(57)【要約】本発明は、細胞内、特に哺乳類の生細胞内でｍＲＮＡの可視化が可能な蛍光発生ＲＮＡ、及びこれを利用する標的ＲＮＡの蛍光標識方法を提供する。本発明は、２以上の蛍光分子結合領域がリンカー配列を介して連結されている塩基配列を含み、前記蛍光分子結合領域は、足場配列中に１以上の蛍光分子結合アプタマー配列が挿入されていることを特徴とする、蛍光発生核酸分子を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
２以上の蛍光分子結合領域がリンカー配列を介して連結されている塩基配列を含み、
前記蛍光分子結合領域は、足場配列中に１以上の蛍光分子結合アプタマー配列が挿入されていることを特徴とする、蛍光発生核酸分子。
【請求項２】
前記リンカー配列の長さが２０塩基以上である、請求項１に記載の蛍光発生核酸分子。
【請求項３】
前記リンカー配列が、特定の立体構造を形成していない、請求項１又は２に記載の蛍光発生核酸分子。
【請求項４】
前記蛍光分子結合領域は、前記足場配列中に２以上の前記蛍光分子結合アプタマー配列が挿入されている、請求項１〜３のいずれか一項に記載の蛍光発生核酸分子。
【請求項５】
前記蛍光分子結合領域が、２以上のループ構造を含有するステム・ループ構造を形成する１本鎖核酸分子のうちの少なくとも２の前記ループ構造が、前記蛍光分子結合アプタマー配列に置換されている構造からなる、請求項４に記載の蛍光発生核酸分子。
【請求項６】
前記蛍光分子結合アプタマー配列が、Ｇ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ構造で挟まれているステム・ループ構造を形成する１本鎖核酸分子の塩基配列を含有しており、
前記ステム・ループ構造が、４〜６塩基のステム構造と４塩基のループ構造からなる、請求項１〜５のいずれか一項に記載の蛍光発生核酸分子。
【請求項７】
前記蛍光分子結合アプタマー配列が、Ｂｒｏｃｃｏｌｉ、Ｂｒｏｃｃｏｌｉ３、又はｄＢｒｏｃｃｏｌｉである、請求項１〜６のいずれか一項に記載の蛍光発生核酸分子。
【請求項８】
前記蛍光分子結合領域が、配列番号１６又は１７で表される塩基配列からなる、請求項１〜５のいずれか一項に記載の蛍光発生核酸分子。
【請求項９】
前記リンカー配列が、配列番号１８〜２０のいずれかで表される塩基配列からなる、請求項１〜８のいずれか一項に記載の蛍光発生核酸分子。
【請求項１０】
前記蛍光分子結合アプタマー配列を４以上含有する、請求項１〜９のいずれか一項に記載の蛍光発生核酸分子。
【請求項１１】
前記蛍光分子結合アプタマー配列が結合する蛍光分子が、ＤＦＨＢＩファミリーの蛍光分子である、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の蛍光発生核酸分子。
【請求項１２】
標的ＲＮＡを蛍光標識する方法であって、
標的ＲＮＡに、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の蛍光発生核酸分子を直接又は間接的に連結させた後、前記蛍光発生核酸分子中の前記蛍光分子結合アプタマー配列が結合する蛍光分子と接触させる、標的ＲＮＡの蛍光標識方法。
【請求項１３】
前記標的ＲＮＡが、標的遺伝子の転写産物であり、
前記標的遺伝子の３’非翻訳領域に、前記蛍光発生核酸分子をコードする塩基配列を組み込んだ細胞の細胞内に、前記蛍光発生核酸分子中の前記蛍光分子結合アプタマー配列が結合する蛍光分子を導入し、前記標的遺伝子の転写産物と前記蛍光分子とを結合させる、請求項１２に記載の標的ＲＮＡの蛍光標識方法。
【請求項１４】
標的ＲＮＡを蛍光標識する方法であって、
標的ＲＮＡを含有する試料に、前記標的ＲＮＡの一部分とハイブリダイズするプローブを請求項１〜１１のいずれか一項に記載の蛍光発生核酸分子に直接又は間接的に連結させた核酸分子と、前記核酸分子中の前記蛍光分子結合アプタマー配列が結合する蛍光分子とを混合する、標的ＲＮＡの蛍光標識方法。
【請求項１５】
外来遺伝子の発現を制御するプロモーターと、
前記プロモーターの下流にあり、前記外来遺伝子のコーディング領域を挿入するための制限酵素部位と、
前記制限酵素部位の下流に３’非翻訳領域と、を有しており、
前記３’非翻訳領域が、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の蛍光発生核酸分子をコードする塩基配列を含む、ベクター。
【請求項１６】
足場配列中に１以上の蛍光分子結合アプタマー配列が挿入されている蛍光分子結合領域が２以上、リンカー配列を介して連結されている塩基配列を含む蛍光発生核酸分子における前記リンカー配列を設計する方法であって、
１の前記蛍光分子結合領域の上流及び下流に候補リンカー配列を連結したＲＮＡ配列を評価用ＲＮＡ配列とし、
前記評価用ＲＮＡ配列中の前記蛍光分子結合領域の立体構造の予測結果が、前記蛍光分子結合領域のみからなるＲＮＡ配列の立体構造の予測結果と同一であり、かつ、前記候補リンカー配列部分が立体構造をとらないと予測されるように、前記リンカー配列を設計する、リンカー配列の設計方法。
【請求項１７】
前記候補リンカー配列が、制限酵素部位にランダムなＲＮＡ配列が付加された配列である、請求項１６に記載のリンカー配列の設計方法。
【請求項１８】
前記候補リンカー配列の長さが、２０塩基以上８０塩基以下である、請求項１６又は１７に記載のリンカー配列の設計方法。
【請求項１９】
請求項１１に記載の蛍光発生核酸分子に、ＤＦＨＢＩファミリーの蛍光分子を結合させた後、前記ＤＦＨＢＩファミリーの蛍光分子の励起光を一定時間連続照射し、照射開始時点の蛍光シグナルの輝度値から照射終了時点の蛍光シグナルの輝度値を差し引いた輝度値を、前記蛍光発生核酸分子と結合している前記ＤＦＨＢＩファミリーの蛍光分子から発される蛍光シグナルとして検出する、蛍光発生核酸分子と結合している蛍光分子から発される蛍光シグナルの検出方法。
【請求項２０】
前記ＤＦＨＢＩファミリーの蛍光分子と結合した前記蛍光発生核酸分子に、前記励起光を、一定時間連続照射した後に一定時間照射を中断する照射サイクルで、複数回繰り返し照射し、
前記照射サイクルごとに、連続照射時の照射開始時点の蛍光シグナルと照射終了時点の蛍光シグナルを検出し、
全照射サイクルで検出された連続照射時の照射開始時点の蛍光シグナルの輝度値を平均化し、
全照射サイクルで検出された連続照射時の照射終了時点の蛍光シグナルの輝度値を平均化し、
平均化された照射開始時点の蛍光シグナルの輝度値から、平均化された照射終了時点の蛍光シグナルの輝度値を差し引いたものを、前記蛍光発生核酸分子と結合した前記ＤＦＨＢＩファミリーの蛍光分子の蛍光シグナルとして検出する、請求項１９に記載の蛍光発生核酸分子と結合している蛍光分子から発される蛍光シグナルの検出方法。
【請求項２１】
請求項１〜１１のいずれか一項に記載の蛍光発生核酸分子と、前記蛍光発生核酸分子中の前記蛍光分子結合アプタマー配列と結合する蛍光分子との結合を阻害する物質をスクリーニングする方法であって、
前記蛍光発生核酸分子と前記蛍光分子とが存在している反応系に、阻害物質の候補物質を共存させて、前記蛍光分子が発する蛍光シグナルを測定し、得られた輝度値が、前記候補物質非存在下において前記蛍光発生核酸分子と結合した前記蛍光分子が発する蛍光シグナルの輝度値よりも小さい場合に、前記候補物質を、前記阻害物質として選抜する、スクリーニング方法。
【請求項２２】
前記蛍光発生核酸分子中の蛍光分子結合アプタマー配列が、Ｇ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ構造で挟まれているステム・ループ構造を形成する１本鎖核酸分子の塩基配列であり、
前記蛍光分子がＤＦＨＢＩファミリーの蛍光分子であり、
前記阻害物質が、Ｇ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ構造をほどき戻す活性を有している、請求項２１に記載のスクリーニング方法。
【請求項２３】
前記蛍光発生核酸分子と前記候補タンパク質を共発現させた細胞に、前記蛍光分子を導入して蛍光シグナルを測定し、得られた輝度値が、前記蛍光発生核酸分子のみを発現させた細胞に前記蛍光分子を導入して得られた蛍光シグナルよりも小さい場合に、前記候補タンパク質を、Ｇ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ構造をほどき戻す活性を有する物質として選抜する、請求項２２に記載のスクリーニング方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＲＮＡを蛍光標識するための蛍光発生核酸分子、及び当該蛍光発生核酸分子を用いて標的ＲＮＡを蛍光標識する方法に関する。
本願は、２０１８年１２月３日に、日本に出願された特願２０１８−２２６７４３号に基づき優先権を主張し、その内容をここに援用する。
【背景技術】
【０００２】
遺伝子発現がｍＲＮＡレベルでどのように制御されるかをよりよく理解するために、生細胞のｍＲＮＡの時空間動態を視覚化する方法の確立が強く求められている。生細胞内のｍＲＮＡの可視化に一般的に用いられている方法は、標的のｍＲＮＡを、ＭＳ２又はＰＰ７１３等のＲＮＡステム・ループのタグを付加して、蛍光分子と融合したタンパク質をリクルートする方法である。当該技術は、細胞質内におけるｍＲＮＡの動きを追跡したり（例えば、非特許文献１参照。）、核内で新生されたｍＲＮＡを可視化するために（例えば、非特許文献２参照。）、適用されている。しかし、タグを付加したｍＲＮＡについて、細胞内のｍＲＮＡ分布のダイナミクスを可視化したり、発現レベルを測定する際に、しばしば、未結合の蛍光タンパク質の高いバックグラウンドが、結果の解釈を難しくする。【０００３】
生細胞内のｍＲＮＡを視覚化する方法として、特定の標的分子に塩基配列依存的に結合するＲＮＡアプタマーを用いる方法が候補として挙げられている。ある種のＲＮＡアプタマーは、蛍光性の低分子化合物と結合することによってその蛍光を増強することができる（例えば、非特許文献３及び４参照。）。このようなＲＮＡアプタマーは、蛍光発生ＲＮＡ（fluorogenic RNA）ともいわれている。蛍光発生ＲＮＡとしては、例えば、ＧＦＰ（Green fluorescent protein）の蛍光団の類似体であるＤＦＨＢＩ（3,5-ジフルオロ-4-ヒドロキシベンジリデンイミダゾリノン）ファミリーの低分子の蛍光分子と結合するSpinachやBroccoli、及びこれらの誘導体がある（例えば、非特許文献５、特許文献１参照。）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】米国特許第９，６６４，６７６号明細書
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Wu et al., Science 2016, vol.352, p.1430-1435.
【非特許文献２】Tyagi, Nature Methods, 2009, vol.6, p.331-338.
【非特許文献３】Paige et al., Science, 2011, vol.333, p.642-646.
【非特許文献４】Filonov et al., Journal of the American Chemical Society, 2014, vol.136, p.16299-16308.
【非特許文献５】Filonov et al., Current Protocols in Chemical Biology, 2017, vol.8(1), p.1-28.
【非特許文献６】Ketterer et al., Nucleic Acids Research, 2015, vol.43, p.9564-9572.
【非特許文献７】Autour et al., Nucleic Acids Research, 2016, vol.44, p.2491-2500.
【非特許文献８】Zou et al., Journal of Molecular Evolution, 2015, vol.81, p.172-178.
【非特許文献９】Ageely et al., ACS Chemical Biology, 2016, vol.11, p.2398-2406.
【非特許文献１０】Filonov et al., Chemistry & Biology, 2015, vol.22, p.649-660.
【非特許文献１１】Filonov et al., Nature Biotechnology, 2011, vol.29, p.757-761.
【非特許文献１２】Takai, et al. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 2015, vol.112, p.4352-4356.
【非特許文献１３】Zuker, Nucleic Acids Research, 2003, Vol. 31, No. 13, p.3406-3415.
【非特許文献１４】Terai et al., Cell structure and Function, 2019, Vol. 44, p.153-169.
【非特許文献１５】Algar et al., Nature Methods, 2019, Vol. 16, p. 815-829.
【非特許文献１６】Jepsen et al., NATURE COMMUNICATIONS, 2018, Vol. 9, Article number 18.
【非特許文献１７】Han et al., Journal of the American Chemical Society, 2013, Vol. 135, p.19033-19038.
【非特許文献１８】Trachman et al., Trends inPharmacologicalSciences, 2017, vol. 38(10), p.928-939.
【非特許文献１９】Guo and Bartel, Science, vol. 353(6306), p.1382.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
理論的には、標的ｍＲＮＡに蛍光発生ＲＮＡのタグを付加することによって、生細胞内の標的ｍＲＮＡを可視化し、定量することができる。しかしながら、既存の蛍光発生ＲＮＡはいずれも、蛍光強度が小さく、細胞内のｍＲＮＡ動態を視覚化することに成功していない。【０００７】
本発明は、細胞内、特に哺乳類の生細胞内でｍＲＮＡの可視化が可能な蛍光発生ＲＮＡ、及びこれを利用する標的ＲＮＡの蛍光標識方法を提供することを主たる目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは鋭意研究した結果、足場ＲＮＡに埋め込んだ状態の蛍光発生ＲＮＡを、リンカー配列を介してタンデムに複数連結した核酸分子とすることにより、蛍光分子と結合した場合に発生する蛍光の強度を顕著に増強できること、当該核酸分子で標的ＲＮＡを標識することにより、生細胞内の標的ＲＮＡを可視化することが可能であることを見出し、本発明を完成させた。【０００９】
すなわち、本発明に係る蛍光発生核酸分子、標的ＲＮＡの蛍光標識方法、ベクター、リンカー配列の設計方法、蛍光シグナルの検出方法、及びスクリーニング方法は、下記［１］〜［２３］である。
［１］  ２以上の蛍光分子結合領域がリンカー配列を介して連結されている塩基配列を含み、
前記蛍光分子結合領域は、足場配列中に１以上の蛍光分子結合アプタマー配列が挿入されていることを特徴とする、蛍光発生核酸分子。
［２］  前記リンカー配列の長さが２０塩基以上である、前記［１］の蛍光発生核酸分子。
［３］  前記リンカー配列が、特定の立体構造を形成していない、前記［１］又は［２］の蛍光発生核酸分子。
［４］  前記蛍光分子結合領域は、前記足場配列中に２以上の前記蛍光分子結合アプタマー配列が挿入されている、前記［３］の蛍光発生核酸分子。
［５］  前記蛍光分子結合領域が、２以上のループ構造を含有するステム・ループ構造を形成する１本鎖核酸分子のうちの少なくとも２の前記ループ構造が、前記蛍光分子結合アプタマー配列に置換されている構造からなる、前記［４］の蛍光発生核酸分子。
［６］  前記蛍光分子結合アプタマー配列が、Ｇ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ構造で挟まれているステム・ループ構造を形成する１本鎖核酸分子の塩基配列を含有しており、
前記ステム・ループ構造が、４〜６塩基のステム構造と４塩基のループ構造からなる、前記［１］〜［５］のいずれかの蛍光発生核酸分子。
［７］  前記蛍光分子結合アプタマー配列が、Ｂｒｏｃｃｏｌｉ、Ｂｒｏｃｃｏｌｉ３、又はｄＢｒｏｃｃｏｌｉである、前記［１］〜［５］のいずれかの蛍光発生核酸分子。
［８］  前記蛍光分子結合領域が、配列番号１６又は１７で表される塩基配列からなる、前記［１］〜［５］のいずれかの蛍光発生核酸分子。
［９］  前記リンカー配列が、配列番号１８〜２０のいずれかで表される塩基配列からなる、前記［１］〜［８］のいずれかの蛍光発生核酸分子。
［１０］  前記蛍光分子結合アプタマー配列を４以上含有する、前記［１］〜［９］のいずれかの蛍光発生核酸分子。
［１１］  前記蛍光分子結合アプタマー配列が結合する蛍光分子が、ＤＦＨＢＩファミリーの蛍光分子である、前記［１］〜［１０］のいずれかの蛍光発生核酸分子。
［１２］  標的ＲＮＡを蛍光標識する方法であって、
標的ＲＮＡに、前記［１］〜［１１］のいずれかの蛍光発生核酸分子を直接又は間接的に連結させた後、前記蛍光発生核酸分子中の前記蛍光分子結合アプタマー配列が結合する蛍光分子と接触させる、標的ＲＮＡの蛍光標識方法。
［１３］  前記標的ＲＮＡが、標的遺伝子の転写産物であり、
前記標的遺伝子の３’非翻訳領域に、前記蛍光発生核酸分子をコードする塩基配列を組み込んだ細胞の細胞内に、前記蛍光発生核酸分子中の前記蛍光分子結合アプタマー配列が結合する蛍光分子を導入し、前記標的遺伝子の転写産物と前記蛍光分子とを結合させる、前記［１２］の標的ＲＮＡの蛍光標識方法。
［１４］  標的ＲＮＡを蛍光標識する方法であって、
標的ＲＮＡを含有する試料に、前記標的ＲＮＡの一部分とハイブリダイズするプローブを前記［１］〜［１１］のいずれかの蛍光発生核酸分子に直接又は間接的に連結させた核酸分子と、前記核酸分子中の前記蛍光分子結合アプタマー配列が結合する蛍光分子とを混合する、標的ＲＮＡの蛍光標識方法。
［１５］  外来遺伝子の発現を制御するプロモーターと、
前記プロモーターの下流にあり、前記外来遺伝子のコーディング領域を挿入するための制限酵素部位と、
前記制限酵素部位の下流に３’非翻訳領域と、を有しており、
前記３’非翻訳領域が、前記［１］〜［１１］のいずれかの蛍光発生核酸分子をコードする塩基配列を含む、ベクター。
［１６］  足場配列中に１以上の蛍光分子結合アプタマー配列が挿入されている蛍光分子結合領域が２以上、リンカー配列を介して連結されている塩基配列を含む蛍光発生核酸分子における前記リンカー配列を設計する方法であって、
１の前記蛍光分子結合領域の上流及び下流に候補リンカー配列を連結したＲＮＡ配列を評価用ＲＮＡ配列とし、
前記評価用ＲＮＡ配列中の前記蛍光分子結合領域の立体構造の予測結果が、前記蛍光分子結合領域のみからなるＲＮＡ配列の立体構造の予測結果と同一であり、かつ、前記候補リンカー配列部分が立体構造をとらないと予測されるように、前記リンカー配列を設計する、リンカー配列の設計方法。
［１７］  前記候補リンカー配列が、制限酵素部位にランダムなＲＮＡ配列が付加された配列である、前記［１６］のリンカー配列の設計方法。
［１８］  前記候補リンカー配列の長さが、２０塩基以上８０塩基以下である、前記［１６］又は［１７］のリンカー配列の設計方法。
［１９］  前記［１１］の蛍光発生核酸分子に、ＤＦＨＢＩファミリーの蛍光分子を結合させた後、前記ＤＦＨＢＩファミリーの蛍光分子の励起光を一定時間連続照射し、照射開始時点の蛍光シグナルの輝度値から照射終了時点の蛍光シグナルの輝度値を差し引いた輝度値を、前記蛍光発生核酸分子と結合している前記ＤＦＨＢＩファミリーの蛍光分子から発される蛍光シグナルとして検出する、蛍光発生核酸分子と結合している蛍光分子から発される蛍光シグナルの検出方法。
［２０］  前記ＤＦＨＢＩファミリーの蛍光分子と結合した前記蛍光発生核酸分子に、前記励起光を、一定時間連続照射した後に一定時間照射を中断する照射サイクルで、複数回繰り返し照射し、
前記照射サイクルごとに、連続照射時の照射開始時点の蛍光シグナルと照射終了時点の蛍光シグナルを検出し、
全照射サイクルで検出された連続照射時の照射開始時点の蛍光シグナルの輝度値を平均化し、
全照射サイクルで検出された連続照射時の照射終了時点の蛍光シグナルの輝度値を平均化し、
平均化された照射開始時点の蛍光シグナルの輝度値から、平均化された照射終了時点の蛍光シグナルの輝度値を差し引いたものを、前記蛍光発生核酸分子と結合した前記ＤＦＨＢＩファミリーの蛍光分子の蛍光シグナルとして検出する、前記［１９］の蛍光発生核酸分子と結合している蛍光分子から発される蛍光シグナルの検出方法。
［２１］  前記［１］〜［１１］のいずれかの蛍光発生核酸分子と、前記蛍光発生核酸分子中の前記蛍光分子結合アプタマー配列と結合する蛍光分子との結合を阻害する物質をスクリーニングする方法であって、
前記蛍光発生核酸分子と前記蛍光分子とが存在している反応系に、阻害物質の候補物質を共存させて、前記蛍光分子が発する蛍光シグナルを測定し、得られた輝度値が、前記候補物質非存在下において前記蛍光発生核酸分子と結合した前記蛍光分子が発する蛍光シグナルの輝度値よりも小さい場合に、前記候補物質を、前記阻害物質として選抜する、スクリーニング方法。
［２２］  前記蛍光発生核酸分子中の蛍光分子結合アプタマー配列が、Ｇ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ構造で挟まれているステム・ループ構造を形成する１本鎖核酸分子の塩基配列であり、
前記蛍光分子がＤＦＨＢＩファミリーの蛍光分子であり、
前記阻害物質が、Ｇ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ構造をほどき戻す活性を有している、前記［２１］のスクリーニング方法。
［２３］  前記蛍光発生核酸分子と前記候補タンパク質を共発現させた細胞に、前記蛍光分子を導入して蛍光シグナルを測定し、得られた輝度値が、前記蛍光発生核酸分子のみを発現させた細胞に前記蛍光分子を導入して得られた蛍光シグナルよりも小さい場合に、前記候補タンパク質を、Ｇ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ構造をほどき戻す活性を有する物質として選抜する、前記［２２］のスクリーニング方法。
【発明の効果】
【００１０】
本発明に係る蛍光発生核酸分子は、足場配列中に１以上の蛍光分子結合アプタマー配列が挿入されている蛍光分子結合領域をタンデムに連結しており、連結する蛍光分子結合領域の数依存的に、対となる蛍光分子と結合した際に発生する蛍光の強度を強くすることができる。このため、本発明に係る蛍光発生核酸分子のうち、充分な数の蛍光分子結合領域を連結させた蛍光発生核酸分子は、生細胞中のｍＲＮＡの可視化ツールとして有用である。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】ＤＦＨＢＩファミリーの蛍光分子と対になる蛍光分子結合アプタマー配列の模式図である。
【図２】実施例１において、候補ＲＮＡ（ＲＮＡ＃１〜＃１７）を発現させた細胞の、ＤＦＨＢＩ−１Ｔ蛍光強度をＮＬＳ−ｉＲＦＰ蛍光強度で除して得た正規化蛍光強度を、さらにＲＮＡ＃１（Ｓｐｉｎａｃｈ）を発現させた細胞の平均正規化蛍光強度で除して得られた相対蛍光強度を示した図である。
【図３】実施例１において、候補ＲＮＡ（ＲＮＡ＃１４、＃１８、＃１９）を発現させた細胞の、ＤＦＨＢＩ−１Ｔ蛍光強度をＮＬＳ−ｉＲＦＰ蛍光強度で除して得た正規化蛍光強度を、さらにＲＮＡ＃１（Ｓｐｉｎａｃｈ）を発現させた細胞の平均正規化蛍光強度で除して得られた相対蛍光強度を示した図である。
【図４】実施例２において、Ｄｏｘ処理後における、Ｒｏｍａｎｅｓｃｏ及びＮＬＳ−ｉＲＦＰの蛍光の定量結果と、Ｒｏｍａｎｅｓｃｏが付加されたＮＬＳ−ｉＲＦＰのｍＲＮＡの発現量の定量結果と、を示した図である。
【図５】実施例２において、ＡｃｔＤ処理後における、Ｒｏｍａｎｅｓｃｏ及びＮＬＳ−ｉＲＦＰの蛍光の定量結果と、Ｒｏｍａｎｅｓｃｏが付加されたＮＬＳ−ｉＲＦＰのｍＲＮＡの発現量の定量結果と、を示した図である。
【図６】実施例２において、ｍＲＮＡコピー数とＲｏｍａｎｅｓｃｏシグナルとの間の直線性の単一細胞分析の結果を示した図である。
【図７】実施例２において、各細胞の落射蛍光顕微鏡法により得られた蛍光シグナルと、時間ゲートＦＬＩＭにより得られた蛍光シグナルの結果を示した図である。
【図８】実施例３において、Ｄｏｘ及びＤＦＨＢＩ−１Ｔ存在下で培養したＲｏｍａｎｅｓｃｏ発現細胞の発光状態の蛍光画像（Ａ）、及び発光状態の蛍光画像から非発光状態の蛍光画像を差し引いたＤＦＨＢＩ−１Ｔ蛍光画像（Ｂ）である。
【図９】実施例４において、候補タンパク質Ａ〜Ｃをそれぞれ過剰発現させたＲｏｍａｎｅｓｃｏ発現細胞の緑色蛍光強度の測定結果を示した図である。
【図１０Ａ】実施例５において、ＣＤ８３標識細胞のＣＤ８３遺伝子ローカスの模式図を図１０Ａに示す。
【図１０Ｂ】実施例５において、ＣＤ８３の表面抗原で刺激したＣＤ８３標識細胞の経時的に取得された蛍光画像である。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本発明及び本願明細書において、「蛍光分子結合アプタマー」とは、特定の蛍光分子と結合することにより当該蛍光分子から発生する蛍光が顕著に強化されるＲＮＡアプタマーを意味する。「蛍光分子結合アプタマー配列」とは、当該ＲＮＡアプタマーの塩基配列を意味する。また、「蛍光分子結合アプタマー配列と対となる蛍光分子」とは、当該ＲＮＡアプタマーと結合することにより、発生する蛍光が顕著に強化される蛍光分子を意味する。
【００１３】
＜蛍光発生核酸分子＞
本発明に係る蛍光発生核酸分子は、足場配列中に１以上の蛍光分子結合アプタマー配列が挿入されている蛍光分子結合領域が、２以上タンデムに連結されている。本発明において、蛍光分子結合領域当たりに含まれる蛍光分子結合アプタマー配列の数は、１個であってもよく、２個以上であってもよい。本発明に係る蛍光発生核酸分子は、少なくとも２個の蛍光分子結合領域を有しており、１分子当たりに結合する対となる蛍光分子が多い。このため、本発明に係る蛍光発生核酸分子は、１分子当たり１つの蛍光分子結合領域のみを備える蛍光発生核酸分子に比べて、蛍光分子の存在下で発される蛍光の強度が高い。
【００１４】
本発明に係る蛍光発生核酸分子が含有する蛍光分子結合領域は、２以上であれば特に限定されるものではない。１分子当たりに含有される蛍光分子結合領域の数が多くなるほど、１分子当たりに存在する蛍光分子結合アプタマー配列が多くなるため、当該核酸分子に結合する対となる蛍光分子も多くなる。つまり、連結する蛍光分子結合領域の数依存的に、対となる蛍光分子と結合した際に発生する蛍光の強度を強くなる。本発明に係る蛍光発生核酸分子を、生細胞内のＲＮＡ等の分子の標識に使用する場合には、蛍光発生核酸分子１分子当たりに含有される蛍光分子結合アプタマー配列の数が４以上、好ましくは８以上、より好ましくは１０以上、さらに好ましくは１２以上となるように、適切な数の蛍光分子結合領域をリンカー配列でタンデムに連結させる。本発明に係る蛍光発生核酸分子が含有する蛍光分子結合領域の数の上限値は特に限定されるものではないが、生細胞内での安定性等を考慮し、蛍光発生核酸分子当たりが含有する蛍光分子結合領域の数は、１０個以下が好ましく、８個以下がより好ましい。例えば、蛍光分子結合アプタマー配列当たり２個の蛍光分子結合アプタマー配列を含有する蛍光分子結合領域を６個、リンカー配列を介してタンデムに連結させた蛍光発生核酸分子は、対となる蛍光分子と結合した際に十分な強度の蛍光を発生させるため、生細胞内の分子、特にｍＲＮＡ等のＲＮＡの蛍光標識に好適である。
【００１５】
本発明に係る蛍光発生核酸分子が有する蛍光分子結合アプタマー配列は、特に限定されるものではなく、使用する蛍光分子の種類に応じて適宜選択することができる。本発明に係る蛍光発生核酸分子が含有する蛍光分子結合アプタマー配列としては、ＤＦＨＢＩファミリーの低分子の蛍光分子と対になる蛍光分子結合アプタマー配列であることが好ましい。「ＤＦＨＢＩファミリーの蛍光分子」（以下、「ＤＦＨＢＩファミリー分子」ということがある）としては、ＤＦＨＢＩに加えて、ＤＦＨＢＩ−１Ｔ（（Z）-4-（3,5-ジフルオロ-4-ヒドロキシベンジリデン）-2-メチル-1-（2,2,2-トリフルオロエチル）-1H-イミダゾール-5（4H）-オン）、ＤＦＨＯ（4-（3,5-ジフルオロ-4-ヒドロキシベンジリデン）-1-メチル-5-オキソ-4,5-ジヒドロ-1H-イミダゾール-2-カルバルデヒドオキシム）等が挙げられる。
【００１６】
「ＤＦＨＢＩファミリー分子と対になる蛍光分子結合アプタマー配列」（以下、「ＤＦＨＢＩ結合アプタマー配列」ということがある）としては、例えば、コンセンサス配列として、４〜６塩基のステム構造と４塩基のループ構造からなるステム・ループ構造がＧ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ構造で挟まれている構造の塩基配列を有するものが挙げられる。当該コンセンサス配列のうち、Ｇ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ構造部分及び末端ステムの塩基配列は特に限定されるものではない。例えば、ステム・ループ構造の５’端側及び３’端側を、図１に示す塩基配列とすることができる（ステム・ループ構造の５’端側：配列番号１（５’−ＧｒＷＧＡｒＶＧＧｒＨＣＧＧＧＵＣＣ−３’）、ステム・ループ構造の：配列番号２（５’−ＧＵｒＹＧＡＧＵＡＧＡＧＵＧＵＧｒＲＧＣＵＣ−３’））。図１中、「ｒＷ」はＡ（アデニン）又はＵ（ウラシル）を示し、「ｒＶ」はＡ、Ｃ（シトシン）又はＧ（グアニン）を示し、「ｒＨ」はＡ、Ｕ又はＣを示し、「ｒＹ」はＵ又はＣを示し、「ｒＲ」はＡ又はＧを示す。
【００１７】
前記コンセンサス配列中のステム・ループ構造部分の塩基配列は特に限定されるものではなく、例えば、５塩基のステム構造からなるものとして配列番号３〜５のいずれかで表される塩基配列が挙げられ、６塩基のステム構造からなるものとして配列番号６又は７で表される塩基配列が挙げられる。本発明に係る蛍光発生核酸分子中の蛍光分子結合アプタマー配列としては、ステム・ループ構造部分の塩基配列が配列番号３又は６で表される塩基配列であることが好ましい。
【００１８】
【表１】
2020116446.tif 000002
【００１９】
前記コンセンサス配列を有する蛍光分子結合アプタマー配列としては、具体的には、Ｓｐｉｎａｃｈ（Ｂａｂｙ  Ｓｐｉｎａｃｈ）（配列番号８、非特許文献３）、Ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ  Ｓｐｉｎａｃｈ（配列番号９、非特許文献６）、ｉＳｐｉｎａｃｈ（配列番号１０、非特許文献７）、ＺＴ−３２４（配列番号１１、非特許文献８）、Ｂｒｏｃｃｏｌｉ（配列番号１２、非特許文献４）、Ｂｒｏｃｃｏｌｉ３（配列番号１３、非特許文献９）、ｄＢｒｏｃｃｏｌｉ（配列番号１４、非特許文献４）等が挙げられる。各配列の模式図を図１に示す。
【００２０】
本発明において蛍光分子結合領域は、足場配列中に１以上の蛍光分子結合アプタマー配列が挿入されている１本鎖核酸構造からなる。当該足場配列としては、蛍光分子結合アプタマー配列が挿入された場合に当該配列からなる１本鎖ＲＮＡの蛍光発生機能を損なわず、足場（scaffolding）として機能し得る１本鎖ＲＮＡの塩基配列であれば、特に限定されるものではない。当該足場配列としては、例えば、ステム・ループ構造を形成する１本鎖核酸分子の塩基配列であってもよい。当該足場配列としては、例えば、各種生物に由来するｔＲＮＡ、Ｔｈｒｅｅ−ｗａｙ  ｊｕｎｃｔｉｏｎ  ｍｏｔｉｆ、又はこれらの改変体等が挙げられる。なかでも、Ｐｈｉ２９ウイルス由来のＴｈｒｅｅ−ｗａｙ  ｊｕｎｃｔｉｏｎ  ｍｏｔｉｆの改変体であるＦ３０スカフォールド（F30 scaffold）配列（配列番号１５、非特許文献１０）が好ましい。Ｆ３０スカフォールド配列からなるＲＮＡは、細胞ヌクレアーゼによって認識されないため、Ｆ３０スカフォールド配列のループ構造部分に蛍光分子結合アプタマー配列を挿入した蛍光分子結合領域を含む蛍光発生核酸分子は、細胞内における安定性が非常に高く、優れている。
【００２１】
ステム・ループ構造を形成する足場配列への蛍光分子結合アプタマー配列の挿入は、例えば、当該ステム・ループ構造のうちのループ構造部分を蛍光分子結合アプタマー配列に置換することによって行うことができる。蛍光分子結合領域当たり２以上の蛍光分子結合アプタマー配列を含む場合、当該蛍光分子結合領域は、例えば、２以上のループ構造を含有するステム・ループ構造を形成する１本鎖核酸分子のうちの少なくとも２の当該ループ構造が、蛍光分子結合アプタマー配列に置換されている構造からなる。
【００２２】
本発明に係る蛍光発生核酸分子が有する蛍光分子結合領域としては、Ｆ３０スカフォールド配列中のループ構造のうちの１箇所又は２箇所に、ＤＦＨＢＩ結合アプタマー配列を挿入したものが好ましく、Ｆ３０スカフォールド配列中のループ構造のうちの１箇所又は２箇所に、図１に示すコンセンサス配列を備える蛍光分子結合アプタマー配列を挿入したものがより好ましい。なかでも、生細胞内のＲＮＡに対する検出感度がより優れていることから、Ｆ３０スカフォールド配列中のループ構造のうちの１箇所又は２箇所に、Ｂａｂｙ  Ｓｐｉｎａｃｈ、Ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ  Ｓｐｉｎａｃｈ、ｉＳｐｉｎａｃｈ、ＺＴ−３２４、Ｂｒｏｃｃｏｌｉ、Ｂｒｏｃｃｏｌｉ３、又はｄＢｒｏｃｃｏｌｉの塩基配列を挿入したものが好ましく、Ｆ３０スカフォールド配列中のループ構造のうちの１箇所にＢｒｏｃｃｏｌｉ３の塩基配列を挿入したもの（配列番号１６）又はＦ３０スカフォールド配列中のループ構造のうちの２箇所にＢｒｏｃｃｏｌｉ３の塩基配列を挿入したもの（配列番号１７）がより好ましく、Ｆ３０スカフォールド配列中の２箇所のループ構造にＢｒｏｃｃｏｌｉ３の塩基配列を挿入したものが特に好ましい。表中、挿入されたＢｒｏｃｃｏｌｉ３の塩基配列には下線を付す。なお、「Ｆ３０スカフォード配列に１個の蛍光分子結合アプタマー配列を挿入した蛍光分子結合アプタマー配列」は、配列番号１６の下線部部分を蛍光分子結合アプタマー配列に置換することにより作製できる。「Ｆ３０スカフォード配列に２個の蛍光分子結合アプタマー配列を挿入した蛍光分子結合アプタマー配列」は、配列番号１７の下線部部分を蛍光分子結合アプタマー配列に置換することにより作製できる。
【００２３】
【表２】
2020116446.tif 000003
【００２４】
本発明に係る蛍光発生核酸分子は、２以上の蛍光分子結合領域がリンカー配列を介して連結されている塩基配列を含む。リンカー配列としては、蛍光発生核酸分子に含まれている蛍光分子結合アプタマー配列の蛍光発生機能を損なわないものであれば特に限定されるものではない。例えば、蛍光発生核酸分子の構築や標的ＲＮＡへの標識等の便のため、制限酵素配列等の機能性配列を含んでいてもよい。当該リンカー配列は、例えば、ＲＮＡ立体構造予測ソフトウェアを利用して、蛍光分子結合領域における蛍光分子結合アプタマー配列の立体構造形成を阻害しないように設計することができる。ＲＮＡ立体構造予測ソフトウェアとしては、例えば、「ｍＦｏｌｄ」（非特許文献１３）などの自由エネルギーが最小となる立体構造を予測するソフトウェアが挙げられる。
【００２５】
同種の蛍光分子同士の間でもＦＲＥＴ（Forster Resonance Energy Transfer）が生じる現象をｈｏｍｏ  ＦＲＥＴという。ｈｏｍｏ  ＦＲＥＴが生じた蛍光分子では、輝度が低下したり、蛍光を発する時間が短くなる（非特許文献１４、１５）。また、ｈｏｍｏ  ＦＲＥＴの効率は、蛍光分子同士の距離や位置関係に影響を受ける（非特許文献１６）。ＦＲＥＴによる蛍光発光効率の低下を避けるため、本発明に係る蛍光発生核酸分子におけるリンカー配列としては、当該リンカー配列で連結されている蛍光分子結合領域中の蛍光分子結合アプタマー配列に結合する蛍光分子同士がＦＲＥＴを生じないように設計されたものであることが好ましい。例えば、リンカー配列は、２０塩基長以上であって、特定の立体構造を取りにくい塩基配列からなるものが好ましい。リンカー配列の長さを好ましくは２０塩基以上、より好ましくは２２塩基以上、さらに好ましくは２４塩基以上とすることにより、蛍光発生核酸分子中の複数の蛍光分子結合アプタマー配列に結合する蛍光分子同士の距離を、ＦＲＥＴが生じ難いほど離すことができる。また、リンカー配列は、特定の立体構造をとらない、フレキシブルなものが好ましい。リンカー配列がフレキシブルであれば、蛍光発生核酸分子中の複数の蛍光分子結合アプタマー配列に結合する蛍光分子同士が、ＦＲＥＴを起こすことができる位置関係で固定されず、ＦＲＥＴが生じ難いためである。また、近接蛍光分子間の相互作用による蛍光の消光現象を引き起こす機構は、ｈｏｍｏＦＲＥＴ以外にもあるが、これらの機構も、フレキシブルなリンカー配列によって阻害されることが期待される。
【００２６】
また、リンカー配列の長さが長すぎると、蛍光発生核酸分子中の複数の蛍光分子結合アプタマー配列に結合する蛍光分子同士が、蛍光発生核酸分子自体の長さが長くなりすぎる。このため、リンカー配列の長さは、１００塩基以下が好ましく、９０塩基以下がより好ましく、８０塩基以下がさらに好ましい。
【００２７】
２０塩基長以上であって、特定の立体構造を取りにくい塩基配列からなるリンカー配列としては、１個の蛍光分子結合領域の上流（５’末端側）及び下流（３’末端側）にリンカー配列を連結したＲＮＡ配列を評価用ＲＮＡ配列として、当該評価用ＲＮＡ配列中の前記蛍光分子結合領域の立体構造の予測結果が、前記蛍光分子結合領域のみからなるＲＮＡ配列の立体構造の予測結果と同一であり、かつ、前記リンカー配列部分が立体構造をとらないと予測されるように、前記リンカー配列を設計することが好ましい。より詳細には、例えば、以下の方法で設計することができる。まず、候補リンカー配列として、２０塩基長以上、好ましくは２０〜８０塩基長のランダムなＲＮＡ配列を設計する。次いで、設計された候補リンカー配列を、１個の蛍光分子結合領域の上流及び下流に連結したＲＮＡ配列を評価用ＲＮＡ配列として設計し、当該評価用ＲＮＡ配列の立体構造を予測する。１本鎖ＲＮＡの立体構造予測は、「ｍＦｏｌｄ」のような、自由エネルギーが最小となる立体構造を予測するためのＲＮＡ立体構造予測ソフトウェアを利用して行うことができる。評価用ＲＮＡ配列の立体構造予測により、蛍光分子結合領域の立体構造の予測結果が、蛍光分子結合領域のみからなるＲＮＡ配列の立体構造の予測結果と同一であり、かつ、当該候補リンカー配列部分が立体構造をとらないと予測された場合に、当該候補リンカー配列を、本発明に係る蛍光発生核酸分子におけるリンカー配列として好ましいと評価する。評価用ＲＮＡ配列の立体構造予測により、蛍光分子結合領域の立体構造の予測結果が蛍光分子結合領域のみからなるＲＮＡ配列の立体構造の予測結果と異なるリンカー配列や、当該候補リンカー配列部分が立体構造を取ると予測されるリンカー配列よりも、蛍光分子結合領域の立体構造の予測結果が蛍光分子結合領域のみからなるＲＮＡ配列の立体構造の予測結果と同一であり、かつ、当該候補リンカー配列部分が立体構造をとらないと予測されるリンカー配列のほうが、ＦＲＥＴによる蛍光輝度の低下等が生じ難い。本発明に係る蛍光発生核酸分子におけるリンカー配列として好ましいと評価された候補リンカー配列が複数得られた場合には、評価用ＲＮＡ配列の自由エネルギーがより小さいものを、本発明に係る蛍光発生核酸分子におけるリンカー配列としてより好ましいと評価することができる。評価用ＲＮＡ配列中の蛍光分子結合領域の立体構造の予測結果が、当該蛍光分子結合領域のみからなるＲＮＡ配列の立体構造の予測結果と同一であり、かつ、候補リンカー配列部分が立体構造をとらないと予測される候補リンカー配列を、リンカー配列として、蛍光発生核酸分子を設計することが好ましい。
【００２８】
候補リンカー配列は、例えば、ＡＵＧＣの４種のＲＮＡを用いて、ＲＡＮＤＢＥＴＷＥＥＮ関数等のランダムな文字列を作成する際に用いられる一般的な方法で設計することができる。また、蛍光発生核酸分子の合成の便のため、ランダムな塩基配列に、制限酵素部位などの機能配列を組み込んだものを候補リンカー配列とすることもできる。
【００２９】
本発明に係る蛍光発生核酸分子中の蛍光分子結合領域が、Ｆ３０スカフォールド配列中のループ構造のうちの１箇所又は２箇所に、Ｂａｂｙ  Ｓｐｉｎａｃｈ、Ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ  Ｓｐｉｎａｃｈ、ｉＳｐｉｎａｃｈ、ＺＴ−３２４、Ｂｒｏｃｃｏｌｉ、Ｂｒｏｃｃｏｌｉ３、又はｄＢｒｏｃｃｏｌｉの塩基配列を挿入したものである場合には、当該蛍光分子結合領域同士を連結するリンカー配列としては、２５〜７５塩基長の塩基配列が好ましく、３０〜７０塩基長の塩基配列がより好ましく、３０〜７０塩基長の中央付近に制限酵素認識配列を含むランダム配列がよりさらに好ましい。中でも、蛍光分子結合領域がＦ３０スカフォールド配列中のループ構造のうちの１箇所又は２箇所にＢｒｏｃｃｏｌｉ３の塩基配列を挿入したものである場合には、当該蛍光分子結合領域同士を連結するリンカー配列としては、配列番号１８、２９〜３１（いずれも３０塩基長）、配列番号１９、３２〜３４（いずれも４４塩基長）、又は配列番号２０、３５〜３７（いずれも６６塩基長）で表される塩基配列が好ましく、配列番号１８（３０塩基長）、配列番号１９（４４塩基長）、又は配列番号２０（６６塩基長）で表される塩基配列がより好ましく、配列番号１６で表される塩基配列が特に好ましい。
【００３０】
【表３】
2020116446.tif 000004
【００３１】
本発明に係る蛍光発生核酸分子は、１本鎖構造のＲＮＡ分子である。本発明に係る蛍光発生核酸分子を構成するＲＮＡは、分子を構成する全てのＲＮＡが天然型ヌクレオチドであってもよく、分子を構成する一部又は全部が天然型ヌクレオチドと同様にヌクレオチド鎖や塩基対を形成することが可能な核酸類似物質であってもよい。核酸類似物質としては、例えば、Ｂｒｉｄｇｅｄ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ（ＢＮＡ）や、天然型ヌクレオチドの４’位酸素原子が硫黄原子に置換されているヌクレオチド、天然型リボヌクレオチドの２’位水酸基がメトキシ基に置換されているヌクレオチドやＨｅｘｉｔｏｌ  Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ（ＨＮＡ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）等が挙げられる。また、本発明に係る蛍光発生核酸分子を構成するＲＮＡのうちの一部がＤＮＡであってもよい。
【００３２】
本発明に係る蛍光発生核酸分子は、蛍光分子結合領域同士がリンカー配列で連結された領域以外にも、当該領域の蛍光発生機能を損なわない限り、その他の領域を有していてもよい。当該その他の領域としては、例えば、対となる蛍光分子以外の物質と相互作用する領域等が挙げられる。また、本発明に係る蛍光発生核酸分子は、対となる蛍光分子による蛍光標識される物質と直接又は適切なリンカーを介して連結させてもよい。
【００３３】
本発明に係る蛍光発生核酸分子は、対となる蛍光分子と結合することで、強い蛍光を発生させる。このため、本発明に係る蛍光発生核酸分子は、生体分子をはじめとする様々な物質の蛍光標識に利用することができる。具体的には、蛍光標識する目的の分子（標的分子）に、本発明に係る蛍光発生核酸分子を直接又は間接的に結合させた後、対となる蛍光分子と結合させる。
【００３４】
＜標的ＲＮＡの蛍光標識方法＞
本発明に係る蛍光発生核酸分子を、標的ＲＮＡ（蛍光標識する目的のＲＮＡ）に直接又は間接的に結合させることにより、当該標的ＲＮＡを蛍光標識することができる。具体的には、標的ＲＮＡに、本発明に係る蛍光発生核酸分子を直接又は間接的に連結させた後、当該蛍光発生核酸分子中の蛍光分子結合アプタマー配列が結合する蛍光分子と接触させる。当該蛍光標識方法は、細胞内のＲＮＡを標的ＲＮＡとしてもよく、細胞外のＲＮＡを標的ＲＮＡとしてもよい。
【００３５】
標的遺伝子の転写産物を標的ＲＮＡとする場合には、標的遺伝子の転写産物に本発明に係る蛍光発生核酸分子を結合させることが好ましい。例えば、標的遺伝子の３’非翻訳領域に本発明に係る蛍光発生核酸分子を組み込む。これにより、標的遺伝子は、その３’末端側に本発明に係る蛍光発生核酸分子が付加された状態で転写されるため、得られた転写産物は、対となる蛍光分子によって蛍光標識することができる。具体的には、標的遺伝子の３’非翻訳領域に本発明に係る蛍光発生核酸分子をコードする塩基配列を組み込んだ細胞の細胞内に、当該蛍光発生核酸分子中の蛍光分子結合アプタマー配列が結合する蛍光分子を導入して、標的遺伝子の転写産物と当該蛍光分子とを結合させる。標的遺伝子の３’非翻訳領域に本発明に係る蛍光発生核酸分子を直接組み込むことにより、細胞内における遺伝子発現において、転写開始から翻訳、その後の分解までの間、標的遺伝子のｍＲＮＡを蛍光により可視化し、リアルタイムに検出し、細胞内の標的遺伝子の発現量を定量化することもできる。特に、本発明に係る蛍光発生核酸分子は蛍光発生能が高く、強い蛍光シグナルを発生させられるため、顕微鏡画像解析により、蛍光発生核酸分子で標識したｍＲＮＡの細胞内における局在をリアルタイムに解析することも可能である。
【００３６】
標的遺伝子が内在性の遺伝子の場合、染色体中の標的遺伝子領域のうちの３’非翻訳領域に、本発明に係る蛍光発生核酸分子をコードするＤＮＡ断片を挿入する。このＤＮＡ断片の挿入は、ゲノム編集法等の当該技術分野で公知の各種の遺伝子改変技術を用いて常法により行うことができる。
【００３７】
外来遺伝子を細胞へ導入して発現させる場合、一般的には、外来遺伝子を発現させるための発現カセットが組み込まれたベクターを細胞内へ導入する。発現カセットとは、外来遺伝子が発現するために必要なＤＮＡ断片であり、少なくとも、当該遺伝子のコーディング領域と、当該遺伝子の発現を制御するプロモーターとを含み、さらに、５’非翻訳領域と３’非翻訳領域とターミネーターとを含むことが好ましい。
【００３８】
標的遺伝子が外来遺伝子の場合、標的遺伝子の発現カセット中の３’非翻訳領域に、予め、本発明に係る蛍光発生核酸分子をコードするＤＮＡ断片を挿入しておく。３’非翻訳領域に本発明に係る蛍光発生核酸分子を挿入した発現カセットを細胞に導入することにより、標的遺伝子は、３’末端側に本発明に係る蛍光発生核酸分子が付加された状態で転写される。標的遺伝子の発現カセットは、細胞の核外に導入されてもよく、核内の染色体中に組み込まれてもよい。標的遺伝子の発現カセットは、当該技術分野で公知の発現カセットに、標的遺伝子のコーディング領域を組み込むことによって作製できる。標的遺伝子の発現カセットの細胞への導入は、リポフェクション法やエレクトロポレーション法、相同組換え法等の当該技術分野で公知の各種の遺伝子組換え技術を用いて常法により行うことができる。
【００３９】
また、一般的に、外来遺伝子の発現カセットが組み込まれたベクターは、外来遺伝子のコーディング領域に代えて制限酵素部位を含むクローニングベクターから作製される。具体的には、当該クローニングベクターは、外来遺伝子の発現を制御するプロモーターと、当該プロモーターの下流にあり、外来遺伝子のコーディング領域を挿入するための制限酵素部位と、当該制限酵素部位の下流に３’非翻訳領域とを有する。当該クローニングベクター中の制限酵素部位に、外来遺伝子のコーディング領域からなるＤＮＡ断片を組み込むことにより、外来遺伝子の発現用ベクターが得られる。
【００４０】
当該クローニングベクターの３’非翻訳領域に、予め、本発明に係る蛍光発生核酸分子をコードする塩基配列が組み込まれたベクターは、蛍光発生核酸分子が３’末端側に付加された転写産物を得るために有用である。当該ベクターの制限酵素部位に、標的遺伝子のコーディング領域のＤＮＡ断片を組み込むことにより、標的遺伝子が、３’末端側に本発明に係る蛍光発生核酸分子が付加された状態で転写される細胞を得るための標的遺伝子発現用ベクターが作製できる。当該ベクターは、例えば、標的遺伝子のコーディング領域のＤＮＡ断片を挿入して標的遺伝子発現用ベクターを作製するために用いられる市販の発現ベクターの３’非翻訳領域に、本発明に係る蛍光発生核酸分子をコードする塩基配列を組み込むことにより作製できる。
【００４１】
標的ＲＮＡの蛍光標識は、末端に標的ＲＮＡの一部分とハイブリダイズするプローブを直接又は間接的に連結させた蛍光発生核酸分子を用いることによっても行うことができる。当該プローブの設計、合成、蛍光発生核酸分子の末端との結合は、常法により行うことができる。標的ＲＮＡを含有する試料に、このプローブを連結した蛍光発生核酸分子と、当該蛍光発生核酸分子中の蛍光分子結合アプタマー配列と対になる蛍光分子とを混合する。これにより、標的ＲＮＡは当該蛍光分子によって標識される。
【００４２】
Ｂａｂｙ  Ｓｐｉｎａｃｈ等のＤＦＨＢＩファミリー分子は、光依存的に構造が変化する。構造変化後の蛍光分子は、ＤＦＨＢＩ結合アプタマー配列からなる１本鎖ＲＮＡとは結合しない。このため、ＤＦＨＢＩファミリー分子が、ＤＦＨＢＩ結合アプタマー配列を含む蛍光発生核酸分子と結合した複合体に光を照射すると、最初は蛍光を発するが、ＤＦＨＢＩファミリー分子は、構造変化によってＤＦＨＢＩ結合アプタマー配列から外れてしまい、蛍光を発しなくなるが、光照射を中断すると、再び構造が変化し、ＤＦＨＢＩファミリー分子と蛍光発生核酸分子とが再結合し、蛍光が復活する（非特許文献１７）。この光依存的な構造変化を利用して、ＤＦＨＢＩファミリー分子と結合する蛍光発生核酸分子から検出される蛍光シグナルのＳ／Ｎ比（信号対雑音比）を向上させることができる。
【００４３】
具体的には、ＤＦＨＢＩファミリー分子が、対となる蛍光発生核酸分子と結合していて蛍光を発する状態（発光状態）で取得した蛍光シグナルの輝度値（強度値）から、ＤＦＨＢＩファミリー分子が蛍光発生核酸分子から外れて蛍光を発しない状態（非発光状態）で取得した蛍光シグナルの輝度値を差し引いたものを、対となる蛍光発生核酸分子と結合しているＤＦＨＢＩファミリー分子から発される蛍光シグナルとして検出する。ＤＦＨＢＩファミリー分子が非発光状態で取得した蛍光シグナルには、背景蛍光や自家蛍光などのＤＦＨＢＩファミリー分子以外から発されるシグナル（ノイズ）が表れている。そこで、発光状態における輝度値から非発光状態における輝度値を差し引くことにより、ＤＦＨＢＩファミリー分子が発する蛍光シグナルのＳ／Ｎ比が高くなる。
【００４４】
発光状態の蛍光シグナルと非発光状態の蛍光シグナルは、例えば、対となる蛍光発生核酸分子と結合しているＤＦＨＢＩファミリー分子に、当該蛍光分子の励起光（当該蛍光分子を励起して蛍光を発生させることが可能な波長の光）を、発光状態から非発光状態にする構造変化を引き起こすために十分な時間以上、連続して照射することで取得できる。励起光の連続照射の照射開始時点の蛍光シグナルが発光状態の蛍光シグナルに相当し、照射終了時点の蛍光シグナルが非発光状態の蛍光シグナルに相当する。励起光の連続照射時間は、ＤＦＨＢＩファミリー分子の種類ごとに適宜設定することができ、例えば、１０〜３０ミリ秒間とすることができる。すなわち、ＤＦＨＢＩ結合アプタマー配列を含む蛍光発生核酸分子に、ＤＦＨＢＩファミリー分子を結合させた後、当該ＤＦＨＢＩファミリー分子の励起光を一定時間連続照射し、照射開始時点の蛍光シグナルの輝度値から照射終了時点の蛍光シグナルの輝度値を差し引いた輝度値を、当該蛍光発生核酸分子と結合しているＤＦＨＢＩファミリー分子から発される蛍光シグナルとして検出する。
【００４５】
光照射を中断すると、再びＤＦＨＢＩファミリー分子の構造が変化し、ＤＦＨＢＩファミリー分子と蛍光発生核酸分子中のＤＦＨＢＩ結合アプタマー配列とが再結合し、蛍光が復活する。そこで、例えば、充分な時間励起光を照射して発光状態の蛍光シグナルと非発光状態の蛍光シグナルを取得した後、光照射を一定期間中断することにより、再びＤＦＨＢＩファミリー分子の構造が変化し、ＤＦＨＢＩファミリー分子と蛍光発生核酸分子中のＤＦＨＢＩ結合アプタマー配列とが再結合する。励起光の照射中断時間は、ＤＦＨＢＩファミリー分子の種類ごとに適宜設定することができ、例えば、５〜２０秒間とすることができる。
【００４６】
遮光して励起光の照射を中断した後、ＤＦＨＢＩファミリー分子と蛍光発生核酸分子中のＤＦＨＢＩ結合アプタマー配列とを再結合させた状態で励起光を再度照射することにより、同じサンプルについて、再度発光状態の蛍光シグナルと非発光状態の蛍光シグナルを取得できる。励起光の連続照射とその後の非照射時間を繰り返すことにより、同じサンプルの発光状態の蛍光シグナルと非発光状態の蛍光シグナルを複数回取得することができ、それぞれの蛍光シグナルを平均化することによって、ＤＦＨＢＩファミリー分子が発する蛍光シグナルの検出精度をより向上させることができる。
【００４７】
具体的には、ＤＦＨＢＩファミリーの蛍光分子と結合した対となる蛍光発生核酸分子に、前記励起光を、一定時間連続照射した後に一定時間照射を中断する照射サイクルで、複数回繰り返し照射する。照射サイクルごとに、連続照射時の照射開始時点の蛍光シグナルと照射終了時点の蛍光シグナルを検出する。全照射サイクルで検出された連続照射時の照射開始時点の蛍光シグナルの輝度値を平均化することで、照射開始時点の蛍光シグナル、すなわち発光状態の蛍光シグナルの検出精度を向上させることができる。同様に、全照射サイクルで検出された連続照射時の照射終了時点の蛍光シグナルの輝度値を平均化することで、照射終了時点の蛍光シグナル、すなわち非発光状態の蛍光シグナルの検出精度を向上させることができる。平均化された照射開始時点の蛍光シグナルの輝度値から、平均化された照射終了時点の蛍光シグナルの輝度値を差し引いたものを、蛍光発生核酸分子と結合したＤＦＨＢＩファミリー分子の蛍光シグナルとして検出する。
【００４８】
＜蛍光分子と対となる蛍光発生核酸分子との結合を阻害する物質のスクリーニング方法＞
蛍光分子と対となる蛍光発生核酸分子とが結合することにより発生する蛍光シグナルを指標として、両者の結合を阻害する阻害物質をスクリーニングすることができる。蛍光分子と対となる蛍光発生核酸分子とが存在している反応系に、阻害物質の候補物質を共存させて、蛍光分子が発する蛍光シグナルを測定し、当該候補物質の非存在下で蛍光発生核酸分子と結合した蛍光分子が発する蛍光シグナルと比較する。候補物質共存下の蛍光分子が発する蛍光シグナルの輝度値が、当該候補物質の非存在下における蛍光シグナルの輝度値よりも小さい場合に、当該候補物質は、蛍光分子と対となる蛍光発生核酸分子との結合を阻害する阻害物質として選抜する。
【００４９】
例えば、候補物質がタンパク質の場合、１本鎖ＲＮＡである蛍光発生核酸分子を発現する細胞に、候補物質をコードする遺伝子を導入して発現させる。候補物質遺伝子を発現させた細胞と発現させていない細胞に、蛍光分子を取り込ませ、蛍光シグナルを検出する。候補物質遺伝子を発現させた細胞の蛍光シグナルが、候補物質遺伝子を発現させていない細胞の蛍光シグナルよりも小さい場合に、当該候補物質は、蛍光分子と対となる蛍光発生核酸分子との結合を阻害する阻害物質として選抜される。各細胞の蛍光シグナルは、細胞に励起光を照射して取得した蛍光画像から求めることができる。
【００５０】
例えば、ＤＦＨＢＩ結合アプタマー配列は、Ｇ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ構造で挟まれているステム・ループ構造を形成し、このＧ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ構造によってＤＦＨＢＩファミリー分子が挟まれることで蛍光を発する（非特許文献１８）。このＧ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ構造をほどき戻す（unfold）と、ＤＦＨＢＩファミリー分子と結合できなくなり、蛍光が消失する。真核細胞には、Ｇ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ構造をほどき戻す酵素（Ｇ４  ｒｅｓｏｌｖａｓｅ）が存在していると考えられているが、まだ同定されていない（非特許文献１９）。
【００５１】
そこで、ＤＦＨＢＩ結合アプタマー配列を含む蛍光発生核酸分子を発現する遺伝子組換え細胞に、さらに、Ｇ４  ｒｅｓｏｌｖａｓｅの候補タンパク質をコードする遺伝子を導入して発現させる。ＤＦＨＢＩ結合アプタマー配列を含む蛍光発生核酸分子と候補タンパク質遺伝子を共発現させた細胞にＤＦＨＢＩファミリー分子を導入して蛍光シグナルを測定し、得られた輝度値が、ＤＦＨＢＩ結合アプタマー配列を含む蛍光発生核酸分子のみを発現させた細胞にＤＦＨＢＩファミリー分子を導入して得られた蛍光シグナルよりも小さい場合に、当該候補タンパク質がＧ４  ｒｅｓｏｌｖａｓｅ活性を有する物質として選抜する。ＤＦＨＢＩファミリー分子とＤＦＨＢＩ結合アプタマー配列を含む蛍光発生核酸分子は、Ｇ４  ｒｅｓｏｌｖａｓｅの遺伝子網羅的同定に応用可能である。
【実施例】
【００５２】
次に、実施例等により本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらの例によって限定されるものではない。【００５３】
＜プラスミド＞
以降の実験で用いたプラスミドは、次の通りにして作製した。【００５４】
ｐＥＧＦＰ−Ｎ１（Clontech社製）のＮｈｅＩ／ＮｏｔＩ部位に、３×ＮＬＳ（ＬＶＰＫＫＫＲＫＶＶＰＫＫＫＲＫＶＶＰＫＫＫＲＫＶＦＥＧＰＤＰＰＶ：配列番号２１）及びｉＲＦＰ７１３（以下、「ｉＲＦＰ」と略称す。松田道幸氏から親切にも贈られた。非特許文献１１）のコーディング配列を融合してサブクローニングし、ｐＮＬＳ−ｉＲＦＰを得た。ＤＦＨＢＩファミリー分子の対となる蛍光発生ＲＮＡの候補（候補ＲＮＡ）をスクリーニングするために、Ｆ３０−２×ｄＢｒｏｃｃｏｌｉはｐＡＶ５Ｓ−Ｆ３０−２×ｄＢｒｏｃｃｏｌｉ（＃66845、Addgene社製）からＰＣＲ増幅して得た。その他のＲＮＡは、合成オリゴヌクレオチド断片から構築した。Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ（Clontech社製）を用いて、これらのオリゴヌクレオチド断片をｐＮＬＳ−ｉＲＦＰのＮｏｔＩ部位にサブクローニングした。Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎのためのプライマーは、ＮｏｔＩ部位の３'側のみが回収されるように設計した。単一断片をＮｏｔＩ部位に繰り返し挿入することにより、ＲＮＡ断片のタンデムリピートを構築した。スクリーニング後、最も高い蛍光発生効果が観察された候補ＲＮＡ「Ｒｏｍａｎｅｓｃｏ」（ＲＮＡ＃１４）は、ＰＣＲ増幅して、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＳＫ（＋）（Stratagene社製）のマルチクローニングサイトにサブクローニングした。【００５５】
ドキシサイクリン（ＤＯＸ）誘導性Ｒｏｍａｎｅｓｃｏ発現については、ｐＡｄｅｎｏＸ−Ｔｅｔ３Ｇ（Clontech社製）由来のＴＲＥ３Ｇプロモーター、ＮＬＳ−ｉＲＦＰコーディング配列、及びＲｏｍａｎｅｓｃｏ配列を融合し、Ｔｏｌ２認識配列、ｃＨＳ４インシュレーター、及びピューロマイシン耐性遺伝子発現カセットを含むｐＴ２−ＭＣＳ−ＰＧＫ−Ｐｕｒｏベクター（非特許文献１２）にサブクローニングし、ｐＴ２−ＴＲＥ３Ｇ−ＮＬＳ−ｉＲＦＰ−Ｒｏｍａｎｅｓｃｏを得た。【００５６】
＜細胞培養とトランスフェクション＞
以降の実験において、特に記載のない限り、細胞培養及びトランスフェクションは、以下の通りに行った。【００５７】
ＨＥＫ２９３Ｔ、ＭＣＦ−７、及びＵ２ＯＳ細胞を、１０%ＦＢＳ、１ｍＭ  ピルビン酸ナトリウム、及び１％ペニシリン／ストレプトマイシンを添加したＤＭＥＭ（和光純薬社製）中、３７℃、５％ＣＯ２下で培養した。細胞へのトランスフェクションは、トランスフェクション試薬（製品名：「X-tremeGEN HP DNA」、Roche社製）を用いて製造者の指示に従って行った。顕微鏡分析のために、画像化前に、Matrigel（BD bioscience社製）でコーティングしたガラス底ディッシュ（MatTek社製）に細胞を再播種した。【００５８】
［参考例１］
Ｆ３０−２×ｄＢｒｏｃｃｏｌｉ（Ｆ３０スカフォールド配列中のループ構造のうちの２箇所にｄＢｒｏｃｃｏｌｉの塩基配列を挿入したもの。配列番号２２）は、Ｂｒｏｃｃｏｌｉ変異体の中で最も蛍光強度が強いと言われている。そこで、まず、このＦ３０−２×ｄＢｒｏｃｃｏｌｉがヒト細胞内のＲＮＡポリメラーゼII（Pol II）依存性ｍＲＮＡを可視化することができるかどうかを調べるために、ＲＮＡポリメラーゼII依存性のＣＭＶプロモーターの下流で、ＤＦＨＢＩ−１Ｔの存在下で緑色蛍光を発するＦ３０−２×ｄＢｒｏｃｃｏｌｉをＮＬＳ−ｉＲＦＰ（核局在性の赤外蛍光タンパク質ｉＲＦＰ）と共にＨＥＫ２９３Ｔ細胞に発現させた。具体的には、ＮＬＳ−ｉＲＦＰを発現させるｐＮＬＳ−ｉＲＦＰの３’非翻訳領域にＦ３０−２×ｄＢｒｏｃｃｏｌｉを組み込んだプラスミドベクター（ｐＮＬＳ−ｉＲＦＰ−＃０）を、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞にトランスフェクションし、さらに、培養培地にＤＦＨＢＩ−１Ｔを添加して培養した。【００５９】
この結果、ｐＮＬＳ−ｉＲＦＰ−＃０を導入したＮＬＳ−ｉＲＦＰ陽性細胞は、ほとんど検出可能な緑色蛍光を示さなかった。つまり、既存の蛍光分子結合アプタマーでは、ヒト細胞内のｍＲＮＡを可視化できなかった。【００６０】
次いで、ｐＮＬＳ−ｉＲＦＰの３’非翻訳領域にＦ３０−２×ｄＢｒｏｃｃｏｌｉをタンデムに直接連結した配列を組み込んだプラスミドベクターをＨＥＫ２９３Ｔ細胞にトランスフェクションし、同様にＤＦＨＢＩ−１Ｔを添加して培養した。この結果、Ｆ３０−２×ｄＢｒｏｃｃｏｌｉのリピート数が多くなるにつれて、有意な緑色蛍光が観察される細胞が増える傾向が観察された。この結果から、蛍光分子結合アプタマーを最適化することにより、細胞内のＲＮＡを可視化するのに十分なほどＤＦＨＢＩファミリー分子の蛍光強度を改善できることが示唆された。【００６１】
［実施例１］
ＤＦＨＢＩファミリー分子の対となる蛍光発生ＲＮＡ、すなわち、ＤＦＨＢＩファミリー分子と結合することによって発生する蛍光強度を改善できる蛍光発生ＲＮＡをスクリーニングした。【００６２】
図１に示すように、ＳｐｉｎａｃｈやＢｒｏｃｃｏｌｉ等の公知の蛍光分子結合アプタマーは、いずれも配列が類似しており、末端ステム（図中、「Terminal stem」）、Ｇ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ、ステム・ループ、コネクターからなる。これらのセグメントは、Ｓｐｉｎａｃｈの結晶構造及び他の蛍光分子結合アプタマーとの塩基配列アラインメントによって決定される。【００６３】
末端ステムでは、Ｓｐｉｎａｃｈ変異体に含まれている、二本鎖−四重鎖移行領域のＡ：Ｇプリン−プリンミスマッチ及びＣ−Ｇワトソン−クリック塩基対が、細胞環境におけるアプタマーの明るさに強く影響することが示唆されている（非特許文献９）。そこで、ＧＡＧＡＣ−ＧＧＣＵＣを末端ステム配列に使用することにした。
Ｇ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘに焦点を当てると、ＳｐｉｎａｃｈとｄＢｒｏｃｃｏｌｉが、Ｇ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘの後半の３番目のポジションにおけるＵの特徴的な１塩基置換Ｃを含むことを除いて、それらの配列にはほとんど変化が見出されなかった。そこで我々は、Ｇ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘには、ＢｒｏｃｃｏｌｉとｄＢｒｏｃｃｏｌｉに由来する配列（ＧＧＵＣＧＧＧＵＣＣ−ＧＵＣＧＡＧＵＡＧＡＧＵＧＵＧ）又はＢｒｏｃｃｏｌｉ３に由来する配列（ＧＧＵＣＧＧＧＵＣＣ−ＧＵＵＧＡＧＵＡＧＡＧＵＧＵＧ）を採用した。【００６４】
ステム・ループでは、シンプルに、ＢｒｏｃｃｏｌｉにはＢｒｏｃｃｏｌｉ由来のステム・ループを使用し、Ｂｒｏｃｃｏｌｉ３のＧ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘには、ｄＢｒｏｃｃｏｌｉ ＧのｑｕａｄｒｕｐｌｅｘとＢｒｏｃｃｏｌｉ３のステム・ループを使用した。さらに、Ｂｒｏｃｃｏｌｉ３のＧ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘと６ｂｐ（塩基対長）ステムと４ｎｔ（塩基長）ループを含むｉＳｐｉｎａｃｈステム・ループのキメラも使用した。【００６５】
Ｆ３０スカフォールドは、哺乳動物細胞におけるＤＦＨＢＩファミリーに対する蛍光分子結合アプタマーの蛍光発生能を増強することが報告されている（非特許文献１０）。そこで、比較のために、Ｆ３０スカフォールド配列を有する候補ＲＮＡと有さない候補ＲＮＡを構築した。【００６６】
Ｆ３０−２×ｄＢｒｏｃｃｏｌｉをタンデムに連結させることによって発生する蛍光強度を改善できたことから（参考例１）、蛍光発生ＲＮＡは、足場配列（Ｆ３０スカフォールド配列）の中に組み込まれている蛍光分子結合アプタマー配列を、リンカー配列を介してタンデムに連結させるように構築し、足場配列に組み込まれた蛍光分子結合アプタマー配列のタンデムリピート数を改変することにより、蛍光発生ＲＮＡの最適化を試みた。タンデムリピートの数は、蛍光発生ＲＮＡを可能な限り小さくし、組換え事象を回避するために、６以下に設定した。なお、後記で設計して合成した、６回反復を含む「Ｒｏｍａｎｅｓｃｏ」（ＲＮＡ＃１４）は、細菌細胞と哺乳動物細胞の両方で研究中に組換えを起こさなかった（データは示さず）。【００６７】
足場配列に組み込まれた蛍光分子結合アプタマー配列同士の間に、３０、４４、又は６６塩基長のリンカー配列を挿入した。リンカー配列は、Ｆ３０スカフォールド及び蛍光分子結合アプタマーの二次構造を妨害しないように、ＲＮＡ立体構造予測ソフトウェア「ｍＦｏｌｄ」を使用することによって最適化した。【００６８】
リンカー配列は、具体的には下記の通りにして設計した。まず、制限酵素部位に対応する６塩基を除く領域の配列をＡＵＧＣの４種のＲＮＡからなるランダム配列とした候補リンカー配列を設計した。ＡＵＧＣの４種のＲＮＡからなるランダム配列は、表計算ソフトウェア「Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ  Ｅｘｃｅｌ」のＲＡＮＤＢＥＴＷＥＥＮ関数を用いて設計した。【００６９】
次いで、設計された各候補リンカー配列について、Ｆ３０−２×ｄＢｒｏｃｃｏｌｉ配列の上流と下流に候補リンカー配列を連結した評価用ＲＮＡ配列（候補リンカー配列−Ｆ３０−２×ｄＢｒｏｃｃｏｌｉ配列−候補リンカー配列）を設計し、その立体構造を予測した。立体構造の予測は、ＲＮＡ立体構造予測ソフトウェア「ｍＦｏｌｄ」にアクセスし（［on line］http://unafold.rna.albany.edu/?q=mfold/RNA-Folding-Form）、得られた評価用ＲＮＡ配列を入力し、「Enter the maximum distance between paired bases if you wish」を１５０に設定し、他のパラメータは初期値のままで、「Fold RNA」をクリックして実行した。なお、「Enter the maximum distance between paired bases if you wish」を１５０に設定するのは、リンカー配列間でのbase pairingを防止するためである。【００７０】
「ｍＦｏｌｄ」により予測された立体構造について、候補リンカー配列によってＦ３０−２×ｄＢｒｏｃｃｏｌｉ配列の立体構造が阻害されていないか、及び当該候補リンカー配列がフレキシブルな領域であるか、を確認する。具体的には、Ｆ３０−２×ｄＢｒｏｃｃｏｌｉ配列部分の立体構造が、Ｆ３０−２×ｄＢｒｏｃｃｏｌｉ配列のみから予測される立体構造と同一であるか否かを確認する。両者の立体構造が異なっている場合には、当該候補リンカー配列によってＦ３０−２×ｄＢｒｏｃｃｏｌｉ配列の立体構造が阻害されると予測される。また、候補リンカー配列部分が特定の立体構造が予測されない場合、当該候補リンカー配列はフレキシブルな領域である予測される。【００７１】
候補リンカー配列のうち、評価用ＲＮＡ配列の「ｍＦｏｌｄ」により予測された立体構造が、Ｆ３０−２×ｄＢｒｏｃｃｏｌｉ配列部分の立体構造が、Ｆ３０−２×ｄＢｒｏｃｃｏｌｉ配列のみから予測される立体構造と同一であり、かつ候補リンカー配列部分が特定の立体構造が予測されないものを、リンカー配列として選抜した。最終的に、リンカー配列として、表３に記載のものを選抜した。それぞれの塩基長のうち、自由エネルギー（ΔＧ）が最小であった配列番号１８、１９、及び２０のリンカー配列を用いて、以降の候補ＲＮＡを合成した。なお、例えば、表４に記載のものは、候補リンカー配列部分が立体構造をとると予測されたり、Ｆ３０−２×ｄＢｒｏｃｃｏｌｉ配列部分の立体構造がリンカー配列部分に影響を受けて変化すると予測されたため、リンカー配列としては、表３に記載のもののほうが好ましいと評価した。【００７２】
【表４】
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【００７３】
まず、１７の候補ＲＮＡ（ＲＮＡ＃１〜１７）を設計した。ＲＮＡ＃１は、Ｂｒｏｃｃｏｌｉ（配列番号１２）のみからなるＲＮＡである。ＲＮＡ＃２は、Ｆ３０スカフォード配列に２個のＢｒｏｃｃｏｌｉを挿入した蛍光分子結合アプタマー配列１個からなるＲＮＡである。ＲＮＡ＃３〜ＲＮＡ＃５は、それぞれ、Ｆ３０スカフォード配列に２個のＢｒｏｃｃｏｌｉを挿入した蛍光分子結合アプタマー配列が２、４、又は６個、４４塩基長のリンカー配列（配列番号１９）で連結されたＲＮＡである。ＲＮＡ＃６は、ＢｒｏｃｃｏｌｉのみからなるＲＮＡ（配列番号１２）が１２個、リンカー配列を介さずに直接タンデムに連結されたＲＮＡである。ＲＮＡ＃７〜ＲＮＡ＃９は、それぞれ、Ｆ３０スカフォード配列に２個のｄＢｒｏｃｃｏｌｉ（配列番号１４）を挿入した蛍光分子結合アプタマー配列が２、４、又は６個、４４塩基長のリンカー配列（配列番号１９）で連結されたＲＮＡである。ＲＮＡ＃１０は、Ｂｒｏｃｃｏｌｉ３（配列番号１３）のみからなるＲＮＡである。ＲＮＡ＃１１は、Ｆ３０スカフォード配列に２個のＢｒｏｃｃｏｌｉ３を挿入した蛍光分子結合アプタマー配列１個からなるＲＮＡである。ＲＮＡ＃１２〜ＲＮＡ＃１４は、それぞれ、Ｆ３０スカフォード配列に２個のＢｒｏｃｃｏｌｉ３を挿入した蛍光分子結合アプタマー配列が２、４、又は６個、４４塩基長のリンカー配列（配列番号１９）で連結されたＲＮＡである。ＲＮＡ＃１５は、ＲＮＡ＃１４中のＢｒｏｃｃｏｌｉ３のステム・ループ領域を、配列番号６で表される塩基配列に置換したＲＮＡである。ＲＮＡ＃１６は、Ｂｒｏｃｃｏｌｉ３のみからなるＲＮＡ（配列番号１３）が１２個、リンカー配列を介さずに直接タンデムに連結されたＲＮＡである。ＲＮＡ＃１７は、ＲＮＡ＃１６中のＢｒｏｃｃｏｌｉ３のステム・ループ領域を、配列番号６で表される塩基配列に置換されたＲＮＡである。【００７４】
設計された１７の候補ＲＮＡ（ＲＮＡ＃１〜１７）を、ｐＮＬＳ−ｉＲＦＰ−＃０と同様にして、ｐＮＬＳ−ｉＲＦＰの３’非翻訳領域に組み込み、ｐＮＬＳ−ｉＲＦＰ−＃１〜１７を作製した。作製されたプラスミドをＨＥＫ２９３Ｔ細胞にトランスフェクトして発現させ、その蛍光発生性能を、従来のレーザー走査共焦点顕微鏡を用いてＤＦＨＢＩ−1Ｔの存在下でＮＬＳ−ｉＲＦＰ陽性細胞の緑色蛍光強度を測定することによって評価した。【００７５】
具体的には、参考例１と同様にして作製されたプラスミドをトランスフェクトしたＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、ガラス底ディッシュ上に播き、培養した。トランスフェクションから２４時間後の細胞を、油浸対物レンズ（製品名：「Plan Fluor 40×/1.30（Nikon社製）を備えた共焦点顕微鏡（製品名：「A1R」、Nikon社製）を用いて撮像した。細胞に対して、４８８ｎｍレーザービーム（Melles Griot、０．５μＷ）及び６４０ｎｍレーザービーム（Coherent、３μＷ）を使用し、候補蛍光発生ＲＮＡ及びＮＬＳ−ｉＲＦＰをそれぞれ励起した。共焦点顕微鏡の走査は、２倍の倍率で可能な最高速度で双方向であり、ピンホールは１００μｍに閉じられた。各視野について、１μｍだけ分離された７枚の画像のスタックを、Ｚ断面として取得した。イメージングの間、ＤＦＨＢＩ−１Ｔ（Tocris社製）を最終濃度２０μＭになるようにＬ−１５培地（Thermo Fisher Scientific社製）に添加した。実験は室温で行った。【００７６】
取得した画像を、画像解析ソフトウェア（製品名：「Fiji」、NIH製）を用いて分析した。 画像は、最初に３２ビットの浮動小数点画像に変換した。各視野について、４８８ｎｍレーザー及び６４０ｎｍレーザーによって誘発された細胞蛍光強度を、以下のように計算した。最初に、全てのｚセクションについて、４８８ｎｍチャネル及び６４０ｎｍチャネルの平均投影を得た。次に、主にＮＬＳ−ｉＲＦＰシグナルからなる６４０ｎｍチャネルの平均イメージを、Ｏｔｓｕ法を用いた自動閾値処理によって２値画像に変換し、Fijiソフトウェアで実施された機能（「Fill Holes」、「Watershed」及び「Analyze Particles」）を適用して、核関心領域（regions of interest：ＲＯＩ）を得た。細胞ＲＯＩは、核ＲＯＩを１０ピクセル（１ピクセル＝３１１ｎｍ）だけ拡大することによって定義した。最後に、核ＲＯＩの平均値を測定して、６４０ｎｍチャネルの蛍光強度を得、細胞ＲＯＩの平均値を測定して４８８ｎｍチャネルの蛍光強度を得た。隣接するトランスフェクトされていない細胞の蛍光強度も各チャネルについて測定し、それらの平均値をバックグラウンドとして差し引いた。以上の処理の結果、細胞毎に、候補ＲＮＡによってＤＦＨＢＩ−1Ｔから発生した蛍光の強度とＮＬＳ−ｉＲＦＰの蛍光強度の値が得られた。なお、以降において、「蛍光発生ＲＮＡによってＤＦＨＢＩファミリーの蛍光分子から発生した蛍光」を「蛍光発生ＲＮＡの蛍光」ということがある。【００７７】
図２は、候補ＲＮＡ（ＲＮＡ＃１〜１７）をそれぞれ発現させた細胞の、候補ＲＮＡの蛍光強度をＮＬＳ−ｉＲＦＰ蛍光強度で除して得た正規化蛍光強度を、さらにＲＮＡ＃１（Ｓｐｉｎａｃｈ）を発現させた細胞の平均正規化蛍光強度で除して得られた相対蛍光強度を示した図である。候補ＲＮＡを発現させた細胞のＤＦＨＢＩ−１Ｔ蛍光の検出限界は、候補ＲＮＡを発現していない細胞の蛍光強度の平均±３ＳＤを計算することによって決定した。ただし、ＮＬＳ−ｉＲＦＰを発現する細胞に対してのみ行った。図中、エラーバーはｓ.ｅ.ｍ.を表す。ＲＮＡ＃１〜１７を発現させた細胞のｎ数は、それぞれ、５５、３１０、２５５、２１７、３６０、３１６、２９９、２１２、２７１、２８２、２１６、４０１、３４３、２２９、２１７、１５０、及び２４４であった。【００７８】
図２に示すように、リンカー配列を介して蛍光分子結合アプタマー配列をタンデム連結した候補ＲＮＡ（ＲＮＡ＃２〜９，１１〜１７）のいずれも、蛍光分子結合アプタマー配列が１つしかない従来の蛍光分子結合アプタマー（ＲＮＡ＃１及び＃１０）よりも高い蛍光発生性能を示した。【００７９】
ＲＮＡ＃１〜＃５を発現させた細胞の結果、ＲＮＡ＃７〜＃９を発現させた細胞の結果、及びＲＮＡ＃１０〜＃１４を発現させた細胞の結果が示すように、タンデム連結された蛍光分子結合アプタマー配列の数が増えると、対となる蛍光分子から発生する蛍光がより明るい蛍光が得られた。また、蛍光分子結合アプタマー配列がＢｒｏｃｃｏｌｉ３の候補ＲＮＡは、蛍光分子結合アプタマー配列がＢｒｏｃｃｏｌｉ又はｄＢｒｏｃｃｏｌｉである候補ＲＮＡよりも、蛍光発生効果に優れていた。また、ＲＮＡ＃５〜＃６を発現させた細胞の結果、及びＲＮＡ＃１４と＃１６を発現させた細胞の結果が示すように、足場配列は、より高い蛍光発生性能のために不可欠である。また、ＲＮＡ＃１４と＃１５を発現させた細胞の結果を比較すると、蛍光分子結合アプタマー配列中のステム・ループ構造を、５ｂｐのステム構造から６ｂｐのステム構造に変換すると、蛍光発生性能は著しく低下した。ＲＮＡ＃１４を発現させた細胞が、その他の候補ＲＮＡを発現させた細胞の中で最も明るい蛍光を示し、ＲＮＡ＃１を発現させた細胞の３００倍以上の明るさであった。【００８０】
ＲＮＡ＃１４について、蛍光発生性能に対するリンカー配列の長さの影響を調べるために、ＲＮＡ＃１４中の４４塩基長のリンカー配列（配列番号１９）を３０塩基長のリンカー配列（配列番号１８）としたＲＮＡ＃１８、ＲＮＡ＃１４中の４４塩基長のリンカー配列（配列番号１９）を６６塩基長のリンカー配列（配列番号２０）としたＲＮＡ＃１９を設計し、同様にして蛍光発生性能を調べた。結果を図３に示す。図中、エラーバーはｓ.ｅ.ｍ.を表す（それぞれ、ｎ＝９４、６８、又は５７）。Ｋｒｕｓｋａｌ−Ｗａｌｌｉｓ試験（ｐ＜０．００１）を行った後、続いてＳｔｅｅｌ−Ｄｗａｓｓ試験を行った（＊＊：ｐ＜０．０１、ｎ．ｓ．：ｐ＞０．０５）。この結果、ＲＮＡ＃１８とＲＮＡ＃１９のいずれも、ＲＮＡ＃１４と同様に、従来のＲＮＡ＃１よりも高い蛍光発生性能を示した。これら３つの候補ＲＮＡの中では、ＲＮＡ＃１４が最も蛍光発生性能が良好であった。【００８１】
生きた哺乳動物細胞のｍＲＮＡの可視化を可能にしたＲＮＡ＃１４を、「Ｒｏｍａｎｅｓｃｏ」と名付け、以降の実験に用いた。【００８２】
［実施例２］
実施例１において作製されたＲｏｍａｎｅｓｃｏが、生細胞内のｍＲＮＡの定量的測定が可能であることを確認した。
ＤＦＨＢＩファミリー分子は、Ｒｏｍａｎｅｓｃｏをはじめとする対となる蛍光分子結合アプタマーと結合して初めて十分な蛍光強度を発生する。このため、細胞のＤＦＨＢＩファミリーに由来する蛍光の全強度は、Ｒｏｍａｎｅｓｃｏを含むｍＲＮＡの発現量を直接反映する。つまり、標的遺伝子のｍＲＮＡをＲｏｍａｎｅｓｃｏで修飾することにより、ＤＦＨＢＩファミリーの蛍光強度に基づいて、当該標的遺伝子の発現量を定量的に評価することができる。【００８３】
Ｒｏｍａｎｅｓｃｏで修飾した標的遺伝子のｍＲＮＡを、ドキシサイクリン（ＤＯＸ）誘導性プロモーターの制御下で発現させ、ＤＦＨＢＩファミリーの存在下で当該細胞のＲｏｍａｎｅｓｃｏの蛍光シグナルの変化を、当該標的遺伝子のｍＲＮＡ合成と共にモニタリングした。【００８４】
＜ｍＲＮＡ合成及び分解のダイナミクスの画像化＞
レポーター細胞として、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞に、ｐＴ２−ＴＲＥ３Ｇ−ＮＬＳ−ｉＲＦＰ−Ｒｏｍａｎｅｓｃｏをトランスフェクトした、ＮＬＳ−ｉＲＦＰ及びＲｏｍａｎｅｓｃｏを発現するレポーター遺伝子を有する細胞を用いた。【００８５】
転写活性化中のＲｏｍａｎｅｓｃｏの経時的イメージングのために、ＤＯＸ誘導性プロモーターの制御下でレポーター細胞を、４ｍＭのＬ−グルタミン、１０％  ＦＢＳ、１ｍＭ  ピルビン酸ナトリウム、１％  ペニシリン／ストレプトマイシン、及び２０μＭ  ＤＦＨＢＩ−１Ｔを含有するＤ−ＭＥＭ（フェノールレッドなし、和光純薬社製）中で培養した。細胞の画像は、共焦点顕微鏡Ａ１Ｒで、油浸対物レンズPlan Fluor 40×／1.30を使用して、３７℃、５％ＣＯ２下で撮像した。終濃度１μｇ／ｍＬのＤＯＸ（Clontech社製）を培地に添加して転写を誘導し、４８８ｎｍレーザービーム（０．５μＷ）及び６４０ｎｍレーザービーム（３μＷ）を用いて、Ｒｏｍａｎｅｓｃｏ及びＮＬＳ−ｉＲＦＰをそれぞれ励起した。走査は、２倍の倍率で可能な最高速度で双方向に行い、ピンホールは１００μｍに閉じた。各視野について、１μｍ間隔の１３枚の画像のスタックを、ｚ断面として１０分間間隔で８時間かけて取得した。【００８６】
転写不活性化中のＲｏｍａｎｅｓｃｏの経時的イメージングのために、レポーター細胞を、１μｇ／ｍＬ  ＤＯＸの存在下で１２時間インキュベートし、前記と同様にしてイメージングに供した後、終濃度５μｇ／ｍＬ  ＡｃｔＤを加えて転写を阻害した。【００８７】
取得した画像を処理し、実施例１と同様にして、各細胞の蛍光強度を測定した。得られたＲｏｍａｎｅｓｃｏ及びＮＬＳ−ｉＲＦＰの蛍光強度を、ＤＯＸ添加後８時間での平均蛍光強度が１であり、ＡｃｔＤ添加後０時間での平均蛍光強度が１になるように正規化した。【００８８】
＜ＲＴ−ｑＰＣＲによるＲｏｍａｎｅｓｃｏ標識ｍＲＮＡ発現レベルの決定＞
転写活性化中のレポーター細胞におけるＲｏｍａｎｅｓｃｏ標識ｍＲＮＡ合成のダイナミクスを分析するために、ＤＯＸ誘導性レポーター遺伝子を安定に発現するＨＥＫ２９３Ｔ細胞を２４ウェルプレート上に播種し、終濃度１μｇ／ｍＬ  ＤＯＸで処理し、ＤＯＸ添加から０、０．５、１、１．５、２、３、４、５、６、及び８時間後の細胞を各ウェルから回収した。転写不活性化中のｍＲＮＡ分解ダイナミクスを分析するために、ＤＯＸ誘導性レポーター遺伝子を安定に発現するＨＥＫ２９３細胞を２４ウェルプレートに播種し、終濃度１μｇ／ｍＬ  ＤＯＸで１２時間処理し、次いで終濃度５μｇ／ｍＬ  ＡｃｔＤで処理し、ＡｃｔＤ添加の０、１、２、３、４、５、及び６時間後の細胞を各ウェルから回収した。【００８９】
次いで、細胞を溶解し、FastGene RNAプレミアムキット（Nippon Genetics社製）を用いてＲＮＡを精製した。得られたＲＮＡを逆転写し、One Step SYBR PrimeScript PLUS RT-PCRキット（TaKaRa社製）を用いて、ＣＦＸ９６システム（Bio-Rad社製）を用いたリアルタイムＰＣＲによって定量した。逆転写及びＰＣＲ反応は、以下の条件で実施した：４２℃で５分間、９５℃で１０秒間、続いて９５℃で１０秒間及び６０℃で３０秒間を５０サイクル。【００９０】
アンプリコンの特異性は、製造者のプロトコールに従って解離曲線分析を行うことによって調べた。レポーターｍＲＮＡの発現レベルを分析するために、ＮＬＳ−ｉＲＦＰのコーディング配列を増幅するＰＣＲプライマーセット（フォワードプライマー：５’−ＣＣＡＡＴＣＣＡＣＡＴＴＣＣＡＧＧＡＧＣＴＡＴＣ−３’（配列番号２３）、リバースプライマー：５’−ＣＴＴＴＣＧＣＡＴＴＧＴＧＡＡＧＣＣＧＡＣ−３’（配列番号２４））を使用した。Ｒｏｍａｎｅｓｃｏは、Ｒｏｍａｎｅｓｃｏ配列内に複数のリピートがあるためである。また、ＤＯＸ処理したサンプルについては、ＰＧＫ１遺伝子をインターナルコントロールとして選択した。ＰＧＫ１の発現レベルはＤＯＸ処理によって影響を受けないためであり、また、ＰＧＫ１増幅のためのプライマーセット（フォワードプライマー：５’−ＴＧＧＡＣＧＴＴＡＡＡＧＧＧＡＡＧＣＧＧＧ−３’（配列番号２５）、リバースプライマー：５’−ＧＧＣＴＣＡＴＡＡＧＧＡＣＴＡＣＣＧＡＣＴＴＧＧＣ−３’（配列番号２６））の増幅効率が、ＮＬＳ−ｉＲＦＰのためのプライマーセットの増幅効率に匹敵したためである（データは図示せず。）。一方で、ＡｃｔＤで処理したサンプルでは、１８ＳリボソームＲＮＡをインターナルコントロールとして選択した。１８ＳリボソームＲＮＡの発現レベルがＡｃｔＤ処理によって影響を受けないためであり、また、１８ＳリボソームＲＮＡ増幅のためのプライマーセット（フォワードプライマー：５’−ＣＧＧＣＴＡＣＣＡＣＡＴＣＣＡＡＧＧＡＡＧ−３’（配列番号２７）、リバースプライマー：５’−ＴＴＴＴＴＣＧＴＣＡＣＴＡＣＣＴＣＣＣＣＧ−３’（配列番号２８））の増幅効率が、ＮＬＳ−ｉＲＦＰのためのプライマーセットの増幅効率に匹敵したためである（データは図示せず）。【００９１】
実験は、３回の生物学的反復で行い、各生物学的反復について、ＲＴ−ｑＰＣＲ分析は、各プライマーセットについて３回実施した。ΔΔＣｑ法を用いて、レポーターｍＲＮＡの相対発現レベルを決定した。得られた値は、ＤＯＸ添加から８時間後の平均発現量がＤＯＸ処理サンプルで１となり、ＡｃｔＤ添加後０時間での平均発現量がＡｃｔＤ処理サンプルで1となるように、さらに正規化した。【００９２】
図４に、Ｄｏｘ処理後における、Ｒｏｍａｎｅｓｃｏ及びＮＬＳ−ｉＲＦＰの蛍光（それぞれ、緑色及びマゼンタ系）の定量結果と、ＲＴ−ｑＰＣＲによって測定された、Ｒｏｍａｎｅｓｃｏが付加されたＮＬＳ−ｉＲＦＰのｍＲＮＡの発現量（黒色点）の定量結果を示す。Ｒｏｍａｎｅｓｃｏ及びＮＬＳ−ｉＲＦＰの蛍光の定量は、ｎ＝６６細胞の結果である。ＲＴ−ｑＰＣＲについては、３回の生物学的反復で行った。図中、ドット領域及び斜線領域は平均±ｓ.ｅ.ｍを表す。Ｒｏｍａｎｅｓｃｏ及びＮＬＳ−ｉＲＦＰの蛍光ダイナミクスと、ｍＲＮＡ発現量のダイナミクスとを比較したところ、Ｒｏｍａｎｅｓｃｏ蛍光シグナルは、Ｒｏｍａｎｅｓｃｏの蛍光ダイナミクスは、ｍＲＮＡ合成のダイナミクスに忠実に従っており、ＤＯＸ添加直後に急速に増加していた。これに対して、ＮＬＳ−ｉＲＦＰの蛍光シグナルは遅れていた。【００９３】
図５に、ＡｃｔＤ処理後における、Ｒｏｍａｎｅｓｃｏ及びＮＬＳ−ｉＲＦＰの蛍光の定量結果と、ＲＴ−ｑＰＣＲによって測定されたＲｏｍａｎｅｓｃｏが付加されたＮＬＳ−ｉＲＦＰのｍＲＮＡの発現量（黒色点）の定量結果を示す。図中、ドット領域及び斜線領域は平均±ｓ.ｅ.ｍを表す。Ｒｏｍａｎｅｓｃｏ及びＮＬＳ−ｉＲＦＰの蛍光の定量は、ｎ＝６７細胞の結果である。ＲＴ−ｑＰＣＲについては、３回の生物学的反復で行った。転写がＡｃｔＤ処理によって不活性化された場合、ＮＬＳ−ｉＲＦＰ蛍光シグナルは持続したが、Ｒｏｍａｎｅｓｃｏ蛍光シグナルは、ｍＲＮＡ分解ダイナミクスを反映して急激に減少した。これらの結果は、Ｒｏｍａｎｅｓｃｏの蛍光をモニタリングすることで、生細胞内のｍＲＮＡ合成及び分解の定量的測定が可能であることが明らかとなった。【００９４】
＜ｍＲＮＡコピー数とＲｏｍａｎｅｓｃｏシグナルとの間の直線性の単一細胞分析＞
Ｒｏｍａｎｅｓｃｏシグナルが、各単一細胞のｍＲＮＡのコピー数を直線的に反映するかどうかをさらに調べた。具体的には、Ｒｏｍａｎｅｓｃｏを発現する細胞を、最初にＲｏｍａｎｅｓｃｏシグナルを決定するために従来のエピ蛍光顕微鏡法により画像化し、次いで、単一細胞ＲＴ−ｑＰＣＲ実験に供して、各単一細胞について発現されたｍＲＮＡ分子のコピー数を分析した。結果を図６に示す。図中、破線は、検出限界に対応するバックグラウンドシグナルの平均±３ＳＤを表す（ｎ＝６３細胞）。実線は、対数変換されたデータに対する線形回帰を表す。この結果、１０３〜３×１０５分子（Ｒ２＝０．８７）の範囲で、ｍＲＮＡコピー数とＲｏｍａｎｅｓｃｏシグナルとの間に高い線形相関が確認された。【００９５】
＜時間依存型ＦＬＩＭ＞
前記単一細胞分析はまた、５．４×１０３未満のＲｏｍａｎｅｓｃｏ分子を有する細胞は、従来の顕微鏡によって視覚化することができないことを明らかにした。そこで、時間依存型ＦＬＩＭがＲｏｍａｎｅｓｃｏ発現をより敏感に視覚化できるかどうかを見るために、低コピー数のＲｏｍａｎｅｓｃｏを有する細胞を、蛍光シグナルを比較するために従来の落射蛍光顕微鏡法及び時間ゲートＦＬＩＭの両方で観察した。【００９６】
各細胞の落射蛍光顕微鏡法により得られた蛍光シグナルと、時間ゲートＦＬＩＭにより得られた蛍光シグナルの結果を図７に示す。各蛍光シグナルは、各顕微鏡（破線）の検出限界に対応する蛍光強度が１になるように、値を正規化した。図７に示すように、従来の顕微鏡法で検出限界以下の蛍光を示した細胞の大部分は、時間依存型ＦＬＩＭにおいて有意な蛍光を示した（１７細胞中、１３細胞）。すなわち、時間依存型ＦＬＩＭは、検出感度を大幅に向上させ、内因性遺伝子のｍＲＮＡレベルに近い１．４×１０３分子を発現する細胞は首尾よく視覚化された。これらの結果から、Ｒｏｍａｎｅｓｃｏが、広範囲の発現レベルにおいて特定のｍＲＮＡの細胞内含有量を定量的に求めることができ、転写活性のダイナミクスの解析に使用できることが明らかである。【００９７】
［実施例３］
実施例２において作製された、ＨＥＫ２９３細胞にｐＴ２−ＴＲＥ３Ｇ−ＮＬＳ−ｉＲＦＰ−ＲｏｍａｎｅｓｃｏをトランスフェクトしたＲｏｍａｎｅｓｃｏ発現細胞を、Ｄｏｘ及びＤＦＨＢＩ−１Ｔ存在下で培養し、当該細胞の発する蛍光シグナルを落射蛍光顕微鏡法により測定した。【００９８】
まず、当該Ｒｏｍａｎｅｓｃｏ発現細胞を、４ｍＭのＬ−グルタミン、１０％  ＦＢＳ、１ｍＭ  ピルビン酸ナトリウム、１％  ペニシリン／ストレプトマイシン、及び２０μＭ  ＤＦＨＢＩ−１Ｔを含有するＤ−ＭＥＭ（フェノールレッドなし、和光純薬社製）中で培養した。終濃度１μｇ／ｍＬのＤＯＸ（Clontech社製）を培地に添加して転写を誘導し、４８８ｎｍレーザービーム（０．５μＷ）を間欠的に照射してＲｏｍａｎｅｓｃｏを励起し、落射型の共焦点蛍光顕微鏡Ａ１Ｒで、Ｒｏｍａｎｅｓｃｏ発現細胞の蛍光画像を取得した。細胞へのレーザービーム照射は、２０ミリ秒間の露光の後８秒間遮光するサイクルを８回繰り返すプログラムで行った。１視野当たり、２０ミリ秒間の露光中、１０ミリ秒間ごとに１枚の蛍光画像を連続して撮像した。【００９９】
各サイクルにおいて、最初の１０ミリ秒間で撮像されたＤＦＨＢＩ−１Ｔが発光状態（ｏｎ  ｓｔａｔｅ）にある蛍光画像、その後の１０ミリ秒間で撮像されたＤＦＨＢＩ−１Ｔが非発光状態（ｏｆｆ  ｓｔａｔｅ）にある蛍光画像とした。一視野当たり得られた８枚の発光状態の蛍光画像を平均化したものを当該視野の発光状態の蛍光画像とした。同様に、一視野当たり得られた８枚の非発光状態の蛍光画像を平均化したものを当該視野の非発光状態の蛍光画像とした。各視野について、発光状態の蛍光画像の各画素の輝度値から、非発光状態の蛍光画像中の対応する画素の輝度値を差し引いた蛍光画像を、当該視野のＤＦＨＢＩ−１Ｔ蛍光画像とした。【０１００】
発光状態の蛍光画像を図８（Ａ）に、ＤＦＨＢＩ−１Ｔ蛍光画像を図８（Ｂ）に、それぞれ示す。図８（Ｂ）では、図８（Ａ）中のＲｏｍａｎｅｓｃｏ非発現細胞に由来する背景蛍光（矢印）や、Ｒｏｍａｎｅｓｃｏ発現細胞における自家蛍光（矢頭）が消失しており、Ｓ／Ｎ比の高いイメージングが実現された。【０１０１】
［実施例４］
実施例２において作製された、ＨＥＫ２９３細胞にｐＴ２−ＴＲＥ３Ｇ−ＮＬＳ−ｉＲＦＰ−ＲｏｍａｎｅｓｃｏをトランスフェクトしたＲｏｍａｎｅｓｃｏ発現細胞を用いて、Ｇ４  ｒｅｓｏｌｖａｓｅの活性を有するタンパク質のスクリーニングを行った。Ｇ４  ｒｅｓｏｌｖａｓｅの候補タンパク質として、３種のタンパク質（Ａ、Ｂ、Ｃ）を用いた。【０１０２】
具体的には、Ｒｏｍａｎｅｓｃｏ発現細胞に、候補タンパク質遺伝子の発現用プラスミドをトランスフェクトして発現させ、ＤＦＨＢＩ−1Ｔの存在下で、当該候補タンパク質を発現させたＮＬＳ−ｉＲＦＰ陽性細胞の緑色蛍光強度を測定した。プラスミドのトランスフェクト、各細胞の緑色蛍光強度の測定は、実施例１と同様にして行った。対照として、候補タンパク質を過剰発現していないＲｏｍａｎｅｓｃｏ発現細胞についても同様にしてＮＬＳ−ｉＲＦＰ陽性細胞の緑色蛍光強度を測定した。【０１０３】
各ＮＬＳ−ｉＲＦＰ陽性細胞の緑色蛍光強度の測定結果を図９に示す。図中、「Ａ」、「Ｂ」、及び「Ｃ」は、それぞれ、Ａタンパク質、Ｂタンパク質、及びＣタンパク質を発現させたＮＬＳ−ｉＲＦＰ陽性細胞の蛍光強度（Ａ．Ｕ．）の測定結果を示す。Ａタンパク質とＣタンパク質を過剰発現させた細胞では、対照の細胞よりも蛍光強度が小さく、これらのタンパク質は、Ｇ４  ｒｅｓｏｌｖａｓｅ活性を有するタンパク質であると選抜された。【０１０４】
一方で、Ｂタンパク質を過剰発現させた細胞では、対照の細胞よりも蛍光強度が大きく、当該タンパク質は、Ｇ４Ｒｏｍａｎｅｓｃｏの輝度を向上させる活性、すなわち、Ｇ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ構造の形成を促す活性を持つタンパク質として同定された。【０１０５】
なお、Ｇ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ構造を取ることができるＲＮＡを溶解させた溶液の円偏光二色性を計測することによって、Ｇ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ構造の形成の程度を測定することができる。Ａタンパク質とＣタンパク質は、Ｇ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ構造を取ることができるＲＮＡをin vitro transcriptionにて合成した反応溶液に添加した場合に、円偏光二色性が変化し、Ｇ−ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ構造がほどかれることが報告されている、すなわち、少なくともｉｎ  ｖｉｔｒｏではＧ４  ｒｅｓｏｌｖａｓｅ活性を有することが報告されているタンパク質である。細胞を用いた本発明におけるスクリーニング方法によって、Ａタンパク質とＣタンパク質が、細胞内でもＧ４  ｒｅｓｏｌｖａｓｅ活性を有することが確認された。【０１０６】
［実施例５］
実施例１で作製したＲｏｍａｎｅｓｃｏを用いて、標的遺伝子の転写産物の発現動態を調べた。【０１０７】
具体的には、まず、ＤＴ４０細胞のＣＤ８３遺伝子の３’ＵＴＲにＲｏｍａｎｅｓｃｏがノックインされたＣＤ８３標識細胞を作製した。当該ＣＤ８３標識細胞のＣＤ８３遺伝子ローカスの模式図を図１０Ａに示す。【０１０８】
ＣＤ８３標識細胞を培養するＤＦＨＢＩ−１Ｔ含有培地に、ＣＤ８３の表面抗原を添加して刺激することによって、ＣＤ８３の発現を誘導し、その転写産物の発現動態をＤＦＨＢＩ−１Ｔの蛍光強度変化として観察した。各細胞の蛍光強度は、実施例２と同様に落射蛍光顕微鏡法により測定した。ＣＤ８３の表面抗原刺激前（添加０分目）と、刺激から１分ごとに３６０分間、各細胞の蛍光画像を取得した。ある細胞について取得された３７枚の蛍光画像を図１０Ｂに示す。図中、上段（図中、「Ｒａｗ」）が一細胞の蛍光シグナルを経時的に検出した結果であり、下段（図中、「Ｍａｓｋｅｄ」）は、細胞領域を囲うＲＯＩを設定し、ＲＯＩ内の蛍光強度を平均化した結果を示す。標的遺伝子をＲｏｍａｎｅｓｃｏで標識することにより、一細胞レベルで標的遺伝子の転写動態を連続的に観測できた。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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