(57)【要約】  本発明は、疎水性基を導入したヒアルロン酸誘導体と抗原の複合体を含む、がんの予防および／または治療に用いるためのワクチン製剤を提供する。
2020158771.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
疎水性基を導入したヒアルロン酸誘導体および抗原を含む、がんの予防または治療に用いるためのワクチン製剤であって、
疎水性基を導入したヒアルロン酸誘導体が、以下：
式（Ｉ）
【化１】
2020158771.tif 000060
［式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、およびＲ４は、それぞれ独立に、水素原子、Ｃ１−６アルキル、ホルミルおよびＣ１−６アルキルカルボニルから選択され；
Ｒ５は、水素原子、ホルミル、またはＣ１−６アルキルカルボニルであり；
Ｚは、直接結合、または２〜３０個の任意のアミノ酸残基からなるペプチドリンカーを表し；
Ｘ１は、以下の式：
−ＮＲｂ−Ｒ、
−ＮＲｂ−ＣＯＯ−Ｒ、
−ＮＲｂ−ＣＯ−Ｒ、
−ＮＲｂ−ＣＯ−ＮＲｃ−Ｒ、
−ＣＯＯ−Ｒ、
−Ｏ−ＣＯＯ−Ｒ、
−Ｓ−Ｒ、
−ＣＯ−Ｙａ−Ｓ−Ｒ、
−Ｏ−ＣＯ−Ｙｂ−Ｓ−Ｒ、
−ＮＲｂ−ＣＯ−Ｙｂ−Ｓ−Ｒ、および
−Ｓ−Ｓ−Ｒ、
により表される基から選択される疎水性基であり；
Ｒａ、ＲｂおよびＲｃは、それぞれ独立に、水素原子、Ｃ１−２０アルキル、アミノＣ２−２０アルキルおよびヒドロキシＣ２−２０アルキルから選択され、ここで当該基のアルキル部分は、−Ｏ−および−ＮＲｆ−から選択される１〜３個の基が挿入されていてもよく；
Ｒｆは、水素原子、Ｃ１−１２アルキル、アミノＣ２−１２アルキルおよびヒドロキシＣ２−１２アルキルから選択され、当該基のアルキル部分は−Ｏ−および−ＮＨ−から選択される１〜２個の基が挿入されていてもよく；
Ｒは、ステリル基であり；
Ｙは、Ｃ２−３０アルキレン、または−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｍ−ＣＨ２ＣＨ２−であり、ここで、当該アルキレンは、−Ｏ−、−ＮＲｇ−および−Ｓ−Ｓ−から選択される１〜５の基が挿入されていてもよく；
Ｒｇは、水素原子、Ｃ１−２０アルキル、アミノＣ２−２０アルキルまたはヒドロキシＣ２−２０アルキルから選択され、当該基のアルキル部分は−Ｏ−および−ＮＨ−から選択される１〜３個の基が挿入されていてもよく；
Ｙａは、Ｃ１−５アルキレンであり；
Ｙｂは、Ｃ２−８アルキレンまたはＣ２−８アルケニレンであり；
ｍは、１〜１００から選択される整数である］
で表される繰り返し単位を１以上含む、ヒアルロン酸誘導体；または
式（ＩＩ）
【化２】
2020158771.tif 000061
［式中、Ｒ１ａ、Ｒ２ａ、Ｒ３ａ、およびＲ４ａは、独立に、水素原子、Ｃ１−６アルキル、ホルミル、およびＣ１−６アルキルカルボニルから選択され；
Ｒ５ａは、水素原子、ホルミル、またはＣ１−６アルキルカルボニルであり；
Ｘ１ａは、ヒドロキシ、−Ｏ−Ｑ＋、Ｃ１−６アルコキシ、−ＮＲ７Ｒ８、または−ＮＲ９−Ｚ１−Ｚ２であり；
Ｑ＋は、カウンターカチオンを表し；
Ｒ６ａ、Ｒ７、Ｒ８、およびＲ９は、独立に、水素原子、およびＣ１−６アルキルから選択され；
Ｒａａは、水素原子、またはＣ１−６アルキルであり、ここで該アルキルは、独立に、ヒドロキシ、カルボキシ、カルバモイル、Ｃ１−６アルキルチオ、アリール、およびヘテロアリールから選択される１以上の基で置換されていてもよく、ここで該アリールは１以上のヒドロキシで置換されていてもよく；
Ｚ１は、Ｃ２−３０アルキレン、または−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｍａ−ＣＨ２ＣＨ２−であり、ここで、該アルキレンは、独立に、−Ｏ−、−ＮＲｇａ−および−Ｓ−Ｓ−から選択される１〜５の基が挿入されていてもよく、ｍａは、１〜１００から選択される整数であり；
Ｚ２は、以下の式：
−ＮＲｂａ−Ｚ３、
−ＮＲｂａ−ＣＯＯ−Ｚ３、
−ＮＲｂａ−ＣＯ−Ｚ３、
−ＮＲｂａ−ＣＯ−ＮＲｃａ−Ｚ３、
−ＣＯＯ−Ｚ３、
−ＣＯ−ＮＲｃａ−Ｚ３、
−Ｏ−ＣＯ−ＮＲｃａ−Ｚ３、
−Ｏ−ＣＯＯ−Ｚ３、
−Ｓ−Ｚ３、
−ＣＯ−Ｚａ−Ｓ−Ｚ３、
−Ｏ−ＣＯ−Ｚｂ−Ｓ−Ｚ３、
−ＮＲｂａ−ＣＯ−Ｚｂ−Ｓ−Ｚ３、および
−Ｓ−Ｓ−Ｚ３、
により表される基から選択され；
ＲｂａおよびＲｃａは、独立に、水素原子、Ｃ１−２０アルキル、アミノＣ２−２０アルキルおよびヒドロキシＣ２−２０アルキルから選択され、ここで当該基のアルキル部分は、独立に、−Ｏ−および−ＮＲｆａ−から選択される１〜３個の基が挿入されていてもよく；
Ｒｆａは、独立に、水素原子、Ｃ１−１２アルキル、アミノＣ２−１２アルキルおよびヒドロキシＣ２−１２アルキルから選択され、当該基のアルキル部分は、独立に、−Ｏ−および−ＮＨ−から選択される１〜２個の基が挿入されていてもよく；
Ｒｇａは、独立に、水素原子、Ｃ１−２０アルキル、アミノＣ２−２０アルキルまたはヒドロキシＣ２−２０アルキルから選択され、当該基のアルキル部分は、独立に、−Ｏ−および−ＮＨ−から選択される１〜３個の基が挿入されていてもよく；
Ｚ３は、ステリル基であり；
Ｚａは、Ｃ１−５アルキレンであり；
Ｚｂは、Ｃ２−８アルキレンまたはＣ２−８アルケニレンである］
で表される繰り返し単位を含むヒアルロン酸誘導体であって、Ｘ１ａが−ＮＲ９−Ｚ１−Ｚ２である式（ＩＩ）で表される繰り返し単位が含まれない場合、さらに式（ＩＩＩ）：
【化３】
2020158771.tif 000062
［式中、Ｒ１ｂ、Ｒ２ｂ、Ｒ３ｂおよびＲ４ｂは、独立に、水素原子、Ｃ１−６アルキル、ホルミル、およびＣ１−６アルキルカルボニルから選択され；
Ｒ５ｂは、水素原子、ホルミル、またはＣ１−６アルキルカルボニルであり；
Ｘ２は、−ＮＲ９−Ｚ１−Ｚ２であり、ここで、Ｒ９、Ｚ１、およびＺ２は既に定義したとおりである］
で表される繰り返し単位を含む、ヒアルロン酸誘導体
である、前記ワクチン製剤。
【請求項２】
疎水性基を導入したヒアルロン酸誘導体が、式（ＩＩＩｃ）
【化４】
2020158771.tif 000063
［式中、Ｒ１ｃ、Ｒ２ｃ、Ｒ３ｃおよびＲ４ｃは、それぞれ独立に、水素原子、Ｃ１−６アルキル、ホルミルおよびＣ１−６アルキルカルボニルから選択され；
Ｒ５ｃは、水素原子、ホルミルおよびＣ１−６アルキルカルボニルから選択され；
Ｘｃは、ヒドロキシおよび−Ｏ−Ｑ＋から選択され、ここでＱ＋は、カウンターカチオンを表す］
で表わされる繰り返し単位をさらに含む、請求項１に記載のワクチン製剤。
【請求項３】
式（Ｉ）で表される繰り返し単位を含むヒアルロン酸誘導体を含み、存在する二糖の繰り返し単位における、式（Ｉ）で表される繰り返し単位の割合が、５〜５０％である、請求項１または２に記載のワクチン製剤。
【請求項４】
式（ＩＩ）で表される繰り返し単位を含むヒアルロン酸誘導体を含み、存在する二糖の繰り返し単位における、基−ＮＲ９−Ｚ１−Ｚ２を含む二糖単位の割合が、５〜５０％である、請求項１または２に記載のワクチン製剤。
【請求項５】
式（Ｉ）で表される繰り返し単位を含むヒアルロン酸誘導体を含み、Ｚが、直接結合であり、Ｙが、Ｃ２−１０アルキレンであり、Ｘ１が、−ＮＨ−ＣＯＯ−Ｒであり、Ｒが、コレステリル基である、請求項１〜３のいずれか１項に記載のワクチン製剤。
【請求項６】
式（ＩＩ）で表される繰り返し単位を含むヒアルロン酸誘導体を含み、Ｚ１が、Ｃ２−１０アルキレンであり、Ｚ２が、−ＮＨ−ＣＯＯ−Ｚ３であり、Ｚ３が、コレステリル基である、請求項１、２および４のいずれか１項に記載のワクチン製剤。
【請求項７】
ヒアルロン酸誘導体が、Ｒ１ｃ、Ｒ２ｃ、Ｒ３ｃ、およびＲ４ｃの全てを水素原子とし、Ｒ５ｃをアセチルとし、かつ、Ｘｃを−Ｏ−Ｎａ＋とした場合の重量平均分子量が５キロダルトン〜２００キロダルトンとなる、請求項２に定義した式（ＩＩＩｃ）で表される二糖単位のみから構成されるヒアルロン酸を用いて製造される、請求項１〜６のいずれか１項に記載のワクチン製剤。
【請求項８】
ヒアルロン酸誘導体と抗原が複合体を形成する、請求項１〜７のいずれか１項に記載のワクチン製剤。
【請求項９】
１種類以上のアジュバントと組み合せて投与するための、請求項１〜８のいずれか１項に記載のワクチン製剤。
【請求項１０】
抗原が、抗原ペプチドまたは抗原タンパクである、請求項１〜９のいずれか１項に記載のワクチン製剤。
【請求項１１】
抗原ペプチドが、ＣＤ８陽性細胞傷害性Ｔ細胞認識エピトープまたはＣＤ４陽性ヘルパーＴ細胞認識エピトープを２つ以上含む、請求項１０に記載のワクチン製剤。
【請求項１２】
抗原ペプチドが、エピトープ間にアミノ酸リンカーを有する、請求項１１に記載のワクチン製剤。
【請求項１３】
がん治療に用いられる１種類以上の抗体と組み合わせて投与するための、請求項１〜１２のいずれか１項に記載のワクチン製剤。
【請求項１４】
請求項１〜７のいずれか１項に記載の式（Ｉ）または式（ＩＩ）で表される繰り返し単位を含むヒアルロン酸誘導体と、がんの予防または治療に用いるためのワクチンに用いられる抗原から形成される複合体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、疎水性基を導入したヒアルロン酸誘導体と抗原の複合体を含むがんの予防および／または治療に用いるためのワクチン製剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
コレステロール化プルラン（ＣＨＰ）やコレステロール化マンナン（ＣＭＰ）などの疎水化多糖類と抗原を含む、がんの予防および／または治療に用いるワクチン製剤が報告されている（特許文献１）。また、ＣＨＰなどの疎水化多糖類と複数のＴ細胞認識エピトープを有する合成した長鎖ペプチド抗原の複合体と免疫増強剤を含む、がん治療用のワクチン製剤が報告されている（特許文献２および３）。【０００３】
これらのワクチン製剤は、抗原提示細胞に貪食された抗原が細胞内のプロテアソームやプロテアーゼ、ペプチダーゼにより種々の長さのペプチドへと切断され、細胞表面の主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）クラスＩ分子やＭＨＣクラスＩＩ分子に抗原エピトープペプチドとして搭載されて複合体を形成することにより、細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ、ＣＤ８＋）やヘルパーＴ細胞（ＣＤ４＋）に特異的に認識されてこれらの細胞を活性化するという原理に基づいている（非特許文献１）。【０００４】
一方、疎水性基としてコレステリル基を有する基をヒアルロン酸に導入したヒアルロン酸誘導体が、水中で会合により微粒子を形成し、薬物と複合体を形成することが報告されている（特許文献４）。また、ヒアルロン酸のグルクロン酸部分のカルボキシル基を、特定のアミノ酸と反応させてアミド基に変換し、さらに残存するカルボキシル基に、疎水性基であるステリル基を導入したヒアルロン酸誘導体が、生分解性と血中滞留性の両方の特性を有し、該ヒアルロン酸と薬物の複合体が医薬組成物として良好な特性を有することが報告されている（特許文献５）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】国際公開第１９９８／００９６５０号
【特許文献２】国際公開第２０１３／０３１８８２号
【特許文献３】国際公開第２０１５／０５０１５８号
【特許文献４】国際公開第２０１０／０５３１４０号
【特許文献５】国際公開第２０１４／０３８６４１号
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】ACS Nano 第8巻、第9209-9218頁、2014年
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
既に報告されているＣＨＰを用いたワクチン製剤よりも、さらに高い機能を有するワクチン製剤が求められている。特に抗原特異的な細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）を顕著に誘導する特性や高い抗腫瘍効果を有するがんワクチン製剤の開発が望まれている。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者は、かかる課題を解決する為に鋭意研究を進めたところ、疎水性基を導入したヒアルロン酸誘導体と抗原の複合体を含むワクチン製剤が、抗原特異的なＣＴＬを顕著に誘導し、高い抗腫瘍活性を有することを見出し、本発明を完成させた。【０００９】
すなわち本発明は、水溶液中で自発的に会合して抗原を封入することで形成され、抗原のリンパ節への集積が向上しており、かつ抗原特異的なＣＴＬを顕著に誘導する複合体、高い抗腫瘍活性を有する複合体、該複合体を含むワクチン製剤、およびそれらの製造方法に関する。また、本発明は、水中でより分散して抗原を封入することで形成され、抗原のリンパ節への集積が向上しており、かつ抗原特異的なＣＴＬを顕著に誘導する複合体、該複合体を含むワクチン製剤、およびそれらの製造方法に関する。【００１０】
本発明の１つの側面において、以下の［１］〜［１３］および［１５］〜［２７］のがんの予防および／または治療に用いるためのワクチン製剤、［１４］および［２８］の該ワクチン製剤に用いるための複合体、および［２９］の該複合体の製造方法が提供される。【００１１】
［１］疎水性基を導入したヒアルロン酸誘導体および抗原を含む、がんの予防または治療に用いるためのワクチン製剤であって、
疎水性基を導入したヒアルロン酸誘導体が、以下：
式（Ｉ）【００１２】
【化１】
2020158771.tif 000003
［式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、およびＲ４は、それぞれ独立に、水素原子、Ｃ１−６アルキル、ホルミルおよびＣ１−６アルキルカルボニルから選択され；
Ｒ５は、水素原子、ホルミル、またはＣ１−６アルキルカルボニルであり；
Ｚは、直接結合、または２〜３０個の任意のアミノ酸残基からなるペプチドリンカーを表し；
Ｘ１は、以下の式：
−ＮＲｂ−Ｒ、
−ＮＲｂ−ＣＯＯ−Ｒ、
−ＮＲｂ−ＣＯ−Ｒ、
−ＮＲｂ−ＣＯ−ＮＲｃ−Ｒ、
−ＣＯＯ−Ｒ、
−Ｏ−ＣＯＯ−Ｒ、
−Ｓ−Ｒ、
−ＣＯ−Ｙａ−Ｓ−Ｒ、
−Ｏ−ＣＯ−Ｙｂ−Ｓ−Ｒ、
−ＮＲｂ−ＣＯ−Ｙｂ−Ｓ−Ｒ、および
−Ｓ−Ｓ−Ｒ、
により表される基から選択される疎水性基であり；
Ｒａ、ＲｂおよびＲｃは、それぞれ独立に、水素原子、Ｃ１−２０アルキル、アミノＣ２−２０アルキルおよびヒドロキシＣ２−２０アルキルから選択され、ここで当該基のアルキル部分は、−Ｏ−および−ＮＲｆ−から選択される１〜３個の基が挿入されていてもよく；
Ｒｆは、水素原子、Ｃ１−１２アルキル、アミノＣ２−１２アルキルおよびヒドロキシＣ２−１２アルキルから選択され、当該基のアルキル部分は−Ｏ−および−ＮＨ−から選択される１〜２個の基が挿入されていてもよく；
Ｒは、ステリル基であり；
Ｙは、Ｃ２−３０アルキレン、または−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｍ−ＣＨ２ＣＨ２−であり、ここで、当該アルキレンは、−Ｏ−、−ＮＲｇ−および−Ｓ−Ｓ−から選択される１〜５の基が挿入されていてもよく；
Ｒｇは、水素原子、Ｃ１−２０アルキル、アミノＣ２−２０アルキルまたはヒドロキシＣ２−２０アルキルから選択され、当該基のアルキル部分は−Ｏ−および−ＮＨ−から選択される１〜３個の基が挿入されていてもよく；
Ｙａは、Ｃ１−５アルキレンであり；
Ｙｂは、Ｃ２−８アルキレンまたはＣ２−８アルケニレンであり；
ｍは、１〜１００から選択される整数である］
で表される繰り返し単位を１以上含む、ヒアルロン酸誘導体；または
式（ＩＩ）【００１３】
【化２】
2020158771.tif 000004
［式中、Ｒ１ａ、Ｒ２ａ、Ｒ３ａ、およびＲ４ａは、独立に、水素原子、Ｃ１−６アルキル、ホルミル、およびＣ１−６アルキルカルボニルから選択され；
Ｒ５ａは、水素原子、ホルミル、またはＣ１−６アルキルカルボニルであり；
Ｘ１ａは、ヒドロキシ、−Ｏ−Ｑ＋、Ｃ１−６アルコキシ、−ＮＲ７Ｒ８、または−ＮＲ９−Ｚ１−Ｚ２であり；
Ｑ＋は、カウンターカチオンを表し；
Ｒ６ａ、Ｒ７、Ｒ８、およびＲ９は、独立に、水素原子、およびＣ１−６アルキルから選択され；
Ｒａａは、水素原子、またはＣ１−６アルキルであり、ここで該アルキルは、独立に、ヒドロキシ、カルボキシ、カルバモイル、Ｃ１−６アルキルチオ、アリール、およびヘテロアリールから選択される１以上の基で置換されていてもよく、ここで該アリールは１以上のヒドロキシで置換されていてもよく；
Ｚ１は、Ｃ２−３０アルキレン、または−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｍａ−ＣＨ２ＣＨ２−であり、ここで、該アルキレンは、独立に、−Ｏ−、−ＮＲｇａ−および−Ｓ−Ｓ−から選択される１〜５の基が挿入されていてもよく、ｍａは、１〜１００から選択される整数であり；
Ｚ２は、以下の式：
−ＮＲｂａ−Ｚ３、
−ＮＲｂａ−ＣＯＯ−Ｚ３、
−ＮＲｂａ−ＣＯ−Ｚ３、
−ＮＲｂａ−ＣＯ−ＮＲｃａ−Ｚ３、
−ＣＯＯ−Ｚ３、
−ＣＯ−ＮＲｃａ−Ｚ３、
−Ｏ−ＣＯ−ＮＲｃａ−Ｚ３、
−Ｏ−ＣＯＯ−Ｚ３、
−Ｓ−Ｚ３、
−ＣＯ−Ｚａ−Ｓ−Ｚ３、
−Ｏ−ＣＯ−Ｚｂ−Ｓ−Ｚ３、
−ＮＲｂａ−ＣＯ−Ｚｂ−Ｓ−Ｚ３、および
−Ｓ−Ｓ−Ｚ３、
により表される基から選択され；
ＲｂａおよびＲｃａは、独立に、水素原子、Ｃ１−２０アルキル、アミノＣ２−２０アルキルおよびヒドロキシＣ２−２０アルキルから選択され、ここで当該基のアルキル部分は、独立に、−Ｏ−および−ＮＲｆａ−から選択される１〜３個の基が挿入されていてもよく；
Ｒｆａは、独立に、水素原子、Ｃ１−１２アルキル、アミノＣ２−１２アルキルおよびヒドロキシＣ２−１２アルキルから選択され、当該基のアルキル部分は、独立に、−Ｏ−および−ＮＨ−から選択される１〜２個の基が挿入されていてもよく；
Ｒｇａは、独立に、水素原子、Ｃ１−２０アルキル、アミノＣ２−２０アルキルまたはヒドロキシＣ２−２０アルキルから選択され、当該基のアルキル部分は、独立に、−Ｏ−および−ＮＨ−から選択される１〜３個の基が挿入されていてもよく；
Ｚ３は、ステリル基であり；
Ｚａは、Ｃ１−５アルキレンであり；
Ｚｂは、Ｃ２−８アルキレンまたはＣ２−８アルケニレンである］
で表される繰り返し単位を含むヒアルロン酸誘導体であって、Ｘ１ａが−ＮＲ９−Ｚ１−Ｚ２である式（ＩＩ）で表される繰り返し単位が含まれない場合、さらに式（ＩＩＩ）：【００１４】
【化３】
2020158771.tif 000005
［式中、Ｒ１ｂ、Ｒ２ｂ、Ｒ３ｂおよびＲ４ｂは、独立に、水素原子、Ｃ１−６アルキル、ホルミル、およびＣ１−６アルキルカルボニルから選択され；
Ｒ５ｂは、水素原子、ホルミル、またはＣ１−６アルキルカルボニルであり；
Ｘ２は、−ＮＲ９−Ｚ１−Ｚ２であり、ここで、Ｒ９、Ｚ１、およびＺ２は既に定義したとおりである］
で表される繰り返し単位を含む、ヒアルロン酸誘導体
である、前記ワクチン製剤。【００１５】
［２］疎水性基を導入したヒアルロン酸誘導体が、式（ＩＩＩｃ）【００１６】
【化４】
2020158771.tif 000006
［式中、Ｒ１ｃ、Ｒ２ｃ、Ｒ３ｃおよびＲ４ｃは、それぞれ独立に、水素原子、Ｃ１−６アルキル、ホルミルおよびＣ１−６アルキルカルボニルから選択され；
Ｒ５ｃは、水素原子、ホルミルおよびＣ１−６アルキルカルボニルから選択され；
Ｘｃは、ヒドロキシおよび−Ｏ−Ｑ＋から選択され、ここでＱ＋は、カウンターカチオンを表す］
で表わされる繰り返し単位をさらに含む、［１］に記載のワクチン製剤。【００１７】
［３］式（Ｉ）で表される繰り返し単位を含むヒアルロン酸誘導体を含み、存在する二糖の繰り返し単位における、式（Ｉ）で表される繰り返し単位の割合が、５〜５０％である、［１］または［２］に記載のワクチン製剤。【００１８】
［４］式（ＩＩ）で表される繰り返し単位を含むヒアルロン酸誘導体を含み、存在する二糖の繰り返し単位における、基−ＮＲ９−Ｚ１−Ｚ２を含む二糖単位の割合が、５〜５０％である、［１］または［２］に記載のワクチン製剤。【００１９】
［５］式（Ｉ）で表される繰り返し単位を含むヒアルロン酸誘導体を含み、Ｚが、直接結合であり、Ｙが、Ｃ２−１０アルキレンであり、Ｘ１が、−ＮＨ−ＣＯＯ−Ｒであり、Ｒが、コレステリル基である、［１］〜［３］のいずれかに記載のワクチン製剤。【００２０】
［６］式（ＩＩ）で表される繰り返し単位を含むヒアルロン酸誘導体を含み、Ｚ１が、Ｃ２−１０アルキレンであり、Ｚ２が、−ＮＨ−ＣＯＯ−Ｚ３であり、Ｚ３が、コレステリル基である、［１］、［２］および［４］のいずれかに記載のワクチン製剤。【００２１】
［７］ヒアルロン酸誘導体が、Ｒ１ｃ、Ｒ２ｃ、Ｒ３ｃ、およびＲ４ｃの全てを水素原子とし、Ｒ５ｃをアセチルとし、かつ、Ｘｃを−Ｏ−Ｎａ＋とした場合の重量平均分子量が５キロダルトン〜２００キロダルトンとなる、［２］に定義した式（ＩＩＩｃ）で表される二糖単位のみから構成されるヒアルロン酸を用いて製造される、［１］〜［６］のいずれかに記載のワクチン製剤。【００２２】
［８］ヒアルロン酸誘導体と抗原が複合体を形成する、［１］〜［７］のいずれかに記載のワクチン製剤。【００２３】
［９］１種類以上のアジュバントと組み合せて投与するための、［１］〜［８］のいずれかに記載のワクチン製剤。【００２４】
［１０］抗原が、抗原ペプチドまたは抗原タンパクである、［１］〜［９］のいずれかに記載のワクチン製剤。【００２５】
［１１］抗原ペプチドが、ＣＤ８陽性細胞傷害性Ｔ細胞認識エピトープまたはＣＤ４陽性ヘルパーＴ細胞認識エピトープを２つ以上含む、［１０］に記載のワクチン製剤。【００２６】
［１２］抗原ペプチドが、エピトープ間にアミノ酸リンカーを有する、［１１］に記載のワクチン製剤。【００２７】
［１３］がん治療に用いられる１種類以上の抗体と組み合わせて投与するための、［１］〜［１２］のいずれかに記載のワクチン製剤。【００２８】
［１４］［１］〜［７］のいずれかに記載の式（Ｉ）または式（ＩＩ）で表される繰り返し単位を含むヒアルロン酸誘導体と、がんの予防または治療に用いるためのワクチンに用いられる抗原から形成される複合体。【００２９】
［１５］式（Ｉ）で表される繰り返し単位を１以上含むヒアルロン酸誘導体を含み、Ｙが−（ＣＨ２）ｎ１−または−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｍ１−ＣＨ２ＣＨ２−であり、ｎ１が２〜１５の整数であり、ｍ１が１〜４の整数である、［１］〜［３］、［５］および［７］〜［１３］のいずれかに記載のワクチン製剤。【００３０】
［１６］式（Ｉ）で表される繰り返し単位を１以上含むヒアルロン酸誘導体を含み、Ｙが−（ＣＨ２）ｎ１−である、［１］〜［３］、［５］、［７］〜［１３］および［１５］のいずれかに記載のワクチン製剤。【００３１】
［１７］式（Ｉ）で表される繰り返し単位を１以上含むヒアルロン酸誘導体を含み、Ｙが−（ＣＨ２）ｎ１であり、ｎ１が２、６、８、または１２である、［１］〜［３］、［５］、［７］〜［１３］、［１５］、および［１６］のいずれかに記載のワクチン製剤。【００３２】
［１８］１種類以上のアジュバントと組み合わせて投与するための、［１］〜［１３］および［１５］〜［１７］のいずれかに記載のワクチン製剤であり、アジュバントが、ｉ）自然免疫受容体（パターン認識受容体）を活性化する物質、ｉｉ）抗原提示細胞刺激物質、またはｉｉｉ）抗原提示細胞の免疫抑制活性の獲得を阻害する作用を持つ物質である、前記ワクチン製剤。【００３３】
［１９］１種類以上のアジュバントと組み合わせて投与するための、［１］〜［１３］および［１５］〜［１８］のいずれかに記載のワクチン製剤であり、アジュバントがＣｐＧオリゴＤＮＡ、ＰｏｌｙＩＣ、ＱｕｉｌＡ、ＱＳ２１、Ｓｔｉｎｇ、モノホスホリルリピッド、Ｒ８４８、イミキモド、またはＭＰＬである、前記ワクチン製剤。【００３４】
［２０］抗原が抗原ペプチドであり、抗原ペプチドが、ＣＤ８陽性細胞傷害性Ｔ細胞認識エピトープおよびＣＤ４陽性ヘルパーＴ細胞認識エピトープをそれぞれ１つ以上含む、［１］〜［１３］および［１５］〜［１９］のいずれかに記載のワクチン製剤。【００３５】
［２１］抗原が抗原ペプチドであり、抗原ペプチドのアミノ酸残基数が、８〜１２０である、［１］〜［１３］および［１５］〜［２０］のいずれかに記載のワクチン製剤。【００３６】
［２２］抗原が抗原ペプチドであり、抗原ペプチドのアミノ酸残基数が、８〜５０である、［１］〜［１３］および［１５］〜［２１］のいずれかに記載のワクチン製剤。【００３７】
［２３］抗原が抗原ペプチドであり、抗原ペプチドのアミノ酸残基数が、１６〜８０である、［１］〜［１３］および［１５］〜［２２］のいずれかに記載のワクチン製剤。【００３８】
［２４］抗原が抗原ペプチドであり、抗原ペプチドのアミノ酸残基数が、２３〜６０である、［１］〜［１３］および［１５］〜［２３］のいずれかに記載のワクチン製剤。【００３９】
［２５］がん治療に用いられる１種類以上の抗体と組み合わせて投与するための、請求［１］〜［１３］および［１５］〜［２４］のいずれかに記載のワクチン製剤であり、抗体が、腫瘍による免疫抑制シグナルを阻害する抗体、または免疫細胞の共刺激シグナルを活性化する１種類以上の抗体である、前記ワクチン製剤。【００４０】
［２６］がん治療に用いられる１種類以上の抗体と組み合わせて投与するための、請求［１］〜［１３］および［１５］〜［２５］のいずれかに記載のワクチン製剤であり、抗体が、抗ＣＴＬＡ４抗体、抗ＰＤ１抗体、抗ＰＤＬ１抗体、抗ＯＸ４０、または抗４−１ＢＢ抗体である、前記ワクチン製剤。【００４１】
［２７］がん治療に用いられる１種類以上の抗体と組み合わせて投与するための、請求［１］〜［１３］および［１５］〜［２６］のいずれかに記載のワクチン製剤であり、抗体が、抗ＰＤＬ１抗体である、前記ワクチン製剤。【００４２】
［２８］［１５］〜［１７］のいずれかに記載の式（Ｉ）または式（ＩＩ）で表される繰り返し単位を含むヒアルロン酸誘導体と、がんの予防または治療に用いるためのワクチンに用いられる抗原から形成される複合体。【００４３】
［２９］［１］〜［７］および［１５］〜［１７］のいずれかに記載の式（Ｉ）または式（ＩＩ）で表される繰り返し単位を含むヒアルロン酸誘導体と、がんの予防または治療に用いるためのワクチンに用いられる抗原ペプチドを溶液中で混合する工程を含む、疎水性基を導入したヒアルロン酸誘導体と抗原の複合体の製造方法。【００４４】
本発明の別の側面において、以下の［３０］〜［４６］のがんの予防および／または治療方法、ならびに［４７］〜［６３］の使用が提供される。【００４５】
［３０］［１］〜［７］および［１５］〜［１７］のいずれかに記載の式（Ｉ）または式（ＩＩ）で表される繰り返し単位を含むヒアルロン酸誘導体および抗原を含むワクチン製剤を、対象に投与することを含む、がんの予防および／または治療方法。【００４６】
［３１］ヒアルロン酸誘導体と抗原が複合体を形成する、［３０］に記載の方法。【００４７】
［３２］ワクチン製剤が、１種類以上のアジュバントと組み合せて投与される、［３０］に記載の方法。【００４８】
［３３］抗原が、抗原ペプチドまたは抗原タンパクである、［３０］に記載の方法。【００４９】
［３４］抗原ペプチドが、ＣＤ８陽性細胞傷害性Ｔ細胞認識エピトープまたはＣＤ４陽性ヘルパーＴ細胞認識エピトープを２つ以上含む、［３３］に記載の方法。【００５０】
［３５］抗原ペプチドが、エピトープ間にアミノ酸リンカーを有する、［３４］に記載の方法。【００５１】
［３６］ワクチン製剤が、がん治療に用いられる１種類以上の抗体と組み合わせて投与される、［３０］に記載の方法。【００５２】
［３７］ワクチン製剤が、１種類以上のアジュバントと組み合わせて投与され、アジュバントが、ｉ）自然免疫受容体（パターン認識受容体）を活性化する物質、ｉｉ）抗原提示細胞刺激物質、またはｉｉｉ）抗原提示細胞の免疫抑制活性の獲得を阻害する作用を持つ物質である、［３０］に記載の方法。【００５３】
［３８］ワクチン製剤が、１種類以上のアジュバントと組み合わせて投与され、アジュバントがＣｐＧオリゴＤＮＡ、ＰｏｌｙＩＣ、ＱｕｉｌＡ、ＱＳ２１、Ｓｔｉｎｇ、モノホスホリルリピッド、Ｒ８４８、イミキモド、またはＭＰＬである、［３０］に記載の方法。【００５４】
［３９］抗原が抗原ペプチドであり、抗原ペプチドが、ＣＤ８陽性細胞傷害性Ｔ細胞認識エピトープおよびＣＤ４陽性ヘルパーＴ細胞認識エピトープをそれぞれ１つ以上含む、［３０］に記載の方法。【００５５】
［４０］抗原が抗原ペプチドであり、抗原ペプチドのアミノ酸残基数が、８〜１２０である、［３０］に記載の方法。【００５６】
［４１］抗原が抗原ペプチドであり、抗原ペプチドのアミノ酸残基数が、８〜５０である、［３０］のいずれかに記載の方法。【００５７】
［４２］抗原が抗原ペプチドであり、抗原ペプチドのアミノ酸残基数が、１６〜８０である、［３０］に記載の方法。【００５８】
［４３］抗原が抗原ペプチドであり、抗原ペプチドのアミノ酸残基数が、２３〜６０である、［３０］に記載の方法。【００５９】
［４４］ワクチン製剤が、がん治療に用いられる１種類以上の抗体と組み合わせて投与され、抗体が、腫瘍による免疫抑制シグナルを阻害する抗体、または免疫細胞の共刺激シグナルを活性化する１種類以上の抗体である、［３０］に記載の方法。【００６０】
［４５］ワクチン製剤が、がん治療に用いられる１種類以上の抗体と組み合わせて投与され、抗体が、抗ＣＴＬＡ４抗体、抗ＰＤ１抗体、抗ＰＤＬ１抗体、抗ＯＸ４０、または抗４−１ＢＢ抗体である、［３０］に記載の方法。【００６１】
［４６］ワクチン製剤が、がん治療に用いられる１種類以上の抗体と組み合わせて投与され、抗体が、抗ＰＤＬ１抗体である、［３０］に記載の方法。【００６２】
［４７］［１］〜［７］および［１５］〜［１７］のいずれかに記載の式（Ｉ）または式（ＩＩ）で表される繰り返し単位を含むヒアルロン酸誘導体および抗原の、がんの予防または治療に用いるためのワクチン製剤の製造における使用。【００６３】
［４８］ヒアルロン酸誘導体と抗原が複合体を形成する、［４７］に記載の使用。【００６４】
［４９］ワクチン製剤が、１種類以上のアジュバントと組み合せて投与される、［４７］に記載の使用。【００６５】
［５０］抗原が、抗原ペプチドまたは抗原タンパクである、［４７］に記載の使用。【００６６】
［５１］抗原ペプチドが、ＣＤ８陽性細胞傷害性Ｔ細胞認識エピトープまたはＣＤ４陽性ヘルパーＴ細胞認識エピトープを２つ以上含む、［５０］に記載の使用。【００６７】
［５２］抗原ペプチドが、エピトープ間にアミノ酸リンカーを有する、［５１］に記載の使用。【００６８】
［５３］ワクチン製剤が、がん治療に用いられる１種類以上の抗体と組み合わせて投与される、［４７］に記載の使用。【００６９】
［５４］ワクチン製剤が、１種類以上のアジュバントと組み合わせて投与され、アジュバントが、ｉ）自然免疫受容体（パターン認識受容体）を活性化する物質、ｉｉ）抗原提示細胞刺激物質、またはｉｉｉ）抗原提示細胞の免疫抑制活性の獲得を阻害する作用を持つ物質である、［４７］に記載の使用。【００７０】
［５５］ワクチン製剤が、１種類以上のアジュバントと組み合わせて投与され、アジュバントがＣｐＧオリゴＤＮＡ、ＰｏｌｙＩＣ、ＱｕｉｌＡ、ＱＳ２１、Ｓｔｉｎｇ、モノホスホリルリピッド、Ｒ８４８、イミキモド、またはＭＰＬである、［４７］に記載の使用。【００７１】
［５６］抗原が抗原ペプチドであり、抗原ペプチドが、ＣＤ８陽性細胞傷害性Ｔ細胞認識エピトープおよびＣＤ４陽性ヘルパーＴ細胞認識エピトープをそれぞれ１つ以上含む、［４７］に記載の使用。【００７２】
［５７］抗原が抗原ペプチドであり、抗原ペプチドのアミノ酸残基数が、８〜１２０である、［４７］に記載の使用。【００７３】
［５８］抗原が抗原ペプチドであり、抗原ペプチドのアミノ酸残基数が、８〜５０である、［４７］のいずれかに記載の使用。【００７４】
［５９］抗原が抗原ペプチドであり、抗原ペプチドのアミノ酸残基数が、１６〜８０である、［４７］に記載の使用。【００７５】
［６０］抗原が抗原ペプチドであり、抗原ペプチドのアミノ酸残基数が、２３〜６０である、［４７］に記載の使用。【００７６】
［６１］ワクチン製剤が、がん治療に用いられる１種類以上の抗体と組み合わせて投与され、抗体が、腫瘍による免疫抑制シグナルを阻害する抗体、または免疫細胞の共刺激シグナルを活性化する１種類以上の抗体である、［４７］に記載の使用。【００７７】
［６２］ワクチン製剤が、がん治療に用いられる１種類以上の抗体と組み合わせて投与され、抗体が、抗ＣＴＬＡ４抗体、抗ＰＤ１抗体、抗ＰＤＬ１抗体、抗ＯＸ４０、または抗４−１ＢＢ抗体である、［４７］に記載の使用。【００７８】
［６３］ワクチン製剤が、がん治療に用いられる１種類以上の抗体と組み合わせて投与され、抗体が、抗ＰＤＬ１抗体である、［４７］に記載の使用。
【発明の効果】
【００７９】
本発明の疎水性基を導入したヒアルロン酸誘導体と抗原の複合体を含むワクチン製剤を用いることにより、抗原のリンパ節への集積が向上し、かつ抗原特異的なＣＴＬの顕著な誘導が可能となり、免疫による抗がん効果を増強することが可能となる。また、本発明の複合体およびワクチン製剤は、用いるヒアルロン酸誘導体が安全性の面においても優れていることから、安全性、特に長期間の投与における安全性においても優れた特性を有している。
【図面の簡単な説明】
【００８０】
【図１】ＣＤ８＋Ｔ細胞刺激用ペプチドとして、ｍＥＲＫ２  ｐ１２１を用いた際の、ＢＡＬＢ／ｃマウス由来の脾臓細胞中の全ＣＤ８＋細胞に対するインターフェロンガンマ産生ＣＤ８＋細胞の数の割合（縦軸）を示すグラフである。各試料は以下のとおりである。ＮＴ：無処理のマウス由来の脾臓細胞、ＣｐＧ：抗原ペプチド（ｍＥＲＫ２  ｐ１２１）およびＣｐＧオリゴＤＮＡを投与したマウス由来の脾臓細胞、ＣＨＰ＋ＣｐＧ：ＣＨＰ（ＣＨＰ−８０Ｔ；８０ｋ）と抗原ペプチドの複合体およびＣｐＧオリゴＤＮＡを投与したマウス由来の脾臓細胞、９９ｋ４１＋ＣｐＧ：抗原ペプチドとＨＡ誘導体（９９ｋ  ＨＡ−Ｃ６−Ｃｈｏｌ−４１％）の複合体およびＣｐＧオリゴＤＮＡを投与したマウス由来の脾臓細胞。
【図２−１】ＣＤ８＋Ｔ細胞刺激用ペプチドとしてｍＥＲＫ２  ｐ１２１を用いた際の、ＢＡＬＢ／ｃマウス由来の脾臓細胞中の全ＣＤ８＋細胞に対するインターフェロンガンマ産生ＣＤ８＋細胞の数の割合（縦軸）を示すグラフである。各試料は以下のとおりである。ＮＴ：無処理のマウス由来の脾臓細胞、９９ｋ４１：抗原ペプチド（ｍＥＲＫ２  ｐ１２１）とＨＡ誘導体（９９ｋ  ＨＡ−Ｃ６−Ｃｈｏｌ−４１％）の複合体を投与したマウス由来の脾臓細胞、９９ｋ４１＋ＣｐＧ：抗原ペプチドと前記ＨＡ誘導体の複合体およびＣｐＧオリゴＤＮＡを投与したマウス由来の脾臓細胞、９９ｋ４１＋ｐｏｌｙＩＣ：抗原ペプチドと前記ＨＡ誘導体の複合体およびｐｏｌｙＩＣを投与したマウス由来の脾臓細胞、９９ｋ４１＋ＱｕｉｌＡ：抗原ペプチドと前記ＨＡ誘導体の複合体およびＱｕｉｌＡを投与したマウス由来の脾臓細胞、９９ｋ４１＋ｓｔｉｎｇ：抗原ペプチドと前記ＨＡ誘導体の複合体およびＳｔｉｎｇを投与したマウス由来の脾臓細胞。
【図２−２】ＣＤ４＋Ｔ細胞刺激用ペプチドとしてｍＥＲＫ２  ｐ１２１を用いた際の、ＢＡＬＢ／ｃマウス由来の脾臓細胞中の全ＣＤ４＋細胞に対するインターフェロンガンマ産生ＣＤ４＋細胞の数の割合（縦軸）を示すグラフである。各試料は図２−１と同様である。
【図３−１】ＣＤ８＋Ｔ細胞刺激用ペプチドとしてｍＥＲＫ２  ｐ１２１を用いた際の、ＢＡＬＢ／ｃマウス由来の脾臓細胞中の全ＣＤ８＋細胞に対するインターフェロンガンマ産生ＣＤ８＋細胞の数の割合（縦軸）を示すグラフである。各試料は以下のとおりである。ＮＴ：無処理のマウス由来の脾臓細胞、９９ｋ４１＋ＣｐＧ：抗原ペプチド（ｍＥＲＫ２  ｐ１２１）とＨＡ誘導体（９９ｋ  ＨＡ−Ｃ６−Ｃｈｏｌ−４１％）の複合体およびＣｐＧオリゴＤＮＡを投与したマウス由来の脾臓細胞、９９ｋ４１＋Ｒ８４８：抗原ペプチドと前記ＨＡ誘導体の複合体およびＲ８４８を投与したマウス由来の脾臓細胞、９９ｋ４１＋ＭＰＬ：抗原ペプチドと前記ＨＡ誘導体の複合体およびＭＰＬを投与したマウス由来の脾臓細胞。
【図３−２】ＣＤ４＋Ｔ細胞刺激用ペプチドとしてｍＥＲＫ２  ｐ１２１を用いた際の、ＢＡＬＢ／ｃマウス由来の脾臓細胞中の全ＣＤ４＋細胞に対するインターフェロンガンマ産生ＣＤ４＋細胞の数の割合（縦軸）を示すグラフである。各試料は図３−１と同様である。
【図４】ＣＤ８＋Ｔ細胞刺激用ペプチドとしてＭＡＧＥ−Ａ４  ｐ２６５を用いた際の、ＢＡＬＢ／ｃマウス由来の脾臓細胞中の全ＣＤ８＋細胞に対するインターフェロンガンマ産生ＣＤ８＋細胞の数の割合（縦軸）を示すグラフである。各試料は以下のとおりである。ＮＴ：無処理のマウス由来の脾臓細胞、ｐｅｐｔｉｄｅ＋ＣｐＧ：抗原ペプチド（ＭＡＧＥ−Ａ４  ｐ２６４）およびＣｐＧオリゴＤＮＡを投与したマウス由来の脾臓細胞、ＣＨＰ／Ｗｔ＋ＣｐＧ：ＣＨＰ（８０ｋ）と抗原ペプチドの複合体およびＣｐＧオリゴＤＮＡを投与したマウス由来の脾臓細胞、９９ｋ４１／Ｗｔ＋ＣｐＧ：抗原ペプチドとＨＡ誘導体（９９ｋ  ＨＡ−Ｃ６−Ｃｈｏｌ−４１％）の複合体およびＣｐＧオリゴＤＮＡを投与したマウス由来の脾臓細胞。
【図５】ＣＤ８＋Ｔ細胞刺激用ペプチドとしてＭＡＧＥ−Ａ４  ｐ２６５を用いた際の、ＢＡＬＢ／ｃマウス由来の脾臓細胞中の全ＣＤ８＋細胞に対するインターフェロンガンマ産生ＣＤ８＋細胞の数の割合（縦軸）を示すグラフである。各試料は以下のとおりである。ＮＴ：無処理のマウス由来の脾臓細胞、ＣＨＰ／Ｗｔ：ＣＨＰ（８０ｋ）と抗原ペプチド（ＭＡＧＥ−Ａ４  ｐ２６４）の複合体を投与したマウス由来の脾臓細胞、９９ｋ４１／Ｗｔ：抗原ペプチドとＨＡ誘導体（９９ｋ  ＨＡ−Ｃ６−Ｃｈｏｌ−４１％）の複合体を投与したマウス由来の脾臓細胞。
【図６】ＣＤ８＋Ｔ細胞刺激用ペプチドとしてＭＡＧＥ−Ａ４  ｐ２６５を用いた際の、ＢＡＬＢ／ｃマウス由来の脾臓細胞中の全ＣＤ８＋細胞に対するインターフェロンガンマ産生ＣＤ８＋細胞の数の割合（縦軸）を示すグラフである。各試料は以下のとおりである。ＮＴ：無処理のマウス由来の脾臓細胞、９９ｋ４１／Ｗｔ＋ＣｐＧ：抗原ペプチド（ＭＡＧＥ−Ａ４  ｐ２６４）とＨＡ誘導体（９９ｋ  ＨＡ−Ｃ６−Ｃｈｏｌ−４１％）の複合体およびＣｐＧオリゴＤＮＡを投与したマウス由来の脾臓細胞、９９ｋ４１／ＬＬＬＬ＋ＣｐＧ：抗原ペプチド（ＭＡＧＥ−Ａ４  ｐ２６４−４Ｌ）と前記ＨＡ誘導体の複合体およびＣｐＧオリゴＤＮＡを投与したマウス由来の脾臓細胞、９９ｋ４１／ＷＷＷＷ＋ＣｐＧ：抗原ペプチド（ＭＡＧＥ−Ａ４  ｐ２６４−４Ｗ）と前記ＨＡ誘導体の複合体およびＣｐＧオリゴＤＮＡを投与したマウス由来の脾臓細胞。
【図７−１】ＣＤ８＋Ｔ細胞刺激用ペプチドとしてＴＲＰ１を用いた際の、Ｃ５７ＢＬ／６マウス由来の脾臓細胞中の全ＣＤ８＋細胞に対するインターフェロンガンマ産生ＣＤ８＋細胞の数の割合（縦軸）を示すグラフである。各試料は以下のとおりである。ＮＴ：無処理のマウス由来の脾臓細胞、ＣＨＰ／６Ｙ＋ＣｐＧ：ＣＨＰと抗原ペプチド（ＴＲＰ２ＴＲＰ１ｇｐ１００−６Ｙ）の複合体およびＣｐＧオリゴＤＮＡを投与したマウス由来の脾臓細胞、９９ｋ４３／６Ｙ＋ＣｐＧ：抗原ペプチドとＨＡ誘導体（９９ｋ  ＨＡ−Ｃ６−Ｃｈｏｌ−４３％）の複合体およびＣｐＧオリゴＤＮＡを投与したマウス由来の脾臓細胞。
【図７−２】ＣＤ８＋Ｔ細胞刺激用ペプチドとしてＴＲＰ２を用いた際の、Ｃ５７ＢＬ／６マウス由来の脾臓細胞中の全ＣＤ８＋細胞に対するインターフェロンガンマ産生ＣＤ８＋細胞の数の割合（縦軸）を示すグラフである。各試料は図７−１と同様である。
【図７−３】ＣＤ８＋Ｔ細胞刺激用ペプチドとしてｇｐ１００を用いた際の、Ｃ５７ＢＬ／６マウス由来の脾臓細胞中の全ＣＤ８＋細胞に対するインターフェロンガンマ産生ＣＤ８＋細胞の数の割合（縦軸）を示すグラフである。各試料は図７−１と同様である。
【図８−１】ＣＤ８＋Ｔ細胞刺激用ペプチドとしてＴＲＰ１を用いた際の、Ｃ５７ＢＬ／６マウス由来の脾臓細胞中の全ＣＤ８＋細胞に対するインターフェロンガンマ産生ＣＤ８＋細胞の数の割合（縦軸）を示すグラフである。各試料は以下のとおりである。ＮＴ：無処理のマウス由来の脾臓細胞、９９ｋ４３／６Ｇ＋ＣｐＧ：抗原ペプチド（ＴＲＰ２ＴＲＰ１ｇｐ１００−６Ｇ）とＨＡ誘導体（９９ｋ  ＨＡ−Ｃ６−Ｃｈｏｌ−４３％）の複合体およびＣｐＧオリゴＤＮＡを投与したマウス由来の脾臓細胞、９９ｋ４３／６Ｙ＋ＣｐＧ：抗原ペプチド（ＴＲＰ２ＴＲＰ１ｇｐ１００−６Ｙ）とＨＡ誘導体の複合体およびＣｐＧオリゴＤＮＡを投与したマウス由来の脾臓細胞、９９ｋ４３／４Ｌ＋ＣｐＧ：抗原ペプチド（ＴＲＰ２ＴＲＰ１ｇｐ１００−４Ｌ）とＨＡ誘導体の複合体およびＣｐＧオリゴＤＮＡを投与したマウス由来の脾臓細胞、９９ｋ４３／６Ｌ＋ＣｐＧ：抗原ペプチド（ＴＲＰ２ＴＲＰ１ｇｐ１００−６Ｌ）とＨＡ誘導体の複合体およびＣｐＧオリゴＤＮＡを投与したマウス由来の脾臓細胞。
【図８−２】ＣＤ８＋Ｔ細胞刺激用ペプチドとしてＴＲＰ２を用いた際の、Ｃ５７ＢＬ／６マウス由来の脾臓細胞中の全ＣＤ８＋細胞に対するインターフェロンガンマ産生ＣＤ８＋細胞の数の割合（縦軸）を示すグラフである。各試料は図８−１と同様である。
【図８−３】ＣＤ８＋Ｔ細胞刺激用ペプチドとしてｇｐ１００を用いた際の、Ｃ５７ＢＬ／６マウス由来の脾臓細胞中の全ＣＤ８＋細胞に対するインターフェロンガンマ産生ＣＤ８＋細胞の数の割合（縦軸）を示すグラフである。各試料は図８−１と同様である。
【図９−１】ＣＤ８＋Ｔ細胞刺激用ペプチドとしてＡＨ１を用いた際の、ＢＡＬＢ／ｃマウス由来の脾臓細胞中の全ＣＤ８＋細胞に対するインターフェロンガンマ産生ＣＤ８＋細胞の数の割合（縦軸）を示すグラフである。各試料は以下のとおりである。ＮＴ：無処理のマウス由来の脾臓細胞、ＣＨＰ／６Ｙ＋ＣｐＧ：ＣＨＰと抗原ペプチド（ＡＨ１ｇｐ７０−６Ｙ）の複合体およびＣｐＧオリゴＤＮＡを投与したマウス由来の脾臓細胞、９９ｋ４３／６Ｙ＋ＣｐＧ：抗原ペプチドとＨＡ誘導体（９９ｋ  ＨＡ−Ｃ６−Ｃｈｏｌ−４３％）の複合体およびＣｐＧオリゴＤＮＡを投与したマウス由来の脾臓細胞。
【図９−２】ＣＤ４＋Ｔ細胞刺激用ペプチドとしてｇｐ７０を用いた際の、ＢＡＬＢ／ｃマウス由来の脾臓細胞中の全ＣＤ４＋細胞に対するインターフェロンガンマ産生ＣＤ４＋細胞の数の割合（縦軸）を示すグラフである。各試料は図９−１と同様である。
【図１０−１】ＣＤ８＋Ｔ細胞刺激用ペプチドとしてＡＨ１を用いた際の、ＢＡＬＢ／ｃマウス由来の脾臓細胞中の全ＣＤ８＋細胞に対するインターフェロンガンマ産生ＣＤ８＋細胞の数の割合（縦軸）を示すグラフである。各試料は以下のとおりである。ＮＴ：無処理のマウス由来の脾臓細胞、ＣＨＰ／６Ｌ＋ＣｐＧ：ＣＨＰと抗原ペプチド（ＡＨ１ｇｐ７０−６Ｌ）の複合体およびＣｐＧオリゴＤＮＡを投与したマウス由来の脾臓細胞、９９ｋ４３／６Ｌ＋ＣｐＧ：抗原ペプチドとＨＡ誘導体（９９ｋ  ＨＡ−Ｃ６−Ｃｈｏｌ−４３％）の複合体およびＣｐＧオリゴＤＮＡを投与したマウス由来の脾臓細胞。
【図１０−２】ＣＤ４＋Ｔ細胞刺激用ペプチドとしてｇｐ７０を用いた際の、ＢＡＬＢ／ｃマウス由来の脾臓細胞中の全ＣＤ４＋細胞に対するインターフェロンガンマ産生ＣＤ４＋細胞の数の割合（縦軸）を示すグラフである。各試料は図１０−１と同様である。
【図１１−１】ＣＤ８＋Ｔ細胞刺激用ペプチドとしてＡＨ１を用いた際の、ＢＡＬＢ／ｃマウス由来の脾臓細胞中の全ＣＤ８＋細胞に対するインターフェロンガンマ産生ＣＤ８＋細胞の数の割合（縦軸）を示すグラフである。各試料は以下のとおりである。ＮＴ：無処理のマウス由来の脾臓細胞、９９ｋ４３／６Ｇ＋ＣｐＧ：抗原ペプチド（ＡＨ１ｇｐ７０−６Ｇ）とＨＡ誘導体（９９ｋ  ＨＡ−Ｃ６−Ｃｈｏｌ−４３％）の複合体およびＣｐＧオリゴＤＮＡを投与したマウス由来の脾臓細胞、９９ｋ４３／６Ｙ＋ＣｐＧ：抗原ペプチド（ＡＨ１ｇｐ７０−６Ｙ）と前記ＨＡ誘導体の複合体およびＣｐＧオリゴＤＮＡを投与したマウス由来の脾臓細胞、９９ｋ４３／４Ｌ＋ＣｐＧ：抗原ペプチド（ＡＨ１ｇｐ７０−４Ｌ）と前記ＨＡ誘導体の複合体およびＣｐＧオリゴＤＮＡを投与したマウス由来の脾臓細胞、９９ｋ４３／６Ｌ＋ＣｐＧ：抗原ペプチド（ＡＨ１ｇｐ７０−６Ｌ）と前記ＨＡ誘導体の複合体およびＣｐＧオリゴＤＮＡを投与したマウス由来の脾臓細胞。
【図１１−２】ＣＤ４＋Ｔ細胞刺激用ペプチドとしてｇｐ７０を用いた際の、ＢＡＬＢ／ｃマウス由来の脾臓細胞中の全ＣＤ４＋細胞に対するインターフェロンガンマ産生ＣＤ４＋細胞の数の割合（縦軸）を示すグラフである。各試料は図１１−１と同様である。
【図１２−１】マウス線維肉腫ＣＭＳ５ａ担癌ＢＡＬＢ／ｃマウス群における腫瘍体積の平均値（縦軸）の推移を示すグラフである。各群は以下のとおりである。コントロール：サンプルを投与していないマウス群、ペプチド：抗原ペプチド（ｍＥＲＫ２  ｐ１２１）およびＣｐＧオリゴＤＮＡを投与したマウス群、エマルジョン：抗原ペプチドで作製したエマルジョン製剤とＣｐＧオリゴＤＮＡを投与したマウス群、ＣＨＰ：ＣＨＰと抗原ペプチドの複合体およびＣｐＧオリゴＤＮＡを投与したマウス群、９９ｋ４１：抗原ペプチドとＨＡ誘導体（９９ｋ  ＨＡ−Ｃ６−Ｃｈｏｌ−４１％）の複合体およびＣｐＧオリゴＤＮＡを投与したマウス群。
【図１２−２】マウス線維肉腫ＣＭＳ５ａ担癌ＢＡＬＢ／ｃマウス群の各個体における腫瘍体積（縦軸）の推移を群ごとに示すグラフである。各群は図１２−１と同様である。
【図１３−１】マウス線維肉腫ＣＭＳ５ａ担癌ＢＡＬＢ／ｃマウス群（ｎ＝５）における腫瘍体積の平均値（縦軸）の推移を示すグラフである。各群は以下のとおりである。コントロール：サンプルを投与していないマウス群、ＣｐＧ：ＣｐＧオリゴＤＮＡを投与したマウス群、ＣＨＰ：ＣＨＰと抗原ペプチド（ｍＥＲＫ２  ｐ１２１）の複合体およびＣｐＧオリゴＤＮＡを投与したマウス群、９９ｋ４１：抗原ペプチドとＨＡ誘導体（９９ｋ  ＨＡ−Ｃ６−Ｃｈｏｌ−４１％）の複合体およびＣｐＧオリゴＤＮＡを投与したマウス群。
【図１３−２】マウス線維肉腫ＣＭＳ５ａ担癌ＢＡＬＢ／ｃマウス群（ｎ＝５）の各個体における腫瘍体積（縦軸）の推移を群ごとに示すグラフである。各群は図１３−１と同様である。
【図１４−１】マウス線維肉腫ＣＭＳ５ａ担癌ＢＡＬＢ／ｃマウス群（ｎ＝５）における腫瘍体積の平均値（縦軸）の推移を示すグラフである。各群は以下のとおりである。コントロール：サンプルを投与していないマウス群、ａＣＴＬＡ４／ａＰＤ１／ａＰＤＬ１：抗ＣＴＬＡ４抗体、抗ＰＤ１抗体、および抗ＰＤＬ１抗体を投与したマウス群、９９ｋ４１：抗原ペプチド（ｍＥＲＫ２  ｐ１２１）とＨＡ誘導体（９９ｋ  ＨＡ−Ｃ６−Ｃｈｏｌ−４１％）の複合体およびＣｐＧオリゴＤＮＡを投与したマウス群。
【図１４−２】マウス線維肉腫ＣＭＳ５ａ担癌ＢＡＬＢ／ｃマウス群（ｎ＝５）の各個体における腫瘍体積（縦軸）の推移を群ごとに示すグラフである。各群は図１４−１と同様である。
【図１５−１】マウス線維肉腫ＣＭＳ５ａ担癌ＢＡＬＢ／ｃマウス群（ｎ＝５）における腫瘍体積の平均値（縦軸）の推移を示すグラフである。各群は以下のとおりである。コントロール：サンプルを投与していないマウス群、ａＣＴＬＡ４／ａＰＤＬ１／ａＯＸ４０／ａ４−１ＢＢ：抗ＣＴＬＡ４抗体、抗ＰＤＬ１抗体、抗ＯＸ４０抗体、および抗４−１ＢＢ抗体を投与したマウス群、９９ｋ４１：抗原ペプチド（ｍＥＲＫ２  ｐ１２１）とＨＡ誘導体（９９ｋ  ＨＡ−Ｃ６−Ｃｈｏｌ−４１％）の複合体およびＣｐＧオリゴＤＮＡを投与したマウス群、９９ｋ４１＋ａＣＴＬＡ４／ａＰＤＬ１／ａＯＸ４０／ａ４−１ＢＢ：抗原ペプチドとＨＡ誘導体の複合体、ＣｐＧオリゴＤＮＡ、ならびに抗ＣＴＬＡ４抗体、抗ＰＤＬ１抗体、抗ＯＸ４０抗体、および抗４−１ＢＢ抗体を投与したマウス群。
【図１５−２】マウス線維肉腫ＣＭＳ５ａ担癌ＢＡＬＢ／ｃマウス群（ｎ＝５）の各個体における腫瘍体積（縦軸）の推移を群ごとに示すグラフである。各群は図１５−１と同様である。
【図１６−１】マウス大腸がん細胞ＣＴ２６担癌ＢＡＬＢ／ｃマウス群における腫瘍体積の平均値（縦軸）の推移を示すグラフである。各群は以下のとおりである。コントロール：サンプルを投与していないマウス群、エマルジョン：抗原ペプチド（ＡＨ１ｇｐ７０−６Ｌ）で作製したエマルジョン製剤とＣｐＧオリゴＤＮＡを投与したマウス群、ＣＨＰ：ＣＨＰと抗原ペプチドの複合体およびＣｐＧオリゴＤＮＡを投与したマウス群、９９ｋ４３：抗原ペプチドとＨＡ誘導体（９９ｋ  ＨＡ−Ｃ６−Ｃｈｏｌ−４３％）の複合体およびＣｐＧオリゴＤＮＡを投与したマウス群。
【図１６−２】マウス大腸がん細胞ＣＴ２６担癌ＢＡＬＢ／ｃマウス群（ｎ＝５）の各個体における腫瘍体積（縦軸）の推移を群ごとに示すグラフである。各群は図１６−１と同様である。
【図１７−１】マウスメラノーマＢ１６Ｆ１０担癌Ｃ５７ＢＬ／６マウス群における腫瘍体積の平均値（縦軸）の推移を示すグラフである。各群は以下のとおりである。コントロール：サンプルを投与していないマウス群、ＣＨＰ：ＣＨＰと抗原ペプチド（ＴＲＰ２ＴＲＰ１ｇｐ１００−６Ｙ）の複合体およびＣｐＧオリゴＤＮＡを投与したマウス群、９９ｋ４３：抗原ペプチドとＨＡ誘導体（９９ｋ  ＨＡ−Ｃ６−Ｃｈｏｌ−４３％）の複合体およびＣｐＧオリゴＤＮＡを投与したマウス群。
【図１７−２】マウスメラノーマＢ１６Ｆ１０担癌Ｃ５７ＢＬ／６マウス群（ｎ＝５）の各個体における腫瘍体積（縦軸）の推移を群ごとに示すグラフである。各群は図１７−１と同様である。
【図１８−１】リンパ節移行性試験における、サンプル投与後２４時間のＢＡＬＢ／ｃマウスのリンパ節の１細胞あたりの蛍光強度を示すグラフである。各投与サンプルは以下のとおりである。ＮＴ：サンプル投与なし、ＬＰＡ：抗原ペプチド（蛍光標識ｍＥＲＫ２  ｐ１２１（フルオロセイン結合））、ＣＨＰ：ＣＨＰおよび抗原ペプチドの複合体、１０ｋ１７：抗原ペプチドおよびＨＡ誘導体（１０ｋ  ＨＡ−Ｃ６−Ｃｈｏｌ−１７％）の複合体、１０ｋ２５：抗原ペプチドおよびＨＡ誘導体（１０ｋ  ＨＡ−Ｃ６−Ｃｈｏｌ−２５％）の複合体、１０ｋ４２：抗原ペプチドおよびＨＡ誘導体（１０ｋ  ＨＡ−Ｃ６−Ｃｈｏｌ−４２％）の複合体、５０ｋ２３：抗原ペプチドおよびＨＡ誘導体（５０ｋ  ＨＡ−Ｃ６−Ｃｈｏｌ−２３％）の複合体、５０ｋ４３：抗原ペプチドおよびＨＡ誘導体（５０ｋ  ＨＡ−Ｃ６−Ｃｈｏｌ−４３％）の複合体、９９ｋ２４：抗原ペプチドおよびＨＡ誘導体（９９ｋ  ＨＡ−Ｃ６−Ｃｈｏｌ−２４％）の複合体、９９ｋ４３：抗原ペプチドおよびＨＡ誘導体（９９ｋ  ＨＡ−Ｃ６−Ｃｈｏｌ−４３％）の複合体。
【図１８−２】リンパ節移行性試験における、サンプル投与後７２時間のＢＡＬＢ／ｃマウスのリンパ節の１細胞あたりの蛍光強度を示すグラフである。各投与サンプルは図１８−１と同様である。
【図１９】リンパ節移行性試験における、サンプル投与後２４時間のＢＡＬＢ／ｃマウスのリンパ節の１細胞あたりの蛍光強度を示すグラフである。各投与サンプルは以下のとおりである。ＮＴ：サンプル投与なし、ｐｅｐｔｉｄｅ：抗原ペプチド（蛍光標識ｍＥＲＫ２  ｐ１２１（フルオロセイン結合））、９９ｋ４１：抗原ペプチドとＨＡ誘導体（９９ｋ  ＨＡ−Ｃ６−Ｃｈｏｌ−４１％）の複合体、１０ｋＨＡ−Ａｌａ−Ｃｈｏｌ３０：抗原ペプチドとＨＡ誘導体（１０ｋ  ＨＡ−Ａｌａ−Ｃ６−Ｃｈｏｌ−３０％）の複合体、１０ｋＨＡ−Ｓｅｒ−Ｃｈｏｌ２８：抗原ペプチドとＨＡ誘導体（１０ｋ  ＨＡ−Ｓｅｒ−Ｃ６−Ｃｈｏｌ−２８％）の複合体、１０ｋＨＡ−Ｇｌｙ−Ｃｈｏｌ３２：抗原ペプチドとＨＡ誘導体（１０ｋ  ＨＡ−Ｇｌｙ−Ｃ６−Ｃｈｏｌ−３２％）の複合体、１０ｋＨＡ−Ｔｈｒ−Ｃｈｏｌ３２：抗原ペプチドとＨＡ誘導体（１０ｋ  ＨＡ−Ｔｈｒ−Ｃ６−Ｃｈｏｌ−３２％）の複合体、１０ｋＨＡ−Ａｓｎ−Ｃｈｏｌ２０：抗原ペプチドとＨＡ誘導体（１０ｋ  ＨＡ−Ａｓｎ−Ｃ６−Ｃｈｏｌ−２０％）の複合体、１０ｋＨＡ−Ａｓｐ−Ｃｈｏｌ３２：抗原ペプチドとＨＡ誘導体（１０ｋ  ＨＡ−Ａｓｐ−Ｃ６−Ｃｈｏｌ−３２％）の複合体、１０ｋＨＡ−Ｐｈｅ−Ｃｈｏｌ３１：抗原ペプチドとＨＡ誘導体（１０ｋ  ＨＡ−Ｐｈｅ−Ｃ６−Ｃｈｏｌ−３１％）の複合体、１０ｋＨＡ−Ｔｙｒ−Ｃｈｏｌ３２：抗原ペプチドとＨＡ誘導体（１０ｋ  ＨＡ−Ｔｙｒ−Ｃ６−Ｃｈｏｌ−３２％）の複合体、１０ｋＨＡ−Ｉｌｅ−Ｃｈｏｌ２８：抗原ペプチドとＨＡ誘導体（１０ｋ  ＨＡ−Ｉｌｅ−Ｃ６−Ｃｈｏｌ−２８％）の複合体、１０ｋＨＡ−Ｌｅｕ−Ｃｈｏｌ３１：抗原ペプチドとＨＡ誘導体（１０ｋ  ＨＡ−Ｌｅｕ−Ｃ６−Ｃｈｏｌ−３１％）の複合体、１０ｋＨＡ−Ｖａｌ−Ｃｈｏｌ３２：抗原ペプチドとＨＡ誘導体（１０ｋ  ＨＡ−Ｖａｌ−Ｃ６−Ｃｈｏｌ−３２％）の複合体、１０ｋＨＡ−Ｔｒｐ−Ｃｈｏｌ２４：抗原ペプチドとＨＡ誘導体（１０ｋ  ＨＡ−Ｔｒｐ−Ｃ６−Ｃｈｏｌ−２４％）の複合体、１０ｋＨＡ−Ｇｌｎ−Ｃｈｏｌ３２：抗原ペプチドとＨＡ誘導体（１０ｋ  ＨＡ−Ｇｌｎ−Ｃ６−Ｃｈｏｌ−３２％）の複合体、１０ｋＨＡ−Ｇｌｕ−Ｃｈｏｌ３２：抗原ペプチドとＨＡ誘導体（１０ｋ  ＨＡ−Ｇｌｕ−Ｃ６−Ｃｈｏｌ−３２％）の複合体。
【図２０−１】マウスメラノーマＢ１６Ｆ１０担癌Ｃ５７ＢＬ／６マウス群における腫瘍体積の平均値（縦軸）の推移を示すグラフである。各群は以下のとおりである。コントロール：サンプルを投与していないマウス群、９９ｋ４２：抗原ペプチドとＨＡ誘導体（９９ｋ  ＨＡ−Ｃ６−Ｃｈｏｌ−４２％）の複合体およびＣｐＧオリゴＤＮＡを投与したマウス群、５０ｋ４２：抗原ペプチドとＨＡ誘導体（５０ｋ  ＨＡ−Ｃ６−Ｃｈｏｌ−４２％）の複合体およびＣｐＧオリゴＤＮＡを投与したマウス群、１０ｋ４３：抗原ペプチドとＨＡ誘導体（１０ｋ  ＨＡ−Ｃ６−Ｃｈｏｌ−４３％）の複合体およびＣｐＧオリゴＤＮＡを投与したマウス群。
【図２０−２】マウスメラノーマＢ１６Ｆ１０担癌Ｃ５７ＢＬ／６マウス群（ｎ＝５）の各個体における腫瘍体積（縦軸）の推移を群ごとに示すグラフである。各群は図２０−１と同様である。
【図２１−１】マウスメラノーマＢ１６Ｆ１０担癌Ｃ５７ＢＬ／６マウス群における腫瘍体積の平均値（縦軸）の推移を示すグラフである。各群は以下のとおりである。コントロール：サンプルを投与していないマウス群、１０ｋＨＡ−Ａｌａ−Ｃｈｏｌ３０：抗原ペプチドとアミノ酸修飾したＨＡ誘導体（１０ｋ  ＨＡ−Ａｌａ−Ｃ６−Ｃｈｏｌ−３０％）の複合体およびＣｐＧオリゴＤＮＡを投与したマウス群、１０ｋＨＡ−Ｇｌｎ−Ｃｈｏｌ３２：抗原ペプチドとアミノ酸修飾したＨＡ誘導体（１０ｋ  ＨＡ−Ｇｌｎ−Ｃ６−Ｃｈｏｌ−３２％）の複合体およびＣｐＧオリゴＤＮＡを投与したマウス群。
【図２１−２】マウスメラノーマＢ１６Ｆ１０担癌Ｃ５７ＢＬ／６マウス群（ｎ＝５）の各個体における腫瘍体積（縦軸）の推移を群ごとに示すグラフである。各群は図２１−１と同様である。
【図２２−１】マウスメラノーマＢ１６Ｆ１０担癌Ｃ５７ＢＬ／６マウス群における腫瘍体積の平均値（縦軸）の推移を示すグラフである。各群は以下のとおりである。コントロール：サンプルを投与していないマウス群、９９ｋ４２＋ＰｏｌｙＩＣ：抗原ペプチドとＨＡ誘導体（９９ｋ  ＨＡ−Ｃ６−Ｃｈｏｌ−４２％）の複合体およびＰｏｌｙＩＣを投与したマウス群。
【図２２−２】マウスメラノーマＢ１６Ｆ１０担癌Ｃ５７ＢＬ／６マウス群（ｎ＝５）の各個体における腫瘍体積（縦軸）の推移を群ごとに示すグラフである。各群は図２２−１と同様である。
【図２３−１】マウスメラノーマＢ１６Ｆ１０担癌Ｃ５７ＢＬ／６マウス群における腫瘍体積の平均値（縦軸）の推移を示すグラフである。各群は以下のとおりである。コントロール：サンプルを投与していないマウス群、９９ｋ４２＋Ｓｔｉｎｇ：抗原ペプチドとＨＡ誘導体（９９ｋ  ＨＡ−Ｃ６−Ｃｈｏｌ−４２％）の複合体およびＳｔｉｎｇアゴニストを投与したマウス群、 ９９ｋ４２＋Ｒ８４８：抗原ペプチドとＨＡ誘導体（９９ｋ  ＨＡ−Ｃ６−Ｃｈｏｌ−４２％）の複合体およびＲ８４８を投与したマウス群。
【図２３−２】マウスメラノーマＢ１６Ｆ１０担癌Ｃ５７ＢＬ／６マウス群（ｎ＝５）の各個体における腫瘍体積（縦軸）の推移を群ごとに示すグラフである。各群は図２３−１と同様である。
【図２４−１】テトラマーとしてＨ−２Ｋｂ  ＴＲＰ−２  Ｔｅｔｒａｍｅｒ−ＳＶＹＤＦＦＶＷＬ−ＡＰＣを用いた際の、マウスメラノーマＢ１６Ｆ１０担癌マウス由来の腫瘍またはリンパ節中の全ＣＤ８＋細胞に対するＴＲＰ２特異的ＣＤ８＋細胞の数の割合（縦軸）を示すグラフである。各試料は以下のとおりである。ＮＴ：無処理の担癌マウス由来の細胞、９９ｋ４１：抗原ペプチド（ＴＲＰ２ＴＲＰ１ｇｐ１００−６Ｙ）とＨＡ誘導体（９９ｋ  ＨＡ−Ｃ６−Ｃｈｏｌ−４１％）の複合体ならびにＣｐＧオリゴＤＮＡを投与した担癌マウス由来の細胞。
【図２４−２】テトラマーとしてＨ−２Ｄｂ  ｇｐ１００  Ｔｅｔｒａｍｅｒ−ＥＧＳＲＮＱＤＷＬ−ＰＥを用いた際の、マウスメラノーマＢ１６Ｆ１０担癌マウス由来の腫瘍またはリンパ節中の全ＣＤ８＋細胞に対するｇｐ１００特異的ＣＤ８＋細胞の数の割合（縦軸）を示すグラフである。各試料は以下のとおりである。ＮＴ：無処理の担癌マウス由来の細胞、９９ｋ４１：抗原ペプチド（ＴＲＰ２ＴＲＰ１ｇｐ１００−６Ｙ）とＨＡ誘導体（９９ｋ  ＨＡ−Ｃ６−Ｃｈｏｌ−４１％）の複合体ならびにＣｐＧオリゴＤＮＡを投与した担癌マウス由来の細胞。
【発明を実施するための形態】
【００８１】
以下、本発明を更に具体的に説明する。
【００８２】
本発明の疎水性基を導入したヒアルロン酸誘導体と抗原の複合体は、式（Ｉ）で表される１以上の二糖単位（繰り返し単位でもある）を含むヒアルロン酸誘導体、または式（ＩＩ）で表される１以上の二糖単位（繰り返し単位でもある）を含むヒアルロン酸誘導体と抗原の複合体であり、該複合体を用いて本発明のワクチン製剤を製造することができる。本明細書においては、本発明の疎水性基を導入したヒアルロン酸誘導体と抗原の複合体を製造する方法の開示も含まれる。
【００８３】
定義
本明細書で言及する用語「ステリル基」とは、ステロイド骨格を有する基であれば特に制限されない。ここでステロイドとしては、具体的には、コレステロール、デヒドロコレステロール、コプロステノール、コプロステロール、コレスタノール、カンペスタノール、エルゴスタノール、スチグマスタノール、コプロスタノール、スチグマステロール、シトステロール、ラノステロール、エルゴステロール、シミアレノール、胆汁酸（コラン酸、リトコール酸、ヒオデオキシコール酸、ケノデオキシコール酸、ウルソデオキシコール酸、デオキシコール酸、アポコール酸、コール酸、デヒドロコール酸、グリココール酸、タウロコール酸）、テストステロン、エストラジオール、プロゲストロン、コルチゾール、コルチゾン、アルドステロン、コルチコステロン、デオキシコルチステロンなどが挙げられる。ステリル基としては、コレステリル基、スチグマステリル基、ラノステリル基、エルゴステリル基、コラノイル基、コロイル基などが挙げられ、好ましくはコレステリル基（特に、下式で示されるコレスタ−５−エン−３β−イル基）、コラノイル基（特に、下式で示される５β−コラン−２４−オイル基）が挙げられる。
【００８４】
【化５】
2020158771.tif 000007
ここで、2個のアスタリスクは、結合位置を表す。
【００８５】
本明細書で言及する用語「Ｃ１−２０アルキル」とは、炭素数１〜２０の直鎖状、分岐鎖状のアルキル基を意味し、例えば、メチル、エチル、ｎ−プロピル、ｉ−プロピル、ｎ−ブチル、ｓ−ブチル、ｉ−ブチル、ｔ−ブチルなどの「Ｃ１−４アルキル」が含まれ、さらに、ｎ−ペンチル、３−メチルブチル、２−メチルブチル、１−メチルブチル、１−エチルプロピル、ｎ−ヘキシル、４−メチルペンチル、３−メチルペンチル、２−メチルペンチル、１−メチルペンチル、３−エチルブチル、および２−エチルブチルなどが含まれる。Ｃ１−２０アルキルには、炭素数が１〜１２の「Ｃ１−１２アルキル」、炭素数が１〜６の「Ｃ１−６アルキル」も含まれる。
【００８６】
本明細書で言及する用語「Ｃ１−６アルキル」とは、炭素数１〜６の直鎖状、分岐鎖状のアルキル基を意味し、例えば、メチル、エチル、ｎ−プロピル、ｉ−プロピル、ｎ−ブチル、ｓ−ブチル、ｉ−ブチル、ｔ−ブチルなどの「Ｃ１−４アルキル」が含まれる。
【００８７】
本明細書で言及する用語「Ｃ１−６アルキルカルボニル」とは、アルキル部分が既に言及したＣ１−６アルキルであるアルキルカルボニル基を意味し、例えば、アセチル、プロピオニル、ｎ−プロピルカルボニル、ｉ−プロピルカルボニル、ｎ−ブチルカルボニル、ｓ−ブチルカルボニル、ｉ−ブチルカルボニル、ｔ−ブチルカルボニルなどの「Ｃ１−４アルキルカルボニル」が含まれる。
【００８８】
本明細書で言及する用語「Ｃ１−６アルコキシ」とは、アルキル部分が既に言及したＣ１−６アルキルであるアルキルオキシ基を意味し、例えば、メトキシ（Ｈ３Ｃ−Ｏ−）、エトキシ、ｎ−プロポキシ、ｉ−プロポキシ、ｎ−ブトキシ、ｓ−ブトキシ、ｉ−ブトキシ、ｔ−ブトキシなどの「Ｃ１−４アルコキシ」が含まれる。
【００８９】
本明細書で言及する用語「Ｃ１−６アルキルチオ」とは、アルキル部分が既に言及したＣ１−６アルキルであるアルキルチオ基を意味し、例えば、メチルチオ（Ｈ３Ｃ−Ｓ−）、エチルチオ、ｎ−プロピルチオ、ｉ−プロピルチオ、ｎ−ブチルチオ、ｓ−ブチルチオ、ｉ−ブチルチオ、ｔ−ブチルチオなどが含まれ、好ましくはメチルチオが挙げられる。
【００９０】
本明細書で言及する用語「アミノＣ２−２０アルキル」は、置換基としてアミノ基を有する炭素数２〜２０の直鎖状、分岐鎖状のアルキル基を意味し、例えば、アミノ基はアルキル基の末端の炭素原子上に位置していてもよい。アミノＣ２−２０アルキルには、炭素数が２〜１２の「アミノＣ２−１２アルキル」も含まれる。
【００９１】
本明細書で言及する用語「ヒドロキシＣ２−２０アルキル」は、置換基としてヒドロキシ基を有する炭素数２〜２０の直鎖状、分岐鎖状のアルキル基を意味し、例えば、ヒドロキシ基はアルキル基の末端の炭素原子上に位置していてもよい。ヒドロキシＣ２−２０アルキルには、炭素数が２〜１２の「ヒドロキシＣ２−１２アルキル」も含まれる。
【００９２】
本明細書で言及する用語「Ｃ２−３０アルキレン」とは、炭素数２〜３０の直鎖状または分岐鎖状の２価の飽和炭化水素基を意味し、例えば、エチレン、プロピレンなどを含み、Ｃ２−２０アルキレン、Ｃ２−８アルキレン、基−（ＣＨ２）ｎ−（ここで、ｎは２〜３０、好ましくは２〜２０、さらに好ましくは２〜１５）を含む。
【００９３】
本明細書で言及する用語「Ｃ１−５アルキレン」とは、炭素数１〜５の直鎖状または分岐鎖状の２価の飽和炭化水素基を意味し、例えば、メチレン、エチレン（エタン−１，２−ジイル、エタン−１，１−ジイル）、プロピレン（プロパン−１，１−ジイル、プロパン−１，２−ジイル、ブタン−１，４−ジイル、およびペンタン−１，５−ジイルなどを含む。
【００９４】
本明細書で言及する用語「Ｃ２−１０アルキレン」とは、炭素数２〜１０の直鎖状または分岐鎖状の２価の飽和炭化水素基を意味し、例えば、エチレン（エタン−１，２−ジイル、エタン−１，１−ジイル）、プロピレン（プロパン−１，１−ジイル、プロパン−１，２−ジイル、プロパン−１，３−ジイル）、ブタン−１，４−ジイル、ペンタン−１，５−ジイル、ヘキサン−１，６−ジイル、ヘプタン−１，７−ジイル、オクタン−１，８−ジイルなどを含む。「Ｃ２−１０アルキレン」は、炭素数２〜８の「Ｃ２−８アルキレン」および炭素数２〜６の「Ｃ２−６アルキレン」を含む。
【００９５】
本明細書で言及する用語「Ｃ２−８アルキレン」とは、炭素数２〜８の直鎖状または分岐鎖状の２価の飽和炭化水素基を意味し、例えば、エチレン（エタン−１，２−ジイル、エタン−１，１−ジイル）、プロピレン（プロパン−１，１−ジイル、プロパン−１，２−ジイル、プロパン−１，３−ジイル）、ブタン−１，４−ジイル、ペンタン−１，５−ジイル、ヘキサン−１，６−ジイル、ヘプタン−１，７−ジイル、オクタン−１，８−ジイルなどを含む。
【００９６】
本明細書で言及する用語「Ｃ２−８アルケニレン」とは、炭素数２〜８の直鎖状または分岐鎖状の、１以上の二重結合を含む、２価の飽和炭化水素基を意味し、例えば、−ＣＨ＝ＣＨ−、−Ｃ（ＣＨ３）＝ＣＨ−、２−ブテン−１，４−ジイル、ヘプタ−２，４−ジエン−１，６−ジイルおよびオクタ−２，４，６−トリエン−１，８−ジイルなどを含む。幾何異性が存在する場合は、それぞれの異性体およびそれらの混合物も含まれる。
【００９７】
本発明において「アリール」とは、芳香族炭素環基、例えば炭素数が６〜１４の芳香族炭素環基を意味し、アリールの例としてはフェニル、ナフチル（１−ナフチル、および２−ナフチル）などが挙げられる。１以上のヒドロキシで置換されたアリールの例としては、４−ヒドロキシフェニルが挙げられる。
【００９８】
本発明において「ヘテロアリール」とは、環を構成する原子中に、１または複数個の、窒素原子、酸素原子及び硫黄原子から選択されるヘテロ原子を含有する芳香族性の環の基を意味し、部分的に飽和されていてもよい。環は単環、またはベンゼン環または単環へテロアリール環と縮合した２環式ヘテロアリールであってもよい。環を構成する原子の数は、例えば４〜１５であり、好ましくは、５〜１４、さらに好ましくは、６〜１０である。ヘテロアリールの例としては、たとえば、フリル、チエニル、ピロリル、イミダゾリル、ピラゾリル、チアゾリル、イソチアゾリル、オキサゾリル、イソオキサゾリル、オキサジアゾリル、チアジアゾリル、トリアゾリル、テトラゾリル、ピリジル、ピリミジル、ピリダジニル、ピラジニル、トリアジニル、ベンゾフラニル、ベンゾチエニル、ベンゾチアジアゾリル、ベンゾチアゾリル、ベンゾオキサゾリル、ベンゾオキサジアゾリル、ベンゾイミダゾリル、インドリル、イソインドリル、インダゾリル、キノリル、イソキノリル、シンノリニル、キナゾリニル、キノキサリニル、ベンゾジオキソリル、インドリジニル、イミダゾピリジルなどが挙げられ、好ましくはインドール−２−イルが挙げられる。
【００９９】
本明細書で言及する「２価のＣ２−５０炭化水素基」は特に限定されず、その例として、炭素数２〜５０の直鎖状、分岐鎖状、環状および一部が環状のアルキレン基、アルケニレン基およびアルキニレン基が挙げられ、当該基は２価の芳香族環であってもよく、または芳香族環を構造の一部に含んでいてもよい。
【０１００】
本明細書で言及する「２価のＣ２−５０ポリアルキレンオキシ」は特には限定されず、繰り返し単位のアルキレン基は直鎖であっても分岐鎖であってもよい。「２価のＣ２−５０ポリアルキレンオキシ」の例には、２価のＣ２−５０ポリエチレンオキシ基、Ｃ３−４８ポリプロピレンオキシ基、Ｃ３−４８ポリブチレンオキシ基などが含まれる。当該基は、酸素原子または炭素原子を介して他の基と連結していてよく、例えばＣ２−５０ポリエチレンオキシ基には、−Ｏ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）１−２５−、−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）１−２５−、−（ＯＣＨ２ＣＨ２）１−２５−、−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）１−２４−（ＣＨ２ＣＨ２）−などが含まれる。
【０１０１】
本明細書で言及する用語「塩物質」とは、水に可溶な無機物であれば特に限定されず、例えば、塩化カルシウム、リン酸カルシウム等のカルシウム塩、硫酸マグネシウム、塩化マグネシウム等のマグネシウム塩、硫酸アルミニウム、塩化アルミニウム等のアルミニウム塩、硫酸カリウム、炭酸カリウム、硝酸カリウム、塩化カリウム、臭化カリウム、ヨウ化カリウム等のカリウム塩、炭酸水素ナトリウム、炭酸ナトリウム、硫酸ナトリウム、硝酸ナトリウム、塩化ナトリウム、臭化ナトリウム、ヨウ化ナトリウム、ケイ酸ナトリウム、リン酸三ナトリウム、リン酸二ナトリウム、ホウ酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム等のナトリウム塩、塩化リチウム、臭化リチウム、ヨウ化リチウム、炭酸リチウム等のリチウム塩が挙げられ、好ましくは、塩化ナトリウム、リン酸三ナトリウム、リン酸二ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、塩化マグネシウムなどが挙げられる。
【０１０２】
本明細書で言及する用語「抗原」とは、免疫を惹起する物質を指す。例えばリンパ節や脾臓において、抗原提示細胞に提示されることにより、Ｔ細胞、Ｂ細胞などのリンパ球の活性化を誘導することができる物質である。用語「抗原タンパク」とは、タンパク質である抗原を指す。また、「抗原ペプチド」とは、ペプチドである抗原を指す。例えば、抗原ペプチドは抗原タンパクに含まれるアミノ酸配列の一部であり、Ｔ細胞認識エピトープが含まれる。Ｔ細胞認識エピトープを複数個組み合わせたものであってもよい。
【０１０３】
本明細書で言及する用語「アジュバント」とは、抗原を含むワクチンと併用して対象に投与することにより、対象における免疫反応を増強する物質を指す。
【０１０４】
式（Ｉ）で表される繰り返し単位を含むヒアルロン酸誘導体
一態様において、式（Ｉ）で表される繰り返し単位を含むヒアルロン酸誘導体は、（１）式（Ｉ）；ならびに（２）式（Ｉ）および式（ＩＩＩｃ）の繰り返し単位から実質的に構成される。
【０１０５】
上記式（Ｉ）で表される繰り返し単位を含むヒアルロン酸誘導体に、式（Ｉ）の繰り返し単位が２以上含まれる場合、当該繰り返し単位は同一であっても、異なっていてもよい。当該ヒアルロン酸誘導体は、式（Ｉ）の繰り返し単位以外の位置において修飾されていてもよく、例えば、ヒドロキシ基は−Ｏ（Ｃ１−６アルキル）、−Ｏ（ホルミル）および−Ｏ（Ｃ１−６アルキルカルボニル）等に変換されていてもよく、カルボキシル基は、アミド基、エステル基に変換されていても、塩を形成していてもよい。
【０１０６】
一つの側面によれば、上記式（Ｉ）の基−Ｚ−Ｎ（Ｒａ）Ｙ−Ｘ１は、以下の式：
−ＮＨ−（ＣＨ２）ｍｚ−ＮＨ−Ｒ；
−ＮＨ−（ＣＨ２）ｍｚ−ＮＨ−ＣＯＯ−Ｒ；
−ＮＨ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｍ−ＣＨ２ＣＨ２−ＮＨ−ＣＯＯ−Ｒ；
−ＮＨ−（ＣＨ２）ｍｚ−ＣＯＯ−Ｒ；
−ＮＨ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｍ−ＣＨ２ＣＨ２−ＣＯＯ−Ｒ；
−ＮＨ−（ＣＨ２）ｍｚ−Ｏ−ＣＯＯ−Ｒ；
−ＮＨ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｍ−ＣＨ２ＣＨ２−Ｏ−ＣＯＯ−Ｒ；
−ＮＨ−（ＣＨ２）ｍｚ−Ｓ−Ｒ；
−ＮＨ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｍ−ＣＨ２ＣＨ２−Ｓ−Ｒ；
−ＮＨ−（ＣＨ２）ｍｚ−Ｏ−ＣＯ−ＣＨ（Ｒ１０）−ＣＨ２−Ｓ−Ｒ；
−ＮＨ−（ＣＨ２）ｍｚ−ＮＨＣＯ−ＣＨ（Ｒ１０）−ＣＨ２−Ｓ−Ｒ；
−ＮＨ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｍ−ＣＨ２ＣＨ２−ＮＨＣＯ−ＣＨ（Ｒ１０）−ＣＨ２−Ｓ−Ｒ；
−ＮＨ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｍ−ＣＨ２ＣＨ２−Ｏ−ＣＯ−ＣＨ（Ｒ１０）−ＣＨ２−Ｓ−Ｒ；および
−ＮＨ−（ＣＨ２）ｍｚ−Ｓ−Ｓ−Ｒ；
−Ｚ−ＮＲａ−Ｙ−ＮＲｂ−ＣＯＯ−Ｒ
（ここで、ｍｚは、２〜３０の整数であり、Ｒ１０は、水素原子またはメチル基であり、Ｒ、およびｍは、本明細書で既に定義したとおりである）
で表される基から選択される。当該基は、好ましくは、
−ＮＨ−（ＣＨ２）ｍｚ−ＮＨ−ＣＯＯ−Ｒ；
−ＮＨ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｍ−ＣＨ２ＣＨ２−ＮＨ−ＣＯＯ−Ｒ；および
−ＮＨ−（ＣＨ２）ｍｚ−Ｓ−Ｓ−Ｒ
（ここで、ｍｚ、Ｒ、およびｍは、本明細書で既に定義したとおりである）
から選択される基である。
【０１０７】
好ましい態様において、上記式（Ｉ）のＺは直接結合である。また、一態様において、上記式（Ｉ）のＺがペプチドリンカーの場合、Ｘ１は−ＮＲｂ−ＣＯＯ−Ｒである。
【０１０８】
上記式（Ｉ）のＹの具体例としては、−ＣＨ２ＣＨ２Ｏ−ＣＨ２ＣＨ２−Ｓ−Ｓ−ＣＨ２ＣＨ２Ｏ−ＣＨ２ＣＨ２−、−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）２−ＣＨ２ＣＨ２−Ｓ−Ｓ−ＣＨ２ＣＨ２Ｏ−ＣＨ２ＣＨ２−、−ＣＨ２ＣＨ２Ｏ−ＣＨ２ＣＨ２−Ｓ−Ｓ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）２−ＣＨ２ＣＨ２−および−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）２−ＣＨ２ＣＨ２−Ｓ−Ｓ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）２−ＣＨ２ＣＨ２−が挙げられる。
【０１０９】
上記式（Ｉ）のＹａとしては、−ＣＨ２−および−ＣＨ２−ＣＨ２−が好ましい。
【０１１０】
上記式（Ｉ）のＹｂとしては、−ＣＨ２−ＣＨ２−、−ＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ２−、２−ブテン−１，４−ジイル、ヘプタ−２，４−ジエン−１，６−ジイルおよびオクタ−２，４，６−トリエン−１，８−ジイルが好ましく、−ＣＨ２−ＣＨ２−および−ＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ２−がさらに好ましい。
【０１１１】
一態様において、上記式（Ｉ）のＺは、−ＮＨ−［ＣＨ（−Ｚａ）−ＣＯＮＨ］ｎ−１−ＣＨ（−Ｚａ）−ＣＯ−で表されるペプチドリンカーであり、ここで、ｎは２〜３０の整数であり、Ｚａは、それぞれ独立に、Ｈ２Ｎ−ＣＨ（−Ｚａ）−ＣＯＯＨとして表されるα−アミノ酸中の置換基を表す。当該ペプチドリンカーは、Ｎ末端にてグルクロン酸部分のカルボキシル基に結合し、Ｃ末端にて基−Ｎ（−Ｒａ）−Ｙ−Ｘ１に結合する。当該ペプチドリンカーのアミノ酸残基として利用できるアミノ酸の例としてはα−アミノ酸、例えばアラニン、アルギニン、アスパラギン（Ａｓｎ）、アスパラギン酸、システイン、グルタミン、グルタミン酸、グリシン（Ｇｌｙ）、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン（Ｌｅｕ）、リジン、メチオニン、フェニルアラニン（Ｐｈｅ）、プロリン、セリン、スレオニン、トリプトファン、チロシン、バリンといった天然型（Ｌ型）のアミノ酸、それらのＤ体などが挙げられ、合成されたアミノ酸を含む全てのα−アミノ酸を用いることができる。すなわち、Ｚａとしては、例えば、−ＣＨ３、Ｈ２ＮＣ（ＮＨ）ＮＨ（ＣＨ２）３−、Ｈ２ＮＣＯＣＨ２−などが挙げられる。また、ｎ個のＺは、同一でも異なっていてもよい。ｎは、２〜３０の整数であるが、２〜１０が好ましく、２〜４がさらに好ましい。ペプチドリンカーの好ましい例としては、例えば、−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−、−Ａｓｎ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−、−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−、−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−などが挙げられる。
【０１１２】
上記式（Ｉ）の基−Ｚ−Ｎ（Ｒａ）Ｙ−Ｘ１の具体例としては、−ＮＨ−（ＣＨ２）２−ＮＨ−ＣＯ−コレステリル、−ＮＨ−（ＣＨ２）４−ＮＨ−（ＣＨ２）３−ＮＨ−（ＣＨ２）３−ＮＨ−ＣＯＯ−コレステリル、−ＮＨ−（ＣＨ２）３−ＮＨ−（ＣＨ２）４−ＮＨ−（ＣＨ２）３−ＮＨ−ＣＯＯ−コレステリル、−ＮＨ−（ＣＨ２）４−ＮＨ−（ＣＨ２）３−ＮＨ−ＣＯＯ−コレステリル、−ＮＨ−（ＣＨ２）４−Ｎ（−（ＣＨ２）３−ＮＨ２）−ＣＯＯ−コレステリル、−ＮＨ−（ＣＨ２）３−ＮＨ−（ＣＨ２）４−Ｎ（−（ＣＨ２）３−ＮＨ２）−ＣＯＯ−コレステリル、−ＮＨ−（ＣＨ２）３−ＮＨ−（ＣＨ２）４−Ｎ（−（ＣＨ２）３−ＮＨ−（ＣＨ２）３−ＮＨ２）−ＣＯＯ−コレステリル、−ＮＨ−（ＣＨ２）３−ＮＨ−（ＣＨ２）４−Ｎ（−（ＣＨ２）３−ＮＨ２）−ＣＯ−ＮＨ−コレステリル、−ＮＨ−（ＣＨ２）３−ＮＨ−（ＣＨ２）４−Ｎ（−（ＣＨ２）３−ＮＨ２）−ＣＯ−コレステリル、−ＮＨ−（ＣＨ２）３−ＮＨ−（ＣＨ２）４−Ｎ（−（ＣＨ２）３−ＮＨ２）−コレステリルが挙げられる。基−Ｚ−Ｎ（Ｒａ）Ｙ−Ｘ１の好ましい態様において、Ｒａ、ＲｂおよびＲｃが、水素原子であり、Ｙが、直鎖状のＣ２−３０アルキレンまたは−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｍ−ＣＨ２ＣＨ２−であり、Ｙａが、直鎖状のＣ１−５アルキレンであるか、またはＹｂが、直鎖状のＣ２−８アルキレンまたは直鎖状のＣ２−８アルケニレンである。
【０１１３】
一態様において、基Ｚ−Ｎ（Ｒａ）Ｙ−Ｘ１は、Ｚが直接結合、Ｒａが水素原子、Ｙが例えばＣ２−１２アルキレン、好ましくはＣ２−６アルキレン、より好ましくはＣ６アルキレン、Ｘ１が−ＮＲｂ−ＣＯＯ−Ｒ、Ｒｂが水素原子、Ｒがコレステリル基である。
【０１１４】
一態様において、上記式（Ｉ）で表される繰り返し単位を含むヒアルロン酸誘導体は、式（ＩＩＩｃ）で表される繰り返し単位をさらに含む。式（ＩＩＩｃ）で表される繰り返し単位が２以上含まれる場合、当該繰り返し単位は同一であっても、異なっていてもよい。
【０１１５】
上記式（ＩＩＩｃ）のＱ＋はカルボキシル基と水中で塩を形成するカウンターカチオンであれば特に限定されず、２価以上の場合は価数に応じて複数のカルボキシル基と塩を形成する。カウンターカチオンの例としては、リチウムイオン、ナトリウムイオン、ルビジウムイオン、セシウムイオン、マグネシウムイオン、カルシウムイオンなどの金属イオン；式：Ｎ＋ＲｊＲｋＲｌＲｍ（式中、Ｒｊ、Ｒｋ、ＲｌおよびＲｍは、それぞれ独立に、水素原子およびＣ１−６アルキルから選択される）で表されるアンモニウムイオンなどが挙げられ、好ましくは、ナトリウムイオン、カリウムイオン、テトラアルキルアンモニウムイオン（例えば、テトラｎ−ブチルアンモニウムイオンなど）が挙げられる。Ｒｊ、Ｒｋ、ＲｌおよびＲｍは、Ｃ１−６アルキルから選択される同一の基であるのが好ましく、ｎ−ブチル基であるのが好ましい。
【０１１６】
上記式（Ｉ）の基Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、およびＲ４、ならびに上記式（ＩＩＩｃ）のＲ１ａ、Ｒ２ａ、Ｒ３ａおよびＲ４ａは、全て水素原子であるのが好ましい。また、ＲａおよびＲｂは、いずれも水素原子であるのが好ましい。
【０１１７】
上記式（Ｉ）の基Ｒ５は、アセチルが好ましい。
【０１１８】
一態様において、上記式（Ｉ）で表される繰り返し単位を含むヒアルロン酸誘導体は、式（Ｉ）および（ＩＩＩｃ）の繰り返し単位から実質的に構成される。当該ヒアルロン酸誘導体は、当該誘導体に含まれるＤ−グルクロン酸とＮ−アセチルグルコサミンとから成る二糖の繰り返し単位のうちの、例えば８０％以上が、好ましくは９０％以上が、より好ましくは９５％以上が式（Ｉ）または（ＩＩＩｃ）の繰り返し単位である。一態様において、上記式（Ｉ）および式（ＩＩＩｃ）で表される繰り返し単位のみから構成される。
【０１１９】
式（Ｉ）で定義したＹは、例えば、−（ＣＨ２）ｎａ−（ここで、ｎａは２〜２０、好ましくは２〜１５、さらに好ましくは２〜１２の整数から選択される）であってもよく、好ましくは、−（ＣＨ２）２−、−（ＣＨ２）６−、−（ＣＨ２）８−および−（ＣＨ２）１２−であり、さらに好ましくは−（ＣＨ２）６−である。これらのＹは、後述する、沈殿形成および安定な分散という観点で好ましいものである。
【０１２０】
一つの側面によれば、上記式（Ｉ）で表される繰り返し単位を含むヒアルロン酸誘導体は、当該誘導体に存在する二糖の繰り返し単位に対する疎水性基の導入率が、例えば１〜５０％、好ましくは７〜５０％、さらに好ましくは１７〜５０％、より好ましくは２０〜４５％である。導入率が前記範囲の場合、上記式（Ｉ）で表される繰り返し単位を含むヒアルロン酸誘導体は、溶液中において抗原と効率よく複合体を形成することができる。
【０１２１】
ここで、疎水性基の導入率は、以下の式：
【０１２２】
【数１】
2020158771.tif 000008
により算出される。ここで、「当該誘導体に存在する二糖の繰り返し単位」には、カルボキシル基がアミド基に変換されて疎水性基が導入されている式（Ｉ）の繰り返し単位、および疎水性基が導入されていない式（ＩＩＩｃ）の繰り返し単位が含まれる。当該導入率は、反応条件、例えば試薬の比率により制御することができ、例えば、ＮＭＲ測定などにより決定することができる。
【０１２３】
上記式（Ｉ）で表される繰り返し単位を含むヒアルロン酸誘導体は、好ましくは、Ｒ１ｃ、Ｒ２ｃ、Ｒ３ｃ、およびＲ４ｃの全てを水素原子とし、Ｒ５ｃをアセチルとし、かつ、Ｘｃを−Ｏ−Ｎａ＋とした場合の重量平均分子量が、例えば１ｋＤａ〜５００ｋＤａ、好ましくは３ｋＤａ〜５００ｋＤａ、より好ましくは５ｋＤａ〜２００ｋＤａとなる、式（ＩＩＩｃ）で表される繰り返し単位のみから構成されるヒアルロン酸またはその誘導体を原料として合成される。一態様として、抗原との複合体形成の観点で好ましい原料の重量平均分子量は、１ｋＤａ〜１０００ｋＤａであり、さらに好ましくは３ｋＤａ〜２００ｋＤａである。複合体のリンパ節移行の観点で好ましい上記原料の重量平均分子量は、１ｋＤａ〜１０００ｋＤａであり、さらに好ましくは３ｋＤａ〜５００ｋＤａであり、さらに好ましくは５ｋＤａ〜２００ｋＤａであり、さらに好ましくは５ｋＤａ〜１５０ｋＤａである。
【０１２４】
なお、一般的に、ヒアルロン酸およびその誘導体は単一品として得ることが難しいため、その分子量は、数平均分子量または重量平均分子量として算出する。本発明においては、重量平均分子量として算出している。重量平均分子量の測定方法については、例えば、中浜精一他著「エッセンシャル高分子科学」（講談社発行、ＩＳＢＮ４−０６−１５３３１０−Ｘ）に記載された、光散乱法、浸透圧法、粘度法等、各種の公知の方法を利用することができ、本明細書において示される粘度平均分子量もウベローデ粘度計を使用するなど、本発明が属する技術分野において通常用いられる方法により測定することができる。分子量を明示して市販されているヒアルロン酸およびその誘導体を使用する場合は、その明示された数値を分子量とすることもできる。
【０１２５】
上記式（Ｉ）の繰り返し単位を含むヒアルロン酸誘導体は、繰り返し単位を構成する二糖の一つであるグルクロン酸のカルボキシル基をアミド基に変換して、疎水性基を導入している。ヒアルロン酸誘導体の修飾の程度を調節することにより、当該誘導体を用いて製造する製剤の体内動態を制御することも可能である。
【０１２６】
上記式（Ｉ）の繰り返し単位を含むヒアルロン酸誘導体のグルクロン酸部分のカルボキシル基修飾率が高ければ、ＣＤ４４を始めとするヒアルロン酸レセプターへの結合が抑制され、当該ヒアルロン酸誘導体は体内で長く滞留する薬物担体（ワクチンを含む）となる。さらにヒアルロン酸誘導体にターゲット素子を導入することにより、リンパ節を含む各臓器ならびに細胞へターゲッティングすることができる。ターゲット素子としては、例えば、標的組織特異的なペプチド、抗体、断片化抗体、アプタマー、がん細胞に対するＲＧＤペプチド、葉酸、アニサミド、トランスフェリン、肝臓に対するガラクトース、トコフェロールなどがある。
【０１２７】
上記式（Ｉ）の繰り返し単位を含むヒアルロン酸誘導体のグルクロン酸部分のカルボキシル基の疎水性基による修飾率、すなわち疎水性基の導入率は、抗原との複合体形成の観点では、４〜６０％が好ましく、５〜５０％がさらに好ましく、７〜５０％がさらに好ましく、７〜４５％がさらに好ましい。複合体のリンパ節移行の観点では、６〜６０％が好ましく、１７〜５０％がさらに好ましく、２０〜５０％がさらに好ましく、２０〜４５％がさらに好ましい。
【０１２８】
上記式（Ｉ）で表される繰り返し単位を含むヒアルロン酸誘導体の原料の分子量と疎水性基の導入率の組み合わせとしては、抗原との複合体形成の観点では、３ｋＤａ〜５００ｋＤａかつ４〜６０％が好ましく、３ｋＤａ〜２００ｋＤａかつ６〜５０％がさらに好ましく、５ｋＤａ〜２００ｋＤａかつ６〜５０％がさらに好ましく、５ｋＤａ〜１５０ｋＤａかつ６〜４５％がさらに好ましい。複合体のリンパ節移行の観点では、３ｋＤａ〜５００ｋＤａかつ４〜６０％が好ましく、３ｋＤａ〜２００ｋＤａかつ６〜５０％がさらに好ましく、５ｋＤａ〜２００ｋＤａかつ６〜５０％がさらに好ましく、５ｋＤａ〜１５０ｋＤａかつ２０〜４５％がさらに好ましい。安定な分散という観点では、３ｋＤａ〜２００ｋＤａかつ４〜６０％が好ましく、３ｋＤａ〜２００ｋＤａかつ６〜５０％がさらに好ましく、５ｋＤａ〜２００ｋＤａかつ６〜５０％がさらに好ましく、５ｋＤａ〜１５０ｋＤａかつ１７〜４５％がさらに好ましい。血中滞留性向上の観点では、５ｋＤａ〜２７ｋＤａかつ２〜５０％が好ましく、５ｋＤａ〜２７ｋＤａかつ８〜３５％がさらに好ましく、５ｋＤａ〜１８ｋＤａかつ８〜３５％がさらに好ましく、５ｋＤａ〜１８ｋＤａかつ８〜３５％がさらに好ましく、５ｋＤａ〜１８ｋＤａかつ１５〜２２％がさらに好ましい。ゲル化の観点では、５ｋＤａ〜３００ｋＤａかつ２〜３０％が好ましく、５ｋＤａ〜５０ｋＤａかつ２〜２２％がさらに好ましく、５ｋＤａ〜２７ｋＤａかつ２〜２２％がさらに好ましく、５ｋＤａ〜２７ｋＤａかつ７〜２２％がさらに好ましい。
【０１２９】
式（ＩＩ）で表される繰り返し単位を含むヒアルロン酸誘導体
一態様において、上記式（ＩＩ）で表される繰り返し単位を含むヒアルロン酸誘導体は、（１）上記式（ＩＩ）；（２）上記式（ＩＩ）および式（ＩＩＩ）；（３）上記式（ＩＩ）および式（ＩＩＩｃ）；または（４）上記式（ＩＩ）、式（ＩＩＩ）、および式（ＩＩＩｃ）の繰り返し単位から実質的に構成される。当該ヒアルロン酸酸誘導体は、当該誘導体に含まれるＤ−グルクロン酸とＮ−アセチルグルコサミンとから成る二糖の繰り返し単位のうちの、例えば８０％以上が、好ましくは９０％以上が、より好ましくは９５％以上が式（ＩＩ）、（ＩＩＩ）、または式（ＩＩＩｃ）の繰り返し単位である。一態様において、当該ヒアルロン酸誘導体は、（１）式（ＩＩ）；（２）式（ＩＩ）および式（ＩＩＩ）；（３）式（ＩＩ）および式（ＩＩＩｃ）；または（４）式（ＩＩ）、式（ＩＩＩ）、および式（ＩＩＩｃ）の繰り返し単位のみから構成される。
【０１３０】
上記式（ＩＩ）で表される繰り返し単位を含むヒアルロン酸誘導体中に存在する二糖の繰り返し単位に対する特定の二糖単位の割合は、二糖単位を繰り返し単位とする多糖類である上記式（ＩＩ）で表される繰り返し単位を含むヒアルロン酸誘導体の一定量に含まれる全ての二糖単位に対する特定の二糖単位の割合を意味する。
【０１３１】
上記式（ＩＩ）で表される繰り返し単位を含むヒアルロン酸誘導体に含まれる二糖単位を表す式（ＩＩ）において、Ｒ１ａ、Ｒ２ａ、Ｒ３ａ、およびＲ４ａは、全て水素原子であるのが好ましい。Ｒ５ａは、水素原子またはＣ１−６アルキルカルボニルであるのが好ましく、水素原子またはアセチルであるのがさらに好ましく、アセチルであるのがさらに好ましい。また、上記式（ＩＩ）で表される繰り返し単位を含むヒアルロン酸誘導体に含まれる二糖単位を表す式（ＩＩＩ）および（ＩＩＩｃ）において、Ｒ１ｂ、Ｒ２ｂ、Ｒ３ｂおよびＲ４ｂ、ならびにＲ１ｃ、Ｒ２ｃ、Ｒ３ｃおよびＲ４ｃは、全て水素原子であるのが好ましい。Ｒ５ｂおよびＲ５ｃは、水素原子またはＣ１−６アルキルカルボニルであるのが好ましく、水素原子またはアセチルであるのがさらに好ましく、いずれもアセチルであるのがさらに好ましい。
【０１３２】
式（ＩＩ）におけるＲａａの具体例としては、水素原子、メチル、ヒドロキシメチル、１−ヒドロキシエチル、カルバモイルメチル、カルボキシメチル、１−メチルプロピル、２−メチルプロピル、イソプロピル、２−カルボキシエチル、２−メチルチオエチル、２−カルバモイルエチル、フェニルメチル、（４−ヒドロキシフェニル）メチル、およびインドール−３−イルメチルなどが挙げられる。
【０１３３】
基−ＣＨＲａａ−が不斉中心となる場合は、それぞれの光学活性体およびそれらの混合物も含まれるが、Ｈ２Ｎ−ＣＨＲａａ−ＣＯＯＨ（アミノ酸）として記載した時、Ｌ型（天然型）となるのが好ましい。
【０１３４】
式（ＩＩ）において、Ｒ６ａ、Ｒ７、Ｒ８、およびＲ９は、例えば、独立に、水素原子またはメチルであり、好ましくは全て水素原子である。
【０１３５】
式（ＩＩ）における基−ＣＨＲａａ−ＣＯ−Ｘ１ａの態様として、例えば、基−ＣＨＲａａ−ＣＯＯＨが挙げられる。該基の具体例として以下の基が挙げられる。
【０１３６】
【化６】
2020158771.tif 000009
ここで、アスタリスクは、−ＮＲ６ａ−との結合位置を表す（以下同じ）。
【０１３７】
基−ＣＨＲａａ−ＣＯＯＨの好ましい例としては以下の基が挙げられる。
【０１３８】
【化７】
2020158771.tif 000010
基−ＣＨＲａａ−ＣＯＯＨの好ましい例としては以下の基が挙げられる。
【０１３９】
【化８】
2020158771.tif 000011
基−ＣＨＲａａ−ＣＯＯＨの好ましい例としては以下の基が挙げられる。
【０１４０】
【化９】
2020158771.tif 000012
基−ＣＨＲａａ−ＣＯＯＨの好ましい例としては以下の基が挙げられる。
【０１４１】
【化１０】
2020158771.tif 000013
複合体のリンパ節へのデリバリーの観点では、基−ＣＨＲａａ−ＣＯＯＨの好ましい例としては以下の基が挙げられる。
【０１４２】
【化１１】
2020158771.tif 000014
さらに好ましい例として以下の基が挙げられる。
【０１４３】
【化１２】
2020158771.tif 000015
さらに好ましい例として以下の基が挙げられる。
【０１４４】
【化１３】
2020158771.tif 000016
上述した基−ＣＨＲａａ−ＣＯＯＨは、いずれも、その一部または全部が、基−ＣＨＲａａ−ＣＯＮＨ−Ｚ１−Ｚ２に変換されていてもよい。基−Ｚ１−Ｚ２の例は、後述の通りである。
【０１４５】
式（ＩＩ）における基−ＣＨＲａａ−ＣＯ−Ｘ１ａの別の態様として、例えば、基−ＣＨＲａａ−ＣＯＮＨ２が挙げられる。該基の具体例として以下の基が挙げられる。
【０１４６】
【化１４】
2020158771.tif 000017
基−ＣＨＲａａ−ＣＯＮＨ２の好ましい例としては以下の基が挙げられる。
【０１４７】
【化１５】
2020158771.tif 000018
基−ＣＨＲａａ−ＣＯＮＨ２の好ましい例としては以下の基が挙げられる。
【０１４８】
【化１６】
2020158771.tif 000019
基−ＣＨＲａａ−ＣＯＮＨ２の好ましい例としては以下の基が挙げられる。
【０１４９】
【化１７】
2020158771.tif 000020
基−ＣＨＲａａ−ＣＯＮＨ２の好ましい例としては以下の基が挙げられる。
【０１５０】
【化１８】
2020158771.tif 000021
これらの基は、生分解性と血中滞留性の両方の特性を有する観点で、好ましい基でもある。
【０１５１】
生分解性と血中滞留性の両方の特性を有する観点では、基−ＣＨＲａａ−ＣＯＮＨ２の好ましい例としては以下の基も挙げられる。
【０１５２】
【化１９】
2020158771.tif 000022
生分解性と血中滞留性の両方の特性を有する観点で、基−ＣＨＲａａ−ＣＯＮＨ２のさらに好ましい例としては以下の基が挙げられる。
【０１５３】
【化２０】
2020158771.tif 000023
純水中でのより好適な分散性の観点で、基−ＣＨＲａａ−ＣＯＮＨ２の好ましい例としては以下の基が挙げられる。
【０１５４】
【化２１】
2020158771.tif 000024
これら２つの基は、持続性の皮下投与用注射製剤の基材としての観点でも好ましい例である。
【０１５５】
持続性の皮下投与用注射製剤の基材としての観点で、基−ＣＨＲａａ−ＣＯＮＨ２の好ましい例としては以下の基が挙げられる。
【０１５６】
【化２２】
2020158771.tif 000025
Ｒ７としては、水素原子およびメチルがさらに好ましく、水素原子がさらに好ましい。
【０１５７】
式（ＩＩ）、（ＩＩＩ）および（ＩＩＩｃ）において定義されるカルボキシは式−ＣＯＯ−Ｑ＋で表される塩を形成していてもよい。ここで、Ｑ＋はカルボキシと水中で塩を形成するカウンターカチオンであれば特に限定されず、２価以上の場合は価数に応じて複数のカルボキシと塩を形成する。カウンターカチオンの例としては、リチウムイオン、ナトリウムイオン、ルビジウムイオン、セシウムイオン、マグネシウムイオン、カルシウムイオンなどの金属イオン；式：Ｎ＋ＲｊＲｋＲｌＲｍ（式中、Ｒｊ、Ｒｋ、ＲｌおよびＲｍは、それぞれ独立に、水素原子およびＣ１−６アルキルから選択される）で表されるアンモニウムイオンなどが挙げられ、好ましくは、ナトリウムイオン、カリウムイオン、テトラアルキルアンモニウムイオン（例えば、テトラｎ−ブチルアンモニウムイオンなど）が挙げられる。Ｒｊ、Ｒｋ、ＲｌおよびＲｍは、Ｃ１−６アルキルから選択される同一の基であるのが好ましく、ｎ−ブチルであるのが好ましい。
【０１５８】
式（ＩＩ）における基−ＣＨＲａａ−ＣＯ−Ｘ１ａの別の態様として、例えば、基−ＣＨＲａａ−ＣＯＮＨ−Ｚ１−Ｚ２が挙げられる。該基の具体例として以下の基が挙げられる。
【０１５９】
【化２３】
2020158771.tif 000026
該基の別の具体例として以下の基が挙げられる。
【０１６０】
【化２４】
2020158771.tif 000027
基−ＣＨＲａａ−ＣＯＮＨ−Ｚ１−Ｚ２の好ましい例としては以下の基が挙げられる。
【０１６１】
【化２５】
2020158771.tif 000028
基−ＣＨＲａａ−ＣＯＮＨ−Ｚ１−Ｚ２の好ましい例としては以下の基が挙げられる。
【０１６２】
【化２６】
2020158771.tif 000029
基−ＣＨＲａａ−ＣＯＮＨ−Ｚ１−Ｚ２の好ましい例としては以下の基が挙げられる。
【０１６３】
【化２７】
2020158771.tif 000030
複合体のリンパ節へのデリバリーの観点では、基−ＣＨＲａａ−ＣＯＮＨ−Ｚ１−Ｚ２の好ましい例としては以下の基が挙げられる。
【０１６４】
【化２８】
2020158771.tif 000031
さらに好ましい基として以下の基が挙げられる。
【０１６５】
【化２９】
2020158771.tif 000032
さらに好ましい例として以下の基が挙げられる。
【０１６６】
【化３０】
2020158771.tif 000033
生分解性と血中滞留性の両方の特性を有する観点で、基−ＣＨＲａａ−ＣＯＮＨ−Ｚ１−Ｚ２の好ましい例としては以下の基が挙げられる。
【０１６７】
【化３１】
2020158771.tif 000034
基−Ｚ１−Ｚ２の例としては、基−（Ｃ２−１０アルキレン）−ＮＨ−ＣＯＯ−Ｚ３が挙げられる。また、基−（Ｃ２−１２アルキレン）−ＮＨ−ＣＯＯ−Ｚ３も挙げられる。ここでＣ２−１２アルキレンの例として、好ましくは、−（ＣＨ２）２−、−（ＣＨ２）６−、−（ＣＨ２）８−、−（ＣＨ２）１０−および−（ＣＨ２）１２−が挙げられ、さらに好ましくは−（ＣＨ２）２−および−（ＣＨ２）６−が挙げられる。さらに、基−Ｚ１−Ｚ２の例としては、基−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｍａ−ＣＨ２ＣＨ２−ＮＨ−Ｚ３が挙げられる。ここでｍａは、１〜２０が好ましく、１〜１０がさらに好ましく、１〜３がさらに好ましい。好ましいｍａの具体例として、２が挙げられる。基−Ｚ１−Ｚ２の例として、好ましくは基−（ヘキサン−１，６−ジイル）−ＮＨ−ＣＯＯ−Ｚ３、基−（エタン−１，２−ジイル）−ＮＨ−ＣＯＯ−Ｚ３および基−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）２−ＣＨ２ＣＨ２−ＮＨ−Ｚ３が挙げられ、さらに好ましくは基−（ヘキサン−１，６−ジイル）−ＮＨ−ＣＯＯ−コレステリル、基−（エタン−１，２−ジイル）−ＮＨ−ＣＯＯ−コレステリルおよび基−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）２−ＣＨ２ＣＨ２−ＮＨ−コラノイルが挙げられ、さらに好ましくは基−（ヘキサン−１，６−ジイル）−ＮＨ−ＣＯＯ−コレステリルが挙げられる。Ｚ１、Ｚ２、基−Ｚ１−Ｚ２の例としては、上記式（Ｉ）で表される繰り返し単位を含むヒアルロン酸誘導体の、Ｙ、Ｘ１、基−Ｙ−Ｘ１に相当するものを、それぞれ挙げることもできる。基−ＣＯ−ＮＲｃａ−Ｚ３および基−Ｏ−ＣＯ−ＮＲｃａ−Ｚ３の例としては、Ｒｃａが水素原子である基を、それぞれ挙げることができる。
【０１６８】
一態様において、式（ＩＩ）で表される繰り返し単位を含むヒアルロン酸誘導体は、基Ｘ１ａにおいて、Ｘ１ａが−ＮＲ９−Ｚ１−Ｚ２、Ｒ９が水素原子、Ｚ１が例えばＣ２−１２アルキレン、好ましくはＣ２−６アルキレン、より好ましくはＣ６アルキレン、Ｚ２が−ＮＲｂａ−ＣＯＯ−Ｚ３、Ｒｂａが水素原子、およびＺ３がステリル基であり、基Ｒａａは、水素原子、またはＣ１−６アルキルであり、ここで該アルキルは、独立に、ヒドロキシ、カルボキシ、カルバモイル、Ｃ１−６アルキルチオ、アリール、およびヘテロアリールから選択される１以上の基で置換されていてもよく、ここで該アリールは１以上のヒドロキシで置換されていてもよい。
【０１６９】
複合体のリンパ節デリバリーの観点で好ましい基Ｒａａの具体例としては、例えばメチル、ヒドロキシメチル、水素原子、１−ヒドロキエチル、カルバモイルメチル、カルボキシメチル、ベンジル、（４−ヒドロキシフェニル）メチル、１−メチルプロピル、２−メチルプロピル、イソプロピル、インドール−３−イルメチル、２−カルバモイルエチルおよび２−カルボキシエチルが挙げられ、好ましくはメチル、ヒドロキシメチル、１−ヒドロキエチル、１−メチルプロピルおよび２−カルバモイルエチル、さらに好ましくはメチルおよび２−カルバモイルエチルである。
【０１７０】
一態様において、式（ＩＩＩ）で表される繰り返し単位を含む、上記式（ＩＩ）で表される繰り返し単位を含むヒアルロン酸誘導体も好ましい。さらに好ましい態様において、式（ＩＩ）のＸ１ａと式（ＩＩＩ）のＸ２は同一である。一つの側面において、上記式（ＩＩ）で表される繰り返し単位を含むヒアルロン酸誘導体は、Ｘ１ａが−ＮＲ９−Ｚ１−Ｚ２である式（ＩＩ）で表される繰り返し単位、式（ＩＩＩ）で表される繰り返し単位および式（ＩＩＩｃ）で表される繰り返し単位を含んでいてもよい。
【０１７１】
さらに別の側面によれば、上記式（ＩＩ）で表される繰り返し単位を含むヒアルロン酸誘導体は、存在する二糖の繰り返し単位に対する基−ＮＲ９−Ｚ１−Ｚ２（以下疎水性基とも称する）を有する式（ＩＩ）および／または式（ＩＩＩ）の繰り返し単位の割合（疎水性基の導入率）が３〜５０％であってもよい。
【０１７２】
ここで、疎水性基の導入率は、以下の式：
【０１７３】
【数２】
2020158771.tif 000035
により算出される。ここで、「当該誘導体に存在する二糖の繰り返し単位」には、式（ＩＩ）および式（ＩＩＩ）の繰り返し単位、ならびに式（ＩＩＩｃ）の繰り返し単位が含まれる。当該導入率は、反応条件、例えば試薬の比率により制御することができ、例えば、ＮＭＲ測定などにより決定することができる。
【０１７４】
上記式（ＩＩ）で表される繰り返し単位を含むヒアルロン酸誘導体における疎水性基の導入率は、例えば３〜５０％であり、好ましくは５〜４０％であり、より好ましくは５〜３５％であり、さらに好ましくは５〜２５％であり、より好ましくは５〜２０％であり、さらに好ましくは５〜１０％である。抗原との複合体形成の観点では、３〜６０％が好ましく、７〜５０％がさらに好ましく、１８〜４５％がさらに好ましく、２０〜３５％がさらに好ましい。複合体のリンパ節移行の観点では、３〜６０％が好ましく、７〜５０％がさらに好ましく、１８〜４５％がさらに好ましく、２０〜３５％がさらに好ましい。
【０１７５】
一態様において、上記式（ＩＩ）で表される繰り返し単位を含むヒアルロン酸誘導体は、式（ＩＩ）においてＸ１ａが−ＮＲ９−Ｚ１−Ｚ２である。この場合、ヒアルロン酸誘導体中に存在する二糖の繰り返し単位に対する式（ＩＩ）の二糖単位の割合は、生分解性及び血中滞留性の両方の特性を有する観点で、例えば７０％以上、好ましくは７５％以上、更に好ましくは９０％以上である。上限は１００％以下であればよい。当該割合の範囲は、例えば、７０〜１００％、好ましくは７５〜１００％、更に好ましくは９０〜１００％である。また、抗原との複合体形成の特性を有する観点で、例えば１０％以上、好ましくは２０％以上、さらに好ましくは５０％以上、さらに好ましくは７０％以上、更に好ましくは９０％以上である。上限は１００％以下であればよい。当該割合の範囲は、例えば、１０〜１００％、好ましくは２０〜１００％、さらに好ましくは５０〜１００％、さらに好ましくは７０〜１００％、更に好ましくは９０〜１００％である。さらに、複合体がリンパ節移行の特性を有する観点で、例えば１０％以上、好ましくは２０％以上、さらに好ましくは５０％以上、さらに好ましくは７０％以上、更に好ましくは９０％以上である。上限は１００％以下であればよい。当該割合の範囲は、例えば、１０〜１００％、好ましくは２０〜１００％、さらに好ましくは５０〜１００％、さらに好ましくは７０〜１００％、更に好ましくは９０〜１００％である。なお、上記式（ＩＩ）で表される繰り返し単位を含むヒアルロン酸誘導体は、式（ＩＩＩ）で表される繰り返し単位をさらに含んでいてもよい。
【０１７６】
一態様において、上記式（ＩＩ）で表される繰り返し単位を含むヒアルロン酸誘導体は、Ｘ１が−ＮＲ９−Ｚ１−Ｚ２である式（ＩＩ）で表される繰り返し単位を含まない。この場合、存在する二糖の繰り返し単位における、式（ＩＩ）で表わされる繰り返し単位の割合、および式（ＩＩＩ）で表わされる繰り返し単位の割合の和は、例えば７０〜１００％、好ましくは８０〜１００％、より好ましくは９０〜１００％である。抗原との複合体形成の観点では、例えば７〜１００％、好ましくは２０〜１００％、より好ましくは３０〜１００％である。複合体のリンパ節移行の観点では、例えば２０〜１００％、好ましくは３０〜１００％、より好ましくは７０〜１００％である。
【０１７７】
ここで、上記式（ＩＩ）で表される繰り返し単位を含むヒアルロン酸誘導体において、存在する二糖の繰り返し単位における式（ＩＩＩ）で表わされる繰り返し単位の割合は、好ましくは３〜５０％、さらに好ましくは５〜４０％、さらに好ましくは５〜３５％、さらに好ましくは５〜２５％、さらに好ましくは５〜２０％、さらに好ましくは５〜１０％である。抗原との複合体形成の観点では、３〜６０％が好ましく、７〜５０％がさらに好ましく、１８〜４５％がさらに好ましく、２０〜３５％がさらに好ましい。複合体のリンパ節移行の観点では、３〜６０％が好ましく、７〜５０％がさらに好ましく、１８〜４５％がさらに好ましく、２０〜３５％がさらに好ましい。
【０１７８】
また、上記式（ＩＩ）で表される繰り返し単位を含むヒアルロン酸誘導体において、存在する二糖の繰り返し単位における式（ＩＩ）で表わされる繰り返し単位の割合は、好ましくは２０〜９７％、さらに好ましくは３０〜９５％、さらに好ましくは３５〜９５％、さらに好ましくは４５〜９５％、さらに好ましくは５０〜９５％、さらに好ましくは６０〜９５％である。抗原との複合体形成の観点では、例えば７〜１００％、好ましくは２０〜１００％、より好ましくは３０〜１００％である。複合体のリンパ節移行の観点では、例えば２０〜１００％、好ましくは３０〜１００％、より好ましくは７０〜１００％である。
【０１７９】
上記式（Ｉ）で表される繰り返し単位を含むヒアルロン酸誘導体および上記式（ＩＩ）で表される繰り返し単位を含むヒアルロン酸誘導体を製造する方法としては、国際公開第２０１０／０５３１４０号および国際公開第２０１４／０３８６４１号に記載の方法が挙げられる。
【０１８０】
一つの側面によれば、上記式（Ｉ）で表される繰り返し単位を含むヒアルロン酸誘導体または上記式（ＩＩ）で表される繰り返し単位を含むヒアルロン酸誘導体は、水中で会合により微粒子を形成することを特徴とする。特に限定はされないが、導入された疎水性基の疎水性相互作用により水中において自発的会合が起こり、微粒子を形成すると考えられている。この特性を生かし、ワクチン用キャリア、リンパ節デリバリーキャリア、血中徐放キャリア、ターゲティングキャリアとして用いることができる。当該微粒子の粒子径は特に限定されないが、例えば、１μｍ以下、好ましくは５００ｎｍ、より好ましくは２００ｎｍ以下、さらに好ましくは１００ｎｍ以下、さらにより好ましくは５０ｎｍ以下である。上記式（Ｉ）で表される繰り返し単位を含むヒアルロン酸誘導体および上記式（ＩＩ）で表される繰り返し単位を含むヒアルロン酸誘導体を微粒子化する方法としては、国際公開第２０１０／０５３１４０号に記載の方法および国際公開第２０１４／０３８６４１号に記載の方法が挙げられる。
【０１８１】
上記式（Ｉ）で表される繰り返し単位を含むヒアルロン酸誘導体および上記式（ＩＩ）で表される繰り返し単位を含むヒアルロン酸誘導体を製造するための原料としては、ヒアルロン酸またはその塩もしくはその誘導体を使用することができる。ヒアルロン酸塩としては、例えば、ナトリウム塩、カリウム塩、リチウム塩等のアルカリ金属塩を挙げることができ、特に好ましい塩は、医薬品として繁用されているナトリウム塩である。ヒアルロン酸またはその薬学的に許容される塩は、鶏冠や豚皮下等の生物由来のものを抽出する方法や生物発酵法等の各種公知の方法を用いて製造することができ、あるいは市販のものを購入して（例えば、デンカ株式会社、株式会社資生堂、生化学工業株式会社、Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍ社等から）入手することも可能である。
【０１８２】
上記式（Ｉ）で表される繰り返し単位を含むヒアルロン酸誘導体または上記式（ＩＩ）で表される繰り返し単位を含むヒアルロン酸誘導体微粒子と複合体を形成した抗原は、投与後、ヒアルロン酸誘導体微粒子の分解・崩壊、およびアルブミンなどの生体成分と抗原の置換によって、複合体から放出されることがある。この放出の速度は、ヒアルロン酸誘導体の疎水性基の導入率や分子量、アミノ酸導入率により制御することが可能である。また、国際公開第２０１０／０５３１４０号に記載の方法により、ヒアルロン酸誘導体を化学架橋し、ゲル化することにより抗原放出速度を制御することも可能である。また、国際公開第２０１０／０５３１４０号に記載の方法により、ヒアルロン酸誘導体と抗原とをコンジュゲートすることにより抗原放出速度を制御することも可能である。
【０１８３】
抗原
上記式（Ｉ）で表される繰り返し単位を含むヒアルロン酸誘導体または上記式（ＩＩ）で表される繰り返し単位を含むヒアルロン酸誘導体との複合体とし、ワクチン製剤を製造するために用いる抗原としては、例えば、抗原ペプチドおよび抗原タンパク、ならびにこれらの抗原配列をコードしたＤＮＡおよびｍＲＮＡが挙げられ、好ましくは抗原ペプチドおよび抗原タンパク、さらに好ましくは抗原ペプチドである。
【０１８４】
抗原は、がん抗原であってもよい。がん抗原は 、がん細胞に多く発現する抗原であり、いくつかの場合には、がん細胞によってのみ発現する。がん抗原は、がん細胞内、またはがん細胞の表面上に発現し得る。
【０１８５】
本発明において使用され得る抗原タンパクは、限定されないが、ＭＡＲＴ−１／Ｍｅｌａｎ−Ａ、ｇｐ１００、アデノシンデアミナーゼ結合タンパク質（ＡＤＡｂｐ）、ＦＡＰ、シクロフィリンｂ、結腸直腸関連抗原（ＣＲＣ）−Ｃ０１７−１Ａ／ＧＡ７３３、がん胎児性抗原（ＣＥＡ）、ＣＡＰ−１、ＣＡＰ−２、ｅｔｖ６、ＡＭＬ１、前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）、Ｐ ＳＡ−１、ＰＳＡ−２、ＰＳＡ−３、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）、Ｔ細胞受容体／ＣＤ３−ゼータ鎖、ＣＤ２０、ＭＡＧＥ−Ａ１、ＭＡＧＥ−Ａ２、ＭＡＧＥ−Ａ３、ＭＡＧＥ−Ａ４、ＭＡＧＥ−Ａ５、ＭＡＧＥ−Ａ６、ＭＡＧＥ−Ａ７、ＭＡＧＥ−Ａ８、ＭＡＧＥ−Ａ９、ＭＡＧＥ−Ａ１０、ＭＡＧＥ−Ａ１１、ＭＡＧＥ−Ａ１２、ＭＡＧＥ−Ｘｐ２（ＭＡＧＥ−Ｂ２）、ＭＡＧＥ−Ｘｐ３（ＭＡＧＥ−Ｂ３）、ＭＡＧＥ−Ｘｐ４（ＭＡＧＥ−Ｂ４）、ＭＡＧＥ−Ｃ１、ＭＡＧＥ−Ｃ２、ＭＡＧＥ−Ｃ３、ＭＡＧＥ−Ｃ４、ＭＡＧＥ−Ｃ５、ＧＡＧＥ−１、ＧＡＧＥ−２、ＧＡＧＥ−３、ＧＡＧＥ−４、ＧＡＧＥ−５、ＧＡＧＥ−６、ＧＡＧＥ−７、ＧＡＧＥ−８およびＧＡＧＥ−９、ＢＡＧＥ、ＲＡＧＥ、ＬＡＧＥ−１、ＮＡＧ、ＧｎＴ−Ｖ、ＭＵＭ−１、ＣＤＫ４、チロシナーゼ、ｐ５３、ＭＵＣファミリー、ＨＥＲ２／ｎｅｕ、ｐ２１ｒａｓ、ＲＣＡＳ１、α−フェトプロテイン、Ｅ−カドヘリン、α−カテニン、β−カテニン、γ−カテニン、ｐ１２０ｃｔｎ、ｇｐ１００Ｐｍｅｌ１１７、ＰＲＡＭＥ、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ｃｄｃ２７、大腸腺腫症タンパク質（ＡＰＣ）、フォドリン、コネキシン３７、Ｉｇイディオタイプ、ｐ１５、ｇｐ７５、ＧＭ２ガングリオシド、ＧＤ２ガングリオシド、ヒトパピローマウイルスタンパク質、腫瘍抗原のＳｍａｄファミリー、ｌｍｐ−１、Ｐ１Ａ、ＥＢＶがコードする核抗原（ＥＢＮＡ）−１、脳グリコーゲンホスホリラーゼ、ＳＳＸ−１、ＳＳＸ−２（ＨＯＭ−ＭＥＬ−４０）、ＳＳＸ−１、ＳＳＸ−４、ＳＳＸ−５、ＳＣＰ−１、ＣＴ−７、ＣＤ２０およびｃ−ｅｒｂＢ−２から選択され得る。
【０１８６】
上記抗原タンパクとしては、その配列の全てが使用されてもよいし、一部が欠失した配列が使用されてもよい。
【０１８７】
上記抗原ペプチドは、抗原タンパクの配列のうち、ＣＤ８陽性細胞傷害性Ｔ細胞認識エピトープおよび／またはＣＤ４陽性ヘルパーＴ細胞認識エピトープを１つ以上含む抗原ペプチドである。一態様において、抗原提示細胞での分解を経てＭＨＣクラスＩ分子またはＭＨＣクラスＩＩ分子に搭載されるという観点から、上記抗原ペプチドは、好ましくは２つ以上のエピトープを含む抗原ペプチドである。具体的には、上記抗原ペプチドとしては、腫瘍細胞の抗原タンパクのエピトープを含む抗原ペプチドが挙げられる。
【０１８８】
一態様において、上記抗原ペプチドは、例えば８〜１２０アミノ酸、好ましくは８〜８０アミノ酸、より好ましくは１５〜８０アミノ酸、より好ましくは１６〜８０アミノ酸、より好ましくは２３〜８０アミノ酸、より好ましくは２３〜６０アミノ酸、より好ましくは２３〜５０アミノ酸、を有する。
【０１８９】
一態様において、ヘルパーＴ細胞による細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）の活性化誘導の観点から、上記抗原ペプチドは、ＣＤ８陽性細胞傷害性Ｔ細胞認識エピトープおよびＣＤ４陽性ヘルパーＴ細胞認識エピトープをそれぞれ１つ以上含む抗原ペプチドである。
【０１９０】
一つの側面において、エピトープを２つ以上含む場合、エピトープ間にアミノ酸リンカーを配置してもよい。該リンカーは、例えば２〜１０アミノ酸、好ましくは４〜１０アミノ酸、より好ましくは４〜８アミノ酸を有する。該リンカーに用いるアミノ酸としては、グリシン（Ｇ）、チロシン（Ｙ）、ロイシン（Ｌ）、トリプトファン（Ｗ）などが挙げられる。好ましくは、チロシン（Ｙ）、ロイシン（Ｌ）、トリプトファン（Ｗ）である。アミノ酸リンカーの具体例としては、例えば、−ＹＹＹＹ−（４Ｙ）、−ＬＬＬＬ−（４Ｌ）、−ＷＷＷＷ−（４Ｗ）、−ＧＧＧＧＧＧ−（６Ｇ）、−ＹＹＹＹＹＹ−（６Ｙ）、−ＬＬＬＬＬＬ−（６Ｌ）、−ＷＷＷＷＷＷ−（６Ｗ）、−ＹＹＹＹＹＹＹＹ−（８Ｙ）、−ＬＬＬＬＬＬＬＬ−（８Ｌ）および−ＷＷＷＷＷＷＷＷ−（８Ｗ）が挙げられ、好ましくは、６Ｙ、６Ｌおよび６Ｗである。
【０１９１】
複合体
本発明の疎水性基を導入したヒアルロン酸誘導体と抗原の複合体は、上記式（Ｉ）で表される繰り返し単位を含むヒアルロン酸誘導体または上記式（ＩＩ）で表される繰り返し単位を含むヒアルロン酸誘導体と抗原を適当な溶液中で混合することで製造することができる。用いる溶液としては、水、生理食塩水、各種緩衝液、糖溶液、ＤＭＳＯ、エタノール、ＤＭＦ、それらの組み合わせなどが挙げられ、透析などの方法により溶媒・緩衝液交換を行ってもよい。
【０１９２】
例えば、上記式（Ｉ）で表される繰り返し単位を含むヒアルロン酸誘導体または上記式（ＩＩ）で表される繰り返し単位を含むヒアルロン酸誘導体の微粒子と抗原を混合することにより、本発明の複合体を製造することができる。特に限定はされないが、上記ヒアルロン酸誘導体の微粒子と抗原が複合体を形成することにより、ヒアルロン酸誘導体と抗原の複合体とすることができる。また、抗原を上記ヒアルロン酸誘導体の微粒子に封入することでヒアルロン酸誘導体と抗原の複合体とすることができる。複合体には、上記ヒアルロン酸誘導体微粒子への抗原封入体が含まれる。当該封入体では、抗原が上記ヒアルロン酸誘導体で被覆されている。
【０１９３】
複合体形成方法として、あらかじめ形成された上記式（Ｉ）で表される繰り返し単位を含むヒアルロン酸誘導体または上記式（ＩＩ）で表される繰り返し単位を含むヒアルロン酸誘導体の微粒子に抗原溶液を添加する方法が挙げられる。当該方法では、形成された当該ヒアルロン酸誘導体の微粒子と抗原が、疎水性相互作用、静電的相互作用、水素結合などの相互作用により、複合体を形成する。相互作用は、微粒子表面、微粒子内部のいずれでも生じる。特に限定されないが、溶媒、塩濃度、ｐＨ、温度、時間、変性剤の添加などの条件は、抗原が安定でかつ高収率で複合体形成するように適宜選択してよい。例えば、複合体形成時の塩濃度やｐＨによって、ヒアルロン酸誘導体微粒子の膨潤度や密度が変化し、抗原の電離状態なども変わるため、その組み合わせによって適宜、適した条件を使用すればよい。複合体化を低塩濃度下で行うことで、ヒアルロン酸誘導体のカルボキシル基同士の静電反発を利用し、微粒子密度を減少させ、複合体化量を増加させることや、より高分子量の抗原と複合体化することができる。複合体形成後、塩濃度を上昇させることにより静電反発を弱め、微粒子密度を上昇させ、ゲル網目を抗原サイズより小さくすることにより、強固に抗原を保持し、放出を遅らせることが可能となる。この際、塩濃度を生理塩濃度とすることもできる。微小化やサイズ均一化のために超音波ホモジナイザーや一点集中型超音波照射装置を用いて超音波照射を行ってもよい。超音波照射は、ヒアルロン酸誘導体と薬物を混合後に行ってもよいし、ヒアルロン酸誘導体だけに行ってもよい。複合体化されなかったフリーの抗原は、透析法やサイズ排除クロマトグラフ（ＳＥＣ）法などで分離、除去することができる。
【０１９４】
また、複合体形成方法として、上記式（Ｉ）で表される繰り返し単位を含むヒアルロン酸誘導体または上記式（ＩＩ）で表される繰り返し単位を含むヒアルロン酸誘導体をＤＭＳＯやＤＭＦなどの非プロトン性極性有機溶媒に溶解させ、抗原と混合した後に、水、または塩水溶液、各種緩衝液水溶液に置換することによって微粒子形成と複合体形成を同時に行うことができる。置換は例えば透析によって行うことができる。微小化やサイズ均一化のために超音波ホモジナイザーや一点集中型超音波照射装置を用いて超音波照射を行ってもよい。超音波照射は、ヒアルロン酸誘導体と抗原の混合後行ってもよいし、ヒアルロン酸誘導体だけに行ってもよい。また、透析前でも透析後でも良い。この方法によりヒアルロン酸誘導体と複合体化した抗原は、複合体から、より放出されにくくなる。特に限定されないが、ヒアルロン酸誘導体と抗原の混合の際の溶媒種、塩濃度、ｐＨ、温度、時間、変性剤の添加、ヒアルロン酸誘導体濃度、抗原濃度、ヒアルロン酸誘導体と抗原の比率などの条件は、抗原が安定でかつ高収率で複合体形成するように適宜選択してよい。特に限定されないが、水、塩水溶液、または各種緩衝液水溶液に置換する際の溶媒種、塩濃度、ｐＨ、温度、時間、回数、変性剤の添加の有無、ヒアルロン酸誘導体濃度、抗原濃度、ヒアルロン酸誘導体と抗原の比率などの条件は、抗原が安定でかつ高収率で複合体形成するように適宜選択してよい。微粒子のサイズも、これらの条件を適宜選択することで、目的のものが得られる。複合体化されなかったフリーの抗原は、透析法やサイズ排除クロマトグラフ（ＳＥＣ）法などで分離、除去すればよい。
【０１９５】
上記複合体が粒子の場合、その粒子径は特に限定されないが、リンパ節移行の観点から、例えば、２０〜２００ｎｍであり、好ましくは２０〜１００ｎｍ、より好ましくは２０〜５０ｎｍである。
【０１９６】
ワクチン製剤
上記複合体を用いることで、本発明のワクチン製剤、具体的には、がんの予防および／または治療に用いるためのワクチン製剤を製造することができる。
【０１９７】
本発明のワクチン製剤は、経口、腸管外、鼻腔内、膣内、眼内、皮下、静脈内、筋肉内、皮内、腹腔内、関節腔内、脳内または口腔内の経路を経て投与されてもよい。好ましくは、皮下、筋肉内、静脈内、皮内を経て投与されてもよい。
【０１９８】
本発明のワクチン製剤は、１種もしくはそれ以上の薬学的に許容し得る希釈剤、湿潤剤、乳化剤、分散剤、補助剤、防腐剤、緩衝剤、結合剤、安定剤等を含む医薬組成物として、目的とする投与経路に応じ、適当な任意の形態にして投与することができる。投与経路は非経口的経路であっても経口的経路であってもよい。
【０１９９】
本発明のワクチン製剤は、１種類以上のアジュバントと組み合わせて投与してもよい。用いるアジュバントとしては、抗原提示細胞の活性を増強させる作用を持つ物質であればよく、より具体的には自然免疫受容体（パターン認識受容体）を活性化する物質やその他の抗原提示細胞刺激物質、抗原提示細胞の免疫抑制活性の獲得を阻害する作用を持つ物質が選択される。自然免疫受容体はＴｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）、Ｃ型レクチン受容体（ＣＬＲ）、ＮＯＤ様受容体（ＮＬＲ）、ＲＩＧ−Ｉ様受容体（ＲＬＲ）および細胞質ＤＮＡセンサーに分類される。自然免疫受容体アゴニストであるアジュバントとしては、不活性化菌体や菌体抽出物、核酸、リポ多糖、リポペプチド、合成低分子化合物などから選択することができ、好ましくはＣｐＧオリゴＤＮＡ、ポリＩＣ  ＲＮＡ、イミダゾキノン（例えばＲ８４８やイミキモドなど）、サポニン（例えばＱｕｉｌＡやＱＳ２１など）、ＳＴＩＮＧアゴニスト（例えばサイクリックｄｉ−ＧＭＰなど）、モノホスホリルリピッドやリポペプチドなどが用いられる。抗原提示細胞刺激剤であるアジュバントとしては、タキサン系の薬物やアントラサイクリン系の薬物を用いることができる。抗原提示細胞の免疫抑制活性の獲得を阻害する作用を持つ薬剤であるアジュバントとしては、ＪＡＫ／ＳＴＡＴの阻害物質やインドールデオキシゲナーゼ（ＩＤＯ）の阻害物質、トリプトファンデオキシゲナーゼ（ＴＤＯ）の阻害物質などから選択される。これらの阻害物質には、当該因子に対して拮抗作用を持つ化合物の他、当該因子の中和抗体やｓｍａｌｌ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ  ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）やアンチセンスＤＮＡも含まれる。
【０２００】
本発明のワクチン製剤に用いるアジュバントは、自然免疫受容体アゴニストであるアジュバントが好ましく、さらにＴｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）、細胞質ＤＮＡセンサーのアゴニストが好ましい。ＴＬＲアゴニストとしては、ＣｐＧオリゴＤＮＡやポリＩＣ  ＲＮＡ、Ｒ８４８やイミキモドといったイミダゾキノン、ＱｕｉｌＡやＱＳ２１といったサポニン、ＳＴＩＮＧアゴニスト、モノホスホリルリピッドが好ましい。
【０２０１】
アジュバントは、ワクチン製剤と別の製剤として投与しても、一緒の製剤として投与してもよい。また、国際公開第２０１０／０５３１４０号に記載の方法により、アジュバントは式（Ｉ）で表される繰り返し単位を含むヒアルロン酸誘導体にコンジュゲートして用いても良い。組み合わせて投与する場合の本発明のワクチン製剤の投与量は、例えば０．０１〜１００ｍｇ／回、好ましくは０．１〜５０ｍｇ／回、より好ましくは例えば０．１〜２０ｍｇ／回であり、アジュバントの投与量は、例えば０．０１〜１００ｍｇ／ｋｇ体重、好ましくは０．１〜５０ｍｇ／ｋｇ体重、より好ましくは０．１〜１０ｍｇ／ｋｇ体重である。アジュバントは本発明のワクチン製剤と同じタイミング（ワクチン製剤中にアジュバントが含まれる場合を含む）で投与しても、異なるタイミングで投与してもよい。異なるタイミングで投与する場合は、一方を投与後にもう一方を、例えば１分〜５時間、好ましくは１分〜１時間以内に投与するのが好ましい。
【０２０２】
本発明のワクチン製剤は、がん治療に用いられる１種類以上の抗体と組み合わせて投与してもよい。抗体は、例えば腫瘍による免疫抑制シグナルを阻害する抗体、または免疫細胞の共刺激シグナルを活性化する１種類以上の抗体であり、好ましくは腫瘍による免疫抑制シグナルを阻害する抗体または免疫細胞の共刺激シグナルを活性化する抗体である。具体的には、抗ＣＴＬＡ４抗体、抗ＰＤ１抗体、抗ＰＤＬ１抗体、抗ＯＸ４０、抗４−１ＢＢ抗体から選択される１種類以上の抗体である。組み合わせて投与する場合の本発明のワクチン製剤の投与量は、例えば０．０１〜１００ｍｇ／回、好ましくは０．１〜５０ｍｇ／回、より好ましくは０．１〜２０ｍｇ／回であり、抗体の投与量は、例えば０．０１〜２００ｍｇ／ｋｇ体重、好ましくは０．１〜１００ｍｇ／ｋｇ体重、より好ましくは１〜４０ｍｇ／ｋｇ体重である。抗体は本発明のワクチン製剤と同じタイミング（ワクチン製剤中に抗体が含まれる場合を含む）で投与しても、異なるタイミングで投与してもよい。異なるタイミングで投与する場合は、一方を投与後にもう一方を、例えば１分〜２４時間、好ましくは１分〜５時間以内に投与するのが好ましい。
【０２０３】
本発明のワクチン製剤は、上記アジュバントと抗体の両方と組み合わせて投与してもよい、その場合の本発明のワクチン製剤の投与量は、例えば０．０１〜１００ｍｇ／回、好ましくは０．１〜５０ｍｇ／回、より好ましくは例えば０．１〜２０ｍｇ／回であり、アジュバントの投与量は、例えば０．０１〜１００ｍｇ／ｋｇ体重、好ましくは０．１〜５０ｍｇ／ｋｇ体重、より好ましくは０．１〜１０ｍｇ／ｋｇ体重であり、抗体の投与量は、例えば０．０１〜２００ｍｇ／ｋｇ体重、好ましくは０．１〜１００ｍｇ／ｋｇ体重、より好ましくは１〜４０ｍｇ／ｋｇ体重である。アジュバントおよび抗体は本発明のワクチン製剤と同じタイミング（ワクチン製剤中にアジュバントおよび抗体が含まれる場合を含む）で投与しても、異なるタイミングで投与してもよい。異なるタイミングで投与する場合は、ワクチン製剤、アジュバント、および抗体の全てを、例えば１分〜２４時間、好ましくは１分〜５時間以内に投与するのが好ましい。
【実施例】
【０２０４】
以下、本発明の好適な具体的態様を実施例として説明する。【０２０５】
〔実施例１〕ヒアルロン酸（ＨＡ）誘導体の合成
国際公開第２０１０／０５３１４０号または国際公開第２０１４／０３８６４１号に記載の方法にて合成した。【０２０６】
〔実施例２〕抗原の入手
抗原ペプチドはシグマジェノシスから購入した。【０２０７】
ｍＥＲＫ２  ｐ１２１（アミノ酸配列：ＮＤＨＩＡＹＦＬＹＱＩＬＲＧＬＱＹＩＨＳＡＮＶＬＨＲＤＬＫＰＳＮＬＬＬＮＴ（配列番号１））
当該配列は、ＣＤ８陽性細胞障害性Ｔ細胞認識エピトープ配列として１６番目のＱから２４番目のＬまでの９個のアミノ酸配列（配列番号２：ＱＹＩＨＳＡＮＶＬ）を、ＣＤ４陽性ヘルパーＴ細胞認識エピトープ配列として１３番目のＲから２９番目のＫまでの１７個のアミノ酸配列（配列番号３：ＲＧＬＱＹＩＨＳＡＮＶＬＨＲＤＬＫ）を含む。【０２０８】
ＭＡＧＥ-Ａ４  ｐ２６４（アミノ酸配列：ＧＳＮＰＡＲＹＥＦＬＷＧＰＲＡＬＡＥＴＳＹＶＫＶＬＥＨＶＶＲＶＮＡＲＶＲＩＡＹＰ（配列番号４））
当該配列は、ＣＤ８陽性細胞障害性Ｔ細胞認識エピトープ配列として２番目のＳから１０番目のＬまでの９個のアミノ酸配列（配列番号５：ＳＮＰＡＲＹＥＦＬ）を含む。ＣＤ４陽性ヘルパーＴ細胞認識エピトープ配列として２２番目のＶから３７番目のＩまでの１６個のアミノ酸配列（配列番号６：ＶＫＶＬＥＨＶＶＲＶＮＡＲＶＲＩ）を含む。【０２０９】
ＭＡＧＥ-Ａ４  ｐ２６５（アミノ酸配列：ＳＮＰＡＲＹＥＦＬ（配列番号７））。【０２１０】
ＭＡＧＥ-Ａ４  ｐ２８５（アミノ酸配列：ＶＫＶＬＥＨＶＶＲＶＮＡＲＶＲＩＡＹＰ（配列番号８））。【０２１１】
ＴＲＰ２ＴＲＰ１ｇｐ１００−６Ｇ（アミノ酸配列：ＳＶＹＤＦＦＶＷＬＧＧＧＧＧＧＴＷＨＲＹＨＬＬＧＧＧＧＧＧＥＧＳＲＮＱＤＷＬ（配列番号９））。【０２１２】
当該配列は、ＣＤ８陽性細胞障害性Ｔ細胞認識エピトープ配列として下記ＴＲＰ２（アミノ酸配列：ＳＶＹＤＦＦＶＷＬ（配列番号１３））、ＴＲＰ１（アミノ酸配列：ＴＷＨＲＹＨＬＬ（配列番号１４））、ｇｐ１００（アミノ酸配列：ＥＧＳＲＮＱＤＷＬ（配列番号１５））を含み、各エピトープ間を６つのＧで結合している。【０２１３】
ＴＲＰ２ＴＲＰ１ｇｐ１００−６Ｙ（アミノ酸配列：ＳＶＹＤＦＦＶＷＬＹＹＹＹＹＹＴＷＨＲＹＨＬＬＹＹＹＹＹＹＥＧＳＲＮＱＤＷＬ（配列番号１０））。【０２１４】
当該配列は、ＣＤ８陽性細胞障害性Ｔ細胞認識エピトープ配列として下記ＴＲＰ２（アミノ酸配列：ＳＶＹＤＦＦＶＷＬ（配列番号１３））、ＴＲＰ１（アミノ酸配列：ＴＷＨＲＹＨＬＬ（配列番号１４））、ｇｐ１００（アミノ酸配列：ＥＧＳＲＮＱＤＷＬ（配列番号１５））を含み、各エピトープ間を６つのＹで結合している。【０２１５】
ＴＲＰ２ＴＲＰ１ｇｐ１００−４Ｌ（アミノ酸配列：ＳＶＹＤＦＦＶＷＬＬＬＬＬＴＷＨＲＹＨＬＬＬＬＬＬＥＧＳＲＮＱＤＷＬ（配列番号１１））。【０２１６】
当該配列は、ＣＤ８陽性細胞障害性Ｔ細胞認識エピトープ配列として下記ＴＲＰ２（アミノ酸配列：ＳＶＹＤＦＦＶＷＬ（配列番号１３））、ＴＲＰ１（アミノ酸配列：ＴＷＨＲＹＨＬＬ（配列番号１４））、ｇｐ１００（アミノ酸配列：ＥＧＳＲＮＱＤＷＬ（配列番号１５））を含み、各エピトープ間を４つのＬで結合している。【０２１７】
ＴＲＰ２ＴＲＰ１ｇｐ１００−６Ｌ（アミノ酸配列：ＳＶＹＤＦＦＶＷＬＬＬＬＬＬＬＴＷＨＲＹＨＬＬＬＬＬＬＬＬＥＧＳＲＮＱＤＷＬ（配列番号１２））。【０２１８】
当該配列は、ＣＤ８陽性細胞障害性Ｔ細胞認識エピトープ配列として下記ＴＲＰ２（アミノ酸配列：ＳＶＹＤＦＦＶＷＬ（配列番号１３））、ＴＲＰ１（アミノ酸配列：ＴＷＨＲＹＨＬＬ（配列番号１４））、ｇｐ１００（アミノ酸配列：ＥＧＳＲＮＱＤＷＬ（配列番号１５））を含み、各エピトープ間を６つのＬで結合している。【０２１９】
ＴＲＰ２（アミノ酸配列：ＳＶＹＤＦＦＶＷＬ（配列番号１３））。【０２２０】
ＴＲＰ１（アミノ酸配列：ＴＷＨＲＹＨＬＬ（配列番号１４））。【０２２１】
ｇｐ１００（アミノ酸配列：ＥＧＳＲＮＱＤＷＬ（配列番号１５））。【０２２２】
ＡＨ１ｇｐ７０−６Ｇ（アミノ酸配列：ＬＶＱＦＩＫＤＲＩＳＶＶＱＡＧＧＧＧＧＧＳＰＳＹＶＹＨＱＦ（配列番号１６））。【０２２３】
当該配列は、ＣＤ４陽性ヘルパーＴ細胞認識エピトープとして下記ｇｐ７０（アミノ酸配列：ＬＶＱＦＩＫＤＲＩＳＶＶＱＡ（配列番号２１））、ＣＤ８陽性細胞障害性Ｔ細胞認識エピトープ配列として下記ＡＨ１（アミノ酸配列：ＳＰＳＹＶＹＨＱＦ（配列番号２０））を含み、エピトープ間を６つのＧで結合している。【０２２４】
ＡＨ１ｇｐ７０−６Ｙ（アミノ酸配列：ＬＶＱＦＩＫＤＲＩＳＶＶＱＡＹＹＹＹＹＹＳＰＳＹＶＹＨＱＦ（配列番号１７））。【０２２５】
当該配列は、ＣＤ４陽性ヘルパーＴ細胞認識エピトープとして下記ｇｐ７０（アミノ酸配列：ＬＶＱＦＩＫＤＲＩＳＶＶＱＡ（配列番号２１））、ＣＤ８陽性細胞障害性Ｔ細胞認識エピトープ配列として下記ＡＨ１（アミノ酸配列：ＳＰＳＹＶＹＨＱＦ（配列番号２０））を含み、エピトープ間を６つのＹで結合している。【０２２６】
ＡＨ１ｇｐ７０−４Ｌ（アミノ酸配列：ＬＶＱＦＩＫＤＲＩＳＶＶＱＡＬＬＬＬＳＰＳＹＶＹＨＱＦ（配列番号１８））。【０２２７】
当該配列は、ＣＤ４陽性ヘルパーＴ細胞認識エピトープとして下記ｇｐ７０（アミノ酸配列：ＬＶＱＦＩＫＤＲＩＳＶＶＱＡ（配列番号２１））、ＣＤ８陽性細胞障害性Ｔ細胞認識エピトープ配列として下記ＡＨ１（アミノ酸配列：ＳＰＳＹＶＹＨＱＦ（配列番号２０））を含み、エピトープ間を４つのＬで結合している。【０２２８】
ＡＨ１ｇｐ７０−６Ｌ（アミノ酸配列：ＬＶＱＦＩＫＤＲＩＳＶＶＱＡＬＬＬＬＬＬＳＰＳＹＶＹＨＱＦ（配列番号１９））。【０２２９】
当該配列は、ＣＤ４陽性ヘルパーＴ細胞認識エピトープとして下記ｇｐ７０（アミノ酸配列：ＬＶＱＦＩＫＤＲＩＳＶＶＱＡ（配列番号２１））、ＣＤ８陽性細胞障害性Ｔ細胞認識エピトープ配列として下記ＡＨ１（アミノ酸配列：ＳＰＳＹＶＹＨＱＦ（配列番号２０））を含み、エピトープ間を６つのＬで結合している。【０２３０】
ＡＨ１（アミノ酸配列：ＳＰＳＹＶＹＨＱＦ（配列番号２０））。【０２３１】
ｇｐ７０（アミノ酸配列：ＬＶＱＦＩＫＤＲＩＳＶＶＱＡ（配列番号２１））。【０２３２】
ＭＡＧＥ-Ａ４  ｐ２６４−４Ｌ（アミノ酸配列：ＧＳＮＰＡＲＹＥＦＬＷＧＰＲＡＬＬＬＬＬＹＶＫＶＬＥＨＶＶＲＶＮＡＲＶＲＩＡＹＰ（配列番号２２））。【０２３３】
当該配列は、ＣＤ８陽性細胞障害性Ｔ細胞認識エピトープ配列として２番目のＳから１０番目のＬまでの９個のアミノ酸配列（配列番号５：ＳＮＰＡＲＹＥＦＬ）、ＣＤ４陽性ヘルパーＴ細胞認識エピトープ配列として２２番目のＶから３７番目のＩまでの１６個のアミノ酸配列（配列番号６：ＶＫＶＬＥＨＶＶＲＶＮＡＲＶＲＩ）を含み、エピトープ間を４つのＬで結合している。【０２３４】
ＭＡＧＥ-Ａ４  ｐ２６４−４Ｗ（アミノ酸配列：ＧＳＮＰＡＲＹＥＦＬＷＧＰＲＡＬＷＷＷＷＹＶＫＶＬＥＨＶＶＲＶＮＡＲＶＲＩＡＹＰ（配列番号２３））。【０２３５】
当該配列は、ＣＤ８陽性細胞障害性Ｔ細胞認識エピトープ配列として２番目のＳから１０番目のＬまでの９個のアミノ酸配列（配列番号５：ＳＮＰＡＲＹＥＦＬ）、ＣＤ４陽性ヘルパーＴ細胞認識エピトープ配列として２２番目のＶから３７番目のＩまでの１６個のアミノ酸配列（配列番号６：ＶＫＶＬＥＨＶＶＲＶＮＡＲＶＲＩ）を含み、エピトープを４つのＷで結合している。【０２３６】
〔実施例３〕ＨＡ誘導体と抗原の複合体の作製
（実施例３−１）抗原とＨＡ誘導体の複合体の調製
ＨＡ誘導体（９９ｋ  ＨＡ−Ｃ６−Ｃｈｏｌ−４２％等）を１２ｍｇ／ｍＬとなるように超純水に溶解させ、超音波処理（コバリス社製、Ｅ２２０Ｘ）を実施した。抗原ペプチドは５０ｍｇ／ｍＬとなるようにＤＭＳＯに溶解させた。ＨＡ誘導体水溶液に対し、抗原ペプチドＤＭＳＯ溶液を加え、バス型ソニケーターにて３０分間超音波処理した。透析キット（Ｓｌｉｄｅ−Ａ−Ｌｙｚｅｒ、分画分子量３．５Ｋ）に移し、５ｍＭ炭酸緩衝液ｐＨ９、１０ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ７、１０％スクロース入り１０ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ７に対して順次透析した。以下の条件による逆相クロマトグラフィー分析により抗原ペプチド濃度を定量し、２５０〜５００μｇ／ｍＬとなるように濃度調整し、投与溶液とした。目的の濃度に達しない場合は、限外濃縮器（Ｖｉｖａｓｐｉｎ６、５０００ＭｗＣＯ，ザウトリウス）にて濃縮した。なお、ＨＡ誘導体は、国際公開第２０１０／０５３１４０Ａ１の実施例１および２に記載のとおりに合成した。例えば、実施例４−１の表１で示す、９９ｋ  ＨＡ−Ｃ６−Ｃｈｏｌ−４２は、式（Ｉ）において、Ｚが直接結合、Ｒａが水素原子、ＹがＣ６アルキレン、Ｘ１が−ＮＲｂ−ＣＯＯ−Ｒ、Ｒｂが水素原子、Ｒがコレステリル基である（すなわち、コレステリル  ６−アミノヘキシルカーバメートが導入されている）、重量平均分子量が９９ｋＤａ、コレステリル基の導入率が４２％のＨＡ誘導体であることを示す。同様に、コレステリル基の導入率が４１％のＨＡ誘導体のＨＡ誘導体は９９ｋ  ＨＡ−Ｃ６−Ｃｈｏｌ−４１とあらわされ、コレステリル基の導入率が４３％のＨＡ誘導体のＨＡ誘導体は９９ｋ  ＨＡ−Ｃ６−Ｃｈｏｌ−４３とあらわされる。【０２３７】
逆相クロマトグラフィー分析条件
分析カラム：ＰＬＲＰ−Ｓ  １０００Å（Ａｇｉｌｅｎｔ社）
カラム温度：４０℃
移動相Ａ：０．１％ＴＦＡ水溶液、移動相Ｂ：０．１％ＴＦＡアセトニトリル溶液
流速：２ｍＬ／ｍｉｎ
検出：ＵＶ２５４ｎｍ
注入量：５０μＬ
〔比較例１〕ＣＨＰと抗原の複合体の作製
国際公開第２０１５／０５０１５８号に準じて調製した。コレステロール修飾プルラン（略称ＣＨＰ）（ＣＨＰ−８０Ｔ；１００単糖あたり１〜２個のコレステロールが導入されている）は（株）日油より入手した。ＣＨＰは１０ｍｇ／ｍLの濃度で６Ｍ尿素含有リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）に溶解させた。ＣＨＰ溶液に抗原ペプチドＤＭＳＯ溶液を加え、暗所にて室温で一晩放置した。混合液を透析膜（分子量カット：３,５００，サーモサイエンティフィック社）に移し、透析外液として容積比１００倍以上の０.６Ｍ尿素含有ＰＢＳに対し４℃で２時間から一晩透析した。次いで、透析外液として容積比１００倍以上の０.０６Ｍ尿素含有ＰＢＳに対し４℃で２時間から一晩透析した。再び、透析外液として容積比１００倍以上のＰＢＳに対し４℃で２時間から一晩透析した。透析内液を回収後、実施例３−１に記載の方法で抗原濃度を定量し、濃度調整し、投与溶液とした。目的の濃度に達しない場合は、限外濃縮器（Ｖｉｖａｓｐｉｎ６、５０００ＭｗＣＯ，ザウトリウス）にて濃縮した。【０２３８】
〔実施例４〕抗原特異的Ｔ細胞誘導試験
実験方法
ＢＡＬＢ／ｃマウス（雌、日本ＳＬＣ；体重１５〜２５ｇ）またはＣ５７ＢＬ／６マウス（雌、日本ＳＬＣ；体重１５〜２５ｇ）の右後背部皮下に、実施例３−１で調製した抗原ペプチドとＨＡ誘導体の複合体または比較例１で調製したＣＨＰと抗原ペプチドの複合体を０．０５〜０．１ｍｇ抗原相当量投与した。アジュバント（ＣｐＧオリゴＤＮＡ（ＯＤＮ１６６８、ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ製）、０．０５ｍｇ）を投与する場合は、続けて付近に皮下投与した。投与回数は２回とし、投与間隔は１週間とした。最終投与の１週間後に、投与マウスから脾臓細胞を次の要領で分離した。マウスから脾臓を単離し、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）含有ＲＰＭＩ１６４０培地で洗浄し脱血した。脾臓を磨砕した後、遊離した細胞をＦＢＳ含有ＲＰＭＩ１６４０培地中に回収した。遠心分離（３００×ｇ、５分間、４℃）後に上清を除去し、１〜２ｍＬのＡＣＫ溶液（シグマ社製）を加えた。１分後、３０ｍＬのＦＢＳ含有ＲＰＭＩ１６４０培地を加え、遠心分離（３００×ｇ、５分間、４℃）した。上清を除き、１０ｍＬのＦＢＳ含有ＲＰＭＩ１６４０培地を加え、４０μｍのセルストレイナーでフィルター処理し、遠心分離（３００×ｇ、５分間、４℃）した。上清を除き、２０ｍＬのＦＢＳ含有ＲＰＭＩ１６４０培地を添加し、遠心分離（３００×ｇ、５分間、４℃）した。上清を除き、細胞を適当な量のＦＢＳ含有ＲＰＭＩ１６４０培地に懸濁させた。細胞数を計数した後、２×１０７個／ｍＬの細胞濃度になるようにＦＢＳ含有ＲＰＭＩ１６４０培地に懸濁させた。【０２３９】
２４穴培養プレート（ヌンク）に、マウス脾臓細胞を１ウェルあたり５×１０６個／０．４ ｍＬで添加した。１００μｇ／ｍＬのＴ細胞刺激用ペプチドを５０μＬ添加し、３７℃、５％ ＣＯ２で３０分間培養を行った。その後、ＦＢＳ含有ＲＰＭＩ１６４０培地にて１００倍希釈したＧｏｌｄｉＰｌｕｇ（ＢＤバイオサイエンス）を１ウェル当たり５０μＬ添加し、３７℃、５％ ＣＯ２で５時間培養を行った。細胞を回収し、９６ウェルＶ底マイクロプレート（ヌンク）に移した。遠心分離（２０００ｒｐｍ, ２分間, ４℃；以降同条件）して上清を除いた後、１ウェル当たり２００μＬの染色用バッファー（０.５％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）含有ＰＢＳ）に懸濁させた。遠心分離して上清を除いた後、蛍光標識抗ＣＤ８抗体（インビトロジェン社製）と蛍光標識抗ＣＤ４抗体（ＢＤバイオサイエンス）を含む溶液５０μＬを添加し、混合した後、４℃の暗所にて１５分間静置した。１５０μＬの染色用バッファーを加え、遠心分離して上清を除いた後、さらに２００μＬの染色用バッファーで細胞を洗浄した。１００μＬのＣｙｔｏｆｉｘ／Ｃｙｔｏｐｅｒｍバッファー（ＢＤバイオサイエンス）を添加し、穏やかに混合した。室温の暗所にて２０分間静置した後、染色用バッファーで２回洗浄した。２００μＬの染色用バッファーを添加し、一晩、遮光冷蔵保存した。遠心分離して上清を除いた後、２００μＬのＰｅｒｍ／Ｗａｓｈバッファー（ＢＤバイオサイエンス）を添加し、遮光下室温で３分間静置した。遠心し、上清を除いた後、各種の抗サイトカイン抗体を添加した５０μＬのＰｅｒｍ／Ｗａｓｈバッファーを細胞に加えて穏やかに懸濁させた後、室温の暗所にて１５分間静置した。１５０μＬのＰｅｒｍ／Ｗａｓｈバッファーで細胞を洗浄した後、染色用バッファー２００μＬに再懸濁を行い、丸底ポリスチレンチューブ（ＢＤバイオサイエンス）へと移した。細胞はフローサイトメーター（ＦＡＣＳ Ｃａｎｔｏ ＩＩ，ＢＤバイオサイエンス）にて、付属の解析ソフトウェア（ＦＡＣＳＤｉｖａ）を用いて解析した。【０２４０】
（実施例４−１）ｍＥＲＫ２ペプチドを用いたＴ細胞誘導試験
ＢＡＬＢ／ｃマウスを用い、表１のサンプルをそれぞれ２回投与し、実施例４に記載の方法で試験を実施した。アジュバントとしてＣｐＧオリゴＤＮＡ（ＯＤＮ１６６８、ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ製）を用いた。ＣＤ８＋Ｔ細胞刺激用ペプチドとしてｍＥＲＫ２  ｐ１２１を用いた際の、全ＣＤ８＋細胞に対するインターフェロンガンマ産生ＣＤ８＋細胞の数の割合を図１に示す。【０２４１】
【表１】
2020158771.tif 000036
キャリアとしてＨＡ誘導体を用いることによって、高レベルのＴ細胞の誘導が可能であることが確認された。【０２４２】
（実施例４−２）ｍＥＲＫ２ペプチドを用いたＴ細胞誘導試験（アジュバント効果１）
ＢＡＬＢ／ｃマウスを用い、表２のサンプルをそれぞれ２回投与し、実施例４に記載の方法で試験を実施した。アジュバントとしてＣｐＧオリゴＤＮＡ（ＯＤＮ１６６８、ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ製）、ＰｏｌｙＩＣ（ＨＭＷ  ＶａｃｃｉＧｒａｄｅ、ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ製）、ＱｕｉｌＡ（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ製）、Ｓｔｉｎｇアゴニスト（２’３’−ｃＧＡＭ（ＰＳ）２（Ｒｐ／Ｓｐ）、ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ製）を用いた。ＣＤ８＋Ｔ細胞刺激用ペプチドとしてｍＥＲＫ２  ｐ１２１を用いた際の、全ＣＤ８＋細胞に対するインターフェロンガンマ産生ＣＤ８＋細胞の数の割合を図２−１に示す。ＣＤ４＋Ｔ細胞刺激用ペプチドとしてｍＥＲＫ２  ｐ１２１を用いた際の、全ＣＤ４＋細胞に対するインターフェロンガンマ産生ＣＤ４＋細胞の数の割合を図２−２に示す。【０２４３】
【表２】
2020158771.tif 000037
いずれのアジュバントを用いた場合においても、Ｔ細胞の誘導が可能であることが確認された。【０２４４】
（実施例４−３）ｍＥＲＫ２ペプチドを用いたＴ細胞誘導試験（アジュバント効果２）
ＢＡＬＢ／ｃマウスを用い、表３のサンプルをそれぞれ２回投与し、実施例４に記載の方法で試験を実施した。アジュバントとしてＣｐＧオリゴＤＮＡ（ＯＤＮ１６６８、ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ製）、Ｒ８４８（ＶａｃｃｉＧｒａｄｅ、ＶａｃｃｉＧｒａｄｅ、ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ製）、ＭＰＬ（ＭＰＬＡｓ  ＶａｃｃｉＧｒａｄｅ、ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ製）をそれぞれ用いた。ＣＤ８＋Ｔ細胞刺激用ペプチドとしてｍＥＲＫ２  ｐ１２１を用いた際の、全ＣＤ８＋細胞に対するインターフェロンガンマ産生ＣＤ８＋細胞の数の割合を図３−１に示す。ＣＤ４＋Ｔ細胞刺激用ペプチドとしてｍＥＲＫ２  ｐ１２１を用いた際の、全ＣＤ４＋細胞に対するインターフェロンガンマ産生ＣＤ４＋細胞の数の割合を図３−２に示す。【０２４５】
【表３】
2020158771.tif 000038
いずれのアジュバントを用いた場合においても、Ｔ細胞の誘導が可能であることが確認された。【０２４６】
（実施例４−４）ＭＡＧＥ−Ａ４  ｐ２６４ペプチドを用いたＴ細胞誘導試験
ＢＡＬＢ／ｃマウスを用い、表４のサンプルをそれぞれ２回投与し、実施例４に記載の方法で試験を実施した。ＣＤ８＋Ｔ細胞刺激用ペプチドとしてＭＡＧＥ−Ａ４  ｐ２６５を用いた際の、全ＣＤ８＋細胞に対するインターフェロンガンマ産生ＣＤ８＋細胞数の割合を図４に示す。【０２４７】
【表４】
2020158771.tif 000039
ＨＡ誘導体を用いることによって、高レベルのＴ細胞の誘導が可能であることが確認された。【０２４８】
（実施例４−５）ＭＡＧＥ−Ａ４  ｐ２６４ペプチドを用いたＴ細胞誘導試験（アジュバントなし）
ＢＡＬＢ／ｃマウスを用い、表５のサンプルをそれぞれ２回投与し、実施例４に記載の方法で試験を実施した。ＣＤ８＋Ｔ細胞刺激用ペプチドとしてＭＡＧＥ−Ａ４  ｐ２６５を用いた際の、全ＣＤ８＋細胞に対するインターフェロンガンマ産生ＣＤ８＋細胞の数の割合を図５に示す。【０２４９】
【表５】
2020158771.tif 000040
キャリアとしてＨＡ誘導体を用いることによって、アジュバントを用いない場合でも高レベルのＴ細胞の誘導が可能であることが確認された。【０２５０】
（実施例４−６）ＭＡＧＥ−Ａ４  ｐ２６４ペプチドを用いたＴ細胞誘導試験
ＢＡＬＢ／ｃマウスを用い、表６のサンプルをそれぞれ２回投与し、実施例４に記載の方法で試験を実施した。ＣＤ８＋Ｔ細胞刺激用ペプチドとしてＭＡＧＥ−Ａ４  ｐ２６５を用いた際の、全ＣＤ８＋細胞に対するインターフェロンガンマ産生ＣＤ８＋細胞の数の割合を図６に示す。【０２５１】
【表６】
2020158771.tif 000041
いずれのアミノ酸リンカーを含むペプチドを用いた場合においても、高レベルのＴ細胞の誘導が可能であることが明らかとなった。【０２５２】
（実施例４−７）ＴＲＰ２ＴＲＰ１ｇｐ１００ペプチドを用いたＴ細胞誘導試験
Ｃ５７ＢＬ／６マウスを用い、表７のサンプルをそれぞれ２回投与し、実施例４に記載の方法で試験を実施した。ＣＤ８＋Ｔ細胞刺激用ペプチドとしてＴＲＰ１、ＴＲＰ２、ｇｐ１００を用いた際の、全ＣＤ８＋細胞に対するインターフェロンガンマ産生ＣＤ８＋細胞の数の割合をそれれぞれ図７−１、図７−２、図７−３に示す。【０２５３】
【表７】
2020158771.tif 000042
キャリアとしてＨＡ誘導体を用いることによって、ＴＲＰ１、ＴＲＰ２、ｇｐ１００のそれぞれに対する高レベルのＴ細胞の誘導が可能であることが確認された。  
（実施例４−８）ＴＲＰ２ＴＲＰ１ｇｐ１００ペプチドを用いたＴ細胞誘導試験
Ｃ５７ＢＬ／６マウスを用い、表８のサンプルをそれぞれ２回投与し、実施例４に記載の方法で試験を実施した。ＣＤ８＋Ｔ細胞刺激用ペプチドとしてＴＲＰ１、ＴＲＰ２、ｇｐ１００を用いた際の、全ＣＤ８＋細胞に対するインターフェロンガンマ産生ＣＤ８＋細胞の数の割合をそれれぞれ図８−１、図８−２、図８−３に示す。【０２５４】
【表８】
2020158771.tif 000043
どのようなペプチドリンカーを用いても、高レベルのＴ細胞の誘導が可能であることが明らかとなった。【０２５５】
（実施例４−９）ＡＨ１ｇｐ７０ペプチドを用いたＴ細胞誘導試験
ＢＡＬＢ／ｃマウスを用い、表９のサンプルをそれぞれ２回投与し、実施例４に記載の方法で試験を実施した。ＣＤ８＋Ｔ細胞刺激用ペプチドとしてＡＨ１を用いた際の、全ＣＤ８＋細胞に対するインターフェロンガンマ産生ＣＤ８＋細胞の数の割合を図９−１に示す。ＣＤ４＋Ｔ細胞刺激用ペプチドとしてｇｐ７０を用いた際の、全ＣＤ４＋細胞に対するインターフェロンガンマ産生ＣＤ４＋細胞の数の割合を図９−２に示す。【０２５６】
【表９】
2020158771.tif 000044
ＨＡ誘導体を用いることによって、ＡＨ１、ｇｐ７０のそれぞれに対する高レベルのＴ細胞の誘導が可能であることが確認された。【０２５７】
（実施例４−１０）ＡＨ１ｇｐ７０ペプチドを用いたＴ細胞誘導試験
ＢＡＬＢ／ｃマウスを用い、表１０のサンプルをそれぞれ２回投与し、実施例４に記載の方法で試験を実施した。ＣＤ８＋Ｔ細胞刺激用ペプチドとしてＡＨ１を用いた際の、全ＣＤ８＋細胞に対するインターフェロンガンマ産生ＣＤ８＋細胞の数の割合を図１０−１に示す。ＣＤ４＋Ｔ細胞刺激用ペプチドとしてｇｐ７０を用いた際の、全ＣＤ４＋細胞に対するインターフェロンガンマ産生ＣＤ４＋細胞の数の割合を図１０−２に示す。【０２５８】
【表１０】
2020158771.tif 000045
ＨＡ誘導体を用いることによって、ＡＨ１、ｇｐ７０のそれぞれに対する高レベルのＴ細胞の誘導が可能であることが確認された。【０２５９】
（実施例４−１１）ＡＨ１ｇｐ７０ペプチドを用いたＴ細胞誘導試験
ＢＡＬＢ／ｃマウスを用い、表１１のサンプルをそれぞれ２回投与し、実施例４に記載の方法で試験を実施した。ＣＤ８＋Ｔ細胞刺激用ペプチドとしてＡＨ１を用いた際の、全ＣＤ８＋細胞に対するインターフェロンガンマ産生ＣＤ８＋細胞の数の割合を図１１−１に示す。ＣＤ４＋Ｔ細胞刺激用ペプチドとしてｇｐ７０を用いた際の、全ＣＤ４＋細胞に対するインターフェロンガンマ産生ＣＤ４＋細胞の数の割合を図１１−２に示す。【０２６０】
【表１１】
2020158771.tif 000046
いずれのアミノ酸リンカーを含むペプチド種を用いた場合においても、高レベルのＴ細胞の誘導が可能であることが明らかとなった。【０２６１】
〔実施例５〕マウス腫瘍増殖試験
実験方法
ｍＥＲＫ２を発現するマウス線維肉腫ＣＭＳ５ａ細胞株、ＡＨ１、ｇｐ７０を発現するマウス大腸がん細胞ＣＴ２６細胞株、ＴＲＰ２、ＴＲＰ１、ｇｐ１００を発現するマウスメラノーマＢ１６Ｆ１０細胞株の皮下移植を行った。ＣＭＳ５ａ細胞株とＣＴ２６細胞株はＢＡＬＢ／ｃマウス（メス；体重１５〜２５ｇ）に対して培養した細胞株を１×１０６個／１００μＬ／個体の量で皮下移植した。Ｂ１６Ｆ１０はＣ５７ＢＬ／６マウス（メス；体重１５〜２５ｇ）に対して培養した細胞株を２×１０５個／１００μＬ／個体の量で皮下移植した。その後は経時的に腫瘍体積を測定した。【０２６２】
（比較例５−１）エマルジョン製剤の調製
抗原ペプチドとフロイント不完全アジュバント（インビボジェン社製）０．５ｍＬと生理食塩水０．５ｍＬをシリンジコネクタで連結した２本のロック金具付硬質ガラス注射筒を用いてエマルジョンを作製した。抗原ペプチド濃度は０．５ｍｇ／ｍＬとなるようにした。【０２６３】
（実施例５−１）マウス線維肉腫ＣＭＳ５ａ
実施例５に記載の方法で調製したマウス線維肉腫ＣＭＳ５ａ担癌マウスに、表１２のサンプルを表１２に記載の頻度で皮下投与し、マウス腫瘍増殖試験を実施した。腫瘍体積の平均値の推移を図１２−１に、各個体の推移を図１２−２に、それぞれ示す。【０２６４】
【表１２】
2020158771.tif 000047
ＨＡ誘導体（９９ｋ４１）群は、ペプチド群、エマルジョン群、ＣＨＰ群と比較して、  高い腫瘍増殖抑制効果を有することが示された。【０２６５】
（実施例５−２）マウス線維肉腫ＣＭＳ５ａ
実施例５に記載の方法で調製したマウス線維肉腫ＣＭＳ５ａ担癌マウスに、表１３のサンプルを表１３に記載の頻度で皮下投与し、マウス腫瘍増殖試験を実施した。腫瘍体積の平均値の推移を図１３−１に、各個体の推移を図１３−２に、それぞれ示す。【０２６６】
【表１３】
2020158771.tif 000048
ＨＡ誘導体（９９ｋ４１）群は、ＣｐＧ単独群、ＣＨＰ群と比較して、高い腫瘍増殖抑制効果を有することが示された。【０２６７】
（実施例５−３）マウス線維肉腫ＣＭＳ５ａ
実施例５に記載の方法で調製したマウス線維肉腫ＣＭＳ５ａ担癌マウスに、表１４のサンプルを表１４に記載の頻度で皮下投与し、マウス腫瘍増殖試験を実施した。抗体は腹腔内投与した。腫瘍体積の平均値の推移を図１４−１に、各個体の推移を図１４−２に示す。なお、抗ＣＴＬＡ４抗体、抗ＰＤ１抗体、抗ＰＤＬ１抗体はＢｉｏＸ  Ｃｅｌｌ社よりそれぞれ入手した。【０２６８】
【表１４】
2020158771.tif 000049
ＨＡ誘導体（９９ｋ４１）群は、７日目からの投与でも高い腫瘍増殖抑制効果を示し、その効果は抗体よりも高いことが示された。【０２６９】
（実施例５−４）マウス線維肉腫ＣＭＳ５ａ
実施例５に記載の方法で調製したマウス線維肉腫ＣＭＳ５ａ担癌マウスに、表１５のサンプルを表１５に記載の頻度で皮下投与し、マウス腫瘍増殖試験を実施した。抗体は腹腔内投与した。腫瘍体積の平均値の推移を図１５−１に、各個体の推移を図１５−２に示す。なお、抗ＣＴＬＡ４抗体、抗ＰＤＬ１抗体、抗ＯＸ４０抗体、抗４−１ＢＢ抗体はＢｉｏＸ  Ｃｅｌｌ社よりそれぞれ入手した。【０２７０】
【表１５】
2020158771.tif 000050
ＨＡ誘導体（９９ｋ４１）は、抗体（ａＣＴＬＡ４／ａＰＤＬ１／ａＯＸ４０／ａ４−１ＢＢ）と組み合わせることにより、より高いｍＥＲＫ２ペプチドによる腫瘍増殖抑制効果を有することが示された。【０２７１】
（実施例５−５）マウス大腸がん細胞ＣＴ２６
実施例５に記載の方法で調製したマウス大腸がん細胞ＣＴ２６担癌マウスに、表１６のサンプルを表１６に記載の頻度で皮下投与し、マウス腫瘍増殖試験を実施した。腫瘍体積の平均値の推移を図１６−１に、各個体の推移を図１６−２に示す。【０２７２】
【表１６】
2020158771.tif 000051
ＨＡ誘導体（９９ｋ４３）群は、エマルジョン群、ＣＨＰ群と比較して、高い腫瘍増殖抑制効果を有することが示された。【０２７３】
（実施例５−６）マウスメラノーマＢ１６Ｆ１０
実施例５に記載の方法で調製したマウスマウスメラノーマＢ１６Ｆ１０担癌マウスに、表１７のサンプルを表１７に記載の頻度で皮下投与し、マウス腫瘍増殖試験を実施した。腫瘍体積の平均値の推移を図１７−１に、各個体の推移を図１７−２に示す。【０２７４】
【表１７】
2020158771.tif 000052
ＨＡ誘導体（９９ｋ４３）群は、ＣＨＰ群と比較して、高い腫瘍増殖抑制効果を有することが示された。【０２７５】
〔実施例６〕リンパ節デリバリー
実験方法
蛍光標識ｍＥＲＫ２  ｐ１２１（フルオロセイン結合）を用い、実施例３に記載の方法で調製したサンプルをＢＡＬＢ／ｃマウス（体重１５〜２５ｇ）の右後背部皮下に投与した。２４時間後、ならびに７２時間後、右鼠径リンパ節を摘出し、抗ＣＤ１１ｂ抗体および抗Ｆ４／８０抗体で染色後、Ｆ４／８０＋ＣＤ１１ｂ＋細胞への蛍光標識ペプチドの取り込みをフローサイトメトリーにより解析した。細胞はフローサイトメーター（ＦＡＣＳ Ｃａｎｔｏ ＩＩ，ＢＤバイオサイエンス）にて、付属の解析ソフトウェア（ＦＡＣＳＤｉｖａ）を用いて解析した。【０２７６】
（実施例６−１）各種ＨＡ誘導体のリンパ節デリバリー
表１８に記載のサンプルを実施例６に記載の方法で投与・分析し、リンパ節移行性試験を実施した。２４時間後の１細胞あたりの蛍光強度を図１８−１に、７２時間後の１細胞あたりの蛍光強度を図１８−２に示す。【０２７７】
【表１８】
2020158771.tif 000053
ＨＡ誘導体群は、ペプチド群、ＣＨＰ群と比較して、より多くのｍＥＲＫ２がリンパ節に移行することが示された。【０２７８】
（実施例６−２）アミノ酸修飾各種ＨＡ誘導体のリンパ節デリバリー
表１９に記載のサンプルを実施例６に記載の方法で投与・分析し、リンパ節移行性試験を実施した。２４時間後の１細胞あたりの蛍光強度を図１９に示す。なお、アミノ酸修飾ＨＡ誘導体は、国際公開第２０１４／０３８６４１号の実施例１に記載のとおりに合成した。例えば、以下の表１９の１０ｋＨＡ−Ａｌａ−Ｃ６−Ｃｈｏｌ−３０％は、式（ＩＩ）において、Ｒａａがメチル（Ｃ１アルキル）、Ｒ６ａが水素原子、Ｘ１ａが−ＮＲ９−Ｚ１−Ｚ２、Ｒ９が水素原子、Ｚ１がＣ６アルキレン、Ｚ２が−ＮＲｂａ−ＣＯＯ−Ｚ３、Ｒｂａが水素原子、およびＺ３がコレステリル基である（すなわち、アラニンとコレステリル  ６−アミノヘキシルカーバメートが導入されている）、重量平均分子量が１０ｋＤａ、コレステリル基の導入率が３０％のＨＡ誘導体であることを示す。なお、合成したアミノ酸修飾ＨＡ誘導体は、国際公開第２０１４／０３８６４１号の実施例３−８に記載されている。【０２７９】
【表１９】
2020158771.tif 000054
アミノ酸修飾したＨＡ誘導体群は、ｍＥＲＫ２がリンパ節に移行することが示された。【０２８０】
〔実施例７〕マウス腫瘍増殖試験
（実施例７−１）マウスメラノーマＢ１６Ｆ１０
実施例５に記載の方法で調製したマウスマウスメラノーマＢ１６Ｆ１０担癌マウスに、表２０のサンプルを表２０に記載の頻度で皮下投与し、マウス腫瘍増殖試験を実施した。腫瘍体積の平均値の推移を図２０−１に、各個体の推移を図２０−２に示す。【０２８１】
【表２０】
2020158771.tif 000055
ＨＡ誘導体（９９ｋ４２）群とはＨＡの分子量が異なるＨＡ誘導体（５０ｋ４２）群、ＨＡ誘導体（１０ｋ４３）群もＨＡ誘導体（９９ｋ４２）群同様に高い腫瘍増殖抑制効果を有することが示された。【０２８２】
（実施例７−２）マウスメラノーマＢ１６Ｆ１０
実施例５に記載の方法で調製したマウスマウスメラノーマＢ１６Ｆ１０担癌マウスに、表２１のサンプルを表２１に記載の頻度で皮下投与し、マウス腫瘍増殖試験を実施した。腫瘍体積の平均値の推移を図２１−１に、各個体の推移を図２１−２に示す。【０２８３】
【表２１】
2020158771.tif 000056
アミノ酸修飾したＨＡ誘導体群（１０ｋＨＡ−Ａｌａ−Ｃｈｏｌ３０、１０ｋＨＡ−Ｇｌｎ−Ｃｈｏｌ３２）も高い腫瘍増殖抑制効果を有することが示された。【０２８４】
（実施例７−３）マウスメラノーマＢ１６Ｆ１０
実施例５に記載の方法で調製したマウスマウスメラノーマＢ１６Ｆ１０担癌マウスに、表２２のサンプルを表２２に記載の頻度で皮下投与し、マウス腫瘍増殖試験を実施した。腫瘍体積の平均値の推移を図２２−１に、各個体の推移を図２２−２に示す。【０２８５】
【表２２】
2020158771.tif 000057
ＰｏｌｙＩＣをアジュバントとして用いても高い腫瘍増殖抑制効果を有することが示された。【０２８６】
（実施例７−４）マウスメラノーマＢ１６Ｆ１０
実施例５に記載の方法で調製したマウスマウスメラノーマＢ１６Ｆ１０担癌マウスに、表２３のサンプルを表２３に記載の頻度で皮下投与し、マウス腫瘍増殖試験を実施した。腫瘍体積の平均値の推移を図２３−１に、各個体の推移を図２３−２に示す。【０２８７】
【表２３】
2020158771.tif 000058
Ｓｔｉｎｇ、Ｒ８４８をアジュバントとして用いても高い腫瘍増殖抑制効果を有することが示された。【０２８８】
〔実施例８〕腫瘍およびリンパ節解析
実施例５に記載の方法で調製したマウスメラノーマＢ１６Ｆ１０担癌マウスに、表２４のサンプルを表２４に記載の頻度で皮下投与し、移植後１２日目、１４日目、１８日目に腫瘍およびリンパ節（左右腋下部及び左右鼠径部の計4箇所）を採取し、テトラマーアッセイ（後述）を実施した。採取した腫瘍及びリンパ節は、2匹分をプールし、各群２サンプル（４匹分）を解析した。ＣＤ８＋細胞に対するＴＲＰ−２抗原特異的ＣＤ８＋細胞の数の割合を図２４−１に、ＣＤ８＋細胞に対するｇｐ１００抗原特異的ＣＤ８＋細胞の数の割合を図２４−２に示す。【０２８９】
【表２４】
2020158771.tif 000059
腫瘍およびリンパ節にＴＲＰ−２抗原特異的ＣＤ８＋細胞およびｇｐ１００抗原特異的ＣＤ８＋細胞が浸潤していることが示された。このことは、ＨＡ誘導体による抗腫瘍効果が抗原特異的なＣＤ８細胞によって引き起こされていることを示している。【０２９０】
テトラマーアッセイ
採取した腫瘍組織サンプルを１ｍＬのＲＰＭＩ−１６４０の入った６ウェルプレートに入れ、ハサミで２ｍｍ角以下に細断した後、ｇｅｎｔｌｅＭＡＣＳ  Ｃ−ｔｕｂｅ（ミルテニーバイオテク社）に回収した。Ｅｎｚｙｍｅ  Ｍｉｘ（ミルテニーバイオテク社）を添加した後、ｇｅｎｔｌｅＭＡＣＳ  Ｄｉｓｓｏｃｉａｔｏｒ（ミルテニーバイオテク社）にセットし、破砕した。その後、３７度で４０分間インキュベートし，再びｇｅｎｔｌｅＭＡＣＳ  Ｄｉｓｓｏｃｉａｔｏｒにセットし破砕した。得られた細胞懸濁液をストレーナーに通してから遠心（３００×ｇ、５分間、４℃）し、ペレットをＭＡＣＳ  Ｂｕｆｆｅｒ（ミルテニーバイオテク社）にて懸濁し、細胞懸濁液とした。【０２９１】
採取したリンパ節はシリンジ内筒のテールを用いて押しつぶし，細胞懸濁液とした。【０２９２】
５×１０７個／ｍＬの腫瘍細胞懸濁液もしくはリンパ節細胞懸濁液を、それぞれ２０μＬ／ｗｅｌｌで９６ウェルＶ底マイクロプレートに添加した。５０倍希釈マウスＦｃＲブロッキング試薬を１０μＬ／ｗｅｌｌで添加し、４℃で５分間反応させた。Ｈ−２Ｋｂ  ＴＲＰ−２  Ｔｅｔｒａｍｅｒ−ＳＶＹＤＦＦＶＷＬ−ＡＰＣ（ＭＢＬ社）、Ｈ−２Ｄｂ  ｇｐ１００  Ｔｅｔｒａｍｅｒ−ＥＧＳＲＮＱＤＷＬ−ＰＥ（ＭＢＬ社）を各１０μＬ／ｗｅｌｌ添加し、４℃、遮光下で３０分間反応させた。ＭＡＣＳ  Ｂｕｆｆｅｒを２００μＬ／ｗｅｌｌ添加し、遠心（３１０〜４００×ｇ、５分間、４℃）して上清を除去する操作を２回繰り返した。次に蛍光標識抗ＣＤ８抗体（ＭＢＬ社）を含む抗体溶液を２０μＬ／ｗｅｌｌ添加し、４℃、遮光下で３０分間反応させた。ＭＡＣＳ  Ｂｕｆｆｅｒを２００μＬ／ｗｅｌｌ添加し、遠心（３１０〜４００×ｇ、５分間、４℃）して上清を除去する操作を２回繰り返した。ＭＡＣＳ  Ｂｕｆｆｅｒを２００μＬ／ｗｅｌｌ添加して懸濁し、フローサイトメーター（ＢＤ  ＬＳＲＦｏｒｔｅｓｓａ  Ｘ−２０、ＢＤ  バイオサイエンス）にて、付属の解析ソフトウェア（ＦＡＣＳＤｉｖａ）を用いて解析した。
【図１】
2020158771.tif 000064
【図２−１】
2020158771.tif 000065
【図２−２】
2020158771.tif 000066
【図３−１】
2020158771.tif 000067
【図３−２】
2020158771.tif 000068
【図４】
2020158771.tif 000069
【図５】
2020158771.tif 000070
【図６】
2020158771.tif 000071
【図７−１】
2020158771.tif 000072
【図７−２】
2020158771.tif 000073
【図７−３】
2020158771.tif 000074
【図８−１】
2020158771.tif 000075
【図８−２】
2020158771.tif 000076
【図８−３】
2020158771.tif 000077
【図９−１】
2020158771.tif 000078
【図９−２】
2020158771.tif 000079
【図１０−１】
2020158771.tif 000080
【図１０−２】
2020158771.tif 000081
【図１１−１】
2020158771.tif 000082
【図１１−２】
2020158771.tif 000083
【図１２−１】
2020158771.tif 000084
【図１２−２】
2020158771.tif 000085
【図１３−１】
2020158771.tif 000086
【図１３−２】
2020158771.tif 000087
【図１４−１】
2020158771.tif 000088
【図１４−２】
2020158771.tif 000089
【図１５−１】
2020158771.tif 000090
【図１５−２】
2020158771.tif 000091
【図１６−１】
2020158771.tif 000092
【図１６−２】
2020158771.tif 000093
【図１７−１】
2020158771.tif 000094
【図１７−２】
2020158771.tif 000095
【図１８−１】
2020158771.tif 000096
【図１８−２】
2020158771.tif 000097
【図１９】
2020158771.tif 000098
【図２０−１】
2020158771.tif 000099
【図２０−２】
2020158771.tif 000100
【図２１−１】
2020158771.tif 000101
【図２１−２】
2020158771.tif 000102
【図２２−１】
2020158771.tif 000103
【図２２−２】
2020158771.tif 000104
【図２３−１】
2020158771.tif 000105
【図２３−２】
2020158771.tif 000106
【図２４−１】
2020158771.tif 000107
【図２４−２】
2020158771.tif 000108
【配列表】
2020158771000001.app
【国際調査報告】
2020158771.tif 000109
2020158771.tif 000110
2020158771.tif 000111
2020158771.tif 000112