【手続補正書】
【提出日】平成20年12月18日(2008.12.18)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
グリコロニトリルからグリコール酸を製造する方法であって、
ａ）グリコロニトリルを適切な水性反応混合物中でニトリラーゼ活性を有するポリペプチドを含む酵素触媒と接触させるステップであって、前記ポリペプチドが、
１）アミノ酸残基１６８でのリシン、メチオニン、トレオニン、またはバリンによる置換、および
２）アミノ酸残基２０１でのグルタミン、グリシン、ヒスチジン、リシン、アスパラギン、セリン、アラニン、システイン、またはトレオニンによる置換
からなる群から選択される少なくとも１つのアミノ酸置換された配列番号６のアミノ酸配列を有し、それによってグリコール酸が製造されるステップと、
（ｂ）塩または酸の形で（ａ）において製造されるグリコール酸を回収するステップを含み、前記酵素触媒が、同一の反応条件下でグリコロニトリルをグリコール酸に変換させる場合、アシドボラックス・ファシリス（Ａｃｉｄｏｖｏｒａｘ  ｆａｃｉｌｉｓ）７２Ｗニトリラーゼのニトリラーゼ活性に対してニトリラーゼ活性の少なくとも１．５倍の増加を提供することを特徴とする方法。
【請求項２】
ニトリラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする単離核酸分子であって、前記ポリペプチドが、
ａ）アミノ酸残基１６８でのメチオニン、またはトレオニンによる置換、および
ｂ）アミノ酸残基２０１でのグルタミン、グリシン、ヒスチジン、リシン、アスパラギン、セリン、アラニン、システイン、またはトレオニンによる置換
からなる群から選択される少なくとも１つのアミノ酸置換された配列番号６のアミノ酸配列を有し、前記ポリペプチドが、同一の反応条件下でグリコロニトリルをグリコール酸に変換させる場合、アシドボラックス・ファシリス（Ａｃｉｄｏｖｏｒａｘ  ｆａｃｉｌｉｓ）７２Ｗニトリラーゼのニトリラーゼ活性に対してニトリラーゼ活性の少なくとも１．５倍の増加を提供することを特徴とする単離核酸分子。
【請求項３】
適切な調節塩基配列に機能しうるように連結された請求項２に記載の単離核酸分子を含むことを特徴とするキメラ遺伝子。
【請求項４】
請求項３に記載のキメラ遺伝子を含むことを特徴とする発現カセット。
【請求項５】
請求項４に記載の発現カセットを含むことを特徴とする形質転換宿主細胞。
【請求項６】
ニトリラーゼ活性を有する単離ポリペプチドであって、前記ポリペプチドが、
ａ）アミノ酸残基１６８でのメチオニン、またはトレオニンによる置換、および
ｂ）アミノ酸残基２０１でのグルタミン、グリシン、ヒスチジン、リシン、アスパラギン、セリン、アラニン、システイン、またはトレオニンによる置換
からなる群から選択される少なくとも１つのアミノ酸置換された配列番号６のアミノ酸配列を有し、前記ポリペプチドが、同一の反応条件下でグリコロニトリルをグリコール酸に変換させる場合、アシドボラックス・ファシリス（Ａｃｉｄｏｖｏｒａｘ  ｆａｃｉｌｉｓ）７２Ｗニトリラーゼのニトリラーゼ活性に対してニトリラーゼ活性の少なくとも１．５倍の増加を提供することを特徴とする単離ポリペプチド。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２５３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２５３】
フラクション１２〜２３を複合し（総６００ｍＬ）、一夜、新鮮なＤｏｗｅｘ（登録商標）Ｇ−２６樹脂（脱イオン化水４５ｍＬで２０分間、３回前洗浄）５ｇで攪拌し、グリコール酸溶液６５１ｇをろ過によって収集した。溶液を回転蒸発によって濃縮し、７０ｗｔ％グリコール酸（生成物１４０ｇ）を生成した。不純物についての７０ｗｔ％グリコール酸の分析は、グリコール酸の純度が９９．９％を上回ることを示した。
本出願は、特許請求の範囲に記載の発明を含め、以下の発明を包含する。
（１）  グリコロニトリルからグリコール酸を製造する方法であって、
ａ）グリコロニトリルを適切な水性反応混合物中でニトリラーゼ活性を有するポリペプチドを含む酵素触媒と接触させるステップであって、前記ポリペプチドが、
１）アミノ酸残基１６８でのリシン、メチオニン、トレオニン、またはバリンによる置換、および
２）アミノ酸残基２０１でのグルタミン、グリシン、ヒスチジン、リシン、アスパラギン、セリン、アラニン、システイン、またはトレオニンによる置換
からなる群から選択される少なくとも１つのアミノ酸置換された配列番号６のアミノ酸配列を有し、それによってグリコール酸が製造されるステップと、
（ｂ）塩または酸の形で（ａ）において製造されるグリコール酸を回収するステップを含み、前記酵素触媒が、同一の反応条件下でグリコロニトリルをグリコール酸に変換させる場合、アシドボラックス・ファシリス（Ａｃｉｄｏｖｏｒａｘ  ｆａｃｉｌｉｓ）７２Ｗニトリラーゼのニトリラーゼ活性に対してニトリラーゼ活性の少なくとも１．５倍の増加を提供することを特徴とする方法。
（２）  前記アミノ酸配列が、配列番号８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、および３２からなる群から選択されることを特徴とする（１）に記載の方法。
（２）  前記酵素触媒が、同一の反応条件下でＡ．ファシリス（ｆａｃｉｌｉｓ）７２Ｗ（ＡＴＣＣ５５７４６）の活性に対してグリコロニトリルをグリコール酸に変換させる場合、ニトリラーゼ活性の少なくとも約２倍の改善を提供する改善されたニトリラーゼ触媒であることを特徴とする（１）に記載の方法。
（４）  前記酵素触媒が、同一の反応条件下でＡ．ファシリス（ｆａｃｉｌｉｓ）７２Ｗ（ＡＴＣＣ５５７４６）の活性に対してグリコロニトリルをグリコール酸に変換させる場合、ニトリラーゼ活性の少なくとも約４倍の改善を提供する改善されたニトリラーゼ触媒であることを特徴とする（２）に記載の方法。
（５）  前記酵素触媒が全微生物細胞、透過性微生物細胞、微生物細胞抽出物の１つまたは複数の細胞成分、部分的に精製された酵素、または精製酵素の形であることを特徴とする（１）に記載の方法。
（６）  前記全微生物細胞が前記ポリペプチドを組換え発現する形質転換微生物宿主細胞であることを特徴とする（５）に記載の方法。
（７）  前記形質転換微生物宿主細胞が、コマモナス（Ｃｏｍａｍｏｎａｓ）種、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）種、ブレビバクテリウム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）種、ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）種、アゾトバクター（Ａｚｏｔｏｂａｃｔｅｒ）種、シトロバクター（Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ）種、エンテロバクター（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ）種、クロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）種、クレブシエラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）種、サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）種、ラクトバチルス（Ｌａｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）種、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）種、サッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）種、チゴサッカロミセス（Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）種、ピチア（Ｐｉｃｈｉａ）種、クルイベロミセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）種、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）種、ハンセニュウラ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）種、デュナリエラ（Ｄｕｎａｌｉｅｌｌａ）種、デバリオミセス（Ｄｅｂａｒｙｏｍｙｃｅｓ）種、ケカビ（Ｍｕｃｏｒ）種、トルロプシス（Ｔｏｒｕｌｏｐｓｉｓ）種、メチロバクテリア（Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉａ）種、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）種、エシェリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）種、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）種、リゾビウム（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）種、およびストレプトミセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）種からなる群から選択されることを特徴とする（５）に記載の方法。
（８）  前記形質転換微生物宿主細胞が大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）であることを特徴とする（７）に記載の方法。
（９）  前記形質転換微生物宿主細胞が、国際寄託番号ＡＴＣＣ４７０７６を有する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＭＧ１６５５および国際寄託番号ＡＴＣＣ５３９１１を有する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＦＭ５からなる群から選択される大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）株であることを特徴とする（８）に記載の方法。
（１０）  前記酵素触媒が可溶性または不溶性支持体中にもしくはその上で固定化されることを特徴とする（１）から（９）のいずれか一項に記載の方法。
（１１）  前記水性反応混合物において製造されるグリコール酸アンモニウムの濃度が約０．０２ｗｔ％〜約９０ｗｔ％であることを特徴とする（１）に記載の方法。
（１２）  前記水性反応混合物において製造されるグリコール酸アンモニウムの濃度が約０．０２ｗｔ％〜約４０ｗｔ％であることを特徴とする（１１）に記載の方法。
（１３）  前記水性反応混合物におけるグリコロニトリル濃度が約５ｍＭ〜約１Ｍの範囲であることを特徴とする（１０）に記載の方法。
（１４）  前記水性反応混合物におけるグリコロニトリル濃度が連続的またはアリコート添加によって維持されることを特徴とする（１３）に記載の方法。
（１５）  前記水性反応混合物におけるｐＨが約５．５〜約７．７に維持されることを特徴とする（１）に記載の方法。
（１６）  グリコロニトリルのグリコール酸への酵素変換が実質的に酸素を含まない条件下で起こることを特徴とする（１）に記載の方法。
（１７）  前記水性反応混合物が、５ｗｔ％未満の濃度でチオ硫酸カリウムおよび亜ジオチオン酸ナトリウムからなる群から選択される安定剤をさらに含むことを特徴とする（１）に記載の方法。
（１８）  前記酵素触媒がリサイクルされた酵素触媒であることを特徴とする（１）に記載の方法。
（１９）  前記酵素触媒が乾燥細胞重量酵素触媒のグラム当り少なくとも３００グラムのグリコール酸の触媒生産性を提供することを特徴とする（１）に記載の方法。
（２０）  前記酵素触媒が乾燥細胞重量酵素触媒のグラム当り少なくとも４５０グラムのグリコール酸の触媒生産性を提供することを特徴とする（１９）に記載の方法。
（２１）  前記酵素触媒が乾燥細胞重量酵素触媒のグラム当り少なくとも１０００グラムのグリコール酸の触媒生産性を提供することを特徴とする（２０）に記載の方法。
（２２）  ニトリラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする単離核酸分子であって、前記ポリペプチドが、
ａ）アミノ酸残基１６８でのメチオニン、またはトレオニンによる置換、および
ｂ）アミノ酸残基２０１でのグルタミン、グリシン、ヒスチジン、リシン、アスパラギン、セリン、アラニン、システイン、またはトレオニンによる置換
からなる群から選択される少なくとも１つのアミノ酸置換された配列番号６のアミノ酸配列を有し、前記ポリペプチドが、同一の反応条件下でグリコロニトリルをグリコール酸に変換させる場合、アシドボラックス・ファシリス（Ａｃｉｄｏｖｏｒａｘ  ｆａｃｉｌｉｓ）７２Ｗニトリラーゼのニトリラーゼ活性に対してニトリラーゼ活性の少なくとも１．５倍の増加を提供することを特徴とする単離核酸分子。
（２３）  配列番号８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２８、および３０からなる群から選択されるアミノ酸配列をコードすることを特徴とする（２２）に記載の単離核酸分子。
（２４）  配列番号７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２７、および２９からなる群から選択される核酸配列を有することを特徴とする（２３）に記載の単離核酸分子。
（２５）  適切な調節塩基配列に機能しうるように連結された（２２）から（２４）のいずれか一項に記載の単離核酸分子を含むことを特徴とするキメラ遺伝子。
（２６）  （２５）に記載のキメラ遺伝子を含むことを特徴とする発現カセット。
（２７）  （２６）に記載の発現カセットを含むことを特徴とする形質転換宿主細胞。
（２８）  前記宿主細胞が、コマモナス（Ｃｏｍａｍｏｎａｓ）種、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）種、ブレビバクテリウム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）種、ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）種、アゾトバクター（Ａｚｏｔｏｂａｃｔｅｒ）種、シトロバクター（Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ）種、エンテロバクター（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ）種、クロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）種、クレブシエラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）種、サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）種、ラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）種、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）種、サッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）種、チゴサッカロミセス（Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）種、ピチア（Ｐｉｃｈｉａ）種、クルイベロミセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）種、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）種、ハンセニュウラ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）種、デュナリエラ（Ｄｕｎａｌｉｅｌｌａ）種、デバリオミセス（Ｄｅｂａｒｙｏｍｙｃｅｓ）種、ケカビ（Ｍｕｃｏｒ）種、トルロプシス（Ｔｏｒｕｌｏｐｓｉｓ）種、メチロバクテリア（Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉａ）種、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）種、エシェリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）種、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）種、リゾビウム（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）種、およびストレプトミセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）種からなる群から選択されることを特徴とする（２７）に記載の形質転換宿主細胞。
（２９）  前記宿主細胞が大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）であることを特徴とする（２８）に記載の形質転換宿主細胞。
（３０）  前記宿主細胞が、国際寄託番号ＡＴＣＣ４７０７６を有する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＭＧ１６５５、および国際寄託番号ＡＴＣＣ５３９１１を有する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＦＭ５からなる群から選択されることを特徴とする（２９）に記載の形質転換宿主細胞。
（３１）  ニトリラーゼ活性を有する単離ポリペプチドであって、前記ポリペプチドが、
ａ）アミノ酸残基１６８でのメチオニン、またはトレオニンによる置換、および
ｂ）アミノ酸残基２０１でのグルタミン、グリシン、ヒスチジン、リシン、アスパラギン、セリン、アラニン、システイン、またはトレオニンによる置換
からなる群から選択される少なくとも１つのアミノ酸置換された配列番号６のアミノ酸配列を有し、前記ポリペプチドが、同一の反応条件下でグリコロニトリルをグリコール酸に変換させる場合、アシドボラックス・ファシリス（Ａｃｉｄｏｖｏｒａｘ  ｆａｃｉｌｉｓ）７２Ｗニトリラーゼのニトリラーゼ活性に対してニトリラーゼ活性の少なくとも１．５倍の増加を提供することを特徴とする単離ポリペプチド。
（３２）  配列番号８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２８、および３０からなる群から選択されるアミノ酸配列をコードすることを特徴とする（３１）に記載の単離ポリペプチド。