(57)【要約】  少量のストレプトリジンＯを使用することにより、高い感度が得られる抗ストレプトリジンＯ抗体測定用ラテックス粒子の製造方法を提供する。  カルボキシル基含量が５０μｅｑ／ｇ〜２５０μｅｑ／ｇ、好ましくは９０μｅｑ／ｇ〜１５０μｅｑ／ｇの範囲で表面に導入されたラテックス粒子に、ストレプトリジンＯを共有結合させる工程を含むストレプトリジンＯ抗体測定用ラテックス粒子の製造方法。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
カルボキシル基含量が５０μｅｑ／ｇ〜２５０μｅｑ／ｇの範囲で表面に導入されたラテックス粒子に、ストレプトリジンＯを共有結合させる工程を含む抗ストレプトリジンＯ抗体測定用ラテックス粒子の製造方法。
【請求項２】
カルボキシル基含量が９０μｅｑ／ｇ〜１５０μｅｑ／ｇの範囲で表面に導入されたラテックス粒子を用いる請求項１に記載の抗ストレプトリジンＯ抗体測定用ラテックス粒子の製造方法。
【請求項３】
平均粒径が５０ｎｍ〜２５０ｎｍのラテックス粒子を用いる請求項１または２に記載の抗ストレプトリジンＯ抗体測定用ラテックス粒子の製造方法。
【請求項４】
平均粒径が９０ｎｍ〜１５０ｎｍのラテックス粒子を用いる請求項３に記載の抗ストレプトリジンＯ抗体測定用ラテックス粒子の製造方法。
【請求項５】
ｐＨ５．９からｐＨ６．７の緩衝液中において、ストレプトリジンＯを、カルボキシル基を表面に有するラテックス粒子に共有結合させる工程を含む、請求項１〜４のいずれかに記載の抗ストレプトリジンＯ抗体測定用ラテックス粒子の製造方法。
【請求項６】
カルボキシル基含量が９０μｅｑ／ｇ〜１５０μｅｑ／ｇの範囲からなるラテックス粒子を使用する、請求項５に記載の抗ストレプトリジンＯ抗体測定用ラテックス粒子の製造方法。
【請求項７】
平均粒径が９５ｎｍから１５０ｎｍの範囲からなるラテックス粒子を使用する、請求項５に記載の抗ストレプトリジンＯ抗体測定用ラテックス粒子の製造方法。
【請求項８】
カルボキシル基含量が９０μｅｑ／ｇ〜１５０μｅｑ／ｇの範囲であって、かつ、平均粒径が９５ｎｍから１５０ｎｍの範囲からなるラテックス粒子を使用する、請求項５に記載の抗ストレプトリジンＯ抗体測定用ラテックス粒子の製造方法。
【請求項９】
ストレプトリジンＯを、カルボキシル基を表面に有するラテックス粒子に共有結合させる際にリン酸緩衝液、ＭＥＳ緩衝液およびＭＯＰＳ緩衝液からなる群より選択されるいずれかの緩衝液を用いる、請求項１〜８のいずれかの記載の抗ストレプトリジンＯ抗体測定用ラテックス粒子の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗ストレプトリジンＯ抗体測定試薬（以下、「ＡＳＯ試薬」と表記することもある。）に用いられるラテックス粒子の製造方法に関する。より詳しくは、ストレプトリジンＯを使用したラテックス凝集比濁法を測定原理とした抗ストレプトリジンＯ抗体測定用ラテックス粒子の製造方法に関する。ストレプトリジンＯ（以下、「ＳＬＯ」と表記することもある。）は溶血性連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）が菌体外に生産する溶血活性を有するタンパク質で、溶血性連鎖球菌の感染有無を診断するためのＡＳＯ測定試薬の原料に広く使用されているものである。
【背景技術】
【０００２】
ラテックス凝集比濁法を測定原理とした測定試薬を製造するためには、測定対象物質と結合する抗体もしくは抗原をラテックス粒子に感作する必要がある。例えば、溶血性連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ）が菌体外に生産するＳＬＯをラテックス粒子に感作すれば、ＳＬＯに対する抗体価（ＡＳＯ価）を測定することが可能であり、ＳＬＯは溶血性連鎖球菌の感染有無を診断するためのＡＳＯ測定試薬の原料として広く使用されている。【０００３】
従来はラテックス粒子とＳＬＯとの疎水性相互作用による物理的吸着法が広く採られ、得られたラテックス粒子とＳＬＯとの複合体をＢＳＡなどの免疫学的に不活性なタンパク質を溶解した緩衝液に懸濁した試薬の状態で保存するのが一般的であった（特許文献１）。しかし、このようにして調製された試薬では試薬を調製する条件により、担体同士の自己凝集が起こったり、感作したＳＬＯの脱離などが起こったりして試薬の反応性が低下し、本来の測定性能が発揮できない場合があった。そこで、ラテックス粒子とＳＬＯとを共有結合させることにより、ＳＬＯの脱離を防止して試薬の安定性を向上させる方法が提案されている（特許文献２、３）。【０００４】
しかしながら、ＡＳＯ試薬の調製においてはラテックス粒子に感作させるＳＬＯが非常に高価であり、試薬の安定性のみならず、少量のＳＬＯで高い感度が得られるＡＳＯ試薬の調製方法を構築することが望まれていた。ただ、物理吸着法とは異なり、共有結合によるラテックス試薬の調製においては、共有結合の種類、ラテックス粒子の種類、抗体もしくは抗原を感作させる条件、ブロッキング条件、洗浄条件、ラテックス粒子の最終保存緩衝液の種類など試薬性能に与えるファクターが多数存在し、それらの条件を体系的に評価し、最適な条件を見出すことは非常に困難であった。これまでに、感度向上に関わる添加剤を第１試薬に添加する手法も報告されているが、いずれの試薬組成でも十分な効果があるとは限らず、逐一検討する必要があった（特許文献４、５，６）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開平５−２０３６４２号公報
【特許文献２】特開２００３−３４４４１０号公報
【特許文献３】特許第４７０４６６２号公報
【特許文献４】特許第３８８６６３９号公報
【特許文献５】特開平１１−３４４４９２号公報
【特許文献６】特許第２９９６６９号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、かかる現状に鑑み創作されたものであり、その目的は少量のＳＬＯで、高い感度が得られるＡＳＯ試薬に用いられるラテックス粒子の製造方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者は、カルボキシル基が結合した共有結合向けラテックス粒子の粒子サイズとカルボキシル基含量に着目し、ＳＬＯを感作するのに適したラテックス粒子を鋭意探索した結果、カルボキシル基含量がラテックス試薬の感度に大きく影響をすることを見出し、本発明を完成させるに至った。【０００８】
すなわち、本発明は、以下の列挙するものが例示される。
［項１］
カルボキシル基含量が５０μｅｑ／ｇ〜２５０μｅｑ／ｇの範囲で表面に導入されたラテックス粒子に、ストレプトリジンＯを共有結合させる工程を含むストレプトリジンＯ測定用ラテックス粒子の製造方法。
［項２］
カルボキシル基含量が９０μｅｑ／ｇ〜１５０μｅｑ／ｇの範囲で表面に導入されたラテックス粒子を用いる項１に記載のストレプトリジンＯ測定用ラテックス粒子の製造方法。
［項３］
平均粒径が５０ｎｍ〜２５０ｎｍのラテックス粒子を用いる項１または２に記載のストレプトリジンＯ測定用ラテックス粒子の製造方法。
［項４］
平均粒径が９０ｎｍ〜１５０ｎｍのラテックス粒子を用いる項３に記載のストレプトリジンＯ測定用ラテックス粒子の製造方法。
［項５］
ｐＨ５．９からｐＨ６．７の緩衝液中において、ストレプトリジンＯを、カルボキシル基を表面に有するラテックス粒子に共有結合させる工程を含む、項１〜４のいずれかに記載の抗ストレプトリジンＯ抗体測定用ラテックス粒子の製造方法。
［項６］
カルボキシル基含量が９０μｅｑ／ｇ〜１５０μｅｑ／ｇの範囲からなるラテックス粒子を使用する、項５に記載の抗ストレプトリジンＯ抗体測定用ラテックス粒子の製造方法。
［項７］
平均粒径が９５ｎｍから１５０ｎｍの範囲からなるラテックス粒子を使用する、項５に記載の抗ストレプトリジンＯ抗体測定用ラテックス粒子の製造方法。
［項８］
カルボキシル基含量が９０μｅｑ／ｇ〜１５０μｅｑ／ｇの範囲であって、かつ、平均粒径が９５ｎｍから１５０ｎｍの範囲からなるラテックス粒子を使用する、項５に記載の抗ストレプトリジンＯ抗体測定用ラテックス粒子の製造方法。
［項９］
ストレプトリジンＯを、カルボキシル基を表面に有するラテックス粒子に共有結合させる際にリン酸緩衝液、ＭＥＳ緩衝液およびＭＯＰＳ緩衝液からなる群より選択されるいずれかの緩衝液を用いる、項１〜８のいずれかの記載の抗ストレプトリジンＯ抗体測定用ラテックス粒子の製造方法。
【発明の効果】
【０００９】
本発明のＡＳＯ試薬に用いられるラテックス粒子の製造方法は、少量のＳＬＯを用いた場合であっても、感度の高い測定を可能とする点で有用である。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】実施例１において、ＳＬＯをラテックス粒子に感作させる際のｐＨがＡＳＯ試薬の測定感度への影響を検討した結果を示す図である。
【図２】実施例４において、ラテックス粒子のロット間差によるＡＳＯ試薬の測定感度への影響を検討した結果を示す図である。
【図３】実施例５において、ＳＬＯラテックス試薬のＳＬＯ濃度による直線性への影響を検討した結果を示す図である。
【図４】実施例６において、ＳＬＯ濃度およびラテックス粒子のロット間差による直線性への影響を検討した結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
（ＳＬＯ）
本発明に用いるＳＬＯとしては、特に限定されず、例えば、溶血性連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ）が菌体外に生産するＳＬＯや組換え大腸菌などを用いて生産された遺伝子組換えのＳＬＯ、また、一部のアミノ酸配列を欠損させた改変型のＳＬＯ、さらにはＭＢＰなどを融合させた融合型ＳＬＯを使用しても良い。例えば、ＷＯ２０１７／２０４３２５に開示されているような、Ｃ末端領域を欠損させたＳＬＯが、熱安定性に優れたＳＬＯとして、好適に例示される。
【００１２】
（ラテックス粒子）
本発明に用いるラテックス粒子としては、特に限定されないが、例えば、スチレンスルホン酸、メタクリル酸、アクリル酸、アクリル酸エステルなどを共重合させたポリスチレン粒子にカルボキシル基を導入した共有結合法向けのラテックス粒子が挙げられる。また、物理吸着を抑制するため、つまり、親水度を高めるためにポリアクリルアミドを含んだラテックス粒子を使用することもできる。好ましくは、アクリル酸を共重合させたポリスチレン粒子が挙げられ、さらに好ましくはポリアクリルアミドにより親水度が高められたアクリル酸を共重合させたポリスチレン粒子が挙げられる。
【００１３】
カルボキシル基の導入効率は適宜選択されるが、好ましくは５０μｅｑ／ｇ〜３００μｅｑ／ｇ、より好ましくは７０μｅｑ／ｇ〜２５０μｅｑ／ｇ、さらに好ましくは９０μｅｑ／ｇ〜２００μｅｑ／ｇ、特に好ましくは９０μｅｑ／ｇ〜１５０μｅｑ／ｇの割合でカルボキシル基が導入されたラテックス粒子である。本明細書において、カルボキシル基の導入効率は、アルカリ溶液の中和滴定により算出することができる。
【００１４】
使用するラテックス粒子の平均粒径は、目的・用途に応じて適宜選択されるが、本発明においては、自動分析機向けであれば、好ましくは５０ｎｍ〜２５０ｎｍ、より好ましくは６０ｎｍ〜２００ｎｍ、さらに好ましくは７０ｎｍ〜１５０ｎｍ、特に好ましくは９５ｎｍから１５０ｎｍの粒径のラテックス粒子であることが好ましい。また、目視判断用の試薬向けであれば、好ましくは１００ｎｍ〜５００ｎｍ、よりこのましくは２００ｎｍ〜４００ｎｍのラテックス粒子であることが好ましい。本明細書において、「平均粒径」は、レーザー回折・散乱法によって求めた粒度分布における積算値５０％での粒径を意味する。
【００１５】
（ＳＬＯをラテックス粒子へ感作する方法）
ラテックス粒子の表面に有するカルボキシル基にＳＬＯのアミノ基を結合させる方法としては、特に限定されるものではないが、例えば、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）などの水溶性カルボジイミドが使用できる。水溶性カルボジイミドの濃度は、０．１％〜５．０％の条件が好ましく、さらに好ましくは、０．５％〜２．０％の条件で用いるのが好ましい。Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドを併用して、不安定なアシルイソ尿素中間体を、アミンと反応しやすいより安定したスクシンイミジルエステルに変換させてもよい。Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドの濃度は、０．１％〜６．０％の条件が好ましく、さらに好ましくは０．２％〜２．０％の条件で用いるのが好ましい。
【００１６】
ＳＬＯをラテックス粒子へ感作する際に用いる緩衝液としては、ＳＬＯを失活させることがなく、かつ、ラテックス粒子への感作を阻害しないようなイオン濃度やｐＨを有するものであればよく、例えば、リン酸緩衝液、酢酸緩衝液、クエン酸緩衝液、コハク酸緩衝液、リンゴ酸緩衝液、ＭＥＳ緩衝液、ＭＯＰＳ緩衝液、ＰＩＰＥＳ緩衝液、ＨＥＰＥＳ緩衝液などの各種グッド緩衝液等が挙げられる。これらの緩衝液は単独で用いてもよく、２種以上を併用してもよい。ｐＨに関しては適宜決められるが、好ましくはｐＨ４．０〜ｐＨ８．０、さらに好ましくはｐＨ５．０〜ｐＨ７．０の範囲である。温度条件は、４℃〜４０℃が好ましく、さらに好ましくは１０℃〜３０℃の条件である。タンパク濃度は、０．１ｍｇ／ｍｌ〜１００ｍｇ／ｍｌの条件が好ましく、さらに好ましくは１ｍｇ／ｍｌ〜１０ｍｇ／ｍｌの条件が好ましい。反応時間は、１分〜２４時間の反応が好ましく、さらに好ましくは１０分〜５時間の反応が好ましい。
【００１７】
ＳＬＯをラテックス粒子へ感作する際のＳＬＯに関しては適宜決められるが、好ましくは０．１〜１０．０（ｍｇ／ｍｌ）、さらに好ましくは０．３〜６．０（ｍｇ／ｍｌ）、特に好ましくは０．７５〜３．０（ｍｇ／ｍｌ）の範囲である。
【００１８】
（ブロッキング）
また、本発明の免疫測定試薬においては、非特異反応を抑制するためや免疫測定試薬自体の安定性を高めるために、特に限定されるものではないが、例えば、アルブミン、カゼイン、ゼラチンなどの蛋白質、これら蛋白質の分解物、アミノ酸、界面活性剤等の１種類もしくは２種類以上を前記不溶性担体に更に担持させても良い。ブロッキング剤の濃度は適宜決められるが、好ましくは０．１％〜５％、さらに好ましくは１％〜３％である。処理温度についても適宜決められるが、好ましくは４℃〜３０℃、さらに好ましくは４℃〜２０℃である。処理時間についても適宜決められるが、好ましくは０．５時間〜２４時間、さらに好ましくは１時間〜１６時間である。
【００１９】
（洗浄）
ブロッキング反応後の洗浄工程においては、各種界面活性剤を含む緩衝液での洗浄を実施することが望ましい。この場合の緩衝液としては、リン酸緩衝液、ＭＥＳ緩衝液およびＭＯＰＳ緩衝液などが挙げられる。界面活性剤としては、Ｔｗｅｅｎ２０、ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、ＣＨＡＰＳ、ＳＤＳ、デオキシコール酸などが挙げられる。使用濃度は適宜決められるが、例えば、０．１％のＴｗｅｅｎ２０を含むリン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７．４）などが好適である。洗浄時間は、１０〜１０００分程度が好ましく、より好ましくは２０〜３００分、特に好ましくは３０〜９０分である。
【００２０】
（測定試薬）
本発明において、ＡＳＯ試薬の好ましい態様としては、２つの試薬から構成されてなり、緩衝溶液を第１試薬、ストレプトリジンＯを感作したラテックス粒子を含むラテックス試液を第２試薬とする構成からなるものが挙げられる。
【００２１】
本発明の免疫測定法としては、本発明のＡＳＯ試薬を用いるのであれば特に限定されるものではないが、例えば、被測定物質を含む媒体に本発明の免疫測定試薬を加え、被測定物質と本発明の免疫測定試薬に含まれるラテックス粒子上に固定された抗原とが抗原抗体反応により結合して生じた凝集を、光学的に観察または目視により観察する。抗原抗体反応のｐＨの好ましい下限は５、上限は１０であり、より好ましい下限は６、上限は９である。反応の温度の好ましい下限は４℃、上限は５０℃であり、より好ましい下限は２０℃、上限は４０℃である。反応時間は適宜決められるが、第２試薬と混合後、１〜１０分間程度反応させることが望ましい。目視により観察して判定する方法としては、例えば、試料と本発明の免疫測定試薬とを、判定板上にて室温で混合し、１〜５分間揺り動かした後、凝集の有無を判定する方法等が挙げられる。
【００２２】
上記媒体としては、被測定物質の種類に応じて適当な各種緩衝液が用いられる。係る緩衝液としては、被測定物質を失活させることがなく、かつ、抗原抗体反応を阻害しないようなイオン濃度やｐＨを有するものであればよく、例えば、リン酸緩衝液、グリシン緩衝液、トリス緩衝液、各種グッド緩衝液等の緩衝液が好適に挙げられる。これらの緩衝液は単独で用いてもよく、２種以上を併用してもよい。
【００２３】
上記媒体は、反応の感度を高めるために、水溶性添加剤、例えばポリエチレングリコール、カルボキシルメチルセルロース、メチルセルロース、デキストラン、ポリビニルピロリドン、ポリグリコシルエチルメタクリレート、プルラン、デキストラン、エルシナン等の水溶性高分子等を含有してもよい。また、特異性の向上、試薬の安定性向上等の目的から、カゼイン、ゼラチン等のタンパク質又はその分解物、変性物；塩化コリン等の第４級アンモニウム塩、ＥＤＴＡ、ポリアニオン、カオトロピックイオン（Ｃｌ−，Ｉ−，ＳＣＮ−等）、アミノ酸、界面活性剤等を含有してもよい。
【００２４】
好ましい態様の一例を挙げると、特に第１試薬においてポリビニルピロリドンを使用することが望ましい。第１試薬に添加するポリビニルピロリドンの濃度としては、第１試薬溶液の最終濃度として、０．０５％〜０．４％、より好ましくは０．０７％〜０．３６％、さらに好ましくは０．０９％〜０．３３％、特に好ましくは０．１％〜０．３％である。
【００２５】
（ＡＳＯ試薬の評価方法）
ＡＳＯ試薬の性能としては、検出感度、測定範囲、測定精度、再現性、安定性などの項目が挙げられる。本発明によれば、ラテックス粒子のカルボキシル基含量を適宜、選択すれば、測定試薬の感度が向上する。ＡＳＯ試薬における測定レンジの上限としては、６００ＩＵ／ｍｌ、好ましくは８００ＩＵ／ｍｌ、より好ましくは１０００ＩＵ／ｍｌ、特に好ましくは１２００ＩＵ／ｍｌである。尚、ＩＵ／ｍｌとは、世界保健機関（ＷＨＯ）が定めた抗ストレプトリジンＯ抗体の国際単位に基づいたものである。このため、ＡＳＯ試薬の感度評価においては、上記の測定レンジを考慮することが好ましい。
【００２６】
本発明におけるＡＳＯ試薬は、感度並びに広い範囲での定量性を有するものである。測定レンジの上限としては、６００ＩＵ／ｍｌ、好ましくは８００ＩＵ／ｍｌ、より好ましくは１０００ＩＵ／ｍｌ、特に好ましくは１２００ＩＵ／ｍｌである。ここで、ＩＵ／ｍｌとは、世界保健機関（ＷＨＯ）が定めた抗ストレプトリジンＯ抗体の国際単位に基づいたものである。
【００２７】
以下に、本発明を実施例により具体的に説明する。なお、本発明は、実施例に限定されるものではない。
【実施例】
【００２８】
［実施例１］ＡＳＯラテックス試薬（第２試薬）の調製
メルク社製カルボキシル基導入ラテックス粒子（製品番号：ＰＳＩ９０−２１）０．１４ｍＬを遠心分離し、上清を抜き取った。次に５０ｍＭ  ＭＥＳ（ｐＨ４．５）を１ｍＬ添加し、十分に懸濁した。その後、再び遠心分離を行い、上清を抜き取った。さらに、５０ｍＭ  ＭＥＳ（ｐＨ４．５）を０．７ｍＬ添加した。これに４％カルボジイミド（ＥＤＣ）０．３５ｍＬ及び２．４％Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）０．３５ｍＬを加えて、ラテックス粒子の１％濃度とした状態で、２５℃で１５分撹拌し、カルボキシル基を活性化した後、遠心分離を行い、上清を抜き取った。【００２９】
これに各種ｐＨ（ｐＨ６．０、ｐＨ６．６、ｐＨ７．５及びｐＨ７．８）の５０ｍＭ  カリウムリン酸緩衝液（以下、「ＫＰＢ」と示す。）を０．７ｍＬ添加し、再び、遠心分離を行い、上清を抜き取った。さらに、各ｐＨの５０ｍＭ  ＫＰＢをそれぞれ０．７ｍＬ添加し、超音波にて分散させることで、活性化ラテックス粒子とした。ＷＯ／２０１７／２０４３２５の実施例２に記載の方法で調製したＳＬＯを３．０（ｍｇ／ｍＬ）の濃度になるよう、同じく各種ｐＨ（ｐＨ６．０、ｐＨ６．６、ｐＨ７．５及びｐＨ７．８）の５０ｍＭ  ＫＰＢで溶解した。次に、活性化ラテックス粒子０．７ｍＬとＳＬＯ溶液０．７ｍＬを同ｐＨの組み合わせで混合し（５０ｍＭ  ＫＰＢ（ｐＨ６．０）で懸濁したラテックス粒子は５０ｍＭ  ＫＰＢ（ｐＨ６．０）で溶解したＳＬＯと混合）、２５℃にて２時間撹拌混合することで、ＳＬＯをラテックス粒子に共有結合させた。【００３０】
次に、遠心分離を行い、上清を除去した後、ブロッキンング溶液（２％ＢＳＡを含む１×ＰＢＳ（ｐＨ７．４））で２ｍＬに再懸濁した。再び、遠心分離により、上清を除去し、１．４ｍＬのブロッキング溶液を添加し、超音波にて分散させた後、４℃で一晩、撹拌した。その後、遠心分離を行い、上清を除去し、最終緩衝液（０．５％ＢＳＡ、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０及び０．０５％アジ化ナトリウムを含む１×ＰＢＳ（ｐＨ７．４））１．４ｍＬに再懸濁した。続いて、超音波にて分散させた後、４℃で１時間、撹拌した。再び、遠心分離により、上清を除去し、２ｍＬの最終緩衝液を添加し、超音波にて十分に分散させた後、２．６７ｍＬの最終緩衝液を添加して、第２試薬とした。【００３１】
［実施例２］ＡＳＯラテックス試薬の感度評価
本発明の免疫学的ラテックス試薬における第１試薬としては、０．５％ＢＳＡを含む１×ＰＢＳ（ｐＨ７．４）を調製した。次に、自動分析装置日立７１８０（日立ハイテクノロジーズ製）を用いて、各ラテックス粒子を用いた場合の感度比較を実施した。まず、第１試薬１２０μｌに各濃度（８００、４００、１００ＩＵ／ｍｌ）のＡＳＯ標準液１．５μｌを添加撹拌し、３７℃で適時保持した後、第２試薬３０μｌを添加撹拌し、この後、３００秒後から６００秒後間の波長５４６ｎｍでの吸光度変化（ΔｍＡｂｓ）を評価した。その結果、ｐＨ７．５やｐＨ７．８の条件下で感作したラテックス粒子を用いた場合は、４００（ＩＵ／ｍＬ）で感度がほぼ定常にとなったが、ｐＨ６．０やｐＨ６．６の条件下で感作したラテックス粒子を用いた場合は、８００（ＩＵ／ｍＬ）まで感度が上昇することを見出した。結果を、表１及び図１に示す。【００３２】
【表１】
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【００３３】
［実施例３］ＡＳＯラテックス試薬（第２試薬）の調製
表２に示した５ロットのメルク社製カルボキシル基導入ラテックス粒子（製品番号：ＰＳＩ９０−２１）０．１４ｍＬをそれぞれ遠心分離し、上清を抜き取った。以後、それぞれのロットは同様の実験操作を行った。次に５０ｍＭ  ＭＥＳ（ｐＨ４．５）を１ｍＬ添加し、十分に懸濁した。その後、再び遠心分離を行い、上清を抜き取った。さらに、５０ｍＭ  ＭＥＳ（ｐＨ４．５）を０．７ｍＬ添加した。これに４％カルボジイミド（ＥＤＣ）０．３５ｍＬ及び２．４％Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）０．３５ｍＬを加えて、ラテックス粒子の１％濃度とした状態で、２５℃で１５分撹拌し、カルボキシル基を活性化した後、遠心分離を行い、上清を抜き取った。これに５０ｍＭ  カリウムリン酸緩衝液（以下、「ＫＰＢ」と示す。）（ｐＨ６．５）を０．７ｍＬ添加し、再び、遠心分離を行い、上清を抜き取った。これに５０ｍＭ  ＫＰＢ（ｐＨ６．５）を０．７ｍＬ添加し、超音波にて分散させることで、活性化ラテックス粒子とした。ＷＯ／２０１７／２０４３２５の実施例２に記載の方法で調製したストレプトリジンＯ（ＳＬＯ）を３．０（ｍｇ／ｍＬ）の濃度になるよう５０ｍＭ  ＫＰＢ（ｐＨ６．５）で溶解した。次に、活性化ラテックス粒子０．７ｍＬとＳＬＯ溶液０．７ｍＬを混合し、２５℃にて２時間撹拌混合することで、ＳＬＯをラテックス粒子に共有結合させた。【００３４】
【表２】
2020095759.tif 000004
【００３５】
次に、遠心分離を行い、上清を除去した後、ブロッキンング溶液（２％ＢＳＡを含む１×ＰＢＳ（ｐＨ７．４））で２ｍＬに再懸濁した。再び、遠心分離により、上清を除去し、１．４ｍＬのブロッキング溶液を添加し、超音波にて分散させた後、４℃で一晩、撹拌した。その後、遠心分離を行い、上清を除去し、最終緩衝液（０．５％ＢＳＡ、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０及び０．０５％アジ化ナトリウムを含む１×ＰＢＳ（ｐＨ７．４））１．４ｍＬに再懸濁した。続いて、超音波にて分散させた後、４℃で１時間、撹拌した。再び、遠心分離により、上清を除去し、２ｍＬの最終緩衝液を添加し、超音波にて十分に分散させた後、２．６７ｍＬの最終緩衝液を添加して、第２試薬とした。【００３６】
［実施例４］ＡＳＯラテックス試薬の感度評価
本発明の免疫学的ラテックス試薬における第１試薬としては、０．５％ＢＳＡを含む１×ＰＢＳ（ｐＨ７．４）を調製した。次に、自動分析装置日立７１８０（日立ハイテクノロジーズ製）を用いて、各ラテックス粒子を用いた場合の感度比較を実施した。まず、第１試薬１２０μｌに各濃度（４００、１００ＩＵ／ｍｌ）のＡＳＯ標準液１．５μｌを添加撹拌し、３７℃で適時保持した後、第２試薬６０μｌを添加撹拌し、この後、３００秒後から６００秒後間の波長５４６ｎｍでの吸光度変化（ΔｍＡｂｓ）を評価した。その結果、メルク社製カルボキシル基導入ラテックス粒子（製品番号：ＰＳＩ９０−２１）のＬｏｔ  Ｎｏ．８００／７９（１３３ｎｍ、ＣＯＯＨ＝１０９μｅｑ／ｇ）、Ｌｏｔ  Ｎｏ．３９３０／９（１０６ｎｍ、ＣＯＯＨ＝１０７μｅｑ／ｇ）及びＬｏｔ  Ｎｏ．３７７８／１７（１１３ｎｍ、ＣＯＯＨ＝１３５μｅｑ／ｇ）を用いて、ＡＳＯ試薬を調製した場合は、図２に示すように高感度な試薬を調製することができた。一方、Ｌｏｔ  Ｎｏ．２３７４／２２（１２８ｎｍ、ＣＯＯＨ＝１７２μｅｑ／ｇ）及びＬｏｔ  Ｎｏ．２５４２／７（１０４ｎｍ、ＣＯＯＨ＝１６８μｅｑ／ｇ）を用いて、ＡＳＯ試薬を調製した場合は感度が悪いことが明らかとなった。以上の結果より、ＳＬＯのアミノ基を共有結合によりラテックス粒子に感作する際には、ラテックス粒子のカルボキシル基含量が感度に影響をすることを明らかにした。【００３７】
[実施例５] ＡＳＯラテックス試薬（第２試薬）の調製におけるＳＬＯ濃度の影響
実施例３に記載の方法でラテックス試薬（第２試薬）を調製した。尚、その際、ラテックス粒子には表２中のＬｏｔ  Ｎｏ．８００／７９（１３３ｎｍ、ＣＯＯＨ＝１０９μｅｑ／ｇ）を使用し、ストレプトリジンＯ（ＳＬＯ）を１．５（ｍｇ／ｍＬ）、２．０（ｍｇ／ｍＬ）、３．０（ｍｇ／ｍＬ）、４．０（ｍｇ／ｍＬ）、５．０（ｍｇ／ｍＬ）及び６．０（ｍｇ／ｍＬ）の濃度になるよう５０ｍＭ  ＫＰＢ（ｐＨ６．５）でそれぞれ溶解したものを調製し、ＳＬＯ濃度の影響を検討した。実施例３に記載の通り、ＳＬＯをラテックス粒子に共有結合させた際は、活性化ラテックス粒子０．７ｍＬとＳＬＯ溶液０．７ｍＬを混合したため、感作時のＳＬＯ濃度はそれぞれ０．７５（ｍｇ／ｍＬ）、１．０（ｍｇ／ｍＬ）、１．５（ｍｇ／ｍＬ）、２．０（ｍｇ／ｍＬ）、２．５（ｍｇ／ｍＬ）及び３．０（ｍｇ／ｍＬ）となった。その結果、終濃度１．０（ｍｇ／ｍＬ）で感作した際、感度は最も高くなりことが明らかとなった。一方で、終濃度１．０（ｍｇ／ｍＬ）より高濃度のＳＬＯを感作すると、感度は下がるものの、８００ＩＵ／ｍｌまでの希釈直線性は高まることが明らかとなった。結果を図３に示した。【００３８】
[実施例６] ＡＳＯラテックス試薬（第２試薬）の調製におけるＳＬＯ濃度及びラテックス粒子のロット間差の影響
実施例５に記載のＳＬＯ濃度がＡＳＯラテックス試薬の感度に与える影響に関して、ラテックス粒子のロット間差が出ないことを確認するため、表２に示されているＬｏｔ  Ｎｏ．８００／７９（１３３ｎｍ、ＣＯＯＨ＝１０９μｅｑ／ｇ）に加えて、表２中のＬｏｔ  Ｎｏ．３７７８／１７（１１３ｎｍ、ＣＯＯＨ＝１３５μｅｑ／ｇ）及び新規ロットとして、同メルク社製カルボキシル基導入ラテックス粒子（製品番号：ＰＳＩ９０−２１）のＬｏｔ  Ｎｏ．３７７８／１７（１１３ｎｍ、ＣＯＯＨ＝１３５μｅｑ／ｇ）を用いて、実施例５と同様の実験を行った。その結果、カルボキシル基含量が同等のラテックス粒子の場合は実施例５の結果と同等の結果が得られることを明らかにした。結果を図４に示す。
【産業上の利用可能性】
【００３９】
本発明は、測定感度に優れた診断薬に用いられるラテックス粒子を提供するものとして、特に医療分野において有用な技術を提供するものである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【国際調査報告】
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