(57)【要約】  本発明は、効率的にＰＵＦＡを生産する微生物及び該微生物を用いたＰＵＦＡの製造法を提供することを目的とする。本発明は、多価不飽和脂肪酸（ＰＵＦＡ）代謝経路を有する微生物に、３−ヒドロキシヘキサノイル  アシルキャリアー蛋白質（３−ｈｙｄｒｏｘｙｈｅｘａｎｏｙｌ  ＡＣＰ）に対する活性が、内在のＦａｂＡ様β−ヒドロキシアシル−ＡＣＰデヒドラターゼ（ＦａｂＡ−ＤＨ）ドメインよりも高い、外来のポリケチドシンターゼデヒドラターゼ（ＰＳ−ＤＨ）ドメインをコードする遺伝子が導入された、ＰＵＦＡを生産し得る微生物等に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
多価不飽和脂肪酸（以下、ＰＵＦＡという。）代謝経路を有する微生物に、３−ヒドロキシヘキサノイル  アシルキャリアー蛋白質（以下、３−ｈｙｄｒｏｘｙｈｅｘａｎｏｙｌ  ＡＣＰという。）に対する活性が、内在のＦａｂＡ様β−ヒドロキシアシル−ＡＣＰデヒドラターゼ（以下、ＦａｂＡ−ＤＨという。）ドメインよりも高い、外来のポリケチドシンターゼデヒドラターゼ（以下、ＰＳ−ＤＨという。）ドメインをコードする遺伝子が導入された、ＰＵＦＡを生産し得る微生物。
【請求項２】
ＰＵＦＡ代謝経路を有する微生物がω３ＰＵＦＡ代謝経路を有する微生物であり、生産し得るＰＵＦＡがω６ＰＵＦＡである、請求項１に記載の微生物。
【請求項３】
ＰＵＦＡ代謝経路を有する微生物がエイコサペンタエン酸（以下、ＥＰＡという。）又はドコサヘキサエン酸（以下、ＤＨＡという。）代謝経路を有する微生物であり、生産し得るＰＵＦＡがアラキドン酸（以下、ＡＲＡという。）又はドコサペンタエン酸（以下、ＤＰＡという。）である、請求項１又は２に記載の微生物。
【請求項４】
ＰＵＦＡ代謝経路を有する微生物がシュワネラ（Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ）属、フォトバクテリウム（Ｐｈｏｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、モリテラ（Ｍｏｒｉｔｅｌｌａ）属、コルウェリア（Ｃｏｌｗｅｌｌｉａ）属、オーランチオキトリウム（Ａｕｒａｎｔｉｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）属、スラウストキトリウム（Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）属、ウルケニア（Ｕｌｋｅｎｉａ）属、パリエチキトリウム（Ｐａｒｉｅｔｉｃｈｙｔｒｉｕｍ）属、ラビリンチュラ（Ｌａｂｙｒｉｎｔｈｕｌａ）属、アプラノキトリウム（Ａｐｌａｎｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）属、オブロンギキトリウム（Ｏｂｌｏｎｇｉｃｈｙｔｒｉｕｍ）属、又はシゾキトリウム（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）属に由来する請求項１〜３のいずれか１項に記載の微生物。
【請求項５】
ＰＵＦＡ代謝経路を有さない微生物に、ＰＵＦＡを合成する活性（以下、ＰＵＦＡ−ＰＫＳ活性という。）を有する下記（ａ）〜（ｊ）に記載の各ドメインをコードする遺伝子が導入された、ＰＵＦＡを生産し得る微生物であって、ＰＳ−ＤＨドメインがＦａｂＡ−ＤＨドメインよりも高い３−ｈｙｄｒｏｘｙｈｅｘａｎｏｙｌ  ＡＣＰに対する活性を示す微生物。
（ａ）β−ケトアシル−ＡＣＰシンターゼ（以下、ＫＳという。）ドメイン
（ｂ）マロニル−ＣｏＡ：ＡＣＰアシルトランスフェラーゼ（以下、ＭＡＴという。）ドメイン
（ｃ）ＡＣＰドメイン
（ｄ）ケトレダクターゼ（以下、ＫＲという。）ドメイン
（ｅ）ＰＳ−ＤＨドメイン
（ｆ）鎖伸長因子（以下、ＣＬＦという。）ドメイン
（ｇ）アシルトランスフェラーゼ（以下、ＡＴという。）ドメイン
（ｈ）ＦａｂＡ−ＤＨドメイン
（ｉ）エノイルＡＣＰ−レダクターゼ（以下、ＥＲという。）ドメイン
（ｊ）ホスホパンテテイントランスフェラーゼ（以下、ＰＰＴという。）ドメイン
【請求項６】
請求項１〜４のいずれか１項に記載のＰＵＦＡを生産し得る微生物が有するＰＵＦＡ合成系遺伝子を全て有する請求項５に記載の微生物。
【請求項７】
生産し得るＰＵＦＡがω６ＰＵＦＡである請求項５又は６に記載の微生物。
【請求項８】
生産し得るＰＵＦＡがＡＲＡ又はＤＰＡである請求項５〜７のいずれか１項に記載の微生物。
【請求項９】
ＰＵＦＡ代謝経路を有さない微生物がエシェリヒア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、ヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）属、サッカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属、又はピキア（Ｐｉｃｈｉａ）属に属する微生物である請求項５〜８のいずれか１項に記載の微生物。
【請求項１０】
ＰＳ−ＤＨドメインが、Ａｕｒｅｉｓｐｉｒａ  ｍａｒｉｎａ由来のＡｒａＢのＰＳ−ＤＨドメインである、請求項１〜９のいずれか１項に記載の微生物。
【請求項１１】
請求項１〜１０のいずれか１項に記載の微生物を培地に培養し、培養物中にＰＵＦＡ又はＰＵＦＡ含有組成物を生成、蓄積させ、該培養物からＰＵＦＡ又はＰＵＦＡ含有組成物を採取する、ＰＵＦＡ又はＰＵＦＡ含有組成物の製造法。
【請求項１２】
下記（Ｉ）又は（ＩＩ）のＰＵＦＡを生産し得る微生物を用いるＰＵＦＡ又はＰＵＦＡ含有組成物の製造法。
（Ｉ）ＰＵＦＡ代謝経路を有する微生物に、３−ｈｙｄｒｏｘｙｈｅｘａｎｏｙｌ  ＡＣＰに対する活性が内在のＦａｂＡ−ＤＨドメインよりも高いＰＳ−ＤＨドメインをコードする遺伝子が導入された、ＰＵＦＡを生産し得る微生物。
（ＩＩ）ＰＵＦＡ代謝経路を有さない微生物に、ＰＵＦＡ−ＰＫＳ活性を有する下記（ａ）〜（ｊ）に記載の各ドメインをコードする遺伝子が導入された、ＰＵＦＡを生産し得る微生物であって、ＰＳ−ＤＨドメインがＦａｂＡ−ＤＨドメインよりも高い３−ｈｙｄｒｏｘｙｈｅｘａｎｏｙｌ  ＡＣＰに対する活性を示す微生物。
（ａ）ＫＳドメイン
（ｂ）ＭＡＴドメイン
（ｃ）ＡＣＰドメイン
（ｄ）ＫＲドメイン
（ｅ）ＰＳ−ＤＨドメイン
（ｆ）ＣＬＦドメイン
（ｇ）ＡＴドメイン
（ｈ）ＦａｂＡ−ＤＨドメイン
（ｉ）ＥＲドメイン
（ｊ）ＰＰＴドメイン
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、多価不飽和脂肪酸（ＰＵＦＡ）を生産する微生物及び該微生物を用いてＰＵＦＡを製造する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ドコサヘキサエン酸（以下、ＤＨＡという。）、エイコサペンタエン酸（以下、ＥＰＡという。）、アラキドン酸（以下、ＡＲＡという。）、ドコサペンタエン酸（以下、ＤＰＡという。）等、分子内に不飽和結合を複数有する長鎖脂肪酸のことを多価不飽和脂肪酸（以下、ＰＵＦＡという。）という。ＰＵＦＡは、動脈硬化や高脂血症の予防等様々な生理機能を有することが知られている（非特許文献１及び非特許文献２）。【０００３】
ＰＵＦＡは、分子中のメチル末端からの二重結合の位置により、ＤＨＡやＥＰＡのようなω３脂肪酸、ＤＰＡやＡＲＡのようなω６脂肪酸、９番目の炭素に最初に二重結合が導入されているω９脂肪酸、１１番目の炭素に最初に二重結合が導入されているω１１脂肪酸等に分類することができる。【０００４】
ＰＵＦＡの生合成経路としては、好気経路と多価不飽和脂肪酸ポリケチドシンターゼ（以下、ＰＵＦＡ−ＰＫＳという。）による嫌気経路の二種類が知られている。好気経路は、脂肪酸合成酵素によって合成されたパルミチン酸等の長鎖脂肪酸に、複数の不飽和化酵素による二重結合の導入や鎖伸長酵素による炭素鎖の伸長がなされることによりＰＵＦＡが合成される経路で、多くの生物が有する古くから知られている合成経路である（非特許文献３）。一方、ＰＵＦＡ−ＰＫＳによる嫌気経路は、アセチル−ＣｏＡやマロニル−ＣｏＡからＰＵＦＡを合成する経路で、一部の海洋性細菌やラビリンチュラ類真核生物がＤＨＡやＥＰＡを生産する経路として有することが知られている（非特許文献４及び非特許文献５）。また、ＡＲＡ生産系としては、例えばＡｕｒｅｉｓｐｉｒａ  ｍａｒｉｎａのＡＲＡ生産系が知られている（非特許文献６）。【０００５】
ＰＵＦＡ−ＰＫＳは、複数の蛋白質から構成される複合酵素（以下、蛋白質複合体ともいう。）であり、各蛋白質にはＰＵＦＡの合成に関わる複数の機能ドメインが存在している。【０００６】
ＰＵＦＡ−ＰＫＳに存在する機能ドメインとしては、マロニル−ＡＣＰとアシル−ＡＣＰの縮合に関わるとされているβ−ケトアシル−アシルキャリアー蛋白質シンターゼドメイン（以下、ＫＳドメインという。）、ホスホパンテテイニル基を介してチオエステル結合によりアシル基と結合し、脂肪酸合成の場として機能するとされているアシルキャリアー蛋白質ドメイン（以下、ＡＣＰドメインという。）、縮合により生成するカルボニル基を還元するとされているケトレダクターゼドメイン（以下、ＫＲドメインという。）、ＫＲドメインにより生成した水酸基を脱水して二重結合を形成するとされているＤＨドメイン、炭素鎖の伸長に関わるとされている鎖伸長因子ドメイン（以下、ＣＬＦドメインという。）、得られた二重結合を還元するとされているエノイルレダクターゼドメイン（以下、ＥＲドメインという。）、アシル基の転移に関わるとされているアシルトランスフェラーゼドメイン（以下、ＡＴドメインという。）及びマロニル−ＣｏＡ：アシルトランスフェラーゼドメイン（以下、ＭＡＴドメインという。）、並びにＡＣＰドメインを活性化するとされているホスホパンテテイントランスフェラーゼドメイン（以下、ＰＰＴドメインという。）があり、これら複数のドメインが協働して働くことで脂肪酸の炭素鎖が伸長すると考えられている。【０００７】
ＡＲＡの工業的な生産方法としては、カビのバイオマスから単離する方法（特許文献１）が知られているが、目的以外の不飽和脂肪酸の副生が多いという課題があり、効率的なＡＲＡの生産方法が求められていた。【０００８】
ＰＵＦＡ−ＰＫＳは、その種類によって生産するＰＵＦＡの種類が異なることが知られている。例えば、Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ  ｓｐ．、Ａｕｒａｎｔｉｏｃｈｙｔｒｉｕｍ  ｓｐ．及びＭｏｒｉｔｅｌｌａ  ｍａｒｉｎａ由来のＰＵＦＡ−ＰＫＳではＤＨＡが、Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ  ｏｎｅｉｄｅｎｓｉｓ及びＰｈｏｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐｒｏｆｕｎｄｕｍ由来のＰＵＦＡ−ＰＫＳではＥＰＡが、Ａｕｒｅｉｓｐｉｒａ  ｍａｒｉｎａ由来のＰＵＦＡ−ＰＫＳではＡＲＡが主要な産物として生産され、他のＰＵＦＡはほとんど生産されないか、生産されるとしても主生産物に比べると少量である。【０００９】
このように、ＰＵＦＡ−ＰＫＳは高い生産物特異性を有するが、これまでにＰＵＦＡ−ＰＫＳの機能解析を目的とした多くの研究がなされている。【００１０】
非特許文献４及び７では、Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ属細菌やストラメノパイル類真核生物からＰＵＦＡ−ＰＫＳ遺伝子をクローニングして異種生物中で発現させ、ＰＵＦＡを生産させる検討がなされている。【００１１】
非特許文献８では、ＤＨＡを生産するＭｏｒｉｔｅｌｌａ  ｍａｒｉｎａ由来のＰＵＦＡ−ＰＫＳの構成遺伝子であるｐｆａＢ遺伝子と、ＥＰＡを生産するＳｈｅｗａｎｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍａｔｏｐｈｏｒｉ由来のＰＵＦＡ−ＰＫＳを構成するｐｆａＢ遺伝子とを用いた研究により、ＡＴドメインをコードするｐｆａＢ遺伝子が生産されるＰＵＦＡの種類に関与することが開示されている。【００１２】
非特許文献９では、大腸菌にＴｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｕｍ属由来のＰＵＦＡ−ＰＫＳのＤＨドメインを導入すると、脂肪酸の生産量が増加し、かつ不飽和脂肪酸の割合が増加することが開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１３】
【特許文献１】日本国特開２００６−２１９５２８号公報
【特許文献２】国際公開第２００８／１４４４７３号
【非特許文献】
【００１４】
【非特許文献１】Ａｎｎｕ．Ｎｕｔｒ．Ｍｅｔａｂｏｌ．，１９９１，３５，１２８−１３１
【非特許文献２】Ｊ．Ａｍ．Ｃｌｉｎ．Ｎｕｔｒ．，１９９４，１３，６５８−６６４
【非特許文献３】Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１９８３，５２，５３７−５７９
【非特許文献４】Ｓｃｉｅｎｃｅ，２００１，２９３，２９０−２９３
【非特許文献５】ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ，２０１１，６，ｅ２０１４６
【非特許文献６】Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｒｅｐｏｒｔｓ  ｖｏｌｕｍｅ  ６，  Ａｒｔｉｃｌｅ  ｎｕｍｂｅｒ：３５４４１（２０１６）、Ｆｉｇ．５
【非特許文献７】Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２００９，４７，４７２−４７８
【非特許文献８】ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．，２００９，２９５，１７０−１７６
【非特許文献９】Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，２０１８，８４７−８５６
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
従来のＰＵＦＡ生産性微生物によるＰＵＦＡ生産系として、例えば非特許文献６に記載の微生物によるＡＲＡ生産系があるが、該ＡＲＡ生産系によるＡＲＡの生産性は工業的レベルにおいては十分ではない。また、特許文献１に記載の方法のようにカビのバイオマスからＡＲＡを単離する方法では、目的以外の不飽和脂肪酸の副生が多いという課題がある。【００１６】
したがって、本発明は、効率的にＰＵＦＡを生産する微生物及び該微生物を用いたＰＵＦＡの製造法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１７】
本発明者らは、ω３ＰＵＦＡを生産し得る微生物において、ＰＵＦＡ生産系における脂肪酸基質である３−ｈｙｄｒｏｘｙｈｅｘａｎｏｙｌ  ＡＣＰに対する活性の強さがＦａｂＡ−ＤＨドメインよりも高いＰＳ−ＤＨドメインの遺伝子を導入することにより、本来の産物であるω３ＰＵＦＡではなく、ＰＵＦＡにおける末端の炭素原子から数えてω６位の位置に最初の二重結合が形成されたω６ＰＵＦＡを効率良く生産できることを見出し、本発明を完成させた。【００１８】
１．ＰＵＦＡという代謝経路を有する微生物に、３−ｈｙｄｒｏｘｙｈｅｘａｎｏｙｌ  ＡＣＰに対する活性が、内在のＦａｂＡ−ＤＨドメインよりも高い、外来のＰＳ−ＤＨドメインをコードする遺伝子が導入された、ＰＵＦＡを生産し得る微生物。
２．ＰＵＦＡ代謝経路を有する微生物がω３ＰＵＦＡ代謝経路を有する微生物であり、生産し得るＰＵＦＡがω６ＰＵＦＡである、前記１に記載の微生物。
３．ＰＵＦＡ代謝経路を有する微生物がＥＰＡ又はＤＨＡ代謝経路を有する微生物であり、生産し得るＰＵＦＡがＡＲＡ又はＤＰＡである、前記１又は２に記載の微生物。
４．ＰＵＦＡ代謝経路を有する微生物がシュワネラ（Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ）属、フォトバクテリウム（Ｐｈｏｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、モリテラ（Ｍｏｒｉｔｅｌｌａ）属、コルウェリア（Ｃｏｌｗｅｌｌｉａ）属、オーランチオキトリウム（Ａｕｒａｎｔｉｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）属、スラウストキトリウム（Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）属、ウルケニア（Ｕｌｋｅｎｉａ）属、パリエチキトリウム（Ｐａｒｉｅｔｉｃｈｙｔｒｉｕｍ）属、ラビリンチュラ（Ｌａｂｙｒｉｎｔｈｕｌａ）属、アプラノキトリウム（Ａｐｌａｎｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）属、オブロンギキトリウム（Ｏｂｌｏｎｇｉｃｈｙｔｒｉｕｍ）属、又はシゾキトリウム（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）属に由来する前記１〜３のいずれか１に記載の微生物。
５．ＰＵＦＡ代謝経路を有さない微生物に、ＰＵＦＡ−ＰＫＳ活性を有する下記（ａ）〜（ｊ）に記載の各ドメインをコードする遺伝子が導入された、ＰＵＦＡを生産し得る微生物であって、ＰＳ−ＤＨドメインがＦａｂＡ−ＤＨドメインよりも高い３−ｈｙｄｒｏｘｙｈｅｘａｎｏｙｌ  ＡＣＰに対する活性を示す微生物。
（ａ）ＫＳドメイン
（ｂ）ＭＡＴドメイン
（ｃ）ＡＣＰドメイン
（ｄ）ＫＲドメイン
（ｅ）ＰＳ−ＤＨドメイン
（ｆ）ＣＬＦドメイン
（ｇ）ＡＴドメイン
（ｈ）ＦａｂＡ−ＤＨドメイン
（ｉ）ＥＲドメイン
（ｊ）ＰＰＴドメイン
６．前記１〜４のいずれか１に記載のＰＵＦＡを生産し得る微生物が有するＰＵＦＡ合成系遺伝子を全て有する前記５に記載の微生物。
７．生産し得るＰＵＦＡがω６ＰＵＦＡである前記５又は６に記載の微生物。
８．生産し得るＰＵＦＡがＡＲＡ又はＤＰＡである前記５〜７のいずれか１に記載の微生物。
９．ＰＵＦＡ代謝経路を有さない微生物がエシェリヒア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、ヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）属、サッカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属、又はピキア（Ｐｉｃｈｉａ）属に属する微生物である前記５〜８のいずれか１に記載の微生物。
１０．ＰＳ−ＤＨドメインが、Ａｕｒｅｉｓｐｉｒａ  ｍａｒｉｎａ由来のＡｒａＢのＰＳ−ＤＨドメインである、前記１〜９のいずれか１に記載の微生物。
１１．前記１〜１０のいずれか１に記載の微生物を培地に培養し、培養物中にＰＵＦＡ又はＰＵＦＡ含有組成物を生成、蓄積させ、該培養物からＰＵＦＡ又はＰＵＦＡ含有組成物を採取する、ＰＵＦＡ又はＰＵＦＡ含有組成物の製造法。
１２．下記（Ｉ）又は（ＩＩ）のＰＵＦＡを生産し得る微生物を用いるＰＵＦＡ又はＰＵＦＡ含有組成物の製造法。
（Ｉ）ＰＵＦＡ代謝経路を有する微生物に、３−ｈｙｄｒｏｘｙｈｅｘａｎｏｙｌ  ＡＣＰに対する活性が内在のＦａｂＡ−ＤＨドメインよりも高いＰＳ−ＤＨドメインをコードする遺伝子が導入された、ＰＵＦＡを生産し得る微生物。
（ＩＩ）ＰＵＦＡ代謝経路を有さない微生物に、ＰＵＦＡ−ＰＫＳ活性を有する下記（ａ）〜（ｊ）に記載の各ドメインをコードする遺伝子が導入された、ＰＵＦＡを生産し得る微生物であって、ＰＳ−ＤＨドメインがＦａｂＡ−ＤＨドメインよりも高い３−ｈｙｄｒｏｘｙｈｅｘａｎｏｙｌ  ＡＣＰに対する活性を示す微生物。
（ａ）ＫＳドメイン
（ｂ）ＭＡＴドメイン
（ｃ）ＡＣＰドメイン
（ｄ）ＫＲドメイン
（ｅ）ＰＳ−ＤＨドメイン
（ｆ）ＣＬＦドメイン
（ｇ）ＡＴドメイン
（ｈ）ＦａｂＡ−ＤＨドメイン
（ｉ）ＥＲドメイン
（ｊ）ＰＰＴドメイン
【発明の効果】
【００１９】
本発明の微生物は、ＰＵＦＡを生産し得る微生物において、脂肪酸基質である３−ｈｙｄｒｏｘｙｈｅｘａｎｏｙｌ  ＡＣＰに対する活性の強さが、ＦａｂＡ−ＤＨドメインよりも高いＰＳ−ＤＨドメインの遺伝子が導入されていることにより、該微生物内におけるＰＳ−ＤＨドメインの３−ｈｙｄｒｏｘｙｈｅｘａｎｏｙｌ  ＡＣＰに対する反応性がＦａｂＡ−ＤＨドメインと比較して相対的に高く、目的とするＰＵＦＡ又はＰＵＦＡ含有組成物を効率良く製造することができる。本発明の製造法によれば、低コスト且つ高効率でＰＵＦＡを生産することができ、ＰＵＦＡの工業的レベルでの生産に適用し得る。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】図１は、各種微生物におけるＰＵＦＡ−ＰＫＳを構成する蛋白質及びそのドメイン構造の模式図を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
本発明において、「多価不飽和脂肪酸（ＰＵＦＡ）」とは、炭素鎖長が１８以上で不飽和結合数が２以上の長鎖脂肪酸をいう。また、本明細書において「ドメイン」とは、蛋白質中の連続するアミノ酸配列からなる一部分であって、当該蛋白質において、特定の生物学的活性又は機能を有する領域である。
【００２２】
本発明において、「ＰＵＦＡ−ＰＫＳ」とはＰＵＦＡ  ｓｙｎｔｈａｓｅと同義である。ＰＵＦＡ  ｓｙｎｔｈａｓｅは、マロニル−ＣｏＡ等を炭素源として用いて特異的な長鎖の不飽和脂肪酸を合成する酵素群であり、ＫＳ、ＭＡＴ、ＡＣＰ、ＫＲ、ＰＳ−ＤＨ、ＣＬＦ、ＡＴ、ＦａｂＡ−ＤＨ、ＥＲ、ＰＰＴａｓｅの各ドメインを含有するものをいう（ＡＣＯＳ  Ｌｉｐｉｄ  Ｌｉｂｒａｒｙ：ＰＵＦＡ  ｓｙｎｔｈａｓｅ；Ｓｃｉｅｎｃｅ，２００１，２９３，２９０−２９３；ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ，２０１１，６，ｅ２０１４６等）。
【００２３】
ＫＳドメインとは、ＰＵＦＡ−ＰＫＳ活性を有する蛋白質複合体を構成する蛋白質が有するドメインであり、マロニルＡＣＰとアシルＡＣＰの縮合に関わるドメインをいう。
【００２４】
ＭＡＴドメイン、ＡＴドメインとは、ＰＵＦＡ−ＰＫＳ活性を有する蛋白質複合体を構成する蛋白質が有するドメインであり、アシル基の転移に関わるドメインのことをいう。
【００２５】
ＡＣＰドメインとは、ＰＵＦＡ−ＰＫＳ活性を有する蛋白質複合体を構成する蛋白質が有するドメインであり、ホスホパンテテイニル基を介してチオエステル結合によりアシル基と結合し、脂肪酸合成の場として機能する、ＰＵＦＡ−ＰＫＳ活性に必須のドメインをいう。
【００２６】
ＫＲドメインとは、ＰＵＦＡ−ＰＫＳ活性を有する蛋白質複合体を構成する蛋白質が有するドメインであり、縮合により生成するケトン基の還元に関わるドメインをいう。
【００２７】
ＤＨドメインである、ＰＳ−ＤＨドメイン及びＦａｂＡ−ＤＨドメインは、ＰＵＦＡ−ＰＫＳ活性を有する蛋白質複合体を構成する蛋白質が有するドメインであり、ケトン基を還元することによって生じた水酸基の脱水に関わるドメインのことをいう。
【００２８】
ＣＬＦドメインとは、ＰＵＦＡ−ＰＫＳ活性を有する蛋白質複合体を構成する蛋白質が有するドメインであり、炭素鎖の伸長に関わるドメインのことをいう。
【００２９】
ＥＲドメインとは、アシル転移酵素ドメイン、マロニル−ＣｏＡ：ＡＣＰアシル転移酵素ドメインとは、ＰＵＦＡ−ＰＫＳ活性を有する蛋白質複合体を構成する蛋白質が有するドメインであり、アシル基の転移に関わるドメインのことをいう。
【００３０】
ＰＰＴａｓｅとは、ＰＵＦＡ−ＰＫＳ活性を有する蛋白質複合体を構成する酵素であり、ＡＣＰドメインの活性化に関わる酵素のことをいう。
【００３１】
本明細書において「協働する」とは、ある蛋白質を他の蛋白質と共存させたとき、一体となって特定の反応を行うことであり、特に本明細書では、ＰＵＦＡ−ＰＫＳ活性に必要な複数のドメインを共存させたとき、他のドメインと一体となってＰＵＦＡ−ＰＫＳ活性を示すことをいう。
【００３２】
本明細書において「外来の」とは内在性ではなく、異種由来のものをいい、形質転換前の宿主生物が、本発明により導入されるべき遺伝子を有していない場合、該遺伝子によりコードされる蛋白質が実質的に発現しない場合、及び異なる遺伝子により当該蛋白質のアミノ酸配列をコードしているが、形質転換後に内因性蛋白質の活性を発現しない場合において、本発明に基づく遺伝子を宿主生物に導入することを意味するために用いられる。
【００３３】
本明細書において、「宿主生物」とは、遺伝子改変及び形質転換等の対象となる元の生物のことをいう。遺伝子導入による形質転換の対象となる元の生物が微生物の場合は、親株、宿主株ともいう。
【００３４】
〔微生物〕
本発明の微生物としては、下記（１）又は（２）の微生物が挙げられる。
（１）ＰＵＦＡ代謝経路を有する微生物に、３−ｈｙｄｒｏｘｙｈｅｘａｎｏｙｌ  ＡＣＰに対する活性が、ＦａｂＡ−ＤＨドメインよりも高い、外来のＰＳ−ＤＨドメインをコードする遺伝子が導入された、ＰＵＦＡを生産し得る微生物。
（２）ＰＵＦＡ代謝経路を有さない微生物に、ＰＵＦＡ−ＰＫＳ活性を有するＫＳ、ＭＡＴ、ＡＣＰ、ＫＲ、ＰＳ−ＤＨ、ＣＬＦ、ＡＴ、ＦａｂＡ−ＤＨ、ＥＲ、ＰＰＴａｓｅの各ドメインをコードする遺伝子が導入された、ＰＵＦＡを生産し得る微生物であって、ＰＳ−ＤＨドメインがＦａｂＡ−ＤＨドメインよりも高い３−ｈｙｄｒｏｘｙｈｅｘａｎｏｙｌ  ＡＣＰに対する活性を示す微生物。
【００３５】
ＰＵＦＡ代謝経路を有する微生物とは、生来的にＰＵＦＡ生産能を有する微生物をいう。ＰＵＦＡ代謝経路を有する微生物としては、シュワネラ（Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ）属、フォトバクテリウム（Ｐｈｏｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、モリテラ（Ｍｏｒｉｔｅｌｌａ）属、コルウェリア（Ｃｏｌｗｅｌｌｉａ）属、オーランチオキトリウム（Ａｕｒａｎｔｉｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）属、スラウストキトリウム（Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）属、ウルケニア（Ｕｌｋｅｎｉａ）属、パリエチキトリウム（Ｐａｒｉｅｔｉｃｈｙｔｒｉｕｍ）属、ラビリンチュラ（Ｌａｂｙｒｉｎｔｈｕｌａ）属、アプラノキトリウム（Ａｐｌａｎｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）属、オブロンギキトリウム（Ｏｂｌｏｎｇｉｃｈｙｔｒｉｕｍ）属、又はシゾキトリウム（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）属が挙げられる。
【００３６】
ＰＵＦＡ代謝経路を有する微生物としては、ω３ＰＵＦＡ代謝経路を有する微生物が好ましく、例えば、ＤＨＡ代謝経路を有する微生物、ＥＰＡ代謝経路を有する微生物が挙げられる。
【００３７】
ＤＨＡ代謝経路を有する微生物としては、例えば、モリテラ（Ｍｏｒｉｔｅｌｌａ）属、コルウェリア（Ｃｏｌｗｅｌｌｉａ）属、オーランチオキトリウム（Ａｕｒａｎｔｉｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）属、スラウストキトリウム（Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）属、シゾキトリウム属（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）の微生物が挙げられる。好ましくはモリテラ・マリナ（Ｍｏｒｉｔｅｌｌａ  ｍａｒｉｎａ）、コルウェリア・サイクレリスラエア（Ｃｏｌｗｅｌｌｉａ  ｐｓｙｃｈｒｅｒｙｔｈｒａｅａ）、オーランチオキトリウム・リマシナム（Ａｕｒａｎｔｉｏｃｈｙｔｒｉｕｍ・ｌｉｍａｃｉｎｕｍ）、スラウストキトリウム・アウレウム（Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｕｍ  ａｕｒｅｕｍ）等が挙げられるがＤＨＡ代謝経路を有する限り、これらに限定されない。
【００３８】
ＤＨＡ代謝経路を有する微生物としては、オーランチオキトリウム（Ａｕｒａｎｔｉｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）属に属する微生物が好ましく、例えばオーランチオキトリウム  エスピー  ＯＨ４株（受託番号ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１５２４）などが挙げられ、さらにその変異株であってＤＨＡ生産能を有する微生物を用いてもよい。
【００３９】
前記のオーランチオキトリウム  エスピー  ＯＨ４株は、日本国茨城県つくば市東１丁目１番地中央第６（郵便番号３０５−８５６６）に所在する、独立行政法人製品評価技術基盤機構（ＮＩＴＥ）の特許微生物寄託センターに寄託された。受領日（寄託日）は平成２５年（西暦２０１３年）１月１１日であり、受託番号はＦＥＲＭ  ＢＰ−１１５２４である。
【００４０】
ＥＰＡ代謝経路を有する微生物としては、例えば、シュワネラ（Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ）属、フォトバクテリウム（Ｐｈｏｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、ビブリオ（Ｖｉｂｒｉｏ）属の微生物が挙げられる。好ましくはシュワネラ・オネイデンシス（Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ  ｏｎｅｉｄｅｎｓｉｓ）、シュワネラ・リビングストネンシス（Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ  ｌｉｖｉｎｇｓｔｏｎｅｎｓｉｓ）、シュワネラ・バルティカ（Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ  ｂａｌｔｉｃａ）、シュワネラ・ペアレアナ（Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ  ｐｅａｌｅａｎａ）、フォトバクテリウム・プロフンダム（Ｐｈｏｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐｒｏｆｕｎｄｕｍ）等が挙げられるがＥＰＡ代謝経路を有する限り、これらに限定されない。
【００４１】
ＰＵＦＡ代謝経路を有さない微生物とは、生来的にＰＵＦＡ生産能を有さない微生物をいう。ＰＵＦＡ代謝経路を有さない微生物としては、例えば、細菌、微細藻類、真菌、原生生物、原生動物が挙げられる。
【００４２】
細菌としては、例えば、エシェリヒア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属、セラチア（Ｓｅｒｒａｔｉａ）属、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属、ブレビバクテリウム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、ミクロバクテリウム（Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属、及びオーレオスピラ（Ａｕｒｅｉｓｐｉｒａ）属からなる群より選ばれる属に属する微生物が挙げられる。これらの中でも、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＸＬ１−Ｂｌｕｅ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＸＬ２−Ｂｌｕｅ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＤＨ１、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＭＣ１０００、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＫＹ３２７６、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  Ｗ１４８５、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＨＢ１０１、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  Ｎｏ．４９、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  Ｗ３１１０、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＮＹ４９、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＢＬ２１  ｃｏｄｏｎ  ｐｌｕｓ（ストラタジーン社製）、Ｓｅｒｒａｔｉａ  ｆｉｃａｒｉａ、Ｓｅｒｒａｔｉａ  ｆｏｎｔｉｃｏｌａ、Ｓｅｒｒａｔｉａ  ｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ、Ｓｅｒｒａｔｉａ  ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｉｍｍａｒｉｏｐｈｉｌｕｍ  ＡＴＣＣ１４０６８、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｍ  ＡＴＣＣ１４０６６、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｍｍｏｎｉａｇｅｎｅｓ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ＡＴＣＣ１３０３２、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ＡＴＣＣ１４０６７、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ  ＡＴＣＣ１３８６９、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｃｅｔｏａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｍ  ＡＴＣＣ１３８７０、Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｍｍｏｎｉａｐｈｉｌｕｍ  ＡＴＣＣ１５３５４、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．Ｄ−０１１０及びＡｕｒｅｉｓｐｉｒａ  ｍａｒｉｎａ  ＪＣＭ２３２０１からなる群より選ばれる微生物が好ましい。
【００４３】
微細藻類としては、例えば、ユーグレナ藻綱（Ｅｕｇｌｅｎｏｐｈｙｃｅａｅ）［例えば、ユーグレナ（Ｅｕｇｌｅｎａ）属 およびペラネマ（Ｐｅｒａｎｅｍａ）属］、緑藻綱（Ｃｈｒｙｓｏｐｈｙｃｅａｅ）［例えば、オクロモナス（Ｏｃｈｒｏｍｏｎａｓ）属］、サヤツナギ綱（Ｄｉｎｏｂｒｙａｃｅａｅ）［例えば、サヤツナギ（Ｄｉｎｏｂｒｙｏｎ）属、プラチクリシス（Ｐｌａｔｙｃｈｒｙｓｉｓ）属およびクリソクロムリナ（Ｃｈｒｙｓｏｃｈｒｏｍｕｌｉｎａ）属］、渦鞭毛藻綱（Ｄｉｎｏｐｈｙｃｅａｅ）［例えば、クリプセコディニウム（Ｃｒｙｐｔｈｅｃｏｄｉｎｉｕｍ）属、ギムノジニウム（Ｇｙｍｎｏｄｉｎｉｕｍ）属、ペリジリウム（Ｐｅｒｉｄｉｎｉｕｍ）属、セラチウム（Ｃｅｒａｔｉｕｍ）属、ギロジニウム（Ｇｙｒｏｄｉｎｉｕｍ）属およびオキシルリス（Ｏｘｙｒｒｈｉｓ）属］、クリプト藻綱（Ｃｒｙｐｔｏｐｈｙｃｅａｅ）［例えば、クリプトモナス（Ｃｒｙｐｔｏｍｏｎａｓ）属およびロドモナス（Ｒｈｏｄｏｍｏｎａｓ）属］、黄緑藻綱（Ｘａｎｔｈｏｐｈｙｃｅａｅ）［例として、オリストディスカス（Ｏｌｉｓｔｈｏｄｉｓｃｕｓ）属］［かつ、鞭毛虫リゾクロリス類（Ｒｈｉｚｏｃｈｌｏｒｉｄａｃｅａｅ）ならびにアファノカエテパシェリ（Ａｐｈａｎｏｃｈａｅｔｅ  ｐａｓｃｈｅｒｉ）、ブミレリアスティゲオクロニウム（Ｂｕｍｉｌｌｅｒｉａ  ｓｔｉｇｅｏｃｌｏｎｉｕｍ）およびバウケリアゲミナタ（Ｖａｕｃｈｅｒｉａ  ｇｅｍｉｎａｔａ）の遊走子／配偶子においてのようなアメーバ状期を生じる藻類の品種を含む］、真正眼点藻綱（Ｅｕｓｔｉｇｍａｔｏｐｈｙｃｅａｅ）およびプリムネシウム藻綱（Ｐｒｙｍｎｅｓｉｏｐｙｃｅａｅ）［例えば、プリムネシウム（Ｐｒｙｍｎｅｓｉｕｍ）属およびディアクロネマ（Ｄｉａｃｒｏｎｅｍａ）属を含む］が挙げられる。
【００４４】
これらの属内の好ましい種は、特に限定されないが、Ｎａｎｎｏｃｈｌｏｒｏｐｓｉｓ  ｏｃｕｌａｔａ、Ｃｒｙｐｔｈｅｃｏｄｉｎｉｕｍ  ｃｏｈｎｉｉ、Ｅｕｇｌｅｎａ  ｇｒａｃｉｌｉｓが挙げられる。
【００４５】
真菌としては、例えば、サッカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属［例えば、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、サッカロマイセス・カールスベルゲンシス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃａｒｌｓｂｅｒｇｅｎｓｉｓ）］を含む酵母、もしくはヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）属、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属、ピキア（Ｐｉｃｈｉａ）属、クルイベロマイセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）属のような他の酵母、又は他の真菌、例えば、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属、ノイロスポラ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）属、ペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）属のような繊維状真菌などが挙げられる。
【００４６】
微生物（２）としては、上記した微生物（１）が有するＰＵＦＡ合成系遺伝子が全て導入された微生物、すなわち上記した微生物（１）が有するＰＵＦＡ合成系遺伝子を全て有する微生物であることが好ましい。
【００４７】
本発明において「３−ｈｙｄｒｏｘｙｈｅｘａｎｏｙｌ  ＡＣＰに対する活性」とは、３−ｈｙｄｒｏｘｙｈｅｘａｎｏｙｌ  ＡＣＰに対して優先的に作用する活性であり、より詳しくは３−ｈｙｄｒｏｘｙｈｅｘａｎｏｙｌ  ＡＣＰに対する反応性（親和性）をいう。３−ｈｙｄｒｏｘｙｈｅｘａｎｏｙｌ  ＡＣＰに対する活性はデヒドラターゼの逆反応（水酸化反応）を評価する手法により測定できる。
【００４８】
前記手法としては、例えば、基質となるｃｒｏｔｏｎｙｌ  ＡＣＰ又は２−ｔｒａｎｓ−ｈｅｘｅｎｏｙｌ  ＡＣＰが調製される条件において、ＦａｂＡ−ＤＨドメイン又はＰＳ−ＤＨドメインを含む蛋白質を添加して得られた生産物をＨＰＬＣで分析し、ピークの高さを比較することにより生成物の量（ｃｒｏｔｏｎｙｌ  ＡＣＰを基質とした場合の産物：３−ｈｙｄｒｏｘｙ−ｂｕｔｙｒｙｌ−ＡＣＰ、２−ｔｒａｎｓ−ｈｅｘｅｎｏｙｌ  ＡＣＰを基質とした場合の産物：３−ｈｙｄｒｏｘｙ−ｈｅｘａｎｏｙｌ−ＡＣＰ）を比較する。そして、ｃｒｏｔｏｎｙｌ  ＡＣＰを基質とした場合の産物の量が２−ｔｒａｎｓ−ｈｅｘｅｎｏｙｌ  ＡＣＰを基質とした場合の産物の量よりも少ない場合に、ＰＳ−ＤＨドメインの３−ｈｙｄｒｏｘｙｈｅｘａｎｏｙｌ  ＡＣＰに対する活性がＦａｂＡ−ＤＨドメインの該活性より高い、と判断する。
【００４９】
本発明において、「ＰＳ−ＤＨドメインがＦａｂＡ−ＤＨドメインよりも高い３−ｈｙｄｒｏｘｙｈｅｘａｎｏｙｌ  ＡＣＰに対する活性を示す」とは、具体的には例えば、下記反応条件により反応させたＨＰＬＣピークの高さについて、２−ｔｒａｎｓ−ｈｅｘｅｎｏｙｌ  ＡＣＰを基質とした場合の産物についてのＨＰＬＣピークの高さがｃｒｏｔｏｎｙｌ  ＡＣＰを基質とした場合の産物についてのＨＰＬＣピークの高さの１．５倍以上であることが好ましく、より好ましくは２倍以上、さらに好ましくは５倍以上である。
【００５０】
（反応条件）
Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ８０ｍＭ、ＮａＣｌ  ８０ｍＭ、ＭｇＣｌ２  ２５ｍＭ、基質となるＡＣＰ  １００μＭ、Ｓｆｐ  ２０μＭ、アシル−ＣｏＡ  ３００μＭを混合し、２０℃にて１０分間反応させた系に、ＰＳ−ＤＨドメイン及びＦａｂＡ−ＤＨドメインを含む蛋白質を１μＭまたは５μＭ添加して、２０℃にて反応させる。反応開始から１、５、１０、３０、６０分後にサンプルを回収し、ＬＣ／ＭＳ分析を行い、ＨＰＬＣピークの高さを解析する。前記Ｓｆｐとは、バチルス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）由来の４’−ｐｈｏｓｐｈｏｐａｎｔｅｔｈｅｉｎｙｌ  ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅを意味する。
【００５１】
具体的には、例えば、上記した微生物（１）の場合、ＰＵＦＡ代謝経路を有する微生物における内在のＰＳ−ＤＨドメインの３−ｈｙｄｒｏｘｙｈｅｘａｎｏｙｌ  ＡＣＰに対する活性が内在のＦａｂＡ−ＤＨドメインと比較して同程度以下であるところ、内在のＦａｂＡ−ＤＨドメインよりも該活性が高い、ＰＳ−ＤＨドメインをコードする外来の遺伝子を該微生物に導入することにより、該微生物内におけるＰＳ−ＤＨドメインの３−ｈｙｄｒｏｘｙｈｅｘａｎｏｙｌ  ＡＣＰへの反応性がＦａｂＡ−ＤＨドメインと比較して相対的に高い微生物となる。
【００５２】
また、例えば、上記した微生物（２）の場合、ＰＵＦＡ代謝経路を有さない微生物に遺伝子を導入して発現させたＰＵＦＡ−ＰＫＳ活性を有する各ドメインのうち、ＰＳ−ＤＨドメインがＦａｂＡ−ＤＨドメインよりも高い３−ｈｙｄｒｏｘｙｈｅｘａｎｏｙｌ  ＡＣＰに対する活性を有することにより、該微生物内におけるＰＳ−ＤＨドメインの３−ｈｙｄｒｏｘｙｈｅｘａｎｏｙｌ  ＡＣＰへの反応性がＦａｂＡ−ＤＨドメインと比較して相対的に高い微生物となる。
【００５３】
微生物内におけるＰＳ−ＤＨドメインの３−ｈｙｄｒｏｘｙｈｅｘａｎｏｙｌ  ＡＣＰへの反応性がＦａｂＡ−ＤＨドメインと比較して相対的に高いことにより、該微生物のＰＵＦＡ代謝経路においてＦａｂＡ−ＤＨドメインよりもＰＳ−ＤＨドメインが優先的に３−ｈｙｄｒｏｘｙｈｅｘａｎｏｙｌ  ＡＣＰに反応し、ＰＳ−ＤＨドメインが機能するＰＵＦＡの生合成経路によりＰＵＦＡが生産される。
【００５４】
ＦａｂＡ−ＤＨドメインが機能するＰＵＦＡ生合成経路及びＰＳ−ＤＨドメインが機能するＰＵＦＡ生合成経路として、ＦａｂＡ−ＤＨドメインが機能するω３ＰＵＦＡの生合成経路とＰＳ−ＤＨドメインが機能するω６ＰＵＦＡの生合成経路が挙げられる。
【００５５】
ＦａｂＡ−ＤＨドメインが機能するＰＵＦＡ生合成経路で得られるＰＵＦＡにおける、末端の炭素原子から数えた二重結合の位置をω（α）位（例えば、ω３位）とすると、ＰＳ−ＤＨドメインが機能するＰＵＦＡの生合成経路で得られるＰＵＦＡは、該末端の炭素原子から数えた二重結合の位置がω（α＋３）位（例えば、ω６位）となる。
【００５６】
したがって、例えば、内在のＦａｂＡ−ＤＨドメインがＰＳ−ＤＨドメインよりも高い３−ｈｙｄｒｏｘｙｈｅｘａｎｏｙｌ  ＡＣＰに対する活性を有するω３ＰＵＦＡの代謝経路を有する微生物に対し、該内在のＦａｂＡ−ＤＨドメインよりも高い３−ｈｙｄｒｏｘｙｈｅｘａｎｏｙｌ  ＡＣＰに対する活性を有する外来のＰＳ−ＤＨドメインをコードする遺伝子を導入することにより、該微生物内におけるＰＳ−ＤＨドメインの３−ｈｙｄｒｏｘｙｈｅｘａｎｏｙｌ  ＡＣＰへの反応性がＦａｂＡ−ＤＨドメインと比較して相対的に高くなる。その結果、３−ｈｙｄｒｏｘｙｈｅｘａｎｏｙｌ  ＡＣＰに対し、ＦａｂＡ−ＤＨドメインよりもＰＳ−ＤＨドメインが優先的に作用し、ω６ＰＵＦＡを最終産物として生産し得る微生物となる。
【００５７】
本発明において、ＰＳ−ＤＨドメインとしては、Ａｕｒｅｉｓｐｉｒａ  ｍａｒｉｎａ由来のＡｒａＢ上のＰＳ−ＤＨドメイン［配列番号２で表されるアミノ酸配列（配列番号１３６で表される塩基配列によりコードされる）を有する蛋白質］、又はＰｓｙｃｈｒｏｆｌｅｘｕｓ  ｔｏｒｑｕｉｓ由来のｐｆａＢ上のＰＳ−ＤＨドメイン［配列番号１３７で表されるアミノ酸配列（配列番号１３９で表される塩基配列によりコードされる）を有する蛋白質］が挙げられ、Ａｕｒｅｉｓｐｉｒａ  ｍａｒｉｎａ由来のａｒａＢ上のＰＳ−ＤＨドメインが好ましい。これらの配列は公知であり、適宜使用することができる。また、公知の配列を利用して、内在のＦａｂＡ−ＤＨドメインよりも高い３−ｈｙｄｒｏｘｙｈｅｘａｎｏｙｌ  ＡＣＰに対する活性を有するＰＳ−ＤＨドメインをコードする遺伝子を得ることができる。
【００５８】
より具体的には、本発明で使用するＰＳ−ＤＨドメインとしては、好ましくは、以下が挙げられる。
［１］配列番号２又は配列番号１３７で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質
［２］配列番号２又は配列番号１３７で表されるアミノ酸配列において、１〜２０個、好ましくは１〜１０個、最も好ましくは１〜５個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、３−ｈｙｄｒｏｘｙｈｅｘａｎｏｙｌ  ＡＣＰに対する活性を有する変異蛋白質
［３］配列番号２又は配列番号１３７で表されるアミノ酸配列と少なくとも９５％以上、好ましくは９７％以上、より好ましくは９８％以上、最も好ましくは９９％以上の同一性を有し、かつ、３−ｈｙｄｒｏｘｙｈｅｘａｎｏｙｌ  ＡＣＰに対する活性を有する相同蛋白質
【００５９】
ＰＳ−ＤＨドメインをコードする遺伝子は、ＰＳ−ＤＨドメインを有する蛋白質をコードする遺伝子を微生物に導入することにより微生物に導入してもよい。ＰＳ−ＤＨドメインを有する蛋白質としては、Ａｕｒｅｉｓｐｉｒａ  ｍａｒｉｎａ由来のＡｒａＢ［配列番号５８で表されるアミノ酸配列（配列番号５７で表される塩基配列によりコードされる）を有する蛋白質］、Ｐｓｙｃｈｒｏｆｌｅｘｕｓ  ｔｏｒｑｕｉｓ由来のＰｆａＢ［配列番号１３８で表されるアミノ酸配列（配列番号１４０で表される塩基配列によりコードされる）を有する蛋白質］が挙げられる。
【００６０】
より具体的には、本発明で使用するＰＳ−ＤＨドメインを有する蛋白質としては、好ましくは、以下が挙げられる。
［４］配列番号５８又は配列番号１３８で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質
［５］配列番号５８又は配列番号１３８で表されるアミノ酸配列において、１〜２０個、好ましくは１〜１０個、最も好ましくは１〜５個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、３−ｈｙｄｒｏｘｙｈｅｘａｎｏｙｌ  ＡＣＰに対する活性を有する変異蛋白質
［６］配列番号５８又は配列番号１３８で表されるアミノ酸配列と少なくとも９５％以上、好ましくは９７％以上、より好ましくは９８％以上、最も好ましくは９９％以上の同一性を有し、かつ、３−ｈｙｄｒｏｘｙｈｅｘａｎｏｙｌ  ＡＣＰに対する活性を有する相同蛋白質
【００６１】
配列番号５８で表されるアミノ酸配列を有する蛋白質は８０１アミノ酸残基からなる蛋白質であり、Ｎ末端側から、５３１〜７９０残基にＰＳ−ＤＨドメインを有する。
【００６２】
変異蛋白質とは、元となる蛋白質中のアミノ酸残基を人為的に欠失、置換、又は該蛋白質中にアミノ酸残基を付加して得られる蛋白質をいう。上記の変異蛋白質において、アミノ酸が欠失、置換、挿入又は付加されたとは、同一配列中の任意の位置において、１〜２０個、好ましくは１〜１０個、最も好ましくは１〜５個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されていてもよい。
【００６３】
欠失、置換又は付加されるアミノ酸は天然型と非天然型とを問わない。天然型アミノ酸としては、Ｌ−アラニン、Ｌ−アスパラギン、Ｌ−アスパラギン酸、Ｌ−グルタミン、Ｌ−グルタミン酸、グリシン、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−リジン、Ｌ−アルギニン、Ｌ−メチオニン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−プロリン、Ｌ−セリン、Ｌ−スレオニン、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−チロシン、Ｌ−バリン、Ｌ−システインが挙げられる。
【００６４】
以下に、相互に置換可能なアミノ酸の例を示す。同一群に含まれるアミノ酸は相互に置換可能である。
Ａ群：ロイシン、イソロイシン、ノルロイシン、バリン、ノルバリン、アラニン、２−アミノブタン酸、メチオニン、Ｏ−メチルセリン、ｔ−ブチルグリシン、ｔ−ブチルアラニン、シクロヘキシルアラニン
Ｂ群：アスパラギン酸、グルタミン酸、イソアスパラギン酸、イソグルタミン酸、２−アミノアジピン酸、２−アミノスベリン酸
Ｃ群：アスパラギン、グルタミン
Ｄ群：リジン、アルギニン、オルニチン、２，４−ジアミノブタン酸、２，３−ジアミノプロピオン酸
Ｅ群：プロリン、３−ヒドロキシプロリン、４−ヒドロキシプロリン
Ｆ群：セリン、スレオニン、ホモセリン
Ｇ群：フェニルアラニン、チロシン
【００６５】
相同蛋白質とは、元となる蛋白質と構造及び機能が類似することにより、その蛋白質をコードする遺伝子が進化上の起源を元の蛋白質をコードする遺伝子と同一にすると考えられる蛋白質であって、自然界に存在する生物が有する蛋白質をいう。
【００６６】
アミノ酸配列や塩基配列の同一性は、Ｋａｒｌｉｎ  ａｎｄ  ＡｌｔｓｃｈｕｌによるアルゴリズムＢＬＡＳＴ［Ｐｒｏ．ＮＡＴドメインｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０，５８７３（１９９３）］やＦＡＳＴＡ［Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１８３，６３（１９９０）］を用いて決定することができる。このアルゴリズムＢＬＡＳＴに基づいて、ＢＬＡＳＴＮやＢＬＡＳＴＸとよばれるプログラムが開発されている［Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２１５，４０３（１９９０）］。ＢＬＡＳＴに基づいてＢＬＡＳＴＮによって塩基配列を解析する場合には、パラメータは例えばＳｃｏｒｅ＝１００、ｗｏｒｄｌｅｎｇｔｈ＝１２とする。また、ＢＬＡＳＴに基づいてＢＬＡＳＴＸによってアミノ酸配列を解析する場合には、パラメータは例えばｓｃｏｒｅ＝５０、ｗｏｒｄｌｅｎｇｔｈ＝３とする。ＢＬＡＳＴとＧａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴプログラムを用いる場合には、各プログラムのデフォルトパラメーターを用いる。これらの解析方法の具体的な手法は公知である。
【００６７】
本発明で使用するＰＳ−ＤＨドメインをコードする遺伝子とは、３−ｈｙｄｒｏｘｙｈｅｘａｎｏｙｌ  ＡＣＰに対する活性を有する蛋白質をコードする遺伝子であれば限定されないが、好ましくは、以下のいずれか１のＤＮＡを有する遺伝子が挙げられる。
［７］上記［１］〜［３］のいずれか１の蛋白質をコードするＤＮＡ
［８］配列番号１３６又は配列番号１３９で表される塩基配列を含むＤＮＡ
［９］前記［７］又は［８］に記載のＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつ、３−ｈｙｄｒｏｘｙｈｅｘａｎｏｙｌ  ＡＣＰに対する活性を有する相同蛋白質をコードするＤＮＡ
［１０］前記［７］又は［８］に記載のＤＮＡの塩基配列と少なくとも９５％以上、好ましくは９７％以上、より好ましくは９８％以上、最も好ましくは９９％以上の同一性を有し、かつ、３−ｈｙｄｒｏｘｙｈｅｘａｎｏｙｌ  ＡＣＰに対する活性を有する相同蛋白質をコードするＤＮＡ
【００６８】
また、ＰＳ−ＤＨドメインを有する蛋白質をコードする遺伝子としては、好ましくは、以下のいずれか１のＤＮＡを有する遺伝子が挙げられる。
［１１］上記［４］〜［６］のいずれか１の蛋白質をコードするＤＮＡ
［１２］配列番号５７又は配列番号１４０で表される塩基配列を含むＤＮＡ
［１３］前記［１１］又は［１２］に記載のＤＮＡの塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、かつ、３−ｈｙｄｒｏｘｙｈｅｘａｎｏｙｌ  ＡＣＰに対する活性を有する相同蛋白質をコードするＤＮＡ
［１４］前記［１１］又は［１２］記載のＤＮＡの塩基配列と少なくとも９５％以上、好ましくは９７％以上、より好ましくは９８％以上、最も好ましくは９９％以上の同一性を有し、かつ、３−ｈｙｄｒｏｘｙｈｅｘａｎｏｙｌ  ＡＣＰに対する活性を有する相同蛋白質をコードするＤＮＡ
【００６９】
ハイブリダイズするとは、特定の塩基配列を有するＤＮＡ又は該ＤＮＡの一部が他のＤＮＡと相補的に複合体を形成することをいう。したがって、該特定の塩基配列を有するＤＮＡ又は該ＤＮＡの一部の塩基配列は、ノーザン又はサザンブロット解析のプローブとして有用であるか、又はＰＣＲ解析のオリゴヌクレオチドプライマーとして使用できる長さのＤＮＡであってもよい。プローブとして用いるＤＮＡとしては、少なくとも１００塩基以上、好ましくは２００塩基以上、より好ましくは５００塩基以上のＤＮＡを挙げることができ、プライマーとして用いられるＤＮＡとしては、少なくとも１０塩基以上、好ましくは１５塩基以上のＤＮＡを挙げることができる。
【００７０】
ＤＮＡのハイブリダイゼーション実験の方法はよく知られており、例えばモレキュラー・クローニング第２版、第３版（２００１年）、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  ＧｅｎＥＲドメインａｌ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ＢａｃｔＥｒｉｏｌｏｇｙ，ＡＳＭ  Ｐｒｅｓｓ（１９９４）、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ｍｅｔｈｏｄｓ  ｍａｎｕａｌ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ）に記載の他、多数の他の標準的な教科書に従ってハイブリダイゼーションの条件を決定し、実験を行うことができる。
【００７１】
また、市販のハイブリダイゼーションキットに付属した説明書に従うことによっても、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡを取得することができる。市販のハイブリダイゼーションキットとしては、例えばランダムプライム法によりプローブを作製し、ストリンジェントな条件でハイブリダイゼーションを行うランダムプライムドＤＮＡラベリングキット（ロシュ・ダイアグノスティックス社製）などを挙げることができる。
【００７２】
ストリンジェントな条件とは、例えばＤＮＡを固定化したフィルターとプローブＤＮＡとを５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ（７５０ｍＭの塩化ナトリウム、７５ｍＭのクエン酸ナトリウム）、５０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ７．６）、５×デンハルト溶液、１０％の硫酸デキストラン、及び２０μｇ／ｌの変性させたサケ精子ＤＮＡを含む溶液中で４２℃にて一晩、インキュベートした後、例えば約６５℃の０．２×ＳＳＣ溶液中で該フィルターを洗浄する条件を挙げることができる。
【００７３】
上記した様々な条件は、ハイブリダイゼーション実験のバックグラウンドを抑えるために用いるブロッキング試薬を添加、又は変更することにより設定することもできる。上記したブロッキング試薬の添加は、条件を適合させるために、ハイブリダイゼーション条件の変更を伴ってもよい。
【００７４】
上記したストリンジェントな条件下でハイブリダイズ可能なＤＮＡとしては、例えば上記したＢＬＡＳＴ及びＦＡＳＴＡ等のプログラムを用いて、上記パラメータに基づいて計算したときに、対象となるＤＮＡの塩基配列と少なくとも９５％以上、好ましくは９７％以上、さらに好ましくは９８％以上、最も好ましくは９９％以上の同一性を有する塩基配列からなるＤＮＡを挙げることができる。
【００７５】
微生物（２）に導入されるＰＵＦＡ−ＰＫＳ活性を有する各ドメインとしては、ＫＳドメイン、ＭＡＴドメイン、ＡＣＰドメイン、ＫＲドメイン、ＣＬＦドメイン、ＡＴドメイン、ＤＨドメインであるＦａｂＡ−ＤＨドメイン、ＥＲドメイン及びＰＰＴドメインが挙げられる。各ドメインは、協働してアセチルＣｏＡを出発基質としてＰＵＦＡを生産する限りにおいて限定されないが、例えば、既知のＰＵＦＡ−ＰＫＳが有する各ドメインを挙げることができる。
【００７６】
微生物（２）に導入されたＰＵＦＡ−ＰＫＳ活性を有する各ドメインが協働して示すＰＵＦＡ−ＰＫＳ活性は、ＰＵＦＡ−ＰＫＳの各ドメインをコードする遺伝子で形質転換した微生物を造成し、該微生物を培地に培養し、培養物中にＰＵＦＡを生成、蓄積させ、該培養物中に蓄積したＰＵＦＡをガスクロマトグラフィーで測定することにより、確認することができる。
【００７７】
本明細書において「既知のＰＵＦＡ−ＰＫＳ」とは、好ましくは、シュワネラ属（Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ）、コルウェリア属（Ｃｏｌｗｅｌｌｉａ）、デサルファチバチルム属（Ｄｅｓｕｌｆａｔｉｂａｃｉｌｌｕｍ）、サイクロフレクサス属（Ｐｓｙｃｈｒｏｆｌｅｘｕｓ）、シゾキトリウム属（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）、ノストック属（Ｎｏｓｔｏｃ）、ミクロシスティス属（Ｍｉｃｒｏｃｙｓｔｉｓ）、サッカロポリスポラ属（Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ）、ジオバクター属（Ｇｅｏｂａｃｔｅｒ）、プランクトマイセス属（Ｐｌａｎｃｔｏｍｙｃｅｓ）、デサルフォコッカス属（Ｄｅｓｕｌｆｏｃｏｃｃｕｓ）、ソランギウム属（Ｓｏｒａｎｇｉｕｍ）、レニバクテリウム属（Ｒｅｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、チチノファガ属（Ｃｈｉｔｉｎｏｐｈａｇａ）、グレオバクター属（Ｇｌｏｅｏｂａｃｔｅｒ）、アゾトバクター属（Ａｚｏｔｏｂａｃｔｅｒ）、ロドコッカス属（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）、ソリバクター属（Ｓｏｌｉｂａｃｔｅｒ）、デサルフォバクテリウム属（Ｄｅｓｕｌｆｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、クロストリジウム属（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）、スラウストキトリウム（Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）属、ウルケニア（Ｕｌｋｅｎｉａ）属、ジャポノチトリウム（Ｊａｐｏｎｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）属、オーランチオキトリウム（Ａｕｒａｎｔｉｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）属、モリテラ（Ｍｏｒｉｔｅｌｌａ）属からなる群より選ばれる属に属する微生物が元来有しているＰＵＦＡ−ＰＫＳを、より好ましくは、Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ  ｐｅａｌｅａｎａ  ＡＴＣＣ  ７００３４５、Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ  ｏｎｅｉｄｅｎｓｉｓ  ＭＲ−１、Ｃｏｌｗｅｌｌｉａ  ｐｓｙｃｈｒｅｒｙｔｈｒａｅａ  ３４Ｈ、Ｄｅｓｕｌｆａｔｉｂａｃｉｌｌｕｍ  ａｌｋｅｎｉｖｏｒａｎｓＡＫ−０１、Ｐｓｙｃｈｒｏｆｌｅｘｕｓ  ｔｏｒｑｕｉｓＡＴＣＣ  ７００７５５、Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ  ｓｐ．  ＡＴＣＣ  ２０８８８、Ｎｏｓｔｏｃ  ｐｕｎｃｔｉｆｏｒｍｅＰＣＣ  ７３１０２、Ｍｉｃｒｏｃｙｓｔｉｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａＮＩＥＳ−８４３、Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ  ｅｒｙｔｈｒａｅａ  ＮＲＲＬ  ２３３８、Ｇｅｏｂａｃｔｅｒ  ｂｅｍｉｄｊｉｅｎｓｉｓ  Ｂｅｍ、Ｐｌａｎｃｔｏｍｙｃｅｓ  ｌｉｍｎｏｐｈｉｌｕｓ  ＤＳＭ３７７６、Ｄｅｓｕｌｆｏｃｏｃｃｕｓ  ｏｌｅｏｖｏｒａｎｓ  Ｈｘｄ３、Ｓｏｒａｎｇｉｕｍ  ｃｅｌｌｕｌｏｓｕｍ  ‘Ｓｏｃｅ  ５６’、  Ｒｅｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓａｌｍｏｎｉｎａｒｕｍ  ＡＴＣＣ  ３３２０９、Ｃｈｉｔｉｎｏｐｈａｇａ  ｐｉｎｅｎｓｉｓＤＳＭ  ２５８８、Ｇｌｏｅｏｂａｃｔｅｒ  ｖｉｏｌａｃｅｕｓＰＣＣ  ７４２１、Ａｚｏｔｏｂａｃｔｅｒ  ｖｉｎｅｌａｎｄｉｉＤＪ、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓＰＲ４、Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ  Ｓｏｌｉｂａｃｔｅｒ  ｕｓｉｔａｔｕｓＥｌｌｉｎ６０７６、Ｄｅｓｕｌｆｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃｕｍＨＲＭ２、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｔｈｅｒｍｏｃｅｌｌｕｍＡＴＣＣ  ２７４０５、Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ  ｍｉｎｕｔｕｍ、Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ  ｓｐ．  Ｓ３１  ＡＴＣＣ  ２０８８８、Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ  ｓｐ．  Ｓ８  ＡＴＣＣ  ２０８８９、Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ  ｓｐ．  ＬＣ−ＲＭ  ＡＴＣＣ  １８９１５、Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ  ｓｐ．  ＳＲ２１、Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ  ａｇｇｒｅｇａｔｕｍ  ＡＴＣＣ  ２８２０９、Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ  ｌｉｍａｃｉｎｕｍ  ＩＦＯ  ３２６９３、Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｕｍ  ｓｐ．２３Ｂ  ＡＴＣＣ  ２０８９１、Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｕｍ  ｓｔｒｉａｔｕｍ  ＡＴＣＣ  ２４４７３、Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｕｍ  ａｕｒｅｕｍ  ＡＴＣＣ  ３４３０４、Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｕｍ  ｒｏｓｅｕｍ  ＡＴＣＣ  ２８２１０、Ｕｌｋｅｎｉａ  ｓｐ．ＢＰ−５６０１、及びＪａｐｏｎｏｃｈｙｔｒｉｕｍ  ｓｐ．Ｌ１  ＡＴＣＣ  ２８２０７からなる群より選ばれる微生物が、元来有しているＰＵＦＡ−ＰＫＳを、最も好ましくは、Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ  ｐｅａｌｅａｎａ  ＡＴＣＣ  ７００３４５、Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ  ｏｎｅｉｄｅｎｓｉｓ  ＭＲ−１、Ｃｏｌｗｅｌｌｉａ  ｐｓｙｃｈｒｅｒｙｔｈｒａｅａ  ３４Ｈ、Ｍｏｒｉｔｅｌｌａ  ｍａｒｉｎａ  ＭＰ−１、Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ  ｓｐ．ＡＴＣＣ  ２０８８８からなる群より選ばれる微生物が、元来有しているＰＵＦＡ−ＰＫＳを挙げることができる［ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．（２００９），Ｖｏｌ．２９５，ｐ１７０−１７６；ＰＬｏＳ  ＯＮＥ（２０１１），Ｖｏｌ．６（５），ａｒｔ．ｎｏ．ｅ２０１４６］。
【００７８】
表１に、後述する実施例で用いたＰＵＦＡ−ＰＫＳを構成する蛋白質が有する各ドメインのアミノ酸配列、および既知のＰＵＦＡ−ＰＫＳを構成する蛋白質が有する各ドメインのアミノ酸配列の例を示す。
【００７９】
【表１】
2020032258.tif 000002
【００８０】
ＰＵＦＡ−ＰＫＳ活性を有する蛋白質複合体及び該蛋白質複合体を構成する蛋白質は、当該蛋白質複合体がＰＵＦＡ−ＰＫＳ活性を有する限りにおいて、相互に物理的に結合していてもよく、分離していてもよい。
【００８１】
ＰＵＦＡ−ＰＫＳ活性を有する蛋白質複合体を構成する蛋白質としては、他の蛋白質と協働してＰＵＦＡ−ＰＫＳ活性を有する蛋白質であれば野生型蛋白質、相同蛋白質及び変異蛋白質のいずれであってもよい。
【００８２】
図１に各種微生物由来のＰＵＦＡ−ＰＫＳを構成する蛋白質及びそのドメイン構造を示す。また、表２に各種微生物におけるＰＵＦＡ−ＰＫＳを構成する蛋白質のアミノ酸配列及び塩基配列の例を示す。
【００８３】
【表２】
2020032258.tif 000003
【００８４】
ＰＵＦＡ−ＰＫＳ活性を有する蛋白質複合体を構成する蛋白質をコードする塩基配列としては、他の蛋白質と協働してＰＵＦＡ−ＰＫＳ活性を有する蛋白質をコードする塩基配列であれは特に制限されず、例えば表２に示す塩基配列、該塩基配列と少なくとも９５％以上、好ましくは９７％以上、より好ましくは９８％以上、最も好ましくは９９％以上の同一性を有し、かつ、該塩基配列によりコードされる蛋白質が他の蛋白質と協働してＰＵＦＡ−ＰＫＳ活性を有する蛋白質をコードする塩基配列が挙げられる。
【００８５】
協働してＰＵＦＡ−ＰＫＳ活性を有する蛋白質複合体を構成する蛋白質の組合せとしては、蛋白質複合体がＰＵＦＡ−ＰＫＳ活性を有し、且つＰＳ−ＤＨドメインがＦａｂＡ−ＤＨドメインよりも高い３−ｈｙｄｒｏｘｙｈｅｘａｎｏｙｌ  ＡＣＰに対する活性を示す限り特に制限されず、例えば下記組合せが挙げられる。下記（ｉ）〜（ｉｖ）において、各蛋白質のアミノ酸配列は表２に示す通りである。
（ｉ）ＰｈｏＡ、ＰｈｏＢ、ＰｈｏＣ、ＰｈｏＤ、ＥｐａＥ、ＡｒａＢ
（ｉｉ）ＥｐａＡ、ＰｈｏＢ、ＰｈｏＣ、ＰｈｏＤ、ＥｐａＥ、ＡｒａＢ
（ｉｉｉ）ＥｐａＡ、ＡｒａＢ、ＡｒａＣ、ＡｒａＤ、ＥｐａＥ
（ｉｖ）ＰｈｏＡ、ＡｒａＢ、ＡｒａＣ、ＡｒａＤ、ＥｐａＥ
【００８６】
〔微生物の造成方法〕
微生物（１）は、ＰＵＦＡ代謝経路を有する微生物を宿主生物として、３−ｈｙｄｒｏｘｙｈｅｘａｎｏｙｌ  ＡＣＰに対する活性が、内在のＦａｂＡ−ＤＨドメインよりも高い、外来のＰＳ−ＤＨドメインをコードする遺伝子、又は該ＰＳ−ＤＨドメインを有する蛋白質をコードする遺伝子を導入して形質転換することにより得られる。
【００８７】
微生物（２）は、ＰＵＦＡ代謝経路を有さない微生物を宿主生物として、ＰＵＦＡ−ＰＫＳ活性を有する各ドメインをコードする遺伝子、又はＰＵＦＡ−ＰＫＳを構成する蛋白質をコードする遺伝子を導入し、該遺伝子の導入によって宿主生物において発現するＰＵＦＡ−ＰＫＳ活性を有する各ドメインのうち、ＰＳ−ＤＨドメインをＦａｂＡ−ＤＨドメインと比較して高い３−ｈｙｄｒｏｘｙｈｅｘａｎｏｙｌ  ＡＣＰに対する活性を示すドメインとすることにより得られる。
【００８８】
ＰＳ−ＤＨドメインをコードする遺伝子の導入としては、自律複製可能なプラスミドとして当該宿主細胞中に存在する場合、宿主細胞中の置換対象の遺伝子を対応する外来の遺伝子に置換する場合、外来のＰＳ−ＤＨドメインをコードする遺伝子を当該宿主細胞中の染色体ＤＮＡ中のＰＵＦＡ−ＰＫＳをコードする遺伝子とは別の領域に組み込む場合を含む。本発明において遺伝子を導入する際には、宿主となる微生物のコドン使用頻度を参考に、配列の至適化を行うことが好ましい。
【００８９】
また、ＰＵＦＡ−ＰＫＳを構成する各ドメインをコードする遺伝子、又はＰＵＦＡ−ＰＫＳを構成する蛋白質をコードする遺伝子は、それぞれ単独で導入してもよいし、複数を組み合わせて導入してもよく、最終的にＰＵＦＡ−ＰＫＳ活性を有する蛋白質複合体を発現し、且つＦａｂＡ−ＤＨドメインよりも高い３−ｈｙｄｒｏｘｙｈｅｘａｎｏｙｌ  ＡＣＰに対する活性を示すＰＳ−ＤＨドメインを有する微生物が得られればよい。
【００９０】
本明細書において、「遺伝子」とは、蛋白質のコーディング領域に加え、転写調節領域、プロモーター領域及びターミネーター領域などを含んでもよいＤＮＡをいう。宿主生物に細菌などの原核生物を親株として用いる場合は、該ＤＮＡとしては、リボソーム結合領域であるシャイン−ダルガノ（Ｓｈｉｎｅ−Ｄａｌｇａｒｎｏ）配列と開始コドンとの間を適当な距離（例えば６〜１８塩基）に調節したプラスミドを用いることが好ましい。該ＤＮＡにおいては、該ＤＮＡの発現に転写終結因子は必ずしも必要ではないが、構造遺伝子の直下に転写終結配列を配置することが好ましい。
【００９１】
宿主生物に導入する遺伝子は、例えば、適当な発現ベクターのプロモーターの下流に挿入した組換え遺伝子とすることにより、宿主細胞に導入することができる。発現ベクターには、プロモーター、転写終結シグナル、形質転換体を選択するための選択マーカー遺伝子（例えば、カナマイシン耐性遺伝子、ストレプトマイシン耐性遺伝子、カルボキシン耐性遺伝子、ゼオシン耐性遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子等の薬剤耐性遺伝子、ロイシン、ヒスチジン、メチオニン、アルギニン、トリプトファン、リジン等のアミノ酸要求変異を相補する遺伝子等、ウラシル、アデニン等の核酸塩基要求性変異を相補する遺伝子等）も含むことができる。ウラシル要求株の場合、マーカー遺伝子として、オロチジン−５’−リン酸デカルボキシラーゼ遺伝子（ｕｒａ３遺伝子）、又はオロチジル酸ピロホスホリラーゼ遺伝子（ｕｒａ５遺伝子）を使用することができる。
【００９２】
プロモーターとして、構造性プロモーターであるか調節プロモーターであるかに拘わらず、ＲＮＡポリメラーゼをＤＮＡに結合させ、ＲＮＡ合成を開始させるＤＮＡの塩基配列と定義される。強いプロモーターとはｍＲＮＡ合成を高頻度で開始させるプロモーターであり、好適に使用される。ｌａｃ系、ｔｒｐ系、ＴＡＣ又はＴＲＣ系、λファージの主要オペレーター及びプロモーター領域、ｆｄコートタンパク質の制御領域、解糖系酵素（例えば、３−ホスホグリセレートキナーゼ、グリセルアルデヒド−３−リン酸脱水素酵素）、グルタミン酸デカルボキシラーゼＡ、セリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼに対するプロモーター等が、その宿主細胞の性質等に応じて利用可能である。
【００９３】
プロモーター及びターミネーター配列のほかに、他の調節エレメントとして、例えば、選択マーカー、増幅シグナル、複製起点などが挙げられる。好ましい調節配列としては、例えば、”Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  １８５”、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ（１９９０）に記載されている配列が挙げられる。
【００９４】
ベクターとして、目的とする遺伝子を発現させることができれば、特に限定されない。ベクターを構築するための試薬類、例えば制限酵素又はライゲーション酵素等の種類についても特に限定されず、市販品を適宜用いることができる。
【００９５】
宿主生物として、ラビリンチュラ類微生物を用いる場合のプロモーターとしては、ラビリンチュラ類微生物の細胞中で機能するプロモーターであれば特に限定されず、例えば、アクチンプロモーター、チューブリンプロモーター、Ｅｌｏｎｇａｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ  Ｔｕプロモーター、解糖系遺伝子の発現プロモーターが挙げられる。
【００９６】
親株にエシェリヒア属に属する微生物を用いる場合は、発現ベクターとして、例えば、ｐＣｏｌｄＩ（タカラバイオ社製）、ｐＥＴ２１ａ、ｐＣＯＬＡＤｕｅｔ−１、ｐＡＣＹＣＤｕｅｔ−１、ｐＣＤＦ−１ｂ、ｐＲＳＦ−１ｂ（いずれもノバジェン社製）、ｐＭＡＬ−ｃ２ｘ（ニューイングランドバイオラブス社製）、ｐＧＥＸ−４Ｔ−１（ジーイーヘルスケアバイオサイエンス社製）、ｐＴｒｃＨｉｓ（インビトロジェン社製）、ｐＳＥ２８０（インビトロジェン社製）、ｐＧＥＭＥＸ−１（プロメガ社製）、ｐＱＥ−３０（キアゲン社製）、ｐＥＴ−３（ノバジェン社製）、ｐＴｒｃ９９Ａ（ジーイーヘルスケアバイオサイエンス社製）、ｐＫＹＰ１０（日本国特開昭５８−１１０６００号公報）、ｐＫＹＰ２００［Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，４８，６６９（１９８４）］、ｐＬＳＡ１［Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，５３，２７７（１９８９）］、ｐＧＥＬ１［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，  ＵＳＡ，８２，４３０６（１９８５）］、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ  ＳＫ（＋）、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ  ＫＳ（−）（ストラタジーン社製）、ｐＴｒＳ３０［エシェリヒア・コリ  ＪＭ１０９／ｐＴｒＳ３０（Ｆｅｒｍ  ＢＰ−５４０７）より調整］、ｐＴｒＳ３２［エシェリヒア・コリ  ＪＭ１０９／ｐＴｒＳ３２（Ｆｅｒｍ  ＢＰ−５４０８）より調整］、ｐＴＫ３１［ＡＰＰＬＩＥＤ  ＡＮＤ  ＥＮＶＩＲＯＮＭＥＮＴＡＬ  ＭＩＣＲＯＢＩＯＬＯＧＹ、２００７、Ｖｏｌ．７３、Ｎｏ．２０、ｐ６３７８−６３８５］、ｐＰＡＣ３１（国際公開第９８／１２３４３号）、ｐＵＣ１９［Ｇｅｎｅ，３３，１０３（１９８５）］、ｐＳＴＶ２８（タカラバイオ社製）、ｐＵＣ１１８（タカラバイオ社製）、ｐＰＡ１（日本国特開昭６３−２３３７９８号公報）、ｐＨＳＧ２９８（タカラバイオ社製）、ｐＵＣ１８（タカラバイオ社製）が挙げられる。
【００９７】
上記発現ベクターを用いる場合のプロモーターとしては、エシェリヒア属に属する微生物の細胞中で機能するプロモーターであれば特に限定されないが、例えば、ｔｒｐプロモーター（Ｐｔｒｐ）、ｌａｃプロモーター（Ｐｌａｃ）、ＰＬプロモーター、ＰＲプロモーター、ＰＳＥプロモーター、Ｔ７プロモーター等の、エシェリヒア・コリやファージ等に由来するプロモーターを用いることができる。また、Ｐｔｒｐを２つ直列させたプロモーター、ｔａｃプロモーター、ｔｒｃプロモーター、ｌａｃＴ７プロモーター、ｌｅｔＩプロモーターのように人為的に設計改変されたプロモーターも用いることができる。
【００９８】
親株にコリネ型細菌を用いる場合は、発現ベクターとしては、例えば、ｐＣＧ１（日本国特開昭５７−１３４５００号公報）、ｐＣＧ２（日本国特開昭５８−３５１９７号公報）、ｐＣＧ４（日本国特開昭５７−１８３７９９号公報）、ｐＣＧ１１（日本国特開昭５７−１３４５００号公報）、ｐＣＧ１１６、ｐＣＥ５４、ｐＣＢ１０１（いずれも日本国特開昭５８−１０５９９９号公報）、ｐＣＥ５１、ｐＣＥ５２、ｐＣＥ５３［いずれもＭｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１９６，１７５（１９８４）］等を挙げることができる。
【００９９】
前記発現ベクターを用いる場合のプロモーターとしては、コリネ型細菌の細胞中で機能するプロモーターであれば特に限定されないが、例えば、Ｐ５４−６プロモーター［Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，５３，６７４−６７９（２０００）］を用いることができる。
【０１００】
親株に酵母菌株を用いる場合には、発現ベクターとしては、例えば、ＹＥｐ１３（ＡＴＣＣ３７１１５）、ＹＥｐ２４（ＡＴＣＣ３７０５１）、ＹＣｐ５１（ＡＴＣＣ３７４１９）、ｐＨＳ１９、ｐＨＳ１５等が挙げられる。
【０１０１】
前記発現ベクターを用いる場合のプロモーターとしては、酵母菌株の細胞中で機能するプロモーターであれば特に限定されないが、例えば、ＰＨ０５プロモーター、ＰＧＫプロモーター、ＧＡＰプロモーター、ＡＤＨプロモーター、ｇａｌ  １プロモーター、ｇａｌ  １０プロモーター、ヒートショックポリペプチドプロモーター、ＭＦα１プロモーター、ＣＵＰ１プロモーター等のプロモーターが挙げられる。
【０１０２】
導入する遺伝子を宿主生物の染色体に組み込む方法としては、相同組換え法を用いることができる。相同組換え法としては、例えば、導入したい親株内では自律複製できない薬剤耐性遺伝子を有するプラスミドＤＮＡと連結して作製できる相同組換え系を利用して、組換え遺伝子を導入する方法を挙げることができる。エシェリヒア・コリで頻用される相同組換えを利用した方法としては、ラムダファージの相同組換え系を利用して、組換え遺伝子を導入する方法［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９７，６６４１−６６４５（２０００）］を挙げることができる。
【０１０３】
さらに、導入する遺伝子と共に染色体上に組み込まれた枯草菌レバンシュークラ―ゼによって大腸菌がシュークロース感受性となることを利用した選択法や、ストレプトマイシン耐性の変異ｒｐｓＬ遺伝子を有する大腸菌に野生型ｒｐｓＬ遺伝子を組み込むことによって大腸菌がストレプトマイシン感受性となることを利用した選択法［Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，５５，１３７（２００５）、Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，７１，２９０５（２００７）］等を用いて、親株の染色体ＤＮＡ上の目的の領域が組換え体ＤＮＡに置換された微生物を取得することができる。
【０１０４】
また、相同組換え法としては、例えば、アグロバクテリウムを介したＡＴＭＴ法［Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，（２００９），ｖｏｌ．７５，ｐ．５５２９−５５３５］が挙げられる。さらに、目的の形質を安定して保持する形質転換体を得ることができれば、ＡＴＭＴ法の改良法等を含み、これらに限定されない。
【０１０５】
導入する遺伝子を宿主生物において自律複製可能なプラスミドとして導入させる方法としては、例えば、カルシウムイオンを用いる方法［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，６９，２１１０（１９７２）］、プロトプラスト法（日本国特開昭６３−２４８３９４号公報）、エレクトロポレーション法［Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１６，６１２７（１９８８）］等の方法を挙げることができる。
【０１０６】
上記方法により取得した微生物が目的の微生物であることは、該微生物を培養し、その培養物に蓄積されたＰＵＦＡをガスクロマトグラフィーで検出するとともに、上記した方法によりＰＳ−ＤＨドメインがＦａｂＡ−ＤＨドメインよりも高い３−ｈｙｄｒｏｘｙｈｅｘａｎｏｙｌ  ＡＣＰに対する活性を示すか否かを評価することにより、確認することができる。
【０１０７】
〔ＰＵＦＡ又はＰＵＦＡ含有組成物の製造法〕
本発明は、上記造成された微生物を培地に培養し、培養物中にＰＵＦＡ又はＰＵＦＡ含有組成物を生成、蓄積させ、該培養物からＰＵＦＡ又はＰＵＦＡ含有組成物を採取することを特徴とする、ＰＵＦＡ又はＰＵＦＡ含有組成物の製造法を含む。
【０１０８】
ＰＵＦＡ、又はＰＵＦＡ含有組成物に含有されるＰＵＦＡは、ω６ＰＵＦＡが好ましく、例えばＤＰＡ又はＡＲＡを挙げることができる。ＰＵＦＡ含有組成物は、例えば、ＰＵＦＡ含有油脂又はＰＵＦＡ含有リン脂質を、好ましくはＰＵＦＡ含有油脂を挙げることができる。該微生物の培養物は、該微生物を適当な培地に接種して、常法にしたがって培養することにより得ることができる。
【０１０９】
培地としては、炭素源、窒素源及び無機塩等を含む公知の培地をいずれも使用できる。例えば、炭素源としてはグルコース、フルクトース、ガラクトース等の炭水化物の他、オレイン酸、大豆油などの油脂類や、グリセロール、酢酸ナトリウムなどが挙げられる。これらの炭素源は、例えば、培地１リットル当たり２０〜３００ｇの濃度で使用できる。特に好ましい態様によれば、初発の炭素源を消費した後に、炭素源をフィードすることにより引き続き培養できる。このような条件で培養することにより、消費させる炭素源の量を増大させて、ＰＵＦＡ含有組成物の生産量を向上できる。
【０１１０】
また、窒素源としては、例えば、酵母エキス、コーンスティープリカー、ポリペプトン、グルタミン酸ナトリウム、尿素等の有機窒素、又は酢酸アンモニウム、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、硝酸ナトリウム、硝酸アンモニウム、アンモニア等の無機窒素が挙げられる。無機塩としては、リン酸カリウム等を適宜組み合わせて使用できる。
【０１１１】
上記の各成分を含有する培地は、適当な酸又は塩基を加えることによりｐＨを４．０〜９．５の範囲内に調整した後、オートクレーブにより殺菌して使用することが好ましい。培養温度は、一般的には１０〜４５℃であり、好ましくは２０〜３７℃である。培養温度は、ＰＵＦＡ含有組成物を生産しうる培養温度に制御することが好ましい。培養時のｐＨは、一般的には３．５〜９．５であり、好ましくは４．５〜９．５である。特に好ましいｐＨは目的によって異なり、油脂を多く生産するためには、ｐＨ５．０〜８．０である。
【０１１２】
培養時間は、例えば２〜７日間とすることができ、通気攪拌培養等で培養を行うことができる。培養物から培養液と微生物とを分離する方法は、当業者により公知の常法により行うことができ、例えば、遠心分離法や濾過等により行うことができる。上記の培養物から分離した微生物を、例えば超音波やダイノミルなどによって破砕した後、例えば、クロロホルム、ヘキサン、ブタノール等による溶媒抽出を行うことにより、ＰＵＦＡ含有組成物を得ることができる。
【０１１３】
上記の製造法で製造されるＰＵＦＡ含有組成物は、例えば、低温溶媒分別法［高橋是太郎，油化学，４０：９３１−９４１（１９９１）］、又はリパーゼ等の加水分解酵素で短鎖の脂肪酸を遊離除去する方法［高橋是太郎，油化学，４０：９３１−９４１（１９９１）］等の方法により、ＰＵＦＡ含有組成物を濃縮して、ＰＵＦＡ含量が高いＰＵＦＡ含有組成物を得ることができる。
【０１１４】
ＰＵＦＡ含有組成物からＰＵＦＡを分離して採取することにより、ＰＵＦＡを製造できる。例えば、加水分解法によりＰＵＦＡ含有組成物からＰＵＦＡを含有する混合脂肪酸を調整した後、例えば、尿素付加法、冷却分離法、高速液体クロマトグラフィー法又は超臨界クロマトグラフィー法などにより、ＰＵＦＡを分離して採取することにより、ＰＵＦＡを製造できる。
【０１１５】
また、ＰＵＦＡ含有組成物からＰＵＦＡアルキルエステルを分離して採取することにより、ＰＵＦＡアルキルエステルを製造できる。ＰＵＦＡアルキルエステルは、ＰＵＦＡアルキルエステルであれば特に限定されないが、好ましくは、ＰＵＦＡエチルエステルが挙げられる。
【０１１６】
ＰＵＦＡ含有組成物からＰＵＦＡアルキルエステルを分離して採取するには、例えばアルコーリシス法によりＰＵＦＡ含有組成物からＰＵＦＡアルキルエステルを含有する混合脂肪酸アルキルエステルを調整した後、例えば、尿素付加法、冷却分離法、高速液体クロマトグラフィー法又は超臨界クロマトグラフィー法等により、ＰＵＦＡアルキルエステルを分離して採取することにより行うことができる。
【実施例】
【０１１７】
以下に実施例を示すが、本発明は下記実施例に限定されるものではない。【０１１８】
［実施例１］
ＡＲＡの製造法−１
１．各発現プラスミドの造成
［ｐＥＴ−ｐｈｏＡの造成］
常法により抽出したＰｈｏｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐｒｏｆｕｎｄｕｍ  ＳＳ９９（ＡＴＣＣ  ＢＡＡ−１２５２）株のゲノムＤＮＡを鋳型に、配列番号１０７及び１０８で表わされるプライマーを用いてＰＣＲを行い、ＰｈｏＡ蛋白質をコードするＤＮＡ（配列番号６５で表わされる塩基配列からなるＤＮＡ）の３’末端領域（６３３番目の塩基から停止コドンまで）を増幅した。【０１１９】
得られたＤＮＡ断片を制限酵素ＢａｍＨＩ及びＥａｇＩで処理し、同一の制限酵素処理を行った大腸菌ベクターｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＳＫ（＋）（アジレント・テクノロジー社製）とライゲーションすることにより、ｐＢｌｕｅ−ＰｈｏＡ−Ｃ−ｔｅｒｍｉｎａｌを得た。【０１２０】
次に、常法により抽出したＰｈｏｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐｒｏｆｕｎｄｕｍ  ＳＳ９９株のゲノムＤＮＡを鋳型に、配列番号１０９及び１１０で表わされるプライマーを用いてＰＣＲを行い、ＰｈｏＡ蛋白質をコードするＤＮＡの５’末端領域（開始コドンから６３３番目の塩基まで）を増幅した。【０１２１】
得られたＤＮＡ断片及び大腸菌ベクターｐＥＴ２１ａ（メルクミリポア社製）を制限酵素ＮｄｅＩ及びＥａｇＩでそれぞれ処理し、得られた制限酵素処理断片をライゲーションすることにより、ｐＥＴ−ｐｈｏＡ−Ｎ−ｔｅｒｍｉｎａｌを得た。【０１２２】
続いて、ｐＢｌｕｅ−ＰｈｏＡ−Ｃ−ｔｅｒｍｉｎａｌ及びｐＥＴ−ｐｈｏＡ−Ｎ−ｔｅｒｍｉｎａｌを制限酵素ＥａｇＩ及びＸｈｏＩでそれぞれ処理し、得られた制限酵素処理断片をライゲーションすることにより、ｐＥＴ−ｐｈｏＡを得た。【０１２３】
［ｐＡＣＹＣ−ＳｏｐｆａＥの造成］
林ら（Ｓｃｉ．Ｒｅｐ．，２０１６，６，３５４４１）と同様の方法により、Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ  ｏｎｅｉｄｅｎｓｉｓ  ＭＲ−１（ＡＴＣＣ  ＢＡＡ−１０９６）株由来のＥｐａＥ蛋白質をコードするＤＮＡ（配列番号８１で表わされる塩基配列からなるＤＮＡ）を有する発現プラスミドｐＡＣＹＣ−ＳｏｐｆａＥを得た。【０１２４】
［ｐＣＯＬＡ−ｐｈｏＤ−ｐｈｏＢの造成］
常法により抽出したＰｈｏｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐｒｏｆｕｎｄｕｍ  ＳＳ９９株のゲノムＤＮＡを鋳型に、配列番号１１１及び１１２で表わされるプライマーを用いてＰＣＲを行い、ＰｈｏＤ蛋白質をコードするＤＮＡ（配列番号７１で表わされる塩基配列からなるＤＮＡ）を有するＤＮＡ断片を増幅した。【０１２５】
得られたＤＮＡ断片を制限酵素ＮｄｅＩ及びＢａｍＨＩで処理し、ＮｄｅＩ及びＢｇｌＩＩで制限酵素処理を行った大腸菌ベクターｐＣＯＬＡＤｕｅｔ−１（メルクミリポア社製）とライゲーションすることにより、ｐＣＯＬＡ−ｐｈｏＤを得た。【０１２６】
常法により抽出したＰｈｏｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐｒｏｆｕｎｄｕｍ  ＳＳ９９株のゲノムＤＮＡを鋳型に、配列番号１１３及び１１４で表わされるプライマーを用いてＰＣＲを行い、ＰｈｏＢ蛋白質をコードするＤＮＡ（配列番号６７で表わされる塩基配列からなるＤＮＡ）を有するＤＮＡ断片を増幅した。【０１２７】
得られたＤＮＡ断片を制限酵素ＮｄｅＩ及びＢａｍＨＩで処理し、ＮｄｅＩ及びＢｇｌＩＩで制限酵素処理を行ったｐＡＣＹＣ−ＳｏｐｆａＥとライゲーションすることにより、ｐＡＣＹＣ−ｅｐａＥ−ｐｈｏＢを得た。【０１２８】
ｐＡＣＹＣ−ｅｐａＥ−ｐｈｏＢを鋳型に、配列番号１１４及び１１５で表わされるプライマーを用いてＰＣＲを行い、ＰｈｏＢ蛋白質をコードするＤＮＡを有するＤＮＡ断片を得た。また、大腸菌ベクターｐＣＯＬＡＤｕｅｔ−１  （メルクミリポア社製）を鋳型に、配列番号１１６及び１１７で表わされるプライマーを用いてＰＣＲを行い、Ｔ７プロモーター領域のＤＮＡ断片を増幅した。【０１２９】
得られた２つのＤＮＡ断片をオーバーラップエクステンションＰＣＲにてアッセンブルした。得られたＤＮＡ断片及びｐＣＯＬＡ−ｐｈｏＤを制限酵素ＡｐａＩ及びＢａｍＨＩでそれぞれ処理し、得られた制限酵素処理断片をライゲーションすることにより、ｐＣＯＬＡ−ｐｈｏＤ−ｐｈｏＢを得た。【０１３０】
［ｐＣＤＦ−ｐｈｏＣの造成］
常法により抽出したＰｈｏｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐｒｏｆｕｎｄｕｍ  ＳＳ９９株のゲノムＤＮＡを鋳型に、配列番号１１８及び１１９で表わされるプライマーを用いてＰＣＲを行い、ＰｈｏＣ蛋白質をコードするＤＮＡ（配列番号６９で表わされる塩基配列からなるＤＮＡ）の５’末端領域（開始コドンから９９３番目の塩基まで）を増幅した。【０１３１】
得られたＤＮＡ断片及び大腸菌ベクターｐＵＣ１８（タカラバイオ社製）を制限酵素ＮｄｅＩ及びＸｂａＩでそれぞれ処理し、得られた制限酵素処理断片をライゲーションした。次に、得られたプラスミド及びｐＣＤＦ−ｏｒｆＢ（Ｓｃｉ．Ｒｅｐ．，２０１６，６，３５４４１）を制限酵素ＮｄｅＩ及びＢａｍＨＩで処理し、得られた制限酵素処理断片をライゲーションすることにより、ｐＣＤＦ−ｐｈｏＣ−Ｎ−ｔｅｒｍｉｎａｌを得た。【０１３２】
続いて、常法により抽出したＰｈｏｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐｒｏｆｕｎｄｕｍ  ＳＳ９９株のゲノムＤＮＡを鋳型に、配列番号１２０及び１２１で表わされるプライマーを用いてＰＣＲを行い、ＰｈｏＣ蛋白質をコードするＤＮＡの３’末端領域（９３３番目の塩基から停止コドンまで）を増幅した。得られたＤＮＡ断片及びｐＣＤＦ−ｐｈｏＣ−Ｎ−ｔｅｒｍｉｎａｌを制限酵素ＮｃｏＩ及びＢａｍＨＩで処理し、得られた制限酵素処理断片をライゲーションすることにより、ｐＣＤＦ−ｐｈｏＣを得た。【０１３３】
［ｐＥＴ−ｅｐａＡの造成］
常法により抽出したＳｈｅｗａｎｅｌｌａ  ｏｎｅｉｄｅｎｓｉｓ  ＭＲ−１（ＡＴＣＣ  ＢＡＡ−１０９６）株のゲノムＤＮＡを鋳型に、配列番号１２２及び１２３で表わされるプライマーを用いてＰＣＲを行い、ＥｐａＡ蛋白質をコードするＤＮＡ（配列番号７３で表わされる塩基配列からなるＤＮＡ）を有するＤＮＡ断片を増幅した。【０１３４】
得られたＤＮＡ断片及び大腸菌ベクターｐＥＴ２１ａ（メルクミリポア社製）を制限酵素ＥｃｏＲＩ及びＸｈｏＩで処理し、得られた制限酵素処理断片をライゲーションすることにより、ｐＥＴ−ｅｐａＡ’を得た。【０１３５】
次に、ｐＥＴ−ｅｐａＡ’を鋳型に、配列番号１２４、１２５、１２６及び１２７で表わされるプライマーを用いてオーバーラップエクステンションＰＣＲを行い、５’末端のＨｉｓ−ｔａｇ遺伝子を除いたＥｐａＡ遺伝子を増幅した。【０１３６】
得られたＤＮＡ断片及びｐＥＴ−ｅｐａＡ’を制限酵素ＡｐａＩ及びＳａｌＩで処理し、得られた制限酵素処理断片をライゲーションすることにより、ｐＥＴ−ｅｐａＡを得た。【０１３７】
［ｐＥＴ−ａｒａＡの造成］
ｐＳＴＶ２９−Ｐｌａｃ−ｐｆａＡＢ［ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．，２０１４，５８８（２１），４０３２−４０３６］を鋳型に、配列番号１２８及び１２９で表わされるプライマーを用いてＰＣＲを行い、ＡｒａＡ蛋白質をコードするＤＮＡ（配列番号５５で表わされる塩基配列からなるＤＮＡ）を有するＤＮＡ断片を増幅した。【０１３８】
得られたＤＮＡ断片及び大腸菌ベクターｐＥＴ２１ａ（メルクミリポア社製）を制限酵素ＮｄｅＩ及びＢａｍＨＩで処理し、得られた制限酵素処理断片をライゲーションすることにより、ｐＥＴ−ａｒａＡを得た。【０１３９】
［ｐＡＣＹＣ−ｅｐａＥ−ａｒａＢの造成］
ｐＳＴＶ２９−Ｐｌａｃ−ｐｆａＡＢ（ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．，２０１４，５８８（２１），４０３２−４０３６）を鋳型に、配列番号１３０及び１３１で表わされるプライマーを用いてＰＣＲを行い、ＡｒａＢ蛋白質をコードするＤＮＡ（配列番号５７で表わされる塩基配列からなるＤＮＡ）を有するＤＮＡ断片を増幅した。【０１４０】
得られたＤＮＡ断片を制限酵素ＮｄｅＩ及びＢａｍＨＩで処理し、ＮｄｅＩ及びＢｇｌＩＩで処理したｐＡＣＹＣ−ＳｏｐｆａＥとライゲーションすることにより、ｐＡＣＹＣ−ｅｐａＥ−ａｒａＢを得た。【０１４１】
［ｐＣＤＦ−ａｒａＣの造成］
ｐＭＷ２１９−Ｐｌａｃ−ｐｆａＣＤ［ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．，２０１４，５８８（２１），４０３２−４０３６］を鋳型に、配列番号１３２及び１３３で表わされるプライマーを用いてＰＣＲを行い、ＡｒａＣ蛋白質をコードするＤＮＡ（配列番号５９で表わされる塩基配列からなるＤＮＡ）を有するＤＮＡ断片を増幅した。【０１４２】
得られたＤＮＡ断片及びｐＣＤＦ−ｏｒｆＢ（Ｓｃｉ．Ｒｅｐ．，２０１６，６，３５４４１）を制限酵素ＮｄｅＩ及びＢａｍＨＩで処理し、得られた制限酵素処理断片をライゲーションすることにより、ｐＣＤＦ−ａｒａＣを得た。【０１４３】
［ｐＣＯＬＡ−ａｒａＤの造成］
ｐＭＷ２１９−Ｐｌａｃ−ｐｆａＣＤ［ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．，２０１４，５８８（２１），４０３２−４０３６］を鋳型に、配列番号１３４及び１３５で表わされるプライマーを用いてＰＣＲを行い、ＡｒａＤ蛋白質をコードするＤＮＡ（配列番号６１で表わされる塩基配列からなるＤＮＡ）を有するＤＮＡ断片を増幅した。【０１４４】
得られたＤＮＡ断片を制限酵素ＮｄｅＩ及びＢａｍＨＩで処理し、ＮｄｅＩ及びＢｇｌＩＩで制限酵素処理を行った大腸菌ベクターｐＣＯＬＡＤｕｅｔ−１  （メルクミリポア社製）とライゲーションすることにより、ｐＣＯＬＡ−ａｒａＤを得た。【０１４５】
２．ＡＲＡの製造−１
林ら（Ｓｃｉ．Ｒｅｐ．，２０１６，６，３５４４１）と同様の方法で、アシル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼＦａｄＥ（配列番号１０６で表わされるアミノ酸配列からなる蛋白質）をコードする遺伝子が欠失した大腸菌ＢＬＲ（ＤＥ３）ΔｆａｄＥ株を造成した。【０１４６】
〈１〉ｐＥＴ−ｐｈｏＡ、ｐＣＤＦ−ｐｈｏＣ、ｐＣＯＬＡ−ｐｈｏＤ−ｐｈｏＢ及びｐＡＣＹＣ−ＳｏｐｆａＥ、又は〈２〉ｐＥＴ−ｐｈｏＡ、ｐＣＤＦ−ｐｈｏＣ、ｐＣＯＬＡ−ｐｈｏＤ−ｐｈｏＢ及びｐＡＣＹＣ−ｅｐａＥ−ａｒａＢで大腸菌ＢＬＲ（ＤＥ３）ΔｆａｄＥ株を形質転換した。【０１４７】
得られた大腸菌を、アンピシリン１００ｍｇ／Ｌ、カナマイシン２０ｍｇ／Ｌ、クロラムフェニコール３０ｍｇ／Ｌ、ストレプトマイシン２０ｍｇ／Ｌを含むＴｅｒｒｉｆｉｃ  Ｂｒｏｔｈ培地（べクトン・ディッキンソンアンドカンパニー社製）２ｍＬへ植菌し、３０℃にて１６時間振とう培養を行った。【０１４８】
得られた培養液１ｍＬを、新たに調製した、アンピシリン１００ｍｇ／Ｌ、カナマイシン２０ｍｇ／Ｌ、クロラムフェニコール３０ｍｇ／Ｌ、ストレプトマイシン２０ｍｇ／Ｌ、１ｍＭ  ＩＰＴＧを含むＴｅｒｒｉｆｉｃ  Ｂｒｏｔｈ培地（べクトン・ディッキンソンアンドカンパニー社製）２０ｍＬが入った２００ｍＬ羽根つきフラスコに植菌し、２３０ｒｐｍ、２０℃にて４８時間培養した。【０１４９】
培養後、培養液を採取し、Ｂｌｉｇｈ―Ｄｙｅｒ法［Ｂｌｉｇｈ，ｅ．Ｇ．ａｎｄ  Ｄｙｅｒ，Ｗ．Ｊ．（１９５９）Ｃａｎ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．３７，９１１−９１７］にて脂質抽出した後、三フッ化ホウ素・メタノール溶液にて脂肪酸をメチル化し、ガスクロマトグラフィー質量分析法にて分析した。【０１５０】
培養液中のＡＲＡ、ＥＰＡ、ジホモ−γ−リノレン酸（以下、ＤＧＬＡという。）及びエイコサテトラエン酸（以下、ＥＴＡという。）を測定した結果を表３に示す。【０１５１】
【表３】
2020032258.tif 000004
【０１５２】
表３に示すとおり、ＰｈｏＡ蛋白質、ＰｈｏＢ蛋白質、ＰｈｏＣ蛋白質、ＰｈｏＤ蛋白質及びＥｐａＥ蛋白質を生産する大腸菌は主にＥＰＡを生産しＡＲＡを生産しなかったのに対し、ＰｈｏＡ蛋白質、ＰｈｏＢ蛋白質、ＰｈｏＣ蛋白質、ＰｈｏＤ蛋白質及びＥｐａＥ蛋白質に加えてＡｒａＢ蛋白質も生産する大腸菌はＥＰＡと同等量のＡＲＡを生産した。【０１５３】
これより、ＥＰＡ生産型のＰＵＦＡ−ＰＫＳに由来するＰｈｏＡ蛋白質、ＰｈｏＢ蛋白質、ＰｈｏＣ蛋白質及びＰｈｏＤ蛋白質に加えてＡｒａＢ蛋白質を生産する大腸菌を用いることにより、効率的にω６脂肪酸であるＡＲＡを製造できることがわかった。【０１５４】
３．ＡＲＡの製造−２
〈３〉ｐＥＴ−ｅｐａＡ、ｐＣＤＦ−ｐｈｏＣ、ｐＣＯＬＡ−ｐｈｏＤ−ｐｈｏＢ及びｐＡＣＹＣ−ＳｏｐｆａＥ、又は〈４〉ｐＥＴ−ｅｐａＡ、ｐＣＤＦ−ｐｈｏＣ、ｐＣＯＬＡ−ｐｈｏＤ−ｐｈｏＢ及びｐＡＣＹＣ−ｅｐａＥ−ａｒａＢで大腸菌ＢＬＲ（ＤＥ３）ΔｆａｄＥ株を形質転換した。【０１５５】
得られた大腸菌を、アンピシリン１００ｍｇ／Ｌ、カナマイシン２０ｍｇ／Ｌ、クロラムフェニコール３０ｍｇ／Ｌ、ストレプトマイシン２０ｍｇ／Ｌを含むＴｅｒｒｉｆｉｃ  Ｂｒｏｔｈ培地（べクトン・ディッキンソンアンドカンパニー社製）２ｍＬへ植菌し、３０℃にて１６時間振とう培養を行った。【０１５６】
得られた培養液１ｍＬを、新たに調製した、アンピシリン１００ｍｇ／Ｌ、カナマイシン２０ｍｇ／Ｌ、クロラムフェニコール３０ｍｇ／Ｌ、ストレプトマイシン２０ｍｇ／Ｌ、１ｍＭ  ＩＰＴＧを含むＴｅｒｒｉｆｉｃ  Ｂｒｏｔｈ培地（べクトン・ディッキンソンアンドカンパニー社製）２０ｍＬが入った２００ｍＬ羽根つきフラスコに植菌し、２３０ｒｐｍ、２０℃にて４８時間培養した。【０１５７】
培養後、培養液を採取し、Ｂｌｉｇｈ―Ｄｙｅｒ法にて脂質抽出した後、三フッ化ホウ素・メタノール溶液にて脂肪酸をメチル化し、ガスクロマトグラフィー質量分析法にて分析した。【０１５８】
培養液中のＡＲＡ、ＥＰＡ、ＤＧＬＡ及びＥＴＡを測定した結果を表４に示す。【０１５９】
【表４】
2020032258.tif 000005
【０１６０】
表４に示すとおり、ＥｐａＡ蛋白質、ＰｈｏＢ蛋白質、ＰｈｏＣ蛋白質、ＰｈｏＤ蛋白質及びＥｐａＥ蛋白質を生産する大腸菌は主にＥＰＡを生産しＡＲＡを生産しなかったのに対し、ＥｐａＡ蛋白質、ＰｈｏＢ蛋白質、ＰｈｏＣ蛋白質、ＰｈｏＤ蛋白質及びＥｐａＥ蛋白質に加えてＡｒａＢ蛋白質も生産する大腸菌はＥＰＡと同等以上のＡＲＡを生産した。【０１６１】
これより、ＥＰＡ生産型のＰＵＦＡ−ＰＫＳに由来するＥｐａＡ蛋白質、ＰｈｏＢ蛋白質、ＰｈｏＣ蛋白質及びＰｈｏＤ蛋白質に加えてＡｒａＢ蛋白質を生産する大腸菌を用いることにより、効率的にω６脂肪酸であるＡＲＡを製造できることがわかった。【０１６２】
４．ＡＲＡの製造−３
〈５〉ｐＥＴ−ａｒａＡ、ｐＣＤＦ−ａｒａＣ、ｐＣＯＬＡ−ａｒａＤ及びｐＡＣＹＣ−ｅｐａＥ−ａｒａＢ、〈６〉ｐＥＴ−ｅｐａＡ、ｐＣＤＦ−ａｒａＣ、ｐＣＯＬＡ−ａｒａＤ及びｐＡＣＹＣ−ｅｐａＥ−ａｒａＢ、又は〈７〉ｐＥＴ−ｐｈｏＡ、ｐＣＤＦ−ａｒａＣ、ｐＣＯＬＡ−ａｒａＤ及びｐＡＣＹＣ−ｅｐａＥ−ａｒａＢで大腸菌ＢＬＲ（ＤＥ３）ΔｆａｄＥ株を形質転換した。【０１６３】
得られた大腸菌を、アンピシリン１００ｍｇ／Ｌ、カナマイシン２０ｍｇ／Ｌ、クロラムフェニコール３０ｍｇ／Ｌ、ストレプトマイシン２０ｍｇ／Ｌを含むＴｅｒｒｉｆｉｃ  Ｂｒｏｔｈ培地（べクトン・ディッキンソンアンドカンパニー社製）２ｍＬへ植菌し、３０℃にて１６時間振とう培養を行った。【０１６４】
得られた培養液１ｍＬを、新たに調製した、アンピシリン１００ｍｇ／Ｌ、カナマイシン２０ｍｇ／Ｌ、クロラムフェニコール３０ｍｇ／Ｌ、ストレプトマイシン２０ｍｇ／Ｌ、１ｍＭ  ＩＰＴＧを含むＴｅｒｒｉｆｉｃ  Ｂｒｏｔｈ培地（べクトン・ディッキンソンアンドカンパニー社製）２０ｍＬが入った２００ｍＬ羽根つきフラスコに植菌し、２３０ｒｐｍ、２０℃にて４８時間培養した。【０１６５】
培養後、培養液を採取し、Ｂｌｉｇｈ―Ｄｙｅｒ法にて脂質抽出した後、三フッ化ホウ素・メタノール溶液にて脂肪酸をメチル化し、ガスクロマトグラフィー質量分析法にて分析した。【０１６６】
培養液中のＡＲＡ、ＥＰＡ、ＤＧＬＡ及びＥＴＡを測定した結果を表５に示す。【０１６７】
【表５】
2020032258.tif 000006
【０１６８】
表５に示すとおり、ＡｒａＡ蛋白質、ＡｒａＢ蛋白質、ＡｒａＣ蛋白質、ＡｒａＤ蛋白質及びＥｐａＥ蛋白質を生産する大腸菌はいずれのＰＵＦＡも検出限界以下であったのに対し、ＥｐａＡ蛋白質、ＡｒａＢ蛋白質、ＡｒａＣ蛋白質、ＡｒａＤ蛋白質及びＥｐａＥ蛋白質を生産する大腸菌、並びにＰｈｏＡ蛋白質、ＡｒａＢ蛋白質、ＡｒａＣ蛋白質、ＡｒａＤ蛋白質及びＥｐａＥ蛋白質を生産する大腸菌は、著量のＡＲＡを生産した。【０１６９】
これより、ＥｐａＡ蛋白質又はＰｈｏＡ蛋白質、並びにＡｒａＢ蛋白質、ＡｒａＣ蛋白質及びＡｒａＤ蛋白質を生産する大腸菌を用いることにより、既知のＡＲＡ生産型のＰＵＦＡ−ＰＫＳを構成する蛋白質であるＡｒａＡ蛋白質、ＡｒａＢ蛋白質、ＡｒａＣ蛋白質及びＡｒａＤ蛋白質を生産する大腸菌を用いた場合と比べ、効率的にω６脂肪酸であるＡＲＡを製造できることがわかった。【０１７０】
［実施例２］
ＤＰＡの製造法
１．各発現プラスミドの造成
［ｐＥＴ−ｏｒｆＡ］
林ら（Ｓｃｉ．Ｒｅｐ．，２０１６，６，３５４４１）と同様の方法により、Ｓｈｉｚｏｃｈｙｔｏｒｉｕｍ  ｓｐ．（ＡＴＣＣ２０８８８）株由来のＯｒｆＡ蛋白質をコードするＤＮＡ（配列番号８３で表わされる塩基配列からなるＤＮＡ）を有する発現プラスミドｐＥＴ−ｏｒｆＡを得た。【０１７１】
［ｐＣＤＦ−ｏｒｆＢ］
林ら（Ｓｃｉ．Ｒｅｐ．，２０１６，６，３５４４１）と同様の方法により、Ｓｈｉｚｏｃｈｙｔｏｒｉｕｍ  ｓｐ．（ＡＴＣＣ２０８８８）株由来のＯｒｆＢ蛋白質をコードするＤＮＡ（配列番号８５で表わされる塩基配列からなるＤＮＡ）を有する発現プラスミドｐＣＤＦ−ｏｒｆＢを得た。【０１７２】
［ｐＣＯＬ９２］
林ら（Ｓｃｉ．Ｒｅｐ．，２０１６，６，３５４４１）と同様の方法により、Ｓｈｉｚｏｃｈｙｔｏｒｉｕｍ  ｓｐ．（ＡＴＣＣ２０８８８）株由来のＯｒｆＣ蛋白質をコードするＤＮＡ（配列番号８７で表わされる塩基配列からなるＤＮＡ）を有する発現プラスミドｐＥＴ−ｏｒｆＡを得た。【０１７３】
２．ＤＰＡの製造
〈８〉ｐＥＴ−ｏｒｆＡ、ｐＣＤＦ−ｏｒｆＢ、ｐＣＯＬ９２及びｐＡＣＹＣ−ＳｏｐｆａＥ、又は〈９〉ｐＥＴ−ｏｒｆＡ、ｐＣＤＦ−ｏｒｆＢ、ｐＣＯＬ９２及びｐＡＣＹＣ−ｅｐａＥ−ａｒａＢで大腸菌ＢＬＲ（ＤＥ３）ΔｆａｄＥ株を形質転換した。【０１７４】
得られた大腸菌を、アンピシリン１００ｍｇ／Ｌ、カナマイシン２０ｍｇ／Ｌ、クロラムフェニコール３０ｍｇ／Ｌ、ストレプトマイシン２０ｍｇ／Ｌを含むＴｅｒｒｉｆｉｃ  Ｂｒｏｔｈ培地（べクトン・ディッキンソンアンドカンパニー社製）２ｍＬへ植菌し、３０℃にて１６時間振とう培養を行った。【０１７５】
得られた培養液１ｍＬを、新たに調製した、アンピシリン１００ｍｇ／Ｌ、カナマイシン２０ｍｇ／Ｌ、クロラムフェニコール３０ｍｇ／Ｌ、ストレプトマイシン２０ｍｇ／Ｌ、１ｍＭ  ＩＰＴＧを含むＴｅｒｒｉｆｉｃ  Ｂｒｏｔｈ培地（べクトン・ディッキンソンアンドカンパニー社製）２０ｍＬが入った２００ｍＬ羽根つきフラスコに植菌し、２３０ｒｐｍ、２０℃にて４８時間培養した。【０１７６】
培養後、培養液を採取し、Ｂｌｉｇｈ―Ｄｙｅｒ法にて脂質抽出した後、三フッ化ホウ素・メタノール溶液にて脂肪酸をメチル化し、ガスクロマトグラフィー質量分析法にて分析した。【０１７７】
培養液中のＤＰＡ、ＤＨＡ、ＥＰＡ及びＥＴＡを測定した結果を表６に示す。【０１７８】
【表６】
2020032258.tif 000007
【０１７９】
表６に示すとおり、ＯｒｆＡ蛋白質、ＯｒｆＢ蛋白質、ＯｒｆＣ蛋白質及びＥｐａＥ蛋白質を生産する大腸菌は主にＤＨＡを生産したのに対し、ＯｒｆＡ蛋白質、ＯｒｆＢ蛋白質、ＯｒｆＣ蛋白質及びＥｐａＥ蛋白質に加えてＡｒａＢ蛋白質も生産する大腸菌はＤＨＡと同等以上のＤＰＡを生産した。【０１８０】
これより、ＤＨＡ生産型のＰＵＦＡ−ＰＫＳに由来するＯｒｆＡ蛋白質、ＯｒｆＢ蛋白質及びＯｒｆＣ蛋白質に加えてＡｒａＢ蛋白質も生産する大腸菌を用いることにより、効率的にω６脂肪酸であるＤＰＡを製造できることがわかった。【０１８１】
本発明を特定の態様を参照して詳細に説明したが、本発明の精神と範囲を離れることなく様々な変更および修正が可能であることは、当業者にとって明らかである。なお、本出願は、２０１８年８月１０日付けで出願された日本特許出願（特願２０１８−１５１２３３）に基づいており、その全体が引用により援用される。また、ここに引用されるすべての参照は全体として取り込まれる。
【図１】
2020032258.tif 000008
【配列表】
2020032258000001.app
【国際調査報告】
2020032258.tif 000009
2020032258.tif 000010
2020032258.tif 000011
2020032258.tif 000012