(57)【要約】  胃癌の長期無再発群と再発転移群での遺伝子発現解析から、ＣＨＲＮＢ２、ＮＰＴＸＲを創薬ターゲットとして同定した。ＣＨＲＮＢ２、ＮＰＴＸＲを標的とする抗体医薬、核酸医薬によって、腫瘍増殖を抑制することができた。さらに、ＣＨＲＮＢ２、ＮＰＴＸＲ結合するポリクローナル抗体、モノクローナル抗体を提供する。これら受容体分子は、新たな分子標的であることから、既存の治療薬が奏効しなかった症例の治療を行うことも可能となる。
2019146759.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｃｈｏｌｉｎｅｒｇｉｃ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  Ｎｉｃｏｔｉｎｉｃ  Ｂｅｔａ  ２  Ｓｕｂｕｎｉｔ  （ＣＨＲＮＢ２）の発現を中和、又は抑制する物質を有効成分として含有する分子標的治療薬。
【請求項２】
前記有効成分が、
抗体、又は核酸であることを特徴とする請求項１記載の分子標的治療薬。
【請求項３】
前記有効成分が、
ＣＨＲＮＢ２のＷＫＰＥＥＦＤＮＭＫＫＶＲＬＰＳＫＨ（配列番号８）、又はＴＦＬＨＳＤＨＳＡＰＳＳＫ（配列番号９）のいずれかを認識するものであることを特徴とする請求項１、又は２記載の分子標的治療薬。
【請求項４】
前記有効成分が抗体であることを特徴とする請求項３に記載の分子標的治療薬。
【請求項５】
前記抗体が受託番号ＮＩＴＥ  Ｐ−０２８５７で表されるハイブリドーマにより産生されるものである請求項４記載の分子標的治療薬。
【請求項６】
前記有効成分が、ＣＨＲＮＢ２に対するｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、アンチセンスオリゴ、アプタマー、又はデコイであることを特徴とする請求項１、又は２に記載の分子標的治療薬。
【請求項７】
前記分子標的治療薬の対象疾患が、
胃癌、大腸癌、乳癌、肺癌、膵癌、食道癌であることを特徴とする請求項１〜６記載の分子標的治療薬。
【請求項８】
受託番号ＮＩＴＥ  Ｐ−０２８５７で表されるハイブリドーマにより産生されるモノクローナル抗体。
【請求項９】
受託番号ＮＩＴＥ  Ｐ−０２８５７で表されるハイブリドーマ。
【請求項１０】
ＣＨＲＮＢ２を認識する抗体、又はＣＨＲＮＢ２のｍＲＮＡ発現を定量するプライマー、及び測定に必要な試薬を含む検査キット。
【請求項１１】
前記ＣＨＲＮＢ２を認識する抗体が、
ＣＨＲＮＢ２のＷＫＰＥＥＦＤＮＭＫＫＶＲＬＰＳＫＨ（配列番号８）、又はＴＦＬＨＳＤＨＳＡＰＳＳＫ（配列番号９）のいずれかを認識するものであることを特徴とする請求項１０記載の検査キット。
【請求項１２】
前記ＣＨＲＮＢ２を認識する抗体が、
受託番号ＮＩＴＥ  Ｐ−０２８５７で表されるハイブリドーマにより産生されるものである請求項１０記載の検査キット。
【請求項１３】
前記ＣＨＲＮＢ２のｍＲＮＡを定量するためのプライマーが配列番号１及び２で表されるプライマーであることを特徴とする請求項１０記載の検査キット。
【請求項１４】
被験物質と
ＣＨＲＮＢ２の細胞表面に表出している領域への結合性を指標とする分子標的薬のスクリーニング方法。
【請求項１５】
被験物質存在下で細胞を培養し、
ＣＨＲＮＢ２の発現を指標とすることにより分子標的薬をスクリーニングする方法。
【請求項１６】
Ｎｅｕｒｏｎａｌ  ｐｅｎｔｒａｘｉｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＮＰＴＸＲ）の発現を中和、又は抑制する物質を有効成分として含有する分子標的治療薬。
【請求項１７】
前記有効成分が、
抗体、又は核酸であることを特徴とする請求項１６記載の分子標的治療薬。
【請求項１８】
前記有効成分が、
ＮＰＴＸＲのＣＥＳＧＬＰＲＧＬＱＧＡＧＰＲＲＤＴ（配列番号１０）、
又はＫＥＲＶＡＬＳＨＳＳＲＲＱＲＱＥＶＥ（配列番号１１）のいずれかを認識するものであることを特徴とする請求項１６、又は１７記載の分子標的治療薬。
【請求項１９】
前記有効成分が抗体であることを特徴とする請求項１８に記載の分子標的治療薬。
【請求項２０】
前記抗体が受託番号ＮＩＴＥ  Ｐ−０２８５６で表されるハイブリドーマにより産生されるものである請求項１９記載の分子標的治療薬。
【請求項２１】
前記有効成分が、ＮＰＴＸＲに対するｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、アンチセンスオリゴ、アプタマー、又はデコイであることを特徴とする請求項１６、又は１７に記載の分子標的治療薬。
【請求項２２】
前記分子標的治療薬の対象疾患が、
胃癌、大腸癌、乳癌、肺癌、膵癌、食道癌であることを特徴とする請求項１６〜２１記載の分子標的治療薬。
【請求項２３】
ＮＰＴＸＲのＣＥＳＧＬＰＲＧＬＱＧＡＧＰＲＲＤＴ（配列番号１０）、
又はＫＥＲＶＡＬＳＨＳＳＲＲＱＲＱＥＶＥ（配列番号１１）を認識する抗体。
【請求項２４】
受託番号ＮＩＴＥ  Ｐ−０２８５６で表されるハイブリドーマにより産生されるモノクローナル抗体。
【請求項２５】
受託番号ＮＩＴＥ  Ｐ−０２８５６で表されるハイブリドーマ。
【請求項２６】
配列番号１２（ＧＬＰＲＧＬＱＧＡＧＰＲＲＤＴ）で表されるエピトープを認識する抗体。
【請求項２７】
ＮＰＴＸＲを認識する抗体、又はＮＰＴＸＲのｍＲＮＡ発現を定量するプライマー、及び測定に必要な試薬を含む検査キット。
【請求項２８】
前記ＮＰＴＸＲを認識する抗体が、
ＣＥＳＧＬＰＲＧＬＱＧＡＧＰＲＲＤＴ（配列番号１０）、
又はＫＥＲＶＡＬＳＨＳＳＲＲＱＲＱＥＶＥ（配列番号１１）のいずれかを認識するものであることを特徴とする請求項２７記載の検査キット。
【請求項２９】
前記ＮＰＴＸＲを認識する抗体が、
受託番号ＮＩＴＥ  Ｐ−０２８５６で表されるハイブリドーマにより産生されるものである請求項２７記載の検査キット。
【請求項３０】
前記ＮＰＴＸＲのｍＲＮＡ発現を定量するプライマーが配列番号３及び４であることを特徴とする請求項２７記載の検査キット。
【請求項３１】
被験物質と
ＮＰＴＸＲの細胞表面に表出している領域への結合性を指標とする分子標的薬のスクリーニング方法。
【請求項３２】
被験物質存在下で細胞を培養し、
ＮＰＴＸＲの発現を指標とすることにより分子標的薬をスクリーニングする方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、受容体タンパク質を標的とする治療薬、及び検査薬に関する。癌細胞表面で多く発現している受容体、及び当該受容体の下流のシグナルを担うシグナル伝達系を標的とする標的医薬、特に受容体タンパク質に対する抗体医薬、核酸医薬に関する。さらに、上記分子標的薬を投与する際のコンパニオン診断薬、あるいは再発など予後を予測する検査薬に関する。また、受容体タンパク質標的とする医薬のスクリーニング方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
胃癌は全世界で罹患数は４位、癌関連死亡数は２位の癌である（２０１２年統計）。胃癌は日本、中国、韓国などのアジア、南米に多い癌であり、日本の癌患者の統計によれば、胃癌新規罹患数は１３３，０００人（３位）、死亡者数４９，４００人（３位）（２０１５年統計）と、罹患率が高く優先的に克服すべき重要な疾患である。【０００３】
我が国では癌検診の普及によって早期発見される例が増えたことから胃癌の死亡率は減少傾向にある。しかしながら、早期胃癌ではほとんど症状がないことから、いまも進行胃癌として発見されることも多く、死亡者数が多い原因となっている。切除不能進行再発胃癌に対する一次治療としては、Ｓ−１（テガフール・ギメラシル・オテラシルカリウム配合剤）とシスプラチンの併用療法が我が国では標準療法として確立している。さらに、ＨＥＲ２陽性症例に対しては、抗ＨＥＲ２抗体であるトラスツズマブが標準治療薬となっている。また、抗ＶＥＧＦＲ−２抗体のラムシルマブが二次治療として、さらに免疫チェックポイント阻害剤である抗ＰＤ−１抗体のニボルマブが承認されている（非特許文献１、２）。【０００４】
従来の抗癌剤が細胞傷害により癌細胞を死滅させることを狙うのに対し、抗体医薬のような分子標的薬は癌細胞で過剰に発現している分子を標的とすることから作用機序が異なる。その結果、今まで効果が得られなかった患者に対しても効果が得られる可能性が高い。胃癌の分子標的治療薬も、新たな抗体医薬の開発が行われている（特許文献１）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特表２０１７−５１１３４２号公報
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Apicella M., et al., Oncotarget. 2017 ,Vol. 8(34), p. 57654-57669.doi: 10.18632/oncotarget.14825. PMID: 28915702
【非特許文献２】大沼  啓之、北海道外科雑誌、２０１７年、Ｖｏｌ．６２、Ｎｏ．１、ｐ．２３−２８
【非特許文献３】Bartolini, A., et al., 2015, Cancer Res. Vol.75(20), p.4265-4271
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
しかし、現在のところ進行胃癌に対してはＨＥＲ２、ＶＥＧＦなど限られた増殖因子を標的とする薬剤しか使用できない。ＨＥＲ２陽性胃癌は、進行、再発胃癌の約２０％程度であり、トラスツズマブはＨＥＲ２陽性胃癌にのみ有効であるにすぎない。また、新たに承認された免疫チェックポイント阻害薬であるニボルマブの奏効率も２０％程度にとどまることが治療の限界を生みだしている。また、米国で進行胃癌の治療に承認されているラムシルマブは、予後延長効果がさほど大きいものとはいえない。そのため、まったく別の機序から胃癌の進展を制御し得る阻害薬創製が治療成績改善のために必須である。【０００８】
本発明は、胃癌進展に関与する分子を同定することによって、標的となり得る分子を見出し、標的治療薬を提供することを課題とする。また、標的となる分子が発現している癌細胞であれば、同様の作用機序により効果を奏すると考えられることから、胃癌だけではなく他の癌に対しても効果を有することが期待される。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明は、以下の分子標的薬、抗体、検査薬、及び分子標的薬のスクリーニング方法に関する。
（１）Ｃｈｏｌｉｎｅｒｇｉｃ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  Ｎｉｃｏｔｉｎｉｃ  Ｂｅｔａ  ２  Ｓｕｂｕｎｉｔ  （ＣＨＲＮＢ２）の発現を中和、又は抑制する物質を有効成分として含有する分子標的治療薬。
（２）前記有効成分が、抗体、又は核酸であることを特徴とする（１）記載の分子標的治療薬。
（３）前記有効成分が、ＣＨＲＮＢ２のＷＫＰＥＥＦＤＮＭＫＫＶＲＬＰＳＫＨ（配列番号８）、又はＴＦＬＨＳＤＨＳＡＰＳＳＫ（配列番号９）のいずれかを認識するものであることを特徴とする（１）、又は（２）記載の分子標的治療薬。
（４）前記有効成分が抗体であることを特徴とする（３）に記載の分子標的治療薬。
（５）前記抗体が受託番号ＮＩＴＥ  Ｐ−０２８５７で表されるハイブリドーマにより産生されるものである（４）記載の分子標的治療薬。
（６）前記有効成分が、ＣＨＲＮＢ２に対するｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、アンチセンスオリゴ、アプタマー、又はデコイであることを特徴とする（１）、又は（２）に記載の分子標的治療薬。
（７）前記分子標的治療薬の対象疾患が、胃癌、大腸癌、乳癌、肺癌、膵癌、食道癌であることを特徴とする（１）〜（６）記載の分子標的治療薬。
（８）受託番号ＮＩＴＥ  Ｐ−０２８５７で表されるハイブリドーマにより産生されるモノクローナル抗体。
（９）受託番号ＮＩＴＥ  Ｐ−０２８５７で表されるハイブリドーマ。
（１０）ＣＨＲＮＢ２を認識する抗体、又はＣＨＲＮＢ２のｍＲＮＡ発現を定量するプライマー、及び測定に必要な試薬を含む検査キット。
（１１）前記ＣＨＲＮＢ２を認識する抗体が、ＣＨＲＮＢ２のＷＫＰＥＥＦＤＮＭＫＫＶＲＬＰＳＫＨ（配列番号８）、又はＴＦＬＨＳＤＨＳＡＰＳＳＫ（配列番号９）のいずれかを認識するものであることを特徴とする（１０）記載の検査キット。
（１２）前記ＣＨＲＮＢ２を認識する抗体が、受託番号ＮＩＴＥ  Ｐ−０２８５７で表されるハイブリドーマにより産生されるものである（１０）記載の検査キット。
（１３）前記ＣＨＲＮＢ２のｍＲＮＡを定量するためのプライマーが配列番号１及び２で表されるプライマーであることを特徴とする（１０）記載の検査キット。
（１４）被験物質とＣＨＲＮＢ２の細胞表面に表出している領域への結合性を指標とする分子標的薬のスクリーニング方法。
（１５）被験物質存在下で細胞を培養し、ＣＨＲＮＢ２の発現を指標とすることにより分子標的薬をスクリーニングする方法。
（１６）Ｎｅｕｒｏｎａｌ  ｐｅｎｔｒａｘｉｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＮＰＴＸＲ）の発現を中和、又は抑制する物質を有効成分として含有する分子標的治療薬。
（１７）前記有効成分が、抗体、又は核酸であることを特徴とする（１６）記載の分子標的治療薬。
（１８）前記有効成分が、ＮＰＴＸＲのＣＥＳＧＬＰＲＧＬＱＧＡＧＰＲＲＤＴ（配列番号１０）、又はＫＥＲＶＡＬＳＨＳＳＲＲＱＲＱＥＶＥ（配列番号１１）のいずれかを認識するものであることを特徴とする（１６）、又は（１７）記載の分子標的治療薬。
（１９）前記有効成分が抗体であることを特徴とする（１８）に記載の分子標的治療薬。
（２０）前記抗体が受託番号ＮＩＴＥ  Ｐ−０２８５６で表されるハイブリドーマにより産生されるものである（１９）記載の分子標的治療薬。
（２１）前記有効成分が、ＮＰＴＸＲに対するｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、アンチセンスオリゴ、アプタマー、又はデコイであることを特徴とする（１６）、又は（１７）に記載の分子標的治療薬。
（２２）前記分子標的治療薬の対象疾患が、胃癌、大腸癌、乳癌、肺癌、膵癌、食道癌であることを特徴とする（１６）〜（２１）記載の分子標的治療薬。
（２３）ＮＰＴＸＲのＣＥＳＧＬＰＲＧＬＱＧＡＧＰＲＲＤＴ（配列番号１０）、
又はＫＥＲＶＡＬＳＨＳＳＲＲＱＲＱＥＶＥ（配列番号１１）を認識する抗体。
（２４）受託番号ＮＩＴＥ  Ｐ−０２８５６で表されるハイブリドーマにより産生されるモノクローナル抗体。
（２５）受託番号ＮＩＴＥ  Ｐ−０２８５６で表されるハイブリドーマ。
（２６）配列番号１２（ＧＬＰＲＧＬＱＧＡＧＰＲＲＤＴ）で表されるエピトープを認識する抗体。
（２７）ＮＰＴＸＲを認識する抗体、又はＮＰＴＸＲのｍＲＮＡ発現を定量するプライマー、及び測定に必要な試薬を含む検査キット。
（２８）前記ＮＰＴＸＲを認識する抗体が、ＣＥＳＧＬＰＲＧＬＱＧＡＧＰＲＲＤＴ（配列番号１０）、又はＫＥＲＶＡＬＳＨＳＳＲＲＱＲＱＥＶＥ（配列番号１１）のいずれかを認識するものであることを特徴とする（２７）記載の検査キット。
（２９）前記ＮＰＴＸＲを認識する抗体が、受託番号ＮＩＴＥ  Ｐ−０２８５６で表されるハイブリドーマにより産生されるものである（２７）記載の検査キット。
（３０）前記ＮＰＴＸＲのｍＲＮＡ発現を定量するプライマーが配列番号３及び４であることを特徴とする（２７）記載の検査キット。
（３１）被験物質とＮＰＴＸＲの細胞表面に表出している領域への結合性を指標とする分子標的薬のスクリーニング方法。
（３２）被験物質存在下で細胞を培養し、ＮＰＴＸＲの発現を指標とすることにより分子標的薬をスクリーニングする方法。
（３３）（１）〜（７）記載の分子標的治療薬を用いることを特徴とする治療方法。
（３４）ＣＨＲＮＢ２発現が高い腫瘍を対象とすることを特徴とする（３３）記載の治療方法。
（３５）（１０）〜（１３）記載の検査キットを用いてＣＨＲＮＢ２発現を検査することを特徴とする（３４）記載の治療方法。
（３６）（１６）〜（２２）記載の分子標的治療薬を用いることを特徴とする治療方法。
（３７）ＮＰＴＸＲ発現が高い腫瘍を対象とすることを特徴とする（３６）記載の治療方法。
（３８）（２７）〜（３０）記載の検査キットを用いてＮＰＴＸＲ発現を検査することを特徴とする（３７）記載の治療方法。
【発明の効果】
【００１０】
現在治療に使用されている抗癌剤とは作用機序の異なる治療薬であることから、今までの治療で奏功が得られなかった患者に対しても効果を有することが期待される。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】胃癌細胞株でのＣＨＲＮＢ２、ＮＰＴＸＲのｍＲＮＡ発現を解析した図。
【図２】ＣＨＲＮＢ２ノックアウト細胞を用いてＣＨＲＮＢ２の機能解析を行った図。（Ａ）は細胞増殖能を、（Ｂ）はアポトーシス比率、（Ｃ）は遊走能、（Ｄ）は浸潤能、（Ｅ）は接着能の解析結果を示す。
【図３】ＮＰＴＸＲノックアウト細胞を用いてＮＰＴＸＲの機能解析を行った図。（Ａ）は細胞増殖能を、（Ｂ）はアポトーシス比率、（Ｃ）は遊走能、（Ｄ）は浸潤能、（Ｅ）は接着能の解析結果を示す。
【図４】ＮＰＴＸＲ発現がアポトーシス経路に与える影響の解析結果を示す図。（Ａ）はミトコンドリアの脱分極を、（Ｂ）はカスパーゼ活性の解析結果を示す図。（Ｃ）は代表的なカスパーゼファミリー分子の活性の解析結果を示す図。
【図５】ＮＰＴＸＲ発現の細胞周期に対する影響を解析した図。（Ａ）はセルソーターにより、（Ｂ）は顕微鏡観察による解析結果を示す図。
【図６】ＮＰＴＸＲ発現の癌幹細胞性に対する影響の解析結果を示す図。
【図７】ＮＰＴＸＲ発現の細胞増殖に対する影響の解析結果を示す図。（Ａ）は癌細胞の増殖に影響を及ぼすＰＩ３Ｋ経路の解析結果を示す図。（Ｂ）は抗癌剤５−ＦＵへの感受性の解析結果を示す図。
【図８】（Ａ）マウス皮下腫瘍モデルにおけるＣＨＲＮＢ２ノックアウト細胞の造腫瘍能の解析結果を示す図。（Ｂ）マウス皮下腫瘍モデルにおけるＮＰＴＸＲノックアウト細胞の造腫瘍能の解析結果を示す図。
【図９】抗ＣＨＲＮＢ２抗体、抗ＮＰＴＸＲ抗体の細胞増殖に対する効果の解析結果を示す図。
【図１０】マウス腹膜播種モデルにおける抗ＣＨＲＮＢ２抗体の効果の解析結果を示す図。
【図１１】マウス腹膜播種モデルにおける抗ＮＰＴＸＲ抗体の効果の解析結果を示す図。
【図１２】抗ＣＨＲＮＢ２モノクローナル抗体の細胞増殖に対する効果の解析結果を示す図。
【図１３】抗ＣＨＲＮＢ２モノクローナル抗体腹膜内投与の腹膜播種治療効果の解析結果を示す図。
【図１４】抗ＮＰＴＸＲモノクローナル抗体の細胞増殖に対する効果を検討した図。（Ａ）はＭＫＮ１細胞を用いた解析結果を示す図。（Ｂ）はＭＩＫＮ１細胞の他、種々の臓器由来の癌細胞株を用いた解析結果を示す図。
【図１５】抗ＮＰＴＸＲモノクローナル抗体腹膜内投与の腹膜播種治療効果の解析結果を示す図。
【図１６】（Ａ）はＣＨＲＮＢ２の、（Ｂ）はＮＰＴＸＲのｓｉＲＮＡの細胞増殖に対する効果の解析結果を示す図。
【図１７】胃癌患者におけるＣＨＲＮＢ２の発現を解析した図。（Ａ）はステージによるｍＲＮＡ発現量を、（Ｂ）は再発・死亡に対するｍＲＮＡ発現量のＲＯＣ曲線解析を、（Ｃ）は計算されたカットオフ値と予後の関係を、（Ｄ）は胃癌組織中のタンパク質発現の解析結果を示す図。
【図１８】胃癌患者におけるＮＰＴＸＲの発現を解析した図。（Ａ）はステージによるｍＲＮＡ発現量を、（Ｂ）は再発・死亡に対するｍＲＮＡ発現量のＲＯＣ曲線解析を、（Ｃ）は計算されたカットオフ値と予後の関係を、（Ｄ）は胃癌組織中のタンパク質発現の解析結果を示す図。
【図１９】胃癌患者組織におけるＮＰＴＸＲの各ステージでのｍＲＮＡ発現量の解析結果を示す図。
【図２０】各種器官・正常組織における発現分布を解析した結果を示す。（Ａ）はＣＨＲＮＢ２発現を、（Ｂ）はＮＰＴＸＲ発現分布を示す図。
【図２１】大腸における発現解析結果を示す図。（Ａ）はＣＨＲＮＢ２発現を、（Ｂ）はＮＰＴＸＲ発現分布を示す。
【図２２】乳腺における発現解析結果を示す図。（Ａ）はＣＨＲＮＢ２発現を、（Ｂ）はＮＰＴＸＲ発現分布を示す。
【図２３】肺における発現解析結果を示す図。（Ａ）はＣＨＲＮＢ２発現を、（Ｂ）はＮＰＴＸＲ発現分布を示す。
【図２４】膵における発現解析結果を示す図。（Ａ）はＣＨＲＮＢ２発現を、（Ｂ）はＮＰＴＸＲ発現分布を示す。
【図２５】食道における発現解析結果を示す図。（Ａ）はＣＨＲＮＢ２発現を、（Ｂ）はＮＰＴＸＲ発現分布を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本発明者は、胃癌進展に関与する分子を同定するために、胃切除術後の症例を経過に応じて分類し、胃癌原発巣組織から得られたｍＲＮＡを対象に次世代シーケンサーを用いた網羅的発現分析を行った。その結果、受容体分子であるＣＨＲＮＢ２、及びＮＰＴＸＲが、胃癌の進展に関連する分子であることを明らかにした。
【００１３】
ＣＨＲＮＢ２、及びＮＰＴＸＲは、公開データベースＧｅｎｅＣａｒｄｓによれば、いずれも脳など神経系の器官で発現が高い遺伝子である。ＣＨＲＮＢ２は胃を含めその他の臓器では発現はあまり高くはなく、各臓器間での差も認められない。また、ＮＰＴＸＲは、神経系以外の臓器でも発現が一様に認められるものの、臓器間で発現に差は認められない。また、これらの遺伝子の機能については、神経芽腫においてＮＰＴＸ／ＮＰＴＸＲの関与を示唆する結果が得られているものの（非特許文献３）、ＣＨＲＮＢ２については胃癌をはじめとする腫瘍との関連や腫瘍での役割は今までに報告がなく明らかではない。また、ＮＰＴＸＲについても、上述のように神経芽腫については報告はあるものの、他の癌種についての報告はなく、上皮性腫瘍での役割についても不明である。
【００１４】
本発明者が解析を進めた結果、これら受容体分子と腫瘍進展との関係や、腫瘍での作用が明らかになった。また、これら分子の中和抗体や発現を阻害する核酸には、腫瘍細胞の増殖抑制や抗腫瘍活性が認められた。したがって、ＣＨＲＮＢ２、及びＮＰＴＸＲタンパク質の機能を阻害する、あるいは遺伝子発現を阻害する物質は分子標的治療薬として機能する。
【００１５】
以下に示すように、実施例においてはＣＨＲＮＢ２、及びＮＰＴＸＲの発現を中和、あるいは阻害する物質として、抗体、ｓｉＲＮＡを用いている。しかし、これら抗体やｓｉＲＮＡだけではなく、ＣＨＲＮＢ２、及びＮＰＴＸＲの発現を中和、あるいは阻害する物質であればどのような物質を用いてもよい。
【００１６】
また、ＣＨＲＮＢ２、及びＮＰＴＸＲの発現を中和、あるいは阻害する物質に腫瘍細胞の増殖抑制や抗腫瘍活性が認められたことから、ＣＨＲＮＢ２やＮＰＴＸＲを標的とする治療薬をスクリーニングすることも可能となる。
【００１７】
具体的には、ＣＨＲＮＢ２、又はＮＰＴＸＲの細胞表面に表出している領域との結合性を評価すれば良い。ＣＨＲＮＢ２、又はＮＰＴＸＲの細胞表面に表出している領域は、タンパク質の立体構造を解析するプログラムによって予測することが可能である。例えば、配列番号８〜１１で表されるペプチドは細胞表面に表出していると考えられることから、これらペプチドとの結合性を評価することによってスクリーニングをすることができる。
【００１８】
また、ＣＨＲＮＢ２、又はＮＰＴＸＲの発現を阻害する物質に効果が認められることから、ＣＨＲＮＢ２、又はＮＰＴＸＲの発現を指標として、分子標的薬をスクリーニングすることもできる。具体的には、候補物質存在下で、ＣＨＲＮＢ２、又はＮＰＴＸＲを発現している細胞を培養し、ＣＨＲＮＢ２、又はＮＰＴＸＲのｍＲＮＡ、又はタンパク質を定量し、候補物質の効果を検討すれば良い。遺伝子発現、タンパク質発現は公知の方法を用いることができるが、例えば、遺伝子発現はＲＴ-ＰＣＲによって、タンパク質発現はＥＬＩＳＡなどによって測定することができる。
【００１９】
本発明で抗ＣＨＲＮＢ２抗体、及び抗ＮＰＴＸＲ抗体とは、ＣＨＲＮＢ２、又はＮＰＴＸＲと結合する免疫グロブリン分子をいう。さらに、以下に示すように、本発明者はＣＨＲＮＢ２、及びＮＰＴＸＲに対するポリクローナル抗体を取得しているだけではなく、モノクローナル抗体もすでに取得している。これらモノクローナル抗体を遺伝子組換え技術を利用してヒト型キメラ抗体、ヒト化ＣＤＲ移植抗体などとしたヒト化抗体、遺伝子改変マウスを用いたヒト抗体もまた本発明の抗体に含まれる。ヒト化抗体、ヒト抗体は、ヒトに投与した場合、ヒト以外の動物の抗体に比べ副作用が少なく、その治療効果が長時間持続する。また、Ｆａｂ、Ｆａｂ´、（Ｆａｂ´）２、Ｆｖ断片などの抗体断片、直鎖状抗体、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、二重特異性抗体なども本発明の範囲に含まれる。
【００２０】
さらに、抗ＮＰＴＸＲモノクローナル抗体はエピトープ解析も行っている。「エピトープ」とは、抗体によって認識される抗原の一部をいい、本明細書において開示される抗体可変領域を含むドメインが結合する抗原上の部位を意味する。ＮＰＴＸＲのようなポリペプチドを抗原とする場合には、抗体は直線的なアミノ酸配列を認識する場合も、３次元的な立体構造を認識する場合もあるが、エプトープは、アミノ酸配列や抗原の構造によって定義することができる。同一エピトープに結合する抗体については、同様の性質を備えていると考えられることから、抗ＮＰＴＸＲモノクローナル抗体についてはエピトープ配列によって規定することもできる。
【００２１】
また、核酸医薬としては、以下の実施例で示すｓｉＲＮＡだけではなく、ＣＨＲＮＢ２、又はＮＰＴＸＲ遺伝子の発現を阻害するものであればよく、ｓｉＲＮＡに限らず、ｍｉＲＮＡ、アンチセンスオリゴのように、ｍＲＮＡ発現を阻害するものを含む。また、アプタマー、デコイなど、抗体のようにＣＨＲＮＢ２、又はＮＰＴＸＲタンパク質に結合し、その活性を中和する核酸を含む。
【００２２】
さらに、ＣＨＲＮＢ２、又はＮＰＴＸＲ受容体の下流に位置するシグナル伝達系を阻害することによって、これら受容体からのシグナルを無効にするような薬剤であっても構わない。例えば、以下に示すように、ＮＰＴＸＲの下流のシグナルとして、ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔシグナル経路の存在が確認された。したがって、ＮＰＴＸＲ高発現の腫瘍の治療に、ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ阻害剤を単独で治療に用いたり、ＮＰＴＸＲの発現を中和、あるいは抑制する分子標的治療薬と併用して使用することにより効果が増強する可能性がある。
【００２３】
また、ＣＨＲＮＢ２やＮＰＴＸＲの発現を中和、あるいは抑制する分子標的治療薬を投与する場合には、無駄な治療を行わないためにも予めＣＨＲＮＢ２やＮＰＴＸＲ発現を調べておく必要がある。ＣＨＲＮＢ２やＮＰＴＸＲの発現は以下に示すように、ＰＣＲ、あるいは抗体による免疫組織化学染色によって調べることができる。発現を測定するためＰＣＲに用いるプライマーセット、又は抗体、及び測定に必要な試薬を合わせて検査キットとすることができる。ＣＨＲＮＢ２やＮＰＴＸＲの発現は、予後とも深い相関があることから、これら検査キットを用いて予後予測を行うことも可能である。
【００２４】
以下に示すデータは、胃癌の解析から得られたものであるが、ＣＨＲＮＢ２やＮＰＴＸＲを標的とする分子標的治療薬は、胃癌だけではなく、ＣＨＲＮＢ２やＮＰＴＸＲを高発現している種々の癌種、あるいはＣＨＲＮＢ２やＮＰＴＸＲを過剰発現している疾患に適用することが可能である。
【００２５】
ＴＣＧＡ（ＴＨＥ  ＣＡＮＣＥＲ  ＧＥＮＯＭＥ  ＡＴＬＡＳ）の癌ゲノムデータベースによれば、ＣＨＲＮＢ２は胃癌と同等以上に、急性骨髄性白血病、乳癌、胆管癌、神経膠芽腫、神経膠腫、肺癌、悪性黒色腫、悪性中皮腫、膵臓癌、子宮癌、子宮肉腫、ブドウ膜黒色腫、腎細胞癌で発現が高い。脳・神経系では正常組織でもＣＨＲＮＢ２の発現が高いことから、神経膠芽腫、神経膠腫でＣＨＲＮＢ２の発現が高いことは、元の組織の発現を反映しているものと考えられる。しかしながら、急性骨髄性白血病、乳癌、胆管癌、肺癌、悪性黒色腫、悪性中皮腫、膵臓癌、子宮癌、子宮肉腫、腎細胞癌は、元の器官でのＣＨＲＮＢ２の発現は胃と同等、あるいはそれ以下である。したがって、これらの癌種におけるＣＨＲＮＢ２の発現の高さは、発癌と相関している可能性が高い。また、以下の実施例において示すように、ＣＨＲＮＢ２の発現を中和、あるいは抑制することにより癌細胞の増殖が抑制されることから、ＣＨＲＮＢ２を標的とする医薬がこれら癌種においても効果を奏する可能性が高い。
【００２６】
また、ＮＰＴＸＲは胃癌と同等以上に、膀胱癌、乳癌、食道癌、神経膠芽腫、神経膠腫、肺癌、悪性黒色腫、卵巣癌、悪性褐色細胞腫、前立腺癌、精巣性胚細胞腫瘍、甲状腺癌、膵臓癌、子宮癌、腎細胞癌で発現が高い。したがって、これら癌腫においても胃癌と同様に、ＮＰＴＸＲを標的とする医薬が効果を奏する可能性が高い。
【００２７】
また、以下に示す実施例では、ＣＨＲＮＢ２、ＮＰＴＸＲを標的とする抗体、あるいは核酸を単独で用いているが、それぞれ併用して用いることができる。本発明者は、抗ＣＨＲＮＢ２抗体、抗ＮＰＴＸＲ抗体に、それぞれ２箇所標的となり得る領域を見出した。したがって、ＣＨＲＮＢ２、あるいはＮＰＴＸＲに対するこれら２種類の抗体を同時に使用してもよいし、ＣＨＲＮＢ２とＮＰＴＸＲ、２つの分子に対する抗体を併用して用いてもよい。また、すでに承認されている化学療法剤やトラスツズマブ、ラムシルマブ、ニボルマブなどの標的医薬と併用して用いることも可能である。
【００２８】
以下にデータを示しながら説明する。
１．ＣＨＲＮＢ２、ＮＰＴＸＲの同定
＜標的分子となり得る胃癌進展に関与する分子の同定＞
これまでに名古屋大学医学部において、ステージIII胃癌で治癒切除術が施行され、術後補助療法としてＳ−１内服を行った症例を経過に応じて群分けした。胃癌患者は大別すると、長期無再発群と再発転移群に分けることができる。５年以上の長期無再発群は「現行治療で制御し得た胃癌」であり、これをコントロールとし、再発転移群と比較した。また、転移には腹膜播種、肝転移、リンパ節転移という異なる種類の転移があることから、再発転移群を腹膜播種再発群、肝転移再発群、リンパ節再発群に分け、５年以上の長期無再発群と合わせて４群、各４例の胃癌原発巣組織から得られたＲＮＡを対象にトランスクリプトーム解析による発現プロファイリングを行った。
【００２９】
手術サンプルは、ＲＮｅａｓｙ  ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて、ＲＮＡを抽出した。抽出したｔｏｔａｌＲＮＡは、ＴｒｕＳｅｑ  ＲＮＡ  Ｓａｍｐｌｅ  Ｐｒｅｐ  Ｋｉｔ（ｉｌｌｕｍｉｎａ社製）を用いて、標準プロトコルに従いシーケンス用ライブラリーの調整を行った。
【００３０】
次に、次世代シーケンサーＨｉｓｅｑ（ｉｌｌｕｍｉｎａ社製）を用いて、Ｐａｉｒｅｄ-Ｅｎｄシーケンシングを行い、トランスクリプトーム解析を行った。読み取り塩基長は１００塩基／リード、参考取得リード数は１億リードペア（２億リード）／レーン、参考取得データ量は２０Ｇｂ／レーンでデータの取得を行った。
【００３１】
解析はＨｉＳｅｑ  ｓｏｆｔｗａｒｅを用いて、指定参照配列へのマッピング処理を行い、ＦＰＫＭ（Fragments per kilobase of exon per million mapped sequence reads）値に基づく遺伝子毎の発現量を算出し、検体間比較テーブルを作成することにより行った。
【００３２】
５７７４９分子の発現量をトランスクリプトーム解析により網羅的に解析し、５年以上の長期無再発群と他の３群とを比較して、再発転移群で高発現している分子の検出を行った。いずれの転移形式においても発現が増加していること、阻害薬創製へのロードマップを考慮して抗体医薬でのアプローチを前提とできる受容体分子であることの２点に着目して解析したところ、条件を満たす候補分子としてＣＨＲＮＢ２、及びＮＰＴＸＲが選出された。
【表１】
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【００３３】
表１に示すように、ＣＨＲＮＢ２、ＮＰＴＸＲは、いずれの再発群でも、コントロールである５年以上の長期無再発群と比較して有意に高発現している。ＣＨＲＮＢ２、ＮＰＴＸＲどちらの分子も悪性腫瘍における役割は不明であったが受容体タンパク質であり、既存の胃癌分子標的薬と全く異なる機序の創薬標的となる可能性があるため、さらに検討を行った。
【００３４】
＜胃癌細胞株でのＣＨＲＮＢ２、ＮＰＴＸＲのｍＲＮＡ発現量の定量的解析＞
１４種の胃癌細胞株、及び非腫瘍性腺管上皮細胞株であるＦＨＳ７４を用いて、定量的ＰＣＲによってＣＨＲＮＢ２、ＮＰＴＸＲのｍＲＮＡ発現量を定量した（図１）。ＲＮＡはＲＮｅａｓｙ  ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）によって抽出、精製し、定量的ＰＣＲは、ＡＢＩ  ＳＴＥＰＯｎｅＰｌｕｓ  Ｒｅａｌ-Ｔｉｍｅ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いて、９５℃１０分加熱後、９５℃１０秒、６０℃３０秒で４０サイクルのＰＣＲ条件で増幅を行い解析した。なお、各ＲＮＡの値を正規化するためにコントロールとしてｇｌｙｃｅｒａｌｄｅｈｙｄｅ−３−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ(ＧＡＰＤＨ)を用いた。用いたＰＣＲプライマーの配列は下記のとおりである。
【００３５】
[ＣＨＲＮＢ２]
Ｆｏｒｗａｒｄ：ＡＧＣＧＡＧＧＡＣＧＡＴＧＡＣＣＡＧ（配列番号１）
Ｒｅｖｅｒｓｅ：ＧＧＴＧＣＣＡＡＡＧＡＣＡＣＡＧＡＣＡＡ（配列番号２）
[ＮＰＴＸＲ]
Ｆｏｒｗａｒｄ：ＴＣＡＴＴＣＴＧＧＡＧＣＴＧＧＡＧＧＡＣ（配列番号３）
Ｒｅｖｅｒｓｅ：ＧＧＣＡＧＣＴＧＡＧＡＧＧＴＴＣＡＣＡ（配列番号４）
[コントロールＧＡＰＤＨ]
Ｆｏｒｗａｒｄ：ＧＡＡＧＧＴＧＡＡＧＧＴＣＧＧＡＧＴＣ（配列番号５）
Ｒｅｖｅｒｓｅ：ＧＡＡＧＡＴＧＧＴＧＡＴＧＧＧＡＴＴＴＣ（配列番号６）
Ｐｒｏｂｅ：ＣＡＡＧＣＴＴＣＣＣＧＴＴＣＴＣＡＧＣＣ（配列番号７）
【００３６】
非腫瘍性腺管上皮細胞株であるＦＨＳ７４では、ＣＨＲＮＢ２、ＮＰＴＸＲいずれの分子も発現量は非常に低値であった。これと比較して、ＣＨＲＮＢ２は１４種の胃癌細胞株中１１種（７９％）、ＮＰＴＸＲは９種（６４％）で発現増加を認めた。すなわち、ＣＨＲＮＢ２、ＮＰＴＸＲは、再発・転移群の患者の胃癌組織、及び胃癌細胞株で発現増加が認められることが分かった。
【００３７】
２．細胞株を用いたＣＨＲＮＢ２、ＮＰＴＸＲの機能解析
＜ノックアウト細胞株を用いた解析結果＞
（１）ＣＨＲＮＢ２ノックアウト細胞株を用いた機能解析
悪性度の高い胃癌細胞株として知られているＭＫＮ１を用い、ＣＲＩＳＰＲ−ＣＡＳ９法（Ｇｅｎｅ  Ａｒｔ  Ｐｌａｔｉｎｕｍ  Ｃａｓ９  ｎｕｃｌｅａｓｅ；Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）によるゲノム編集によってＣＨＲＮＢ２のノックアウト（ＫＯ）細胞を作製した。ノックアウト細胞はシングルセルクローニングを経て選択し、ダイレクトシーケンスもしくはＷｅｓｔｅｒｎ  ｂｌｏｔｔｉｎｇ法によりノックアウトされていることを確認した。増殖能、アポトーシス比率、遊走能、浸潤能、接着能について、コントロール（未処理のＭＫＮ１）細胞と比較した（図２）。
【００３８】
細胞の増殖能は以下の方法で解析した。各々１×１０４個になるよう、９６ウェルプレートに播種し、２％ウシ胎児血清を添加したＤＭＥＭ培地で５日目まで経時的に細胞増殖を測定した。測定は、１０μＬのＣｅｌｌ  Ｃｏｕｎｔｉｎｇ  Ｋｉｔ−８（Ｄｏｊｉｎｄｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）を添加して吸光度を測定し、測定開始時の値を１として表示した（図２Ａ）。ＣＨＲＮＢ２をノックアウトしたＭＫＮ１細胞（ＫＯ−ＣＨＲＮＢ２細胞）では、細胞増殖率が低下し、播種１日後から細胞数に有意な差が認められた（図中＊で示す。以下、有意差が認められたものは同様に表示する。）。また、ＫＯ−ＣＨＲＮＢ２細胞は、播種５日後でもほとんど増殖が見られなかった。なお、有意差はＭａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ検定により解析している。
【００３９】
アポトーシス細胞比率は以下のようにして解析した。Ａｎｎｅｘｉｎ  Ｖ  Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５６８  ｃｏｎｊｕｇａｔｅ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を用いて、Ａｎｎｅｘｉｎ  Ｖ染色を行った。１×１０６個の細胞に対して１０μＬのＡｎｎｅｘｉｎ  Ｖ試薬を添加し、１５分間室温で静置したのちにスライド上に載せ、蛍光顕微鏡（ＦＳＸ１００、Ｏｌｙｍｐｕｓ社製）を用いて細胞数とＡｎｎｅｘｉｎ  Ｖ陽性細胞数を計測した。
【００４０】
ＫＯ−ＣＨＲＮＢ２細胞では、アポトーシス比率が有意に増加していた（図２Ｂ）。図２Ａに示すように、ＣＨＲＮＢ２をノックアウトすることによって、細胞増殖能が親株である胃癌細胞ＭＫＮ１細胞に比べて著しく低下していた。この結果から、ＫＯ−ＣＨＲＮＢ２細胞の増殖が抑制される機序の一つにアポトーシス誘導があることが明らかとなった。すなわち、ＣＨＲＮＢが過剰発現していることによって、アポトーシスが誘導されにくく、そのために悪性度が高くなっているものと考えられる。
【００４１】
細胞の遊走能は、創傷治癒アッセイ（Ｗｏｕｎｄ−ｈｅａｌｉｎｇ  ａｓｓａｙ）により評価を行った。各細胞は各々２×１０４個になるように、１２ウェルプレートにｉｂｉｄｉ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  ｉｎｓｅｒｔ  ｍｅｔｈｏｄ（ｉｂｉｄ社製）を予め定めた幅でｗｏｕｎｄ  ｇａｐを形成して播種し、無血清培地で培養した。播種２４時間後にインサートを除去し、６時間ごとに２００μｍ間隔でｗｏｕｎｄ幅を測定した。測定は、４０倍の倍率の顕微鏡を用い、各ウェル１０か所を測定して平均及び標準偏差を求めた（図２Ｃ）。ＣＨＲＮＢ２をノックアウトすることで、遊走能も有意に低下することが明らかとなった。
【００４２】
細胞の浸潤能は、コントロール細胞、ＫＯ−ＣＨＲＮＢ２細胞をマトリゲル浸潤アッセイ（Ｍａｔｒｉｇｅｌ  ｉｎｖａｓｉｏｎ  ａｓｓａｙ）により評価した。ＢｉｏＣｏａｔ  Ｍａｔｒｉｇｅｌ  ｉｎｖａｓｉｏｎ  Ｃｈａｍｂｅｒｓ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）を用い、プロトコルにしたがってアッセイを行った。具体的には、各細胞を１ウェルあたり各々２．５×１０４個になるように播種し、無血清ＤＭＥＭ培地で２４時間培養後、膜底面の細胞を固定し、ディフクイック（シスメックス社製）で染色して顕微鏡下で観察し細胞数を数えた。顕微鏡観察は２００倍の倍率で行い、ランダムに選択した５つの視野の平均と標準偏差を求めた。ＣＨＲＮＢ２をノックアウトすることで浸潤能も有意に低下していた（図２Ｄ）。
【００４３】
細胞接着能はＣｙｔｏＳｅｌｅｃｔ  ４８−Ｗｅｌｌ  Ｃｅｌｌ  Ａｄｈｅｓｉｏｎ  Ａｓｓａｙ（Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌａｂｓ社製）を用いて、以下のようにして解析した。接着因子のコーティングしてあるプレート上に、各細胞を１ウェルあたり７．５×１０４個になるように播種し、無血清ＤＭＥＭ培地で１時間培養後に各吸光度を測定した。５種類の細胞接着因子に対する接着能を解析したところ、ＫＯ−ＣＨＲＮＢ２細胞では接着能も低下していることが明らかとなった（図２Ｅ）。
【００４４】
これらの結果から、ＣＨＲＮＢ２の発現を失うことでＭＫＮ１細胞は、増殖能、アポトーシス比率、遊走能、浸潤能、接着能といった癌進展にかかわる性質が著しく変化していることが明らかとなった。したがって、ＣＨＲＮＢ２の作用を阻害することにより、胃癌細胞の癌進展を抑制できる可能性がある。
【００４５】
（２）ＮＰＴＸＲノックアウト細胞株を用いた機能解析
次に、ＮＰＴＸＲについても、同様にして、胃癌細胞株ＭＫＮ１でＣＲＩＳＰＲ−ＣＡＳ９法を用いたノックアウト細胞を作製し、増殖能、アポトーシス比率、遊走能、浸潤能、接着能について解析を行った（図３）。
【００４６】
図３に示すように、ＮＰＴＸＲをノックアウトした細胞（ＮＰＴＸＲ-ＫＯ-１、ＮＰＴＸＲ-ＫＯ-２細胞）では、増殖能、遊走能、浸潤能、接着能は、いずれも有意に親株であるＭＫＮ１細胞に対して低下し、アポトーシス比率が有意に増加していた。独立して樹立された２つのノックアウト細胞株を作製して検討を行った結果、いずれの株も増殖能、遊走能、浸潤能、接着能は、有意に親株であるＭＫＮ１細胞に対して低下し、アポトーシス比率が有意に増加するという結果が得られた。したがって、ＣＨＲＮＢ２同様、ＮＰＴＸＲを失うことによって、胃癌細胞ＭＫＮ１の癌進展に関わる性質が著しく損なわれることが明らかとなった。
【００４７】
上記結果から、ＮＰＴＸＲ発現が、アポトーシスに影響を及ぼし、細胞増殖を亢進していることが示唆された。そこで、ＮＰＴＸＲノックアウト細胞株を用いて、アポトーシスに関連する性質について解析を行った。ミトコンドリアはアポトーシスに深く関わっていることが知られている。ミトコンドリアの膜電位の消失がチトクロームｃの放出を促し、カスパーゼカスケードが活性化され、アポトーシスが誘導されることが知られている。そこで、ＮＰＴＸＲ発現がミトコンドリアを介したアポトーシスに関与するか解析を行った（図４）。
【００４８】
まず、ミトコンドリアの膜電位を可視化し、ミトコンドリアの脱分極が生じている生細胞、すなわちアポトーシスが誘導されている細胞を可視化した（図４（Ａ））。ＮＰＴＸＲノックアウト細胞であるＮＰＴＸＲ−ＫＯ−１とＮＰＴＸＲ−ＫＯ−２、及びコントロールとして親株であるＭＮＫ１細胞を各１×１０５個ずつ、Ｍｕｓｅ  ＭｉｔｏＰｏｔｅｎｔｉａｌ  ｋｉｔ（Ｍｅｒｃｋ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）で染色し、セルソーターで解析を行った。
【００４９】
ＮＰＴＸＲをノックアウトした２つの細胞株は、いずれも脱分極が生じた生細胞の割合が、親株であるＭＮＫ１細胞に比べて６．５〜１０倍程度増加していた。ミトコンドリアの脱分極は、アポトーシスがミトコンドリアを介したものであることを示している。これらの結果は、ＮＰＴＸＲ発現が、ミトコンドリアを介したアポトーシスを抑制することを示している。
【００５０】
次に、ＮＰＴＸＲノックアウト細胞において、アポトーシスを進行させるプロテアーゼであるカスパーゼ活性を解析した。各細胞株各１×１０５個ずつＭｕｓｅ  Ｍｕｌｔｉ−Ｃａｓｐａｓｅ  ｋｉｔ（Ｍｅｒｃｋ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）で染色し、セルソーターにより解析した。いずれのノックアウト細胞株でもカスパーゼ陽性細胞（Ｃａｓｐａｓｅ＋／Ｄｅａｄ、及びＣａｓｐａｓｅ＋／Ｌｉｖｅ分画）が増加していることが観察された。すなわちＮＰＴＸＲ発現はカスパーゼの活性を阻害しアポトーシスを抑制していると考えられる。
【００５１】
次に、カスパーゼファミリーのどのカスパーゼが活性化しているかを、Ｃａｓｐａｓｅ  Ｃｏｌｏｒｉｍｅｔｒｉｃ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ（ＢｉｏＶｉｓｉｏｎ社製）を用いて解析を行った（図４（Ｃ））。カスパーゼはアポトーシス誘導の初期に関わるイニシエーター・カスパーゼと、アポトーシスの実行に関わるエフェクター・カスパーゼが存在する。カスパーゼ３はエフェクター・カスパーゼ、カスパーゼ８、９はイニシエーター・カスパーゼである。カスパーゼ１２はマウスのみで発見されているカスパーゼで小胞体ストレスによるアポトーシスを誘導するイニシエーターとして作用するのではないかと考えられている。
【００５２】
ＮＰＴＸＲ発現をノックアウトすることによって、エフェクター・カスパーゼであるカスパーゼ３と、イニシエーター・カスパーゼであるカスパーゼ９が活性化することが認められた。これらの結果から、ＮＰＴＸＲ発現により、ミトコンドリア経路のアポトーシスの誘導が抑制され、その結果、カスパーゼの活性化も抑制されることが示された。
【００５３】
次に、細胞増殖に関する特徴について解析を行った。まず、ＮＰＴＸＲ発現の細胞周期に対する影響の解析を行った。Ｍｕｓｅ  Ｃｅｌｌ  Ｃｙｃｌｅ  ｋｉｔ（Ｍｅｒｃｋ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）を用いセルソーター（図５（Ａ））で解析、あるいはＣｅｌｌ  Ｃｙｃｌｅ  Ａｓｓａｙ  Ｃｅｌｌ−Ｃｌｏｃｋ  Ｋｉｔ  （Ｂｉｏｃｏｌｏｒ社製）を用いて顕微鏡下（図５（Ｂ））で各周期の細胞数を８視野で数え、解析を行った。いずれの解析においても、ＮＰＴＸＲノックアウト細胞株では、Ｇ２／Ｍ期での細胞周期休止が起こっており、ＮＰＴＸＲ発現が細胞周期にも関与していることが示された。
【００５４】
癌細胞は、上記で示したような高い増殖力、アポトーシスに対する抵抗性、浸潤・転移能を備えているという特徴がある。しかし、すべての癌細胞が、同じような性質を備えているわけではなく、癌細胞の一部が幹細胞の性質を備え、癌が発生するという癌幹細胞仮説が提唱されている。幹細胞で発現されているアルデヒド脱水素酵素（Ａｌｄｅｈｙｄｅ  Ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ、ＡＬＤＨ）活性を指標として、幹細胞の比率を解析した。ＡＬＤＥＦＬＯＵＲ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｒｅａｇｅｎｔ  ｓｙｓｔｅｍ（Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）によって、ＡＬＤＨ陽性細胞の比率を測定した（図６）。親株であるＭＫＮ１細胞、ＮＰＴＸＲノックアウト細胞を夫々１×１０５細胞ずつ染色し解析を行った。
【００５５】
処理前の細胞（Ｃｏｎｔｒｏｌ）と試薬投与後（ｔｅｓｔ）の値を比較すると、ＮＰＴＸＲノックアウト細胞では、親株であるＭＫＮ１細胞に比べるとＡＬＤＨ陽性細胞が減少していることが示された。すなわち、ＮＰＴＸＲ発現は幹細胞性に対しても影響を及ぼしていることが示された。
【００５６】
次に癌細胞の増殖性について解析を行った（図７）。ＰＩ３キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）は、細胞内シグナル伝達系であり、Ａｋｔを介する生存、増殖、タンパク合成、Ｒａｃを介する細胞運動など多彩な機能の調節を行い、癌とも深い関係があり、種々の癌で高発現することが知られている。
【００５７】
ＮＰＴＸＲノックアウト細胞におけるＰＩ３Ｋの活性をＭｕｓｅ  ＰＩ３Ｋ  Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  Ｄｕａｌ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）を用いて測定した（図７（Ａ））。親株であるＭＫＮ１細胞ではほとんどの細胞でＰＩ３Ｋが活性化しているのに対し、ＮＰＴＸＲノックアウト細胞では、ＰＩ３Ｋ陽性細胞の比率の減少が認められた。ＮＰＴＸＲ発現が消失することによって、ＰＩ３Ｋ活性が抑制されることが示された。
【００５８】
さらに、胃癌において一般的に用いられる抗癌剤である５−ＦＵへの感受性に対して、ＮＰＴＸＲ発現が影響を及ぼすか解析した（図７（Ｂ））。コントロールである親株のＭＫＮ１、ＮＰＴＸＲ−ＫＯ−１、及びＮＰＴＸＲ−ＫＯ−２細胞を、５×１０３細胞ずつウェルに播種し、０、０．０１、０．１、１、１０、１００ｍｇ／Ｌの５−ＦＵに暴露し、７２時間後の細胞数をＣｅｌｌ  Ｃｏｕｎｔｉｎｇ  Ｋｉｔ−８により測定した。
【００５９】
ＮＰＴＸＲノックアウト細胞では、いずれも５−ＦＵへの感受性が増強していた。特に、０．１、及び１ｍｇ／Ｌという低濃度領域で、親株であるＭＫＮ１と比較して有意に感受性に差が認められた。
【００６０】
この結果は、ＮＰＴＸＲ発現を抑制することによって５−ＦＵに対して感受性が高まることを意味しており、ＮＰＴＸＲ発現抑制剤と５−ＦＵを併用することによって、より効果が得られる可能性を示唆している。
【００６１】
（３）マウス皮下腫瘍モデルを用いた解析
ＣＨＲＮＢ２、あるいはＮＰＴＸＲをノックアウトしたＭＫＮ１細胞、未処理のＭＫＮ１細胞を９週齢のヌードマウス（ＢＡＬＢｃｎｕ／ｎｕ、日本ＳＬＣ社より入手）の両肩皮下に１×１０６個移植し、腫瘍体積を経時的に測定した。なお、各群３匹のマウスを用い、腫瘍体積は短径×短径×長径／２によって計測し、算出した。
【００６２】
マウス皮下腫瘍モデルを作成し造腫瘍能を比較すると、コントロール（未処理のＭＫＮ１）では経時的に腫瘍が増大したが、ＣＨＲＮＢ２をノックアウトした細胞では、移植後４週目から有意（図８中＊で示す。）に腫瘍体積に差が見られ、ＣＨＲＮＢ２をノックアウトすることにより造腫瘍能が低下していることが明らかとなった（図８（Ａ））。また、ＮＰＴＸＲをノックアウトした細胞を移植したマウスでは、移植後３週目から有意に腫瘍体積に差が見られ、造腫瘍能が低下していることが明らかとなった（図８（Ｂ））。
【００６３】
マウス皮下腫瘍モデルで、ＣＨＲＮＢ２、あるいはＮＰＴＸＲをノックアウトした細胞では、有意に腫瘍の増殖が低下していたことは、これらの分子を標的とした医薬が腫瘍に対して抑制効果を有することを示唆している。そこで、これら分子の中和抗体、核酸医薬を作製し、効果の検討を行った。
【００６４】
３．ＣＨＲＮＢ２、ＮＰＴＸＲの分子標的薬の作製
（１）抗体医薬の作製
［実施例１］
＜ＣＨＲＮＢ２中和抗体（ポリクローナル抗体）の作製＞
ＣＨＲＮＢ２の特異的抗体を作用させその活性を抑制することにより、胃癌細胞の活性を阻害できるか検証を行った。エピトープ検索ツール（コスモバイオ社製）を用いて親水性、２次構造、抗原性の推定と最適抗原部位検索を行った。標的配列として以下の２つの配列を選択して、常法に従いウサギを免疫し、ＣＨＲＮＢ２（アクセッション番号：ＮＰ＿０００７３９）に対するポリクローナル抗体を２種作製した。なお、ＣＨＲＮＢ２抗体−１は９４−１１１位（標的配列１、配列番号８）、ＣＨＲＮＢ２抗体−２は４９０−５０２位（標的配列２、配列番号９）のアミノ酸配列を免疫して得られた抗体である。
【００６５】
標的配列；
ＣＨＲＮＢ２抗体−１：ＷＫＰＥＥＦＤＮＭＫＫＶＲＬＰＳＫＨ（配列番号８）
ＣＨＲＮＢ２抗体−２：ＴＦＬＨＳＤＨＳＡＰＳＳＫ（配列番号９）
【００６６】
最初に、これら標的配列に対する抗体が、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで胃癌細胞株ＭＫＮ１の増殖を阻害するか検討した。ＭＫＮ１細胞を１×１０４個になるよう、９６ウェルプレートに播種し、各抗体を０．７μｇ／ｍＬ濃度になるように添加し、経時的に細胞増殖をＷＳＴ−１アッセイにより測定した（図９上）。なお、コントロールとしてプレブリード血清を用いた。胃癌細胞株ＭＫＮ１に対して２種類のＣＨＲＮＢ２抗体を添加すると、標的配列１、２いずれに対する抗体を用いた場合でも、ＭＫＮ１細胞は１２時間後には有意（＊）に細胞増殖抑制を示すことが認められた。
【００６７】
［実施例２］
＜ＮＰＴＸＲ中和抗体（ポリクローナル抗体）の作製＞
ＮＰＴＸＲの特異的抗体を作用させその活性を抑制し、胃癌細胞の活性を阻害できるかを検証するため、同様にしてエピトープ検索ツールを用いて親水性、２次構造、抗原性の推定と最適抗原部位検索を行った。標的配列として以下の２つの配列を選択して、常法に従いウサギを免疫し、ＮＰＴＸＲ（アクセッション番号：ＮＰ＿０５５１０８）に対するポリクローナル抗体を２種作製した。なお、ＮＰＴＸＲ抗体−１は１６１−１７８位（標的配列１、配列番号１０）、ＮＰＴＸＲ抗体−２（標的配列２、配列番号１１）は２５１−２６８位のアミノ酸配列に対する抗体である。
【００６８】
標的配列；
ＮＰＴＸＲ抗体−１：ＣＥＳＧＬＰＲＧＬＱＧＡＧＰＲＲＤＴ（配列番号１０）
ＮＰＴＸＲ抗体−２：ＫＥＲＶＡＬＳＨＳＳＲＲＱＲＱＥＶＥ（配列番号１１）
【００６９】
これら標的配列に対する抗体のｉｎ  ｖｉｔｒｏでの細胞増殖阻害活性の解析を同様にして行った（図９下）。胃癌細胞株ＭＫＮ１に対して２種類のＮＰＴＸＲ抗体を添加すると、標的配列１、２いずれの抗体を用いた場合でも、ＭＫＮ１細胞は２４時間後から有意（＊）な細胞増殖抑制を示すことが認められた。
【００７０】
［実施例３］
＜ＣＨＲＮＢ２中和抗体のマウス腹膜播種モデルを用いた効果の検討＞
次に、上記２種類の標的を認識するＣＨＲＮＢ２抗体の効果をマウス腹膜播種モデルによって解析した。１×１０６個のＭＫＮ１細胞を８週齢のヌードマウス（ＢＡＬＢｃｎｕ／ｎｕ、日本ＳＬＣ社より入手）の腹腔内に移植し治療効果を調べた。なお、各群４匹のマウスを用い、図１０に示す投与スケジュールのように、ＣＨＲＮＢ２抗体（夫々ＣＨＲＮＢ２抗体−１は６．５μｇ／５００μＬ、ＣＨＲＮＢ２抗体−２は８．７μｇ／５００μＬ）を週２回、６週間腹腔内投与しコントロール群と胃癌腹膜播種形成量を比較した。なお、コントロールは抗体投与を行っていない群である。
【００７１】
コントロール群、ＣＨＲＮＢ２抗体-１、ＣＨＲＮＢ２抗体-２投与群の６週間後の開腹肉眼的所見を示す（図１０、写真）。肉眼所見において、腹膜播種が観察された箇所を矢印で示している。ＣＨＲＮＢ２抗体投与群では、どちらの抗体を用いた場合でも腹膜播種結節はわずかに認めるのみであり、その治療効果が示された。
【００７２】
開腹したマウスから播種結節を回収し、各マウスにおける播種結節の総重量を測定した（図１０下）。抗体投与群は、コントロールに対して総腫瘍重量が有意（＊）に減少していた。
【００７３】
［実施例４］
＜ＮＰＴＸＲ中和抗体のマウス腹膜播種モデルを用いた効果の検討＞
実施例３と同様にして、ＮＰＴＸＲの２箇所の標的を認識するＮＰＴＸＲ抗体の効果をマウス腹膜播種モデルによって解析した（図１１）。
【００７４】
コントロール群、ＮＰＴＸＲ抗体-１、ＮＰＴＸＲ抗体-２投与群の６週間後の治療後の開腹肉眼的所見を示す（図１１上）。ＮＰＴＸＲ抗体投与群では、どちらの抗体を用いた場合でも腹膜播種結節はわずかに認めるのみであり、その治療効果が示された。
【００７５】
また、開腹したマウスから播種結節を回収し、各マウスにおける播種結節の総重量を測定した（図１１下）。抗体投与群は、コントロールに対して総腫瘍重量が有意（＊）に減少していた。
【００７６】
実施例１、２に示したｉｎ  ｖｉｔｒｏの系でも、実施例３、４に示したｉｎ  ｖｉｖｏの系でも、ＣＨＲＮＢ２、ＮＰＴＸＲを標的とし、その発現を中和することにより、癌細胞の増殖を有意に抑制することができる。したがって、ＣＨＲＮＢ２、ＮＰＴＸＲを認識する抗体を医薬として用いれば、再発・転移性の胃癌の治療を行うことができる。
【００７７】
また、上述のようにＣＨＲＮＢ２、ＮＰＴＸＲは胃癌だけではなく、多くの癌で発現が増加している。それらの癌についても同様にＣＨＲＮＢ２、ＮＰＴＸＲの中和抗体を用いて治療を行うことができる蓋然性が高い。
【００７８】
［実施例５］
＜抗ＣＨＲＮＢ２モノクローナル抗体の樹立＞
配列番号９で表されるペプチドを抗原として、ＣＨＲＮＢ２に対するモノクローナル抗体を常法により樹立した。得られたハイブリドーマから３つのクローンを選択し、モノクローナル抗体を得た。実施例１と同様にして、ＭＫＮ１細胞を１×１０４個になるよう、９６ウェルプレートに播種し、各抗体を０．７μｇ／ｍＬ濃度になるように添加し、経時的に細胞増殖をＷＳＴ−１アッセイにより測定した（図１２）。いずれのクローンから得られた抗体も細胞増殖に対して同様の阻害効果を示した。
【００７９】
このうち、クローン３（以下、ＣＨ−０１という）は、受託番号ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２８５７として、２０１９年１月７日に、独立行政法人製品評価技術基盤機構（ＮＩＴＥ）  特許微生物寄託センター（ＮＰＭＤ）（日本国千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８  １２２号室）に寄託されている。
【００８０】
＜ＣＨ−０１抗体のマウス腹膜播種モデルに対する効果＞
抗ＣＨＲＮＢ２モノクローナル抗体（クローン３、ＣＨ−０１）のマウス腹膜播種モデルに対する治療効果を調べた（図１３）。２×１０６個のＭＫＮ１細胞を８週齢のヌードマウス（ＢＡＬＢｃｎｕ／ｎｕ）の腹腔内に移植し治療効果を調べた。抗ＣＨＲＮＢ２モノクローナル抗体２５μｇ／５００μｌを週３回、４週間腹腔内投与し、無治療群と胃癌腹膜播種形成量を比較した（各群ｎ＝５）。
【００８１】
抗ＣＨＲＮＢ２モノクローナル抗体投与群では、肉眼的に明瞭な腹膜播種進行の抑制が観察された（図１３上）。さらに、胃癌腹膜播種結節を回収し、重量を比較したところ、抗ＣＨＲＮＢ２モノクローナル抗体投与群では、総腫瘍量が顕著に減少していた（図１３下）。
【００８２】
［実施例６］
＜抗ＮＰＴＸＲモノクローナル抗体の樹立＞
配列番号１０で表されるペプチドを抗原として、ＮＰＴＸＲに対するモノクローナル抗体を樹立した。実施例１と同様にして、ＭＫＮ１細胞を１×１０４個になるよう、９６ウェルプレートに播種し、各抗体を０．７μｇ／ｍＬ濃度になるように添加し、経時的に細胞増殖をＷＳＴ−１アッセイにより測定した（図１４（Ａ））。いずれのクローンも細胞増殖に対して同様の阻害効果を示した。
【００８３】
さらに、種々の臓器由来の癌細胞株に対して、抗ＮＰＴＸＲモノクローナル抗体クローン１の効果を解析した。各癌細胞株に対して、上記と同様にして抗体を添加し、５日目の抗体投与群のコントロールに対する増殖比率を算出した（図１４（Ｂ））。いずれの細胞株においても、抗体添加によって、細胞の増殖が抑制されることが示された。特に、胃癌から樹立された細胞株であるＭＫＮ１、ＮＵＧＣ４に対しては抗体の強い細胞増殖抑制効果が見られた。
【００８４】
＜抗ＮＰＴＸＲモノクローナル抗体のマウス腹膜播種モデルに対する効果＞
抗ＮＰＴＸＲモノクローナル抗体のマウス腹膜播種モデルに対する治療効果を調べた（図１５）。２×１０６個のＭＫＮ１細胞を８週齢のヌードマウス（ＢＡＬＢｃｎｕ／ｎｕ）の腹腔内に移植し、クローン１〜３から得られた抗体の治療効果を調べた。抗ＮＰＴＸＲモノクローナル抗体２５μｇ／５００μｌを週３回、２週間腹腔内投与し、無治療群と胃癌腹膜播種形成量を比較した（各群ｎ＝３）。
【００８５】
抗ＮＰＴＸＲモノクローナル抗体投与群では、肉眼的に明瞭な腹膜播種進行の抑制が観察された（図１５上）。特に、クローン１から得られた抗体を投与した群では、腹膜播種病巣を肉眼的に検出することができなかった。さらに、胃癌腹膜播種結節を回収し、重量を比較した（図１５下）。いずれの抗体投与群においても、総腫瘍量は顕著に減少していた。
【００８６】
なお、クローン１（以下、ＮＰ−０１という）は、受託番号ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２８５６として、２０１９年１月７日に、独立行政法人製品評価技術基盤機構（ＮＩＴＥ）  特許微生物寄託センター（ＮＰＭＤ）（日本国千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８  １２２号室）に寄託されている。
【００８７】
＜ＮＰ−０１抗体のエピトープマッピング＞
ＮＰ−０１抗体のエピトープ解析を行った。ＮＰＴＸＲタンパク質の１５１位から１９０位の領域において、表２に示すように、１５アミノ酸からなるペプチドを１つずつＮ末からＣ末にずらしながら合成した。各ペプチドに対する結合を競合酵素結合免疫吸着検査法によって測定し、エピトープを決定した（表３）。その結果、１６４位から１７８位のアミノ酸配列、ＧＬＰＲＧＬＱＧＡＧＰＲＲＤＴ（配列番号１２）をエピトープとして強く認識していることが明らかとなった。同一のエピトープを認識する抗体は同じような性質を備えていると考えられることから、配列番号１２で表されるペプチドを認識する抗体は、ＮＰＴＸＲに対して結合し、癌細胞の増殖を抑制する効果があるものと考えられる。
【００８８】
【表２】
2019146759.tif 000004
【表３】
2019146759.tif 000005
（２）核酸医薬の作製
［実施例７］
＜ＣＨＲＮＢ２に対する核酸医薬の検討＞
核酸医薬によってＣＨＲＮＢ２発現を阻害することにより、胃癌細胞の増殖を抑制できるか解析を行った。ＣＨＲＮＢ２に対する特異的ｓｉＲＮＡを用いて増殖能への影響をｉｎ  ｖｉｔｒｏで解析した。ＣＨＲＮＢ２のｓｉＲＮＡ（ｓｉＣＨＲＮＢ２）、コントロールｓｉＲＮＡ（ｓｉＣｏｎｔｒｏｌ）はいずれも北海道システムサイエンス社より得た。また、コントロールは無処理の細胞の増殖を示す。
【００８９】
ＬｉｐｏＴｒｕｓｔ（登録商標）ＥＸ  Ｏｌｉｇｏ（北海道システムサイエンス社製）を用いてＭＫＮ１細胞にｓｉＲＮＡを導入し、７２時間無血清ＤＭＥＭ培地で培養後、増殖能の評価を行った（図１６（Ａ））。
【００９０】
左のグラフはＣＨＲＮＢ２  ｍＲＮＡの発現量を定量的ＰＣＲで解析した結果を、右は細胞増殖をＣｅｌｌ  Ｃｏｕｎｔｉｎｇ  Ｋｉｔ−８により解析した結果を示す。ＣＨＲＮＢ２に対する特異的ｓｉＲＮＡにより、胃癌細胞の増殖能は有意（＊）に低下した。
【００９１】
［実施例８］
＜ＮＰＴＸＲに対する核酸医薬の検討＞
次に、ＮＰＴＸＲに対する特異的ｓｉＲＮＡを用い、実施例７と同様にして、増殖能への影響をｉｎ  ｖｉｔｒｏで解析を行った。ＭＫＮ１細胞にＮＰＴＸＲのｓｉＲＮＡを導入し、７２時間無血清ＤＭＥＭ培地で培養後、増殖能の評価を行った（図１６（Ｂ））。
【００９２】
左のグラフはＮＰＴＸＲ  ｍＲＮＡの発現量を定量的ＰＣＲで解析した結果を、右は細胞増殖をＣｅｌｌ  Ｃｏｕｎｔｉｎｇ  Ｋｉｔ−８により解析した結果を示す。ＮＰＴＸＲに対する特異的ｓｉＲＮＡにより、胃癌細胞の増殖能は有意（＊）に低下した。
【００９３】
上記結果から、ＣＨＲＮＢ２、ＮＰＴＸＲいずれの場合もｍＲＮＡ発現を阻害することによって、細胞増殖を抑制できることが明らかとなった。抗体医薬同様、核酸医薬によって、これら分子の発現抑制を行うことにより、癌の進展を抑制することが可能である。
【００９４】
４．ヒト臨床データを用いたＣＨＲＮＢ２、ＮＰＴＸＲ発現解析
ＣＨＲＮＢ２、ＮＰＴＸＲを分子標的とする医薬を臨床で用いる場合には、ＣＨＲＮＢ２、ＮＰＴＸＲの発現を予め確認して、腫瘍組織で発現が増強している患者にのみ治療を行えば無駄な治療を行うことがない。そこで、胃癌組織中のＣＨＲＮＢ２、ＮＰＴＸＲのｍＲＮＡ発現量を切除検体によって解析した。また、予後とｍＲＮＡ発現量の相関性をＲＯＣ曲線解析で評価し、ｍＲＮＡ発現量が予後予測に使用できるか検討した。
【００９５】
［実施例９］
＜胃癌組織中のＣＨＲＮＢ２発現量の定量的解析＞
網羅的解析データの再現性を確認するため、３００例の胃癌症例から得られた胃癌組織中のＣＨＲＮＢ２のｍＲＮＡ発現量を定量的ＰＣＲ法で調べた。正常胃粘膜、ステージＩ、ＩＩの胃癌１２１症例、ステージＩＩＩ、ＩＶの胃癌１７９症例から得られた組織中のＣＨＲＮＢ２発現を定量的ＰＣＲによって測定した（図１７（Ａ））。
【００９６】
ＣＨＲＮＢ２の発現は、胃癌組織中では正常胃粘膜に比べ発現が高く、さらに、ステージＩ、ＩＩに対して、ステージＩＩＩ、ＩＶ胃癌で有意に発現が増加していた。これらのデータから、ＣＨＲＮＢ２の発現はステージが進行するにしたがって増強しているものと認められる。
【００９７】
ＲＯＣ曲線解析により、再発・死亡に対する胃癌原発巣組織中のＣＨＲＮＢ２  ｍＲＮＡ発現量のカットオフ値を求めた。カットオフ値を０．００１３に設定することにより、感度５４％、特異度７５％、ＡＵＣ＝０．６６７という結果を得た（図１７（Ｂ））。この結果を用いて、３００例の胃癌症例をＣＨＲＮＢ２高発現群と低発現群に分けて解析すると、ＣＨＲＮＢ２高発現群は有意に予後不良であった（図１７（Ｃ）左）。この結果は、Ｗｅｂ公開（ｈｔｔｐ：／／ｋｍｐｌｏｔ．ｃｏｍ／ａｎａｌｙｓｉｓ／）されている欧米４カ国の統合データで再現された（図１７（Ｃ）右）。したがって、ＣＨＲＮＢ２発現を予後予測に用いることができる。
【００９８】
さらに、免疫組織化学染色法によって胃組織中のＣＨＲＮＢ２タンパク質の検出を行った（図１７（Ｄ））。ＣＨＲＮＢ２に対するポリクローナル抗体を用いて、常法によって組織の免疫染色を行った。腫瘍部組織中に明瞭に発現を認める症例と、発現のない症例を判定することが可能である。したがって、免疫組織化学染色によってＣＨＲＮＢ２タンパク質の発現を確認することができる。
【００９９】
［実施例１０］
＜胃癌組織中のＮＰＴＸＲ発現量の定量的解析＞
実施例９と同様にして、３００例の胃癌症例から得られた胃癌組織中のＮＰＴＸＲのｍＲＮＡ発現量を定量的ＰＣＲ法で調べた（図１８（Ａ））。ＮＰＴＸＲの発現は、ステージに関わらず、胃癌組織中では正常胃粘膜に比べ発現が有意に増加していた。
【０１００】
さらに、ＮＰＴＸＲについては、上記３００症例について詳細にステージ毎に分け、上記と同様にして定量的ＰＣＲ法で調べた（図１９）。ＮＰＴＸＲの発現は、ステージが進行するにしたがって、増加する傾向が認められ、正常組織とステージＩ、ステージＩＩとＩＩＩで有意に発現に差があることが認められた。
【０１０１】
さらに、ＲＯＣ曲線解析により、再発・死亡に対する胃癌原発巣組織中のＮＰＴＸＲ  ｍＲＮＡ発現量のカットオフ値を求めた。カットオフ値を０．００８６に設定することにより、感度５８％、特異度６６％、ＡＵＣ＝０．６３８という結果を得た（図１８（Ｂ））。この結果を用いて、３００例の胃癌症例をＮＰＴＸＲ高発現群と低発現群に分けて解析すると、ＮＰＴＸＲ高発現群は有意に予後不良であった（図１８（Ｃ）左）。この結果は、Ｗｅｂ公開（ｈｔｔｐ：／／ｋｍｐｌｏｔ．ｃｏｍ／ａｎａｌｙｓｉｓ／）されている欧米４カ国の統合データで再現された（図１８（Ｃ）右）。したがって、ＮＰＴＸＲ発現も予後予測に用いることができる。
【０１０２】
さらに、免疫組織化学染色法によって胃組織中のＮＰＴＸＲタンパク質の検出を行った（図１８（Ｄ））。ＮＰＴＸＲに対するポリクローナル抗体を用いて、常法によって組織の免疫染色を行った。腫瘍部組織中に明瞭に発現を認める症例と、発現のない症例を判定することが可能である。したがって、免疫組織化学染色によってＮＰＴＸＲタンパク質の発現を確認することができる。
【０１０３】
ＣＨＲＮＢ２抗体、ＮＰＴＸＲ抗体は、ＣＨＲＮＢ２、ＮＰＴＸＲを標的とした分子標的治療の適応患者の選別を可能とするコンパニオン診断に応用可能であることが示された。また、ＣＨＲＮＢ２、ＮＰＴＸＲは、長期無再発群と再発転移群を対比し、発現に差が認められたタンパク質であることから、ＣＨＲＮＢ２、ＮＰＴＸＲ発現を予後予測マーカーとしても用いることができる。免疫組織化学染色は少量の組織検体からも判定可能であるため、手術検体のみならず内視鏡検査時の生検検体も対象となる。また、免疫組織化学染色は、臨床で通常行われている検査であることから、検体中のこれらタンパク質の発現を抗体によって確認できることは、臨床上非常に意味がある。
【０１０４】
［実施例１１］
＜組織マイクロアレイによる発現分布＞
（１）各種器官・正常組織における発現分布
ＣＨＲＮＢ２、ＮＰＴＸＲに結合する抗体医薬、あるいは発現を阻害する医薬を用いた場合の安全性を検討するデータとして、ＣＨＲＮＢ２、ＮＰＴＸＲの各種器官・正常組織における発現分布の解析を行った（図２０）。
【０１０５】
組織マイクロアレイ（Ｐｒｏｖｉｔｒｏ社製）を用い、免疫組織化学染色法によって、ＣＨＲＮＢ２、ＮＰＴＸＲ発現を解析した。組織染色の結果、解析した組織を、発現なし、低発現、高発現に分類し、その比率をグラフに表している。なお、グラフ上に（ｎ）として解析した組織の数を表している。ヒト正常組織中には、ＣＨＲＮＢ２発現、ＮＰＴＸＲ発現ともに少なく、目的としない器官に対して有害事象が発現する可能性は低いことが示唆される。
【０１０６】
２．種々の器官の癌における発現分布
組織マイクロアレイ（Ｐｒｏｖｉｔｒｏ社製）を用い、種々の癌におけるＣＨＲＮＢ２、ＮＰＴＸＲの発現解析を行った。上記と同様にして、組織染色の結果、解析した組織を、発現なし、低発現、高発現に分類し、グラフに表している。大腸におけるＣＨＲＮＢ２、ＮＰＴＸＲ発現解析を行った。ＣＨＲＮＢ２は大腸癌の約７０％、ＮＰＴＸＲは約５０％で発現が認められた（図２１）。以下の癌種においても同様にして解析を行った。
【０１０７】
乳癌におけるＣＨＲＮＢ２、ＮＰＴＸＲ発現解析を行った（図２２）。ＣＨＲＮＢ２は乳癌の約４０％、ＮＰＴＸＲは約３０％で発現が認められた。肺癌におけるＣＨＲＮＢ２、ＮＰＴＸＲ発現解析を行った（図２３）。ＣＨＲＮＢ２、ＮＰＴＸＲともに、肺癌の約５０％で発現が認められた。膵癌におけるＣＨＲＮＢ２、ＮＰＴＸＲ発現解析を行った（図２４）。ＣＨＲＮＢ２は膵癌の約４０％、ＮＰＴＸＲは約５０％で発現が認められた。食道癌におけるＣＨＲＮＢ２、ＮＰＴＸＲ発現解析を行った（図２５）。ＣＨＲＮＢ２、ＮＰＴＸＲともに、食道癌の約５０％で発現が認められた。
【０１０８】
上記組織アレイの結果によれば、ＣＨＲＮＢ２、ＮＰＴＸＲの発現は、正常組織での発現は低く、また、胃癌だけではなく、乳癌、肺癌、膵癌、食道癌など種々の癌で発現が認められる。したがって、これらの癌においてもＣＨＲＮＢ２、ＮＰＴＸＲ発現を阻害する阻害薬、あるいはＣＨＲＮＢ２、ＮＰＴＸＲに結合する抗体医薬によって、治療を行えることが示唆された。
【産業上の利用可能性】
【０１０９】
標準的治療に位置づけられているＳ−１術後補助療法の施行された症例群から、ＣＨＲＮＢ２、ＮＰＴＸＲ高発現群が見出されているということは、これら２つの分子は既存治療では制御できなかった状況を克服するための鍵となる分子であると言える。ＣＨＲＮＢ２、ＮＰＴＸＲの発現を中和、抑制する医薬は、既存の増殖因子受容体中心の分子標的治療薬の標的と全く異なるため、完全に新しい治療薬となる。また、胃癌に限らず、ＣＨＲＮＢ２、ＮＰＴＸＲ高発現の腫瘍に対して効果を有する医薬となり得る。
【図１】
2019146759.tif 000006
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【配列表】
2019146759000001.app
【手続補正書】
【提出日】令和1年8月2日(2019.8.2)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｃｈｏｌｉｎｅｒｇｉｃ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  Ｎｉｃｏｔｉｎｉｃ  Ｂｅｔａ  ２  Ｓｕｂｕｎｉｔ（ＣＨＲＮＢ２）の発現を中和、又は抑制する物質を有効成分として含有する胃癌、大腸癌、乳癌、肺癌、膵癌、食道癌の分子標的治療薬。
【請求項２】
前記有効成分が、
抗体、又は核酸であることを特徴とする請求項１記載の分子標的治療薬。
【請求項３】
前記有効成分が、
ＣＨＲＮＢ２のＷＫＰＥＥＦＤＮＭＫＫＶＲＬＰＳＫＨ（配列番号８）、又はＴＦＬＨＳＤＨＳＡＰＳＳＫ（配列番号９）のいずれかを認識するものであることを特徴とする請求項１、又は２記載の分子標的治療薬。
【請求項４】
前記有効成分が抗体であることを特徴とする請求項３に記載の分子標的治療薬。
【請求項５】
前記抗体が受託番号ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２８５７で表されるハイブリドーマにより産生されるものである請求項４記載の分子標的治療薬。
【請求項６】
前記有効成分が、ＣＨＲＮＢ２に対するｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、アンチセンスオリゴ、アプタマー、又はデコイであることを特徴とする請求項１、又は２に記載の分子標的治療薬。
【請求項７】
（削除）
【請求項８】
受託番号ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２８５７で表されるハイブリドーマにより産生されるモノクローナル抗体。
【請求項９】
受託番号ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２８５７で表されるハイブリドーマ。
【請求項１０】
ＣＨＲＮＢ２を認識する抗体、又はＣＨＲＮＢ２のｍＲＮＡ発現を定量するプライマー、及び測定に必要な試薬を含む胃癌、大腸癌、乳癌、肺癌、膵癌、食道癌を検査するためのキット。
【請求項１１】
前記ＣＨＲＮＢ２を認識する抗体が、
ＣＨＲＮＢ２のＷＫＰＥＥＦＤＮＭＫＫＶＲＬＰＳＫＨ（配列番号８）、又はＴＦＬＨＳＤＨＳＡＰＳＳＫ（配列番号９）のいずれかを認識するものであることを特徴とする請求項１０記載の検査キット。
【請求項１２】
前記ＣＨＲＮＢ２を認識する抗体が、
受託番号ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２８５７で表されるハイブリドーマにより産生されるものである請求項１０記載の検査キット。
【請求項１３】
前記ＣＨＲＮＢ２のｍＲＮＡを定量するためのプライマーが配列番号１及び２で表されるプライマーであることを特徴とする請求項１０記載の検査キット。
【請求項１４】
被験物質と
ＣＨＲＮＢ２の細胞表面に表出している領域への結合性を指標とする分子標的薬のスクリーニング方法。
【請求項１５】
被験物質存在下で細胞を培養し、
ＣＨＲＮＢ２の発現を指標とすることにより分子標的薬をスクリーニングする方法。
【請求項１６】
Ｎｅｕｒｏｎａｌ  ｐｅｎｔｒａｘｉｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＮＰＴＸＲ）の発現を中和、又は抑制する物質を有効成分として含有する胃癌、大腸癌、乳癌、膵癌、食道癌の分子標的治療薬。
【請求項１７】
前記有効成分が、
抗体、又は核酸であることを特徴とする請求項１６記載の分子標的治療薬。
【請求項１８】
前記有効成分が、
ＮＰＴＸＲのＣＥＳＧＬＰＲＧＬＱＧＡＧＰＲＲＤＴ（配列番号１０）、
又はＫＥＲＶＡＬＳＨＳＳＲＲＱＲＱＥＶＥ（配列番号１１）のいずれかを認識するものであることを特徴とする請求項１６、又は１７記載の分子標的治療薬。
【請求項１９】
前記有効成分が抗体であることを特徴とする請求項１８に記載の分子標的治療薬。
【請求項２０】
前記抗体が受託番号ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２８５６で表されるハイブリドーマにより産生されるものである請求項１９記載の分子標的治療薬。
【請求項２１】
前記有効成分が、ＮＰＴＸＲに対するｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、アンチセンスオリゴ、アプタマー、又はデコイであることを特徴とする請求項１６、又は１７に記載の分子標的治療薬。
【請求項２２】
（削除）
【請求項２３】
ＮＰＴＸＲのＣＥＳＧＬＰＲＧＬＱＧＡＧＰＲＲＤＴ（配列番号１０）、
又はＫＥＲＶＡＬＳＨＳＳＲＲＱＲＱＥＶＥ（配列番号１１）を認識する抗体。
【請求項２４】
受託番号ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２８５６で表されるハイブリドーマにより産生されるモノクローナル抗体。
【請求項２５】
受託番号ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２８５６で表されるハイブリドーマ。
【請求項２６】
配列番号１２（ＧＬＰＲＧＬＱＧＡＧＰＲＲＤＴ）で表されるエピトープを認識する抗体。
【請求項２７】
ＮＰＴＸＲを認識する抗体、又はＮＰＴＸＲのｍＲＮＡ発現を定量するプライマー、及び測定に必要な試薬を含む胃癌、大腸癌、乳癌、膵癌、食道癌を検出するための検査キット。
【請求項２８】
前記ＮＰＴＸＲを認識する抗体が、
ＣＥＳＧＬＰＲＧＬＱＧＡＧＰＲＲＤＴ（配列番号１０）、
又はＫＥＲＶＡＬＳＨＳＳＲＲＱＲＱＥＶＥ（配列番号１１）のいずれかを認識するものであることを特徴とする請求項２７記載の検査キット。
【請求項２９】
前記ＮＰＴＸＲを認識する抗体が、
受託番号ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２８５６で表されるハイブリドーマにより産生されるものである請求項２７記載の検査キット。
【請求項３０】
前記ＮＰＴＸＲのｍＲＮＡ発現を定量するプライマーが配列番号３及び４であることを特徴とする請求項２７記載の検査キット。
【請求項３１】
（削除）
【請求項３２】
（削除）
【請求項３３】
前記分子標的治療薬の対象疾患が胃癌であることを特徴とする請求項１６〜２１いずれか１項記載の分子標的治療薬。
【請求項３４】
前記検査キットが、
胃癌の再発転移を予測するものである請求項２７〜３０いずれか１項記載の検査キット。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００３】
得る分子を見出し、標的治療薬を提供することを課題とする。また、標的となる分子が発現している癌細胞であれば、同様の作用機序により効果を奏すると考えられることから、胃癌だけではなく他の癌に対しても効果を有することが期待される。
課題を解決するための手段
［０００９］
本発明は、以下の分子標的薬、抗体、検査薬、及び分子標的薬のスクリーニング方法に関する。
（１）Ｃｈｏｌｉｎｅｒｇｉｃ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  Ｎｉｃｏｔｉｎｉｃ  Ｂｅｔａ  ２  Ｓｕｂｕｎｉｔ（ＣＨＲＮＢ２）の発現を中和、又は抑制する物質を有効成分として含有する分子標的治療薬。
（２）前記有効成分が、抗体、又は核酸であることを特徴とする（１）記載の分子標的治療薬。
（３）前記有効成分が、ＣＨＲＮＢ２のＷＫＰＥＥＦＤＮＭＫＫＶＲＬＰＳＫＨ（配列番号８）、又はＴＦＬＨＳＤＨＳＡＰＳＳＫ（配列番号９）のいずれかを認識するものであることを特徴とする（１）、又は（２）記載の分子標的治療薬。
（４）前記有効成分が抗体であることを特徴とする（３）に記載の分子標的治療薬。
（５）前記抗体が受託番号ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２８５７で表されるハイブリドーマにより産生されるものである（４）記載の分子標的治療薬。
（６）前記有効成分が、ＣＨＲＮＢ２に対するｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、アンチセンスオリゴ、アプタマー、又はデコイであることを特徴とする（１）、又は（２）に記載の分子標的治療薬。
（７）前記分子標的治療薬の対象疾患が、胃癌、大腸癌、乳癌、肺癌、膵癌、食道癌であることを特徴とする（１）〜（６）記載の分子標的治療薬。
（８）受託番号ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２８５７で表されるハイブリドーマにより産生されるモノクローナル抗体。
（９）受託番号ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２８５７で表されるハイブリドーマ。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００４】
（１０）ＣＨＲＮＢ２を認識する抗体、又はＣＨＲＮＢ２のｍＲＮＡ発現を定量するプライマー、及び測定に必要な試薬を含む検査キット。
（１１）前記ＣＨＲＮＢ２を認識する抗体が、ＣＨＲＮＢ２のＷＫＰＥＥＦＤＮＭＫＫＶＲＬＰＳＫＨ（配列番号８）、又はＴＦＬＨＳＤＨＳＡＰＳＳＫ（配列番号９）のいずれかを認識するものであることを特徴とする（１０）記載の検査キット。
（１２）前記ＣＨＲＮＢ２を認識する抗体が、受託番号ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２８５７で表されるハイブリドーマにより産生されるものである（１０）記載の検査キット。
（１３）前記ＣＨＲＮＢ２のｍＲＮＡを定量するためのプライマーが配列番号１及び２で表されるプライマーであることを特徴とする（１０）記載の検査キット。
（１４）被験物質とＣＨＲＮＢ２の細胞表面に表出している領域への結合性を指標とする分子標的薬のスクリーニング方法。
（１５）被験物質存在下で細胞を培養し、ＣＨＲＮＢ２の発現を指標とすることにより分子標的薬をスクリーニングする方法。
（１６）Ｎｅｕｒｏｎａｌ  ｐｅｎｔｒａｘｉｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＮＰＴＸＲ）の発現を中和、又は抑制する物質を有効成分として含有する分子標的治療薬。
（１７）前記有効成分が、抗体、又は核酸であることを特徴とする（１６）記載の分子標的治療薬。
（１８）前記有効成分が、ＮＰＴＸＲのＣＥＳＧＬＰＲＧＬＱＧＡＧＰＲＲＤＴ（配列番号１０）、又はＫＥＲＶＡＬＳＨＳＳＲＲＱＲＱＥＶＥ（配列番号１１）のいずれかを認識するものであることを特徴とする（１６）、又は（１７）記載の分子標的治療薬。
（１９）前記有効成分が抗体であることを特徴とする（１８）に記載の分子標的治療薬。
（２０）前記抗体が受託番号ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２８５６で表されるハイブ
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００５】
リドーマにより産生されるものである（１９）記載の分子標的治療薬。
（２１）前記有効成分が、ＮＰＴＸＲに対するｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、アンチセンスオリゴ、アプタマー、又はデコイであることを特徴とする（１６）、又は（１７）に記載の分子標的治療薬。
（２２）前記分子標的治療薬の対象疾患が、胃癌、大腸癌、乳癌、肺癌、膵癌、食道癌であることを特徴とする（１６）〜（２１）記載の分子標的治療薬。
（２３）ＮＰＴＸＲのＣＥＳＧＬＰＲＧＬＱＧＡＧＰＲＲＤＴ（配列番号１０）、
又はＫＥＲＶＡＬＳＨＳＳＲＲＱＲＱＥＶＥ（配列番号１１）を認識する抗体、
（２４）受託番号ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２８５６で表されるハイブリドーマにより産生されるモノクローナル抗体。
（２５）受託番号ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２８５６で表されるハイブリドーマ。
（２６）配列番号１２（ＧＬＰＲＧＬＱＧＡＧＰＲＲＤＴ）で表されるエピトープを認識する抗体。
（２７）ＮＰＴＸＲを認識する抗体、又はＮＰＴＸＲのｍＲＮＡ発現を定量するプライマー、及び測定に必要な試薬を含む検査キット。
（２８）前記ＮＰＴＸＲを認識する抗体が、ＣＥＳＧＬＰＲＧＬＱＧＡＧＰＲＲＤＴ（配列番号１０）、又はＫＥＲＶＡＬＳＨＳＳＲＲＱＲＱＥＶＥ（配列番号１１）のいずれかを認識するものであることを特徴とする（２７）記載の検査キット。
（２９）前記ＮＰＴＸＲを認識する抗体が、受託番号ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２８５６で表されるハイブリドーマにより産生されるものである（２７）記載の検査キット。
（３０）前記ＮＰＴＸＲのｍＲＮＡ発現を定量するプライマーが配列番号３及び４であることを特徴とする（２７）記載の検査キット。
（３１）被験物質とＮＰＴＸＲの細胞表面に表出している領域への結合性を
【国際調査報告】
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