(57)【要約】  本発明の課題は、ＣＭＶの先天性感染を予防及び治療できる有効なワクチンを提供することである。本発明のサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）の先天性感染を予防又は治療するためのワクチンは、ＣＭＶのエンベロープ糖タンパク質Ｂ（ｇＢタンパク質）抗原と、ペンタマー（Ｐｅｎｔａｍｅｒ）抗原とを含む。
2020121983.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）のエンベロープ糖タンパク質Ｂ（ｇＢタンパク質）抗原と、ペンタマー抗原とを含む、ＣＭＶの先天性感染を予防又は治療するためのワクチン。
【請求項２】
ｇＢタンパク質抗原がＣＭＶ  ｇＢタンパク質のエクトドメインである、請求項１に記載のワクチン。
【請求項３】
ｇＢタンパク質抗原が配列番号１に記載のアミノ酸配列を有するヒトサイトメガロウイルス（ＨＣＭＶ）のｇＢタンパク質のエクトドメインである、請求項２に記載のワクチン。
【請求項４】
ペンタマー抗原が、ヒトサイトメガロウイルス（ＨＣＭＶ）のｇＨ、ｇＬ、ＵＬ１２８、ＵＬ１３０及びＵＬ１３１からなる、請求項１〜３のいずれか一項に記載のワクチン。
【請求項５】
ペンタマー抗原が、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５及び配列番号６に記載のアミノ酸配列を有するヒトサイトメガロウイルス（ＨＣＭＶ）のペンタマータンパク質のエクトドメインである、請求項４に記載のワクチン。
【請求項６】
ヒトサイトメガロウイルス（ＨＣＭＶ）のエンベロープ糖タンパク質Ｂ（ｇＢタンパク質）抗原を含むワクチンと、
ＨＣＭＶのｇＨ、ｇＬ、ＵＬ１２８、ＵＬ１３０及びＵＬ１３１からなるペンタマー抗原とを含むワクチンと
を含む、ＨＣＭＶの先天性感染を予防又は治療するためのワクチンキット。
【請求項７】
ヒトサイトメガロウイルス（ＨＣＭＶ）の先天性感染を予防又は治療するためのワクチン又はワクチンキットの製造における、ＨＣＭＶのエンベロープ糖タンパク質Ｂ（ｇＢタンパク質）抗原、並びに、ＨＣＭＶのｇＨ、ｇＬ、ＵＬ１２８、ＵＬ１３０及びＵＬ１３１からなるペンタマー抗原の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、サイトメガロウイルスの先天性感染を予防又は治療するためのワクチンに関する。
【背景技術】
【０００２】
サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）感染症には、大きく２つがある。１つ目は妊婦が初感染した場合に胎児が発症する先天性ＣＭＶ感染症であり、２つ目は、移植、ＡＩＤＳ、先天性免疫不全などの免疫抑制状態の患者において発症するＣＭＶ肺炎、腸炎、網膜炎などの臓器障害である。このうち、先天性ＣＭＶ感染症は、ＴＯＲＣＨ症候群の１つであり、胎児に奇形又は重篤な臨床症状を引き起こす重要な先天性感染症である。妊婦がＣＭＶに初感染した場合、およそ４０％で胎盤を通して胎児の先天性感染が発生する（本明細書においては、「先天性感染」という用語と「経胎盤感染」という用語を同じ意味で用いている）。また、死産の約１５％が先天性ＣＭＶ感染によるという報告もある。先天性感染児の年間発生件数は、日本で３０００人以上、米国で約４万人であり、症候性は日本で約１０００人、米国で約８０００人とも言われ、このうち約９割に中枢神経障害や難聴などの後障害が残る。【０００３】
日本におけるＣＭＶ抗体保有率は欧米諸国に比して高く、日本人成人の８０％〜９０％はＣＭＶ抗体陽性であり、ほとんどの人が乳幼児期に感染を受けている。しかし、最近の傾向として、若年者のＣＭＶ抗体保有率は９０％台から６０％台に低下傾向を示しており、先天性ＣＭＶ感染症の予防対策の必要性はさらに高まっている（非特許文献１）。【０００４】
米国医学研究所（ｔｈｅ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ）は、先天性ＣＭＶ感染症が先進国における先天性の中枢神経障害の原因としてダウン症候群を凌ぐインパクトを持っており、障害が残った先天性感染児の生涯に及ぶＱＯＬの低下と社会経済的損失をＱＡＬＹｓ（ｑｕａｌｉｔｙ−ａｄｊｕｓｔｅｄ  ｌｉｆｅ  ｙｅａｒｓ）として算出すると、ＣＭＶワクチンは、最も医療経済効果が高いカテゴリーに分類されると分析している（非特許文献２）。【０００５】
感染症を引き起こす病原体は、従来型ワクチンで十分な効果を得ることができるＣｌａｓｓ  Ｉ群病原体と、従来型ワクチン又は病原体感染歴では十分な防御免疫を獲得できないＣｌａｓｓ  ＩＩ群病原体とに大別されるが、ＣＭＶは後者に分類される。Ｃｌａｓｓ  ＩＩ群病原体の克服が難しい理由として、それらが有する巧妙な免疫逃避機構が指摘されている。人類はこれまでにＣｌａｓｓ  Ｉ群病原体に対する数多くの有効なワクチンを開発し、それらの引き起こす感染症の脅威に打ち勝ってきた。そして今後のワクチン開発の焦点は、Ｃｌａｓｓ  ＩＩ群病原体へと移りつつある。【０００６】
先天性ＣＭＶ感染症の被害を最小限に留めるために、妊婦スクリーニングで未感染妊婦を同定し、生活上の注意を啓発することも行われているが、十分ではない。さらに初感染妊婦を同定して、ＣＭＶ抗体高力価免疫グロブリンを妊婦に投与することで胎児への感染予防や重症化の軽減に有効であったとする報告もあるが、現在のところ有効性に疑問が出てきている（非特許文献３）。一方、低分子薬としてガンシクロビル（ｇａｎｃｉｃｌｏｖｉｒ）も上市されているが、その効果は限定的であり、副作用の問題もある。現時点においてＣＭＶワクチンは存在せず、また前述の通り十分に有効な治療法も無いことから、そのアンメットニーズは高いと考えられる。【０００７】
ＣＭＶワクチン開発に関しては、これまで複数の製薬企業やアカデミアにおいて弱毒生ワクチンやサブユニットワクチン、ＤＮＡワクチンなどを用いた検討が試みられてきたが、いずれもＴ細胞免疫、Ｂ細胞免疫共に応答が不十分であり、結果としてワクチンとして実用に耐え得る効果は得られていない。【０００８】
その中でＳａｎｏｆｉ社のワクチンは、ＣＭＶ糖タンパク質のｇＢを抗原としたサブユニットワクチンであるが、未感染成人女性を対象とした臨床試験において約５０％程度の感染予防効果を示した。効果が限定的だったため、開発は事実上中断しているが、「ｇＢ抗原のみで一定の効果を示しうる（だが十分ではない）」という意義のある知見が得られた（非特許文献４）。【０００９】
ＣＭＶのワクチン候補品の効果の実験的証明については、ＣＭＶの種特異性についての考慮が必要となる。ＣＭＶには種特異性があるため、ヒトサイトメガロウイルス（ＨＣＭＶ）を用いた動物実験は基本的に不可能である。動物実験はマウス、ラット、モルモット、サルなどを用いて行われるが、各種動物種に固有のＣＭＶを用いて実施される。経胎盤感染については、モルモットのみが、母体へのウイルス感染を起こさせることで、特殊な処置をせずとも胎仔への感染が確認できる動物モデル系であり、モルモットの経胎盤感染試験系は広く利用されている（非特許文献５）。【００１０】
ｇＢワクチンの経胎盤感染に対する効果に関しては、組換えＧＰＣＭＶのｇＢタンパク質＋アジュバントの雌モルモットへの投与により、雌モルモットの初感染が抑制され、また、胎仔への経胎盤感染も抑制されたことが報告されている（非特許文献６）。【００１１】
非特許文献７では、ＧＰＣＭＶのｇＢタンパク質を組み込んだアデノウイルスベクターワクチンを用いて、モルモットの経胎盤感染モデルにおいて胎仔への経胎盤感染をｇＢが抑制することが示されている。【００１２】
一方、ＣＭＶの主要抗原としてここ数年で大きな注目を集めているのがペンタマー（Ｐｅｎｔａｍｅｒ）抗原である。ペンタマーはＣＭＶの細胞指向性決定因子であり、ヒトＣＭＶではｇＨ、ｇＬ、ＵＬ１２８、ＵＬ１３０及びＵＬ１３１（ｇＨ／ｇＬ／ＵＬ１２８／ＵＬ１３０／ＵＬ１３１）の５つのサブユニットから構成される分子である。【００１３】
ペンタマーの経胎盤感染における寄与に関しては、ペンタマー遺伝子を欠失したＧＰＣＭＶは上皮・内皮細胞への感染性と経胎盤感染能を失っており、欠失した遺伝子を異所性に発現させることによりそれらが復活することが報告されている（非特許文献８）。【００１４】
また、ペンタマーワクチンの効果に関しては、ペンタマーを発現させたベクターワクチンＭＶＡ−ＰＣをマウスに投与し誘導されたモノクローナル抗体について詳細に解析した結果、抗ｇＨ抗体に比べて抗ペンタマー抗体の上皮及び内皮細胞系での中和能が明らかに高く、経胎盤感染において重要と考えられる栄養膜細胞での中和能についても同様であったことが報告されている（非特許文献９）。【００１５】
その一方で、相反する報告もある。非特許文献１０では、ヒトの胎盤における栄養芽前駆細胞はＣＭＶのターゲットであり、当細胞へのＣＭＶの感染にはペンタマーの寄与はほぼ認められず、ｇＢの寄与は明確に認められたとしている。【００１６】
また、非特許文献１１では、ｅｘ  ｖｉｖｏの胎盤感染試験系を用いて、ＧＰＣＭＶの胎盤組織への感染及び増殖にはペンタマーの寄与がほとんど認められないとしている。【００１７】
このように、ペンタマーのワクチン抗原としての有用性を示唆する報告は散見されるものの、経胎盤感染におけるペンタマーの役割が明白ではなく、ペンタマーワクチンの経胎盤感染に対する抑制効果については未だ結論が出ているとは言えない状況にある。【００１８】
ペンタマーとｇＢの併用の効果については、特許文献１において、サルを対象とした感染防御試験において、ペンタマーとｇＢの併用が有効であったとする報告がなされているものの、経胎盤感染への影響については何らの示唆も与えていない。また、ペンタマー単独群及び非免疫群と比較して、ペンタマー＋ｇＢの併用群が優れていることは示されているが、ｇＢ単独群が設定されていないため、正確には併用の効果を示していることにならない。【００１９】
また、非特許文献１２では、抗ｇＢモノクローナル抗体と抗ペンタマーモノクローナル抗体との併用効果についてｉｎ  ｖｉｔｒｏで検証し、中和能と耐性株出現抑制に関して併用の利点があるとしているが、生体における感染防御能について併用の効果を証明してはいない。【００２０】
更に、特許文献２では、ｇＢ＋ペンタマーの２価ワクチンで免疫することで、いくつかのサイトカインの産生が単独群より高いというデータがあるが、中和能では併用群は優位ではなく、また、感染実験もされていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００２１】
【特許文献１】国際公開第２０１７１５３９５４号
【特許文献２】特表２０１７−５１５５０３号公報
【特許文献３】国際公開第２００３００４６４７号
【非特許文献】
【００２２】
【非特許文献１】Azuma H et al.,“Cytomegalovirus seropositivity in pregnant women in Japan during 1996-2009” J Jpn Soc Perin Neon Med 46 (2010) 1273-1279
【非特許文献２】Kathleen R. Stratton et al., “Vaccines for the 21st century: a Tool for Decisionmaking” The National Academies Press, 2000
【非特許文献３】Revello MG et al., “Randomized trial of hyperimmune globulin to prevent congenital cytomegalovirus” N Engl J Med 370 (2014) 1316-1326
【非特許文献４】Rieder F et al., “Cytomegalovirus vaccine: phase II clinical trial results” Clin Microbiol Infect 20 Suppl 5 (2014) 95-102
【非特許文献５】Yamada S et al., “Characterization of the guinea pig cytomegalovirus genome locus that encodes homologs of human cytomegalovirus major immediate-early genes, UL128,and UL130” Virology 391 (2009) 99-106
【非特許文献６】Schleiss MR et al., “Glycoprotein B(gB) vaccines adjuvanted with AS01 or AS02 protect female guinea pigs against cytomegalovirus (CMV) viremia and offspring mortality in a CMV-challenge model” Vaccine 32 (2014) 2756-2762
【非特許文献７】Hashimoto K et al., “Effects of immunization of pregnant guinea pigs with guinea pig cytomegalovirus glycoprotein B on viral spread in the placenta” Vaccine 31 (2013) 3199-3205
【非特許文献８】Coleman S et al., “A Homolog Pentameric Complex Dictates Viral Epithelial Tropism, Pathogenicity and Congenital Infection Rate in Guinea Pig Cytomegalovirus” PLoS Pathog 12 (2016) e1005755
【非特許文献９】Flavia Chiuppesi et al., “Vaccine-Derived Neutralizing Antibodies to the Human Cytomegalovirus gH/gL Pentamer Potently Block Primary Cytotrophoblast Infection” J Virol 89 (2015) 11884-11898
【非特許文献１０】Martin Zydek et al., “HCMV Infection of Human Trophoblast Progenitor Cells of the Placenta Is Neutralized by a Human Monoclonal Antibody to Glycoprotein B and Not by Antibodies to the Pentamer Complex” Viruses 6 (2014)1346-1364
【非特許文献１１】Yamada S et al., “An Ex vivo culture model for placental cytomegalovirus infection using slices of Guinea pig placental tissue” Placenta 37 (2016) 85-88
【非特許文献１２】Patel HD et al., “In Vitro Characterization of Human Cytomegalovirus-Targeting Therapeutic Monoclonal Antibodies LJP538 and LJP539” Antimicrob Agents Chemother 60 (2016) 4961-4971
【非特許文献１３】Burke HG et al., “Crystal Structure of the Human Cytomegalovirus Glycoprotein B” PLoS Pathog 11 (2015) e1005227
【非特許文献１４】Ciferri C et al., “Structural and biochemical studies of HCM VgH/gL/gO and Pentamer reveal mutually exclusive cell entry complexes” Proc Natl Acad Sci USA 112 (2015) 1767-1772
【非特許文献１５】Kanai K et al., “Re-evaluation of the genome sequence of guinea pig cytomegalovirus” J Gen Virol 92(Pt 5) (2011) 1005-1020
【非特許文献１６】Yamada S et al., “Guinea pig cytomegalovirus GP129/131/133,homologues of human cytomegalovirus UL128/130/131A, are necessary for infection of monocytes and macrophages” J Gen Virol 95(Pt 6) (2014) 1376-1382
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００２３】
上述したように、ＣＭＶの感染予防において、特にＣＭＶの先天性感染を抑制し得る有効なＣＭＶワクチンが存在しない。したがって、本発明は、ＣＭＶの先天性感染を予防及び治療できる有効なワクチンを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００２４】
本発明者らは、ＣＭＶの主要な抗原であるｇＢとペンタマーを併用し２価ワクチンとすることで、モルモットにおける先天性ＣＭＶ感染を強く抑制しうることを見出し、本発明の完成に至った。【００２５】
すなわち、本発明は、以下の各発明に関する。
［１］  サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）のエンベロープ糖タンパク質Ｂ（ｇＢタンパク質）抗原と、ペンタマー抗原とを含む、ＣＭＶの先天性感染を予防又は治療するためのワクチン。
［２］  ｇＢタンパク質抗原がＣＭＶ  ｇＢタンパク質のエクトドメインである、［１］のワクチン。
［３］  ｇＢタンパク質抗原が配列番号１に記載のアミノ酸配列を有するヒトサイトメガロウイルス（ＨＣＭＶ）のｇＢタンパク質のエクトドメインである、［２］のワクチン。
［４］  ペンタマー抗原が、ヒトサイトメガロウイルス（ＨＣＭＶ）のｇＨ、ｇＬ、ＵＬ１２８、ＵＬ１３０及びＵＬ１３１からなる、［１］〜［３］のいずれかのワクチン。
［５］  ペンタマー抗原が、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５及び配列番号６に記載のアミノ酸配列を有するヒトサイトメガロウイルス（ＨＣＭＶ）のペンタマータンパク質のエクトドメインである、［４］のワクチン。
［６］  ヒトサイトメガロウイルス（ＨＣＭＶ）のエンベロープ糖タンパク質Ｂ（ｇＢタンパク質）抗原を含むワクチンと、
ＨＣＭＶのｇＨ、ｇＬ、ＵＬ１２８、ＵＬ１３０及びＵＬ１３１からなるペンタマー抗原とを含むワクチンと
を含む、ＨＣＭＶの先天性感染を予防又は治療するためのワクチンキット。
［７］  ヒトサイトメガロウイルス（ＨＣＭＶ）の先天性感染を予防又は治療するためのワクチン又はワクチンキットの製造における、ＨＣＭＶのエンベロープ糖タンパク質Ｂ（ｇＢタンパク質）抗原、並びに、ＨＣＭＶのｇＨ、ｇＬ、ＵＬ１２８、ＵＬ１３０及びＵＬ１３１からなるペンタマー抗原の使用。
【発明の効果】
【００２６】
本発明によれば、ＣＭＶの先天性感染防御において、ｇＢタンパク質抗原とペンタマー抗原とを併用することで、それぞれの単独投与による効果を上回る感染抑制効果を有するワクチンを提供することができる。これにより、ＣＭＶワクチンの実用化が期待できる。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１】ＳＤＳ−ＰＡＧＥによるＧＰＣＭＶ−ｇＢの性状解析の結果を示す図である。
【図２】ＨＰＬＣゲルろ過分析によるＧＰＣＭＶ−ｇＢの性状解析の結果を示す図である。
【図３】ＳＤＳ−ＰＡＧＥによるＧＰＣＭＶ−Ｐｅｎｔａｍｅｒの性状解析の結果を示す図である。
【図４】ＨＰＬＣゲルろ過分析によるＧＰＣＭＶ−Ｐｅｎｔａｍｅｒの性状解析の結果を示す図である。
【図５】ＳＤＳ−ＰＡＧＥによるＨＣＭＶ−ｇＢの性状解析の結果を示す図である。
【図６】ＨＰＬＣゲルろ過分析によるＨＣＭＶ−ｇＢの性状解析の結果を示す図である。
【図７】ＳＤＳ−ＰＡＧＥによるＨＣＭＶ−Ｐｅｎｔａｍｅｒの性状解析の結果を示す図である。
【図８】ＨＰＬＣゲルろ過分析によるＨＣＭＶ−Ｐｅｎｔａｍｅｒの性状解析の結果を示す図である。
【図９】ＧＰＣＭＶ−ｇＢ、ＧＰＣＭＶ−Ｐｅｎｔａｍｅｒ又はＧＰＣＭＶ−ｇＢとＧＰＣＭＶ−Ｐｅｎｔａｍｅｒ２価の免疫血清に含まれるＧＰＣＭＶ−ｇＢ結合抗体価を評価した結果を示す図である。
【図１０】ＧＰＣＭＶ−ｇＢ、ＧＰＣＭＶ−Ｐｅｎｔａｍｅｒ又はＧＰＣＭＶ−ｇＢとＧＰＣＭＶ−Ｐｅｎｔａｍｅｒ２価の免疫血清に含まれるＧＰＣＭＶ−Ｐｅｎｔａｍｅｒ結合抗体価を評価した結果を示す図である。
【図１１】ＨＣＭＶ−ｇＢ、ＨＣＭＶ−Ｐｅｎｔａｍｅｒ又はＨＣＭＶ−ｇＢとＨＣＭＶ−Ｐｅｎｔａｍｅｒ２価の免疫血清に含まれるＨＣＭＶ−ｇＢ結合抗体価を評価した結果を示す図である。
【図１２】ＨＣＭＶ−ｇＢ、ＨＣＭＶ−Ｐｅｎｔａｍｅｒ又はＨＣＭＶ−ｇＢとＨＣＭＶ−Ｐｅｎｔａｍｅｒ２価の免疫血清に含まれるＨＣＭＶ−Ｐｅｎｔａｍｅｒ結合抗体価を評価した結果を示す図である。
【図１３】ＨＣＭＶ既感染者ＰＢＭＣを用い、ＨＣＭＶ−ｇＢ、ＨＣＭＶ−Ｐｅｎｔａｍｅｒ又はＨＣＭＶ−ｇＢとＨＣＭＶ−Ｐｅｎｔａｍｅｒの２価で刺激した場合のＩＦＮγ産生ドナーの割合を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２８】
本発明のワクチンの一実施形態は、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）のエンベロープ糖タンパク質Ｂ（ｇＢタンパク質）抗原と、ペンタマー抗原とを含む、ＣＭＶの先天性感染を予防又は治療するためのワクチンである。すなわち、本実施形態のワクチンは２種類の抗原タンパク質を含む２価ワクチンである。
【００２９】
サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）は、任意のＣＭＶ株を含み、例えば、ヒトサイトメガロウイルス（ＨＣＭＶ）、モルモットサイトメガロウイルス（ＧＰＣＭＶ）、マウスサイトメガロウイルス（ＭＣＭＶ）、ラットサイトメガロウイルス（ＲＣＭＶ）及びアカゲザルサイトメガロウイルス（ＲｈＣＭＶ）などが挙げられる。
【００３０】
ＣＭＶのｇＢタンパク質は、野生型ＣＭＶ  ｇＢタンパク質であっても、改変型ＣＭＶ  ｇＢタンパク質であってもよい。
【００３１】
野生型ＣＭＶ  ｇＢタンパク質とは、任意のＣＭＶ株に由来するｇＢタンパク質を意味し、例えば配列番号７に記載のアミノ酸配列を有するＨＣＭＶ  ＡＤ１６９株由来のｇＢタンパク質（ＧｅｎＢａｎｋの登録番号：ＧｅｎＢａｎｋ  ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ  Ｎｏ．：  Ｘ１７４０３．１）、配列番号８に記載のアミノ酸配列を有するＧＰＣＭＶ  ２２１２２株に由来するｇＢタンパク質（ＧｅｎＢａｎｋの登録番号：ＡＢ５９２９２８．１）などが挙げられる。
【００３２】
改変型ＣＭＶ  ｇＢタンパク質としては、例えば、凝集体が形成しないようにするための改変を有する改変体、抗体誘導能又は中和抗体誘導能を向上させるための改変を有する改変体などが挙げられる。「中和抗体誘導能」とは、抗原タンパク質に対する中和抗体を誘導できる能力をいい、抗原タンパク質を被検動物に接種することで得られる免疫血清中の中和抗体価（ｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｔｉｔｅｒ）で評価され得る。「中和抗体」とは、ウイルス粒子の感染性を失わせることができる抗体をいい、例えば被検ウイルスのプラーク数を５０％減少させるのに必要な抗体の濃度（ＮＴ５０）にてその抗体の中和活性の高さを評価することができる。
【００３３】
改変型ＣＭＶ  ｇＢタンパク質は、野生型ＣＭＶ  ｇＢタンパク質に対して、少なくとも一つのアミノ酸残基又は連続したアミノ酸残基領域が、置換、欠損（欠失）又は付加されたタンパク質をいい、アミノ酸残基の置換又は欠損によって糖鎖導入されたタンパク質などの野生型に存在しないタンパク質修飾がされたタンパク質も含む。
【００３４】
ＣＭＶのｇＢタンパク質抗原は、ｇＢタンパク質の全長であっても、ｇＢタンパク質の一部の断片であってもよい。断片としては、例えばＣＭＶのｇＢタンパク質のエクトドメイン又はエクトドメインの一部の領域が挙げられる。ｇＢタンパク質の全長としては、例えば、配列番号７に記載のアミノ酸配列を有するＨＣＭＶ  ｇＢタンパク質が挙げられる（ＧｅｎＢａｎｋの登録番号：ＧｅｎＢａｎｋ  ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ  Ｎｏ．：  Ｘ１７４０３．１）。但し、配列番号７に記載のアミノ酸配列のうち、１番目から２４番目のアミノ酸配列は、リーダー配列である。エクトドメインとしては、例えば、配列番号７に記載のアミノ酸配列のうち、２５番目から７０６番目のアミノ酸配列を有するＨＣＭＶ  ｇＢタンパク質の断片が挙げられる。
【００３５】
また、これらｇＢタンパク質抗原は、アミノ酸置換などにより性状が改善されたものであってもよい。例えば、配列番号７に記載のアミノ酸配列のうち、１番目から７０６番目のアミノ酸配列を有するＨＣＭＶ  ｇＢタンパク質のエクトドメインを基として、非特許文献１３を参考に、１５６番目のアミノ酸残基をヒスチジン残基（Ｈｉｓ）に、１５７番目のアミノ酸残基をアルギニン残基（Ａｒｇ）に、２３９番目のアミノ酸残基をグルタミン酸残基（Ｇｌｕ）に、２４０番目のアミノ酸残基をアラニン残基（Ａｌａ）に、４５６番目のアミノ酸残基をトレオニン残基（Ｔｈｒ）に、４５８番目のアミノ酸残基をグルタミン残基（Ｇｌｎ）に置換したＨＣＭＶ  ｇＢタンパク質エクトドメイン改変体（配列番号１）が挙げられる。
【００３６】
ＣＭＶのｇＢタンパク質抗原は、ＣＭＶを用いてタンパク質精製によって作製してもよく、遺伝子工学の手法によって作製することができる。作製方法は特に限定されないが、たとえば、野生型ｇＢタンパク質のｃＤＮＡをテンプレートとし、プライマーを設計して、ＰＣＲによって核酸を得て、発現プロモーターと機能的に連結し、場合によってタグも連結し、適切な発現ベクターに導入し、発現させることによって得ることができる。作製されたＣＭＶ  ｇＢタンパク質抗原は、必要に応じて精製してもよい。精製方法は特に限定されないが、アフィニティクロマトグラフィーカラムなどによる精製が挙げられる。
【００３７】
改変型ｇＢタンパク質抗原が変異導入による改変体の場合、目的の変異を導入するためのプライマーを設計して、ＰＣＲによって変異が導入された核酸を得て、発現プロモーターと機能的に連結し、場合によってタグも連結し、適切な発現ベクターに導入し、発現させることによって得ることができる。
【００３８】
また、改変型ｇＢタンパク質抗原が糖鎖導入（糖鎖修飾）による改変体の場合は、通常の方法であればよく、特に限定されないが、たとえば、Ｎ型糖鎖を導入する場合、野生型ｇＢタンパク質のｃＤＮＡをテンプレートとし、Ｎ型糖鎖を導入する目的部位の３つの連続したアミノ酸配列が、Ｎ−Ｘ−Ｓ／Ｔ（Ｘはプロリン以外の任意のアミノ酸）となるように、プライマーを設計し、ＰＣＲによって変異を導入する。目的の改変型ｇＢタンパク質の核酸配列、さらに必要あれば６×Ｈｉｓなどのタグを連結した核酸配列を適切なベクターにクローニングし、発現させることによって改変型ＣＭＶ  ｇＢタンパク質を得ることができる。そして、ｇＢ改変体の目的部位のアスパラギンに通常の方法によってＮ型糖鎖を付加する。
【００３９】
ＣＭＶのペンタマーは、五量体複合体、又は単に五量体ともいう。野生型ＣＭＶペンタマーであっても、改変型ＣＭＶペンタマーであってもよい。
【００４０】
野生型ＣＭＶペンタマーとは、任意のＣＭＶ株に由来するペンタマーを意味し、例えばヒトサイトメガロウイルス（ＨＣＭＶ）のｇＨ、ｇＬ、ＵＬ１２８、ＵＬ１３０及びＵＬ１３１からなる五量体、モルモットサイトメガロウイルス（ＧＰＣＭＶ）のＧＰ７５（ｇＨ）、ＧＰ１１５（ｇＬ）、ＧＰ１２９（ＵＬ１２８）、ＧＰ１３１（ＵＬ１３０）及びＧＰ１３３（ＵＬ１３１）からなる五量体などが挙げられる。
【００４１】
ＨＣＭＶペンタマーは、例えば配列番号２（ｇＨ）、配列番号３（ｇＬ）、配列番号４（ＵＬ１２８）、配列番号５（ＵＬ１３０）及び配列番号６（ＵＬ１３１）に記載のアミノ酸配列を有するＨＣＭＶ  Ｍｅｒｌｉｎ株由来のペンタマータンパク質（ＧｅｎＢａｎｋの登録番号：ＧｅｎＢａｎｋ  ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ  Ｎｏ．：  ＡＹ４４６８９４．２）（但し、ＵＬ１２８の塩基配列には変異を含んでいるため、他のＣＭＶ株の配列情報を基に修正を加えている）などが挙げられる。
【００４２】
ＧＰＣＭＶペンタマーは、例えば配列番号１０（ＧＰ７５）、配列番号１１（ＧＰ１１５）、配列番号１２（ＧＰ１２９）、配列番号１３（ＧＰ１３１）及び配列番号１４（ＧＰ１３３）に記載のアミノ酸配列を有するＧＰＣＭＶ  ２２１２２株由来のペンタマータンパク質（ＧｅｎＢａｎｋの登録番号：ＧｅｎＢａｎｋ  ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ  Ｎｏ．：  ＡＢ５９２９２８．１）（但し、ＧＰ１３３の塩基配列には変異を含んでいるため、他のＣＭＶ株の配列情報を基に修正を加えている）などが挙げられる。
【００４３】
改変型ＣＭＶペンタマーとしては、例えば、凝集体が形成しないようにするための改変を有する改変体、抗体誘導能又は中和抗体誘導能を向上させるための改変を有する改変体などが挙げられる。改変型ＣＭＶペンタマーは、野生型ＣＭＶペンタマーを構成する５つのタンパク質のうち少なくとも１つが改変タンパク質であるペンタマーをいい、野生型ＣＭＶペンタマーを構成するタンパク質に対して、少なくとも一つのアミノ酸残基又は連続したアミノ酸残基領域が、置換、欠損（欠失）又は付加されたタンパク質をいい、アミノ酸残基の置換又は欠損によって糖鎖導入されたタンパク質などの野生型に存在しないタンパク質修飾がされたタンパク質も含む。
【００４４】
ＣＭＶペンタマー抗原は、ＣＭＶを用いてタンパク質精製によって作製してもよく、遺伝子工学の手法によって作製することができる。作製方法は特に限定されないが、たとえば、野生型ＣＭＶペンタマーを構成する５つのタンパク質のｃＤＮＡをテンプレートとし、プライマーを設計して、ＰＣＲによって核酸を得て、発現プロモーターと機能的に連結し、場合によってタグも連結し、適切な発現ベクターに導入し、発現させ、フォールディングさせ五量体構造を形成させることによって得ることができる。ＣＭＶペンタマー抗原は、必要に応じて分泌型蛋白として発現させることもできる。例えば、ｇＨを全長（配列番号９）ではなく、エクトドメイン（配列番号２）の断片として発現させることで、分泌型蛋白としての発現が可能となる。作製されたＣＭＶペンタマー抗原は、必要に応じて精製してもよい。精製方法は特に限定されないが、アフィニティクロマトグラフィーカラムなどによる精製が挙げられる。
【００４５】
改変型ＣＭＶペンタマー抗原が変異導入による改変体、又は糖鎖導入（糖鎖修飾）による改変体の場合は、上述のように作製することができる。
【００４６】
本実施形態のワクチンは、たとえば、１：１０〜１０：１の質量比でＣＭＶのｇＢタンパク質抗原とＣＭＶペンタマー抗原とを含有してよく、等質量で含有することが好ましい。ワクチンにおけるタンパク質抗原の含有量は、ＣＭＶのｇＢタンパク質抗原及びＣＭＶペンタマー抗原は、それぞれ０．１〜１０００μｇであればよく、１〜１００μｇであることが好ましい。
【００４７】
本実施形態のワクチンの剤形は、例えば、液状、粉末状（凍結乾燥粉末、乾燥粉末）、カプセル状、錠剤、凍結状態であってもよい。
【００４８】
本実施形態のＣＭＶワクチンは、医薬として許容されうる担体を含んでいてもよい。上記担体としては、ワクチン製造に通常用いられる担体を制限なく使用することができ、具体的には、食塩水、緩衝食塩水、デキストロース、水、グリセロール、等張水性緩衝液及びそれらの組み合わせが挙げられる。ワクチンは、乳化剤、保存剤（例えば、チメロサール）、等張化剤、ｐＨ調整剤、不活化剤（例えば、ホルマリン）などが、更に適宜配合されてもよい。
【００４９】
本実施形態のワクチンの免疫原性をさらに高めるために、アジュバントを更に含むことも可能である。アジュバントとしては、例えば、アルミニウムアジュバント又はスクアレンを含む水中油型乳濁アジュバント（ＡＳ０３、ＭＦ５９など）、ＣｐＧ及び３−Ｏ−脱アシル化−４’−モノホスホリル  ｌｉｐｉｄ  Ａ（ＭＰＬ）などのＴｏｌｌ様受容体のリガンド、サポニン系アジュバント、ポリγ−グルタミン酸などのポリマー系アジュバント、キトサン及びイヌリンなどの多糖類が挙げられる。
【００５０】
本実施形態のワクチンは、ＣＭＶ  ｇＢタンパク質抗原及びＣＭＶペンタマー抗原と、必要に応じて、担体、アジュバントなどと混合することにより得ることができる。アジュバントは、用時に混合するものであってもよい。
【００５１】
本実施形態のワクチンの投与経路は、例えば、経皮投与、舌下投与、点眼投与、皮内投与、筋肉内投与、経口投与、経腸投与、経鼻投与、静脈内投与、皮下投与、腹腔内投与、口から肺への吸入投与であってもよい。
【００５２】
本実施形態のワクチンの投与方法は、例えば、シリンジ、経皮的パッチ、マイクロニードル、移植可能な徐放性デバイス、マイクロニードルを付けたシリンジ、無針装置、スプレーによって投与する方法であってもよい。
【００５３】
本実施形態のワクチンによれば、ＣＭＶの経胎盤感染を予防又は治療することができる。経胎盤感染の予防とは、母体にワクチンを投与することにより、胎児へのＣＭＶの垂直感染を抑制すること、或いは、先天性感染により生じる各種症状の発現を抑制することである。これらは、胎児の羊水や新生児の体液を用いた核酸増幅法による検査や、新生児の頭部超音波検査、頭部CT検査、頭部MRI検査、または聴覚スクリーニングなどによって評価することができる。経胎盤感染の治療とは、先天性感染児にワクチンを投与することにより、先天性感染により生じる各種症状の発現や進展を抑制することである。これらは、先天性感染児の聴力検査、視力検査、その他の身体学的検査や精神発達検査などによって評価することができる。本実施形態のワクチンは、妊娠可能年齢の女性或いは女子児童を対象に投与することが好ましい。集団免疫の観点から、男性や男子児童、高齢者までを対象とすることも考えられる。また、投与回数は1回から３回、但し、２ヶ月から数年の間隔を置いて複数回接種することが望ましい。血中の抗体価を測定し、抗体が陰性或いは抗体価が低い人を接種対象とすることもできる。
【００５４】
本発明のワクチンキットは、ＨＣＭＶ  ｇＢタンパク質抗原を含むワクチンと、ＨＣＭＶのｇＨ、ｇＬ、ＵＬ１２８、ＵＬ１３０及びＵＬ１３１からなるペンタマー抗原とを含むワクチンとを含む、ＨＣＭＶの経胎盤感染を予防又は治療するためのワクチンキットである。すなわち、ＨＣＭＶ  ｇＢタンパク質抗原を含む１価ワクチンと、ＨＣＭＶペンタマー抗原を含む１価ワクチンとの２種類のワクチンを含むワクチンキットである。
【００５５】
２種類のワクチンは、混合して投与してもよく、別々に投与してもよい。別々に投与する場合は、順番を問わず順に投与すればよく、例えば１種類目の投与後１５分以内に２種類目を投与する。
【実施例】
【００５６】
［材料・方法］
＜ＧＰＣＭＶ−ｇＢの調製及び性状解析＞
モルモット経胎盤感染モデル系を用いて評価するため、モルモットに感染性を示すモルモットサイトメガロウイルス（ＧＰＣＭＶ）を用いた。組換えＧＰＣＭＶ  ｇＢタンパク質は凝集体を含む場合があるため、凝集体を含まない、性状改善した改変ＧＰＣＭＶ  ｇＢタンパク質を作製した。【００５７】
ＧＰＣＭＶ  ２２１２２株に由来するｇＢのエクトドメイン（１−６５６ａａ）にリーダー配列を付加し、さらに性状改善のためのアミノ酸変異を導入したｇＢ（配列番号１５）をコードする遺伝子を人工合成し、ｐＣＡＧＧＳ１−ｄｈｆｒ−ｎｅｏ（特許文献３）にクローニングした。ｇＢのＣ末端にはＨｉｓ−ｔａｇが付加されるようにデザインした。発現には、Ｅｘｐｉ２９３発現システム（ライフテクノロジーズ社）を用いた。発現プラスミドを細胞にトランスフェクションし、４〜６日で培養上清を回収した。ＧＰＣＭＶ  ｇＢを含む培養上清から、Ｎｉ  ＮＴＡ  Ａｇａｒｏｓｅ（ＱＩＡＧＥＮ社）を用いて精製し、ＰＢＳ＋０．５Ｍ  Ａｒｇｉｎｉｎｅに対して透析を行い、改変ＧＰＣＭＶ  ｇＢタンパク質のエクトドメイン（以下、「ＧＰＣＭＶ−ｇＢ」と呼ぶ）の精製品を得た。【００５８】
ＧＰＣＭＶ−ｇＢの精製品について、以下の通り性状解析を実施した。ジチオトレイトール（ＤＴＴ）による還元処理を行った検体（ＤＴＴ（＋））と、行っていない検体（ＤＴＴ（−））とをそれぞれ８〜１６％ＳＤＳ−ＰＡＧＥグラジエントゲルにて泳動し、Ｂｕｌｌｅｔ  ＣＢＢ  Ｓｔａｉｎ  Ｏｎｅ（ｎａｃａｌａｉ  ｔｅｓｑｕｅ社）で染色した。その結果は図１に示す。図１におけるレーン１、２はそれぞれマーカー（Ｂｅｎｃｈ  Ｍａｒｋ  Ｐｒｅｓｔａｉｎｅｄ  Ｉｎｖｉｔｏｇｅｎ１０７４８−０１０）、及び、精製したＧＰＣＭＶ−ｇＢ  ２μｇ／レーンであり、レーン２においてＧＰＣＭＶ−ｇＢのバンドがメインバンドとして確認された。また、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００  Ｉｎｃｒｅａｓｅ  ５／１５０  ＧＬ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）を用いて、移動相としてＰＢＳを用い、流速０．４ｍＬ／分でＨＰＬＣゲルろ過分析を行った結果、期待された三量体のピークがほぼシングルピークとして確認された（図２）。【００５９】
＜ＧＰＣＭＶ−Ｐｅｎｔａｍｅｒの調製及び性状解析＞
次に、ＧＰＣＭＶ  ２２１２２株に由来するペンタマーのエクトドメインを調製した。ＧＰＣＭＶペンタマーのエクトドメインの可溶性発現に関しては報告例がなかったため、ＨＣＭＶペンタマーのエクトドメインの可溶性発現の報告例（非特許文献１４）を参考に、以下に述べるようにデザインし、発現プラスミドを構築した。【００６０】
ｇＨのエクトドメイン（１−６９８ａａ、配列番号１６）をコードする遺伝子を人工合成し、ｐＣＡＧＧＳ１−ｄｈｆｒ−ｎｅｏにクローニングした。ｇＨのＣ末端にはＨｉｓ−ｔａｇが付加されるようにデザインした。更に、ＨＣＭＶのｇＬのオルソログであるＧＰ１１５（１−２５８ａａ、配列番号１１）をコードする遺伝子、ＨＣＭＶのＵＬ１２８のオルソログであるＧＰ１２９（１−１７９ａａ、配列番号１２）をコードする遺伝子、ＨＣＭＶのＵＬ１３０のオルソログであるＧＰ１３１（１−１９２ａａ、配列番号１３）をコードする遺伝子、ＨＣＭＶのＵＬ１３１のオルソログであるＧＰ１３３（１−１２７ａａ、配列番号１４）をコードする遺伝子を、それぞれ人工合成し、ｐＣＡＧＧＳ１−ｄｈｆｒ−ｎｅｏにクローニングした。発現及び精製はＧＰＣＭＶ−ｇＢと同様の方法で行い、ＧＰＣＭＶペンタマーのエクトドメイン（以下、「ＧＰＣＭＶ−Ｐｅｎｔａｍｅｒ」と呼ぶ）精製品を得た。【００６１】
ＧＰＣＭＶ−ｇＢと同様に性状解析を実施したところ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥではＧＰＣＭＶ−Ｐｅｎｔａｍｅｒを構成する各種構成成分のバンドがそれぞれ確認された（図３）。また、ＨＰＬＣゲルろ過分析においては、期待された五量体（ペンタマー）のピークがメインピークとして確認された（図４）。【００６２】
＜ＧＰＣＭＶ／モルモット免疫原性試験＞
作製したＧＰＣＭＶ−ｇＢ及びＧＰＣＭＶ−Ｐｅｎｔａｍｅｒを用いて、モルモット免疫原性試験を実施した。４週齢、雌のＨａｒｔｌｅｙモルモットに対し、各抗原（ＧＰＣＭＶ−ｇＢ、ＧＰＣＭＶ−Ｐｅｎｔａｍｅｒ又はＧＰＣＭＶ−ｇＢ＋ＧＰＣＭＶ−Ｐｅｎｔａｍｅｒ）は２５μｇ／匹になるように、生理食塩水（大塚製薬）で調製し、アジュバントとして１０ｖ／ｖ％のＡｌｕｍ（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ）及び５０μｇ／匹のＣｐＧ  ＯＤＮ１８２６（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ）を使用した。調製した抗原液を２週間間隔で３回、Ｈａｒｔｌｅｙモルモット（雌  ３匹／群）に筋肉内接種（１００μＬ、後肢及び両足）し、最終免疫の２週間後にイソフルラン吸入麻酔下での心臓採血により全採血した。得られた血液は凝固促進剤入り分離管で血清分離し、５６℃、３０分間非働化処理を行ったものを免疫血清として、これら免疫血清を用いて中和抗体誘導能解析（中和抗体価解析）及び結合抗体誘導能解析（結合抗体価解析）を実施した。【００６３】
＜中和抗体価解析のためのモルモットの細胞とＧＰＣＭＶ＞
ウイルスの培養と線維芽細胞系の中和抗体価解析にはＡＴＣＣから購入したＧＰＬ細胞（ＣＣＬ  １５８）を使用した。細胞培養用培地はＦ１２（ｘ１）  Ｎｕｔｒｉｅｎｔ  Ｍｉｘｔｕｒｅ  （＋）  Ｌ−ｇｌｕｔａｍｉｎｅ培地（Ｇｉｂｃｏ，Ｃａｔ．Ｎｏ．１１７６５−０５４）に１０％ＦＢＳ  （Ｈｙｃｌｏｎｅ），１００Ｕｎｉｔｓ／ｍＬ  Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ，１００μｇ／ｍＬ  Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ（Ｇｉｂｃｏ，Ｃａｔ．Ｎｏ．１５１４０−１２２）を添加して調製し、細胞の拡張、維持、解析に使用し、いずれも３７℃、５％のＣＯ２濃度の条件下で培養した。【００６４】
中和抗体価解析に用いるモルモット由来マクロファージの調製は以下のように行った。脾臓細胞を回収し、遠心して細胞を集め、１０〜２０ｍＬの１×ＲＢＣ（ＮＨ４Ｃｌ  ８．２６ｇ，ＮａＨＣＯ３  １．１９ｇ，ＥＤＴＡ・Ｎａ２  ０．３７８ｇを滅菌水１００ｍＬに溶解し、ｐＨを７．３に合わせて、ろ過滅菌後冷蔵保存し、使用時に滅菌水で１０倍希釈したもの）に懸濁し赤血球を溶血させた。遠心の後、細胞を１×ＰＢＳに懸濁しては遠心することを数回繰り返し、得られた細胞を単球として−８０℃に１０％ＤＭＳＯと５０％ＦＢＳを含む培地を加えて保存、もしくは、そのままマクロファージに分化させて使用した。中和抗体価解析に用いるモルモット由来マクロファージは、単球１．５〜２．５×１０５個／ウェル／９６穴プレートを１００ｎＭ  ＴＰＡ存在下で２日培養し、上清を除いた後、プレートに張り付いている細胞をマクロファージとして使用した。【００６５】
中和抗体価解析に用いるウイルスは、以下の手順で作製した。まず、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＫＳ（＋）に、ＡＴＣＣから購入したＧＰＣＭＶ  ２２１２２株（ＶＲ−６８２）感染細胞より抽出したＤＮＡを鋳型としてＰＣＲ増幅して得たＧＰＣＭＶゲノムの塩基配列（非特許文献１５）の２６４２−４２４７領域及び１３０３０−１４４８２領域をクローニングした。次に、このプラスミドに、８．６ｋｂのＦプラスミドレプリコン（ＢＡＣ）とＧＦＰ発現カセットを、ＧＰＣＭＶ塩基配列３９９２と３９９３の間にクローニングした。得られたプラスミドをＧＰＣＭＶ  ２２１２２株ゲノムＤＮＡとともにＧＰＬ細胞に遺伝子導入し、出現したＧＦＰ発現ウイルスを５回継代後、その感染細胞からＨｉｒｔ法により環状ＤＮＡを回収し、エレクトロポレーション法にて大腸菌ＤＨ１０Ｂに遺伝子導入し、ｐＢＡＣ−ＧＰＣＭＶΔ９Ｋを得た。このＢＡＣ  ＤＮＡをＧＰＬ細胞に遺伝子導入することで、ＧＦＰを発現しクローン化されたＧＰＣＭＶ−ＢＡＣΔ９Ｋを作出した（非特許文献１６）。【００６６】
中和抗体価解析用の精製ウイルスバンクは以下のように調製した。７０〜８０％程度の密度となったＧＰＬ細胞に、１０分の１量のＧＰＣＭＶ−ＢＡＣΔ９Ｋ感染ＧＰＬ細胞を加え、６０〜７０％の細胞が細胞変性効果により剥がれるまで数日間培養後、培養液を回収し、室温で１７００×ｇの遠心を１０分間行い、その上清を回収し、５ｍＬの２０％蔗糖含有ＰＢＳを最初に加えた超遠心用３０ｍＬ遠心管に、蔗糖層と混ぜることがないようにゆっくりと重層し、７０，０００×ｇで２時間超遠心（ローター：日立工機Ｐ３２ＳＴ）した。上清を除き、ペレットを上層した上清の５０〜１００分の１量のＰＢＳに懸濁後、分注し、中和抗体価解析用の精製ウイルスバンクとして−８０℃に保存し、使用時には各分注を使いきりとした。【００６７】
中和抗体価解析用の精製ウイルスバンクのウイルス力価は、以下のようにして決定した。−８０℃に保存した精製ウイルスの分注を融解し、ＰＢＳにて希釈系列を作製後、２４穴プレートに播種し８０〜９０％となっているＧＰＬ細胞に感染させ、１〜２日培養した。蛍光倒立顕微鏡下で、ＧＦＰを発現するＧＰＣＭＶのフォーカスを計数した。なお、このＧＦＰ発現にもとづく力価決定法と、ＧＰＣＭＶに対するモノクローナル抗体を用いた免疫染色法は同じ結果となることは予め確認された。【００６８】
＜ＧＰＣＭＶ／線維芽細胞中和抗体価解析＞
ＧＰＬ細胞を用いた中和抗体価解析は、フォーカス数減少活性（フォーカスリダクション活性）を用いて行った。解析には、９６穴プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ  ３５９６）に２×１０４細胞／ウェルで播種したＧＰＬ細胞を一晩培養したプレートを使用した。各免疫血清（抗ＧＰＣＭＶ−ｇＢ血清、抗ＧＰＣＭＶ−Ｐｅｎｔａｍｅｒ血清、又はＧＰＣＭＶ−ｇＢ＋ＧＰＣＭＶ−Ｐｅｎｔａｍｅｒ血清）を、培地を用いて段階希釈して所定の濃度になるように調製し、約１３５ＰＦＵのＧＰＣＭＶ−ＢＡＣΔ９Ｋ株を加えて５０μＬとした混合液を、３７℃で３０分反応させた。陰性コントロールとして血清の代わりに培地を加えた反応液を同様に反応させた。解析プレートの細胞に２０μＬ／ウェルを接種後、３７℃で２時間培養し、細胞に吸着させた。反応液を除去し、培地を加えて２日間培養した。ＧＦＰ発現フォーカス数を、蛍光顕微鏡を用いて計数し、抗体を含まない反応液での結果を基準に、各免疫血清による細胞数の割合の抑制率から、中和抗体価を判定した。結果を表１に示す。【００６９】
＜ＧＰＣＭＶ／マクロファージ中和抗体価解析試験＞
マクロファージを用いた中和抗体価解析は、感染細胞数減少活性を用いて行った。解析には、上述の方法にて９６穴プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ  ３５９６）で単球から分化させたマクロファージを用いた。各免疫血清を、培地を用いて段階希釈して所定の濃度になるように調製し、約１３５０ＰＦＵのＧＰＣＭＶ−ＢＡＣΔ９Ｋ株を加えて５０μＬとした混合液を、３７℃で３０分反応させた。陰性コントロールとして血清の代わりに培地を加えた反応液を同様に反応させた。解析プレートの細胞に２０μＬ／ウェルを接種後、３７℃２時間培養し、マクロファージに吸着させた。反応液を除去し、培地を加えて２日間培養した。ＧＦＰ発現マクロファージを、蛍光顕微鏡を用いて計数し、抗体を含まない反応液での結果を基準に、各免疫血清による細胞数の割合の抑制率から、中和能を判定した。結果を表１に示す。
【表１】
2020121983.tif 000003
【００７０】
＜ＧＰＣＭＶ／結合抗体価解析＞
ＧＰＣＭＶ−ｇＢ又はＧＰＣＭＶ−ＰｅｎｔａｍｅｒをＰＢＳ（Ｗａｋｏ）で１μｇ／ｍＬに希釈し、ＭａｘｉＳｏｒｐ  ｐｌａｔｅ（Ｎｕｎｃ）に５０μＬ入れ、４℃でオーバーナイトインキュベートすることによって固相化した。固相化後、プレートをＰＢＳで洗浄し、各免疫血清（抗ＧＰＣＭＶ−ｇＢ血清、抗ＧＰＣＭＶ−Ｐｅｎｔａｍｅｒ血清、又はＧＰＣＭＶ−ｇＢ＋ＧＰＣＭＶ−Ｐｅｎｔａｍｅｒ血清）の希釈液をプレートのウェルに１００μＬ加え室温でインキュベートした。１時間後、ＰＢＳＴで洗浄し、検出抗体ｇｏａｔ  ａｎｔｉ−Ｇｕｉｎｅａ  Ｐｉｇ  ＩｇＧ  ＨＲＰ  ｓｅｃｏｎｄａｒｙ  ａｎｔｉｂｏｄｙ（ＲＯＣＫＬＡＮＤ社  Ｃａｔ．６０６−１０３−１２９）をプレートのウェルに１００μＬ加え、室温でインキュベートした。１時間後、ＰＢＳＴで洗浄し、ＴＭＢ（ＳＩＧＭＡ社  Ｃａｔ．Ｔ−４４４４）をプレートのウェルに１００μＬ加えることによって発色させた。３０分後、１Ｎ硫酸で反応を停止させ、マイクロプレートリーダー（モレキュラーデバイス社）で発色値（Ｏ．Ｄ．４５０ｎｍ／６５０ｎｍ）を測定した。測定した結果を図９、及び図１０に示す。ＧＰＣＭＶ−ｇＢ＋ＧＰＣＭＶ−Ｐｅｎｔａｍｅｒ免疫血清は、ＧＰＣＭＶ−ｇＢ及びＧＰＣＭＶ−Ｐｅｎｔａｍｅｒいずれに対しても高い結合抗体価を示していた。このことから、ＧＰＣＭＶ−ｇＢ＋ＧＰＣＭＶ−Ｐｅｎｔａｍｅｒ免疫群では、これら２種の抗原両方に対する免疫応答が誘導されたと考えられる。【００７１】
＜モルモット経胎盤感染試験＞
以下の方法でモルモットの経胎盤感染に対する各種抗原の防御能の検討を行った。まず、上記得られたＧＰＣＭＶ−ｇＢ及びＧＰＣＭＶ−Ｐｅｎｔａｍｅｒを非妊娠雌モルモット（Ｈａｒｔｌｅｙ、４週齢）に免疫した。【００７２】
群構成としては、ＧＰＣＭＶ−ｇＢ群、ＧＰＣＭＶ−Ｐｅｎｔａｍｅｒ群、ＧＰＣＭＶ−ｇＢ＋ＧＰＣＭＶ−Ｐｅｎｔａｍｅｒ併用群、及び対照群として生理食塩水群の４群構成（各群４０匹）とした。各抗原を２５μｇ／匹で、アジュバントにはＡｌｕｍ＋ＣｐＧを用いた。２週間隔で計３回の筋肉内投与を行い、３回目の投与から２週間後に抗血清を回収し、各群につき４０匹分の抗血清をプールした。プールした抗血清からＰｒｏｔｅｉｎＡカラムクロマトグラフィーによる抗体画分の精製を行った。溶出後ＰＢＳに対して透析したものを抗体画分とした。【００７３】
＜モルモットＩｇＧの定量＞
抗体画分の投与量を決定するために各種モルモット抗血清中のＩｇＧ濃度をＩｇＧ定量ＥＬＩＳＡにより定量した。【００７４】
ＩｇＧ定量ＥＬＩＳＡは以下の手順で実施した。Ａｎｔｉ−ＧＵＩＮＥＡ  ＰＩＧ  ＩｇＧ  （Ｈ＆Ｌ）  （ＧＯＡＴ）  Ａｎｔｉｂｏｄｙ（ＲＯＣＫＬＡＮＤ社  Ｃａｔ．６０６−１１０２）をＰＢＳ（Ｗａｋｏ）で１μｇ／ｍＬに希釈し、ＭａｘｉＳｏｒｐ  ｐｌａｔｅ（Ｎｕｎｃ）に１００μＬ入れ、４℃でオーバーナイトインキュベートすることによって固相化した。固相化後、プレートをＰＢＳで洗浄し、各種抗血清の希釈液をプレートのウェルに１００μＬ加え室温でインキュベーションした。１時間後、ＰＢＳＴで洗浄し、ＨＲＰ標識抗モルモットＩｇＧ抗体（自家調製品）をプレートのウェルに１００μＬ加え、室温でインキュベートした。１時間後、ＰＢＳＴで洗浄し、ＴＭＢ（ＳＩＧＭＡ社Ｃａｔ．Ｔ−４４４４）をプレートのウェルに１００μＬ加えることによって発色させた。３０分後、１Ｎ  硫酸で反応を停止させ、マイクロプレートリーダー（モレキュラーデバイス社）で発色値（Ｏ．Ｄ．４５０ｎｍ／６５０ｎｍ）を測定した。標準品として抗ＨＳＶ  ｇＤ抗体（自家調製品）を用い、検量線を作成することによって抗血清中のＩｇＧ濃度を定量した。【００７５】
その結果、抗血清中のＩｇＧ濃度は、ＧＰＣＭＶ−ｇＢ群が２．７１ｍｇ／ｍＬ、ＧＰＣＭＶ−Ｐｅｎｔａｍｅｒ群が２．９４ｍｇ／ｍＬ、ＧＰＣＭＶ−ｇＢ＋ＧＰＣＭＶ−Ｐｅｎｔａｍｅｒ併用群が３．４４ｍｇ／ｍＬ、及び対照群が１．５６ｍｇ／ｍＬであった。【００７６】
血清中ＩｇＧ濃度が１．６〜３．４ｍｇ／ｍＬであったため、１回の投与で１匹分のＩｇＧを投与するために、２ｍＬ／匹ずつの投与を想定して、Ａｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ（メルク社  ＵＦＣ９０３０２４）を用いてタンパク質濃縮を行い、１５〜３０ｍｇ／ｍＬのＩｇＧ精製品を調製した。【００７７】
ＩｇＧ精製品を妊娠モルモットに投与し、翌日、ＧＰＣＭＶを感染させた（各群４匹）。感染から１週間後に抗体画分を追加投与した。【００７８】
Ｈａｒｔｌｅｙモルモット（妊娠４週齢）の腹腔内にＩｇＧ精製品を２ｍＬずつ投与した。翌日、野生型ＧＰＣＭＶを１×１０６ＰＦＵ／個体となるように皮下接種した。代謝された抗体を補う目的で、１週間後に腹腔内にＩｇＧ精製品を１ｍＬずつ追加投与した。感染３週間後に安楽殺後、解剖し、母体の臓器（脾臓、肝臓、腎臓、肺、唾液腺、胎盤）、胎仔の臓器（肝臓、肺、脳）を採集した。各臓器を細切後ホモジネートにした検体からウイルスＤＮＡをＭａｘｗｅｌｌ１６  Ｔｉｓｓｕｅ  ＤＮＡＰｕｒｉｆｉｃａｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ社）を用いて精製し、定量ＰＣＲによりウイルスコピー数を算出した。５×１０５個の細胞あたり１コピー以上のウイルスコピー数が検出された検体は「感染あり」と判定した。なお、定量ＰＣＲは表２に示す条件で実施した。使用したプライマー及びプローブは表３に示す。
【表２】
2020121983.tif 000004
【表３】
2020121983.tif 000005
【００７９】
［結果・考察］
結果を表４に示す。括弧内の数値は、評価した検体数（母体と胎仔は匹数で、胎盤は個数）に対してウイルス陽性となった検体数を表す。表４から、胎仔への先天性感染の抑制効果はｇＢ＋Ｐｅｎｔａｍｅｒ群が最も高かった。次いでＰｅｎｔａｍｅｒ群が高く、ｇＢ群ではほとんど効果を認めなかった。ｇＢ＋Ｐｅｎｔａｍｅｒ併用群が胎仔への感染を最も強力に抑制したことから、ＣＭＶワクチンの実用化に向けたアプローチとしては「ｇＢ及びペンタマーを併用したサブユニットワクチン」という新たな方向性が有効と期待される。
【表４】
2020121983.tif 000006
【００８０】
以上より、ｇＢ＋Ｐｅｎｔａｍｅｒ併用群は、モルモット母体の初感染にはほとんど効果を示さなかったにも関わらず、胎児への感染を有意に抑制した。その抑制効果は、ｇＢ及びＰｅｎｔａｍｅｒのそれぞれの単独群に比べて高いものであった。今回の結果は、母体から胎児へのウイルスの移行を、抗ｇＢ抗体及び抗Ｐｅｎｔａｍｅｒ抗体が共存することによって、より有効に抑制できることを、動物病態モデルを用いて示した初めての例であり、ｇＢ＋Ｐｅｎｔａｍｅｒの併用療法がヒトの先天性感染抑制にも有効である可能性を強く示唆するものである。【００８１】
［ヒトへの適用／人体用ワクチン抗原の作製］
上記実施例にて、モルモットへの併用抗原の投与が経胎盤感染予防に効果があることが証明され、人体用ＣＭＶワクチン候補として、併用抗原が有効であると示唆された。そこで、ヒトへの適用のため、ＨＣＭＶのｇＢ及びペンタマー抗原を作製した。【００８２】
＜ＨＣＭＶ−ｇＢの調製及び性状解析＞
ＡＤ１６９株に由来するＨＣＭＶ−ｇＢのエクトドメインをベースに性状改善のためのアミノ酸変異を導入した改変ＨＣＭＶ−ｇＢタンパク質「ｇＢ１−６８２−ｆｍ３Ｍｖ９」（以下、「ＨＣＭＶ−ｇＢ」と呼ぶ）を作製し（配列番号１）、ＧＰＣＭＶ−ｇＢと同様の方法で発現及び精製を行った。【００８３】
性状解析もＧＰＣＭＶ−ｇＢと同様に行った。ＳＤＳ−ＰＡＧＥではＨＣＭＶ−ｇＢのバンドがメインバンドとして確認された（図５）。また、ＨＰＬＣゲルろ過分析においては、期待された三量体のピークがメインピークとして確認された（図６）。【００８４】
＜ＨＣＭＶ−Ｐｅｎｔａｍｅｒの調製及び性状解析＞
次に、Ｍｅｒｌｉｎ株に由来するＨＣＭＶペンタマーのエクトドメインを作製した。ＨＣＭＶペンタマーのエクトドメインを構成するタンパク質として、Ｍｅｒｌｉｎ株に由来するＵＬ１２８（配列番号４）、ＵＬ１３０（配列番号５）、ＵＬ１３１（配列番号６）、ｇＬ（配列番号３）、及びｇＨ（配列番号９）を使用した。【００８５】
人工遺伝子合成及び遺伝子工学的手法を用いて、ＨＣＭＶペンタマーのエクトドメインを構成する各タンパク質の遺伝子配列をｐＣＡＧＧＳ１．ｄｈｆｒ．ｎｅｏベクターにそれぞれクローニングし、野生型ＵＬ１２８発現プラスミド、野生型ＵＬ１３０発現プラスミド、野生型ＵＬ１３１発現プラスミド、野生型ｇＬ発現プラスミド、野生型ｇＨ発現プラスミドを作製した。次に、分泌型ＣＭＶ五量体を作製するために、野生型ｇＨ発現プラスミドを改変した。非特許文献１４を参考に、ｇＨのＣ末端の位置７１６番目以降のアミノ酸を欠損させ、その位置にＬＧＧリンカーとＨｉｓｔａｇを付加する改変を行った。【００８６】
発現及び精製はＧＰＣＭＶ−ｇＢと同様の方法で行い、ＨＣＭＶペンタマーのエクトドメイン（以下、「ＨＣＭＶ−Ｐｅｎｔａｍｅｒ」と呼ぶ）精製品を得た。【００８７】
ＧＰＣＭＶ−ｇＢと同様に性状解析を実施したところ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥではＨＣＭＶ−Ｐｅｎｔａｍｅｒを構成する各種構成成分のバンドがそれぞれ確認された（図７）。また、ＨＰＬＣゲルろ過分析においては、期待された五量体（ペンタマー）のピークがメインピークとして確認された（図８）。【００８８】
＜ＨＣＭＶ／モルモット免疫原性試験＞
作製したＨＣＭＶ−ｇＢ及びＨＣＭＶ−Ｐｅｎｔａｍｅｒを用いて、モルモット免疫原性試験を実施した。４週齢、雌のＨａｒｔｌｅｙモルモットに対し、各抗原（抗ＨＣＭＶ−ｇＢ血清、抗ＨＣＭＶ−Ｐｅｎｔａｍｅｒ血清、又はＨＣＭＶ−ｇＢ＋ＨＣＭＶ−Ｐｅｎｔａｍｅｒ血清）は２５μｇ／匹になるように、生理食塩水（大塚製薬）で調製し、アジュバントとして１０ｖ／ｖ％のＡｌｕｍ（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ）及び５０μｇ／匹のＣｐＧ  ＯＤＮ１８２６（ｅｕｒｏｆｉｎｓ）を使用した。調製した抗原液を２週間間隔で３回、Ｈａｒｔｌｅｙモルモット（雌  ３匹／群）に筋肉内接種（１００μＬ、後肢両足）し、最終免疫の２週間後にイソフルラン吸入麻酔下での心臓採血により全採血した。得られた血液は凝固促進剤入り分離管で血清分離し、５６℃、３０分間非働化処理を行ったものを免疫血清とし、これら免疫血清を用いて結合抗体誘導能解析（結合抗体価解析）を実施した。【００８９】
＜ＨＣＭＶ／結合抗体価解析＞
ＨＣＭＶ−ｇＢ又はＨＣＭＶ−ＰｅｎｔａｍｅｒをＰＢＳ（Ｗａｋｏ）で１μｇ／ｍＬに希釈し、ＭａｘｉＳｏｒｐ  ｐｌａｔｅ  （Ｎｕｎｃ）に５０μＬ入れ、４℃でオーバーナイトインキュベートすることによって固相化した。固相化後、プレートをＰＢＳで洗浄し、各免疫血清（抗ＨＣＭＶ−ｇＢ血清、抗ＨＣＭＶ−Ｐｅｎｔａｍｅｒ血清、又はＨＣＭＶ−ｇＢ＋ＨＣＭＶ−Ｐｅｎｔａｍｅｒ血清）の希釈液をプレートのウェルに１００μＬ加え室温でインキュベートした。１時間後、ＰＢＳＴで洗浄し、検出抗体ｇｏａｔ  ａｎｔｉ−Ｇｕｉｎｅａ  Ｐｉｇ  ＩｇＧ  ＨＲＰ  ｓｅｃｏｎｄａｒｙ  ａｎｔｉｂｏｄｙ（ＲＯＣＫＬＡＮＤ社  Ｃａｔ．６０６−１０３−１２９）をプレートのウェルに１００μＬ加え、室温でインキュベートした。１時間後、ＰＢＳＴで洗浄し、ＴＭＢ（ＳＩＧＭＡ社  Ｃａｔ．Ｔ−４４４４）をプレートのウェルに１００μＬ加えることによって発色させた。３０分後、１Ｎ硫酸で反応を停止させ、マイクロプレートリーダー（モレキュラーデバイス社）で発色値（Ｏ．Ｄ．４５０ｎｍ／６５０ｎｍ）を測定した。測定した結果を図１１、及び図１２に示す。ＨＣＭＶ−ｇＢ＋ＨＣＭＶ−Ｐｅｎｔａｍｅｒ免疫血清は、ＨＣＭＶ−ｇＢ及びＨＣＭＶ−Ｐｅｎｔａｍｅｒいずれに対しても高い結合抗体価を示していた。このことから、ＨＣＭＶ−ｇＢ＋ＨＣＭＶ−Ｐｅｎｔａｍｅｒ免疫群では、これら２種の抗原両方に対する免疫応答が誘導されたと考えられる。【００９０】
＜ＨＣＭＶ既感染者ＰＢＭＣに対するＩＦＮγ誘導能の評価＞
細胞性免疫の評価にはＰＢＭＣ（ＣＴＬ社  Ｃａｔ．ＣＴＬ−ＣＰ１）を使用した。ＰＢＭＣは、ＣＴＬ社のデータによりＨＣＭＶ感染歴があることが確かめられた２１名のドナー由来検体を使用した。【００９１】
ＣＴＬ  Ａｎｔｉ−Ａｇｇｒｅｇａｔｅ  Ｗａｓｈ（２０×）（ＣＴＬ社  Ｃａｔ．ＣＴＬ−ＡＡ−００１）を３７℃に設定したウォーターバスで１０分間温めて完全に解凍し、１９ｍＬのＲＰＭＩ１６４０培地（ｇｉｂｃｏ社  Ｃａｔ．２１８７０−０７６）にＣＴＬ  Ａｎｔｉ−Ａｇｇｒｅｇａｔｅ  Ｗａｓｈ（２０×）を１ｍＬ加えてＣＴＬ  Ａｎｔｉ−Ａｇｇｒｅｇａｔｅ  Ｗａｓｈ（１×）とした。調製したＣＴＬ  Ａｎｔｉ−Ａｇｇｒｅｇａｔｅ  Ｗａｓｈ（１×）は、使用まで３７℃、５％ＣＯ２条件下で２０分以上静置し、１時間以内に使用した。ＣＴＬ−Ｔｅｓｔ  Ｍｅｄｉｕｍ（ＣＴＬ社  Ｃａｔ．ＣＴＬＴ−０１０）にはＬ−Ｇｌｕｔａｍｉｎｅ（１００×）（Ｗａｋｏ社  Ｃａｔ．０７３−０５３９１）を１％（ｖ／ｖ）添加し、使用まで３７℃、５％ＣＯ２条件下で２０分以上静置した。【００９２】
ＰＢＭＣが入ったバイアルを３７℃に設定したウォーターバスで８分間温め、その後バイアルを２回転倒混和し、ＰＢＭＣを懸濁した。バイアル中の細胞溶液を全て５０ｍＬチューブへ移し、さらにＣＴＬ  Ａｎｔｉ−Ａｇｇｒｅｇａｔｅ  Ｗａｓｈ（１×）１ｍＬをバイアルに入れ、細胞溶液を完全に回収した。５０ｍＬチューブを穏やかに回しながら、ＣＴＬ  Ａｎｉ−Ａｇｇｒｅｇａｔｅ  Ｗａｓｈ（１×）３ｍＬを１５秒間かけて加え、さらにＣＴＬ  Ａｎｔｉ−Ａｇｇｒｅｇａｔｅ  Ｗａｓｈ（１×）５ｍＬを穏やかに加えて細胞溶液とした。細胞溶液を急速加速、急速減速設定で遠心（３３０×ｇ、１０分、室温）し、遠心後の上清を除去し、タッピングにて細胞を懸濁した。ＣＴＬ  Ａｎｔｉ−Ａｇｇｒｅｇａｔｅ  Ｗａｓｈ（１×）を１０ｍＬ添加し、２回転倒混和した。細胞溶液を急速加速、急速減速設定で遠心（３３０×ｇ、１０分、室温）し、遠心後の上清を除去し、タッピングにて細胞を懸濁した。細胞を１×Ｌ−Ｇｌｕｔａｍｉｎｅ−ＣＴＬ−Ｔｅｓｔ  Ｍｅｄｉｕｍで３×１０６細胞／ｍＬ〜５×１０６細胞／ｍＬの範囲内の濃度に希釈した。【００９３】
Ｈｕｍａｎ  ＩＦＮ−γ  ＥＬＩＳｐｏｔＰＬＵＳ（ＭＡＢＴＥＣＨ社  Ｃａｔ．３４２０−４ＨＳＴ−２）に付属のプレートを３００μＬ／ウェルのＤ−ＰＢＳ（−）（Ｗａｋｏ社  Ｃａｔ．０４５−２９７９５）で４回洗浄した後、１×Ｌ−Ｇｌｕｔａｍｉｎｅ−ＣＴＬ−Ｔｅｓｔ  Ｍｅｄｉｕｍを３００μＬ／ウェル添加し、３０分以上室温に静置した。プレートからＣＴＬ−Ｔｅｓｔ  Ｍｅｄｉｕｍを除き、細胞懸濁液を１００  μＬ／ウェル添加した。さらにＨＣＭＶ−ｇＢ、ＨＣＭＶ−Ｐｅｎｔａｍｅｒ、ＨＣＭＶ−ｇＢ抗原とＨＣＭＶ−Ｐｅｎｔａｍｅｒ抗原の混合、Ｈｕｍａｎ  ＩＦＮ−γ  ＥＬＩＳｐｏｔＰＬＵＳに付属のポジティブコントロール（ｍＡＢ  ＣＤ３−２）を１×Ｌ−Ｇｌｕｔａｍｉｎｅ−ＣＴＬ−Ｔｅｓｔ  Ｍｅｄｉｕｍで希釈したもの、およびネガティブコントロールとして１×Ｌ−Ｇｌｕｔａｍｉｎｅ−ＣＴＬ−Ｔｅｓｔ  Ｍｅｄｉｕｍを、それぞれ１００μＬ／ウェル添加し懸濁した。プレートをアルミ箔で覆い、３７℃、５％ＣＯ２条件下で１２〜２４時間培養した。【００９４】
Ｈｕｍａｎ  ＩＦＮ−γ  ＥＬＩＳｐｏｔＰＬＵＳに付属の検出抗体（７−Ｂ６−１−ｂｉｏｔｉｎ）を０．５％ＦＢＳ（ＣＯＲＮＩＮＧ社  Ｃａｔ．３５−０７６−ＣＶ）−ＰＢＳで１μｇ／ｍＬに希釈し、検出抗体液を作製した。プレートから培地とともに細胞を除去し、３００μＬ／ウェルのＤ−ＰＢＳ（−）で５回洗浄した。検出抗体液を１００μＬ／ウェル添加し、室温で２時間静置した。Ｈｕｍａｎ  ＩＦＮ−γ  ＥＬＩＳｐｏｔＰＬＵＳに付属のＳｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ−ＨＲＰを０．５％ＦＢＳ−ＰＢＳで１０００倍に希釈し、Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ−ＨＲＰ溶液を作製した。プレートから検出抗体液を除去し、３００μＬ／ウェルのＤ−ＰＢＳ（−）で５回洗浄後、Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ−ＨＲＰ溶液を１００μＬ／ウェル添加し、室温で１時間静置した。Ｈｕｍａｎ  ＩＦＮ−γ  ＥＬＩＳｐｏｔＰＬＵＳに付属のＲｅａｄｙ−ｔｏ−ｕｓｅ  ＴＭＢを０．２２μｍフィルターに通し、Ｒｅａｄｙ−ｔｏ−ｕｓｅ  ＴＭＢ溶液を作製した。プレートからＳｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ−ＨＲＰ溶液を除去し、３００μＬ／ウェルのＤ−ＰＢＳ（−）で５回洗浄した。プレートにＲｅａｄｙ−ｔｏ−ｕｓｅ  ＴＭＢ溶液を１００μＬ／ウェル添加し、明瞭なスポットが観察されるまで室温に５〜３０分の範囲内で静置後、３００μＬ／ウェルの純水で３回洗浄した。プレートフレームからストリップウェルを取り外してプレート底面のＰＶＤＦ膜側を純水ですすぎ、ストリップウェルを一晩乾燥させた。ＣＴＬ社  ＥＬＩＳＰＯＴリーダーにて画像撮影を行い、ＣＴＬ社ＩｍｍｕｎｏＳｐｏｔ  Ｓ５  ｖｅｒｓｅ  Ａｎａｌｙｚｅｒにてスポット数のカウントを行った。全検体のネガティブコントロール（対照）ウェルにおけるスポット数平均値よりも５倍以上のスポット数が見られた検体を「抗原刺激によるＩＦＮγ誘導反応陽性」と判定した。判定結果から得られたＥＬＩＳｐｏｔ陽性率（全ドナーにおける「抗原刺激によるＩＦＮγ誘導反応陽性」ドナーの割合）を図１３に示す。【００９５】
［結果・考察］
ＨＣＭＶ−ｇＢもしくはＨＣＭＶ−Ｐｅｎｔａｍｅｒで刺激した場合と比べて、ＨＣＭＶ−ｇＢとＨＣＭＶ−Ｐｅｎｔａｍｅｒを混合して刺激した場合はより多くのドナーでＩＦＮγ誘導が見られた。このことから、ＨＣＭＶ既感染者の中にはＨＣＭＶ−ｇＢとＨＣＭＶ−Ｐｅｎｔａｍｅｒのうち、いずれか一方の抗原に対してはＩＦＮγを誘導できない集団が存在しており、なおかつＨＣＭＶ−ｇＢとＨＣＭＶ−Ｐｅｎｔａｍｅｒを併用してワクチンとして投与することで、両抗原のいずれに対する細胞性免疫誘導能をも有する集団のみならず、いずれか一方の抗原に対してのみしか細胞性免疫を誘導できない集団に対しても細胞性免疫を誘導できると考えられる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】令和3年4月28日(2021.4.28)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６０】
ＧＰ７５のエクトドメイン（１−６９８ａａ、配列番号１６）をコードする遺伝子を人工合成し、ｐＣＡＧＧＳ１−ｄｈｆｒ−ｎｅｏにクローニングした。ＧＰ７５のＣ末端にはＨｉｓ−ｔａｇが付加されるようにデザインした。更に、ＨＣＭＶのｇＬのオルソログであるＧＰ１１５（１−２５８ａａ、配列番号１１）をコードする遺伝子、ＨＣＭＶのＵＬ１２８のオルソログであるＧＰ１２９（１−１７９ａａ、配列番号１２）をコードする遺伝子、ＨＣＭＶのＵＬ１３０のオルソログであるＧＰ１３１（１−１９２ａａ、配列番号１３）をコードする遺伝子、ＨＣＭＶのＵＬ１３１のオルソログであるＧＰ１３３（１−１２７ａａ、配列番号１４）をコードする遺伝子を、それぞれ人工合成し、ｐＣＡＧＧＳ１−ｄｈｆｒ−ｎｅｏにクローニングした。発現及び精製はＧＰＣＭＶ−ｇＢと同様の方法で行い、ＧＰＣＭＶペンタマーのエクトドメイン（以下、「ＧＰＣＭＶ−Ｐｅｎｔａｍｅｒ」と呼ぶ）精製品を得た。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】変更
【補正の内容】
【配列表】
2020121983000001.app
【国際調査報告】
2020121983.tif 000020
2020121983.tif 000021
2020121983.tif 000022
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