(57)【要約】  RNA結合タンパク質の細胞内での異常蓄積による毒性を軽減し、神経変性疾患の予防または治療に用い得る核酸、および該核酸を含む神経変性疾患の予防または治療薬の提供。  式(U(Me)GX1X2X3...Xm)n[U(Me)は2'-O-Me化されていることを示し、X1、X2、X3、...Xmは存在していても、いなくてもよく、存在する場合独立にA、C、GまたはUのいずれかであり、同じであっても異なっていてもよく、mは１〜10であり、G、X1、X2、X3、...Xmのそれぞれは2'-O-Me化されていてもいなくてもよく、nは４〜15である]で表される塩基からなるリピートRNAを含む核酸、および該核酸を有効成分として含むTDP-43の細胞内での異常蓄積により引き起こされる神経変性疾患の予防または治療薬。【特許請求の範囲】
【請求項１】
RNA認識配列（RRM)に結合する天然または人工核酸。
【請求項２】
TDP-43のRNA認識配列（RRM)に結合する、請求項１記載の核酸。
【請求項３】
式(U(Mod)GX1X2X3...Xm)n[U(Mod)はリボースの2'位に酸素原子を有するUの誘導体を表し、X1、X2、X3、...Xmは存在していても、いなくてもよく、存在する場合独立にA、C、GまたはUのいずれかであり、同じであっても異なっていてもよく、mは１〜10であり、G、X1、X2、X3、...Xmのそれぞれは2'位に酸素原子を有する誘導体であってもなくてもよく、nは４〜15である]で表される塩基からなるリピートRNAを含む、請求項１または２に記載の核酸。
【請求項４】
U(Mod)が2'-O-メチル化または2'-O-メトキシエチル（MOE）化されたUである、請求項３に記載の核酸。
【請求項５】
式(U(Me)GX1X2X3...Xm)n[U(Me)は2'-O-Me化されていることを示し、X1、X2、X3、...Xmは存在していても、いなくてもよく、存在する場合独立にA、C、GまたはUのいずれかであり、同じであっても異なっていてもよく、mは１〜10であり、G、X1、X2、X3、...Xmのそれぞれは2'-O-Me化されていてもいなくてもよく、nは４〜15である]で表される塩基からなるリピートRNAを含む、請求項４記載の核酸。
【請求項６】
(U(Me)G)nまたは(U(Me)G(Me))n[U(Me)およびG(Me)は2'-O-Me化されていることを示し、nは７〜30である]で表される塩基からなるリピートRNAを含む、請求項５記載の核酸。
【請求項７】
(U(Me)G)12または(U(Me)G(Me))12[U(Me)およびG(Me)は2'-O-Me化されていることを示す]で表される塩基からなるリピートRNAを含む、請求項５記載の核酸。
【請求項８】
(U(Me)G(Me)G(Me)A(Me)A(Me))5〜10[U(Me)、G(Me)およびA(Me)は2'-O-Me化されていることを示す]で表される塩基からなるリピートRNAを含む、請求項５記載の核酸。
【請求項９】
式(U(MOE)GX1X2X3...Xm)n[U(MOE)は2'-O-メトキシエチル化されていることを示し、X1、X2、X3、...Xmは存在していても、いなくてもよく、存在する場合独立にA、C、GまたはUのいずれかであり、同じであっても異なっていてもよく、mは１〜10であり、G、X1、X2、X3、...Xmのそれぞれは2'-O-メトキシエチル化されていてもいなくてもよく、nは４〜15である]で表される塩基からなるリピートRNAを含む、請求項４記載の核酸。
【請求項１０】
(U(MOE)G)nまたは(U(MOE)G(MOE))n[U(MOE)およびG(MOE)は2'-O-メトキシエチル化されていることを示し、nは７〜30である]で表される塩基からなるリピートRNAを含む、請求項９記載の核酸。
【請求項１１】
(U(MOE)G)12または(U(MOE)G(MOE))12[U(MOE)およびG(MOE)は2'-O-メトキシエチルMOE化されていることを示す]で表される塩基からなるリピートRNAを含む、請求項９記載の核酸。
【請求項１２】
(U(MOE)G(MOE)G(MOE)A(MOE)A(MOE))5〜10[U(MOE)、G(MOE)およびA(MOE)は2'-O-メトキシエチル化化されていることを示す]で表される塩基からなるリピートRNAを含む、請求項９記載の核酸。
【請求項１３】
リピートRNAのRNA部位の少なくとも１つをDNAに置換した、請求項３〜１２のいずれか１項に記載の核酸。
【請求項１４】
(U(Mod)G)または(U(Mod)G(Mod))[U(Mod)およびG(Mod)は各々独立して2'-O-メチル化または2'-O-メトキシエチルされているUおよびGを示す]であらわされるジヌクレオチド単位を少なくとも5個含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載の核酸。
【請求項１５】
総塩基数が10〜50塩基である、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の核酸。
【請求項１６】
請求項１〜１５のいずれか１項に記載の核酸を有効成分として含む医薬組成物。
【請求項１７】
請求項１〜１５のいずれか１項に記載の核酸を有効成分として含む、TDP-43の細胞内での異常蓄積により引き起こされる神経変性疾患の予防または治療薬。
【請求項１８】
核酸がTDP-43の細胞内での異常蓄積を抑制する、請求項１７記載の予防または治療薬。
【請求項１９】
神経変性疾患がTDP-43プロテイノパチーである、請求項１７または１８に記載の予防または治療薬。
【請求項２０】
神経変性疾患が、孤発性筋萎縮性側索硬化症（ALS)もしくは家族性筋萎縮性側索硬化症である筋萎縮性側索硬化症、前頭側頭葉変性症（FTLD:Frontotemporal lobar degeneration)、アルツハイマー病、レビー小体型認知症、ハンチントン病、パーキンソン病、嗜銀顆粒性認知症（グレイン病）、ペリー症候群、進行性核上性麻痺、大脳皮質基底核変性症およびピック病からなる群から選択される請求項１７〜１９のいずれか１項に記載の予防または治療薬。
【請求項２１】
神経変性疾患が、孤発性筋萎縮性側索硬化症（ALS)もしくは家族性筋萎縮性側索硬化症である筋萎縮性側索硬化症、または前頭側頭葉変性症（FTLD:Frontotemporal lobar degeneration)である、請求項２０記載の予防または治療薬。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、筋萎縮性側索硬化症（ALS)等の神経変性疾患の予防または治療に用い得る核酸に関する。
【背景技術】
【０００２】
筋萎縮性側索硬化症（ALS）は上位および下位の運動ニューロンが選択的に変性し全身の筋力が低下していく神経難病である。日本における有病率は人口10万人当たり7〜11人であり、１年間での発病率は人口10万人当たり約1〜2.5人となっている。症状は、筋萎縮と筋力低下が主体であり、進行に伴い四肢および体幹の機能障害、歩行障害、脳神経系では構音障害、嚥下障害などが出現し、最終的には呼吸筋麻痺による呼吸障害に至る。病勢の進展は比較的速く、人工呼吸器を用いなければ通常は2〜5年で死亡することが多い。治療薬としてはALSの進行を遅らせる作用のある薬：リルゾール(商品名  リルテック(登録商標))という薬が使われるが、満足のいく治療効果は得られていないのが実情である。【０００３】
近年、TDP-43、FUS/TLS等の機能や構造が共通したRNA結合タンパク質がその病態に深く関与していることが明らかになってきた（非特許文献１を参照）。特に、変性したニューロンにおいて観察されるTDP-43が陽性である封入体は、孤発性筋萎縮性側索硬化症のみならずほとんどの筋萎縮性側索硬化症に共通した病理像である。すなわち、TDP-43は筋萎縮性側索硬化症の発症および病態に重要な役割を果たしている。現在、ALSにおいては、RNA結合タンパク質に共通する機能および標的の制御異常という観点に加えて、これらのタンパク質等の凝集体の形成による毒性発揮という観点の両方の観点から研究が進められている。【０００４】
TDP-43が変性したニューロンの細胞質の封入体に蓄積しているという発見により、筋萎縮性側索硬化症の研究は大きく進展した。その一つとして、本来、TDP-43は約9割が核に局在しているが、変性したニューロンにおいてはほとんどすべてが細胞質の封入体に蓄積し核から消失しているという病理所見が得られたことである。従って変性したニューロンにおいては、本来、核で果たされているTDP-43の生理的な機能は喪失しているはずである。このため、封入体を構成するTDP-43凝集体が毒性を発揮し細胞死に至るという毒性の獲得の観点と、TDP-43の機能の異常という観点から病態の研究が進んだ。またFUS/TLSについても生理的には主に核内で存在していたものがALS患者における神経細胞では細胞質に過剰に保持され局在異常を呈することが報告されている（非特許文献２を参照）。【０００５】
これまでの研究から野生型のヒトTDP-43を過剰に発現したトランスジェニックマウスは、運動ニューロンの変性により筋萎縮性側索硬化症様の症状を呈することが明らかになった。同様に、遺伝性の筋萎縮性側索硬化症において同定された変異型TDP-43を発現させたトランスジェニックマウスも、筋萎縮性側索硬化症様の症状を呈する。これらの所見は、運動ニューロンなど特定のニューロンはTDP-43の変異の有無にかかわらず、特に、TDP-43の過剰な状態に脆弱であることを示唆している。そして過剰なTDP-43はRNA認識モチーフ（RNA Recognition Motif; RRM）によるRNA結合能を介して毒性を発揮することが報告されている(非特許文献３および４を参照)。
TDP-43の毒性を軽減するRNA配列について報告されている（特許文献１）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】国際公開第WO2016/088797号
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Clotilde Lagier-Tourenne et al., Nature Neuroscience 15, 1488-1497 (2012)
【非特許文献２】T. J. Kwiatkowski Jr.,D. A. Bosco et.al., Science vol.323 1205-1208 (2009)
【非特許文献３】Ryoko Ihara, Koji Matsukawa et.al., Hum. Mol. Genet. (2013) 22 (22) : 4474-4484.
【非特許文献４】J. Gavin Daigle1, Nicholas A et.al., Hum. Mol. Genet. (2013) 22 (6): 1193-1205.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、ALS等の神経変性疾患の原因となるRNA結合タンパク質であるTDP-43（TAR (transactivation responsive region) DNA-binding protein;トランス活性化応答領域DNA結合タンパク質43）の細胞内での異常蓄積およびRNAとの過剰結合による毒性を軽減し、ALS等の神経変性疾患の予防または治療に用い得る核酸の提供を目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、先に(UGGAA)nリピートRNAがTDP-43の凝集を抑制することにより、毒性を軽減し、ALSの症状を改善させる核酸医薬として用い得ることを見出した（国際公開第WO2016/088797号）。【００１０】
本発明者は、さらにTDP-43の凝集を抑制する塩基配列の探索を行い、UGで始まる塩基配列の繰り返し配列と他の繰り返し配列を比較し、UGで始まる塩基配列の繰り返し配列の効果が高いことを見出した。さらに、RNAのリボースに2'-O-メチル化修飾等の化学修飾を施し、TDP-43の凝集抑制効果が増強されるかについて検討を行った。【００１１】
その結果、少なくとも最初のUを2'-O-メチル化することにより、TDP-43の凝集抑制効果が顕著に増強されることを見出し、本発明を完成させるに至った。【００１２】
すなわち、本発明は以下のとおりである。
[１]  RNA認識配列（RRM)に結合する天然または人工核酸。
[２]  TDP-43のRNA認識配列（RRM)に結合する、[１]の核酸。
[３]  式(U(Mod)GX1X2X3...Xm)n[U(Mod)はリボースの2'位に酸素原子を有するUの誘導体を表し、X1、X2、X3、...Xmは存在していても、いなくてもよく、存在する場合独立にA、C、GまたはUのいずれかであり、同じであっても異なっていてもよく、mは１〜10であり、G、X1、X2、X3、...Xmのそれぞれは2'位に酸素原子を有する誘導体であってもなくてもよく、nは４〜15である]で表される塩基からなるリピートRNAを含む、[１]または[２]の核酸。
[４]  U(Mod)が2'-O-メチル化または2'-O-メトキシエチル（MOE）化されたUである、[３]の核酸。
[５]  式(U(Me)GX1X2X3...Xm)n[U(Me)は2'-O-Me化されていることを示し、X1、X2、X3、...Xmは存在していても、いなくてもよく、存在する場合独立にA、C、GまたはUのいずれかであり、同じであっても異なっていてもよく、mは１〜10であり、G、X1、X2、X3、...Xmのそれぞれは2'-O-Me化されていてもいなくてもよく、nは４〜15である]で表される塩基からなるリピートRNAを含む、[４]の核酸。
[６]  (U(Me)G)nまたは(U(Me)G(Me))n[U(Me)およびG(Me)は2'-O-Me化されていることを示し、nは７〜30である]で表される塩基からなるリピートRNAを含む、[５]の核酸。
[７]  (U(Me)G)12または(U(Me)G(Me))12[U(Me)およびG(Me)は2'-O-Me化されていることを示す]で表される塩基からなるリピートRNAを含む、[５]の核酸。
[８]  (U(Me)G(Me)G(Me)A(Me)A(Me))5〜10[U(Me)、G(Me)およびA(Me)は2'-O-Me化されていることを示す]で表される塩基からなるリピートRNAを含む、[５]の核酸。
[９]  式(U(MOE)GX1X2X3...Xm)n[U(MOE)は2'-O-メトキシエチル化されていることを示し、X1、X2、X3、...Xmは存在していても、いなくてもよく、存在する場合独立にA、C、GまたはUのいずれかであり、同じであっても異なっていてもよく、mは１〜10であり、G、X1、X2、X3、...Xmのそれぞれは2'-O-メトキシエチル化されていてもいなくてもよく、nは４〜15である]で表される塩基からなるリピートRNAを含む、[４]の核酸。
[１０]  (U(MOE)G)nまたは(U(MOE)G(MOE))n[U(MOE)およびG(MOE)は2'-O-メトキシエチル化されていることを示し、nは７〜30である]で表される塩基からなるリピートRNAを含む、[９]の核酸。
[１１]  (U(MOE)G)12または(U(MOE)G(MOE))12[U(MOE)およびG(MOE)は2'-O-メトキシエチルMOE化されていることを示す]で表される塩基からなるリピートRNAを含む、[９]の核酸。
[１２]  (U(MOE)G(MOE)G(MOE)A(MOE)A(MOE))5〜10[U(MOE)、G(MOE)およびA(MOE)は2'-O-メトキシエチル化されていることを示す]で表される塩基からなるリピートRNAを含む、[９]の核酸。
[１３]  リピートRNAのRNA部位の少なくとも１つをDNAに置換した、[３]〜[１２]のいずれかの核酸。
[１４]  (U(Mod)G)または(U(Mod)G(Mod))[U(Mod)およびG(Mod)は各々独立して2'-O-メチル化または2'-O-メトキシエチルされているUおよびGを示す]であらわされるジヌクレオチド単位を少なくとも5個含む、[１]〜[４]のいずれかの核酸。
[１５]  総塩基数が10〜50塩基である、[１]〜[１４]のいずれかの核酸。
[１６]  [１]〜[１５]のいずれかの核酸を有効成分として含む医薬組成物。
[１７]  [１]〜[１５]のいずれかの核酸を有効成分として含む、TDP-43の細胞内での異常蓄積により引き起こされる神経変性疾患の予防または治療薬。
[１８]  核酸がTDP-43の細胞内での異常蓄積を抑制する、[１７]の予防または治療薬。
[１９]  神経変性疾患がTDP-43プロテイノパチーである、[１７]または[１８]の予防または治療薬。
[２０]  神経変性疾患が、孤発性筋萎縮性側索硬化症（ALS)もしくは家族性筋萎縮性側索硬化症である筋萎縮性側索硬化症、前頭側頭葉変性症（FTLD:Frontotemporal lobar degeneration)、アルツハイマー病、レビー小体型認知症、ハンチントン病、パーキンソン病、嗜銀顆粒性認知症（グレイン病）、ペリー症候群、進行性核上性麻痺、大脳皮質基底核変性症およびピック病からなる群から選択される[１７]〜[１９]のいずれかの予防または治療薬。
[２１]  神経変性疾患が、孤発性筋萎縮性側索硬化症（ALS)もしくは家族性筋萎縮性側索硬化症である筋萎縮性側索硬化症、または前頭側頭葉変性症（FTLD:Frontotemporal lobar degeneration)である、[２０]の予防または治療薬。
本明細書は本願の優先権の基礎となる日本国特許出願番号2018-146891号の開示内容を包含する。
【発明の効果】
【００１３】
UGの２塩基で始まる２〜10塩基からなるRNAのn回の繰り返し配列であるリピートRNAであって、少なくとも最初のUが修飾されている、例えば2'-O-Me化(2'-O-メチル化：2'-O-methylation）またはMOE化されているリピートRNAは、TDP-43等のRNA結合タンパク質の異常発現による細胞内での異常蓄積や異常凝集およびRNAとの過剰結合に起因する細胞毒性を軽減し得る。RNA結合タンパク質の異常発現による細胞内での異常蓄積は、孤発性筋萎縮性側索硬化症（ALS)、家族性筋萎縮性側索硬化症等の筋萎縮性側索硬化症や前頭側頭葉変性症（FTLD:Frontotemporal lobar degeneration)等の神経変性疾患を引き起こす。従って、上記のリピートRNAはRNA結合タンパク質の細胞内での異常蓄積に起因する神経変性疾患の予防または治療に用いることができる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】2'-O-Me化されたヌクレオチドの構造を示す図である。
【図２】合成核酸の凝集阻害効果の評価方法を示す図である。
【図３】TDP-43結合RNA（24〜48 mer）の凝集阻害効果を示す図である。
【図４】(UG)12配列RNAの効果を増強する化学修飾の探索の結果を示す図である。
【図５】(UG)12配列RNAに対する2'-O-Me化の効果を示す図である。
【図６】(U(Me)G(Me)）nのリピート数による凝集阻害効果を示す図である。
【図７】(UGGAA)n配列RNAの凝集阻害効果に対する2'-O-Me化の影響を示す図である。
【図８】脳脊髄液（CSF）中における(UG)12-2’OMeの安定性を示す図である。
【図９】定量リアルタイムPCRによる (UG)12-2’OMeの安全性評価の結果を示す図である。
【図１０】投与した(UG)12-2’OMeの対側（右脳）における検出の結果を示す図である。
【図１１】(UG)12-2’OMeと神経細胞・グリア細胞との共染色の結果を示す図である。
【図１２】(UG)12-2’OMe投与によるTDP-43凝集抑制効果を示す図である。
【図１３】(UG)12-2’OMe投与における運動機能の改善効果を示す図である。
【図１４】(UG)12-2’OMe投与における体重減少の抑制を示す図である。
【図１５】(UG)12-2’OMe投与における生存期間の延長を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明の核酸は、RNA認識配列（RRM)に結合する天然または人工核酸であり、好ましくは、TDP-43のRNA認識配列（RRM)に結合する核酸である。特に、本発明の核酸は、ALSの原因となるRNA結合タンパク質であるTDP-43（TAR (transactivation responsive region) DNA-binding protein; トランス活性化応答領域DNA結合タンパク質43)に結合し、TDP-43の毒性や蓄積、凝集を抑制する核酸である。
【００１６】
該核酸は、好ましくはRNAであり、UGの２塩基で始まる２〜10塩基からなるRNAのn回の繰り返し配列であるリピートRNAである。ここで、総塩基数が10〜50個のリピートRNAであり得る。少なくとも最初のUはリボースの2'位に酸素原子を有するUの誘導体である。リボースの2'位に酸素原子を有するUの誘導体をU(Mod)と表す。他の塩基は2'位に酸素原子を有する誘導体であってもなくてもよいが、２番目のGは好ましくは2'位に酸素原子を有する誘導体である。また、好ましくは全ての塩基が2'位に酸素原子を有する誘導体である。
リボースの2'位に酸素原子を有する誘導体として、2'-O-メチル化または2'-O-メトキシエチル（MOE）化された誘導体が挙げられる。
【００１７】
なお、本発明に係る核酸の総塩基数は、10〜50塩基であり得、例えば、18〜48塩基、より具体的には、例えば、18塩基、20塩基、22塩基、24塩基、26塩基、28塩基、30塩基、32塩基、34塩基、36塩基、38塩基、40塩基、42塩基、44塩基、46塩基、48塩基であり得る。
【００１８】
すなわち、上記核酸は、好ましくはRNAであり、UGの２塩基で始まる２〜10塩基からなるRNAのn回の繰り返し配列であるリピートRNAである。総塩基数が10〜50個のリピートRNAであり得る。ここで、少なくとも最初のUは2'-O-Me化(2'-O-メチル化：2'-O-methylation）されている。2'-O-Me化を2'-O-Me化修飾ともいう。他の塩基は2'-O-Me化されていてもされていなくてもよいが、２番目のGは好ましくは2'-O-Me化されている。また、好ましくは全ての塩基が2'-O-Me化されている。本発明において、2'-O-Me化されているヌクレオチドを、Uの場合にU(Me)またはU(2'OMe)と表す。図１に2'-O-Me化されたヌクレオチドの構造を示す。なお、本発明に係る核酸の総塩基数は、10〜50塩基であり得、例えば、18〜48塩基、より具体的には、例えば、18塩基、20塩基、22塩基、24塩基、26塩基、28塩基、30塩基、32塩基、34塩基、36塩基、38塩基、40塩基、42塩基、44塩基、46塩基、48塩基であり得る。
【００１９】
また、上記核酸は、好ましくはRNAであり、UGの２塩基で始まる２〜10塩基からなるRNAのn回の繰り返し配列であるリピートRNAであって、総塩基数は10〜50個のリピートRNAであり得る。ここで、少なくとも最初のUは2'-O-メトキシエチル化されている。他の塩基は2'-O-メトキシエチル化されていてもされていなくてもよいが、２番目のGは好ましくは2'-O-メトキシエチル化されている。また、好ましくは全ての塩基が2'-O-メトキシエチル化されている。本発明において、2'-O-メトキシエチル化されているヌクレオチドをUの場合にU(MOE)と表す。2'-O-メトキシエチル化を2'-O-メトキシエチル化修飾ともいう。
【００２０】
上記核酸において、2'-O-メチル化核酸または2'-O-メトキシエチル（MOE）化核酸が混在していてもよい。
【００２１】
以下、2'-O-Me化されているヌクレオチドの場合について説明するが、上記のようにヌクレオチドは2'位に酸素原子を有するヌクレオチドの誘導体であってもよく、2'位に酸素原子を有するヌクレオチドの誘導体として、2'-O-Me化されているヌクレオチド及び2'-O-メトキシエチル化されているヌクレオチドが含まれる。従って、以下の説明において、「U(Me)」は「U(Mod）」または「U(MOE)」と、「G(Me)」は「G(Mod）」または「G(MOE)」と、「A(Me)」は「A(Mod）」又は「A(MOE)」と、「C(Me)」は「C(Mod）」または「C(MOE)」と置き換えることができる。
【００２２】
なお、本発明に係る核酸の総塩基数は、10〜50塩基であり得、例えば、18〜48塩基、より具体的には、例えば、18塩基、20塩基、22塩基、24塩基、26塩基、28塩基、30塩基、32塩基、34塩基、36塩基、38塩基、40塩基、42塩基、44塩基、46塩基、48塩基であり得る。
【００２３】
該リピートRNAは、式(U(Me)GX1X2X3...Xm)nで表される。該式ここで、X1、X2、X3、...Xmは存在していても、いなくてもよく、存在する場合独立にA、C、GまたはUのいずれかであり、同じであっても異なっていてもよい。mは１〜10、好ましくは５である。すなわち、上記式中、X1X2X3...Xmは１〜m個（例えば５個）からなる塩基であり、各塩基は独立にA、C、GまたはUのいずれかである。また、G、X1、X2、X3、...Xmのそれぞれは2'-O-Me化されていてもいなくてもよい。好ましくはGは2'-O-Me化されている。また、好ましくは全てのヌクレオチドが2'-O-Me化されている。nは繰り返し回数を示し、２〜30、好ましくは５〜25または4〜15である。
【００２４】
また、上記式の中でも、(U(Me)G)nまたは(U(Me)G(Me))nが好ましい。この場合のnは７〜30、好ましくは７〜25である。さらに、U(Me)GX1X2X3...Xmとして、U(Me)GGAAが挙げられる。
【００２５】
具体的には、例えば以下の配列が挙げられる。
(U(Me)G)5〜15
(U(Me)G)12
(U(Me)G(Me))5〜15
(U(Me)G(Me))12
(U(Me)GGAA)5〜10
(U(Me)GGAA)8
(U(Me)G(Me)GAA)5〜10
(U(Me)G(Me)GAA)8
(U(Me)G(Me)G(Me)AA)5〜10
(U(Me)G(Me)G(Me)AA)8
(U(Me)G(Me)G(Me)A(Me)A)5〜10
(U(Me)G(Me)G(Me)A(Me)A)8
(U(Me)G(Me)G(Me)A(Me)A(Me))5〜10
(U(Me)G(Me)G(Me)A(Me)A(Me))8
(U(Me)GG(Me)AA)5〜10
(U(Me)GG(Me)AA)8
(U(Me)GGA(Me)A)5〜10
(U(Me)GGA(Me)A)8
(U(Me)GGAA(Me))5〜10
(U(Me)GGAAA(Me))8
(U(Me)G(Me)GA(Me)A)5〜10
(U(Me)G(Me)GA(Me)A)8
(U(Me)G(Me)GAA(Me))5〜10
(U(Me)G(Me)GAA(Me))8
(U(Me)GG(Me)A(Me)A)5〜10
(U(Me)GG(Me)A(Me)A)8
(U(Me)GG(Me)AA(Me))5〜10
(U(Me)GG(Me)AA(Me))8
(U(Me)GGA(Me)A(Me))5〜10
(U(Me)GGA(Me)A(Me))8
(U(Me)GG(Me)A(Me)A(Me))5〜10
(U(Me)GG(Me)A(Me)A(Me))8
(U(Me)G(Me)GA(Me)A(Me))5〜10
(U(Me)G(Me)GA(Me)A(Me))8
(U(Me)G(Me)G(Me)AA(Me))5〜10
(U(Me)G(Me)G(Me)AA(Me))8
本発明において、このようなRNAリピートを短鎖リピートRNAと呼ぶ。
【００２６】
なお、上記核酸において、2'-O-メチル化核酸または2'-O-メトキシエチル（MOE）化核酸が混在していてもよいので、上記のそれぞれの式において、それぞれの「（Me)」は、独立に「（MOE)」に置き換えることができる。
【００２７】
本発明は、例えば、(U(Mod)G)または(U(Mod)G(Mod))[U(Mod)およびG(Mod)は各々独立して2'-O-メチル化または2'-O-メトキシエチルされているUおよびGを示す]であらわされるジヌクレオチド単位を少なくとも5個含む、核酸を含む。なお、本発明に係る核酸の総塩基数は、10〜50塩基であり得、例えば、18〜48塩基、より具体的には、例えば、18塩基、20塩基、22塩基、24塩基、26塩基、28塩基、30塩基、32塩基、34塩基、36塩基、38塩基、40塩基、42塩基、44塩基、46塩基、48塩基であり得る。
【００２８】
上記のように、本発明のリピートRNAにおいて、繰り返し単位となる塩基配列の少なくとも最初のUは2'-O-Me化されている必要がある。塩基配列が部分的に2'-O-Me化されることにより、疎水性が高まり、TDP-43に結合しやすい立体構造をとると予測される。
【００２９】
本発明の核酸は、上記のリピートRNAを含む核酸である。すなわち、上記のリピートRNAの5'側および3'側に他の核酸が付加されていてもよい。上記のリピート配列の前後の核酸の塩基の種類や数は限定されず、核酸の中に上記のリピート配列が含まれていれば、該部分がRNA結合タンパク質に結合し、効果を発揮する。よって、別の言い方をすれば、本発明の核酸は、本質的に上記のリピートRNAから成るものでありうる。
【００３０】
さらに、本発明の核酸には上記の短鎖リピートRNAのRNA部位をDNAに置換した核酸も含まれる。単鎖リピートRNAのRNA部位の少なくとも１つがDNAに置換されていればよく、RNAの10％以上、20％以上、30％以上、40％以上、50％以上、60％以上、70％以上、80％以上、90％以上、または総てのRNAがDNAに置換されていてもよい。さらに、本発明の核酸は、一部または全てのヌクレオシド間結合が修飾されていてもよく、例えば、一部または全てのヌクレオシド間結合がホスホロチオエート化されていてもよい。
【００３１】
本発明の核酸は、RNA結合タンパク質に結合する。RNA結合タンパク質は、RNAに結合してRNAのスプライシング、miRNA合成、RNA輸送などの重要なRNA代謝機能を担っている。RNA結合タンパク質が細胞内で異常に蓄積し、ターゲットとなるRNA群に結合することによりスプライシング異常や輸送異常等のRNA代謝に影響を与え細胞に対して毒性を発揮する。また、細胞質内で異常に凝集することによっても毒性を発揮する。これらのRNA結合タンパク質がニューロンで凝集体を形成した場合、ニューロンに対して毒性を発揮し、種々の神経変性疾患を引き起こす。本発明の核酸は、細胞質内で異常発現したRNA結合タンパク質のRNA認識配列（RRM: RNA Recognition Motif)（RNA結合モチーフ）に結合し、該配列をブロックすることにより、アブゾーバーやRNA結合タンパク質とRNAの結合に競合するデコイとして作用し、RNA結合タンパク質の毒性を軽減する。
【００３２】
従って、本発明の核酸はRNA結合タンパク質の細胞内での異常蓄積や細胞質への異常凝集により引き起こされる疾患の予防または治療に用いることができる。
【００３３】
本発明の核酸は、TDP-43の凝集により引き起こされる神経変性疾患の予防または治療に用い得る。TDP-43はhnRNPファミリーに属するタンパク質であり、RNAに結合してRNAのスプライシング、miRNA合成、RNA輸送などの重要なRNA代謝機能を担っているRNAシャペロン群に属する。TDP-43はRNA認識配列（RNA結合ドメイン（RPM)）やグリシンリッチ領域を有しており、本発明の核酸はRNA認識配列に結合する。TDP-43の家族性変異は主にグリシンリッチ領域に生じ、変異が生じることによりTDP-43のタンパク質凝集性が高まる。また、マウスやショウジョウバエなどのモデル動物においてTDP-43を過剰発現させると細胞質内で凝集し、毒性を発揮する。細胞がニューロンのとき、神経が変性し、神経変性疾患を引き起こす。本発明の核酸がTDP-43に結合すると、例えばTDP-43の細胞内での蓄積や凝集を抑制し、TDP-43の細胞毒性を低減し得る。
【００３４】
TDP-43が細胞質内で異常凝集し蓄積し細胞内封入体を形成することにより引き起こされる疾患として神経変性疾患が挙げられる。ここで、神経変性疾患とは、中枢神経系の神経細胞が異常タンパク質の凝集体の蓄積により、徐々に変性し、機能不全や細胞死に陥る進行性疾患をいう。TDP-43が異常蓄積し、あるいは異常凝集して引き起こされる疾患をRBPプロテイノパチーの中でも、特にTDP-43プロテイノパチーと呼ぶ。MSPプロテイノパチーもTDP-43プロテイノパチーの１つである。RBPプロテイノパチーとして、具体的には、孤発性筋萎縮性側索硬化症（ALS)、家族性筋萎縮性側索硬化症等の筋萎縮性側索硬化症、前頭側頭葉変性症（FTLD:Frontotemporal lobar degeneration)、アルツハイマー病、レビー小体型認知症、ハンチントン病、パーキンソン病、嗜銀顆粒性認知症（グレイン病）、ペリー症候群、進行性核上性麻痺、大脳皮質基底核変性症、ピック病等が挙げられる。また、認知症を伴う神経変性疾患の予防または治療に用い得る。この中でも筋萎縮性側索硬化症および前頭側頭葉変性症の予防または治療に有用である。
【００３５】
孤発性筋萎縮性側索硬化症（ALS）や一部の家族性筋萎縮性側索硬化症の患者では、脳組織において分子量25〜35kDaのTDP-43のC末端フラグメントを認め、病態に関与することが知られている。このC末端フラグメントは全長TDP-43と同様に凝集性を有し、C末端フラグメントが全長TDP-43と共凝集し、より毒性を発揮する。本発明の核酸は、脳組織で全長TDP-43に加えてC末端フラグメントの凝集、毒性も抑制することにより孤発性筋萎縮性側索硬化症（ALS)に対しても治療効果を発揮する。
【００３６】
本発明の核酸は、上記の神経変性疾患の予防または治療に用いることができる。また、本発明の核酸は、上記の神経変性疾患の進行を抑制し、再発を防止することができる。本発明において、神経変性疾患の進行の抑制や再発の防止も神経変性疾患の予防または治療に包含される。さらに、本発明の核酸はTDP-43の細胞内異常蓄積や細胞質内凝集の抑制または阻害に用いることができる。
【００３７】
本発明の核酸の神経変性疾患の予防または治療剤の投与方法は、髄液内、静脈内、筋肉内、皮下および腹腔内の注射または非経腸的ルート等の非経口的ルート、ならびに経口ルートで投与できるが非経口ルートが好ましく、髄液内注射がさらに好ましい。形態としては、注射剤、錠剤、カプセル剤、加硫剤、シロップ剤、乳剤、噴霧剤等が挙げられる。本発明の核酸は、通常用いられる医薬担体と配合して使用される。担体としては、生理的食塩水、リン酸緩衝生理食塩水、グルコース液および緩衝生理食塩水が含まれるが、これらに限定されるものではない。また、キシロース、トレハロース、果糖などの糖類；マンニトール、キシリトール、ソルビトールなどの糖アルコール；リン酸緩衝液、クエン酸緩衝液、グルタミン酸緩衝液などの緩衝液；脂肪酸エステルなどの界面活性剤などを添加剤として用いることができる。担体と配合される場合、核酸の含有量は、製剤により適宜選択されればよく、製剤により種々異なるが、0.001〜１重量％であることが好ましい。投与量は患者の年齢、性別、体重、症状、治療目的等により決定されるが、一般に、成人の患者に対して、非経口投与の場合、0.0001〜１mgを１日１回〜数回に分けて投与することができる。この投与量は疾病の種類、患者の年齢、体重、症状などにより適宜増減することができる。
【実施例】
【００３８】
本発明を以下の実施例によって具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例によって限定されるものではない。【００３９】
[実施例１]  TDP-43の凝集を阻害する配列の探索
様々なTDP-43結合配列を含む合成核酸から最も凝集阻害能力の高い配列を探索した。
TDP-43を含む溶液を激しく振盪することで凝集させることができる性質を利用し（Huang et al. (2013) PLoS One. 8,e64002）、合成核酸によるTDP-43の凝集阻害効果を評価した。本実施例では脳抽出液に含まれる内在性TDP-43を用いた。マウス（C57BL/6J）の線条体をバッファー（50 mM HEPES pH7.4,150 mM NaCl, 10% glycerol, 1% triton X-100, 5 mM MgCl2, 1 mM EGTA, protease inhibitors, phosphatase inhibitors）中でホモジェナイズし、4℃, 20,000×gで30分間遠心したのち、上清を回収した。この上清を3 mg/mlとなるように調整し脳抽出液とした。【００４０】
次に、候補となる合成核酸を、最終濃度0.1μMとなるように脳抽出液に加え、37℃, 1,800 rpmで3時間振盪したのち4℃, 16,000×gで30分間遠心し、上清と沈殿に分けた。これら各画分に含まれるTDP-43をウエスタンブロッティングにより検出し、凝集率（沈殿に含まれるTDP-43の割合）を算出した。図２に評価方法を示す。図２Ａはプロトコールを示し、図２Ｂは凝集率の算出方法を示し、図２Ｃは結果の評価方法を示す。ウエスタンブロッティングのバンドの濃さをデンシトメーターで測定し、定量化し、凝集率を算出した。TDP-43抗体はproteintech社（Rosemont, IL）のポリクロナール抗体（12892-1-AP）を用いた。【００４１】
合成核酸は株式会社ジーンデザインもしくは北海道システムサイエンス株式会社より購入した。【００４２】
既知のTDP-43結合RNA（24〜48 mer）を用いてそれぞれの凝集阻害効果を検証した。結果を図３に示す。図３中、(-)は核酸なしを示す。候補となる合成核酸は、TDP-43に結合しない（CA)12（ネガティブコントロール）、(UG)12配列、（UGGAA)8、CLIP34およびtb14であった。（UGGAA)8、CLIP34およびtb14はTDP-43に結合することが報告されている配列である。(UGGAA)nは脊髄小脳変性症31型の原因遺伝子に認められる異常伸長領域の配列（Ishiguro et al. (2017) Neuron. 94, 108-24）、CLIP34はTDP-43自身のメッセンジャーRNAの3’UTRに含まれるTDP-43結合領域の配列（GAGAGAGCGCGUGCAGAGACUUGGUGGUGCAUAA（配列番号１）, Ayala et al. 2011）、tb14はSELEXにより同定されたTDP-43結合配列（GAAGUGGGAUGUGGGAAGAGGGAUGUUGUG（配列番号２）, Ishiguro et al. (2016) Genes Cells. 21, 466-81）である。【００４３】
RNAはいずれも最終濃度0.1μMとなるように加えた。図３Ａはウエスタンブロッティングの結果を示し、図３Ｂは、ウエスタンブロッティングのバンドの濃さをデンシトメーターで定量化した結果を示す。図３Ａ中、sは上清、pは沈殿を表す。図３Ｂは、(-)（核酸なし）の凝集率を1として各RNAの凝集率を示した。この結果、(UG)12が最も高い凝集阻害効果を示した。【００４４】
[実施例２]  (UG)12配列RNAの効果を増強する化学修飾の探索
実施例1で得られた(UG)12配列の凝集阻害効果を増強する化学修飾を探索した。
(UG)12配列を骨格としたA〜Dの合成核酸の凝集阻害効果を検証した。ネガティブコントロールとして（CA)12を骨格とする合成核酸も同時に検証した。【００４５】
検討した化学修飾は、RNAとDNAの置換（DNAを小文字のアルファベットで示す）、2'-O-methylation（2'OMe）、locked nucleic acid（LNA）である。すなわち、以下の塩基配列からなる核酸を用いた。「(Me)」は2'-O-methylationを示し、「(L)」はLNAを示す。
A：(U(Me)G(Me))12
B：(tG(L))12
C：(UG(L))12
D：(U(Me)G(L))12
以上の4種類の組み合わせを検討した。【００４６】
結果を図４に示す。図４Ａはウエスタンブロッティングの結果を示し、図４Ｂは、ウエスタンブロッティングのバンドの濃さをデンシトメーターで定量化した結果を示す。ウエスタンブロッティングによって得られた各分画のバンドの濃さから凝集率を算出した結果、ウラシルヌクレオチドとグアニンヌクレオチド両者に2'-O-Me修飾を施した核酸が最も高い効果を示した（図４Ｂ）。【００４７】
この結果から、さらに2'-O原子の修飾について詳細に解析した。結果を図５に示す。図５Ａはウエスタンブロッティングの結果を示し、図５Ｂは、ウエスタンブロッティングのバンドの濃さをデンシトメーターで定量化した結果を示す。まず(UG)12と(U(Me)G(Me))12の効果を比較すると、2'OMe修飾により(UG)12の凝集阻害効果が有意に（p<0.05）増強されることがわかった。一方で、同じ2'-O原子の修飾である2'-fluoro (2'F)化をウラシルヌクレオチドとグアニンヌクレオチドの両者に施した核酸（[U(F)G(F)]12）では、凝集阻害効果は増強されなかった。次に、ウラシルヌクレオチドとグアニンヌクレオチドの一方だけが2'-O-Me化されている合成核酸を用いたところ、ウラシルヌクレオチドだけが2'-O-Me化されていれば（U(Me)G）、(U(Me)G(Me))12と同様の増強効果が得られるものの（有意差は無し）、グアニンヌクレオチドだけが2'-O-Me化されていても(UG(Me))、(UG)12の凝集阻害効果は増強されないことがわかった。これらの結果と図４の結果を合わせて考えると、ウラシルヌクレオチドが2'-O-Me化されていてもグアニンヌクレオチドがLNAの場合は凝集阻害効果がないことから、TDP-43の凝集阻害核酸(UG)12は、ウラシルヌクレオチドが2'-O-Me化されており、その上でグアニンヌクレオチドがRNAまたは2'-O-Me化されていることで、その効果が増強できることが明らかとなった。【００４８】
次いで、（U(Me)G(Me))nのリピート数について、n=3〜24で検討を行った。結果を図６に示す。図６に示すように、n=９以上、すなわち総塩基数18以上で凝集阻害効果が認められた。【００４９】
［実施例３]  (UG)12以外の配列における2'-O-Me化の効果
実施例2により、凝集阻害効果を増強する化学修飾であることが判明した2'-O-Me化が、(UG)12以外の配列においても有効かどうかを検証した。
これまでに(UGGAA)n配列RNAがTDP-43に結合することが報告されている（Ishiguro et al. 2017; 国際公開第WO2016/088797号）。この配列をもとに(UGGAA)8においても2'-O-Me化が凝集阻害効果を増強するかどうかを検討した。全てのヌクレオチドを2'-O-Me化した(UGGAA)8の効果を実施例1に記載した方法で検証した。結果を図７に示す。図７に示すように、化学修飾のない(UGGAA)8（all RNA）に比較してその効果が有意に増強され、(UGGGAA)8配列においても2'-O-Me化が凝集抑制効果を増強することが明らかとなった。総てのヌクレオチドが2'-O-Me化されている場合に、最も凝集抑制効果が大きかったが、UGGGAA配列の最初のUが2'-O-Me化されている場合も、(UGGAA)8（all RNA）と比較して凝集抑制効果が大きかった。【００５０】
[実施例４]  in vivoでの(U(Me)G(Me))12の有効性
in vitroの評価で効果の高かった(U(Me)G(Me))12の有効性を動物モデルで評価するため、脳脊髄液（CSF: Cerebrospinal fluid)中での安定性を検討した。市販のヒト脳脊髄液40μLに20μg/μLの核酸5μLを添加し37℃に静置した。1週間ごとに最大6週間まで回収し、アクリルアミドゲル電気泳動をした後、可視化して検出した。静置開始から6週間後においても(U(Me)G(Me))12の分解はほとんど観察されず、脳脊髄液中での安定性が確認できた（図８））。【００５１】
次に、(U(Me)G(Me))12((UG)12-2'OMe)の安全性について検討した。5週齢の野生型マウスに、麻酔下で20μg/μLの核酸5μLを脳室内投与した。表１の11項目に基づいて、マウスの行動を観察し急性の毒性の有無を検討した（毒性が高い場合に高いスコアを示す）。表１の項目はUS20160304871A1とWO 2016/127000 A1を参考にして作製した。その結果、30分後及び3時間後ともにマウスの行動に異常は見られずスコアはゼロであった。さらに、神経細胞死や炎症の検出によっても毒性を評価した。核酸の脳室内投与から2週間後に、投与領域周辺の脳組織からRNAを抽出し、定量リアルタイムPCRによってGFAP（グリオーシスの指標）、TNF-α、IL-1β（ともに炎症の指標）の発現量を評価した。いずれの指標についても、コントロールのPBS投与群に比較して上昇は認められず、動物モデルにおける評価を安全に行えると考えられた（図９）。【００５２】
次に投与した(U(Me)G(Me))12の脳内分布及び細胞内局在について検討した。蛍光染色によって検出するため3’末端をジゴキシゲニン（DIG）でラベルした(U(Me)G(Me))12((UG)12-2'OMe-DIG)を脳室内投与し、3日後に灌流固定して脳切片を作製し、DIG抗体、TDP-43抗体を用いて蛍光染色（図１０）、並びにDIG抗体、NeuN抗体（神経細胞のマーカー）、Iba1抗体（マイクログリアのマーカー）、GFAP抗体（アストロサイトのマーカー）を用いて蛍光染色（図１１）を行なった。コントロールとしてPBSを投与した。また、DAPIにより核を染色した。その結果、投与した左脳に加えて右脳でもDIG陽性の細胞が観察され、(U(Me)G(Me))12は脳内に広く分布することがわかった（図１０）。また、DIGのシグナルはマイクログリアやアストロサイトとはほとんど共局在せず、NeuN陽性細胞に多く確認された。さらに、DIGのシグナルはDAPIとは共局在しないことから、(U(Me)G(Me))12は神経細胞の細胞質に多く局在することがわかった（図１１）。【００５３】
【表１】
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【００５４】
以上の結果から動物モデルにおける有効性評価が可能であると考え、(U(Me)G(Me))12((UG)12-2'OMe)を脳室内投与し、in vivoにおけるその効果を検証した。動物モデルは、核移行シグナル欠損型ヒトTDP-43（hTDP-43-ΔNLS）を神経細胞特異的に過剰発現するトランスジェニックマウスをJackson laboratoryから購入した。このマウスはエサからドキシサイクリン（DOX）を取り除くことによりhTDP-43-ΔNLSの発現を誘導することが可能で（tet-off-inducible）、過剰発現に伴い、神経細胞の細胞質におけるTDP-43の凝集、神経細胞死、運動機能の異常が観察されるモデルマウスである。DOX入りのエサを与えてマウスを5週齢まで成長させた後、麻酔下で100μgの(U(Me)G(Me))12を脳室内投与し、同時にDOX無しのエサに切り替えてhTDP-43-ΔNLSの発現を誘導した。投与から2週間後に左脳運動野を採取し、TDP-43の凝集体を含む分画（RIPA不溶性分画）のTDP-43の量をウェスタンブロッティングによって検出した。コントロールとして、((CA)12-2'OMe)を用いた。その結果、(U(Me)G(Me))12の投与によってTDP-43の凝集が阻害されていた（図１２）。【００５５】
次に、運動協調性を測定する試験であるrotarod testを行った結果、(U(Me)G(Me))12((UG)12-2'OMe)投与によりlatency to fall (秒）が向上し、運動障害が軽減される効果が認められた（図１３）。また、マウスの体重変化を測定したところコントロールのPBS投与群（Tg-マウス-PBS)に比べて(U(Me)G(Me))12投与群(Tg-マウス-(UG)12-2'OMe)にはhTDP-43-ΔNLSの過剰発現に伴う体重減少を遅延させる効果が認められた（図１４）。さらに、PBS投与群では過剰発現開始から42日目までに全てのマウスが死亡したのに対し、(U(Me)G(Me))12((UG)12-2'OMe)投与群は同日に42%のマウスが生存していた（図１５）。これらの結果から(U(Me)G(Me))12はTDP-43過剰発現に伴う病態の改善に有効であることが見出され、ALSの治療薬として有用であることがわかった。
【産業上の利用可能性】
【００５６】
本発明の核酸は、RNA結合タンパク質の異常発現により引き起こされる神経変性疾患の予防または治療薬として利用することができる。
本明細書で引用した全ての刊行物、特許及び特許出願はそのまま引用により本明細書に組み入れられるものとする。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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