(57)【要約】本開示は、トランス脂肪酸含有油脂を分解する技術を提供する。本開示の新規リパーゼは、トランス脂肪酸含有油脂を分解する活性を有した。本開示のリパーゼは、配列番号４、１１、１６または１８に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、もしくは配列番号１、７、１５または１７の核酸配列によってコードされるポリペプチド、またはそれらと少なくとも７０％の配列相同性を有するポリペプチドからなる。このリパーゼは、高温でも油脂を分解する能力を有し、熱安定性に優れている局面も見いだされた。本開示のリパーゼは、例えば排水処理、洗剤、脂肪改変・油脂生産技術などの油処理に有用である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）配列番号４、１１、１６または１８に示すアミノ酸配列を含むポリペプチド；
（ｂ）（ａ）のアミノ酸配列において、１アミノ酸以上の置換、付加、欠失またはそれらの組合せを含むアミノ酸配列を含み、生物学的活性を有するポリペプチド；
（ｃ）（ａ）または（ｂ）に示すアミノ酸配列と少なくとも７０％以上の配列同一性を有し、生物学的活性を有するポリペプチド；
（ｄ）配列番号１、７、１５または１７に示す核酸配列によってコードされるアミノ酸配列を含むポリペプチド；
（ｅ）（ｄ）に示す核酸配列において、１ヌクレオチド以上の置換、付加、欠失またはそれらの組合せを含む核酸配列によってコードされ、生物学的活性を有するポリペプチド；
（ｆ）（ｄ）または（ｅ）に示す核酸配列と少なくとも７０％以上の配列同一性を有する核酸配列によってコードされ、生物学的活性を有するポリペプチド；
（ｇ）（ｄ）〜（ｆ）のいずれか１つに示す核酸配列またはその相補的配列を含むポリヌクレオチドと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸配列によってコードされ、かつ生物学的活性を有するポリペプチド；
（ｈ）（ｄ）〜（ｇ）のいずれか１つの核酸配列の対立遺伝子変異体によってコードされ、生物学的活性を有するポリペプチド；または
（ｉ）（ａ）〜（ｈ）に示すアミノ酸配列の断片を含む、ポリペプチド、
である、ポリペプチド。
【請求項２】
前記生物学的活性は、トランス脂肪酸含有油脂の資化に関連する能力、またはトランス脂肪酸含有油脂を分解する能力である、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項３】
４５〜７０℃が油脂を分解する能力の至適温度である、請求項１または２に記載のポリペプチド。
【請求項４】
３５〜５５℃が油脂を分解する能力の至適温度である、請求項１または２に記載のポリペプチド。
【請求項５】
６５℃以上において熱安定性を有する、請求項１〜３のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項６】
７５℃以上において熱安定性を有する、請求項１、２または４のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項７】
１５℃において油脂を分解する能力を有する、請求項１〜６のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項８】
ブルクホルデリア  アルボリス（Burkholderia  arboris）に由来するポリペプチドである、請求項１〜７のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項９】
（Ａ）配列番号１、７、１５または１７に示す核酸配列を含むポリヌクレオチド；
（Ｂ）（Ａ）に示す核酸配列において、１ヌクレオチド以上の置換、付加、欠失またはそれらの組合せを含む核酸配列を含むポリヌクレオチド；
（Ｃ）（Ａ）または（Ｂ）に示す核酸配列と少なくとも７０％以上の配列同一性を有する核酸配列を含み、生物学的活性を有するポリペプチドをコードする、ポリヌクレオチド；
（Ｄ）（Ａ）〜（Ｃ）のいずれか１つに示す核酸配列またはその相補的配列を含むポリヌクレオチドと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸配列を含み、かつ生物学的活性を有するポリペプチドをコードする、ポリヌクレオチド；
（Ｅ）（Ａ）〜（Ｄ）のいずれか１つの核酸配列の対立遺伝子変異体であって、生物学的活性を有するポリペプチドをコードする、ポリヌクレオチド；または
（Ｆ）配列番号４、１１、１６または１８に示すアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする、ポリヌクレオチド；
（Ｇ）（Ｆ）のアミノ酸配列において、１アミノ酸以上の置換、付加、欠失またはそれらの組合せを含むアミノ酸配列を含み、生物学的活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
（Ｈ）（Ｆ）または（Ｇ）に示すアミノ酸配列と少なくとも７０％以上の配列同一性を有し、生物学的活性を有するポリペプチドをコードする、ポリヌクレオチド；または
（Ｉ）（Ｆ）〜（Ｈ）に示す核酸配列の断片を含む、ポリヌクレオチド、
である、ポリヌクレオチド。
【請求項１０】
前記生物学的活性は、トランス脂肪酸含有油脂の資化に関連する能力、またはトランス脂肪酸含有油脂を分解する能力である、請求項９に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１１】
４５〜７０℃が油脂を分解する能力の至適温度であるポリペプチドをコードする、請求項９または１０に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１２】
３５〜５５℃が油脂を分解する能力の至適温度であるポリペプチドをコードする、請求項９または１０に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１３】
６５℃以上において熱安定性を有するポリペプチドをコードする、請求項９〜１１のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１４】
７５℃以上において熱安定性を有するポリペプチドをコードする、請求項９、１０または１２のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１５】
前記ポリヌクレオチドは、１５℃において油脂を分解する能力を有するポリペプチドをコードする、請求項９〜１４のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１６】
ブルクホルデリア  アルボリス（Burkholderia  arboris）に由来するポリヌクレオチドである、請求項９〜１５のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１７】
請求項９〜１６のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドを含む細胞または無細胞発現系。
【請求項１８】
請求項１〜８のいずれか一項に記載のポリペプチド、または請求項９〜１６のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドを含む細胞もしくは無細胞発現系、または請求項１７に記載の細胞もしくは無細胞発現系を含む油分解剤。
【請求項１９】
さらなる油処理成分を含む、請求項１８に記載の油分解剤。
【請求項２０】
請求項１〜８のいずれか一項に記載のポリペプチド、または請求項９〜１６のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドを含む細胞もしくは無細胞発現系、請求項１７に記載の細胞もしくは無細胞発現系または請求項１８に記載の油分解剤と、さらなる油処理成分とを備える、油分解のためのキット。
【請求項２１】
請求項１〜８のいずれか一項に記載のポリペプチド、または請求項９〜１６のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドを含む細胞または無細胞発現系、請求項１７に記載の細胞または無細胞発現系または請求項１８もしくは１９に記載の油分解剤を処理対象に作用させることを包含する、油分解除去方法。
【請求項２２】
前記処理対象はトランス脂肪酸またはトランス脂肪酸含有油脂を含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
請求項１〜８のいずれか一項に記載のポリペプチド、または請求項９〜１６のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドを含む細胞もしくは無細胞発現系、または請求項１７に記載の細胞もしくは無細胞発現系を含む洗剤。
【請求項２４】
脂肪改変・油脂生産技術における、請求項１〜８のいずれか一項に記載のポリペプチド、または請求項９〜１６のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドを含む細胞または無細胞発現系、請求項１７に記載の細胞または無細胞発現系または請求項１８もしくは１９に記載の油分解剤の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本開示は、トランス脂肪酸含有油脂を分解する新規リパーゼ、およびその応用（例えば、排水処理、油処理）に関する。別の局面では、本開示は、高温でも油脂を分解する新規リパーゼおよびその応用に関する。
【背景技術】
【０００２】
一般家庭、外食産業、工業用設備などで発生する汚れの代表的なものとして、油汚れが挙げられる。油汚れは、台所、流し、厨房、パイプ、排水溝、換気扇、洗濯などといった場面で生じる洗浄が困難な汚れである。油汚れは、悪臭や害虫の発生源となり、環境汚染も生じさせ得るものであるため、油処理における画期的な技術の確立が、公衆衛生面および環境面の両面から切望されている。【０００３】
外食産業の厨房排水に含まれる油分を固液分離により除く処理設備であるグリーストラップは悪臭や害虫の発生源であること、分離した油の回収や運搬、清掃等のメンテナンスに労苦やコストがかかることなどを考慮すると、グリーストラップ内の油を消滅させるような画期的な技術の確立が、外食産業を中心とする産業界から切望されている。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明者らは、鋭意研究した結果、トランス脂肪酸含有油脂を分解するリパーゼを見出した。このリパーゼは、高温でも油脂を分解する能力を有し、熱安定性に優れている局面も見いだされた。本開示は、本開示のリパーゼの応用、例えば油処理等にも関する。【０００５】
したがって、本開示は、以下を提供する。
（項目１）
（ａ）配列番号４、１１、１６または１８に示すアミノ酸配列を含むポリペプチド；
（ｂ）（ａ）のアミノ酸配列において、１アミノ酸以上の置換、付加、欠失またはそれらの組合せを含むアミノ酸配列を含み、生物学的活性を有するポリペプチド；
（ｃ）（ａ）または（ｂ）に示すアミノ酸配列と少なくとも７０％以上の配列同一性を有し、生物学的活性を有するポリペプチド；
（ｄ）配列番号１、７、１５または１７に示す核酸配列によってコードされるアミノ酸配列を含むポリペプチド；
（ｅ）（ｄ）に示す核酸配列において、１ヌクレオチド以上の置換、付加、欠失またはそれらの組合せを含む核酸配列によってコードされ、生物学的活性を有するポリペプチド；
（ｆ）（ｄ）または（ｅ）に示す核酸配列と少なくとも７０％以上の配列同一性を有する核酸配列によってコードされ、生物学的活性を有するポリペプチド；
（ｇ）（ｄ）〜（ｆ）のいずれか１つに示す核酸配列またはその相補的配列を含むポリヌクレオチドと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸配列によってコードされ、かつ生物学的活性を有するポリペプチド；
（ｈ）（ｄ）〜（ｇ）のいずれか１つの核酸配列の対立遺伝子変異体によってコードされ、生物学的活性を有するポリペプチド；または
（ｉ）（ａ）〜（ｈ）に示すアミノ酸配列の断片を含む、ポリペプチド、
である、ポリペプチド。
（項目２）
前記生物学的活性は、トランス脂肪酸含有油脂の資化に関連する能力、またはトランス脂肪酸含有油脂を分解する能力である、項目１に記載のポリペプチド。
（項目３）
４５〜７０℃が油脂を分解する能力の至適温度である、項目１または２に記載のポリペプチド。
（項目４）
３５〜５５℃が油脂を分解する能力の至適温度である、項目１〜３のいずれか一項に記載のポリペプチド。
（項目５）
６５℃以上で、好ましくは８５℃以下において熱安定性を有する、項目１〜４のいずれか一項に記載のポリペプチド。
（項目６）
７５℃以上で、好ましくは８０℃以下において熱安定性を有する、項目１〜５のいずれか一項に記載のポリペプチド。
（項目７）
１５℃において油脂を分解する能力を有する、項目１〜６のいずれか一項に記載のポリペプチド。
（項目８）
ブルクホルデリア  アルボリス（Burkholderia  arboris）に由来するポリペプチドである、項目１〜７のいずれか一項に記載のポリペプチド。
（項目９）
（Ａ）配列番号１、７、１５または１７に示す核酸配列を含むポリヌクレオチド；
（Ｂ）（Ａ）に示す核酸配列において、１ヌクレオチド以上の置換、付加、欠失またはそれらの組合せを含む核酸配列を含むポリヌクレオチド；
（Ｃ）（Ａ）または（Ｂ）に示す核酸配列と少なくとも７０％以上の配列同一性を有する核酸配列を含み、生物学的活性を有するポリペプチドをコードする、ポリヌクレオチド；
（Ｄ）（Ａ）〜（Ｃ）のいずれか１つに示す核酸配列またはその相補的配列を含むポリヌクレオチドと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸配列を含み、かつ生物学的活性を有するポリペプチドをコードする、ポリヌクレオチド；
（Ｅ）（Ａ）〜（Ｄ）のいずれか１つの核酸配列の対立遺伝子変異体であって、生物学的活性を有するポリペプチドをコードする、ポリヌクレオチド；または
（Ｆ）配列番号４、１１、１６または１８に示すアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする、ポリヌクレオチド；
（Ｇ）（Ｆ）のアミノ酸配列において、１アミノ酸以上の置換、付加、欠失またはそれらの組合せを含むアミノ酸配列を含み、生物学的活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
（Ｈ）（Ｆ）または（Ｇ）に示すアミノ酸配列と少なくとも７０％以上の配列同一性を有し、生物学的活性を有するポリペプチドをコードする、ポリヌクレオチド；または
（Ｉ）（Ｆ）〜（Ｈ）に示す核酸配列の断片を含む、ポリヌクレオチド、
である、ポリヌクレオチド。
（項目１０）
前記生物学的活性は、トランス脂肪酸含有油脂の資化に関連する能力、またはトランス脂肪酸含有油脂を分解する能力である、項目９に記載のポリヌクレオチド。
（項目１１）
４５〜７０℃が油脂を分解する能力の至適温度であるポリペプチドをコードする、項目９または１０に記載のポリヌクレオチド。
（項目１２）
３５〜５５℃が油脂を分解する能力の至適温度であるポリペプチドをコードする、項目９〜１１のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
（項目１３）
６５℃以上で、好ましくは８５℃以下において熱安定性を有するポリペプチドをコードする、項目９〜１２のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
（項目１４）
７５℃以上で、好ましくは８０℃以下において熱安定性を有するポリペプチドをコードする、項目９〜１３のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
（項目１５）
前記ポリヌクレオチドは、１５℃において油脂を分解する能力を有するポリペプチドをコードする、項目９〜１４のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
（項目１６）
ブルクホルデリア  アルボリス（Burkholderia  arboris）に由来するポリヌクレオチドである、項目９〜１５のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
（項目１７）
項目９〜１６のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドを含む細胞または無細胞発現系。
（項目１８）
項目１〜８のいずれか一項に記載のポリペプチド、項目９〜１６のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドを含む細胞もしくは無細胞発現系、または項目１７に記載の細胞もしくは無細胞発現系を含む油分解剤。
（項目１９）
さらなる油処理成分を含む、項目１８に記載の油分解剤。
（項目２０）
項目１〜８のいずれか一項に記載のポリペプチド、または項目９〜１６のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドを含む細胞または無細胞発現系、項目１７に記載の細胞もしくは無細胞発現系、または項目１８に記載の油分解剤と、さらなる油処理成分とを備える、油分解のためのキット。
（項目２１）
項目１〜８のいずれか一項に記載のポリペプチド、または項目９〜１６のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドを含む細胞または無細胞発現系、項目１７に記載の細胞または無細胞発現系または項目１８もしくは１９に記載の油分解剤を処理対象に作用させることを包含する、油分解除去方法。
（項目２２）
前記処理対象はトランス脂肪酸またはトランス脂肪酸含有油脂を含む、項目２１に記載の方法。
（項目２３）
項目１〜８のいずれか一項に記載のポリペプチド、項目９〜１６のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドを含む細胞もしくは無細胞発現系、または項目１７に記載の細胞もしくは無細胞発現系を含む洗剤。
（項目２４）
脂肪改変・油脂生産技術（エステル交換等）における、項目１〜８のいずれか一項に記載のポリペプチド、または項目９〜１６のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドを含む細胞または無細胞発現系、項目１７に記載の細胞または無細胞発現系または項目１８もしくは１９に記載の油分解剤の使用。【０００６】
本開示において、上記１または複数の特徴は、明示された組み合わせに加え、さらに組み合わせて提供されうることが意図される。本開示のなおさらなる実施形態および利点は、必要に応じて以下の詳細な説明を読んで理解すれば、当業者に認識される。
【発明の効果】
【０００７】
本開示のリパーゼを使用して、従来除去が困難であったトランス脂肪酸含有油脂の処理が容易になった。また、従来の微生物や酵素では使用が難しかった高温環境下や低温環境下でも油脂除去や油処理ができるようになった。したがって、本開示の新規リパーゼは、洗剤、皮革工業、食品工業、油脂による環境汚染の浄化、生ごみ処理、コンポスト化処理、排水処理などの廃棄物処理および堆肥化、消化剤などの医薬品、脂性肌のための化粧品などの技術分野に有用である。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】図１は、油脂を添加した場合の本開示のリパーゼをコードする遺伝子の発現レベルを示す。ＫＨ−１株をトリオレイン、オレイン酸、エライジン酸またはトリエライジンを含む無機塩培地中で、２８℃で６時間培養した後、ＫＨ−１株からＲＮＡを抽出し、定量ＲＴ−ＰＣＲによって、本開示のリパーゼ遺伝子の発現レベルを定量した。Ｏｌｅはオレイン酸培養を示し、ＴＯｌｅはトリオレイン培養を示し、ＥＤはエライジン酸培養を示し、ＴＥＤはトリエライジン培養での結果を示す。発現レベルは、ｒｐｏＤ遺伝子の発現量で正規化し、オレイン酸培養またはトリオレインでの発現レベルを１としたときの相対値として示す。（Ａ）はトリオレインでの発現レベルを１としたときの相対値を示し、（Ｂ）はオレイン酸での発現レベルを１としたときの相対値を示す。上段のグラフは第１のリパーゼ遺伝子の代表的配列のものの発現レベルを示し、下段のグラフは第２のリパーゼ遺伝子の代表的配列のものの発現レベルを示す。エラーバーは標準偏差を示す。
【図２】図２は、２８℃で培養したＫＨ−１株培養上清からの本開示の第１のリパーゼの代表的配列のものの精製を示す。２８℃で培養したＫＨ−１株の培養上清を、疎水性カラムクロマトグラフィーによって精製した。溶出画分をＣＢＢ染色により解析した結果を示す。左から、溶出された画分の番号を示し、左側に分子量を示す。
【図３】図３は、１５℃で培養したＫＨ−１株培養上清からの本開示の第２のリパーゼの代表的配列のものの精製を示す。１５℃で培養したＫＨ−１株の培養上清を、疎水性カラムクロマトグラフィーによって精製した。溶出画分をＣＢＢ染色により解析した結果を示す。左から、溶出された画分の番号を示し、左側に分子量を示す。
【図４】図４は、左から、第１のリパーゼの代表的配列のものの至適温度（Ａ）、熱安定性（Ｂ）、至適ｐＨ（Ｃ）およびｐＨ安定性（Ｄ）を示す。（Ａ）〜（Ｄ）のグラフの縦軸は、相対的なリパーゼ活性を示し、（Ａ）および（Ｂ）の横軸は温度を示し、（Ｃ）および（Ｄ）の横軸はｐＨを示す。（Ｃ）および（Ｄ）において、「〇」は酢酸緩衝液を使用してｐＨ３．０〜５．０の範囲で解析した結果を示し、「▲」はリン酸ナトリウム緩衝液を使用してｐＨ５．０〜７．０の範囲で解析した結果を示し、「□」はＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液を使用してｐＨ７．０〜９．０の範囲で解析した結果を示し、「△」はＣＡＰＳ緩衝液を使用してｐＨ９．０〜１１．０の範囲で解析した結果を示す。エラーバーは標準偏差を示す。
【図５】図５は、左から、第２のリパーゼの代表的配列のものの至適温度（Ａ）、熱安定性（Ｂ）、至適ｐＨ（Ｃ）およびｐＨ安定性（Ｄ）を示す。（Ａ）〜（Ｄ）のグラフの縦軸は、相対的なリパーゼ活性を示し、（Ａ）および（Ｂ）の横軸は温度を示し、（Ｃ）および（Ｄ）の横軸はｐＨを示す。（Ｃ）および（Ｄ）において、「〇」は酢酸緩衝液を使用してｐＨ３．０〜５．０の範囲で解析した結果を示し、「▲」はリン酸ナトリウム緩衝液を使用してｐＨ５．０〜７．０の範囲で解析した結果を示し、「□」はＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液を使用してｐＨ７．０〜９．０の範囲で解析した結果を示し、「△」はＣＡＰＳ緩衝液を使用してｐＨ９．０〜１１．０の範囲で解析した結果を示す。エラーバーは標準偏差を示す。
【図６】図６は、第１および第２のリパーゼの代表的配列のものを含む培養上清と油用洗剤および一般洗剤との、換気扇汚れの分解活性を比較した結果を示す。左上のフィルターは、油が付着した処理前のフィルターであり、上段の中央および右側は、ＫＨ−１培養上清にそれぞれ３０分間および１時間浸漬させたフィルターを示す。中段の中央および右側は、油用洗剤にそれぞれ２時間および４時間浸漬させたフィルターを示す。下段の中央および右側は、一般洗剤にそれぞれ２時間および４時間浸漬させたフィルターを示す。
【図７】図７は、第１のリパーゼの代表的配列のものおよび第２のリパーゼの代表的配列のものとＮｏｖｏｚｙｍ（登録商標）５１０３２リパーゼ（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ）との、換気扇汚れの分解活性の比較を示す。（Ａ）左側は、Ｎｏｖｏｚｙｍ５１０３２リパーゼ（Ｎ−５１０３２）に30分間浸漬させた後の換気扇フィルターの写真を示し、右側は、換気扇フィルターを浸漬させた後のＮｏｖｏｚｙｍ５１０３２リパーゼの溶液の写真を示す。（Ｂ）左側は、第１のリパーゼの代表的配列のものに30分間浸漬させた後の換気扇フィルターの写真を示し、右側は、換気扇フィルターを浸漬させた後の第１のリパーゼの代表的配列のものの溶液の写真を示す。（Ｃ）左側は、第２のリパーゼの代表的配列のものに30分間浸漬させた後の換気扇フィルターの写真を示し、右側は、換気扇フィルターを浸漬させた後の第２のリパーゼの代表的配列のものの溶液の写真を示す。
【図８】図８は、第１のリパーゼの代表的配列のものによるラードおよびショートニングの分解活性を示す。第１のリパーゼの代表的配列のものは、２８℃で培養したＫＨ−１株から疎水性カラムクロマトグラフィーによって精製した。（Ａ）は緩衝液または第１のリパーゼの代表的配列のものとインキュベートしたラードを示し、（Ｂ）は緩衝液または第１のリパーゼの代表的配列のものとインキュベートしたショートニングを示し、（Ｃ）は抽出した油脂を薄層クロマトグラフィーによって分離した結果を示す。
【図９】図９は、第２のリパーゼの代表的配列のものによるラードおよびショートニングの分解活性を示す。第２のリパーゼの代表的配列のものは、１５℃で培養したＫＨ−１株から疎水性カラムクロマトグラフィーによって精製した。（Ａ）は緩衝液または第２のリパーゼの代表的配列のものとインキュベートしたラードを示し、（Ｂ）は緩衝液または第２のリパーゼの代表的配列のものとインキュベートしたショートニングを示し、（Ｃ）は抽出した油脂を薄層クロマトグラフィーによって分離した結果を示す。
【図１０】図１０は、ＫＨ−１株およびＢＲ３２００（BioRemove3200、Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ）によるトランス脂肪酸含有排水の処理試験を示す。（Ａ）はトランス脂肪酸含有排水を与え、ＫＨ−１株およびＢＲ３２００を２４時間または４８時間培養した後の、排水中の油脂を薄層クロマトグラフィーによって分離した結果を示し、（Ｂ）はＫＨ−１株培養後およびＢＲ３２００培養後の排水中の油分濃度を示す。
【図１１】図１１は、第１のリパーゼの代表的配列のものによる、３７℃条件下でのトリオレインおよびトリエライジンの分解を示す。左側はトリオレインの分解を示し、右側はトリエライジンの分解を示す。ＴＯｌｅはトリオレインを示し、ＴＥＤはトリエライジンを示す。各プレートの上側にトリグリセリド（トリオレインまたはトリエライジン）のシグナルを示し、下側に遊離脂肪酸（オレイン酸またはエライジン酸）のシグナルを示す。対照として酵素を含まない緩衝液だけによる処理結果も示す。
【図１２】図１２は、第２のリパーゼの代表的配列のものによる、３７℃条件下でのトリオレインおよびトリエライジンの分解を示す。左側はトリオレインの分解を示し、右側はトリエライジンの分解を示す。ＴＯｌｅはトリオレインを示し、ＴＥＤはトリエライジンを示す。各プレートの上側にトリグリセリドのシグナルを示し、下側に遊離脂肪酸のシグナルを示す。対照として酵素を含まない緩衝液だけによる処理結果も示す。
【図１３】図１３は、本開示のリパーゼによる、１５℃条件下でのトリオレインおよびトリエライジンの分解を示す。ＫＨ−１株培養上清から、Ｂｕｔｙｌ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラムによって、第１のリパーゼの代表的配列のものおよび第２のリパーゼの代表的配列のものを精製し、トリエライジンまたはトリオレインと混合し、１５℃で２４時間処理した。左側はトリオレインの処理を示し、右側はトリエライジンの処理を示す。各プレートにおいて、左側は第２のリパーゼの代表的配列のものを含む溶液による処理を示し、右側は第１のリパーゼの代表的配列のものを含む溶液による処理を示す。各プレートの上側にトリグリセリド（トリオレインまたはトリエライジン）のシグナルを示し、下側に遊離脂肪酸（オレイン酸またはエライジン酸）のシグナルを示す。
【図１４】図１４は、本開示の第１および第２のリパーゼによる、トリオレインの脂肪改変を示す。第１および第２のリパーゼの代表的配列のもの、または緩衝液単独をメタノールおよびトリオレインと混合して反応させたもの、ならびにオレイン酸メチル評品をＴＬＣ分析により解析した結果を示す。各シグナルは、上から順に、オレイン酸メチルエステル、トリオレイン、オレイン酸およびジアシルグリセロールに対応する。
【図１５】図１５は、本開示の第１および第２のリパーゼによる、トランス脂肪酸の脂肪改変を示す。（Ａ）第１および第２のリパーゼの代表的配列のもの、または緩衝液単独をメタノールおよびパルミテライジン酸と混合して反応させたもの、ならびにパルミテライジン酸メチル評品をＴＬＣ分析により解析した結果を示す。各シグナルは、上から順に、パルミテライジン酸メチルエステルおよびパルミテライジン酸に対応する。（Ｂ）第１および第２のリパーゼの代表的配列のもの、または緩衝液単独をメタノールおよびバクセン酸と混合して反応させたもの、ならびにバクセン酸メチル評品をＴＬＣ分析により解析した結果を示す。各シグナルは、上から順に、バクセン酸メチルエステルおよびバクセン酸に対応する。
【図１６】図１６は、本発明の第１のリパーゼの改変体の油脂分解活性を示す。左側はトリオレイン（ＴＯｌｅ）の分解を示し、右側はトリエライジン（ＴＥＤ）の分解を示す。各写真において、左側のレーンは緩衝液単独による処理の結果を示し、右側のレーンは第１のリパーゼの改変体による処理の結果を示す。各写真において、上部の矢印は分解されていない油脂に対応し、下部の矢印は遊離脂肪酸に対応する。
【図１７】図１７は、本発明の第２のリパーゼの改変体の油脂分解活性を示す。左側はトリオレイン（ＴＯｌｅ）の分解を示し、右側はトリエライジン（ＴＥＤ）の分解を示す。各写真において、左側のレーンは緩衝液単独による処理の結果を示し、右側のレーンは第２のリパーゼの改変体による処理の結果を示す。各写真において、上部の矢印は分解されていない油脂に対応し、下部の矢印は遊離脂肪酸に対応する。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
以下、本開示を最良の形態を示しながら説明する。本明細書の全体にわたり、単数形の表現は、特に言及しない限り、その複数形の概念をも含むことが理解されるべきである。従って、単数形の冠詞（例えば、英語の場合は「ａ」、「ａｎ」、「ｔｈｅ」など）は、特に言及しない限り、その複数形の概念をも含むことが理解されるべきである。また、本明細書において使用される用語は、特に言及しない限り、当該分野で通常用いられる意味で用いられることが理解されるべきである。したがって、他に定義されない限り、本明細書中で使用されるすべての専門用語および科学技術用語は、本開示の属する分野の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。矛盾する場合、本明細書（定義を含めて）が優先する。
【００１０】
以下に本明細書において特に使用される用語の定義および／または基本的技術内容を適宜説明する。
【００１１】
（用語の定義）
本明細書において「リパーゼ」とは、エステラーゼの一種であり、中性脂肪(グリセロールエステル)を加水分解して，脂肪酸とグリセロールに分解する反応を可逆的に触媒する酵素をいう。本開示のリパーゼは、酵素番号（ＥＣ番号）でEC3.1.1.3に分類される、トリグリセロールリパーゼに分類される。
【００１２】
本明細書において、リパーゼ活性は、パルミチン酸と４−ニトロフェノールとのエステルである４−ニトロフェニルパルミテート（４−ＮＰＰ）を基質として用いて酵素反応を行い、エステルの加水分解により生じたｐ−ニトロフェノールの量を４１０ｎｍの吸光度を測定することによって決定できる。まず、４−ＮＰＰ（１８．９ｍｇ）を３％（ｖ／ｖ）ＴｒｉｔｏｎＸ―１００（１２ｍｌ）に加え、７０℃で溶解して基質溶液とする。基質溶液１ｍＬ、イオン交換水０．９ｍＬおよび１５０ｍＭ  ＧＴＡ緩衝液（１５０ｍＭ  ３，３−ｄｉｍｅｔｈｙｌｇｌｕｔａｒｉｃ  ａｃｉｄ，１５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ，および１５０ｍＭ  ２−ａｍｉｎｏ−２−ｍｅｔｈｙｌ−１，３−ｐｒｏｐａｎｅｄｉｏｌにＮａＯＨまたはＨＣｌを加えてｐＨ７．０に調製）１ｍＬをセルに入れ、２８℃で５分間保温する。これに培養上清を０．１ｍＬ添加して、攪拌しながら４１０ｎｍの値を測定する。リパーゼ活性は、１μモルの４−ニトロフェノールを生産する酵素量を１ユニット（Ｕ）と定義して活性測定を行い、培養上清１ｍＬ当たりのユニットを算出する。
【００１３】
油脂と脂肪酸の分解・消費能力は、培地中に残存する油脂および加水分解により生じた遊離脂肪酸を薄層クロマトグラフィーにより解析することで測定できる。具体的な定量手順を示すと、まず、培養上清に等量のクロロホルムを加えることによって、油脂を抽出する。この抽出物５μｌを、クロロホルム、アセトンおよびメタノールを、体積比でそれぞれ９６：４：１の比率で含む展開溶媒を使用し、シリカゲルコートプレート上に展開する。プレートをモリブデン酸ｎ水和物により処理し、油脂を発色させる。
【００１４】
本明細書において、「トランス脂肪酸含有油脂」とは、トランス脂肪酸を含有する油脂を指す。「トランス脂肪酸」は、本技術分野において通常使用される意味で使用され、トランス型の二重結合を有する不飽和脂肪酸を意味する。トランス脂肪酸は、天然には共役リノール酸やバクセン酸として微量に存在するが、油脂工業においては不飽和脂肪酸の水素化によって飽和脂肪酸を製造する際に多量に生産され、マーガリンおよびショートニングなどの食品にも含まれる。トランス脂肪酸には、エライジン酸、パルミテライジン酸（パルミトエライジン酸）、バクセン酸などが包含されるが、本明細書中で言及する場合、トランス脂肪酸の種類に特に制限はない。トランス脂肪酸含有油脂中に存在するトランス脂肪酸の比率は、特に限定されない。
【００１５】
本明細書において、「トランス脂肪酸含有油脂の資化に関連する能力」とは、微生物によるトランス脂肪酸含有油脂の資化をもたらすための活性を指す。本明細書において、「トランス脂肪酸含有油脂を資化する」は、本技術分野において通常使用される意味で使用され、微生物がトランス脂肪酸含有油脂を炭素源などの栄養源として取り込むことを意味する。「資化」する場合、グリセロールと遊離脂肪酸とに加水分解することのほか、他の物質の一部に変化することも含まれる。
【００１６】
本明細書において、「トランス脂肪酸含有油脂を分解する能力」とは、トランス脂肪酸含有油脂を、グリセロールと遊離脂肪酸とに加水分解する活性を指す。
【００１７】
本明細書において、（各温度での）「油脂を分解する能力」は、以下のように測定する。すなわち、本明細書中に記載の方法によりリパーゼを精製し、測定すべき温度設定での恒温下でリパーゼとｐ−ニトロフェニルパルミテートとを混合し、４１０ｎｍにおける吸光度を計測することによって測定することができる。代替的に、本明細書中に記載の方法により、ＫＨ−１株またはその誘導株の培養上清を回収し、リパーゼを含む培養上清または粗精製リパーゼ液を恒温下でｐ−ニトロフェニルパルミテートと混合し、４１０ｎｍにおける吸光度を計測することによって測定することができる。
【００１８】
本明細書において、油脂を分解する能力の「至適温度」とは、本技術分野において通常使用される意味で使用され、油脂を分解する活性が一定レベルの所望以上（例えば、その酵素がもつ最大レベルの８０％以上の活性が保持される温度範囲を言うが、別の実施形態では、最大のレベルをさすこともある。）にある温度を指す。具体的には、本開示の第１のリパーゼは、油脂を分解する活性のピークが約６０℃であり、約４５〜７０℃の範囲でピークの８０％以上の活性を保持する。本開示の第２のリパーゼは、油脂を分解する活性のピークが約５０℃であり、約３５〜５５℃の範囲でピークの８０％以上の活性を保持する。本開示のリパーゼの至適温度について言及する文脈において、本開示の第１のリパーゼの至適温度は、４５〜７５℃、好ましくは５０〜７０℃、より好ましくは５５〜６５℃、さらに好ましくは５８〜６３℃、最も好ましくは６０℃であることを意図する。本開示の第２リパーゼの至適温度は、３５〜５５℃、好ましくは４０〜５５℃、より好ましくは４５〜５０℃であることを意図する。他の実施形態では、本開示のリパーゼは、至適温度を変更するように改変することもでき、その至適温度の下限としては、２０℃、２５℃、３０℃、３５℃、４０℃、４５℃、５０℃、５５℃、６０℃など（あるいは、これらの間の温度で１℃ずつ変更したもの）であってもよく、上限としては、４５℃、５０℃、５５℃、６０℃、６５℃、７０℃、７５℃、８０℃（あるいは、これらの間の温度で１℃ずつ変更したもの）であってもよい。
【００１９】
本明細書において、「熱安定性」とは、「温度安定性」、「耐熱性」などの用語と同様の意味を有し、本技術分野において通常使用される意味で使用され、酵素が高温で活性を保持することを意味する。一般に、酵素は、５０℃程度の温度で分子構造の変化などの要因により、失活することが知られている。これとは対照的に、本開示の第１のリパーゼの場合、一例として、３０℃で３０分処理後の酵素活性を１００％とした場合の相対的な酵素活性は、約３０〜約８５℃程度の温度の範囲で３０分処理後でも１００％以上であり、９０℃で３０分処理後であっても約３０％の酵素活性を保持するため、本開示のリパーゼは、高い熱安定性を有するといえる。本開示の第２のリパーゼの場合、７０℃で３０分処理後の酵素活性を１００％とした場合の相対的な酵素活性は、一例として、約１５〜約７５℃程度の温度の範囲で３０分処理後でも９０％以上を、８０℃でも８０％程度を保持する。本明細書において、「熱安定性を保持する」などと同様の表現は、３０℃程度での３０分処理後の酵素活性を１００％とした場合の相対的な酵素活性が、概ね５０％以上保持されることを意味する。
【００２０】
本明細書において、油脂を分解する能力の「至適ｐＨ」とは、本技術分野において通常使用される意味で使用され、油脂を分解する活性が一定レベル以上（例えば、その酵素がもつ最大レベルの８０％以上の活性が保持されるｐＨ範囲を言うが、別の実施形態では、最大のレベルをさすこともある。）のときのｐＨを指す。本開示の第１および第２のリパーゼは、いずれも油脂を分解する活性のピークが約ｐＨ９であり、約ｐＨ７．５〜ｐＨ９．５の範囲でピークの８０％以上の活性を保持する。第１および第２のリパーゼの至適ｐＨについて言及する文脈において、本開示の（第１および第２の両方）リパーゼの至適ｐＨは、ｐＨ７．５〜ｐＨ９．５、好ましくはｐＨ８．０〜ｐＨ９．３、より好ましくはｐＨ９であることを意図する。
【００２１】
本明細書において、「ブルクホルデリア  アルボリス（Burkholderia  arboris）」とは、生物分類学上のブルクホルデリア（バークホルデリア）属アルボリス種を意味する。本明細書におけるブルクホルデリア  アルボリス種ＫＨ−１株は、少なくとも２種類のリパーゼ（すなわち本開示の「第１のリパーゼ」の代表的配列および「第２のリパーゼ」の代表的配列）をコードする遺伝子を有する。本開示のリパーゼは、ブルクホルデリア  アルボリス種に属するＫＨ−１株またはその誘導株によって生産されるものを包含するが、これに限定されない。
【００２２】
本明細書において、「無細胞発現系」とは、本技術分野において通常使用される意味で使用され、細胞から抽出される生体分子の転写翻訳機構を使用して、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで目的の組換えタンパク質を生産する系を指す。本開示のリパーゼを生産するための無細胞発現系としては、特に限定されないが、大腸菌などの原核生物由来の無細胞発現系を利用することができる。
【００２３】
本明細書において、「油処理成分」とは、油脂の資化および分解を補助する成分を意味する。具体的には、バイオサーファクタントなどの、油脂の分散化を促進する成分、油脂を脂肪酸とグリセロールとに分解する成分のほか、脂肪酸を分解するもの、グリセロールを分解するもののほか、油を吸着して処理の対象物から除去するものなどを包含する。一局面では、油処理成分には、ＫＨ−１株が産生するバイオサーファクタントなどが含まれる。
【００２４】
本明細書において「油分解剤」とは、本開示のブルクホルデリア  アルボリス種ＫＨ−１細菌株またはこの細菌株によって産生される本開示の第１または第２のリパーゼを有効成分とする、油脂の分解が可能な製剤を指す。本開示において、油分解剤は、油処理成分と併用して使用されてもよい。この場合の油分解剤と油処理成分との併用使用のタイミングは、同時に使用しても、いずれか片方を先に使用することにしてもよい。さらに、油分解剤には、使用する細菌株または細菌株由来のリパーゼの活性を高める成分（例えば炭素源、窒素源）、界面活性剤、乾燥保護剤、細菌を長期間維持するための成分、防腐剤、賦形剤、強化剤、酸化防止剤等を更に含有させてもよい。
本開示で提供される油分解剤は液体又は固体ないし乾燥体の状態で提供される。液体形状としては、細菌の培養液（必要に応じて濃縮又は希釈してもよい）、培養上清、培養液由来の酵素成分を支持体に吸着させたもの、培養液から酵素を分離精製して溶媒に懸濁させたものなどを例示できる。また、固体については、グリセロールなどの保護剤を含む溶媒に懸濁し凍結させたもの、担体に固定化させたもの（担体に共有結合、静電相互作用・疎水性相互作用などにより吸着させたもの、担体に分子架橋させたものなど）、遠心分離やプレス圧縮等により脱水したもの、さらには乾燥した乾燥体などを例示できる。好ましい実施形態では、油分解剤は、代表的には、液体形状、粉末、顆粒の形状で提供され、洗剤としてまたは洗剤の成分として他の成分とともに含有されて提供され得る。
【００２５】
本明細書で使用される（リパーゼ等の）「誘導体」、「類似体」または「変異体」は、好ましくは、限定を意図するものではないが、対象となるタンパク質（例えば、リパーゼ）に実質的に相同な領域を含む分子を含み、このような分子は、種々の実施形態において、同一サイズのアミノ酸配列にわたり、または当該分野で公知のコンピュータ相同性プログラムによってアラインメントを行ってアラインされる配列と比較した際、少なくとも30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％または99％同一であるか、あるいはこのような分子をコードする核酸は、（高度に）ストリンジェントな条件、中程度にストリンジェントな条件、またはストリンジェントでない条件下で、構成要素タンパク質をコードする配列にハイブリダイズ可能である。これは、それぞれ、アミノ酸置換、欠失および付加によって、タンパク質を改変した産物であり、その誘導体がなお元のタンパク質の生物学的機能を、必ずしも同じ度合いでなくてもよいが示すタンパク質を意味する。例えば、本明細書において記載されあるいは当該分野で公知の適切で利用可能なｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイによって、このようなタンパク質の生物学的機能を調べることも可能である。本明細書で使用される「機能的に活性な」または「機能的活性を有する」は、本明細書において、本開示のポリペプチド、すなわちフラグメントまたは誘導体が関連する態様に従って、生物学的活性などの、タンパク質の構造的機能、制御機能、または生化学的機能を有することを指す。
【００２６】
本開示において、リパーゼのフラグメントとは、リパーゼの任意の領域を含むポリペプチドであり、本開示の目的（例えば、トランス脂肪酸含有油脂の分解）として機能する限り、必ずしも天然のリパーゼの生物学的機能のすべてを有していなくてもよい。
【００２７】
本明細書において「タンパク質」、「ポリペプチド」、「オリゴペプチド」および「ペプチド」は、本明細書において同じ意味で使用され、任意の長さのアミノ酸のポリマーをいう。このポリマーは、直鎖であっても分岐していてもよく、環状であってもよい。アミノ酸は、天然のものであっても非天然のものであってもよく、改変されたアミノ酸であってもよい。この用語はまた、複数のポリペプチド鎖の複合体へとアセンブルされたものを包含し得る。この用語はまた、天然または人工的に改変されたアミノ酸ポリマーも包含する。そのような改変としては、例えば、ジスルフィド結合形成、グリコシル化、脂質化、アセチル化、リン酸化または任意の他の操作もしくは改変（例えば、標識成分との結合体化）が包含される。この定義にはまた、例えば、アミノ酸の1または2以上のアナログを含むポリペプチド（例えば、非天然アミノ酸などを含む）、ペプチド様化合物（例えば、ペプトイド）および当該分野において公知の他の改変が包含される。本明細書において、「アミノ酸」は、アミノ基とカルボキシル基を持つ有機化合物の総称である。本開示の実施形態に係るタンパク質または酵素が「特定のアミノ酸配列」を含むとき、そのアミノ酸配列中のいずれかのアミノ酸が化学修飾を受けていてもよい。また、そのアミノ酸配列中のいずれかのアミノ酸が塩、または溶媒和物を形成していてもよい。また、そのアミノ酸配列中のいずれかのアミノ酸がL型、またはD型であってもよい。それらのような場合でも、本開示の実施形態に係る蛋白質は、上記「特定のアミノ酸配列」を含むといえる。蛋白質に含まれるアミノ酸が生体内で受ける化学修飾としては、例えば、N末端修飾（例えば、アセチル化、ミリストイル化等）、C末端修飾（例えば、アミド化、グリコシルホスファチジルイノシトール付加等）、または側鎖修飾（例えば、リン酸化、糖鎖付加等）等が知られている。アミノ酸は、本開示の目的を満たす限り、天然のものでも非天然のものでもよい。
【００２８】
本明細書において「ポリヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」および「核酸」は、本明細書において同じ意味で使用され、任意の長さのヌクレオチドのポリマーをいう。この用語はまた、「オリゴヌクレオチド誘導体」または「ポリヌクレオチド誘導体」を含む。「オリゴヌクレオチド誘導体」または「ポリヌクレオチド誘導体」とは、ヌクレオチドの誘導体を含むか、またはヌクレオチド間の結合が通常とは異なるオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドをいい、互換的に使用される。そのようなオリゴヌクレオチドとして具体的には、例えば、2’−O−メチル−リボヌクレオチド、オリゴヌクレオチド中のリン酸ジエステル結合がホスホロチオエート結合に変換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のリン酸ジエステル結合がN3’−P5’ホスホロアミデート結合に変換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のリボースとリン酸ジエステル結合とがペプチド核酸結合に変換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のウラシルがC−5プロピニルウラシルで置換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のウラシルがC−5チアゾールウラシルで置換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のシトシンがC−5プロピニルシトシンで置換されたオリゴヌクレオチド誘導体、オリゴヌクレオチド中のシトシンがフェノキサジン修飾シトシン（phenoxazine−modified  cytosine）で置換されたオリゴヌクレオチド誘導体、DNA中のリボースが2’−O−プロピルリボースで置換されたオリゴヌクレオチド誘導体およびオリゴヌクレオチド中のリボースが2’−メトキシエトキシリボースで置換されたオリゴヌクレオチド誘導体などが例示される。他にそうではないと示されなければ、特定の核酸配列はまた、明示的に示された配列と同様に、その保存的に改変された改変体（例えば、縮重コドン置換体）および相補配列を包含することが企図される。具体的には、縮重コドン置換体は、1またはそれ以上の選択された（または、すべての）コドンの3番目の位置が混合塩基および／またはデオキシイノシン残基で置換された配列を作成することにより達成され得る（Batzer  et  al.,  Nucleic  Acid  Res.19:5081(1991);Ohtsuka  et  al.,  J.  Biol.  Chem.  260:  2605-2608(1985);Rossolini  et  al.,  Mol.Cell.Probes  8:91-98(1994)）。本明細書において「核酸」はまた、遺伝子、cDNA、mRNA、オリゴヌクレオチド、およびポリヌクレオチドと互換可能に使用される。本明細書において「ヌクレオチド」は、天然のものでも非天然のものでもよい。
【００２９】
本明細書において「遺伝子」とは、遺伝形質を規定する因子をいい、「遺伝子」は、「ポリヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」および「核酸」をさすことがある。
【００３０】
本明細書において遺伝子の「相同性」とは、2以上の遺伝子配列の、互いに対する同一性の程度をいい、一般に「相同性」を有するとは、同一性または類似性の程度が高いことをいう。従って、ある2つの遺伝子の相同性が高いほど、それらの配列の同一性または類似性は高い。2種類の遺伝子が相同性を有するか否かは、配列の直接の比較、または核酸の場合ストリンジェントな条件下でのハイブリダイゼーション法によって調べられ得る。2つの遺伝子配列を直接比較する場合、その遺伝子配列間でDNA配列が、代表的には少なくとも50％同一である場合、好ましくは少なくとも70％同一である場合、より好ましくは少なくとも80％、90％、95％、96％、97％、98％または99％同一である場合、それらの遺伝子は相同性を有する。従って本明細書において「相同体」または「相同遺伝子産物」は、本明細書にさらに記載する複合体のタンパク質構成要素と同じ生物学的機能を発揮する、別の種、好ましくは微生物、より好ましくは細菌におけるタンパク質を意味する。こうような相同体はまた、「オルソログ遺伝子産物」とも称されることもある。本開示の目的に合致する限り、このような相同体、相同遺伝子産物、オルソログ遺伝子産物等も用いることができることが理解される。
【００３１】
アミノ酸は、その一般に公知の3文字記号か、またはIUPAC−IUB  Biochemical  Nomenclature  Commissionにより推奨される1文字記号のいずれかにより、本明細書中で言及され得る。ヌクレオチドも同様に、一般に認知された1文字コードにより言及され得る。本明細書では、アミノ酸配列および塩基配列の類似性、同一性および相同性の比較は、配列分析用ツールであるBLASTを用いてデフォルトパラメータを用いて算出される。同一性の検索は例えば、NCBIのBLAST2.7.1（2017.10.19発行）を用いて行うことができる。本明細書における「同一性」の値は通常は上記BLASTを用い、デフォルトの条件でアラインした際の値をいう。ただし、パラメータの変更により、より高い値が出る場合は、最も高い値を同一性の値とする。複数の領域で同一性が評価される場合はそのうちの最も高い値を同一性の値とする。「類似性」は、同一性に加え、類似のアミノ酸についても計算に入れた数値である。
【００３２】
本開示の一実施形態において「数個」は、例えば、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、または2個であってもよく、それらいずれかの値以下であってもよい。1または数個のアミノ酸残基の欠失、付加、挿入、または他のアミノ酸による置換を受けたポリペプチドが、その生物学的活性を維持することは知られている（Mark  et  al.,  Proc  Natl  Acad  Sci  USA.1984  Sep;81(18):  5662-5666.、Zoller  et  al.,Nucleic  Acids  Res.  1982  Oct  25;10(20):6487-6500.、Wang  et  al.,  Science.  1984  Jun  29;224(4656):1431-1433.）。欠失等がなされたタンパク質は、例えば、部位特異的変異導入法、ランダム変異導入法、またはタンパク質ファージライブラリを用いたバイオパニング等によって作製できる。部位特異的変異導入法としては、例えばKOD-Plus-  Mutagenesis  Kit  (TOYOBO  CO.,  LTD.)を使用できる。欠失等を導入した変異型タンパク質から、野生型と同様の活性のあるタンパク質を選択することは、FACS解析やELISA等の各種キャラクタリゼーションを行うことで可能である。
【００３３】
本開示の一実施形態において同一性等の数値である「70％以上」は、例えば、70％以上、75％以上、80％以上、85％以上、90％以上、95％以上、96％以上、97％以上、98％以上、99％以上、または100％であってもよく、それら起点となる数値のいずれか2つの値の範囲内であってもよい。上記「同一性」は、2つもしくは複数間のアミノ酸配列において相同なアミノ酸数の割合を、上述したような公知の方法に従って算定される。具体的に説明すると、割合を算定する前には、比較するアミノ酸配列群のアミノ酸配列を整列させ、同一アミノ酸の割合を最大にするために必要である場合はアミノ酸配列の一部に間隙を導入する。整列のための方法、割合の算定方法、比較方法、およびそれらに関連するコンピュータプログラムは、当該分野で従来からよく知られている(例えば、上述したBLAST等)。本明細書において「同一性」および「類似性」は、特に断りのない限りNCBIのBLASTによって測定された値で表すことができる。BLASTでアミノ酸配列を比較するときのアルゴリズムには、Blastpをデフォルト設定で使用できる。測定結果はPositivesまたはIdentitiesとして数値化される。
【００３４】
本明細書において「ストリンジェント（な）条件でハイブリダイズするポリヌクレオチド」とは、当該分野で慣用される周知の条件をいう。本開示のポリヌクレオチド中から選択されたポリヌクレオチドをプローブとして、コロニー・ハイブリダイゼーション法、プラーク・ハイブリダイゼーション法あるいはサザンブロットハイブリダイゼーション法などを用いることにより、そのようなポリヌクレオチドを得ることができる。具体的には、コロニーあるいはプラーク由来のDNAを固定化したフィルターを用いて、0．7〜1．0MのNaCl存在下、65℃でハイブリダイゼーションを行った後、0．1〜2倍濃度のSSC（saline-sodiumcitrate）溶液（1倍濃度のSSC溶液の組成は、150mM塩化ナトリウム、15mMクエン酸ナトリウムである）を用い、65℃条件下でフィルターを洗浄することにより同定できるポリヌクレオチドを意味する。「ストリンジェントな条件」は、例えば、以下の条件を採用することができる。(1)洗浄のために低イオン強度および高温度を用いる(例えば、50℃で、0.015Mの塩化ナトリウム/0.0015Mのクエン酸ナトリウム/0.1％のドデシル硫酸ナトリウム)、(2)ハイブリダイゼーション中にホルムアミド等の変性剤を用いる(例えば、42℃で、50％(v/v)ホルムアミドと0.1％ウシ血清アルブミン/0.1％フィコール/0.1％のポリビニルピロリドン/50mMのpH6.5のリン酸ナトリウムバッファー、および750mMの塩化ナトリウム、75mMクエン酸ナトリウム)、または(3)20％ホルムアミド、5×SSC、50mMリン酸ナトリウム(pH7.6)、5×デンハード液、10％硫酸デキストラン、および20mg/mlの変性剪断サケ精子DNAを含む溶液中で、37℃で一晩インキュベーションし、次に約37-50℃で1×SSCでフィルターを洗浄する。なお、ホルムアミド濃度は50％またはそれ以上であってもよい。洗浄時間は、5、15、30、60、もしくは120分、またはそれら以上であってもよい。ハイブリダイゼーション反応のストリンジェンシーに影響する要素としては温度、塩濃度など複数の要素が考えられ、詳細はAusubel  et  al.,  Current  Protocols  in  Molecular  Biology,  Wiley  Interscience  Publishers,(1995)を参照することができる。「高度にストリンジェントな条件」の例は、０．００１５Ｍ塩化ナトリウム、０．００１５Ｍクエン酸ナトリウム、６５〜６８℃、または０．０１５Ｍ塩化ナトリウム、０．００１５Ｍクエン酸ナトリウム、および５０％ホルムアミド、４２℃である。ハイブリダイゼーション、Molecular  Cloning  2nd  ed.,Current  Protocols  in  Molecular  Biology,  Supplement  1-38,  DNA  Cloning  1:Core  Techniques,  A  Practical  Approach,  Second  Edition,  Oxford  University  Press(1995)などの実験書に記載されている方法に準じて行うことができる。ここで、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする配列からは、好ましくは、A配列のみまたはT配列のみを含む配列が除外される。中程度のストリンジェントな条件は、例えば、ＤＮＡの長さに基づき、当業者によって、容易に決定することができ、Sambrookら、Molecular  Cloning:ALaboratory  Manual、第３番、Vol．１、７．４２−７．４５  Cold  Spring  Harbor  Laboratory  Press，2001に示され、そしてニトロセルロースフィルターに関し、５×ＳＳＣ、０．５％  ＳＤＳ、１．０ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）の前洗浄溶液、約４０−５０℃での、約５０％ホルムアミド、２×ＳＳＣ−６×ＳＳＣ（または約４２℃での約５０％ホルムアミド���の、スターク溶液（Ｓｔａｒｋ’ｓ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ）などの他の同様のハイブリダイゼーション溶液）のハイブリダイゼーション条件、および約６０℃、０．５×ＳＳＣ、０．１％  ＳＤＳの洗浄条件の使用が含まれる。従って、本開示において使用されるポリペプチドには、本開示で特に記載されたポリペプチドをコードする核酸分子に対して、高度または中程度でストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸分子によってコードされるポリペプチドも包含される。
【００３５】
本開示のリパーゼは、好ましくは「精製された」または「単離された」ものであり得る。本明細書において「精製された」物質または生物学的因子（例えば、核酸またはタンパク質など）とは、その物質または生物学的因子に天然に随伴する因子の少なくとも一部が除去されたものをいう。従って、通常、精製された生物学的因子におけるその生物学的因子の純度は、その生物学的因子が通常存在する状態よりも高い（すなわち濃縮されている）。本明細書中で使用される用語「精製された」は、好ましくは少なくとも75重量％、より好ましくは少なくとも85重量％、よりさらに好ましくは少なくとも95重量％、そして最も好ましくは少なくとも98重量％の、同型の生物学的因子が存在することを意味する。本開示で用いられる物質または生物学的因子は、好ましくは「精製された」物質である。本明細書で使用される「単離された」物質または生物学的因子（例えば、核酸またはタンパク質など）とは、その物質または生物学的因子に天然に随伴する因子が実質的に除去されたものをいう。本明細書中で使用される用語「単離された」は、その目的に応じて変動するため、必ずしも純度で表示される必要はないが、必要な場合、好ましくは少なくとも75重量％、より好ましくは少なくとも85重量％、よりさらに好ましくは少なくとも95重量％、そして最も好ましくは少なくとも98重量％の、同型の生物学的因子が存在することを意味する。本開示で用いられる物質は、好ましくは「単離された」物質または生物学的因子である。
【００３６】
本明細書において「フラグメント」または「断片」は、同義で使用され、全長のポリペプチドまたはポリヌクレオチド（長さがn）に対して、1〜n−1までの配列長さを有するポリペプチドまたはポリヌクレオチドをいう。フラグメントまたは断片の長さは、その目的に応じて、適宜変更することができ、例えば、その長さの下限としては、ポリペプチドの場合、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、40、50およびそれ以上のアミノ酸が挙げられ、ここの具体的に列挙していない整数で表される長さ（例えば、11など）もまた、下限として適切であり得る。また、ポリヌクレオチドの場合、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、40、50、75、100およびそれ以上のヌクレオチドが挙げられ、ここの具体的に列挙していない整数で表される長さ（例えば、11など）もまた、下限として適切であり得る。本明細書において、このようなフラグメントまたは断片は、例えば、全長のものが油脂分解分子として機能する場合、そのフラグメントまたは断片自体もまた油脂分解分子としての機能を有する限り、本開示の範囲内に入ることが理解される。
【００３７】
本明細書において「生物学的機能」とは、ある遺伝子またはそれに関する核酸分子もしくはポリペプチドについて言及するとき、その遺伝子、核酸分子またはポリペプチドが生体内または生体外において有し得る特定の機能をいい、これには、例えば、油脂の分解（例えば、トランス脂肪酸含有油脂の分解）等を挙げることができるがそれらに限定されない。本開示においては、例えば、トランス脂肪酸含有油脂の分解のほか、シス脂肪酸含有油脂の分解、二重結合を含まない飽和脂肪酸含有油脂の分解などを挙げることができるがそれらに限定されない。本明細書において、生物学的機能は、対応する「生物学的活性」によって発揮され得る。本明細書において「生物学的活性」とは、ある因子（例えば、ポリヌクレオチド、タンパク質など）が、有し得る活性のことをいい、種々の機能（例えば、トランス脂肪酸含有油脂の分解活性）を発揮する活性が包含される。「生物学的活性」は、生体内で発揮される活性であっても、分泌などによって生体外で発揮される活性であってもよい。例えば、ある因子が酵素である場合、その生物学的活性は、その酵素活性を包含する。そのような生物学的活性は、当該分野において周知の技術によって測定することができる。従って、「活性」は、結合（直接的または間接的のいずれか）を示すかまたは明らかにするか；応答に影響する（すなわち、いくらかの曝露または刺激に応答する測定可能な影響を有する）、種々の測定可能な指標をいい、例えば、本開示のポリペプチドまたはポリヌクレオチドに直接結合する化合物の親和性、または例えば、いくつかの刺激後または事象後の上流または下流のタンパク質の量あるいは他の類似の機能の尺度も含まれ得る。
【００３８】
本明細書において遺伝子、ポリヌクレオチド、ポリペプチドなどの「発現」とは、その遺伝子などがインビボで一定の作用を受けて、別の形態になることをいう。好ましくは、遺伝子、ポリヌクレオチドなどが、転写および翻訳されて、ポリペプチドの形態になることをいうが、転写されてmRNAが作製されることもまた発現の一態様である。したがって、本明細書において「発現産物」とは、このようなポリペプチドもしくはタンパク質、またはｍRNAを含む。より好ましくは、そのようなポリペプチドの形態は、翻訳後プロセシングを受けたものであり得る。例えば、リパーゼの発現レベルは、任意の方法によって決定することができる。具体的には、リパーゼのmRNAの量、リパーゼタンパク質の量、そしてリパーゼタンパク質の生物学的な活性を評価することによって、リパーゼの発現レベルを知ることができる。リパーゼのmRNAやタンパク質の量は、本明細書の他の箇所に詳述したような方法あるいは他の当該分野において公知の方法によって決定することができる。
【００３９】
本明細書において「機能的等価物」とは、対象となるもとの実体に対して、目的となる機能が同じであるが構造が異なる任意のものをいう。従って、本開示の「リパーゼ」の機能的等価物は、本開示のリパーゼ自体ではないが、その変異体または改変体（例えば、アミノ酸配列改変体等）であって、そのリパーゼの持つ生物学的作用を有するもの、ならびに、作用する時点において、そのリパーゼの持つ生物学的作用を持つ変異体もしくは改変体に変化することができるもの（例えば、その変異体もしくは改変体をコードする核酸、およびその核酸を含むベクター、細胞等を含む）が包含されることが理解される。本開示において、リパーゼの機能的等価物は、格別に言及していなくても、リパーゼと同様に用いられうることが理解される。機能的等価物は、データベース等を検索することによって、見出すことができる。本明細書において「検索」とは、電子的にまたは生物学的あるいは他の方法により、ある核酸塩基配列を利用して、特定の機能および／または性質を有する他の核酸塩基配列を見出すことをいう。電子的な検索としては、BLAST（Altschul  et  al.,J.Mol.Biol.215:403-410(1990))、FASTA(Pearson  &  Lipman,  Proc.Natl.Acad.Sci.,USA  85:2444-2448(1988)）、Smith  and  Waterman法（Smith  and  Waterman,J.Mol.Biol.147:195-197(1981)）、およびNeedleman  and  Wunsch法（Needleman  and  Wunsch,J.Mol.Biol.48:443-453(1970)）などが挙げられるがそれらに限定されない。生物学的な検索としては、ストリンジェントハイブリダイゼーション、ゲノムDNAをナイロンメンブレン等に貼り付けたマクロアレイまたはガラス板に貼り付けたマイクロアレイ（マイクロアレイアッセイ）、PCRおよびin  situハイブリダイゼーションなどが挙げられるがそれらに限定されない。本明細書において、本開示において使用される遺伝子には、このような電子的検索、生物学的検索によって同定された対応遺伝子も含まれるべきであることが意図される。
【００４０】
本開示の機能的等価物としては、アミノ酸配列において、1もしくは複数個のアミノ酸の挿入、置換もしくは欠失、またはその一方もしくは両末端への付加されたものを用いることができる。本明細書において、「アミノ酸配列において、1もしくは複数個のアミノ酸の挿入、置換もしくは欠失、またはその一方もしくは両末端への付加」とは、部位特異的突然変異誘発法等の周知の技術的方法により、あるいは天然の変異により、天然に生じ得る程度の複数個の数のアミノ酸の置換等により改変がなされていることを意味する。改変アミノ酸配列は、例えば1〜30個、好ましくは1〜20個、より好ましくは1〜9個、さらに好ましくは1〜5個、特に好ましくは1〜2個のアミノ酸の挿入、置換、もしくは欠失、またはその一方もしくは両末端への付加がなされたものであることができる。改変アミノ酸配列は、好ましくは、そのアミノ酸配列が、配列番号４〜６、１１〜１４、１６または１８のアミノ酸配列において1または複数個（好ましくは1もしくは複数個または1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14もしくは15個）の保存的置換を有するアミノ酸配列であってもよい。ここで「保存的置換」とは、タンパク質の機能を実質的に改変しないように、1または複数個のアミノ酸残基を、別の化学的に類似したアミノ酸残基で置換えることを意味する。例えば、ある疎水性残基を別の疎水性残基によって置換する場合、ある極性残基を同じ電荷を有する別の極性残基によって置換する場合などが挙げられる。このような置換を行うことができる機能的に類似のアミノ酸は、アミノ酸毎に当該分野において公知である。具体例を挙げると、非極性（疎水性）アミノ酸としては、アラニン、バリン、イソロイシン、ロイシン、プロリン、トリプトファン、フェニルアラニン、メチオニンなどが挙げられる。極性（中性）アミノ酸としては、グリシン、セリン、スレオニン、チロシン、グルタミン、アスパラギン、システインなどが挙げられる。陽電荷をもつ（塩基性）アミノ酸としては、アルギニン、ヒスチジン、リジンなどが挙げられる。また、負電荷をもつ（酸性）アミノ酸としては、アスパラギン酸、グルタミン酸などが挙げられる。
【００４１】
本明細書において「キット」とは、通常2つ以上の区画に分けて、提供されるべき部分（例えば、酵素や油脂分解剤、緩衝液、説明書など）が提供されるユニットをいう。安定性等のため、混合されて提供されるべきでなく、使用直前に混合して使用することが好ましいような組成物の提供を目的とするときに、このキットの形態は好ましい。そのようなキットは、好ましくは、提供される部分（例えば、酵素や油脂分解剤）をどのように使用するか、あるいは、試薬あるいは使用後の廃液をどのように処理すべきかを記載する指示書または説明書を備えていることが有利である。本明細書においてキットが試薬キットとして使用される場合、キットには、通常、酵素や油脂分解剤等の使い方などを記載した指示書などが含まれる。
【００４２】
本明細書において「指示書」は、本開示のリパーゼを使用する方法を使用者に対する説明を記載したものである。この指示書は、本開示のリパーゼの使用方法を指示する文言が記載されている。この指示書は、必要な場合は、本発明が実施される国の監督官庁（例えば、日本であれば厚生労働省または農林水産省等、米国であれば食品医薬品局（FDA）、農務省（USDA）など）が規定した様式に従って作成され、その監督官庁により承認を受けた旨が明記される。指示書は、紙媒体で提供され得るが、それに限定されず、例えば、電子媒体（例えば、インターネットで提供されるホームページ、電子メール）のような形態でも提供され得る。
【００４３】
（好ましい実施形態）
以下に本開示の好ましい実施形態を説明する。以下に提供される実施形態は、本開示のよりよい理解のために提供されるものであり、本開示の範囲は以下の記載に限定されるべきでないことが理解される。従って、当業者は、本明細書中の記載を参酌して、本開示の範囲内で適宜改変を行うことができることは明らかである。また、本開示の以下の実施形態は単独でも使用されあるいはそれらを組み合わせて使用することができることが理解される。
【００４４】
（酵素）
本開示は、新規のポリペプチドを提供する。
本開示は、代表的に、ブルクホルデリア  アルボリス（Burkholderia  arboris）種ＫＨ−１株またはその誘導株から得られる第１のリパーゼの代表的配列および第２のリパーゼの代表的配列ならびにそれらの誘導体を提供する。
１つの局面において、本開示のポリペプチドは、
（ａ）配列番号４、１１、１６または１８に示すアミノ酸配列を含むポリペプチド；
（ｂ）（ａ）のアミノ酸配列において、１アミノ酸以上の置換、付加、欠失またはそれらの組合せを含むアミノ酸配列を含み、生物学的活性を有するポリペプチド；
（ｃ）（ａ）または（ｂ）に示すアミノ酸配列と少なくとも７０％以上の配列同一性を有し、生物学的活性を有するポリペプチド；
（ｄ）配列番号１、７、１５または１７に示す核酸配列によってコードされるアミノ酸配列を含むポリペプチド；
（ｅ）（ｄ）に示す核酸配列において、１ヌクレオチド以上の置換、付加、欠失またはそれらの組合せを含む核酸配列によってコードされ、生物学的活性を有するポリペプチド；
（ｆ）（ｄ）または（ｅ）に示す核酸配列と少なくとも７０％以上の配列同一性を有する核酸配列によってコードされ、生物学的活性を有するポリペプチド；
（ｇ）（ｄ）〜（ｆ）のいずれか１つに示す核酸配列またはその相補的配列を含むポリヌクレオチドと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸配列によってコードされ、かつ生物学的活性を有するポリペプチド；
（ｈ）（ｄ）〜（ｇ）のいずれか１つの核酸配列の対立遺伝子変異体によってコードされ、生物学的活性を有するポリペプチド；または
（ｉ）（ａ）〜（ｈ）に示すアミノ酸配列の断片を含む、ポリペプチド、
である、ポリペプチドであり得る。
別の局面では、本開示は、新規のポリペプチドをコードする核酸配列を提供する。本開示のポリヌクレオチドは、
（Ａ）配列番号１、７、１５または１７に示す核酸配列を含むポリヌクレオチド；
（Ｂ）（Ａ）に示す核酸配列において、１ヌクレオチド以上の置換、付加、欠失またはそれらの組合せを含む核酸配列を含むポリヌクレオチド；
（Ｃ）（Ａ）または（Ｂ）に示す核酸配列と少なくとも７０％以上の配列同一性を有する核酸配列を含み、生物学的活性を有するポリペプチドをコードする、ポリヌクレオチド；
（Ｄ）（Ａ）〜（Ｃ）のいずれか１つに示す核酸配列またはその相補的配列を含むポリヌクレオチドと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸配列を含み、かつ生物学的活性を有するポリペプチドをコードする、ポリヌクレオチド；
（Ｅ）（Ａ）〜（Ｄ）のいずれか１つの核酸配列の対立遺伝子変異体であって、生物学的活性を有するポリペプチドをコードする、ポリヌクレオチド；または
（Ｆ）配列番号４、１１、１６または１８に示すアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする、ポリヌクレオチド；
（Ｇ）（Ｆ）のアミノ酸配列において、１アミノ酸以上の置換、付加、欠失またはそれらの組合せを含むアミノ酸配列を含み、生物学的活性を有するポリペプチドをコードする、ポリヌクレオチド；
（Ｈ）（Ｆ）または（Ｇ）に示すアミノ酸配列と少なくとも７０％以上の配列同一性を有し、生物学的活性を有するポリペプチドをコードする、ポリヌクレオチド；または
（Ｉ）（Ｆ）〜（Ｈ）に示す核酸配列の断片を含む、ポリヌクレオチド、
である、ポリヌクレオチドであり得る。
本開示のポリペプチドが有する生物学的活性は、本開示の第１または第２のリパーゼが有する任意の特性の少なくとも１つであり得るが、例えば、トランス脂肪酸含有油脂の資化に関連する能力、またはトランス脂肪酸含有油脂を分解する能力またはその両方を包含し得る。
したがって、１つの実施形態では、本開示のポリペプチドまたはポリヌクレオチドがコードするポリペプチドは、トランス脂肪酸含有油脂の資化に関連する能力、またはトランス脂肪酸含有油脂を分解する能力またはその両方を有し得る。
１つの好ましい実施形態では、本開示のポリペプチドまたはポリヌクレオチドがコードするポリペプチドは、１５℃、あるいは１０℃において油脂を分解する能力を有する。
別の好ましい実施形態では、本開示の第１のリパーゼである、ポリペプチドまたはポリヌクレオチドがコードするポリペプチドは、４５〜７５℃、５０〜７０℃、好ましくは５５〜６５℃、５８〜６３℃、あるいは６０℃が油脂を分解する能力の至適温度である。本開示の第２のリパーゼである、ポリペプチドまたはポリヌクレオチドがコードするポリペプチドは、３５〜５５℃、４０〜５５℃、好ましくは４５〜５５℃、４５〜５０℃、あるいは５０℃が油脂を分解する能力の至適温度である。
１つの実施形態では、本開示の第１のリパーゼである、ポリペプチドまたはポリヌクレオチドがコードするポリペプチドは、５０℃以上、５５℃以上、６０℃以上、６５℃以上、７０℃以上、あるいは７５℃以上で熱安定性を有し得、この熱安定性は、５０℃以下、５５℃以下、６０℃以下、６５℃以下、７０℃以下、７５℃以下、８０℃以下、８５℃以下、あるいは８８℃以下まで保持され得る。本開示の第１のリパーゼである、ポリペプチドまたはポリヌクレオチドがコードするポリペプチドは、好ましくは、６５℃以上で熱安定性を有し得、この熱安定性は、８５℃以下まで保持され得る。本開示の第２のリパーゼである、ポリペプチドまたはポリヌクレオチドがコードするポリペプチドは、４０℃以上、４５℃以上、５５℃以上、６０℃以上、６５℃以上、７０℃以上、あるいは７５℃以上で熱安定性を有し得、この熱安定性は、４０℃以下、４５℃以下、５０℃以下、５５℃以下、６０℃以下、６５℃以下、７０℃以下、７５℃以下、８０℃以下、あるいは８５℃以下において保持され得る。本開示の第２のリパーゼである、ポリペプチドまたはポリヌクレオチドがコードするポリペプチドは、好ましくは、５０℃以上で熱安定性を有し、この熱安定性は８０℃以下において保持され得る。
１つの具体的な実施形態では、本開示のポリペプチドまたはポリヌクレオチドがコードするポリペプチドは、ブルクホルデリア  アルボリス（Burkholderia  arboris）種に由来するものであってもよいが、これに限定されない。好ましい実施形態では、Burkholderia  arboris  ＫＨ−１株またはその誘導株に由来する酵素であってもよいがこれに限定されない。
さらなる局面において、本開示は、上記のいずれかのポリペプチド、またはポリヌクレオチドを含む細胞または無細胞発現系を含む、油分解剤を提供する。
本開示の細胞は、本開示の第１または第２のリパーゼのポリペプチドを含むか、本開示の第１または第２のリパーゼのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが発現可能に組み込まれているものである。無細胞発現系は、本開示の第１または第２のリパーゼのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが発現可能に提供され、適宜の仕組みによりポリペプチドが発現し、油分解効果を発揮する。
１つの実施形態では、上記油分解剤は、さらなる油処理成分を含む。
別の局面では、本開示は、本開示のポリペプチド、または本開示の細胞もしくは無細胞発現系、または油分解剤と、さらなる油処理成分とを備える、油分解または油脂処理のためのキットを提供する。本開示のキットに含まれる油分解剤および油処理成分は、本明細書において他の箇所に説明される任意の種類のものを任意の組合せで用いることができることが理解される。
別の局面では、本開示は、本開示のポリペプチド、または本開示の細胞もしくは無細胞発現系、または本開示の油分解剤を処理対象に作用させることを包含する、油分解除去方法を提供する。本開示の油分解除去方法において、前記処理対象は、トランス脂肪酸含有油脂を含むことが好ましいが、これに限定されない。トランス脂肪酸含有油脂を含まない対象であっても、本開示のリパーゼを用いる場合、非常に効率よく油分解を行うことができることが本明細書において示されている。
別の局面では、本開示は、本開示のポリペプチド、本開示の細胞もしくは無細胞発現系、または本開示の油分解剤を含む、洗剤を提供する。
さらに別の局面では、本開示のポリペプチド、本開示の細胞もしくは無細胞発現系、または本開示の油分解剤を使用した、脂肪改変・油脂生産技術（エステル交換等）における応用を提供する。脂肪改変・油脂生産技術（エステル交換等）としては、エステル体、例えばメチルエステルやエチルエステルを生じる反応、油脂含有脂肪酸の置換反応、ジアシルグリセロールやモノアシルグリセロールの生産などが挙げられる。
【００４５】
本開示のポリペプチドには、配列番号４〜６、配列番号１１〜１４、１６または１８のアミノ酸配列を有するポリペプチドだけでなく、それらの改変体も包含されることが意図される。このようなポリペプチドとしては、配列番号４〜６、配列番号１１〜１４、１６または１８のアミノ酸配列に対して、１アミノ酸以上の置換、付加、欠失またはそれらの組合せを含むアミノ酸配列を含み、生物学的活性を有するポリペプチドが挙げられる。特定の実施形態では、本発明の第１のリパーゼの代表的配列において、配列番号４に示すアミノ酸配列における、１位、３位、６位、１３７位、２２０位、２２７位、２４３位、２７６位および３１６位に対応するアミノ酸が置換される。別の実施形態では、本発明の第２のリパーゼの代表的配列において、配列番号１１に示すアミノ酸配列における、１３位、２６位、４５位、７５位、１００位、１３８位、１６８位、１７１位、２１４位、２３０位、２３４位、２４８位、２５０位、３３１位および３６０位のアミノ酸が置換される。
【００４６】
本開示はさらに、新規のポリペプチドをコードする核酸配列も提供し、この核酸配列には、配列番号１〜３、配列番号７〜１０、１５または１７に示す核酸配列だけでなく、それらの改変体も包含されることが意図される。このような核酸配列としては、配列番号１〜３、配列番号７〜１０、１５または１７の核酸配列に対して、１ヌクレオチド以上の置換、付加、欠失またはそれらの組合せを含み、生物学的活性を有するポリペプチドをコードする核酸配列が挙げられる。
上記アミノ酸配列または核酸配列において変異が導入され得る位置は、当業者であれば、ホモロジーサーチ、モチーフ検索、ドメイン解析、アラインメント、二次構造予測などといった手法によって容易に決定することができる。アミノ酸配列または核酸配列において変異が導入され得る位置は、その位置において変異を有する改変体が本開示のリパーゼの活性を保持する限り、いずれの位置であってもよく、複数の位置に変異が導入されてもよい。具体的には、本開示の第１のリパーゼの場合、配列番号６（全長のアミノ酸配列）のいずれの位置に変異を有していてもよく、１つの例としては、配列番号６の１３１位のＳ、３０８位のＤ、３３０位のＨに対応する残基以外における変異が望ましいがこれに限定されない。
【００４７】
（酵素の生産）
本開示の第１または第２のリパーゼは、一例として、ブルクホルデリア  アルボリス（Burkholderia  arboris）種ＫＨ−１株（受託番号  ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２７３１）またはその誘導株から精製することができる。具体的には、本開示の第１のリパーゼは、
（ａ）ＫＨ−１株またはその誘導株を１％キャノーラ油を含む培地中で２８℃で２４時間以上培養する工程、
（ｂ）（ａ）の培養上清を、０．４５μｍ孔のフィルターによって滅菌し、カラム体積の約１０倍量の０．５Ｍ  ＮａＣｌおよび２ｍＭ  ＣａＣｌ２を含む２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．０）緩衝液（以後、Ｔｒｉｓ緩衝液と記載する）によりあらかじめ平衡化させたＢｕｔｙｌ−Ｓ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ６  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ（ＧＥヘルスケア）にアプライし、約１時間静置して疎水性タンパク質をカラムに吸着させる工程、
（ｃ）（ｂ）のカラムをカラム体積の約１０倍量のＴｒｉｓ緩衝液で洗浄し、その後カラム体積の約１倍量のＮａＣｌを含まないＴｒｉｓ緩衝液で５回洗浄し、カラム担体に弱く結合したタンパク質を溶出させる工程、および
（ｄ）（ｃ）のカラムを、カラム体積の約１倍量の０．５％のＴｒｉｔｏｎＸ−１００を含むＴｒｉｓ緩衝液で４回洗浄し、カラムに強く結合したタンパク質を溶出させる工程
を含む方法によって精製することができる。
本開示の第２のリパーゼは、
（ａ）ＫＨ−１株またはその誘導株を１％キャノーラ油を含む培地中で１５℃で４８時間以上培養する工程、
（ｂ）（ａ）の培養上清を、０．４５μｍ孔のフィルターによって滅菌し、カラム体積の約１０倍量の０．５Ｍ  ＮａＣｌおよび２ｍＭ  ＣａＣｌ２を含む２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．０）緩衝液（以後、Ｔｒｉｓ緩衝液と記載する）によりあらかじめ平衡化させたＢｕｔｙｌ−Ｓ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ６  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ（ＧＥヘルスケア）にアプライし、約１時間静置して疎水性タンパク質をカラムに吸着させる工程、
（ｃ）（ｂ）のカラムをカラム体積の約１０倍量のＴｒｉｓ緩衝液で洗浄し、その後カラム体積の約１倍量のＮａＣｌを含まないＴｒｉｓ緩衝液で５回洗浄し、カラム担体に弱く結合したタンパク質を溶出させる工程、および
（ｄ）（ｃ）のカラムを、カラム体積の約１倍量の０．５％のＴｒｉｔｏｎＸ−１００を含むＴｒｉｓ緩衝液で４回洗浄し、カラムに強く結合したタンパク質を溶出させる工程
を含む方法によって精製することができる。
酵素の精製方法において、ＫＨ−１株またはその誘導株の培養条件、カラムクロマトグラフィーの条件等の詳細な条件は、当業者によって適宜調整される。
【００４８】
本開示の第１および第２のリパーゼは、微生物を使用する分泌生産系によって生産することもできる。具体的には、本開示の第１または第２のリパーゼは、
（ａ）本開示の第１または第２のリパーゼの成熟体をコードする核酸分子（例えば、配列番号１、７、１５または１７またはその改変配列）をｐＢＩＣ１プラスミド（タカラバイオ社）内に遺伝子導入し、ブレビバチルス（Brevibacillus）細菌内で発現させる工程、および
（ｂ）ブレビバチルス（Brevibacillus）細菌から分泌されたタンパク質をＮｉ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅにより精製する工程
を含む方法によって生産することができる。または、本開示のリパーゼ組換えタンパク質は、Corynebacterium  glutamicumを使用するＣＯＲＹＮＥＸ（登録商標）システム（味の素）、Pichia  pastoris発現系（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）、昆虫細胞を使用するバキュロウイルス発現系（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）、麹菌を使用するタンパク質分泌発現系（大関）、ｐＥＴシステムによる大腸菌のペリプラズム分泌生産系（メルク）などの発現系によって生産することができる。この微生物を使用するリパーゼの生産方法において、リパーゼを発現させる方法、リパーゼを発現させる宿主、宿主から分泌されたリパーゼの精製方法等の詳細な条件は、当業者によって適宜調整される。さらに、本開示のリパーゼは、微生物の分泌生産系以外にも、菌体内発現系、無細胞発現系等の種々の発現系を使用して発現させることもできる。
【００４９】
（酵素の使用）
本開示のリパーゼは、油脂の処理に有用であり、油脂を含む排水や廃液などの処理に使用することができる。この実施形態では、本開示のリパーゼは、排水処理において使用される。本開示のリパーゼは、排水処理用に使用される場合、工場排水、厨房排水、住宅排水などの用途において使用され得る。
この他の例としては、本開示のリパーゼは、洗剤として使用される。本開示のリパーゼは、洗剤として使用される場合、洗濯用洗剤、台所用洗剤、掃除用洗剤、工業用洗剤などの用途において使用され得る。本開示のリパーゼを含む洗剤は、パイプクリーナーなどの排水溝洗剤に特に有用である。
他の実施形態では、本開示のリパーゼは、脂肪改変・油脂生産技術において使用される。本開示のリパーゼは、脂肪改変・油脂生産技術において使用される場合、食品用、工業用、燃料用などの用途において使用され得る。
他の実施形態では、本開示のリパーゼは、環境汚染対策として使用され得る。本開示のリパーゼは、環境汚染対策において使用される場合、油による土壌汚染、地下水汚染、海洋汚染などでの汚染物質の除去に使用され得る。
他の実施形態では、本開示のリパーゼは、廃棄物処理および堆肥化において使用される。本開示のリパーゼは、廃棄物処理および堆肥化において使用される場合、消滅型を含む生ごみ処理、コンポスト化、農産物・食品廃棄物の飼料化、加圧浮上分離装置やグリーストラップから出る油性汚泥の減容化などの用途において使用され得る。
他の実施形態では、本開示のリパーゼは、医薬品として使用される。本開示のリパーゼは、医薬品として使用される場合、消化剤、脂肪分解促進剤などの用途において使用され得る。
他の実施形態では、本開示のリパーゼは、化粧品として使用される。本開示のリパーゼは、化粧品として使用される場合、脂性肌を改善、予防または処置するための化粧品などの用途において使用され得る。
本開示のリパーゼが使用される場合、単離された酵素を含む成分として使用してもよく、細菌自体を含む成分として使用してもよい。
【００５０】
（一般技術）
本明細書において用いられる分子生物学的手法、生化学的手法、微生物学的手法は、当該分野において周知であり慣用されるものであり、例えば、Savli,H.,  Karadenizli,A.,  Kolayli,F.,  Gundes,S.,  Ozbek,U.,  Vahaboglu,H.  2003.  Expression  stability  of  six  housekeeping  genes:A  proposal  for  resistance  gene  quantification  studies  of  Pseudomonas  aeruginosa  by  real-time  quantitative  RT-PCR.  J.Med.Microbiol.  52:403-408.、Marie-Ange  Teste,  Manon  Duquenne,  Jean  M  Francois  and  Jean-Luc  Parrou  2009.  Validation  of  reference  genes  for  quantitative  expression  analysis  by  real-time  RT-PCR  in  Saccharomyces  cerevisiae.  BMC  Molecular  Biology  10:99、石井誠治、奥村弘、松原チヨ、二宮扶実、吉岡浩、2004年、「熱感応性ポリマーを用いた水中油分の簡易測定方法」Vol  46、No.12、「用水と排水」などに記載されており、これらは本明細書において関連する部分（全部であり得る）が参考として援用される。
【００５１】
（注記）
本明細書において「または」は、文章中に列挙されている事項の「少なくとも1つ以上」を採用できるときに使用される。「もしくは」も同様である。本明細書において「2つの値の範囲内」と明記した場合、その範囲には2つの値自体も含む。
【００５２】
本明細書において引用された、科学文献、特許、特許出願などの参考文献は、その全体が、各々具体的に記載されたのと同じ程度に本明細書において参考として援用される。
【００５３】
以上、本開示を、理解の容易のために好ましい実施形態を示して説明してきた。以下に、実施例に基づいて本開示を説明するが、上述の説明および以下の実施例は、例示の目的のみに提供され、本開示を限定する目的で提供したのではない。従って、本開示の範囲は、本明細書に具体的に記載された実施形態にも実施例にも限定されず、特許請求の範囲によってのみ限定される。
【実施例】
【００５４】
以下に実施例を記載する。以下の実施例で用いる生物の取り扱いは、必要な場合、名古屋大学や監督官庁およびカルタヘナ法において規定される基準を遵守した。試薬類は具体的には実施例中に記載した製品を使用したが、他メーカー（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、富士フイルム和光純薬、ナカライテスク、Ｒ＆ＤＳｙｓｔｅｍｓ、ＵＳＣＮ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ＩＮＣ、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、関東化学、フナコシ、東京化成、Ｍｅｒｃｋ等）の同等品でも代用可能である。【００５５】
（実施例１：推定リパーゼの発現解析）
本実施例では、ＫＨ−１株において見出された推定リパーゼ遺伝子の各温度での発現解析を示す。【００５６】
（実験手法）
ＫＨ−１株を、１％キャノーラオイルを含む無機塩培地（Ｎａ２ＨＰＯ４  ３．５ｇ／Ｌ、ＫＨ２ＰＯ４  ２．０ｇ／Ｌ、（ＮＨ４）２ＳＯ４  ４．０ｇ／Ｌ、ＭｇＣｌ２・６Ｈ２Ｏ  ０．３４ｇ／Ｌ、ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ  ２．８ｍｇ／Ｌ、ＭｎＳＯ４・５Ｈ２Ｏ  ２．４ｍｇ／Ｌ、ＣｏＣｌ２・６Ｈ２Ｏ  ２．４ｍｇ／Ｌ、ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ  １．７ｍｇ／Ｌ、ＣｕＣｌ２・２Ｈ２Ｏ  ０．２ｍｇ／Ｌ、ＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ  ０．３ｍｇ／Ｌ、およびＮａＭｏＯ４  ０．２５ｍｇ／Ｌ）３Ｌに、HITACHI  U-2810分光光度計（日立製作所、東京）を使用して、菌体光学密度による最終濃度がＯＤ６６０＝０．０３となるように植菌し、５Ｌ容積ファーメンター（２５０ｒｐｍ、２００ｍｌ／ｍｉｎの空気還流下）中で、２８℃または１５℃で培養した。経時的にサンプリングした各培養物から、ハイピュアＲＮＡアイソレーションキット（Ｒｏｃｈｅ）を使用して全ＲＮＡを抽出した。2μｇの全ＲＮＡを鋳型とし、ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔＴＭ  ＲＴ  ｒｅａｇｅｎｔ  Ｋｉｔ  ｗｉｔｈ  ｇＤＮＡ  Ｅｒａｓｅｒ  Ｐｅｒｆｅｃｔ  Ｒｅａｌ  Ｔｉｍｅ（タカラバイオ社）を使用して、ゲノムＤＮＡを除去し、ｃＤＮＡを合成した。その後、キットに付属の希釈溶液を使用してｃＤＮＡ原液を３倍に希釈した。本開示の第１のリパーゼおよび第２のリパーゼをコードする遺伝子に特異的な合成プライマーを使用して、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ＳｔｅｐＯｎｅＰｌｕｓＴＭ  （Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）により、定量リアルタイムＲＴ−ＰＣＲを行った。ＰＣＲ反応は、ＰｏｗｅｒＵｐＴＭ  ＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｒｅｅｎ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）（１０μｌ）、各プライマー（終濃度０．５μＭ）、ｃＤＮＡ（１μｌ）を含む２０μｌ溶液中で実施した。ＰＣＲ反応はファストサイクリングモードを使用し、９５℃で２分の変性を１サイクル行った後、９５℃で3秒間、60℃で30秒間のサイクルを４０回反復するプログラムで行った。発現レベルは、ＲＮＡポリメラーゼシグマファクター（ｒｐｏＤ）の発現レベルで正規化した。データは、溶融曲線が単一のピークを有することを確認した後、比較Ｃｔ法（ΔΔＣｔ法）により解析した。ＬＢ培地で培養した場合に発現した各リパーゼ遺伝子を対照として１に設定したときの、相対的な発現レベルを示す。【００５７】
（結果）
油脂存在下でのＫＨ−１株の培養によって、２種類のリパーゼ（第１のリパーゼの代表的配列のものおよび第２のリパーゼの代表的配列のもの）をコードする遺伝子の発現誘導が認められた。以下の表１に示すように、第１のリパーゼの代表的配列のものをコードする遺伝子は、２８℃で培養した場合に約２４時間で発現レベルのピークを示し、１５℃で培養した場合には約６０時間で発現レベルのピークを示した。第２のリパーゼの代表的配列のものをコードする遺伝子は、２８℃で培養した場合に約２４時間で発現レベルのピークを示し、１５℃で培養した場合には約９６時間で発現レベルのピークを示した。
【表１】
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【００５８】
（実施例２：変異体の実験）
本実施例では、本開示のリパーゼの変異体を使用した実験を示す。【００５９】
（実験手法）
本開示の第１のリパーゼの代表的配列のもののアミノ酸配列（配列番号４）ならびに第２のリパーゼの代表的配列のもののアミノ酸配列（配列番号１１）に、リパーゼで活性部位として知られている部位以外のアミノ酸残基について、配列同一性が７０〜９９％になるようにそれぞれ変異を導入したポリペプチドを作製する。この変異体ポリペプチドを使用してトランス脂肪酸含有油脂の分解活性を測定する。【００６０】
（実施例３：本開示の第１および第２のリパーゼのトランス脂肪酸およびトランス脂肪酸含有油脂による発現誘導）
本実施例では、トランス脂肪酸（エライジン酸）およびトランス脂肪酸含有油脂（トリエライジン）を添加した場合の本開示の第１および第２のリパーゼの代表的配列のものをコードする遺伝子の発現レベルを、シス脂肪酸（オレイン酸）およびシス脂肪酸含有脂肪酸（トリオレイン）と比較した。【００６１】
（実験手法）
ＫＨ−１株をトリオレインプレートで２日間培養した。その後ＫＨ−１株を綿棒で擦り取り、ＰＢＳに懸濁し、次いでＰＢＳで２回洗浄を行った。油脂のストック溶液として、終濃度２％のオレイン酸、トリオレイン、エライジン酸またはトリエライジンを含む、終濃度５％のＴｒｉｔｏｎＸ−１００溶液を調製し、７０℃で溶解を行った。２０ｍｌの無機塩培地に、各油脂のストック溶液を体積比で１／１０となるように添加し、ここに洗浄したＫＨ−１株を植菌した（終濃度は、０．２％の油脂、０．５％のＴｒｉｔｏｎＸ−１００であり、菌株は、ＯＤ６６０＝０．１である）。２８℃で６時間の培養を行った後、ＫＨ−１株を回収し、回収したＫＨ−１株から全ＲＮＡを抽出した。２μｇの全ＲＮＡを鋳型として使用して上記に従いｃＤＮＡを合成した後、３倍に希釈したｃＤＮＡを鋳型として定量ＲＴ−ＰＣＲを行った。発現レベルは、ｒｐｏＤ遺伝子の発現量で正規化し、オレイン酸培養またはトリオレインでの発現レベルを１としたときの相対値で比較を行った。【００６２】
（結果および考察）
第１のリパーゼの代表的配列のものをコードする遺伝子の発現レベルが、トリエライジン処理後に１００倍程度増大した（図１Ａおよび１Ｂ上段）。この結果は、トランス脂肪酸またはトランス脂肪酸含有油脂が、第１のリパーゼの誘導剤となる可能性を示唆する。第２のリパーゼの代表的配列のものをコードする遺伝子の発現についても、トリエライジン処理後に１０〜２０倍程度増大し（図１Ａおよび１Ｂ下段）、この結果は、トランス脂肪酸またはトランス脂肪酸含有油脂が、第２のリパーゼに対しても誘導剤となる可能性を示唆する。【００６３】
（実施例４：ＫＨ−１株を２８℃で培養した上清からの第１のリパーゼの精製）
本実施例では、２８℃でのＫＨ−１株培養上清からの第１のリパーゼの代表的配列のものの精製を示す。【００６４】
（実験手法）
４ｍｌのＢｕｔｙｌ−Ｓ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ６  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ（ＧＥヘルスケア）を、０．５Ｍ  ＮａＣｌおよび２ｍＭ  ＣａＣｌ２を含む２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．０）緩衝液４０ｍｌで平衡化した。ＫＨ−１株を２８℃で培養した後の培養上清を、０．４５μｍのフィルターにより滅菌し、カラムにアプライした。１時間放置して疎水性タンパク質を吸着させた後、４０ｍｌの前出の緩衝液で洗浄した。その後、ＮａＣｌを含まない４ｍｌの前出の緩衝液で５回洗浄し、カラム担体に緩く結合するタンパク質を溶出させた。さらに０．５％のＴｒｉｔｏｎＸ−１００を含む４ｍｌの前出の緩衝液で４回洗浄し、カラム担体に強く疎水性結合したタンパク質の溶出を行った。各溶出サンプルを０．４５μｍのフィルターでろ過し、そのうちの２０μｌに、４μｌの５×ＳＤＳ−ＰＡＧＥサンプル緩衝液を添加した。１００℃で５分間熱処理を行った後、遠心分離し、２０μｌの上清をポリアクリルアミドゲル（５−１２％グラディエントゲル）にアプライし、２０ｍＡで９０分間電気泳動を行った。次いでＣＢＢ染色を行うことによって、サンプルに含まれるタンパク質を分離解析した。【００６５】
溶出リパーゼに対するＮ末端アミノ酸配列の分析を行った。溶出画分を３０ｋＤａカットのスピンカラムで濃縮した後、スピンカラムタイプの界面活性剤除去カラムＤｅｔｅｒｇｅｎｔＯｕｔＴＭ（ＴａＫａＲａ）にサンプルをアプライし、製造元のプロトコールに従って２ｍＭ  ＣａＣｌ２を含む２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．０）の緩衝液に置換して、溶出時に使用したＴｒｉｔｏｎＸ−１００を除去した。得られた脱界面活性剤リパーゼサンプルをＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、目的のタンパク質をＰＶＤＦ膜にブロッティングした後、エドマン分解によりＮ末端アミノ酸配列を決定した。【００６６】
（結果）
２８℃の培養上清から精製されたタンパク質は、約３０ｋＤａの分子量を示した（図２）。そして、ＫＨ−１の２８℃での培養上清から疎水性カラムクロマトグラフィーにより精製されたリパーゼは、ほぼ単一のバンドであり、ほとんど単一のタンパク質からなることが示された。【００６７】
２８℃での培養上清から精製されたタンパク質のＮ末端配列は、Ａｌａ−Ａｓｐ−Ａｓｎ−Ｔｙｒ−Ａｌａと解読され、第１のリパーゼをコードする遺伝子の産物であることが確認された。【００６８】
（考察）
第１のリパーゼの代表的配列のものの成熟タンパク質のアミノ酸配列は、ＲＡＳＴの遺伝子情報から得られた遺伝子配列から推定された産物の４５位からの配列と一致するものであり、１〜４４位のアミノ酸残基はプレ配列として細胞内からの分泌後に切断されることが示唆された。【００６９】
（実施例５：ＫＨ−１株を１５℃で培養した上清からの第２のリパーゼの精製）
本実施例では、１５℃でのＫＨ−１株培養上清からの第２のリパーゼの代表的配列のものの精製を示す。【００７０】
（実験手法）
実施例４と同様の手法によって、ＫＨ−１株を１５℃で培養した後の培養上清から、リパーゼを精製した。精製した蛋白質画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離後、目的のバンドをゲルから切り出し、脱色・洗浄後、トリプシンを含むトリス緩衝液（ｐＨ８．０）を加え、３５℃で２０時間、酵素消化に処した。回収したサンプル溶液を、脱塩・濃縮後にＬＣ−ＭＳ／ＭＳ（Thermo  Fisher  Scientific  Inc.,  USA）で解析した。【００７１】
（結果）
１５℃の培養上清から精製されたタンパク質は、約４０ｋＤａの分子量を示した（図３）。そして、ＫＨ−１の１５℃での培養上清から疎水性カラムクロマトグラフィーにより精製されたリパーゼは、ほぼ単一のバンドであり、ほとんど単一のタンパク質からなることが示された。【００７２】
１５℃での培養上清から精製された蛋白質の質量分析の結果から、Ａｓｎ−Ｖａｌ−Ｔｈｒ−Ｔｙｒ−Ｈｉｓの断片が検出され、それよりＮ末端側の配列は検出されなかった。トリプシン消化の特異性を考慮すると、この配列またはさらに２残基Ｎ末側に延ばしたＴｈｒ−Ａｒｇ−Ａｓｎ−Ｖａｌ−Ｔｈｒ−Ｔｙｒ−ＨｉｓをＮ末端配列とする第２のリパーゼをコードする遺伝子の産物であると推定された。【００７３】
（考察）
第２のリパーゼの代表的配列のものの成熟タンパク質のアミノ酸配列は、ＲＡＳＴの遺伝子情報から得られた遺伝子配列から推定された産物の４９位または５１位からの配列と一致するものであり、１〜４８または５０位のアミノ酸残基はプレ配列として細胞内からの分泌後に切断されることが示唆された。【００７４】
（実施例６：本開示のリパーゼの熱安定性、至適温度、至適ｐＨおよびｐＨ安定性）
本実施例では、本開示の第１および第２のリパーゼの熱安定性、至適温度、至適ｐＨおよびｐＨ安定性を示す。【００７５】
（実験手法）
本開示の第１および第２のリパーゼの代表的配列のものを、それぞれ２８℃または１５℃で培養したＫＨ−１株から疎水性カラムクロマトグラフィーによって精製し、５Ｕ／ｍｌに調製した。各リパーゼ活性は、以下の（Ａ）〜（Ｄ）の条件でのｐ−ニトロフェニルパルミテートの加水分解を測定することによって定量した。（Ａ）１０〜８０℃の間の温度に調整した緩衝液と本開示の第１または第２のリパーゼの代表的配列のものとを混合し、直後に各温度でリパーゼ活性を測定した。（Ｂ）本開示の第１または第２のリパーゼを、３０〜９５℃の間の温度で３０分間インキュベートし、その後各リパーゼ活性を３７℃で測定した。（Ｃ）酢酸緩衝液（ｐＨ３．０〜５．０）、リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．０〜７．０）、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．０〜９．０）またはＣＡＰＳ緩衝液（ｐＨ９．０〜１１．０）と本開示の第１または第２のリパーゼの代表的配列のものとを混合し、その後リパーゼ活性を測定した。ｐＨ９．０でのリパーゼ活性を１００％とした場合の相対強度として示す。（Ｄ）（Ｃ）において使用した各緩衝液と本開示の第１または第２のリパーゼの代表的配列のものの溶液とを、１：１の体積比で混合し、２８℃で２４時間放置し、その後リパーゼ活性をｐＨ７．０にて測定した。【００７６】
（結果）
本開示の第１のリパーゼの代表的配列のものの至適温度は６０℃であり、３０℃〜８５℃の間の広範な温度範囲で熱安定性を示した（図４）。本開示の第２のリパーゼの代表的配列のものの至適温度は５０℃であり、１５℃〜８０℃の間の広範な温度範囲で熱安定性を示した（図５）。本開示の第１のリパーゼの代表的配列のものの至適ｐＨはｐＨ９．０、安定なｐＨはｐＨ９．０〜９．５であった。本開示の第２のリパーゼの代表的配列のものの至適ｐＨはｐＨ９．０であり、安定なｐＨはｐＨ７．５〜１０．５であった。【００７７】
（考察）
本開示の第１および第２のリパーゼの至適温度および熱安定性の結果から、本開示のリパーゼは、高温でも高い活性を保持するリパーゼであることが示された。【００７８】
（実施例７：ＫＨ−１株培養上清と洗剤との換気扇汚れ分解活性の比較）
本実施例では、ＫＨ−１株培養上清と油用洗剤および一般洗剤との、換気扇汚れの分解活性を比較した。【００７９】
（実験手法）
ＫＨ−１株培養上清として、ＫＨ−１株を１％キャノーラ油を含む培地中で２８℃で２４時間培養したときの培養物の上清を使用した。油用洗剤および一般洗剤として、それぞれ天然酵素洗剤ニコエコ台所用（ニコエコ、長野、説明書に従って１４３倍に水で希釈）およびファミリー（登録商標）（花王、東京、説明書に従い、６６６倍に希釈）を使用した。油汚れが沈着した換気扇フィルターを２ｃｍ角に切りプレートに入れ、各プレートにＫＨ−１株培養上清（ＫＨ−１）、油用洗剤または一般洗剤を５ｍｌずつ添加し、３０分間〜４時間浸漬させた。【００８０】
（結果）
実施例７の結果を図６に示す。一般洗剤と油用洗剤は、４時間の浸漬洗浄でも油汚れを完全に落とすことはできなかったが、ＫＨ−１株培養上清は、１時間の浸漬洗浄によって、フィルターを新品と同程度になるまで洗浄することができた。【００８１】
（考察）
この培養条件により得られた培養上清中の主要なリパーゼは、本開示の酵素であると考えられるため、この油汚れの分解活性は、本開示の酵素によるものであると考えられる。【００８２】
（実施例８：ＫＨ−１株由来の本開示の酵素とＮ−５１０３２酵素との換気扇汚れ分解活性の比較）
本実施例では、ＫＨ−１株由来の本開示の第１および第２のリパーゼの代表的配列のものとＮｏｖｏｚｙｍ５１０３２リパーゼ（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ）との、換気扇汚れの分解活性を比較した。【００８３】
（実験手法）
ＫＨ−１株由来の本開示の第１のリパーゼの代表的配列のものおよび第２のリパーゼの代表的配列のものは、それぞれＫＨ−１株の培養上清を、上記に従い疎水性カラムクロマトグラフィーによって精製することによって得た。Ｎｏｖｏｚｙｍ５１０３２リパーゼ（Ｎ−５１０３２）は、Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ社から購入した。各リパーゼを、２ｍＭ  ＣａＣｌ２および０．２５％  ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を含む２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．４）に、１５Ｕ／ｍｌの濃度となるように溶解した。油汚れが沈着した換気扇フィルターを２ｃｍ角に切りプレートに入れ、各プレートに各リパーゼの溶液を５ｍｌずつ添加し、３０分間浸漬させた。【００８４】
（結果）
リパーゼ溶液に浸漬させた後の換気扇フィルターおよび浸漬させた後のリパーゼ溶液を図７に示す。本開示の第１および第２のリパーゼの代表的配列のものに浸漬させた換気扇フィルターはいずれも、Ｎｏｖｏｚｙｍ５１０３２リパーゼに浸漬させた換気扇フィルターよりも油汚れが顕著に分解されていた。【００８５】
（実施例９：本開示の第１のリパーゼによるラードおよびショートニングの分解）
本実施例では、本開示の第１のリパーゼの代表的配列のものによるラードおよびショートニングの分解活性を示す。【００８６】
（実験手法）
ＫＨ−１株の培養上清から本開示の第１のリパーゼの代表的配列のものを、２ｍＭ  ＣａＣｌ２および０．５％  ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を含む２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．０）溶出緩衝液を使用して、疎水性カラムクロマトグラフィーによって精製した。２ｍｌの本開示のリパーゼの溶液（５０Ｕ／ｍｌ）をプレートに入れ、ここに０．７ｇのラード（Ａ）または０．５ｇのショートニング（Ｂ）を添加した。適宜攪拌し溶液となじませながら、２８℃で２４時間放置した。前出の溶出緩衝液のみで処理したものを対照とした。【００８７】
（Ｃ）２．５％  ＴｒｉｔｏｎＸ−１００中に、終濃度が２％となるようにラードまたはショートニングを溶解して、ストック溶液を作成した。ラードおよびショートニングを６５℃で融解させたストック溶液０．２ｍｌを１．８ｍｌの上記リパーゼ含有緩衝液に加えた。ＴｒｉｔｏｎＸ−１００および各油脂の終濃度は、それぞれ０．２５％および０．２％である。２８℃で２４時間インキュベートを行い、等量のクロロホルムにより油脂を抽出し、５μｌの抽出物を薄層クロマトグラフィーに供した。【００８８】
（結果）
実施例９の結果を図８に示す。本実施例における実験結果から、緩衝液単独で処理したラードおよびショートニングは、処理後も固体の状態であったのに対し、第１のリパーゼの代表的配列のもので処理した油脂は溶解された（図８（Ａ）および（Ｂ））。薄層クロマトグラフィーの結果からも、ラードおよびショートニング中のトリグリセリドが遊離脂肪酸に分解されたことが実証された（図８（Ｃ））。本開示の第１のリパーゼは、ラードおよびショートニングを加水分解し、可溶化する活性を有することが示された。【００８９】
（実施例１０：本開示の第２のリパーゼによるラードおよびショートニングの分解）
本実施例では、本開示の第２のリパーゼによるラードおよびショートニングの分解活性を示す。【００９０】
（実験手法）
１５℃で９６時間培養したＫＨ−１株の培養上清から本開示の第２のリパーゼの代表的配列のものを、２ｍＭ  ＣａＣｌ２および０．５％  ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を含む２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．０）溶出緩衝液を使用して、疎水性カラムクロマトグラフィーによって精製した。２ｍｌの本開示のリパーゼの溶液（５０Ｕ／ｍｌ）をプレートに入れ、ここに０．７ｇのラード（Ａ）または０．５ｇのショートニング（Ｂ）を添加した。適宜攪拌し溶液となじませながら、２８℃で２４時間放置した。前出の溶出緩衝液のみで処理したものを対照とした。【００９１】
（Ｃ）２．５％  ＴｒｉｔｏｎＸ−１００中に、終濃度が２％となるようにラードまたはショートニングを溶解して、ストック溶液を作成した。ラードおよびショートニングを６５℃で融解させたストック溶液０．２ｍｌを１．８ｍｌの上記リパーゼ含有緩衝液に加えた。ＴｒｉｔｏｎＸ−１００および各油脂の終濃度は、それぞれ０．２５％および０．２％である。２８℃で２４時間インキュベートを行い、等量のクロロホルムにより油脂を抽出し、５μｌの抽出物を薄層クロマトグラフィーに供した。【００９２】
（結果）
実施例１０の結果を図９に示す。本実施例における実験結果から、緩衝液単独で処理したラードおよびショートニングは、処理後も固体の状態であったのに対し、第２のリパーゼの代表的配列のもので処理した油脂は溶解された（図９（Ａ）および（Ｂ））。薄層クロマトグラフィーの結果からも、ラードおよびショートニング中のトリグリセリドが遊離脂肪酸に分解されたことが実証された（図９（Ｃ））。本開示の第２のリパーゼの代表的配列のものは、ラードおよびショートニングを加水分解し、可溶化する活性を有することが示された。【００９３】
（実施例１１：ＫＨ−１株によるトランス脂肪酸含有排水の処理試験）
本実施例では、ＫＨ−１株が含むリパーゼおよびＢｉｏＲｅｍｏｖｅ３２００（ＢＲ３２００、Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ）によるトランス脂肪酸含有排水の処理試験を示す。【００９４】
（実験手法）
（Ａ）排水サンプルに、無機塩培地相当のＮ（窒素）およびＰ（リン）を添加した。ＫＨ−１株は、ＬＢ培地において培養し、培養後洗浄を行い、ＯＤ＝０．１になるように接種しリパーゼを分泌する条件に供した。ＢＲ３２００（ＢｉｏＲｅｍｏｖｅ３２００、Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ）は、通常使用される濃度の１０倍の量になるように添加した。この排水サンプルを２８℃で２４時間または４８時間培養した。その後サンプルを、クロロホルム、アセトンおよびメタノールを、体積比でそれぞれ９６：４：１の比率で含む展開溶媒を使用し、シリカゲルコートプレート上に展開した。油脂の分解は、薄層クロマトグラフィーを使用して、モリブデン酸ｎ水和物による発色によって検出した。【００９５】
（Ｂ）２４および４８時間処理後の排水サンプルに対してノルマルヘキサン抽出相当の油分濃度を測定試薬キットにより測定した。【００９６】
（結果）
ＫＨ−１株が分泌するリパーゼは、２４時間処理により排水サンプル中の油分を、ＢＲ３２００の５０％程度まで分解することができることが明らかになった（図１０）。さらに、４８時間処理では、ＫＨ−１株が分泌するリパーゼは、排水サンプル中の油分を、ＢＲ３２００の１／７程度まで分解することができた。【００９７】
（実施例１２：本開示の第１のリパーゼによる各油脂の分解）
本実施例では、本開示の第１のリパーゼの代表的配列のものによるトリオレインおよびトリエライジンの分解を示す。【００９８】
（実験手法）
本開示の第１のリパーゼの代表的配列のものは、ＫＨ−１株を１％のキャノーラ油を含む無機塩培地で、２８℃で培養した培養上清から疎水性カラムクロマトグラフィーによって精製したものを使用した。トリオレインおよびトリエライジンを、終濃度が２％となるように５％のＴｒｉｔｏｎＸ−１００を含む蒸留水に溶解し、ストック溶液とした（１０×ストック溶液）。本開示の第１のリパーゼの代表的配列のものの溶液（終濃度３０Ｕ／ｍｌの２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ緩衝液（２ｍＭ  ＣａＣｌ２と０．５％  ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を含む；ｐＨ７．０）中）またはリパーゼを含まない同緩衝液のそれぞれ１００μｌをチューブに分注し、上記の油脂１０×ストック溶液を、体積比で１／１０となるように添加した。各油脂の終濃度は０．２％、ＴｒｉｔｏｎＸ−１００の終濃度は０．５％となる。これらの溶液を３７℃で２４時間インキュベートした。その後、クロロホルム、アセトンおよびメタノールを、体積比でそれぞれ９６：４：１の比率で含む展開溶媒を使用し、シリカゲルコートプレート上に展開した。油脂の分解は、薄層クロマトグラフィーを使用して、モリブトン酸ｎ水和物による発色によって検出した。【００９９】
（結果）
本開示の第１のリパーゼの代表的配列のものは、トリオレインおよびトリエライジンのいずれも加水分解する活性を有した（図１１）【０１００】
（考察）
本開示の第１のリパーゼの代表的配列のものは、シス体のトリグリセリドであるトリオレインと、トランス体のトリグリセリドであるトリエライジンとの両方を加水分解する活性を有することが明らかとなった。【０１０１】
（実施例１３：本開示の第２のリパーゼによる各油脂の分解）
本実施例では、本開示の第２のリパーゼの代表的配列のものによるトリオレインおよびトリエライジンの分解を示す。【０１０２】
（実験手法）
本開示の第２のリパーゼの代表的配列のものは、ＫＨ−１株を１％のキャノーラ油を含む無機塩培地で、１５℃で培養した培養上清から疎水性カラムクロマトグラフィーによって精製したものを使用した。本開示の第２のリパーゼ溶液（終濃度０．３Ｕ／ｍｌの２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ緩衝液（２ｍＭ  ＣａＣｌ２と０．５％  ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を含む；ｐＨ７．０）中）またはリパーゼを含まない同緩衝液のそれぞれ１００μｌをチューブに分注し、上述の油脂の１０×ストック溶液を、体積比で１／１０となるように添加した。各油脂の終濃度は０．２％、ＴｒｉｔｏｎＸ−１００の終濃度は０．５％となる。これらの溶液を３７℃で２２時間インキュベートした。その後、クロロホルム、アセトンおよびメタノールを、体積比でそれぞれ９６：４：１の比率で含む展開溶媒を使用し、シリカゲルコートプレート上に展開した。油脂の分解は、薄層クロマトグラフィーを使用して、モリブトン酸ｎ水和物による発色によって検出した。【０１０３】
（結果）
本開示の第２のリパーゼの代表的配列のものは、シス体のトリグリセリドであるトリオレインと、トランス体のトリグリセリドであるトリエライジンとの両方を加水分解する活性を有した（図１２）。【０１０４】
（実施例１４：低温下での本開示のリパーゼによる各油脂の分解）
本実施例では、１５℃条件下での本開示の第１および第２のリパーゼの代表的配列のものによるトリオレインおよびトリエライジンの分解を示す。【０１０５】
（実験手法）
第１のリパーゼの代表的配列のものとして、ＫＨ−１株を１％のキャノーラ油を含む無機塩培地で、２８℃で培養した培養上清から疎水性カラムクロマトグラフィーによって精製したものを使用した。第２のリパーゼの代表的配列のものとして、ＫＨ−１株を１５℃で同様に培養した培養上清から疎水性カラムクロマトグラフィーによって精製したものを使用した。トリオレインまたはトリエライジンは、終濃度が０．１％となるように、上記１０×ストック溶液を１／２０添加し、第１または第２のリパーゼ溶液と混合した。第１のリパーゼの代表的配列のものは４−ＮＰＰを基質として終濃度６Ｕ／ｍｌ、第２のリパーゼの代表的配列のものは４−ＮＰＰを基質として終濃度６Ｕ／ｍｌとした。これらの溶液を１５℃で７２時間インキュベートした。その後、クロロホルム、アセトンおよびメタノールを、体積比でそれぞれ９６：４：１の比率で含む展開溶媒を使用し、シリカゲルコートプレート上に展開した。油脂の分解は、薄層クロマトグラフィーを使用して、モリブトン酸ｎ水和物による発色によって検出した。【０１０６】
（結果および考察）
シス体のトリグリセリドであるトリオレインは、第１および第２のリパーゼの代表的配列のもののいずれの処理によっても、オレイン酸に分解された。トランス体のトリグリセリドであるトリエライジンは、第１および第２のリパーゼのいずれの処理によっても、エライジン酸に分解された（図１３）。この結果から、本開示の第１および第２のリパーゼの代表的配列のものは、低温（１５℃）の条件下であっても、シス脂肪酸含有油脂およびトランス脂肪酸含有油脂のいずれも分解する活性を有することが実証された。【０１０７】
(実施例１５：トリオレインの脂肪改変および脂肪酸メチルエステルの油脂生産技術）
本実施例では、本発明の第１および第２のリパーゼの代表的配列のものによる、シス体の脂肪酸の脂肪改変を示す。【０１０８】
（実験方法）
１％のキャノーラ油を含むBS培養液中でＫＨ−１株を48時間ファーメンター培養し、その上清からＢｕｔｙｌ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラムを使用して第１および第２のリパーゼの代表的配列のものを精製した。第１および第２のリパーゼの溶液を、５Ｕ／ｍｌに調整した。トリオレインは０．５％となるようにメタノールに溶解してストック溶液とした。そのストック溶液80μlと各酵素溶液20μlとの混合液をスクリューキャップ付きチューブに分注し、37℃のインキュベーターで96時間静置した。なお、リパーゼを含有しない緩衝液と混合したものを対照区とした。その後、各溶液に100μlの水および50μlのクロロホルムを添加し、ボルテックスミキサーでよく攪拌した後、12,000ｇで5分間遠心分離した。10μlの下層のクロロホルム層を、ヘキサン、ジエチルエーテルおよび酢酸を、体積比でそれぞれ８０：２０：１の比率で含む展開溶媒を使用してＴＬＣ解析に供した。【０１０９】
（結果）
実施例１５の結果を図１４に示す。本発明の第１のリパーゼおよび第２のリパーゼのいずれも、シス体のトリグリセリドであるトリオレインのエステル交換反応を触媒し、オレイン酸メチルエステルを生成した。【０１１０】
(実施例１６：トランス脂肪酸の脂肪改変および脂肪酸メチルエステルの油脂生産技術）
本実施例では、本発明の第１および第２のリパーゼの代表的配列のものによる、トランス脂肪酸の脂肪改変を示す。【０１１１】
（実験方法）
１％のキャノーラ油を含むBS培養液中でＫＨ−１株を48時間ファーメンター培養し、その上清からＢｕｔｙｌ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラムを使用して第１および第２のリパーゼの代表的配列のものを精製した。第１および第２のリパーゼの溶液を、５Ｕ／ｍｌに調整した。（Ａ）パルミテライジン酸および（Ｂ）バクセン酸の各トランス脂肪酸モノマーは、各脂肪酸モノマーが０．５％となるようにメタノールに溶解してストック溶液とした。各トランス脂肪酸ストック溶液80μlと各酵素溶液20μlとの混合液を、スクリューキャップ付きチューブに分注し、37℃のインキュベーターで72時間静置した。なお、リパーゼを含有しない緩衝液と混合したものを対照区とした。その後、各溶液に100μlの水および50μlのクロロホルムを添加し、ボルテックスミキサーでよく攪拌した後、12,000ｇで5分間遠心分離した。5μlの下層のクロロホルム層を、ヘキサン、ジエチルエーテルおよび酢酸を、体積比でそれぞれ８０：２０：１の比率で含む展開溶媒を使用してＴＬＣ解析に供した。【０１１２】
（結果）
実施例１６の結果を図１５に示す。本発明の第１のリパーゼおよび第２のリパーゼのいずれも、トランス脂肪酸であるパルミテライジン酸およびバクセン酸のエステル交換反応を触媒し、それぞれパルミテライジン酸メチルエステルおよびバクセン酸メチルエステルを生成した。これにより、これらの酵素は、エライジン酸以外のトランス脂肪酸の反応にも有用であることが明らかになった。【０１１３】
（実施例１７：本発明の第１のリパーゼの改変体の油脂分解活性）
本実施例では、本発明の第１のリパーゼの改変体の油脂分解活性を解析した。【０１１４】
（実験方法）
本発明の第１のリパーゼの代表的配列のもの（配列番号４）のアミノ酸配列において、１位、３位、６位、１３７位、２２０位、２２７位、２４３位、２７６位および３１６位に対応するアミノ酸が、それぞれセリン、アスパラギン酸、スレオニン、セリン、バリン、スレオニン、ロイシン、グルタミンおよびリジンに置換された改変体（配列番号１６）の発現コンストラクトは、ブレビバチルス発現系を使用した発現システム(BIC  system:  TaKaRa)にしたがって構築した。菌体は、２ＳＹ培地に終濃度で50  μg/mlになるようネオマイシンを添加した培地で４８時間３０℃で培養した。培養した菌の上清50mlをＢｕｔｙｌ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラムにアプライし、0.25%  TritonX-100を含む20  mM  Tris-HCl，2  mM  CaCl2に溶出した。なお、リコンビナントリパーゼは成熟型配列のN末端に、AD+6xHis+DDDK  (Enterokinase認識配列)が付加されている。油脂として、トリオレイン（ＴＯｌｅ）およびトリエライジン（TED）を使用して、以下の実験条件にしたがって、各油脂の分解活性をTLCにより解析した：
・油脂の種類：トリオレイン、トリエライジン
・反応液：20  mM  Tris-HCl  (pH7.0),    2mM  CaCl2,  0.5%  Triton  X100
・油脂終濃度：0.2%  
・処理方法：エッペンドルフチューブに100μlの酵素溶液を入れ、10x各油脂ストックを1/5量添加した。
・処理温度：37℃
・処理時間：48時間
・油分抽出：半量のクロロホルムで抽出し10μｌをアプライしてTLCを行った。
・展開プレート：シリカゲルコートプレート
・展開溶剤：chlorofolm:acetone：methanol=96:4:2
・検出：モリブトリン酸n水和物による発色  (2.4  g/60  ml  EtOH)【０１１５】
（結果）
実施例１７の結果を図１６に示す。上記９か所の変異を有する改変体も、高い油脂分解活性を有していた。【０１１６】
（実施例１８：本発明の第２のリパーゼの改変体の油脂分解活性）
本実施例では、本発明の第２のリパーゼの改変体の油脂分解活性を解析した。【０１１７】
（実験方法）
本発明の第２のリパーゼの代表的配列のもの（配列番号１１）のアミノ酸配列において、１３位、２６位、４５位、７５位、１００位、１３８位、１６８位、１７１位、２１４位、２３０位、２３４位、２４８位、２５０位、３３１位および３６０位のアミノ酸が、それぞれロイシン、ロイシン、アルギニン、イソロイシン、バリン、セリン、グルタミン酸、アルギニン、グリシン、アスパラギン、セリン、アルギニン、グリシン、アスパラギンおよびアラニンに置換された改変体（配列番号１８）の発現コンストラクトは、ブレビバチルス発現系を使用した発現システム(BIC  system:  TaKaRa)にしたがって構築した。菌体は、ＴＭ培地に終濃度20mMになるようMgCl2と終濃度50  μg/mlになるようネオマイシンを添加した培地で７２時間３０℃で培養した。培養した菌の上清50mlをＢｕｔｙｌ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラムにアプライし、0.25%  TritonX-100を含む20  mM  Tris-HCl，2  mM  CaCl2に溶出した。なお、リコンビナントリパーゼは推定のシグナル配列が切断された配列のN末端に、AD+6xHis+DDDK  (Enterokinase認識配列)が付加されている。油脂として、トリオレイン（ＴＯｌｅ）およびトリエライジン（TED）を使用して、以下の実験条件にしたがって、各油脂の分解活性をTLCにより解析した：
・油脂の種類：トリオレイン、トリエライジン
・反応液：20  mM  Tris-HCl  (pH7.0),    2mM  CaCl2,  0.5%  Triton  X100
・油脂終濃度：0.2%  
・処理方法：エッペンドルフチューブに100μlの酵素溶液を入れ、10x各油脂ストックを1/5量添加した。
・処理温度：37℃
・処理時間：48時間
・油分抽出：等量のクロロホルムで抽出し10μｌをアプライしてTLCを行った。
・展開プレート：シリカゲルコートプレート
・展開溶剤：chlorofolm:acetone：methanol=96:4:2
・検出：モリブトリン酸n水和物による発色  (2.4  g/60  ml  EtOH)【０１１８】
（結果）
実施例１８の結果を図１７に示す。上記１５か所の変異を有する改変体も、高い油脂分解活性を有していた。【０１１９】
（注記）
以上のように、本開示の好ましい実施形態を用いて本開示を例示してきたが、本開示は、特許請求の範囲によってのみその範囲が解釈されるべきであることが理解される。本明細書において引用した特許、特許出願及び他の文献は、その内容自体が具体的に本明細書に記載されているのと同様にその内容が本明細書に対する参考として援用されるべきであることが理解される。本願は日本国特許庁に２０１８年７月６日に提出された特願２０１８−１２９５０４に対して優先権主張を伴うものであり、その内容はすべて本明細書に対する参考として援用されるべきであることが理解される。
【産業上の利用可能性】
【０１２０】
本開示は、トランス脂肪酸含有油脂を分解することにおいて、食品工場などで問題となっているトランス脂肪酸含有排水の処理などにおいて、有用性を有する。
【受託番号】
【０１２１】
ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２７３１
【配列表フリーテキスト】
【０１２２】
配列番号１  本開示の第１のリパーゼの代表的核酸配列の成熟配列
配列番号２  本開示の第１のリパーゼの代表的核酸配列においてプレ配列をコードするヌクレオチドを含む核酸配列
配列番号３  本開示の第１のリパーゼの代表的核酸配列の全長配列
配列番号４  本開示の第１のリパーゼの代表的アミノ酸配列の成熟配列
配列番号５  本開示の第１のリパーゼの代表的アミノ酸配列においてプレ配列を含むアミノ酸配列
配列番号６  本開示の第１のリパーゼの代表的アミノ酸配列の全長配列
配列番号７  本開示の第２のリパーゼの代表的核酸配列の成熟配列
配列番号８  本開示の第２のリパーゼの代表的核酸配列において短鎖プレ配列をコードするヌクレオチドを含む核酸配列
配列番号９  本開示の第２のリパーゼの代表的核酸配列において長鎖プレ配列をコードするヌクレオチドを含む核酸配列
配列番号１０  本開示の第２のリパーゼの代表的核酸配列の全長配列
配列番号１１  本開示の第２のリパーゼの代表的アミノ酸配列の成熟配列
配列番号１２  本開示の第２のリパーゼの代表的アミノ酸配列において短鎖プレ配列を含むアミノ酸配列
配列番号１３  本開示の第２のリパーゼの代表的アミノ酸配列において長鎖プレ配列を含むアミノ酸配列
配列番号１４  本開示の第２のリパーゼの代表的アミノ酸配列の全長配列
配列番号１５  本開示の第１のリパーゼの代表的核酸配列の成熟配列の改変配列
配列番号１６  本開示の第１のリパーゼの代表的アミノ酸配列の成熟配列の改変配列
配列番号１７  本開示の第２のリパーゼの代表的核酸配列の成熟配列の改変配列
配列番号１８  本開示の第２のリパーゼの代表的アミノ酸配列の成熟配列の改変配列
【図１】
2020009231.tif 000003
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
2020009231.tif 000014
【図１３】
2020009231.tif 000015
【図１４】
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【図１５】
2020009231.tif 000017
【図１６】
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【図１７】
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【配列表】
2020009231000001.app
【手続補正書】
【提出日】令和1年11月18日(2019.11.18)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）配列番号４、１１、１６または１８に示すアミノ酸配列を含むポリペプチド；
（ｂ）（ａ）のアミノ酸配列において、１アミノ酸以上３０アミノ酸以下の置換、付加、欠失またはそれらの組合せを含むアミノ酸配列を含み、生物学的活性を有するポリペプチド；
（ｃ）（ａ）に示すアミノ酸配列と少なくとも８０％以上の配列同一性を有し、生物学的活性を有するポリペプチド；
（ｄ）配列番号１、７、１５または１７に示す核酸配列によってコードされるアミノ酸配列を含むポリペプチド；
（ｅ）（ｄ）に示す核酸配列において、１ヌクレオチド以上９０ヌクレオチド以下の置換、付加、欠失またはそれらの組合せを含む核酸配列によってコードされ、生物学的活性を有するポリペプチド；
（ｆ）（ｄ）に示す核酸配列と少なくとも８０％以上の配列同一性を有する核酸配列によってコードされ、生物学的活性を有するポリペプチド；
（ｇ）（ｄ）〜（ｆ）のいずれか１つの核酸配列の対立遺伝子変異体によってコードされ、生物学的活性を有するポリペプチド；または
（ｈ）（ａ）〜（ｇ）に示すアミノ酸配列の断片を含み、生物学的活性を有するポリペプチド、
である、ポリペプチドであって、該生物学的活性は、トランス脂肪酸含有油脂の資化に関連する能力、またはトランス脂肪酸含有油脂を分解する能力である、ポリペプチド。
【請求項２】
（削除）
【請求項３】
４５〜７０℃が油脂を分解する能力の至適温度である、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項４】
３５〜５５℃が油脂を分解する能力の至適温度である、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項５】
６５℃以上において熱安定性を有する、請求項１または３に記載のポリペプチド。
【請求項６】
７５℃以上において熱安定性を有する、請求項１または４に記載のポリペプチド。
【請求項７】
１５℃において油脂を分解する能力を有する、請求項１および３〜６のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項８】
ブルクホルデリア  アルボリス（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ａｒｂｏｒｉｓ）に由来するポリペプチドである、請求項１および３〜７のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項９】
（Ａ）配列番号１、７、１５または１７に示す核酸配列を含むポリヌクレオチド；
（Ｂ）（Ａ）に示す核酸配列において、１ヌクレオチド以上９０ヌクレオチド以下の置換、付加、欠失またはそれらの組合せを含む核酸配列を含み、生物学的活性を有するポリペプチドをコードする、ポリヌクレオチド；
（Ｃ）（Ａ）に示す核酸配列と少なくとも８０％以上の配列同一性を有する核酸配列を含み、生物学的活性を有するポリペプチドをコードする、ポリヌクレオチド；
（Ｄ）（Ａ）〜（Ｃ）のいずれか１つの核酸配列の対立遺伝子変異体であって、生物学的活性を有するポリペプチドをコードする、ポリヌクレオチド；または
（Ｅ）配列番号４、１１、１６または１８に示すアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする、ポリヌクレオチド；
（Ｆ）（Ｅ）のアミノ酸配列において、１アミノ酸以上３０アミノ酸以下の置換、付加、欠失またはそれらの組合せを含むアミノ酸配列を含み、生物学的活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；または
（Ｇ）（Ｅ）に示すアミノ酸配列と少なくとも８０％以上の配列同一性を有し、生物学的活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
（Ｈ）（Ｅ）〜（Ｇ）に示す核酸配列の断片を含み、生物学的活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、
である、ポリヌクレオチドであって、該生物学的活性は、トランス脂肪酸含有油脂の資化に関連する能力、またはトランス脂肪酸含有油脂を分解する能力である、ポリヌクレオチド。
【請求項１０】
（削除）
【請求項１１】
４５〜７０℃が油脂を分解する能力の至適温度であるポリペプチドをコードする、請求項９に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１２】
３５〜５５℃が油脂を分解する能力の至適温度であるポリペプチドをコードする、請求項９に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１３】
６５℃以上において熱安定性を有するポリペプチドをコードする、請求項９または１１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１４】
７５℃以上において熱安定性を有するポリペプチドをコードする、請求項９または１２に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１５】
前記ポリヌクレオチドは、１５℃において油脂を分解する能力を有するポリペプチドをコードする、請求項９および１１〜１４のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１６】
ブルクホルデリア  アルボリス（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ａｒｂｏｒｉｓ）に由来するポリヌクレオチドである、請求項９および１１〜１５のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１７】
請求項９および１１〜１６のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドを含む細胞または無細胞発現系。
【請求項１８】
（ａ）配列番号４、１１、１６または１８に示すアミノ酸配列を含むポリペプチド；
（ｂ）（ａ）のアミノ酸配列において、１アミノ酸以上３０アミノ酸以下の置換、付加、欠失またはそれらの組合せを含むアミノ酸配列を含み、生物学的活性を有するポリペプチド；
（ｃ）（ａ）に示すアミノ酸配列と少なくとも８０％以上の配列同一性を有し、生物学的活性を有するポリペプチド；
（ｄ）配列番号１、７、１５または１７に示す核酸配列によってコードされるアミノ酸配列を含むポリペプチド；
（ｅ）（ｄ）に示す核酸配列において、１ヌクレオチド以上９０ヌクレオチド以下の置換、付加、欠失またはそれらの組合せを含む核酸配列によってコードされ、生物学的活性を有するポリペプチド；
（ｆ）（ｄ）に示す核酸配列と少なくとも８０％以上の配列同一性を有する核酸配列によってコードされ、生物学的活性を有するポリペプチド；
（ｇ）（ｄ）〜（ｆ）のいずれか１つに示す核酸配列またはその相補的配列を含むポリヌクレオチドと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸配列によってコードされ、かつ生物学的活性を有するポリペプチド；
（ｈ）（ｄ）〜（ｇ）のいずれか１つの核酸配列の対立遺伝子変異体によってコードされ、生物学的活性を有するポリペプチド；または
（ｉ）（ａ）〜（ｈ）に示すアミノ酸配列の断片を含み、生物学的活性を有するポリペプチド、
であって、該生物学的活性は、トランス脂肪酸含有油脂の資化に関連する能力、またはトランス脂肪酸含有油脂を分解する能力である、ポリペプチド、該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む細胞もしくは無細胞発現系、あるいは、
請求項１、３〜８および２８〜３０のいずれか一項に記載のポリペプチド、請求項９および１１〜１６のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドを含む細胞もしくは無細胞発現系、または請求項１７に記載の細胞もしくは無細胞発現系を含む油分解剤。
【請求項１９】
さらなる油処理成分を含む、請求項１８に記載の油分解剤。
【請求項２０】
（ａ）配列番号４、１１、１６または１８に示すアミノ酸配列を含むポリペプチド；
（ｂ）（ａ）のアミノ酸配列において、１アミノ酸以上３０アミノ酸以下の置換、付加、欠失またはそれらの組合せを含むアミノ酸配列を含み、生物学的活性を有するポリペプチド；
（ｃ）（ａ）に示すアミノ酸配列と少なくとも８０％以上の配列同一性を有し、生物学的活性を有するポリペプチド；
（ｄ）配列番号１、７、１５または１７に示す核酸配列によってコードされるアミノ酸配列を含むポリペプチド；
（ｅ）（ｄ）に示す核酸配列において、１ヌクレオチド以上９０ヌクレオチド以下の置換、付加、欠失またはそれらの組合せを含む核酸配列によってコードされ、生物学的活性を有するポリペプチド；
（ｆ）（ｄ）に示す核酸配列と少なくとも８０％以上の配列同一性を有する核酸配列によってコードされ、生物学的活性を有するポリペプチド；
（ｇ）（ｄ）〜（ｆ）のいずれか１つに示す核酸配列またはその相補的配列を含むポリヌクレオチドと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸配列によってコードされ、かつ生物学的活性を有するポリペプチド；
（ｈ）（ｄ）〜（ｇ）のいずれか１つの核酸配列の対立遺伝子変異体によってコードされ、生物学的活性を有するポリペプチド；または
（ｉ）（ａ）〜（ｈ）に示すアミノ酸配列の断片を含み、生物学的活性を有するポリペプチド、
であって、該生物学的活性は、トランス脂肪酸含有油脂の資化に関連する能力、またはトランス脂肪酸含有油脂を分解する能力である、ポリペプチド、該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む細胞もしくは無細胞発現系、あるいは、
請求項１、３〜８および２８〜３０のいずれか一項に記載のポリペプチド、請求項９および１１〜１６のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドを含む細胞もしくは無細胞発現系、請求項１７に記載の細胞もしくは無細胞発現系、または請求項１８に記載の油分解剤と、さらなる油処理成分とを備える、油分解のためのキット。
【請求項２１】
（ａ）配列番号４、１１、１６または１８に示すアミノ酸配列を含むポリペプチド；
（ｂ）（ａ）のアミノ酸配列において、１アミノ酸以上３０アミノ酸以下の置換、付加、欠失またはそれらの組合せを含むアミノ酸配列を含み、生物学的活性を有するポリペプチド；
（ｃ）（ａ）に示すアミノ酸配列と少なくとも８０％以上の配列同一性を有し、生物学的活性を有するポリペプチド；
（ｄ）配列番号１、７、１５または１７に示す核酸配列によってコードされるアミノ酸配列を含むポリペプチド；
（ｅ）（ｄ）に示す核酸配列において、１ヌクレオチド以上９０ヌクレオチド以下の置換、付加、欠失またはそれらの組合せを含む核酸配列によってコードされ、生物学的活性を有するポリペプチド；
（ｆ）（ｄ）に示す核酸配列と少なくとも８０％以上の配列同一性を有する核酸配列によってコードされ、生物学的活性を有するポリペプチド；
（ｇ）（ｄ）〜（ｆ）のいずれか１つに示す核酸配列またはその相補的配列を含むポリヌクレオチドと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸配列によってコードされ、かつ生物学的活性を有するポリペプチド；
（ｈ）（ｄ）〜（ｇ）のいずれか１つの核酸配列の対立遺伝子変異体によってコードされ、生物学的活性を有するポリペプチド；または
（ｉ）（ａ）〜（ｈ）に示すアミノ酸配列の断片を含み、生物学的活性を有するポリペプチド、
であって、該生物学的活性は、トランス脂肪酸含有油脂の資化に関連する能力、またはトランス脂肪酸含有油脂を分解する能力である、ポリペプチド、該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む細胞もしくは無細胞発現系、あるいは、
請求項１、３〜８および２８〜３０のいずれか一項に記載のポリペプチド、請求項９および１１〜１６のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドを含む細胞または無細胞発現系、請求項１７に記載の細胞または無細胞発現系、または請求項１８もしくは１９に記載の油分解剤を処理対象に作用させることを包含する、油分解除去方法。
【請求項２２】
前記処理対象はトランス脂肪酸またはトランス脂肪酸含有油脂を含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
（ａ）配列番号４、１１、１６または１８に示すアミノ酸配列を含むポリペプチド；
（ｂ）（ａ）のアミノ酸配列において、１アミノ酸以上３０アミノ酸以下の置換、付加、欠失またはそれらの組合せを含むアミノ酸配列を含み、生物学的活性を有するポリペプチド；
（ｃ）（ａ）に示すアミノ酸配列と少なくとも８０％以上の配列同一性を有し、生物学的活性を有するポリペプチド；
（ｄ）配列番号１、７、１５または１７に示す核酸配列によってコードされるアミノ酸配列を含むポリペプチド；
（ｅ）（ｄ）に示す核酸配列において、１ヌクレオチド以上９０ヌクレオチド以下の置換、付加、欠失またはそれらの組合せを含む核酸配列によってコードされ、生物学的活性を有するポリペプチド；
（ｆ）（ｄ）に示す核酸配列と少なくとも８０％以上の配列同一性を有する核酸配列によってコードされ、生物学的活性を有するポリペプチド；
（ｇ）（ｄ）〜（ｆ）のいずれか１つに示す核酸配列またはその相補的配列を含むポリヌクレオチドと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸配列によってコードされ、かつ生物学的活性を有するポリペプチド；
（ｈ）（ｄ）〜（ｇ）のいずれか１つの核酸配列の対立遺伝子変異体によってコードされ、生物学的活性を有するポリペプチド；または
（ｉ）（ａ）〜（ｈ）に示すアミノ酸配列の断片を含み、生物学的活性を有するポリペプチド、
であって、該生物学的活性は、トランス脂肪酸含有油脂の資化に関連する能力、またはトランス脂肪酸含有油脂を分解する能力である、ポリペプチド、該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む細胞もしくは無細胞発現系、あるいは、
請求項１、３〜８および２８〜３０のいずれか一項に記載のポリペプチド、請求項９および１１〜１６のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドを含む細胞もしくは無細胞発現系、請求項１７に記載の細胞もしくは無細胞発現系、または請求項１８もしくは１９に記載の油分解剤を含む洗剤。
【請求項２４】
脂肪改変・油脂生産技術における、
（ａ）配列番号４、１１、１６または１８に示すアミノ酸配列を含むポリペプチド；
（ｂ）（ａ）のアミノ酸配列において、１アミノ酸以上３０アミノ酸以下の置換、付加、欠失またはそれらの組合せを含むアミノ酸配列を含み、生物学的活性を有するポリペプチド；
（ｃ）（ａ）に示すアミノ酸配列と少なくとも８０％以上の配列同一性を有し、生物学的活性を有するポリペプチド；
（ｄ）配列番号１、７、１５または１７に示す核酸配列によってコードされるアミノ酸配列を含むポリペプチド；
（ｅ）（ｄ）に示す核酸配列において、１ヌクレオチド以上９０ヌクレオチド以下の置換、付加、欠失またはそれらの組合せを含む核酸配列によってコードされ、生物学的活性を有するポリペプチド；
（ｆ）（ｄ）に示す核酸配列と少なくとも８０％以上の配列同一性を有する核酸配列によってコードされ、生物学的活性を有するポリペプチド；
（ｇ）（ｄ）〜（ｆ）のいずれか１つに示す核酸配列またはその相補的配列を含むポリヌクレオチドと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸配列によってコードされ、かつ生物学的活性を有するポリペプチド；
（ｈ）（ｄ）〜（ｇ）のいずれか１つの核酸配列の対立遺伝子変異体によってコードされ、生物学的活性を有するポリペプチド；または
（ｉ）（ａ）〜（ｈ）に示すアミノ酸配列の断片を含み、生物学的活性を有するポリペプチド、
であって、該生物学的活性は、トランス脂肪酸含有油脂の資化に関連する能力、またはトランス脂肪酸含有油脂を分解する能力である、ポリペプチド、該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む細胞もしくは無細胞発現系、あるいは、
請求項１、３〜８および２８〜３０のいずれか一項に記載のポリペプチド、請求項９および１１〜１６のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドを含む細胞または無細胞発現系、請求項１７に記載の細胞または無細胞発現系、または請求項１８もしくは１９に記載の油分解剤の使用。
【請求項２５】
（ａ）配列番号４、１１、１６または１８に示すアミノ酸配列を含むポリペプチド；
（ｂ）（ａ）のアミノ酸配列において、１アミノ酸以上３０アミノ酸以下の置換、付加、欠失またはそれらの組合せを含むアミノ酸配列を含み、生物学的活性を有するポリペプチド；
（ｃ）（ａ）に示すアミノ酸配列と少なくとも８０％以上の配列同一性を有し、生物学的活性を有するポリペプチド；
（ｄ）配列番号１、７、１５または１７に示す核酸配列によってコードされるアミノ酸配列を含むポリペプチド；
（ｅ）（ｄ）に示す核酸配列において、１ヌクレオチド以上９０ヌクレオチド以下の置換、付加、欠失またはそれらの組合せを含む核酸配列によってコードされ、生物学的活性を有するポリペプチド；
（ｆ）（ｄ）に示す核酸配列と少なくとも８０％以上の配列同一性を有する核酸配列によってコードされ、生物学的活性を有するポリペプチド；
（ｇ）（ｄ）〜（ｆ）のいずれか１つに示す核酸配列またはその相補的配列を含むポリヌクレオチドと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸配列によってコードされ、かつ生物学的活性を有するポリペプチド；
（ｈ）（ｄ）〜（ｇ）のいずれか１つの核酸配列の対立遺伝子変異体によってコードされ、生物学的活性を有するポリペプチド；または
（ｉ）（ａ）〜（ｈ）に示すアミノ酸配列の断片を含み、生物学的活性を有するポリペプチド、
であって、該生物学的活性は、トランス脂肪酸含有油脂の資化に関連する能力、またはトランス脂肪酸含有油脂を分解する能力である、ポリペプチド、該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む細胞もしくは無細胞発現系、あるいは
請求項１、３〜８および２８〜３０のいずれか一項に記載のポリペプチド、請求項９および１１〜１６のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドを含む細胞もしくは無細胞発現系、請求項１７に記載の細胞もしくは無細胞発現系、または請求項１８もしくは１９に記載の油分解剤を含む化粧品。
【請求項２６】
（ａ）配列番号４、１１、１６または１８に示すアミノ酸配列を含むポリペプチド；
（ｂ）（ａ）のアミノ酸配列において、１アミノ酸以上３０アミノ酸以下の置換、付加、欠失またはそれらの組合せを含むアミノ酸配列を含み、生物学的活性を有するポリペプチド；
（ｃ）（ａ）に示すアミノ酸配列と少なくとも８０％以上の配列同一性を有し、生物学的活性を有するポリペプチド；
（ｄ）配列番号１、７、１５または１７に示す核酸配列によってコードされるアミノ酸配列を含むポリペプチド；
（ｅ）（ｄ）に示す核酸配列において、１ヌクレオチド以上９０ヌクレオチド以下の置換、付加、欠失またはそれらの組合せを含む核酸配列によってコードされ、生物学的活性を有するポリペプチド；
（ｆ）（ｄ）に示す核酸配列と少なくとも８０％以上の配列同一性を有する核酸配列によってコードされ、生物学的活性を有するポリペプチド；
（ｇ）（ｄ）〜（ｆ）のいずれか１つに示す核酸配列またはその相補的配列を含むポリヌクレオチドと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸配列によってコードされ、かつ生物学的活性を有するポリペプチド；
（ｈ）（ｄ）〜（ｇ）のいずれか１つの核酸配列の対立遺伝子変異体によってコードされ、生物学的活性を有するポリペプチド；または
（ｉ）（ａ）〜（ｈ）に示すアミノ酸配列の断片を含み、生物学的活性を有するポリペプチド、
であって、該生物学的活性は、トランス脂肪酸含有油脂の資化に関連する能力、またはトランス脂肪酸含有油脂を分解する能力である、ポリペプチド、該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む細胞もしくは無細胞発現系、あるいは、
請求項１、３〜８および２８〜３０のいずれか一項に記載のポリペプチド、または請求項９〜１６のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドを含む細胞もしくは無細胞発現系、請求項１７に記載の細胞もしくは無細胞発現系、または請求項１８もしくは１９に記載の油分解剤を含む医薬品。
【請求項２７】
（ａ）配列番号４、１１、１６または１８に示すアミノ酸配列を含むポリペプチド；
（ｂ）（ａ）のアミノ酸配列において、１アミノ酸以上３０アミノ酸以下の置換、付加、欠失またはそれらの組合せを含むアミノ酸配列を含み、生物学的活性を有するポリペプチド；
（ｃ）（ａ）に示すアミノ酸配列と少なくとも８０％以上の配列同一性を有し、生物学的活性を有するポリペプチド；
（ｄ）配列番号１、７、１５または１７に示す核酸配列によってコードされるアミノ酸配列を含むポリペプチド；
（ｅ）（ｄ）に示す核酸配列において、１ヌクレオチド以上９０ヌクレオチド以下の置換、付加、欠失またはそれらの組合せを含む核酸配列によってコードされ、生物学的活性を有するポリペプチド；
（ｆ）（ｄ）に示す核酸配列と少なくとも８０％以上の配列同一性を有する核酸配列によってコードされ、生物学的活性を有するポリペプチド；
（ｇ）（ｄ）〜（ｆ）のいずれか１つに示す核酸配列またはその相補的配列を含むポリヌクレオチドと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸配列によってコードされ、かつ生物学的活性を有するポリペプチド；
（ｈ）（ｄ）〜（ｇ）のいずれか１つの核酸配列の対立遺伝子変異体によってコードされ、生物学的活性を有するポリペプチド；または
（ｉ）（ａ）〜（ｈ）に示すアミノ酸配列の断片を含み、生物学的活性を有するポリペプチド、
であって、該生物学的活性は、トランス脂肪酸含有油脂の資化に関連する能力、またはトランス脂肪酸含有油脂を分解する能力である、ポリペプチド、該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む細胞もしくは無細胞発現系、あるいは、
請求項１、３〜８および２８〜３０のいずれか一項に記載のポリペプチド、請求項９および１１〜１６のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドを含む細胞もしくは無細胞発現系、請求項１７に記載の細胞もしくは無細胞発現系、または請求項１８もしくは１９に記載の油分解剤を含む、トランス脂肪酸含有油脂を分解するための組成物。
【請求項２８】
（ａ）配列番号４、１１、１６または１８に示すアミノ酸配列を含むポリペプチド、または
（ｃ）（ａ）に示すアミノ酸配列と少なくとも９０％以上の配列同一性を有し、前記生物学的活性を有するポリペプチド
である、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項２９】
（ａ）配列番号４、１１、１６または１８に示すアミノ酸配列を含むポリペプチド；または
（ｂ）（ａ）のアミノ酸配列において、１アミノ酸以上１５アミノ酸以下の置換、付加、欠失またはそれらの組合せを含むアミノ酸配列を含み、前記生物学的活性を有するポリペプチド
である、請求項１および３〜８のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項３０】
（ａ）配列番号４、１１、１６または１８に示すアミノ酸配列を含むポリペプチド；または
（ｂ）（ａ）のアミノ酸配列において、１アミノ酸以上３アミノ酸以下の置換、付加、欠失またはそれらの組合せを含むアミノ酸配列を含み、前記生物学的活性を有するポリペプチド
である、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項３１】
前記ポリペプチドは、
（ａ）配列番号４、１１、１６または１８に示すアミノ酸配列を含むポリペプチド、または
（ｃ）（ａ）に示すアミノ酸配列と少なくとも９０％以上の配列同一性を有し、前記生物学的活性を有するポリペプチド
である、請求項１８または１９に記載の油分解剤。
【請求項３２】
前記ポリペプチドは、
（ａ）配列番号４、１１、１６または１８に示すアミノ酸配列を含むポリペプチド；または
（ｂ）（ａ）のアミノ酸配列において、１アミノ酸以上１５アミノ酸以下の置換、付加、欠失またはそれらの組合せを含むアミノ酸配列を含み、前記生物学的活性を有するポリペプチド
である、請求項１８または１９に記載の油分解剤。
【請求項３３】
前記ポリペプチドは、
（ａ）配列番号４、１１、１６または１８に示すアミノ酸配列を含むポリペプチド；または
（ｂ）（ａ）のアミノ酸配列において、１アミノ酸以上３アミノ酸以下の置換、付加、欠失またはそれらの組合せを含むアミノ酸配列を含み、前記生物学的活性を有するポリペプチド
である、請求項１８または１９に記載の油分解剤。
【請求項３４】
前記ポリペプチドは、
（ａ）配列番号４、１１、１６または１８に示すアミノ酸配列を含むポリペプチド、または
（ｃ）（ａ）に示すアミノ酸配列と少なくとも９０％以上の配列同一性を有し、前記生物学的活性を有するポリペプチド
である、請求項２７に記載の組成物。
【請求項３５】
前記ポリペプチドは、
（ａ）配列番号４、１１、１６または１８に示すアミノ酸配列を含むポリペプチド；または
（ｂ）（ａ）のアミノ酸配列において、１アミノ酸以上１５アミノ酸以下の置換、付加、欠失またはそれらの組合せを含むアミノ酸配列を含み、前記生物学的活性を有するポリペプチド
である、請求項２７に記載の組成物。
【請求項３６】
前記ポリペプチドは、
（ａ）配列番号４、１１、１６または１８に示すアミノ酸配列を含むポリペプチド；または
（ｂ）（ａ）のアミノ酸配列において、１アミノ酸以上３アミノ酸以下の置換、付加、欠失またはそれらの組合せを含むアミノ酸配列を含み、前記生物学的活性を有するポリペプチド
である、請求項２７に記載の組成物。
【手続補正書】
【提出日】令和2年1月28日(2020.1.28)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）配列番号４、１１、１６または１８に示すアミノ酸配列を含むポリペプチド；
（ｂ）（ａ）のアミノ酸配列において、１アミノ酸以上３０アミノ酸以下の置換、付加、欠失またはそれらの組合せを含むアミノ酸配列を含み、生物学的活性を有するポリペプチド；
（ｃ）（ａ）に示すアミノ酸配列と少なくとも８０％以上の配列同一性を有し、生物学的活性を有するポリペプチド；
（ｄ）配列番号１、７、１５または１７に示す核酸配列によってコードされるアミノ酸配列を含むポリペプチド；
（ｅ）（ｄ）に示す核酸配列において、１ヌクレオチド以上９０ヌクレオチド以下の置換、付加、欠失またはそれらの組合せを含む核酸配列によってコードされ、生物学的活性を有するポリペプチド；
（ｆ）（ｄ）に示す核酸配列と少なくとも８０％以上の配列同一性を有する核酸配列によってコードされ、生物学的活性を有するポリペプチド；
（ｇ）（ｄ）〜（ｆ）のいずれか１つに示す核酸配列またはその相補的配列を含むポリヌクレオチドと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸配列によってコードされ、かつ生物学的活性を有するポリペプチド；
（ｈ）（ｄ）〜（ｇ）のいずれか１つの核酸配列の対立遺伝子変異体によってコードされ、生物学的活性を有するポリペプチド；または
（ｉ）（ａ）〜（ｈ）に示すアミノ酸配列の断片を含み、生物学的活性を有するポリペプチド、
である、ポリペプチドであって、該生物学的活性は、トランス脂肪酸含有油脂の資化に関連する能力、トランス脂肪酸含有油脂を分解する能力、および（ａ）に記載のポリペプチドが有する油脂分解活性と少なくとも同じ度合いの活性の少なくとも１つを含む、ポリペプチドであって、
該ポリペプチドは、
（１）
2020009231.tif 000020
（２）
【化１】
2020009231.tif 000021
からなるポリペプチド、
（３）
【化２】
2020009231.tif 000022
からなるポリペプチド、
（４）
2020009231.tif 000023
（５）
2020009231.tif 000024
（６）
2020009231.tif 000025
（７）
2020009231.tif 000026
のいずれでもない、ポリペプチド。
【請求項２】
（削除）
【請求項３】
４５〜７０℃が油脂を分解する能力の至適温度である、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項４】
３５〜５５℃が油脂を分解する能力の至適温度である、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項５】
６５℃以上において熱安定性を有する、請求項１または３に記載のポリペプチド。
【請求項６】
７５℃以上において熱安定性を有する、請求項１または４に記載のポリペプチド。
【請求項７】
１５℃において油脂を分解する能力を有する、請求項１および３〜６のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項８】
ブルクホルデリア  アルボリス（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ａｒｂｏｒｉｓ）に由来するポリペプチドである、請求項１および３〜７のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項９】
（Ａ）配列番号１、７、１５または１７に示す核酸配列を含むポリヌクレオチド；
（Ｂ）（Ａ）に示す核酸配列において、１ヌクレオチド以上９０ヌクレオチド以下の置換、付加、欠失またはそれらの組合せを含む核酸配列を含み、生物学的活性を有するポリペプチドをコードする、ポリヌクレオチド；
（Ｃ）（Ａ）に示す核酸配列と少なくとも８０％以上の配列同一性を有する核酸配列を含み、生物学的活性を有するポリペプチドをコードする、ポリヌクレオチド；
（Ｄ）（Ａ）〜（Ｃ）のいずれか１つに示す核酸配列またはその相補的配列を含むポリヌクレオチドと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸配列を含み、かつ生物学的活性を有するポリペプチドをコードする、ポリヌクレオチド；
（Ｅ）（Ａ）〜（Ｄ）のいずれか１つの核酸配列の対立遺伝子変異体であって、生物学的活性を有するポリペプチドをコードする、ポリヌクレオチド；または
（Ｆ）配列番号４、１１、１６または１８に示すアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする、ポリヌクレオチド；
（Ｇ）（Ｆ）のアミノ酸配列において、１アミノ酸以上３０アミノ酸以下の置換、付加、欠失またはそれらの組合せを含むアミノ酸配列を含み、生物学的活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；または
（Ｈ）（Ｆ）に示すアミノ酸配列と少なくとも８０％以上の配列同一性を有し、生物学的活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
（Ｉ）（Ｆ）〜（Ｈ）に示す核酸配列の断片を含み、生物学的活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、
である、ポリヌクレオチドであって、該生物学的活性は、トランス脂肪酸含有油脂の資化に関連する能力、トランス脂肪酸含有油脂を分解する能力、および（Ａ）に記載のポリヌクレオチドがコードするポリペプチドが有する油脂分解活性と少なくとも同じ度合いの活性の少なくとも１つを含む、ポリヌクレオチドであって、
該ポリヌクレオチドは、
（１）
2020009231.tif 000027
2020009231.tif 000028
（２）
【化３】
2020009231.tif 000029
からなるポリヌクレオチド、
（３）
2020009231.tif 000030
2020009231.tif 000031
（４）
2020009231.tif 000032
2020009231.tif 000033
（５）
2020009231.tif 000034
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のいずれでもない、ポリヌクレオチド。
【請求項１０】
（削除）
【請求項１１】
４５〜７０℃が油脂を分解する能力の至適温度であるポリペプチドをコードする、請求項９に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１２】
３５〜５５℃が油脂を分解する能力の至適温度であるポリペプチドをコードする、請求項９に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１３】
６５℃以上において熱安定性を有するポリペプチドをコードする、請求項９または１１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１４】
７５℃以上において熱安定性を有するポリペプチドをコードする、請求項９または１２に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１５】
前記ポリヌクレオチドは、１５℃において油脂を分解する能力を有するポリペプチドをコードする、請求項９および１１〜１４のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１６】
ブルクホルデリア  アルボリス（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｃｒｉａ  ａｒｂｏｒｉｓ）に由来するポリヌクレオチドである、請求項９および１１〜１５のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１７】
請求項９および１１〜１６のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドを含む細胞または無細胞発現系。
【請求項１８】
請求項１、３〜８および２８〜３０のいずれか一項に記載のポリペプチド、請求項９および１１〜１６のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドを含む細胞もしくは無細胞発現系、または請求項１７に記載の細胞もしくは無細胞発現系を含む油分解剤。
【請求項１９】
さらなる油処理成分を含む、請求項１８に記載の油分解剤。
【請求項２０】
請求項１、３〜８および２８〜３０のいずれか一項に記載のポリペプチド、請求項９および１１〜１６のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドを含む細胞もしくは無細胞発現系、請求項１７に記載の細胞もしくは無細胞発現系、または請求項１８に記載の油分解剤と、さらなる油処理成分とを備える、油分解のためのキット。
【請求項２１】
請求項１、３〜８および２８〜３０のいずれか一項に記載のポリペプチド、請求項９および１１〜１６のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドを含む細胞または無細胞発現系、請求項１７に記載の細胞または無細胞発現系、または請求項１８もしくは１９に記載の油分解剤を処理対象に作用させることを包含する、油分解除去方法。
【請求項２２】
（ａ）配列番号４、１１、１６または１８に示すアミノ酸配列を含むポリペプチド；
（ｂ）（ａ）のアミノ酸配列において、１アミノ酸以上３０アミノ酸以下の置換、付加、欠失またはそれらの組合せを含むアミノ酸配列を含み、生物学的活性を有するポリペプチド；
（ｃ）（ａ）に示すアミノ酸配列と少なくとも８０％以上の配列同一性を有し、生物学的活性を有するポリペプチド；
（ｄ）配列番号１、７、１５または１７に示す核酸配列によってコードされるアミノ酸配列を含むポリペプチド；
（ｅ）（ｄ）に示す核酸配列において、１ヌクレオチド以上９０ヌクレオチド以下の置換、付加、欠失またはそれらの組合せを含む核酸配列によってコードされ、生物学的活性を有するポリペプチド；
（ｆ）（ｄ）に示す核酸配列と少なくとも８０％以上の配列同一性を有する核酸配列によってコードされ、生物学的活性を有するポリペプチド；
（ｇ）（ｄ）〜（ｆ）のいずれか１つに示す核酸配列またはその相補的配列を含むポリヌクレオチドと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸配列によってコードされ、かつ生物学的活性を有するポリペプチド；
（ｈ）（ｄ）〜（ｇ）のいずれか１つの核酸配列の対立遺伝子変異体によってコードされ、生物学的活性を有するポリペプチド；または
（ｉ）（ａ）〜（ｈ）に示すアミノ酸配列の断片を含み、生物学的活性を有するポリペプチド、
である、ポリペプチドであって、該生物学的活性は、トランス脂肪酸含有油脂の資化に関連する能力、トランス脂肪酸含有油脂を分解する能力、および（ａ）に記載のポリペプチドが有する油脂分解活性と少なくとも同じ度合いの活性の少なくとも１つを含む、ポリペプチド、または該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む細胞もしくは無細胞発現系を、処理対象に作用させることを包含する、油分解除去方法であって、該処理対象はトランス脂肪酸またはトランス脂肪酸含有油脂を含む、方法。
【請求項２３】
請求項１、３〜８および２８〜３０のいずれか一項に記載のポリペプチド、請求項９および１１〜１６のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドを含む細胞もしくは無細胞発現系、請求項１７に記載の細胞もしくは無細胞発現系、または請求項１８もしくは１９に記載の油分解剤を含む洗剤。
【請求項２４】
脂肪改変・油脂生産技術における、請求項１、３〜８および２８〜３０のいずれか一項に記載のポリペプチド、請求項９および１１〜１６のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドを含む細胞または無細胞発現系、請求項１７に記載の細胞または無細胞発現系、または請求項１８もしくは１９に記載の油分解剤の使用。
【請求項２５】
請求項１、３〜８および２８〜３０のいずれか一項に記載のポリペプチド、請求項９および１１〜１６のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドを含む細胞もしくは無細胞発現系、請求項１７に記載の細胞もしくは無細胞発現系、または請求項１８もしくは１９に記載の油分解剤を含む化粧品。
【請求項２６】
請求項１、３〜８および２８〜３０のいずれか一項に記載のポリペプチド、または請求項９〜１６のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドを含む細胞もしくは無細胞発現系、請求項１７に記載の細胞もしくは無細胞発現系、または請求項１８もしくは１９に記載の油分解剤を含む医薬品。
【請求項２７】
（ａ）配列番号４、１１、１６または１８に示すアミノ酸配列を含むポリペプチド；
（ｂ）（ａ）のアミノ酸配列において、１アミノ酸以上３０アミノ酸以下の置換、付加、欠失またはそれらの組合せを含むアミノ酸配列を含み、生物学的活性を有するポリペプチド；
（ｃ）（ａ）に示すアミノ酸配列と少なくとも８０％以上の配列同一性を有し、生物学的活性を有するポリペプチド；
（ｄ）配列番号１、７、１５または１７に示す核酸配列によってコードされるアミノ酸配列を含むポリペプチド；
（ｅ）（ｄ）に示す核酸配列において、１ヌクレオチド以上９０ヌクレオチド以下の置換、付加、欠失またはそれらの組合せを含む核酸配列によってコードされ、生物学的活性を有するポリペプチド；
（ｆ）（ｄ）に示す核酸配列と少なくとも８０％以上の配列同一性を有する核酸配列によってコードされ、生物学的活性を有するポリペプチド；
（ｇ）（ｄ）〜（ｆ）のいずれか１つに示す核酸配列またはその相補的配列を含むポリヌクレオチドと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸配列によってコードされ、かつ生物学的活性を有するポリペプチド；
（ｈ）（ｄ）〜（ｇ）のいずれか１つの核酸配列の対立遺伝子変異体によってコードされ、生物学的活性を有するポリペプチド；または
（ｉ）（ａ）〜（ｈ）に示すアミノ酸配列の断片を含み、生物学的活性を有するポリペプチド、
であって、該生物学的活性は、トランス脂肪酸含有油脂の資化に関連する能力、トランス脂肪酸含有油脂を分解する能力、および（ａ）に記載のポリペプチドが有する油脂分解活性と少なくとも同じ度合いの活性の少なくとも１つを含む、ポリペプチド、該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む細胞もしくは無細胞発現系を含む、トランス脂肪酸含有油脂を分解するための組成物。
【請求項２８】
（ａ）配列番号４、１１、１６または１８に示すアミノ酸配列を含むポリペプチド、または
（ｃ）（ａ）に示すアミノ酸配列と少なくとも９０％以上の配列同一性を有し、前記生物学的活性を有するポリペプチド
である、請求項１および３〜８のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項２９】
（ａ）配列番号４、１１、１６または１８に示すアミノ酸配列を含むポリペプチド；または
（ｂ）（ａ）のアミノ酸配列において、１アミノ酸以上１５アミノ酸以下の置換、付加、欠失またはそれらの組合せを含むアミノ酸配列を含み、前記生物学的活性を有するポリペプチド
である、請求項１および３〜８のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項３０】
（ａ）配列番号４、１１、１６または１８に示すアミノ酸配列を含むポリペプチド；または
（ｂ）（ａ）のアミノ酸配列において、１アミノ酸以上３アミノ酸以下の置換、付加、欠失またはそれらの組合せを含むアミノ酸配列を含み、前記生物学的活性を有するポリペプチド
である、請求項１および３〜８のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項３１】
前記ポリペプチドは、
（ａ）配列番号４、１１、１６または１８に示すアミノ酸配列を含むポリペプチド、または
（ｃ）（ａ）に示すアミノ酸配列と少なくとも９０％以上の配列同一性を有し、前記生物学的活性を有するポリペプチド
である、請求項１８または１９に記載の油分解剤。
【請求項３２】
前記ポリペプチドは、
（ａ）配列番号４、１１、１６または１８に示すアミノ酸配列を含むポリペプチド；または
（ｂ）（ａ）のアミノ酸配列において、１アミノ酸以上１５アミノ酸以下の置換、付加、欠失またはそれらの組合せを含むアミノ酸配列を含み、前記生物学的活性を有するポリペプチド
である、請求項１８または１９に記載の油分解剤。
【請求項３３】
前記ポリペプチドは、
（ａ）配列番号４、１１、１６または１８に示すアミノ酸配列を含むポリペプチド；または
（ｂ）（ａ）のアミノ酸配列において、１アミノ酸以上３アミノ酸以下の置換、付加、欠失またはそれらの組合せを含むアミノ酸配列を含み、前記生物学的活性を有するポリペプチド
である、請求項１８または１９に記載の油分解剤。
【請求項３４】
前記ポリペプチドは、
（ａ）配列番号４、１１、１６または１８に示すアミノ酸配列を含むポリペプチド、または
（ｃ）（ａ）に示すアミノ酸配列と少なくとも９０％以上の配列同一性を有し、前記生物学的活性を有するポリペプチド
である、請求項２７に記載の組成物。
【請求項３５】
前記ポリペプチドは、
（ａ）配列番号４、１１、１６または１８に示すアミノ酸配列を含むポリペプチド；または
（ｂ）（ａ）のアミノ酸配列において、１アミノ酸以上１５アミノ酸以下の置換、付加、欠失またはそれらの組合せを含むアミノ酸配列を含み、前記生物学的活性を有するポリペプチド
である、請求項２７に記載の組成物。
【請求項３６】
前記ポリペプチドは、
（ａ）配列番号４、１１、１６または１８に示すアミノ酸配列を含むポリペプチド；または
（ｂ）（ａ）のアミノ酸配列において、１アミノ酸以上３アミノ酸以下の置換、付加、欠失またはそれらの組合せを含むアミノ酸配列を含み、前記生物学的活性を有するポリペプチド
である、請求項２７に記載の組成物。
【国際調査報告】
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