(57)【要約】目的タンパク質に下記のアミノ酸配列を有するペプチドタグを連結して発現させることで目的タンパク質を効率よく可溶性画分に蓄積させる。      Ｘ(ＰＹ)qＰＺＰはプロリンを示し、Ｘはアルギニン（Ｒ）、グリシン（Ｇ）、セリン（Ｓ）、リジン（Ｋ）、トレオニン（Ｔ）、ロイシン（Ｌ）、アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）およびメチオニン（Ｍ）からなる群より独立に選択される０〜５個のアミノ酸からなるアミノ酸配列を示し、ＹはＲ、Ｇ、Ｋ、Ｔ、Ｌ、Ｎ、ＱおよびＭからなる群より独立に選択される１〜４個のアミノ酸からなるアミノ酸配列を示し、ｑは１〜１０の整数を示し、ＺはＲ、Ｇ、Ｓ、Ｋ、Ｔ、Ｌ、Ｎ、ＱおよびＭからなる群より独立に選択される０〜１０個のアミノ酸からなるアミノ酸配列を示し、前記ペプチドタグのアミノ酸配列中には、Ｑ、Ｍ、Ｌ、ＮおよびＴが合計で３つ以上含まれる。
2020045530.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
目的タンパク質、および該目的タンパク質に連結された下記アミノ酸配列を含むペプチドタグ、を含む融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドが導入された発現系において、前記ポリヌクレオチドから前記融合タンパク質を産生させて蓄積させた可溶性画分。
Ｘ(ＰＹ)qＰＺ
Ｐはプロリンを示し、
Ｘはアルギニン（Ｒ）、グリシン（Ｇ）、セリン（Ｓ）、リジン（Ｋ）、トレオニン（Ｔ）、ロイシン（Ｌ）、アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）およびメチオニン（Ｍ）からなる群より独立に選択される０〜５個のアミノ酸からなるアミノ酸配列を示し、
ＹはＲ、Ｇ、Ｋ、Ｔ、Ｌ、Ｎ、ＱおよびＭからなる群より独立に選択される１〜４個のアミノ酸からなるアミノ酸配列を示し、
ｑは１〜１０の整数を示し、
ＺはＲ、Ｇ、Ｓ、Ｋ、Ｔ、Ｌ、Ｎ、ＱおよびＭからなる群より独立に選択される０〜１０個のアミノ酸からなるアミノ酸配列を示し、
前記ペプチドタグのアミノ酸配列中には、Ｑ、Ｍ、Ｌ、ＮおよびＴが合計で３つ以上含まれる。
【請求項２】
ＰＹがＰＧＱ、ＰＧＭ、ＰＧＴ、ＰＧＬ、ＰＱＱ、ＰＧＮ、ＰＧＱＧ、ＰＧＭＧ、ＰＧＴＧ、ＰＧＬＧ、ＰＧＮＧ、ＰＱＱＱから選択される１種類以上である、請求項１に記載の可溶性画分。
【請求項３】
前記ペプチドタグの長さが１０〜３０アミノ酸である、請求項１または２に記載の可溶性画分。
【請求項４】
前記ペプチドタグは配列番号７、１０、１２、１５、１７、１９、２１または２３のアミノ酸配列を有する、請求項１〜３のいずれか一項に記載の可溶性画分。
【請求項５】
目的タンパク質が酵素である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の可溶性画分。
【請求項６】
前記融合タンパク質は分泌シグナルを含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載の可溶性画分。
【請求項７】
前記ペプチドタグが前記目的タンパク質のＣ末端側に連結されていることを特徴とする、請求項１〜６のいずれか一項に記載の可溶性画分。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれか１項に記載の可溶性画分を回収し、前記融合タンパク質を抽出することを特徴とする融合タンパク質の製造方法。
【請求項９】
目的タンパク質、および該目的タンパク質に連結された下記アミノ酸配列を含むペプチドタグ、を含む融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドが導入された発現系であって、無変性の前記融合タンパク質を産生する発現系。
Ｘ(ＰＹ)qＰＺ
Ｐはプロリンを示し、
Ｘはアルギニン（Ｒ）、グリシン（Ｇ）、セリン（Ｓ）、リジン（Ｋ）、トレオニン（Ｔ）、ロイシン（Ｌ）、アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）およびメチオニン（Ｍ）からなる群より独立に選択される０〜５個のアミノ酸からなるアミノ酸配列を示し、
ＹはＲ、Ｇ、Ｋ、Ｔ、Ｌ、Ｎ、ＱおよびＭからなる群より独立に選択される１〜４個のアミノ酸からなるアミノ酸配列を示し、
ｑは１〜１０の整数を示し、ＺはＲ、Ｇ、Ｓ、Ｋ、Ｔ、Ｌ、Ｎ、ＱおよびＭからなる群より独立に選択される０〜１０個のアミノ酸からなるアミノ酸配列を示し、
前記ペプチドタグのアミノ酸配列中には、Ｑ、Ｍ、Ｌ、ＮおよびＴが合計で３つ以上含まれる。
【請求項１０】
請求項９に記載の発現系から産生され、無変性の前記融合タンパク質を含む溶液。
【請求項１１】
請求項９に記載の発現系を用いて、目的タンパク質が酵素である前記融合タンパク質を無変性タンパク質として産生させ、得られた無変性の酵素融合タンパク質を用いて基質変換反応を行うことを特徴とする、酵素が関与する代謝系による物質生産を効率化する方法。
【請求項１２】
目的タンパク質、および該目的タンパク質に連結された下記アミノ酸配列を含むペプチドタグ、を含む融合タンパク質。
Ｘ(ＰＹ)qＰＺ
Ｐはプロリンを示し、
Ｘはアルギニン（Ｒ）、グリシン（Ｇ）、セリン（Ｓ）、リジン（Ｋ）、トレオニン（Ｔ）、ロイシン（Ｌ）、アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）およびメチオニン（Ｍ）からなる群より独立に選択される０〜５個のアミノ酸からなるアミノ酸配列を示し、
ＹはＲ、Ｇ、Ｋ、Ｔ、Ｌ、Ｎ、ＱおよびＭからなる群より独立に選択される１〜４個のアミノ酸からなるアミノ酸配列を示し、
ｑは１〜１０の整数を示し、
ＺはＲ、Ｇ、Ｓ、Ｋ、Ｔ、Ｌ、Ｎ、ＱおよびＭからなる群より独立に選択される０〜１０個のアミノ酸からなるアミノ酸配列を示し、
前記ペプチドタグのアミノ酸配列中には、Ｑ、Ｍ、Ｌ、ＮおよびＴが合計で３つ以上含まれ、少なくとも１つのＭが含まれる。
【請求項１３】
ＰＹがＰＧＭ、ＰＧＭＧから選択される１種類以上である、請求項１２に記載の融合タンパク質。
【請求項１４】
前記ペプチドタグの長さが１０〜３０アミノ酸である、請求項１２または１３に記載の融合タンパク質。
【請求項１５】
前記ペプチドタグは配列番号７、１０、１２、１５、１７、１９、２１または２３のアミノ酸配列を有する、請求項１２〜１４のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項１６】
目的タンパク質が酵素である、請求項１２〜１５のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項１７】
前記融合タンパク質は分泌シグナルを含む、請求項１２〜１５のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項１８】
前記ペプチドタグが前記目的タンパク質のＣ末端側に連結されていることを特徴とする、請求項１２〜１７のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項１９】
請求項１２〜１８のいずれか一項に記載の融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド。
【請求項２０】
請求項１９に記載のポリヌクレオチドを含む組換えベクター。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は組換えタンパク質の生産技術に関し、より詳細には、組換えタンパク質を可溶性画分に効率よく発現させるための技術に関する。
【背景技術】
【０００２】
遺伝子組換え技術の発展は、高等生物由来の有用タンパク質の大腸菌や酵母などを利用した異種発現を可能なものとし、更には今日、異種発現による有用タンパク質の生産を、汎用技術として位置づけられるまでに至らしめた。有用タンパク質の発現、蓄積量を向上させる方策として、プロモーターおよびターミネーターの選定、翻訳エンハンサーの利用、導入遺伝子のコドン改変、タンパク質の細胞内輸送および局在化などが検討されている。また、それ以外にも、有用タンパク質にペプチドタグを連結させることで、その発現を改善させる技術も幾つか開発されている。例えば、特許文献１にはENTROPIC BRISTLE DOMAIN（EBD）ペプチドを連結させて有用タンパク質を発現させることにより、有用タンパク質の可溶性画分における発現を向上させることが開示されている。しかしながら、EBDペプチド中のプロリンとプロリンの間にはセリンが含まれるため、産生されるタンパク質の総生産量が低くなる恐れがある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】米国特許公開20090137004号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明は、遺伝子組換えタンパク質生産技術において可溶性画分に目的タンパク質を効率よく産生させることを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者らは上記課題を解決するために鋭意検討を行った。その結果、下記のアミノ酸配列を有するペプチドタグを使用することにより、目的タンパク質の可溶性画分における発現量が著しく向上することを見出した。すなわち、連結させるペプチドタグのアミノ酸組成および配列を鋭意改変することにより、目的タンパク質の発現量を維持しつつ、飛躍的に可溶性画分における発現量を向上させることに成功した。このような知見に基づき、本発明は完成した。【０００６】
本発明の要旨は以下のとおりである。
［１］目的タンパク質、および該目的タンパク質に連結された下記アミノ酸配列を含むペプチドタグ、を含む融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドが導入された発現系において、前記ポリヌクレオチドから前記融合タンパク質を産生させて蓄積させた可溶性画分。
Ｘ(ＰＹ)qＰＺ
Ｐはプロリンを示し、
Ｘはアルギニン（Ｒ）、グリシン（Ｇ）、セリン（Ｓ）、リジン（Ｋ）、トレオニン（Ｔ）、ロイシン（Ｌ）、アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）およびメチオニン（Ｍ）からなる群より独立に選択される０〜５個のアミノ酸からなるアミノ酸配列を示し、
ＹはＲ、Ｇ、Ｋ、Ｔ、Ｌ、Ｎ、ＱおよびＭからなる群より独立に選択される１〜４個のアミノ酸からなるアミノ酸配列を示し、
ｑは１〜１０の整数を示し、ＺはＲ、Ｇ、Ｓ、Ｋ、Ｔ、Ｌ、Ｎ、ＱおよびＭからなる群より独立に選択される０〜１０個のアミノ酸からなるアミノ酸配列を示し、
前記ペプチドタグのアミノ酸配列中には、Ｑ、Ｍ、Ｌ、ＮおよびＴが合計で３つ以上含まれる。
［２］ＰＹがＰＧＱ、ＰＧＭ、ＰＧＴ、ＰＧＬ、ＰＱＱ、ＰＧＮ、ＰＧＱＧ、ＰＧＭＧ、ＰＧＴＧ、ＰＧＬＧ、ＰＧＮＧ、ＰＱＱＱから選択される１種類以上である、［１］に記載の可溶性画分。
［３］前記ペプチドタグの長さが１０〜３０アミノ酸である、［１］または［２］に記載の可溶性画分。
［４］前記ペプチドタグは配列番号７、１０、１２、１５、１７、１９、２１または２３のアミノ酸配列を有する、［１］〜［３］のいずれかに記載の可溶性画分。
［５］目的タンパク質が酵素である、［１］〜［４］のいずれかに記載の可溶性画分。
［６］前記融合タンパク質は分泌シグナルを含む、［１］〜［５］のいずれかに記載の可溶性画分。
［７］前記ペプチドタグが前記目的タンパク質のＣ末端側に連結されていることを特徴とする、［１］〜［６］のいずれかに記載の可溶性画分。
［８］［１］〜［７］のいずれかに記載の可溶性画分を回収し、前記融合タンパク質を抽出することを特徴とする融合タンパク質の製造方法。
［９］目的タンパク質、および該目的タンパク質に連結された下記アミノ酸配列を含むペプチドタグ、を含む融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドが導入された発現系であって、無変性の前記融合タンパク質を産生する発現系。
Ｘ(ＰＹ)qＰＺ
Ｐはプロリンを示し、
Ｘはアルギニン（Ｒ）、グリシン（Ｇ）、セリン（Ｓ）、リジン（Ｋ）、トレオニン（Ｔ）、ロイシン（Ｌ）、アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）およびメチオニン（Ｍ）からなる群より独立に選択される０〜５個のアミノ酸からなるアミノ酸配列を示し、
ＹはＲ、Ｇ、Ｋ、Ｔ、Ｌ、Ｎ、ＱおよびＭからなる群より独立に選択される１〜４個のアミノ酸からなるアミノ酸配列を示し、
ｑは１〜１０の整数を示し、
ＺはＲ、Ｇ、Ｓ、Ｋ、Ｔ、Ｌ、Ｎ、ＱおよびＭからなる群より独立に選択される０〜１０個のアミノ酸からなるアミノ酸配列を示し、
前記ペプチドタグのアミノ酸配列中には、Ｑ、Ｍ、Ｌ、ＮおよびＴが合計で３つ以上含まれる。
［１０］［９］に記載の発現系から産生され、無変性の前記融合タンパク質を含む溶液。［１１］［９］に記載の発現系を用いて、目的タンパク質が酵素である前記融合タンパク質を無変性タンパク質として産生させ、得られた無変性の酵素融合タンパク質を用いて基質変換反応を行うことを特徴とする、酵素が関与する代謝系による物質生産を効率化する方法。
［１２］目的タンパク質、および該目的タンパク質に連結された下記アミノ酸配列を含むペプチドタグ、を含む融合タンパク質。
Ｘ(ＰＹ)qＰＺ
Ｐはプロリンを示し、
Ｘはアルギニン（Ｒ）、グリシン（Ｇ）、セリン（Ｓ）、リジン（Ｋ）、トレオニン（Ｔ）、ロイシン（Ｌ）、アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）およびメチオニン（Ｍ）からなる群より独立に選択される０〜５個のアミノ酸からなるアミノ酸配列を示し、
ＹはＲ、Ｇ、Ｋ、Ｔ、Ｌ、Ｎ、ＱおよびＭからなる群より独立に選択される１〜４個のアミノ酸からなるアミノ酸配列を示し、
ｑは１〜１０の整数を示し、
ＺはＲ、Ｇ、Ｓ、Ｋ、Ｔ、Ｌ、Ｎ、ＱおよびＭからなる群より独立に選択される０〜１０個のアミノ酸からなるアミノ酸配列を示し、前記ペプチドタグのアミノ酸配列中には、Ｑ、Ｍ、Ｌ、ＮおよびＴが合計で３つ以上含まれ、少なくとも１つのＭが含まれる。
［１３］ＰＹがＰＧＭ、ＰＧＭＧから選択される１種類以上である、［１２］に記載の融合タンパク質。
［１４］前記ペプチドタグの長さが１０〜３０アミノ酸である、［１２］または［１３］に記載の融合タンパク質。
［１５］前記ペプチドタグは配列番号７、１０、１２、１５、１７、１９、２１または２３のアミノ酸配列を有する、［１２］〜［１４］のいずれかに記載の融合タンパク質。
［１６］目的タンパク質が酵素である、［１２］〜［１５］のいずれかに記載の融合タンパク質。
［１７］前記融合タンパク質は分泌シグナルを含む、［１２］〜［１５］のいずれかに記載の融合タンパク質。
［１８］前記ペプチドタグが前記目的タンパク質のＣ末端側に連結されていることを特徴とする、［１２］〜［１７］のいずれかに記載の融合タンパク質。
［１９］［１２］〜［１８］のいずれかに記載の融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド。
［２０］［１９］に記載のポリヌクレオチドを含む組換えベクター。
【発明の効果】
【０００７】
本発明によれば、特定の配列を含むペプチドタグを連結することにより、目的タンパク質の発現効率を向上させると共に可溶性画分での蓄積量を向上させることが可能となり、目的タンパク質の分離・精製が容易となる。目的タンパク質が分泌シグナル配列を含む場合は目的タンパク質の培地中への分泌生産効率も向上させることができる。
また、目的タンパク質が酵素の場合、無変性の酵素融合タンパク質を含む溶液を培地や細胞破砕液などから容易に調製し、酵素が関与する代謝系による酵素反応に適用することができるので、基質の効率的な変換反応を利用した物質生産に貢献することができる。
また、導入した酵素が細胞内で凝集および不溶化することが少ないので、細胞内で酵素反応においても効率的に寄与する。
本発明において使用されるペプチドタグは、特許文献１に記載のペプチドタグとは異なり、プロリン間にセリンを含まないため、可溶性画分におけるタンパク質の生産量が向上することが期待できる。また、目的タンパク質のＣ末端側に連結した場合でも融合タンパク質の可溶性画分における発現を向上することができる。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】エステラーゼのＮ末端に各種ペプチドタグを連結した融合タンパク質をブレビバチルスで発現させるためのプラスミドの構築手順を示す図。
【図２】エステラーゼのＣ末端に各種ペプチドタグを連結した融合タンパク質をブレビバチルスで発現させるためのプラスミドの構築手順を示す図。
【図３】各ペプチドタグをＮ末端側に連結させたエステラーゼの可溶性画分での発現量の比較を示すグラフ。
【図４】各ペプチドタグをＣ末端側に連結させたエステラーゼの可溶性画分での発現量の比較を示すグラフ。
【図５】タグ（Ａ：PX12-32, Ｂ：PX12-34）を付加したエステラーゼの活性をタグなしと比較した結果を示すグラフ。Ｓは培地中に分泌された画分、Ｐは細胞内の可溶性画分を示す。
【図６】各ペプチドタグをＮ末端側に連結させたヒト成長ホルモンの各画分での発現量の比較を示すグラフ（酵母）。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
目的タンパク質、および該目的タンパク質に連結された下記アミノ酸配列を含むペプチドタグ、を含む融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドが導入された発現系において、前記ポリヌクレオチドから前記融合タンパク質を産生させて蓄積させた可溶性画分を回収し、前記融合タンパク質を抽出することができる。
【００１０】
本発明で使用されるペプチドタグは下記の配列を有する。
Ｘ(ＰＹ)qＰＺ
【００１１】
Ｘはアルギニン（Ｒ）、グリシン（Ｇ）、セリン（Ｓ）、リジン（Ｋ）、トレオニン（Ｔ）、ロイシン（Ｌ）、アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）およびメチオニン（Ｍ）から独立に選択される０〜５個のアミノ酸からなるアミノ酸配列を示す。
【００１２】
Ｘが０個のアミノ酸の場合、ペプチドタグのＮ末端のアミノ酸はＰとなる。
Ｘが１個のアミノ酸の場合、Ｒ、Ｇ、Ｓ、Ｋ、Ｔ、Ｌ、Ｎ、ＱおよびＭから選択されるアミノ酸がペプチドタグのＮ末端となる。
Ｘは１個のアミノ酸の場合、Ｑ、Ｌ、Ｎ、ＭまたはＴであることが好ましく、Ｑ、ＭまたはＴであることがより好ましい。
【００１３】
Ｘが２〜５個のアミノ酸の場合、２〜５個のＸはＲ、Ｇ、Ｓ、Ｋ、Ｔ、Ｌ、Ｎ、Ｑ、Ｍから選択される同じアミノ酸残基であってもよいし、異なるアミノ酸残基であってもよい。
Ｘの個数は、好ましくは１〜５個であり、より好ましくは２〜５個であり、さらに好ましくは２〜３個であり、特に好ましくは２個である。
Ｘは２〜５個のアミノ酸の場合、Ｃ末側の２アミノ酸、すなわち(ＰＹ)qの直前の２アミノ酸がＲＱ、ＲＬ、ＲＮ、ＲＭまたはＲＴであることが好ましく、ＲＱ、ＲＭまたはＲＴであることがより好ましい。
【００１４】
(ＰＹ)qにおけるＹはＲ、Ｇ、Ｋ、Ｔ、Ｌ、Ｎ、ＱおよびＭから独立に選択される１〜４個のアミノ酸からなるアミノ酸配列を示し、ｑは１〜１０の整数を示す。
すなわち、(ＰＹ)qとはＰＹ、すなわち、Ｙが１個のアミノ酸（ＰＹa）、２個のアミノ酸（ＰＹaＹb）、３個のアミノ酸（ＰＹaＹbＹc）または４個のアミノ酸（ＰＹaＹbＹcＹd）なので、ＰＹa、ＰＹaＹb、ＰＹaＹbＹc、およびＰＹaＹbＹcＹdのいずれか１つ以上が合計でq回連続することを意味する（Ｐはプロリンを示す）。なお、ＰＹは好ましくは２個のアミノ酸（ＰＹaＹb）または３個のアミノ酸（ＰＹaＹbＹc）である。ｑは１〜１０の整数であり、好ましくは２〜１０の整数、より好ましくは２〜５の整数、さらに好ましくは２〜３の整数、特に好ましくは２である。
【００１５】
それぞれのＹはＲ、Ｇ、Ｋ、Ｔ、Ｌ、Ｎ、ＱおよびＭから選択される同じアミノ酸残基であってもよいし、異なるアミノ酸残基であってもよいが、q回連続するＰＹに含まれる全てのＹ（ペプチドタグに含まれる全てのＹ）のうち、少なくとも１つは、Ｑ、Ｎ、Ｌ、ＭまたはＴであることが好ましく、２つ以上がＱ、Ｎ、Ｌ、ＭまたはＴであることがより好ましい。望ましくは、q回連続するＰＹに含まれる全てのＹ（ペプチドタグに含まれる全てのＹ）のうち、少なくとも１つは、Ｑ、ＭまたはＴであることが好ましく、２つ以上がＱ、ＭまたはＴであることがより好ましい。
【００１６】
また、ｑ回連続するそれぞれのＰＹ（ＰＹ1、ＰＹ1Ｙ2、ＰＹ1Ｙ2Ｙ3、およびＰＹ1Ｙ2Ｙ3Ｙ4）は、Ｑ、Ｎ、Ｌ、ＭまたはＴを１つ含むことが好ましく、Ｑ、ＭまたはＴを1つ含むことがより好ましく、Ｙのうち、Ｑ、Ｎ、Ｌ、ＭおよびＴ以外のアミノ酸はＧであることが好ましい。
例えば、Ｙが２個のアミノ酸（ＰＹ1Ｙ2）の場合、ＰＹはＰＧＱ、ＰＧＮ、ＰＧＬ、ＰＧＭまたはＰＧＴであることが好ましく、ＰＧＱ、ＰＧＭまたはＰＧＴであることがより好ましく、Ｙが３個のアミノ酸（ＰＹ1Ｙ2Ｙ3）の場合、ＰＹはＰＧＱＧ、ＰＧＮＧ、ＰＧＬＧ、ＰＧＭＧまたはＰＧＴＧであることが好ましく、ＰＧＱＧ、ＰＧＭＧまたはＰＧＴＧであることがより好ましく、これらが任意の組み合わせでｑ回連続する配列が好ましい一態様である。
【００１７】
ＺはＲ、Ｇ、Ｓ、Ｋ、Ｔ、Ｌ、Ｎ、ＱおよびＭからなる群より独立に選択される０〜１０個のアミノ酸からなるアミノ酸配列を示す。
Ｚが０個のアミノ酸の場合、ペプチドタグのＣ末端のアミノ酸はＰとなる。
Ｚが１個のアミノ酸の場合、Ｒ、Ｇ、Ｓ、Ｋ、Ｔ、Ｌ、Ｎ、ＱおよびＭから選択されるアミノ酸がペプチドタグのＣ末端となる。
Ｚが２〜１０個のアミノ酸の場合、２〜１０個のＺはＲ、Ｇ、Ｓ、Ｋ、Ｔ、Ｌ、Ｎ、ＱおよびＭから選択される同じアミノ酸残基であってもよいし、異なるアミノ酸残基であってもよい。
Ｚの個数は、好ましくは１〜１０個であり、より好ましくは１〜５個であり、より好ましくは２〜５個であり、さらに好ましくは２〜３個であり、特に好ましくは２個である。
【００１８】
Ｚは１個のアミノ酸の場合、ＲまたはＳであることが好ましく、Ｒであることがより好ましい。
Ｚは２〜１０個のアミノ酸の場合、Ｃ末側の２アミノ酸、すなわちペプチドタグの最後の２アミノ酸がＲＳであることが好ましい。
【００１９】
ペプチドタグに含まれるアミノ酸、すなわち、Ｘに含まれるアミノ酸、Ｙに含まれるアミノ酸、およびＺに含まれるアミノ酸のうち、Ｑ、Ｎ、Ｌ、ＭおよびＴが合計で３つ以上含まれることが好ましく、Ｑ、ＭまたはＴが合計で３つ以上含まれることがより好ましい。ペプチドタグに含まれるアミノ酸のうち、Ｑ、Ｎ、Ｌ、ＭおよびＴの合計の割合は好ましくは２０〜５０％、より好ましくは２０〜３０％である。
【００２０】
なお、ペプチドタグに含まれるアミノ酸、すなわち、Ｘに含まれるアミノ酸、Ｙに含まれるアミノ酸、およびＺに含まれるアミノ酸のうち、Ｑ、Ｎ、Ｌ、ＭおよびＴが合計で３つ以上含まれ、Ｍが少なくとも１つ含まれる前記ペプチドタグは新規ペプチドタグであり、当該新規ペプチドタグを含む融合タンパク質及びそれをコードするポリヌクレオチドならびに該ポリヌクレオチドを含む組換えベクターはそれら自体が本発明の範囲に含まれる。
【００２１】
本発明で使用されるペプチドタグの長さは６〜５０アミノ酸であることが好ましく、６〜４０アミノ酸であることがより好ましく、８〜４０アミノ酸であることがさらに好ましく、１０〜３０アミノ酸であることがいっそう好ましく、１２〜２５アミノ酸であることがよりいっそう好ましく、１２〜２０アミノ酸であることが特に好ましい。
【００２２】
本発明で使用されるペプチドタグの好ましい例としては、以下のような配列を有するペプチドタグが挙げられる。
【００２３】
【表１−１】
2020045530.tif 000003
【００２４】
【表１−２】
2020045530.tif 000004
【００２５】
【表１−３】
2020045530.tif 000005
【００２６】
【表１−４】
2020045530.tif 000006
【００２７】
【表１−５】
2020045530.tif 000007
【００２８】
【表１−６】
2020045530.tif 000008
【００２９】
本発明において、融合タンパク質は、目的タンパク質に上記ペプチドタグを連結させたものである。目的タンパク質のＮ末端にペプチドタグが連結してもよいし、目的タンパク質のＣ末端にペプチドタグが連結してもよいし、目的タンパク質のＮ末端とＣ末端の両方にペプチドタグが連結してもよい。目的タンパク質のＮ末端および／またはＣ末端にペプチドタグが直接連結してもよいし、１〜数アミノ酸（例えば、１〜５アミノ酸）の配列を介して結合してもよい。１〜数アミノ酸の配列は目的タンパク質の機能や発現量に悪影響を及ぼさない配列であれば任意の配列でよいが、プロテアーゼ認識配列とすることにより、発現し、精製した後にペプチドタグを目的タンパク質から切り離すことができる。プロテアーゼ認識配列としてはファクターＸａ認識配列などが例示される。また、融合タンパク質は、Ｈｉｓタグ、ＨＮタグ、ＦＬＡＧタグなど、検出や精製などに必要な他のタグ配列を含むものでもよい。
【００３０】
融合タンパク質に含まれる目的タンパク質の種類は特に制限されないが、医療用、診断用、または物質生産用に使用されるタンパク質が好ましく、例えば、成長因子、ホルモン、サイトカイン、血液タンパク質、酵素、抗原、抗体、転写因子、受容体、蛍光タンパク質またはそれらの部分ペプチドなどが挙げられる。
【００３１】
酵素としては、例えば、リパーゼ、プロテアーゼ、ステロイド合成酵素、キナーゼ、フォスファターゼ、キシラナーゼ、エステラーゼ、メチラーゼ、デメチラーゼ、酸化酵素、還元酵素、セルラーゼ、アロマターゼ、コラゲナーゼ、トランスグルタミナーゼ、グリコシダーゼおよびキチナーゼが挙げられる。
【００３２】
成長因子としては、例えば、上皮成長因子（EGF）、インスリン様成長因子（IGF）、トランスフォーミング成長因子（TGF）、神経成長因子（NGF）、脳由来神経栄養因子（BDNF）、血管内皮細胞増殖因子（VEGF）、顆粒球コロニー刺激因子（G-CSF）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（GM-CSF）、血小板由来成長因子（PDGF）、エリスロポエチン（EPO）、トロンボポエチン（TPO）、線維芽細胞増殖因子（FGF）、肝細胞増殖因子（HGF）が挙げられる。
【００３３】
ホルモンとしては、例えば、インスリン、グルカゴン、ソマトスタチン、成長ホルモン、副甲状腺ホルモン、プロラクチン、レプチン、カルシトニンが挙げられる。
【００３４】
サイトカインとしては、例えば、インターロイキン、インターフェロン（IFNα、IFNβ、IFNγ）、腫瘍壊死因子（TNF）が挙げられる。
【００３５】
血液タンパク質としては、例えば、トロンビン、血清アルブミン、ＶＩＩ因子、ＶＩＩＩ因子、ＩＸ因子、Ｘ因子、組織プラスミノゲン活性化因子が挙げられる。
【００３６】
抗体としては、例えば、完全抗体、Fab、F（ab'）、F（ab'）2、Fc、Fc融合タンパク質、重鎖（H鎖）、軽鎖（L鎖）、単鎖Fv（scFv）、sc（Fv）2、ジスルフィド結合Ｆｖ（sdFv）、Diabodyが挙げられる。
【００３７】
ワクチンとして使用される抗原タンパク質は、免疫応答を惹起できるものであれば特に制限されず、想定する免疫応答の対象に応じて適宜選択すればよいが、例えば、病原性細菌由来のタンパク質や病原性ウイルス由来のタンパク質が挙げられる。
【００３８】
融合タンパク質は、分泌生産用に、宿主細胞で機能する分泌シグナルペプチドが付加されていてもよい。分泌シグナルペプチドは、酵母を宿主とする場合は、インベルターゼ分泌シグナル、P3分泌シグナル、α因子分泌シグナルなどが挙げられ、大腸菌を宿主とする場合はPelB分泌シグナルが挙げられ、ブレビバチルスを宿主とする場合はP2分泌シグナル、P22分泌シグナルなどが挙げられる。また、植物を宿主とする場合、タバコ(Nicotiana tabacum)、シロイヌナズナ(Arabidopsis thaliana)、オランダイチゴ（Fragaria×ananassa）、レタス(Lactuca sativa)等に由来する分泌シグナルが挙げられる。
【００３９】
さらに、融合タンパク質は、特定の細胞区画で発現させるために、小胞体残留シグナルペプチド、液胞移行シグナルペプチド等の輸送シグナルペプチドが付加されていてもよい。
【００４０】
融合タンパク質は、融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを発現系に導入することにより、遺伝子工学的に生産することができる。
【００４１】
本発明において、ポリヌクレオチドとは融合タンパク質をコードする遺伝情報を担う塩基配列を有する物質を意味し、ポリヌクレオチドにはDNA、RNA等が含まれる。すなわち、融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、目的タンパク質をコードするポリヌクレオチド、及びペプチドタグをコードするポリヌクレオチドを含んでおり、目的タンパク質をコードするポリヌクレオチド、及びペプチドタグをコードするポリヌクレオチドは読み枠を合わせて連結される。
【００４２】
目的タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、例えば、公知の塩基配列に基づいて、一般的な遺伝子工学的な手法により得ることができる。
また、融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、該タンパク質を生産させる宿主細胞に応じて、融合タンパク質の翻訳量が増大するように、融合タンパク質を構成するアミノ酸に対応するコドンが適宜改変されていることも好ましい。コドン改変の方法としては、例えばKang et al. (Protein Expr Purif. 2004 Nov;38(1):129-35.)の方法を参考にすることができる。また、宿主細胞において使用頻度の高いコドンを選択したり、GC含量が高いコドンを選択したり、宿主細胞のハウスキーピング遺伝子において使用頻度の高いコドンを選択したりする方法が挙げられる。
【００４３】
融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、宿主細胞における発現を向上させるために、宿主細胞において機能するエンハンサー配列等を含むものであってもよい。
【００４４】
融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、一般的な遺伝子工学的手法により作製することができ、例えば、上記ペプチドタグをコードするDNA、及び目的タンパク質をコードするDNA等をPCRやDNAリガーゼ等を用いて連結することで構築することができる。
【００４５】
融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドはそのまま発現系に導入してもよいが、当該ポリヌクレオチドを含む組換えベクターとして発現系に導入することが好ましい。
組換えベクターは、前記融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドが、ベクターが導入される宿主細胞において発現可能なように、ベクター内に挿入されているものであればよい。ベクターは、宿主細胞において複製可能なものであれば特に制限されず、例えば、プラスミドDNA、ウイルスDNA等が挙げられる。また、ベクターは薬剤耐性遺伝子等の選択マーカーを含むことが好ましい。具体的なプラスミドベクターとして、例えば、pTrcHis2ベクター、pUC119、pBR322、pBluescript II KS+、pYES2、pAUR123、pQE-Tri、pET、pGEM-3Z、pGEX、pMAL、pRI909、pRI910、pBI221、pBI121、ｐNCMO2、pBI101、pIG121Hm、pTrc99A、 pKK223、pA1−11、pXT1、pRc/CMV、pRc/RSV、pcDNA I/Neo、p3×FLAG-CMV-14、pCAT3、pcDNA3.1、pCMV等が例示される。
【００４６】
ベクター内で用いられるプロモーターは、ベクターが導入される宿主細胞に応じて適宜選択することができる。例えば、酵母で発現させる場合、GAL1プロモーター、PGK1プロモーター、TEF1プロモーター、ADH1プロモーター、TPI1プロモーター、PYK1プロモーターなどが使用可能である。哺乳動物細胞で発現させる場合、CMVプロモーター、SV40プロモーター、EF1αプロモーターなどが使用可能である。植物で発現させる場合、カリフラワーモザイクウイルス35Sプロモーター、イネのアクチンプロモーター、トウモロコシのユビキチンプロモーター、レタスのユビキチンプロモーターなどが使用可能である。大腸菌で発現させる場合、T7プロモーターなどが挙げられ、ブレビバチルスで発現させる場合、P2プロモーターやP22プロモーターなどが挙げられる。誘導可能なプロモーターであってもよく、例えば、IPTGにより誘導可能なプロモーターであるlac、tac、trcの他、IAAで誘導可能なtrp、L-アラビノースで誘導可能なara、テトラサイクリンを用いて誘導可能なPzt-1、高温（42℃）で誘導可能なPLプロモーター、コールドショック遺伝子の一つであるcspA遺伝子のプロモーターなどが使用できる。
また、必要に応じ、ターミネーター配列も宿主細胞に応じて含めることができる。
【００４７】
組換えベクターは、例えば、融合タンパク質をコードするDNAを適当な制限酵素で切断又はPCRによって制限酵素部位を付加し、ベクターの制限酵素部位又はマルチクローニングサイトに挿入することによって作製することができる。
【００４８】
本発明においては、上記のような融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドまたはそれを含む組換えベクターを発現系に導入し、当該発現系において融合タンパク質を発現させることで、融合タンパク質を可溶性画分に効率よく蓄積させることができる。
【００４９】
ここで、発現系とは、リボソーム、tRNAおよびアミノ酸などのタンパク質発現に必要な翻訳因子を備えており、融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドまたはそれを含む組換えベクターから融合タンパク質を生産できる系を意味し、例えば、大腸菌、枯草菌（バチルス属細菌）、ブレビバチルス属細菌、放線菌、コリネバクテリウム、シアノバクテリア等の細菌細胞を含む原核細胞、または、パン酵母、ピキア酵母、分裂酵母等の酵母細胞、麹菌、昆虫細胞、哺乳動物細胞、植物細胞等の真核細胞などが例示される。また、大腸菌等の原核細胞由来の無細胞タンパク質発現系、および網状赤血球、小麦胚芽、昆虫細胞抽出液等の真核細胞由来の無細胞タンパク質発現系なども例示される。
【００５０】
発現系は、融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドまたはそれを含む組換えベクターを発現系で形質転換された形質転換細胞が好ましい。形質転換細胞は、一般的な遺伝子工学的手法を用いて、融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドまたは組換えベクターを宿主細胞に導入することにより作製することができる。例えば、エレクトロポレーション法（Tada, et al., 1990, Theor．Appl．Genet, 80：475）、プロトプラスト法(Gene, 39, 281-286(1985))、ポリエチレングリコール法（Lazzeri, et al., 1991, Theor. Appl. Genet. 81：437）、アグロバクテリウムを利用した導入方法（Hood, et al., 1993, Transgenic, Res. 2：218，Hiei, et al.，1994 Plant J. 6：271）、パーティクルガン法（Sanford, et al., 1987, J. Part. Sci.tech. 5：27）、ポリカチオン法（Ohtsuki, et al., FEBS Lett. 1998 May 29;428(3):235-40.）などの方法を用いることが可能である。なお、遺伝子発現は一過的発現でもよく、染色体に組み込まれる安定的発現でもよい。形質転換体の選別に際しては薬剤耐性遺伝子などの選択マーカーを利用してもよい。
【００５１】
上記の形質転換細胞や無細胞タンパク質発現系などの発現系において、融合タンパク質は可溶性画分に蓄積される。タンパク質発現のための培地、温度、時間等の条件は発現系の種類に応じて適宜選択することができる。
可溶性画分は、細胞外の培地や、細胞内の核や細胞内小器官を除いた液体画分などを含み、融合タンパク質を溶液として回収できる画分を意味する。
【００５２】
融合タンパク質は好ましくは無変性タンパク質として産生される。ここで、無変性タンパク質とは、タンパク質の高次構造が維持され、活性の消失や不溶化等の変化が起きていない、もしくは当該変化が小さいタンパク質を意味する。
【００５３】
上記の可溶性画分を回収することにより、無変性のタンパク質を含む溶液を得ることができる。
ここで無変性のタンパク質を含む溶液とは、細胞内および細胞外において、水に無変性状態のタンパク質が可溶化した状態を意味する。細胞内では、発現した当該タンパク質が凝集することなくサイトソルまたは細胞内の然るべき場所に位置し、本来の機能、活性を発揮し易い状態であり、細胞外においては、目的タンパク質が凝集することなく水を主体とした溶媒に可溶化した状態であり、可溶化した当該タンパク質が本来の機能、活性を有している状態である。
【００５４】
可溶性画分に蓄積した融合タンパク質はそのまま酵素反応等に使用してもよいが、当業者によく知られた方法に従って分離精製することができる。例えば、塩析、エタノール沈殿、限外濾過、ゲル濾過クロマトグラフィー、イオン交換カラムクロマトグラフィー、アフィニーティークロマトグラフィー、中高圧液体クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー等の既知の適切な方法、またはこれらを組み合わせることにより分離精製することができる。
【実施例】
【００５５】
以下、本発明の実施例を説明するが、本発明はかかる実施例に限定されるものではない。【００５６】
(１)ブレビバチルス用のペプチドタグ付加エステラーゼをコードする遺伝子発現用プラスミドの構築および形質転換
Bacillus subtilis由来のエステラーゼ（EstA、配列番号２５）をコードする人工合成DNA（配列番号２６）を、pUC19改変プラスミドpUCFa（ファスマック）のEcoRV認識部位に挿入してプラスミド１を得た。
ブレビバチルス発現用プラスミドとしてｐNCMO2（タカラバイオ）を使用した（プラスミド２）。【００５７】
下記手順で、エステラーゼのN末端に各種ペプチドタグを、C末端に検出用および精製用の6xHisタグを付加した融合タンパク質、若しくは、エステラーゼのN末端に検出用および精製用の6xHisタグを、C末端に各種ペプチドタグを付加した融合タンパク質、をブレビバチルスで発現させるためのプラスミドをそれぞれ構築した（図１，２）。【００５８】
【表２】
2020045530.tif 000009
【００５９】
まず、エステラーゼのNまたはC末端に各種ペプチドタグを付加するために、表３に示した鋳型プラスミド、フォワードプライマー、リバースプライマーの組み合わせによるPCRを実施した。【００６０】
【表３】
2020045530.tif 000010
【００６１】
各プライマーの5’末端にはプラスミド２との相同配列を付加した。また、フォワードプライマーは、シグナルペプチドに続き、2個のアミノ酸残基ADが付加されるように設計した。PCRはKOD-PLUS-Ver.2（東洋紡）を用い、2 pg/μl 鋳型プラスミド、0.3 μM フォワードプライマー、0.3 μM リバースプライマー、0.2 mM dNTPs、1×Buffer for KOD-Plus-Ver.2、1.5 mM MgSO4、0.02 U/μl KOD-PLUS-Ver.2 となるように50 μl反応液を調製し、94℃、5分間加熱した後、98℃、10秒間、60℃、 30秒間、68℃, 40秒間の加熱処理を30サイクル行い、最後に68℃で5分間加熱した。【００６２】
得られた増幅断片はQIAquick PCR Purification Kit（Qiagen）で精製した。
プラスミド２はNcoI、HindIIIで消化後、0.8% SeaKem GTG Agaroseを用いた電気泳動により分離し、QIAquick Gel Extraction Kit（Qiagen）を用いゲルから抽出した。【００６３】
約50 ng分の抽出したプラスミド２と精製PCR産物2 μlを混合し液量を5 μlに調整後、Gene Art Seamless PLUS Cloning and Assembly Kit（Thermo Fisher Scientific）添付の2×Enzyme Mix 5 μlと混合し、室温で30分間静置、その後5分間氷上に静置した。【００６４】
反応液5 μlをコンピテントセルDH5-αと混合し氷上で30分間静置後、42℃で45秒間加温し、氷上で2分間静置後、SOCを250 μl添加し、37℃、200 rpmで1時間振盪した。その後、振盪物の50μlを100 mg/lアンピシリンを含む2×YT寒天培地に塗布後、37℃で一晩静置培養し、形質転換コロニーを得た。コロニーを100 mg/lアンピシリンを含む2×YT液体培地に移植し、37℃、200 rpmで一晩振盪培養後、遺伝子発現用プラスミドを抽出し、塩基配列を確認後、ブレビバチルスの形質転換に用いた。【００６５】
ブレビバチルス  チョーシネンシス（Brevibacillus choshinensis）SP3株のコンピテントセルを37℃ヒートブロックで30秒間静置して急速解凍し、遠心分離（12,000 rpm、室温、1分間）後上清を除去後、上記遺伝子発現用プラスミド溶液1 μlと50 μl Solution Aを混合したものを全量添加しボルテックスによりコンピテントセルのペレットを完全に懸濁し、5分間静置した。150 μlのSolution Bを加え、ボルテックスで10秒間混和し、遠心分離（5,000 rpm、室温、5分間）後上清を除去、再度遠心分離（5,000 rpm、室温、30秒間）し完全に上清を除去した。これに1 ml MT培地を加え、マイクロピペットを使って完全に懸濁後、37 ℃、200 rpmで1時間振盪培養した。培養液はMTNmプレートにプレーティングし、37 ℃で1晩静置培養し、形質転換ブレビバチルスを得た。【００６６】
(２) ブレビバチルスのタンパク質発現培養
形質転換ブレビバチルスのシングルコロニーをMTNmプレートに塗株し、30℃、一晩静置し培養を行った。培養後のプレート培地より1μl滅菌ディスポループで菌体をかきとり、予め滅菌ポリスチレン製50 mlチューブに分注しておいた5 ml TMNm培地に植菌し、30℃、120rpmで48時間振盪培養した。培養終了後、菌体を含む培養液のサンプリングを行った。
菌体を含む培養液は100 μlずつ1.5 mlエッペンドルフチューブに小分けし、遠心分離（8,000×g、4℃、10分間）により培養上清と菌体とに分け、培養上清50μlと菌体全量を-80 ℃で保存した。【００６７】
(３) ブレビバチルスからのタンパク質抽出
凍結保存した培養上清50μlに対し、2×サンプルバッファー（EZ Apply、ATTO製）50μlを加え、ボルテックスミキサーにて撹拌後、沸騰水中で10分間加熱しSDS化を行った。
一方、菌体に関しては、0.01%のSEM-nuclease（Wako）を含むxTractor Buffer（タカラバイオ）100μlで細胞を破砕した後、10,000 x g、10分間、4℃で遠心分離を行った。その後、上清画分（細胞内の可溶性画分）50μlに2×サンプルバッファー50μlを加え、同様の工程でSDS化を行った。【００６８】
(４) ウエスタン解析
タンパク質定量時の標準物質にはエステラーゼ（EstA）標品を用いた。これをサンプルバッファーで2倍希釈を繰り返すことにより希釈系列を作成し、これらをスタンダードとして用いた。
タンパク質の電気泳動（SDS-PAGE）は、電気泳動槽（Criterion cell、BIO RAD）およびCriterion TGX-ゲル（BIO RAD）を用いた。電気泳動槽に泳動バッファー（Tris/Glycine/SDS Buffer、BIO RAD）を入れ、ウェルにSDS化したサンプルを4 μlアプライし、200 V定電圧で40分間泳動した。
電気泳動後のゲルは、トランスブロット転写パック（BIO RAD）を用い、トランスブロットTurbo（BIO RAD）でブロッティングを行った。
ブロッティング後のメンブレンはブロッキング溶液（TBS系, pH7.2、ナカライテスク）に浸し、室温で1時間振盪または4℃で16時間静置後、TBS-T（137 mM 塩化ナトリウム、2.68 mM 塩化カリウム、1% ポリオキシエチレンソルビタンモノラウラート、25 mM Tris-HCl、pH 7.4）中で室温、5分間の振盪を3回行い洗浄した。【００６９】
エステラーゼの検出には、抗血清Mouse-monoclonal Anti-6xHis antibody(アブカム)をTBS-Tで6,000倍希釈して使用した。希釈液中にメンブレンを浸し、室温で２時間振盪することにより抗原抗体反応を行い、TBS-T中で室温、5分間の振盪を3回行い洗浄した。二次抗体には、TBS-Tで3,000倍希釈したAnti-Mouse IgG, AP-linked Antibody（Cell Signaling TECHNOLOGY）を使用した。【００７０】
本希釈液中にメンブレンを浸し、室温で1時間振盪することにより抗原抗体反応を行い、TBS-T中で室温、5分間の振盪を3回行い洗浄した。アルカリホスファターゼによる発色反応は、発色液（0.1 M 塩化ナトリウム、5 mM 塩化マグネシウム、0.33 mg/mlニトロブルーテトラゾリウム、0.33 mg/ml 5-ブロモ-4-クロロ-3-インドリル-リン酸、0.1 M Tris-HCl、pH9.5、）中にメンブレンを浸し、室温で15分間振盪することにより行い、メンブレンを蒸留水で洗浄した後、常温で乾燥した。【００７１】
発色したメンブレンはスキャナー（PM-A900、エプソン）により解像度600 dpiで画像化し、画像解析ソフト（CS Analyzer ver. 3.0、アトー）を用い、培養上清中と菌体可溶化画分中のエステラーゼの定量を行い、培養上清中と菌体可溶化画分中の当該酵素量の合計を可溶化総エステラーゼ量として、比較した。【００７２】
（５）酵素精製用の培養サンプルの準備
−80 ℃保存のエステラーゼ発現用に構築したブレビバチルス株を、滅菌ループでMTNmプレートに塗株し、37 ℃、16〜20時間培養した。次に、50 mlのポリプロピレン製コニカルチューブに5 mlのTMNmを分注後、滅菌ループで前述のプレートサンプルを植菌した。30℃、120 rpmで16〜20時間振盪培養後、150 ml TMNm培地を分注した500 mlバッフル付き三角フラスコに上記の培養物を全部加え、120 rpm、30 ℃で48時間振盪培養を行った。培養物50 mlを50 mlポリプロピレン製コニカルチューブに分取し、8,000×g、10分間、4 ℃で遠心分離を行い、菌体を沈殿後、上清40 mlを別のチューブに移し、残りの上清は完全にピペットで抜き取った後、上清及び菌体（沈殿）それぞれの入ったチューブを液体窒素で凍結し、−80 ℃で保存した。【００７３】
（６）上清画分からのHisタグ融合酵素タンパク質の精製
−80 ℃で凍結保存した40 mlの上清画分を解凍後、1.2 M NaCl及び0.04 M イミダゾールを含む13.3 mlのｐH 7.4, 0.4 M リン酸ナトリウム緩衝液を加え混合した。エコパックカラム（BIO RAD）にTALON Hisタグ融合タンパク質精製樹脂（Clontech）5 mlを充填し、25 mlの平衡化緩衝液（0.3 M NaCl及び0.01 M イミダゾールを含むpH 7.4, 0.1M リン酸ナトリウム緩衝液）で平衡化した後、リン酸緩衝液で調製済みの上記上清サンプルの10ml程度をカラムにチャージし樹脂を懸濁させ100 mlのポリプロピレン製遠沈管（IWAKI製）に残りのサンプルを使って樹脂の全量洗い移した。サンプルの入った遠沈管をローテーターにセットし、低温庫内（4 ℃）で2時間、樹脂にHisタグ融合酵素タンパク質を吸着させた。【００７４】
次に、空のカラムにサンプルを吸着させた樹脂を懸濁したサンプル緩衝液を移し、緩衝液だけを溶出させた。更に、平衡化緩衝液50 mlをカラムに流し、樹脂の洗浄を行った。
洗浄終了後、溶出用緩衝液（0.3 M NaCl及び0.15 M イミダゾールを含むpH 7.4, 0.1 Mリン酸ナトリウム緩衝液）20 mlを用いて樹脂に吸着したHisタグ融合酵素タンパク質を溶出した。溶出は、アルミブロックで氷冷した2 mlエッペンドルフチューブに2 mlずつフラクションを分取し、本操作を10回繰り返し、10本のチューブにフラクションを分ける方法を採った。各フラクション20 μlを1.5 mlエッペンドルフチューブに分取し、20 μlの２×サンプルバッファー（EZ Apply、ATTO製）を加え、ボルテックスミキサーにて撹拌後、沸騰水中で10分間加熱し、サンプルのSDS化を行った。【００７５】
（７）菌体画分からのHisタグ融合酵素タンパク質の精製
−80 ℃で凍結保存した菌体画分を解凍後、SEM ヌクレアーゼ（Wako製）5 μlを含むxTractorバッファー（Clonthech）50mlを加え約20分間、室温で振盪し、菌体を可溶化させた。上清サンプル同様に、エコパックカラム（BIO RAD）にTALON Hisタグ融合タンパク質精製樹脂（Clontech）5 mlを充填し、以下同様な方法で、Hisタグ融合酵素タンパク質の精製を行い、各フラクション20 μlを1.5 mlエッペンドルフチューブに分取し、20 μlの２×サンプルバッファー（EZ Apply、ATTO製）を加え、ボルテックスミキサーにて撹拌後、沸騰水中で10分間加熱し、サンプルのSDS化を行った。【００７６】
（８）精製フラクションのウエスタン解析
タンパク質定量時の標準物質には粗抽出画分の定量と同様に、精製エステラーゼを標品として用いた。これをサンプルバッファーで2倍希釈を繰り返すことにより希釈系列を作成し、これらをスタンダードとして用いた。タンパク質の電気泳動（SDS-PAGE）は、電気泳動槽（Criterion cell、BIO RAD）およびCriterion TGX-ゲル（BIO RAD）を用いた。電気泳動槽に泳動バッファー（Tris/Glycine/SDS Buffer、BIO RAD）を入れ、ウェルにSDS化したフラクションサンプルを4 μlアプライし、200 V定電圧で40分間泳動した。
電気泳動後のゲルは、トランスブロット転写パック（BIO RAD）を用い、トランスブロットTurbo（BIO RAD）でブロッティングを行った。【００７７】
以下、ブロッティング後の操作は、前述の粗抽出サンプルのウエスタン解析と同様の方法で実施した。【００７８】
（９）精製Hisタグ融合酵素タンパク質の限外濾過と濃縮
前述のウエスタン解析により目的酵素タンパク質の存在が確認できたフラクションを合わせ、遠心濾過ユニット（Amicon Ultra-10 K、Merck）に移し、5,000×g、30 分、4 ℃で限外濾過を行った。次に、濾液を棄て、1×PBSバッファー pH 7.4を10 ml加え、上記と同様な方法で限外濾過を行った。更に同様の操作を3回繰り返し、サンプルを約1.0 mlまで濃縮し、サンプル中のイミダゾールを除去した。濃縮物の酵素タンパク質濃度は、BSAを標準物質としてBradford法により決定した。【００７９】
（１０）エステラーゼ活性の測定
エステラーゼ活性測定は、DSファーマバイオメディカルのLipase Kit Sを用いて以下の方法で行った。
先ず発色剤容器に付属の緩衝液2.4 mlを加え、完全に溶解させ、蒸留水22 mlを加え発色原液とした。調製した、発色原液は、1.1 mlずつ1.5 mlエッペンドルフチューブに分注し、−20 ℃で凍結保存した。
次に、付属の反応停止原液を30 ℃で5〜10分間インキュベートし融解した後、全量を蒸留水で希釈し、500 mlにメスアップした後、4 ℃冷蔵庫内で保存した。上記の発色原液1.1 mlを活性測定の直前に融解し、付属の緩衝液1.1 mlと蒸留水8.8 mlを加え、発色液を調製した。
次に発色液100 μlに対し、測定用エステラーゼサンプル5 μlを96ウェルマイクロプレートに分注し、ボルテックスミキサーでミックスした後、付属の基質溶液（BALB）を10 μl各ウェルに加え、更にミックスした。次に、プレートをアルミホイルで覆い、暗条件下、30 ℃、30分間酵素反応を行った。反応後、予め30 ℃でインキュベートしておいた反応停止液を150 μl加え、反応を停止させた。ブランクとして、基質を反応後に加えたサンプルシリーズも用意し、両者の吸光度（412 nm）をマイクロプレートリーダーで測定し、ブランク値を差し引いた値に1,000を乗してBALB unit値を得、本値を酵素活性の指標とした。【００８０】
（１１）酵母S. cerevisiaeでの評価
WO2017/115853の図２に記載の方法で、ヒト成長ホルモンタンパク質（hGH）のN末端にペプチドタグを付加した融合タンパク質をコードするプラスミドを導入された各形質転換酵母を培養し、200μlの培養物を1.5mlのエッペンドルフチューブに分取後、2,000xg、4℃で5分間、遠心分離を行い、上清を棄て、沈殿（菌体）を液体窒素で凍結後、−80℃で保存した。次に、氷上で沈殿を解凍後、ボルテックスによって細胞塊を解した。更にcOmplete ULTRAカクテル(Merck社製)及び0.1μg/mlのSEM ヌクレアーゼ（富士フイルム和光純薬製）を含む0.5mlのYeast PreLysis buffer(アトー社製)を添加し室温で10分間静置した。次に、上記細胞溶解液を10,000xg、4℃で10分間遠心し、遠心上清と沈殿それぞれを可溶性画分と不溶性画分とし、所定の方法でSDS化を行った後、SDS-PAGEによる泳動を行い、ウエスタン解析によりそれぞれの画分のhGH量を測定した。【００８１】
＜結果＞
(1) 各種ペプチドタグのＮ末端付加によるブレビバチルスにおける可溶性画分におけるタンパク質の発現量向上
作出した遺伝子組換えブレビバチルスを所定の条件で培養し、所定の条件にてエステラーゼを抽出し、ウエスタン解析により可溶性画分における当該酵素の発現量を測定した。その結果、図３より、比較例２としてPG12（配列番号１）をＮ末に付加した場合は、タグ無付加に対して可溶性画分におけるエステラーゼの発現向上は認められなかった。また、比較例３としてPX12-20をＮ末に付加した場合の発現量はタグ無付加に対し3.6倍であった。それに対し、PX12-32、PX12-33、PX12-34、PX12-35、PX12-36、PX12-90、PX12-89、及びPX12-83をエステラーゼのＮ末端に付加したとき、これらはタグ無し6倍以上の発現量が得られ、比較例に比べ明らかに優っていた。特に、PX12-32をＮ末端に付加した際に高い生産性が得られた。【００８２】
(2) 各種ペプチドタグのＣ末端付加によるブレビバチルスにおける可溶性画分におけるタンパク質の発現量向上
作出した遺伝子組換えブレビバチルスを所定の条件で培養し、所定の条件にてエステラーゼを抽出し、ウエスタン解析により可溶性画分における当該酵素の発現量を測定した。その結果、図４より、比較例５としてPG12（配列番号１）をＣ末に付加した場合、タグ無付加に対して可溶性画分におけるエステラーゼの発現向上は認められなかった。また、比較例６としてPX12-20をＣ末に付加した場合の発現量はタグ無しに対し4倍程度であった。それに対し、PX12-32、及びPX12-32をエステラーゼのＣ末端に付加したとき、タグ無しに対し８倍以上の高い発現量が得られ、比較例6（PX12-20付加）に対しても明らかに可溶性画分におけるエステラーゼの生産量は優っていた。【００８３】
（3）各種ペプチドタグ付加のエステラーゼ活性への影響
作出した遺伝子組換えブレビバチルスを所定の条件で培養し、培地中に分泌されたエステラーゼと菌体内可溶性画分におけるエステラーゼにつき所定の条件にて精製を行い、タグ付加の酵素活性に対する影響を確認した。その結果、図５に示すように、培地中に分泌されたタグＮ末付加エステラーゼ（PX12-32-S, PX12-34-S）は、タグ無し（Tag(-)）のエステラーゼと同等の活性を有していることが確認出来た。また、菌体を破砕して得られたタグＮ末付加エステラーゼ（PX12-32-P, PX12-34-P）もタグ無し（Tag(-)）のエステラーゼと同等の活性を有していることが確認出来た。【００８４】
(4) 各種ペプチドタグのＮ末端付加による酵母における可溶性画分におけるタンパク質の発現量向上
作出した遺伝子組換え酵母を培養し、ウエスタン解析により各画分におけるhGHの発現量を測定した。その結果、図６より、PX12-20-NをN末に付加した場合、hGHの量は可溶性画分の方が不溶性画分よりも少なかったが、PX12-32、及びPX12-34をhGHのN末端に付加したとき、可溶性画分におけるhGHの発現量は顕著に増加した。このことから、真核細胞においても可溶性画分におけるタンパク質の発現量向上効果がみられることがわかった。
真核生物において、特定の配列を含むペプチドタグを連結することにより、融合タンパク質の分解抑制の効果が期待できる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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