(57)【要約】  本発明は、核酸または核酸誘導体を簡便かつ効率的に細胞内へ導入する方法であって、細胞への悪影響を回避し得る方法、および当該方法で使用される担体−核酸等複合体の提供を目的とする。また、本発明は、核酸等を細胞内へ導入するための試薬の提供を目的とする。より具体的には、本発明は、核酸等を細胞内へ導入するための担体−核酸等複合体であって、多価不飽和脂肪酸と核酸等のエステルであることを特徴とする複合体を提供する。さらに、発明は、当該複合体を細胞に接触させことを含む、当該核酸等を細胞内へ導入する方法を提供する。さらに、本発明は、当該複合体を簡便に調製する試薬として、多価不飽和脂肪酸のハロゲン化アルキルエステルを含む、核酸等の細胞内導入用試薬を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
核酸等を細胞内へ導入するための担体−核酸等複合体であって、多価不飽和脂肪酸と核酸等のエステルであることを特徴とする、前記複合体。
【請求項２】
前記多価不飽和脂肪酸が、炭素数18以上25以下で、2個以上の二重結合を有することを特徴とする請求項１に記載の複合体。
【請求項３】
前記多価不飽和脂肪酸が、α−リノレン酸、γ−リノレン酸、ピノレン酸、α−エレオステアリン酸、β−エレオステアリン酸、ミード酸、ジホモ−γ−リノレン酸、エイコサトリエン酸、ステアリドン酸、アラキドン酸、エイコサテトラエン酸、アドレン酸、ボセオペンタエン酸、エイコサペンタエン酸、オズボンド酸、ドコサペンタエン酸、テトラコサペンタエン酸およびドコサヘキサエン酸からなるグループから選択させることを特徴とする請求項１または２に記載の複合体。
【請求項４】
核酸等を細胞へ導入する方法であって、請求項１ないし３に記載の担体−核酸等複合体を細胞に接触させる工程を含む、前記方法。
【請求項５】
多価不飽和脂肪酸のハロゲン化アルキルエステルを含む、核酸等の細胞内導入用試薬。
【請求項６】
前記ハロゲン化アルキルエステルが、ヨウ化アルキルエステルであることを特徴とする、請求項５に記載の試薬。
【請求項７】
前記多価不飽和脂肪酸が、炭素数18以上25以下で、2個以上の二重結合を有することを特徴とする請求項６に記載の試薬。
【請求項８】
前記多価不飽和脂肪酸が、α−リノレン酸、γ−リノレン酸、ピノレン酸、α−エレオステアリン酸、β−エレオステアリン酸、ミード酸、ジホモ−γ−リノレン酸、エイコサトリエン酸、ステアリドン酸、アラキドン酸、エイコサテトラエン酸、アドレン酸、ボセオペンタエン酸、エイコサペンタエン酸、オズボンド酸、ドコサペンタエン酸、テトラコサペンタエン酸およびドコサヘキサエン酸からなるグループから選択されることを特徴とする請求項７に記載の試薬。
【請求項９】
請求項５ないし８のいずれかに記載の試薬と多価不飽和脂肪酸を混合する工程を含む、請求項１ないし３のいずれかに記載の複合体を製造する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、核酸および核酸アナログを細胞内へ導入する方法および当該方法の実施のための試薬に関する。
【背景技術】
【０００２】
核酸（DNA/RNA）は、遺伝情報の保存およびタンパク質の合成など、生命にとって重要な役割を担う生体物質の１つである。近年では、生体における核酸の機能を利用した治療薬、例えば、オリゴヌクレオチド治療薬（アンチセンス核酸やsiRNAなど）などが臨床医学分野において注目されている。オリゴヌクレオチド治療薬は、従来の小分子薬での治療が難しい疾患治療のブレークスルーとして期待されている。オリゴヌクレオチド治療薬の薬効を最大限発揮させるためには、核酸分子を細胞中に効率的に導入する必要がある。しかしながら、核酸分子は多くの負電荷を有しているため、疎水性の細胞膜との親和性が低く、その結果、細胞への導入効率が悪い。この細胞への導入効率の低さが、オリゴヌクレオチド治療薬における深刻な問題となっている。【０００３】
これまでに、標的細胞に核酸を導入するための様々な方法が提唱されてきた。例えば、リン酸カルシウム法、エレクトロポレーション法、リポソーム法、リポフェクチン法、マイクロインジェクション法、ハイドロダイナミック法、ウイルスベクター法、遺伝子銃（パーティクルガン法）および核酸と抗体またはペプチド担体との複合体を使用する方法などが報告されている。しかしながら、これらの方法によると、細胞へ与えるダメージが大きい、担体からの核酸の漏出が生じる、担体が細胞に大量に残存してしまう、ウイルスベクターによる癌遺伝子の組み換えなどの懸念が残るなど、多くの問題を抱えている。【０００４】
そこで、細胞内へ核酸を安全に導入する方法として、中性脂質−オリゴヌクレオチド複合体の利用が報告されている（非特許文献１）。これまでに、例えば、コレステロールと癌遺伝子を標的とするsiRNA複合体をマウスモデルに導入することで、腫瘍の増殖を抑制したことが報告されている（非特許文献２）。しかし、コレステロールの血管内投与は、心血管イベントとの関連性の問題が存在しており、コレステロールの使用は生体への安全性の点で不安が残る。他方、生体への安全性が見込まれる天然由来の多価不飽和脂肪酸と、抗がん剤との複合体について、薬物動態および薬効の点で有効であることが報告されている（非特許文献３〜５）。従って、多価不飽和脂肪酸を用いて核酸を細胞に導入することは、薬物動態学的には有利であると考えられるが、細胞への導入効率、核酸複合体の細胞への影響など、不明な点が多い。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Raouaneら, Bioconjugate Cahemistry, 2012, 23:1091-1104.
【非特許文献２】Raouaneら, Jornal of Medidinal Chemistry, 2011, 54:4067-4076.
【非特許文献３】Bradleyら, Clinical Cancer Research, 2001, 7: 3229-3238.
【非特許文献４】KuznetsovaおよびChen, Bioorganic Medicinal Chemistry Letter, 2006, 16: 974-977.
【非特許文献５】WangおよびJiang, Bioorganic Medicinal Chemistry Letter, 2006, 16, 2974-2977.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
上記事情に鑑み、本発明は、核酸または核酸アナログを簡便かつ効率的に細胞内へ導入する方法であって、細胞への悪影響を回避し得る方法、当該方法で使用される担体−核酸等複合体の提供を目的とする。
また、本発明は、核酸等を細胞内へ導入するための試薬の提供を目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、多価不飽和脂肪酸（例えば、リノレン酸）とDNAを、エステル結合を介して結合させ、細胞に添加したところ、多価不飽和脂肪酸−DNAの複合体が、ミセル様凝集体を形成して、効率よく細胞に取り込まれることを見出した。さらに、発明者らは、多価不飽和脂肪酸−DNA複合体が細胞内に入った後、細胞内のエステラーゼによってエステル結合が切断され、多価不飽和脂肪酸とDNAが分離され、DNAが核へ移行することを確認した。本発明者らが、核酸を細胞内へ導入するためのキャリア分子（担体）として使用した多価不飽和脂肪酸は、元々細胞内に存在する生体物質であることから、細胞への悪影響はほとんど生じ得ないと考えられる。
また、本発明者らは、多価不飽和脂肪酸のヨウ化メチルエステルと核酸とを混合するだけで、多価不飽和脂肪酸−DNA複合体を簡便かつ効率的に調製できることも見出した。【０００８】
すなわち、本発明は以下の（１）〜（９）である。
（１）核酸等を細胞内へ導入するための担体−核酸等複合体であって、多価不飽和脂肪酸と核酸等のエステルであることを特徴とする、前記複合体。
（２）前記多価不飽和脂肪酸が、炭素数18以上25以下で、2個以上の二重結合を有することを特徴とする上記（１）に記載の複合体。
（３）前記多価不飽和脂肪酸が、α−リノレン酸、γ−リノレン酸、ピノレン酸、α−エレオステアリン酸、β−エレオステアリン酸、ミード酸、ジホモ−γ−リノレン酸、エイコサトリエン酸、ステアリドン酸、アラキドン酸、エイコサテトラエン酸、アドレン酸、ボセオペンタエン酸、エイコサペンタエン酸、オズボンド酸、ドコサペンタエン酸、テトラコサペンタエン酸およびドコサヘキサエン酸からなるグループから選択させることを特徴とする上記（１）または（２）に記載の複合体。
（４）核酸等を細胞へ導入する方法であって、上記（１）ないし（３）のいずれかに記載の担体−核酸等複合体を細胞に接触させる工程を含む、前記方法。
（５）多価不飽和脂肪酸のハロゲン化アルキルエステルを含む、核酸等の細胞内導入用試薬。
（６）前記ハロゲン化アルキルエステルが、ヨウ化アルキルエステルであることを特徴とする、上記（５）に記載の試薬。
（７）前記多価不飽和脂肪酸が、炭素数18以上25以下で、2個以上の二重結合を有することを特徴とする上記（５）または（６）に記載の試薬。
（８）前記多価不飽和脂肪酸が、α−リノレン酸、γ−リノレン酸、ピノレン酸、α−エレオステアリン酸、β−エレオステアリン酸、ミード酸、ジホモ−γ−リノレン酸、エイコサトリエン酸、ステアリドン酸、アラキドン酸、エイコサテトラエン酸、アドレン酸、ボセオペンタエン酸、エイコサペンタエン酸、オズボンド酸、ドコサペンタエン酸、テトラコサペンタエン酸およびドコサヘキサエン酸からなるグループから選択されることを特徴とする上記（７）に記載の試薬。
（９）上記（５）ないし（８）のいずれかに記載の試薬と多価不飽和脂肪酸を混合する工程を含む、上記（１）ないし（３）いずれかの複合体を製造する方法。
【発明の効果】
【０００９】
本発明にかかる方法によれば、核酸または核酸アナログを細胞へ効率良く導入することが可能である。【００１０】
さらに、本発明にかかる多価不飽和脂肪酸−核酸等複合体は、エステル結合によって脂肪酸と核酸等が結合されているため、細胞内の酵素（エステラーゼ）によって容易に脂肪酸と核酸等に分離される。従って、機能分子である核酸等そのものを細胞内へ導入することが可能である。【００１１】
本発明にかかる核酸等の細胞内導入試薬（多価不飽和脂肪酸のハロゲン化アルキルエステル）は、核酸等と混合するだけで、多価不飽和脂肪酸−核酸等複合体を容易に製造することが可能である。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】酵素によって分解可能な担体（多価不飽和脂肪酸）が結合したオリゴヌクレオチド（プロオリゴヌクレオチド）の模式図である。核酸と不飽和脂肪酸はエステル結合を含むリンカーを介して結合している。不飽和脂肪酸と核酸は、合成後修飾により結合可能で、エステラーゼによって切断される。
【図２】HeLa細胞へのプロオリゴヌクレオチドの取り込みを観察した結果を示す。（ａ）〜（ｄ）は、プロオリゴヌクレオチドを培養液に添加した後の細胞由来の蛍光を観察した結果である。バーは50μm。（ａ）脂肪酸で修飾していないT10FT10；（ｂ）oleate-T10FT10；（ｃ）linoleate-T10FT10；（ｄ）linolenate-T10FT10。（ｅ）は、プロオリゴヌクレオチドの細胞への取り込み率を測定した結果である。全細胞数に対する蛍光を発する細胞数の比率を算定した。値は各サンプルにおける平均%で示し、エラーバーは、標準誤差を示す。（ｆ）および（ｇ）は、linolenate-T10FT10を取り込んだ細胞の蛍光写真（ｆ）と細胞内における蛍光の分布を（ｇ）を示す。バーは10μm。
【図３】プロオリゴヌクレオチド凝集体に含まれるFRET色素の放出を解析した結果を示す。FRET色素のDiOおよびDilと、プロオリゴヌクレオチド凝集体の混合物に、90% FBSを加えた後、蛍光スペクトルを測定した（λexc = 450 nm）。（ａ）oleate-T20、pH7.0；（ｂ）linoleate-T20、pH7.0；（ｃ）linolenatee-T20、pH7.0；（ｄ）linolenate-T20、pH5.2。
【図４】プロオリゴヌクレオチドをエステラーゼで処理し、反応産物を経時的に検出した結果を示す。Ａはプロオリゴヌクレオチド（linolenate-T20）の存在率の経時変化を示し、Ｂは各時点（0、2、4、6および8時間後）における反応物を逆相HPLCで分析した結果を示す。
【図５】linolenate-T20が細胞外から核へ輸送される経路の概念図を示す。細胞に添加されたlinolenate-T20は、110-130 nmの微粒子を形成する（1）。クラスリン機構により、微粒子が細胞の中に取り込まれる（2）。エンドソーム内の酸性条件において、微粒子が不安定化し、linolenate-T20分子が放出される（3）。linolenate-T20はエンドソーム内のエステラーゼで切断されて、核酸が分離する（4）。エンドソームから放出された核酸は速やかに核内へ輸送される（5）。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本発明の第１の実施形態は、核酸等を細胞内へ導入するための担体−核酸等複合体であって、多価不飽和脂肪酸と核酸等のエステルであることを特徴とする複合体である。
ここで担体とは、核酸等を細胞内へ導入するためのキャリア分子のことで、第１の実施形態においては、多価不飽和脂肪酸に相当する。すなわち、第１の実施形態において、担体−核酸等複合体とは、多価不飽和脂肪酸−核酸等複合体（以下「本発明の核酸等複合体」とも記載する）のことである。
本明細書において核酸等とは、DNAおよびRNAなどの核酸の他、核酸に種々の化学修飾を施した核酸アナログを含む。核酸等に含まれる糖はリボース、デオキシリボースおよびこれらに化学修飾が施されてものであってもよい。また、塩基は、アデニン、グアニン、チミン、シトシンおよびウラシルの他、イノシンであってもよく、さらに、これらに化学修飾が施された、例えば、7-デアザアデニン、7-デアザグアニンおよびヒポキサンチンなどであってもよい。さらに、核酸アナログは、当該技術分野において周知であって、当業者によって選択可能なものであればよく、例えば、核酸のリン酸ジエステル結合部分の酸素原子を１つ硫黄に置換したホスホロチオエート（Phosphorothioate）、RNAの2’位の酸素原子と4’位の炭素原子をメチレンで架橋したLNA（Locked nucleic Acid）、モノホリノ核酸アナログなどを挙げることができる。
また、核酸等の長さは、目的に応じて適宜選択することが可能であり、核酸医薬等の細胞内への導入に使用する場合などは、例えば、3〜50塩基、10〜30塩基程度であってもよい。
【００１４】
本実施形態で使用される多価不飽和脂肪酸は、特に限定はしないが、例えば、炭素数17〜30、好ましくは、炭素数18〜25で、2個以上の二重結合（二価以上）、好ましくは3個以上の二重結合（三価以上）を有する脂肪酸が望ましい。好ましい多価不飽和脂肪酸として、特に限定はしないが、例えば、α−リノレン酸、γ−リノレン酸、ピノレン酸、α−エレオステアリン酸、β−エレオステアリン酸、ミード酸、ジホモ−γ−リノレン酸、エイコサトリエン酸、ステアリドン酸、アラキドン酸、エイコサテトラエン酸、アドレン酸、ボセオペンタエン酸、エイコサペンタエン酸、オズボンド酸、ドコサペンタエン酸、テトラコサペンタエン酸およびドコサヘキサエン酸などを挙げることができる。
【００１５】
本発明の核酸等複合体は、核酸等と多価不飽和脂肪酸がエステル結合によって結合させている。このような形体をとることで、当該複合体は容易に細胞内へ入り、その後、細胞に内在するエステラーゼによってエステル結合が切断され、その結果、核酸等のみが細胞内へ導入されることになる。このようにして細胞内へ導入された核酸等は速やかに核へ移行することが可能である（実施例を参照のこと）。
核酸等と多価不飽和脂肪酸とのエステル化反応は、当業者において周知のいかなる方法を用いてもよい。例えば、多価不飽和脂肪酸のハロゲン化メチルエステル（特に、ヨウ化メチルエステルが好ましい）を用いると、これと核酸等を混合し、数時間インキュベートするだけで、本発明の核酸等複合体を合成することができる。
また、本発明の核酸等複合体において、核酸等が、アンチセンスオリゴヌクレオチド、RNAi、核酸アプタマーまたは核酸デコイなどの機能を有する場合には、本発明の核酸等複合体は、いわゆる、核酸医薬（核酸医薬のプロドラッグ）として使用することが可能である。
【００１６】
第２の実施形態は、核酸等を細胞へ導入する方法であって、本発明の核酸等複合体を細胞に接触させる工程を含む、核酸等の細胞への導入方法である。
本発明の核酸等複合体を細胞に接触させる工程は、当業者において周知の方法により実施可能である。例えば、インビトロにおいては、細胞の培養系に本発明の核酸等複合体を添加するだけでもよい。また、インビボにおいては、例えば、静脈内注射等による投与（例えば、非特許文献２などを参照のこと）、または、標的化DDSなどの利用により、本発明の核酸等を目的の細胞または臓器に送達し、接触させることができる。
本発明の核酸等は複数が集まってミセル様凝集体を形成し、細胞（細胞膜）と接触するとエンドサイトーシス等によって、速やかに細胞内へ取り込まれる。細胞内では、上述のとおり、内在性のエステラーゼによって、脂肪酸と核酸等が分離され、核酸等は細胞内において所望の機能を発揮すると考えられる。
【００１７】
第３の実施形態は、多価不飽和脂肪酸のハロゲン化アルキルエステルを含む、核酸等の細胞内導入用試薬である。
多価不飽和脂肪酸のハロゲン化アルキルエステル、例えば、多価不飽和脂肪酸のヨウ化アルキルエステルを、所望の核酸等と混合し、適当な条件下でインキュベートするだけで、容易に本発明の核酸等複合体を調製することができる。第３の実施形態にかかる試薬を用いることで、合成後修飾により、核酸と多価不飽和脂肪酸を結合させることが可能であるため、天然の核酸に多価不飽和脂肪酸を結合させることも、可能である。多価飽和脂肪酸のハロゲン化アルキルエステルは、核酸等の細胞内導入用試薬としての機能および用途を有する。ここで、ハロゲンとしては、ヨウ素が好ましく、アルキルとしては、低級アルキル（炭素数１〜６程度）、例えば、メチル、エチル、プロピルなどが好ましい。
【００１８】
第４の実施形態は、多価不飽和脂肪酸のハロゲン化アルキルエステル（第３の実施形態にかかる核酸等の細胞内導入用試薬）と、核酸等を混合し、インキュベートする工程を含む、本発明の核酸等複合体を製造する方法である。
ここで、多価不飽和脂肪酸のハロゲン化アルキルエステルと核酸等を混合した後、インキュベートする条件は、核酸等の種類によって異なるが、当業者であれば予備的な実験により選択することができる。核酸がDNAの場合、例えば、20℃〜70℃程度で、1〜10時間程度インキュベートしてもよい。第３の実施形態における多価不飽和脂肪酸および核酸等については、第１の実施形態における説明を参照のこと。
【００１９】
本明細書において引用されたすべての文献の開示内容は、全体として明細書に参照により組み込まれる。また、本明細書全体において、単数形の「a」、「an」および「the」の単語が含まれる場合、文脈から明らかにそうでないことが示されていない限り、単数のみならず複数のものを含むものとする。
以下に実施例を示してさらに本発明の説明を行うが、実施例は、あくまでも本発明の実施形態の例示にすぎず、本発明の範囲を限定するものではない。
【実施例】
【００２０】
１．材料および実験方法
１−１．材料等
すべての試薬は、Sigma-Aldrich, Wako Chemicals, and Tokyo Chemical Industryから購入した。1H and 13C NMRスペクトルはBruker Avance 600 (600 MHz)で測定した。エレクトロスプレーイオン化マススペクトル（Electrospray ionization mass spectra：ESI-MS）は、Bruker microTOF II-NACで記録した。MALDI-TOFマススペクトルは、Bruker microflex-NACで記録した。DNAは、NTS H-8 DNA/RNA synthesizer（Nihon Techno Service）で合成した。合成したオリゴヌクレオチドは、GILSON Inc.と JASCO Inc.のモジュールで構成されたHPLCシステムで精製した。吸収スペクトルはShimadzu UV-2550分光光度計およびRF-5300PC分光光度計で測定した。【００２１】
１−２．プロオリゴヌクレオチド（不飽和脂肪酸−DNA複合体）の合成
各プロオリゴヌクレオチドは、スキーム１に示す経路で合成した。
【化１】
2020158636.tif 000002
【００２２】
１−２−１．化合物2a
40 mlのリノレン酸（1a）（4.02 mL, 13 mmol）水溶液に、Na2CO3（5.51 g、52 mmol）を添加した。20分後、反応液を0℃に冷却し、nBu4NHSO4（3.02 mL、2.6 mmol）、ジクロロメタン（80 mL）およびクロロ硫酸クロロメチル（1.71 mL, 16.9 mmol）を添加した。反応液を25℃で、一晩撹拌した。その後、水（50 mL）とクロロメタン（50 mL）を添加して、反応を停止した。水層をジクロロメタンで抽出した（100 mL×2）。有機層をMg2SO4で乾燥させ、真空中で濃縮した。合成産物は、カラムクロマトグラフィーを用いて、ジクロロメタン−ヘキサン（1:9, v/v）で溶出して精製し、油性無色のリノレン酸のクロロメチルアルキルエステル（2a）を得た（収率60%、2.14 g）。
【表１】
2020158636.tif 000003
【００２３】
１−２−２．化合物3a
化合物2aのアセトニトリル溶液（1 g、2.87 mmol）にヨウ化ナトリウム（1.3 g、8.61 mmol）を添加した。フラスコをアルミホイルで遮光し、反応液を25℃で一晩撹拌した。その後、水（50 mL）とクロロメタン（50 mL）を添加して、反応を停止させ、水層をジクロロメタン（100 mL×2）で抽出した。有機層を飽和NaHCO3水溶液（50 ml）、5 %亜硫酸ナトリウム水溶液（50 mL）および塩水（25 ml×2）で洗浄後、濃縮し、油性黄色のリノレン酸のヨウ化メチルアルキルエステル（3a）を得た（収率100%、1.82 g）。
【表２】
2020158636.tif 000004
【００２４】
１−２−３．化合物2b
１−２−１．と同様にして、リノール酸（1b）からリノール酸のクロロメチルアルキルエステル（2b）を合成した。油性無色の物質として化合物2bを得た（収率79%、2.47 g）。
【表３】
2020158636.tif 000005
【００２５】
１−２−４．化合物3b
１−２−２．と同様にして、リノール酸のクロロメチルアルキルエステル（2b）からリノール酸のヨウ化メチルエステル（3b）を合成した。油性黄色の物質として化合物3bを得た（収率100%、1.19 g）。
【表４】
2020158636.tif 000006
【００２６】
１−２−５．化合物2c
１−２−１．と同様にして、オレイン酸（1c）からオレイン酸のクロロメチルアルキルエステル（2c）を合成した。油性無色の物質として化合物2cを得た（収率82%、2.31 g）。
【表５】
2020158636.tif 000007
【００２７】
１−２−６．化合物3c
１−２−２．と同様にして、オレイン酸のクロロメチルアルキルエステル（3b）からオレイン酸のヨウ化メチルエステル（3c）を合成した。油性黄色の物質として化合物3cを得た（収率100%、1.14 g）。
【表６】
2020158636.tif 000008
【００２８】
１−２−７．オリゴヌクレオチドの結合
100 μlのオリゴヌクレオチド（ポリdT20）水溶液（30 nmol）および600 μlのアセトニトリルの混合液に、不飽和脂肪酸のヨウ化メチルアルキルエステル（3a、3b、3c）（500当量）およびDIEA（N,N-ジメチルホルムアミド）（500当量）を添加した。反応混合物を60℃で6時間加熱した後、室温まで冷却した。粗反応物を、逆相HPLCで精製した。以下、オレイン酸、リノール酸およびリノレン酸とポリdT20との複合体を、各々、oleate-T20、linoleate-T20およびlinolenate-T20とする。【００２９】
１−３．脂肪酸を結合した蛍光標識プロオリゴヌクレオチドの細胞内への取り込み
不飽和脂肪酸を結合した蛍光標識プロオリゴヌクレオチド（2 μM、1.0 μL）をOPTI-MEM（9.0 μL）と混合した。3.5 cmのグラスボトムディッシュで培養した細胞（1×105細胞）を1 mlの1×PBS(-)で1回洗浄した後、各サンプル（各蛍光標識プロオリゴヌクレオチド）溶液をグラスディッシュの中央に添加し、細胞と接触させた。その後、細胞は37℃で2時間培養した。次いで、サンプル溶液を除去し、各ディッシュを1×PBS(-)とOPTI-MEMで洗浄した。蛍光イメージは、共焦点レーザー走査顕微鏡下で記録した（Ex：488 nm, 505 nmより大きな波長を検出した）。【００３０】
１−４．動的光散乱法（Dynamic Light Scattering）
プロオリゴヌクレオチドで形成される粒子（ミセル）のサイズをMalvern Zetasizer Nano-ZS90（Malvern Instruments）で測定し、Zetasizer software（Malvern Instruments）で解析した。各サンプルを調製した後、核酸フリーの水で希釈した。全ての測定は、25℃で実施し、各サンプルについて、少なくとも10回のsub-runを伴う3回の測定を実施した。【００３１】
１−５．フェルスター共鳴エネルギー移動（FRET）によるミセルの安定性の測定
3,3’-dioctadecyloxacarbocyanineperchlorate (DiO) および1,1’-dioctadecyl-3,3,3’,3’-tetramethylindocarbocyanineperchlorate (Dil)を、2 mg/mlとなるようにエタノールに溶解した。また、不飽和脂肪酸−DNA複合体をエタノールに溶解したサンプル溶液に、5 wt%となるように各色素を添加した。エタノールを減圧濃縮装置で蒸発させ、脂質の薄いフィルムを得た。得られたフィルムは、最終濃度1 mg/mlとなるように、25 mM NaHPO4、50 mM KCl、pH = 7.2で再水和させた。得られた混合物を65℃で15分間加熱後、ゆっくりと室温まで冷却した。得られたサンプルをポアサイズ0.45μmのフィルターチューブで遠心し、凝集物を除去した。ミセルの安定性の測定のために、90 % FBS（PBS中）を添加した96-ウェルプレートにサンプル加えた。multi-well Cytation 5 plate reader（BioTek Instruments、JPN）を用い、サンプルを450 nmで励起し、475 nm〜650 nmの波長範囲で、24時間、経時的に蛍光強度を測定した。FRETの測定は、サンプルを37℃に保温して行った。【００３２】
１−６．エステラーゼによるリノレン酸の除去
ブタの肝臓エステラーゼ（0.3 mg/ml）を含むPBS（10×）180 μlを、10 μmolのlinolenate-T20を（リノレン酸を結合したポリdT）含むチューブに添加した。混合物を37℃のインキュベーター中で震盪した。サンプル溶液の一部を以下の条件にて、逆相HPLCで分析した。
HPLC条件：
Aバッファー（0.1 M TEAA バッファー）
Bバッファー（CH3CN）
グラジエント；（B）5%→100%（30分間）【００３３】
１−７．インビトロにおけるCell Viability Prestoblue（登録商標）アッセイ
HeLa細胞は、10 %(v/v)胎児ウシ血清（FBS）および1 %(v/v) antibiotic-antimycotic solutionを含むダルベッコ改変イーグル培地（Dulbecco's modified Eagle's medium：DMEM）で、37℃、5 % CO2の条件で培養した。細胞が80 %コンフルエントとなった時点で、継代した。細胞は細胞濃度を5,000細胞/ウェルにて、96-ウェルプレートに播種し、一晩培養し、接着させた。72時間後、細胞を、種々の濃度（6.25、12.5、25、50および100 nM）のlinolenate-T20で処理した。細胞のみをポジティブコントロールとし、DMEMのみをネガティブコントロールとした。細胞の生存率は、Prestoblueアッセイで測定した。Prestoblue溶液を各ウェルに添加し、37℃、5% CO2の条件で1時間培養した。multi-well Cytation 5 plate reader（BioTek Instruments, JPN）を使用して、560 nmで励起し、590 nmの吸光度を測定した。【００３４】
２．結果
２−１．プロオリゴヌクレオチドの合成
リポソーム法を含む核酸送達システムにおいて、添加した脂質分子は、実質的には、DNAまたはRNAをコートする脂質層を構成し、細胞膜を通過することが知られている。特に、多価不飽和脂肪酸は、その脂溶性により細胞膜の構造と流動性を破壊し、細胞による生体分子の取り込みを促進する。例えば、多価不飽和脂肪酸を結合させたパクリタキセルは、化学療法の治療効率を向上させることが報告されている。そこで、発明者らは、多価不飽和脂肪酸のエステルを合成後修飾により、核酸に結合させることにした。この多価不飽和脂肪酸エステルは細胞内に内在するエステラーゼによって分解される（図１）。酵素によって分解可能な担体と結合したオリゴヌクレオチド（プロオリゴヌクレオチド：pro-oligonucleotides）は、細胞へ効率的に輸送されたのち、本来の核酸に戻ると考えられる。【００３５】
18個の炭素原子を有し、不飽和結合の数が異なる（1〜3）長鎖脂肪酸（1a-c）は（18炭素鎖の不飽和脂肪酸；オレイン酸、cis-Δ9-オクタデカン酸(1a)；リノール酸、cis,cis-Δ9,Δ12-オクタデカジエン酸(1b)；リノレン酸、cis,cis,cis-Δ9,Δ12,Δ15-オクタデカトリエン酸(1c)）を、クロロ硫酸クロロメチルと反応させ、脂肪酸のクロロメチルエステル（2a-c）を合成した。塩化物を、ヨウ化ナトリウムで、定量的にヨウ化物（3a-c）に変換した。ヨウ化物（3a-c）をDNAと混合し、ジイソプロピルエチルアミン存在下、60℃で6時間反応させ、1当量の脂肪酸メチルエステルとDNAが結合したプロオリゴヌクレオチドを得た。DNAとしてポリdT配列を用いて反応を行ったところ、1当量の脂肪酸メチルエステルが結合したプロオリゴヌクレオチド（oleate-T20、linoleate-T20、linolenate-T20）が合成された。また、フルオロセインで標識したdTをポリdT配列の中央に挿入したT10FT10に、1当量の不飽和脂肪酸ヨウ化エステルを結合させたプロオリゴヌクレオチド（oleate-T10FT10、linoleate-T10FT10、linolenate-T10FT10）を合成した。
なお、5’端のヒドロキシ基がフルオロセインで修飾されたポリdT配列に対して脂肪酸メチルエステルを付加させることはできなかった。また、プリンを含む配列の場合、合成後修飾による、脂肪酸メチルエステルの導入効率は低かった。この点については、例えば、G、Aなどのプリン塩基の代わりに、7-デアザグアニン、7-デアザアデニンまたはイノシンなどを含む核酸を用いることで改善できると考えられる。【００３６】
２−２．プロオリゴヌクレオチドの細胞内への取り込み
2 μMのプロオリゴヌクレオチド溶液をHeLa細胞に添加し、2時間培養した後、細胞由来の蛍光を観察した。不飽和脂肪酸を結合していないT10FT10を添加した場合には、細胞から蛍光は検出されなかった（図２ａおよびｅ）。この結果から、不飽和脂肪酸を結合していない核酸は、細胞に取り込まれないことが確認された。
oleate-T10FT10由来の蛍光は、不飽和脂肪酸を結合していないT10FT10と同様に、細胞から検出されなかった（図２ｂおよびｅ）。これに対し、linoleate-T10FT10は、30〜40%の細胞によって取り込まれることが確認された（図２ｃおよびｅ）。そして、細胞由来の蛍光強度は、多価不飽和脂肪酸の二重結合の数が増えるに従って増大し、linolenate-T10FT10は、細胞への添加後2時間以内に、細胞由来の蛍光強度が非常に強くなった（細胞への取込率：94%）（図２ｄおよびｅ）。蛍光イメージにおける蛍光の分布から、linolenate-T10FT10は、その大部分が核へ移行することが示された（図２ｆおよびｇ）。蛍光は細胞の細胞質領域からも観察されたが、核からの蛍光よりもかなり弱く、粒状の蛍光スポットは確認されなかった、また、細胞膜からの蛍光も確認されなかった。【００３７】
２−３．細胞内におけるプロオリゴヌクレオチドの安定性
脂肪酸メチルエステルとDNAが結合したプロオリゴヌクレオチドは、水中でミセル様凝集体を形成すると考えられる。そこで、水中での凝集体のサイズ（流体力学的径）を、Zetasizerで測定した。その結果、凝集体サイズは不飽和脂肪酸の不飽和度が増加するにつれて減少した（oleate-T20, 368; linoleate-T20, 150; linolenate-T20, 112 nm）。オリゴヌクレオチドへ蛍光色素を導入すると凝集体のサイズが12-23%増大した（oleate-T10FT10, 412; linoleate-T10FT10, 184; linolenate-T10FT10, 132 nm）。
次に、プロオリゴヌクレオチド凝集体の安定性を凝集体コア部由来の疎水性プローブの放出を追跡することで評価した。疎水性プローブとして、Forster resonance energy transfer（FRET）ペアとして機能する3,3’-dioctadecyloxacarbocyanine perchlorate（DiO、ドナー、λem 505 nm）および1,1’-dioctadecyl-3,3,3’,3’-tetramethylindocarbocyanine perchlorate（DiI、アクセプター、λem 575 nm）を凝集体内部に封入した。凝集体コア中では、DiI/DiO同士が接触するため、FRETが生じるが、凝集体の崩壊またはDilとDiOの放出により、FRETが減少する。測定開始時（90% FBS添加時）、全てのプロオリゴヌクレオチドは、FRETにより生じる、Dil由来の575 nmの蛍光を示し、DiO由来の505 nmの蛍光は検出されなかった（図３ａ、ｂおよびｃ）。しかし、oleate-T20またはlinoleate-T20由来の凝集体では、測定開始後1時間以内でDiO由来の蛍光が急速に増大し、その後蛍光の増大は少なかった（図ａおよびｂ）。この結果から、oleate-T20およびlinoleate-T20からなる凝集体では、90% FBSの存在下において、分子が頻繁に出入りするのに十分な大きさの、緩い凝集体を形成することが示唆された。これに対し、linolenate-T20で構成される凝集体においては、oleate-T20およびlinoleate-T20とは異なり、DiO由来の蛍光は9時間程度かけて緩やかに増大した（図３ｃ）。この結果から、linolenate-T20によって形成され凝集体は、他の２つの凝集体よりも安定した形体を維持していることが示唆された。【００３８】
プロオリゴヌクレオチドの凝集体は、自己集合によって形成されるミセル様の小胞と考えられる。エンドサイトーシスの経路は小胞のサイズによって異なることが知られている。直径200 nm以下の小胞のエンドサイトーシスは、クラスリンを介したメカニズムによって進行する。他方、これより大きな小胞が細胞内へ取り込まれるためには、エネルギーに依存した工程が必要である（Biochem. J., 2004, 377, 159-169）。 Linolenate-T20で構成される凝集体は、直径200 nm未満の小胞で、その構造は、90 % FBS中で数時間維持された（図３ｃ）。他方、Linoleate-T20に由来する凝集体は、直径200 nm未満のサイズであったが、90% FBS中における存在時間は短く、oleate-T20は直径200 nm より大きなサイズで、90% FBS中における存在時間はさらに短かった。
Linolenate-T20に由来の凝集体のサイズは、クラスリンを介したエンドサイトーシスが行われる小胞サイズの範囲である。従って、Linolenate-T20で構成される小胞は、以前報告されたように、平均200 nmのリポプレックス（lipoplex）と同様の経路で細胞内に取り込まれると推測される。【００３９】
２−４．プロオリゴヌクレオチドの核移行
linolenate-T10FT10を取り込んだ細胞の核内からは、強い蛍光が検出された（図２ｆおよびｇ）。このことは、リノレン酸が結合したオリゴヌクレオチドの細胞内輸送が、マイクロインジェクションで核領域に注入されると速やかに核内へ移行する短鎖DNAの場合と同様であることを示している。しかしながら、プロオリゴヌクレオチド凝集体のサイズは核膜孔のサイズ（8 nm）より大きい。核膜孔は、核膜に存在する輸送チャネルで、核と細胞質間の両方向性の物質交換を媒介する唯一の出入り口である。核膜孔のサイズよりも大きな核酸輸送核酸複合体は、核酸の核への輸送が制限されるとの報告がある。従って、核酸が核内へ輸送されるためには、核膜孔を通過し得る本来の核酸のサイズとなるように、核酸が複合体から分離される必要がある。
プロオリゴヌクレオチドの凝集体は、エンドソームを介して細胞内へ取り込まれるが、エンドソーム内は、プロトンポンプの作用により弱酸性の環境にある。そこで、発明者らは、エンドソーム内におけると同程度の弱酸性条件（pH 5.2）でlinolenate-T20凝集体の安定性を調べるために、FRET解析を行った。その結果。Iinolenate-T20の凝集体は弱酸性（pH5.2）の環境では、oleate-T20およびlinoleate-T20由来の凝集体と同様に、DiO由来の蛍光が1時間以内に速やかに増大した（図３ｄ）。すなわち、linolenate-T20の凝集体は、酸性の環境下において容易に不安定化すると考えられる。【００４０】
エンドソームのような酸性環境下において、linolenate-T20の凝集体は不安定化し、エンドソームから放出され、その後、linolenate-T20のエステル結合は、細胞に内在するエステラーゼによって切断され、脂肪酸と核酸が分離されことが予想される。そこで、エステラーゼ処理後のlinolenate-T20の変化をモニターした。
linolenate-T20をブタ肝臓由来のエステラーゼで処理した後、処理産物を逆相HPLCで分析した。エステラーゼ処理後、0、2、4、6および8時間後に反応物を逆相HPLCで分離したところ、linolenate-T20のピーク（プロオリゴ）は経時的に減少し（図４ＡおよびＢ）、代わって、ポリdTのピーク（オリゴ）が増大し、8時間後にはほぼ全てのlinolenate-T20が核酸（ポリdT）に変換されたことが確認された（図４Ｂ）。【００４１】
以上の結果を踏まえて、プロオリゴヌクレオチドを細胞へ添加してから、核酸が核へ輸送されるまでの経路について、図５に概念図としてまとめた。プロオリゴヌクレオチドの各ステップにおける反応およびその輸送は非常に速やかに進行すると考えられる。
【産業上の利用可能性】
【００４２】
本発明にかかる担体−核酸等複合体（多価脂肪酸と核酸とのエステル）は、細胞内に容易に導入され、細胞内に不適切な残留物を残すことなく、本来の核酸としての機能を発揮し得る。従って、本発明は、核酸医薬などの創薬分野等においての利用が期待される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【国際調査報告】
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