(57)【要約】  本発明のＲＩ標識された抗ＭＵＣ５ＡＣヒト化抗体は、放射性核種がキレートしたキレート剤と、抗体との複合体（前記放射性核種がα線又はポジトロンを放出する金属核種であり、前記抗体が、ＭＵＣ５ＡＣに特異的に結合するヒト化抗体である）であり、ＭＵＣ５ＡＣに対する特異性と腫瘍への集積性に優れているので、ＭＵＣ５ＡＣが過剰発現している疾患、特にがんの治療及び／又は診断に極めて有用である。
2021075544.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
放射性核種がキレートしたキレート剤と、抗体との複合体であって、
前記放射性核種がα線またはポジトロンを放出する金属核種であり、
前記抗体が、ムチンサブタイプ５ＡＣに特異的に結合するヒト化抗体である、複合体。
【請求項２】
前記抗体が、
（１）配列番号１で示されるアミノ酸配列（Ｈ０１）、
（２）配列番号２で示されるアミノ酸配列（Ｈ０２）、
（３）配列番号３で示されるアミノ酸配列（Ｈ０３）、又は
（４）配列番号４で示されるアミノ酸配列（Ｈ０４）
からなる重鎖可変領域と、
（５）配列番号５で示されるアミノ酸配列（Ｌ０１）、
（６）配列番号６で示されるアミノ酸配列（Ｌ０２）、
（７）配列番号７で示されるアミノ酸配列（Ｌ０３）、又は
（８）配列番号８で示されるアミノ酸配列（Ｌ０４）
からなる軽鎖可変領域と、
を有するヒト化抗体である、請求項１に記載の複合体。
【請求項３】
前記抗体が、
（１）配列番号１で示されるアミノ酸配列（Ｈ０１）からなる重鎖可変領域と、
（７）配列番号７で示されるアミノ酸配列（Ｌ０３）からなる軽鎖可変領域と、
を有するヒト化抗体である、請求項２に記載の複合体。
【請求項４】
α線を放出する前記金属核種が、アクチニウム−２２５であり、ポジトロンを放出する金属核種がＺｒ−８９である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の複合体。
【請求項５】
前記抗体１分子に対し、前記キレート剤を１分子以上８分子以下備える、請求項１〜４のいずれか１項に記載の複合体。
【請求項６】
前記キレート剤が、リンカーを介して、前記抗体のＦｃ領域を部位特異的に修飾している、請求項１〜５のいずれか１項に記載の複合体。
【請求項７】
前記リンカーが、下記式（ｉ）で表される、１３以上１７以下のアミノ酸残基からなるペプチドを含み、架橋剤で修飾された前記ペプチドと前記抗体の架橋反応によって形成されている、請求項６に記載の複合体。
(Xa)-Xaa1-(Xb)-Xaa2-(Xc)-Xaa3-(Xd)・・・（ｉ）
（式中、Ｘａ、Ｘｂ、Ｘｃ及びＸｄは、それぞれ、連続するａ個のＸ、連続するｂ個のＸ、連続するｃ個のＸ、及び連続するｄ個のＸを表し、
Ｘは、側鎖にチオール基及びハロアセチル基のいずれも有しないアミノ酸残基であり、
ａ、ｂ、ｃ及びｄはそれぞれ独立に１以上５以下の整数で、かつａ＋ｂ＋ｃ＋ｄ≦１４を満たし、
Ｘａａ１及びＸａａ３は、それぞれ独立に、
側鎖にチオール基を有するアミノ酸に由来するアミノ酸残基を表し、又は、
一方が、側鎖にチオール基を有するアミノ酸に由来するアミノ酸残基を表し、他方が、側鎖にハロアセチル基を有するアミノ酸に由来するアミノ酸残基を表し、Ｘａａ１とＸａａ３とが連結しており、
Ｘａａ２は、リシン残基、アルギニン残基、システイン残基、アスパラギン酸残基、グルタミン酸残基、２−アミノスベリン酸、又はジアミノプロピオン酸であり、前記架橋剤で修飾されている。）
【請求項８】
前記キレート剤が、下記式（Ａ）で表される化合物又はその塩に由来する構造を有する、請求項１〜７のいずれか１項に記載の複合体。
【化１】
2021075544.tif 000054
（式（Ａ）中、Ｒ１１、Ｒ１３及びＲ１４は、それぞれ独立して、−（ＣＨ２）ｐＣＯＯＨ、−（ＣＨ２）ｐＣ５Ｈ５Ｎ、−（ＣＨ２）ｐＰＯ３Ｈ２、−（ＣＨ２）ｐＣＯＮＨ２若しくは、−（ＣＨＣＯＯＨ）（ＣＨ２）ｐＣＯＯＨからなる基であり、Ｒ１２又はＲ１５の一方が、水素原子、カルボキシル基、又は、炭素数２若しくは３のカルボキシアルキル基であり、他方が、前記抗体と複合体化するための置換基であり、ｐが０以上３以下の整数であり、Ｒ１２が前記抗体と複合化するための置換基であるときＲ１５は水素原子であり、Ｒ１２が前記抗体と複合化するための置換基でないときＲ１５は前記抗体と複合化するための置換基である。）
【請求項９】
請求項１〜８のいずれか１項に記載の複合体を有効成分として含有する、放射性医薬。
【請求項１０】
前記放射性核種がα線を放出する金属核種であり、がんのＲＩ内用療法に用いられる、請求項９に記載の放射性医薬。
【請求項１１】
前記ＲＩ内用療法において、対象に対し１回あたり２５０ｋＢｑ／ｋｇ以下の投与量で投与されるための、請求項１０に記載の放射性医薬。
【請求項１２】
前記投与量が、１回あたり８０ｋＢｑ／ｋｇ以下である、請求項１１に記載の放射性医薬。
【請求項１３】
前記放射性核種がポジトロンを放出する金属核種であり、がんの診断に用いられる、請求項９に記載の放射性医薬。
【請求項１４】
放射性核種がキレートしたキレート剤と、抗体との複合体を含有する放射性医薬であって、
前記抗体が、ムチンサブタイプ５ＡＣに特異的に結合するヒト化抗体である、
請求項１０〜１２いずれか一項に記載の放射性医薬を用いたＲＩ内用療法におけるがんの診断用放射性医薬。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、放射性核種がキレートしたキレート剤とムチンサブタイプ５ＡＣ特異的ヒト化抗体との複合体、それを含む放射性医薬およびそれらの用途に関する。
【背景技術】
【０００２】
ムチンは動物の上皮細胞などから分泌される粘液の主成分であり分子量１００万〜１０００万の糖を多量に含む糖タンパク質である。ムチンには上皮細胞などが産生する分泌型ムチンと、疎水性の膜貫通部位を持ち細胞膜に結合した状態で存在する膜結合型ムチンがある。ムチンのコアタンパクは総称してＭＵＣと呼ばれており、コアタンパクをコードする遺伝子は少なくとも２０種類あることがわかっている。その内の１種であるムチンサブタイプ５ＡＣ（ＭＵＣ５ＡＣ）は分泌型ムチンに属する。【０００３】
ＭＵＣ５ＡＣは、正常組織では胃や気管において発現しているが、膵がんでの過剰発現が報告されており、その他にも甲状腺がん、肝臓がん、大腸がん、胃がん、尿路上皮がん、乳がん、子宮頸がん、卵巣がん、子宮内膜がん、胆管がんでも過剰発現が報告されている。ＭＵＣ５ＡＣに対する抗体については、ヒト膵がん細胞株ＳＷ１９９０のｘｅｎｏｇｒａｆｔより精製した膵がんムチン分画を抗原として作製したマウス抗体（非特許文献１）や、それを元に作製されたキメラ抗体（特許文献１、２、非特許文献２、３）、ヒト化抗体（特許文献３、４）の報告がある。【０００４】
抗体は、抗体が有する標的分子に対する特異性を利用して、標的分子の検出のための試薬、診断薬、又は、疾患の治療のための医薬品として用いられている。検出性能及び治療効果の更なる向上を目的として、放射性核種や薬剤が結合した抗体に関する検討が進められている。非特許文献１では、β線放出核種である１３１Ｉで標識されたマウス抗体を用いた膵がんモデルマウスの放射免疫治療が報告されている。非特許文献３では、γ線放出核種である１１１Ｉｎで標識されたキメラ抗体を用いた膵がん患者のＳＰＥＣＴイメージングについて報告されている。特許文献３及び４では、ＭＵＣ５ＡＣ特異的ヒト化抗体についての記載があり、９０Ｙや１１１Ｉｎ等で標識している。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開平７−２０３９７４号公報
【特許文献２】特開平１１−５７４９号公報
【特許文献３】国際公開第２０１３／１５７１０２号
【特許文献４】国際公開第２０１３／１５７１０５号
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Japanese Journal of Cancer Research, 87, 977-984, 1996
【非特許文献２】日本臨牀64巻, 増刊号1, 2006, 274-278
【非特許文献３】Japanese Journal of Cancer Research, 90, 1179-1186, 1999
【発明の概要】
【０００７】
本発明は、ムチンサブタイプ５ＡＣ（ＭＵＣ５ＡＣ）に対する特異性と腫瘍への集積性に優れた、放射性核種で標識された抗ＭＵＣ５ＡＣヒト化抗体の提供を目的とする。
【０００８】
本発明者らは、上記課題に鑑み鋭意検討を行った結果、金属核種である放射性核種がキレートしたキレート剤と、特定のアミノ酸配列で構成される抗ＭＵＣ５ＡＣヒト化抗体との複合体を製造することに成功し、該複合体がＭＵＣ５ＡＣに対する特異性及び腫瘍への集積性に優れていることを見出し、その効果を確認して本発明を完成するに至った。
【０００９】
本発明の一態様は、放射性核種がキレートしたキレート剤と、抗体との複合体であって、放射性核種がα線またはポジトロンを放出する金属核種であり、抗体が、ＭＵＣ５ＡＣに特異的に結合するヒト化抗体である、複合体を提供するものである。
【００１０】
本発明によればＭＵＣ５ＡＣに対する特異性と腫瘍への集積性に優れた、放射性核種で標識された抗ＭＵＣ５ＡＣヒト化抗体の提供及び該抗体の用途が提供され得る。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】図１は、１１１Ｉｎ標識した各抗体を用いてＳＰＥＣＴ−ＣＴイメージングを実施した結果を示す図である。１１１Ｉｎ標識した各抗体のＳＰＥＣＴ画像を示す。
【図２】図２は、１１１Ｉｎ標識した各抗体のＳＰＥＣＴ画像より各時間点の腫瘍及び肝臓をＶＯＩ（volume of interest、三次元ＲＯＩ）解析した結果を示すグラフである。
【図３】図３は、１１１Ｉｎ標識した各抗体を投与して１６８時間後の体内分布及び排泄経路を確認した結果を示すグラフである。
【図４】図４は、１１１Ｉｎ標識した各抗体のｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ＡＲＧによる結合能を比較した結果を示す画像である。
【図５】図５は、１１１Ｉｎ標識した各抗体のｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ＡＲＧによる結合能を定量化し、比較した結果を示すグラフである。
【図６】図６は、２２５Ａｃ標識一価抗体投与後担がんマウスにおける経時的な腫瘍体積の変化を示したグラフである。
【図７】図７は、２２５Ａｃ標識一価抗体投与後担がんマウスにおける経時的な体重の変化を、投与前を１．０とした場合の相対値で示したグラフである。
【図８】図８は、２２５Ａｃ標識一価抗体投与後担がんマウスにおける肝毒性及び腎毒性について確認した結果を示すグラフである。
【図９】図９は、２２５Ａｃ標識一価抗体投与後担がんマウスにおける血液毒性（白血球数、血小板数）について確認した結果を示すグラフである。
【図１０】図１０は、高用量の２２５Ａｃ標識一価抗体投与後担がんマウスにおける経時的な腫瘍体積の変化を示したグラフである。
【図１１】図１１は、高用量の２２５Ａｃ標識一価抗体投与後担がんマウスにおける経時的な体重の変化を、投与前を１．０とした場合の相対値で示したグラフである。
【図１２】図１２は、高用量の２２５Ａｃ標識抗体投与後担がんマウスにおける肝毒性及び腎毒性について確認した結果を示すグラフである。
【図１３】図１３は、高用量の２２５Ａｃ標識抗体投与後担がんマウスにおける血液毒性（白血球数、血小板数）について確認した結果を示すグラフである。
【図１４】図１４は、２２５Ａｃ標識一価抗体又は２２５Ａｃ標識二価抗体投与後担がんマウスにおける経時的な腫瘍体積の変化を示したグラフである。
【図１５】図１５は、２２５Ａｃ標識一価抗体又は２２５Ａｃ標識二価抗体投与後担がんマウスにおける経時的な体重の変化を、投与前を１．０とした場合の相対値で示したグラフである。
【図１６】図１６は、２２５Ａｃ標識一価抗体又は２２５Ａｃ標識二価抗体投与後担がんマウスにおける肝毒性について確認した結果を示すグラフである。
【図１７】図１７は、２２５Ａｃ標識一価抗体又は２２５Ａｃ標識二価抗体投与後担がんマウスにおける腎毒性について確認した結果を示すグラフである。
【図１８】図１８は、２２５Ａｃ標識一価抗体又は２２５Ａｃ標識二価抗体投与後担がんマウスにおける血液毒性（白血球数）について確認した結果を示すグラフである。
【図１９】図１９は、２２５Ａｃ標識一価抗体又は２２５Ａｃ標識二価抗体投与後担がんマウスにおける血液毒性（血小板数）について確認した結果を示すグラフである。
【図２０】図２０は、１１１Ｉｎ標識した一価抗体又は二価抗体を投与して２０、６８及び１８８時間後の体内分布における各臓器への単位重量あたりの放射能集積量（％ＩＤ／ｇ）の結果を示すグラフである。
【図２１】図２１は、１１１Ｉｎ標識した一価抗体又は二価抗体を投与して２０、６８及び１８８時間後の体内分布における腫瘍、血液、排泄尿、排泄糞及び排泄尿及び排泄糞の合計の放射能集積率の経時変化を示すグラフである。
【図２２Ａ】図２２Ａは、８９Ｚｒ標識した抗ＭＵＣ５ＡＣヒト化抗体のヒト（−■−、…■…）及びマウス（−●−、…●…）血漿中の安定性を評価した。各種８９Ｚｒ標識抗体をヒト及びマウス血漿と混合して３７℃でインキュベートし、各経過時点での放射化学純度の経時変化を示すグラフである。上段は８９Ｚｒ標識ＤＯＴＡ−Ｂｎ−ＤＢＣＯを用いて作製した８９Ｚｒ標識抗ＭＵＣ５ＡＣヒト化抗体の結果（インキュベート後、２４時間、４８時間、１６８時間及び３７８時間の時点）を、下段は８９Ｚｒ標識ＤＯＴＡＧＡ−ＤＢＣＯを用いて作製した８９Ｚｒ標識抗ＭＵＣ５ＡＣヒト化抗体の結果（インキュベート後、２４時間、１６８時間及び３３６時間の時点）をそれぞれ示す。
【図２２Ｂ】図２２Ｂは、２２５Ａｃ標識した抗ＭＵＣ５ＡＣヒト化抗体のヒト（−■−、…■…）及びマウス（−●−、…●…）血漿中の安定性を評価した。各種２２５Ａｃ標識抗体をヒト及びマウス血漿と混合して３７℃でインキュベートし、各経過時点での放射化学純度の経時変化を示すグラフである。上段は２２５Ａｃ標識ＤＯＴＡ−Ｂｎ−ＤＢＣＯを用いて作製した２２５Ａｃ標識抗ＭＵＣ５ＡＣヒト化抗体の結果（インキュベート後、２１時間、１１５時間、１４０時間及び１６８時間の時点）を、下段は２２５Ａｃ標識ＤＯＴＡＧＡ−ＤＢＣＯを用いて作製した２２５Ａｃ標識抗ＭＵＣ５ＡＣヒト化抗体の結果（インキュベート後、４８時間、１６８時間及び３３６時間の時点）をそれぞれ示す。
【図２３】図２３は、８９Ｚｒ標識した各抗体のｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ＡＲＧによる結合能を比較した結果を示す画像である。
【図２４】図２４は、２２５Ａｃ標識した抗体のｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ＡＲＧによる結合能を比較した結果を示す画像である。
【図２５】図２５は、各８９Ｚｒ標識抗体投与後４８時間のＰＥＴ−ＣＴ撮像を実施した結果を示す画像である。
【図２６】図２６は、８９Ｚｒ標識ＤＯＴＡ−Ｂｎ−ＤＢＣＯ（−■−）及び８９Ｚｒ標識ＤＯＴＡＧＡ−ＤＢＣＯ（…●…）を用いて作製した８９Ｚｒ標識した各抗体のＳＰＥＣＴ画像より各時間点（１２、４８、８４、１６８及び２５２時間点）の腫瘍（上段図）、心臓（中段図）及び肝臓（下段図）をＶＯＩ（volume of interest、三次元ＲＯＩ）解析した結果を示すグラフである。
【図２７】図２７は、８９Ｚｒ標識ＤＯＴＡ−Ｂｎ−ＤＢＣＯ（−●−）及び８９Ｚｒ標識ＤＯＴＡＧＡ−ＤＢＣＯ（…●…）を用いて作製した８９Ｚｒ標識した各抗体を投与後、各時間点（１２、４８、８４、１６８及び２５２時間点）の腫瘍及び肝臓への集積から腫瘍肝臓比を算出した結果を示すグラフである。
【図２８Ａ】図２８Ａは、８９Ｚｒ標識ＤＯＴＡ−Ｂｎ−ＤＢＣＯ（−■−）及び８９Ｚｒ標識ＤＯＴＡＧＡ−ＤＢＣＯ（…●…）を用いて作製した８９Ｚｒ標識した各抗体を投与して２０、６８及び１８８時間後の体内分布における各臓器への単位重量あたりの放射能集積量（％ＩＤ／ｇ）の結果を示すグラフである。上段は腫瘍の、下段は血液の結果をそれぞれ示す。
【図２８Ｂ】図２８Ｂは、８９Ｚｒ標識ＤＯＴＡ−Ｂｎ−ＤＢＣＯ（−■−）及び８９Ｚｒ標識ＤＯＴＡＧＡ−ＤＢＣＯ（…●…）を用いて作製した８９Ｚｒ標識した各抗体を投与して２０、６８及び１８８時間後の体内分布における各臓器への単位重量あたりの放射能集積量（％ＩＤ／ｇ）の結果を示すグラフである。上段は肝臓の、下段は腎臓の結果をそれぞれ示す。
【図２８Ｃ】図２８Ｃは、８９Ｚｒ標識ＤＯＴＡ−Ｂｎ−ＤＢＣＯ（−■−）及び８９Ｚｒ標識ＤＯＴＡＧＡ−ＤＢＣＯ（…●…）を用いて作製した８９Ｚｒ標識した各抗体を投与して２０、６８及び１８８時間後の体内分布における各臓器への単位重量あたりの放射能集積量（％ＩＤ／ｇ）の結果を示すグラフである。上段は心臓の、下段は肺の結果をそれぞれ示す。
【図２８Ｄ】図２８Ｄは、８９Ｚｒ標識ＤＯＴＡ−Ｂｎ−ＤＢＣＯ（−■−）及び８９Ｚｒ標識ＤＯＴＡＧＡ−ＤＢＣＯ（…●…）を用いて作製した８９Ｚｒ標識した各抗体を投与して２０、６８及び１８８時間後の体内分布における各臓器への単位重量あたりの放射能集積量（％ＩＤ／ｇ）の結果を示すグラフである。脾臓及び膵臓の結果をそれぞれ示す。
【図２９】図２９は、８９Ｚｒ標識ＤＯＴＡ−Ｂｎ−ＤＢＣＯ（−■−、−□−）及び８９Ｚｒ標識ＤＯＴＡＧＡ−ＤＢＣＯ（…●…、…〇…）を用いて作製した８９Ｚｒ標識した各抗体を投与して２０、６８及び１８８時間後の排泄糞（−□−、…〇…）及び排泄尿（−■−、…●…）の放射能集積率（％ＩＤ）の経時変化を示すグラフである。
【図３０】図３０は、２２５Ａｃ標識ＤＯＴＡＧＡ−ＤＢＣＯを用いて作製した２２５Ａｃ標識抗体を担がんマウスに投与放射能量５ｋＢｑ／匹又は１０ｋＢｑ／匹で投与した後の経時的な腫瘍体積（Ａ）及び体重（Ｂ）の変化を示したグラフである。
【図３１】図３１は、２２５Ａｃ標識ＤＯＴＡＧＡ−ＤＢＣＯを用いて作製した２２５Ａｃ標識抗体投与後担がんマウスにおける血液毒性（白血球数）について確認した結果を示すグラフである。
【図３２】図３２は、２２５Ａｃ標識ＤＯＴＡＧＡ−ＤＢＣＯを用いて作製した２２５Ａｃ標識抗体投与後担がんマウスにおける血液毒性（血小板数）について確認した結果を示すグラフである。
【図３３】図３３は、２２５Ａｃ標識ＤＯＴＡＧＡ−ＤＢＣＯを用いて作製した２２５Ａｃ標識抗体投与後担がんマウスにおける肝毒性（ＡＬＴ、ＡＳＴ）について確認した結果を示すグラフである。
【図３４】図３４は、２２５Ａｃ標識ＤＯＴＡＧＡ−ＤＢＣＯを用いて作製した２２５Ａｃ標識抗体投与後担がんマウスにおける腎毒性（ＢＵＮ）について確認した結果を示すグラフである。
【図３５】図３５は、[89Zr]Random-DFO-抗ＭＵＣ５ＡＣヒト化抗体を用い経時的にＳＰＥＣＴ−ＣＴイメージングを実施した結果を示す図である。
【図３６】図３６は、[89Zr]Random-DFO-抗ＭＵＣ５ＡＣヒト化抗体のＳＰＥＣＴ画像より各時間点の腫瘍（−●−）、心臓（血液）（…■…）及び肝臓（…△…）をＶＯＩ（volume of interest、三次元ＲＯＩ）解析した結果を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本明細書で使用する用語は、特に言及しない限り、当該技術分野で通常用いられる意味で用いることができる。
【００１３】
（１）複合体１
本発明は、放射性核種がキレートしたキレート剤（以下、本発明のキレート剤とも称する）と、抗体との複合体であって、前記放射性核種はα線を放出する金属核種であり、前記抗体はＭＵＣ５ＡＣに特異的に結合するヒト化抗体である、複合体（以下、本発明の複合体とも称する）を提供する。
【００１４】
（１−１）放射性核種
本発明の複合体に含まれる放射性核種は、α線を放出する金属核種である。該金属核種は、放射性金属の壊変過程でα線を放出する核種であればよく、詳細には、２１２Ｂｉ、２１３Ｂｉ、２２７Ｔｈ又は２２５Ａｃ等が好ましく用いられ、より好ましくは２２７Ｔｈ又は２２５Ａｃであり、更に好ましくは２２５Ａｃ（アクチニウム−２２５）である。
本発明のα線を放出する金属核種は、サイクロトロンや線形加速器等の加速器を用いて公知の方法によって製造することができ、例えば２２５Ａｃは、サイクロトロンを用いて２２６Ｒａターゲットに陽子を照射することで、（ｐ，２ｎ）の核反応によって生成することができる。生成したα線を放出する金属核種は、ターゲットから分離精製することで精製することができ、例えば２２５Ａｃは、２２５Ａｃを含むターゲットを酸等で溶解し、溶解液にアルカリを添加することで２２５Ａｃを含む塩を析出させ、当該塩を分離精製することで、精製した２２５Ａｃを得ることができる。このようにして精製したα線放出核種に必要に応じて化学処理を加えてＲＩ標識に適した化学形とすることで、ＲＩ標識に使用することができる。
【００１５】
（１−２）抗体
本発明の複合体に含まれる抗体は、ＭＵＣ５ＡＣに特異的に結合するヒト化抗体（以下、本発明で用いられるヒト化抗体とも称する）である。該抗体としては、ＭＵＣ５ＡＣに特異的に結合する能力を有するヒト化抗体であれば特に限定されず、安定な物性を有し且つ腫瘍集積性に優れていることが好ましい。該抗体はその抗原結合断片として用いられてもよく、かかる態様も本願発明に包含される。具体的には後述する特定の重鎖可変領域と軽鎖可変領域とを含み、所望により適切な重鎖定常領域と軽鎖定常領域を有することができる。本明細書において「抗原結合断片」とは本発明で用いられるヒト化抗体の一部からなる抗体断片であって、且つＭＵＣ５ＡＣとの結合能を有するものを意味する。ＭＵＣ５ＡＣとの結合能を有する限り、抗原結合断片を構成するポリペプチドに含まれるアミノ酸の数は特に限定されるものではない。
【００１６】
下記に本発明で用いられるヒト化抗体の重鎖可変領域として好ましいアミノ酸配列を示す。重鎖可変領域１（Ｈ０１）、重鎖可変領域２（Ｈ０２）、重鎖可変領域３（Ｈ０３）、及び重鎖可変領域４（Ｈ０４）は、本明細書に添付した配列表の配列番号１〜４に、それぞれ相当する。下線を付した部位はＣＤＲ部位である。
【００１７】
【化１】
2021075544.tif 000003
【００１８】
下記に本発明においてヒト化抗体の軽鎖可変領域として好ましいアミノ酸配列を示す。軽鎖可変領域１（Ｌ０１）、軽鎖可変領域２（Ｌ０２）、軽鎖可変領域３（Ｌ０３）、及び軽鎖可変領域４（Ｌ０４）は、本明細書に添付した配列表の配列番号５〜８に、それぞれ相当する。下線を付した部位はＣＤＲ部位である。
【００１９】
【化２】
2021075544.tif 000004
【００２０】
言い換えれば、本発明において好ましいヒト化抗体の重鎖可変領域は配列番号１から配列番号４のいずれか１つで示されるアミノ酸配列からなり、軽鎖可変領域は配列番号５から配列番号８のいずれか１つで示されるアミノ酸配列からなる。すなわち本発明で用いられるヒト化抗体は、上記で述べた４つの重鎖可変領域（Ｈ０１〜Ｈ０４）と４つの軽鎖可変領域（Ｌ０１〜Ｌ０４）との組み合わせからなる。
【００２１】
本発明において好適なヒト化抗体は重鎖可変領域がＨ０１、Ｈ０３、Ｈ０４であり、かつ軽鎖可変領域がＬ０１〜Ｌ０４のいずれか１つであるヒト化抗体である。
【００２２】
本発明において最も好適なヒト化抗体は重鎖可変領域がＨ０１であり軽鎖可変領域がＬ０３である抗体である。
【００２３】
本発明においてヒト化抗体の重鎖可変領域は、配列番号１から配列番号４で示されるアミノ酸配列によって規定されるものに限定されず、機能を保持している変異体も含む。すなわち配列番号１から配列番号４で示されるアミノ酸配列と９０％以上、好ましくは９５％以上、更に好ましくは９８％以上、最も好ましくは９９％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなる変異した重鎖可変領域も、本発明の軽鎖可変領域と組み合わされたときにＭＵＣ５ＡＣとの結合能を有する限り本発明で用いられるヒト化抗体の重鎖可変領域として用いることができる。
【００２４】
本明細書においてアミノ酸配列の同一性とは、対象とする２つのタンパク質間のアミノ酸配列の同一性をいい、当該技術分野において公知の数学的アルゴリズムを用いて作成されたアミノ酸配列の最適なアラインメントにおいて一致するアミノ酸残基の割合（％）によって表される。アミノ酸配列の同一性は、視覚的検査及び数学的計算により決定することができ、当業者に周知のホモロジー検索プログラム（例えば、ＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡ）や配列整列プログラム（例えば、ＣｌｕｓｔａｌＷ））、あるいは遺伝情報処理ソフトウェア（例えば、ＧＥＮＥＴＹＸ［登録商標］）などを用いて算出することができる。本明細書におけるアミノ酸配列の同一性は、具体的には、ＤＤＢＪ（DNA DataBank of Japan）のウェブサイトで公開されている系統解析プログラムＣｌｕｓｔａｌＷ（http://clustalw.ddbj.nig.ac.jp/index.php?lang=ja）を用い、初期設定の条件（Version2.1、Alignment type:slow、DNA Weight Matrix: Gonnet、GAP OPEN: 10、GAP EXTENSION: 0.1）で求めることができる。
【００２５】
加えて、本発明で用いられるヒト化抗体の重鎖可変領域として、配列番号１から配列番号４で示されるアミノ酸配列において、１０個以下、好ましくは８個以下、更に好ましくは５個以下、最も好ましくは３個以下のアミノ酸が欠失、置換、または置換したアミノ酸配列からなる変異した重鎖可変領域も、本発明の軽鎖可変領域と組み合わされたときにＭＵＣ５ＡＣとの結合能を有する限り、本発明で用いられるヒト化抗体の重鎖可変領域として用いることができる。
【００２６】
本発明で用いられるヒト化抗体の軽鎖可変領域は、配列番号５から配列番号８で示されるアミノ酸配列に限定されず、機能を保持している変異体も含む。すなわち配列番号５から配列番号８で示されるアミノ酸配列と９０％以上、好ましくは９５％以上、更に好ましくは９８％以上、最も好ましくは９９％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなる変異した軽鎖可変領域も、本発明の重鎖可変領域と組み合わされたときにＭＵＣ５ＡＣとの結合能を有する限り本発明で用いられるヒト化抗体の軽鎖可変領域として用いられる。
【００２７】
加えて、本発明で用いられるヒト化抗体の軽鎖可変領域として、配列番号５から配列番号８で示されるアミノ酸配列において１０個以下、好ましくは８個以下、更に好ましくは５個以下、最も好ましくは３個以下のアミノ酸が欠失、置換、または置換したアミノ酸配列からなる変異した軽鎖可変領域も、本発明の重鎖可変領域と組み合わされたときにＭＵＣ５ＡＣとの結合能を有する限り、本発明で用いられるヒト化抗体の軽鎖可変領域として用いられる。
【００２８】
本発明で用いられるヒト化抗体は本技術分野で一般的に実施されている方法又はそれに準じた方法によって製造することができる。具体的には、以下の手順で行うことができる。
本発明で用いられるヒト化抗体の重鎖可変領域と軽鎖可変領域のアミノ酸配列が配列番号１から配列番号８に開示されているので、それらのアミノ酸配列情報に基づき得られた該抗体をコードする核酸を構築し、適当な発現ベクターに挿入する。発現ベクターは、本発明で用いられるヒト化抗体をコードする核酸に加えて、任意に、翻訳効率を上げるためのコザック配列、宿主に導入された際に本発明で用いられるヒト化抗体が培地中に分泌することを促進するシグナル配列、およびプロモーター配列などを含むことができる。本発明で使用することができるベクターは、本技術分野で一般的に使用されているものから選択することができるが、プラスミドベクターであるpcDNA3.4が好ましい。発現ベクターの宿主細胞への導入も特に限定されず、細胞内に遺伝子を導入する方法としては本技術分野で従来から使用されている方法、例えば、リン酸カルシウム法、エレクトロポレーション法、リポフェクション法、ＤＥＡＥ−デキストラン法の当業者に公知の方法を用いることができる。下記の実施例で行なっているように、リポフェクション法を用いた導入方法は特に好適である。なおこの目的に使用される宿主細胞も、本技術分野で従来から使用されているものを使用することができる。そのような宿主細胞の例として、ＣＨＯ細胞、２９３細胞、大腸菌、ピキア酵母、Ｓｆ９細胞などを挙げることができる。なお現在は目的とするタンパク質を発現させるための発現システムのキットも市販されており、下記の実施例で使用しているExpiCHO System (サーモフィッシャーサイエンティフィック社)は、迅速かつ確実な目的タンパク質の発現のために、特に好ましい。
【００２９】
本発明で用いられるヒト化抗体をコードする核酸を発現ベクターに挿入し、その核酸を含む発現ベクターにより宿主細胞にその核酸を導入し、核酸が導入された宿主細胞を培養し、その培養上清から、クロマトグラフィーなどの精製手段により、本発明で用いられるヒト化抗体を得ることができる。本方法においては宿主細胞を培養することによって培養上清に本発明で用いられるヒト化抗体を分泌させる。培養上清から、クロマトグラフィーなどの精製手段を用いて、本発明で用いられるヒト化抗体またはその抗原結合断片を得ることができる。クロマトグラフィーの手段として、アフィニティークロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィーなど本技術分野で知られた種々の手段を用いることができる。下記の実施例で使用しているプロテインＡカラムを用いたアフィニティークロマトグラフィーは、特に好ましい。
【００３０】
また上記のヒト化抗体はポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体であってもよい。
【００３１】
（１−３）キレート剤
本発明においてキレート剤は、放射性核種が配位する部位を構造中に有するものであれば特に限定されないが、好ましくは、放射性核種が配位する部位であるキレート部と抗体との複合化を可能とするための置換基とを有する。キレート部として、例えば、CB-TE2A（1,4,8,11-Tetraazabicyclo[6.6.2]hexadecane-4,11-diacetic acid）、CDTA（Cyclohexane-trans-1,2-diamine tetra-acetic acid）、CDTPA（4-cyano-4-[[(dodecylthio)thioxomethyl]thio]-Pentanoic acid）、DOTA(1,4,7,10-Tetraazacyclododecane-1,4,7,10-tetraacetic acid)、DOTMA((1R,4R,7R,10R)-α,α’,α”,α’”-tetramethyl-1,4,7,10-tetraazacyclododecane-1,4,7,10-tetraacetic acid)、DOTAM（1,4,7,10-tetrakis(carbamoylmethyl)-1,4,7,10-tetraazacyclododecane）、DOTA-GA(α-(2-Carboxyethyl)-1,4,7,10-tetraazacyclododecane-1,4,7,10-tetraacetic acid)、DOTP(((1,4,7,10-Tetraazacyclododecane-1,4,7,10-tetrayl)tetrakis(methylene))tetraphosphonic acid)、DOTMP(1,4,7,10-Tetraazacyclododecane-1,4,7,10-tetrakis(methylenephosphonic acid))、DOTA-4AMP(1,4,7,10-tetraazacyclododecane-1,4,7,10-tetrakis(acetamidomethylenephosphonic acid)、D02P(Tetraazacyclododecane dimethanephosphonic acid)、Deferoxamine (DFO)、DTPA(Glycine, N,N-bis[2-[bis(carboxymethyl)amino]ethyl]-)、DTPA-BMA(5,8-Bis(carboxymethyl)-11-[2-(methylamino)-2-oxoethyl]-3-oxo-2,5,8,11-tetraazatridecan-13-oic acid)、EDTA(2,2′,2′′,2′′′-(ethane-1,2-diylbis(azanetriyl))tetraacetic acid)、NOTA(1,4,7-Triazacyclononane-1,4,7-triacetic acid)、NOTP(1,4,7-Triazacyclononane-1,4,7-triyltris(methylenephosphonic acid)、TETPA(1,4,8,11-tetraazacyclotetradecane-1,4,8,11-tetrapropionic acid)、TETA(1,4,8,11-Tetraazacyclotetradecane-N,N′,N′′,N′′′-tetraacetic acid)、TTHA(3,6,9,12-Tetrakis(carboxymethyl)-3,6,9,12-tetraazatetradecanedioic acid)、HEHA(1,2,7,10,13-hexaazacyclooctadecane-1,4,7,10,13,16-hexaacetic acid)、1,2-HOPO(N,N’,N”,N’”-tetra(1,2-dihydro-1-hydroxy-2-oxopyridine-6-carbonyl)-1,5,10,14-tetraazatetradecane)、PEPA(1,4,7,10,13-pentaazacyclopentadecane-N,N’,N”,N’”,N””-penta-acetic acid)、H4octapa(N,N’-bis(6-carboxy-2-pyridylmethyl)-ethylenediamine-N,N’-diacetic acid)、H2bispa2(6,6’-({9-hydroxy-1,5-bis(methoxycarbonyl)-2,4-di(pyridine-2-yl)-3,7-diazabicyclo[3.3.1]nonane-3,7-diyl}bis(-methylene))dipicolinic acid)、H2dedpa(1,2-[{6-(carboxy)-pyridin-2-yl}-methylamino]ethane)、H2macropa(6-(1,4,10,13-tetraoxa-7,16-diazacyclooctadecan-N,N’-methyl)picolinic acid)、H5decapa(N,N”-bis(6-carboxy-2-pyridylmethyl)-diethylenetriamine-N,N’,N”-triacetic acid)、H6phospa(N,N’-(methylenephosphonate)-N,N’-[6-(methoxycarbonyl)pyridin-2-yl]-methyl-1,2-diaminoethane)、HP-D03A(Hydroxypropyltetraazacyclododecanetriacetic acid)、porphyrin、といったものが挙げられるが、下記式（Ａ）で表される化合物に由来する構造を有することが好ましい。
【００３２】
【化３】
2021075544.tif 000005
【００３３】
（式（Ａ）中、Ｒ１１、Ｒ１３及びＲ１４は、それぞれ独立して、−（ＣＨ２）ｐＣＯＯＨ、−（ＣＨ２）ｐＣ５Ｈ５Ｎ、−（ＣＨ２）ｐＰＯ３Ｈ２、−（ＣＨ２）ｐＣＯＮＨ２若しくは、−（ＣＨＣＯＯＨ）(ＣＨ２)ｐＣＯＯＨからなる基であり、であり、Ｒ１２又はＲ１５の一方が、水素原子、カルボキシル基、又は、炭素数２若しくは３のカルボキシアルキル基であり、他方が、前記抗体と複合化するための置換基であり、ｐが０以上３以下の整数であり、Ｒ１２が前記抗体と複合化するための置換基であるときＲ１５は水素原子であり、Ｒ１２が前記抗体と複合化するための置換基でないときＲ１５は前記抗体と複合化するための置換基である。）
【００３４】
式（Ａ）で表される具体的な構造としては、以下の式（Ａ−１）〜（Ａ−１２）で表される化合物に由来する構造が挙げられる。
【００３５】
【化４】
2021075544.tif 000006
【００３６】
【化５】
2021075544.tif 000007
【００３７】
【化６】
2021075544.tif 000008
【００３８】
キレート部と、抗体と複合化を可能とするための置換基との連結部位は、アミド結合か、チオウレア結合であることが好ましいが、安定性の観点からはアミド結合がより好ましい。
【００３９】
アミド結合は、例えば、上記式（Ａ−１０）や（Ａ−１１）のＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＮＨＳ）基、又は、上記（Ａ−１２）の２，６−ジオキソテトラヒドロ−２Ｈ−ピラニル基と、第１級アミンとの反応により形成される。また、チオウレア結合は、上記式（Ａ−２）、（Ａ−３）で示す化合物のイソチオシアネート基と、第１級アミン又はマレイミド基との反応により形成される。
【００４０】
本発明の複合体において、キレート剤は、抗体１分子に対し、少なくとも1分子以上備えていればよいが、１分子以上８分子以下備えることが好ましい。ただし、抗体そのものの活性（抗原認識作用、中和作用、補体活性化作用及び／又はオプソニン作用）を維持する観点から、抗体のＦｃ領域（定常領域）に部位特異的にキレート剤が導入されることが好ましく、本発明において、キレート剤は、抗体１分子に対して1分子又は２分子備えていることがより好ましい。
【００４１】
本発明の複合体において、キレート剤は、リンカーを介して抗体と接続されていてもよい。リンカーとしては、置換又は無置換のアルキル基、置換又は無置換のヘテロアルキル基、ポリエチレングリコール（PEG）基、ペプチド、糖鎖、ジスルフィド基及びこれらの組み合わせなどが挙げられる。
好ましくは、キレート剤は、リンカーを介して、抗体を部位特異的に、より好ましくはＦｃ領域に修飾している。この場合、リンカーは、下記式（ｉ）で表される、１３以上１７以下のアミノ酸残基からなるペプチド（以下、「抗体修飾ペプチド」ともいう。）を含み、かつ架橋剤で修飾された抗体修飾ペプチドと抗体との架橋反応によって形成されているものを用いることができる。なお、式（ｉ）において、アミノ酸配列の紙面左側がＮ末端側を示し、アミノ酸配列の紙面右側がＣ末端側を示すものとして説明する。キレート剤がリンカーとして抗体修飾ペプチドを介して抗体と接続される場合、キレート剤と抗体修飾ペプチドが連結する位置は特に限定しないが、例えば抗体修飾ペプチドのN末端又はC末端、好ましくはN末端に直接又は間接的に連結することができる。また、抗体修飾ペプチドのC末端はその安定性の向上等のためにアミド化等の修飾を受けていてもよい。
【００４２】
(Xa)-Xaa1-(Xb)-Xaa2-(Xc)-Xaa3-(Xd)・・・（ｉ）
式（ｉ）中、Ｘａ、Ｘｂ、Ｘｃ及びＸｄは、それぞれ、連続するａ個のＸ、連続するｂ個のＸ、連続するｃ個のＸ、及び連続するｄ個のＸを表し、
Ｘは、側鎖にチオール基及びハロアセチル基のいずれも有しないアミノ酸残基であり、
ａ、ｂ、ｃ及びｄはそれぞれ独立に１以上５以下の整数で、かつａ＋ｂ＋ｃ＋ｄ≦１４を満たし
Ｘａａ１及びＸａａ３は、それぞれ独立に、
側鎖にチオール基を有するアミノ酸に由来するアミノ酸残基を表し、又は、
一方が、側鎖にチオール基を有するアミノ酸に由来するアミノ酸残基を表し、他方が、側鎖にハロアセチル基を有するアミノ酸に由来するアミノ酸残基を表し、Ｘａａ１とＸａａ３とが連結しており、
Ｘａａ２は、リシン残基、アルギニン残基、システイン残基、アスパラギン酸残基、グルタミン酸残基、２−アミノスベリン酸、又はジアミノプロピオン酸であり、架橋剤で修飾されている。
【００４３】
上記式（ｉ）におけるＸに含まれ得るアミノ酸残基としては、例えば、グリシン、アラニン、フェニルアラニン、プロリン、アスパラギン、アスパラギン酸、グルタミン酸、アルギニン、ヒスチジン、セリン、スレオニン、チロシン、メチオニン等のアミノ酸に由来するものが挙げられ、Ｘは、同一の種類のアミノ酸からなるアミノ酸残基であってもよく、それぞれ異なる種類のアミノ酸からなるアミノ酸残基であってもよい。
【００４４】
式（ｉ）中のａ、ｂ、ｃ及びｄは、上述した範囲の数であれば特に制限はないが、ペプチドと抗体との結合安定性の観点から、ａ＋ｂ＋ｃ＋ｄ≦１４を条件として、ａは好ましくは１以上３以下の整数、ｂは好ましくは１以上３以下の整数、ｃは好ましくは３以上５以下の整数、及びｄは好ましくは１以上３以下の整数である。
【００４５】
Ｘａａ１及びＸａａ３は、側鎖にチオール基を有するアミノ酸に由来するアミノ酸残基であり、該アミノ酸はそれぞれ同一であってもよく、異なっていてもよい。側鎖にチオール基を有するアミノ酸としては、例えばシステイン、ホモシステインが挙げられる。このようなアミノ酸残基は、ジスルフィド結合によって結合しているか、又は以下の式（４）に示すリンカーを介して、スルフィド基が結合されていることが好ましい。式（４）中、破線部分はスルフィド基との結合部分を示す。
【００４６】
【化７】
2021075544.tif 000009
【００４７】
Ｘａａ１及びＸａａ３は、上述した組み合わせに代えて、Ｘａａ１及びＸａａ３のうち一方が側鎖にチオール基を有するアミノ酸に由来するアミノ酸残基であり、他方が側鎖にハロアセチル基を有するアミノ酸に由来するアミノ酸残基であってもよい。これらは、チオエーテル結合を介して結合している。ハロアセチル基は、その末端がヨウ素等のハロゲンで置換されており、他方の側鎖におけるチオール基との反応によってハロゲンが脱離して、チオエーテル結合が形成される。
【００４８】
式（ｉ）で表される抗体修飾ペプチドの具体的なアミノ酸配列は、例えば国際公開２０１６／１８６２０６号パンフレット、国際公開２０１７／２１７３４７号パンフレット及び国際公開２０１８／２３０２５７号パンフレットに記載のペプチドが挙げられ、これらを用いることもできる。
【００４９】
これらのうち、抗体修飾ペプチドのアミノ酸配列として、以下の配列（１）〜（１４）のいずれか一つを有していることが好ましく、以下の配列（１）、（２）、（１３）又は（１４）を有していることが更に好ましい。以下のアミノ酸配列（１）〜（１４）において、（Ｘａａ２）はリシン残基、システイン残基、アスパラギン酸残基、グルタミン酸残基、２−アミノスベリン酸、又はジアミノプロピオン酸を示し、（Ｘａａ１）及び（Ｘａａ３）はともにホモシステイン残基を示す。また、以下のアミノ酸配列（１）〜（１４）中、（Ｘａａ１）、（Ｘａａ２）及び（Ｘａａ３）以外のアミノ酸は一文字略号にて表記する。
【００５０】
（１）DCAYH(Xaa2)GELVWCT  （配列番号９）
（２）GPDCAYH(Xaa2)GELVWCTFH  （配列番号１０）
（３）RCAYH(Xaa2)GELVWCS  （配列番号１１）
（４）GPRCAYH(Xaa2)GELVWCSFH  （配列番号１２）
（５）SPDCAYH(Xaa2)GELVWCTFH  （配列番号１３）
（６）GDDCAYH(Xaa2)GELVWCTFH  （配列番号１４）
（７）GPSCAYH(Xaa2)GELVWCTFH  （配列番号１５）
（８）GPDCAYH(Xaa2)GELVWCSFH  （配列番号１６）
（９）GPDCAYH(Xaa2)GELVWCTHH  （配列番号１７）
（１０）GPDCAYH(Xaa2)GELVWCTFY  （配列番号１８）
（１１）SPDCAYH(Xaa2)GELVWCTFY  （配列番号１９） 
（１２）SDDCAYH(Xaa2)GELVWCTFY  （配列番号２０）
（１３）RGNCAYH(Xaa2)GQLVWCTYH  （配列番号２１） 
（１４）G(Xaa1)DCAYH(Xaa2)GELVWCT(Xaa3)H  （配列番号２２）
【００５１】
（１−４）複合体の製造方法
本発明の複合体の製造方法は、キレート剤と抗体とをコンジュゲーションするコンジュゲーション工程と、放射性核種とキレート剤との錯体を形成する錯体形成工程との２つの工程から製造することができる。コンジュゲーション工程は、錯体形成工程の前であってもよいし錯体形成工程の後であってもよい。
【００５２】
コンジュゲーション工程においては、種々の抗体の化学修飾法が用いられる。具体的には、(ａ)〜（ｆ）の方法が挙げられる。
（ａ）アミンカップリング法（N-ヒドロキシスクシミジル(NHS)基で活性化されたカルボキシル基をもつキレート剤またはキレートを用いて抗体のリシン残基のアミノ基を修飾する方法）
（ｂ）抗体のヒンジ部位にあるポリペプチド鎖間のジスルフィド結合（SS結合）を部分的に還元することによって生じるスルフヒドリル(SH)基に対して、SH基に反応性を有するマレイミド基を持つキレート剤またはリンカーで修飾する方法
（ｃ）遺伝子工学によるアミノ酸変異によって、抗体に新たに導入されたシステインに対してマレイミド基をもつキレート剤またはリンカーを修飾する方法
（ｄ）遺伝子工学によるアミノ酸変異によって、抗体に新たに導入されたアジド化リシンのアジド基に、クリック反応を利用して、アルキン（例えばDibensylciclooctene: DBCO）をもつキレート剤またはリンカーを修飾する方法
（ｅ）トランスグルタミナーゼを利用して、抗体の特定の位置に導入されたグルタミンに、リシンの側鎖を有するキレート剤またはリンカーを修飾する方法
（ｆ）前述した（i）で示す抗体修飾ペプチドを有するキレート剤またはリンカーを、抗体のＦｃ領域を部位特異的に修飾する方法
【００５３】
錯体形成工程では、キレート剤に放射性核種をキレート（錯体形成）させる。ここで使用する放射性核種は、錯体形成効率を高める観点から、電離可能な態様で用いることが好ましく、イオンの態様で用いることが更に好ましい。錯体形成工程は、放射性核種との錯体形成が可能であれば、キレート剤への放射性核種の添加順序は問わない。例えば、水を主体とする溶媒に、放射性金属イオンが溶解した溶液を放射性核種として用いることができる。
錯体形成後、ろ過フィルター、メンブランフィルター、種々の充填剤を充填したカラム、クロマトグラフィー等を用いて、得られた錯体を精製してもよい。
【００５４】
本発明の複合体の製造方法は、錯体形成工程の後にコンジュゲーション工程が実行されることが好ましい。
より好ましい態様において、錯体形成工程（Ａ）では、放射性核種とクリック反応可能な第１の原子団を抗体と複合化を可能とするための置換基として有するキレート剤との間で錯体を形成する。次いで、コンジュゲーション工程（Ｂ）では、前述した（i）で示す抗体修飾ペプチドと、クリック反応可能な第２の原子団とを有する抗体修飾リンカーを用いて、Ｆｃ領域を部位特異的に修飾されたペプチド修飾抗体と、工程（Ａ）で得られた錯体形成されたキレート剤との間でクリック反応を実行し、本発明の複合体を得る。
以下工程（Ａ）及び（Ｂ）について、詳述する。
【００５５】
クリック反応可能な第１原子団と第２原子団の組み合わせとしては、クリック反応の種類に応じて適切なものが選択され、例えば、アルキンとアジドとの組み合わせ、１，２，４，５−テトラジンとアルケンとの組み合わせ等が挙げられる。これらの原子団は、第１原子団が上記原子団の組み合わせのうち一つを有し、第２原子団が上記原子団の組み合わせのうち第１原子団と異なる一つとなる原子団を有していればよい。キレート剤及び抗体の安定性と、これらの結合効率の向上とを両立する観点から、キレートリンカーがアルキンであり且つ抗体修飾リンカーがアジドであるか、又はキレートリンカーが１，２，４，５−テトラジンであり且つ抗体修飾リンカーがアルケンであることが好ましい。このような原子団の組み合わせによるクリック反応の具体例として、ヒュスゲン環化付加反応、あるいは逆電子要請型ディールスアルダー反応等が挙げられる。
【００５６】
クリック反応可能な原子団の組み合わせの具体例としては、以下の式に示すように、第１原子団のアルキンとしてジベンジルシクロオクチン（ＤＢＣＯ）を含む原子団（式（１ａ））と、第２原子団のアジドとしてアジド基を含む原子団（式（２ａ））との組み合わせ、あるいは、第１原子団が１，２，４，５−テトラジンを含む原子団（式（１ｂ））と、第２原子団のアルケンとしてｔｒａｎｓ−シクロオクテン（ＴＣＯ）を含む原子団（式（２ｂ））との組み合わせが挙げられる。好ましくは式（１ａ）と式（２ａ）との組合せである。
【００５７】
【化８】
2021075544.tif 000010
【００５８】
（式中、Ｒ１は、キレート剤との連結部位を示し、Ｒ２は、抗体における抗体修飾ペプチドとの連結部位を示す。）
【００５９】
【化９】
2021075544.tif 000011
【００６０】
（式中、Ｒ３及びＲ４のうち一方がキレート剤又は抗体における抗体修飾ペプチドのいずれか一方との連結部位を示し、他方が水素原子、メチル基、フェニル基又はピリジル基を示し、Ｒ５は、R3又はR4に応じてキレート剤又は抗体における抗体修飾ペプチドのいずれか一方との連結部位を示す。）
【００６１】
第1原子団のアルキンとして、上記式（１ａ）で表されるジベンジルシクロオクチン（ＤＢＣＯ）を含む原子団を用いる場合は、市販されている種々のＤＢＣＯ試薬が挙げられる。具体的には、例えば、DBCO-C6-Acid、Dibenzylcyclooctyne-Amine、Dibenzylcyclooctyne Maleimide、DBCO-PEG acid、DBCO-PEG-NHS ester、DBCO-PEG-Alcohol、DBCO-PEG-amine、DBCO-PEG-NH-Boc、Carboxyrhodamine-PEG-DBCO、Sulforhodamine-PEG-DBCO、TAMRA-PEG-DBCO、DBCO-PEG-Biotin、DBCO-PEG-DBCO、DBCO-PEG-Maleimide、TCO-PEG-DBCO、DBCO-mPEGなどが選択できるが、好ましくはDibenzylcyclooctyne Maleimideを用いる。
【００６２】
工程（Ａ）では、より好ましくは、以下の式（ｉｉ）で表される構造を有するキレート剤を用いる。
Ａ−Ｂ−Ｃ  ・・・（ｉｉ） 
式（ｉｉ）中、Ａは、以下の式（ｉｉａ）で表されるキレート部である。
【００６３】
【化１０】
2021075544.tif 000012
【００６４】
式（ｉｉａ）中、Ｒａ、Ｒｂ及びＲｃは、独立して、−（ＣＨ２）ｐＣＯＯＨ、−（ＣＨ２）ｐＣ５Ｈ５Ｎ、−（ＣＨ２）ｐＰＯ３Ｈ２、−（ＣＨ２）ｐＣＯＮＨ２若しくは、−（ＣＨＣＯＯＨ）（ＣＨ２）ｐＣＯＯＨからなる基であり、ｐは０以上３以下の整数であり、Ｒｄ又はＲｅのいずれか一方が、Ｂとの結合部位（＊）であり、他方が水素原子であるか、−（ＣＨ２）ｐＣＯＯＨ、−（ＣＨ２）ｐＣ５Ｈ５Ｎ、−（ＣＨ２）ｐＰＯ３Ｈ２、−（ＣＨ２）ｐＣＯＮＨ２若しくは、−（ＣＨＣＯＯＨ）（ＣＨ２）ｐＣＯＯＨからなる基であり、ｐは０以上３以下の整数である。
式（ｉｉ）中、Ｂは以下の式（ｉｉｂ）で表される。
【００６５】
【化１１】
2021075544.tif 000013
【００６６】
式（ｉｉｂ）中、Ｌａ及びＬｂは、独立して、少なくともアミド結合又はチオウレア結合を含む炭素数１以上５０以下の結合リンカーであり、ｔは０以上３０以下の整数であり、sは０又は１であり、＊はＡとの結合部位であり、＊＊はＣとの結合部位である。
式（ｉｉ）中、Ｃは、以下の式（ｉｉｃ）で表されるアルキン誘導体又は式（ｉｉｄ）で表されるテトラジン誘導体のいずれかである。
【００６７】
【化１２】
2021075544.tif 000014
【００６８】
式（ｉｉｃ）中、ＸはＣＨＲｋ―＊＊又はＮ−＊＊であり、ＹはＣＨＲｋ又はＣ＝Ｏであり、Ｒｋは独立して水素原子であるか、炭素数１以上５以下のアルキル基であって、ＸがＣＨＲｋ―＊＊で、ＹがＣＨＲｋである場合は、Ｒｋ部分が一緒になってシクロアルキル基を形成してもよく、Ｒｆ、Ｒｇ、Ｒｈ及びＲｉは、独立して、水素原子、ハロゲン原子、炭素数１以上５以下のアルキル基であり、ＲｆとＲｇが一緒になって、若しくはＲｈとＲｉが一緒になって炭化水素環を形成してもよく、＊＊はＢとの結合部位を示し、式（ｉｉｄ）中、＊＊はＢとの結合部位を示し、Ｒｊは水素原子、メチル基、フェニル基又はピリジル基を示す）
【００６９】
工程（Ａ）で使用されるキレート剤として、上記式（ｉｉａ）中、Ｒａ乃至Ｒｄが、−（ＣＨ２）ｐＣＯＯＨであり、ｐが１であり、ＲｅがＢとの結合部位であるＤＯＴＡ誘導体；又はＲａ乃至Ｒｃが、−（ＣＨ２）ｐＣＯＯＨであり、ｐが１であり、ＲｄがＢとの結合部位（＊）であり、Ｒｅが水素原子であるＤＯ３Ａ誘導体若しくはＤＯＴＡＧＡ誘導体のいずれかがより好ましい。
【００７０】
式(ｉｉ)中、Ａが上記ＤＯＴＡ誘導体である場合、Ｂは、Ｌａがチオウレア結合を含む炭素数１以上５０以下の結合リンカーであり、ｓが０又は１であり、ｓが1である場合は、ｔが０以上３０以下の整数であり、Ｌｂがアミド結合若しくはチオウレア結合を含む炭素数１以上５０以下の結合リンカーであり、Ｃは、式（ｉｉｃ）で表されるアルキン誘導体であり、式（ｉｉｃ）中、ＸがＮ―＊＊であり、ＹがＣＨＲｋであり、Ｒｋが水素原子であり、ＲｆとＲｇが一緒になってベンゼン環を形成しており、ＲｈとＲｉが一緒になってベンゼン環を形成しており、＊＊はＢとの結合部位である、ＤＯＴＡ−ＰＥＧｔ−ＤＢＣＯ誘導体；又はＢは、Ｌａがチオウレア結合を含む炭素数１以上５０以下の結合リンカーであり、ｓが０又は１であり、ｓが1である場合は、ｔが０以上３０以下の整数であり、Ｌｂがアミド結合若しくはチオウレア結合を含む炭素数１以上５０以下の結合リンカーであり、Ｃは、式（ｉｉｄ）で表されるテトラジン誘導体である、ＤＯＴＡ−ＰＥＧｔ−Ｔｚ誘導体が更により好ましい。
【００７１】
式(ｉｉ)中、Ａが上記ＤＯ３Ａ誘導体である場合、上記ＤＯ３Ａ誘導体である場合、Ｂは、Ｌａがアミド結合若しくはチオウレア結合を含む炭素数１以上５０以下の結合リンカーであり、ｓが０又は１であり、ｓが１である場合は、ｔが０以上３０以下の整数であり、Ｌｂがアミド結合を含む炭素数１以上５０以下の結合リンカーであり、Ｃは、式（ｉｉｃ）で表されるアルキン誘導体であり、式（ｉｉｃ）中、ＸがＮ―＊＊であり、ＹがＣＨＲｋであり、Ｒｋが水素原子であり、ＲｆとＲｇが一緒になってベンゼン環を形成しており、ＲｈとＲｉが一緒になってベンゼン環を形成しており、＊＊はＢとの結合部位である、ＤＯ３Ａ−ＰＥＧｔ−ＤＢＣＯ誘導体が更により好ましい。
【００７２】
式(ｉｉ)中、Ａが上記ＤＯＴＡＧＡ誘導体である場合、Ｂは、Ｌａがアミド結合若しくはチオウレア結合を含む炭素数１以上５０以下の結合リンカーであり、ｓが０又は１であり、ｓが１である場合は、ｔが０以上３０以下の整数であり、Ｌｂがアミド結合を含む若しくはチオウレア結合を含む炭素数１以上５０以下の結合リンカーであり、Ｃは、式（ｉｉｃ）で表されるアルキン誘導体であり、式（ｉｉｃ）中、ＸがＮ―＊＊であり、ＹがＣＨＲｋであり、Ｒｋが水素原子であり、ＲｆとＲｇが一緒になってベンゼン環を形成しており、ＲｈとＲｉが一緒になってベンゼン環を形成しており、＊＊はＢとの結合部位である、ＤＯＴＡＧＡ−ＰＥＧｔ−ＤＢＣＯ誘導体が更により好ましい。
【００７３】
キレート剤と放射性核種とのモル比率は、キレート部／放射性核種として、下限が、１０／１以上が好ましく、１００／１以上がより好ましく、５００／１以上がさらに好ましく、上限が、１００００／１以下が好ましく、８０００／１以下がより好ましく、７０００／１以下がさらに好ましく、例えば、１００／１以上７０００／１以下の範囲が好ましく、より好ましくは５００／１以上７０００／１以下の範囲である。
【００７４】
錯体形成反応は、溶媒下に行うことが好ましい。溶媒としては、例えば水、生理食塩水、又は酢酸ナトリウム緩衝液、酢酸アンモニウム緩衝液、リン酸緩衝液、リン酸緩衝生理食塩水、トリスヒドロキシメチルアミノメタン緩衝液（Ｔｒｉｓ緩衝液）、４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジンエタンスルホン酸緩衝液（ＨＥＰＥＳ緩衝液）、若しくはテトラメチルアンモニウム酢酸緩衝液等の緩衝液等を用いることができる。
【００７５】
溶媒の液量は特に限定されないが、製造工程における実用性の観点から、工程（Ａ）の開始時において、下限は、０．０１ｍＬ以上、好ましくは０．１ｍＬ以上、より好ましくは１．０ｍＬ以上、さらに好ましくは１０ｍＬ以上、よりさらに好ましくは１００ｍＬ以上であり、上限は、好ましくは１０００以下、より好ましくは１００ｍＬ以下、さらに好ましくは１０ｍＬ以下、よりさらに好ましくは１．０ｍＬ以下であり、例えば、０．０１ｍＬ以上１００ｍＬ以下の範囲である。
【００７６】
錯体形成反応の反応液中のキレート剤の濃度は、目的とするキレート剤の収率の観点から、それぞれ独立して、工程（Ａ）の開始時において、下限は、好ましくは０．００１μｍｏｌ／Ｌ以上、より好ましくは０．０１μｍｏｌ／Ｌ以上、さらに好ましくは０．１μｍｏｌ／Ｌ以上、より好ましくは１μｍｏｌ／Ｌ以上であり、上限は、好ましくは１０００μｍｏｌ／Ｌ以下、より好ましくは１００μｍｏｌ／Ｌ以下、さらに好ましくは１０μｍｏｌ／Ｌ以下であり、例えば、１μｍｏｌ／Ｌ以上１００μｍｏｌ／Ｌ以下の範囲が挙げられる。
【００７７】
錯体形成反応の温度としては、例えば室温（２５℃）であってもよく、加熱条件下であってもよいが、キレート剤の分解抑制と錯体の形成効率向上とを両立する観点から、下限は、好ましくは２０℃以上、より好ましくは３０℃以上、さらに好ましくは３５℃以上、よりさらに好ましくは３７℃以上、特に好ましくは４５℃以上であり、上限は、好ましくは１５０℃以下、より好ましくは１２０℃以下、さらに好ましくは１００℃以下、よりさらに好ましくは９０℃以下であり、例えば、３０℃以上１００℃以下の範囲が好ましく、より好ましくは３５℃以上９０℃以下の範囲である。
【００７８】
反応時間は、上述の反応温度であることを条件として、下限は、好ましくは５分以上、より好ましくは１０分以上、さらに好ましくは２０分以上、よりさらに好ましくは３０分以上、特に好ましくは４５分以上であり、上限は、好ましくは１８０分以下、より好ましくは１５０分以下、さらに好ましくは１２０分以下、よりさらに好ましくは９０分以下、特に好ましくは６０分以下であり、例えば、１０分以上１５０分以下の範囲が好ましく、より好ましくは１０分以上６０分以下の範囲である。
【００７９】
工程（Ｂ）で使用される抗体は、前述した（i）で示す抗体修飾ペプチドと、クリック反応可能な第２の原子団とを有する抗体修飾リンカーを用いて、上記「（１−２）抗体」の項で詳述したヒト化抗体のＦｃ領域（定常領域）が部位特異的に修飾されたペプチド修飾抗体である。
【００８０】
抗体修飾ペプチドは、天然アミノ酸及び非天然アミノ酸を問わないアミノ酸を組み合わせて用いて、例えば液相合成法、固相合成法、自動ペプチド合成法、遺伝子組み換え法及びファージディスプレイ法等のペプチド合成法に供することよって製造することができる。ペプチドの合成にあたり、必要に応じて、用いられるアミノ酸の官能基の保護を行ってもよい。これらは、例えば、国際公開２０１７／２１７３４７号パンフレット及び国際公開２０１８／２３０２５７号パンフレットに記載の方法に準じて行うことができる。
【００８１】
抗体修飾リンカーは、抗体修飾ペプチドと、以下の式（Ｓ１）で表されるリンカーとが結合したものであってもよい。
＊−（（Ｌ１）ｍ−Ｚ）ｋ−Ｌ２−ＡＧ２  ・・・（Ｓ１）
（式中、＊は、ペプチドのＮ末端又はＣ末端との結合部位を示し、
Ｌ１は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）リンカー部であり、
ｍは、１以上５０以下の整数であり、
Ｚは、（Ｌ１）ｍとＬ２とを結合する第２リンカー部であり、
ｋは、０又は１であり、
Ｌ２は、第２のＰＥＧリンカー部であり、
ＡＧ２は第２原子団である。）
【００８２】
前記式（Ｓ１）において、Ｚの構造は、（Ｌ１）ｍとＬ２とを互いに結合するリンカー構造であれば特に限定されないが、例えば１以上５以下のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列を含むことができる。この場合、Ｚに含まれるアミノ酸配列は、システイン残基を含むことが好ましく、システイン残基のチオール基とマレイミド基との結合により形成されたチオエーテル基を介してＬ２と結合していることがより好ましい。
【００８３】
本発明において、Ｌ２を構成するＰＥＧリンカー部は、以下の式（Ｐ２）に示す構造を有していることが好ましい。式（Ｐ２）中、ｎは整数であり、好ましくは１以上５０以下、より好ましくは１以上２０以下、さらに好ましくは２以上１０以下、一層好ましくは２以上６以下である。
【００８４】
【化１３】
2021075544.tif 000015
【００８５】
ＰＥＧリンカー部の構造の一端は、市販されているＰＥＧ化試薬に由来する構造又はＰＥＧ化する際に通常用いられる試薬に由来する構造によって修飾されていてもよく、特に限定されないが、例えばジグリコール酸又はその誘導体、マレイミド又はその誘導体に由来する構造が例示される。
【００８６】
抗体修飾リンカーへの前記第２原子団への導入方法は、上述の方法によって所望のアミノ酸配列を有する抗体修飾ペプチドを得た後、該ペプチドを、溶解補助剤及び還元剤、並びに必要に応じて酸を加えた溶液に溶解し、該溶液に第２原子団として、アジド基又はｔｒａｎｓ−シクロオクテン（ＴＣＯ）を含む原子団の有機溶媒溶液を添加し、室温で攪拌することにより導入する方法が挙げられる。
【００８７】
第２原子団としてアジド基を含む原子団を導入する場合には、市販のアジド基導入試薬を用いて、常法に従い、ペプチドのＮ末端又はＣ末端に直接アジド基を導入するか、又は上述したリンカー構造を介してアジド基を含む原子団を導入することができる。用いられるアジド基導入試薬としては例えば、シリルアジド、リン酸アジド、アルキルアンモニウムアジド、無機アジド、スルホニルアジド、又はＰＥＧアジド等が挙げられる。
【００８８】
また、第２原子団としてＴＣＯを含む原子団を導入する場合には、ＴＣＯを含む市販のクリックケミストリー用試薬を用いて、常法に従い、ペプチドのＮ末端又はＣ末端に直接ＴＣＯを導入するか、又は上述したリンカー構造を介してＴＣＯを含む原子団を導入することができる。
【００８９】
抗体修飾ペプチドと抗体とを結合させて、ペプチド修飾抗体を得る方法は、例えば架橋剤を用いて行うことができる。架橋剤とは、抗体修飾ペプチドと、抗体とを共有結合により連結させるための化学物質であり、その例として、ジスクシンイミジルグルタレート（ＤＳＧ）、ジスクシンイミジルスベレート（ＤＳＳ）等のスクシンイミジル基を好ましくは２以上含む架橋剤、アジプイミド酸ジメチル等のイミド酸部分を好ましくは２以上含む化合物又はその塩からなる架橋剤、並びに３，３’−ジチオビスプロピオンイミド酸ジメチル、ジチオビススクシンイミジルプロピオン酸等のジスルフィド結合を有する化合物又はその塩からなるもの等が挙げられる。このような架橋剤を用いることによって、抗体修飾ペプチドにおけるXaa2のアミノ酸残基と、抗体との間で架橋反応を起こすことができる。抗体における架橋反応は、例えば抗体として本発明のヒト化抗体を用いた場合、Xaa2のアミノ酸残基と、本発明のヒト化抗体におけるＥｕナンバリングに従うＬｙｓ２５２残基との間に部位特異的に生じる。これらのＬｙｓ残基は、本発明のヒト化抗体におけるＦｃ領域に存在する。
【００９０】
抗体修飾ペプチドと抗体との結合方法は、例えば、上述した抗体修飾ペプチドと、抗体と、架橋剤と、必要に応じて触媒とを、適切な緩衝液中に１０℃以上３０℃以下環境下で分散させて行うことができる。反応時間は１０分以上２時間程度とするとができる。ペプチドと抗体との反応時におけるモル比率は、抗体／ペプチドとして、下限は、好ましくは１／５以上、より好ましくは１／３以上、さらに好ましくは１／１．５以上であり、上限は、好ましくは２０／１以下、より好ましくは１０／１以下、さらに好ましくは５／１以下、よりさらに好ましくは１／１以下、特に好ましくは１／１．７以下であり、例えば１／５以上２０／１以下の範囲が好ましく、より好ましくは１／１．５以上１／１．７以下である。
【００９１】
以上の工程を経て得られるペプチド修飾抗体は、抗体１分子に対して抗体修飾ペプチド1分子が結合した抗体（以下、「一価抗体」という）と、抗体1分子に対して抗体修飾ペプチド２分子が結合した抗体（以下、「二価抗体」という）とを任意の割合で含有する混合物であるが、これをそのままで以後の工程に供してもよく、ろ過フィルター、メンブランフィルター、種々の充填剤を充填したカラム、各種クロマトグラフィー等の方法で、未修飾抗体と、一価抗体と、二価抗体とを分離精製したあとでいずれかの価数の抗体のみを以後の工程に供してもよい。精製の結果、未修飾抗体と他の価数の抗体との分離ができない場合には、これらを含有する混合物として以降の工程に供してもよい。
未修飾抗体と、一価抗体と、二価抗体とを分離精製する場合は、上記のいずれの精製方法で分離精製してもよいが、種々の充填剤を充填したカラムを用いることが好ましく、抗体等のタンパク質の分離精製に適した充填剤を充填したカラムを用いることがより好ましい。
【００９２】
抗体等のタンパク質の分離精製に適した充填剤としては、抗体と特異的に結合する、イムノグロブリン結合性タンパク質が水不溶性の基材からなる担体に固定化されたものであれば特に限定されない。イムノグロブリン結合性タンパク質としては、例えば、プロテインＡ、プロテインＧ、プロテインＬなどがあげられる。これらのイムノグロブリン結合性タンパク質は、遺伝子操作した組換え型であってもよく、組換え型のイムノグロブリン結合性タンパク質としては、遺伝子改変型プロテインＡ、遺伝子改変型プロテインＧ、又は、プロテインＡのドメインとプロテインＧのドメインとの融合型が挙げられる。本発明において、少なくとも一価抗体と二価抗体との分離精製に適した充填剤としてはプロテインＡがより好ましく、遺伝子改変型プロテインＡがさらに好ましい。ここで、プロテインＡおよびプロテインＧとは、抗体分子であるＩｇＧと特異的に結合をすることができるタンパク質分子であり、分離された微生物由来の違いにより、プロテインＡ（黄色ブドウ球菌：Staphylococcus aureus）あるいはプロテインＧ（レンサ球菌：Streptococcus属）と分類されるものである。遺伝子改変型プロテインＡとは、プロテインＡのＩｇＧ結合ドメイン（Ｅ、Ｄ、Ａ、Ｂ及びＣドメイン）のうちいずれかのドメインのアミノ酸残基に対して少なくとも１つのアミノ酸変異を導入したプロテインＡであり、本発明においては、少なくとも１つのアミノ酸変異を導入したドメインを多量体化させた遺伝子改変型プロテインＡが好ましく、プロテインＡの少なくとも１つのアミノ酸変異を導入したＡ、Ｂ又はＣドメインの多量体化させたものがより好ましく、２量体以上５量体以下に多量体化させたものがさらにより好ましい。アミノ酸変異は、遺伝子の転写翻訳工程におけるアミノ酸配列又はアミノ酸をコードする塩基配列の置換、欠失、挿入等のいずれの変異に由来するものであってもよい。特に限定されない一例として国際公開２００３／０８０６５５号パンフレット、国際公開２０１１／１１８６９９号パンフレットに記載される遺伝子改変型プロテインＡ等が挙げられる。
【００９３】
イムノグロブリン結合性タンパク質が固定化される水不溶性の基材としては、ガラスビーズ、シリカゲルなどの無機担体、架橋ポリビニルアルコール、架橋ポリアクリレート、架橋ポリアクリルアミド、架橋ポリスチレンなどの合成高分子や、結晶性セルロース、架橋セルロース、架橋アガロース、架橋デキストランなどの多糖類からなる有機担体、さらにはこれらの組み合わせによって得られる有機−有機、有機−無機などの複合担体などが挙げられる。
【００９４】
上述の遺伝子改変型プロテインＡを充填剤として充填したカラムとしては、例えば、株式会社カネカのKanCap（登録商標）シリーズ（KANEKA KanCapA prepacked column）、GEヘルスケア社のHiTrap（登録商標）シリーズ（HiTrap Mabselect、HiTrap Mabselect SuRe、HiTrap Mabselect Xtra）、GEヘルスケア社のHiScreenシリーズ（HiScreen Mabselect SuRe）、又は東ソー株式会社のTOYOPEARL（登録商標）シリーズ（TOYOPEARL AF-rProtein A-650F）などとして、市販されている。
【００９５】
工程（Ｂ）におけるクリック反応に用いるペプチド修飾抗体を分離精製する場合を例に、以下説明する。
ペプチド修飾抗体は、抗体修飾ペプチドを備えるリンカー（抗体修飾リンカー）によって抗体のＦｃ領域を部位特異的に修飾して修飾抗体を得る抗体修飾工程と、上述のイムノグロブリン結合性タンパク質が固定化された担体を用いて修飾抗体を精製する抗体精製工程とを経て、工程（Ｂ）におけるクリック反応に供される。また、抗体精製工程は、担体に保持される修飾抗体を担体に保持させる保持工程と、担体に保持されない修飾抗体を洗浄する洗浄工程、保持工程で担体に保持された修飾抗体を溶出する溶出工程とを更に含む。
より具体的には、抗体修飾工程において、抗体修飾リンカーが修飾されない未修飾抗体と、一価抗体と、二価抗体と、を含む混合物として修飾抗体を取得し、抗体精製工程において、未修飾抗体、一価抗体および二価抗体のイムノグロブリン結合性タンパク質に対するそれぞれの相互作用の違いを利用して、未修飾抗体および一価抗体を相対的に多く含む第一の抗体組成物と、二価抗体を相対的に多く含む第二の抗体組成物とをそれぞれ溶出する。すなわち、抗体精製工程のうち、保持工程および洗浄工程では、イムノグロブリン結合性タンパク質との相互作用の程度が低いペプチド修飾抗体（二価抗体）を相対的に多く含む第二の抗体組成物が溶出され、抗体精製工程のうち溶出工程では、イムノグロブリン結合性タンパク質との相互作用の程度が高いペプチド修飾抗体（未修飾抗体及び一価抗体）を相対的に多く含む第一の抗体組成物が溶出される。ここで、「未修飾抗体及び一価抗体を相対的に多く含む」とは、第一の抗体組成物に含まれる未修飾抗体及び一価抗体の合計量が、該抗体組成物に含まれる二価抗体よりも多いことを意味し、好ましくは該抗体組成物に含まれる未修飾抗体及び修飾抗体の全量（１００％）に対して、未修飾抗体及び一価抗体の合計量が５５％以上、６３％以上、７０％以上、８０％以上、又は９０％以上であることを意味し、「二価抗体を相対的に多く含む」とは、第二の抗体組成物に含まれる二価抗体の量が該抗体組成物に含まれる一価抗体より多いことを意味し、好ましくは該抗体組成物に含まれる未修飾抗体及び修飾抗体の全量（１００％）に対して、二価抗体の量が５５％以上、６３％以上、７０％以上、８０％以上、又は９０％以上であることを意味する。
【００９６】
保持工程では、抗体修飾工程で得られた未修飾抗体、一価抗体および二価抗体の混合物を含有する溶液をカラムに添加して、担体に保持される未修飾抗体および一価抗体をカラムに保持させ、担体に保持されない二価抗体を通過させる。ここで、保持工程で通過した溶液は第二の抗体組成物の一部を構成する。未修飾抗体および一価抗体をカラムに保持しやすくするため、また、これらの凝集若しくは変性を防ぐために、ペプチド修飾抗体の混合溶液を適切な希釈溶媒で希釈してカラムに添加することが好ましい。希釈溶媒としては、ペプチド修飾抗体が溶解し、溶媒中で凝集又は変性しにくい溶媒であれば特に限定されず、水、生理食塩水、又は酢酸ナトリウム緩衝液、酢酸アンモニウム緩衝液、リン酸緩衝液、リン酸緩衝生理食塩水、２−アミノ−２−（ヒドロキシメチル）プロパン−１，３−ジオール（Ｔｒｉｓ）緩衝液、２−［４−（２−ヒドロキシエチル)−１−ピペラジニル]−エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）緩衝液等の緩衝液等を用いることができ、上述したいずれかの緩衝液を用いることが好ましく、酢酸ナトリウム緩衝液を用いることがより好ましい。希釈溶媒に緩衝液を用いる場合は、緩衝剤の濃度は、下限として１０ｍｍｏｌ／Ｌ以上、好ましくは１５ｍｍｏｌ／Ｌ以上、より好ましくは２０ｍｍｏｌ／Ｌ以上、上限として１０００ｍｍｏｌ／Ｌ以下、好ましくは５００ｍｍｏｌ／Ｌ以下、より好ましくは１００ｍｍｏｌ／Ｌ以下である。また、二価抗体や抗体修飾ペプチドのカラム担体への非特異的結合の低減の観点から、溶出溶媒は塩化ナトリウム、塩化カリウム等の添加剤を含有してもよい。溶出溶媒が含有する添加剤の濃度は特に限定されないが、例えば０．１５ｍｏｌ／Ｌを用いることができる。
【００９７】
洗浄工程では、洗浄溶媒を用いてカラム内に残存している修飾抗体をカラムから溶出する。上述の保持工程でカラムを通過した溶液と、洗浄工程でカラムから溶出した溶液は、二価抗体を相対的に多く含むので、これらを合わせて第二の抗体組成物として用いることができる。
洗浄溶媒としては、ペプチド修飾抗体が溶解し、溶媒中で凝集又は変性しにくく、適切なｐＨ緩衝能を持つ緩衝液であれば特に限定されず、酢酸ナトリウム緩衝液、酢酸アンモニウム緩衝液、リン酸緩衝液、リン酸緩衝生理食塩水、２−アミノ−２−（ヒドロキシメチル）プロパン−１，３−ジオール（Ｔｒｉｓ）緩衝液、２−［４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル］−エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）緩衝液等の緩衝液等を用いることができ、上述したいずれかの緩衝液を用いることが好ましく、酢酸ナトリウム緩衝液を用いることがより好ましい。洗浄溶媒に用いる緩衝剤の濃度は、下限として、２０ｍｍｏｌ／Ｌ以上、好ましくは３０ｍｍｏｌ／Ｌ以上、上限としては２００ｍｍｏｌ／Ｌ以下、好ましくは７０ｍｍｏｌ／Ｌ以下である。また、洗浄溶媒のｐＨは、下限として４．０以上、好ましくは４．５以上、より好ましくは４．８以上、上限として７．４以下、好ましくは６．０以下、より好ましくは５．２以下である。さらに、二価抗体や抗体修飾ペプチドのカラム担体への非特異的結合の低減の観点から、溶出溶媒は塩化ナトリウム、塩化カリウム等の添加剤を含有してもよい。溶出溶媒が含有する添加剤の濃度は特に限定されないが、例えば０．１５ｍｏｌ／Ｌを用いることができる。
【００９８】
溶出工程では、担体に保持された修飾抗体を溶出溶媒を用いてカラムから溶出する。すなわち未修飾抗体および一価抗体を相対的に多く含む第一の抗体組成物を溶出溶媒を用いてカラムから溶出する。
溶出溶媒としては、酢酸ナトリウム緩衝液、酢酸アンモニウム緩衝液、クエン酸緩衝液等の緩衝液等を用いることができる。また、抗体修飾リンカー、未修飾抗体及び修飾抗体カラム担体への非特異的結合の低減の観点から、溶出溶媒は塩化ナトリウム、塩化カリウム等の添加剤を含有してもよい。溶出溶媒が含有する添加剤の濃度は特に限定されないが、例えば０．１５ｍｏｌ／Ｌを用いることができる。
溶出溶媒が緩衝剤を含む場合は、緩衝剤の濃度は、下限として、２０ｍｍｏｌ／Ｌ以上、好ましくは３０ｍｍｏｌ／Ｌ以上、上限としては２００ｍｍｏｌ／Ｌ以下、好ましくは７０ｍｍｏｌ／Ｌ以下である。また、溶出溶媒のｐＨは、未修飾抗体および一価抗体と、イムノグロブリン結合性タンパク質との相互作用を弱めるため、また、抗体の変性および凝集を防ぐ観点から、下限としてｐＨ３．０以上、上限としてｐＨ４．２以下が好ましい。
【００９９】
抗体精製工程で取得した第一の抗体組成物又は第二の抗体組成物は、そのまま以降の工程（Ｂ）におけるクリック反応に用いてもよく、含有するペプチド修飾抗体のタンパク質濃度を調節してから工程（Ｂ）におけるクリック反応に用いてもよい。
【０１００】
工程（Ｂ）におけるクリック反応は、キレート剤が有するクリック反応可能な第一原子団と、ペプチド修飾抗体が有するクリック反応可能な第二原子団との間で実行されるものである。かかるクリック反応によりキレート剤と抗体とを連結する結合基（抗体との複合化を可能とする置換基）が形成される。
【０１０１】
ペプチド修飾抗体と工程（Ａ）で得られた錯体とがクリック反応可能であれば、これらの添加順序は問わず、例えば、溶媒を収容した反応容器に、該錯体及び該ペプチド修飾抗体の一方を添加し、次いで他方を添加して反応させてもよく、該キレート剤及び該抗体の一方を溶媒に分散した分散液に他方を添加して反応させてもよい。あるいは、溶媒を収容した反応容器に、これらを同時に添加して反応させてもよい。
【０１０２】
工程（Ｂ）のクリック反応に用いられる溶媒としては、水を含む溶媒を用いることができ、例えば、水、生理食塩水、又は酢酸ナトリウム緩衝液、酢酸アンモニウム緩衝液、リン酸緩衝液、リン酸緩衝生理食塩水、Ｔｒｉｓ緩衝液、ＨＥＰＥＳ緩衝液、若しくはテトラメチルアンモニウム酢酸緩衝液等の緩衝液等を用いることができる。緩衝液を用いる場合、錯体及び抗体の安定性と、これらの結合効率とを両立する観点から、２５℃におけるｐＨを好ましくは４．０以上１０．０以下、更に好ましくは５．５以上８．５以下とする。
【０１０３】
反応液量は、特に限定されないが、製造工程における実用性の観点から、工程（Ｂ）の開始時において、下限は、０．００１ｍＬ以上が好ましく、０．０１ｍＬ以上がより好ましく、０．１ｍＬ以上がさらに好ましく、１ｍＬ以上がよりさらに好ましく、上限は、１０００ｍＬ以下が好ましく、１００ｍＬ以下がより好ましく、１０ｍＬ以下がさらに好ましく、１ｍＬ以下がよりさらに好ましく、例えば０．００１ｍＬ以上１０００ｍＬ以下の範囲が好ましく、０．１ｍＬ以上１０ｍＬ以下の範囲がより好ましい。
【０１０４】
また、キレート剤及び抗体の反応液中の濃度は、それぞれ独立して、工程（Ｂ）の開始時において、下限として、０．００１μｍｏｌ／Ｌ以上が好ましく、０．０１μｍｏｌ／Ｌ以上がより好ましく、０．１μｍｏｌ／Ｌ以上がさらに好ましく、１．０μｍｏｌ／Ｌ以上がよりさらに好ましく、上限として、１０００μｍｏｌ／Ｌ以下が好ましく、１００μｍｏｌ／Ｌ以下がより好ましく、例えば、０．１μｍｏｌ／Ｌ以上１０００μｍｏｌ／Ｌ以下の範囲が好ましく、１μｍｏｌ／Ｌ以上１００μｍｏｌ／Ｌ以下の範囲であることが、目的とする複合体の収量の観点からより好ましい。
【０１０５】
抗体の意図しない変性を防ぎつつ、反応効率を高める観点から、工程（Ｂ）におけるクリック反応は、反応温度の上限は、５０℃以下が好ましく、４０℃以下がより好ましい。また、反応温度の下限は、反応が進行する温度であれば特に制限はないが、１５℃以上が好ましい。クリック反応の反応時間は、上述の反応温度であることを条件として、好ましくは５分以上、より好ましくは１０分以上であり、２４時間以下が好ましく、より好ましくは２０時間以下であり、例えば、５分以上２４時間以下の範囲が好ましく、より好ましくは１０分以上２０時間以下の範囲である。
【０１０６】
得られた複合体は、これをそのままで用いてもよく、あるいは、ろ過フィルター、メンブランフィルター、種々の充填剤を充填したカラム、クロマトグラフィー等を用いて精製してもよい。
【０１０７】
工程（Ａ）及び（Ｂ）によって製造される複合体は、ＭＵＣ５ＡＣに特異的に結合するヒト化抗体の特定の部位（例えば抗体のＦｃ領域のリジン残基）がキレート剤により特異的に修飾されたものである。この複合体は、該抗体１分子に対し、前記キレート剤を１分子又は２分子備える。キレート剤は、リンカーを介して、本発明の抗体のＦｃ領域を部位特異的に修飾している。該リンカーは、キレート剤に接続するキレートリンカー、該リンカーに接続する第１原子団、第１原子団とクリック反応し得る第２原子団、第２原子団に接続する抗体修飾リンカー（上記式（ｉ）で表される抗体修飾ペプチドを含む）で構成される。従って、該リンカーは、第１原子団と第２原子団とに由来する化学構造を有する。このような化学構造としては、下記式（１０ａ）又は（１０ｂ）で表されるトリアゾール骨格含有構造又は下記式（１０ｃ）で表されるピリダジン骨格含有構造が考えられる。式（１０ａ）と式（１０ｂ）は異性体の関係にあるため任意の割合で含まれていてもよい。
【０１０８】
【化１４】
2021075544.tif 000016
【０１０９】
式（１０ａ）及び式（１０ｂ）中、Ｒ１Ａはキレートリンカーとの結合部位を示し、Ｒ２Ａは抗体修飾リンカーとの結合部位を示す。式（１０ｃ）中、Ｒ３Ａ及びＲ４Ａのうち一方は水素原子、メチル基、フェニル基又はピリジル基を示し、他方はキレートリンカーとの結合部位を示し、Ｒ５Ａは抗体修飾リンカーとの結合部位を示す。
【０１１０】
（１−５）放射性医薬
上述の（１−４）に示す方法で製造した複合体は、これをそのままで、又はこれを精製したあとで、該複合体を有効成分として含む放射性医薬を調製することもできる。放射性医薬とは、本発明の複合体、即ち放射性核種（α線を放出する金属核種）で標識された抗ＭＵＣ５ＡＣヒト化抗体又はその誘導体を含み、対象の生体内への投与に適した形態となっている組成物を指す。放射性医薬は、例えば上述の方法で製造された本発明の複合体を、水を主体とし、且つ生体と略等張の溶媒に溶解させて製造することができる。この場合、放射性医薬は水溶液の形態であることが好ましく、必要に応じて、薬学的に許容される他の成分を含んでいてもよい。放射性医薬は、その有効量が、経口的に、又は静脈内、皮下、腹腔内若しくは筋肉内等の非経口的に生体に投与され、疾患の治療、疾患の診断、あるいは病巣の検出等に用いられる。
ここで投与対象としてはヒト、またはマウス、ラット、サル、モルモット、チンパンジ−、ヒツジ、ヤギ、イヌ、ネコ、ブタ、ウシもしくはウマなどの動物であるが、特に限定されるものではない。好ましくはヒトである。
好ましい対象疾患としてがんが挙げられる。本発明で治療、診断されるがんは、膵がん、甲状腺がん、肝臓がん、大腸がん、胃がん、尿路上皮がん、乳がん、子宮頸がん、卵巣がん、または子宮内膜がんを挙げることができ、特に膵がんへの適用が好ましい。
【０１１１】
本発明で治療、診断されるがんの例としては、胆管がんも挙げることができる。
【０１１２】
また、ＭＵＣ５ＡＣは、ＣＡ１９−９の抗原キャリアであることが複数報告されている（ＰＬоＳ ＯＮＥ（Ｄｅｃｅｍｂｅｒ２０１１, Ｖｏｌｕｍｅ６, Ｉｓｓｕｅ１２, ｅ２９１８０, ｐ１−１０））。したがって、本発明で治療されるがんとしては、ＣＡ１９−９を過剰発現する、胆道がん、子宮体がん、肺がん、または食道がんも挙げることができ、効率良く治療することができる。
【０１１３】
ここでの「有効量」とは、投与対象における治療上有効な効果を得ることができる量である。対象に投与するべき有効量は、対象の種類、対象の体重、投与する剤形（錠剤、注射剤など）および経路（経口投与、非経口投与など）、および疾患（例、がん）の重篤度などにより異なる。医師や獣医師はそれらの因子を考慮して、適切な有効量を決定することができる。
【０１１４】
放射性核種として治療効果を有するものを選択することにより、本発明の複合体は、放射性核種内用療法（ＲＩ内用療法）に用いることができる。ＲＩ内用療法は、放射性医薬を静注や経口で投与し、がん原発巣や転移巣のような病巣部位にこの放射性薬剤を集積させ、放射性薬剤から放出される放射線により、病巣部位のがん細胞を破壊するというものである。従って、本発明の複合体はがんのＲＩ内用療法に好ましく用いることができる。この場合、当該医薬の投与量、用量は、有効成分の有効性、投与の形態・経路、疾患（特にがん）の進行ステージ、患者の体型・体重・年齢、併用する他の疾患の治療薬の種類や量に応じ、適宜選択されるが、通常１回あたり２５０ｋＢｑ／ｋｇ以下で投与され得る。１回あたり８０ｋＢｑ／ｋｇ以下の用量でも効果を発揮し得る。
【０１１５】
また、本発明の他の態様として、前述した複合体において、放射性核種のみ、α線放出核種からポジトロンやγ線を放出する放射性核種（６８Ｇａ、６４Ｃｕ、８６Ｙ、８９Ｚｒ、１１１Ｉｎ）に置き換えた複合体を有効成分とする放射性医薬を用意し、これを上述したがんのＲＩ内用療法におけるがんの診断に用いてもよい。本発明のがんの診断用放射性医薬は、がんのＲＩ内用療法を行う前の診断に用いてもよいし、がんのＲＩ内用療法を行った後の診断に用いてもよい。がんのＲＩ内用療法を行う前の診断に用いられることによって、α線を放出する金属核種を備えた本発明の複合体を用いたがんのＲＩ内用療法を実行するかどうかの治療選択の判断に用いることができる。また、がんのＲＩ内用療法を行った後の診断に用いられることによって、α線を放出する金属核種を備えた本発明の複合体を用いたがんのＲＩ内用療法の効果があるかどうかの判定や投与量の増減などの治療計画の適正化に用いることができる。
【０１１６】
（２）複合体２
別の一実施態様として、本発明は、放射性核種がキレートしたキレート剤と、抗体との複合体であって、上記放射性核種がポジトロンを放出する金属核種であり、上記抗体がＭＵＣ５ＡＣに特異的に結合するヒト化抗体である、複合体を提供する。
【０１１７】
キレート剤における放射性核種がポジトロンを放出する金属核種であること以外は、上記「（１）複合体１」と同様の定義が適用される。
ポジトロンを放出する金属核種は、放射性金属の壊変過程でプラスの電荷を持つ電子（ポジトロン）を放出する核種であればよく、詳細には、６８Ｇａ、６４Ｃｕ、８６Ｙ及び８９Ｚｒ等が好ましく用いられ、より好ましくは８９Ｚｒ（ジルコニウム−８９）である。ポジトロン放出核種で標識された抗体はＰＥＴ（Positron Emission Tomography）検査に好適に用いることができる。
また、放射性核種としてポジトロン放出核種を用いた複合体２は、放射性核種としてα線放出核種を利用した上記複合体１を用いたＲＩ内用療法のための、がんの診断用放射性医薬としても用いることができる。この場合、当該医薬の投与量は、ＰＥＴ検査における疾患（特にがん）の病巣の描出に必要十分な量であれば特に限定されないが、疾患（特にがん）の進行ステージ、患者の体型・体重・年齢、併用する他の疾患の治療薬の種類や量に応じ、適宜選択されることが好ましい。
【０１１８】
以上述べた本発明の実施の形態によれば、ＭＵＣ５ＡＣに対する特異性と腫瘍への集積性に優れた、放射性核種、特にα線放出核種で標識された抗ＭＵＣ５ＡＣ抗体、特にヒト化抗体が提供される。
また、本発明の実施の形態によれば、セラノスティックスを達成するための、がん診断用および／またはがん治療用のＲＩ標識抗ＭＵＣ５ＡＣ抗体が提供される。
【０１１９】
本発明の上記の実施形態は、以下の技術思想を包含するものである。
［１］放射性核種がキレートしたキレート剤と、抗体との複合体であって、前記放射性核種がα線を放出する金属核種であり、前記抗体が、ＭＵＣ５ＡＣに特異的に結合するヒト化抗体である、複合体。
［２］前記抗体が、
（１）配列番号１で示されるアミノ酸配列（Ｈ０１）、
（２）配列番号２で示されるアミノ酸配列（Ｈ０２）、
（３）配列番号３で示されるアミノ酸配列（Ｈ０３）、又は
（４）配列番号４で示されるアミノ酸配列（Ｈ０４）
からなる重鎖可変領域と、
（５）配列番号５で示されるアミノ酸配列（Ｌ０１）、
（６）配列番号６で示されるアミノ酸配列（Ｌ０２）、
（７）配列番号７で示されるアミノ酸配列（Ｌ０３）、又は
（８）配列番号８で示されるアミノ酸配列（Ｌ０４）
からなる軽鎖可変領域と、 
を有するヒト化抗体である、上記［１］に記載の複合体。
［３］前記抗体が、
（１）配列番号１で示されるアミノ酸配列（Ｈ０１）からなる重鎖可変領域と、
（７）配列番号７で示されるアミノ酸配列（Ｌ０３）からなる軽鎖可変領域と、
を有するヒト化抗体である、上記［２］に記載の複合体。
［４］α線を放出する前記金属核種が、アクチニウム−２２５である、上記［１］〜［３］のいずれかに記載の複合体。
［５］前記抗体１分子に対し、前記キレート剤を１分子以上８分子以下備える、上記［１］〜［４］のいずれかに記載の複合体。
［６］前記キレート剤が、リンカーを介して、前記抗体のＦｃ領域を部位特異的に修飾している、上記［１］〜［５］のいずれかに記載の複合体。
［７］前記リンカーが、下記式（ｉ）で表される、１３以上１７以下のアミノ酸残基からなる抗体修飾ペプチドを含む、上記［６］に記載の複合体。
(Xa)-Xaa1-(Xb)-Xaa2-(Xc)-Xaa3-(Xd)・・・（ｉ）
（式中、Ｘａ、Ｘｂ、Ｘｃ及びＸｄは、それぞれ、連続するａ個のＸ、連続するｂ個のＸ、連続するｃ個のＸ、及び連続するｄ個のＸを表し、
Ｘは、側鎖にチオール基及びハロアセチル基のいずれも有しないアミノ酸残基であり、
ａ、ｂ、ｃ及びｄはそれぞれ独立に１以上５以下の整数で、かつａ＋ｂ＋ｃ＋ｄ≦１４を満たし、
Ｘａａ１及びＸａａ３は、それぞれ独立に、
側鎖にチオール基を有するアミノ酸に由来するアミノ酸残基を表し、かつ、ジスルフィド結合を介して結合しているか若しくはスルフィド基がリンカーを介して結合しており、又は、
一方が、側鎖にチオール基を有するアミノ酸に由来するアミノ酸残基を表し、他方が、側鎖にハロアセチル基を有するアミノ酸に由来するアミノ酸残基を表し、かつ、チオエーテル結合を介して結合しており、
Ｘａａ２は、リシン残基、アルギニン残基、システイン残基、アスパラギン酸残基、グルタミン酸残基、２−アミノスベリン酸、又はジアミノプロピオン酸である。）
［８］前記抗体修飾ペプチドが、前記式（ｉ）中、Ｘａａ２がリシン残基である、上記［７］に記載の複合体。
［９］前記抗体修飾ペプチドが、配列番号１０（ただし、Ｘａａ２はリシン残基である）で表されるアミノ酸配列からなる抗体修飾ペプチドを含む、上記［７］又は［８］に記載の複合体。
［１０］前記キレート剤が、下記式（Ａ）で表される化合物又はその塩に由来する構造を有する、上記［１］〜［９］のいずれかに記載の複合体。
【０１２０】
【化１５】
2021075544.tif 000017
【０１２１】
（式（Ａ）中、Ｒ１１、Ｒ１３及びＲ１４は、それぞれ独立して、−（ＣＨ２）ｐＣＯＯＨ、−（ＣＨ２）ｐＣ５Ｈ５Ｎ、−（ＣＨ２）ｐＰＯ３Ｈ２、−（ＣＨ２）ｐＣＯＮＨ２若しくは、−（ＣＨＣＯＯＨ）(ＣＨ２)ｐＣＯＯＨからなる基であり、Ｒ１２又はＲ１５の一方が、水素原子、カルボキシル基、又は、炭素数２若しくは３のカルボキシアルキル基であり、他方が、前記抗体と複合化するための置換基であり、ｐが０以上３以下の整数であり、Ｒ１２が前記抗体と複合化するための置換基であるときＲ１５は水素原子であり、Ｒ１２が前記抗体と複合化するための置換基でないときＲ１５は前記抗体と複合化するための置換基である。）
［１１］前記キレート剤が、リンカーを介して、前記抗体のＦｃ領域を部位特異的に修飾しており、前記リンカーが、クリック反応で形成された結合基を有する、上記［６］〜［１０］のいずれかに記載の複合体。
［１２］前記リンカーが、前記キレート剤と前記クリック反応で形成された結合基とを接続するキレートリンカーと、前記抗体と前記クリック反応で形成された結合基とを接続する抗体修飾リンカーとを有し、前記クリック反応で形成された前記結合基が、下記式（１０ａ）で表されるトリアゾール骨格含有構造、又は、ピリダジン骨格含有構造を備える、上記［１１］に記載の複合体。
【０１２２】
【化１６】
2021075544.tif 000018
【０１２３】
（式中、Ｒ１Ａは前記キレートリンカーとの結合部位を示し、Ｒ２Ａは前記抗体修飾リンカーとの結合部位を示す。）
［１３］上記［１］〜［１２］のいずれかに記載の複合体を有効成分として含有する、放射性医薬。
［１４］がんのＲＩ内用療法に用いられる、上記［１３］に記載の放射性医薬。
［１５］前記ＲＩ内用療法において、対象に対し１回あたり２５０ｋＢｑ／ｋｇ以下の投与量で投与されるための、上記［１４］に記載の放射性医薬。
［１６］前記投与量が、１回あたり８０ｋＢｑ／ｋｇ以下である、上記［１５］に記載の放射性医薬。
［１７］放射性核種がキレートしたキレート剤と、抗体との複合体を含有する放射性医薬であって、前記抗体が、ＭＵＣ５ＡＣに特異的に結合するヒト化抗体である、
上記［１４］〜［１６］のいずれかに記載の放射性医薬を用いたＲＩ内用療法におけるがんの診断用放射性医薬。
［１８］放射性核種がキレートしたキレート剤と、抗体との複合体であって、
前記放射性核種がポジトロンを放出する金属核種であり、
前記抗体が、ＭＵＣ５ＡＣに特異的に結合するヒト化抗体である、複合体。
［１９］前記抗体が、
（１）配列番号１で示されるアミノ酸配列（Ｈ０１）、
（２）配列番号２で示されるアミノ酸配列（Ｈ０２）、
（３）配列番号３で示されるアミノ酸配列（Ｈ０３）、又は
（４）配列番号４で示されるアミノ酸配列（Ｈ０４）
からなる重鎖可変領域と、
（５）配列番号５で示されるアミノ酸配列（Ｌ０１）、
（６）配列番号６で示されるアミノ酸配列（Ｌ０２）、
（７）配列番号７で示されるアミノ酸配列（Ｌ０３）、又は
（８）配列番号８で示されるアミノ酸配列（Ｌ０４）
からなる軽鎖可変領域と、
を有するヒト化抗体である、上記［１８］に記載の複合体。
［２０］前記抗体が、
（１）配列番号１で示されるアミノ酸配列（Ｈ０１）からなる重鎖可変領域と、
（７）配列番号７で示されるアミノ酸配列（Ｌ０３）からなる軽鎖可変領域と、
を有するヒト化抗体である、上記［１９］に記載の複合体。
［２１］ポジトロンを放出する前記金属核種が、ジルコニウム−８９である、上記［１８］〜［２０］のいずれかに記載の複合体。
［２２］前記抗体１分子に対し、前記キレート剤を１〜８分子備える、上記［１８］〜［２１］のいずれかに記載の複合体。
［２３］前記キレート剤が、リンカーを介して、前記抗体のＦｃ領域を部位特異的に修飾している、上記［１８］〜［２１］のいずれかに記載の複合体。
［２４］前記リンカーが、下記式（ｉ）で表される、１３〜１７アミノ酸残基からなる抗体修飾ペプチドを含む、上記［２３］に記載の複合体。
(Xa)-Xaa1-(Xb)-Xaa2-(Xc)-Xaa3-(Xd)・・・(i)
（式中、Ｘａ、Ｘｂ、Ｘｃ及びＸｄは、それぞれ、連続するａ個のＸ、連続するｂ個のＸ、連続するｃ個のＸ、及び連続するｄ個のＸを表し、
Ｘは、側鎖にチオール基及びハロアセチル基のいずれも有しないアミノ酸残基であり、
ａ、ｂ、ｃ及びｄはそれぞれ独立に１以上５以下の整数で、かつａ＋ｂ＋ｃ＋ｄ≦１４を満たし、
Ｘａａ１及びＸａａ３は、それぞれ独立に、
側鎖にチオール基を有するアミノ酸に由来するアミノ酸残基を表し、かつ、ジスルフィド結合を介して結合しているか若しくはスルフィド基がリンカーを介して結合しており、又は、
一方が、側鎖にチオール基を有するアミノ酸に由来するアミノ酸残基を表し、他方が、側鎖にハロアセチル基を有するアミノ酸に由来するアミノ酸残基を表し、かつ、チオエーテル結合を介して結合しており、
Ｘａａ２は、リシン残基、アルギニン残基、システイン残基、アスパラギン酸残基、グルタミン酸残基、２−アミノスベリン酸、又はジアミノプロピオン酸である。）
［２５］前記抗体修飾ペプチドが、前記式（ｉ）中、Ｘａａ２がリシン残基である、上記［２４］に記載の複合体。
［２６］前記抗体修飾ペプチドが、配列番号１０（ただし、Ｘａａ２はリシン残基である）で表されるアミノ酸配列からなる抗体修飾ペプチドを含む、上記［２４］又は［２５］に記載の複合体。
［２７］前記キレート剤が、下記式（Ａ）で表される化合物に由来する構造を有する、上記［１８］〜［２６］いずれかに記載の複合体。
【０１２４】
【化１７】
2021075544.tif 000019
【０１２５】
（式（Ａ）中、Ｒ１１、Ｒ１３及びＲ１４は、それぞれ独立して、−（ＣＨ２）ｐＣＯＯＨ、−（ＣＨ２）ｐＣ５Ｈ５Ｎ、−（ＣＨ２）ｐＰＯ３Ｈ２、−（ＣＨ２）ｐＣＯＮＨ２若しくは、−（ＣＨＣＯＯＨ）(ＣＨ２)ｐＣＯＯＨからなる基であり、Ｒ１２又はＲ１５の一方が、水素原子、カルボキシル基、又は、炭素数２若しくは３のカルボキシアルキル基であり、他方が、前記抗体と複合化するための置換基であり、ｐが０以上３以下の整数であり、Ｒ１２が前記抗体と複合化するための置換基であるときＲ１５は水素原子であり、Ｒ１２が前記抗体と複合化するための置換基でないときＲ１５は前記抗体と複合化するための置換基である。）
［２８］上記［１８］〜［２７］のいずれかに記載の複合体を有効成分として含有する、
放射性医薬。
［２９］放射性核種がキレートしたキレート剤と、抗ＭＵＣ５ＡＣ抗体とを複合化して、前記キレート剤と前記抗ＭＵＣ５ＡＣ抗体との複合体を生成する複合化工程を含む、上記［１］〜［１２］及び［１８］〜［２７］のいずれに記載の複合体の製造方法。
［３０］前記キレート剤は、キレートリンカーに接続しており、前記抗ＭＵＣ５ＡＣ抗体は、抗体修飾ペプチドを備える抗体修飾リンカーによりＦｃ領域が特異的に修飾されており、前記複合化工程においてクリック反応を実行することにより、前記キレートリンカーと前記抗体修飾リンカーとを接続する、上記［２９］に記載の複合体の製造方法。
［３１］抗体修飾ペプチドを備える抗体修飾リンカーにより抗体のＦｃ領域が特異的に修飾された修飾抗体であって、前記抗体が、抗ＭＵＣ５ＡＣ抗体であり、前記抗体修飾リンカーが、放射性核種がキレートしたキレート剤が備えるキレートリンカーに対してクリック反応により接続するための原子団を有する、修飾抗体。
［３２］抗体修飾ペプチドを備える抗体修飾リンカーにより抗体のＦｃ領域が特異的に修飾された修飾抗体の製造方法であって、
前記抗体のＦｃ領域を、抗体修飾ペプチドを備えるリンカーで部位特異的に修飾して修飾抗体を得る抗体修飾工程と、
イムノグロブリン結合性タンパク質が固定化された担体を用いて前記抗体を精製する抗体精製工程と、
を含み、
前記抗体が、抗ＭＵＣ５ＡＣ抗体である、修飾抗体の製造方法。
［３３］前記イムノグロブリン結合性タンパク質が、プロテインA又は遺伝子改変型プロテインAである、上記［３２］に記載の修飾抗体の製造方法。
［３４］前記担体が充填されたカラムを用いて前記抗体精製工程を実行する、上記［３２］又は［３３］に記載の修飾抗体の製造方法。
［３５］前記抗体精製工程は、前記修飾抗体を前記担体に保持させる保持工程と、
前記担体に保持された前記修飾抗体を溶出する溶出工程と、を含む、上記［３２］〜［３４］のいずれかに記載の修飾抗体の製造方法。
［３６］前記抗体修飾工程において、前記抗体修飾リンカーが修飾されていない未修飾抗体と、前記抗体1分子に対して前記抗体修飾リンカー1分子が修飾された一価抗体と、前記抗体1分子に対して前記抗体修飾リンカー２分子が修飾された二価抗体とを含む混合物として前記修飾抗体を取得し、
前記抗体精製工程において、前記未修飾抗体、前記一価抗体および前記二価抗体の前記イムノグロブリン結合性タンパク質に対するそれぞれの相互作用の違いを利用して、未修飾抗体及び一価抗体を相対的に多く含む第一の抗体組成物と二価抗体を相対的に多く含む第二の抗体組成物とをそれぞれ取得する工程を含む、上記［３５］に記載の修飾抗体の製造方法。
［３７］上記［３２］〜［３６］のいずれかに記載の修飾抗体の製造方法を実行して修飾抗体を得る修飾抗体製造工程と、前記修飾抗体と放射性核種がキレートしたキレート剤とを複合化して、前記キレート剤と前記修飾抗体との複合体を生成する複合化工程を含む、複合体の製造方法。
［３８］前記修飾抗体製造工程において、前記抗体1分子に対して前記抗体修飾リンカー２分子が修飾された二価抗体よりも、前記抗体修飾リンカーが修飾されていない未修飾抗体及び前記抗体1分子に対して前記抗体修飾リンカー1分子が修飾された一価抗体の合計の割合が多い第一の抗体組成物を取得し、
前記複合化工程において、前記キレート剤と、前記一価抗体との複合体を形成する、上記［３７］に記載の複合体の製造方法。
［３９］前記修飾抗体製造工程において、前記抗体修飾リンカーが修飾されていない未修飾抗体及び前記抗体1分子に対して前記抗体修飾リンカー１分子が修飾された一価抗体の合計よりも前記抗体1分子に対して前記抗体修飾リンカー２分子が修飾された二価抗体の割合が多い第二の抗体組成物を取得し、
前記複合化工程において、前記キレート剤と、前記二価抗体との複合体を形成する、上記［３７］に記載の複合体の製造方法。
［４０］前記キレート剤は、キレートリンカーに接続しており、前記複合化工程においてクリック反応を実行することにより、前記キレートリンカーと前記抗体修飾リンカーとを接続する、上記［３７］〜［３９］のいずれかに記載の複合体の製造方法。
［４１］放射性核種がキレートしたキレート剤と、抗体との複合体を製造するためのキットであって、（１）放射性核種をキレートできるキレート剤および（２）抗ＭＵＣ５ＡＣ抗体を含み、前記複合体が上記［１］〜［１２］及び［１８］〜［２７］のいずれかに記載の複合体である、キット。
［４２］さらに（１）クリック反応可能な第一原子団および（２）クリック反応可能な第二原子団を含む、［４１］に記載のキット。
［４３］さらにキレート剤にキレートできる放射性核種を含む、［４１］に記載のキット。
【０１２６】
上記［１４］の放射性医薬によれば、ＭＵＣ５ＡＣに特異的に結合するヒト化抗体と、α線を放出する金属核種とを備えた複合体を有効成分として含有するので、がんのＲＩ内用療法に用いることで、ＭＵＣ５ＡＣを発現する腫瘍に対して特異的に集積し、正常細胞には影響を与えず腫瘍細胞特異的にα線を照射することができ、より高い安全性と治療効果が得られる。
上記［２８］の放射性医薬によれば、ＭＵＣ５ＡＣに特異的に結合するヒト化抗体と、ポジトロンを放出する金属核種とを備えた複合体を有効成分として含有するので、ＰＥＴ検査に適しており、また、上記［１４］のＲＩ内用療法に用いられる放射性医薬と同様の集積性を示すことで、ＭＵＣ５ＡＣを発現するがんのＲＩ内用療法のための診断用放射性医薬として、効率的に用いることができる。
上記［２９］の複合体の製造方法によれば、放射性核種がキレートしたキレート剤と、抗ＭＵＣ５ＡＣ抗体とを複合化させる複合化工程を含むので、抗体にとってより過酷な条件であるキレート工程に抗ＭＵＣ５ＡＣ抗体を付することなく、抗体の変性を防ぎ、効率的に該複合体を得ることができる。
上記［３０］の複合体の製造方法によれば、複合化工程においてクリック反応を含むので、緩衝溶液中、常温という極めて温和な条件下において複合化することができ、抗ＭＵＣ５ＡＣ抗体を変性させることなく効率的に該複合体が得ることができる。
上記［３１］の修飾抗体によれば、抗体修飾リンカーにより抗ＭＵＣ５ＡＣ抗体のFc領域が特異的に修飾されているので、抗MUC5AC抗体の抗原結合能を損なうことなく、該修飾抗体を放射性核種がキレートしたキレート剤が備えるキレートリンカーに対してクリック反応に用いることができる。
上記［３２］の修飾抗体の製造方法によれば、抗MUC5AC抗体のＦｃ領域を、抗体修飾ペプチドを備えるリンカーで部位特異的に修飾して修飾抗体を得る抗体修飾工程と、イムノグロブリン結合性タンパク質が固定化された担体を用いて前記抗体を精製する抗体精製工程とを備えるので、より該修飾抗体の純度を高めることができる。
上記［３８］又は［３９］の複合体の製造方法によれば、一価抗体又は二価抗体のいずれか一方の割合が他方の割合より多い抗体組成物を用いて複合化工程を行うので、目的に応じて抗MUC5AC抗体に結合するキレート剤の数を調節することができ、所望の価数の複合体をより純度高く得ることができる。
上記［４１］のキットによれば、放射性核種をキレートできるキレート剤と抗体との複合体に、必要なタイミングで放射性核種と反応させて、［１］〜［１２］及び［１８］〜［２７］のいずれかに記載の複合体を用時調製することができ、放射性核種の半減期及び抗体活性の両方を損なうことなく効率的な治療または診断が可能となる。
上記［４２］のキットによれば、放射性核種をキレートできるキレート剤とクリック反応原子団を含む複合体と、抗体とクリック反応原子団を含む複合体を別々に備えるので、必要なタイミングで放射性核種をキレート剤にキレートし、これらをクリック反応させて、［１］〜［１２］及び［１８］〜［２７］のいずれかに記載の複合体を用時調製することができ、放射性核種の半減期及び抗体活性の両方を損なうことなく効率的な治療または診断が可能となる。
【０１２７】
以下、実施例等により、本発明を詳しく説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【実施例】
【０１２８】
製造例１：抗ＭＵＣ５ＡＣヒト化抗体の作製
シグナル配列を付加した各種可変領域のアミノ酸配列、および各種定常領域のアミノ酸配列を、ＣＨＯ細胞における発現に適したコドンユーセージになるように考慮しながら塩基配列に変換した。シグナル配列の開始コドン部位にコザック配列を付加し、定常領域のＣ末端側には停止コドンを付加した。さらにコザック配列の上流と停止コドンの下流に制限酵素サイトを付加し、哺乳類細胞発現用プラスミド（pcDNA3.4）の発現用遺伝子導入サイトに導入できるようにした。このように設計した各ＤＮＡ断片は、化学合成により作製した。目的のＨ鎖と目的のＬ鎖となるような可変領域を含むＤＮＡ断片と、定常領域を含むＤＮＡ断片とを融合ＰＣＲを用い連結した。【０１２９】
作製した各種抗体遺伝子を制限処理したのち精製した。同様に哺乳類細胞一過性発現用プラスミド（pcDNA3.4）も同じ制限酵素で処理したのち精製した。両断片を適切な混合比で混合しライゲーションを行った。ライゲーション反応液を大腸菌ＤＨ５αコンピテントセルと混合しトランスフォーメーションを行った。生じたトランスフォーマントから、コロニーＰＣＲ、シングルコロニーアイソレーション、小スケール培養液からのプラスミド抽出、インサート部分の塩基配列決定を行い、設計した抗体遺伝子全長が設計した通りの配列で意図した方向に正しく挿入されているプラスミド（大腸菌クローン）を選抜した。選抜した大腸菌クローンについて大スケール培養を実施し、エンドトキシン除去工程を含むプラスミド抽出・精製を行った。精製したプラスミドは２６０ｎｍの吸光度を測定し濃度を算出した。【０１３０】
ExpiCHO System (サーモフィッシャーサイエンティフィック社)を使用し、ＣＨＯ細胞による一過性発現を実施した。作製した各Ｈ鎖発現用プラスミドと各Ｌ鎖発現用プラスミドより、Ｈ鎖１種、Ｌ鎖１種を目的の組み合わせになるように選び、リポフェクション法にてトランスフェクションを行い、培養、フィードを行った。トランスフェクションから７日〜１３日後、培養液を回収した。遠心分離およびフィルター濾過した培養上清をＰｒｏｔｅｉｎＡカラムに添加して通常のアフィニティカラムクロマトグラフィー（吸着後洗浄、酸性緩衝液による溶出、溶出液の中和）によって抗体を精製した。精製した抗体は２８０ｎｍの吸光度を測定し濃度を算出した。【０１３１】
上記で述べた方法を用いて下記の抗ＭＵＣ５ＡＣヒト化抗体を作製した。以下に重鎖可変領域と軽鎖可変領域の組み合わせに対して付した抗体の番号を示す。
抗体１：Ｈ０１Ｌ０３
抗体２：Ｈ０１Ｌ０４
抗体３：Ｈ０２Ｌ０４
抗体４：Ｈ０４Ｌ０４
ここでＨ０１、Ｈ０２及びＨ０４はそれぞれ、配列番号１、配列番号２及び配列番号４に示す重鎖可変領域であり、Ｌ０３及びＬ０４はそれぞれ、配列番号７及び配列番号８に示す軽鎖可変領域である。以下の実施例で使用された抗体は、重鎖定常領域１（配列番号２５）と軽鎖定常領域１（配列番号２６）、及び上記の抗体１から抗体４の重鎖可変領域と軽鎖可変領域との組み合わせからなる。【０１３２】
製造例２：ペプチドリンカーによる部位特異的抗体修飾
（１）抗体修飾工程
抗体修飾ペプチドを国際公開２０１７／２１７３４７号パンフレットに記載の方法で製造して、下記式（Ｐ３）で表される１７個のアミノ酸残基を含むペプチドを得た。このペプチドのアミノ酸配列は、配列番号１０のＸａａ２がリシン残基である配列と同一であり、リシン残基の側鎖末端アミノ基がＲ１で示される構造で修飾されていた。また、２つのシステイン残基で互いにジスルフィド結合を形成しており、ペプチドのＮ末端はジグリコール酸及び８つのＰＥＧを有するリンカー構造を介して、第２原子団であるアジド基を含む原子団として、エチルアジドが結合しているものであった。【０１３３】
【化１８】
2021075544.tif 000020
【０１３４】
（式（Ｐ３）中、Ｇｌｙはグリシンを、Ｐｒｏはプロリンを、Ａｓｐはアスパラギン酸を、Ｃｙｓはシステインを、Ａｌａはアラニンを、Ｔｙｒはチロシンを、Ｈｉｓはヒスチジンを、Ｇｌｕはグルタミン酸を、Ｌｅｕはロイシンを、Ｖａｌはバリンを、Ｔｒｐはトリプトファンを、Ｐｈｅはフェニルアラニンを示す）【０１３５】
このペプチドと、製造例１で作製した抗ＭＵＣ５ＡＣヒト化抗体（抗体１）とを酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．０）に混合した混合液を、室温で３０分間反応させて、ペプチド修飾抗体を含む溶液を得た。このペプチド修飾抗体は、上記のペプチドによって抗体のＦｃ領域が部位特異的に修飾されたものである。【０１３６】
（２）ペプチド修飾抗体分離工程
このペプチド修飾抗体を，１ｍｏｌ／Ｌ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．０）で希釈して，ＰｒｏｔｅｉｎＡカラム（ＧＥヘルスケア社製，ＨｉＴｒａｐ ＭａｂＳｅｌｅｃｔ ＳｕＲｅ）に添加し、０．１５ｍｏｌ/Ｌ塩化ナトリウム含有０．０５ｍｏｌ/Ｌ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．７）を流し、ペプチド２分子が修飾されたペプチド修飾抗体（以下、「二価抗体」ともいう。）を回収し、回収した画分に含まれる二価抗体の濃度が１５ｍｇ／ｍＬになるように濃度を調整した。その後、ＰｒｏｔｅｉｎＡカラムに０．１５ｍｏｌ/Ｌ塩化ナトリウム含有０．０５ｍｏｌ/Ｌ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ３．５）を流し、ペプチド１分子が修飾されたペプチド修飾抗体（以下、「一価抗体」ともいう。）を回収し、回収した画分に含まれる一価抗体の濃度が１５ｍｇ／ｍＬになるように濃度を調整した。【０１３７】
実施例１：２２５Ａｃ標識抗ＭＵＣ５ＡＣヒト化抗体（２２５Ａｃ標識一価抗体）の作製１
（１）キレート剤合成工程
本実施例に用いられるキレート部（Ｉｒｉｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  ＧｍｂＨ社製）の構造を、以下の式（Ｌ１−３）に示す。このキレート部を溶媒として０．１ｍｏｌ／Ｌ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．０）に溶解させて、キレート部を１．７ｍｍｏｌ／Ｌ含む溶液とした。この溶液０．００５ｍＬと、放射性金属源として２２５Ａｃイオン含有溶液（０．２ｍｏｌ／Ｌ塩酸水溶液、放射能濃度３００ＭＢｑ／ｍＬ、Ｏａｋ  Ｒｉｄｇｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ製より調製、液量：０．００５ｍＬ）１．５ＭＢｑ（検定日時放射能量から減衰計算した計算値）とを混合した反応液を、加熱条件下で反応させて、225Ａｃ錯体溶液を得た。キレート部と放射性金属イオンとのモル比率は、キレート部：225Ａｃイオン＝約２０００：１であり、反応液の加熱温度は７０℃、加熱時間は９０分間とした。【０１３８】
【化１９】
2021075544.tif 000021
【０１３９】
得られた２２５Ａｃ錯体の放射化学的純度を、次の方法で測定した。すなわち、２２５Ａｃ錯体溶液の一部を薄層クロマトグラフィー（Ａｇｉｌｅｎｔ社製、型番：ＳＧＩ０００１、展開溶媒：アセトニトリル／水混合液（体積比１：１））で展開し、その後、ラジオγ−ＴＬＣアナライザー（ｒａｙｔｅｓｔ製、ＭＯＤＥＬ  ＧＩＴＡ  Ｓｔａｒ）で測定した。検出された全放射能（カウント）に対する、原点付近に検出されたピークの放射能（カウント）の百分率を２２５Ａｃ錯体の放射化学的純度（％）とした。その結果、２２５Ａｃ錯体の放射化学的純度は８６％であった。得られた２２５Ａｃ錯体溶液は、そのまま次の標識工程に用いた。【０１４０】
（２）標識工程
製造例２で得られた一価抗体の溶出液、および、上述の（１）の工程で得られた２２５Ａｃ錯体の溶液をそれぞれ０．０２ｍｏｌ／Ｌ（２０ｍＭ）アスコルビン酸含有０．０９ｍｏｌ／Ｌ酢酸ナトリウム緩衝液に添加し、３７℃で１２０分間クリック反応させて、２２５Ａｃ標識一価抗体を得た。２２５Ａｃ錯体量及びペプチド修飾抗体量はそれぞれ４４μｍｏｌ及び４６μｍｏｌであり、第１原子団（ＤＢＣＯ）と第２原子団（アジド）とのモル比はそれぞれ約１：１であった。
更に、３７℃で２時間反応させて得られた２２５Ａｃ標識一価抗体の溶液を限外ろ過フィルター（Ｍｅｒｃｋ社製、型番：ＵＦＣ５０５０９６）を用いて精製し、以降の実験に供した。精製後の２２５Ａｃ標識一価抗体（検定日時放射能量から減衰計算した放射能量０．３０３ＭＢｑ）の放射化学的純度は、９３％であり、放射化学的収率は、３９％であった。ここで、放射化学的純度は、薄層クロマトグラフィーで分析した場合の薄層板の全放射能カウントに対する２２５Ａｃ標識一価抗体に相当するピークの放射能カウントの割合（％）であり、放射化学的収率は、γ線スペクトロメーター（Ｇｅ半導体検出器：GMX10P4-70（ORTEC社製）、マルチチャンネルアナライザ：M7-000（セイコー・イージーアンドジー社製）、データ処理：Spectrum Navigator：DS-P300（セイコー・イージーアンドジー社製）及びGamma Studio：DS-P600（セイコー・イージーアンドジー社製））で測定した標識工程開始時の放射能カウントから計算した放射能量に対する２２５Ａｃ標識一価抗体の放射能カウントから計算した放射能量の割合（％）である。【０１４１】
実施例２：２２５Ａｃ標識抗ＭＵＣ５ＡＣヒト化抗体（２２５Ａｃ標識一価抗体）の作製２
（１）キレート剤合成工程
本実施例に用いられるキレート部の構造を、以下の式（Ｌ１−４）に示す。式（Ｌ１−４）に示されるＤＯＴＡ−Ｂｎ−ＤＢＣＯは、Wang H, Wang R, Cai K, He H, Liu Y, Yen J et al. Selective in vivo metabolic cell-labeling-mediated cancer targeting. Nat Chem Biol. Apr; 13(4): 415-424. (2017)に記載の方法に準じて製造した。このキレート部を溶媒として０．１ｍｏｌ／Ｌ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．０）に溶解させて、キレート部を１．７ｍｍｏｌ／Ｌ含む溶液とした。この溶液０．００２５ｍＬと、放射性金属源として225Ａｃイオン含有溶液（０．２ｍｏｌ／Ｌ塩酸水溶液、放射能濃度４３２ＭＢｑ／ｍＬ、Ｏａｋ  Ｒｉｄｇｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ製、液量：０．００２５ｍＬ）１．０８ＭＢｑ（検定日時放射能量から減衰計算した計算値）及び０．１ｍｏｌ／Ｌ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．０）０．０３７５ｍＬとを混合した反応液を、加熱条件下で反応させて、２２５Ａｃ錯体溶液を得た。キレート部と放射性金属イオンとのモル比率は、キレート部：225Ａｃイオン＝約２０００：１であり、反応液の加熱温度は７０℃、加熱時間は９０分間とした。【０１４２】
【化２０】
2021075544.tif 000022
【０１４３】
得られた２２５Ａｃ錯体の放射化学的純度を、次の方法で測定した。すなわち、２２５Ａｃ錯体溶液の一部を薄層クロマトグラフィー（Ａｇｉｌｅｎｔ社製、型番：ＳＧＩ０００１、展開溶媒：アセトニトリル／水混合液（体積比１：１））で展開し、その後、ラジオγ−ＴＬＣアナライザー（ｒａｙｔｅｓｔ製、ＭＯＤＥＬ  ＧＩＴＡ  Ｓｔａｒ）で測定した。検出された全放射能（カウント）に対する、原線付近に検出されたピークの放射能（カウント）の百分率を２２５Ａｃ錯体の放射化学的純度（％）とした。その結果、２２５Ａｃ錯体の放射化学的純度は９８％であった。得られた225Ａｃ錯体溶液は、そのまま次の標識工程に用いた。【０１４４】
（２）標識工程
製造例２で得られた一価抗体の溶出液、および、上述の（１）の工程で得られた２２５Ａｃ錯体の溶液を３７℃で１２０分間クリック反応させて、２２５Ａｃ標識一価抗体を得た。２２５Ａｃ錯体量及びペプチド修飾抗体量はそれぞれ４４μｍｏｌ及び４６μｍｏｌであり、第１原子団（ＤＢＣＯ）と第２原子団（アジド）とのモル比はそれぞれ約１：１であった。
更に、３７℃で１２０分間反応させて得られた２２５Ａｃ標識一価抗体の溶液に２０ｍｍｏｌ／Ｌアスコルビン酸含有９０ｍｍｏｌ／Ｌ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．０）を加え限外ろ過フィルター（Ｍｅｒｃｋ社製、型番：ＵＦＣ５０５０９６）を用いて精製し、以降の実験に供した。精製後の２２５Ａｃ標識一価抗体（検定日時放射能量から減衰計算した放射能量：０．２３１ＭＢｑ）の放射化学的純度は、８６％であり、放射化学的収率は、２１％であった。ここで、放射化学的純度は、薄層クロマトグラフィーで分析した場合の薄層板の全放射能カウントに対する２２５Ａｃ標識一価抗体に相当するピークの放射能カウントの割合（％）であり、放射化学的収率は、γ線スペクトロメーター（Ｇｅ半導体検出器：GMX10P4-70（ORTEC社製）、マルチチャンネルアナライザ：M7-000（セイコー・イージーアンドジー社製）、データ処理：Spectrum Navigator：DS-P300（セイコー・イージーアンドジー社製）及びGamma Studio：DS-P600（セイコー・イージーアンドジー社製））で測定した標識工程開始時の放射能カウントから計算した放射能量に対する225Ａｃ標識抗体の放射能カウントから計算した放射能量の割合（％）である。【０１４５】
実施例３：２２５Ａｃ標識抗ＭＵＣ５ＡＣヒト化抗体（２２５Ａｃ標識二価抗体）の作製
実施例２において、一価抗体の溶出液に代えて、製造例２で得た二価抗体の溶出液を用いた以外は、同様にして、２２５Ａｃ標識二価抗体を得た。得られた２２５Ａｃ標識二価抗体（検定日時放射能量から減衰計算した放射能量：０．１６８ＭＢｑ）の放射化学的純度は、９９％であり、放射化学的収率は、２０％であった。【０１４６】
実施例４：Ｉｎ−１１１（１１１Ｉｎ）標識抗体を用いたヒト化抗体のスクリーニング
実施例４−１：１１１Ｉｎ標識抗体の調製
腫瘍集積能が高く、且つ最大耐用量の高い抗ＭＵＣ５ＡＣ抗体を見出すために、各種抗体を１１１Ｉｎ標識し、担がんマウスに投与してＳＰＥＣＴ−ＣＴ撮像を行い、得られた画像より腫瘍及び肝臓の累積放射能量及び吸収線量を算出し、比較を行った。
抗体は、製造例１で作製した抗ＭＵＣ５ＡＣヒト化抗体４種類と特許文献１で開示された抗ＭＵＣ５ＡＣキメラ抗体１種類を用い、１１１Ｉｎ標識した。
特許文献１に開示されているキメラ抗体の重鎖可変領域及び軽鎖可変領域のアミノ酸配列（それぞれ配列番号２３及び２４）は以下の通りである。
１１１Ｉｎ標識は、下記式で示される構造を有する標識前駆体と各種抗体との複合体に対して行った。【０１４７】
【化２１】
2021075544.tif 000023
【０１４８】
【化２２】
2021075544.tif 000024
【０１４９】
上記標識前駆体は、キレート部としてＤＯＴＡが、抗体修飾ペプチド（配列番号１０のＸａａ２がリシン残基である配列と同一の配列を有する１７個のアミノ酸残基を含むペプチド）のＮ末端に８つのポリエチレングリコールを介して連結し、かつ、当該構造中のＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル基を介して、各種抗体におけるＥＵナンバリングで２５２番目のリシン残基に連結している構造を有しているものであった。
この標識前駆体を４５０μｇ、溶媒として１００ｍｍｏｌ／Ｌの４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジンエタンスルホン酸緩衝液（ｐＨ５．５）に溶解させた。この溶液と、放射性金属源として１１１Ｉｎイオン含有溶液（塩化インジウム（１１１Ｉｎ）注射液、日本メジフィジックス社製）を放射能量として１０ＭＢｑとを混合し、４５℃で１２０分間標識反応を行った。【０１５０】
各種１１１Ｉｎ標識抗体の放射化学的収率、放射化学的純度、動物に投与した放射能量を表１に示す。ここでいう放射化学的収率とは、使用した１１１Ｉｎの放射能量に対する１１１Ｉｎ標識抗体の放射能量のことを指す。放射能測定はラジオアイソトープ・ドーズ・キャリブレーター（ＣＡＰＩＮＴＥＣ社製、型番：ＣＲＣ−１５Ｒ）を用いた。放射化学的純度は、ろ紙クロマトグラフィーで分析した場合のろ紙の全放射能カウントに対する１１１Ｉｎ標識抗体に相当するピークの放射能カウントの割合（％）のことを指す。ろ紙クロマトグラフィーは、ろ紙：ＡＤＶＡＮＴＥＣ社製、型番：Ｎｏ．５９０、展開溶媒：０．０１％ ＥＤＴＡ、５０ｍＭ クエン酸-クエン酸ナトリウム水溶液）で展開し、放射能カウントの検出は、ラジオγ−ＴＬＣアナライザー（ｒａｙｔｅｓｔ製、ＭＯＤＥＬ  ＧＩＴＡ  Ｓｔａｒ）を用いた。【０１５１】
【表１】
2021075544.tif 000025
【０１５２】
実施例４−２：担がんマウスを用いた体内分布【０１５３】
（担がんマウスの作製方法）
ヒト膵臓がん細胞株ＳＷ１９９０を０．７×１０７個を、Ｂａｌｂ／ｃヌードマウス（雄性）の脇腹から背部にかけて皮下投与した。
ＳＷ１９９０を移植１４日後の、腫瘍の大きさがおよそ１５０−３００ｍｍ３となった時点で、実施例４−１で調製した各種１１１Ｉｎ標識抗体をマウス尾静脈より投与した。また、腫瘍の体積は以下の計算式より算出した。
腫瘍の体積＝（腫瘍の短径２×腫瘍の長径）／２【０１５４】
【表２】
2021075544.tif 000026
【０１５５】
（評価方法）
ＳＰＥＣＴ−ＣＴイメージング（小動物用ＳＰＥＣＴ−ＣＴ装置:ＦＸ−３０００、Ｔｒｉｆｏｉｌ社製）は下表の条件で実施した。撮像した時間点は投与後１、６、２４、４８、７２、１６８時間後である。画像再構成はＳＰＥＣＴをＯＳＥＭ法，ＣＴをＦＢＰ法で実施した。各時間点の腫瘍及び肝臓のＶＯＩ（ｖｏｌｕｍｅ  ｏｆ  ｉｎｔｅｒｅｓｔ、３次元ＲＯＩ）解析を実施した。臓器体積当たりのカウント数を％ＩＤ／ｇに補正し、物理的半減期を１１１Ｉｎから２２５Ａｃに換算して、物理学的半減期の差を補正し、さらに生物学的半減期を加味したｔｉｍｅ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｃｕｒｖｅを得た。このｔｉｍｅ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｃｕｒｖｅの積分値より累積放射能量を算出し、球体モデル（ＯＬＩＮＤＡ／ＥＸＭ  ｖｅｒ２．０）で吸収線量を算出し、これを各抗体で比較検討した。ただし、Ｈ０１Ｌ０３については投与後１６８時間でｔｉｍｅ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｃｕｒｖｅの減少を認めないため、生物学的半減期は考慮せず、物理的半減期のみを加味した。【０１５６】
【表３】
2021075544.tif 000027
【０１５７】
【表４】
2021075544.tif 000028
【０１５８】
（結果）
ＳＰＥＣＴ−ＣＴ撮像を実施した結果を図１に示す。各時間点の腫瘍及び肝臓のＶＯＩ解析を実施した結果を図２に示す。投与後１６８時間後のＳＰＥＣＴ−ＣＴ撮像終了後の体内分布・排泄経路を確認した結果を示すグラフを図３に示す。
腫瘍への集積は、ヒト化抗体（Ｈ０１Ｌ０３）を用いた場合が最も高く、一方でキメラ抗体を用いた場合が最も低かった。肝臓への集積は、キメラ抗体を用いた場合が最も高く、ヒト化抗体を用いた場合はいずれもキメラ抗体と比較して低かった。ヒト化抗体（Ｈ０１Ｌ０３）を用いた場合の排泄が最も遅く、血液滞留性が高かった。いずれの抗体を用いた場合でも、正常臓器の中では肝臓及び脾臓への集積が高く、次いで肺及び腎臓への集積が高かった。【０１５９】
肝臓のしきい線量を３０Ｇｙと設定した場合の最大耐用量は、ヒト化抗体（Ｈ０１Ｌ０３）を用いた場合には３．９０ＭＢｑと高い値であったが、一方でキメラ抗体を用いた場合には０．４３ＭＢｑと低い値であった。最大耐用量（ＭＢｑ）は、しきい線量（Ｇｙ）／吸収線量（Ｇｙ／ＭＢｑ）で算出した。【０１６０】
実施例４−３：ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  オートラジオグラフィー
実施例４−１で調製した各種１１１Ｉｎ標識抗体を用い、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  オートラジオグラフィー（ＡＲＧ）による各種抗体のＭＵＣ５ＡＣに対する結合性及び特異性を評価した画像結果を図４に示す。また、切片全体に関心領域（ＲＯＩ）を設定して算出したＲＯＩ中の放射能密度（Ｂｑ／ｍｍ２）の数値のグラフを図５に示す。
ＭＵＣ５ＡＣ高発現腫瘍（ＳＷ１９９０移植腫瘍組織）又はＭＵＣ５ＡＣ低発現腫瘍（ＭＩＡＰａＣａ２移植腫瘍組織）を液体窒素中で凍結した凍結ブロックから、クリオスタット（Ｌｅｉｃａ社製）を用いて、厚み１０μｍの切片を作製し、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ＡＲＧに使用した。
使用時まで−８０℃で保存した切片を、室温に戻し、３０分間以上乾燥させた後、リン酸緩衝生理食塩水に３０分間浸漬し、次いで、１体積％ウシ血清アルブミン含有リン酸緩衝生理食塩水に３０分浸漬することで、切片の親水化を行った。
親水化した凍結切片を、各種１１１Ｉｎ標識抗体を５ｋＢｑ／ｍＬ含有１体積％ウシ血清アルブミン含有リン酸緩衝生理食塩水にそれぞれ３０分間浸漬した。次いで、１体積％ウシ血清アルブミン含有リン酸緩衝生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水の順に各溶液に５分間ずつ浸漬して切片の洗浄を行った。洗浄後の切片を風乾し、イメージングプレート（ＢＡＳ−ＳＲ２０４０、富士フイルム社製）で約１５時間露光させ、フルオロイメージアナライザ（Ｔｙｐｈｏｏｎ  ＦＬＡ  ７０００  ＩＰ、ＧＥヘルスケア社製）を用いてオートラジオグラムを得た。得られたオートラジオグラムを、フルオロイメージアナライザ付属の解析ソフトウェア「Ｉｍａｇｅ  Ｑｕａｎｔ  ＴＬ」を用いて、切片全体に関心領域（ＲＯＩ）を設定し、ＲＯＩ中の放射能密度（Ｂｑ／ｍｍ２）を算出した。
１１１Ｉｎ標識した全てのヒト化抗体においてＭＵＣ５ＡＣに対しての結合性及び特異性を保持していることを確認した（図５、ＭＵＣ５ＡＣ高発現腫瘍のデータ参照）。キメラ抗体と比較して、各種ヒト化抗体は非特異的な結合が少ないことを確認した（図５、ＭＵＣ５ＡＣ低・未発現腫瘍のデータ参照）。
実施例４−２、４−３の結果より、ヒト化抗体は、キメラ抗体と比較してＭＵＣ５ＡＣに対する特異性が高く、また腫瘍への高い集積性と肝臓等の正常臓器への低い集積性を有することから、ＲＩ標識抗体に関するより優れたデリバリー技術を提供するものであることが明らかとなった。【０１６１】
本実施例の結果を下表にまとめる。表中、ＳＰＥＣＴの吸収線量において、腫瘍体積は１５０ｍｍ３を想定して算出した。また、肝臓の吸収線量は、本実施例で使用したマウス肝臓重量の平均値（１．１５±０．１４ｇ、ｎ＝１９）を基に算出した。体内分布の数値はｎ＝４の平均±標準偏差で表した（ただし、Ｈ０２Ｌ０４は、ｎ＝３）。【０１６２】
【表５】
2021075544.tif 000029
【０１６３】
実施例５：担がんマウスを用いた２２５Ａｃ標識一価抗体の評価
実施例１に準じて製造した２２５Ａｃ標識一価抗体（Ｈ０１Ｌ０３）を用いた。担がんマウスは、２２５Ａｃ標識一価抗体の投与放射能量によって３群に分け、２．５ｋＢｑ投与群、５ｋＢｑ投与群、１０ｋＢｑ投与群とし、製造例１で製造したヒト化抗体（Ｈ０１Ｌ０３）を投与した群（抗体対照群）と比較した。各群６匹とし、投与後４週間、一般状態の観察、体重および腫瘍体積の測定を実施した。評価に用いた担がんマウスは、実施例４−２と同様の手順で作製し、ＳＷ１９９０を移植１０日後の、腫瘍の大きさがおよそ２００ｍｍ3となった時点で、実験に供した。各群の動物情報について下記にまとめる。【０１６４】
【表６】
2021075544.tif 000030
【０１６５】
経時的な腫瘍体積の変化を図６に、投与前の腫瘍体積を１．０とした場合の観察期間最終日の腫瘍体積の相対比を下記表に示す。２２５Ａｃ標識一価抗体は用量依存的な腫瘍成長抑制効果を示し、全ての用量で統計学的有意に腫瘍成長を抑制した。【０１６６】
【表７】
2021075544.tif 000031
【０１６７】
観察期間最終日に剖検を実施し、腫瘍の採取・重量測定を実施した。腫瘍重量を比較した結果を下記表に示す。２２５Ａｃ標識一価抗体では用量依存的に腫瘍重量が低く、２２５Ａｃ標識一価抗体を投与した全ての群において抗体対照群と比較して腫瘍重量が統計学的に有意に低いことを認めた。【０１６８】
【表８】
2021075544.tif 000032
【０１６９】
経時的な体重の変化の相対値について図７に示す。全ての群において投与前と比較して１０％以上の体重減少を認めなかった。従って２２５Ａｃ標識一価抗体投与による全身状態への影響がない若しくは十分に低い可能性が示された。【０１７０】
観察期間最終日に剖検を実施し、肝臓、腎臓及び脾臓の採取・重量測定を実施した。各臓器重量を比較した結果を下記表に示す。２２５Ａｃ標識一価抗体を２．５ｋＢｑ投与した群で肝臓の重量が抗体対照群と比較して統計学的有意に低いことを確認したが、用量依存性を認めなかったため偶発的な結果と考えられた。腎臓及び脾臓、他の用量での肝臓では抗体対照群と比較して統計学的有意差を認めなかったことより、肝臓、腎臓及び脾臓への影響がない、若しくは十分に低い可能性が示された。【０１７１】
【表９】
2021075544.tif 000033
【０１７２】
観察期間終了時に採取した血液サンプルを用いて腎毒性（Ｃｒｅａｔｉｎｉｎｅ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ（Ｃａｙｍａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ社製）を用いて血漿中クレアチニンを測定）、肝毒性（ＡＬＴ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  Ｋｉｔ（Ｂｉｏ  Ｖｉｓｉｏｎ社製）を用いて血漿中アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）を測定）及び血液毒性（自動血球計測装置（型式：ｔｈｉｎｋａ  ＣＢ−１０１０、アークレイ社製）を用いて白血球数及び血小板数を測定）の評価を副次的に実施した。各測定値に対して、Ｓｔａｔ  ＰｒｅＣｌｉｎｉｃａ（タクミインフォメーションテクノロジー社製）を用いて、測定値の等分散性を確認し、等分散性がある場合はパラメトリック検定のＤｕｎｎｅｔｔ法による解析を、等分散性がない場合には、ノンパラメトリック検定のＳｔｅｅｌ法による解析を行った。【０１７３】
肝毒性及び腎毒性についての結果を図８に示す。２２５Ａｃ標識一価抗体の全投与群において、抗体対照群に対して有意水準５％で統計学的有意差を認めなかった。血液毒性についての結果を図９に示す。採血した各時間点での２２５Ａｃ標識一価抗体の各用量群において、抗体対照群に対して有意水準５％で統計学的有意差を認めなかった。【０１７４】
本実施例により、２２５Ａｃ標識一価抗体による腫瘍成長抑制効果が確認された。抑制効果は用量依存的であり、全ての用量（２．５、５、１０ｋＢｑ）において有意水準５％で統計学的に有意な抑制効果を示した。また、２２５Ａｃ標識一価抗体の投与前と比較して１０％以上の体重減少は認めなかったことに加え、２２５Ａｃ標識一価抗体による肝毒性及び腎毒性、血液毒性の可能性が低いことが示唆された。これらの結果より、２２５Ａｃ標識一価抗体は、非常に高い抗腫瘍効果を有しながら安全性が高く、非常に有用ながん治療薬であることが明らかとなった。【０１７５】
実施例６：担がんマウスを用いた２２５Ａｃ標識一価抗体の高用量評価
投与放射能量を２５ｋＢｑ／匹（実施例５の最低用量の１０倍）にした以外は実施例５と同様にして、２２５Ａｃ標識一価抗体を評価した（２２５Ａｃ標識一価抗体投与群）。また、２０ｍＭアスコルビン酸含有０．１Ｍ酢酸緩衝液中に製造例１で製造した抗体（Ｈ０１Ｌ０３）のみを溶解させた溶液を投与する群（抗体対照群）を設けた。本実施例で用いた抗体は実施例５と同様に作製した。評価に用いた担がんマウスは実施例４−２と同様に作製した。各群５匹とし、投与後４週間、一般状態の観察、体重および腫瘍体積の測定を実施した。各群の動物情報について下記にまとめる。【０１７６】
【表１０】
2021075544.tif 000034
【０１７７】
経時的な腫瘍体積の変化を確認した結果を図１０に示す。２２５Ａｃ標識一価抗体投与群では統計学的に有意に腫瘍成長を抑制し、高用量の２２５Ａｃ標識一価抗体の投与による腫瘍成長抑制効果を確認した。【０１７８】
観察期間最終日に剖検を実施し、腫瘍の採取・重量測定を実施した。腫瘍重量を比較した結果を下記表に示す。２２５Ａｃ標識一価抗体投与群では抗体対照群と比較して腫瘍重量が統計学的に有意に低いことを認めた。【０１７９】
【表１１】
2021075544.tif 000035
【０１８０】
経時的な体重変化を確認した結果を図１１に示す。２２５Ａｃ標識一価抗体投与群では、投与早期に体重減少が認められたが、相対比として０．９を下回らなかった。【０１８１】
観察期間最終日に剖検を実施し、肝臓、腎臓及び脾臓の採取・重量測定を実施した。腫瘍重量を比較した結果を下記表に示す。２２５Ａｃ標識一価抗体投与群では抗体対照群と比較して脾臓の重量のみが統計学的に有意に低いことを認めた。【０１８２】
【表１２】
2021075544.tif 000036
【０１８３】
肝毒性及び腎毒性についての結果を図１２に示す。抗体対照群に対して統計学的有意差を認めなかったため、本用量では肝障害及び腎障害を誘発しないことが示唆された。血液毒性についての結果を図１３に示す。抗体対照群に対して統計学的有意差を認めなかったため、本用量では血液毒性を誘発しないことが示唆された。【０１８４】
これらの結果からも、２２５Ａｃ標識一価抗体は非常に高い抗腫瘍効果を有しながら安全性が高く、非常に有用ながん治療薬であることが示唆された。【０１８５】
マウス投与量からヒト投与量を換算する方法としては、下記計算式を用いる方法がある。
Ａｎｉｍａｌ  ｄｏｓｅ  ｉｎ  ｍｇ／ｋｇ  ｘ  （ａｎｉｍａｌ  ｗｅｉｇｈｔ  ｉｎ  ｋｇ／ｈｕｍａｎ  ｗｅｉｇｈｔ  ｉｎ  ｋｇ）  ｘ  ０．３３
本式に従った場合、本実施例でマウスに対し２５ｋＢｑ／２０ｇを投与したことは、８９．０ｋＢｑ／ｋｇ(ヒト)で投与したことに相当する。【０１８６】
実施例７：担がんマウスを用いた２２５Ａｃ標識一価抗体及び２２５Ａｃ標識二価抗体の評価
担がんマウスを用いて２２５Ａｃ標識一価抗体及び２２５Ａｃ標識二価抗体のそれぞれの抗体の性能を評価した。実施例２に準じて製造した２２５Ａｃ標識一価抗体を、実施例４−２と同様に作製した担がんマウスに投与放射能量５ｋＢｑ／匹又は１０ｋＢｑ／匹で投与した（２２５Ａｃ標識一価抗体投与群）。また、実施例３に準じて製造した２２５Ａｃ標識二価抗体を、実施例４−２と同様に作製した担がんマウスに投与放射能量５ｋＢｑ／匹又は１０ｋＢｑ／匹で投与した（２２５Ａｃ標識二価抗体投与群）。また、実施例５、６と同様に抗体対照群を設けた。各群６匹とし、投与後４週間、一般状態の観察、体重および腫瘍体積の測定を実施した。各群の動物情報について下記にまとめる。【０１８７】
【表１３】
2021075544.tif 000037
【０１８８】
経時的な腫瘍体積の変化を確認した結果を図１４に示す。観察期間最終日の腫瘍体積と、投与前の腫瘍体積を１．０とした場合の相対比を下記表に示す。２２５Ａｃ標識一価抗体投与群では統計学的に有意に腫瘍成長を抑制し、用量依存的な腫瘍成長抑制効果を確認した。２２５Ａｃ標識二価抗体投与群では腫瘍成長を抑制する傾向を示した。【０１８９】
【表１４】
2021075544.tif 000038
【０１９０】
観察期間最終日にイソフルラン麻酔下での放血による安楽死を実施し、腫瘍の採取・重量測定を実施した。腫瘍重量を比較した結果を下記表に示す。２２５Ａｃ標識一価抗体投与群では抗体対照群と比較して腫瘍重量が統計学的に有意に低いことを認め、用量依存的な腫瘍成長抑制効果を確認した。２２５Ａｃ標識二価抗体投与群でも抗体対照群と比較して腫瘍重量が低いことを認めたが、統計学的有意差は認めなかった。【０１９１】
【表１５】
2021075544.tif 000039
【０１９２】
経時的な体重変化を確認した結果を図１５に示す。相対比の平均値として０．９を下回らなかった。また、各個体の相対比として０．８を下回らなかった。【０１９３】
観察期間最終日にイソフルラン麻酔下での放血による安楽死を実施し、剖検を実施した。剖検の結果、異常所見は認めなかった。また、肝臓、腎臓及び脾臓の採取・重量測定を実施した。正常臓器重量を比較した結果を下表に示す。いずれの２２５Ａｃ標識抗体投与群において抗体対照群と比較して臓器重量の統計学的有意な減少は認めなかった。【０１９４】
【表１６】
2021075544.tif 000040
【０１９５】
225Ａｃ標識一価抗体及び225Ａｃ標識二価抗体の肝毒性についての結果を図１６に示す。腎毒性についての結果を図１７に示す。抗体対照群に対して統計学的有意な値の上昇を認めなかったため、本用量では肝障害及び腎障害を誘発しないことが示唆された。血液毒性について投与後１週間と投与後４週間の白血球数の結果を図１８に示す。また、投与後１週間と投与後４週間の血小板数の結果を図１９に示す。白血球数に関して，投与後1週間では抗体対照群に対して1価抗体投与群（５ｋＢｑ及び１０ｋＢｑ）及び２価抗体投与群（１０ｋＢｑ）で統計学的有意差を認めたが、投与後４週間で回復していた。投与後４週間で抗体対照群に対して統計学的有意差を認めた２価抗体投与群（５ｋＢｑ）群に関しては、用量依存的な事象ではなかった。血小板数に関しては、１個体を除いて、いずれの時間点においても正常範囲の下限値である５００×１０９ｃｅｌｌｓ／Ｌを下回らなかった。これらより、本用量では血液毒性を誘発しないことが示唆された。【０１９６】
実施例８：Ｉｎ−１１１（１１１Ｉｎ）標識一価抗体及び１１１Ｉｎ標識二価抗体を用いた体内動態の比較
実施例８−１：各１１１Ｉｎ標識抗体の調製
一価抗体と二価抗体の体内動態を比較するために、一価抗体と二価抗体を１１１Ｉｎ標識し、担がんマウスに投与して，投与２０、６８、１８８時間後に体内分布実験を実施し、一価抗体と二価抗体の体内動態の比較を行った。
（１）キレーターを導入した各抗体の作製
抗体は、製造例１及び製造例２と同様に作製し、ヒト化抗体Ｈ０１Ｌ０３のペプチド修飾抗体の一価抗体及び二価抗体を得た。
キレート部（構造式：Ｌ１−４）を３４ｎｍｏｌ含む０．１ｍｏｌ／Ｌ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．０）と、一価抗体又は二価抗体をそれぞれ３４ｎｍｏｌ含む０．１ｍｏｌ／Ｌアルギニン含有０．１ｍｏｌ／Ｌヒスチジン緩衝液（ｐＨ６．０）とを、３７℃で１２０分間反応させ、キレーター導入抗体を得た。
これを脱塩カラム（型番：ＰＤ−１０、ＧＥヘルスケア社製）に通液し、キレーター導入抗体が含まれるフラクションを回収した。回収したフラクションはさらに限外ろ過フィルター（Ｍｅｒｃｋ社製、型番：ＵＦＣ５０５０９６）を用いて精製した。精製した一価抗体の濃度は７．１３ｍｇ／ｍＬであり、二価抗体の濃度は５．０７ｍｇ／ｍＬであった。【０１９７】
（２）各抗体の１１１Ｉｎ標識
放射性金属源として１１１Ｉｎイオン含有溶液（塩化インジウム（１１１Ｉｎ）注射液、日本メジフィジックス社製）を放射能量として９１〜９２ＭＢｑを用い、各キレーター導入抗体を０．０５ｍＬ加え、よく混和した。ｐＨ試験紙（Ｍｅｒｃｋ社製）によりｐＨが４であることを確認した。これを４５度で１２０分間反応させた。
反応液は限外ろ過フィルター（Ｍｅｒｃｋ社製、型番：ＵＦＣ５０５０９６）を用いて精製し、加えて２０ｍｍｏｌ／Ｌアスコルビン酸含有９０ｍｍｏｌ／Ｌ酢酸ナトリウム緩衝液で溶媒置換した。【０１９８】
各１１１Ｉｎ標識抗体の放射化学的収率は一価抗体で５５％であり、二価抗体で５９％であった。放射化学的純度は一価抗体で９７％であり、二価抗体で９８％であった。動物に投与した放射能量を表１７に示す。ここでいう放射化学的収率とは、使用した１１１Ｉｎの放射能量に対する１１１Ｉｎ標識抗体の放射能量のことを指す。放射能測定はラジオアイソトープ・ドーズ・キャリブレーター（ＣＡＰＩＮＴＥＣ社製、型番：ＣＲＣ−１５Ｒ）を用いた。放射化学的純度は、薄層クロマトグラフィーで分析した場合の薄層板の全放射能カウントに対する１１１Ｉｎ標識抗体に相当するピークの放射能カウントの割合（％）のことを指す。薄層クロマトグラフィー（薄層板：Ａｇｉｌｅｎｔ社製、型番：ＳＧＩ０００１は、展開溶媒：１００ｍｍｏｌ／Ｌ  ＥＤＴＡ溶液（ｐＨ５．０）／アセトニトリル混液（体積比１：１）で展開し、放射能カウントの検出は、ラジオγ−ＴＬＣアナライザー（ｒａｙｔｅｓｔ社製、ＭＯＤＥＬ  ＧＩＴＡ  Ｓｔａｒ）を用いた。【０１９９】
【表１７】
2021075544.tif 000041
【０２００】
実施例８−２：担がんマウスを用いた体内分布【０２０１】
ヒト膵臓がん細胞株ＳＷ１９９０を０．５×１０７個を、Ｂａｌｂ／ｃヌードマウス（雄性）の脇腹から背部にかけて皮下投与した。腫瘍体積がおよそ３００ｍｍ3前後となった時点で、実施例８−１で調製した１１１Ｉｎ標識した一価抗体と二価抗体を尾静脈より投与した。【０２０２】
（評価方法）
担がんマウスは各１１１Ｉｎ標識抗体を投与後に代謝ケージ内で飼養し、各時間点（投与２０、６８、１８８時間後）までに排泄された糞及び尿を回収した。各時間点において担がんマウスをイソフルラン麻酔下での放血による安楽死を実施した。腫瘍、血液、正常臓器（残全身を含む）を採取し、重量を測定した。重量測定した臓器に加え、排泄糞及び排泄尿の放射能量を測定した（γ線ウェルシンチレーション測定装置：ＪＤＣ−１７１２、日立アロカメディカル社製）。各臓器（排泄糞及び排泄尿を含む）の放射能量（カウント）より投与量に対する放射能集積率（％ＩＤ）を算出し、臓器重量当たりの放射能集積率として放射能集積量（％ＩＤ／ｇ）を算出した。【０２０３】
（結果）
各臓器の放射能集積量の経時変化を示した結果を図２０に示す。排泄糞及び排泄尿の放射能集積率、これらを合計した放射能集積率の経時変化を示した結果を図２１に示す。
血液の放射能集積量は二価抗体と比較して、一価抗体のほうがいずれの時間点でも高い値を示した。これより、一価抗体のほうが二価抗体と比較して血液滞留性が高いことを確認した。腫瘍の放射能集積量は二価抗体と比較して、一価抗体のほうがいずれの時間点でも高い値を示した。正常臓器への放射能集積の傾向として、一価抗体では脾臓、肝臓、肺、腎臓の順に高いことを確認した。二価抗体では肝臓及び脾臓の順に顕著に高い値を示し、精巣、心臓、腎臓、大腿骨の順に高いことを確認した。各正常臓器の放射能集積は経時的に減少することを確認した。排泄量は一価抗体と比較して、二価抗体のほうがいずれの時間点でも高い値を示し、排泄速度は二価抗体のほうが速いことを確認した。一価抗体では、糞及び尿排泄量が同程度であった。一方で二価抗体では尿排泄が糞排泄より高く、主に腎尿路系で排泄されることを確認した。【０２０４】
実施例９：２２５Ａｃ標識ＤＯＴＡＧＡ−ＤＢＣＯを用いた２２５Ａｃ標識抗ＭＵＣ５ＡＣヒト化抗体の製造
（１．キレート剤合成工程）
本実施例に用いられるキレート部（ＤＯＴＡＧＡ−ＤＢＣＯ）の構造を、以下の式（Ｌ１−５）に示す。式（Ｌ１−５）に示されるＤＯＴＡＧＡ−ＤＢＣＯは、Bernhard et al. DOTAGA-Anhydride: A Valuable Building Block for the Preparation of DOTA-Like Chelating Agents Chem. Eur. J. 2012, 18, 7834-7841に記載の方法に準じて製造した。このキレート部を、溶媒として０．１ｍｏｌ／Ｌ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．０）に分散させて、キレート部を１．７ｍｍｏｌ／Ｌ含む分散液とした。この分散液０．００４ｍＬと、放射性金属源として２２５Ａｃイオン含有溶液（０．２ｍｏｌ／Ｌ塩酸水溶液、放射能濃度１２２５ＭＢｑ／ｍＬ、Ｏａｋ  Ｒｉｄｇｅ  ＮａｔｉｏｎａｌＬａｂｏｒａｔｏｒｙ製より調製、液量０．００４ｍＬ）４．９ＭＢｑ（検定日時放射能から減衰計算した計算値）と０．１ｍｏｌ／Ｌ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．０）０．０６ｍＬを混合した反応液を、加熱条件下で反応させて、２２５Ａｃ錯体溶液を得た。キレート部と放射性金属イオンとのモル比率は、キレート部：２２５Ａｃイオン＝約６７０：１であり、反応液の加熱温度は７０℃、加熱時間は３０分間とした。【０２０５】
【化２３】
2021075544.tif 000042
【０２０６】
得られた２２５Ａｃ錯体の放射化学的純度を、実施例１と同様に測定した結果、２２５Ａｃ錯体の放射化学的純度は８５％であった。得られた２２５Ａｃ錯体溶液は、そのまま標識工程に用いた。【０２０７】
（２．標識工程）
上述の（１．キレート剤合成工程）を経て得られた２２５Ａｃ錯体の溶液と、室温で６０分反応させた以外は製造例２と同様にして製造したペプチド修飾抗体（一価抗体；Ｈ０１Ｌ０３）を含む溶液とを未精製のままそれぞれ混合し、３７℃で２時間クリック反応させて、２２５Ａｃ錯体標識抗体を得た。キレート部又は２２５Ａｃ標識錯体を含むキレート部及びペプチド修飾抗体（一価抗体）の量はそれぞれ６８ｎｍｏｌ及び８０ｎｍｏｌであり、第１原子団（ＤＢＣＯ）と第２原子団（アジド）とのモル比はそれぞれ約１：１．２であった。
更に、３７℃で２時間反応させて得られた２２５Ａｃ錯体標識抗体の溶液を限外ろ過フィルター（Ｍｅｒｃｋ社製、型番：ＵＦＣ５０５０９６）を用いて精製した。精製後の２２５Ａｃ標識一価抗体の放射化学的純度は９６％であり、放射化学的収率は、６８％であった。２２５Ａｃ標識一価抗体の放射化学的純度及び放射化学的収率の測定方法は、実施例１と同様に行った。【０２０８】
実施例１０：８９Ｚｒ標識ＤＯＴＡＧＡ−ＤＢＣＯを用いた８９Ｚｒ標識抗ＭＵＣ５ＡＣヒト化抗体の製造（ＨＰＬＣ精製）
（１−１．キレート剤合成工程）
本実施例では上記式（Ｌ１−５）で示すキレート部と同一のキレート部を用いた。このキレート部を、ＤＭＳＯ溶液に分散させて、キレート部を２．０ｍｍｏｌ／Ｌ含む分散液とした。この分散液０．１５０ｍＬと、放射性金属源として８９Ｚｒイオン含有溶液（０．１ｍｏｌ／Ｌ塩酸水溶液、放射能濃度１３３５ＭＢｑ／ｍＬ、日本メジフィジックス株式会社製より調製、液量０．１００ｍＬ）１３４ＭＢｑと３００ｍｍｏｌ／Ｌゲンチジン酸含有７８０ｍｍｏｌ／Ｌ酢酸緩衝液０．０５０ｍＬを混合した反応液を、加熱条件下で反応させて、８９Ｚｒ錯体溶液を得た。キレート部と放射性金属イオンとのモル比率は、キレート部：８９Ｚｒイオン＝約３３３３：１であり、反応液の加熱温度は７０℃、加熱時間は６０分間とした。【０２０９】
得られた８９Ｚｒ錯体の放射化学的純度を、次の方法で測定した。すなわち、８９Ｚｒ錯体溶液の一部を薄層クロマトグラフィー（Ａｇｉｌｅｎｔ社製、型番：ＳＧＩ０００１、展開溶媒：アセトニトリル／水混合液（体積比１：１））で展開し、その後、ラジオγ−ＴＬＣアナライザー（ｒａｙｔｅｓｔ製、ＭＯＤＥＬ  ＧＩＴＡ  Ｓｔａｒ  ＰＳ）で測定した。検出された全放射能（カウント）に対する、原点付近に検出されたピークの放射能（カウント）の百分率を８９Ｚｒ錯体の放射化学的純度（％）とした。その結果、８９Ｚｒ錯体の放射化学的純度は９８％であった。【０２１０】
（１−２．８９Ｚｒ錯体精製工程）
上述の（１−１．キレート剤合成工程）で得られた８９Ｚｒ錯体溶液を高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を用いて分取し、未反応のＤＯＴＡＧＡ−ＤＢＣＯを除去した。得られた分取液を約３０μＬまで溶媒留去し、標識工程に用いた。８９Ｚｒ錯体標識抗体の未反応物除去工程における放射化学的収率（ＨＰＬＣ回収率）の測定方法は以下のとおりとした。すなわち、本工程開始時に仕込み放射能量に対して、分取液の放射能の百分率を未反応物除去工程におけるＨＰＬＣ回収率（％）とした。
ＨＰＬＣ条件は以下のとおりで、保持時間２７分付近の画分を分取した。
＜ＨＰＬＣ条件＞
検出器 ：紫外吸光光度計（測定波長：２２０ｎｍ、２５４ｎｍ）／シンチレーション検出器
カラム ：ＸＢｒｉｄｇｅ  Ｃ１８  ３．５μｍ、４．６  ｘ  １００ｍｍ、Ｗａｔｅｒｓ製
流量：毎分０．５ｍＬ
面積測定範囲：試料注入後４５分間
移動相Ａ：１０ｍｍｏｌ／Ｌヒスチジン緩衝液ｐＨ６．５
移動相Ｂ：液体クロマトグラフィー用アセトニトリル
移動相Ｃ：アセトニトリル／水混液（１：１）
移動相の送液：移動相Ａ，移動相Ｂ及び移動相Ｃ混合比を次のように変えて濃度勾配制御した。【０２１１】
【表１８】
2021075544.tif 000043
【０２１２】
（２．標識工程）
上述の各工程を経て得られた８９Ｚｒ錯体の溶液と、製造例２と同様にして製造したペプチド修飾抗体（一価抗体；Ｈ０１Ｌ０３）を含む溶液とを混合し、３７℃で１．５時間クリック反応させて、８９Ｚｒ錯体標識抗体を得た。８９Ｚｒ標識錯体を含むキレート部及びペプチド修飾抗体（一価抗体）の量はそれぞれ７３ｐｍｏｌ及び５０ｎｍｏｌであり、第１原子団（ＤＢＣＯ）と第２原子団（アジド）とのモル比はそれぞれ約１：６８５であった。
更に、３７℃で１．５時間反応させて得られた８９Ｚｒ錯体標識抗体の溶液を限外ろ過フィルター（Ｍｅｒｃｋ社製、型番：ＵＦＣ５０５０９６）を用いて精製した。精製後の８９Ｚｒ錯体標識抗体の放射化学的純度は９５％であり、放射化学的収率は５０％であった。８９Ｚｒ錯体標識抗体の放射化学的純度及び放射化学的収率の測定方法は以下のとおりとした。すなわち、薄層クロマトグラフィー（Ａｇｉｌｅｎｔ社製、型番：ＳＧＩ０００１、展開溶媒はアセトニトリル：０．１ｍｍｏｌ／Ｌ  ＥＤＴＡ溶液の混液（体積比１：１））をラジオγ−ＴＬＣアナライザー（ｒａｙｔｅｓｔ製、ＭＯＤＥＬ  ＧＩＴＡ  Ｓｔａｒ  ＰＳ）で測定し、検出された全放射能（カウント）に対する、原点付近に検出されたピークの放射能（カウント）の百分率を放射化学的純度（％）とした。また、標識工程開始時に加えた全放射能に対して、限外ろ過精製後に回収した放射能の百分率を放射化学的収率（％）とした。【０２１３】
実施例１１：各８９Ｚｒ及び２２５Ａｃ標識抗ＭＵＣ５ＡＣヒト化抗体のヒト及びマウス血漿中の安定性評価
８９Ｚｒ標識ＤＯＴＡＧＡ−ＤＢＣＯを用いて作製した８９Ｚｒ標識抗ＭＵＣ５ＡＣヒト化抗体は実施例１０に準じて製造した。８９Ｚｒ標識ＤＯＴＡ−Ｂｎ−ＤＢＣＯを用いて作製した８９Ｚｒ標識抗ＭＵＣ５ＡＣヒト化抗体はキレート部として上述の式（Ｌ１−４）に示されるキレート部を用いた以外は、実施例１０に準じて製造した。
２２５Ａｃ標識ＤＯＴＡ−Ｂｎ−ＤＢＣＯを用いて作製した２２５Ａｃ標識抗ＭＵＣ５ＡＣヒト化抗体は実施例２に準じて製造した。２２５Ａｃ標識ＤＯＴＡＧＡ−ＤＢＣＯを用いて作製した２２５Ａｃ標識抗ＭＵＣ５ＡＣヒト化抗体は実施例９に準じて製造した。
なお、いずれも溶媒として０．１Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．０）を使用した。【０２１４】
各種８９Ｚｒ標識抗体及び２２５Ａｃ標識抗体をヒト及びマウス血漿と混合し、３７℃でインキュベートした際の各経過時点での安定性について、セルロースアセテート膜電気泳動により評価した。加えて、８９Ｚｒ標識抗体及び２２５Ａｃ標識抗体以外の血漿中の分解物を評価するために、８９Ｚｒもしくは２２５Ａｃの各キレーターからの離脱、及び各リンカー部位の切断を想定しそれぞれの単体を別途各血漿に混合して、セルロースアセテート膜電気泳動を実施した。インキュベートした各時間点より採集した各血漿サンプルを用いて、セルロースアセテート膜電気泳動を実施し、泳動終了後にセルロースアセテート膜をイメージングプレートに露光した。露光したイメージングプレートをスキャナータイプ画像解析装置（ＧＥヘルスケア社製、型番：Ｔｙｐｈｏｏｎ−７０００）で読み取り、イメージング解析ソフトウェア（ＧＥヘルスケア社製、ソフトウェア名：ＩｍａｇｅＱｕａｎｔ）で各種８９Ｚｒ標識抗体及び２２５Ａｃ標識抗体の放射化学的純度を定量評価した。評価サンプルの組成を表１９に示した。検出された全放射能（カウント）に対する、各標識抗体に相当するピークの放射能（カウント）の百分率を放射化学的純度（％）とした。【０２１５】
【表１９】
2021075544.tif 000044
【０２１６】
【表２０】
2021075544.tif 000045
【０２１７】
ＲＩ標識ＤＯＴＡ−Ｂｎ−ＤＢＣＯを用いて作製したＲＩ標識抗ＭＵＣ５ＡＣヒト化抗体に関して、安定性評価のインキュベート時間直後にサンプリングして薄層クロマトグラフィーで測定した血漿サンプルの放射化学的純度はマウス血漿中で９４％、ヒト血漿中で９５％であった。最終的には３７８時間インキュベートした時点の放射化学的純度はいずれも７０％以上であった。結果のグラフは図２２Ａ上段に示した。
本評価に供した２２５Ａｃ標識抗体の放射化学的純度は７７％であり、安定性評価のインキュベート時間直後にサンプリングして薄層クロマトグラフィーで測定した血漿サンプルの放射化学的純度と解離を認めた（マウス：９０％、ヒト：８０％）。これは何らかの固形成分が原線に固着しており、求めた放射化学的純度は実際の値よりも低かったことが考えられた．最終的には１６８時間インキュベートした時点の放射化学的純度はいずれも６０％以上であった。結果のグラフは図２２Ｂ上段に示した。【０２１８】
ＲＩ標識ＤＯＴＡＧＡ−ＤＢＣＯを用いて作製したＲＩ標識抗ＭＵＣ５ＡＣヒト化抗体に関して、本評価に供した８９Ｚｒ標識抗体の放射化学的純度は９４％であり、安定性評価のインキュベート時間直後に測定した血漿サンプルの放射化学的純度と概ね同値（マウス：９９％、ヒト：９９％）であった。最終的には３３６時間インキュベートした時点の放射化学的純度はいずれも８５％以上であった。結果のグラフは図２２Ａ下段に示した。
本評価に供した２２５Ａｃ標識抗体の放射化学的純度は１００％であり、安定性評価のインキュベート時間直後に測定した血漿サンプルの放射化学的純度と概ね同値（マウス：９７％、ヒト：１００％）であった。最終的には３３６時間インキュベートした時点の放射化学的純度はいずれも８０％以上であった。結果のグラフは図２２Ｂ下段に示した。【０２１９】
実施例１２：ＲＩ標識抗ＭＵＣ５ＡＣヒト化抗体のＭＵＣ５ＡＣに対する結合性及び特異性
２２５Ａｃ又は８９Ｚｒ標識ＤＯＴＡＧＡ−ＤＢＣＯを用いて作製したＲＩ標識抗ＭＵＣ５ＡＣヒト化抗体は実施例９及び実施例１０に準じて製造した。また、８９Ｚｒ標識ＤＯＴＡ−Ｂｎ−ＤＢＣＯを用いて作製したＲＩ標識抗ＭＵＣ５ＡＣヒト化抗体は実施例１１に準じて製造した。これらのＲＩ標識抗ＭＵＣ５ＡＣヒト化抗体を用いてｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ＡＲＧによるＭＵＣ５ＡＣに対する各ＲＩ標識抗体の結合性及び特異性を評価した。具体的な操作は、被験物質として上記のＲＩ標識抗ＭＵＣ５ＡＣヒト化抗体を用いた以外は、実施例４−３に準じて行った。８９Ｚｒ標識抗体の結果の画像を図２３に、２２５Ａｃ標識抗体の結果を図２４にそれぞれ示す。また、８９Ｚｒ標識抗体を用いた場合は、ＭＵＣ５ＡＣ陽性腫瘍切片及び陰性腫瘍切片の各切片全体にＲＯＩを設定し、算出したＲＯＩ中の数値を用いて，ＭＵＣ５ＡＣ陽性腫瘍と陰性腫瘍への結合比を算出した。２２５Ａｃ標識抗体を用いた場合は、ＭＵＣ５ＡＣ陽性腫瘍切片及び陰性腫瘍切片の腫瘍組織内に小さなＲＯＩを複数設定し、その平均値で、ＭＵＣ５ＡＣ陽性腫瘍と陰性腫瘍への結合比を算出した。その結果、２２５Ａｃ標識ＤＯＴＡＧＡ−ＤＢＣＯを用いて作製したＲＩ標識抗ＭＵＣ５ＡＣヒト化抗体は６．５倍の結合比を示した。８９Ｚｒ標識ＤＯＴＡＧＡ−ＤＢＣＯを用いて作製したＲＩ標識抗ＭＵＣ５ＡＣヒト化抗体は１３８倍の結合比を示した。８９Ｚｒ標識ＤＯＴＡ−Ｂｎ−ＤＢＣＯを用いて作製したＲＩ標識抗ＭＵＣ５ＡＣヒト化抗体は１５１倍の結合比を示した。８９Ｚｒ又は２２５Ａｃ標識ＤＯＴＡＧＡ−ＤＢＣＯを用いて作製した８９Ｚｒ又は２２５Ａｃ標識抗ＭＵＣ５ＡＣヒト化抗体及び８９Ｚｒ標識ＤＯＴＡ−Ｂｎ−ＤＢＣＯを用いて作製した８９Ｚｒ標識抗ＭＵＣ５ＡＣヒト化抗体はいずれもＭＵＣ５ＡＣに対しての結合性及び特異性を保持していることを確認した。【０２２０】
実施例１３：８９Ｚｒ標識ＤＯＴＡ−Ｂｎ−ＤＢＣＯ及びＤＯＴＡＧＡ−ＤＢＣＯを用いて作製した８９Ｚｒ標識抗ＭＵＣ５ＡＣヒト化抗体のＰＥＴ−ＣＴイメージング
８９Ｚｒ標識ＤＯＴＡ−Ｂｎ−ＤＢＣＯ及びＤＯＴＡＧＡ−ＤＢＣＯを用いて８９Ｚｒ標識抗体を実施例１０に準じて製造し、各々を担がんマウスに投与し、ＰＥＴ−ＣＴイメージングを用いた評価を実施した。
ヒト膵臓がん由来でＭＵＣ５ＡＣ高発現腫瘍細胞株であるＳＷ１９９０を０．７×１０７個を、Ｂａｌｂ／ｃヌードマウス（雄性）の脇腹から背部にかけて皮下投与した。移植後の腫瘍体積がおよそ１５０−３００ｍｍ３となった時点で、各種８９Ｚｒ標識抗ＭＵＣ５ＡＣヒト化抗体をマウス尾静脈より投与した。なお、腫瘍の体積は以下の計算式より算出した。
腫瘍の体積＝（腫瘍の短径２×腫瘍の長径）／２
投与した各種８９Ｚｒ標識抗ＭＵＣ５ＡＣヒト化抗体の放射化学的純度及び動物情報を表２１に示した。【０２２１】
【表２１】
2021075544.tif 000046
【０２２２】
ＰＥＴ−ＣＴイメージング（小動物用ＰＥＴ−ＣＴ装置:Ｓｉ７８、Ｂｒｕｋｅｒ社製）は下表の条件で実施した。ＰＥＴ及びＣＴを撮像した時間点は投与後１２、４８、８４、１６８、２５２時間である。画像再構成はＰＥＴをＭＬＥＭ法，ＣＴをＦＢＰ法で実施した。各時間点の腫瘍及び心臓（血液）、肝臓のＳＵＶ（standardized uptake value）のＶＯＩ解析を実施し、ｔｉｍｅ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｃｕｒｖｅよりＳＵＶの推移を比較した。【０２２３】
【表２２】
2021075544.tif 000047
【０２２４】
【表２３】
2021075544.tif 000048
【０２２５】
各８９Ｚｒ標識抗体投与後４８時間のＰＥＴ−ＣＴ撮像を実施した結果を図２５に示す。各時間点の腫瘍及び心臓（血液）、肝臓のＶＯＩ解析を実施した結果を図２６に示す。加えて、各時間点の腫瘍肝臓比の結果を図２７に示す。
腫瘍への集積の最大値は、いずれもＳＵＶとして２．８以上であり、投与後84時間の腫瘍肝臓比の最大値は８９Ｚｒ標識ＤＯＴＡ−Ｂｎ−ＤＢＣＯを用いて作製した８９Ｚｒ標識抗体で３．６であり、８９Ｚｒ標識ＤＯＴＡＧＡ−ＤＢＣＯを用いて作製した８９Ｚｒ標識抗体で３．４であった。各値において統計学的有意差は認めなかった。
各種８９Ｚｒ標識抗体の心臓（血液）への集積は、経時的に減少することを確認し、投与後２５２時間でほぼ血液中から消失していることを確認した。加えて、各種８９Ｚｒ標識抗体間の各時間点での心臓（血液）への集積に関して統計学的有意差は認めなかった。同様に、各種８９Ｚｒ標識抗体の肝臓及び筋肉への集積も経時的に減少することを確認し、各種８９Ｚｒ標識抗体間の各時間点での各組織への集積に関して統計学的有意差は認めなかった。【０２２６】
実施例１４：８９Ｚｒ標識ＤＯＴＡ−Ｂｎ−ＤＢＣＯ及びＤＯＴＡＧＡ−ＤＢＣＯを用いて作製した８９Ｚｒ標識抗ＭＵＣ５ＡＣヒト化抗体の体内分布実験
より詳細な体内動態を確認するために、８９Ｚｒ標識ＤＯＴＡ−ＤＢＣＯ及びＤＯＴＡＧＡ−ＤＢＣＯを用いて作製した８９Ｚｒ標識抗体を担がんマウスに投与し、投与２０、６８、１８８時間後に体内分布実験を実施した。なお、各種８９Ｚｒ標識抗体は実施例１３と同様に実施例１０に準じて、製造した。【０２２７】
体内分布実験は実施例４−２と同様の方法で作製した担がんマウスに各種８９Ｚｒ標識抗体を尾静脈より投与した。なお、投与した各種８９Ｚｒ標識抗ＭＵＣ５ＡＣヒト化抗体の放射化学的純度及び動物情報を表２４に示した。投与放射能量としていずれの群に対して約５ＭＢｑを投与した。【０２２８】
【表２４】
2021075544.tif 000049
【０２２９】
担がんマウスは各種８９Ｚｒ標識抗体を投与後に代謝ケージ内で飼養し、各時間点（投与２０、６８、１８８時間後）までに排泄された糞及び尿を回収した。各時間点において担がんマウスをイソフルラン麻酔下での放血による安楽死を実施した。腫瘍、血液、正常臓器（残全身を含む）を採取し、重量を測定した。重量測定した臓器に加え、排泄糞及び排泄尿の放射能量を測定した（γ線ウェルシンチレーション測定装置：ＪＤＣ−１７１２、日立アロカメディカル社製）。各臓器（排泄糞及び排泄尿を含む）の放射能量（カウント）より投与量に対する放射能集積率（％ＩＤ）を算出し、臓器重量当たりの放射能集積率として放射能集積量（％ＩＤ／ｇ）を算出した。腫瘍組織及び各臓器の放射能集積量の経時変化を示した結果を図２８Ａ〜Ｄに示す。排泄糞及び排泄尿の放射能集積量（カウント）より投与量に対する放射能集積率（％ＩＤ）を算出し、経時変化を示した結果を図２９に示す。【０２３０】
腫瘍の放射能集積量に関して、８９Ｚｒ標識ＤＯＴＡ−Ｂｎ−ＤＢＣＯ及を用いて作製した８９Ｚｒ標識抗体では投与後１８８時間が最も高く、８９Ｚｒ標識ＤＯＴＡＧＡ−ＤＢＣＯを用いて作製した８９Ｚｒ標識抗体では投与後６８時間が最も高かった。その際の放射能集積量は２０％ＩＤ／ｇ以上を示した。血液の放射能集積の経時変化は各種８９Ｚｒ標識抗体で同様に減少する傾向を示し，血液クリアランスは同程度と判断できる。排泄に関して、投与後１８８時間で糞及び尿中の放射能集積率は６５％ＩＤ以上であった。正常組織への放射能集積に関して、いずれも投与後２０時間が最も高く、２０時間後以降では放射能集積が減少する傾向を認めた。投与後２０時間の放射能集積が高い正常組織は肝臓、肺、脾臓の順であった。【０２３１】
実施例１５：２２５Ａｃ標識ＤＯＴＡＧＡ−ＤＢＣＯを用いて作製した２２５Ａｃ標識抗ＭＵＣ５ＡＣヒト化抗体の薬効評価
２２５Ａｃ標識ＤＯＴＡＧＡ−ＤＢＣＯを用いて作製した２２５Ａｃ標識抗体を担がんマウスに投与し、腫瘍成長抑制効果を確認する検討を実施した。なお、２２５Ａｃ標識抗体は実施例９に準じて、製造した。担がんマウスは実施例４−２と同様の方法で作製した。
２２５Ａｃ標識抗体を担がんマウスに投与放射能量５ｋＢｑ／匹又は１０ｋＢｑ／匹で投与し、２２５Ａｃ標識抗体の性能を評価した。また、０．１Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．０）中に抗ＭＵＣ５ＡＣヒト化抗体のみを溶解させた溶液を投与する群（抗体対照群）を設けた。各群６匹とし、投与後４週間、一般状態の観察、体重および腫瘍体積の測定を実施した。結果を表２５に示した。【０２３２】
【表２５】
2021075544.tif 000050
【０２３３】
経時的な腫瘍体積の変化を確認した結果を図３０の（Ａ）に示す。２２５Ａｃ標識抗体投与群のいずれの投与放射能量で抗体対照群と比較して統計学的に有意に腫瘍成長を抑制し、２２５Ａｃ標識抗体の投与による腫瘍成長抑制効果を確認した。【０２３４】
観察期間最終日に剖検を実施し、腫瘍の採取・重量測定を実施した。腫瘍重量を比較した結果を表２６に示す。各種２２５Ａｃ標識抗体投与群では抗体対照群と比較して腫瘍重量が統計学的に有意に低いことを認めた。【０２３５】
【表２６】
2021075544.tif 000051
【０２３６】
経時的な体重変化を確認した結果を図３０の（Ｂ）に示す。各種２２５Ａｃ標識抗体投与群の１０ｋＢｑ投与した群で観察期間早期に体重減少を認めたが、相対比として０．９を下回らなかった。観察期間後期では体重が投与前程度まで回復した。【０２３７】
観察期間最終日に剖検を実施し、肝臓、腎臓及び脾臓の採取・重量測定を実施した。いずれの２２５Ａｃ標識抗体投与群において，組織重量が抗体対照群と比較して統計学的に有意な減少を認めなかった。【０２３８】
【表２７】
2021075544.tif 000052
【０２３９】
肝毒性及び腎毒性についての結果をそれぞれ図３３及び３４に示す。抗体対照群に対して統計学的有意差を認めなかったため、本用量では肝障害及び腎障害を誘発しないことが示唆された。血液毒性についての結果を図３１及び３２に示す。抗体対照群に対して統計学的有意差を認めなかったため、本用量では血液毒性を誘発しないことが示唆された。【０２４０】
実施例１６：８９Ｚｒランダム標識抗ＭＵＣ５ＡＣヒト化抗体（[89Zr]Random-DFO-抗ＭＵＣ５ＡＣヒト化抗体）の作製
製造例２と同様にして製造したペプチド修飾抗体（一価抗体；Ｈ０１Ｌ０３）0.1mg（0.7nmol）及び1-(4-isothiocyanatophenyl)-3-[6,17-dihydroxy-7,10,18,21-tetraoxo-27-(N-acetylhydroxylamino)- 6,11,17, 22- tetraazaheptaeicosine] thiourea（p-SCN-Bn-DFO、Macrocyclics社）0.26mg（0.35μmol）を0.1M 炭酸水素ナトリウム緩衝液中で混和し、室温下で120分間反応させた。反応終了後、限外濾過により精製、溶媒を100mmolアルギニン含有50mmolヒスチジン緩衝液（pH6.1）（以下、RH緩衝液）に置換することで、抗ＭＵＣ５ＡＣヒト化抗体のアミノ基にランダムにDFOが結合した抗ＭＵＣ５ＡＣヒト化抗体（以下、「Random-DFO-抗ＭＵＣ５ＡＣヒト化抗体」）を作製した。NanoDrop2000（ThermoFisher社）によるタンパク濃度測定の結果、Random-DFO-抗ＭＵＣ５ＡＣヒト化抗体溶液のタンパク濃度は1.12mg/mLであった．得られたRandom-DFO-抗ＭＵＣ５ＡＣヒト化抗体溶液89.6μL（0.1mg、0.67μmol）を、89ZrCl3溶液10μL（11.8MBq）とRH緩衝液301.6μLで混合することで錯体形成反応を進行させ、錯体形成後、限外濾過によって精製を行うことで、[89Zr]Random-DFO-抗ＭＵＣ５ＡＣヒト化抗体を得た。実施例１０と同様に放射化学的純度を算出した結果、放射化学的純度は97.3％であった。また、反応開始時の放射能を元に放射化学的収率を算出した結果、43.0％であった。【０２４１】
実施例１７：[89Zr]Random-DFO-抗ＭＵＣ５ＡＣヒト化抗体のPET-CTイメージング
実施例１６で得られた[89Zr]Random-DFO-抗ＭＵＣ５ＡＣヒト化抗体を1.27MBq/22.5μg protein/100μL/mouseの濃度になるようにＲＨ緩衝液で希釈・調整し、実施例４−２と同様に作製した担がんマウスに投与（ｎ＝３）し、投与後１９、４２、８６、１５８時間点において、ＰＥＴ−ＣＴイメージングを用いた評価を実施した。本評価に供した動物の腫瘍体積を実施例４−２と同様に算出した結果、腫瘍体積の平均値は６０．０±２０．０ｍｍ３であった。ＰＥＴ撮像条件及び画像再構成方法は実施例１３に準じた。各時間点の腫瘍及び心臓（血液）、肝臓のＳＵＶのＶＯＩ解析を実施し、ｔｉｍｅ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｃｕｒｖｅよりＳＵＶの推移を比較した。【０２４２】
ＰＥＴ−ＣＴ撮像を実施した結果を図３５に示す。各時間点の腫瘍、心臓及び肝臓のＶＯＩ解析を実施した結果を図３６に示す。ＶＯＩ解析の結果から，腫瘍には経時的な集積が認められ、いずれの時間点においても、ＳＵＶの平均値は２．７以上でありＳＵＶの最大平均値は１５８時間点における５．１であった。腫瘍以外の臓器（心臓（血液）、肝臓）におけるＳＵＶは経時的に減少することを確認した。投与後１５８時間点におけるＳＵＶの腫瘍肝臓比は３．７であった。【０２４３】
実施例１８：[89Zr]Random-DFO-抗ＭＵＣ５ＡＣヒト化抗体の体内分布実験
実施例１７において158時間点におけるPET-CT撮像終了後、イソフルラン麻酔下で放血による安楽死を実施した。腫瘍、血液、正常臓器（残全身を含む）を採取し、重量を測定した。さらに、γ線ウェルシンチレーション測定装置（JDC-1712，日立アロカメディカル社）を用いて，各臓器の放射能量を測定した。各臓器（排泄糞及び排泄尿を含む）の放射能量（カウント）より投与量に対する放射能集積率（％ＩＤ）を算出し、臓器重量当たりの放射能集積率として放射能集積量（％ＩＤ／ｇ）を算出した。【０２４４】
ＰＥＴ−ＣＴ撮像終了後の体内分布評価の結果を表２８に示す。投与後１５８時間点における腫瘍の放射能分布率は５．１±２．３％ＩＤであり、単位重量当たりの放射能分布率は４９．５±５．２％ＩＤであった。肝臓への高い放射能分布が確認され、肝臓における放射能分布率は５．１％ＩＤ、単位重量当たりの放射能分布率は１０．４％ＩＤ／ｇであった。腫瘍を除く放射能分布率の高い正常臓器は、順に肝臓、腎臓、肺であった。【０２４５】
【表２８】
2021075544.tif 000053
【０２４６】
以上、実施形態を参照して本発明を説明したが、本発明は、上記実施形態に限定されるものではない。本発明の構成や詳細には、本発明のスコープ内で当業者が理解しうる様々な変更をすることができる。
ここで述べられた特許および特許出願明細書を含む全ての刊行物に記載された内容は、ここに引用されたことによって、その全てが明示されたと同程度に本明細書に組み込まれるものである。
【産業上の利用可能性】
【０２４７】
本発明のＲＩ標識された抗ＭＵＣ５ＡＣヒト化抗体は特異性と腫瘍への集積性に優れているので、ＭＵＣ５ＡＣが過剰発現している疾患、特にがんの治療及び／又は診断に極めて有用である。【０２４８】
本出願は、日本で出願された特願２０１９−１９１５６２（出願日：２０１９年１０月１８日）を基礎としておりその内容は本明細書に全て包含されるものである。
【図１】
2021075544.tif 000055
【図２】
2021075544.tif 000056
【図３】
2021075544.tif 000057
【図４】
2021075544.tif 000058
【図５】
2021075544.tif 000059
【図６】
2021075544.tif 000060
【図７】
2021075544.tif 000061
【図８】
2021075544.tif 000062
【図９】
2021075544.tif 000063
【図１０】
2021075544.tif 000064
【図１１】
2021075544.tif 000065
【図１２】
2021075544.tif 000066
【図１３】
2021075544.tif 000067
【図１４】
2021075544.tif 000068
【図１５】
2021075544.tif 000069
【図１６】
2021075544.tif 000070
【図１７】
2021075544.tif 000071
【図１８】
2021075544.tif 000072
【図１９】
2021075544.tif 000073
【図２０】
2021075544.tif 000074
【図２１】
2021075544.tif 000075
【図２２Ａ】
2021075544.tif 000076
【図２２Ｂ】
2021075544.tif 000077
【図２３】
2021075544.tif 000078
【図２４】
2021075544.tif 000079
【図２５】
2021075544.tif 000080
【図２６】
2021075544.tif 000081
【図２７】
2021075544.tif 000082
【図２８Ａ】
2021075544.tif 000083
【図２８Ｂ】
2021075544.tif 000084
【図２８Ｃ】
2021075544.tif 000085
【図２８Ｄ】
2021075544.tif 000086
【図２９】
2021075544.tif 000087
【図３０】
2021075544.tif 000088
【図３１】
2021075544.tif 000089
【図３２】
2021075544.tif 000090
【図３３】
2021075544.tif 000091
【図３４】
2021075544.tif 000092
【図３５】
2021075544.tif 000093
【図３６】
2021075544.tif 000094
【配列表】
2021075544000001.app
【手続補正書】
【提出日】令和3年6月29日(2021.6.29)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
放射性核種がキレートしたキレート剤と、抗体との複合体であって、
前記放射性核種がα線またはポジトロンを放出する金属核種であり、
前記α線を放出する前記金属核種が、アクチニウム−２２５であり、前記ポジトロンを放出する金属核種がＺｒ−８９であり、
前記抗体が、
（１）配列番号１で示されるアミノ酸配列（Ｈ０１）、若しくは配列番号１で示されるアミノ酸配列と９５％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列、
（２）配列番号２で示されるアミノ酸配列（Ｈ０２）、若しくは配列番号２で示されるアミノ酸配列と９５％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列、
（３）配列番号３で示されるアミノ酸配列（Ｈ０３）、若しくは配列番号３で示されるアミノ酸配列と９５％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列、又は
（４）配列番号４で示されるアミノ酸配列（Ｈ０４）、若しくは配列番号４で示されるアミノ酸配列と９５％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列
からなる重鎖可変領域と、
（５）配列番号５で示されるアミノ酸配列（Ｌ０１）、若しくは配列番号５で示されるアミノ酸配列と９５％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列、
（６）配列番号６で示されるアミノ酸配列（Ｌ０２）、若しくは配列番号６で示されるアミノ酸配列と９５％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列、
（７）配列番号７で示されるアミノ酸配列（Ｌ０３）、若しくは配列番号７で示されるアミノ酸配列と９５％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列、又は
（８）配列番号８で示されるアミノ酸配列（Ｌ０４）、若しくは配列番号８で示されるアミノ酸配列と９５％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列
からなる軽鎖可変領域と、
を有する、ムチンサブタイプ５ＡＣに特異的に結合するヒト化抗体であり、
前記キレート剤が、リンカーを介して、前記抗体のＦｃ領域を部位特異的に修飾し、
前記リンカーが、下記式（ｉ）
(Xa)-Xaa1-(Xb)-Xaa2-(Xc)-Xaa3-(Xd)・・・（ｉ）
（式中、Ｘａ、Ｘｂ、Ｘｃ及びＸｄは、それぞれ、連続するａ個のＸ、連続するｂ個のＸ、連続するｃ個のＸ、及び連続するｄ個のＸを表し、
Ｘは、側鎖にチオール基及びハロアセチル基のいずれも有しないアミノ酸残基であり、
ａ、ｂ、ｃ及びｄはそれぞれ独立に１以上５以下の整数で、かつａ＋ｂ＋ｃ＋ｄ≦１４を満たし、
Ｘａａ１及びＸａａ３は、それぞれ独立に、
側鎖にチオール基を有するアミノ酸に由来するアミノ酸残基を表し、
又は、
一方が、側鎖にチオール基を有するアミノ酸に由来するアミノ酸残基を表し、他方が、側鎖にハロアセチル基を有するアミノ酸に由来するアミノ酸残基を表し、Ｘａａ１とＸａａ３とが連結しており、
Ｘａａ２は、リシン残基、アルギニン残基、システイン残基、アスパラギン酸残基、グルタミン酸残基、２−アミノスベリン酸、又はジアミノプロピオン酸であり、前記架橋剤で修飾されている。）
で表される、１３以上１７以下のアミノ酸残基からなるペプチドを含み、かつ
架橋剤で修飾された前記ペプチドと前記抗体の架橋反応によって形成されており、
前記キレート剤が、下記式（Ａ）
【化１】
2021075544.tif 000095
（式（Ａ）中、Ｒ１１、Ｒ１３及びＲ１４は、それぞれ独立して、−（ＣＨ２）ｐＣＯＯＨ、−（ＣＨ２）ｐＣ５Ｈ５Ｎ、−（ＣＨ２）ｐＰＯ３Ｈ２、−（ＣＨ２）ｐＣＯＮＨ２若しくは、−（ＣＨＣＯＯＨ）（ＣＨ２）ｐＣＯＯＨからなる基であり、Ｒ１２又はＲ１５の一方が、水素原子、カルボキシル基、又は、炭素数２若しくは３のカルボキシアルキル基であり、他方が、前記抗体と複合体化するための置換基であり、ｐが０以上３以下の整数であり、Ｒ１２が前記抗体と複合化するための置換基であるときＲ１５は水素原子であり、Ｒ１２が前記抗体と複合化するための置換基でないときＲ１５は前記抗体と複合化するための置換基である。）
で表される化合物又はその塩に由来する構造を有する、複合体。
【請求項２】
前記抗体が、
（１）配列番号１で示されるアミノ酸配列（Ｈ０１）、若しくは配列番号１で示されるアミノ酸配列と９５％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなる重鎖可変領域と、
（７）配列番号７で示されるアミノ酸配列（Ｌ０３）、若しくは配列番号７で示されるアミノ酸配列と９５％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域と、
を有するヒト化抗体である、請求項１に記載の複合体。
【請求項３】
前記ペプチドが、
（１）ＤＣＡＹＨ（Ｘａａ２）ＧＥＬＶＷＴ（配列番号９）
（２）ＧＰＤＣＡＹＨ（Ｘａａ２）ＧＥＬＶＷＣＴＦＨ（配列番号１０）
（３）ＲＣＡＹＨ（Ｘａａ２）ＧＥＬＶＷＣＳ（配列番号１１）
（４）ＧＰＲＣＡＹＨ（Ｘａａ２）ＧＥＬＶＷＣＳＦＨ （配列番号１２）
（５）ＳＰＤＣＡＹＨ（Ｘａａ２）ＧＥＬＶＷＣＴＦＨ （配列番号１３）
（６）ＧＤＤＣＡＹＨ（Ｘａａ２）ＧＥＬＶＷＣＴＦＨ （配列番号１４）
（７）ＧＰＳＣＡＹＨ（Ｘａａ２）ＧＥＬＶＷＣＴＦＨ （配列番号１５）
（８）ＧＰＤＣＡＹＨ（Ｘａａ２）ＧＥＬＶＷＣＳＦＨ （配列番号１６）
（９）ＧＰＤＣＡＹＨ（Ｘａａ２）ＧＥＬＶＷＣＴＨＨ （配列番号１７）
（１０）ＧＰＤＣＡＹＨ（Ｘａａ２）ＧＥＬＶＷＣＴＦＹ （配列番号１８）
（１１）ＳＰＤＣＡＹＨ（Ｘａａ２）ＧＥＬＶＷＣＴＦＹ （配列番号１９）
（１２）ＳＤＤＣＡＹＨ（Ｘａａ２）ＧＥＬＶＷＣＴＦＹ （配列番号２０）又は
（１３）ＲＧＮＣＡＹＨ（Ｘａａ２）ＧＱＬＶＷＣＴＹＨ （配列番号２１）
からなるアミノ酸配列のいずれか１つを含み、Ｘａａ２はリシン残基である、請求項１又は２記載の複合体。
【請求項４】
前記ペプチドが、
（２）ＧＰＤＣＡＹＨ（Ｘａａ２）ＧＥＬＶＷＣＴＦＨ（配列番号１０）
（８）ＧＰＤＣＡＹＨ（Ｘａａ２）ＧＥＬＶＷＣＳＦＨ （配列番号１６）
（９）ＧＰＤＣＡＹＨ（Ｘａａ２）ＧＥＬＶＷＣＴＨＨ （配列番号１７）
（１０）ＧＰＤＣＡＹＨ（Ｘａａ２）ＧＥＬＶＷＣＴＦＹ （配列番号１８）
からなるアミノ酸配列のいずれか１つを含む、請求項３記載の複合体。
【請求項５】
前記キレート剤が、前記式（Ａ）中、Ｒ１１、Ｒ１３及びＲ１４は、それぞれ独立して、−（ＣＨ２）ｐＣＯＯＨ又は−（ＣＨＣＯＯＨ）（ＣＨ２）ｐＣＯＯＨであり、ｐは１であり、Ｒ１２が前記抗体と複合化するための置換基であり、Ｒ１５は水素原子である、化合物又はその塩に由来する構造を有する、請求項１〜４のいずれか１項に記載の複合体。
【請求項６】
前記キレート剤が、下記式（Ａ−９）
【化２】
2021075544.tif 000096
で示される化合物又はその塩に由来する構造を有する、請求項１〜５のいずれか１項に記載の複合体。
【請求項７】
前記放射性核種がα線を放出する金属核種であり、
前記α線を放出する前記金属核種が、アクチニウム−２２５であり、
前記抗体が、
（１）配列番号１で示されるアミノ酸配列（Ｈ０１）で示されるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域と、
（７）配列番号７で示されるアミノ酸配列（Ｌ０３）で示されるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域と、を有し、
前記ペプチドが、
（２）ＧＰＤＣＡＹＨ（Ｘａａ２）ＧＥＬＶＷＣＴＦＨ（配列番号１０）
からなるアミノ酸配列を含み、Ｘａａ２は、リシン残基であり、
前記キレート剤が、下記式（Ａ−９）
【化３】
2021075544.tif 000097
で示される化合物又はその塩に由来する構造を有する、請求項１〜６のいずれか１項に記載の複合体。
【請求項８】
前記放射性核種がポジトロンを放出する金属核種であり、
前記ポジトロンを放出する金属核種がＺｒ−８９であり、
前記抗体が、
（１）配列番号１で示されるアミノ酸配列（Ｈ０１）で示されるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域と、
（７）配列番号７で示されるアミノ酸配列（Ｌ０３）で示されるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域と、を有し、
前記ペプチドが、
（２）ＧＰＤＣＡＹＨ（Ｘａａ２）ＧＥＬＶＷＣＴＦＨ（配列番号１０）
からなるアミノ酸配列を含み、Ｘａａ２は、リシン残基であり、
前記キレート剤が、下記式（Ａ−９）
【化４】
2021075544.tif 000098
で示される化合物又はその塩に由来する構造を有する、請求項１〜６のいずれか１項に記載の複合体。
【請求項９】
前記リンカーが、
前記キレート剤に接続するキレートリンカー、
該キレートリンカーに接続する第１原子団、
前記第１原子団とクリック反応しうる第２原子団、及び
前記第２原子団に接続し、かつ前記ペプチドを含む抗体修飾リンカー、
を有し、
前記リンカーが、前記第１原子団及び前記第２原子団に由来する化学構造として下記式（１０ａ）、（１０ｂ）又は（１０ｃ）の化学構造のいずれか１つを含む、請求項１〜８のいずれか１項に記載の複合体。
【化５】
2021075544.tif 000099
（式（１０ａ）及び（１０ｂ）中、Ｒ１Ａは前記キレートリンカーとの結合部位を示し、Ｒ２Ａは前記抗体修飾リンカーとの結合部位を示す。式（１０ｃ）中、Ｒ３Ａ及びＲ４Ａのうち一方は水素原子、メチル基、フェニル基又はピリジル基を示し、他方はキレートリンカーとの結合部位を示し、Ｒ５Ａは前記抗体修飾リンカーとの結合部位を示す。）
【請求項１０】
請求項１〜９のいずれか１項に記載の複合体を有効成分として含有する、放射性医薬。
【請求項１１】
前記放射性核種がα線を放出する金属核種であり、がんのＲＩ内用療法に用いられる、請求項１０に記載の放射性医薬。
【請求項１２】
前記ＲＩ内用療法において、対象に対し１回あたり２５０ｋＢｑ／ｋｇ以下の投与量で投与されるための、請求項１１に記載の放射性医薬。
【請求項１３】
前記投与量が、１回あたり８０ｋＢｑ／ｋｇ以下である、請求項１２に記載の放射性医薬。
【請求項１４】
前記放射性核種がポジトロンを放出する金属核種であり、がんの診断に用いられる、請求項１０に記載の放射性医薬。
【請求項１５】
放射性核種がキレートしたキレート剤と、抗体との複合体を含有する放射性医薬であって、
前記抗体が、ムチンサブタイプ５ＡＣに特異的に結合するヒト化抗体である、
請求項１１〜１３のいずれか１項に記載の放射性医薬を用いたＲＩ内用療法におけるがんの診断用放射性医薬。
【請求項１６】
放射性核種がキレートしたキレート剤と、抗体との複合体を製造するためのキットであって、
（１）放射性核種をキレートできるキレート剤、および
（２）ムチンサブタイプ５ＡＣに特異的に結合するヒト化抗体を含み、
前記複合体が請求項１〜９のいずれか１項に記載の複合体である、キット。
【請求項１７】
さらに（１）クリック反応可能な第１原子団、および（２）クリック反応可能な第２原子団を含む、請求項１６に記載のキット。
【請求項１８】
前記クリック反応可能な第１原子団、および前記クリック反応可能な第２原子団が、それぞれ、アルキン、アジド、１，２，４，５−テトラジン又はアルケンのいずれか１つを含む、請求項１７に記載のキット。
【請求項１９】
さらにキレート剤にキレートできる放射性核種を含む、請求項１６〜１８のいずれか１項に記載のキット。
【請求項２０】
放射性核種がキレートしたキレート剤と、抗体との複合体を有効成分として含有する放射性医薬であって、
前記放射性核種がα線を放出する金属核種であり、
前記α線を放出する前記金属核種が、アクチニウム−２２５であり、
前記抗体が、
（１）配列番号１で示されるアミノ酸配列（Ｈ０１）、若しくは配列番号１で示されるアミノ酸配列と９５％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなる重鎖可変領域と、
（７）配列番号７で示されるアミノ酸配列（Ｌ０３）、若しくは配列番号７で示されるアミノ酸配列と９５％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域と、
を有する、ムチンサブタイプ５ＡＣに特異的に結合するヒト化抗体であり、
前記キレート剤が、リンカーを介して、前記抗体のＦｃ領域を部位特異的に修飾し、
前記リンカーが、下記式（ｉ）
(Xa)-Xaa1-(Xb)-Xaa2-(Xc)-Xaa3-(Xd)・・・（ｉ）
（式中、Ｘａ、Ｘｂ、Ｘｃ及びＸｄは、それぞれ、連続するａ個のＸ、連続するｂ個のＸ、連続するｃ個のＸ、及び連続するｄ個のＸを表し、
Ｘは、側鎖にチオール基及びハロアセチル基のいずれも有しないアミノ酸残基であり、
ａ、ｂ、ｃ及びｄはそれぞれ独立に１以上５以下の整数で、かつａ＋ｂ＋ｃ＋ｄ≦１４を満たし、
Ｘａａ１及びＸａａ３は、それぞれ独立に、
側鎖にチオール基を有するアミノ酸に由来するアミノ酸残基を表し、
又は、
一方が、側鎖にチオール基を有するアミノ酸に由来するアミノ酸残基を表し、他方が、側鎖にハロアセチル基を有するアミノ酸に由来するアミノ酸残基を表し、Ｘａａ１とＸａａ３とが連結しており、
Ｘａａ２は、リシン残基であり、前記架橋剤で修飾されている。）
で表される、１３以上１７以下のアミノ酸残基からなるペプチドを含み、かつ
架橋剤で修飾された前記ペプチドと前記抗体の架橋反応によって形成されており、
前記ペプチドが、
（２）ＧＰＤＣＡＹＨ（Ｘａａ２）ＧＥＬＶＷＣＴＦＨ（配列番号１０）
（８）ＧＰＤＣＡＹＨ（Ｘａａ２）ＧＥＬＶＷＣＳＦＨ （配列番号１６）
（９）ＧＰＤＣＡＹＨ（Ｘａａ２）ＧＥＬＶＷＣＴＨＨ （配列番号１７）又は
（１０）ＧＰＤＣＡＹＨ（Ｘａａ２）ＧＥＬＶＷＣＴＦＹ （配列番号１８）
で示されるアミノ酸配列からなるペプチドを含み、
前記キレート剤が、下記式（Ａ−９）
【化６】
2021075544.tif 000100
で示される化合物又はその塩に由来する構造を有する複合体、を有効成分として含有する放射性医薬。
【請求項２１】
放射性核種がキレートしたキレート剤と、抗体との複合体を有効成分として含有する放射性医薬であって、
前記放射性核種がポジトロンを放出する金属核種であり、
前記ポジトロンを放出する金属核種がＺｒ−８９であり、
前記抗体が、
（１）配列番号１で示されるアミノ酸配列（Ｈ０１）、若しくは配列番号１で示されるアミノ酸配列と９５％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなる重鎖可変領域と、
（７）配列番号７で示されるアミノ酸配列（Ｌ０３）、若しくは配列番号７で示されるアミノ酸配列と９５％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域と、
を有する、ムチンサブタイプ５ＡＣに特異的に結合するヒト化抗体であり、
前記キレート剤が、リンカーを介して、前記抗体のＦｃ領域を部位特異的に修飾し、
前記リンカーが、下記式（ｉ）
(Xa)-Xaa1-(Xb)-Xaa2-(Xc)-Xaa3-(Xd)・・・（ｉ）
（式中、Ｘａ、Ｘｂ、Ｘｃ及びＸｄは、それぞれ、連続するａ個のＸ、連続するｂ個のＸ、連続するｃ個のＸ、及び連続するｄ個のＸを表し、
Ｘは、側鎖にチオール基及びハロアセチル基のいずれも有しないアミノ酸残基であり、
ａ、ｂ、ｃ及びｄはそれぞれ独立に１以上５以下の整数で、かつａ＋ｂ＋ｃ＋ｄ≦１４を満たし、
Ｘａａ１及びＸａａ３は、それぞれ独立に、
側鎖にチオール基を有するアミノ酸に由来するアミノ酸残基を表し、
又は、
一方が、側鎖にチオール基を有するアミノ酸に由来するアミノ酸残基を表し、他方が、側鎖にハロアセチル基を有するアミノ酸に由来するアミノ酸残基を表し、Ｘａａ１とＸａａ３とが連結しており、
Ｘａａ２は、リシン残基であり、前記架橋剤で修飾されている。）
で表される、１３以上１７以下のアミノ酸残基からなるペプチドを含み、かつ
架橋剤で修飾された前記ペプチドと前記抗体の架橋反応によって形成されており、
前記ペプチドが、
（２）ＧＰＤＣＡＹＨ（Ｘａａ２）ＧＥＬＶＷＣＴＦＨ（配列番号１０）
（８）ＧＰＤＣＡＹＨ（Ｘａａ２）ＧＥＬＶＷＣＳＦＨ （配列番号１６）
（９）ＧＰＤＣＡＹＨ（Ｘａａ２）ＧＥＬＶＷＣＴＨＨ （配列番号１７）又は、
（１０）ＧＰＤＣＡＹＨ（Ｘａａ２）ＧＥＬＶＷＣＴＦＹ （配列番号１８）
で示されるアミノ酸配列からなるペプチドを含み、
前記キレート剤が、下記式（Ａ−９）
【化７】
2021075544.tif 000101
で示される化合物又はその塩に由来する構造を有する複合体を有効成分として含有する放射性医薬。
【請求項２２】
抗体修飾ペプチドを備える抗体修飾リンカーにより抗体のＦｃ領域が特異的に修飾された修飾抗体であって、前記抗体が、
（１）配列番号１で示されるアミノ酸配列（Ｈ０１）、若しくは配列番号１で示されるアミノ酸配列と９５％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列、
（２）配列番号２で示されるアミノ酸配列（Ｈ０２）、若しくは配列番号２で示されるアミノ酸配列と９５％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列、
（３）配列番号３で示されるアミノ酸配列（Ｈ０３）、若しくは配列番号３で示されるアミノ酸配列と９５％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列、又は
（４）配列番号４で示されるアミノ酸配列（Ｈ０４）、若しくは配列番号４で示されるアミノ酸配列と９５％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列
からなる重鎖可変領域と、
（５）配列番号５で示されるアミノ酸配列（Ｌ０１）、若しくは配列番号５で示されるアミノ酸配列と９５％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列、
（６）配列番号６で示されるアミノ酸配列（Ｌ０２）、若しくは配列番号６で示されるアミノ酸配列と９５％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列、
（７）配列番号７で示されるアミノ酸配列（Ｌ０３）、若しくは配列番号７で示されるアミノ酸配列と９５％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列、又は
（８）配列番号８で示されるアミノ酸配列（Ｌ０４）、若しくは配列番号８で示されるアミノ酸配列と９５％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列
からなる軽鎖可変領域と、を有する、ムチンサブタイプ５ＡＣに特異的に結合するヒト化抗体であり、
前記抗体修飾リンカーが、放射性核種がキレートしたキレート剤が備えるキレートリンカーに対してクリック反応により接続するための原子団を有する、修飾抗体。
【国際調査報告】
2021075544.tif 000102
2021075544.tif 000103
2021075544.tif 000104
2021075544.tif 000105