(57)【要約】  本発明は、下記式（１）で算出される凝集自由エネルギーｇ（ｋ）の１アミノ酸残基あたりの平均値が−４．０以下であるアミノ酸配列を有する、ポリペプチドに関する。    【数１】2020158947.tif 000013［式（１）中、εｐｉ，ｊ（Ｌ）及びεａｉ，ｊ（Ｌ）は、アミノ酸残基のペアに対して算出されたエネルギーである。δｉ≦ｋ＜ｉ＋Ｌは、ｋがｉ〜ｉ＋Ｌ−１に属するときは１であり、それ以外は０である。δｊ≦ｋ＜ｊ＋Ｌは、ｋがｊ〜ｊ＋Ｌ−１に属するときは１であり、それ以外は０である。ｉ及びｊは、始点を１としたアミノ酸配列中の残基番号に対応する。λは、２．０である。］
2020158947.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記式（１）で算出される凝集自由エネルギーｇ（ｋ）の１アミノ酸残基あたりの平均値が−４．０以下であるアミノ酸配列を有する、ポリペプチド。
【数１】
2020158947.tif 000012
［式（１）中、εｐｉ，ｊ（Ｌ）及びεａｉ，ｊ（Ｌ）は、アミノ酸残基のペアに対して算出されたエネルギーである。δｉ≦ｋ＜ｉ＋Ｌは、ｋがｉ〜ｉ＋Ｌ−１に属するときは１であり、それ以外は０である。δｊ≦ｋ＜ｊ＋Ｌは、ｋがｊ〜ｊ＋Ｌ−１に属するときは１であり、それ以外は０である。ｉ及びｊは、始点を１としたアミノ酸配列中の残基番号に対応する。λは、２．０である。］
【請求項２】
配列番号３〜１６のいずれかで示されるアミノ酸配列と６０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、ポリペプチド。
【請求項３】
Ｎ末端及びＣ末端のいずれか一方又は両方にタグ配列を含む、請求項１又は２に記載のポリペプチド。
【請求項４】
前記タグ配列が、配列番号１７で示されるアミノ酸配列を含む、請求項３に記載のポリペプチド。
【請求項５】
配列番号３〜１６のいずれかで示されるアミノ酸配列を含む、ポリペプチド。
【請求項６】
配列番号１８〜３１のいずれかで示されるアミノ酸配列を含む、ポリペプチド。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか一項に記載のポリペプチドをコードする核酸。
【請求項８】
請求項１〜６のいずれか一項に記載のポリペプチドと、タンパク質とが融合されたアミノ酸配列を含む、融合タンパク質。
【請求項９】
前記タンパク質のアミノ酸配列と、前記ポリペプチドのアミノ酸配列とを含む、請求項８に記載の融合タンパク質。
【請求項１０】
前記タンパク質のアミノ酸配列中に、前記ポリペプチドのアミノ酸配列を含む、請求項８に記載の融合タンパク質。
【請求項１１】
前記タンパク質のＮ末端又はＣ末端から融合部位までのアミノ酸残基数が、前記タンパク質の総アミノ酸残基数に対して、１０％以下である、請求項１０に記載の融合タンパク質。
【請求項１２】
前記タンパク質が、構造タンパク質である、請求項８〜１１のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項１３】
前記タンパク質が、クモ糸タンパク質である、請求項８〜１２のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項１４】
請求項８〜１３のいずれか一項に記載の融合タンパク質をコードする核酸。
【請求項１５】
請求項１〜６のいずれか一項に記載のポリペプチドと、タンパク質とを融合させることを含む、前記タンパク質に自己会合能を付与する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ポリペプチドに関する。本発明はまた、当該ポリペプチドを含む融合タンパク質に関する。
【背景技術】
【０００２】
タンパク質は、タンパク質分子間の相互作用（タンパク質間相互作用）を通じて、特異的複合体を形成することがある。タンパク質間相互作用は、例えば、Ｔｗｏ−ｈｙｂｒｉｄ法等により検出することができる。また、近年、タンパク質間相互作用を予測する手法も報告されている（例えば、特許文献１及び非特許文献１）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】特許第３５８８６０５号公報
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】ＰＬＯＳ  ＣＯＭＰＵＴＡＴＩＯＮＡＬ  ＢＩＯＬＯＧＹ，２００６年，Ｖｏｌ．２，Ｉｓｓｕｅ１２，ｐｐ．１６０８−１６１８
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
タンパク質間相互作用に関与するアミノ酸配列は、種々応用することができる。例えば、所望のタンパク質にタンパク質間相互作用に関与するアミノ酸配列を有するポリペプチドを付加等することにより、当該タンパク質同士の会合を制御することが可能になると考えられる。【０００６】
タンパク質間相互作用には、タンパク質の高次構造（例えば、二次構造、三次構造）もその一要因として関与していると考えられる。タンパク質の高次構造は、例えば、温度、ｐＨ、変性剤の存在により影響を受けやすく、タンパク質が置かれる環境によっては、安定してタンパク質同士を相互作用させることができないという問題があった。【０００７】
本発明は、変性条件下でも選択的に相互作用させることができるポリペプチドを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、例えば、以下の各発明に関する。
［１］
下記式（１）で算出される凝集自由エネルギーｇ（ｋ）の１アミノ酸残基あたりの平均値が−４．０以下であるアミノ酸配列を有する、ポリペプチド。
【数１】
2020158947.tif 000003
［式（１）中、εｐｉ，ｊ（Ｌ）及びεａｉ，ｊ（Ｌ）は、アミノ酸残基のペアに対して算出されたエネルギーである。δｉ≦ｋ＜ｉ＋Ｌは、ｋがｉ〜ｉ＋Ｌ−１に属するときは１であり、それ以外は０である。δｊ≦ｋ＜ｊ＋Ｌは、ｋがｊ〜ｊ＋Ｌ−１に属するときは１であり、それ以外は０である。ｉ及びｊは、始点を１としたアミノ酸配列中の残基番号に対応する。λは、２．０である。］
［２］
配列番号３〜１６のいずれかで示されるアミノ酸配列と６０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、ポリペプチド。
［３］
Ｎ末端及びＣ末端のいずれか一方又は両方にタグ配列を含む、［１］又は［２］に記載のポリペプチド。
［４］
上記タグ配列が、配列番号１７で示されるアミノ酸配列を含む、［３］に記載のポリペプチド。
［５］
配列番号３〜１６のいずれかで示されるアミノ酸配列を含む、ポリペプチド。
［６］
配列番号１８〜３１のいずれかで示されるアミノ酸配列を含む、ポリペプチド。
［７］
［１］〜［６］のいずれかに記載のポリペプチドをコードする核酸。
［８］
［１］〜［６］のいずれかに記載のポリペプチドと、タンパク質とが融合されたアミノ酸配列を含む、融合タンパク質。
［９］
上記タンパク質のアミノ酸配列と、上記ポリペプチドのアミノ酸配列とを含む、［８］に記載の融合タンパク質。
［１０］
上記タンパク質のアミノ酸配列中に、上記ポリペプチドのアミノ酸配列を含む、［８］に記載の融合タンパク質。
［１１］
上記タンパク質のＮ末端又はＣ末端から融合部位までのアミノ酸残基数が、上記タンパク質の総アミノ酸残基数に対して、１０％以下である、［１０］に記載の融合タンパク質。
［１２］
上記タンパク質が、構造タンパク質である、［８］〜［１１］のいずれかに記載の融合タンパク質。
［１３］
上記タンパク質が、クモ糸タンパク質である、［８］〜［１２］のいずれかに記載の融合タンパク質。
［１４］
［８］〜［１３］のいずれかに記載の融合タンパク質をコードする核酸。
［１５］
［１］〜［６］のいずれかに記載のポリペプチドと、タンパク質とを融合させることを含む、上記タンパク質に自己会合能を付与する方法。
【発明の効果】
【０００９】
本発明によれば、変性条件下でも選択的に相互作用させることができるポリペプチドの提供が可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】ニワオニグモの大吐糸管しおり糸タンパク質（ＡＤＦ４）のＮ末端に配列番号１７で示されるタグ配列を付加したアミノ酸配列（＃ＧＥＮ８９１，配列番号１）における凝集自由エネルギーｇ（ｋ）を残基番号に対してプロットしたグラフである。
【図２】ニワオニグモの大吐糸管しおり糸タンパク質（ＡＤＦ３）のＮ末端に配列番号１７で示されるタグ配列を付加したアミノ酸配列（＃ＧＥＮ８８９，配列番号２）における凝集自由エネルギーｇ（ｋ）を残基番号に対してプロットしたグラフである。
【図３】ＳＤＳ及びグアニジンチオシアン酸塩を含むポリペプチド（Ｈｉｓ−ＡＤＦ３−ＮＲＣ（配列番号２０）又はＨｉｓ−ＡＤＦ３−ｓｈｏｒｔＮＲＣ（配列番号２２））液の上清及び沈殿を、変性剤（２−メルカプトエタノール）存在下でＳＤＳ−ＰＡＧＥ法により分析した結果を示す写真である。
【図４】配列番号２０又は２２で示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドのカラム精製の際の各溶液を変性剤非存在下でＳＤＳ−ＰＡＧＥ法により分析した結果を示す写真である。
【図５】変性剤添加前、変性剤（ＤＴＴ）添加後、透析開始から３時間後、６時間後及び１２時間後のポリペプチド（Ｈｉｓ−ＡＤＦ４−ＮＲＣ（配列番号１８））溶液をＳＤＳ−ＰＡＧＥ法により分析した結果を示す写真である。
【図６】変性剤（ＤＴＴ）添加直後（０時間）、透析開始から１．５時間後、３時間後、６時間後及び８時間後のポリペプチド（Ｈｉｓ−ＡＤＦ３−９４６７（配列番号３０））溶液をＳＤＳ−ＰＡＧＥ法により分析した結果を示す写真である。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
以下、本発明を実施するための形態について詳細に説明する。ただし、本発明は以下の実施形態に限定されるものではない。
【００１２】
本実施形態に係るポリペプチドは、下記式（１）で算出される凝集自由エネルギーｇ（ｋ）の１アミノ酸残基あたりの平均値が−４．０以下であるアミノ酸配列を有する。
【数２】
2020158947.tif 000004
［式（１）中、εｐｉ，ｊ（Ｌ）及びεａｉ，ｊ（Ｌ）は、アミノ酸残基のペアに対して算出されたエネルギーである。δｉ≦ｋ＜ｉ＋Ｌは、ｋがｉ〜ｉ＋Ｌ−１に属するときは１であり、それ以外は０である。δｊ≦ｋ＜ｊ＋Ｌは、ｋがｊ〜ｊ＋Ｌ−１に属するときは１であり、それ以外は０である。ｉ及びｊは、始点を１としたアミノ酸配列中の残基番号に対応する。λは、２．０である。］
【００１３】
なお、凝集自由エネルギーｇ（ｋ）は、残基番号ｋのアミノ酸残基に対して算出される値である。凝集自由エネルギーｇ（ｋ）の１アミノ酸残基あたりの平均値とは、あるアミノ酸配列における各アミノ酸残基に対して算出された凝集自由エネルギーｇ（ｋ）の合計値をアミノ酸残基数で除した値を意味する。
【００１４】
本実施形態に係るポリペプチドは、このような構成を有することから、変性条件下でも選択的に相互作用（自己会合）することができる。
【００１５】
εｐｉ，ｊ（Ｌ）及びεａｉ，ｊ（Ｌ）で表されるエネルギーは、タンパク質データベース（ＰＤＢ）に登録されている高品質の球状タンパク質（上位５００）に対して、ＤＳＳＰアルゴリズムにより帰属される二次構造を元に下記式（２）で算出した値であり、具体的には表１（Ｅｐａｂ）及び表２（Ｅａａｂ）に示すものである。
【数３】
2020158947.tif 000005
【００１６】
【表１】
2020158947.tif 000006
【００１７】
【表２】
2020158947.tif 000007
【００１８】
表１及び表２中、第１列及び第１行のアルファベットは、アミノ酸残基の一文字表記である。
【００１９】
本実施形態に係るポリペプチドは、少なくとも一部に凝集自由エネルギーｇ（ｋ）の１アミノ酸残基あたりの平均値が−４．０以下であるアミノ酸配列（以下、「自己会合配列」ともいう。）を有すればよく、当該自己会合配列に加えて、凝集自由エネルギーｇ（ｋ）の１アミノ酸残基あたりの平均値が−４．０超であるアミノ酸配列を有していてもよい。
【００２０】
自己会合配列の凝集自由エネルギーｇ（ｋ）の１アミノ酸残基あたりの平均値は、−４．５以下であることが好ましく、−５．０以下であることがより好ましく、−５．５以下であることが更に好ましく、−６．０以下であることが更により好ましく、−６．５以下であることが更により一層好ましく、−７．０以下であることが特に好ましい。
【００２１】
本実施形態に係るポリペプチドの具体例として、配列番号１で示されるアミノ酸配列の５４６番目のアミノ酸残基から５８２番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列、配列番号２で示されるアミノ酸配列の５４７番目のアミノ酸残基から５７９番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列、配列番号３〜１６で示されるアミノ酸配列が挙げられる。
【００２２】
配列番号３〜８で示されるアミノ酸配列は、配列番号１又は配列番号２で示されるアミノ酸配列中の自己会合配列の一部又は全部を含むアミノ酸配列である。
【００２３】
他の実施形態に係るポリペプチドは、配列番号３〜１６のいずれかで示されるアミノ酸配列と６０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。本実施形態に係るポリペプチドは、このような構成を有することから、変性剤存在下でも選択的に相互作用（自己会合）することができる。
【００２４】
配列番号３で示されるアミノ酸配列は、二ワオニグモ（Ａｒａｎｅｕｓ  ｄｉａｄｅｍａｔｕｓ）の大吐糸管しおり糸タンパク質（ＡＤＦ４）のＣ末端の非繰り返し領域（ＮＲＣ領域）のアミノ酸配列である。配列番号４で示されるアミノ酸配列は、配列番号３で示されるアミノ酸配列の部分配列であり、凝集自由エネルギーｇ（ｋ）の１アミノ酸残基あたりの平均値が特に低い部分に対応するアミノ酸配列である。
【００２５】
配列番号５で示されるアミノ酸配列は、二ワオニグモの大吐糸管しおり糸タンパク質（ＡＤＦ３）のＣ末端の非繰り返し領域のアミノ酸配列である。配列番号６で示されるアミノ酸配列は、配列番号５で示されるアミノ酸配列の部分配列であり、凝集自由エネルギーｇ（ｋ）の１アミノ酸残基あたりの平均値が特に低い部分に対応するアミノ酸配列である。
【００２６】
配列番号７で示されるアミノ酸配列は、二ワオニグモの大吐糸管しおり糸タンパク質（ＡＤＦ３）のＣ末端の非繰り返し領域から最もＣ末端側に位置するヘリックス５が欠損したアミノ酸配列である。配列番号８で示されるアミノ酸配列は、配列番号７で示されるアミノ酸配列の部分配列であり、凝集自由エネルギーｇ（ｋ）の１アミノ酸残基あたりの平均値が特に低い部分に対応するアミノ酸配列である。
【００２７】
配列番号１０、１２、１４及び１６で示されるアミノ酸配列は、以下の手順で選出したアミノ酸配列である。まず、既知の大瓶状腺スピドロイン（ＭａＳｐ）のＣ末端のアミノ酸配列（具体的には、配列番号２７〜１９１で示されるアミノ酸配列）からプロファイル隠れマルコフモデル（ＨＭＭ）を作成した。作成したＨＭＭを入力値としてｈｍｍｅｍｉｔプログラムを実行することにより、アミノ酸配列を生成した（１００００配列）。生成したアミノ酸配列に対して、連続する５アミノ酸残基ごとに凝集自由エネルギーｇ（ｋ）の１アミノ酸残基あたりの平均値を算出した。算出した平均値の最小値が−４．５以下になるアミノ酸配列を選出した。
【００２８】
配列番号９、１１、１３及び１５で示されるアミノ酸配列は、それぞれ配列番号１０、１２、１４及び１６で示されるアミノ酸配列のＮ末端に付加配列を付加したアミノ酸配列である。
【００２９】
配列番号３、配列番号５及び配列番号７で示されるアミノ酸配列は、相互に少なくとも６０％以上（６３％）の配列同一性を有する。
【００３０】
本実施形態に係るポリペプチドは、配列番号３〜１６のいずれかで示されるアミノ酸配列と６５％以上の配列同一性を有するものであってもよく、７０％以上の配列同一性を有するものであってもよく、７５％以上の配列同一性を有するものであってもよく、８０％以上の配列同一性を有するものであってもよく、８５％以上の配列同一性を有するものであってもよく、９０％以上の配列同一性を有するものであってもよく、９５％以上の配列同一性を有するものであってもよく、９８％以上の配列同一性を有するものであってもよく、９９％以上の配列同一性を有するものであってもよい。
【００３１】
本実施形態に係るポリペプチドは、配列番号３〜１６のいずれかで示されるアミノ酸配列を含むものであってよく、配列番号３〜１６のいずれかで示されるアミノ酸配列からなるものであってもよい。
【００３２】
本実施形態に係るポリペプチドは、Ｎ末端及びＣ末端のいずれか一方又は両方にタグ配列が付加されたものであってよい。これにより、本実施形態に係るポリペプチドの単離、固定化、検出及び可視化等が可能となる。
【００３３】
タグ配列として、例えば、他の分子との特異的親和性（結合性、アフィニティ）を利用したアフィニティタグを挙げることができる。アフィニティタグの具体例として、ヒスチジンタグ（Ｈｉｓタグ）を挙げることができる。Ｈｉｓタグは、ヒスチジン残基が４から１０個程度並んだ短いペプチドで、ニッケル等の金属イオンと特異的に結合する性質があるため、金属キレートクロマトグラフィー（ｃｈｅｌａｔｉｎｇ  ｍｅｔａｌ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）による本実施形態に係るポリペプチドの単離に利用することができる。タグ配列の具体例として、例えば、配列番号１７で示されるアミノ酸配列（Ｈｉｓタグを含むアミノ酸配列）が挙げられる。
【００３４】
また、グルタチオンに特異的に結合するグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、マルトースに特異的に結合するマルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）等のタグ配列を利用することもできる。
【００３５】
さらに、抗原抗体反応を利用した「エピトープタグ」を利用することもできる。抗原性を示すペプチド（エピトープ）をタグ配列として付加することにより、当該エピトープに対する抗体を結合させることができる。エピトープタグとして、ＨＡ（インフルエンザウイルスのヘマグルチニンのペプチド配列）タグ、ｍｙｃタグ、ＦＬＡＧタグ等を挙げることができる。エピトープタグを利用することにより、高い特異性で容易に本実施形態に係るポリペプチドを精製することができる。
【００３６】
さらにタグ配列を特定のプロテアーゼで切り離せるようにしたものも使用することができる。当該タグ配列を介して吸着した本実施形態に係るポリペプチドをプロテアーゼ処理することにより、タグ配列を切り離した本実施形態に係るポリペプチドを回収することもできる。
【００３７】
タグ配列を含むポリペプチドの具体例として、例えば、配列番号１８〜３１のいずれかで示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドを挙げることができる。配列番号１８〜３１で示されるアミノ酸配列は、それぞれ配列番号３〜１６で示されるアミノ酸配列のＮ末端に配列番号１７で示されるアミノ酸配列（Ｈｉｓタグを含むアミノ酸配列）を付加したものである。
【００３８】
一実施形態に係るポリペプチドは、配列番号１８〜３１のいずれかで示されるアミノ酸配列を含むものであってよく、配列番号１８〜３１のいずれかで示されるアミノ酸配列からなるものであってもよい。
【００３９】
本実施形態に係るポリペプチドの分子量は、特に限定されないが、例えば、１ｋＤａ以上３００ｋＤａ以下であってよい。本実施形態に係るポリペプチドの分子量は、例えば、２ｋＤａ以上、３ｋＤａ以上、４ｋＤａ以上、５ｋＤａ以上、６ｋＤａ以上、７ｋＤａ以上、８ｋＤａ以上、９ｋＤａ以上、又は１０ｋＤａ以上であってよく、例えば、２５０ｋＤａ以下、２００ｋＤａ以下、１５０ｋＤａ以下、１００ｋＤａ以下、９０ｋＤａ以下、８０ｋＤａ以下、７０ｋＤａ以下、６０ｋＤａ以下、５０ｋＤａ以下、４０ｋＤａ以下、３０ｋＤａ以下、２０ｋＤａ以下、又は１５ｋＤａ以下であってよい。
【００４０】
本実施形態に係るポリペプチドのアミノ酸残基数は、特に限定されないが、例えば、１５０アミノ酸残基以下、１２０アミノ酸残基以下、１００アミノ酸残基以下、８０アミノ酸残基以下、６０アミノ酸残基以下、４０アミノ酸残基以下、３０アミノ酸残基以下、２５アミノ酸残基以下、又は２０アミノ酸残基以下であってよく、例えば、５アミノ酸残基以上、１０アミノ酸残基以上、又は１５アミノ酸残基以上であってよい。本実施形態に係るポリペプチドのアミノ酸残基数が少ない場合（例えば、２０アミノ酸残基程度）、例えば、微生物等で本実施形態に係るポリペプチドを含む融合タンパク質を生産させる場合に、融合タンパク質のアミノ酸残基総数を大きく増やさないため生産性に与える影響を低くすることができ、また融合タンパク質の凝集性を高める、又は凝集性を付加することができる。
【００４１】
本実施形態に係るポリペプチドは、親水性であってもよく、疎水性であってもよい。本実施形態に係るポリペプチドは、ポリペプチドを構成する全てのアミノ酸残基の疎水性指標（ハイドロパシー・インデックス、ＨＩ）の総和を求め、次にその総和を全アミノ酸残基数で除した値（平均ＨＩ、以下「疎水度」とも表す。）が−１．０以上であるものが好ましい。アミノ酸残基の疎水性指標については、公知の指標（Ｈｙｄｒｏｐａｔｈｙ  ｉｎｄｅｘ：Ｋｙｔｅ  Ｊ，＆Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ  Ｒ（１９８２）“Ａ  ｓｉｍｐｌｅ  ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｄｉｓｐｌａｙｉｎｇ  ｔｈｅ  ｈｙｄｒｏｐａｔｈｉｃ  ｃｈａｒａｃｔｅｒ  ｏｆ  ａ  ｐｒｏｔｅｉｎ”，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１５７，ｐｐ．１０５−１３２）を使用する。具体的には、各アミノ酸の疎水性指標は、下記表３に示すとおりである。
【００４２】
【表３】
2020158947.tif 000008
【００４３】
本実施形態に係るポリペプチドの疎水度は、−０．５以上、０以上、１以上、５以上又は１０以上であってよく、また、１０以下、５以下又は１以下であってよい。
【００４４】
本実施形態に係るポリペプチドは、当該ポリペプチド同士でタンパク質間相互作用し、特異的複合体を形成するものであること（すなわち、自己会合能を有するものであること）が好ましく、変性条件下で自己会合能を有するものであることがより好ましい。
【００４５】
本実施形態に係るポリペプチドは、人工ポリペプチドであってよい。本明細書において「人工ポリペプチド」は、人為的に製造されたポリペプチドを意味する。人工ポリペプチドは、例えば、遺伝子組換え技術を使用して製造されたポリペプチド、化学合成されたポリペプチドを含む。
【００４６】
（変性条件）
変性条件は、タンパク質の高次構造（例えば、二次構造、三次構造）を破壊し得る条件である。変性条件としては、例えば、タンパク質溶液のｐＨ（例えば、ｐＨ１〜４の酸性条件、及びｐＨ１０〜１４のアルカリ性条件）、タンパク質がおかれる環境温度（例えば、−２０℃〜５℃の低温条件、及び３５℃以上の高温条件）、変性剤の存在等が挙げられる。
【００４７】
変性剤としては、例えば、タンパク質分子間及び／又は分子内の水素結合、疎水結合、イオン結合、ジスルフィド結合を破壊する物質が挙げられる。変性剤の具体例としては、例えば、尿素、グアニジン塩（例えば、グアニジンチオシアン酸塩）、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、２−メルカプトエタノール、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）、並びにジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、アセトン、アルコール類（例えば、メタノール、エタノール、イソプロパノール）、ジオキサン、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）及びアセトニトリル等の水と混和する極性溶媒が挙げられる。
【００４８】
（ポリペプチドの製造方法）
本実施形態に係るポリペプチドは、当該ポリペプチドをコードする核酸を使用して、常法により製造することができる。当該ポリペプチドをコードする核酸は、塩基配列情報に基づいて、化学合成してもよく、ＰＣＲ法等を利用して合成してもよい。
【００４９】
〔融合タンパク質〕
本実施形態に係る融合タンパク質は、本発明に係るポリペプチドと、タンパク質とが融合されたアミノ酸配列を含む。
【００５０】
本実施形態に係る融合タンパク質における融合の態様は特に限定されず、例えば、タンパク質のアミノ酸配列と、本発明に係るポリペプチドのアミノ酸配列とを含む融合タンパク質（例えば、タンパク質のアミノ酸配列のＮ末端及びＣ末端のいずれか一方又は両方に本発明に係るポリペプチドのアミノ酸配列を含む融合タンパク質）であってもよく、タンパク質のアミノ酸配列中に、本発明に係るポリペプチドのアミノ酸配列を含む融合タンパク質（例えば、タンパク質のアミノ酸配列の途中に本発明に係るポリペプチドのアミノ酸配列を含む融合タンパク質）であってもよい。
【００５１】
タンパク質のアミノ酸配列中に、本発明に係るポリペプチドのアミノ酸配列を含む融合タンパク質においては、タンパク質のＮ末端又はＣ末端から融合部位（タンパク質のアミノ酸配列中の本発明に係るポリペプチドの挿入部位）までのアミノ酸残基数が、タンパク質の総アミノ酸残基数に対して、４５％以下であってよく、４０％以下であってよく、３５％以下であってよく、３０％以下であってよく、２５％以下であってよく、２０％以下であってよく、１５％以下であることが好ましく、１０％以下、９％以下、８％以下、７％以下、６％以下、５％以下、４％以下、３％以下、２％以下、又は１％以下であることがより好ましい。当該比率が低いほど、本発明に係るポリペプチドが、タンパク質のＮ末端又はＣ末端により近い位置に融合されていることになり、選択的な相互作用（自己会合）をより生じやすくなる。
【００５２】
（タンパク質）
本実施形態に係る融合タンパク質におけるタンパク質には、特に制限はなく、任意のタンパク質を使用することができる。タンパク質の具体例として、例えば、工業用に利用できるタンパク質、医療用に利用できるタンパク質、及び構造タンパク質等を挙げることができる。工業用又は医療用に利用できるタンパク質の具体例としては、クモ糸タンパク質、酵素、制御タンパク質、受容体、ペプチドホルモン、サイトカイン、膜又は輸送タンパク質、予防接種に使用する抗原、ワクチン、抗原結合タンパク質、免疫刺激タンパク質、アレルゲン、及び完全長抗体又は抗体フラグメント若しくは誘導体を挙げることができる。構造タンパク質の具体例としては、フィブロイン（例えば、クモ糸フィブロイン（スパイダーシルク）、カイコシルク等）、ケラチン、コラ−ゲン、エラスチン、レシリン、及びこれらタンパク質の断片、並びにこれら由来のタンパク質等を挙げることができる。
【００５３】
本明細書においてフィブロインは、天然由来のフィブロインと改変フィブロインとを含む。本明細書において「天然由来のフィブロイン」とは、天然由来のフィブロインと同一のアミノ酸配列を有するフィブロインを意味し、「改変フィブロイン」とは、天然由来のフィブロインとは異なるアミノ酸配列を有するフィブロインを意味する。
【００５４】
フィブロインは、クモ糸フィブロインであってよい。「クモ糸フィブロイン」には、天然クモ糸フィブロイン、及び天然クモ糸フィブロインに由来する改変フィブロインが含まれる。天然クモ糸フィブロインとしては、例えば、クモ類が産生するスパイダーシルクタンパク質（ＳＳＰ）が挙げられる。
【００５５】
フィブロインは、例えば、式３：［（Ａ）ｎモチーフ−ＲＥＰ］ｍ、又は式４：［（Ａ）ｎモチーフ−ＲＥＰ］ｍ−（Ａ）ｎモチーフで表されるドメイン配列を含むタンパク質であってもよい。本実施形態に係るフィブロインは、ドメイン配列のＮ末端側及びＣ末端側のいずれか一方又は両方に更にアミノ酸配列（Ｎ末端配列及びＣ末端配列）が付加されていてもよい。Ｎ末端配列及びＣ末端配列は、これに限定されるものではないが、典型的には、フィブロインに特徴的なアミノ酸モチーフの反復を有さない領域であり、１００残基程度のアミノ酸からなる。
【００５６】
本明細書において「ドメイン配列」とは、フィブロイン特有の結晶領域（典型的には、アミノ酸配列の（Ａ）ｎモチーフに相当する。）と非晶領域（典型的には、アミノ酸配列のＲＥＰに相当する。）を生じるアミノ酸配列であり、式３：［（Ａ）ｎモチーフ−ＲＥＰ］ｍ、又は式４：［（Ａ）ｎモチーフ−ＲＥＰ］ｍ−（Ａ）ｎモチーフで表されるアミノ酸配列を意味する。ここで、（Ａ）ｎモチーフは、アラニン残基を主とするアミノ酸配列を示し、アミノ酸残基数は２〜２７である。（Ａ）ｎモチーフのアミノ酸残基数は、２〜２０、４〜２７、４〜２０、８〜２０、１０〜２０、４〜１６、８〜１６、又は１０〜１６の整数であってよい。また、（Ａ）ｎモチーフ中の全アミノ酸残基数に対するアラニン残基数の割合は４０％以上であればよく、６０％以上、７０％以上、８０％以上、８３％以上、８５％以上、８６％以上、９０％以上、９５％以上、又は１００％（アラニン残基のみで構成されることを意味する。）であってもよい。ドメイン配列中に複数存在する（Ａ）ｎモチーフは、少なくとも７つがアラニン残基のみで構成されてもよい。ＲＥＰは２〜２００アミノ酸残基から構成されるアミノ酸配列を示す。ＲＥＰは、１０〜２００アミノ酸残基から構成されるアミノ酸配列であってもよい。ｍは２〜３００の整数を示し、１０〜３００の整数であってもよい。複数存在する（Ａ）ｎモチーフは、互いに同一のアミノ酸配列でもよく、異なるアミノ酸配列でもよい。複数存在するＲＥＰは、互いに同一のアミノ酸配列でもよく、異なるアミノ酸配列でもよい。
【００５７】
天然由来のフィブロインとしては、例えば、式３：［（Ａ）ｎモチーフ−ＲＥＰ］ｍ、又は式４：［（Ａ）ｎモチーフ−ＲＥＰ］ｍ−（Ａ）ｎモチーフで表されるドメイン配列を含むタンパク質を挙げることができる。天然由来のフィブロインの具体例としては、例えば、昆虫又はクモ類が産生するフィブロインが挙げられる。
【００５８】
昆虫が産生するフィブロインとしては、例えば、ボンビックス・モリ（Ｂｏｍｂｙｘ  ｍｏｒｉ）、クワコ（Ｂｏｍｂｙｘ  ｍａｎｄａｒｉｎａ）、天蚕（Ａｎｔｈｅｒａｅａ  ｙａｍａｍａｉ）、柞蚕（Ａｎｔｅｒａｅａ  ｐｅｒｎｙｉ）、楓蚕（Ｅｒｉｏｇｙｎａ  ｐｙｒｅｔｏｒｕｍ）、蓖蚕（Ｐｉｌｏｓａｍｉａ  Ｃｙｎｔｈｉａ  ｒｉｃｉｎｉ）、樗蚕（Ｓａｍｉａ  ｃｙｎｔｈｉａ）、栗虫（Ｃａｌｉｇｕｒａ  ｊａｐｏｎｉｃａ）、チュッサー蚕（Ａｎｔｈｅｒａｅａ  ｍｙｌｉｔｔａ）、ムガ蚕（Ａｎｔｈｅｒａｅａ  ａｓｓａｍａ）等のカイコが産生する絹タンパク質、及びスズメバチ（Ｖｅｓｐａ  ｓｉｍｉｌｌｉｍａ  ｘａｎｔｈｏｐｔｅｒａ）の幼虫が吐出するホーネットシルクタンパク質が挙げられる。
【００５９】
昆虫が産生するフィブロインのより具体的な例としては、例えば、カイコ・フィブロインＬ鎖（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｍ７６４３０（塩基配列）、及びＡＡＡ２７８４０．１（アミノ酸配列））が挙げられる。
【００６０】
クモ類が産生するフィブロインとしては、例えば、クモ目（Ａｒａｎｅａｅ）に属するクモが産生するスパイダーシルクタンパク質が挙げられる。より具体的には、オニグモ、ニワオニグモ、アカオニグモ、アオオニグモ及びマメオニグモ等のオニグモ属（Ａｒａｎｅｕｓ属）に属するクモ、ヤマシロオニグモ、イエオニグモ、ドヨウオニグモ及びサツマノミダマシ等のヒメオニグモ属（Ｎｅｏｓｃｏｎａ属）に属するクモ、コオニグモモドキ等のコオニグモモドキ属（Ｐｒｏｎｕｓ属）に属するクモ、トリノフンダマシ及びオオトリノフンダマシ等のトリノフンダマシ属（Ｃｙｒｔａｒａｃｈｎｅ属）に属するクモ、トゲグモ及びチブサトゲグモ等のトゲグモ属（Ｇａｓｔｅｒａｃａｎｔｈａ属）に属するクモ、マメイタイセキグモ及びムツトゲイセキグモ等のイセキグモ属（Ｏｒｄｇａｒｉｕｓ属）に属するクモ、コガネグモ、コガタコガネグモ及びナガコガネグモ等のコガネグモ属（Ａｒｇｉｏｐｅ属）に属するクモ、キジロオヒキグモ等のオヒキグモ属（Ａｒａｃｈｎｕｒａ属）に属するクモ、ハツリグモ等のハツリグモ属（Ａｃｕｓｉｌａｓ属）に属するクモ、スズミグモ、キヌアミグモ及びハラビロスズミグモ等のスズミグモ属（Ｃｙｔｏｐｈｏｒａ属）に属するクモ、ゲホウグモ等のゲホウグモ属（Ｐｏｌｔｙｓ属）に属するクモ、ゴミグモ、ヨツデゴミグモ、マルゴミグモ及びカラスゴミグモ等のゴミグモ属（Ｃｙｃｌｏｓａ属）に属するクモ、及びヤマトカナエグモ等のカナエグモ属（Ｃｈｏｒｉｚｏｐｅｓ属）に属するクモが産生するスパイダーシルクタンパク質、並びにアシナガグモ、ヤサガタアシナガグモ、ハラビロアシダカグモ及びウロコアシナガグモ等のアシナガグモ属（Ｔｅｔｒａｇｎａｔｈａ属）に属するクモ、オオシロカネグモ、チュウガタシロカネグモ及びコシロカネグモ等のシロカネグモ属（Ｌｅｕｃａｕｇｅ属）に属するクモ、ジョロウグモ及びオオジョロウグモ等のジョロウグモ属（Ｎｅｐｈｉｌａ属）に属するクモ、キンヨウグモ等のアズミグモ属（Ｍｅｎｏｓｉｒａ属）に属するクモ、ヒメアシナガグモ等のヒメアシナガグモ属（Ｄｙｓｃｈｉｒｉｏｇｎａｔｈａ属）に属するクモ、クロゴケグモ、セアカゴケグモ、ハイイロゴケグモ及びジュウサンボシゴケグモ等のゴケグモ属（Ｌａｔｒｏｄｅｃｔｕｓ属）に属するクモ、及びユープロステノプス属（Ｅｕｐｒｏｓｔｈｅｎｏｐｓ属）に属するクモ等のアシナガグモ科（Ｔｅｔｒａｇｎａｔｈｉｄａｅ科）に属するクモが産生するスパイダーシルクタンパク質が挙げられる。スパイダーシルクタンパク質としては、例えば、ＭａＳｐ（ＭａＳｐ１及びＭａＳｐ２）、ＡＤＦ（ＡＤＦ３及びＡＤＦ４）等の牽引糸タンパク質、ＭｉＳｐ（ＭｉＳｐ１及びＭｉＳｐ２）、ＡｃＳｐ、ＰｙＳｐ、Ｆｌａｇ等が挙げられる。
【００６１】
ケラチン由来のタンパク質として、例えば、カプラ・ヒルクス（Ｃａｐｒａ  ｈｉｒｃｕｓ）のタイプＩケラチン等を挙げることができる。
【００６２】
コラーゲン由来のタンパク質としては、例えば、式５：［ＲＥＰ２］ｐで表されるドメイン配列を含むタンパク質（ここで、式５中、ｐは５〜３００の整数を示す。ＲＥＰ２は、Ｇｌｙ−Ｘ−Ｙから構成されるアミノ酸配列を示し、Ｘ及びＹはＧｌｙ以外の任意のアミノ酸残基を示す。複数存在するＲＥＰ２は、互いに同一のアミノ酸配列でもよく、異なるアミノ酸配列でもよい。）を挙げることができる。
【００６３】
エラスチン由来のタンパク質としては、例えば、ＮＣＢＩのＧｅｎＢａｎｋのアクセッション番号ＡＡＣ９８３９５（ヒト）、Ｉ４７０７６（ヒツジ）、ＮＰ７８６９６６（ウシ）等のアミノ酸配列を有するタンパク質を挙げることができる。
【００６４】
レシリン由来のタンパク質としては、例えば、式６：［ＲＥＰ３］ｑで表されるドメイン配列を含むタンパク質（ここで、式６中、ｑは４〜３００の整数を示す。ＲＥＰ３はＳｅｒ−Ｊ−Ｊ−Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−Ｕ−Ｐｒｏから構成されるアミノ酸配列を示す。Ｊは任意アミノ酸残基を示し、特にＡｓｐ、Ｓｅｒ及びＴｈｒからなる群から選ばれるアミノ酸残基であることが好ましい。Ｕは任意のアミノ酸残基を示し、特にＰｒｏ、Ａｌａ、Ｔｈｒ及びＳｅｒからなる群から選ばれるアミノ酸残基であることが好ましい。複数存在するＲＥＰ４は、互いに同一のアミノ酸配列でもよく、異なるアミノ酸配列でもよい。）を挙げることができる。
【００６５】
（融合タンパク質の製造方法）
本実施形態に係る融合タンパク質は、当該融合タンパク質をコードする核酸を使用して、常法により製造することができる。当該融合タンパク質をコードする核酸は、塩基配列情報に基づいて、化学合成してもよく、ＰＣＲ法等を利用して合成してもよい。
【００６６】
〔核酸〕
本実施形態に係る核酸は、本発明に係るポリペプチド、又は本発明に係る融合タンパク質をコードする。
【００６７】
一実施形態に係る核酸は、本発明に係るポリペプチド、又は本発明に係る融合タンパク質をコードする核酸の相補鎖とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸であってもよい。
【００６８】
「ストリンジェントな条件」とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。「ストリンジェントな条件」は、低ストリンジェントな条件、中ストリンジェントな条件及び高ストリンジェントな条件のいずれでもよい。低ストリンジェントな条件とは、少なくとも８５％以上の同一性が配列間に存在する時のみハイブリダイゼーションが起こることを意味し、例えば、０．５％ＳＤＳを含む５×ＳＳＣを用い、４２℃でハイブリダイズする条件が挙げられる。中ストリンジェントな条件とは、少なくとも９０％以上の同一性が配列間に存在する時のみハイブリダイゼーションが起こることを意味し、例えば、０．５％ＳＤＳを含む５×ＳＳＣを用い、５０℃でハイブリダイズする条件が挙げられる。高ストリンジェントな条件とは、少なくとも９５％以上の同一性が配列間に存在する時のみハイブリダイゼーションが起こることを意味し、例えば、０．５％ＳＤＳを含む５×ＳＳＣを用い、６０℃でハイブリダイズする条件が挙げられる。
【００６９】
一実施形態に係る核酸は、本発明に係るポリペプチド、又は本発明に係る融合タンパク質をコードする核酸と９０％以上の配列同一性を有する核酸であってもよい。配列同一性は、９５％以上であることが好ましい。
【００７０】
本実施形態に係る核酸の具体例として、配列番号３２、配列番号３３又は配列番号３４で示される塩基配列を有する核酸を挙げることができる。配列番号３２、配列番号３３又は配列番号３４で示される塩基配列は、それぞれ配列番号３、配列番号５及び配列番号７で示されるアミノ酸配列をコードするものである。
【００７１】
本実施形態に係る核酸は、発現ベクターに組み込まれた形態で提供されてもよい。当該発現ベクターは、本実施形態に係る核酸配列と、当該核酸配列に作動可能に連結された１又は複数の調節配列とを有する。調節配列は、宿主における組換えタンパク質の発現を制御する配列（例えば、プロモーター、エンハンサー、リボソーム結合配列、転写終結配列等）であり、宿主の種類に応じて適宜選択することができる。発現ベクターの種類は、プラスミドベクター、ウイルスベクター、コスミドベクター、フォスミドベクター、人工染色体ベクター等、宿主の種類に応じて適宜選択することができる。
【００７２】
〔タンパク質に自己会合能を付与する方法〕
本発明はまた、本発明に係るポリペプチドと、タンパク質とを融合させることを含む、タンパク質に自己会合能を付与する方法と捉えることもできる。ポリペプチド、タンパク質、及び融合タンパク質の製造方法等の具体的な態様等は、上述したとおりである。
【実施例】
【００７３】
以下、実施例に基づいて本発明をより具体的に説明する。ただし、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。【００７４】
［試験例１：凝集自由エネルギーｇ（ｋ）の評価］
二ワオニグモの大吐糸管しおり糸タンパク質（ＡＤＦ４）のＮ末端に配列番号１７で示されるタグ配列を付加したアミノ酸配列（＃ＧＥＮ８９１，配列番号１）及び二ワオニグモの大吐糸管しおり糸タンパク質（ＡＤＦ３）のＮ末端に配列番号１７で示されるタグ配列を付加したアミノ酸配列（＃ＧＥＮ８８９，配列番号２）の凝集自由エネルギーｇ（ｋ）を下記式（１）に従って算出した。
【数４】
2020158947.tif 000009
【００７５】
式（１）中、εｐｉ，ｊ（Ｌ）及びεａｉ，ｊ（Ｌ）は、アミノ酸残基のペアに対して算出されたエネルギーである（表１及び表２参照）。【００７６】
また、式（１）中、δｉ≦ｋ＜ｉ＋Ｌは、ｋがｉ〜ｉ＋Ｌ−１に属するときは１であり、それ以外は０である。δｊ≦ｋ＜ｊ＋Ｌは、ｋがｊ〜ｊ＋Ｌ−１に属するときは１であり、それ以外は０である。ｉ及びｊは、始点を１としたアミノ酸配列中の残基番号に対応する。λは、２．０である。【００７７】
図１は、二ワオニグモの大吐糸管しおり糸タンパク質（ＡＤＦ４）のＮ末端に配列番号１７で示されるタグ配列を付加したアミノ酸配列（＃ＧＥＮ８９１，配列番号１）における凝集自由エネルギーｇ（ｋ）を残基番号に対してプロットしたグラフである。図２は、二ワオニグモの大吐糸管しおり糸タンパク質（ＡＤＦ３）のＮ末端に配列番号１７で示されるタグ配列を付加したアミノ酸配列（＃ＧＥＮ８８９，配列番号２）における凝集自由エネルギーｇ（ｋ）を残基番号に対してプロットしたグラフである。＃ＧＥＮ８９１は、５４６番目のアミノ酸残基から５８２番目のアミノ酸残基において、各アミノ酸残基の凝集自由エネルギーｇ（ｋ）が−４．０以下となった（図１）。なお、これらのアミノ酸残基からなるアミノ酸配列における凝集自由エネルギーｇ（ｋ）の１アミノ酸残基あたりの平均値も当然−４．０以下である。＃ＧＥＮ８８９は、５４７番目のアミノ酸残基から５７９番目のアミノ酸残基において、各アミノ酸残基の凝集自由エネルギーｇ（ｋ）が−４．０以下となった（図２）。なお、これらのアミノ酸残基からなるアミノ酸配列における凝集自由エネルギーｇ（ｋ）の１アミノ酸残基あたりの平均値も当然−４．０以下である。凝集自由エネルギーｇ（ｋ）が低い程、凝集傾向は強くなるため、これらのアミノ酸配列は、自己会合能を有するアミノ酸配列であると考えられる。【００７８】
［試験例２：自己会合能を有するポリペプチドの製造及び評価］
（１）自己会合能を有するポリペプチドの製造
配列番号１８、２０及び２２で示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドを設計した。配列番号１８で示されるアミノ酸配列は、二ワオニグモ（Ａｒａｎｅｕｓ  ｄｉａｄｅｍａｔｕｓ）の大吐糸管しおり糸タンパク質（ＡＤＦ４）のＣ末端の非繰り返し領域（ＮＲＣ領域）のアミノ酸配列に配列番号１７で示すアミノ酸配列（タグ配列）を付加したものである（Ｈｉｓ−ＡＤＦ４−ＮＲＣ，平均ＨＩ  ０．２９７，分子量１２．９ｋＤａ）。配列番号２０で示されるアミノ酸配列は、二ワオニグモの大吐糸管しおり糸タンパク質（ＡＤＦ３）のＣ末端の非繰り返し領域のアミノ酸配列に配列番号１７で示すアミノ酸配列（タグ配列）を付加したものである（Ｈｉｓ−ＡＤＦ３−ＮＲＣ，平均ＨＩ  ０．２２１，分子量１３．５ｋＤａ）。配列番号２２で示されるアミノ酸配列は、二ワオニグモの大吐糸管しおり糸タンパク質（ＡＤＦ３）のＣ末端の非繰り返し領域から最もＣ末端側に位置するヘリックス５が欠損したアミノ酸配列に配列番号１７で示すアミノ酸配列（タグ配列）を付加したものである（Ｈｉｓ−ＡＤＦ３−ｓｈｏｒｔＮＲＣ，平均ＨＩ  ０．７７７，分子量１０．６ｋＤａ）。配列番号１８、２０及び２２で示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドは、＃ＧＥＮ８９１及び＃ＧＥＮ８８９の凝集自由エネルギーｇ（ｋ）が−４．０以下であるアミノ酸残基からなるアミノ酸配列の一部又は全部を含むものである。【００７９】
各ポリペプチドをコードする核酸をそれぞれクローニングベクター（ｐＵＣ１１８）にクローニングした。その後、各核酸をＮｄｅＩ及びＥｃｏＲＩで制限酵素処理して切り出した後、それぞれタンパク質発現ベクターｐＥＴ−２２ｂ（＋）に組換えて発現ベクターを得た。得られた発現ベクターで、大腸菌ＢＬＲ（ＤＥ３）をそれぞれ形質転換して、各ポリペプチドを発現する形質転換大腸菌（組換え細胞）を得た。【００８０】
得られた形質転換大腸菌を、アンピシリンを含む２ｍＬのＬＢ培地で１５時間培養した。当該培養液を、アンピシリンを含む１００ｍＬのシード培養用培地（表４）にＯＤ６００が０．００５となるように添加した。培養液温度を３０℃に保ち、ＯＤ６００が５になるまでフラスコ培養を行い（約１５時間）、シード培養液を得た。【００８１】
【表４】
2020158947.tif 000010
【００８２】
５００ｍＬの生産培地（表５）を添加したジャーファーメンターにＯＤ６００が０．０５となるように当該シード培養液を添加した。培養液温度を３７℃に保ち、ｐＨ６．９で一定に制御して培養した。また培養液中の溶存酸素濃度を、溶存酸素飽和濃度の２０％に維持した。【００８３】
【表５】
2020158947.tif 000011
【００８４】
生産培地中のグルコースが完全に消費された直後に、フィード液（グルコース４５５ｇ／１Ｌ、酵母エキス１２０ｇ／１Ｌ）を１ｍＬ／分の速度で添加した。培養液温度を３７℃に保ち、ｐＨ６．９で一定に制御して培養した。また培養液中の溶存酸素濃度を、溶存酸素飽和濃度の２０％に維持し、２０時間培養を行った。その後、１Ｍのイソプロピル−β−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を培養液に対して終濃度１ｍＭになるよう添加し、目的のポリペプチドを発現誘導させた。ＩＰＴＧ添加後２０時間経過した時点で、培養液を遠心分離し、菌体を回収した。ＩＰＴＧ添加前とＩＰＴＧ添加後の培養液から調製した菌体を超音波破砕し、遠心分離を行い、目的とするポリペプチドを回収した。回収した目的とするポリペプチドをＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、ＩＰＴＧ添加に依存した目的とするポリペプチドの分子量に対応するバンドの出現により、目的とするポリペプチドが不溶体として発現されていることを確認した。【００８５】
（２）自己会合能を有するポリペプチドの可溶化
目的とするポリペプチドをエッペンチューブに分取し、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）（２％）（富士フィルム和光純薬社製、生化学用）及びグアニジンチオシアン酸塩（富士フィルム和光純薬社製、生化学用）を添加し、目的とする各ポリペプチドを溶解させた。図３は、ＳＤＳ及びグアニジンチオシアン酸塩を含むポリペプチド（Ｈｉｓ−ＡＤＦ３−ＮＲＣ（配列番号２０）又はＨｉｓ−ＡＤＦ３−ｓｈｏｒｔＮＲＣ（配列番号２２））液の上清及び沈殿を、変性剤（２−メルカプトエタノール）存在下でＳＤＳ−ＰＡＧＥ法により分析した結果を示す写真である。各ポリペプチド（Ｈｉｓ−ＡＤＦ３−ＮＲＣ及びＨｉｓ−ＡＤＦ３−ｓｈｏｒｔＮＲＣ）の分子量に対応するバンドが主に上清から検出されており、ＳＤＳ及びグアニジンチオシアン酸塩の添加により、各ポリペプチドを可溶化できたことが示された。【００８６】
（３）自己会合能の確認
各ポリペプチドをＳＤＳを含む緩衝液（１％ＳＤＳ、５ｍＭトリス塩酸塩、２ｍＭ  ＤＴＴ、ｐＨ８．０）に溶解し、透析によって溶媒を尿素を含む緩衝液（８Ｍ尿素、２５ｍＭトリス塩酸塩、ｐＨ８．０）に交換し、ヒスチジンタグを利用して以下に示す条件でカラム精製を行った。【００８７】
（カラム精製）
平衡化溶液（８Ｍ尿素、１００ｍＭ塩化ナトリウム、２５ｍＭトリス塩酸塩、１０ｍＭイミダゾール、ｐＨ８．０）で平衡化したＨｉｓ  Ｇｒａｖｉ  Ｔｒａｐカラム（ベッド体積１ｍＬ、ＧＥヘルスケア社製）に各ポリペプチドを含む溶液を通し、各ポリペプチドをカラムに吸着させた。カラムを４ｍＬの洗浄液（８Ｍ尿素、１００ｍＭ塩化ナトリウム、２５ｍＭトリス塩酸塩、１０ｍＭイミダゾール、ｐＨ８．０）で洗浄した。次にカラムに第１の溶出液（８Ｍ尿素、１００ｍＭ塩化ナトリウム、２５ｍＭトリス塩酸塩、３００ｍＭイミダゾール、ｐＨ８．０）を３ｍＬ流し、ポリペプチドを溶出させた。さらに第２の溶出液（８Ｍ尿素、１００ｍＭ塩化ナトリウム、２５ｍＭトリス塩酸塩、５００ｍＭイミダゾール、ｐＨ８．０）を３ｍＬ流し、ポリペプチドを溶出させた。【００８８】
図４は、カラム精製の際の各溶液を変性剤非存在下でＳＤＳ−ＰＡＧＥ法により分析した結果を示す写真である。図４中、「ｔｈｒｏｕｇｈ」は溶解液をカラムに負荷した際の通過液、「ｗａｓｈ」はカラムを洗浄した際の通過液、「ｅｌｕｔｅ１」は第１の溶出液で溶出した際の溶出液、「ｅｌｕｔｅ２」は第２の溶出液で溶出した際の溶出液である。図４に示すとおり、各ポリペプチドは二量体に相当する分子量を有するバンドとして検出された。この結果より、各ポリペプチドは、変性剤非存在下では二量体化することが確認でき、自己会合能を有することが確認された。【００８９】
（４）変性剤存在下での自己会合能の確認
上記（３）と同様の条件でカラム精製した配列番号１８で示されるアミノ酸配列を有するポリペプチド（Ｈｉｓ−ＡＤＦ４−ＮＲＣ）を使用して、当該ポリペプチドが変性剤（ＤＴＴ：ジチオトレイトール）存在下で選択的な自己会合能を有するかを確認した。対照として、当該ポリペプチドに代えて、非特許文献（Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓｔｒｕｃｔ．Ｆｕｎｃｔ．Ｇｅｎｅｔ．，ｖｏｌ．４９，ｐｐ．２５５−２６５，（２００２年）、Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓｔｒｕｃｔ．Ｆｕｎｃｔ．Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔ．，ｖｏｌ．５８，ｐｐ．２７１−２７７，（２００５年））に記載の方法に従って調製したＳＮａｓｅ（Ｋ１１６Ｃ）を使用した。【００９０】
Ｈｉｓ−ＡＤＦ４−ＮＲＣ溶液（溶媒：５Ｍグアニジンチオシアン酸塩、１０ｍＭトリス塩酸塩、ｐＨ８）にＤＴＴを５ｍＭとなるように添加した。ＤＴＴを添加した溶液を透析チューブ（ＢｉｏＤｅｓｉｇｎＤｉａｌｙｓｉｓＴｕｂｉｎｇ  ＃Ｄ１００、８０００ＭＷＣＯ，ＢｉｏＤｅｓｉｇｎ  Ｉｎｃ．製）に移し、透析液（５Ｍグアニジンチオシアン酸塩、１０ｍＭトリス塩酸塩、ｐＨ８）に入れて、１２時間透析を行った。ＤＴＴ添加前、ＤＴＴ添加直後、透析開始から３時間後、６時間後及び１２時間後にＨｉｓ−ＡＤＦ４−ＮＲＣ溶液から試料を採取し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ法により分析した。ＳＮａｓｅ（Ｋ１１６Ｃ）についても同様に分析を行った。図５は、変性剤添加前、変性剤（ＤＴＴ）添加後、透析開始から３時間後、６時間後及び１２時間後のポリペプチド（Ｈｉｓ−ＡＤＦ４−ＮＲＣ）溶液をＳＤＳ−ＰＡＧＥ法により分析した結果を示す写真である。【００９１】
図５に示すとおり、配列番号１８で示されるアミノ酸配列を有するポリペプチド（Ｈｉｓ−ＡＤＦ４−ＮＲＣ）は、変性剤添加直後は単量体となっているものの、透析開始から３時間後には、ほとんどが二量体化していた。一方、ＳＮａｓｅ（Ｋ１１６Ｃ）透析開始から１２時間後であっても二量体化していないタンパク質が存在することが確認された。【００９２】
変性剤存在下では立体構造を保つことができず、タンパク質同士の相互作用はランダムな熱ゆらぎによって制御されるため、タンパク質間相互作用の効率は非常に低くなる。しかし、一般的なタンパク質（ＳＮａｓｅ（Ｋ１１６Ｃ））が二量体していない透析開始から３時間後（すなわち、変性剤の影響が残っていると考えられる。）には、配列番号１８で示されるアミノ酸配列を有するポリペプチド（Ｈｉｓ−ＡＤＦ４−ＮＲＣ）は、非常に高い効率で二量体化が起きることが確認された。すなわち、配列番号１８で示されるアミノ酸配列を有するポリペプチド（Ｈｉｓ−ＡＤＦ４−ＮＲＣ）は、変性剤存在下であっても選択的な自己会合能を有しているといえる。また、配列番号１８で示されるアミノ酸配列を有するポリペプチド（Ｈｉｓ−ＡＤＦ４−ＮＲＣ）は、選択的な相互作用を介して短時間でジスルフィド結合の形成が可能である。なお、ＳＮａｓｅ（Ｋ１１６Ｃ）の一部が二量体化しているのは、ブラウン運動により分子が衝突することで二量体化しているものと考えられる。【００９３】
［試験例３：自己会合能を有するポリペプチドの設計及び評価］
（１）自己会合能を有するポリペプチドの設計
既知の大瓶状腺スピドロイン（ＭａＳｐ）のＣ末端のアミノ酸配列（配列番号２７〜１９１で示されるアミノ酸配列）に基づいて、プロファイル隠れマルコフモデル（ＨＭＭ）を作成した。次いで、作成したＨＭＭを入力値としてｈｍｍｅｍｉｔプログラムを実行することにより、Ｅ値が１０−５よりも小さいアミノ酸配列を生成した（１００００配列）。生成したアミノ酸配列に対して、連続する５アミノ酸残基ごとに凝集自由エネルギーｇ（ｋ）の１アミノ酸残基あたりの平均値を算出した。算出した平均値の最小値が−４．５以下になるアミノ酸配列として、配列番号１０、１２、１４及び１６で示されるアミノ酸配列を選出した。【００９４】
（２）自己会合能を有するポリペプチドの製造
配列番号３０で示されるアミノ酸配列を有するポリペプチド（Ｈｉｓ−ＡＤＦ３−９４６７）を設計した。配列番号３０で示されるアミノ酸配列は、配列番号１５で示されるアミノ酸配列のＮ末端に配列番号１７で示すアミノ酸配列（タグ配列）を付加したものである。また、配列番号１５で示されるアミノ酸配列は、配列番号１６で示されるアミノ酸配列のＮ末端に付加配列を付加したものである。【００９５】
配列番号３０で示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドは、当該ポリペプチドをコードする核酸を使用した他は、試験例２と同様の手順で製造及び可溶化し、試験例２と同様の手順で変性剤存在下での自己会合能の確認を行った。変性剤存在下での自己会合能の確認では、ＤＴＴ添加直後、透析開始から１．５時間後、３時間後、６時間後及び８時間後にポリペプチド（Ｈｉｓ−ＡＤＦ３−９４６７）溶液から試料を採取し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ法により分析した。結果を図６に示す。【００９６】
図６は、変性剤（ＤＴＴ）添加直後（０時間）、透析開始から１．５時間後、３時間後、６時間後及び８時間後のポリペプチド（Ｈｉｓ−ＡＤＦ３−９４６７）溶液をＳＤＳ−ＰＡＧＥ法により分析した結果を示す写真である。図６に示すとおり、配列番号３０で示されるアミノ酸配列を有するポリペプチド（Ｈｉｓ−ＡＤＦ３−９４６７）は、変性剤添加直後は単量体となっているものの、透析開始から１．５時間後には二量体が形成されており、変性剤存在下であっても選択的な自己会合能を有することが確認された。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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