(57)【要約】  本発明は、α鎖、β鎖、γ鎖及びδ鎖からなる群から選択されるＴ細胞受容体鎖の定常領域を含むポリペプチドを２つ組み合わせてなる、Ｔ細胞受容体の改変体であって、該ポリペプチドが該Ｔ細胞受容体鎖の相補性決定領域（ＣＤＲ）、α鎖の相補性決定領域（ＣＤＲ）およびβ鎖の相補性決定領域（ＣＤＲ）を含まないことを特徴とする、改変体を提供する。
2020138256.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
α鎖、β鎖、γ鎖及びδ鎖からなる群から選択されるＴ細胞受容体鎖の定常領域を含むポリペプチドを２つ組み合わせてなる、Ｔ細胞受容体の改変体であって、該ポリペプチドが該Ｔ細胞受容体鎖の相補性決定領域（ＣＤＲ）、α鎖の相補性決定領域（ＣＤＲ）およびβ鎖の相補性決定領域（ＣＤＲ）を含まないことを特徴とする、改変体。
【請求項２】
前記ポリペプチドの一方がＴ細胞受容体α鎖又はβ鎖の定常領域を含み、他方がＴ細胞受容体α鎖又はβ鎖の定常領域を含む、請求項１に記載の改変体。
【請求項３】
２つのポリペプチドが１つ以上のジスルフィド結合で結合された、請求項１又は２に記載の改変体。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか１項に記載の改変体をコードする核酸分子。
【請求項５】
請求項４に記載の核酸分子を含む、ベクター。
【請求項６】
請求項５に記載のベクターを導入する工程を含む、細胞の製造方法。
【請求項７】
請求項１〜３のいずれか１項に記載の改変体を発現する細胞。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ｔ細胞受容体の改変体及び該改変体を発現する細胞等に関する。【０００２】
（発明の背景）
Ｔ細胞は、細菌やウイルスなどの外来の病原体や癌細胞などの異常な細胞に対する免疫システムにおいて中心的な役割を果たしている。なかでも、細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）は、その細胞表面上に存在するＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を介して、抗原提示細胞のクラス１主要組織適合抗原と共に提示された、ウイルスや腫瘍等由来の抗原ペプチドを認識し、異物である該抗原ペプチドを提示する細胞に対して特異的に細胞傷害活性を発揮する。【０００３】
このように、Ｔ細胞は免疫システムにおいて中心的な役割を果たしているため、患者由来の細胞、又はＨＬＡ遺伝子型が同一若しくは実質的に同一である同種細胞に、ウイルスや腫瘍等由来の抗原ペプチドを認識するＴＣＲ遺伝子、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）等を導入し、人為的に大量のがん抗原特異的Ｔ細胞をｉｎｖｉｔｒｏで作製し、生体内に輸注するアプローチであるＴ細胞療法の開発が進められている。しかしながら、遺伝子導入を受けるＴ細胞には、内在性のＴＣＲが存在しており、内在性のＴＣＲと導入したＴＣＲとが競合して、ＴＣＲの細胞表面への発現に必要なＣＤ３分子と結合することで、導入したＴＣＲの発現が阻害されるとの問題が生じる。また、遺伝子導入したＴＣＲ鎖が、内在性のＴＣＲ鎖とミスペアリングするとの問題も指摘されている。さらに、同種細胞を用いた場合には、内在性のＴＣＲがレシピエントの抗原を認識し、移植片対宿主病（ＧｖＨＤ）を引き起こす可能性も存在する。【０００４】
これらの問題を解決する方法として、ＴＣＲβ鎖の定常領域（Ｃβ）に、α鎖の可変領域（Ｖα）とβ鎖の可変領域（Ｖβ）とを融合させた一本鎖のキメラＴＣＲと、ＴＣＲα鎖の定常領域（Ｃα）を細胞に導入する方法が報告されており、該方法により内在性のＴＣＲα鎖とのミスマッチを抑制でき、それにより予期せぬｉｎｖｉｖｏ作用を抑制することが可能と考えられることが報告されている（非特許文献１）。また、導入するＴＣＲのα鎖とβ鎖の定常領域にシステインを導入することで、導入されたＴＣＲ鎖と内在性のＴＣＲ鎖とのミスマッチを抑制できることも報告されている（非特許文献２）。しかしながら、これらの文献は、導入したＴＣＲ鎖と、内在性のＴＣＲ鎖とでミスマッチが生じることを防ぐことに主に焦点を当てており、内在性のＴＣＲ鎖のアロ反応性（Ａｌｌｏｒｅａｃｔｉｖｉｔｙ）については検証しておらず、また、抗原−ＨＬＡ複合体の認識に重要であるＴＣＲα鎖及びβ鎖のいずれの相補性決定領域（ＣＤＲ）も有さないＴＣＲの改変体については、開示も示唆さえもない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Knies D. et al., Oncotarget, 7(16):21199-21221 (2016）
【非特許文献２】Kuball J. et al., blood, 109(6):2331-2338 (2007)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
従って、本発明は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）α鎖及びβ鎖のいずれの相補性決定領域（ＣＤＲ）も有さない、新規なＴ細胞受容体の改変体を提供することを課題とする。また、該改変体を発現する、アロ反応性（Ａｌｌｏｒｅａｃｔｉｖｉｔｙ）が抑制されたＴ細胞を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、上記課題を解決できる、アロ反応性が抑制されたＴ細胞受容体（ＴＣＲ）の開発を進めていたところ、ＴＣＲα鎖及びβ鎖のＣＤＲを含まないＴ細胞受容体の改変体が導入された細胞では、意外にも内在性のＴＣＲに起因すると考えられるアロ反応性が抑制されているとの知見を見出した。また、ＴＣＲ鎖の異なる鎖を組み合わせる、即ちαβＴＣＲの定常領域と、γδＴＣＲのＣＤＲを有する改変ＴＣＲも、同様にＴ細胞のアロ反応性を抑制できることを見出した。これらの知見に基づき鋭意研究した結果、本発明を完成させるに至った。【０００８】
即ち、本発明は以下を提供する。
［１］  α鎖、β鎖、γ鎖及びδ鎖からなる群から選択されるＴ細胞受容体鎖の定常領域を含むポリペプチドを２つ組み合わせてなる、Ｔ細胞受容体の改変体であって、該ポリペプチドが該Ｔ細胞受容体鎖の相補性決定領域（ＣＤＲ）、α鎖の相補性決定領域（ＣＤＲ）およびβ鎖の相補性決定領域（ＣＤＲ）を含まないことを特徴とする、改変体。
［２］  前記ポリペプチドの一方がＴ細胞受容体α鎖又はβ鎖の定常領域を含み、他方がＴ細胞受容体α鎖又はβ鎖の定常領域を含む、［１］に記載の改変体。
［２ａ］  前記ポリペプチドの少なくとも一方が、Ｔ細胞受容体γ鎖の相補性決定領域（ＣＤＲ）、及び／又はＴ細胞受容体δ鎖の相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む、［２］に記載の改変体。
［２ｂ］  前記ポリペプチドの少なくとも一方に含まれる定常領域がα鎖の定常領域であり、かつ相補性決定領域（ＣＤＲ）がγ鎖の相補性決定領域（ＣＤＲ）である、［２ａ］に記載の改変体。
［２ｃ］  前記ポリペプチドの少なくとも一方に含まれる定常領域がβ鎖の定常領域であり、かつ相補性決定領域（ＣＤＲ）がδ鎖の相補性決定領域（ＣＤＲ）である、［２ａ］又は［２ｂ］に記載の改変体。
［３］  ２つのポリペプチドが１つ以上のジスルフィド結合で結合された、［１］〜［２ｃ］のいずれかに記載の改変体。
［３ａ］  前記ポリペプチドがさらに１つ以上のシグナルペプチドを含む、［１］〜［３］のいずれかに記載の改変体。
［３ｂ］  前記シグナルペプチドが、Ｔ細胞受容体鎖の定常領域のＮ末端に結合している、［３ａ］に記載の改変体。
［３ｃ］  前記シグナルペプチドが、ＣＤ８および／またはＩＧＨのシグナルペプチドである、［３ａ］に記載の改変体。
［４］  ［１］〜［３ｃ］のいずれかに記載の改変体をコードする核酸分子。
［５］  ［４］に記載の核酸分子を含む、ベクター。
［６］  ［５］に記載のベクターを導入する工程を含む、細胞の製造方法。
［６ａ］  ［１］〜［３ｃ］のいずれかに記載の改変体をコードする核酸を含む多能性幹細胞。
［６ｂ］  前記多能性幹細胞が人工多能性幹細胞（iPS細胞）である、［６ａ］に記載の細胞。
［７］  ［１］〜［３ｃ］のいずれかに記載の改変体を発現する細胞。
【発明の効果】
【０００９】
本発明のＴ細胞受容体の改変体は、細胞に導入されると、該細胞のアロ反応性を抑制することができるため、同種移植における移植片対宿主病（ＧｖＨＤ）のリスクを低減することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】図１は、ＴＣＲ鎖の可変領域を含まず、Ｃ領域を含むＴＣＲの改変体を発現するＴ細胞について、フローサイトメトリーを用いて細胞膜表面上のＣＤ３分子の発現を検出した結果を示す。横軸はCD3分子の細胞膜表面発現、縦軸は細胞数をそれぞれ示す。
【図２】図２は、レンチウイルスベクターを用いてＡＢ６を遺伝子導入したｉＰＳ細胞から分化させた細胞膜上に発現するＣＤ３、ＣＤ５、ＣＤ７およびαβＴＣＲの発現をフローサイトメトリーで測定した結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
（発明の詳細な説明）
１．Ｔ細胞受容体の改変体
本発明は、α鎖、β鎖、γ鎖及びδ鎖からなる群から選択されるＴ細胞受容体（ＴＣＲ）鎖の定常領域を含むポリペプチドを２つ組み合わせてなる、Ｔ細胞受容体の改変体（以下「本発明の改変体」と称する場合がある）を提供する。本発明の改変体は、ＴＣＲα鎖及びβ鎖の相補性決定領域（ＣＤＲ）、又は同一種類の鎖の相補性決定領域（ＣＤＲ）（好ましくは該ＣＤＲを含む可変領域の一部又は全部）をいずれも含まないこと、および、定常領域が由来するＴ細胞受容体鎖の相補性決定領域（ＣＤＲ）、又は同一種類の鎖の相補性決定領域（ＣＤＲ）（好ましくは該ＣＤＲを含む可変領域の一部又は全部）を含まないことを特徴とする。従って、本発明の改変体には、天然型又は人工型（例えば、定常領域と可変領域の由来となる動物種が異なる）のαβＴＣＲ、γδＴＣＲ、あるいはこれらのＴＣＲにアミノ酸がさらに付加されたＴＣＲ改変体は包含されない。例えば、本発明の改変体の少なくとも一方の鎖に該当するポリペプチドが、Ｔ細胞受容体α鎖の定常領域を含む場合には、該ポリペプチドには、Ｔ細胞受容体α鎖のＣＤＲ、好ましくは該ＣＤＲを含む可変領域の一部又は全部、を含まないが、α鎖およびβ鎖以外、の異なるＴＣＲ鎖、例えばγ鎖、δ鎖のＣＤＲや可変領域は含んでいてもよい。同様に、本発明の改変体の少なくとも一方の鎖に該当するポリペプチドが、Ｔ細胞受容体β鎖の定常領域を含む場合には、該ポリペプチドには、Ｔ細胞受容体β鎖のＣＤＲ、好ましくは該ＣＤＲを含む可変領域の一部又は全部、を含まないが、α鎖およびβ鎖以外、の異なるＴＣＲ鎖、例えばγ鎖、δ鎖のＣＤＲや可変領域は含んでいてもよい。γ鎖及びδ鎖についても同様である。本発明の一態様において、Ｔ細胞受容体β鎖は、Ｔ細胞受容体β１鎖（配列番号２）またはＴ細胞受容体β２鎖（配列番号３）を含む。本発明の一態様において、Ｔ細胞受容体β鎖はＴ細胞受容体β１鎖（配列番号２）およびＴ細胞受容体β２鎖（配列番号３）を含む。
【００１２】
また、本発明のポリペプチドはさらに、膜移行シグナルペプチド（以下、「シグナルペプチド」と称する）が付加されていてもよい。シグナルペプチドとしては、ＣＤ８、Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ−Ｈ（ＩＧＨ）、ＣＤ４の他、膜貫通ドメインを有する各種ペプチドをコードする遺伝子に由来する膜移行シグナルペプチド及び／または、当該シグナルペプチドのアミノ酸配列において１若しくは数個（例えば、２個、３個、４個、５個）のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／若しくは付加されたアミノ酸配列、もしくは当該シグナルペプチドのアミノ酸配列と同一性を有するアミノ酸配列からなるシグナルペプチドを使用することができる。シグナルペプチドが付加する場合の結合位置およびシグナルペプチドの数は特に限定されない。
【００１３】
本明細書において、「Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）」とは、ＴＣＲ鎖（α鎖、β鎖、γ鎖、δ鎖）のダイマーから構成され、抗原又は該抗原−ＨＬＡ（ヒト白血球型抗原）（ＭＨＣ；主要組織適合遺伝子複合体）複合体を認識してＴ細胞へ刺激シグナルを伝達する受容体を意味する。それぞれのＴＣＲ鎖は可変領域と定常領域から構成され、可変領域には、３つの相補性決定領域（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３）が存在する。ＴＣＲの改変体は、各ポリペプチドが上記ＴＣＲ鎖の定常領域を少なくとも含む、該ＴＣＲ鎖のダイマーを意味する。
【００１４】
本発明の一態様において、本発明の改変体を構成する一方のポリペプチドがＴ細胞受容体α鎖又はβ鎖の定常領域（Ｃ領域ともいう）を含み、他方がＴ細胞受容体α鎖又はβ鎖の定常領域を含む改変体が提供される。該改変体は、一方のポリペプチドがＴＣＲγ鎖のＣＤＲ、好ましくは該ＣＤＲを含むＴＣＲγ鎖の可変領域の一部又は全部、及び／又はＴＣＲδ鎖のＣＤＲ、好ましくは該ＣＤＲを含むＴＣＲδ鎖の可変領域の一部又は全部、を含んでいることが好ましい。かかる可変領域の少なくとも一部を含む場合、好ましくは、本発明の改変体を構成する少なくとも一方のポリペプチドの定常領域がＴＣＲα鎖又はβ鎖の定常領域であり、かつＣＤＲがγ鎖又はδ鎖のＣＤＲであることが好ましい。より好ましくは、本発明の改変体を構成する一方のポリペプチドの定常領域がＴＣＲα鎖の定常領域であり、ＣＤＲがγ鎖のＣＤＲであり、かつ他方のポリペプチドの定常領域がＴＣＲβ鎖の定常領域であり、ＣＤＲがδ鎖のＣＤＲである。
【００１５】
本発明の一態様として、ＴＣＲ鎖のＣＤＲを含む可変領域の一部又は全部を含まず、Ｃ領域を含む改変体が提供される。該改変体は例えば、一方のポリペプチドがＴ細胞受容体α鎖又はβ鎖の定常領域を含み、他方がＴ細胞受容体α鎖又はβ鎖の定常領域を含むことができる。また、該改変体は、例えば、一方のポリペプチドがＴ細胞受容体γ鎖又はδ鎖の定常領域を含み、他方がＴ細胞受容体γ鎖又はδ鎖の定常領域を含むことができる。また、該改変体は例えば、一方のポリペプチドがＴ細胞受容体α鎖又はβ鎖の定常領域を含み、他方がＴ細胞受容体γ鎖又はδ鎖の定常領域を含むことができる。
【００１６】
本発明の改変体を構成するポリペプチドとして、例えば、配列番号１で示されるアミノ酸配列、配列番号１で示されるアミノ酸配列において１若しくは数個（例えば、２個、３個、４個、５個）のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／若しくは付加されたアミノ酸配列、又は配列番号１で示されるアミノ酸配列と同一性を有するアミノ酸配列からなるＴＣＲα鎖の定常領域を含むポリペプチド（以下「ポリペプチド１」と称する）が挙げられる。また、本発明の改変体を構成するポリペプチドとして、例えば、配列番号２または３で示されるアミノ酸配列、配列番号２または３で示されるアミノ酸配列において１若しくは数個（例えば、２個、３個、４個、５個）のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／若しくは付加されたアミノ酸配列、又は配列番号２または３で示されるアミノ酸配列と同一性を有するアミノ酸配列からなるＴＣＲβ鎖の定常領域を含むポリペプチド（以下それぞれ「ポリペプチド２」及び「ポリペプチド３」と称する）が挙げられる。本発明の好ましい実施態様において、本発明の改変体は、前記ポリペプチド１（ＴＣＲα鎖の定常領域）及びポリペプチド２（ＴＣＲβ１鎖の定常領域）、または前記ポリペプチド１（ＴＣＲα鎖の定常領域）及びポリペプチド３（ＴＣＲβ２鎖の定常領域）からなる。
【００１７】
本発明の一実施形態として、ＴＣＲ鎖のＣＤＲを含む可変領域の一部又は全部を含まず、Ｃ領域を含むポリペプチド（例えば、前記ポリペプチド１及びポリペプチド２、または前記ポリペプチド１及びポリペプチド３からなる改変体）をより効率的に細胞膜表面上に発現させるために、少なくともいずれかのポリペプチドにさらにシグナルペプチドが付加されていることが好ましい。シグナルペプチドとしては、ＣＤ８、ＩＧＨが好ましい。シグナルペプチドが付加する場合の結合位置は特に限定されず、ＴＣＲのＣ領域を含むポリペプチドのＣ末端またはＮ末端に付加することが好ましく、Ｎ末端に付加することがより好ましい。シグナルペプチドが付加する場合のシグナルペプチドの数は特に限定されず、各ポリペプチドに対して１つ以上付加することが好ましく、１つ付加することが好ましい。
【００１８】
シグナルペプチドとしては、例えば、配列番号４（ＣＤ８）または５（ＩＧＨ）で示されるアミノ酸配列、配列番号４または５で示されるアミノ酸配列においてそれぞれ１若しくは数個（例えば、２個、３個、４個、５個）のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／若しくは付加されたアミノ酸配列、又は配列番号４または５で示されるアミノ酸配列とそれぞれ同一性を有するアミノ酸配列からなるシグナルペプチド（以下それぞれ「シグナルペプチド４」および「シグナルペプチド５」と称する）が挙げられる。
本発明の好ましい実施態様において、本発明の改変体は、前記シグナルペプチド５がポリペプチド１のＮ末端に付加した、配列番号８もしくは１１で示されるポリペプチド（以下、「ポリペプチド８」および「ポリペプチド１１」と称する）、および前記シグナルペプチド４がポリペプチド２のＮ末端に付加した、配列番号７もしくは１０で示されるポリペプチド（以下、「ポリペプチド７」および「ポリペプチド１０」と称する）からなる。
また、本発明の別の好ましい実施態様において、ポリペプチド８もしくはポリペプチド１１、および前記シグナルペプチド４がポリペプチド３のＮ末端に付加した、配列番号１３もしくは１５で示されるポリペプチド（以下、「ポリペプチド１３」および「ポリペプチド１５」と称する）からなる。
【００１９】
また、本発明の改変体を構成するポリペプチドとして、ＴＣＲγ鎖の可変領域を含むポリペプチドが挙げられる。また、本発明の改変体を構成するポリペプチドとして、ＴＣＲδ鎖の可変領域を含むポリペプチドが挙げられる。
【００２０】
本明細書において、「同一性」とは、90％以上の（例：91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％若しくは99％又はそれより高い）同一性を意味する。アミノ酸配列の同一性は、以下の条件下（expectancy =10; gap allowed; matrix=BLOSUM62; filtering=OFF）で、相同性計算アルゴリズムのNCBI BLAST（National Center for Biotechnology Information Basic Local Alignment Search Tool）（https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）を用いて計算することができる。同一性を決定するため、全長にわたる本発明の配列を別の配列と比較することが理解される。言い換えれば、本発明における同一性は、本発明の配列の短い断片（例えば１〜３アミノ酸）を別の配列と比較すること、又はその逆を除外する。
【００２１】
本発明の改変体に含まれるＴＣＲ鎖の定常領域、可変領域及びＣＤＲの由来は、特に制限されないが、動物哺乳動物（例：マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、ネコ、イヌ、ウシ、ヒツジ、サル、ヒト）に由来するものが好ましく、なかでもヒトに由来するものがより好ましい。
【００２２】
また、本発明の改変体に含まれるＴＣＲ鎖の定常領域は、天然型のＴＣＲ鎖の定常領域において、所定の改変が施されていることが好ましい。この改変としては、例えば、天然型のＴＣＲの定常領域の特定のアミノ酸残基をシステイン残基に置換（例：配列番号１で示されるアミノ酸配列からなる定常領域の48番目のスレオニン（トレオニン）をシステインに置換、配列番号２または配列番号３で示されるアミノ酸配列からなる定常領域の56番目又は55番目のセリンをシステインに置換）することで、α鎖とβ鎖間のジスルフィド結合によるダイマー発現効率を亢進することなどが挙げられるが、これらに限定されない。好ましい実施態様において、２つのポリペプチドが１つ以上、好ましくは２つ以上のジスルフィド結合で結合されていることが好ましく、該ジスルフィド結合は、改変体の各ポリペプチドの含まれるシステイン残基（天然型に含まれているものでもよいし、上述のように人工的に導入したものでもよい）間で、酸化又は翻訳後修飾により形成される。
【００２３】
本発明の改変体は、後述する本発明の核酸又はベクターを使用して遺伝子工学的に作製することができる。例えば、本発明の改変体を構成する一方のポリペプチドをコードする核酸及び他方のポリペプチドをコードする核酸の両方を細胞に導入して、各ポリペプチドを発現させてダイマーを形成させ、自体公知の方法により該ダイマーを単離することで作製することができる。
【００２４】
２．本発明の改変体をコードする核酸又は該核酸を含むベクター
本発明は、上述した本発明のＴＣＲをコードする核酸（以下「本発明の核酸」と称する場合がある）を提供する。本発明の核酸としては、本発明の改変体を構成する一方のポリペプチドをコードする核酸と、他方のポリペプチドをコードする核酸とは、別の分子に含まれていてもよく、両方のポリペプチドをコードする核酸が単一の分子に含まれていてもよい。
【００２５】
本発明の核酸はＤＮＡであってもＲＮＡであってもよく、あるいはＤＮＡ/ＲＮＡキメラであってもよいが、好ましくはＤＮＡである。また、該核酸は二本鎖であっても、一本鎖であってもよい。二本鎖の場合は、二本鎖ＤＮＡ、二本鎖ＲＮＡ又はＤＮＡ：ＲＮＡのハイブリッドでもよい。核酸がＲＮＡである場合は、ＲＮＡの配列については、配列表におけるＴをＵと読み替えることとする。また、本発明の核酸は、ｉｎｖｉｔｒｏ又は細胞中で、ポリペプチドを発現できる限り、天然ヌクレオチド、修飾ヌクレオチド、ヌクレオチド類似体、又はこれらの混合物を含んでもよい。
【００２６】
本発明の核酸は、自体公知の方法により作製することができ、例えば、ＴＣＲ鎖の公知のＤＮＡ配列情報に基づいて、当該配列の所望の部分をカバーするようにオリゴＤＮＡプライマーを合成し、当該配列を有する細胞より調製した全ＲＮＡもしくはｍＲＮＡ画分を鋳型として用い、ＲＴ−ＰＣＲ法によって増幅することにより、クローニングすることができる。あるいは、化学的にＤＮＡ鎖を合成するか、もしくは合成した一部オーバーラップするオリゴＤＮＡ短鎖を、ＰＣＲ法（オーバーラップＰＣＲ法）やＧｉｂｓｏｎＡｓｓｅｍｂｌｙ法を利用して接続することにより、その全長又は一部をコードするＤＮＡを構築することが可能である。
【００２７】
本発明の核酸は、発現ベクターに組み込むことができる。従って、本発明は、上述した本発明の核酸を含む発現ベクター（以下「本発明のベクター」と称する場合がある）を提供する。
【００２８】
本発明のベクターに使用されるプロモーターとしては、例えば、ユビキチンプロモーター、ＥＦ１αプロモーター、ＣＡＧプロモーター、ＳＲαプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＬＴＲプロモーター、ＣＭＶ（サイトメガロウイルス）プロモーター、ＲＳＶ（ラウス肉腫ウイルス）プロモーター、ＭｏＭｕＬＶ（モロニーマウス白血病ウイルス）ＬＴＲ、ＨＳＶ-ＴＫ（単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ）プロモーターなどが用いられる。なかでも、ユビキチンプロモーター、ＥＦ１αプロモーター、ＣＡＧプロモーター、ＭｏＭｕＬＶＬＴＲ、ＣＭＶプロモーター、ＳＲαプロモーターなどが好ましい。
【００２９】
本発明のベクターは、上記プロモーターの他に、所望により、転写及び翻訳調節配列、リボソーム結合部位、エンハンサー、複製起点、ポリＡ付加シグナル、選択マーカー遺伝子などを含んでいてもよい。選択マーカー遺伝子としては、例えば、ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子、ピューロマイシン耐性遺伝子などが挙げられる。
【００３０】
本発明の一態様において、上述した本発明の改変体を構成する一方のポリペプチドをコードする核酸と、他方のポリペプチドをコードする核酸とを含む発現ベクターを標的細胞内に導入し、細胞内や細胞表面に両方のポリペプチドのヘテロダイマーを構成することができる。この場合において、本発明の改変体を構成する一方のポリペプチドをコードする核酸と、他方のポリペプチドをコードする核酸は、別々の発現ベクターに組み込んでもよいし、１つの発現ベクターに組み込んでもよい。1つの発現ベクターに組み込む場合には、これら２種類の核酸は、ポリシストロニック発現を可能にする配列を介して組み込むことが好ましい。ポリシストロニック発現を可能にする配列を用いることにより、1種類の発現ベクターに組み込まれている複数の遺伝子をより効率的に発現させることが可能になる。ポリシストロニック発現を可能にする配列としては、例えば、２Ａ配列（例：口蹄疫ウイルス（ＦＭＤＶ）由来の２Ａ配列（Ｆ２Ａ）、ウマ鼻炎Ａウイルス（ＥＲＡＶ）由来の２Ａ配列（Ｅ２Ａ）、Ｐｏｒｃｉｎｅｔｅｓｃｈｏｖｉｒｕｓ（ＰＴＶ−１）由来の２Ａ配列（Ｐ２Ａ）、Ｔｈｏｓｅａ  ａｓｉｇｎａ  ｖｉｒｕｓ（ＴａＶ）由来の２Ａ配列（Ｔ２Ａ））（PLoS ONE, 3:e2532, 2008、Stem Cells 25, 1707, 2007等）、内部リボソームエントリー部位（ＩＲＥＳ）（U.S. Patent No. 4,937,190）などが挙げられるが、均一な発現量の観点からは、２Ａ配列が好ましい。また、２Ａ配列のうち、Ｐ２Ａ配列およびＴ２Ａ配列が好ましい。
【００３１】
本発明に用いることができる発現ベクターとしては、ウイルスベクター、プラスミドベクターなどが挙げられる。ウイルスベクターとしては、レトロウイルスベクター（レンチウイルスベクターやシュードタイプベクターを含む）、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター、センダイウイルス、エピソーマルベクターなどが挙げられる。また、トランスポゾン発現システム（例：ＰｉｇｇｙＢａｃシステム）を用いてもよい。プラスミドベクターとしては、動物細胞発現プラスミド（例：ｐａ１−１１、ｐＸＴ１、ｐＲｃ/ＣＭＶ、ｐＲｃ/ＲＳＶ、ｐｃＤＮＡＩ/Ｎｅｏ）などが挙げられる。
【００３２】
３．本発明の改変体を発現するＴ細胞
本発明は、本発明の核酸又はベクターが導入された細胞（以下「本発明の細胞」と称する場合がある）を提供する。本発明の細胞は、本発明の改変体を発現していることが好ましい。
【００３３】
本発明の核酸又は発現ベクターを導入する細胞としては、例えば、リンパ球、リンパ球の前駆細胞、多能性幹細胞が挙げられる。本発明において、「リンパ球」とは、脊椎動物の免疫系における白血球のサブタイプの一つを意味し、リンパ球としては、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラー細胞（ＮＫ細胞）が挙げられる。本発明の核酸又はベクターを導入する細胞としては、多能性幹細胞が好ましい。
【００３４】
本発明において、「Ｔ細胞」とは、ＣＤ３陽性細胞を意味する。本発明の改変体を発現するＴ細胞としては、例えば、ＣＤ８陽性細胞である細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）、ＣＤ４陽性細胞であるヘルパーＴ細胞、制御性Ｔ細胞、エフェクターＴ細胞などが挙げられるが、好ましくは、細胞傷害性Ｔ細胞である。本発明の改変体を発現するＴ細胞は、生体より採取されたＴ細胞に、本発明の核酸又はベクターを導入することにより得ることができる。あるいは、本発明の核酸又はベクターが導入された、多能性幹細胞又はリンパ球の前駆細胞からＴ細胞へ分化誘導することで、本発明のＴＣＲを発現するＴ細胞（即ち、該多能性化細胞又は前駆細胞に由来するＴ細胞）を得ることができる。
本発明の一形態において、Ｔ細胞はＣＤ３に加えて、ＣＤ５および／またはＣＤ７を発現する場合がある。ＣＤ５および／またはＣＤ７は生体内のＴ細胞においてもその細胞表面に発現する場合がある。Ｔ細胞がＣＤ５および／またはＣＤ７を発現する場合、ＣＤ３はＴ細胞において、ＴＣＲと複合体を形成することにより細胞表面に発現するのに対し、ＣＤ５およびＣＤ７はＴＣＲ分子と複合体を形成することなく発現する。
【００３５】
本発明の細胞（例：細胞傷害性Ｔ細胞）は、該細胞が本来有するＴＣＲ遺伝子に加えて、本発明の核酸又はベクターに由来する外因性のＴＣＲ遺伝子も有する。この点において、本発明の細胞は、生体より採取された細胞とは異なる。本発明の細胞は、本発明の改変体に加えて、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現していてもよい。
【００３６】
前記リンパ球は、ヒト又は非ヒト哺乳動物の例えば末梢血、骨髄及び臍帯血より採取することができる。本発明の改変体を発現する細胞を、癌などの疾患の治療に用いる場合には、当該細胞集団は治療対象本人、又は治療対象のＨＬＡタイプと一致したドナーから採取することが好ましい。
【００３７】
リンパ球の前駆細胞としては、例えば、造血幹細胞、自己複製能を失った多能性前駆細胞（multipotent progenitor：ＭＭＰ）、ミエローリンフォイド共通前駆細胞（ＭＬＰ）、ミエロイド系前駆細胞（ＭＰ）、顆粒球単核前駆細胞（ＧＭＰ）、マクロファージ−樹状細胞前駆細胞（ＭＤＰ）、樹状細胞前駆細胞（ＤＣＰ）などが挙げられる。多能性幹細胞としては、例えば、胚性幹細胞（embryonic stem cell：ＥＳ細胞）、人工多能性幹細胞（induced pluripotent stem cell：ｉＰＳ細胞）、胚性腫瘍細胞（ＥＣ細胞）、胚性生殖幹細胞（ＥＧ細胞）などが挙げられる。上記多能性幹細胞がＥＳ細胞又はヒト胚に由来する任意の細胞である場合、その細胞は胚を破壊して作製された細胞であっても、胚を破壊することなく作製された細胞であってもよいが、好ましくは、胚を破壊することなく作製された細胞である。
【００３８】
本明細書において、「多能性幹細胞（pluripotent stem cell）」とは、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）及びこれと同様の分化多能性、すなわち生体の様々な組織（内胚葉、中胚葉、外胚葉の全て）に分化する能力を潜在的に有する細胞を指す。ES細胞と同様の分化多能性を有する細胞としては、「人工多能性幹細胞」（本明細書中、「iPS細胞」と称することもある）が挙げられる。
【００３９】
「ES細胞」としては、マウスES細胞であれば、inGenious targeting laboratory社、理研（理化学研究所）等が樹立した各種マウスES細胞株が利用可能であり、ヒトES細胞であれば、NIH、理研、京都大学、Cellartis社が樹立した各種ヒトES細胞株が利用可能である。たとえば、ヒトES細胞株としては、NIHのCHB-1〜CHB-12株、RUES1株、RUES2株、HUES1〜HUES28株等、WisCell ResearchのH1株、H9株、理研のKhES-1株、KhES-2株、KhES-3株、KhES-4株、KhES-5株、SSES1株、SSES2株、SSES3株等を利用することができる。
【００４０】
本明細書において、「人工多能性幹細胞（iPS細胞）」とは、哺乳動物体細胞又は未分化幹細胞に、特定の因子（核初期化因子）を導入して再プログラミングすることにより得られる細胞を指す。現在、「人工多能性幹細胞」にはさまざまなものがあり、山中らにより、マウス線維芽細胞にOct3/4・Sox2・Klf4・c-Mycの４因子を導入することにより、樹立されたiPS細胞（Takahashi K, Yamanaka S., Cell, (2006) 126: 663-676）のほか、同様の４因子をヒト線維芽細胞に導入して樹立されたヒト細胞由来のiPS細胞（Takahashi K, Yamanaka S., et al. Cell, (2007) 131: 861-872.）、上記４因子導入後、Nanogの発現を指標として選別し、樹立したNanog-iPS細胞（Okita, K., Ichisaka, T., and Yamanaka, S. (2007). Nature 448, 313-317.）、c-Mycを含まない方法で作製されたiPS細胞（Nakagawa M, Yamanaka S., et al. Nature Biotechnology, (2008) 26, 101-106）、ウイルスフリー法で6因子を導入して樹立されたiPS細胞（Okita K et al. Nat. Methods 2011 May;8(5):409-12, Okita K et al. Stem Cells. 31(3):458-66.）も用いることができる。また、Thomsonらにより作製されたOCT3/4・SOX2・NANOG・LIN28の４因子を導入して樹立された人工多能性幹細胞（Yu J., Thomson JA. et al., Science (2007) 318: 1917-1920.）、Daleyらにより作製された人工多能性幹細胞（Park IH, Daley GQ. et al., Nature (2007) 451: 141-146）、桜田らにより作製された人工多能性幹細胞（特開2008-307007号）等も用いることができる。
【００４１】
このほか、公開されているすべての論文（例えば、Shi Y., Ding S., et al., Cell Stem Cell, (2008) Vol3, Issue 5,568-574；Kim JB., Scholer HR., et al., Nature, (2008) 454, 646-650；Huangfu D., Melton, DA., et al., Nature Biotechnology, (2008) 26, No 7, 795-797）、あるいは特許（例えば、特開2008-307007号、特開2008-283972号、US2008-2336610、US2009-047263、WO2007-069666、WO2008-118220、WO2008-124133、WO2008-151058、WO2009-006930、WO2009-006997、WO2009-007852）に記載されている当該分野で公知の人工多能性幹細胞のいずれも用いることができる。
【００４２】
人工多能性細胞株としては、NIH、理研、京都大学等が樹立した各種iPS細胞株が利用可能である。例えば、ヒトiPS細胞株であれば、理研のHiPS-RIKEN-1A株、HiPS-RIKEN-2A株、HiPS-RIKEN-12A株、Nips-B2株、京都大学の253G1株、201B7株、409B2株、454E2株、606A1株、610B1株、648A1株、1231A3株、FfI-01s04株等が挙げられる。
【００４３】
本発明において、「造血前駆細胞」とは、血球系細胞に分化し得る多能性幹細胞（multipotent stem cell）である。ヒトでは、主として骨髄に存在し、白血球（好中球、好酸球、好塩基球、リンパ球、単球、マクロファージ）、赤血球、血小板、肥満細胞、樹状細胞に分化する。また本発明において、「造血前駆細胞」とは、ＣＤ３４陽性細胞を意味し、好ましくは、ＣＤ３４/ＣＤ４３両陽性（ＤＰ）細胞である。本発明に用いる造血前駆細胞の由来は制限されず、例えば、下述の方法により、多能性幹細胞を分化誘導することにより得られる造血前駆細胞であってもよく、また、生体組織から、公知の手法により単離した造血前駆細胞であってもよい。
【００４４】
多能性幹細胞又はリンパ球の前駆細胞に本発明の核酸又は発現ベクターを導入する場合、該細胞は、自体公知の方法により、リンパ球、好ましくはＴ細胞に分化させることが好ましい。多能性幹細胞をＴ細胞に分化させる方法として、例えば、(1)本発明の核酸又はベクターが導入された多能性幹細胞を、造血前駆細胞に分化させる工程、及び(2)該造血前駆細胞をＴ細胞に分化させる工程を含む方法が挙げられる。前記工程(1)は、例えば、国際公開第２０１３／０７５２２２号、国際公開第２０１６／０７６４１５号及びLiu S.et al., Cytotherapy, 17 (2015);344-358などに記載されているように、造血前駆細胞への誘導培地中で多能性幹細胞を培養する方法が挙げられる。また、前記工程(2)は、国際公開第２０１６／０７６４１５号などに記載されているような、(2-1)造血前駆細胞からＣＤ４ＣＤ８両陽性T細胞を誘導する工程、及び(2-2)ＣＤ４ＣＤ８両陽性Ｔ細胞からＣＤ８陽性Ｔ細胞を誘導する工程を含む方法が挙げられる。
【００４５】
本発明の核酸又はベクターを細胞に導入する方法に特に限定はなく、公知の方法を用いることができる。核酸やプラスミドベクターを導入する場合には、例えば、リン酸カルシウム共沈殿法、ＰＥＧ法、エレクトロポレーション法、マイクロインジェクション法、リポフェクション法などにより行うことができる。例えば、細胞工学別冊８  新細胞工学実験プロトコール，263-267 (1995)（秀潤社発行）、ヴィロロジー（Virology），52巻，456 (1973)、日薬理誌（Folia Pharmacol. Jpn.）, 第119巻 (第6号), 345-351 (2002) などに記載の方法を用いることができる。ウイルスベクターを用いる場合には、本発明の核酸を適当なパッケージング細胞（例、Ｐｌａｔ−Ｅ細胞）や相補細胞株（例、２９３細胞）に導入して、培養上清中に産生されるウイルスベクターを回収し、各ウイルスベクターに応じた適切な方法により、該ベクターを細胞に感染させることで、細胞に導入することができる。例えば、ベクターとしてレトロウイルスベクターを用いる具体的手段が、国際公開第２００７/６９６６６号、Cell, 126, 663-676 (2006) 及び Cell, 131, 861-872 (2007)などに開示されている。また、ベクターとしてレンチウイルスを用いる具体的手段が、Zufferey R. et al., Nat Biotechnol, 15(9):871-895 (1997)などに開示されている。特に、レトロウイルスベクターを用いる場合には、組換えフィブロネクチンフラグメントであるＣＨ−２９６（タカラバイオ社製）を用いることにより、各種細胞に対して、高効率な遺伝子導入が可能となる。あるいは、ゲノム編集（例えば、ＣＲＩＳＰＲシステム、ＴＡＬＥＮ、ＺＦＮなど）により、本発明の核酸又はベクターを細胞のゲノムに導入してもよい。
【００４６】
本発明の核酸はまた、ＲＮＡの形態で直接細胞に導入し、細胞内で本発明の改変体を発現するために用いてもよい。ＲＮＡの導入方法としては、公知の方法を用いることができ、例えば、リポフェクション法や電気穿孔法などが好適に使用できる。
【００４７】
本発明の改変体の発現は、例えば、本発明の改変体の一部（例：ＴＣＲ鎖の定常領域等）を認識する抗体を用いて、免疫学的手法により検出又は測定することができる。免疫学的手法としては、例えば、抗体アレイ、フローサイトメトリー解析、放射性同位元素免疫測定法（ＲＩＡ法）、ＥＬＩＳＡ、ウェスタンブロッティング、免疫組織染色、酵素免疫測定法（ＥＩＡ法）、蛍光免疫測定法（ＦＩＡ）、イムノクロマトグラフィー法などが挙げられる。
【００４８】
本発明の改変体により、細胞のアロ反応性が抑制されることは、自体公知の方法により確認することができる。例えば、本発明の改変体を発現する細胞と、該改変体を発現しない対象の細胞とで、混合白血球反応（ＭＬＲ）、Ｅｌｉｓｐｏｔアッセイ、限界希釈アッセイ（Ｌｉｍｉｔｔｉｎｇｄｉｌｉｔｉｏｎ ａｓｓａｙ）等を行い、該改変体を発現する細胞において、少なくともいずれかのアッセイでアロ反応性が低い結果となった場合に、本発明の改変体によりアロ反応性が抑制されたと評価することができる。
【００４９】
４．本発明の細胞の製造方法
本発明は、本発明の核酸又はベクターを細胞に導入する工程を含む、細胞の製造方法（以下「本発明の製法」と称する場合がある）を提供する。本発明の核酸又はベクターが導入される細胞、導入方法等は、上記３．に記載の通りである。前記細胞は、本発明の改変体を発現していることが好ましい。本発明の改変体の発現は、上記３．に記載の方法により検出又は測定することができる。
【００５０】
本発明の製法の一態様において、（１）本発明の核酸又はベクターが導入された多能性幹細胞を、造血前駆細胞に分化させる工程、及び（２）該造血前駆細胞をＴ細胞に分化させる工程を含む、Ｔ細胞の製法が提供される。
【００５１】
（１）多能性幹細胞を造血前駆細胞に分化させる工程（工程（１））
多能性幹細胞から造血前駆細胞への分化方法としては、造血前駆細胞へ分化できる限り特に制限されないが、例えば、国際公開第２０１３／０７５２２２号、国際公開第２０１６／０７６４１５号及びLiu S. et al., Cytotherapy, 17 (2015);344-358などに記載されているように、造血前駆細胞への誘導培地中で多能性幹細胞を培養する方法が挙げられる。
【００５２】
本発明において、造血前駆細胞への誘導培地は、特に限定されないが、動物細胞の培養に用いられる培地を基礎培地として調製することができる。基礎培地としては、例えばIscove's Modified Dulbecco's Medium（IMDM）培地、Medium 199培地、Eagle's Minimum Essential Medium (EMEM)培地、αMEM培地、Dulbecco's modified Eagle's Medium (DMEM)培地、Ham's F12培地、RPMI 1640培地、Fischer's培地、Neurobasal Medium（ライフテクノロジーズ）、これらの混合培地などが挙げられる。培地には、血清が含有されていてもよいし、あるいは無血清で使用してもよい。必要に応じて、基礎培地には、例えば、ビタミンＣ類（例：アスコルビン酸）、アルブミン、インスリン、トランスフェリン、セレン、脂肪酸、微量元素、2-メルカプトエタノール、チオールグリセロール、脂質、アミノ酸、L-グルタミン、非必須アミノ酸、ビタミン、増殖因子、低分子化合物、抗生物質、抗酸化剤、ピルビン酸、緩衝剤、無機塩類、サイトカインなどが含まれていてもよい。
【００５３】
本発明においてビタミンＣ類とは、L-アスコルビン酸及びその誘導体を意味し、L-アスコルビン酸誘導体とは、生体内で酵素反応によりビタミンCとなるものを意味する。本発明に用いるアスコルビン酸の誘導体として、リン酸ビタミンC、アスコルビン酸グルコシド、アスコルビルエチル、ビタミンCエステル、テトラヘキシルデカン酸アスコビル、ステアリン酸アスコビル及びアスコルビン酸-2リン酸-6パルミチン酸が例示される。好ましくは、リン酸ビタミンCであり、例えば、リン酸-L-アスコルビン酸Na又はリン酸-L-アスコルビン酸Mgなどのリン酸-L-アスコルビン酸塩が挙げられる。
【００５４】
工程（１）で用いる好ましい基礎培地は、血清、インスリン、トランスフェリン、セリン、チオールグリセロール、L-グルタミン、アスコルビン酸を含むIMDM培地である。
【００５５】
工程（１）で用いる培地は、BMP4 (Bone morphogenetic protein 4)、VEGF (vascular endothelial growth factor)、SCF (Stem cell factor)及びFLT-3L (Flt3 Ligand)からなる群より選択される少なくとも１種類のサイトカインがさらに添加されていてもよい。より好ましくは、VEGF、SCF及びFLT-3Lを添加した培地である。
【００５６】
工程（１）でビタミンC類を用いる場合、ビタミンＣ類は、４日毎、３日毎、２日毎、又は１日毎に、別途添加（補充）することが好ましく、１日毎に添加することが好ましい。当該ビタミンC類の培地中の濃度は、特に制限されないが、5 ng/ml〜500 ng/mlに相当する量（例：5 ng/ml、10 ng/ml、25 ng/ml、50 ng/ml、100 ng/ml、200 ng/ml、300 ng/ml、400 ng/ml、500 ng/mlに相当する量）であることが好ましい。
【００５７】
工程（１）でBMP4を用いる場合、培地中のBMP4の濃度は、特に制限されないが、10 ng/ml〜100 ng/ml（例：10 ng/ml、20 ng/ml、30 ng/ml、40 ng/ml、50 ng/ml、60 ng/ml、70 ng/ml、80 ng/ml、90 ng/ml、100 ng/ml）であることが好ましく、20 ng/ml〜40 ng/mlであることがより好ましい。
【００５８】
工程（１）でVEGFを用いる場合、培地中のVEGFの濃度は、特に制限されないが、10 ng/ml〜100 ng/ml（例：10 ng/ml、20 ng/ml、30 ng/ml、40 ng/ml、50 ng/ml、60 ng/ml、70 ng/ml、80 ng/ml、90 ng/ml、100 ng/ml）であることが好ましく、なかでも、20 ng/mlが好ましい。
【００５９】
工程（１）でSCFを用いる場合、培地中のSCFの濃度は、特に制限されないが、10 ng/ml〜100 ng/ml（例：10 ng/ml、20 ng/ml、30 ng/ml、40 ng/ml、50 ng/ml、60 ng/ml、70 ng/ml、80 ng/ml、90 ng/ml、100 ng/ml）であることが好ましく、なかでも、30 ng/mlが好ましい。
【００６０】
工程（１）でFLT-3Lを用いる場合、培地中のFLT-3Lの濃度は、特に制限されないが、1 ng/ml〜100 ng/ml（例：1 ng/ml、2 ng/ml、3 ng/ml、4 ng/ml、5 ng/ml、6 ng/ml、7 ng/ml、8 ng/ml、9 ng/ml、10 ng/ml、20 ng/ml、50 ng/ml、100 ng/ml）であることが好ましく、なかでも、10 ng/mlが好ましい。
【００６１】
工程（１）において、多能性幹細胞の培養は、接着培養又は浮遊培養であってもよく、接着培養の場合、コーティング剤をコーティングした培養容器を用いて行ってもよく、また他の細胞と共培養してもよい。共培養する他の細胞として、C3H10T1/2（Takayama N., et al. J Exp Med. 2817-2830, 2010）、異種由来のストローマ細胞（Niwa A et al. J Cell Physiol. 2009 Nov;221(2):367-77.）が例示される。コーティング剤としては、マトリゲル（Niwa A, et al. PLoS One.6(7):e22261, 2011）が例示される。浮遊培養では、Chadwick et al. Blood 2003, 102: 906-15、Vijayaragavan et al. Cell Stem Cell 2009, 4: 248-62、及びSaeki et al. Stem Cells 2009, 27: 59-67に記載の方法が例示される。
【００６２】
工程（１）において、培養温度の条件は、特に制限されないが、例えば、37℃〜42℃程度、37℃〜39℃程度が好ましい。また、培養期間については、当業者であれば造血前駆細胞の数などをモニターしながら、適宜決定することが可能である。造血前駆細胞が得られる限り、日数は特に限定されないが、例えば、少なくとも6日間以上、7日以上、8日以上、9日以上、10日以上、11日以上、12日以上、13日以上、14日以上であり、好ましくは14日である。培養期間が長いことについては、造血前駆細胞の製造においては通常問題とされないが、例えば３５日以下が好ましく、２１日以下がより好ましい。また、低酸素条件で培養してもよく、本発明において低酸素条件とは、15％、10％、9％、8％、7％、6％、5％又はそれら以下の酸素濃度が例示される。
【００６３】
（２）造血前駆細胞をＴ細胞に分化させる工程（工程（２））
造血前駆細胞からＴ細胞への分化方法としては、造血前駆細胞をＴ細胞へ分化できる限り特に制限されないが、例えば、国際公開第２０１６／０７６４１５号などに記載されているような、（２−１）造血前駆細胞からＣＤ４ＣＤ８両陽性Ｔ細胞を誘導する工程、及び（２−２）ＣＤ４ＣＤ８両陽性Ｔ細胞からＣＤ８陽性Ｔ細胞を誘導する工程を含む方法が挙げられる。造血前駆体は、工程（１）により得られた細胞集団から、造血前駆細胞のマーカーを用いてあらかじめ単離することが好ましい。該マーカーとしては、ＣＤ４３、ＣＤ３４、ＣＤ３１及びＣＤ１４４からなる群から選択される少なくとも１つが挙げられる。
【００６４】
（２−１）造血前駆細胞からＣＤ４ＣＤ８両陽性Ｔ細胞を誘導する工程（工程（２−１））
本発明において、ＣＤ４ＣＤ８両陽性Ｔ細胞への分化方法としては、例えば、ＣＤ４ＣＤ８両陽性Ｔ細胞への誘導培地中で造血前駆細胞を培養する方法が挙げられる。
【００６５】
本発明において、ＣＤ４ＣＤ８両陽性Ｔ細胞への分化誘導培地としては、特に制限されないが、動物細胞の培養に用いられる培地を基礎培地として調製することができる。基礎培地には、上記工程（１）で用いたものと同様のものが挙げられる。培地には、血清が含有されていてもよいし、あるいは無血清で使用してもよい。必要に応じて、基礎培地には、例えば、ビタミンＣ類、アルブミン、インスリン、トランスフェリン、セレン、脂肪酸、微量元素、2-メルカプトエタノール、チオールグリセロール、脂質、アミノ酸、L-グルタミン、非必須アミノ酸、ビタミン、増殖因子、低分子化合物、抗生物質、抗酸化剤、ピルビン酸、緩衝剤、無機塩類、サイトカインなどが含まれていてもよい。
【００６６】
工程（２−１）で用いる好ましい基礎培地は、血清、トランスフェリン、セリン、及びL-グルタミンを含むαMEM培地である。基礎培地へビタミンＣ類を添加する場合、ビタミンC類は、工程（１）の場合と同様である。
【００６７】
工程（２−１）で用いる培地は、サイトカインであるFLT-3L及び／又はIL-7をさらに含んでいてもよく、より好ましくは、FLT-3L及びIL-7を添加した培地である。
【００６８】
工程（２−１）でIL-7を用いる場合、培地中のIL-7の濃度は、1 ng/ml〜50 ng/ml（例：1 ng/ml、2 ng/ml、3 ng/ml、4 ng/ml、5 ng/ml、6 ng/ml、7 ng/ml、8 ng/ml、9 ng/ml、10 ng/ml、20 ng/ml、30 ng/ml、40 ng/ml、50 ng/ml）であることが好ましく、なかでも、5 ng/mlが好ましい。
【００６９】
工程（２−１）でFLT-3Lを用いる場合、FLT-3Lは、上記工程(1)と同様に用いることができる。
【００７０】
工程（２−１）において、造血前駆細胞を接着培養又は浮遊培養してもよく、接着培養の場合、培養容器をコーティングして用いてもよく、またフィーダー細胞等と共培養してもよい。共培養するフィーダー細胞として、骨髄間質細胞株ＯＰ９細胞（理研BioResource Centerより入手可能）が例示される。当該ＯＰ９細胞は、好ましくは、ＤＬＬ４又はＤＬＬ１を恒常的に発現するＯＰ９−ＤＬ４細胞又はＯＰ９−ＤＬ１細胞である（例えば、Holmes R1 and Zuniga-Pflucker JC. Cold Spring Harb Protoc. 2009）。本発明において、フィーダー細胞としてＯＰ９細胞を用いる場合、別途用意したＤＬＬ４若しくはＤＬＬ１、あるいはＤＬＬ４若しくはＤＬＬ１とＦｃ等との融合タンパク質を適宜培地に添加することにより行ってもよい。フィーダー細胞を用いる場合、当該フィーダー細胞を適宜交換して培養を行うことが好ましい。フィーダー細胞の交換は、予め播種したフィーダー細胞上へ培養中の対象細胞を移すことによって行い得る。当該交換は、5日毎、4日毎、3日毎、又は2日毎にて行い得る。また、胚様体を浮遊培養して造血前駆細胞を得た場合は、これを単細胞に解離させたのちに、接着培養を行うことが好ましい。フィーダー細胞と共培養してもよいが、好ましくはフィーダー細胞を用いずに培養を行う。
【００７１】
接着培養の場合であって、培養容器をコーティングする場合のコーティング剤としては、例えば、マトリゲル（Niwa A, et al. PLos One, 6(7):e22261, 2011））、コラーゲン、ゼラチン、ラミニン、ヘパラン硫酸プロテオグリカン、レトロネクチン、ＤＬＬ４若しくはＤＬＬ１、あるいはＤＬＬ４若しくはＤＬＬ１と抗体のＦｃ領域等との融合タンパク質（例：ＤＬＬ４／Ｆｃｃｈｉｍｅｒａ）、エンタクチン、及び／又はこれらの組み合わせが挙げられ、レトロネクチン及びＤＬＬ４とＦｃ領域等との融合タンパク質の組み合わせが好ましい。
【００７２】
工程（２−１）において、培養温度の条件は、特に制限されないが、例えば、37℃〜42℃程度、37℃〜39℃程度が好ましい。また、培養期間については、当業者であればＣＤ４ＣＤ８両陽性Ｔ細胞の数などをモニターしながら、適宜決定することが可能である。造血前駆細胞が得られる限り、日数は特に限定されないが、例えば、少なくとも10日間以上、12日以上、14日以上、16日以上、18日以上、20日以上、22日以上、23日以上であり、好ましくは23日である。また、90日以下が好ましく、42日以下がより好ましい。
【００７３】
（２−２）ＣＤ４ＣＤ８両陽性(ＤＰ)Ｔ細胞からＣＤ８陽性Ｔ細胞（ＣＤ３シングルポジティブＴ細胞）を誘導する工程（工程（２−２））
工程（２−１）により得られたＣＤ４/ＣＤ８ＤＰＴ細胞を、ＣＤ８陽性Ｔ細胞に分化誘導する工程に付すことにより、ＣＤ８陽性Ｔ細胞へ分化誘導することができる。
【００７４】
工程（２−２）で用いる基礎培地及び培地としては、工程（１）に記載された基礎培地及び培地と同様のものが挙げられる。
【００７５】
前記培地は、副腎皮質ホルモン剤を含んでいてもよい。副腎皮質ホルモン剤としては、例えば、糖質コルチコイド及びその誘導体などが挙げられ、該糖質コルチコイドとしては、例えば、酢酸コルチゾン、ヒドロコルチゾン、酢酸フルドロコルチゾン、プレドニゾロン、トリアムシノロン、メチルプレドニゾロン、デキサメタゾン、ベタメタゾン、プロピオン酸ベクロメタゾンが挙げられる。なかでも、デキサメタゾンが好ましい。
【００７６】
副腎皮質ホルモン剤としてデキサメタゾンを用いる場合、培地中のデキサメタゾンの濃度は、1nM〜100nM（例：1nM、5nM、10nM、20nM、30nM、40nM、50nM、60nM、70nM、80nM、90nM、100nM）が好ましく、なかでも、10nMが好ましい。
【００７７】
前記培地は、抗体（例：抗CD3抗体、抗CD28抗体、抗CD2抗体）、サイトカイン（例：IL-7、IL-2、IL-15）などを含有していてもよい。
【００７８】
工程（２−２）で抗ＣＤ３抗体を用いる場合、該抗ＣＤ３抗体としては、ＣＤ３を特異的に認識する抗体であれば特に限定されないが、例えば、ＯＫＴ３クローンから産生される抗体が挙げられる。抗ＣＤ３抗体は、磁気ビーズ等が結合されているものであってもよく、また、前記抗ＣＤ３抗体を培地中に添加する代わりに、抗ＣＤ３抗体を表面に結合させた培養容器上で該Ｔリンパ球を一定期間培養することによって刺激を与えてもよい。抗ＣＤ３抗体の培地中における濃度は、10ng/ml〜1000ng/ml（例：10 ng/ml、50 ng/ml、100 ng/ml、200ng/ml、300 ng/ml、400 ng/ml、500 ng/ml、600 ng/ml、700 ng/ml、800 ng/ml、900 ng/ml、1000 ng/ml）が好ましく、なかでも、500 ng/mlが好ましい。その他の抗体の濃度についても、当業者は、培養条件等に基づき、適宜決定することができる。
【００７９】
工程（２−２）でIL-2を用いる場合、培地中におけるIL-2の濃度は、10 U/ml〜1000 U/ml（例：10 U/ml、20 U/ml、30 U/ml、40 U/ml、50 U/ml、60 U/ml、70 U/ml、80 U/ml、90 U/ml、100 U/ml、200 U/ml、500 U/ml、1000 U/ml）が好ましく、なかでも、100 U/mlが好ましい。工程(2-2)で用いるIL-7又はIL15の培地中における濃度は、1 ng/ml〜100 ng/ml（例：1 ng/ml、5 ng/ml、10 ng/ml、20 ng/ml、30 ng/ml、40 ng/ml、50 ng/ml、60 ng/ml、70 ng/ml、80 ng/ml、90 ng/ml、100 ng/ml）が好ましく、なかでも、10 ng/mlが好ましい。
【００８０】
工程（２−２）において、培養温度の条件は、特に制限されないが、37℃〜42℃程度が好ましく、37℃〜39℃程度がより好ましい。また、培養期間については、当業者であればＣＤ８陽性Ｔ細胞の数などをモニターしながら、適宜決定することができる。ＣＤ８陽性Ｔ細胞が得られる限り、日数は特に限定されないが、1日以上、3日以上、7日以上が好ましく、60日以下が好ましく、35日以下がより好ましい。
【００８１】
また別の態様において、本発明は、本発明の核酸又はベクターを細胞に導入する工程を含む、該細胞におけるアロ反応性を低減する方法を提供する。
【００８２】
以下に実施例を挙げて本発明をさらに具体的に説明するが、これらは単なる例示であって本発明はこれらに限定されない。
【実施例】
【００８３】
［実施例１］αβＴＣＲの定常領域を有し、相補性決定領域（ＣＤＲ）を有さないＴＣＲの改変体をコードする核酸を含むＬｅｎｔｉＶベクターの作製
N末端にCD8分子の膜移行シグナルペプチドを付加した各α鎖（ＴＲＡＣ）と、N末端にIGH分子の膜移行シグナルペプチドを付加した各β鎖（ＴＲＢＣ１もしくはＴＲＢＣ２）のアミノ酸をP2A配列で繋ぐポリペプチド鎖を設計した（表１AB5-AB8）。設計したポリペプチド鎖をコードするオリゴDNAを人工合成（GenScript）して、レンチウイルスベクタープラスミドのマルチクローニングサイトに挿入した。レンチウイルスベクタータープラスミドは、pCDH-CMV-MCS-EF1a-Puro（SystemBioscience）のCMVプロモーターをヒトユビキチンプロモーターに置換したものを使用した。ウイルスベクター作製は、SIRION社に委託した。【００８４】
【表１】
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【００８５】
［実施例２］ＴＣＲの改変体を発現するT細胞の製造
レトロネクチン（タカラバイオ社）でコートした２４ウェルプレートを用いて、４種類のＣＤ３遺伝子（γ、δ、εおよびζ）を強制発現させたK562細胞（K562-CD3細胞、国立癌研究センター植村先生に御供与いただいた）に、表1に示す各改変体をコードする遺伝子を搭載したレンチウイルスベクターを感染させ、各改変体をコードする遺伝子を形質導入した。レンチウイルスベクターに感染させた後、３７℃、５％ＣＯ２条件下で３日間培養した。【００８６】
［試験例１］上記ＴＣＲの改変体を発現するＴ細胞の細胞膜表面分子発現の評価
［実施例２］で得られた、表1に示す各改変体を発現するＴ細胞について、抗ＣＤ３抗体（APC/Cy7, UCHT1, BioLegend）で染色した後、LSRFortessaTMX-20 (BD Bioscience社)フローサイトメトリーを用いて、細胞膜表面上のＣＤ３分子の発現を、フローサイトメトリーを用いて検出した（図１）。ＡＢ５により得られた細胞およびＡＢ７により得られた細胞においても、細胞膜表面上にＣＤ３の発現が認められた。またＡＢ６により得られた細胞およびＡＢ８により得られた細胞において、細胞膜表面上により強くＣＤ３の発現が認められた。【００８７】
［実施例３］ＴＣＲの改変体を発現するｉＰＳ細胞由来のＴ細胞の製造
１．iPS細胞の準備
iPS細胞には、京都大学iPS細胞研究所（CiRA）から供与されたiPS細胞（Ff-I01s04株：健常人末梢血単核球由来）を使用した。iPS細胞培養は、CiRAが配布するプロトコール「フィーダーフリーでのヒトiPS 細胞の培養」に準じて行った。【００８８】
２．αβＴＣＲの定常領域を有し、相補性決定領域（ＣＤＲ）を有さないＴＣＲの改変体をコードする核酸を含むＬｅｎｔｉ Ｖベクターの作製
pLVSIN-CMV Neo（クロンテック社）からネオマイシン耐性遺伝子をコードする配列を除去し、CMVプロモーターをヒトユビキチンプロモーターに置換したpLVSIN-Ubを用いたレンチウイルスベクターを作製した。上記で合成したAB6をコードする人工オリゴDNAをpLVSIN-Ubレンチウイルスベクターのマルチクローニングサイトに組込んだ。このプラスミドとクロンテック社のLenti-XTM 293T細胞株およびLenti-XTMPackaging Single Shots (VSV-G）を用いてレンチウイルスベクターを作製した。【００８９】
３．iPS細胞への改変型T細胞受容体遺伝子の導入
［実施例１］で作成したAB6を組み込んだレンチウイルスベクターを、iPS細胞に感染させることで、改変型T細胞受容体遺伝子の該細胞への導入を行った。
作製したレンチウイルスベクターを、［実施例３］１．で準備したiPS細胞に感染させることにより、改変TCR遺伝子をiPS細胞に導入した。以下、改変TCR遺伝子が導入されたiPS細胞を「tTCR-iPSC」ということがある。【００９０】
４．iPS細胞の造血前駆細胞（HPC）への分化
iPS細胞の造血前駆細胞(HPC)への分化は、公知の方法（例えば、Cell Reports 2(2012)1722-1735や国際公開第2017/221975号に記載された方法）に準じて行った。具体的には、［実施例３］３．で得られたtTCR-iPSCを、それぞれ超低接着処理された6 well plateに3 ｘ 105cells/wellで播種し、EB培地(StemPro34に10 μg/mlヒトインスリン、5.5 μg/mlヒトトランスフェリン、5 ng/ml 亜セレン酸ナトリウム、2 mM L-グルタミン、45 mM α-モノチオグリセロー ル、および50 μg/ml Ascorbic acid 2-phosphate を添加）に10 ng/ml BMP4、50 ng/ml bFGF、15 ng/ml VEGF、2 μM SB431542、を加えて、低酸素条件下（5% O2) にて5日間培養を行った。続いて、50 ng/ml SCF、30 ng/ml TPO、10 ng/ml Flt3Lを添加し、さらに5〜9日間培養を行い、浮遊細胞集団を得た。なお、培養期間中は2日または3日ごとに培地交換を行った。HPCを含む上記浮遊細胞集団を、表２の抗体セットを用いて染色した。上記染色を行った細胞集団を、FACSAriaによるソーティングに供した。【００９１】
【表２】
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【００９２】
５．HPCのT細胞への分化
［実施例３］４．で得られた細胞分画を、公知の方法（例えば、Journal of Leukocyte Biology 96(2016)1165-1175や国際公開第2017/221975号に記載された方法）に準じて、リンパ球系細胞へ分化させた。具体的には、造血前駆細胞集団を、2000 cells/wellで、Recombinant h-DLL4/Fc chimera（SinoBiological）とRetronectin（タカラバイオ）をコートした48-well-plateに2000cells/wellで播種し、5%CO2、37℃条件下に培養した。培養期間中は2日または3日ごとに培地交換を行った。なお、培地には、15% FBSと2 mM L-グルタミン、100 U/mlペニシリン、100 ng/mlストレプトマイシン、55 μΜ 2-メルカプトエタノール、50 μg/ml Ascorbic acid 2-phosphate、10 μg/mlヒトインスリン、5.5 μg/mlヒトトランスフェリン、 5 ng/ml亜セレン酸ナトリウム、50 ng/ml SCF、50 ng/ml IL-7、50 ng/ml Flt3L、100 ng/ml TPO、15μM SB203580、30 ng/ml SDF-1αを添加したαＭＥＭ培地を用いた。培養開始から7日目および14日目に同様のコートをした48-well-plateに継代した。培養開始21日目にすべての細胞を回収した。回収した細胞は、表３の抗体セットを用いて染色した。【００９３】
【表３】
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【００９４】
［試験例２］上記ＴＣＲの改変体を発現するＴ細胞の細胞膜表面分子発現の評価
［実施例３］５．で得られた細胞について、細胞膜表面上のCD3、CD5、CD7、およびαβTCRの発現をフローサイトメーターで測定した（図２）。【００９５】
本明細書において、「含む（comprising）」又は「含む（comprise）」のような各用語は、任意選択で、「からなる（consisting of）」又は「からなる(consists of)」で置き換えられてもよい。
【産業上の利用可能性】
【００９６】
本発明の改変体は、細胞に発現されると、該細胞のアロ反応性を抑制することができるため、同種移植における移植片対宿主病（ＧｖＨＤ）のリスクを低減することができる。即ち、本発明の改変体の導入は、Ｔ細胞療法におけるアロ反応性制御の一つのオプションとなり得る。【００９７】
本出願は、日本国で出願された特願２０１８−２４５２５３（出願日：２０１８年１２月２７日）を基礎としており、ここで言及することにより、それらの内容は本明細書に全て包含される。
【図１】
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【図２】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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