(57)【要約】  本発明は、間質性肺炎患者の呼吸機能の低下リスクに関する情報を取得する方法に関する。本発明は、間質性肺炎患者の呼吸機能の低下リスクを判定する方法に関する。本発明は、間質性肺炎患者の呼吸機能の低下リスクを判定するための装置及びコンピュータプログラムに関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
間質性肺炎患者の呼吸機能の低下リスクに関する情報を取得する方法であって、
前記方法が、間質性肺炎患者の生体試料中の少なくとも１つのバイオマーカーを測定することを含み、前記バイオマーカーがCCL17及びCXCL9を含み、前記バイオマーカーの測定結果が、前記患者の呼吸機能の低下リスクの指標となる、
前記方法。
【請求項２】
間質性肺炎患者の呼吸機能の低下リスクに関する情報を取得する方法であって、
前記方法が、間質性肺炎患者の生体試料中の少なくとも１つのバイオマーカーを測定することを含み、前記バイオマーカーがCCL17、CXCL9及びCXCL11を含み、前記バイオマーカーの測定結果が、前記患者の呼吸機能の低下リスクの指標となる、
前記方法。
【請求項３】
前記呼吸機能の低下リスクが、前記生体試料の取得から６か月後の肺活量が低下するリスクである請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記肺活量が低下するリスクが、前記生体試料の取得から６か月後の肺活量が、前記生体試料の取得時の肺活量から５％以上低下するリスクである請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記間質性肺炎患者が、未治療の患者である請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記間質性肺炎患者が、過敏性肺炎患者である請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記生体試料が、血液試料である請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記バイオマーカーの測定結果が、CCL17の測定値、CXCL9の測定値、CXCL9の測定値に対するCCL17の測定値の比、及びCCL17の測定値に対するCXCL9の測定値の比から選択される少なくとも１つである請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記バイオマーカーの測定結果が、CCL17の測定値、CXCL9の測定値、CXCL11の測定値、CXCL9の測定値に対するCCL17の測定値の比、CCL17の測定値に対するCXCL9の測定値の比、CCL17の測定値に対するCXCL11の測定値の比、及びCXCL11の測定値に対するCCL17の測定値の比から選択される少なくとも１つである請求項２及び請求項２を引用する請求項３〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
前記バイオマーカーが、CCL22、CXCL10及びCXCL11から選択される少なくとも１つをさらに含む請求項１及び請求項１を引用する請求項３〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
前記バイオマーカーが、CCL22及びCXCL10から選択される少なくとも１つをさらに含む請求項２、請求項２を引用する請求項３〜７、及び請求項９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
前記バイオマーカーの測定結果が、CCL17の測定値、又はCXCL9の測定値に対するCCL17の測定値の比であり、前記測定値又は前記比の値が、各値に対応する所定の閾値より高い場合、呼吸機能の低下リスクが高いことを示唆する請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
前記バイオマーカーの測定結果が、CCL17の測定値、又はCXCL9の測定値に対するCCL17の測定値の比であり、前記測定値又は前記比の値が、各値に対応する所定の閾値より低い場合、呼吸機能の低下リスクが低いことを示唆する請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
前記バイオマーカーの測定結果が、CCL17の測定値、CXCL9の測定値に対するCCL17の測定値の比、CXCL11の測定値に対するCCL17の測定値の比、CXCL11の測定値に対するCCL22の測定値の比、又はCXCL9の測定値に対するCCL22の測定値の比であり、前記測定値又は前記比の値が、各値に対応する所定の閾値より高い場合、呼吸機能の低下リスクが高いことを示唆する請求項１０又は１１に記載の方法。
【請求項１５】
前記バイオマーカーの測定結果が、CCL17の測定値、CXCL9の測定値に対するCCL17の測定値の比、CXCL11の測定値に対するCCL17の測定値の比、CXCL11の測定値に対するCCL22の測定値の比、又はCXCL9の測定値に対するCCL22の測定値の比であり、前記測定値又は前記比の値が、各値に対応する所定の閾値より低い場合、呼吸機能の低下リスクが低いことを示唆する請求項１０又は１１に記載の方法。
【請求項１６】
間質性肺炎患者の呼吸機能の低下リスクの判定方法であって、
前記方法が、間質性肺炎患者の生体試料中の少なくとも１つのバイオマーカーを測定する工程と、
前記バイオマーカーの測定結果に基づいて、前記患者の呼吸機能の低下リスクを判定する工程と
を含み、前記バイオマーカーがCCL17及びCXCL9を含む、
前記方法。
【請求項１７】
間質性肺炎患者の呼吸機能の低下リスクの判定方法であって、
前記方法が、間質性肺炎患者の生体試料中の少なくとも１つのバイオマーカーを測定する工程と、
前記バイオマーカーの測定結果に基づいて、前記患者の呼吸機能の低下リスクを判定する工程と
を含み、前記バイオマーカーがCCL17、CXCL9及びCXCL11を含む、
前記方法。
【請求項１８】
前記バイオマーカーの測定結果が、CCL17の測定値、CXCL9の測定値に対するCCL17の測定値の比、又はCXCL11の測定値に対するCCL17の測定値の比であるとき、前記判定工程において、前記測定値又は前記比の値が、各値に対応する所定の閾値より高い場合、呼吸機能の低下リスクが高いと判定する請求項１６又は１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記バイオマーカーの測定結果が、CCL17の測定値、CXCL9の測定値に対するCCL17の測定値の比、又はCXCL11の測定値に対するCCL17の測定値の比であるとき、前記判定工程において、前記測定値又は前記比の値が、各値に対応する所定の閾値より低い場合、呼吸機能の低下リスクが低いと判定する請求項１６又は１７に記載の方法。
【請求項２０】
前記バイオマーカーの測定結果が、CXCL9の測定値、CXCL11の測定値、CCL17の測定値に対するCXCL9の測定値の比、又はCCL17の測定値に対するCXCL11の測定値の比であるとき、前記判定工程において、前記測定値又は前記比の値が、各値に対応する所定の閾値より低い場合、呼吸機能の低下リスクが高いと判定する請求項１６又は１７に記載の方法。
【請求項２１】
前記バイオマーカーの測定結果が、CXCL9の測定値、CXCL11の測定値、CCL17の測定値に対するCXCL9の測定値の比、又はCCL17の測定値に対するCXCL11の測定値の比であるとき、前記判定工程において、前記測定値又は前記比の値が、各値に対応する所定の閾値より高い場合、呼吸機能の低下リスクが低いと判定する請求項１６又は１７に記載の方法。
【請求項２２】
前記バイオマーカーがCCL22をさらに含み、
前記バイオマーカーの測定結果が、CXCL11の測定値に対するCCL22の測定値の比、又はCXCL9の測定値に対するCCL22の測定値の比であるとき、前記判定工程において、前記比の値が、各値に対応する所定の閾値より高い場合、呼吸機能の低下リスクが高いと判定する請求項１７に記載の方法。
【請求項２３】
前記バイオマーカーがCCL22をさらに含み、
前記バイオマーカーの測定結果が、CXCL11の測定値に対するCCL22の測定値の比、又はCXCL9の測定値に対するCCL22の測定値の比であるとき、前記判定工程において、前記比の値が、各値に対応する所定の閾値より低い場合、呼吸機能の低下リスクが低いと判定する請求項１７に記載の方法。
【請求項２４】
前記バイオマーカーがCCL22をさらに含み、
前記バイオマーカーの測定結果が、CCL22の測定値に対するCXCL11の測定値の比、又はCCL22の測定値に対するCXCL9の測定値の比であるとき、前記判定工程において、前記比の値が、各値に対応する所定の閾値より低い場合、呼吸機能の低下リスクが高いと判定する請求項１７に記載の方法。
【請求項２５】
前記バイオマーカーがCCL22をさらに含み、
前記バイオマーカーの測定結果が、CCL22の測定値に対するCXCL11の測定値の比、又はCCL22の測定値に対するCXCL9の測定値の比であるとき、前記判定工程において、前記比の値が、各値に対応する所定の閾値より高い場合、呼吸機能の低下リスクが低いと判定する請求項１７に記載の方法。
【請求項２６】
CCL17と特異的に結合可能な物質を含む試薬、及び／又はCXCL9と特異的に結合可能な物質を含む試薬を含む、請求項１〜２５のいずれか１項に記載の方法に用いるための試薬キット。
【請求項２７】
CCL17と特異的に結合可能な物質を含む試薬、及び／又はCXCL9と特異的に結合可能な物質を含む試薬、及び／又はCXCL11と特異的に結合可能な物質を含む試薬を含む、請求項１〜２５のいずれか１項に記載の方法に用いるための試薬キット。
【請求項２８】
プロセッサ及び前記プロセッサの制御下にあるメモリを含むコンピュータを備え、
前記メモリには、
間質性肺炎患者の生体試料中の少なくとも１つのバイオマーカーの測定結果を取得するステップと、
前記バイオマーカーの測定結果に基づいて、前記患者の呼吸機能の低下リスクを判定するステップと
を前記コンピュータに実行させるためのコンピュータプログラムが記録され、
前記バイオマーカーがCCL17及びCXCL9を含む、
間質性肺炎患者の呼吸機能の低下リスクの判定装置。
【請求項２９】
プロセッサ及び前記プロセッサの制御下にあるメモリを含むコンピュータを備え、
前記メモリには、
間質性肺炎患者の生体試料中の少なくとも１つのバイオマーカーの測定結果を取得するステップと、
前記バイオマーカーの測定結果に基づいて、前記患者の呼吸機能の低下リスクを判定するステップと
を前記コンピュータに実行させるためのコンピュータプログラムが記録され、
前記バイオマーカーがCCL17、CXCL9及びCXCL11を含む、
間質性肺炎患者の呼吸機能の低下リスクの判定装置。
【請求項３０】
コンピュータに読み取り可能な媒体に記録されているコンピュータプログラムであって、下記のステップ：
間質性肺炎患者の生体試料中の少なくとも１つのバイオマーカーの測定結果を取得するステップと、
前記バイオマーカーの測定結果に基づいて、前記患者の呼吸機能の低下リスクを判定するステップと
を前記コンピュータに実行させるためのコンピュータプログラムが記録され、
前記バイオマーカーがCCL17及びCXCL9を含む、
間質性肺炎患者の呼吸機能の低下リスクの判定のためのコンピュータプログラム。
【請求項３１】
コンピュータに読み取り可能な媒体に記録されているコンピュータプログラムであって、下記のステップ：
間質性肺炎患者の生体試料中の少なくとも１つのバイオマーカーの測定結果を取得するステップと、
前記バイオマーカーの測定結果に基づいて、前記患者の呼吸機能の低下リスクを判定するステップと
を前記コンピュータに実行させるためのコンピュータプログラムが記録され、
前記バイオマーカーがCCL17、CXCL9及びCXCL11を含む、
間質性肺炎患者の呼吸機能の低下リスクの判定のためのコンピュータプログラム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、間質性肺炎患者の呼吸機能の低下リスクに関する情報を取得する方法に関する。本発明は、間質性肺炎患者の呼吸機能の低下リスクを判定する方法に関する。本発明は、間質性肺炎患者の呼吸機能の低下リスクを判定するための装置及びコンピュータプログラムに関する。
【背景技術】
【０００２】
間質性肺炎は、肺の間質組織、特に肺胞隔壁に炎症及び線維化が生じる疾患である。間質性肺炎の初期段階では、症状がほとんどない場合が多い。しかし、間質性肺炎が進行すると、肺の線維化により肺活量及びガス交換能が低下して、呼吸困難の症状が現れる。間質性肺炎の原因は多岐にわたる。特異抗原の吸入によるアレルギーを原因とする場合は過敏性肺炎(HP)と呼ばれ、原因不明の場合は特発性間質性肺炎(IIPs)と呼ばれる。IIPsは、原因となる抗原が不明であるだけで、病理メカニズムはHPと同じである。【０００３】
間質性肺炎の治療はHPとIIPsとで異なる。HPの治療では主に抗原回避が行われ、炎症に対してはステロイド及び免疫抑制薬が用いられる。IIPsの大部分を占める疾患である特発性肺線維症(IPF)の治療では、抗炎症療法はむしろ行われず、ピルフェニドンなどの抗線維化薬が用いられる。治療の有効性は、通常、治療の開始から６か月後の呼吸機能(例えば肺活量など)により評価される。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】宮崎泰成, 過敏性肺炎における慢性・線維化病態に関する研究, 日サ会誌, 2014, vol.34, p.11-17
【非特許文献２】Kishi M.ら, Pathogenesis of cBFL in common with IPF? Correlation of IP-10/TARC ratio with histological patterns, Thorax, 2008, vol.63, p.810-816
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
上述のように、間質性肺炎の治療の有効性は治療の開始から６か月後の呼吸機能により評価されるので、呼吸機能の低下リスクが分かれば、治療効果をあらかじめ判定することが可能となる。よって、呼吸機能の低下リスクの判定は、治療方針の決定に有用である。一方、現在の間質性肺炎の治療は、疾患の進行を抑制するだけで、肺の損傷及び線維化により低下した呼吸機能は回復しない。呼吸機能の低下リスクを判定できれば、ハイリスクの患者に対して、間質性肺炎が進行する前に積極的に治療を試みることが可能となる。しかし、患者の呼吸機能が将来において低下するリスクを判定する方法又はそのようなリスクと相関するバイオマーカーなどは知られていない。【０００６】
間質性肺炎に関連するバイオマーカーの一つとして、ケモカインが知られている。例えば、非特許文献１には、CCL17(CC chemokine ligand 17)が、急性増悪の発症リスクを判定するマーカーとなり得ることが開示されている。しかし、急性増悪とは、間質性肺炎の症状が数日のうちに急激に悪化して致命的な呼吸困難になることである。つまり、急性増悪は、間質性肺炎の通常の進行によって呼吸機能が低下した状態とは異なる。非特許文献２には、通常型間質性肺炎(UIP)の患者の血清においてCCL17濃度が上昇したことが開示されている。しかし、非特許文献２には、ケモカインと、間質性肺炎患者の呼吸機能の低下リスクとの関連については開示されていない。【０００７】
上記の事情に鑑み、本発明は、間質性肺炎患者の呼吸機能の低下リスクの判定を可能にする手段の提供を目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、間質性肺炎患者の血液試料中のケモカイン濃度と、各患者の呼吸機能との関連を検討した。その結果、本発明者らは、CCL17、CXCL9(CXC chemokine ligand 9)及びCXCL11(CXC chemokine ligand 11)の濃度と、患者のその後の呼吸機能の低下との間に有意な相関があることを見出して、本発明を完成した。【０００９】
よって、本発明は、間質性肺炎患者の生体試料中の少なくとも１つのバイオマーカーを測定することを含み、バイオマーカーがCCL17、CXCL9及びCXCL11を含み、バイオマーカーの測定結果が、上記患者の呼吸機能の低下リスクの指標となる、間質性肺炎患者の呼吸機能の低下リスクに関する情報を取得する方法を提供する。【００１０】
本発明は、間質性肺炎患者の生体試料中の少なくとも１つのバイオマーカーを測定する工程と、バイオマーカーの測定結果に基づいて、上記患者の呼吸機能の低下リスクを判定する工程とを含み、バイオマーカーがCCL17、CXCL9及びCXCL11を含む、間質性肺炎患者の呼吸機能の低下リスクの判定方法を提供する。【００１１】
本発明は、CCL17と特異的に結合可能な物質を含む試薬、及び／又はCXCL9と特異的に結合可能な物質を含む試薬、及び／又はCXCL11と特異的に結合可能な物質を含む試薬を含む、上記の方法に用いるための試薬キットを提供する。【００１２】
本発明は、プロセッサ及びプロセッサの制御下にあるメモリを含むコンピュータを備え、メモリには、間質性肺炎患者の生体試料中の少なくとも１つのバイオマーカーの測定結果を取得するステップと、バイオマーカーの測定結果に基づいて、上記患者の呼吸機能の低下リスクを判定するステップとをコンピュータに実行させるためのコンピュータプログラムが記録され、バイオマーカーがCCL17、CXCL9及びCXCL11を含む、間質性肺炎患者の呼吸機能の低下リスクの判定装置を提供する。【００１３】
本発明は、コンピュータに読み取り可能な媒体に記録されているコンピュータプログラムであって、間質性肺炎患者の生体試料中の少なくとも１つのバイオマーカーの測定結果を取得するステップと、バイオマーカーの測定結果に基づいて、上記患者の呼吸機能の低下リスクを判定するステップとをコンピュータに実行させるためのコンピュータプログラムが記録され、バイオマーカーがCCL17、CXCL9及びCXCL11を含む、間質性肺炎患者の呼吸機能の低下リスクの判定のためのコンピュータプログラムを提供する。
【発明の効果】
【００１４】
本発明によれば、間質性肺炎患者の呼吸機能の低下リスクに関する情報を取得することを可能にする。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１Ａ】本実施形態の試薬キットの外観の一例を示す図である。
【図１Ｂ】本実施形態の試薬キットの外観の一例を示す図である。
【図２】呼吸機能の低下リスクの判定装置の一例を示した概略図である。
【図３】呼吸機能の低下リスクの判定装置のハードウェア構成を示すブロック図である。
【図４Ａ】呼吸機能の低下リスクの判定装置を用いた判定のフローチャートである。
【図４Ｂ】呼吸機能の低下リスクの判定装置を用いた判定のフローチャートである。
【図４Ｃ】呼吸機能の低下リスクの判定装置を用いた判定のフローチャートである。
【図４Ｄ】呼吸機能の低下リスクの判定装置を用いた判定のフローチャートである。
【図４Ｅ】呼吸機能の低下リスクの判定装置を用いた判定のフローチャートである。
【図４Ｆ】呼吸機能の低下リスクの判定装置を用いた判定のフローチャートである。
【図４Ｇ】呼吸機能の低下リスクの判定装置を用いた判定のフローチャートである。
【図５】クラスター解析により、間質性肺炎患者を血清中のCCL17及びCXCL9の濃度に基づいて分類した結果を示す図である。
【図６】G1群、G2群及びG3群の患者の６か月後の肺活量の変化量を示すグラフである。
【図７Ａ】血清CCL17濃度の中央値により分けられた高値群(High)及び低値群(Low)の６か月後の肺活量の低下率(%)を示すグラフである。
【図７Ｂ】血清CXCL9濃度の中央値により分けられた高値群(High)及び低値群(Low)の６か月後の肺活量の低下率(%)を示すグラフである。
【図７Ｃ】血清CXCL9濃度に対する血清CCL17濃度の比の中央値により分けられた高値群(High)及び低値群(Low)の６か月後の肺活量の低下率(%)を示すグラフである。
【図７Ｄ】血清CXCL11濃度の中央値により分けられた高値群(HIGH)及び低値群(LOW)の６か月後の肺活量の低下率(%)を示すグラフである。
【図７Ｅ】血清CXCL10濃度に対する血清CCL17濃度の比の中央値により分けられた高値群(HIGH)及び低値群(LOW)の６か月後の肺活量の低下率(%)を示すグラフである。
【図７Ｆ】血清CXCL11濃度に対する血清CCL17濃度の比の中央値により分けられた高値群(HIGH)及び低値群(LOW)の６か月後の肺活量の低下率(%)を示すグラフである。
【図７Ｇ】血清CXCL11濃度に対する血清CCL22濃度の比の中央値により分けられた高値群(HIGH)及び低値群(LOW)の６か月後の肺活量の低下率(%)を示すグラフである。
【図７Ｈ】血清CXCL9濃度に対する血清CCL22濃度の比の中央値により分けられた高値群(HIGH)及び低値群(LOW)の６か月後の肺活量の低下率(%)を示すグラフである。
【図８Ａ】血清CCL17濃度に基づいて呼吸機能の低下リスクの判定を行ったときのROC(receiver operating characteristic)曲線である。
【図８Ｂ】血清CXCL9濃度に基づいて呼吸機能の低下リスクの判定を行ったときのROC曲線である。
【図８Ｃ】血清CXCL9濃度に対する血清CCL17濃度の比に基づいて呼吸機能の低下リスクの判定を行ったときのROC曲線である。
【図８Ｄ】血清CXCL11濃度に基づいて呼吸機能の低下リスクの判定を行ったときのROC曲線である。
【図８Ｅ】血清CXCL10濃度に対する血清CCL17濃度の比に基づいて呼吸機能の低下リスクの判定を行ったときのROC曲線である。
【図８Ｆ】血清CXCL11濃度に対する血清CCL17濃度の比に基づいて呼吸機能の低下リスクの判定を行ったときのROC曲線である。
【図８Ｇ】血清CXCL9濃度に対する血清CCL22濃度の比に基づいて呼吸機能の低下リスクの判定を行ったときのROC曲線である。
【図８Ｈ】血清CXCL11濃度に対する血清CCL22濃度の比に基づいて呼吸機能の低下リスクの判定を行ったときのROC曲線である。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
[１．呼吸機能の低下リスクに関する情報を取得するための方法]
本実施形態の呼吸機能の低下リスクに関する情報を取得するための方法(以下、単に「方法」ともいう)では、間質性肺炎患者の生体試料中の少なくとも１つのバイオマーカーを測定する。
【００１７】
本実施形態の方法における被検者は、間質性肺炎と診断された患者であれば特に限定されないが、好ましくは未治療の間質性肺炎患者である。あるいは、被検者は、間質性肺炎に罹患している疑いのある者であってもよい。本明細書では「間質性肺炎患者」との用語は、間質性肺炎と診断された患者及び間質性肺炎に罹患している疑いのある者の両方を含む。間質性肺炎の種類は特に限定されないが、好ましくは過敏性肺炎である。
【００１８】
生体試料は、後述のバイオマーカーを含む試料であれば特に限定されない。そのような生体試料としては、例えば血液試料、気管支肺胞洗浄液などが挙げられる。血液試料としては、例えば、被検者から採取した血液(全血)、及びその血液から調製した血漿又は血清が挙げられる。本実施形態では、血清が特に好ましい。
【００１９】
生体試料に細胞などの不溶性の夾雑物が含まれる場合は、例えば、遠心分離、ろ過などの公知の手段により、生体試料から夾雑物を除去してもよい。また、生体試料は、必要に応じて適切な水性媒体で希釈してもよい。そのような水性媒体は、後述の測定を妨げないかぎり特に限定されず、例えば、水、生理食塩水、緩衝液などが挙げられる。緩衝液は、中性付近のpH(例えば６以上８以下のpH)で緩衝作用を有するかぎり、特に限定されない。そのような緩衝液は、例えば、HEPES、MES、PIPESなどのグッド緩衝液、トリス緩衝生理食塩水(TBS)、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)などが挙げられる。
【００２０】
本実施形態の方法において測定するバイオマーカーとして、CCL17、CXCL9及びCXCL11が挙げられる。CCL17は、Th2タイプケモカインの一種であり、TARC(Thymus- and activation-regulated chemokine)とも呼ばれる。CXCL9は、Th1タイプケモカインの一種であり、MIG(Monokine induced by interferonγ)とも呼ばれる。CCL17は、Th2細胞表面に発現するCCR4受容体のリガンドであり、CXCL9は、Th1細胞表面に発現するCXCR3受容体のリガンドである。CXCL11は、I-TAC(Interferon-inducible T-cell Chemoattractant)とも呼ばれるケモカインであり、CXCL9と同様にCXCR3受容体のリガンドである。CCL17、CXCL9及びCXCL11のアミノ酸配列自体は公知であり、例えばNCBI(National Center for Biotechnology Information)などの公知のデータベースから知ることができる。
【００２１】
本実施形態では、バイオマーカーは、CCL22及びCXCL10から選択される少なくとも１つをさらに含んでもよい。CCL22は、MDC(Macrophage-derived chemokine)とも呼ばれるケモカインであり、CCL17と同様にCCR4受容体のリガンドである。ヒトにおいてCCL17及びCCL22の遺伝子はいずれも16番染色体上に存在することが知られている。CXCL10は、IP-10(Interferon-inducible Protein-10)とも呼ばれるケモカインであり、CXCL9と同様にCXCR3受容体のリガンドである。CXCL9、CXCL10及びCXCL11はいずれも、インターフェロンγ刺激により様々な細胞から産生誘導されることが知られている。CCL22及びCXCL10のアミノ酸配列自体は公知であり、例えばNCBIなどの公知のデータベースから知ることができる。
【００２２】
本明細書において「バイオマーカーを測定する」とは、バイオマーカーの量又は濃度の値を決定すること、及び、バイオマーカーの量又は濃度を反映する情報を取得することを含む。「バイオマーカーの量又は濃度を反映する情報」とは、生体試料又は該生体試料から調製した測定試料におけるバイオマーカーの量又は濃度に応じて変化する指標を意味する。そのような指標は、視認可能又は機械的に測定可能な光学的変化の指標であることが好ましい。光学的変化の指標としては、例えば、発光強度、蛍光強度、吸光度、濁度、発色の濃さなどが挙げられる。
【００２３】
バイオマーカーの量又は濃度を反映する情報は、定性的に示されてもよいし、定量的に示されてもよいし、半定量的に示されてもよい。定性的に示される情報は、バイオマーカーの有無を示す情報である。定量的に示される情報は、測定機器によって得られた数値(以下、「生データ」ともいう)、該数値から算出される値などの数値情報である。生データから算出される値としては、例えば、生データから陰性対照試料の値又はバックグラウンドの値を差し引いた値などが挙げられる。定量的情報に基づいて、バイオマーカーの量又は濃度の値を決定できる。半定量的に示される情報は、バイオマーカーの量又は濃度を、語句、数字(階級を示す)、色などにより段階的に示す情報である。例えば、「検出限界以下」、「少ない」、「中程度」、「多い」などの語句を用いてもよい。
【００２４】
本実施形態では、バイオマーカーの測定結果は、バイオマーカーを測定することにより得られた値、情報及びそれらの組み合わせを含む。好ましい実施形態では、バイオマーカーの測定結果は、バイオマーカーの量又は濃度を反映する定量的情報、及び／又は該定量的情報に基づいて決定されたバイオマーカーの量又は濃度の値である。以下、バイオマーカーの量又は濃度を反映する定量的情報、及び／又はバイオマーカーの量又は濃度の値を「バイオマーカーの測定値」ともいう。バイオマーカーの測定値としては、例えばCCL17の測定値、CXCL9の測定値、CCL22の測定値、CXCL10の測定値、CXCL11の測定値が挙げられる。
【００２５】
バイオマーカーの測定結果は、１つのバイオマーカーの測定値であってもよいし、２つ以上のバイオマーカーの測定値を用いて算出される値であってもよい。この算出には、必要に応じて、任意の係数及び／又は定数をさらに用いてもよい。例えば、２つのバイオマーカーの測定値を用いて算出される値としては、２つの測定値の比、積、和、差などが挙げられる。本実施形態では、CXCL9の測定値に対するCCL17の測定値の比(以下、「CCL17/CXCL9」ともいう)、CCL17の測定値に対するCXCL9の測定値の比(以下、「CXCL9/CCL17」ともいう)、CXCL10の測定値に対するCCL17の測定値の比(以下、「CCL17/CXCL10」ともいう)、CCL17の測定値に対するCXCL10の測定値の比(以下、「CXCL10/CCL17」ともいう)、CXCL11の測定値に対するCCL17の測定値の比(以下、「CCL17/CXCL11」ともいう)、CCL17の測定値に対するCXCL11の測定値の比(以下、「CXCL11/CCL17」ともいう)、CXCL11の測定値に対するCCL22の測定値の比(以下、「CCL22/CXCL11」ともいう)、CCL22の測定値に対するCXCL11の測定値の比(以下、「CXCL11/CCL22」ともいう)、CXCL9の測定値に対するCCL22の測定値の比(以下、「CCL22/CXCL9」ともいう)及びCCL22の測定値に対するCXCL9の測定値の比(以下、「CXCL9/CCL22」ともいう)が好ましい。それらの中でも、CCL17/CXCL9、CCL17/CXCL11及びCCL22/CXCL11が特に好ましい。これらの比の値に100を掛けて、比をパーセンテージで表してもよい。
【００２６】
本実施形態では、２つ以上のバイオマーカーの測定値を用いて算出される値は、公知の多変量解析により得られる値であってもよい。多変量解析によるバイオマーカーの測定値の解析は、例えばクラスター解析、多重ロジスティック解析、決定木(デシジョンツリー)などにより行うことができる。
【００２７】
バイオマーカーを測定する手段は、生体試料又は該生体試料から調製した測定試料におけるバイオマーカーの量又は濃度を反映する情報を取得できるかぎり、特に限定されない。本実施形態では、バイオマーカーと特異的に結合可能な物質を用いて、該バイオマーカーを捕捉する方法が好ましい。このような物質により捕捉されたバイオマーカーを、当該技術において公知の方法で検出することにより、生体試料に含まれるバイオマーカーを測定できる。
【００２８】
バイオマーカーと特異的に結合可能な物質としては、例えば、抗体、アプタマー、レセプタータンパクなどが挙げられるが、それらの中でも抗体が特に好ましい。上記の各ケモカインに対する抗体自体は公知であり、一般に入手可能である。バイオマーカーに対する抗体は、バイオマーカーと特異的に結合できる抗体であれば、特に限定されない。そのような抗体は、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、及びそれらのフラグメント(例えば、Fab、F(ab')2など)のいずれであってもよい。また、市販の抗体を用いてもよい。
【００２９】
抗体を用いてバイオマーカーを測定する方法は特に限定されず、公知の免疫学的測定法から適宜選択できる。そのような測定法としては、例えば酵素結合免疫吸着法(ELISA法)、ウェスタンブロット法などが挙げられる。それらの中でもELISA法が好ましい。ELISA法の種類は、サンドイッチ法、競合法、直接法などのいずれであってもよいが、サンドイッチ法が特に好ましい。一例として、サンドイッチELISA法により、生体試料中のバイオマーカーを測定する場合について、以下に説明する。
【００３０】
まず、バイオマーカーと、バイオマーカーを捕捉するための抗体(以下、「捕捉用抗体」ともいう)と、バイオマーカーを検出するための抗体(以下、「検出用抗体」ともいう)とを含む複合体を固相上に形成させる。該複合体は、バイオマーカーを含み得る生体試料と、捕捉用抗体と、検出用抗体とを混合することにより形成できる。そして、複合体を含む溶液を、捕捉用抗体を捕捉できる固相と接触させることにより、上記の複合体を固相上に形成させることができる。あるいは、捕捉用抗体をあらかじめ固定させた固相を用いてもよい。すなわち、捕捉用抗体を固定させた固相と、生体試料と、検出用抗体とを接触することにより、上記の複合体を固相上に形成させることができる。なお、捕捉用抗体及び検出用抗体がいずれもモノクローナル抗体の場合は、互いのエピトープが異なっていることが好ましい。
【００３１】
捕捉用抗体の固相への固定の態様は、特に限定されない。例えば、捕捉用抗体と固相とを直接結合させてもよいし、捕捉用抗体と固相とを別の物質を介して間接的に結合させてもよい。直接の結合としては、例えば、物理的吸着などが挙げられる。間接的な結合としては、例えば、ビオチン類(ビオチン、及びデスチオビオチンなどのビオチン類縁体を含む)と、アビジン類(アビジン、及びストレプトアビジン、タマビジン(登録商標)などのアビジン類縁体を含む)との組み合わせを介した結合が挙げられる。この場合、捕捉用抗体をあらかじめビオチン類で修飾し、固相にアビジン類をあらかじめ結合させておくことにより、ビオチン類とアビジン類との結合を介して、捕捉用抗体と固相とを間接的に結合させることができる。
【００３２】
固相の素材は特に限定されず、例えば、有機高分子化合物、無機化合物、生体高分子などから選択できる。有機高分子化合物としては、ラテックス、ポリスチレン、ポリプロピレンなどが挙げられる。無機化合物としては、磁性体(酸化鉄、酸化クロム及びフェライトなど)、シリカ、アルミナ、ガラスなどが挙げられる。生体高分子としては、不溶性アガロース、不溶性デキストラン、ゼラチン、セルロースなどが挙げられる。これらのうちの２種以上を組み合わせて用いてもよい。固相の形状は特に限定されず、例えば、粒子、膜、マイクロプレート、マイクロチューブ、試験管などが挙げられる。それらの中でも粒子が好ましく、磁性粒子が特に好ましい。
【００３３】
本実施形態においては、複合体の形成工程と複合体の検出工程との間に、複合体を形成していない未反応の遊離成分を除去するB/F(Bound/Free)分離を行ってもよい。未反応の遊離成分とは、複合体を構成しない成分をいう。例えば、バイオマーカーと結合しなかった捕捉用抗体及び検出用抗体などが挙げられる。B/F分離の手段は特に限定されないが、固相が粒子であれば、遠心分離により、複合体を捕捉した固相だけを回収することによりB/F分離ができる。固相がマイクロプレートやマイクロチューブなどの容器であれば、未反応の遊離成分を含む液を除去することによりB/F分離ができる。また、固相が磁性粒子の場合は、磁石で磁性粒子を磁気的に拘束した状態でノズルによって未反応の遊離成分を含む液を吸引除去することによりB/F分離ができ、自動化の観点で好ましい。未反応の遊離成分を除去した後、複合体を捕捉した固相をPBSなどの適切な水性媒体で洗浄してもよい。
【００３４】
そして、固相上に形成された複合体を、当該技術において公知の方法で検出することにより、生体試料に含まれるバイオマーカーを測定できる。例えば、検出用抗体として、標識物質で標識した抗体を用いた場合は、その標識物質により生じるシグナルを検出することにより、生体試料におけるバイオマーカーを測定できる。あるいは、検出用抗体に対する標識二次抗体を用いた場合も、同様にして生体試料におけるバイオマーカーを測定できる。
【００３５】
また、抗体を用いてバイオマーカーを測定する方法の例として、特開平1-254868号公報に記載の免疫複合体転移法を用いることもできる。
【００３６】
本明細書において「シグナルを検出する」とは、シグナルの有無を定性的に検出すること、シグナル強度を定量すること、及び、シグナルの強度を半定量的に検出することを含む。半定量的な検出とは、シグナルの強度を、「シグナル発生せず」、「弱」、「中」、「強」などのように段階的に示すことをいう。本実施形態では、シグナルの強度を定量的又は半定量的に検出することが好ましい。
【００３７】
標識物質は、検出可能なシグナルが生じるかぎり、特に限定されない。例えば、それ自体がシグナルを発生する物質(以下、「シグナル発生物質」ともいう)であってもよいし、他の物質の反応を触媒してシグナルを発生させる物質であってもよい。シグナル発生物質としては、例えば、蛍光物質、放射性同位元素などが挙げられる。他の物質の反応を触媒して検出可能なシグナルを発生させる物質としては、例えば、酵素が挙げられる。酵素としては、アルカリホスファターゼ、ペルオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼなどが挙げられる。蛍光物質としては、フルオレセインイソチオシアネート(FITC)、ローダミン、Alexa Fluor(登録商標)などの蛍光色素、GFPなどの蛍光タンパク質などが挙げられる。放射性同位元素としては、125Ｉ、14Ｃ、32Ｐなどが挙げられる。それらの中でも、標識物質として、酵素が好ましく、アルカリホスファターゼ及びペルオキシダーゼが特に好ましい。
【００３８】
シグナルを検出する方法自体は、当該技術において公知である。本実施形態では、上記の標識物質に由来するシグナルの種類に応じた測定方法を適宜選択すればよい。例えば、標識物質が酵素である場合、該酵素に対する基質を反応させることによって発生する光、色などのシグナルを、分光光度計などの公知の装置を用いて測定することにより行うことができる。
【００３９】
酵素の基質は、該酵素の種類に応じて公知の基質から適宜選択できる。例えば、酵素としてアルカリホスファターゼを用いる場合、基質として、CDP-Star(登録商標)(4-クロロ-3-(メトキシスピロ[1, 2-ジオキセタン-3, 2'-(5'-クロロ)トリクシロ[3. 3. 1. 13, 7]デカン]-4-イル)フェニルリン酸２ナトリウム)、CSPD(登録商標)(3-(4-メトキシスピロ[1, 2-ジオキセタン-3, 2-(5'-クロロ)トリシクロ[3. 3. 1. 13, 7]デカン]-4-イル)フェニルリン酸２ナトリウム)などの化学発光基質、5-ブロモ-4-クロロ-3-インドリルリン酸(BCIP)、5-ブロモ-6-クロロ−インドリルリン酸２ナトリウム、p-ニトロフェニルリン酸などの発色基質が挙げられる。また、酵素としてペルオキシダーゼを用いる場合、基質としては、ルミノール及びその誘導体などの化学発光基質、2, 2'-アジノビス(3-エチルベンゾチアゾリン-6-スルホン酸アンモニウム)(ABTS)、1, 2-フェニレンジアミン(OPD)、3, 3',5, 5'-テトラメチルベンジジン(TMB)などの発色基質が挙げられる。
【００４０】
標識物質が放射性同位体である場合は、シグナルとしての放射線を、シンチレーションカウンターなどの公知の装置を用いて測定できる。また、標識物質が蛍光物質である場合は、シグナルとしての蛍光を、蛍光マイクロプレートリーダーなどの公知の装置を用いて測定できる。なお、励起波長及び蛍光波長は、用いた蛍光物質の種類に応じて適宜決定できる。
【００４１】
シグナルの検出結果は、バイオマーカーの測定結果として用いることができる。例えば、シグナルの強度を定量する場合は、シグナル強度の測定値自体又は該測定値から取得される値を、バイオマーカーの測定結果として用いることができる。シグナル強度の測定値から取得される値としては、例えば、該測定値から陰性対照試料の測定値又はバックグラウンドの値を差し引いた値などが挙げられる。また、シグナル強度の測定値を検量線に当てはめて、バイオマーカーの量又は濃度の値を決定してもよい。陰性対照試料は、適宜選択できるが、例えば、健常人から得た生体試料などが挙げられる。
【００４２】
本実施形態では、磁性粒子に固定された捕捉用抗体と、標識物質で標識された検出用抗体とを用いるサンドイッチELISA法により、生体試料に含まれる遊離タンパク質マーカーを測定することが好ましい。この場合、測定は、HISCLシリーズ(シスメックス株式会社製)などの市販の全自動免疫測定装置を用いて行ってもよい。
【００４３】
本実施形態では、バイオマーカーの測定結果が、間質性肺炎患者の呼吸機能の低下リスクの指標となる。例えば実施例に示されるように、生体試料中のCCL17の濃度が高い患者群は、該濃度が低い患者群に比べて、呼吸機能の低下リスクが高い。また、生体試料中のCXCL9又はCXCL11の濃度が低い患者群は、該濃度が高い患者群に比べて、呼吸機能の低下リスクが高い。よって、本実施形態では、バイオマーカーの測定結果を、間質性肺炎患者の呼吸機能の低下リスクに関する情報として取得できる。例えば、バイオマーカーの測定結果は、CCL17の測定値、CXCL9の測定値に対するCCL17の測定値の比(CCL17/CXCL9)、又はCXCL11の測定値に対するCCL17の測定値の比(CCL17/CXCL11)であってもよい。該測定値又は該比の値が、各値に対応する所定の閾値より高い場合、呼吸機能の低下リスクが高いことが示唆される。CCL17の測定値、CCL17/CXCL9の値又はCCL17/CXCL11の値が、各値に対応する所定の閾値より低い場合、呼吸機能の低下リスクが低いことが示唆される。
【００４４】
また、バイオマーカーの測定結果は、CXCL9の測定値、CXCL11の測定値、CCL17の測定値に対するCXCL9の測定値の比(CXCL9/CCL17)、又はCCL17の測定値に対するCXCL11の測定値の比(CXCL11/CCL17)であってもよい。該測定値又は該比の値が、各値に対応する所定の閾値より低い場合、呼吸機能の低下リスクが高いことが示唆される。CXCL9の測定値、CXCL11の測定値、CXCL9/CCL17の値又はCXCL11/CCL17の値が、各値に対応する所定の閾値より高い場合、呼吸機能の低下リスクが低いことが示唆される。
【００４５】
CXCL10及び／又はCCL22の測定値をさらに取得している場合、バイオマーカーの測定結果は、CXCL10の測定値に対するCCL17の測定値の比(CCL17/CXCL10)、CXCL11の測定値に対するCCL22の測定値の比(CCL22/CXCL11)、又はCXCL9の測定値に対するCCL22の測定値の比(CCL22/CXCL9)の値であってもよい。該比の値が、各値に対応する所定の閾値より高い場合、呼吸機能の低下リスクが高いことが示唆される。該比の値が、各値に対応する所定の閾値より低い場合、呼吸機能の低下リスクが低いことが示唆される。
【００４６】
また、バイオマーカーの測定結果は、CCL17の測定値に対するCXCL10の測定値の比(CXCL10/CCL17)、CCL22の測定値に対するCXCL11の測定値の比(CXCL11/CCL22)、又はCCL22の測定値に対するCXCL9の測定値の比(CXCL9/CCL22)の値であってもよい。該比の値が、各値に対応する所定の閾値より低い場合、呼吸機能の低下リスクが高いことが示唆される。該比の値が、各値に対応する所定の閾値より高い場合、呼吸機能の低下リスクが低いことが示唆される。
【００４７】
本実施形態において、呼吸機能の低下リスクは、生体試料の取得から所定の期間の経過後における、呼吸機能を示す検査数値が低下するリスクであってもよい。例えば、呼吸機能の低下リスクは、生体試料の取得時から例えば６か月後の肺活量が低下するリスクであってもよい。肺活量が低下するリスクは、生体試料の取得時から例えば６か月後の肺活量が、生体試料の取得時の肺活量から例えば５％以上低下するリスクであってもよい。
【００４８】
バイオマーカーの測定結果は、呼吸機能の低下リスクを判定するために用いられ得る。医師等の医療従事者は、当該測定結果を用いて呼吸機能の低下リスクを判定してもよいし、当該測定結果と他の情報を組み合わせて呼吸機能の低下リスクを判定してもよい。ここで、「他の情報」とは、肺活量、肺拡散能、Ｘ線画像又はCT画像の所見、その他の医学的所見を含む。
【００４９】
[２．呼吸機能の低下リスクの判定方法]
本実施形態では、上記の方法で得られたバイオマーカーの測定結果を、間質性肺炎患者の呼吸機能の低下リスクの判定に利用できる。本実施形態の間質性肺炎患者の呼吸機能の低下リスクを判定する方法(以下、「判定方法」ともいう)では、まず、間質性肺炎患者の生体試料中の少なくとも１つのバイオマーカーを測定する。この測定の詳細は、本実施形態の呼吸機能の低下リスクに関する情報を取得するための方法について述べたことと同じである。
【００５０】
本実施形態の判定方法では、バイオマーカーの測定結果に基づいて、間質性肺炎患者の呼吸機能の低下リスクを判定する。呼吸機能の低下リスクの詳細は、本実施形態の呼吸機能の低下リスクに関する情報を取得するための方法について述べたことと同じである。好ましい実施形態では、１つのバイオマーカーの測定値、又は２つのバイオマーカーの測定値の比の値と、各値に対応する所定の閾値との比較結果に基づいて、患者の呼吸機能の低下リスクを判定する。
【００５１】
例えば、バイオマーカーの測定結果が、CCL17の測定値、CXCL9の測定値に対するCCL17の測定値の比(CCL17/CXCL9)、CXCL11の測定値に対するCCL17の測定値の比(CCL17/CXCL11)、CXCL11の測定値に対するCCL22の測定値の比(CCL22/CXCL11)、又はCXCL9の測定値に対するCCL22の測定値の比(CCL22/CXCL9)であるとき、CCL17の測定値、CCL17/CXCL9の値、CCL17/CXCL11の値、CCL22/CXCL11の値又はCCL22/CXCL9の値が、各値に対応する所定の閾値より高い場合、呼吸機能の低下リスクが高いと判定する。また、CCL17の測定値、CCL17/CXCL9の値、CCL17/CXCL11の値、CCL22/CXCL11の値又はCCL22/CXCL9の値が、各値に対応する所定の閾値より低い場合、呼吸機能の低下リスクが低いと判定する。本実施形態では、上記の測定値又は比の値が、各値に対応する所定の閾値と同じ場合、呼吸機能の低下リスクが低いと判定してもよいし、呼吸機能の低下リスクが高いと判定してもよい。すなわち、CCL17の測定値、CCL17/CXCL9の値、CCL17/CXCL11の値、CCL22/CXCL11の値又はCCL22/CXCL9の値が、各値に対応する所定の閾値以上の場合、呼吸機能の低下リスクが高いと判定してもよい。あるいは、CCL17の測定値、CCL17/CXCL9の値、CCL17/CXCL11の値、CCL22/CXCL11の値又はCCL22/CXCL9の値が、各値に対応する所定の閾値以下の場合、呼吸機能の低下リスクが低いと判定してもよい。
【００５２】
例えば、バイオマーカーの測定結果が、CXCL9の測定値、CXCL11の測定値、CCL17の測定値に対するCXCL9の測定値の比(CXCL9/CCL17)、CCL17の測定値に対するCXCL11の測定値の比(CXCL11/CCL17)、CCL22の測定値に対するCXCL11の測定値の比(CXCL11/CCL22)、又はCCL22の測定値に対するCXCL9の測定値の比(CXCL9/CCL22)であるとき、CXCL9の測定値、CXCL11の測定値、CXCL9/CCL17の値、CXCL11/CCL17の値、CXCL11/CCL22の値又はCXCL9/CCL22の値が、各値に対応する所定の閾値より低い場合、呼吸機能の低下リスクが高いと判定する。また、CXCL9の測定値、CXCL11の測定値、CXCL9/CCL17の値、CXCL11/CCL17の値、CXCL11/CCL22の値又はCXCL9/CCL22の値が、各値に対応する所定の閾値より高い場合、呼吸機能の低下リスクが低いと判定する。本実施形態では、上記の測定値又は比の値が、各値に対応する所定の閾値と同じ場合、呼吸機能の低下リスクが低いと判定してもよいし、呼吸機能の低下リスクが高いと判定してもよい。すなわち、CXCL9の測定値、CXCL11の測定値、CXCL9/CCL17の値、CXCL11/CCL17の値、CXCL11/CCL22の値又はCXCL9/CCL22の値が、各値に対応する所定の閾値以下の場合、呼吸機能の低下リスクが高いと判定してもよい。あるいは、CXCL9の測定値、CXCL11の測定値、CXCL9/CCL17の値、CXCL11/CCL17の値、CXCL11/CCL22の値又はCXCL9/CCL22の値が、各値に対応する所定の閾値以上の場合、呼吸機能の低下リスクが低いと判定してもよい。
【００５３】
呼吸機能の低下リスクが高いと判定された患者は、例えば、生体試料の取得時から６か月後の呼吸機能(例えば肺活量)が５％以上低下する可能性が高いと判定してもよい。一方、呼吸機能の低下リスクが低いと判定された患者は、例えば、生体試料の取得時から６か月後の呼吸機能(例えば肺活量)が５％以上低下する可能性が低いと判定してもよい。
【００５４】
このように、本実施形態の判定方法は、医師等の医療従事者に対して、呼吸機能の低下リスクの判定を補助する情報の提供を可能にする。本実施形態の判定方法によって呼吸機能の低下リスクが高いと判定された間質性肺炎患者に対して適切な治療を行うことで、疾患の進行を未然に防ぎ、呼吸機能の低下を予防することが可能となる。例えば、過敏性肺炎の治療では、主に抗原回避と抗炎症療法が行われるが、本実施形態の判定方法により呼吸機能の低下リスクが高いと判定された場合は、さらに抗線維化薬を投与することを検討してもよい。
【００５５】
所定の閾値は特に限定されず、適宜設定できる。例えば、間質性肺炎患者のバイオマーカーの測定値のデータを蓄積することにより、所定の閾値を経験的に設定してもよい。あるいは、次のようにして所定の閾値を設定してもよい。まず、複数の間質性肺炎患者から生体試料を採取し、バイオマーカーを測定して、バイオマーカーの測定値を得る。生体試料の採取から所定の期間(例えば６か月)の経過後、これらの患者の呼吸機能が低下したか否かを確認する。上記のデータを、呼吸機能が低下した患者群のデータと、呼吸機能が低下しなかった患者群のデータとに分類する。そして、呼吸機能が低下した患者群と、呼吸機能が低下しなかった患者群とを最も精度よく区別可能な値を求め、その値を所定の閾値として設定する。閾値の設定においては、感度、特異度、陽性的中率、陰性的中率などを考慮することが好ましい。
【００５６】
[３．試薬キット]
本発明の範囲には、本実施形態の方法及び判定方法に用いられる試薬キットも含まれる。すなわち、CCL17と特異的に結合可能な物質を含む試薬、及び／又はCXCL9と特異的に結合可能な物質を含む試薬、及び／又はCXCL11と特異的に結合可能な物質を含む試薬を含む試薬キット(以下、「試薬キット」ともいう)が提供される。CCL17、CXCL9及びCXCL11のそれぞれと特異的に結合可能な物質の詳細は、本実施形態の方法で用いるバイオマーカーと特異的に結合可能な物質について述べたことと同じである。
【００５７】
本実施形態では、各試薬を収容した容器を箱に梱包して、ユーザに提供してもよい。箱には、添付文書を同梱していてもよい。添付文書には、試薬キットの構成、使用方法、当該試薬キットにより得られた測定結果と呼吸機能の低下リスクとの関係等について記載されていてもよい。そのような試薬キットの例を図に示す。図１Ａを参照して、１１は、試薬キットを示し、１２は、CCL17と特異的に結合可能な物質を含む試薬を収容した第１容器を示し、１３は、CXCL9と特異的に結合可能な物質を含む試薬を収容した第２容器を示し、１４は、CXCL11と特異的に結合可能な物質を含む試薬を収容した第３容器を示し、１５は、梱包箱を示し、１６は、添付文書を示す。
【００５８】
本実施形態の試薬キットは、バイオマーカーと特異的に結合可能な物質を固定化するための固相をさらに含んでもよい。図１Ｂを参照して、２１は、試薬キットを示し、２２は、CCL17と特異的に結合可能な物質を含む試薬を収容した第１容器を示し、２３は、CXCL9と特異的に結合可能な物質を含む試薬を収容した第２容器を示し、２４は、CXCL11と特異的に結合可能な物質を含む試薬を収容した第３容器を示し、２５は、梱包箱を示し、２６は、添付文書を示し、２７は、固相を示す。図中、固相は、96ウェルマイクロプレートとして表されるが、本発明はこの例に限定されない。
【００５９】
本実施形態の試薬キットは、CCL22と特異的に結合可能な物質を含む試薬、及びCXCL10と特異的に結合可能な物質を含む試薬から選択される少なくとも１つの試薬をさらに含んでもよい。
【００６０】
本実施形態では、CCL17と特異的に結合可能な物質を含む試薬は、CCL17に対する捕捉用抗体を含む試薬及びCCL17に対する検出用抗体を含む試薬の組み合わせであることが好ましい。また、CXCL9と特異的に結合可能な物質を含む試薬は、CXCL9に対する捕捉用抗体を含む試薬及びCXCL9に対する検出用抗体を含む試薬の組み合わせであることが好ましい。さらに、CXCL11と特異的に結合可能な物質を含む試薬は、CXCL11に対する捕捉用抗体を含む試薬及びCXCL11に対する検出用抗体を含む試薬の組み合わせであることが好ましい。検出用抗体は、標識物質で標識されてもよい。標識物質が酵素である場合、試薬キットは、該酵素の基質を含んでもよい。捕捉用抗体、検出用抗体、標識物質及び基質の詳細は、上記の本実施形態の方法において述べたことと同じである。捕捉用抗体、検出用抗体、標識物質及び基質の形態は特に限定されず、固体(例えば粉末、結晶、凍結乾燥品など)であってもよいし、液体(例えば溶液、懸濁液、乳濁液など)であってもよい。
【００６１】
本実施形態では、試薬キットは、各バイオマーカーのキャリブレータを含んでもよい。キャリブレータの一例としては、CCL17定量用キャリブレータ、CXCL9定量用キャリブレータ及びCXCL11定量用キャリブレータが挙げられる。CCL17定量用キャリブレータは、例えば、CCL17を含まない緩衝液(ネガティブコントロール)と、CCL17を既知濃度で含む緩衝液とを備えていてもよい。CXCL9定量用キャリブレータは、例えば、CXCL9を含まない緩衝液(ネガティブコントロール)と、CXCL9を既知濃度で含む緩衝液とを備えていてもよい。CXCL11定量用キャリブレータは、例えば、CXCL11を含まない緩衝液(ネガティブコントロール)と、CXCL11を既知濃度で含む緩衝液とを備えていてもよい。別のキャリブレータの例は、CCL17、CXCL9及びCXCL11のいずれも含まない緩衝液(ネガティブコントロール)と、CCL17を既知濃度で含む緩衝液と、CXCL9を既知濃度で含む緩衝液と、CXCL11を既知濃度で含む緩衝液とを備える。別のキャリブレータの例は、CCL17、CXCL9及びCXCL11のいずれも含まない緩衝液(ネガティブコントロール)と、CCL17、CXCL9及びCXCL11をそれぞれ既知濃度で含む緩衝液とを備える。
【００６２】
［４．装置及びコンピュータプログラム］
本発明の範囲には、本実施形態の呼吸機能の低下リスクの判定方法を実施するための装置及びコンピュータプログラムも含まれる。本実施形態の呼吸機能の低下リスクの判定装置の一例を、図面を参照して説明する。しかし、本実施形態は、この例に示される形態のみに限定されない。図２に示された判定装置１０は、測定装置２０と、該測定装置２０と接続されたコンピュータシステム３０とを含む。
【００６３】
測定装置の種類は特に限定されず、バイオマーカーの測定方法に応じて適宜選択できる。図２に示す例では、測定装置２０は、捕捉用抗体を固定した磁性粒子及び酵素標識された検出用抗体を用いるサンドイッチELISA法により生じる化学発光シグナルを検出可能な市販の自動免疫測定装置である。しかし、本発明はこの例に限定されない。バイオマーカーをELISA法により測定する場合、測定装置は、用いた標識物質に基づくシグナルの検出が可能であれば、特に限定されない。
【００６４】
捕捉用抗体を固定した磁性粒子を含む試薬、酵素標識された検出用抗体を含む試薬及び被検者から採取した生体試料を測定装置２０にセットすると、該測定装置２０は、各試薬を用いて抗原抗体反応を実行し、バイオマーカーと特異的に結合した酵素標識抗体に基づく光学的情報として化学発光シグナルを取得し、得られた光学的情報をコンピュータシステム３０に送信する。
【００６５】
コンピュータシステム３０は、コンピュータ本体３００と、入力部３０１と、表示部３０２とを含む。表示部３０２は、検体情報、判定結果などを表示する。コンピュータシステム３０は、測定装置２０から光学的情報を受信する。そして、コンピュータシステム３０のプロセッサは、光学的情報に基づいて、ハードディスク３１３にインストールされた、呼吸機能の低下リスクの判定のためのコンピュータプログラムを実行する。なお、コンピュータシステム３０は、図２に示されるように、測定装置２０とは別個の機器であってもよいし、測定装置２０を内包する機器であってもよい。後者の場合、コンピュータシステム３０は、それ自体で判定装置１０となってもよい。市販の自動免疫測定装置に、呼吸機能の低下リスクの判定のためのコンピュータプログラムを搭載してもよい。
【００６６】
図３を参照して、コンピュータ本体３００は、ＣＰＵ(Central Processing Unit)３１０と、ＲＯＭ(Read Only Memory)３１１と、ＲＡＭ(Random Access Memory)３１２と、ハードディスク３１３と、入出力インターフェイス３１４と、読取装置３１５と、通信インターフェイス３１６と、画像出力インターフェイス３１７とを備えている。ＣＰＵ３１０、ＲＯＭ３１１、ＲＡＭ３１２、ハードディスク３１３、入出力インターフェイス３１４、読取装置３１５、通信インターフェイス３１６及び画像出力インターフェイス３１７は、バス３１８によってデータ通信可能に接続されている。また、測定装置２０は、通信インターフェイス３１６により、コンピュータシステム３０と通信可能に接続されている。
【００６７】
ＣＰＵ３１０は、ＲＯＭ３１１又はハードディスク３１３に記憶されているプログラム及びＲＡＭ３１２にロードされたプログラムを実行することが可能である。ＣＰＵ３１０は、測定装置２０から取得した光学的情報に基づいて、バイオマーカーの測定値を取得する。２つ以上のバイオマーカーを測定した場合、ＣＰＵ３１０は、２つ以上のバイオマーカーの測定値を用いて算出される値を取得してもよい。これらの値の詳細は、本実施形態の方法について述べたことと同じである。ＣＰＵ３１０は、取得した値と、ＲＯＭ３１１又はハードディスク３１３に記憶されている所定の閾値とに基づいて、呼吸機能の低下リスクを判定する。ＣＰＵ３１０は、判定結果を出力して表示部３０２に表示させる。
【００６８】
ＲＯＭ３１１は、マスクＲＯＭ、ＰＲＯＭ、ＥＰＲＯＭ、ＥＥＰＲＯＭなどによって構成されている。ＲＯＭ３１１には、ＣＰＵ３１０によって実行されるコンピュータプログラム及び該コンピュータプログラムの実行に用いるデータが記録されている。
【００６９】
ＲＡＭ３１２は、ＳＲＡＭ、ＤＲＡＭなどによって構成されている。ＲＡＭ３１２は、ＲＯＭ３１１及びハードディスク３１３に記録されているプログラムの読み出しに用いられる。ＲＡＭ３１２はまた、これらのプログラムを実行するときに、ＣＰＵ３１０の作業領域として利用される。
【００７０】
ハードディスク３１３は、ＣＰＵ３１０に実行させるためのオペレーティングシステム、アプリケーションプログラム(呼吸機能の低下リスクの判定用プログラム)などのコンピュータプログラム及び該コンピュータプログラムの実行に用いるデータがインストールされている。
【００７１】
読取装置３１５は、フレキシブルディスクドライブ、ＣＤ−ＲＯＭドライブ、ＤＶＤ−ＲＯＭドライブなどによって構成されている。読取装置３１５は、可搬型記録媒体４０に記録されたプログラム又はデータを読み取ることができる。
【００７２】
入出力インターフェイス３１４は、例えば、ＵＳＢ、ＩＥＥＥ１３９４、ＲＳ−２３２Ｃなどのシリアルインターフェイスと、ＳＣＳＩ、ＩＤＥ、ＩＥＥＥ１２８４などのパラレルインターフェイスと、Ｄ／Ａ変換器、Ａ／Ｄ変換器などからなるアナログインターフェイスとから構成されている。入出力インターフェイス３１４には、キーボード、マウスなどの入力部３０１が接続されている。操作者は、該入力部３０１により、コンピュータ本体３００に各種の指令を入力することが可能である。
【００７３】
通信インターフェイス３１６は、例えば、Ethernet(登録商標)インターフェイスなどである。コンピュータ本体３００は、通信インターフェイス３１６により、プリンタなどへの印刷データの送信も可能である。
【００７４】
画像出力インターフェイス３１７は、ＬＣＤ、ＣＲＴなどで構成される表示部３０２に接続されている。これにより、表示部３０２は、ＣＰＵ３１０から与えられた画像データに応じた映像信号を出力できる。表示部３０２は、入力された映像信号にしたがって画像(画面)を表示する。
【００７５】
図４Ａを参照して、判定装置１０により実行される、呼吸機能の低下リスクの判定の処理手順を説明する。具体的には、サンドイッチELISA法により生じた化学発光シグナルの強度からCCL17の測定値を取得し、取得した測定値とこれに対応する所定の閾値を用いて判定を行なう場合を例として説明する。しかし、本実施形態は、この例のみに限定されない。
【００７６】
ステップＳ１０１において、ＣＰＵ３１０は、測定装置２０から光学的情報(化学発光シグナル)を取得してハードディスク３１３に記憶する。ステップＳ１０２において、ＣＰＵ３１０は、取得した光学的情報からCCL17の測定値を取得し、ハードディスク３１３に記憶する。ステップＳ１０３において、ＣＰＵ３１０は、取得した測定値と、ハードディスク３１３に記憶された所定の閾値とを比較する。測定値が所定の閾値より高いとき、処理は、ステップＳ１０４に進行し、患者の呼吸機能の低下リスクが高いことを示す判定結果をハードディスク３１３に記憶する。測定値が所定の閾値以下であるとき、処理は、ステップＳ１０５に進行し、患者の呼吸機能の低下リスクが低いことを示す判定結果をハードディスク３１３に記憶する。ステップＳ１０６において、ＣＰＵ３１０は、判定結果を出力し、表示部３０２に表示したり、プリンタで印刷したりする。これにより、呼吸機能の低下リスクの判定を補助する情報を医師などに提供することができる。
【００７７】
図４Ｂを参照して、CXCL9の測定値に基づいて判定を行う場合について説明する。ステップＳ２０１及びＳ２０６は、それぞれ上記のステップＳ１０１及びＳ１０６について述べたことと同様である。ステップＳ２０２において、ＣＰＵ３１０は、取得した光学的情報からCXCL9の測定値を取得し、ハードディスク３１３に記憶する。ステップＳ２０３において、ＣＰＵ３１０は、取得した測定値と、ハードディスク３１３に記憶された所定の閾値とを比較する。測定値が所定の閾値より低いとき、処理は、ステップＳ２０４に進行し、患者の呼吸機能の低下リスクが高いことを示す判定結果をハードディスク３１３に記憶する。測定値が所定の閾値以上であるとき、処理は、ステップＳ２０５に進行し、患者の呼吸機能の低下リスクが低いことを示す判定結果をハードディスク３１３に記憶する。
【００７８】
図４Ｃを参照して、CCL17及びCXCL9を測定し、これらのバイオマーカーの測定値を用いて算出される値に基づいて判定を行う場合について説明する。ステップＳ３０１及びＳ３０７は、それぞれ上記のステップＳ１０１及びＳ１０６について述べたことと同様である。ステップＳ３０２において、ＣＰＵ３１０は、取得した光学的情報からCCL17の測定値及びCXCL9の測定値を取得し、ハードディスク３１３に記憶する。ステップＳ３０３において、ＣＰＵ３１０は、CCL17の測定値をCXCL9の測定値で割ることにより、CCL17/CXCL9の値を取得する。ステップＳ３０４において、ＣＰＵ３１０は、取得したCCL17/CXCL9の値と、ハードディスク３１３に記憶された所定の閾値とを比較する。CCL17/CXCL9の値が所定の閾値より高いとき、処理は、ステップＳ３０５に進行し、患者の呼吸機能の低下リスクが高いことを示す判定結果をハードディスク３１３に記憶する。CCL17/CXCL9の値が所定の閾値以下であるとき、処理は、ステップＳ３０６に進行し、患者の呼吸機能の低下リスクが低いことを示す判定結果をハードディスク３１３に記憶する。
【００７９】
ステップＳ３０３において、CCL17/CXCL9の値を取得することに替えて、CXCL9の測定値をCCL17の測定値で割ることにより、CXCL9/CCL17の値を取得してもよい。この場合、ＣＰＵ３１０は、算出したCXCL9/CCL17の値と、ハードディスク３１３に記憶された所定の閾値とを比較する。CXCL9/CCL17の値が所定の閾値より低いとき、ＣＰＵ３１０は、患者の呼吸機能の低下リスクが高いことを示す判定結果をハードディスク３１３に記憶する。CCL17/CXCL9の値が所定の閾値以上であるとき、ＣＰＵ３１０は、患者の呼吸機能の低下リスクが低いことを示す判定結果をハードディスク３１３に記憶する。
【００８０】
図４Ｄを参照して、CXCL11の測定値に基づいて判定を行う場合について説明する。ステップＳ４０１及びＳ４０６は、それぞれ上記のステップＳ１０１及びＳ１０６について述べたことと同様である。ステップＳ４０２において、ＣＰＵ３１０は、取得した光学的情報からCXCL11の測定値を取得し、ハードディスク３１３に記憶する。ステップＳ４０３において、ＣＰＵ３１０は、取得した測定値と、ハードディスク３１３に記憶された所定の閾値とを比較する。測定値が所定の閾値より低いとき、処理は、ステップＳ４０４に進行し、患者の呼吸機能の低下リスクが高いことを示す判定結果をハードディスク３１３に記憶する。測定値が所定の閾値以上であるとき、処理は、ステップＳ４０５に進行し、患者の呼吸機能の低下リスクが低いことを示す判定結果をハードディスク３１３に記憶する。
【００８１】
図４Ｅを参照して、CCL17及びCXCL11を測定し、これらのバイオマーカーの測定値を用いて算出される値に基づいて判定を行う場合について説明する。ステップＳ５０１及びＳ５０７は、それぞれ上記のステップＳ１０１及びＳ１０６について述べたことと同様である。ステップＳ５０２において、ＣＰＵ３１０は、取得した光学的情報からCCL17の測定値及びCXCL11の測定値を取得し、ハードディスク３１３に記憶する。ステップＳ５０３において、ＣＰＵ３１０は、CCL17の測定値をCXCL11の測定値で割ることにより、CCL17/CXCL11の値を取得する。ステップＳ５０４において、ＣＰＵ３１０は、取得したCCL17/CXCL11の値と、ハードディスク３１３に記憶された所定の閾値とを比較する。CCL17/CXCL11の値が所定の閾値より高いとき、処理は、ステップＳ５０５に進行し、患者の呼吸機能の低下リスクが高いことを示す判定結果をハードディスク３１３に記憶する。CCL17/CXCL11の値が所定の閾値以下であるとき、処理は、ステップＳ５０６に進行し、患者の呼吸機能の低下リスクが低いことを示す判定結果をハードディスク３１３に記憶する。
【００８２】
図４Ｆを参照して、CCL22及びCXCL11を測定し、これらのバイオマーカーの測定値を用いて算出される値に基づいて判定を行う場合について説明する。ステップＳ６０１及びＳ６０７は、それぞれ上記のステップＳ１０１及びＳ１０６について述べたことと同様である。ステップＳ６０２において、ＣＰＵ３１０は、取得した光学的情報からCCL22の測定値及びCXCL11の測定値を取得し、ハードディスク３１３に記憶する。ステップＳ６０３において、ＣＰＵ３１０は、CCL22の測定値をCXCL11の測定値で割ることにより、CCL22/CXCL11の値を取得する。ステップＳ６０４において、ＣＰＵ３１０は、取得したCCL22/CXCL11の値と、ハードディスク３１３に記憶された所定の閾値とを比較する。CCL22/CXCL11の値が所定の閾値より高いとき、処理は、ステップＳ６０５に進行し、患者の呼吸機能の低下リスクが高いことを示す判定結果をハードディスク３１３に記憶する。CCL22/CXCL11の値が所定の閾値以下であるとき、処理は、ステップＳ６０６に進行し、患者の呼吸機能の低下リスクが低いことを示す判定結果をハードディスク３１３に記憶する。
【００８３】
図４Ｇを参照して、CCL22及びCXCL9を測定し、これらのバイオマーカーの測定値を用いて算出される値に基づいて判定を行う場合について説明する。ステップＳ７０１及びＳ７０７は、それぞれ上記のステップＳ１０１及びＳ１０６について述べたことと同様である。ステップＳ７０２において、ＣＰＵ３１０は、取得した光学的情報からCCL22の測定値及びCXCL9の測定値を取得し、ハードディスク３１３に記憶する。ステップＳ７０３において、ＣＰＵ３１０は、CCL22の測定値をCXCL9の測定値で割ることにより、CCL22/CXCL9の値を取得する。ステップＳ７０４において、ＣＰＵ３１０は、取得したCCL22/CXCL9の値と、ハードディスク３１３に記憶された所定の閾値とを比較する。CCL22/CXCL9の値が所定の閾値より高いとき、処理は、ステップＳ７０５に進行し、患者の呼吸機能の低下リスクが高いことを示す判定結果をハードディスク３１３に記憶する。CCL22/CXCL9の値が所定の閾値以下であるとき、処理は、ステップＳ７０６に進行し、患者の呼吸機能の低下リスクが低いことを示す判定結果をハードディスク３１３に記憶する。
【００８４】
以下に、本発明を実施例により詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。以下、「HISCL」はシスメックス株式会社の登録商標である。
【実施例】
【００８５】
実施例１
(１) 生体試料
未治療の間質性肺炎患者61名の血清を生体試料として用いた。61名の患者のうち48名について、血清の取得時から６か月後に呼吸機能(肺活量)を確認する試験を行った。肺活量の低下が５％以上であった患者を「低下群」に分類し、肺活量の低下が５％未満であった患者を「安定群」に分類した。各群の患者情報を表１に示す。表中、パックイヤーとは、喫煙量の指標であり、１日に喫煙するタバコの箱数に喫煙年数を掛けて算出される。表中、各群の年齢及びパックイヤーは、中央値、第一及び第三四分位数で示した。CCL17及びCXCL9の測定には、表１に示す患者から得た生体試料を用いた。CCL22、CXCL10及びCXCL11の測定には、表１に示す患者に含まれる表２に示す患者から得た生体試料を用いた。【００８６】
【表１】
2020090683.tif 000002
【００８７】
【表２】
2020090683.tif 000003
【００８８】
(２) バイオマーカーの測定
(2.1) CCL17の測定
各患者の血清中のCCL17濃度を、HISCL TARC試薬(塩野義製薬株式会社)を用いて全自動免疫測定装置HISCL-5000(シスメックス株式会社)により測定した。HISCL TARC試薬には、ビオチン標識マウス抗ヒトTARCモノクローナル抗体を含むR1試薬、表面にストレプトアビジンが固定された磁性粒子(以下、「STA結合磁性粒子」ともいう)を含むR2試薬、アルカリホスファターゼ(ALP)標識マウス抗ヒトTARCモノクローナル抗体を含むR3試薬、測定用緩衝液であるHISCL R4試薬、及びALPの化学発光基質であるCDP-Star(登録商標)(アプライドバイオシステムズ社)を含むHISCL R5試薬、HISCL洗浄液、及びTARCキャリブレータが含まれていた。【００８９】
HISCL-5000による測定手順は、次のとおりであった。血清(20μL)とR1試薬(50μL)とを混合した後、R2試薬(30μL)を添加した。得られた混合液中の磁性粒子を集磁して上清を除き、HISCL洗浄液(300μL)を加えて磁性粒子を洗浄した。上清を除き、磁性粒子にR3試薬(100μL)を添加して混合した。得られた混合液中の磁性粒子を集磁して上清を除き、HISCL洗浄液(300μL)を加えて磁性粒子を洗浄した。上清を除き、磁性粒子にR4試薬(50μL)及びR5試薬(100μL)を添加して、化学発光強度を測定した。得られた化学発光強度を検量線に当てはめて、CCL17の濃度を決定した。【００９０】
(2.2) CXCL9の測定
各患者の血清中のCXCL9濃度を、下記のR1〜R5試薬を用いてHISCL-5000 (シスメックス株式会社)により測定した。CXCL9の測定手順は、CCL17の測定と同様であった。各試薬は、以下のようにして調製した。【００９１】
・R1試薬
抗MIGモノクローナル抗体(RANDOX社)を慣用の手法によりペプシン又はIdeSプロテアーゼで消化して、Fabフラグメントを得た。Fabフラグメントを慣用の手法によりビオチンで標識して、１％ウシ血清アルブミン(BSA)及び0.5％カゼイン含有バッファーに溶解して、R1試薬を得た。【００９２】
・R2試薬
STA結合磁性粒子(平均粒子径２μm。磁性粒子１gあたりのストレプトアビジンの量は2.9〜3.5 mg)を、10 mM HEPES緩衝液(pH 7.5)で３回洗浄した。洗浄後のSTA結合磁性粒子を、ストレプトアビジン濃度が18〜22μg/ml(STA結合磁性粒子の濃度が0.48〜0.52 mg/ml)となるように10 mM HEPES(pH 7.5)に添加して、R2試薬を得た。【００９３】
・R3試薬
抗MIGモノクローナル抗体(RANDOX社)を慣用の手法によりペプシン又はIdeSプロテアーゼで消化して、Fabフラグメントを得た。Fabフラグメントを慣用の手法によりALPで標識して、１％BSA及び0.5％カゼイン含有バッファーに溶解して、R3試薬を得た。【００９４】
・R4試薬及びR5試薬
R4試薬として、HISCL R4試薬(シスメックス株式会社)を用いた。R5試薬として、HISCL R5試薬(シスメックス株式会社)を用いた。【００９５】
(2.3) CCL22の測定
各患者の血清中のCCL22濃度をELISA法により測定した。CCL22の測定手順は、次のとおりであった。96ウェルプレートの各ウェルに、２μg/mLの抗CCL22マウスモノクローナル抗体溶液を添加して、該抗体をウェルに感作した。検体希釈液で20倍希釈した血清(100μL)を各ウェルに添加して２時間反応させた。HISCL洗浄液(300μL)で各ウェルを６回洗浄した後、100μLのビオチン化ニワトリ抗ヒトCCL22抗体(0.0125μg/mL、１%BSA、0.5%カゼイン、PBS、pH7.4)を添加して２時間反応させた。HISCL洗浄液(300μL)で各ウェルを６回洗浄した後、100μLのストレプトアビジンALPを添加して20分間反応させた。HISCL洗浄液(300μL)で各ウェルを６回洗浄した後、１:２の割合で混合したR4及びR5試薬を各ウェルに100μLずつ添加して、プレートリーダーで発光シグナルをカウントした。抗CCL22抗体は、R&Dシステムズ社Duoset DY336を用いた。【００９６】
(2.4) CXCL10の測定
各患者の血清中のCXCL10濃度をELISA法により測定した。CXCL10の測定手順は、次のとおりであった。96ウェルプレートの各ウェルに、２μg/mLの抗CXCL10マウスモノクローナル抗体溶液を添加して、該抗体をウェルに感作した。検体希釈液で５倍希釈した血清(50μL)を各ウェルに添加して２時間反応させた。HISCL洗浄液(300μL)で各ウェルを６回洗浄した後、50μLのビオチン化ヤギ抗ヒトCXCL10抗体(0.0125μg/mL、１%BSA、0.5%カゼイン、PBS、pH7.4)を添加して２時間反応させた。HISCL洗浄液(300μL)で各ウェルを６回洗浄した後、50μLのストレプトアビジンALPを添加し20分間反応させた。HISCL洗浄液(300μL)で各ウェルを６回洗浄した後、１:２の割合で混合したR4及びR5試薬を各ウェルに100μLずつ添加して、プレートリーダーで発光シグナルをカウントした。抗CXCL10抗体は、R&Dシステムズ社Duoset DY266を用いた。【００９７】
(2.5) CXCL11の測定
各患者の血清中のCXCL11濃度をELISA法により測定した。CXCL11の測定手順は、次のとおりであった。96ウェルプレートの各ウェルに、１μg/mLの抗CXCL11マウスモノクローナル抗体溶液を添加して、該抗体をウェルに感作した。検体希釈液で５倍希釈した血清(100μL)を各ウェルに添加して２時間反応させた。HISCL洗浄液(300μL)で各ウェルを６回洗浄した後、100μLのビオチン化ヤギ抗ヒトCXCL11抗体(0.6μg/mL、１%BSA、0.5%カゼイン、PBS、pH7.4)を添加して２時間反応させた。HISCL洗浄液(300μL)で各ウェルを６回洗浄した後、100μLのストレプトアビジンALPを添加して20分間反応させた。HISCL洗浄液(300μL)で各ウェルを６回洗浄した後、１:２の割合で混合したR4及びR5試薬を各ウェルに100μLずつ添加して、プレートリーダーで発光シグナルをカウントした。抗CXCL11抗体は、R&Dシステムズ社Duoset DY672を用いた。【００９８】
(３) 測定結果
低下群及び安定群におけるCCL17、CCL22、CXCL9、CXCL10及びCXCL11の濃度を表３に示す。表中、各群のCCL17、CCL22、CXCL9、CXCL10及びCXCL11の濃度は、中央値、第一及び第三四分位数で示した。表３から分かるように、血清中のCCL17濃度は、低下群で有意に高値となった。また、血清中のCXCL11濃度は、安定群で有意に高値となった。一方、血清中のCCL22、CXCL9及びCXCL10の濃度は、安定群でやや高値となったが、低下群と安定群との間に有意差はなかった。【００９９】
【表３】
2020090683.tif 000004
【０１００】
(４) 多重ロジスティック解析による多変量解析
多重ロジスティック解析により、年齢、性別、血清中のCCL17濃度、血清中のCXCL9濃度、浸潤影、及び気管支肺胞洗浄液中のリンパ球比率(BAL lym%)を説明変数として用いて多変量解析を行った。この解析には、SPSS Statistics version 22.0(IBM社)を用いた。結果を表４に示す。表４から分かるように、血清中のCCL17及びCXCL9の各濃度は独立して、呼吸機能の低下と有意に関連することが示された。【０１０１】
【表４】
2020090683.tif 000005
【０１０２】
(５) クラスター解析
61名の患者を、クラスター解析により血清中のCCL17及びCXCL9の濃度に基づいて分類した。クラスター解析は、ユークリッド距離に基づく完全連結法により行った。結果を図５に示す。解析によって、間質性肺炎患者は、表５に示されるようにG1、G2及びG3の３群に層別化されることが明らかになった。G1は、CXCL9濃度にかかわらずCCL17濃度が低い群であり、G2は、CXCL9濃度が低値且つCCL17濃度が高値の群であり、G3は、CXCL9濃度が高値且つCCL17濃度が高値の群であった。【０１０３】
【表５】
2020090683.tif 000006
【０１０４】
各群の呼吸機能の変化について調べた。結果を表６及び図６に示す。表中、VC(Vital capacity)は、肺活量を示し、DLCO(Diffusing capacity of lung for carbon monoxide)は、肺拡散能力を示す。表中、各群の呼吸機能の変化量は、中央値、第一及び第三四分位数で示した。表６に示されるように、G2群では肺活量が５％以上低下していた。また、図６に示されるように、G2群は、G1群及びG3群に比べて肺活量が有意に低下していた。このように、G2群は、呼吸機能の低下が著しく大きいことがわかった。【０１０５】
【表６】
2020090683.tif 000007
【０１０６】
(６) 中央値検定
血清CCL17濃度、血清CXCL9濃度、血清CXCL11濃度、血清CXCL9濃度に対する血清CCL17濃度の比(CCL17/CXCL9)、血清CXCL10濃度に対する血清CCL17濃度の比(CCL17/CXCL10)、血清CXCL11濃度に対する血清CCL17濃度の比(CCL17/CXCL11という)、血清CXCL11濃度に対する血清CCL22濃度の比(CCL22/CXCL11)、及び血清CXCL9濃度に対する血清CCL22濃度の比(CCL22/CXCL9)のそれぞれの中央値で患者を２群(高値群及び低値群)に分けた。各群の６か月後の呼吸機能(肺活量)の低下率(%)を比較した。結果を図７Ａ〜Ｈに示す。これらの図において「High」及び「HIGH」は高値群であり、「Low」及び「LOW」は低値群である。また、これらの図において、6M VC低下率が０%を下回る場合は、６か月後の肺活量が低下したことを示し、6M VC低下率が０%を上回る場合は、６か月後の肺活量が上昇したことを示す。図７Ａ、Ｃ、Ｆ、Ｇ及びＨから分かるように、血清CCL17濃度、CCL17/CXCL9、CCL17/CXCL11、CCL22/CXCL11又はCCL22/CXCL9が高値の群では、低値群に比べて有意に呼吸機能の低下が認められた。図７Ｂ及びＤから分かるように、血清CXCL9濃度又は血清CXCL11濃度が低値の群では、高値群に比べて有意に呼吸機能の低下が認められた。図７Ｅより、CCL17/CXCL10が高値の群では、呼吸機能が低下する傾向が認められたが、高値群と低値群との間に有意差はなかった。【０１０７】
(７) ROC解析
血清CCL17濃度、血清CXCL9濃度、血清CXCL11濃度、CCL17/CXCL9、CCL17/CXCL10、CCL17/CXCL11、CCL22/CXCL9及びCCL22/CXCL11の各値について、ROC解析により、６か月後の呼吸機能(肺活量)の低下が５％以上である患者と、該低下が５％未満である患者とを判別する最適なカットオフ値を求めた。設定したカットオフ値による判別の感度、特異度及び曲線下面積(AUC)を算出した。得られたROC曲線を図８Ａ〜Ｈに示す。血清CCL17濃度、血清CXCL9濃度、血清CXCL11濃度、CCL17/CXCL9、CCL17/CXCL10、CCL17/CXCL11、CCL22/CXCL9及びCCL22/CXCL11のそれぞれのカットオフ値、該カットオフ値を用いた判別の感度、特異度及びAUCを表７に示す。【０１０８】
【表７】
2020090683.tif 000008
【０１０９】
表７より、血清CCL17濃度、血清CXCL9濃度、血清CXCL11濃度、CCL17/CXCL9、CCL17/CXCL10、CCL17/CXCL11、CCL22/CXCL9及びCCL22/CXCL11の各値により、６か月後の呼吸機能(肺活量)の低下が５％以上である患者と、該低下が５％未満である患者との判別ができることがわかった。よって、CCL17、CXCL9及びCXCL11は、呼吸機能の低下リスクの判定を可能にするバイオマーカーであることが示された。また、これらのバイオマーカーにCXCL10及びCCL22を組み合わせることによっても、呼吸機能の低下リスクを判定できることが示された。
【符号の説明】
【０１１０】
１１、２１：  試薬キット
１２、２２：  第１容器
１３，２３：  第２容器
１４、２４：  第３容器
１５、２５：  梱包箱
１６、２６：  添付文書
２７：  固相(96ウェルマイクロプレート)
１０：  判定装置
２０：  測定装置
３０：  コンピュータシステム
【図１Ａ】
2020090683.tif 000009
【図１Ｂ】
2020090683.tif 000010
【図２】
2020090683.tif 000011
【図３】
2020090683.tif 000012
【図４Ａ】
2020090683.tif 000013
【図４Ｂ】
2020090683.tif 000014
【図４Ｃ】
2020090683.tif 000015
【図４Ｄ】
2020090683.tif 000016
【図４Ｅ】
2020090683.tif 000017
【図４Ｆ】
2020090683.tif 000018
【図４Ｇ】
2020090683.tif 000019
【図５】
2020090683.tif 000020
【図６】
2020090683.tif 000021
【図７Ａ】
2020090683.tif 000022
【図７Ｂ】
2020090683.tif 000023
【図７Ｃ】
2020090683.tif 000024
【図７Ｄ】
2020090683.tif 000025
【図７Ｅ】
2020090683.tif 000026
【図７Ｆ】
2020090683.tif 000027
【図７Ｇ】
2020090683.tif 000028
【図７Ｈ】
2020090683.tif 000029
【図８Ａ】
2020090683.tif 000030
【図８Ｂ】
2020090683.tif 000031
【図８Ｃ】
2020090683.tif 000032
【図８Ｄ】
2020090683.tif 000033
【図８Ｅ】
2020090683.tif 000034
【図８Ｆ】
2020090683.tif 000035
【図８Ｇ】
2020090683.tif 000036
【図８Ｈ】
2020090683.tif 000037
【国際調査報告】
2020090683.tif 000038
2020090683.tif 000039
2020090683.tif 000040
2020090683.tif 000041
2020090683.tif 000042
2020090683.tif 000043