(57)【要約】  非アルコール性脂肪肝疾患の検出方法は、哺乳動物の体液に由来する試料を取得することと、試料における２−アミノアジピン酸、２−オキソカプロン酸、２−オキソグルタル酸、アラニン、グルタミン酸、チロシン、乳酸、尿酸、バリン、ピルビン酸、フェニルアラニン、およびプロリンからなる群から選択される少なくとも一つの分子の検出を行うことと、を備える。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳動物の体液に由来する試料を取得することと、
前記試料における２−アミノアジピン酸、２−オキソカプロン酸、２−オキソグルタル酸、アラニン、グルタミン酸、チロシン、乳酸、尿酸、バリン、ピルビン酸、フェニルアラニン、およびプロリンからなる群から選択される少なくとも一つの分子の検出を行うことと、を備える非アルコール性脂肪肝疾患の検出方法。
【請求項２】
請求項１に記載の非アルコール性脂肪肝疾患の検出方法において、
前記検出における、前記分子に対応する検出信号の大きさに基づいて得られた、前記哺乳動物が、非アルコール性脂肪肝疾患を患っているか否かについての情報を出力する、非アルコール性脂肪肝疾患の検出方法。
【請求項３】
請求項２に記載の非アルコール性脂肪肝疾患の検出方法において、
前記検出信号の大きさに基づいて、前記試料における前記分子の濃度を算出し、算出された前記濃度が所定の閾値に基づく条件を満たしているか否かに基づいて得られた、前記哺乳動物が非アルコール性脂肪肝疾患を患っているか否かについての情報を出力する、非アルコール性脂肪肝疾患の検出方法。
【請求項４】
請求項１から３までのいずれか一項に記載の非アルコール性脂肪肝疾患の検出方法において、
前記検出は、ガスクロマトグラフィ、液体クロマトグラフィ、質量分析、ガスクロマトグラフィ／質量分析、液体クロマトグラフィ／質量分析、核磁気共鳴分光法、および免疫学的検出法の少なくとも一つにより行われる、非アルコール性脂肪肝疾患の検出方法。
【請求項５】
請求項１から３までのいずれか一項に記載の非アルコール性脂肪肝疾患の検出方法において、
前記哺乳動物は、人間である、非アルコール性脂肪肝疾患の検出方法。
【請求項６】
請求項１から３までのいずれか一項に記載の非アルコール性脂肪肝疾患の検出方法において、
前記体液は、血液である、非アルコール性脂肪肝疾患の検出方法。
【請求項７】
２−アミノアジピン酸、２−オキソカプロン酸、２−オキソグルタル酸、アラニン、グルタミン酸、チロシン、乳酸、尿酸、バリン、ピルビン酸、フェニルアラニン、およびプロリンからなる群から選択される少なくとも一つの分子の測定試薬を含む、非アルコール性脂肪肝疾患検出用キット。
【請求項８】
２−アミノアジピン酸、２−オキソカプロン酸、２−オキソグルタル酸、アラニン、グルタミン酸、チロシン、乳酸、尿酸、バリン、ピルビン酸、フェニルアラニン、およびプロリンからなる群から選択される少なくとも一つの分子を含む、非アルコール性脂肪肝疾患検出用バイオマーカー。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、非アルコール性脂肪肝疾患の検出方法、非アルコール性脂肪肝疾患検出用キットおよび非アルコール性脂肪肝疾患検出用バイオマーカーに関する。
【背景技術】
【０００２】
非アルコール性脂肪肝疾患（ｎｏｎａｌｃｏｈｏｌｉｃ  ｆａｔｔｙ  ｌｉｖｅｒ  ｄｉｓｅａｓｅ；ＮＡＦＬＤ）は、脂肪沈着のみが認められ、予後が良好な肝疾患である単純性脂肪肝（ｓｉｍｐｌｅ  ｓｔｅａｔｏｓｉｓ；ＳＳ）と、高度の線維化や肝発癌をきたす進行性の非アルコール性脂肪性肝炎（ｎｏｎａｌｃｏｈｏｌｉｃ  ｓｔｅａｔｏｈｅｐａｔｉｔｉｓ；ＮＡＳＨ）を包括する疾患概念である（非特許文献１参照）。ＳＳはＮＡＳＨを引き起こす場合がある等、進行すると重篤な疾患を引き起こすため、ＳＳを含めたＮＡＦＬＤをより早い段階、または可能であるなら疾患を発症する前にその発症の予測を行うことは重要である。【０００３】
しかし、現在、ＮＡＦＬＤの発症を予測する診断手法は確立していない。ＳＳのスクリーニングや程度を把握する方法として、腹部超音波検査やＣＴ、ＭＲＩ等の画像検査が用いられる。ＮＡＳＨの診断は生検が標準的な方法である。この肝生検は侵襲的であり、安全性と経済性の面でスクリーニングには適していない。【０００４】
簡便かつ非侵襲的な方法でＮＡＦＬＤおよびＮＡＳＨを診断できるバイオマーカーの開発は現在最も注目されている領域の一つであるが、臨床の現場で有効に活用できるバイオマーカーは確立されていない。近年、多数のタンパク質を網羅的に解析することができるプロテオミクスやメタボロミクスの技術の進歩により、これらの技術を用いたＮＡＦＬＤ患者の血清等におけるバイオマーカーの探索が行われるようになってきている（非特許文献２参照）。【０００５】
非特許文献３および特許文献１には、ＮＡＳＨ等の患者と、健常者とを対象に、血漿中の脂質代謝物を定量した結果が報告されている。非特許文献４には、各種肝臓疾患の患者と、健常者等を対象に、ジペプチド等を定量した結果が報告されている。特許文献２には、アセトアミノフェンが投与された、ＮＡＳＨ等の患者および健常者を対象に、血漿中のアセトアミノフェン−グルクロニドを定量した結果が報告されている。特許文献３には、ＮＡＦＬＤ患者と、健常者とを対象に、血清中のキニノーゲン由来のペプチドを定量した結果が報告されている。特許文献４には、各種肝臓疾患の患者と、健常者とを対象に、血清中の可溶性ＬＲ１１を定量した結果が報告されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】日本国特表２０１０−５００５６６号公報
【特許文献２】日本国特表２０１２−５０４６２９号公報
【特許文献３】国際公開第２００９／０５１２５９号
【特許文献４】日本国特開２０１４−１６７４４６号公報
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Naga  Chalasani,  Zobair  Younossi,  Joel  E.  Lavine,  Anna  Mae  Diehl,  Elizabeth  M.  Brunt,  Kenneth  Cusi,  Michael Charlton, Arun J. Sanyal. "The diagnosis and management of non-alcoholic fatty liver disease: practice guideline by the American Gastroenterological Association, American Association for the Study of Liver Diseases, and American College of Gastroenterology" Gastroenterology,(米国), American Gastroenterological Association, 2012年6月、Volume 142, Issue 7, p.1592-1609
【非特許文献２】Marc-Emmanuel Dumas, James Kinross, Jeremy K. Nicholson. "Metabolic Phenotyping and Systems Biology Approaches to Understanding Metabolic Syndrome and Fatty Liver Disease." Gastroenterology,(米国), American Gastroenterological Association, 2014年1月、Volume 146, Issue 1, p.46-62
【非特許文献３】Puneet Puri, Michelle M. Wiest, Onpan Cheung, Faridoddin Mirshahi, Carol Sargeant, Hae-Ki Min, Melissa J. Contos, Richard K. Sterling, Michael Fuchs, Huiping Zhou, Steven M. Watkins, and Arun J. Sanyal1. "The plasma lipidomic signature of nonalcoholic steatohepatitis." Hepatology,(米国), American Association for the Study of Liver Diseases, 2009年12月、Volume 50, Issue 6, p.1827-1838
【非特許文献４】Tomoyoshi Soga, Masahiro Sugimoto, Masashi Honma, Masayo Mori, Kaori Igarashi, Kasumi Kashikura, Satsuki Ikeda, Akiyoshi Hirayama, Takehito Yamamoto, Haruhiko Yoshida, Motoyuki Otsuka, Shoji Tsuji, Yutaka Yatomi, Tadayuki Sakuragawa, Hisayoshi Watanabe, Kouei Nihei, Takafumi Saito, Sumio Kawata, Hiroshi Suzuki, Masaru Tomita, Makoto Suematsu. "Serum metabolomics reveals γ-glutamyl dipeptides as biomarkers for discrimination among different forms of liver disease." Journal of Hepatology,(オランタ゛王国), European Association of Study of the Liver, 2011年10月、Volume 55, Issue 4, p.896-905
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
これらの報告では、ＮＡＦＬＤについての被験者の数が数十人以下と多くなかった。より多くの症例を対象とした各種分子の定量に基づいて得られた、より信頼性の高いバイオマーカーを用いて、被験者由来の試料からＮＡＦＬＤに関する情報を得ることが望ましい。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明の第１の態様によると、非アルコール性脂肪肝疾患の検出方法は、哺乳動物の体液に由来する試料を取得することと、前記試料における２−アミノアジピン酸、２−オキソカプロン酸、２−オキソグルタル酸、アラニン、グルタミン酸、チロシン、乳酸、尿酸、バリン、ピルビン酸、フェニルアラニン、およびプロリンからなる群から選択される少なくとも一つの分子の検出を行うことと、を備える。
本発明の第２の態様によると、第１の態様の非アルコール性脂肪肝疾患の検出方法において、前記検出における、前記分子に対応する検出信号の大きさに基づいて得られた、前記哺乳動物が、非アルコール性脂肪肝疾患を患っているか否かについての情報を出力することが好ましい。
本発明の第３の態様によると、第２の態様の非アルコール性脂肪感疾患の検出方法において、前記検出信号の大きさに基づいて、前記試料における前記分子の濃度を算出し、算出された前記濃度が所定の閾値に基づく条件を満たしているか否かに基づいて得られた、前記哺乳動物が非アルコール性脂肪肝疾患を患っているか否かについての情報を出力することが好ましい。
本発明の第４の態様によると、第１から第３までのいずれかの態様の非アルコール性脂肪肝疾患の検出方法において、前記検出は、ガスクロマトグラフィ、液体クロマトグラフィ、質量分析、ガスクロマトグラフィ／質量分析、液体クロマトグラフィ／質量分析、核磁気共鳴分光法、および免疫学的検出法の少なくとも一つにより行われることが好ましい。
本発明の第５の態様によると、第１から第４までのいずれかの態様の非アルコール性脂肪肝疾患の検出方法において、前記哺乳動物は、人間であることが好ましい。
本発明の第６の態様によると、第１から第５までのいずれかの態様の非アルコール性脂肪肝疾患の検出方法において、前記体液は、血液であることが好ましい。
本発明の第７の態様によると、非アルコール性脂肪肝疾患検出用キットは、２−アミノアジピン酸、２−オキソカプロン酸、２−オキソグルタル酸、アラニン、グルタミン酸、チロシン、乳酸、尿酸、バリン、ピルビン酸、フェニルアラニン、およびプロリンからなる群から選択される少なくとも一つの分子の測定試薬を含む。
本発明の第８の態様によると、非アルコール性脂肪肝疾患検出用バイオマーカーは、２−アミノアジピン酸、２−オキソカプロン酸、２−オキソグルタル酸、アラニン、グルタミン酸、チロシン、乳酸、尿酸、バリン、ピルビン酸、フェニルアラニン、およびプロリンからなる群から選択される少なくとも一つの分子を含む。
【発明の効果】
【００１０】
本発明によれば、数千人を対象とした大規模な分析に基づいて得られたより信頼性の高いバイオマーカーに基づいて、より正確に被験者由来の試料からＮＡＦＬＤに関する情報を得ることができる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】図１は、一実施形態の検出方法の流れを示すフローチャートである。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
以下、図を参照して本発明を実施するための形態について説明する。以下の実施形態の非アルコール性脂肪肝疾患（ＮＡＦＬＤ）の検出方法は、対象の個体に由来する試料における所定の分子の検出を行い、当該検出に基づいてこの個体がＮＡＦＬＤを患っているか否かについての情報を取得するものである。
【００１３】
上記所定の分子は、ＮＡＦＬＤを患っている個体由来の試料と、健常な個体由来の試料とにおいて濃度が異なる分子である。試料中の当該分子を検出することで、個体がＮＡＦＬＤを患っているか否かについての情報を得られるため、上記所定の分子は、ＮＡＦＬＤのバイオマーカーであり、以下、マーカーと呼ぶ。
【００１４】
本実施形態におけるＮＡＦＬＤのマーカーは、２−アミノアジピン酸、２−オキソカプロン酸、２−オキソグルタル酸、アラニン、グルタミン酸、チロシン、乳酸、尿酸、バリン、ピルビン酸、フェニルアラニン、およびプロリンからなる群から選択される。本実施形態の非アルコール性脂肪肝疾患の検出方法では、この群から選択される少なくとも一つのマーカーの検出を行い、検出されたマーカーに対応する検出信号の大きさに基づいて、上記個体がＮＡＦＬＤを患っているか否かの情報を取得することができる。
なお、以下の実施形態において、「マーカーを検出する」とは、試料に含まれているマーカーを定量するための検出を行うことを指し、イオン化されたマーカー、解離されたマーカー、またはマーカーの誘導体等の、マーカー由来の物質を直接検出するがマーカー自体を直接検出しない場合も含む。
【００１５】
（試料について）
ＮＡＦＬＤを患っている個体由来の試料と、健常な個体由来の試料とにおいてマーカーの濃度が異なれば、対象となる個体の生物種は特に限定されないが、哺乳動物が好ましく、人間がより好ましい。
【００１６】
ＮＡＦＬＤを患っている個体由来の試料と、健常な個体由来の試料とにおいてマーカーの濃度が異なれば、対象となる個体の任意の体液を用いて試料を調製することができるが、当該体液は、血液が好ましい。以下では、人間の血液に由来する試料におけるマーカーを検出する例を用いて説明する。本実施形態のＮＡＦＬＤの検出方法の対象となる人間を被験者とよぶ。
【００１７】
被験者となる対象は、特に限定されないが、例えばＮＡＦＬＤと診断されていない人間である。人間ドック等、定期的な健康診断を受ける人間を対象とすることが好ましいが、健康診断を受ける生命保険の加入予定者等でもよい。アルコールを所定の量以上摂取している人間や、所定の疾患を現在または過去に患っている者は、適宜対象から除外してもよい。上記所定の量は、例えばエタノール換算で男性３０ｇ／日以上、女性２０ｇ／日以上である。上記所定の疾患は、例えば、肝疾患、糖尿病、脂質異常症、高尿酸血症または悪性疾患である。
【００１８】
（マーカーの検出について）
試料におけるマーカーの検出方法は、検出されたマーカーの濃度が、ＮＡＦＬＤに対応する濃度か否かを所望の精度で判別することができれば特に限定されない。
【００１９】
定量性等の観点から、試料に含まれるマーカーは、ガスクロマトグラフィ、液体クロマトグラフィ、質量分析、核磁気共鳴分光法、若しくは、これらの組合せ、またはＥＬＩＳＡに代表される免疫学的検出法により検出されることが好ましい。様々な種類の物質を含む試料から、目的のマーカーを好適に分離して検出する観点から、試料に含まれるマーカーは、ガスクロマトグラフィ／質量分析（以下、ＧＣ／ＭＳと呼ぶ）または液体クロマトグラフィ／質量分析（ＬＣ／ＭＳと呼ぶ）により検出されることがより好ましい。ここで、ＧＣ／ＭＳおよびＬＣ／ＭＳは、タンデム質量分析やＭＳｎ等の複数回の質量分離を行う場合も含むものとする。
【００２０】
従って、試料に含まれるマーカーを検出する検出装置または検査装置としては、ガスクロマトグラフ、液体クロマトグラフ、質量分析計、ＮＭＲ分光計、またはこれらを組み合わせた装置が用いられる。上述の通り、ガスクロマトグラフ−質量分析計（以下、ＧＣ−ＭＳと呼ぶ）によりＧＣ／ＭＳを行ったり、液体クロマトグラフ−質量分析計（以下、ＬＣ−ＭＳと呼ぶ）によりＬＣ／ＭＳを行うことが好ましい。質量分析計はシングル質量分析計でも２段階以上の質量分離が可能な質量分析計でもよい。質量分析計の内部でこれらの質量分離を行う質量分析器についてもその種類は特に限定されず、四重極マスフィルタ、イオントラップおよび飛行時間型質量分析器等を適宜含むものとすることができる。
【００２１】
一方、検出の容易さや迅速さ等の観点から、試料に検出試薬を加え、当該検出試薬とマーカーとの化学反応を利用してマーカーの濃度を検出することが好ましい。例えば、検出試薬は、マーカーとの化学反応により発色する指示薬を含むことができ、当該指示薬を加えた試料溶液の色調からマーカーの濃度を検出することができる。
【００２２】
上述のガスクロマトグラフィ、液体クロマトグラフィ、質量分析若しくは核磁気共鳴分光法に用いる消耗品、または上記検出試薬を備える非アルコール性脂肪肝疾患検出用キットが提供される。このようなキットを用いて本実施形態の非アルコール性脂肪肝疾患の検出方法を行うことで、より迅速に、かつ／またはより簡便に、被験者がＮＡＦＬＤを患っているか否かについての情報を取得することができる。
【００２３】
（試料の前処理について）
被験者から採血等により得られた試料は、適宜保管された後、前処理に供される。試料は、血液のまま保管されてもよいし、血液を遠心分離して得られた血漿または血清の状態で保管されてもよい。試料の保管方法は特に限定されず、冷凍保存、冷蔵保存または常温での保存を行うことができる。
【００２４】
マーカーを検出するために試料を検出装置に供する前の前処理の方法は特に限定されない。ＧＣ／ＭＳを行う場合、試料に内部標準を加え、溶媒抽出した後に遠心濃縮、凍結乾燥および誘導体化を適宜行うことができる。内部標準は、検出するマーカーのｍ／ｚや試料の種類（血清、血漿等）等に合わせて適宜選択することができる。例えば血清試料においてｍ／ｚ  ５００以下の領域を測定する場合、血清に含まれない合成化合物である２−イソプロピルリンゴ酸等を適宜用いることができる。誘導化の方法は特に限定されず、例えば凍結乾燥後の試料にメトキシアミン溶液を加えオキシム化した後、Ｎ−メチル−Ｎ−トリメチルシリルトリフルオロアセトアミド（ＭＳＴＦＡ）を加えてシリル化することができる。前処理が行われた試料は、検出装置に導入される。
【００２５】
（検出により得られたデータの解析について）
検出により得られたデータを解析する方法は特に限定されず、試料におけるマーカーの濃度（以下、マーカー濃度と呼ぶ）が算出できれば良い。当該データの解析は、パーソナルコンピュータ等の情報処理装置や、検出装置に含まれる処理装置等の解析装置により行われることが好ましいが、人間が行ってもよい。質量分析によりマーカーの検出を行った場合には、マススペクトルやマスクロマトグラムに対応するデータが作成される。その後、これらにおけるピークの強度や面積に基づいてマーカーの検出量が算出され、マーカーの検出量を内部標準の検出量で割った値と、内部標準の既知の濃度との積等によりマーカー濃度が算出される。
【００２６】
マーカー濃度が算出されたら、マーカー濃度が所定の閾値（以下、マーカー閾値と呼ぶ）に基づく条件を満たすか否かにより、被験者がＮＡＦＬＤを患っているか否か、またはＮＡＦＬＤを患っているリスクが高いか否かが判定（以下、罹患判定と呼ぶ）される。マーカー閾値は、過去に測定された、ＮＡＦＬＤの患者および健常者におけるマーカーの濃度に基づき、例えば感度または特異度が所望の値になるように予め設定されたものを用いる。例えば、ＮＡＦＬＤの患者におけるマーカーの濃度が健常者におけるマーカーの濃度よりも統計的に高いとすると、被験者におけるマーカー濃度がマーカー閾値よりも高い場合に、被験者がＮＡＦＬＤの患者として判定されるようにマーカー閾値に基づく条件が設定されている。
【００２７】
罹患判定は１つのマーカーについてのマーカー濃度により行うことができる。複数のマーカーについてのマーカー濃度を用いて罹患判定を行う場合は、複数のマーカー濃度の値と、対応する複数のマーカー閾値とに基づいて多変量解析等により行うことができる。あるいは、複数のマーカーのうち、マーカー濃度がマーカー閾値に基づく条件を満たすものの個数により、罹患判定を行ってもよい。この場合、当該個数によりリスクを「高」「中」「低」の３段階等に分類してもよい。
【００２８】
検出により得られたデータの解析により得られた、マススペクトル若しくはマスクロマトグラム、マーカー濃度または罹患判定の結果を示す情報等は医師や医療従事者等に向けて表示される。この情報により、医師は、被験者がＮＡＦＬＤを患っているか否かについて診断を行い、被験者がＮＡＦＬＤである場合は治療を行うことができる。また、医療従事者等は被験者の状態を把握等することができる。
【００２９】
図１は、本実施形態の非アルコール性脂肪肝疾患の検出方法の流れを示すフローチャートである。本実施形態の検出方法は、ＮＡＦＬＤの診断を行うため、被験者の血液由来の試料からマーカーをイン・ビトロで検出する方法である。図１のフローチャートでは、ＧＣ／ＭＳによりマーカーを検出する例を示すが、本発明はこれに限定されない。
【００３０】
ＮＡＦＬＤの診断ステップＳ１００１において、医療従事者等により採血等が行われ、被験者から血液が取得される。ステップＳ１００１が終了したら、ステップＳ１００３が開始される。ステップＳ１００３において、検査者や、検出装置のユーザー等が血液に対して前処理を行い、血液に由来する試料を調製する。ステップＳ１００３が終了したらステップＳ１００５が開始される。
【００３１】
ステップＳ１００５において、試料がガスクロマトグラフィにより分離される。ステップＳ１００５が終了したら、ステップＳ１００７が開始される。ステップＳ１００７において、分離された試料に含まれるマーカーが質量分析により検出される。ステップＳ１００７が終了したら、ステップＳ１００９が開始される。
【００３２】
ステップＳ１００９において、マーカーに対応する検出信号の大きさから、試料におけるマーカーの濃度が算出される。ステップＳ１００９が終了したら、ステップＳ１０１１が開始される。ステップＳ１０１１において、算出されたマーカーの濃度が、所定の閾値（マーカー閾値）に基づく条件を満たしているかが判定され、判定結果に基づいて、被験者がＮＡＦＬＤを患っているか否かについてのデータが作成される。ステップＳ１０１１が終了したら、ステップＳ１０１３が開始される。
【００３３】
ステップＳ１０１３において、ステップＳ１０１１で作成されたデータに基づいて、被験者がＮＡＦＬＤを患っているか否かについての情報が表示装置等に出力される。ステップＳ１０１３が終了したら、処理が終了される。
【００３４】
上述の実施の形態によれば、次の作用効果が得られる。
（１）本実施形態の非アルコール性脂肪肝疾患の検出方法は、人間の血液に由来する試料を取得することと、試料における２−アミノアジピン酸、２−オキソカプロン酸、２−オキソグルタル酸、アラニン、グルタミン酸、チロシン、乳酸、尿酸、バリン、ピルビン酸、フェニルアラニン、およびプロリンからなる群から選択される少なくとも一つの分子の検出を行うことと、を備える。これにより、迅速に非アルコール性脂肪肝疾患のスクリーニングを行うことができる。また、これらの分子は後述の実施例に記載されたように、大規模な症例に基づいた分析により得られたマーカーであるから、正確なスクリーニングを行うことができる。
【００３５】
（２）本実施形態の非アルコール性脂肪肝疾患の検出方法において、マーカーの検出における、マーカーに対応する検出信号の大きさに基づいて得られた、被験者がＮＡＦＬＤを患っているか否かについての情報を出力する。これにより、定量されたマーカーに基づいて、より精密にスクリーニングを行うことができる。
【００３６】
（３）本実施形態の非アルコール性脂肪肝疾患の検出方法において、マーカーに対応する検出信号の大きさに基づいて、試料におけるマーカーの濃度を算出し、算出された濃度がマーカー閾値に基づく条件を満たしているか否かに基づいて、被験者がＮＡＦＬＤを患っているか否かについての情報を出力する。これにより、定量されたマーカーの濃度に基づいて、より精密にスクリーニングを行うことができる。
【００３７】
（４）本実施形態の非アルコール性脂肪肝疾患の検出方法において、マーカーの検出は、ガスクロマトグラフィ、液体クロマトグラフィ、質量分析、ガスクロマトグラフィ／質量分析、液体クロマトグラフィ／質量分析、核磁気共鳴分光法または免疫学的検出法により行うことができる。これにより、試料に含まれる各成分を分離し、より精密にスクリーニングを行うことができる。
【００３８】
（５）本実施形態に係る非アルコール性脂肪肝疾患検出用バイオマーカーは、試料における２−アミノアジピン酸、２−オキソカプロン酸、２−オキソグルタル酸、アラニン、グルタミン酸、チロシン、乳酸、尿酸、バリン、ピルビン酸、フェニルアラニン、およびプロリンからなる群から選択される少なくとも一つの分子を含む。これにより、迅速に非アルコール性脂肪肝疾患のスクリーニングを行うことができる。また、これらの分子は後述の実施例に記載されたように、大規模な症例に基づいた分析により得られたマーカーであるから、正確なスクリーニングを行うことができる。
【００３９】
本発明は上記実施形態の内容に限定されるものではない。本発明の技術的思想の範囲内で考えられるその他の態様も本発明の範囲内に含まれる。
【実施例】
【００４０】
以下の実施例では、腹部超音波所見によりＮＡＦＬＤと診断された患者（ＮＡＦＬＤ群）と、健常者（正常群）とから得られた血清をＧＣ／ＭＳに供し、ＮＡＦＬＤ群と正常群とで濃度の異なる血清中の成分を探索した分析の結果が説明される。
なお、本発明は、以下の実施例に示された数値、条件に限定されない。【００４１】
（対象者）
２０１５年１０月から２０１６年９月までに病院を訪れた日本人の人間ドック受診者からランダムに抽出した者のうち、採用基準を満たした３７３３人の血清の分析を行った。採用基準は以下の（１）〜（５）のいずれにもあてはまらないこととした。
（１）研究参加に不同意を表明した者
（２）アルコール摂取量（男性：エタノール換算３０ｇ／日以上、女性：エタノール換算２０ｇ／日以上）であった者
（３）肝疾患で治療中の現病歴を有する者
（４）糖尿病、脂質異常症、高尿酸血症の少なくとも一つについて治療中の現病歴を有する者
（５）悪性疾患について治療中の現病歴を有する者
上記採用基準を満たした者はいずれも人間ドックで腹部超音波所見が得られており、病院内の研究倫理審査委員会の承諾の下に臨床情報と血清を分析した結果とがつき合わされた。【００４２】
ＮＡＦＬＤ群と正常群とを合わせた３７３３名のうち、女性は２２５２名（６０．３％）であり、中央値年齢は５１歳（四分位範囲：４３歳〜６１歳）であった。分析対象となった研究集団のベースライン特性を以下の表１に示した。ＢＭＩの平均は、算術平均を用いた。【００４３】
【表１】
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【００４４】
（前処理）
採血後、遠心分離により血清が抽出され、採血から５〜８時間以内に−８０℃で冷凍保存された。冷凍保存された血清を２５℃に５分間置いて解凍した。解凍された血清を、１０，０００×ｇ、４℃の条件で１分間遠心を行い上清をうつしかえ、氷上に静置した。メタノール／水／クロロホルムを２．５：１：１の割合で混合した混合液２５０μＬに、内部標準溶液（０．１ｍｇ／ｍＬ  ２‐イソプロピルリンゴ酸）６μＬを添加し、この混合液をうつしかえた血清試料に加え、ボルテックスミキサーを用いて撹拌した。血清試料を３７  ℃、３０分間、１，２００ｒｐｍの条件で振とうした。振とう後の試料を１６，０００×ｇ、２５℃の条件で５分間遠心した。遠心後の上清１５０μＬを、予め、水１４０μＬを加えたチューブに添加し、ボルテックスミキサーを用いて撹拌した。撹拌後の溶液を、１６，０００×ｇ、２５℃の条件で５分間遠心した。遠心後の上清１８０μＬを新しいチューブに回収した。室温で６０分間遠心エバポレーターにより濃縮を行った。濃縮後の試料を、−８０℃下に３０分放置し凍結させた。凍結した試料をオーバーナイトで乾燥させた。乾燥後の試料は、デシケーターで保存した。乾燥した試料にメトキシアミン溶液（２０ｍｇ／ｍＬ、ピリジンで溶解）８０μＬを添加し、３７℃、３０分間、２００ｒｐｍの条件で振とうした。その後、Ｎ−メチル−Ｎ−トリメチルシリルトリフルオロアセトアミド４０μＬを添加し、３７℃、３０分間、１２００ｒｐｍの条件で振とうした。振とう後の試料を、１６０００×ｇ、２５℃の条件で５分間遠心した。遠心後の上清５０μＬをガラスバイアルに移し、このバイアルをＧＣ−ＭＳのオートサンプラーに設置した。【００４５】
（ＧＣ／ＭＳ）
ガスクロマトグラフィの条件
システム：ＧＣＭＳ−ＴＱ８０４０（島津製作所）
カラムオーブン温度：８０℃、インジェクション温度：２８０℃、インジェクションモード：スプリット導入法、キャリアガス：ヘリウム、キャリアガス流量：３９ｃｍ／ｓｅｃ
分離カラム：
ＤＢ−５（アジレントテクノロジー）：固定相；（５％−フェニル）−メチルポリシロキサン（無極性）、長さ；３０．０ｍ、内径：０．２５ｍｍ、膜厚：１．００μｍ
カラム温度プログラム：
時間（分）          温度（℃）
０                  ８０
２．５              ８０
１８．５            ２８０
２３．０            ２８０【００４６】
質量分析の条件
システム：ＧＣＭＳ−ＴＱ８０４０（島津製作所）
イオン源温度：２００℃、インターフェイス温度：２５０℃、検出器電圧：０．２ｋＶ、測定モード：スキャンモード、走査範囲：ｍ／ｚ  ８５−５００【００４７】
（データ解析）
各保持時間においてｍ／ｚを走査して得られた検出強度から、各保持時間におけるマススペクトルを作成した。過去に得られた血清試料におけるマススペクトルのデータに基づいて、作成したマススペクトルにおける各ピークに対応する代謝物（１３６種）を同定した。各代謝物に対応する検出強度を、内部標準であるイソプロピルリンゴ酸に対応する検出強度を用いて標準化し、試料における濃度を算出した。ＮＡＦＬＤ群と正常群とにおいて各代謝物の濃度を統計解析により比較した。統計解析では、単変量解析として対応の無いｔ検定およびマン・ホイットニーのＵ検定を用い、複数の代謝物についての多変量解析としてロジスティック回帰分析を用いた。ＮＡＦＬＤの診断能は、各代謝物については、ＲＯＣ（Ｒｅｃｅｉｖｅｒ  Ｏｐｅｒａｔｉｎｇ  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃ）曲線を作成し、ＲＯＣ曲線より下側の部分の面積（ＡＵＣ）を用いて評価した。複数の代謝物での検討はＬＡＳＳＯ法を用いた。代謝物および調整因子を投入したモデルでは、ｃ統計量を用いて評価した。【００４８】
（結果）
ＮＡＦＬＤ群および正常群の２群間で対応のないｔ検定を行い、有意な差が認められた代謝物はグルタミン酸、２−オキソグルタル酸、バリン、チロシン、２−アミノアジピン酸、フェニルアラニン、ピルビン酸、尿酸、２−オキソカプロン酸およびアラニン（ｐ値が最も小さい代謝物を第１位とし、ｐ値が小さい順に第１０位までの代謝物を列挙）であった。以下の表２に、これらの代謝物のｐ値とｔ統計量とを示した。ｔ統計量はいずれの代謝物においても負の値であったことから、ＮＡＦＬＤ群よりも正常群において代謝物の量が少なかったことがわかる。表中「ｘＥ−ｙ」の表記は、ｘに１０の−ｙ乗を掛けあわせた値を示し、以下の各表でも同様である。【００４９】
【表２】
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【００５０】
従属変数としてＮＡＦＬＤ群／正常群、調整因子として年齢、性およびＢＭＩを投入しＮＡＦＬＤ群と各代謝物の関連をロジスティック回帰分析で検討した結果、２−オキソグルタル酸で最も強い関連を認めた（回帰係数  ０．５６５８、標準誤差  ０．０５４７、１ＳＤ当たりの変化に対するオッズ比１．７６１、９５％信頼区間  １．５８２−１．９６０、ｐ値=４．１０Ｅ−２５）。以下の表３に２−オキソグルタル酸を含む５代謝物のロジスティック回帰分析における回帰係数、標準誤差およびｐ値を示した。なお、調整因子での調整を行わなかった時（すなわち表２における）の順位、およびt統計量とＰ値を記載した。【００５１】
【表３】
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【００５２】
診断能について検討した。従属変数はＮＡＦＬＤ群／正常群とし各代謝物についてＲＯＣ解析を行い、ＡＵＣを検討した結果、値の大きかった代謝物はグルタミン酸（ＡＵＣ＝０．７５９）、２−オキソグルタル酸（ＡＵＣ＝０．７２９）、バリン（ＡＵＣ＝０．６９９）であった。以下の表に各代謝物のＡＵＣを示す。【００５３】
【表４】
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【００５４】
前記では、単一の代謝物による診断能の検討であったが、複数の代謝物を用いて、同様に検討した。ＬＡＳＳＯ法による検討を行った結果、７０の代謝物が選択され、その場合のＡＵＣは０．８７０であった。７０の代謝物は以下の通りである。ホウ酸、フェノール、２-ヒドロキシイソ酪酸、グリコール酸、アラニン、グリシン、２-ヒドロキシ酪酸、ｐ-クレゾール、３-ヒドロキシ酪酸、３-ヒドロキシイソ酪酸、２-ヒドロキシイソ吉草酸、２-アミノ酪酸、３-ヒドロキシイソ吉草酸、バリン、尿素、カプリル酸、グリセロール、アセツル酸、リン酸、イソロイシン、プロリン、コハク酸、フマル酸、セリン、グルタル酸、２‐デオキシテトロン酸、デカン酸、アスパラギン酸、メチオニン、ピログルタミン酸、ヒドロキシプロリン、グルタミン酸、フェニルアラニン、ラウリン酸、アスパラギン、２-アミノアジピン酸、アコニット酸、グルタミン、ヒスチジン、チロシン、パルミトレイン酸、尿酸、ステアリン酸、トリプトファン、２-ピリドン、ピルビン酸、３-アミノプロパン酸、エリトリトール、トレオン酸、２-オキソグルタル酸、クレアチニン、キシリトール、アラビトール、フコース、エタノールアミンリン酸、イソクエン酸、ヒポキサンチン、馬尿酸、１，５−アンヒドロ−Ｄ−グルシトール、３-メチルヒスチジン、マンノース、リシン、パラキサンチン、シロイノシトール、３-インドールプロピオン酸、キヌレニン、シスチン、アセト酢酸、グルコン酸、リボース。【００５５】
同じ従属変数に対して調整因子として年齢、性およびＢＭＩを投入したモデルでのｃ統計量はグルタミン酸が０．８７３と最も大きくなった。以下の表５に各代謝物のｃ統計量を示した。なお、調整因子での調整を行わなかった時（すなわち表４における）の順位、およびＡＵＣを記載した。【００５６】
【表５】
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【００５７】
近年、ＢＭＩが高くない、つまり肥満とはされない群におけるＮＡＦＬＤが臨床的に問題視されている。そこで、上記解析をＢＭＩが２５未満の肥満ではない群において行ったところ、同様の結果となった。【００５８】
さらに、ＢＭＩが２３未満の標準体重未満ではない群において、上述の解析を行ったところ、同様の結果となった。【００５９】
次の優先権基礎出願の開示内容は引用文としてここに組み込まれる。
日本国特許出願２０１８年第１８０８８６号（２０１８年９月２６日出願）
【図１】
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【手続補正書】
【提出日】令和3年3月22日(2021.3.22)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳動物の体液に由来する試料を取得することと、
前記試料における２−アミノアジピン酸の検出を行うことと、を備える非アルコール性脂肪肝疾患の検出方法。
【請求項２】
請求項１に記載の非アルコール性脂肪肝疾患の検出方法において、
前記検出における、２−アミノアジピン酸に対応する検出信号の大きさに基づいて得られた、前記哺乳動物が、非アルコール性脂肪肝疾患を患っているか否かについての情報を出力する、非アルコール性脂肪肝疾患の検出方法。
【請求項３】
請求項２に記載の非アルコール性脂肪肝疾患の検出方法において、
前記検出信号の大きさに基づいて、前記試料における２−アミノアジピン酸の濃度を算出し、算出された前記濃度が所定の閾値に基づく条件を満たしているか否かに基づいて得られた、前記哺乳動物が非アルコール性脂肪肝疾患を患っているか否かについての情報を出力する、非アルコール性脂肪肝疾患の検出方法。
【請求項４】
請求項１から３までのいずれか一項に記載の非アルコール性脂肪肝疾患の検出方法において、
前記検出は、ガスクロマトグラフィ、液体クロマトグラフィ、質量分析、ガスクロマトグラフィ／質量分析、液体クロマトグラフィ／質量分析、核磁気共鳴分光法、および免疫学的検出法の少なくとも一つにより行われる、非アルコール性脂肪肝疾患の検出方法。
【請求項５】
請求項１から３までのいずれか一項に記載の非アルコール性脂肪肝疾患の検出方法において、
前記哺乳動物は、人間である、非アルコール性脂肪肝疾患の検出方法。
【請求項６】
請求項１から３までのいずれか一項に記載の非アルコール性脂肪肝疾患の検出方法において、
前記体液は、血液である、非アルコール性脂肪肝疾患の検出方法。
【請求項７】
２−アミノアジピン酸の測定試薬を含む、非アルコール性脂肪肝疾患検出用キット。
【請求項８】
２−アミノアジピン酸を含む、非アルコール性脂肪肝疾患検出用バイオマーカー。 
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００９】
本発明の第１の態様によると、非アルコール性脂肪肝疾患の検出方法は、哺乳動物の体液に由来する試料を取得することと、前記試料における２−アミノアジピン酸の検出を行うことと、を備える。
本発明の第２の態様によると、第１の態様の非アルコール性脂肪肝疾患の検出方法において、前記検出における、２−アミノアジピン酸に対応する検出信号の大きさに基づいて得られた、前記哺乳動物が、非アルコール性脂肪肝疾患を患っているか否かについての情報を出力する。
本発明の第３の態様によると、第２の態様の非アルコール性脂肪感疾患の検出方法において、前記検出信号の大きさに基づいて、前記試料における２−アミノアジピン酸の濃度を算出し、算出された前記濃度が所定の閾値に基づく条件を満たしているか否かに基づいて得られた、前記哺乳動物が非アルコール性脂肪肝疾患を患っているか否かについての情報を出力する。
本発明の第４の態様によると、第１から第３までのいずれかの態様の非アルコール性脂肪肝疾患の検出方法において、前記検出は、ガスクロマトグラフィ、液体クロマトグラフィ、質量分析、ガスクロマトグラフィ／質量分析、液体クロマトグラフィ／質量分析、核磁気共鳴分光法、および免疫学的検出法の少なくとも一つにより行われる。
本発明の第５の態様によると、第１から第４までのいずれかの態様の非アルコール性脂肪肝疾患の検出方法において、前記哺乳動物は、人間である。
本発明の第６の態様によると、第１から第５までのいずれかの態様の非アルコール性脂肪肝疾患の検出方法において、前記体液は、血液である。
本発明の第７の態様によると、非アルコール性脂肪肝疾患検出用キットは、２−アミノアジピン酸の測定試薬を含む。
本発明の第８の態様によると、非アルコール性脂肪肝疾患検出用バイオマーカーは、２−アミノアジピン酸を含む。
【国際調査報告】
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