(57)【要約】  ｉＰＳ細胞由来の種々の細胞、例えば心筋細胞、を該細胞の機能を高度に有したまま含み、高品質な移植片、例えばシート状細胞培養物、を製造する方法、当該方法を用いて製造された移植片、当該移植片を用いた疾患の処置方法などを提供することを目的とする。（ａ）ｉＰＳ細胞から分化誘導された細胞を含む細胞集団を、培養基材上に播種する工程、および（ｂ）播種した細胞集団を、血小板溶解物を含む移植片形成媒体で移植片形成培養する工程を含む、移植片の製造方法などにより、上記課題が解決された。【特許請求の範囲】
【請求項１】
多能性幹細胞から分化誘導された細胞を含む移植片を製造する方法であって；
（ａ）前記細胞を含む細胞集団を、培養基材上に播種する工程、および
（ｂ）播種した細胞集団を、血小板溶解物を含む移植片形成媒体で移植片形成培養する工程、
を含む、前記方法。
【請求項２】
多能性幹細胞が、ｉＰＳ細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
移植片が、シート状細胞培養物である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
移植片形成媒体が、移植片に含まれる細胞種と異種の血清を含まない、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
移植片形成媒体が、さらに細胞接着性成分を含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
培養基材が、細胞接着性成分および／または血小板溶解物でコーティングされている、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
細胞が、心筋細胞である、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
ｉＰＳ細胞から分化誘導した心筋細胞を含む移植片において該心筋細胞の拍動開始を早める方法であって、前記心筋細胞を含む細胞集団を、血小板溶解物を含む移植片形成媒体で移植片形成培養することを含む、前記方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本開示は、平成３０年度、国立研究開発法人日本医療研究開発機構  再生医療実現拠点ネットワークプログラム  疾患・組織別実用化研究拠点（拠点Ａ）「ｉＰＳ細胞を用いた心筋再生治療創成拠点」に係る委託研究開発、産業技術力強化法第１９条の適用を受ける特許出願であって、人工多能性幹細胞由来の分化誘導細胞、特に心筋細胞を含む、シート状細胞培養物などの移植片を製造する方法、当該方法を用いて製造された移植片、当該移植片を用いた疾患の処置方法などに関する。
【背景技術】
【０００２】
成体の心筋細胞は自己複製能に乏しく、心筋組織が損傷を受けた場合、その修復は極めて困難である。近年、損傷した心筋組織の修復のために、細胞工学的手法により作製した心筋細胞を含む移植片を患部に移植する試みが行われている（特許文献１、非特許文献１）。かかる移植片の作製に用いる心筋細胞の給源として最近注目されているのが、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）や人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）などの多能性幹細胞から誘導した心筋細胞であり、このような多能性幹細胞由来の心筋細胞を含むシート状細胞培養物の作製や動物での治療実験が試みられている（非特許文献２〜３）。しかしながら、多能性幹細胞由来の心筋細胞を含むシート状細胞培養物の開発は始まったばかりであり、その機能的特性や、それに影響する因子などについては依然不明な部分が多い。【０００３】
再生医療に用いる臨床用のシート状細胞培養物を製造する場合、なるべくヒト以外の異種由来成分を含まない状態、いわゆるゼノフリーな状態で製造されることが望ましい。しかしながら、ゼノフリーな状態でシート状細胞培養物を形成することはコストや手間がかかる場合が多く、また用いる細胞によっては該細胞の所望の性質を保ったままシート状細胞培養物を形成することが困難である場合もある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特表２００７−５２８７５５号公報
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Shimizu et al., Circ Res. 2002 Feb 22;90(3):e40-e48
【非特許文献２】Matsuura et al., Biomaterials. 2011 Oct;32(30):7355-62
【非特許文献３】Kawamura et al., Circulation. 2012 Sep 11;126(11 Suppl 1):S29-37
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本開示は、ｉＰＳ細胞由来の分化誘導細胞、特に心筋細胞、を該細胞の機能を高度に有したまま含み、高品質なシート状細胞培養物などの移植片を製造する方法、当該方法を用いて製造された移植片、当該移植片を用いた疾患の処置方法などを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
移植の用に供する心筋細胞を含む移植片を調製するにあたっては、ゼノフリー環境下で調製される必要がある。また、ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を用いたり無血清培地を用いたりすると、心筋細胞が十分に拍動しないなどの問題が見出されていた。【０００８】
本発明者らは、ゼノフリー環境下で調製しても十分な機能を有するｉＰＳ細胞由来の心筋細胞を用いた生体移植用のシート状細胞培養物の調製を試みる中で、血清の代わりに血小板溶解物（Platelet lysate）を用いると、血清を用いた場合よりも短時間で強い拍動を観察できるという新たな知見を見出した。かかる知見に基づいてさらに研究を進め、ｉＰＳ細胞から分化誘導された種々の体細胞を含有する移植片の調製において、臨床応用に耐え得る高品質な移植片を製造することが可能であることを見出し、本発明を完成させるに至った。【０００９】
すなわち、本発明に下記に掲げるものに関する：
［１］多能性幹細胞から分化誘導された細胞を含む移植片を製造する方法であって；
（ａ）前記細胞を含む細胞集団を、培養基材上に播種する工程、および
（ｂ）播種した細胞集団を、血小板溶解物を含む移植片形成媒体で移植片形成培養する工程、
を含む、前記方法。
［２］多能性幹細胞が、ｉＰＳ細胞である、［１］の方法。
［３］移植片が、シート状細胞培養物である、［１］または［２］の方法。
［４］移植片形成媒体が、移植片に含まれる細胞種と異種の血清を含まない、［１］〜［３］の方法。
［５］移植片形成媒体が、さらに細胞接着性成分を含む、［１］〜［４］の方法。
［６］培養基材が、細胞接着性成分および／または血小板溶解物でコーティングされている、［１］〜［５］の方法。
［７］細胞が、心筋細胞である、［１］〜［６］の方法。
［８］ｉＰＳ細胞から分化誘導した心筋細胞を含む移植片において該心筋細胞の拍動開始を早める方法であって、前記心筋細胞を含む細胞集団を、血小板溶解物を含む移植片形成媒体で移植片形成培養することを含む、前記方法。
【発明の効果】
【００１０】
本発明によれば、ｉＰＳ細胞から分化誘導した分化誘導細胞、特に心筋細胞を含む細胞集団から、従来よりも高品質なシート状細胞培養物などの移植片を高効率に製造することができる。特にｉＰＳ細胞から分化誘導した心筋細胞など、再生医療に用いるシート状細胞培養物などの移植片の調製において、所望の性質を高いレベルで保持した移植片を調製可能であり、とくにヒトへの生体移植用に非常に好適な移植片を提供することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】図１は、例２における無血清培地とＰＬ含有培地とをそれぞれ用いてシート化培養を行った場合の結果の比較を表す表である。ＰＬ含有培地を用いた場合は、２日間の培養で全てのロットでシートが得られたが、無血清培地を用いた場合は、半分のロットで破損などによりシートができなかった。
【図２】図２は、ＦＢＳ含有培地を用いた場合と、ＰＬ含有培地を用いた場合とで作成されるシート状心筋細胞培養物の拍動の様子を比較したグラフである。ＰＬ含有培地で作成されたものは、ＦＢＳ含有培地で作成されたものと比較して、早期に強い拍動が観察された。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
以下、本発明を詳細に説明する。
本明細書において別様に定義されない限り、本明細書で用いる全ての技術用語および科学用語は、当業者が通常理解しているものと同じ意味を有する。本明細書中で参照する全ての特許、出願および他の出版物や情報は、その全体を参照により本明細書に援用する。また本明細書において参照された出版物と本明細書の記載に矛盾が生じた場合は、本明細書の記載が優先されるものとする。
【００１３】
本開示は、多能性幹細胞から分化誘導された細胞を含む移植片を製造する方法であって；
（ａ）前記細胞を含む細胞集団を、培養基材上に播種する工程、および
（ｂ）播種した細胞集団を、血小板溶解物を含む培地で移植片形成培養する工程、
を含む、前記方法に関する。
【００１４】
本開示において、「移植片」とは、生体内へ移植するための構造物を意味し、特に細胞を構成成分として含む移植用構造物を意味する。移植片において細胞同士は接着して全体としてある形状を形成している状態を少なくとも一つ含み、一つ一つの細胞が全てバラバラに遊離して存在している、いわゆる懸濁状態は、本開示の「移植片」には含まれない。好ましい一態様においては、移植片は、細胞および細胞由来の物質以外の構造物（例えばスキャフォールドなど）を含まない移植用構造物である。本開示における移植片としては、これに限定するものではないが、例えばシート状細胞培養物、スフェロイド、細胞凝集塊、細胞懸濁物、フィブリンゲルを含む細胞懸濁物、ナノファイバーを用いた細胞培養物などが挙げられ、好ましくはシート状細胞培養物またはスフェロイド、より好ましくはシート状細胞培養物である。
【００１５】
本開示において、「シート状細胞培養物」は、細胞が互いに連結してシート状になったものをいう。本開示において、「スフェロイド」は細胞が互いに連結して略球状になったものをいう。細胞同士は、直接（接着分子などの細胞要素を介するものを含む）および／または介在物質を介して、互いに連結していてもよい。介在物質としては、細胞同士を少なくとも物理的（機械的）に連結し得る物質であれば特に限定されないが、例えば、細胞外マトリックスなどが挙げられる。介在物質は、好ましくは細胞由来のもの、特に、シート状細胞培養物やスフェロイドを構成する細胞に由来するものである。細胞は少なくとも物理的（機械的）に連結されるが、さらに機能的、例えば、化学的、電気的に連結されてもよい。シート状細胞培養物は、１の細胞層から構成されるもの（単層）であっても、２以上の細胞層から構成されるもの（積層体（多層）、例えば、２層、３層、４層、５層、６層など）であってもよい。また、シート状細胞培養物は、細胞が明確な層構造を示すことなく、細胞１個分の厚みを超える厚みを有する３次元構造を有してもよい。例えば、シート状細胞培養物の垂直断面において、細胞が水平方向に均一に整列することなく、不均一に（例えば、モザイク状に）配置された状態で存在していてもよい。 
【００１６】
本開示の移植片、特にシート状細胞培養物は、好ましくはスキャフォールド（支持体）を含まない。スキャフォールドは、その表面上および／またはその内部に細胞を付着させ、シート状細胞培養物の物理的一体性を維持するために当該技術分野において用いられることがあり、例えば、ポリビニリデンジフルオリド（ＰＶＤＦ）製の膜等が知られているが、本開示の移植片は、かかるスキャフォールドがなくともその物理的一体性を維持することができる。また、本開示のシート状細胞培養物は、好ましくは、移植片を構成する細胞由来の物質のみからなり、それら以外の物質を含まない。
【００１７】
細胞は異種由来細胞であっても同種由来細胞であってもよい。ここで「異種由来細胞」は、シート状細胞培養物が移植に用いられる場合、そのレシピエントとは異なる種の生物に由来する細胞を意味する。例えば、レシピエントがヒトである場合、サルやブタに由来する細胞などが異種由来細胞に該当する。また、「同種由来細胞」は、レシピエントと同一の種の生物に由来する細胞を意味する。例えば、レシピエントがヒトである場合、ヒト細胞が同種由来細胞に該当する。同種由来細胞は、自己由来細胞（自己細胞または自家細胞ともいう）、すなわち、レシピエントに由来する細胞と、同種非自己由来細胞（他家細胞ともいう）を含む。自己由来細胞は、移植しても拒絶反応が生じないため、本開示においては好ましい。しかしながら、異種由来細胞や同種非自己由来細胞を利用することも可能である。異種由来細胞や同種非自己由来細胞を利用する場合は、拒絶反応を抑制するため、免疫抑制処置が必要となることがある。なお、本明細書中で、自己由来細胞以外の細胞、すなわち、異種由来細胞と同種非自己由来細胞を非自己由来細胞と総称することもある。本開示の一態様において、細胞は自家細胞または他家細胞である。本開示の一態様において、細胞は自家細胞（自家ｉＰＳ細胞を含む）である。本開示の別の態様において、細胞は他家細胞（他家ｉＰＳ細胞を含む）である。
【００１８】
本開示の移植片を構成する細胞は、多能性幹細胞から分化誘導された細胞であって、シート状細胞培養物などの移植片を形成し得るものであれば特に限定されず、例えば、接着細胞（付着性細胞）を含む。接着細胞は、例えば、接着性の体細胞（例えば、心筋細胞、線維芽細胞、上皮細胞、内皮細胞、肝細胞、膵細胞、腎細胞、副腎細胞、歯根膜細胞、歯肉細胞、骨膜細胞、皮膚細胞、滑膜細胞、軟骨細胞など）および幹細胞（例えば、筋芽細胞、心臓幹細胞などの組織幹細胞、間葉系幹細胞等）などを含む。体細胞は、幹細胞、特にｉＰＳ細胞から分化させたもの（ｉＰＳ細胞由来接着細胞）であってもよい。シート状細胞培養物を構成する細胞の非限定例としては、例えば、ｉＰＳ細胞由来の心筋細胞、線維芽細胞、上皮細胞、内皮細胞、肝細胞、膵細胞、腎細胞、副腎細胞、歯根膜細胞、歯肉細胞、骨膜細胞、皮膚細胞、滑膜細胞、軟骨細胞などが挙げられる。
【００１９】
移植片を構成する細胞は、移植片による治療が可能な任意の生物に由来し得る。かかる生物には、限定されずに、例えば、ヒト、非ヒト霊長類、イヌ、ネコ、ブタ、ウマ、ヤギ、ヒツジ、げっ歯目動物（例えば、マウス、ラット、ハムスター、モルモットなど）、ウサギなどが含まれる。また、移植片を構成する細胞の種類の数は特に限定されず、１種類のみの細胞で構成されていてもよいが、２種類以上の細胞を用いたものであってもよい。移植片を形成する細胞が２種類以上ある場合、最も多い細胞の含有比率（純度）は、移植片の形成終了時において、例えば５０％以上、好ましくは６０％以上、より好ましくは７０％以上、さらに好ましくは７５％以上であり得る。
【００２０】
培養基材は、細胞がその上で細胞培養物を形成し得るものであれば特に限定されず、例えば、種々の材質および／または形状の容器、容器中の固形もしくは半固形の表面などを含む。容器は、培養液などの液体を透過させない構造・材料が好ましい。かかる材料としては、限定することなく、例えば、ポリエチレン、ポリプロピレン、テフロン（登録商標）、ポリエチレンテレフタレート、ポリメチルメタクリレート、ナイロン６，６、ポリビニルアルコール、セルロース、シリコン、ポリスチレン、ガラス、ポリアクリルアミド、ポリジメチルアクリルアミド、金属（例えば、鉄、ステンレス、アルミニウム、銅、真鍮）等が挙げられる。また、容器は、少なくとも１つの平坦な面を有することが好ましい。かかる容器の例としては、限定することなく、例えば、細胞培養物の形成が可能な培養基材で構成された底面と、液体不透過性の側面とを備えた培養容器が挙げられる。かかる培養容器の特定の例としては、限定されずに、細胞培養皿、細胞培養ボトルなどが挙げられる。容器の底面は透明であっても不透明であってもよい。容器の底面が透明であると、容器の裏側から細胞の観察、計数などが可能となる。また、容器は、その内部に固形もしくは半固形の表面を有してもよい。固形の表面としては、上記のごとき種々の材料のプレートや容器などが、半固形の表面としては、ゲル、軟質のポリマーマトリックスなどが挙げられる。培養基材は、上記材料を用いて作製してもよいし、市販のものを利用してもよい。
【００２１】
好ましい培養基材としては、限定することなく、例えば、シート状細胞培養物の形成に適した、接着性の表面を有する基材、スフェロイドの形成に適した、低接着性の表面を有する基材および／または均一なウェル状構造を有する基材などが挙げられる。具体的には、シート状細胞培養物の形成の場合であれば、例えば、コロナ放電処理したポリスチレン、コラーゲンゲルや親水性ポリマーなどの親水性化合物を該表面にコーティングした基材、さらには、コラーゲン、フィブロネクチン、ラミニン、ビトロネクチン、プロテオグリカン、グリコサミノグリカンなどの細胞外マトリックスや、カドヘリンファミリー、セレクチンファミリー、インテグリンファミリーなどの細胞接着因子などを表面にコーティングした基材などが挙げられる。また、かかる基材は市販されている（例えば、Corning(R) TC-Treated Culture Dish、Corningなど）。またスフェロイドの形成の場合であれば、例えば軟寒天、ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）（ＰＩＰＡＡｍ）をポリエチレングリコール（ＰＥＧ）で架橋した温度応答性ゲル（市販名：メビオールゲル）、ポリメタクリル酸ヒドロキシエチル（ポリＨＥＭＡ）、２−メタクリロイルオキシエチルホスホリスコリン（ＭＰＣ）ポリマーなどのハイドロゲルなどの非細胞接着性化合物を表面にコーティングした基材および／または均一な凹凸構造を表面に有する基材などが挙げられる。かかる基材もまた市販されている（例えば、EZSPHERE(R)など）。培養基材は全体または部分が透明であっても不透明であってもよい。 
【００２２】
培養基材は、刺激、例えば、温度や光に応答して物性が変化する材料で表面が被覆されていてもよい。かかる材料としては、限定されずに、例えば、（メタ）アクリルアミド化合物、Ｎ−アルキル置換（メタ）アクリルアミド誘導体（例えば、Ｎ−エチルアクリルアミド、Ｎ−ｎ−プロピルアクリルアミド、Ｎ−ｎ−プロピルメタクリルアミド、Ｎ−イソプロピルアクリルアミド、Ｎ−イソプロピルメタクリルアミド、Ｎ−シクロプロピルアクリルアミド、Ｎ−シクロプロピルメタクリルアミド、Ｎ−エトキシエチルアクリルアミド、Ｎ−エトキシエチルメタクリルアミド、Ｎ−テトラヒドロフルフリルアクリルアミド、Ｎ−テトラヒドロフルフリルメタクリルアミド等）、Ｎ，Ｎ−ジアルキル置換（メタ）アクリルアミド誘導体（例えば、Ｎ，Ｎ−ジメチル（メタ）アクリルアミド、Ｎ，Ｎ−エチルメチルアクリルアミド、Ｎ，Ｎ−ジエチルアクリルアミド等）、環状基を有する（メタ）アクリルアミド誘導体（例えば、１−（１−オキソ−２−プロペニル）−ピロリジン、１−（１−オキソ−２−プロペニル）−ピペリジン、４−（１−オキソ−２−プロペニル）−モルホリン、１−（１−オキソ−２−メチル−２−プロペニル）−ピロリジン、１−（１−オキソ−２−メチル−２−プロペニル）−ピペリジン、４−（１−オキソ−２−メチル−２−プロペニル）−モルホリン等）、またはビニルエーテル誘導体（例えば、メチルビニルエーテル）のホモポリマーまたはコポリマーからなる温度応答性材料、アゾベンゼン基を有する光吸収性高分子、トリフェニルメタンロイコハイドロオキシドのビニル誘導体とアクリルアミド系単量体との共重合体、および、スピロベンゾピランを含むＮ−イソプロピルアクリルアミドゲル等の光応答性材料などの公知のものを用いることができる（例えば、特開平２−２１１８６５、特開２００３−３３１７７参照）。これらの材料に所定の刺激を与えることによりその物性、例えば、親水性や疎水性を変化させ、同材料上に付着した細胞培養物の剥離を促進することができる。温度応答性材料で被覆された培養皿は市販されており（例えば、CellSeed Inc.のUpCell(R)）、これらを本開示の製造方法に使用することができる。 
【００２３】
培養基材は、種々の形状であってもよい。また、その面積は特に限定されないが、例えば、約１ｃｍ２〜約２００ｃｍ２、約２ｃｍ２〜約１００ｃｍ２、約３ｃｍ２〜約５０ｃｍ２などであってよい。例えば、培養基材として直径１０ｃｍの円形の培養皿が挙げられる。この場合、面積は５６．７ｃｍ２となる。培養表面は平坦であってもよいし、凹凸構造を有していてもよい。凹凸構造を有する場合、均一な凹凸構造であることが好ましい。
【００２４】
本開示において、「人工多能性幹細胞」または「ｉＰＳ細胞」は、当該技術分野で周知の用語であり、体細胞へ複数の遺伝子を導入することにより、三胚葉、すなわち内胚葉、中胚葉および外胚葉に属する全ての系列の細胞に分化することができる能力を獲得させた細胞を意味する。すなわち、人工多能性幹細胞またはｉＰＳ細胞とは、遺伝子を導入することにより誘導された、分化万能性および自己複製能を有する細胞である。ｉＰＳ細胞を特定の細胞に分化誘導する際には、まずｉＰＳ細胞を浮遊培養して、上記三胚葉のいずれかの細胞の凝集体を形成し、その後凝集体を形成する細胞を目的とする特定の細胞に分化誘導させる。本開示において、ｉＰＳ細胞は、任意の哺乳動物の細胞であり得るが、好ましくはヒト細胞から誘導されたｉＰＳ細胞である。
【００２５】
本開示において、「ｉＰＳ細胞由来の分化誘導細胞」は、ｉＰＳ細胞から特定の種類の細胞に分化するように分化誘導処理された任意の細胞を意味する。分化誘導細胞の非限定例は、心筋細胞、骨格筋芽細胞などの筋肉系の細胞、ニューロン細胞、オリゴデンドロサイト、ドーパミン産生細胞などの神経系の細胞、網膜色素上皮細胞などの網膜細胞、血球細胞、骨髄細胞などの造血系の細胞、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞、樹状細胞、Ｂ細胞などの免疫関連の細胞、肝細胞、膵β細胞、腎細胞などの臓器を構成する細胞、軟骨細胞、生殖細胞などの他、これらの細胞に分化する前駆細胞や体性幹細胞などを含む。かかる前駆細胞や体性幹細胞の典型例としては、例えば心筋細胞における間葉系幹細胞、多分化性心臓前駆細胞、単能性心臓前駆細胞、神経系の細胞における神経幹細胞、造血系の細胞や免疫関連の細胞における造血幹細胞およびリンパ系幹細胞などが挙げられる。ｉＰＳ細胞の分化誘導は、既知の任意の手法を用いて行うことができる。例えば、ｉＰＳ細胞から心筋細胞への分化誘導は、Miki et al., Cell Stem Cell 16, 699-711, June 4, 2015やＷＯ２０１４／１８５３５８に記載の手法に基づいて行うことができる。
【００２６】
また分化誘導細胞は、リプログラミングのための遺伝子以外の任意の有用な遺伝子が導入されたｉＰＳ細胞から誘導された細胞であってもよい。かかる細胞の非限定例としては、例えば、Themeli M. et al. Nature Biotechnology, vol. 31, no. 10, pp. 928-933, 2013に記載のキメラ抗原受容体の遺伝子が導入されたｉＰＳ細胞から誘導されるＴ細胞などが挙げられる。また、ｉＰＳ細胞から分化誘導された後、任意の有用な遺伝子が導入された細胞もまた、本発明の分化誘導細胞に包含される。
【００２７】
以下に所望の細胞がｉＰＳ細胞から分化誘導された心筋細胞であり、移植片がシート状細胞培養物である場合を例として、本発明を詳述する。
本開示の一側面は、ｉＰＳ細胞から分化誘導された心筋細胞を含む高品質なシート状細胞培養物を製造する方法に関する。本開示の方法は、以下の工程（ａ）および（ｂ）を含む：
（ａ）ｉＰＳ細胞から分化誘導された心筋細胞を含む細胞集団を、培養基材上に播種する工程、および
（ｂ）播種した細胞集団を、血小板溶解物を含むシート化媒体でシート化培養する工程。
【００２８】
本開示において、「心筋細胞」とは、心筋細胞の特徴を有する細胞を意味する。心筋細胞の特徴としては、限定されずに、例えば、心筋細胞マーカーの発現、自律的拍動の存在などが挙げられる。心筋細胞マーカーの非限定例としては、例えば、ｃ−ＴＮＴ（cardiac troponin T）、ＣＤ１７２ａ（別名ＳＩＲＰＡまたはＳＨＰＳ−１）、ＫＤＲ（別名ＣＤ３０９、ＦＬＫ１またはＶＥＧＦＲ２）、ＰＤＧＦＲＡ、ＥＭＩＬＩＮ２、ＶＣＡＭなどが挙げられる。一態様において、ｉＰＳ細胞由来の心筋細胞は、ｃ−ＴＮＴ陽性かつ／またはＣＤ１７２ａ陽性である。
【００２９】
工程（ａ）において、培養基材への播種は、例えば、細胞をシート化媒体に懸濁した細胞懸濁液を、培養基材を備えた培養容器に注入することなどにより行ってもよい。細胞懸濁液の注入には、スポイトやピペットなど、細胞懸濁液の注入操作に適した器具を用いることができる。細胞の播種密度は、シート状細胞培養物を形成し得る密度で行われ、かかる密度は所望の細胞により異なり得るが、当業者であれば当該技術分野において公知の手法などから適切な密度を選択することができる。例えば心筋細胞を含むシート状細胞培養物である場合、例えば２．０×１０５個／ｃｍ２以上などであり得るが、より高密度で播種してもよい。
【００３０】
より高密度の例としては、例えばコンフルエントに達する密度、すなわち播種した際に細胞が培養容器の接着表面一面を覆うことが想定される程度の密度、例えば、播種した際に、細胞が互いに接触することが想定される程度の密度、接触阻害が発生する密度、または接触阻害により細胞の増殖を実質的に停止する密度であり得る。播種密度の上限は、特に制限されないが、密度が過度に高い場合には、死滅する細胞が多くなり、非効率となる。本開示の一態様において、播種密度は、例えば約１．０×１０６個／ｃｍ２〜約１．０×１０７個／ｃｍ２、約１．０×１０６個／ｃｍ２〜約５．０×１０６個／ｃｍ２、約１．０×１０６個／ｃｍ２〜約３．０×１０６個／ｃｍ２、約１．５×１０６個／ｃｍ２〜約１．０×１０７個／ｃｍ２、約１．５×１０６個／ｃｍ２〜約５．０×１０６個／ｃｍ２、約１．５×１０６個／ｃｍ２〜約３．０×１０６個／ｃｍ２、約２．０×１０６個／ｃｍ２〜約１．０×１０７個／ｃｍ２、約２．０×１０６個／ｃｍ２〜約５．０×１０６個／ｃｍ２、約２．０×１０６個／ｃｍ２〜約３．０×１０６個／ｃｍ２などであり得る。好ましい一態様において、播種密度は、約１．７６×１０６個／ｃｍ２〜約２．３３×１０６個／ｃｍ２である。
【００３１】
播種される培養基材は、上記で詳述したとおりであるが、好ましい一態様において、細胞外マトリクスや細胞接着因子などの細胞接着性成分を表面にコーティングした培養基材である。細胞接着性成分としては、これに限定するものではないが、例えばコラーゲン、フィブロネクチン、ラミニン、ビトロネクチン、プロテオグリカン、グリコサミノグリカンなどの細胞外マトリックス、カドヘリンファミリー、セレクチンファミリー、インテグリンファミリーなどの細胞接着因子などが挙げられるほか、これらの改変物、例えばラミニン５１１（ラミニンの改変物）、ＶＴＮ−Ｎ（ビトロネクチンの改変物）、レトロネクチン(R)（フィブロネクチンの改変物）、であってもよい。
【００３２】
播種される細胞集団は、ｉＰＳ細胞から分化誘導された心筋細胞を含んでいれば、他の細胞を含んでいてもよい。一般にｉＰＳ細胞から心筋細胞へ分化誘導して得られる細胞集団には、心筋細胞の他、例えば線維芽細胞や血管内皮細胞などが含まれ得る。細胞集団は、例えば上記Miki et al., Cell Stem Cell 16, 699-711, June 4, 2015やＷＯ２０１４／１８５３５８に記載の手法などを用いてｉＰＳ細胞から分化誘導して得られた細胞集団をそのまま用いてもよいし、凍結保存やプレ培養などを実施した後に用いてもよい。好ましい一態様において、播種される細胞集団は、ｉＰＳ細胞から分化誘導後、培養基材上（好ましくは平面状の培養基材上）に播種して接着培養を行い、その後回収された細胞集団である。かかる接着培養の前または後に、凍結保存および解凍を実施してもよい。接着培養を行うことにより、その後の移植片の形成において、高品質な移植片の形成を、高確率で達成することが可能となる。一態様において、形成された移植片には心筋細胞のほかにのほかに血管内皮細胞、細胞壁、線維芽細胞を含んでもよい。本開示の移植片に含まれる細胞の構成比は、例えば、心筋細胞約３０〜７０％、血管内皮細胞０．１％〜約２０％、および壁細胞約１％〜約４０％であってもよい。
かかる接着培養ステップにおいて、培養条件などは、通常の接着培養を行う場合の条件に準じてよい。例えば、市販の接着培養用培養容器を用いて、３７℃、５％ＣＯ２条件下での培養などであってよい。細胞の播種密度は、細胞同士の接着および／または細胞と培養基材との接着の形成を妨げない密度であればいかなる密度であってもよく、例えばサブコンフルエントな密度であってもよいし、コンフルエントに達する密度またはそれ以上であってもよい。培養時間は、細胞同士の接着および／または細胞と培養基材との接着が形成される程度の時間であればよく、具体的には例えば２〜１６８時間、２〜１４４時間、２〜１２０時間、２〜９６時間、２〜７２時間、２〜４８時間、２〜２４時間、２〜１２時間、２〜６時間、２〜４時間程度であればよい。
【００３３】
工程（ｂ）において、播種した細胞をシート化培養する。本明細書においては、播種した細胞を移植片として形成するための培養を「移植片形成培養」と称し、移植片がシート状細胞培養物であり、播種した細胞をシート化するための培養を特に、「シート化培養」と称する。播種した細胞のシート化は、既知の任意の手法および条件で行うことができる。かかる手法の非限定例は、例えば、特開2010-081829、特開2010-226991、特開2011-110368、特開2011-172925、WO 2014/185517などに記載されている。細胞のシート化は、細胞同士が接着分子や、細胞外マトリックスなどの細胞間接着機構を介して互いに接着することにより達成されると考えられている。したがって、播種した細胞をシート化するステップは、例えば、細胞を、細胞間接着を形成する条件下で培養することにより達成することができる。かかる条件は、細胞間接着を形成することができればいかなるものであってもよいが、通常は一般的な細胞培養条件と同様の条件であれば細胞間接着を形成することができる。かかる条件としては、例えば、約３７℃、５％ＣＯ２での培養が挙げられる。また、培養は通常の圧力下（大気圧下、非加圧下）で行うことができる。培養は任意の大きさおよび形状の容器で行うことができる。シート状細胞培養物の大きさや形状は、培養容器の細胞付着面の大きさ・形状を調整すること、または、培養容器の細胞付着面に、所望の大きさ・形状の型枠を設置し、その内部で細胞を培養することなどにより任意に調節することができる。
【００３４】
シート化培養の時間は、播種する細胞の種類や細胞密度により異なり得る。例えばｉＰＳ細胞から心筋細胞を調製してシート化する場合、例えば約２．１×１０５個／ｃｍ２などの密度で播種し、４日以上培養することによりシート化を行ってよい。また、播種密度をコンフルエントに達する密度、すなわちより高密度で播種する場合、シート化培養の期間を短縮することができ、培養時間は２〜４日、より好ましくは２〜３日であってよい。
【００３５】
移植片形成（例えばシート化）に用いる媒体（移植片形成媒体、移植片形成がシート化である場合は特にシート化媒体と称する場合もある）としては、細胞の移植片形成を可能にするものであれば特に限定されず、例えば、生理食塩水、種々の生理緩衝液（例えば、ＰＢＳ、ＨＢＳＳ等）、種々の細胞培養用の基礎培地をベースにしたものなどを使用してもよい。かかる基礎培地には、限定されずに、例えば、ＤＭＥＭ、ＭＥＭ、Ｆ１２、ＤＭＥ、ＲＰＭＩ１６４０、ＭＣＤＢ（ＭＣＤＢ１０２、１０４、１０７、１２０、１３１、１５３、１９９など）、Ｌ１５、ＳｋＢＭ、ＲＩＴＣ８０−７、ＤＭＥＭ／Ｆ１２などが含まれる。これらの基礎培地の多くは市販されており、その組成も公知となっている。基礎培地は、標準的な組成のまま（例えば、市販されたままの状態で）用いてもよいし、細胞種や細胞条件に応じてその組成を適宜変更してもよい。したがって、本発明に用いる基礎培地は、公知の組成のものに限定されず、１または２以上の成分が追加、除去、増量もしくは減量されたものを含む。移植片形成媒体は、通常血清（例えば、ウシ胎仔血清などのウシ血清、ウマ血清、ヒト血清等）、種々の成長因子（例えば、ＦＧＦ、ＥＧＦ、ＶＥＧＦ、ＨＧＦ等）などの添加物を含んでもよいが、移植片をゼノフリー条件下で製造する場合、特にウシ血清、ウマ血清など、移植片に含まれる細胞が由来する種と異種の血清を含まないことが好ましい。本開示は、血清や成長因子に代えてまたは加えて、血小板溶解物を含む移植片形成媒体で移植片形成培養を行うことを特徴とする。好ましい一態様において、移植片形成媒体は血小板溶解物を含むが、血清を含まない。
【００３６】
本開示において、「血小板溶解物」（Platelet lysate：ＰＬ）は、血小板に対して凍結融解を繰り返すことにより得られる、成長因子等を豊富に含む組成物をいう。血小板溶解物は、近年では、間葉系幹細胞の増殖を促進することなどが知られている。本発明者らは、ｉＰＳ細胞から誘導された心筋細胞を含むシート状細胞培養物の製造において、シート化媒体に血小板溶解物を含有せしめることにより、従来よりも早い培養日数で、強い自律拍動が観察されることを初めて見出した。
【００３７】
血小板溶解物は、細胞培養用の培地添加物として市販されており、当該技術分野において公知である。血小板溶解物は、例えば特表2014-533715、Bieback et al., STEM CELLS, 2009;27:2331-2341などに記載の方法などにより調製可能である。
具体的な調製方法としては、例えば、血小板の集団を溶解させ、そこから血小板の粒子や膜などの夾雑物を除去して上清を得るなどの手段により調製できる。血小板の溶解は、化学的手段（例えばＣａＣｌ２の使用など）、浸透圧的手段（例えば蒸留水の使用など）、凍結融解手段、機械的破壊手段などの工程を介して達成することができる。夾雑物の除去は、遠心分離やろ過などの方法により達成することができる。
【００３８】
移植片形成媒体中に含まれる血小板溶解物の濃度は、当該技術分野において通常用いられる程度であればよく、例えば１％、２．５％、５％、１０％、１５％、２０％などであってよい。好ましい一態様において、血小板溶解物は、移植片形成媒体中に１％〜２０％、より好ましくは２％〜１０％、さらに好ましくは２．５％〜１０％程度含有される。
【００３９】
移植片形成媒体は、移植片形成培養中に適宜入れ替えてよい。また、移植片形成の進行に合わせて媒体の組成を変化させてもよい。本発明者らは、ｉＰＳ細胞から誘導された心筋細胞を含むシート状細胞培養物の製造において、Ｒｈｏキナーゼ（ＲＯＣＫ）阻害剤を添加したシート化媒体を、シート化培養１日目の媒体として用いることにより、効果的にシート状細胞培養物が形成されることを新たに見出した。したがって本開示の好適な一態様において、１日目のシート化培養に用いるシート化媒体は、Ｒｈｏキナーゼ阻害剤を含む。かかる態様においては、２日目以降のシート化媒体にはＲｈｏキナーゼ阻害剤を含んでも含まなくてもよいが、好ましくはＲｈｏキナーゼ阻害剤を含まない。
【００４０】
シート化媒体は、さらに細胞接着性成分を含んでよい。細胞接着性成分については上記で詳述したとおりである。シート化媒体に細胞接着性成分が含まれる場合、培養基材は細胞接着性成分でコーティングされていてもコーティングされていなくてもよい。培養基材が細胞接着性成分でコーティングされている場合、シート化媒体に含まれる細胞接着性成分は、培養基材をコーティングしている細胞接着性成分と同一であってもよいし異なっていてもよいが、好ましくは同一の細胞接着性成分である。
【００４１】
移植片形成媒体に含まれる細胞接着性成分の濃度は、含まれる細胞接着性成分の種類や移植片形成する細胞の状態などにより異なり得る。例えば、バイアビリティの低い、すなわち活性が弱い細胞を用いている場合、細胞接着性成分の含有量は少ない方がよい。シート化媒体に含まれる細胞接着性成分の濃度は、培養基材のコーティング剤として同じ細胞接着性成分を用いる場合に使用する濃度を基準（１００％）として、約０．１％、約０．５％、約１％、約５％、約１０％、約２０％、約２５％、約５０％、約７５％、約１００％などであってよい。したがって好ましい一態様において、シート化媒体に含まれる細胞接着性成分の濃度範囲は、培養基材のコーティング剤として同じ細胞接着性成分を用いる場合に使用する濃度を基準（１００％）として、約０．１％〜約１００％、約０．１％〜約１００％、約０．１％〜約５０％、約０．１％〜約２５％、約０．１％〜約２０％、約０．１％〜約１０％、約１％〜約１００％、約１％〜約１００％、約０．５％〜約１００％、約０．５％〜約１００％、約０．５％〜約５０％、約０．５％〜約２５％、約０．５％〜約２０％、約０．５％〜約１０％、約１％〜約５０％、約１％〜約２５％、約１％〜約２０％、約１％〜約１０％、約０．５％〜約１００％、約５％〜約１００％、約５％〜約５０％、約５％〜約２５％、約５％〜約２０％、約５％〜約１０％などであってよい。
【００４２】
本開示の別の側面は、ｉＰＳ細胞から分化誘導した心筋細胞を含む移植片において心筋細胞の拍動開始を早める方法であって、前記心筋細胞を含む細胞集団を、血小板溶解物を含む移植片形成媒体中で移植片形成培養することを含む、前記方法に関する。本発明者らは、ｉＰＳ細胞から分化誘導した心筋細胞を含む移植片を形成する際に移植片形成媒体に血小板溶解物を添加することにより、無血清媒体での移植片形成を行う場合と比較して心筋細胞の拍動開始が早まることを見出した。これにより、ゼノフリー環境において簡便に、かつ高品質な移植片を形成することが可能となる。
【００４３】
本開示の別の側面は、本開示の方法により製造された移植片の有効量を、それを必要とする対象に適用することを含む、前記対象における疾患を処置する方法に関する。処置の対象となる疾患は、上記したとおりである。
【００４４】
本開示において、用語「処置」は、疾患の治癒、一時的寛解または予防などを目的とする医学的に許容される全ての種類の予防的および／または治療的介入を包含するものとする。例えば、「処置」の用語は、組織の異常に関連する疾患の進行の遅延または停止、病変の退縮または消失、当該疾患発症の予防または再発の防止などを含む、種々の目的の医学的に許容される介入を包含する。
【００４５】
本開示の処置方法においては、移植片の生存性、生着性および／または機能などを高める成分や、対象疾患の処置に有用な他の有効成分などを、本開示の移植片等と併用することができる。
【００４６】
本開示の処置方法は、本開示の製造方法に従って、本開示の移植片を製造するステップをさらに含んでもよい。本開示の処置方法は、移植片を製造するステップの前に、対象から移植片を製造するための細胞（例えば、皮膚細胞、血球等の、ｉＰＳ細胞へと誘導するための体細胞）または細胞の供給源となる組織（例えば、皮膚組織、血液等の、ｉＰＳ細胞へと誘導するための体細胞を含む組織）を採取するステップをさらに含んでもよい。一態様において、細胞または細胞の供給源となる組織を採取する対象は、細胞培養物、組成物、または移植片等の投与を受ける対象と同一の個体である。別の態様において、細胞または細胞の供給源となる組織を採取する対象は、細胞培養物、組成物、または移植片等の投与を受ける対象とは同種の別個体である。別の態様において、細胞または細胞の供給源となる組織を採取する対象は、移植片等の投与を受ける対象とは異種の個体である。
【００４７】
本開示において、有効量とは、例えば、疾患の発症や再発を抑制し、症状を軽減し、または進行を遅延もしくは停止し得る量（例えば、移植片のサイズ、重量、数等）であり、好ましくは、当該疾患の発症および再発を予防し、または当該疾患を治癒する量である。また、投与による利益を超える悪影響が生じない量が好ましい。かかる量は、例えば、マウス、ラット、イヌまたはブタなどの実験動物や疾患モデル動物における試験などにより適宜決定することができ、このような試験法は当業者によく知られている。また、処置の対象となる組織病変の大きさは、有効量決定のための重要な指標となり得る。
【００４８】
投与方法としては、例えば、静脈投与、筋肉内投与、骨内投与、髄腔内投与、組織への直接的な適用などが挙げられる。投与頻度は、典型的には１回の処置につき１回であるが、所望の効果が得られない場合には、複数回投与することも可能である。組織に適用する際、本発明の細胞培養物、組成物、またはシート状細胞培養物等を対象の組織に縫合糸やステープルなどの係止手段により固定してもよい。
【実施例】
【００４９】
本発明を以下の例を参照してより詳細に説明するが、これらは本発明の特定の具体例を示すものであり、本発明はこれらに限定されるものではない。【００５０】
以下の実施例において、多能性幹細胞として、京都大学ｉＰＳ細胞研究所（ＣｉＲＡ）で樹立された臨床用ヒトｉＰＳ細胞を用いた。M. Nakagawa et al., Scientific Reports, 4:3594 (2014)を参考に、ヒトｉＰＳ細胞をフィーダーフリー法で維持した。ついで、Miki et al., Cell Stem Cell 16, 699-711, June 4, 2015やＷＯ２０１４／１８５３５８およびＷＯ２０１７／０３８５６２の記載を参考にして、ヒトｉＰＳ細胞を心筋細胞へと分化誘導して胚様体を得た。具体的には、フィーダー細胞を含まない培養液で維持培養したヒトｉＰＳ細胞を、EZ Sphere（旭硝子）上で１０μＭのY27632（和光純薬）を含有するStemFit AK03培地（味の素）中で１日培養し、得られた胚様体をアクチビンＡ、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）４および塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）を含有する培養液中で培養し、さらにＷｎｔ阻害剤（ＩＷＰ３）およびＢＭＰ４阻害剤（Dorsomorphin）およびＴＧＦβ阻害剤（ＳＢ４３１５４２）を含む培養液中で培養し、その後ＶＥＧＦおよびｂＦＧＦを含む培養液中で培養を行うことで、ｉＰＳ細胞由来のヒト心筋細胞を得た。得られた細胞集団における心筋細胞の割合は５０％〜９０％であった。【００５１】
例１．ＦＢＳ含有培地とＰＬ含有培地との比較
上記で得られた、ヒトｉＰＳ細胞から分化誘導した心筋細胞を含む細胞集団を用い、シート化培養条件を検討した。ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地に２０％ＦＢＳまたは５％ヒト血小板溶解物をそれぞれ加えたものをシート化媒体とした。血小板溶解物を加えたシート化媒体には、さらに細胞接着性成分としてラミニン（iMatrix-511）をそれぞれ０．１μｇ／ｍＬ、０．２５μｇ／ｍＬまたは０．５μｇ／ｍＬ加えた。また、シート化培養の１日目のみ、シート化媒体にＲｈｏキナーゼ阻害剤Ｙ２７６３２を加えた。心筋細胞を含む細胞集団は、１．５×１０６個／ｃｍ２の密度で温度応答性培養皿（ＵｐＣｅｌｌ（Ｒ）、セルシード）播種し、３７℃、５％ＣＯ２の環境で３日間培養した。温度応答性培養皿は、培養液と同じもの（ただしＹ２７６３２は含まない）を入れて、３７℃で一晩インキュベートしてプレコーティングしたものを用いた。培養の後、培養皿から心筋細胞を含むシート状細胞培養物を剥離した 。【００５２】
結果を下表に示す。
【表１】
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ＦＢＳを入れたシート化媒体を用いた場合は、３日間シート化培養した時点では、拍動が観察されなかったり、また観察されても弱い拍動であったのに対し、ラミニンおよび血小板溶解物を入れたシート化媒体を用いたものは、いずれも３日間の培養で強い拍動が観察された。【００５３】
例２．無血清培地とＰＬ含有培地との比較
例１と同様に、ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地にラミニン（iMatrix-511）を０．１μｇ／ｍＬ加えたものと、それにさらに５％の血小板溶解物を加えたものをそれぞれシート化媒体として、シート化培養を行った。
結果を図１に示す。シート化培養２日目におけるシート化成功率を比較したところＰＬ群では１００％成功していたのに対し、無血清培地では５０％であった。【００５４】
また、心筋細胞の拍動の強さを計測するため、セルモーションイメージングシステムSI8000（ソニー）を用いて拍動の様子を撮影し、Analyzer Softwareで拍動の加速度（acceleration）や拍動変形距離（contration deformation distance）を算出し、例１のＦＢＳ含有培地を用いた場合と例２のＰＬ含有培地を用いた場合とで比較した。結果を図２に示す。ＰＬ含有培地を用いてシート状細胞培養物を形成した群は、ＦＢＳ含有培地を用いた群と比べて、その拍動が強いことが確認された。無血清培地を用いた場合は、培養２日目までは拍動が観察されず、３日目にようやく拍動が観察されたのに対し、ＰＬ含有培地の場合は培養２日目において既に強い拍動が観察された。【００５５】
これらのことから、ＰＬ含有培地を用いてシート化（移植片形成）をした場合は、無血清培地やＦＢＳ含有培地を用いた場合と比較して十分な細胞間ジャンクションの形成が達成されていることが予想される。そのためシート強度、心筋細胞の機能発現、成熟度などにおいて優れた移植片が形成できると考えられる。
【産業上の利用可能性】
【００５６】
本発明により、多能性幹細胞から分化誘導した細胞等を用いてシート状細胞培養物を形成する際に、高品質なシート状細胞培養物を得ることができる。特に臨床用に用いるゼノフリーなシート状細胞培養物の製造においても、高品質なシート状細胞培養物を簡便に形成することが可能となる。
【図１】
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【図２】
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【国際調査報告】
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