(57)【要約】  本発明者らは，単回又は数回の単独投与による長期間のＨＩＶウイルス制御を投与群に高確率でもたらす抗体について鋭意検討した結果，驚くべきことに，１Ｃ１０として報告された抗体遺伝子をカイコで生産させることにより得られたＳＷ−１Ｃ１０抗体の小数回単独投与により，投与された全ての個体において，早期に血中ウイルスが検出限界以下に抑えられたのみならず，１２週という長期に渡って血中ウイルスＲＮＡが検出限界以下で維持されることを見出した。更に，これまで，カイコによる抗体の生産量は繭１個あたり数百μｇ，繭１ｍｇあたり数μｇ程度であり，これ以上の生産性を高める検討は行われてこなかった。本発明者らは，多数の抗ＨＩＶ抗体の中から，絹糸虫における生産量がより高い抗体を見出すべく検討を重ねた結果，抗ＨＩＶ抗体である１Ｃ１０抗体及び１Ｄ９抗体が絹糸虫の絹糸中に従来の生産量よりも優れた量で生産されることを見出した。
2020090747.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＨＩＶへの結合能を有し；かつ，
当該抗体に結合する糖鎖がフコースを含まず：かつ，
ＨＩＶ感染者への単回投与または数回投与により，９０％以上の確率で当該ＨＩＶ感染者の血中のＨＩＶを検出限界以下に抑制する作用を有する抗体。
【請求項２】
ＩｇＧ抗体であって，
配列番号７に記載のアミノ酸配列，それと８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列，あるいは，そのアミノ酸配列のうち数個のアミノ酸が置換，欠失，付加，及び／又は挿入されたアミノ酸配列を含む重鎖，並びに，配列番号９に記載のアミノ酸配列，それと８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列，又は，そのアミノ酸配列のうち数個のアミノ酸が置換，欠失，付加，及び／又は挿入されたアミノ酸配列を含む軽鎖を有し；
ＨＩＶへの結合能を有し；かつ，
当該抗体に結合する糖鎖がフコースを含まない抗体。
【請求項３】
重鎖が配列番号７に記載の重鎖アミノ酸配列における３つのＣＤＲ配列を有し，かつ，軽鎖が配列番号９に記載のアミノ酸配列における３つのＣＤＲ配列を有する，請求項１又は請求項２に記載の抗体。
【請求項４】
ＨＩＶ感染者への単回投与または数回投与により，９０％以上の確率で当該ＨＩＶ感染者の血中のＨＩＶを検出限界以下に抑制する作用を有する，請求項１〜請求項３のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項５】
配列番号７に記載のアミノ酸配列からなる重鎖，並びに，配列番号９に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖を有する，請求項１に記載の抗体。
【請求項６】
以下から選択される糖鎖構造を有する，請求項１〜請求項５のいずれか１項に記載の抗体。
【化１】
2020090747.tif 000007
【請求項７】
トランスジェニック絹糸虫によって産生されたことを特徴とする，請求項１〜請求項６のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項８】
ＨＩＶへの結合能を有するＩｇＧ抗体を含む組成物であって，
該ＩｇＧ抗体の８０％以上が請求項１〜請求項７又は請求項１４に記載の抗体である，組成物。
【請求項９】
絹糸腺特異的遺伝子プロモーターの下流に機能的に結合した，以下の（ｉ）〜（ｘ）から選択されるいずれか１つのポリヌクレオチドを含有する発現カセット：
（ｉ）配列番号６に記載の塩基配列及び／又は配列番号８に記載の塩基配列を有するポリヌクレオチド；
（ｉｉ）配列番号６に記載の塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列，及び／又は，配列番号８に記載の塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を有するポリヌクレオチド；
（ｉｉｉ）配列番号７に記載のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド，及び／又は，配列番号９に記載のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド；
（ｉｖ）配列番号７に記載のアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド，及び／又は，配列番号９に記載のアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド；
（ｖ）配列番号７に記載のアミノ酸配列において，数個のアミノ酸が置換，欠失，付加，挿入されたアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド，及び／又は，配列番号９に記載のアミノ酸配列において，数個のアミノ酸が置換，欠失，付加，挿入されたアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド；
（ｖｉ）配列番号１０に記載の塩基配列及び／又は配列番号１２に記載の塩基配列を有するポリヌクレオチド；
（ｖｉｉ）配列番号１０に記載の塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列，及び／又は，配列番号１２に記載の塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を有するポリヌクレオチド；
（ｖｉｉｉ）配列番号１１に記載のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド，及び／又は，配列番号１３に記載のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド；
（ｉｘ）配列番号１１に記載のアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド，及び／又は，配列番号１３に記載のアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド；並びに，
（ｘ）配列番号１１に記載のアミノ酸配列において，数個のアミノ酸が置換，欠失，付加，挿入されたアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド，及び又は，配列番号１３に記載のアミノ酸配列において，数個のアミノ酸が置換，欠失，付加，挿入されたアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド。
【請求項１０】
前記プロモーター領域が，セリシン１プロモーター，セリシン２プロモーター，又はセリシン３プロモーターである，請求項９に記載の発現カセット。
【請求項１１】
請求項９又は請求項１０に記載の発現カセットを含有する，プラスミドベクター。
【請求項１２】
請求項１１に記載のプラスミドベクターを絹糸虫の卵に挿入することを含む，トランスジェニック絹糸虫の製造方法。
【請求項１３】
請求項１０に記載の発現カセットが染色体に組み込まれた，トランスジェニック絹糸虫。
【請求項１４】
抗体の製造方法であって，請求項１３に記載のトランスジェニック絹糸虫が産生した絹糸から当該抗体を抽出することを含む方法。
【請求項１５】
トランスジェニック絹糸虫によって産生された，配列番号１１に記載のアミノ酸配列を有する重鎖及び配列番号１３に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖を含む抗体。
【請求項１６】
請求項１〜請求項７又は請求項１５に記載の抗体，あるいは請求項８に記載の組成物を有効成分として含有する，ＨＩＶ治療用薬又は予防用の医薬組成物
【請求項１７】
ＨＩＶ感染後，１〜５回投与されるための，請求項１６に記載の医薬組成物。
【請求項１８】
２回以上投与され，かつ，２回目以降の投与が前回の投与の３〜３０日後に行われるための，請求項６５に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【関連出願の相互参照】
【０００１】
本国際出願は、２０１８年１０月２９日に日本国特許庁に出願された日本国特許出願第２０１８−２０３１１４号及び２０１９年９月１２日に日本国特許庁に出願された日本国特許出願第２０１９−１６６０４０号に基づく優先権を主張するものであり、日本国特許出願第２０１８−２０３１１４号及び日本国特許出願第２０１９−１６６０４０号の全内容を本国際出願に参照により援用する。
【技術分野】
【０００２】
本発明は効率的な抗ＨＩＶ抗体の製造方法に関するものである。より具体的には，本発明は，カイコを利用した高効率で抗ＨＩＶ抗体を製造する方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
カイコのセリシンプロモーターの下流に抗体遺伝子を配置して，抗体分子を繭に発現させることにより，治療用抗体をカイコで製造する試みが行われている（非特許文献１及び２など）。特に，カイコの繭に発現させた抗体は，糖鎖にコアフコースが含まれないことから，優れたＡＤＣＣ活性を示すことが知られている（特許文献１及び２）。【０００４】
また，ＨＩＶ治療戦略において，単回又は数回の抗体投与により，その後長期間にわたってＨＩＶをコントロール可能な抗体が期待されている。例えば，非特許文献３においては，ＰＧＴ１２１を単回投与した４匹のアカゲザルのうち，１匹においてウイルスＲＮＡが約７０日間にわたって検出限界以下に抑えられたことを報告している。【０００５】
また，ＨＩＶのエンベロープタンパク質であるｇｐ１２０のＶ３ループを認識するヒト化抗体であるＫＤ２４７が開発され，臨床試験も実施されている。ＫＤ２４７を３回投与した患者において，ウイルスの抑制が確認されたものの，長期間検出限界以下にまでウイルスを抑えるには至らなかった。このように，単剤で単回から数回投与することで，高い確率で長期間ウイルスを検出限界以下にまで抑制できる抗体は，未だ開発されていない。【０００６】
そこで，ＫＤ２４７と同じ抗原認識部位を有するヒト抗体である１Ｃ１０抗体の開発が進められている。１Ｃ１０抗体は，幅広いＨＩＶ株に対して中和可能な抗体を体内に持ち，２５年以上という長期間未治療でも症状を抑制している患者から単離された抗体であり，抗体医薬品としてＨＩＶ感染患者に投与することで高い治療効果を発揮することが期待されている（特許文献２及び非特許文献４）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開２０１４−１２０２４号
【特許文献２】国際公開ＷＯ２００９／０６６７０２号
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Ｍａｓａｓｈｉ  Ｉｉｚｕｋａ，ｅｔ  ａｌ．，ＦＥＢＳ  Ｊｏｕｒｎａｌ；２７６：５８０６−５８２０（２００９）
【非特許文献２】Ｍｉｎｏｒｕ  Ｔｏｄａ，ｅｔ  ａｌ．，ｍＡＢｓ；７（６）：１１３８−１１５０（２０１５）
【非特許文献３】Ｄａｎ  Ｈ。Ｂａｒｏｕｃｈ，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ；５０３（７４７５）：２２４−２２８（２０１３）
【非特許文献４】Ｋｒｉｓｔｅｌ  Ｐａｏｌａ  Ｒａｍｉｒｅｚ  Ｖａｌｄｅｚ，ｅｔ  ａｌ．，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ；４７５：１８７−２０３（２０１５）
【発明の概要】
【０００９】
本発明者らは，単回又は数回の単独投与による長期間のＨＩＶウイルス制御を投与群に高確率でもたらす抗体について鋭意検討した結果，驚くべきことに，１Ｃ１０として報告された抗体遺伝子をカイコで生産させることにより得られたＳＷ−１Ｃ１０抗体の小数回単独投与により，投与された全ての個体において，早期に血中ウイルスが検出限界以下に抑えられたのみならず，１２週という長期に渡って血中ウイルスＲＮＡが検出限界以下で維持されることを見出した。更に，カイコで生産された抗体とＣＨＯ細胞で生産した抗体とを比較し，その構造的な違いが糖鎖構造にあることを確認した。このことから，本発明者らは，フコースを欠落させることが１Ｃ１０抗体に投与全例における長期間ウイルス抑制という極めて優れた効果をもたらすことを見出すに至った。このような，投与全例における長期間のウイルス増殖制御が可能であることは過去に報告が無く，本発明者らは初めて少数回の単独投与により投与対象に対して広く安定的にウイルス抑制をもたらす抗体を見出すことに成功した。
【００１０】
更に，これまで，カイコによる抗体の生産量は繭１個あたり数百μｇ，繭１ｍｇあたり数μｇ程度であり，これ以上の生産性を高める検討は行われてこなかった。本発明者らは，多数の抗ＨＩＶ抗体の中から，絹糸虫における生産量がより高い抗体を見出すべく検討を重ねた結果，抗ＨＩＶ抗体である１Ｃ１０抗体及び１Ｄ９抗体が絹糸虫の絹糸中に従来の生産量よりも優れた量で生産されることを見出し，本発明を完成させた。
【００１１】
よって，一態様において，本発明は，ＨＩＶへの結合能を有し；かつ，当該抗体に結合する糖鎖がフコースを含まず：かつ，ＨＩＶ感染者への単回投与または数回投与により，９０％以上の確率で当該ＨＩＶ感染者の血中のＨＩＶを検出限界以下に抑制する作用を有する抗体に関する。ある抗体がＨＩＶへの結合能を有するか否かを調べる方法は，本技術分野において広く知られている。例えば，ＨＩＶを固相化した担体に当該抗体を接触させて，当該固相に結合した抗体を検出することにより確認することができる。
【００１２】
一態様において，本発明は，ＩｇＧ抗体であって，配列番号７に記載のアミノ酸配列，それと８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列，あるいは，そのアミノ酸配列のうち数個のアミノ酸が置換，欠失，付加，及び／又は挿入されたアミノ酸配列を含む重鎖，並びに，配列番号９に記載のアミノ酸配列，それと８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列，又は，そのアミノ酸配列のうち数個のアミノ酸が置換，欠失，付加，及び／又は挿入されたアミノ酸配列を含む軽鎖を有し；ＨＩＶへの結合能を有し；かつ，当該抗体に結合する糖鎖がフコースを含まない抗体に関する。
【００１３】
好ましくは，本発明の抗体は，重鎖が配列番号７に記載の重鎖アミノ酸配列における３つのＣＤＲ配列を有し，かつ，軽鎖が配列番号９に記載のアミノ酸配列における３つのＣＤＲ配列を有する。ＣＤＲ配列の決定の仕方は，Ｋａｂａｔらのナンバリングシステム（Ｋａｂａｔ，Ｅ．ら，Ｕ．Ｓ．  Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，（１９８３）及びその後続版），Ｃｈｏｔｈｉａらのナンバリングシステム（Ｃｈｏｔｈｉａ及びＬｅｓｋ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１９６：９０１−９１７（１９８７）），Ｈｏｎｅｇｇｅｒらのナンバリングシステム（Ｈｏｎｅｇｇｅｒ，Ａら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３０９：６５７−６７０（２００１）），ｃｏｎｔａｃｔ定義法（ＭａｃＣａｌｌｕｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ，２６２（５）：７３２−７４５（１９９６）），ＩＭＧＴデータベース（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｉｍｇｔ．ｏｒｇ／）によるナンバリングシステム，又は既知の配列データベースへのアラインメントにより決定することができる。例えば，本発明の抗体のＣＤＲ配列は，ＣＤＲＨ１：ＧＦＭＦＳＮＹＡ（配列番号１４）；ＣＤＲＨ２：ＩＳＮＤＧＳＤＫ（配列番号１５）；ＣＤＲＨ３：ＣＡＲＤＬＤＱＴＩＰＤＬＴＡＰＡＦＥＶ（配列番号１６），及びＣＤＲＬ１：ＱＳＬＬＨＳＤＧＮＮ（配列番号１７）；ＣＤＲＬ２：ＬＴＳ（配列番号１８）；ＣＤＲＬ３：ＭＱＳＬＱＴＷＴ（配列番号１９）あり得る。より好ましくは，本発明の抗体は，配列番号７に記載のアミノ酸配列からなる重鎖，並びに，配列番号９に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖を有する。
【００１４】
本発明の抗体は，結合する糖鎖にフコースを含まない。例えば，本発明の抗体は，以下から選択される糖鎖構造を有していてもよい。
【００１５】
【化１】
2020090747.tif 000003
一態様において，本発明は，絹糸腺特異的遺伝子プロモーターの下流に機能的に結合した，以下の（ｉ）〜（ｘ）から選択されるいずれか１つのポリヌクレオチドを含有する発現カセットに関する：
（ｉ）配列番号６に記載の塩基配列及び／又は配列番号８に記載の塩基配列を有するポリヌクレオチド；
（ｉｉ）配列番号６に記載の塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列，及び／又は，配列番号８に記載の塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を有するポリヌクレオチド；
（ｉｉｉ）配列番号７に記載のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド，及び／又は，配列番号９に記載のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド；
（ｉｖ）配列番号７に記載のアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド，及び／又は，配列番号９に記載のアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド；
（ｖ）配列番号７に記載のアミノ酸配列において，数個のアミノ酸が置換，欠失，付加，及び／又は挿入されたアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド，及び／又は，配列番号９に記載のアミノ酸配列において，数個のアミノ酸が置換，欠失，付加，挿入されたアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド；
（ｖｉ）配列番号１０に記載の塩基配列及び／又は配列番号１２に記載の塩基配列を有するポリヌクレオチド；
（ｖｉｉ）配列番号１０に記載の塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列，及び／又は，配列番号１２に記載の塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を有するポリヌクレオチド；
（ｖｉｉｉ）配列番号１１に記載のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド，及び／又は，配列番号１３に記載のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド；
（ｉｘ）配列番号１１に記載のアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド，及び／又は，配列番号１３に記載のアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド；並びに，
（ｘ）配列番号１１に記載のアミノ酸配列において，数個のアミノ酸が置換，欠失，付加，挿入されたアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド，及び／又は，配列番号１３に記載のアミノ酸配列において，数個のアミノ酸が置換，欠失，付加，及び／又は挿入されたアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド。
【００１６】
本明細書において，１Ｃ１０抗体とは，配列番号７に記載のアミノ酸配列からなる重鎖，及び，配列番号９に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖を有する抗体である。なお，配列番号７に記載のアミノ酸配列のうち，１番目から１９番目まではシグナル配列である。本明細書に記載された抗体の重鎖及び／又は軽鎖は，本願明細書に記載されたシグナル配列を含んでいなくてもよい。あるいは，本願明細書に記載されたシグナル配列以外のシグナル配列を含んでいてもよい。よって，本明細書において，「配列番号７に記載のアミノ酸配列からなる重鎖」の語は，適宜，「配列番号７の２０番目から４７４番目までのアミノ酸配列からなる重鎖」と読み替えてもよい。同様に，配列番号９に記載のアミノ酸配列のうち，１番目から２０番目まではシグナル配列である。よって，本明細書において，「配列番号９に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖」の語は，適宜，「配列番号９の２１番目から２３８番目までのアミノ酸配列からなる軽鎖」と読み替えてもよい。また，本明細書において，１Ｄ９抗体とは，配列番号１１に記載のアミノ酸配列からなる重鎖，及び，配列番号１３に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖を有する抗体である。なお，配列番号１１に記載のアミノ酸配列のうち，１番目から１９番目まではシグナル配列である。よって，本明細書において，「配列番号１１に記載のアミノ酸配列からなる重鎖」の語は，適宜，「配列番号１１の２０番目から４７２番目までのアミノ酸配列からなる重鎖」と読み替えてもよい。同様に，配列番号１３に記載のアミノ酸配列のうち，１番目から２０番目まではシグナル配列である。よって，本明細書において，「配列番号１３に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖」の語は，適宜，「配列番号９の２１番目から２３８番目までのアミノ酸配列からなる軽鎖」と読み替えてもよい。
【００１７】
１Ｃ１０抗体をコードするＤＮＡ配列としては，例えば，配列番号６に記載の塩基配列（重鎖）及び配列番号８に記載の塩基配列（軽鎖）が挙げられる。上述の通り，配列番号６に記載の塩基配列（重鎖）のうち，５７ｂａｓｅはシグナル配列をコードしている。よって，本明細書において，「配列番号６に記載の塩基配列」の語は，適宜，「配列番号６に記載の塩基配列のうち，５８番目から１４２５番目までの塩基配列」と読み替えてもよい。同様に，配列番号８に記載の塩基配列（軽鎖）のうち，６０ｂａｓｅはシグナル配列をコードしている。よって，本明細書において，「配列番号８に記載の塩基配列」の語は，適宜，「配列番号８に記載の塩基配列のうち，６１番目から７１７番目までの塩基配列」と読み替えてもよい。また，１Ｄ９抗体をコードするＤＮＡ配列としては，例えば，配列番号１０に記載の塩基配列（重鎖）及び配列番号１２に記載の塩基配列（軽鎖）が挙げられる。上述の通り，配列番号１０に記載の塩基配列（重鎖）のうち，５７ｂａｓｅはシグナル配列をコードしている。よって，本明細書において，「配列番号１０に記載の塩基配列」の語は，適宜，「配列番号１０に記載の塩基配列のうち，５８番目から１４１９番目までの塩基配列」と読み替えてもよい。同様に，配列番号１２に記載の塩基配列（軽鎖）のうち，６０ｂａｓｅはシグナル配列をコードしている。よって，本明細書において，「配列番号１２に記載の塩基配列」の語は，適宜，「配列番号１２に記載の塩基配列のうち，６１番目から７１７番目までの塩基配列」と読み替えてもよい。
【００１８】
本明細書において，「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする」とは，当業者に通常用いられるハイブリダイゼーション条件でハイブリダイズすることを意味する。例えば，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｎｕａｌ，Ｆｏｕｒｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（２０１２）又は，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  Ｗｉｌｅｙ  Ｏｎｌｉｎｅ  Ｌｉｂｒａｒｙ等に記載の方法によりハイブリダイズするか否かを決定することができる。例えば，ハイブリダイズの条件は，６×ＳＳＣ（０．９Ｍ  ＮａＣｌ，０．０９Ｍ  クエン酸三ナトリウム）または６×ＳＳＰＥ（３Ｍ  ＮａＣｌ，０．２Ｍ  ＮａＨ２ＰＯ４，２０ｍＭ  ＥＤＴＡ・２Ｎａ，ｐＨ７．４）中４２℃でハイブリダイズさせ，その後４２℃で０．５×ＳＳＣで洗浄する条件であってもよい。
【００１９】
一態様において，本発明は，配列番号７に記載のアミノ酸配列，及び，配列番号９に記載のアミノ酸配列，又は，配列番号１１に記載のアミノ酸配列，及び，配列番号１３に記載のアミノ酸配列（本段落において，「配列番号７に記載のアミノ酸配列等」という）のそれぞれと８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドに関する。アミノ酸配列の同一性は，２種類のタンパク質間において，比較対象とするアミノ酸配列範囲における種類が同一なアミノ酸数の割合（％）を意味し，例えば，ＢＬＡＳＴ，ＦＡＳＴＡ等の公知のプログラムを用いて決定することができる。上述の同一性としては，８０％以上よりも高い同一性であってもよく，例えば，８５％以上，９０％以上，９５％以上，９８％以上，又は９９％以上の同一性であってもよい。あるいは，本発明のポリヌクレオチドは，配列番号７に記載のアミノ酸配列等とＢｌａｓｔにおける相同性スコアが２００以上を示すアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドであってもよい。相同性スコアは，配列番号７等に記載のアミノ酸配列と目的のタンパク質のアミノ酸配列をアラインメントし，比較対象とする各アミノ酸の点数をスコアマトリックスから求め，その総和として計算することができる（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｓｉｃ．ｔｉｔｅｃｈ．ａｃ．ｊｐ／ｓｕｐｅｒｃｏｎ／ｓｕｐｅｒｃｏｎ２００４−ｅ／ａｌｉｇｎｍｅｎｔＥ．ｈｔｍｌ参照）。例えば，相同性スコアは，公知のＢＬＡＳＴプログラムを用いて決定することができる。スコアマトリックスとしては，ＢＬＯＳＵＭ６２やＰＡＭ３２などが知られており，本明細書において好ましくはＢＬＯＳＵＭ６２である。
【００２０】
置換，欠失，付加，及び／又は挿入されるアミノ酸の数は，前記抗体の生物学的活性に影響を与えない数であれば特に限定されないが，例えば，１〜１０個，１〜５個，１〜４個，又は１〜３個とすることができる。アミノ酸の置換は，好ましくは保存的アミノ酸同士の置換（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｃｅｌｌ，Ｇａｒｌａｎｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ；６版参照）である。
【００２１】
「絹糸腺特異的遺伝子プロモーター」とは，絹糸虫の絹糸腺において特異的に発現する遺伝子のプロモーターである。このようなプロモーターとしては，絹タンパク質遺伝子プロモーター，例えば，後部絹糸腺特異的遺伝子プロモーター及び中部絹糸腺特異的遺伝子プロモーターなどが挙げられ，例えば，セリシン遺伝子プロモーター（セリシン１遺伝子プロモーター，セリシン２遺伝子プロモーター，及びセリシン３遺伝子プロモーター）又はフィブロイン遺伝子プロモーター（フィブロイン重鎖遺伝子プロモーター，フィブロイン軽鎖遺伝子プロモーター，及びフィブロヘキサメリンプロモーター）が挙げられる。好ましくは，セリシン１遺伝子プロモーター，セリシン２遺伝子プロモーター，及びセリシン３遺伝子プロモーターであり，ＭＳＧプロモーター及びＰＳＧプロモーター（ＷＯ２０１７１３５４５２Ａ１）を含む。プロモーターの下流に機能的に結合したとは，プロモーターの活性化により結合された遺伝子が発現可能となるように結合されていることを意味する。
【００２２】
別の態様において，本発明は上記発現カセットを含有する，プラスミドベクターに関する。プラスミドベクターは，絹糸虫細胞に導入し，維持することができるベクターであれば特に制限されない。例えば，Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ  ｎｉに由来するＤＮＡ型トランスポゾンｐｉｇｇｙＢａｃを組み込んだプラスミドベクター（Ｔａｍｕｒａ，Ｔら，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１８：８１−８４（２０００））を挙げることができる。例えば，ベクターとして，ｐＰＩＧＡ３ＧＦＰ（Ｔａｍｕｒａ，Ｔら，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１８：８１−８４（２０００））やｐＢａｃ［３ｘＰ３−ＤｓＲｅｄ／ｐＡ］（ＮａｔｕｒｅＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２１：５２−５６（２００３））を挙げることができる。また，本発明のベクターは，例えば，米国特許公開公報２００８／０３０１８２３に記載された方法により作製されたベクター（ｐＭＳＧ１．１ＭＧ）の制限酵素切断部位に前記発現カセットを挿入することによっても作製することができる。あるいは，例えば，ベクターは，絹糸虫形質転換用ベクターｐＭＳＧ３．１ＭＧ（特開２０１２−１８２９９５）であってもよい。
【００２３】
ある態様において，本発明は上記発現カセットが染色体に組み込まれた，トランスジェニック絹糸虫に関する。本明細書において「絹糸虫」とは，絹糸腺を有し，絹糸を吐糸することのできる昆虫であれば特に制限されるものではなく，チョウ目昆虫，ハチ目昆虫，アミメカゲロウ目昆虫，トビケラ目昆虫等において，主として幼虫期に営巣，営繭又は移動のために吐糸する種類を意味する。絹糸虫としては，多量の絹糸を吐糸できるチョウ目昆虫が好ましく，カイコガ科，ヤママユガ科，イボタガ科，オビガ科，カレハガ科，ミノガ科，ヒトリガ科，又はヤガ科等に属する種を挙げることができる。また，絹糸虫は，カイコ，クワコ，シンジュサン，エリサン，ヤママユガ，サクサン，ヒメヤママユ，オオミズアオ等を含む。本発明のトランスジェニック絹糸虫は，前記抗体を絹糸（繭）（好ましくは，セリシン層）中に産生（分泌）する。
【００２４】
別の態様において，本発明は前記トランスジェニック絹糸虫によって産生された抗体に関する。当該抗体は，配列番号７に記載のアミノ酸配列を有する重鎖及び／又は配列番号９に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖を含む抗体，あるいは，配列番号１１に記載のアミノ酸配列を有する重鎖及び／又は配列番号１３に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖を含んでいてもよい。あるいは，当該抗体は，配列番号７及び／若しくは配列番号９，又は，配列番号１１及び／若しくは配列番号１３のそれぞれと８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有する，それぞれ，重鎖及び／若しくは軽鎖を含んでいてもよい。あるいは，本発明の抗体は，配列番号７及び／若しくは配列番号９，又は，配列番号１１及び／若しくは配列番号１３のそれぞれとＢｌａｓｔにおける相同性スコアが２００以上を示すアミノ酸配列を有する，それぞれ，重鎖及び／若しくは軽鎖を有していてもよい。あるいは，本発明の抗体は，列番号７及び／若しくは配列番号９，又は，配列番号１１及び／若しくは配列番号１３のそれぞれにおいて，数個のアミノ酸が置換，欠失，付加，及び／又は挿入されたアミノ酸配列からなる，それぞれ，重鎖及び軽鎖を有していてもよい。また，本明細書において，「抗体」の用語は，Ｆｃと抗原結合部位を含む限り，抗体の一部又は断片や改変体であってもよく，例えば，一本鎖抗体（例えば，重鎖抗体）や二重特異性抗体であってもよい。
【００２５】
カイコの繭中に産生される抗体は糖鎖としてフコースが結合していないことが知られている。また，フコースが付加されていない抗体は，ＡＤＣＣ活性に優れることが既に本技術分野において広く知られている。ＡＤＣＣ活性と抗体投与によるウイルス抑制についてはこれまでに報告がないが，本発明のこのような効果はＡＤＣＣ活性によりもたらされている可能性がある。よって，一態様において，本発明は，ＩｇＧ抗体であって，配列番号７に記載のアミノ酸配列，それと８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列，あるいは，そのアミノ酸配列のうち数個のアミノ酸が置換，欠失，付加，及び／又は挿入されたアミノ酸配列を含む重鎖，並びに，配列番号９に記載のアミノ酸配列，それと８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列，又は，そのアミノ酸配列のうち数個のアミノ酸が置換，欠失，付加，及び／又は挿入されたアミノ酸配列を含む軽鎖を有し；ＨＩＶへの結合能を有し；かつ，ＡＤＣＣ活性向上のためにＦｃ領域を改変した抗体を含む組成物であって，ＡＤＣＣ活性がＣＨＯ細胞に産生させた野生型抗体より高いことを特徴とし，ＨＩＶ感染者への単回投与または数回投与により９０％以上の確率で当該ＨＩＶ感染者の血中ＨＩＶを検出限界以下に抑制する作用を有する抗ＨＩＶ抗体組成物を含んでいてもよい。
【００２６】
また，ＦｃとＦｃγＲとの関係がＡＤＣＣ活性に影響を与えることが示されており，Ｆｃ領域のアミノ酸置換によってＦｃγＲとの親和性を高めることができることも報告されている。特に，ＦｃγＲＩＩＩａなどの活性型ＦｃγＲへの結合が高く，ＦｃγＲＩＩｂなどの阻害型ＦｃγＲへの結合が弱いＦｃがエフェクター機能に優れることが知られている。このような変異として，Ｆ１５８Ｖ，Ａ３３０Ｌ，Ｓ２３９Ｄ，及びＩ３３２Ｅ（Ｇｒｅｇ  ＡＬａｚａｒら，ＰＮＡＳ（２００６）１０３（１１）：４００５−４０１０）や，Ｆ２４３Ｌ，Ｄ２７０Ｅ，Ｒ２９２Ｐ，Ｓ２９８Ｎ，Ｙ３００Ｌ，Ｖ３０５Ｉ，Ａ３３０Ｖ，及びＰ３９６Ｌ（Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ（２００７）６７（１８）：８８８２−８８９０）が報告されている。本発明の抗体のＦｃ領域は，このような変異を有していてもよく，例えば，Ａ３３０Ｌ，Ｓ２３９Ｄ，Ｉ３３２Ｅ，Ｆ２４３Ｌ，Ｄ２７０Ｅ，Ｒ２９２Ｐ，Ｓ２９８Ｎ，Ｙ３００Ｌ，Ｖ３０５Ｉ，Ａ３３０Ｖ，及びＰ３９６Ｌから選択される１〜１０個の変異を有していてもよい。
【００２７】
別の態様において，本発明は，ＨＩＶへの結合能を有するＩｇＧ抗体を含む組成物であって，該ＩｇＧ抗体の８０％以上が抗体結合糖鎖中にフコースを含まない抗体である，組成物に関する。すなわち，本発明の組成物において，必ずしも全ての（１００％の）抗ＨＩＶ抗体においてフコースが含まれていない必要はなく，少なくとも，８０％以上（好ましくは，８５％以上，９０％以上，９５％以上，９６％以上，９７％以上，９８％以上，９９％以上）の抗ＨＩＶ抗体においてフコースが含まれていなければよい。好ましくは，当該組成物は，ＨＩＶ感染者への単回投与または数回投与により，９０％以上の確率で当該ＨＩＶ感染者の血中のＨＩＶを検出限界以下に抑制する作用を有する。当該組成物が有する抗ＨＩＶ抗体が有する配列等の特徴は，前記本発明の抗ＨＩＶ抗体と同様である。
【００２８】
本明細書において，「ＨＩＶ感染者への単回投与または数回投与により，９０％以上（好ましくは，９２％以上，９３％以上，９４％以上，９５％以上，９６％以上，９７％以上，９８％以上，９９％以上，又は１００％）の確率で当該ＨＩＶ感染者の血中のＨＩＶを検出限界以下に抑制する作用を有する」か否かは，被検抗体を複数のＨＩＶ感染者に投与し，その後の血中ＨＩＶを常法，例えば，ＰＣＲを利用する方法，に従って検出することにより確認することができる。被検抗体を投与されたＨＩＶ患者の９０％以上において血中ＨＩＶが検出されなかった場合には，ＨＩＶ感染者への単回投与または数回投与により，９０％以上の確率で当該ＨＩＶ感染者の血中のＨＩＶを検出限界以下に抑制する作用を有すると判定することができる。血中のＨＩＶを検出限界以下に抑制しているか否かの判定時期は，抗体の投与がすべて終了した後であることが望ましく，好ましくは，投与完了後１２週，１６週，２０週，２４週，２８週，３２週，３６週，４０週，１年，２年，３年，４年，又は５年の時点とすることができる。
【００２９】
更に別の態様において，本発明は，上記抗体を有効成分として含有する，ＨＩＶ感染症の治療薬又は予防薬（医薬組成物）に関する。本発明の医薬組成物は，患者に投与することができる製剤であれば経口又は非経口のいかなる製剤を採用してもよい。非経口投与のための組成物としては，例えば，注射剤，点鼻剤，坐剤，貼布剤，軟膏等を挙げることができる。好ましくは，注射剤である。本発明の医薬組成物の剤形は，例えば，液剤又は凍結乾燥製剤を挙げることができる。本発明の医薬組成物を注射剤として使用する場合，必要に応じて，プロピレングリコール，エチレンジアミン等の溶解補助剤，リン酸塩等の緩衝材，塩化ナトリウム，グリセリン等の等張化剤，亜硫酸塩等の安定剤，フェノール等の保存剤，リドカイン等の無痛化剤等の添加物（「医薬品添加物事典」薬事日報社，「Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ  Ｆｉｆｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ」ＡＰｈＡ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ社参照）を加えることができる。また，本発明の医薬組成物を注射剤として使用する場合，保存容器としては，アンプル，バイアル，プレフィルドシリンジ，ペン型注射器用カートリッジ，及び，点滴用バッグ等を挙げることができる。
【発明の効果】
【００３０】
本発明の抗体は，カイコにより高効率で生産することができることから，より生産コストの安いＨＩＶ感染症治療用抗体を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００３１】
【図１】トランスジェニックカイコによる発現量をＳＤＳ−ＰＡＧＥ後のＣＢＢ染色により比較した写真である。Ａ：全抽出液；Ｂ：中性緩衝液抽出液。写真の左側の数値は分子量（ｋＤａ）を表し，写真の上部は用いた抗体の種類を示す。
【図２】トランスジェニックカイコにより生産された各抗体のＨＩＶ−１  ＢａＬ株に対する結合活性を測定した結果を表すグラフである。縦軸は平均蛍光強度（ＭＦＩ），横軸は抗体濃度（μｇ／ｍＬ）を表す。
【図３】由来の異なる各抗体のＨＩＶ−１  ＢａＬ株に対する中和活性を測定した結果を表すグラフである。縦軸は阻害割合（％ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ），横軸は抗体のＬｏｇ濃度（μｇ／ｍＬ）を表す。下の表は各抗体の各濃度における阻害割合（％ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ）を示す。
【図４】カイコの繭中に発現させた抗体とＣＨＯ細胞に産生させた抗体の糖鎖構造をマススペクトルから推定した結果を示す。主要な糖鎖構造とその存在比率を示す。
【図５】ＳＷ−１Ｃ１０，２９３Ａ−１Ｃ１０，ＣＨＯ−１Ｃ１０，及びＫＤ−２４７を０．２，２，２０μｇ／ｍＬでＨＩＶ−１  ＢａＬ株に添加した際のＡＤＣＣ活性を測定した結果を表すグラフ（Ａ）及び表（Ｂ）である。ＡＤＣＣ活性はＳＷ−１Ｃ１０が最も高く，次いでＣＨＯ−１Ｃ１０が高かった。
【図６】急性感染期におけるＳＷ−１Ｃ１０の効力について評価するため，強毒性ＳＨＩＶ８９．６Ｐ（Ｒｅｉｍａｎｎ  Ｋ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７０，６９２２−６９２８．）を接種したカニクイザルにＳＷ−１Ｃ１０を投与した結果を示すグラフである。左のグラフはＳＷ−１Ｃ１０投与群（ｎ＝３）を示し，右のグラフは無処置群（ｎ＝２）を示す。上のグラフの縦軸は血漿１ｍｌ中のウイルスＲＮＡコピー数（ｌｏｇ１０  ｃｏｐｉｅｓ／ｍＬ）を示し，下のグラフの縦軸はＣＤ４＋Ｔ細胞数（ｃｏｕｎｔ／μＬ）を示す。全身感染を成立させた。全てのグラフの横軸は，ウイルス感染後の経過期間（週）を表す。ＳＷ−１Ｃ１０の投与は，ウイルス接種後３日目，１０日目，１７日目に静脈経由で行った。
【発明を実施するための形態】
【００３２】
１．抗体
一態様において，本発明はカイコに本発明の抗体遺伝子を発現させることを含む，本発明の抗体の製造方法，及び当該方法により製造された抗体を含む。本発明の製造方法は，具体的には以下に記載された方法により実施することができる。
（発現カセットの作製）
本発明のカイコの絹糸腺細胞で遺伝子発現を引き起こすプロモーター領域と機能的に連結された，抗体遺伝子を含む発現カセットは，カイコの絹糸腺細胞で遺伝子発現を引き起こすプロモーター領域をコードするポリヌクレオチドと，上述の（ｉ）〜（ｘ）から選択されるいずれか１つのポリヌクレオチドとを，当業者が周知の遺伝子組換え技術により結合させて作製することができる。カイコの絹糸腺細胞で遺伝子発現を引き起こすプロモーター領域のポリヌクレオチドは，例えば，カイコ細胞より抽出したゲノムＤＮＡをテンプレートとして，目的のプロモーターに対応するプロモーターを用いてＰＣＲを行うことにより得ることができる。例えば，セリシン１遺伝子プロモーターの取得方法が，米国特許公開公報２００８／０３０１８２３に記載されている。
【００３３】
本発明の発現カセットが，エンハンサー，フィブロイン重鎖遺伝子の−１８６０〜−１１２７の領域，及び／又は，−５０００〜−３８４８の領域，バキュロウイルスｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ  ｒｅｇｉｏｎをコードするポリヌクレオチド，バキュロウイルス・ポリヘドリンの５’非翻訳領域を構成するポリヌクレオチド，及び／又は，バキュロウイルスＩＥ１をコードするポリヌクレオチド等を含む場合，当業者周知の方法により（例えば，制限酵素切断部位を利用することにより）これらのポリヌクレオチドとカイコの絹糸腺細胞で遺伝子発現を引き起こすプロモーター領域と機能的に連結された抗体遺伝子とを結合させることにより得ることができる。例えば，本発明の発現カセットは，特開２００４−３４４１２３，米国特許公開公報２００８／０３０１８２３，特開２００８−１２５３６６などに記載された方法に従って，作製することができる。
（ベクターの作製）
前記発現カセットを含有するプラスミドベクターは，所望のベクターに前記発現カセット又はその構成成分を組み込むことにより得ることができる。ベクターは，トランスジェニックカイコを作製可能なプラスミドベクターであれば特に限定されず，例えば，上述のベクターの制限酵素切断部位に前記発現カセットを挿入することによって作製することができる。
（トランスジェニックカイコの作製）
一態様において，本発明は，前記プラスミドベクターを絹糸虫の卵に挿入することを含む，前記抗体を絹糸（繭）（好ましくは，セリシン層）中に産生（分泌）するトランスジェニックカイコの製造方法に関する。具体的には，本発明のトランスジェニックカイコの製造方法は，前記プラスミドベクターを産卵後２〜８時間のカイコ卵（カイコ胚）に注入し，孵化したカイコの成虫を交配してＧ１卵塊を得，標識遺伝子の発現等を指標に本発明の発現カセットが組み込まれたトランスジェニックカイコをスクリーニングすることを含む。
【００３４】
一例として，得られたプラスミドベクターを精製した後，ヘルパープラスミドであるｐＨＡ３ＰＩＧ（Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１８，８１−８４（２０００））とプラスミド量が１：１になるように混合し，さらにエタノール沈殿を行った後，ＤＮＡ濃度が１０〜１０００μｇ／ｍｌなるようにインジェクションバッファー（０．５ｍＭリン酸バッファーｐＨ７．０，５ｍＭ  ＫＣｌ）に溶解する。このベクター混合液を，産卵後２〜８時間の前胚盤葉期のカイコ卵（カイコ胚）に，一つの卵あたり約１〜２００ｎｌの液量で微量注入する。ベクターＤＮＡを微量注入した卵を約２５℃でインキュベートし，孵化したカイコを飼育し，得られた生殖可能な成虫を交配し，Ｇ１世代の卵塊を得る。産卵日から３〜１０日目のＧ１卵塊のうち，眼や神経系から緑色蛍光を発するトランスジェニックカイコの卵を選択して孵化させ，抗体ｃＤＮＡが組み込まれたトランスジェニックカイコを樹立することができる。
【００３５】
また，本発明のトランスジェニックカイコは，本発明の発現カセットとは別に，前記遺伝子発現を増強させるためのポリヌクレオチドを導入してもよい。例えば，本発明のプラスミドベクターとは異なるプラスミドベクターに遺伝子発現を増強させるためのポリヌクレオチドを組み込み，これを本発明のプラスミドベクターと同時にまたは別々にカイコ卵に注入してもよい。あるいは，上述の方法により得られた本発明の発現カセットが組み込まれたトランスジェニックカイコを，遺伝子発現を増強させるためのポリヌクレオチドが組み込まれたトランスジェニックカイコと交配させることにより，本発明の発現カセットと，前記遺伝子発現を増強させるためのポリヌクレオチドが導入されたトランスジェニックカイコを得ることもできる。例えば，得られたトランスジェニックカイコを，ＢｍＮＰＶ由来のトランスアクチベーターであるｉｅ１遺伝子を発現するカイコ（特開２０１２−１８２９９５）と交配し，得られたＧ２世代のカイコから，抗体ｃＤＮＡとｉｅ１遺伝子の両方を有するカイコを選別することもできる。
（抗体の製造方法）
別の態様において，本発明は，配列番号７に記載のアミノ酸配列を有する重鎖及び配列番号９に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖を含む抗体，あるいは，配列番号１１に記載のアミノ酸配列を有する重鎖及び配列番号１３に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖を含む抗体の製造方法であって，前記トランスジェニック絹糸虫が産生した絹糸から当該抗体を抽出することを含む方法に関する。
【００３６】
例えば，抗体の製造は，前記カイコを飼育して繭を作らせる。カイコの繭を，抽出バッファー（ＰＢＳ（終濃度０．５Ｍ  ＮａＣｌ），０．１％  ＴｒｉｔｏｎＸ−１００）に浸漬し，１時間室温で撹拌して繭抽出液を調製する。抽出液を０．４５μｍのフィルターで濾過し，プロテインＧカラム（ＰｒｏｔｅｉｎＧ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ４  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ，ＧＥヘルスケア）に供する。０．１Ｍグリシン（ｐＨ２．７）で溶出させ，溶液に１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ９．０）を加えて中和し，最後にＰＢＳに対して透析することにより得ることができる。
【００３７】
また，抗体の断片は，当業者周知の様々な方法で調製することができ，例えば，上述の方法により得られた抗体をパパイン処理することにより，得ることができる。
【００３８】
また，フコースが結合していない抗体は，上述のカイコの繭中に産生させる方法による他，薬剤で処理したＣＨＯ細胞から高いフコースを有する細胞を殺傷して選択されたフコシル化の減少を示す細胞を用いて生産する方法（米国特許公開２０１０／００８１１５０号），Ｆｘタンパク質の突然変異によるおよびフコースの外部源の供給力を制御することによるフコシル化の減少したＣＨＯ細胞株を用いて生産する方法（米国特許公開２０１０／０３０４４３６号），ＧＭＤエクソン５，６および７領域に相当するゲノム欠失を有するＧＭＤノックアウト細胞およびＦＵＴ８ノックアウト宿主細胞株を用いて生産する方法（ＫＡＮＤＡ，Ｙ．ら（２００７）Ｊ．ＢＩＯＴＥＣＨＮＯＬ；１３０（３）：３００−１０），Ｎ−メチル−Ｎ−ニトロソグアニジンとインキュベートすることによりもたらされた４種のレクチン耐性ＣＨＯ変異細胞により製造する方法（ＲＩＰＫＡ，Ｊ．ら（１９８６）ＳＯＭＡＴ  ＣＥＬＬ  ＭＯＬ  ＧＥＮＥＴ；１２（１）：５１−６２），Ｌｅｃ１３（フコース欠損ＣＨＯ）細胞株により産生させる方法（ＳＨＩＥＬＤＳ，Ｒ．Ｌ．ら（２００２）Ｊ  ＢＩＯＬ  ＣＨＥＭ；２７７（３０）：２６７３３−４０），メトトレキサート（ＭＴＸ）処理後ＣＨＯ細胞の集団をヒイロチャワンダケ（ａｌｅｕｒｉａ  ａｕｒａｎｔｉａ）レクチン（ＡＡＬ）またはアスペルギルス・オリゼー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）１−フコース特異的レクチン（ＡＯＬ）の非毒性フコース結合剤と接触させて，フコース結合剤に結合した細胞を除去して得られた細胞を用いて製造する方法（ＷＯ２０１２／１２０５００），抗体から糖鎖を一度切断した後，フコース非結合糖鎖を抗体に再結合させる方法（特開２０１６−０８２９６２），並びに，アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩＩを発現する細胞を用いて製造する方法（米国特許６，６０２，６８４）が知られている。本発明の抗体は，これらのいずれの方法又はここに記載されていない他のフコース結合量が減少する公知の抗体産生方法により製造されてもよい。
２．医薬組成物
本発明の抗体は，経口投与形態，又は注射剤，点滴剤等の非経口投与形態の医薬組成物として用いることができる。哺乳動物等に投与する場合，医薬組成物は，錠剤，散剤，顆粒剤，シロップ剤等などの経口投与形態であってもよいし，又は，注射剤，点滴剤などの非経口的投与形態であってもよい。
【００３９】
本発明の医薬組成物は，通常の薬学的に許容される担体を用いて，常法により製剤化することができる。経口用固形製剤を調製する場合は，主薬に賦形剤，更に必要に応じて，結合剤，崩壊剤，滑沢剤等を加えた後，常法により溶剤，顆粒剤，散剤，カプセル剤等とする。注射剤を調製する場合には，主薬に必要によりｐＨ調整剤，緩衝剤，安定化剤，可溶化剤等を添加し，常法により皮下又は静脈内用注射剤とすることができる。
【００４０】
別の態様において，本発明は，それを必要とする患者に有効量の本発明の抗体を投与することを備える，ＨＩＶ感染症の治療方法又は予防方法に関する。あるいは，本発明は，ＨＩＶ感染症の治療薬又は予防薬を製造するための，本発明の抗体の使用に関する。本発明の抗体を哺乳動物等に投与する場合の投与量は，症状，年齢，性別，体重，投与形態等により異なるが，例えば成人に静脈内投与する場合には，通常１回量は０．１〜１００００ｍｇとすることができる。好ましくは，投与後も長期間にわたって（例えば，１２週以上，１６週以上，２０週以上，２４週以上，２８週以上，３２週以上，３６週以上，４０週以上，１年以上，２年以上，３年以上，４年以上，又は５年以上）血中ＨＩＶを検出限界以下に維持できる投与方法である。投与後に血中ＨＩＶを検出限界以下に維持できているかを確認するため，必要に応じて，投与期間中及び投与期間後に血中ＨＩＶ量（例えば，ＨＩＶ  ＲＮＡ量）をモニタリングしてもよい。本発明の抗体は，例えば，ＨＩＶに感染した患者に対して，全部で１〜１０回，１〜８回，１〜５回，１〜４回，１〜３回，１〜２回，１回，２回，又は３回投与することができる。投与間隔は，３〜３０日，３〜１５日，４〜１０日，５〜９日，６〜８日，又は７日とすることができる。
【００４１】
以下，本発明をより詳細に説明するため実施例を示すが，本発明はこれに限定されるものではない。なお，本願明細書全体を通じて引用する文献は，参照によりその全体が本願明細書に組み込まれる。また，本願は平成３０年１０月２９日に出願された日本国特許出願第２０１８−２０３１１４号からの優先権を主張する。本願が優先権を主張する日本国特許出願第２０１８−２０３１１４号記載の内容は全て参照によりそのまま本願に組み込まれる。
【実施例】
【００４２】
（１）ベクターの作製
１Ｃ１０抗体の重鎖（配列番号６）および軽鎖（配列番号８）のｃＤＮＡが組み込まれたプラスミド（ｐＭＰＥ−１Ｃ１０）を鋳型とし，制限酵素ＮｒｕＩ認識配列およびＢｍＮＰＶポリヘドリンの５’非翻訳領域配列（特開２００８−１２５３６６）を含むプライマー（ＮｒｕＩ−ＢｍＮＰＶ−ＡＴＧ），および１Ｃ１０重鎖５’末端側配列よりなるプライマー（Ｈｃ−Ｆ）の混合液をフォワードプライマーとして，また，制限酵素ＮｒｕＩおよびＸｈｏＩ認識配列を付加した重鎖３’末端側配列よりなるプライマー（Ｃ−ｈＩｇＧ１−ＮｒｕＩ−ＸｈｏＩ）をリバースプライマーとして用いてＰＣＲを行うことにより，１Ｃ１０重鎖のｃＤＮＡを増幅した。【００４３】
増幅されたフラグメントをＸｈｏＩで処理し，ＥｃｏＲＶおよびＸｈｏＩで処理したクローニングベクター（ｐＣＲ−ＭＣＳ）に組み込んだ。同様にして，１Ｃ１０軽鎖のｃＤＮＡが組み込まれたプラスミド（ｐＫＶＡ２−１Ｃ１０）を鋳型とし，ＮｒｕＩ−ＢｍＮＰＶ−ＡＴＧ，および軽鎖５’末端側配列よりなるプライマー（ＬｃＫ−Ｆ）の混合液をフォワードプライマーとして，また，制限酵素ＮｒｕＩおよびＸｈｏＩ認識配列を付加した軽鎖３’末端側配列よりなるプライマー（ＬｃＫ−Ｒ）をリバースプライマーとして用いてＰＣＲを行うことにより，１Ｃ１０軽鎖のｃＤＮＡを増幅し，得られたフラグメントをｐＣＲ−ＭＣＳに挿入した。
（フォワードプライマー）
ＮｒｕＩ−ＢｍＮＰＶ−ＡＴＧ
５’−ＡＴＣＧＣＧＡＡＡＧＴＡＴＴＴＴＡＣＴＧＴＴＴＴＣＧＴＡＡＣＡＧＴＴＴＴＧＴＡＡＴＡＡＡＡＡＡＡＣＣＴＡＴＡＡＡＴＡＴＧ−３’（配列番号１）
Ｈｃ−Ｆ
５’−ＧＴＡＡＴＡＡＡＡＡＡＡＣＣＴＡＴＡＡＡＴＡＴＧＧＡＣＴＧＧＡＣＣＴＧＧＡＧＧＡＴＣ−３’（配列番号２）
ＬｃＫ−Ｆ
５’−ＧＴＡＡＴＡＡＡＡＡＡＡＣＣＴＡＴＡＡＡＴＡＴＧＧＴＧＴＴＧＣＡＧＡＣＣＣＡＧＧＴＣ−３（配列番号４）
（リバースプライマー）
Ｃ−ｈＩｇＧ１−ＮｒｕＩ−ＸｈｏＩ
５’−ＣＧＣＴＣＧＡＧＴＣＧＣＧＡＴＴＡＴＴＴＡＣＣＣＧＧＡＧＡＣＡＧＧＧＡＧＡＧ−３’（配列番号３）
ＬｃＫ−Ｒ
５’−ＣＧＣＴＣＧＡＧＴＣＧＣＧＡＴＴＡＡＣＡＣＴＣＴＣＣＣＣＴＧＴＴＧＡＡＧＣＴＣ−３’（配列番号５）
１Ｃ１０軽鎖のｃＤＮＡが組み込まれたｐＣＲ−ＭＣＳをＮｒｕＩにて切断して軽鎖のｃＤＮＡを切り出し，Ａｏｒ５１ＨＩで処理したトランスジェニックカイコ作製用ベクター（ｐＭＳＧ３．１ＭＧ，特開２０１２−１８２９９５）に組み込んだ。次に，このベクターをＮｒｕＩで消化し，１Ｃ１０重鎖のｃＤＮＡが組み込まれたｐＣＲ−ＭＣＳからＮｒｕＩにて切り出した重鎖ｃＤＮＡとライゲーションした。得られたベクター（１Ｃ１０／ｐＭＳＧ３．１ＭＧ）は，１Ｃ１０重鎖および軽鎖のｃＤＮＡが，それぞれセリシン１プロモーターの下流に組み込まれている。【００４４】
同様な方法により，１Ｃ１０が単離された同じ患者由来の抗ＨＩＶヒト抗体である１Ｄ９（重鎖のｃＤＮＡ配列：配列番号１０；軽鎖のｃＤＮＡ配列：配列番号１２）および４９Ｇ２，また，他のＨＩＶ患者由来のヒト抗体であるＶＲＣ０１（Ｓｃｉｅｎｃｅ．  ３２９，  ８５６−６１（２０１０））およびＰＧＴ１２１（Ｎａｔｕｒｅ．  ４７７，  ４６６−４７０（２０１１））についても，重鎖と軽鎖をｐＭＳＧ３．１ＭＧに組み込んだトランスジェニックカイコ作製用ベクターを調製した。
（２）トランスジェニックカイコの作製
１Ｃ１０／ｐＭＳＧ３．１ＭＧをＰｌａｓｍｉｄ  Ｍｉｄｉ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）で精製した後，ヘルパープラスミドであるｐＨＡ３ＰＩＧ（Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．；１８：８１−８４（２０００））とプラスミド量が１：１になるように混合し，さらにエタノール沈殿を行った後，ＤＮＡ濃度が２００μｇ／ｍＬなるようにインジェクションバッファー（０．５ｍＭリン酸緩衝液  ｐＨ７．０，５ｍＭ  ＫＣｌ）に溶解した。このベクター混合液を，産卵後２〜８時間の前胚盤葉期のカイコ卵（カイコ胚）３８３個に，一つの卵あたり約１５〜２０ｎＬの液量で微量注入した。【００４５】
ベクターＤＮＡを微量注入した卵を２５℃でインキュベートしたところ，８５％の卵が孵化した。これらのカイコ幼虫を飼育し，成長した成虫を交配して，７２区（雌成虫が産んだ卵塊）のＧ１世代の卵を得た。産卵日から５〜６日目のＧ１卵塊を蛍光実体顕微鏡で観察し，眼や神経系から緑色蛍光を発するトランスジェニックカイコの卵を含む３１区の卵塊を取得した。得られた卵を孵化させ飼育した結果，４８頭のトランスジェニックカイコを樹立できたため，これらの繭タンパク質を抽出してＳＤＳ−ＰＡＧＥにより解析した。また，成虫からゲノムＤＮＡを抽出してサザンブロットを行った。これらの解析により，繭に１Ｃ１０抗体が発現しており，かつゲノム中に１コピーの組換え遺伝子を有する６系統のトランスジェニックカイコを選抜した。【００４６】
上記のトランスジェニックカイコを，ＢｍＮＰＶ由来のトランスアクチベーターであるｉｅ１遺伝子を発現するカイコ（特開２０１２−１８２９９５）と交配した。ｉｅ１遺伝子から合成されるＩＥ１タンパク質は，ｐＭＳＧ３．１ＭＧに含まれるＢｍＮＰＶ由来のｈｒ３エンハンサーや，セリシン１プロモーターに作用し，中部絹糸腺における組換えタンパク質の発現量を増加させることが知られている（Ｂｉｏｔｅｃｈｏｌ．  Ｂｉｏｅｎｇ．；１０６：８６０−８７０（２０１０））。交配して得られたＧ２世代のカイコから，１Ｃ１０  ｃＤＮＡとｉｅ１遺伝子の両方を有するカイコ（以下「１Ｃ１０生産用系統」と記す）を選別し，これらのカイコを飼育して繭を作らせた。【００４７】
同様にして，１Ｃ１０と同じ患者に由来する１Ｄ９および４９Ｇ２，また，他の患者由来のＶＲＣ０１およびＰＧＴ１２１のｃＤＮＡを組み込んだベクターについてもカイコ卵に微量注入してトランスジェニックカイコを作製した。ｉｅ１遺伝子を発現するカイコと交配して，それぞれの抗体が含まれた繭を作らせた。【００４８】
それぞれの遺伝子を組み込んだカイコ各１系統について，得られた繭の繭層重量を記載した（表１）。１Ｃ１０，１Ｄ９，ＶＲＣ０１，およびＰＧＴ１２１については，平均的な重量の繭を作ったが，４９Ｇ２は全く繭を作らなかった。【００４９】
【表１】
2020090747.tif 000004
（３）発現量の解析
繭が得られた１Ｃ１０，１Ｄ９，ＶＲＣ０１，およびＰＧＴ１２１について，抗体の発現量を調べた。それぞれのカイコの繭１０ｍｇを，１ｍＬの８Ｍ尿素，５０ｍＭトリス塩緩衝液ｐＨ８．０，０．１Ｍ  ＤＴＴに浸漬し，８０℃にて５分間加温することにより絹糸のセリシン層に含まれるタンパク質を全て可溶化し（全抽出），還元条件でＳＤＳ−ＰＡＧＥをおこなった後ＣＢＢ染色をおこない，抗体の発現量を比較した。【００５０】
結果を図１Ａに示した。４種類の遺伝子組換えカイコの繭から抗体の重鎖（Ｈ鎖）および軽鎖（Ｌ鎖）が検出された。発現量は，１Ｃ１０が最も高く，１Ｄ９およびＰＧＴ１２１も比較的高発現であったが，これらに比べＶＲＣ０１の発現量は低かった。【００５１】
次に，中性の緩衝液に対する抗体の抽出量について解析した。１０ｍｇの繭を１ｍＬのＰＢＳ（終濃度０．５Ｍ  ＮａＣｌ），０．１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００に浸漬し，１時間室温で撹拌した後，遠心分離して上清を回収した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより抽出液中のタンパク質を解析したところ，抗体の抽出量は１Ｃ１０が最も多く，比較的発現量が高かった１Ｄ９およびＰＧＴ１２１の抽出率は，１Ｃ１０に比べてかなり低かった。抽出液中に含まれる抗体量を，プロテインＡカラム（ＨｉＴｒａｐ  ＭａｂＳｅｌｅｃｔ  ＳｕＲｅ  ｃｏｌｕｍｎ（０．７×２．５ｃｍ；１ｍＬ），ＧＥヘルスケア）を取り付けたＨＰＬＣシステム（Ａｌｌｉａｎｃｅ  ＨＰＬＣ  Ｓｙｓｔｅｍ，Ｗａｔｅｒｓ）を用いて定量した。各カイコの繭から調製した抽出液３００μＬを，プロテインＡカラムに供し，ＰＢＳで洗浄した後，１００ｍＭ  クエン酸  ｐＨ３．０にて結合した抗体を溶出して，溶出ピークの面積から抗体濃度を定量した。また，この結果から，繭１個あたりから抽出される抗体量を算出した。表１に示すとおり，１Ｃ１０の繭１個あたりから抽出できる抗体量は１．４８ｍｇであり，同じＨＩＶ感染患者由来の１Ｄ９の約３．２倍の抗体量を抽出できることが判った。
（４）１Ｃ１０抗体の精製
１Ｃ１０生産用系統の繭を，ＰＢＳ（終濃度０．５Ｍ  ＮａＣｌ），０．１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００に浸漬し，１時間室温で撹拌して繭抽出液を調製した。抽出液を０．４５μｍのフィルターで濾過し，プロテインＧカラム（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｇ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ４  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ，ＧＥヘルスケア）に供した。カラムからの抗体の溶出には，０．１Ｍグリシン塩酸緩衝液（ｐＨ２．７）を使用した。溶出した抗体溶液に１Ｍ
Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ９．０）を加えて中和し，最後にＰＢＳに対して透析した。精製した抗体を，ＳＷ−１Ｃ１０として，以下の実験に使用した。
（５）由来の異なる１Ｃ１０抗体の準備
抗体の由来による結合活性および中和活性の違いを調べるため，Ｂｃｅｌｌ−１Ｃ１０（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ．；４７５：１８７−２０３（２０１５）），２９３Ａ−１Ｃ１０（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ．；４７５：１８７−２０３（２０１５）），及びＣＨＯ−１Ｃ１０の異なる由来の１Ｃ１０抗体を作製した。【００５２】
ＣＨＯ−１Ｃ１０は以下のように作製した。ＥｘｐｉＣＨＯ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ  Ｋｉｔ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて，ＥｘｐｉＣＨＯ−Ｓ細胞（キットに付属）に１Ｃ１０のｃＤＮＡが組み込まれたプラスミド（ｐＭＰＥ−１Ｃ１０）のトランスフェクションを行った。トランスフェクションから１２−１４日後に培養上清を回収し，０．２μｍのフィルターで濾過したあと，プロテインＡカラム（ＨｉＴｒａｐ  ｒＰｒｏｔｅｉｎ  Ａ  ＦＦ，ＧＥヘルスケア）に結合させた。カラムからの抗体の溶出には，５０ｍＭグリシン塩酸緩衝液（ｐＨ２．３９）を使用した。１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ９．０）を加えて中和し，ＰＢＳに対して透析した。ＰＥＧ６，０００（Ｗａｋｏ）を用いて抗体溶液を濃縮後，再びＰＢＳに対して２回透析を行った。【００５３】
（６）ＨＩＶ−１  ＢａＬ株に対する結合活性測定
ＳＷ−１Ｃ１０と２９３Ａ−１Ｃ１０のＨＩＶ−１  ＢａＬ株（Ｓｃｉｅｎｃｅ．；２５３：７１−４（１９９１））に対する結合活性の比較を行った。まずＢａＬウイルス感染細胞を準備した。ＣＥＭ．ＮＫＲ−ＣＣＲ５（ＮＫＲ２４）細胞（Ｊ  Ｖｉｒｏｌ．；８６：１２０３９−５２（２０１２）懸濁液（１×１０６ｃｅｌｌｓ／５０μＬ）とＢａＬウイルス懸濁液５０μＬを１．５ｍＬチューブ内で混合し，１，２００×ｇで２時間，室温で遠心した。Ｒ１０  ｍｅｄｉｕｍ（Ｊ  Ｖｉｒｏｌ．；８６：１２０３９−５２（２０１２））を添加し，２４−ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅ上で３７℃，５％ＣＯ２にて培養を開始した。ＮＫＲ２４細胞には，ＨＩＶ−１のＬＴＲプロモーターに制御されたＬｕｃｉｆｅｒａｓｅ遺伝子が導入されている（Ｊ  Ｖｉｒｏｌ．；８６：１２０３９−５２（２０１２））。このＮＫＲ２４細胞で産生されるＬｕｃｉｆｅｒａｓｅ活性をｎｅｏｌｉｔｅ  Ｒｅｐｏｒｔｅｒ  Ｇｅｎｅ  Ａｓｓａｙ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）で測定し，適宜ウイルスの感染状況を確認した。【００５４】
ＢａＬ感染ＮＫＲ２４細胞および非感染（Ｎｏｒｍａｌ）ＮＫＲ２４細胞が準備できた段階で，ＦＡＣＳ解析用サンプルを調製した（反応液として０．２％  ＢＳＡ／ＰＢＳを使用）。反応液に懸濁し，２．５×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬに調整した細胞を９６−ｗｅｌｌプレートに５０μＬ添加した（２５×１０４ｃｅｌｌｓ／ｔｕｂｅ）。そこへ終濃度０．０３２／０．１６／０．８／４／２０／１００μｇ／ｍＬとなるように等量の抗体溶液（Ｄ−ＰＢＳ（−）で濃度調整）を添加した。３０〜４０分間室温でインキュベート後，反応液で２回洗浄し，反応液で２００倍希釈したＡＰＣ標識ａｎｔｉ−ｈｕｍａｎ  ＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）を５０μＬ添加した（以降は遮光しながら操作）。１５分間室温でインキュベート後，反応液で２回洗浄し，１０％  Ｆｏｒｍａｌｉｎ／ＰＢＳを１００μＬ添加した。１５分間氷上でインキュベート後，ＢＤ  ＦＡＣＳ  Ｃａｎｔｏ  ＩＩ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）にて解析を行い，ＡＰＣの平均蛍光強度（ＭＦＩ）から結合活性を調べた。【００５５】
その結果，ＳＷ−１Ｃ１０，  ２９３Ａ−１Ｃ１０共にＢａＬ感染ＮＫＲ２４細胞に対して特異的に結合し，さらに抗体濃度依存的な結合活性を示すことが確かめられた（表２及び図２）。【００５６】
【表２】
2020090747.tif 000005
（７）ＨＩＶ−１  ＢａＬ株に対する中和活性測定
ＳＷ−１Ｃ１０，Ｂｃｅｌｌ−１Ｃ１０，２９３Ａ−１Ｃ１０，ＣＨＯ−１Ｃ１０について，ＨＩＶ−１  ＢａＬ株に対する中和活性の比較を行った。４μｇ／ｍＬを最大濃度として５倍ずつ８段階の抗体希釈系列を９６−ｗｅｌｌプレート上に作製（１００μＬ／ｗｅｌｌ）後，４，０００  ＴＣＩＤ５０／ｍＬに調整したＢａＬウイルスを５０μＬ添加（ｆｉｎａｌ  ２００  ＴＣＩＤ５０）した。３７℃，５％ＣＯ２にて１時間インキュベート後，ＴＺＭ−ｂｌ細胞（ＡＩＤＳ；２３：８９７−９０６（２００９））を１×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬ（＋３７．５μｇ／ｍＬ  ＤＥＡＥ  ｄｅｘｔｒａｎ）に調整し，１００μＬ添加した。ポジティブコントロールとしてＶＣ（ｖｉｒｕｓ  ｃｏｎｔｒｏｌ；ウイルスと細胞のみ），ネガティブコントロールとしてＣＣ（ｃｅｌｌ  ｃｏｎｔｒｏｌ；細胞のみ）のウェルも同時に準備した。３７℃，５％ＣＯ２にて２日間培養後，細胞をＰＢＳで洗浄して各ウェルにＬｕｃｉｆｅｒａｓｅ  Ｃｅｌｌ  Ｌｙｓｉｓ  Ｂｕｆｆｅｒ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を３０μＬ添加後，１５分撹拌した。Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  Ａｓｓａｙ  Ｒｅａｇｅｎｔを検出用ｗｈｉｔｅ  ｐｌａｔｅ（Ｃｏｓｔｅｒ）に５０μＬ添加後，撹拌終了後のｃｅｌｌ  ｌｙｓａｔｅを１０μＬ添加し，ＬｕｍｉｎｏｍｅｔｅｒによりＲＬＵ（相対発光強度）を測定した。ＣＣにおけるＲＬＵをバックグラウンドとして感染抑制率（％ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ）＝｛（ＶＣにおけるＲＬＵ）−（各抗体濃度におけるＲＬＵ）｝／（ＶＣにおけるＲＬＵ）を算出し，ＩＣ５０（５０％  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ  ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ）を求めた。【００５７】
表３にＩＣ５０，図３に各抗体濃度における感染抑制率を示す。その結果，ＳＷ−１Ｃ１０を含む各種抗体がほぼ同等の中和活性を示すことが確かめられた。【００５８】
【表３】
2020090747.tif 000006
（８）糖鎖構造解析
文献（Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｐｒｏｔｅｏｍ．；６：１４３７−１４４５（２００７））に従い，以下の操作により，ＳＷ−１Ｃ１０とＣＨＯ−１Ｃ１０の糖鎖構造を解析した。５０μｇの精製１Ｃ１０を，界面活性剤存在下で還元アルキル化，トリプシン消化の後に，ＰＮＧａｓｅＡによる酵素消化を行うことで，Ｎ−ｇｌｙｃａｎを遊離した。続いて，５０ｐｍｏｌの内部標準物質を加えて，グライコブロッティング法を行った（この工程で，Ｎ−ｇｌｙｃａｎの捕捉，カルボキシル基のメチル化およびＢＯＡラベル化がおこなわれる）。これを質量分析（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ；Ｕｌｔｒａｆｌｅｘ  ＩＩＩ，ポジティブモード）に供し，得られたスペクトルを，ＧｌｙｃｏＭｏｄ  Ｔｏｏｌ（ｈｔｔｐ：／／ｗｅｂ．ｅｘｐａｓｙ．ｏｒｇ／ｇｌｙｃｏｍｏｄ／）に照合して，Ｎ−ｇｌｙｃａｎの構造を推定した。また，予め添加した内部標準物質とのピーク面積を用いて，それぞれのピーク面積を規格化した。【００５９】
得られたマススペクトルより推定される主要な糖鎖構造と，その存在比率を図４に示した。ＣＨＯ−１Ｃ１０には，約７０．３％のコアフコース付加糖鎖が認められたのに対し，ＳＷ−１Ｃ１０からは，コアフコース付加糖鎖が全く検出されなかった。また，ＳＷ−１Ｃ１０の糖鎖は，シアル酸付加やバイセクティングＧｌｃＮＡｃを含む糖鎖が存在しない点では，ＣＨＯ−１Ｃ１０の糖鎖構造と類似していた。
（９）ＡＤＣＣ活性の測定
ＳＷ−１Ｃ１０，２９３Ａ−１Ｃ１０，およびＣＨＯ−１Ｃ１０に加え，ｇｐ１２０のＶ３ループを認識するヒト化抗体であるＫＤ−２４７を用意し，ＨＩＶ−１  ＢａＬ株に対するＡＤＣＣ活性の比較を行った。【００６０】
結合活性測定の場合と同様の方法により，ＢａＬ感染ＮＫＲ２４細胞を調製した。ＢａＬ感染ＮＫＲ２４細胞および非感染（Ｎｏｒｍａｌ）ＮＫＲ２４細胞が準備できた段階で，ＡＤＣＣ活性測定用サンプルを調製した（反応液および抗体希釈液としてＲ１０  ｍｅｄｉｕｍ  １０Ｕ／ｍｌ  ＩＬ−２を使用）。反応液で３回洗浄後，２．５×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬに調整したＮＫＲ２４細胞を９６−ｗｅｌｌプレートに４０μＬ添加した（１×１０４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ）。反応液で１回洗浄後，エフェクター細胞として２．５×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬに調整したナチュラルキラー細胞株であるｈｕｍａｎ  ＣＤ１６＋  ＫＨＹＧ−１細胞（（Ｎ６細胞；Ｊ  Ｖｉｒｏｌ．；８６：１２０３９−５２（２０１２））を４０μＬ添加した（１０×１０４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ）。その後，準備した各抗体を終濃度０．２，２，又は２０μｇ／ｍＬとなるように２０μＬ添加した。ポジティブコントロールとしてＶＣ（ｖｉｒｕｓ  ｃｏｎｔｒｏｌ；ＢａＬ感染ＮＫＲ２４細胞とＮ６細胞のみ），ネガティブコントロールとしてＣＣ（ｃｅｌｌ  ｃｏｎｔｒｏｌ；非感染ＮＫＲ２４細胞とＮ６細胞のみ）のウェルも同時に準備し，３７℃，５％ＣＯ２にて６時間インキュベートを行った。【００６１】
ＡＤＣＣ活性測定にはｎｅｏｌｉｔｅ  Ｒｅｐｏｒｔｅｒ  Ｇｅｎｅ  Ａｓｓａｙ  Ｓｙｓｔｅｍを使用した。ｎｅｏｌｉｔｅ  ｒｅａｇｅｎｔを検出用ｗｈｉｔｅ  ｐｌａｔｅ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）に４０μＬ添加後，インキュベート後の反応液を懸濁して４０μｌ添加し，ＬｕｍｉｎｏｍｅｔｅｒによりＲＬＵ（相対発光強度）を測定した。ＣＣにおけるＲＬＵをバックグラウンドとしてウイルス殺傷率（％ｋｉｌｌｉｎｇ；（ＶＣにおけるＲＬＵ−各抗体濃度におけるＲＬＵ）／ＶＣにおけるＲＬＵ）を算出し，ＡＤＣＣ活性とした（図５ＡおよびＢ）。その結果，ＳＷ−１Ｃ１０が比較した抗体の中で最も高いＡＤＣＣ活性を示すことが確かめられた。
（１０）動物実験用１Ｃ１０の大量生産
約３万頭の１Ｃ１０生産用系統を全齢にて人工飼料（日本農産工業株式会社  シルクメイト原種用１−３齢用Ｓ）を与えて飼育し，繭を生産した。繭をハサミで切開して蛹を取り出し，約１．１ｋｇの繭層を得た。このうち１．０ｋｇを使用して，ＳＷ−１Ｃ１０の抽出および精製を行った。【００６２】
繭１ｋｇを１００Ｌの抽出バッファー（５０ｍＭ酢酸緩衝液ｐＨ５．３，３０ｍＭ  ＮａＣｌ，０．２％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００，０．０１％ポリジメチルシロキサン）に浸漬し，２５℃で２時間圧搾することでタンパク質を抽出した。１０μｍ工業用フィルター（ＳＭＣ）でろ過後，５Ｌの陽イオン交換担体（ＳＴＲＥＡＭＬＩＮＥ  ＳＰ（ＧＥヘルスケア））が充填されたＳＴＲＥＡＭＬＩＮＥ  ２００  Ｃｏｌｕｍｎ（ＧＥヘルスケア）に供し，ＳＰ洗浄バッファー（５０ｍＭ  酢酸緩衝液ｐＨ５．３，３０ｍＭ  ＮａＣｌ，０．２％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００）で洗浄した後，ＳＰ溶出バッファー（５０ｍＭ酢酸緩衝液ｐＨ５．３，３００ｍＭ  ＮａＣｌ）にて溶出して１Ｃ１０抗体を回収した。さらに，限外ろ過膜（Ｂｉｏｍａｘ−１００  ＴＦ（ミリポア））を用いて濃縮し，次いでＰＢＳに溶媒交換した。これを，プロテインＡ担体（ＭａｂＳｅｌｅｃｔ  ＳｕＲｅ（ＧＥヘルスケア））を充填したカラムに供し，ＰＢＳで洗浄した後，１００ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ３．０）にて１Ｃ１０抗体を溶出した。最後に，限外ろ過膜にて濃縮し，保存溶液（１０ｍＭ酢酸緩衝液ｐＨ５．５，５０ｍＭ  ＮａＣｌ，１００ｍＭ  アルギニン塩酸塩）に溶媒置換した。以上の操作により，純度９９．０％以上の精製ＳＷ−１Ｃ１０を約７．９ｇ調製した。
（１１）ＨＩＶ感染カニクイザルへの１Ｃ１０の投与
急性感染期におけるＳＷ−１Ｃ１０の効力について評価するため，７匹のカニクイザルの直腸に，５０，０００  ＴＣＩＤ５０の，ＨＩＶ８９．６株に由来するＥｎｖをＳＩＶに組み込んだキメラウイルスである強毒性ＳＨＩＶ８９．６Ｐ（Ｒｅｉｍａｎｎ  Ｋ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７０，６９２２−６９２８．）を接種し，全身感染を成立させた。カニクイザルの群構成は対照となる無処置群を４匹，ＳＷ−１Ｃ１０投与群を３匹とした。ＳＷ−１Ｃ１０の投与は，ウイルス接種後３日目，１０日目，１７日目に静脈経由で実施し，血中ウイルス抑制効果を観察した。【００６３】
ウイルス接種時より８週目までは通常７日おきに，それ以降は４週に１回の頻度で，麻酔したサルから経時的に抹消血（ＥＤＴＡを添加）を採取した。採取した血液は遠心分離により血漿を回収し，次に血球をＰＢＳに希釈後，比重１．０７０のＰｅｒｃｏｌｌに重層後，遠心分離してＰＢＭＣｓ（ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ  ｂｌｏｏｄ  ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ  ｃｅｌｌｓ，末梢血単核球）を分離した。血漿よりウイルスＲＮＡを抽出し，定量ＲＴ−ＰＣＲによりＳＩＶｍａｃ２３９のｇａｇ領域を増殖し，その生成物の濃度より血漿中のウイルスＲＮＡコピー数を算出した。血漿中のウイルスＲＮＡはＭａｇＮＡ  ＰｕｒｅＣｏｍｐａｃｔ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ｋｉｔ（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｋｓ）を利用して抽出・精製した。【００６４】
ＲＮＡ量の算出は，ＳＩＶｍａｃ２３９のｇａｇ領域を標的としたプライマーとプローブを設計し，ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ  ４８０  ｔｈｅｒｍｏｃｙｃｌｅｒ（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）を用いて行った。ウイルスＲＮＡは，ＱｕａｎｔｉＴｅｃ  Ｐｒｏｂｅ  ＲＴ−ＰＣＲ  ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて，増幅及び検出を行った。プライマー及び鋳型は以下のものを設計した。即ち，フォワードプライマーとして，「５’−ＧＣＡＧＡＧＧＡＧＧＡＡＡＴＴＡＣＣＣＡＧＴＡＣ−３’／配列番号１４」を，リバースプライマーとして「５’−ＣＡＡＴＴＴＴＡＣＣＣＡＧＧＣＡＴＴＴＡＡＴＧＴＴ−３’／配列番号１５」を，プローブとして「５’−ＦＡＭ−ＴＧＴＣＣＡＣＣＴＧＣＣＡＴＴＡＡＧＴＣＣＣＧＡ−ＴＡＭＲＡ−３’／配列番号１６」を用いた。【００６５】
ＲＴ−ＰＣＲ産物はＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ  ４８０  ｔｈｅｒｍｏｃｙｃｌｅｒによって蛍光の検出を行い，その量を決定した。血漿中のウイルス量は，Ｄｕｐｌｉｃａｔｅで２回の測定を行い，ウイルス量は既知の濃度のＳＩＶ  ＲＮＡを段階希釈にて作成した検量線を用いて換算して求めた。また，鋳型ＤＮＡやその他の混入ＤＮＡはＤＮＡａｓｅＩにて処理した。この測定系の感度は，１００コピー／ｍｌであった。【００６６】
対照となる無処置のサルでは，ウイルス接種２週目で血漿１ｍｌ中のウイルスＲＮＡコピー数が数千万〜数億コピーまで上昇したのち，８週目以降にウイルス学的セットポイントと呼ばれる定常状態に入り，数万〜数十万コピー／ｍｌで推移した。ＨＩＶの感染対象であるＣＤ４＋Ｔ細胞数は，２〜４週間で急速に低下し，その後細胞数は低いレベルで推移した。一方，ＳＷ−１Ｃ１０投与群では，ウイルス接種４週目の１０万〜１００万コピー／ｍｌをピークにウイルス量は低減，１２週目以降は３匹すべてでウイルスが検出されなかった。また，ＣＤ４＋Ｔ細胞数は大きく低下することなく，ウイルス投与前のレベルを維持した。（図６）。【００６７】
本結果から，驚くべきことに，ＳＷ−１Ｃ１０を投与した全ての個体において，早期からウイルスが検出限界以下となり，１２週という長期に渡ってウイルスＲＮＡを検出限界以下に制御した。このような，投与全例における長期間のウイルス増殖制御が可能であることは過去に報告が無く，本発明者らは初めて投与対象に対して広く安定的にウイルス制御をもたらす抗体を見出すことに成功した。
【図１】
2020090747.tif 000008
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】令和2年8月19日(2020.8.19)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＩｇＧ抗体であって，
配列番号７に記載のアミノ酸配列，それと８５％以上の同一性を有するアミノ酸配列，あるいは，そのアミノ酸配列のうち数個のアミノ酸が置換，欠失，付加，及び／又は挿入されたアミノ酸配列を含む重鎖，並びに，配列番号９に記載のアミノ酸配列，それと８５％以上の同一性を有するアミノ酸配列，又は，そのアミノ酸配列のうち数個のアミノ酸が置換，欠失，付加，及び／又は挿入されたアミノ酸配列を含む軽鎖を有し；
ＨＩＶへの結合能を有し；かつ，
当該抗体に結合する糖鎖がフコースを含まない抗体。
【請求項２】
配列番号７に記載のアミノ酸配列，それと９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列，あるいは，そのアミノ酸配列のうち数個のアミノ酸が置換，欠失，付加，及び／又は挿入されたアミノ酸配列を含む重鎖，並びに，配列番号９に記載のアミノ酸配列，それと９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列，又は，そのアミノ酸配列のうち数個のアミノ酸が置換，欠失，付加，及び／又は挿入されたアミノ酸配列を含む軽鎖を有する、請求項１に記載の抗体。
【請求項３】
重鎖が配列番号７に記載の重鎖アミノ酸配列における３つのＣＤＲ配列を有し，かつ，軽鎖が配列番号９に記載のアミノ酸配列における３つのＣＤＲ配列を有する，請求項１又は請求項２に記載の抗体。
【請求項４】
ＨＩＶ感染者への単回投与または数回投与により，９０％以上の確率で当該ＨＩＶ感染者の血中のＨＩＶを検出限界以下に抑制する作用を有する，請求項１〜請求項３のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項５】
配列番号７に記載のアミノ酸配列からなる重鎖，並びに，配列番号９に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖を有する，請求項１に記載の抗体。
【請求項６】
以下から選択される糖鎖構造を有する，請求項１〜請求項５のいずれか１項に記載の抗体。
【化１】
2020090747.tif 000014
【請求項７】
トランスジェニック絹糸虫によって産生されたことを特徴とする，請求項１〜請求項６のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項８】
ＨＩＶへの結合能を有するＩｇＧ抗体を含む組成物であって，
該ＩｇＧ抗体の８０％以上が請求項１〜請求項７又は請求項１５に記載の抗体である，組成物。
【請求項９】
絹糸腺特異的遺伝子プロモーターの下流に機能的に結合した，以下の（ｉ）〜（ｘ）から選択されるいずれか１つのポリヌクレオチドを含有する発現カセット：
（ｉ）配列番号６に記載の塩基配列及び／又は配列番号８に記載の塩基配列を有するポリヌクレオチド；
（ｉｉ）配列番号６に記載の塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列，及び／又は，配列番号８に記載の塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を有するポリヌクレオチド；
（ｉｉｉ）配列番号７に記載のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド，及び／又は，配列番号９に記載のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド；
（ｉｖ）配列番号７に記載のアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド，及び／又は，配列番号９に記載のアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド；
（ｖ）配列番号７に記載のアミノ酸配列において，数個のアミノ酸が置換，欠失，付加，挿入されたアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド，及び／又は，配列番号９に記載のアミノ酸配列において，数個のアミノ酸が置換，欠失，付加，挿入されたアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド；
（ｖｉ）配列番号１０に記載の塩基配列及び／又は配列番号１２に記載の塩基配列を有するポリヌクレオチド；
（ｖｉｉ）配列番号１０に記載の塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列，及び／又は，配列番号１２に記載の塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を有するポリヌクレオチド；
（ｖｉｉｉ）配列番号１１に記載のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド，及び／又は，配列番号１３に記載のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド；
（ｉｘ）配列番号１１に記載のアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド，及び／又は，配列番号１３に記載のアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド；並びに，
（ｘ）配列番号１１に記載のアミノ酸配列において，数個のアミノ酸が置換，欠失，付加，挿入されたアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド，及び又は，配列番号１３に記載のアミノ酸配列において，数個のアミノ酸が置換，欠失，付加，挿入されたアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド。
【請求項１０】
前記プロモーター領域が，セリシン１プロモーター，セリシン２プロモーター，又はセリシン３プロモーターである，請求項９に記載の発現カセット。
【請求項１１】
請求項９又は請求項１０に記載の発現カセットを含有する，プラスミドベクター。
【請求項１２】
請求項１１に記載のプラスミドベクターを絹糸虫の卵に挿入することを含む，トランスジェニック絹糸虫の製造方法。
【請求項１３】
請求項１０に記載の発現カセットが染色体に組み込まれた，トランスジェニック絹糸虫。
【請求項１４】
抗体の製造方法であって，請求項１３に記載のトランスジェニック絹糸虫が産生した絹糸から当該抗体を抽出することを含む方法。
【請求項１５】
トランスジェニック絹糸虫によって産生された，配列番号１１に記載のアミノ酸配列を有する重鎖及び配列番号１３に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖を含む抗体。
【請求項１６】
請求項１〜請求項７又は請求項１５に記載の抗体，あるいは請求項８に記載の組成物を有効成分として含有する，ＨＩＶ治療用薬又は予防用の医薬組成物。
【請求項１７】
ＨＩＶ感染後，１〜５回投与されるための，請求項１６に記載の医薬組成物。
【請求項１８】
２回以上投与され，かつ，２回目以降の投与が前回の投与の３〜３０日後に行われるための，請求項１６に記載の医薬組成物。
【手続補正書】
【提出日】令和2年12月21日(2020.12.21)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（削除）
【請求項２】
（削除）
【請求項３】
ＩｇＧ抗体であって，
重鎖が配列番号７に記載の重鎖アミノ酸配列における３つのＣＤＲ配列を有し，かつ，軽鎖が配列番号９に記載のアミノ酸配列における３つのＣＤＲ配列を有し；
ＨＩＶへの結合能を有し；かつ，
当該抗体に結合する糖鎖がフコースを含まない抗体。
【請求項４】
ＨＩＶ感染者への単回投与または数回投与により，９０％以上の確率で当該ＨＩＶ感染者の血中のＨＩＶを検出限界以下に抑制する作用を有する，請求項３に記載の抗体。
【請求項５】
ＩｇＧ抗体であって，
配列番号７に記載のアミノ酸配列からなる重鎖，並びに，配列番号９に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖を有し；
ＨＩＶへの結合能を有し；かつ，
当該抗体に結合する糖鎖がフコースを含まない抗体。
【請求項６】
以下から選択される糖鎖構造を有する，請求項３〜請求項５のいずれか１項に記載の抗体。
【化１】
2020090747.tif 000015
【請求項７】
トランスジェニック絹糸虫によって産生されたことを特徴とする，請求項３〜請求項６のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項８】
ＨＩＶへの結合能を有するＩｇＧ抗体を含む組成物であって，
該ＩｇＧ抗体の８０％以上が請求項３〜請求項７又は請求項１５に記載の抗体である，組成物。
【請求項９】
絹糸腺特異的遺伝子プロモーターの下流に機能的に結合した，以下の（ｉ）、（ｉｉｉ）及び（ｖ）から選択されるいずれか１つのポリヌクレオチドを含有する発現カセット：
（ｉ）配列番号６に記載の塩基配列及び／又は配列番号８に記載の塩基配列を有するポリヌクレオチド；
（ｉｉｉ）配列番号７に記載のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド，及び／又は，配列番号９に記載のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド；
（ｖ）配列番号７に記載のアミノ酸配列において，数個のアミノ酸が置換，欠失，付加，挿入されたアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド，及び／又は，配列番号９に記載のアミノ酸配列において，数個のアミノ酸が置換，欠失，付加，挿入されたアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド。
【請求項１０】
前記プロモーター領域が，セリシン１プロモーター，セリシン２プロモーター，又はセリシン３プロモーターである，請求項９に記載の発現カセット。
【請求項１１】
請求項９又は請求項１０に記載の発現カセットを含有する，プラスミドベクター。
【請求項１２】
請求項１１に記載のプラスミドベクターを絹糸虫の卵に挿入することを含む，トランスジェニック絹糸虫の製造方法。
【請求項１３】
請求項１０に記載の発現カセットが染色体に組み込まれた，トランスジェニック絹糸虫。
【請求項１４】
抗体の製造方法であって，請求項１３に記載のトランスジェニック絹糸虫が産生した絹糸から当該抗体を抽出することを含む方法。
【請求項１５】
トランスジェニック絹糸虫によって産生された，配列番号１１に記載のアミノ酸配列を有する重鎖及び配列番号１３に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖を含む抗体。
【請求項１６】
請求項３〜請求項７又は請求項１５に記載の抗体，あるいは請求項８に記載の組成物を有効成分として含有する，ＨＩＶ治療用薬又は予防用の医薬組成物。
【請求項１７】
ＨＩＶ感染後，１〜５回投与されるための，請求項１６に記載の医薬組成物。
【請求項１８】
２回以上投与され，かつ，２回目以降の投与が前回の投与の３〜３０日後に行われるための，請求項１６に記載の医薬組成物。
【国際調査報告】
2020090747.tif 000016
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2020090747.tif 000018
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