(57)【要約】  ペリオスチンの発現量増加またはスプライシングバリアントの変化を伴う疾患の治療用医薬組成物であって、ペリオスチン遺伝子の転写段階において、エクソン17をスキップさせる核酸および／またはエクソン21をスキップさせる核酸を有効成分として含有することを特徴とする医薬組成物を提供する。本発明の医薬組成物により、ペリオスチンの機能を完全に阻害することなく、ペリオスチンの発現量増加またはスプライシングバリアントの変化を伴う疾患を治療することができる。
2019146621.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ペリオスチンの発現量増加またはスプライシングバリアントの変化を伴う疾患の治療用医薬組成物であって、ペリオスチン遺伝子の転写段階において、エクソン17をスキップさせる核酸および／またはエクソン21をスキップさせる核酸を有効成分として含有することを特徴とする医薬組成物。
【請求項２】
前記核酸がアンチセンス核酸である請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項３】
エクソン17をスキップさせるアンチセンス核酸が、配列番号１で示される塩基配列の24143番目〜24323番目の範囲を標的配列とし14〜50塩基からなる1種または2種以上の核酸であることを特徴とする請求項２に記載の医薬組成物。
【請求項４】
エクソン17をスキップさせるアンチセンス核酸が、配列番号１で示される塩基配列の24191番目〜24193番目、24215番目〜24220番目、24247番目〜24254番目、24249番目〜24258番目、24252番目〜24255番目および24273番目〜24275番目の少なくとも１つの範囲を標的配列とする請求項３に記載の医薬組成物。
【請求項５】
エクソン21をスキップさせるアンチセンス核酸が、配列番号１で示される塩基配列の29412番目〜29595番目の範囲を標的配列とし14〜50塩基からなる1種または2種以上の核酸であることを特徴とする請求項２に記載の医薬組成物。
【請求項６】
エクソン21をスキップさせるアンチセンス核酸が、配列番号１で示される塩基配列の29460番目〜29462番目、29468番目〜29474番目、29472番目〜29479番目、29509番目〜29515番目、29525番目〜29531番目、29530番目〜29536番目、29531番目〜29538番目、29534番目〜29539番目、29534番目〜29541番目、29536番目〜29542番目および29545番目〜29547番目の少なくとも１つの範囲を標的配列とする請求項５に記載の医薬組成物。
【請求項７】
エクソン17をスキップさせるアンチセンス核酸および／またはエクソン21をスキップさせるアンチセンス核酸を発現するアデノ随伴ウイルスベクターを含有する請求項２〜６のいずれかに記載の医薬組成物。
【請求項８】
ペリオスチンの発現量増加またはスプライシングバリアントの変化を伴う疾患が、ペリオスチン遺伝子のエクソン17および／またはエクソン21を含むスプライシングバリアントの増加を伴う疾患である請求項１〜７のいずれかに記載の医薬組成物。
【請求項９】
ペリオスチンの発現量増加またはスプライシングバリアントの変化を伴う疾患が、心不全、腎不全、乳がん、胆管細胞がん、膵がん、悪性黒色腫、神経膠芽腫、気管支喘息、糖尿病性網膜症、変形性膝関節症、アトピー性皮膚炎、特発性間質性肺炎、加齢黄斑変性からなる群から選択される少なくとも一種である請求項８に記載の医薬組成物。
【請求項１０】
心不全の治療、腎不全の治療、糖尿病性網膜症の治療、乳がんの転移抑制または悪性黒色腫の転移抑制に用いられる請求項８に記載の医薬組成物。
【請求項１１】
ペリオスチンの発現量増加またはスプライシングバリアントの変化を伴う疾患の治療薬と組み合わせて使用される請求項１〜１０のいずれかに記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ペリオスチンの発現量増加またはスプライシングバリアントの変化を伴う疾患の治療用医薬組成物に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
ペリオスチンは分子量約9万の細胞外マトリックスタンパク質であり、当初マウス骨芽細胞株に発現する、骨や歯の形成に関与するタンパク質として同定された。ペリオスチンの構造は、図1に示されるように、中央に4つのFAS1ドメインがあり、N末端側には分泌シグナル配列とそれに続くシステインに富んだEMIドメインがある。C末端領域（エクソン15〜23）には主に4つのスプライシングバリアントが存在する（図1参照）。【０００３】
ペリオスチンは各種細胞外マトリックスと架橋し、線維化細胞巣を形成すること（非特許文献1）が知られている。また、ペリオスチンはインテグリンと結合し、細胞と器質間の相互作用を仲介するマトリセルラータンパク質である（非特許文献2）。さらに、ペリオスチンは各種疾患においてその発現量が増加していることや、スプライシングバリアントが変化していることが報告されている。具体的には、心不全（非特許文献3〜5）、乳がん（非特許文献6）、胆管細胞がん（非特許文献7）、膵がん、悪性黒色腫、神経膠芽腫、気管支喘息（非特許文献8〜9）、糖尿病性網膜症（非特許文献10〜12）、変形性膝関節症（非特許文献13）、アトピー性皮膚炎（非特許文献14〜15）、特発性間質性肺炎、加齢黄斑変性、上皮間葉転換した治療抵抗性乳がん細胞（非特許文献16）などでペリオスチンの発現量が増加していることが知られている。【０００４】
ペリオスチンは様々な健常組織においても発現しており、歯牙形成、骨形成、心臓弁形成等に関与する。したがって、ペリオスチンノックアウトマウスでは、歯の形成異常、成長障害、心臓弁の形成異常が生じる（非特許文献17）。また、ペリオスチンノックアウトマウスでは、野生型マウスと比較して心筋梗塞後の心破裂が生じやすい（非特許文献18）。【０００５】
本発明者らはこれまでに、ペリオスチンタンパク質のC末端領域に存在するスプライシングバリアントを標的とする中和抗体、すなわちエクソン17によりコードされるペプチドに対する中和抗体およびエクソン21によりコードされるペプチドに対する中和抗体を作製し、これらの抗体が心不全、癌、炎症性疾患等の治療に有効であることを示している（特許文献1〜3）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】国際公開WO2007/077934号
【特許文献２】国際公開WO2009/001940号
【特許文献３】国際公開WO2014/136910号
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Kii I, and Ito H, Cell Mol Life Sci. 2017 Dec;74(23):4269-4277.
【非特許文献２】Baril P, et al., Oncogene. 2007 Mar 29;26(14):2082-94.
【非特許文献３】Norum HM, et al., J Cardiovasc Transl Res. 2017 Aug;10(4):401-410.
【非特許文献４】Katsuragi N, et al., Circulation. 2004 Sep 28;110(13):1806-13.
【非特許文献５】Taniyama Y, et al., Hypertension. 2016 Feb;67(2):356-61.
【非特許文献６】Kyutoku M, et al., Int J Mol Med. 2011 Aug;28(2):181-6.
【非特許文献７】Fujimoto K, et al., Oncol Rep. 2011 May;25(5):1211-6.
【非特許文献８】Woodruff PG, et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 2007 Oct 2;104(40):15858-63.
【非特許文献９】Jia G, et al., J Allergy Clin Immunol. 2012 Sep;130(3):647-654.e10.
【非特許文献１０】Takada M, et al., Biochem Biophys Res Commun. 2010 Aug 20;399(2):221-6.
【非特許文献１１】Yoshida S, et al., Ophthalmol Vis Sci. 2011 Jul 29;52(8):5670-8.
【非特許文献１２】Nakama T, et al., Exp Eye Res. 2016 Dec;153:133-140.
【非特許文献１３】Chijimatsu R, et al., BMC Musculoskelet Disord. 2015 Aug 21;16:215.
【非特許文献１４】Masuoka M, et al., J Clin Invest. 2012 Jul;122(7):2590-600.
【非特許文献１５】Shiraishi H, et al., Allergol Int. 2012 Dec;61(4):563-72.
【非特許文献１６】Morra L, and Moch H. Virchows Arch. 2011 Nov;459(5):465-75. Review.
【非特許文献１７】Rios H, et al., Mol Cell Biol. 2005 Dec;25(24):11131-44.
【非特許文献１８】Shimazaki M, et al., J Exp Med. 2008 Feb 18;205(2):295-303.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、ペリオスチンの機能を完全に阻害することなく、ペリオスチンの発現量増加またはスプライシングバリアントの変化を伴う疾患を治療するための医薬組成物を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明は、上記課題を解決するために、以下の各発明を包含する。
［１］ペリオスチンの発現量増加またはスプライシングバリアントの変化を伴う疾患の治療用医薬組成物であって、ペリオスチン遺伝子の転写段階において、エクソン17をスキップさせる核酸および／またはエクソン21をスキップさせる核酸を有効成分として含有することを特徴とする医薬組成物。
［２］前記核酸がアンチセンス核酸である前記［１］に記載の医薬組成物。
［３］エクソン17をスキップさせるアンチセンス核酸が、配列番号１で示される塩基配列の24143番目〜24323番目の範囲を標的配列とし14〜50塩基からなる1種または2種以上の核酸であることを特徴とする前記［２］に記載の医薬組成物。
［４］エクソン17をスキップさせるアンチセンス核酸が、配列番号１で示される塩基配列の24191番目〜24193番目、24215番目〜24220番目、24247番目〜24254番目、24249番目〜24258番目、24252番目〜24255番目および24273番目〜24275番目の少なくとも１つの範囲を標的配列とする前記［３］に記載の医薬組成物。
［５］エクソン21をスキップさせるアンチセンス核酸が、配列番号１で示される塩基配列の29412番目〜29595番目の範囲を標的配列とし14〜50塩基からなる1種または2種以上の核酸であることを特徴とする前記［２］に記載の医薬組成物。
［６］エクソン21をスキップさせるアンチセンス核酸が、配列番号１で示される塩基配列の29460番目〜29462番目、29468番目〜29474番目、29472番目〜29479番目、29509番目〜29515番目、29525番目〜29531番目、29530番目〜29536番目、29531番目〜29538番目、29534番目〜29539番目、29534番目〜29541番目、29536番目〜29542番目および24545番目〜24547番目の少なくとも１つの範囲を標的配列とする前記［５］に記載の医薬組成物。
［７］エクソン17をスキップさせるアンチセンス核酸および／またはエクソン21をスキップさせるアンチセンス核酸を発現するアデノ随伴ウイルスベクターを含有する前記［２］〜［６］のいずれかに記載の医薬組成物。
［８］ペリオスチンの発現量増加またはスプライシングバリアントの変化を伴う疾患が、ペリオスチン遺伝子のエクソン17および／またはエクソン21を含むスプライシングバリアントの増加を伴う疾患である前記［１］〜［７］のいずれかに記載の医薬組成物。
［９］ペリオスチンの発現量増加またはスプライシングバリアントの変化を伴う疾患が、心不全、腎不全、乳がん、胆管細胞がん、膵がん、悪性黒色腫、神経膠芽腫、気管支喘息、糖尿病性網膜症、変形性膝関節症、アトピー性皮膚炎、特発性間質性肺炎、加齢黄斑変性からなる群から選択される少なくとも一種である前記［８］に記載の医薬組成物。
［１０］心不全の治療、腎不全の治療、糖尿病性網膜症の治療、乳がんの転移抑制または悪性黒色腫の転移抑制に用いられる前記［８］に記載の医薬組成物。
［１１］ペリオスチンの発現量増加またはスプライシングバリアントの変化を伴う疾患の治療薬と組み合わせて使用される前記［１］〜［１０］のいずれかに記載の医薬組成物。
【発明の効果】
【００１０】
本発明により、ペリオスチンの機能を完全に阻害することなく、ペリオスチンの発現量増加またはスプライシングバリアントの変化を伴う疾患を治療するための医薬組成物を提供することができる。本発明の医薬組成物はペリオスチンの機能を完全に阻害しないので、骨や歯の成長抑制等の副作用を生じることなく、ペリオスチンの発現量増加またはスプライシングバリアントの変化を伴う疾患を治療することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】ペリオスチンタンパク質の構造とC末端領域の4種類のスプライシングバリアントを示す模式図である。
【図２】健常マウスの各臓器におけるペリオスチンスプライシングバリアントの発現を解析した結果を示す図である。
【図３】（A）野生型マウス、（B）ペリオスチンエクソン17ノックアウトマウス（Pn 17KO）、（C）ペリオスチンエクソン21ノックアウトマウス（Pn 21KO）および（D）全ペリオスチンノックアウトマウス（Pn null）の歯牙の観察結果を示す図である。
【図４】野生型マウス、ペリオスチンエクソン17ノックアウトマウス（Pn 17KO）、ペリオスチンエクソン21ノックアウトマウス（Pn 21KO）および全ペリオスチンノックアウトマウス（Pn null）の体重を測定した結果を示す図である。
【図５】野生型マウス、ペリオスチンエクソン17ノックアウトマウス（Pn 17KO）、ペリオスチンエクソン21ノックアウトマウス（Pn 21KO）および全ペリオスチンノックアウトマウス（Pn null）の尻尾長を測定した結果を示す図である。
【図６】野生型マウスの片側尿細管結紮モデルにおけるペリオスチンスプライシングバリアントの発現を測定した結果を示す図である。
【図７】野生型マウスの片側尿細管結紮モデルを作製し、0、21および28日目に摘出した腎臓のパラフィン包埋切片を抗エクソン17抗体で免疫染色した結果を示す図であり、（A）は抗エクソン17抗体および抗αSMAを用いた免疫蛍光染色の結果であり、（B）は抗エクソン17抗体用いた免疫染色（21日目）の結果である。
【図８】野生型マウスの片側尿細管結紮モデルを作製し、21日目に摘出した腎臓のパラフィン包埋切片に、マウスペリオスチンcDNAから作製したリボプローブを用いてin situハイブリダイゼーションを行った結果を示す図である。
【図９】野生型マウス、ペリオスチンエクソン17ノックアウトマウス（Pn 17KO）および全ペリオスチンノックアウトマウス（Pn null）の片側尿細管結紮モデルを作製し、21日目に摘出した腎臓のパラフィン包埋切片にマッソントリクローム染色を行い、マッソントリクローム陽性領域（線維化領域）の面積を測定した結果を示す図である。
【図１０】野生型マウス、ペリオスチンエクソン17ノックアウトマウス（Pn 17KO）および全ペリオスチンノックアウトマウス（Pn null）の片側尿細管結紮モデルを作製し、0および21日目に摘出した腎臓における線維化マーカー（αSMA、1型コラーゲン）、炎症マーカー（TNFα、IL-1β）のmRNA発現量を定量PCRで測定した結果を示す図である。
【図１１】野生型マウス、ペリオスチンエクソン17ノックアウトマウス（Pn 17KO）および全ペリオスチンノックアウトマウス（Pn null）の片側尿細管結紮モデルを作製し、0および21日目に摘出した腎臓におけるTGF-βシグナル関連分子（TGF-β1、Snail 1、c-myc、CTGF）のmRNA発現量を定量PCRで測定した結果を示す図である。
【図１２】野生型マウス、ペリオスチンエクソン17ノックアウトマウス（Pn 17KO）および全ペリオスチンノックアウトマウス（Pn null）の片側尿細管結紮モデルを作製し、21日目に摘出した腎臓のパラフィン包埋切片に抗β-カテニン抗体で蛍光染色およびDAPIで核染色を行い、核内移行したβ-カテニン量を測定した結果を示す図である。
【図１３】ヒトペリオスチン遺伝子のエクソン17またはエクソン21をスキップさせるモルホリノアンチセンスオリゴヌクレオチドをヒト心臓線維芽細胞およびヒト乳がん細胞にそれぞれ導入し、48時間後にRNAを抽出して、エクソン17スキッピングまたはエクソン21スキッピングを検出するためのプライマーセットを用いてRT-PCRを行った結果を示す図である。
【図１４】ヒト腎臓近位尿細管上皮細胞にヒトペリオスチン遺伝子のエクソン17をスキップさせるモルホリノアンチセンスオリゴヌクレオチドを導入し、24時間後に培地にヒトTGF-βを添加して24時間培養後にRNAを抽出し、スプライシングバリアントPn 1（図1参照）の発現量を定量PCRで測定した結果を示す図である。
【図１５】ヒト腎臓近位尿細管上皮細胞にヒトペリオスチン遺伝子のエクソン17をスキップさせるモルホリノアンチセンスオリゴヌクレオチドを導入し、24時間後に培地にヒトTGF-βを添加して24時間培養後にRNAを抽出し、TGF-βにより誘導される下流シグナル（αSMA、Snail 1、TNFα、CTGF、Vimentin）のmRNA発現量を定量PCRで測定した結果を示す図である。
【図１６】ルシフェラーゼ発現マウス乳がん細胞（4T1-Luc）にマウスペリオスチン遺伝子のエクソン17をスキップさせるモルホリノアンチセンスオリゴヌクレオチドを導入し、2日間培養後、細胞懸濁液を調製してヌードマウスの尾静脈から投与し、5日後の肺転移をルシフェラーゼ活性として測定した結果を示す図である。
【図１７】ヒト乳がん細胞（BT549）にヒトペリオスチン遺伝子のエクソン17をスキップさせるモルホリノアンチセンスオリゴヌクレオチド、エクソン21をスキップさせるモルホリノアンチセンスオリゴヌクレオチドをそれぞれ導入し、抗がん剤パクリタキセルで処理し、または処理せずに、72時間後に生細胞数を測定した結果を示す図であり、(A)はパクリタキセル処理なし、(B)はパクリタキセル処理ありの結果を示す図である。
【図１８】ヒト乳がん細胞（BT549）にヒトペリオスチン遺伝子のエクソン17をスキップさせるモルホリノアンチセンスオリゴヌクレオチド、エクソン21をスキップさせるモルホリノアンチセンスオリゴヌクレオチドをそれぞれ導入し、抗がん剤パクリタキセルで処理し、または処理せずに、72時間後にATP産生量を測定した結果を示す図であり、(A)はパクリタキセル処理なし、(B)はパクリタキセル処理ありの結果を示す図である。
【図１９】野生型マウス、ペリオスチンエクソン17ノックアウトマウス（Pn 17KO）、ペリオスチンエクソン21ノックアウトマウス（Pn 21KO）および全ペリオスチンノックアウトマウス（Pn null）の左足底にマウス乳がん細胞（4T1）を移植し、3週間後の肺転移コロニー数をカウントした結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本発明の医薬組成物は、ペリオスチンの発現量増加またはスプライシングバリアントの変化を伴う疾患の治療用医薬組成物であって、ペリオスチン遺伝子の転写段階において、エクソン17をスキップさせる核酸および／またはエクソン21をスキップさせる核酸を有効成分として含有するものであればよい。ペリオスチン遺伝子としては、例えば配列番号1で示されるヒトペリオスチン遺伝子、配列番号2で示されるマウスペリオスチン遺伝子などが挙げられる。
【００１３】
ペリオスチン遺伝子の転写段階においてエクソン17をスキップするとは、一次転写産物であるプレmRNAからイントロン部分を切り出して成熟mRNAを生成するスプライシングの過程で、イントロン部分だけでなくエクソン17部分も切り出してエクソン17を含まない成熟mRNAを生成することを意味する。同様に、ペリオスチン遺伝子の転写段階においてエクソン21をスキップするとは、一次転写産物であるプレmRNAからイントロン部分を切り出して成熟mRNAを生成するスプライシングの過程で、イントロン部分だけでなくエクソン21部分も切り出してエクソン21を含まない成熟mRNAを生成することを意味する。したがって、本発明の医薬組成物の有効成分となる核酸は、ペリオスチン遺伝子の一次転写産物であるプレmRNAの標的配列にハイブリダイズし得る核酸であればよい。このような核酸として、アンチセンス核酸、siRNA（short interfering RNA）、shRNA（short hairpin RNA）などが挙げられる。
【００１４】
特定のエクソンをスキップさせる核酸の標的配列としては、一般に、スプライシング受容部位を含む配列、スプライシング供与部位を含む配列、イントロン内スプライシング促進配列を含む配列、エクソン内スプライシング促進配列を含む配列が好ましく用いられる（Nucleic Acid Ther. 2014, Feb;24(1):69-86、Biochem Biophys Res Commun. 2007, Jun 29;358(2):521-527）。したがって、本発明の医薬組成物の有効成分となる核酸は、ペリオスチン遺伝子の塩基配列情報とこれらの公知技術を組み合わせて標的配列を決定し、当該標的領域の塩基配列に基づいて設計することができる。
【００１５】
エクソン17をスキップさせる核酸は、配列番号1で示される塩基配列の24143番目〜24323番目の範囲を標的配列とすることが好ましい。この範囲には、エクソン17（24193番目〜24273番目）と、その上流側に隣接するイントロンの50塩基および下流側に隣接するイントロンの50塩基が含まれる。この範囲内にエクソン17の上流側のスプライシング受容部位、エクソン17の下流側のスプライシング供与部位、および複数のエクソン内スプライシング促進配列が含まれる。
【００１６】
ヒトペリオスチン遺伝子のエクソン17の上流側のスプライシング受容部位を含む配列としては配列番号1で示される塩基配列の24191番目〜24193番目の配列、ヒトペリオスチン遺伝子のエクソン17の下流側のスプライシング供与部位を含む配列としては配列番号1で示される塩基配列の24273番目〜24275番目の配列、ヒトペリオスチン遺伝子のエクソン17のエクソン内スプライシング促進配列としては、配列番号1で示される塩基配列の24215番目〜24220番目、24247番目〜24254番目、24249番目〜24258番目、24252番目〜24255番目等の配列が挙げられる。エクソン17をスキップさせる核酸は、これらの少なくとも１つの配列を標的配列とすることが好ましい。なお、エクソン内スプライシング促進配列は、例えばESEfinder3.0（http://rulai.cshl.edu/cgi-bin/tools/ESE3/esefinder.cgi）を用いて予測することができる。
【００１７】
エクソン21をスキップさせる核酸は、配列番号1で示される塩基配列の29412番目〜29595番目の範囲を標的配列とすることが好ましい。この範囲には、エクソン21（29462番目〜29545番目）と、その上流側に隣接するイントロンの50塩基および下流側に隣接するイントロンの50塩基が含まれる。この範囲内にエクソン21の上流側のスプライシング受容部位、エクソン21の下流側のスプライシング供与部位、および複数のエクソン内スプライシング促進配列が含まれる。
【００１８】
ヒトペリオスチン遺伝子のエクソン21の上流側のスプライシング受容部位を含む配列としては配列番号1で示される塩基配列の29460番目〜29462番目の配列、ヒトペリオスチン遺伝子のエクソン21の下流側のスプライシング供与部位を含む配列としては配列番号1で示される塩基配列の29545番目〜29547番目の配列、ヒトペリオスチン遺伝子のエクソン21のエクソン内スプライシング促進配列としては、配列番号1で示される塩基配列の29468番目〜29474番目、29472番目〜29479番目、29509番目〜29515番目、29525番目〜29531番目、29530番目〜29536番目、29531番目〜29538番目、29534番目〜29539番目、29534番目〜29541番目、29536番目〜29542番目等の配列が挙げられる。エクソン21をスキップさせる核酸は、これらの少なくとも１つの配列を標的配列とすることが好ましい。
【００１９】
本発明の医薬組成物の有効成分がアンチセンス核酸である場合、アンチセンス核酸の長さは特に限定されない。好ましくは14〜50塩基、より好ましくは14〜40塩基、さらに好ましくは14〜30塩基である。本発明に用いられるアンチセンス核酸は、標的配列（ペリオスチン遺伝子のプレmRNAの塩基配列）に相補的な配列を含むものであるが、完全に相補的であることを要するものではなく、標的配列とハイブリッドを形成できる限りにおいてミスマッチを含むものであってもよい。相補的な配列部分はアンチセンス核酸の長さ（塩基数）の50％以上、60％以上、70％以上、80％以上、90％以上、95％以上、98％以上、99％以上であってもよく、100％であってもよい。
【００２０】
ヒトペリオスチン遺伝子のエクソン17をスキップさせるアンチセンス核酸としては、例えば以下の塩基配列からなるアンチセンス核酸を用いることができる。
5'-CCATGTATAACATTGATTTTTACCTTCAGT-3'（配列番号3）
ヒトペリオスチン遺伝子のエクソン21をスキップさせるアンチセンス核酸としては、例えば以下の塩基配列からなるアンチセンス核酸を用いることができる。
5'-TTGTTGTCCTTTTACTAACCTCCCT-3'（配列番号4）
マウスペリオスチン遺伝子のエクソン17をスキップさせるアンチセンス核酸としては、例えば以下の塩基配列からなるアンチセンス核酸を用いることができる。
5'-TGCTGAAAACATAGAAAGTGGAGCA-3'（配列番号5）
【００２１】
アンチセンス核酸がエクソン17をスキップさせることは、例えばペリオスチンを発現する培養細胞にアンチセンス核酸を導入してRNAを抽出し、ペリオスチン遺伝子の転写産物をRT-PCR等で分析することにより確認できる。アンチセンス核酸がエクソン21をスキップさせることも、同様の手順で確認できる。
【００２２】
アンチセンス核酸は、DNA鎖、RNA鎖、DNAとRNAの混合鎖のいずれからなるものでもよい。また、ヌクレオチド類似体を含むものであってもよい。アンチセンス核酸は、ヌクレアーゼ耐性を増加させ、および／または標的配列に対する親和性を増加させるように修飾されることが好ましい。好ましいヌクレオチド類似体は、例えば、モルホリノ骨格、カルバメート骨格、シロキサン骨格、スルフィド骨格、スルホキシド骨格、スルホン骨格、ホルムアセチル骨格、チオホルムアセチル骨格、メチレンホルムアセチル骨格、リボアセチル骨格、アルケン含有骨格、スルホメート骨格、スルホネート骨格、スルホンアミド骨格、メチレンイミノ骨格、メチレンヒドラジノ骨格、アミド骨格などの修飾骨格を含む。モルホリノオリゴヌクレオチドは、DNAのデオキシリボース糖が六員環に置き換えられ、ホスホジエステル結合がホスホロジアミデート結合に置き換えられた無電荷の骨格を有する。モルホリノオリゴヌクレオチドは酵素分解に耐性を有する。
【００２３】
さらに、ヌクレオチド類似体は、ホスホジエステル結合中の非架橋酸素の1つの置換を含むことが好ましい。この修飾により、ヌクレアーゼ分解に対する重要な耐性が加えられる。好ましいヌクレオチド類似体は、ホスホロチオエート、キラルなホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホトリエステル、アミノアルキルホスホトリエステル、Ｈ−ホスホネート、例えば3'-アルキレンホスホネート、5'-アルキレンホスホネート、キラルなホスホネートを含むエチルおよび他のアルキルホスホネート、ホスフィネート、例えば3'-アミノホスホルアミデートおよびアミノアルキルホスホルアミデートを含むホスホルアミデート、チオノホスホルアミデート、チオノアルキルホスホネート、チオノアルキルホスホトリエステル、セレノホスフェートまたはボラノホスフェートを含む。
【００２４】
さらに、ヌクレオチド類似体は、-OH；-F；1つまたは複数のヘテロ原子が間に存在してもよい、置換または非置換の、直鎖状または分岐状の低級（C1〜C10）アルキル、アルケニル、アルキニル、アルカリル、アリルまたはアラルキル；O-、S-またはN-アルキル；O-、S-またはN-アルケニル；O-、S-またはN-アルキニル；O-、S-またはN-アリル；O-アルキル-O-アルキル、-メトキシ、-アミノプロポキシ；-メトキシエトキシ；-ジメチルアミノオキシエトキシ；-ジメチルアミノエトキシエトキシなどの、2'、3'および／または5'位で一または二置換される1つまたは複数の糖部分を含むことが好ましい。糖部分は、ピラノースもしくはその誘導体、またはデオキシピラノースもしくはその誘導体、好ましくはリボースもしくはその誘導体、またはデオキシリボースもしくはその誘導体であってよい。好ましい誘導体化された糖部分は、ロックト核酸（LNA）を含み、2'炭素原子が糖環の3'または4'炭素原子に連結し、それによって二環式糖部分を形成する。好ましいLNAは、2'-O,4'-C-エチレン架橋核酸を含む（Morita et al., 2001, Nucleic Acid Res Supplement No.1:241−242）。これらの置換により、ヌクレオチド類似体または同等物に、RNaseHおよびヌクレアーゼ耐性が与えられ、標的RNAに対する親和性が増加する。
【００２５】
さらにまた、アンチセンス核酸は、5'末端および／または3'末端が修飾されていてもよい。かかる修飾は、トリエチレングリコール（TEG）修飾、ヘキサエチレングリコール（HEG）修飾、ドデカエチレングリコール（DODEG）修飾を含む。
【００２６】
アンチセンス核酸は、公知の核酸合成方法を用いて製造することができる。公知の方法としては、例えば、国際公開公報WO2009/064471または国際公開公報WO2013/100190に記載の方法を用いることができる。siRNAやshRNAも公知の核酸合成方法を用いて製造することができる。
【００２７】
ペリオスチンの発現量増加を伴う疾患とは、健常時のペリオスチンの発現量と比較して、発病後のペリオスチン発現量が増加している疾患を意味する。ペリオスチン発現量は、血中ペリオスチンタンパク質濃度や疾患部位の細胞におけるペリオスチンmRNA量またはペリオスチンタンパク質量を測定することにより確認することができる。ペリオスチンスプライシングバリアントの変化を伴う疾患とは、健常時のペリオスチンスプライシングバリアントの発現パターンと、発病後のペリオスチンスプライシングバリアントの発現パターンが異なる疾患を意味する。本発明者らは、健常時にはほとんどの臓器でPn4（エクソン17およびエクソン21がスキップしたスプライシングバリアント、図1参照）が発現しており、他のスプライシングバリアントはほとんど発現していないことを確認している（参考例1）。それゆえ、発病後にPn1、Pn2、Pn3等のスプライシングバリアント（図1参照）の発現が増加するような疾患が、ペリオスチンスプライシングバリアントの変化を伴う疾患に該当する。
【００２８】
本発明の医薬組成物の治療対象であるペリオスチンの発現量増加またはスプライシングバリアントの変化を伴う疾患としては、例えば、心不全（急性心筋梗塞後心不全、特発性心筋症等）、腎不全（急性腎不全、慢性腎不全等）、がん（乳がん、胆管細胞がん、膵がん、悪性黒色腫、神経膠芽腫等）、気管支喘息、糖尿病性網膜症、変形性膝関節症、アトピー性皮膚炎、特発性間質性肺炎、加齢黄斑変性などが挙げられる。なかでも、本発明の医薬組成物は、心不全の治療、腎不全の治療、糖尿病性網膜症の治療、乳がんの転移抑制、悪性黒色腫の転移抑制などに有効である。また、本発明の医薬組成物は、治療対象であるペリオスチンの発現量増加またはスプライシングバリアントの変化を伴う疾患の他の治療薬と組み合わせて使用することにより、当該他の治療薬の効果を増強することができる。例えば、すでに抗がん剤治療を行っている患者に、本発明の医薬組成物を組み合わせることにより、抗がん剤による治療効果を増強させることができる。
【００２９】
本発明の医薬組成物は、1種のアンチセンス核酸を有効成分とするものでもよく、2種以上のアンチセンス核酸を有効成分とするものでもよい。2種以上のアンチセンス核酸の組み合わせは特に限定されないが、単独で使用するより効果が増強される組み合わせを適宜選択して有効成分とすることが好ましい。
【００３０】
本発明の医薬組成物は、ペリオスチン遺伝子の転写段階において、エクソン17をスキップさせるアンチセンス核酸および／またはエクソン21をスキップさせるアンチセンス核酸を有効成分とし、薬学的に許容される担体または添加剤を適宜配合して製剤化することができる。具体的には錠剤、被覆錠剤、丸剤、散剤、顆粒剤、カプセル剤、液剤、懸濁剤、乳剤等の経口剤；注射剤、輸液、坐剤、軟膏、パッチ剤等の非経口剤とすることができる。好ましくは、非経口剤である。注射剤は凍結乾燥製剤としてもよい。担体または添加剤の配合割合については、医薬品分野において通常採用されている範囲に基づいて適宜設定すればよい。配合できる担体または添加剤は特に制限されないが、例えば、水、生理食塩水、その他の水性溶媒、水性または油性基剤等の各種担体、賦形剤、結合剤、pH調整剤、崩壊剤、吸収促進剤、滑沢剤、着色剤、矯味剤、香料等の各種添加剤が挙げられる。
【００３１】
錠剤、カプセル剤などに混和することができる添加剤としては、例えば、ゼラチン、コーンスターチ、トラガント、アラビアゴムのような結合剤、結晶性セルロースのような賦形剤、コーンスターチ、ゼラチン、アルギン酸などのような膨化剤、ステアリン酸マグネシウムのような潤滑剤、ショ糖、乳糖またはサッカリンのような甘味剤、ペパーミント、アカモノ油またはチェリーのような香味剤などが用いられる。調剤単位形態がカプセルである場合には、上記タイプの材料にさらに油脂のような液状担体を含有することができる。注射のための無菌組成物は通常の製剤業務（例えば有効成分を注射用水、天然植物油等の溶媒に溶解または懸濁させる等）に従って調製することができる。注射用の水性液としては、例えば、生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液（例えば、D-ソルビトール、D-マンニトール、スクロース、塩化ナトリウムなど）などが用いられ、適当な溶解補助剤、例えば、アルコール（例、エタノール）、ポリアルコール（例、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール）、非イオン性界面活性剤（例、ポリソルベート80、HCO-50）などと併用してもよい。油性液としては、例えば、ゴマ油、大豆油などが用いられ、溶解補助剤である安息香酸ベンジル、ベンジルアルコールなどと併用してもよい。また、緩衝剤（例えば、リン酸塩緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝液）、無痛化剤（例えば、塩化ベンザルコニウム、塩酸プロカインなど）、安定剤（例えば、ヒト血清アルブミン、ポリエチレングリコールなど）、保存剤（例えば、ベンジルアルコール、フェノールなど）、酸化防止剤などと配合してもよい。さらに、凍結乾燥製剤としてもよい。
【００３２】
本発明の医薬組成物は、ペリオスチンの発現量増加またはスプライシングバリアントの変化を伴う疾患を発症しているヒトに対して投与することができる。投与経路は特に限定されないが、非経口投与が好ましい。非経口投与は、静脈内投与等の全身性投与、筋肉内投与、経皮投与、経粘膜投与等の局所投与のいずれであってもよい。また、本発明の医薬組成物の有効成分であるアンチセンス核酸は、非ウイルスベクターまたはウイルスベクターの形態で投与することができる。さらに、リポソームを用いてアンチセンス核酸を導入する方法（リポソーム法、HVJ-リポソーム法、カチオニックリポソーム法、リポフェクション法、リポフェクトアミン法など）、マイクロインジェクション法、遺伝子銃（Gene Gun）でキャリア（金属粒子）とともにアンチセンス核酸を細胞に移入する方法、超音波導入法等を併用して投与する方法などを利用することができる。
【００３３】
本発明の医薬組成物は、アデノ随伴ウイルスベクターの形態で投与するものであってもよい。アデノ随伴ウイルスは高い安全性と、低い宿主細胞への免疫反応、および非増殖細胞において長期間発現維持できることから、遺伝子治療に好適なウイルスベクターである。既に血友病、筋ジストロフィー、加齢黄斑変性症等で臨床適用実績があり、ヒトヘの安全性も確立されていることから、本発明の医薬組成物の好適な投与形態の一つである。
【００３４】
本発明の医薬組成物の用量は、対象疾患、含有するアンチセンス核酸の種類、剤形、投与経路、患者の年齢や体重によって異なるが、注射剤の形で投与する場合、1日当たり約0.01mg〜60g程度、好ましくは約0.1mg〜24g程度、より好ましくは約0.1mg〜6g程度を投与することができる。投与間隔は1日1回〜数回、または1日〜2週間の間隔を設定することができる。
【００３５】
本発明の医薬組成物を他の治療薬と組み合わせて使用する場合、両者を投与対象に対して同時に投与してもよいし、時間差をおいて投与してもよい。本明細書において「組み合わせて使用する」とは、２以上の薬剤の適用時期が重複していることを意味し、同時に投与することを要するものではない。組み合わせ方は特に限定されず、本発明の医薬組成物と一種または複数の他の治療薬をどのように組み合わせて使用してもよい。他の治療薬の投与量は、臨床上用いられている投与量に準ずればよく、投与対象、投与対象の年齢および体重、症状、投与時間、剤形、投与方法、組み合わせ等により適宜選択することができる。
【００３６】
本発明の医薬組成物はペリオスチンの機能を完全に阻害せず、特定のスプライシングバリアント、すなわちペリオスチン遺伝子のエクソン17によりコードされる部分および／またはエクソン21によりコードされる部分に起因する機能を選択的に阻害するものであるため、骨や歯の成長抑制等の副作用を生じない点で非常に有用である。また、本発明の医薬組成物は、従来の抗体医薬では抑制できない細胞内の特定のペリオスチン発現を抑制することができる点で有用である。
【００３７】
さらに本発明には以下の発明が含まれる。
（i）ペリオスチンの発現量増加またはスプライシングバリアントの変化を伴う疾患の治療方法であって、当該疾患患者に対して、ペリオスチン遺伝子の転写段階において、エクソン17をスキップさせるアンチセンス核酸および／またはエクソン21をスキップさせるアンチセンス核酸の有効量を投与することを特徴とする治療方法。
（ii）ペリオスチンの発現量増加またはスプライシングバリアントの変化を伴う疾患の治療に使用するための、ペリオスチン遺伝子の転写段階において、エクソン17をスキップさせるアンチセンス核酸および／またはエクソン21をスキップさせるアンチセンス核酸。
（iii）ペリオスチンの発現量増加またはスプライシングバリアントの変化を伴う疾患の治療薬を製造するための、ペリオスチン遺伝子の転写段階において、エクソン17をスキップさせるアンチセンス核酸および／またはエクソン21をスキップさせるアンチセンス核酸の使用。
【００３８】
なお、本発明者は、参考例５（図19）に示したようにエクソン2およびエクソン3に対するターゲッティングベクターをES細胞に導入して作製した全ペリオスチンノックアウトマウス（参考例２参照）は、エクソン17ノックアウトマウスおよびエクソン21ノックアウトマウスと同様に抗腫瘍効果（乳がん細胞の肺転移抑制）を示すことを確認している。したがって、ペリオスチン遺伝子の転写段階において、エクソン2をスキップさせる核酸および／またはエクソン3をスキップさせる核酸も、本発明の医薬品の有効成分になり得る可能性があると考えられる。
【実施例】
【００３９】
以下、実施例により本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。【００４０】
〔参考例１：健常マウスの各臓器におけるペリオスチンスプライシングバリアントの発現解析〕
＜実験方法＞
C57BL/6J雄マウス8週齢（オリエンタルバイオサービス）を4匹使用した。麻酔下で開腹し、心臓から生理食塩水で臓器灌流を行った後に、各臓器（心臓、大動脈、副腎、肺、脾臓、胃、腎臓、皮膚、脳、肝臓、結腸、精巣）を摘出した。定法に従って臓器をホモジナイズし、RNeasy Plus Mini Kit（Qiagen）を用いてトータルRNAを抽出した。DNase処理したトータルRNAをHigh-Capacity cDNA Reverse Transcriptase Kit（Applied Biosystems）を用いて逆転写し、得られたcDNAを定量PCRに供した。試料中の転写物のコピー数は、既知のコピー数を有する各スプライシングバリアント（Pn1、Pn2、Pn3およびPn4、図1参照）プラスミドを使用して決定した。定量PCRには、ViiA-7 real-time PCR system（Applied Biosystems, Foster City, CA, USA）を用いた。統計処理にはJUMP統計ソフトウェアパッケージを使用し、分散分析およびTukey-Kramer adjustmentを行った。【００４１】
＜結果＞
結果を図2に示した。健常マウスにおいては、測定したすべての臓器においてもPn4（エクソン17およびエクソン21がスキップしたスプライシングバリアント）のコピー数が他のスプライシングバリアント（Pn1、Pn2、Pn3）に比較しておよそ100-10000倍多いことが証明された。【００４２】
〔参考例２：ペリオスチンノックアウトマウスの特徴〕
＜実験方法＞
（１）ノックアウトマウスの作製
エクソン17ノックアウトマウス（Pn 17KO）、エクソン21ノックアウトマウス（Pn 21KO）、全ペリオスチンノックアウトマウス（Pn null）をそれぞれ作製した。具体的には、Pn nullはエクソン2およびエクソン3に対するターゲッティングベクター、Pn 17KOはエクソン17に対するターゲッティングベクター、Pn21 KOはエクソン21に対するターゲッティングベクターをそれぞれ作製し、ES細胞に導入後、キメラマウスを得た。引き続き正常マウスと交配させて誕生したヘテロ接合体マウス同士を交配し、ノックアウトマウス（ホモ接合体）を作製した。これらのノックアウトマウスの作製は理化学研究所に依頼した。【００４３】
（２）歯牙観察
野生型マウス（C57BL/6J、雄、n=5）、Pn 17KO、Pn 21KOおよびPn null（雄、各n=10）の8週齢における歯牙を観察し、代表例の写真を撮影した。【００４４】
（３）体重および尻尾長の測定
野生型マウス（C57BL/6J、雄、n=5）、Pn 17KO、Pn 21KOおよびPn null（雄、各n=10）の6週齢〜16週齢まで2週ごとに体重および尻尾長を測定した。統計処理にはJUMP統計ソフトウェアパッケージを使用し、分散分析およびTukey-Kramer adjustmentを行った。【００４５】
＜結果＞
図3に各群の歯牙の観察結果（各群の代表例の写真）を示した。Pn nullの歯牙は、野生型マウス（WT）、Pn 17KO、Pn 21KOの歯牙と比較して小さく、歯牙の形成障害が生じていると考えられた。
体重測定の結果を図4に、尻尾長の測定結果を図5にそれぞれ示した。Pn nullはWT、Pn 17KO、Pn 21KOより体重が少なく、尻尾長が短かった。【００４６】
〔参考例３：野生型マウスの片側尿細管結紮モデル〕
＜実験方法＞
野生型マウス（C57BL/6J、雄、8週齢）を使用した。麻酔下で開腹し、片側尿細管を4-0silk糸にて結紮して片側尿細管結紮（Unilateral ureteral obstruction: UUO）モデルを作製した。片側尿細管結紮モデルは、急性腎不全から線維化を生じ、慢性腎不全へ移行するモデルであることが知られている（Kidney Int. 2009, Jun;75(11):1145-52）。術前（0日目）、術後3、7、14、21、28、42および49日目に、それぞれ6匹のマウスから結紮側の腎臓を摘出し、参考例１と同じ方法でトータルRNAを抽出してcDNAを取得し、各ペリオスチンスプライシングバリアント（Pn1、Pn2、Pn3およびPn4、図1参照）の発現量を、以下の各スプライシングバリアントに特異的なプライマーセットを用いて定量PCRにより測定した。統計処理にはJUMP統計ソフトウェアパッケージを使用し、分散分析およびTukey-Kramer adjustmentを行った。
Mouse Pn1-F：5'-ATAACCAAAGTCGTGGAACC-3'（配列番号7）
Mouse Pn1-R：5'-TGTCTCCCTGAAGCAGTCTT-3'（配列番号8）
Mouse Pn2-F：5'-CCATGACTGTCTATAGACCTG-3'（配列番号9）
Mouse Pn2-R：5'-TGTCTCCCTGAAGCAGTCTT-3'（配列番号10）
Mouse Pn3-F：5'-ATAACCAAAGTCGTGGAACC-3'（配列番号11）
Mouse Pn3-R：5'-TTTGCAGGTGTGTCTTTTTG-3'（配列番号12）
Mouse Pn4-F：5'-CCCCATGACTGTCTATAGACC-3'（配列番号13）
Mouse Pn4-R：5'-TTCTTTGCAGGTGTGTCTTTT-3'（配列番号14）【００４７】
0、21および28日目に摘出した腎臓をホルマリン固定した後、厚さ4μmのパラフィン包埋切片を作製し、定法に従って抗エクソン17抗体および抗αSMA（smooth muscle actin）抗体を用いて免疫染色を行った。また、21日目に摘出した腎臓のパラフィン包埋切片（厚さ10μm）を作製し、マウスペリオスチンcDNAから作製したリボプローブを用いてin situハイブリダイゼーションを行った。【００４８】
＜結果＞
野生型マウスの片側尿細管結紮モデルにおけるペリオスチンスプライシングバリアントの発現を測定した結果を図6に示した。図中、＊は0日目に対して有意差があることを示す（P<0.05）。尿細管を結紮した腎臓において、いずれのスプライシングバリアントの発現も非常に増加し、術後21日目〜28日目頃にピークに達した。Pn 2およびPn 4のmRNAは、42日目〜49日目にほぼベースラインまで減少したが、Pn 1およびPn 3のmRNAは、42日目以後も依然としてより高いままであった。【００４９】
免疫染色の結果を図7に示した。（A）は抗エクソン17抗体および抗αSMAを用いた免疫蛍光染色の結果であり、（B）は抗エクソン17抗体用いた免疫染色の結果である。スケールバーはいずれも100μmである。（A）より、術後21日目および28日目のαSMA陽性細胞（筋線維芽細胞）においてペリオスチンエクソン17の発現が強く誘導されていた。また（B）より、術後21日目に尿細管上皮細胞にペリオスチンエクソン17の発現が観察された（図中矢印）。【００５０】
in situハイブリダイゼーションの結果を図8に示した。スケールバーは100μmである。図8から、術後21日目に尿細管上皮細胞にDIG陽性シグナルが観察された（図中矢印）。また、DIG陽性シグナルはαSMA陽性細胞（筋線維芽細胞）にも観察された。以上の結果から、ペリオスチン、特にエクソン17を含むバリアント（Pn 1およびPn 3）が尿細管上皮細胞および筋線維芽細胞で産生されていることが示された。【００５１】
〔参考例４：ペリオスチンノックアウトマウスの片側尿細管結紮モデル〕
＜実験方法＞
野生型マウス（C57BL/6J）、Pn 17KOおよびPn null（雄、8週齢）を使用し、参考例３と同じ方法で片側尿細管結紮モデルを作製した。術後21日目に結紮側の腎臓を摘出し、参考例３と同様に厚さ4μmのパラフィン包埋切片を作製し、マッソントリクローム染色キット（GeneCopoeia）を用いてマッソントリクローム染色を行った（各n=5）。マッソントリクローム陽性領域（線維化領域）の面積をIMARIS software（Zurich, Switzerland）とBZ-II Analyzer（Keyence, Osaka, Japan）を用いて測定した。【００５２】
また、術前（0日目）および術後21日目の腎臓からトータルRNAを抽出してcDNAを取得し（参考例１参照）、線維化マーカー（αSMA、1型コラーゲン）、炎症マーカー（TNFα、IL-1β）、TGF-βシグナル関連分子（TGF-β1、Snail 1、c-myc、CTGF(connective tissue growth factor)）のmRNA発現量を、以下のプライマーを用いて定量PCRで測定した（各n=4）。統計処理にはJUMP統計ソフトウェアパッケージを使用し、分散分析およびTukey-Kramer adjustmentを行った。【００５３】
Mouse Collagen 1-F：5'-TTCTCCTGGCAAAGACGGAC-3'（配列番号15）
Mouse Collagen 1-R：5'-CGGCCACCATCTTGAGACTT-3'（配列番号16）
Mouse αSMA-F：5'-CCCTGGAGAAGAGCTACGAAC-3'（配列番号17）
Mouse αSMA-R：5'-TACCCCCTGACAGGACGTTG-3'（配列番号18）
Mouse TNFα-F：5'-ACGGCATGGATCTCAAAGAC-3'（配列番号19）
Mouse TNFα-R：5'-AGATAGCAAATCGGCTGACG-3'（配列番号20）
Mouse IL-1β-F：5'-CAAGCAATACCCAAAGAAGA-3'（配列番号21）
Mouse IL-1β-R：5'-GAACAGTCCAGCCCATAC-3'（配列番号22）
Mouse TGF-β1-F：5'-TGCGCTTGCAGAGATTAAAA-3'（配列番号23）
Mouse TGF-β1-R：5'-CGTCAAAAGACAGCCACTCA-3'（配列番号24）
Mouse Snail 1-F：5'-AGCCCAACTATAGCGAGCTG-3'（配列番号25）
Mouse Snail 1-R：5'-GGGTACCAGGAGAGAGTCCC-3'（配列番号26）
Mouse c-myc -F：5'-TCCATCCTATGTTGCGGTCG-3'（配列番号27）
Mouse c-myc -R：5'-AACCGCTCCACATACAGTCC-3'（配列番号28）
Mouse CTGF-F：5'-AGGGCCTCTTCTGCGATTTC-3'（配列番号29）
Mouse CTGF-R：5'-CTTTGGAAGGACTCACCGCT-3'（配列番号30）【００５４】
さらに、TGF-βシグナル経路の下流に存在するβ-カテニンの核内移行を観察するために、術後21日目に結紮側の腎臓のパラフィン包埋切片（厚さ4μm）を作製し、抗β-カテニン抗体（BD Bioscience）で免疫蛍光染色した。核をDAPI染色し、核内のβ-カテニンの蛍光強度をIMARIS software（Zurich, Switzerland）とBZ-II Analyzer（Keyence, Osaka, Japan）を用いて測定した（各n=4）。統計処理にはJUMP統計ソフトウェアパッケージを使用し、分散分析およびTukey-Kramer adjustmentを行った。【００５５】
＜結果＞
マッソントリクローム陽性領域（線維化領域）の測定結果を、腎臓の面積に対する線維化領域の面積の割合（％）として図9に示した。図中、＊はWTに対して有意差があることを示す（P<0.05）。Pn nullおよびPn 17KOのマッソントリクローム陽性領域は野生型マウスに比べて有意に減少していた。【００５６】
線維化マーカー（αSMA、1型コラーゲン）および炎症マーカー（TNFα、IL-1β）のmRNA発現量の測定結果を図10に示した。図中、＊は各0日目に対して有意差があることを示し（P<0.05）、＊＊は各21日目のWTに対して有意差があることを示す（P<0.05）。いずれのマーカーについても、Pn nullおよびPn 17KOの術後21日目の発現量は、野生型に比べて有意に低かった。これらの結果から、ペリオスチン、特にエクソン17を含むペリオスチンが尿細管結紮後の腎線維化に関与していることが明らかになった。【００５７】
TGF-βシグナル関連分子（TGF-β1、Snail 1、c-myc、CTGF）のmRNA発現量の測定結果を図11に示した。図中、＊は各0日目に対して有意差があることを示し（P<0.05）、＊＊は各21日目のWTに対して有意差があることを示す（P<0.05）。術後21日目のTGF-β1は群間に差がなかった。TGF-βシグナル経路の転写物であるSnail 1、c-mycおよびCTGFについては、Pn nullおよびPn 17KOの術後21日目の発現量は、野生型に比べて有意に低かった。【００５８】
核内移行したβ-カテニン量を測定した結果を、単位面積（μm2）あたりの蛍光強度として図12に示した。図中、＊はWTに対して有意差があることを示す（P<0.05）。Pn nullおよびPn 17KOの術後21日目におけるβ-カテニンの核内移行は、野生型に比べて有意に減少していた。
以上の結果から、エクソン17を含むペリオスチンはTGF-βのシグナル伝達に関与し、線維化を促進するが、ペリオスチンのエクソン17を遮断することにより、線維化が抑制されることが示された。【００５９】
〔実施例１：アンチセンスオリゴヌクレオチドを用いたエクソン17およびエクソン21の選択的スキップ〕
参考例１〜４の知見から、ペリオスチン全体の阻害は片側尿細管結紮モデルの腎線維化を抑制するが、体格の小型化や歯牙の形成不全を引き起こす可能性があるため、ペリオスチンエクソン17の選択的阻害がより安全な治療法につながると考えられた。ペリオスチンエクソン21の選択的阻害についても同様と考えられる。そこで、エクソン17またはエクソン21をスキップしたmRNAを生成させるアンチセンス核酸の使用を試みた。【００６０】
＜実験方法＞
（１）アンチセンス核酸
ヒトペリオスチン遺伝子のエクソン17またはエクソン21をスキップさせるモルホリノアンチセンスオリゴヌクレオチドをフナコシから購入した。各アンチセンス核酸の塩基配列を以下に示す。
ヒトエクソン17アンチセンス：5'-CCATGTATAACATTGATTTTTACCTTCAGT-3'（配列番号3）
ヒトエクソン21アンチセンス：5'-TTGTTGTCCTTTTACTAACCTCCCT-3'（配列番号4）
コントロールアンチセンス：5'-CCTCTTACCTCAGTTACAATTTATA-3'（配列番号6）
ヒトエクソン17アンチセンスの標的は、配列番号1の24267番目〜24296番目であり、ヒトエクソン21アンチセンスの標的は、配列番号1の29540番目〜29564番目である。【００６１】
（２）細胞
ヒト心臓線維芽細胞（コスモバイオ、Catalog #6300）およびヒト乳がん細胞MDA-MB-231（ATCC番号：HTB-26）を使用した。ヒト心臓線維芽細胞およびヒト乳がん細胞MDA-MB-231は、10％ウシ胎児血清（FBS）および1%ペニシリン／ストレプトマイシンを含有するDMEMで培養した。これらの細胞に、ヒトエクソン17アンチセンスまたはヒトエクソン21アンチセンスを、トランスフェクション試薬「Endo-Porter（Gene Tools）」を用いて導入した。アンチセンス核酸は、培地に最終濃度10μMで添加した。導入後48時間目に細胞からトータルRNAを抽出してcDNAを取得し（参考例１参照）、RT-PCRを行った。PCR産物の有無をアガロースゲル電気泳動で確認した。【００６２】
エクソン17スキッピングの検出には、以下のプライマーを使用した。
・フォワードプライマー（3種類）
Human periostin exon 17 primer：5'-AACCAAAGTTGTGGAACCA-3'（配列番号31）
Human periostin exon 16/18 primer：5'-ATCCCCGTGACTGTCTATAGACCCA-3'（配列番号32）
Human periostin exon 16/19 primer：5'-ATCCCCGTGACTGTCTATAAGCCAA-3'（配列番号33）
・リバースプライマー（1種類）
Human periostin exon 20 primer：5'-GACCATCACCACCTTCAATG-3'（配列番号34）【００６３】
エクソン21スキッピングの検出には、以下のプライマーを使用した。
・フォワードプライマー（2種類）
Human periostin exon 21 primer：5'-GGTCACCAAGGTCACCAAATTC-3'（配列番号35）
Human periostin exon 20/22 primer：5'-GTTACAAGAAGACACACCCGTG-3'（配列番号36）
・リバースプライマー（1種類）
Human periostin exon 23 primer：5'-CCTGAAGTCAACTTGGCTCTCAC-3'（配列番号37）【００６４】
＜結果＞
結果を図13に示した。図13から明らかなように、アンチセンス核酸の導入により、目的のスプライシングバリアントが抑制されていることが示された。【００６５】
〔実施例２：エクソン17スキップアンチセンスオリゴヌクレオチドのTGF-βシグナルに及ぼす影響〕
＜実験方法＞
ヒト腎臓近位尿細管上皮細胞（Human renal proximal tubular epithelial cells: hRPTEC、ATCC番号：PCS-400-010）を10％ウシ胎児血清（FBS）および1%ペニシリン／ストレプトマイシンを含有する腎臓上皮細胞用培地（REBM: renal epithelial cell basal medium、Cambrex Bio Science Inc.）で培養した。この細胞に、実施例１と同様の方法でヒトエクソン17アンチセンス（Pn exon 17 AS）またはコントロールアンチセンス（Control AS）を導入した。導入後24時間目に血清を含まない培地に交換し、その24時間後に培地にヒトTGF-β1（PeproTech）を添加し、さらに24時間培養した。培養終了後、細胞からトータルRNAを抽出してcDNAを取得し（参考例１参照）、スプライシングバリアントPn 1（エクソン17およびエクソン21を含む、図1参照）の発現量（各n=3）、およびTGF-βにより誘導される下流シグナル（αSMA、Snail 1、TNFα、CTGF、Vimentin）のmRNA発現量（各n=4）を、以下のプライマーを用いて定量PCRで測定した。統計処理にはJUMP統計ソフトウェアパッケージを使用し、分散分析およびTukey-Kramer adjustmentを行った。【００６６】
Human periostin exon 17 (Pn 1)-F：5'-AGCCTATTATCAAAACTGAAGG-3'（配列番号38）
Human periostin exon 17 (Pn 1)-R：5'-GTCTCCCTGAAGCAGTCTTTT-3'（配列番号39）’
Human αSMA-F：5'-CAATGAGCTTCGTGTTGCCC-3'（配列番号40）
Human αSMA-R：5'-CATAGAGAGACAGCACCGCC-3'（配列番号41）
Human Snail 1-F：5'-GCTGACCTCCCTGTCAGATG-3'（配列番号42）
Human Snail 1-R：5'-GCACCCAGGCTGAGGTATTC-3'（配列番号43）
Human TNFα-F：5'-ATGAGCACTGAAAGCATGATCC-3'（配列番号44）
Human TNFα-R：5'-GAGGGCTGATTAGAGAGAGGTC-3'（配列番号45）
Human CTGF-F：5'-AGTGCATCCGTACTCCCAAA-3'（配列番号46）
Human CTGF-R：5'-TCTTCTTCATGACCTCGCCG-3'（配列番号47）
Human Vimentin-F：5'-GGACCAGCTAACCAACGACA-3'（配列番号48）
Human Vimentin-R：5'-AAGGTCAAGACGTGCCAGAG-3'（配列番号49）【００６７】
＜結果＞
スプライシングバリアントPn 1の発現量の結果を図14に示した。また、TGF-βにより誘導される下流シグナルのmRNA発現量の結果を図15に示した。図14、15において、＊はTGF-β(-) Control ASに対して有意差があることを示し（P<0.05）、＊＊はTGF-β(+) Control ASに対して有意差があることを示す（P<0.05）。図14に示したように、TGF-β(+) Control AS群では、スプライシングバリアントPn 1の発現量が有意に増加した。図15に示したように、TGF-β(+) Control AS群では、TGF-βにより誘導されるαSMA、Snail 1、TNFα、CTGFおよびVimentinの発現がいずれも有意に増加していたが、TGF-β(+) Pn exon 17 AS群では、いずれも発現が有意に抑制されていた。この結果から、ペリオスチンエクソン17を選択的にスキップさせるアンチセンス核酸が、TGF-β1シグナル伝達を介する線維化の抑制に有効であることが示された。【００６８】
〔実施例３：エクソン17スキップアンチセンスオリゴヌクレオチドのTGF-βシグナルに及ぼす影響の検討〕
＜実験方法＞
ルシフェラーゼ発現マウス乳がん細胞（4T1-Luc）を10％FBSおよび1%ペニシリン／ストレプトマイシンを含有するDMEMで培養した。マウスペリオスチン遺伝子のエクソン17をスキップさせるモルホリノアンチセンスオリゴヌクレオチドをフナコシから購入した。塩基配列を以下に示す。
マウスエクソン17アンチセンス：5'-TGCTGAAAACATAGAAAGTGGAGCA-3'（配列番号5）
マウスエクソン17アンチセンスの標的は、配列番号2で示されるマウスペリオスチン遺伝子の21118番目〜21142番目である。【００６９】
4T1-Luc細胞に、実施例１と同様の方法でマウスエクソン17アンチセンスおよびコントロールアンチセンス（配列番号6）を導入した。2日間培養後、細胞を剥がして細胞懸濁液をそれぞれ調製した。ヌードマウス（BALB/c-nu、雌、8〜10週齢）の尾静脈からマウス1匹あたり5×105個の4T1-Luc細胞を投与した（各n=3）。5日後に麻酔下で肺を摘出し、ホモジナイズ後にルシフェラーゼ活性を、Dual-Luciferase reporter assay system（Promega、#E1910）を用いて測定した。2群間比較にはマン・ホイットニ−検定(MWU)を用いた。【００７０】
＜結果＞
結果を図16に示した。コントロールアンチセンスを導入した4T1-Luc細胞を投与したマウスでは、高いルシフェラーゼ活性が測定され、4T1-Luc細胞が肺に転移していることが示された。一方、エクソン17アンチセンスを導入した4T1-Luc細胞を投与したマウスでは、ルシフェラーゼ活性は非常に低く、4T1-Luc細胞がほとんど肺に転移していないことが示された。この結果から、ペリオスチンエクソン17を選択的にスキップさせるアンチセンス核酸が、乳がん細胞の肺への転移を抑制することが示された。【００７１】
〔実施例４：ペリオスチン高発現乳がん細胞株BT549におけるエクソン17スキッピングまたはエクソン21スキッピングによるパクリタキセルの作用増強〕
＜実験方法＞
ペリオスチンを高発現するヒト乳がん細胞株BT549を10％FBSおよび1%ペニシリン／ストレプトマイシンを含有するRPMI1640で培養した。BT549細胞は、エストロゲン受容体陰性、プロゲステロン受容体陰性、HER2陰性のトリプルネガティブ乳がん細胞株である。
BT549細胞に、実施例１と同様の方法で、ヒトエクソン17アンチセンスまたはヒトエクソン21アンチセンスを導入した。その後細胞を96ウェルプレートに5×103個/ウェルで播種した。コントロールとして、コントロールアンチセンスを導入したBT549細胞を、同様に96ウェルプレートに播種した。播種の翌日に、パクリタキセルを10nMになるように各ウェルに添加した。72時間培養後、細胞増殖（生細胞数）およびATP産生能（ATP定量）を評価した。生細胞数の測定は、CellTiter 96 AQueous One Solution Cell Proliferation Assay（商品名、プロメガ、#G3582）を用いて行った（MTSアッセイ）。ATP量の測定は、CellTiter-Glo Luminescent Cell Viability Assay（商品名、プロメガ、#G7570）を用いて行った（ATPアッセイ）。各群間比較にはTukey-Kramer法を用いた。【００７２】
＜結果＞
MTSアッセイの結果を図17に示した。エクソン21アンチセンスを導入したBT549細胞は、エクソン17アンチセンス導入したBT549細胞およびコントロールアンチセンスを導入したBT549細胞と比較して有意に細胞増殖が抑制された（図17(A)）。エクソン17アンチセンスを導入したBT549細胞、エクソン21アンチセンスを導入したBT549細胞およびコントロールアンチセンスを導入したBT549細胞にそれぞれパクリタキセルを処理すると、エクソン17アンチセンスを導入したBT549細胞およびエクソン21アンチセンスを導入したBT549細胞は、どちらもコントロールアンチセンスを導入したBT549細胞より、有意に細胞増殖が抑制された（図17(B)）。【００７３】
ATPアッセイの結果を図18に示した。エクソン17アンチセンスを導入したBT549細胞およびエクソン21アンチセンスを導入したBT549細胞は、どちらもコントロールアンチセンスを導入したBT549細胞と比較して有意にATP産生が抑制された（図18(A)）。エクソン17アンチセンス導入BT549細胞とエクソン21アンチセンス導入BT549細胞を比較すると、エクソン21アンチセンス導入BT549細胞のほうが有意にATP産生が抑制された（図18(A)）。エクソン17アンチセンスを導入したBT549細胞、エクソン21アンチセンスを導入したBT549細胞およびコントロールアンチセンスを導入したBT549細胞にそれぞれパクリタキセルを処理すると、エクソン17アンチセンスを導入したBT549細胞およびエクソン21アンチセンスを導入したBT549細胞は、どちらもコントロールアンチセンスを導入したBT549細胞より、有意にATP産生が抑制された（図18(B)）。パクリタキセル処理したエクソン17アンチセンス導入BT549細胞とパクリタキセル処理したエクソン21アンチセンス導入BT549細胞を比較すると、エクソン21アンチセンス導入BT549細胞のほうが有意にATP産生が抑制された（図18(B)）。【００７４】
これらの結果から、ペリオスチンエクソン17を選択的にスキップさせるアンチセンス核酸およびペリオスチンエクソン21を選択的にスキップさせるアンチセンス核酸が、乳がん細胞の抗がん剤感受性を増強させることが明らかになった。【００７５】
〔参考例５：ペリオスチンノックアウトマウスを用いた乳がん細胞の肺転移の検討〕
＜使用動物＞
参考例２で作製したエクソン17ノックアウトマウス（Pn 17KO, n=6）、エクソン21ノックアウトマウス（Pn 21KO, n=6）、全ペリオスチンノックアウトマウス（Pn null, n=6）を使用した。コントロールとして野生型マウス（BALB/c, n=6）を使用した。いずれも8週齢の雌を使用した。【００７６】
＜実験方法＞
マウス乳がん細胞株4T1を10％FBSおよび1%ペニシリン／ストレプトマイシンを含有するDMEMで培養した。細胞懸濁液を調製し、1×103個の細胞をマウスの左足底に移植した。移植3週間後にマウスを安楽死させ、肺を摘出してブラウン液で染色し、転移コロニー数を目視でカウントした。各群の比較にはTukey-Kramer法を用いた。【００７７】
＜結果＞
結果を図19に示した。野生型マウス（WT）では多数の肺転移コロニーが観察された。一方、エクソン17ノックアウトマウス（Pn 17KO）、エクソン21ノックアウトマウス（Pn 21KO）、全ペリオスチンノックアウトマウス（Pn null）では、いずれも野生型マウスと比較して、有意に肺転移コロニー数が減少していた。【００７８】
なお本発明は上述した各実施形態および実施例に限定されるものではなく、請求項に示した範囲で種々の変更が可能であり、異なる実施形態にそれぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。また、本明細書中に記載された学術文献および特許文献の全てが、本明細書中において参考として援用される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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