(57)【要約】  多能性幹細胞を誘導培養した培地の上清を含む、医薬品組成物又は医薬品組成物原料が提供される。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
体細胞をリプログラミングした際に使用した培地の上清を含む、医薬品組成物又は医薬品組成物原料。
【請求項２】
請求項１に記載の医薬品組成物又は医薬品組成物原料を含む、皮膚のシミ、しわ及びたるみのいずれかの形成防止及び改善剤。
【請求項３】
体細胞をリプログラミングした際に使用した培地の上清を含む、化粧品組成物又は化粧品組成物原料。
【請求項４】
請求項３に記載の化粧品組成物又は化粧品組成物原料を含む、皮膚のシミ、しわ及びたるみのいずれかの形成防止及び改善剤。
【請求項５】
体細胞をリプログラミングした際に使用した培地の上清を含む、コラーゲン産生促進剤又はコラーゲン産生促進剤原料。
【請求項６】
体細胞をリプログラミングした際に使用した培地の上清を含む、発毛剤、発毛剤原料、育毛剤又は育毛剤原料。
【請求項７】
体細胞をリプログラミングした際に使用した培地の上清を含む、毛乳頭細胞の活性化剤又は毛乳頭細胞の活性化剤原料。
【請求項８】
体細胞をリプログラミングした際に使用した培地の上清を含む、線維芽細胞成長因子ファミリー産生促進剤又は線維芽細胞成長因子ファミリー産生促進剤原料。
【請求項９】
体細胞をリプログラミングした際に使用した培地の上清を含む、血管内皮細胞増殖因子産生促進剤又は血管内皮細胞増殖因子産生促進剤原料。
【請求項１０】
体細胞をリプログラミングした際に使用した培地の上清を含む、創傷治療剤又は創傷治療剤原料。
【請求項１１】
体細胞をリプログラミングした際に使用した培地の上清を含む、表皮細胞増殖促進剤又は表皮細胞増殖促進剤原料。
【請求項１２】
幹細胞の抽出物を含む、医薬品組成物又は医薬品組成物原料。
【請求項１３】
前記幹細胞の抽出物がペーストであるか、又は前記幹細胞の抽出物が凍結乾燥されている、請求項１２に記載の医薬品組成物又は医薬品組成物原料。
【請求項１４】
請求項１２又は１３に記載の医薬品組成物又は医薬品組成物原料を含む、皮膚のシミ、しわ及びたるみのいずれかの形成防止及び改善剤。
【請求項１５】
幹細胞の抽出物を含む、化粧品組成物又は化粧品組成物原料。
【請求項１６】
前記幹細胞の抽出物がペーストであるか、又は前記幹細胞の抽出物が凍結乾燥されている、請求項１５に記載の化粧品組成物又は化粧品組成物原料。
【請求項１７】
請求項１５又は１６に記載の化粧品組成物又は化粧品組成物原料を含む、皮膚のシミ、しわ及びたるみのいずれかの形成防止及び改善剤。
【請求項１８】
幹細胞の抽出物を含む、コラーゲン産生促進剤又はコラーゲン産生促進剤原料。
【請求項１９】
前記幹細胞の抽出物がペーストであるか、又は前記幹細胞の抽出物が凍結乾燥されている、請求項１８に記載のコラーゲン産生促進剤又はコラーゲン産生促進剤原料。
【請求項２０】
幹細胞の抽出物を含む、発毛剤、発毛剤原料、育毛剤又は育毛剤原料。
【請求項２１】
前記幹細胞の抽出物がペーストであるか、又は前記幹細胞の抽出物が凍結乾燥されている、請求項２０に記載の発毛剤、発毛剤原料、育毛剤又は育毛剤原料。
【請求項２２】
幹細胞の抽出物を含む、毛乳頭細胞の活性化剤又は毛乳頭細胞の活性化剤原料。
【請求項２３】
前記幹細胞の抽出物がペーストであるか、又は前記幹細胞の抽出物が凍結乾燥されている、請求項２２に記載の毛乳頭細胞の活性化剤又は毛乳頭細胞の活性化剤原料。
【請求項２４】
幹細胞の抽出物を含む、線維芽細胞成長因子ファミリー産生促進剤又は線維芽細胞成長因子ファミリー産生促進剤原料。
【請求項２５】
前記幹細胞の抽出物がペーストであるか、又は前記幹細胞の抽出物が凍結乾燥されている、請求項２４に記載の線維芽細胞成長因子ファミリー産生促進剤又は線維芽細胞成長因子ファミリー産生促進剤原料。
【請求項２６】
幹細胞の抽出物を含む、血管内皮細胞増殖因子産生促進剤又は血管内皮細胞増殖因子産生促進剤原料。
【請求項２７】
前記幹細胞の抽出物がペーストであるか、又は前記幹細胞の抽出物が凍結乾燥されている、請求項２６に記載の血管内皮細胞増殖因子産生促進剤又は血管内皮細胞増殖因子産生促進剤原料。
【請求項２８】
幹細胞の抽出物を含む、創傷治療剤又は創傷治療剤原料。
【請求項２９】
前記幹細胞の抽出物がペーストであるか、又は前記幹細胞の抽出物が凍結乾燥されている、請求項２８に記載の創傷治療剤又は創傷治療剤原料。
【請求項３０】
幹細胞の抽出物を含む、表皮細胞増殖促進剤又は表皮細胞増殖促進剤原料。
【請求項３１】
前記幹細胞の抽出物がペーストであるか、又は前記幹細胞の抽出物が凍結乾燥されている、請求項３０に記載の表皮細胞増殖促進剤又は表皮細胞増殖促進剤原料。
【請求項３２】
老化疾患患者又は皮膚疾患患者由来の体細胞から作製された多能性幹細胞から分化誘導した皮膚細胞を用意することと、
前記皮膚細胞に紫外線を照射することと、
前記紫外線を照射された皮膚細胞を複数の異なる溶液のそれぞれで培養することと、
前記紫外線による前記皮膚細胞のダメージが少ない培地又は前記紫外線を受けた前記皮膚細胞の修復が早い溶液を選択することと、
を含む、抗紫外線物質のスクリーニング方法。
【請求項３３】
老化疾患患者又は皮膚疾患患者由来の体細胞から作製された多能性幹細胞から分化誘導した皮膚細胞を用意することと、
前記皮膚細胞を乾燥することと、
前記乾燥された皮膚細胞を複数の異なる溶液のそれぞれで培養することと、
前記皮膚細胞の生存率が高い溶液を選択することと、
を含む、抗乾燥物質のスクリーニング方法。
【請求項３４】
老化疾患患者又は皮膚疾患患者由来の体細胞から作製された多能性幹細胞から分化誘導した皮膚細胞を用意することと、
前記皮膚細胞を乾燥することと、
前記乾燥された皮膚細胞を複数の異なる溶液のそれぞれで培養することと、
前記皮膚細胞のタイトジャンクションの損傷が小さい溶液を選択することと、
を含む、抗乾燥物質のスクリーニング方法。
【請求項３５】
前記タイトジャンクションにおけるオクルディン及びクローディンの少なくとも一方を分析する、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
老化疾患患者又は皮膚疾患患者由来の体細胞から作製された多能性幹細胞から分化誘導した皮膚細胞を用意することと、
前記皮膚細胞に酸化ストレスを与えることと、
前記酸化ストレスを与えられた皮膚細胞を複数の異なる溶液のそれぞれで培養することと、
前記皮膚細胞の生存率が高い溶液を選択することと、
を含む、抗酸化ストレス物質のスクリーニング方法。
【請求項３７】
老化疾患患者又は皮膚疾患患者由来の体細胞から作製された多能性幹細胞から分化誘導した皮膚細胞を用意することと、
前記皮膚細胞を複数の異なる溶液のそれぞれで培養することと、
前記複数の異なる溶液から前記皮膚細胞由来の天然保湿因子の量が多い溶液を選択することと、
を含む、保湿促進物質のスクリーニング方法。
【請求項３８】
前記天然保湿因子がセラミド及びフィラグリンの少なくも一方である、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
被験者由来の体細胞から作製された多能性幹細胞から分化誘導した皮膚細胞を用意することと、
紫外線による前記皮膚細胞のダメージを検査することと、
を含む、皮膚の紫外線耐性検査方法。
【請求項４０】
被験者由来の体細胞から作製された多能性幹細胞から分化誘導した皮膚細胞を用意することと、
前記皮膚細胞を乾燥することと、
前記皮膚細胞の生存率を検査することと、
を含む、皮膚の乾燥耐性検査方法。
【請求項４１】
被験者由来の体細胞から作製された多能性幹細胞から分化誘導した皮膚細胞を用意することと、
前記皮膚細胞を乾燥することと、
前記皮膚細胞のタイトジャンクションの損傷を検査することと、
を含む、皮膚の乾燥耐性検査方法。
【請求項４２】
前記皮膚細胞のタイトジャンクションの損傷を検査することにおいて、前記タイトジャンクションにおけるオクルディン及びクローディンの少なくとも一方を分析する、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
被験者由来の体細胞から作製された多能性幹細胞から分化誘導した皮膚細胞を用意することと、
前記皮膚細胞に酸化ストレスを与えることと、
前記皮膚細胞の生存率を検査することと、
を含む、皮膚の酸化ストレス耐性検査方法。
【請求項４４】
被験者由来の体細胞から作製された多能性幹細胞から分化誘導した皮膚細胞を用意することと、
前記皮膚細胞を培養することと、
前記皮膚細胞由来の天然保湿因子の量を検査することと、
を含む、皮膚の保湿能力の検査方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、医薬品組成物及び化粧品組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
胚性幹細胞（ＥＳ細胞）は、ヒトやマウスの初期胚から樹立された幹細胞である。ＥＳ細胞は、生体に存在する全ての細胞へと分化できる多能性を有する。現在、ヒトＥＳ細胞は、パーキンソン病、若年性糖尿病、及び白血病等、多くの疾患に対する細胞移植療法に利用可能である。しかし、ＥＳ細胞の移植には障害もある。特に、ＥＳ細胞の移植は、不成功な臓器移植に続いて起こる拒絶反応と同様の免疫拒絶反応を惹起しうる。また、ヒト胚を破壊して樹立されるＥＳ細胞の利用に対しては、倫理的見地から批判や反対意見が多い。【０００３】
このような背景の状況の下、京都大学の山中伸弥教授は、４種の遺伝子：ＯＣＴ３／４、ＫＬＦ４、ｃ−ＭＹＣ、及びＳＯＸ２を体細胞に導入することにより、誘導多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）を樹立することに成功した。これにより、山中教授は、２０１２年のノーベル生理学・医学賞を受賞した（例えば、特許文献１参照。）。ｉＰＳ細胞は、拒絶反応や倫理的問題のない理想的な多能性細胞である。したがって、ｉＰＳ細胞は、細胞移植療法への利用が期待されている。一方、ｉＰＳ細胞の培養に用いた培地を、医薬品組成物に再利用したとの報告がある（例えば、特許文献２参照。）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特許第４１８３７４２号公報
【特許文献２】特開２０１６−１２８３９６号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかし、本発明者らが検証したところ、特許文献２に記載の培養方法では、ｉＰＳ細胞は分化してしまうため、実際にはｉＰＳ細胞ではなく分化した細胞を培養した培地が再利用されているものと考えられる。本発明は、ｉＰＳ細胞の培地を有効活用した医薬品組成物及び化粧品組成物を提供することを目的の一つとする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明の態様によれば、体細胞をリプログラミングした際に使用した培地の上清を含む、医薬品組成物又は医薬品組成物原料が提供される。【０００７】
本発明の態様によれば、上記の医薬品組成物又は医薬品組成物原料を含む、皮膚のシミ、しわ及びたるみのいずれかの形成防止及び改善剤が提供される。【０００８】
本発明の態様によれば、体細胞をリプログラミングした際に使用した培地の上清を含む、化粧品組成物又は化粧品組成物原料が提供される。【０００９】
本発明の態様によれば、上記の化粧品組成物又は化粧品組成物原料を含む、皮膚のシミ、しわ及びたるみのいずれかの形成防止及び改善剤が提供される。【００１０】
本発明の態様によれば、体細胞をリプログラミングした際に使用した培地の上清を含む、コラーゲン産生促進剤又はコラーゲン産生促進剤原料が提供される。【００１１】
本発明の態様によれば、体細胞をリプログラミングした際に使用した培地の上清を含む、発毛剤、発毛剤原料、育毛剤又は育毛剤原料が提供される。【００１２】
本発明の態様によれば、体細胞をリプログラミングした際に使用した培地の上清を含む、毛乳頭細胞の活性化剤又は毛乳頭細胞の活性化剤原料が提供される。【００１３】
本発明の態様によれば、体細胞をリプログラミングした際に使用した培地の上清を含む、線維芽細胞成長因子ファミリー産生促進剤又は線維芽細胞成長因子ファミリー産生促進剤原料が提供される。【００１４】
本発明の態様によれば、体細胞をリプログラミングした際に使用した培地の上清を含む、血管内皮細胞増殖因子産生促進剤又は血管内皮細胞増殖因子産生促進剤原料が提供される。【００１５】
本発明の態様によれば、体細胞をリプログラミングした際に使用した培地の上清を含む、創傷治療剤又は創傷治療剤原料が提供される。【００１６】
本発明の態様によれば、体細胞をリプログラミングした際に使用した培地の上清を含む、表皮細胞増殖促進剤又は表皮細胞増殖促進剤原料が提供される。【００１７】
本発明の態様によれば、幹細胞の抽出物を含む、医薬品組成物又は医薬品組成物原料が提供される。【００１８】
上記の医薬品組成物又は医薬品組成物原料において、幹細胞の抽出物がペーストであるか、又は幹細胞の抽出物が凍結乾燥されていてもよい。【００１９】
本発明の態様によれば、上記の医薬品組成物又は医薬品組成物原料を含む、皮膚のシミ、しわ及びたるみのいずれかの形成防止及び改善剤が提供される。【００２０】
本発明の態様によれば、幹細胞の抽出物を含む、化粧品組成物又は化粧品組成物原料が提供される。【００２１】
上記の化粧品組成物又は化粧品組成物原料において、幹細胞の抽出物がペーストであるか、又は幹細胞の抽出物が凍結乾燥されていてもよい。【００２２】
本発明の態様によれば、上記の化粧品組成物又は化粧品組成物原料を含む、皮膚のシミ、しわ及びたるみのいずれかの形成防止及び改善剤が提供される。【００２３】
本発明の態様によれば、幹細胞の抽出物を含む、コラーゲン産生促進剤又はコラーゲン産生促進剤原料が提供される。【００２４】
上記のコラーゲン産生促進剤又はコラーゲン産生促進剤原料において、幹細胞の抽出物がペーストであるか、又は幹細胞の抽出物が凍結乾燥されていてもよい。【００２５】
本発明の態様によれば、幹細胞の抽出物を含む、発毛剤、発毛剤原料、育毛剤又は育毛剤原料が提供される。【００２６】
上記の発毛剤、発毛剤原料、育毛剤又は育毛剤原料において、幹細胞の抽出物がペーストであるか、又は幹細胞の抽出物が凍結乾燥されていてもよい。【００２７】
本発明の態様によれば、幹細胞の抽出物を含む、毛乳頭細胞の活性化剤又は毛乳頭細胞の活性化剤原料が提供される。【００２８】
上記の毛乳頭細胞の活性化剤又は毛乳頭細胞の活性化剤原料において、幹細胞の抽出物がペーストであるか、又は幹細胞の抽出物が凍結乾燥されていてもよい。【００２９】
本発明の態様によれば、幹細胞の抽出物を含む、線維芽細胞成長因子ファミリー産生促進剤又は線維芽細胞成長因子ファミリー産生促進剤原料が提供される。【００３０】
上記の線維芽細胞成長因子ファミリー産生促進剤又は線維芽細胞成長因子ファミリー産生促進剤原料において、幹細胞の抽出物がペーストであるか、又は幹細胞の抽出物が凍結乾燥されていてもよい。【００３１】
本発明の態様によれば、幹細胞の抽出物を含む、血管内皮細胞増殖因子産生促進剤又は血管内皮細胞増殖因子産生促進剤原料が提供される。【００３２】
上記の血管内皮細胞増殖因子産生促進剤又は血管内皮細胞増殖因子産生促進剤原料において、幹細胞の抽出物がペーストであるか、又は幹細胞の抽出物が凍結乾燥されていてもよい。【００３３】
本発明の態様によれば、幹細胞の抽出物を含む、創傷治療剤又は創傷治療剤原料が提供される。【００３４】
上記の創傷治療剤又は創傷治療剤原料において、幹細胞の抽出物がペーストであるか、又は幹細胞の抽出物が凍結乾燥されていてもよい。【００３５】
本発明の態様によれば、幹細胞の抽出物を含む、表皮細胞増殖促進剤又は表皮細胞増殖促進剤原料が提供される。【００３６】
上記の表皮細胞増殖促進剤又は表皮細胞増殖促進剤原料において、幹細胞の抽出物がペーストであるか、又は幹細胞の抽出物が凍結乾燥されていてもよい。【００３７】
本発明の態様によれば、老化疾患患者又は皮膚疾患患者由来の体細胞から作製された多能性幹細胞から分化誘導した皮膚細胞を用意することと、皮膚細胞に紫外線を照射することと、紫外線を照射された皮膚細胞を複数の異なる溶液のそれぞれで培養することと、紫外線による皮膚細胞のダメージが少ない培地又は紫外線を受けた皮膚細胞の修復が早い溶液を選択することと、を含む、抗紫外線物質のスクリーニング方法が提供される。【００３８】
本発明の態様によれば、老化疾患患者又は皮膚疾患患者由来の体細胞から作製された多能性幹細胞から分化誘導した皮膚細胞を用意することと、皮膚細胞を乾燥することと、乾燥された皮膚細胞を複数の異なる溶液のそれぞれで培養することと、皮膚細胞の生存率が高い溶液を選択することと、を含む、抗乾燥物質のスクリーニング方法が提供される。【００３９】
本発明の態様によれば、老化疾患患者又は皮膚疾患患者由来の体細胞から作製された多能性幹細胞から分化誘導した皮膚細胞を用意することと、皮膚細胞を乾燥することと、乾燥された皮膚細胞を複数の異なる溶液のそれぞれで培養することと、皮膚細胞のタイトジャンクションの損傷が小さい溶液を選択することと、を含む、抗乾燥物質のスクリーニング方法が提供される。【００４０】
上記の方法において、タイトジャンクションにおけるオクルディン及びクローディンの少なくとも一方を分析してもよい。【００４１】
本発明の態様によれば、老化疾患患者又は皮膚疾患患者由来の体細胞から作製された多能性幹細胞から分化誘導した皮膚細胞を用意することと、皮膚細胞に酸化ストレスを与えることと、酸化ストレスを与えられた皮膚細胞を複数の異なる溶液のそれぞれで培養することと、皮膚細胞の生存率が高い溶液を選択することと、を含む、抗酸化ストレス物質のスクリーニング方法が提供される。【００４２】
本発明の態様によれば、老化疾患患者又は皮膚疾患患者由来の体細胞から作製された多能性幹細胞から分化誘導した皮膚細胞を用意することと、皮膚細胞を複数の異なる溶液のそれぞれで培養することと、複数の異なる溶液から皮膚細胞由来の天然保湿因子の量が多い溶液を選択することと、を含む、保湿促進物質のスクリーニング方法が提供される。【００４３】
上記の方法において、天然保湿因子がセラミド及びフィラグリンの少なくも一方であってもよい。【００４４】
本発明の態様によれば、被験者由来の体細胞から作製された多能性幹細胞から分化誘導した皮膚細胞を用意することと、紫外線による皮膚細胞のダメージを検査することと、を含む、皮膚の紫外線耐性検査方法が提供される。【００４５】
本発明の態様によれば、被験者由来の体細胞から作製された多能性幹細胞から分化誘導した皮膚細胞を用意することと、皮膚細胞を乾燥することと、皮膚細胞の生存率を検査することと、を含む、皮膚の乾燥耐性検査方法が提供される。【００４６】
本発明の態様によれば、被験者由来の体細胞から作製された多能性幹細胞から分化誘導した皮膚細胞を用意することと、皮膚細胞を乾燥することと、皮膚細胞のタイトジャンクションの損傷を検査することと、を含む、皮膚の乾燥耐性検査方法が提供される。【００４７】
上記の方法において、皮膚細胞のタイトジャンクションの損傷を検査することにおいて、タイトジャンクションにおけるオクルディン及びクローディンの少なくとも一方を分析してもよい。【００４８】
本発明の態様によれば、被験者由来の体細胞から作製された多能性幹細胞から分化誘導した皮膚細胞を用意することと、皮膚細胞に酸化ストレスを与えることと、皮膚細胞の生存率を検査することと、を含む、皮膚の酸化ストレス耐性検査方法が提供される。【００４９】
本発明の態様によれば、被験者由来の体細胞から作製された多能性幹細胞から分化誘導した皮膚細胞を用意することと、皮膚細胞を培養することと、皮膚細胞由来の天然保湿因子の量を検査することと、を含む、皮膚の保湿能力の検査方法が提供される。
【発明の効果】
【００５０】
本発明によれば、ｉＰＳ細胞の培地を有効活用した医薬品組成物及び化粧品組成物を提供可能である。
【図面の簡単な説明】
【００５１】
【図１】実施例２に係る線維芽細胞によるヒアルロン酸産生試験の結果を示すグラフである。
【図２】実施例４に係る線維芽細胞によるＩ型コラーゲン産生試験の結果を示すグラフである。
【図３】実施例４に係る線維芽細胞によるＩ型コラーゲン産生試験の結果を示す表である。
【図４】実施例５に係る毛乳頭細胞の増殖性試験の結果を示すグラフである。
【図５】実施例５に係る毛乳頭細胞の増殖性試験の結果を示す表である。
【図６】実施例６に係る毛乳頭細胞によるＶＥＧＦ産生試験の結果を示すグラフである。
【図７】実施例６に係る毛乳頭細胞によるＶＥＧＦ産生試験の結果を示す表である。
【図８】実施例７に係る毛乳頭細胞によるＦＧＦ−７産生試験の結果を示すグラフである。
【図９】実施例７に係る毛乳頭細胞によるＦＧＦ−７産生試験の結果を示す表である。
【図１０】実施例８に係る線維芽細胞の遊走性試験の結果を示す写真である。
【図１１】実施例８に係る線維芽細胞の遊走性試験の結果を示す写真である。
【図１２】実施例１０に係る皮膚線維芽細胞のＵＶ照射試験の結果を示すグラフである。
【図１３】実施例１１に係る皮膚線維芽細胞の乾燥刺激試験の結果を示すグラフである。
【図１４】実施例１２に係る皮膚線維芽細胞の酸化ストレス試験の結果を示すグラフである。
【図１５】実施例１２に係る皮膚線維芽細胞の酸化ストレス試験の結果を示すグラフである。
【図１６】参考例に係る細胞の顕微鏡写真である。
【図１７】参考例に係る細胞の顕微鏡写真である。
【図１８】参考例に係る細胞のフローサイトメトリーの結果を示すヒスとグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００５２】
以下、本発明の実施の形態について詳細に説明する。なお以下の示す実施の形態は、この発明の技術的思想を具体化するための装置や方法を例示するものであって、この発明の技術的思想は構成部材の組み合わせ等を下記のものに特定するものではない。この発明の技術的思想は、特許請求の範囲において種々の変更を加えることができる。
【００５３】
（第１実施形態）
第１実施形態に係る医薬品組成物、医薬品組成物原料、化粧品組成物、及び化粧品組成物原料のそれぞれは、体細胞をｉＰＳ細胞等の多能性幹細胞にリプログラミングした際に使用した培地の上清を含む。第１実施形態に係る医薬品組成物、医薬品組成物原料、化粧品組成物、及び化粧品組成物原料のそれぞれは、体細胞をｉＰＳ細胞等の多能性幹細胞にリプログラミングした際に使用した培地の上清の凍結乾燥物を含んでいてもよい。第１実施形態に係る医薬品組成物、医薬品組成物原料、化粧品組成物、及び化粧品組成物原料のそれぞれは、体細胞をｉＰＳ細胞等の多能性幹細胞にリプログラミングした際に使用した培地の上清をナノカプセル等のカプセル又はナノエマルジョン等のエマルジョン中に含んでいてもよい。
【００５４】
ｉＰＳ細胞は、例えば血液細胞及び線維芽細胞等の分化細胞等の体細胞に、ＯＣＴ３／４、ＫＬＦ４、ｃ−ＭＹＣ、及びＳＯＸ２等の初期化因子を導入することにより誘導される。ｉＰＳ細胞に誘導することを、リプログラミング、初期化、形質転換、分化転換（Ｔｒａｎｓｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ｏｒ  Ｌｉｎｅａｇｅ  ｒｅｐｒｏｇｒａｍｍｉｎｇ）、及び細胞の運命変更（Ｃｅｌｌ  ｆａｔｅ  ｒｅｐｒｏｇｒａｍｍｉｎｇ）という場合がある。多能性幹細胞は、浮遊培養等の三次元培養されながら誘導されてもよい。三次元培養の際には、ゲル培地を用いてもよいし、液体培地を用いてもよい。多能性幹細胞は、例えば、ＴＲＡ１−６０、ＯＣＴ３／４、ＳＳＥＡ３、ＳＳＥＡ４、ＴＲＡ１−８１、及びＮＡＮＯＧのいずれかの陽性率が、３０％以上、５０％以上、好ましくは８０％以上である。ゲル培地は、フィーダー細胞を含まなくともよい。
【００５５】
誘導培養する際の培地としては、例えば、ＴｅＳＲ２（ＳＴＥＭＣＥＬＬ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）等のヒトＥＳ／ｉＰＳ培地を使用可能である。ただし、培地は、これに限定されず、種々の幹細胞培地が使用可能である。例えばＰｒｉｍａｔｅ  ＥＳ  Ｃｅｌｌ  Ｍｅｄｉｕｍ、Ｒｅｐｒｏｓｔｅｍ、ＲｅｐｒｏＦＦ、ＲｅｐｒｏＦＦ２、ＲｅｐｒｏＸＦ（Ｒｅｐｒｏｃｅｌｌ）、ｍＴｅＳＲ１、ＴｅＳＲＥ８、ＲｅｐｒｏＴｅＳＲ（ＳＴＥＭＣＥＬＬ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、ＰｌｕｒｉＳＴＥＭ（登録商標）Ｈｕｍａｎ  ＥＳ／ｉＰＳ  Ｍｅｄｉｕｍ（Ｍｅｒｃｋ）、ＮｕｔｒｉＳｔｅｍ  （登録商標）ＸＦ／ＦＦ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｕｍ  ｆｏｒ  Ｈｕｍａｎ  ｉＰＳ  ａｎｄ  ＥＳ  Ｃｅｌｌｓ、Ｐｌｕｒｉｔｏｎ  ｒｅｐｒｏｇｒａｍｍｉｎｇ  ｍｅｄｉｕｍ（Ｓｔｅｍｇｅｎｔ）、ＰｌｕｒｉＳＴＥＭ（登録商標）、Ｓｔｅｍｆｉｔ  ＡＫ０２Ｎ、Ｓｔｅｍｆｉｔ  ＡＫ０３（Ａｊｉｎｏｍｏｔｏ）、ＥＳＣ−Ｓｕｒｅ（登録商標）ｓｅｒｕｍ  ａｎｄ  ｆｅｅｄｅｒ  ｆｒｅｅ  ｍｅｄｉｕｍ  ｆｏｒ  ｈＥＳＣ／ｉＰＳ（Ａｐｐｌｉｅｄ  ＳｔｅｍＣｅｌｌ）、Ｌ７（登録商標）ｈＰＳＣ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｓｙｓｔｅｍ  （ＬＯＮＺＡ）、及びＰｒｉｍａｔｅ  ＥＳ  Ｃｅｌｌ  Ｍｅｄｉｕｍ  （ＲｅｐｒｏＣＥＬＬ）等を利用してもよい。
【００５６】
ゲル培地は、例えば、上記の培地に脱アシル化ジェランガムを終濃度が０．５重量％から０．００１重量％、０．１重量％から０．００５重量％、あるいは０．０５重量％から０．０１重量％となるよう添加することにより調製される。
【００５７】
ゲル培地は、ジェランガム、ヒアルロン酸、ラムザンガム、ダイユータンガム、キサンタンガム、カラギーナン、フコイダン、ペクチン、ペクチン酸、ペクチニン酸、ヘパラン硫酸、ヘパリン、ヘパリチン硫酸、ケラト硫酸、コンドロイチン硫酸、デルタマン硫酸、ラムナン硫酸、及びそれらの塩からなる群から選択される少なくとも１種の高分子化合物を含んでいてもよい。また、ゲル培地は、メチルセルロースを含んでいてもよい。メチルセルロースを含むことにより、細胞同士の凝集がより抑制される。
【００５８】
あるいは、ゲル培地は、poly(glycerol monomethacrylate) (PGMA)、poly(2-hydroxypropyl methacrylate) (PHPMA）、Poly (N-isopropylacrylamide) (PNIPAM)、amine terminated、carboxylic acid terminated、maleimide terminated、N-hydroxysuccinimide (NHS) ester terminated、triethoxysilane terminated、Poly (N-isopropylacrylamide-co-acrylamide)、Poly (N-isopropylacrylamide-co-acrylic acid)、Poly (N-isopropylacrylamide-co-butylacrylate)、Poly (N-isopropylacrylamide-co-methacrylic acid)、Poly (N-isopropylacrylamide-co-methacrylic acid-co-octadecyl acrylate)、及びN-Isopropylacrylamideから選択される少なくの温度感受性ゲルを含んでいてもよい。
【００５９】
あるいは、第１実施形態に係る医薬品組成物、医薬品組成物原料、化粧品組成物、及び化粧品組成物原料のそれぞれは、幹細胞の抽出物を含む。抽出物は、液体であってもよい。すなわち、抽出物は、抽出液であってもよい。幹細胞は、ｉＰＳ細胞のような多能性幹細胞、及び胚性幹細胞（ＥＳ細胞）を含む。幹細胞は、例えば、ＴＲＡ１−６０又は、Ｏｃｔ３／４の陽性率が、３０％以上、５０％以上、好ましくは８０％以上である。幹細胞を未分化状態で維持培養する場合、培地はｂ−ＦＧＦを１０ｎｇ／ｍｌ以上、好ましくは４０ｎｇ／ｍｌ以上含む。医薬品組成物、医薬品組成物原料、化粧品組成物、及び化粧品組成物原料のそれぞれは、幹細胞の抽出物は、幹細胞のペーストであってもよい。幹細胞のペーストは、ｉＰＳ細胞をすり潰すことにより得られる。幹細胞の抽出物は、凍結乾燥物であってもよい。また、幹細胞の抽出物は、粉体であってもよい。あるいは、幹細胞の抽出物は、幹細胞の溶解物であってもよい。
【００６０】
第１実施形態に係る医薬品組成物は、皮膚塗布組成物であってもよい。第１実施形態に係る医薬品組成物は、皮膚疾患治療剤であってもよい。第１実施形態に係る皮膚疾患治療剤で治療可能な疾患の例としては、尋常性ざ瘡、尋常性乾癬、ケロイド、脂漏性皮膚炎、接触皮膚炎、アトピー性皮膚炎、アトピー性乾燥皮膚炎、皮膚粗鬆症（ｄｅｒｍａｔｏｐｏｒｏｓｉｓ）、光線性弾性線維症、日光性角化症、眼瞼下垂症、円形脱毛症、頭髪脱毛症、睫毛貧毛症、肝斑、老人性色素班、汗疹、そばかす、遅発性両側性太田母班、脂漏性角化症、早老症による皮膚疾患、及び単純疱疹等が挙げられる。
【００６１】
第１実施形態に係る化粧品組成物で改善又は解消可能な状態の例としては、シミ、そばかす、しわ、たるみ、きしみ、肌のはりの低下、くすみ、敏感肌、乾燥肌、及び薄毛等が挙げられる。第１実施形態に係る化粧品組成物の効果としては、肌を整える、肌のキメを整える、皮膚をすこやかに保つ、肌荒れを防ぐ、肌をひきしめる、皮膚にうるおいを与える、皮膚の水分及び油分を補い保つ、皮膚の柔軟性を保つ、皮膚を保護する、皮膚の乾燥を防ぐ、肌を柔らげる、肌にはりを与える、肌にツヤを与える、肌を滑らかにする、肌にはり与える、シミを目立たなくさせる、しわを抑制する及び肌を明るくする等が挙げられる。さらに、第１実施形態に係る化粧品組成物の頭皮あるいは毛髪に関する効果としては、頭皮を健やかに保つ、育毛、薄毛の予防、かゆみの予防、脱毛の予防、毛生促進、発毛促進、病後又は産後の脱毛の予防、及び養毛等が挙げられる。
【００６２】
第１実施形態に係る医薬品組成物は、創傷治療剤、表皮細胞増殖促進剤、表皮ターンオーバー促進剤、発毛剤、育毛剤、及び睫毛貧毛症治療薬であってもよい。第１実施形態に係る医薬品組成物及び化粧品組成物は、コラーゲン産生促進剤、ヒアルロン酸産生促進剤、発毛剤、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）ファミリー産生促進剤、及び血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）産生促進剤であってもよい。
【００６３】
毛髪の成長においては毛根の毛母細胞が分裂し、そこから生じた細胞が毛髪を構成していく。一方、毛髪の成長には毛周期と呼ばれる周期があり、成長期、退行期、及び休止期を繰り返す。毛乳頭細胞は増殖因子の産生と放出を通じて、毛包上皮幹細胞の増殖及び分化に影響を及ぼし、毛周期を制御している。毛乳頭細胞や毛母細胞の活性化が毛成長のメカニズムに寄与するといわれている。また、毛周期に応じて毛包では活発に血管のリモデリングが行われるが、このときの血管新生に問題があると、毛髪形成のための栄養や酸素の供給が不十分になる。毛包血管網からの血流の不足は男性型脱毛症（ＡＧＡ）の病態に関与するといわれている。
【００６４】
毛乳頭細胞の遺伝子と発毛及び毛成長については、以下のようなことが知られている。すなわち、乳頭細胞が毛母細胞に対して分泌する増殖因子としては、ＦＧＦ−７及びＩＧＦ−１等が知られている。これら遺伝子には毛包成長を維持する作用がある。血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）は毛乳頭細胞より分泌されて毛包血管の増生に関わり、またオートクラインに毛乳頭細胞を増殖させる効果があるが、成長期から退行期へ移行するにしたがい、発現量は減少する。ＶＥＧＦ遺伝子はＡＧＡ（男性型脱毛症）の毛組織で発現が低下している。ＶＥＧＦＢはＶＥＧＦが作用する受容体であるＶＥＧＦＲ−１に競合して結合する。ＶＥＧＦＢは血管内皮細胞の増殖や透過性亢進活性を持つが、毛包での効果は不明である。
【００６５】
第１実施形態に係る医薬品組成物及び化粧品組成物は、毛乳頭に直接作用し、発毛促進因子であるＦＧＦ−７の産生量を高めて発毛を促進することで毛周期の成長期を長くさせ、細く弱い毛から太くて強い毛に育てる効果、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）を高め、毛乳頭細胞より分泌されて毛包血管の増生に関わり、またオートクラインに毛乳頭細胞を増殖させる効果がある。したがって、第１実施形態に係る医薬品組成物及び化粧品組成物は、毛乳頭細胞の活性化剤として使用可能である。
【００６６】
第１実施形態に係る医薬品組成物及び化粧品組成物が育毛剤又は発毛剤として用いられる場合、ミノキシジル、センブリ、パントテニルエチルエーテル、トコフェロール酢酸エステル、グリチルリチン酸二カリウム、及びアデノシン等の他の有効成分を含んでいてもよい。
【００６７】
第１実施形態に係る創傷治療剤で治療可能な創傷の例としては、熱傷、擦過創、裂傷、挫傷、縫合創、褥瘡、及び皮膚欠損創等が挙げられる。
【００６８】
第１実施形態に係る医薬品組成物及び化粧品組成物は、体細胞をリプログラミングした際に使用した培地の上清を有効量含む。あるいは、第１実施形態に係る医薬品組成物及び化粧品組成物は、幹細胞の抽出物を有効量含む。ここで、有効量とは、医薬品組成物あるいは化粧品組成物として効用を発揮可能な量をいう。有効量は、患者の年齢、対象疾患、他の成功成分の有無、及び他の配合物の量に応じて、適宜設定される。
【００６９】
第１実施形態に係る医薬品組成物及び化粧品組成物は、製剤上許容される担体、賦形剤、崩壊剤、緩衝剤、乳化剤、懸濁剤、無痛化剤、安定剤、保存剤、防腐剤、及び生理食塩水等を含んでいてもよい。賦形剤の例としては、乳糖、デンプン、ソルビトール、Ｄ−マンニトール、及び白糖が挙げられる。崩壊剤の例としては、カルボキシメチルセルロース、及び炭酸カルシウムが挙げられる。緩衝剤の例としては、リン酸塩、クエン酸塩、及び酢酸塩が挙げられる。乳化剤の例としては、アラビアゴム、アルギン酸ナトリウム、及びトラガントが挙げられる。
【００７０】
懸濁剤の例としては、モノステアリン酸グリセリン、モノステアリン酸アルミニウム、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシメチルセルロース、及びラウリル硫酸ナトリウムが挙げられる。無痛化剤の例としては、ベンジルアルコール、クロロブタノール、及びソルビトールが挙げられる。安定剤の例としては、プロピレングリコール、及びアスコルビン酸が挙げられる。保存剤の例としては、フェノール、塩化ベンザルコニウム、ベンジルアルコール、クロロブタノール、及びメチルパラベンが挙げられる。防腐剤の例としては、塩化ベンザルコニウム、パラオキシ安息香酸、及びクロロブタノールが挙げられる。
【００７１】
また、第１実施形態に係る医薬品組成物及び化粧品組成物には、水、アルコール、界面活性剤（カチオン、アニオン、ノニオン、及び両性界面活性剤等）、保湿剤（グリセリン、１，３-ブチレングリコール、プロピレングリコール、プロパンジオール、ペンタンジオール、ポリクオタニウム、アミノ酸、尿素、ピロリドンカルボン酸塩、核酸類、単糖類、及び少糖等、並びにそれらの誘導体等）、増粘剤（多糖類、ポリアクリル酸塩、カルボキシビニルポリマー、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール、キチン、キトサン、アルギン酸、カラギーナン、キサンタンガム、及びメチルセルロース等、並びにそれらの誘導体等）、ワックス、ワセリン、炭化水素飽和脂肪酸、不飽和脂肪酸、及びシリコン油等、並びにそれらの誘導体、トリ（カプリル・カプリン酸）グリセリル、及びトリオクタン酸グリセリル等のトリグリセライド類、ステアリン酸イソプロピル等のエステル油類、天然油脂類（オリブ油、椿油、アボガド油、アーモンド油、カカオ脂、月見草油、ブドウ種子油、マカデミアンナッツ油、ユーカリ油、ローズヒップ油、スクワラン、オレンジラフィー油、ラノリン、及びセラミド等）、防腐剤（オキシ安息香酸誘導体、デヒドロ酢酸塩、感光素、ソルビン酸、及びフェノキシエタノール等、並びにそれらの誘導体等）、殺菌剤（イオウ、トリクロカルバアニリド、サリチル酸、ジンクピリチオン、及びヒノキチオール等、並びにそれらの誘導体等）、紫外線吸収剤（パラアミノ安息香酸、及びメトキシケイ皮酸等、並びにそれらの誘導体等）、抗炎症剤（アラントイン、ビサボロール、ε−アミノカプロン酸、アセチルファネシルシスティン、及びグリチルリチン酸等、並びにそれらの誘導体等）、抗酸化剤（トコフェロール、ＢＨＡ、ＢＨＴ、及びアスタキサンチン等、並びにそれらの誘導体等）、キレート剤（エデト酸、及びヒドロキシエタンジホスホン酸等、並びにそれらの誘導体等）、動植物エキス（アシタバ、アロエ、エイジツ、オウゴン、オウバク、海藻、カリン、カミツレ、甘草、キウイ、キュウリ、クワ、シラカバ、トウキ、ニンニク、ボタン、ホップ、マロニエ、ラベンダー、ローズマリー、ユーカリ、ミルク、各種ペプタイド、プラセンタ、ローヤルゼリー、ユーグレナエキス、加水分解ユーグレナエキス、及びユーグレナ油等、並びにこれらの含有成分精製物又は発酵物等）、ｐＨ調整剤（無機酸、無機酸塩、有機酸、及び有機酸塩等、並びにそれらの誘導体等）、ビタミン類（ビタミンＡ類、ビタミンＢ類、ビタミンＣ、ビタミンＤ類、ユビキノン、及びニコチン酸アミド等、並びにそれらの誘導体等）、酵母、麹菌及び乳酸菌の発酵液、ガラクトミセス培養液、美白剤（トラネキサム酸、トラネキサム酸セチル塩酸塩、４−ｎ−ブチルレゾルシノール、アルブチン、コウジ酸、エラグ酸、カンゾウフラボノイド、ナイアシンアミド、及びビタミンＣ誘導体等）、セラミド・セラミド誘導体、抗シワ剤（レチノール、及びレチナール、並びにそれらの誘導体、ニコチン酸アミド、及びオリゴぺプチド等、並びにそれらの誘導体等、好中球エラスターゼ阻害、並びにＭＭＰ−１及びＭＭＰ−２阻害作用のある天然及び合成成分等）、酸化チタン、タルク、マイカ、シリカ、酸化亜鉛、酸化鉄、シリコン、及びこれらを加工処理した粉体類等を、第１実施形態に係る医薬品組成物及び化粧品組成物の目的を達成する範囲内で配合することができる。
【００７２】
なお、第１実施形態に係る医薬品組成物及び化粧品組成物に添加可能な成分は、上記に限られるものではなく、医薬品組成物及び化粧品組成物に用い得る成分であれば自由に選択が可能である。第１実施形態に係る医薬品組成物及び化粧品組成物をハップ剤として用いる場合、上記成分に加えて、基剤（カオリン、及びベントナイト等）、ゲル化剤（ポリアクリル酸塩、及びポリビニルアルコール等）を目的を達成する範囲内で配合することができる。第１実施形態に係る医薬品組成物及び化粧品組成物を入浴剤として用いる場合、硫酸塩、炭酸水素塩、ホウ酸塩、色素、及び保湿剤を目的を達成する範囲内で適宜配合し、パウダータイプ、液剤タイプに調製してもよい。
【００７３】
第１実施形態に係る医薬品組成物及び化粧品組成物は、当該技術分野において周知慣用されている方法によって製造可能である。
【００７４】
（第２実施形態）
第２実施形態に係る抗紫外線物質のスクリーニング方法は、早老症患者及び皮膚疾患患者等の老化疾患患者又は皮膚疾患患者由来の体細胞から作製されたｉＰＳ細胞から分化誘導した皮膚細胞を用意することと、任意により分化誘導した皮膚細胞に紫外線を照射することと、紫外線を照射された皮膚細胞を複数の異なる溶液のそれぞれで培養することと、紫外線による皮膚細胞のダメージが少ない溶液又は紫外線を受けた皮膚細胞の修復が早い溶液を選択することと、を含む。なお、患者はヒトに限定されず、非ヒト動物も含む。
【００７５】
早老症の例としては、ウェルナー症候群、色素性乾皮症及びコケイン症候群が挙げられるが、特に限定されない。早老症患者由来の体細胞は、例えば線維芽細胞、血液細胞、上皮細胞、体性幹細胞、ケラチノサイト、毛乳頭細胞、及び歯髄幹細胞であるが、特に限定されない。ｉＰＳ細胞は、早老症患者由来の体細胞に、ＯＣＴ３／４、ＫＬＦ４、ｃ−ＭＹＣ、及びＳＯＸ２等の初期化因子を導入することにより誘導される。ｉＰＳ細胞から皮膚細胞を分化誘導する際には、例えば、ｂＦＧＦを含まない培養液を入れた細胞低接着ディッシュにｉＰＳ細胞を播種する。その後、２日おきに培地を交換し、８日後に形成された胚様体（ＥＢ）をディッシュに播種し、細胞をディッシュに接着させ、１０％ＦＢＳ培地で細胞を培養する。細胞がコンフルエントになったところで、トリプシンで細胞をディッシュから剥がし、継代培養する。同様に継代培養を１か月繰り返す。その後、ＣＤ１３等の線維芽細胞マーカーを用いて、細胞が線維芽細胞に分化したことを確認する。また、ＴＲＡ  １−６０等のｉＰＳ細胞マーカーを用いて、細胞に未分化のｉＰＳ細胞が残っていないかを確認してもよい。分化誘導される皮膚細胞は、例えば皮膚線維芽細胞であるが、特に限定されない。
【００７６】
分化誘導された皮膚細胞は、適宜培養された後、紫外線（ＵＶ）を照射される。紫外線の強さ、波長範囲、及び照射時間は、スクリーニングされる抗紫外線物質の用途、用法及び用量等に応じて適宜設定される。ＵＶを照射された皮膚細胞は、スクリーニング対象となる異なる物質をそれぞれ含む複数の異なる溶液のそれぞれの中で培養される。溶液は、培地であってもよい。溶液中におけるスクリーニング対象物質及び培養時間等は、スクリーニングされる抗紫外線物質の用途、用法及び用量等に応じて適宜設定される。
【００７７】
その後、皮膚細胞のダメージが少ない溶液又は皮膚細胞の修復が早い溶液を、抗紫外線物質を含む溶液として選択する。例えば、複数の溶液のそれぞれで培養された皮膚細胞を分析し、ダメージが少ない皮膚細胞の培養に用いられた溶液の一つ又はグループを選択し、ダメージが多い皮膚細胞の培養に用いられた溶液の一つ又はグループを除外する。あるいは、複数の溶液のそれぞれで培養された皮膚細胞を分析し、早く修復した皮膚細胞の培養に用いられた溶液の一つ又はグループを選択し、遅く修復した皮膚細胞又は修復しなかった皮膚細胞の培養に用いられた溶液の一つ又はグループを除外する。
【００７８】
本発明者らの知見によれば、早老症患者及び皮膚疾患患者等の老化疾患患者又は皮膚疾患患者由来の体細胞から誘導されたｉＰＳ細胞から誘導された皮膚細胞は、健常者の皮膚細胞と比較して、ＵＶ照射に対する抵抗力がない傾向にある。したがって、早老症患者及び皮膚疾患患者等の老化疾患患者又は皮膚疾患患者由来の体細胞から誘導されたｉＰＳ細胞から誘導された皮膚細胞を用いることにより、効果的な抗紫外線物質をスクリーニングすることが可能である。
【００７９】
（第３実施形態）
第３実施形態に係る皮膚の紫外線耐性検査方法は、被験者由来の体細胞から作製された多能性幹細胞から分化誘導した皮膚細胞を用意することと、皮膚細胞に紫外線を照射することと、紫外線による皮膚細胞のダメージを検査することと、を含む。
【００８０】
被験者は疾患患者であってもよいし、健常者であってもよい。被験者由来の体細胞は、予め被験者から取得されており、当該方法は、被験者から体細胞を取得するステップを含まなくともよい。紫外線による皮膚細胞のダメージが大きければ、被験者の皮膚細胞が、紫外線耐性を有しないと判定してもよい。紫外線による皮膚細胞のダメージが小さければ、被験者の皮膚細胞が、紫外線耐性を有すると判定してもよい。当該方法によれば、紫外線による皮膚細胞のダメージの検査結果に基づいて、被験者の皮膚細胞が、紫外線耐性を有するか否かを検査することが可能である。
【００８１】
（第４実施形態）
第４実施形態に係る抗乾燥物質のスクリーニング方法は、早老症患者及び皮膚疾患患者等の老化疾患患者又は皮膚疾患患者由来の体細胞から作製されたｉＰＳ細胞から分化誘導した皮膚細胞を用意することと、皮膚細胞を乾燥することと、乾燥された皮膚細胞を複数の異なる溶液のそれぞれで培養することと、皮膚細胞の生存率が高い溶液を選択することと、を含む。
【００８２】
第２実施形態と同様に分化誘導された皮膚細胞は、適宜培養された後、乾燥させられる。皮膚細胞を乾燥する際には、例えば、皮膚細胞周囲の培地を除去する。また、皮膚細胞に気流をあててもよいし、乾燥剤等を用いて皮膚細胞を乾燥させてもよい。皮膚細胞の乾燥方法及び乾燥時間は、スクリーニングされる抗乾燥物質の用途、用法及び用量等に応じて適宜設定される。乾燥させられた皮膚細胞は、スクリーニング対象となる異なる物質をそれぞれ含む複数の異なる溶液のそれぞれの中で培養される。溶液は培地であってもよい。溶液中におけるスクリーニング対象物質及び培養時間等は、スクリーニングされる抗乾燥物質の用途、用法及び用量等に応じて適宜設定される。
【００８３】
その後、複数の溶液のそれぞれで培養された皮膚細胞の生存率を測定し、皮膚細胞の生存率が高い溶液を、抗乾燥物質を含む溶液として選択する。例えば、複数の溶液のそれぞれで培養された皮膚細胞の生存率を測定し、生存率が高い皮膚細胞の培養に用いられた溶液の一つ又はグループを選択し、生存率が低い皮膚細胞の培養に用いられた溶液の一つ又はグループを除外する。
【００８４】
なお、皮膚細胞の生存率が高い溶液を選択する代わりに、皮膚細胞のタイトジャンクションの損傷が小さい溶液を選択してもよい。この場合、タイトジャンクションにおけるオクルディン及びクローディンの少なくとも一方を分析し、オクルディン及びクローディンの少なくとも一方の量が多い溶液を選択してもよい。一般に、皮膚細胞は、乾燥するとタイトジャンクションが損傷し、オクルディン及びクローディンの量が減少する。したがって、例えば、複数の溶液のそれぞれで培養された皮膚細胞のタイトジャンクションを分析し、タイトジャンクションの損傷が小さい皮膚細胞の培養に用いられた溶液の一つ又はグループを選択し、タイトジャンクションの損傷が大きい皮膚細胞の培養に用いられた溶液の一つ又はグループを除外する。
【００８５】
本発明者らの知見によれば、早老症患者及び皮膚疾患患者等の老化疾患患者又は皮膚疾患患者由来の体細胞から誘導されたｉＰＳ細胞から誘導された皮膚細胞は、健常者の皮膚細胞と比較して、乾燥に対する抵抗力がない傾向にある。したがって、早老症患者及び皮膚疾患患者等の老化疾患患者又は皮膚疾患患者由来の体細胞から誘導されたｉＰＳ細胞から誘導された皮膚細胞を用いることにより、効果的な抗乾燥物質をスクリーニングすることが可能である。
【００８６】
（第５実施形態）
第５実施形態に係る皮膚の乾燥耐性検査方法は、被験者由来の体細胞から作製された多能性幹細胞から分化誘導した皮膚細胞を用意することと、皮膚細胞を乾燥することと、皮膚細胞の生存率を検査することと、を含む。
【００８７】
被験者は疾患患者であってもよいし、健常者であってもよい。被験者由来の体細胞は、予め被験者から取得されており、当該方法は、被験者から体細胞を取得するステップを含まなくともよい。皮膚細胞の生存率が高ければ、被験者の皮膚細胞が乾燥耐性を有すると判定してもよい。皮膚細胞の生存率が低ければ、被験者の皮膚細胞が乾燥耐性を有しない判定してもよい。当該方法によれば、皮膚細胞の生存率の検査結果に基づいて、被験者の皮膚細胞が、乾燥耐性を有するか否かを検査することが可能である。
【００８８】
なお、皮膚細胞の生存率を検査する代わりに、皮膚細胞のタイトジャンクションの損傷を検査してもよい。タイトジャンクションの損傷が小さい場合、被験者の皮膚細胞が、乾燥耐性を有し、タイトジャンクションの損傷が大きい場合、被験者の皮膚細胞が、乾燥耐性を有しないと判定してもよい。
【００８９】
（第６実施形態）
第６実施形態に係る抗酸化ストレス物質のスクリーニング方法は、早老症患者及び皮膚疾患患者等の老化疾患患者又は皮膚疾患患者由来の体細胞から作製されたｉＰＳ細胞から分化誘導した皮膚細胞を用意することと、皮膚細胞に酸化ストレスを与えることと、酸化ストレスを与えられた皮膚細胞を複数の異なる溶液のそれぞれで培養することと、皮膚細胞の生存率が高い溶液を選択することと、を含む。
【００９０】
第２実施形態と同様に分化誘導された皮膚細胞は、適宜培養された後、酸化ストレスを与えられる。皮膚細胞に酸化ストレスを与える方法は、特に限定されないが、例えば、皮膚細胞を培養している培地に過酸化水素等の酸化物質を添加することを含む。皮膚細胞に酸化ストレスを与える方法及び皮膚細胞に酸化ストレスを与える時間は、スクリーニングされる抗酸化ストレス物質の用途、用法及び用量等に応じて適宜設定される。酸化ストレスを与えられた皮膚細胞は、例えば酸化ストレスを与える物質を除去した後、スクリーニング対象となる異なる物質をそれぞれ含む複数の異なる溶液のそれぞれの中で培養される。溶液は培地であってもよい。溶液中におけるスクリーニング対象物質及び培養時間等は、スクリーニングされる抗酸化ストレス物質の用途、用法及び用量等に応じて適宜設定される。
【００９１】
その後、複数の溶液のそれぞれで培養された皮膚細胞の生存率を測定し、皮膚細胞の生存率が高い溶液を、抗酸化ストレス物質を含む溶液として選択する。例えば、複数の溶液のそれぞれで培養された皮膚細胞の生存率を測定し、生存率が高い皮膚細胞の培養に用いられた溶液の一つ又はグループを選択し、生存率が低い皮膚細胞の培養に用いられた溶液の一つ又はグループを除外する。
【００９２】
本発明者らの知見によれば、早老症患者及び皮膚疾患患者等の老化疾患患者又は皮膚疾患患者由来の体細胞から誘導されたｉＰＳ細胞から誘導された皮膚細胞は、健常者の皮膚細胞と比較して、酸化ストレスに対する抵抗力がない傾向にある。したがって、早老症患者及び皮膚疾患患者等の老化疾患患者又は皮膚疾患患者由来の体細胞から誘導されたｉＰＳ細胞から誘導された皮膚細胞を用いることにより、効果的な抗酸化ストレス物質をスクリーニングすることが可能である。
【００９３】
（第７実施形態）
第７実施形態に係る皮膚の酸化ストレス耐性検査方法は、被験者由来の体細胞から作製された多能性幹細胞から分化誘導した皮膚細胞を用意することと、皮膚細胞に酸化ストレスを与えることと、皮膚細胞の生存率を検査することと、を含む。
【００９４】
被験者は疾患患者であってもよいし、健常者であってもよい。被験者由来の体細胞は、予め被験者から取得されており、当該方法は、被験者から体細胞を取得するステップを含まなくともよい。酸化ストレスによる皮膚細胞のダメージが大きければ、被験者の皮膚細胞が、酸化ストレス耐性を有しないと判定してもよい。酸化ストレスによる皮膚細胞のダメージが小さければ、被験者の皮膚細胞が、酸化ストレス耐性を有すると判定してもよい。当該方法によれば、酸化ストレスによる皮膚細胞のダメージの検査結果に基づいて、被験者の皮膚細胞が、酸化ストレス耐性を有するか否かを検査することが可能である。
【００９５】
（第８実施形態）
第８実施形態に係る保湿促進物質のスクリーニング方法は、早老症患者及び皮膚疾患患者等の老化疾患患者又は皮膚疾患患者由来の体細胞から作製された多能性幹細胞から分化誘導した皮膚細胞を用意することと、皮膚細胞を複数の異なる溶液のそれぞれで培養することと、複数の異なる溶液から皮膚細胞由来の天然保湿因子の量が多い溶液を選択することと、を含む。
【００９６】
第２実施形態と同様に分化誘導された皮膚細胞は、スクリーニング対象となる異なる物質をそれぞれ含む複数の異なる溶液のそれぞれの中で培養される。溶液中におけるスクリーニング対象物質及び培養時間等は、スクリーニングされる保湿促進物質の用途、用法及び用量等に応じて適宜設定される。
【００９７】
その後、複数の溶液のそれぞれにおける、皮膚細胞由来の天然保湿因子の量を測定する。天然保湿因子としては、特に限定されないが、セラミド及びフィラグリンが挙げられる。天然保湿因子の量が多い溶液を、保湿促進物質を含む溶液として選択する。例えば、複数の溶液のそれぞれで天然保湿因子の量を測定し、天然保湿因子の量が多い溶液の一つ又はグループを選択し、天然保湿因子の量が少ない溶液の一つ又はグループを除外する。
【００９８】
本発明者らの知見によれば、老化や皮膚疾患が進むと皮膚細胞における保湿促進物質の発現量が低下する傾向にある。したがって、早老症患者及び皮膚疾患患者等の老化疾患患者又は皮膚疾患患者由来の体細胞から誘導されたｉＰＳ細胞から誘導された皮膚細胞を用いることにより、効果的な保湿促進物質をスクリーニングすることが可能である。
【００９９】
（第９実施形態）
第９実施形態に係る皮膚の保湿能力の検査方法は、被験者由来の体細胞から作製された多能性幹細胞から分化誘導した皮膚細胞を用意することと、皮膚細胞を培養することと、皮膚細胞由来の天然保湿因子の量を検査することと、を含む。
【０１００】
被験者は疾患患者であってもよいし、健常者であってもよい。被験者由来の体細胞は、予め被験者から取得されており、当該方法は、被験者から体細胞を取得するステップを含まなくともよい。皮膚細胞由来の天然保湿因子の量が大きければ、被験者の皮膚細胞が、保湿能力が高いと判定してもよい。皮膚細胞由来の天然保湿因子の量が小さければ、被験者の皮膚細胞が、保湿能力が低いと判定してもよい。当該方法によれば、皮膚細胞由来の天然保湿因子の量の検査結果に基づいて、被験者の皮膚細胞が、保湿能力を有するか否かを検査することが可能である。
【実施例】
【０１０１】
（実施例１：血液細胞をｉＰＳ細胞にリプログラミングしながら培養した培地の調製）
無血清かつ動物由来成分フリーの造血系細胞培地（Ｓｔｅｍｓｐａｎ  ＡＣＦ、ＳＴＥＭＣＥＬＬ  ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＩＥＳ）に成長因子を展開して、造血系細胞培地を調製した。１２ウェルディッシュのそれぞれのウェルに、２×１０５個の血液細胞（末梢血単核球）を播種し、それぞれのウェルに造血系細胞ゲル培地を滴下して血液細胞を造血系細胞ゲル培地中に懸濁した。その後、１２ウェルディッシュを３７℃のＣＯ２インキュベーター中に静置し、細胞を浮遊培養した。【０１０２】
細胞の培養を開始してから３日後、それぞれのウェルに造血系細胞ゲル培地を適宜追加した。細胞の培養を開始してから６日後、それぞれのウェルにおいて、ウイルスタイターが１から２０になるよう、ｉＰＳ細胞作製用センダイウイルスベクターキット（ＣｙｔｏＴｕｎｅ  ２．０  Ｒｅｐｒｏｇｒａｍｍｉｎｇ  Ｋｉｔ、登録商標、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ）を培養液中に加えて遺伝子を導入するか、又はエピソーマルプラスミド(Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ)をエレクトロポレーションして遺伝子を導入後、それぞれのウェルにゲル培地を加え、細胞を培養をした。【０１０３】
ｈＥＳ培地に終濃度が０．０２％となるようゲランガムを添加し、幹細胞ゲル培地を調製した。感染２日後から、２日に１回、それぞれのウェルに２ｍＬの幹細胞ゲル培地を加えた。感染１４日後、ｉＰＳ細胞塊が誘導されたことを確認し、ゲル培地上清を回収した。回収したゲル培地上清をフィルターでろ過して滅菌し、フィルターを通過したゲル培地上清を、実施例１に係るリプログラミング培地の上清とした。【０１０４】
（参考例１：ｉＰＳ細胞を未分化状態を維持しながら培養した培地の調製）
ｍＴｅＳＲ１（登録商標、ＳＴＥＭＣＥＬＬ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）又はＳｔｅｍＦｉｔ（登録商標、Ａｊｉｎｏｍｏｔｏ）を用いて、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（登録商標、コーニング）又はＬａｍｉｎｉｎ５１１でコートした接着培養用シャーレ上で、ヒトｉＰＳ細胞を接着維持培養した。ヒトｉＰＳ細胞は、１週間ごとに継代した。継代の際には、ＥＳ細胞解離液（ＴｒｙｐＬＥ  Ｓｅｌｅｃｔ、登録商標、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）で処理した。【０１０５】
上記の通り維持培養されたヒトｉＰＳ細胞を、ＥＳ細胞解離液（ＴｒｙｐＬＥ  Ｓｅｌｅｃｔ、登録商標、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を用いて、接着培養用シャーレから剥がし、シングルセルまで分割した。次に、ジェランガム及び１０μｍｏｌ／ＬのＲＯＣＫ阻害剤（Ｓｅｌｌｅｃｋ）を添加してゲル化した幹細胞用培地にヒトｉＰＳ細胞を播種し、ヒトｉＰＳ細胞を１４日間浮遊培養した。１４日間浮遊培養する場合、２日に一度、ゲル化した幹細胞用培地を培養器に補充した。【０１０６】
その後、ヒトｉＰＳ細胞が懸濁しているゲル化幹細胞用培地をメッシュフィルターでろ過し、細胞塊を除去した。さらに、ろ過されたゲル化幹細胞用培地を１５００ｇで５分遠心して細胞及びゲルを沈殿させ、遠心後の幹細胞用培地の上清を再度回収した後に３０００回転で３分遠心し、遠心後の幹細胞用培地の上清を０．２２μｍのフィルターでろ過した。ろ過後の幹細胞用培地の上清を、参考例１に係るｉＰＳ細胞を維持培養した培地の上清とした。【０１０７】
また、維持培養されたｉＰＳ細胞は、未分化マーカーであるＮＡＮＯＧ、ＯＣＴ３／４、及びＴＲＡ  １−６０が陽性であることを確認した。【０１０８】
（実施例２：線維芽細胞によるヒアルロン酸産生試験）
増殖培地Ａとして、１０％ＦＢＳ及び１％ペニシリン−ストレプトマイシン添加ＤＭＥＭ培地を用意した。次に、成人由来正常ヒト線維芽細胞（ＫＦ−４１０９、Ｓｔｒａｉｎ  Ｎｏ．０１０３５、クラボウ）を、濃度が５×１０３細胞／０．１ｍＬ／ウェルとなるよう増殖培地Ａで懸濁し、９６ウェルプレートに播種して、ＣＯ２インキュベーター内（５％ＣＯ２、３７℃）で１日間培養した。【０１０９】
試験培地Ａとして、１０％ＦＢＳ及び１％ペニシリン−ストレプトマイシン添加ＤＭＥＭ培地を用意した。次に、実施例１及び参考例１に係る上清溶液のそれぞれと、試験培地Ａと、を、混合し、濃度が１０％の実施例１及び参考例１に係る上清添加培地Ａを得た。線維芽細胞を培養している一部のウェル内の増殖培地Ａを、実施例１及び参考例１に係る上清添加培地Ａのそれぞれに置換した。また、陰性コントロールとして、一部のウェルの増殖培地Ａを、ＦＢＳ、ペニシリン−ストレプトマイシン、及び上清を添加していないＤＭＥＭ培地（無添加試験培地Ａ）に置換した。【０１１０】
培地を交換した後、３日間、線維芽細胞を培養し、培地の上清を回収し、培地の上清のヒアルロン酸濃度を、ＤｕｅＳｅｔ  Ｈｙａｌｕｒｏｎａｎ（Ｃａｔ．Ｎｏ．ＤＹ３６１４、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて測定した。結果を図１に示す。実施例１に係るリプログラミング培地の上清を添加した培地で培養した線維芽細胞は、参考例１に係るｉＰＳ細胞を維持培養した培地の上清を添加した培地で培養した線維芽細胞と比較して、倍以上のヒアルロン酸を産生していることが確認された。【０１１１】
（実施例３：ｉＰＳ細胞の抽出液の調製）
ｉＰＳ細胞をマトリゲルコート及びラミニンコートのそれぞれの上で、Ｔｅｓｅｒ１、Ｔｅｓｅｒ２、Ｓｔｅｍ  Ｆｉｔ、Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ８、Ｔｅｓｅｒ−Ｅ８、Ｎｕｔｒｉ  Ｓｔｅｍのそれぞれを使用して培養をした。ｉＰＳ細胞が８０％コンフルエントになった段階で、トリプルセレクトを使ってｉＰＳ細胞を培養器から剥がし、剥がされたｉＰＳ細胞を含む溶液を５分間、２００ｇで遠心して、ｉＰＳ細胞を１．５ｍＬのチューブに集めた。その後、すりこ木（Ｐｅｓｔｌｅ  ｉｎ  Ｇ−Ｔｕｂｅ、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ）でｉＰＳ細胞の細胞塊をすり潰し、すり潰されたｉＰＳ細胞のペーストを含むｉＰＳ細胞の抽出液を液体窒素で瞬間凍結した。ｉＰＳ細胞の抽出液を使用するときは、５ｍＬの培養液にｉＰＳ細胞の抽出液を懸濁し、一晩４℃でインキュベートし、翌日に懸濁液を１０分間１５００ｇで遠心して、細胞破砕片を溶液から除去した。その後、溶液をフィルターでろ過し、フィルターを通過した溶液を、ｉＰＳ細胞の抽出液とした。【０１１２】
（実施例４：線維芽細胞によるＩ型コラーゲン産生試験）
実施例２と同様に成人由来正常ヒト線維芽細胞を増殖培地Ａを用いて培養した。また、実施例２と同様に試験培地Ａを用意した。次に、実施例３に係るｉＰＳ細胞の抽出液と、試験培地Ａと、を、混合し、濃度が５０．０ｖ／ｖ％又は１００．０ｖ／ｖ％の実施例３に係るｉＰＳ細胞の抽出液を含む抽出液添加培地Ａを得た。線維芽細胞を培養している一部のウェル内の増殖培地Ａを、抽出液添加培地Ａに置換した。また、陰性コントロールとして、一部のウェルの増殖培地Ａを、ＦＢＳ、ペニシリン−ストレプトマイシン、及びｉＰＳ細胞の抽出液を添加していないＤＭＥＭ培地（無添加試験培地Ａ）に置換した。【０１１３】
培地を交換した後、３日間、線維芽細胞を培養し、培地の上清を回収し、−８０℃で保存した。その後、培地の上清を解凍し、培地の上清のＩ型コラーゲンの濃度を、ヒトコラーゲンタイプ１  ＥＬＩＳＡ  ｋｉｔ（Ｃａｔ．Ｎｏ．ＥＣ１−Ｅ１０５）で測定した。結果を図２及び図３に示す。ｉＰＳ細胞の抽出液を添加した培地で培養した線維芽細胞は、ｉＰＳ細胞の抽出液を添加しなかった培地で培養した線維芽細胞と比較して、多くのコラーゲンを産生していることが確認された。【０１１４】
（実施例５：毛乳頭細胞の増殖性試験）
増殖培地Ｂとして、専用添加剤（牛胎児血清、インスリン・トランスフェリン・トリヨードサイロニン混液、牛下垂体抽出液、サイプロテロンアセテート）添加済みの毛乳頭細胞専用培地（Ｃａｔ．Ｎｏ．ＴＭＴＰＧＭ−２５０、ＴＯＹＯＢＯ）を用意した。次に、正常ヒト毛乳頭細胞（Ｃａｔ．Ｎｏ．ＣＡ６０２０５ａ、Ｌｏｔ．Ｎｏ．２８６８、ＴＯＹＯＢＯ）を、濃度が１．２×１０４細胞／０．３ｍＬ／ウェルとなるよう増殖培地Ｂで懸濁し、ｔｙｐｅＩコラーゲンコート４８ウェルプレートに播種して、ＣＯ２インキュベーター内（５％ＣＯ２、３７℃）で１日間培養した。【０１１５】
実施例３に係るｉＰＳ細胞の抽出液と、添加剤を添加していない毛乳頭細胞専用培地（無添加試験培地Ｂ）と、を、混合し、濃度が５０．０ｖ／ｖ％又は１００．０ｖ／ｖ％の実施例３に係るｉＰＳ細胞の抽出液を含む抽出液添加培地Ｂを得た。陰性コントロールとして、一部のウェルの増殖培地Ｂを、添加剤及びｉＰＳ細胞の抽出液を添加していない毛乳頭細胞専用培地（無添加試験培地Ｂ）に置換した。【０１１６】
置換された培地で、３日間、毛乳頭細胞を培養し、ＷＳＴ−８法で生細胞数測定を行った。結果を図４及び図５に示す。実施例３に係るｉＰＳ細胞の抽出液を含む無添加試験培地Ｂを用いた場合、ｉＰＳ細胞の抽出液を含まない無添加試験培地Ｂを用いた場合と比較して、毛乳頭細胞が優位に増殖したことが確認された。したがって、ｉＰＳ細胞の抽出液が、薄毛の治療、脱毛の予防、毛生促進、及び発毛促進等の育毛及び発毛効果を有することが示唆された。【０１１７】
（実施例６：毛乳頭細胞によるＶＥＧＦ産生試験）
実施例５と同様に、増殖培地Ｂで正常ヒト毛乳頭細胞を１日間培養した。その後、一部のウェル内の増殖培地Ｂに、濃度が１０．０ｖ／ｖ％及び２０．０ｖ／ｖ％となるよう、実施例１に係るリプログラミング培地の上清を添加した。また、一部のウェル内の増殖培地Ｂに、濃度が５０．０ｖ／ｖ％及び１００．０ｖ／ｖ％となるよう、実施例３に係るｉＰＳ細胞の抽出液を添加した。【０１１８】
陰性コントロールとして、一部のウェルの増殖培地Ｂを、無添加試験培地Ｂに置換した。また、参考コントロールとして、一部のウェルの増殖培地Ｂを、毛乳頭細胞専用培地に１００μｍｏｌ／Ｌのアデノシンを添加したアデノシン添加培地、及び毛乳頭細胞専用培地に３０μｍｏｌ／Ｌのミノキシジルを添加したミノキシジル添加培地のそれぞれに置換した。また、ミノキシジルのビヒクル・コントロールとして、一部のウェルの増殖培地Ｂを、毛乳頭細胞専用培地に０．１％ＤＭＳＯを添加したＤＭＳＯ添加培地に置換した。【０１１９】
培地を交換した後、３日間、毛乳頭細胞を培養し、培地の上清を回収し、−８０℃で保存した。その後、培地の上清を解凍し、培地の上清の線維芽細胞成長因子７（ＦＧＦ−７）濃度を、ＦＧＦ−７  Ｈｕｍａｎ  ＥＬＩＳＡ  ｋｉｔ（Ｃａｔ．Ｎｏ．ａｂ１００５１９、Ａｂｃａｍ）で測定した。結果を図６及び図７に示す。ｉＰＳ細胞を誘導培養した培地の上清及びｉＰＳ細胞の抽出液が、毛乳頭細胞のＶＥＧＦ産生を促進することが示された。これにより、ｉＰＳ細胞を誘導培養した培地の上清及びｉＰＳ細胞の抽出液が、育毛、発毛及び増毛に有効であることが示唆された。【０１２０】
（実施例７：毛乳頭細胞によるＦＧＦ−７産生試験）
実施例５と同様に、増殖培地Ｂで正常ヒト毛乳頭細胞を１日間培養した。その後、一部のウェル内の増殖培地Ｂに、濃度が１０．０ｖ／ｖ％及び２０．０ｖ／ｖ％となるよう、実施例１に係るリプログラミング培地の上清を添加した。また、一部のウェル内の増殖培地Ｂに、濃度が５０．０ｖ／ｖ％及び１００．０ｖ／ｖ％となるよう、実施例３に係るｉＰＳ細胞の抽出液を添加した。【０１２１】
陰性コントロールとして、一部のウェルの増殖培地Ｂを、無添加試験培地Ｂに置換した。また、参考コントロールとして、一部のウェルの増殖培地Ｂを、毛乳頭細胞専用培地に１００μｍｏｌ／Ｌのアデノシンを添加したアデノシン添加培地、及び毛乳頭細胞専用培地に３０μｍｏｌ／Ｌのミノキシジルを添加したミノキシジル添加培地のそれぞれに置換した。また、ミノキシジルのビヒクル・コントロールとして、一部のウェルの増殖培地Ｂを、毛乳頭細胞専用培地に０．１％ＤＭＳＯを添加したＤＭＳＯ添加培地に置換した。【０１２２】
培地を交換した後、３日間、毛乳頭細胞を培養し、培地の上清を回収し、−８０℃で保存した。その後、培地の上清を解凍し、培地の上清の線維芽細胞成長因子７（ＦＧＦ−７）濃度を、ＦＧＦ−７  Ｈｕｍａｎ  ＥＬＩＳＡ  ｋｉｔ（Ｃａｔ．Ｎｏ．ａｂ１００５１９、Ａｂｃａｍ）で測定した。結果を図８及び図９に示す。ｉＰＳ細胞を誘導培養した培地の上清及びｉＰＳ細胞の抽出液が、毛乳頭細胞のＦＧＦ−７産生を促進することが示された。これにより、ｉＰＳ細胞を誘導培養した培地の上清及びｉＰＳ細胞の抽出液が、育毛、発毛及び増毛に有効であることが示唆された。【０１２３】
（実施例８：線維芽細胞の遊走性試験）
成人由来正常ヒト線維芽細胞を濃度が１×１０５から２×１０５細胞／ウェルとなるよう１０％ＦＢＳ培地で懸濁をして遊走能を測定するキット（Ｒａｄｉｕｓ  Ｃｅｌｌ  Ｍｉｇｒａｔｉｏｎ  Ａｓｓａｙ、登録商標）のプレートに播種した。次に、１０μｇ／ｍＬのマイトマイシンＣ（Ｃａｔ．Ｎｏ．２０８９８−２１、Ｎａｃａｌａｉ  ｔｅｓｑｕｅ）でヒト線維芽細胞を２時間処理し、ヒト線維芽細胞の細胞分裂を停止させた。その後、ヒト線維芽細胞を、ＣＯ２インキュベーター内（５％ＣＯ２、３７℃）で１日間培養した。【０１２４】
一部のプレート内の培地を、１０％ＦＢＳ培地に濃度が１０ｖ／ｖ％となるよう実施例３に係るｉＰＳ細胞の抽出液を添加した培地に置換した。また、一部のプレート内の培地を、１０％ＦＢＳ培地に濃度が１０．０ｖ／ｖ％及び２０．０ｖ／ｖ％となるよう実施例１に係るリプログラミング培地の上清を添加した培地に置換した。【０１２５】
一部のプレート上の増殖培地Ｂを、陰性コントロールとして、増殖添加剤を添加していない表皮細胞培地（無添加試験培地Ｂ）に置換した。【０１２６】
プロトコールに準じてヒト線維芽細胞を処理して、遊走試験を実施した。創傷治癒の過程では、傷に向かってヒト線維芽細胞が遊走して創傷が収縮する。本実施例においては、遊走試験前にストッパーで塞がれていてヒト線維芽細胞が接着していなかった部分にヒト線維芽細胞が遊走したか否かを、プレートリーダーを用いて分析した。具体的には、培地を置換してから２３時間後、Ｈｅｃｈｅｓｔで表皮細胞を染色し、観察した。【０１２７】
結果を図１０及び図１１に示す。ｉＰＳ細胞の抽出液及びｉＰＳ細胞を誘導培養した培地の上清が、ヒト線維芽細胞の遊走能を促進することが確認された。したがって、ｉＰＳ細胞の抽出液及びｉＰＳ細胞を誘導培養した培地の上清が、創傷治癒に有効であることが示された。【０１２８】
（実施例９：早老症患者由来の細胞の用意）
ウェルナー症候群患者由来の線維芽細胞（ＡＧ０４１１０）、色素性乾皮症患者由来の線維芽細胞（ＧＭ１６６８４及びＧＭ１６６８７）、及びコケイン症候群患者由来の線維芽細胞（ＧＭ０１０９８）をＣｏｒｉｅｌｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｆｏｒ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈから購入した。これら早老症患者由来の線維芽細胞をｉＰＳ細胞に誘導した。さらにｉＰＳ細胞を、皮膚線維芽細胞に分化誘導した。【０１２９】
（実施例１０：皮膚線維芽細胞のＵＶ照射試験）
成人由来正常ヒト皮膚線維芽細胞及び実施例９で用意した早老症患者の体細胞から誘導した皮膚線維芽細胞のそれぞれを、濃度が２×１０５細胞／ウェルとなるよう試験培地Ａで懸濁し、６ウェルプレートに播種して、ＣＯ２インキュベーター内（５％ＣＯ２、３７℃）で１日間培養した。【０１３０】
翌日、ＵＶ照射機を使って３０２ｎｍの紫外線を１５分、ウェル内の皮膚線維芽細胞のそれぞれに照射した。次に、参考例１に係る上清溶液と、試験培地Ａと、を、体積比で、１０．００：９０．００となるよう混合し、濃度が１０．００ｖ／ｖ％の参考例１に係る上清添加培地Ａを得た。一部のウェル内の試験培地Ａを、参考例１に係る上清添加培地Ａに置換した。翌日、全ての細胞をトリプシンでウェルから剥がし、細胞を７−アミノアクチノマイシンＤ（７−ＡＡＤ）で染色した後、フローサイトメーターを用いて死細胞率を計測した。【０１３１】
その結果、図１２に示すように、いずれの皮膚線維芽細胞においても、ＵＶを照射された細胞は、ＵＶを照射されなかった細胞と比較して、死細胞率が上昇した。また、正常皮膚線維芽細胞と比較して、早老症患者の体細胞から誘導した皮膚線維芽細胞のほうが、ＵＶ照射による死亡率が高かった。ただし、ｉＰＳ細胞を維持培養した際の培地の上清を添加した培地中の皮膚線維芽細胞は、ｉＰＳ細胞を維持培養した際の培地の上清を添加しなかった培地中の皮膚線維芽細胞より生存率が高かった。したがって、早老症患者の体細胞から誘導した皮膚線維芽細胞は、ＵＶ照射に対して繊細であり、抗ＵＶ物質のスクリーニングに適していることが示唆された。【０１３２】
（実施例１１：皮膚線維芽細胞の乾燥刺激試験）
実施例１０と同様に、成人由来正常ヒト皮膚線維芽細胞及び実施例９で用意した早老症患者の体細胞から誘導した皮膚線維芽細胞のそれぞれを試験培地Ａを用いて１日間培養した。翌日、クリーンベンチの通気口内で各ウェルを４０秒乾燥をさせた。次に、一部のウェル内の試験培地Ａを、参考例１に係る上清添加培地Ａに置換した。また、実施例１に係る上清溶液と、試験培地Ａと、を、体積比で、１０．００：９０．００となるよう混合し、濃度が１０．００ｖ／ｖ％の実施例１に係る上清添加培地Ａを得た。一部のウェル内の試験培地Ａを、実施例１に係る上清添加培地Ａに置換した。翌日、全ての細胞をトリプシンでウェルから剥がし、細胞を７−アミノアクチノマイシンＤ（７−ＡＡＤ）で染色した後、フローサイトメーターを用いて死細胞率を計測した。【０１３３】
その結果、図１３に示すように、正常皮膚線維芽細胞と比較して、早老症患者の体細胞から誘導した皮膚線維芽細胞のほうが、乾燥刺激による死亡率が高かった。ただし、ｉＰＳ細胞を維持培養した際の培地の上清を添加した培地中の皮膚線維芽細胞は、ｉＰＳ細胞を維持培養した際の培地の上清を添加しなかった培地中の皮膚線維芽細胞より生存率が高かった。また、血液細胞をｉＰＳ細胞に誘導培養した際の培地の上清を添加した培地中の皮膚線維芽細胞は、ｉＰＳ細胞を維持培養した際の培地の上清を添加した培地中の皮膚線維芽細胞より生存率が高かった。したがって、早老症患者の体細胞から誘導した皮膚線維芽細胞は、乾燥刺激に対して繊細であり、抗乾燥刺激物質のスクリーニングに適していることが示唆された。【０１３４】
（実施例１２：皮膚線維芽細胞の酸化ストレス試験）
実施例１０と同様に、成人由来正常ヒト皮膚線維芽細胞及び実施例９で用意した早老症患者の体細胞から誘導した皮膚線維芽細胞のそれぞれを試験培地Ａを用いて１日間培養した。翌日、それぞれのウェルの試験培地Ａに、濃度が０．０３％になるように過酸化水素を加えた。１０分後、一部のウェル内の培地を過酸化水素を含まない試験培地Ａに戻した。また、一部のウェル内の培地を実施例１及び参考例１に係る上清添加培地Ａのそれぞれに置換した。さらに、一部のウェル内の培地を、実施例３に係るｉＰＳ細胞の抽出液を含む培地に置換した。翌日、全ての細胞をトリプシンでウェルから剥がし、細胞を７−アミノアクチノマイシンＤ（７−ＡＡＤ）で染色した後、フローサイトメーターを用いて死細胞率を計測した。【０１３５】
その結果、図１４及び図１５に示すように、正常皮膚線維芽細胞と比較して、色素性乾皮症患者の体細胞から誘導した皮膚線維芽細胞のほうが、乾燥刺激による死亡率が高かった。図１５は、色素性乾皮症患者の体細胞から誘導した皮膚線維芽細胞の死細胞率を示す。図１５に示すように、ｉＰＳ細胞を維持培養した際の培地の上清を添加した培地、血液細胞をｉＰＳ細胞に誘導培養した際の培地の上清を添加した培地、及びｉＰＳ細胞の抽出液を添加した培地中の皮膚線維芽細胞は、無添加の試験培地Ａ中の皮膚線維芽細胞より生存率が高かった。したがって、色素性乾皮症患者の体細胞から誘導した皮膚線維芽細胞は、酸化ストレスに対して繊細であり、抗酸化ストレス物質のスクリーニングに適していることが示唆された。【０１３６】
（参考例）
特開２０１６−１２８３９６号公報に記載の実施例に準じてヒトｉＰＳ細胞を培養した。すなわち、実施例１と同じ幹細胞用培地を用いて、接着培養用シャーレ上のフィーダー細胞上で、ヒトｉＰＳ細胞を接着維持培養した。ヒトｉＰＳ細胞は、１週間ごとに継代した。継代の際には、ヒトｉＰＳ細胞を、０．２５％トリプシン、０．１ｍｇ／ｍＬのコラゲナーゼＩＶ、１ｍｍｏｌ／ＬのＣａＣｌ２、及び２０％のＫＳＲを含む剥離溶液で処理した。【０１３７】
上記の通り培養されたヒトｉＰＳ細胞を、ＥＳ細胞解離液（ＴｒｙｐＬＥ  Ｓｅｌｅｃｔ、登録商標、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を用いて、接着培養用シャーレから剥がした。剥がしたヒトｉＰＳ細胞を、非接着培養用シャーレに入れたゲル化していないヒトｉＰＳ細胞中で１週間浮遊培養した。この結果、胚様体（ＥＢ）が形成された。形成された胚様体を接着培養用シャーレ上に播種し、１０％ＦＢＳ及び１％アンチアンチ（登録商標、抗真菌剤）を含有するＤＭＥＭ中で１週間成長（ｏｕｔｇｒｏｗｔｈ）させた。【０１３８】
次に、細胞を０．０５％トリプシン−ＥＤＴＡ溶液を用いて接着培養用シャーレから剥がし、シングルセルまで分割された細胞を新たな接着培養用シャーレに播種した。その後、培地として１０％ＦＢＳを含有するＤＭＥＭを用い、細胞を一週間培養した。【０１３９】
細胞が７０％から８０％以上コンフルエントになったことを確認した後、細胞を観察した。本参考例で培養した細胞の写真を図１６（ａ）に示す。通常、未分化のｉＰＳ細胞の形態は、図１６（ｂ）に示される写真のようになる。したがって、本参考例で培養した細胞は、未分化状態を維持していないことが形態的に観察された。また、本参考例に係る細胞を２１日間培養した後、蛍光試薬で標識された抗ＯＣＴ３／４抗体及び蛍光試薬で標識された抗ＮＡＮＯＧ抗体で細胞を処理した後、顕微鏡で細胞を観察した結果を図１７に示す。図１７（ａ）は、励起光を用いずに観察した細胞の写真を示す。図１７（ｂ）は、抗ＯＣＴ３／４抗体に結合している蛍光試薬に対応する励起光を用いて観察した細胞の写真を示す。図１７（ｃ）は、抗ＮＡＮＯＧ抗体に結合している蛍光試薬に対応する励起光を用いて観察した細胞の写真を示す。図１７（ｂ）及び図１７（ｃ）において蛍光は観察されず、細胞がＯＣＴ３／４陰性及びＮＡＮＯＧ陰性であることが確認された。さらに、細胞をフローサイトメーターで検査したところ、培養された細胞は、未分化マーカーであるＮＡＮＯＧ、ＯＣＴ３／４、及びＴＲＡ  １−６０が陰性であることが確認された。よって、細胞は未分化状態を維持しておらず、分化していたことが確認された。
【図１】
2020095592.tif 000003
【図２】
2020095592.tif 000004
【図３】
2020095592.tif 000005
【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
2020095592.tif 000010
【図９】
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【図１０】
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【図１１】
2020095592.tif 000013
【図１２】
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【図１３】
2020095592.tif 000015
【図１４】
2020095592.tif 000016
【図１５】
2020095592.tif 000017
【図１６】
2020095592.tif 000018
【図１７】
2020095592.tif 000019
【図１８】
2020095592.tif 000020
【手続補正書】
【提出日】令和3年5月12日(2021.5.12)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
血液細胞をリプログラミングした際に使用した培地の上清を含む、医薬品組成物。
【請求項２】
請求項１に記載の医薬品組成物を含む、皮膚のシミ、しわ及びたるみのいずれかの形成防止及び改善剤。
【請求項３】
血液細胞をリプログラミングした際に使用した培地の上清を含む、化粧品組成物。
【請求項４】
請求項３に記載の化粧品組成物を含む、皮膚のシミ、しわ及びたるみのいずれかの形成防止及び改善剤。
【請求項５】
体細胞をリプログラミングした際に使用した培地の上清を含む、毛乳頭細胞の増殖剤。
【請求項６】
体細胞をリプログラミングした際に使用した培地の上清を含む、毛乳頭細胞の増殖因子分泌活性化剤。
【請求項７】
体細胞を培養しながらリプログラミングした際に使用した培地の上清を含む、毛乳頭細胞の線維芽細胞成長因子ファミリー産生促進剤。
【請求項８】
体細胞をリプログラミングした際に使用した培地の上清を含む、毛乳頭細胞の血管内皮細胞増殖因子産生促進剤。
【請求項９】
血液細胞をリプログラミングした際に使用した培地の上清を含む、創傷治療剤。
【請求項１０】
血液細胞をリプログラミングした際に使用した培地の上清を含む、表皮細胞増殖促進剤。
【請求項１１】
多能性幹細胞の抽出物を含む、発毛剤、又は育毛剤。
【請求項１２】
前記多能性幹細胞の抽出物がペーストであるか、又は前記多能性幹細胞の抽出物が凍結乾燥されている、請求項１１に記載の発毛剤、又は育毛剤。
【請求項１３】
多能性幹細胞の抽出物を含む、毛乳頭細胞の活性化剤。
【請求項１４】
前記多能性幹細胞の抽出物がペーストであるか、又は前記多能性幹細胞の抽出物が凍結乾燥されている、請求項１３に記載の毛乳頭細胞の活性化剤。
【請求項１５】
ウェルナー症候群患者又はコケイン症候群患者由来の体細胞から作製された多能性幹細胞から分化誘導した皮膚細胞を用意することと、
前記皮膚細胞に紫外線を照射することと、
前記紫外線を照射された皮膚細胞を複数の異なる溶液のそれぞれで培養することと、
前記紫外線による前記皮膚細胞のダメージが少ない培地又は前記紫外線を受けた前記皮膚細胞の修復が早い溶液を選択することと、
を含む、抗紫外線物質のスクリーニング方法。
【請求項１６】
ウェルナー症候群患者又はコケイン症候群患者由来の体細胞から作製された多能性幹細胞から分化誘導した皮膚細胞を用意することと、
前記皮膚細胞を乾燥することと、
前記乾燥された皮膚細胞を複数の異なる溶液のそれぞれで培養することと、
前記皮膚細胞の生存率が高い溶液を選択することと、
を含む、抗乾燥物質のスクリーニング方法。
【請求項１７】
ウェルナー症候群患者又はコケイン症候群患者由来の体細胞から作製された多能性幹細胞から分化誘導した皮膚細胞を用意することと、
前記皮膚細胞を乾燥することと、
前記乾燥された皮膚細胞を複数の異なる溶液のそれぞれで培養することと、
前記皮膚細胞のタイトジャンクションの損傷が小さい溶液を選択することと、
を含む、抗乾燥物質のスクリーニング方法。
【請求項１８】
前記タイトジャンクションにおけるオクルディン及びクローディンの少なくとも一方を分析する、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
ウェルナー症候群患者又はコケイン症候群患者由来の体細胞から作製された多能性幹細胞から分化誘導した皮膚細胞を用意することと、
前記皮膚細胞に酸化ストレスを与えることと、
前記酸化ストレスを与えられた皮膚細胞を複数の異なる溶液のそれぞれで培養することと、
前記皮膚細胞の生存率が高い溶液を選択することと、
を含む、抗酸化ストレス物質のスクリーニング方法。
【請求項２０】
ウェルナー症候群患者又はコケイン症候群患者由来の体細胞から作製された多能性幹細胞から分化誘導した皮膚細胞を用意することと、
前記皮膚細胞を複数の異なる溶液のそれぞれで培養することと、
前記複数の異なる溶液から前記皮膚細胞由来の天然保湿因子の量が多い溶液を選択することと、
を含む、保湿促進物質のスクリーニング方法。
【請求項２１】
前記天然保湿因子がセラミド及びフィラグリンの少なくも一方である、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
体細胞をリプログラミングした際に使用した培地の上清を含む、毛乳頭細胞のＩＧＦ−１分泌活性化剤。
【請求項２３】
ｉＰＳ細胞の抽出物を含む、毛乳頭細胞のＩＧＦ−１分泌活性化剤。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５７】
ゲル培地は、ジェランガム、ヒアルロン酸、ラムザンガム、ダイユータンガム、キサンタンガム、カラギーナン、フコイダン、ペクチン、ペクチン酸、ペクチニン酸、ヘパラン硫酸、ヘパリン、ヘパリチン硫酸、ケラト硫酸、コンドロイチン硫酸、デルマタン硫酸、ラムナン硫酸、及びそれらの塩からなる群から選択される少なくとも１種の高分子化合物を含んでいてもよい。また、ゲル培地は、メチルセルロースを含んでいてもよい。メチルセルロースを含むことにより、細胞同士の凝集がより抑制される。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６４】
毛乳頭細胞の遺伝子と発毛及び毛成長については、以下のようなことが知られている。すなわち、乳頭細胞が毛母細胞に対して分泌する増殖因子としては、ＦＧＦ−７及びＩＧＦ−１等が知られている。これら因子には毛包成長を維持する作用がある。血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）は毛乳頭細胞より分泌されて毛包血管の増生に関わり、またオートクラインに毛乳頭細胞を増殖させる効果があるが、成長期から退行期へ移行するにしたがい、発現量は減少する。ＶＥＧＦ遺伝子はＡＧＡ（男性型脱毛症）の毛組織で発現が低下している。ＶＥＧＦＢはＶＥＧＦが作用する受容体であるＶＥＧＦＲ−１に競合して結合する。ＶＥＧＦＢは血管内皮細胞の増殖や透過性亢進活性を持つが、毛包での効果は不明である。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１０１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１０１】
（実施例１：血液細胞をｉＰＳ細胞にリプログラミングしながら培養した培地の調製）
無血清かつ動物由来成分フリーの造血系細胞培地（ＳｔｅｍｓｐａｎＡＣＦ、ＳＴＥＭＣＥＬＬＴＥＣＨＮＯＬＯＧＩＥＳ）に成長因子を添加して、造血系細胞培地を調製した。１２ウェルディッシュのそれぞれのウェルに、２×１０5個の血液細胞（末梢血単核球）を播種し、それぞれのウェルに造血系細胞ゲル培地を滴下して血液細胞を造血系細胞ゲル培地中に懸濁した。その後、１２ウェルディッシュを３７℃のＣＯ２インキュベーター中に静置し、細胞を浮遊培養した。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１１９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１１９】
培地を交換した後、３日間、毛乳頭細胞を培養し、培地の上清を回収し、−８０℃で保存した。その後、培地の上清を解凍し、培地の上清の血管内皮細胞成長因子（ＶＥＧＦ）濃度を、Ｈｕｍａｎ  ＥＬＩＳＡ  ｋｉｔ（Ｃａｔ．Ｎｏ．ａｂ１００５１９、Ａｂｃａｍ）で測定した。結果を図６及び図７に示す。ｉＰＳ細胞を誘導培養した培地の上清及びｉＰＳ細胞の抽出液が、毛乳頭細胞のＶＥＧＦ産生を促進することが示された。これにより、ｉＰＳ細胞を誘導培養した培地の上清及びｉＰＳ細胞の抽出液が、育毛、発毛及び増毛に有効であることが示唆された。
【手続補正６】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図９】
2020095592.tif 000021
【手続補正７】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図１０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図１０】
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【国際調査報告】
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2020095592.tif 000026
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