(57)【要約】  本発明は、容易に作製可能であり、かつ、身体の組織、特に皮膚や粘膜などの上皮組織の状態を改善することができる新たな局所適用組成物の提供。特に、本発明は、口腔上皮細胞由来の細胞外小胞を含む局所適用組成物を提供する。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
口腔上皮細胞由来の細胞外小胞を含む、局所適用組成物。
【請求項２】
細胞外小胞がエクソソームを含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
細胞外小胞がエクソソームについて濃縮されている、請求項１又は２に記載の組成物。
【請求項４】
口腔上皮細胞がヒト由来である、請求項１−３のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項５】
上皮への塗布により適用される、請求項１−４のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項６】
皮膚、粘膜、又は上皮を有する他の器官の健康な組織構造又は機能を回復するための、請求項１−５のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項７】
肝細胞増殖因子、血管内皮増殖因子、線維芽細胞増殖因子、及び結合組織増殖因子からなる群から選択される１以上の増殖因子が治療効果を有する疾患又は状態を治療するための、請求項１−６のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項８】
皮膚又は粘膜の創傷を治療するための、請求項１−７のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項９】
皮膚又は粘膜の瘢痕を治療又は予防するための、請求項１−７のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１０】
内臓器官の線維化を治療又は予防するための、請求項１−７のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１１】
請求項１−１０のいずれか１項に記載の組成物を含む医薬品。
【請求項１２】
請求項１−１０のいずれか１項に記載の組成物を含む化粧品。
【請求項１３】
口腔上皮細胞を培地中で培養する工程、
培養物から口腔上皮細胞を分離して馴化培地を回収する工程、
馴化培地から口腔上皮細胞の細胞外小胞を単離する工程、及び、
単離した細胞外小胞を局所適用に適した媒体中に添加する工程、
を含む、局所適用組成物の製造方法。
【請求項１４】
細胞外小胞中のエクソソームを濃縮する工程をさらに含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
上皮細胞がヒト由来である、請求項１３又は１４に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、口腔上皮細胞由来の細胞外小胞、特にエクソソームを含む、皮膚等の上皮に局所適用するための組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、アンメットメディカルニーズを解決するために、細胞や組織を用いた再生医療等製品の研究や開発が進められている。例えば上皮細胞は上皮欠損部位に移植することにより、創傷治癒を促進することが知られており、これを用いた再生医療等製品などが上市されている。また、口腔上皮細胞の培養物が、角膜の再生や食道粘膜の治癒の改善などの用途に使用されている。【０００３】
また、様々な細胞種から分泌されるエクソソーム等の細胞外小胞（Extracellular vesicles；EVs）についても、その再生促進効果についての研究が進められており、その研究の多くは骨髄間葉系間質細胞(BM-MSC)-由来のエクソソームについて行われている（Journal of Translational Medicine (2015), 13:49）。しかしながら、上皮細胞由来の細胞外小胞に関しての研究はほとんど報告されておらず、特に口腔上皮細胞由来の細胞外小胞については、ウイルス免疫学に関する報告（Journal of Virology, Vol.90 No.7 (2016), p. 3469-3479）が存在するに過ぎない。
【発明の概要】
【０００４】
本発明は、容易に作製可能であり、かつ、身体の組織、特に皮膚や粘膜などの上皮組織の状態を改善することができる新たな局所適用組成物を提供することを目的とする。
【０００５】
本願発明者らは、口腔上皮細胞を培養する際などに培地中に分泌される細胞外小胞を含む組成物が、皮膚や粘膜等の表皮や上皮組織の創傷治癒促進等の効果を有することを見出し、本願発明を完成するに至った。
即ち、本発明は、口腔上皮細胞由来の細胞外小胞を含む局所適用組成物を提供する。さらに、本発明は、口腔上皮細胞を培地中で培養する工程、培養物から口腔上皮細胞を分離して馴化培地を回収する工程、馴化培地から口腔上皮細胞の細胞外小胞を単離する工程、及び、単離した細胞外小胞を局所適用に適した媒体中に添加する工程を含む、局所適用組成物の製造方法を提供する。
【０００６】
本発明の局所適用組成物は、口腔上皮細胞の培養液等から細胞外小胞を単離することにより容易に作製可能であり、皮膚又は粘膜などの表皮の熱傷や潰瘍における創傷治癒や線維化軽減による瘢痕の治療又は予防に使用できる。また、組織修復を促すことにより表皮の状態を改善することにより若返り効果を有する。さらに線維化軽減による効果として心臓・肺・肝臓・腎臓などの線維症を改善させることができる。
【図面の簡単な説明】
【０００７】
【図１】細胞外小胞を含む画分のウエスタンブロットの結果を示す。
【図２】単離した細胞外小胞の電子顕微鏡図を示す（スケールバー：50nm）。
【図３】線維芽細胞増殖アッセイの結果を示す。
【図４】線維芽細胞に対する細胞毒性アッセイの結果を示す。
【図５】線維芽細胞における各種増殖因子の遺伝子発現解析（図５a）、ELISAによるHGF-放出アッセイ（図５b）、及びIV型コラーゲン遺伝子の発現解析（図５c）の結果を示す。
【図６】扁平上皮癌細胞を使用した増殖試験の結果を示す。
【図７】ラット全層創傷治癒モデルを用いたインビボ試験の観察結果（図７a）及びヘマトキシリン・エオシンとピクロシリウスレッドによる染色後の顕微鏡図（図７b）を示す。
【図８】ラット全層創傷治癒モデルを用いたインビボ試験における創傷面積測定の結果を示す。
【図９】ブタ皮膚創傷モデルを用いたインビボ試験におけるヘマトキシリン・エオシン染色後の顕微鏡図を示す（スケールバー：500nm）。
【発明を実施するための形態】
【０００８】
本発明の局所適用組成物は、口腔上皮細胞由来の細胞外小胞を含む。口腔上皮細胞は、口腔内粘膜の表面部を構成する細胞であり、上皮組織を構成する任意の細胞を含む。その採取方法及びそのための器具等は当業者に周知である。また、研究用に様々な細胞が開発又は市販されており、それらの細胞を使用することも可能である。
本発明では、好ましくは哺乳動物由来の口腔上皮細胞が使用される。口腔上皮細胞は、最終の局所適用組成物が適用される生物種とは異なる生物種由来のものであってもよいが、ヒトへの適用を考慮した安全性及び入手容易性などの観点から、好ましくはヒト由来の口腔上皮細胞が使用される。上記ヒトは特に限定されず非成人/成人を問わないが、好ましくは成人由来の口腔上皮細胞が使用される。
【０００９】
口腔上皮細胞からの細胞外小胞の単離は、当業者が任意の方法により行うことが可能である。例えば、口腔上皮細胞を培地中で培養することにより細胞外小胞が培地中に分泌されるため、培養後の培養物から細胞及び残渣を除いた培地（馴化培地）を回収した上で、周知の手法によりその馴化培地から口腔上皮細胞由来の細胞外小胞を単離することができる。
【００１０】
細胞の培養に使用される培地及び培養条件などは特に限定されないが、好ましくは液体培地、例えば高グルコースダルベッコ改変イーグル培地が使用される。培養に必要な他の成分を培地に適宜添加してもよく、例えばF-12 Hamなどの栄養混合物、ソル・コーテフ等のコルチコステロイド、抗生物質、自家血清等を含めてもよい。培養の条件は特に限定されず、使用する細胞や必要とする細胞外小胞の量に応じて当業者が適宜設定することが可能であるが、例えば３３〜４０℃、好ましくは３５〜３８℃、より好ましくは３７℃の温度で、１２時間〜２５日間、好ましくは１〜２０日間、より好ましくは３〜１８日間培養される。必要により培養の途中で培地交換を行ってもよく、それらの培地物はその後まとめて使用することができる。上記の培養を行った後、遠心分離又は濾過などにより培養物から細胞を分離することにより馴化培地が回収される。回収した馴化培地についてさらに遠心分離又は濾過を行って細胞残渣等の不純物をさらに取り除いてもよい。遠心分離及び濾過の条件は当業者が適宜決定することが可能であるが、例えば、培養物をまず200xg〜400xg、好ましくは250xg〜350xgで10分程度、遠心分離して細胞を分離し、その後2500xg〜3500xgで再度遠心分離するか、例えば0.22μmの濾過を行うことにより細かい不純物を除去することができる。
【００１１】
前述の通り、馴化培地から細胞外小胞を単離する方法は周知であって特に限定されず、当業者が任意の手法により単離することができる。必要により限外濾過等によって培地を濃縮した後、例えば、サイズ排除クロマトグラフィー、超遠心法、精密濾過法、密度勾配遠心法などを単独で、または適宜組み合わせて実施することができる。好ましくは、限外濾過を行って濃縮した培地についてサイズ排除クロマトグラフィーを行うことにより細胞外小胞が単離される。限外濾過には、例えばメルクミリポア社のアミコン（100kDa、1000kDa等）等を製造者の指示手順に従って用いることが可能である。
【００１２】
単離される細胞外小胞は、好ましくはエクソソームを含む。一般に細胞外小胞の種類の区別（エクソソーム、マイクロベシクル等）は必ずしもすべて学術的に明確にされておらず、さらに特定の種類の細胞外小胞を選択的に単離することは技術的に容易ではないため、いずれの手法を用いて細胞外小胞体を単離したとしても通常はエクソソームを含むこととなる。従って、本発明の実施において、細胞外小胞を単離するための態様や条件は、細胞外小胞の種類を厳密に区別して特定のものを標的とするようなものに限定されることはない。
【００１３】
しかしながら、実施する個別の単離手法について、その分離精度が許容するのであれば、細胞外小胞のうちエクソソームが濃縮されるような条件で単離操作を行ってもよく、また、エクソソームを濃縮する工程を別途追加で行ってもよい。例えば、サイズ排除クロマトグラフィーにより細胞外小胞を単離する場合、30〜200nm、好ましくは40〜150nm、さらに好ましくは80〜130mmのサイズの物質を含む画分を回収することによって、エクソソームの割合を上昇させてエクソソームの濃縮することができる。
【００１４】
上記のように細胞外小胞を単離した後、その細胞外小胞を局所適用に適した媒体中に添加することにより本発明の局所適用組成物を得ることができる。媒体の種類は、身体に適用する態様に応じて液体、固体、半固体などから当業者が適宜選択することができ、例えば溶液、ゲル、ローション、クリーム、軟膏、硬膏とするための任意の媒体が挙げられる。また、本発明の局所適用組成物は、上記の態様について許容される任意のアジュバント、添加剤等をさらに含んでもよい。最終組成物中における細胞外小胞の濃度は、治療効果又は所望の効果を奏するのに有効な量となるように、組成物の用途や所望の効果等に基づいて適宜設定できるが、局所適用する部位の面積に応じて0.2μg〜2mg/cm2、好ましくは2.0〜200μg/cm2、さらに好ましくは10〜100μg/cm2、特に好ましくは20〜40μg/cm2の濃度となるように組成物中に添加することが好ましい。
【００１５】
本発明における局所適用とは、本発明の組成物による効果を意図する身体の部位に直接作用する態様で適用することを意味し、好ましくは当該部位に接触する態様での使用を意味する。好ましくは、本発明の組成物は身体表面の上皮に塗布することにより適用される（固体の組成物を接触させることを含む）。局所適用はいわゆる外用を含むが、適用される部位は身体表面部（外部から直接視認可能な部位、例えば皮膚、角膜）への適用には限定されず、口腔、鼻腔、消化器官等の粘膜に適用する態様を含む。さらに、外科的処置等を通して内臓器官（心臓、肺、肝臓、腎臓、甲状腺、副甲状腺、膵臓、胆嚢など）に直接適用する態様も含む。好ましくは、本発明の組成物は皮膚又は粘膜に適用することが好ましく、これらの部位に塗布することにより適用される。
【００１６】
本発明の組成物を身体の所定の部位に局所適用することにより、皮膚、粘膜、又は上皮を有する他の器官（心臓、肺、肝臓、腎臓、甲状腺、副甲状腺、膵臓、胆嚢など）の健康な組織構造又は機能を回復し、創傷治癒の促進や瘢痕の治療又は軽減等の効果を得ることができる。上記の態様として、例えば、皮膚又は粘膜の創傷の治癒を促進することより創傷又は疾患の状態を改善することができる。創傷としては任意の態様に基づくものが含まれ、外傷、手術痕、さらに熱傷を含む。この治癒の促進により、皮膚又は粘膜の痛みが緩和される共に、瘢痕を治療又は予防することによって適用部位の外観の見た目を向上させることができる。さらに、前述の通り繊維化が問題となる内臓器官（心臓、肺、肝臓、腎臓など）に適用することによって、該器官の線維化を治療又は予防することができる。
【００１７】
その他、本発明の組成物は、後述の実施例に示すように線維芽細胞を刺激して、肝細胞増殖因子（HGF）、血管内皮増殖因子（VEGF）、線維芽細胞増殖因子（FGF）、及び結合組織増殖因子（CTGF）等の増殖因子の放出を促進することが示されているため、組成物を所定の部位に適用することによって、上記の増殖因子が治療効果を有する任意の疾患又は状態を予防又は治療する効果が予想される。
【００１８】
本発明の組成物を医薬品に配合することにより、上記の治療又は予防効果を有する医薬品を得ることができる。特に、後述の実施例に示すように、口腔上皮細胞由来の細胞外小胞は、骨髄間葉系間質細胞由来の細胞外小胞とは対照的に腫瘍増殖を促進しないことが確認されているため、様々な疾患又は症状に対する医薬品に安全に配合することができる。
【００１９】
さらに、本発明の組成物は、皮膚等の組織の状態を改善し、組織修復を促進することによる表皮の若返り効果を有するため、化粧品に配合することによって健康な皮膚に対しても好ましい効果をもたらすことができる。
以下、実施例により本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例の態様に限定されるものではない。
【実施例】
【００２０】
１．細胞外小胞の単離
健常成人ドナーの口内から生検で単離した細胞から臨床グレードの口腔粘膜細胞シートを製造する際に使用した馴化培地をCellSeed社より得た。提供を受けた馴化培地は、ケラチノサイト培養培地（75％の高グルコースダルベッコ改変イーグル培地、25％の栄養混合物F-12 Ham、0.475g/LのL-グルタミン、5μg/mlのヒューマリンレギュラー（Humulin Regular）、0.4μg/mLのソル・コーテフ、1nMのコレラ毒素、2nMのT3、10ng/mLのEGF、40μg/mLのゲンスマイシン（Gensumycin）、0.14μg/mLのファンギゾンおよび5％の自家血清）で細胞を37℃で培養した際のものであり、培養の第5、8、10、12、13、14、15及び16日目における培地交換の際にそれぞれ8〜12mLの馴化培地を回収したものを合わせて、細胞外小胞の単離に使用した。【００２１】
回収した馴化培地を、300xg、10分間、4℃の遠心分離し、次いで、0.22μmの限外濾過によって細胞及び細胞残渣を取り除いた。限外濾過カラム（アミコン、メルクミリポア）100kDa（5,000xg、4℃）、次いで10kDa（7,500xg、4℃）により培地を濃縮し、細胞外小胞（エクソソームを含む）を遊離タンパク質から分離するためサイズ排除クロマトグラフィーカラム（qEVカラム、Izon）に加えた。カラム製造者の指示書に従い、画分7〜9（各500μl）を細胞外小胞画分として回収した。【００２２】
２．総タンパク質濃度測定
Pierce BCAプロテインアッセイキット（ThermoFisher Scientific）を使用してタンパク質濃度を測定した。細胞外小胞をRIPA（Radioimmunoprecipitation assay）バッファーで1:1に希釈し、5分間（オン/オフ: 15秒/15秒、氷浴中、高セッティング（コスモバイオ・超音波破砕装置））で超音波処理した。超音波処理した細胞外小胞及び細胞溶解物をMilliQ水（メルクミリポア）で希釈し、BCA（ビシンコニン酸）アッセイを指示書に従って実施した。【００２３】
３．細胞溶解物の調製
線維芽細胞（CC-2509、Lonza）および口腔ケラチノサイト（#2610、ScienCell）から細胞溶解物を得た。細胞懸濁液（細胞約 4x106個）を300xgで5分間遠心し、上清を捨て、ペレットをPBSに再懸濁して再度遠心した。ペレットを、1%のプロテアーゼ/ホスファターゼ阻害剤カクテル（Cell Signaling Technology）を含むRIPA（Radioimmunoprecipitation assay）バッファー（Sigma）に再懸濁し、氷浴中で5分間（15秒オン、15秒オフのインターバル）超音波処理した。次いで、サンプルを4℃、8000xgで10分間遠心し、上清を回収し、等量ずつに分けて以後の分析に使用した。
上記の通り調製した細胞外小胞及び細胞溶解物を使用して、分子生物学的手法、電子顕微鏡観察、ナノ粒子トラッキング解析により細胞外小胞の存在及び特性を確認・測定し、さらにそれらの機能をインビトロ研究で分析した。【００２４】
４．ウエスタンブロット
細胞溶解物又は細胞外小胞単離物をLaemmliサンプルバッファー（BioRad）で1:1に希釈し、95℃で5分間加熱し、その後氷上で冷却した。サンプルをNuPage 4-12% 1.5x15 ウェルゲル（ThermoFisher）上にロードし、電気泳動（200V、125mA、25分；パワーステーション 1000XP；Atto）を行い、その後、iBlot（Invitrogen）の11分プログラムを使用してタンパク質をニトロセルロースメンブレン（タンパク質iBlotゲル転写スタック、Invitrogen）上に転写した。その後のブロッキング、抗体インキュベーション、及び洗浄のステップは傾斜式シェーカー上で実施した。5% 粉ミルク（CellSignaling）を含むTBS-T（BioRad）を使用して60分間フィルターのブロッキングを行い、4℃、オーバーナイトで一次抗体に曝露した。オービタルシェーカー上でフィルターをTBS-Tで3x10分間洗浄し、室温で二次抗体に60分間曝露し、その後再度3x10分間、TBS-Tで洗浄した。フィルターからバッファーを抜き、検出剤（ECL Prime WB 検出キット、Sigma-Aldrich）を加えて5分間置いた。その後、LAS 4000 mini（富士フィルム）を使用してタンパク質の発現を確認した。細胞外小胞の画分由来のサンプルは、国際的に認められたマーカー（CD9及びフロチリン）について陽性であり、陰性マーカーGRP94について陰性であった（図１）。
使用した抗体及び濃度は以下の通り：CD9（#13174、Cell Signaling Technologies）、Flotillin（#18634、Cell Signaling Technologies）、GRP94（#2104、Cell Signaling Technologies）、抗-ウサギIgG、HRP-linked（#7074、Cell Signaling Technologies、1:5000）。抗体はCan Get Signal solution（東洋紡）中に希釈した。各メンブレンをストリッピングして、異なる抗体で再使用した：30分、2% SDS、0.8%β-メルカプトエタノール、Tris-HCl（pH 6.6）、50℃、その後、TBS-Tで3x10分間洗浄した。【００２５】
５．透過型電子顕微鏡観察
10μLの細胞外小胞懸濁液を銅グリッド上に20分間置き、さらに2%酢酸ウラニルを加えて1分間置いた。酢酸ウラニルを取り除き、蒸留水を加えて1分間置き、その後取り除いた。グリッドをそのまま15分間空気乾燥させ、透過型電子顕微鏡（H7650、日立）を使用して細胞外小胞（エクソソーム）の形態を確認した（図２）。【００２６】
６．ナノ粒子トラッキング解析
LM10 ナノ粒子解析装置（NanoSight）を用い、製造者の指示に従って細胞外小胞のサイズ及び数を測定した。小胞のサイズは約125nm（124.8±4.1nm(標準偏差)）であった。【００２７】
７．線維芽細胞増殖アッセイ
NHDFp13の細胞（CC-2509、Lonza）を、1,600個/ウェルの濃度で96-ウェルプレート中に播種した。翌日、培地を、細胞外小胞（2μg/mL、0.67μg/mL、0.2μg/mL）を含む血清非含有培地、細胞外小胞を含まないコントロール培地又はデキサメタゾン（10nm）含有培地に交換した。72時間後に、CCKキット（同仁化学研究所）を使用して細胞の代謝を測定した。細胞外小胞含有のサンプルは、抗瘢痕剤として一般に使用されるコルチコステロイドであるデキサメタゾンと同様に線維芽細胞の増殖を抑制することが確認された（図３）。【００２８】
８．線維芽細胞の細胞毒性及びHGF-放出アッセイ
NHDFp15の細胞（CC-2509、Lonza）を、50,000個/ウェルの濃度で24-ウェルプレート中に播種した。翌日、培地を、2μg/mLの細胞外小胞を含む血清非含有培地又は細胞外小胞を含まない血清非含有培地に交換した。72時間後、培地を回収して-80℃で凍結し、CCKキット（同仁化学研究所）を使用して細胞の代謝を測定した結果、細胞外小胞は線維芽細胞に対して細胞毒性を示さないことが確認された（図４）。また、馴化培地中の肝細胞増殖因子（HGF）含有量をELISAキット（Abcam）により測定したところ、HGF含有量が上昇していることがタンパク質レベルで確認された（図５(b)）。【００２９】
９．線維芽細胞における遺伝子発現解析
NHDFp14の細胞（CC-2509、Lonza）を、336,000個/ウェルの濃度で6-ウェルプレート中に播種した。翌日、培地を、2μg/mL細胞外小胞を含む血清非含有培地（コントロールのウェルについては細胞外小胞を含まない血清非含有培地）に交換した。72時間後、RNeasyキット（Qiagen）を使用してRNAを単離した。市販キット（OriGene）を使用してcDNAを合成し、TaqMan Fast Advanced Master Mix（ThermoFisher Scientific）を使用して、各種増殖因子について定量PCRを行った。
使用したプライマーは以下の通り：β-アクチン（4326315E-1112022、Applied Biosystem）、HGF（HS00300159_m1、ThermoFischer Scientific）、VEGFA（HS00900055_m1、ThermoFischer Scientific）、FGF2（HS00266645_m1、ThermoFischer Scientific）、CTGF（HS01026927_g1、ThermoFischer Scientific）。IV型コラーゲン解析については、継代5回、17回のNHDF細胞、及びプライマー Col4a1（HS00266237_m1、ThermoFischer Scientific）を使用して同様に行った。【００３０】
図５(a)に示すように、細胞外小胞は線維芽細胞を刺激して、肝細胞増殖因子（HGF）、血管内皮増殖因子A（VEGFA）、線維芽細胞増殖因子（FGF2）、及び結合組織増殖因子（CTGF）などの重要な増殖因子の遺伝子発現を有意に増加させた。なお、肝細胞増殖因子（HGF）の結果については、前述の図５(b)において肝細胞増殖因子放出の増加がタンパク質レベルで確認されたELISAの結果とも対応した。また、図５(c)に示すように、古い（高継代）線維芽細胞は、若い（継代5回）線維芽細胞と比較して、IV型コラーゲン-遺伝子を低いレベルで発現した。しかしながら、「古い」線維芽細胞が一旦細胞外小胞に曝露されると「若い」細胞と同様の発現を示した。【００３１】
１０．癌細胞増殖試験
市販の扁平上皮癌細胞（TR146）を、10% FBS、1%抗生物質を含むDMEM中で培養した。細胞を、10,000個/cm2の密度で96-ウェルプレート中に播種し、翌日、培地を様々な濃度の細胞外小胞を含む血清非含有培地、又は、細胞外小胞を含まないコントロール培地と交換した。48時間後、Cell Counting Kit-8（CCK、同仁化学研究所）を用いて細胞数を測定した。その結果、口腔上皮細胞由来の細胞外小胞は、扁平上皮癌細胞（TR146）の増殖を濃度依存的に低減することが確認された（図６）。【００３２】
１１．細胞外小胞のラベリング
蛍光メンブレン色素（PKH26-GL-1KT、Sigma Aldrich）で細胞外小胞をラベリングし、細胞外小胞を500μLの希釈液Cで希釈し、すぐに500μLの希釈液C（2μLのPKH26を含む）を再度加え、穏やかに混合しながら5分間のインキュベーション工程を行った。その後、2.5mLのPBSを加え、10kDaフィルター（アミコン）を使用して細胞外小胞を再濃縮した。この工程を合計3回行った。コントロールとして、細胞外小胞無しで全ての工程を同様に行った。【００３３】
１２．ラット全層創傷治癒モデル
6週齢のオスのSprague Dawleyラット（n=3）を使用した。イソフルランを使用して知覚麻酔を起こさせ、ドミトール（0.375mg/kg）、ミダゾラム（2mg/kg）、酒石酸ブトルファノール（2.5mg/kg）の混合物を用いてその状態を維持した。背部の被毛を取り除き、5mm 生検トレパン（Kai メディカル）を使用して全層創傷（一匹あたりn=4）を作成した。20μl（4.44μg）の細胞外小胞懸濁液又はコントロール懸濁液を創傷に加え、45分間保持させ、デジタルカメラ及び実体顕微鏡（オリンパス社製：MVX10）を用いてイメージを取得し、その後、テガダーム創傷包帯を使用して創傷を被覆した。翌日、ラットを麻酔して写真撮影した後、１日目と同様に14μL（3.1μg）の細胞外小胞懸濁液を追加して創傷に加えた。
第3、4、5日目に動物を麻酔してイメージを取得し、第6日にと殺した。8mm生検トレパン（Kai メディカル）を用いて創傷を摘出して組織学分析に使用した。また、別途実施した同様の実験において、ラット（n=3）を第17日にと殺した。クリオスタット（MicroEdge）を用いて組織切片（8μm）を作製し、ヘマトキシリン・エオシン及びピクロシリウスレッド（Polysciences）で染色した。ピクロシリウスレッドで染色したスライドを偏光顕微鏡下で可視化し、盲検でイメージを評価した。
図７(a)に示すように、蛍光標識した細胞外小胞からのシグナルは、適用後5日までラットの創傷ベッドで確認された。また、図７(b)に示すように、ヘマトキシリン・エオシン及びピクロシリウスレッド-染色により示されるように、細胞外小胞は、ラットの全層皮膚創傷における創傷治癒を促進した。さらに、図８に示すように、盲検評価に基づいて、細胞外小胞による治療群は、第6日及び第17日において、コントロールと比較して有意に小さい創傷面積を示した。【００３４】
１３．ブタ皮膚創傷治癒試験
ブタ（Japanese farm pig）（n=1）を、ドミトール、ミダゾラム及び酒石酸ブトルファノールで鎮静化し、セボフルランを用いて麻酔を維持した。背部の皮膚を剃り、ヨウ素で滅菌した。生検トレパン（Kai メディカル）を使用して5mmの皮膚創傷を作り、20μL（4.75μg）の細胞外小胞又はコントロール（PBS）懸濁液を創傷に加え、45分間保持させ、その後創傷をテガダームで覆った。7日後に電気メスを用いて創傷を解剖した。解剖したサンプルをクリオスタット（MicroEdge）により切片化し、ヘマトキシリン・エオシンで染色した。その結果、コントロール群について観察された再上皮化は限定的であったのに対して、細胞外小胞処置群については完全な再上皮化が確認された（図９の矢印）。また、細胞外小胞処置群について副作用の兆候はみられなかった。【００３５】
上記の各実施例に示すように、ヒト口腔上皮細胞の産生する細胞外小胞を含む組成物を、ラットの皮膚（表皮、真皮）を切除した創傷モデルに直接塗布することにより、生理食塩水を塗布したコントロール群に比べて、創傷治癒が促進、瘢痕が軽減、さらに組織修復による若返り効果が認められた。
また、特に図６の癌細胞増殖試験の結果に示されるように、口腔上皮細胞由来の細胞外小胞は、骨髄間葉系間質細胞由来の細胞外小胞とは対照的に、腫瘍増殖を促進しないことが確認された。従って、本発明の組成物は、様々な疾患又は症状に対する医薬品に安全に配合することができる利点を有する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【国際調査報告】
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