(57)【要約】  本発明の課題は、がんの治療又は診断において使用するための、がん細胞を認識する抗体とストレプトアビジン変異体との融合タンパク質を提供することである。本発明によれば、Ｎ末端側からＣ末端側に、配列番号２又は配列番号７に記載のアミノ酸配列と、リンカー配列と、配列番号１に記載のアミノ酸配列（但し、Ｃ末端の６個のヒスチジンからなる配列アミノ酸配列は一部又は全部が欠失していてもよい）とをこの順に有する、融合タンパク質が提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｎ末端側からＣ末端側に、配列番号２又は配列番号７に記載のアミノ酸配列と、リンカー配列と、配列番号１に記載のアミノ酸配列（但し、Ｃ末端の６個のヒスチジンからなる配列アミノ酸配列は一部又は全部が欠失していてもよい）とをこの順に有する、融合タンパク質。
【請求項２】
リンカー配列のアミノ酸数が５から１５アミノ酸である、請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項３】
リンカー配列が、４〜１４個のグリシン残基及び１個のシステイン残基からなる、請求項１又は２に記載の融合タンパク質。
【請求項４】
リンカー配列が、Gly- Gly-Gly- Gly-Ser- Gly- Gly- Gly- GlyまたはGly- Gly- Gly-Gly- Gly-Ser- Gly- Gly- Gly- Gly- Gly
である、請求項１から３の何れか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項５】
配列番号３又は配列番号８に記載のアミノ酸配列（但し、Ｃ末端の６個のヒスチジンからなる配列アミノ酸配列は一部又は全部が欠失していてもよい）を有する、融合タンパク質。
【請求項６】
さらに分泌シグナル配列を有する、請求項１から５の何れか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項７】
配列番号４又は配列番号９に記載のアミノ酸配列（但し、Ｃ末端の６個のヒスチジンからなる配列アミノ酸配列は一部又は全部が欠失していてもよい）を有する、融合タンパク質。
【請求項８】
配列番号３又は配列番号８に記載のアミノ酸配列（但し、Ｃ末端の６個のヒスチジンからなる配列アミノ酸配列は一部又は全部が欠失していてもよい）を有する融合タンパク質をコードする核酸。
【請求項９】
配列番号４又は配列番号９に記載のアミノ酸配列（但し、Ｃ末端の６個のヒスチジンからなる配列アミノ酸配列は一部又は全部が欠失していてもよい）を有する、融合タンパク質をコードする核酸。
【請求項１０】
請求項１から７の何れか１項に記載の融合タンパク質を含む、がん治療剤またはがん診断剤。
【請求項１１】
（１）請求項１から７の何れか１項に記載の融合タンパク質、及び（２）下記式（１）で示される化合物又はその塩と、診断用物質又は治療用物質とのコンジュゲートを含む、がんの治療または診断キット。
【化１】
2020138427.tif 000015
（式中、
Ｘ１ａ、Ｘ１ｂ、Ｘ２ａ及びＸ２ｂはそれぞれ独立にＯ又はＮＨを示し、
Ｙ１及びＹ２はそれぞれ独立にＣ又はＳを示し、
Ｚ１及びＺ２はそれぞれ独立にＯ、Ｓ又はＮＨを示し、
Ｖ１及びＶ２はそれぞれ独立にＳ又はＳ＋−Ｏ−を示し、ｎ１及びｎ２はそれぞれ独立に０又は１の整数を示し、
Ｌ１及びＬ２はそれぞれ独立に、２価の連結基を示し、
Ｌ３は、診断用物質又は治療用物質と結合できる官能基を末端に含む基であり、
Ｌ４は、３価の連結基を示す。）
【請求項１２】
診断用物質又は治療用物質が、フタロシアニン染料である、請求項１１に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、がん細胞を認識する抗体とストレプトアビジン変異体との融合タンパク質、並びにその利用に関する。
【背景技術】
【０００２】
アビジンとビオチン、あるいはストレプトアビジンとビオチンの間の親和性は非常に高く（Kd=10-15 から10-14M）、生体二分子間の相互作用としては、最も強い相互作用の一つである。現在、アビジン／ストレプトアビジン-ビオチン相互作用は、生化学、分子生物学、あるいは医学の分野で広く応用されている。アビジン／ストレプトアビジンとビオチンの高い結合能と抗体分子とを組み合わせたドラッグデリバリーの方法およびプレターゲティング法が考案されている。これらの研究に関連し、特許文献１には、天然ビオチンに対する親和性を低減させたストレプトアビジン変異体、並びにこの天然ビオチンに対する低親和性のストレプトアビジン変異体に対して高い親和性を有するビオチン改変二量体が報告されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】国際公開ＷＯ２０１５／１２５８２０
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明は、がんの治療又は診断において使用するための、がん細胞を認識する抗体とストレプトアビジン変異体との融合タンパク質を提供することを解決すべき課題とした。さらに本発明は、上記した融合タンパク質を用いた、がんの治療手段又はがんの診断手段を提供することを解決すべき課題とした。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者は上記課題を解決するために鋭意検討した結果、がん細胞を認識する抗体として抗ＣＥＡ抗体および抗ＨＥＲ２抗体を選択し、上記抗体と、ストレプトアビジン変異体との融合タンパク質を調製した。そして、上記の融合タンパク質と、ビオチン改変二量体とフタロシアニン染料とのコンジュゲートとを用いた光免疫療法により、がん細胞の増殖を抑制できることを見出し、本発明を完成するに至った。【０００６】
即ち、本発明によれば、以下の発明が提供される。
＜１＞  Ｎ末端側からＣ末端側に、配列番号２又は配列番号７に記載のアミノ酸配列と、リンカー配列と、配列番号１に記載のアミノ酸配列（但し、Ｃ末端の６個のヒスチジンからなる配列アミノ酸配列は一部又は全部が欠失していてもよい）とをこの順に有する、融合タンパク質。
＜２＞  リンカー配列のアミノ酸数が５から１５アミノ酸である、＜１＞に記載の融合タンパク質。
＜３＞  リンカー配列が、４〜１４個のグリシン残基及び１個のシステイン残基からなる、＜１＞又は＜２＞に記載の融合タンパク質。
＜４＞  リンカー配列が、Gly- Gly-Gly- Gly-Ser- Gly- Gly- Gly- GlyまたはGly- Gly- Gly-Gly- Gly-Ser- Gly- Gly- Gly- Gly- Gly
である、＜１＞から＜３＞の何れか一に記載の融合タンパク質。
＜５＞  配列番号３又は配列番号８に記載のアミノ酸配列（但し、Ｃ末端の６個のヒスチジンからなる配列アミノ酸配列は一部又は全部が欠失していてもよい）を有する、融合タンパク質。
＜６＞  さらに分泌シグナル配列を有する、＜１＞から＜５＞の何れか一に記載の融合タンパク質。
＜７＞  配列番号４又は配列番号９に記載のアミノ酸配列（但し、Ｃ末端の６個のヒスチジンからなる配列アミノ酸配列は一部又は全部が欠失していてもよい）を有する、融合タンパク質。
＜８＞  配列番号３又は配列番号８に記載のアミノ酸配列（但し、Ｃ末端の６個のヒスチジンからなる配列アミノ酸配列は一部又は全部が欠失していてもよい）を有する融合タンパク質をコードする核酸。
＜９＞  配列番号４又は配列番号９に記載のアミノ酸配列（但し、Ｃ末端の６個のヒスチジンからなる配列アミノ酸配列は一部又は全部が欠失していてもよい）を有する、融合タンパク質をコードする核酸。
＜１０＞  ＜１＞から＜７＞の何れか一に記載の融合タンパク質を含む、がん治療剤またはがん診断剤。
＜１１＞  （１）＜１＞から＜７＞の何れか一に記載の融合タンパク質、及び（２）下記式（１）で示される化合物又はその塩と、診断用物質又は治療用物質とのコンジュゲートを含む、がんの治療または診断キット。
【化１】
2020138427.tif 000002
（式中、
Ｘ１ａ、Ｘ１ｂ、Ｘ２ａ及びＸ２ｂはそれぞれ独立にＯ又はＮＨを示し、
Ｙ１及びＹ２はそれぞれ独立にＣ又はＳを示し、
Ｚ１及びＺ２はそれぞれ独立にＯ、Ｓ又はＮＨを示し、
Ｖ１及びＶ２はそれぞれ独立にＳ又はＳ＋−Ｏ−を示し、ｎ１及びｎ２はそれぞれ独立に０又は１の整数を示し、
Ｌ１及びＬ２はそれぞれ独立に、２価の連結基を示し、
Ｌ３は、診断用物質又は治療用物質と結合できる官能基を末端に含む基であり、
Ｌ４は、３価の連結基を示す。）
＜１２＞  診断用物質又は治療用物質が、フタロシアニン染料である、＜１１＞に記載のキット。
【発明の効果】
【０００７】
本発明によるがん細胞を認識する抗体とストレプトアビジン変異体との融合タンパク質を用いることによれば、がん細胞の増殖を抑制することができる。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】図１は、ドメイン構造の概略を示す。
【図２】図２は、CEA-V2122のSDS-PAGE泳動CBB 染色像を示す。
【図３】図３は、CEA-Cupidの抗原（CEACAM5）との結合性能評価を示す。
【図４】図４は、CEA-Cupidのビオチン改変体との結合性能評価を示す。
【図５】図５は、FITC標識CEA-V2122による細胞染色像を示す。
【図６】図６は、FITC標識CEA-V2122による細胞染色像MKN45 cell 時系列データを示す。
【図７】図７は、光活性化化合物結合ビオチン改変体を示す。
【図８】図８は、CEA-Cupidと光活性化化合物結合ビオチン改変体とを組合わせた in vitro 細胞障害性を示す。
【図９】図９は、腫瘍塊の大きさの変化を示す。
【図１０】図１０は、CEA-Cupidと光活性化化合物結合ビオチン改変体とを組合わせた in vivo 細胞障害性を示す。
【図１１】図１１は、CEA-Cupidと光活性化化合物結合ビオチン改変体とを組合わせたin vivo 細胞障害性 病理組織像を示す。
【図１２】図１２は、抗CEACAM5抗体を用いた病理切片の解析を示す。
【図１３】図１３は、HER2-V2122構造図を示す。
【図１４】図１４は、HER2-V2122のSDS-PAGE泳動CBB 染色像を示す。
【図１５】図１５は、HER2-Cupid の抗原（HER2) との結合性能評価を示す。
【図１６】図１６は、HER2-Cupid のビオチン改変体との結合性能評価を示す。
【図１７】図１７は、HER2-Cupidと光活性化化合物結合ビオチン改変体とを組合わせた in vitro 細胞障害性を示す。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
以下、本発明について更に詳細に説明する。
＜抗体とストレプトアビジン変異体との融合タンパク質＞
本発明の融合タンパク質は、Ｎ末端側からＣ末端側に、配列番号２又は配列番号７に記載のアミノ酸配列と、リンカー配列と、配列番号１に記載のアミノ酸配列（但し、Ｃ末端の６個のヒスチジンからなる配列アミノ酸配列は一部又は全部が欠失していてもよい）とをこの順に有する融合タンパク質である。本発明の融合タンパク質は、Ｎ末端側からＣ末端側に、抗デスモグレイン抗体のアミノ酸配列と、リンカー配列と、配列番号１に記載のアミノ酸配列（但し、Ｃ末端の６個のヒスチジンからなる配列アミノ酸配列は一部又は全部が欠失していてもよい）とをこの順に有する融合タンパク質でもよい。
配列番号２に記載のアミノ酸配列は、ｓｃＦｖ型の抗ＣＥＡＣＡＭ抗体のアミノ酸配列である。配列番号７に記載のアミノ酸配列は、ｓｃＦｖ型の抗Ｈｅｒ２抗体のアミノ酸配列である。
配列番号１に記載のアミノ酸配列は、ステレプトアビジン変異体のアミノ酸配列であり、具体的には、国際公開ＷＯ２０１５／１２５８２０の実施例３（国際公開ＷＯ２０１５／１２５８２０の配列番号４）（本願明細書の配列番号１）に記載されているストレプトアビジン変異体LISA314-V2122である。
上記の通り、本発明の融合タンパク質は、上記の通り、がん細胞を認識する抗体とストレプトアビジン変異体との融合タンパク質である。
【００１０】
リンカー配列は、本発明の効果を達成できる限り特に限定されないが、アミノ酸数は５から１５アミノ酸が好ましく、７から１３アミノ酸がより好ましく、９から１１アミノ酸はさらに好ましい。
リンカー配列の具体例としては、４〜１４個のグリシン残基及び１個のシステイン残基からなる配列を挙げることができる。リンカー配列としては、例えば、（Ｇｌｙ）ｍ−Ｃｙｓ−（Ｇｌｙ）ｎ（ｍ及びｎはそれぞれ独立に１〜１３の整数を示す）で示されるアミノ酸配列を使用することができる。リンカー配列の具体例としては、Gly- Gly-Gly- Gly-Ser- Gly- Gly- Gly- GlyまたはGly- Gly- Gly-Gly- Gly-Ser- Gly- Gly- Gly- Gly- Glyを挙げることができるが特に限定されない。
【００１１】
本発明の融合タンパク質の具体例としては、配列番号３又は配列番号８に記載のアミノ酸配列（但し、Ｃ末端の６個のヒスチジンからなる配列アミノ酸配列は一部又は全部が欠失していてもよい）を有する、融合タンパク質を挙げることができる。
本発明の融合タンパク質は、そのＮ末端に、分泌シグナル配列を有していてもよい。分泌シグナル配列を有する融合タンパク質としては、配列番号４又は配列番号９に記載のアミノ酸配列（但し、Ｃ末端の６個のヒスチジンからなる配列アミノ酸配列は一部又は全部が欠失していてもよい）を有する融合タンパク質を挙げることができる。
【００１２】
本発明によればさらに、上記した本発明の融合タンパク質をコードする核酸（例えば、ＤＮＡ）が提供される。本発明の核酸の具体例としては、配列番号３又は配列番号８に記載のアミノ酸配列（但し、Ｃ末端の６個のヒスチジンからなる配列アミノ酸配列は一部又は全部が欠失していてもよい）を有する融合タンパク質をコードする核酸を挙げることができる。本発明の核酸のさらなる具体例としては、配列番号４又は配列番号９に記載のアミノ酸配列（但し、Ｃ末端の６個のヒスチジンからなる配列アミノ酸配列は一部又は全部が欠失していてもよい）を有する、融合タンパク質をコードする核酸を挙げることができる。
【００１３】
本発明の融合タンパク質をコードする核酸（例えば、ＤＮＡ）は、ベクターに組み込んで使用することができる。本発明の融合タンパク質を製造するためには、本発明の融合タンパク質をコードする核酸を発現ベクターに組み込み、この発現ベクターを宿主に形質転換することによって、本発明の融合タンパク質を発現させることができる。
【００１４】
大腸菌を宿主とする場合には、ベクターとしては、複製起点（ori）を有し、さらに形質転換された宿主を選択するための遺伝子（例えば、アンピシリン、テトラサイクリン、カナマイシン又はクロラムフェニコールなどの薬剤に対する薬剤耐性遺伝子など）を有していることが好ましい。また、発現ベクターの場合には、宿主において本発明のストレプトアビジン変異体を効率よく発現させることができるようなプロモーター、例えば、lacZプロモーターまたはT7プロモーターなどを持っていることが好ましい。このようなベクターとしては、ベクターの例としては、M13系ベクター、pUC系ベクター、pBR322、pBluescript、pCR-Script、pGEX-5X-1（ファルマシア）、「QIAexpress system」（キアゲン）、pEGFP、またはpET(この場合、宿主はT7 RNAポリメラーゼを発現しているBL21を使用することが好ましい)などが挙げられる。
【００１５】
宿主細胞へのベクターの導入は、例えば塩化カルシウム法、エレクトロポレーション法を用いて行うことができる。また、可溶性を向上させるためのタグ、例えばグルタチオンーS−トランスフェラーゼやチオレドキシン、マルトース結合蛋白質をコードする配列が付加されていてもよい。また、精製を容易にすることを目的にした設計されたタグ、例えばポリヒスチジンタグ、Ｍｙｃエピトープ、ヘマグルチニン（ＨＡ）エピトープ、Ｔ７エピトープ、ＸｐｒｅｓｓタグやＦＬＡＧペプチドタグ、その他の既知のタグ配列をコードする配列が付加されていてもよい。
【００１６】
大腸菌以外にも、哺乳動物由来の発現ベクター（例えば、pcDNA3(インビトロゲン社製）や、pEGF-BOS(Nucleic Acids. Res.1990, 18(17),p5322)、pEF、pCDM8）、昆虫細胞由来の発現ベクター（例えば「Bac-to-BAC baculovairus expression system」（ギブコBRL社製）、pBacPAK8）、植物由来の発現ベクター（例えばpMH1、pMH2）、動物ウィルス由来の発現ベクター（例えば、pHSV、pMV、pAdexLcw）、レトロウィルス由来の発現ベクター（例えば、pZIPneo）、酵母由来の発現ベクター（例えば、「Pichia Expression Kit」（インビトロゲン社製）、pNV11 、SP-Q01）、枯草菌由来の発現ベクター（例えば、pPL608、pKTH50）が挙げられる。
【００１７】
CHO細胞、COS細胞、NIH3T3細胞等の動物細胞での発現を目的とした場合には、細胞内で発現させるために必要なプロモーター、例えばSV40プロモーター（Mulliganら, Nature (1979) 277, 108）、MMLV-LTRプロモーター、EF1αプロモーター（Mizushimaら, Nucleic Acids Res. (1990) 18, 5322）、CMVプロモーターなどを持っていることが不可欠であり、細胞への形質転換を選抜するための遺伝子（例えば、薬剤（ネオマイシン、G418など）により判別できるような薬剤耐性遺伝子）を有すればさらに好ましい。このような特性を有するベクターとしては、例えば、pMAM、pDR2、pBK-RSV、pBK-CMV、pOPRSV、pOP13などが挙げられる。
【００１８】
ベクターが導入される宿主細胞としては特に制限はなく、原核生物および真核生物のいずれでもよい。例えば、大腸菌や種々の動物細胞などを用いることが可能である。
【００１９】
真核細胞を使用する場合、例えば、動物細胞、植物細胞、真菌細胞を宿主に用いることができる。動物細胞としては、哺乳類細胞、例えば、CHO細胞、COS細胞、3T3細胞、HeLa細胞、Vero細胞、あるいは昆虫細胞、例えば、Sf9、Sf21、Tn5などを用いることができる。動物細胞において、大量発現を目的とする場合には特にCHO細胞が好ましい。宿主細胞へのベクターの導入は、例えば、リン酸カルシウム法、DEAEデキストラン法、カチオニックリボソームDOTAP（ベーリンガーマンハイム社製）を用いた方法、エレクトロポーレーション法、リポフェクションなどの方法で行うことが可能である。
【００２０】
植物細胞としては、例えば、ニコチアナ・タバカム（Nicotiana tabacum）由来の細胞が蛋白質生産系として知られており、これをカルス培養すればよい。真菌細胞としては、酵母、例えば、サッカロミセス（Saccharomyces）属、例えば、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）、糸状菌、例えば、アスペルギルス（Aspergillus）属、例えば、アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）が知られている。
【００２１】
原核細胞を使用する場合は、大腸菌（E. coli）、例えば、JM109、DH5α、HB101等が挙げられ、その他、枯草菌が知られている。
【００２２】
これらの細胞を、本発明の核酸により形質転換し、形質転換された細胞をin vitroで培養することにより本発明の融合タンパク質が得られる。培養は、公知の方法に従い行うことができる。例えば、動物細胞の培養液として、例えば、DMEM、MEM、RPMI1640、IMDMを使用することができる。その際、牛胎児血清（FCS）等の血清補液を併用することもできるし、無血清培養してもよい。培養時のpHは、約6〜8であるのが好ましい。培養は、通常、約30〜40℃で約15〜200時間行い、必要に応じて培地の交換、通気、攪拌を加える。また、細胞の増殖を促進するための成長因子の添加を行ってもよい。
【００２３】
＜がん治療剤またはがん診断剤＞
本発明の融合タンパク質は、がん治療剤またはがん診断剤として有用である。
本発明によれば、（１）本発明の融合タンパク質、及び（２）後記する式（１）で示される化合物又はその塩と、診断用物質又は治療用物質とのコンジュゲートを含む、がんの治療または診断キットが提供される。
【００２４】
本発明の融合タンパク質を患者に投与することで、がん細胞に特異的にストレプトアビジン変異体を集積できることができる。次に、ストレプトアビジン変異体に親和性を有するビオチン改変二量体と診断用物質又は治療用物質とのコンジュゲートを患者に投与することによって、癌細胞へ的確に診断用物質又は治療用物質を集積させることが可能になる。
【００２５】
あるいは、「本発明の融合タンパク質」と、「ストレプトアビジン変異体に親和性を有するビオチン改変二量体と診断用物質又は治療用物質とのコンジュゲート」とを、結合させた複合体を調製し、この複合体を患者に投与することもできる。
【００２６】
＜ビオチン改変二量体＞
ビオチン改変二量体は、下記式（１）で示される化合物又はその塩であり、好ましくは下記式（２）で示される化合物又はその塩である。ビオチン改変二量体は、国際公開ＷＯ２０１５／１２５８２０号に記載されている化合物を使用することができる。
【００２７】
【化２】
2020138427.tif 000003
【００２８】
【化３】
2020138427.tif 000004
【００２９】
（式中、
Ｘ１ａ、Ｘ１ｂ、Ｘ２ａ及びＸ２ｂはそれぞれ独立にＯ又はＮＨを示し、
Ｙ１及びＹ２はそれぞれ独立にＣ又はＳを示し、
Ｚ１及びＺ２はそれぞれ独立にＯ、Ｓ又はＮＨを示し、
Ｖ１及びＶ２はそれぞれ独立にＳ又はＳ＋−Ｏ−を示し、ｎ１及びｎ２はそれぞれ独立に０又は１の整数を示し、
Ｌ１及びＬ２はそれぞれ独立に、２価の連結基を示し、
Ｌ３は、診断用物質又は治療用物質（例えば、フタロシアニン染料）と結合できる官能基を末端に含む基であり、
Ｌ４は、３価の連結基を示す。）
【００３０】
式（１）及び式（２）において、下記構造：
【化４】
2020138427.tif 000005
で示される部分は好ましくは、
【化５】
2020138427.tif 000006
の何れかであるが、これらに限定はされない。
【００３１】
Ｘ１ａ、Ｘ１ｂ、Ｘ２ａ及びＸ２ｂがＮＨを示すことが好ましく、Ｙ１及びＹ２がＣを示すことが好ましく、Ｚ１及びＺ２がＮＨを示すことが好ましく、Ｖ１及びＶ２がＳを示すことが好ましい。
【００３２】
Ｌ１及びＬ２はそれぞれ独立に、−ＣＯＮＨ−、−ＮＨＣＯ−、−ＣＯＯ−、−ＯＣＯ―、−ＣＯ−、−Ｏ−、及び炭素数１から１０のアルキレン基から選択される基の組み合わせからなる２価の連結基であることが好ましい。
Ｌ１及びＬ２はそれぞれ独立に、−ＣＯＮＨ−、−ＮＨＣＯ−、−Ｏ−、及び炭素数１から１０のアルキレン基から選択される基の組み合わせからなる２価の連結基であることが好ましい。
Ｌ１、及びＬ２はそれぞれ独立に、−ＣＯＮＨ−、−ＮＨＣＯ−、及び炭素数１から１０のアルキレン基から選択される基の組み合わせからなる２価の連結基であることが好ましい。
【００３３】
Ｌ４は、３価の連結基を示し、好ましくは、
【化６】
2020138427.tif 000007
又は、
【化７】
2020138427.tif 000008
である（ベンゼンに由来する３価の連結基または窒素原子）。
【００３４】
Ｌ３は、好ましくは、−ＣＯＮＨ−、−ＮＨＣＯ−、−ＣＯＯ−、−ＯＣＯ―、−ＣＯ−、−Ｏ−、及び炭素数１から１０のアルキレン基から選択される基の組み合わせからなる基であって、さらにアミノ基を末端に含む基である。
【００３５】
＜ビオチン改変二量体と診断用物質又は治療用物質とのコンジュゲート＞
ビオチン改変二量体に、診断用物質又は治療用物質を結合させることにより、ビオチン改変二量体と診断用物質又は治療用物質とのコンジュゲートを調製することができる。診断用物質又は治療用物質としては、蛍光色素、化学発光剤、放射性同位元素、金属化合物等からなる増感剤、金属化合物等からなる中性子捕捉剤、フタロシアニン染料、低分子化合物、マイクロあるいはナノバブル、タンパク質などを挙げることができる。好ましくは、フタロシアニン染料を使用することができる。
【００３６】
＜フタロシアニン染料＞
フタロシアニン染料は、好ましくはシリコンフタロシアニン染料である。ＩＲＤｙｅ（登録商標）７００ＤＸのようなフタロシアニン染料の具体例は、例えば、米国特許第７，００５，５１８号に記載されている。
【００３７】
フタロシアニン染料としては、下記式（２１）で示される染料を使用することができ、一例としては、下記式（２２）で示される染料を使用することができ
【００３８】
【化８】
2020138427.tif 000009
【００３９】
【化９】
2020138427.tif 000010
【００４０】
式中、Ｌ２１は２価の連結基を示し、Ｒ２１は、式（１）で示される化合物又はその塩と結合できる官能基を示す。
【００４１】
Ｘ及びＹはそれぞれ独立に親水性基、−ＯＨ、水素原子又は置換基である。ここで言う置換基としては、ハロゲン原子（フッ素原子）、炭素原子を含む置換基（炭化水素基など）、窒素原子を含む置換基（アミノ基など）などを挙げることができるが、特に限定されない。
Ｘ及びＹの具体例としては、
（ｉ）Ｘ及びＹがともに親水性基である場合、
（ｉｉ）Ｘ及びＹの一方が親水性基であり、Ｘ及びＹの他方が−ＯＨ、又は水素原子である場合、
（ｉｉｉ）Ｘ及びＹが、−ＯＨ、又は水素原子である場合、
を挙げることができる。
【００４２】
Ｘ及び／又はＹで示される親水性基は特に限定されないが、一例を下記に示す。
【化１０】
2020138427.tif 000011
【００４３】
フタロシアニン染料としては、ＩＲＤｙｅ（登録商標）７００ＤＸなどの市販品を使用することができる。本発明においては、 ＩＲＤｙｅ（登録商標）７００ＤＸのＮＨＳエステルを使用して、これを、アミノ基を有するビオチン改変二量体と反応させることによりコンジュゲートを製造することができる。ＩＲＤｙｅ（登録商標）７００ＤＸの他のバリエーションは、米国特許第７，００５，５１８号に記載されており、それらを使用することもできる。
【００４４】
Ｒ２１は、式（１）で示される化合物又はその塩と結合できる官能基を示す。Ｒ２１は、好ましくは、ビオチン改変二量体上のカルボキシル基、アミン、又はチオール基と反応して結合できる官能基である。Ｒ２１は、好ましくは、活性化エステル、ハロゲン化アシル、ハロゲン化アルキル、適宜置換されたアミン、無水物、カルボン酸、カルボジイミド、ヒドロキシル、ヨードアセトアミド、イソシアネート、イソチオシアネート、マレイミド、ＮＨＳエステル、ホスホロアミダイト、スルホン酸エステル、チオール、又はチオシアネートなどが挙げられるが特に限定されない。
【００４５】
Ｌ２１は２価の連結基を示し、例えば、エーテル、チオエーテル、アミン、エステル、カルバマート、ウレア、チオウレア、オキシ又はアミド結合の任意の組み合わせ、又は一重、二重、三重若しくは芳香族炭素−炭素結合；又はリン−酸素、リン−硫黄、窒素−窒素、窒素−酸素、若しくは窒素−プラチナ結合；又は芳香族若しくは複素芳香族結合を含んでいてもよい。Ｌ２１は、好ましくは、−ＣＯＮＨ−、−ＮＨＣＯ−、−ＣＯＯ−、−ＯＣＯ―、−ＣＯ−、−Ｏ−、及び炭素数１から１０のアルキレン基から選択される基の組み合わせからなる基である。
【００４６】
−Ｌ２１−Ｒ２１は、ホスホロアミダイト基、ＮＨＳエステル、活性カルボン酸、チオシアネート、イソチオシアネート、マレイミド、及びヨードアセトアミドを含んでいてもよい。
【００４７】
Ｌ２１は、−（ＣＨ２）ｎ−基を含み、式中、ｎは１〜１０の整数であり、好ましくは、ｎは１〜４の整数である。一例としては、−Ｌ２１−Ｒ２１は、−Ｏ−（ＣＨ２）３−ＯＣ（Ｏ）−ＮＨ−（ＣＨ２）５−Ｃ（Ｏ）Ｏ−Ｎ−スクシンイミジルである。
【００４８】
＜光免疫療法＞
光免疫療法とは、体内で特定の細胞を破壊するために光増感剤及び照射光を使用する治療法である。光増感剤は、特異的な波長の光に晒されるとき、付近の細胞のアポトーシス、ネクローシス、及び／又は自食作用を誘発できる細胞傷害性の活性酸素種を生じる。例えば、特許６１２７０４５号公報には、細胞を死滅させる方法であって、 細胞表面タンパク質を含む細胞を、治療有効量の１または複数の抗体−ＩＲ７００分子と接触させるステップであって、該抗体が該細胞表面タンパク質に特異的に結合するステップと；該細胞に、６６０〜７４０ｎｍの波長で、かつ少なくとも１Ｊｃｍ−２の線量で照射するステップと；該細胞に照射した約０〜８時間後に、該細胞を１または複数の治療剤と接触させ、これにより、該細胞を死滅させるステップとを含む方法が記載されている。特表２０１７−５２４６５９号公報には、疾患又は病態を患っている対象において細胞毒性を誘発する方法であって、（ａ）対象の細胞に特異的に結合するプローブにコンジュゲートしたＩＲＤｙｅ（登録商標）７００ＤＸなどのフタロシアニン染料を包含する治療的に有効な薬剤を該対象に投与し；そして、（ｂ）細胞死を誘発するのに有効な量で適切な励起光を前記細胞に照射することを含む、方法が記載されている。
【００４９】
本発明の融合タンパク質と、ビオチン改変二量体とフタロシアニン染料とのコンジュゲートとを対象に投与し、細胞増殖の抑制または細胞死を誘発するのに有効な量で励起光を細胞に照射することによって、細胞増殖の抑制または細胞死を誘発し、対象を治療することができる。
【００５０】
好ましくは、本発明の融合タンパク質と、ビオチン改変二量体とフタロシアニン染料とのコンジュゲートとを対象に投与し、細胞増殖の抑制または細胞死を誘発するのに有効な量で励起光を細胞に照射することによって、細胞増殖の抑制または細胞死を誘発し、対象を治療することができる。
【００５１】
対象としては、ヒトおよび非ヒト哺乳動物を包含し、ヒト、またはマウスなどの実験動物が挙げられる。対象としては、細胞増殖の抑制または細胞死の誘発が望まれる疾患を患っている対象が好ましく、例えば、がん又は固形腫瘍を有する対象を挙げることができる。
【００５２】
「がん」とは、癌腫、リンパ腫、芽細胞腫、肉腫、及び白血病又は悪性リンパ腫が挙げられる。がんの具体例としては、扁平上皮癌（例えば、上皮性扁平細胞癌）、小細胞肺癌を含めた肺癌、非小細胞肺癌（「ＮＳＣＬＣ」）、肺腺癌及び肺の扁平上皮癌、腹膜の癌、肝細胞性癌、消化器癌を含めた胃体又は胃癌、膵臓癌、神経膠芽腫、子宮頚癌、卵巣癌、肝臓癌、膀胱癌、肝細胞癌、乳癌、結腸癌、直腸癌、結腸直腸癌、子宮内膜又は子宮癌腫、唾液腺癌腫、腎臓又は腎臓部癌、前立腺癌、外陰部癌、甲状腺癌、肝細胞癌腫、肛門癌腫、陰茎癌腫、並びに頭頚部癌が挙げられる。
【００５３】
固形腫瘍とは、良性でも悪性でも、通常包嚢を含まない細胞の異常な塊を指す。固形腫瘍としては、神経膠腫、星状細胞腫、髄芽腫、頭蓋咽頭腫、上衣腫、松果体腫、血管芽腫、聴神経腫、希突起神経膠腫、髄膜腫、黒色腫、神経芽細胞腫、及び網膜芽細胞腫が挙げられる。
【００５４】
対象への投与方法としては、局所経路、注射（皮下注射、筋肉内注射、皮内注射、腹腔内注射、腫瘍内注射、および静脈内注射など）、経口経路、眼経路、舌下経路、直腸経路、経皮経路、鼻腔内経路、膣経路、および吸入経路などが挙げられるが、これらに限定されない。
【００５５】
ビオチン改変二量体とフタロシアニン染料とのコンジュゲートと、本発明の融合タンパク質はそれぞれ、治療有効量で投与することが好ましい。
治療有効量は、上記のコンジュゲートと融合タンパク質のそれぞれについて、６０キログラム当たり少なくとも０．５ミリグラム（ｍｇ／６０ｋｇ）、少なくとも５ｍｇ／６０ｋｇ、少なくとも１０ｍｇ／６０ｋｇ、少なくとも２０ｍｇ／６０ｋｇ、少なくとも３０ｍｇ／６０ｋｇ、少なくとも５０ｍｇ／６０ｋｇである。例えば、静脈内投与される場合、１ｍｇ／６０ｋｇ、２ｍｇ／６０ｋｇ、５ｍｇ／６０ｋｇ、２０ｍｇ／６０ｋｇ、または５０ｍｇ／６０ｋｇの用量など、例えば、０．５〜５０ｍｇ／６０ｋｇである。別の例では、治療有効量は、少なくとも１００μｇ／ｋｇ、少なくとも５００μｇ／ｋｇまたは少なくとも５００μｇ／ｋｇなど、少なくとも１０μｇ／ｋｇ、例えば、腫瘍内投与または腹腔内投与される場合、１００μｇ／ｋｇ、２５０μｇ／ｋｇ、約５００μｇ／ｋｇ、７５０μｇ／ｋｇ、または１０００μｇ／ｋｇの用量など、例えば、１０μｇ／ｋｇ〜１０００μｇ／ｋｇである。一例では、治療有効量は、局所用溶液で投与される１０μｇ／ｍｌ、２０μｇ／ｍｌ、３０μｇ／ｍｌ、４０μｇ／ｍｌ、５０μｇ／ｍｌ、６０μｇ／ｍｌ、７０μｇ／ｍｌ、８０μｇ／ｍｌ、９０μｇ／ｍｌ、または１００μｇ／ｍｌなど、２０μｇ／ｍｌ〜１００μｇ／ｍｌの間など、少なくとも５００μｇ／ｍｌなど、少なくとも１μｇ／ｍｌである。
【００５６】
上記した投与量を、１回もしくは複数回にわたる分割用量（２、３、または４回の用量など）または単一の製剤で投与することができる。
【００５７】
ビオチン改変二量体とフタロシアニン染料とのコンジュゲートと、本発明の融合タンパク質はそれぞれ、単独で投与することもでき、薬学的に許容されるキャリアの存在下で投与することもでき、他の治療剤（他の抗がん剤など）の存在下で投与することもできる。
【００５８】
ビオチン改変二量体とフタロシアニン染料とのコンジュゲートと、本発明の融合タンパク質は、循環している腫瘍細胞又は固形腫瘍の細胞などの標的細胞又は標的組織に結合することができる。その後に、光を照射すると、上記コンジュゲート又は複合体は、光を吸収し、標的細胞又は組織を損傷又は破壊することができる。
【００５９】
光免疫療法において照射光の波長は、好ましくは６６０〜７４０ｎｍであり、例えば６６０ｎｍ、６７０ｎｍ、６８０ｎｍ、６９０ｎｍ、７００ｎｍ、７１０ｎｍ、７２０ｎｍ、７３０ｎｍ、又は７４０ｎｍの波長を有する。光の照射は、近赤外（ＮＩＲ）発光ダイオードを備えたデバイスを使用することによって行ってもよい。
【００６０】
光の照射量は、少なくとも１Ｊ／ｃｍ２、例えば、少なくとも４Ｊ／ｃｍ２、少なくとも１０Ｊ／ｃｍ２、少なくとも１５Ｊ／ｃｍ２、少なくとも２０Ｊ／ｃｍ２、少なくとも５０Ｊ／ｃｍ２、または少なくとも１００Ｊ／ｃｍ２、例えば、１〜５００Ｊ／ｃｍ２である。光照射は、複数回（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０回）実施してもよい。
【００６１】
以下の実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明は実施例によって限定されるものではない。
【実施例】
【００６２】
＜製造例１＞
【化１１】
2020138427.tif 000012
【００６３】
Psyche J (1.8 mg, 1.6 μmol) にIR Dye 700 NHS Ester (3.0 mg, 1.5μmol)、リン酸水素二ナトリウム緩衝液 (pH 8.4, 144 μL) とジメチルスルホキシド (120 μL) を加え、アルミホイルで光を遮蔽し室温で24時間攪拌した。反応液を水で500μLに希釈したものを逆相HPLC (グラジエント：0% for 5 min; 0-100% for 100 min アセトニトリル in 50 mM triethylammonium acetate 水溶液 (pH 6.5), 保持時間 = 47.2 min, YMC-Triart C18, flow rate = 3.5 mL/min)で精製することで標的化合物1 (深青緑色) を得た。IR700に対して報告されている水中694 nmのモル吸光係数165,000 (M-1 cm-1)から定量し、収率 (1.0 μmol, 72%) を算出した。
LRMS (ESI): m/z 1303 [M+2H]2+, 869 [M+3H]3+【００６４】
＜製造例２＞
【化１２】
2020138427.tif 000013
【００６５】
化合物1 (0.375 mg, 144 nmol) に 0.1% ギ酸水溶液 (266 μL) とアセトニトリル (133 μL) を加えてボルテックスミキサーで攪拌し、遠心した後、暗室37°Cの条件下で90 分静置した。その溶液を逆相HPLC (グラジエント：0% for 5 min; 0-100% for 100 min アセトニトリル in 50 mM triethylammonium acetate 水溶液 (pH 6.5), 保持時間 = 51.6 min, YMC-Triart C18, flow rate = 3.5 mL/min)で精製することで標的化合物2 (深青緑色)を得た。同様に定量し、収率（48 nmol, 33%）を算出した。
LRMS (ESI): m/z 1054 [M-H2O+2H]2+, 703 [M-H2O+3H]3+【００６６】
＜製造例３＞
【化１３】
2020138427.tif 000014
【００６７】
化合物1 (0.375 mg, 144 nmol) に 0.1% ギ酸水溶液 (266 μL) とアセトニトリル (133 μL) を加えてボルテックスミキサーで攪拌し、遠心した後、暗室37°Cの条件下で28時間静置した。その溶液を逆相HPLC (グラジエント：0% for 5 min; 0-100% for 100 min アセトニトリル in 50 mM triethylammonium acetate 水溶液 (pH 6.5), 保持時間 = 56.2 min, YMC-Triart C18, flow rate = 3.5 mL/min)で精製することで標的化合物 3 (深青緑色)を得た。同様に定量し、収率（15 nmol, 10%）を算出した。
LRMS (ESI): m/z 813 [M-H2O+2H]2+, 542 [M-H2O+3H]3+【００６８】
実施例１：CEA-V2122タンパク質の発現と精製
V2122は、国際公開ＷＯ２０１５／１２５８２０の実施例３（国際公開ＷＯ２０１５／１２５８２０の配列番号４）に記載されているストレプトアビジン変異体である。V2122のアミノ酸配列（Ｃ末端に６×Ｈｉｓタグを有する配列）を配列表の配列番号１に記載する。【００６９】
scFv-V2122は、上記のV2122に、CEACAM5に対する一本鎖抗体（scFv）を結合したものである。このscFv型の抗CEACAM5抗体は特許文献US7626011B2に記載されているscFv配列である。scFv型の抗CEACAM5抗体のアミノ酸配列を配列表の配列番号２に記載する。また、scFv型の抗CEACAM5抗体とV2122とをアミノ酸リンカー(GGGGSGGGG)（配列番号１１）で結合したCEA-V2122のアミノ酸配列を配列表の配列番号３に記載する。【００７０】
CEA-V2122融合タンパク質の発現のために、大腸菌にて分泌発現するためのpelBシグナルをN末端に、また6xHis-Tag配列をC末端に組み込んだCEA-V2122遺伝子配列のDNAコドンを大腸菌に最適化し人工遺伝子合成を行なった。このアミノ酸配列を配列表の配列番号４、DNA配列を配列表の配列番号５に記載する。また、ドメイン構造の概略を図１に示す。【００７１】
具体的なタンパク質発現ベクターは、pETDuet1ベクターのMCS2にシャペロンskp遺伝子が組み込まれたベクターを使用した。skp遺伝子は配列表の配列番号６に記載されたアミノ酸配列を元にコドンを大腸菌に最適化したDNAの人工遺伝子合成を行った。合成されたskp遺伝子はプライマー（AAGGAGATATACATATGGATAAAATTGCCATTGTTAATAT（配列番号１２）, TTGAGATCTGCCATATGTTATTTCACTTGTTTCAGAACG（配列番号１３））を使用しPCRで増幅し、制限酵素NdeIで直鎖化されたpETDue1ベクターのMCS2にIn-Fusion HD Cloning Kitをもちいてクローニングを行い pETDuet_skp とした。次に、 pETDuet_skp のMCS1にCEA-V2122遺伝子を組み込んだ。具体的には、人工合成されたCEA-V2122遺伝子をプライマー（AGAAGGAGATATACCATGAAATATCTGCTGCCGAC（配列番号１４）、CGCCGAGCTCGAATTTTAATGATGGTGATGATGATG（配列番号１５））を用いPCRにて増幅した。また、 pETDuet_skp をプライマー（GGTATATCTCCTTCTTAAAGTTAAAC（配列番号１６）、AATTCGAGCTCGGCGCGCCTGCAG（配列番号１７））を使用しPCRにて直鎖化した。PCRにより増幅された CEA-V2122と直鎖化された pETDuet_skp を In-Fusion HD Cloning Kit をもちいてクローニングを行った。クローニングされたベクターはシーケンスにより組み込まれた遺伝子配列の確認を行い pETDuet_CEA-V2122_skp とした。【００７２】
タンパク質発現のために、pETDuet_CEA-V2122_skpをBL21(DE3)(ニッポン・ジーン社)に形質転換し 2xYT培地(SIGMA-ADLRICH社)、37℃にて一晩、前培養を行った。前培養を行った培地を 新しい培地に100倍希釈になるように添加し、OD(600nm) = 0.5〜2.0になるまで37℃で培養を行った。次に最終濃度0.5mM IPTGを添加し37℃で4時間培養し培養上清を回収した後、4℃で保存した。【００７３】
CEA-V2122タンパク質は、C末端に付加されている6xHis-Tagを利用し バッチ法で粗精製を行った。具体的にはバッファーA(50mM TrisHCl, 0.2M NaCl, 1mM ED TA, 5mM Imidazole, pH8.0)で平衡化したcOmplete His-Tag Purification Resin を4℃で保存した培養上清へ添加し、2時間から一晩、4℃にて撹拌しレジンへのタンパク質結 合処理を行った。次にレジンをカラムに回収し、バッファーAで20カラム容量の洗浄作業 を行った。その後、バッファーB(50mM TrisHCl, 0.2M NaCl, 1mM EDTA, 400mM Imidazol e, pH8.0)で溶出しCEA-V2122の粗精製物の回収を行った。 【００７４】
次に、粗精製物についてProtein L カラムによる精製を行った。具体的にはCapto L (GE Healthcare Life Sciences) 1mLをPD-10カラムに充填し、10カラムボリュームのPBSで平衡化後、上述の粗精製物をアプライし、10カラムボリュームのPBSで洗浄後、10mM グリシン塩酸 pH2.0で溶出しVivaspin Turbo 15 (MWCO 100,000) による遠心濃縮を行なった。さらに PD-10 (GE Healthcare Life Sciences社) を用いてPBSへバッファー置換を行い、さらに Vivaspin Turbo 4  (MWCO 100,000) による遠心濃縮を行い最終精製物とした。SDS-PAGE電気泳動後、CBB染色により４量体CEA-V2122の純度の検定を行なった結果を図２に示す。SDS-PAGEゲルは Mini-PROTEAN TGX 4-15% (Bio-Rad社) を使用し CBB染色液はBullet CBB Stain One(Ready To Use) (ナカライテスク社）を使用した。
図２より精製されたCEA-V2122は約150kDaの４量体を主たる成分であることが確認された。【００７５】
実施例２：CEA-V2122のSPRでの性能評価
CEA-V2122と抗原CEACAM5との親和性を表面プラズモン共鳴（SPR）測定装置：Biacore T200 (GE Healthcare Life Sciences社) を用いて実施した。具体的にはRecombinant Human CEACAM-5/CD66e Protein, CF (R&D SYSTEMS社) を Sensor Chip CM5 (GE Healthcare Life Sciences社) にアミンカップリングキット (GE Healthcare Life Sciences社) を用いて固定化操作を行い、リガンドの最終固定化量は279RUとなった。また、精製されたCEA-V2122は 1E-08 M から 6.25E-10 M までの２倍希釈系列をアナライトとして調整した。相互作用解析は Single-Cycle Kinetics 解析にてデータの取得を行った。得られたデータを Biacore T200 Evaluation Software, version 2.0 にて Bivalent Analyze モードによるカーブフィッティングを実施しka1=3.208E+5, kd1=3.461E-7の値を得た。また、Bivalent AnalyzeではKD＝kd1/ka1で評価できることからKD＝kd1/ka1= 3.461E-7/3.208E+5=1.078E-12の評価値を得た。それらの結果を図３に示す。
図３に示されるセンサーグラム、KD値よりCEA-V2122はCEACAM5に強く結合することが確認された。【００７６】
また、CEA-V2122とビオチン改変体との相互作用解析も Biacore T200 を用いて実施した。具体的なビオチン改変体は国際公開ＷＯ２０１８／０７２３９の実施例１に記載されている標題化合物14である。また具体的な解析方法は以下の通りである。アミンカップリングキットを使用し、Sensor Chip CM5 に目標値 5000RUとなるように設定し、精製された CEA-V2122 の固定化を行なった。アナライトの濃度は 1E-08 M から 6.25E-10 M までの２倍希釈系列５種類を使用した。相互作用解析はSingle-Cycle Kinetics 解析にてデータの取得を行った。得られたデータを Biacore T200 Evaluation Software, version 2.0 にて Bivalent Analyze モードによるカーブフィッティングを実施しka1=3.792E+4, kd1=4.424E-6の値を得た。また、Bivalent AnalyzeではKD＝kd1/ka1で評価できることからKD＝kd1/ka1= 3.792E+4/4.424E-6=1.167E-10の評価値を得た。それらの結果を図４に示す。
図４に示されるセンサーグラム、KD値よりCEA-V2122はビオチン改変体に強く結合することが確認された。【００７７】
実施例３：FITC標識CEA-V2122 を用いたCEACAM5発現細胞株の細胞染色
CEACAM5発現陽性のがん細胞株の染色のために、精製されたCEA-V2122 タンパク質を100 μg 使用しFITC標識を行なった。具体的には、Fluorescein Labeling Kit - NH2 (同仁化学研究所) を用いて操作手順書の用法用量に従い標識を実施し、得られた産物をCEA-V2122-FITC とした。具体的なCEACAM5発現陽性のがん細胞株の染色は次のとおりである。 CELLSTAR, μClear, 96ウエルプレート (Greiner社) に2.0x104cell/well となるようにCEACAM5陽性のヒト胃がん由来MKN-45細胞とCEACAM5陰性のヒト結腸がん由来DLD1細胞を播種し一晩培養した。次に 20 nM CEA-V2122-FITCと1μM Hoechist を含む培養液を100 μL/well となるように添加し4℃にて30分間反応ののち、In Cell Analyzer 6000 (GE Healthcare Life Sciences社) にて画像の取得を行なった。その結果を図５および図６に示す。【００７８】
図５に示された結果より、CEA-V2122-FITCは細胞膜表面のCEACAM5を特異的に認識することが確認された。また、図６に示された結果より、CEACAM5はCEA-V2122-FITC結合後、細胞膜表面に滞留することが確認された。【００７９】
実施例４：CEA-V2122 と光活性化化合物標識ビオチン改変体を用いた in vitro 細胞傷害性試験
光活性化化合物標識ビオチン改変体、コンパウンド１、コンパウンド２およびコンパウンド３を用いて細胞傷害性試験を実施した。これらのコンパウンドは出願番号：特願2018-149295 に記載されている化合物である。コンパウンド１、コンパウンド２およびコンパウンド３を図７に示す。具体的にはMKN45細胞を細胞培養用96ウェルプレートに細胞数が 5x103 cells/well、培養液が 50 μL/well となるように播種し一晩培養した。CEA-V2122と光活性化化合物標識ビオチン改変体の複合体溶液は、CEA-V2122と各コンパウンドとのモル比が1:2となるように混合し室温で10分間インキュベーションをおこない、CEA-V2122の最終濃度10μg/mLとなるように培養液で濃度調製を行なった。希釈系列は20μg/mLを開始濃度とし、4倍希釈系列を４系列（5.0 μg/mL, 1.25 μg/mL, 0.312 μg/mL, 0.078μg/mL）を５系列の複合体希釈系列液とした。また、複合体を含まない培地のみをゼロコントロールとした。【００８０】
一晩培養した細胞に複合体希釈系列液を最終濃度（10 μg/mL, 2.5 μg/mL, 0.625 μg/mL, 0.156 μg/mL, 0.039 μg/mL）となるように 50 μL/well づつ各 well 添加した。複合体添加、1時間後、2時間後に 690 ± 10 nm の波長の光を出すLEDを用いて、100 J/cm2 となるように細胞に光を照射した。その後、48時間培養し Cell Counting Kit-8 (同仁化学社) を用いて生細胞数の比較を行なった。各条件は n=3 とした。用法用量は取扱説明書に従い試薬添加1時間半37℃、CO2 インキュベーターでインキュベーションしたのち、吸光度450nmを測定し、平均値を計算しバックグラウンド補正後、コントロールを100％として各条件のコントロールに対する細胞増殖の割合を計算した。その結果を図８に示す。
図８に示されるように、CEA-V2122とコンパウンド１、コンパウンド２、コンパウンド３との複合体の濃度依存的に細胞傷害性を示すことが確認された。【００８１】
実施例５：ゼノグラフトモデルマウスを用いたCEA-V2122 と光活性化化合物標識ビオチン改変体による in vivo 細胞傷害性試験
ヌードマウスにMKN45細胞を皮下に移植したゼノグラフトモデルマウスの作製を行なった。４週例のヌードマウス雌を購入し、１週間馴化後、１匹あたり細胞数 2x10^5 cells にて皮下に細胞を移植した。移植後、約10日に実験例４に記載されているCEA-V2122と光活性化化合物標識ビオチン改変体コンパウンド１の複合体を100 μg を尾静脈から投与した。波長690 nm の光を発生するLED光源(USHIO OPTO SMICONDUCTORS, INC., LD690D-66-60-550.), T-Cube LED Driver(THORLABS, NC0713145)およびT-CUBE 15V POWER SUPPLY(THORLABS, TPS001) を使用し、投与6時間後に690 nm の光を230 J/cm^2 となるように照射した。再度、複合体投与24時間後に690 nm の光を230 J/cm^2 となるように照射した。光源として腫瘍の体積の変化のグラフを図９に示す。複合体投与５日後のマウス個体の写真を図１０に示す。また、複合体投与７日目にマウス個体を安楽死させ、解剖を行い腫瘍部分を病理解析した。具体的な手法は次のとおりである。マウス皮下腫瘍とその周囲組織を一塊として摘出し、4%パラホルムアルデヒド溶液(和光純薬, 163-20145)に室温で一晩浸漬して組織を固定した。固定後の皮下腫瘍組織に対して約3~5mm厚の割を入れてパラフィン包埋ブロックを作成し、ミクロトームによって4μm厚の薄切病理標本を作成した。【００８２】
ヘマトキシリン・エオジン染色については、薄切病理標本をキシレン溶液(和光純薬, 241-00091)に室温10分間浸漬して脱パラフィン処理を行った後にヘマトキシリン染色(サクラファインテック, #8650)およびエオジン染色(サクラファインテック, #8660)を実施した。この結果を図１１に示す。【００８３】
また、CEACAM5に対する免疫染色は以下のように実施した。薄切病理標本をキシレン溶液(和光純薬, 241-00091)に室温10分間浸漬して脱パラフィン処理を行った後に、クエン酸バッファー(pH=6.0)によるオートクレーブ処理(121℃, 5分)で抗原賦活化を行った。その後に0.3%過酸化水素(和光純薬, 081-04215)/メタノール(和光純薬, 137-01823)溶液に室温10分間浸漬し、内因性ペルオキシダーゼの除去を行った。非特異的反応のブロッキングは2% BSA(Sigma Aldrich, A1470)/Phosphate buffered saline溶液で実施した。抗CEACAM5抗体(R&D SYSTEMS, MAB41281), 濃度1/100)を4℃にて一晩反応させた後に、Histostar(商標)(MBL, #8460)およびDAB Substrate Solution (MBL, #8469)を用いて免疫染色シグナルを可視化し、最後にヘマトキシリン(サクラファインテック, #8650)による核染色を実施した。この結果を図１２に示す。
図１１及び図１２よりCEA-V2122とコンパウンド１との複合体を投与し、690 nm の光を照射することでゼノグラフトモデルマウスの腫瘍の壊死を誘導できることが確認された。【００８４】
実施例６：HER2-V2122タンパク質の発現と精製
V2122は、国際公開ＷＯ２０１５／１２５８２０の実施例３（国際公開ＷＯ２０１５／１２５８２０の配列番号４）に記載されているストレプトアビジン変異体である。V2122のアミノ酸配列を配列表の配列番号１に記載する。
scFv-V2122は、上記のV2122に、HER2 (ERBB2) に対する一本鎖抗体（scFv）を結合したものである。このscFv型の抗HER2抗体は、Zhang H, et al.,Therapeutic potential of an anti-HER2 single chain antibody-DM1 conjugates for the treatment of HER2-positive cancer. Signal Transduct Target Ther. 2017 May 19;2:17015. doi: 10.1038/sigtrans.2017.15に記載されているscFv配列である。scFv型の抗HER2抗体のアミノ酸配列を配列表の配列番号７に記載する。また、scFv型の抗HER2抗体とV2122とをアミノ酸リンカー(GGGGGSGGGGG)（配列番号１８）で結合したHER2-V2122の構造図を図１３、アミノ酸配列を配列表の配列番号８に示す。【００８５】
HER2-V2122融合タンパク質の発現のために、大腸菌にて分泌発現するためのpelBシグナルをN末端に、また6xHis-Tag配列をC末端に組み込んだHER2-V2122遺伝子配列のDNAコドンを大腸菌に最適化し人工遺伝子合成を行なった。このアミノ酸配列を配列表の配列番号９、DNA配列を配列表の配列番号１０に記載する。【００８６】
具体的なタンパク質発現ベクターは、pETDuet1ベクターのMCS2にシャペロンskp遺伝子が組み込まれたベクターを使用した。skp遺伝子は配列表の配列番号６に記載されたアミノ酸配列を元にコドンを大腸菌に最適化したDNAの人工遺伝子合成を行った。合成されたskp遺伝子はプライマー（AAGGAGATATACATATGGATAAAATTGCCATTGTTAATAT（配列番号１２）, TTGAGATCTGCCATATGTTATTTCACTTGTTTCAGAACG（配列番号１３））を使用しPCRで増幅し、制限酵素NdeIで直鎖化されたpETDue1ベクターのMCS2にIn-Fusion HD Cloning Kitをもちいてクローニングを行い pETDuet_skp とした。次に、 pETDuet_skp のMCS1にHER2-V2122遺伝子を組み込んだ。具体的には、人工合成されたHER2-V2122遺伝子をプライマー（AGAAGGAGATATACCATGAAATATCTGCTGCCGAC（配列番号１４）、CGCCGAGCTCGAATTTTAATGATGGTGATGATGATG（配列番号１５））を用いPCRにて増幅した。また、 pETDuet_skp をプライマー（GGTATATCTCCTTCTTAAAGTTAAAC（配列番号１６）、AATTCGAGCTCGGCGCGCCTGCAG（配列番号１７））を使用しPCRにて直鎖化した。PCRにより増幅された CEA-V2122と直鎖化された pETDuet_skp を In-Fusion HD Cloning Kit をもちいてクローニングを行った。クローニングされたベクターはシーケンスにより組み込まれた遺伝子配列の確認を行い pETDuet_HER-V2122_skp とした。【００８７】
タンパク質発現のために、pETDuet_HER2-V2122_skpをBL21(DE3)(ニッポン・ジーン社)に形質転換し 2xYT培地(SIGMA-ADLRICH社)、37°Cにて一晩、前培養を行った。前培養を行った培地を 新しい培地に100倍希釈になるように添加し、OD(600nm) = 0.5〜2.0になるまで37℃で培養を行った。次に最終濃度0.5mM IPTGを添加し37℃で4時間培養し培養上清を回収した後、4℃で保存した。【００８８】
HER2-V2122タンパク質は、C末端に付加されている6xHis-Tagを利用し バッチ法で粗精製を行った。具体的にはバッファーA(50mM TrisHCl, 0.2M NaCl, 1mM ED TA, 5mM Imidazole, pH8.0)で平衡化したcOmplete His-Tag Purification Resin を4℃で保存した培養上清へ添加し、2時間から一晩、4℃にて撹拌しレジンへのタンパク質結 合処理を行った。次にレジンをカラムに回収し、バッファーAで20カラム容量の洗浄作業 を行った。その後、バッファーB(50mM TrisHCl, 0.2M NaCl, 1mM EDTA, 400mM Imidazol e, pH8.0)で溶出しHER2-V2122の粗精製物の回収を行った。 【００８９】
次に、粗精製物についてProtein L カラムによる精製を行った。具体的にはCapto L (GEヘルスケア)1mLをPD-10カラムに充填し、10カラムボリュームのPBSで平衡化後、上述の粗精製物をアプライし、10カラムボリュームのPBSで洗浄後、10mM グリシン塩酸 pH2.0で溶出しVivaspin Turbo 15 (MWCO 100,000) による遠心濃縮を行なった。さらに PD-10（GEヘルスケア）を用いてPBSへバッファー置換を行い、さらに Vivaspin Turbo 4  (MWCO 100,000) による遠心濃縮を行い最終精製物とした。精製物についてCBB染色により４量体HER2-V2122の純度の検定を行なった結果を図１４に示す。SDS-PAGEゲルは Mini-PROTEAN TGX 4-15% (Bio-Rad社) を使用し CBB染色液はBullet CBB Stain One(Ready To Use) (ナカライテスク社）を使用した。
図１４より精製されたHER2-V2122は約150kDaの４量体を主たる成分であることが確認された。【００９０】
実施例７：HER2-V2122のSPRでの性能評価
HER2-V2122と抗原CEACAM5との親和性を表面プラズモン共鳴（SPR）測定装置：Biacore T200 (GE Healthcare Life Sciences社) を用いて実施した。具体的にはErbB2/Fcキメラ、ヒト、組換え体、キャリアフリー (R&D SYSTEMS、1129-ER-050) を Sensor Chip CM5 (GE Healthcare Life Sciences社) にアミンカップリングキット (GE Healthcare Life Sciences社) を用いて固定化操作を行い、リガンドの最終固定化量は279RUとなった。また、精製された HER2-V2122 は 1E-08 M から 6.25E-10 M までの２倍希釈系列をアナライトとして調整した。相互作用解析は Single-Cycle Kinetics 解析にてデータの取得を行った。得られたデータを Biacore T200 Evaluation Software, version 2.0 にて Bivalent Analyze モードによるカーブフィッティングを実施しka1=3.857E+5, kd1=1.710E-6の値を得た。また、Bivalent AnalyzeではKD＝kd1/ka1で評価できることからKD＝kd1/ka1=1.710E-6/3.857E+5=4.433E-12の評価値を得た。それらの結果を図１５に示す。
図１５に示されるセンサーグラムおよび計算されたKD値よりHER-V2122はErbB2を認識し強く結合することが確認された。【００９１】
また、HER2-V2122とビオチン改変体 (製造例１、化１１に示された化合物）との相互作用解析も Biacore T200 を用いて実施した。具体的には、 アミンカップリングキットを使用し、Sensor Chip CM5 に目標値 5000RUとなるように設定し、精製された HER2-V2122 の固定化を行なった。アナライトの濃度は 1E-08 M から 6.25E-10 M までの２倍希釈系列５種類を使用した。相互作用解析はSingle-Cycle Kinetics 解析にてデータの取得を行った。得られたデータを Biacore T200 Evaluation Software, version 2.0 にて Bivalent Analyze モードによるカーブフィッティングを実施し親和性の評価値を得た。それらの結果を図１６に示す。【００９２】
実施例８：HER2-V2122 と光活性化化合物標識ビオチン改変体を用いた in vitro 細胞傷害性試験
光活性化化合物標識ビオチン改変体、コンパウンド１、コンパウンド２およびコンパウンド３を用いて細胞傷害性試験を実施した。これらのコンパウンドは出願番号：特願2018-149295 に記載されている化合物である。コンパウンド１、コンパウンド２およびコンパウンド３を図７に示す。具体的には 10% FBSを含むMcCoy’s 培地にて培養したSK-BR-3細胞を細胞培養用96ウェルプレートに細胞数が 5.0x103 cells/well、培養液が 50 μL/well となるように播種し一晩培養した。CEA-V2122と光活性化化合物標識ビオチン改変体の複合体溶液は、CEA-V2122と各コンパウンドとのモル比が1:2となるように混合し室温で10分間インキュベーションをおこない、HER2-V2122の最終濃度10μg/mLとなるように培養液で濃度調製を行なった。希釈系列は20 μg/mLを開始濃度とし、4倍希釈系列を４系列（5.0 μg/mL, 1.25 μg/mL, 0.312 μg/mL, 0.078μg/mL）を５系列の複合体希釈系列液とした。また、複合体を含まない培地のみをゼロコントロールとした。【００９３】
一晩培養した細胞に複合体希釈系列液を最終濃度（10 μg/mL, 2.5 μg/mL, 0.625 μg/mL, 0.156 μg/mL, 0.039 μg/mL）となるように 50 μL/well づつ各 well 添加した。複合体添加、1時間後、2時間後に 690 ± 10 nm の波長の光を出すLEDを用いて、100 J/cm2 となるように細胞に光を照射した。その後、48時間培養し Cell Counting Kit-8 (同仁化学社) を用いて生細胞数の比較を行なった。各条件は n=3 とした。用法用量は取扱説明書に従い試薬添加1時間半37℃、CO2 インキュベーターでインキュベーションしたのち、吸光度450nmを測定し、平均値を計算しバックグラウンド補正後、コントロールを100％として各条件のコントロールに対する細胞増殖の割合を計算した。その結果を図１７に示す。
図１７の結果より、HER2-Cupidと光活性化化合物標識ビオチン改変体との複合体は濃度依存的に細胞傷害性を有することが確認された。【００９４】
配列番号１
AEAGITGTWSDQLGDTFIVTAGADGALTGTYENAVGGAESRYVLTGRYDSAPATDGSGTALGWTVAWKNNSKNAHSATTWSGQYVGGADAKINTQWLLTSGTTNANAWKSTLVGHDTFTKVKPSAASHHHHHH【００９５】
配列番号２(sm3E-scFv配列)
QVKLEQSGAEVVKPGASVKLSCKASGFNIKDSYMHWLRQGPGQRLEWIGWIDPENGDTEYAPKFQGKATFTTDTSANTAYLGLSSLRPEDTAVYYCNEGTPTGPYYFDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSENVLTQSPSSMSVSVGDRVNIACSASSSVPYMHWLQQKPGKSPKLLIYLTSNLASGVPSRFSGSGSGTDYSLTISSVQPEDAATYYCQQRSSYPLTFGGGTKLEIK【００９６】
配列番号３
QVKLEQSGAEVVKPGASVKLSCKASGFNIKDSYMHWLRQGPGQRLEWIGWIDPENGDTEYAPKFQGKATFTTDTSANTAYLGLSSLRPEDTAVYYCNEGTPTGPYYFDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSENVLTQSPSSMSVSVGDRVNIACSASSSVPYMHWLQQKPGKSPKLLIYLTSNLASGVPSRFSGSGSGTDYSLTISSVQPEDAATYYCQQRSSYPLTFGGGTKLEIKGGGGSGGGGAEAGITGTWSDQLGDTFIVTAGADGALTGTYENAVGGAESRYVLTGRYDSAPATDGSGTALGWTVAWKNNSKNAHSATTWSGQYVGGADAKINTQWLLTSGTTNANAWKSTLVGHDTFTKVKPSAASHHHHHH【００９７】
配列番号４
MKYLLPTAAAGLLLLAAQPAMAQVKLEQSGAEVVKPGASVKLSCKASGFNIKDSYMHWLRQGPGQRLEWIGWIDPENGDTEYAPKFQGKATFTTDTSANTAYLGLSSLRPEDTAVYYCNEGTPTGPYYFDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSENVLTQSPSSMSVSVGDRVNIACSASSSVPYMHWLQQKPGKSPKLLIYLTSNLASGVPSRFSGSGSGTDYSLTISSVQPEDAATYYCQQRSSYPLTFGGGTKLEIKGGGGSGGGGAEAGITGTWSDQLGDTFIVTAGADGALTGTYENAVGGAESRYVLTGRYDSAPATDGSGTALGWTVAWKNNSKNAHSATTWSGQYVGGADAKINTQWLLTSGTTNANAWKSTLVGHDTFTKVKPSAASHHHHHH【００９８】
配列番号５
ATGAAATATCTGCTGCCGACCGCAGCAGCGGGTCTGCTGCTGCTGGCAGCACAGCCTGCAATGGCACAGGTTAAACTGGAACAGAGCGGTGCCGAAGTTGTTAAACCGGGTGCAAGCGTTAAACTGAGCTGTAAAGCAAGCGGCTTTAACATCAAAGATAGCTATATGCATTGGCTGCGTCAGGGTCCGGGTCAGCGTCTGGAATGGATTGGTTGGATTGATCCGGAAAATGGTGATACCGAATATGCACCGAAATTTCAGGGTAAAGCAACCTTTACCACCGATACCAGCGCAAATACCGCATATCTGGGTCTGAGCAGCCTGCGTCCGGAAGATACCGCAGTGTATTATTGTAATGAAGGCACCCCGACCGGTCCGTATTATTTCGATTATTGGGGTCAGGGCACCCTGGTTACCGTTAGCAGCGGTGGTGGTGGTAGTGGTGGCGGTGGTTCAGGCGGTGGCGGTAGCGAAAATGTTCTGACCCAGAGCCCGAGCAGCATGAGCGTTAGCGTTGGTGATCGTGTTAATATTGCATGTAGCGCAAGCAGCAGCGTTCCGTACATGCACTGGCTGCAGCAGAAACCGGGTAAAAGCCCGAAACTGCTGATTTATCTGACCAGCAATCTGGCAAGCGGTGTTCCGAGCCGTTTTAGCGGTAGCGGTAGTGGCACCGATTATAGCCTGACCATTAGCAGCGTGCAGCCTGAAGATGCAGCAACCTATTATTGTCAGCAGCGTAGCAGTTATCCGCTGACCTTTGGTGGTGGCACCAAACTGGAAATTAAAGGGGGTGGTGGCTCAGGTGGCGGAGGTGCAGAAGCAGGTATTACCGGTACATGGTCAGATCAGCTGGGTGATACCTTTATTGTTACCGCAGGCGCAGATGGTGCACTGACCGGCACCTATGAAAATGCAGTTGGTGGTGCAGAAAGCCGTTATGTGCTGACCGGTCGTTATGATAGCGCACCGGCAACCGATGGTAGCGGCACCGCACTGGGTTGGACCGTTGCATGGAAAAATAACAGCAAAAATGCACATAGCGCAACCACCTGGTCAGGTCAGTATGTGGGTGGTGCCGATGCCAAAATTAACACCCAGTGGCTGCTGACCAGCGGTACAACCAATGCAAATGCCTGGAAAAGTACCCTGGTTGGTCATGATACATTCACCAAAGTTAAACCGAGCGCAGCAAGCCATCATCATCACCATCATTAA【００９９】
配列番号６
MDKIAIVNMGSLFQQVAQKTGVSNTLENEFKGRASELQRMETDLQAKMKKLQSMKAGSDRTKLEKDVMAQRQTFAQKAQAFEQDRARRSNEERGKLVTRIQTAVKSVANSQDIDLVVDANAVAYNSSDVKDITADVLKQVK【０１００】
配列番号７
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNIKDTYIHWVRQAPGKGLEWVARIYPTNGYTRYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCSRWGGDGFYAMDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVNTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFSGSRSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQHYTTPPTFGQGTKVEIK【０１０１】
配列番号８
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNIKDTYIHWVRQAPGKGLEWVARIYPTNGYTRYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCSRWGGDGFYAMDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVNTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFSGSRSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQHYTTPPTFGQGTKVEIKGGGGGSGGGGGAEAGITGTWSDQLGDTFIVTAGADGALTGTYENAVGGAESRYVLTGRYDSAPATDGSGTALGWTVAWKNNSKNAHSATTWSGQYVGGADAKINTQWLLTSGTTNANAWKSTLVGHDTFTKVKPSAASHHHHHH【０１０２】
配列番号９
MKYLLPTAAAGLLLLAAQPAMAEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNIKDTYIHWVRQAPGKGLEWVARIYPTNGYTRYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCSRWGGDGFYAMDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVNTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFSGSRSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQHYTTPPTFGQGTKVEIKGGGGGSGGGGGAEAGITGTWSDQLGDTFIVTAGADGALTGTYENAVGGAESRYVLTGRYDSAPATDGSGTALGWTVAWKNNSKNAHSATTWSGQYVGGADAKINTQWLLTSGTTNANAWKSTLVGHDTFTKVKPSAASHHHHHH【０１０３】
配列番号１０
ATGAAATATCTGCTGCCGACCGCAGCAGCGGGTCTGCTGCTGCTGGCAGCACAGCCTGCAATGGCAGAAGTTCAGCTGGTTGAAAGCGGTGGTGGTCTGGTTCAGCCTGGTGGTAGCCTGCGTCTGAGCTGTGCAGCAAGCGGTTTTAACATTAAAGATACCTATATTCATTGGGTGCGTCAGGCACCTGGTAAAGGTCTGGAATGGGTTGCACGTATTTATCCGACCAATGGTTATACCCGTTATGCCGATAGCGTTAAAGGTCGTTTTACCATTAGCGCAGATACCAGCAAAAATACCGCATACCTGCAGATGAATAGTCTGCGTGCAGAGGATACCGCAGTGTATTATTGTAGCCGTTGGGGTGGTGATGGTTTTTATGCAATGGATTATTGGGGTCAGGGCACCCTGGTTACCGTTAGCTCAGGTGGAGGCGGTTCCGGTGGCGGAGGTTCCGGTGGAGGTGGCTCCGGTGGCGGAGGTTCCGATATTCAGATGACCCAGAGTCCGAGCAGCCTGAGCGCAAGCGTTGGTGATCGTGTGACCATTACCTGTCGTGCAAGCCAGGATGTTAATACAGCAGTTGCATGGTATCAGCAGAAACCGGGTAAAGCACCGAAACTGCTGATTTATAGCGCAAGCTTTCTGTATAGCGGTGTTCCGAGCCGTTTTAGCGGTAGCCGTAGCGGCACCGATTTTACCCTGACCATTAGCAGCCTGCAGCCGGAAGATTTTGCAACCTATTATTGTCAGCAGCATTACACCACACCGCCTACCTTTGGCCAGGGCACCAAAGTTGAAATTAAAGGAGGTGGCGGTGGATCCGGCGGAGGTGGCGGAGCAGAAGCAGGTATTACCGGTACATGGTCAGATCAGCTGGGTGATACCTTTATTGTTACCGCAGGCGCAGATGGTGCACTGACCGGCACCTATGAAAATGCAGTTGGTGGTGCAGAAAGCCGTTATGTGCTGACCGGTCGTTATGATAGCGCACCGGCAACCGATGGTAGCGGCACCGCACTGGGTTGGACCGTTGCATGGAAAAATAACAGCAAAAATGCACATAGCGCAACCACCTGGTCAGGTCAGTATGTGGGTGGTGCCGATGCCAAAATTAACACCCAGTGGCTGCTGACCAGCGGTACAACCAATGCAAATGCCTGGAAAAGTACCCTGGTTGGTCATGATACATTCACCAAAGTTAAACCGAGCGCAGCAAGCCATCATCATCACCATCATTAA
【図１】
2020138427.tif 000016
【図２】
2020138427.tif 000017
【図３】
2020138427.tif 000018
【図４】
2020138427.tif 000019
【図５】
2020138427.tif 000020
【図６】
2020138427.tif 000021
【図７】
2020138427.tif 000022
【図８】
2020138427.tif 000023
【図９】
2020138427.tif 000024
【図１０】
2020138427.tif 000025
【図１１】
2020138427.tif 000026
【図１２】
2020138427.tif 000027
【図１３】
2020138427.tif 000028
【図１４】
2020138427.tif 000029
【図１５】
2020138427.tif 000030
【図１６】
2020138427.tif 000031
【図１７】
2020138427.tif 000032
【配列表】
2020138427000001.app
【国際調査報告】
2020138427.tif 000033
2020138427.tif 000034
2020138427.tif 000035
2020138427.tif 000036
2020138427.tif 000037
2020138427.tif 000038
2020138427.tif 000039
2020138427.tif 000040
2020138427.tif 000041
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