(57)【要約】  本発明は、細胞を用いて薬物などの化合物の動態を解析するための方法および手段を提供する。具体的には、本発明は、細胞を用いた化合物の動態解析方法であって、対象の化合物を含み細胞を収容した容器に第１バッファ液を添加し、前記容器内の温度を第１温度に調整して保温し、前記容器内の温度を前記第１温度より低い第２温度に調整するＣＥ工程を含み、前記ＣＥ工程において、前記第１バッファ液中の前記化合物の量ＳおよびＳ’を間隔ｔ１を空けて測定し、前記量ＳおよびＳ’と前記間隔ｔ１とに基づき、前記細胞のベーサル／バソラテラル面からの前記化合物の排出速度を算出する、化合物の動態解析方法に関する。
2020174568.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞を用いた化合物の動態解析方法であって、
対象の化合物を含み細胞を収容した容器に第１バッファ液を添加し、前記容器内の温度を第１温度に調整して保温し、前記容器内の温度を前記第１温度より低い第２温度に調整するＣＥ工程を含み、
前記ＣＥ工程において、前記第１バッファ液中の前記化合物の量ＳおよびＳ’を間隔ｔ１を空けて測定し、
前記量ＳおよびＳ’と前記間隔ｔ１とに基づき、前記細胞のベーサル／バソラテラル面からの前記化合物の排出速度を算出する、
化合物の動態解析方法。
【請求項２】
請求項１に記載の化合物の動態解析方法であって、
前記化合物を含む細胞を各々収容した第１容器、第２容器および第３容器のそれぞれで前記ＣＥ工程を実施し、前記第１容器、前記第２容器および前記第３容器のそれぞれから、前記第１バッファ液を回収するＣＥ終了工程と、
前記ＣＥ終了工程の後、前記第１容器に、細胞間接着を解除する試薬を含む第２バッファ液を添加し、前記第１容器内の温度を第３温度に調整して保温するＥＡ１工程とを含み、
前記ＥＡ１工程において、前記第２バッファ液中の前記化合物の量Ｂ１およびＢ１’を間隔ｔ２を空けて測定し、
前記量Ｂ１およびＢ１’と前記間隔ｔ２とに基づき、前記細胞のベーサル／バソラテラル面およびアピカル面からの前記化合物の排出速度を算出する、
化合物の動態解析方法。
【請求項３】
請求項２に記載の化合物の動態解析方法であって、
前記ＣＥ終了工程の後、前記第２容器に、第３バッファ液を添加し、前記第２容器内の温度を前記第３温度に調整して保温するＥＡ２工程を含み、
前記ＥＡ２工程において、前記第３バッファ液中の前記化合物の量Ｂ２およびＢ２’を前記間隔ｔ２を空けて測定し、
前記量Ｂ２およびＢ２’と前記間隔ｔ２とに基づき、前記細胞のベーサル／バソラテラル面からの前記化合物の排出速度を算出する、
化合物の動態解析方法。
【請求項４】
請求項３に記載の化合物の動態解析方法であって、
前記量Ｂ１およびＢ１’ならびにＢ２およびＢ２’と前記間隔ｔ２とに基づき、前記細胞のアピカル面からの前記化合物の排出速度を算出する、
化合物の動態解析方法。
【請求項５】
請求項３に記載の化合物の動態解析方法であって、
前記ＣＥ終了工程の後、前記第３容器に、前記第３バッファ液を添加し、前記第３容器内の温度を前記第３温度より低い第４温度に調整して保温するＥＡ３工程を含み、
前記ＥＡ３工程において、前記第３バッファ液中の前記化合物の量Ｂ３およびＢ３’を前記間隔ｔ２を空けて測定し、
前記量Ｂ３およびＢ３’と前記間隔ｔ２とに基づき、受動拡散による前記細胞のベーサル／バソラテラル面からの前記化合物の排出速度を算出する、
化合物の動態解析方法。
【請求項６】
請求項５に記載の化合物の動態解析方法であって、
前記量Ｂ２およびＢ２’ならびにＢ３およびＢ３’と前記間隔ｔ２とに基づき、トランスポータ経由による前記細胞のベーサル／バソラテラル面からの前記化合物の排出速度を算出する、
化合物の動態解析方法。
【請求項７】
請求項１に記載の化合物の動態解析方法であって、
前記化合物を含む細胞を各々収容した第１容器、第２容器および第３容器のそれぞれで前記ＣＥ工程を実施し、前記第１容器、前記第２容器および前記第３容器のそれぞれから、前記第１バッファ液を回収するＣＥ終了工程と、
前記ＣＥ終了工程の後、前記第２容器に、第３バッファ液を添加し、前記第２容器内の温度を第３温度に調整して保温するＥＡ２工程を含み、
前記ＥＡ２工程において、前記第３バッファ液中の前記化合物の量Ｂ２およびＢ２’を間隔ｔ２を空けて測定し、
前記量Ｂ２およびＢ２’と前記間隔ｔ２とに基づき、前記細胞のベーサル／バソラテラル面からの前記化合物の排出速度を算出する、
化合物の動態解析方法。
【請求項８】
請求項１に記載の化合物の動態解析方法であって、
前記化合物を含む細胞を各々収容した第１容器、第２容器および第３容器のそれぞれで前記ＣＥ工程を実施し、前記第１容器、前記第２容器および前記第３容器のそれぞれから、前記第１バッファ液を回収するＣＥ終了工程と、
前記ＣＥ終了工程の後、前記第３容器に、第３バッファ液を添加し、前記第３容器内の温度を第３温度より低い第４温度に調整して保温するＥＡ３工程を含み、
前記ＥＡ３工程において、前記第３バッファ液中の前記化合物の量Ｂ３およびＢ３’を間隔ｔ２を空けて測定し、
前記量Ｂ３およびＢ３’と前記間隔ｔ２とに基づき、受動拡散による前記細胞のベーサル／バソラテラル面からの前記化合物の排出速度を算出する、
化合物の動態解析方法。
【請求項９】
細胞を用いた化合物の動態解析方法であって、
対象の化合物を含み細胞を各々収容した第１容器、第２容器および第３容器のそれぞれに第１バッファ液を添加し、前記容器内の温度を第１温度に調整して保温し、前記容器内の温度を前記第１温度より低い第２温度に調整するＣＥ工程と、
前記第１容器、前記第２容器および前記第３容器のそれぞれから、前記第１バッファ液を回収するＣＥ終了工程と、
前記ＣＥ終了工程の後、前記第１容器に、細胞間接着を解除する試薬を含む第２バッファ液を添加し、前記第１容器内の温度を第３温度に調整して保温するＥＡ１工程と
を含み、
前記ＥＡ１工程において、前記第２バッファ液中の前記化合物の量Ｂ１およびＢ１’を間隔ｔ２を空けて測定し、
前記量Ｂ１およびＢ１’と前記間隔ｔ２とに基づき、前記細胞のベーサル／バソラテラル面およびアピカル面からの前記化合物の排出速度を算出する、
化合物の動態解析方法。
【請求項１０】
細胞を用いた化合物の動態解析方法であって、
対象の化合物を含み細胞を各々収容した第１容器、第２容器および第３容器のそれぞれに第１バッファ液を添加し、前記容器内の温度を第１温度に調整して保温し、前記容器内の温度を前記第１温度より低い第２温度に調整するＣＥ工程と、
前記第１容器、前記第２容器および前記第３容器のそれぞれから、前記第１バッファ液を回収するＣＥ終了工程と、
前記ＣＥ終了工程の後、前記第２容器に、第３バッファ液を添加し、前記第２容器内の温度を前記第３温度に調整して保温するＥＡ２工程と
を含み、
前記ＥＡ２工程において、前記第３バッファ液中の前記化合物の量Ｂ２およびＢ２’を間隔ｔ２を空けて測定し、
前記量Ｂ２およびＢ２’と前記間隔ｔ２とに基づき、前記細胞のベーサル／バソラテラル面からの前記化合物の排出速度を算出する、
化合物の動態解析方法。
【請求項１１】
細胞を用いた化合物の動態解析方法であって、
対象の化合物を含み細胞を各々収容した第１容器、第２容器および第３容器のそれぞれに第１バッファ液を添加し、前記容器内の温度を第１温度に調整して保温し、前記容器内の温度を前記第１温度より低い第２温度に調整するＣＥ工程と、
前記第１容器、前記第２容器および前記第３容器のそれぞれから、前記第１バッファ液を回収するＣＥ終了工程と、
前記ＣＥ終了工程の後、前記第３容器に、前記第３バッファ液を添加し、前記第３容器内の温度を前記第３温度より低い第４温度に調整して保温するＥＡ３工程を含み、
前記ＥＡ３工程において、前記第３バッファ液中の前記化合物の量Ｂ３およびＢ３’を間隔ｔ２を空けて測定し、
前記量Ｂ３およびＢ３’と前記間隔ｔ２とに基づき、受動拡散による前記細胞のベーサル／バソラテラル面からの前記化合物の排出速度を算出する、
化合物の動態解析方法。
【請求項１２】
請求項１〜１１のいずれか１項に記載の化合物の動態解析方法であって、
前記ＣＥ工程の前に、容器内において前記化合物を含む溶液に前記細胞を曝露し、前記細胞に前記化合物を取り込ませる取込工程を含み、
前記取込工程において、前記溶液中の前記化合物の量ＡおよびＡ’を間隔ｔ３を空けて測定し、
前記量ＡおよびＡ’と前記間隔ｔ３とに基づき、前記細胞が前記化合物を取り込む取込速度を算出する、
化合物の動態解析方法。
【請求項１３】
請求項１〜１１のいずれか１項に記載の化合物の動態解析方法であって、
前記細胞が肝細胞を含む、化合物の動態解析方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、化合物の取込み、代謝、排泄を含む化合物動態の全体像のin vitro（生体外）での解析および評価に関する。
【背景技術】
【０００２】
新薬開発工程においては、ヒトの体内に投与し、効能を検証する臨床試験（「ヒト臨床試験」）を行うことが薬事法上必然となるが、ヒト臨床試験や動物実験は莫大な開発費を要する。このような動物実験やヒト臨床試験に移行する前の段階で薬剤候補の薬効や毒性を検証すること、特にヒト由来細胞を応用したin vitro（生体外）試験系で評価することが望まれている。【０００３】
薬剤が体内で薬効を発揮するためには、一旦肝臓に取り込まれた薬剤が、代謝産物になるか、あるいは代謝を受けずに元々の化合物（親化合物）のまま、血管側に排出された後に、再び血流に乗って再循環し、目的の臓器・器官にたどり着く必要がある。したがって、in vitro試験系においても、投与後に血管側に排出される医薬品候補化合物の再循環分を測定し、新薬開発において最も重要な指標の一つである薬効を評価できれば、非常に有用な薬物動態評価法となりえる。加えて、胆管（胆汁）排泄後に糞便として体外に排泄される、細胞から毛細胆管に排泄される分（消失分）、細胞内貯留分を含んだ薬物動態全体像を把握することにより、各画分への分配比率を求めることができるようになる。【０００４】
特許文献１および特許文献２には、培養細胞に薬剤を投与し、細胞接着間に形成された毛細胆管に排泄される分（消失分）を評価する手法が開示されている。この評価方法は、投与薬剤が胆汁排泄され、その後、糞便として体外に排泄される薬剤消失分の評価を行うものである。これらの手法は、あくまでも胆管（胆汁）排泄評価に特化した方法であった。【０００５】
本発明者の研究グループは、薬効のある成分の情報を得るために、血管側に排泄される成分の量を直接的に評価するための方法および装置を開発した（特許文献３および特許文献４）。この方法および装置では、薬物動態の一部を評価するのではなく、投与薬剤の血管（Basal/Basolateral）側排出画分、管腔（Apical）側排出画分、細胞内貯留画分といった、投与薬剤が細胞のどこから排泄され、どこに貯留しているのか、細分化して定量することができ、in vitroでの薬物動態全体像を提供し、より精度の高い薬効評価を行うことができるものであった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】国際公開WO2005/118787号
【特許文献２】国際公開WO94/12662号
【特許文献３】国際公開WO2015/080106号
【特許文献４】国際公開WO2016/166995号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、より迅速かつ簡便に、そしてより理解および把握しやすく、細胞を用いて薬物などの化合物の動態を解析するための方法および手段を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
前記課題を解決するため鋭意検討を行った結果、本発明者は、細胞を用いた化合物の動態解析において、化合物の排泄および／または取込を複数のタイムポイントで測定し、化合物の排泄速度および／または取込速度を算出することによって、化合物の動態をより理解および把握することが可能となることを見出し、本発明を完成するに至った。本発明は、例えば以下の態様を包含する。【０００９】
［１］細胞を用いた化合物の動態解析方法であって、
対象の化合物を含み細胞を収容した容器に第１バッファ液を添加し、前記容器内の温度を第１温度に調整して保温し、前記容器内の温度を前記第１温度より低い第２温度に調整するＣＥ工程を含み、
前記ＣＥ工程において、前記第１バッファ液中の前記化合物の量ＳおよびＳ’を間隔ｔ１を空けて測定し、
前記量ＳおよびＳ’と前記間隔ｔ１とに基づき、前記細胞のベーサル／バソラテラル面からの前記化合物の排出速度を算出する、
化合物の動態解析方法。【００１０】
［２］［１］に記載の化合物の動態解析方法であって、
前記化合物を含む細胞を各々収容した第１容器、第２容器および第３容器のそれぞれで前記ＣＥ工程を実施し、前記第１容器、前記第２容器および前記第３容器のそれぞれから、前記第１バッファ液を回収するＣＥ終了工程と、
前記ＣＥ終了工程の後、前記第１容器に、細胞間接着を解除する試薬を含む第２バッファ液を添加し、前記第１容器内の温度を第３温度に調整して保温するＥＡ１工程とを含み、
前記ＥＡ１工程において、前記第２バッファ液中の前記化合物の量Ｂ１およびＢ１’を間隔ｔ２を空けて測定し、
前記量Ｂ１およびＢ１’と前記間隔ｔ２とに基づき、前記細胞のベーサル／バソラテラル面およびアピカル面からの前記化合物の排出速度を算出する、
化合物の動態解析方法。【００１１】
［３］［２］に記載の化合物の動態解析方法であって、
前記ＣＥ終了工程の後、前記第２容器に、第３バッファ液を添加し、前記第２容器内の温度を前記第３温度に調整して保温するＥＡ２工程を含み、
前記ＥＡ２工程において、前記第３バッファ液中の前記化合物の量Ｂ２およびＢ２’を前記間隔ｔ２を空けて測定し、
前記量Ｂ２およびＢ２’と前記間隔ｔ２とに基づき、前記細胞のベーサル／バソラテラル面からの前記化合物の排出速度を算出する、
化合物の動態解析方法。【００１２】
［４］［３］に記載の化合物の動態解析方法であって、
前記量Ｂ１およびＢ１’ならびにＢ２およびＢ２’と前記間隔ｔ２とに基づき、前記細胞のアピカル面からの前記化合物の排出速度を算出する、
化合物の動態解析方法。【００１３】
［５］［３］に記載の化合物の動態解析方法であって、
前記ＣＥ終了工程の後、前記第３容器に、前記第３バッファ液を添加し、前記第３容器内の温度を前記第３温度より低い第４温度に調整して保温するＥＡ３工程を含み、
前記ＥＡ３工程において、前記第３バッファ液中の前記化合物の量Ｂ３およびＢ３’を前記間隔ｔ２を空けて測定し、
前記量Ｂ３およびＢ３’と前記間隔ｔ２とに基づき、受動拡散による前記細胞のベーサル／バソラテラル面からの前記化合物の排出速度を算出する、
化合物の動態解析方法。【００１４】
［６］［５］に記載の化合物の動態解析方法であって、
前記量Ｂ２およびＢ２’ならびにＢ３およびＢ３’と前記間隔ｔ２とに基づき、トランスポータ経由による前記細胞のベーサル／バソラテラル面からの前記化合物の排出速度を算出する、
化合物の動態解析方法。【００１５】
［７］［１］に記載の化合物の動態解析方法であって、
前記化合物を含む細胞を各々収容した第１容器、第２容器および第３容器のそれぞれで前記ＣＥ工程を実施し、前記第１容器、前記第２容器および前記第３容器のそれぞれから、前記第１バッファ液を回収するＣＥ終了工程と、
前記ＣＥ終了工程の後、前記第２容器に、第３バッファ液を添加し、前記第２容器内の温度を第３温度に調整して保温するＥＡ２工程を含み、
前記ＥＡ２工程において、前記第３バッファ液中の前記化合物の量Ｂ２およびＢ２’を間隔ｔ２を空けて測定し、
前記量Ｂ２およびＢ２’と前記間隔ｔ２とに基づき、前記細胞のベーサル／バソラテラル面からの前記化合物の排出速度を算出する、
化合物の動態解析方法。【００１６】
［８］［１］に記載の化合物の動態解析方法であって、
前記化合物を含む細胞を各々収容した第１容器、第２容器および第３容器のそれぞれで前記ＣＥ工程を実施し、前記第１容器、前記第２容器および前記第３容器のそれぞれから、前記第１バッファ液を回収するＣＥ終了工程と、
前記ＣＥ終了工程の後、前記第３容器に、第３バッファ液を添加し、前記第３容器内の温度を第３温度より低い第４温度に調整して保温するＥＡ３工程を含み、
前記ＥＡ３工程において、前記第３バッファ液中の前記化合物の量Ｂ３およびＢ３’を間隔ｔ２を空けて測定し、
前記量Ｂ３およびＢ３’と前記間隔ｔ２とに基づき、受動拡散による前記細胞のベーサル／バソラテラル面からの前記化合物の排出速度を算出する、
化合物の動態解析方法。【００１７】
［９］細胞を用いた化合物の動態解析方法であって、
対象の化合物を含み細胞を各々収容した第１容器、第２容器および第３容器のそれぞれに第１バッファ液を添加し、前記容器内の温度を第１温度に調整して保温し、前記容器内の温度を前記第１温度より低い第２温度に調整するＣＥ工程と、
前記第１容器、前記第２容器および前記第３容器のそれぞれから、前記第１バッファ液を回収するＣＥ終了工程と、
前記ＣＥ終了工程の後、前記第１容器に、細胞間接着を解除する試薬を含む第２バッファ液を添加し、前記第１容器内の温度を第３温度に調整して保温するＥＡ１工程と
を含み、
前記ＥＡ１工程において、前記第２バッファ液中の前記化合物の量Ｂ１およびＢ１’を間隔ｔ２を空けて測定し、
前記量Ｂ１およびＢ１’と前記間隔ｔ２とに基づき、前記細胞のベーサル／バソラテラル面およびアピカル面からの前記化合物の排出速度を算出する、
化合物の動態解析方法。【００１８】
［１０］細胞を用いた化合物の動態解析方法であって、
対象の化合物を含み細胞を各々収容した第１容器、第２容器および第３容器のそれぞれに第１バッファ液を添加し、前記容器内の温度を第１温度に調整して保温し、前記容器内の温度を前記第１温度より低い第２温度に調整するＣＥ工程と、
前記第１容器、前記第２容器および前記第３容器のそれぞれから、前記第１バッファ液を回収するＣＥ終了工程と、
前記ＣＥ終了工程の後、前記第２容器に、第３バッファ液を添加し、前記第２容器内の温度を前記第３温度に調整して保温するＥＡ２工程と
を含み、
前記ＥＡ２工程において、前記第３バッファ液中の前記化合物の量Ｂ２およびＢ２’を間隔ｔ２を空けて測定し、
前記量Ｂ２およびＢ２’と前記間隔ｔ２とに基づき、前記細胞のベーサル／バソラテラル面からの前記化合物の排出速度を算出する、
化合物の動態解析方法。【００１９】
［１１］細胞を用いた化合物の動態解析方法であって、
対象の化合物を含み細胞を各々収容した第１容器、第２容器および第３容器のそれぞれに第１バッファ液を添加し、前記容器内の温度を第１温度に調整して保温し、前記容器内の温度を前記第１温度より低い第２温度に調整するＣＥ工程と、
前記第１容器、前記第２容器および前記第３容器のそれぞれから、前記第１バッファ液を回収するＣＥ終了工程と、
前記ＣＥ終了工程の後、前記第３容器に、前記第３バッファ液を添加し、前記第３容器内の温度を前記第３温度より低い第４温度に調整して保温するＥＡ３工程を含み、
前記ＥＡ３工程において、前記第３バッファ液中の前記化合物の量Ｂ３およびＢ３’を間隔ｔ２を空けて測定し、
前記量Ｂ３およびＢ３’と前記間隔ｔ２とに基づき、受動拡散による前記細胞のベーサル／バソラテラル面からの前記化合物の排出速度を算出する、
化合物の動態解析方法。【００２０】
［１２］［１］〜［１１］のいずれかに記載の化合物の動態解析方法であって、
前記ＣＥ工程の前に、容器内において前記化合物を含む溶液に前記細胞を曝露し、前記細胞に前記化合物を取り込ませる取込工程を含み、
前記取込工程において、前記溶液中の前記化合物の量ＡおよびＡ’を間隔ｔ３を空けて測定し、
前記量ＡおよびＡ’と前記間隔ｔ３とに基づき、前記細胞が前記化合物を取り込む取込速度を算出する、
化合物の動態解析方法。【００２１】
［１３］［１］〜［１１］のいずれかに記載の化合物の動態解析方法であって、
前記細胞が肝細胞を含む、化合物の動態解析方法。
【発明の効果】
【００２２】
本発明を適用することによって、細胞内における化合物の動態をより迅速かつ正確に、そしてより理解および把握しやすく解析することが可能となる。さらに、医薬品候補化合物（親化合物および代謝産物）のトランスポータ経由および拡散経由での血管（Basal/Basolateral）側排出画分、管腔（Apical）側排出画分、細胞内残留画分を定量することができる。投与された医薬品候補化合物の総量および各画分への分配比率を判定することによって、投与された医薬品候補化合物の動態を評価することが可能となり、膨大な数の医薬品候補化合物の中から、薬効を発揮する薬剤候補をin vitroでのスクリーニング精度を向上させることができる。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】化合物の動態解析の概念を示すグラフである。
【図２】サンプル調製フローの一例を示す。
【図３】工程４、５、６の定量対象および化合物分布イメージを示す。
【図４】各画分の定義と蛍光試薬CDFの結果の例を示す。
【図５】蛍光試薬CDFの分配比率の例を示すグラフである。
【図６】蛍光試薬Rhodamine123の分配比率の例を示すグラフである。
【図７】培養プレートの一例を示す。
【図８】自動計測装置の構成例を示す図である。
【図９】サンプル調製部の上面図である。
【図１０】サンプル調製部の正面図である。
【図１１（ａ）】自動計測装置の動作フローチャートである。
【図１１（ｂ）】自動計測装置の動作フローチャートである。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
本発明は、細胞における（in vitroにおける）化合物の動態解析方法の改良に関する。本発明者が以前に開発した化合物の動態解析方法（特許文献３および４）の概要は次の通りである。すなわち、図３に示すように、3つの試験区１〜３を使用して、
【００２５】
試験区１では、細胞からバッファ液（例えばハンクス（-）液）に、胆管側排出（3）と、第二血管側排出（受動拡散（1）とトランスポータ（TP）（2）とからの排出）との合算分を排出させる；
【００２６】
試験区２では、試験区１のように胆管を崩壊させず、第二血管側排出（受動拡散（1）とトランスポータ（2））のみを排出させる；
【００２７】
試験区３では、試験区１および２よりも低い温度条件とすることで、第二血管側排出のうち、トランスポータ（1）から排出される化合物を抑制し、受動拡散（2）による排出分のみを排出させる。
【００２８】
この動態解析方法では、試験区１〜３の少なくとも1つにおいて回収した化合物の量を定量的に解析することにより、例えば、試験区１で回収した化合物量を定量化した値から、試験区２で回収した化合物量を定量化した値を減算することにより、胆管側排出（3）の化合物量と、第二血管側排出の化合物量を夫々算出することができる。また、試験区２と試験区３との比較においてトランスポータ経由による血管側化合物排出量を算出（定量）することが可能となる。各化合物には細胞内外を移動するための特異的なトランスポータが存在する。したがって、受動拡散経由の排出量を排除し、トランスポータ経由での排出量を定量できることは、各化合物に特異的な排出量を定量できることを意味する。
【００２９】
本発明に係る方法では、上記の動態解析方法をさらに迅速かつ簡便に行い、そして視覚的に把握するため、細胞からの化合物の排出を少なくとも2つの時点で測定し、化合物の排出速度を求める（図１）。また、細胞への化合物の取り込みを少なくとも2つの時点で測定し、化合物の取り込み速度を求めてもよい（図１）。化合物の排出速度（および任意で取り込み速度）を求めることで、例えば上記試験区１〜３の細胞培養工程を完了する前に化合物の動態を解析することができる。また、実測値のみを測定する場合と比べて変動をより正確に解析し、またその後の化合物動態を予測することが可能となる。さらに、図１に例示したようなグラフを作成することで、化合物の動態を視覚的に把握することが可能となる。
【００３０】
本方法において、細胞とは、化合物の取込および／または排泄などの動態を評価しようとする任意の細胞であり、限定されるものではない。細胞の由来となる生体も特に限定されるものではなく、脊椎動物（例えば哺乳類、鳥類、爬虫類、魚類、両生類など）、無脊椎動物（例えば昆虫、線虫、甲殻類など）、原生生物、植物、真菌、細菌などの任意の生体に由来する細胞を用いることができる。好ましくは、哺乳類、特にヒトの細胞である。細胞の種類も特に限定されるものではなく、好ましくは胆汁排泄または血中排泄評価を行うために適した細胞、例えば肝細胞を用いることができる。細胞は、当該技術分野において慣用的な調製方法により調製したり、市販の細胞や寄託細胞（株化細胞等）を利用したり、当業者であれば容易に理解することができる。
【００３１】
また本方法において、評価対象の化合物は、細胞への取込および／または細胞からの排泄などの細胞における動態を評価しようとする任意の化合物であり、限定されるものではない。具体的には、天然に生じる化合物、例えば、アミノ酸、ペプチド、オリゴペプチド、ポリペプチド、タンパク質、核酸、脂質、炭水化物（糖等）、ステロイド、グリコペプチド、糖タンパク質、プロテオグリカンなど；天然に生じる化合物の合成アナログまたは誘導体、例えば、ペプチド擬態物、核酸分子（アプタマー、アンチセンス核酸、二本鎖RNA（RNAi）等）など；天然に生じない化合物、例えば低分子有機化合物（無機および有機化合物ライブラリー、またはコンビナトリアルライブラリー等）など；並びにそれらの混合物を挙げることができる。また化合物は、単一物質であってもよいし、複数の物質から構成される複合体や、食品および食餌等であってもよい。
【００３２】
一態様において、本開示は、
細胞を用いた化合物の動態解析方法であって、
評価対象の化合物を含み細胞を収容した容器に第１バッファ液を添加し、前記容器内の温度を第１温度に調整して保温し、前記容器内の温度を前記第１温度より低い第２温度に調整するＣＥ工程を含み、
前記ＣＥ工程において、前記第１バッファ液中の前記化合物の量ＳおよびＳ’を間隔ｔ１を空けて測定し、
前記量ＳおよびＳ’と前記間隔ｔ１とに基づき、前記細胞のベーサル／バソラテラル面からの前記化合物の排出速度を算出する、
化合物の動態解析方法を提供する。
【００３３】
上記方法では、図１のＣＥ工程における［１］の経時変化（グラフの傾き）を求めることになる。図３に示されるＳ１、Ｓ２およびＳ３はＳ１≒Ｓ２≒Ｓ３であるため、ＳおよびＳ’の測定（第１バッファ液中の化合物のサンプリング）を行う試験区は、図３の試験区１〜３のいずれでもよい。
【００３４】
ここで、ＣＥ工程とは、Conditioning Effluxを意味し、細胞のコンディショニングを行う工程である（実施例における工程４に相当する）。ＣＥ工程は、前工程（実施例における工程３に相当）である低温（例えば4℃）での細胞洗浄の後に、所定の時間にわたって培養温度（例えば37℃）でインキュベーションを行い、培養容器を冷却し、上清画分を回収する工程である。このＣＥ工程により、前工程では除去しきれない、細胞への化合物吸着分を除去することができ、それ以降の工程の排出評価データへの影響を抑制することができる。このＣＥ工程を省略した場合には、化合物吸着分（＝ノイズ）がＣＥ工程後の工程（実施例における工程５に相当）の画分に含まれることになる。また、細胞内化合物量低減による、ＣＥ工程後の工程の排出減速にともなう排出評価の安定化を図ることができる。例えば、多サンプルを同時にサンプリングする際の微妙な時間差の影響を軽減することが可能である。一方、例えば、吸着を無視可能な化合物等については、ＣＥ工程を短縮または割愛（または限りなく０に近付ける）してもよい。
【００３５】
さらに、ＣＥ工程の上清画分の定量値を比較することによって、細胞培養からＣＥ工程までのサンプル間（例えばウェル間）における細胞およびリキッドハンドリング状態をチェックすることができ、例えば特異値の把握・除去が可能となる。すなわち、細胞培養からＣＥ工程までの細胞そのものの状態と、ＣＥ工程までのリキッドハンドリングとが、サンプル間で同等になっているかのチェックを行うことが可能である。
【００３６】
ＣＥ工程が長すぎると、それ以降の工程のための化合物の細胞内濃度が減少し、解析データにぶれが生じやすくなる。一方、ＣＥ工程が短すぎると、細胞に吸着した化合物を十分に除去できず、それ以降の工程の解析データに影響を及ぼす可能性がある。そのため、ＣＥ工程の長さは、細胞の種類、対象の化合物の種類などに応じて適宜設定する。
【００３７】
具体的には、ＣＥ工程では、評価対象の化合物を含む細胞を収容した容器に第１バッファ液（例えば、ハンクス液）を添加し、容器内の温度を第１温度（例えば37℃）に調整して保温し、容器内の温度を第１温度より低い第２温度（例えば4℃）に調整する。
【００３８】
細胞を収容する容器は、当技術分野で公知の細胞培養用容器であれば特に限定されるものではなく、使用する細胞の種類などに応じて適宜選択することができる。複数の容器を使用する場合、容器は、別個の容器であってもよいし、マルチタイタープレートのような複数のウェルから構成される容器であってもよい。
【００３９】
容器には、細胞と評価対象の化合物が含まれる。細胞の数および化合物の量（濃度）もまた適宜設定することが可能である。
【００４０】
第１バッファ液は、使用する細胞の機能を維持可能なように、無機塩類を含み、等張条件下に調整され、緩衝能を有する、平衡塩溶液・生理食塩水等をベースとしたものであり、使用する細胞の種類に応じて適宜選択することができる。例えば、ハンクス平衡塩溶液、アール平衡塩溶液、ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水、Puck’s平衡塩溶液などを使用することができる。容器への添加量は、細胞の種類、培養（インキュベーション）時間、予定するサンプリング回数などに応じて、適当に設定する。
【００４１】
第１バッファ液の添加後、容器内の温度を第１温度に調整して保温する。第１温度は、使用する細胞の培養に最も適した温度であり、使用する細胞の種類に応じて適宜選択することができる。一般的には、生体内環境としての体温である、例えば約37℃である。続いて、容器内の温度を第１温度より低い第２温度に調整する。第２温度は、化合物を取り込んだ細胞がその化合物を外部へ排出することを抑制する温度であり、使用する細胞の種類に応じて適宜選択することができる。一般的には、例えば約4℃の冷却（氷冷）条件下である。
【００４２】
このＣＥ工程において、第１バッファ液中の化合物の量ＳおよびＳ’を、間隔ｔ１を空けて測定する。すなわち、時間を間隔ｔ１空けて少なくとも2回サンプリングを行い、第１バッファ液中の化合物の量を測定する。経時変化、すなわち速度をより正確に求めるため、2回以上サンプリングを行うことが好ましい。ただし、場合によっては便宜的に当該工程の開始時点で１回目のサンプリングを行ってもよい。
【００４３】
複数回のサンプリングは、任意の方法により行うことができる。例えば、サンプリングを行う時点（以下、タイムポイントともいう）ごとに、異なるウェルを設ける方法を採用することができる。タイムポイントを2つ設定する場合には、条件をそろえたウェルが少なくとも2つあればよい。あるいは、同じウェルからバッファ液をサンプリングすることによっても複数回のサンプリングを行うことができる。この方法の場合には、同じウェル、すなわち同じ細胞による化合物の排出速度を解析することができる。この同じウェルからバッファ液をサンプリングする方法は、さらに
−サンプリング後にサンプリング量と同量のバッファ液をそのウェルに補填する方法（ただし、補填後のウェル内バッファ液は補填前のウェル内バッファ液よりも化合物の濃度が薄くなる）と、
−サンプリング後にバッファ液を補填しない方法（ただし、サンプリング後のウェル内バッファ液は液量が減るため、細胞からの化合物の排出速度が一定である場合、サンプリングしなかったウェル内バッファ液に比べ、所定時間経過後の化合物の濃度が濃くなる）
とに大別できる。このように、同じウェルからバッファ液をサンプリングする方法は、ウェル内バッファ液中の化合物の濃度に影響を与える場合がある。細胞や評価対象の化合物の性質に応じて、適切な方法を選択する、あるいは、複数の方法を試行することが好ましい。
【００４４】
タイムポイントは、工程（ＣＥ工程）中、濃度曲線が直線となっている（細胞からの化合物の取込速度または排出速度が一定となっている）ところに設けるのがよい（例えば、図１の［１］で例示する直線）。しかしながら、多くの場合、どの時点で濃度曲線が直線になるかは未知である。工程の開始直後および終了直後は化合物の取込速度および排出速度の変化が激しくなる場合があることから、タイムポイントは工程の中ほどに設けることが好ましい。評価対象の化合物の種類や使用する細胞の種類に応じて最適なタイムポイントは異なるが、ＣＥ工程においては、例えば数秒〜数十分の間隔を空けて、少なくとも2回、好ましくは2回以上タイムポイントを設定する。このようにタイムポイントを設定することにより、ＣＥ工程における化合物の動態（速度）の解析を適切に行うことができる。ただし、場合によっては便宜的に当該工程の開始時点で１回目のサンプリングを行ってもよい。
【００４５】
例えば一実施形態において、間隔ｔ１を空けて行う２回の測定は容器内の温度が同一条件、例えば第１温度である間に実施する。
【００４６】
第１バッファ中の化合物量の測定は、対象の化合物の種類に応じて、当業者であれば慣用的に使用されている方法または試薬を使用して行うことができる。複数のタイムポイントでの測定は、同じ方法または試薬を使用して行うことが好ましい。
【００４７】
ここで、化合物の測定は、バッファ中の化合物またはその代謝物の量または濃度を、好ましくは半定量的または定量的に測定することを意味し、その量は、絶対量であってもよいしまたは相対量であってもよい。測定は、直接的または間接的に行うことができる。直接的な測定は、化合物の分子数と直接相関するシグナルに基づいて、その量または濃度を測定することを含む。間接的な測定は、二次成分（すなわち化合物以外の成分）、例えばリガンド、標識または酵素反応生成物から得られるシグナルの測定である。
【００４８】
化合物自体ではなく、化合物の代謝物の動態を解析する場合には、解析式の分母および分子をタンパク質あたりまたは細胞あたりの分子数で計算すればよい。測定して得られた濃度を分子数に換算する。一方、化合物自体を測定する場合は分子数の他に濃度で計算することもできる。濃度を用いる場合はサンプリングの率を加味して計算する。
【００４９】
上述した方法によりＣＥ工程の経時変化（図１の［１］の傾き）を解析することで、細胞のベーサル／バソラテラル面からの化合物の排出速度、すなわち総血中排出速度（受動拡散＋トランスポーター経由）を求めることが可能である。具体的には、間隔ｔ１を空けて測定した化合物量ＳおよびＳ’から、式（Ｓ’−Ｓ）／ｔ１により、細胞のベーサル／バソラテラル面からの化合物の排出速度を算出する。
【００５０】
上述のように、ＣＥ工程を経時的に解析することで、トータルの排泄（血中排泄分の総量＝能動＋受動）の初期速度を測定することが可能となる。
【００５１】
別の態様において、本開示は、細胞を用いた化合物の動態解析方法であって、
化合物を含む細胞を各々収容した第１容器、第２容器および第３容器のそれぞれで上述したＣＥ工程を実施し、前記第１容器、前記第２容器および前記第３容器のそれぞれから、第１バッファ液を回収するＣＥ終了工程と、
前記ＣＥ終了工程の後、前記第１容器に、細胞間接着を解除する試薬を含む第２バッファ液を添加し、前記第１容器内の温度を第３温度に調整して保温するＥＡ１工程とを含み、
前記ＥＡ１工程において、前記第２バッファ液中の前記化合物の量Ｂ１およびＢ１’を間隔ｔ２を空けて測定し、
前記量Ｂ１およびＢ１’と前記間隔ｔ２とに基づき、前記細胞のベーサル／バソラテラル面およびアピカル面からの前記化合物の排出速度を算出する、
化合物の動態解析方法を提供する。
【００５２】
上記方法では、図１のＥＡ工程における［２］の経時変化（グラフの傾き）を求めることになる。Ｂ１およびＢ１’の測定（第２バッファ液中の化合物のサンプリング）を行う試験区は、図３の試験区１である。
【００５３】
まず、化合物を含む細胞を各々収容した第１容器、第２容器および第３容器のそれぞれで上述したＣＥ工程を実施し、第１容器、第２容器および第３容器のそれぞれから、第１バッファ液を回収するＣＥ終了工程を行う。
【００５４】
続いて、ＥＡ工程を行う。ここで、ＥＡ工程とは、Efflux Assayを意味し、細胞からの胆汁および血中（トランスポーター経由および受動拡散）排泄分を同じ土俵（工程・サンプル）で識別評価するための工程である（実施例における工程５に相当する）。本方法では、ＥＡ工程を、試験区１〜３でそれぞれ区別し、それぞれＥＡ１工程、ＥＡ２工程およびＥＡ３工程とする。
【００５５】
具体的には、ＥＡ１工程では、ＣＥ終了工程の後、第１容器に、細胞間接着を解除する試薬を含む第２バッファ液を添加し、第１容器内の温度を第３温度に調整して保温する。
【００５６】
細胞間接着を解除する試薬を使用して細胞の細胞間接着を解除することによって、細胞内に残留する化合物以外の化合物をすべて放出させる（図３の試験区１、37℃崩壊系）。細胞間接着を解除する試薬としては、当技術分野で公知の試薬を用いることができ、例えばキレーター（グリコールエーテルジアミン四酢酸EGTA等）を使用することができる。EGTAは細胞間接着分子の接着に関与しているCa2+、Mg2+の作用を抑えるキレート作用を持ち、細胞間接着を解除するための試薬として周知である。
【００５７】
この細胞間接着を解除する試薬を含む第２バッファ液（例えばハンクス（-）液）を第１容器に添加して、第１容器内の温度を第３温度に調整する。第３温度は、使用する細胞の培養に最も適した温度であり、使用する細胞の種類に応じて適宜選択することができる。一般的には、生体内環境としての体温である、例えば約37℃である。
【００５８】
上記ＥＡ１工程において、第２バッファ液中の化合物の量Ｂ１およびＢ１’を間隔ｔ２を空けて測定する。すなわち、時間を間隔ｔ２空けて少なくとも2回サンプリングを行い、第２バッファ液中の化合物の量を測定する。評価対象の化合物の種類や使用する細胞の種類に応じてサンプリングの最適なタイムポイントは異なるが、ＥＡ１工程においては、例えば数秒〜数十分の間隔を空けて、少なくとも2回、好ましくは2回以上タイムポイントを設定する。ただし、場合によっては便宜的に当該工程の開始時点で１回目のサンプリングを行ってもよい。
【００５９】
複数回のサンプリングおよび化合物量の測定は、上述した通りである。試験区１（図３の37℃崩壊系）では細胞間接着が崩壊（し、胆管内に存在した成分が外に経時的に放出）する。
【００６０】
試験区１では、細胞からバッファ液（例えばハンクス（-）液）に、胆管側排出（3）と、第二血管側排出（受動拡散（1）とトランスポータ（TP）（2）とからの排出）との合算分が排出される（図３）。したがって、上述した方法によりＥＡ１工程の経時変化（図１の［２］の傾き）を解析することで、細胞のベーサル／バソラテラル面およびアピカル面からの化合物の排出速度を求めることが可能である。具体的には、間隔ｔ２を空けて測定した化合物量Ｂ１およびＢ１’から、式（Ｂ１’−Ｂ１）／ｔ２により、細胞のベーサル／バソラテラル面およびアピカル面からの化合物の排出速度を算出する。
【００６１】
また別の態様において、本開示は、細胞を用いた化合物の動態解析方法であって、
上述したＣＥ終了工程の後、第２容器に、第３バッファ液を添加し、前記第２容器内の温度を第３温度に調整して保温するＥＡ２工程を含み、
前記ＥＡ２工程において、前記第３バッファ液中の前記化合物の量Ｂ２およびＢ２’を間隔ｔ２を空けて測定し、
前記量Ｂ２およびＢ２’と前記間隔ｔ２とに基づき、前記細胞のベーサル／バソラテラル面からの前記化合物の排出速度を算出する、
化合物の動態解析方法を提供する。
【００６２】
上記方法では、図１のＥＡ工程における［３］の経時変化（グラフの傾き）を求めることになる。Ｂ２およびＢ２’の測定（第３バッファ液中の化合物のサンプリング）を行う試験区は、図３の試験区２である。
【００６３】
まず、上述と同様にＣＥ終了工程を行う。続いてＥＡ２工程では、ＣＥ終了工程の後、第２容器に、第３バッファ液を添加し、第２容器内の温度を第３温度に調整して保温する。
【００６４】
第３バッファ液は、細胞培養に適したバッファ液であり、例えば第１バッファ液（ハンクス液）などを使用することができる。第３温度は、上記ＥＡ１工程と同様である。
【００６５】
ＥＡ２工程において、第３バッファ液中の化合物の量Ｂ２およびＢ２’を間隔ｔ２を空けて測定する。すなわち、時間を間隔ｔ２空けて少なくとも2回サンプリングを行い、第３バッファ液中の化合物の量を測定する。評価対象の化合物の種類や使用する細胞の種類に応じてサンプリングの最適なタイムポイントは異なるが、ＥＡ２工程においては、例えば数秒〜数十分の間隔を空けて、少なくとも2回、好ましくは2回以上タイムポイントを設定する。複数回のサンプリングおよび化合物量の測定は、上述した通りである。ただし、場合によっては便宜的に当該工程の開始時点で１回目のサンプリングを行ってもよい。
【００６６】
試験区２では、第二血管側排出（受動拡散（1）とトランスポータ（2））のみが排出される（図３）。したがって、上述した方法によりＥＡ２工程の経時変化（図１の［３］の傾き）を解析することで、細胞のベーサル／バソラテラル面からの化合物の排出速度を求めることが可能である。具体的には、間隔ｔ２を空けて測定した化合物量Ｂ２およびＢ２’から、式（Ｂ２’−Ｂ２）／ｔ２により、細胞のベーサル／バソラテラル面からの化合物の排出速度を算出する。
【００６７】
さらに別の態様において、本開示は、細胞を用いた化合物の動態解析方法であって、
上述したＣＥ終了工程の後、第３容器に、第３バッファ液を添加し、前記第３容器内の温度を第３温度より低い第４温度に調整して保温するＥＡ３工程を含み、
前記ＥＡ３工程において、前記第３バッファ液中の前記化合物の量Ｂ３およびＢ３’を間隔ｔ２を空けて測定し、
前記量Ｂ３およびＢ３’と前記間隔ｔ２とに基づき、受動拡散による前記細胞のベーサル／バソラテラル面からの前記化合物の排出速度を算出する、
化合物の動態解析方法を提供する。
【００６８】
上記方法では、図１のＥＡ工程における［４］の経時変化（グラフの傾き）を求めることになる。Ｂ３およびＢ３’の測定（第３バッファ液中の化合物のサンプリング）を行う試験区は、図３の試験区３である。
【００６９】
まず、上述と同様にＣＥ終了工程を行う。続いてＥＡ３工程では、ＣＥ終了工程の後、第３容器に、第３バッファ液を添加し、第３容器内の温度を第３温度より低い第４温度に調整して保温する。
【００７０】
第３バッファ液は上記工程ＥＡ２と同様である。また第４温度は、化合物を取り込んだ細胞がその化合物を外部へ排出することを抑制する温度であり、使用する細胞の種類に応じて適宜選択することができる。一般的には、例えば約4℃（4℃±1℃）であり、好ましくは4℃である。
【００７１】
ＥＡ３工程において、第３バッファ液中の化合物の量Ｂ３およびＢ３’を間隔ｔ２を空けて測定する。すなわち、時間を間隔ｔ２空けて少なくとも2回サンプリングを行い、第３バッファ液中の化合物の量を測定する。評価対象の化合物の種類や使用する細胞の種類に応じてサンプリングの最適なタイムポイントは異なるが、ＥＡ３工程においては、例えば数秒〜数十分の間隔を空けて、少なくとも2回、好ましくは2回以上タイムポイントを設定する。複数回のサンプリングおよび化合物量の測定は、上述した通りである。ただし、場合によっては便宜的に当該工程の開始時点で１回目のサンプリングを行ってもよい。
【００７２】
試験区３では、第二血管側排出のうち、トランスポータ（1）から排出される化合物を抑制し、受動拡散（2）による排出分のみが排出される（図３）。したがって、上述した方法によりＥＡ３工程の経時変化（図１の［４］の傾き）を解析することで、受動拡散による細胞のベーサル／バソラテラル面からの化合物の排出速度を求めることが可能である。具体的には、間隔ｔ２を空けて測定した化合物量Ｂ３およびＢ３’から、式（Ｂ３’−Ｂ３）／ｔ２により、受動拡散による細胞のベーサル／バソラテラル面からの化合物の排出速度を算出する。
【００７３】
さらなる態様において、本開示は、上述した化合物の動態解析方法であって、
前記量Ｂ１およびＢ１’ならびにＢ２およびＢ２’と間隔ｔ２とに基づき、前記細胞のアピカル面からの前記化合物の排出速度を算出する、
化合物の動態解析方法を提供する。
【００７４】
ＥＡ１工程とＥＡ２工程の経時変化の差を解析することで、細胞のアピカル面からの化合物の排出速度を求めることが可能である。具体的には、間隔ｔ２を空けて測定した化合物量Ｂ１およびＢ１’と化合物量Ｂ２およびＢ２’から、式｛（Ｂ１’−Ｂ２’）−（Ｂ１−Ｂ２）｝／ｔ２により、細胞のアピカル面からの化合物の排出速度を算出する。
【００７５】
別の態様において、本開示は、上述した化合物の動態解析方法であって、
前記量Ｂ２およびＢ２’ならびにＢ３およびＢ３’と間隔ｔ２とに基づき、トランスポータ経由による前記細胞のベーサル／バソラテラル面からの前記化合物の排出速度を算出する、
化合物の動態解析方法を提供する。
【００７６】
ＥＡ２工程とＥＡ３工程の経時変化の差を解析することで、トランスポータ経由による細胞のベーサル／バソラテラル面からの化合物の排出速度を求めることが可能である。具体的には、間隔ｔ２を空けて測定した化合物量Ｂ２およびＢ２’と化合物量Ｂ３およびＢ３’から、式｛（Ｂ２’−Ｂ３’）−（Ｂ２−Ｂ３）｝／ｔ２により、トランスポータ経由による細胞のベーサル／バソラテラル面からの化合物の排出速度を算出する。
【００７７】
本明細書においては、ＥＡ工程におけるサンプリングの間隔を「ｔ２」として表したが、ＥＡ１、ＥＡ２およびＥＡ３の各工程（試験区）において間隔ｔ２は、同じであってもよいしまたは異なっていてもよい。例えば、ＥＡ１、ＥＡ２およびＥＡ３の工程において異なるタイムポイントでサンプリングを行うことが想定される。より具体的には、ＥＡ工程において、ｔ２ｉ、ｔ２ｉｉ、ｔ２ｉｉｉ、・・・ｔ２ｘのタイムポイントでサンプリングする場合を想定する。サンプリングして測定した化合物量に基づいてグラフを作成し、より直線に近い範囲で経時変化（速度）を求めるために、ＥＡ１工程ではｔ２ｉ〜ｔ２ｉｉの間、ＥＡ２工程ではｔ２ｉ〜ｔ２ｉｉｉの間、ＥＡ３工程ではｔ２ｉｖ、・・・ｔ２ｘの間の経時変化を求めることができる。
【００７８】
また別の態様において、本開示は、上述した化合物の動態解析方法であって、
前記ＣＥ工程の前に、容器内において前記化合物を含む溶液に前記細胞を曝露し、前記細胞に前記化合物を取り込ませる取込工程を含み、
前記取込工程において、前記溶液中の前記化合物の量ＡおよびＡ’を間隔ｔ３を空けて測定し、
前記量ＡおよびＡ’と前記間隔ｔ３とに基づき、前記細胞が前記化合物を取り込む取込速度を算出する、
化合物の動態解析方法を提供する。
【００７９】
上記方法では、図１の化合物取込工程における初期取込速度を求めることになる。図３に示されるＳ１、Ｓ２およびＳ３はＳ１≒Ｓ２≒Ｓ３であるため、ＡおよびＡ’の測定（溶液中の化合物のサンプリング）を行う試験区は、図３の試験区１〜３のいずれでもよい。
【００８０】
ここで、化合物取込工程とは、化合物を含む溶液に細胞を曝露し、細胞に化合物を取り込ませる工程である（実施例における工程２に相当する）。
【００８１】
化合物取込工程における初期取込速度は、いくつかの方法により求めることができる。例えば、上述したＣＥ工程およびＥＡ工程後、ＩＡ工程（細胞内残留量を求めるIntracellular Assay）を経た後（実施例における工程３〜６を経た後）に、計算により細胞に取り込まれた化合物量を求める。あるいは、実施例における工程３の次に工程６を行い、その際に時間を変えて2ウェル以上実施することによって、細胞に取り込まれた化合物量を求める。また別の方法では、上清中の化合物量が時間経過と共に減ることから（メディアロス）、上清をサンプリングして、細胞に取り込まれた化合物量を求める。
【００８２】
一実施形態では、取込工程において、溶液中の化合物の量ＡおよびＡ’を間隔ｔ３を空けて測定する。化合物量の測定は上述と同様に行うことができる。
【００８３】
取込工程の経時変化を解析することで、細胞が化合物を取り込む取込速度を求めることが可能である。具体的には、間隔ｔ３を空けて測定した化合物量ＡおよびＡ’から、式（Ａ’−Ａ）／ｔ３により、細胞が化合物を取り込む取込速度を算出する。
【００８４】
また、化合物取込工程（実施例における工程２）では、化合物に最適な初期濃度を求めることが好ましい。例えば、複数の初期濃度を設定して化合物の取り込みデータから図１のようなグラフを作成し、得られたグラフを比較して、最適な初期濃度、すなわち細胞に重篤なダメージを与えず、正確なデータ解析を行うことができる（例えばトランスポータが飽和しない）濃度を設定する。
【００８５】
以上のように、細胞への化合物の取込速度、ならびに細胞からの化合物の排出速度を算出することによって、細胞を用いてin vitroで化合物の動態を簡便かつ正確に、そして理解および把握しやすく解析することが可能となる。化合物動態の速度を求めることで、化合物の取込量・排泄量を視覚化（グラフ化）でき、化合物の動態がより理解しやすくなり、判断材料が増える。例えば、化合物の取込と排泄のインタープレイを理解したり、測定後の排泄を予測することが可能となる。
【００８６】
以下、本発明の具体的な実施の形態を実施例により説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【実施例１】
【００８７】
本実施例では、本発明を適用した化合物の動態解析方法について図２の工程０〜６に則して説明する。また、工程４〜６については、図３を用いて詳述する。【００８８】
なお、以下の実施例は、本発明を説明するための一例であって、本実施例にて示す、バッファ液や温度、時間等の具体的な条件は、技術思想として同様の効果を有するのであれば別の条件を使用可能である。【００８９】
本実施例においては、試験区１〜３の３つの試験区を用いた場合について説明する。各試験区には、細胞を保持する保持領域が存在するが、これら保持領域は、各試験区ごとに別々の容器を用いてもよいし、複数の保持領域を有する一つの容器内を区切って、各試験区を設定してもよい。【００９０】
＜工程０：細胞の調製と培養＞
本工程では、まず化合物の動態を解析するための細胞の調製・培養を行う。以下一例を示す。【００９１】
（１）肝細胞
肝細胞の調製は、in situコラゲナーゼかん流法にしたがった。詳しくは以下の通りである。ラット（5〜6週齢）を、ペントバルビタール麻酔下で開腹し、門脈にカテーテルを挿入して前かん流液（Ca2+とMg2+不含、グリコールエーテルジアミン四酢酸（EGTA）を含むハンクス液）を注入する。肝臓からの脱血が十分になされたことを確認した後にかん流を止める。かん流液をコラゲナーゼ溶液に換えて、かん流を行う。本実施例では0.05％コラゲナーゼを含むハンクス液を用いてかん流を行うが、この限りではない。細胞間組織がコラゲナーゼにより消化されたことを確認した後、かん流を止める。肝臓を切り離し、冷したハンクス液中で細切りし、ピペッティングにより細胞まで分散する。等張パーコール液を使用して500G、5分の遠心分離で傷害のある肝細胞を除去する。得られた肝細胞の生存率はトリパンブルー排除法で計測し、生存率85％以上の肝細胞を培養に使用する。ここでは、生存率85％以上の肝細胞を培養に使用するが、必ずしも当該条件に限られるものではない。また、肝細胞の調製は必ずしもin situコラゲナーゼかん流法に限られるものではない。用いる肝細胞もラット由来のものに限らないし、ラットの系統も限定されない。本実施例では肝細胞を利用したが、これに限らない。【００９２】
（２）その他の細胞
ヒトあるいは動物等の肝臓から調製した肝細胞以外に、マウス等に発現させたヒト化肝細胞やiPS細胞から分化誘導させたiPS細胞由来肝細胞を実験に適用することも可能である。また、セルライン（株化細胞）のHepaRG細胞やHepG2細胞も同様に適用可能である。加えて、各種臓器由来細胞も本発明に適用できる。【００９３】
（３）前述の通り調製した細胞を培地に懸濁し、市販のコラーゲンコート培養ディッシュに肝細胞を5X105 cells/mLの密度で培地に懸濁し播種する。播種密度、培地、培養プレート001は特に限定されない。培養プレートの一例を図７に示す。ここでは24個の培養領域（ウェル、002）を含む24ウェル培養プレートを示したが、これに限らず所定の細胞を保持できる容器であれば他の形状の容器を用いてもよい。播種後、CO2インキュベータを用いて5％CO2、37℃の条件下で培養を開始する。18時間以上経過した後に、最初の培地交換を行う。播種後18時間目以降の培養に用いる培地は特に限定されるものではないが、本実施例では、培地（10％FCS+）からFCSを除いた培地（以下、培地（FCS-））にマトリゲルを添加した培地を用いた。以降24時間毎に培地（FCS-）を用いて培地交換を行う。後述するように、工程５で3種類の異なる条件下での試験（試験区１、２、３：工程５で詳述）を行うため、この時点で同条件の培養プレートを独立に3プレート用意する。工程０から４、および工程５においては、3種類の試験区とも同一の試験操作を行う。【００９４】
＜工程１：細胞のコンディショニング＞
本工程では、工程０にて培養した細胞を、動態解析に適したコンディショニングに整える。以下一例を示す。【００９５】
工程０によって4日間培養した細胞の培養上清を除去し、バッファとしてハンクス液を400μL添加し、37℃で10分インキュベーションする（図２の工程１）。バッファの種類と量は特に限定されるものではない。【００９６】
工程１の操作は2回繰り返すのが望ましい。このように工程０の培養にて使用した培地から、バッファ液（例えばハンクス液）へ細胞が馴染む成分を置換させることにより、以下の工程で正確な測定・解析を行うための下地を整えることができる。ただし、工程１を何度繰り返すかは、使用するバッファ液の種類や細胞の種類によって、任意に変更する。【００９７】
＜工程２：化合物投与＞
本工程では、動態解析を行う対象の化合物を細胞に投与する。以下一例を示す。【００９８】
バッファを除去後、10μMのカルボキシジクロロフルオレセイン（CDF；蛍光試薬）200μLをウェルに添加し、37℃で30分間インキュベーションし、その後に4℃で5分間保持した（図２の工程２）。試薬の種類、濃度、量は特に限定されるものではない。CDFは蛍光を発するため、モデル試薬としてプレートリーダで簡便に定量できる。また、投与量を200μLとしたが、これはウェル内の細胞全体が試薬に浸る量として選択した。CDFの濃度は細胞の蛍光アッセイとして従来用いられている濃度であればよい。プレートリーダで検出するための試薬量としても本濃度を適用することが望ましい。インキュベーションの時間は30分としたが、これは化合物の取り込みと排出がほぼ平衡状態になるまでの時間が30分であるという予備検討の結果をもとに採用した。投与された化合物の細胞外への漏出を防ぐ目的で、30分インキュベーション後にプレート温度を4℃にした。容器内の温度を低くすることにより、細胞が化合物を外部へ排出することを抑制する現象を生じさせるからである。【００９９】
このように細胞の温度を所定の温度以下にすることにより、化合物は細胞内へ留まり、細胞外へ漏出する現象を抑制することができる。本実施例では4℃としたが、投与された化合物が細胞外へ漏出することを抑制できる温度であればこれに限られるものではない。また、投与された化合物が細胞外へ漏出することを抑制できる、例えばインヒビターを投与するような方法があれば、温度を下げる方法に限らない。いずれにせよ、工程１で設定したプレート温度よりも、工程２における温度の方が低い温度となる。工程１でのコンディショニングでは工程２とは逆に、細胞内が化合物を吸収・排出する現象が活性化する温度（例えば37℃）の方が望ましいからである。【０１００】
化合物投与のタイミングは、本実施例に限定されるものではない。例えば、化合物投与を試験日の前日もしくは数日前から行う場合もある。この場合は、工程０の段階で化合物を投与し、工程１、２は省略してもよい。【０１０１】
工程２では、インキュベーション時間を変えながら、すなわち複数のタイムポイントでウェルから培地をサンプリングする。例えば、タイムポイントＴとＴ’（Ｔ＋ｔ３）においてウェルから培地をサンプリングする。サンプリングされた培地中の化合物の測定方法は後述する通りである。それにより、ＣＥ工程（工程４）の前の化合物取込工程において、間隔ｔ３を空けた化合物量Ａ及びＡ’が求められる。式（Ａ’−Ａ）／ｔ３により、細胞が化合物を取り込む取込速度を算出する。ただし、場合によっては便宜的に当該工程の開始時点をタイムポイントTに適用してもよい。【０１０２】
＜工程３：細胞洗浄＞
本工程では、工程３によって細胞内に含まれた化合物以外を洗い流す。以下一例を説明する。【０１０３】
プレートを4℃に保持したまま、氷冷したハンクス液400μLを用いて3回洗浄した（図２の工程３）。4℃の目的は上記と同様である。培養時の培地の量が400μLであり、ウェル内壁に残留している培地成分を除去する目的で、洗浄ハンクス液の量を400μLとした。一般的な生化学アッセイでの洗浄回数は3回が通例となっており、これに従った。各条件は限定されない。これにより、測定対象となる化合物以外を除去し、後の工程における動態解析の精度をより向上させることが可能となる。【０１０４】
＜工程４（ＣＥ工程）：血管側排出画分回収＞
化合物動態を解析する一つの指標として、投与した化合物が、細胞内に長時間留まりやすいものであるか、または短期間しか留まりにくいものであるかを分析することが有効である。そこで本工程では、上記指標のためのデータを取得するべく、後述の工程５にて各試験区内の細胞を評価する前に、化合物を細胞内から所定時間以内に漏出させる。以下一例を示す。【０１０５】
まず、前処理用のバッファ液（例えばハンクス液）を投与し、37℃で30分間インキュベーションし、化合物を含むハンクス液（上清）を回収した（図２の工程４）。バッファ液は、工程５にて使用するバッファ液と同一種のものを使用してもよいし、別の種類のものを使用してもよい。工程３までにより細胞（図３、イメージ図中101）内に貯留させた化合物を、ハンクス液中に、第一血管側排出、つまりは受動拡散経由（図２の工程４、図３(1)’）、およびトランスポータ（TP）経由（図２の工程４、図３(2)’およびイメージ図中102）で排出させるため、37℃に維持した。後述の通り、工程５においても血管側排出が行われるため、両者を区別するため、工程４おける血管側排出を第一血管側排出、工程５における血管側排出を第二血管側排出と定義した。本質的には、ともに細胞内から血管側（Basal/Basolateral）（上清）に排出される工程である。トランスポータは細胞膜上に発現している物質輸送を担う膜タンパク質であり、細胞内外での能動的な物質輸送を担う。また、受動拡散は、トランスポータ経由以外による細胞外への排出であり、細胞膜からの漏出等を含む。工程４でハンクス液に排出された化合物を血管側排出画分と定義したのは、ハンクス液に面している細胞上面部分は、ベーサル（Basal）/バソラテラル（Basolateral）面（図３、イメージ図中104）に相当し、生体内では血管に面している部分と想定されるためである。【０１０６】
次に説明する工程５では、異なる3種類の操作で化合物の回収を行う工程（試験区１、２、３）となるが、工程５の前に、工程４にて上述のように第一血管側排出画分（ハンクス液に排出された化合物）を取得しておくことにより、化合物が細胞に留まりやすいものかどうかを検証する指標を取得することができる。【０１０７】
尚、血管側排出各分を把握するのに用いるハンクス液は、どの試験区のハンクス液を用いてもよい。例えば、後述の試験区１〜３すべてのハンクス液について評価してもよいし、一部のみ用いてもよい。【０１０８】
工程４において、インキュベーション時間を変えながら、すなわち複数のタイムポイントでウェルから培地をサンプリングする。例えば、タイムポイントＴとＴ’（Ｔ＋ｔ１）においてウェルから培地をサンプリングする。サンプリングされた培地中の化合物の測定方法は後述する通りである。それにより、ＣＥ工程（工程４）において、間隔ｔ１を空けた化合物量Ｓ及びＳ’が求められる。式（Ｓ’−Ｓ）／ｔ１により、細胞のベーサル／バソラテラル面からの化合物の排出速度を算出する。ただし、場合によっては便宜的に当該工程の開始時点をタイムポイントＴに適用してもよい。【０１０９】
上記工程０〜４は、図２に示すように、少なくとも試験区１〜３のいずれかにおいて行われるものである。工程５では、本発明で求める複数の指標データを後述の解析によって取得するべく、試験区１〜３夫々について、別条件で処理を行う。以下一例を示す。【０１１０】
＜工程５、試験区１（ＥＡ１工程）：37℃崩壊系による上清の回収＞
試験区１では、図３の試験区１にて示すように、細胞からバッファ液（例えばハンクス（-）液）に、胆管側排出（3）と、第二血管側排出（つまりは拡散（1）とトランスポータ（TP）（2）とからの排出）との合算分を排出させる。ハンクス（-）液は、カルシウムイオンやマグネシウムイオンを含まないハンクス液のことであり、本試験区のような細胞間接着を強化しない場合等に用いる。細胞間接着を積極的に解除する目的としては、以下述べるようにEGTAのようなキレーターを用いる。次に、1mMのEGTAを含むハンクス（-）液を200μL添加した。EGTAは細胞間接着分子の接着に関与しているCa2+、Mg2+の作用を抑えるキレート作用を持ち、細胞間接着を解除するための試薬である。これにより培養過程において形成された胆管を崩壊させる。37℃で30分間インキュベーションした後に、上清を回収した。キレート作用を持つ試薬であればEGTAに限定されない。EGTAを含むバッファの種類、量、およびインキュベーション温度と時間は特に限定されない。工程５の試験区１では、工程４が終了した段階で細胞内に貯留している化合物（図３の工程５、およびイメージ図（1）、（2））、および胆管に排出されている化合物（図３の工程５およびイメージ図（3））がすべて上清中に排出され、回収される（図３の工程５、試験区１）。工程５で（3）を胆管側排出画分と定義したのは、細胞間接着部分に形成される間隙周囲の細胞膜部分は、アピカル（Apical）面（図３、105）に相当し、かつ間隙は毛細胆管（図３、103）に想定されるためである。工程５の試験区１では、温度は37℃に維持されているため、細胞内から血管側に排出される画分には受動拡散経由（図３の工程５、（1））、およびトランスポータ経由（図３の工程５、（2））が含まれる。【０１１１】
工程５の試験区１（ＥＡ１工程）において、インキュベーション時間を変えながら、すなわち複数のタイムポイントでウェルから培地をサンプリングする。例えば、タイムポイントＴとＴ’（Ｔ＋ｔ２）においてウェルから培地をサンプリングする。サンプリングされた培地中の化合物の測定方法は後述する通りである。それにより、ＥＡ１工程において、間隔ｔ２を空けた化合物量Ｂ１及びＢ１’が求められる。式（Ｂ１’−Ｂ１）／ｔ２により、細胞のベーサル／バソラテラル面およびアピカル面からの化合物の排出速度を算出する。ただし、場合によっては便宜的に当該工程の開始時点をタイムポイントＴに適用してもよい。【０１１２】
＜工程５、試験区２（ＥＡ２工程）：37℃維持系による上清の回収＞
試験区２は、試験区１のように胆管を崩壊させず、図３にいう第二血管側排出（拡散（1）とトランスポータ（2））のみを排出させる。【０１１３】
ハンクス液は200μL添加した。試験区２は、試験区１とは異なり、EGTA等のキレート剤を含まないため、細胞間接着は維持されたままであり、したがって、毛細胆管の崩壊も誘起されない試験区である。37℃で30分間インキュベーションした後に、上清を回収した。工程５の試験区２では、工程４が終了した段階で細胞内に貯留している化合物（図３の工程５、およびイメージ図（1）、（2））が上清中に排出され、回収される（図３の工程５、試験区２）。これまでの説明にしたがい、上清中に排出される化合物は、第二血管側排出画分と定義される。工程５の試験区２では、温度は37℃に維持されているため、細胞内から血管側に排出される画分には受動拡散経由（図３の工程５、（1））、およびトランスポータ経由（図３の工程５、（2））が含まれる。【０１１４】
工程５の試験区２（ＥＡ２工程）において、インキュベーション時間を変えながら、すなわち複数のタイムポイントでウェルから培地をサンプリングする。例えば、タイムポイントＴとＴ’（Ｔ＋ｔ２）においてウェルから培地をサンプリングする。サンプリングされた培地中の化合物の測定方法は後述する通りである。それにより、ＥＡ２工程において、間隔ｔ２を空けた化合物量Ｂ２及びＢ２’が求められる。式（Ｂ２’−Ｂ２）／ｔ２により、細胞のベーサル／バソラテラル面からの化合物の排出速度を算出する。ただし、場合によっては便宜的に当該工程の開始時点をタイムポイントＴに適用してもよい。【０１１５】
また、工程５の試験区１と試験区２から、回収した化合物の量を定量的に解析することにより、例えば、試験区１で回収した化合物量を定量化した値から、試験区２で回収した化合物量を定量化した値を減算することにより、胆管側排出（3）の化合物量と、第二血管側排出の化合物量を夫々算出することができる。【０１１６】
＜工程５、試験区３（ＥＡ３工程）：4℃維持系による上清の回収＞
試験区３は、後述のように試験区１、２よりも低い温度条件とすることで、第二血管側排出のうち、トランスポータ（1）から排出される化合物を抑制し、拡散（2）による排出分のみを排出させる。【０１１７】
ハンクス液を200μL添加し、4℃で30分間インキュベーションした後に、上清を回収した。同じ維持系の工程５の試験区２とは試験温度が異なる。これは、4℃にすることにより、トランスポータ経由の血管側排出を抑制させるためである。工程５の試験区３において、トランスポータ活性を抑制させる低温4℃の試験区を採用することにより、受動拡散経由の排出量のみを定量し（図３の工程５、（1））、工程５の試験区２との比較においてトランスポータ経由による血管側化合物排出量を算出（定量）することが可能となる。各化合物には細胞内外を移動するための特異的なトランスポータが存在する。したがって、受動拡散経由の排出量を排除し、トランスポータ経由での排出量を定量できることは、各化合物に特異的な排出量を定量できることを意味する。バッファの種類、量、およびインキュベーション温度と時間は特に限定されない。上述同様に、工程５の試験区２と試験区３から、回収化合物を定量することにより、トランスポータ経由の排出画分を算出することができる。【０１１８】
工程５の試験区３（ＥＡ３工程）において、インキュベーション時間を変えながら、すなわち複数のタイムポイントでウェルから培地をサンプリングする。例えば、タイムポイントＴとＴ’（Ｔ＋ｔ２）においてウェルから培地をサンプリングする。サンプリングされた培地中の化合物の測定方法は後述する通りである。それにより、ＥＡ３工程において、間隔ｔ２を空けた化合物量Ｂ３及びＢ３’が求められる。式（Ｂ３’−Ｂ３）／ｔ２により、受動拡散による細胞のベーサル／バソラテラル面からの化合物の排出速度を算出する。ただし、場合によっては便宜的に当該工程の開始時点をタイムポイントＴに適用してもよい。【０１１９】
尚、本実施例では試験区１、２、３を用いて排出画分を夫々算出する例について示したが、試験区の数は必ず３つである必要はない。例えば、胆管側排出（3）と、第二血管側排出（（1）+（2））のみを分離したいのであれば、試験区１および２のみを実施すればよいし、第二血管側排出において、拡散（1）とトランスポータ（1）を単に分離したいのであれば、試験区２、３のみを実施すればよい。また、必要に応じて、別途4℃の崩壊系を設けることにより、毛細胆管側への排出のうち、トランスポータ経由の排出を抑制し、拡散による排出分のみを測定することができる。これにより、例えば、この4℃崩壊系と試験区３との比較から、拡散による毛細胆管側への排出とトランスポータ経由による毛細胆管側への排出分を切り分けて評価することが可能となる。【０１２０】
さらに、試験区１（ＥＡ１工程）と試験区２（ＥＡ２工程）との差を算出することによって、単位時間内における胆汁排泄量を求めることができる。具体的には、上述した複数のタイムポイントＴとＴ’（Ｔ＋ｔ２）間の時間（ここでは間隔ｔ２）を分母とし、複数のタイムポイントにおける化合物量の差（すなわち胆汁排泄量）を分子として算出する。例えば、式｛（Ｂ１’−Ｂ２’）−（Ｂ１−Ｂ２）／ｔ２により、胆汁排泄量、すなわち細胞のアピカル面からの化合物の排出速度を算出することができる。ただし、場合によっては便宜的に当該工程の開始時点をタイムポイントＴに適用してもよい。【０１２１】
また、試験区２（ＥＡ２工程）と試験区３（ＥＡ３工程）との差を算出することによって、単位時間内におけるトランスポータ経由による血中排泄量を求めることができる。具体的には、上述した複数のタイムポイントＴとＴ’（Ｔ＋ｔ２）間の時間（ここでは間隔ｔ２）を分母とし、複数のタイムポイントにおける化合物量の差（すなわちトランスポータ経由の血中排泄量）を分子として算出する。例えば、式｛（Ｂ２’−Ｂ３’）−（Ｂ２−Ｂ３）／ｔ２により、トランスポータ経由による血中排泄量、すなわちトランスポータ経由による細胞のベーサル／バソラテラル面からの化合物の排出速度を算出することができる。ただし、場合によっては便宜的に当該工程の開始時点をタイムポイントＴに適用してもよい。【０１２２】
上述した試験区１〜３夫々における工程は、どの順番で行ってもよいし、各工程を並行して実施してもよい。【０１２３】
＜工程６：胆管画分、細胞内画分の回収＞
再び工程６では3つの試験区とも共通の操作に戻る。工程６では、細胞内残留画分の定量を行うための化合物の回収を行う。蛍光薬剤等をプレートリーダ等を用いて定量を行う場合には、1％の界面活性剤を含むハンクス液を例えば200μL添加し、懸濁し、全量を回収することが望ましい（図２の工程６）。これにより、細胞膜を破砕し、細胞内に残留する化合物を排出させることが可能となる。得られたサンプルを培養プレートに移し、プレートリーダを用いて蛍光計測を行った。ブランク測定用にハンクス液のみを添加したウェルを準備する。励起波長484nm、吸収波長519nmで蛍光強度を測定する。【０１２４】
また、化合物を質量分析（LCMS）装置等を用いて定量する場合には、水添加による低張化、有機溶剤処理等により、細胞内残留分抽出後にメタノール等の有機溶剤を用いて懸濁し、全量を回収する（図２の工程６）。その後、LCMS装置を用い、後述のように化合物の定量を行う。【０１２５】
＜測定結果をもとにした各画分への分配比率の決定、およびスコア付け＞
上記工程により得られた化合物量を反映した蛍光強度をもとに、各画分への分配比率を計算する。ここでは、工程５、６の総和（図３、B#＋C#＝（1）＋（2）＋（3）＋（4））を化合物量100％とする。この場合を「パターン１」とする。【０１２６】
蛍光量測定により求めた6種類の値（B1、B2、B3、C1、C2、C3）から、図４のパターン１に示すような各区分への分配比率が求められる。これらの値から、
・拡散のみによる第二血管側排出画分（Extracellular Efflux by Diffusion、ExEfx-Dif）はB3、
・トランスポータ経由のみによる第二血管側排出画分（Extracellular Efflux by Transporter、ExEfx-TP）はB2−B3、
・胆管側排出画分（Bile Canaliculi Efflux、BCEfx）はB1−B2、
・細胞内残留画分（Cell）はC1
に対応づけられる。この結果をもとに、図５のパターン１のような円グラフが描画でき、各画分への分配比率の全体像を視覚的に理解することが可能となる。【０１２７】
さらに、定量結果をもとに、以下のような化合物固有のスコア付けが可能になる。本実施例では、算出したCDFのスコアの一例を示す。算出されるスコアはこれらに限らない。【０１２８】
トランスポータ経由での血管側排出を評価するスコアは、
・第二血管側排出化合物量に対するトランスポータ経由で排出された化合物量の割合（Ratio of Extracellular Efflux by Diffusion、RexEMTP）として（B2−B3）／B2
によって求められる。【０１２９】
胆管への排泄を評価するスコアは、
・細胞内に取り込まれた全化合物量に対する胆管排泄化合物量の割合（Biliary Retention Drug、BiRD）として（B1−B2）／（C1＋C2）、
または、別法の、
・細胞内に残留している化合物量に対する胆管排泄化合物量の割合として（C2−C1）／C2、あるいは（B1−B2）／C1
等によって求められる。【０１３０】
＜異なる化合物間の分配比率およびスコアの比較＞
CDFをRhodamine123に変えて上記と同様の操作により、図６に示す結果（パターン１）を得ることができる。CDFの結果を示す図５（パターン１）とは明らかに異なる分配比率を検出できることが分かる。【０１３１】
また、例えば、CDFの血管側排出化合物量に対するトランスポータ経由で排出された化合物量の割合（RexEMTP）と、細胞内に取り込まれた全化合物量に対する胆管排泄化合物量の割合（BiRD）は、それぞれ、41.08、18.58であるのに対し、Rhodamine123のそれらは、52.52、4.92となり、CDFはRhodamine123に比べて胆管に排泄されやすく、血管側には排出されにくい性質を保持した化合物であることがわかる。以上のように、本発明により、それぞれの化合物がどのような動態を示すかを評価することが可能になる。【０１３２】
＜化合物動態の視覚化＞
上述のようにして求めた化合物の取込量および排泄量に基づいて、細胞内の化合物動態を図１のように化合物取込・排泄曲線（Disposition curve）としてグラフ化することによって、化合物の動態を視覚的に理解することが可能となる。
【実施例２】
【０１３３】
実施例２では、測定結果をもとにした各画分への分配比率の決定、およびスコア付けについて、実施例１とは異なる方法を用いた場合について説明する。【０１３４】
本実施例では、図３に記載のS#（工程４に相当）の定量値を利用することにより、実施例１のパターン１で示した各画分への分配比率に加えて、投与化合物が細胞内に留まりやすいのか、留まりにくいのかの情報も与えることができ、より精密な評価をすることが可能となる。すなわち、工程４、５、６の総和（図３、S#＋B#＋C#＝(1)’＋(2)’＋（1）＋（2）＋（3）＋（4））を100％の投与化合物量とする。この場合を「パターン２」とする。したがって、工程４、５、６の各試験区により求められる9種類（S1、S2、S3、B1、B2、B3、C1、C2、C3）を評価指標として用いることができる。【０１３５】
蛍光量測定により求めた9種類の値から、図４のパターン２に示すような各区分への分配比率が求められる。これらの値から、
・第一血管側排出画分（Sup画分）はS1（≒S2≒S3）、
・拡散のみによる第二血管側排出画分（Extracellular Efflux by Diffusion、ExEfx-Dif）はB3、
・トランスポータ経由のみによる第二血管側排出画分（Extracellular Efflux by Transporter、ExEfx-TP）はB2−B3、
・胆管側排出画分（Bile Canaliculi Efflux、BCEfx）はB1−B2、
・細胞内残留画分（Cell）はC1
に対応づけられる。この結果をもとに、図５のパターン２のような円グラフが描画でき、各画分への分配比率全体像を視覚的に理解することが可能となる。実施例２で示した方法を用いることにより、細胞内に留まりやすいか留まりにくいかの指標となるSup画分が、CDFでは70.82であるのに対し、Rhodamine123では39.29（図６、パターン２）となり、CDFが血管側に排出されやすい傾向にあることがわかる。このことは、実施例１の細胞内残留画分評価に一致する。【０１３６】
さらに、定量結果をもとに、化合物固有のスコア付けが可能になるが、これは実施例１に記載の通りである。
【実施例３】
【０１３７】
本実施例では、EA工程に移行する細胞内化合物量を基準（100％）として解析する（パターン３）。試験区１〜３における化合物量は原理的には同一であるべきであるが、実験誤差が生じるため、平均値に基づいて解析する。実施例１のパターン１で示した各画分の化合物量を、以下の式に当てはめる。
化合物量100％＝｛（B1＋C1）＋（B2＋C2）＋（B3＋C3）｝／3【０１３８】
このパターン３により、パターン１より精確な解析が可能となる。
【実施例４】
【０１３９】
本実施例では、細胞内への化合物の総取込量を基準（100％）として解析する（パターン４）。試験区１〜３における化合物量は原理的には同一であるべきであるが、実験誤差が生じるため、平均値に基づいて解析する。実施例２のパターン２で示した各画分の化合物量を、以下の式に当てはめる。
化合物量100％＝｛（S1＋B1＋C1）＋（S2＋B2＋C2）＋（S3＋B3＋C3）｝／3【０１４０】
このパターン４により、パターン２より精確な解析が可能となる。
【実施例５】
【０１４１】
実施例５では、実施例１〜４で述べてきた一連の工程の自動化を実現する装置の一例について述べる。尚、後述する装置の動作の目的、各構成の役割等について、上記実施例１〜４と重複する場合は、記載を省略する場合がある。【０１４２】
実施例１〜４で示した試験区１〜３の夫々に設定される細胞を保持する領域について、後述する装置構成においては、「試験区１用ウェル」「試験区２用ウェル」「試験区３用ウェル」等の表現を用いて説明するが、これらは、例えば上述の「ウェル培養プレート」の複数の容器を夫々の試験区ごとに設定してもよいし、一つのウェル培養プレートの中の複数のウェルを区切って、区切った領域ごとに、例えば「第１容器」「第２容器」「第３容器」等として設定してもよい。【０１４３】
特に試験区１用ウェルと試験区２用ウェルは、ほぼ同じ温度調整を行うため、ひとつのウェル培養プレート内を区切って設定した方が精度や速度の観点から効率的に評価することが可能となる。【０１４４】
尚、後述の装置動作について各試験区用ウェル（容器）の交換作業については、自動で交換しても手作業で交換してもよい。当該容器の交換や設置作業については、以下省略して説明することとする。【０１４５】
本装置は、図８に示すように、培養部106、サンプル調製部107（含む入力部107A）、分析部108、および表示部109により構成される。さらにサンプル調製部107は、後述する各容器（プレート）内の温度を調整する温度調整部107Bと、液体を容器に供給または回収可能な送液部107C等を有している。分析部108は、化合物等の成分の量を測定する測定部108Aと、測定部から取得した化合物等の成分の量から、トランスポータ経由、胆管経由、細胞内残存、トランスポータと胆管以外から排出される分（拡散）の夫々の量、複数のタイムポイントでの測定結果に基づいて排出速度および／または取込速度を解析する解析部108Bを有する。上記装置構成は一例であり、例えば解析部のみ別の装置に実行させ、当該別の装置に測定部から取得した情報を送信する等の構成としてもよい。【０１４６】
また、サンプル調製部の詳細構成を図９および１０に示す。サンプル調製部では、これまで実施例１〜４で述べてきたように、分析対象となる各画分を自動調製することが目的となる。各構成要素の説明は、後述のフローチャートにしたがって述べる。【０１４７】
自動計測装置の動作フローチャートは図１１に示す。図１１のフローチャートは一例にすぎず、実施例１＜工程２＞に記載の通り、化合物投与のタイミングが異なる場合は、この限りではない。本実施例においては、細胞を保持する容器について、複数の細胞保持領域（ウェル）を有するプレートを一例として用いて説明するが、容器はプレートに限られるものでなく、細胞を保持できるものであればよい。【０１４８】
＜培養部からサンプル調製部への移送＞
まず、肝細胞が培養部106において培養される（図８および１１）（図１１(a)サブ工程１）。その後、培養された肝細胞を保持したプレートはサンプル調製部の第一温調機能付きプレートホルダ210上、および第二温調機能付きプレートホルダ211上に移送される（図８および１１）（図１１(a)サブ工程２）。【０１４９】
＜サンプル調製：実施例１〜４の工程１に相当＞
送液部107Cに設置されている、液体を吸引するための吸引ノズルが付加された吸引ヘッド205が、上記プレートホルダ上の、除去すべき培地が満たされた培養プレート001のウェル002に移動し、ウェルから培地を吸引して全量除去する（図１１(a)サブ工程３）。除去された培地は、廃液槽206に廃棄回収される。【０１５０】
次に、液体を保持するチップを、吸引ノズルに取り付けられたチップヘッド204に、複数のチップが保管されているチップラック207から装着する。チップヘッドが常温薬液ラック209に移動し、バッファを吸引する（図１１(a)サブ工程４）。目的のウェルに移動し、バッファを添加した後（図１１(a)サブ工程５）、チップヘッドがダストボックス214に移動し、チップを廃棄する。コンタミネーション等を防ぐため、取替え可能なチップをここでは利用するが、その限りではない。シリンジポンプコントローラ201は、シリンジポンプ203を制御し、その結果、チップヘッド204および吸引ヘッド205を制御する。また、温調コントローラ202は、第一温調機能付きプレートホルダ210および第二温調機能付きプレートホルダ211や、培養部の温度を調節する。【０１５１】
吸引ヘッドは、バッファで満たされているウェルに移動し、バッファの除去を行う（図１１(a)サブ工程６）。除去された培地は、廃液槽206に廃棄回収される。この工程を合計2回繰り返す（洗浄工程）（図１１(a)サブ工程７）。【０１５２】
次に、チップヘッド204にチップラック207内のチップを装着し、チップヘッドが常温薬液ラック209に移動し、バッファを吸引する（図１１(a)サブ工程８）。目的のウェルに移動し、バッファを添加した後、チップヘッドがダストボックス214に移動し、チップを廃棄する。37℃で10分間待機する（コンディショニング）（図１１(a)サブ工程９）。その後、吸引ヘッド205が、バッファで満たされているウェルに移動し、バッファを全量除去する（図１１(a)サブ工程１０）。【０１５３】
＜サンプル調製：実施例１〜４の工程２に相当＞
チップヘッド204にチップラック207内のチップを装着し、チップヘッドが常温薬液ラック209に移動し、薬液を吸引する（図１１(a)サブ工程１１）。目的のウェルに移動し、薬液を添加した後（図１１(a)サブ工程１２）、チップヘッド204がダストボックス214に移動し、チップを廃棄する。37℃で30分間待機する（図１１(a)サブ工程１２）。その後、容器を保持する容器保持部の一構成例である、第一温調機能付きプレートホルダ210、および第二温調機能付きプレートホルダ211が37℃から4℃に変化した後（図１１(a)サブ工程１３）、吸引ヘッド205が、薬液で満たされているウェルに移動し、薬液を全量除去する（図１１(a)サブ工程１４）。【０１５４】
尚、本実施例における温度調整部は、プレートホルダに温調機能を搭載する説明としたが、温度調節部は容器保持部と別離して存在してもよい。【０１５５】
＜サンプル調製：実施例１〜４の工程３に相当＞
チップヘッド204にチップラック207内のチップを装着し、チップヘッドが冷蔵薬液ラック208に移動し、バッファを吸引する（図１１(a)サブ工程１５）。冷蔵した薬液を用いるのは、トランスポータ活性のような能動的な生命現象を停止させるためであることは前述の通りである。冷蔵薬液ラック208はこの目的のため、薬液、バッファ等を低温に保持するためのものである。目的のウェルに移動し、バッファを添加した後（図１１(a)サブ工程１６）、チップヘッド204がダストボックス214に移動し、チップを廃棄する。吸引ヘッドがバッファで満たされているウェルに移動し、バッファを除去する（図１１(a)サブ工程１７）。除去された培地は、廃液槽206に廃棄される。この工程を合計3回繰り返す（洗浄工程）（図１１(a)サブ工程１８）。【０１５６】
＜サンプル調製：実施例１〜４の工程４に相当＞
第一温調機能付きプレートホルダ210、および第二温調機能付きプレートホルダ211が4℃から37℃に変化した後（図１１(a)サブ工程１９）、チップヘッド204にチップラック207内のチップを装着し、チップヘッドが冷蔵薬液ラック208に移動し、バッファを吸引する（図１１(a)サブ工程２０）。目的のウェルに移動し、バッファを添加した後（図１１(a)サブ工程２１）、チップヘッド204がダストボックス214に移動し、チップを廃棄する。37℃で30分間待機する（図１１(a)サブ工程２０）。その後、第一温調機能付きプレートホルダ210、および第二温調機能付きプレートホルダ211が37℃から4℃に変化した後（図１１(a)サブ工程２２）、チップヘッド204にチップラック207内のチップを装着し、化合物を含むバッファで満たされたウェルに移動し、化合物を含むバッファ（上清）を吸引し、第一プレートホルダ212、および第二プレートホルダ213上の回収用の回収プレートに分注する（回収）（図１１(a)サブ工程２３）。【０１５７】
＜サンプル調製：実施例１〜４の工程５に相当＞
第一温調付きプレートホルダ210が4℃から37℃に変化した後（図１１(a)サブ工程２４）、チップヘッド204にチップラック207内のチップを装着し、チップヘッドが常温薬液ラック209に移動し、EGTAを含むバッファを吸引する（図１１(a)サブ工程２５）。第一プレートホルダ212上の試験区１用のウェルに移動し、EGTAを含むバッファを添加した後（図１１(b)サブ工程２６）、チップヘッド204がダストボックス214に移動し、チップを廃棄する。37℃で30分間待機する（図１１(b)サブ工程２６）。【０１５８】
チップヘッド204にチップラック207内のチップを装着し、チップヘッドが常温薬液ラック209に移動し、バッファを吸引する（図１１(b)サブ工程２７）。第一プレートホルダ212上の試験区２用のウェルに移動し、バッファを添加した後（図１１(b)サブ工程２８）、チップヘッド204がダストボックス214に移動し、チップを廃棄する。37℃で30分間待機する（図１１(b)サブ工程２８）。【０１５９】
チップヘッド204にチップラック207内のチップを装着し、チップヘッドが冷蔵薬液ラック209に移動し、バッファを吸引する（図１１(b)サブ工程２９）。【０１６０】
第二プレートホルダ213上の試験区３用のウェルに移動し、バッファを添加した後（図１１(b)サブ工程３０）、チップヘッド204がダストボックス214に移動し、チップを廃棄する。4℃で30分間待機する（図１１(b)サブ工程３０）。【０１６１】
チップヘッド204にチップラック207内のチップを装着し、化合物を含むEGTAバッファで満たされたウェルに移動し、化合物を含むEGTAバッファ（上清）を吸引し、第一プレートホルダ212上の回収用の回収プレートに分注（回収）する（図１１(b)サブ工程３１）。【０１６２】
チップヘッド204にチップラック207内のチップを装着し、化合物を含むバッファで満たされたウェルに移動し、化合物を含むバッファ（上清）を吸引し、第一プレートホルダ212上の回収用の回収プレートに分注（回収）する（図１１(b)サブ工程３２）。【０１６３】
チップヘッド204にチップラック207内のチップを装着し、化合物を含むEGTAバッファで満たされたウェルに移動し、化合物を含むバッファ（上清）を吸引し、第一プレートホルダ213上の回収用の回収プレートに分注する（回収）する（図１１(b)サブ工程３３）。【０１６４】
第一温調機能付きプレートホルダ210、および第二温調機能付きプレートホルダ211がともに室温に変化した後（図１１(b)サブ工程３４）、チップヘッド204にチップラック207内のチップを装着し、チップヘッドが常温薬液ラック209に移動し、1％TritonX-100または純水/メタノールを吸引する（図１１(b)サブ工程３５）。第一温調機能付きプレートホルダ210、および第二温調機能付きプレートホルダ211上の試験区１、２、３用のウェルに移動し、1％TritonX-100または純水/メタノールを添加した後（図１１(b)サブ工程３６）、チップヘッド204がダストボックス214に移動し、チップを廃棄する。【０１６５】
チップヘッド204にチップラック207内のチップを装着し、上記試薬で満たされたウェルに移動し、細胞懸濁液を全量吸引し、第一プレートホルダ212および第二プレートホルダ213上の回収用の回収プレートに分注する（回収）（図１１(b)サブ工程３７）。【０１６６】
上記装置の動作は、実施例１〜４の試験区１〜３の夫々工程における動作を順次実施した場合について述べたが、各工程は順番で行ってもよいし、各工程を並行して実施してもよい。【０１６７】
＜サンプル調製部から測定部への移送＞
培養プレートの回収された化合物は、測定部に移送される（図１１(b)サブ工程３８）。測定部において、プレートリーダ、あるいはLCMSによる化合物の測定がおこなわれる（図１１(b)サブ工程３９）。【０１６８】
＜解析部による分配比率とスコアの算出および結果の表示＞
測定結果から各画分への分配比率とスコアならびに各排出速度と取込速度を算出する（図１１(b)サブ工程４０）。その後、得られた算出値を表示部に表示する（図１１(b)サブ工程４１）。
【符号の説明】
【０１６９】
001  培養プレート
002  ウェル
101  肝細胞
102  トランスポータ
103  毛細胆管
104  ベーサル（Basal）/バソラテラル（Basolateral）面
105  アピカル（Apical）面
201  シリンジポンプコントローラ
202  温調コントローラ
203  シリンジポンプ
204  チップヘッド
205  吸引ヘッド
206  廃液槽
207  チップラック
208  冷蔵薬液ラック
209  常温薬液ラック
210  第一温調機能付きプレートホルダ
211  第二温調機能付きプレートホルダ
212  第一プレートホルダ
213  第二プレートホルダ
214  ダストボックス
【図１】
2020174568.tif 000003
【図２】
2020174568.tif 000004
【図３】
2020174568.tif 000005
【図４】
2020174568.tif 000006
【図５】
2020174568.tif 000007
【図６】
2020174568.tif 000008
【図７】
2020174568.tif 000009
【図８】
2020174568.tif 000010
【図９】
2020174568.tif 000011
【図１０】
2020174568.tif 000012
【図１１（ａ）】
2020174568.tif 000013
【図１１（ｂ）】
2020174568.tif 000014
【手続補正書】
【提出日】令和3年3月1日(2021.3.1)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞を用いた化合物の動態解析方法であって、
対象の化合物を含み細胞を各々収容した第１容器、第２容器および第３容器のそれぞれに第１バッファ液を添加し、前記容器内の温度を第１温度に調整して保温し、前記容器内の温度を前記第１温度より低い第２温度に調整するＣＥ工程と、
前記第１容器、前記第２容器および前記第３容器のそれぞれから、前記第１バッファ液を回収するＣＥ終了工程と、
前記ＣＥ終了工程の後、前記第１容器に、細胞間接着を解除する試薬を含む第２バッファ液を添加し、前記第１容器内の温度を第３温度に調整して保温するＥＡ１工程と
を含み、
前記ＣＥ工程において、前記第１バッファ液中の前記化合物の量ＳおよびＳ’を間隔ｔ１を空けて測定し、
前記ＥＡ１工程において、前記第２バッファ液中の前記化合物の量Ｂ１およびＢ１’を間隔ｔ２を空けて測定し、
前記量ＳおよびＳ’と前記間隔ｔ１とに基づき、ＣＥ工程の前記細胞のベーサル／バソラテラル面からの前記化合物の排出速度を算出し、
前記量Ｂ１およびＢ１’と前記間隔ｔ２とに基づき、ＥＡ１工程の前記細胞のベーサル／バソラテラル面およびアピカル面からの前記化合物の排出速度を算出し、
ＣＥ工程の前記細胞のベーサル／バソラテラル面からの前記化合物の排出速度とＥＡ１工程の前記細胞のベーサル／バソラテラル面およびアピカル面からの前記化合物の排出速度に基づいて、前記細胞における化合物の動態を解析する、
化合物の動態解析方法。
【請求項２】
請求項１に記載の化合物の動態解析方法であって、
前記ＣＥ終了工程の後、前記第２容器に、第３バッファ液を添加し、前記第２容器内の温度を前記第３温度に調整して保温するＥＡ２工程を含み、
前記ＥＡ２工程において、前記第３バッファ液中の前記化合物の量Ｂ２およびＢ２’を前記間隔ｔ２を空けて測定し、
前記量Ｂ２およびＢ２’と前記間隔ｔ２とに基づき、ＥＡ２工程の前記細胞のベーサル／バソラテラル面からの前記化合物の排出速度を算出し、
ＣＥ工程の前記細胞のベーサル／バソラテラル面からの前記化合物の排出速度と、ＥＡ１工程の前記細胞のベーサル／バソラテラル面およびアピカル面からの前記化合物の排出速度と、ＥＡ２工程の前記細胞のベーサル／バソラテラル面からの前記化合物の排出速度に基づいて、前記細胞における化合物の動態を解析する、
化合物の動態解析方法。
【請求項３】
請求項２に記載の化合物の動態解析方法であって、
前記量Ｂ１およびＢ１’ならびにＢ２およびＢ２’と前記間隔ｔ２とに基づき、前記細胞のアピカル面からの前記化合物の排出速度を算出し、
ＣＥ工程の前記細胞のベーサル／バソラテラル面からの前記化合物の排出速度と、ＥＡ１工程の前記細胞のベーサル／バソラテラル面およびアピカル面からの前記化合物の排出速度と、ＥＡ２工程の前記細胞のベーサル／バソラテラル面からの前記化合物の排出速度と、前記細胞のアピカル面からの前記化合物の排出速度に基づいて、前記細胞における化合物の動態を解析する、
化合物の動態解析方法。
【請求項４】
請求項２に記載の化合物の動態解析方法であって、
前記ＣＥ終了工程の後、前記第３容器に、前記第３バッファ液を添加し、前記第３容器内の温度を前記第３温度より低い第４温度に調整して保温するＥＡ３工程を含み、
前記ＥＡ３工程において、前記第３バッファ液中の前記化合物の量Ｂ３およびＢ３’を前記間隔ｔ２を空けて測定し、
前記量Ｂ３およびＢ３’と前記間隔ｔ２とに基づき、ＥＡ３工程の受動拡散による前記細胞のベーサル／バソラテラル面からの前記化合物の排出速度を算出し、
ＣＥ工程の前記細胞のベーサル／バソラテラル面からの前記化合物の排出速度と、ＥＡ１工程の前記細胞のベーサル／バソラテラル面およびアピカル面からの前記化合物の排出速度と、ＥＡ２工程の前記細胞のベーサル／バソラテラル面からの前記化合物の排出速度と、ＥＡ３工程の受動拡散による前記細胞のベーサル／バソラテラル面からの前記化合物の排出速度に基づいて、前記細胞における化合物の動態を解析する、
化合物の動態解析方法。
【請求項５】
請求項４に記載の化合物の動態解析方法であって、
前記量Ｂ２およびＢ２’ならびにＢ３およびＢ３’と前記間隔ｔ２とに基づき、トランスポータ経由による前記細胞のベーサル／バソラテラル面からの前記化合物の排出速度を算出し、
ＣＥ工程の前記細胞のベーサル／バソラテラル面からの前記化合物の排出速度と、ＥＡ１工程の前記細胞のベーサル／バソラテラル面およびアピカル面からの前記化合物の排出速度と、ＥＡ２工程の前記細胞のベーサル／バソラテラル面からの前記化合物の排出速度と、トランスポータ経由による前記細胞のベーサル／バソラテラル面からの前記化合物の排出速度に基づいて、前記細胞における化合物の動態を解析する、
化合物の動態解析方法。
【請求項６】
細胞を用いた化合物の動態解析方法であって、
対象の化合物を含み細胞を各々収容した第１容器、第２容器および第３容器のそれぞれに第１バッファ液を添加し、前記容器内の温度を第１温度に調整して保温し、前記容器内の温度を前記第１温度より低い第２温度に調整するＣＥ工程と、
前記第１容器、前記第２容器および前記第３容器のそれぞれから、前記第１バッファ液を回収するＣＥ終了工程と、
前記ＣＥ終了工程の後、前記第２容器に、第３バッファ液を添加し、前記第２容器内の温度を第３温度に調整して保温するＥＡ２工程と
を含み、
前記ＣＥ工程において、前記第１バッファ液中の前記化合物の量ＳおよびＳ’を間隔ｔ１を空けて測定し、
前記ＥＡ２工程において、前記第３バッファ液中の前記化合物の量Ｂ２およびＢ２’を間隔ｔ２を空けて測定し、
前記量ＳおよびＳ’と前記間隔ｔ１とに基づき、ＣＥ工程の前記細胞のベーサル／バソラテラル面からの前記化合物の排出速度を算出し、
前記量Ｂ２およびＢ２’と前記間隔ｔ２とに基づき、ＥＡ２工程の前記細胞のベーサル／バソラテラル面からの前記化合物の排出速度を算出し、
ＣＥ工程の前記細胞のベーサル／バソラテラル面からの前記化合物の排出速度とＥＡ２工程の前記細胞のベーサル／バソラテラル面からの前記化合物の排出速度に基づいて、前記細胞における化合物の動態を解析する、
化合物の動態解析方法。
【請求項７】
細胞を用いた化合物の動態解析方法であって、
対象の化合物を含み細胞を各々収容した第１容器、第２容器および第３容器のそれぞれに第１バッファ液を添加し、前記容器内の温度を第１温度に調整して保温し、前記容器内の温度を前記第１温度より低い第２温度に調整するＣＥ工程と、
前記第１容器、前記第２容器および前記第３容器のそれぞれから、前記第１バッファ液を回収するＣＥ終了工程と、
前記ＣＥ終了工程の後、前記第３容器に、第３バッファ液を添加し、前記第３容器内の温度を第３温度より低い第４温度に調整して保温するＥＡ３工程と
を含み、
前記ＣＥ工程において、前記第１バッファ液中の前記化合物の量ＳおよびＳ’を間隔ｔ１を空けて測定し、
前記ＥＡ３工程において、前記第３バッファ液中の前記化合物の量Ｂ３およびＢ３’を間隔ｔ２を空けて測定し、
前記量ＳおよびＳ’と前記間隔ｔ１とに基づき、ＣＥ工程の前記細胞のベーサル／バソラテラル面からの前記化合物の排出速度を算出し、
前記量Ｂ３およびＢ３’と前記間隔ｔ２とに基づき、ＥＡ３工程の受動拡散による前記細胞のベーサル／バソラテラル面からの前記化合物の排出速度を算出し、
ＣＥ工程の前記細胞のベーサル／バソラテラル面からの前記化合物の排出速度とＥＡ３工程の前記細胞の受動拡散によるベーサル／バソラテラル面からの前記化合物の排出速度に基づいて、前記細胞における化合物の動態を解析する、
化合物の動態解析方法。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれか１項に記載の化合物の動態解析方法であって、
前記ＣＥ工程の前に、容器内において前記化合物を含む溶液に前記細胞を曝露し、前記細胞に前記化合物を取り込ませる取込工程を含み、
前記取込工程において、前記溶液中の前記化合物の量ＡおよびＡ’を間隔ｔ３を空けて測定し、
前記量ＡおよびＡ’と前記間隔ｔ３とに基づき、前記細胞が前記化合物を取り込む取込速度を算出する、
化合物の動態解析方法。
【請求項９】
請求項１〜７のいずれか１項に記載の化合物の動態解析方法であって、
前記細胞が肝細胞を含む、化合物の動態解析方法。
【国際調査報告】
2020174568.tif 000015
2020174568.tif 000016
2020174568.tif 000017
2020174568.tif 000018