゾリネタント投与後にクロロキンを投与し、掻破行動を解析した結果を示す。【０１７７】
その結果、フェゾリネタントの投与は、ＩＬ−３１による掻破行動の頻度を低下させたが、ヒスタミン及びクロロキンによる掻破行動の頻度は低下させないことが明らかとなり、オサネタントを投与した場合と同様な結果が得られることが示された。【０１７８】
さらに、他のＮＫ３Ｒの選択的アンタゴニストであるタルネタント、パヴィネタント、ＳＳＲ−１４６９７７及びＳＢ−２３５３７５を、野生型Ｃ５７ＢＬ／６マウスに投与した後、ＩＬ−３１又はクロロキンにより誘起される掻破行動に及ぼす影響を解析した。【０１７９】
図１３（ａ）は、タルネタント注射後にＩＬ−３１を投与し、掻破行動を解析した結果を示す。図１３（ｂ）は、タルネタント注射後にクロロキンを投与し、掻破行動を解析した結果を示す。図１４（ａ）は、パヴィネタント注射後にＩＬ−３１を投与し、掻破行動を解析した結果を示す。図１４（ｂ）は、パヴィネタント注射後にクロロキンを投与し、掻破行動を解析した結果を示す。図１５（ａ）は、ＳＳＲ−１４６９７７注射後にＩＬ−３１を投与し、掻破行動を解析した結果を示す。図１５（ｂ）は、ＳＳＲ−１４６９７７注射後にクロロキンを投与し、掻破行動を解析した結果を示す。図１８（ａ）は、ＳＢ−２３５３７５を経口投与後にＩＬ−３１を投与し、掻破行動を解析した結果を示す。図１８（ｂ）は、ＳＢ−２３５３７５を経口投与後にクロロキンを投与し、掻破行動を解析した結果を示す。【０１８０】
図１３、１４、１５及び１８に示される結果より、ＮＫ３Ｒの選択的アンタゴニストであるタルネタント、パヴィネタント、ＳＳＲ−１４６９７７及びＳＢ−２３５３７５の投与は、クロロキンによる掻破行動の頻度は低下させないが、ＩＬ−３１による掻破行動の頻度を低下させることが明らかになった。これらの結果は、オサネタント及びフェゾリネタントを投与した場合に得られる結果と同一であった。【０１８１】
さらに、ニューロキニン３受容体（ＮＫ３Ｒ）に対するアンタゴニストであるとともに、ニューロキニン１受容体（ＮＫ１Ｒ）及びニューロキニン２受容体（ＮＫ２Ｒ）に対するアンタゴニストでもあるＣＳ−００３、並びにＮＫ３Ｒ及びＮＫ２Ｒに対するアンタゴニストであるＳＳＲ−２４１５８６を、野生型Ｃ５７ＢＬ／６マウスに投与した後、ＩＬ−３１又はクロロキンにより誘起される掻破行動に及ぼす影響を解析した。【０１８２】
図１６（ａ）は、ＳＳＲ−２４１５８６注射後にＩＬ−３１を投与し、掻破行動を解析した結果を示す。図１６（ｂ）は、ＳＳＲ−２４１５８６注射後にクロロキンを投与し、掻破行動を解析した結果を示す。図１７（ａ）は、ＣＳ−００３注射後にＩＬ−３１を投与し、掻破行動を解析した結果を示す。図１６（ｂ）は、ＣＳ−００３注射後にクロロキンを投与し、掻破行動を解析した結果を示す。【０１８３】
図１６及び１７に示される結果より、ＮＫ３Ｒの非選択的アンタゴニストであっても、ＮＫ３Ｒアンタゴニストとしての活性を有する化合物は、クロロキンによる掻破行動の頻度は低下させないが、ＩＬ−３１による掻破行動の頻度を低下させることが明らかになった。【０１８４】
なお、図１２〜図１８の各図において、「＊」はｐ＜０．０５で有意差があることを示し、「＊＊」はｐ＜０．０１で有意差があることを示す。【０１８５】
小括すると、ＩＬ−３１の投与により、ＮＫ３Ｒを発現する神経細胞が活性化することが明らかになった。また、ＮＫ３Ｒの薬理学的な阻害は、ＩＬ−３１による掻破行動を選択的に抑制することが明らかになった。
【産業上の利用可能性】
【０１８６】
本発明によれば、ニューロキニンＢシグナル遮断剤を有効成分として含む、ＩＬ−３１介在性疾患の予防又は治療剤を提供することができる。
【図１】
2020101017.tif 000031
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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