(57)【要約】  本発明は、免疫細胞を含む全血と免疫刺激因子とをインビトロで混合し、免疫細胞の標的分子を標識する工程と、標識を検出することにより、免疫細胞における標的分子の局在に関する情報を取得する工程とを含む、免疫細胞の分析方法に関する。また、本発明は、免疫細胞を含む全血と免疫刺激因子とをインビトロで混合し、免疫細胞において標的分子の局在を生成することにより得られた細胞を分析する装置に関する。
2020111135.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
免疫細胞を含む全血と免疫刺激因子とをインビトロで混合し、前記免疫細胞の標的分子を標識する工程と、
前記標識を検出することにより、前記免疫細胞における前記標的分子の局在に関する情報を取得する工程と
を含む、免疫細胞の分析方法。
【請求項２】
前記標的分子を標識する工程が、前記免疫細胞と、前記免疫細胞とは異なる物質とを接触する工程を含む請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記接触工程が、前記免疫細胞を含む全血及び前記免疫刺激因子の混合物を、遠心分離、撹拌、又は静置することにより行われる請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記免疫細胞とは異なる物質が、前記標的分子を標識される免疫細胞以外の血球、又は前記全血を収容する容器の内表面である請求項２又は３に記載の方法。
【請求項５】
前記接触工程が、前記免疫細胞を含む全血及び前記免疫刺激因子の混合物を遠心分離して、前記免疫細胞を含む層と、赤血球を含む層とを形成することにより行われる請求項２〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記標的分子を標識する工程と、前記標的分子の局在に関する情報を取得する工程との間に、前記免疫細胞を固定する工程を含む請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記標的分子を標識する工程と、前記標的分子の局在に関する情報を取得する工程との間に、前記全血に含まれる赤血球を溶解する工程を含む請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記赤血球を溶解する工程が、前記免疫細胞を固定する工程と、前記標的分子の局在に関する情報を取得する工程との間に行われる請求項６を引用する請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記標的分子の局在に関する情報を取得する工程において、前記免疫細胞の前記標的分子と、前記標的分子に結合する捕捉体と、検出可能な光学シグナルを生じうる標識物質とを結合することにより、前記標的分子を標識する請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
前記免疫刺激因子が、前記標的分子に結合する捕捉体として共用される請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記標識物質が、前記捕捉体に直接的又は間接的に結合することにより、前記標的分子を標識する請求項９又は１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記標識物質から生じた光学シグナルを検出し、検出した光学シグナルに基づいて、前記免疫細胞における前記標的分子の局在に関する情報を取得する請求項９〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
前記光学シグナルに基づいて、前記免疫細胞における標識された標的分子の分布を反映する値を取得し、取得した値に基づいて、前記標的分子の局在が生成している免疫細胞を計数する請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記全血に含まれる免疫細胞が、Ｔ細胞サブセット又はNK細胞サブセットである請求項１〜１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
前記標的分子の局在が生成している免疫細胞の数に基づいて、前記Ｔ細胞サブセット又は前記NK細胞サブセットの免疫刺激応答性の指標を取得する請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記全血に含まれる免疫細胞の総数を計数し、前記標的分子の局在が生成している免疫細胞の数と、前記総数に基づいて、前記Ｔ細胞サブセット又は前記NK細胞サブセットの免疫刺激応答性の指標を取得する請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記標的分子が、表面抗原、及び構造タンパク質の重合体から選択される少なくとも１つである請求項１〜１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
前記表面抗原が、免疫シナプスを構成する分子である請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記表面抗原が、CD28、CD3、TCRα/β、CD40L、OX40、CTLA4、PD-1及びICOSから選択される少なくとも１つであり、前記構造タンパク質の重合体がＦアクチンである請求項１７又は１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記免疫刺激因子が、免疫刺激抗体、免疫刺激ペプチド、主要組織適合性分子(MHC分子)、及びMHC分子と抗原ペプチドとの複合体からなる群より選択される少なくとも１つを含む請求項１〜１９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２１】
前記免疫刺激因子が、他家細胞、抗原提示細胞、及び腫瘍細胞からなる群より選択される少なくとも１つの細胞上に存在する免疫刺激因子を含む請求項１〜１９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２２】
前記免疫刺激因子による前記免疫細胞の刺激時間が、６時間未満である請求項１〜２１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２３】
免疫細胞の分析方法であって、
標識された標的分子を有する免疫細胞の前記標識を検出することにより、前記免疫細胞における前記標的分子の局在に関する情報を取得する工程を含み、
前記標識された標的分子を含む免疫細胞が、免疫細胞を含む全血と免疫刺激因子とをインビトロで混合し、前記全血に含まれる免疫細胞の標的分子を標識することにより調製された細胞である、
前記方法。
【請求項２４】
免疫細胞と、前記免疫細胞の標的分子に結合する捕捉体と、検出可能な光学シグナルを生じうる標識物質との複合体を導入する導入部と、
前記導入部から供給された前記複合体を撮像する撮像部と、
前記撮像部により撮像された画像に基づいて、前記免疫細胞における前記標的分子の局在に関する情報を取得する解析部と
を備える細胞分析装置であって、
前記免疫細胞が、前記免疫細胞を含む全血と免疫刺激因子とをインビトロで混合し、前記免疫細胞において前記標的分子の局在を生成することにより得られた細胞である、
前記細胞分析装置。
【請求項２５】
免疫細胞と、前記免疫細胞の標的分子に結合する捕捉体と、検出可能な光学シグナルを生じうる標識物質との複合体を導入する導入部と、
前記導入部から供給された前記複合体に光を照射し、前記複合体から生じた光学シグナルを検出する検出部と、
検出した光学シグナルに基づいて、前記免疫細胞における前記標的分子の局在に関する情報を取得する解析部と
を備える細胞分析装置であって、
前記免疫細胞が、前記免疫細胞を含む全血と免疫刺激因子とをインビトロで混合し、前記免疫細胞において前記標的分子の局在を生成することにより得られた細胞である、
前記細胞分析装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、免疫細胞の分析方法及び細胞分析装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
免疫細胞は、生体の免疫系で中心的役割を果たす細胞である。免疫細胞は、がん、自己免疫疾患などの種々の疾患にも関連しており、これらの疾患では、免疫細胞の活性や機能を調節する治療法が知られている。例えば、がんの分野では、免疫チェックポイント阻害剤を投与して、がん細胞によって抑制されているＴ細胞を活性化する治療法が注目されている。自己免疫疾患の分野では、免疫抑制剤の投与により、疾患の原因となる免疫細胞の機能を抑制する治療法が行われている。これらの疾患においては、治療方針の決定及び治療効果のモニタリングを行うために、患者の免疫細胞の活性、特に免疫細胞の刺激応答性を正確に把握することの重要性が高まっている。【０００３】
近年、免疫細胞の刺激応答性の指標の一つとして、免疫シナプス(immunological synapse：IS)を測定することが注目されている。ISは、免疫細胞が標的細胞と接触したときに、その接触面で免疫細胞に形成される構造体である。IS形成能は、免疫細胞のサイトカイン分泌能と相関することが知られている。ISの形成は、免疫細胞と標的細胞との接触後、数分から数十分で生じることから、免疫細胞の活性化初期の重要なプロセスであるとされている。【０００４】
ISと同様の構造体は、免疫細胞と免疫刺激因子及び異物との接触により、免疫細胞に形成されることが知られている。特許文献１には、末梢血単核細胞(PBMC)から調製したＴ細胞クローンを、抗CD3抗体を固定化したプレートに播種し、抗CD28抗体を添加することにより、抗体による刺激及びプレート底面との接触を行った結果、Ｔ細胞クローン上にCD3分子及びCD28分子の局在が生じたことが記載されている。特許文献１では、Ｔ細胞クローン上に生じた標的分子(CD3及びCD28)の局在を、ISに相当する構造体として検出している。具体的には、プレートから回収したＴ細胞クローンを、CD3及びCD28に結合する蛍光標識抗体で免疫染色してフローサイトメータで測定することにより、細胞上のCD3分子及びCD28分子の局在を検出し、免疫細胞の免疫刺激応答性を評価している。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】米国特許出願公開第2018/0292385号明細書
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
特許文献１に記載の方法では、PBMCから調製したＴ細胞クローンのような、単離された免疫細胞が測定される。この方法により被検者の免疫細胞の分析を行う場合、例えば、被検者から採取した血液に含まれる免疫細胞を分析対象とする。しかし、血液中の血球成分の内訳は、赤血球が90%以上を占め、白血球などの免疫細胞は数%である。このように、血液中では赤血球が免疫細胞に比べて圧倒的に多いので、免疫細胞以外の血球が、免疫細胞のIS形成に影響するおそれがある。そのような影響を排除するために、免疫細胞を予め血液から分離及び単離する必要がある。【０００７】
しかし、血液などの生体試料から免疫細胞を分離及び単離する作業は、煩雑で時間がかかる。また、作業者によって、免疫細胞の回収率にばらつきが生じる。さらに、免疫細胞の分離及び単離に用いる試薬及び遠心分離などの物理的処理により免疫細胞が損傷して、免疫細胞の質及び機能が低下しうるので、免疫細胞の活性を正確に測定できないおそれがある。そのため、生体試料から免疫細胞を分離及び単離する工程を要しない、免疫細胞の分析方法が求められている。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、被検者から採取した全血に免疫刺激因子を添加することにより、全血中で免疫細胞を刺激して、標的分子の局在が形成されるかを確認した。すると、驚くべきことに、本発明者らは、全血中で免疫細胞を刺激した場合であっても、免疫細胞において標的分子の局在が形成され、これを検出できることを見出した。【０００９】
本発明の一態様は、免疫細胞を含む全血と免疫刺激因子とをインビトロで混合し、免疫細胞の標的分子を標識する工程と、標識を検出することにより、免疫細胞における標的分子の局在に関する情報を取得する工程とを含む、免疫細胞の分析方法を提供する。【００１０】
本発明の一態様は、標識された標的分子を有する免疫細胞の標識を検出することにより、免疫細胞における標的分子の局在に関する情報を取得する工程を含む、免疫細胞の分析方法を提供する。この方法において、標識された標的分子を含む免疫細胞は、免疫細胞を含む全血と免疫刺激因子とをインビトロで混合し、全血に含まれる免疫細胞の標的分子を標識することにより調製された細胞である。【００１１】
本発明の一態様は、免疫細胞と、免疫細胞の標的分子に結合する捕捉体と、検出可能な光学シグナルを生じうる標識物質との複合体を導入する導入部と、導入部から供給された複合体を撮像する撮像部と、撮像部により撮像された画像に基づいて、免疫細胞における標的分子の局在に関する情報を取得する解析部とを備える細胞分析装置を提供する。この装置において、免疫細胞は、免疫細胞を含む全血と免疫刺激因子とをインビトロで混合し、免疫細胞において標的分子の局在を生成することにより得られた細胞である。【００１２】
本発明の一態様は、免疫細胞と、免疫細胞の標的分子に結合する捕捉体と、検出可能な光学シグナルを生じうる標識物質との複合体を導入する導入部と、導入部から供給された複合体に光を照射し、複合体から生じた光学シグナルを検出する検出部と、検出した光学シグナルに基づいて、免疫細胞における標的分子の局在に関する情報を取得する解析部とを備える細胞分析装置を提供する。この装置において、免疫細胞は、免疫細胞を含む全血と免疫刺激因子とをインビトロで混合し、免疫細胞において標的分子の局在を生成することにより得られた細胞である。
【発明の効果】
【００１３】
本発明によれば、生体試料から免疫細胞を分離及び単離する工程が不要となるので、分析にかかる時間が短縮される。また、免疫細胞へのダメージを最小限に抑えられるので、免疫細胞の質及び機能の低下を防ぐことができ、より正確に免疫細胞の状態を分析することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】分析対象の免疫細胞における標的分子の標識の例を説明する模式図である。
【図２】細胞分析装置の構成を示す図である。
【図３】測定装置の構成を示す図である。
【図４】撮像部の構成を示す図である。
【図５】カメラの受光面上の領域を示す模式図である。
【図６】情報処理装置の構成を示す図である。
【図７】検体の測定処理及び解析処理を示すフローチャートである。
【図８】測定データを示す画像の一例である。
【図９】測定データに基づく計測過程を示す模式図である。
【図１０】解析処理を示すフローチャートである。
【図１１】実施形態１(ａ、ｂ及びｃ)及び実施形態２(ｄ)に係る解析処理を示す2Dスキャッタグラムである。
【図１２】撮像部の変形例としての検出部の構成を示す図である。
【図１３】共刺激分子の分布状態が異なる細胞から得られる蛍光シグナルのパルスデータを説明するための模式図である。
【図１４】蛍光シグナルのパルスデータから得られた解析用パラメータの2Dスキャッタグラムを説明するための模式図である。
【図１５Ａ】免疫刺激因子(抗CD28抗体)を添加していない全血中の免疫細胞(Ｔ細胞)の分布を示す2Dスキャッタグラムである。
【図１５Ｂ】抗CD28抗体を添加した全血中のＴ細胞の分布を示す2Dスキャッタグラムである。
【図１６Ａ】抗CD28抗体を添加していない全血中のＴ細胞におけるCD28及びCD3の発現分布を示す画像の一例である。
【図１６Ｂ】抗CD28抗体を添加した全血中のＴ細胞におけるCD28及びCD3の発現分布を示す画像の一例である。
【図１７】全血中のＴ細胞に対する、CD28が局在したＴ細胞の割合(CD28局在陽性率)を示すグラフである。
【図１８】全血又は全血から単離した末梢血単核細胞(PBMC)中のＴ細胞に対する、CD28が局在したＴ細胞の割合(CD28局在陽性率)を示すグラフである。
【図１９】抗CD28抗体を添加していない全血又は全血から単離したPBMC中のＴ細胞に対する、CD28が局在したＴ細胞の割合(CD28局在陽性率)を示すグラフである。
【図２０Ａ】全血又はプレートに添加したＴ細胞クローンに対する、CD28が局在したＴ細胞クローンの割合(CD28局在陽性率)を示すグラフである。
【図２０Ｂ】全血又はプレートに添加したＴ細胞クローンに対する、CD28が局在したＴ細胞クローンの割合(CD28局在陽性率)を示すグラフである。
【図２１】全血又はプレートに添加したＴ細胞クローンに対する、CD28が局在したＴ細胞クローンの割合(CD28局在陽性率)を示すグラフである。
【図２２】全血又はプレートに添加したＴ細胞クローンに対する、CD28が局在したＴ細胞クローンの割合(CD28局在陽性率)を示すグラフである。
【図２３】2Dスキャッタグラムにおいて、CD3陰性且つCD56陽性の免疫細胞及びCD3陽性且つCD56陰性の免疫細胞を表すドットが出現する領域を示す模式図である。
【図２４】ヒトＢ細胞を添加したか又は添加していない全血中のＴ細胞及びNK細胞の分布を示す2Dスキャッタグラムである。
【図２５】全血中のＴ細胞におけるCD3及びＦアクチンの発現分布、及び全血中のNK細胞におけるCD56及びＦアクチンの発現分布を示す画像の一例である。
【図２６Ａ】全血中のＴ細胞に対する、Ｆアクチンが局在したＴ細胞の割合(F-actin局在陽性率)を示すグラフである。
【図２６Ｂ】全血中のNK細胞に対する、Ｆアクチンが局在したNK細胞の割合(F-actin局在陽性率)を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
[１．免疫細胞の分析方法]
(免疫細胞に標的分子の局在を生成する工程)
本実施形態の免疫細胞の分析方法(以下、「方法」という)では、以下の工程を経て得られた免疫細胞を分析する：免疫細胞を含む全血と、免疫刺激因子とをインビトロで混合し、該免疫細胞の標的分子を標識する工程。この標的分子の標識工程について、以下に説明する。
【００１６】
全血は、ヒト又は非ヒト哺乳動物から採取した血液であればよい。全血としては、例えば末梢血、臍帯血などが挙げられるが、好ましくは末梢血である。必要に応じて、全血に抗凝固剤及び／又はキレート剤を添加してもよい。抗凝固剤としては、例えばヘパリン、クエン酸又はクエン酸塩などが挙げられる。キレート剤としては、例えばEDTA(ethylene diamine tetraacetic acid)塩が挙げられる。
【００１７】
免疫細胞は、自己と非自己を識別し非自己を排除する機構である免疫系を担う細胞をいう。本実施形態の方法において分析の対象とする免疫細胞(以下、「分析対象の免疫細胞」ともいう)は、公知の免疫細胞から任意に選択できる。分析対象の免疫細胞は、１個の細胞であってもよいが、複数個の同種の免疫細胞から実質的に構成される亜集団(サブセット)であることが好ましい。当該技術分野では、免疫細胞は、その機能及び／又は形態により各種のサブセットに分類される。免疫細胞のサブセットとしては、例えばリンパ球、顆粒球、単球などのサブセットが挙げられる。リンパ球は、Ｔ細胞、ナチュラルキラー(NK)細胞、及びＢ細胞のサブセットにさらに分類される。顆粒球は、好中球、好酸球、及び好塩基球のサブセットにさらに分類される
【００１８】
分析対象の免疫細胞は、被検者から採取した全血に元から含まれる免疫細胞であってもよいし、外部から全血に添加した免疫細胞であってもよい。分析対象の免疫細胞としては、細胞性免疫に関与する免疫細胞が好ましく、例えばＴ細胞、NK細胞などが挙げられる。それらの中でも、Ｔ細胞が特に好ましい。
【００１９】
Ｔ細胞としては、ヘルパーＴ細胞(CD4+Ｔ細胞とも称される)、制御性Ｔ細胞(Treg細胞とも称される)、細胞傷害性Ｔ細胞(キラーＴ細胞又はCD8+Ｔ細胞とも称される)などのエフェクターＴ細胞、ナイーブＴ細胞、及び遺伝子改変されたＴ細胞などが上げられる。エフェクターＴ細胞は、インビボ及びインビトロのいずれで活性化されたＴ細胞であってもよい。Ｔ細胞は、１種でもよいし、２種以上でもよい。
【００２０】
本明細書において「免疫刺激因子」とは、免疫細胞に作用して該免疫細胞の活性化を誘導し得る物質をいう。免疫細胞の活性化とは、例えば、免疫細胞の増殖、運動性の亢進、サイトカイン分泌などをいう。免疫刺激因子として、例えば、免疫刺激抗体、免疫刺激ペプチド、主要組織適合性分子(Major histocompatibility molecule：以下、「MHC分子」ともいう)などが挙げられる。また、他家細胞、抗原提示細胞及び腫瘍細胞上に存在する免疫刺激因子を用いてもよい。免疫刺激因子は、１種であってもよいし、２種以上を組み合わせてもよい。免疫刺激因子は、免疫細胞とは異なる物質と結合又は複合した形態で用いてもよい。例えば、MHC分子と抗原ペプチドの複合体の形態、ビーズ、容器などの非生物材料上に固定された形態、抗原提示細胞上に提示された形態などが挙げられる。
【００２１】
本明細書において、「免疫刺激抗体」は、免疫細胞を特異的に刺激して、免疫細胞の活性化を誘導し得る抗体をいう。免疫刺激抗体は、例えば抗CD28抗体、抗CD3抗体、抗TCRα/β抗体、抗CD40L(CD40 ligand)抗体、抗OX40抗体、抗CD2抗体、抗CD137抗体、抗CTLA4(cytolytic T lymphocyte associated antigen-4)抗体、抗PD-1(programmed cell death-1)抗体、抗ICOS(inducible co-stimulatory molecule)抗体、抗インテグリン抗体(抗CD2抗体)などが挙げられるが、これらに限定されない。本実施形態では、抗CD28抗体及び抗CD3抗体が好ましい。これらの免疫刺激抗体は、１種単独で又は２種以上を組み合わせて用いてもよい。免疫刺激抗体は、後述の非生物材料の異物上に固定化された状態で用いられてもよい。
【００２２】
本明細書において、抗体は、特に限定しない限り、モノクローナル抗体及びポリクローナル抗体のいずれであってもよい。また、抗体は、Fab、F(ab')2などの抗体フラグメント、一本鎖抗体、及びそれらの誘導体であってもよい。
【００２３】
本明細書において、「免疫刺激ペプチド」は、免疫細胞を刺激して、免疫細胞の活性化を誘導し得るペプチドをいう。ペプチドには、タンパク質も含まれる。免疫刺激ペプチドは、例えば抗原ペプチド(結核菌の抗原ペプチドなど)である。抗原ペプチドは、１種単独で又は２種以上を組み合わせて用いてもよい。抗原ペプチドは、MHC分子上に提示されたMHC分子との複合体の形態で用いられてもよい。
【００２４】
本明細書において、「主要組織適合性分子」(MHC分子)は、臓器、組織及び細胞の同種移植に際し、最も強い拒絶反応をひき起こすアロ抗原性を担う分子をいう。ヒトではHLA分子、マウスではH-2分子がMHC分子に相当する。MHC分子には、クラスＩ分子とクラスII分子がある。MHCクラスＩ分子は、ほとんどすべての有核細胞上に発現し、細胞内で産生されるペプチドと複合体を形成し、これをCTL(CD8+Ｔ細胞)の受容体に提示する。MHCクラスII分子は、マクロファージ、Ｂ細胞などのいわゆる抗原提示細胞上にのみ発現し、外来抗原由来のペプチドをヘルパーＴ細胞(CD4+Ｔ細胞)の受容体に提示する。
【００２５】
本実施形態において、免疫刺激因子が、MHC分子又はMHC分子と抗原ペプチドの複合体である場合、該MHC分子は、MHCクラスＩ分子及びMHCクラスII分子のいずれであってもよい。MHC分子又はMHC分子と抗原ペプチドの複合体は、例えば、抗原提示細胞、腫瘍細胞などの細胞膜に存在する形態で用いられてよい。
【００２６】
本明細書において「免疫刺激」とは、免疫細胞と免疫刺激因子とを接触することを含む。免疫細胞と免疫刺激因子との接触の形態は特に限定されず、例えば、免疫細胞上の分子と免疫刺激因子との結合、会合又は複合体形成、免疫細胞による免疫刺激因子の取り込みなどが挙げられる。免疫刺激因子と接触する免疫細胞上の分子は、後述の標的分子であってもよいし、標的分子とは別の分子であってもよい。
【００２７】
好ましい実施形態では、免疫刺激は、免疫刺激因子と接触している免疫細胞と、異物とを接触することを含む。ここで「異物」とは、分析対象の免疫細胞とは異なる物質をいう。通常、全血は容器に収容されて用いられるので、全血と免疫刺激因子とをインビトロで混合することにより、免疫細胞と免疫刺激因子との接触、及び、該免疫刺激因子と接触している免疫細胞と、異物としての容器の内表面との接触の両方が行われる。
【００２８】
分析対象の免疫細胞とは異なる物質は、非生物材料であってもよいし、生物材料であってもよい。非生物材料の異物は、特に限定されないが、例えばチューブ、マルチウェルプレート、ディッシュなどの容器、スライドグラス、ビーズなどであってもよい。好ましくは、採取した全血を収容する容器である。生物材料の異物は、特に限定されないが、例えば、標的分子を標識される免疫細胞以外の血球、他家細胞、抗原提示細胞、腫瘍細胞などであってもよい。標的分子を標識される免疫細胞以外の血球とは、例えば赤血球、分析対象ではない免疫細胞などが挙げられる。例えば、標的分子を標識される免疫細胞、すなわち分析対象の免疫細胞がＴ細胞であるとき、NK細胞、顆粒球、単球、Ｂ細胞などが、分析対象ではない免疫細胞に該当する。他家細胞とは、非自己の細胞であり、本実施形態の方法に用いる全血が採取された個体とは別の個体に由来する細胞であればよい。分析対象の免疫細胞以外の血球、他家細胞、抗原提示細胞及び腫瘍細胞は、株化細胞であってもよい。他家細胞及び腫瘍細胞は、それらを含む組織の形態にあってもよい。
【００２９】
本実施形態では、免疫細胞を含む全血と、免疫刺激因子とをインビトロで混合することにより、該免疫細胞が免疫刺激されて、免疫細胞において標的分子の局在が生成する。すなわち、標的分子の標識工程は、免疫細胞を含む全血と、免疫刺激因子とをインビトロで混合して、免疫細胞において標的分子の局在を生成する工程を含む。全血と免疫刺激因子とをインビトロで混合する方法は、全血中の免疫細胞と免疫刺激因子とが接触可能になる限り、特に限定されない。例えば、採取した全血に免疫刺激因子を添加してもよい。免疫刺激因子が、免疫細胞とは異なる物質上に存在する場合、免疫細胞を含む全血と、該物質とをインビトロで接触させてもよい。この場合、全血中の免疫細胞は、免疫刺激因子と接触すると同時に、免疫細胞とは異なる物質とも接触する。
【００３０】
免疫刺激因子の量は、免疫刺激因子の種類に応じて適宜決定できる。本実施形態では、免疫細胞を十分に活性化できる量であれば、特に限定されない。
【００３１】
本実施形態では、免疫刺激因子による刺激時間は、特に限定されないが、上限としては、例えば６時間未満、好ましくは３時間以下、より好ましくは２時間以下である。刺激時間の下限としては、例えば２分以上、好ましくは５分以上、より好ましくは10分以上である。ここで、刺激時間とは、例えば、免疫細胞を含む全血と、免疫刺激因子とをインビトロで混合してから、該免疫細胞の標的分子を標識するまでの時間である。好ましい実施形態では、刺激時間は、免疫細胞を含む全血と、免疫刺激因子とをインビトロで混合してから、該免疫細胞を固定するまでの時間である。
【００３２】
全血に含まれる免疫細胞を免疫刺激することにより、該免疫細胞において標的分子の局在の生成が促される。本明細書において「標的分子」とは、免疫細胞に発現している分子であって、免疫刺激により免疫細胞における分布が変化し得る分子をいう。「標的分子の局在」とは、免疫刺激された免疫細胞の一部分に標的分子が集まることで形成される、標的分子の集団をいう。免疫細胞における標的分子の局在が生成する部位としては、免疫細胞の細胞膜の一部分が好ましい。標的分子としては、例えば免疫シナプスを構成する分子などが挙げられる。免疫シナプスを構成する分子としては、例えば表面抗原、構造タンパク質の重合体などが挙げられる。本実施形態の方法は、免疫刺激による標的分子の局在を指標として、免疫細胞の免疫刺激応答性を評価できる。
【００３３】
免疫シナプスは、免疫細胞の表面に形成され、活性化に役割を果たす分子複合体をいう。免疫シナプスは、受容体(例えば、Ｔ細胞受容体(TCR)又はNK細胞受容体)、該受容体の補助因子(例えばCD3)、種々の共刺激分子(例えばCD28)、構造タンパク質(例えばアクチン)、接着分子(例えばインテグリン)及びシグナル分子が細胞表面の一部分に集まって形成されることが知られている。ISは、免疫細胞が標的とする細胞と、免疫細胞とが接触することによって、免疫細胞に形成され得る。また、これに限らず、IS形成を誘導する分子(例えば、免疫刺激因子)、非生物材料等との接触によっても形成され得る。本明細書では、「標的分子の局在」と「免疫シナプス」は同義である。ISは、他の細胞や非生物材料などとの接触が解消され、免疫細胞単独の状態になった後も細胞上にしばらくの間(30分程度)は存続する。
【００３４】
表面抗原は、細胞外ドメインを有するタンパク質である。表面抗原は、細胞内ドメイン、膜貫通ドメイン(trans-membrane domain)などを有していてもよい。表面抗原は、細胞膜上に存在するタンパク質、糖鎖、脂質及びそれらの組み合わせであり得る。表面抗原の種類は、表面抗原に結合可能な捕捉物質が存在するか、又はそのような捕捉物質を製造できるかぎり、特に限定されない。好ましい表面抗原は、免疫細胞における免疫シナプスを構成する分子である。表面抗原としては、例えばCD3、CD28、TCRα/β、CD40L、OX40、CTLA4、PD-1及びICOSなどが挙げられる。表面抗原は、共刺激分子であってもよい。共刺激分子は、免疫細胞の表面抗原の一種である。例えば、Ｔ細胞の共刺激分子は、TCRを介した抗原特異的なシグナルに加えて、Ｔ細胞を活性化するための補助シグナルをＴ細胞に与え得る分子である。NK細胞の共刺激分子は、NK細胞の活性化受容体を介した標的細胞のリガンド特異的なシグナルに加えて、NK細胞を活性化するための補助シグナルをNK細胞に与え得る分子である。共刺激分子としては、例えばCD28、OX40、CD40L、CTLA4、PD-1、ICOSなどが挙げられる。
【００３５】
構造タンパク質とは、生体内で細胞、器官などの構造又は形態の維持及び調節に関わるタンパク質をいう。構造タンパク質としては、例えばアクチン、チューブリンなどが挙げられる。本実施形態では、構造タンパク質の重合体としては、細胞骨格を構成するタンパク質の重合体が好ましく、Ｆアクチンが特に好ましい。Ｆアクチンは、免疫刺激された免疫細胞において、細胞質側の細胞膜の一部分に局在する。
【００３６】
免疫細胞における標的分子の局在の生成は、免疫刺激因子と接触している免疫細胞と、異物との接触により促進される。本実施形態では、全血と免疫刺激因子とのインビトロでの混合後、免疫細胞と、該免疫細胞とは異なる物質とを接触する工程を行うことが好ましい。この工程は、例えば、免疫細胞を含む全血及び免疫刺激因子の混合物を、遠心分離、撹拌、又は静置することにより行うことができる。これにより、分析対象の免疫細胞は、該分析対象の免疫細胞以外の血球、及び全血を収容する容器の内表面と接触できる。接触は、例えば２分以上120分以下の範囲で行えばよい。
【００３７】
全血の撹拌は、転倒混和、ピペッティング、スターラーによる撹拌などのいずれであってもよい。好ましくは転倒混和である。転倒混和は、用手法で行ってもよいし、ローテーターを用いて行ってもよい。
【００３８】
遠心分離の回転速度又は遠心加速度は、特に限定されないが、免疫細胞を損傷しない程度の穏やかな条件が好ましい。例えば、遠心分離は、全血を血漿成分及び細胞成分に分離する条件で行うことが挙げられる。この場合、細胞成分は、白血球などの免疫細胞を含む層(バフィーコート)と、赤血球を含む層とに分離している。これにより、バフィーコートにおいて分析対象の免疫細胞は、他の白血球と効率よくと接触できる。他の白血球とは、バフィーコートに含まれる、分析対象ではない免疫細胞である。接触後、分離した全血を撹拌してもよい。
【００３９】
本実施形態では、免疫細胞を含む全血と免疫刺激因子とをインビトロで混合することにより、該免疫細胞のうち、免疫刺激に応答性を示す細胞において、標的分子の局在が生成する。例えばCD28分子は、免疫刺激されていないＴ細胞においては、通常、細胞膜上に一様に分布している。一方、Ｔ細胞が、免疫刺激因子としての抗CD28抗体及び異物と接触により免疫刺激されると、CD28分子は、細胞膜上の抗CD28抗体と接触している位置に局在する傾向にある。
【００４０】
本実施形態では、免疫細胞の標的分子を標識する工程と、後述の免疫細胞における標的分子の局在に関する情報を取得する工程との間に、全血に含まれる免疫細胞を固定することが好ましい。免疫細胞に生成した標的分子の局在はしばらくの間は存続するが、固定処理を行うことで、生成した標的分子の局在をより確実に保持できる。
【００４１】
免疫細胞の固定は、免疫刺激因子と混合した全血に固定剤を添加することにより行うことができる。固定剤としては、細胞又は組織の免疫染色に通常用いられる試薬であればよく、例えばパラホルムアルデヒド、低級アルコールなどが挙げられる。市販の細胞固定液を用いてもよい。
【００４２】
本実施形態では、免疫細胞の標的分子を標識する工程と、後述の免疫細胞における標的分子の局在に関する情報を取得する工程との間に、全血に含まれる赤血球を溶解することが好ましい。上述のように、全血中では赤血球は、免疫細胞よりも極めて多いので、赤血球を溶解することにより、免疫細胞をより正確に測定できる。免疫細胞に生成した標的分子の局在への影響を低減するため、好ましい実施形態では、全血に含まれる免疫細胞を固定する工程と、後述の免疫細胞における標的分子の局在に関する情報を取得する工程との間に、全血に含まれる赤血球を溶解する。
【００４３】
赤血球の溶解は、免疫刺激因子と混合した全血に溶血剤を添加することにより行うことができる。溶血剤としては、赤血球の細胞膜を破壊して溶血するが、免疫細胞は実質的に損傷しない試薬であればよい。そのような溶血剤としては、例えば塩化アンモニウム、界面活性剤及びそれらの混合物などが挙げられる。界面活性剤としては、カチオン性界面活性剤、ノニオン性界面活性剤又はそれらの組み合わせが好ましい。溶血剤を含む試薬は市販されている。例えば、白血球分類用試薬など、血液検査分野で公知の血球測定用試薬を用いてもよい。
【００４４】
本実施形態では、必要に応じて、免疫細胞の細胞膜の透過処理を行ってもよい。これにより、捕捉体及び標識物質が免疫細胞内に入ることができ、細胞内部にある標的分子を標識できる。また、細胞核の標識も可能となる。細胞膜の透過処理自体は公知であり、例えばサポニン、Triton(商標)X-100、Tween(商標)20などの界面活性剤を用いる方法が挙げられる。界面活性剤を含む溶血剤を用いる場合は、赤血球の溶解と免疫細胞の細胞膜の透過処理を同時に行うことができる。
【００４５】
本実施形態の方法では、免疫細胞を含む全血と免疫刺激因子とをインビトロで混合した後、該免疫細胞の標的分子を標識することが好ましい。
【００４６】
好ましい実施形態では、免疫細胞の標的分子と、該標的分子に結合する捕捉体と、検出可能な光学シグナルを生じうる標識物質とを結合することにより、標的分子を標識する。この場合、標識物質が、捕捉体を介して標的分子と間接的に結合することにより、該標的分子が標識される。
【００４７】
標的分子の標識の具体的操作としては、免疫刺激因子による免疫刺激を受けた免疫細胞を含む全血に、標的分子に結合する捕捉体と、検出可能な光学シグナルを生じうる標識物質とを添加すればよい。すなわち、本実施形態の方法では、標的分子の標識のために、免疫刺激後の全血から免疫細胞を単離する必要がなく、作業に要する工程数及び時間を削減できる点で有利である。
【００４８】
標的分子に結合する捕捉体(以下、単に「捕捉体」ともいう)は、標的分子の種類に応じて適宜決定できる。好ましい捕捉体は、標的分子と特異的に結合可能な物質であり、例えば抗体、アプタマー、レセプター分子、リガンド分子などが挙げられる。標的分子がＦアクチンである場合、その捕捉体としてファロイジンを用いてもよい。ファロイジンは、Ｆアクチンと特異的に結合する７アミノ酸からなるペプチドである。
【００４９】
検出可能な光学シグナルを生じうる標識物質(以下、単に「標識物質」ともいう)としては、蛍光物質が好ましい。蛍光物質は、フィコエリスリン(PE)、アロフィコシアニン(APC)、フルオレセインイソチオシアネート(FITC)、ローダミン、Alexa Fluor(登録商標)、シアニン系色素などの公知の蛍光色素、及び、緑色蛍光タンパク(GFP)などの公知の蛍光タンパク質などから適宜選択できる。
【００５０】
標識物質は、捕捉体に直接的又は間接的に結合することが好ましい。標識物質と捕捉体との直接的な結合としては、例えば、捕捉体を標識物質で標識することが挙げられる。物質の標識方法自体は、当該技術において公知である。例えば、架橋剤などを用いて、捕捉体と標識物質とを共有結合した分子(標識捕捉体)を調製してもよい。捕捉体が抗体などのタンパク質である場合は、市販の蛍光ラベリングキットなどを用いて標識してもよい。あるいは、標的分子に対する標識抗体が市販されている場合は、それを用いてもよい。標識物質が直接的に結合した捕捉体が、標的分子に結合することにより、標的分子が標識される。
【００５１】
標識物質と捕捉体との間接的な結合としては、例えば、標識物質と捕捉体とを、捕捉体に特異的に結合できる物質を介して結合することが挙げられる。この場合、捕捉体に特異的に結合できる物質は、標識物質で標識されていることが好ましい。捕捉体に特異的に結合できる物質としては、例えば抗体、アプタマーなどが挙げられる。捕捉体が抗体である場合、捕捉体と特異的に結合する標識抗体を用いることが好ましい。この場合、捕捉体が一次抗体として標的分子に結合し、捕捉体と特異的に結合する標識抗体が二次抗体として、標的分子に結合している捕捉体に結合する。これにより、標識物質が捕捉体に間接的に結合して、標的分子が標識される。
【００５２】
あるいは、ビオチン修飾した捕捉体と、標識物質を固定したアビジン類とを用いてもよい。この場合、ビオチンとアビジン類との特異的結合を介して、標識物質が、標的分子と結合した捕捉体に間接的に結合できる。なお、アビジン類とは、アビジン、ストレプトアビジン及びそれらの誘導体をいう。
【００５３】
本実施形態では、必要に応じて、免疫細胞の細胞核を標識してもよい。免疫細胞の細胞膜が透過処理されている場合、細胞核は、核酸を染色可能な蛍光色素により染色できる。そのような蛍光色素としては、例えばHoechst33342、Hoechst33258、4'，6-ジアミジノ-2-フェニルインドール・ジヒドロクロリド(DAPI)などが挙げられる。
【００５４】
本実施形態では、上記の免疫刺激因子が、標的分子に結合する捕捉体として共用されてもよい。本明細書において、免疫刺激因子が「捕捉体として共用される」とは、免疫刺激因子が、標的分子に結合する捕捉体としても機能し、免疫細胞の刺激及び標的分子の捕捉の両方に用いられることをいう。そのような免疫刺激因子としては、免疫刺激抗体が好ましい。捕捉体として共用される免疫刺激因子を用いることにより、免疫細胞における標的分子の局在の生成、及び標的分子の捕捉を同時に行うことができる。また、捕捉体として共用される免疫刺激因子が標識物質で標識されている場合、免疫細胞における標的分子の局在の生成、標的分子の捕捉及び標識を同時に行うことができる。
【００５５】
図１を参照して、本実施形態の方法における標的分子の捕捉及び標識の例について説明する。図１では、免疫刺激因子、捕捉体及び該捕捉体に特異的に結合する物質はいずれも抗体として示されるが、本発明はこれに限定されない。図１のパネルＡ及びＢは、免疫刺激因子が捕捉体として共用される場合を示す。パネルＡでは、標識物質は、免疫刺激因子(捕捉体)に直接的に結合している。この場合、免疫刺激因子と免疫細胞との接触により標的分子の局在が生成すると同時に、該免疫刺激因子により標的分子が捕捉される。さらに、標識物質が免疫刺激因子に直接結合しているので、標的分子が標識される。パネルＢでは、標識物質が免疫刺激因子(捕捉体)に間接的に結合する。この場合、免疫刺激因子との接触により標的分子の局在が生成すると同時に、該免疫刺激因子により標的分子が捕捉される。そして、標識物質で標識された、捕捉体に特異的に結合する物質を、二次抗体として捕捉体に結合させることにより、標的分子が標識される。
【００５６】
パネルＣ及びＤは、免疫刺激因子と捕捉体とが別々の分子である場合を示す。なお、パネルＣ及びＤでは、免疫刺激因子と接触する免疫細胞上の分子は、標的分子とは別の分子である場合を例示するが、本発明はこの例に限定されない。パネルＣでは、標識物質は、捕捉体に直接的に結合している。この場合、まず、免疫刺激因子と免疫細胞との接触により、標的分子の局在が生成する。そして、局在している標的分子に捕捉体が結合する。ここで、標識物質は捕捉体に直接結合しているので、標的分子は捕捉されると同時に標識される。パネルＤでは、標識物質は、捕捉体に間接的に結合する。この場合、まず、免疫刺激因子と免疫細胞との接触により、標的分子の局在が生成する。そして、局在している標的分子に捕捉体が結合する。さらに、標識物質で標識された、捕捉体に特異的に結合する物質を二次抗体として、捕捉体に結合させることにより、標的分子が標識される。
【００５７】
(標的分子の局在に関する情報を取得する工程)
本実施形態の分析方法では、上記の標的分子を標識する工程により得られた免疫細胞を分析する。具体的には、標識を検出することにより、免疫細胞における標的分子の局在に関する情報を取得する。
【００５８】
本実施形態では、標識物質から生じた光学シグナルを検出し、検出した光学シグナルに基づいて、免疫細胞における標的分子の局在に関する情報を取得することが好ましい。光学シグナルの検出手段は、特に限定されないが、個々の細胞について分析可能な手段が好ましい。そのような光学シグナルの検出手段としては、例えばフローサイトメータ(FCM)及びイメージングフローサイトメータ(IFC)などが挙げられる。好ましい実施形態では、FCM又はIFCを用いて光学シグナルを検出する。
【００５９】
FCM又はIFCで光学シグナルの検出を行う場合、免疫刺激因子、捕捉体及び標識物質を含む全血を、そのまま測定用試料として用いることができる。すなわち、FCM又はIFCを用いる本実施形態の方法では、標識した免疫細胞の分析のために、免疫刺激及び標識処理後の全血から免疫細胞を単離する必要がなく、作業に要する工程数及び時間を削減できる点で有利である。
【００６０】
FCMは、液中を流れる細胞に光を照射し、個々の細胞から発せられる散乱光シグナル及び／又は蛍光シグナルを検出することで、細胞集団中の個々の細胞の大きさ、タンパク質の発現量の分布などを測定可能な装置である。IFCは、CCDカメラなどの撮像部を備えたフローサイトメータであり、液中を流れる細胞の画像を取得可能な装置である。より具体的には、IFCは、数秒から数分の短時間に、数千個から数百万個の細胞のそれぞれから蛍光シグナル、散乱光シグナル、蛍光画像及び透過光画像を取得し、定量測定できる。画像処理により、１つ１つの細胞の情報を抽出できる。
【００６１】
本実施形態では、FCM及びIFCは特に限定されず、市販のFCM又はIFCを用いてもよい。また、FCM及びIFCの光源は特に限定されず、蛍光物質の励起に好適な波長の光源を適宜選択できる。光源としては、例えば、青色半導体レーザー、赤色半導体レーザー、アルゴンレーザー、He-Neレーザー、水銀アークランプなどが用いられる。
【００６２】
本実施形態では、IFCにより、標識物質から生じた光学シグナルを検出し、検出した光学シグナルに基づいて、免疫細胞における標的分子の局在に関する情報を取得することが好ましい。後述するように、IFCによれば、撮像された細胞の蛍光画像及び透過光画像に基づいて、蛍光シグナル面積値、総蛍光シグナル強度、細胞のサイズ、アスペクト比などを含む多重パラメータを得ることができる。
【００６３】
本実施形態では、免疫細胞における標的分子の局在に関する情報として、例えば、標的分子の局在が生成している免疫細胞の数を取得してもよい。標的分子の局在が生成している免疫細胞の数は、例えば、検出された光学シグナルに基づいて、免疫細胞における標識された標的分子の分布を反映する値を取得し、取得した値に基づいて計数できる。標識された標的分子の分布を反映する値としては、例えば、標識物質が蛍光物質である場合、標的分子に間接的に結合している標識物質からの蛍光シグナルのパルス幅、パルスの高さ及びパルス面積などが挙げられる。
【００６４】
例えば、標的分子がCD28である場合、免疫刺激していない免疫細胞では、CD28は、通常、細胞膜に一様に分布しているので、パルス幅は大きくなり、且つパルスの高さは低くなる。一方、免疫刺激した免疫細胞において、CD28が細胞膜上の所定の位置に局在したとき、免疫刺激していない免疫細胞に比べて、パルス幅は小さくなり、且つパルスの高さは高くなる。
【００６５】
標識物質が蛍光物質であり、IFCを用いて蛍光シグナルを検出する場合、蛍光シグナルに基づいて個々の細胞の蛍光画像を取得し、該蛍光画像に基づいて、標的分子の局在が生成している免疫細胞を計数してもよい。例えば、標識された標的分子の分布を反映する値として、個々の細胞の蛍光画像に基づいて、蛍光シグナル面積値を取得してもよい。ここで、「蛍光シグナル面積値」とは、個々の細胞の蛍光画像において、蛍光シグナルを示すエリアを構成する画素(ピクセル)の数である。蛍光シグナルを示すエリアを構成する各画素は、蛍光シグナルに対応する画素値を有する。細胞の蛍光画像からの蛍光シグナル面積値の取得において、所定の画素値(例えばバックグラウンド)よりも高い画素値を有する画素の数を取得してもよい。
【００６６】
例えば、標的分子がCD28である場合、免疫刺激していない免疫細胞では、CD28は、通常、細胞膜に一様に分布しているので、蛍光シグナル面積値は高くなる。一方、免疫刺激した免疫細胞において、CD28が細胞膜上の所定の位置に局在したとき、免疫刺激していない免疫細胞に比べて、蛍光シグナル面積値は低くなる。
【００６７】
本実施形態では、ある１つの免疫細胞の蛍光シグナル面積値が、所定の閾値より低いとき、その免疫細胞は、標的分子の局在が生成している免疫細胞であると判定できる。また、ある１つの免疫細胞の蛍光シグナル面積値が、所定の閾値より高いとき、その免疫細胞は、標的分子の局在が生成していない免疫細胞であると判定できる。よって、IFCで測定した免疫細胞群のデータから、蛍光シグナル面積値が所定の閾値より低い免疫細胞群のデータを抽出することにより、標的分子の局在が生成している免疫細胞を計数することができる。なお、ある１つの免疫細胞の蛍光シグナル面積値が、所定の閾値と同じであるときは、その免疫細胞は、標的分子の局在が生成している免疫細胞と判定してもよいし、標的分子の局在が生成していない免疫細胞であると判定してもよい。
【００６８】
蛍光シグナル面積値の所定の閾値は、特に限定されず、適宜設定できる。例えば、免疫刺激因子を添加した全血と添加していない全血とから調製した試料をIFCにより測定し、蛍光シグナル面積値のデータを蓄積することにより、所定の閾値を経験的に設定してもよい。
【００６９】
標的分子の局在が生成している免疫細胞の数を、測定した免疫細胞の総数で割ることにより、全血中の免疫細胞に対する、標的分子が局在した免疫細胞の割合(以下、「局在陽性率」ともいう)を算出してもよい。本実施形態では、局在陽性率を、免疫細胞における標的分子の局在に関する情報として取得してもよい。
【００７０】
局在陽性率は、全血に含まれる所定の免疫細胞サブセットの免疫刺激応答性の指標といえる。よって、本実施形態では、局在陽性率に基づいて、全血に含まれる免疫細胞サブセットの免疫刺激応答性を判定してもよい。所定の免疫細胞サブセットとしては、Ｔ細胞サブセット又はNK細胞サブセットが好ましい。例えば、被検者の全血に含まれる所定の免疫細胞サブセットの局在陽性率が、所定の閾値より低いとき、該所定の免疫細胞サブセットの免疫刺激応答性は低いと判定できる。また、被検者の全血に含まれる所定の免疫細胞サブセットの局在陽性率が、所定の閾値より高いとき、該所定の免疫細胞サブセットの免疫刺激応答性は高いと判定できる。なお、被検者の全血に含まれる所定の免疫細胞サブセットの局在陽性率が、所定の閾値と同じであるときは、該所定の免疫細胞サブセットの免疫刺激応答性は、低いと判定してもよいし、高いと判定してもよい。
【００７１】
局在陽性率の所定の閾値は、特に限定されず、適宜設定できる。局在陽性率は、被検者の疾患、健康状態などによっても変化し得る。例えば、健康な被検者から採取した全血と、免疫刺激因子とをインビトロで混合して調製した試料をIFCにより測定し、局在陽性率のデータを蓄積することにより、所定の閾値を経験的に設定してもよい。
【００７２】
IFCにより測定される試料には、免疫細胞以外にも、溶解した赤血球の残骸(赤血球ゴースト)などの分析対象ではない粒子が含まれる。ここで、粒子とは、測定試料中に存在する有形成分であり、例えば、細胞、赤血球ゴースト、血小板凝集などが挙げられる。IFCを用いる本実施形態では、分析対象の免疫細胞と、該免疫細胞以外の粒子とを区別するため、個々の細胞の透過光画像及び蛍光画像を取得し、それらの画像に基づいて、分析対象の免疫細胞を計数してもよい。例えば、個々の細胞の透過光画像から、細胞のサイズ及びアスペクト比を取得してもよい。個々の細胞の蛍光画像から、総蛍光シグナル強度を取得してもよい。
【００７３】
本明細書において「細胞のサイズ」は、個々の細胞の透過光画像において、所定の閾値よりも低い画素値を示す細胞膜の領域が検出され、検出された細胞膜で囲まれた細胞を反映する画像のピクセル数である。細胞の「アスペクト比」は、透過光画像における細胞粒子を反映する画像の縦と横の長さ(ピクセル数)の比である。例えば、細胞のサイズ及び／又はアスペクト比が所定の閾値より小さい粒子は、細胞ではなく、赤血球ゴーストなどのデブリスとみなして除外できる。
【００７４】
本明細書において「総蛍光シグナル強度」は、個々の細胞の蛍光画像において、蛍光シグナルを示すエリアを構成する各画素の画素値の積分値である。例えば、総蛍光シグナル強度が所定の閾値より小さい粒子は、標識されていない細胞、すなわち分析対象の免疫細胞以外の細胞とみなして除外できる。
【００７５】
[２．細胞分析装置]
本発明の範囲には、細胞分析装置も含まれる。本発明のこの態様に係る実施形態について、図面を参照しつつ説明する。なお、以下の説明はすべて例示であって、本発明をこの説明に限定されない。
【００７６】
＜細胞分析装置の実施形態１＞
図２を参照して、細胞分析装置１は、測定装置２と情報処理装置３を備える。測定装置２は、捕捉体及び標識物質が結合している免疫細胞を含む試料をフローサイトメトリ法により光学的に測定する。情報処理装置３は、測定装置２による測定結果を解析し、解析結果を表示部３２０に表示する。本実施形態はこの例のみに限定されず、例えば、測定装置２及び情報処理装置３が一体的に構成された装置であってもよい。
【００７７】
図３を参照して、測定装置２は、導入部２０１と、撮像部２０３と、信号処理部２１０と、ＣＰＵ２０４と、通信インターフェース２０５と、メモリ２０６とを有する。信号処理部２１０は、アナログ信号処理部２１１と、Ａ／Ｄコンバータ２１２と、デジタル信号処理部２１３と、メモリ２１４とを有する。
【００７８】
この実施形態において、導入部２０１は、容器とポンプ(図示せず)を備えている。容器中の試料は、ポンプにより、シース液と共に撮像部２０３のフローセル２０３ｃ(図４参照)に供給される。導入部２０１は、ＣＰＵ２０４の指示に従って、撮像部２０３に試料を供給する。実施形態１において、測定される試料は、次のようにして調製される。容器に収容されたヒト末梢血に抗CD28抗体を添加して遠心分離することにより、末梢血中の免疫細胞に免疫刺激を与える。この例では、標的分子はCD28であり、抗CD28抗体は捕捉体として共用される。末梢血中の細胞を固定し、赤血球を溶血した後、抗CD28抗体に結合するPE標識二次抗体を用いて免疫細胞を標識する。しかし、本発明は、この例に限定されない。
【００７９】
撮像部２０３は、導入部２０１から供給された試料に対してレーザー光を照射し、標識した免疫細胞を含む粒子を撮像し、生成された透過光画像と蛍光画像の画像情報を電気信号としてアナログ信号処理部２１１に出力する。アナログ信号処理部２１１は、ＣＰＵ２０４の指示に従って、撮像部２０３から出力された電気信号を増幅し、Ａ／Ｄコンバータ２１２に出力する。
【００８０】
Ａ／Ｄコンバータ２１２は、アナログ信号処理部２１１によって増幅された電気信号をデジタル信号に変換し、デジタル信号処理部２１３に出力する。デジタル信号処理部２１３は、ＣＰＵ２０４の指示に従って、Ａ／Ｄコンバータ２１２から出力されるデジタル信号に対して所定の信号処理を施し、測定データが生成される。生成された測定データは、メモリ２１４に格納される。
【００８１】
メモリ２１４に格納された測定データは、試料中の個々の粒子がフローセル２０３ｃを通過した際に生じた透過光及び蛍光に基づく透過光画像及び蛍光画像を含む。
【００８２】
ＣＰＵ２０４は、メモリ２１４に格納された測定データを通信インターフェース２０５に出力する。ＣＰＵ２０４は、通信インターフェース２０５を介して情報処理装置３から制御信号を受信し、その制御信号に従って測定装置２の各部を制御する。
【００８３】
通信インターフェース２０５は、ＣＰＵ２０４から出力された測定データを情報処理装置３に送信し、情報処理装置３から出力される制御信号を受信する。メモリ２０６は、ＣＰＵ２０４の作業領域として用いられる。
【００８４】
図４を参照して、撮像部２０３は、光源２０３ａ、２０３ｂと、フローセル２０３ｃと、集光レンズ２０３ｄ、２０３ｅと、対物レンズ２０３ｆと、光学ユニット２０３ｇと、集光レンズ２０３ｈと、カメラ２０３ｉとを備えている。
【００８５】
この実施形態において、光源２０３ａは半導体レーザーである。光源２０３ａから照射される光は、波長λ１のレーザー光である。集光レンズ２０３ｄは、光源２０３ａから照射された光を集光してフローセル２０３ｃ中の試料に導く。光源２０３ａから照射された波長λ１の光は、フローセル２０３ｃの内部を通過する試料中の個々の粒子に照射され、これにより、粒子から波長λ１の透過光が生じる。
【００８６】
光源２０３ｂは、半導体レーザー光源である。光源２０３ｂから照射される光は、波長λ２のレーザー光である。この実施形態において、波長λ２は約488 nmである。集光レンズ２０３ｅは、光源２０３ｂから照射された光を集光して、フローセル２０３ｃ中の試料に導く。光源２０３ｂから照射された波長λ２の光は、フローセル２０３ｃの内部を通過する試料中の個々の粒子に照射される。PEで標識された免疫細胞に光が照射されたとき、PEから波長λ３の蛍光が生じる。
【００８７】
対物レンズ２０３ｆは、波長λ１の透過光及び波長λ３の蛍光を集光する。光学ユニット２０３ｇは、２枚のダイクロイックミラーが組み合わせられた構成を有する。光学ユニット２０３ｇの２枚のダイクロイックミラーは、波長λ１の透過光及び波長λ３の蛍光を、互いに異なる角度で反射し、後述するカメラ２０３ｉの受光面２０３ｉａ(図５参照)上において分離される。集光レンズ２０３ｈは、波長λ１の透過光及び波長λ３の蛍光を集光する。カメラ２０３ｉは、波長λ１の透過光及び波長λ３の蛍光を受光して、フローセル２０３ｃ中の試料の画像情報を電気信号として、アナログ信号処理部２１１に出力する。カメラ２０３ｉは、TDI(Time Delay Integration)カメラであってよい。TDIカメラを用いることで、より精度の高い画像情報を取得できる。
【００８８】
図５に示すように、カメラ２０３ｉは、受光面２０３ｉａ上の受光領域２０３ｉｂ、２０３ｉｃにおいて、それぞれ、波長λ１の透過光及び波長λ３の蛍光を受光する。受光面２０３ｉａは、カメラ２０３ｉに配されたCMOSイメージセンサなどの撮像素子の受光面である。受光面２０３ｉａに照射される光の位置は、試料がフローセル２０３ｃの移動に合わせて、矢印で示すように、それぞれ受光領域２０３ｉｂ、２０３ｉｃ内で移動する。このように、光学ユニット２０３ｇによって、２つの光が受光面２０３ｉａ上において分離されるため、ＣＰＵ２０４は、カメラ２０３ｉが出力する画像信号から各光に対応する信号を抽出できる。
【００８９】
図６を参照して、情報処理装置３は、本体３００と、入力部３１０と、表示部３２０から構成される。本体３００は、ＣＰＵ(Central Processing Unit)３０１と、ＲＯＭ(Read Only Memory)３０２と、ＲＡＭ(Random Access Memory)３０３と、ハードディスク３０４と、読出装置３０５と、入出力インターフェース３０６と、画像出力インターフェース３０７と、通信インターフェース３０８とを備える。
【００９０】
ＣＰＵ３０１は、ＲＯＭ３０２に格納されているコンピュータプログラム及びＲＡＭ３０３にロードされたコンピュータプログラムを実行する。ＲＯＭ３０２に格納されているコンピュータプログラムには、BIOS(Basic Input Output System)が含まれる。ＲＡＭ３０３は、ＲＯＭ３０２及びハードディスク３０４に記録されているコンピュータプログラムの読み出しに用いられる。ＲＡＭ３０３は、これらのコンピュータプログラムを実行するときに、ＣＰＵ３０１の作業領域としても利用される。
【００９１】
ハードディスク３０４には、OS(Operating System)及びアプリケーションプログラムなど、ＣＰＵ３０１に実行させるための種々のコンピュータプログラム及びコンピュータプログラムの実行に用いられるデータが格納されている。また、ハードディスク３０４には、測定装置２から受信した測定データが格納されている。
【００９２】
ハードディスク３０４には、測定データに基づいて試料に含まれる免疫細胞の数、細胞のサイズ、アスペクト比、蛍光シグナル面積値、総蛍光シグナル強度などを含む解析用パラメータを計測し、試料についての解析を行うためのプログラムや、解析結果を表示部３２０に表示させる表示プログラムが格納されている。これらプログラムが格納されることで、後述の解析処理や表示処理が行われる。すなわち、ＣＰＵ３０１には、これらのプログラムにより、後述する図７ｂの処理を実行する機能が付与されている。
【００９３】
読出装置３０５は、CD-ROMドライブ、DVD-ROMドライブ、USBポート、SDカードリーダ、CFカードリーダ、メモリースティックリーダ、ソリッドステートドライブ、フレキシブルディスクドライブなどによって構成される。読出装置３０５は、CD、DVDなどの可搬型記録媒体に記録されたコンピュータプログラム及びデータを読み出すことができる。
【００９４】
入出力インターフェース３０６には、マウス、キーボードなどで構成される入力部３１０が接続されており、ユーザが入力部３１０を使用して、情報処理装置３に対する指示を入力する。画像出力インターフェース３０７は、ディスプレイなどで構成される表示部３２０に接続されており、画像データに応じた映像信号を、表示部３２０に出力する。表示部３２０は、入力された映像信号をもとに、画像を表示する。
【００９５】
情報処理装置３は、通信インターフェース３０８により測定装置２から送信された測定データの受信が可能となる。受信された測定データは、ハードディスク３０４に格納される。
【００９６】
図７は、測定装置２のＣＰＵ２０４と情報処理装置３のＣＰＵ３０１の制御を示すフローチャートである。図７ａは、測定装置２のＣＰＵ２０４による制御処理を示すフローチャートであり、図７ｂは、情報処理装置３のＣＰＵ３０１による制御処理を示すフローチャートである。
【００９７】
情報処理装置３のＣＰＵ３０１の制御処理に関して、図７ｂを参照する。ＣＰＵ３０１は、入力部３１０を介してユーザからの測定開始指示があると(ステップＳ１１：ＹＥＳ)、測定装置２に測定開始信号を送信する(ステップＳ１２)。続いて、ＣＰＵ３０１は、測定データを受信したかを判定する(ステップＳ１３)。測定データが受信されていないと(ステップＳ１３：ＮＯ)、処理が待機される。
【００９８】
測定装置２のＣＰＵ２０４の制御処理に関して、図７ａを参照する。ＣＰＵ２０４は、情報処理装置３から測定開始信号を受信すると(ステップＳ２１：ＹＥＳ)、試料の測定を行う(ステップＳ２２)。測定処理(ステップＳ２２)では、導入部２０１からフローセル２０３ｃへシース液と共に、標識された免疫細胞を含む試料が供給され、フローセル２０３ｃにおいてシース液に包まれた試料の流れが形成される。形成された試料の流れに光源２０３ａ、２０３ｂからのレーザビームが照射され、フローセル２０３ｃにビームスポットが形成される。試料中の個々の粒子がビームスポットを通過すると、透過光及び蛍光が発生する。生じた透過光及び蛍光はカメラ２０３ｉによりそれぞれ撮像されて、電気信号に変換される。
【００９９】
これらの電気信号は、Ａ／Ｄコンバータ２１２によって、デジタル信号に変換され、デジタル信号処理部２１３によって、信号処理が施される。これにより、フローセル２０３ｃを通過した複合体ごとに、透過光画像及び蛍光画像を含む測定データが得られる。測定データはメモリ２１４に格納される。試料の測定が終了すると、ＣＰＵ２０４は、測定処理により生成された測定データを情報処理装置３へ送信し(ステップＳ２３)、処理を終了する。
【０１００】
再び図７ｂを参照して、情報処理装置３のＣＰＵ３０１は、測定装置２から測定データを受信すると(ステップＳ１３：ＹＥＳ)、ハードディスク３０４に測定データを格納し、かかる測定データに基づいて計測処理を行って、解析用パラメータを取得する(ステップＳ１４)。そして、ＣＰＵ３０１は、解析用パラメータを用いて解析処理を行う(ステップＳ１５)。続いて、ＣＰＵ３０１は、Ｓ１４で取得した解析結果を表示部３２０に表示する(ステップＳ１６)。その後、処理は終了する。
【０１０１】
図８〜図１０を参照し、情報処理装置３のＣＰＵ３０１が測定データに基づいて行う解析処理(図７ｂのステップＳ１４)の一例について、さらに説明する。図８は、標識された免疫細胞を測定して得られた測定データのうち、透過光画像、蛍光画像(CD28)及びそれらの重ね合せ(Merge)画像を示す。図８ａの蛍光画像で示されるように、免疫刺激を与えない場合、CD28は免疫細胞の細胞膜上に一様に分布する傾向を示す。図８ｂの蛍光画像で示されるように、免疫刺激を与えた場合、CD28は免疫細胞の細胞膜上の一部に局在する傾向を示す。理論に拘束されることを意図しないが、CD28が局在を示す細胞膜部分が、免疫シナプスを示すと考えられる。
【０１０２】
ＣＰＵ３０１は、図７ａのステップＳ２２において撮像した全ての粒子の透過光画像及び蛍光画像に基づいて計測処理を行い、解析用パラメータを取得する(図７ｂのステップＳ１４)。解析用パラメータとしては、例えば、細胞のサイズ(ピクセル数)、細胞のアスペクト比、細胞における蛍光シグナルを示すエリア(蛍光シグナル面積値：ピクセル数)、該エリア内の総蛍光シグナル強度、それらの比などが挙げられるが、これらに限定されない。図９は、情報処理装置３のＣＰＵ３０１が示した透過光画像及び蛍光画像(図８ｂ参照)の計測処理(図７ｂのステップＳ１４)の模式図を示す。得られた測定データは、ハードディスク３０４に格納される。なお、細胞のサイズ、アスペクト比、蛍光シグナル面積値及び総蛍光シグナル強度の各用語の意味については、上述のとおりである。
【０１０３】
図１０は、情報処理装置３のＣＰＵ３０１のステップＳ１５における解析処理（図７ｂ参照）を示すフローチャートである。ＣＰＵ３０１は、図７ｂのステップＳ１４で計測した解析用パラメータをＸ軸とＹ軸にそれぞれ割り当てた２次元ヒストグラム(2Dスキャッタグラム)を作成して、所定の範囲内に存在するドットに対応する細胞の測定データを抽出して解析する。なお、以下に説明する解析処理は一例に過ぎず、本実施形態では、異なる解析処理を用いてもよい。
【０１０４】
ステップＳ５１において、ＣＰＵ３０１は、Ｘ軸に細胞サイズを割り当て、Ｙ軸に細胞のアスペクト比を割り当てた2Dスキャッタグラムを作成する(図１１ａ参照)。2Dスキャッタグラムに表示されたドットの１つ１つが、測定した個々の粒子に対応する。ＣＰＵ３０１は、2Dスキャッタグラム中のＲ１と表示された所定の領域(以下、「所定の範囲(Ｒ１)」と呼ぶ)にある細胞の測定データを抽出する。所定の範囲(Ｒ１)は、細胞サイズ(Ｘ軸)において細胞単独の大きさを反映する所定の範囲でゲーティングし、かつアスペクト比(Ｙ軸)において細胞が単独で存在することを反映する所定の範囲でゲーティングした領域である。これにより、細胞より小さい赤血球ゴーストなどのデブリス、単独の細胞よりも大きい細胞の凝集塊に由来するデータが除外される。
【０１０５】
この実施形態において、2Dスキャッタグラムに表示されたドットには、図７ａのステップＳ２２で測定された個々の粒子の測定データがリンクされている。ＣＰＵ３０１は、ユーザにより2Dスキャッタグラムに表示されたドットが指定された場合、そのドットに対応する粒子の測定データ(透過光画像及び／又は蛍光画像)をハードディスク３０４から読み出して、表示部３２０に表示する。
【０１０６】
ステップＳ５２において、ＣＰＵ３０１は、ステップＳ５１で抽出された細胞の測定データについて、Ｘ軸に総蛍光シグナル強度を割り当て、Ｙ軸に蛍光画像のシャープネス(画像の鮮明さ)を割り当てた2Dスキャッタグラムを作成する(図１１ｂ)。ＣＰＵ３０１は、2Dスキャッタグラム中のＲ２と表示された所定の領域(以下、「所定の範囲(Ｒ２)」と呼ぶ)にある細胞の測定データをさらに抽出する。範囲(Ｒ２)は、総蛍光シグナル強度(Ｘ軸)において所定のCD28発現量を反映する範囲でゲーティングし、シャープネス(Ｙ軸)において所定の画像のシャープネスを反映する範囲でゲーティングした領域である。これにより、所定量のCD28を発現している細胞のデータが抽出され、所定量のCD28を発現していない細胞のデータは除外される。
【０１０７】
この例では、図１１ｂに示す2Dスキャッタグラムを作成したが、この2Dスキャッタグラムを作成しなくてもよい。例えば、総蛍光シグナル強度のみに基づいて、所定量のCD28を発現している細胞のデータを抽出してもよい。具体的には、ステップＳ５１で抽出された細胞の測定データから、総蛍光シグナル強度が所定の値より高いデータを抽出することにより、所定量のCD28を発現している細胞のデータを抽出する。
【０１０８】
ステップＳ５３において、ＣＰＵ３０１は、ステップＳ５２で抽出された測定データについて、Ｘ軸に細胞の総蛍光シグナル強度を割り当て、Ｙ軸に蛍光シグナルを示すエリアを割り当てた2Dスキャッタグラムを作成する(図１１ｃ)。ＣＰＵ３０１は、2Dスキャッタグラム中のＲ３と表示された所定の領域(以下、「所定の範囲(Ｒ３)」と呼ぶ)にある測定データ数を計数する。範囲(Ｒ３)は、細胞の総蛍光シグナル強度(Ｘ軸)において所定のCD28発現量を反映する範囲でゲーティングし、蛍光シグナル面積値(Ｙ軸)においてCD28の局在を反映する所定の範囲でゲーティングした領域である。この実施形態において、範囲(Ｒ３)内のドットに対応する細胞は、CD28の局在が生成されている傾向がある。よって、範囲(Ｒ３)内のドットを計数することにより、CD28の局在が生成した免疫細胞が計数される。
【０１０９】
ステップＳ５４において、ＣＰＵ３０１は、図１１ｃの2Dスキャッタグラム全体に示されたドットの数(図１１ｂの範囲(Ｒ２)にあるドットの数に対応する)を計数し、範囲(Ｒ２)内のドットの数に対する、範囲(Ｒ３)内のドットの数の割合([範囲(Ｒ３)内のドット数]／[範囲(Ｒ２)内のドット数])を算出してもよい。これにより、所定量のCD28を発現する免疫細胞に対する、CD28の局在が生成した免疫細胞の割合が算出される。上記の解析処理により得られた各範囲内のドット数及び割合など解析結果は、表示部３２０に表示される。
【０１１０】
＜細胞分析装置の実施形態２＞
実施形態１の解析処理のステップＳ５３に代えて、ＣＰＵ３０１は、ステップＳ５２で抽出された測定データについて、Ｘ軸に蛍光シグナル面積値を割り当て、Ｙ軸に細胞のサイズを割り当てた2Dスキャッタグラムを作成してもよい(図11ｄ)。ＣＰＵ３０１は、2Dスキャッタグラム中のＲ４と表示された所定の領域(以下、「所定の範囲(Ｒ４)」と呼ぶ)にある測定データ数を計数してもよい。範囲(Ｒ４)は、蛍光シグナル面積値(Ｘ軸)においてCD28の局在を反映する所定の範囲でゲーティングし、かつ細胞のサイズ(Ｙ軸)において細胞単独の大きさを反映する所定の範囲でゲーティングする。範囲(Ｒ４)における測定データを計数することにより、免疫刺激に対して応答性の免疫細胞の数が計数される。この実施形態において、範囲(Ｒ４)にあるドットに対応する細胞は、CD28の局在が生成されている傾向がある。よって、範囲(Ｒ４)内のドットを計数することにより、CD28の局在が生成した免疫細胞が計数される。
【０１１１】
実施形態１の解析処理のステップＳ５４に代えて、ＣＰＵ３０１は、図１１ｄの2Dスキャッタグラム全体に示されたドットの数(図１１ｂの範囲(Ｒ２)にあるドットの数に対応する)を計数し、範囲(Ｒ２)内のドットの数に対する、範囲(Ｒ４)内のドットの数の割合([範囲(Ｒ４)内のドット数]／[範囲(Ｒ２)内のドット数])を算出してもよい。これにより、所定量のCD28を発現する免疫細胞に対する、CD28の局在が生成した免疫細胞の割合が算出される。上記の解析処理により得られた各範囲内のドット数及び割合など解析結果は、表示部３２０に表示される。
【０１１２】
＜細胞分析装置の実施形態３＞
測定データの解析において、2Dスキャッタグラムを用いずに、免疫細胞における標的分子の局在に関する分析を行ってもよい。例えば、実施形態１の解析処理のステップＳ５３に代えて、ＣＰＵ３０１は、ステップＳ５２で抽出された細胞の測定データについて、Ｘ軸に蛍光シグナル面積値の階級値を割り当て、Ｙ軸に度数を割り当てたヒストグラムを作成して、表示部３２０に表示してもよい。実施形態１の解析処理のステップＳ５４に代えて、ＣＰＵ３０１は、このヒストグラムから、ステップＳ５２で抽出された測定データの、蛍光シグナル面積値の平均値、中央値及び最頻値の少なくとも１つを算出してもよい。得られた値を用いて、さらに解析してもよい。例えば、被検者の全血由来の試料から得た蛍光シグナル面積値の最頻値と、健常者の全血由来の試料から得た蛍光シグナル面積値の標準化された最頻値とを比較してもよい。この解析において、被検者の上記最頻値を示す階級値が、健常者の標準化された最頻値を示す階級値よりも小さい場合、被検者の全血中の免疫細胞では、健常者の全血中の免疫細胞よりも、CD28の局在が生成していると判定できる。
【０１１３】
＜細胞分析装置の実施形態４＞
実施形態１〜３の解析処理では、撮像された画像データに基づいた解析を例示したが、画像データ以外の測定データから、免疫細胞における標的分子の局在に関する分析を行うことができる。撮像部２０３の変形例として、例えば図１２を参照して、撮像部２０３は、光源２０３ａ、２０３ｂと、フローセル２０３ｃと、集光レンズ２０３ｄ、２０３ｅ、２０３ｊと、ダイクロックミラー２０３ｋと、蛍光受光部２０３ｌと、前方散乱受光部２０３ｍとを備えた、光学シグナルを検出する検出部であってもよい。
【０１１４】
光源２０３ｂは、半導体レーザー光源である。光源２０３ｂから照射される光は、波長λ２のレーザー光である。この実施形態において、波長λ２は約488 nmである。集光レンズ２０３ｅは、光源２０３ｂから照射された光を集光して、フローセル２０３ｃ中の試料に導く。光源２０３ｂから照射された波長λ２の光は、フローセル２０３ｃの内部を通過する試料中の個々の粒子に照射される。PEで標識された免疫細胞に光が照射されたとき、PEから波長λ３の蛍光が生じる。集光レンズ２０３ｊは、波長λ１の透過光及び波長λ３の蛍光を集光する。波長λ１の前方散乱光は、ダイクロイックミラー２０３ｋにより反射されて、前方散乱受光部２０３ｍにより受光される。波長λ３の蛍光は、ダイクロイックミラー２０３ｋを透過して、蛍光受光部２０３ｌにより受光される。蛍光受光部２０３ｌ及び前方散乱受光部２０３ｍとして、アバランシェフォトダイオード、フォトダイオード又は光電子倍増管を使用できる。
【０１１５】
この例において、図７ａのステップＳ２２で得られる光学シグナルは、前方散乱光シグナル及び蛍光シグナルである。また、図７ｂのステップＳ１４では、解析用パラメータとして「パルス幅(Ｗ)」、「パルス面積(Ａ)」及び「パルスの高さ(Ｈ)」が得られる。図１３を参照して、これらの解析用パラメータについて説明する。
【０１１６】
図１３は、CD28が細胞膜上に一様に分布している細胞(図１３ａ)と、CD28が細胞膜上に局在している細胞(図１３ｂ)が、ビームスポットを矢印方向に通過する間に検出される蛍光シグナルをそれぞれ示す模式図である(図１３ｃ及びｄ)。
【０１１７】
本明細書において、図１３ｃ及びｄで示すような蛍光強度のパルスにおいて、閾値としたベースラインを超えて蛍光シグナルが得られた時間が「パルス幅(Ｗ)」といい、蛍光強度においてパルスのピークを示した場合の蛍光強度を「パルスの高さ(Ｈ)」という。「パルス面積(Ａ)」は、ベースラインと蛍光シグナル強度曲線との間の面積をいう。
【０１１８】
この例において、図１３ａの細胞と図１３ｂの細胞とで同じ量のCD28が細胞膜上に発現されており、図１３ｃと図１３ｄのパスル面積(Ａ)は等しい値となる。ここで、パルス幅(Ｗ)及びパルス高さ(Ｈ)は、CD28の分布パターンにより相違する。CD28が細胞膜上に一様に分布している場合に比べて(図１３ａ)、CD28が細胞膜上に局在している場合(図１３ｂ)、そのパルス幅(Ｗ)は小さくなり、一方で、パルスの高さ(Ｈ)は高くなる(図１３ｃ及びｄ)。
【０１１９】
図１４は、この実施形態４において、複数の免疫細胞を測定して2Dスキャッタグラムを作成した場合の模式図である。図１４ａは、Ｘ軸にパルスの高さ(Ｈ)を割り当て、Ｙ軸にパルス幅(Ｗ)を割り当てた2Dスキャッタグラムであり、図１４ｂは、Ｘ軸にパルスの高さ(Ｈ)を割り当て、Ｙ軸にパルス面積(Ａ)を割り当てた2Dスキャッタグラムである。
【０１２０】
上記のように、共刺激分子が細胞膜上に一様に分布している場合、共刺激分子が細胞膜上で局在している場合と比べて、そのパルス幅(Ｗ)は大きくなる傾向を示し、パルスの高さ(Ｈ)は低くなる傾向を示す。そのため、図１４ａで示される2Dスキャッタグラムでは、破線の丸で囲まれた領域に入るデータが、CD28が細胞膜上に一様に分布している細胞を反映するデータである。一方、実線の四角で囲まれた領域に入るデータが、CD28が細胞膜上に局在している細胞を反映するデータである傾向を示す。図１４ｂで示される2Dスキャッタグラムでは、破線の四角で囲まれた領域に入るデータが、CD28が細胞膜上に一様に分布している細胞を反映するデータである。一方、実線の四角で囲まれた領域に入るデータが、CD28が細胞膜上に局在している細胞を反映するデータである傾向を示す。
【０１２１】
実施形態４で例示されるように、撮像された画像データに基づいた解析処理だけでなく、上記のような光学シグナルに基づく解析処理によっても、免疫細胞における標的分子の局在を分析できることが理解される。
【０１２２】
なお、ここに示す解析用パラメータ及び解析処理は一例に過ぎず、測定データから異なる解析用パラメータを計測してもよく、また計測された解析用パラメータに対して異なる解析処理が行われてもよい。例えば、パルス面積は、パルスの時間曲線下面積を反映する値であれば近似値であってもよく、時間積分値には限定されない。パルス面積は、パルス幅とピークの高さの積であってもよいし、パルス幅とピークの高さから求めた三角形の面積であってもよい。また、時間積分値を計測する形態において、底辺はベースラインでなくてもよく、適宜設定できる。例えば、ベースラインから所定の閾値を越えた値を底辺としてもよい。
【０１２３】
以下に、本発明を実施例により詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【実施例】
【０１２４】
実施例１：  全血中の免疫細胞の免疫刺激応答性の測定
被検者から採取した全血(末梢血)に免疫刺激因子として抗CD28抗体を添加することにより、全血中の免疫細胞(Ｔ細胞)を刺激して、該免疫細胞上のCD28の局在に関する情報を取得した。対照として、免疫刺激因子を添加していない全血中の免疫細胞について測定した。【０１２５】
１．測定
(1) 刺激した免疫細胞の測定
５名の被検者(健常ボランティア)から全血を採取した。各被検者の全血(200μL)をチューブに分取し、マウス抗ヒトCD28抗体(＃302914 Clone：CD28.2：BioLegend社)を添加して穏やかに撹拌した。抗体を含む全血を200×gで２分間、室温で遠心分離してバフィーコートを形成した。バフィーコートをCO2インキュベーター内(37℃)で約２〜120分間静置することにより、分析対象の免疫細胞と他の白血球とを接触した後、4% PFAを含む固定液を添加して、免疫細胞の細胞膜を固定化処理した。抗ヒトCD28抗体の添加から4% PFAの添加までの時間は約５〜125分であった。次に、溶血剤(0.4〜0.8%塩化アンモニウム)を添加して、溶血処理を行った。その後、PE標識ヤギ抗マウスIgG抗体(＃405307：BioLegend社)、APC標識マウス抗ヒトCD3抗体(#300411 Clone: UCHT1：BioLegend社)及びHoechst(H342：同仁化学)を用いて細胞及び細胞核を染色した。染色した細胞を1% BSA/PBSに懸濁し、イメージングフローサイトメータ(ImageStreamX MarkII Imaging Flow Cytometer：Amnis社)を用いて測定した。【０１２６】
(2) 刺激していない免疫細胞の測定
マウス抗ヒトCD28抗体を添加しなかったこと以外は上記(1)と同様にして、上記の健常ボランティアの全血(200μL)に含まれる免疫細胞を処理して、IFCを用いて測定した。【０１２７】
２．データ解析
IFCによる測定で得られた、刺激した免疫細胞を含む全血の測定データと、刺激しなかった免疫細胞を含む全血の測定データの多重パラメータ解析を行った。簡単には、IFCで取得した個々の細胞の透過光画像及び蛍光画像(CD28)に基づいて画像解析し、細胞のサイズ、細胞のアスペクト比、蛍光シグナル面積値及び総蛍光シグナル強度を取得した。まず、個々の細胞の透過光画像のデータに基づいて、Ｘ軸に細胞サイズをとり、Ｙ軸に細胞のアスペクト比をとった2Dスキャッタグラムを作成した(図示せず)。赤血球ゴーストなどのデブリスの測定データを除くため、この2Dスキャッタグラムの所定の範囲(Cells)内にあるドットを選択し、選択した各ドットに対応する測定データを、細胞の測定データとして抽出した。【０１２８】
次いで、範囲(Cells)内の測定データに基づいて、Ｘ軸に総蛍光シグナル強度をとり、Ｙ軸に蛍光シグナル面積値をとった2Dスキャッタグラムを作成した(図示せず)。この2Dスキャッタグラムにおいて、総蛍光シグナル強度が所定の値以上である範囲(Tcells)内にあるドットを選択した。選択した各ドットに対応する測定データを、免疫細胞(CD28陽性Ｔ細胞)の測定データとして抽出した。抽出した測定データについて、Ｘ軸に総蛍光シグナル強度をとり、Ｙ軸に蛍光シグナル面積値をとった2Dスキャッタグラムを作成した。そして、範囲(Tcells)内の測定データから、蛍光シグナル面積値が低い細胞集団の測定データを抽出した。具体的には、作成した2Dスキャッタグラムにおいて、所定の範囲(IS area2)内にあるドットを選択し、選択した各ドットに対応する測定データを、免疫刺激応答性Ｔ細胞の測定データとして抽出した。なお、ISはImmunological Synapseの略語である。【０１２９】
範囲(Tcells)内の測定データに基づいて作成した2Dスキャッタグラムの一例を、図１５Ａ(刺激しなかった免疫細胞)及び図１５Ｂ(刺激した免疫細胞)に示す。図１５Ａ及びＢ中、長方形で囲んだ領域が範囲(IS area2)である。また、図１５Ａ及びＢ中、楕円で囲んだ領域内の各ドットに対応する細胞の画像の一例を、図１６Ａ及びＢに示す。範囲(Tcells)内及び範囲(IS area2)内にあるドットを計数し、以下の式より、全血中のＴ細胞に対する、CD28が局在したＴ細胞の割合(CD28局在陽性率)を算出した。各被検者についてＴ細胞のCD28局在陽性率を図１７に示す。【０１３０】
[CD28局在陽性率(%)]＝｛[範囲(IS area2)内のドット数]／[範囲(Tcells)内のドット数]｝×100【０１３１】
３．結果及び考察
図１６Ａから分かるように、抗CD28抗体による免疫刺激を与えなかったＴ細胞では、CD28分子は細胞膜上に一様に分布した。これに対して、図１６Ｂから分かるように、免疫刺激を与えたＴ細胞では、CD28分子は、細胞膜上の一部に局在していた。CD28の蛍光画像における、この局在を示した部分が、形成された免疫シナプスを示すと考えられる。図１５Ａ及びＢの2Dスキャッタグラムにおいて、蛍光シグナル面積値が小さい値を示す細胞は、免疫シナプスを形成している傾向がある。よって、蛍光シグナル面積値が小さい領域をゲーティングして、免疫刺激応答性を示す免疫細胞が出現する領域(範囲(IS area2))を示した。図１５Ａ(刺激しなかった免疫細胞)と図１５Ｂ(刺激した免疫細胞)とを比較すると、図１５Ｂにおいて、ゲーティングした領域(範囲(IS area2))に細胞が顕著に出現していることが分かる。【０１３２】
図１７より、いずれ被検者から採取した全血においても、刺激なしの場合はCD28局在陽性率が非常に低い値を示した。一方、刺激ありの場合はCD28局在陽性率が上昇し、刺激なしの場合に比べて顕著な差異が見られた。以上のことから、試料として全血を用いる本実施形態の方法により、免疫刺激応答性を示す免疫細胞(IS形成能を示す免疫細胞)を検出できることが示された。また、検出結果に基づいて、免疫細胞の免疫刺激応答性(IS形成能)を評価できることが示された。【０１３３】
実施例２：  全血を用いる本実施形態の方法と、単離したPBMCを用いる従来法との比較(１)
試料として全血を用いる本実施形態の方法と、試料として全血から単離したPBMC(末梢血単核細胞)を用いる従来法とを、CD28局在陽性率を指標として比較した。【０１３４】
１．測定
(1) 全血中の免疫細胞の測定
健常ボランティアから全血を採取した。採取した全血の一部(200μL)を用いて、実施例１と同様にして、抗ヒトCD28抗体で刺激した免疫細胞及び刺激していない免疫細胞の測定を行った。【０１３５】
(2) PBMC中の免疫細胞の測定
上記の全血の一部(200μL)を取り、フィコールを用いる密度勾配遠心法によりPBMCを単離した。単離したPBMCをチューブに分取し、実施例１と同じ抗ヒトCD28抗体を添加し、200×gで２分間、室温で遠心分離して細胞を沈降させた。細胞をCO2インキュベーター内(37℃)で約２〜120分間静置することにより免疫細胞とチューブの壁面とを接触した後、4% PFAを含む固定液を添加して、免疫細胞の細胞膜を固定化処理した。次に、実施例１と同じ溶血剤を添加して、溶血処理を行った。その後、実施例１と同じPE標識ヤギ抗マウスIgG抗体、APC標識マウス抗ヒトCD3抗体及びHoechstを用いて細胞及び細胞核を染色した。実施例１と同様にして、染色した細胞をIFCで測定した。免疫刺激しなかった細胞の測定は、マウス抗ヒトCD28抗体を添加しなかったこと以外は上記と同様にして、全血から単離したPBMCを処理して、IFCを用いて測定した。【０１３６】
２．データ解析
実施例１と同様にして、IFCによる測定で得られたデータの多重パラメータ解析を行った。全血又は単離したPBMC中のＴ細胞に対する、CD28が局在したＴ細胞の割合(CD28局在陽性率)を算出した。結果を図１８に示す。【０１３７】
３．結果及び考察
図１８より、刺激なしの場合、PBMC及び全血におけるＴ細胞のCD28局在陽性率は同程度の値を示した。一方、刺激ありの場合、PBMCにおけるＴ細胞のCD28局在陽性率は、全血よりも顕著に低い値を示した。これは、全血からPBMCを分離及び単離する工程に起因する免疫細胞の質及び機能の変化を示唆すると考えられる。本実施形態の方法では、PBMCを分離及び単離する工程を行わないので、当該工程に起因する質及び機能への影響が無くなる。よって、本実施形態の方法は、PBMCを用いる従来法よりも測定の精度が向上することが示された。【０１３８】
実施例３：  全血を用いる本実施形態の方法と、単離したPBMCを用いる従来法との比較(２)
試料として全血を用いる本実施形態の方法と、試料として全血から単離したPBMC(末梢血単核細胞)を用いる従来法とを、ノイズシグナルを指標として比較した。【０１３９】
１．測定及びデータ解析
実施例１と同様にして、５名の被検者から採取した全血を用いて、抗CD28抗体を添加せずに全血中のＴ細胞を測定し、CD28局在陽性率を算出した。また、実施例２と同様にして、４名の被検者から採取した全血からPBMCを単離し、抗CD28抗体を添加せずにPBMC中のＴ細胞を測定し、CD28局在陽性率を算出した。結果を図１９に示す。【０１４０】
２．結果及び考察
図１９より、刺激なしの条件での全血及びPBMCにおけるＴ細胞のCD28局在陽性率を比較すると、PMBCにおいてデータのばらつきやノイズシグナルが見られた。これは、全血からPBMCを分離及び単離する工程が、免疫細胞の質及び機能に影響することを示唆すると考えられる。一方、全血を用いる本実施形態の方法では、PBMCを分離及び単離する工程を行わないので、当該工程に起因するデータのばらつきやノイズシグナルが低減された。よって、本実施形態の方法は、PBMCを用いる従来法よりも測定の精度が向上することが示された。【０１４１】
実施例４：  全血中での免疫刺激による標的分子の局在及び測定への影響
分析対象の免疫細胞としてＴ細胞クローンを用いて、本実施形態の方法及び従来法による測定を行い、Ｔ細胞クローンのCD28局在陽性率を比較した。【０１４２】
１．Ｔ細胞クローンの調製
5×106 cellsのCD4陽性細胞(ST-70026：Stemcell Technologies社)及びCD8陽性細胞(0508-100：フナコシ、PB08C-1：コスモバイオ)を、1μg/mL LEAF(商標)精製抗ヒトCD3抗体(317315：Biolegend社)、10 ng/mL 組換え型ヒトIL-2(rhIL-2)(202-IL-500：R&D systems社)、0.2μg/mL フィトヘマグルチニン-L(PHA)(L4144-5MG：SIGMA社)及び2%ヒト血清(H4522-100ML：SIGMA社)を含むYssel's培地(400102：Gemini Bio-Products社)に播種し、1×106 cellsのPBMC及び1×104 cellsのJY細胞と14日間、共培養した。14日後、Ｔ細胞を限界希釈法により0.3、1.0及び3.0 cells/wellとなるように96ウェルプレートに播種し、コロニーが形成されるまで、1×104 cellsのPBMCと共培養した。コロニーが形成されたウェルからＴ細胞を回収して、Ｔ細胞クローンを樹立した。【０１４３】
２．測定
(1) 本実施形態の方法によるＴ細胞クローンの測定
Hoechstで標識したＴ細胞クローン(5×105 cells/100μL)を、健常ボランティアから採取した全血(200μL)に添加し、そして実施例１と同じ抗ヒトCD28抗体を添加した。実施例１と同様にして、バフィーコートを形成した。バフィーコートをCO2インキュベーター内(37℃)で約２〜120分間静置することにより、Ｔ細胞クローンを含む免疫細胞と他の白血球とを接触した後、4% PFAを含む固定液を添加して、免疫細胞の細胞膜を固定化処理した。次に、実施例１と同じ溶血剤を添加して、溶血処理を行った。その後、実施例1と同じPE標識ヤギ抗マウスIgG抗体、APC標識マウス抗ヒトCD3抗体を用いて細胞を染色した。実施例１と同様にして、染色した細胞をIFCで測定した。免疫刺激しなかったＴ細胞クローンの測定は、マウス抗ヒトCD28抗体を添加しなかったこと以外は上記と同様にして、全血に添加したＴ細胞クローンをIFCで測定した。【０１４４】
(2) 従来法によるＴ細胞クローンの測定
Hoechstで標識したＴ細胞クローン(5×105 cells/100μL)を48ウェルプレートに播種し、実施例１と同じ抗ヒトCD28抗体を添加した。200×gで２分間、室温で遠心分離して細胞をプレート内に沈降させた。細胞をCO2インキュベーター内(37℃)で約２〜120分間静置することにより免疫細胞とプレートの底面とを接触した後、4% PFAを含む固定液を添加して、免疫細胞の細胞膜を固定化処理した。次に、実施例１と同じ溶血剤を添加して、溶血処理を行った。その後、実施例１と同じPE標識ヤギ抗マウスIgG抗体、APC標識マウス抗ヒトCD3抗体及びHoechstを用いて細胞及び細胞核を染色した。実施例１と同様にして、染色した細胞をIFCで測定した。免疫刺激しなかった細胞の測定は、マウス抗ヒトCD28抗体を添加しなかったこと以外は上記と同様にして、48ウェルプレートに播種したＴ細胞クローンをIFCで測定した。【０１４５】
３．データ解析
実施例１と同様にして、IFCによる測定で得られたデータの多重パラメータ解析を行った。全血又はプレートに添加したＴ細胞クローンに対する、CD28が局在したＴ細胞クローンの割合(CD28局在陽性率)を算出した。結果を図２０Ａ及びＢに示す。図中、「Ｐ」は、プレートを用いた従来法の条件を示し、「Ｂ」は、全血を用いた本実施形態の方法の条件を示す。【０１４６】
４．結果及び考察
図２０Ａ及びＢから分かるように、Ｔ細胞クローンのCD28局在陽性率は、全血中にＴ細胞クローンを添加した場合と、プレート中にＴ細胞クローンを播種した場合との間で顕著な差は認められなかった。これまで、全血に含まれる免疫細胞以外の血球成分は、免疫刺激による標的分子の局在及び測定に影響すると考えられてきた。しかし、本実施形態の方法では、全血中で免疫刺激しても、従来法と同様に、免疫刺激応答性を示す免疫細胞(IS形成能を示す免疫細胞)を検出できることが示された。【０１４７】
実施例５：  溶血剤の検討
２種類の溶血剤を用いて、本実施形態の方法及び従来法による測定を行い、免疫細胞のCD28局在陽性率を比較した。分析対象の免疫細胞として、実施例４のＴ細胞クローンを用いた。【０１４８】
１．測定
(1) 本実施形態の方法によるＴ細胞クローンの測定
溶血剤１(0.8%塩化アンモニウム)又は溶血剤２(0.41%塩化アンモニウム及び0.2%界面活性剤)を用いたこと以外は、実施例４と同様にして、全血に添加したＴ細胞クローンをIFCで測定した。溶血剤１及び２はいずれも、溶血用試薬として市販されている製品であった。【０１４９】
(2) 従来法によるＴ細胞クローンの測定
実施例４と同様にして、48ウェルプレートに播種したＴ細胞クローンをIFCで測定した。【０１５０】
２．データ解析
実施例１と同様にして、IFCによる測定で得られたデータの多重パラメータ解析を行った。全血又はプレートに添加したＴ細胞クローンに対する、CD28が局在したＴ細胞クローンの割合(CD28局在陽性率)を算出した。結果を図２１に示す。図中、「Ｐ」は、プレートを用いた従来法の条件を示し、「Ｂ」は、全血を用いた本実施形態の方法の条件を示す。また、「１」は、溶血剤１を用いたことを示し、「２」は、溶血剤２を用いたことを示す。【０１５１】
３．結果及び考察
図２１から分かるように、溶血剤１及び２のいずれを用いた場合も、Ｔ細胞クローンのCD28局在陽性率に顕著な差は認められなかった。本実施形態の方法では、市販の溶血用試薬を用いれば、免疫刺激応答性を示す免疫細胞(IS形成能を示す免疫細胞)を検出できることが示された。【０１５２】
実施例６：  免疫細胞と、免疫細胞とは異なる物質との接触方法の検討
これまでの実施例では、免疫刺激した免疫細胞と、全血の遠心分離により形成した赤血球層とを接触していたが、他の接触方法でも本実施形態の方法を実施できるかを検討した。分析対象の免疫細胞として、実施例４のＴ細胞クローンを用いた。【０１５３】
１．免疫細胞と、免疫細胞とは異なる物質との接触
(1) 遠心分離による接触
Hoechstで標識したＴ細胞クローン(5×105 cells/100μL)を、健常ボランティアから採取した全血(200μL)に添加し、そして実施例１と同じ抗ヒトCD28抗体を添加した。実施例１と同様にして、遠心分離によりバフィーコートを形成した。バフィーコートをCO2インキュベーター内(37℃)で約２〜120分間静置することにより、Ｔ細胞クローンを含む免疫細胞と他の白血球とを接触した。また、抗ヒトCD28抗体を添加しなかったこと以外は、上記と同様にして、刺激していないＴ細胞クローンを含む免疫細胞と赤血球層とを接触した。【０１５４】
(2) ローテーションによる接触
Hoechstで標識したＴ細胞クローン(5×105 cells/100μL)を、健常ボランティアから採取した全血(200μL)に添加し、そして実施例１と同じ抗ヒトCD28抗体を添加した。刺激したＴ細胞クローンを含む全血を収容したチューブを、ローテーターにセットして、30 rpmで約２〜120分間、CO2インキュベーター内(37℃)で転倒混和した。【０１５５】
(3) 静置による接触
Hoechstで標識したＴ細胞クローン(5×105 cells/100μL)を、健常ボランティアから採取した全血(200μL)に添加し、そして実施例１と同じ抗ヒトCD28抗体を添加した。刺激したＴ細胞クローンを含む全血を収容したチューブをCO2インキュベーター内(37℃)で約２〜120分間静置した。【０１５６】
２．測定
接触面の提供後、Ｔ細胞クローンを含む全血に4% PFAを含む固定液を添加して、免疫細胞の細胞膜を固定化処理した。次に、実施例１と同じ溶血剤を添加して、溶血処理を行った。その後、実施例1と同じPE標識ヤギ抗マウスIgG抗体、APC標識マウス抗ヒトCD3抗体及びHoechstを用いて細胞及び細胞核を染色した。実施例１と同様にして、染色した細胞をIFCで測定した。【０１５７】
２．データ解析
実施例１と同様にして、IFCによる測定で得られたデータの多重パラメータ解析を行った。全血又はプレートに添加したＴ細胞クローンに対する、CD28が局在したＴ細胞クローンの割合(CD28局在陽性率)を算出した。結果を図２２に示す。【０１５８】
３．結果及び考察
図２２から分かるように、遠心分離、ローテーション及び静置のいずれの接触方法によっても、CD28局在陽性率は、刺激しなかったＴ細胞クローンに比べて、顕著に高い値を示した。ローテーション及び静置によってもCD28局在陽性率は増加したことから、全血を収容するチューブの内壁面との接触も、免疫細胞への免疫刺激に寄与していることが示唆される。本実施形態の方法では、いずれの接触方法によっても、免疫刺激応答性を示す免疫細胞(IS形成能を示す免疫細胞)を検出できることが示された。【０１５９】
実施例７：  全血中の免疫細胞の免疫刺激応答性の測定
被験者から採取した全血(末梢血)に、免疫刺激因子を有する他家細胞(ヒトＢ細胞)を添加することにより、全血中の免疫細胞(Ｔ細胞及びNK細胞)を刺激して、該免疫細胞の構造タンパク質であるＦアクチンの局在に関する情報を取得した。対照として、他家細胞を添加していない全血中の免疫細胞について測定した。【０１６０】
１．測定
(1) 免疫刺激した免疫細胞の測定
健常人ボランティア血(200μL)をチューブに分取し、ここに他家細胞としてヒトＢ細胞(理化学研究所、製品番号HEV0032)を添加した。得られた全血試料を遠心分離して、バフィーコートを形成させた。10分以上の反応後、4%PFAを含む固定液で試料中の免疫細胞の細胞膜を固定化処理した。次に、固定化した細胞に溶血剤を添加し、溶血処理を行った。その後、Alexa488-マウス抗ヒトCD3抗体、PE-Cy7-マウス抗ヒトCD56抗体、及びAlexa674-ファロイジンを用いて細胞を染色した。染色した細胞をIFC(ImageStreamX MarkII Imaging Flow Cytometer：Amnis社)を用いて測定した。【０１６１】
(2) 免疫刺激していない免疫細胞の測定
健常人ボランティア血(200μL)をチューブに分取し、遠心分離によりバフィーコートを形成させた。２分以上の反応後、4%PFAを含む固定液で試料中の免疫細胞の細胞膜を固定化処理した。次に、固定化した細胞に溶血剤を添加し、溶血処理を行った。その後、Alexa488-マウス抗ヒトCD3抗体、PE-Cy7-マウス抗ヒトCD56抗体、及びAlexa674-ファロイジンを用いて細胞を染色した。染色した細胞をIFC(ImageStreamX MarkII Imaging Flow Cytometer：Amnis社)を用いて測定した。【０１６２】
２．データ解析
IFCによる測定で得られた、刺激した免疫細胞を含む全血の測定データと、刺激しなかった免疫細胞を含む全血の測定データの多重パラメータ解析を行った。簡単には、IFCで取得した個々の細胞の透過光画像及び蛍光画像(CD3、CD56及びＦアクチン)に基づいて画像解析し、細胞のサイズ、細胞のアスペクト比、蛍光シグナル面積値及び総蛍光シグナル強度を取得した。まず、個々の細胞の透過光画像のデータに基づいて、Ｘ軸に細胞サイズをとり、Ｙ軸に細胞のアスペクト比をとった2Dスキャッタグラムを作成した(図示せず)。赤血球ゴーストなどのデブリスの測定データを除くため、この2Dスキャッタグラムの所定の範囲(Cells)内にあるドットを選択し、選択した各ドットに対応する測定データを、細胞の測定データとして抽出した。【０１６３】
次いで、範囲(Cells)内の測定データに基づいて、Ｘ軸に蛍光画像(CD3)から取得した総蛍光シグナル強度をとり、Ｙ軸に蛍光画像(CD56)から取得した総蛍光シグナル強度をとった2Dスキャッタグラムを作成した(図２４を参照)。この2Dスキャッタグラムにおいて、CD3総蛍光シグナル強度が所定の値以上であり、且つCD56総蛍光シグナル強度が所定の値以下の範囲内にあるドットを、CD3陽性且つCD56陰性の免疫細胞と定義した(以下、該免疫細胞を「CD3+CD56-細胞」とも呼ぶ)。また、この2Dスキャッタグラムにおいて、CD3総蛍光シグナル強度が所定の値以下であり、且つCD56総蛍光シグナル強度が所定の値以上の範囲内にあるドットを、CD3陰性且つCD56陽性の免疫細胞と定義した(以下、該免疫細胞を「CD3-CD56+細胞」とも呼ぶ)。【０１６４】
CD3+CD56-細胞の蛍光画像(Ｆアクチン)から取得したデータに基づき、Ｘ軸に総蛍光シグナル強度をとり、Ｙ軸に蛍光シグナル面積値をとった2Dスキャッタグラムを作成した(図示せず)。この2Dスキャッタグラムにおいて、総蛍光シグナル強度が所定の値以上である範囲(Tcells)内にあるドットを選択した。選択した各ドットに対応する測定データを、免疫細胞(T細胞)の測定データとして抽出した。抽出した測定データについて、Ｘ軸に総蛍光シグナル強度をとり、Ｙ軸に蛍光シグナル面積値をとった2Dスキャッタグラムを作成した。そして、範囲(Tcells)内の測定データから、蛍光シグナル面積値が低い細胞集団の測定データを抽出した。具体的には、作成した2Dスキャッタグラムにおいて、所定の範囲(F-actin IS)内にあるドットを選択し、選択した各ドットに対応する測定データを、免疫刺激応答性Ｔ細胞の測定データとして抽出した。なお、ISはImmunological Synapseの略語である。【０１６５】
同様にして、CD3-CD56+細胞の蛍光画像(Ｆアクチン)のデータに基づき、免疫刺激応答性NK細胞の測定データを抽出した。CD3-CD56+細胞の蛍光画像(F-actin)から取得したデータに基づき、Ｘ軸に総蛍光シグナル強度をとり、Ｙ軸に蛍光シグナル面積値をとった2Dスキャッタグラムを作成した(図示せず)。この2Dスキャッタグラムにおいて、総蛍光シグナル強度が所定の値以上である範囲(NKcells)内にあるドットを選択した。選択した各ドットに対応する測定データを、免疫細胞(NK細胞)の測定データとして抽出した。抽出した測定データについて、Ｘ軸に総蛍光シグナル強度をとり、Ｙ軸に蛍光シグナル面積値をとった2Dスキャッタグラムを作成した。そして、範囲(NKcells)内の測定データから、蛍光シグナル面積値が低い細胞集団の測定データを抽出した。具体的には、作成した2Dスキャッタグラムにおいて、所定の範囲(F-actin IS)内にあるドットを選択し、選択した各ドットに対応する測定データを、免疫刺激応答性NK細胞の測定データとして抽出した。【０１６６】
範囲(Tcells)又は範囲(NKcells)内の測定データに基づいて作成した2Dスキャッタグラムの一例を図２４に示す。図中、刺激(-)は、免疫刺激しなかった免疫細胞の分布を示し、刺激(+)は、免疫刺激した免疫細胞の分布を示す。図中、長方形で囲んだ領域が範囲(F-actin IS)である。また、図２４中、楕円で囲んだ領域内の各ドットに対応する細胞の画像の一例を、図２５に示す。範囲(Tcells)内及び範囲(F-actin IS01)内にあるドットを計数し、以下の式より、全血中のＴ細胞に対する、Ｆアクチンが局在したＴ細胞の割合(F-actin局在陽性率)を算出した。同様にして、範囲(NKcells)内及び範囲(F-actin IS01)内にあるドットを計数し、以下の式より、全血中のNK細胞に対する、Ｆアクチンが局在したNK細胞の割合(F-actin局在陽性率)を算出した。Ｔ細胞及びNK細胞のF-actin局在陽性率を図２６Ａ及びＢに示す。【０１６７】
[F-actin局在陽性率(%)]＝｛[範囲(F-actin IS)内のドット数]／[範囲(Tcells)内のドット数]｝×100
[F-actin局在陽性率(%)]＝｛[範囲(F-actin IS)内のドット数]／[範囲(NKcells)内のドット数]｝×100【０１６８】
３．結果及び・考察
ヒトＢ細胞株を含む免疫刺激因子との接触を与えなかったＴ細胞及びNK細胞では、Ｆアクチン分子は細胞膜上に一様に分布した。これに対して、当該免疫刺激を与えた場合では、Ｆアクチン分子はＴ細胞及びNK細胞の膜上の一部に局在していることが分かった。この局在を示す部分が、形成された免疫シナプスを示すと考えられる(図２５参照)。2Dスキャッタグラムでは、Ｙ軸に細胞におけるＦアクチン蛍光シグナルの面積値を反映する情報を、Ｘ軸に細胞におけるＦアクチンの総蛍光シグナル値を反映する情報を示す(図２４参照)。ここで、局在面積が小さい値を示す細胞は、ISが形成されている傾向があるため、この領域をゲーティングして免疫刺激応答性を示す免疫細胞が出現する領域を示した。図２４を参照して、刺激なし及び刺激ありの2Dスキャッタグラムを比較すると、刺激ありの場合において、ゲーティングエリアに細胞が顕著に出現していることが分かる。図２６Ａ及びＢより、刺激なしの場合、全血中のＴ細胞及びNK細胞のIS陽性率は非常に低い値を示した。刺激なしの場合に比べて、刺激ありの場合では、全血中のＴ細胞及びNK細胞のIS陽性率の値は有意に増加した。【０１６９】
以上のことから、本実施例の全血を用いた方法により、免疫刺激応答性を示す免疫細胞(IS形成能を示す免疫細胞を示す免疫細胞)を検出でき、検出結果に基づいて免疫細胞の免疫刺激応答性(IS形成能)を評価できることが示された。
【符号の説明】
【０１７０】
１  細胞分析装置
２  測定装置
３  情報処理装置
３００  本体
３１０  入力部
３２０  表示部
【図１】
2020111135.tif 000003
【図２】
2020111135.tif 000004
【図３】
2020111135.tif 000005
【図４】
2020111135.tif 000006
【図５】
2020111135.tif 000007
【図６】
2020111135.tif 000008
【図７】
2020111135.tif 000009
【図８】
2020111135.tif 000010
【図９】
2020111135.tif 000011
【図１０】
2020111135.tif 000012
【図１１】
2020111135.tif 000013
【図１２】
2020111135.tif 000014
【図１３】
2020111135.tif 000015
【図１４】
2020111135.tif 000016
【図１５Ａ】
2020111135.tif 000017
【図１５Ｂ】
2020111135.tif 000018
【図１６Ａ】
2020111135.tif 000019
【図１６Ｂ】
2020111135.tif 000020
【図１７】
2020111135.tif 000021
【図１８】
2020111135.tif 000022
【図１９】
2020111135.tif 000023
【図２０Ａ】
2020111135.tif 000024
【図２０Ｂ】
2020111135.tif 000025
【図２１】
2020111135.tif 000026
【図２２】
2020111135.tif 000027
【図２３】
2020111135.tif 000028
【図２４】
2020111135.tif 000029
【図２５】
2020111135.tif 000030
【図２６Ａ】
2020111135.tif 000031
【図２６Ｂ】
2020111135.tif 000032
【国際調査報告】
2020111135.tif 000033
2020111135.tif 000034
2020111135.tif 000035
2020111135.tif 000036
2020111135.tif 000037
2020111135.tif 000038