(57)【要約】  尿検体からエクソソームを抽出する抽出工程と、前記エクソソーム中に存在するmicroRNAのうち、miR-103と、miR-21および／またはmiR-19とを定量する工程と、miR-103と、miR-21および／またはmiR-19のmicroRNA量に基づいてがんの状態を分析する分析工程とを含む。
2019220759.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
尿検体からエクソソームを抽出する抽出工程と、
前記エクソソーム中に存在するmicroRNAのうち、miR-103と、miR-21および／またはmiR-19とを定量する工程と、
miR-103と、miR-21および／またはmiR-19のmicroRNA量に基づいてがんの状態を分析する分析工程と
を含むがんの分析方法。
【請求項２】
前記抽出工程は、前記エクソソームをトラップできるように処理されたろ紙を用いて行う請求項１記載のがんの分析方法。
【請求項３】
前記尿検体を前記ろ紙上に採取して検査機関に輸送する工程を含む請求項２記載のがんの分析方法。
【請求項４】
尿検体から抽出されたエクソソーム中に存在するmicroRNAのうち、miR-103と、miR-21
および／またはmiR-19とのmicroRNA量を定量する測定部と、
前記測定部により定量されたmiR-103と、miR-21および／またはmiR-19のmicroRNA量を分析装置に送信する送信部と
を備える測定装置と、
前記測定装置から送信された前記microRNA量を受信する受信部と、
前記microRNA量に基づいてがんの状態を分析する分析する分析部と
を備える分析装置と
を含むがんの分析システム。
【請求項５】
コンピュータを
尿検体から抽出されたエクソソーム中に存在するmicroRNAのうち、miR-103と、miR-21
および／またはmiR-19とを定量して得られたmicroRNA量のデータを取得する手段と、
miR-103と、miR-21および／またはmiR-19のmicroRNA量のデータに基づいてがんの状態を分析する手段
として機能させるためのプログラム。
【請求項６】
コンピュータを
尿検体から抽出されたエクソソーム中に存在するmicroRNAのうち、miR-103と、miR-21
および／またはmiR-19とを定量して得られたmicroRNA量のデータを取得する手段と、
miR-103と、miR-21および／またはmiR-19の前記microRNA量のデータに基づいてがんの状態を分析する手段
として機能させるためのプログラムを記録したコンピュータ読み取り可能な記録媒体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、がんの分析方法、がんの分析システム、プログラムおよびコンピュータ読み取り可能な記録媒体に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
がんは、厚生労働省により発表された平成２８年（２０１６）人口動態統計の死因において第１位となっている。また、がん細胞は増殖能力が極めて高いため、早期発見が重要となっている。【０００３】
現在、がんの検査としてＰＥＴ検査、Ｘ線検査、腫瘍マーカー検査等が行われているが、がんの大きさが５ｍｍ以上とならないと検出できない一方、がんの大きさが０．１ｍｍ程度からすでに転移が生じる可能性についても報告されている。【０００４】
例えば、腫瘍マーカー検査は主にがん細胞が死ぬ際に放出されるたんぱく質を検出するものであり、がんがある程度進行した状態でなければ発見が困難である。また、この腫瘍マーカー検査は血液検査が主体の検査であり、血液採取等、検査時の生体への負担も生じるものである。【０００５】
他方で、血中に分泌するmicroRNA（マイクロRNA）を用いるがん検査が検討されている。この試みは、１３種類のがん（胃がん、食道がん、肺がん、肝臓がん、胆道がん、膵臓（すいぞう）がん、大腸がん、卵巣がん、前立腺がん、ぼうこうがん、乳がん、肉腫、神経膠腫）のそれぞれに特有のmicroRNAが２〜１０種類存在するという特徴を利用して、患者の血液中のmicroRNAを分析することにより、がん検査を行うというものである（例えば非特許文献１参照）。【０００６】
また、血液中のアミノ酸濃度を測定して、がんのリスクを予測する検査も行われている（例えば、特許文献１〜３参照）。この検査はアミノインデックス（登録商標）がんリスクスクリーニングと呼ばれるものであり、血液中のアミノ酸濃度を測定し、健康な人とがんである人のアミノ酸濃度のバランスの違いを統計的に解析することにより、がんのリスクの予測を行っている。【０００７】
しかし、これらの検査は血液を用いる検査であり、生体への負担を生じない非侵襲のものではなかった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】国際公開第２００８／０７５６６２号
【特許文献２】国際公開第２００８／０７５６６３号
【特許文献３】国際公開第２００８／０７５６６４号
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】“血液１滴でがん13種診断  早期発見へ臨床研究”，［online］，2017年8月20日，日本経済新聞社，［2018年5月9日検索］＜URL：https://www.nikkei.com/article/DGXLASDG19H4L_Q7A820C1CR8000/＞
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明の目的は、非侵襲かつ、早期にがんの発見が可能ながんの分析方法、がんの分析システム、プログラムおよびコンピュータ読み取り可能な記録媒体を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討の結果、尿検体由来のエクソソームを用いることにより上記目的を達成できることを見出し、本発明を完成するに至った。【００１２】
即ち、本発明によれば、
（１）  尿検体からエクソソームを抽出する抽出工程と、前記エクソソーム中に存在するmicroRNAのうち、miR-103と、miR-21および／またはmiR-19とを定量する工程と、miR-103と、miR-21および／またはmiR-19のmicroRNA量に基づいてがんの状態を分析する分析工程とを含むがんの分析方法、
（２）  前記抽出工程は、前記エクソソームをトラップできるように処理されたろ紙を用いて行う（１）記載のがんの分析方法、
（３）  前記尿検体を前記ろ紙上に採取して検査機関に輸送する工程を含む（２）記載のがんの分析方法、
（４）  尿検体から抽出されたエクソソーム中に存在するmicroRNAのうち、miR-103と、miR-21および／またはmiR-19とのmicroRNA量を定量する測定部と、前記測定部により定量されたmiR-103と、miR-21および／またはmiR-19のmicroRNA量を分析装置に送信する送信部とを備える測定装置と、前記測定装置から送信された前記microRNA量を受信する受信部と、前記microRNA量に基づいてがんの状態を分析する分析する分析部とを備える分析装置とを含むがんの分析システム、
（５）  コンピュータを尿検体から抽出されたエクソソーム中に存在するmicroRNAのうち、miR-103と、miR-21および／またはmiR-19とを定量して得られたmicroRNA量のデータを取得する手段と、miR-103と、miR-21および／またはmiR-19のmicroRNA量のデータに基づいてがんの状態を分析する手段として機能させるためのプログラム、
（６）  コンピュータを尿検体から抽出されたエクソソーム中に存在するmicroRNAのうち、miR-103と、miR-21および／またはmiR-19とを定量して得られたmicroRNA量のデータを取得する手段と、miR-103と、miR-21および／またはmiR-19の前記microRNA量のデータに基づいてがんの状態を分析する手段として機能させるためのプログラムを記録したコンピュータ読み取り可能な記録媒体
が提供される。
【発明の効果】
【００１３】
本発明によれば、非侵襲かつ、早期にがんの発見が可能ながんの分析方法、がんの分析システム、プログラムおよびコンピュータ読み取り可能な記録媒体が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】本発明の実施の形態に係るがんの分析システムのシステム構成を示すブロック図である。
【図２】本発明の実施の形態に係るがんの分析システムを用いたがんの分析方法を示すフローチャートである。
【図３】本発明の実施例における定量ＰＣＲにより得られたmiR-21の量のmiR-103の量に対する値を示すグラフである。
【図４】本発明の実施例における定量ＰＣＲにより得られたmiR-19の量のmiR-103の量に対する値を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
以下、図面を参照して本発明のがんの分析方法およびがんの分析システムについて説明する。
【００１６】
本発明のがんの分析方法は、尿検体からエクソソームを抽出する抽出工程と、前記エクソソーム中に存在するmicroRNAのうち、miR-103と、miR-21および／またはmiR-19とを定量する工程と、miR-103と、miR-21および／またはmiR-19のmicroRNA量に基づいてがんの状態を分析する分析工程とを含む。
【００１７】
また、本発明のがんの分析システムは、尿検体から抽出されたエクソソーム中に存在するmicroRNAのうち、miR-103と、miR-21および／またはmiR-19とのmicroRNA量を定量する測定部と、前記測定部により定量されたmiR-103と、miR-21および／またはmiR-19のmicroRNA量を分析装置に送信する送信部とを備える測定装置と、前記測定装置から送信された前記microRNA量を受信する受信部と、前記microRNA量に基づいてがんの状態を分析する分析部とを備える分析装置とを含む。
【００１８】
図１は、本発明の実施の形態に係るがんの分析システムのシステム構成を示すブロック図である。図１に示すようにがんの分析システム２は、測定装置としての定量ＰＣＲ装置４、分析装置としてのＰＣ（パーソナルコンピュータ）６を備えている。
【００１９】
また、定量ＰＣＲ装置４は、定量ＰＣＲ装置４の各部を統括的に制御する制御部８を備え、制御部８には測定条件や測定開始等の入力操作を受け付ける入力部１０、microRNAを所定のプライマーを用いて増幅し、定量する測定部１２、測定部１２により測定したmiR-103と、miR-21および／またはmiR-19のmicroRNA量のデータをＰＣ６へ送信する送信部１４が接続されている。
【００２０】
また、ＰＣ６は、ＣＰＵ１６を備え、ＣＰＵ１６には定量ＰＣＲ装置４から送信されたmiR-103と、miR-21および／またはmiR-19のmicroRNA量のデータを受信する受信部１８、microRNA量のデータを記憶する記憶部２０、microRNA量のデータに基づいてがんの状態を分析する分析部２２、がんの状態の分析に用いるデータの指定およびがんの分析開始指示等の入力を行う操作部２４が接続されている。
【００２１】
次に、図２に示すフローチャートを参照して本発明の実施の形態に係るがんの分析システムを用いたがんの分析方法について説明する。
【００２２】
まず、本発明においては、検体として尿を用い、この尿検体からエクソソームを抽出する（ステップＳ１）。エクソソームの抽出方法としては、超遠心分離法、限外濾過法、ゲル濾過法、ＨＰＬＣや抽出用試薬を用いた方法等が挙げられるが、エクソソームをトラップできるように処理されたろ紙を用いることが好ましい。
【００２３】
このようなろ紙としては例えば、ＦＴＡマイクロカード（ＧＥヘルスケア社製）等が挙げられる（たとえば、米国特許第５４９６５６２号、第５７５６１２６号、第５８０７５２７号、第５９７２３８６号および第５９８５３２７号等参照）。このＦＴＡマイクロカードは、セルロースベースの紙に、トリスヒドロキシメチルメタン等の弱塩基、エチレンジアミン四酢酸塩等のキレート剤、ドデシル硫酸ナトリウム等のアニオン性界面活性剤、尿酸または尿酸塩等のフリーラジカルトラップを含んでなる組成物を吸着又は組み込ませたろ紙を有する。
【００２４】
なお、ＦＴＡマイクロカードを構成するろ紙は、核酸を絡めてトラップするように設計されているが、本発明者らの検討によれば、ＦＴＡマイクロカードに尿検体を注ぐ、又は付着させると、エクソソームがトラップされることが分かった。
【００２５】
したがって、ＦＴＡマイクロカード等のエクソソームをトラップできるように処理されたろ紙に尿検体を注ぐ等することにより付着又は吸着させた後に、この状態（以下、「尿検体付着ろ紙」ということがある。）で簡便に運搬することができる。
【００２６】
エクソソームの抽出方法として超遠心分離法、限外濾過法、ゲル濾過法、ＨＰＬＣや抽出用試薬を用いた方法を用いた場合には、採尿してから採尿管等により液体の状態で検査機関・検査室まで運搬する必要があるが、エクソソームをトラップできるように処理されたろ紙を用いると、ＦＴＡマイクロカード等のカードや紙を媒体として検査機関・検査室まで運搬することができるため、室温で運搬できるなどの輸送の容易さの点、輸送コストの点で好ましい。
【００２７】
なお、尿検体付着ろ紙を運搬する際には、防臭等の観点から所定の袋等に入れて運搬してもよい。
【００２８】
次に抽出工程において尿検体からエクソソームを抽出した後、エクソソームからmicroRNAを取り出す（ステップＳ２）。エクソソームからmicroRNAを取り出す方法としては、特に限定されず、市販の種々の抽出用キットを用いることができる。例えば、miRCURY RNA Isolation Kit (Product# 300110; EXIQON社)などが使用できる。
【００２９】
次に、抽出したmicroRNAの量を、定量ＰＣＲ装置４を用いて定量する（ステップＳ３）。定量を行う際には、まず、ステップＳ２にて取り出したmicroRNAを測定部１２にセットする。そして、操作者により入力部１０から定量開始の指示が入力されると、制御部８は測定部１２にセットされたmicroRNAの定量を開始させる。ここで、定量ＰＣＲ装置４においてはポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）による増幅を経時的に測定するリアルタイムＰＣＲにより測定を行うことが好ましい。
【００３０】
本発明において、定量する対象となるmicroRNAは、miR-103と、miR-21および／またはmiR-19である。
【００３１】
ここで、miR-103は血清／血漿中、尿中および脳脊髄液のエクソソーム中において安定して発現するものである（例えば、http://www.exiqon.com/ls/Documents/Scientific/microRNA-serum-plasma-guidelines.pdfのTable6（25頁）参照）。
【００３２】
また、miR-21は、血清または脳脊髄液等から抽出されたエクソソームに含まれる疾患特異的分子として、卵巣がん、大腸がん、膵臓がん、子宮頸がん、肝臓がん、咽頭扁平上皮がんおよび神経膠腫といった幅広い種類のがんにみられるmicroRNAである。即ち、幅広い種類のがん細胞から多く分泌される種類のmicroRNAである。
【００３３】
ここで、上述のmiR-103のように血清／血漿中、尿中および脳脊髄液のエクソソームで安定して発現する種類のmicroRNAもあれば、安定して発現しないmicroRNAも存在する（上記と同様に、例えば、http://www.exiqon.com/ls/Documents/Scientific/microRNA-serum-plasma-guidelines.pdfのTable6（25頁）参照）。したがって、血清や脳脊髄液等から抽出されたエクソソームに含まれる種類のmicroRNAとして発現するからといって、尿から抽出されたエクソソームに含まれる種類のmicroRNAとして発現するとはいえないものである。すなわち、血清や脳脊髄液等から抽出されたエクソソームに含まれるmicroRNAの種類と、尿から抽出されたエクソソームに含まれるmicroRNAの種類との間に完全な相関が認められるものではない。
【００３４】
また、miR-19は、幅広いがん細胞から分泌が抑制される種類のmicroRNAであり、がん患者の血清または脳脊髄液等から抽出されたエクソソームに含まれる種類のmicroRNAとしては発現量が少なくなる。
【００３５】
次に、定量ＰＣＲ装置４の制御部８は送信部１４を介して、定量によって得られたmicroRNA量のデータをＰＣ６へ送信し（ステップＳ４）、ＰＣ６は受信部１８を介して定量によって得られたmicroRNA量のデータを受信する（ステップＳ５）。ここで、定量ＰＣＲ装置４の送信部１４とＰＣ６の受信部１８との間の通信は有線ＬＡＮ等の有線通信により行ってもよいし、無線ＬＡＮやBluetooth（登録商標）等の無線通信により行ってもよい。
【００３６】
次に、ＰＣ６のＣＰＵ１６は、受信部１８を介して受信したmicroRNA量のデータを記憶部２０に記憶させる（ステップＳ６）。ここで、記憶部２０においては、microRNA量のデータを例えば、検体ＩＤや測定日時、測定番号などと対応させて記憶する。
【００３７】
そして、操作部２４を介して分析対象のデータを指定し、分析開始の指示が入力されると、ＣＰＵ１６は分析部２２にがんの状態の分析を行わせる（ステップＳ７）。なお、がんの状態の分析を行う際には、ＣＰＵ１６は記憶部２０に記憶されたmicroRNA量のデータのうち、分析対象として指定されたデータを読み出し、分析部２２にがんの状態の分析を行わせる。
【００３８】
ここで、定量ＰＣＲ装置４を用いて定量されたmicroRNA量は、統計処理により分析することができるが、比較Ｃｔ法により得られたデータを統計処理して分析することが好ましい。たとえば、特定の人の尿検体から抽出したエクソソームに含まれるmiR-103と、miR-21および／またはmiR-19を継続的に定量することにより、平常時（すなわち、非がんであるとき）のデータを収集し、これに対してmiR-21の発現量が多くなった時、および／またはmiR-19の発現量が少なくなった時にがんと分析することができる。ここで、miR-21の量およびmiR-19の量は、miR-103の量と比較した値を用いる。これらの値は、実施例においても後述するように、がんと非がんとの２群間で統計的有意差をもって変動する値であることが、本発明者らの検討により判明した。
【００３９】
分析部２２によるがんの状態の分析においては、たとえば、特定の個人ごとに継続的に収集したデータを用いることにより、継続的に収集したデータよりもmiR-21の量のmiR-103の量に対する値が多くなった時、および／または、miR-19の量のmiR-103の量に対する値が少なくなった時にがんである状態と分析することができる。
【００４０】
また、がんの状態を分析する際に、所定の閾値を用いて分析を行ってもよい。この場合には、記憶部２０に記憶されたmicroRNA量のうちの全部のデータや無作為に抽出されたデータからmiR-21の量のmiR-103の量に対する値、および／またはmiR-19の量のmiR-103の量に対する値を統計処理することにより、予めがんである状態と分析するための閾値を算出する。そして、この閾値をがんの状態を分析する際の閾値として設定することにより、特定のデータががんである状態であるか否かの分析を行うことができる。
【００４１】
なお、上述のがんの状態の分析においては外れ値や欠損値等のデータを除去して、がんの状態の分析を行ってもよい。
【００４２】
本発明の実施の形態に係るがんの分析方法およびがんの分析システムによれば、非侵襲かつ、早期にがんを発見することができる。
【００４３】
なお、上述の実施の形態においては、分析装置としてＰＣ６を例に説明したが、分析装置としてタブレット端末等を用いてもよい。また、がんの分析システム２として定量ＰＣＲ装置４およびＰＣ６の２台の装置を備える構成を例に説明したが、例えば、定量ＰＣＲ装置４に分析装置の機能を組み込むことにより１台の装置により分析システムを構成することもできる。
【００４４】
また、上述の実施の形態において、測定装置である定量ＰＣＲ装置４から分析装置であるＰＣ６へmicroRNA量のデータを送信する構成としたが、定量ＰＣＲ装置４とＰＣ６との間での通信が不可能である場合等に、ＵＳＢメモリやＳＤカード等の記録媒体を介して定量ＰＣＲ装置４からＰＣ６へmicroRNA量のデータを移行してもよい。
【００４５】
また、上述の実施の形態において、操作部２４を介して分析対象のデータを指定し、分析開始の指示が入力されると、ＰＣ６によりがんの状態を分析する構成として説明したが、尿検体から抽出されたエクソソーム中に存在するmicroRNAのうち、miR-103と、miR-21および／またはmiR-19とを定量して得られたmicroRNA量のデータに基づいてがんの状態を分析する分析プログラムをインターネット等のネットワークを介してダウンロードし、コンピュータに組み込むことによって、上述の分析処理が行うことができるようにコンピュータを機能させるようにしてもよい。ここで、この分析プログラムは、ネットワーク上またはコンピュータ上に記憶されているmiR-103と、miR-21および／またはmiR-19のmicroRNA量のデータを読み出して、がんの状態の分析に用いてもよい。
【００４６】
また、当該プログラムはフレキシブルディスク、ＣＤ−ＲＯＭ、ＤＶＤ等のコンピュータ読み取り可能な記録媒体に記録されていてもよい。即ち、コンピュータ読み取り可能な記録媒体から読み取り、コンピュータに組み込むことによって、上述のがんの状態の分析を行うことができるようにコンピュータを機能させるようにしてもよい。
【実施例】
【００４７】
以下に、実施例を挙げて本発明を説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。なお、本実施例における部および％は、特記しない限り重量基準である。【００４８】
がん患者（ｎ＝６）および非がん患者（ｎ＝６）のそれぞれについて尿検体をＦＴＡマイクロカードに付着または吸着させた。これにより尿検体からエクソソームを抽出した。【００４９】
次にmicroRNA抽出用キット（miRCURY RNA Isolation Kit (Product# 300110; EXIQON社)）を用いてそれぞれのエクソソームからmicroRNAを抽出した。そして、得られたmicroRNAをそれぞれ超純水により分散または溶解させて所定の濃度とし、次にそれぞれの検体から逆転写酵素によって逆転写反応させて、cDNAを合成させ、そのcDNAを用いて、miR-103と、miR-21およびmiR-19の発現を定量ＰＣＲで解析した。【００５０】
定量ＰＣＲ法の具体的な手順としては以下のように行った。上記microRNAから得たcDNAを用いてPrimeScript RT Master Mix (Takara)の方法に準じ、cDNAに逆転写し、SYBR Premix EX Taq II (Takara)により増幅した。なお、PCR反応液としては、５０μＬ（２５μＬ SYBR Green Mix (2x), １μＬ cDNA, ２μＬ primer pair mix (５ｐｍｏｌ／μＬ each primer), ２２μＬ Ｈ２Ｏ）のＰＣＲ反応液を用い、反応は９５℃にて３０秒を１サイクル、さらに９５℃にて５秒および６０℃にて３０秒のサイクルを５０サイクルの条件にて行った。比較Ct法（ΔΔCt法）より相対定量を行った。なお、RT-PCR（リアルタイムＰＣＲ）に用いた各種ターゲット（miR-103と、miR-21およびmiR-19）のPrimerとしてはそれぞれ所定のものを用いた。【００５１】
またmicroRNAを元にして、このRT反応と定量PCRを１つの試験管内で行えるOne Step-RT-PCR Kitを用いることも出来る。例えば、Luna Universal One-step Reaction Mix (New England BioLabs社)も使用できる。【００５２】
そして、定量ＰＣＲにより得られたmiR-21の量のmiR-103の量に対する値を図３に、およびmiR-19の量のmiR-103の量に対する値を図４にそれぞれ示す。【００５３】
図３および図４から、miR-21の量のmiR-103の量に対する値が大きいほどがんである状態と分析することができ、miR-19の量のmiR-103の量に対する値が小さいほど、がんである状態と分析することができることが分かった。【００５４】
なお、図３および図４において点線で囲った部分ががんの状態であると分析できる範囲であり、実線で囲った部分が非がんの状態であると分析できる範囲であり、破線で囲った部分がボーダーの状態、または、閾値と分析できる範囲である。また、図３のmiR-21の値で小さいほうに外れている検体が１点あるが、この検体は図４のmiR-19においてもはずれており、miR-21、miR-19が共通してはずれているため、正常では無いと判断できる。
【図１】
2019220759.tif 000003
【図２】
2019220759.tif 000004
【図３】
2019220759.tif 000005
【図４】
2019220759.tif 000006
【国際調査報告】
2019220759.tif 000007
2019220759.tif 000008