(57)【要約】  本発明は、細胞接着、細胞増殖、及び幹細胞能維持の少なくとも一つ、好ましくは全てを促す成分を提供することを目的とする。  一実施形態において、本発明は、DPRIEWKKI（配列番号33）、又は配列番号33のアミノ酸配列において1個のアミノ酸が付加、欠失及び／又は置換されたアミノ酸配列含むペプチド又はその塩に関する。一実施形態において、本発明は、上記ペプチド又はその塩を含む、細胞培養基材のコーティング剤、細胞増殖促進剤、幹細胞能維持剤、又は培地に関する。一実施形態において、本発明は、上記ペプチド又はその塩がコーティングされた細胞培養基材に関する。一実施形態において、本発明は、上記コーティング剤、細胞培養基材、細胞増殖促進剤、又は幹細胞能維持剤を用いる細胞培養方法に関する。一実施形態において、本発明は、上記コーティング剤で細胞培養基材をコーティングする工程を含む、細胞培養基材の生産方法に関する。
2019221039.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
DPRIEWKKI（配列番号33）、又は配列番号33のアミノ酸配列において1個のアミノ酸が付加、欠失及び／又は置換されたアミノ酸配列を含むペプチド又はその塩。
【請求項２】
請求項１に記載のペプチド又はその塩を含む、細胞培養基材のコーティング剤。
【請求項３】
請求項１に記載のペプチド又はその塩がコーティングされた、細胞培養基材。
【請求項４】
幹細胞培養用である、請求項２又は３に記載のコーティング剤又は細胞培養基材。
【請求項５】
請求項１に記載のペプチド又はその塩を含む、細胞増殖促進剤。
【請求項６】
請求項１に記載のペプチド又はその塩を含む、幹細胞能維持剤。
【請求項７】
請求項１に記載のペプチド又はその塩を含む、培地。
【請求項８】
請求項１に記載のペプチド又はその塩、請求項２〜４のいずれか一項に記載のコーティング剤若しくは細胞培養基材、請求項５に記載の細胞増殖促進剤、請求項６に記載の幹細胞能維持剤、又は請求項７に記載の培地を用いる、細胞培養方法。
【請求項９】
請求項１に記載のペプチド又はその塩、もしくは請求項２又は４に記載のコーティング剤で細胞培養基材をコーティングする工程、及び
コーティングされた細胞培養基材上で細胞を培養する工程を含む、細胞培養方法。
【請求項１０】
請求項３又は４に記載の細胞培養基材上で細胞を培養する工程を含む、細胞培養方法。
【請求項１１】
請求項７に記載の培地中で細胞を培養する工程を含む、細胞培養方法。
【請求項１２】
幹細胞培養方法である、請求項８〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
請求項２又は４に記載のコーティング剤で細胞培養基材をコーティングする工程を含む、細胞培養基材の生産方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規ペプチド又はその塩、細胞培養基材のコーティング剤、細胞増殖促進剤、幹細胞能維持剤、又は培地に関する。また、本発明は、細胞培養基材に関する。さらにまた、本発明は、細胞培養方法又は細胞培養基材の生産方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、iPS細胞の発見に端を発する再生医学の著しい進歩によって、幹細胞を用いた再生医療の実現が現実味をおびてきた。幾つかの疾患に対しては幹細胞を用いる臨床試験が開始されており、難治性疾患に対する細胞治療は今後いっそうさかんに試みられていくと考えられる。【０００３】
幹細胞を用いた細胞治療には極めて大量の細胞が必要である。実際に小型サルの心筋梗塞治療モデルでは、体重10 kg前後の個体に対して10億個もの細胞が移植された(非特許文献１)が、これは10 cm培養皿100枚以上に相当する莫大な量である。それに加えて組織幹細胞は一般に増殖速度が遅いため、品質を十分に維持したまま培養するためには様々な小分子やリコンビナント蛋白などを含んだ特殊な培地が必要であり、通常の細胞培養と比較してコストが大きい。したがって幹細胞を用いた再生医療を実施するにあたっては、飛躍的に培養効率を高める新規培養法の確立が望まれている。【０００４】
細胞培養においては、培地や添加剤など液性因子が特に注目されがちであるが、それに加えて接着基質の最適化も重要である。特に細胞接着、細胞増殖、及び幹細胞能維持の少なくとも一つ、好ましくは全てを促す接着基質又は液性因子の開発は、効率的な培養法の開発に役立つと考えられる。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Chong et al., Nature, 2014, 510, 273-277
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、細胞接着、細胞増殖、及び幹細胞能維持の少なくとも一つ、好ましくは全てを促す成分を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者は、DPRIEWKKI（配列番号33）のアミノ酸配列を含むペプチドが、細胞と接着することを見出した。また、本発明者は、配列番号33のアミノ酸配列を含むペプチドが、細胞増殖を促進し、幹細胞能を維持し得ることを見出した。【０００８】
本発明は少なくとも部分的に上記知見に基づくものであり、以下の態様を包含する。
（１）DPRIEWKKI（配列番号33）、又は配列番号33のアミノ酸配列において1個のアミノ酸が付加、欠失及び／又は置換されたアミノ酸配列を含むペプチド又はその塩。
（２）（１）に記載のペプチド又はその塩を含む、細胞培養基材のコーティング剤。
（３）（１）に記載のペプチド又はその塩がコーティングされた、細胞培養基材。
（４）幹細胞培養用である、（２）又は（３）に記載のコーティング剤又は細胞培養基材。
（５）（１）に記載のペプチド又はその塩を含む、細胞増殖促進剤。
（６）（１）に記載のペプチド又はその塩を含む、幹細胞能維持剤。
（７）（１）に記載のペプチド又はその塩を含む、培地。
（８）（１）に記載のペプチド又はその塩、（２）〜（４）のいずれかに記載のコーティング剤若しくは細胞培養基材、（５）に記載の細胞増殖促進剤、（６）に記載の幹細胞能維持剤、又は（７）に記載の培地を用いる、細胞培養方法。
（９）（１）に記載のペプチド又はその塩、もしくは（２）又は（４）に記載のコーティング剤で細胞培養基材をコーティングする工程、及び
コーティングされた細胞培養基材上で細胞を培養する工程を含む、細胞培養方法。
（１０）（３）又は（４）に記載の細胞培養基材上で細胞を培養する工程を含む、細胞培養方法。
（１１）（７）に記載の培地中で細胞を培養する工程を含む、細胞培養方法。
（１２）幹細胞培養方法である、（８）〜（１１）のいずれかに記載の方法。
（１３）（２）又は（４）に記載のコーティング剤で細胞培養基材をコーティングする工程を含む、細胞培養基材の生産方法。
（１４）（１）に記載のペプチド又はその塩を含む培地中で細胞を培養する工程を含む、細胞増殖促進方法。
（１５）（１）に記載のペプチド又はその塩を含む培地中で細胞を培養する工程を含む、幹細胞能維持方法。【０００９】
本明細書は本願の優先権の基礎となる日本国特許出願番号2018-093313号の開示内容を包含する。
【発明の効果】
【００１０】
本発明は、細胞接着、細胞増殖、及び幹細胞能維持の少なくとも一つ、好ましくは全てを向上させることによって、細胞、特に幹細胞の培養効率を向上させ得る。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】図1Aは、ADSC（adipose-derived stem cell; 脂肪由来幹細胞）の細胞抽出物とその培養上清をJAM-CのN末端を認識する抗体(抗JAM-C(N)抗体)を用いたウエスタンブロットの結果を示す。図1Bは、抗JAM-C(N)抗体に加えて、JAM-CのC末端を抗原とする別の抗体(抗JAM-C(C)抗体)を用いたウエスタンブロットの結果を示す。Controlはマウス脾臓組織、mFatはマウス脂肪組織、mADSCはマウス脂肪由来幹細胞の結果を示す。N.S.は非特異的シグナルを示す。図1Cは、C末端にHAタグを付加したJAM-Cコード配列(Jam3-HA)をHEK293T細胞に一過性発現させ、細胞抽出物と培養上清をウエスタンブロットに供した結果を示す。ControlはJAM3-HAを発現させていないHEK293T細胞の結果を示す。
【図２】図2は、リコンビナント可溶性JAM-C (以下、rJAM-Cとも記載する)とADSCの接着性の評価結果を示す。rJAM-C又は陰性コントロールとしてマウスIgG（mIgG）を（いずれも20、100、及び500 ng（それぞれ57、286、及び1,430 ng/cm2））、陽性コントロールとしてtype I collagenを（500 ng）、96穴プラスチック培養皿に加えたのち、ADSCを加えて30分後の接着細胞数をクリスタルバイオレッド染色により計測し、相対的な吸光度を測定した。吸光度は、ビヒクルの結果を1としたときの相対的な吸光度で示した。エラーバーは標準偏差を示す。アスタリスクはt検定の結果を示し、*はP<0.05; ***はP<0.001を意味する。
【図３】図3は、rJAM-C（132 ng/cm2）で被覆した12穴培養皿でADSCを培養し、幹細胞マーカーであるKlf4、Nanog、c-Myc、及びSox2の発現を半定量的RT-PCRで評価した結果を示す。結果は、mIgGの値を1としたときの相対値で示した。エラーバーは標準偏差を示す。アスタリスクはt検定の結果を示し、*はP<0.05; **はP<0.01; ***はP<0.001を意味する。
【図４】図4は、rJAM-C（104 ng/cm2）で被覆した6穴培養皿でADSCを培養し、BrdUにより増殖期にある細胞の核を標識し、DAPI陽性細胞数で除して細胞増殖を評価した結果を示す。結果はmIgGを1としたときの相対値で示した。エラーバーは標準偏差を示す。アスタリスクはt検定の結果を示し、*はP<0.05; **はP<0.01; ***はP<0.001を意味する。
【図５】図5は、実施例3で得られたペプチドのMSスペクトルの結果を示す。
【図６】図6は、JAM-C D1ペプチドとF9細胞の接着性の評価結果を示す。陰性コントロールとしてコーティングなしを、陽性コントロールとしてtype I collagen（1,430 ng/cm2）及びrJAM-C（1,430 ng/cm2）を使用し、JAM-C D1 （286 ng/cm2）を96穴プラスチック培養皿に加えたのち、F9幹細胞を加えて30分後の接着細胞数をクリスタルバイオレッド染色により計測した。細胞数はビヒクルを1とした相対値を示した。エラーバーは標準偏差を示す。アスタリスクはt検定の結果を示し、*はP<0.05; ***はP<0.001を意味する。
【図７】図7は、JAM-C D1（52 ng/cm2）で被覆した6穴培養皿でADSCを培養し、BrdUにより増殖期にある細胞の核を標識し、BrdU陽性細胞数と陰性細胞数をそれぞれDAPI陽性細胞数で除することにより、細胞増殖を評価した結果を示す。結果は総細胞数を1としたときの相対値で示した。カイ二乗検定によりP値を算出した（n=353, n=501)。
【図８】図8は、JAM-C D1（52 ng/cm2）で被覆した6穴培養皿でADSCを培養し、幹細胞マーカーであるNanog、Klf4、Sox2、及びc-Mycの発現を半定量的RT-PCRで評価した結果を示す。結果は、ビヒクルの値を1としたときの相対値で示した。エラーバーは3回の実験による標準偏差を示す。アスタリスクはt検定の結果を示し、それぞれ*はP<0.05; **はP<0.01; ***はP<0.001を意味する。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
＜１．ペプチド又はその塩＞
一態様において、本発明は、DPRIEWKKI（配列番号33）、又は配列番号33のアミノ酸配列において1個のアミノ酸が付加、欠失及び／又は置換されたアミノ酸配列を含む、又は該アミノ酸配列からなるペプチド又はその塩に関する（以下、本明細書において、本ペプチドを「本発明のペプチド」とも称する）。配列番号33のアミノ酸配列は、JAM-Cの細胞外ドメインに含まれる9アミノ酸からなる配列である。
【００１３】
本明細書において、「塩」とは、ある化合物の特定の置換基（例えば、アミノ基又はカルボキシル基）に基づいて、塩基又は酸を用いて調製された塩をいう。塩は、使用した塩基又は酸により塩基性付加塩と酸付加塩とに分類できる。
【００１４】
「塩基性付加塩」としては、例えば、ナトリウム塩、カリウム塩等のアルカリ金属塩、カルシウム塩、マグネシウム塩等のアルカリ土類金属塩、トリメチルアミン塩、トリエチルアミン塩、ジシクロヘキシルアミン塩、エタノールアミン塩、ジエタノールアミン塩、トリエタノールアミン塩、ブロカイン塩等の脂肪族アミン塩、Ｎ,Ｎ-ジベンジルエチレンジアミン等のアラルキルアミン塩、ピリジン塩、ピコリン塩、キノリン塩、イソキノリン塩等の複素環芳香族アミン塩、アルギニン塩、リジン塩等の塩基性アミノ酸塩、テトラメチルアンモニウム塩、テトラエチルアモニウム塩、ベンジルトリメチルアンモニウム塩、ベンジルトリエチルアンモニウム塩、ベンジルトリブチルアンモニウム塩、メチルトリオクチルアンモニウム塩、テトラブチルアンモニウム塩等の第４級アンモニウム塩、アンモニウム塩等が挙げられる。
【００１５】
「酸付加塩」としては、例えば、塩酸塩、硫酸塩、硝酸塩、リン酸塩、炭酸塩、炭酸水素塩、過塩素酸塩等の無機酸塩、酢酸塩、プロピオン酸塩、乳酸塩、マレイン酸塩、フマル酸塩、酒石酸塩、リンゴ酸塩、クエン酸塩、アスコルビン酸塩等の有機酸塩、メタンスルホン酸塩、イセチオン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、ｐ−トルエンスルホン酸塩等のスルホン酸塩、アスパラギン酸塩、グルタミン酸塩等の酸性アミノ酸等が挙げられる。
【００１６】
一実施形態において、本発明のペプチドは、JAM-Cの細胞外ドメインを含む。本明細書において、JAM-Cは、Junctional adhesion molecule C（接合部接着分子C）を指す。JAM-Cは免疫グロブリンスーパーファミリーに属するタンパク質で、ヒトでは血小板、T細胞、及び上皮細胞をはじめとする多様な細胞、組織において発現し、炎症応答等多彩な機能を担っていることが知られている（Ebnet, Physiol. Rev., 2017, 97, 1529-1554; Kummer et al., Cells, 2018, 26, E25）。
【００１７】
JAM-Cは、細胞外ドメインの基部での切断により可溶化されて細胞外に放出されることが報告されている(Rabquer et al., J. Immunol., 2010, 185, 1777-1785)。JAM-Cは、N末端側から順番に、IG like-1ドメイン、IG like-2ドメイン、膜貫通ドメイン、及びPC likeドメインを含み、本明細書において、「JAM-Cの細胞外ドメイン」とは、膜貫通ドメインからN末端側のアミノ酸配列、すなわちIG like-1ドメイン及びIG like-2ドメインを含むペプチドであり得る。JAM-Cの細胞外ドメインは、タンパク質のドメイン予測及び／又は他の生物種のJAM-Cとのアライメント等により、当業者であれば容易に特定することができる。ドメイン予測は、SMART及びPfam等の公のプログラムにより行うことができる。より正確にJAM-Cの細胞外ドメインを特定するには、例えば全長JAM-Cを組換え発現させ、培養上清中に分泌されるペプチドを解析してもよい。
【００１８】
本発明のペプチドは、常法に従って固相合成及び液相合成等の化学合成により調製することができる。また、本発明のペプチドは、生物学的な手法により調製することもできる。この場合、本発明のペプチドは、天然であってもよいし、組換え体であってもよい。本発明のペプチドは、当業者にとって公知の方法、例えば細胞又は組織から天然のタンパク質を精製することにより得てもよいし、又は、遺伝子組み換え法を用いて製造してもよい。例えば、本発明のペプチドは、本発明のペプチド（又はJAM-Cの全長又はJAM-Cの細胞外ドメイン）をコードするポリヌクレオチドを含むベクターを導入した宿主細胞中を培養し、細胞溶解物又は上清を回収することにより、調製することができる。組換えによりペプチドを得る場合、細胞中又は上清から得てもよい。例えば、本発明のペプチドがJAM-Cの細胞外ドメインを含む場合、JAM-Cの細胞外ドメインのみを発現させて細胞中からタンパク質を得てもよいし、JAM-Cの全長を発現させ、基部での切断により可溶化されたタンパク質を培養上清から得てもよい。
【００１９】
本発明のペプチドは、配列番号33のアミノ酸配列、又は配列番号33のアミノ酸配列において1個のアミノ酸が付加、欠失及び／又は置換されたアミノ酸配列、又はJAM-Cの細胞外ドメインに加えて、他の配列を含んでもよい。そのような配列の例として、例えば培養上性への分泌を促すシグナルペプチド、後述する回収若しくは精製、又は検出を促進するタグペプチド、及び他の機能性ペプチドの配列が挙げられる。
【００２０】
化学合成、天然、又は組換えの本発明のペプチドは、常法により回収又は精製することができる。例えば、回収又は精製は、ゲルろ過クロマトグラフィー、イオン交換カラムクロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、逆相カラムクロマトグラフィー、HPLC等のクロマトグラフィー、硫安分画、限外ろ過、及び免疫吸着法のいずれか一つ、又はこれらを二以上組み合わせて用いて行うことができる。
【００２１】
本発明のペプチドの由来となる生物種は、特に限定しない。例えば、哺乳動物（例えばヒト及びアカゲザル等の霊長類、ラット、マウス、及びドブネズミ等の実験動物、ブタ、ウシ、ウマ、ヒツジ、及びヤギ等の家畜動物、並びにイヌ及びネコ等の愛玩動物が挙げられ、好ましくはヒト又はマウス、最も好ましくはヒト）、鳥類（ニワトリ及びセキショクヤケイ等）、爬虫類、両生類（アフリカツメガエル及びネッタイツメガエル等）、及び魚類（ゼブラフィッシュ等）が挙げられ、好ましくは哺乳動物である。
【００２２】
JAM-Cのアミノ酸配列及びJAM-Cをコードする遺伝子のポリヌクレオチド配列は、当技術分野で公知の任意の方法により、例えば公のデータベース（例えば、NCBI（米国）、DDBJ（日本）、EMBL（欧州））より、入手することができる。例えば、ヒトJAM-Cは配列番号1のアミノ酸配列を含んでよく、JAM-Cをコードするポリヌクレオチドは配列番号2の塩基配列を含んでよい。同様に、アカゲザル、イヌ、マウス、ドブネズミ、ヒツジ、セキショクヤケイ、ネッタイツメガエル、及びゼブラフィッシュのJAM-Cは、配列番号3、5、7、9、11、13、15、及び17のアミノ酸配列をそれぞれ含んでよい。また、アカゲザル、イヌ、マウス、ドブネズミ、ヒツジ、セキショクヤケイ、ネッタイツメガエル、及びゼブラフィッシュのJAM-Cをコードするポリヌクレオチドは、配列番号4、6、8、10、12、14、16、及び18の塩基配列をそれぞれ含んでよい。なお、配列番号33のアミノ酸配列は、アカゲザル、イヌ、マウス、ドブネズミ、ヒツジ、セキショクヤケイ、及びネッタイツメガエルの全てのJAM-Cにおいて保存されている。
【００２３】
上記JAM-Cのアミノ酸配列中における細胞外ドメインは、上記の通りタンパク質のドメイン予測及び／又は他の生物種のJAM-Cとのアライメント等により、当業者であれば容易に特定することができる。例えば、JAM-Cの細胞外ドメインは：
（i）配列番号1、3、5、7、及び9のいずれかの1〜244位のアミノ酸配列、配列番号11の1〜263位のアミノ酸配列、配列番号13の1〜234位のアミノ酸配列、配列番号15の1〜233位のアミノ酸配列、配列番号17の1〜236位のアミノ酸配列、好ましくは1、3、5、7、及び9のいずれかの1〜244位のアミノ酸配列、最も好ましくは配列番号1の1〜244位のアミノ酸配列；
（ii）（i）のいずれかのアミノ酸配列に対して90%以上の同一性を有するアミノ酸配列；又は
（iii）（i）のいずれかのアミノ酸配列において1若しくは数個のアミノ酸が付加、欠失、及び／若しくは置換されたアミノ酸配列
を含むペプチドであってよい。
【００２４】
本明細書において、アミノ酸配列に関する「１若しくは数個」の範囲は、1から10個、好ましくは1から7個、さらに好ましくは1から5個、例えば1から4個又は1から3個、あるいは1個又は2個である。
【００２５】
本発明のペプチドのアミノ酸長は特に限定しないが、例えば8アミノ酸以上、9アミノ酸以上、又は10アミノ酸以上であってよく、例えば300以下、250以下、200以下、150以下、好ましくは100以下、50以下、40以下、30以下、20以下、15以下、又は10以下であってよい。
【００２６】
本発明のペプチドがJAM-Cの細胞外ドメインを含む場合、そのアミノ酸長は、限定しないが、例えば150アミノ酸以上、200アミノ酸以上、220アミノ酸以上、又は240アミノ酸以上であってよく、1000アミノ酸以下、500アミノ酸以下、400アミノ酸以下、又は300アミノ酸以下であってよい。
【００２７】
本発明のペプチドのアミノ酸長は、十〜数百程度と短いものであり得るため、数千という長いアミノ酸長を有するラミニン等のポリペプチドに比べて製造コストが安いという利点を有し得る。
【００２８】
一実施形態において、本発明のペプチドは、細胞接着、細胞増殖、及び幹細胞能維持の少なくとも一つ、好ましくは全てを促す。
【００２９】
＜２．コーティング剤、細胞培養基材、細胞増殖促進剤、及び幹細胞能維持剤＞
一態様において、本発明は、＜１．ペプチド又はその塩＞に記載のペプチド又はその塩を含む、細胞培養基材のコーティング剤に関する。
【００３０】
本明細書において、「細胞培養基材」とは、細胞を培養する際に使用されるものであればいかなるものであってもよく、例えば、細胞培養皿、細胞培養ボトル（またはフラスコ）、マルチウェルプレート、マイクロキャリア等が挙げられる。細胞培養基材として、市販のものを用いてもよい。培養基材の材質も特に限定されず、例えば、ガラス又はプラスチック等が挙げられる。本発明のペプチド又はその塩を含むコーティング剤を細胞培養基材にコーティングすることによって、細胞培養基材の細胞接着性、細胞増殖性、及び幹細胞能維持の少なくとも一つ、好ましくは全てが向上し得る。
【００３１】
一態様において、本発明は、本発明のペプチド又はその塩がコーティングされた、細胞培養基材に関する。本明細書において、「コーティング」とは細胞培養基材の表面の少なくとも一部を処理し覆う工程をいう。コーティングの方法は限定しないが、例えば適当な濃度の本発明のペプチド又はその塩を細胞培養基材に添加し、放置し、必要に応じてPBS又は水等の溶液により一回以上洗浄することにより行うことができる。ペプチド又はその塩の細胞培養基材への添加濃度は限定しないが、例えば0.04μg/mL以上、0.1μg/mL以上、0.2μg/mL以上、又は0.4μg/mL以上であってよく、100μg/mL以下、50μg/mL以下、20μg/mL以下、又は10μg/mL以下であってよい。また、ペプチド又はその塩の細胞培養基材への添加濃度は、例えば0.5ng/cm2以上、5ng/cm2以上、10ng/cm2以上、25ng/cm2以上、又は50ng/cm2以上であってよく、150μg/cm2以下、15μg/cm2以下、6μg/cm2以下、3μg/cm2以下又は1.4μg/cm2以下であってよい。また、ペプチド又はその塩添加後の放置時間も限定しないが、例えば1時間以上、3時間以上、6時間以上、又は9時間以上であってよく、120時間以下、48時間以下、24時間以下、18時間以下、好ましくは約12時間であってよい。ペプチド又はその塩添加後の温度も限定しないが、例えば20℃〜40℃、25℃〜35℃、約30℃又は室温であってよい。
【００３２】
一実施形態において、本発明のコーティング剤又は細胞培養基材は、JAM-C及び／又はJAM-B（Junctional Adhesion Molecule B）を発現する細胞に適用される。
【００３３】
一実施形態において、本発明のコーティング剤又は細胞培養基材は、幹細胞培養用である。幹細胞は、幹細胞のみからなる細胞集団であってもよいし、幹細胞を豊富に含む細胞集団であってもよい。本明細書において「幹細胞」とは、別種の細胞又は様々な種類の細胞に分化することができる能力と、自己複製能力の両方を有する細胞を指す。幹細胞の例としては、骨髄、血液、皮膚、及び脂肪等の生体組織に存在する未分化な状態の細胞（総称して、体性幹細胞といい、その例としてミューズ細胞が挙げられる）、胚性幹細胞（ES細胞）、人工多能性幹細胞（iPS細胞）などを含む。このような幹細胞は、自体公知の方法によって作製することができるが、所定の機関より入手でき、また市販品を購入することもできる。これら幹細胞は、初代培養細胞、継代培養細胞、及び凍結細胞のいずれであってもよい。
【００３４】
本明細書における細胞の由来は、限定しないが、例えば、哺乳動物（例えばヒト及びアカゲザル等の霊長類、ラット、マウス、及びドブネズミ等の実験動物、ブタ、ウシ、ウマ、ヒツジ、及びヤギ等の家畜動物、並びにイヌ及びネコ等の愛玩動物が挙げられ、好ましくはヒト又はマウス、最も好ましくはヒト）、鳥類（ニワトリ及びセキショクヤケイ等）、爬虫類、両生類（アフリカツメガエル及びネッタイツメガエル等）、及び魚類（ゼブラフィッシュ等）が挙げられ、好ましくは哺乳動物である。
【００３５】
一態様において、本発明は、本発明のペプチド又はその塩を含む、細胞増殖促進剤、又は幹細胞能維持剤に関する。本発明のペプチド又はその塩、及び細胞については上記の通りである。
【００３６】
細胞増殖促進剤による細胞増殖の程度は、例えば本発明のペプチド又はその塩を用いない場合に比べて、1.1倍、1.2倍、1.3倍、1.4倍、1.5倍、1.6倍、1.7倍、1.8倍、1.9倍、又は2倍以上であってよい。細胞増殖の程度は、例えば実施例2に記載の方法により測定することができる。
【００３７】
「幹細胞能」とは、別の細胞に分化することができる能力と、自己複製能力の両方を指し、幹細胞能の維持とは、これらの能力を維持又は向上させることをいう。幹細胞能は、Kfl4、c-Myc、Nanog、及びSox2等の幹細胞マーカーの発現量により測定することができ、これらのマーカーの発現量が高い程、幹細胞能が維持又は向上していると考えられる。幹細胞マーカーは、例えば実施例2に記載の方法により測定することができる。
【００３８】
細胞増殖及び幹細胞能維持は、理論により拘束されるものではないが、（i）細胞の接着性の増加によって、及び／又は、（ii）JAM-Cの細胞外ドメインがJAM-Bと会合し、この会合体にリクルートされたSrcファミリーキナーゼ（SFKs）がJAM-Bをリン酸化し、さらに下流にシグナリング経路を有することによって生ずると考えられる。
【００３９】
本発明のコーティング剤、細胞増殖促進剤、及び幹細胞能維持剤は、本発明のペプチド又はその塩からなってもいし、それに加えて他の成分を含んでもよい。他の成分としては、限定しないが、緩衝液、界面活性剤、及び安定化剤、並びに他のコーティング剤、細胞増殖促進剤、及び幹細胞能維持剤が挙げられる。
【００４０】
一態様において、本発明は、本発明のペプチド又はその塩を含む、培地に関する。本発明の培地は、本発明のペプチド又はその塩を通常の培地に添加することにより容易に調製できる。培地の種類は限定されず、例えば市販の培地（例えば、DMEM、MEM、BME、RPMI 1640、F-10、F-12、DMEM-F12、α-MEM、IMDM、MacCoy's 5A培地）又は調製した培地であってよい。培地中のペプチド濃度は、例えば0.04μg/mL以上、0.1μg/mL以上、0.2μg/mL以上、又は0.4μg/mL以上であってよく、100μg/mL以下、50μg/mL以下、20μg/mL以下、又は10μg/mL以下であってよい。
【００４１】
＜３．細胞培養方法＞
一態様において、本発明は、＜１．ペプチド又はその塩＞に記載のペプチド又はその塩、又は＜２．コーティング剤、細胞培養基材、細胞増殖促進剤、及び幹細胞能維持剤＞に記載のコーティング剤、細胞培養基材、細胞増殖促進剤、幹細胞能維持剤、又は培地を用いる、細胞培養方法に関する。
【００４２】
一態様において、本発明は、＜１．ペプチド又はその塩＞に記載のペプチド又はその塩、又は＜２．コーティング剤、細胞培養基材、細胞増殖促進剤、及び幹細胞能維持剤＞に記載のコーティング剤で細胞培養基材をコーティングする工程、及びコーティングされた細胞培養基材上で細胞を培養する工程を含む、細胞培養方法に関する。
【００４３】
コーティング工程は限定しないが、例えば適当な濃度の本発明のペプチド又はその塩又はコーティング剤を細胞培養基材に添加し、放置し、必要に応じてPBS又は水等の溶液により一回以上洗浄することにより行うことができる。ペプチド又はその塩の細胞培養基材への添加濃度は限定しないが、例えば0.04μg/mL以上、0.1μg/mL以上、0.2μg/mL以上、又は0.4μg/mL以上であってよく、100μg/mL以下、50μg/mL以下、20μg/mL以下、又は10μg/mL以下であってよい。また、ペプチド又はその塩の細胞培養基材への添加濃度は、例えば0.5ng/cm2以上、5ng/cm2以上、10ng/cm2以上、25ng/cm2以上、又は50ng/cm2以上であってよく、150μg/cm2以下、15μg/cm2以下、6μg/cm2以下、3μg/cm2以下又は1.4μg/cm2以下であってよい。また、ペプチド又はその塩添加後の放置時間も限定しないが、例えば1時間以上、3時間以上、6時間以上、又は9時間以上であってよく、120時間以下、48時間以下、24時間以下、18時間以下、好ましくは約12時間であってよい。ペプチド又はその塩添加後の温度も限定しないが、例えば20℃〜40℃、25℃〜35℃、約30℃又は室温であってよい。
【００４４】
細胞培養工程における培養条件は限定されず、例えば、培養温度は約30℃〜約40℃、CO2濃度は約2%〜約10％であってよい。培養は、接着培養であっても懸濁培養であってもよいが、好ましくは接着培養である。培養工程における培地も限定されず、市販の培地（例えば、DMEM、MEM、BME、RPMI 1640、F-10、F-12、DMEM-F12、α-MEM、IMDM、MacCoy's 5A培地）又は調製した培地を用いて行うこともできる。また、培養工程の時間は、例えば、数時間〜数日行ってもよいし、拡大培養又は継代培養を経て数日〜数週間又は数か月行ってもよい。
【００４５】
一態様において、本発明は、＜２．コーティング剤、細胞培養基材、細胞増殖促進剤、及び幹細胞能維持剤＞に記載の細胞培養基材上で細胞を培養する工程を含む、細胞培養方法に関する。
【００４６】
また、一態様において、本発明は、本発明のペプチド又はその塩を含む培地中で細胞を培養する工程を含む、細胞培養方法に関する。本方法は、接着細胞に対しても浮遊細胞に対しても適用することができる。
【００４７】
本発明の細胞培養方法は、細胞増殖性を促進し、及び／又は幹細胞能を維持させるという利点を有し得る。
【００４８】
一態様において、本発明は、本発明のペプチド又はその塩を含む培地中で細胞を培養する工程を含む、細胞増殖促進方法又は幹細胞能維持方法に関する。本方法は、接着細胞に対しても浮遊細胞に対しても適用することができる。
【００４９】
＜４．細胞培養基材の生産方法＞
一態様において、本発明は、＜２．コーティング剤、細胞培養基材、細胞増殖促進剤、及び幹細胞能維持剤＞に記載のコーティング剤で細胞培養基材をコーティングする工程を含む、細胞培養基材の生産方法に関する。
【００５０】
コーティング工程については、＜３．細胞培養方法＞において記載したのと同様であるからここでは記載を省略する。
【実施例】
【００５１】
＜実施例１：発現確認＞
JAM-Cは、細胞外ドメインの基部での切断により可溶化されて細胞外に放出されることが報告されている(Rabquer et al., J. Immunol., 2010, 185, 1777-1785)。そこで培養ADSC（脂肪由来幹細胞）において、JAM-Cが同様に切断及び可溶化されているかどうかを検討した。【００５２】
（材料と方法）
抗体
ウエスタンブロットには、JAM-C (N) (R＆D Systems, AF1213), JAM-C (C) (Thermo Fisher Scientific, 40-9000)を使用した。【００５３】
マウスADSCの分離
マウスADSCの分離は一般的に用いられている確立された方法(Lin et al., Stem Cells Dev. 2008, 17, 1053-63)に従い、福島県立医科大学動物実験委員会の承認を得て、福島県立医科大学動物実験規程を遵守して行った。【００５４】
まず、8〜12週齢のC57BL/6N系統の雄マウスから大腿部皮下脂肪組織を採取した後、PBSでよく洗浄しながら剪刀で細断し、0.075% Collagenase A (Roche)で37℃45分間振盪した。浮遊する脂肪組織塊を除去した後に200Gで遠心分離することでSVF（stromal vascular fraction）を単離し、12×104個の細胞を6 cm培養皿に播種した。【００５５】
細胞培養
ADSCの培養は10％ウシ血清を添加したDulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)を用いて行った。2日ごとに培地交換し、50-70%の細胞密度に達した時点で0.25%トリプシン/1mM EDTA溶液を用いて剥離し、2×105個の細胞数を継代した。解析には3-5継代の細胞を使用した。【００５６】
HEK293Tも同一の培地を用い、同様の方法で培養した。遺伝子導入はPEI: Polyethylenimine Max (コスモバイオ)により製造業者のプロトコルに従って行い、48時間後に細胞抽出物と培養上清を回収した。【００５７】
発現ベクタープラスミド
RIKEN BioResource Centerより供与されたCSII-EF-Venusの多重クローニング部位(MCS)に、マウス腎臓から得たcDNAライブラリを鋳型としてPCRで増幅した全長マウスJAM-Cをコードする遺伝子(Jam3)を、ピューロマイシン耐性遺伝子と共にIn-Fusion(登録商標) HD Cloning Kit (タカラバイオ)を用いた2フラグメント挿入法でクローニングした。プライマーはそれぞれ、Jam3の増幅には5’-GAGAATTCTGCAGCGGCCGCCATGGCGCTGAGCCGGCGGCT-3'（配列番号19）及び5’-CTGCATAGTCCGGGACGTCATACGGATAGCCCGCATAGTCAGGAACATCGTATGGGTAGATAACAAAGGACGATTTGTGTC-3'（配列番号20）を、ピューロマイシン耐性遺伝子の増幅には、5’-ATGACGTCCCGGACTATGCAGGATCCTATCCATATGACGTTCCAGATTACGCTGCTACTAACTTCAGCCTGCTGAAGCA-3'（配列番号21）及び5’-GGGAGAGGGGCGGATCCTAGGCACCGGGCTTGCGGGTCAT-3'（配列番号22）を用いた。【００５８】
ウエスタンブロット
ウエスタンブロットは過去に記載された一般的な方法(Sugimoto et al., PLoS One, 2013, 10:e751062013)を用いて行った。細胞抽出物の蛋白質サンプルにはRadio Immunoprecipitation assay (RIPA) Buffer (25 mM Tris-HCl pH7.6, 150 mM NaCl, 1% NP-40, 1% sodium deoxycholate, 0.1% SDS) にタンパク質分解酵素阻害剤 (Complete mini EDTA-free; Roche Diagnostics, Mannheim, Germany), 5 mM NaF, 1mM Na3VO4及び1 mM Phenyl methanesulfonyl fluoride Solution (PMFS) を添加した可溶化液を用いた。培養上清は冷却した10倍量の10%トリクロロ酢酸アセトン溶液により濃縮して使用した。SDS-PAGE、転写、及び抗体反応を順に行い、ECL Prime (GE Healthcare)によって化学発光させ、CCDイメージャーImage Quant LAS4000 (GE Health care) を用いて撮像した。【００５９】
（結果）
まず培養ADSCの細胞抽出物とその培養上清をJAM-CのN末端を認識する抗体(抗JAM-C(N)抗体)を用いるウエスタンブロットに供したところ、細胞抽出物で全長の約38 kDaの分子(full-length JAM-C(以下、fJAM-Cとも称する))が検出されたのに加えて、培養上清で約28 kDaの短い分子が検出された(図1A)。このことから、JAM-Cが可溶性の分子(soluble JAM-C(以下、sJAM-Cとも称する))として培養液中に放出されていることが明らかになった。【００６０】
続いて、JAM-CのC末端を抗原とする別の抗体(抗JAM-C(C)抗体)を用いて、マウス脂肪組織のウエスタンブロットを行った。その結果、sJAM-Cに相当する低分子量のバンドは脾臓及び脂肪組織において抗JAM-C(N)抗体で検出され、抗JAM-C(C)抗体では検出されなかった(図1B)。【００６１】
さらにC末端にHAタグを付加したJAM-Cコード配列(Jam3-HA)をHEK293T細胞に一過性発現させ、同様に細胞抽出物と培養上清をウエスタンブロットに供した。その結果抗JAM-C(N)抗体はこれまでと同様にfJAM-CとsJAM-Cの両方を認識したが、抗HA抗体ではfJAM-Cのみが標識された(図1C)。したがってsJAM-CはJAM-Cの細胞外ドメインであり、切断により放出される可溶化体であることが示された。これらの結果より、JAM-CのN末端側に存在する細胞外ドメインが、膜貫通部近傍で切断されて可溶性のsJAM-Cとして放出されることが示された。【００６２】
＜実施例２：細胞への効果＞
次に基質に沈着したsJAM-CがADSCに与える効果を検討した。 【００６３】
（材料と方法）
基本的な細胞培養の方法等は実施例１に従った。【００６４】
細胞接着アッセイ
リコンビナント可溶化JAM-C (ヒトJAM-Cの細胞外ドメイン(Met 1-Asn 241)のC末端にヒトIgG1のFc領域を連結したポリペプチド、Sino Biological)とマウスIgG (GE Healthcare)はそれぞれ20、100、又は500 ngの容量を50 μLのPBSに希釈して96穴丸底プレートに処置し、30℃で12時間静置した。陽性コントロールとして500 ngのコラーゲン Cellmatrix type I-A (新田ゼラチン)を同様に処置した。その後PBSで2回洗浄し、10%ウシ血清アルブミン(BSA; 和光純薬)を100 μL加えて37℃で2時間静置してブロッキングした。【００６５】
PBSで2回洗浄後に、0.25%トリプシン/1mM EDTA溶液を用いて剥離したADSCを上記プレートに播種し、37℃のCO2インキュベーターで30分間培養した。その後培養上清を除去し、クリスタルバイオレットで染色した後にPBSで10回洗浄した。最後に50 μLの5%SDSで溶解し、560 nm長における吸光度を測定した。【００６６】
RNA抽出及びRT-PCR
RNA抽出とRT-PCRは過去に記載された一般的な方法(Sugimoto et al., PLoS One, 2013, 10:e751062013)を用いて行った。上記の細胞接着アッセイと同様の方法で12穴培養皿に播種(リコンビナント可溶化JAM-Cなどは底面積に合わせて4倍量使用)し、その後10％FBS添加DMEMで48時間培養した細胞からTRIzol Reagent (ambion)によりRNAを抽出し、PrimeScript II 1st strand cDNA Synthesis Kit (タカラバイオ)を用いて逆転写反応を行ってcDNAライブラリを得た。半定量的PCRはGoTaq Green Master Mix Kit (Promega)を用い、プライマー[Sox2（5’-TAGAGCTAGACTCCGGGCGATGA-3'（配列番号23）, 5’-TTGCCTTAAACAAGACCACGAAA-3’（配列番号24））, c-Myc (5’-TGACCTAACTCGAGGAGGAGCTGGAATC-3'（配列番号25）, 5’-AAGTTTGAGGCAGTTAAAATTATGGCTGAAGC-3’（配列番号26）), Nanog (5’-AGGGTCTGCTACTGAGATGCTCTG-3'（配列番号27）, 5’-CAACCACTGGTTTTTCTGCCACCG-3’（配列番号28）), Klf4 (5’-GCGAACTCACACAGGCGAGAAACC-3'（配列番号29）, 5’-TCGCTTCCTCTTCCTCCGACACA-3’（配列番号30）), Gapdh (5’-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3'（配列番号31）, 5’-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3’（配列番号32）)]によって標的配列を増幅した。2%アガロースゲルに泳動してエチジウムブロマイドで染色した後、CCDイメージャーImage Quant LAS4000 (GE Health care) で撮像した。その後ImageJ (National Institute of Health; NIH)を用いて目的とする分子量に相当する領域の輝度を定量して統計解析した。【００６７】
細胞増殖アッセイ
6穴培養皿に4×104個の細胞を播種し、24時間後に最終濃度10 μMの5-Bromo-2'-deoxyuridine(BrdU; #B-5002, Sigma-Aldrich)を2時間処置してから4%PFAで固定した。その後、製造業者が推奨する方法で染色し、蛍光位相差顕微鏡(OLYMPUS IX71, OLYMPUS)とDP controllerで撮影した。BrdU陽性のパーティクルをDAPI陽性のそれで除算して増殖細胞数を求めた。【００６８】
（結果）
まずリコンビナント可溶性JAM-C (recombinant JAM-C(以下、rJAM-Cとも称する))とADSCの接着性を評価した。rJAM-C又はコントロールとしてIgGを、プラスチック培養皿に加えたのち、ADSCを加えて30分後の接着細胞数をクリスタルバイオレッド染色により計測したところ、rJAM-Cでは20、100、及び500 ngで接着が有意に亢進していた（図2）。以上より細胞外のrJAM-CがADSCと強く結合することが示された。【００６９】
次にrJAM-Cで被覆した培養皿でADSCを培養し、幹細胞マーカーであるKlf4、Nanog、c-Myc、及びSox2の発現を半定量的RT-PCRで評価した。その結果試験した4種類全ての幹細胞マーカーの発現が、rJAM-Cで被覆した培養皿で培養したADSCにおいて有意に亢進していた(図3)。【００７０】
次にrJAM-Cで被覆した培養皿でADSCを培養し、BrdUにより増殖期にある細胞の核を標識し、DAPI陽性細胞数で除して細胞増殖を評価した。その結果rJAM-C上で培養したADSCにおいて増殖能が約2倍程度と有意に亢進していた(図4)。【００７１】
以上の結果により、基質に沈着したsJAM-Cが幹細胞ニッチとして機能し、ADSCの増殖及び幹細胞能維持に貢献していることが明らかとなった。【００７２】
＜実施例３：ペプチドの調製＞
DPRIEWKKI（配列番号33）のアミノ酸配列からなるJAM-C D1ペプチド（以下、JAM-C D1とも記載する）の化学合成及び精製は、ユーロフィン社に委託した。【００７３】
以下の条件で液体クロマトグラフィーを行った。
カラム：YMC-Pack ODS-AMφ4.6mm×75mm
移動相：A（水中0.02% TFA）及びB（アセトニトリル中0.02% TFA）
流速：1.0000mL/min
検出：214 nm
カラムオーブン温度：40℃
ピーク面積より推定したペプチドの純度は、98.145%であった。【００７４】
続いて、以下の条件でMSを行った。
プローブ：ESI
ガス流速：1.5L/min
DL温度：250℃
ブロック温度：200℃
プローブバイアス：+1.10kV
平均MSスペクトルの結果を図5に示す。【００７５】
＜実施例４：ペプチドの細胞への効果＞
（材料と方法）
実施例3で調製したJAM-C D1を用い、接着試験においてADSCにかえて、JAM-BとJAM-Cを発現するF9細胞（Satohisa et al., Exp. Cell Res., 2005, 310, 66-78）を用いる以外は、基本的に実施例2と同様に実験を行った。【００７６】
（結果）
JAM-C D1ペプチドとF9細胞の接着性の評価結果を図6に示す。図6に示される通り、JAM-C D1により接着が有意に亢進していた。この結果より、JAM-C D1がF9細胞と強く結合することが示された。【００７７】
BrdU染色とDAPI染色により細胞増殖を評価した結果を図7に示す。白カラムはBrdU陽性細胞数をDAPI陽性細胞数で除したもの、黒カラムはBrdU陰性細胞数をDAPI陽性細胞数で除したものを示す。図7に示される通り、JAM-C D1によりADSCの増殖能が有意に亢進したことが示された。【００７８】
JAM-C D1で被覆した培養皿でADSCを培養し、幹細胞マーカーであるNanog、Klf4、Sox2、及びc-Mycの発現を半定量的RT-PCRで評価した結果を図8に示す。その結果、試験した4種類全ての幹細胞マーカーの発現が、JAM-C D1で被覆した培養皿で培養したADSCにおいて有意に亢進していた。【００７９】
本明細書で引用した全ての刊行物、特許及び特許出願はそのまま引用により本明細書に組み入れられるものとする。
【図１】
2019221039.tif 000003
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
2019221039.tif 000009
【図８】
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【配列表】
2019221039000001.app
【国際調査報告】
2019221039.tif 000011
2019221039.tif 000012
2019221039.tif 000013
2019221039.tif 000014