(57)【要約】  本発明は、下記式１で表される核酸複合体を提供する。式１：【化１】2020111280.tif 000267（式１中、  Ｘは、センス鎖およびアンチセンス鎖からなり、少なくとも11個の塩基対の二重鎖領域を含む二本鎖核酸であり、    該二本鎖核酸は、該アンチセンス鎖中の、17個〜30個のヌクレオチドの鎖長のオリゴヌクレオチド鎖において、表1-1〜表1-13に記載された標的APCS mRNA配列のいずれかと相補的であり、    該センス鎖の3'末端または5'末端はＳ３に結合し、  Ｌ１およびＬ２は、それぞれ独立して、糖リガンドであり、  Ｓ１、Ｓ２およびＳ３は、それぞれ独立して、リンカーである。）
2020111280.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記式１で表される核酸複合体。
式１：
【化１】
2020111280.tif 000232
（式１中、
Ｘは、センス鎖およびアンチセンス鎖からなり、少なくとも11個の塩基対の二重鎖領域を含む二本鎖核酸であり、
該二本鎖核酸は、該アンチセンス鎖中の、17個〜30個のヌクレオチドの鎖長のオリゴヌクレオチド鎖において、表1-1〜表1-13に記載された標的APCS mRNA配列のいずれかと相補的であり、
該センス鎖の3'末端または5'末端はＳ３に結合し、
Ｌ１およびＬ２は、それぞれ独立して、糖リガンドであり、
Ｓ１、Ｓ２およびＳ３は、それぞれ独立して、リンカーである。）
【請求項２】
下記式２で表される構造を有する、請求項１に記載の核酸複合体。
式２：
【化２】
2020111280.tif 000233
（式２中、
Ｘ、Ｌ１、Ｌ２およびＳ３は、それぞれ前記と同義であり、
Ｐ１、Ｐ２、Ｐ３、Ｐ４、Ｐ５およびＰ６、ならびにＴ１およびＴ２は、それぞれ独立して、存在しないか、または、−ＣＯ−、−ＮＨ−、−Ｏ−、−Ｓ−、−Ｏ−ＣＯ−、−Ｓ−ＣＯ−、−ＮＨ−ＣＯ−、−ＣＯ−Ｏ−、−ＣＯ−Ｓ−もしくは−ＣＯ−ＮＨ−であり、
Ｑ１、Ｑ２、Ｑ３およびＱ４は、それぞれ独立して、存在しないか、または、置換もしくは無置換の炭素数１〜１２のアルキレンまたは−（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）n−ＣＨ2ＣＨ2−であり、ｎは０〜９９の整数であり、
Ｂ１およびＢ２は、それぞれ独立して、結合手であるか、または、下記式２−１で表されるいずれかの構造であり、各構造における末端の黒丸点は、それぞれ、Ｐ２またはＰ３あるいはＰ５またはＰ６との結合点であり、ｍ１、ｍ２、ｍ３およびｍ４は、それぞれ独立して、０〜１０の整数であり、
式２−１：
【化３】
2020111280.tif 000234
ｐ１およびｐ２は、それぞれ独立して、１、２または３の整数であり、
ｑ１、ｑ２、ｑ３およびｑ４は、それぞれ独立して、０〜１０の整数であり、
ただし、ｐ１およびｐ２がそれぞれ２または３の整数であるとき、それぞれのＰ３およびＰ６、Ｑ２およびＱ４、Ｔ１およびＴ２ならびにＬ１およびＬ２は、同一または異なっていてもよく、ｑ１〜ｑ４が２〜１０のとき、それぞれの−［Ｐ２−Ｑ１］−，−［Ｑ２−Ｐ３］−，−［Ｐ５−Ｑ３］−，−［Ｑ４−Ｐ６］−の組み合わせは同一または異なっていてもよい。）
【請求項３】
Ｐ１およびＰ４が、それぞれ独立して、−ＣＯ−ＮＨ−、−ＮＨ−ＣＯ−または−Ｏ−である請求項２に記載の核酸複合体。
【請求項４】
−[Ｐ２−Ｑ１]q1−および−[Ｐ５−Ｑ３]q3−がそれぞれ独立して、存在しないか、または下記式３−１〜式３−３で表されるいずれかの構造である、請求項２または３に記載の核酸複合体。
式３−１：
【化４】
2020111280.tif 000235
式３−２：
【化５】
2020111280.tif 000236
式３−３：
【化６】
2020111280.tif 000237
（式３−１〜式３−３中、
ｍ５およびｍ６は、それぞれ独立して、０〜１０の整数であり、式３−１〜式３−３の構造における末端の黒丸点は、それぞれ、Ｂ１またはＢ２あるいはＰ１またはＰ４との結合点である。）
【請求項５】
下記式４−１〜式４−９で表されるいずれかの構造を有する、請求項２〜４のいずれか１項に記載の核酸複合体。
式４−１：
【化７】
2020111280.tif 000238
式４−２：
【化８】
2020111280.tif 000239
式４−３：
【化９】
2020111280.tif 000240
式４−４：
【化１０】
2020111280.tif 000241
式４−５：
【化１１】
2020111280.tif 000242
式４−６：
【化１２】
2020111280.tif 000243
式４−７：
【化１３】
2020111280.tif 000244
式４−８：
【化１４】
2020111280.tif 000245
式４−９：
【化１５】
2020111280.tif 000246
（式４−１〜４−９中、
Ｘ、Ｌ１、Ｌ２、Ｓ３、Ｐ３、Ｐ６、Ｔ１、Ｔ２、Ｑ２、Ｑ４、ｑ２およびｑ４はそれぞれ前記と同義である。）
【請求項６】
下記式５で表される構造を有する、請求項１に記載の核酸複合体。
式５：
【化１６】
2020111280.tif 000247
（式５中、
Ｘ、Ｓ３、Ｐ１、Ｐ２、Ｐ３、Ｑ１、Ｑ２、Ｂ１、Ｔ１、Ｌ１、p１、q１およびｑ２はそれぞれ前記と同義である。）
【請求項７】
Ｐ１が−ＣＯ−ＮＨ−、−ＮＨ−ＣＯ−または−Ｏ−である請求項６に記載の核酸複合体。
【請求項８】
下記式６−１〜式６−９で表されるいずれかの構造を有する、請求項６または７に記載の核酸複合体。
式６−１：
【化１７】
2020111280.tif 000248
式６−２：
【化１８】
2020111280.tif 000249
式６−３：
【化１９】
2020111280.tif 000250
式６−４：
【化２０】
2020111280.tif 000251
式６−５：
【化２１】
2020111280.tif 000252
式６−６：
【化２２】
2020111280.tif 000253
式６−７：
【化２３】
2020111280.tif 000254
式６−８：
【化２４】
2020111280.tif 000255
式６−９：
【化２５】
2020111280.tif 000256
（式６−１〜６−９中、
Ｘ、Ｓ３、Ｐ３、Ｑ２、Ｔ1、Ｌ１およびｑ２は、それぞれ前記と同義である。）
【請求項９】
下記式７−１〜式７−９で表されるいずれかの構造を有する、請求項２〜５のいずれか１項に記載の核酸複合体。
式７−１：
【化２６】
2020111280.tif 000257
式７−２：
【化２７】
2020111280.tif 000258
式７−３：
【化２８】
2020111280.tif 000259
式７−４：
【化２９】
2020111280.tif 000260
式７−５：
【化３０】
2020111280.tif 000261
式７−６：
【化３１】
2020111280.tif 000262
式７−７：
【化３２】
2020111280.tif 000263
式７−８：
【化３３】
2020111280.tif 000264
式７−９：
【化３４】
2020111280.tif 000265
（式７−１〜７−９中、
Ｘ、Ｓ３、Ｌ１およびＬ２は、それぞれ前記と同義である。）
【請求項１０】
前記糖リガンドが、Ｎ−アセチルガラクトサミンである、請求項１〜９のいずれか１項に記載の核酸複合体。
【請求項１１】
前記二本鎖核酸が、修飾ヌクレオチドを含む、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の核酸複合体。
【請求項１２】
センス鎖の3'末端およびアンチセンス鎖の5'末端は、平滑末端を形成する、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の核酸複合体。
【請求項１３】
前記二本鎖核酸が、糖部修飾ヌクレオチドを含む、請求項１１に記載の核酸複合体。
【請求項１４】
下記式７−８−１で表される構造を有する、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の核酸複合体。
式７−８−１：
【化３５】
2020111280.tif 000266
（式７−８−１中、Ｘは前記と同義である。）
【請求項１５】
Ｘが、表1-1〜表1-13に記載のセンス鎖／アンチセンス鎖から成る群から選択される1対のセンス鎖／アンチセンス鎖である、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の核酸複合体。
【請求項１６】
Ｘが、表M1-1〜表M1-3、表R-1〜表R-2および表R-3〜表R-4に記載のセンス鎖／アンチセンス鎖から成る群から選択される1対のセンス鎖／アンチセンス鎖である、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の核酸複合体。
【請求項１７】
請求項１〜１６のいずれか１項に記載の核酸複合体を含む、医薬組成物。
【請求項１８】
細胞内に導入するための、請求項１７に記載の医薬組成物。
【請求項１９】
静脈内投与または皮下投与される、請求項１７または１８に記載の医薬組成物。
【請求項２０】
請求項１〜１６のいずれか１項に記載の核酸複合体または請求項１７〜１９のいずれか１項に記載の医薬組成物を、それを必要とする患者に投与することを含む、疾患の治療または予防方法。
【請求項２１】
請求項１〜１６のいずれか１項に記載の核酸複合体または請求項１７〜１９のいずれか１項に記載の医薬組成物を用いて二本鎖核酸を細胞内に導入することを含む、APCS遺伝子の発現を抑制する方法。
【請求項２２】
請求項１〜１６のいずれか１項に記載の核酸複合体または請求項１７〜１９のいずれか１項に記載の医薬組成物を哺乳動物に投与することを含む、アミロイド関連疾患の治療方法。
【請求項２３】
請求項１〜１６のいずれか１項に記載の核酸複合体または請求項１７〜１９のいずれか１項に記載の医薬組成物を含む、アミロイド関連疾患の治療に用いるための医薬。
【請求項２４】
請求項１〜１６のいずれか１項に記載の核酸複合体または請求項１７〜１９のいずれか１項に記載の医薬組成物を含む、アミロイド関連疾患の治療剤。
【請求項２５】
アミロイド関連疾患が、APCSを含んだアミロイド線維により媒介される障害によって引き起こされる疾患である、請求項２２に記載の治療方法。
【請求項２６】
アミロイド関連疾患が、APCSを含んだアミロイド線維により媒介される障害によって引き起こされる疾患である、請求項２３に記載の医薬。
【請求項２７】
アミロイド関連疾患が、APCSを含んだアミロイド線維により媒介される障害によって引き起こされる疾患である、請求項２４に記載の治療剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、核酸複合体および該核酸複合体を含む医薬組成物等に関する。
【背景技術】
【０００２】
核酸医薬として、アプタマー、アンチセンス、デコイ核酸、リボザイム、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡおよびａｎｔｉｍｉＲＮＡ等が知られている。核酸医薬は、細胞内のあらゆる遺伝子を制御できる汎用性の高さから、今まで治療困難とされてきたさまざまな疾患への臨床応用が期待されている。
また、核酸医薬は、細胞内における標的選択性と活性の高さから、抗体、低分子医薬に次ぐ次世代医薬として期待されている。
しかしながら、核酸医薬の問題点として、標的組織への送達が困難であることが挙げられる。【０００３】
インビボにおける効果的な核酸医薬の送達法の１つとして、標的化化合物と核酸との核酸複合体（コンジュゲート）を用いることが報告されている。標的化化合物として、細胞外に発現する受容体に結合可能なリガンドが挙げられる。その中でも特に、肝細胞に極めて高発現しているアシアロ糖タンパク質受容体（ＡＳＧＰＲ）に結合可能であるリガンドとして、Ｎ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）等を利用した核酸複合体が複数報告されている。近年では、これらのリガンドとｓｉＲＮＡ類とを結合した核酸複合体が肝細胞に効率的に送達されることが報告されている（非特許文献１）。【０００４】
標的化化合物とオリゴヌクレオチドの複合体として、例えば特許文献１および２には、以下に示す核酸複合体が開示されている。【０００５】
【化１】
2020111280.tif 000003
（式中、Ａｃはアセチル基を表す。以下、本明細書において同様である。）【０００６】
また、特許文献３には、特許文献１および２に開示される核酸複合体と同様の糖リガンド−テザーユニットを有する以下に示す構造を有する核酸複合体が開示されている。【０００７】
【化２】
2020111280.tif 000004
【０００８】
また、特許文献４には、糖リガンド−テザーユニットとして、以下に示す構造を有する核酸複合体が開示されている。【０００９】
【化３】
2020111280.tif 000005
【００１０】
APCS（amyloid P component, serum）(別名Serum amyloid P、SAPあるいはPentraxin-2とも言う）は223アミノ酸から構成される糖蛋白質の五量体構造を有する。APCSは、肝臓で産生される糖蛋白質であり、血中に30〜50 μg/mLという比較的高濃度で存在する。
また、APCSはカルシウム依存的にすべての種類のアミロイド線維に結合する生化学的特性を持ち、アミロイドを有する患者のアミロイド中にも20,000 mgもの多量のAPCSが含まれていることが知られている（非特許文献２）。
APCSは、すべてのアミロイド関連疾患の患者におけるアミロイド中に存在することから、アミロイド関連疾患の患者における診断マーカーとして用いられている（非特許文献３）。【００１１】
アミロイド関連疾患は、アミロイド線維として知られている異常な不溶性蛋白質線維が組織に沈着して臓器障害が引き起こされる疾患である。
APCSがアミロイドに結合することでプロテアーゼによる分解耐性や免疫細胞による貪食に対する耐性を誘導することにより、APCSが結合したアミロイドを安定化し得ることが明らかとなっており、また、APCSのアミロイドへの結合を阻害することで、臓器へのアミロイド沈着及びそれに伴う組織障害を軽減できることが、動物モデルを用いた研究ならびに臨床研究より強く示唆されている（非特許文献４および５）。
APCSの発現を特異的に抑制することにより、アミロイド関連疾患を予防又は治療できると期待できるものの、APCSの発現を特異的に抑制する医薬品はこれまでに報告されていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１２】
【特許文献１】国際公開第２００９／０７３８０９号
【特許文献２】国際公開第２０１３／０７５０３５号
【特許文献３】国際公開第２０１５／１０５０８３号
【特許文献４】国際公開第２０１４／１７９６２０号
【非特許文献】
【００１３】
【非特許文献１】ジャーナル・オブ・アメリカン・ケミカル・ソサイエティー（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ），２０１４年，第１３６巻，ｐ１６９５８−１６９６１
【非特許文献２】アミロイド（Ａｍｙｌｏｉｄ）１９９７年，  第４：４巻，  ｐ２７４−２９５
【非特許文献３】ニューイングランド・ジャーナル・オブ・メディシン（Ｎ.  Ｅｎｇｌ.  Ｊ.  Ｍｅｄ．）１９９０年，  第３２３巻，  ｐ５０８−１３
【非特許文献４】ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）２０１０年，  第４６８巻，  ｐ９３−９７
【非特許文献５】ニューイングランド・ジャーナル・オブ・メディシン（Ｎ.  Ｅｎｇｌ.  Ｊ.  Ｍｅｄ．）２０１５年，  第３７３巻，  ｐ１１０６−１１１４
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
本発明の目的は、APCSの発現を抑制することが可能な核酸複合体を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
本発明は、以下に関する。
［１］
下記式１で表される核酸複合体。
式１：
【化４】
2020111280.tif 000006
（式１中、
Ｘは、センス鎖およびアンチセンス鎖からなり、少なくとも11個の塩基対の二重鎖領域を含む二本鎖核酸であり、
該二本鎖核酸は、該アンチセンス鎖中の、17個〜30個のヌクレオチドの鎖長のオリゴヌクレオチド鎖において、表1-1〜表1-13に記載された標的APCS mRNA配列のいずれかと相補的であり、
該センス鎖の3'末端または5'末端はＳ３に結合し、
Ｌ１およびＬ２は、それぞれ独立して、糖リガンドであり、
Ｓ１、Ｓ２およびＳ３は、それぞれ独立して、リンカーである。）
［２］
下記式２で表される構造を有する、［１］に記載の核酸複合体。
式２：
【化５】
2020111280.tif 000007
（式２中、
Ｘ、Ｌ１、Ｌ２およびＳ３は、それぞれ前記と同義であり、
Ｐ１、Ｐ２、Ｐ３、Ｐ４、Ｐ５およびＰ６、ならびにＴ１およびＴ２は、それぞれ独立して、存在しないか、または、−ＣＯ−、−ＮＨ−、−Ｏ−、−Ｓ−、−Ｏ−ＣＯ−、−Ｓ−ＣＯ−、−ＮＨ−ＣＯ−、−ＣＯ−Ｏ−、−ＣＯ−Ｓ−もしくは−ＣＯ−ＮＨ−であり、
Ｑ１、Ｑ２、Ｑ３およびＱ４は、それぞれ独立して、存在しないか、または、置換もしくは無置換の炭素数１〜１２のアルキレンまたは−（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）n−ＣＨ2ＣＨ2−であり、ｎは０〜９９の整数であり、
Ｂ１およびＢ２は、それぞれ独立して、結合手であるか、または、下記式２−１で表されるいずれかの構造であり、各構造における末端の黒丸点は、それぞれ、Ｐ２またはＰ３あるいはＰ５またはＰ６との結合点であり、ｍ１、ｍ２、ｍ３およびｍ４は、それぞれ独立して、０〜１０の整数であり、
式２−１：
【化６】
2020111280.tif 000008
ｐ１およびｐ２は、それぞれ独立して、１、２または３の整数であり、
ｑ１、ｑ２、ｑ３およびｑ４は、それぞれ独立して、０〜１０の整数であり、
ただし、ｐ１およびｐ２がそれぞれ２または３の整数であるとき、それぞれのＰ３およびＰ６、Ｑ２およびＱ４、Ｔ１およびＴ２ならびにＬ１およびＬ２は、同一または異なっていてもよく、ｑ１〜ｑ４が２〜１０のとき、それぞれの−［Ｐ２−Ｑ１］−，−［Ｑ２−Ｐ３］−，−［Ｐ５−Ｑ３］−，−［Ｑ４−Ｐ６］−の組み合わせは同一または異なっていてもよい。）
［３］
Ｐ１およびＰ４が、それぞれ独立して、−ＣＯ−ＮＨ−、−ＮＨ−ＣＯ−または−Ｏ−である［２］に記載の核酸複合体。
［４］
−［Ｐ２−Ｑ１］q1−および−［Ｐ５−Ｑ３］q3−がそれぞれ独立して、存在しないか、または下記式３−１〜式３−３で表されるいずれかの構造である、［２］または［３］に記載の核酸複合体。
式３−１：
【化７】
2020111280.tif 000009
式３−２：
【化８】
2020111280.tif 000010
式３−３：
【化９】
2020111280.tif 000011
（式３−１〜式３−３中、
ｍ５およびｍ６は、それぞれ独立して、０〜１０の整数であり、式３−１〜式３−３の構造における末端の黒丸点は、それぞれ、Ｂ１またはＢ２あるいはＰ１またはＰ４との結合点である。）
［５］
下記式４−１〜式４−９で表されるいずれかの構造を有する、［２］〜［４］のいずれか１項に記載の核酸複合体。
式４−１：
【化１０】
2020111280.tif 000012
式４−２：
【化１１】
2020111280.tif 000013
式４−３：
【化１２】
2020111280.tif 000014
式４−４：
【化１３】
2020111280.tif 000015
式４−５：
【化１４】
2020111280.tif 000016
式４−６：
【化１５】
2020111280.tif 000017
式４−７：
【化１６】
2020111280.tif 000018
式４−８：
【化１７】
2020111280.tif 000019
式４−９：
【化１８】
2020111280.tif 000020
（式４−１〜４−９中、
Ｘ、Ｌ１、Ｌ２、Ｓ３、Ｐ３、Ｐ６、Ｔ１、Ｔ２、Ｑ２、Ｑ４、ｑ２およびｑ４はそれぞれ前記と同義である。）
［６］
下記式５で表される構造を有する、［１］に記載の核酸複合体。
式５：
【化１９】
2020111280.tif 000021
（式５中、
Ｘ、Ｓ３、Ｐ１、Ｐ２、Ｐ３、Ｑ１、Ｑ２、Ｂ１、Ｔ１、Ｌ１、p１、q１およびｑ２はそれぞれ前記と同義である。）
［７］
Ｐ１が−ＣＯ−ＮＨ−、−ＮＨ−ＣＯ−または−Ｏ−である［６］に記載の核酸複合体。
［８］
下記式６−１〜式６−９で表されるいずれかの構造を有する、［６］または［７］に記載の核酸複合体。
式６−１：
【化２０】
2020111280.tif 000022
式６−２：
【化２１】
2020111280.tif 000023
式６−３：
【化２２】
2020111280.tif 000024
式６−４：
【化２３】
2020111280.tif 000025
式６−５：
【化２４】
2020111280.tif 000026
式６−６：
【化２５】
2020111280.tif 000027
式６−７：
【化２６】
2020111280.tif 000028
式６−８：
【化２７】
2020111280.tif 000029
式６−９：
【化２８】
2020111280.tif 000030
（式６−１〜６−９中、
Ｘ、Ｓ３、Ｐ３、Ｑ２、Ｔ1、Ｌ１およびｑ２は、それぞれ前記と同義である。）
［９］
下記式７−１〜式７−９で表されるいずれかの構造を有する、［２］〜［５］のいずれか１項に記載の核酸複合体。
式７−１：
【化２９】
2020111280.tif 000031
式７−２：
【化３０】
2020111280.tif 000032
式７−３：
【化３１】
2020111280.tif 000033
式７−４：
【化３２】
2020111280.tif 000034
式７−５：
【化３３】
2020111280.tif 000035
式７−６：
【化３４】
2020111280.tif 000036
式７−７：
【化３５】
2020111280.tif 000037
式７−８：
【化３６】
2020111280.tif 000038
式７−９：
【化３７】
2020111280.tif 000039
（式７−１〜７−９中、
Ｘ、Ｓ３、Ｌ１およびＬ２は、それぞれ前記と同義である。）
［１０］
前記糖リガンドが、Ｎ−アセチルガラクトサミンである、［１］〜［９］のいずれか１項に記載の核酸複合体。
［１１］
前記二本鎖核酸が修飾ヌクレオチドを含む、［１］〜［１０］のいずれか１項に記載の核酸複合体。
［１２］
センス鎖の3'末端およびアンチセンス鎖の5'末端は、平滑末端を形成する、［１］〜［１１］のいずれか１項に記載の核酸複合体。
［１３］
前記二本鎖核酸が、糖部修飾ヌクレオチドを含む、［１１］に記載の核酸複合体。
［１４]
下記式７−８−１で表される構造を有する、[１]〜[１３]のいずれか１項に記載の核酸複合体。
式７−８−１：
【化３８】
2020111280.tif 000040
（式７−８−１中、Ｘは前記と同義である。）
［１５］
Ｘが、表1-1〜表1-13に記載のセンス鎖／アンチセンス鎖から成る群から選択される1対のセンス鎖／アンチセンス鎖である、［１］〜［１４］のいずれか１項に記載の核酸複合体。
［１６］
Ｘが、表M1-1〜表M1-3および表R-1〜表R-4に記載のセンス鎖／アンチセンス鎖から成る群から選択される1対のセンス鎖／アンチセンス鎖である、［１］〜［１４］のいずれか１項に記載の核酸複合体。
［１６−Ａ１］
Ｘが、3'末端がＳ３に結合するセンス鎖と、配列番号２１２６、２１４４、２１４６のいずれかのアンチセンス鎖からなる1対のセンス鎖／アンチセンス鎖である、［１］〜［１４］のいずれか１項に記載の核酸複合体。
［１６−Ａ２］
下記式６−１〜式６−９で表される構造を有する、［１６−Ａ１］に記載の核酸複合体。
式６−７：
【化３９】
2020111280.tif 000041
（式６−７中、
Ｘ、Ｓ３、Ｐ３、Ｑ２、Ｔ1、Ｌ１およびｑ２は、それぞれ前記と同義である。）
［１６−Ａ３］
下記式７−８で表される構造を有する、［１６−Ａ１］に記載の核酸複合体。
式７−８：
【化４０】
2020111280.tif 000042
（式７−８中、
Ｘ、Ｓ３、Ｌ１およびＬ２は、それぞれ前記と同義である。）
［１６−Ａ４］
下記式７−８−１で表される構造を有する、［１６−Ａ１］に記載の核酸複合体。
式７−８−１：
【化４１】
2020111280.tif 000043
（式７−８−１中、Ｘは前記と同義である。）
［１６−Ｂ１］
Ｘが、配列番号２０８３のセンス鎖と配列番号２１２６のアンチセンス鎖、配列番号２１０１のセンス鎖と配列番号２１４４のアンチセンス鎖、または配列番号２１０３のセンス鎖と配列番号２１４６のアンチセンス鎖からなる1対のセンス鎖／アンチセンス鎖である、［１］〜［１４］のいずれか１項に記載の核酸複合体。
［１６−Ｂ２］
下記式６−１〜式６−９で表される構造を有する、［１６−Ｂ１］に記載の核酸複合体。
式６−７：
【化４２】
2020111280.tif 000044
（式６−７中、
Ｘ、Ｓ３、Ｐ３、Ｑ２、Ｔ1、Ｌ１およびｑ２は、それぞれ前記と同義である。）
［１６−Ｂ３］
下記式７−８で表される構造を有する、［１６−Ｂ１］に記載の核酸複合体。
式７−８：
【化４３】
2020111280.tif 000045
（式７−８中、
Ｘ、Ｓ３、Ｌ１およびＬ２は、それぞれ前記と同義である。）
［１６−Ｂ４］
下記式７−８−１で表される構造を有する、［１６−Ｂ１］に記載の核酸複合体。
式７−８−１：
【化４４】
2020111280.tif 000046
（式７−８−１中、Ｘは前記と同義である。）
［１７］
［１］〜［１６］のいずれか１項に記載の核酸複合体を含む、医薬組成物。
［１８］
細胞内に導入するための、［１７］に記載の医薬組成物。
［１９］
静脈内投与または皮下投与される、［１７］または［１８］に記載の医薬組成物。
［２０］
［１］〜［１６］のいずれか１項に記載の核酸複合体または［１７］〜［１９］のいずれか１項に記載の医薬組成物を、それを必要とする患者に投与することを含む、疾患の治療または予防方法。
［２１］
［１］〜［１６］のいずれか１項に記載の核酸複合体または［１７］〜［１９］のいずれか１項に記載の医薬組成物を用いて二本鎖核酸を細胞内に導入することを含む、APCS遺伝子の発現を抑制する方法。
［２２］
［１］〜［１６］のいずれか１項に記載の核酸複合体または［１７］〜［１９］のいずれか１項に記載の医薬組成物を哺乳動物に投与することを含む、アミロイド関連疾患の治療方法。
［２３］
［１］〜［１６］のいずれか１項に記載の核酸複合体または［１７］〜［１９］のいずれか１項に記載の医薬組成物を含む、アミロイド関連疾患の治療に用いるための医薬。
［２４］
［１］〜［１６］のいずれか１項に記載の核酸複合体または［１７］〜［１９］のいずれか１項に記載の医薬組成物を含む、アミロイド関連疾患の治療剤。
［２５］
アミロイド関連疾患が、APCSを含んだアミロイド線維により媒介される障害によって引き起こされる疾患である、［２２］に記載の治療方法。
［２６］
アミロイド関連疾患が、APCSを含んだアミロイド線維により媒介される障害によって引き起こされる疾患である、［２３］に記載の医薬。
［２７］
アミロイド関連疾患が、APCSを含んだアミロイド線維により媒介される障害によって引き起こされる疾患である、［２４］に記載の治療剤。
【発明の効果】
【００１６】
例えば本発明の核酸複合体を含む医薬組成物を、哺乳動物に投与して、生体内において、各種関連疾患を治療することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】試験例２における各マウス群の血中ヒトAPCS濃度の推移を示す図である。図中Day0のAPCS濃度は、投与６日前の値を示し、初回投与日をDay0とした。横軸は初回投与日を０日目とした経過日数、縦軸は血中ヒトAPCS濃度（μg/mL)を示す。〇はコントロール群、▲は化合物５−２の10 mg/kg投与群を示す。図のエラーバーは標準偏差（SD)を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
本発明の核酸複合体は、下記式１で表される核酸複合体である。
式１：
【００１９】
【化４５】
2020111280.tif 000047
【００２０】
式１中、
Ｘは、センス鎖およびアンチセンス鎖からなり、少なくとも11個の塩基対の二重鎖領域を含む二本鎖核酸であり、
該二本鎖核酸は、該アンチセンス鎖中の、17個〜30個のヌクレオチドの鎖長のオリゴヌクレオチド鎖において、表1-1〜表1-13に記載された標的APCS mRNA配列のいずれかと相補的であり、
該センス鎖の3'末端または5'末端はＳ３に結合し、
Ｌ１およびＬ２は、それぞれ独立して、糖リガンドであり、
Ｓ１、Ｓ２およびＳ３は、それぞれ独立して、リンカーである。
【００２１】
本発明において、Ｓ１およびＳ２は、Ｓ３のベンゼン環上の置換位置に対して、それぞれオルト位、メタ位、パラ位でベンゼン環と結合し得るが、下記式１−１で表される核酸複合体であることが好適である。式１におけるＳ１およびＳ２のベンゼン環への結合手は、ベンゼン環上のＳ３の置換位置以外で任意の位置であり得ることを意味する。
式１−１：
【００２２】
【化４６】
2020111280.tif 000048
【００２３】
式１−１中、
Ｘ、Ｌ１、Ｌ２、Ｓ１、Ｓ２およびＳ３は、それぞれ前記と同義である。
本明細書において、前記と同義とは、式１−１中を例示して説明すると、式１−１中のＸ、Ｌ１、Ｌ２、Ｓ１およびＳ２それぞれについて、式１において前記するＸ、Ｌ１、Ｌ２、Ｓ１およびＳ２それぞれについての定義と同様の基であり得ることを意味している。
【００２４】
本発明において、Ｘは、センス鎖およびアンチセンス鎖からなり、少なくとも11個の塩基対の二重鎖領域を含む二本鎖核酸である。
また、該二本鎖核酸は、該アンチセンス鎖中の、17個〜30個のヌクレオチドの鎖長のオリゴヌクレオチド鎖において、後述する表1-1〜表1-13に記載された標的APCS mRNA配列のいずれかと相補的である。
さらにまた、該センス鎖の3'末端または5'末端はＳ３に結合する。
【００２５】
Ｌ１およびＬ２は、それぞれ独立して、糖リガンドである。
本発明において、糖リガンドとは、標的細胞に発現している受容体に結合可能な糖類（単糖、二糖、三糖および多糖等）に由来する基を意味する。また、本発明において、糖リガンドがＯ−結合によりＳ１およびＳ２のリンカーに結合している場合には、糖リガンドとは、それを構成する糖類の結合に関与する水酸基を除いた部分が糖類に由来する基を意味する。
本発明においては、オリゴヌクレオチドの標的となる糖リガンドを選択すればよい。
単糖としては、例えば、アロース、アルトース、アラビノース、クラジノース、エリトロース、エリスルロース、フルクトース、Ｄ−フシトール、Ｌ−フシトール、フコサミン、フコース、フクロース、ガラクトサミン、Ｄ−ガラクトサミニトール、Ｎ−アセチル−ガラクトサミン、ガラクトース、グルコサミン、Ｎ−アセチル−グルコサミン、グルコサミニトール、グルコース、グルコース−６−リン酸、グロース、グリセルアルデヒド、Ｌ−グリセロ−Ｄ−マンノ−ヘプトース、グリセロール、グリセロン、グロース、イドース、リキソース、マンノサミン、マンノース、マンノース−６−リン酸、プシコース、キノボース、キノボサミン、ラムニトール、ラムノサミン、ラムノース、リボース、リブロース、セドヘプツロース、ソルボース、タガトース、タロース、酒石酸、トレオース、キシロース、およびキシルロース等が挙げられる。
二糖、三糖、多糖としては、例えば、アベクオース、アクラボース、アミセトース、アミロペクチン、アミロース、アピオース、アルカノース、アスカリロース、アスコルビン酸、ボイビノース、セロビオース、セロトリオース、セルロース、カコトリオース、カルコース、キチン、コリトース、シクロデキストリン、シマロース、デキストリン、２−デオキシリボース、２−デオキシグルコース、ジギノース、ジギタロース、ジギトキソース、エバロース、エベミトロース（ｅｖｅｍｉｔｒｏｓｅ）、フルクトオリゴ糖、ガルトオリゴ糖（ｇａｌｔｏ−ｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅ）、ゲンチアノース、ゲンチオビオース、グルカン、グリコーゲン、ハマメロース、ヘパリン、イヌリン、イソレボグルコセノン、イソマルトース、イソマルトトリオース、イソパノース、コジビオース、ラクトース、ラクトサミン、ラクトースジアミン、ラミナラビオース、レボグルコサン、レボグルコセノン、β−マルトース、マルトリオース、マンナン−オリゴ糖、マンニノトリオース、メレチトース、メリビオース、ムラミン酸、ミカロース、ミシノース、ノイラミン酸、シアル酸含有糖鎖、ニゲロース、ノジリミシン、ノビオース、オレアンドロース、パノース、パラトース、プランテオース、プリメベロース、ラフィノース、ロジノース、ルチノース、サルメントース、セドヘプツロース、セドヘプツロサン、ソラトリオース、ソホロース、スタキオース、ストレプトース、スクロース、α，α−トレハロース、トラハロサミン、ツラノース、チベロース、キシロビオース、ウンベリフェロース等が挙げられる。
【００２６】
糖類における各単糖は、Ｄ体またはＬ体であってもよく、Ｄ体とＬ体の任意割合による混合物であってもよい。
糖類は、デオキシ糖（アルコールヒドロキシ基を水素原子に置換したもの）、アミノ糖（アルコールヒドロキシ基をアミノ基に置換したもの）、チオ糖（アルコールヒドロキシ基をチオールに置換したもの、またはＣ＝ＯをＣ＝Ｓに置換したもの、または環酸素を硫黄に置換したもの）、セレノ糖、テルロ糖、アザ糖（環炭素を窒素に置換したもの）、イミノ糖（環酸素を窒素に置換したもの）、ホスファノ糖（環酸素をリンに置換したもの）、ホスファ糖（環炭素をリンに置換したもの）、Ｃ−置換単糖（非末端炭素原子における水素原子を炭素原子で置換したもの）、不飽和単糖、アルジトール（カルボニル基をＣＨＯＨ基で置換したもの）、アルドン酸（アルデヒド基をカルボキシ基に置換したもの）、ケトアルドン酸、ウロン酸、アルダル酸等を含んでいてもよい。
単糖であるアミノ糖として、ガラクトサミン、グルコサミン、マンノサミン、フコサミン、キノボサミン、ノイラミン酸、ムラミン酸、ラクトースジアミン、アコサミン、バシロサミン、ダウノサミン、デソサミン、フォロサミン、ガロサミン、カノサミン、カンソサミン（ｋａｎｓｏｓａｍｉｎｅ）、ミカミノース、ミコサミン、ペロサミン、プノイモサミン、プルプロサミン（ｐｕｒｐｕｒｏｓａｍｉｎｅ）、ロドサミン等が挙げられる。また、アミノ糖のアミノ基は、アセチル基等で置換されていてもよい。
シアル酸含有糖鎖としては、ＮｅｕＡｃを糖鎖非還元末端に含有する糖鎖が挙げられ、具体的には、ＮｅｕＡｃ−Ｇａｌ−ＧｌｃＮＡｃを含有する糖鎖や、Ｎｅｕ５Ａｃα（２−６）Ｇａｌβ（１−３）ＧｌｃＮＡｃ等が挙げられる。
糖類における各単糖は、標的細胞に発現している受容体に結合可能であることを限度として、置換基で置換されていてもよく、例えば、水酸基が置換されていてもよく、各単糖における水素原子がアジドおよび／または置換されていてもよいアリール基で１〜複数置換されていてもよい。
【００２７】
糖リガンドとしては、標的とする各臓器に対応して標的細胞の表面に発現する受容体に結合する糖リガンドを選択することが好ましい。例えば、標的細胞が肝細胞である場合、肝細胞表面に発現する受容体に対する糖リガンドが好ましく、アシアロ糖タンパク質受容体（ＡＳＧＰＲ）に対する糖リガンドがより好ましい。
【００２８】
ＡＳＧＰＲに対する糖リガンドとしては、マンノースまたはＮ−アセチルガラクトサミンが好ましく、Ｎ−アセチルガラクトサミンがより好ましい。
ＡＳＧＰＲに対してより親和性の高い糖リガンドとして、例えばＢｉｏｏｒｇａｎｉｃ  Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，  １７，７２５４  （２００９）、およびＪｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ，  １３４，  １９７８  （２０１２）等に記載の糖誘導体が知られており、これらを用いてもよい。
【００２９】
本発明において、Ｓ１、Ｓ２およびＳ３は、リンカーである。
Ｓ１とＳ２は、糖リガンドであるＬ１とＬ２と、ベンゼン環とを連結する構造であれば特に限定されるものではなく、核酸複合体において用いられる公知の構造を採用してもよい。Ｓ１とＳ２は、同一であってもよく、異なっていてもよい。
糖リガンドであるＬ１とＬ２は、Ｓ１およびＳ２とグリコシド結合により連結していることが好ましい。Ｓ１およびＳ２は、ベンゼン環と、例えば、−ＣＯ−、−ＮＨ−、−Ｏ−、−Ｓ−、−Ｏ−ＣＯ−、−Ｓ−ＣＯ−、−ＮＨ−ＣＯ−、−ＣＯ−Ｏ−、−ＣＯ−Ｓ−もしくは−ＣＯ−ＮＨ−結合によりそれぞれ連結していてもよい。
【００３０】
Ｓ３は、二本鎖核酸であるＸと、ベンゼン環とを連結する構造であれば特に限定されるものではなく、核酸複合体において用いられる公知の構造を採用してよい。
オリゴヌクレオチドであるＸは、Ｓ３とホスホジエステル結合により連結していることが好ましい。Ｓ３は、ベンゼン環と、例えば、−ＣＯ−、−ＮＨ−、−Ｏ−、−Ｓ−、−Ｏ−ＣＯ−、−Ｓ−ＣＯ−、−ＮＨ−ＣＯ−、−ＣＯ−Ｏ−、−ＣＯ−Ｓ−もしくは−ＣＯ−ＮＨ−結合により連結していてもよい。
【００３１】
Ｓ１、Ｓ２およびＳ３のリンカーは、例えば、国際公開第２００９／０７３８０９号、国際公開第２０１３／０７５０３５号、国際公開第２０１５／１０５０８３号、国際公開第２０１４／１７９６２０号、国際公開第２０１５／００６７４０号に開示される構造を採用してもよい。
【００３２】
本発明において、核酸複合体は、下記式２で表される構造を有する核酸複合体であることが好適である。
式２：
【００３３】
【化４７】
2020111280.tif 000049
【００３４】
式２中、
Ｘ、Ｌ１、Ｌ２およびＳ３は、それぞれ前記と同義であり、
Ｐ１、Ｐ２、Ｐ３、Ｐ４、Ｐ５およびＰ６、ならびにＴ１およびＴ２は、それぞれ独立して、存在しないか、または、−ＣＯ−、−ＮＨ−、−Ｏ−、−Ｓ−、−Ｏ−ＣＯ−、−Ｓ−ＣＯ−、−ＮＨ−ＣＯ−、−ＣＯ−Ｏ−、−ＣＯ−Ｓ−もしくは−ＣＯ−ＮＨ−であり、
Ｑ１、Ｑ２、Ｑ３およびＱ４は、それぞれ独立して、存在しないか、または、置換もしくは無置換の炭素数１〜１２のアルキレンまたは−（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）n−ＣＨ2ＣＨ2−であり、ｎは０〜９９の整数である。
【００３５】
Ｐ１およびＰ４は、それぞれ独立して、存在しないか、または、−ＣＯ−、−ＮＨ−、−Ｏ−、−Ｓ−、−Ｏ−ＣＯ−、−Ｓ−ＣＯ−、−ＮＨ−ＣＯ−、−ＣＯ−Ｏ−、−ＣＯ−Ｓ−もしくは−ＣＯ−ＮＨ−であるが、−Ｏ−、−Ｏ−ＣＯ−、−ＮＨ−ＣＯ−または−ＣＯ−ＮＨ−であることが好ましく、−Ｏ−、−ＮＨ−ＣＯ−または−ＣＯ−ＮＨ−であることがより好ましく、−ＮＨ−ＣＯ−であることがさらに好ましい。
Ｐ１またはＰ４が、例えば、−ＮＨ−ＣＯ−である場合、−ＮＨ−ＣＯ−ベンゼン環という部分構造を有する。
【００３６】
Ｑ１、Ｑ２、Ｑ３およびＱ４は、それぞれ独立して、存在しないか、または、置換もしくは無置換の炭素数１〜１２のアルキレンまたは−（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）n−ＣＨ2ＣＨ2−であり、ｎは０〜９９の整数であるが、置換もしくは無置換の炭素数１〜１２のアルキレンであることが好ましく、無置換の炭素数１〜１２のアルキレンであることがより好ましく、無置換の炭素数１〜６のアルキレンであることがさらに好ましく、無置換の炭素数１〜４のアルキレンであることがよりさらに好ましい。
【００３７】
Ｐ２およびＰ５は、それぞれ独立して、存在しないか、または、−ＣＯ−、−ＮＨ−、−Ｏ−、−Ｓ−、−Ｏ−ＣＯ−、−Ｓ−ＣＯ−、−ＮＨ−ＣＯ−、−ＣＯ−Ｏ−、−ＣＯ−Ｓ−もしくは−ＣＯ−ＮＨ−であるが、存在しないか、−ＣＯ−Ｏ−または−ＣＯ−ＮＨ−であることが好ましく、存在しないか、−ＣＯ−ＮＨ−であることがより好ましい。Ｐ２およびＰ５が、例えば、−ＣＯ−ＮＨ−である場合、Ｂ１−ＣＯ−ＮＨ−Ｑ１およびＢ２−ＣＯ−ＮＨ−Ｑ３という部分構造を有する。
【００３８】
−［Ｐ２−Ｑ１］q1−および−［Ｐ５−Ｑ３］q3−がそれぞれ独立して、存在しないか、または下記式３−１〜式３−３で表されるいずれかの構造であることが好適である。
式３−１：
【００３９】
【化４８】
2020111280.tif 000050
式３−２：
【００４０】
【化４９】
2020111280.tif 000051
式３−３：
【００４１】
【化５０】
2020111280.tif 000052
【００４２】
式３−１〜３−３中、
ｍ５およびｍ６は、それぞれ独立して、０〜１０の整数であり、式３−１〜式３−３の構造における末端の黒丸点は、それぞれ、Ｂ１またはＢ２あるいはＰ１またはＰ４との結合点である。
【００４３】
Ｂ１およびＢ２は、それぞれ独立して、結合手であるか、または、下記式で表されるいずれかの構造であり、各構造における末端の黒丸点は、それぞれ、Ｐ２またはＰ３あるいはＰ５またはＰ６との結合点であり、ｍ１、ｍ２、ｍ３およびｍ４は、それぞれ独立して、０〜１０の整数である。
【００４４】
【化５１】
2020111280.tif 000053
【００４５】
Ｂ１およびＢ２は、グルタミン酸、アスパラギン酸、リジン、イミノ二酢酸等の非天然アミノ酸を含むアミノ酸、または2-アミノ-1，3−プロパンジオール等のアミノアルコールに由来する基であることが好ましく、Ｂ１およびＢ２がグルタミン酸およびアスパラギン酸に由来する基である場合、グルタミン酸およびアスパラギン酸のアミノ基がそれぞれ結合して、Ｐ２およびＰ５として、−ＮＨ−ＣＯ−結合であることが好ましく、Ｂ１およびＢ２がリジンに由来する基である場合、リジンのカルボキシル基がそれぞれ結合して、Ｐ２およびＰ５として、−ＣＯ−ＮＨ−結合であることが好ましく、Ｂ１およびＢ２がイミノ二酢酸に由来する基である場合、イミノ二酢酸のアミノ基がそれぞれ結合して、Ｐ２およびＰ５として、−ＣＯ−結合となることが好ましい。Ｂ１およびＢ２は、具体的には、以下の構造を持つことが好ましい。
【００４６】
【化５２】
2020111280.tif 000054
【００４７】
ｐ１およびｐ２がそれぞれ２または３の整数であるとき、それぞれのＰ３およびＰ６、Ｑ２およびＱ４、Ｔ１およびＴ２ならびにＬ１およびＬ２は、同一または異なっていてもよい。
ｑ１〜ｑ４が２〜１０のとき、それぞれの−［Ｐ２−Ｑ１］−，−［Ｑ２−Ｐ３］−，−［Ｐ５−Ｑ３］−，−［Ｑ４−Ｐ６］−の組み合わせは同一または異なっていてもよい。それぞれの−［Ｐ２−Ｑ１］−，−［Ｑ２−Ｐ３］−，−［Ｐ５−Ｑ３］−，および−［Ｑ４−Ｐ６］−の組み合わせが同一または異なるとは、−［Ｐ２−Ｑ１］−，−［Ｑ２−Ｐ３］−，−［Ｐ５−Ｑ３］−，および−［Ｑ４−Ｐ６］−で示される各２〜１０の単位が、同一である場合と異なる場合があることを意味する。
【００４８】
本発明において、核酸複合体は、下記式４−１〜４−９で表される構造を有する核酸複合体であることが好適である。
式４−１：
【００４９】
【化５３】
2020111280.tif 000055
式４−２：
【００５０】
【化５４】
2020111280.tif 000056
式４−３：
【００５１】
【化５５】
2020111280.tif 000057
式４−４：
【００５２】
【化５６】
2020111280.tif 000058
式４−５：
【００５３】
【化５７】
2020111280.tif 000059
式４−６：
【００５４】
【化５８】
2020111280.tif 000060
式４−７：
【００５５】
【化５９】
2020111280.tif 000061
式４−８：
【００５６】
【化６０】
2020111280.tif 000062
式４−９：
【００５７】
【化６１】
2020111280.tif 000063
【００５８】
式４−１〜４−９中、
Ｘ、Ｌ１、Ｌ２、Ｓ３、Ｐ３、Ｐ６、Ｔ１、Ｔ２、Ｑ２、Ｑ４、ｑ２およびｑ４はそれぞれ前記と同義である。
【００５９】
Ｐ３およびＰ６は、それぞれ独立して、存在しないか、または、−ＣＯ−、−ＮＨ−、−Ｏ−、−Ｓ−、−Ｏ−ＣＯ−、−Ｓ−ＣＯ−、−ＮＨ−ＣＯ−、−ＣＯ−Ｏ−、−ＣＯ−Ｓ−もしくは−ＣＯ−ＮＨ−であるが、−Ｏ−ＣＯ−または−ＮＨ−ＣＯ−であることが好ましく、−ＮＨ−ＣＯ−であることがより好ましい。Ｐ３およびＰ６が、例えば、−ＮＨ−ＣＯ−である場合、それぞれ、Ｂ１−ＮＨ−ＣＯ−Ｑ２およびＢ２−ＮＨ−ＣＯ−Ｑ４という部分構造を有する。
【００６０】
Ｔ１およびＴ２は、それぞれ独立して、存在しないか、または、−ＣＯ−、−ＮＨ−、−Ｏ−、−Ｓ−、−Ｏ−ＣＯ−、−Ｓ−ＣＯ−、−ＮＨ−ＣＯ−、−ＣＯ−Ｏ−、−ＣＯ−Ｓ−もしくは−ＣＯ−ＮＨ−であるが、−Ｏ−または−Ｓ−であることが好ましく、−Ｏ−であることがより好ましい。
【００６１】
本発明において、核酸複合体は、下記式５で表される構造を有する核酸複合体であることが好適である。
式５では、式２におけるＰ１とＰ４、Ｐ２とＰ５、Ｐ３とＰ６、Ｑ１とＱ３、Ｑ２とＱ４、Ｂ１とＢ２、Ｔ１とＴ２、Ｌ１とＬ２、ｐ１とｐ２、ｑ１とｑ３ならびにｑ２とｑ４がそれぞれ同一である。
式５：
【００６２】
【化６２】
2020111280.tif 000064
【００６３】
式５中、
Ｘ、Ｓ３、Ｐ１、Ｐ２、Ｐ３、Ｑ１、Ｑ２、Ｂ１、Ｔ１、Ｌ１、p１、q１およびｑ２はそれぞれ前記と同義である。
また、式５におけるＸ、Ｓ３、Ｐ１、Ｐ２、Ｐ３、Ｑ１、Ｑ２、Ｂ１、Ｔ１、Ｌ１、p１、q１およびｑ２は、各々、上述した好適な基であって良いが、Ｐ１が−ＣＯ−ＮＨ−、−ＮＨ−ＣＯ−または−Ｏ−であることが好ましい。
式５における−（Ｐ２−Ｑ１）q1−は、存在しないか、または上記式３−１〜式３−３で表されるいずれかの構造であることが好適である。
【００６４】
本発明において、核酸複合体は、下記式６−１〜６−９で表される構造を有する核酸複合体であることが好適である。
式６−１：
【００６５】
【化６３】
2020111280.tif 000065
式６−２：
【００６６】
【化６４】
2020111280.tif 000066
式６−３：
【００６７】
【化６５】
2020111280.tif 000067
式６−４：
【００６８】
【化６６】
2020111280.tif 000068
式６−５：
【００６９】
【化６７】
2020111280.tif 000069
式６−６：
【００７０】
【化６８】
2020111280.tif 000070
式６−７：
【００７１】
【化６９】
2020111280.tif 000071
式６−８：
【００７２】
【化７０】
2020111280.tif 000072
式６−９：
【００７３】
【化７１】
2020111280.tif 000073
【００７４】
式６−１〜式６−９中、
Ｘ、Ｓ３、Ｐ３、Ｑ２、Ｔ1、Ｌ１およびｑ２は、それぞれ前記と同義である。
【００７５】
本発明において、核酸複合体は、下記式７−１〜式７−９のいずれかで表される構造を有する核酸複合体であることが好適である。
式７−１：
【００７６】
【化７２】
2020111280.tif 000074
式７−２：
【００７７】
【化７３】
2020111280.tif 000075
式７−３：
【００７８】
【化７４】
2020111280.tif 000076
式７−４：
【００７９】
【化７５】
2020111280.tif 000077
式７−５：
【００８０】
【化７６】
2020111280.tif 000078
式７−６：
【００８１】
【化７７】
2020111280.tif 000079
式７−７：
【００８２】
【化７８】
2020111280.tif 000080
式７−８：
【００８３】
【化７９】
2020111280.tif 000081
式７−９：
【００８４】
【化８０】
2020111280.tif 000082
【００８５】
式７−１〜式７−９中、
Ｘ、Ｌ１、Ｌ２およびＳ３は、それぞれ前記と同義である。Ｌ１とＬ２は同一であってもよく、異なっていてもよく、同一であることが好適である。
式７−１〜式７−９において、各アルキレン基部分を鎖長の異なるアルキレン鎖を導入することにより、また、アミド結合等を他の結合に置換することにより、式７−１〜式７−９で表される構造を有する核酸複合体以外の核酸誘導体を製造することもできる。
【００８６】
本発明において、核酸複合体は、下記式１１で表される構造を有する核酸複合体であることが好適である。
式１１：
【００８７】
【化８１】
2020111280.tif 000083
【００８８】
式１１中、
Ｌ１、Ｌ２、Ｓ１Ｓ２およびＸは、それぞれ前記と同義であり、
Ｐ７およびＰ８は、それぞれ独立して、存在しないか、または、−ＣＯ−、−ＮＨ−、−Ｏ−、−Ｓ−、−Ｏ−ＣＯ−、−Ｓ−ＣＯ−、−ＮＨ−ＣＯ−、−ＣＯ−Ｏ−、−ＣＯ−Ｓ−もしくは−ＣＯ−ＮＨ−であり、
Ｑ５、Ｑ６およびＱ７は、それぞれ独立して、存在しないか、または、置換もしくは無置換の炭素数１〜１２のアルキレンまたは−（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）n8−ＣＨ2ＣＨ2−であり、ｎ８は０〜９９の整数であり、
Ｂ３は、本明細書中ではブランチャーユニットと呼ばれ、下記式１１−１で表されるいずれかの構造であり、破線は、それぞれ、Ｑ５およびＱ６との結合手を意味する。
式１１−１：
【００８９】
【化８２】
2020111280.tif 000084
【００９０】
式１１−１中、トリアゾール環を有する基における置換は、該トリアゾール環の1位および3位の窒素原子のいずれかである。
ｑ５およびｑ６は、それぞれ独立して、０〜１０の整数である。
【００９１】
Ｐ７は、存在しないか、または、−ＣＯ−、−ＮＨ−、−Ｏ−、−Ｓ−、−Ｏ−ＣＯ−、−Ｓ−ＣＯ−、−ＮＨ−ＣＯ−、−ＣＯ−Ｏ−、−ＣＯ−Ｓ−もしくは−ＣＯ−ＮＨ−であるが、−Ｏ−、−ＮＨ−ＣＯ−または-ＣＯ−ＮＨ−であることが好ましく、−Ｏ−または−ＮＨ−ＣＯ−であることがより好ましい。Ｐ７が、例えば、−Ｏ−である場合、ベンゼン環−Ｏ−という部分構造を有する。
【００９２】
Ｐ８は、存在しないか、または、−ＣＯ−、−ＮＨ−、−Ｏ−、−Ｓ−、−Ｏ−ＣＯ−
、−Ｓ−ＣＯ−、−ＮＨ−ＣＯ−、−ＣＯ−Ｏ−、−ＣＯ−Ｓ−もしくは−ＣＯ−ＮＨ−あるが、存在する場合、−ＣＯ−Ｏ−または−ＣＯ−ＮＨ−であることが好ましく、−ＣＯ−ＮＨ−であることがより好ましい。Ｐ８が、例えば、−ＣＯ−ＮＨ−である場合、Ｑ６−ＣＯ−ＮＨ−という部分構造を有する。
【００９３】
Ｑ５、Ｑ６およびＱ７は、それぞれ独立して、存在しないか、または、置換もしくは無置換の炭素数１〜１２のアルキレンまたは−（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）n8−ＣＨ2ＣＨ2−であり、ｎ８は０〜９９の整数であるが、置換もしくは無置換の炭素数１〜１２のアルキレンであることが好ましく、無置換の炭素数１〜１２のアルキレンであることがより好ましく、無置換の炭素数１〜６のアルキレンであることがさらに好ましく、無置換の炭素数１〜４のアルキレンであることがよりさらに好ましい。
【００９４】
−（Ｐ７−Ｑ５）q5−は、−Ｏ−（ＣＨ2）m15−ＮＨ−および−ＮＨ−ＣＯ−（ＣＨ2）m16−ＮＨであり、ｍ１５およびｍ１６は、それぞれ独立して、１〜１０の整数であることが好適である。
【００９５】
本発明において、核酸複合体は、下記式１２−１〜式１２−１２のいずれかで表される構造を有する核酸複合体であることが好適である。
式１２−１：
【００９６】
【化８３】
2020111280.tif 000085
式１２−２：
【００９７】
【化８４】
2020111280.tif 000086
式１２−３：
【００９８】
【化８５】
2020111280.tif 000087
式１２−４：
【００９９】
【化８６】
2020111280.tif 000088
式１２−５：
【０１００】
【化８７】
2020111280.tif 000089
式１２−６：
【０１０１】
【化８８】
2020111280.tif 000090
式１２−７：
【０１０２】
【化８９】
2020111280.tif 000091
式１２−８：
【０１０３】
【化９０】
2020111280.tif 000092
式１２−９：
【０１０４】
【化９１】
2020111280.tif 000093
式１２−１０：
【０１０５】
【化９２】
2020111280.tif 000094
式１２−１１：
【０１０６】
【化９３】
2020111280.tif 000095
式１２−１２：
【０１０７】
【化９４】
2020111280.tif 000096
【０１０８】
式１２−１〜１２−１２中、
Ｘ、Ｌ１、Ｌ２、Ｓ１およびＳ２は、それぞれ前記と同義であり、ｎ１'〜ｎ１２'はそれぞれ独立して、１〜１０の整数である。
【０１０９】
本発明の核酸複合体は、式１で表される核酸複合体において、Ｓ１およびＳ２に対応する式２に記載の構造と、Ｓ３に対応する式１１に記載の構造とを組み合わせた核酸複合体であることが好ましい。式２が、式４−１〜式４−９であってもよく、式６−１〜式６−９であってもよく、式７−１〜式７−９であってもよく、式２が、式４−１〜式４−９、式６−１〜式６−９、あるいは式７−１〜式７−９である場合に、式１１が、式１２−１〜式１２−１２であってもよい。本発明の核酸複合体は、式１で表される核酸複合体において、Ｓ１およびＳ２に対応する式４−１〜式４−９に記載のいずれか１つの構造、およびＳ３に対応する式１２−１〜式１２−１２に記載のいずれか１つの構造とを組み合わせた核酸複合体、Ｓ１およびＳ２に対応する式６−１〜式６−９に記載のいずれか１つの構造および、Ｓ３に対応する式１２−１〜式１２−１２に記載のいずれか１つの構造とを組み合わせた核酸複合体、Ｓ１およびＳ２に対応する式７−１〜式７−９に記載のいずれか１つの構造および、Ｓ３に対応する式１２−１〜式１２−１２に記載のいずれか１つの構造を組み合わせた核酸複合体であることがより好適である。
【０１１０】
本発明の核酸複合体は、下記式７−８−１で表されることが好ましい。
式７−８−１：
【化９５】
2020111280.tif 000097
（式７−８−１中、Ｘは前記と同義である。）
【０１１１】
式1におけるＸは、センス鎖およびアンチセンス鎖からなり、少なくとも11個の塩基対の二重鎖領域を含む二本鎖核酸であり、該二本鎖核酸は、該アンチセンス鎖中の、17個〜30個のヌクレオチドの鎖長のオリゴヌクレオチド鎖において、表1-1〜表1-13に記載された標的APCS mRNA配列のいずれかと相補的である。センス鎖の3'末端または5'末端がＳ３に結合するため、式1において、Ｓ３と結合するＸは、二本鎖核酸を構成するセンス鎖であり、後述する表1-1〜表1-13または表M1-1〜表M1-3および表R-1〜表R-2中のセンス鎖配列であらわされるセンス鎖である。
【０１１２】
本発明において、APCS mRNAに対して相補的な塩基配列を含む核酸をアンチセンス鎖核酸と称し、アンチセンス鎖核酸の塩基配列に対して相補的な塩基配列を含む核酸をセンス鎖核酸とも称する。
【０１１３】
本発明の核酸複合体を構成する二本鎖核酸は、哺乳動物細胞に導入された場合、APCS遺伝子の発現を低下または停止させる能力を有する二本鎖核酸であって、センス鎖およびアンチセンス鎖を有する二本鎖核酸である。また、該センス鎖と該アンチセンス鎖とは少なくとも11個の塩基対を有し、該アンチセンス鎖中の、少なくとも17個のヌクレオチドかつ多くとも30個の、すなわち、17個〜30個のヌクレオチドの鎖長のオリゴヌクレオチド鎖が、表1-1〜表1-13に記載された群から選択される標的APCS mRNA配列と相補的である。
【０１１４】
本発明の核酸複合体を構成する二本鎖核酸は、ヌクレオチドまたは該ヌクレオチドと同等の機能を有する分子が重合した重合体であれば、いかなる二本鎖核酸であってもよい。そのような重合体としては、例えばリボヌクレオチドの重合体であるRNA、デオキシリボヌクレオチドの重合体であるDNA、RNAとDNAとからなるキメラ核酸、およびこれらの核酸の少なくとも一つのヌクレオチドが該ヌクレオチドと同等の機能を有する分子で置換されたヌクレオチド重合体が挙げられる。また、これらの核酸内にヌクレオチドと同等の機能を有する分子を少なくとも一つ含む誘導体も、本発明で用いられる薬物としての二本鎖核酸に含まれる。またウラシル（U）は、チミン（T）に一義的に読み替えることができる。
【０１１５】
ヌクレオチドと同等の機能を有する分子としては、例えばヌクレオチド誘導体等が挙げられる。ヌクレオチド誘導体としては、ヌクレオチドに修飾を施した分子であればいかなる分子であってもよいが、例えばRNAまたはDNAと比較して、ヌクレアーゼ耐性の向上もしくは安定化させるため、相補鎖核酸とのアフィニティーを上げるため、細胞透過性を上げるため、または可視化させるために、リボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチドに修飾を施した分子等が好適に用いられる。
【０１１６】
ヌクレオチドに修飾を施した分子としては、例えば糖部修飾ヌクレオチド、リン酸ジエステル結合修飾ヌクレオチド、塩基修飾ヌクレオチド、ならびに糖部、リン酸ジエステル結合および塩基の少なくとも一つが修飾されたヌクレオチド等が挙げられる。
【０１１７】
糖部修飾ヌクレオチドとしては、ヌクレオチドの糖の化学構造の一部あるいは全てに対し、任意の置換基で修飾もしくは置換したもの、または任意の原子で置換したものであればいかなるものでもよいが、2'-修飾ヌクレオチドが好ましく用いられる。
【０１１８】
2'-修飾ヌクレオチドとしては、例えばリボースの2'-OH基がH、OR、R、R'OR、SH、SR、NH2、NHR、NR2、N3、CN、F、Cl、BrおよびIからなる群(Rはアルキルまたはアリール、好ましくは炭素数1〜6のアルキルであり、R'はアルキレン、好ましくは炭素数1〜6のアルキレンである)から選択される置換基で置換されたヌクレオチドであり、より好ましくは2'-OH基がH、Fまたはメトキシ基で置換されたヌクレオチドであり、さらに好ましくは2'-OH基がFまたはメトキシ基で置換されたヌクレオチドである。また、2'-OH基が2-(methoxy)ethoxy基、3-aminopropoxy基、2-[(N,N-dimethylamino)oxy]ethoxy基、3-(N,N-dimethylamino)propoxy基、2-[2-(N,N-dimethylamino)ethoxy]ethoxy基、2-(methylamino)-2-oxoethoxy基、2-(N-methylcarbamoyl)etoxy 基および2-cyanoetoxy 基からなる群から選択される置換基で置換されたヌクレオチド等も挙げられる。
二本鎖核酸領域内のヌクレオチドに対して、2'-修飾ヌクレオチドは、50〜100％含まれることが好ましく、70〜100％含まれることがより好ましく、90〜100％含まれることがさらに好ましい。また、センス鎖のヌクレオチドに対して、2'-修飾ヌクレオチドは、20〜100％含まれることが好ましく、40〜100％含まれることがより好ましく、60％〜100％含まれることがさらに好ましい。また、アンチセンス鎖のヌクレオチドに対して、2'-修飾ヌクレオチドは、20〜100％含まれることが好ましく、40〜100％含まれることがより好ましく、60〜100%含まれることがさらに好ましい。
【０１１９】
リン酸ジエステル結合修飾ヌクレオチドとしては、ヌクレオチドのリン酸ジエステル結合の化学構造の一部あるいは全てに対し、任意の置換基で修飾もしくは置換したもの、または任意の原子で置換したものであればいかなるものでもよく、例えば、リン酸ジエステル結合がホスホロチオエート結合に置換されたヌクレオチド、リン酸ジエステル結合がホスホロジチオエート結合に置換されたヌクレオチド、リン酸ジエステル結合がアルキルホスホネート結合に置換されたヌクレオチド、リン酸ジエステル結合がホスホロアミデート結合に置換されたヌクレオチド等が挙げられる。
【０１２０】
塩基修飾ヌクレオチドとしては、ヌクレオチドの塩基の化学構造の一部あるいは全てに対し、任意の置換基で修飾もしくは置換したもの、または任意の原子で置換したものであればいかなるものでもよく、例えば、塩基内の酸素原子が硫黄原子で置換されたもの、水素原子が炭素数1〜6のアルキル基、ハロゲン等で置換されたもの、メチル基が水素、ヒドロキシメチル、炭素数2〜6のアルキル基等で置換されたもの、アミノ基が炭素数1〜6のアルキル基、炭素数1〜6のアルカノイル基、オキソ基、ヒドロキシ基等に置換されたものが挙げられる。
【０１２１】
ヌクレオチド誘導体としては、ヌクレオチドまたは糖部、リン酸ジエステル結合もしくは塩基の少なくとも一つが修飾されたヌクレオチド誘導体に、ペプチド、蛋白質、糖、脂質、リン脂質、フェナジン、フォレート、フェナントリジン、アントラキノン、アクリジン、フルオレセイン、ローダミン、クマリン、色素等、別の化学物質を、直接またはリンカーを介して付加したものも挙げられ、具体的には、5'-ポリアミン付加ヌクレオチド誘導体、コレステロール付加ヌクレオチド誘導体、ステロイド付加ヌクレオチド誘導体、胆汁酸付加ヌクレオチド誘導体、ビタミン付加ヌクレオチド誘導体、Cy5付加ヌクレオチド誘導体、Cy3付加ヌクレオチド誘導体、6-FAM付加ヌクレオチド誘導体、およびビオチン付加ヌクレオチド誘導体等が挙げられる。
ヌクレオチド誘導体は、核酸内の他のヌクレオチドまたはヌクレオチド誘導体とアルキレン構造、ペプチド構造、ヌクレオチド構造、エーテル構造、エステル構造、およびこれらの少なくとも一つを組み合わせた構造等の架橋構造を形成してもよい。
【０１２２】
本明細書において「相補」とは、2つの塩基間で塩基対合をし得る関係を意味し、例えば、アデニンとチミンまたはウラシルとの関係、並びにグアニンとシトシンとの関係のように緩やかな水素結合を介して、二重鎖領域全体として2重螺旋構造をとるものをいう。
【０１２３】
本明細書において「相補的」とは、2つのヌクレオチド配列が完全に相補する場合だけでなく、該ヌクレオチド配列間で0〜30％、0〜20％または0〜10％のミスマッチ塩基を有することができ、例えば、APCS mRNAに対して相補的なアンチセンス鎖は、該mRNAの部分塩基配列と完全に相補する塩基配列において、1つまたは複数の塩基の置換を含んでよいことを意味する。具体的には、アンチセンス鎖は、標的遺伝子の標的配列に対して1〜8個、好ましくは1〜6個、1〜4個、1〜3個、特に2個または1個のミスマッチ塩基を有していてもよい。例えば、アンチセンス鎖が21塩基長の場合には、標的遺伝子の標的配列に対して6個、5個、4個、3個、2個または1個のミスマッチ塩基を有してもよく、そのミスマッチの位置は、それぞれの配列の5'末端または3'末端であってもよい。
また、「相補的」とは、一方のヌクレオチド配列が、他方のヌクレオチド配列と完全に相補する塩基配列において、１つまたは複数の塩基が付加および／または欠失した配列である場合を包含する意味である。例えば、APCS mRNAと本発明のアンチセンス鎖核酸とは、アンチセンス鎖における塩基の付加および／または欠失により、アンチセンス鎖および／または標的APCS mRNA領域に1個または2個のバルジ塩基を有してもよい。
【０１２４】
本発明で用いられる薬物としての二本鎖核酸は、APCS mRNAの一部の塩基配列に対して相補的な塩基配列を含む核酸および／または該核酸の塩基配列に対して相補的な塩基配列を含む核酸であれば、いずれのヌクレオチドまたはその誘導体から構成されていてもよい。本発明の二本鎖核酸は、標的APCS mRNA配列に対して相補的な塩基配列を含む核酸と、該核酸の塩基配列に対して相補的な塩基配列を含む核酸とが、少なくとも11個の塩基対の二重鎖を形成することができればいずれの長さでもよいが、二重鎖を形成できる配列の長さは、通常11〜27塩基であり、15〜25塩基が好ましく、17〜23塩基がより好ましく、19〜23塩基がさらに好ましい。
【０１２５】
本発明の核酸複合体のアンチセンス鎖としては、標的APCS mRNA配列に対して相補的な塩基配列を含む核酸が用いられるが、該核酸のうち1〜3塩基、好ましくは1〜2塩基、より好ましくは1塩基が欠失、置換または付加したものを用いてもよい。
【０１２６】
APCSの発現を抑制する核酸としては、標的APCS mRNA配列に対して相補的な塩基配列を含む核酸であって、かつAPCSの発現を抑制する一本鎖核酸、もしくは標的APCS mRNA配列に対して相補的な塩基配列を含む核酸と、該核酸の塩基配列に対して相補的な塩基配列を含む核酸とからなり、かつAPCSの発現を抑制する二本鎖核酸が好適に用いられる。
【０１２７】
二本鎖核酸を構成する一本鎖のアンチセンス鎖核酸およびセンス鎖核酸は、それぞれ同一または異なって、通常11〜30塩基からなるが、それぞれ同一又は異なって、17〜27塩基からなることが好ましく、17〜25塩基からなることがより好ましく、19〜25塩基からなることがさらに好ましく、21または23塩基からなることがよりさらに好ましい。
【０１２８】
本発明で用いられる薬物としての二本鎖核酸において、二重鎖領域に続く3'側または5'側に二重鎖を形成しない追加のヌクレオチドまたはヌクレオチド誘導体を有する場合には、これを突出部(オーバーハング)と呼ぶ。突出部を有する場合には、突出部を構成するヌクレオチドはリボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチドまたはこれらの誘導体であってもよい。
【０１２９】
突出部を有する二本鎖核酸としては、少なくとも一方の鎖の3'末端または5'末端に1〜6塩基、通常は1〜3塩基からなる突出部を有するものが用いられるが、2塩基からなる突出部を有するものが好ましく用いられ、例えば、dTdT(dTはデオキシチミジンを表す)またはUU(Uはウリジンを表す)からなる突出部を有するものが挙げられる。突出部は、アンチセンス鎖のみ、センス鎖のみ、およびアンチセンス鎖とセンス鎖の両方に有することができるが、本発明において、アンチセンス鎖に突出部を有する二本鎖核酸が好ましく用いられる。なお、アンチセンス鎖は、二重鎖領域とそれに続く突出部とを含む、17個〜30個のヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチド鎖において、表1-1〜表1-13に記載された群から選択される標的APCS mRNA配列のいずれかと十分に相補的である。さらに、本発明の二本鎖核酸としては、例えばDicer等のリボヌクレアーゼの作用により二本鎖核酸を生成する核酸分子(WO2005/089287)や、3'末端や5'末端の突出部を有さず平滑末端を形成する二本鎖核酸、センス鎖のみが突出した二本鎖核酸（US2012/0040459）等を用いることもできる。
【０１３０】
本発明の核酸複合体を構成する二本鎖核酸としては、標的遺伝子の塩基配列またはその相補鎖の塩基配列と同一の配列からなる核酸を用いてもよいが、該核酸の少なくとも一方の鎖の5'末端または3'末端が1〜4塩基削除された核酸と、該核酸の塩基配列に対して相補的な塩基配列を含む核酸とからなる二本鎖核酸を用いてもよい。
【０１３１】
本発明の核酸複合体を構成する二本鎖核酸は、RNA同士が二重鎖を形成した二本鎖RNA（dsRNA）、DNA同士が二重鎖を形成した二本鎖DNA（dsDNA）、またはRNAとDNAが二重鎖を形成したハイブリッド核酸であってもよい。あるいは、二本鎖のうちの一方もしくは両方の鎖がDNAとRNAとのキメラ核酸であってもよい。好ましくは二本鎖RNA（dsRNA）である。
【０１３２】
本発明の核酸複合体のアンチセンス鎖の5'末端から2番目のヌクレオチドは、標的APCS mRNA配列の3'末端から2番目のデオキシリボヌクレオチドと相補であることが好ましく、アンチセンス鎖の5'末端から2〜7番目のヌクレオチドが、標的APCS mRNA配列の3'末端から2〜7番目のデオキシリボヌクレオチドと完全に相補であることがより好ましく、アンチセンス鎖の5'末端から2〜11番目のヌクレオチドが、標的APCS mRNA配列の3'末端から2〜11番目のデオキシリボヌクレオチドと完全に相補であることがさらに好ましい。また、本発明の核酸におけるアンチセンス鎖の5'末端から11番目のヌクレオチドが、標的APCS mRNA配列の3'末端から11番目のデオキシリボヌクレオチドと相補であることが好ましく、アンチセンス鎖の5'末端から9〜13番目のヌクレオチドが、標的APCS mRNA配列の3'末端から9〜13番目のデオキシリボヌクレオチドと完全に相補であることがより好ましく、アンチセンス鎖の5'末端から7〜15番目のヌクレオチドが、標的APCS mRNA配列の3'末端から7〜15番目のデオキシリボヌクレオチドと完全に相補であることがさらに好まし
い。
【０１３３】
本発明の核酸複合体のアンチセンス鎖およびセンス鎖は、例えば、Genbank Accession No. NM_001639.3として登録されているヒトAPCSの完全長mRNAのcDNA（センス鎖）の塩基配列（配列番号1)に基づいて設計することができる。
【０１３４】
二本鎖核酸は、APCS遺伝子配列内の標的配列と相互作用するように設計することができる。
【０１３５】
二本鎖核酸の1つの鎖の配列は、上記した標的部位配列に対して相補的である。二本鎖核酸は、本明細書に記述された方法を使用して、化学的に合成することができる。
【０１３６】
RNAは、酵素的または部分/全有機合成によって生成してもよく、また修飾されたリボヌクレオチドは、インビトロで酵素的または有機合成によって導入することができる。一つの態様において、それぞれの鎖は、化学的に調製される。RNA分子を化学的に合成する方法は、当該技術分野において公知である[ヌクレイックアシッズリサーチ（Nucleic Acids Research）、1998年、第32巻、p.936-948参照]。一般に、二本鎖核酸は、固相オリゴヌクレオチド合成法を使用することによって合成することができる(例えば、Usman et al.,米国特許第5,804,683号明細書;米国特許第5,831,071号明細書;米国特許第5,998,203号明細書;米国特許第6,117,657号明細書;米国特許第6,353,098号明細書;米国特許第6,362,323号明細書;米国特許第6,437,117号明細書;米国特許第6,469,158号明細書;Scaringe et al.,米国特許第6,111,086号明細書;米国特許第6,008,400号明細書;米国特許第6,111,086号明細書を参照)。
【０１３７】
一本鎖核酸は、固相ホスホロアミダイト法（ヌクレイックアシッズリサーチ（Nucleic Acids Research)、1993年、第30巻、p.2435-2443参照)を使用して合成され、脱保護され、およびNAP-5カラム(Amersham Pharmacia Biotech、Piscataway、NJ)上で脱塩される。オリゴマーは、15分工程のリニア勾配を使用するAmersham Source 15Qカラム-1.0cm。高さ.25 cm (Amersham Pharmacia Biotech、Piscataway、NJ)でのイオン交換高性能液体クロマトグラフィー(IE-HPLC)を使用して精製する。勾配は、90:10の緩衝液A:Bから52:48の緩衝液A:Bに変化し、緩衝液Aは100mmol/L Tris pH 8.5であり、および緩衝液Bは、100mmol/L Tris pH 8.5(1mol/LのNaCl)である。試料は、260nmにてモニターされ、全長オリゴヌクレオチド種に対応するピークは、収集され、プールされ、NAP-5カラムで脱塩され、および凍結乾燥される。
【０１３８】
各一本鎖核酸の純度は、Beckman PACE 5000(Beckman Coulter、Inc., Fullerton, Calif)でのキャピラリー電気泳動(CE)によって決定される。CEキャピラリーは、100μmの内径を有し、ssDNA 100R Gel(Beckman-Coulter)を含む。典型的には、約0.6nmoleのオリゴヌクレオチドをキャピラリーに注射して、444V/cmの電界において実行して、260nmにおけるUV吸光度によって検出される。変性トリス-ホウ酸-7mol/L-尿素泳動緩衝液は、Beckman-Coulterから購入する。以下に記述した実験に使用するための、CEによって評価すると少なくとも90%純粋である一本鎖核酸が得られる。化合物同一性は、製造業者の推奨プロトコルにしたがって、Voyager DE.TM.Biospectometryワークステーション(Applied Biosystems、Foster City,、Calif.)でのマトリックス支援レーザー脱離イオン化-飛行時間型(MALDI-TOF)質量分光法によって検証される。一本鎖核酸の相対的な分子質量は、予想される分子質量の0.2%以内で得ることができる。
【０１３９】
一本鎖核酸は、100mmol/L 酢酸カリウム、30mmol/L HEPES、pH 7.5からなる緩衝液中に100μmol/L濃度にて再懸濁させる。相補的センス鎖およびアンチセンス鎖を同等のモル量で混合して、50μmol/L二本鎖核酸の最終溶液を得る。試料を95℃まで5分間加熱して、使用前に室温に冷却させる。二本鎖核酸は、-20℃にて保存する。一本鎖核酸は、凍結乾燥させるか、またはヌクレアーゼフリー水中に、-80℃で貯蔵する。
【０１４０】
本発明におけるセンス鎖およびアンチセンス鎖からなり、少なくとも11個の塩基対の二重鎖領域を含み、該アンチセンス鎖中の、11個〜30個のヌクレオチドの鎖長のオリゴヌクレオチド鎖において、後述する表1-1〜表1-13に記載された群から選択される標的APCS mRNA配列と相補的な二本鎖核酸として、表M1-1〜表M1-3および表R-3〜表R-4、並びに表1-1〜表1-13に記載されたアンチセンス鎖から成る群から選択される配列を含む二本鎖核酸か、後述する表M1-1〜表M1-3および表R-1〜表R-2、ならびに表1-1〜表1-13に記載されたセンス鎖から成る群から選択される配列を含む二本鎖核酸か、あるいは表M1-1〜表M1-3および表R-1〜表R-4、ならびに表1-1〜表1-13に記載のセンス鎖／アンチセンス鎖から成る群から選択される１対のセンス鎖／アンチセンス鎖の配列を含む二本鎖核酸を用いてよい。
【０１４１】
すなわち、本発明で用いられる核酸複合体を構成する二本鎖核酸の具体例は、表M1-1〜表M1-3および表R-1〜表R-4、ならびに表1-1〜表1-13中のセンス鎖およびアンチセンス鎖から成る二本鎖核酸である。なお、表M1-1〜表M1-3および表R-1〜表R-4中、N(M)は2'-O-メチル修飾RNA、N(F)は2'-フッ素修飾RNA、および＾はホスホロチオエートを示す。また、表1-1〜表1-13、および表M1-1〜表M1-3および表R-3〜表R-4に記載のアンチセンス鎖配列の5'末端ヌクレオチドは、5'末端においてリン酸化されていてもよく、リン酸化されていなくてもよいが、リン酸化されていることが好ましい。
【０１４２】
表1-1〜表1-13に記載のセンス鎖／アンチセンス鎖の配列を含む二本鎖核酸は、1nM添加時のノックダウン活性の測定において、二本鎖核酸を加えていない条件に対して二本鎖核酸を加えた時の、APCSの相対的発現量が0.50以下であるものが好ましく、0.30以下であるものがより好ましく、0.20以下であるものがさらに好ましく、0.10以下であるものが最も好ましい。
本発明におけるオリゴヌクレオチドは、2'-修飾ヌクレオチドを含む二本鎖核酸であってよく、表M1〜表M3に記載のものが好ましく、1nM添加時のノックダウン活性の測定において、二本鎖核酸を加えていない条件に対して二本鎖核酸を加えた時のAPCSの相対的発現量が0.10以下であるものがより好ましい。
上記の好ましい二本鎖核酸と公知のリガンドリンカーを組み合わせた核酸複合体も本発明に含まれる。公知のリガンドリンカーとしては、例えば、国際公開第２００９／０７３８０９号および国際公開第２０１３／０７５０３５号に開示されているものが挙げられる。
【０１４３】
本発明の核酸複合体は、表S1で記載されている核酸複合体（化合物１−２〜化合物４３−２）が好ましく、核酸複合体を終濃度として3 nM添加時のノックダウン活性の測定において、核酸複合体を加えていない陰性対照に対して核酸複合体を加えた時のAPCSの相対的発現量が0.50以下である核酸複合体がより好ましい。核酸複合体の具体例としては、化合物１−２、５−２、９−２、１０−２、１５−２、２０−２、３３−２、３５−２が挙げられる。
【０１４４】
本発明の核酸複合体の製造法について説明する。なお、以下に示す製造法において、定義した基が該製造法の条件下で変化するかまたは該製造法を実施するのに不適切な場合、有機合成化学で常用される保護基の導入および除去方法［例えば、プロテクティブ・グループス・イン・オーガニック・シンセシス第３版（Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  Ｇｒｏｕｐｓ  ｉｎ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，  ｔｈｉｒｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ）、グリーン（Ｔ．Ｗ．Ｇｒｅｅｎｅ）著、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ  Ｉｎｃ．（１９９９年）等に記載の方法］等を用いることにより、目的化合物を製造することができる。また、必要に応じて置換基導入等の反応工程の順序を変えることもできる。
式１で表される核酸複合体は、固相合成によっても合成することができる。
【０１４５】
式１で表される核酸複合体は、核酸複合体として公知のリンカー構造の合成方法を参考にして合成することができる。
式１で表される核酸複合体における、Ｓ１をリンカーとしたＬ１−ベンゼン環ユニットやＳ２をリンカーとしたＬ２−ベンゼン環ユニットの合成は、例えば、式２で表される核酸複合体を例として説明する。
式２で表される核酸複合体におけるＬ１−ベンゼン環ユニットやＬ２−ベンゼン環ユニットは、Ｐ１、Ｐ２、Ｐ３、Ｐ４、Ｐ５、およびＰ６ならびにＴ１およびＴ２により連結している。
Ｐ１、Ｐ２、Ｐ３、Ｐ４、Ｐ５、およびＰ６ならびにＴ１およびＴ２の−ＣＯ−、−ＮＨ−、−Ｏ−、−Ｓ−、−Ｏ−ＣＯ−、−Ｓ−ＣＯ−、−ＮＨ−ＣＯ−、−ＣＯ−Ｏ−、−ＣＯ−Ｓ−または−ＣＯ−ＮＨ−結合は、例えば、第４版実験化学講座１９「有機化合物の合成Ｉ」丸善（１９９２年）、第４版実験化学講座２０「有機化合物の合成ＩＩ」、丸善（１９９２年）等に記載の結合反応の方法を参考にして、式２で表される構造を形成するのに適切な原料を選択することにより適宜合成することができる。
また、ベンゼン環から順次、Ｑ１を部分構造として有する化合物、Ｂ１を部分構造として有する化合物を結合させることで、Ｌ１−ベンゼン環ユニットの部分構造を製造することができる。
Ｌ１とＱ２を部分構造として有する化合物を別途合成し、Ｌ１とＱ２を部分構造として有する化合物をベンゼン環、Ｑ１およびＢ１を部分構造として有するＬ１−ベンゼン環ユニットの部分構造を有する化合物と結合させることにより、Ｌ１−ベンゼン環ユニット構造を製造することができる。
Ｌ２−ベンゼン環ユニットについても同様に、ベンゼン環から順次、Ｑ３を部分構造として有する化合物、Ｂ２を部分構造として有する化合物を結合させることで、Ｌ２−ベンゼン環ユニットの部分構造を製造することができる。
Ｌ２とＱ４を部分構造として有する化合物を別途合成し、Ｌ２とＱ４を部分構造として有する化合物をベンゼン環、Ｑ３およびＢ２を部分構造として有するＬ２−ベンゼン環ユニットの部分構造を有する化合物と結合させることにより、Ｌ２−ベンゼン環ユニット構造を製造することができる。
【０１４６】
Ｑ１を部分構造として有する化合物、Ｑ３を部分構造として有する化合物としては、炭素数１〜１０のアルキレンまたは−（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）n−ＣＨ2ＣＨ2−の両末端に、水酸基、カルボキシル基、アミノ基、チオール基を有する化合物が挙げられる。
Ｂ１を部分構造として有する化合物、Ｂ２を部分構造として有する化合物としては、下記式２−１で表されるいずれかの構造を有し、各構造における末端の黒丸点において、それぞれ、水酸基、カルボキシル基、アミノ基、またはチオール基を有する化合物が挙げられる。
式２−１：
【０１４７】
【化９６】
2020111280.tif 000098
【０１４８】
Ｂ１を部分構造として有する化合物、Ｂ２を部分構造として有する化合物の具体例としては、グリコール、グルタミン酸、アスパラギン酸、リジン、Ｔｒｉｓ、イミノ二酢酸、２−アミノ−１，３−プロパンジオール等が挙げられ、グルタミン酸、アスパラギン酸、リジン、イミノ二酢酸が好ましい。具体的には、Ｂ１およびＢ２は以下の構造が好ましい。
【０１４９】
【化９７】
2020111280.tif 000099
【０１５０】
Ｌ１、Ｑ２およびＢ１を部分構造として有する化合物を合成してから、Ｑ１とベンゼン環を有する化合物と結合することにより、Ｌ１−ベンゼン環ユニット構造を製造してもよい。
Ｌ２、Ｑ４およびＢ２を部分構造として有する化合物を合成してから、Ｑ３とベンゼン環を有する化合物と結合することにより、Ｌ２−ベンゼン環ユニット構造を製造してもよい。
本発明においては、［Ｌ１−Ｔ１−（Ｑ２−Ｐ３）q2−］p1−Ｂ１−（Ｐ２−Ｑ１）q1−Ｐ１−である部分構造と、［Ｌ２−Ｔ２−（Ｑ３−Ｐ６）q4−］p2−Ｂ２−（Ｐ５−Ｑ３）q3−Ｐ２−である部分構造とは同一または異なっていても良いが、同一であることが好ましい。
【０１５１】
糖リガンドのＬ１−Ｔ１−Ｑ２に相当するユニットとして、例えば、Ｌ３−Ｔ１−Ｑ２−ＣＯＯＨ、Ｌ３−Ｔ１−（Ｑ２−Ｐ３）q2-1−Ｑ２−ＮＨ2等が挙げられる。具体的には、Ｌ３−Ｏ―炭素数１〜１２のアルキレン―ＣＯＯＨや、Ｌ３−炭素数１〜１２のアルキレン−ＣＯ−ＮＨ−炭素数２〜１２のアルキレン−ＮＨ2等が挙げられる。
Ｌ３は、脱保護することにより、Ｌ１となる糖リガンド誘導体であれば特に限定されない。糖リガンドの置換基としては、糖質化学の分野で汎用される置換基であれば特に限定されないが、Ａｃ基が好ましい。
【０１５２】
Ｓ１をリンカーとしたＬ１−ベンゼン環ユニットやＳ２をリンカーとしたＬ２−ベンゼン環ユニットの合成は、具体的には実施例に記載の方法を参考にして、アルキレン鎖の炭素数を適宜増減し、また、末端アミノ基や末端カルボキシル基を、−ＣＯ−、−ＮＨ−、−Ｏ−、−Ｓ−、−Ｏ−ＣＯ−、−Ｓ−ＣＯ−、−ＮＨ−ＣＯ−、−ＣＯ−Ｏ−、−ＣＯ−Ｓ−または−ＣＯ−ＮＨ−結合を形成し得る基に変換した化合物を用いることにより、合成することができる。また、Ｌ１の糖リガンドについても、実施例においては、マンノースまたはＮ−アセチルガラクトサミンを例示しているが、他の糖リガンドに変更して実施することができる。
【０１５３】
式１で表される核酸複合体における、Ｓ３をリンカーとしたＸ−ベンゼン環ユニットの合成は、例えば、式１２で表される核酸複合体を例として説明する。
式１２で表される核酸複合体におけるＸ−ベンゼン環ユニットは、オリゴヌクレオチドの結合以外に、Ｐ７およびＰ８により表される結合を有する。
Ｐ７およびＰ８の−ＣＯ−、−ＮＨ−、−Ｏ−、−Ｓ−、−Ｏ−ＣＯ−、−Ｓ−ＣＯ−、−ＮＨ−ＣＯ−、−ＣＯ−Ｏ−、−ＣＯ−Ｓ−または−ＣＯ−ＮＨ−結合は、例えば、第４版実験化学講座１９「有機化合物の合成Ｉ」丸善（１９９２年）、第４版実験化学講座２０「有機化合物の合成ＩＩ」、丸善（１９９２年）に記載の結合反応の方法を参考にして、式１２で表される構造を形成するのに適切な原料を選択することにより適宜合成することができる。
また、ベンゼン環から順次、Ｑ５を部分構造として有する化合物、Ｂ３を部分構造として有する化合物を結合させることで、Ｘ−ベンゼン環ユニットの部分構造を製造することができる。
【０１５４】
ＸとＱ７を部分構造として有する化合物や、ＸとＱ６を部分構造として有する化合物を別途合成し、ＸとＱ７を部分構造として有する化合物やＸとＱ６を部分構造として有する化合物をベンゼン環およびＱ５を部分構造として有するＸ−ベンゼン環ユニットの部分構造を有する化合物と結合させて、Ｂ３部分を構築することにより、Ｘ−ベンゼン環ユニット構造を製造することができる。
具体的には、ベンゼン環およびＱ５を部分構造として有するＸ−ベンゼン環ユニットの部分構造を有する化合物の末端にアジド基を有する場合を例にとると、実施例に開示するような末端結合性官能基化したオリゴヌクレオチドを反応させることにより、環化付加させて、トリアゾール環を形成させて、Ｂ３部分を構築することにより、Ｘ−ベンゼン環ユニット構造を製造することができる。
【０１５５】
Ｑ５を部分構造として有する化合物、Ｑ６を部分構造として有する化合物、Ｑ７を部分構造として有する化合物としては、炭素数１〜１０のアルキレンまたは−（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）n8−ＣＨ2ＣＨ2−の両末端に、水酸基、カルボキシル基、アミノ基、チオール基を有する化合物が挙げられる。
【０１５６】
Ｌ１−ベンゼン環ユニット構造、Ｌ２−ベンゼン環ユニット構造と、Ｘ−ベンゼン環ユニット構造とは、それぞれ順次製造していくことができるが、Ｌ１−ベンゼン環ユニット構造およびＬ２−ベンゼン環ユニット構造を合成してから、Ｘ−ベンゼン環ユニット構造を結合させることが好ましい。特に、オリゴヌクレオチド部分を有するＸについては、糖リガンド複合体合成の最終工程近くで化合物内に導入することが好ましい。
【０１５７】
本発明においては、下記式８〜式１０で表される化合物が合成中間体として得られる。
式８：
【０１５８】
【化９８】
2020111280.tif 000100
【０１５９】
（式８中、
Ｒ１およびＲ２は、それぞれ独立して、水素原子、ｔ−ブトキシカルボニル基（Ｂｏｃ基）、ベンジルオキシカルボニル基（Ｚ基）、９−フルオレニルメチルオキシカルボニル基（Ｆｍｏｃ基）、−ＣＯ−Ｒ４、または−ＣＯ−Ｂ４−［（Ｐ９−Ｑ８）q7−Ｔ３−Ｌ３］p3であり、
Ｐ９およびＴ３は、それぞれ独立して、存在しないか、または、−ＣＯ−、−ＮＨ−、−Ｏ−、−Ｓ−、−Ｏ−ＣＯ−、−Ｓ−ＣＯ−、−ＮＨ−ＣＯ−、−ＣＯ−Ｏ−、−ＣＯ−Ｓ−もしくは−ＣＯ−ＮＨ−であり、
Ｑ８は、存在しないか、または、置換もしくは無置換の炭素数１〜１２のアルキレンまたは−（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）n1−ＣＨ2ＣＨ2−であり、ｎ１は０〜９９の整数であり、
Ｂ４は、それぞれ独立して、結合手であるか、または、下記式８−１で表されるいずれかの構造であり、各構造における末端の黒丸点は、それぞれ、カルボニル基またはＰ９との結合点であり、ｍ７、ｍ８、ｍ９およびｍ１０は、それぞれ独立して、０〜１０の整数であり、
式８−１：
【０１６０】
【化９９】
2020111280.tif 000101
【０１６１】
ｐ３は、１、２または３の整数であり、
ｑ７は、０〜１０の整数であり、
Ｌ３は、糖リガンドであり、
Ｙは-Ｏ−（ＣＨ2）m11−ＮＨ−および−ＮＨ−ＣＯ−（ＣＨ2）m12−ＮＨであり、ｍ１１およびｍ１２は、それぞれ独立して、１〜１０の整数であり、
Ｒ３は、水素原子、ｔ−ブトキシカルボニル基、ベンジルオキシカルボニル基、９−フルオレニルメチルオキシカルボニル基、−ＣＯ−Ｒ４、−ＣＯ−（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）n2−ＣＨ2ＣＨ2−Ｎ3、または−ＣＯ−Ｑ９−Ｂ５−（Ｑ１０−Ｐ１０）q8−Ｘ１あり、ｎ２は０〜９９の整数であり、
Ｐ１０は、存在しないか、または、−ＣＯ−、−ＮＨ−、−Ｏ−、−Ｓ−、−Ｏ−ＣＯ−、−Ｓ−ＣＯ−、−ＮＨ−ＣＯ−、−ＣＯ−Ｏ−、−ＣＯ−Ｓ−もしくは−ＣＯ−ＮＨ−であり、
Ｑ９およびＱ１０は、それぞれ独立して、存在しないか、または、置換もしくは無置換の炭素数１〜１２のアルキレンまたは−（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）n3−ＣＨ2ＣＨ2−であり、ｎ３は０〜９９の整数であり、
Ｂ５は、下記式８−２で表されるいずれかの構造であり、破線において、それぞれ、Ｑ９およびＱ１０との結合手を意味し、
式８−２：
【０１６２】
【化１００】
2020111280.tif 000102
【０１６３】
式８−２中、トリアゾール環を有する基における置換は、該トリアゾール環の1位および3位の窒素原子のいずれかである。
ｑ８は、０〜１０の整数であり、
Ｘ１は、水素原子または固相担体であり、
Ｒ４は、ｔ−ブトキシカルボニル基、ベンジルオキシカルボニル基、９−フルオレニルメチルオキシカルボニル基で置換もしくは無置換のアミノ基、カルボキシ基、マレイミド基、およびアラルキルオキシカルボニル基からなる群から選択される１または２個の置換基で置換された炭素数２〜１０のアルキル基である。）
【０１６４】
式９：
【０１６５】
【化１０１】
2020111280.tif 000103
【０１６６】
（式９中、
Ｒ５およびＲ６は、それぞれ独立して、水素原子、ｔ−ブトキシカルボニル基、ベンジルオキシカルボニル基、９−フルオレニルメチルオキシカルボニル基、−ＣＯ−Ｒ４'、または−ＣＯ−Ｑ１１−（Ｐ１１−Ｑ１１'）q9−Ｔ４−Ｌ４であり、
Ｐ１１およびＴ４は、それぞれ独立して、存在しないか、または、−ＣＯ−、−ＮＨ−、−Ｏ−、−Ｓ−、−Ｏ−ＣＯ−、−Ｓ−ＣＯ−、−ＮＨ−ＣＯ−、−ＣＯ−Ｏ−、−ＣＯ−Ｓ−もしくは−ＣＯ−ＮＨ−であり、
Ｑ１１およびＱ１１'は、存在しないか、または、置換もしくは無置換の炭素数１〜１２のアルキレンまたは−（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）n4−ＣＨ2ＣＨ2−であり、ｎ４は０〜９９の整数であり、
ｑ９は、０〜１０の整数であり、
Ｌ４は、糖リガンドであり、
Ｙ'は-Ｏ−（ＣＨ2）m11'−ＮＨ−および−ＮＨ−ＣＯ−（ＣＨ2）m12'−ＮＨであり、ｍ１１'およびｍ１２'は、それぞれ独立して、１〜１０の整数であり、
Ｒ３'は、水素原子、ｔ−ブトキシカルボニル基、ベンジルオキシカルボニル基、９−フルオレニルメチルオキシカルボニル基、−ＣＯ−Ｒ４'、−ＣＯ−（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）n2'−ＣＨ2ＣＨ2−Ｎ3、または−ＣＯ−Ｑ９'−Ｂ５'−（Ｑ１０'−Ｐ１０'）q8'−Ｘ１'であり、ｎ２'は０〜９９の整数であり、
Ｐ１０'は、存在しないか、または、−ＣＯ−、−ＮＨ−、−Ｏ−、−Ｓ−、−Ｏ−ＣＯ−、−Ｓ−ＣＯ−、−ＮＨ−ＣＯ−、−ＣＯ−Ｏ−、−ＣＯ−Ｓ−もしくは−ＣＯ−ＮＨ−であり、
Ｑ９'およびＱ１０'は、それぞれ独立して、存在しないか、または、置換もしくは無置換の炭素数１〜１２のアルキレンまたは−（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）n3'−ＣＨ2ＣＨ2−であり、ｎ３'は０〜９９の整数であり、
Ｂ５'は、下記式９−１で表されるいずれかの構造であり、破線において、それぞれ、Ｑ９'およびＱ１０'との結合手を意味し、
式９−１：
【０１６７】
【化１０２】
2020111280.tif 000104
【０１６８】
式９−１中、トリアゾール環を有する基における置換は、該トリアゾール環の1位および3位の窒素原子のいずれかである。
ｑ８'は、０〜１０の整数であり、
Ｘ１'は、水素原子または固相担体であり、
Ｒ４'は、ｔ−ブトキシカルボニル基、ベンジルオキシカルボニル基、９−フルオレニルメチルオキシカルボニル基で置換もしくは無置換のアミノ基、カルボキシ基、マレイミド基、およびアラルキルオキシカルボニル基からなる群から選択される１または２個の置換基で置換された炭素数２〜１０のアルキル基である。）
【０１６９】
式１０：
【０１７０】
【化１０３】
2020111280.tif 000105
【０１７１】
式１０中、
Ｒ７およびＲ８は、それぞれ独立して、ヒドロキシ基、ｔ−ブトキシ基、ベンジルオキシ基、−ＮＨ−Ｒ１０、または−ＮＨ−Ｑ１２−（Ｐ１２−Ｑ１２'）q10−Ｔ４−Ｌ４であり、
Ｐ１２およびＴ４は、それぞれ独立して、存在しないか、または、−ＣＯ−、−ＮＨ−、−Ｏ−、−Ｓ−、−Ｏ−ＣＯ−、−Ｓ−ＣＯ−、−ＮＨ−ＣＯ−、−ＣＯ−Ｏ−、−ＣＯ−Ｓ−もしくは−ＣＯ−ＮＨ−であり、
Ｑ１２およびＱ１２'は、存在しないか、または、置換もしくは無置換の炭素数１〜１２のアルキレンまたは−（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）ｎ2−ＣＨ2ＣＨ2−であり、ｎ2は０〜９９の整数であり、
Ｌ４は、糖リガンドであり、
Ｙ２は-Ｏ−（ＣＨ2）ｍ９−ＮＨ−および−ＮＨ−ＣＯ−（ＣＨ2）ｍ１０−ＮＨであり、ｍ９、ｍ１０は、それぞれ独立して、１〜１０の整数であり、
ｑ１０は、０〜１０の整数であり、
Ｒ９は、水素原子、ｔ−ブトキシカルボニル基、ベンジルオキシカルボニル基、９−フルオレニルメチルオキシカルボニル基、−ＣＯ−Ｒ１０、−ＣＯ−（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）n6−ＣＨ2ＣＨ2−Ｎ3、または−ＣＯ−Ｑ１３−Ｂ６−（Ｑ１４−Ｐ１３）q11−Ｘ２であり、ｎ６は０〜９９の整数であり、
Ｐ１３は、存在しないか、または、−ＣＯ−、−ＮＨ−、−Ｏ−、−Ｓ−、−Ｏ−ＣＯ−、−Ｓ−ＣＯ−、−ＮＨ−ＣＯ−、−ＣＯ−Ｏ−、−ＣＯ−Ｓ−もしくは−ＣＯ−ＮＨ−であり、
Ｑ１３およびＱ１４は、それぞれ独立して、存在しないか、または、置換もしくは無置換の炭素数１〜１２のアルキレンまたは−（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）n7−ＣＨ2ＣＨ2−であり、ｎ７は０〜９９の整数であり、
Ｂ６は、下記式１０−１で表されるいずれかの構造であり、破線において、それぞれ、Ｑ１３およびＱ１４との結合手を意味し、
式１０−１：
【０１７２】
【化１０４】
2020111280.tif 000106
【０１７３】
式１０−１中、トリアゾール環を有する基における置換は、該トリアゾール環の1位および3位の窒素原子のいずれかである。
ｑ１１は、０〜１０の整数であり、
Ｘ２は、水素原子または固相担体であり、
Ｒ１０は、ｔ−ブトキシカルボニル基、ベンジルオキシカルボニル基、９−フルオレニルメチルオキシカルボニル基で置換もしくは無置換のアミノ基、カルボキシ基、マレイミド基、およびアラルキルオキシカルボニル基からなる群から選択される１または２個の置換基で置換された炭素数２〜１０のアルキル基である。）
【０１７４】
以下、本発明に関連して、製造方法を一例として示す。なお、以下の製造方法１〜製造方法１７に関する記載において、本発明の核酸誘導体等における式１〜式１２で表される化合物とで、基を表す記号として同一の記号が用いられているものがあるが、両者は切り離して理解されるものであり、製造方法１〜製造方法１２に対して記載される基の説明により、本発明が限定的に解釈されるものではない。また、本発明における核酸誘導体に関し、オリゴヌクレオチドを表すＸを、製造方法１〜製造方法１７では、−Ｏ−Ｘとして記載する。
【０１７５】
製造方法１
本発明における核酸誘導体は、式（Ｉ'）で表される部分構造を有する化合物の製造方法として、その製造方法を例示することができる。
【０１７６】
【化１０５】
2020111280.tif 000107
【０１７７】
（式中、Ｐ１はＦｍｏｃ等の塩基により脱保護可能な保護基であり、ＤＭＴｒはｐ，ｐ'−ジメトキシトリチル基を表し、Ｒは糖リガンド-テザーユニットを表し、Ｒ'は、Ｒ中の糖リガンドの各水酸基がアセチル基等の塩基で脱保護可能な保護基で保護された基を表し、Ｐｏｌｙｍｅｒは固相担体を表し、Ｑ'は−ＣＯ−である。）
【０１７８】
工程１
化合物（Ｉ−Ｂ）は、化合物（Ｉ−Ａ）とｐ，ｐ'−ジメトキシトリチルクロリドを、ピリジン等の溶媒中、必要に応じて共溶媒の存在下、０℃と１００℃の間の温度で、５分間〜１００時間反応させることにより製造することができる。
共溶媒としては、例えばメタノール、エタノール、ジクロロメタン、クロロホルム、１，２−ジクロロエタン、トルエン、酢酸エチル、アセトニトリル、ジエチルエーテル、テトラヒドロフラン、１，２−ジメトキシエタン、ジオキサン、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド、Ｎ−メチルピロリドン、ピリジン、水等があげられ、これらは単独でまたは混合して用いられる。
【０１７９】
工程２
化合物（Ｉ−Ｃ）は、化合物（Ｉ−Ｂ）を、無溶媒でまたは溶媒中、１〜１０００当量の２級アミン存在下、室温と２００℃の間の温度で、５分間〜１００時間反応させることにより製造することができる。
溶媒としては、例えばメタノール、エタノール、ジクロロメタン、クロロホルム、１，２−ジクロロエタン、トルエン、酢酸エチル、アセトニトリル、ジエチルエーテル、テトラヒドロフラン、１，２−ジメトキシエタン、ジオキサン、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド、Ｎ−メチルピロリドン、ピリジン、水等があげられ、これらは単独でまたは混合して用いられる。
２級アミンとしては、例えばジエチルアミン、ピペリジン等が挙げられる。
【０１８０】
工程３
化合物（１−Ｅ）は、化合物（Ｉ−Ｃ）と化合物（Ｉ−Ｄ）を、無溶媒でまたは溶媒中、１〜３０当量の塩基、縮合剤および必要に応じて０．０１〜３０当量の添加剤の存在下、室温と２００℃の間の温度で、５分間〜１００時間反応させることにより製造することができる。
溶媒としては、工程２で例示したものが挙げられる。
塩基としては、例えば炭酸セシウム、炭酸カリウム、水酸化カリウム、水酸化ナトリウム、ナトリウムメトキシド、カリウム  ｔｅｒｔ−ブトキシド、トリエチルアミン、ジイソプロピルエチルアミン、Ｎ−メチルモルホリン、ピリジン、１，８−ジアザビシクロ［５．４．０］−７−ウンデセン（ＤＢＵ）、Ｎ，Ｎ−ジメチル−４−アミノピリジン（ＤＭＡＰ）等が挙げられる。
縮合剤としては、例えば１，３−ジシクロヘキサンカルボジイミド（DCC）、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド・塩酸塩（ＥＤＣ）、カルボニルジイミダゾール、ベンゾトリアゾール−１−イルオキシトリス（ジメチルアミノ）ホスホニウムヘキサフルホロホスファート、（ベンゾトリアゾール−１−イルオキシ）トリピロリジノホスホニウム  ヘキサフルオロホスファート、Ｏ−（７−アザベンゾトリアゾール−１−イル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ'，Ｎ'−テトラメチルウロニウム  ヘキサフルオロホスファート（ＨＡＴＵ）、Ｏ−（ベンゾトリアゾール−１−イル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ'，Ｎ'−テトラメチルウロニウム  ヘキサフルオロホスファート（ＨＢＴＵ）、ヨウ化  ２−クロロ−１−メチルピリジニウム等が挙げられる。
添加剤としては、例えば１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ）、４−ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ）等が挙げられる。
化合物（Ｉ−Ｄ）は、公知の方法（例えば、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ，  １３６，  １６９５８，  （２０１４）を参照）もしくはそれに準じた方法で得ることができる。
【０１８１】
工程４
化合物（Ｉ−Ｆ）は、化合物（Ｉ−Ｅ）とコハク酸無水物を、溶媒中、１〜３０当量の塩基存在下、室温と２００℃の間の温度で、５分間〜１００時間反応させることにより製造することができる。
【０１８２】
溶媒としては、工程２で例示したものが挙げられる。
【０１８３】
塩基としては、工程３で例示したものが挙げられる。
【０１８４】
工程５
化合物（Ｉ−Ｇ）は、化合物（Ｉ−Ｆ）と末端がアミノ化された固相担体とを、無溶媒でまたは溶媒中、１〜３０当量の塩基、縮合剤および必要に応じて０．０１〜３０当量の添加剤の存在下、室温と２００℃の間の温度で、５分間〜１００時間反応した後、無水酢酸／ピリジン溶液と室温と２００℃の間の温度で５分間〜１００時間反応させることにより製造することができる。
溶媒としては、工程２で例示したものが挙げられる。
塩基、縮合剤および添加剤としては、それぞれ工程３で例示したものがあげられる。
アミノ化された固相担体としては、例えば長鎖アルキルアミン細孔性ガラス（ＬＣＡＡ−ＣＰＧ）等  があげられ、これらは市販品として得ることができる。
【０１８５】
工程６
式（Ｉ'）で表される糖リガンド−テザー−ブランチャーユニットを有する核酸複合体は、化合物（Ｉ−Ｇ）を用い、公知のオリゴヌクレオチド化学合成法で対応するヌクレオチド鎖を伸長した後に、固相からの脱離、保護基の脱保護および精製を行うことで製造することができる。
【０１８６】
公知のオリゴヌクレオチド化学合成法としては、ホスホロアミダイト法、ホスホロチオエート法、ホスホトリエステル法、ＣＥＭ法（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，  ３５，  ３２８７  （２００７）を参照）等をあげることができ、例えば、ＡＢＩ３９００ハイスループット核酸合成機（アプライドバイオシステムズ社製）により合成することができる。
【０１８７】
固相からの脱離、脱保護は、オリゴヌクレオチド化学合成後、溶媒または無溶媒中、−８０℃から２００℃の間の温度で、１０秒間から７２時間塩基で処理することにより製造することができる。
【０１８８】
塩基としては、例えばアンモニア、メチルアミン、ジメチルアミン、エチルアミン、ジエチルアミン、イソプロピルアミン、ジイソプロピルアミン、ピペリジン、トリエチルアミン、エチレンジアミン、１，８−ジアザビシクロ［５．４．０］−７−ウンデセン（ＤＢＵ）、炭酸カリウム等が挙げられる。
【０１８９】
溶媒としては、水、メタノール、エタノール、ＴＨＦ等が挙げられる。
【０１９０】
オリゴヌクレオチドの精製は、Ｃ１８逆相カラムあるいは陰イオン交換カラム、好ましくは前述２つの手法を組み合わせにより可能である。精製後の核酸複合体純度は、９０％以上、好ましくは９５％以上とするのが望ましい。
【０１９１】
また、上記工程３において、必要により、化合物（Ｉ−Ｄ）を二つのユニットに分割し、２段階に分けて化合物（Ｉ−Ｃ）と縮合することで行うこともできる。具体的には、例えばＲ−Ｑ'がＲ−ＮＨ−ＣＯ−Ｑ４'−ＣＯ−である場合（Ｑ４'は置換もしくは無置換の炭素数１〜１２のアルキレンである）、工程３において、化合物（Ｉ−Ｃ）と、ＣＨ3ＣＨ2−Ｏ−ＣＯ−Ｑ４'−ＣＯ−ＯＨ（Ｑ４'は前記と同義）とを、工程３と同様の方法で縮合させ、得られた化合物のエチルエステルをエタノールや水等の溶媒中、水酸化リチウム等の塩基で加水分解した後に、さらにＲ'−ＮＨ2（Ｒ'は前記と同義）と縮合させることで目的とする化合物を得ることができる。なお、ＣＨ3ＣＨ2−Ｏ−ＣＯ−Ｑ４'−ＣＯ−ＯＨ（Ｑ４'は前記と同義）およびＲ'−ＮＨ2（Ｒ'は前記と同義）は、公知の方法（例えば、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ，  １３６，  １６９５８  （２０１４）を参照）もしくはそれに準じた方法で得ることができる。ここで、Ｑ４'において、置換もしくは無置換の炭素数１〜１２のアルキレンにおける置換基およびアルキレン部分は上記と同様である。
【０１９２】
Ｑが−ＣＯ−である場合を例示して示しているが、Ｑが−ＣＯ−でない場合の化合物についても、Ｑの構造を適宜変更することにより、上記と同様の方法、公知の方法またはこれらを組み合わせ、適宜反応条件を変更することにより調製することができる。
【０１９３】
製造方法２
本発明における核酸誘導体は、式（ＩＩ'）で表される部分構造を有する化合物の製造方法として、その製造方法を例示することができる。
【０１９４】
【化１０６】
2020111280.tif 000108
【０１９５】
（式中、ＤＭＴｒ、Ｒ、Ｒ'、Ｘ、Ｑ'、およびＰｏｌｙｍｅｒは前記と同義。ＴＢＤＭＳはｔ−ブチルジメチルシリル基、Ｆｍｏｃは９−フルオレニルメチルオキシカルボニル基を表す）
【０１９６】
工程７
化合物（ＩＩ−Ａ）は、化合物（Ｉ−Ａ）、ｔ−ブチルジメチルシリルクロリドおよびジメチルアミノピリジンをＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）等の溶媒中、好ましくは２等量の塩基の存在下、０℃〜１００℃の間の温度で、５分間〜１００時間反応させることにより製造することができる。
塩基としては、製造方法１の工程３で例示したものが挙げられる。
【０１９７】
工程８
化合物（ＩＩ−Ｂ）は、化合物（ＩＩ−Ａ）を用い、製造方法１の工程１と同様の条件にて製造することができる。
【０１９８】
工程９
化合物（ＩＩ−Ｃ）は、化合物（ＩＩ−Ｂ）とフッ化ｎ−テトラブチルアンモニウム（ＴＢＡＦ）を、溶媒中、室温と２００℃の間の温度で、５分間〜１００時間反応させることにより製造することができる。
溶媒としては、工程２で例示したものが挙げられる。
【０１９９】
工程１０
化合物（ＩＩ−Ｄ）は、化合物（ＩＩ−Ｃ）を用い、製造方法１の工程２と同様の条件にて製造することができる。
【０２００】
工程１１
化合物（ＩＩ−Ｅ）は、化合物（ＩＩ−Ｄ）および化合物（Ｉ−Ｄ）を用い、製造方法１の工程３と同様の条件にて製造することができる。
【０２０１】
工程１２〜１４
化合物（ＩＩ'）は、化合物（ＩＩ−Ｅ）を用い、製造方法１の工程４〜工程６と同様の条件にて製造することができる。
【０２０２】
また、上記工程１１において、必要により、化合物（Ｉ−Ｄ）を二つのユニットに分割し、２段階に分けて化合物（ＩＩ−Ｃ）と縮合することで行うこともできる。具体的には、例えばＲ−Ｑ'が−ＮＨ−ＣＯ−Ｑ４'−ＣＯ−である場合（Ｑ４'は置換もしくは無置換の炭素数１〜１２のアルキレン）、工程１１において、化合物（ＩＩ−Ｃ）と、ＣＨ3ＣＨ2−Ｏ−ＣＯ−Ｑ４'−ＣＯ−ＯＨ（Ｑ４'は前記と同義）とを、工程１１と同様の方法で縮合させ、得られた化合物のエチルエステルをエタノールや水等の溶媒中、水酸化リチウム等の塩基で加水分解した後に、さらにＲ'−ＮＨ2（Ｒ'は前記と同義）と縮合させることで目的とする化合物を得ることができる。なお、ＣＨ3ＣＨ2−Ｏ−ＣＯ−Ｑ４'−ＣＯ−ＯＨ（Ｑ４'は前記と同義）およびＲ'−ＮＨ2（Ｒ'は前記と同義）は、公知の方法（例えば、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ，  １３６，  １６９５８  （２０１４）を参照）もしくはそれに準じた方法で得ることができる。
【０２０３】
Ｑが−ＣＯ−である場合を例示して示しているが、Ｑが−ＣＯ−でない場合の化合物についても、Ｑの構造を適宜変更することにより、上記と同様の方法、公知の方法またはこれらを組み合わせ、適宜反応条件を変更することにより調製することができる。
【０２０４】
製造方法３
本発明における核酸誘導体は、式（ＩＩＩ'）で表される部分構造を有する化合物の製造方法として、その製造方法を例示することができる。
【０２０５】
【化１０７】
2020111280.tif 000109
【０２０６】
（式中、ＤＭＴｒ、Ｆｍｏｃ、Ｒ、Ｒ'、Ｑ'、ＸおよびＰｏｌｙｍｅｒは前記と同義である。）
【０２０７】
化合物（ＩＩＩ'）は、化合物（ＩＩＩ−Ａ）を用い、製造方法１の工程１から工程６と同様の条件にて製造する事ができる。なお、化合物（ＩＩＩ−Ａ）は市販品として得ることができる。
【０２０８】
工程１５
化合物（ＩＩＩ−Ｂ）は、化合物（ＩＩＩ−Ａ）を用い、製造法１の工程１と同様の条件にて製造することができる。
化合物（ＩＩＩ−Ａ）は市販品として購入することができる。
【０２０９】
工程１６
化合物（ＩＩＩ−Ｃ）は、化合物（ＩＩＩ−Ｂ）を用い、製造法１の工程２と同様の条件にて製造することができる。
【０２１０】
工程１７
化合物（ＩＩＩ−Ｅ）は、化合物（ＩＩＩ−Ｃ）を用い、製造法１の工程３と同様の条件にて製造することができる。
【０２１１】
工程１８〜２０
化合物（ＩＩＩ'）は、化合物（ＩＩＩ−Ｅ）を用い、製造方法１の工程４〜工程６と同様の条件にて製造することができる。
【０２１２】
また、上記工程１７において、必要により、化合物（Ｉ−Ｄ）を二つのユニットに分割し、２段階に分けて化合物（ＩＩＩ−Ｃ）と縮合することで行うこともできる。具体的には、例えばＲ−Ｑ'が−ＮＨ−ＣＯ−Ｑ４'−ＣＯ−である場合（Ｑ４'は置換もしくは無置換の炭素数１〜１２のアルキレン）、工程１７において、化合物（ＩＩＩ−Ｃ）と、ＣＨ3ＣＨ2−Ｏ−ＣＯ−Ｑ４'−ＣＯ−ＯＨ（Ｑ４'は前記と同義）とを、工程１７と同様の方法で縮合させ、得られた化合物のエチルエステルをエタノールや水等の溶媒中、水酸化リチウム等の塩基で加水分解した後に、さらにＲ'−ＮＨ2（Ｒ'は前記と同義）と縮合させることで目的とする化合物を得ることができる。なお、ＣＨ3ＣＨ2−Ｏ−ＣＯ−Ｑ４'−ＣＯ−ＯＨ（Ｑ４'は前記と同義）およびＲ'−ＮＨ2（Ｒ'は前記と同義）は、公知の方法（例えば、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ，１３６，  １６９５８  （２０１４）を参照）もしくはそれに準じた方法で得ることができる。
【０２１３】
Ｑが−ＣＯ−である場合を例示して示しているが、Ｑが−ＣＯ−でない場合の化合物についても、Ｑの構造を適宜変更することにより、上記と同様の方法、公知の方法またはこれらを組み合わせ、適宜反応条件を変更することにより調製することができる。
【０２１４】
製造方法４
本発明における核酸誘導体は、式（ＩＶ'）で表される部分構造を有する化合物の製造方法として、その製造方法を例示することができる。
【０２１５】
【化１０８】
2020111280.tif 000110
【０２１６】
（式中、ＤＭＴｒ、Ｆｍｏｃ、Ｒ、Ｒ'、Ｑ'、ＸおよびＰｏｌｙｍｅｒは前記と同義である。）
【０２１７】
化合物（ＩＶ'）は、化合物（ＩＶ−Ａ）を用い、製造方法１の工程１から工程６と同様の条件にて製造することができる。なお、化合物（ＩＶ−Ａ）は市販品として得ることができる。
【０２１８】
また、上記工程２３において、必要により、化合物（Ｉ−Ｄ）を二つのユニットに分割し、２段階に分けて化合物（ＩＶ−Ｃ）と縮合することで行うこともできる。具体的には、例えばＲ'−Ｑ'が−ＮＨ−ＣＯ−Ｑ４'−ＣＯ−である場合（Ｑ４'は置換もしくは無置換の炭素数１〜１２のアルキレンである）、工程２３において、化合物（ＩＶ−Ｃ）と、ＣＨ3ＣＨ2−Ｏ−ＣＯ−Ｑ４'−ＣＯ−ＯＨ（Ｑ４'は前記と同義）とを、工程２３と同様の方法で縮合させ、得られた化合物のエチルエステルをエタノールや水等の溶媒中、水酸化リチウム等の塩基で加水分解した後に、さらにＲ'−ＮＨ2（Ｒ'は前記と同義）と縮合させることで目的とする化合物を得ることができる。なお、ＣＨ3ＣＨ2−Ｏ−ＣＯ−Ｑ４'−ＣＯ−ＯＨ（Ｑ４'は前記と同義）およびＲ'−ＮＨ２（Ｒ'は前記と同義）は、公知の方法（例えば、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ，  １３６，  １６９５８  （２０１４）を参照）もしくはそれに準じた方法で得ることができる。
【０２１９】
Ｑが−ＣＯ−である場合を例示して示しているが、Ｑが−ＣＯ−でない場合の化合物についても、Ｑの構造を適宜変更することにより、上記と同様の方法、公知の方法またはこれらを組み合わせ、適宜反応条件を変更することにより調製することができる。
【０２２０】
製造方法５
本発明における核酸誘導体は、式（Ｖ'）で表される部分構造を有する化合物の製造方法として、その製造方法を例示することができる。
【０２２１】
【化１０９】
2020111280.tif 000111
【０２２２】
（式中、ＤＭＴｒ、Ｒ、Ｒ'、Ｘ、Ｑ'、ＴＢＤＭＳ、ＦｍｏｃおよびＰｏｌｙｍｅｒは前記と同義。）
【０２２３】
化合物（Ｖ'）は、化合物（ＩＶ−Ａ）を用い、製造方法２の工程１から工程７と同様の条件にて製造することができる。なお、化合物（ＩＶ−Ａ）は市販品として得ることができる。
【０２２４】
また、上記工程３１において、必要により、化合物（Ｉ−Ｄ）を二つのユニットに分割し、２段階に分けて化合物（Ｖ−Ｄ）と縮合することで行うこともできる。具体的には、例えばＲ'−Ｑ'が−ＮＨ−ＣＯ−Ｑ４'−ＣＯ−である場合（Ｑ４'は置換もしくは無置換の炭素数１〜１２のアルキレンである）、工程３１において、化合物（Ｖ−Ｄ）と、ＣＨ3ＣＨ2−Ｏ−ＣＯ−Ｑ４'−ＣＯ−ＯＨ（Ｑ４'は前記と同義）とを、工程３１と同様の方法で縮合させ、得られた化合物のエチルエステルをエタノールや水等の溶媒中、水酸化リチウム等の塩基で加水分解した後に、さらにＲ'−ＮＨ2（Ｒ'は前記と同義）と縮合させることで目的とする化合物を得ることができる。なお、ＣＨ3ＣＨ2−Ｏ−ＣＯ−Ｑ４'−ＣＯ−ＯＨ（Ｑ４'は前記と同義）およびＲ'−ＮＨ2（Ｒ'は前記と同義）は、公知の方法（例えば、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ，  １３６，  １６９５８  （２０１４）を参照）もしくはそれに準じた方法で得ることができる。
【０２２５】
Ｑが−ＣＯ−である場合を例示して示しているが、Ｑが−ＣＯ−でない場合の化合物についても、Ｑ−ＯＨの構造を適宜変更することにより、上記と同様の方法、公知の方法またはこれらを組み合わせ、適宜反応条件を変更することにより調製することができる。
【０２２６】
製造方法６
オリゴヌクレオチドの５'末端に糖リガンド−テザー−ブランチャーユニットが結合した、本発明の核酸複合体の製造方法を以下に例示する。
【０２２７】
【化１１０】
2020111280.tif 000112
（式中、Ｒ、Ｒ'、Ｑ'、ＤＭＴｒおよびＸは前記と同義である）
【０２２８】
工程３５
化合物（Ｉ−Ｈ）は、化合物（ＩＩ−Ｅ）と２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ，Ｎ'，Ｎ'−テトライソプロピルホスホジアミダイトを、無溶媒でまたは溶媒中、塩基および反応促進剤共存下、室温と２００℃の間の温度で、５分間〜１００時間反応させることにより製造することができる。
溶媒としては、製造方法１の工程２で例示したものがあげられる。
塩基としては、製造方法１の工程３で例示したものがあげられる。
反応促進剤としては、例えば、１Ｈ−テトラゾール、４，５−ジシアノイミダゾール、５−エチルチオテトラゾール、５−ベンジルチオテトラゾール等があげられ、市販品として購入できる。
【０２２９】
工程３６
オリゴヌクレオチド鎖を伸長し、最後に化合物（Ｉ−Ｈ）を用い、オリゴヌクレオチド
の５'末端を糖リガンド−テザー−ブランチャーユニットで修飾した後、固相からの脱離保護基の脱保護および精製を行うことにより、化合物(I'')を製造することができる。ここで、固相からの脱離、保護基の脱保護および精製は、それぞれ製造方法１の工程７と同様にして製造できる。
【０２３０】
製造方法７
オリゴヌクレオチドの５'末端に糖リガンド−テザー−ブランチャーユニットが結合した、本発明の核酸複合体の製造方法を以下に例示する。
【０２３１】
製造方法６の工程３５および３６と同様の条件にて製造することができる。
【０２３２】
【化１１１】
2020111280.tif 000113
【０２３３】
（式中、Ｒ、Ｒ'、Ｑ'、ＤＭＴｒおよびＸは前記と同義である）
【０２３４】
製造方法８
オリゴヌクレオチドの５'末端に糖リガンド−テザー−ブランチャーユニットが結合した、本発明の核酸複合体の製造方法を以下に例示する。
【０２３５】
製造方法６の工程３５および３６と同様の条件にて製造することができる。
【０２３６】
【化１１２】
2020111280.tif 000114
【０２３７】
（式中、Ｒ、Ｒ'、Ｑ'、ＤＭＴｒおよびＸは前記と同義である）
【０２３８】
製造方法９
オリゴヌクレオチドの５'末端に糖リガンド−テザー−ブランチャーユニットが結合した、本発明の核酸複合体の製造方法を以下に例示する。
【０２３９】
製造方法６の工程３５および３６と同様の条件にて製造することができる。
【０２４０】
【化１１３】
2020111280.tif 000115
【０２４１】
（式中、Ｒ、Ｒ'、Ｑ'、ＤＭＴｒおよびＸは前記と同義である）
【０２４２】
製造方法１０
オリゴヌクレオチドの５'末端に糖リガンド−テザー−ブランチャーユニットが結合した、本発明の核酸複合体の製造方法を以下に例示する。
【０２４３】
製造方法６の工程３５および３６と同様の条件にて製造することができる。
【０２４４】
【化１１４】
2020111280.tif 000116
【０２４５】
（式中、Ｒ、Ｒ'、Ｑ'、ＤＭＴｒおよびＸは前記と同義である）
【０２４６】
製造方法１１
二本鎖核酸を構成するセンス鎖の３末端'または５'末端に糖リガンド−テザー−ブランチャーユニットを有するセンス鎖と、二本鎖核酸を構成するアンチセンス鎖とを、水または適当な緩衝液にそれぞれ溶解し、混合することにより二本鎖核酸を有する核酸複合体を得ることができる。
緩衝液としては、例えば酢酸緩衝液、トリス緩衝液、クエン酸緩衝液、リン酸緩衝液、水等が挙げられ、これらを単独または混合して用いられる。
【０２４７】
センス鎖とアンチセンス鎖の混合比としては、センス鎖１当量に対してアンチセンス鎖が０．５〜２当量が好ましく、０．９〜１．１当量がより好ましく、０．９５当量〜１．０５当量がさらに好ましい。
【０２４８】
また、該センス鎖と該アンチセンス鎖を混合後、適宜アニーリング処理を行ってもよい。アニーリング処理は、センス鎖とアンチセンス鎖の混合物を、好ましくは５０〜１００℃、より好ましくは６０〜１００℃、さらに好ましくは８０〜１００℃に加熱した後に、室温まで徐冷することにより行うことができる。
【０２４９】
アンチセンス鎖は、上記の公知オリゴヌクレオチド合成法に準じて得ることができる。
【０２５０】
製造方法１２
本発明における核酸誘導体は、式（ＶＩ'）で表される部分構造を有する化合物の製造方法として、その製造方法を例示することができる。
【０２５１】
【化１１５】
2020111280.tif 000117
【０２５２】
(式中、ＤＭＴｒ、Ｒ、Ｒ'、Ｘ、Ｑ'、Ｐｏｌｙｍｅｒ、およびＦｍｏｃは前記と同義であり、ＴＢＳはｔ−ブチルジメチルシリル基を表し、Ｒ０およびＲｘは、同一または異なって、水素原子、Ｃ１〜Ｃ１０のアルキレンまたはＣ３−Ｃ８のシクロアルキレンを表し、ＷはＣ１〜Ｃ１０のアルキレン、Ｃ３−Ｃ８のシクロアルキレンであるか、Ｒ０と一緒になって、Ｃ４−Ｃ８の含窒素複素環を形成してもよい。)
【０２５３】
工程４５
化合物（ＶＩ−Ｂ）は化合物（ＶＩ−Ａ）を用い、製造方法１の工程１と同様の条件にて製造することができる。
化合物（ＶＩ−Ａ）は市販品として、または公知の方法（例えばバイオオーガニック・アンド・メディシナル・ケミストリー・レターズ，第１１巻，３８３−３８６頁）もしくはそれに準じた方法で得ることができる。
【０２５４】
工程４６
化合物（ＶＩ−Ｃ）は化合物（ＶＩ−Ｂ）を用い、製造方法１の工程２と同様の条件にて製造することができる。
【０２５５】
工程４７
化合物（ＶＩ−Ｄ）は化合物（ＶＩ−Ｃ）を用い、製造方法１の工程３と同様の条件にて製造することができる。
【０２５６】
工程４８
化合物（ＶＩ−Ｅ）は化合物（ＶＩ−Ｄ）を用い、製造方法１の工程２と同様の条件にて製造することができる。
【０２５７】
工程４９
化合物（ＶＩ−Ｇ）は化合物（ＶＩ−Ｅ）と化合物（ＶＩ−Ｆ）とを用い、製造方法１の工程３と同様の条件にて製造することができる。
【０２５８】
工程５０
化合物（ＶＩ−Ｈ）は化合物（ＶＩ−Ｇ）を用い、製造方法２の工程９と同様の条件にて製造することができる。
【０２５９】
工程５１〜５３
化合物（ＶＩ'）は化合物（ＶＩ−Ｈ）、化合物（ＶＩ−Ｉ）および化合物（ＶＩ−Ｊ）を用い、製造方法１の工程４〜６と同様の条件にて製造することができる。
【０２６０】
工程４５〜５３は公知の方法（例えば国際公開第２０１５／１０５０８３号記載の方法）、またはそれに準じた方法でも実施することができる。
化合物（ＶＩ−Ｆ）は公知の方法（例えば、ジャーナル・オブ・アメリカン・ケミカル・ソサイエティ（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ），  １３６巻，  １６９５８貢，  ２０１４年記載の方法）、またはそれに準じた方法で得ることができる。
【０２６１】
製造方法１３
式２においてＰ１およびＰ４が−ＮＨ−ＣＯ−、−Ｏ−ＣＯ−または−Ｓ−ＣＯ−である、糖リガンド−テザーーユニットは以下の方法で製造することができる。
【０２６２】
【化１１６】
2020111280.tif 000118
【０２６３】
（式中、Ｑ１、Ｑ２、Ｑ３、Ｑ４、Ｑ５、Ｐ２、Ｐ３、Ｐ５、Ｐ６、Ｐ７、Ｔ１、Ｔ２、L１、Ｌ２、ｑ１、ｑ２、ｑ３およびｑ４はそれぞれ前記と同義であり、ｑ２'はｑ２より１小さい整数を表し、ｑ４'はｑ４より１小さい整数を表し、Ｐ１'およびＰ４'は、それぞれ独立して、−ＮＨ−ＣＯ−、−Ｏ−ＣＯ−または−Ｓ−ＣＯ−を表し、ＺはＨ、ＯＨ、ＮＨ2、ＳＨ、塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子、メタンスルホニルオキシ、p-トルエンスルホニルオキシまたはカルボン酸を表し、Ｂ１'およびＢ２'は下記式の構造体のいずれか１つを表し、ＰＧ１、ＰＧ２、ＰＧ３、ＰＧ４、ＰＧ５、ＰＧ６およびＰＧ７はそれぞれ適切な保護基を表す。）
式：
【０２６４】
【化１１７】
2020111280.tif 000119
【０２６５】
ｍ１、ｍ２、ｍ３またはｍ４はそれぞれ独立して、０〜１０の整数を表す。
【０２６６】
工程５４
化合物（ＶＩＩ−Ｃ）は、化合物（ＶＩＩ−Ａ）と化合物（ＶＩＩ−Ｂ）を、テトロヒドロフラン等の溶媒中、トリフェニルホスフィンポリマー担持体を加え、氷冷下、ジイソプロピルアゾジカルボキシレートトルエン溶液を反応させることにより製造することができる。
溶媒としては製造工程１の工程２で例示したものが挙げられる。
化合物（ＶＩＩ−Ａ）は市販品として得ることができる。
【０２６７】
工程５５
化合物（ＶＩＩ−Ｄ）は化合物（ＶＩＩ−Ｃ）を用い、メタノール等の溶媒中、氷冷下、塩基の存在下、反応させることにより製造することができる。
溶媒としては、製造工程１の工程２で例示したものが挙げられる。
塩基としては、製造工程１の工程３で例示したものが挙げられる。
【０２６８】
工程５６
化合物（ＶＩＩ−Ｆ）は化合物（ＶＩＩ−Ｄ）および化合物（ＶＩＩ−Ｅ）を用い、製造工程１の工程３と同様の条件で製造することができる。
【０２６９】
工程５７
化合物（ＶＩＩ−Ｈ）は化合物（ＶＩＩ−Ｆ）および化合物（ＶＩＩ−Ｇ）を用い、製造工程１の工程３と同様の条件で製造することができる。
【０２７０】
工程５８
化合物（ＶＩＩ−Ｊ）は化合物（ＶＩＩ−Ｈ）および化合物（ＶＩＩ−Ｉ）を用い、製造工程１の工程３と同様の条件で製造することができる。
また、下記工程ＤＰ１と工程５８を繰り返し行うことで、望みのｑ１の値をもつ化合物（ＶＩＩ−Ｊ）を製造することができる。
【０２７１】
工程５９
化合物（ＶＩＩ−Ｌ）は化合物（ＶＩＩ−Ｊ）および化合物（ＶＩＩ−Ｋ）を用い、製造工程１の工程３と同様の条件で製造することができる。
【０２７２】
工程６０
化合物（ＶＩＩ−Ｎ）は化合物（ＶＩＩ−Ｌ）および化合物（ＶＩＩ−Ｍ）を用い、製造工程１の工程３と同様の条件で製造することができる。
【０２７３】
工程６１〜６３
化合物（ＶＩＩ'）は化合物（ＶＩＩ−Ｏ）、化合物（ＶＩＩ−Ｐ）および化合物  （ＶＩＩ−Ｑ）を用い、製造工程１の工程３と同様の条件で製造することができる。
また、下記工程ＤＰ１と工程６１を繰り返し行うことで、望みのｑ3の値をもつ化合物（ＶＩＩ'）を製造することができる。
【０２７４】
工程ＤＰ１
有機合成化学で常用される方法［例えば、プロテクティブ・グループス・イン・オーガニック・シンセシス第３版（Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  Ｇｒｏｕｐｓ  ｉｎ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，  ｔｈｉｒｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ）、グリーン（Ｔ．Ｗ．Ｇｒｅｅｎｅ）著、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ  Ｉｎｃ．（１９９９年）等に記載の方法等］を適切に用いることで所望の化合物を製造することができる。
化合物（ＶＩＩ−Ｂ）、化合物（ＶＩＩ−Ｅ）、化合物（ＶＩＩ−Ｇ）、化合物（ＶＩＩ−Ｉ）、化合物（ＶＩＩ−Ｋ）、化合物（ＶＩＩ−Ｍ）、化合物（ＶＩＩ−Ｏ）、化合物（ＶＩＩ−Ｐ）および化合物（ＶＩＩ−Ｑ）は市販品として、または「実験化学講座第４版  有機合成、ｐ．  ２５８、丸善（１９９２年）」、「Ｍａｒｃｈ'ｓ  Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ：  Ｒｅａｃｔｉｏｎｓ，  Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ，  ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，  ７th  Ｅｄｉｔｉｏｎ」に記載の方法を組み合わせること、もしくはそれに準じた方法で得ることができる。
【０２７５】
製造方法１４
式４においてＰ７が−Ｏ−である、ユニットは以下の方法で製造することができる。
【０２７６】
【化１１８】
2020111280.tif 000120
【０２７７】
（式中、Ｑ５、Ｐ７、ｑ５はそれぞれ前記と同義であり、ｑ５' 'はｑ５より２小さい整数を表し、ｑ５'はｑ５より１小さい整数を表し、Ｚ２はＨ、ＯＨ、ＮＨ2またはＳＨを表し、ＰＧ８およびＰＧ９はそれぞれ適切な保護基を表し、ＬＣは糖リガンド−テザーユニットを表し、Ｅはカルボン酸またはマレイミドを表す。）
【０２７８】
工程６４
化合物（ＶＩＩＩ−Ｃ）は化合物（ＶＩＩＩ−Ａ）および化合物（ＶＩＩＩ−Ｂ）を用い、製造工程１の工程３と同様の条件で製造することができる。
また、下記工程ＤＰ２と工程６４を繰り返し行うことで、望みのｑ5''の値をもつ化合物（ＶＩＩＩ−Ｃ）を製造することができる。化合物（ＶＩＩＩ−Ｂ）は市販品として、または「実験化学講座第４版  有機合成、ｐ．  ２５８、丸善（１９９２年）」、「Ｍａｒｃｈ'ｓ  Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ：  Ｒｅａｃｔｉｏｎｓ，  Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ，  ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，  ７th  Ｅｄｉｔｉｏｎ」に記載の方法を組み合わせること、もしくはそれに準じた方法で得ることができる。
【０２７９】
工程６５
化合物（ＶＩＩＩ'）は化合物（ＶＩＩＩ−Ｃ）および化合物（ＶＩＩＩ−Ｄ）を用い、製造工程１の工程３と同様の条件で製造することができる。
化合物（ＶＩＩＩ−Ｄ）は市販品として、または「実験化学講座第４版  有機合成、ｐ．  ２５８、丸善（１９９２年）」、「Ｍａｒｃｈ'ｓ  Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ：  Ｒｅａｃｔｉｏｎｓ，  Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ，  ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，  ７th  Ｅｄｉｔｉｏｎ」に記載の方法を組み合わせること、もしくはそれに準じた方法で得ることができる。
【０２８０】
工程ＤＰ２
有機合成化学で常用される方法［例えば、プロテクティブ・グループス・イン・オーガニック・シンセシス第３版（Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  Ｇｒｏｕｐｓ  ｉｎ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，  ｔｈｉｒｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ）、グリーン（Ｔ．Ｗ．Ｇｒｅｅｎｅ）著、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ  Ｉｎｃ．（１９９９年）等に記載の方法等］を適切に用いることで所望の化合物を製造することができる。
【０２８１】
製造方法１５
式２においてＰ１およびＰ４が−Ｏ−である、糖リガンド−テザーユニットは以下の方法で製造することができる。
【０２８２】
【化１１９】
2020111280.tif 000121
【０２８３】
（式中、Ｑ１、Ｑ２、Ｑ３、Ｑ４、Ｐ２、Ｐ３、Ｐ５、Ｐ６、Ｔ１、Ｔ２、Ｌ１、Ｌ２、
ｑ１、ｑ２、ｑ３、ｑ４、ｑ２'、ｑ４' 、Ｚ、Ｂ１'、Ｂ２'はそれぞれ前記と同義であり、ＰＧ１０、ＰＧ１１、ＰＧ１２、ＰＧ１３、ＰＧ１４およびＰＧ１５はそれぞれ適切保護基を表す）
式：
【０２８４】
【化１２０】
2020111280.tif 000122
【０２８５】
ｍ１、ｍ２、ｍ３およびｍ４は前記と同義である。
【０２８６】
工程６６
化合物（ＩＸ−Ｃ）は化合物（ＩＸ−Ａ）と化合物（ＩＸ−Ｂ）をＮ，Ｎ'−ジメチルホルムアミドな等の溶媒に溶解し、炭酸水素カリウム等の塩基を加えて、室温〜２００℃にて５分間〜１００時間反応させることにより製造することができる。
溶媒としては、製造工程１の工程２に例示したものが挙げられる。
塩基としては、製造工程１の工程３で例示したものが挙げられる。
【０２８７】
工程６７
化合物（ＩＸ−Ｅ）は化合物化合物（ＩＸ−Ｃ）と化合物（ＩＸ−Ｄ）をＮ，  Ｎ'−ジメチルホルムアミド等の溶媒に溶解し、炭酸水素カリウム等の塩基を加えて、室温〜２００℃で５分間〜１００時間反応させることにより製造することができる。
溶媒としては、製造工程１の工程２で例示したものが挙げられる。
塩基としては、製造工程１の工程３で例示したものが挙げられる。
化合物（ＩＸ−Ａ）は市販品として得ることができる。
【０２８８】
工程６８
化合物（ＩＸ−Ｇ）は化合物（ＩＸ−Ｅ）および化合物（ＩＸ−Ｆ）を用い、製造工程１の工程３と同様の条件で製造することができる。
【０２８９】
工程６９
化合物（ＩＸ−Ｉ）は化合物（ＩＸ−Ｇ）および化合物（ＩＸ−Ｈ）を用い、製造工程１の工程３と同様の条件で製造することができる。
また、工程ＤＰと工程６９を繰り返し行うことで、望みのｑ１の値をもつ化合物（ＶＩＩ−Ｊ）を製造することができる。
【０２９０】
工程７０
化合物（ＩＸ−Ｋ）は化合物（ＩＸ−Ｉ）および化合物（ＩＸ−Ｊ）を用い、製造工程１の工程３と同様の条件で製造することができる。
【０２９１】
工程７１
化合物（ＩＸ−Ｍ）は化合物（ＩＸ−Ｋ）および化合物（ＩＸ−Ｌ）を用い、製造工程１の工程３と同様の条件で製造することができる。
【０２９２】
工程７２−７４
化合物（ＩＸ'）は化合物（ＩＸ−Ｍ），  化合物（ＩＸ−Ｎ），  化合物（ＩＸ−Ｏ）および化合物（ＩＸ−Ｐ）を用い、製造工程１の工程３と同様の条件で製造することができる。
また、下記工程ＤＰ３と工程７２を繰り返し行うことで、望みのｑ３の値をもつ化合物（ＩＸ'）を製造することができる。
【０２９３】
工程ＤＰ３
有機合成化学で常用される方法［例えば、プロテクティブ・グループス・イン・オーガニック・シンセシス第３版（Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  Ｇｒｏｕｐｓ  ｉｎ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，  ｔｈｉｒｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ）、グリーン（Ｔ．Ｗ．Ｇｒｅｅｎｅ）著、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ  Ｉｎｃ．（１９９９年）等に記載の方法等］を適切に用いることで所望の化合物を製造することができる。
【０２９４】
化合物（ＩＸ'−Ｂ），  化合物（ＩＸ'−Ｄ），  化合物（ＩＸ'−Ｆ），  化合物（ＩＸ'−Ｈ），  化合物（ＩＸ'−Ｊ），  化合物（ＩＸ'−Ｌ），  化合物（ＩＸ'−Ｎ），  化合物（ＩＸ'−Ｏ）および化合物（ＩＸ'−Ｐ）は市販品として、または「実験化学講座第４版  有機合成、ｐ．  ２５８、丸善（１９９２年）」、「Ｍａｒｃｈ'ｓ  Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ：  Ｒｅａｃｔｉｏｎｓ，  Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ，  ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，  ７th  Ｅｄｉｔｉｏｎ」に記載の方法を組み合わせること、もしくはそれに準じた方法で得ることができる。
【０２９５】
製造方法１６
式１〜式８の核酸複合体の製造方法として、以下の方法も用いることができる。
【０２９６】
【化１２１】
2020111280.tif 000123
【０２９７】
（式中、ＬＣ、Ｑ５、Ｑ６、Ｑ７、Ｐ７、Ｐ８、ｑ５'、ｑ６およびＸは前記と同義である。）
【０２９８】
工程７５
化合物（Ｘ−Ｂ）は化合物（ＸＩＩＩ''）と化合物（Ｘ−Ａ）を溶媒中、０℃〜１００℃で１０秒間〜１００時間反応させることにより製造することができる。
溶媒としては水、リン酸緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝液、ジメチルスルホキシド等があげられ、これらは単独でまたは混合して用いられる。
化合物（ＶＩＩＩ'）は製造法１４を用いることで、得ることができる。
【０２９９】
化合物（Ｘ−Ａ）は公知の方法（例えばバイオコンジュゲート・ケミストリー（Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ），  第２１巻，  １８７−２０２頁，  ２０１０年、またはカレント・プロトコールズ・イン・ヌクレイック・アシッド・ケミストリー  （Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ），  ２０１０年，  ９月；  ＣＨＡＰＴＥＲ：  Ｕｎｉｔ  ４．４１）もしくはそれに準じた方法で得ることができる。
【０３００】
工程７６
化合物（Ｘ'）は化合物（Ｘ−Ｂ）を用いて炭酸ナトリウム水溶液またはアンモニア水中等ｐＨ８以上の条件下、室温と２００℃の間の温度で、５分間〜１００時間反応させる事により製造することができる。
【０３０１】
製造方法１７
式１〜式８の核酸複合体の製造方法として、以下の方法も用いることができる。
【０３０２】
【化１２２】
2020111280.tif 000124
【０３０３】
（式中、ＬＣ、Ｑ５、Ｑ６、Ｑ７、Ｐ７、Ｐ８、ｑ５'、ｑ６およびＸは前記と同義である。）
【０３０４】
工程７７
化合物（ＸＩ−Ａ）は化合物（ＶＩＩＩ''）を用いて、公知の方法（例えばバイオコンジュゲート・ケミストリー（Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ），  第２６巻，  １４５１−１４５５頁，  ２０１５年に記載の方法）またはそれに準じた方法で得ることができる。
化合物（ＶＩＩＩ'''）は製造法１４を用いることで、得ることができる。
【０３０５】
工程７８
化合物（ＸＩ'）は化合物（ＸＩ−Ａ）と化合物（ＸＩ−Ｂ）を用いて、公知の方法（例えばバイオコンジュゲート・ケミストリー（Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ），  第２６巻，  １４５１−１４５５頁，  ２０１５年に記載の方法）またはそれに準じた方法で得ることができる。
化合物（ＸＩ−Ｂ）はバイオコンジュゲート・ケミストリー（Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ），  第２６巻，  １４５１−１４５５頁，  ２０１５年に記載の方法）またはそれに準じた方法で得ることができる。
【０３０６】
工程７９
また別の方法として、化合物（ＸＩ'）は、公知の方法（例えばバイオコンジュゲートケミストリー（Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ），  第２２巻，１７２３−１７２８頁，  ２０１１年を参照）あるいははそれに準じた方法で、化合物（ＸＩ−Ａ）から直接得ることができる。
【０３０７】
本明細書における核酸複合体は、例えば酸付加塩、金属塩、アンモニウム塩、有機アミン付加塩、アミノ酸付加塩等の塩として得ることも可能である。
【０３０８】
酸付加塩としては、例えば塩酸塩、硫酸塩、リン酸塩等の無機酸塩、酢酸塩、マレイン酸塩、フマル酸塩、クエン酸塩、メタンスルホン酸塩等の有機酸塩が挙げられ、金属塩としては、例えばナトリウム塩、カリウム塩等のアルカリ金属塩、マグネシウム塩、カルシウム塩等のアルカリ土類金属塩、アルミニウム塩、亜鉛塩等が挙げられ、アンモニウム塩としては、例えばアンモニウム、テトラメチルアンモニウム等の塩が挙げられ、有機アミン付加塩としては、例えば、モルホリン、ピペリジン等の付加塩が挙げられ、アミノ酸付加塩としては、例えば、リジン、グリシン、フェニルアラニン等の付加塩が挙げられる。
【０３０９】
本明細書の核酸複合体の塩を調製したい場合には、該複合体が所望の塩の形で得られるときはそのまま精製すればよく、また、遊離の形で得られるときは、該複合体を適当な溶媒に溶解または懸濁し、対応する酸または塩基を加え、単離・精製すればよい。また、該複合体塩を形成する対イオンを異なる対イオンに変換する際には、該複合体塩を適当な溶媒に溶解または懸濁した後、酸、塩基および／または塩（塩化ナトリウム、塩化アンモニウム等の無機塩等）を数当量〜大過剰量加えて単離、精製すればよい。
【０３１０】
本明細書の核酸複合体の中には、幾何異性体、光学異性体等の立体異性体、互変異性体等が存在し得るものもあるが、全ての可能な異性体およびそれらの混合物も本発明に包含される。
【０３１１】
また、本明細書の核酸複合体は、水または各種溶媒との付加物の形で存在することもあり、これらの付加物も本発明の核酸複合体に包含される。
【０３１２】
さらに、本発明の核酸複合体は、分子中の一部あるいは全部の原子が質量数の異なる原子（同位体）（例えば、重水素原子等）で置換されたものも包含される。
【０３１３】
本発明の医薬組成物は、式１で表される核酸複合体を含む。本発明の核酸複合体は、Ｌ１およびＬ２の糖リガンドを有することにより、標的細胞に認識され、細胞内に導入される。
本発明の核酸複合体は、哺乳動物に投与して、生体内において、標的遺伝子の発現を低下または停止させることで抑制し、標的遺伝子に関連する疾患の治療に用いることができる。
本発明の核酸複合体を治療剤または予防剤として使用する場合、投与経路としては、治療に際し最も効果的な投与経路を使用するのが望ましく、特に限定されるものではないが、例えば、静脈内投与、皮下投与、筋肉内投与等が挙げられ、好ましくは皮下投与である。
投与量は、投与対象の病状や年齢、投与経路等によって異なるが、例えば二本鎖のオリゴヌクレオチドに換算した1日投与量が0.1μg〜1000 mgとなるように投与すればよく、1日投与量が1〜100 mgとなるように投与することがより好ましい。
【０３１４】
静脈内投与または筋肉内投与に適当な製剤としては、例えば注射剤があげられ、調製した液剤をそのまま例えば注射剤等の形態として用いることも可能であるが、該液剤から例えば濾過、遠心分離等によって溶媒を除去して使用することも、該液剤を凍結乾燥して使用する、および/または例えばマンニトール、ラクトース、トレハロース、マルトースもしくはグリシン等の賦形剤を加えた液剤を凍結乾燥して使用することもできる。
注射剤の場合、液剤または溶媒を除去または凍結乾燥した組成物に、例えば水、酸、アルカリ、種々の緩衝液、生理食塩水またはアミノ酸輸液等を混合して注射剤を調製することが好ましい。また、例えばクエン酸、アスコルビン酸、システインもしくはEDTA等の抗酸化剤、またはグリセリン、ブドウ糖もしくは塩化ナトリウム等の等張化剤等を添加して注射剤を調製することも可能である。また、例えばグリセリン等の凍結保存剤を加えて凍結保存することもできる。
【０３１５】
本発明の組成物を、哺乳動物の細胞に投与することで、本発明の組成物中の二本鎖核酸を細胞内に導入することができる。
【０３１６】
インビボにおける本発明の核酸複合体の哺乳動物の細胞への導入方法は、インビボにおいて行うことのできる公知のトランスフェクションの手順に従って行えばよい。本発明の組成物を、人を含む哺乳動物に静脈内投与することで、肝臓へ送達され、肝臓または肝細胞内に本発明の組成物中の二本鎖核酸を導入することができる。
【０３１７】
肝臓または肝細胞内に本発明の組成物中の二本鎖核酸が導入されると、その肝細胞内のAPCS遺伝子の発現を低下させ、アミロイド関連疾患を治療あるいは予防することができる。アミロイド関連疾患としては、APCSを含んだアミロイド線維により媒介される障害によって引き起こされる疾患が挙げられ、具体的にはアミロイド線維として知られている異常な不溶性蛋白質線維が組織に沈着して臓器障害が引き起こされる疾患である。アミロイド関連疾患として、より具体的には全身性アミロイドーシスであるALアミロイドーシス、AAアミロイドーシス、ATTRアミロイドーシス、透析アミロイドーシス、アミロイド沈着を伴う心不全、アミロイド沈着を伴う腎症、老年性アミロイドーシス、手根管症候群等、限局性アミロイドーシスであるアルツハイマー型認知症、脳アミロイドアンギオパチー、II型糖尿病等が挙げられる。本発明の核酸複合体の投与対象は哺乳動物であり、ヒトであることが好ましい。
【０３１８】
本発明の核酸複合体を、アミロイド関連疾患の治療剤または予防剤として使用する場合、投与経路としては、治療に際し最も効果的な投与経路を使用するのが望ましく、好ましくは静脈内投与、皮下投与または筋肉内投与をあげることができ、より好ましくは皮下投与が挙げられる。
【０３１９】
投与量は、投与対象の病状や年齢、投与経路等によって異なるが、例えば二本鎖核酸に換算した1日投与量が0.1μg〜1000 mgとなるように投与すればよく、1日投与量が1〜100 mgとなるように投与することが好ましい。
【０３２０】
また、本発明は、疾患の治療に使用するための核酸複合体；疾患の治療に使用するための医薬組成物；疾患を治療するための核酸複合体の使用；疾患の治療用医薬の製造における核酸複合体の使用；疾患の治療用医薬の製造に使用するための核酸複合体；有効量の核酸複合体を、その必要のある対象に投与することを含む、疾患の治療または予防方法；を提供する。
【実施例】
【０３２１】
次に、参考例、実施例および試験例により、本発明を具体的に説明する。ただし、本発明はこれら実施例および試験例に限定されるものではない。なお、実施例および参考例に示されたプロトン核磁気共鳴スペクトル(1H NMR)は、270MHz、300MHzまたは400MHzで測定されたものであり、化合物および測定条件によっては交換性プロトンが明瞭には観測されないことがある。また、シグナルの多重度の表記としては通常用いられるものを用いているが、brとはbroadを意味し、見かけ上幅広いシグナルであることを表す。
UPLC分析は以下の条件を用いた。
移動相A：  0.1%ギ酸含有水溶液、B：  アセトニトリル溶液
グラジエント：  移動相Bが10%-90%のリニアグラジエント（3分間）
カラム：  Waters社製ACQUITY UPLC BEH C18 (1.7 μm、内経 2.1 x 50 mm)
流速：  0.8 mL/min
PDA検出波長：  254 nm (検出範囲190-800 nm)【０３２２】
表X-1〜表X-4に参考例化合物を示す。【０３２３】
【表１】
2020111280.tif 000125
【０３２４】
【表２】
2020111280.tif 000126
【０３２５】
【表３】
2020111280.tif 000127
【０３２６】
【表４】
2020111280.tif 000128
【０３２７】
【表５】
2020111280.tif 000129
【０３２８】
【表６】
2020111280.tif 000130
【０３２９】
【表７】
2020111280.tif 000131
【０３３０】
【表８】
2020111280.tif 000132
【０３３１】
【表９】
2020111280.tif 000133
【０３３２】
【表１０】
2020111280.tif 000134
【０３３３】
参考例１【０３３４】
【化１２３】
2020111280.tif 000135
【０３３５】
化合物RE1-2の合成
参考例1工程1
ジャーナル・オブ・アメリカン・ケミカル・ソサイエティー (Journal of American Chemical Society), 第136巻, 16958−16961頁, 2014年に記載された方法で合成した化合物RE1-1 (0.8755 g, 1.9567 mmol)をテトラヒドロフラン (10 mL)に溶解し、1, 3−ジシクロヘキサンカルボジイミド（DCC, 0.4247 g, 2.0584 mmol)とN-ヒドロキシスクシミド (0.2412 g, 2.0958 mmol)を加え室温にて一晩撹拌した。反応混合物から析出した固体を除き、減圧下、溶媒を留去した。得られた混合物をN, N'-ジメチルホルムアミド (DMF)に溶解し、2-アミノエチルマレイミド臭酸塩 (0.6479 g, 2.5491 mmol)とジイソプロピルエチルアミン (1.7 mL, 9.7835 mmol)を加えた後、室温で一晩撹拌した。減圧下、反応液の溶媒を留去し、逆相カラムクロマトグラフィー (水/メタノール=80/20)で溶出させることにより、化合物RE1-2 (0.8502 g, 収率76%)を得た。
ESI-MS m/z: 570 (M + H)+;
1H-NMR (DMSO-D6) δ: 1.45-1.56 (4H, m), 1.78 (3H, s), 1.90 (3H, s), 1.97 (2H, t, J = 7.0 Hz), 2.00 (3H, s), 2.11 (3H, s), 3.18-3.19 (2H, m), 3.38-3.45 (3H, m), 3.64-3.71 (1H, m), 3.85-3.89 (1H, m), 4.01-4.04 (3H, m), 4.48 (1H, d, J = 8.6 Hz), 4.95-4.98 (1H, m), 5.21 (1H, d, J = 3.5 Hz), 6.99 (2H, s), 7.81-7.87 (2H, m).【０３３６】
化合物RE1-4の合成
参考例1工程2
化合物RE1-1 (0.9602 g, 2.1460 mmol)をN,N'-ジメチルホルムアミド (10 mL)に溶解し、N-Boc-エチレンジアミン （シグマアルドリッチ社製, 0.6877 g, 4.292 mmol）、ジイソプロピルエチルアミン (1.90 mL, 10.87 mmol)、および2-(1H-ベンゾトリアゾール-1-イル)-1,1,3,3-テトラメチルウロニウム ヘキサフルオロリン酸塩 (和光純薬工業社製, 1.6437 g, 4.3229 mmol)を加えて、室温にて終夜攪拌した。反応液に水を加え、クロロホルムで2回抽出した後、有機層を飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥した。減圧下、溶媒を留去し、化合物RE1-3の粗精製物を得た。
ESI-MS m/z: 590 (M + H)+【０３３７】
参考例1工程3
化合物RE1-4の合成工程1で合成した化合物RE1-3 (1.2654 g, 2.1460 mmol)をジクロロメタン (15 mL)に溶解し、トリフルオロ酢酸 (4 mL)を加えて、室温にて一晩攪拌した。反応液に水を加え、酢酸エチルで抽出した後、有機層を飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥した。減圧下、溶媒を留去し、逆相カラムクロマトグラフィー (水/メタノール=80/20)で溶出させることにより、化合物RE1-4 (0.3879 g, 収率37 %)を得た。
ESI-MS m/z: 490 (M + H)+;
1H-NMR (DMSO-D6) δ: 1.46-1.52 (4H, m), 1.78 (3H, s), 1.90 (3H, s), 2.00 (3H, s), 2.08 (2H, t, J = 7.4 Hz), 2.11 (3H, s), 2.85 (2H, t, J = 6.3 Hz), 3.27 (2H, dd, J = 12.3, 6.2 Hz), 3.67-3.69 (1H, m), 3.68-3.73 (1H, m), 3.86-3.90 (1H, m), 4.01-4.04 (3H, m), 4.49 (1H, d, J = 8.4 Hz), 4.97 (1H, dd, J = 11.3, 3.4 Hz), 5.22 (1H, d, J = 3.5 Hz), 7.86 (1H, d, J = 9.1 Hz), 7.95-8.02 (1H, m).【０３３８】
参考例2【０３３９】
【化１２４】
2020111280.tif 000136
【０３４０】
参考例2工程１
(9H-フルオレン-9-イル)メチル((2R,3R)-1,3-ジヒドロキシブタン-2-イル)カルバマート (化合物RE2-1, Chem-Impex International, Inc社製, 1.50 g, 4.58 mmol)をピリジン (20 mL)に溶解し、氷冷下、4,4'-ジメトキシトリチルクロライド (東京化成工業社製, 1.71 g, 5.04 mmol)を加えた後、室温にて2時間攪拌した。反応液を氷冷し、10%クエン酸水溶液を加え、酢酸エチルで抽出した後、有機層を飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥した。減圧下、溶媒を留去し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー (ヘキサン/酢酸エチル=90/10)で精製することにより、化合物RE2-2 (1.07 g, 収率37%)を得た。
ESI-MS m/z: 630 (M + H)+【０３４１】
参考例2工程2
参考例2工程1で合成した化合物RE2-2 (1.07 g, 1.699 mmol)をN,N-ジメチルホルムアミド (10 mL)に溶解し、室温にてピペリジン (0.336 mL, 3.40 mmol)を加えて3時間攪拌した。反応液に水を加え、酢酸エチルで抽出した後、有機層を飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥した。減圧下、溶媒を留去し、残渣をアミノシリカゲルカラムクロマトグラフィー (クロロホルム/メタノール=90/10)で精製することにより、化合物RE2-3 (0.59 g, 収率85 %)を得た。
ESI-MS m/z: 408 (M + H)+【０３４２】
参考例3【０３４３】
【化１２５】
2020111280.tif 000137
【０３４４】
参考例3工程1
5-ヒドロキシイソフタル酸ジメチル (化合物RE3-1, 和光純薬工業社製, 5.0443 g, 24 mmol)をテトラヒドロフラン (和光純薬工業社製25 mL)に溶解し、2-(tert-ブトキシカルボニルアミノ)-1-エタノール (東京化成工業社製, 4.0343 g, 25.03 mmol）、およびトリフェニルホスフィン ポリマー担持体 （シグマアルドリッチ社製, 6.61 g, 25.2 mmol）を加えた後、氷冷下、40％ジイソプロピルアゾジカルボキシレート(DIAD)トルエン溶液 (東京化成工業社製, 13.26 mL, 25.2 mmol)を加え、室温にて一晩攪拌した。反応液をろ過し、減圧下、ろ液を留去した後、残渣をアミノシリカゲルカラムクロマトグラフィー (ヘキサン/酢酸エチル=95/5〜80/20)で精製することにより、化合物RE3-2 (5.3071 g, 収率63%)を得た。
ESI-MS m/z: 254 (M + H)+, 脱Boc体として検出【０３４５】
参考例3工程2
参考例3工程1で合成した化合物RE3-2 (5.3071 g, 15.02 mmol)をメタノール (25 mL)に溶解し、氷冷下、2mol/L水酸化ナトリウム水溶液 (和光純薬工業社製, 13 mL)を加え、室温にて4時間攪拌した。反応液を氷冷し、10%クエン酸水溶液を加え、酢酸エチルで抽出した後、有機層を飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥した。減圧下、溶媒を留去することにより、化合物RE3-3を定量的に得た。
ESI-MS m/z: 324 (M - H)-【０３４６】
参考例3工程3
参考例3工程2で合成した化合物RE3-3 (1.9296 g, 5.93 mmol)をN, N'-ジメチルホルムアミド (70 mL)に溶解し、N-1-(9H-フルオレン-9-イルメトキシカルボニル)-エチレンジアミン塩酸塩 (3.3493 g, 11.86 mmol)、ジイソプロピルエチルアミン (5.18 mL, 29.7 mmol)、および2-(1H-ベンゾトリアゾール-1-イル)-1,1,3,3-テトラメチルウロニウムヘキサフルオロリン酸塩 (4.5168 g,  11.88 mmol)を加えて、室温にて4時間攪拌した。反応液を氷冷し、10%クエン酸水溶液を加え、クロロホルムで抽出した後、有機層を飽和炭酸水素ナトリウム水溶液および飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥した。減圧下、溶媒を留去し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー (クロロホルム/メタノール)で精製することにより、化合物RE3-4 (3.4407 g, 収率68%)を得た。
ESI-MS m/z: 898 (M + HCOO)-【０３４７】
参考例3工程4
参考例3工程3で合成した化合物RE3-4 (1.6087 g, 1.884 mmol)をジクロロメタン (20 mL)に溶解し、氷冷下、トリフルオロ酢酸 (5mL, 64.9 mmol)を加えて、室温にて4時間攪拌した。反応液を減圧下、溶媒を留去することにより、化合物RE3-5 (2.4079 g)を定量的に得た。
ESI-MS m/z: 798(M + HCOO)-【０３４８】
参考例3工程5
参考例3工程4で合成した化合物RE3-5 (386 mg, 0.512 mmol)をテトラヒドロフラン (10 mL)に溶解し、氷冷下、塩化ベンゾイル (175 mg, 1.024 mmol)を加えて、室温にて1時間攪拌した。反応液を減圧下、溶媒を留去し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(クロロホルム/メタノール)で精製することにより、化合物RE3-6 (373 mg, 収率82%)を得た。
ESI-MS m/z: 888(M + H)+【０３４９】
参考例3工程6
参考例3工程5で合成した化合物RE3-6 (108 mg, 0.122 mmol)をジクロロメタン (5 mL)に溶解し、室温にてジエチルアミン (0.5 mL,4.8 mmol)を加えて1時間攪拌した。減圧下、溶媒を留去することにより、化合物RE3-7 (54.9 mg)を定量的に得た。
ESI-MS m/z: 444(M + H)+【０３５０】
参考例3工程7
参考例3工程6で合成した化合物RE3-7 (180 mg, 0.406 mmol)、Nα,Nε-ビス(tert-ブトキシカルボニル)-L-リジン (ノババイオケム社製, 295 mg, 0.852 mmol)、ジイソプロピルエチルアミン (0.354 mL,2.029 mmol)、および2-(1H-ベンゾトリアゾール-1-イル)-1,1,3,3-テトラメチルウロニウムヘキサフルオロリン酸塩 (324 mg, 0.852 mmol)を加えて、室温にて終夜攪拌した。反応液を氷冷し、10%クエン酸水溶液を加え、クロロホルムで抽出した後、有機層を飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥した。減圧下、溶媒を留去し、残渣をアミノシリカゲルカラムクロマトグラフィー (クロロホルム/メタノール)で精製することにより、化合物RE3-8 (450 mg)を定量的に得た。
ESI-MS m/z: 1101(M + H)+【０３５１】
参考例3工程8
参考例3工程7で合成した化合物RE3-8 (2.1558 g, 1.9593 mmol)をジクロロメタン (20 mL)に溶解し、氷冷下、トリフルオロ酢酸 (5 mL)を加えて、室温にて4時間攪拌した。反応液を減圧下、溶媒を留去することにより、化合物RE3-9を定量的に得た。
ESI-MS m/z: 700(M + H)+【０３５２】
参考例４【０３５３】
【化１２６】
2020111280.tif 000138
（図中、Bnはベンジル基を表す。）【０３５４】
参考例4工程1
参考例3に記載の方法で合成した化合物RE4-1(参考例3における化合物RE3-5, 0.5716 g, 0.7582 mmol)、バイオコンジュゲート・ケミストリー (Bioconjugate Chemistry), 第22巻, 690−699頁, 2011年に記載された方法で合成したドデカン酸モノベンジルエステル (0.4859 g, 1.5164 mmol)、ジイソプロピルエチルアミン (0.662 mL, 3.79 mmol)、および2-(1H-ベンゾトリアゾール-1-イル)-1,1,3,3-テトラメチルウロニウムヘキサフルオロリン酸塩 (0.5766 g, 1.516 mmol)をN,Nジメチルホルムアミド(12 mL)に溶解し、室温にて1時間攪拌した。反応液を氷冷し、飽和クエン酸水溶液を加え、クロロホルムで抽出した後、有機層を飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥した。減圧下、溶媒を留去し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー (クロロホルム/メタノール)で精製することにより、化合物RE4-2 (0.88 g, 収率84%)を得た。
ESI-MS m/z: 1057(M + H)+【０３５５】
参考例4工程2
参考例4工程1で合成した化合物RE4-2 (0.7545 g, 0.714 mmol)をジクロロメタンとテトラヒドロフランの混合溶媒 (20 mL)に溶解し、室温にてジエチルアミン (5 mL,47.9 mmol)を加えて終夜攪拌した。減圧下、溶媒を留去することにより、化合物RE4-3を定量的に得た。
ESI-MS m/z: 612(M + H)+【０３５６】
参考例4工程3
参考例4工程2で合成した化合物RE4-3 (0.437 g, 0.7143 mmol)、Nα,Nε-ビス(tert-ブトキシカルボニル)-L-リジン (ノババイオケム社製, 0.5483 g, 1.583 mmol)、ジイソプロピルエチルアミン (0.624 mL, 3.57 mmol)、2-(1H-ベンゾトリアゾール-1-イル)-1,1,3,3-テトラメチルウロニウムヘキサフルオロリン酸塩 (0.5703 g, 1.5 mmol)を加えて、室温にて2時間攪拌した。反応液に10%クエン酸水溶液を加え、酢酸エチルで抽出した後、有機層を飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥した。減圧下、溶媒を留去することにより、化合物RE4-4の粗生成物を得た。
ESI-MS m/z: 1269(M + H)+【０３５７】
参考例4工程4
参考例4工程3で合成した化合物RE4-4 (0.906 g, 0.7143 mmol)をジクロロメタン (12 mL)に溶解し、氷冷下、トリフルオロ酢酸 (3mL, 38.9 mmol)を加えて、室温にて4時間攪拌した。反応液を減圧下、溶媒を留去することにより、化合物RE4-5の粗生成物を得た。
ESI-MS m/z: 869(M + H)+【０３５８】
参考例５【０３５９】
【化１２７】
2020111280.tif 000139
【０３６０】
参考例5工程1
参考例3に記載の方法で合成した化合物RE5-1 (参考例3におけるRE3-8, 100 mg, 0.091 mmol)をメタノール (3 mL)に溶解し、酢酸 (2 μL)を添加した後、パラジウム/炭素による接触水素還元を行った。得られた溶液留分を減圧下、溶媒を留去することにより、化合物RE5-2を定量的に得た。
ESI-MS m/z: 967 (M + H)+【０３６１】
参考例5工程2
化合物RE5-2 (50 mg, 0.052 mmol)およびN-(6-マレイミドカプロイルオキシ)スクシミド (48 mg, 0.155 mmol)をテトラヒドロフラン (2 mL)に溶解し、ジイソプロピルエチルアミン (0.045 mL, 0.259  mmol)を加えて、室温にて終夜攪拌した。減圧下、溶媒を留去し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(クロロホルム/メタノール)で精製することにより、化合物RE5-3 (18 mg, 収率30%)を得た。
ESI-MS m/z: 1160 (M + H)+【０３６２】
参考例5工程3
参考例5工程2で合成した化合物RE5-3 (18 mg, 0.016 mmol)をジクロロメタン (2 mL)に溶解し、氷冷下、トリフルオロ酢酸 (0.2 mL, 2.6 mmol)を加えて、室温にて終夜攪拌した。反応液を減圧下、溶媒を留去し、ジエチルエーテルにて晶析した後、化合物RE5-4 (7.5 mg, 収率64%)を白色固体として得た。
ESI-MS m/z: 759 (M + H)+【０３６３】
参考例6【０３６４】
【化１２８】
2020111280.tif 000140
【０３６５】
参考例6工程1
参考例3に記載の方法で合成した化合物RE6-1 (参考例3における化合物RE3-2, 0.9372 g, 2.8809 mmol)、β-アラニンメチルエステル塩酸塩 (東京化成工業株式会社製, 0.8082 g, 5.7902 mmol)を用い、参考例3工程3と同様の方法で化合物RE6-2を定量的に得た。
ESI-MS m/z: 495 (M + H)+【０３６６】
参考例6工程2
参考例6工程1で合成した化合物RE6-2 (0.9622 g, 1.952 mmol)を用い、参考例3工程4と同様の方法で化合物RE6-3を定量的に得た。
ESI-MS m/z: 396 (M + H)+【０３６７】
参考例6工程3
参考例6工程2で合成した化合物RE6-3 (0.1146 g, 0.290 mmol)およびN-スクシンイミジル15-アジド-4,7,10,13-テトラオキサペンタデカン酸(N3-PEG4-NHS， 東京化成工業株式会社製, 0.0750 g, 0.1931 mmol)を用い、参考例5工程2と同様の方法で化合物RE6-4を定量的に得た。
ESI-MS m/z: 669 (M + H)+【０３６８】
参考例6工程4
参考例6工程3で合成した化合物RE6-4 (0.1291 g, 0.193 mmol)を用い、参考例3工程2と同様の方法で化合物RE6-5を定量的に得た。
ESI-MS m/z: 641 (M + H)+【０３６９】
参考例6工程5
参考例6工程4で合成した化合物RE6-5 (0.1252 g, 0.193 mmol)およびL-グルタミン酸 ジ-tert-ブチルエステル(渡辺化学株式会社製, 0.1180 g, 0.399 mmol)を用い、参考例3工程3と同様の方法で化合物RE6-6 (0.0521 g, 収率24%)を得た。
ESI-MS m/z: 1124 (M + H)+【０３７０】
参考例6工程6
参考例6工程5で合成した化合物RE6-6 (0.0521 g, 0.0464 mmol)を用い 、参考例3工程4と同様の方法で化合物RE6-7 (36 mg, 収率86%)を得た。
ESI-MS m/z: 899 (M + H)+【０３７１】
参考例７【０３７２】
【化１２９】
2020111280.tif 000141
【０３７３】
参考例7工程1
参考例3に記載の方法で合成した化合物RE7-1 (参考例3におけるRE3-9, 0.2586 g, 0.3695 mmol)とジャーナル・オブ・アメリカン・ケミカル・ソサイエティー (Journal of American Chemical Society), 第136巻, 16958−16961頁, 2014年に記載された方法で合成した参考例1に記載の化合物RE-1 (0.8559 g, 1.7927 mmol)を用い、参考例3工程3と同様の方法で化合物RE7-2 (0.5272 g, 収率61%)を得た。
ESI-MS m/z: 2418 (M + H)+【０３７４】
参考例7工程2
参考例7工程1で合成した化合物RE7-2 (0.2653 g, 0.1097 mmol)を用い、参考例5工程1と同様の方法で化合物RE7-3 (0.1524 g, 収率61%)を得た。
ESI-MS m/z: 2284 (M + H)+【０３７５】
参考例8:化合物A1およびB1の合成【０３７６】
【化１３０】
2020111280.tif 000142
【０３７７】
化合物A1の合成
参考例7に記載の方法で合成した化合物RE8-1 (参考例7における化合物RE7-3, 0.0152 g, 0.006657 mmol)を用い、参考例5工程2と同様の方法で化合物A1 (0.0077 g, 収率47%)を得た。
ESI-MS m/z: 1239(M + 2H)2+
1H-NMR (DMSO-D6) δ: 1.11-1.66 (34H, m), 1.77 (12H, d, J = 1.5 Hz), 1.89 (12H, s), 2.01-2.14 (10H, m), 2.01 (12H, s), 2.10 (12H, s), 2.92-2.99 (4H, m), 3.16-3.54 (14H, m), 3.65-3.74 (4H, m), 3.81-3.91 (4H, m), 3.98-4.08 (14H, m), 4.11-4.24 (4H, m), 4.48 (4H, dd, J = 8.4, 1.8 Hz), 4.93-5.00 (4H, m), 5.21 (4H, d, J = 3.5 Hz), 6.99 (2H, s), 7.52 (2H, s), 7.66-7.75 (2H, m), 7.78-7.87 (6H, m), 7.91 (1H, br s), 8.01-8.08 (3H, br m), 8.54-8.60 (2H, br m).【０３７８】
化合物B1の合成
化合物RE8-1 (参考例7における化合物RE7-3, 0.0150 g, 0.00657 mmol)を用い、参考例3工程3と同様の方法で化合物B1 (0.0062 g, 収率37%)を得た。
ESI-MS m/z: 1279(M + 2H)2+
1H-NMR (DMSO-D6) δ: 1.11-1.66 (30H, m), 1.77 (12H, s), 1.89 (12H, s), 2.01-2.14 (8H, m), 2.01 (12H, s), 2.10 (12H, s), 2.33-2.38 (2H, m), 2.92-2.99 (4H, m), 3.16-3.54 (14H, m), 3.58-3.63 (16H, m), 3.65-3.74 (4H, m), 3.81-3.91 (4H, m), 3.98-4.08 (12H, m), 4.11-4.24 (4H, m), 4.48 (4H, dd, J = 8.4, 1.8 Hz), 4.93-5.00 (4H, m), 5.21 (4H, d, J = 3.5 Hz), 7.52 (2H, s), 7.66-7.75 (2H, m), 7.78-7.87 (6H, m), 7.91 (1H, br s), 8.01-8.08 (3H, br m), 8.54-8.60 (2H, br m).【０３７９】
参考例9:化合物B2およびB3の合成【０３８０】
【化１３１】
2020111280.tif 000143
【０３８１】
化合物B2の合成
参考例6に記載の方法で合成した化合物RE9-1 (参考例6における化合物RE6-5, 0.00436 g, 0.00681 mmol)および参考例1の化合物RE1-4 (0.010 g, 0.020 mmol)を用い、参考例3工程3と同様の方法で化合物B2の粗生成物を得た。
ESI-MS m/z: 1584(M + H)+【０３８２】
化合物B3の合成
参考例6に記載の方法で合成した化合物RE9-2 (参考例6における化合物RE6-7, 0.0100 g, 0.01112 mmol)を用い、参考例3工程3と同様の方法で化合物B3 (0.0223 g, 収率72%)を得た。
ESI-MS m/z: 1393(M + 2H)2+【０３８３】
参考例10：化合物C1およびD1の合成【０３８４】
【化１３２】
2020111280.tif 000144
【０３８５】
参考例10工程1
参考例4に記載の方法で合成した化合物RE10-1 (参考例4における化合物RE4-5, 0.1952 g, 0.225 mmol)とジャーナル・オブ・アメリカン・ケミカル・ソサイエティー (Journal of American Chemical Society), 第136巻, 16958−16961頁、2014年に記載された方法で合成した参考例1の化合物RE1-1 (0.4162 g, 0.93 mmol)を用い、参考例3工程3と同様の方法で化合物RE10-2 (334.8 mg, 収率58%)を得た。
ESI-MS m/z: 1294 (M + 2H)2+【０３８６】
参考例10工程2
参考例10工程1で合成した化合物RE10-2 (0.1459 g, 0.056 mmol)を用い、参考例5工程1と同様の方法で化合物D1 (112 mg, 収率80%)を得た。
ESI-MS m/z: 1249 (M + 2H)2+
1H-NMR (DMSO-D6) δ: 1.11-1.66 (44H, m), 1.77 (12H, d, J = 1.5 Hz), 1.89 (12H, s), 2.01-2.20 (12H, m), 2.01 (12H, s), 2.10 (12H, s), 2.92-2.99 (4H, m), 3.16-3.54 (10H, m), 3.58-3.64 (4H, m), 3.65-3.74 (4H, m), 3.81-3.91 (4H, m), 3.98-4.08 (12H, m), 4.11-4.24 (4H, m), 4.48 (4H, dd, J = 8.4, 1.8 Hz), 4.93-5.00 (4H, m), 5.21 (4H, d, J = 3.5 Hz), 6.99 (2H, s), 7.52 (2H, s), 7.66-7.75 (2H, m), 7.78-7.87 (6H, m), 7.91 (1H, br s), 8.01-8.08 (3H, br m), 8.54-8.60 (2H, br m).【０３８７】
参考例10工程3
参考例10工程2で合成した化合物D1 (0.1091 g, 0.044 mmol)および参考例2の化合物RE2-3 (0.0748 g, 0.184 mmol)を用い、参考例3工程3と同様の方法で化合物RE10-3を粗生成物として得た。
ESI-MS m/z: 1292 (M + 2H)2+, 脱DMTr体として検出【０３８８】
参考例10工程4
参考例10工程3で合成した化合物RE10-3 (0.161 g, 0.05586 mmol)をジクロロメタン (5 mL)に溶解し、コハク酸無水物 (東京化成工業社製, 0.1182 g, 1.181 mmol）、N,N-ジメチルアミノピリジン (0.0224 g,0.183 mmol)、およびトリエチルアミン(0.55 mL, 3.95 mmol)を加えて、室温にて一晩攪拌した。反応液を氷冷し、水を加え、酢酸エチルで2回抽出した後、有機層を飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥した。減圧下、溶媒を留去することにより、化合物RE10-4の粗生成物を得た。
ESI-MS m/z: 1342(M + 2H)2+, 脱DMTr体として検出【０３８９】
参考例10工程5
参考例10工程4で合成した化合物RE10-4 (0.0816 g, 0.02734 mmol)、O-(ベンゾトリアゾール-1-イル)-N,N,N',N'-テトラメチルウロニウム ヘキサフルオロリン酸塩 (0.0221 g, 0.05827 mmol)、およびジイソプロピルエチルアミン（0.02 mL, 0.1094 mmol）をN,N-ジメチルホルムアミド(4 mL)に溶解し、LCAA-CPG (Chem Gene社製, 0.4882 g)を加え、室温にて終夜攪拌した。混合物を濾別し、ジクロロメタン、10%メタノールジクロロメタン溶液、およびジエチルエーテルで順次洗浄した後、無水酢酸/ピリジン溶液と作用させることにより、化合物C1（49.5 μmol/g, 収率89%）を得た。なお、収率は1%トリフルオロ酢酸/ジクロロメタン溶液を固相担持体に添加し、DMTr基に由来する吸収から計算できる固相担体への導入率より算出した。【０３９０】
参考例11【０３９１】
【化１３３】
2020111280.tif 000145
【０３９２】
化合物RE11-1（1.200 g, 3.640 mmol）から、ジャーナル・オブ・メディシナル・ケミストリー（Journal of Medicinal Chemistry）, 第59巻, 2718-2733頁, 2016年に記載された方法で化合物RE11-2（1.050 g, 収率50%）を合成した。
ESI-MS m/z: 582 (M + H)+【０３９３】
参考例12【０３９４】
【化１３４】
2020111280.tif 000146
【０３９５】
化合物RE12-1（4.000g, 10.27 mmol）をジクロロメタン（60 mL）に溶解し、ベンジル-2-(2-ヒドロキシエトキシ)エチルカーバメイト（2.700 g, 11.30 mmol）、およびトリフルオロメタンスルホン酸（0.1360 mL, 1.541 mmol）を加えて、還流条件下で終夜攪拌した。反応液に10 wt% 炭酸カリウム水溶液を加え、ジクロロメタンと分液した後、有機相を水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。減圧下、溶媒を留去し、2-メチルテトラヒドロフランへと置換濃縮した。残渣をへプタンに滴下し、得られた結晶をろ過することにより、化合物RE12-2（5.130 g, 収率88%）を得た。
ESI-MS m/z: 570 (M + H)+【０３９６】
参考例13【０３９７】
【化１３５】
2020111280.tif 000147
【０３９８】
化合物RE13-1（参考例1における化合物RE1-1, 898.0 mg, 2.007 mmol）をジクロロメタン（15 mL）に溶解し、1-ヒドロキシベンゾトリアゾール一水和物（338.0 mg, 2.208 mmol）、1-(3-ジメチルアミノプロピル)-3-エチルカルボジイミド塩酸塩（343 mg, 2.208 mmol）、およびN-1-Z-1, 3-ジアミノプロパン塩酸塩（0.4910 mL, 2.208 mmol）を加え、室温で3時間攪拌した。反応液に水を加え、ジクロロメタンで分液した後、有機層を飽和炭酸水素ナトリウム水溶液で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。減圧下、溶媒を留去し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（クロロホルム/メタノール=90/10）で精製することにより、化合物RE13-2（873.0 mg, 収率68%）を得た。
ESI-MS m/z: 639 (M + H)+【０３９９】
参考例14【０４００】
【化１３６】
2020111280.tif 000148
【０４０１】
参考例14工程1
化合物RE14-1 (参考例1における化合物RE1-1, 3.00 g, 6.70 mmol)をジクロロメタン (60 mL)に溶解し、室温にてL-リジンベンジルエステル二p-トルエンスルホン酸塩 (1.75 g, 3.02 mmol)、トリエチルアミン(0.935 mL, 6.70 mmol), 1-(3-ジメチルアミノプロピル)-3-エチルカルボジイミド塩酸塩 (1.29 g, 6.70 mmol)、1-ヒドロキシベンゾトリアゾール１水和物 (103 mg, 0.670 mmol)を加えて2.5時間撹拌した。反応液を水と飽和炭酸水素ナトリウム水溶液で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。減圧下、溶媒を留去し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー (クロロホルム/メタノール=90/10)で精製することにより、化合物RE14-2を定量的に得た。
ESI-MS m/z: 1096 (M + H)+【０４０２】
参考例14工程2
化合物RE14-2 (2.30 g, 2.10 mmol)をテトラヒドロフラン (46 mL)に溶解し、室温にて10%パラジウムカーボン粉末 (含水品, 54.29%; 424 mg)を加え、水素雰囲気下で終夜撹拌した。反応液をろ過し、減圧下、溶媒を留去することにより、化合物RE14-3を定量的に得た。
ESI-MS m/z: 1006 (M + H)+【０４０３】
参考例15【０４０４】
【化１３７】
2020111280.tif 000149
【０４０５】
参考例15工程1
イミノ二酢酸 (東京化成工業社製, 1.5 g, 6.43 mmol,)を塩化メチレン(30 mL)に溶解し、ペンタフルオロトリフルオロ酢酸(東京化成工業社製, 2.75 mL, 16.08 mmol)、トリエチルアミン(4.48 mL, 32.2 mmol)を加えて4時間撹拌した。反応液に10%クエン酸水溶液を加え、クロロホルムで抽出した後、有機層を飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥した。そこに、参考例11に記載の方法で合成した化合物RE15-1 (参考例11における化合物RE11-2, 2 g, 3.45 mmol)を酢酸エチル(10 mL)とアセトニトリル(10 mL)との混合液に溶解し、パラジウム/炭素による接触水素還元を行った。得られた溶液部分を減圧下、溶媒を留去することにより、化合物RE15-2の粗製生物を得た。
ESI-MS m/z: 1091(M+H)+【０４０６】
参考例15工程2
化合物RE15-2 (1.5 g,1.37 mmol)を用い、参考例1工程3と同様の方法で化合物RE15-3を定量的に得た。
ESI-MS m/z: 990(M+H)+【０４０７】
参考例16【０４０８】
【化１３８】
2020111280.tif 000150
【０４０９】
参考例16工程1
N-(t-ブトキシカルボニル)-L-グルタミン酸 (東京化成工業社製)を用いて、参考例11に記載の方法で合成した化合物RE16-1 (1.855 g, 3.19 mmol)を用い、参考例15工程1と同様の方法で化合物RE16-2の粗精製物を得た。
ESI-MS m/z: 1105(M+H)+【０４１０】
参考例16工程2
化合物RE16-2(1.421 g, 1.2866 mmol)を用い、参考例1工程3と同様の方法で化合物RE16-3を定量的に得た。
ESI-MS m/z: 1004(M+H)+【０４１１】
参考例17【０４１２】
【化１３９】
2020111280.tif 000151
【０４１３】
ジャーナル・オブ・オーガニック・ケミストリー（Journal of Organic Chemistry）, 第74巻, 6837-6842頁, 2009年に記載された方法で合成した化合物RE17-1 (90 mg, 0.173 mmol) をテトラヒドロフラン (1 mL) に溶解し、トリフェニルホスフィン、ポリマー担持 (シグマアルドリッチ社製, 63 mg, 0.189 mmol) を加えて、加熱環流下3時間撹拌した。反応液をろ過し、減圧下、溶媒を留去することにより、化合物RE17-2 (70 mg, 収率82%)
を得た。
ESI-MS m/z: 516 (M+Na)+
1H-NMR (400 MHz, CDCl3): δ0.89 (3H, s), 1.42-1.48 (2H, m), 1.52-1.61 (2H, m), 1.85 (1H, br s), 2.68 (2H, t, J = 7.2 Hz), 3.06-3.07 (2H, m), 3.39-3.44 (3H, m), 3.51-3.55 (3H, m), 3.78 (6H, s), 6.80-6.85 (4H, m), 7.17-7.23 (1H, m), 7.27-7.33 (6H, m), 7.41-7.43 (2H, m).【０４１４】
参考例18【０４１５】
【化１４０】
2020111280.tif 000152
【０４１６】
参考例18工程1
化合物RE18-1 (東京化成工業社製, 0.500 g, 3.73 mmoL)を用いて参考例2工程1と同様の方法で化合物RE18-2の粗生成物 (1.5 g) を得た。
ESI-MS m/z: 435 (M-H)-【０４１７】
参考例18工程2
化合物RE18-2の粗生成物 (1.5 g) と1,4-Diaminobutane (東京化成工業社製, 3.29 g, 37.3 mmol)を用いて参考例3工程3と同様の方法で化合物RE18-3 (0.18 g, 2 段階収率10%)を得た。
ESI-MS m/z: 551 (M+HCOO)-
1H-NMR (400 MHz, MeOD)：δ1.09 (3H, s), 1.45-1.52 (4H, m), 2.80 (2H, t, J = 7.2 Hz), 2.91 (2H, s), 3.05 (1H, d, J = 8.8 Hz), 3.12-3.16 (4H, m), 3.24 (1H, s), 3.43 (1H, d, J = 10.8 Hz), 3.62-3.66 (7H, m), 6.71-6.76 (4H, m), 7.05-7.11 (1H, m), 7.12-7.20 (6H, m), 7.28-7.32 (2H, m).【０４１８】
参考例19【０４１９】
【化１４１】
2020111280.tif 000153
【０４２０】
ジャーナル・オブ・オーガニック・ケミストリー（Journal of Organic Chemistry）, 第74巻, 6837-6842頁, 2009年に記載された方法で合成した化合物RE19-1 (110 mg, 0.212 mmol) をテトラヒドロフラン (2 mL) に溶解し、N-(1R,8S,9s)-Bicyclo[6.1.0]non-4-yn-9-ylmethyloxycarbonyl-1,8-diamino-3,6-dioxaoctane (東京化成工業社製, 72 mg, 0.222 mmol) を加えて、室温にて1時間撹拌した。反応液に水を加え、クロロホルムで抽出した後、有機層を飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥した。減圧下、溶媒を留去し、残渣をアミノシリカゲルカラムクロマトグラフィー (クロロホルム/メタノール=90/10)で精製することにより、化合物RE19-2 (160 mg, 収率90 %)を得た。
ESI-MS m/z: 845 (M+H)+
1H-NMR (400 MHz, CDCl3)：δ0.88 (3H, s), 0.91-1.09 (3H, m), 1.20-1.25 (1H, m), 1.52-1.59 (4H, m), 1.80-1.85 (2H, m), 2.19-2.25 (4H, m), 2.59-2.68 (1H, m), 2.84-2.90 (4H, m), 3.02-3.11 (3H, m), 3.35-3.44 (5H, m), 3.49-3.53 (5H, m), 3.54-3.58 (2H, m), 3.62 (5H, s), 3.78 (6H, s), 4.13 (2H, d, J = 6.4 Hz), 4.21 (2H, t, J = 7.2 Hz), 6.79-6.84 (4H, m), 7.18-7.21 (1H, m), 7.24-7.27 (2H, m), 7.28-7.32 (4H, m), 7.39-7.44 (2H, m).【０４２１】
参考例20【０４２２】
【化１４２】
2020111280.tif 000154
【０４２３】
参考例20工程1
化合物RE20-1 (AstaTech社製, 100 mg, 1.148 mmol)およびFmoc-Ser(tBuMe2Si)-OH (渡辺化学工業社製, 532 mg, 1.205 mmol)を用いて参考例3工程3と同様の方法で化合物RE20-2 (410 mg, 収率70%)を得た。
ESI-MS m/z: 511 (M+H)+
1H-NMR (400 MHz, CDCl3)：δ 0.06 (6H, s), 0.90 (9H, s), 2.76-2.85 (1H, m), 3.65-3.86 (5H, m), 4.02-4.23 (3H, m), 4.32-4.40 (4H, m), 5.55 (1H, d, J = 8.0 Hz), 7.31 (2H, t, J = 7.6 Hz), 7.40 (2H, t, J = 7.6 Hz), 7.59 (2H, d, J = 7.6 Hz), 7.76 (2H, d, J = 7.6 Hz).【０４２４】
参考例20工程2
化合物RE20-2 (410 mg, 0.803 mmol)を用いて参考例2工程1と同様の方法で化合物RE20-3の粗生成物(680 mg)を得た。
ESI-MS m/z: 814 (M+H)+【０４２５】
参考例20工程3
化合物RE20-3の粗生成物 (680 mg)を用いて参考例2工程5と同様の方法で化合物RE20-4 (330 mg, 2段階収率70％)を得た。
ESI-MS m/z: 519 (M+H)+
1H-NMR (400 MHz, CDCl3)：δ0.02-0.09 (6H, m), 0.89 (9H, d, J = 28.8 Hz), 2.84-2.94 (1H, m), 3.24-3.30 (2H, m), 3.46 (1H, t, J = 7.2 Hz), 3.52-3.68 (2H, m), 3.75-3.80 (1H, m), 3.82 (6H, d, J = 2.4 Hz), 3.89-3.96 (1H, m), 4.05-4.17 (1H, m), 4.27-4.37 (1H, m), 6.82-6.89 (4H, m), 7.22-7.27 (1H, m), 7.29-7.34 (6H, m), 7.41-7.45 (2H, m)【０４２６】
参考例21【０４２７】
【化１４３】
2020111280.tif 000155
【０４２８】
参考例21工程1
N-(Tert-ブトキシカルボニル)-1,3-ジアミノプロパン（東京化成工業社製，1.788 g, 10.26 mmol）をジクロロメタン（22.8 mL）に溶解し、トリエチルアミン（1.907 mL, 13.68 mmol)を加え、室温で15分撹拌した。反応液に、オーガニックレター（Organic Letter）, 第16巻, 6318-6321頁, 2014年に記載された方法で合成した化合物RE21-1（1.126 g, 6.84 mmol）のジクロロメタン溶液（5 mL)を滴下し、室温で2時間撹拌した。反応液に水を加え、クロロホルムで抽出した後、有機層を飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥した。減圧下、溶媒を留去し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(ヘプタン/酢酸エチル＝35/65）で精製することにより、化合物RE21-2（1.65 ｇ，収率80％）を得た。
ESI-MS m/z: 303 (M+H)+【０４２９】
参考例21工程2
化合物RE21-2 (1.65 g, 5.46 mmol)を用いて参考例1工程2と同様の方法で化合物RE21-3 (1.10 g, 収率100%)を得た。
ESI-MS m/z: 203 (M+H)+
1H-NMR (400 MHz, CDCl3)：δ1.74 (2H, dt, J = 12.0, 6.0 Hz), 2.95 (2H, t, J = 6.0 Hz), 3.18 (1H, s), 3.60 (2H, td, J = 6.0, 5.2 Hz), 7.54 (2H, dt, J = 8.4, 1.8 Hz), 7.76 (2H, dt, J = 8.4, 1.8 Hz), 7.97 (1H, br s).【０４３０】
参考例22【０４３１】
【化１４４】
2020111280.tif 000156
【０４３２】
参考例22工程1
化合物RE22-1 (東京化成社製, 1.2 g, 4.24mmol)を用いて参考例2工程1と同様の方法で化合物RE22-2の粗製生物を得た。
ESI-MS m/z: 608(M+Na)+【０４３３】
参考例22工程2
化合物RE22-2の粗生成物を用いて参考例2工程5と同様の方法で化合物R22-3 (1.34 g, 2段階収率52%) を得た。
ESI-MS m/z: 386(M+Na)+
1H-NMR (400 MHz, CDCl3)：δ3.34 (2H, t, J = 6.4 Hz), 3.47 (2H, t, J = 6.4 Hz), 3.79 (6H, s), 6.78-6.84 (4H, m), 7.17-7.21 (1H, m), 7.27-7.35 (6H, m), 7.42-7.46 (2H, m).【０４３４】
参考例22工程3
化合物RE22-3 (1.15 g,3.16  mmol)およびFmoc-Ser(tBuMe2Si)-OH(渡辺化学工業社製, 1.677 g, 3.8  mmol)を用いて参考例3工程3と同様の方法で化合物RE22-4 (560 mg, 収率31%)を得た。
1H-NMR (400 MHz, CDCl3) δ: 0.00-0.07 (6H, m), 0.83-0.89 (9H, m), 3.18-3.26 (2H, m), 3.39-3.46 (2H, m), 3.61-3.68 (1H, m), 3.76 (6H, s), 3.89 (1H, dd, J = 10.0, 4.0 Hz), 4.03 (1H, dd, J = 10.0, 4.0 Hz), 4.15-4.20 (1H, m), 4.22-4.28 (1H, m), 4.32-4.40 (2H, m), 5.65-5.88 (1H, m), 6.76-6.85 (4H, m), 7.16-7.23 (1H, m), 7.25-7.34 (8H, m), 7.36-7.44 (4H, m), 7.50-7.64 (2H, m), 7.72-7.79 (2H, m).【０４３５】
参考例23
表Y-1に記載された化合物RE23-1〜RE23-5およびFmoc-Ser(tBuMe2Si)-OHを用いて、参考例22と同様の方法により、表Y-2に記載された化合物RE23-6〜RE23-10を得た。
参考例22の化合物RE22-3とFmoc-Thr(tBuMe2Si)-OHを用いて、参考例22と同様の方法により表Y-2に記載した化合物RE23-11を得た。
表Y-1に記載された化合物RE23-1とFmoc-Thr(tBuMe2Si)-OHを用いて、参考例22と同様の方法により表Y-2に記載した化合物RE23-12を得た。
本実施例により合成した化合物のNMR分析データを表Y-3に示す。【０４３６】
【表１１】
2020111280.tif 000157
【０４３７】
【表１２】
2020111280.tif 000158
【０４３８】
【表１３】
2020111280.tif 000159
【０４３９】
参考例24【０４４０】
【化１４５】
2020111280.tif 000160
【０４４１】
参考例22に記載の方法で合成した化合物RE24-1 (参考例22における化合物RE22-4, 2.487 g, 3.16  mmol)を用いて参考例2工程2と同様の方法で化合物RE24-2を得た (1.2 g, 収率67%)。
ESI-MS m/z: 587(M+Na)+
1H-NMR (400 MHz, CDCl3):δ-0.01-0.07 (6H, m), 0.86-0.90 (9H, m), 3.15-3.21 (2H, m), 3.41-3.48 (3H, m), 3.72 (1H, dd, J = 10.0, 6.4 Hz), 3.79 (6H, s), 3.84 (1H, dd, J = 10.0, 4.8 Hz), 6.79-6.84 (4H, m), 7.18-7.23 (1H, m), 7.27-7.33 (6H, m), 7.40-7.44 (2H, m), 7.72-7.75 (1H, br m).【０４４２】
参考例25
表Y-2に記載した化合物RE23-6〜RE23-12を用いて参考例24と同様の方法により表Z-1に記載した化合物RE25-1〜RE25-7を得た。
本実施例により合成した化合物の質量分析結果を表Z-2に示す。【０４４３】
【表１４】
2020111280.tif 000161
【０４４４】
【表１５】
2020111280.tif 000162
【０４４５】
参考例26【０４４６】
【化１４６】
2020111280.tif 000163
【０４４７】
参考例26工程1
化合物RE26-1 (2.00 g, 9.47 mmol)をN, N'-ジメチルホルムアミド (40 mL)に溶解し、室温にてイミノ二酢酸ジ-tert-ブチルエステル (5.11 g, 20.84 mmol)、1-(3-ジメチルアミノプロピル)-3-エチルカルボジイミド塩酸塩 (4.00 g, 20.84 mmol)、1-ヒドロキシベンゾトリアゾール１水和物 (145 mg, 0.947 mmol)を加えて2時間撹拌した。反応液に水を加え、酢酸エチルで抽出した後、有機層を飽和炭酸水素ナトリウム水溶液と飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。減圧下、溶媒を留去し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー (ヘプタン/酢酸エチル=50/50)で精製した。さらにメタノールでスラリー精製することにより、化合物RE26-2 (4.07 g, 収率65 %)を得た。
ESI-MS m/z: 664 (M - H)-【０４４８】
参考例26工程2
化合物RE26-2 (2.66 g, 4.00 mmol)をテトラヒドロフラン (53 mL)に溶解し、室温にて10%パラジウムカーボン粉末 (含水品, 54.29%; 490 mg)を加え、水素雰囲気下で3時間撹拌した。反応液をろ過し、減圧下、溶媒を留去することにより、化合物RE26-3 (2.86 g, 収率113%)を得た。
ESI-MS m/z: 634 (M - H)-【０４４９】
参考例26工程3
化合物RE26-3（871.0 mg, 1.370 mmol）をN, N'-ジメチルホルムアミド（17 mL）に溶解し、O-(7-アザベンゾトリアゾール-１-イン)-N,N,N',N'-テトラメチルウロニウムヘキサフルオロリン酸塩（625.0 mg, 1.644 mmol）、ジイソプロピルエチルアミン（0.5730 mL, 3.290 mmol）、およびドデカン二酸モノベンジルエステル（527.0 mg, 1.644 mmol）を加え、室温で終夜攪拌した。反応液に水を加え、酢酸エチルで抽出した後、有機層を飽和炭酸水素ナトリウム水溶液および飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。減圧下、溶媒を留去し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（へプタン/酢酸エチル=60/40）で精製することにより、化合物RE26-4（1.030 g, 収率80%）を得た。
ESI-MS m/z: 939 (M + H)+【０４５０】
参考例26工程4
化合物RE26-4（1.030 g, 1.098 mmol）をジクロロメタン（10 mL）に溶解し、トリフルオロ酢酸（10.00 mL, 130.0 mmol）を加え、室温で1時間攪拌した。減圧下、溶媒を留去し、化合物RE26-5の粗生成物を得た。
ESI-MS m/z: 713 (M - H)-【０４５１】
参考例27【０４５２】
【化１４７】
2020111280.tif 000164
【０４５３】
参考例27工程1
化合物RE27-1（2.000 g, 12.98 mmol）をN, N'-ジメチルホルムアミド（30 mL）に溶解し、炭酸水素カリウム（1.559 g, 15.57 mmol）および塩化ベンジル（2.328 mL, 19.47 mmol）を加えて、室温にて4時間攪拌した。反応液に飽和塩化アンモニウム水溶液を加え、ジクロロメタンで抽出した後、有機層を水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。減圧下、溶媒を留去し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（へプタン/酢酸エチル=50/50）で精製することにより、化合物RE27-2（2.850 g, 収率90%）を得た。
ESI-MS m/z: 243 (M - H)-【０４５４】
参考例27工程2
化合物RE27-2（2.500 g, 10.24 mmol）をN, N'-ジメチルホルムアミド（30 mL）に溶解し、炭酸カリウム（5.660 g, 40.90 mmol）およびtert-ブチルブロモ酢酸（3.300 mL, 22.52 mmol）を加え、90℃で4時間攪拌した。反応液に飽和塩化アンモニウム水溶液を加え、ジクロロメタンで抽出した後、有機層を飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。減圧下、溶媒を留去し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（へプタン/酢酸エチル=75/25）で精製することにより、化合物RE27-3（4.300 g, 収率89%）を得た。
ESI-MS m/z: 472 (M - H)-【０４５５】
参考例27工程3
化合物RE27-3（1.000 g, 2.116 mmol）をジクロロメタン（10 mL）に溶解し、トリフルオロ酢酸（10.00 mL, 130.0 mmol）を加え、室温で6時間攪拌した。減圧下、溶媒を留去し、化合物RE27-4の粗生成物を得た。
ESI-MS m/z: 359 (M - H)-【０４５６】
参考例27工程4
化合物RE27-4（350.0 mg, 0.9710 mmol）をN, N'-ジメチルホルムアミド（7 mL）に溶解し、1-ヒドロキシベンゾトリアゾール一水和物（327.0 mg, 2.137 mmol）、1-(3-ジメチルアミノプロピル)-3-エチルカルボジイミド塩酸塩（410.0 mg, 2.137 mmol）、およびイミノジ酢酸ジ-tert-ブチルエステル（524.0 mg, 2.137 mmol）を加え、室温で5時間攪拌した。反応液に水を加え、酢酸エチルで抽出した後、有機層を飽和炭酸水素ナトリウム水溶液および飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。減圧下、溶媒を留去し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（へプタン/酢酸エチル=60/40）で精製することにより、化合物RE27-5（617.0 mg, 収率78%）を得た。
ESI-MS m/z: 814 (M - H)-【０４５７】
参考例27工程5
化合物RE27-5（610.0 mg, 0.7490 mmol）をジクロロメタン（6 mL）に溶解し、トリフルオロ酢酸（6 mL, 78.00 mmol）を加え、室温で1時間攪拌した。減圧下、溶媒を留去し、化合物RE27-6の粗生成物を得た。
ESI-MS m/z: 590 (M + H)+【０４５８】
参考例28【０４５９】
【化１４８】
2020111280.tif 000165
【０４６０】
参考例28工程1
参考例26に記載に方法で合成した化合物RE28-1 (参考例26における化合物RE26-3, 474 mg, 0.744 mmol)をN, N'-ジメチルホルムアミド (10 mL)に溶解し、室温にてジャーナル・オブ・メディシナル・ケミストリー (Journal of Medicinal Chemistry), 第54巻, 2433-2446頁, 2011年に記載された方法で合成したtrans-シクロヘキサン-1,4-ジカルボン酸モノベンジルエステル (0.234 mg, 0.893 mmol)、ジイソプロピルエチルアミン (0.312 mL, 1.79 mmol)、O-(7-アザベンゾトリアゾール-1-イル)-N,N,N',N'-テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスファート (339 mg, 0.893 mmol)を加えて6時間撹拌した。反応液に水を加え、酢酸エチルで抽出した後、有機層を飽和炭酸水素ナトリウム水溶液と飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。減圧下、溶媒を留去し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー (ヘプタン/酢酸エチル=50/50)で精製することにより、化合物RE28-2 (448 mg, 収率68 %)を得た。
ESI-MS m/z: 879 (M - H)-【０４６１】
参考例28工程2
化合物RE28-2 (341 mg, 0.387 mmol)をジクロロメタン (3.4 mL)に溶解し、室温にてトリフルオロ酢酸 (3.4 mL)を加えて終夜撹拌した。反応液を減圧濃縮し、酢酸エチルで共沸し、ヘプタンでスラリー精製することにより、化合物RE28-3 (254 mg, 収率100%)を得た。
ESI-MS m/z: 656 (M + H)+【０４６２】
参考例29【０４６３】
【化１４９】
2020111280.tif 000166
【０４６４】
参考例29工程1
化合物RE29-1 (500 mg, 2.75 mmol)をN, N'-ジメチルホルムアミド (10 mL)に溶解し、室温にてイミノジ酢酸ジ-tert-ブチルエステル (1.48 g, 6.04 mmol)、1-(3-ジメチルアミノプロピル)-3-エチルカルボジイミド塩酸塩 (1.16 g, 6.04 mmol)、1-ヒドロキシベンゾトリアゾール１水和物 (42.0 mg, 0.275 mmol)を加えて4時間撹拌した。反応液に水を加え、酢酸エチルで抽出した後、有機層を飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。減圧下、溶媒を留去し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー (ヘプタン/酢酸エチル=50/50)で精製することにより、化合物RE29-2 (329 mg, 収率19 %)を得た。
ESI-MS m/z: 635 (M - H)-【０４６５】
参考例29工程2
化合物RE29-2 (323 mg, 0.507 mmol)をN, N'-ジメチルホルムアミド (6.5 mL)に溶解し、室温にて炭酸カリウム (84.0 mg, 0.609 mmol)、ブロモ酢酸ベンジル (139 mg, 0.609 mmol)を加えて3時間撹拌した。反応液に水を加え、酢酸エチルで抽出した後、有機層を飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。減圧下、溶媒を留去し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー (ヘプタン/酢酸エチル=50/50)で精製することにより、化合物RE29-3 (313 mg, 収率79 %)を得た。
ESI-MS m/z: 783 (M - H)-【０４６６】
参考例29工程3
化合物RE29-3 (312 mg, 0.398 mmol)をジクロロメタン (3.1 mL)に溶解し、室温にてトリフルオロ酢酸 (3.1 mL)を加えて終夜撹拌した。反応液を減圧濃縮し、酢酸エチルで共沸することにより、化合物RE29-4 (252 mg, 定量的)を得た。
ESI-MS m/z: 561 (M + H)+【０４６７】
参考例30【０４６８】
【化１５０】
2020111280.tif 000167
【０４６９】
参考例30工程1
化合物RE30-1 (2.00 g, 9.47 mmol)をN, N'-ジメチルホルムアミド (40 mL)に溶解し、室温にて2-アミノ-1,3-プロパンジオール (1.90 g, 20.84 mmol)、1-(3-ジメチルアミノプロピル)-3-エチルカルボジイミド塩酸塩 (4.00 g, 20.84 mmol)、1-ヒドロキシベンゾトリアゾール１水和物 (145 mg, 0.947 mmol)を加えて2時間撹拌した。減圧下、溶媒を留去し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー (酢酸エチル/メタノール=70/30)で精製した。さらに酢酸エチルでスラリー精製することにより、化合物RE30-2 (2.68 g, 収率79 %)を得た。
ESI-MS m/z: 356 (M - H)-【０４７０】
参考例30工程2
化合物RE30-2 (500 mg, 1.40 mmol)をアセトニトリル (10 mL)に懸濁し、室温にてアクリル酸tert-ブチルエステル (3.59 g, 28.0 mmol)、ベンジルトリメチルアンモニウムヒドロキシド (40%水溶液; 1.76 mL, 702 mmol)を加えて終夜撹拌した。減圧下、溶媒を留去し、水を加え、酢酸エチルで抽出した後、有機層を飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。減圧下、溶媒を留去し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー (ヘプタン/酢酸エチル=50/50)で精製することにより、化合物RE30-3 (300 mg, 収率24 %)を得た。
ESI-MS m/z: 871 (M + H)+【０４７１】
参考例30工程3
化合物RE30-3 (340 mg, 0391 mmol)をテトラヒドロフラン (6.8 mL)に溶解し、室温にて10%パラジウムカーボン粉末 (含水品, 54.29%; 31.3 mg)を加え、水素雰囲気下で6時間撹拌した。反応液をろ過し、減圧下、溶媒を留去し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー (ヘプタン/酢酸エチル=30/70)で精製することにより、化合物RE30-4 (235 mg, 収率72 %)を得た。
ESI-MS m/z: 841 (M + H)+【０４７２】
参考例30工程4
化合物RE30-4 (232 mg, 0.276 mmol)をN, N'-ジメチルホルムアミド (4.6 mL)に溶解し、室温にてドデカン酸モノベンジルエステル (0.133 mg, 0.414 mmol)、ジイソプロピルエチルアミン (0.145 mL, 0.829 mmol)、O-(7-アザベンゾトリアゾール-1-イル)-N,N,N',N'-テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスファート (158 mg, 0.414 mmol)を加えて終夜撹拌した。反応液に水を加え、酢酸エチルで抽出した後、有機層を飽和炭酸水素ナトリウム水溶液と飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。減圧下、溶媒を留去し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー (ヘプタン/酢酸エチル=30/70)で精製することにより、化合物RE30-5 (274 mg, 収率87 %)を得た。
ESI-MS m/z: 1141 (M - H)-【０４７３】
参考例30工程5
化合物RE30-5 (273 mg, 0.239 mmol)をジクロロメタン (2.7 mL)に溶解し、室温にてトリフルオロ酢酸 (2.7 mL)を加えて終夜撹拌した。反応液を減圧濃縮し、酢酸エチルで共沸することにより、化合物RE30-6 (231 mg, 定量的)を得た。
ESI-MS m/z: 919 (M + H)+【０４７４】
参考例31【０４７５】
【化１５１】
2020111280.tif 000168
【０４７６】
参考例31工程1
4-ニトロイソフタル酸RE31-1 (500 mg, 2.37 mmol)およびN-Boc-エチレンジアミン (808 mg, 5.21 mmol)をN, N'-ジメチルホルムアミド (10 mL)に溶解し、室温にてトリエチルアミン (0.90 mL, 7.11 mmol)、1-ヒドロキシベンゾトリアゾール一水和物（703 mg, 5.21 mmol）および1-(3-ジメチルアミノプロピル)-3-エチルカルボジイミド塩酸塩（1.36 g, 7.11 mmol）を加えて16時間撹拌した。反応液を後処理し、粗体をシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製することにより、化合物RE31-2 (650 mg, 収率55 %)を得た。【０４７７】
参考例31工程2
化合物RE31-2 (500 mg, 1.01 mmol)および亜鉛末 (330 mg, 5.05 mmol)をメタノール (3.5 mL)およびテトラヒドロフラン (3.5 mL)に懸濁し、0℃にて塩化アンモニウム (378 mg, 7.07 mmol)の水溶液を滴下し、室温にて24時間撹拌した。反応液を後処理し、粗体をシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製することにより、化合物RE31-3 (160 mg, 収率34 %)を得た。【０４７８】
参考例31工程3
化合物RE31-3 (200 mg, 0.430 mmol)およびN-ベンジルオキシカルボニル-グリシン（ベンジルオキシカルボニルを、Cbzとも記載する。） (90.0 mg, 0.430 mmol)をN, N'-ジメチルホルムアミド (2.0 mL)に溶解し、室温にてジイソプロピルエチルアミン (0.220 mL, 1.29 mmol)、O-(7-アザベンゾトリアゾール-1-イル)-N,N,N',N'-テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスファート (245 mg, 0.645 mmol)を加えて16時間撹拌した。反応液を後処理し、粗体をシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製することにより、化合物RE31-4 (180 mg, 収率64 %)を得た。
ESI-MS m/z: 657 (M + H)+【０４７９】
参考例32【０４８０】
【化１５２】
2020111280.tif 000169
【０４８１】
参考例32工程1
3,5-ジニトロ安息香酸RE32-1 (500 mg, 2.36 mmol)およびN-Cbz-エチレンジアミン (588 mg, 2.83 mmol)をN, N'-ジメチルホルムアミド (5.0 mL)に溶解し、室温にてトリエチルアミン (0.65 mL, 4.72 mmol)、1-ヒドロキシベンゾトリアゾール一水和物（380 mg, 2.83 mmol）および1-(3-ジメチルアミノプロピル)-3-エチルカルボジイミド塩酸塩（675 mg, 3.54 mmol）を加えて16時間撹拌した。反応液を後処理し、粗体をシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製することにより、化合物RE32-2 (445 mg, 収率48 %)を得た。【０４８２】
参考例32工程2
化合物RE32-2 (200 mg, 0.515 mmol)をエタノール (5.0 mL)に溶解し、室温にて塩化スズ(II) (584 mg, 3.09 mmol)および濃塩酸 (0.2 mL)を加え、80℃で16時間撹拌した。反応液を後処理し、化合物RE32-3 (180 mg,定量的)を得た。
ESI-MS m/z: 329 (M + H)+【０４８３】
参考例33【０４８４】
【化１５３】
2020111280.tif 000170
【０４８５】
参考例33工程1
参考例3に記載の方法で合成した化合物RE33-1 (参考例3における化合物RE3-2, 8.17 g, 23.12 mmol)を用いて参考例3の工程4と同様の方法で化合物RE33-2 (3.7 g, 収率63%)を得た。
ESI-MS m/z: 254(M+H)+【０４８６】
参考例33工程2
化合物RE33-2 (3.7 g, 14.63 mmol)を用いて参考例3の工程5と同様の方法で化合物RE33-3 (3.82 g, 収率67%)を得た。
ESI-MS m/z: 432(M+HCOO)-【０４８７】
参考例33工程3
化合物RE33-3 (3.82 g, 9.86 mmol)を用いて参考例1の工程2と同様の方法で化合物RE33-4(3.08 g, 収率87%)を得た。
ESI-MS m/z: 360(M+H)+【０４８８】
参考例34
【化１５４】
2020111280.tif 000171
【０４８９】
参考例34工程1
化合物RE34-1 (2g, 9.53mmol)とtert-ブトキシカルボニルアミノ)-1-ペンタノール (東京化成社製, 2g,10mmol)を用い、参考例3の工程1と同様の方法で化合物RE34-2 (2.40 g, 収率63%)を得た。
ESI-MS m/z: 296(M+H)+, 脱Boc体として検出【０４９０】
参考例34工程2
化合物RE34-2を用いて、参考例3の工程2〜4および参考例4の工程1〜4と同様の方法で化合物RE34-3 (1.579g,収率21%)を得た。
ESI-MS m/z: 910 (M+H)+【０４９１】
参考例35:化合物D2の合成【０４９２】
【化１５５】
2020111280.tif 000172
【０４９３】
参考例35工程1
参考例11に記載の方法で合成した化合物RE35-1 (参考例11における化合物RE11-2, 1.015 g, 1.748 mmol)をN, N'-ジメチルホルムアミド (12 mL)に溶解し、室温にて10%パラジウムカーボン粉末 (含水品, 54.29%; 187 mg)を加え、水素雰囲気下で6時間撹拌した。反応液をろ過した。ろ液に参考例26で合成した化合物RE26-5（250.0 mg, 0.350 mmol）, 1-ヒドロキシベンゾトリアゾール一水和物（26.80 mg, 0.1750 mmol）、および1-(3-ジメチルアミノプロピル)-3-エチルカルボジイミド塩酸塩（402.0 mg, 2.099 mmol）を加え、室温で終夜攪拌した。反応液に水を加え、酢酸エチルで抽出した後、有機層を飽和炭酸水素ナトリウム水溶液および飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。減圧下、溶媒を留去し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（クロロホルム/メタノール=87/13）で精製することにより、化合物RE35-2（617.0 mg, 収率88%）を得た。
ESI-MS m/z: 1215 (M + 2H) 2+【０４９４】
参考例35工程2
化合物RE35-2 (0.7380 g, 0.3040 mmol)をテトラヒドロフラン (7 mL)に溶解し、室温にて10%パラジウムカーボン粉末 (含水品, 54.29%; 135.90 mg)を加え、水素雰囲気下で終夜撹拌した。反応液をろ過し、減圧下、溶媒を留去し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（クロロホルム/メタノール=87/13）で精製することにより、化合物D2（581 mg, 収率82%）を得た。
ESI-MS m/z: 1170 (M + 2H) 2+
1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6,δ): 1.12-2.36 (106H, m), 2.91-3.19 (8H, m), 3.23-3.55 (14H, m), 3.60-3.76 (4H, m), 3.78-3.94 (8H, m), 3.95-4.10 (16H, m), 4.47 (4H, d, J = 8.8 Hz), 4.92-5.01 (4H, m), 5.17-5.24 (4H, m), 6.98 (1H, s), 7.64 (2H, s), 7.81-7.95 (4H, m), 8.28-8.38 (2H, m), 8.44-8.56 (2H, m), 10.13 (1H, s)【０４９５】
参考例36:化合物D3の合成【０４９６】
【化１５６】
2020111280.tif 000173
【０４９７】
参考例36工程1
参考例12に記載の方法で合成した化合物RE36-1 (参考例12における化合物RE12-2, 500 mg, 0.879 mmol)をN, N'-ジメチルホルムアミド (6.5 mL)に溶解し、室温にて10%パラジウムカーボン粉末 (含水品, 54.29%; 94 mg)を加え、水素雰囲気下で4時間撹拌した。反応液をろ過した。ろ液に参考例26における化合物RE26-5（126.0 mg, 0.176 mmol）, 1-ヒドロキシベンゾトリアゾール一水和物（13.47 mg, 0.088 mmol）、および1-(3-ジメチルアミノプロピル)-3-エチルカルボジイミド塩酸塩（202.0 mg, 1.055 mmol）を加え、室温で終夜攪拌した。反応液を減圧下、溶媒を留去し、残渣を逆相カラムクロマトグラフィー（水/アセトニトリル）で精製することにより、化合物RE36-2（249.7 mg, 収率60%）を得た。
ESI-MS m/z: 1191 (M + 2H) 2+【０４９８】
参考例36工程2
化合物RE36-2 (0.242 g, 0.102 mmol)をテトラヒドロフラン (3.6 mL)および水（1.2 mL）に溶解し、室温にて10%パラジウムカーボン粉末 (含水品, 54.29%; 45 mg)を加え、水素雰囲気下で4時間攪拌した。反応液をろ過し、減圧下、溶媒を留去し、化合物D3（216 mg, 収率93%）を得た。
ESI-MS m/z: 1146 (M + 2H) 2+
1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6,δ): 1.15-1.65 (20H, m), 1.68-2.15 (52H, m), 3.13-3.29 (6H, m), 3.40-3.67 (16H, m), 3.71-3.96 (11H, m), 3.98-4.14 (16H, m), 4.55 (4H, t, J = 8.8 Hz), 4.93-5.06 (4H, m), 5.12-5.28 (4H, m), 6.56 (1H, s), 6.98 (1H. s), 7.64 (2H, s), 7.77-7.93 (4H, m), 8.26-8.49 (3H, m), 10.10 (1H, s)【０４９９】
参考例37:化合物D4の合成【０５００】
【化１５７】
2020111280.tif 000174
【０５０１】
参考例37工程1
参考例13に記載の方法で合成した化合物RE37-1 (参考例13における化合物RE13-2, 430 mg, 0.674 mmol)をN, N'-ジメチルホルムアミド (6 mL)に溶解し、室温にて10%パラジウムカーボン粉末 (含水品, 54.29%; 79 mg)を加え、水素雰囲気下で4時間撹拌した。反応液をろ過した。ろ液に参考例26における化合物RE26-5（105.0 mg, 0.148 mmol）, 1-ヒドロキシベンゾトリアゾール一水和物（11.31 mg, 0.074 mmol）、および1-(3-ジメチルアミノプロピル)-3-エチルカルボジイミド塩酸塩（170.0.0 mg, 0.887 mmol）を加え、室温で終夜攪拌した。反応液を減圧下、溶媒を留去し、残渣を逆相カラムクロマトグラフィー（水/アセトニトリル）で精製することにより、化合物RE37-2（218.1 mg, 収率56%）を得た。
ESI-MS m/z: 1329 (M + 2H) 2+【０５０２】
参考例37工程2
化合物RE37-2 (0.210 g, 0.079 mmol)をテトラヒドロフラン (3.1 mL)および水（1.0 mL）に溶解し、室温にて10%パラジウムカーボン粉末 (含水品, 54.29%; 39 mg)を加え、水素雰囲気下で4時間攪拌した。反応液をろ過し、減圧下、溶媒を留去し、化合物D4 （192.7 mg, 収率95%）を得た。
ESI-MS m/z: 1284 (M + 2H) 2+
1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6,δ): 1.17-1.65 (42H, m), 1.69-2.13 (61H, m), 2.95-3.17 (16H, m), 3.65-3.77 (3H, m), 3.79-3.94 (6H, m), 3.96-4.10 (16H, m), 4.48 (4H, d, J = 8.4 Hz), 4.96 (4H, dd, J = 2.4, 11.2 Hz), 5.21 (4H, d, J = 3.2 Hz), 7.01 (1H, s), 7.64-7.92 (11H, m), 8.26-8.48 (4H, m), 10.14 (1H, s)【０５０３】
参考例38：化合物D5の合成【０５０４】
【化１５８】
2020111280.tif 000175
【０５０５】
参考例38工程1
参考例12に記載の方法で合成した化合物RE38-1 (参考例12における化合物RE12-2, 450 mg, 0.791 mmol)をN, N'-ジメチルホルムアミド (6 mL)に溶解し、室温にて10%パラジウムカーボン粉末 (含水品, 54.29%; 85 mg)を加え、水素雰囲気下で5時間撹拌した。反応液をろ過した。ろ液に参考例27における化合物RE27-6（94 mg, 0.158 mmol）, 1-ヒドロキシベンゾトリアゾール一水和物（133.0 mg, 0.871 mmol）、および1-(3-ジメチルアミノプロピル)-3-エチルカルボジイミド塩酸塩（182.0 mg, 0.950 mmol）を加え、室温で終夜攪拌した。反応液を減圧下、溶媒を留去し、残渣を逆相カラムクロマトグラフィー（水/アセトニトリル）で精製することにより、化合物RE38-2（99 mg, 収率28%）を得た。
ESI-MS m/z: 1129 (M + 2H) 2+【０５０６】
参考例38工程2
化合物RE38-2 (80 mg, 0.035 mmol)をテトラヒドロフラン (1.7 mL)および水（0.85 mL）に溶解し、室温にて10%パラジウムカーボン粉末 (含水品, 54.29%; 26 mg)を加え、水素雰囲気下で2時間撹拌した。反応液をろ過し、減圧下、溶媒を留去し、化合物D5（57.5 mg, 収率75%）を得た。
ESI-MS m/z: 1084 (M + 2H) 2+
1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6,δ): 1.69-2.21 (46H, m), 3.14-3.65 (28H, m), 3.67-4.22 (27H, m), 4.43-4.66 (4H, m), 4.69-4.88 (4H, m), 4.89-5.08 (4H, m), 5.12-5.32 (4H, m), 6.54-6.68 (1H, br), 7.01 (2H, s), 7.78-8.09 (3H, m), 8.13-8.31 (2H, m), 8.58-8.75 (2H, m)【０５０７】
参考例39：化合物D6の合成【０５０８】
【化１５９】
2020111280.tif 000176
【０５０９】
参考例39工程1
参考例13に記載の方法で合成した化合物RE39-1 (参考例13における化合物RE13-2, 418 mg, 0.655 mmol)をN, N'-ジメチルホルムアミド (6 mL)に溶解し、室温にて10%パラジウムカーボン粉末 (含水品, 54.29%; 77 mg)を加え、水素雰囲気下で5時間撹拌した。反応液をろ過した。ろ液に参考例27で合成した化合物RE27-6（85 mg, 0.144 mmol）, 1-ヒドロキシベンゾトリアゾール一水和物（121.0 mg, 0.791 mmol）、および1-(3-ジメチルアミノプロピル)-3-エチルカルボジイミド塩酸塩（165.0 mg, 0.863 mmol）を加え、室温で終夜攪拌した。反応液を減圧下、溶媒を留去し、残渣を逆相カラムクロマトグラフィー（水/アセトニトリル）で精製することにより、化合物RE39-2（99 mg, 収率28%）を得た。
ESI-MS m/z: 1268 (M + 2H) 2+【０５１０】
参考例39工程2
化合物RE39-2 (186 mg, 0.073 mmol)をテトラヒドロフラン (2.8 mL)および水（0.93 mL）に溶解し、室温にて10%パラジウムカーボン粉末 (含水品, 54.29%; 40 mg)を加え、水素雰囲気下で2時間撹拌した。反応液をろ過し、減圧下、溶媒を留去し、化合物D6（156.7 mg, 収率87%）を得た。
ESI-MS m/z: 1222 (M + 2H) 2+
1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6,δ): 1.36-1.62 (27H, m), 1.67-2.17 (64H, m), 2.92-3.21 (15H, m), 3.58-3.77 (2H, m), 3.80-3.95 (7H, m), 3.97-4.13 (15H, m), 4.47 (4H, d, J = 8.8 Hz), 4.88-5.02 (7H, m), 5.10-5.24 (3H, m), 6.95-7.00 (1H, m), 7.26-7.31 (2H, m), 7.72-7.88 (8H, m), 8.10-8.20 (2H, m), 8.51-8.60 (2H, m)【０５１１】
参考例40【０５１２】
【化１６０】
2020111280.tif 000177
【０５１３】
参考例40工程1
参考例38に記載の方法で合成した化合物D5 (171 mg, 0.079 mmol)をN, N'-ジメチルホルムアミド (3.4 mL)に溶解し、グリシンベンジル p-トルエンスルホン酸塩（32.0 mg, 0.095 mmol）、1-ヒドロキシベンゾトリアゾール一水和物（12.09 mg, 0.079 mmol）、および1-(3-ジメチルアミノプロピル)-3-エチルカルボジイミド塩酸塩（18.16 mg, 0.095 mmol）を加え、室温で終夜攪拌した。反応液を減圧下、溶媒を留去し、残渣を逆相カラムクロマトグラフィー（水/アセトニトリル）で精製することにより、化合物RE40-2（55.7 mg, 収率31%）を得た。
ESI-MS m/z: 1158 (M + 2H) 2+【０５１４】
参考例40工程2
化合物RE40-2 (54 mg, 0.023 mmol)をテトラヒドロフラン (0.83 mL)および水（0.28 mL）に溶解し、室温にて10%パラジウムカーボン粉末 (含水品, 54.29%; 18 mg)を加え、水素雰囲気下で2時間撹拌した。反応液をろ過し、減圧下、溶媒を留去し、化合物RE40-3（50.1 mg, 収率97%）を得た。
ESI-MS m/z: 1112 (M + 2H) 2+
1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6,δ): 0.96-1.06 (3H, m), 1.71-2.20 (54H, m), 3.41-3.64 (15H, m), 3.68-4.20 (32H), 4.55 (4H, d, J = 8.4 Hz), 4.81 (4H, s), 4.94-5.02 (4H, m), 5.17-5.25 (4H, m), 6.63-6.76 (2H, m), 6.93-7.02 (2H, m), 7.84-8.00 (3H, m), 8.17-8.30 (2H, m), 8.58-8.70 (2H, m)【０５１５】
参考例41:化合物D7の合成【０５１６】
【化１６１】
2020111280.tif 000178
【０５１７】
参考例41工程1
化合物RE41-1 (500 mg, 0.861 mmol)をN, N'-ジメチルホルムアミド (10 mL)に溶解し、室温にて10%パラジウムカーボン粉末 (含水品, 54.29%; 92.1 mg)を加え、水素雰囲気下で2時間撹拌した。アルゴン雰囲気下、室温にて参考例27で合成した化合物RE27-3 (113 mg, 0.172 mmol)、1-(3-ジメチルアミノプロピル)-3-エチルカルボジイミド塩酸塩 (198 mg, 1.03 mmol)、1-ヒドロキシベンゾトリアゾール１水和物 (13.2 mg, 0.086 mmol)を加えて終夜撹拌した。反応液をセライトでろ過し、減圧下、溶媒を留去し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー (クロロホルム/メタノール=90/10)で精製し、さらに逆相分取HPLC (アセトニトリル/水)で精製することにより、化合物RE41-2 (195 mg, 収率48%)を得た。
ESI-MS m/z: 1186 (M + 2H) 2+【０５１８】
参考例41工程2
化合物RE41-2 (194 mg, 0.082 mmol)をテトラヒドロフラン (2.9 mg)および水 (1.0 mL)に溶解し、室温にて10%パラジウムカーボン粉末 (含水品, 54.29%; 35.7 mg)を加え、水素雰囲気下で8時間撹拌した。反応液をろ過し、減圧下、溶媒を留去し、化合物D7（183 mg, 収率98%）を得た。
ESI-MS m/z: 1141 (M + 2H) 2+
1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6,δ): 1.21-1.45 (m, 40H), 1.76-2.18 (m, 50H), 3.00-3.09 (m, 8H), 3.40-4.20 (m, 32H), 4.47 (d, J = 8.5 Hz, 4H), 4.96 (dd, J = 3.1, 11.2 Hz, 4H), 5.21 (d, J = 3.1 Hz, 4H), 6.98 (s, 1H), 7.65 (s, 2H), 7.84 (d, J = 9.0 Hz, 4H), 8.31 (brs, 1H), 8.44 (brs, 1H), 10.11 (s, 1H).【０５１９】
参考例42：化合物D8の合成【０５２０】
【化１６２】
2020111280.tif 000179
【０５２１】
参考例42工程1
参考例11に記載の方法で合成した化合物RE42-1 (参考例11における化合物RE11-2, 500 mg, 0.861 mmol)をN, N'-ジメチルホルムアミド (10 mL)に溶解し、室温にて10%パラジウムカーボン粉末 (含水品, 54.29%; 92.1 mg)を加え、水素雰囲気下で2時間撹拌した。アルゴン雰囲気下、室温にて参考例29で合成した化合物RE29-4 (97.0 mg, 0.172 mmol)、1-(3-ジメチルアミノプロピル)-3-エチルカルボジイミド塩酸塩 (198 mg, 1.03 mmol)、1-ヒドロキシベンゾトリアゾール１水和物 (13.2 mg, 0.086 mmol)を加えて終夜撹拌した。反応液をセライトでろ過し、減圧下、溶媒を留去し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー (クロロホルム/メタノール=85/15)で精製し、さらに逆相分取HPLC (アセトニトリル/水)で精製することにより、化合物RE42-2 (179 mg, 収率46%)を得た。
ESI-MS m/z: 1138 (M + 2H) 2+【０５２２】
参考例42工程2
化合物RE42-2 (175 mg, 0.077 mmol)をテトラヒドロフラン (2.6 mg)および水 (0.9 mL)に溶解し、室温にて10%パラジウムカーボン粉末 (含水品, 54.29%; 32.4 mg)を加え、水素雰囲気下で1時間撹拌した。反応液をろ過し、減圧下、溶媒を留去し、化合物D8（160 mg, 収率95%）を得た。
ESI-MS m/z: 1093 (M + 2H) 2+
1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6,δ): 1.23-1.45 (m, 32H), 1.77 (s, 12H), 1.89 (s, 12H), 1.99 (s, 12H), 2.10 (s, 12H), 3.01-3.11 (m, 8H), 3.69-4.02 (m, 34H), 4.47-4.50 (m, 4H), 4.94-4.98 (m, 4H), 5.21 (d, J = 3.1 Hz, 4H), 6.92 (s, 1H), 6.94 (s, 2H), 7.87 (d, J = 9.4 Hz, 2H), 7.92 (d, J = 8.5 Hz, 2H), 8.33 (brs, 2H), 8.50 (brs, 2H).【０５２３】
参考例43:化合物D9の合成【０５２４】
【化１６３】
2020111280.tif 000180
【０５２５】
参考例43工程1
参考例13に記載の方法で合成した化合物RE43-1 (参考例13における化合物RE13-2, 500 mg, 0.784 mmol)をN, N'-ジメチルホルムアミド (10 mL)に溶解し、室温にて10%パラジウムカーボン粉末 (含水品, 54.29%; 92.1 mg)を加え、水素雰囲気下で2時間撹拌した。アルゴン雰囲気下、室温にて参考例30で合成した化合物RE30-6 (144 mg, 0.157 mmol)、1-(3-ジメチルアミノプロピル)-3-エチルカルボジイミド塩酸塩 (180 mg, 0.941 mmol)、1-ヒドロキシベンゾトリアゾール１水和物 (12.0 mg, 0.078 mmol)を加えて終夜撹拌した。反応液をセライトでろ過し、減圧下、溶媒を留去し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー (クロロホルム/メタノール=80/20)で精製し、さらに逆相分取HPLC (アセトニトリル/水)で精製することにより、化合物RE43-2 (191 mg, 収率43%)を得た。
ESI-MS m/z: 1431 (M + 2H) 2+【０５２６】
参考例43工程2
化合物RE43-2 (186 mg, 0.065 mmol)をテトラヒドロフラン (2.8 mg)および水 (0.9 mL)に溶解し、室温にて10%パラジウムカーボン粉末 (含水品, 54.29%; 34.3 mg)を加え、水素雰囲気下で1時間撹拌した。反応液をろ過し、減圧下、溶媒を留去し、化合物D9（174 mg, 収率97%）を得た。
ESI-MS m/z: 1386 (M + 2H) 2+
1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6,δ):1.25-4.02 (m, 164H), 4.18-4.26 (m, 2H), 4.47 (d, J = 8.1 Hz, 4H), 4.96 (dd, J = 3.1, 11.2 Hz, 4H), 5.21 (d, J = 3.6 Hz, 4H), 7.74-7.91 (m, 13H), 8.18 (s, 2H), 8.36 (d, J = 7.2 Hz, 2H), 10.27 (brs, 1H).【０５２７】
参考例44：化合物A2の合成【０５２８】
【化１６４】
2020111280.tif 000181
【０５２９】
参考例44工程1
参考例31に記載の方法で合成した化合物RE44-1 (参考例31における化合物RE31-4, 150 mg, 0.228 mmol)をジクロロメタン (1.5 mL)に溶解し、室温にてトリフルオロ酢酸 (1.5 mL)を加えて4時間撹拌した。反応液を減圧濃縮し、酢酸エチルで共沸した。残渣をN, N'-ジメチルホルムアミド (3 mL)に溶解し、室温にて参考例14の化合物RE14-3 (574 mg, 0.571 mmol)、1-(3-ジメチルアミノプロピル)-3-エチルカルボジイミド塩酸塩 (109 mg, 0.571 mmol)、トリエチルアミン (0.159 mL, 1.14 mmol)、1-ヒドロキシベンゾトリアゾール１水和物 (3.50 mg, 0.023 mmol)を加えて終夜撹拌した。反応液を減圧濃縮し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー (クロロホルム/メタノール=90/10)で精製し、さらに逆相分取HPLC (アセトニトリル/水)で精製することにより、化合物RE44-2 (242 mg, 収率44%)を得た。
ESI-MS m/z: 1216 (M + 2H) 2+【０５３０】
参考例44工程2
化合物RE44-2 (242 mg, 0.100 mmol)を テトラヒドロフラン/水 (4/1; 12 mL)に溶解し、室温にて10%パラジウムカーボン粉末 (含水品, 54.29%; 44.6 mg)を加え、水素雰囲気下で2時間撹拌した。アルゴン雰囲気下、室温にて6-マレイミドヘキサン酸 (23.2 mg, 0.110 mmol)、4-(4,6-ジメトキシ-1,3,5-トリアジン-2-イル)-4-メチルモルホリニウムクロリド (55.2 mg, 0.199 mmol)を加えて終夜撹拌した。反応液をセライトでろ過し、減圧下、溶媒を留去し、残渣をHP20レジン (アセトン/水)で精製精製することにより、化合物A2 (97.4 mg, 収率39%)を得た。
ESI-MS m/z: 1245 (M + 2H) 2+
1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6,δ):1.14-2.16 (100H, m), 2.96-2.98 (4H, m), 3.24-3.41 (18H, m), 3.69-3.73 (4H, m), 3.83-3.91 (6H, m), 4.14-4.16 (2H, m), 4.47 (4H, d, J = 8.6 Hz), 4.96 (4H, dd, J = 3.6, 11.3 Hz), 5.21 (4H, d, J = 3.2 Hz), 7.01 (2H, s), 7.73-7.75 (2H, m), 7.83-7.94 (7H, m), 8.05-8.08 (2H, m), 8.14-8.20 (3H, m), 8.55-8.56 (2H, m), 10.24 (1H, brs).【０５３１】
参考例45：化合物A3の合成【０５３２】
【化１６５】
2020111280.tif 000182
【０５３３】
参考例45工程1
参考例32に記載の方法で合成した化合物RE45-1 (参考例32における化合物RE32-3, 75.0 mg, 0.228 mmol)をN, N'-ジメチルホルムアミド (3.0 mL)に溶解し、室温にて参考例14の化合物RE14-3 (574 mg, 0.571 mmol)、ジイソプロピルエチルアミン (0.199 mL, 1.14 mmol)、O-(7-アザベンゾトリアゾール-1-イル)-N,N,N',N'-テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスファート (217 mg, 0.571 mmol)を加えて終夜撹拌した。減圧下、溶媒を留去し、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー (クロロホルム/メタノール=90/10)で精製し、さらに逆相分取HPLC (アセトニトリル/水)で精製することにより、化合物RE45-2 (202 mg, 収率38%)を得た。
ESI-MS m/z: 1152 (M + 2H) 2+【０５３４】
参考例45工程2
化合物RE45-2 (196 mg, 0.085 mmol)を テトラヒドロフラン/水 (4/1; 10 mL)に溶解し、室温にて10%パラジウムカーボン粉末 (含水品, 54.29%; 36.1 mg)を加え、水素雰囲気下で2時間撹拌した。アルゴン雰囲気下、室温にて6-マレイミドヘキサン酸 (19.8 mg, 0.094 mmol)、4-(4,6-ジメトキシ-1,3,5-トリアジン-2-イル)-4-メチルモルホリニウムクロリド (47.0 mg, 0.170 mmol)を加えて終夜撹拌した。反応液をセライトでろ過し、減圧下、溶媒を留去し、残渣をHP20レジン (アセトン/水)で精製することにより、化合物A3 (42.4 mg, 収率21%)を得た。
ESI-MS m/z: 1182 (M + 2H) 2+【０５３５】
参考例46:化合物D10【０５３６】
【化１６６】
2020111280.tif 000183
【０５３７】
参考例34に記載の方法で合成した化合物RE46-1（参考例34における化合物RE34-3）を用い、参考例10工程1および2と同様の方法で化合物D10 (2.2 g, 収率58%)を得た。
ESI-MS m/z: 2437(M+H)+【０５３８】
参考例47：化合物A4の合成【０５３９】
【化１６７】
2020111280.tif 000184
【０５４０】
参考例47工程1
参考例33に記載の方法で合成した化合物RE47-1 (参考例33における化合物RE33-4, 0.101 g, 0.282 mmol)を用いて、参考例15の化合物RE15-2 (0.607 g, 0.613 mmol)を用い、参考例3工程3と同様の方法によって化合物RE47-2 (0.25 g, 収率39%)を得た。
ESI-MS m/z: 2304(M+H)+【０５４１】
参考例47工程2
化合物RE47-2 (0.255 g, 0.111 mmol)を用いて、参考例3工程2と同様の方法によって化合物RE47-3 (0.15 g, 収率63%)を得た。
ESI-MS m/z: 2170(M+H)+【０５４２】
参考例47工程3
化合物RE47-3 (20.8 mg, 9.59 μmol)を用いて、参考例5工程2と同様の方法によって化合物A4 (5.5 mg, 収率24%)を得た。
ESI-MS m/z: 1182(M+2H)2+【０５４３】
参考例48：化合物A5の合成【０５４４】
【化１６８】
2020111280.tif 000185
【０５４５】
参考例48工程1
参考例33に記載の方法で合成した化合物RE48-1 (参考例33における化合物RE33-4, 0.099g, 0.277 mmol)を用いて、参考例16工程2で合成した化合物RE16-3 (0.618 g, 0.615 mmol)を用い、参考例3工程3と同様の方法によって化合物RE48-2 (0.343 g, 収率53%)を得た。
ESI-MS m/z: 2333(M+H)+【０５４６】
参考例48工程2
化合物RE48-2を用いて、参考例10工程1および2と同様の方法で化合物A5 (6.9 mg, 収率28%)を得た。
ESI-MS m/z: 2392(M+H)+【０５４７】
参考例49：化合物A6の合成【０５４８】
【化１６９】
2020111280.tif 000186
【０５４９】
化合物RE49-1 (0.048 g, 0.021 mmol)と3-マレイミドプロピオン酸 N-スクシンイミジル (東京化成社製, 0.017 g, 0.064 mmol)を用いて参考例8の化合物A1の合成と同様の方法で化合物A6 (0.040 g, 収率78%)を得た。
ESI-MS m/z: 2480(M+HCOO)-【０５５０】
参考例50：化合物A7の合成【０５５１】
【化１７０】
2020111280.tif 000187
【０５５２】
工程131
参考例10に記載の方法で合成した化合物D1 (23.6 mg, 9.46 μmol)とN-(2-アミノエチル)マレイミド トリフルオロ酢酸塩 (シグマアルドリッチ社製, 7.21 mg, 0.028 μmol)を用いて参考例3工程3と同様の方法で化合物A7 (9.1 mg, 収率36%)を得た。
ESI-MS m/z: 1310(M+2H)2+【０５５３】
参考例51【０５５４】
【化１７１】
2020111280.tif 000188
【０５５５】
参考例51工程1
参考例7に記載の方法で合成した化合物RE51-1 (0.122 g, 0.054 mmol)と、バイオコンジュゲート・ケミストリー (Bioconjugate Chemistry), 第22巻, 690−699頁, 2011年に記載された方法と同様の方法を用いて合成したヘキサン酸モノベンジルエステルを用い、参考例4工程1と同様の方法で、化合物RE51-2 (0.076 g, 収率56%)を得た。
ESI-MS m/z: 2503(M+H)+【０５５６】
参考例51工程2
化合物RE51-2 (0.076 g, 0.03 mmol)を用いて参考例3工程1と同様の方法で化合物RE51-3 (0.030 g, 収率40%)を得た。
ESI-MS m/z: 2412(M+H)+【０５５７】
参考例52【０５５８】
【化１７２】
2020111280.tif 000189
【０５５９】
参考例6に記載の方法で合成した化合物RE52-1 (参考例6における化合物RE6-5, 4.36 mg, 0.006 mmol)と参考例1の化合物RE1-4 (10 mg, 0.02 mmol) を用い、参考例3工程7と同様の方法で化合物RE52-2 (7 mg, 収率65%)を得た。
ESI-MS m/z: 1581 (M - H)-【０５６０】
参考例53：化合物C2の合成【０５６１】
【化１７３】
2020111280.tif 000190
【０５６２】
参考例53工程1
参考例46に記載の方法で合成した化合物D10 (0.2011 g, 0.079 mmol)を用いて、参考例10工程3と同様の方法で化合物RE53-1 (0.129 g, 収率55%)を得た。
ESI-MS m/z: 2972 (M+HCOO)-【０５６３】
参考例53工程2
化合物RE53-1(0.129 g, 0.044 mmol)を用いて、参考例10工程4と同様の方法で化合物RE53-2の粗製生物を得た。
ESI-MS m/z: 1535 (M+HCOOH-2H)2-【０５６４】
参考例53工程3
化合物RE53-2 (0.0467 g, 0.013 mmol)を用いて、参考例10工程5と同様の方法で、化合物C2(19.4 μmol/g, 収率35%)を得た。【０５６５】
参考例54:化合物C3の合成【０５６６】
【化１７４】
2020111280.tif 000191
【０５６７】
参考例54工程1
参考例10に記載の方法で合成した化合物D1 (100 mg, 0.040mmol) および参考例17の化合物RE17-2を用い、参考例10工程3と同様の方法で化合物RE54-1 (90 mg, 収率76%) を得た。
ESI-MS m/z: 1335 (M-DMTr+2H)2+【０５６８】
参考例54工程2
化合物RE54-1 (90 mg, 0.030 mmol) を用い、参考例10工程4と同様の方法で化合物RE54-2の粗生成物を得た。
ESI-MS m/z: 1558 (M+HCOOH-2H)2-【０５６９】
参考例54工程3
化合物RE54-2の粗生成物を用い、参考例10工程5と同様の方法で化合物C3 (21.5 μmol/g, 2段階収率32%) を得た。【０５７０】
参考例55：化合物C4の合成【０５７１】
【化１７５】
2020111280.tif 000192
【０５７２】
参考例55工程1
参考例46に記載の方法で合成した化合物D10 (100 mg, 0.039 mmol) および参考例17で合成した化合物RE17-2を用い、参考例10工程3と同様の方法で化合物RE55-1 (90 mg, 収率76%) を得た。
ESI-MS m/z: 1356 (M+2H)2+ 脱DMTr体として検出【０５７３】
参考例55工程2
化合物RE55-1 (90 mg, 0.030 mmol) を用い、参考例10工程4と同様の方法で化合物RE55-2の粗生成物を得た。
ESI-MS m/z: 1579 (M+HCOOH-2H)2-【０５７４】
参考例55工程3
化合物RE55-2の粗生成物を用い、参考例10工程5と同様の方法で化合物C4 (17.0 μmol/g, 2段階収率26%) を得た。【０５７５】
参考例56：化合物C5の合成【０５７６】
【化１７６】
2020111280.tif 000193
【０５７７】
参考例56工程1
参考例46に記載の方法で合成した化合物D10 (100 mg, 0.039 mmol) および参考例18の工程2で合成した化合物RE18-3を用い、参考例10工程3と同様の方法で化合物RE56-1 (50 mg, 収率42%) を得た。
ESI-MS m/z: 1363 (M+2H)2+ 脱DMTr体として検出【０５７８】
参考例56工程2
化合物RE56-1 (50 mg, 0.017 mmol) を用い、参考例10工程4と同様の方法で化合物RE56-2の粗生成物を得た。
ESI-MS m/z: 1587 (M+HCOOH-2H)2-【０５７９】
参考例56工程3
化合物RE56-2の粗生成物を用い、参考例10工程5と同様の方法で化合物C5 (0.5 μmol/g, 2段階収率1%) を得た。【０５８０】
参考例57：化合物C6の合成【０５８１】
【化１７７】
2020111280.tif 000194
【０５８２】
参考例57工程1
参考例46に記載の方法で合成した化合物D10 (100 mg, 0.039 mmol) および参考例19の化合物RE19-2を用い、参考例10工程3と同様の方法で化合物RE57-1 (40 mg, 収率30%) を得た。
ESI-MS m/z: 1532 (M+2H)2+ 脱DMTr体として検出【０５８３】
参考例57工程2
化合物RE57-1(40 mg, 0.012 mmol)を用い、参考例10工程4と同様の方法で化合物RE57-2の粗生成物を得た。
ESI-MS m/z: 1582 (M+2H)2+
脱DMTr体として検出【０５８４】
参考例57工程3
化合物RE57-2の粗生成物を用い、参考例10工程5と同様の方法で化合物C6 (0.2 μmol/g, 2段階収率1%) を得た。【０５８５】
参考例58：化合物C7の合成【０５８６】
【化１７８】
2020111280.tif 000195
【０５８７】
参考例58工程1
参考例10に記載の方法で合成した化合物D1 (70 mg, 0.028 mmol) および参考例21の化合物RE21-3を用い、参考例10工程3と同様の方法で化合物RE58-1 (58 mg, 収率77%) を得た。
ESI-MS m/z: 1341 (M+2H)2+【０５８８】
参考例58工程2
化合物RE58-1 (58 mg, 0.022 mmol) をメタノール (0.15  mL) に溶解し、ジャーナルオブオーガニックケミストリー（Journal of Organic Chemistry）, 第74巻, 6837-6842頁, 2009年に記載された方法で合成した参考例17の化合物RE17-1 (16.9 mg, 0.032 mmol)、1 mol /L SODIUM L-ASCORBATE水溶液 (0.022 mL, 0.022 mmol)、20 mmol/L 硫酸銅(ＩＩ)水溶液 (0.011 mL, 0.22 μmol)、及び10 mmol/L Tris(2-benzimidazolylmethyl)amine / DMSO溶液 (0.022 mL, 0.22μmol)を加え、室温にて3時間撹拌した。反応液をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(クロロホルム／メタノール=80/20）にて精製し、化合物RE58-2 (7 mg, 収率10%) を得た。
ESI-MS m/z: 1450 (M+2H)2+ 脱DMTr体として検出【０５８９】
参考例58工程3
化合物RE58-2 (10 mg, 3.13 μmol) を用い、参考例10工程4と同様の方法で化合物RE58-3の粗生成物を得た。
ESI-MS m/z: 1500 (M+2H)2+ 脱DMTr体として検出【０５９０】
参考例58工程4
化合物RE58-3の粗生成物を用い、参考例10工程5と同様の方法で化合物C7 (8.4 μmol/g,収率27%) を得た。【０５９１】
参考例59【０５９２】
【化１７９】
2020111280.tif 000196
【０５９３】
参考例59工程1
参考例46に記載の方法で合成した化合物D10 (74.1 mg, 0.029 mmol)と参考例22の化合物RE22-2 (15 mg, 0.027 mmol)を用いて、参考例3工程3と同様の方法、またはバイオコンジュゲートケミストリー, 第26巻,1451-1455頁, 2015年に記載の方法で化合物RE59-1の粗製生物を得た。
ESI-MS m/z: 1392(M +H)+, 脱DMTr体として検出【０５９４】
参考例59工程2
化合物RE59-1 (0.083 g, 0.027 mmol)を用いて、国際公開公報2015105083号に記載の方法により化合物RE59-2の粗製生物を得た。
ESI-MS m/z: 2669(M+H)+ , 脱DMTr体として検出【０５９５】
参考例59工程3
化合物RE59-2 (0.08 g, 0.027 mmol)を用いて、参考例10工程4と同様の方法で化合物RE59-3の粗製生物を得た。
ESI-MS m/z: 1556(M+HOOH-2H)2-
1H-NMR (400 MHz, MeOD)：δ1.45-1.86 (48H, m), 1.93 (12H, s), 1.94 (12H, s), 2.02 (12H, s), 2.13 (12H, s), 2.16-2.28 (17H, m), 2.48 (4H, s), 3.10-3.16 (6H, m), 3.36-3.56 (19H, m), 3.77 (6H, s), 3.80-3.89 (6H, m), 3.98-4.35 (30H, m), 4.53-4.59 (4H, m), 4.66-4.72 (1H, m), 5.04-5.10 (4H, m), 5.31-5.36 (4H, m), 6.81-6.88 (4H, m), 7.17-7.23 (1H, m), 7.26-7.32 (6H, m), 7.38-7.44 (2H, m), 7.54 (2H, br s), 7.90 (1H, br s).【０５９６】
参考例60
化合物D1、および表Z-1記載の構造または参考例20の化合物RE20-4を用い、参考例59工程1および工程2と同様の方法にて、表P-1および表P-2に記載した化合物を得た。
本実施例により合成した化合物の質量分析結果を表P-3に示す。【０５９７】
【表１６】
2020111280.tif 000197
【０５９８】
【表１７】
2020111280.tif 000198
【０５９９】
【表１８】
2020111280.tif 000199
【０６００】
【表１９】
2020111280.tif 000200
【０６０１】
参考例61：化合物C8の合成【０６０２】
【化１８０】
2020111280.tif 000201
【０６０３】
参考例59に記載の化合物RE59-3を用いて、参考例10工程5と同様の方法で化合物C8 (10.0 μmol/g) を得た。【０６０４】
参考例62：C9〜C17の合成
表P-1および表P-2に記載した化合物を用いて、参考例61と同様の方法で表Q-1および表Q-2記載の化合物を得た。
本実施例により合成した化合物の担持量を表Q-3に示す。【０６０５】
【表２０】
2020111280.tif 000202
【０６０６】
【表２１】
2020111280.tif 000203
【０６０７】
【表２２】
2020111280.tif 000204
【０６０８】
【表２３】
2020111280.tif 000205
【０６０９】
実施例１：化合物１−１および１−２の合成【０６１０】
【化１８１】
2020111280.tif 000206
【０６１１】
工程１
参考例化合物Ａ１と、モレキュールズ (Molecules), 第17巻, 13825−13843頁, 2012年に記載された方法で合成した末端チオール化されたオリゴヌクレオチドを加えて、室温にて4時間静置した。反応混合物に炭酸ナトリウムを加え、4℃で一晩静置した。陰イオン交換クロマトグラフィー (GE Healthcare, MonoQ 5/50GL, 10μm, 5.0 mm x 50 mm、A液： 10 mmol/L Tris緩衝液/30%アセトニトリル, B液: 10 mmol/L Tris緩衝液/30%アセトニトリル/1 mol/L NaBrによるグラジエント)あるいは逆相液体クロマトグラフィー (ウォーターズ, X BridgeC18, 5μm, 4.6 mmx250 mm、0.1 mol/L酢酸トリエチルアンモニウム緩衝液, B液:アセトニトリルによるグラジエント)のいずれかの方法で精製することにより化合物１−１を得た。センス鎖配列は、表R-1〜表R-2に記載されているとおりである。【０６１２】
工程２
工程１で合成した化合物１−１（3'-APCS-ssRNA）を、混合緩衝液（100 mmol/L酢酸カリウム、30 mmol/L 2-[4-(2-ヒドロキシエチル)ピペラジン-1-イル]エタンスルホン酸、HEPES)-KOH(pH 7.4)、2 mmol/L酢酸マグネシウム）にて濃度調整（50 μmol/L）した。前述センス鎖とアンチセンス鎖（50 μmol/L）を各々等量混合し、80 ℃で10分間静置した。アンチセンス鎖配列は、表R-3〜表R-4に記載されているとおりである。徐々に温度を下げ、37 ℃で1時間静置し、2本鎖の化合物１−２を得た。【０６１３】
実施例２〜１０：化合物２−１〜１０−１および化合物２−２〜１０−２の合成
実施例1とは塩基配列の異なるオリゴヌクレオチドを用い、実施例１と同様にして、化合物２−１〜１０−１および化合物２−２〜１０−２を合成した。【０６１４】
実施例１１：化合物１１−１および化合物１１−２の合成【０６１５】
【化１８２】
2020111280.tif 000207
【０６１６】
工程1
参考例化合物Ｄ５を用いて、モレキュールズ(Molecules)、第17巻、13825-13843頁、2012年に記載された方法で合成した末端がアミノ基で修飾されたオリゴヌクレオチドを加えて、バイオコンジュゲートケミストリー, 第22巻,1723-1728頁, 2011年もしくはバイオコンジュゲートケミストリー, 第26巻,1451-1455頁, 2015年に記載の方法にて反応させた。実施例1に記載した方法で精製することにより、化合物１１−１を得た。【０６１７】
工程２
実施例1の工程２と同様の方法にて、化合物１１−２を得た。【０６１８】
実施例１２〜４３：化合物１２−１〜４３−１および化合物１２−２〜４３−２の合成
実施例１１とは塩基配列の異なるオリゴヌクレオチドを用い、実施例１１と同様にして、化合物１２−１〜４３−１および化合物１２−２〜４３−２を合成した。【０６１９】
本実施例により合成した化合物のリガンド−リンカー構造を以下に示す。【０６２０】
【化１８３】
2020111280.tif 000208
【０６２１】
本実施例により合成した核酸複合体の配列（センス鎖）および質量分析結果を表R-1〜表R-2に示す。なお、表R-1〜表R-2中、N(M)は2'-O-メチル修飾RNA、N(F)は2'-フッ素修飾RNA、pは5'末端におけるリン酸化、＾はホスホロチオエート、Ｘは参考例化合物Ａ１の残基、およびＹは参考例化合物Ｄ５の残基を示す。配列番号２０６９〜〜２１１１に示すリボヌクレオチドから成るセンス鎖と、配列番号２１１２〜２１５４に示すリボヌクレオチドから成るアンチセンス鎖との二本鎖核酸で構成される（配列番号ｎ（ｎ＝２０６９〜〜２１１１）に示すセンス鎖と配列番号［ｎ＋４３］に示すアンチセンス鎖とが対をなす）。【０６２２】
【表２４】
2020111280.tif 000209
【０６２３】
【表２５】
2020111280.tif 000210
【０６２４】
本実施例により合成した核酸複合体の配列を表R-3〜表R-4に示す。なお、表R-3〜表R-4中、N(M)は2'-O-メチル修飾RNA、N(F)は2'-フッ素修飾RNA、pは5'末端におけるリン酸化、および＾はホスホロチオエートを示す。【０６２５】
【表２６】
2020111280.tif 000211
【０６２６】
【表２７】
2020111280.tif 000212
【０６２７】
参考試験例1: siRNAのヒト細胞におけるAPCS mRNAのノックダウン活性の測定
二本鎖核酸は、表1-1〜表１〜１３に記載のものをシグマアルドリッチ社にて合成して利用した。具体的には配列番号２〜６４４に示すリボヌクレオチドから成るセンス鎖、配列番号６４５〜１２８７に示すリボヌクレオチドから成るアンチセンス鎖をアニーリングさせた二本鎖核酸で構成される（配列番号ｎ（ｎ＝２〜６４４）に示すセンス鎖と配列番号［ｎ＋６４３］に示すアンチセンス鎖とが対をなす）。384ウェルの培養プレートに、二本鎖核酸とRNAiMaxトランスフェクション試薬(Thermo Fisher Scientific社製、カタログ番号13778150)をOpti-MEM I Reduced Serum Medium培地(Thermo Fisher Scientific社製、カタログ番号31985070)で希釈したsiRNA/RNAiMax混合液20 μLを添加した。ヒト卵巣癌由来の細胞株であるRMG-I細胞（JCRB細胞バンク、JCRB0172）を、10,000細胞/40 μL/ウェルとなるよう各々384ウェルの培養プレートに播種し、37℃、5% CO2条件下で24時間培養した。培地は、10%ウシ胎仔血清(Thermo Fisher Scientific社製、カタログ番号10091-148)を含むHam's F-12 Nutrient Mix培地(Thermo Fisher Scientific社製、カタログ番号11765-047)を用いた。二本鎖核酸の終濃度は1 nMとなるようにした。その後、細胞をDPBS, no calcium, no magnesium（Thermo Fisher Scientific社製、カタログ番号14190-144）で洗浄し、各々のプレートからTaqMan（登録商標） Fast Cells-to-CT（商標）キット（Thermo Fisher Scientific社製、カタログ番号4399003）を用いて以下の方法でcDNAを合成した。Lysis solution（キット内容物）とDNase I（キット内容物）を100：1で混合した溶液を10 μLずつ添加し、5分間混合した。Stop Solution（キット内容物）を1 μLずつ添加、2分間混合し、RNA抽出液とした。5 μLの2×RT Buffer（キット内容物）、0.5 μLの20×RT Enzyme Mix（キット内容物）、2.5 μLのNuclease-free Water、2 μLのRNA抽出液を混合し、これを37℃、60分間、95℃、5分間で反応させ、cDNAを合成した。このcDNA 2 μLをMicroAmp（登録商標） EnduraPlate（商標） Optical 384-Well Clear Reaction Plates with Barcode（Thermo Fisher Scientific社製、カタログ番号4483285）に加え、更に5 μLのTaqMan（登録商標） Fast Universal PCR Master Mix（Thermo Fisher Scientific社製、カタログ番号4352042）、2.5 μLのDISTILLED WATER (ULTRAPURE)（Thermo Fisher Scientific社製、カタログ番号10977015）、0.25 μLのhuman APCSプローブ、0.25 μLのhuman ACTBプローブを添加した。QuantStudio（商標） 7 Flexを用いて、human APCS遺伝子及びhuman ACTB（actin beta）遺伝子のリアルタイムPCRをおこなった。ACTBは構成的発現遺伝子であり内部対照として測定し、APCS遺伝子発現量を補正した。siRNAを添加せずにトランスフェクション試薬だけでRMG-I細胞を処理した時のAPCS mRNA量を1.0として、各siRNAを導入した時のAPCS mRNA相対発現量値を算出した。本実験を2回おこない、APCS mRNA相対発現量値の最小値を表1-1〜表1-13に示した。【０６２８】
【表２８】
2020111280.tif 000213
【０６２９】
【表２９】
2020111280.tif 000214
【０６３０】
【表３０】
2020111280.tif 000215
【０６３１】
【表３１】
2020111280.tif 000216
【０６３２】
【表３２】
2020111280.tif 000217
【０６３３】
【表３３】
2020111280.tif 000218
【０６３４】
【表３４】
2020111280.tif 000219
【０６３５】
【表３５】
2020111280.tif 000220
【０６３６】
【表３６】
2020111280.tif 000221
【０６３７】
【表３７】
2020111280.tif 000222
【０６３８】
【表３８】
2020111280.tif 000223
【０６３９】
【表３９】
2020111280.tif 000224
【０６４０】
【表４０】
2020111280.tif 000225
【０６４１】
なお、APCS 2nd strand cDNAの全長の塩基配列を表2に示す。【０６４２】
【表４１】
2020111280.tif 000226
【０６４３】
参考試験例2: 修飾siRNAのヒト細胞におけるAPCS mRNAのノックダウン活性の測定１  ジーンデザイン社に依頼して、配列番号１９３１〜１９７４に示すリボヌクレオチドから成るセンス鎖核酸、配列番号１９７５〜２０１８に示すリボヌクレオチドから成るアンチセンス鎖核酸、及びそれらをアニーリングさせた二本鎖核酸（配列番号ｎ(ｎ＝１９３１〜１９７４)に示すセンス鎖と配列番号［ｎ＋４４］に示すアンチセンス鎖とが対をなす）を合成した。
合成した二本鎖核酸の終濃度は1 nM、又は0.1 nMとなるようにし、当該二本鎖核酸をRMG-1細胞に導入し、24時間培養した以外は、参考試験例１と同様の操作を行って、APCS mRNA相対発現量を算出した。本実験を4回おこない、APCS mRNA相対発現量値の中央値を表M1-1〜表M1-2に示した。表M1-1〜表M1-2において、N(M)は2'-O-methyl-RNAを、N(F)は2'-F-RNAを示す。【０６４４】
【表４２】
2020111280.tif 000227
【０６４５】
【表４３】
2020111280.tif 000228
【０６４６】
参考試験例3 修飾siRNAのヒト細胞におけるAPCS mRNAのノックダウン活性の測定２
二本鎖核酸は、表M1-3に記載のものをジーンデザイン社にて合成して利用した。具体的には配列番号２０１９〜２０４３に示すリボヌクレオチドから成るセンス鎖、配列番号２０４４〜２０６８に示すリボヌクレオチドから成るアンチセンス鎖をアニーリングさせた二本鎖核酸で構成される（配列番号ｎ（ｎ＝２０１９〜２０４３）に示すセンス鎖と配列番号［ｎ＋２５］に示すアンチセンス鎖とが対をなす）。96ウェルの培養プレートに、各二本鎖核酸とRNAiMaxトランスフェクション試薬(Thermo Fisher Scientific社製、カタログ番号13778150)をOpti-MEM I Reduced Serum Medium培地(Thermo Fisher Scientific社製、カタログ番号31985070)で希釈したsiRNA/RNAiMax混合液20 μLを添加した。ヒト卵巣癌由来の細胞株であるRMG-I細胞（JCRB細胞バンク、JCRB0172）を、10,000細胞/60 μL/ウェルとなるよう各々96ウェルの培養プレートに播種し、37℃、5% CO2条件下で24時間培養した。培地は、10%ウシ胎仔血清(Thermo Fisher Scientific社製、カタログ番号10091-148)を含むHam's F-12 Nutrient Mix培地(Thermo Fisher Scientific社製、カタログ番号11765-047)を用いた。二本鎖核酸の終濃度は1または0.1 nMとなるようにした。その後、細胞をDPBS, no calcium, no magnesium（Thermo Fisher Scientific社製、カタログ番号14190-144）で洗浄し、各々のプレートからスーパープレップセルリシスアンドアールティーキットフォーキューピーシーアール (東洋紡社製、カタログ番号 SCQ-101)を用いて、製品に添付された説明書に記載された方法に従い全RNAの回収と、得られた全RNAを鋳型とする逆転写反応によるcDNAの作製を行った。このcDNA 3μLをMicroAmpOptical 384ウェルプレート（アプライドバイオシステムズ社製、カタログ番号:4309849）に加え、更に10μLのTaqMan Gene Expression Master Mix（アプライドバイオシステムズ社製、カタログ番号4369016）、6μLのUltraPure Distilled Water（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製、カタログ番号:10977-015）、1μLのhuman APCSプローブあるいは1μLのhuman GAPDH（D-glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase）プローブを添加し、クオントスタジオ12ケーフレックスリアルタイムピーシーアールシステム (サーモフィッシャーサイエンティフィック社製)を用いて、human APCS遺伝子およびhuman GAPDH遺伝子のリアルタイムPCRをおこなった。GAPDHは構成的発現遺伝子であり内部対照として測定し、APCS遺伝子発現量を補正した。siRNAを添加せずにトランスフェクション試薬だけでRMG-I細胞を処理した時のAPCS mRNA量を1.0として、各siRNAを導入した時のAPCS mRNA相対発現量値を算出した。本実験を2回おこない、APCS mRNA相対発現量値の平均値を表M1-3に示した。なお、表M1-3中、N(M)は2'-O-メチル修飾RNA、N(F)は2'-フッ素修飾RNAを示す。【０６４７】
【表４４】
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【０６４８】
試験例1  核酸複合体のヒト初代肝細胞に対するAPCS mRNAのノックダウン試験
実施例1〜43で得られた各核酸複合体について、ヒト初代肝細胞におけるin vitroノックダウン活性を測定した。この核酸複合体の終濃度が300, 30, 3または0.3 nmol/Lとなるように、オプティメム (Opti-MEM)(サーモフィッシャーサイエンティフィック社製、カタログ番号31985)で希釈した各核酸複合体を、96ウェルのコラーゲンIコート培養プレート (コーニング社製、カタログ番号:356407) に20 μLずつ分注した後、プレーティングメディウム (バイオプレディックインターナショナル社製、カタログ番号 LV0304-2)に懸濁させたヒト初代肝細胞（バイオプレディックインターナショナル社製、カタログ番号HEP187)を、10,000細胞/80μL/ウェルとなるよう播種し、37℃、5%CO2条件下で6時間培養したのちに、培養上清を注意深く除去し、インキュベーションメディウム (バイオプレディックインターナショナル社製、カタログ番号LV0304-2)を添加して、各核酸複合体をヒト初代肝細胞に供した。また陰性対照の群として20 μLのオプティメムを供したヒト初代肝細胞を用いた各核酸複合体を添加した細胞を37℃の5% CO2インキュベーター内で18時間培養し、氷冷したリン酸緩衝化生理食塩水(DPBS)(ナカライテスク社製、カタログ番号14249-95)で洗浄し、各々のプレートからスーパープレップセルリシスアンドアールティーキットフォーキューピーシーアール (東洋紡社製、カタログ番号 SCQ-101)を用いて、製品に添付された説明書に記載された方法に従い全RNAの回収と、得られた全RNAを鋳型とする逆転写反応によるcDNAの作製を行った。このcDNA 3μLをMicroAmpOptical 384ウェルプレート（アプライドバイオシステムズ社製、カタログ番号:4309849）に加え、更に10μLのTaqMan Gene Expression Master Mix（アプライドバイオシステムズ社製、カタログ番号4369016）、6μLのUltraPure Distilled Water（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製、カタログ番号:10977-015）、1μLのhuman APCSプローブ（アプライドバイオシステムズ社製) あるいは1μLのhuman GAPDHプローブ（アプライドバイオシステムズ社製)を添加し、クオントスタジオ12ケーフレックスリアルタイムピーシーアールシステム (サーモフィッシャーサイエンティフィック社製)を用い、添付された使用説明書に記載された方法に従ってhuman APCS遺伝子およびhuman GAPDH遺伝子のリアルタイムPCRをおこなった。GAPDHは構成的発現遺伝子であり内部対照として測定し、APCS発現量を補正した。同様に測定した陰性対照におけるAPCSのmRNAの準定量値を1.0として、各核酸複合体を導入した時のAPCS mRNA相対発現量を算出した。本実験を2回おこない、APCS mRNA相対発現量の平均値を表S1に示した。【０６４９】
【表４５】
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【０６５０】
表S1から明らかなように、各核酸複合体はヒト初代肝細胞に添加後、APCS遺伝子のmRNAの発現を抑制した。【０６５１】
試験例2  核酸複合体のマウスにおけるin vivoノックダウン試験
実施例1〜43で得られた核酸複合体について、以下の方法によりin vivoノックダウン試験を実施した。なお、各核酸複合体は試験に合わせてリン酸緩衝化生理食塩水(DPBS)(ナカライテスク社製)で希釈して用いた。マウスはヒト肝細胞が移植されたPXBマウス（PXB/human Hepatocyte repopulated cDNA-uPA/SCID Tg、フェニックスバイオ社より入手）を使用し、ヒトAPCSに対する核酸複合体の効果を評価した。PXBマウスを馴化飼育後、各核酸複合体をマウスに皮下投与した。投与用量は10 mg/kgであり、投与用量は5 mL/kgとした。コントロール群としてはDPBSのみをマウスに皮下投与した。投与６日前および投与後１、２、３、６、１０、１３日に採血を行い、1500×gで遠心分離することで血清を得た。これらの血清をヒトSAP ELISA（SAP, Human, ELISA kit 、HycultBiotech社製、#HK331-02）を用いて、血中ヒトAPCS量を評価した。ELISAは付属されたマニュアルに沿って実施した。各マウス群の血中ヒトAPCS濃度の推移を、図１に示した。DPBS投与群に対する核酸複合体投与群におけるAPCS発現比率（%）を表S2に示す。【０６５２】
【表４６】
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【０６５３】
表S2から明らかなように、本発明の核酸複合体を、ヒトAPCSを発現するマウスに投与して、マウス末梢血中のAPCSタンパク質発現を低下させることが明らかになった。
【産業上の利用可能性】
【０６５４】
本発明の核酸複合体は、哺乳動物に投与して、生体内において、アミロイド関連疾患を治療するために用いることができる。
【図１】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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