(57)【要約】  本発明は、アミノ酸もしくはグルコース、またはアミノ酸およびグルコースを含有する動物細胞の培養用添加物、培地成分に加えて、アミノ酸もしくはグルコース、またはアミノ酸およびグルコースをさらに含有する動物細胞の培養用培地、ならびに前記培地を用いて動物細胞を培養すること、あるいは前記添加物を培養物に添加することを含む、動物細胞の培養方法に関する。  本発明によれば、特に無血清培地や低アルブミン培地を用いて動物細胞の培養を行う際に、動物細胞の増殖性を向上させることができる。
2020067502.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
アミノ酸もしくはグルコース、またはアミノ酸およびグルコースを含有する、動物細胞の培養用添加物。
【請求項２】
アミノ酸が、トリプトファン、セリン、システイン、シスチン、メチオニンおよびアルギニンからなる群より選択される１種または２種以上である、請求項１に記載の添加物。
【請求項３】
アミノ酸が、トリプトファン、セリン、システイン、シスチン、メチオニン、アルギニン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リシン、フェニルアラニンおよびバリンからなる群より選択される１種または２種以上である、請求項１に記載の添加物。
【請求項４】
動物細胞が幹細胞である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の添加物。
【請求項５】
幹細胞が、成体幹細胞、胚性幹細胞および人工多能性幹細胞からなる群より選択される１種または２種以上である、請求項４に記載の添加物。
【請求項６】
動物細胞の浮遊培養用添加物である、請求項１〜５のいずれか１項に記載の添加物。
【請求項７】
動物細胞の浮遊培養が、細胞塊の状態での浮遊培養である、請求項６に記載の添加物。
【請求項８】
動物細胞の接着培養用添加物である、請求項１〜５のいずれか１項に記載の添加物。
【請求項９】
培地成分に加えて、アミノ酸もしくはグルコース、またはアミノ酸およびグルコースをさらに含有する、動物細胞の培養用培地。
【請求項１０】
アミノ酸が、トリプトファン、セリン、システイン、シスチン、メチオニンおよびアルギニンからなる群より選択される１種または２種以上である、請求項９に記載の培地。
【請求項１１】
アミノ酸が、トリプトファン、セリン、システイン、シスチン、メチオニン、アルギニン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リシン、フェニルアラニンおよびバリンからなる群より選択される１種または２種以上である、請求項９に記載の培地。
【請求項１２】
ｐＨが７以上である、請求項９〜１１のいずれか１項に記載の培地。
【請求項１３】
動物細胞が幹細胞である、請求項９〜１２のいずれか１項に記載の培地。
【請求項１４】
幹細胞が、成体幹細胞、胚性幹細胞および人工多能性幹細胞からなる群より選択される１種または２種以上である、請求項１３に記載の培地。
【請求項１５】
動物細胞の浮遊培養用培地である、請求項９〜１４のいずれか１項に記載の培地。
【請求項１６】
動物細胞の浮遊培養が、細胞塊の状態での浮遊培養である、請求項１５に記載の培地。
【請求項１７】
動物細胞の接着培養用培地である、請求項９〜１４のいずれか１項に記載の培地。
【請求項１８】
アミノ酸もしくはグルコース、またはアミノ酸およびグルコースが添加された動物細胞の培養用培地にて動物細胞を培養すること、あるいはアミノ酸もしくはグルコース、またはアミノ酸およびグルコースを動物細胞の培養物に添加することを含む、動物細胞の培養方法。
【請求項１９】
アミノ酸が、トリプトファン、セリン、システイン、シスチン、メチオニンおよびアルギニンからなる群より選択される１種または２種以上である、請求項１８に記載の培養方法。
【請求項２０】
アミノ酸が、トリプトファン、セリン、システイン、シスチン、メチオニン、アルギニン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リシン、フェニルアラニンおよびバリンからなる群より選択される１種または２種以上である、請求項１８に記載の培養方法。
【請求項２１】
動物細胞が幹細胞である、請求項１８〜２０のいずれか１項に記載の培養方法。
【請求項２２】
幹細胞が、成体幹細胞、胚性幹細胞および人工多能性幹細胞からなる群より選択される１種または２種以上である、請求項２１に記載の培養方法。
【請求項２３】
動物細胞の浮遊培養方法である、請求項１８〜２２のいずれか１項に記載の培養方法。
【請求項２４】
細胞塊を形成させて動物細胞を浮遊培養する、請求項２３に記載の培養方法。
【請求項２５】
動物細胞の接着培養方法である、請求項１８〜２２のいずれか１項に記載の培養方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、動物細胞の増殖性を向上させ得る動物細胞の培養用添加物、培養用培地、および培養方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
胚性幹細胞、人工多能性幹細胞等の幹細胞をはじめ、多くの動物細胞は、マトリジェルや、ビトロネクチン、ラミニン等のヒト型リコンビナントのマトリックス等を足場材料として使用した接着培養により、増殖維持されてきた。
しかし、動物細胞を研究、物質生産、医療などに応用するために、効率よく増殖させ、大量に培養する方法としては、上記した接着培養ではなく、細胞塊の状態で浮遊培養する方法が用いられている。【０００３】
動物細胞の培養においては、一般的に、増殖因子等の成分を補うため、培養液中に５（ｗ／ｖ）％〜２０（ｗ／ｖ）％程度の血清を添加する必要がある。
しかし、血清は高価であり、血清中には未知の成分を含む５００種以上の蛋白質が含まれることから、細胞に作用する因子の分子レベルでの研究や、細胞から産生された物質の単離・精製が困難となることが多い。また、血清には、プリオンやウイルス等が含まれる可能性がある。それゆえ、動物細胞の培養には、血清を含有しない無血清培地や、アルブミン含有量が低減された低アルブミン培地が用いられることも多い。無血清培地や低アルブミン培地を用いて動物細胞を培養する際、細胞の増殖性を向上させるために、トランスフェリン等のタンパク質、各種増殖因子、インスリン等のホルモン等が添加される。
しかしながら、培養される動物細胞の種類により、増殖に必要な増殖因子、ホルモン等の種類および組み合わせが異なり、種々の動物細胞の増殖を促進し得る添加物を低コストで得ることは困難であった。
それゆえ、種々の動物細胞の増殖を効率よく促進し得る動物細胞の培養用添加物が求められている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
そこで、本発明は、特に無血清培地や低アルブミン培地を用いて動物細胞の培養を行う際に、動物細胞の増殖性を向上させ得る培養用添加物、ならびに培養用培地および培養方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者らは、上記の課題を解決すべく鋭意検討した結果、トリプトファン、セリン、システイン、シスチン、メチオニン、アルギニン等のアミノ酸もしくはグルコースを添加することにより、または前記アミノ酸およびグルコースを添加することにより、動物細胞の増殖性が向上することを見出し、本発明を完成するに至った。【０００６】
すなわち、本発明は以下に関する。
［１］アミノ酸もしくはグルコース、またはアミノ酸およびグルコースを含有する、動物細胞の培養用添加物。
［２］アミノ酸が、トリプトファン、セリン、システイン、シスチン、メチオニンおよびアルギニンからなる群より選択される１種または２種以上である、［１］に記載の添加物。
［３］アミノ酸が、トリプトファン、セリン、システイン、シスチン、メチオニン、アルギニン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リシン、フェニルアラニンおよびバリンからなる群より選択される１種または２種以上である、［１］に記載の添加物。
［４］動物細胞が幹細胞である、［１］〜［３］のいずれかに記載の添加物。
［５］幹細胞が、成体幹細胞、胚性幹細胞および人工多能性幹細胞からなる群より選択される１種または２種以上である、［４］に記載の添加物。
［６］動物細胞の浮遊培養用添加物である、［１］〜［５］のいずれかに記載の添加物。
［７］動物細胞の浮遊培養が、細胞塊の状態での浮遊培養である、［６］に記載の添加物。
［８］動物細胞の接着培養用添加物である、［１］〜［５］のいずれかに記載の添加物。
［９］培地成分に加えて、アミノ酸もしくはグルコース、またはアミノ酸およびグルコースをさらに含有する、動物細胞の培養用培地。
［１０］アミノ酸が、トリプトファン、セリン、システイン、シスチン、メチオニンおよびアルギニンからなる群より選択される１種または２種以上である、［９］に記載の培地。
［１１］アミノ酸が、トリプトファン、セリン、システイン、シスチン、メチオニン、アルギニン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リシン、フェニルアラニンおよびバリンからなる群より選択される１種または２種以上である、［９］に記載の培地。
［１２］ｐＨが７以上である、［９］〜［１１］のいずれかに記載の培地。
［１３］動物細胞が幹細胞である、［９］〜［１２］のいずれかに記載の培地。
［１４］幹細胞が、成体幹細胞、胚性幹細胞および人工多能性幹細胞からなる群より選択される１種または２種以上である、［１３］に記載の培地。
［１５］動物細胞の浮遊培養用培地である、［９］〜［１４］のいずれかに記載の培地。
［１６］動物細胞の浮遊培養が、細胞塊の状態での浮遊培養である、［１５］に記載の培地。
［１７］動物細胞の接着培養用培地である、［９］〜［１４］のいずれかに記載の培地。
［１８］アミノ酸もしくはグルコース、またはアミノ酸およびグルコースが添加された動物細胞の培養用培地にて動物細胞を培養すること、あるいはアミノ酸もしくはグルコース、またはアミノ酸およびグルコースを動物細胞の培養物に添加することを含む、動物細胞の培養方法。
［１９］アミノ酸が、トリプトファン、セリン、システイン、シスチン、メチオニンおよびアルギニンからなる群より選択される１種または２種以上である、［１８］に記載の培養方法。
［２０］アミノ酸が、トリプトファン、セリン、システイン、シスチン、メチオニン、アルギニン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リシン、フェニルアラニンおよびバリンからなる群より選択される１種または２種以上である、［１８］に記載の培養方法。
［２１］動物細胞が幹細胞である、［１８］〜［２０］のいずれかに記載の培養方法。
［２２］幹細胞が、成体幹細胞、胚性幹細胞および人工多能性幹細胞からなる群より選択される１種または２種以上である、［２１］に記載の培養方法。
［２３］動物細胞の浮遊培養方法である、［１８］〜［２２］のいずれかに記載の培養方法。
［２４］細胞塊を形成させて動物細胞を浮遊培養する、［２３］に記載の培養方法。
［２５］動物細胞の接着培養方法である、［１８］〜［２２］のいずれかに記載の培養方法。
【発明の効果】
【０００７】
本発明により、動物細胞、特に幹細胞の増殖性を好適に向上させ得る動物細胞の培養用添加物を提供することができ、動物細胞の増殖性を好適に向上させ得る動物細胞の培養用培地、および動物細胞の培養方法を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】試験例１において、本発明の培養用添加物がヒト人工多能性幹細胞１２１０Ｂ２株の浮遊培養における増殖性に及ぼす影響を示す図である。
【図２】試験例２において、本発明の培地がヒト人工多能性幹細胞１２１０Ｂ２株の接着培養における増殖性に及ぼす影響を示す図である。
【図３】試験例２において、本発明の培地がヒト人工多能性幹細胞２０１Ｂ７株の接着培養における増殖性に及ぼす影響を示す図である。
【図４】試験例３において、本発明の培養方法がヒト人工多能性幹細胞１２１０Ｂ２株の浮遊培養における増殖性に及ぼす影響を示す図である。
【図５】試験例３において、本発明の培養方法がヒト人工多能性幹細胞１２３１Ａ３株の浮遊培養における増殖性に及ぼす影響を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
本発明は、動物細胞の培養用添加物（以下、本明細書において「本発明の添加物」とも称する）を提供する。
ここで、「動物細胞の培養用添加物」とは、動物細胞の培養に適する添加物をいい、動物細胞の培養に際して培地または培養物に添加される添加物をいう。
【００１０】
本発明において、動物細胞としては、哺乳動物由来の正常細胞、幹細胞および前駆細胞が挙げられる。
【００１１】
哺乳動物由来の正常細胞としては、精子、卵子等の生殖細胞や、生体を構成する体細胞が挙げられる。
生体を構成する体細胞の例としては、以下に限定されるものではないが、線維芽細胞、骨髄細胞、Ｂリンパ球、Ｔリンパ球、好中球、赤血球、血小板、マクロファージ、単球、骨細胞、周皮細胞、樹状細胞、脂肪細胞、間葉細胞、上皮細胞、表皮細胞（たとえば、角化細胞（ケラチノサイト）、角質細胞等）、内皮細胞、血管内皮細胞、肝実質細胞、軟骨細胞、卵丘細胞、神経細胞、グリア細胞、オリゴデンドロサイト（希突起膠細胞）、マイクログリア（小膠細胞）、アストロサイト（星状膠細胞）、心臓細胞、食道細胞、筋肉細胞（たとえば、平滑筋細胞、骨格筋細胞）、膵臓ベータ細胞、メラニン細胞および単核細胞等が挙げられる。
当該体細胞には、たとえば皮膚、腎臓、脾臓、副腎、肝臓、肺、卵巣、膵臓、子宮、胃、結腸、小腸、大腸、膀胱、前立腺、精巣、胸腺、筋肉、結合組織、骨、軟骨、血管組織、血液（臍帯血を含む）、骨髄、心臓、眼、脳または神経組織などの任意の組織から採取される細胞が含まれる。
【００１２】
幹細胞とは、自己複製能と、別の種類の細胞に分化する能力を持ち、際限なく増殖できる細胞をいう。
たとえば、造血幹細胞、衛星細胞、神経幹細胞、間葉系幹細胞、乳腺幹細胞、嗅粘膜幹細胞、神経冠幹細胞、肝幹細胞、膵幹細胞、筋幹細胞、生殖幹細胞、腸管幹細胞、毛包幹細胞等の成体幹細胞；胚性幹細胞（ＥＳ細胞）、胚性腫瘍細胞、胚性生殖幹細胞、人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）等の多能性幹細胞；癌幹細胞等が挙げられる。
【００１３】
前駆細胞とは、前記幹細胞から特定の体細胞や生殖細胞に分化する途中の段階にある細胞であり、衛星細胞、膵前駆細胞、血管前駆細胞、血管内皮前駆細胞、造血前駆細胞（臍帯血由来のＣＤ３４陽性細胞等）等が挙げられる。
【００１４】
本発明の添加物は、好ましくは幹細胞の培養用添加物として提供され、より好ましくは成体幹細胞、胚性幹細胞および人工多能性幹細胞の培養用添加物として提供され、さらに好ましくは胚性幹細胞および人工多能性幹細胞の培養用添加物として提供される。
【００１５】
本発明の添加物は、アミノ酸もしくはグルコース、またはアミノ酸およびグルコースを含有する。
【００１６】
本発明の添加物に含有されるアミノ酸は、アミノ基およびカルボキシル基を有する両性の有機化合物であるが、好ましくは、生体のタンパク質の構成単位となるα−アミノ酸であり、アルキル基を有する中性アミノ酸（グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン）、ヒドロキシ基を有するアミノ酸（セリン、トレオニン）、イオウを含有するアミノ酸（メチオニン、システイン）、アミド基を有するアミノ酸（アスパラギン、グルタミン）、イミノ基を有するアミノ酸（プロリン）、芳香族基を有するアミノ酸（フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン）、酸性アミノ酸（アスパラギン酸、グルタミン酸）、塩基性アミノ酸（アルギニン、リシン、ヒスチジン）等が挙げられる。
また、システインの二量体であるシスチンも、培地や培養物に添加されると還元されてシステインとなるため、システインと同様に用いることができる。
本発明の添加物には、アミノ酸は１種を単独で含有させてもよく、２種以上を組み合わせて含有させてもよい。
【００１７】
動物細胞の増殖性向上効果の観点からは、アミノ酸として、トリプトファン（２−アミノ−３−（インドリル）プロピオン酸）、セリン（２−アミノ−３−ヒドロキシプロピオン酸）、システイン（２−アミノ−３−スルファニルプロピオン酸）、シスチン（３，３’−ジチオビス（２−アミノプロピオン酸））、メチオニン（（Ｓ）−４−（メチルチオ）−２−アミノ酪酸）およびアルギニン（２−アミノ−５−グアニジノペンタン酸）からなる群より選択される１種または２種以上を含有させることがより好ましく、トリプトファン、セリン、システインもしくはシスチン、メチオニンおよびアルギニンの５種のアミノ酸を含有させることがさらに好ましい。
【００１８】
また、動物細胞の増殖性向上効果の観点から、上記トリプトファン、セリン、システイン、シスチン、メチオニン、アルギニンに加えて、ヒスチジン（２−アミノ−３−（１Ｈ−イミダゾール−４−イル）プロピオン酸）、イソロイシン（２−アミノ−３−メチルペンタン酸）、ロイシン（２−アミノ−４−メチルペンタン酸）、リシン（２，６−ジアミノヘキサン酸）、フェニルアラニン（２−アミノ−３−フェニルプロパン酸）、バリン（２−アミノ−３−メチルブタン酸）も好ましいアミノ酸として挙げられる。
従って、本発明の別の態様においては、トリプトファン、セリン、システイン、シスチン、メチオニン、アルギニン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リシン、フェニルアラニンおよびバリンからなる群より選択される１種または２種以上を含有させることがより好ましく、トリプトファン、セリン、システインもしくはシスチン、メチオニン、アルギニン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リシン、フェニルアラニンおよびバリンの１１種のアミノ酸を含有させることがさらに好ましい。
【００１９】
本発明の添加物に含有されるアミノ酸としては、Ｌ−体、Ｄ−体、ＤＬ−体のいずれも使用できるが、好ましくは、Ｌ−体およびＤＬ−体であり、さらに好ましくは、Ｌ−体である。
また、上記アミノ酸は、遊離体のみならず、塩の形態でも使用することができる。本明細書における「アミノ酸」、「トリプトファン」、「セリン」、「システイン」、「シスチン」、「メチオニン」、「アルギニン」、「ヒスチジン」、「イソロイシン」、「ロイシン」、「リシン」、「フェニルアラニン」および「バリン」という語は、それぞれ塩をも包含する概念である。塩の形態としては、酸付加塩や塩基との塩等を挙げることができ、薬理学上許容される塩を選択することが好ましい。
【００２０】
上記アミノ酸の塩としては、具体的には無機塩基、有機塩基、無機酸、有機酸との塩およびアミノ酸との塩等が挙げられる。無機塩基との塩としては、たとえば、リチウム、ナトリウム、カリウム等のアルカリ金属との塩、マグネシウム、カルシウム等のアルカリ土類金属との塩、アンモニウム塩等が挙げられる。有機塩基との塩としては、たとえばモノエタノールアミン、ジエタノールアミン、トリエタノールアミン等のアルカノールアミンとの塩、モルホリン、ピペリジン等の複素環式アミンとの塩等が挙げられる。無機酸との塩としては、たとえば、ハロゲン化水素酸（塩酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸等）、硫酸、硝酸、リン酸等との塩等が挙げられる。有機酸との塩としては、たとえば、ギ酸、酢酸、プロパン酸等のモノカルボン酸との塩；シュウ酸、マロン酸、リンゴ酸、コハク酸等の飽和ジカルボン酸との塩；マレイン酸、フマル酸等の不飽和ジカルボン酸との塩；クエン酸等のトリカルボン酸との塩；α−ケトグルタル酸等のケト酸との塩等が挙げられる。アミノ酸との塩としては、グリシン、アラニン等の脂肪族アミノ酸との塩；フェニルアラニン等の芳香族アミノ酸との塩；アルギニン、リシン等の塩基性アミノ酸との塩；アスパラギン酸、グルタミン酸等の酸性アミノ酸との塩；ピログルタミン酸等のラクタムを形成したアミノ酸との塩等が挙げられる。
【００２１】
本発明の目的には、上記アミノ酸としては遊離体が好ましい。また、塩酸塩も好ましく用いられる。
【００２２】
本発明において、遊離体および塩の形態の上記アミノ酸は、天然に存在する動植物等から抽出し精製したもの、あるいは、化学合成法、発酵法、酵素法又は遺伝子組換え法等によって得られるもののいずれを使用してもよいが、各社より提供されている市販の製品を利用してもよい。
【００２３】
本発明の添加物におけるアミノ酸の含有量は、アミノ酸の全量にして通常０．０１重量％〜１００重量％であり、好ましくは０．１重量％〜１００重量％である。
なお、本発明の添加物に含有されるアミノ酸の中に、塩の形態で含有されるアミノ酸が存在する場合は、当該アミノ酸については遊離体に換算した含有量にて、上記したアミノ酸の含有量が算出される。
本発明の添加物が、トリプトファン、セリン、システインもしくはシスチン、メチオニンおよびアルギニンの５種のアミノ酸を含有する場合、これらは、それぞれ遊離体に換算した含有量の重量比（トリプトファン：セリン：システイン（シスチンが用いられる場合、還元されて生成されるシステインに換算した量で表す）：メチオニン：アルギニン）が、１：０．０１〜１００：０．０１〜１００：０．０１〜１００：０．０１〜１００となるように含有されることが好ましく、１：０．１〜１０：０．１〜１０：０．１〜１０：０．１〜１０となるように含有されることがより好ましい。
また、本発明の添加物が、トリプトファン、セリン、システインもしくはシスチン、メチオニン、アルギニン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リシン、フェニルアラニンおよびバリンの１１種のアミノ酸を含有する場合、これらは、それぞれ遊離体に換算した含有量の重量比（トリプトファン：セリン：システイン（シスチンが用いられる場合、還元されて生成されるシステインに換算した量で表す）：メチオニン：アルギニン：ヒスチジン：イソロイシン：ロイシン：リシン：フェニルアラニン：バリン）が、１：０．０１〜１００：０．０１〜１００：０．０１〜１００：０．０１〜１００：０．０１〜１００：０．０１〜１００：０．０１〜１００：０．０１〜１００：０．０１〜１００：０．０１〜１００となるように含有されることが好ましく、１：０．１〜１０：０．１〜１０：０．１〜１０：０．１〜１０：０．１〜１０：０．１〜１０：０．１〜１０：０．１〜１０：０．１〜１０：０．１〜１０となるように含有されることがより好ましい。
【００２４】
本発明の添加物に含有されるグルコースは、果実や蜂蜜中に遊離して存在するアルドヘキソースであり、動物細胞の培養において、炭素源として利用される。
本発明において、グルコースとしては、果実や蜂蜜等から単離精製し、また澱粉の加水分解等により製造して用いてもよいが、各社より提供されている市販の製品を利用してもよい。
本発明の添加物におけるグルコースの含有量は、通常１重量％〜１００重量％であり、好ましくは１０重量％〜１００重量％である。
【００２５】
本発明の添加物には、アミノ酸とグルコースはいずれかを含有させてもよく、両者をともに含有させてもよい。
動物細胞の増殖性向上効果の観点からは、アミノ酸とグルコースの双方を含有させることが好ましく、トリプトファン、セリン、システイン、シスチン、メチオニンおよびアルギニンからなる群より選択される１種または２種以上とグルコースとを含有させることがより好ましく、トリプトファン、セリン、システインもしくはシスチン、メチオニンおよびアルギニンとグルコースとを含有させることがさらに好ましい。
また、本発明の別の態様において、トリプトファン、セリン、システイン、シスチン、メチオニン、アルギニン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リシン、フェニルアラニンおよびバリンからなる群より選択される１種または２種以上とグルコースとを含有させることがより好ましく、トリプトファン、セリン、システインもしくはシスチン、メチオニン、アルギニン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リシン、フェニルアラニンおよびバリンとグルコースとを含有させることがさらに好ましい。
なお、本発明の添加物において、アミノ酸とグルコースとは、アミノ酸の全量（遊離体に換算した量）とグルコースの重量比［アミノ酸の全量（遊離体に換算した量）：グルコース］が１：１〜１：５００となるように含有されることが好ましく、１：５〜１：５０となるように含有されることがより好ましい。
【００２６】
本発明においては、アミノ酸もしくはグルコース、またはアミノ酸およびグルコースをそのまま本発明の添加物としてもよく、また、水、多価アルコール等の溶媒に溶解もしくは分散し、水溶液、分散液等の液状の形態、あるいは賦形剤、結合剤等の一般的に製剤化に用いられる添加剤と混合して、粉末状、顆粒状、錠剤状等の固形状の形態の添加物としてもよい。
また、上記したアミノ酸もしくはグルコース、またはアミノ酸およびグルコースを、炭水化物、無機塩等の以下に述べる培地成分の一部と混合して、本発明の添加物として調製してもよい。
動物細胞の培養用培地への添加が簡便で、培地との混和も容易であるとの観点から、本発明の添加物は、好ましくは液状、粉末状、顆粒状、錠剤状等の形態で提供される。
【００２７】
本発明の添加物は、滅菌処理して調製することが好ましい。滅菌処理の方法は特に制限されず、たとえば、１２１℃で２０分間のオートクレーブ滅菌、放射線滅菌、エチレンオキサイドガス滅菌、フィルターろ過滅菌等が挙げられ、本発明の添加物の形態等により、適宜選択することができる。
【００２８】
本発明の添加物は、後述する動物細胞の培養用培地の成分に添加して、動物細胞の培養用培地の調製に用いることができ、また、後述する動物細胞の培養用培地に添加して用いることができる。あるいは、本発明の添加物は、動物細胞の培養物に添加して用いることもできる。
【００２９】
本発明の添加物は、動物細胞の培養用培地または動物細胞の培養物に対し、アミノ酸の濃度（遊離体のアミノ酸に換算した濃度）にして通常０．１ｍｇ／Ｌ／ｄａｙ〜９０００００ｍｇ／Ｌ／ｄａｙ、好ましくは１ｍｇ／Ｌ／ｄａｙ〜１００００ｍｇ／Ｌ／ｄａｙ、より好ましくは１ｍｇ／Ｌ／ｄａｙ〜６００ｍｇ／Ｌ／ｄａｙ、グルコースの濃度にして通常０．１ｇ／Ｌ／ｄａｙ〜９００ｇ／Ｌ／ｄａｙ、好ましくは１ｇ／Ｌ／ｄａｙ〜２００ｇ／Ｌ／ｄａｙ、より好ましくは１ｇ／Ｌ／ｄａｙ〜２０ｇ／Ｌ／ｄａｙとなるように添加される。
なお、本発明の添加物が、アミノ酸としてトリプトファン、セリン、システイン、シスチン、メチオニンおよびアルギニンからなる群より選択される１種または２種以上を含有する場合、本発明の添加物は、動物細胞の培養用培地または動物細胞の培養物に対し、トリプトファンの濃度（遊離体のトリプトファンに換算した濃度）にして通常０．１ｍｇ／Ｌ／ｄａｙ〜１１０００ｍｇ／Ｌ／ｄａｙ、好ましくは１ｍｇ／Ｌ／ｄａｙ〜１０００ｍｇ／Ｌ／ｄａｙ、より好ましくは１ｍｇ／Ｌ／ｄａｙ〜１００ｍｇ／Ｌ／ｄａｙ、セリンの濃度（遊離体のセリンに換算した濃度）にして通常０．１ｍｇ／Ｌ／ｄａｙ〜４２５０００ｍｇ／Ｌ／ｄａｙ、好ましくは１ｍｇ／Ｌ／ｄａｙ〜１０００ｍｇ／Ｌ／ｄａｙ、より好ましくは１ｍｇ／Ｌ／ｄａｙ〜１００ｍｇ／Ｌ／ｄａｙ、システインもしくはシスチンの濃度（遊離体のシステインに換算した濃度）にして通常０．１ｍｇ／Ｌ／ｄａｙ〜２８００００ｍｇ／Ｌ／ｄａｙ、好ましくは１ｍｇ／Ｌ／ｄａｙ〜１０００ｍｇ／Ｌ／ｄａｙ、より好ましくは１ｍｇ／Ｌ／ｄａｙ〜１００ｍｇ／Ｌ／ｄａｙ、メチオニンの濃度（遊離体のメチオニンに換算した濃度）にして通常０．１ｍｇ／Ｌ／ｄａｙ〜５５０００ｍｇ／Ｌ／ｄａｙ、好ましくは１ｍｇ／Ｌ／ｄａｙ〜１０００ｍｇ／Ｌ／ｄａｙ、より好ましくは１ｍｇ／Ｌ／ｄａｙ〜１００ｍｇ／Ｌ／ｄａｙ、アルギニンの濃度（遊離体のアルギニンに換算した濃度）にして通常０．１ｍｇ／Ｌ／ｄａｙ〜１５００００ｍｇ／Ｌ／ｄａｙ、好ましくは１ｍｇ／Ｌ／ｄａｙ〜２０００ｍｇ／Ｌ／ｄａｙ、より好ましくは１ｍｇ／Ｌ／ｄａｙ〜２００ｍｇ／Ｌ／ｄａｙとなるように添加される。
【００３０】
また、本発明の添加物が、アミノ酸としてトリプトファン、セリン、システイン、シスチン、メチオニン、アルギニン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リシン、フェニルアラニンおよびバリンからなる群より選択される１種または２種以上を含有する場合、本発明の添加物は、動物細胞の培養用培地または動物細胞の培養物に対し、トリプトファンの濃度（遊離体のトリプトファンに換算した濃度）にして通常０．１ｍｇ／Ｌ／ｄａｙ〜１１０００ｍｇ／Ｌ／ｄａｙ、好ましくは１ｍｇ／Ｌ／ｄａｙ〜１０００ｍｇ／Ｌ／ｄａｙ、より好ましくは１ｍｇ／Ｌ／ｄａｙ〜１００ｍｇ／Ｌ／ｄａｙ、セリンの濃度（遊離体のセリンに換算した濃度）にして通常０．１ｍｇ／Ｌ／ｄａｙ〜４２５０００ｍｇ／Ｌ／ｄａｙ、好ましくは１ｍｇ／Ｌ／ｄａｙ〜１０００ｍｇ／Ｌ／ｄａｙ、より好ましくは１ｍｇ／Ｌ／ｄａｙ〜１００ｍｇ／Ｌ／ｄａｙ、システインもしくはシスチンの濃度（遊離体のシステインに換算した濃度）にして通常０．１ｍｇ／Ｌ／ｄａｙ〜２８００００ｍｇ／Ｌ／ｄａｙ、好ましくは１ｍｇ／Ｌ／ｄａｙ〜１０００ｍｇ／Ｌ／ｄａｙ、より好ましくは１ｍｇ／Ｌ／ｄａｙ〜１００ｍｇ／Ｌ／ｄａｙ、メチオニンの濃度（遊離体のメチオニンに換算した濃度）にして通常０．１ｍｇ／Ｌ／ｄａｙ〜５５０００ｍｇ／Ｌ／ｄａｙ、好ましくは１ｍｇ／Ｌ／ｄａｙ〜１０００ｍｇ／Ｌ／ｄａｙ、より好ましくは１ｍｇ／Ｌ／ｄａｙ〜１００ｍｇ／Ｌ／ｄａｙ、アルギニンの濃度（遊離体のアルギニンに換算した濃度）にして通常０．１ｍｇ／Ｌ／ｄａｙ〜１５００００ｍｇ／Ｌ／ｄａｙ、好ましくは１ｍｇ／Ｌ／ｄａｙ〜２０００ｍｇ／Ｌ／ｄａｙ、より好ましくは１ｍｇ／Ｌ／ｄａｙ〜２００ｍｇ／Ｌ／ｄａｙ、ヒスチジンの濃度（遊離体のヒスチジンに換算した濃度）にして通常０．１ｍｇ／Ｌ／ｄａｙ〜４１９００ｍｇ／Ｌ／ｄａｙ、好ましくは１ｍｇ／Ｌ／ｄａｙ〜１０００ｍｇ／Ｌ／ｄａｙ、より好ましくは１ｍｇ／Ｌ／ｄａｙ〜１００ｍｇ／Ｌ／ｄａｙ、イソロイシンの濃度（遊離体のイソロイシンに換算した濃度）にして通常０．１ｍｇ／Ｌ／ｄａｙ〜４１２００ｍｇ／Ｌ／ｄａｙ、好ましくは１ｍｇ／Ｌ／ｄａｙ〜１０００ｍｇ／Ｌ／ｄａｙ、より好ましくは１ｍｇ／Ｌ／ｄａｙ〜１００ｍｇ／Ｌ／ｄａｙ、ロイシンの濃度（遊離体のロイシンに換算した濃度）にして通常０．１ｍｇ／Ｌ／ｄａｙ〜２２４００ｍｇ／Ｌ／ｄａｙ、好ましくは１ｍｇ／Ｌ／ｄａｙ〜１０００ｍｇ／Ｌ／ｄａｙ、より好ましくは１ｍｇ／Ｌ／ｄａｙ〜１００ｍｇ／Ｌ／ｄａｙ、リシンの濃度（遊離体のリシンに換算した濃度）にして通常０．１ｍｇ／Ｌ／ｄａｙ〜９０００００ｍｇ／Ｌ／ｄａｙ、好ましくは１ｍｇ／Ｌ／ｄａｙ〜１０００ｍｇ／Ｌ／ｄａｙ、より好ましくは１ｍｇ／Ｌ／ｄａｙ〜１００ｍｇ／Ｌ／ｄａｙ、フェニルアラニンの濃度（遊離体のフェニルアラニンに換算した濃度）にして通常０．１ｍｇ／Ｌ／ｄａｙ〜２９６００ｍｇ／Ｌ／ｄａｙ、好ましくは１ｍｇ／Ｌ／ｄａｙ〜１０００ｍｇ／Ｌ／ｄａｙ、より好ましくは１ｍｇ／Ｌ／ｄａｙ〜１００ｍｇ／Ｌ／ｄａｙ、バリンの濃度（遊離体のバリンに換算した濃度）にして通常０．１ｍｇ／Ｌ／ｄａｙ〜８５０００ｍｇ／Ｌ／ｄａｙ、好ましくは１ｍｇ／Ｌ／ｄａｙ〜１０００ｍｇ／Ｌ／ｄａｙ、より好ましくは１ｍｇ／Ｌ／ｄａｙ〜１００ｍｇ／Ｌ／ｄａｙとなるように添加される。
【００３１】
本発明の添加物が添加される動物細胞の培養用培地は、通常、炭素源として、グルコース、スクロース、マルトース等の糖や澱粉等の炭水化物を含有し、また窒素源として、アミノ酸、ペプチド、タンパク質を含有する。
従って、本発明の添加物が添加される動物細胞の培養用培地は、もともとアミノ酸やグルコースを含有するものであってもよく、該培地におけるアミノ酸の当初の含有濃度（遊離体のアミノ酸に換算した濃度）は、通常０．１ｍｇ／Ｌ〜５ｇ／Ｌ程度であり、該培地におけるグルコースの当初の含有濃度は、通常０．１ｇ／Ｌ〜１０ｇ／Ｌ程度である。
【００３２】
本発明の添加物を添加して調製した動物細胞の培養用培地を用い、また、本発明の添加物を動物細胞の培養用培地に添加して動物細胞を培養し、あるいは動物細胞の培養物に本発明の添加物を添加することにより、動物細胞の増殖性を向上させることができる。本発明の添加物は、特に、無血清培地または低アルブミン培地により動物細胞を培養する際に、動物細胞の増殖性を向上させるのに好適である。
【００３３】
本発明の添加物は、動物細胞を培地中に浮遊させて増殖させる浮遊培養、および動物細胞を培養容器に付着させて増殖させる接着培養のいずれの培養にも用いることができる。
本発明の添加物を用いて動物細胞の浮遊培養を行う場合、大きさの制御された細胞塊を形成させることができ、細胞塊の状態で浮遊培養を行うことができる。
【００３４】
本発明はまた、動物細胞の培養用培地（以下、本明細書にて「本発明の培地」とも称する）を提供する。
【００３５】
「動物細胞」については、本発明の添加物について上記した通りである。
なお、本発明の培地は、好ましくは幹細胞の培養用培地として提供され、より好ましくは成体幹細胞、胚性幹細胞および人工多能性幹細胞の培養用培地として提供され、さらに好ましくは胚性幹細胞および人工多能性幹細胞の培養用培地として提供される。
【００３６】
本発明の培地は、動物細胞の培養に通常用いられる培地成分に加えて、さらにアミノ酸もしくはグルコース、またはアミノ酸およびグルコースを含有する。
本発明の培地にさらに含有されるアミノ酸およびグルコースについては、本発明の添加物について上記した通りである。
本発明においては、アミノ酸もしくはグルコース、またはアミノ酸およびグルコースは、上記した本発明の添加物として調製された状態で、前記培地成分とともに含有されてもよく、または培地成分に対して直接添加されてもよい。
本発明の培地において、アミノ酸もしくはグルコース、またはアミノ酸およびグルコースは、本発明の添加物について上記した濃度で培地成分に添加される。
【００３７】
本発明の培地に含有させ得る培地成分としては、動物細胞の培養に通常用いられる培地成分を挙げることができ、たとえば、グルコース、フルクトース、スクロース、マルトース等の糖；アスパラギン、アスパラギン酸、グルタミン、グルタミン酸等のアミノ酸；アルブミン、トランスフェリン等のタンパク質；グリシルグリシルグリシン、大豆ペプチド等のペプチド；血清；ビタミンＡ、ビタミンＢ群（チアミン、リボフラビン、ピリドキシン、シアノコバラミン、ビオチン、葉酸、パントテン酸、ニコチンアミド等）、ビタミンＣ、ビタミンＥ等のビタミン；オレイン酸、アラキドン酸、リノール酸等の脂肪酸；コレステロール等の脂質；塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、硫酸マグネシウム、リン酸二水素ナトリウム等の無機塩；亜鉛、銅、セレン等の微量元素；Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）−２−アミノエタンスルホン酸（N,N-bis(2-hydroxyethyl)-2-aminoethanesulfonic acid（ＢＥＳ））、４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジンエタンスルホン酸（4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid（ＨＥＰＥＳ））、Ｎ−［トリス（ヒドロキシメチル）メチル］グリシン（N-[tris(hydroxymethyl)methyl]glycine（Ｔｒｉｃｉｎｅ））等の緩衝剤；アンホテリシンＢ、カナマイシン、ゲンタマイシン、ストレプトマイシン、ペニシリン等の抗生物質；Ｔｙｐｅ  Ｉ  コラーゲン、Ｔｙｐｅ  ＩＩ  コラーゲン、フィブロネクチン、ラミニン、ポリ−Ｌ−リシン、ポリ−Ｄ−リシン等の細胞接着因子および細胞外マトリックス成分；インターロイキン、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、トランスフォーミング増殖因子（ＴＧＦ）−α、トランスフォーミング増殖因子（ＴＧＦ）−β、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、アクチビンＡ等のサイトカインおよび増殖因子；デキサメサゾン、ヒドロコルチゾン、エストラジオール、プロゲステロン、グルカゴン、インスリン等のホルモン等が挙げられ、培養する動物細胞の種類に応じて適切な成分を選択して用いることができる。
なお、血清には未知の因子やプリオン、ウイルス等が含まれる可能性があるため、本発明の培地は、培地成分として血清を含有しないことが好ましい。また、本発明の培地が、ヒトの細胞の培養用培地として調製される場合には、ヒト以外の動物由来成分を含有しないことが好ましい。
【００３８】
また、本発明においては、アミノ酸もしくはグルコース、またはアミノ酸およびグルコースは、上記した哺乳動物由来の正常細胞、幹細胞および前駆細胞等の動物細胞の培養用として汎用される培地に添加して、本発明の培地としてもよい。
哺乳動物細胞由来の正常細胞の培養に用いられる培地としては、ダルベッコ改変イーグル培地（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ’ｓ Ｍｅｄｉｕｍ）（ＤＭＥＭ）、ハムＦ１２培地（Ｈａｍ’ｓ Ｎｕｔｒｉｅｎｔ Ｍｉｘｔｕｒｅ Ｆ１２）、ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地、マッコイ５Ａ培地（ＭｃＣｏｙ’ｓ ５Ａ ｍｅｄｉｕｍ）、最小必須培地（Ｍｉｎｉｍｕｍ Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｍｅｄｉｕｍ）（ＭＥＭ）、イーグル最小必須培地（Ｅａｇｌｅ’ｓ Ｍｉｎｉｍｕｍ Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｍｅｄｉｕｍ）（ＥＭＥＭ）、α改変型イーグル最小必須培地（ａｌｐｈａ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ’ｓ Ｍｉｎｉｍｕｍ Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｍｅｄｉｕｍ）（αＭＥＭ）、ロズウェルパーク記念研究所（Ｒｏｓｗｅｌｌ  Ｐａｒｋ  Ｍｅｍｏｒｉａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）（ＲＰＭＩ）１６４０培地、イスコフ改変ダルベッコ培地（Ｉｓｃｏｖｅ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｅｄｉｕｍ）（ＩＭＤＭ）、ＭＣＤＢ１３１培地、ウィリアム培地Ｅ（Ｗｉｌｌｉａｍ’ｓ  Ｍｅｄｉｕｍ  Ｅ）、フィッシャー培地（Ｆｉｓｃｈｅｒ’ｓ  Ｍｅｄｉｕｍ）等が挙げられる。
【００３９】
幹細胞の培養に用いられる培地としては、ＳＴＥＭＰＲＯ（登録商標）  ｈＥＳＣ  ＳＦＭ培地（ライフテクノロジーズ（Life Technologies）社）、ｍＴｅＳＲ１培地（ステムセルテクノロジーズ（STEMCELL Technologies）社）、ＴｅＳＲ２培地（ステムセルテクノロジーズ（STEMCELL Technologies）社）、ＴｅＳＲ−Ｅ８培地（ステムセルテクノロジーズ（STEMCELL Technologies）社）、Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  ８培地（ライフテクノロジーズ（Life Technologies）社）、ＨＥＳｃＧＲＯ（商標）  Ｓｅｒｕｍ−Ｆｒｅｅ  Ｍｅｄｉｕｍ  ｆｏｒ  ｈＥＳ  ｃｅｌｌｓ（ミリポア（Millipore）社）、ＰｌｕｒｉＳＴＥＭ（商標）  Ｈｕｍａｎ  ＥＳ／ｉＰＳ  Ｍｅｄｉｕｍ（イーエムディー  ミリポア（EMD Millipore）社）、ＮｕｔｒｉＳｔｅｍ（登録商標）  ｈＥＳＣ  ＸＦ培地（バイオロジカル インダストリーズ  イスラエル  ベイト−ヘメク（Biological Industries Israel Beit-Haemek）株式会社）、ＮｕｔｒｉＳｔｅｍ（商標）  ＸＦ／ＦＦ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｕｍ（ステムジェント（Stemgent）社）、ＡＦ  ＮｕｔｒｉＳｔｅｍ（登録商標）  ｈＥＳＣ  ＸＦ培地（バイオロジカル インダストリーズ  イスラエル  ベイト−ヘメク（Biological Industries Israel Beit-Haemek）株式会社）、Ｓ−ｍｅｄｉｕｍ（ＤＳファーマバイオメディカル株式会社）、ＳｔｅｍＦｉｔ（登録商標）  ＡＫ０３Ｎ培地（味の素株式会社）、ｈＥＳＦ９培地、ｈＥＳＦ−ＦＸ培地、ＣＤＭ培地、ＤＥＦ−ＣＳ  ５００  Ｘｅｎｏ−Ｆｒｅｅ  ３Ｄ  Ｓｐｈｅｒｏｉｄ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｕｍ（セラルティス（Cellartis）社）、ＳｔｅｍＦｌｅｘ培地（サーモフィッシャー  サイエンティフィック（Thermo Fisher Scientific）社）等が挙げられる。
【００４０】
前駆細胞の培養に用いられる培地としては、ＨＰＧＭ（商標）（ケンブレックス社）、ＱＢＳＦ−６０（クオリティバイオロジカル社）等が挙げられる。
【００４１】
本発明においては、アミノ酸もしくはグルコース、またはアミノ酸およびグルコースは、幹細胞の培養用培地に添加されることが好ましく、成体幹細胞、胚性幹細胞および人工多能性幹細胞の培養用培地に添加されることがより好ましく、胚性幹細胞および人工多能性幹細胞の培養用培地に添加されることがさらに好ましい。
また、本発明の目的には、無血清培地または低アルブミン培地を用いることがより好ましく、また、ヒトの細胞の培養用培地に用いるには、ヒト以外の動物由来成分を含有しないもの（ゼノフリー培地）が好ましい。
【００４２】
なお、本発明の培地は、もともと培地成分として、グルコースやアミノ酸を含有するものであってもよい。かかる場合における培地中のアミノ酸の当初の含有濃度（遊離体のアミノ酸に換算した濃度）は、通常０．１ｍｇ／Ｌ〜５ｇ／Ｌ程度であり、グルコースの当初の含有濃度は、通常０．１ｇ／Ｌ〜１０ｇ／Ｌ程度である。
【００４３】
さらに、動物細胞の浮遊培養にも用いるという観点からは、本発明の培地は、溶液、分散液等の液状の形態とすることが好ましい。
【００４４】
また、本発明の培地において、動物細胞の培養に供される際のｐＨを７以上に制御することが好ましい。
本発明の培地のｐＨは、本発明の培地に含有される培地成分、または本発明の培地に添加される本発明の添加物に、ｐＨ調整剤や緩衝剤を添加することにより調整され得る。
かかるｐＨ調整剤または緩衝剤としては、本発明の培地のｐＨを７以上に制御できるものであれば特に限定されないが、たとえば炭酸水素ナトリウム、炭酸ナトリウム、リン酸、リン酸二水素ナトリウム、リン酸一水素ナトリウム、リン酸二水素カリウム、リン酸一水素カリウム、トリスヒドロキシメチルアミノメタン等が挙げられ、培地中の含有成分に応じて、適宜選択して用いられる。
なお、本発明の培地のｐＨは、培養温度にて、通常の方法により測定される。たとえば、液状の培地であれば、ガラス電極法により測定することができ、固形状の培地であれば、フラットタイプの電極を用いる、または半流動状態とする等の前処理を行った後に、通常のガラス電極を用いて測定することができる。
【００４５】
本発明の培地は、公知の組成に従って、上記した培地成分から適宜選択される成分と、アミノ酸もしくはグルコース、またはアミノ酸およびグルコースとを水等の溶媒に添加し、溶解または分散して調製することができる。
また、本発明の培地は、各社・各機関から提供されている上記した動物細胞培養用培地に、アミノ酸もしくはグルコース、またはアミノ酸およびグルコースを添加して溶解または分散して調製することができる。
さらに、本発明の培地は、使用時の濃度よりも濃縮した状態や、凍結乾燥された粉末状の状態で調製し、使用時に水等の溶媒で希釈し、または水等の溶媒に溶解または分散して用いる態様とすることもできる。
本発明の培地は、上記したような滅菌処理を施して調製されることが好ましい。
【００４６】
本発明の培地は、動物細胞の浮遊培養および接着培養のいずれにも用いることができる。本発明の培地を動物細胞の浮遊培養に用いる場合は、大きさの制御された細胞塊の形成が可能で、細胞塊の状態での浮遊培養を行うのに好適である。
本発明の培地を用いることにより、浮遊培養、接着培養のいずれにおいても、動物細胞の増殖性を向上させることができる。
【００４７】
本発明の培地は、好ましくは幹細胞の培養に用いられ、より好ましくは成体幹細胞、胚性幹細胞および人工多能性幹細胞の培養に用いられ、さらに好ましくは胚性幹細胞および人工多能性幹細胞の培養に用いられる。
【００４８】
さらに、本発明は、動物細胞の培養方法（以下、本明細書にて「本発明の培養方法」とも称する）を提供する。
本発明の培養方法は、アミノ酸もしくはグルコース、またはアミノ酸およびグルコースが添加された動物細胞の培養用培地にて、動物細胞を培養することを含む。あるいは、本発明の培養方法は、アミノ酸もしくはグルコース、またはアミノ酸およびグルコースを、動物細胞の培養物に添加することを含む。
なお、本発明においては、動物細胞の浮遊培養および接着培養のいずれも行うことができる。本発明の培養方法は、特に、大きさの制御された細胞塊を形成させることができ、細胞塊の状態で浮遊培養するのに好適である。
【００４９】
「アミノ酸もしくはグルコース、またはアミノ酸およびグルコースが添加された動物細胞の培養用培地」については、本発明の添加物および本発明の培地に関して上記した通りであり、本発明において、動物細胞の培養用培地に添加されるアミノ酸もしくはグルコース、またはアミノ酸およびグルコースは、上記した本発明の添加物として調製されて添加されたものでもよく、アミノ酸もしくはグルコース、またはアミノ酸およびグルコースが動物細胞の培養用培地に直接添加されたものでもよい。
また、本発明の培養方法において、アミノ酸およびグルコースは、それぞれ本発明の添加物において上記した濃度で、動物細胞の培養用培地または培養物に添加される。
なお、動物細胞の接着培養を行う場合は、足場材料を用いることが好ましい。かかる足場材料としては、動物細胞の接着培養に通常用いられる足場材料を用いることができ、たとえば、マトリジェル等の基底膜マトリックス、ビトロネクチン、ラミニン等のヒト型リコンビナントのマトリックスを用いることができる。
【００５０】
動物細胞については、本発明の添加物において上記した通りである。
本発明の培養方法において、動物細胞の培養は、通常の浮遊培養または接着培養の方法に従って行うことができる。
すなわち、培養の形態（浮遊培養または接着培養）および培養スケールに応じて、適宜細胞培養用プレート、細胞培養フラスコ、バイオリアクター等の培養容器または培養装置を用い、上記した本発明の培地または本発明の添加物を添加した動物細胞の培養用培地に動物細胞を播種して、通常２５℃〜３９℃、好ましくは３３℃〜３９℃で、通常４体積％〜１０体積％、好ましくは４体積％〜６体積％の二酸化炭素存在下、また通常１体積％〜２５体積％、好ましくは４体積％〜２０体積％の酸素存在下にて、通常１日間〜３０日間、好ましくは２日間〜１４日間培養を行う。なお、２〜３日間ごとに、または１日１回または複数回培地交換を行う。
培地交換は、浮遊培養の場合は、遠心分離やろ過により動物細胞と培地とを分離した後、新しい培地を動物細胞に添加する、あるいは、遠心分離やろ過を行うことにより動物細胞を適宜濃縮した後、新しい培地を濃縮細胞液に添加することにより行う。
上記遠心分離の際の重力加速度（Ｇ）は、通常５０Ｇ〜１，０００Ｇ、好ましくは、１００Ｇ〜５００Ｇであり、ろ過に用いるフィルターの細孔の大きさ（直径）は、通常１０μｍ〜２００μｍである。
接着培養の場合の培地交換は、培地を吸引等して除去し、新しい培地を動物細胞に添加して行うことができる。
【００５１】
本発明において、動物細胞の浮遊培養は、撹拌、振とう、還流、気体通気等を行って実施することができる。
撹拌は、バイオリアクター、撹拌羽根付き培養槽等を用いて行うことができ、通常１０ｒｐｍ〜２，０００ｒｐｍ、好ましくは４０ｒｐｍ〜１，０００ｒｐｍの撹拌速度で行う。
振とうは、振とう機や振とう培養機を用いて行うことができ、通常１０ｒｐｍ〜５００ｒｐｍ、好ましくは５０ｒｐｍ〜２５０ｒｐｍの振とう速度で行う。
還流は、ペリスタルティックポンプ、チュービングポンプ等を用いて行うことができ、通常１０μＬ／分〜１，０００ｍＬ／分、好ましくは１ｍＬ／分〜１００ｍＬ／分の流速で行う。還流用チューブとしては、シリコーン、ネオプレン（クロロプレンゴム）、マープレン（ポリプロピレン・エチレンプロピレンゴム）製等のペリスタルティックポンプ用チューブ、チュービングポンプ用チューブ等を用いる。
気体通気は、マイクロスパージャー、フィルタースパージャー等、各種スパージャーを用いて行うことができ、通常１ｍＬ／分〜１，０００ｍＬ／分、好ましくは５０ｍＬ／分〜２００ｍＬ／分の通気量で行うことができる。
大きさの制御された細胞塊を効率よく得るためには、動物細胞の浮遊培養は、撹拌または振とうを行って実施することが好ましい。
【００５２】
浮遊培養により培養された動物細胞は、遠心分離またはフィルターを用いたろ過により回収することができる。
遠心分離は、５０Ｇ〜１，０００Ｇ、好ましくは１００Ｇ〜５００Ｇで１分間〜１０分間程度行う。
また、ろ過は、直径が１０μｍ〜２００μｍ程度の細孔を有するフィルターを用いて行うことができる。
【００５３】
接着培養により培養された動物細胞は、培地を吸引除去し、たとえば、トリプシン溶液またはトリプシンおよびエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）溶液を用いて処理することにより、培養容器から剥離した後、遠心分離またはフィルターを用いたろ過により回収することができる。
【００５４】
培養され、回収された動物細胞は、ステム−セルバンカー（ＳＴＥＭ−ＣＥＬＬＢＡＮＫＥＲ）（日本全薬工業株式会社）等の凍結保護剤を含有する凍結用培地を用いて、液体窒素中で保存することが好ましい。
【００５５】
本発明の培養方法により、浮遊培養、接着培養のいずれにおいても、動物細胞の増殖性を向上させることができる。
なお、本発明の培養方法は、幹細胞の培養において好ましく用いられ、成体幹細胞、胚性幹細胞および人工多能性幹細胞の培養により好ましく用いることができ、胚性幹細胞および人工多能性幹細胞の培養にさらに好ましく用いることができる。
【実施例】
【００５６】
以下、実施例により、本発明についてさらに詳細に説明する。【００５７】
［実施例１］動物細胞の培養用添加物
Ｄ−グルコース（ナカライテスク株式会社；16806-25）を、そのまま本発明の添加物（実施例１）とした。【００５８】
［実施例２］動物細胞の培養用添加物
Ｌ−トリプトファン（味の素株式会社）、Ｌ−セリン（味の素株式会社）、Ｌ−システイン（日本プロテイン株式会社）、Ｌ−メチオニン（味の素株式会社）およびＬ−アルギニン（味の素株式会社）を、１：１：１：１：２の重量比（Ｌ−トリプトファン：Ｌ−セリン：Ｌ−システイン：Ｌ−メチオニン：Ｌ−アルギニン）にて混合し、本発明の添加物（実施例２）とした。【００５９】
［実施例３］動物細胞の培養用添加物
Ｌ−トリプトファン（味の素株式会社）、Ｌ−セリン（味の素株式会社）、Ｌ−システイン（日本プロテイン株式会社）、Ｌ−メチオニン（味の素株式会社）、Ｌ−アルギニン（味の素株式会社）およびＤ−グルコース（ナカライテスク株式会社；16806-25）を、１：１：１：１：２：１００の重量比（Ｌ−トリプトファン：Ｌ−セリン：Ｌ−システイン：Ｌ−メチオニン：Ｌ−アルギニン：Ｄ−グルコース）にて混合し、本発明の添加物（実施例３）とした。【００６０】
［試験例１］ヒト人工多能性幹細胞（ｉＰＳ）の浮遊培養における本発明の添加物の効果の評価
マイクロバイオリアクター（ａｍｂｒ１５（ザルトリウス（sartorius）社；001-0881）を用いて、１０μＭのＲｈｏ結合キナーゼ阻害剤（Ｙ−２７６３２）（富士フィルム和光純薬株式会社；034-24024）を含有するステムフィット（ＳｔｅｍＦｉｔ）（登録商標）ＡＫ０３Ｎ培地（味の素株式会社）１４ｍＬに、ｉＰＳ細胞１２１０Ｂ２株（ｉＰＳアカデミアジャパン株式会社）を２×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬの細胞密度で播種し、３７℃、ｐＨ＝７．２、二酸化炭素濃度＝５体積％、溶存酸素濃度＝２０体積％、攪拌速度＝３００ｒｐｍの条件下で攪拌培養した。
播種２日目以降に毎日７割の培地をステムフィット（ＳｔｅｍＦｉｔ）（登録商標） ＡＫ０３Ｎ培地に交換し、実施例１の本発明の添加物を、Ｄ−グルコースの濃度にして２ｇ／Ｌ／ｄａｙ、実施例２の本発明の添加物を、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−セリン、Ｌ−システインおよびＬ−メチオニンについてはそれぞれ２０ｍｇ／Ｌ／ｄａｙ、Ｌ−アルギニンについては４０ｍｇ／Ｌ／ｄａｙ、実施例３の本発明の添加物を、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−セリン、Ｌ−システインおよびＬ−メチオニンについてはそれぞれ２０ｍｇ／Ｌ／ｄａｙ、Ｌ−アルギニンについては４０ｍｇ／Ｌ／ｄａｙ、Ｄ−グルコースについては２ｇ／Ｌ／ｄａｙの濃度で、それぞれ添加して、培養を継続した。
なお、対照として、いずれの添加物をも添加せずに、同様に培地交換を行って培養を継続した。
実施例１〜３の各添加物を添加して培養した場合、および対照について、培養６日目に生細胞数を生死細胞オートアナライザー（Ｖｉ−ＣＥＬＬ（登録商標） ＸＲ（ベックマン・コールター株式会社））を用いて測定した。測定結果を図１に示した。【００６１】
図１に示されるように、実施例１〜３の添加物をそれぞれｉＰＳ細胞の培養物に添加した場合には、対照に比べて生細胞数の増加が認められた。
従って、５種のアミノ酸（Ｌ−トリプトファン、Ｌ−セリン、Ｌ−システイン、Ｌ−メチオニンおよびＬ−アルギニン）もしくはグルコースの添加により、ｉＰＳ細胞の増殖性が向上することが確認された。
また、５種のアミノ酸とグルコースの双方を添加することにより、相加的なｉＰＳ細胞の増殖性向上効果が得られることが認められた。【００６２】
［実施例４］動物細胞の培養用培地
ステムフィット（ＳｔｅｍＦｉｔ）（登録商標）ＡＫ０３Ｎ培地（味の素株式会社）に、Ｄ−グルコース（和光純薬工業株式会社；045-31167）を２ｇ／Ｌの濃度で添加して、実施例４の動物細胞の培養用培地とした。【００６３】
［実施例５］動物細胞の培養用培地
ステムフィット（ＳｔｅｍＦｉｔ）（登録商標）ＡＫ０３Ｎ培地（味の素株式会社）に、Ｌ−トリプトファン（味の素株式会社）、Ｌ−セリン（味の素株式会社）、Ｌ−システイン（日本プロテイン株式会社）およびＬ−メチオニン（味の素株式会社）を各２０ｍｇ／Ｌ、ならびにＬ−アルギニン（味の素株式会社）を４０ｍｇ／Ｌの濃度で添加して、実施例５の動物細胞の培養用培地とした。【００６４】
［実施例６］動物細胞の培養用培地
ステムフィット（ＳｔｅｍＦｉｔ）（登録商標）ＡＫ０３Ｎ培地（味の素株式会社）に、Ｌ−トリプトファン（味の素株式会社）、Ｌ−セリン（味の素株式会社）、Ｌ−システイン（日本プロテイン株式会社）およびＬ−メチオニン（味の素株式会社）を各２０ｍｇ／Ｌ、Ｌ−アルギニン（味の素株式会社）を４０ｍｇ／Ｌ、ならびにＤ−グルコース（和光純薬工業株式会社；045-31167）を２ｇ／Ｌの濃度で添加して、実施例６の動物細胞培養用培地とした。【００６５】
［試験例２］ｉＰＳ細胞の接着培養における本発明の培地の効果の評価
ｉＰＳ細胞として、１２１０Ｂ２株および２０１Ｂ７株（ｉＰＳアカデミアジャパン株式会社）を用い、１２１０Ｂ２株については実施例５および６の各培地にて、２０１Ｂ７株については実施例４〜６の各培地にて接着培養を行った。
基底膜マトリックス（ｉＭａｔｒｉｘ−５１１（株式会社ニッピ；892012））をコートした１２ウェルプレートを用意し、１ウェルあたり実施例４〜６の各培地１ｍＬを添加し、１０，０００個の細胞をシングルセルの状態で播種して、３７℃、二酸化炭素濃度＝５体積％、酸素濃度＝２０体積％の条件下に７日間培養した。各培地には、最終濃度＝１０μＭのＲｈｏ結合キナーゼ阻害剤（Ｙ−２７６３２）（富士フィルム和光純薬株式会社；034-24024）を加えた。培養１、２、５および６日目に、全量培地交換を行った。
なお、対照として、ステムフィット（ＳｔｅｍＦｉｔ）（登録商標）ＡＫ０３Ｎ培地（味の素株式会社）を用いて同様にｉＰＳ細胞１２１０Ｂ２株および２０１Ｂ７株の接着培養を行った。
培養７日目にインキュサイト（ＩｎｃｕＣｙｔｅ）（エッセンバイオサイエンス株式会社）にて細胞被覆率を測定した。各培地を用いた接着培養および細胞被覆率の測定は、それぞれ３回行い、測定結果は平均値にて図２、３に示した。【００６６】
図２に示されるように、１２１０Ｂ２株の接着培養においては、本発明の実施例５および６の各培地を用いた場合に、対照に比べて細胞増殖性の向上が認められた。
また、図３に示されるように、２０１Ｂ７株の接着培養においては、本発明の実施例４〜６の各培地を用いることにより、細胞増殖性の向上が認められた。
試験例２の上記結果から、ｉＰＳ細胞の接着培養においても、５種のアミノ酸（Ｌ−トリプトファン、Ｌ−セリン、Ｌ−システイン、Ｌ−メチオニンおよびＬ−アルギニン）もしくはグルコース、または前記５種のアミノ酸およびグルコースの添加により、細胞増殖性が向上することが示唆された。【００６７】
［実施例７、８］ｉＰＳ細胞の浮遊培養
ｉＰＳ細胞用３０ｍＬシングルユースバイオリアクター（エイブル（ABLE）社: BWV-S03A）を用いて、１０μＭのＲｈｏ結合キナーゼ阻害剤（Ｙ−２７６３２）（富士フィルム和光純薬株式会社；034-24024）を加えたステムフィット（ＳｔｅｍＦｉｔ）（登録商標）ＡＫ０３Ｎ培地（味の素株式会社）に、ｉＰＳ細胞１２１０Ｂ２株および１２３１Ａ３株（ｉＰＳアカデミアジャパン株式会社）を６×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬの細胞密度で播種し、ＣＯ２インキュベーター内で攪拌培養した（３７℃、酸素濃度＝２０体積％、二酸化炭素濃度＝５体積％）。播種後２日目に培地の７０％をステムフィット（ＳｔｅｍＦｉｔ）（登録商標）ＡＫ０３Ｎ培地（味の素株式会社）に交換した。播種後３日目に細胞懸濁液１０ｍＬを新鮮なステムフィット（ＳｔｅｍＦｉｔ）（登録商標）ＡＫ０３Ｎ培地（味の素株式会社）１０ｍＬに再懸濁し（１２１０Ｂ２株については細胞密度＝０．８０６×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬ、１２３１Ａ３株については細胞密度＝０．４８１×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬ）、マイクロバイオリアクター（ａｍｂｒ１５（ザルトリウス（sartorius）社:001-0881）に移し、３７℃、ｐＨ＝７．２、溶存酸素濃度＝２０体積％、二酸化炭素濃度＝５体積％、攪拌速度＝３００ｒｐｍの条件下で攪拌培養を続け、1日１回、培地の７０％を交換した。
その際、一方の群には、Ｌ−トリプトファン（味の素株式会社）（４０ｍｇ／Ｌ／ｄａｙ）、Ｌ−セリン（味の素株式会社）（４０ｍｇ／Ｌ／ｄａｙ）、Ｌ−システイン塩酸塩（日本プロテイン株式会社）（４０ｍｇ／Ｌ／ｄａｙ）、Ｌ−メチオニン（味の素株式会社）（４０ｍｇ／Ｌ／ｄａｙ）、Ｌ−アルギニン（味の素株式会社）（１６０ｍｇ／Ｌ／ｄａｙ）、Ｄ−グルコース（ナカライテスク株式会社；16806-25）（４ｇ／Ｌ／ｄａｙ）を添加し（実施例７）、もう一方の群には前記の５種のアミノ酸およびグルコースに加えて、Ｌ−ヒスチジン（味の素株式会社）（１８．６ｍｇ／Ｌ／ｄａｙ）、Ｌ−イソロイシン（味の素株式会社）（４３．７ｍｇ／Ｌ／ｄａｙ）、Ｌ−ロイシン（味の素株式会社）（４３．７ｍｇ／Ｌ／ｄａｙ）、Ｌ−リシン塩酸塩（味の素株式会社）（７３．１ｍｇ／Ｌ／ｄａｙ）、Ｌ−フェニルアラニン（味の素株式会社）（２８．４ｍｇ／Ｌ／ｄａｙ）およびＬ−バリン（味の素株式会社）（４２．３ｍｇ／Ｌ／ｄａｙ）を添加して培養した（実施例８）。【００６８】
［試験例３］ｉＰＳ細胞の浮遊培養における本発明の培養方法の効果の評価
１２１０Ｂ２株については培養８日目に、１２３１Ａ３株については培養７日目に、生細胞数を生死細胞オートアナライザー（Ｖｉ−ＣＥＬＬ（登録商標） ＸＲ（ベックマン・コールター株式会社）を用いて測定した。
１２１０Ｂ２株および１２３１Ａ３株について、生細胞数の測定結果を図４および５にそれぞれ示した。【００６９】
図４および５に示されるように、５種類のアミノ酸（Ｌ−トリプトファン、Ｌ−セリン、Ｌ−システイン塩酸塩、Ｌ−メチオニンおよびＬ−アルギニン）とグルコースを添加して培養した場合（実施例７）ならびに１１種類のアミノ酸（Ｌ−トリプトファン、Ｌ−セリン、Ｌ−システイン塩酸塩、Ｌ−メチオニン、Ｌ−アルギニン、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−リシン塩酸塩、Ｌ−フェニルアラニンおよびＬ−バリン）とグルコースを添加して培養した場合（実施例８）のいずれにおいても、１２１０Ｂ２株および１２３１Ａ３株の双方において、再懸濁時に比べて生細胞数の増加が認められ、細胞増殖が促進されたが、１１種類のアミノ酸とグルコースを添加した場合（実施例８）において、より大きな細胞増殖促進効果が認められた。
【産業上の利用可能性】
【００７０】
以上詳述したように、本発明により、動物細胞、特に幹細胞の増殖性を好適に向上させ得る動物細胞の培養用添加物を提供することができ、動物細胞の増殖性を好適に向上させ得る動物細胞の培養用培地、および動物細胞の培養方法を提供することができる。【００７１】
本願は、日本国で出願された特願２０１８−１８４３５２を基礎としており、その内容は本明細書にすべて包含されるものである。
【図１】
2020067502.tif 000003
【図２】
2020067502.tif 000004
【図３】
2020067502.tif 000005
【図４】
2020067502.tif 000006
【図５】
2020067502.tif 000007
【国際調査報告】
2020067502.tif 000008
2020067502.tif 000009
2020067502.tif 000010
2020067502.tif 000011