(57)【要約】  本発明の課題は、アナフィラキシーを含む即時型アレルギーの発症リスクを抑えながら、アレルギー性疾患を治療又は予防するためのアレルゲンワクチンを提供することにある。  本発明者らは、（１）アレルギー性疾患を有する対象に、特定の抗原（アレルゲン）とＳＦ１０とを含む組成物を経口接種することにより、該抗原の感作による即時型アレルギーの発症を抑制できること、また、（２）アレルギー性疾患を有さない対象に、特定の抗原（アレルゲン）とＳＦ１０とを含む組成物を経口接種すると、該抗原に対する感作成立を阻害できることを見出いし、本発明を完成するに至った。
2020045155.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
肺サーファクタント由来人工合成粘膜アジュバントＳＦ１０と、抗原とを含む、経口投与用の免疫寛容誘導剤。
【請求項２】
抗原が、オボムコイド、オボアルブミン、及びカゼインから選択される１又は２以上の抗原である、請求項１に記載の免疫寛容誘導剤。
【請求項３】
肺サーファクタント由来人工合成粘膜アジュバントＳＦ１０と抗原とを含む、経口投与用の免疫寛容誘導剤を有効成分として含有するアレルギー性疾患の治療又は予防剤。
【請求項４】
治療又は予防が、経口免疫療法である、請求項３に記載のアレルギー性疾患の治療又は予防剤。
【請求項５】
アレルギー性疾患が、食物アレルギーである、請求項３又は４に記載のアレルギー性疾患の治療又は予防剤。
【請求項６】
食物アレルギーが、牛乳アレルギー又は卵アレルギーである、請求項５に記載のアレルギー性疾患の治療又は予防剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、肺サーファクタント由来人工合成粘膜アジュバントＳＦ１０（特許文献、非特許文献にＳＦ−１０と記載されることもある）と、抗原とを含む、経口投与用の免疫寛容誘導剤やアレルギー性疾患の治療又は予防剤に関する。本発明の免疫寛容誘導剤やアレルギー性疾患の治療又は予防剤は、アレルギー性疾患、特に食物アレルギーの治療又は予防のための経口免疫療法に用いることができる。
【背景技術】
【０００２】
アレルギーとは、原因物質（アレルゲン）への暴露よって起きる、生体に不利益を与える免疫反応の一つである。ヒトは異種生物を食料として消化・吸収することにより生命を維持しているので、消化しきれていない未消化異物が絶えず体内に取り込まれる状態にあるが、かかる未消化異物に対して生体の防御反応（アレルギー反応）が起きないように、免疫寛容（免疫トレランス）が通常働いているとされている。しかし、現在は出生人口の５−１０％の乳児において、生後１年までに食物アレルギー等の何らかのアレルギー性疾患に罹患しており、またその多くは５〜６歳までに自然治癒するものの、治癒しない場合には、アトピー性皮膚炎、喘息など伴う重度のアレルギー症状（アレルギーマーチ）に進行することがある。一方、環境中のアレルゲン（花粉、カビ、ハウスダスト等）に対しては、年齢が増すとともに、それまでの免疫寛容状態が破綻して、アレルギーが発症することがある。先進国では、このようなアレルギーは年々増加の傾向をたどっており、全人口の約３０％が何かしらのアレルギー性疾患に罹患しているとも言われており、その対策が強く望まれている。【０００３】
従来、アレルギー性疾患に対する有効な治療法は存在せず、アレルギー症状の軽減を目的とした対症療法が一般的であった。しかし近年、アレルギー性疾患の根治療法として、アレルゲン免疫療法（減感作療法とも呼ばれる）が開発され注目を集めている。アレルゲン免疫療法とは、医師の管理下でアレルゲン（抗原）を患者に投与し、免疫寛容を誘導しようとするものであり、食物アレルギーに対する経口免疫療法（特許文献１及び２）、花粉やダニアレルギーに対する舌下免疫療法（特許文献３）、及び経皮免疫療法（特許文献４）が知られている。【０００４】
アレルゲン免疫療法では、安全に免疫療法を実施するために低いアレルゲン投与量から開始し、徐々に投与量を増やすが、その際、閾値を超える量のアレルゲンを投与することで重篤な即時型アレルギー症状を起こす危険性がある。そのため、アレルゲン免疫療法では、標準化されたアレルゲンワクチンが使用される。アレルゲンワクチンは、天然アレルゲンを加工（成分抽出、加熱処理、化学的修飾、徐放性製剤化など）することによって、免疫寛容を誘導できるようなアレルゲン性を維持しながら、即時型症状の誘発リスクを低下させたものである。アレルゲンワクチンの例としては、卵を加熱変性して粉末化した卵アレルギー治療用組成物や（特許文献５及び６）、修飾β−ラクトグロブリンを含む牛乳アレルギー治療用組成物が開示されている（特許文献７）。また、スギ花粉の主要なアレルゲンタンパク質とされるＣｒｙｊ１とＣｒｙｊ２との融合タンパク質を用いたスギ花粉症治療用組成物や（特許文献８）、それら以外のスギ花粉アレルゲンタンパク質を利用したスギ花粉症治療用組成物も開示されている（特許文献９）。【０００５】
しかし、このようなアレルゲンワクチンを用いた場合でも、減感作療法によって重篤なアレルギー発症を完全に防ぐことは困難であることが知られている（非特許文献１〜３）。特に、食物アレルギー患者には乳児や幼児も多く含まれるため、減感作療法のリスクはさらに高いものとなる。実際、日本では、経口免疫療法によって、心肺停止を含む重篤なアレルギー症状（アナフィラキシー）を呈した数件の事例が報告されている。以上のことから、より安全性の高い経口免疫療法用のアレルゲンワクチン（免疫寛容誘導剤）の開発が強く求められている。【０００６】
他方、ヒトの肺胞II型細胞から分泌される「肺サーファクタント」は、新生児呼吸窮迫症候群の特効薬として知られている。本発明者らは、「肺サーファクタント」のアジュバントとしての利用可能性に早くから注目し、大量生産が可能な人工合成肺サーファクタント（Synthetic pulmonary surfactant；ＳＳＦ）を開発した（特許文献１０〜１２）。さらに、本発明者らは、増粘剤のカルボキシビニルポリマー（Carboxyvinyl polymer；ＣＶＰ）を添加することにより、ＳＳＦによる抗原の運搬時間が延長できることを突き止め、ＳＳＦとＣＶＰと含む人工合成粘膜アジュバントＳＦ１０を開発した（特許文献１３、非特許文献４、及び非特許文献５）。【０００７】
また発明者らは、経鼻接種用インフルエンザワクチンのアジュバントとしてＳＦ１０を用いた結果、Ｔｈ１及びＴｈ２免疫系がバランス良く誘導され、血中だけでなく、鼻腔洗浄液や気管支肺胞洗浄液中でもインフルエンザ抗原特異的ＩｇＡが増加すること、また、炎症反応を含むいかなる副作用も起こらなかったことを明らかにした（非特許文献４、非特許文献５、非特許文献６）。しかし、ＳＦ１０の経口投与はこれまで全く試みられておらず、その効果は全く不明である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特許第４８４３７９２号
【特許文献２】特許第５０２８６２７号
【特許文献３】特許第５４７３８９９号
【特許文献４】特許第５８０４２７８号
【特許文献５】特開２０１５−１０５２３４号
【特許文献６】特開２０１５−１０４３３１号
【特許文献７】特表２０１１―５２５８９１号
【特許文献８】国際公開ＷＯ２００７／０８０９７７号
【特許文献９】特開２００８−１４１９９３号
【特許文献１０】国際公開ＷＯ２００５／０９７１８２号
【特許文献１１】国際公開ＷＯ２００７／０１８１５２号
【特許文献１２】国際公開ＷＯ２００９／１２３１１９号
【特許文献１３】国際公開ＷＯ２０１１／１０８５２１号
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Ventura MT et al. Immunopharmacol Immunotoxicol. 30: 153-61,2008
【非特許文献２】Rezvani M et al. Immunol Allergy Clin North Am. 27: 295-307,2007
【非特許文献３】Bernstein DI. Allergy. 63:374, 2008
【非特許文献４】Kimoto T et al. Influenza and Other Resp. Viruses 7(6): 1218-1226, 2013.
【非特許文献５】Mizuno D et al. Vaccine 34(16): 1881-1888, 2016.
【非特許文献６】Kim H, et al. PLOS ONE 13(1):e0191133, 2018.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明の課題は、ＳＦ１０をアジュバントとして利用したアレルゲン免疫寛容誘導剤（「免疫寛容誘導ワクチン」と称することもある）を開発して、アナフィラキシーを含む即時型アレルギーの発症リスクを抑えながら、アレルギー性疾患を治療又は予防するための免疫寛容誘導剤や、アレルギー性疾患の治療又は予防剤を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
ヒト肺サーファクタントは、胎生３４週以後肺胞II型細胞から盛んに産生され、羊水中では胎脂−肺サーファクタント複合体を形成して蓄積される。胎児は、この胎脂−肺サーファクタント複合体を絶えず飲み込んでいるが、肺サーファクタントは上部消化管粘膜で選択的に吸収され、吸収部位の腸管粘膜の成熟を促進することが知られている（Nishijima K, et al. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 2012; 303: L208-L214.）。このような報告から、本発明者らは、アレルゲン（抗原）とＳＦ１０とを含む複合体（以下、「アレルゲン−ＳＦ１０」又は「抗原−ＳＦ１０」）を経口投与すれば、上部消化管粘膜でＳＳＦ（とそれに結合したアレルゲン）が選択的に吸収されて効率的な腸管免疫応答が起こり、アレルゲンの単独投与と比較して、より少ない量のアレルゲン（すなわち、反応閾値以下のアレルゲン）で免疫応答を誘導することが可能ではないかと考えた。【００１２】
そして、本発明者らは、種々のアレルゲンとＳＦ１０とを含む複合体をアレルゲン免疫寛容誘導剤として作製して、その効果をアレルゲン経皮感作モデルマウス（体重約２０ｇ）を用いて検討した。その結果、i）オボムコイド（ＯＶＡ）経皮感作アレルギーマウスに、ＯＶＡとＳＦ１０との複合体（ＯＶＭ−ＳＦ１０）を治療用アレルゲン免疫寛容誘導剤として投与すると、ＯＶＡ経口投与負荷試験によるアナフィラキシーの発症がほぼ完全に抑制されること、ii）治療用アレルゲン免疫寛容誘導剤として投与したＯＶＭ−ＳＦ１０のワクチン効果はＯＶＭ含有量がマウス１匹当たり０．０１μｇ（すなわち、単独ではマウスの免疫応答に影響を及ぼさない量）のときが最も高いこと、iii）健常（アレルゲン非感作）マウスに、カゼインとＳＦ１０との複合体（カゼイン−ＳＦ１０）を予め予防用アレルゲン免疫寛容誘導剤として経口接種すると、その後カゼイン経皮感作を行ってもカゼインアレルギーを発症しないことを明らかにした。【００１３】
抗原−ＳＦ１０複合体の経鼻接種によって該抗原に対する免疫応答が誘導されることが知られている状況において、本発明者らは、抗原（アレルゲン）−ＳＦ１０複合体を経口接種することによって該抗原（アレルゲン）に対する免疫寛容が誘導されるという予想外の結果を見いだし、本発明を完成するに至った。【００１４】
すなわち、本発明は（１）肺サーファクタント由来人工合成粘膜アジュバントＳＦ１０と、抗原とを含む、経口投与用の免疫誘導剤や、（２）抗原が、オボムコイド、オボアルブミン、及びカゼインから選択される１又は２以上の抗原である、上記（１）に記載の免疫寛容誘導剤や、（３）肺サーファクタント由来人工合成粘膜アジュバントＳＦ１０と抗原とを含む、経口投与用の免疫寛容誘導剤を有効成分として含有するアレルギー性疾患の治療又は予防剤や、（４）治療又は予防が、経口免疫療法である、上記（３）に記載の治療又は予防剤や、（５）アレルギー性疾患が、食物アレルギーである、上記（３）又は（４）に記載の治療又は予防剤や、（６）食物アレルギーが、牛乳アレルギー又は卵アレルギーである、上記（５）に記載の治療又は予防剤に関する。
【発明の効果】
【００１５】
本発明の免疫寛容誘導剤を経口投与すると、ＳＦ１０のアジュバント効果により、アナフィラキシー反応閾値より少ない量の抗原であっても、免疫寛容を誘導・成立させることができる。したがって、本発明の免疫寛容誘導剤をアレルゲンワクチンとして利用すれば、アレルギー性疾患を有する対象において経口免疫療法を安全且つ効率的に行うことができる。また、本発明の免疫寛容誘導剤を、アレルギー性疾患を有さない対象に投与することによって、アレルギー性疾患の予防を行うことができる。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】本発明のアレルギーモデルマウスを用いた、アナフィラキシー誘発実験のプロトコールを示す図である。アナフィラキシー誘発の３０分前にアスピリンをマウスに服用させることで、経口アレルゲン（抗原）チャレンジによるアナフィラキシー誘発が増幅され、免疫寛容誘導剤によるアナフィラキシー反応の抑制効果を確実に評価することができる。
【図２】本発明の経皮感作アレルギーモデルマウス（体重約２０ｇ）を用いた、アナフィラキシー誘発実験の結果を示す図である。経皮感作アレルギーモデルマウスは、週５回、２週間アレルゲン（ＯＶＡ）を経皮感作した後、１〜２週間を経てアナフィラキシー誘発状態になってから実験に用いる。グラフの縦軸はマウス直腸温の変化を示し、横軸はアレルゲン（ＯＶＡ）経口チャレンジ後の時間を示す。ＡＳＡ: アスピリン（５０％エタノールに溶解）は、ＯＶＡチャレンジの３０分前に経口投与する。ＯＶＡ: オボアルブミン
【図３】インフルエンザワクチン抗原（ＨＡｖ）とＳＦ１０との複合体を経鼻接種した２週間後の、マウス（体重約２０ｇ）の各免疫器官に含まれるＨＡｖ特異的ＩｇＡ抗体の誘導促進効果を示す図である。グラフの縦軸は、マウス１匹当たりの気管支肺胞洗浄液、鼻腔洗浄液、膣液、及び腸管液（小腸液、大腸液（便）、小腸液＋大腸液）に含まれるＨＡｖ特異的ＩｇＡ抗体量を示す。また、グラフの横軸の「ｓａｌｉｎｅ」はコントロール溶媒として用いた生理食塩水のみの投与群を、「ＨＡｖ」はＨＡｖ単独投与群、「ＨＡｖ−Ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）」はＨＡｖとＰｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）との組合せ投与群を、「ＨＡｖ−ＳＦ１０」はＨＡｖとＳＦ１０との複合体投与群をそれぞれ示す。
【図４】図４Ａは腸管構造の模式図を示し、図４Ｂ〜Ｅは本発明の複合体（蛍光標識ＯＶＡとＳＦ１０との複合体）の樹状細胞への取込みをヒストグラム解析した結果を示す。これらの図で、樹状細胞は、ＭＨＣII+ＣＤ１１ｃ+抗体で染色される細胞集団として示される。また、かかる樹状細胞集団をさらにＣＤ１１ｂ陽性、ＣＤ１０３陽性細胞（ＭＨＣII+ＣＤ１１ｃ+ＣＤ１１ｂ+ＣＤ１０３+）とＣＤ１１ｂ陽性、ＣＤ１０３陰性細胞（ＭＨＣII+ＣＤ１１ｃ+ＣＤ１１ｂ+ＣＤ１０３-）との２種に分け、合計３種の樹状細胞集団に分けて解析した結果を示す。灰色表示は無処理群の結果を、点線表示は蛍光標識ＯＶＡの単独経口投与群の結果を、実線表示は蛍光標識ＯＶＡ−ＳＦ１０経口投与群の結果を示す。図４Ｆ〜Ｈは、これら３種類の樹状細胞集団の中で、蛍光標識ＯＶＡを取り込んだ樹状細胞の割合を％で示す。ＳＦ１０アジュバントと蛍光標識ＯＶＡとの複合体を形成することで、樹状細胞に取り込まれた蛍光標識ＯＶＡは、経口投与１２時間後にいずれの樹状細胞においても、蛍光標識ＯＶＡ単独投与群に比べて有意に取り込み量の増加が認められた。２４時間後では、このＳＦ１０の取り込み増強効果は消失していた。
【図５】インフルエンザ抗原（ＨＡｖ）とＳＦ１０との複合体（ＨＡｖ−ＳＦ１０）を経口免疫した後の、マウス（体重約２０ｇ）の全身リンパ組織におけるＨＡｖ特異的ＩｇＡ及びＩｇＧ産生細胞量の増加を示した図である。図５中で、Ａは肺リンパ節、Ｂは脾臓、Ｃは頸部リンパ節、Ｄは胸縦隔リンパ節、Ｅはパイエル板、及びＦは胃所属リンパ節由来のリンパ球の中で、ＨＡｖ特異的ＩｇＡ及びＩｇＧ産生細胞集団（コロニー）数を示した結果である。ＨＡｖ単独経口免疫群に比べて、ＨＡｖ−ＳＦ１０経口免疫群では、有意にＩｇＡ及びＩｇＧ産生コロニー数の増加が認められる。各図右のグラフにおいて、「塗りつぶした●」はＨＡｖ特異的ＩｇＡ分泌細胞コロニー数の平均値を、「塗りつぶした■」はＨＡｖ特異的ＩｇＧ分泌細胞コロニー数の平均値を示す。
【図６】インフルエンザ抗原（ＨＡｖ）とＳＦ１０との複合体を、マウス（体重約２０ｇ）に皮下、経鼻、又は経口免疫した後に採取したマウス脾臓細胞の培養条件下において、ＨＡｖ刺激の有無でＴｈ１、Ｔｈ２，Ｔｈ１７サイトカイン分泌量応答を示している。図中、「ｓ．ｃ．」は皮下接種群を、「ｉ．ｎ．」は経鼻接種群を、「ｐ．ｏ．」は経口投与群をそれぞれ示す。Ｔｈ１サイトカインとして、ＩＬ−１とＩＦＮ−γを、Ｔｈ２サイトカインとしてＩＬ−４，ＩＬ−５を、Ｔｈ１７サイトカインとしてＩＬ−１７ＡとＩＬ−２２を測定した。ＨＡｖ（ｓ．ｃ．）免疫ではＴｈ１とＴｈ２サイトカインを優位に誘導したが、ＨＡｖ−ＳＦ１０（ｐ．ｏ．）免疫では、最も強力なＴｈ１７とＴｈ１サイトカインの誘導と、比較的温和なＴｈ２サイトカイン誘導が示された。
【図７】インフルエンザ抗原（ＨＡｖ）とＳＦ１０との複合体を皮下、経鼻、又は経口免疫した後の、マウス（体重約２０ｇ）の各器官におけるＨＡｖ特異的ＩｇＡ及びＩｇＧ産生量増強効果を示した図である。図７中で、Ａは血液、Ｂは気管支肺胞洗浄液、Ｃは鼻腔洗浄液、Ｄは胃抽出液、及びＥは糞便抽出液の結果をそれぞれ示す。グラフの縦軸は、サンプル中のＨＡｖ特異的抗体濃度（白カラム：ＩｇＡ、黒カラム：ＩｇＧ）を示す。グラフの横軸は異なる接種ルート群を示し、「ｓ．ｃ．」は皮下接種群を、「ｉ．ｎ．」は経鼻接種群を、「ｐ．ｏ．」は経口投与群をそれぞれ示す。
【図８】本発明経皮感作アレルギーモデルマウス（体重約２０ｇ）に、ＯＶＭとＳＦ１０との複合体（ＯＶＭ−ＳＦ１０）を免疫寛容誘導ワクチンとして経口免疫した後に、経口アレルゲンチャレンジによるアナフィラキシー誘発試験を行った結果を示した図である。グラフの縦軸はマウス直腸温を、横軸はＯＶＭ経口投与（チャレンジ試験）後の時間をそれぞれ示す。また、図中、「ワクチン」は本発明の免疫寛容誘導ワクチン（ＯＶＭとＳＦ１０との複合体）を示し、「感作」はＯＶＭの経皮感作によるアナフィラキシー誘発状態への誘導を示す。すなわち、この図において、「感作無し」とは健常マウスにＯＶＭ経口チャレンジを行った群を示し、「感作のみ（ワクチン無し）」とはＯＶＭの経皮感作によってアナフィラキシー誘発状態になったアレルギーモデルマウスに、ＯＶＭ経口チャレンジを行った群を示し、「感作＋ワクチン」とは上記アレルギーモデルマウスに、免疫寛容誘導ワクチン（本発明の複合体）を経口免疫した後に、ＯＶＭ経口チャレンジを行った群をそれぞれ示す。
【図９】ＯＶＭとＳＦ１０との複合体（ＯＶＭ−ＳＦ１０）による免疫寛容誘導ワクチン効果に及ぼす、ＯＶＭ含有量の影響を調べた結果を示す図である。グラフの縦軸は、体重約２０ｇのマウスを対象としたＯＶＭチャレンジ試験後のマウス直腸温の変化を、中央値と平均値で示す（負荷試験前の温度を基準値として算出した）。また、グラフの横軸は免疫寛容誘導ワクチンに含まれるＯＶＭ抗原量を示し、「（−）」はワクチン非投与群を、「０．００１」はＯＶＭ（０．００１μｇ）−ＳＦ１０投与群を、「０．０１」はＯＶＭ（０．０１μｇ）−ＳＦ１０投与群を、「０．１」はＯＶＭ（０．１μｇ）−ＳＦ１０投与群を、「１」はＯＶＭ（１μｇ）−ＳＦ１０投与群をそれぞれ示す。
【図１０】本発明のＯＶＭ経皮感作アレルギーモデルマウス（体重約２０ｇ、ｎ＝１０）に、０．０１μｇのＯＶＭを単独で経口投与したときの、アナフィラキシー反応による直腸温変化を示す図である。グラフの縦軸は直腸温の変化を箱ひげグラフで、横軸はＯＶＭ単独投与後の時間をそれぞれ示す。なお、０．０１μｇＯＶＭは、免疫寛容誘導効果が最も良く見られたＯＶＭ−ＳＦ１０免疫寛容誘導ワクチンに含まれるＯＶＭ含量である。
【図１１】カゼインの皮下注射による、経皮アレルゲン免疫療法の予防効果を調べた結果を示す図である。図１１（Ａ）は、カゼイン経皮感作アレルギーモデルマウスを用いて、カゼイン経口チャレンジによるアナフィラキシー誘発試験を実施した個別データとその平均値を示す（体重約２０ｇ、ｎ＝５）。図１１（Ｂ）は、経皮アレルゲン免疫予防療法として、予めマウス（体重約２０ｇ）にカゼインを皮下注射した２週間後に、カゼインの経皮感作を実施し、感作終了２週間後に経口カゼインチャレンジによるアナフィラキシー誘発試験を実施した個別データとその平均値を示す（ｎ＝５）。また、図１１（Ａ）及び（Ｂ）の「皮下免疫無し、ワクチン接種無しの平均」は、健常マウス（カゼインの予防的皮下免疫なし、カゼインの経皮感作なし）の経口カゼインチャレンジ結果（細い点線）を示す。（Ｂ）における「皮下免疫後、経皮感作した群の平均」は、予め予防的にカゼインを２週間間隔で２回皮下免疫した後、カゼインの経皮感作を実施し、感作終了の２週間後に経口カゼインチャレンジ試験を実施した結果の平均値（太い点線、ｎ＝５）で示し、その個別データを細い実線で示す。グラフの縦軸は、カゼインチャレンジ試験後のアナフィラキシー反応によるマウス直腸温の変化を示し（チャレンジ試験前の温度を基準値として算出した）、横軸はチャレンジ試験後の時間を示す。
【図１２】カゼインとＳＦ１０との複合体（カゼインーＳＦ１０免疫寛容誘導ワクチン）の予防的経口投与による、カゼインアレルギーへの予防効果を調べた結果を示す図である。図１２は、カゼイン―ＳＦ１０免疫寛容誘導ワクチンの経口接種を２回（体重約２０ｇのマウスに、初回とその３日後）行い、最終免疫の２週間後にカゼインの経皮感作を実施したマウスを用いて、経口カゼインチャレンジ試験を実施した結果を示す（ｎ＝４）。図１２の「経口免疫無し、経皮感作無しの平均」は、健常マウス（カゼインの予防的経口免疫無し、カゼインの経皮感作なし）におけるチャレンジ試験結果の平均を点線で示す。「経口免疫無しで経皮感作した群の平均」は、カゼイン―ＳＦ１０の予防的経口接種無しのマウスにカゼインを経皮感作した後、経口カゼインチャレンジした結果の平均値を太い点線で示す（それぞれ、４例の平均値）。さらに、カゼイン―ＳＦ１０免疫寛容誘導ワクチンを予防的に経口接種したマウスにカゼインを経皮感作した後、経口カゼインチャレンジした「個別データ」を細い実線で示す。グラフの縦軸は、アナフィラキシー誘発チャレンジ試験後のマウス直腸温の変化を示し（負荷試験前の温度を基準値として算出した）、横軸は負荷試験後の時間を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
本発明の「免疫寛容誘導剤」（本明細書においては「免疫寛容誘導ワクチン」と称する場合もある）としては、ＳＦ１０と抗原とを含み、経口投与によって前記抗原に対する免疫寛容を誘導し得るものであれば特に制限されず、ここで「免疫寛容の誘導」とは、アレルギー性疾患を有する対象においては、アナフィラキシーを含む即時型アレルギー反応の（ｉ）発症抑制、（ii）症状軽症化、（iii）進行遅延、又は（iv）回復促進を意味し、アレルギー性疾患を有さない対象においては、上記（ｉ）〜（iv）に加えて、さらに（ｖ）アレルゲン（抗原）に対する感作成立の阻害又は抑制を意味する。また、本願明細書においては、上記「免疫寛容誘導剤」を、アレルギー性疾患の治療に用いる場合には「治療用アレルゲン免疫寛容誘導剤」と称し、アレルギー性疾患の予防に用いる場合には「予防用アレルゲン免疫寛容誘導剤」と称する場合がある。
【００１８】
本発明に用いられる「ＳＦ１０」とは、（ａ）ＫｎＬｍ（ただし、ｎは４〜８、ｍは１１〜２０）のアミノ酸配列からなる合成ペプチドと、脂質とからなる人工合成肺サーファクタント（ＳＳＦ）、及び（ｂ）カルボキシビニルポリマー（ＣＶＰ）を含むアジュバントを意味し、上記「脂質」としては、ホスファチジルコリン、ジパルミトイルホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジン酸、ラウリル酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、オレイン酸などを好適に例示することができるが、なかでも、ジパルミトイルホスファチジルコリン、ホスファチジルグリセロール、及びパルミチン酸の組合せであることが特に好ましい。
【００１９】
また、本発明に用いられる「抗原」とは、アレルギー性疾患を引き起こすアレルゲンを意味し、食品、植物、動物、又は菌由来のどのようなアレルゲンであってもよい。具体的には、上記「食品由来のアレルゲン」の例としては、卵、牛乳、小麦、大豆、蕎麦、落花生、牛肉、鶏肉、豚肉、ゴマ、ゼラチン、ヤマイモ、マツタケ、イクラ、果物（例えば、オレンジ、キウイフルーツ、モモ、リンゴ、バナナ等）、甲殻類（例えば、エビやカニ）、魚類（例えば、サケやサバ）、貝類（例えば、アワビやイカ）、種実類（例えば、カシューナッツやクルミ）等に由来するアレルゲンを挙げることができるが、なかでも、卵又は牛乳に由来するアレルゲンであることが好ましく、オボムコイド（ＯＶＭ）、オボアルブミン（ＯＶＡ）、又はカゼインであることが特に好ましい。
【００２０】
また、上記「植物由来のアレルゲン」の例としては、樹木類の花粉（例えば、アカスギ、アカシア、ハンノキ、ビロードアオダイモ、セイヨウブナ、白樺、カエデ、ヤマスギ、ハコヤナギ、ヒノキ、アメリカニレ、アキニレ、トガサワラ、ゴムの木、ユーカリの木、エノキ、ヒッコリー、アメリカシナノキ、サトウカエデ、メスキート、カジノキ、コナラ属、オリーブ、ペカン、コショウ、マツ、イボタツキ、ロシアオリーブ、アメリカスズカケ、ニワウルシ、クロクルミ、クロヤナギ等の花粉）、草木類の花粉（ワタ、ギョウギシバ、ナガハグサ、スズメノチャヒキ、トウモロコシ、ヒロハウシノケグサ、セイバンモロコシ、カラスムギ、カモガヤ、コヌカグサ、ホソムギ、コメ、ハルガヤ、オオアワガエリ、ヒユ、アカザ、オナモミ、ギシギシ、セイタカアワダチソウ、イソホウキ、シロザ、キンセンカ、イラクサ、アオビエ、ヘラオオバコ、オオブタクサ、ブタクサ、ブタクサモドキ、ノハラヒジキ、ヤマヨモギ、エニシダ、ヒメスイバ等の花粉）等に由来するアレルゲンを挙げることができ、上記「動物由来のアレルゲン」の例としては、ダニ（イエダニ、チリダニ、ツメダニ、コナダニ、マダニ、ヒゼンダニ等）、哺乳動物（例えば、イヌ、ネコ、マウス等）、昆虫（例えば、ミツバチ、スズメバチ、アリ、ゴキブリ等）等に由来するアレルゲンを挙げることができ、上記「菌由来のアレルゲン」の例としては、アルテルナリア、アスペルギルス、ボツリヌス、カンジダ、セファロスポリウム、カーブラリア属、エピコッカム菌、表皮菌、フザリウム属、ヘルミントスポリウム属、連鎖クラドスポリウム、ケカビ、ペニシュリウム、ファーマ属、プルラリアプルランス、クモノスカビ等に由来するアレルゲンを挙げることができる。
【００２１】
さらに、本発明に用いられる「抗原」は、食品、植物、動物、又は菌に含まれる「天然のアレルゲン成分」であってもよいし、そのような天然のアレルゲン成分の一部からなる「特定のアレルゲン分子」であってもよい。また、上記「特定のアレルゲン分子」は、天然のアレルゲン成分から単離・精製されものであっても、遺伝子組換え技術やペプチド合成技術を用いて人工的に合成されたものであってもよい。さらに、上記「天然のアレルゲン成分」又は「特定のアレルゲン分子」は、そのアレルギー誘発性が低下又は増加するように、変性処理（例えば、熱変性や化学的修飾）が施されたものであってもよい。
【００２２】
また、上記本発明の免疫寛容誘導剤は、上記抗原のうちの１つを含むものであってもよいし、２以上を組み合わせて含むものであってもよい。また、上記本発明の免疫寛容誘導剤における、上記抗原と上記脂質（ＳＳＦに含まれるリン脂質）の質量比（抗原／リン脂質）は、０．０１〜１００であることが好ましく、０．０５〜１０であることがより好ましく、０．０７〜２であることがさらに好ましく、０．１〜１であることが特に好ましい。
【００２３】
上記本発明の免疫寛容誘導剤は、アレルギー性疾患の治療又は予防に用いることができることから、本発明は、本発明の免疫寛容誘導剤を有効成分として含有するアレルギー性疾患の治療又は予防剤にも関する。上記「アレルギー性疾患」とは、上記抗原への曝露によって引き起こされるアレルギー性疾患であれば特に制限されないが、具体的には、食物アレルギー、アレルギー性鼻炎（花粉症等）、アトピー性皮膚炎、アレルギー性結膜炎、アレルギー性胃腸炎、気管支喘息、喘息、蕁麻疹等を好適に例示することができるが、なかでも、経口免疫療法の対象となる食物アレルギーであることが好ましく、卵アレルギー又は牛乳アレルギーであることがより好ましい。上記「アレルギー性疾患の治療」においては、上記アレルギー性疾患を有する対象（ヒト、又はペットや家畜等の非ヒト動物）に、上記本発明の免疫寛容誘導剤を１回、好ましくは２回、より好ましくは３回、さらに好ましくは４回、特に好ましくは５回以上経口投与することによって、前記対象において前記抗原に対する免疫寛容を誘導し、症状を改善又は根治する。また、上記「アレルギー性疾患の予防」においては、アレルギー性疾患を有さない対象（ヒト、又はペットや家畜等の非ヒト動物）に、上記本発明の「免疫寛容誘導剤」を１回、好ましくは２回、より好ましくは３回、さらに好ましくは４回、特に好ましくは５回以上経口投与することによって、前記対象において前記抗原に対する免疫寛容を誘導し、その後の該抗原の暴露によるアレルギー性疾患の発症を予防することができる。
【００２４】
上記本発明の免疫寛容誘導剤やアレルギー性疾患の治療又は予防剤における「抗原の含有量」は、１回接種量当たり０．００１〜１０００μｇ／Ｋｇ体重であることが好ましく、０．０１〜１００μｇ／Ｋｇ体重であることがより好ましく、０．０５〜５０μｇ／Ｋｇ体重であることがさらに好ましく、０．０５〜５μｇ／Ｋｇ体重であることがより好ましく、０．０５〜０．５μｇ／Ｋｇ体重であることが特に好ましい。なかでもアレルゲン感作によりアナフィラキシーの発症リスクの高いケースを対象とした、治療用免疫寛容誘導剤を用いる場合では、抗原としてＯＶＭ又はＯＶＡを用いる場合、これらを低濃度（例えば、１回接種量当たり５０μｇ／Ｋｇ体重以下、好ましくは５μｇ／Ｋｇ体重以下、より好ましくは０．５μｇ／Ｋｇ体重以下）で含有することが好ましい。なお、接種量はアレルゲンの種類によっても異なるが、予め実施するアナフィラキシー誘発試験で明らかになったアナフィラキシー誘発抗原量の０．１倍以下、より好ましくは０．０２倍以下で、上記の範囲に入ることが好ましい。上記の範囲に入らない微量抗原であっても、投与回数を増やすことで、免疫寛容誘導効果を増幅実現させることができる。上記本発明の免疫寛容誘導剤やアレルギー性疾患の治療又は予防剤は、胃液による抗原の消化や酸性環境下での不活性化を防ぐための弱アルカリ緩衝液（例えば、炭酸緩衝液やリン酸緩衝液）、さらにはカプセル封入、ゼリー状の消化酵素からの保護剤等を含むものであってもよい。
【００２５】
上記本発明の免疫寛容誘導剤やアレルギー性疾患の治療又は予防剤は、他のアレルゲン免疫療法用のアレルゲンワクチン（アレルゲン抽出物など）と同時に使用することもできるし、又は、他のアレルゲン免疫療法用のアレルゲンワクチンの使用前後に使用することもできる。また、上記本発明の免疫寛容誘導剤は、トラニラスト、フマル酸クレマスチン、塩酸シプロヘプタジン、ジフェンヒドラミン、メトジラミン、クレミゾール、メトキシフェナミン等の公知のアレルギー性疾患治療薬と組み合わせて用いることもできる。さらに、上記本発明の免疫寛容誘導剤やアレルギー性疾患の治療又は予防剤には、必要に応じて、薬理学的に許容し得る担体、賦形剤、結合剤、香料、矯味剤、甘味剤、着色剤、等張化剤、防腐殺菌剤、酸化防止剤、溶解剤、溶解補助剤、懸濁化剤、充填剤、ｐＨ調節剤、安定化剤、吸収促進剤、放出速度制御剤、可塑剤、架橋剤、粘着剤、又は界面活性剤等を添加することができる。
【００２６】
さらに、本発明は、アレルギー性疾患の治療又は予防や、ＳＦ１０と抗原とを含む複合体（免疫寛容誘導ワクチン）を、それを必要とする対象に経口接種するステップを含む、免疫寛容誘導方法や、免疫寛容誘導剤としての使用のための、ＳＦ１０と抗原とを含む複合体や、免疫寛容を誘導するための医薬の製造のためのＳＦ１０と抗原とを含む複合体の使用に関する。
【００２７】
以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの例示に限定されるものではない。
【実施例１】
【００２８】
［食物アレルギーモデルマウスの作製］
Ｂａｌｂ／ｃマウス（６〜７週齢、雌）の頭側背部の毛をバリカンで除去した後に、１００μＬのＳＤＳ水溶液（４％）を均一に塗布して皮膚バリアー機能に損傷を与え、さらに、１０分後に、１００μＬのオボムコイド（ＯＶＭ）（ナカライテスク社製）水溶液（１０ｍｇ/ｍＬ)、１００μＬのオボアルブミン（ＯＶＡ）（Sigma-Aldrich社製）水溶液（１０ｍｇ/ｍＬ)、又は１００μＬのカゼイン（Sigma-Aldrich社製）水溶液（１０ｍｇ/ｍＬ)を均一に塗布した。このようなアレルゲン塗布を合計１０回（５回／週の頻度で２週間）行い、ＯＶＭ、ＯＶＡ、又はカゼインに対する経皮感作食物アレルギーモデルマウスを作製した。以下の実験には、経皮感作から１０〜１４日後のマウスを供した。
以下、それぞれのモデルマウスをそれぞれ「本発明のＯＶＭアレルギーマウス」、「本発明のＯＶＡアレルギーマウス」、及び「本発明のカゼイアレルギーマウス」と称する場合がある。また、これらの３種のマウスを「本発明のアレルギーマウス」と総称する場合がある。
【実施例２】
【００２９】
［アスピリンを用いたアナフィラキシー誘発試験］
食物アレルギー患者では、経口摂取されたアレルゲンが腸管粘膜を介して体内に取り込まれることによって、アナフィラキシーを含むアレルギー反応が誘発される。しかし従来、感作モデルマウスにアナフィラキシーを発症させる方法としては、少量のアレルゲン（数十μｇ〜１ｍｇ/マウス１匹）の静脈又は腹腔内注射が一般的であった。これらの投与方法は重症アナフィラキシーを確実に発症させることが可能であるが、アレルゲンの取込み経路が経口とは異なるために、ヒトにおける食物アレルギーの発症機序を正確に反映したものとは言い難い。また、大量のアレルゲン（５０〜１００ｍｇ/マウス１匹）をモデルマウスに経口投与して、アナフィラキシーを誘発させる試みもなされているが、大量アレルゲン投与にも係わらずアナフィラキシー誘発の程度に大きなばらつきがあり、アナフィラキシー抑制効果の定量的評価が困難であることが知られている。これらのことから、モデルマウスに高い確率でアナフィラキシーを誘発させる経口アレルゲンチャレンジ法の開発が望まれていた。
一方、アスピリン（アセチルサリチル酸；ＡＳＡ）は、食物アレルギーの症状を増強する物質として知られており、ヒトでは食物依存性運動誘発アナフィラキシー試験に使用されてもいる。具体的には、食物依存性運動誘発アナフィラキシー診断で、「アスピリンの前投与」と「食物＋運動」の３種の負荷とを組み合わせて診断する方法の中で、アスピリンが誘発促進剤として使用されることがあった（Brockow K et al. J Allergy Clin Immunol. 2015; 135: 977-984.e4.）。【００３０】
本発明者らは、図１に示すスケジュールに沿って、本発明のアレルゲン経皮感作モデルマウスに対して「ＡＳＡ前投与」及び「アレルゲン経口投与」の２種の負荷を組み合わせて実施し、アナフィラキシーが確実に誘発されるか否かを調べた。以下の（１）〜（４）に、実験手順及び結果を示す。
（１）ＡＳＡ前投与
本発明のＯＶＡ経皮感作モデルマウス（体重約２０ｇ）を２時間以上絶食させた後に、５０％エタノールに溶解したＡＳＡ（Sigma-Aldrich社製）を経口投与した（１．２５ｍｇ／１００μＬ／匹）。また、コントロールとして、ＡＳＡを含まない５０％エタノールのみを経口前投与した群を設けた。
（２）ＯＶＡ経口チャレンジ
ＡＳＡ又はエタノールの前投与から３０分後に、ＯＶＡ水溶液（Sigma-Aldrich社製）を経口チャレンジした（２０ｍｇ／１００μＬ／匹）。また、コントロールとして、水のみ（ＯＶＡを含まない）を経口投与した群を設けた。
（３）直腸温モニタリング
直腸温はアナフィラキシー発症の指標として一般的に使用されており、アナフィラキシーの症状が重いほど直腸温が低下することが知られている。本実験では、ＯＶＡ投与の１０分前から、投与後９０〜１２０分間の直腸温を１０分間隔で測定した。そして、ＯＶＡ投与１０分前の温度を基準値として、ＯＶＡ投与後の温度変化をモニタリングし、基準値よりも直腸温度が１度以上低下した場合、そのマウスがアナフィラキシーを発症していると判定した。
（４）結果
結果を図２に示す。また、以下の表１に、図２における表記がどの投与群に対応するかを示した。【００３１】
【表１】
2020045155.tif 000003
【００３２】
ＡＳＡを前投与した後に、ＯＶＡを経口投与した群では（図２の「ＡＳＡ／５０％エタノール＋ＯＶＡ」）、ＯＶＡのチャレンジから３０分後には直腸温の急激な低下が起こり（約２．８度の低下）、９０分後でも１．３℃の低下が認められた。この結果は、かかる投与群において、アナフィラキシーが誘発され、さらに、その症状は９０分後でも回復には至らなかったことを明確に示すものである。
これに対し、ＡＳＡの前投与なしに、ＯＶＡを経口投与した群では（図２の「ＯＶＡ単独」）、ＯＶＡのチャレンジから１０分後にわずかに直腸温が低下（１．１℃程度）したが、短時間で回復したことから、アナフィラキシーの誘発は極めて軽度と判定した。
また、ＡＳＡ前投与のみを行い、ＯＶＡをチャレンジしていない群（図２の「ＡＳＡ／５０％エタノール」）では、直腸温が３０分後から上昇する傾向が認められた。同様に、５０％エタノールの前投与を行い、ＯＶＡを経口チャレンジした群（図２の「５０％エタノール＋ＯＶＡ」）でも、直腸温の上昇が３０分後から認められた。これらの群における直腸温度上昇は、５０％エタノール投与の影響によるものと推測され、アレルギー症状とは無関係であると考えられる。また「ＡＳＡ/５０％エタノール」群でも、同様の経時変化で直腸温の上昇が認められた。
以上の結果から、本発明のアレルギーマウスに予めＡＳＡを経口投与することによって、アレルゲン経口投与によるアナフィラキシーの誘発が促進されることが明らかとなった。
【実施例３】
【００３３】
［インフルエンザ抗原（ＨＡｖ）とＳＦ１０との複合体の経鼻接種による、全身粘膜のＨＡｖ特異的ＩｇＡの誘導］
上述の通り、インフルエンザ抗原（ヘマグルチニン；ＨＡｖ）とＳＦ１０との複合体（ＨＡｖ−ＳＦ１０）は経鼻接種用ワクチンとして有用であることが既に知られている（Kimoto T, et al. Influenza and Other Resp. Viruses 7(6):1218-1226, 2013.；Mizuno D, et al. Vaccine 34(16): 1881-1888, 2016.；Kim H, et al. PLOS ONE 13(1):e0191133, 2018.）。またこれらの論文では、ＨＡv−ＳＦ１０を経鼻接種すると、血中だけでなく、鼻腔洗浄液や気管支肺胞洗浄液中でも、ＨＡv特異的ＩｇＡが誘導されることが明らかになっている。
そこで、本発明者らは、経鼻接種ＨＡｖ−ＳＦ１０ワクチンの消化管を含む全身粘膜のＩｇＡ産生誘導に及ぼす影響を調べた。具体的には、ＨＡｖ―ＳＦ１０をマウス（体重約２０ｇ）に経鼻接種し、２週間後に、気管支肺胞洗浄液、鼻腔洗浄液、膣液、及び腸管液（小腸液、大腸液（便）、小腸液＋大腸液）を採取して、それぞれに含まれるＨＡｖ特異的ＩｇＡ量を測定した。また、ＳＦ１０との比較のため、経鼻接種ワクチンの動物実験に一般的に使用される強力な粘膜アジュバントであるＰｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）を用いて（Ichinohe T, et al. J Virol. 2005; 79: 2910-2919.）、同様の実験を行った。
結果を図３に示す。ＨＡｖ−ＳＦ１０の経鼻接種後、鼻腔洗浄液や気管支洗浄液だけでなく、膣や消化管の分泌液中でもＨＡｖ特異的ＩｇＡ量が増加することが明らかとなった。ｓａｌｉｎｅとＨＡｖ単独投与群では、気管支洗浄液で示すようにＨＡｖ特異的ＩｇＡ抗体量は検出限界値であり、この傾向は鼻腔洗浄液、膣液、及び腸管液でも同様であったため、表示を省略している。以上から、ＨＡｖ単独経鼻接種に比べて、ＨＡｖとＳＦ１０の複合体の経鼻接種により、ＨＡｖ特異的ＩｇＡ産生量が大きく増加することが判明した。また、ＨＡｖ−ＳＦ１０ワクチンの経鼻接種が腸管のＩｇＡ産生に及ぼす効果が最も大きく、その効果はＰｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）を含む経鼻接種ワクチンと同等か、それよりも高いことが示され、ＳＦ１０のアジュバント効果が消化管で現れ易いことが示唆された。
【実施例４】
【００３４】
［経口食物アレルゲン―ＳＦ１０複合体接種による、消化管粘膜樹状細胞への食物アレルゲンの取込み促進効果］
実施例３の結果から、ＳＦ１０アジュバントが消化管における抗体産生に影響を及ぼす可能性が強く示唆された。また、ウサギを用いた研究により、ヒト肺サーフェクタントと胎脂の複合体を羊水中に投与すると、ウサギ胎児消化管粘膜に選択的に吸収され、吸収部位の粘膜上皮の発育を促進することが報告されている（Nishijima K, et al. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 2012; 303: L208-L214.）。これらのことから、本発明者らは、ＳＦ１０が経鼻接種以外に経口接種用ワクチンでの抗原運搬体として利用できる可能性があると考え、ＯＶＡとＳＦ１０との複合体（以下、「ＯＶＡ―ＳＦ１０」と称する場合がある）をマウスに経口接種して小腸粘膜樹状細胞へのＯＶＡの取込みを調べた。以下の（１）〜（４）に、実験手順及び結果を示す。
（１）蛍光標識ＯＶＡ−ＳＦ１０の作製
公知の手法（Mizuno D, et al. Vaccine 29(33):5368-5678, 2011.； Kimoto T, et al. Influenza and Other Resp. Viruses 7(6):1218-1226, 2013.； Mizuno D, et al. Vaccine 34(16): 1881-1888, 2016.； Kim H, et al. PLOS ONE 13(1):e0191133, 2018.）に従って、蛍光標識されたＯＶＡとＳＦ１０との複合体を作製した。なお、蛍光色素標識ＯＶＡの小腸樹状細胞への取り込みを明確に測定するため、経口接種ＯＶＡ―ＳＦ１０に含まれるＯＶＡ量は、経口接種抗体誘導実験（通常の抗原量：０．２〜１μｇ/匹、体重約２０ｇ）に比較すると大量の抗原（１００μｇ/匹、体重約２０ｇ）を用いた。
具体的には、蛍光色素のＡｌｅｘａ６４７で標識したＯＶＡ(Sigma-Aldrich社製)と上記の公知の手法で作成したＳＳＦを混合して凍結乾燥し、蛍光標識ＯＶＡとＳＳＦとの複合体（以下、「ＯＶＡ−ＳＳＦ」と称する場合がある）を作製した。上記混合の際には、ＳＳＦ中のリン脂質：ＯＶＡが１０：１（質量混合比）となるように調整した。経口接種の直前に、凍結乾燥済みＯＶＡ−ＳＳＦ（凍結乾燥、５.５ｍｇ）当たり、生理食塩水で１．０％に調整したＣＶＰ（ハイビスワコー１０４、富士フィルム和光純薬社製）０．５ｍＬを加えて均一に溶解し、さらに、胃酸による抗原の不活化を避けるために、等量の５０ｍＭの炭酸緩衝液（ｐＨ９．７）を加えて、最終蛍光標識ＯＶＡ−ＳＦ１０複合体（ＯＶＡ−ＳＦ１０）を作製した。この一連の操作により、１匹当たりに接種するワクチン液２００μＬには、１００μｇのＯＶＡ，０．５％ＣＶＰ、２５ｍＭ炭酸緩衝液が含まれる。
（２）マウスへの経口接種
ケタミン（６２．６ｍｇ／ｋｇ体重）及びキシラジン（１２．４ｍｇ／ｋｇ体重）の腹腔内注射により、マウスに麻酔を施した。マウス１匹（体重約２０ｇ）当たり、上記ＯＶＡ−ＳＦ１０溶液（２００μＬ）を、経口ゾンデを用いてマウスの胃に直接接種した。また、コントロールとして、１匹当たりＡｌｅｘａ６４７標識ＯＶＡ（１００μｇ/２００μＬ、２５ｍＭ炭酸緩衝液）を、同様に経口接種した群を設けた。
（３）サンプル採取と解析
経口接種から１２及び２４時間後に、上記マウスから小腸粘膜を採取した。さらに、公知の手法（Harusato A, et al. Methods Mol Biol. 2016; 1422: 171-180.）に従って、２ｍＭのＥＤＴＡ，１．５ｍｇ／ｍＬのコラゲナーゼｔｙｐｅＩＶ存在下で、小腸粘膜から粘膜上皮層細胞及び粘膜固有層細胞を単離した。
（４）フローサイトメトリー解析
得られた細胞を、樹状細胞マーカー抗体（抗マウスＭＨＣクラスII（Ｉ−Ａ／Ｉ−Ｅ）抗体、ＣＤ１１ｂ抗体、ＣＤ１１ｃ抗体、及びＣＤ１０３抗体、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ社製）によって染色した。フローサイトメトリー解析（BD FACSVerseフローサイトメーター；BD Bioscience社製）により、各種樹状細胞群における、Ａｌｅｘａ６４７陽性細胞の割合を算出し、ＯＶＡの取込み細胞数を測定した。
（５）結果
図４Ｂ〜Ｅは、Ａに示す小腸粘膜上皮層と粘膜固有層に含まれるＭＨＣ II＋ＣＤ１１
ｂ＋細胞（ＭＨＣ II＋ＣＤ１１ｂ＋樹状細胞）、ＭＨＣ II＋ＣＤ１１ｂ＋ＣＤ１１ｃ＋ＣＤ１０３＋細胞（ＣＤ１０３＋樹状細胞）、ＭＨＣ II＋ＣＤ１１ｂ＋ＣＤ１１ｃ＋ＣＤ１０３−細胞（ＣＤ１０３−樹状細胞）のそれぞれの樹状細胞集団における、蛍光標色素標識ＯＶＡの取込みをヒストグラム解析した結果である。図４Ｂ〜Ｅに対応するサンプルを以下の表２に示す。【００３５】
【表２】
2020045155.tif 000004
【００３６】
また、図４Ｆ〜Ｈは、Ｆに示すＭＨＣ II＋ＣＤ１１ｂ＋樹状細胞と、さらにこの樹状細胞をＣＤ１１ｂ+、ＣＤ１０３＋樹状細胞とＣＤ１１ｂ+、ＣＤ１０３−樹状細胞に分けて、これら３種の樹状細胞それぞれにおける、蛍光色素標識ＯＶＡの取込み細胞数を棒グラフとして示した結果である。
図４Ｆ〜Ｈに示されるように、経口ワクチン接種から１２時間後では、３種全ての樹状細胞（ＭＨＣ II＋ＣＤ１１ｂ＋樹状細胞、ＣＤ１１ｂ+、ＣＤ１０３＋樹状細胞、及びＣＤ１１ｂ+、ＣＤ１０３−樹状細胞）において、ＯＶＡ単独経口接種に比較して、ＯＶＡ―ＳＦ１０ワクチン接種群の方が有意に蛍光色素標識ＯＶＡ取込み細胞数が増加していた。一方、経口投与から２４時間後では、いずれの細胞においても樹状細胞に取り込まれたＯＶＡシグナルが検出限界程度にまで減弱していた。
以上の結果から、抗原とＳＦ１０とを組み合わせて経口接種すると、小腸粘膜中の樹状細胞に抗原が効率的に取り込まれることが明らかとなった。これまで強力なアジュバントとして知られているＰｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）やＣｐＧなどが、樹状細胞を直接刺激して抗体産生を促進することを考えると、本実験で確認されたＳＦ１０のアジュバント作用は抗原運搬効果を促進するユニークなものと言える。なお、ＳＦ１０やＳＳＦの本となった肺サーファクタントのアジュバント効果においては、Ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）やＣｐＧなどのような樹状細胞への直接的刺激効果を示さないことが明らかになっており、安全性の高いアジュバントと言える（Mizuno D, et al. J Immunol, 176: 1122-1130, 2006）。消化管で抗原情報を認識した樹状細胞は、その後全身のリンパ節へ移動して、抗原特異的ＩｇＧ及びＩｇＡの産生を全身で可能にすると考えられている。
【実施例５】
【００３７】
［ＨＡｖ−ＳＦ１０ワクチン経口接種後の、全身リンパ節における抗原特異的ＩｇＧ及びＩｇＡの産生増加］
実施例３で、ＨＡｖ−ＳＦ１０の経鼻接種により消化管などでもＨＡｖ特異的ＩｇＡ産生量が促進されることが示された。そこで、本発明者らは、全身のリンパ節におけるリンパ球の抗原特異的ＩｇＧ及びＩｇＡ産生に、経口接種ＨＡｖ−ＳＦ１０ワクチンがどのような影響を及ぼすかを調べた。以下の（１）〜（４）に実験手順及び結果を示す。
（１）ＨＡｖ−ＳＦ１０ワクチンの経口接種
１μｇのＨＡｖを含むＨＡｖ−ＳＦ１０（ＳＳＦ中のリン脂質：ＨＡｖが１０：１（質量混合比））を作製して、マウス（体重約２０ｇ）に経口接種した（１μｇ ＨＡｖ／２００μＬ／匹）。なお、ＨＡｖ−ＳＦ１０ワクチンの調整では、ＨＡｖが比較的胃酸の影響を受けにくいため、炭酸緩衝液は使用していない。ＨＡｖ−ＳＦ１０ワクチン接種は、最初の投与から、３日後、１４日後、及び１７日後の合計４回、同量のＨＡv−ＳＦ１０を経口接種した（追加免疫）。また、コントロールとして、同様のスケジュールでＨＡを単独で経口接種した群を設けた。
（２）リンパ球の採取と培養
最終免疫（４回目のＨＡｖ−ＳＦ１０の接種）から１４日後に、肺、脾臓、頸部リンパ節、胸縦隔リンパ節、パイエル板、及び胃所属リンパ節からそれぞれリンパ球を採取した。ＨＡｖ抗原でコーティングしたプレートに、得られたリンパ球（１×１０５〜１×１０６個）を播種して３日間培養した。培養には、１μｇ／ｍＬのＲ８４８（Novus Biologicals社製）、１０ｎｇ／ｍＬのｒｍＩＬ−２（BioLegend社製）、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝液、１ｍＭのピルビン酸ナトリウム、１％非必須アミノ酸溶液、１４．３μＭの２−メルカプトエタノール、１０μｇ/ｍＬのゲンタマイシン、及び１０％の加熱不活性化胎児血清を含む、ＲＰＭＩ１６４０培養液を用いた。
（３）免疫染色
ＨＲＰ標識抗ＩｇＧ抗体又はＨＲＰ標識抗ＩｇＡ抗体（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社製）を用いて、培養リンパ球の免疫染色を行い、ＥＬＩＳｐｏｔアッセイを行った。細胞数の測定は、ＬＵＮＡ−IIＴＭ  Ａｕｔｏｍａｔｅｄ  Ｃｅｌｌ  Ｃｏｕｎｔｅｒ（Logos Biosystems社製）を用いて実施した。
（４）結果
図５Ａ〜Ｆの左側に、各臓器由来のリンパ球の染色像（ＩｇＡ及びＩｇＧ産生スポット写真）を示す（Ａ：肺、Ｂ：脾臓、Ｃ：頸部リンパ節、Ｄ：胸縦隔リンパ節、Ｅ：パイエル板、Ｆ：胃所属リンパ節）。また、図５Ａ〜Ｆの右側のグラフに、１×１０６個のリンパ球当たりのＩｇＡ又はＩｇＧ産生細胞数（ＩｇＡ：○、ＩｇＧ：□、塗りつぶしシンボルはそれぞれの平均値）を示す（Ｎ．Ｄ．：not-detected、＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１）。
ＨＡｖ単独投与群では、頸部リンパ節と脾臓由来のリンパ球においてＩｇＧ産生スポットが極わずかに検出されたが、それ以外の臓器由来のリンパ球においてスポットは検出されなかった。これに対して、ＨＡｖ−ＳＦ１０経口接種群では、全ての臓器由来のリンパ球において、多数のＩｇＧ及びＩｇＡ産生スポットが検出された。これらの結果から、ＳＦ１０と抗原とを組み合わせて経口接種すると、全身の免疫応答が効果的に誘導され、抗原特異的ＩｇＧ及びＩｇＡの産生が強く促進されることが明らかとなった。
【実施例６】
【００３８】
［脾臓細胞のサイトカイン分泌に及ぼすＨＡｖ−ＳＦ１０の影響］
実施例５で認められた、ＨＡｖ−ＳＦ１０経口接種による抗体産生促進作用のメカニズムを探るために、ＨＡｖ−ＳＦ１０経口接種後の全身各組織のＨＡｖ特異的ＩｇＧ及びＩｇＡ産生と、脾臓細胞のサイトカイン分泌の変化を調べた。以下の（１）〜（４）に実験手順及び結果を示す。
（１）ワクチン接種
ＨＡｖ単独又はＨＡｖ−ＳＦ１０を、マウス（体重約２０ｇ）に経鼻、経口接種した。比較対照としてＨＡｖの皮下接種群を設けた。投与スケジュールは、実施例５における経口接種と同様であった（０日、３日目、１４日目、及び１７日目の計４回）。また、コントロールとして無処置群を設けた。それぞれの群についてｎ＝６で実験を行った。
（２）脾臓細胞の培養とサイトカインの測定
最終免疫から２週間後に、各投与群のマウスから脾臓細胞を採取し、１０μｇ／ｍＬのＨＡ存在下又は非存在下で３日間培養した。培養後に、培地中のＩＬ−２、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−１７Ａ、及びＩＬ−２２の濃度をLEGENDplexＴＭ（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ社製）にて測定した。以下、ＩＬ−２及びＩＦＮ−γを「Ｔｈ１サイトカイン」、ＩＬ−４及びＩＬ−５を「Ｔｈ２サイトカイン」、ＩＬ−１７Ａ及びＩＬ−２２を「Ｔｈ１７サイトカイン」とそれぞれ称する場合がある。
（３）ＨＡｖ特異的抗体産生量の測定
上記（１）の各免疫群のマウスから、血液、気管支肺胞洗浄液、鼻腔洗浄液、及び胃抽出液、糞便抽出液を採取し、ＨＡｖ特異的ＩｇＧ及びＩｇＡの濃度をこれまで記載の報告（Mizuno D, et al. J Immunol, 176: 1122-1130, 2006）に従って、ＥＬＩＳＡ（Enzyme-linked immunosorbent assay）にて測定した。
（４）結果
上記（２）の結果を図６に示す。調整したマウス脾臓細胞では、ＨＡｖ刺激有の培養条件下でＴｈ１、Ｔｈ２，Ｔｈ１７サイトカインの分泌量の増加が、いずれの免疫系においても認められた。これらの中で、ＨＡｖ単独免疫の場合、皮下投与群（ｓ．ｃ．）において、経鼻接種群（ｉ．ｎ．）又は経口接種群（ｐ．ｏ．）と比較して、Ｔｈ２及びＴｈ１サイトカインの産生が強く促進されることが明らかとなった。一方、ＨＡｖ−ＳＦ１０ワクチンを用いた場合、経口接種群では経鼻接種群と比較して、ＴＨ１７サイトカインとＩＬ−２の分泌が強く増加することが明らかとなった。特に、ＩＬ−１７Ａについては、ＨＡｖ−ＳＦ１０ワクチン経口接種群における分泌量が経鼻接種群と比較して６．６倍も高く、有意な分泌促進効果が明らかとなった。ＩＬ−１７Ａは粘膜のＩｇＡ分泌に関与することが報告されている（Jaffar Z, et al. Eur J Immunol. 2009; 39: 3307-3314.； Hirota K, et al. Nat Immunol. 2013; 14: 372-379.）が、ＨＡｖ−ＳＦ１０経口ワクチン接種は、ＩＬ−１７Ａ分泌増加を誘導するユニークなワクチンと推定された。ＨＡｖ−ＳＦ１０経口ワクチン接種の特に高いＩｇＡ産生促進作用は、このようなＩＬ−１７Ａ分泌増加を介したものである可能性が考えられる。またＨＡｖ−ＳＦ１０ワクチンの経口接種では、Ｔｈ１７以外に高いＩＬ−２（Ｔｈ１サイトカイン）産生と、中等度のＩＬ−５（Ｔｈ２サイトカイン）産生が認められ、これらの結果が、以下に示す全身での高いＨＡｖ特異的ＩｇＡとＩｇＧ誘導に現れていると推定された。
上記（３）の結果を図７Ａ〜Ｅに示す（Ａ：血液、Ｂ：気管支肺胞洗浄液、Ｃ：鼻腔洗浄液、Ｄ：胃抽出液、Ｅ：糞便抽出液）。グラフの縦軸は、サンプル中のＨＡｖ特異的抗体濃度（白カラム：ＩｇＡ、黒カラム：ＩｇＧ）を示す（ｍｅａｎ＋ＳＥＭ、＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１）。また、グラフの横軸は各接種ルートの異なる免疫群を示す（ｓ．ｃ．：皮下接種群、ｉ．ｎ．：経鼻接種群、ｐ．ｏ．：経口接種群）。
図７の「ｓ．ｃ．」のデータを見ると分かるように、ＨＡｖの皮下接種群（日本での通常行われているインフルエンザワクチンの投与方法）では、ＩｇＧ産生のみが誘導され、ＩｇＡ抗体はほとんど産生誘導されていなかった。これに対して、ＨＡｖ−ＳＦ１０ワクチンの経口接種群（ｐ．ｏ．）では、全ての検体において抗原特異的ＩｇＧ及びＩｇＡの産生が強く促進された。血液検体においては、ＨＡｖ皮下投与群（ｓ．ｃ．）と比較して、ＨＡｖ−ＳＦ１０ワクチンの経口接種群（ｐ．ｏ．）では、ＩｇＧで約６．７倍、ＩｇＡで約１８０倍に増加していた。ＩｇＡは、病原体の侵入経路となる粘膜で分泌され、交叉免疫性の強いことが報告されている（Tamura SI, et al. Eur J Immunol. 1992; 22: 477-481.）。このことから、本実施例によって示された、ＨＡｖ−ＳＦ１０ワクチンの経口接種によってＩｇＡ抗体の産生が促進されるという結果は、生体防御の観点から優れた特徴を有することを示唆している。
また、ＨＡｖ−ＳＦ１０ワクチンの経鼻接種では、血液（Ａ）における抗原特異的ＩｇＧ及びＩｇＡの産生量はＩｇＧの方が約６．７倍高く産生されたが、これに対して気管支肺胞洗浄液（Ｂ）、鼻腔洗浄液（Ｃ）、及び胃抽出液（Ｄ）等の粘膜分泌液では、逆にＩｇＡの方がＩｇＧに比べて１０倍から２００倍より強く産生促進されることが明らかとなった。ＨＡｖ−ＳＦ１０ワクチンの経鼻接種群と経口接種群を比較すると、全ての検体において経口接種の方が強いＩｇＧ及びＩｇＡ抗体産生誘導効果を示し、この違いは気管支肺胞洗浄液で最も大きく、経鼻接種群に比較してＩｇＡで約７００倍、ＩｇＧで約２００倍の強い抗体産生を示した。なお、血液（Ａ）では、経口接種は経鼻接種よりも、ＩｇＧ及びＩｇＡ量は共に約２０倍の高い抗体産生量を示した。
以上のように実施例５及び６の結果から、ＨＡｖ−ＳＦ１０ワクチンの経口接種は全身の様々な免疫器官においてＨＡｖ特異的ＩｇＧ及びＩｇＡの産生を強く誘導することが明らかとなった。特に全身の粘膜分泌液における、抗原特異的ＩｇＡ産生の強い誘導は、未だ作用機序は不明であるが、脾臓細胞におけるＨＡｖ−ＳＦ１０の強いＩＬ−１７Ａ分泌促進作用が関与している可能性が示唆された。
【実施例７】
【００３９】
［ＯＶＭ−ＳＦ１０治療用経口免疫寛容誘導ワクチン接種による免疫寛容誘導］
ＯＶＭは鶏卵中で最もアレルゲン性の高い成分であることが知られている。そこで、ＯＶＭ経皮感作アレルギーマウスを用いて、ＯＶＭとＳＦ１０との複合体（以下、「ＯＶＭ−ＳＦ１０」）治療用ワクチンの経口接種による免疫寛容誘導効果を、アナフィラキシー抑制効果を指標に調べた。
（１）ＯＶＭ−ＳＦ１０治療用経口免疫寛容誘導ワクチンの作製
実施例４の（１）の手法に沿って、マウス１匹（体重約２０ｇ）当たりに接種する種々の濃度のＯＶＭ（１μｇ、０．１μｇ、０．０１μｇ）を含む、ＯＶＭ−ＳＦ１０経口免疫寛容誘導ワクチンを作製した（以下、それぞれ「ＯＶＭ（１μｇ）−ＳＦ１０」、「ＯＶＭ（０．１μｇ）−ＳＦ１０」、及び「ＯＶＭ（０．０１μｇ）−ＳＦ１０」と称する）。なお、治療用経口免疫寛容誘導ワクチンの作成にあたっては、実施例４と作成方法は同じであるが、抗原量が微量である点に特徴を示す。具体的には、ＯＶＭ（１μｇ、０．１μｇ、又は０．０１μｇ）と、その十倍量のリン脂質（１０μｇ、１μｇ、又は０．１μｇ）を含むＳＳＦとを混合して凍結乾燥した。経口投与直前に１．０％ＣＶＰ／生理食塩水（１００μＬ）を加えて溶解し、さらに、等量の５０ｍＭの炭酸緩衝液（ｐＨ９．７）を加えて、１匹に経口接種するＯＶＭ−ＳＦ１０ワクチン溶液（２００μＬ）を作製した。この一連の操作により、１匹当たりに接種する治療用経口ワクチン溶液２００μＬには、０．０１〜１μｇのＯＶＭ，０．５％ＣＶＰ、２５ｍＭ炭酸緩衝液が含まれた経口免疫寛容誘導ワクチンが作成される。
（２）ＯＶＭ−ＳＦ１０治療用経口免疫寛容誘導ワクチンの接種
予めアナフィラキシー誘発状態にした経皮感作ＯＶＭアレルギーマウスを２時間絶食させた後に、治療用ＯＶＭ−ＳＦ１０免疫寛容誘導ワクチン（２００μＬ）を経口接種した。ワクチン接種は、最初の投与から、３日後、１４日後、及び１７日後に同量の治療用免疫寛容誘導ＯＶＭ−ＳＦ１０ワクチンを経口接種（合計４回接種）した。また、対照群として、ワクチン非投与群（感作のみ、経口ワクチン無し）を設けた。
（３）ＯＶＭによる経口チャレンジアナフィラキシー誘発試験
実施例２の手順に沿って、チャレンジ試験前の絶食とＡＳＡ投与を行った後に、経口アレルゲンチャレンジ試験を行った。具体的には、最終免疫（４回目のＯＶＭ−ＳＦ１０ワクチンの投与）から１４日後のマウスを絶食した後、ＡＳＡを前投与し、その後ＯＶＭの経口チャレンジを実施し（１０ｍｇＯＶＭ／２００μＬ／匹）、１２０分間に渡って直腸温をモニターした。また、コントロールとして、経皮感作していないマウス（無感作マウス）でも、同様にＯＶＭを経口チャレンジして直腸温のモニターを実施した。
（４）結果
得られたデータは箱ひげ図として図８に示した。各投与群と図８における表記は、以下の表３の通りである。また、図８中の太い実線は「感作のみ（ワクチン無し）」群の直腸温の中央値を示し、太い点線は「感作＋ワクチン０．０１μｇ」群の直腸温の中央値をそれぞれ示す。【００４０】
【表３】
2020045155.tif 000005
【００４１】
図８に示されるように、無感作マウス群では、ＯＶＭチャレンジ後の直腸温変化は認められず、アナフィラキシーは誘発されないことが確認された。これに対して、「感作のみ（ワクチン無し）」群（太い実線）では、ＯＶＭチャレンジから３０分後に１.７度を超える直腸温の低下のピークが認められ、アナフィラキシーを発症したことが明らかとなった。これらの結果は、本発明のＯＶＭ経皮感作アレルギーマウスが、ＯＶＭに対する即時型アレルギー症状を呈するモデルマウスとして使用できることを裏付けるものである。
一方、治療用経口免疫寛容誘導ワクチン投与群では、「感作＋経口ワクチン０．０１μｇ」群において、ＯＶＭチャレンジ後の直腸温の低下は認められず、アナフィラキシーの発症がほぼ完全に抑制されることが確認された。また、「感作＋経口ワクチン０．１μｇ」群及び「感作＋経口ワクチン１μｇ」群では、ＯＶＭ投与後にわずかな直腸温の低下が認められ、「感作＋経口ワクチン０．０１μｇ」群に比べると、免疫寛容誘導効果において若干劣る傾向が示された。
以上のことから、ＯＶＭ経皮感作アレルギーマウスに、治療用ＯＶＭ−ＳＦ１０免疫寛容誘導ワクチンを経口接種すると、免疫寛容を誘導すると考えられる。また、治療用ＯＶＭ−ＳＦ１０経口免疫寛容誘導ワクチンの作用は、ＯＶＭ含有量が微量の場合により強い免疫寛容誘導効果を示すことが示された。
【実施例８】
【００４２】
［ＯＶＭ−ＳＦ１０治療用経口免疫寛容誘導ワクチンにおける、最適ＯＶＭ含有量の検討］
実施例７の結果から、治療用ＯＶＭ−ＳＦ１０免疫寛容誘導ワクチン効果（免疫寛容誘導作用）は、そのＯＶＭ含有量に依存して免疫寛容誘導効果が異なることが示唆された。そこで、実施例８では、治療用ＯＶＭ−ＳＦ１０経口免疫寛容誘導ワクチンにおける最適ＯＶＭ含有量を検討した。
実施例７の手順に沿って、０．００１μｇ〜１μｇのＯＶＭを含む治療用ＯＶＭ−ＳＦ１０免疫寛容誘導ワクチンを作製した（以下、それぞれ「ＯＶＭ（１μｇ）−ＳＦ１０」、「ＯＶＭ（０．１μｇ）−ＳＦ１０」、「ＯＶＭ（０．０１μｇ）−ＳＦ１０」、及び「ＯＶＭ（０．００１μｇ）−ＳＦ１０」と称する）。次に、それらを経皮感作ＯＶＭアレルギーマウス（体重約２０ｇ）に経口接種し、１４日後にＯＶＭによる経口チャレンジ試験を行った。チャレンジ試験に先立って、マウスの絶食、ＡＳＡ投与は、実施例２に従って実施した。
ＯＶＭチャレンジ投与後約３０分の直腸温の変化の箱ひげグラフを図９に示す。直腸温の平均値及び中央値は、ＯＶＭ（０．０１μｇ）−ＳＦ１０経口免疫寛容誘導ワクチン投与群が最も高く、アナフィラキシー抑制効果が見られたことから、ワクチンに含まれるＯＶＭの最適含有量は０．０１μｇであることが示された。通常の経口チャレンジ試験に使用されるＯＶＭ量が１０ｍｇ/匹であることを考えると、チャレンジ試験に使用される抗原（ＯＶＭ）の１／１０，０００，０００という極めて微量な抗原で、ＳＦ１０存在下に免疫寛容が誘導できることが明らかとなった。
【実施例９】
【００４３】
［微量ＯＶＭのアナフィラキシー誘発試験］
実施例７及び８により、０．０１μｇのＯＶＭをＳＦ１０と組み合わせた経口免疫寛容誘導ワクチンを経口接種したマウスでは、ＯＶＭに対する免疫寛容が成立することが明らかとなった。そこで、実施例９では、経口免疫寛容を誘導した０．０１μｇのＯＶＭを、ＳＦ１０アジュバント非存在下に単独経口接種した場合、アナフィラキシーが誘導され得るか否かを調べた。即ちＯＶＭとＳＦ１０の複合体からＯＶＭが遊離して、アナフィラキシーを誘発するリスクの有無の検討である。
具体的には、経皮感作ＯＶＭアレルギーモデルマウス（体重約２０ｇ、ｎ＝１０）を、実施例２の手順に沿って、チャレンジ試験前の絶食とＡＳＡ投与を行った後に、経口ＯＶＭチャレンジ試験を実施した。経口ＯＶＭチャレンジ試験は、０．０１μｇのＯＶＭを１回経口チャレンジし、６０分間の直腸温の変化を調べた。図１０の箱ひげグラフに示すように、０．０１μｇのＯＶＭ投与後の直腸温は、試験した全てのマウスにおいて低下することは無かった。このことから、経皮感作ＯＶＭアレルギーマウスであっても、０．０１μｇの微量ＯＶＭの経口投与では、アナフィラキシーは誘導されないことが明らかとなった。
実施例７〜９の結果を考えあわせると、アナフィラキシー誘発準備状態にあるマウスであっても、アレルゲン単独の経口チャレンジでは免疫応答（アナフィラキシー）を誘導しない微量のＯＶＭとＳＦ１０アジュバントを組み合わせ、これを治療用ＯＶＭ−ＳＦ１０経口免疫寛容誘導ワクチンとして経口接種することにより、免疫寛容を成立させることが可能であることが示された。また、微量抗原とＳＦ１０との複合体から成る治療用経口ワクチンの場合、例え抗原が複合体から遊離してもアナフィラキシー発症の危険性が低く、しかも効果的な免疫寛容を誘導することが示された。アレルギー治療・予防剤として優れた作用を有することを示唆している。
【実施例１０】
【００４４】
［カゼイン−ＳＦ１０複合体免疫寛容誘導ワクチンの経口接種による、牛乳アレルギーの予防］
牛乳アレルギーは免疫寛容の誘導が困難で、経口免疫療法の過程でアナフィラキシーによる医療事故も多く報告されている。そこで本発明者らは、カゼインとＳＦ１０との複合体（以下、「カゼイン−ＳＦ１０」と称する場合がある）を作製して、予防用カゼイン−ＳＦ１０経口免疫寛容ワクチンによるアナフィラキシーの発症抑制予防効果を調べた。なお、予防用経口免疫寛容誘導ワクチンの場合、アレルギーの無い状態（アナフィラキシーの発症リスクの無い状態）時に接種することから、用いるアレルゲン量は実施例７に記載の治療用経口免疫寛容誘導剤に比べて多い方が効果的であり、含有アレルゲン量が多くても副反応のリスクは少ないと考えられる。
以下の（１）〜（４）に実験手順及び結果を示す。
（１）予防用カゼイン−ＳＦ１０経口免疫寛容誘導ワクチンの作製
実施例４の手法に沿って、予防用カゼイン−ＳＦ１０免疫寛容誘導ワクチンを作製した。具体的には、１０ｍｇのカゼイン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社製）及び公知の手法で作成したＳＳＦ（Kimoto T, et al. Influenza and Other Resp. Viruses 7(6):1218-1226, 2013.；Mizuno D, et al. Vaccine 34(16): 1881-1888, 2016.；Kim H, et al. PLOS ONE 13(1):e0191133, 2018.）１００ｍｇを混合して凍結乾燥し、カゼインとＳＳＦとの複合体（カゼイン−ＳＳＦ）を作製した。上記混合の際には、ＳＳＦ中のリン脂質：カゼインが１０：１（質量混合比）となるように調整した。経口投与直前に、凍結乾燥した１．１ｍｇのカゼイン−ＳＳＦに１００ｍＬの１．０％ＣＶＰ（ハイビスワコー１０４、富士フィルム和光純薬社製）／生理食塩水を加えて均一に溶解し、さらに、５０ｍＭの炭酸緩衝液（ｐＨ９．７）等量を加えて最終の予防用経口免疫寛容誘導ワクチン溶液（２００ｍＬ）を調整した。この一連の操作により、１匹当たり経口接種する予防用免疫寛容誘導ワクチン溶液２００μＬには、１μｇのカゼイン，０．５％ＣＶＰ、２５ｍＭ炭酸緩衝液が含まれる。
（２）予防用カゼイン−ＳＦ１０免疫寛容誘導剤の接種
実施例４の手法に沿って、健常マウス（Ｂａｌｂ／ｃマウス、体重約２０ｇ）に予防用カゼイン−ＳＦ１０ワクチン溶液２００μＬを経口接種し、さらに、その３日後に同量のカゼイン−ＳＦ１０ワクチンを経口接種した（合計２回接種）。最終免疫から１ヶ月後のマウスを、以下（３）の実験に供した。また、コントロールとして、カゼイン−ＳＦ１０免疫寛容誘導ワクチンの非投与群を設けた。さらに、予防用カゼイン−ＳＦ１０経口免疫寛容誘導ワクチンの接種群と予防効果を比較するために、カゼイン単独の皮下注射（１μｇのカゼイン／１００μＬの生理食塩水；２回接種）群（既知の皮下免疫療法群）を設けた。最終免疫から１ヶ月後の免疫マウスを、以下（３）の実験に供した。
（３）カゼインの経皮感作
実施例１の手法に沿って、上記（２）のマウスに対するカゼインの経皮感作を行った。具体的には、マウスの背中に１回当たりカゼイン（１ｍｇ/１００μＬ）水溶液を週５回、２週間に渡って塗布し（計１０回塗布）、カゼインの経皮感作を行った。塗布感作から１ヶ月後に、以下のカゼイン腹腔内チャレンジ試験を行った。なお、このカゼインの経皮感作条件で、アナフィラキシー誘発状態になっていることは予め確認してある。
（４）カゼインの腹腔内チャレンジによるアナフィラキシー誘発試験
上記（３）のマウスに、カゼインを腹腔内投与して（１ｍｇ／匹）、その後１００分間の直腸温をモニタリングした（ｎ＝４〜５）。アレルゲンの腹腔内投与、あるいは血管内投与によるアナフィラキシーの誘発は、アナフィラキシー誘発試験の中でも最も重症で激烈な免疫反応を発現する。予防用ワクチン接種の場合、経皮アレルゲン感作を含む全てのアレルゲン感作、例えば血管内感作の可能性をも考慮して、最も重度なアナフィラキシーに対しても予防効果を示すことが期待される。このような背景から、予防用カゼイン−ＳＦ１０免疫寛容誘導ワクチンの接種効果は、カゼインの腹腔内チャレンジによるアナフィラキシー誘発抑制試験で評価した。
（５）結果
結果を図１１及び１２に示す。図１１及び１２における各投与群の表記は、以下の表４の通りである。【００４５】
【表４】
2020045155.tif 000006
【００４６】
図１１及び１２の「経皮感作あり、ワクチン接種無しの平均」群（太い点線表示）に示されるように、ワクチンの前投与なしにカゼインの経皮感作のみを行った群（５−４例のマウスの平均値）においては、カゼインの腹腔内チャレンジから約３０−４０分をピークに２．８度の著しい直腸温の低下が認められた。
また、図１１（Ｂ）では、「皮下免疫後、経皮感作した群の個別データ」（細い実践表示）に示されるように、カゼイン皮下注射（皮下免疫療法に相当）の前投与を行った後にカゼイン経皮感作を行った群では、１例のみ腹腔内チャレンジ試験後の直腸温低下の改善が見られたが、他の４例ではむしろ顕著に直腸温が低下する増悪傾向が明らかとなった。これらの結果は、従来の皮下免疫療法は、牛乳アレルギー発症を予防する効果において、更なる検討が必要であることを示している。
一方、図１２に示されるように、予防用カゼイン−ＳＦ１０経口免疫寛容誘導ワクチンの接種後にカゼインの経皮感作を行った群（細い実践表示）では、４例のマウス全てにおいて、カゼインの腹腔内チャレンジを実施したのも関わらず直腸温の顕著な低下は認められなかった。これらの結果は、予防用カゼイン−ＳＦ１０経口免疫寛容誘導ワクチン接種がカゼインアレルギーの発症予防に効果的であることを示している。
【産業上の利用可能性】
【００４７】
本発明の免疫寛容誘導剤は、近年増加しているアレルギー性疾患の根治治療に使用することができる他、アレルギー性疾患の予防にも使用することができる。
【図１】
2020045155.tif 000007
【図２】
2020045155.tif 000008
【図３】
2020045155.tif 000009
【図４】
2020045155.tif 000010
【図５】
2020045155.tif 000011
【図６】
2020045155.tif 000012
【図７】
2020045155.tif 000013
【図８】
2020045155.tif 000014
【図９】
2020045155.tif 000015
【図１０】
2020045155.tif 000016
【図１１】
2020045155.tif 000017
【図１２】
2020045155.tif 000018
【国際調査報告】
2020045155.tif 000019
2020045155.tif 000020