(57)【要約】  てんかん焦点の外科的切除は根治療法であるが、切除できない部位に焦点が存在する場合等は根治術が適用できないことがある。また、脳冷却装置の使用は外科的介入が必須であるため、患者にとって心理的障壁が高いという点は避けられない。そこで本発明の課題は、てんかん焦点を切除すること無く、かつ脳冷却装置を用いずに焦点性てんかん発作の抑制又は治療が可能な薬剤を提供することを課題とする。  イシリンを有効成分とする焦点性てんかん発作の抑制又は治療剤とする。かかる焦点性てんかん発作の抑制又は治療剤は、イシリンを１．０〜５．０ｍＭ含有することや、薬学的に許容される添加物を含むことが好ましい。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
イシリンを有効成分とする焦点性てんかん発作の抑制又は治療剤。
【請求項２】
ＴＲＰＡ１アンタゴニストを含むことを特徴とする請求項１記載の焦点性てんかん発作の抑制又は治療剤。
【請求項３】
イシリンを１．０〜５．０ｍＭ含有することを特徴とする請求項１又は２記載の焦点性てんかん発作の抑制又は治療剤。
【請求項４】
薬学的に許容される添加物を含むことを特徴とする請求項１〜３のいずれか記載の焦点性てんかん発作の抑制又は治療剤。
【請求項５】
イシリンを有効成分とする焦点性てんかん発作の予防剤。
【請求項６】
ＴＲＰＡ１アンタゴニストを含むことを特徴とする請求項５記載の焦点性てんかん発作の予防剤。
【請求項７】
イシリンを１．０〜５．０ｍＭ含有することを特徴とする請求項５又は６記載の焦点性てんかん発作の予防剤。
【請求項８】
薬学的に許容される添加物を含むことを特徴とする請求項５〜７のいずれか記載の焦点性てんかん発作の予防剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はてんかん発作の抑制又は治療剤や、てんかん発作の予防剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
てんかん患者の生涯有病率は１００人に１人程度と中枢疾患の中でも多い。このうち、複数の抗てんかん薬を使用しても発作が抑制できない難治性てんかん患者は約３割にのぼり、これらの患者は治療薬を変えてもほとんど有効ではない。てんかん焦点の外科的切除は根治療法であるが、切除できない部位に焦点が存在する場合等は根治術が適用できないことがある。【０００３】
このような状況の中、本発明者らは難治性てんかん患者のための治療装置として慢性埋め込み型の局所冷却デバイスの開発を進めてきた。たとえば、可撓性の材料からなる袋状体容器又は熱伝導性の高い金属材料からなる、脳表部を冷却するための薄型容器に温度検知センサが付設されてなり脳表部に近接して埋設される冷却部と、冷却水が滞留し冷却器が付設されたリザーバとポンプとを備えた放熱部等を備え、前記冷却部が脳表部に接して頭蓋内に設置され、脳表部温度が１５〜２５℃の温度範囲になるように制御を行うてんかん発作抑制装置（特許文献１参照）を提案した。また、冷却水流通部を付設したペルチエ素子をケーシング内に収容し温度検知センサを付設してなる体内要冷却箇所に埋設される冷却部と、冷却水循環動作を行うポンプ及び冷却水が滞留するリザーバを備えた放熱部等を備え、少なくとも前記冷却部と連結接続部と制御部とが体内に埋設された局部冷却装置（特許文献２参照）を提案した。【０００４】
さらに、慢性埋め込み型の局所冷却デバイスの効果を裏付ける基礎、臨床研究を進めてきた。局所脳冷却の作用機序は、神経伝達物質の放出量の抑制や、電位依存性ナトリウム／カリウムチャンネルに対する機能抑制又は遅延効果が報告されているが、温度情報自体がどのような経路を介して上記のような効果を引き出すのかについては不明な点が多く、分子生物学的及び生理学的双方のアプローチによる機序解明が必要である。さらに、将来の実臨床において、脳冷却デバイス使用は外科的介入が必須であるため、患者にとって心理的障壁が高いという点は避けられない。【０００５】
ところで、近年、所定の温度帯で活性化されるＴＲＰ（ｔｒａｎｓｉｅｎｔ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ）チャンネルの機能の生理学的解析が進められている。こうしたなか、一過性受容体電位メラスタチン８チャンネル（ｔｒａｎｓｉｅｎｔ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ｍｅｌａｓｔａｔｉｎ  ８：ＴＲＰＭ８）は８〜２８℃で活性化するチャンネルであり、イシリン等のＴＰＲＭ８アゴニストによって活性化されることや、イシリンがＴＲＰＭ８チャンネルに対して高い親和性を有する冷却化合物であり、一次体性感覚野の神経において脱分極を抑制することが知られている（非特許文献１〜３参照）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開２０１１−０８３３１６号公報
【特許文献２】特開２０１１−０８３３１５号公報
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Bautista DM, Siemens J, Glazer JM, et al. Nature 2007;448:204-208.
【非特許文献２】McKemy DD NW, Julius D. Nature 2002;416:52-56.
【非特許文献３】Pezzoli M, Elhamdani A, Camacho S, et al. Sci Rep 2014;4:6825.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
上述特許文献１、２により脳冷却装置により脳を冷却することでてんかん発作を抑制することができるが、脳冷却装置の使用は外科的介入が必須であるため、患者にとって心理的障壁が高いという点は避けられない。また、上記非特許文献１〜３においてイシリンが一次体性感覚野の神経において脱分極を抑制することは知られているものの、焦点性てんかん（focal epilepsy）に着目した研究は進んでいない。そこで、本発明の課題は、てんかん焦点を切除すること無く、かつ脳冷却装置を用いずに焦点性てんかん発作の抑制又は治療が可能な薬剤を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、冷却によるてんかん発作抑制効果の経路に温度依存的な分子的基盤があると考え、その分子基盤に対して薬物による介入が立証できれば、冷却装置を用いた局所脳冷却と同等の効果を持つ“薬物による擬似的局所脳冷却技術”を確立することができ、「治療はより低侵襲に」という患者側のニーズにあった治療法を提案できるのではないかと考えた。また、本発明者らによる先行研究により、ペニシリンＧ（ＰＧ）により誘発されたてんかん性（ｅｐｉｌｅｐｔｉｆｏｒｍ）異常脳波は局所脳冷却（１５℃）により消失することを確認した。そこで、その局所脳冷却の分子的機序を解明する手掛かりとして、温度感受性ＴＲＰチャネルのなかでも１５℃の冷却条件下で活性化するＴＰＲＭ８に着目した。【００１０】
上記ＴＰＲＭ８のアゴニストのなかでも、特にイシリン（Ｉｃｉｌｉｎ）に着目し、難治性てんかん患者に対する新たな作用による抗てんかん薬の開発を目的として、イシリンによるＴＲＰＭ８活性化がてんかん性異常脳波（Ｅｐｉｌｅｐｔｉｆｏｒｍ  ｄｉｓｃｈａｒｇｅ：ＥＤ）の消失及び抑制に寄与することかどうかを調べた。その結果、イシリンが用量依存的にてんかん性異常脳波（ＥＤ）の消失及び抑制に寄与することを見出し、本発明を完成した。【００１１】
すなわち、本発明は、以下のとおりである。
〔１〕イシリンを有効成分とする焦点性てんかん発作の抑制又は治療剤。
〔２〕ＴＲＰＡ１（Ｔｒａｎｓｉｅｎｔ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  Ａｎｋｙｒｉｎ１）アンタゴニストを含むことを特徴とする上記〔１〕記載の焦点性てんかん発作の抑制又は治療剤。
〔３〕イシリンを１．０〜５．０ｍＭ含有することを特徴とする上記〔１〕又は〔２〕記載の焦点性てんかん発作の抑制又は治療剤。
〔４〕薬学的に許容される添加物を含むことを特徴とする上記〔１〕〜〔３〕のいずれか記載の焦点性てんかん発作の抑制又は治療剤。
〔５〕イシリンを有効成分とする焦点性てんかん発作の予防剤。
〔６〕ＴＲＰＡ１アンタゴニストを含むことを特徴とする上記〔５〕記載の焦点性てんかん発作の予防剤。
〔７〕イシリンを１．０〜５．０ｍＭ含有することを特徴とする上記〔５〕又は〔６〕記載の焦点性てんかん発作の予防剤。
〔８〕薬学的に許容される添加物を含むことを特徴とする上記〔５〕〜〔７〕のいずれか記載の焦点性てんかん発作の予防剤。
【発明の効果】
【００１２】
本発明により、てんかん焦点を切除すること無く、かつ脳冷却装置を用いずに焦点性てんかん発作の抑制又は治療が可能となる。さらに、焦点性てんかん発作の予防が可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】実施例１において、Ａ−ＤはそれぞれＰＧの左体性感覚皮質内投与後、及び１％ＤＭＳＯ、又は０．３、１．０、３．０ｍＭのイシリンを含有する１％ＤＭＳＯ投与前後におけるＥＣｏＧ（ｍＶ）（左上段）、皮質温度（℃）（左下段）を示す。Ａ−Ｄそれぞれの右側は、各濃度のイシリンを含有する１％ＤＭＳＯ注入前後の振幅の一部を拡大したものである。
【図２】実施例１において、ＰＧの左体性感覚皮質内投与後、１％ＤＭＳＯ、又は０．３、１．０、３．０ｍＭのイシリンを含有する１％ＤＭＳＯ投与の前後におけるスパイク振幅を調べた結果を示す図である。それぞれの濃度において左のカラムが投与前、右のカラムが投与後である（以下の図３、図４も同様）。
【図３】実施例１において、ＰＧの左体性感覚皮質内投与後、１％ＤＭＳＯ、又は０．３、１．０、３．０ｍＭのイシリンを含有する１％ＤＭＳＯ投与の前後におけるスパイク持続時間を調べた結果を示す図である。
【図４】実施例１において、ＰＧの左体性感覚皮質内投与後、１％ＤＭＳＯ、又は０．３、１．０、３．０ｍＭのイシリンを含有する１％ＤＭＳＯ投与の前後における発火率を調べた結果を示す図である。
【図５】実施例１において、ＰＧの左体性感覚皮質内投与後、１％ＤＭＳＯ、又は０．３、１．０、３．０ｍＭのイシリンを含有する１％ＤＭＳＯ投与の前後におけるパワー密度を調べた結果を示す図である。それぞれの濃度において、左のカラムが基礎律動（Ｂａｓａｌ  ａｃｔｉｖｉｔｙ）、中央のカラムが投与前、右のカラムが投与後である。
【図６】実施例２において、ＰＧの左体性感覚皮質内投与後、３．０ｍＭのイシリンを含有する１％ＤＭＳＯ投与前後におけるＥＣｏＧ（ｍＶ）（上段）、皮質温度（℃）（下段）を示す。
【図７】実施例２において、ＰＧの左体性感覚皮質内投与後、３．０ｍＭのイシリン及び３．０ｍＭ  ＡＭＴＢを含有する１％ＤＭＳＯ投与前後におけるＥＣｏＧ（ｍＶ）（上段）、皮質温度（℃）（下段）を示す。
【図８】実施例２において、ＰＧの左体性感覚皮質内投与後、３．０ｍＭのイシリンを含有する１％ＤＭＳＯ、又は３．０ｍＭのイシリン及び３．０ｍＭ  ＡＭＴＢを含有する１％ＤＭＳＯ投与の前後におけるスパイク振幅を調べた結果を示す図である。それぞれの濃度において左のカラムが投与前、右のカラムが投与後である（以下の図９、図１０も同様）。
【図９】実施例２において、ＰＧの左体性感覚皮質内投与後、３．０ｍＭのイシリンを含有する１％ＤＭＳＯ、又は３．０ｍＭのイシリン及び３．０ｍＭ  ＡＭＴＢを含有する１％ＤＭＳＯ投与の前後におけるスパイク持続時間を調べた結果を示す図である。
【図１０】実施例２において、ＰＧの左体性感覚皮質内投与後、３．０ｍＭのイシリンを含有する１％ＤＭＳＯ、又は３．０ｍＭのイシリン及び３．０ｍＭ  ＡＭＴＢを含有する１％ＤＭＳＯ投与の前後における発火率を調べた結果を示す図である。
【図１１】実施例２において、ＰＧの左体性感覚皮質内投与後、３．０ｍＭのイシリンを含有する１％ＤＭＳＯ、又は３．０ｍＭのイシリンを含有する１％ＤＭＳＯ投与の前後におけるパワー密度を調べた結果を示す図である。それぞれの濃度において、左のカラムが基礎律動、中央のカラムが投与前、右のカラムが投与後である。
【図１２】実施例３において、Ｃ５７ＢＬ／６雄マウスにＰＧの左体性感覚皮質内投与後、その後３ｍＭのイシリン及びＴＲＰＡ１の選択的アンタゴニストであるＨＣ−０３００３１を同時に加えた場合のＥＣｏＧ（ｍＶ）を調べた結果を示す図である。右側は、基礎律動、イシリン及びＨＣ−０３００３１注入前、イシリン及びＨＣ−０３００３１注入前後の振幅の一部を拡大したものである（以下の図１３−図１５も同様）。
【図１３】実施例３において、ＴＰＲＭ８  ＫＯマウスにＰＧの左体性感覚皮質内投与後、３ｍＭのイシリン及びＴＲＰＡ１の選択的アンタゴニストであるＨＣ−０３００３１を同時に加えた場合のＥＣｏＧ（ｍＶ）を調べた結果を示す図である。
【図１４】実施例３において、Ｃ５７ＢＬ／６雄マウスに３ｍＭのイシリン及びＴＲＰＡ１の選択的アンタゴニストであるＨＣ−０３００３１を同時に加え、その後ＰＧの左体性感覚皮質内投与を行った場合のＥＣｏＧ（ｍＶ）を調べた結果を示す図である。
【図１５】実施例３において、ＴＰＲＭ８  ＫＯマウスに３ｍＭのイシリン及びＴＲＰＡ１の選択的アンタゴニストであるＨＣ−０３００３１を同時に加え、その後ＰＧの左体性感覚皮質内投与を行った場合のＥＣｏＧ（ｍＶ）を調べた結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本発明のイシリンを有効成分とする焦点性てんかん発作の抑制又は治療剤や、本発明のイシリンを有効成分とする焦点性てんかん発作の予防剤におけるイシリン（（１−（２−ヒドロキシフェニル）−４−（３−ニトロフェニル）−３，６−ジヒドロピリミジン−２−オン）：ＣＡＳ番号３６９４５−９８−９）は、ＴＲＰ（ｔｒａｎｓｉｅｎｔ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ｍｅｌａｓｔａｔｉｎ  ８：ＴＲＰＭ８）に対して高い親和性を有する物質である。上記ＴＲＰＭ８はＴＲＰイオンチャネルファミリーに属する興奮性のイオンチャネルであり、８〜２８℃で活性化するチャンネルとして知られている。イシリンの構造を以下の式（I）に示す。
【００１５】
【化１】
2019235519.tif 000003
【００１６】
上記イシリンは化学合成されたものを用いることができ、商業的に市販されているものを購入することにより入手してもよい。
【００１７】
本発明におけるてんかん発作とは、「脳の同期した過剰な異常神経活動に基づく一過性に生じる症状・兆候」を意味し、焦点性てんかん発作とは、てんかんの焦点（原生）が片側半球の神経回路に存在する発作を意味する。かかる焦点性てんかん発作が生じる部位としては、前頭葉、側頭葉、後頭葉、頭頂葉等を挙げることができる。
【００１８】
本発明におけるてんかん発作の抑制とは、てんかん発作の症状を和らげることが含まれ、てんかん発作の治療には、てんかん発作をコントロール、すなわち正常状態に維持することが含まれる。
【００１９】
本発明におけるてんかん発作の予防とは、てんかん発作の発生を防止することや、てんかん発作の発生リスクを低減することが含まれる。
【００２０】
本発明のイシリンを有効成分とする焦点性てんかん発作の抑制又は治療剤や、本発明のイシリンを有効成分とする焦点性てんかん発作の予防剤におけるイシリンの含有量としては、０．１〜５．０ｍＭ、好ましくは０．２〜４．０ｍＭ、より好ましくは０．３〜３．０ｍＭ、さらに好ましくは１．０〜３．０ｍＭを挙げることができる。
【００２１】
本発明のイシリンを有効成分とする焦点性てんかん発作の抑制又は治療剤や、本発明のイシリンを有効成分とする焦点性てんかん発作の予防剤には、さらにイシリンを溶解するための溶剤を含めることが好ましい。かかる溶剤としては、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）等の非プロトン系極性溶剤や、薬学的に許容される有機溶剤を挙げることができる。また、上記溶剤を含有する場合には、イシリンが上記溶剤によって溶解されていることが好ましい。
【００２２】
本発明のイシリンを有効成分とする焦点性てんかん発作の抑制又は治療剤や、本発明のイシリンを有効成分とする焦点性てんかん発作の予防剤には、さらにＴＲＰＡ１アンタゴニストを含有することが好ましい。イシリンはＴＲＰＭ８だけでなくＴＲＰＡ１にも作用することが知られているが、ＴＲＰＡ１アンタゴニストを含有することで、ＴＲＰＭ８及びＴＲＰＡ１の相互作用による作用の増悪リスクを低減することが可能となる。
【００２３】
ＴＲＰＡ１アンタゴニストとしては、２−（１、３−ジメチル−２、６−ジオキソ−１、２、３、６−テトラヒドロ−７Ｈ−プリン−７−イル）−Ｎ−（４−イソプロピルフェニル）アセトアミド（2-(1,3-dimethyl-2,6-dioxo-1,2,3,6-tetorahydro-7H-purin-7-yl)-n-(4-isopropylphenyl)acetamide:製品名：ＨＣ−０３００３１）、４−（４−クロロフェニル）−３−メチル−３−ブテン−２−オンオキシム（4-(4-Chlorophenyl)-3-methyl-3-buten-2-oneoxime：製品名  ＡＰ１８）、（１Ｅ、３Ｅ）−１−（４−フルオロフェニル）−２−メチル−１−ペンテン−３−オンオキシム（(1E,3E)-1-(4-Fluorophenyl)-2-methyl-1-penten-3-one oxime：製品名  Ａ−９６７０７９）、ＧＲＣ−１７５３６（製品名）、ＣＢ−６２５（製品名）、ＣＨＥＭ（製品名）等を挙げることができる。
【００２４】
本発明のイシリンを有効成分とする焦点性てんかん発作の抑制又は治療剤や、本発明のイシリンを有効成分とする焦点性てんかん発作の予防剤には、製剤化のために通常使用され薬学的に許容される賦形剤、結合剤、滑沢剤、崩壊剤、防腐剤、等張化剤、安定化剤、分散剤、酸化防止剤、着色剤、香味剤、緩衝剤等の添加物を含んでいてもよい。製剤の剤型としては、注射剤であっても、散剤、顆粒剤等の固形剤であってもよい。
【００２５】
本発明のイシリンを有効成分とする焦点性てんかん発作の抑制又は治療剤の投与方法としては、所望の焦点性てんかん発作の抑制又は治療効果が得られる限り特に制限されず、静脈内投与、経口投与、皮質投与等を挙げることができる。同様に、本発明のイシリンを有効成分とする焦点性てんかん発作の予防剤としては、所望の焦点性てんかん発作の予防効果が得られる限り特に制限されず、静脈内投与、経口投与、皮質投与等を挙げることができる。また、本発明のイシリンを有効成分とする焦点性てんかん発作の抑制又は治療剤や、本発明のイシリンを有効成分とする焦点性てんかん発作の予防剤の投与量は特に制限されず、被検者や被検動物の体調、病状、体重、年齢、性別等によって適宜調整することができる。１日あたりの投与量は、上記の投与方法のうちいずれを用いるかによって異なるが、感受性の違いを踏まえ、イシリン含有量として０．１〜１００ｍｇ／ｋｇ体重、好ましくは０．５〜５０ｍｇ／ｋｇ体重を挙げることができる。さらに、本発明のイシリンを有効成分とする焦点性てんかん発作の抑制又は治療剤を他の焦点性てんかん発作の抑制又は治療剤と併用してもよく、本発明のイシリンを有効成分とする焦点性てんかん発作の予防剤を他の焦点性てんかん発作の予防剤と併用してもよい。本発明のイシリンを有効成分とする焦点性てんかん発作の抑制又は治療剤や、本発明のイシリンを有効成分とする焦点性てんかん発作の予防剤の投与回数や投与期間等も特に制限されず、１日あたりの投与量を１日１回又は数回に分けて投与することもできる。また投与対象の細胞、組織の由来や生体は特に制限されず、好ましくは哺乳類であり、例えばヒト、サル、ウシ、ウマ、ヒツジ、ブタ、イヌ、ネコ、ラット、マウス、ハムスター等を例示することができ、好ましくはヒトを例示することができる。
【実施例】
【００２６】
以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの
例示に限定されるものではない。なお、てんかん発作時の異常脳波のモデルとして、Ａ型γアミノ酪酸受容体（ＧＡＢＡＡ−Ｒ）の拮抗薬であるペニシリンＧ（ＰＧ）によって誘発される、皮質における焦点性てんかん性異常脳波（ＥＤ）を用いた。また、以下の実施例ではラット麻酔下にて脳を傷つけないように開頭を施すことで、組織切片のように脳実質に手術操作を加えずに実験を実施している。したがって、てんかん性異常脳波（ＥＤ）をより正確に表現可能な細胞間ネットワークを維持していることから焦点性てんかんへの影響を評価することとなり、より病態を反映した解析といえる。【００２７】
［実施例１］イシリンの投与によるてんかん性異常脳波（ＥＤ）の消失および抑制
（ラットへのＰＧ及びイシリンの注入）
１ゲージに３匹のグループに分けて、生後１０〜１１週齢、３２０〜４００ｇの雄ＳＤラット（ＳＬＣ社製）を温度２３±２℃、湿度５５±５％の条件下で生育した。上記ラットにウレタン（１．４ｇ／ｋｇ:ｉ．ｐ．）で麻酔し、脳定位固定装置（ＳＲ−６：ナリシゲ社製）で固定した。小動物用体温保持装置（ＢＷＴ−１００：バイオリサーチセンター社製）で直腸温度を３７±２℃に調整し、皮質の温度を３５±２℃に維持した。皮質の温度を３５±２℃に維持することで、ＴＲＰＭ８の活性化の影響や脳における低温療法による影響を除外した。【００２８】
直径１．０ｍｍのバーホール（ｂｕｒｒ  ｈｏｌｅ）を、十字縫合に対して前方２．０ｍｍ、側方４．０ｍｍとなるように左感覚運動皮質上に開けた。次に、インジェクションカニューラ（０．４×４０ｍｍ  ａｎｄ  ３μＬ  ｖｏｌｕｍｅ、ＥＩＭ−４０：エイコム社製）の挿入のために硬膜に小さなスリットを開けた。【００２９】
ペニシリンＧ（ＰＧ：Ｍｅｉｊｉ  Ｓｅｉｋａファルマ社製）及びイシリン（メルク社製）を次の工程によってそれぞれを混合することなく同じ位置に注入した。まず、２６ゲージの取り外し可能なニードル（１７０１ＲＮ−７７５８−０２：ｈａｍｉｌｔｏｎ社製）を備えた１０μＬのハミルトンシリンジ（ＭＳ−１０：伊藤製作所社製）を用いた。ニードルにおける１μＬの内腔を１μＬのＰＧでフィルアップし、シリンジ容器を１％ＤＭＳＯ、０．３、１．０、３．０ｍＭのイシリンを含有する１％ＤＭＳＯを８．８μＬと、空気０．２μＬとでフィルアップした。次に、インジェクションカニューラとハミルトンシリンジをテフロン（登録商標）チューブ（ＪＴ−１０：エイコム社製）につないだ。その後溶液はインジェクションカニューラのチップに到達した。最後にインジェクションカニューラを脳表から１ｍｍの深さの地点に入れた。ＰＧとイシリンはこのように０．２μＬのエアーによって隔てた。ＰＧは４００ＩＵ／μＬの濃度となるように０．９％の生理食塩水で溶解し、皮質脳波（ｅｌｅｃｔｒｏｃｏｒｔｉｃｏｇｒａｍ：ＥＣｏＧ）記録開始の１時間後に左体性感覚皮質内に投与した。イシリンは１％のジメチルスルフォキシド（ＤＭＳＯ：メルク社製）を含む生理食塩水で溶解しＰＧ注入から１．５時間後に皮質内に投与した。ＰＧとイシリンはマイクロ注入ポンプ（ＤＳＰ−６４：エイコム社製）を用いて０．１μＬ／分の割合で１０分間注入した。【００３０】
ＥＣｏＧは細胞外記録用アンプ（ＥＸ−１：Ｄａｇａｎ社製）によって増幅し、２ｋＨｚのサンプリング率でＡ／Ｄコンバーターを用いて４時間（１時間はＥＣｏＧの安定化、３時間はＰＧ誘導のてんかん性異常脳波（ＥＤ）の取得）ほど継続的に記録した。ＥＣｏＧ記録の条件は、低周波数フィルター０．１Ｈｚ、高周波数フィルター１０ｋＨｚ、ノッチフィルターオフとした。【００３１】
Ｌａｂ  Ｃｈａｒｔ  Ｐｒｏ  ｖ．８．１．５（ＡＤ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ社製）を用いて、スパイク振幅（Ｓｐｉｋｅ  ａｍｐｌｉｔｕｄｅ：ｍＶ）、持続時間（Ｓｐｉｋｅ  ｄｕｒａｔｉｏｎ：ｍｓ）、それぞれのバンドパスフィルター、及び発火率（Ｆｉｒｉｎｇ  ｒａｔｅ：Ｈｚ）の４つを測定した。それぞれのてんかんモデルラットにおけるスパイク振幅と持続時間は、Ｌａｂ  Ｃｈａｒｔ  Ｐｒｏ  ｖ．８．１．５を用いて自動的に計算し、測定した。ＥＣｏＧを高速フーリエ解析（ｆａｓｔ  Ｆｏｕｒｉｅｒ  ｔｒａｎｓｆｏｒｍ：  ＦＦＴ）し、突出ＥＣｏＧスペクトルバンド（Ｄｅｌｔａ：１−４Ｈｚ，Ｔｈｅｔａ：４−９Ｈｚ，Ａｌｐｈａ：９−１４Ｈｚ，Ｂｅｔa１：１４−２４Ｈｚ  ａｎｄ  Ｂｅｔａ２：２４−３０Ｈｚ）の絶対バンドパワーを計算した。特に、次の文献（Ｋｉｄａ  Ｈ，  Ｆｕｊｉｉ  Ｍ，  Ｉｎｏｕｅ  Ｔ，ｅｔ  ａｌ．Ｃｌｉｎ  Ｎｅｕｒｏｐｈｙｓｉｏl  ２０１２；１２３：１７０８−１７１３）に基づき、スパイクの持続時間は１００ｍｓ未満ほど持続したスパイク波の時間とした。ＰＧ注入前の１０分、イシリン注入前の１０分、イシリン注入直後から１０分のｂａｓａｌ  ＥＣｏＧ活性を測定した。イシリン注入後のてんかん性異常脳波（ＥＤ）の時間経過を考慮して、注入後のＥＤを１０分とし、これはＰＧ注入後の１００分から１１０分に該当する。【００３２】
図１に、ＰＧの左体性感覚皮質内投与後、及び１％ＤＭＳＯ（イシリンなしのコントロール）、０．３、１．０、３．０ｍＭ（１μＬあたり、それぞれ２３．４４ｎｇ、７８．１３ｎｇ、２３４．３９ｎｇ）のイシリンを含有する１％ＤＭＳＯを１μＬ投与前後におけるＥＣｏＧ（ｍＶ）（左上段）、皮質温度（℃）（左下段）を示す。Ａは１％ＤＭＳＯ（イシリンなしのコントロール）、Ｂは０．３ｍＭのイシリン（１％ＤＭＳＯに溶解）、Ｃは１．０ｍＭのイシリン（１％ＤＭＳＯに溶解）、Ｄは３．０ｍＭのイシリン（１％ＤＭＳＯに溶解）である。また、それぞれの１％ＤＭＳＯ注入前後の振幅の一部を拡大したものをＡ〜Ｄそれぞれの右欄に示す。【００３３】
図１に示すように、イシリンの投与によってＰＧによるてんかん性異常脳波（ＥＤ）が投与したイシリンの用量に依存して抑制されることが明らかとなった。なお、同じラットにおいて右体性感覚皮質におけるてんかん性異常脳波（ＥＤ）は発生せず、基礎律動への影響も見られなかったことから、ＰＧにより誘発したてんかん性異常脳波（ＥＤ）は焦点性であり、かつイシリンは焦点特異的に影響を及ぼしたと言える。【００３４】
また、それぞれの１％ＤＭＳＯ、０．３、１．０、３．０ｍＭ（１μＬあたり、それぞれ２３．４４ｎｇ、７８．１３ｎｇ、２３４．３９ｎｇ）のイシリンを含有する１％ＤＭＳＯを１μＬ投与による、スパイク振幅を調べた結果を図２に、スパイク持続時間を調べた結果を図３に、発火率を調べた結果を図４に、パワー密度を調べた結果を図５に示す。【００３５】
図２、３に示すように、イシリンの投与により、それぞれのラットにおいてスパイク振幅及びスパイク持続時間が投与前と比較して抑制された。また、図４、５に示すように、イシリン１．０ｍＭ又は３．０ｍＭの投与により、それぞれのラットにおいて発火率及びパワー密度が投与前と比較して抑制された。特に、イシリン３．０ｍＭの投与により、パワー密度についてはベースの活性（ｂａｓａｌ  ａｃｔｉｖｉｔｙ）にまで抑制された。なお、ベースの活性は維持していることから、イシリンの投与により正常な状態に戻して維持ができること、及び正常脳波の過度な抑制作用は起こさないことが明らかとなった。【００３６】
上記結果から、イシリンが用量依存的にてんかん性異常脳波（ＥＤ）の消失および抑制に寄与することが明らかとなった。【００３７】
［実施例２］イシリンによるてんかん性異常脳波（ＥＤ）の抑制のメカニズム
次に、イシリンによるてんかん性異常脳波（ＥＤ）の抑制のメカニズムを確認するために、１％ＤＭＳＯ（イシリンなしのコントロール）、又は３．０ｍＭのイシリン及び３．０ｍＭ  ＡＭＴＢ（Ｎ−（３−ａｍｉｎｏｐｒｏｐｙｌ）−２−（［（３−ｍｅｔｈｙｌｐｈｅｎｙｌ）  ｍｅｔｈｙｌ］ｏｘｙ）−Ｎ−（２−ｔｈｉｅｎｙｌｍｅｔｈｙｌ）ｂｅｎｚａｍｉｄｅ  ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ  ｓａｌｔ）を含有する１％ＤＭＳＯ投与前後におけるＥＣｏＧ（ｍＶ）及び皮質温度（℃）を調べた結果をそれぞれ図６、７に、スパイク振幅を調べた結果を図８に、スパイク持続時間を調べた結果を図９に、発火率を調べた結果を図１０に、パワー密度を調べた結果を図１１に示す。なお、ＡＭＴＢはＴＲＰＭ８のアンタゴニストである。図８に示すように、イシリンと共にＡＭＴＢを加えると、てんかん性異常脳波（ＥＤ）が抑制されていなかった。また、図８、９に示すように、イシリンと共にＡＭＴＢを投与すると、それぞれのラットにおいてスパイク振幅、スパイク持続時間は投与前と比較して抑制されていなかった。さらに、図１０、１１に示すように、発火率及びパワー密度も投与前と比較して抑制されなかった。かかる結果より、イシリンによるてんかん性異常脳波（ＥＤ）の抑制は、ＴＲＰＡ１の活性化ではなくＴＲＰＭ８の活性化によるものであることが確認された。【００３８】
［実施例３］イシリン及びＴＲＰＡ１アンタゴニストの投与によるてんかん性異常脳波（ＥＤ）の消失および抑制
イシリンによるてんかん性異常脳波（ＥＤ）の抑制作用のうち、ＴＲＰＭ８単独の作用をさらに確認するために、ＴＲＰＡ１アンタゴニストを用いて解析を行った。ＴＲＰＡ１アンタゴニストを用いることで、ＴＲＰＡ１の活性化を抑制した状態の効果を観察することが可能となる。 【００３９】
Ｃ５７ＢＬ／６雄マウスの皮質脳波（ＥＣｏＧ）が安定して記録を開始してから２０分後、インジェクションカニューラを脳表から１ｍｍの深さの地点に入れ、その後ＰＧ２００ＩＵを加えた（ＥＣｏＧ記録開始から３０〜４０分）。さらに、３ｍＭ（1μＬ中に０．９３μｇ）のイシリン及び３ｍＭ（１μＬ中に１．０７μｇ）のＴＲＰＡ１の選択的アンタゴニスト（ＨＣ−０３００３１: 富士フイルム和光純薬社）を同時に加えた（ＥｃｏＧ記録開始から１２０〜１３０分）。結果を図１２に示す。図１２に示すように、イシリン及びＴＲＰＡ１の選択的アンタゴニスト（ＨＣ−０３００３１）を同時に加えても、てんかん性異常脳波（ＥＤ）は抑制されることが確認された。【００４０】
次に、雄Ｃ５７ＢＬ／６マウスの代わりにＴＰＲＭ８を発現しないマウス（ＴＰＲＭ８  ＫＯマウス）を用いた以外は上記と同様の処理を行った結果を図１３に示す。図１３から明らかなように、ＴＰＲＭ８  ＫＯマウスでは、てんかん性異常脳波（ＥＤ）は抑制されなかった。かかる結果からも、イシリンによるてんかん性異常脳波（ＥＤ）の抑制は、ＴＲＰＭ８の活性化によるものであることが確認された。【００４１】
さらに、雄Ｃ５７ＢＬ／６マウス又はＴＰＲＭ８  ＫＯマウスにイシリン及びＴＲＰＡ１の選択的アンタゴニスト（ＨＣ−０３００３１）を同時に加え、その後ＰＧ２００ＩＵを加えた結果を図１４、１５に示す。図１４、１５の結果から、イシリン及びＴＲＰＡ１の選択的アンタゴニスト（ＨＣ−０３００３１）を投与することによって、てんかん性異常脳波（ＥＤ）の発生を防ぐことが明らかとなった。すなわち、イシリン及びＴＲＰＡ１の選択的アンタゴニスト（ＨＣ−０３００３１）を投与することによって、焦点性てんかん発作を予防することが可能であること、及びイシリンによるてんかん性異常脳波（ＥＤ）は、ＴＲＰＭ８単独の活性化によっても抑制できることが明らかとなった。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【手続補正書】
【提出日】令和2年1月21日(2020.1.21)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
イシリンを有効成分とする、前頭葉、側頭葉、後頭葉、又は頭頂葉における焦点性てんかん発作の抑制又は治療剤。
【請求項２】
ＴＲＰＡ１アンタゴニストを含むことを特徴とする請求項１記載の焦点性てんかん発作の抑制又は治療剤。
【請求項３】
イシリンを１．０〜５．０ｍＭ含有することを特徴とする請求項１又は２記載の焦点性てんかん発作の抑制又は治療剤。
【請求項４】
薬学的に許容される添加物を含むことを特徴とする請求項１〜３のいずれか記載の焦点性てんかん発作の抑制又は治療剤。
【請求項５】
イシリンを有効成分とする、前頭葉、側頭葉、後頭葉、又は頭頂葉における焦点性てんかん発作の予防剤。
【請求項６】
ＴＲＰＡ１アンタゴニストを含むことを特徴とする請求項５記載の焦点性てんかん発作の予防剤。
【請求項７】
イシリンを１．０〜５．０ｍＭ含有することを特徴とする請求項５又は６記載の焦点性てんかん発作の予防剤。
【請求項８】
薬学的に許容される添加物を含むことを特徴とする請求項５〜７のいずれか記載の焦点性てんかん発作の予防剤。
【国際調査報告】
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