(57)【要約】  抗体産生細胞（例えば、抗体産生ＣＨＯ細胞）をコア層に含ませた抗体生産用のアルギン酸ゲルファイバ、及び当該アルギン酸ゲルファイバを用いる抗体の製造方法を提供する。これにより、さらなる抗体の生産方法が提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗体産生細胞及び基材が含まれるコア層をコア層よりも高い機械的強度を有するアルギン酸ゲルを含むシェル層で被覆して形成されるアルギン酸ゲルファイバ。
【請求項２】
コア層に含まれる抗体産生細胞が、ＣＨＯ細胞、ＣＨＯ細胞亜株、ＣＯＳ細胞、Ｓｐ２／０細胞、ＮＳ０細胞、ＳＰ２細胞、ＰＥＲＣ６細胞、ＹＢ２／０細胞、ＹＥ２／０細胞、１Ｒ９８３Ｆ細胞、Ｎａｍａｌｗａ細胞、Ｗｉｌ−２細胞、Ｊｕｒｋａｔ細胞、Ｖｅｒａ細胞、Ｍｏｌｔ−４細胞、２９３−ＨＥＫ細胞、ＢＨＫ細胞、ＫＧＨ６細胞、Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８．６５３細胞、Ｃ１２７細胞、ＪＣ細胞、ＬＡ７細胞、ＺＲ−４５−３０細胞、ｈＴＥＲＴ細胞、ＮＭ２Ｃ５細胞、及びＵＡＣＣ−８１２細胞からなる群から選択される細胞である、請求項１に記載のアルギン酸ゲルファイバ。
【請求項３】
コア層に含まれる基材がコラーゲン溶液、コラーゲンゲル、培地（または培養液）、アルギン酸溶液（例えば、アルギン酸ナトリウム溶液）、アルギン酸ゲル、又はそれらの混合物等からなる群から選択される基材である、請求項１〜２のいずれか１項に記載のアルギン酸ゲルファイバ。
【請求項４】
シェル層に含まれるアルギン酸ゲルの原料がアルギン酸ナトリウムであり、アルギン酸ナトリウムのＭ／Ｇ比が０．４〜１．８の範囲又は０．１〜０．４の範囲である、請求項１〜３のいずれか１項に記載のアルギン酸ゲルファイバ。
【請求項５】
シェル層に含まれるアルギン酸ゲルの原料がアルギン酸ナトリウムであり、アルギン酸ナトリウムの分子量（ＧＰＣ）が７００，０００〜１，０００，０００の範囲又は８００，０００〜１，０００，０００の範囲である、請求項１〜４のいずれか１項に記載のアルギン酸ゲルファイバ。
【請求項６】
シェル層に含まれるアルギン酸ゲルの原料がアルギン酸ナトリウムであり、アルギン酸ナトリウムの１ｗ／ｗ％の粘度が５０〜１５０（ｍＰａ・ｓ）の範囲又は７０〜１５０（ｍＰａ・ｓ）の範囲である、請求項１〜５のいずれか１項に記載のアルギン酸ゲルファイバ。
【請求項７】
アルギン酸ゲルファイバの外径が０．２μｍ〜２０００μｍの範囲であり、アルギン酸ゲルファイバのコア層の直径が０．１μｍ〜１０００μｍの範囲である、請求項１〜６のいずれか１項に記載のアルギン酸ゲルファイバ。
【請求項８】
抗体産生細胞及び基材が含まれるコア層を、コア層よりも高い機械的強度を有するアルギン酸ゲルを含むシェル層で被覆して形成されるアルギン酸ゲルファイバの製造方法であって、
導入管４０と、導入管４０の導入口１と、導入口１の下流に位置する導入管４０の導入口２と、導入口２の下流に位置する導入管４０の導入口３と、導入口２の下流に位置する導入管４０の出口５０を含む、マイクロ流体装置１０を用い、
（１）導入口１から、抗体産生細胞６と基材を導入して射出して、導入管４０内に抗体産生細胞６と基材の第１の層流を形成する工程、
（２）導入口２から、アルギン酸ナトリウム溶液を導入して射出して、第１の層流の外周を覆う、アルギン酸ナトリウム溶液の第２の層流を形成する工程、
（３）導入口３から、２価金属イオンを含む溶液を導入して射出して、第２の層流の外周を覆う、２価金属イオンを含む溶液の第３の層流を形成する工程、
（４）出口５０から射出される、抗体産生細胞及び基材が含まれるコア層を、アルギン酸ゲルを含むシェル層で被覆して形成されるアルギン酸ゲルファイバを得る工程
を含むことを特徴とする、アルギン酸ゲルファイバの製造方法。
【請求項９】
抗体産生細胞６が、請求項２に記載の細胞である、請求項８に記載のアルギン酸ゲルファイバの製造方法。
【請求項１０】
コア層に含まれる基材がコラーゲン溶液、コラーゲンゲル、培地（または培養液）、アルギン酸溶液（例えば、アルギン酸ナトリウム溶液）、アルギン酸ゲル、又はそれらの混合物等からなる群から選択される基材である請求項８または９に記載のアルギン酸ゲルファイバの製造方法。
【請求項１１】
２価金属イオンが、カルシウムイオン、マグネシウムイオン、バリウムイオン、ストロンチウムイオン、及び亜鉛イオンからなる群から選択されるイオンである、請求項８〜１０のいずれか１項に記載のアルギン酸ゲルファイバの製造方法。
【請求項１２】
２価金属イオンを含む溶液が、塩化カルシウム水溶液、炭酸カルシウム水溶液、及びグルコン酸カルシウム水溶液なる群から選択される水溶液である、請求項８〜１１のいずれか１項に記載のアルギン酸ゲルファイバの製造方法。
【請求項１３】
アルギン酸ゲルファイバの製法時の温度が、４〜２５℃の範囲である、請求項８〜１２のいずれか１項に記載のアルギン酸ゲルファイバの製造方法。
【請求項１４】
抗体産生細胞及び基材が含まれるコア層を、コア層よりも高い機械的強度を有するアルギン酸ゲルを含むシェル層で被覆して形成されるアルギン酸ゲルファイバを用いる抗体の製造方法であり、請求項１〜７のいずれか１項に記載のアルギン酸ゲルファイバを培養容器に入れ、培地を添加して前記アルギン酸ゲルファイバを含浸させ、振とう培養を行うことによる、抗体の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗体生産用のアルギン酸ゲルファイバ、当該ゲルファイバの製造方法、及び当該ゲルファイバを用いる抗体の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
遺伝子組換え技術を利用した抗体生産が行われている。これ迄に、抗体産生細胞として、ＣＨＯ細胞、Ｓｐ２／０細胞、ＮＳ０細胞又は大腸菌等が用いられ種々の抗体が産生されている。【０００３】
とりわけ、ＣＨＯ細胞（チャイニーズハムスター卵巣由来）は、浮遊培養が可能な細胞であり、又細胞の増殖速度が速く、ＣＨＯ細胞の大量培養により、目的のタンパク質を大量生産することが容易なことから、抗体の培養に頻用されている。【０００４】
近年、抗体医薬品の開発・製造において、抗体医薬品の安定生産、低コスト化への取組みが求められており、それらを達成するべく、より生産性の高い効率的な生産システム（例えば、連続生産方法、小規模生産設備による必要な量の抗体産生の為の新規な培養技術、等）の開発が注目されている。【０００５】
抗体産生細胞の培養は、抗体産生細胞株をスピナーフラスコ等で細胞を起こした後に、培地組成・温度・攪拌条件・ガス交換・ｐＨ等の培養条件を制御しながら拡大培養を行い、最終的に数千から１万Ｌスケールの大規模な生産培養タンクにて培養が行われる。【０００６】
抗体産生細胞を高密度で連続培養する場合、細胞と培養液の分離方法、効果的な酸素の供給方法等が問題になる場合がある。前者に関しては、重力沈降管や連続遠心分離機を用いて分離する方法等が検討されており、後者に関しては、培養タンク内に入れた多孔質のチューブを通した酸素拡散法、酸素溶解度の高いフッ素化炭素を培養液に添加する等の種々の方法が検討されており、種々の改善が図られている。しかし、抗体を効率的に生産させるためには、未だ種々の問題を解決することが必要とされている。【０００７】
コア部に各種細胞が含まれるコア・シェル構造を有するマイクロファイバが知られている（特許文献１：国際公開第２０１１／０４６１０５号パンフレット）。【０００８】
細胞層を含む中空マイクロファイバ、当該マイクロファイバの製造方法が知られている。（特許文献２：国際公開第２０１５／１７８４２７号パンフレット）【０００９】
アルギン酸ゲル中空ファイバの中空部にて、生体適合性ポリマー含有水溶液中に懸濁した細胞を培養することにより線状細胞凝集塊の作製方法が知られている。（特許文献３：特開２０１４−２３６６９８号公報）【００１０】
培養液を組織の隅々にまで供給することが可能な３次元細胞構造体の製造方法及び培養方法が知られている。（特許文献４：特開２０１６−７７２２９号公報）【００１１】
内部に細胞又は水溶性化学物質を含み、最外層に疎水性ポリマーを含む半透膜を備えることを特徴とするマイクロチューブが知られている。（特許文献５：特開２０１７−７７４７３号公報）【００１２】
二重同軸層流を有するマイクロ流体装置を用いて、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）タンパク質と分化細胞又は体細胞幹細胞をカプセル化したメーター長のコア−シェルヒドロゲル微小繊維の製造方法が知られている。（非特許文献１）【００１３】
アルギン酸塩とポリアクリルアミドからなるダブルネットワーク（ＤＮ）ハイドロゲルを用いて、機械的特性と取扱性を向上させた、細胞含有ハイドロゲルマイクロファイバーが知られている。（非特許文献２）【００１４】
しかし、特許文献１〜５及び非特許文献１及び２には、抗体産生細胞が含まれるコア層を、高い機械的強度を有するアルギン酸ゲル（好ましくは、コア層よりも高い機械的強度を有するアルギン酸ゲル）を含むシェル層で被覆した高い機械的強度を有するアルギン酸ゲルファイバ、及び当該アルギン酸ゲルファイバを用いる抗体の製造方法が開示されていないし、示唆もされていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１５】
【特許文献１】国際公開第２０１１／０４６１０５号パンフレット
【特許文献２】国際公開第２０１５／１７８４２７号パンフレット
【特許文献３】特開２０１４−２３６６９８号公報
【特許文献４】特開２０１６−７７２２９号公報
【特許文献５】特開２０１７−７７４７３号公報
【非特許文献】
【００１６】
【非特許文献１】Nature Materials.,12, p584−590, 2013年.
【非特許文献２】ACS Biomater. Sci. Eng., 3 (3), p392−398, 2017年.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１７】
これまで、抗体産生細胞（例えば、ＣＨＯ細胞等）及び基材（例えば、コラーゲン、培地、アルギン酸等の溶液又はゲル）が含まれるコア層を、架橋アルギン酸ゲル（例えば、天然由来の架橋アルギン酸ゲル）を含むシェル層で被覆した抗体生産用のアルギン酸ゲルファイバ、及び当該ゲルファイバを用いて、組み換え抗体生産を行うことは知られていなかった。又、これまで、一定の長さを有する前記アルギン酸ゲルファイバを形成することや、当該アルギン酸ゲルファイバを用いた連続的な抗体の生産方法も知られていない。【００１８】
このような状況の下、さらなる抗体の生産方法が求められていた。
【課題を解決するための手段】
【００１９】
本発明者らは、鋭意研究を重ねた結果、抗体産生細胞及び基材（例えば、コラーゲン、培地、アルギン酸等の溶液又はゲルからなる群から選択される基材）が含まれるコア層を、高い機械的強度を有するアルギン酸ゲル（好ましくは、コア層よりも高い機械的強度を有するアルギン酸ゲル）を含むシェル層で被覆することで抗体産生用のアルギン酸ゲルファイバを作製できることを見出した。又、このように作製したアルギン酸ゲルファイバを用いて抗体産生細胞の培養を行ったところ、抗体を長期間連続して産生できることを見出し、本発明を完成するに至った。【００２０】
後述の実施例から、抗体産生細胞として抗体遺伝子を組み込んだＣＨＯ細胞及び基材としてコラーゲンゲルを含むコア層を、高い機械的強度を有するカルシウム架橋アルギン酸ゲル（好ましくは、コア層よりも高い機械的強度を有するカルシウム架橋アルギン酸ゲル）を含むシェル層で被覆し、高い機械的強度を有するアルギン酸ゲルファイバを作製し、当該ゲルファイバを培養したところ、長期間連続して抗体（遺伝子組換え）を産生できることが分かった。このように、作製したアルギン酸ゲルファイバは、抗体産生ＣＨＯ細胞にとって抗体の連続産生に適した環境を提供しており、コア層で産生された抗体は、シェル層を連続的に透過しゲルファイバ外に放出された。
【発明の効果】
【００２１】
本発明により、さらなる抗体の生産方法が提供される。
いくつかの態様では、抗体産生細胞及び基材が含まれるコア層を、高い機械的強度を有するアルギン酸ゲル（好ましくは、コア層よりも高い機械的強度を有するアルギン酸ゲル）を含むシェル層で被覆することで、高い機械的強度を有するアルギン酸ゲルファイバが提供される。後述の実施例では、抗体産生細胞を含むコア層を、高い機械的強度を有するシェルを形成するために、アルギン酸ナトリウム溶液（Ａ−２又はＢ−２）から形成されるカルシウム架橋アルギン酸ゲルで被覆したアルギン酸ゲルファイバを作製し、抗体産生細胞を培養することにより、コア層で長期間抗体が連続産生され、その抗体がシェル層を透過して、アルギン酸ゲルファイバ外に連続的に放出される特徴を有する。【００２２】
好ましい態様のアルギン酸ゲルファイバは、抗体の生産に適した環境を提供する。細胞がコア層に封入されているため、培養液中の抗体産生細胞への物理的ストレスが少なく、封入した抗体産生細胞が長期間に渡り抗体を産生し続けることが期待される。従って、このようなアルギン酸ゲルファイバを用いた抗体の製造方法は、抗体の生産効率を飛躍的に向上させることが期待できる。例えば、大規模な培養タンクを要する抗体の浮遊培養とは異なり、小規模の生産設備にて抗体を製造することも期待される。少量・多種品目の抗体医薬品製造にも適した次世代型抗体医薬品の連続生産技術としても期待される。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】コア層に抗体産生細胞が含有されるアルギン酸ゲルファイバの断面図である。
【図２】コア層に抗体産生細胞が含有されるアルギン酸ゲルファイバの製造過程の１つの態様を説明する模式図である。
【図３】コア層に抗体産生細胞が含有されるアルギン酸ゲルファイバの横断面、産生された抗体、代謝物、老廃物、培養液（栄養源）、及び酸素がシェル層を透過することを説明する模式図である。
【図４】アルギン酸ゲルファイバＡの培養後（１２日間）の顕微鏡写真である。
【図５】アルギン酸ゲルファイバＢの培養後（２８日間）の顕微鏡写真である。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
［具体的態様］
ここでは、アルギン酸ゲルファイバ、当該ゲルファイバの製造方法、及び当該ゲルファイバを用いる抗体の製造方法の具体的態様について説明する。より具体的には、以下の態様［１］〜［１２−１］に記載の通りである。
【００２５】
［１］第１の態様は、抗体産生細胞及び基材が含まれるコア層を、高い機械的強度を有するアルギン酸ゲルを含むシェル層で被覆して形成されるアルギン酸ゲルファイバである。
【００２６】
［１−１］前記態様［１］において、コア層に含まれる抗体産生細胞が、例えば、ＣＨＯ細胞、ＣＨＯ細胞亜株、ＣＯＳ細胞、Ｓｐ２／０細胞、ＮＳ０細胞、ＳＰ２細胞、ＰＥＲＣ６細胞、ＹＢ２／０細胞、ＹＥ２／０細胞、１Ｒ９８３Ｆ細胞、Ｎａｍａｌｗａ細胞、Ｗｉｌ−２細胞、Ｊｕｒｋａｔ細胞、Ｖｅｒａ細胞、Ｍｏｌｔ−４細胞、２９３−ＨＥＫ細胞、ＢＨＫ細胞、ＫＧＨ６細胞、Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８．６５３細胞、Ｃ１２７細胞、ＪＣ細胞、ＬＡ７細胞、ＺＲ−４５−３０細胞、ｈＴＥＲＴ細胞、ＮＭ２Ｃ５細胞、ＵＡＣＣ−８１２細胞等からなる群から選択される細胞であり；好ましくは、ＣＨＯ細胞、ＣＨＯ細胞亜株、ＣＯＳ細胞、Ｓｐ２／０細胞、ＮＳ０細胞、ＳＰ２細胞、及びＰＥＲＣ６細胞からなる群から選択される細胞であり；より好ましくは、ＣＨＯ細胞、Ｓｐ２／０細胞、及びＮＳ０細胞からなる群から選択される細胞であり；更に好ましくは、ＣＨＯ細胞である。
【００２７】
［１−２］前記態様［１］又は［１−１］において、アルギン酸ゲルファイバのコア層に含まれる抗体産生細胞がＣＨＯ細胞であり、ＣＨＯ細胞が、例えば、ムロモナブ−ＣＤ３産生ＣＨＯ細胞、トラスツズマブ産生ＣＨＯ細胞、リツキシマブ産生ＣＨＯ細胞、パリビズマブ産生ＣＨＯ細胞、インフリキシマブ産生ＣＨＯ細胞、バシリキシマブ産生ＣＨＯ細胞、トシリズマブ産生ＣＨＯ細胞、ゲムツズマブ  オゾガマイシン産生ＣＨＯ細胞、ベバシズマブ産生ＣＨＯ細胞、イブリツモマブ  チウキセタン産生ＣＨＯ細胞、アダリムマブ産生ＣＨＯ細胞、セツキシマブ産生ＣＨＯ細胞、ラニビズマブ産生ＣＨＯ細胞、オマリズマブ産生ＣＨＯ細胞、エクリズマブ産生ＣＨＯ細胞、パニツムマブ産生ＣＨＯ細胞、ウステキヌマブ産生ＣＨＯ細胞、ゴリムマブ産生ＣＨＯ細胞、カナキヌマブ産生ＣＨＯ細胞、デノスマブ産生ＣＨＯ細胞、モガムリズマブ産生ＣＨＯ細胞、セルトリズマブ  ペゴル産生ＣＨＯ細胞、オファツムマブ産生ＣＨＯ細胞、ペルツズマブ産生ＣＨＯ細胞、トラスツズマブ  エムタンシン産生ＣＨＯ細胞、ブレンツキシマブ  ベドチン産生ＣＨＯ細胞、ナタリズマブ産生ＣＨＯ細胞、ニボルマブ産生ＣＨＯ細胞、アレムツズマブ産生ＣＨＯ細胞、セクキヌマブ産生ＣＨＯ細胞、ラムシルマブ産生ＣＨＯ細胞、イピリムマブ産生ＣＨＯ細胞、エボロクマブ産生ＣＨＯ細胞、メポリズマブ産生ＣＨＯ細胞、アリロクマブ産生ＣＨＯ細胞、イキセキズマブ産生ＣＨＯ細胞、ブロダルマブ産生ＣＨＯ細胞、イダルシズマブ産生ＣＨＯ細胞、エロツズマブ産生ＣＨＯ細胞、ペムブロリズマブ産生ＣＨＯ細胞、サリルマブ産生ＣＨＯ細胞、ベズロトクスマブ産生ＣＨＯ細胞、ベリムマブ産生ＣＨＯ細胞、ダラツムマブ産生ＣＨＯ細胞、アベルマブ産生ＣＨＯ細胞、デュピルマブ産生ＣＨＯ細胞、アテゾリズマブ産生ＣＨＯ細胞、ベンラリズマブ産生ＣＨＯ細胞、イノツズマブ  オゾガマイシン産生ＣＨＯ細胞、エミシズマブ産生ＣＨＯ細胞、グセルクマブ産生ＣＨＯ細胞、デュルバルマブ産生ＣＨＯ細胞、オビヌツズマブ産生ＣＨＯ細胞、ベドリズマブ産生ＣＨＯ細胞等からなる群から選択されるＣＨＯ細胞であり；好ましくは、トラスツズマブ産生ＣＨＯ細胞、リツキシマブ産生ＣＨＯ細胞、インフリキシマブ産生ＣＨＯ細胞、トシリズマブ産生ＣＨＯ細胞、アダリムマブ産生ＣＨＯ細胞、及びニボルマブ産生ＣＨＯ細胞からなる群から選択されるＣＨＯ細胞であり；より好ましくは、トシリズマブ産生ＣＨＯ細胞である。
【００２８】
［１−３］前記態様［１］〜［１−２］のいずれか１つにおいて、コア層に含まれる基材は、例えば、コラーゲン溶液、コラーゲンゲル、培地（または培養液）、アルギン酸溶液（例えば、アルギン酸ナトリウム溶液）、アルギン酸ゲル、又はそれらの混合物等からなる群から選択される基材であり；好ましくは、コラーゲン溶液、コラーゲンゲル、培地（または培養液）、アルギン酸溶液、アルギン酸ゲルからなる群から選択される基材であり；より好ましくは、コラーゲン溶液又はコラーゲンゲルである。
【００２９】
［２］第２の態様は、シェル層に含まれるアルギン酸ゲルの原料がアルギン酸ナトリウムであり、アルギン酸ナトリウムのＭ／Ｇ比が０．４〜１．８の範囲又は０．１〜０．４の範囲である、前記態様［１］〜［１−３］のいずれか１つに記載のアルギン酸ゲルファイバである。
【００３０】
［３］第３の態様は、シェル層に含まれるアルギン酸ゲルの原料がアルギン酸ナトリウムであり、アルギン酸ナトリウムの分子量（ＧＰＣ）が７００，０００〜１，０００，０００の範囲又は８００，０００〜１，０００，０００の範囲である、前記態様［１］〜［２］のいずれか１つに記載のアルギン酸ゲルファイバである。
【００３１】
［４］第４の態様はシェル層に含まれるアルギン酸ゲルの原料がアルギン酸ナトリウムであり、アルギン酸ナトリウムの１ｗ／ｗ％の粘度が５０〜１５０（ｍＰａ・ｓ）の範囲又は７０〜１５０（ｍＰａ・ｓ）の範囲である、前記態様［１］〜［３］のいずれか１つに記載のアルギン酸ゲルファイバである。
【００３２】
［５］第５の態様は、アルギン酸ゲルファイバの外径が、例えば、０．２μｍ〜２０００μｍの範囲である、前記態様［１］〜［４］のいずれか１つに記載のアルギン酸ゲルファイバである。
【００３３】
［５−１］前記態様［５］において、アルギン酸ゲルファイバの外径は、例えば、５０μｍ〜１０００μｍの範囲であり；好ましくは、３００μｍである。
【００３４】
［６］第６の態様は、アルギン酸ゲルファイバのコア層の直径が、例えば、０．１μｍ〜１０００μｍの範囲である、前記態様［１］〜［５−１］のいずれか１つに記載のアルギン酸ゲルファイバである。
【００３５】
［６−１］前記態様［６］において、アルギン酸ゲルファイバのコア層の直径は、例えば、１０μｍ〜１５０μｍの範囲であり；好ましくは１００μｍである。
【００３６】
［７］第７の態様は、アルギン酸ゲルファイバの外径が０．２μｍ〜２０００μｍの範囲であり、アルギン酸ゲルファイバのコア層の直径が０．１μｍ〜１０００μｍの範囲である、前記態様［１］〜［６−１］のいずれか１つに記載のアルギン酸ゲルファイバである。
【００３７】
［７−１］前記態様［７］において、例えば、アルギン酸ゲルファイバの外径が、５０μｍ〜１０００μｍの範囲であり、アルギン酸ゲルファイバのコア層の直径が、１０μｍ〜１５０μｍの範囲であり；好ましくは、アルギン酸ゲルファイバの外径が、３００μｍであり、アルギン酸ゲルファイバのコア層の直径が、１００μｍである。
【００３８】
［８］第８の態様は、抗体産生細胞及び基材が含まれるコア層を、アルギン酸ゲルを含むシェル層で被覆して形成される高い機械的強度を有するアルギン酸ゲルファイバの製造方法であって、
導入管４０と、導入管４０の導入口１と、導入口１の下流に位置する導入管４０の導入口２と、導入口２の下流に位置する導入管４０の導入口３と、導入口２の下流に位置する導入管４０の出口５０を含む、マイクロ流体装置１０を用い、
（１）導入口１から、抗体産生細胞６と基材を導入して射出して、導入管４０内に抗体産生細胞６と基材の第１の層流を形成する工程、
（２）導入口２から、アルギン酸ナトリウム溶液を導入して射出して、第１の層流の外周を覆う、アルギン酸ナトリウム溶液の第２の層流を形成する工程、
（３）導入口３から、２価金属イオンを含む溶液を導入して射出して、第２の層流の外周を覆う、２価金属イオンを含む溶液の第３の層流を形成する工程、
（４）出口５０から射出される、抗体産生細胞及び基材が含まれるコア層を、アルギン酸ゲルを含むシェル層で被覆して形成されるアルギン酸ゲルファイバを得る工程
を含むことを特徴とする、アルギン酸ゲルファイバの製造方法である。
【００３９】
［８−１］前記態様［８］において、抗体産生細胞６は、例えば、前記態様[１−１]に記載の細胞であり、すなわち、例えば、ＣＨＯ細胞、ＣＨＯ細胞亜株、ＣＯＳ細胞、Ｓｐ２／０細胞、ＮＳ０細胞、ＳＰ２細胞、ＰＥＲＣ６細胞、ＹＢ２／０細胞、ＹＥ２／０細胞、１Ｒ９８３Ｆ細胞、Ｎａｍａｌｗａ細胞、Ｗｉｌ−２細胞、Ｊｕｒｋａｔ細胞、Ｖｅｒａ細胞、Ｍｏｌｔ−４細胞、２９３−ＨＥＫ細胞、ＢＨＫ細胞、ＫＧＨ６細胞、Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８．６５３細胞、Ｃ１２７細胞、ＪＣ細胞、ＬＡ７細胞、ＺＲ−４５−３０細胞、ｈＴＥＲＴ細胞、ＮＭ２Ｃ５細胞、ＵＡＣＣ−８１２細胞等からなる群から選択される細胞であり；好ましくは、ＣＨＯ細胞、ＣＨＯ細胞亜株、ＣＯＳ細胞、Ｓｐ２／０細胞、ＮＳ０細胞、ＳＰ２細胞、及びＰＥＲＣ６細胞からなる群から選択される細胞であり；より好ましくは、ＣＨＯ細胞、Ｓｐ２／０細胞、及びＮＳ０からなる群から選択される細胞であり；更に好ましくは、ＣＨＯ細胞である。
【００４０】
［８−２］前記態様［８］又は［８−１］において、アルギン酸ゲルファイバのコア層に含まれる抗体産生細胞がＣＨＯ細胞であり、ＣＨＯ細胞が、例えば、ムロモナブ−ＣＤ３産生ＣＨＯ細胞、トラスツズマブ産生ＣＨＯ細胞、リツキシマブ産生ＣＨＯ細胞、パリビズマブ産生ＣＨＯ細胞、インフリキシマブ産生ＣＨＯ細胞、バシリキシマブ産生ＣＨＯ細胞、トシリズマブ産生ＣＨＯ細胞、ゲムツズマブ  オゾガマイシン産生ＣＨＯ細胞、ベバシズマブ産生ＣＨＯ細胞、イブリツモマブ  チウキセタン産生ＣＨＯ細胞、アダリムマブ産生ＣＨＯ細胞、セツキシマブ産生ＣＨＯ細胞、ラニビズマブ産生ＣＨＯ細胞、オマリズマブ産生ＣＨＯ細胞、エクリズマブ産生ＣＨＯ細胞、パニツムマブ産生ＣＨＯ細胞、ウステキヌマブ産生ＣＨＯ細胞、ゴリムマブ産生ＣＨＯ細胞、カナキヌマブ産生ＣＨＯ細胞、デノスマブ産生ＣＨＯ細胞、モガムリズマブ産生ＣＨＯ細胞、セルトリズマブ  ペゴル産生ＣＨＯ細胞、オファツムマブ産生ＣＨＯ細胞、ペルツズマブ産生ＣＨＯ細胞、トラスツズマブ  エムタンシン産生ＣＨＯ細胞、ブレンツキシマブ  ベドチン産生ＣＨＯ細胞、ナタリズマブ産生ＣＨＯ細胞、ニボルマブ産生ＣＨＯ細胞、アレムツズマブ産生ＣＨＯ細胞、セクキヌマブ産生ＣＨＯ細胞、ラムシルマブ産生ＣＨＯ細胞、イピリムマブ産生ＣＨＯ細胞、エボロクマブ産生ＣＨＯ細胞、メポリズマブ産生ＣＨＯ細胞、アリロクマブ産生ＣＨＯ細胞、イキセキズマブ産生ＣＨＯ細胞、ブロダルマブ産生ＣＨＯ細胞、イダルシズマブ産生ＣＨＯ細胞、エロツズマブ産生ＣＨＯ細胞、ペムブロリズマブ産生ＣＨＯ細胞、サリルマブ産生ＣＨＯ細胞、ベズロトクスマブ産生ＣＨＯ細胞、ベリムマブ産生ＣＨＯ細胞、ダラツムマブ産生ＣＨＯ細胞、アベルマブ産生ＣＨＯ細胞、デュピルマブ産生ＣＨＯ細胞、アテゾリズマブ産生ＣＨＯ細胞、ベンラリズマブ産生ＣＨＯ細胞、イノツズマブ  オゾガマイシン産生ＣＨＯ細胞、エミシズマブ産生ＣＨＯ細胞、グセルクマブ産生ＣＨＯ細胞、デュルバルマブ産生ＣＨＯ細胞、オビヌツズマブ産生ＣＨＯ細胞、ベドリズマブ産生ＣＨＯ細胞等からなる群から選択されるＣＨＯ細胞であり；好ましくは、トラスツズマブ産生ＣＨＯ細胞、リツキシマブ産生ＣＨＯ細胞、インフリキシマブ産生ＣＨＯ細胞、トシリズマブ産生ＣＨＯ細胞、アダリムマブ産生ＣＨＯ細胞、及びニボルマブ産生ＣＨＯ細胞からなる群から選択されるＣＨＯ細胞であり；より好ましくは、トシリズマブ産生ＣＨＯ細胞である。
【００４１】
［８−３］前記態様［８］〜［８−２］のいずれか１つにおいて、コア層に含まれる基材が、
例えば、コラーゲン溶液、コラーゲンゲル、培地（または培養液）、アルギン酸溶液（例えば、アルギン酸ナトリウム溶液）、アルギン酸ゲル、及びそれらの混合物等からなる群から選択される基材であり；
好ましくは、コラーゲン溶液、コラーゲンゲル、培地（または培養液）、アルギン酸溶液、及びアルギン酸ゲルからなる群から選択される基材であり；
より好ましくは、コラーゲン溶液又はコラーゲンゲルである。
【００４２】
［８−４］前記態様［８］〜［８−３］のいずれか１つにおいて、２価金属イオンが、例えば、カルシウムイオン、マグネシウムイオン、バリウムイオン、ストロンチウムイオン、亜鉛イオン等からなる群から選択されるイオンであり；好ましくは、カルシウムイオンである。
【００４３】
［８−５］前記態様［８］〜［８−４］のいずれか１つにおいて、２価金属イオンを含む溶液は、例えば、塩化カルシウム水溶液、炭酸カルシウム水溶液、グルコン酸カルシウム水溶液等からなる群から選択される水溶液であり；好ましくは、塩化カルシウム水溶液である。
【００４４】
［８−６］前記態様［８］〜［８−５］のいずれか１つにおいて、２価金属イオンを含む溶液の２価金属イオンの濃度が、例えば、１ｍＭ〜１Ｍの範囲、又は５０〜５００ｍＭの範囲であり；好ましくは、１００ｍＭである。
【００４５】
［８−７］前記態様［８］〜［８−６］のいずれか１つにおいて、マイクロ流体装置１０の導入口１から射出される抗体産生細胞６と基材の流速は、例えば、１０〜５００μＬ／分の範囲である。
【００４６】
［８−８］前記態様［８］〜［８−７］のいずれか１つにおいて、マイクロ流体装置１０の導入口２から射出されるアルギン酸ナトリウム溶液の流速は、例えば、１０〜５００μＬ／分の範囲である。
【００４７】
［８−９］前記態様［８］〜［８−８］のいずれか１つにおいて、マイクロ流体装置１０の導入口３から射出される２価金属イオンを含む溶液の流速は、例えば、１〜１０ｍＬ／分の範囲である。
【００４８】
［８−１０］前記態様［８］〜［８−９］のいずれか１つにおいて、例えば、マイクロ流体装置１０の導入口１から射出される抗体産生細胞６と基材の流速が、１０〜５００μＬ／分の範囲であり、マイクロ流体装置１０の導入口２から射出されるアルギン酸ナトリウム溶液の流速が、１０〜５００μＬ／分の範囲であり、マイクロ流体装置１０の導入口３から射出される２価金属イオンを含む溶液の流速が、１〜１０ｍＬ／分の範囲である。
【００４９】
［８−１１］前記態様［８］〜［８−１０］のいずれか１つにおいて、アルギン酸ゲルファイバの製法時の温度は、例えば、４〜２５℃の範囲である。
【００５０】
［９］第９の態様は、抗体産生細胞及び基材が含まれるコア層を、アルギン酸ゲルを含むシェル層で被覆して形成されるアルギン酸ゲルファイバを用いる抗体の製造方法であり、前記態様［１］〜［７−１］のいずれか１つに記載のアルギン酸ゲルファイバを培養容器に入れ、培地を添加して前記アルギン酸ゲルファイバを含浸させ、振とう培養を行うことによる、抗体の製造方法である。
【００５１】
［９−１］前記態様［９］において、培養容器は、例えば、三角フラスコ、Ｔ−フラスコ、スピナーフラスコ等からなる群から選択される容器であり；好ましくは三角フラスコである。
【００５２】
［９−２］前記態様［９］又は［９−１］において、振とう培養の条件は、例えば、３７℃、５％ＣＯ２インキュベータ内で１２５ｒｐｍである。
【００５３】
［９−３］前記態様［９］〜［９−２］のいずれか１つにおいて、振とう培養する期間は、例えば、３０日であり；又は１２日であり；又は２８日である。
【００５４】
［９−４］前記態様［９］〜［９−３］のいずれか１つにおいて、抗体産生細胞は、例えば、前記態様[１−１]に記載の細胞であり、すなわち、例えば、ＣＨＯ細胞、ＣＨＯ細胞亜株、ＣＯＳ細胞、Ｓｐ２／０細胞、ＮＳ０細胞、ＳＰ２細胞、ＰＥＲＣ６細胞、ＹＢ２／０細胞、ＹＥ２／０細胞、１Ｒ９８３Ｆ細胞、Ｎａｍａｌｗａ細胞、Ｗｉｌ−２細胞、Ｊｕｒｋａｔ細胞、Ｖｅｒａ細胞、Ｍｏｌｔ−４細胞、２９３−ＨＥＫ細胞、ＢＨＫ細胞、ＫＧＨ６細胞、Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８．６５３細胞、Ｃ１２７細胞、ＪＣ細胞、ＬＡ７細胞、ＺＲ−４５−３０細胞、ｈＴＥＲＴ細胞、ＮＭ２Ｃ５細胞、ＵＡＣＣ−８１２細胞等からなる群から選択される細胞であり；好ましくは、ＣＨＯ細胞、ＣＨＯ細胞亜株、ＣＯＳ細胞、Ｓｐ２／０細胞、ＮＳ０細胞、ＳＰ２細胞、及びＰＥＲＣ６細胞からなる群から選択される細胞であり；より好ましくは、ＣＨＯ細胞、Ｓｐ２／０細胞、及びＮＳ０からなる群から選択される細胞であり；更に好ましくは、ＣＨＯ細胞である。
【００５５】
［９−５］前記態様［９］〜［９−４］のいずれか１つにおいて、抗体産生細胞がＣＨＯ細胞であり、ＣＨＯ細胞が、例えば、ムロモナブ−ＣＤ３産生ＣＨＯ細胞、トラスツズマブ産生ＣＨＯ細胞、リツキシマブ産生ＣＨＯ細胞、パリビズマブ産生ＣＨＯ細胞、インフリキシマブ産生ＣＨＯ細胞、バシリキシマブ産生ＣＨＯ細胞、トシリズマブ産生ＣＨＯ細胞、ゲムツズマブ  オゾガマイシン産生ＣＨＯ細胞、ベバシズマブ産生ＣＨＯ細胞、イブリツモマブ  チウキセタン産生ＣＨＯ細胞、アダリムマブ産生ＣＨＯ細胞、セツキシマブ産生ＣＨＯ細胞、ラニビズマブ産生ＣＨＯ細胞、オマリズマブ産生ＣＨＯ細胞、エクリズマブ産生ＣＨＯ細胞、パニツムマブ産生ＣＨＯ細胞、ウステキヌマブ産生ＣＨＯ細胞、ゴリムマブ産生ＣＨＯ細胞、カナキヌマブ産生ＣＨＯ細胞、デノスマブ産生ＣＨＯ細胞、モガムリズマブ産生ＣＨＯ細胞、セルトリズマブ  ペゴル産生ＣＨＯ細胞、オファツムマブ産生ＣＨＯ細胞、ペルツズマブ産生ＣＨＯ細胞、トラスツズマブ  エムタンシン産生ＣＨＯ細胞、ブレンツキシマブ  ベドチン産生ＣＨＯ細胞、ナタリズマブ産生ＣＨＯ細胞、ニボルマブ産生ＣＨＯ細胞、アレムツズマブ産生ＣＨＯ細胞、セクキヌマブ産生ＣＨＯ細胞、ラムシルマブ産生ＣＨＯ細胞、イピリムマブ産生ＣＨＯ細胞、エボロクマブ産生ＣＨＯ細胞、メポリズマブ産生ＣＨＯ細胞、アリロクマブ産生ＣＨＯ細胞、イキセキズマブ産生ＣＨＯ細胞、ブロダルマブ産生ＣＨＯ細胞、イダルシズマブ産生ＣＨＯ細胞、エロツズマブ産生ＣＨＯ細胞、ペムブロリズマブ産生ＣＨＯ細胞、サリルマブ産生ＣＨＯ細胞、ベズロトクスマブ産生ＣＨＯ細胞、ベリムマブ産生ＣＨＯ細胞、ダラツムマブ産生ＣＨＯ細胞、アベルマブ産生ＣＨＯ細胞、デュピルマブ産生ＣＨＯ細胞、アテゾリズマブ産生ＣＨＯ細胞、ベンラリズマブ産生ＣＨＯ細胞、イノツズマブ  オゾガマイシン産生ＣＨＯ細胞、エミシズマブ産生ＣＨＯ細胞、グセルクマブ産生ＣＨＯ細胞、デュルバルマブ産生ＣＨＯ細胞、オビヌツズマブ産生ＣＨＯ細胞、ベドリズマブ産生ＣＨＯ細胞等からなる群から選択されるＣＨＯ細胞であり；好ましくは、トラスツズマブ産生ＣＨＯ細胞、リツキシマブ産生ＣＨＯ細胞、インフリキシマブ産生ＣＨＯ細胞、トシリズマブ産生ＣＨＯ細胞、アダリムマブ産生ＣＨＯ細胞、及びニボルマブ産生ＣＨＯ細胞からなる群から選択される細胞であり；より好ましくは、トシリズマブ産生ＣＨＯ細胞である。
【００５６】
［１０］第１０の態様は、前記態様［９］〜［９−５］のいずれか１つに記載の抗体の製造方法で得られるアルギン酸ゲルファイバのコア層で産生されシェル層を透過する抗体が、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、及びＩｇＥ等からなる群から選択されるアイソタイプを有する抗体である。
【００５７】
［１０−１］前記態様［１０］において、コア層で産生されシェル層を透過する抗体が有するアイソタイプが、好ましくは、ＩｇＧ又はＩｇＥであり；より好ましくは、ＩｇＧである。
【００５８】
［１１］第１１の態様は、前記態様［９］〜［９−５］のいずれか１つに記載の抗体の製造方法で得られるアルギン酸ゲルファイバのコア層で産生されシェル層を透過する抗体の分子量が、４５，０００〜９００，０００の範囲である抗体である。
【００５９】
［１１−１］前記態様［１１］において、コア層で産生されシェル層を透過する抗体の分子量が、好ましくは、４５，０００〜１６０，０００の範囲であり；より１４０，０００〜１５０，０００の範囲である。
【００６０】
［１２］第１２の態様は、前記態様［９］〜［９−５］のいずれか１つに記載の抗体の製造方法にて得られる抗体が、
例えば、ムロモナブ−ＣＤ３産生ＣＨＯ細胞を用いてムロモナブ−ＣＤ３、トラスツズマブ産生ＣＨＯ細胞を用いてトラスツズマブ、リツキシマブ産生ＣＨＯ細胞を用いてリツキシマブ、パリビズマブ産生ＣＨＯ細胞を用いてパリビズマブ、インフリキシマブ産生ＣＨＯ細胞を用いてインフリキシマブ、バシリキシマブ産生ＣＨＯ細胞を用いてバシリキシマブ、トシリズマブ産生ＣＨＯ細胞を用いてトシリズマブ、ゲムツズマブ  オゾガマイシン産生ＣＨＯ細胞を用いてゲムツズマブ  オゾガマイシン、ベバシズマブ産生ＣＨＯ細胞を用いてベバシズマブ、イブリツモマブ  チウキセタン産生ＣＨＯ細胞を用いてイブリツモマブ  チウキセタン、アダリムマブ産生ＣＨＯ細胞を用いてアダリムマブ、セツキシマブ産生ＣＨＯ細胞を用いてセツキシマブ、ラニビズマブ産生ＣＨＯ細胞を用いてラニビズマブ、オマリズマブ産生ＣＨＯ細胞を用いてオマリズマブ、エクリズマブ産生ＣＨＯ細胞を用いてエクリズマブ、パニツムマブ産生ＣＨＯ細胞を用いてパニツムマブ、ウステキヌマブ産生ＣＨＯ細胞を用いてウステキヌマブ、ゴリムマブ産生ＣＨＯ細胞を用いてゴリムマブ、カナキヌマブ産生ＣＨＯ細胞を用いてカナキヌマブ、デノスマブ産生ＣＨＯ細胞を用いてデノスマブ、モガムリズマブ産生ＣＨＯ細胞を用いてモガムリズマブ、セルトリズマブ  ペゴル産生ＣＨＯ細胞を用いてセルトリズマブ  ペゴル、オファツムマブ産生ＣＨＯ細胞を用いてオファツムマブ、ペルツズマブ産生ＣＨＯ細胞を用いてペルツズマブ、トラスツズマブ  エムタンシン産生ＣＨＯ細胞を用いてトラスツズマブ  エムタンシン、ブレンツキシマブ  ベドチン産生ＣＨＯ細胞を用いてブレンツキシマブ  ベドチン、ナタリズマブ産生ＣＨＯ細胞を用いてナタリズマブ、ニボルマブ産生ＣＨＯ細胞を用いてニボルマブ、アレムツズマブ産生ＣＨＯ細胞を用いてアレムツズマブ、セクキヌマブ産生ＣＨＯ細胞を用いてセクキヌマブ、ラムシルマブ産生ＣＨＯ細胞を用いてラムシルマブ、イピリムマブ産生ＣＨＯ細胞を用いてイピリムマブ、エボロクマブ産生ＣＨＯ細胞を用いてエボロクマブ、メポリズマブ産生ＣＨＯ細胞を用いてメポリズマブ、アリロクマブ産生ＣＨＯ細胞を用いてアリロクマブ、イキセキズマブ産生ＣＨＯ細胞を用いてイキセキズマブ、ブロダルマブ産生ＣＨＯ細胞を用いてブロダルマブ、イダルシズマブ産生ＣＨＯ細胞を用いてイダルシズマブ、エロツズマブ産生ＣＨＯ細胞を用いてエロツズマブ、ペムブロリズマブ産生ＣＨＯ細胞を用いてペムブロリズマブ、サリルマブ産生ＣＨＯ細胞を用いてサリルマブ、ベズロトクスマブ産生ＣＨＯ細胞を用いてベズロトクスマブ、ベリムマブ産生ＣＨＯ細胞を用いてベリムマブ、ダラツムマブ産生ＣＨＯ細胞を用いてダラツムマブ、アベルマブ産生ＣＨＯ細胞を用いてアベルマブ、デュピルマブ産生ＣＨＯ細胞を用いてデュピルマブ、アテゾリズマブ産生ＣＨＯ細胞を用いてアテゾリズマブ、ベンラリズマブ産生ＣＨＯ細胞を用いてベンラリズマブ、イノツズマブ  オゾガマイシン産生ＣＨＯ細胞を用いてイノツズマブ  オゾガマイシン、エミシズマブ産生ＣＨＯ細胞を用いてエミシズマブ、グセルクマブ産生ＣＨＯ細胞を用いてグセルクマブ、デュルバルマブ産生ＣＨＯ細胞を用いてデュルバルマブ、オビヌツズマブ産生ＣＨＯ細胞を用いてオビヌツズマブ、又はベドリズマブ産生ＣＨＯ細胞を用いてベドリズマブである。
【００６１】
［１２−１］前記態様［１２］において、前記態様［９］〜［９−５］のいずれか１つに記載の抗体の製造方法にて産生可能な抗体として、好ましくは、トラスツズマブ産生ＣＨＯ細胞を用いてトラスツズマブ、リツキシマブ産生ＣＨＯ細胞を用いてリツキシマブ、インフリキシマブ産生ＣＨＯ細胞を用いてインフリキシマブ、トシリズマブ産生ＣＨＯ細胞を用いてトシリズマブ、アダリムマブ産生ＣＨＯを用いてアダリムマブ、又はニボルマブ産生ＣＨＯ細胞を用いてニボルマブであり；より好ましくは、トシリズマブ産生ＣＨＯ細胞を用いてトシリズマブである。
【００６２】
以下、詳細に説明する。
１．アルギン酸：
本明細書中、アルギン酸と記載する場合、アルギン酸、アルギン酸エステル、及びそれらの塩（例えば、アルギン酸ナトリウム）からなる群から選択される少なくとも１種のアルギン酸（「アルギン酸類」という場合がある）を意味する。用いられるアルギン酸は、天然由来でも合成物であってもよいが、天然由来であるのが好ましい。好ましく用いられるアルギン酸類は、レッソニア、マクロシスティス、ラミナリア、アスコフィラム、ダービリア、カジカ、アラメ、コンブなどの褐藻類から抽出される生体内吸収性の多糖類であって、Ｄ−マンヌロン酸（Ｍ）とＬ−グルロン酸（Ｇ）という２種類のウロン酸が直鎖状に重合したポリマーである。より具体的には、Ｄ−マンヌロン酸のホモポリマー画分（ＭＭ画分）、Ｌ−グルロン酸のホモポリマー画分（ＧＧ画分）、及びＤ−マンヌロン酸とＬ−グルロン酸がランダムに配列した画分（Ｍ／Ｇ画分）が任意に結合したブロック共重合体である。
【００６３】
アルギン酸ナトリウムは、市販品のアルギン酸ナトリウムを用いることができる。例えば、アルギン酸ナトリウムは、下表に記載したＡ−１、Ａ−２、Ａ−３、Ｂ−１、Ｂ−２、又はＢ−３のアルギン酸ナトリウム（発売元  持田製薬株式会社）を用いてもよい。各アルギン酸ナトリウムの１ｗ／ｗ％（質量％）の水溶液の粘度、重量平均分子量及びＭ／Ｇ灯を表１に示す。
【００６４】
【表１】
2020032221.tif 000002
【００６５】
前記アルギン酸ナトリウムＡ−１、Ａ−２及びＡ−３の各物性値は、下記の各種方法により測定をしているが、測定方法は、当該方法に限定されるものではない。
【００６６】
［アルギン酸ナトリウムの粘度測定］
日本薬局方（第１６版）の粘度測定法に従い、回転粘度計法（コーンプレート型回転粘度計）を用いて測定した。具体的な測定条件は以下のとおりである。試料溶液の調製は、ＭｉｌｌｉＱ水を用いて行った。測定機器は、コーンプレート型回転粘度計（粘度粘弾性測定装置レオストレスＲＳ６００（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｈａａｋｅ  ＧｍｂＨ）センサー：３５／１）を用いた。回転数は、１ｗ／ｗ％（質量％）アルギン酸ナトリウム溶液測定時は１ｒｐｍとした。読み取り時間は、２分間測定し、開始１分から２分までの平均値とした。３回の測定の平均値を測定値とした。測定温度は２０℃とした。
【００６７】
［アルギン酸ナトリウムの重量平均分子量測定］
（１）ゲル浸透クロマトグラフィー（ＧＰＣ）と、（２）ＧＰＣ−ＭＡＬＳの２種類の測定法で測定した。測定条件は以下のとおりである。
【００６８】
［前処理方法］
試料に溶離液を加え溶解後、０．４５μｍメンブランフィルターろ過したものを測定溶液とした。
（１）ゲル浸透クロマトグラフィー（ＧＰＣ）測定
［測定条件（相対分子量分布測定）］
カラム：ＴＳＫｇｅｌ  ＧＭＰＷ−ＸＬ×２＋Ｇ２５００ＰＷ−ＸＬ（７．８ｍｍ  Ｉ．Ｄ．×３００ｍｍ×３本）
溶離液：２００ｍＭ硝酸ナトリウム水溶液
流量：１．０ｍＬ／ｍｉｎ
濃度：０．０５％
検出器：ＲＩ検出器
カラム温度：４０℃
注入量：２００μＬ
分子量標準：標準プルラン、グルコース
【００６９】
（２）ＧＰＣ−ＭＡＬＳ測定
［屈折率増分（ｄｎ／ｄｃ）測定（測定条件）］
示唆屈折率計：Ｏｐｔｉｌａｂ  Ｔ−ｒＥＸ
測定波長：６５８ｎｍ
測定温度：４０℃
溶媒：２００ｍＭ硝酸ナトリウム水溶液
試料濃度：０．５〜２．５ｍｇ／ｍＬ（５濃度）
【００７０】
［測定条件（絶対分子量分布測定）］
カラム：ＴＳＫｇｅｌ  ＧＭＰＷ−ＸＬ×２＋Ｇ２５００ＰＷ−ＸＬ（７．８ｍｍ  Ｉ．Ｄ．×３００ｍｍ×３本）
溶離液：２００ｍＭ硝酸ナトリウム水溶液
流量：１．０ｍＬ／ｍｉｎ
濃度：０．０５％
検出器：ＲＩ検出器、光散乱検出器（ＭＡＬＳ）
カラム温度：４０℃
注入量：２００μＬ
【００７１】
本明細書中、アルギン酸、アルギン酸誘導体、架橋アルギン酸、及び架橋アルギン酸の分子量において、単位としてＤａ（ダルトン）を付記する場合がある。
【００７２】
アルギン酸類のＤ−マンヌロン酸とＬ−グルロン酸の構成比（Ｍ／Ｇ比）は、主に海藻等の由来となる生物の種類によって異なり、また、その生物の生育場所や季節による影響を受け、Ｍ／Ｇ比が約０．２の高Ｇ型からＭ／Ｇ比が約５の高Ｍ型まで高範囲にわたる。アルギン酸類のゲル化能力及び生成したゲルの性質は、Ｍ／Ｇ比によって影響を受け、一般的に、Ｇ比率が高い場合にはイオン架橋アルギン酸のゲル強度が高くなることが知られている。Ｍ／Ｇ比は、その他にも、ゲルの硬さ、もろさ、吸水性、柔軟性などにも影響を与える。用いるアルギン酸類及び／又はその塩のＭ／Ｇ比は、例えば、０．４〜１．８の範囲であり、又は０．１〜０．４の範囲である。
本明細書中、「〜」を用いて示された数値範囲は、「〜」の前後に記載される数値をそれぞれ最小値及び最大値として含む範囲を示す。
【００７３】
用いられる「アルギン酸エステル」、「アルギン酸塩」とは、特に限定されないが、架橋剤と反応させるため、架橋反応を阻害する官能基を有していないことが必要である。アルギン酸エステルとしては、好ましくは、アルギン酸プロピレングリコール、等が挙げられる。
【００７４】
アルギン酸塩としては、例えば、アルギン酸の１価の塩、アルギン酸の２価の塩が挙げられる。アルギン酸の１価の塩としては、好ましくは、アルギン酸ナトリウム、アルギン酸カリウム、アルギン酸アンモニウム、等が挙げられ、より好ましくは、アルギン酸ナトリウム又はアルギン酸カリウムであり、特に好ましくは、アルギン酸ナトリウムである。アルギン酸の２価の塩としては、好ましくは、アルギン酸カルシウム、アルギン酸マグネシウム、アルギン酸バリウム、アルギン酸ストロンチウム、等が挙げられる。
【００７５】
アルギン酸は、高分子多糖類であり、分子量を正確に定めることは困難であるが、一般的に重量平均分子量で１０００〜１０００万、好ましくは１万〜８００万、より好ましくは２万〜３００万の範囲である。天然物由来の高分子物質の分子量測定では、測定方法により値に違いが生じうることが知られている。
【００７６】
いくつかの態様では、ゲル浸透クロマトグラフィー（ＧＰＣ）又はゲルろ過クロマトグラフィー（これらを合わせてサイズ排除クロマトグラフィーともいう）により測定したアルギン酸の重量平均分子量は、例えば、３００，０００〜４００，０００の範囲、７００，０００〜１，０００，０００の範囲、１，１００，０００〜１，７００，０００の範囲、４００，０００〜５００，０００の範囲、８００，０００〜１，０００，０００の範囲、又は１，５００，０００〜１，９００，０００の範囲である。
例えば、ゲル浸透クロマトグラフィー（ＧＰＣ）又はゲルろ過クロマトグラフィー（これらを合わせてサイズ排除クロマトグラフィーともいう）により測定した重量平均分子量は、例えば、アルギン酸Ａ−１で、３００，０００〜４００，０００の範囲であり；アルギン酸Ａ−２で、７００，０００〜１，０００，０００の範囲であり；アルギン酸Ａ−３で、１，１００，０００〜１，７００，０００の範囲であり；アルギン酸Ｂ−１で、４００，０００〜５００，０００の範囲であり；アルギン酸Ｂ−２で、８００，０００〜１，０００，０００の範囲であり；アルギン酸Ｂ−３で、１，５００，０００〜１，９００，０００の範囲である。
【００７７】
好ましい態様では、ゲル浸透クロマトグラフィー（ＧＰＣ）又はゲルろ過クロマトグラフィー（これらを合わせてサイズ排除クロマトグラフィーともいう）により測定したアルギン酸の重量平均分子量は、７００，０００〜１，０００，０００の範囲、又は８００，０００〜１，０００，０００の範囲である。
好ましくは、アルギン酸Ａ−２での、７００，０００〜１，０００，０００の範囲、又は、アルギン酸Ｂ−２での、８００，０００〜１，０００，０００の範囲である。
【００７８】
また、例えば、ＧＰＣ−ＭＡＬＳ法によれば、絶対重量平均分子量を測定することができる。
いくつかの態様では、ＧＰＣ−ＭＡＬＳ法により測定した重量平均分子量(絶対分子量)は、例えば、６０，０００〜８０，０００の範囲、１００，０００〜２００，０００の範囲、２００，０００〜４００，０００の範囲、７０，０００〜９０，０００の範囲、１００，０００〜２００，０００の範囲、又は２００，０００〜３５０，０００の範囲である。
例えば、ＧＰＣ−ＭＡＬＳ法により測定した重量平均分子量(絶対分子量)は、例えば、アルギン酸Ａ−１で、６０，０００〜８０，０００の範囲であり；アルギン酸Ａ−２で、１００，０００〜２００，０００の範囲であり；アルギン酸Ａ−３で、２００，０００〜４００，０００の範囲であり；アルギン酸Ｂ−１で、７０，０００〜９０，０００の範囲であり；アルギン酸Ｂ−２で１００，０００〜２００，０００の範囲であり；アルギン酸Ｂ−３で、２００，０００〜３５０，０００の範囲である。
【００７９】
好ましい態様では、ＧＰＣ−ＭＡＬＳ法により測定した重量平均分子量(絶対分子量)は、１００，０００〜２００，０００の範囲である。
好ましくは、アルギン酸Ａ−２での１００，０００〜２００，０００の範囲、又は、アルギン酸Ｂ−２での１００，０００〜２００，０００の範囲である。
【００８０】
通常、高分子多糖類の分子量を上記のような手法で算出する場合、１０％〜２０％の測定誤差を生じうる。例えば、４０万であれば３２万〜４８万、５０万であれば４０万〜６０万、１００万であれば８０万〜１２０万程度の範囲で値の変動が生じうる。
【００８１】
アルギン酸類の分子量の測定は、常法に従い測定することができる。
【００８２】
分子量測定にゲルろ過クロマトグラフィーを用いる場合の代表的な条件は、前述のとおりである。カラムは、例えば、Ｓｕｐｅｒｏｓｅ６  Ｉｎｃｒｅａｓｅ１０／３００  ＧＬカラム（ＧＥヘルスケアサイエンス社）を用いることができ、展開溶媒として、例えば、０．１５ｍｏｌ／Ｌ  ＮａＣｌを含む１０ｍｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）を使用することができ、分子量標準としてブルーデキストラン、チログロブリン、フェリチン、アルドラーゼ、コンアルブミン、オブアルブミン、リボヌクレアーゼＡ及びアプロチニンを用いることができる。
【００８３】
本明細書中で用いられるアルギン酸の粘度は、特に限定されないが、１ｗ／ｗ％のアルギン酸類の水溶液として粘度を測定した場合、例えば、アルギン酸Ａ−１で、１０〜４０（ｍＰａ・ｓ）の範囲であり；アルギン酸Ａ−２で、５０〜１５０（ｍＰａ・ｓ）の範囲であり；アルギン酸Ａ−３で、３００〜６００（ｍＰａ・ｓ）の範囲であり；アルギン酸Ｂ−１で、１０〜４０（ｍＰａ・ｓ）の範囲であり；アルギン酸Ｂ−２で、７０〜１５０（ｍＰａ・ｓ）の範囲であり；アルギン酸Ｂ−３で、４００〜６００（ｍＰａ・ｓ）の範囲である。
【００８４】
好ましくは、アルギン酸Ａ−２での、５０〜１５０（ｍＰａ・ｓ）の範囲、又は、アルギン酸Ｂ−２での、７０〜１５０（ｍＰａ・ｓ）の範囲である。
【００８５】
アルギン酸の水溶液の粘度の測定は、常法に従い測定することができる。例えば、回転粘度計法の、共軸二重円筒形回転粘度計、単一円筒形回転粘度計（ブルックフィールド型粘度計）、円すい−平板形回転粘度計（コーンプレート型粘度計）等を用いて測定することができる。好ましくは、日本薬局方（第１６版）の粘度測定法に従うことが望ましい。より好ましくは、コーンプレート型粘度計を用いる。
【００８６】
アルギン酸類は、褐藻類から抽出された当初は、分子量が大きく、粘度が高めだが、熱による乾燥、精製などの過程で、分子量が小さくなり、粘度は低めとなる。製造工程の温度等の条件管理、原料とする褐藻類の選択、製造工程における分子量の分画などの手法により分子量の異なるアルギン酸類を製造することができる。さらに、異なる分子量あるいは粘度を持つ別ロットのアルギン酸類と混合することにより、目的とする分子量を有するアルギン酸類とすることも可能である。
【００８７】
別のいくつかの態様において、アルギン酸ゲルファイバのコア層又はシェル層の形成に用いられるアルギン酸（アルギン酸ナトリウム）は、特に限定されることは無いが、例えば、前記表１に記載のアルギン酸ナトリウムＡ−１、Ａ−２、Ａ−３、Ｂ−１、Ｂ−２、又はＢ−３から選択することが可能である。前記アルギン酸ナトリウムを用いて調整されたアルギン酸ナトリウム溶液の濃度は、例えば、０．１〜２．０質量％（ｗ／ｗ％）の範囲である。又、シェル層形成に用いられるアルギン酸ナトリウムは、好ましくは、Ａ−２又はＢ−２であり、又、当該アルギン酸ナトリウムを用いて調整されたアルギン酸ナトリウム溶液の濃度は、好ましくは、１．５質量％（ｗ／ｗ％）である。
【００８８】
いくつかの態様において、アルギン酸ゲルファイバのコア層又はシェル層の形成に用いられるアルギン酸（アルギン酸ナトリウム）は、特に限定されることは無いが、コラーゲン溶液、又は培地（または培養液）等を、混合して用いることも可能である。
尚、アルギン酸ナトリウム溶液、コラーゲン溶液等に用いられる溶媒は、後述の通りである。
【００８９】
２．アルギン酸ゲル（シェル層）
アルギン酸溶液は２価金属イオンにより部分的に架橋が形成されアルギン酸ゲル（イオン架橋アルギン酸）となる。
【００９０】
２価金属イオンと接触することにより、アルギン酸ゲルが形成される時間は、例えば、瞬時（例えば、１〜５秒）〜数時間（例えば、１〜３時間）である。
【００９１】
前記アルギン酸ゲルを得る為に用いられる２価金属イオンとしては、特に限定されないが、例えば、カルシウムイオン、マグネシウムイオン、バリウムイオン、ストロンチウムイオン、亜鉛イオン等が挙げられ、好ましくはカルシウムイオンである。
【００９２】
２価金属イオンを含む溶液としては、特に限定されないが、例えば、カルシウムイオンを含む溶液（例えば、塩化カルシウム水溶液、炭酸カルシウム水溶液、グルコン酸カルシウム水溶液、等の水溶液）が挙げられ、好ましくは塩化カルシウム水溶液である。
【００９３】
２価金属イオンを含む溶液の２価金属イオン濃度（例えば、カルシウムイオン濃度）は、特に限定されないが、例えば、１ｍＭ〜１Ｍの範囲、又は５ｍＭ〜５００ｍＭの範囲であり、より好ましくは１００ｍＭである。
【００９４】
前記方法にて用いるアルギン酸は、前述の通り、その分子量やＭ／Ｇ比、また、溶液としてのアルギン酸濃度、カルシウムイオン濃度によりゲル強度等の物性が異なる。従って、高い機械的強度を有する所望のゲル、例えばコア層よりも高い機械的強度を有する所望のゲルは、これらを調節することにより製造することができる。
【００９５】
シェル層におけるアルギン酸溶液、２価金属イオンを含む溶液等における溶媒も特に限定されないが、それぞれ独立して、例えば、水道水、純水（例えば、蒸留水、イオン交換水、ＲＯ水、ＲＯ−ＥＤＩ水、等）、超純水（ＭｉｌｌｉＱ水）、培地（すなわち、細胞培養用培地（または培養液））、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、及び生理食塩水等が挙げられ、好ましくは超純水である。
【００９６】
３．アルギン酸ゲルファイバ
「アルギン酸ゲルファイバ」は、コア層と、アルギン酸ゲルを含むシェル層を含む線維状の構造体を意味する。図１に、コア・シェル構造を有するファイバとして形成されたアルギン酸ゲルファイバの一例の断面図を示す。このアルギン酸ゲルファイバは、その外径がｃであり、直径ａのコア層５と厚さｃのシェル層４を含み、コア層５には、抗体産生細胞６と基材が含まれ、シェル層４はアルギン酸ゲルを含む。
【００９７】
ここで、アルギン酸ゲルファイバのコア層に含まれる基材及びシェル層を構成する基材（すなわち、アルギン酸ゲル）は、異なる基材であっても良く又は同一の基材であっても良い。いくつかの態様のアルギン酸ゲルファイバでは、抗体産生細胞及びコラーゲン（溶媒又はゲル）を含むコア層が、アルギン酸ゲルを含むシェル層により被覆して形成されたもの、すなわち、コア層に含まれる基材及びシェル層を構成する基材が異なるものである。
【００９８】
「アルギン酸ゲルファイバ」は、上記のコア・シェル構造（中心軸を通る中空部分構造）を有し、アルギン酸ゲルファイバの外径が例えば０．２μｍ〜２０００μｍ程度であり（但し、外径は当該径に限定されない）、繊維状の構造体で有ることから、ここでは、「アルギン酸中空マイクロファイバ」と言うこともある。
【００９９】
アルギン酸ゲルファイバの中心軸に対する垂直方向の断面形状としては、円形、楕円系、又は多角形（例えば、四角形、五角形等）等の多様な形状であっても良く、好ましくは、図１に示されるような円形の断面形状である。
【０１００】
アルギン酸ゲルファイバのコア層（中空部）の直径は、特に限定されないが、例えば０．１μｍ〜１０００μｍの範囲であり、又は１０μｍ〜１５０μｍの範囲であっても良く、好ましくは１００μｍである。尚、シェル層の内径は、コア層の直径と等しい。
【０１０１】
アルギン酸ゲルファイバのシェル層の厚さは、シェル層の厚さは、「（アルギン酸ゲルファイバの外径−コア層の直径）／２」により求めることができる。
【０１０２】
アルギン酸ゲルファイバの外径は、特に限定されないが、例えば、０．２μｍ〜２０００μｍの範囲であり、又は５０μｍ〜１０００μｍの範囲であっても良く、好ましくは、３００μｍである。
【０１０３】
いくつかの形態において、アルギン酸ゲルファイバのコア層の直径は１００μｍであり、そしてアルギン酸ゲルファイバの外径は３００μｍである。このとき、シェル層の厚さは、１００μｍである。
【０１０４】
上記のアルギン酸ゲルファイバのコア層（中空部）の直径、並びにシェル層の内径及びアルギン酸ゲルファイバ外径は、例えば、位相差光学顕微鏡による画像からの計測値であって、当該アルギン酸ゲルファイバの数カ所における計測値の平均値として表される。上記のアルギン酸ゲルファイバのコア層及びシェル層は、通常、実質的に均一な厚みを有しており、好ましくは、各層は、±５％の範囲内の厚さ均一性を有する。
【０１０５】
アルギン酸ゲルファイバの長さは、特に限定されないが、例えば１ｍｍ〜２００ｍであり、例えば１ｃｍ〜５０ｍであっても良く、好ましくは、１〜３０ｍである。
【０１０６】
本明細書中、アルギン酸ゲルファイバにおいて、コア層を形成する基材としては、細胞毒性を有さないものであれば特に限定されないが、例えば、コラーゲン溶液、コラーゲンゲル、培地（または培養液）、アルギン酸溶液（例えば、アルギン酸ナトリウム溶液）、アルギン酸ゲル、及びそれらの混合物等からなる群から選択される基材であり；好ましくは、コラーゲン溶液、コラーゲンゲル、培地（または培養液）、アルギン酸溶液、及びアルギン酸ゲルからなる群から選択される基材であり；より好ましくは、コラーゲン溶液又はコラーゲンゲルである。
【０１０７】
本明細書中、コア層は、前記基材に抗体産生細胞を含ませ、全体を適切な濃度の溶液としたものから形成される。アルギン酸ナトリウム溶液を用いる場合、例えば、０．１〜２．０質量％（ｗ／ｗ％）溶液であり、好ましくは、１．５質量％（ｗ／ｗ％）溶液であり；コラーゲン溶液を用いる場合、例えば、０．１〜２．０質量％（ｗ／ｗ％）溶液であり、好ましくは、０．２質量％（ｗ／ｗ％）溶液である。
【０１０８】
コア層の基材に用いる溶媒も特に限定されないが、例えば、水道水、純水（例えば、蒸留水、イオン交換水、ＲＯ水、ＲＯ−ＥＤＩ水、等）、超純水（ＭｉｌｌｉＱ水）、細胞培養用培地（または培養液）、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、及び生理食塩水等が挙げられ、好ましくは超純水である。
【０１０９】
本明細書中、細胞培養用培地には、市販の培地基材又は調製済み培地、若しくは自製した培地を使用することができる。又、天然培地（例えば、ＬＢ培地、Ｎｕｔｒｉｅｎｔ Ｂｒｏｔｈ（ＮＢ）培地、ソイビーン−カゼインダイジェスト培地（ＳＣＤ培地）等がある）又は合成培地（増殖に必要な各種栄養素を全て化学薬品にて補う培地である）を使用することもできる。又、当該培地は、特に限定されることは無いが、細胞の生存増殖に必要な成分（無機塩、炭水化物、ホルモン、必須アミノ酸、非必須アミノ酸、ビタミン等）が含まれる基本培地であれば良く、例えば、ＤＭＥＭ、Ｍｉｎｉｍｕｍ  Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｍｅｄｉｕｍ（ＭＥＭ）、ＲＰＭＩ−１６４０、Ｂａｓａｌ  Ｍｅｄｉｕｍ  Ｅａｇｌｅ（ＢＭＥ）、Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ’ｓ  Ｍｅｄｉｕｍ：Ｎｕｔｒｉｅｎｔ  Ｍｉｘｔｕｒｅ  Ｆ−１２（ＤＭＥＭ／Ｆ−１２）、Ｇｌａｓｇｏｗ  Ｍｉｎｉｍｕｍ  Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｍｅｄｉｕｍ（Ｇｌａｓｇｏｗ ＭＥＭ）、Ｇ０１６培地、等が挙げられる。
【０１１０】
又、前記培地には、更に血清が含まれていても良い。前記血清としては、特に限定されることは無いが、例えば、ＦＢＳ／ＦＣＳ（Ｆｅｔａｌ  Ｂｏｖｉｎｅ／Ｃａｌｆ  Ｓｅｒｕｍ）、ＮＣＳ（Ｎｅｗｂｏｒｎ  Ｃａｌｆ  ｓｅｒｕｍ）、ＣＳ（Ｃａｌｆ  Ｓｅｒｕｍ）、ＨＳ（Ｈｏｒｓｅ  Ｓｅｒｕｍ）等が挙げられる。培地に含まれる血清の濃度は、例えば、２質量％以上１０質量％以下である。
【０１１１】
アルギン酸ゲルファイバのコア層に含むことのできる抗体産生細胞としては、特に限定されることは無いが、例えば、ＣＨＯ細胞、ＣＨＯ細胞亜株、ＣＯＳ細胞、Ｓｐ２／０細胞、ＮＳ０細胞、ＳＰ２細胞、ＰＥＲＣ６細胞、ＹＢ２／０細胞、ＹＥ２／０細胞、１Ｒ９８３Ｆ細胞、Ｎａｍａｌｗａ細胞、Ｗｉｌ−２細胞、Ｊｕｒｋａｔ細胞、Ｖｅｒａ細胞、Ｍｏｌｔ−４細胞、２９３−ＨＥＫ細胞、ＢＨＫ細胞、ＫＧＨ６細胞、Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８．６５３細胞、Ｃ１２７細胞、ＪＣ細胞、ＬＡ７細胞、ＺＲ−４５−３０細胞、ｈＴＥＲＴ細胞、ＮＭ２Ｃ５細胞、又はＵＡＣＣ−８１２細胞等（これらの細胞は、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎから入手可能なＡＴＣＣ細胞系カタログに記載されているものもある）から、適宜選択することができる。
【０１１２】
アルギン酸ゲルファイバのコア層に含むことのできる抗体産生細胞は、好ましくは、ＣＨＯ細胞、ＣＨＯ細胞亜株、ＣＯＳ細胞、Ｓｐ２／０細胞、ＮＳ０細胞、ＳＰ２細胞、又はＰＥＲＣ６細胞であり、より好ましくは、ＣＨＯ細胞、Ｓｐ２／０細胞、又はＮＳ０であり、更に好ましくは、ＣＨＯ細胞である。
【０１１３】
本明細書中、アルギン酸ゲルファイバのコア層に含むことのできるＣＨＯ細胞としては、特に限定されることは無いが、例えば、ムロモナブ−ＣＤ３産生ＣＨＯ細胞、トラスツズマブ産生ＣＨＯ細胞、リツキシマブ産生ＣＨＯ細胞、パリビズマブ産生ＣＨＯ細胞、インフリキシマブ産生ＣＨＯ細胞、バシリキシマブ産生ＣＨＯ細胞、トシリズマブ産生ＣＨＯ細胞、ゲムツズマブ  オゾガマイシン産生ＣＨＯ細胞、ベバシズマブ産生ＣＨＯ細胞、イブリツモマブ  チウキセタン産生ＣＨＯ細胞、アダリムマブ産生ＣＨＯ細胞、セツキシマブ産生ＣＨＯ細胞、ラニビズマブ産生ＣＨＯ細胞、オマリズマブ産生ＣＨＯ細胞、エクリズマブ産生ＣＨＯ細胞、パニツムマブ産生ＣＨＯ細胞、ウステキヌマブ産生ＣＨＯ細胞、ゴリムマブ産生ＣＨＯ細胞、カナキヌマブ産生ＣＨＯ細胞、デノスマブ産生ＣＨＯ細胞、モガムリズマブ産生ＣＨＯ細胞、セルトリズマブ  ペゴル産生ＣＨＯ細胞、オファツムマブ産生ＣＨＯ細胞、ペルツズマブ産生ＣＨＯ細胞、トラスツズマブ  エムタンシン産生ＣＨＯ細胞、ブレンツキシマブ  ベドチン産生ＣＨＯ細胞、ナタリズマブ産生ＣＨＯ細胞、ニボルマブ産生ＣＨＯ細胞、アレムツズマブ産生ＣＨＯ細胞、セクキヌマブ産生ＣＨＯ細胞、ラムシルマブ産生ＣＨＯ細胞、イピリムマブ産生ＣＨＯ細胞、エボロクマブ産生ＣＨＯ細胞、メポリズマブ産生ＣＨＯ細胞、アリロクマブ産生ＣＨＯ細胞、イキセキズマブ産生ＣＨＯ細胞、ブロダルマブ産生ＣＨＯ細胞、イダルシズマブ産生ＣＨＯ細胞、エロツズマブ産生ＣＨＯ細胞、ペムブロリズマブ産生ＣＨＯ細胞、サリルマブ産生ＣＨＯ細胞、ベズロトクスマブ産生ＣＨＯ細胞、ベリムマブ産生ＣＨＯ細胞、ダラツムマブ産生ＣＨＯ細胞、アベルマブ産生ＣＨＯ細胞、デュピルマブ産生ＣＨＯ細胞、アテゾリズマブ産生ＣＨＯ細胞、ベンラリズマブ産生ＣＨＯ細胞、イノツズマブ  オゾガマイシン産生ＣＨＯ細胞、エミシズマブ産生ＣＨＯ細胞、グセルクマブ産生ＣＨＯ細胞、デュルバルマブ産生ＣＨＯ細胞、オビヌツズマブ産生ＣＨＯ細胞、又はベドリズマブ産生ＣＨＯ細胞等が挙げられる。
【０１１４】
本明細書中、アルギン酸ゲルファイバのコア層に含むことのできるＣＨＯ細胞として、より好ましくは、トラスツズマブ産生ＣＨＯ細胞、リツキシマブ産生ＣＨＯ細胞、インフリキシマブ産生ＣＨＯ細胞、トシリズマブ産生ＣＨＯ細胞、アダリムマブ産生ＣＨＯ細胞、及びニボルマブ産生ＣＨＯ細胞からなる群から選択されるＣＨＯ細胞であり、更に好ましくは、トシリズマブ産生ＣＨＯ細胞である。
【０１１５】
アルギン酸ゲルファイバのシェル層は、架橋アルギン酸ゲル（例えば、天然由来の架橋アルギン酸ゲル）を含む。当該アルギン酸ゲルは、被覆される抗体産生細胞を含むコア層に比べて、より高い又は同等な機械的強度を有するゲルであっても良く、好ましくは、当該アルギン酸ゲルは、被覆される抗体産生細胞を含むコア層に比べて、より高い機械的強度を有するゲルである。又、培養時にアルギン酸ゲルファイバ外に存在している培養液（栄養源）及び酸素等の成分に対して十分な透過性を有しているものである。
【０１１６】
前記架橋アルギン酸ゲルの機械的強度については、当業者に周知の方法に従って、引っ張り試験機を水中で用いる方法などにより引っ張り強度や荷重強度などを測定することができる。前記架橋アルギン酸ゲル中には、生体成分や非生体成分を必要に応じて添加することもできる。
【０１１７】
いくつかの態様のアルギン酸ゲルは、外的刺激によりゲル化するアルギン酸ゲルである。外的刺激としては、例えば、２価金属イオンの添加（２価金属イオンを含む溶液の添加）、酵素処理、ｐＨ変動、加熱、ＵＶ照射、放射線照射などが挙げられるがこれらに限定されない。好ましくは、２価金属イオンである。
【０１１８】
前記２価金属イオンとしては、特に限定されないが、例えば、カルシウムイオン、マグネシウムイオン、バリウムイオン、ストロンチウムイオン、亜鉛イオン等が挙げられ、好ましくはカルシウムイオンである。
【０１１９】
前記カルシウムイオンを含む溶液としては、特に限定されないが、例えば、塩化カルシウム水溶液、炭酸カルシウム水溶液、グルコン酸カルシウム水溶液、等の水溶液が挙げられ、好ましくは塩化カルシウム水溶液である。
【０１２０】
好ましくは、アルギン酸ゲルファイバは、当該ゲルファイバを形成した後の早い段階で、培養液に浸潤させ培養を開始することができる。より好ましくは、コア層に含まれる、抗体産生細胞を壊死させることなく、コア層の直径が大きいなゲルファイバを提供することができる。即ち、アルギン酸ゲルファイバにより、抗体産生細胞がある一定数含まれたコア層を有するゲルファイバを容易に得ることができる。
【０１２１】
コア層を被覆するシェル層によっては、十分な機械的強度が得られないことにより、コア層を被覆する段階でシェル層が潰れる場合や、壊れてしまう場合があり得る。しかし、本発明者らは、コア層を被覆するシェル層にアルギン酸（例えば、天然由来のアルギン酸）を用いて、カルシウムイオンにより架橋し硬化させることで、コア層を被覆するのに十分な強度を有しており、又、培養液（栄養源）及び酸素を供給することができるアルギン酸ゲルファイバが得られることを見出した。好ましい態様では、シェル層を形成する、アルギン酸ゲルは、コア層よりも高い機械的強度を有するアルギン酸ゲルとなっている。
【０１２２】
従って、アルギン酸ゲルファイバは、抗体産生細胞及び基材が含まれるコア層を、高い機械的強度を有するアルギン酸ゲルを含むシェル層で被覆して形成されるアルギン酸ゲルファイバである。又、ここでは、このアルギン酸ゲルファイバを、「抗体産生細胞及び基材が含まれるコア層を、カルシウムイオン架橋アルギン酸ゲルを含むシェル層で被覆して形成されるアルギン酸ゲルファイバ」と言うこともある。
【０１２３】
ここで、「コア層よりも高い機械的強度を有するアルギン酸ゲル」とは、アルギン酸ゲルファイバのシェル層に、被覆されるコア層を形成する基材（例えば、コラーゲン溶液、コラーゲンゲル、培地（または培養液）、アルギン酸溶液（例えば、アルギン酸ナトリウム溶液）、アルギン酸ゲル、及びそれらの混合物等からなる群から選択される基材）と比べて実質的に同一又はより高い機械的強度を有するゲル（例えば、アルギン酸ゲルやアガロースゲルを挙げることができるが、これらに限定されることはない）を用いることで、コア層を被覆する段階でシェル層が潰れたり、壊れたりする恐れが少ない、アルギン酸ゲルを意味する。
シェル層を形成するゲルとして、好ましくは、カルシウムイオンなどの金属イオンの存在下でゲル化する性質を有するアルギン酸ゲル（例えば、カルシウムイオン架橋アルギン酸ゲル）を用いることで、コア層よりも高い機械的強度を有するアルギン酸ゲルファイバを得ることもできる。
ゲルの機械的強度については、当業者に周知の方法に従って、引っ張り試験機を水中で用いる方法などにより引っ張り強度や荷重強度などを測定することができる。
【０１２４】
又、シェル層を形成するゲル及びコア層を形成する基材のヤング率を比較することにより、シェル層がコア層よりも高い機械的強度を有することが確認できる。例えば、シェル層の１つであるアルギン酸のヤング率は、１質量％アルギン酸で３．６  ｋＰａ、２質量％アルギン酸で６．０  ｋＰａであり（実施例で用いられているアルギン酸は１．５質量％であり、３．６ｋＰａ〜６．０ｋＰａ間の値と推定できる）、コア層の基材の１つであるコラーゲンのヤング率は０．１３  ｋＰａであることから、シェル層がアルギンゲルであり、コア層を形成する基材がコラーゲン溶液又はコラーゲンゲルであるアルギン酸ゲルファイバにおいては、シェル層がコア層よりも高い機械的強度を有することとなる。
【０１２５】
ヤング率（縦弾性係数又は縦弾性率とも言う）は、材料の引張試験により得られた応力ひずみ線図における弾性域（の線形部）の傾きとして定義される値であり、機械的強度の指標となり得る。ヤング率として、例えば、以下の各材料に関する値が知られている。１％アルギン酸：３．６ｋＰａ、２質量％アルギン酸：６．０ｋＰａ、０．２質量％アガロース：０．７ｋＰａ、０．５質量％アガロース：  ２．４ｋＰａ、１質量％アガロース：３．６ｋＰａ、２質量％アガロース：１０．６ｋＰａ、５質量％ＰＥＧ−ＤＡ（Ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｇｌｙｃｏｌ  ｄｉａｃｒｙｌａｔｅ）：０．５ｋＰａ、１０質量％ＰＥＧ−ＤＡ：１．１ｋＰａ、ＰＤＭＳ（Ｐｏｌｙｄｉｍｅｔｈｙｌｓｉｌｏｘａｎｅ）：１７８３ｋＰａ、コラーゲン：０．１３ｋＰａ（Ａｎｎａｌｓ  ｏｆ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，３６（７），ｐｐ．１２５４−１２６７，２００８年．又はＬａｂ  Ｃｈｉｐ，１６，ｐｐ．１７５７−１７７６，２０１６年を参照）。
【０１２６】
アルギン酸ゲルファイバは、その両端がアルギン酸ゲル等で封止されたゲルファイバであっても良い。ゲルファイバの両端を封止することにより、培養期間中にコア層がアルギン酸ゲルファイバ外へ漏れだすことの防止に繋がる。
【０１２７】
［アルギン酸ゲルファイバの製造方法］
ここでは、抗体産生細胞及び基材が含まれるコア層を、アルギン酸ゲルを含むシェル層で被覆して形成されるアルギン酸ゲルファイバの製造方法であって、マイクロ流体装置を用いることを含む方法が提供される。
【０１２８】
以下に、抗体産生細胞及び基材が含まれるコア層を、アルギン酸ゲルを含むシェル層で被覆して形成されるアルギン酸ゲルファイバの作製方法について説明する。
【０１２９】
前記アルギン酸ゲルファイバの作製方法は特に限定されないが、マイクロ流体装置を用いて行う。ここでのマイクロ流体装置は、アルギン酸ゲルファイバを作製するのに好ましく用いられる装置である。具体的には、マイクロ流体装置は、導入口が３つ、出口が１つの微細流路を作るための装置であり、第１の導入口に第１の液、第２の導入口に第２の液、及び第３の導入口に第３の液を適当な速さで流すと、第１の液と第２の液が交差して一本となった流路では、第１の液と第２の液が混ざることなく、２層のきれいな層流になり、さらに、その下流で第３の液と交差して３つの液が一本となった流路では、第１の液と第２の液と第３の液が混ざることなく、３層のきれいな層流になる。マイクロ流体装置としては、例えば、図２に示すような二重の同軸マイクロ流体装置（ｃｏａｘｉａｌ  ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃ  ｄｅｖｉｃｅ）１０を挙げることができる。
【０１３０】
２つの流体を同軸となるようにコア部及びシェル部に分けて射出することができるマイクロ流体装置１０は、例えば、Ｗｏｎｊｅ  Ｊｅｏｎｇ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｈｙｄｒｏｄｙｎａｍｉｃ  ｍｉｃｒｏｆａｂｒｉｃａｔｉｏｎ  ｖｉａ  “ｏｎ  ｔｈｅ  ｆｌｙ”  ｐｈｏｔｏｐｏｌｙｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｉｃｒｏｓｃａｌｅ  ｆｉｂｅｒｓ  ａｎｄ  ｔｕｂｅｓ，  Ｌａｂ  Ｃｈｉｐ，  ２００４，  ４，  ｐ５７６−５８０  のＦｉｇ．１、又は、例えば、特開２０１６−７７２２９号公報（出願人：国立大学法人  東京大学）の図１又は図２に具体的に記載されているものを挙げることができる。いくつかの態様では、これらに記載されているマイクロ流体装置１０の具体例またはそれと同様な装置を用いて、同様な作製条件にて、アルギン酸ゲルファイバを製造することができる。
【０１３１】
図２に示すように、マイクロ流体装置１０は、導入管４０と、導入管４０の導入口１と、導入口１の下流に位置する導入管４０の導入口２と、導入口２の下流に位置する導入管４０の導入口３と、導入口２の下流に位置する導入管４０の出口５０を含む。
【０１３２】
図２は、アルギン酸ゲルファイバの製造過程の１つの態様を説明する模式図である。一例として、コア層の基材にコラーゲン溶液を用い、シェル部の基材にアルギン酸ナトリウム溶液を用いる作製方法について説明する。
【０１３３】
アルギン酸ゲルファイバは、例えば下記工程（１）〜（４）を含む方法により製造することができる。
（１）導入口１から、抗体産生細胞６と基材を導入して射出して、導入管４０内に抗体産生細胞６と基材の第１の層流を形成する工程、
（２）導入口２から、アルギン酸ナトリウム溶液を導入して射出して、第１の層流の外周を覆う、アルギン酸ナトリウム溶液の第２の層流を形成する工程、
（３）導入口３から、２価金属イオンを含む溶液を導入して射出して、第２の層流の外周を覆う、２価金属イオンを含む溶液の第３の層流を形成する工程、
（４）出口５０から射出される、抗体産生細胞及び基材が含まれるコア層を、アルギン酸ゲルを含むシェル層で被覆して形成されるアルギン酸ゲルファイバを得る工程
（１）〜（４）の工程を行うことにより、シェル層のアルギン酸ナトリウム溶液がゲル化し、シェル層４にカルシウム架橋アルギン酸ゲルを含み、またコア層５に抗体産生細胞６と基材を含むアルギン酸ゲルファイバ２０を製造することができる。
【０１３４】
また、前記方法により得られたアルギン酸ゲルファイバを、例えば３７℃程度で数分（例えば、２〜５分）〜約１時間程度加熱してもよく、これによりコア層５の抗体産生細胞６を含むコラーゲン溶液をゲル化させてもよい。
【０１３５】
導入口２及び３における溶液の射出速度は特に限定されないが、マイクロ流体装置１０の導入口１の口径が５０μｍ〜２ｍｍ程度である場合には、例えば、１０〜５００μＬ／分程度であってもよい。導入口２及び３における溶液の射出速度を調節することにより、コア層の直径及びシェル層の被覆厚みを適宜調節できる。例えば、導入口２及び３における溶液の射出速度を速くすると、コア層の直径及びシェル層の被覆厚みが小さくなり、一方、射出速度を遅くすると、コア層の直径及びシェル層の被覆厚みが大きくなる。
【０１３６】
導入口１から射出される抗体産生細胞６を含むコラーゲン溶液は以下の通り調製する。
コラーゲン酸性溶液Ｉ−ＰＣ（株式会社高研、ｃａｔ＃．ＩＰＣ−５０）にＨＢＳＳ、Ｈｅｐｅｓ、ＮａＨＣＯ３で構成されるバッファーを４：１で添加し、コラーゲン濃度を４ｍｇ／ｍＬに調製する。その後、培地で所定の濃度に調製した細胞懸濁液と１：１で混合し、コラーゲン終濃度２ｍｇ／ｍＬ（０．２％）の抗体産生細胞６を含むコラーゲン溶液を調製する。
【０１３７】
マイクロ流体装置１０の導入口１から射出される抗体産生細胞６と基材の流速（射出速度）は特に限定されないが、例えば、マイクロ流体装置１０の口径が５０μｍ〜２０００μｍ程度である場合には、１０〜５００μＬ／分程度であってもよい。
【０１３８】
導入口２から射出されるアルギン酸ナトリウム溶液は、例えば、表１に記載されたアルギン酸ナトリウムを用いて、培養液（例えば、ＣＨＯ培養培地）を添加して、所定の濃度（例えば、１．５質量％（ｗ／ｗ％））のアルギン酸ナトリウム溶液を調製する。
マイクロ流体装置１０の導入口２から射出されるアルギン酸ナトリウム溶液の流速は、特に限定されないが、例えば、マイクロ流体装置１０の口径が５０μｍ〜２０００μｍ程度である場合には、１０〜５００μＬ／分程度の範囲であってもよい。
【０１３９】
導入口３から射出される２価金属イオンを含む溶液は、例えば、塩化カルシウムを用いて、ＭｉｌｌｉＱ水を添加して、所定の濃度（例えば、１００ｍＭ）の塩化カルシウム水溶液を調製する。
マイクロ流体装置１０の導入口３から射出される２価金属イオンを含む溶液の流速は、特に限定されないが、例えば１〜１０ｍＬ／分程度の範囲であってもよい。
【０１４０】
作製されるアルギン酸ゲルファイバ２０の外径は、特に限定されないが、前述の通りであり、例えば、０．２μｍ〜２０００μｍの範囲、又は５０μｍ〜１０００μｍの範囲であっても良く、好ましくは、３００μｍである。中空マイクロファイバ２００の長さは特に限定されず、前述の通りであり、例えば数ｍｍ〜数ｍ程度であってもよい。細胞ファイバ２００の断面形状としては、前述の通りであり、例えば、円形、楕円系、四角形や五角形等の多角形等が挙げられる。
【０１４１】
いくつかの態様では、アルギン酸ゲルファイバを培養液中で培養することにより、抗体産生細胞が培養され、抗体を産生することができる。アルギン酸ゲルファイバは、培養液を適切に交換することにより、抗体を数か月の連続培養することが可能となる。
【０１４２】
［抗体産生細胞の培養方法］
ここでは、抗体産生細胞及び基材が含まれるコア層を、アルギン酸ゲルを含むシェル層で被覆して形成されるアルギン酸ゲルファイバを用いることを含む、抗体の製造方法が提供される。以下、「抗体の製造方法」を「抗体産生細胞の培養方法」という場合がある。
【０１４３】
好ましい態様の抗体産生細胞の培養方法によれば、抗体産生細胞及び基材が含まれるコア層を、アルギン酸ゲルを含むシェル層で被覆して形成されるアルギン酸ゲルファイバを製造した後、直ぐに抗体産生細胞の培養を開始する。これにより、図３に示すように、コア層への培養液（栄養源）及び酸素の供給をすぐに行うことができる。特に好ましい態様では、コア層での抗体産生細胞の壊死を十分に防ぎつつ、抗体を産生することができる。
【０１４４】
以下に、抗体産生細胞の培養方法の一例について、具体的に説明するが、これに限定されない。１２５  ｍＬポリカーボネート製三角フラスコに、コア層に抗体産生細胞を含むアルギン酸ゲルファイバを入れ、後述する表３の組成である培地（３０  ｍＬ）を添加し、ゲルファイバを含浸させた後、３７℃、５％ＣＯ２インキュベータ内で１２５  ｒｐｍで振とうしながら培養を行う。継代については、培養期間中の培地交換は一切行わないが、２〜３日に一回、培地１．８  ｍＬを抜き取り、Ｆｅｅｄ（Ｉｒｖｉｎｅ社製、ＪＸ  Ｆｅｅｄ  ００３、細胞培養中に消費されるグルコースやグルタミンなど必要な栄養成分を高濃度に含んだ培地）１．８  ｍＬを添加し、培地の総量を３０  ｍＬに保つ。
【０１４５】
又、好ましい態様のアルギン酸ゲルファイバを用いる抗体の製造技術は、コア層に含まれる抗体産生細胞がある一定数以上には増殖しないことにより、細胞への物理的ストレスが少ないため、封入した抗体産生細胞が長期間に渡り抗体を産生し続ける可能性を有している点で優れている。
【０１４６】
特に好ましい態様では、抗体の生産・精製効率を飛躍的に向上させる可能性があり（例えば、好ましい態様のマイクロゲルファイバを用いることで、大規模な培養タンクを要する浮遊培養とは異なり、小規模の生産設備にて抗体を培養することも可能となる）、少量・多種品目の抗体医薬品（具体的には、抗体医薬品等）の製造にも適した次世代型抗体医薬品の連続生産技術として期待できる。
【０１４７】
培養により産生された抗体（例えば、トシリズマブ）は、アルギン酸ゲルファイバのコア層に貯留されても良く、好ましくは、アルギン酸ゲルファイバのシェル層を透過しアルギン酸ゲルファイバ外の培養液中に貯留される。尚、抗体の回収・精製は、後述の記載を参照し、行うことが可能である。
【０１４８】
好ましい態様では、図３に示すように、コア層内で産生された抗体がシェル層を透過してアルギン酸ゲルファイバ外へ順次放出されることとなり、抗体の連続培養が可能なサイクルが形成可能である。尚、このとき、代謝物及び老廃物もアルギン酸ゲルファイバ外へ放出されてもよい。
実際に、後述の実施例では、シェル層の原料であるアルギン酸ナトリウムに、前述の表１中のＡ−２及びＢ−２を用いた場合、産生された抗体（トシリズマブ）がコア層及び培養液中に貯留された事が確認できた。
【０１４９】
抗体産生細胞が含まれるコア層をアルギン酸ゲルで被覆して形成されるアルギン酸ゲルファイバを培養する、培養容器としては、例えば、三角フラスコ、Ｔ−フラスコ、スピナーフラスコ等が挙げられる。好ましくは、三角フラスコであり、より好ましくはポリカーボネート製三角フラスコである。
【０１５０】
抗体は、定常領域の構造上の違いにより、下記表２に示されるようなクラス（アイソタイプ）やサブクラスに分類される。
【０１５１】
ヒトＩｇの分類
【表２】
2020032221.tif 000003
【０１５２】
いくつかの態様の抗体の製造方法にて、抗体産生細胞を培養することよってアルギン酸ゲルファイバのコア層で産生されシェル層を透過し得る抗体としては、特に限定されることは無いが、例えば、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＥ等からなる群から選択されるクラス（アイソタイプ）を有する抗体が挙げられる。抗体産生細胞を培養することによってアルギン酸ゲルファイバのコア層で産生されシェル層を透過し得る抗体は、好ましくは、ＩｇＧ、又はＩｇＥのクラス（アイソタイプ）の抗体であり、より好ましくは、ＩｇＧのクラス（アイソタイプ）の抗体である。
【０１５３】
いくつかの態様の抗体の製造方法にて、抗体産生細胞を培養することによって、アルギン酸ゲルファイバのコア層で産生されシェル層を透過し得る抗体の分子量は、特に限定されることは無いが、例えば、４５，０００〜９００，０００の範囲にある抗体である。いくつかの態様の抗体の製造方法にてアルギン酸ゲルファイバのコア層で産生されシェル層を透過し得る抗体の分子量は、好ましくは、４５，０００〜１６０，０００の範囲であり、より好ましくは、１４０，０００〜１５０，０００の範囲である。
【０１５４】
本明細書中、前記記載の各抗体産生ＣＨＯ細胞を用いて前記記載の抗体の製造方法にて培養を行う場合、用いた抗体産生ＣＨＯ細胞に対応する抗体が産生される。例えば、ムロモナブ−ＣＤ３産生ＣＨＯ細胞を用いる場合、抗体としてムロモナブ−ＣＤ３が産生される。
【０１５５】
産生される抗体としては、例えば、ムロモナブ−ＣＤ３産生ＣＨＯ細胞を用いてムロモナブ−ＣＤ３（ＩｇＧ；１５０，０００）、トラスツズマブ産生ＣＨＯ細胞を用いてトラスツズマブ（ＩｇＧ；１４８，０００）、リツキシマブ産生ＣＨＯ細胞を用いてリツキシマブ（ＩｇＧ；１４４，５１０）、パリビズマブ産生ＣＨＯ細胞を用いてパリビズマブ（ＩｇＧ；“１４７，７００”）、インフリキシマブ産生ＣＨＯ細胞を用いてインフリキシマブ（ＩｇＧ；“１４９，０００”）、バシリキシマブ産生ＣＨＯ細胞を用いてバシリキシマブ（ＩｇＧ；１４７，０００）、トシリズマブ産生ＣＨＯ細胞を用いてトシリズマブ（ＩｇＧ；１４８，０００）、ゲムツズマブ  オゾガマイシン産生ＣＨＯ細胞を用いてゲムツズマブ  オゾガマイシン（ＩｇＧ；“１５３，０００”）、ベバシズマブ産生ＣＨＯ細胞を用いてベバシズマブ（ＩｇＧ；１４９，０００）、イブリツモマブ  チウキセタン産生ＣＨＯ細胞を用いてイブリツモマブ  チウキセタン（ＩｇＧ；１４８，０００）、アダリムマブ産生ＣＨＯ細胞を用いてアダリムマブ（ＩｇＧ；１４８，０００）、セツキシマブ産生ＣＨＯ細胞を用いてセツキシマブ（ＩｇＧ；１５１，８００）、ラニビズマブ産生ＣＨＯ細胞を用いてラニビズマブ（ＩｇＧ；４８，０００）、オマリズマブ産生ＣＨＯ細胞を用いてオマリズマブ（ＩｇＥ；１４９，０００）、エクリズマブ産生ＣＨＯ細胞を用いてエクリズマブ（ＩｇＧ；１４５，２３５）、パニツムマブ産生ＣＨＯ細胞を用いてパニツムマブ（ＩｇＧ；１４７，０００）、ウステキヌマブ産生ＣＨＯ細胞を用いてウステキヌマブ（ＩｇＧ；１４８，０７９〜１４９，６９０）、ゴリムマブ産生ＣＨＯ細胞を用いてゴリムマブ（ＩｇＧ；１４９，８０２〜１５１，０６４）、カナキヌマブ産生ＣＨＯ細胞を用いてカナキヌマブ（ＩｇＧ；１４８，０００）、デノスマブ産生ＣＨＯ細胞を用いてデノスマブ（ＩｇＧ；１５０，０００）、モガムリズマブ産生ＣＨＯ細胞を用いてモガムリズマブ（ＩｇＧ；１４９，０００）、セルトリズマブ  ペゴル産生ＣＨＯ細胞を用いてセルトリズマブ  ペゴル（ＩｇＧ；９０，０００）、オファツムマブ産生ＣＨＯ細胞を用いてオファツムマブ（ＩｇＧ；１４９，０００）、ペルツズマブ産生ＣＨＯ細胞を用いてペルツズマブ（ＩｇＧ；１４８，０００）、トラスツズマブ  エムタンシン産生ＣＨＯ細胞を用いてトラスツズマブ  エムタンシン（ＩｇＧ；１５１，０００）、ブレンツキシマブ  ベドチン産生ＣＨＯ細胞を用いてブレンツキシマブ  ベドチン（ＩｇＧ；１５３，０００）、ナタリズマブ産生ＣＨＯ細胞を用いてナタリズマブ（ＩｇＧ；１４６，１７８）、ニボルマブ産生ＣＨＯ細胞を用いてニボルマブ（ＩｇＧ；１４５，０００）、アレムツズマブ産生ＣＨＯ細胞を用いてアレムツズマブ（ＩｇＧ；１５０，０００）、セクキヌマブ産生ＣＨＯ細胞を用いてセクキヌマブ（ＩｇＧ；１５１，０００）、ラムシルマブ産生ＣＨＯ細胞を用いてラムシルマブ（ＩｇＧ；１４７，０００）、イピリムマブ産生ＣＨＯ細胞を用いてイピリムマブ（ＩｇＧ；１４８，０００）、エボロクマブ産生ＣＨＯ細胞を用いてエボロクマブ（ＩｇＧ；１４１，７８９）、メポリズマブ産生ＣＨＯ細胞を用いてメポリズマブ���ＩｇＧ；１４９，０００）、アリロクマブ産生ＣＨＯ細胞を用いてアリロクマブ（ＩｇＧ；１４５８９２．０４９．）、イキセキズマブ産生ＣＨＯ細胞を用いてイキセキズマブ（ＩｇＧ；１４９，０００）、ブロダルマブ産生ＣＨＯ細胞を用いてブロダルマブ（ＩｇＧ；１４７，０００）、イダルシズマブ産生ＣＨＯ細胞を用いてイダルシズマブ（ＩｇＧ；４７，７８２）、エロツズマブ産生ＣＨＯ細胞を用いてエロツズマブ（ＩｇＧ；１４８，０００）、ペムブロリズマブ産生ＣＨＯ細胞を用いてペムブロリズマブ（ＩｇＧ；１４９，０００）、サリルマブ産生ＣＨＯ細胞を用いてサリルマブ（ＩｇＧ；１５０，０００）、ベズロトクスマブ産生ＣＨＯ細胞を用いてベズロトクスマブ（ＩｇＧ；１４８，０００）、ベリムマブ産生ＣＨＯ細胞を用いてベリムマブ（ＩｇＧ；１４７，０００）、ダラツムマブ産生ＣＨＯ細胞を用いてダラツムマブ（ＩｇＧ；１４８，０００）、アベルマブ産生ＣＨＯ細胞を用いてアベルマブ（ＩｇＧ；１４７，０００）、デュピルマブ産生ＣＨＯ細胞を用いてデュピルマブ（ＩｇＧ；１５２，０００）、アテゾリズマブ産生ＣＨＯ細胞を用いてアテゾリズマブ（ＩｇＧ；１４４，６１１）、ベンラリズマブ産生ＣＨＯ細胞を用いてベンラリズマブ（ＩｇＧ；１４８，０００）、イノツズマブ  オゾガマイシン産生ＣＨＯ細胞を用いてイノツズマブ  オゾガマイシン（ＩｇＧ；１５９，０００）、エミシズマブ産生ＣＨＯ細胞を用いてエミシズマブ（ＩｇＧ；１４８，０００）、グセルクマブ産生ＣＨＯ細胞を用いてグセルクマブ（ＩｇＧ；１４６，０００）、デュルバルマブ産生ＣＨＯ細胞を用いてデュルバルマブ（ＩｇＧ；１４９，０００）、オビヌツズマブ産生ＣＨＯ細胞を用いてオビヌツズマブ（ＩｇＧ；１４８，０００〜１５０，０００）、又はベドリズマブ産生ＣＨＯ細胞を用いてベドリズマブ（ＩｇＧ；１５０，０００）が挙げられる（抗体名後のカッコ内は、当該抗体のクラス（アイソタイプ）及び分子量を示す）。
【０１５６】
産生された抗体は、例えば、下記の３工程を経て精製が行われる。
〔工程１〕培地中に含まれる、抗体以外のタンパク質及び固形物をほぼ取り除く為に、遠心分離法又はフィルターによる濾過等を行う。
〔工程２〕例えば、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ又はＰｒｏｔｅｉｎ  Ｇを用いたアフィニティークロマトグラフィー、又はイオン交換クロマトグラフィー等のクロマトグラフィーにて目的とする抗体を取り出す。
〔工程３〕工程２で混入してきた夾雑物を除去する為に、ゲルろ過クロマトグラフィーを行い、目的とする抗体を高純度精製する。
【０１５７】
Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ又はＰｒｏｔｅｉｎ Ｇを用いたアフィニティークロマトグラフィー：
ＩｇＧの精製法としては、例えば、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ又はＰｒｏｔｅｉｎ Ｇを用いた抗体の精製方法が知られている。Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａを用いた抗体の精製法として、下記方法が１例として挙げられる。（１）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａが固定されたビーズが充填されたカラムを用いて、前記〔ステップ１〕の方法で得られてくる溶液に血清を添加した溶液をろ過することで、ＩｇＧがカラム中のビーズに結合して、他の血清成分がカラム外へ流出がされる。（２）その後、カラムに酸性溶液を通過させることにより、ビーズに結合していたＩｇＧが切れて、カラム外へ溶出されてＩｇＧが得られる。尚、ＩｇのＰｒｏｔｅｉｎ ＡとＰｒｏｔｅｉｎ Ｇへの結合力が、動物種やサブクラスによって違うことから、目的によって、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ又はＰｒｏｔｅｉｎ Ｇを使い分けることができる。
【０１５８】
イオン交換クロマトグラフィー：
タンパク質が有する電気的な性質（電荷）を利用してタンパク質を分離する方法である。正電荷を示す塩基性タンパク質は、負電荷をもつ陽イオン交換体（担体）にイオン結合し、負電荷を示す酸性タ ンパク質は正電荷を持つ陰イオン交換体に結合することから、タンパク質が含まれる試料をイオン交換体が充填されたカラムを通すことで、タンパク質がイオン交換体に結合する。その後、カラムを通す溶媒の塩濃度を高濃度にすることで、タンパク質とイオン交換体とのイオン結合が弱くなり、結合力の弱いタンパク質から順番に、イオン交換体から外れて、カラム外へ流出してくる。陽イオン交換体又は陰イオン交換体の選択は、試料として用いるタンパク質の電荷から選択するものとする。
【０１５９】
ゲルろ過クロマトグラフィー：
タンパク質の分子量の違いを利用してタンパク質を分離する方法である。小孔が付いている担体が充填されたカラムに試料を流すことで、分子量の小さいタンパク質は、前記小孔に入り込みながら流出してき、分子量の大きいタンパク質は前記小孔に入らずに流出してくる為、カラムを通過する時間が分子量の小さいタンパク質は遅く、分子量の大きいタンパク質は早くなることから、時間差的にタンパク質を分離することが可能となる。
【０１６０】
尚、本明細書において引用した全ての文献、及び公開公報、特許公報、その他の特許文献は、参照として本明細書に組み込むものとする。本明細書は、本願の優先権主張の基礎となる日本国特許出願である特願２０１８−１５１５７４号（２０１８年８月１０日出願）の特許請求の範囲、明細書、および図面の開示内容を包含する。
【実施例】
【０１６１】
以下、実施例により本発明を説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。【０１６２】
［実施例１］アルギン酸ゲルファイバＡの製法
図２に模式的に示す製造過程にしたがって、特開２０１６−７７２２９号公報（出願人：国立大学法人  東京大学）に記載されているアルギン酸ゲルファイバの作製条件と同様にして、アルギン酸ゲルファイバＡを作製した。細胞は、トシリズマブ産生ＣＨＯ細胞を用いた。マイクロ流体装置１０の導入口１から、細胞濃度１×１０６細胞／ｍＬ（２×１０５細胞／２５ｍファイバ１本）の細胞を含む０．２質量％コラーゲン溶液（コラーゲン酸性溶液Ｉ−ＰＣ  ５ｍｇ、ｐＨ３．０、無菌Ａｔｅｌｏｃｏｌｌａｇ（株式会社高研、ｃａｔ＃．ＩＰＣ−５０）溶媒）を導入し、導入口２から、１．５質量％（ｗ／ｗ％）アルギン酸ナトリウム（Ａ−２  持田製薬）溶液（溶媒：下記表３の組成である培地）を導入し、導入口３から１００ｍＭ塩化カルシウム水溶液を導入して射出することにより、コア層直径約１００μｍ、外径約３００μｍ、全長２５ｍのアルギン酸ゲルファイバＡを得た。【０１６３】
［実施例２］アルギン酸ゲルファイバＢの製法
図２に模式的に示す製造過程にしたがって、特開２０１６−７７２２９号公報（出願人：国立大学法人  東京大学）に記載されているアルギン酸ゲルファイバの作製条件と同様にして、アルギン酸ゲルファイバＢを作製した。細胞は、トシリズマブ産生ＣＨＯ細胞を用いた。マイクロ流体装置１０の導入口１から、細胞濃度５×１０６細胞／ｍＬ（１×１０６細胞／２５ｍファイバ１本）の細胞を含む０．２％コラーゲン溶液（コラーゲン酸性溶液Ｉ−ＰＣ  ５ｍｇ、ｐＨ３．０  、無菌Ａｔｅｌｏｃｏｌｌａｇ（株式会社高研、ｃａｔ＃．ＩＰＣ−５０）溶媒）を導入し、導入口２から、１．５質量％（ｗ／ｗ％）アルギン酸ナトリウム（Ｂ−２  持田製薬）溶液（溶媒：下記表３の組成である培地）を導入し、導入口３から１００ｍＭ塩化カルシウム水溶液を導入して射出することにより、コア層直径約１００μｍ、外径約３００μｍ、全長２５ｍのアルギン酸ゲルファイバＢを得た。【０１６４】
［実施例３］アルギン酸ゲルファイバＡ中でのトシリズマブ産生ＣＨＯ細胞の培養
１２５  ｍＬポリカーボネート製三角フラスコに、実施例１で得られたアルギン酸ゲルファイバＡ（外径３００μｍ×長さ２５ｍ、ファイバ体積（外形部分）約１．８  ｍＬ分）を入れ、下記表３の組成である培地（３０  ｍＬ）を添加し、ファイバを含浸させた。３７℃、５％ＣＯ２インキュベータ内で１２５  ｒｐｍで振とうしながら培養を、１２日間実施した。１２日間培養を行うことで、抗体（トシリズマブ）が産生され、ファイバ外液中に放出されたことを確認した。産生された抗体がトシリズマブであることは、ヒトＩＬ−６  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ａ（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ，  Ｃａｔ＃  ２００−０６ＲＣ）を用いたＥＬＩＳＡ測定により確認した。又、本実験結果より、産生された抗体がファイバ外に透過できることを見い出せた。１２日培養後のアルギン酸ゲルファイバの顕微鏡写真を図４に示す。【０１６５】
培地組成：Ｇ０１６培地に下表の各種添加物を加え、全量を１０００ｍＬに調製した。
【表３】
2020032221.tif 000004
【０１６６】
［実施例４］アルギン酸ゲルファイバＢ中でのトシリズマブ産生ＣＨＯ細胞の培養
１２５  ｍＬポリカーボネート製三角フラスコに、実施例２で得られたアルギン酸ゲルファイバＢ（外径３００μｍ×長さ２５ｍ、ファイバ体積（外形部分）約１．８  ｍＬ分）を入れ、上記表３の組成である培地（３０  ｍＬ）を添加し、ファイバを含浸させた。３７℃、５％ＣＯ２インキュベータ内で１２５  ｒｐｍで振とうしながら培養を、２８日間実施した。２８日間培養を行うことで、抗体（トシリズマブ）が、４．７７ｍｇ産生された。産生された抗体がトシリズマブであることは、ヒトＩＬ−６  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ａ（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ，  Ｃａｔ＃  ２００−０６ＲＣ）を用いたＥＬＩＳＡ測定により確認した。又、本実験結果より、産生された抗体がファイバ外に透過できることを見い出せた。２８日培養後のアルギン酸ゲルファイバの顕微鏡写真を図５に示す。
【産業上の利用可能性】
【０１６７】
ここでは、抗体産生細胞がコア層に含まれた抗体生産用のアルギン酸ゲルファイバ（アルギン酸中空マイクロファイバ）が提供される。また、当該アルギン酸ゲルファイバの製造方法、及び当該アルギン酸ゲルファイバを用いた抗体の培養方法を提供することができる。
【符号の説明】
【０１６８】
ａ：アルギン酸ゲルファイバのコア層（中空部）の直径
ｂ：アルギン酸ゲルファイバのシェル層の厚さ
ｃ：アルギン酸ゲルファイバの外径
４：シェル層
５：コア層
６：抗体産生細胞【０１６９】
１０：マイクロ流体装置
１：抗体産生細胞６を含む基材の導入口
２：アルギン酸ナトリウム溶液の導入口
３：塩化カルシウム溶液の導入口
２０： アルギン酸ゲルファイバ
４０：導入管
５０：出口
【図１】
2020032221.tif 000005
【図２】
2020032221.tif 000006
【図３】
2020032221.tif 000007
【図４】
2020032221.tif 000008
【図５】
2020032221.tif 000009
【国際調査報告】
2020032221.tif 000010
2020032221.tif 000011
2020032221.tif 000012
2020032221.tif 000013