(57)【要約】  本発明によると、下記工程：（ａ）ＲＮＡウイルスを含む可能性のある試料を用意する工程、（ｂ）工程（ａ）の試料と耐熱性逆転写酵素を含む逆転写反応液を調製する工程、（ｃ）工程（ｂ）で得られた反応液を加熱する工程を含む、ＲＮＡウイルスの処理方法が提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記工程を含む、ＲＮＡウイルスの処理方法；
（ａ）ＲＮＡウイルスを含む可能性のある試料を用意する工程、
（ｂ）工程（ａ）の試料と耐熱性逆転写酵素を含む逆転写反応液を調製する工程、
（ｃ）工程（ｂ）で得られた反応液を加熱する工程。
【請求項２】
逆転写反応液がさらにＰＣＲ反応に必要な試薬を含有することを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項３】
逆転写反応液が界面活性剤を含むことを特徴とする請求項１または２記載の処理方法。
【請求項４】
耐熱性逆転写酵素が、４０℃以上で逆転写活性を示す逆転写酵素である請求項１〜３のいずれか一項に記載の処理方法。
【請求項５】
耐熱性逆転写酵素がＤＮＡ依存性のＤＮＡ合成活性を有する酵素である請求項１〜４のいずれか一項に記載の処理方法。
【請求項６】
前記工程（ｃ）の加熱の時間が１５分以下であることを特徴とする請求項１〜５のいずれか一項に記載の処理方法。
【請求項７】
前記工程（ｃ）の加熱の時間が３分以下であることを特徴とする請求項６記載の処理方法。
【請求項８】
前記工程（ｃ）の加熱の温度が、７０℃以上、１００℃未満であること特徴とする請求項７記載の処理方法。
【請求項９】
ＲＮＡウイルスを含む可能性のある試料が糞便、または糞便懸濁液もしくはその上清であることを特徴とする、請求項１〜８のいずれか一項に記載の処理方法。
【請求項１０】
糞便懸濁液上清が、糞便を緩衝液、滅菌水、もしくは生理食塩水に懸濁して調製された上清である、請求項９記載の処理方法。
【請求項１１】
ＲＮＡウイルスがカリシウイルス科ウイルスである請求項１〜１０いずれか一項に記載の処理方法。
【請求項１２】
ＲＮＡウイルスがノロウイルスである請求項１〜１０のいずれか一項に記載の処理方法。
【請求項１３】
下記工程を含む、ｃＤＮＡの合成方法；
（ａ）ＲＮＡウイルスを含む可能性のある試料を用意する工程、
（ｂ）工程（ａ）の試料と耐熱性逆転写酵素を含む逆転写反応液を調製する工程、
（ｃ）工程（ｂ）で得られた反応液を加熱する工程、
（ｄ）工程（ｃ）で得られた反応液をさらに耐熱性逆転写酵素が逆転写酵素活性を示す条件で反応させる工程。
【請求項１４】
下記工程を含む、核酸増幅方法；
（ａ）ＲＮＡウイルスを含む可能性のある試料を用意する工程、
（ｂ）工程（ａ）の試料と耐熱性逆転写酵素を含む逆転写反応液を調製する工程、
（ｃ）工程（ｂ）で得られた反応液を加熱する工程、
（ｄ）工程（ｃ）で得られた反応液をさらに耐熱性逆転写酵素が逆転写酵素活性を示す条件で反応させる工程、
（ｅ）工程（ｄ）で得られた反応液をさらに核酸増幅条件で反応させる工程。
【請求項１５】
工程（ｅ）における核酸増幅がＰＣＲであることを特徴とする請求項１４記載の核酸増幅方法。
【請求項１６】
耐熱性逆転写酵素がさらに耐熱性ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有することを特徴とする請求項１４または１５記載の核酸増幅方法。
【請求項１７】
工程（ａ）〜（ｅ）の反応が同一容器内で行われる請求項１４〜１６のいずれか一項に記載の核酸増幅方法。
【請求項１８】
工程（ａ）〜（ｄ）の反応が同一容器内で行われる請求項１３に記載のｃＤＮＡの合成方法。
【請求項１９】
少なくとも、以下の試薬を含むことを特徴とする請求項１〜１２のいずれか一項に記載のＲＮＡの処理方法を実施するためのキット。
耐熱性逆転写酵素、
デオキシリボヌクレオチド類、
緩衝成分。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＲＮＡウイルスの処理方法および該処理液を用いた核酸検出方法に関する。本発明は、食品衛生検査、環境検査、臨床診断等に利用できる。
【背景技術】
【０００２】
核酸増幅法を利用した検査の対象となる検体は、目的に応じて様々である。感染症原因菌の検出であれば、原因菌が存在しうる検体すなわち、尿、喀痰、糞便、血液、鼻腔液、膣分泌液などである。食品衛生検査であれば食品、あるいは食品取扱者から採取された糞便や尿、環境衛生検査であれば土壌や河川水、雨水、海水などの環境水、製造設備等の拭き取り物などである。特に特徴的な症状が発生するまでの潜伏期間がある微生物が原因の食中毒については被害拡大防止のために迅速な検査法が求められており、その場合の検体としては糞便、製造設備等の拭き取り物などになる。【０００３】
ところが検体によっては核酸以外の物質も多量に含んでおり、特に酵素を利用した核酸増幅反応を効率的に行うには通常は検体中の核酸の分離精製が必要とされている。前記核酸の分離精製には様々な手法があるが、基本的には核酸と他の物質を固体相と液体相に分けて固液分離する工程から構成される。例えばエタノール沈殿で核酸を固体相とし遠心分離で分離する方法、固相（例えばビーズ）上の核酸に標的核酸をハイブリダイズし、遠心分離や磁性化体で分離する方法がある。しかし、検体中の成分の分離をともなうこれらの精製法は、操作が煩雑で、かつ時間を要し、操作中に分解やコンタミネーションを生じる危険性がある。また、検体中の核酸含量が少ない場合には、増幅反応に必要な量を回収することができない場合もある。さらに核酸増幅法に要する時間は長くても数時間ほどであるが、このサンプル核酸調製に時間を要すると結果を得るまでの迅速性が失われることにもなる。したがって、検体を、別の容器への分離操作をともなう精製工程を経ることなく反応液へ持込み、標的核酸を増幅する方法が求められていた。【０００４】
このような方法として、例えば、特許文献１では糞便の懸濁上清液にアルカリ含有液を添加し加熱処理したサンプルを反応液に直接添加し核酸増幅反応を実施する方法が開示されている。また特許文献２では糞便の懸濁上清液に対しペクチナーゼ処理を行い加熱処理したサンプルを反応液に直接添加し核酸増幅反応を実施する方法が開示されている。【０００５】
特許文献１、２の実施例及び非特許文献１、２では検体中のＲＮＡを検出するため核酸増幅法として逆転写ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）が実施されている。しかし上記方法のＲＮＡサンプル調製ではいずれも逆転写酵素を含まない溶液で加熱処理が行われ、その後、該処理液を用いてｃＤＮＡ合成が行われている。また特許文献２には、加熱処理によるＲＮＡの加水分解の危険性が記載されているものの、加熱処理の必要性が記載されている。また、このような従来の方法では、いずれの方法においても核酸抽出及び反応阻害物失活のために加熱処理が施されているが、通常は加熱処理後の試料溶液に逆転写酵素が添加される。ここで発生する反応液の開閉や試薬の添加といった操作は非常に煩雑であり、容器を開閉することでエアロゾル中にふくまれるＲＮＡが飛散し、サンプル間のコンタミネーションを起こすリスクも高い。【０００６】
また、逆転写ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）反応液中で直接、検体中のＲＮＡを検出するための核酸増幅法として、例えば、特許文献３ではＲＴ−ＰＣＲ緩衝液中で真核細胞を加熱することで細胞を溶解し、核酸増幅する方法が開示されている。特許文献３の実施例では少量かつ、比較的容易にＲＮＡが溶出可能と考えられる培養細胞を用いてｃＤＮＡの合成及び増幅が行われており、特許文献３には、カプシドを持つウイルスや厚いペプチドグリカンを持つ原核生物など強固な外層構造に保護されているＲＮＡについての記載はない。【０００７】
さらに、特許文献４では、試料からのウイルスＲＮＡの精製や試料の熱処理を行うことなく、逆転写酵素および耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを含む１ステップＲＴ−ＰＣＲ反応液中に試料を加えることを特徴とする、試料のＲＮＡウイルス検出方法が開示されている。特許文献４の方法ではウイルスからＲＮＡを溶出するための熱処理を行わないが、実施例ではＲＴ−ＰＣＲ反応液中に第４級アンモニウム塩等の添加剤が含まれており、該添加剤がＲＮＡの溶出に関与していると考えられる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】ＷＯ２００７／０５２７６５
【特許文献２】特開２０１５−１１９６５６
【特許文献３】ＷＯ２０１２／０４５６６８
【特許文献４】特開２０１７−１３１１６４
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】東洋紡株式会社製  製品Ｃｏｄｅ  Ｎｏ．ＦＩＫ−２５３  取扱説明書
【非特許文献２】株式会社島津製作所製  製品Ｃｏｄｅ  Ｎｏ．ＰＮ  ２４１−０９５００−９１  取扱説明書
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明の目的は、ＲＮＡウイルスを含む可能性のある試料からＲＮＡを抽出する工程を経ることなく、耐熱性逆転写酵素反応液を調製して核酸合成を可能にすることである。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは、上記事情に鑑み、鋭意研究を行った結果、試料中のＲＮＡウイルスの検出方法において、ＲＮＡの精製や事前の熱処理を行っていない試料と耐熱性逆転写酵素を混合して逆転写反応液を調製し、逆転写反応においてＲＮＡの溶出とｃＤＮＡ合成を連続して行うことで、容器を開閉する操作の煩雑さや、エアロゾル中にふくまれるＲＮＡが飛散し、サンプル間のコンタミネーションを起こすリスクを解消する核酸合成方法を開発するに至った。さらに本発明者らは、ＤＮＡ依存性ＤＮＡ合成活性を有する耐熱性逆転写酵素を含むＲＴ−ＰＣＲ反応液に試料を直接添加し、ＲＮＡの溶出とｃＤＮＡ合成、及び核酸増幅反応を連続して行うことで、より効率よくウイルスＲＮＡを検出可能であることを見出し、本発明を完成するに至った。【００１２】
代表的な本願発明は、以下の通りである。
［１］  下記工程を含む、ＲＮＡウイルスの処理方法；
（ａ）ＲＮＡウイルスを含む可能性のある試料を用意する工程、
（ｂ）工程（ａ）の試料と耐熱性逆転写酵素を含む逆転写反応液を調製する工程、
（ｃ）工程（ｂ）で得られた反応液を加熱する工程。
［２］  逆転写反応液がさらにＰＣＲ反応に必要な試薬を含有することを特徴とする［１］記載の方法。
［３］  逆転写反応液が界面活性剤を含むことを特徴とする［１］または［２］記載の処理方法。
［４］  耐熱性逆転写酵素が、４０℃以上で逆転写活性を示す逆転写酵素である［１］〜［３］のいずれか一項に記載の処理方法。
［５］  耐熱性逆転写酵素がＤＮＡ依存性のＤＮＡ合成活性を有する酵素である［１］〜［４］のいずれか一項に記載の処理方法。
［６］  前記工程（ｃ）の加熱の時間が１５分以下であることを特徴とする［１］〜［５］のいずれか一項に記載の処理方法。
［７］  前記工程（ｃ）の加熱の時間が３分以下であることを特徴とする［６］記載の処理方法。
［８］  前記工程（ｃ）の加熱の温度が、７０℃以上、１００℃未満であること特徴とする［７］記載の処理方法。
［９］  ＲＮＡウイルスを含む可能性のある試料が糞便、または糞便懸濁液もしくはその上清であることを特徴とする、［１］〜［８］のいずれか一項に記載の処理方法。
［１０］  糞便懸濁液上清が、糞便を緩衝液、滅菌水、もしくは生理食塩水に懸濁して調製された上清である、［９］記載の処理方法。
［１１］ＲＮＡウイルスがカリシウイルス科ウイルスである請求項１〜１０いずれか一項に記載の処理方法。
［１２］  ＲＮＡウイルスがノロウイルスである［１］〜［１０］のいずれか一項に記載の処理方法。
［１３］  下記工程を含む、ｃＤＮＡの合成方法；
（ａ）ＲＮＡウイルスを含む可能性のある試料を用意する工程、
（ｂ）工程（ａ）の試料と耐熱性逆転写酵素を含む逆転写反応液を調製する工程、
（ｃ）工程（ｂ）で得られた反応液を加熱する工程、
（ｄ）工程（ｃ）で得られた反応液をさらに耐熱性逆転写酵素が逆転写酵素活性を示す条件で反応させる工程。
［１４］  下記工程を含む、核酸増幅方法；
（ａ）ＲＮＡウイルスを含む可能性のある試料を用意する工程、
（ｂ）工程（ａ）の試料と耐熱性逆転写酵素を含む逆転写反応液を調製する工程、
（ｃ）工程（ｂ）で得られた反応液を加熱する工程、
（ｄ）工程（ｃ）で得られた反応液をさらに耐熱性逆転写酵素が逆転写酵素活性を示す条件で反応させる工程、
（ｅ）工程（ｄ）で得られた反応液をさらに核酸増幅条件で反応させる工程。
［１５］  工程（ｅ）における核酸増幅がＰＣＲであることを特徴とする［１４］記載の核酸増幅方法。
［１６］  耐熱性逆転写酵素がさらに耐熱性ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有することを特徴とする［１４］または［１５］記載の核酸増幅方法。
［１７］  工程（ａ）〜（ｅ）の反応が同一容器内で行われる［１４］〜［１６］のいずれか一項に記載の核酸増幅方法。
［１８］
工程（ａ）〜（ｄ）の反応が同一容器内で行われる［１３］に記載のｃＤＮＡの合成方法。
［１９］  少なくとも、以下の試薬を含むことを特徴とする［１］〜［１２］のいずれか一項に記載のＲＮＡの処理方法を実施するためのキット。
耐熱性逆転写酵素、
デオキシリボヌクレオチド類、
緩衝成分。
【発明の効果】
【００１３】
本発明によって、試料からウイルスＲＮＡの単離や精製を行う工程を設けることなく、試料を逆転写反応液に添加するだけで、試料中のＲＮＡウイルスのＲＮＡからｃＤＮＡを合成することが出来る。また、核酸増幅反応に先立ち核酸を分離精製するための時間・コストを削減することができる。さらに核酸を分離精製する際に生じる可能性のあるリスク、すなわち試料ロスやクロスコンタミネーションの危険性を低減することができる。特に糞便に代表される生体由来物質を試料とする多数の検体を処理するような検査において、その効果は顕著となる。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
以下、本発明の実施形態を示しつつ、本発明についてさらに詳説する。
【００１５】
（１）本発明のＲＮＡウイルスの処理方法
本発明の処理方法を適用できる試料としては、ＲＮＡウイルスを含有する可能性のある試料であれば特に限定はないが、例えば、生体から採取された検体（例えば組織、組織片、血液等）、生体排出検体、環境中から採取された検体に由来する試料が挙げられる。前記生体排出検体には糞便、尿、吐瀉物、鼻汁、鼻汁塗沫、唾液、唾液塗沫等が含まれ、これらはそのまま試料として本発明に適用することができる。さらにこれらの生体排出検体を水（滅菌水等）、生理食塩水、緩衝液、有機溶媒、液体培地、またはゲル培地（例えばキャリブレア培地）に懸濁したもの、前記の懸濁液から調製した上清など、何らかの処理をしたものも試料として本発明の方法に適用することができる。前記生体としては、ヒト、ペット、家畜、野性動物、昆虫、その他あらゆる動物が挙げられる。腸内細菌、腸管上皮細胞、食物由来物質などから構成されている糞便は、本発明の検体の代表的なものである。また、生体排出検体は環境から採取されたものであってもよい。
【００１６】
前記環境には、検出することが望まれるＲＮＡウイルスが存在する可能性がある、ありとあらゆる場所が含まれるが、自然環境に限定されるものではない。特に製造施設や調理施設のような施設自体、施設中の水、施設からの排水や、当該施設の備品等、ＲＮＡウイルスが存在しうるあらゆる物の表面が例示される。これら環境からの検体の採取には、拭き取り操作や、その他の公知方法などが使用される。通常、採取物を適切な溶液、例えば水（滅菌水等）、生理食塩水、緩衝液等に懸濁したものや、懸濁液より遠心分離等で回収した上清と沈殿物等いずれもが本発明の方法に適用される。
【００１７】
本発明の検出方法で検出対象とするＲＮＡウイルスとしては、いずれであってもよいが、例えば非エンベロープ型ＲＮＡウイルスが挙げられる。非エンベロープ型ＲＮＡウイルスとしては、例えばカリシウイルス科に属するウイルス（ノロウイルス（ＮｏＶ）、サポウイルス（ＳＶ）、ネコカリシウイルス（ＦＣＶ）等）やレオウイルス科に属するウイルス（ロタウイルス（Ｒｏｔａ））、ピコルナウイルス科に属するウイルス（エコーウイルス（Ｅ）、エンテロウイルス（ＥＶ））等が挙げられる。なお、上記に挙げたネコカリシウイルス（ＦＣＶ）は、容易に培養できないヒトノロウイルス（ＨｕＮｏＶ）に代わって、消毒剤や洗浄剤の評価等に広く用いられている代替ウイルスである。
【００１８】
本発明の一つの態様としては、ＲＮＡウイルスを含む可能性のある試料と耐熱性逆転写酵素を混合し、逆転写反応液を調製する工程が含まれる。ここで、前記の逆転写反応液とは、耐熱性逆転写酵素ならびに逆転写反応に必要なその他の要素を含む溶液を言う。
【００１９】
本発明の方法に使用される耐熱性逆転写酵素とは、本発明を特に限定するものではないが、４０℃以上で逆転写活性を示す酵素、好ましくは５０℃以上で逆転写活性を示す酵素、より好ましくは６０℃以上で逆転写活性を示す酵素、さらに好ましくは６５℃以上で逆転写活性を示す酵素を言う。例えば、ＭＭＬＶ、ＨＩＶ、ＲＡＶ２、ＥＩＡＶ等のウイルス由来逆転写酵素の耐熱性変異体が例示される。
【００２０】
本発明を特に限定するものではないが、本発明に好適な耐熱性逆転写酵素としては、好熱菌や超耐熱性菌由来の逆転写酵素や逆転写活性を有しＤＮＡ依存性のＤＮＡ合成活性を有するＤＮＡポリメラーゼが好適に使用できる。特に限定されないが、例えばサーマス  サーモフィルス（Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、サーマス  アクアティカス（Ｔ．  ａｑｕａｔｉｃｕｓ）、バシルス  ステアロサーモフィラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、バシルス  カルドテナクス（Ｂ．  ｃａｌｄｏｔｅｎａｘ）、サーマス  スピーシーズＺ０５（Ｔ．  ｓｐｅｃｉｅｓ  Ｚ０５）、等のＤＮＡポリメラーゼ、ジオバシルス  ステアロサーモフィラス（Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）のｔｒｔ遺伝子産物［Ａｐｐｌ．  Ｅｎｖ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．第７０巻、ｐ７１４０−７１４７（２００４）］あるいはそれらの変異体が例示される。
【００２１】
また、逆転写反応に必要な要素としては、検出すべきＲＮＡに相補的な配列を有するｃＤＮＡ合成用プライマー、塩類、デオキシリボヌクレオチド類、及び緩衝成分が挙げられる。これらの要素を耐熱性逆転写酵素とともに試料に添加、混合し、逆転写反応液が調製される。上記の塩類にはＭｇＣｌ２やＫＣｌなどが用いられるが、適宜、他の塩類を追加するか、あるいは他の塩類に変更しても良い。前記の緩衝成分は、反応溶液の水素イオン濃度（ｐＨ）の変動を和らげる作用を持つ化合物又は混合物をいう。一般に弱酸とその塩、あるいは弱塩基とその塩の混合溶液は強い緩衝作用を持つので、適切なｐＨを維持する目的で広く用いられている。本発明には生化学分野で公知の、各種の反応緩衝剤を使用することができ、逆転写反応や核酸増幅反応が実施される通常の範囲に設定されるのが適当である。
【００２２】
該逆転写反応液はさらに界面活性剤を含んでいてもよく、界面活性剤を添加するとさらに好適な結果が得られる。当該界面活性剤には特に限定はなく、非イオン性、陰イオン性、陽イオン性あるいは両イオン性の界面活性剤を単独または組み合わせて使用してもよい。前記界面活性剤としては、特に限定はないが、Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）    Ｘ−１００（Ｐｏｌｙｏｘｙｅｔｈｙｌｅｎｅ（１０）    ｏｃｔｙｌｐｈｅｎｙｌ    ｅｔｈｅｒ）、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）    ２０（Ｐｏｌｙｏｘｙｅｔｈｙｌｅｎｅ    Ｓｏｒｂｉｔａｎ    Ｍｏｎｏｌａｕｒａｔｅ）、及びＮｏｎｉｄｅｔ（登録商標）    Ｐ−４０（Ｏｃｔｙｌｐｈｅｎｙｌ−ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ    ｇｌｙｃｏｌ）等の非イオン性界面活性剤、ｐｏｌｙ（ｅｔｈｙｌｅｎｅ    ｇｌｙｃｏｌ）４−ｎｏｎｙｌｐｈｅｎｙｌ    ３−ｓｕｌｆｏｐｒｏｐｙｌ    ｅｔｈｅｒ（ＰＮＳＥ）等の陰イオン性界面活性剤、塩化ジステアリルジメチルアンモニウム等の陽イオン性界面活性剤、及びコカミドプロピルベタイン等の両性界面活性剤が例示される、そのうちＴｒｉｔｏｎ（登録商標）    Ｘ−１００、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）    ２０、Ｎｏｎｉｄｅｔ（登録商標）    Ｐ−４０、及びｐｏｌｙ（ｅｔｈｙｌｅｎｅ    ｇｌｙｃｏｌ）４−ｎｏｎｙｌｐｈｅｎｙｌ    ３−ｓｕｌｆｏｐｒｏｐｙｌ    ｅｔｈｅｒが好適に例示される。界面活性剤は、細胞膜を分解するためあるいは細胞壁やカプシドタンパク質構造を軟弱化するため、本処理方法は細胞や細菌のＲＮＡ溶出にも好適に使用できると考えられる。さらに反応性改善などを目的として逆転写反応液や核酸増幅反応液に添加される公知の物質を包含していても良い。反応液に添加する物質としては、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）のようなタンパク質、ベタイン、ポリアニオン性の高分子物質等が例示されるが、これらに限定されるものではない。
【００２３】
また別の態様として、該逆転写反応液はさらに、標的核酸増幅に必要な試薬を含んでいてもよい。後述するように、ＲＮＡウイルスの処理、逆転写反応および標的核酸増幅までをワンステップで実施する場合は、このような逆転写反応液を用いる。標的核酸増幅に必要な試薬として、例えば、限定するものではないが、核酸増幅用プライマー対、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ、デオキシリボヌクレオチド類（ｄＮＴＰ）等が挙げられる。核酸増幅用プライマー対の一方はｃＤＮＡ合成用プライマーと共通であってもよい。また、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼは、耐熱性の逆転写酵素活性を有するＤＮＡポリメラーゼであってもよい。本態様における逆転写反応液の組成は、ＲＮＡウイルスの処理、逆転写反応および標的核酸増幅のそれぞれが適切に行われるように調整されることは言うまでもない。
【００２４】
本発明のＲＮＡウイルスの処理方法においては、上記のようにＲＮＡウイルスを含有する可能性のある試料と耐熱性逆転写酵素を含む逆転写反応液を高温で反応させる。当該反応における保持温度は、６５℃以上、１００℃未満であり、好ましくは７０℃以上、１００℃未満、次に好ましいのは７５℃から９９℃、より好ましくは８０℃から９９℃、さらに好ましくは８５℃から９９℃、特に好ましくは９０℃から９９℃の範囲である。好適な保持時間は３０分以下であり、好ましくは１５分以下、より好ましくは５分以下、さらに好ましくは３分以下、特に好ましくは０秒〜１分である。なお、保持時間０秒とは、意図した温度に到達すると同時に加熱を中止することを言う。この処理により、試料にＲＮＡウイルスが含まれる場合、該ＲＮＡウイルスからＲＮＡが溶出されると考えられる。溶出されたＲＮＡは即時逆転写酵素と接触し、逆転写反応が開始されることからＲＮＡの分解は最小限に止められると考えられる。なお、該保持温度への昇温は、逆転写反応液の調製後すぐに実施すればよく、逆転写反応液調製後に保温工程などの他の工程を必要としない。なお、真核生物細胞や細菌などのＲＮＡ溶出にも、このような耐熱性逆転写酵素を含む逆転写反応液中での加熱処理は、好適に使用できると考えられる。特に細胞壁を持たない真核細胞のＲＮＡ溶出には、より好適に使用できると考えられる。
【００２５】
（２）本発明のｃＤＮＡの合成方法
本発明の方法において、上記（１）のＲＮＡウイルスの処理方法を行った反応液はそのまま、試料中のＲＮＡウイルスが有しているＲＮＡに相補的なＤＮＡを合成するための逆転写反応に供することができる。前記の逆転写反応における反応温度は、耐熱性逆転写酵素が活性を示す温度であれば特に限定はない。なお、ＲＮＡの二次構造を破壊することを考慮すると、３５℃以上、１００℃未満であり、好ましくは４０℃から９０℃、より好ましくは４５℃から８０℃、さらに好ましくは５０℃から７０℃である。例えば、Ｔｔｈ  ＤＮＡポリメラーゼの逆転写活性を利用する場合は、至適温度の６０℃を好適に利用できる。また、別態様としては、７０℃〜８９℃まで反応溶液を昇温させる時間を利用して当該逆転写反応を行ってもよい。なお、ｃＤＮＡ合成用プライマーがアニーリング可能な温度範囲で、反応温度を出来るだけ高温に維持すれば、ｃＤＮＡ合成工程に掛かる時間をより短縮することが出来る。逆転写反応の時間は、合成されるｃＤＮＡの鎖長等を考慮して適宜設定することができる。
【００２６】
（３）本発明の標的核酸増幅方法
本発明の方法においては、上記（２）の逆転写反応に続いてｃＤＮＡの増幅反応を組み合わせることができる。核酸増幅法は公知の方法であれば特に限定はなく、例えば、Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  （ＰＣＲ）、Ｓｔｒａｎｄ  Ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  （ＳＤＡ）、Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  Ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  （ＭＤＡ）、Ｒｏｌｌｉｎｇ−Ｃｉｒｃｌｅ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  （ＲＣＡ）、Ｌｏｏｐ−Ｍｅｄｉａｔｅｄ  Ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  （ＬＡＭＰ）、Ｓｍａｒｔ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｐｒｏｃｅｓｓ  （ＳｍａｒｔＡｍｐ）、Ｈｅｌｉｃａｓｅ−Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  （ＨＤＡ）、Ｌｉｇａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  （ＬＣＲ）などが例示される。これらの核酸増幅法のうち、例えばＰＣＲと組み合わせる場合においては、同一容器内、同一反応溶液中でＲＮＡウイルスからのＲＮＡ溶出処理、逆転写反応ならびに標的核酸の増幅反応を連続して行う、いわゆる１ステップのＲＴ−ＰＣＲが実施できる。前記１ステップのＲＴ−ＰＣＲの場合、ＲＮＡウイルスを含有する可能性のある試料を含むＲＴ−ＰＣＲ反応液が調製された後、閉鎖されたままの同一容器中で、高温逆転写反応ならびに核酸増幅反応が連続して実施される。このＲＴ−ＰＣＲ反応液は耐熱性逆転写酵素と耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを含むものが使用される。耐熱性ＤＮＡポリメラーゼとしては、ＰＣＲに使用可能な各種のポリメラーゼ、例えばポルＩ型ポリメラーゼ、α型ポリメラーゼやそれらの混合物が例示される。本発明の一つの態様として、前記ＲＴ−ＰＣＲ反応液は耐熱性の逆転写酵素活性を有する耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを使用することができる。逆転写酵素活性とＤＮＡ依存性ＤＮＡ合成活性を併せ持つ酵素としてはポルＩ型の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼが好ましく、例えばサーマス  サーモフィルス（Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、サーマス  アクアティカス（Ｔ．  ａｑｕａｔｉｃｕｓ）、バシルス  ステアロサーモフィラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、バシルス  カルドテナクス（Ｂ．  ｃａｌｄｏｔｅｎａｘ）、サーマス  スピーシーズＺ０５（Ｔ．  ｓｐｅｃｉｅｓ  Ｚ０５）、等のＤＮＡポリメラーゼ、あるいはそれらの変異体を挙げることができる。
【００２７】
本発明の標的核酸増幅方法に使用されるＲＴ−ＰＣＲ反応液としては、ｃＤＮＡの標的領域を増幅するためのプライマー対をさらに含んでいてもよい。また、当該標的核酸の増幅に使用されるプライマーの一方が、前工程の逆転写反応おける逆転写反応用プライマーと共用であってもよい。さらに、当該標的核酸の領域が複数あり、そのために複数種のプライマー対を含んでいてもよい。
【００２８】
なお、前記のＲＴ−ＰＣＲ反応溶液は、反応性改善などを目的として逆転写反応液や核酸増幅反応液に添加される公知の物質を包含していても良い。反応液に添加する物質としては、上記（１）で記載したウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）のようなタンパク質、各種界面活性剤、ベタイン、酸性高分子等が例示されるが、これらに限定されるものではない。また本発明の方法においてｄＮＴＰは通常、ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰの４種が用いられるが、ＤＮＡ増幅産物が他の核酸増幅反応の鋳型となる汚染を防止する目的でさらにｄＵＴＰを反応液に添加しても良いし、ｄＴＴＰをｄＵＴＰに置き換えてもよい。この反応で得られた核酸増幅物には、ｄＵＴＰが取り込まれることになり、ウラシル含有ＤＮＡの分解活性を有するＵｒａｃｉｌ−Ｎ−ｇｌｙｃｏｓｙｒａｓｅ（ＵＮＧ）を次の核酸増幅反応前に作用させることで、前記核酸増幅物を分解することができる。こうして、先に実施された反応で得られた増幅物が後の反応に混入しておこる汚染を防止することができる。
【００２９】
上記の標的核酸の増幅方法において、得られた増幅ＤＮＡ産物をさらに、電気泳動法、融解曲線法、各種プローブ法（Ｑプローブ、スコーピオンプローブ、ハイブリプローブなど）で検出、識別することができる。増幅産物のコンタミネーション防止の観点から特にリアルタイム検出方法が好適であり、特に限定はされないが温度昇降機能と蛍光測定機能を備えた機器であれば、ＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブ、Ｃｙｃｌｅａｖｅ（商標）プローブなどの蛍光標識と消光標識を有するプローブ、あるいはＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｒｅｅｎ  Ｉ、ＳＹＴＯ−６０、ＳＹＴＯ−６２、ＰＯＰＯ−３、ＴＯＴＯ−３、ＢＯＢＯ−３、ＴＯ−ＰＲＯ−３、ＹＯ−ＰＲＯ−１、ＳＹＴＯＸ  ＯｒａｎｇｅＳＹＢＲ（登録商標）、ＴＢ  Ｇｒｅｅｎ（登録商標）等のインターカレーティング色素などを用いることにより、反応進行中に増幅ＤＮＡ産物を検出識別することができる。本発明の標的核酸の増幅方法に使用されるＲＴ−ＰＣＲ反応液に前記の標的核酸検出用の要素を添加しておくことにより、本発明の効果を損なうことなく、簡便に標的核酸由来の増幅産物を検出することができる。
【００３０】
（４）本発明のキット
本発明は、前記の本発明の標的核酸の増幅方法に使用されるキットを提供する。本発明のキットは、試料を含む逆転写反応液の加熱と、耐熱性逆転写酵素によるｃＤＮＡ合成と、得られたｃＤＮＡ由来の核酸の増幅とを連続して実施するための反応液を調製するために必要な成分をコンポーネントとして含有する。さらに、標的核酸検出用として、リアルタイム検出用のプローブやインタカレーターを含んでいてもよい。特に限定はされないが、本発明のキットは、例えば、緩衝成分、耐熱性逆転写酵素、ｄＮＴＰやｄＵＴＰなどのデオキシリボヌクレオチド類を含む。さらに界面活性剤、塩類、逆転写反応用プライマー等を含んでもよい。また別態様としては例えばｏｎｅ−ｓｔｅｐ緩衝成分、耐熱性逆転写酵素、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ、界面活性剤、塩類、ｄＮＴＰやｄＵＴＰなどのデオキシリボヌクレオチド類を含むプレミックス反応液を含むキットが例示される。さらに好適な態様としては、前記の各成分に加えて逆転写反応用プライマー、少なくとも１種類の標的核酸増幅用プライマー対を含有し、試料を添加するのみでＲＴ−ＰＣＲ反応液の調製が可能なオールインワン組成物が例示される。本発明のキットは、耐熱性逆転写酵素と耐熱性ＤＮＡポリメラーゼの組合せに代えて、逆転写酵素活性とＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する耐熱性酵素を含有してもよい。
【実施例】
【００３１】
以下実施例をもって本発明を具体的に説明する。もっとも、本発明は下記実施例に限定されるものではない。【００３２】
参考例１．  ノロウイルスモデル系での検討
ノロウイルスＮＡＴｔｒｏｌ  Ｎｏｒｏｖｉｒｕｓ  ＧＩ  Ｐｏｓｉｔｉｖｅ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  （６  ｘ  ０．１２５ｍＬ）（ＺｅｐｔｏＭｅｔｒｉｘ社製）をモデルとして以下の熱処理検討に使用した。即ち、前記ノロウイルスを生理食塩水で１０倍希釈し、調製したウイルス溶液を６５℃、７０℃、７５℃、８０℃、８５℃、９０℃の各温度で３分間処理した。当該加熱処理液をＲＮＡサンプルとした。ＲＴ−ＰＣＲは、ＲＲ２９６Ａ  ＴａＫａＲａノロウイルスＧＩ／ＧＩＩ検出キット（高速検出用）（タカラバイオ社製）のキットを使用し説明書の記載に従い、最終容量２５μＬ反応液で行った。ＲＴ−ＰＣＲ条件は、４２℃  ５ｍｉｎ、９４℃  ３０ｓｅｃ処理後、９４℃  ５ｓｅｃ−５６℃  ３０ｓｅｃを１サイクルとする５サイクル、９０℃  ５ｓｅｃ−５６℃  ３０ｓｅｃを１サイクルとする４０サイクル反応で行った。なお、核酸増幅装置は、ＴＰ９００  ＴｈｅｒｍａｌＣｙｃｌｅｒ  Ｄｉｃｅ（登録商標）ＲｅａｌＴｉｍｅＳｙｓｔｅｍＩＩ（タカラバイオ社製）を用いた。その結果を表１に示す。【００３３】
【表１】
2019212023.tif 000002
【００３４】
表１に示すように、いずれの条件でも増幅物は検出され、特に７０℃以上の加熱条件でＲＴ−ＰＣＲに十分なＲＮＡが得られることを確認した。したがって、逆転写酵素の耐熱性が７０℃以上であれば、逆転写反応液中でＲＮＡウイルスを破壊し、反応容器の開封を必要としない逆転写反応を好適に実施できることが示唆された。【００３５】
参考例２．  糞便ｓａｍｐｌｅでの検討
従来法でノロウイルスＧＩが検出されたヒト糞便について検討した。即ち、前記糞便をＰＢＳに約１０％（ｗ／ｖ）になるよう懸濁し、遠心によって得られた上清を調製した。当該ウイルス溶液を参考例１記載の方法でＲＴ−ＰＣＲを行った。その結果を表２に示す。【００３６】
【表２】
2019212023.tif 000003
【００３７】
表２に示すように、いずれの条件でも増幅物は検出され、特に７０℃以上の加熱条件でＲＴ−ＰＣＲに十分なＲＮＡが得られることを確認した。したがって、参考例１と同様に、逆転写酵素の耐熱性が７０℃以上であれば、逆転写反応液中でＲＮＡウイルスを破壊し、反応容器の開封を必要としない逆転写反応を好適に実施できることが示唆された。【００３８】
実施例１．  Ｏｎｅ−Ｔｕｂｅ反応系での検討
参考例１で調製したウイルス溶液を用いて、逆転写反応及びＤＮＡ増幅反応に必要な試薬をすべて含む溶液中での目的遺伝子増幅について検討した。即ち、反応液容量の１／２５容量の前記ウイルス溶液、Ｒ５１０Ａ  ＴａＫａＲａ  Ｔｔｈ（宝日医生物技術社製）に添付の５×ＲＴ−ＰＣＲ緩衝液、最終濃度２．５ｍＭの酢酸マンガン、最終濃度が各０．０００４ｍＭの配列表の配列番号１及び２記載の塩基配列を有するノロウイルスＧ１遺伝子増幅用プライマー対、最終濃度０．０００２ｍＭの配列表の配列番号３及び４記載の塩基配列を有するＧ１遺伝子検出用プローブ、終濃度０．３ｍＭのｄＮＴＰ、５ＵのＴｔｈ  ＤＮＡポリメラーゼ（宝日医生物技術社製）、２．５ＵのＴａｑ抗体（タカラバイオ社製）並びに各種濃度の界面活性剤を含む全量２５μＬの反応液を調製した。前記界面活性剤は、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）  ２０、Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標表）  Ｘ−１００、Ｎｏｎｉｄｅｔ（登録商標）  Ｐ−４０、ｐｏｌｙ（ｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｇｌｙｃｏｌ）４−ｎｏｎｙｌｐｈｅｎｙｌ  ３−ｓｕｌｆｏｐｒｏｐｙｌ  ｅｔｈｅｒから選択した。対照として界面活性剤なしのものも調製した。また、各種界面活性剤の最終濃度は、０．０２、０．２、２、４、６、８、１０％（Ｖ／Ｖ）を設定した。ＲＴ−ＰＣＲ条件は、９０℃  ３ｍｉｎ、５８℃  ３０ｍｉｎ、９５℃  ３０ｓｅｃの連続温度処理後、反応容器の蓋を開けることなく、９５℃  ５ｓｅｃ−５６℃  ３０ｓｅｃを１サイクルとする５サイクル反応、さらに９０℃  ５ｓｅｃ−５６℃  ３０ｓｅｃを１サイクルとする４０サイクル反応を行った。なお、核酸増幅装置は、参考例１と同じ装置を用いた。その結果、界面活性剤を使用しない場合であっても標的核酸は増幅したが、いずれの界面活性剤を使用した場合においても、界面活性剤を使用しない場合に比較してＣｔ値が小さくなることが確認できた。また界面活性剤の種類に関わらず、最終濃度が２％（Ｖ／Ｖ）以上でＣｔ値が４以上小さくなることが確認できた。このことは、本発明のＲＮＡウイルスの処理方法を用いることにより、Ｏｎｅ−Ｔｕｂｅ内にある逆転写反応及びＤＮＡ増幅反応に必要な試薬をすべて含む溶液にＲＮＡウイルスを含む懸濁液上清を添加するだけで、逆転写反応さらにＤＮＡ増幅反応を連続して同一容器内で行うことが可能であること、また本発明の方法に界面活性剤を組み合わせることにより最大１６倍感度が上昇することが確認できた。【００３９】
実施例２．  糞便検体を用いたＯｎｅ−Ｔｕｂｅ反応系の検討
逆転写反応及びＤＮＡ増幅反応に必要な試薬をすべて含む溶液中で実検体のノロウイルス検出を検討した。即ち、インフォームドコンセントの得られた被験者より採取された  ノロウイルス陽性の糞便検体を約１０％（ｗ／ｖ）となるようＰＢＳに懸濁した後、１５，０００ｒｐｍにて５分間遠心処理を行った。こうして得られた上清１μＬを以下の反応に使用した。【００４０】
本実施例においては、市販のＴｔｈ  ＤＮＡポリメラーゼ（宝日医生物技術社製）及び日本特許第３８４４９７５号公報の記載のＴｔｈ  ＤＮＡポリメラーゼ変異体を使用した。当該変異体は、逆転写酵素活性の効率が高いと報告されているものであり、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｇｅｎｂａｎｋ  Ａｃｃ．Ｎｏ．ＢＡＡ０６７７５．１）記載のアミノ酸配列の６８１位が、Ｇｅｎｂａｎｋ  Ａｃｃ．  Ｎｏ．ＷＰ＿０１１２２８４０５記載のアミノ酸配列に基づくＴｔｈ  ＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸配列では６８３位に相当することから、前記アミノ酸配列の６８３位のグルタミン酸をリシンに置換変異したＴｔｈ  ＤＮＡポリメラーゼ変異体（Ｅ６８３Ｋ）を調製した。常法に従い、当該アミノ酸配列中の特定の部位に変異を導入した配列の人工遺伝子を化学的に合成した。得られた人工遺伝子は、Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ（登録商標）ＨＤ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔ（タカラバイオＵＳＡ社製）を用いて、プラスミドｐＥＴ６ｘＨＮ−Ｎ（タカラバイオＵＳＡ社製）に導入した。【００４１】
次に、当該プラスミドで大腸菌を形質転換し、常法に従い、種培養、本培養を行った。培養終了後菌体を採取し、菌体破砕後、粗酵素液を調製した。得られた粗酵素液をＴｔｈ  ＤＮＡポリメラーゼ変異体粗精製溶液として、以下の試験に使用した。【００４２】
使用したプライマー対は、厚生労働省  医薬食品局  食品安全部  監視安全課より通知された「ノロウイルスの検出法について」（平成１５年１１月５日付け食安監発第１１０５００１号別添  最終改正：平成２５年１０月２２日付け食安監発１０２２第１号）（以下「公定法」と記載する）に記載されたものと同じ塩基配列のＧＩ検出用およびＧＩＩ検出用プライマーである。【００４３】
前記糞便上清液１μＬ、５×ＲＴ−ＰＣＲ緩衝液（終濃度５０ｍＭ  トリシン緩衝液（ｐＨ８．１５）、終濃度５０ｍＭ  酢酸カリウム、終濃度８％グリセロール、終濃度１％のＤＭＳＯ、終濃度２．５ｍＭ  酢酸マンガン、終濃度０．１％  ＢＳＡ）、公定法で定められた終濃度０．２μＭのＧＩプライマー対あるいはＧＩＩプライマー対、終濃度０．２μＭのＧＩ検出用プローブあるいはＧＩＩ検出用プローブ、終濃度０．３ｍＭのｄＮＴＰ、前述のＴｔｈ  ＤＮＡポリメラーゼあるいはＴｔｈ  ＤＮＡポリメラーゼ変異体５Ｕ、終濃度４％のｐｏｌｙ（ｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｇｌｙｃｏｌ）４−ｎｏｎｙｌｐｈｅｎｙｌ  ３−ｓｕｌｆｏｐｒｏｐｙｌ  ｅｔｈｅｒ並びに２．５ＵのＴａｑ抗体（タカラバイオ社製）を含む最終容量２５μＬの反応液を調製した。ＲＴ−ＰＣＲ条件は、Ｔｔｈ  ＤＮＡポリメラーゼの場合は、９０℃  ３分、５８℃  ５分あるいは３０分、９５℃  ３０秒間処理した後、９５℃  ５秒、５６℃  ３０秒を１サイクルとする５サイクル反応、連続して９０℃  ５秒、５６℃  ３０秒を１サイクルとする４０サイクル反応に設定した。Ｔｔｈ  ＤＮＡポリメラーゼ変異体の場合は、９０℃  ３分、５８℃  ５分、９５℃  ３０秒間処理した後、９５℃  ５秒、５６℃  ３０秒を１サイクルとする５サイクル反応、連続して９０℃  ５秒、５６℃  ３０秒を１サイクルとする４０サイクル反応に設定した。サーマルサイクラーは、ＴＰ９９０  ＴｈｅｒｍａｌＣｙｃｌｅｒ  Ｄｉｃｅ（登録商標）ＲｅａｌＴｉｍｅ  ＳｙｓｔｅｍＩＩＩ（タカラバイオ社製）を用いて、リアルタイムＰＣＲを行い、Ｃｔ値を測定した。【００４４】
上記検討の結果、糞便検体中のノロウイルスＧＩ並びにＧＩＩ検出について、Ｔｔｈ  ＤＮＡポリメラーゼは、逆転写反応が５８℃  ３０分の場合のみ検出することができた。一方、逆転写酵素活性の効率が高いと報告されているＴｔｈ  ＤＮＡポリメラーゼ変異体（Ｅ６８３Ｋ）は、逆転写反応が５８℃  ５分であっても検出できた。このことから、本発明のＲＮＡウイルスの処理方法は、糞便検体でも利用可能であること、さらに通常のＲＴ−ＰＣＲ法並びに逆転写反応時間の短いＲＴ−ＰＣＲ法のいずれにおいても利用可能であることが確認できた。【００４５】
実施例３．  低濃度の界面活性剤の効果についての確認
界面活性剤が溶液中に大量に存在すると、泡立ちのリスクが発生する場合がある。特に自動分注機器を使用した大量処理の場合には、分注誤差の可能性があるため、実施例１で確認した界面活性剤添加による効果についてさらに低濃度で効果が得られるかどうかを参考例１で調製したウイルス溶液を用いて追加検証した。Ｎｏｎｉｄｅｔ（登録商標）  Ｐ−４０を用いて検証を行った。実施例１と同様に、界面活性剤無しのものと、界面活性剤の終濃度が０．０２、０．２、０．４、０．６、０．８、１．０、１．２、１．４、１．６、１．８％（Ｖ／Ｖ）の反応液を調製した。界面活性剤の濃度以外のＰＣＲ反応組成は実施例１と同様である。ＲＴ−ＰＣＲ条件は、９０℃  ３分、５８℃  ３０分、９５℃  ３０秒の連続温度処理後、反応容器の蓋を開けることなく、９５℃  ５秒−５６℃  ３０秒を１サイクルとする５サイクル反応、さらに９０℃  ５秒−５６℃  ３０秒を１サイクルとする４０サイクル反応を行った。なお、核酸増幅装置は、実施例２で使用したものと同じ装置を用いて、リアルタイムＰＣＲを行い、Ｃｔ値を測定した。その結果を表３−１及び表３−２に示す。【００４６】
【表３−１】
2019212023.tif 000004
【００４７】
【表３−２】
2019212023.tif 000005
【００４８】
表３−１及び表３−２に示すように、いずれの濃度の界面活性剤を添加した場合においても、界面活性剤を使用しない場合に比較してＣｔ値が小さくなることが確認できた。また界面活性剤の終濃度が、０．２％（Ｖ／Ｖ）以上でＣＴ値が２．５以上小さくなることが確認できた。このことは、本発明において界面活性剤の添加量を減らすことで、泡立ちのリスクを抑え、自動分注機器などを利用した、検査システムのオートメーション化を行う際にも分注誤差の回避に役立つことが示された。【００４９】
実施例４．  本発明の効果の確認
本発明における高温逆転写反応の効果を確認するために、参考例１で調製したウイルス溶液と逆転写反応及びＤＮＡ増幅反応に必要な試薬をすべて含む溶液中での目的遺伝子増幅について検討した。即ち、前記ウイルス溶液１μＬ、Ｒ５１０Ａ  ＴａＫａＲａ  Ｔｔｈのコンポーネントに含まれる、５×Ｔｔｈ  ＲＴ−ＰＣＲ緩衝液（宝日医生物技術社製）、最終濃度２．５ｍＭの酢酸マンガン、終濃度０．３ｍＭのｄＮＴＰ、終濃度０．２Ｕ／μＬのｒＴｔｈ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＴＴＨ−３０１  ｒＴｔｈ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  東洋紡社製）、プライマーおよびプローブとして、ＲＲ２９８Ａ  ＴａＫａＲａノロウイルスＧＩ／ＧＩＩ検出キットＶｅｒ．３のコンポーネントに含まれるＮＶ  Ｐｒｉｍｅｒ／Ｐｒｏｂｅ  Ｍｉｘ７（タカラバイオ社製）を８μＬ添加し、最終容量２５μＬの反応液Ａを調製した。また、別に、前記ウイルス溶液１μＬ、Ｒ５１０Ａ  ＴａＫａＲａ  Ｔｔｈのコンポーネントに含まれる、５×Ｔｔｈ  ＲＴ−ＰＣＲ緩衝液（宝日医生物技術社製）、最終濃度２．５ｍＭの酢酸マンガン、終濃度０．３ｍＭのｄＮＴＰ、終濃度０．２Ｕ／μＬのｒＴｔｈ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＴＴＨ−３０１  ｒＴｔｈ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  東洋紡社製）、プライマーおよびプローブとして、ＲＲ２９８Ａ  ＴａＫａＲａノロウイルスＧＩ／ＧＩＩ検出キットＶｅｒ．３のコンポーネントに含まれるＮＶ  Ｐｒｉｍｅｒ／Ｐｒｏｂｅ  Ｍｉｘ７（タカラバイオ社製）８μＬと、さらに添加剤として、終濃度４％の１，３プロパンジオールと終濃度０．３ＭのＬ−カルニチンを含む最終容量２５μＬの反応液Ｂを調製した。さらに、対照として、前記反応液ＡおよびＢにおいて前記ウイルス溶液の代わりに、ノロウイルス合成ＲＮＡ溶液を添加した反応液ＣおよびＤを調製した。該ノロウイルス合成ＲＮＡ溶液は、ＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃｓTMＨｅｌｉｘ  ＥｌｉｔｅTMＮｏｒｏｖｉｒｕｓ  ＧＩＩ．４合成ＲＮＡ（Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃｓ社製）凍結乾燥品に付属しているＨ２Ｏで溶解して作成した１０×８乗コピーのストック溶液をさらにＨ２Ｏで１０倍希釈した１０×７乗コピーのＲＮＡ溶液であった。なお、それぞれの条件にウイルス溶液及びノロウイルス合成ＲＮＡ溶液はＮ＝３で調製した。【００５０】
反応液Ａ〜Ｄを高温加熱工程なしの通常のＲＴ−ＰＣＲを行った。また別に、反応液Ａを高温逆転写後、ＰＣＲを行った。ＲＴ−ＰＣＲ条件は、高温逆転写反応の場合、９０℃  ３分、５０℃で３０分の逆転写後、９５℃  ３０秒の熱変性、９５℃  ５秒、５６℃  ６０秒を１サイクルとする５サイクル反応、連続して９０℃  ５秒、５６℃  ６０秒を１サイクルとする４０サイクル反応に設定した。通常のＲＴ−ＰＣＲの場合には、高温逆転写反応の９０℃  ３分の工程を省略し、５０℃で３０分の逆転写後、前記と同じＰＣＲ条件で実施した。【００５１】
核酸増幅装置は、実施例２で使用したものと同じ装置を用いて、リアルタイムＰＣＲを行い、Ｃｔ値を測定した。その結果を表４に示す。【００５２】
【表４】
2019212023.tif 000006
【００５３】
表４に示すように、ＲＮＡウイルスを含む試料を前処理（加熱）なしで高温逆転写した場合、増幅物は検出された。一方、ＲＮＡウイルスを含む試料を前処理（加熱）なしで通常の逆転写反応を行った場合は、添加剤を加えても増幅物は検出されなかった。一方、ウイルス溶液の代わりに合成ＲＮＡを含む反応液ＣおよびＤを用いた前処理（加熱）なしで通常の逆転写反応を行った場合で増幅物が検出された。即ち、ＲＮＡウイルスを含む試料を高温保持しない場合は、ウイルスを検出できないと結論付けられた。以上の結果から、本発明は、ＲＴ−ＰＣＲ反応液中で試料を高温保持することにより、ＲＮＡウイルスのカプシドから高効率的でＲＮＡを溶出させることが可能であり、反応容器の開封を必要としない逆転写反応を好適に実施出来ることが明らかとなった。
【産業上の利用可能性】
【００５４】
本発明は、食品衛生検査、環境検査、臨床診断等に用いられる。
【配列表フリーテキスト】
【００５５】
ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：１  ；  ＰＣＲ  ｆｏｒｗａｒｄ  Ｐｒｉｍｅｒ  ＣＯＧ１Ｆ．
ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：２  ；  ＰＣＲ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｐｒｉｍｅｒ  ＣＯＧ１Ｒ．
ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：３  ；  Ｐｒｏｂｅ  ＲＩＮＧ１−ＴＰ（ａ）．  ５’−ｅｎｄ  ｉｓ  ｌａｂｅｌｅｄ  Ｃｙ５  ａｎｄ  ３’−ｅｎｄ  ｉｓ  ｌａｂｅｌｅｄ  ＢＨＱ３．
ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：４  ；  Ｐｒｏｂｅ  ＲＩＮＧ１−ＴＰ（ｂ）．  ５’−ｅｎｄ  ｉｓ  ｌａｂｅｌｅｄ  Ｃｙ５  ａｎｄ  ３’−ｅｎｄ  ｉｓ  ｌａｂｅｌｅｄ  ＢＨＱ３．
【配列表】
2019212023000001.app
【国際調査報告】
2019212023.tif 000007
2019212023.tif 000008
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