(57)【要約】  メソセリンを標的とした免疫担当細胞を提供することを目的とする。  ヒトメソセリン（Ｈｕｍａｎ  Ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎ）を特異的に認識する細胞表面分子、インターロイキン７（ＩＬ−７）、及びケモカイン（Ｃ−Ｃ  モチーフ）リガンド１９（ＣＣＬ１９）を発現する免疫担当細胞を作製する。ヒトメソセリンを特異的に認識する細胞表面分子が一本鎖抗体、細胞膜貫通領域、及び免疫担当細胞の活性化を誘導するシグナル伝達領域を備えたキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）であることや、重鎖可変領域と軽鎖可変領域が２〜３０個のアミノ酸配列からなるペプチドリンカーを介して結合していることが好ましい。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトメソセリン（Ｈｕｍａｎ  Ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎ）を特異的に認識する細胞表面分子、インターロイキン７（ＩＬ−７）、及びケモカイン（Ｃ−Ｃ  モチーフ）リガンド１９（ＣＣＬ１９）を発現する免疫担当細胞。
【請求項２】
生体から分離された免疫担当細胞であることを特徴とする請求項１記載の免疫担当細胞。
【請求項３】
外来のヒトメソセリンを特異的に認識する細胞表面分子をコードする核酸、外来のＩＬ−７をコードする核酸、及び外来のＣＣＬ１９をコードする核酸を含有することを特徴とする請求項１又は２記載の免疫担当細胞。
【請求項４】
外来のＩＬ−７をコードする核酸、及び外来のＣＣＬ１９をコードする核酸が、外来のヒトＩＬ−７をコードする核酸、及び外来のヒトＣＣＬ１９をコードする核酸であることを特徴とする請求項３記載の免疫担当細胞。
【請求項５】
外来のヒトメソセリンを特異的に認識する細胞表面分子をコードする核酸、外来のＩＬ−７をコードする核酸、及び外来のＣＣＬ１９をコードする核酸がゲノムに組み込まれていることを特徴とする請求項３又は４記載の免疫担当細胞。
【請求項６】
ヒトメソセリンを特異的に認識する細胞表面分子が、一本鎖抗体、細胞膜貫通領域、及び免疫担当細胞の活性化を誘導するシグナル伝達領域を備えたキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）であることを特徴とする請求項１〜５のいずれか記載の免疫担当細胞。
【請求項７】
ＣＡＲにおける一本鎖抗体が、以下のいずれかである、請求項６記載の免疫担当細胞。
（１−１）配列番号１３に示されるアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ１、配列番号１４に示されるアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ２、及び配列番号１５に示されるアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域と、配列番号１６に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ１、配列番号１７に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号１８に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域を含む一本鎖抗体；
（２−１）配列番号１３に示されるアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ１、配列番号１４に示されるアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ２、及び配列番号１５に示されるアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域と、配列番号１９に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ１、配列番号１７に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号１８に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域を含む一本鎖抗体；
（３−１）配列番号２０に示されるアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ１、配列番号２１に示されるアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ２、及び配列番号２２に示されるアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域と、配列番号２３に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ１、配列番号２４に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号２５に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域を含む一本鎖抗体；
【請求項８】
ＣＡＲにおける一本鎖抗体が、以下のいずれかである、請求項６又は７記載の免疫担当細胞。
（１−２）配列番号１に示されるアミノ酸配列と８５％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなる重鎖可変領域と、配列番号２に示されるアミノ酸配列と８５％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域とを含む一本鎖抗体；
（２−２）配列番号３に示されるアミノ酸配列と８５％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなる重鎖可変領域と、配列番号４に示されるアミノ酸配列と８５％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域とを含む一本鎖抗体；
（３−２）配列番号５に示されるアミノ酸配列と８５％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなる重鎖可変領域と、配列番号６に示されるアミノ酸配列と８５％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域とを含む一本鎖抗体；
（４−２）配列番号１に示されるアミノ酸配列と８５％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなる重鎖可変領域と、配列番号４に示されるアミノ酸配列と８５％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域とを含む一本鎖抗体；
（５−２）配列番号３に示されるアミノ酸配列と８５％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなる重鎖可変領域と、配列番号２に示されるアミノ酸配列と８５％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域とを含む一本鎖抗体；
【請求項９】
ＣＡＲにおける一本鎖抗体が、以下のいずれかである、請求項６〜８のいずれか記載の免疫担当細胞。
（１−３）配列番号１に示されるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域と、配列番号２に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域とを含む一本鎖抗体；
（２−３）配列番号３に示されるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域と、配列番号４に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域とを含む一本鎖抗体；
（３−３）配列番号５に示されるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域と、配列番号６に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域とを含む一本鎖抗体；
（４−３）配列番号１に示されるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域と、配列番号４に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域とを含む一本鎖抗体；
（５−３）配列番号３に示されるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域と、配列番号２に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域とを含む一本鎖抗体；
【請求項１０】
ＣＡＲにおける細胞膜貫通領域が、配列番号７に示すアミノ酸配列と８５％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことを特徴とする請求項６〜９のいずれか記載の免疫担当細胞。
【請求項１１】
ＣＡＲにおける免疫担当細胞の活性化を誘導するシグナル伝達領域が、配列番号８、９及び１０に示すアミノ酸配列を含むことを特徴とする請求項６〜１０のいずれか記載の免疫担当細胞。
【請求項１２】
重鎖可変領域と軽鎖可変領域が２〜３０個のアミノ酸配列からなるペプチドリンカーを介して結合していることを特徴とする、請求項７〜１１のいずれか記載の免疫担当細胞。
【請求項１３】
ペプチドリンカーが、配列番号２６又は配列番号２７に示されるアミノ酸配列からなることを特徴とする請求項１２記載の免疫担当細胞。
【請求項１４】
ＣＡＲにおける一本鎖抗体が、以下のいずれかである、請求項６〜１３のいずれか記載の免疫担当細胞。
（１−４）配列番号１に示されるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域、配列番号２６に示されるアミノ酸配列からなるペプチドリンカー、及び配列番号２に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を順次含む一本鎖抗体；
（２−４）配列番号３に示されるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域、配列番号２６に示されるアミノ酸配列からなるペプチドリンカー、及び配列番号４に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域とを順次含む一本鎖抗体；
（３−４）配列番号２に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域、配列番号２６に示されるアミノ酸配列からなるペプチドリンカー、及び配列番号１に示されるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域を順次含む一本鎖抗体；
（４−４）配列番号１に示されるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域、配列番号２７に示されるアミノ酸配列からなるペプチドリンカー、及び配列番号２に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域とを順次含む一本鎖抗体；
（５−４）配列番号２に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域、配列番号２７に示されるアミノ酸配列からなるペプチドリンカー、及び配列番号１に示されるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域とを順次含む一本鎖抗体；
（６−４）配列番号５に示されるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域、配列番号２６に示されるアミノ酸配列からなるペプチドリンカー、及び配列番号６に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を順次含む一本鎖抗体；
（７−４）配列番号６に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域、配列番号２６に示されるアミノ酸配列からなるペプチドリンカー、及び配列番号５に示されるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域とを順次含む一本鎖抗体；
（８−４）配列番号５に示されるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域、配列番号２７に示されるアミノ酸配列からなるペプチドリンカー、及び配列番号６に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を順次含む一本鎖抗体；
（９−４）配列番号６に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域、配列番号２７に示されるアミノ酸配列からなるペプチドリンカー、及び配列番号５に示されるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域とを順次含む一本鎖抗体；
【請求項１５】
ＣＡＲにおける免疫担当細胞の活性化を誘導するシグナル伝達領域が、ＣＤ２８の細胞内領域のポリペプチド、４−１ＢＢの細胞内領域のポリペプチド、及びＣＤ３ζの細胞内領域のポリペプチドを含むことを特徴とする請求項６〜１４のいずれか記載の免疫担当細胞。
【請求項１６】
免疫担当細胞がＴ細胞であることを特徴とする請求項１〜１５のいずれか記載の免疫担当細胞。
【請求項１７】
免疫担当細胞がヒト由来又はヒトから分離されたＴ細胞であることを特徴とする請求項１〜１６のいずれか記載の免疫担当細胞。
【請求項１８】
請求項１〜１７のいずれか記載の免疫担当細胞と薬学的に許容される添加剤とを含有する医薬組成物。
【請求項１９】
がんの治療に用いるための、請求項１８記載の医薬組成物。
【請求項２０】
ヒトメソセリンを特異的に認識する細胞表面分子コードする核酸、ＩＬ−７コードする核酸、及びＣＣＬ１９をコードする核酸を含有する発現ベクター。
【請求項２１】
ヒトメソセリンを特異的に認識する細胞表面分子をコードする核酸、ＩＬ−７をコードする核酸、及びＣＣＬ１９をコードする核酸を免疫担当細胞に導入することを特徴とする、ヒトメソセリンを特異的に認識する細胞表面分子、ＩＬ−７、及びＣＣＬ１９を発現する免疫担当細胞の作製方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒトメソセリン（Ｈｕｍａｎ  Ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎ）を特異的に認識する細胞表面分子、インターロイキン７（Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−７：ＩＬ−７）、及びケモカイン（Ｃ−Ｃ  モチーフ）リガンド１９（ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ（Ｃ−Ｃ  ｍｏｔｉｆ）  ｌｉｇａｎｄ  １９：ＣＣＬ１９）を発現する免疫担当細胞や、かかる免疫担当細胞を含有する医薬組成物や、メソセリンを特異的に認識する細胞表面分子をコードする核酸、ＩＬ−７をコードする核酸、及びＣＣＬ１９をコードする核酸を含む発現ベクターや、ヒトメソセリンを特異的に認識する細胞表面分子をコードする核酸、ＩＬ−７をコードする核酸、及びＣＣＬ１９をコードする核酸を免疫担当細胞に導入することを特徴とする、ヒトメソセリンを特異的に認識する細胞表面分子、ＩＬ−７、及びＣＣＬ１９を発現する免疫担当細胞の作製方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
悪性腫瘍は世界中で多くの罹患者がいる疾患であり、一般的に化学療法、放射線療法、又は外科療法が広く行われている。しかしながら、副作用が生じることや、一部の機能が失われることや、再発若しくは転移を治療できないこと等、様々な問題があった。そこで、より患者のクオリティ・オブ・ライフ（ＱＯＬ）を高く維持すべく、近年、免疫細胞療法の開発が進められている。この免疫細胞療法は、患者から免疫担当細胞を採取し、かかる免疫担当細胞の免疫機能を高めるように処置して増幅し、再度患者に移入する療法である。具体的には、患者からＴ細胞を採取し、かかるＴ細胞にキメラ抗原受容体（ｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｖｅ  ａｎｄｒｏｓｔａｎｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ：以下「ＣＡＲ」ともいう）をコードする核酸を導入して増幅し、再度患者に移入する療法（非特許文献１参照）が知られている。かかる療法は、現在世界中で臨床試験が進行しており、白血病やリンパ腫等の造血器悪性腫瘍等において有効性を示す結果が得られている。【０００３】
一方、本発明者らは、ＩＬ−７とＣＣＬ１９を同時に発現することで、固形がんを顕著に抑制する免疫細胞療法（特許文献１、２参照）を提案した。かかる方法によって、内在性の免疫担当細胞の活性化や腫瘍細胞への集積能を高めることができる。【０００４】
ところで、メソセリンは中皮腫、大腸がん（直腸がん、結腸がん）、膵臓がん、卵巣がん、肺がん、乳がん、頭頸部がん等のがん細胞において発現することが知られている。かかるメソセリンをターゲットとしたＣＡＲ−Ｔ細胞が開示されている（特許文献３、４参照）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】国際公開第２０１６／０５６２２８号パンフレット
【特許文献２】国際公開第２０１７／１５９７３６号パンフレット
【特許文献３】米国特許出願公開第２０１４／０３０１９９３号明細書
【特許文献４】特開２０１７−５１８０５３号公報
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】中沢洋三  信州医誌  ６１（４）：１９７〜２０３（２０１３）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
上記のようにＩＬ−７とＣＣＬ１９を同時に発現するＣＡＲ発現Ｔ細胞やＴＣＲ発現Ｔ細胞などを用いた免疫細胞療法を開発し、免疫担当細胞の増殖能、生存能、又は宿主の免疫担当細胞の集積能を顕著に向上させ、従来免疫細胞療法で十分な治療効果が認められなかった固形がんに適応できる技術の開発が進んでいる。一方、中皮腫、膵臓がん等のがん細胞に高発現しているメソセリンを標的としたＣＡＲ発現免疫担当細胞の開発においては、がん局所への免疫担当細胞の集積が不十分であることや、抗腫瘍効果が短く腫瘍が再発するおそれがあることなど、臨床結果でも満足のいく結果が出ていないのが現状である。そこで本発明の課題は、新たなメソセリンを標的とした免疫担当細胞を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、これまで自らが開発してきたＣＡＲ、ＩＬ−７及びＣＣＬ１９を発現するＴ細胞の更なる可能性を検討した。その結果、ヒトメソセリンを特異的に認識する細胞表面分子として特定のアミノ酸配列を含有し、ヒトメソセリンに特異的に結合する一本鎖抗体を含有するＣＡＲを選択して用いることで、メソセリンを発現するがん細胞に対する細胞傷害活性を有すると共に、メソセリンを発現するがん細胞よって形成された腫瘍による生存率低下を抑制できることを見出し、本発明を完成した。【０００９】
すなわち、本発明は、以下のとおりである。
〔１〕ヒトメソセリン（Ｈｕｍａｎ  Ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎ）を特異的に認識する細胞表面分子、インターロイキン７（ＩＬ−７）、及びケモカイン（Ｃ−Ｃ  モチーフ）リガンド１９（ＣＣＬ１９）を発現する免疫担当細胞。
〔２〕生体から分離された免疫担当細胞であることを特徴とする上記〔１〕記載の免疫担当細胞。
〔３〕外来のヒトメソセリンを特異的に認識する細胞表面分子をコードする核酸、外来のＩＬ―７をコードする核酸、及び外来のＣＣＬ１９をコードする核酸を含有することを特徴とする上記〔１〕又は〔２〕記載の免疫担当細胞。
〔４〕外来のＩＬ−７をコードする核酸、及び外来のＣＣＬ１９をコードする核酸が、外来のヒトＩＬ−７をコードする核酸、及び外来のヒトＣＣＬ１９をコードする核酸であることを特徴とする上記〔３〕記載の免疫担当細胞。
〔５〕外来のヒトメソセリンを特異的に認識する細胞表面分子をコードする核酸、外来のＩＬ−７をコードする核酸、及び外来のＣＣＬ１９をコードする核酸がゲノムに組み込まれていることを特徴とする上記〔３〕又は〔４〕記載の免疫担当細胞。
〔６〕ヒトメソセリンを特異的に認識する細胞表面分子が、一本鎖抗体、細胞膜貫通領域、及び免疫担当細胞の活性化を誘導するシグナル伝達領域を備えたキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）であることを特徴とする上記〔１〕〜〔５〕のいずれか記載の免疫担当細胞。
〔７〕ＣＡＲにおける一本鎖抗体が、以下のいずれかである、上記〔６〕記載の免疫担当細胞。
（１−１）配列番号１３に示されるアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ１、配列番号１４に示されるアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ２、及び配列番号１５に示されるアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域と、配列番号１６に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ１、配列番号１７に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号１８に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域を含む一本鎖抗体；
（２−１）配列番号１３に示されるアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ１、配列番号１４に示されるアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ２、及び配列番号１５に示されるアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域と、配列番号１９に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ１、配列番号１７に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号１８に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域を含む一本鎖抗体；
（３−１）配列番号２０に示されるアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ１、配列番号２１に示されるアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ２、及び配列番号２２に示されるアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域と、配列番号２３に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ１、配列番号２４に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号２５に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域を含む一本鎖抗体；
〔８〕ＣＡＲにおける一本鎖抗体が、以下のいずれかである、上記〔６〕又は〔７〕記載の免疫担当細胞。
（１−２）配列番号１に示されるアミノ酸配列と８５％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなる重鎖可変領域と、配列番号２に示されるアミノ酸配列と８５％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域とを含む一本鎖抗体；
（２−２）配列番号３に示されるアミノ酸配列と８５％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなる重鎖可変領域と、配列番号４に示されるアミノ酸配列と８５％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域とを含む一本鎖抗体；
（３−２）配列番号５に示されるアミノ酸配列と８５％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなる重鎖可変領域と、配列番号６に示されるアミノ酸配列と８５％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域とを含む一本鎖抗体；
（４−２）配列番号１に示されるアミノ酸配列と８５％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなる重鎖可変領域と、配列番号４に示されるアミノ酸配列と８５％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域とを含む一本鎖抗体；
（５−２）配列番号３に示されるアミノ酸配列と８５％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなる重鎖可変領域と、配列番号２に示されるアミノ酸配列と８５％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域とを含む一本鎖抗体；
〔９〕ＣＡＲにおける一本鎖抗体が、以下のいずれかである、上記〔６〕〜〔８〕のいずれか記載の免疫担当細胞。
（１−３）配列番号１に示されるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域と、配列番号２に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域とを含む一本鎖抗体；
（２−３）配列番号３に示されるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域と、配列番号４に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域とを含む一本鎖抗体；
（３−３）配列番号５に示されるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域と、配列番号６に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域とを含む一本鎖抗体；
（４−３）配列番号１に示されるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域と、配列番号４に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域とを含む一本鎖抗体；
（５−３）配列番号３に示されるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域と、配列番号２に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域とを含む一本鎖抗体；
〔１０〕ＣＡＲにおける細胞膜貫通領域が、配列番号７に示すアミノ酸配列と８５％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことを特徴とする上記〔６〕〜〔９〕のいずれか記載の免疫担当細胞。
〔１１〕ＣＡＲにおける免疫担当細胞の活性化を誘導するシグナル伝達領域が、配列番号８、９及び１０に示すアミノ酸配列を含むことを特徴とする上記〔６〕〜〔１０〕のいずれか記載の免疫担当細胞。
〔１２〕重鎖可変領域と軽鎖可変領域が２〜３０個のアミノ酸配列からなるペプチドリンカーを介して結合していることを特徴とする、上記〔７〕〜〔１１〕のいずれか記載の免疫担当細胞。
〔１３〕ペプチドリンカーが、配列番号２６又は配列番号２７に示されるアミノ酸配列からなることを特徴とする上記〔１２〕記載の免疫担当細胞。
〔１４〕ＣＡＲにおける一本鎖抗体が、以下のいずれかである、上記〔６〕〜〔１３〕のいずれか記載の免疫担当細胞。
（１−４）配列番号１に示されるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域、配列番号２６に示されるアミノ酸配列からなるペプチドリンカー、及び配列番号２に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を順次含む一本鎖抗体；
（２−４）配列番号３に示されるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域、配列番号２６に示されるアミノ酸配列からなるペプチドリンカー、及び配列番号４に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域とを順次含む一本鎖抗体；
（３−４）配列番号２に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域、配列番号２６に示されるアミノ酸配列からなるペプチドリンカー、及び配列番号１に示されるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域を順次含む一本鎖抗体；
（４−４）配列番号１に示されるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域、配列番号２７に示されるアミノ酸配列からなるペプチドリンカー、及び配列番号２に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域とを順次含む一本鎖抗体；
（５−４）配列番号２に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域、配列番号２７に示されるアミノ酸配列からなるペプチドリンカー、及び配列番号１に示されるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域とを順次含む一本鎖抗体；
（６−４）配列番号５に示されるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域、配列番号２６に示されるアミノ酸配列からなるペプチドリンカー、及び配列番号６に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を順次含む一本鎖抗体；
（７−４）配列番号６に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域、配列番号２６に示されるアミノ酸配列からなるペプチドリンカー、及び配列番号５に示されるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域とを順次含む一本鎖抗体；
（８−４）配列番号５に示されるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域、配列番号２７に示されるアミノ酸配列からなるペプチドリンカー、及び配列番号６に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を順次含む一本鎖抗体；
（９−４）配列番号６に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域、配列番号２７に示されるアミノ酸配列からなるペプチドリンカー、及び配列番号５に示されるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域とを順次含む一本鎖抗体；
〔１５〕ＣＡＲにおける免疫担当細胞の活性化を誘導するシグナル伝達領域が、ＣＤ２８の細胞内領域のポリペプチド、４−１ＢＢの細胞内領域のポリペプチド、及びＣＤ３ζの細胞内領域のポリペプチドを含むことを特徴とする上記〔６〕〜〔１４〕のいずれか記載の免疫担当細胞。
〔１６〕免疫担当細胞がＴ細胞であることを特徴とする上記〔１〕〜〔１５〕のいずれか記載の免疫担当細胞。
〔１７〕免疫担当細胞がヒト由来又はヒトから分離されたＴ細胞であることを特徴とする上記〔１〕〜〔１６〕のいずれか記載の免疫担当細胞。
〔１８〕上記〔１〕〜〔１７〕のいずれか記載の免疫担当細胞と薬学的に許容される添加剤とを含有する医薬組成物。
〔１９〕がんの治療に用いるための、上記〔１８〕記載の医薬組成物。
〔２０〕ヒトメソセリンを特異的に認識する細胞表面分子コードする核酸、ＩＬ―７コードする核酸、及びＣＣＬ１９をコードする核酸を含有する発現ベクター。
〔２１〕ヒトメソセリンを特異的に認識する細胞表面分子をコードする核酸、ＩＬ―７をコードする核酸、及びＣＣＬ１９をコードする核酸を免疫担当細胞に導入することを特徴とする、ヒトメソセリンを特異的に認識する細胞表面分子、ＩＬ―７、及びＣＣＬ１９を発現する免疫担当細胞の作製方法。
【発明の効果】
【００１０】
本発明の免疫担当細胞は、ヒトメソセリンを発現するがん細胞傷害活性を有し、ヒトメソセリンを発現する腫瘍形成を抑制することが可能となる。また、本発明の免疫担当細胞は、がん細胞の再発抑制効果をも有する。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】実施例１において、作製した９種類の抗ヒトメソセリン  ｓｃＦｖの配置（ａ）及びアミノ酸配列（ｂ）を示す図である。
【図２】実施例２において、抗ヒトメソセリンＣＡＲ−ＩＬ−７／ＣＣＬ１９発現Ｔ細胞におけるＣＡＲの発現を調べた結果を示す図である。（ａ）はＣＡＲ、ＩＬ―７、及びＣＣＬ１９非発現−Ｔ細胞（Ｎｏｎ−ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ）、（ｂ）〜（ｄ）はそれぞれｓｃＦｖ領域としてＶＨ０７（１５）ＶＬ０７（シグナルペプチドＴ）、ＶＨ０７（１５）ＶＬ０７（シグナルペプチドＰ）、ＶＨ３６（１５）ＶＬ３６を有する抗ヒトメソセリンＣＡＲ−ＩＬ−７／ＣＣＬ１９発現Ｔ細胞の結果である。
【図３】実施例２において、抗ヒトメソセリンＣＡＲ−ＩＬ−７／ＣＣＬ１９発現Ｔ細胞におけるＣＡＲの発現を調べた結果を示す図である。（ａ）はＣＡＲ、ＩＬ―７、及びＣＣＬ１９非発現−Ｔ細胞（Ｎｏｎ−ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ）、（ｂ）〜（ｅ）はそれぞれｓｃＦｖ領域としてＶＨ０７（１５）ＶＬ０７、ＶＬ０７（１５）ＶＨ０７、ＶＨ０７（２５）ＶＬ０７、ＶＬ０７（２５）ＶＨ０７を有する抗ヒトメソセリンＣＡＲ−ＩＬ−７／ＣＣＬ１９発現Ｔ細胞の結果である。
【図４】実施例３において、腫瘍細胞株におけるメソセリンの発現レベルをフローサイトメーターによって確認した図である。
【図５】実施例４において、抗ヒトメソセリン  ＣＡＲ−ＩＬ−７／ＣＣＬ１９発現Ｔ細胞と、メソセリン陽性腫瘍細胞株又はメソセリン陰性腫瘍細胞株との共培養試験の説明図である。
【図６Ａ】実施例４において、残存している腫瘍細胞株ＡＣＣ−ＭＥＳＯ−１のフローサイトメトリーでの測定結果を示す図である。
【図６Ｂ】実施例４において、残存している腫瘍細胞株ＮＣＩ−Ｈ２０５２のフローサイトメトリーでの測定結果を示す図である。
【図６Ｃ】実施例４において、残存している腫瘍細胞株Ａ４９８のフローサイトメトリーでの測定結果を示す図である。
【図７Ａ】実施例４において、抗ヒトメソセリン  ＣＡＲ−ＩＬ−７／ＣＣＬ１９発現Ｔ細胞とメソセリン陽性腫瘍細胞株ＡＣＣ−ＭＥＳＯ−１との共培養後の産生されたＩＦＮ−γの測定結果を示す図である。
【図７Ｂ】実施例４において、抗ヒトメソセリン  ＣＡＲ−ＩＬ−７／ＣＣＬ１９発現Ｔ細胞とメソセリン陽性腫瘍細胞株ＮＣＩ−Ｈ２０５２との共培養後の産生されたＩＦＮ−γの測定結果を示す図である。
【図７Ｃ】実施例４において、抗ヒトメソセリン  ＣＡＲ−ＩＬ−７／ＣＣＬ１９発現Ｔ細胞とメソセリン陰性腫瘍細胞株Ａ４９８との共培養後の産生されたＩＦＮ−γの測定結果を示す図である。
【図８】実施例５において、残存している白血球（Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ  ｎｕｍｂｅｒ）又はＰＡＮ０２腫瘍細胞株のフローサイトメトリーでの測定結果を示す図である。
【図９】実施例５において、抗メソセリン  ＣＡＲ−ＩＬ−７／ＣＣＬ１９発現Ｔ細胞とＰＡＮ０２腫瘍細胞株との共培養後の産生されたＩＦＮ−γの測定結果を示す図である。
【図１０】実施例６において腫瘍モデルマウスへのメソセリン  ＣＡＲ−マウスＩＬ−７／マウスＣＣＬ１９発現マウスＴ細胞の投与による生存率の結果を示す図である。
【図１１】実施例６において腫瘍モデルマウスへのメソセリン  ＣＡＲ−マウスＩＬ−７／マウスＣＣＬ１９発現マウスＴ細胞の投与による腫瘍の体積の測定結果を示す図である。
【図１２Ａ】実施例７において、ＡＣＣ−ＭＥＳＯ−１−ＧＦＰ−Ｌｕｃを投与した日をｄａｙ１として、ｄａｙ１、３、７、１０、１４、２１、３１、３８のマウスを露光時間３０秒で撮影した結果を示す図である。
【図１２Ｂ】実施例７において、ＡＣＣ−ＭＥＳＯ−１−ＧＦＰ−Ｌｕｃを投与した日をｄａｙ１として、ｄａｙ４５、５９、７３、８７、１０１、１１５、１２９、１４３のマウスを露光時間３０秒で撮影した結果を示す図である。ｄａｙ１２９の左から２番目の個体は死亡したため写真を省略する。
【図１３】実施例７おいて、投与からの日数とマウスの生存率との関係を示したグラフである。
【図１４】実施例７において、投与からの日数とトータルの蛍光量との関係を示したグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本発明の免疫担当細胞は、ヒトメソセリンを特異的に認識する細胞表面分子、ＩＬ―７、及びＣＣＬ１９を発現する免疫担当細胞であればよいが、外来の細胞表面分子をコードする核酸、外来のＩＬ―７をコードする核酸、及び外来のＣＣＬ１９をコードする核酸を含有する免疫担当細胞であることが好ましく、かかる免疫担当細胞により、ヒトメソセリンを発現するがん細胞による腫瘍形成を抑制することが可能となる。
【００１３】
（ヒトメソセリン）
ヒトメソセリンは、４０ｋＤａのタンパク質であり、正常細胞ではほとんど発現しておらず、中皮腫、膵臓がん等のがん細胞に高発現している。ヒトメソセリンの配列情報は、公知の文献やＮＣＢＩ（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/guide/）等のデータベースを検索して適宜入手することができる。例えば、ヒトメソセリンのアミノ酸配列情報としては、Ｇｅｎｂａｎｋ  アクセッション番号  ＮＰ＿０３７５３６．２、ＡＡＶ８７５３０．１や、これらのアイソフォームなどを挙げることができる。
【００１４】
（細胞表面分子）
ヒトメソセリンを特異的に認識する細胞表面分子としては、ヒトメソセリンを特異的に認識するＣＡＲ、ヒトメソセリン由来のペプチドを特異的に認識するＴ細胞受容体（Ｔ  ｃｅｌｌ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ：ＴＣＲ）、ヒトメソセリンに特異的に結合するタンパク質若しくは核酸等の、細胞表面に発現することよってヒトメソセリンに対して特異的な識別能を付与する分子又は因子を挙げることができる。なお、ＣＡＲとは、がん細胞の細胞表面抗原を認識する一本鎖抗体（ｓｉｎｇｌｅ  ｃｈａｉｎ  Ｆｖ：ｓｃＦｖ）と、Ｔ細胞の活性化を誘導するシグナル伝達領域を融合させた人工的なキメラタンパク質である。
【００１５】
上記細胞表面分子は、シグナルペプチド（リーダー配列）によって免疫担当細胞の細胞表面に局在していることが好ましい。シグナルペプチドとしては、免疫グロブリン重鎖、イムノグロブリン軽鎖、ＣＤ８、Ｔ細胞受容体のα、β鎖、ＣＤ３ζ、ＣＤ２８、ＣＤ３ε、ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＩＣＯＳ、ＣＤ１５４、ＧＩＴＲ由来のシグナルペプチド（リーダー配列）のポリペプチドを挙げることができる。具体的には、配列番号１１又は１２に示すアミノ酸配列において、８５％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９８％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号１１又は１２と同等の作用を有するポリペプチドや、配列番号１１又は１２に示すアミノ酸配列において、１又は複数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、配列番号１１又は１２に示すアミノ酸配列と同等の作用を有するポリペプチドを挙げることができる。なお、シグナルペプチドは、局在化が完了した成熟タンパク質では除去されている。
【００１６】
本明細書において、「１若しくは数個のアミノ酸残基が欠失、置換、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列」とは、例えば１〜３０個の範囲内、好ましくは１〜２０個の範囲内、より好ましくは１〜１５個の範囲内、さらに好ましくは１〜１０個の範囲内、さらに好ましくは１〜５個の範囲内、さらに好ましくは１〜３個の範囲内、さらに好ましくは１〜２個の範囲内の数のアミノ酸残基が欠失、置換、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列をも包含する。これらアミノ酸残基の変異処理は、化学合成、遺伝子工学的手法、突然変異誘発等の当業者に既知の任意の方法により行うことができる。
【００１７】
本明細書において、用語「同一性」は、ポリペプチド又はポリヌクレオチド配列近似性の程度（これは、クエリー配列と他の好ましくは同一の型の配列（核酸若しくはタンパク質配列）とのマッチングにより決定される）を意味する。「同一性」を計算及び決定する好ましいコンピュータープログラム法としては、例えば、ＧＣＧ  ＢＬＡＳＴ（Basic Local Alignment Search Tool）（Altschul et al.，J.Mol.Biol.1990，215:403-410;Altschul et al．，Nucleic Acids Res.1997,25:3389-3402;Devereux et al．，Nucleic Acid Res．1984,12:387）、並びにＢＬＡＳＴＮ  ２．０（Gish W．，http://blast．Wustl．edu，1996−2002）、並びにＦＡＳＴＡ（Pearson及びLipman,Proc.Natl．Acad．Sci．USA 1988,85:2444−2448）、並びに最も長く重複した一対のコンティグを決定及びアライメントするＧＣＧ  ＧｅｌＭｅｒｇｅ（Wibur及びLipman,SIAM J.Appl.Math.1984,44:557-567;Needleman及びWunsch,J．Mol．Biol．1970，48:443-453）を挙げることができる。
【００１８】
（ヒトメソセリンを特異的に認識する一本鎖抗体）
細胞表面分子がＣＡＲである場合には、ヒトメソセリンを特異的に認識する分子としてヒトメソセリンを特異的に認識する一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）を含有していることが好ましい。かかるヒトメソセリンを特異的に認識する一本鎖抗体においては、ヒトメソセリンを特異的に認識する抗体の重鎖可変領域（ＶＨ）及び軽鎖可変領域（ＶＬ）が、前記重鎖可変領域及び前記軽鎖可変領域を連結するためのペプチドリンカーによって結合されていればよい。かかるヒトメソセリンを特異的に認識する一本鎖抗体における重鎖可変領域と軽鎖可変領域の組み合わせとしては、例えば、以下の組み合わせを挙げることができる。なお、重鎖可変領域に対して軽鎖可変領域が上流（Ｎ末端側）に位置しても下流（Ｃ末端側）に位置してもよい。
【００１９】
（１−１）配列番号１３に示されるアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ  ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ  ｒｅｇｉｏｎ）１、配列番号１４に示されるアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ２、及び配列番号１５に示されるアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域と、配列番号１６に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ１、配列番号１７に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号１８に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域の組み合わせ；
（２−１）配列番号１３に示されるアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ１、配列番号１４に示されるアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ２、及び配列番号１５に示されるアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域と、配列番号１９に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ１、配列番号１７に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号１８に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域の組み合わせ；
（３−１）配列番号２０に示されるアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ１、配列番号２１に示されるアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ２、及び配列番号２２に示されるアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域と、配列番号２３に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ１、配列番号２４に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号２５に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域の組み合わせ；
【００２０】
このほか、たとえば以下の文献（米国特許第８，３５７，７８３号、特表２０１７−５１８０５３）等に記載された公知のヒトメソセリンを特異的に認識する抗体の重鎖可変領域及び軽鎖可変領域のアミノ酸配列に基づき、ＩＭＧＴ、Ｋａｂａｔ、Ｃｈｏｔｈｉａ、Ｎｏｒｔｈ、又はＣｏｎｔａｃｔ等の番号付けシステムに基づきヒトメソセリンを特異的に認識する重鎖可変領域及び軽鎖可変領域のＣＤＲを特定し、かかるＣＤＲを備えた重鎖可変領域と軽鎖可変領域の組み合わせも挙げることができる。なお、ＣＤＲは、以下のＡｂｏｄｙＢｕｉｌｄｅｒウェブサイト（http://opig.stats.ox.ac.uk/webapps/sabdab-sabpred/Modelling.php）により特定することができる。
【００２１】
また、上記ヒトメソセリンを特異的に認識する一本鎖抗体における重鎖可変領域と軽鎖可変領域の組み合わせとして、以下の組み合わせも挙げることができる。
（１−２）配列番号１に示されるアミノ酸配列と８５％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９８％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなる重鎖可変領域と、配列番号２に示されるアミノ酸配列と８５％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９８％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域の組み合わせ；
（２−２）配列番号３に示されるアミノ酸配列と８５％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９８％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなる重鎖可変領域と、配列番号４に示されるアミノ酸配列と８５％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９８％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域の組み合わせ；
（３−２）配列番号５に示されるアミノ酸配列と８５％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９８％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなる重鎖可変領域と、配列番号６に示されるアミノ酸配列と８５％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９８％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域の組み合わせ；
（４−２）配列番号１に示されるアミノ酸配列と８５％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９８％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなる重鎖可変領域と、配列番号４に示されるアミノ酸配列と８５％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９８％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域の組み合わせ；
（５−２）配列番号３に示されるアミノ酸配列と８５％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９８％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなる重鎖可変領域と、配列番号２に示されるアミノ酸配列と８５％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９８％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域の組み合わせ；
【００２２】
このほか、たとえば以下の文献（米国特許第８，３５７，７８３号、特表２０１７−５１８０５３）等に記載された公知のヒトメソセリンを特異的に認識する抗体の重鎖可変領域と８５％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９８％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなる重鎖可変領域と、上記公知のヒトメソセリンを特異的に認識する抗体の軽鎖可変領域と８５％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９８％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域の組み合わせでてもよい。
【００２３】
さらに、上記ヒトメソセリンを特異的に認識する一本鎖抗体における重鎖可変領域と軽鎖可変領域の組み合わせとして、以下の組み合わせも挙げることもできる。
（１−３）配列番号１に示されるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域と、配列番号２に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域の組み合わせ；
（２−３）配列番号３に示されるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域と、配列番号４に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域の組み合わせ；
（３−３）配列番号５に示されるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域と、配列番号６に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域の組み合わせ；
（４−３）配列番号１に示されるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域と、配列番号４に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域の組み合わせ；
（５−３）配列番号３に示されるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域と、配列番号２に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域の組み合わせ；
【００２４】
このほか、たとえば以下の文献（米国特許第８，３５７，７８３号、特表２０１７−５１８０５３）等に記載された公知のヒトメソセリンを特異的に認識する抗体の重鎖可変領域や軽鎖可変領域の組み合わせであってもよい。
【００２５】
（ペプチドリンカー）
重鎖可変領域及び軽鎖可変領域はペプチドリンカーを介して結合している。かかるペプチドリンカーの長さは、２〜３０、好ましくは１５〜２５であり、より好ましくは１５、又は２５である。具体的には、グリシン−セリン連続配列を含む配列番号２６又は２７に示すアミノ酸配列において、８５％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９８％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、配列番号２６又は２７と同等の作用を有するポリペプチドや、配列番号２６又は２７に示すアミノ酸配列において、１又は複数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、配列番号２６又は２７に示すアミノ酸配列と同等の作用を有するポリペプチドを好適に挙げることができる。
【００２６】
上記ヒトメソセリンを特異的に認識する一本鎖抗体における重鎖可変領域と軽鎖可変領域、及びペプチドリンカーの組み合わせとして、以下の組み合わせを挙げることもできる。なお、以下の「順次」とは、Ｎ末端側から順にという意味である。
（１−４）配列番号１に示されるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域、配列番号２６に示されるアミノ酸配列からなるペプチドリンカー、及び配列番号２に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を順次含む組み合わせ；
（２−４）配列番号３に示されるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域、配列番号２６に示されるアミノ酸配列からなるペプチドリンカー、及び配列番号４に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域とを順次含む組み合わせ；
（３−４）配列番号２に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域、配列番号２６に示されるアミノ酸配列からなるペプチドリンカー、及び配列番号１に示されるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域を順次含む組み合わせ；
（４−４）配列番号１に示されるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域、配列番号２７に示されるアミノ酸配列からなるペプチドリンカー、及び配列番号２に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域とを順次含む組み合わせ；
（５−４）配列番号２に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域、配列番号２７に示されるアミノ酸配列からなるペプチドリンカー、及び配列番号１に示されるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域とを順次含む組み合わせ；
（６−４）配列番号５に示されるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域、配列番号２６に示されるアミノ酸配列からなるペプチドリンカー、及び配列番号６に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を順次含む組み合わせ；
（７−４）配列番号６に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域、配列番号２６に示されるアミノ酸配列からなるペプチドリンカー、及び配列番号５に示されるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域とを順次含む組み合わせ；
（８−４）配列番号５に示されるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域、配列番号２７に示されるアミノ酸配列からなるペプチドリンカー、及び配列番号６に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を順次含む組み合わせ；
（９−４）配列番号６に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域、配列番号２７に示されるアミノ酸配列からなるペプチドリンカー、及び配列番号５に示されるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域とを順次含む組み合わせ；
【００２７】
（ＩＬ−７、ＣＣＬ１９）
上記ＩＬ−７はＴ細胞の生存に必須のサイトカインであり、骨髄、胸腺、リンパ器官・組織のストローマ細胞などの非造血細胞によって産生される。一方、Ｔ細胞自体の産生能力はほとんど認められない。
【００２８】
また、上記ＣＣＬ１９は主にリンパ節の樹状細胞やマクロファージから産生され、その受容体であるＣＣＲ７を介してＴ細胞やＢ細胞、成熟した樹状細胞の遊走を惹起する機能を有する。
【００２９】
ＩＬ−７及びＣＣＬ１９が由来する生物は、特に限定されないが、ヒトであることが好ましい。なお、これらのタンパク質のアミノ酸配列は、ＧｅｎＢａｎｋ等の公知の配列データベースから入手可能である。例えば、ヒトＩＬ−７のアミノ酸配列の例としては、ＧｅｎＢａｎｋ  アクセッション番号：ＮＭ＿０００８８０．３（配列番号２８）として登録された配列や、これらのアイソフォーム等を挙げることができる。また、ヒトＣＣＬ１９のアミノ酸配列の例としては、ＧｅｎＢａｎｋ  アクセッション番号：ＮＭ＿００６２７４．２（配列番号２９）として登録された配列や、これらのアイソフォーム等を挙げることができる。なお、ＩＬ−７及びＣＣＬ１９は、シグナルペプチドを有してもよいが、成熟タンパク質では、シグナルペプチドは除去される。例えば、配列番号２８に記載のヒトＩＬ−７のアミノ酸配列において、１〜２５位の配列はシグナルペプチドに該当する。また、例えば、配列番号２９に記載のヒトＣＣＬ１９のアミノ酸配列において、１〜２１位の配列はシグナルペプチドに該当する。
【００３０】
また、ＩＬ−７及びＣＣＬ１９は、上記のような天然タンパク質の変異体であってもよい。ＩＬ−７の変異体の例としては、配列番号２８に記載のヒトＩＬ−７のアミノ酸配列において、８５％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９８％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、ＩＬ−７における細胞増殖率又は細胞生存率の亢進作用を有するポリペプチドや、配列番号２８に記載のヒトＩＬ−７のアミノ酸配列において、１又は複数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、ＩＬ−７における細胞増殖率又は細胞生存率の亢進作用を有するポリペプチドを挙げることができる。ヒトＣＣＬ１９の変異体の例としては、配列番号２９に記載のヒトＣＣＬ１９のアミノ酸配列において、８５％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９８％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、ＣＣＬ１９における細胞の遊走作用を有するポリペプチドや、配列番号２９に記載のヒトＣＣＬ１９のアミノ酸配列において、１又は複数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、ＣＣＬ１９における細胞の遊走作用を有するポリペプチドを挙げることができる。
【００３１】
（他の免疫機能制御因子）
本発明の免疫担当細胞は、さらに、ＩＬ−１５、ＣＣＬ２１、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１７、ＩＬ−１８、ＩＰ−１０、Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ−γ、ＭＩＰ−１ａｌｐｈａ、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｍ−ＣＳＦ、ＴＧＦ−ｂｅｔａ、ＴＮＦ−ａｌｐｈａ等の他の免疫機能制御因子を発現していてもよいが、上記他の免疫制御因子としては、ＩＬ−１２以外の免疫機能制御因子であることが好ましいい。
【００３２】
（細胞膜貫通領域）
本発明における細胞膜貫通領域としては、ＣＤ８、Ｔ細胞受容体のα、β鎖、ＣＤ３ζ、ＣＤ２８、ＣＤ３ε、ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＩＣＯＳ、ＣＤ１５４、ＧＩＴＲ由来の細胞膜貫通領域のポリペプチドを挙げることができ、配列番号７に示すヒトＣＤ８細胞膜貫通領域のアミノ酸配列と８５％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９８％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、配列番号７に示すアミノ酸配列と同等の作用を有するポリペプチドや、配列番号７に示すアミノ酸配列において、１又は複数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、配列番号７に示すアミノ酸配列と同等の作用を有するポリペプチドを好適に挙げることができる。かかる細胞膜貫通領域によって、ＣＡＲがＴ細胞の細胞膜に固定される。
【００３３】
前記細胞膜貫通領域には、任意のオリゴペプチド又はポリペプチドからなり、長さが１〜１００アミノ酸、好ましくは１０〜７０アミノ酸のヒンジ領域を含んでもよい。ヒンジ領域としては、ヒトＣＤ８のヒンジ領域を挙げることができる。
【００３４】
（免疫担当細胞活性化シグナル伝達領域）
免疫担当細胞活性化シグナル伝達領域は、前記細胞表面分子がメソセリンを認識した際に、細胞内にシグナル伝達することが可能な領域であり、ＣＤ２８、４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ＧＩＴＲ、ＣＤ２７、ＯＸ４０、ＨＶＥＭ、ＣＤ３ζ、又はＦｃ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  γｃｈａｉｎの細胞内領域のポリペプチドから選択される少なくとも１種又は２種以上を含むことが好ましく、ＣＤ２８の細胞内領域のポリペプチド、４−１ＢＢの細胞内領域のポリペプチド、及びＣＤ３ζの細胞内領域のポリペプチドの３種のポリペプチドを含むことがより好ましい。ＣＤ２８の細胞内領域のアミノ酸配列としては、配列番号８に示すアミノ酸配列と８５％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９８％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、配列番号８に示すアミノ酸配列と同等の作用を有するポリペプチドや、配列番号８に示すアミノ酸配列において、１又は複数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、配列番号８に示すアミノ酸配列と同等の作用を有するポリペプチドを挙げることができる。４−１ＢＢの細胞内領域のアミノ酸配列としては、配列番号９示すアミノ酸配列と８５％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９８％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、配列番号９に示すアミノ酸配列と同等の作用を有するポリペプチドや、配列番号９に示すアミノ酸配列において、１又は複数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、配列番号９に示すアミノ酸配列と同等の作用を有するポリペプチドを挙げることができる。ＣＤ３ζの細胞内領域のアミノ酸配列としては、配列番号１０示すアミノ酸配列と８５％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９８％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、配列番号１０に示すアミノ酸配列と同等の作用を有するポリペプチドや、配列番号１０に示すアミノ酸配列において、１又は複数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、配列番号１０に示すアミノ酸配列と同等の作用を有するポリペプチドを挙げることができる。なお、免疫担当細胞としてＴ細胞を用いるときは、Ｔ細胞内にシグナル伝達することが可能なポリペプチドを選択すればよく、他の免疫担当細胞を用いるときにも、かかる免疫担当細胞にシグナル伝達することが可能なポリペプチドを選択すればよい。免疫担当細胞としてＴ細胞を用いる場合における免疫担当細胞活性化シグナル伝達領域としては、配列番号８、９及び１０に示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドを挙げることができ、Ｎ末端側から順に配列番号８、９及び１０に示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドを好適に挙げることができる。
【００３５】
（細胞外ヒンジ領域、スペーサー）
また、メソセリンを認識する細胞表面分子と細胞膜貫通領域との間には、任意のオリゴペプチド又はポリペプチドからなる細胞外ヒンジ領域を設けてもよい。細胞外ヒンジ領域の長さとしては、１〜１００アミノ酸残基、好ましくは１０〜７０アミノ酸残基を挙げることができ、かかる細胞外ヒンジ領域として、ＣＤ８、ＣＤ２８、ＣＤ４等由来のヒンジ領域や、免疫グロブリンのヒンジ領域を挙げることができる。
【００３６】
さらに、細胞膜貫通領域と免疫担当細胞活性化シグナル伝達領域との間には、任意のオリゴペプチド又はポリペプチドからなるスペーサー領域を設けてもよい。スペーサー領域の長さとしては、１〜１００アミノ酸残基、好ましくは１０〜５０アミノ酸残基を挙げることができ、かかるスペーサー領域として、グリシン−セリン連続配列を挙げることができる。
【００３７】
（各領域の配置）
上記ＣＡＲにおいて、上記の各領域は、Ｎ末端から、一本鎖抗体、細胞膜貫通領域、免疫担当細胞活性化シグナル伝達領域の順に配置することができる。具体的には、Ｎ末端側から、ヒトメソセリンを特異的に認識する一本鎖抗体、ヒトＣＤ８の細胞外ヒンジ領域、ヒトＣＤ８の細胞膜貫通領域、ヒトＣＤ２８のＴ細胞活性化シグナル伝達領域、ヒト４−１ＢＢのＴ細胞活性化シグナル伝達領域、及びヒトＣＤ３ζのＴ細胞活性化シグナル伝達領域の順に配置されたＣＡＲを挙げることができる。
【００３８】
（自殺遺伝子によって発現するタンパク質）
また、本発明の免疫担当細胞は、単純ヘルペスウイルスのチミジンキナーゼ（ＨＳＶ−ＴＫ）又は誘導性カスパーゼ９（ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ  ｃａｓｐａｓｅ  ９）等の自らの細胞を死に至らしめる機能を有するタンパク質（自殺遺伝子によって発現するタンパク質）を発現してもよい。これら自殺遺伝子に基づくタンパク質が発現することによって直接的に、あるいは二次的に細胞毒性を有する物質を誘導し、自らの細胞を死に至らしめる機能を有することが可能となる。そのため、例えばがんの治療経過に応じて、腫瘍が消失した場合に上記の機能を活性化する薬剤を投与し、生体内にある本発明の免疫担当細胞を制御することができる。すなわち、必要に応じて、本発明の免疫担当細胞におけるサイトカイン放出症候群になるリスクを確実に低減させることが可能となる。
【００３９】
単純ヘルペスウイルスのチミジンキナーゼ（ＨＳＶ−ＴＫ）又は誘導性カスパーゼ９（ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ  ｃａｓｐａｓｅ  ９）の機能を活性化する薬剤としては、前者に対してはガンシクロビル、後者に対しては二量体誘導化合物（ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｄｉｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ：ＣＩＤ）であるＡＰ１９０３を挙げることができる（Cooper LJ.,et. al. Cytotherapy. 2006;8(2):105-17.,Jensen M. C. et. al. Biol Blood Marrow Transplant. 2010 Sep;16(9):1245-56., Jones BS. Front Pharmacol.2014 Nov 27;5:254., Minagawa K., Pharmaceuticals (Basel). 2015 May 8;8(2):230-49., Bole-Richard E., Front Pharmacol. 2015  Aug  25;6:174）。
【００４０】
（免疫担当細胞における細胞の種類）
上記免疫担当細胞における細胞の種類としては、免疫応答に関与し、ヒトメソセリンを特異的に認識する細胞表面分子をコードする核酸、ＩＬ−７をコードする核酸、及びＣＣＬ１９をコードする核酸を導入することでヒトメソセリンを特異的に認識する細胞表面分子、ＩＬ―７及びＣＣＬ１９を発現できる細胞であれば特に制限されないが、生体から分離された免疫担当細胞であることが好ましく、Ｔ細胞、ナチュラルキラー細胞（ＮＫ細胞）、Ｂ細胞等のリンパ球系細胞や、単球、マクロファージ、樹状細胞等の抗原提示細胞や、好中球、好酸球、好塩基球、肥満細胞等の顆粒球であって生体から分離されたものを挙げることができる。具体的には、ヒト、イヌ、ネコ、ブタ、マウス等の哺乳動物由来又は哺乳動物から分離されたＴ細胞、好ましくはヒト由来又はヒトから分離されたＴ細胞を好適に挙げることができる。なお、ヒト、イヌ、ネコ、ブタ、マウス等の哺乳動物由来のＴ細胞には、ヒト、イヌ、ネコ、ブタ、マウス等の哺乳動物から分離（採取）されたＴ細胞を人為的に生体外で培養したＴ細胞、又は当該Ｔ細胞から継代培養されたＴ細胞が含まれる。また、上記分離されたＴ細胞としては、Ｔ細胞を主として含む細胞集団でよく、Ｔ細胞以外に他の細胞も含んでいてもよいが、５０％以上、好ましくは６０％以上、より好ましくは７０％以上、さらに好ましくは８０％以上、最も好ましくは９０％の割合でＴ細胞を含んでいることが好ましい。また、Ｔ細胞は、血液、骨髄液等の体液や、脾臓、胸腺、リンパ節等の組織、若しくは原発腫瘍、転移性腫瘍、がん性腹水等のがん組織に浸潤する免疫細胞から免疫担当細胞を含む細胞集団を分離して得ることができる。前記細胞集団に含まれるＴ細胞の割合を高めるため、分離した前記細胞集団を、必要に応じて定法により更に単離又は精製して得ることもできる。さらに、上記免疫担当細胞における細胞としてＥＳ細胞やｉＰＳ細胞から作製されたものを利用してもよい。かかるＴ細胞としては、アルファ・ベータＴ細胞、ガンマ・デルタＴ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞、腫瘍浸潤Ｔ細胞、メモリーＴ細胞、ナイーブＴ細胞、ＮＫＴ細胞を挙げることができる。なお、免疫担当細胞の由来と投与対象とは同じであっても異なってもよい。さらに、投与対処がヒトの場合において、免疫担当細胞としては、投与対象としての患者本人から採取した自家細胞を用いても、他人から採取した他家細胞を用いてもよい。すなわち、ドナーとレシピエントは一致しても不一致でもよいが、一致することが好ましい。
【００４１】
（免疫担当細胞の作製方法）
本発明の免疫担当細胞の作製方法としては、細胞表面分子をコードする核酸、ＩＬ−７をコードする核酸、及びＣＣＬ１９をコードする核酸を免疫担当細胞に導入して作製する方法を挙げることができ、例えば上記特許文献１又は２に記載の方法などにより、後述する本発明の発現ベクターを免疫担当細胞に導入して作製する方法を好適に挙げることができる。若しくは、受精卵に対して、ヒトメソセリンを特異的に認識する細胞表面分子、ＩＬ−７、及び／又はＣＣＬ１９を発現するベクターを注入して作製したトランスジェニック哺乳動物から免疫担当細胞を精製して得る方法や、かかるトランスジェニック哺乳動物から精製して得た免疫担当細胞に、さらに必要に応じてヒトメソセリンを特異的に認識する細胞表面分子、ＩＬ−７、及び／又はＣＣＬ１９を発現するベクターを導入して作製する方法も挙げることができる。
【００４２】
細胞表面分子をコードする核酸、ＩＬ−７をコードする核酸、及びＣＣＬ１９をコードする核酸や、後述する本発明のベクターを免疫担当細胞に導入する場合の核酸又はベクターの導入方法としては、免疫担当細胞に核酸又はベクターを導入する方法であればよく、例えば、エレクトロポレーション法（Cytotechnology,3,133(1990)）、リン酸カルシウム法（特開平２−２２７０７５号公報）、リポフェクション法（Proc.Natl.Acad.Sci.U．S.A.,84,7413(1987)）、ウイルス感染法等の方法を挙げることができる。かかるウイルス感染法としては、導入するベクターと、パッケージングプラスミドとをＧＰ２−２９３細胞（タカラバイオ社製）、Ｐｌａｔ−ＧＰ細胞（コスモ・バイオ社製）、ＰＧ１３細胞（ATCC CRL-10686）、ＰＡ３１７細胞（ATCC CRL-9078）などのパッケージング細胞にトランスフェクションして組換えウイルスを作製し、かかる組換えウイルスを免疫担当細胞細胞に感染させる方法（上記特許文献２）を挙げることができる。
【００４３】
上記「ヒトメソセリンを特異的に認識する細胞表面分子、ＩＬ−７、及びＣＣＬ１９を発現する免疫担当細胞」をベクターを用いて作製する場合には、以下のいずれかの方法によって作製することができる。
【００４４】
（１）ヒトメソセリンを特異的に認識する細胞表面分子をコードする核酸、ＩＬ−７をコードする核酸及びＣＣＬ１９をコードする核酸を含有し、ヒトメソセリンを特異的に認識する細胞表面分子、ＩＬ−７及びＣＣＬ１９を発現するベクターを免疫担当細胞に導入する方法；
（２）ヒトメソセリンを特異的に認識する細胞表面分子をコードする核酸を含有し、ヒトメソセリンを特異的に認識する細胞表面分子を発現するベクター、及びＩＬ−７をコードする核酸及びＣＣＬ１９をコードする核酸を含有し、ＩＬ−７及びＣＣＬ１９を発現するベクター、の２種類のベクターを同時に、又は段階的に免疫担当細胞に導入する方法；
（３）ヒトメソセリンを特異的に認識する細胞表面分子をコードする核酸とＩＬ−７をコードする核酸を含有し、ヒトメソセリンを特異的に認識する細胞表面分子とＩＬ−７を発現するベクター、及びＣＣＬ１９をコードする核酸を含有し、ＣＣＬ１９を発現するベクター、の２種類のベクターを同時に、又は段階的に免疫担当細胞に導入する方法；
（４）ヒトメソセリンを特異的に認識する細胞表面分子をコードする核酸とＣＣＬ１９をコードする核酸を含有し、ヒトメソセリンを特異的に認識する細胞表面分子とＣＣＬ１９を発現するベクター、及びＩＬ−７をコードする核酸を含有し、ＩＬ−７を発現するベクター、の２種類のベクターを同時に、又は段階的に免疫担当細胞に導入する方法；
（５）ヒトメソセリンを特異的に認識する細胞表面分子をコードする核酸とＩＬ−７をコードする核酸を含有し、ヒトメソセリンを特異的に認識する細胞表面分子とＩＬ−７を発現するベクター、及びヒトメソセリンを特異的に認識する細胞表面分子をコードする核酸とＣＣＬ１９をコードする核酸を含有し、ヒトメソセリンを特異的に認識する細胞表面分子とＣＣＬ１９を発現するベクター、の２種類のベクターを同時に、又は段階的に免疫担当細胞に導入する方法；
（６）ヒトメソセリンを特異的に認識する細胞表面分子をコードする核酸とＩＬ−７をコードする核酸を含有し、ヒトメソセリンを特異的に認識する細胞表面分子とＩＬ−７を発現するベクター、及びＩＬ−７をコードする核酸とＣＣＬ１９をコードする核酸を含有し、ＩＬ−７とＣＣＬ１９を発現するベクター、の２種類のベクターを同時に、又は段階的に免疫担当細胞に導入する方法；
（７）ヒトメソセリンを特異的に認識する細胞表面分子をコードする核酸とＣＣＬ１９をコードする核酸を含有し、ヒトメソセリンを特異的に認識する細胞表面分子とＣＣＬ１９を発現するベクター、及びＩＬ−７をコードする核酸とＣＣＬ１９をコードする核酸を含有し、ＩＬ−７とＣＣＬ１９を発現するベクター、の２種類のベクターを同時に、又は段階的に免疫担当細胞に導入する方法；
（８）ヒトメソセリンを特異的に認識する細胞表面分子をコードする核酸を含有し、ヒトメソセリンを特異的に認識する細胞表面分子を発現するベクター、ＩＬ−７をコードする核酸を含有し、ＩＬ−７を発現するベクター、及びＣＣＬ１９をコードする核酸を含有し、ＣＣＬ１９を発現するベクターの３種類のベクターを同時に、又は段階的に免疫担当細胞に導入する方法；
【００４５】
さらに、上記「ヒトメソセリンを特異的に認識する細胞表面分子、ＩＬ−７、及びＣＣＬ１９を発現する免疫担当細胞」をベクターを用いて作製する場合には、予めヒトメソセリンを特異的に認識する細胞表面分子を発現する免疫担当細胞を調製し、かかるヒトメソセリンを特異的に認識する細胞表面分子を発現する免疫担当細胞を用いて以下のいずれかの方法によって作製することもできる。
（１）ＩＬ−７をコードする核酸及びＣＣＬ１９をコードする核酸を含有し、ＩＬ−７及びＣＣＬ１９を発現するベクターを上記ヒトメソセリンを特異的に認識する細胞表面分子を発現する免疫担当細胞に導入する方法；
（２）ＩＬ−７をコードする核酸を含有し、ＩＬ−７を発現するベクター、及びＣＣＬ１９をコードする核酸を含有し、ＣＣＬ１９を発現するベクターの２種類を同時に、又は段階的に上記ヒトメソセリンを特異的に認識する細胞表面分子を発現する免疫担当細胞に導入する方法；
【００４６】
上記それぞれの免疫担当細胞を用いる場合には、当該免疫担当細胞の培養物であって、当該免疫細胞を含有するものを用いてもよい。また、ヒトメソセリンを特異的に認識する細胞表面分子をコードする核酸、ＩＬ−７をコードする核酸、及びＣＣＬ１９をコードする核酸が免疫担当細胞のゲノムに組み込まれた状態でも、ゲノムに組み込まれない状態（例えば、エピソーマルな状態）で用いてもよい。さらに、上記それぞれの免疫担当細胞を用いる場合には、ヒトメソセリンを特異的に認識する細胞表面分子をコードする核酸、ＩＬ−７をコードする核酸、及びＣＣＬ１９をコードする核酸が免疫担当細胞のゲノムに組み込まれた免疫担当細胞と、ヒトメソセリンを特異的に認識する細胞表面分子をコードする核酸、ＩＬ−７をコードする核酸、及びＣＣＬ１９をコードする核酸がゲノムに組み込まれない免疫担当細胞の混合物を用いてもよい。
【００４７】
また、上記のように「ヒトメソセリンを特異的に認識する細胞表面分子、ＩＬ−７、及びＣＣＬ１９を発現する免疫担当細胞」は、上記ヒトメソセリンを特異的に認識する細胞表面分子、ＩＬ−７をコードする核酸、及びＣＣＬ１９をコードする核酸を、公知の遺伝子編集技術を用いて、適切なプロモーターの制御下で発現可能なように、細胞のゲノムに組み込むことによって製造してもよい。公知の遺伝子編集術としては、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、ＴＡＬＥＮ（転写活性化様エフェクターヌクレアーゼ）、ＣＲＩＳＰＲ（Ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ  Ｒｅｇｕｌａｒｌｙ  Ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ  Ｓｈｏｒｔ  Ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ  Ｒｅｐｅａｔ）−Ｃａｓシステム等のエンドヌクレアーゼを用いる技術が挙げられる。また、例えば、ヒトメソセリンを特異的に認識するＣＡＲ（抗ヒトメソセリン  ＣＡＲ）発現−免疫担当細胞に他の外来タンパク質を発現させる場合も同様に、遺伝子編集技術を用いて、他の外来タンパク質をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを、適切なプロモーターの制御下で発現可能なように、細胞のゲノムに組み込んでもよい。具体的には、適切なプロモーターに機能的に連結された抗ヒトメソセリン  ＣＡＲ（又は他のタンパク質）をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを、細胞ゲノムの非コード領域等に組み込む方法；抗ヒトメソセリン  ＣＡＲ（又は他のタンパク質）をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを、細胞ゲノムの内在性プロモーターの下流に組み込む方法等が挙げられる。内在性プロモーターとしては、例えば、ＴＣＲα、ＴＣＲβのプロモーター等が挙げられる。
【００４８】
（投与対象）
上記投与対象としては、哺乳動物又は哺乳動物細胞を好適に挙げることができ、かかる哺乳動物の中でも、ヒト、マウス、イヌ、ラット、モルモット、ウサギ、トリ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ウマ、ネコ、サル、チンパンジーをより好適に挙げることができ、ヒトを特に好適に挙げることができる。
【００４９】
（発現ベクター）
本発明の発現ベクターは、免疫担当細胞又はその前駆細胞と接触させて細胞内に導入し、そこにコードされた所定のタンパク質（ポリペプチド）を免疫担当細胞において発現させることにより、本発明の免疫担当細胞を作製することができるものであればよく、どのような実施形態であるかは特に限定されるものではない。当業者であれば、所望のタンパク質（ポリペプチド）を免疫担当細胞において発現させることのできる発現ベクターを設計し、作製することが可能である。例えば、本発明のヒトメソセリンを特異的に認識する細胞表面分子をコードする核酸、ＩＬ―７をコードする核酸、及びＣＣＬ１９をコードする核酸を含有する発現ベクターとしては、上記本発明の免疫担当細胞を作製するための以下の（ａ）〜（ｅ）のいずれかの発現ベクター（以下、「ＩＬ−７／ＣＣＬ１９発現−抗ヒトメソセリン  ベクター」ともいう）を挙げることができる。なお、以下の「２つの発現ベクター」とは２種類の発現ベクターのセットを意味し、「３つの発現ベクター」とは３種類の発現ベクターのセットを意味する。
（ａ）ヒトメソセリンを特異的に認識する細胞表面分子をコードする核酸、ＩＬ−７をコードする核酸、及びＣＣＬ１９をコードする核酸を含有する発現ベクター：
（ｂ）以下の（ｂ−１）及び（ｂ−２）の２つの発現ベクター：
（ｂ−１）ヒトメソセリンを特異的に認識する細胞表面分子をコードする核酸を含有する発現ベクター；
（ｂ−２）ＩＬ−７をコードする核酸、及びＣＣＬ１９をコードする核酸を含有する発現ベクター；
（ｃ）以下の（ｃ−１）及び（ｃ−２）の２つの発現ベクター：
（ｃ−１）ヒトメソセリンを特異的に認識する細胞表面分子をコードする核酸、及びＩＬ−７をコードする核酸を含有する発現ベクター；
（ｃ−２）ＣＣＬ１９をコードする核酸を含有する発現ベクター；
（ｄ）以下の（ｄ−１）及び（ｄ−２）の２つの発現ベクター：
（ｄ−１）ＩＬ−７をコードする核酸を含有する発現ベクター；
（ｄ−２）ヒトメソセリンを特異的に認識する細胞表面分子をコードする核酸、及びＣＣＬ１９をコードする核酸を含有する発現ベクター；
（ｅ）以下の（ｅ−１）及び（ｅ−２）の２つの発現ベクター：
（ｅ−１）ヒトメソセリンを特異的に認識する細胞表面分子をコードする核酸、及びＩＬ−７をコードする核酸を含有する発現ベクター；
（ｅ−２）ヒトメソセリンを特異的に認識する細胞表面分子をコードする核酸、及びＣＣＬ１９をコードする核酸を含有する発現ベクター；
（ｆ）以下の（ｆ−１）及び（ｆ−２）の２つの発現ベクター：
（ｆ−１）ヒトメソセリンを特異的に認識する細胞表面分子をコードする核酸、及びＩＬ−７をコードする核酸を含有する発現ベクター；
（ｆ−２）ＩＬ−７をコードする核酸、及びＣＣＬ１９をコードする核酸を含有する発現ベクター；
（ｇ）以下の（ｇ−１）及び（ｇ−２）の２つの発現ベクター：
（ｇ−１）ヒトメソセリンを特異的に認識する細胞表面分子をコードする核酸、及びＣＣＬ１９をコードする核酸を含有する発現ベクター；
（ｇ−２）ＩＬ−７をコードする核酸、及びＣＣＬ１９をコードする核酸を含有する発現ベクター；
（ｈ）以下の（ｈ−１）、（ｈ−２）及び（ｈ−３）の３つの発現ベクター：
（ｈ−１）ヒトメソセリンを特異的に認識する細胞表面分子をコードする核酸を含有する発現ベクター；
（ｈ−２）ＩＬ−７をコードする核酸を含有する発現ベクター；
（ｈ−３）ＣＣＬ１９をコードする核酸を含有する発現ベクター；
【００５０】
上記ＩＬ−７／ＣＣＬ１９発現−抗ヒトメソセリン  ベクターは、さらに、ＩＬ−１５、ＣＣＬ２１、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１７、ＩＬ−１８、ＩＰ−１０、Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ−γ、ＭＩＰ−１ａｌｐｈａ、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｍ−ＣＳＦ、ＴＧＦ−β、ＴＮＦ−α、チェックポイント阻害抗体若しくはその断片等の他の免疫機能制御因子をコードする核酸を含有してもよいが、上記他の免疫制御因子をコードする核酸としては、ＩＬ−１２以外の免疫機能制御因子をコードする核酸であることが好ましい。
【００５１】
（核酸）
本明細書において、「核酸」とは、ヌクレオチド及び該ヌクレオチドと同等の機能を有する分子が重合した分子であればいかなるものでもよく、例えば、リボヌクレオチドの重合体であるＲＮＡ、デオキシリボヌクレオチドの重合体であるＤＮＡ、リボヌクレオチド及びデオキシリボヌクレオチドが混合した重合体、及び、ヌクレオチド類似体を含むヌクレオチド重合体を挙げることができ、さらに、核酸誘導体を含むヌクレオチド重合体であってもよい。また、核酸は、一本鎖核酸又は二本鎖核酸であってもよい。また二本鎖核酸には、一方の鎖に対し、他方の鎖がストリンジェントな条件でハイブリダイズする二本鎖核酸も含まれる。
【００５２】
上記ヌクレオチド類似体としては、ＲＮＡ又はＤＮＡと比較して、ヌクレアーゼ耐性の向上若しくは、安定化させるため、相補鎖核酸とのアフィニティーを上げるため、あるいは細胞透過性を上げるため、あるいは可視化させるために、リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、ＲＮＡ又はＤＮＡに修飾を施した分子であればいかなる分子でもよい。ヌクレオチド類似体としては、天然に存在する分子でも非天然の分子でもよく、例えば、糖部修飾ヌクレオチド類似体やリン酸ジエステル結合修飾ヌクレオチド類似体等が挙げられる。
【００５３】
上記糖部修飾ヌクレオチド類似体としては、ヌクレオチドの糖の化学構造の一部あるいは全てに対し、任意の化学構造物質を付加あるいは置換したものであればいかなるものでもよく、その具体例としては、２’−Ｏ−メチルリボースで置換されたヌクレオチド類似体、２’−Ｏ−プロピルリボースで置換されたヌクレオチド類似体、２’−メトキシエトキシリボースで置換されたヌクレオチド類似体、２’−Ｏ−メトキシエチルリボースで置換されたヌクレオチド類似体、２’−Ｏ−[２−(グアニジウム)エチル]リボースで置換されたヌクレオチド類似体、２’−フルオロリボースで置換されたヌクレオチド類似体、糖部に架橋構造を導入することにより２つの環状構造を有する架橋構造型人工核酸（Bridged Nucleic Acid）（ＢＮＡ）、より具体的には、２’位の酸素原子と４’位の炭素原子がメチレンを介して架橋したロックド人工核酸（Locked Nucleic Acid）（ＬＮＡ）、及びエチレン架橋構造型人工核酸（Ethylene bridged nucleic acid）（ＥＮＡ）［Nucleic Acid Research, 32, e175(2004)］が挙げられ、さらにペプチド核酸（ＰＮＡ）［Acc. Chem. Res., 32, 624(1999)］、オキシペプチド核酸（ＯＰＮＡ）［J. Am．Chem. Soc., 123， 4653 (2001)］、及びペプチドリボ核酸（ＰＲＮＡ）［J．Am. Chem. Soc., 122, 6900 (2000)］等を挙げることができる。
【００５４】
上記リン酸ジエステル結合修飾ヌクレオチド類似体としては、ヌクレオチドのリン酸ジエステル結合の化学構造の一部あるいは全てに対し、任意の化学物質を付加あるいは置換したものであればいかなるものでもよく、その具体例としては、ホスフォロチオエート結合に置換されたヌクレオチド類似体、Ｎ３’−Ｐ５’ホスフォアミデート結合に置換されたヌクレオチド類似体等を挙げることができる［細胞工学， 16, 1463-1473 (1997)］［RNAi法とアンチセンス法、講談社(2005)］。
【００５５】
上記核酸誘導体としては、核酸に比べ、ヌクレアーゼ耐性を向上させるため、安定化させるため、相補鎖核酸とのアフィニティーを上げるため、細胞透過性を上げるため、あるいは可視化させるために、該核酸に別の化学物質を付加した分子であればいかなる分子でもよく、その具体例としては、５’−ポリアミン付加誘導体、コレステロール付加誘導体、ステロイド付加誘導体、胆汁酸付加誘導体、ビタミン付加誘導体、Ｃｙ５付加誘導体、Ｃｙ３付加誘導体、６−ＦＡＭ付加誘導体、及びビオチン付加誘導体等を挙げることができる。
【００５６】
（ヒトメソセリンを特異的に認識する細胞表面分子、ＩＬ−７、ＣＣＬ１９等をコードする核酸）
上記ヒトメソセリンを特異的に認識する細胞表面分子をコードする核酸、ＩＬ−７をコードする核酸、及びＣＣＬ１９をコードする核酸はそれぞれ哺乳動物由来の核酸を挙げることができ、ヒト由来の核酸を好適に挙げることができる。上記それぞれの核酸は、本発明の発現ベクターを導入する細胞の種類に応じて適宜選択でき、かかるそれぞれの核酸の配列情報は、公知の文献やＮＣＢＩ（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/guide/）等のデータベースを検索して適宜入手することができる。
【００５７】
ヒトメソセリンを特異的に認識する細胞表面分子をコードする核酸としては、ヒトメソセリンを特異的に認識するＣＡＲをコードする核酸を挙げることができる。
【００５８】
上記ヒトメソセリンを特異的に認識するＣＡＲに含まれる一本鎖抗体をコードする核酸としては、具体的には、以下の（１−１Ｄ）〜（３−１Ｄ）を挙げることができる。
（１−１Ｄ）配列番号１３に示されるアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ１、配列番号１４に示されるアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ２、及び配列番号１５に示されるアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域と、配列番号１６に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ１、配列番号１７に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号１８に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域を含む一本鎖抗体をコードする核酸；
（２−１Ｄ）配列番号１３に示されるアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ１、配列番号１４に示されるアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ２、及び配列番号１５に示されるアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域と、配列番号１９に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ１、配列番号１７に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号１８に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域を含む一本鎖抗体をコードする核酸；
（３−１Ｄ）配列番号２０に示されるアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ１、配列番号２１に示されるアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ２、及び配列番号２２に示されるアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域と、配列番号２３に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ１、配列番号２４に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号２５に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域を含む一本鎖抗体をコードする核酸；
【００５９】
上記ヒトメソセリンを特異的に認識するＣＡＲに含まれる一本鎖抗体をコードする核酸の他の態様１としては、具体的には、以下の（１−２Ｄ）〜（５−２Ｄ）を挙げることができる。
（１−２Ｄ）配列番号１に示されるアミノ酸配列と８５％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９８％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなる重鎖可変領域と、配列番号２に示されるアミノ酸配列と８５％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９８％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域とを含む一本鎖抗体をコードする核酸；
（２−２Ｄ）配列番号３に示されるアミノ酸配列と８５％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９８％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなる重鎖可変領域と、配列番号４に示されるアミノ酸配列と８５％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９８％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域とを含む一本鎖抗体をコードする核酸；
（３−２Ｄ）配列番号５に示されるアミノ酸配列と８５％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９８％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなる重鎖可変領域と、配列番号６に示されるアミノ酸配列と８５％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９８％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域とを含む一本鎖抗体をコードする核酸；
（４−２Ｄ）配列番号１に示されるアミノ酸配列と８５％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９８％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなる重鎖可変領域と、配列番号４に示されるアミノ酸配列と８５％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９８％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域とを含む一本鎖抗体をコードする核酸；
（５−２Ｄ）配列番号３に示されるアミノ酸配列と８５％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９８％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなる重鎖可変領域と、配列番号２に示されるアミノ酸配列と８５％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９８％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域とを含む一本鎖抗体をコードする核酸；
【００６０】
上記ヒトメソセリンを特異的に認識するＣＡＲに含まれる一本鎖抗体をコードする核酸の他の態様２としては、具体的には、以下の（１−３Ｄ）〜（５−３Ｄ）を挙げることができる。
（１−３Ｄ）配列番号１に示されるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域と、配列番号２に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域とを含む一本鎖抗体をコードする核酸；
（２−３Ｄ）配列番号３に示されるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域と、配列番号４に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域とを含む一本鎖抗体をコードする核酸；
（３−３Ｄ）配列番号５に示されるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域と、配列番号６に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域とを含む一本鎖抗体をコードする核酸；
（４−３Ｄ）配列番号１に示されるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域と、配列番号４に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域とを含む一本鎖抗体をコードする核酸；
（５−３Ｄ）配列番号３に示されるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域と、配列番号２に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域とを含む一本鎖抗体をコードする核酸；
【００６１】
上記ヒトメソセリンを特異的に認識するＣＡＲに含まれる一本鎖抗体をコードする核酸の他の態様３としては、具体的には、以下の（１−４Ｄ）〜（９−４Ｄ）を挙げることができる。
（１−４Ｄ）配列番号１に示されるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域、配列番号２６に示されるアミノ酸配列からなるペプチドリンカー、及び配列番号２に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を順次含む一本鎖抗体をコードする核酸；
（２−４Ｄ）配列番号３に示されるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域、配列番号２６に示されるアミノ酸配列からなるペプチドリンカー、及び配列番号４に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域とを順次含む一本鎖抗体をコードする核酸；
（３−４Ｄ）配列番号２に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域、配列番号２６に示されるアミノ酸配列からなるペプチドリンカー、及び配列番号１に示されるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域を順次含む一本鎖抗体をコードする核酸；
（４−４Ｄ）配列番号１に示されるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域、配列番号２７に示されるアミノ酸配列からなるペプチドリンカー、及び配列番号２に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域とを順次含む一本鎖抗体をコードする核酸；
（５−４Ｄ）配列番号２に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域、配列番号２７に示されるアミノ酸配列からなるペプチドリンカー、及び配列番号１に示されるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域とを順次含む一本鎖抗体をコードする核酸；
（６−４Ｄ）配列番号５に示されるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域、配列番号２６に示されるアミノ酸配列からなるペプチドリンカー、及び配列番号６に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を順次含む一本鎖抗体をコードする核酸；
（７−４Ｄ）配列番号６に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域、配列番号２６に示されるアミノ酸配列からなるペプチドリンカー、及び配列番号５に示されるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域とを順次含む一本鎖抗体をコードする核酸；
（８−４Ｄ）配列番号５に示されるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域、配列番号２７に示されるアミノ酸配列からなるペプチドリンカー、及び配列番号６に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を順次含む一本鎖抗体をコードする核酸；
（９−４Ｄ）配列番号６に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域、配列番号２７に示されるアミノ酸配列からなるペプチドリンカー、及び配列番号５に示されるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域とを順次含む一本鎖抗体をコードする核酸；
【００６２】
上記ＣＡＲに含まれる細胞膜貫通領域のポリペプチドをコードする核酸としては、配列番号８に示すアミノ酸配列と８５％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９８％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むヒトＣＤ８細胞膜貫通領域のポリペプチドをコードする核酸を挙げることができる。また、上記ＣＡＲに含まれる免疫担当細胞活性化シグナル伝達領域におけるＣＤ２８、４−１ＢＢ、及びＣＤ３ζの細胞内領域のポリペプチドをコードする核酸としては、配列番号８に示すヒトＣＤ２８の細胞内領域のアミノ酸配列と８５％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９８％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列配列を含み、配列番号８に示すアミノ酸配列と同等の作用を有するポリペプチドをコードする核酸、配列番号９に示すヒト４−１ＢＢの細胞内領域のアミノ酸配列と８５％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９８％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列配列を含み、配列番号９に示すアミノ酸配列と同等の作用を有するポリペプチドをコードする核酸、配列番号１０に示すヒトＣＤ３ζの細胞内領域のアミノ酸配列と８５％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９８％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列配列を含み、配列番号１０に示すアミノ酸配列と同等の作用を有するポリペプチドをコードする核酸又はそれらの組み合わせ、好ましくは、上流（５’末端側）から順に配列番号８に示すヒトＣＤ２８の細胞内領域のポリペプチドの細胞内領域のポリペプチドをコードする核酸、配列番号９に示すヒト４−１ＢＢの細胞内領域のポリペプチドをコードする核酸、配列番号１０に示すヒトＣＤ３ζの細胞内領域のポリペプチドをコードする核酸を挙げることができる。
【００６３】
ＩＬ−７をコードする核酸としては、配列番号２８に示すアミノ酸配列と８５％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９８％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列配列を含み、配列番号２８に示すアミノ酸配列と同等の作用を有するポリペプチドをコードする核酸、具体的には配列番号３０に示す塩基配列からなる核酸を挙げることができ、ＩＬ−７における細胞増殖率又は細胞生存率の亢進作用を有する限り、配列番号３０に示す塩基配列からなる核酸と８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、最も好ましくは９８％以上の配列同一性を有する核酸でもよい。ＣＣＬ１９をコードする核酸としては、配列番号２９に示すアミノ酸配列と８５％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９８％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、配列番号２９に示すアミノ酸配列と同等の作用を有するポリペプチドをコードする核酸、具体的には配列番号３１に示す塩基配列からなる核酸を挙げることができ、ＣＣＬ１９における細胞の遊走作用を有する限り、配列番号３１に示す塩基配列からなる核酸と８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、最も好ましくは９８％以上の配列同一性を有する核酸を用いてもよい。
【００６４】
（自殺遺伝子）
また、本発明の発現ベクターには、自殺遺伝子をコードする核酸を含んでいてもよい。自殺遺伝子とは、発現することによって直接的に、あるいは二次的に細胞毒性を有する物質を誘導し、自らの細胞を死に至らしめる機能を有する遺伝子を意味する。本発明の発現ベクターに自殺遺伝子をコードする核酸を含ませることによって、がんの治療経過に応じて、たとえば腫瘍が消失した場合に自殺遺伝子の機能を活性化する薬剤を投与し、生体内の免疫担当細胞を制御することができる。また、ＩＬ−７又はＣＣＬ１９は他のサイトカインとは異なり、副作用としてサイトカイン放出症候群や遺伝子導入細胞の腫瘍化を引き起こす可能性は低い。しかしながら、本発明の発現ベクターを導入した免疫担当細胞の機能が高まることで、標的のがん組織を攻撃する際に放出するサイトカイン等が予想外にも周辺組織へ影響することがあり得る。かかる場合には、本発明の発現ベクターに自殺遺伝子をコードする核酸を含ませることによって、サイトカイン放出症候群になるリスクを確実に低減させることが可能となる。
【００６５】
自殺遺伝子としては、以下の文献に記載された単純ヘルペスウイルスのチミジンキナーゼ（ＨＳＶ−ＴＫ）や誘導性カスパーゼ９（ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ  ｃａｓｐａｓｅ  ９）をコードする遺伝子等を挙げることができ、かかる遺伝子の機能を活性化する薬剤としては、前者に対してはガンシクロビル、後者に対しては二量体誘導化合物（chemical induction of dimerization:CID）であるＡＰ１９０３を挙げることができる。
【００６６】
（核酸配列情報の入手及び核酸の作製）
本発明の発現ベクターに含まれる上記それぞれの核酸は、天然由来の核酸でも人工合成の核酸でもよく、本発明の発現ベクターを導入する細胞の種類に応じて適宜選択でき、配列情報は、公知の文献やＮＣＢＩ（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/guide/）等のデータベースを検索して適宜入手することができる。
【００６７】
上記それぞれの核酸は、それぞれをコードする核酸の塩基配列の情報に基づき、化学合成する方法や、ＰＣＲによって増幅する方法等の公知の技術によって作製することができる。なお、アミノ酸をコードするための選択されるコドンは、目的の宿主細胞における核酸の発現を最適化するために改変されてもよい。
【００６８】
（各核酸の配置）
本発明の発現ベクターにおける、（ａ）ヒトメソセリンを特異的に認識する細胞表面分子をコードする核酸、ＩＬ−７をコードする核酸、及びＣＣＬ１９をコードする核酸を含有する発現ベクターは、いずれの核酸がいずれの上流又は下流に配置されてもよい。具体的には、ヒトメソセリンを特異的に認識する細胞表面分子をコードする核酸として抗ヒトメソセリンＣＡＲをコードする核酸を含有する場合を例にすると、上流（５’末端側）から順に抗ヒトメソセリンＣＡＲをコードする核酸、ＩＬ−７をコードする核酸及びＣＣＬ１９をコードする核酸であっても、抗ヒトメソセリンＣＡＲをコードする核酸、ＣＣＬ１９をコードする核酸及びＩＬ−７をコードする核酸であっても、ＩＬ−７をコードする核酸、ＣＣＬ１９をコードする核酸及び抗ヒトメソセリンＣＡＲをコードする核酸であっても、ＩＬ−７をコードする核酸、抗メソセリンＣＡＲをコードする核酸及びＣＣＬ１９をコードする核酸であっても、ＣＣＬ１９をコードする核酸、抗メソセリンＣＡＲをコードする核酸、及びＩＬ−７をコードする核酸であっても、ＣＣＬ１９をコードする核酸、ＩＬ−７をコードする核酸及び抗ヒトメソセリンＣＡＲをコードする核酸であってもよい。
【００６９】
本発明のベクターにおける、（ｂ−２）、（ｆ−２）、及び（ｇ−２）におけるＩＬ−７をコードする核酸、及びＣＣＬ１９をコードする核酸を含有する発現ベクターにおいて、ＩＬ−７をコードする核酸及びＣＣＬ１９をコードする核酸の配置は特に制限されず、ＩＬ−７をコードする核酸に対してＣＣＬ１９をコードする核酸が上流に配置されても下流に配置されてもよい。
【００７０】
本発明のベクターにおける、（ｃ−１）、（ｅ−１）及び（ｆ−１）におけるヒトメソセリンを特異的に認識する細胞表面分子をコードする核酸、及びＩＬ−７をコードする核酸を含有する発現ベクターにおいて、ヒトメソセリンを特異的に認識する細胞表面分子をコードする核酸及びＩＬ−７をコードする核酸の配置は特に制限されず、ヒトメソセリンを特異的に認識する細胞表面分子をコードする核酸に対してＩＬ−７をコードする核酸が上流に配置されても下流に配置されてもよい。
【００７１】
本発明のベクターにおける、（ｄ−２）、（ｅ−２）及び（ｇ−１）におけるヒトメソセリンを特異的に認識する細胞表面分子をコードする核酸、及びＣＣＬ１９をコードする核酸を含有する発現ベクターにおいて、ヒトメソセリンを特異的に認識する細胞表面分子をコードする核酸及びＣＣＬ１９をコードする核酸の配置は特に制限されず、ヒトメソセリンを特異的に認識する細胞表面分子をコードする核酸に対してＣＣＬ１９をコードする核酸が上流に配置されても下流に配置されてもよい。
【００７２】
（転写）
なお、メソセリンを特異的に認識する細胞表面分子をコードする核酸、ＩＬ−７をコードする核酸及びＣＣＬ１９をコードする核酸、自殺遺伝子をコードする核酸はそれぞれ別のプロモーターにより転写されてもよく、内部リボソームエントリー部位（ＩＲＥＳ：ｉｎｔｅｒｎａｌ  ｒｉｂｏｚｙｍｅ  ｅｎｔｒｙ  ｓｉｔｅ）又は自己切断型２Ａペプチドを使用して一つのプロモーターで転写されてもよい。
【００７３】
内部リボソームエントリー部位（ＩＲＥＳ）又は自己切断型２Ａペプチドを使用して一つのプロモーターでＩＬ−７をコードする核酸及びＣＣＬ１９をコードする核酸を転写させる場合における上記各核酸の間や、上記メソセリンを特異的に認識する細胞表面分子をコードする核酸を含む場合における当該核酸とＩＬ−７をコードする核酸及びＣＣＬ１９をコードする核酸との間には、それぞれの核酸を発現し得る限り、任意の核酸を含んでもよいが、自己切断型ペプチド（２Ａペプチド）、又はＩＲＥＳをコードする配列、好ましくは２Ａペプチドをコードする配列を介して連結されていることが好ましい。かかる配列を用いて連結することにより、それぞれの核酸を効率よく発現させることが可能となる。
【００７４】
２Ａペプチドとは、ウイルス由来の自己切断型ペプチドであり、配列番号３２で示されるアミノ酸配列中のＧ−Ｐ間（Ｃ末端から１残基の位置）が小胞体で切断される特徴を有する（Szymczak et al., Expert Opin. Biol. Ther.5(5):627-638(2005)）。そのため、２Ａペプチドを介してその前後に組み込まれた核酸は、細胞内で互いに独立して発現することとなる。
【００７５】
前記２Ａペプチドとしては、ピコルナウイルス、ロタウイルス、昆虫ウイルス、アフトウイルス又はトリパノソーマウイルス由来の２Ａペプチドであることが好ましく、配列番号３３に示すピコルナウイルス由来の２Ａペプチド（Ｆ２Ａ）であることがより好ましい。
【００７６】
（ベクターの種類）
本発明の発現ベクターにおけるベクターの種類としては直鎖状でも環状でもよく、プラスミド等の非ウイルスベクターでも、ウイルスベクターでも、トランスポゾンによるベクターでもよい。また、かかるベクターには、プロモーターやターミネーター等の制御配列や、薬剤耐性遺伝子、レポーター遺伝子等の選択マーカー配列を含有していてもよい。プロモーター配列の下流に作動可能にＩＬ−７をコードする核酸及びＣＣＬ１９をコードする核酸を配置することで、それぞれの核酸を効率よく転写することが可能となる。
【００７７】
上記プロモーターとしては、レトロウイルスのＬＴＲプロモーター、ＳＶ４０初期プロモーター、サイトメガロウイルスプロモーター、単純ヘルペスウイルスのチミジンキナーゼプロモーター等のウイルス由来プロモーター、ホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ）プロモーター、Ｘｉｓｔプロモーター、β−アクチンプロモーター、ＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモーター等の哺乳類由来プロモーターを挙げることができる。また、テトラサイクリンによって誘導されるテトラサイクリン応答型プロモーター、インターフェロンによって誘導されるＭｘ１プロモーター等を用いてもよい。本発明の発現ベクターにおいて上記特定の物質によって誘導されるプロモーターを用いることによって、たとえば本発明のベクターを含有する免疫担当細胞をがんの治療に用いるための医薬組成物として用いる場合に、がんの治療経過に応じてＩＬ−７及びＣＣＬ１９の発現の誘導を制御することが可能となる。
【００７８】
前記ウイルスベクターとしては、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクターを挙げることができ、レトロウイルスベクターを好適に挙げることができ、ｐＭＳＧＶベクター（Tamada k et al., Clin Cancer Res 18:6436-6445(2002)）やｐＭＳＣＶベクター（タカラバイオ社製）をより好適に挙げることができる。レトロウイルスベクターを用いれば、導入遺伝子はホスト細胞のゲノムへ取り込まれるため、長期間かつ安定に発現することが可能となる。
【００７９】
免疫担当細胞における本発明の発現ベクター含有の確認は、例えばＣＡＲをコードする核酸を含有する場合には、フローサイトメトリー、ノザンブロッティング、サザンブロッティング、ＲＴ−ＰＣＲ等のＰＣＲ、ＥＬＩＳＡ、ウェスタンブロッティングによってＣＡＲの発現を調べることができ、本発明の発現ベクターにマーカー遺伝子を含有する場合には、当該発現ベクターに挿入されたマーカー遺伝子の発現を調べることによって確認することができる。
【００８０】
（医薬組成物）
本発明の医薬組成物は、本発明の免疫担当細胞と薬学的に許容される添加剤を含有していていればよく、前記添加剤としては、生理食塩水、緩衝生理食塩水、細胞培養培地、デキストロース、注射用水、グリセロール、エタノール及びこれらの組合せ、安定剤、可溶化剤及び界面活性剤、緩衝剤及び防腐剤、等張化剤、充填剤、並びに潤滑剤を挙げることができる。また、上記本発明の医薬組成物における免疫担当細胞には、免疫担当細胞の活性化を誘導するシグナル伝達領域を備えていることから、本発明の医薬組成物はがんの治療に用いるための医薬組成物としてもよい。かかるがんの治療に用いるための医薬組成物には、がんの治療に用いるための使用方法等を記載した添付文書、ラベル、パッケージ等を包含してもよい。さらに、上記本発明の医薬組成物における免疫担当細胞には、腫瘍の再発抑制効果を有することから、本発明の医薬組成物は腫瘍再発の抑制に用いるための医薬組成物としてもよい。かかる腫瘍再発の抑制に用いるための医薬組成物には、腫瘍再発の抑制に用いるための使用方法等を記載した添付文書、ラベル、パッケージ等を包含してもよい。
【００８１】
本発明の医薬組成物は、当業者に既知の方法を用いて、それを必要とする被検体に投与することができ、投与方法としては、静脈内、腫瘍内、皮内、皮下、筋肉内、腹腔内、動脈内、髄内、心臓内、関節内、滑液嚢内、頭蓋内、髄腔内、及びくも膜下（髄液）への注射を挙げることができる。
【００８２】
本発明の医薬組成物は、１日４回、３回、２回又は１回、１日おき、２日おき、３日おき、４日おき、５日おき、週１回、７日おき、８日おき、９日おき、週２回、月１回又は月２回独立して、一回又は数回に分けて投与する方法を挙げることができる。
【００８３】
本発明の医薬組成物におけるがんとしては特に限定されないが、がん組織においてメソセリンを発現するがん種、又はメソセリンを発現するがん細胞由来のがん種であることが好ましく、中皮腫、大腸がん（結腸がん又は直腸がん）、膵臓がん、胸腺がん、胆管がん、肺がん（腺がん、扁平上皮がん、腺扁平上皮がん、未分化がん、大細胞がん、小細胞がん）、皮膚がん、乳がん、前立腺がん、膀胱がん、膣がん、頸部がん、子宮がん、肝臓がん、腎臓がん、膵臓がん、脾臓がん、気管がん、気管支がん、結腸がん、小腸がん、胃がん、食道がん、胆嚢がん、精巣がん、卵巣がん等のがんや、骨組織、軟骨組織、脂肪組織、筋組織、血管組織及び造血組織のがんのほか、軟骨肉腫、ユーイング肉腫、悪性血管内皮腫、悪性シュワン腫、骨肉腫、軟部組織肉腫等の肉腫や、肝芽腫、髄芽腫、腎芽腫、神経芽腫、膵芽腫、胸膜肺芽腫、網膜芽腫等の芽腫や、胚細胞腫瘍を挙げることができる。投与量としては、治療的有効量を投与することができ、例えば、１回の投与において、投与細胞の個数として、１×１０４〜１×１０１０個、好ましくは１×１０５〜１×１０９個、より好ましくは５×１０６〜５×１０８個を挙げることができる。
【００８４】
本発明の医薬組成物は、他の抗がん剤と併用して用いることができる。他の抗がん剤としては、シクロホスファミド、ベンダムスチン、イオスファミド、ダカルバジン等のアルキル化薬、ペントスタチン、フルダラビン、クラドリビン、メソトレキセート、５−フルオロウラシル、６−メルカプトプリン、エノシタビン等の代謝拮抗薬、リツキシマブ、セツキシマブ、トラスツズマブ等の分子標的薬、イマチニブ、ゲフェチニブ、エルロチニブ、アファチニブ、ダサチニブ、スニチニブ、トラメチニブ等のキナーゼ阻害剤、ボルテゾミブ等のプロテアソーム阻害剤、シクロスポリン、タクロリムス等のカルシニューリン阻害薬、イダルビジン、ドキソルビシンマイトマイシンＣ等の抗がん性抗生物質、イリノテカン、エトポシド等の植物アルカロイド、シスプラチン、オキサリプラチン、カルボプラチン等のプラチナ製剤、タモキシフェン、ビカルダミド等のホルモン療法薬、インターフェロン、ニボルマブ、ペンブロリズマブ等の免疫制御薬を挙げることができる。
【００８５】
上記「本発明の医薬組成物と他の抗がん剤と併用して用いる」方法としては、他の抗がん剤を用いて処理し、その後本発明の医薬組成物を用いる方法や、本発明の医薬組成物と他の抗がん剤を同時に用いる方法や、本発明の医薬組成物を用いて処理し、その後他の抗がん剤を用いる方法を挙げることができる。また、本発明のがんの治療に用いるための医薬組成物と他の抗がん剤と併用した場合には、がんの治療効果がより向上するとともに、それぞれの抗がん剤の投与回数又は投与量を減らすことで、それぞれの抗がん剤による副作用を低減させることが可能となる。また、本発明の医薬組成物に上記他の抗がん剤を含めてもよい。
【００８６】
（本発明の別の態様）
本発明の別の態様１として、１）本発明の免疫担当細胞を、がんの治療を必要とする患者に投与することを特徴とするがんの治療方法や、２）医薬組成物として使用するための、本発明の免疫担当細胞や、３）本発明の免疫担当細胞の、医薬組成物の調製における使用を挙げることができる。
【００８７】
また、本発明の別の態様２として、以下のいずれかの一本鎖抗体、細胞膜貫通領域、及び免疫担当細胞の活性化を誘導するシグナル伝達領域を備えたキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を挙げることができ、かかるＣＡＲを免疫担当細胞に発現させることで、ヒトメソセリンによる刺激によって免疫担当細胞を活性化することが可能となる。
る。
（１−１）配列番号１３に示されるアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ１、配列番号１４に示されるアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ２、及び配列番号１５に示されるアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域と、配列番号１６に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ１、配列番号１７に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号１８に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域を含む一本鎖抗体；
（２−１）配列番号１３に示されるアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ１、配列番号１４に示されるアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ２、及び配列番号１５に示されるアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域と、配列番号１９に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ１、配列番号１７に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号１８に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域を含む一本鎖抗体；
（３−１）配列番号２０に示されるアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ１、配列番号２１に示されるアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ２、及び配列番号２２に示されるアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域と、配列番号２３に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ１、配列番号２４に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号２５に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域を含む一本鎖抗体；
【００８８】
さらに、本発明の別の態様３として、本発明の発現ベクターを備えている、免疫担当細胞を作製するためのキットを挙げることができ、かかるキットとしては、本発明の発現ベクターを備えていれば特に制限されず、本発明の免疫担当細胞を作製するための説明書や、本発明の発現ベクターを免疫担当細胞に導入するために用いる試薬を含んでいてもよい。
【００８９】
さらに、本発明の別の態様４として、細胞表面分子（好ましくは、ヒトメソセリンを特異的に認識する一本鎖抗体を備えたＣＡＲ）、ＩＬ−７及びＣＣＬ１９を同時に発現する免疫担当細胞を対象に投与する、がんの再発抑制方法を挙げることができる。
【００９０】
以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの例示に限定されるものではない。
【００９１】
［実施例１］抗ヒトメソセリン  ＣＡＲの作製
（抗ヒトメソセリン  ＣＡＲのｓｃＦｖ配列及びＤＮＡ断片の合成）
ＶＬ及びＶＨの配列、順序、及び適切なシグナルペプチドの種類を比較するため、図１に示す９種類の抗ヒトメソセリン  ｓｃＦｖの配列を設計した。
ＶＨ０７（１５）ＶＬ０７は配列番号１に示す重鎖可変領域のアミノ酸配列と配列番号２６に示すペプチドリンカーのアミノ酸配列と配列番号２に示す軽鎖可変領域のアミノ酸配列からなる。
ＶＨ３６（１５）ＶＬ３６は配列番号３に示す重鎖可変領域のアミノ酸配列と配列番号２６に示すペプチドリンカーのアミノ酸配列と配列番号４に示す軽鎖可変領域のアミノ酸配列からなる。
ＶＬ０７（１５）ＶＨ０７は配列番号２に示す軽鎖可変領域のアミノ酸配列と配列番号２６に示すペプチドリンカーのアミノ酸配列と配列番号１に示す重鎖可変領域のアミノ酸配列からなる。
ＶＨ０７（２５）ＶＬ０７は配列番号１に示す重鎖可変領域のアミノ酸配列と配列番号２７に示すペプチドリンカーのアミノ酸配列と配列番号２に示す軽鎖可変領域のアミノ酸配列からなる。
ＶＬ０７（２５）ＶＨ０７は配列番号２に示す軽鎖可変領域のアミノ酸配列と配列番号２７に示すペプチドリンカーのアミノ酸配列と配列番号１に示す重鎖可変領域のアミノ酸配列からなる。
ＶＨＭＯ（１５）ＶＬＭＯは配列番号５に示す重鎖可変領域のアミノ酸配列と配列番号２６に示すペプチドリンカーのアミノ酸配列と配列番号６に示す軽鎖可変領域のアミノ酸配列からなる。
ＶＬＭＯ（１５）ＶＨＭＯは配列番号６に示す軽鎖可変領域のアミノ酸配列と配列番号２６に示すペプチドリンカーのアミノ酸配列と配列番号５に示す重鎖可変領域のアミノ酸配列からなる。
ＶＨＭＯ（２５）ＶＬＭＯは配列番号５に示す重鎖可変領域のアミノ酸配列と配列番号２７に示すペプチドリンカーのアミノ酸配列と配列番号６に示す軽鎖可変領域のアミノ酸配列からなる。
ＶＬＭＯ（２５）ＶＨＭＯは配列番号６に示す軽鎖可変領域のアミノ酸配列と配列番号２７に示すペプチドリンカーのアミノ酸配列と配列番号５に示す重鎖可変領域のアミノ酸配列からなる。なお、配列番号１と配列番号３に示すアミノ酸配列とは、配列番号１における１２７番目がグリシン（Ｇ）であるのに対し、配列番号３に示すアミノ酸配列ではロイシン（Ｌ）である点が相違する。また、配列番号２と配列番号４に示すアミノ酸配列は、配列番号２における３３番目のチロシン（Ｙ）が配列番号４に示すアミノ酸配列では欠失している点が相違する。
【００９２】
次に、上記各抗ヒトメソセリン  ｓｃＦｖのアミノ酸配列をコードするＤＮＡ断片をそれぞれ合成した。
【００９３】
（ＩＬ−７／ＣＣＬ１９及びＨＳＶ−ＴＫを発現する抗ヒトメソセリン  ＩＬ−７／ＣＣＬ１９  ＣＡＲ発現ベクターと、ＩＬ−７／ＣＣＬ１９を発現しないコンベンショナル（Ｃｏｎｖ．）抗ヒトメソセリン  ＣＡＲ発現ベクターの作製）
ＣＡＲ−Ｔ細胞療法では、標的抗原に対する強力な免疫応答によりサイトカイン放出症候群などの全身性の副作用が起こることがある。この問題に対応するため自殺遺伝子としてヘルペスウイルス由来チミジンキナーゼ遺伝子ＨＳＶ−ＴＫを導入したＣＡＲコンストラクトを作製した。このコンストラクトをＴ細胞に遺伝子導入し、ＣＡＲ発現Ｔ細胞にＨＳＶ−ＴＫを発現させるとサイトメガロウイルス治療薬であるガンシクロビルの添加によりＣＡＲ−Ｔ細胞はアポトーシスを誘導され死滅することから、ガンシクロビル投与により体内のＣＡＲ−Ｔ細胞の制御が可能となる。
【００９４】
上記特許文献２に記載の方法に準じて、最初に、Ｎ末端側から抗ヒトメソセリンｓｃＦｖ、ヒトＣＤ８膜貫通領域及びヒトＣＤ２８−４−１ＢＢ−ＣＤ３ζ細胞内シグナル伝達領域を順次備えた第３世代ＣＡＲコンストラクトを作製した。当該コンストラクトのＣ末端に２ＡペプチドであるＦ２Ａを加え、さらに、その下流にヒトＩＬ−７−Ｆ２Ａ−ヒトＣＣＬ１９−Ｆ２Ａ−ＨＳＶ−ＴＫを加えた。得られたｓｃＦｖ、ヒトＣＤ８膜貫通領域、ヒトＣＤ２８−４−１ＢＢ−ＣＤ３ζ細胞内シグナル伝達領域、ヒトＩＬ−７、ヒトＣＣＬ１９、ＨＳＶ−ＴＫを順次備えたコンストラクトをｐＭＳＧＶ１レトロウイルス発現ベクター（Tamada k et al., Clin Cancer Res 18:6436-6445(2012)）に挿入して抗ヒトメソセリンｓｃＦｖ、ヒトＣＤ８膜貫通領域、ヒトＣＤ２８−４−１ＢＢ−ＣＤ３ζ細胞内シグナル伝達領域、ヒトＩＬ−７、ヒトＣＣＬ１９、及びＨＳＶ−ＴＫを発現するｐＭＳＧＶベクターを作製した。次に、上記ｐＭＳＧＶベクター内の抗ヒトメソセリンｓｃＦｖ領域を、上記「抗ヒトメソセリン  ＣＡＲのｓｃＦｖ配列及びＤＮＡ断片の合成」欄で記載の方法で合成した各抗ヒトメソセリンｓｃＦｖ  ＤＮＡ断片で、制限酵素（ＮｃｏＩ及びＮｏｔＩ）処理及びライゲーションにより置き換えて、それぞれの「ＩＬ−７／ＣＣＬ１９発現−抗ヒトメソセリン  ＣＡＲベクター」を作製した。なお、ｐＭＳＧＶ１ベクターはｓｃＦｖのＮ末端側に免疫グロブリンＧ由来のシグナルペプチドＴ（配列番号１１）を備えているが、上記ｓｃＦｖ領域をＶＨ０７（１５）ＶＬ０７  ＤＮＡ断片で置き換えたものについては、さらにシグナルペプチドとして、上記配列番号１１に示すシグナルペプチドＴを、配列番号１２に示すシグナルペプチドＰに置き換えたものも作製した。さらに、ＩＬ−７及びＣＣＬ１９なしのコントロールとして、上記ヒトＩＬ−７−Ｆ２Ａ−ヒトＣＣＬ１９−Ｆ２Ａ−ＨＳＶ−ＴＫの代わりにＨＳＶ−ＴＫを用いた以外は上記と同様の方法で「コンベンショナル抗ヒトメソセリン  ＣＡＲベクター」を作製した。
【００９５】
（ＩＬ−７／ＣＣＬ１９発現−抗ヒトメソセリン  ＣＡＲベクター又はコンベンショナル抗ヒトメソセリン  ＣＡＲベクターを導入したレトロウイルスの作製）
Ｔ細胞への遺伝子導入のためレトロウイルスを作製した。リポフェクタミン３０００（ライフテクノロジー社製）を用い、上記のそれぞれのＩＬ−７／ＣＣＬ１９発現−抗ヒトメソセリン  ＣＡＲベクター又はコンベンショナル抗ヒトメソセリン  ＣＡＲベクターとｐ−Ａｍｐｈｏプラスミド（タカラバイオ社製）をＧＰ２−２９３パッケージング細胞株（タカラバイオ社製）にトランスフェクションすることで、ＩＬ−７／ＣＣＬ１９発現−抗ヒトメソセリン  ＣＡＲベクター又はコンベンショナル抗ヒトメソセリン  ＣＡＲベクターを導入したレトロウイルスを作製した。トランスフェクションから４８時間後に前記レトロウイルスを含有する上清を回収した。
【００９６】
前記ＧＰ２−２９３細胞の培養液としては、１０％ＦＣＳ、１％Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ−Ｓｔｒｅｐｔｍｙｃｉｎ（和光純薬社製）を加えたＤＭＥＭを用いた。また、後述の実施例で用いるＴ細胞の培養液としては、２.０％ヒトＡＢ型血清（Sigma-Aldrich社製）、１％Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ−Ｓｔｒｅｐｔｍｙｃｉｎ（和光純薬社製）、２.５μｇ／ｍｌのアンホテリシンB（ブリストル・マイヤーズスクイブ社製）を含むＧＴ−Ｔ５５１を用いた。
【００９７】
（Ｔ細胞の形質導入）
健常人ドナーの血液から採取した２×１０6個の末梢血単核球を、Ｔ細胞の活性化のため抗ＣＤ３モノクローナル抗体（５μｇ／ｍｌ）及びレトロネクチン（登録商標：タカラバイオ社製、２５μｇ／ｍｌ）を固層化したプレート上で、ＩＬ−２（Peprotech社製）と共に、３７℃、５％ＣＯ２インキュベータで３日間培養した。培養開始後２日目に、上記で作製したＩＬ−７／ＣＣＬ１９発現−抗ヒトメソセリン  ＣＡＲベクター又はコンベンショナル抗ヒトメソセリン  ＣＡＲベクター導入したレトロウイルスを含有する上清を、あらかじめ２５μｇ／ｍｌのレトロネクチン（タカラバイオ社製）でコートした表面未処理２４ウェルプレートに１ウェルあたり５００μｌずつ添加し、２０００ｇ、２時間の遠心によりレトロウイルスプレロードプレートを作製した。プレートは計２枚作製し、遠心終了後１．５％ＢＳＡ／ＰＢＳにて洗浄し、使用するまで４℃で保存した。培養３日目に、活性化させた細胞を上記プレートから回収し、細胞懸濁液（１×１０5ｃｅｌｌｓ／ｍｌ）として調整した。この細胞懸濁液を１ウェルあたり１ｍｌずつレトロウイルスプレロードプレートに添加し、ＩＬ−２の存在下で３７℃、５％ＣＯ２インキュベータにて２４時間培養し、１回目のレトロウイルス感染を行った。翌日（培養４日目）、各ウェルの細胞溶液を、保存していた２枚目のウイルスプレロードプレートに移し、５００ｇで１分間遠心後、３７℃で４時間培養し、２回目の感染を行った。３７℃で４時間培養後、各ウェルの細胞懸濁液１ｍｌを新しい１２ウェル細胞培養プレートに移し、ＩＬ−２を含有する新しい培養液（ＧＴ−Ｔ５５１）で４倍に希釈して、３７℃、５％ＣＯ２インキュベータにて培養した。末梢血単核球の培養開始日から数えて７日目まで培養し、ＩＬ−７／ＣＣＬ１９発現−抗ヒトメソセリン  ＣＡＲベクターを導入したＴ細胞である「抗ヒトメソセリン  ＣＡＲ−ＩＬ−７／ＣＣＬ１９発現Ｔ細胞」又はコンベンショナル抗ヒトメソセリン  ＣＡＲベクターを導入したＴ細胞である「抗ヒトメソセリン  ＣＡＲ発現Ｔ細胞」を得た。抗ヒトメソセリン  ＣＡＲ−ＩＬ−７／ＣＣＬ１９発現Ｔ細胞には、外来の抗ヒトメソセリン  ＣＡＲをコードする核酸、外来のＩＬ−７をコードする核酸、及び外来のＣＣＬ１９をコードする核酸を含有している。抗ヒトメソセリン  ＣＡＲ発現Ｔ細胞には、抗ヒトメソセリン  ＣＡＲをコードする核酸を含有しており、外来のＩＬ−７をコードする核酸、及び外来のＣＣＬ１９をコードする核酸は含有していない。また同時に、ＣＡＲ陰性細胞コントロールとして、同一の健常人ドナーから得た末梢血単核球を同様の手法で活性化するがレトロウイルス感染をしていない「ＣＡＲ、ＩＬ−７、及びＣＣＬ１９非発現−Ｔ細胞」（非遺伝子導入細胞：Ｎｏｎ−ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ）を作製した。
【００９８】
ここで、上記のとおりＴ細胞に抗ヒトメソセリン  ＣＡＲをコードする核酸、ＩＬ−７をコードする核酸、及びＣＣＬ１９をコードする核酸を導入するためにレトロウイルスベクターを用いている。そのため、上記それぞれの核酸を導入したＴ細胞を培養して増殖した場合には、そのＴ細胞の細胞質内にレトロウイルスベクターを含んでいるものもあるが、多くはＴ細胞において、抗ヒトメソセリン  ＣＡＲをコードする核酸、ＩＬ−７をコードする核酸、及びＣＣＬ１９をコードする核酸がゲノムに組み込まれる。そのＴ細胞において、抗ヒトメソセリン  ＣＡＲをコードする核酸、ＩＬ−７をコードする核酸、及びＣＣＬ１９をコードする核酸がゲノムに組み込まれた場合には、抗ヒトメソセリン  ＣＡＲ、ＩＬ−７、及びＣＣＬ１９は導入した外来の組換えコンストラクトから発現することとなる。
【００９９】
［実施例２］フローサイトメトリーによるＣＡＲ発現測定
（フローサイトメトリー解析）
メソセリンを抗原として認識するＣＡＲの発現レベル解析をフローサイトメトリー解析によって行った。作製した抗ヒトメソセリン  ＣＡＲ−ＩＬ−７／ＣＣＬ１９発現Ｔ細胞を、リコンビナントヒトメソセリン(Ｃ末端に６-Ｈｉｓを含むもの)（BioLegend社製）、フィコエリスリン（ＰＥ）標識抗６-Ｈｉｓモノクローナル抗体（abcam社製）、及びアロフィコシアニン（ＡＰＣ）標識抗ＣＤ８モノクローナル抗体（Affymetrix社製）と反応させて、染色を行った。フローサイトメーターはＥＣ８００（ソニー社製）を用い、データ解析はＦｌｏｗＪｏ  ｓｏｆｔｗａｒｅ（Tree Star社製）を用いた。
【０１００】
（結果）
まず、ｓｃＦｖ領域としてＶＨ０７（１５）ＶＬ０７（シグナルペプチドＴにより発現）、ＶＨ０７（１５）ＶＬ０７（シグナルペプチドＰにより発現）又はＶＨ３６（１５）ＶＬ３６を有する抗ヒトメソセリンＣＡＲ−ＩＬ−７／ＣＣＬ１９発現Ｔ細胞のフローサイトメトリー解析結果を図２に示す。図２中、それぞれのグラフにおいて横軸はＣＡＲの発現、縦軸はＣＤ８の発現を示す。図２に示すように、ＣＡＲ、ＩＬ―７、及びＣＣＬ１９非発現−Ｔ細胞（Ｎｏｎ−ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ）と比較して３種類の抗ヒトメソセリンＣＡＲ−ＩＬ−７／ＣＣＬ１９発現Ｔ細胞はいずれもＣＡＲの発現が高いことが確認された。
【０１０１】
次に、ｓｃＦｖ領域としてＶＨ０７（１５）ＶＬ０７、ＶＬ０７（１５）ＶＨ０７、ＶＨ０７（２５）ＶＬ０７、ＶＬ０７（２５）ＶＨ０７を有する抗ヒトメソセリン  ＣＡＲ−ＩＬ−７／ＣＣＬ１９発現Ｔ細胞のフローサイトメトリー解析結果を図３に示す。図３中、それぞれのグラフにおいて横軸はＣＡＲの発現、縦軸はＣＤ８の発現を示す。（ａ）はＣＡＲ、ＩＬ−７、及びＣＣＬ１９非発現−Ｔ細胞（Ｎｏｎ−ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ）、（ｂ）〜（ｅ）はそれぞれのｓｃＦｖ領域を持つ抗ヒトメソセリン  ＣＡＲ−ＩＬ−７／ＣＣＬ１９発現Ｔ細胞の結果である。また、図中の数値はそれぞれのポピュレーションのパーセンテージを表す。図３（ｂ）〜（ｅ）に示すように、抗ヒトメソセリン  ＣＡＲ−ＩＬ−７／ＣＣＬ１９発現Ｔ細胞において、ＣＡＲの発現が確認された。
【０１０２】
［実施例３］各腫瘍細胞のメソセリン発現
（フローサイトメトリー解析）
メソセリンを発現する腫瘍細胞株を確認するため、各腫瘍細胞株におけるメソセリンの発現レベルを確認した。悪性中皮腫の細胞株ＡＣＣ−ＭＥＳＯ−１、Ｙ−ＭＥＳＯ８Ａ、ＮＣＩ−Ｈ２０５２、ＮＣＩ−Ｈ２２６、ＭＳＴＯ２１１Ｈ、腎がんの細胞株Ａ４９８を、ＰＥで標識した市販のメソシリン抗体（Catalog Number FAB32652P：R&D systems社製）で染色し、フローサイトメトリー解析により各腫瘍細胞におけるメソセリンの発現を測定した。なお、ＰＥ標識抗ヒトメソセリン抗体は、３μｇ／サンプルで染色を行った。フローサイトメーターはＥＣ８００（ソニー社製）を用い、データ解析はＦｌｏｗＪｏ  ｓｏｆｔｗａｒｅ（Tree Star社製）を用いた。
【０１０３】
（結果）
結果を図４に示す。悪性中皮腫の細胞株ＡＣＣ−ＭＥＳＯ−１、Ｙ−ＭＥＳＯ８Ａ、ＮＣＩ−Ｈ２０５２、ＮＣＩ−Ｈ２２６、ＭＳＴＯ２１１Ｈにおいて、メソセリンの発現が確認された。一方、腎がんの細胞株Ａ４９８においてはメソセリンの発現は確認されなかった。
【０１０４】
［実施例４］細胞傷害性試験−１
（共培養試験）
抗ヒトメソセリン  ＣＡＲ−ＩＬ−７／ＣＣＬ１９発現Ｔ細胞（ｓｃＦｖ領域はＶＨ０７（１５）ＶＬ０７又はＶＨ０７（２５）ＶＬ０７）をエフェクターとし、メソセリン陽性腫瘍細胞株（ＡＣＣ−ＭＥＳＯ−１、ＮＣＩ−Ｈ２０５２）又はメソセリン陰性腫瘍細胞株（Ａ４９８）と共に培養プレート上にてエフェクター：腫瘍細胞比を１：１、１：３、１：５（１：５はＩＦＮ−γの測定解析のみ）になるよう調整したうえで、３７℃インキュベータにて共培養を行った。かかる共培養の説明を図５に示す。培養液は１０％ウシ胎児血清（Ｆｅｔａｌ  ｃａｌｆ  ｓｅｒｕｍ：ＦＣＳ）、１％Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ−Ｓｔｒｅｐｔｍｙｃｉｎ（和光純薬社製）、５０μＭの２−ＭＥ（Gibco社製）及び２５ｍＭのＨＥＰＥＳ（Sigma-Aldrich社製）を含むＲＰＭＩを用いた。共培養開始から２日後に残存している腫瘍細胞株をフローサイトメトリーで測定するとともに培養上清中に産生されたＩＦＮ−γを市販のＩＦＮ−γＥＬＩＳＡキット（BioLegend社製）を用いて測定した。共培養開始から２日後に残存している腫瘍細胞株のフローサイトメトリーでの測定結果を図６Ａ〜６Ｃに、共培養後の産生されたＩＦＮ−γの測定結果を図７Ａ〜７Ｃに示す。なお、抗ヒトメソセリン  ＣＡＲ−ＩＬ−７／ＣＣＬ１９発現Ｔ細胞のコントロールとして、ＣＡＲ、ＩＬ−７、及びＣＣＬ１９非発現−Ｔ細胞（Ｎｏｎ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ）を用いた。フローサイトメトリーに際しては死細胞をＺｏｍｂｉｅ  Ｙｅｌｌｏｗ（登録商標：BioLegend社製）で染色して区別し、Ｔ細胞をＰＥ標識抗ＣＤ４５モノクローナル抗体（BioLegend社製）で染色した。フローサイトメーターはＢＤ  ＬＳＲＦｏｒｔｅｓｓａ  Ｘ-２０（BD Biosciences社製）を用い、データ解析はＦｌｏｗＪｏ  ｓｏｆｔｗａｒｅ（Tree Star社製）を用いた。
【０１０５】
（結果）
図６Ａ〜６Ｃに示すように、コントロールのＣＡＲ、ＩＬ−７、及びＣＣＬ１９非発現−Ｔ細胞（Ｎｏｎ−ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ）のそれぞれとターゲット腫瘍細胞との共培養においては、どのターゲット腫瘍細胞も腫瘍のみのウェル（ｔｕｍｏｒ  ｏｎｌｙ）と同程度に増殖していることが示された。一方、抗ヒトメソセリン  ＣＡＲ−ＩＬ−７／ＣＣＬ１９発現Ｔ細胞においては、メソセリン陰性ターゲット細胞（Ａ４９８：図６Ｃ）との共培養では、ターゲット腫瘍細胞は、腫瘍のみのウェル同様に増殖していたが、メソセリン陽性腫瘍細胞（ＡＣＣ−ＭＥＳＯ−１：図６Ａ、ＮＣＩ−Ｈ２０５２：図６Ｂ）との共培養では、メソセリン陽性腫瘍細胞のみのウェル及びコントロール細胞との共培養のウェルと比較し、明らかに腫瘍細胞の数が減少していることが観察された。これより、抗ヒトメソセリン  ＣＡＲ−ＩＬ−７／ＣＣＬ１９発現Ｔ細胞は抗原特異的に腫瘍細胞を傷害していることが確認できた。
【０１０６】
さらに、図７Ａ〜Ｃに示すように、共培養後の上清を用いたＩＦＮ−γのＥＬＩＳＡ解析においても、抗ヒトメソセリン  ＣＡＲ−ＩＬ−７／ＣＣＬ１９発現Ｔ細胞とメソセリン陽性腫瘍細胞（ＡＣＣ−ＭＥＳＯ−１：図７Ａ、ＮＣＩ−Ｈ２０５２：図７Ｂ）の共培養の上清においてのみ顕著なＩＦＮ−γの産生が確認された。
【０１０７】
［実施例５］細胞傷害性試験−２
（共培養試験）
実施例４と同様の方法で、抗ヒトメソセリン  ＣＡＲ−ＩＬ−７／ＣＣＬ１９発現Ｔ細胞（ｓｃＦｖ領域はＶＨＭＯ（１５）ＶＬＭＯ、ＶＬＭＯ（１５）ＶＨＭＯ、ＶＨＭＯ（２５）ＶＬＭＯ、又はＶＬＭＯ（２５）ＶＨＭＯ）、又は「ＣＡＲ、ＩＬ―７、及びＣＣＬ１９非発現−Ｔ細胞」（非遺伝子導入細胞：Ｎｏｎ−ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ）を、メソセリン陽性腫瘍細胞株であるＰＡＮ０２腫瘍細胞株又はメソセリン陰性腫瘍細胞株と共に培養プレート上にてエフェクター：腫瘍細胞比を１：１、１：３になるよう調整したうえで、３７℃インキュベータにて共培養を行った。共培養開始から３日後又は５日後に残存している白血球又はＰＡＮ０２腫瘍細胞株のフローサイトメトリーでの測定結果を図８に、共培養後の産生されたＩＦＮ−γの測定結果を図９に示す。なお、本実施例及び後述する実施例５の「腫瘍モデルでの治療効果」において用いた抗ヒトメソセリン  ＣＡＲ、ＩＬ−７及びＣＣＬ１９発現するＴ細胞は、ｐＭＳＧＶ１レトロウイルス発現ベクターとして、ヒトＩＬ−７−Ｆ２Ａ−ヒトＣＣＬ１９−Ｆ２Ａ−ＨＳＶ−ＴＫの代わりに、マウスＩＬ−７−Ｆ２Ａ−マウスＣＣＬ１９−Ｆ２Ａ−ＨＳＶ−ＴＫ、ヒトＣＤ８膜貫通領域及びヒトＣＤ２８−４−１ＢＢ−ＣＤ３ζ細胞内シグナル伝達領域の代わりにマウスＣＤ８膜貫通領域及びマウスＣＤ２８−４−１ＢＢ−ＣＤ３ζ細胞内シグナル伝達領域を挿入されるように調製したｐＭＳＧＶ１レトロウイルス発現ベクターを用い、Ｔ細胞としては脾臓及びリンパ球由来のマウスＴ細胞を用いて実施例１の方法に準じて作製した（以下「抗ヒトメソセリン  ＣＡＲ−マウスＩＬ−７／マウスＣＣＬ１９発現マウスＴ細胞」という）。また、本実施例で用いた「ＣＡＲ、ＩＬ−７、及びＣＣＬ１９非発現−Ｔ細胞」（非遺伝子導入細胞：Ｎｏｎ−ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ）は、Ｔ細胞として脾臓及びリンパ球由来のマウスＴ細胞を用いた。
【０１０８】
（結果）
図８に示すように、抗ヒトメソセリン  ＣＡＲ−マウスＩＬ−７／マウスＣＣＬ１９発現マウスＴ細胞は腫瘍細胞を傷害していることが確認できた。また、図９に示すように、共培養後の上清を用いたＩＦＮ−γのＥＬＩＳＡにおいても、抗ヒトメソセリン  ＣＡＲ−マウスＩＬ−７／マウスＣＣＬ１９発現マウスＴ細胞とＰＡＮ０２腫瘍細胞株の共培養の上清においてのみ顕著なＩＦＮ−γの産生が確認された。
【０１０９】
［実施例６］腫瘍モデルでの治療効果
（腫瘍モデルマウスへの抗マウスメソセリン  ＣＡＲ−ＩＬ−７／ＣＣＬ１９発現Ｔ細胞の投与）
７−１０週齢のＣ５７ＢＬ／６マウス（ＳＬＣ社より購入）に５×１０５個のＰＡＮ０２膵がん細胞株を皮下接種した。接種後７日目に抗がん剤であるシクロホスファミド（Ｃｙｃｌｏｐｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ：ＣＰＡ、１００ｍｇ／ｋｇ）を腹腔内に投与し、１０日目に１×１０6個の上記実施例５で作製した抗ヒトメソセリン  ＣＡＲ−マウスＩＬ−７／マウスＣＣＬ１９発現マウスＴ細胞（ｓｃＦｖ領域はＶＨＭＯ（１５）ＶＬＭＯ、ＶＬＭＯ（１５）ＶＨＭＯ、ＶＨＭＯ（２５）ＶＬＭＯ、又はＶＬＭＯ（２５）ＶＨＭＯ））又は「抗ヒトメソセリン  ＣＡＲ発現マウスＴ細胞」を静脈内に投与した。ＶＨＭＯ（１５）ＶＬＭＯ、ＶＨＭＯ（２５）ＶＬＭＯにおけるマウスの生存率の結果を図１０に、ＶＨＭＯ（１５）ＶＬＭＯ、ＶＬＭＯ（１５）ＶＨＭＯ、ＶＨＭＯ（２５）ＶＬＭＯ、又はＶＬＭＯ（２５）ＶＨＭＯ）における腫瘍の体積の結果を図１１に示す。図１０中、横軸はＰＡＮ０２を皮下接種後の日数（マウスにＰＡＮ０２を皮下接種した日を０日とした）、縦軸は生存率である。また、図１１中、横軸はＰＡＮ０２を皮下接種後の日数、縦軸は腫瘍体積（腫瘍の長軸×（腫瘍の短軸）２／２（ｍｍ3））である。「ｎｏ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ」はＣＰＡのみ投与したグループ、「Ｃｏｎｖ．」はＣＰＡ投与後に抗ヒトメソセリン  ＣＡＲ発現マウスＴ細胞を投与したグループ、「７×１９」はＣＰＡ投与後に抗ヒトメソセリン  ＣＡＲ−マウスＩＬ−７／マウスＣＣＬ１９発現マウスＴ細胞を投与したグループを示す。なお、上記「抗ヒトメソセリン  ＣＡＲ発現マウスＴ細胞」は、上記実施例１の記載の「抗ヒトメソセリン  ＣＡＲ発現Ｔ細胞」の作製方法において、ｐＭＳＧＶ１レトロウイルス発現ベクターとして、ヒトＩＬ−７−Ｆ２Ａ−ヒトＣＣＬ１９−Ｆ２Ａ−ＨＳＶ−ＴＫの代わりにＨＳＶ−ＴＫ、ヒトＣＤ８膜貫通領域及びヒトＣＤ２８−４−１ＢＢ−ＣＤ３ζ細胞内シグナル伝達領域の代わりにマウスＣＤ８膜貫通領域及びマウスＣＤ２８−４−１ＢＢ−ＣＤ３ζ細胞内シグナル伝達領域を挿入されるように調製したｐＭＳＧＶ１レトロウイルス発現ベクターを用い、Ｔ細胞として脾臓及びリンパ球由来のマウスＴ細胞を用いた以外は実施例１と同様の方法で作製した。
【０１１０】
（結果）
図１０に示すように、本発明の抗ヒトメソセリン  ＣＡＲ−ＩＬ−７／ＣＣＬ１９発現Ｔ細胞を投与することで、生存率が有意に高くなることが明らかとなった。また、図１１に示すように本発明の抗ヒトメソセリン  ＣＡＲ−ＩＬ−７／ＣＣＬ１９発現Ｔ細胞を投与することで、腫瘍の増殖が明らかに抑制されることが明らかとなった。これより、腫瘍モデルマウスにおいて、抗ヒトメソセリン  ＣＡＲ−ＩＬ−７／ＣＣＬ１９発現Ｔ細胞は優れた抗腫瘍活性を示すことが明らかとなった。
【０１１１】
［実施例７］腫瘍モデルでの治療効果−２
抗ヒトメソセリン  ＣＡＲ−ＩＬ−７／ＣＣＬ１９発現Ｔ細胞は優れた抗腫瘍活性を示すことが明らかとなったが、さらに長期的な抗腫瘍効果及び膵がん以外での抗腫瘍効果を確認するために、ヒト悪性胸膜中皮腫細胞株を免疫不全マウスに投与して腫瘍を形成させ、その後、抗ヒトメソセリン  ＣＡＲ−ＩＬ−７／ＣＣＬ１９発現Ｔ細胞の投与の有無による１４３日間の腫瘍再発の有無を調べた。本実施例で用いる「ＡＣＣ−ＭＥＳＯ−１−ＧＦＰ−Ｌｕｃ株の作製方法」、「Ｔ細胞の活性化方法」は以下のとおりである。
【０１１２】
（ＡＣＣ−ＭＥＳＯ−１−ＧＦＰ−Ｌｕｃ株の作製）
愛知県がんセンター研究所  関戸好孝先生から分与いただいたメソセリン陽性腫瘍細胞株であるヒト悪性中皮種細胞株ＡＣＣ−ＭＥＳＯ−１にレンチウイルスを用いて緑色蛍光タンパク質−ルシフェラーゼ（ＧＦＰ−Ｌｕｃ）の遺伝子導入を行った。
【０１１３】
ｄａｙ０に９６  ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅに１×１０３ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌでＡＣＣ−ＭＥＳＯ−１を蒔いた。培地は１０％ＦＢＳ添加ＲＰＭＩ１６４０（Gibco社製）を使用した。ｄａｙ１に発光細胞作製用レンチウイルス粒子であるＲｅｄｉＦｅｃｔ  Ｒｅｄ−ＦＬｕｃ−ＧＦＰ（PerkinElmer社製）をＭＯＩ  １００で加えて形質導入を開始した。その際に遺伝子導入効率を高めるため、Ｈｅｘａｄｉｍｅｔｈｒｉｎｅ  Ｂｒｏｍｉｄｅ（Sigma-aldrich社製）を再終濃度４μｇ／ｍＬとなるように培地に加えた。ウイルス添加２４時間後（ｄａｙ２）にウイルスを含む培地を除去して培地の交換を行った。培養継続後、ＧＦＰを発現する細胞のみをＳＨ８００（SONY社製）でソーティングし、ＧＦＰを発現するＡＣＣ−ＭＥＳＯ−１、すなわち「ＡＣＣ−ＭＥＳＯ−１−ＧＦＰ−Ｌｕｃ」を得た。
【０１１４】
（抗ヒトメソセリン  ＣＡＲ−ＩＬ−７−ＣＣＬ１９発現Ｔ細胞及び抗ヒトメソセリン  ＣＡＲ発現Ｔ細胞の作製）
本実施例７では、実施例１によって得られたＩＬ−７／ＣＣＬ１９発現−抗ヒトメソセリン  ＣＡＲベクター（ｓｃＦｖ領域はＶＨ０７（１５）ＶＬ０７  ＤＮＡ断片で置き換え：シグナルペプチドは配列番号１１に示すシグナルペプチドＴ）又はコンベンショナル抗ヒトメソセリン  ＣＡＲベクター（ｓｃＦｖ領域はＶＨ０７（１５）ＶＬ０７  ＤＮＡ断片で置き換え：シグナルペプチドは配列番号１１に示すシグナルペプチドＴ）を用いた。
【０１１５】
（Ｔ細胞の活性化）
ｄａｙ０に健常人ドナーから採取した２×１０６個の末梢血単核球を、レトロネクチン２５μＬ／ｍＬ（タカラバイオ社製）と、抗ヒトＣＤ３モノクローナル抗体５μｇ／ｍＬ（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製、５μｇ／ｍＬ）を固層化させた細胞培養用６ｗｅｌｌプレートで、ＩＬ−２（Peprotech社製）と共に３７℃、５％ＣＯ２インキュベータで培養を開始した。培養液にはＯｐＴｍｉｚｅｒ  ＣＴＳ（Gibco社製）にＬ−グルタミン２ｍＭ（Gibco社製）、１％ペニシリンーストレプトマイシン（和光純薬工業社製）及びファンギゾン２．５μｇ／ｍＬ（ブリストル・マイヤーズスクイブ社製）を加えたものを用いた。３日間培養し、ｄａｙ３にＴ細胞が活性化して形態変化が起きていることを顕微鏡下にて確認して活性化Ｔ細胞を得た。
【０１１６】
（腫瘍の再発観察）
まず、ｄａｙ０に８週齢の雌ＮＳＧ免疫不全マウスに対して２×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍｏｕｓｅで上記ＡＣＣ−ＭＥＳＯ−１−ＧＦＰ−Ｌｕｃを胸腔内投与した。ｄａｙ１にＩｎ  ｖｉｖｏイメージングシステム（ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｉｍａｇｉｎｇ  ｓｙｓｔｅｍ：ＩＶＩＳ）を用いて胸腔内への腫瘍生着を確認した。ｄａｙ１に実施例１の方法で作製後に凍結していた抗ヒトメソセリン  ＣＡＲ発現Ｔ細胞、抗ヒトメソセリン  ＣＡＲ−ＩＬ−７−ＣＣＬ１９発現Ｔ細胞（ｓｃＦｖ領域はＶＨ０７（１５）ＶＬ０７）、及び上記方法で活性化したＴ細胞を解凍した。上記抗ヒトメソセリン  ＣＡＲ発現Ｔ細胞と上記抗ヒトメソセリン  ＣＡＲ−ＩＬ−７−ＣＣＬ１９発現Ｔ細胞のＣＡＲ発現率はそれぞれ４９．６％、３２．５％であったため、抗ヒトメソセリン  ＣＡＲ発現Ｔ細胞に上記活性化Ｔ細胞を加えて両者のＣＡＲ発現率を合わせた後、１×１０５ｃｅｌｌｓの上記抗ヒトメソセリン  ＣＡＲ発現Ｔ細胞を投与する群（Ｎ＝５）、１×１０５ｃｅｌｌｓの上記抗ヒトメソセリン  ＣＡＲ−ＩＬ−７−ＣＣＬ１９発現Ｔ細胞を投与する群（Ｎ＝５）を準備した。抗ヒトメソセリン  ＣＡＲ発現Ｔ細胞及び抗ヒトメソセリン  ＣＡＲ−ＩＬ−７−ＣＣＬ１９発現Ｔ細胞の投与は尾静脈より静脈内投与にて行った。さらに、ｄａｙ３以降、ＩＶＩＳを用いた腫瘍蛍光強度の測定（発光量：Ｔｏｔａｌ  Ｆｌｕｘ（ｐｈｏｔｏｎｓ/ｓｅｃ）を行った。結果を図１２Ａ、Ｂに示す。また、上記結果における投与からの日数とマウスの生存率との関係をグラフ化したものを図１３に、投与からの日数とトータルの蛍光量（ｐｈｏｔｏｎｓ／ｓｅｃｏｎｄ）との関係をグラフ化したものを図１４に示す。図１２Ａ、Ｂ、図１３、及び図１４中、抗ヒトメソセリン  ＣＡＲ−ＩＬ−７−ＣＣＬ１９発現Ｔ細胞を投与したものを「７×１９  ＣＡＲ−Ｔ」で示し、抗ヒトメソセリン  ＣＡＲ発現Ｔ細胞を投与したものを「Ｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎａｌ  ＣＡＲ−Ｔ」で示している。なお、本実施例７では内在性Ｔ細胞が欠損しているＮＳＧ免疫不全マウスをレシピエントとして使用しているため、レシピエントの内在性Ｔ細胞の影響は除かれており、投与した抗ヒトメソセリン  ＣＡＲ−ＩＬ−７−ＣＣＬ１９発現Ｔ細胞自体の効果を評価していることとなる。
【０１１７】
図１２Ａ、Ｂ、図１３、及び図１４に示すように、ｄａｙ２１には７×１９  ＣＡＲ−Ｔ、Ｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎａｌ  ＣＡＲ−Ｔのいずれも腫瘍蛍光強度がほとんど観察されていない。７×１９  ＣＡＲ−Ｔにおいては、その後ｄａｙ１４３まで腫瘍蛍光が観察されておらず、再発が完全に抑制されていることが確認された。一方、Ｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎａｌ  ＣＡＲ−Ｔではｄａｙ４５あたりから腫瘍蛍光が観察され始めて、ｄａｙ１１５には腫瘍蛍光強度が高まり、ｄａｙ１２９には１匹死亡し、ｄａｙ１４３には残りの４匹も死亡した。したがって、ＣＡＲ−ＩＬ−７−ＣＣＬ１９発現Ｔ細胞の投与により、膵がんだけでなくヒト悪性胸膜中皮腫等のヒトメソセリンを発現するがん細胞に対する細胞傷害活性を有すること、及び長期的な抗腫瘍効果を有することが明らかとなった。
【０１１８】
本出願は、２０１７年１２月２４日に出願された日本国特願２０１７−２４７１０９号を基礎としており、その内容は本明細書にすべて包含されるものである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１３】
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【図１４】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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