(57)【要約】  本発明の課題は、ＲＮＡウイルスに対して効果を示す、ピラジン誘導体と特定の化合物の新たな組み合わせを含むＲＮＡウイルス感染症治療剤を提供すること、および複数のＲＮＡウイルスに対する抗ウイルス活性を同時に増強できる、ピラジン誘導体と特定の化合物の組み合わせを含むＲＮＡウイルス感染症治療剤を提供することである。本発明によれば、ピラジン誘導体又はその塩と細胞内におけるピラジン誘導体リボース三リン酸体の量を増加させる化合物とを組み合わせてなるＲＮＡウイルス感染症治療剤が提供される。
2020138067.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
一般式［１］
【化１】
2020138067.tif 000021
（式中、Ｒ１及びＲ２は、同一又は異なって水素原子又はハロゲン原子を；Ｒ３は、水素原子又はアミノ保護基を示す。）で表されるピラジン誘導体又はその塩と、細胞内におけるピラジン誘導体リボース三リン酸体の量を増加させる化合物とを組み合わせてなる、ＲＮＡウイルス感染症治療剤。
【請求項２】
Ｒ１が水素原子、Ｒ２がフッ素原子又は水素原子、及びＲ３が水素原子である請求項１記載の治療剤。
【請求項３】
Ｒ１が水素原子、Ｒ２がフッ素原子、及びＲ３が水素原子である請求項２記載の治療剤。
【請求項４】
細胞内におけるピラジン誘導体リボース三リン酸体の量を増加させる化合物が、葉酸拮抗剤、チオプリン系代謝拮抗剤、チアゾフリン、アルキル化剤およびキサンチン誘導体からなる群から選ばれる一種以上の化合物である、請求項１から３いずれか一項に記載の治療剤。
【請求項５】
葉酸拮抗剤がメトトレキサート又はプララトレキサートであり、チオプリン系代謝拮抗剤が一般式［２］
【化２】
2020138067.tif 000022
（式中、Ｒ４は、水素原子又は保護されていてもよいアミノ基を；Ｒ５は、水素原子又は一般式［３］
【化３】
2020138067.tif 000023
（式中、Ｒ６は、水素原子、Ｃ１−６アルキル基又はカルボキシ基を；Ｒ７は、水素原子、Ｃ１−６アルキル基、ベンジル基又はｐ−ニトロベンジル基を示す。）を示す。）で表されるメルカプトプリン誘導体であり、アルキル化剤がテモゾロミドであり、キサンチン誘導体がテオフィリンである、請求項４に記載の治療剤。
【請求項６】
チオプリン系代謝拮抗剤が、６−メルカプトプリン、アザチオプリン又は６−チオグアニンである請求項５に記載の治療剤。
【請求項７】
一つ以上の他のＲＮＡウイルス感染症治療剤又は抗ＲＮＡウイルス阻害作用を示す薬剤をさらに組み合わせてなる、請求項１から６いずれか一項に記載の治療剤。
【請求項８】
他のＲＮＡウイルス感染症治療剤又は抗ＲＮＡウイルス阻害作用を示す薬剤がリバビリンである、請求項７に記載の治療剤。
【請求項９】
一般式［１］
【化４】
2020138067.tif 000024
（式中、Ｒ１及びＲ２は、同一又は異なって水素原子又はハロゲン原子を；Ｒ３は、水素原子又はアミノ保護基を示す。）で表されるピラジン誘導体又はその塩と、葉酸拮抗剤、チオプリン系代謝拮抗剤、チアゾフリン、アルキル化剤およびキサンチン誘導体からなる群から選ばれる一種以上の化合物とを組み合わせてなる、ＲＮＡウイルス感染症治療剤。
【請求項１０】
細胞内におけるピラジン誘導体リボース三リン酸体の量を増加させる化合物と併用される、一般式［１］
【化５】
2020138067.tif 000025
（式中、Ｒ１、Ｒ２は、同一又は異なって水素原子又はハロゲン原子を；Ｒ３は、水素原子又はアミノ保護基を示す。）で表されるピラジン誘導体又はその塩を含有する、ＲＮＡウイルス感染症治療剤。
【請求項１１】
Ｒ１が水素原子、Ｒ２がフッ素原子又は水素原子、及びＲ３が水素原子である請求項１０記載の治療剤。
【請求項１２】
Ｒ１が水素原子、Ｒ２がフッ素原子、及びＲ３が水素原子である請求項１１記載の治療剤。
【請求項１３】
細胞内におけるピラジン誘導体リボース三リン酸体の量を増加させる化合物が、葉酸拮抗剤、チオプリン系代謝拮抗剤、チアゾフリン、アルキル化剤およびキサンチン誘導体からなる群から選ばれる一種以上の化合物である、請求項１０から１２いずれか一項に記載の治療剤。
【請求項１４】
葉酸拮抗剤がメトトレキサート又はプララトレキサートであり、チオプリン系代謝拮抗剤が一般式［２］
【化６】
2020138067.tif 000026
（式中、Ｒ４は、水素原子又は保護されていてもよいアミノ基を；Ｒ５は、水素原子又は一般式［３］
【化７】
2020138067.tif 000027
（式中、Ｒ６は、水素原子、Ｃ１−６アルキル基又はカルボキシ基を；Ｒ７は、水素原子、Ｃ１−６アルキル基、ベンジル基又はｐ−ニトロベンジル基を示す。）を示す。）で表されるメルカプトプリン誘導体であり、アルキル化剤がテモゾロミドであり、キサンチン誘導体がテオフィリンである、請求項１３に記載の治療剤。
【請求項１５】
チオプリン系代謝拮抗剤が、６−メルカプトプリン、アザチオプリン又は６−チオグアニンである請求項１４に記載の治療剤。
【請求項１６】
葉酸拮抗剤、チオプリン系代謝拮抗剤、チアゾフリン、アルキル化剤およびキサンチン誘導体からなる群から選ばれる一種以上の化合物と併用される、一般式［１］
【化８】
2020138067.tif 000028
（式中、Ｒ１、Ｒ２は、同一又は異なって水素原子又はハロゲン原子を；Ｒ３は、水素原子又はアミノ保護基を示す。）で表されるピラジン誘導体又はその塩を含有する、ＲＮＡウイルス感染症治療剤。
【請求項１７】
一つ以上の他のＲＮＡウイルス感染症治療剤又は抗ＲＮＡウイルス阻害作用を示す薬剤とさらに併用される、請求項１０から１５いずれか一項に記載の治療剤。
【請求項１８】
他のＲＮＡウイルス感染症治療剤又は抗ＲＮＡウイルス阻害作用を示す薬剤がリバビリンである、請求項１７に記載の治療剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ピラジン誘導体又はその塩と細胞内におけるピラジン誘導体リボース三リン酸体の量を増加させる化合物とを組み合わせてなるＲＮＡウイルス感染症治療剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
インフルエンザウイルスやエボラウイルス等のＲＮＡウイルスは、様々な感染症の原因となり、その対応策が求められている。一方、多くのＲＮＡウイルスに対して幅広い抗ウイルス活性を有する化合物として、ファビピラビル（以下、Ｔ−７０５とも言う）等のピラジン誘導体が知られている（非特許文献１）。【０００３】
これらピラジン誘導体の活性を増強できれば、医薬としてより有用である。これまで、ファビピラビルとノイラミニダーゼ阻害剤を組み合わせることで、インフルエンザウイルスに対して相乗的な効果を示すことが報告されていた（特許文献１）。また、ファビピラビルとゲムシタビン又はオバトクラックスを組み合わせることで、エボラウイルスに対して相乗的な効果を示すことも報告されていた（特許文献２）。【０００４】
しかし、ＲＮＡウイルスは進化により薬剤耐性を獲得する。例えば、ノイラミニダーゼ阻害剤耐性のインフルエンザウイルスが知られている（非特許文献２）。こうした耐性獲得に対抗するため、ＲＮＡウイルスに対して効果を示す、新たな化合物の組み合わせは常に求められている。【０００５】
また前記の通り、多くのＲＮＡウイルスに幅広く効果を示すのがファビピラビルの特徴である。しかし、複数のＲＮＡウイルスに対する抗ウイルス活性を同時に増強できる、ピラジン誘導体と特定の化合物の組み合わせは知られていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】国際公開第０８／０９９８７４号パンフレット
【特許文献２】国際公開第２００７／２０２７８９号パンフレット
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ｐｒｏｃ Ｊｐｎ Ａｃａｄ Ｓｅｒ Ｂ Ｐｈｙｓ Ｂｉｏｌ Ｓｃｉ. ９３, ４４９−４６３.
【非特許文献２】ＣＤＣ Ｈｅａｌｔｈ Ａｄｖｉｓｏｒｙ：ＣＤＣ ｉｓｓｕｅｓ ｉｎｔｅｒｉｍ ｒｅｃｏｍｍｅｎｄａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｕｓｅ ｏｆ ｉｎｆｌｕｅｎｚａ ａｎｔｉｖｉｒａｌｓ ｉｎ ｔｈｅ ｓｅｔｔｉｎｇ ｏｆ ｏｓｅｌｔａｍｉｖｉｒ Ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ａｍｏｎｇ ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ ｉｎｆｌｕｅｎｚａ Ａ （Ｈ１Ｎ１） ｖｉｒｕｓｅｓ, ２００８-０９ Ｓｅａｓｏｎ.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明の課題は、ＲＮＡウイルスに対して効果を示す、ピラジン誘導体と特定の化合物の新たな組み合わせを含むＲＮＡウイルス感染症治療剤を提供することである。また本発明の別の課題は、複数のＲＮＡウイルスに対する抗ウイルス活性を同時に増強できる、ピラジン誘導体と特定の化合物の組み合わせを含むＲＮＡウイルス感染症治療剤を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
このような状況下において、本発明者は、鋭意検討を行った結果、一般式［１］
【化１】
2020138067.tif 000003
（式中、Ｒ１及びＲ２は、同一又は異なって水素原子又はハロゲン原子を；Ｒ３は、水素原子又はアミノ保護基を示す。）で表されるピラジン誘導体又はその塩と、細胞内におけるピラジン誘導体リボース三リン酸体の量を増加させる化合物、特に、葉酸拮抗剤、チオプリン系代謝拮抗剤、チアゾフリン、アルキル化剤およびキサンチン誘導体からなる群から選ばれる一種以上の化合物とを組み合わせて使用すると、複数のＲＮＡウイルスに対する抗ウイルス活性が同時に増強されることを見出し、本発明を完成した。【００１０】
すなわち本発明は、以下を提供する。
［１］
一般式［１］
【化２】
2020138067.tif 000004
（式中、Ｒ１及びＲ２は、同一又は異なって水素原子又はハロゲン原子を；Ｒ３は、水素原子又はアミノ保護基を示す。）で表されるピラジン誘導体又はその塩と、細胞内におけるピラジン誘導体リボース三リン酸体の量を増加させる化合物とを組み合わせてなる、ＲＮＡウイルス感染症治療剤。
［２］
Ｒ１が水素原子、Ｒ２がフッ素原子又は水素原子、及びＲ３が水素原子である［１］に記載の治療剤。
［３］
Ｒ１が水素原子、Ｒ２がフッ素原子、及びＲ３が水素原子である［２］に記載の治療剤。
［４］
細胞内におけるピラジン誘導体リボース三リン酸体の量を増加させる化合物が、葉酸拮抗剤、チオプリン系代謝拮抗剤、チアゾフリン、アルキル化剤およびキサンチン誘導体からなる群から選ばれる一種以上の化合物である、［１］から［３］いずれか一に記載の治療剤。
［５］
葉酸拮抗剤がメトトレキサート又はプララトレキサートであり、チオプリン系代謝拮抗剤が一般式［２］
【化３】
2020138067.tif 000005
（式中、Ｒ４は、水素原子又は保護されていてもよいアミノ基を；Ｒ５は、水素原子又は一般式［３］
【化４】
2020138067.tif 000006
（式中、Ｒ６は、水素原子、Ｃ１−６アルキル基又はカルボキシ基を；Ｒ７は、水素原子、Ｃ１−６アルキル基、ベンジル基又はｐ−ニトロベンジル基を示す。）を示す。）で表されるメルカプトプリン誘導体であり、アルキル化剤がテモゾロミドであり、キサンチン誘導体がテオフィリンである、［４］に記載の治療剤。
［６］
チオプリン系代謝拮抗剤が、６−メルカプトプリン、アザチオプリン又は６−チオグアニンである［５］に記載の治療剤。
［７］
一つ以上の他のＲＮＡウイルス感染症治療剤又は抗ＲＮＡウイルス阻害作用を示す薬剤をさらに組み合わせてなる、［１］から［６］いずれか一に記載の治療剤。
［８］
他のＲＮＡウイルス感染症治療剤又は抗ＲＮＡウイルス阻害作用を示す薬剤がリバビリンである、［７］に記載の治療剤。
［９］
一般式［１］
【化５】
2020138067.tif 000007
（式中、Ｒ１及びＲ２は、同一又は異なって水素原子又はハロゲン原子を；Ｒ３は、水素原子又はアミノ保護基を示す。）で表されるピラジン誘導体又はその塩と、葉酸拮抗剤、チオプリン系代謝拮抗剤、チアゾフリン、アルキル化剤およびキサンチン誘導体からなる群から選ばれる一種以上の化合物とを組み合わせてなる、ＲＮＡウイルス感染症治療剤。
［１０］
細胞内におけるピラジン誘導体リボース三リン酸体の量を増加させる化合物と併用される、一般式［１］
【化６】
2020138067.tif 000008
（式中、Ｒ１、Ｒ２は、同一又は異なって水素原子又はハロゲン原子を；Ｒ３は、水素原子又はアミノ保護基を示す。）で表されるピラジン誘導体又はその塩を含有する、ＲＮＡウイルス感染症治療剤。
［１１］
Ｒ１が水素原子、Ｒ２がフッ素原子又は水素原子、及びＲ３が水素原子である［１０］に記載の治療剤。
［１２］
Ｒ１が水素原子、Ｒ２がフッ素原子、及びＲ３が水素原子である［１１］に記載の治療剤。
［１３］
細胞内におけるピラジン誘導体リボース三リン酸体の量を増加させる化合物が、葉酸拮抗剤、チオプリン系代謝拮抗剤、チアゾフリン、アルキル化剤およびキサンチン誘導体からなる群から選ばれる一種以上の化合物である、［１０］から［１２］いずれか一に記載の治療剤。
［１４］
葉酸拮抗剤がメトトレキサート又はプララトレキサートであり、チオプリン系代謝拮抗剤が一般式［２］
【化７】
2020138067.tif 000009
（式中、Ｒ４は、水素原子又は保護されていてもよいアミノ基を；Ｒ５は、水素原子又は一般式［３］
【化８】
2020138067.tif 000010
（式中、Ｒ６は、水素原子、Ｃ１−６アルキル基又はカルボキシ基を；Ｒ７は、水素原子、Ｃ１−６アルキル基、ベンジル基又はｐ−ニトロベンジル基を示す。）を示す。）で表されるメルカプトプリン誘導体であり、アルキル化剤がテモゾロミドであり、キサンチン誘導体がテオフィリンである、［１３］に記載の治療剤。
［１５］
チオプリン系代謝拮抗剤が、６−メルカプトプリン、アザチオプリン又は６−チオグアニンである［１４］に記載の治療剤。
［１６］
葉酸拮抗剤、チオプリン系代謝拮抗剤、チアゾフリン、アルキル化剤およびキサンチン誘導体からなる群から選ばれる一種以上の化合物と併用される、一般式［１］
【化９】
2020138067.tif 000011
（式中、Ｒ１、Ｒ２は、同一又は異なって水素原子又はハロゲン原子を；Ｒ３は、水素原子又はアミノ保護基を示す。）で表されるピラジン誘導体又はその塩を含有する、ＲＮＡウイルス感染症治療剤。
［１７］
一つ以上の他のＲＮＡウイルス感染症治療剤又は抗ＲＮＡウイルス阻害作用を示す薬剤とさらに併用される、［１０］から［１５］いずれか一に記載の治療剤。
［１８］
他のＲＮＡウイルス感染症治療剤又は抗ＲＮＡウイルス阻害作用を示す薬剤がリバビリンである、［１７］に記載の治療剤。【００１１】
本発明は、さらに以下を提供する。
［Ａ］
一般式［１］
【化１０】
2020138067.tif 000012
（式中、Ｒ１及びＲ２は、同一又は異なって水素原子又はハロゲン原子を；Ｒ３は、水素原子又はアミノ保護基を示す。）で表されるピラジン誘導体又はその塩と、細胞内におけるピラジン誘導体リボース三リン酸体の量を増加させる化合物とを対象に投与することを含む、ＲＮＡウイルス感染症の治療法。
［Ｂ］
ＲＮＡウイルス感染症治療薬を製造するための、一般式［１］
【化１１】
2020138067.tif 000013
（式中、Ｒ１及びＲ２は、同一又は異なって水素原子又はハロゲン原子を；Ｒ３は、水素原子又はアミノ保護基を示す。）で表されるピラジン誘導体又はその塩と、細胞内におけるピラジン誘導体リボース三リン酸体の量を増加させる化合物の使用。
［Ｃ］
ＲＮＡウイルス感染症の治療において使用するための、一般式［１］
【化１２】
2020138067.tif 000014
（式中、Ｒ１及びＲ２は、同一又は異なって水素原子又はハロゲン原子を；Ｒ３は、水素原子又はアミノ保護基を示す。）で表されるピラジン誘導体又はその塩と、細胞内におけるピラジン誘導体リボース三リン酸体の量を増加させる化合物との組み合わせ。
【発明の効果】
【００１２】
ピラジン誘導体又はその塩と、細胞内におけるピラジン誘導体リボース三リン酸体の量を増加させる化合物とを組み合わせたＲＮＡウイルス感染症治療剤は、ＲＮＡウイルス感染症の治療又は予防などの処置に有用である。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】試験例６の、Ｔ−７０５と６−メルカプトプリン（６ＭＰ）の併用曝露による２９３Ｔ細胞内Ｔ７０５−ＲＴＰ量の変化を示す図面である。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
以下、本発明について詳述する。
ハロゲン原子とは、フッ素原子、塩素原子、臭素原子及びヨウ素原子を意味する。Ｃ１−６アルキル基とは、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、ｓｅｃ−ブチル、イソブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ペンチル、イソペンチル、２−メチルブチル、２−ペンチル、３−ペンチル及びヘキシル基などの直鎖状又は分枝鎖状のＣ１−６アルキル基を意味する。
【００１５】
アミノ保護基としては、通常のアミノ保護基として使用し得るすべての基を含み、たとえば、Ｗ．グリーン（Ｗ．Ｇｒｅｅｎｅ）ら、プロテクティブ・グループス・イン・オーガニック・シンセシス（Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ Ｇｒｏｕｐｓ ｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）第５版、第８９５〜１１９３頁、２０１４年、ジョン・ウィリイ・アンド・サンズ社（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ,ＩＮＣ.）に記載されている基が挙げられる。
【００１６】
具体的には、たとえば、アシル基、アルキルオキシカルボニル基、アリールアルキルオキシカルボニル基、アリールオキシカルボニル基、アリールアルキル基、アルコキシアルキル基、アリールアルキルオキシアルキル基、アリールチオ基、アルキルスルホニル基、アリールスルホニル基、ジアルキルアミノアルキリデン基、アリールアルキリデン基、含窒素複素環式アルキリデン基、シクロアルキリデン基、ジアリールホスホリル基、ジアリールアルキルホスホリル基、含酸素複素環式アルキル基及び置換シリル基などが挙げられる。
【００１７】
一般式［１］の化合物の塩としては、通常知られているヒドロキシル基における塩を挙げることができる。たとえば、ナトリウム及びカリウムなどのアルカリ金属との塩；カルシウム及びマグネシウムなどのアルカリ土類金属との塩；アンモニウム塩；ならびにトリメチルアミン、トリエチルアミン、トリブチルアミン、Ｎ−メチルピペリジン、Ｎ−メチルモルホリン、ジエチルアミン、ジシクロヘキシルアミン、プロカイン、ジベンジルアミン、Ｎ−ベンジル−β−フェネチルアミン、１−エフェナミン及びＮ,Ｎ'−ジベンジルエチレンジアミンなどの含窒素有機塩基との塩などを挙げることができる。好ましい塩としては、薬理学的に許容される塩が挙げられ、ナトリウムとの塩が、より好ましい。
【００１８】
一般式［１］の化合物において、好ましくは、Ｒ１が、水素原子；Ｒ２が、フッ素原子；Ｒ３が水素原子である。なお、好ましいこの化合物がＴ−７０５である。
【００１９】
または、一般式［１］の化合物において、好ましくは、Ｒ１が、水素原子；Ｒ２が、水素原子；Ｒ３が水素原子である。好ましいこの化合物がＴ−１１０５である。
【００２０】
一般式［１］の化合物は、自体公知の方法を組み合わせることにより製造されるが、たとえば、国際公開第００／１０５６９号パンフレットに記載の製造法により製造することができる。
【００２１】
一般式［１］で表されるピラジン誘導体又はその塩、例えばＴ−７０５は、細胞内でリボシルリン酸化を受け、その結果生じるピラジン誘導体リボース三リン酸体が抗ウイルス作用を示すことが知られている（Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ. ２００５；４９（３）：９８１−６.）。ここで、ピラジン誘導体リボース三リン酸体とは、一般式［４］
【化１３】
2020138067.tif 000015
（式中、Ｒ１及びＲ２は、同一又は異なって水素原子又はハロゲン原子を；Ｒ３は、水素原子又はアミノ保護基を示す。）で表される化合物である。
【００２２】
細胞内におけるピラジン誘導体リボース三リン酸体の量を増加させる化合物とは、一般式［１］で表されるピラジン誘導体又はその塩と組み合わせて用いた際に、細胞内の酵素や代謝経路を活性化又は阻害すること等を通じ、結果として、細胞内におけるピラジン誘導体リボース三リン酸体の量を増加させる化合物である。組み合わせない場合と比較して、ピラジン誘導体リボース三リン酸体の濃度を、好ましくは１．５倍以上、より好ましくは２倍以上増加させる。そのような化合物として、例えば、葉酸拮抗剤、チオプリン系代謝拮抗剤、チアゾフリン、アルキル化剤およびキサンチン誘導体が挙げられる。なお、葉酸拮抗剤、チオプリン系代謝拮抗剤およびチアゾフリンは代謝拮抗剤である。
【００２３】
葉酸拮抗剤とは、メトトレキサート及びプララトレキサート等の、ＤＮＡ合成に必要な葉酸代謝酵素を阻害し細胞増殖を抑える化合物である。メトトレキサート及びプララトレキサートが好ましい。
【００２４】
葉酸拮抗剤は、自体公知の方法を組み合わせることにより製造するか、市販されているものを用いればよい。
【００２５】
チオプリン系代謝拮抗剤とは、６−メルカプトプリン、アザチオプリン及び６−チオグアニン等の、チオプリン骨格を有する代謝拮抗剤である。チオプリン系代謝拮抗剤は、一般式［２］で示すチオプリン系代謝拮抗剤が好ましい。一般式［２］の化合物において、好ましくは、Ｒ４が、水素原子又はアミノ基であり、Ｒ５が、水素原子又は一般式［３］で表される基である。一般式［３］で表される基において、好ましくは、Ｒ６が水素原子、Ｒ７がメチル基である。
【００２６】
特に好ましいチオプリン系代謝拮抗剤として、６−メルカプトプリン、アザチオプリン及び６−チオグアニンが挙げられ、６−メルカプトプリンが最も好ましい。
【００２７】
チオプリン系代謝拮抗剤は、自体公知の方法を組み合わせることにより製造するか、市販されているものを用いればよい。
【００２８】
アルキル化剤とは、ＤＮＡに相互作用して、細胞増殖を阻害する化合物であり、例えば、テモゾロミド、ナイトロジェンマスタード、塩酸ナイトロジェンマスタード−Ｎ−オキシド、クロラムブチル、シクロフォスファミド、イホスファミド、チオテパ、カルボコン、トシル酸インプロスルファン、ブスルファン、塩酸ニムスチン、ミトブロニトール、メルファラン、ダカルバジン、ラニムスチン、リン酸エストラムスチンナトリウム、トリエチレンメラミン、カルムスチン、ロムスチン、ストレプトゾシン、ピポブロマン、エトグルシド、カルボプラチン、シスプラチン、ミボプラチン、ネダプラチン、オキサリプラチン、アルトレタミン、アンバムスチン、塩酸ジブロスピジウム、フォテムスチン、プレドニムスチン、プミテパ、リボムスチン、トレオスルファン、トロフォスファミド、ジノスタチンスチマラマー、アドゼレシン、システムスチン及びビゼレシンが挙げられる。テモゾロミドが好ましい。
【００２９】
アルキル化剤は、自体公知の方法を組み合わせることにより製造するか、市販されているものを用いればよい。
【００３０】
キサンチン誘導体とは、キサンチン骨格を有する化合物であり、例えば、キサンチン、テオフィリン、カフェイン、パラキサンチン、テオブロミン、ドキソフィリン、エンプロフィリン、アミノフィリン、コリンテオフィリナート、ジプロフィリン及びプロキシフィリンが挙げられる。テオフィリンが好ましい。
【００３１】
キサンチン誘導体は、自体公知の方法を組み合わせることにより製造するか、市販されているものを用いればよい。
【００３２】
本発明では、ピラジン誘導体と、細胞内におけるピラジン誘導体リボース三リン酸体の量を増加させる化合物を組み合わせて用いる。組み合わせとは、ピラジン誘導体と、細胞内におけるピラジン誘導体リボース三リン酸体の量を増加させる化合物とを同時に、別個に又は特定の順序で投与する形態（併用）及び混合物（配合剤）としての形態を含む。
【００３３】
すなわち、ピラジン誘導体又はその塩並びに細胞内におけるピラジン誘導体リボース三リン酸体の量を増加させる化合物の投与時期が、同一であることのみを意味するものではなく、１つの投与スケジュール中にピラジン誘導体又はその塩並びに細胞内におけるピラジン誘導体リボース三リン酸体の量を増加させる化合物を投与する形態も「併用」に含まれる。ピラジン誘導体又はその塩並びに細胞内におけるピラジン誘導体リボース三リン酸体の量を増加させる化合物の投与経路は、同一であってもよいし、異なっていてもよい。
【００３４】
ピラジン誘導体又はその塩と、細胞内におけるピラジン誘導体リボース三リン酸体の量を増加させる化合物の量比は、ピラジン誘導体又はその塩の抗ウイルス活性が増強される量比であればよい。好ましくは、ピラジン誘導体又はその塩：細胞内におけるピラジン誘導体リボース三リン酸体の量を増加させる化合物（モル比）が、１：５００〜５００：１より好ましくは１：２００〜２００：１、さらに好ましくは１：５０〜５０：１、よりさらに好ましくは、１：１０〜１０：１である。
【００３５】
本発明のピラジン誘導体又はその塩並びに細胞内におけるピラジン誘導体リボース三リン酸体の量を増加させる化合物を用いる場合、通常、製剤化に使用される賦形剤、担体及び希釈剤などの製剤補助剤を適宜混合してもよく、これらは常法にしたがって、錠剤、カプセル剤、散剤、シロップ剤、顆粒剤、丸剤、懸濁剤、乳剤、液剤、粉体製剤、坐剤、点眼剤、点鼻剤、点耳剤、貼付剤、軟膏剤又は注射剤などの形態とすることができる。
【００３６】
合剤として用いる場合、ピラジン誘導体又はその塩並びに細胞内におけるピラジン誘導体リボース三リン酸体の量を増加させる化合物を、上記製剤化の過程で混合し、均一化した後、適当な製剤とすればよい。
【００３７】
本発明のＲＮＡウイルス感染症治療剤の投与経路は、特に限定されず、静脈内、経口、筋肉内、皮下、吸入、噴霧又は他の投与経路により投与することができる。また、ピラジン誘導体又はその塩は、細胞内におけるピラジン誘導体リボース三リン酸体の量を増加させる化合物と同時に又は特定の順序で投与してもよい。
【００３８】
投与方法、投与量及び投与回数は、患者の年齢、体重及び症状に応じて適宜選択することができる。通常、成人に対しては、経口又は非経口（たとえば、注射、点滴及び直腸部位への投与など）投与により、有効成分であるピラジン誘導体又はその塩の量として０．１〜１０００ｍｇ/ｋｇ、好ましくは０．１〜１００ｍｇ/ｋｇを、１日１回から数回に分割して投与すればよい。
【００３９】
本発明のＲＮＡウイルス感染症治療剤は、ＲＮＡウイルス感染症の治療又は予防などの処置に有用である。
【００４０】
ＲＮＡウイルス感染症とは、インフルエンザウイルス、パラインフルエンザウイルス、ブニヤウイルス（クリミア・コンゴ熱ウイルス、リフトバレー熱ウイルス、ラクロス脳炎ウイルス、ドブラバウイルス、マポラルウイルス、プロスペクトヒルウイルス、アンデスウイルス、サンドフライ熱ウイルス、ハートランドウイルス、プンタトロウイルス、重症熱性血小板減少症候群ウイルス等）、アレナウイルス（フニンウイルス、ピチンデウイルス、タカリベウイルス、グアナリトウイルス、マチュポウイルス、リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス、ラッサ熱ウイルス等）、フィロウイルス（エボラウイルス、マールブルグウイルス等）、狂犬病ウイルス、ヒトメタニューモウイルス、ＲＳウイルス、ニパウイルス、ヘンドラウイルス、麻疹ウイルス、Ａ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、Ｅ型肝炎ウイルス、チクングニヤウイルス、西部ウマ脳炎ウイルス、ベネズエラ脳炎ウイルス、東部ウマ脳炎ウイルス、ノロウイルス、ポリオウイルス、エコーウイルス、コクサッキーウイルス、エンテロウイルス、ライノウイルス、ロタウイルス、ニューカッスル病ウイルス、ムンプスウイルス、水疱性口内炎ウイルス、日本脳炎ウイルス、ダニ媒介性フラビウイルス、黄熱病ウイルス、デング熱ウイルス、西ナイルウイルス又はジカ熱ウイルス等のＲＮＡウイルスが原因となる感染症である。本発明は、好ましくはインフルエンザウイルス、狂犬病ウイルス、ラッサ熱ウイルス、ブニヤウイルス（クリミア・コンゴ熱ウイルス、リフトバレー熱ウイルス、重症熱性血小板減少症候群ウイルス等）及びフィロウイルス（エボラウイルス、マールブルグウイルス等）の感染症治療剤として、特に好ましくはインフルエンザ感染症治療剤として用いることができる。
【００４１】
本発明のＲＮＡウイルス感染症治療剤は、作用の増強等を目的に、さらに他のＲＮＡウイルス感染症治療剤又は抗ＲＮＡウイルス阻害作用を示す薬剤と組み合わせて用いることができる。他のＲＮＡウイルス感染症治療剤とは、ＲＮＡウイルス感染症に対する治療剤で、例えば、インフルエンザ治療剤、Ｃ型肝炎治療剤、フィロウイルス感染症治療剤等が挙げられる。インフルエンザ治療剤としては、アマンタジン、リマンタジン、オセルタミビル、ザナミビル、ペラミビル、ラニナミビル、バロキサビル等が挙げられる。Ｃ型肝炎治療剤としては、リバビリン、ペグ化インターフェロン、テラプレビル、ボセプレビル等が挙げられる。フィロウイルス感染症治療剤としては、リバビリン、パリビズマブ、モタビズマブ、ＲＳＶ−ＩＧＩＶ、ＭＥＤＩ−５５７、Ａ−６０４４４、ＭＤＴ−６３７、ＢＭＳ−４３３７７１、アミオダロン、ドロネダロン、ベラパミル、エボラ回復期血漿（Ｅｂｏｌａ Ｃｏｎｖａｌｅｓｃｅｎｔ Ｐｌａｓｍａ）、ＴＫＭ−１００２０１、ＢＣＸ４４３０、ＦＧＩ−１０６、ＴＫＭ−エボラ、ＺＭａｐｐ、ｒＮＡＰｃ２、ＯＳ−２９６６、ＭＶＡ−ＢＮ ｆｉｌｏ、ブリンシドフォビル、Ａｄ２６−ＺＥＢＯＶ等が挙げられる。抗ＲＮＡウイルス阻害作用を示す薬剤とは、例えば、ミコフェノール酸、ダプトマイシン、ニコロサミド、アジスロマイシン、ノボビオシン、クロロキン、メマンチン、プロクロルペラジン、クロルシクリジン、マニジピン、ＧＳ−５７３４、Ｉｍａｔｉｎｉｂ、クロルプロマジン、ニタゾキサニド等が挙げられる（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｙｏｕｎｇ Ｐｈａｒｍａｃｉｓｔｓ． ２０１９；１１（２）：１１７−１２１.）。リバビリンと組み合わせることが好ましい。
【００４２】
本発明のＲＮＡウイルス感染症治療剤と、他のＲＮＡウイルス感染症治療剤又は抗ＲＮＡウイルス阻害作用を組み合わせて用いる場合、ピラジン誘導体又はその塩と、細胞内におけるピラジン誘導体リボース三リン酸体の量を増加させる化合物の量比は、ピラジン誘導体又はその塩の抗ウイルス活性が増強される量比であればよい。好ましくは、ピラジン誘導体又はその塩：細胞内におけるピラジン誘導体リボース三リン酸体の量を増加させる化合物（モル比）が、１：５００〜５００：１より好ましくは１：２５０〜２５０：１、さらに好ましくは１：１５０〜１５０：１である。
【００４３】
本発明のＲＮＡウイルス感染症治療剤と、他のＲＮＡウイルス感染症治療剤又は抗ＲＮＡウイルス阻害作用を示す薬剤の量比は、本発明のＲＮＡウイルス感染症治療剤の抗ウイルス活性が増強される量比であればよい。好ましくは、本発明のＲＮＡウイルス感染症治療剤：他のＲＮＡウイルス感染症治療剤又は抗ＲＮＡウイルス阻害作用を示す薬剤（モル比）が、１：１００〜１００：１より好ましくは１：５０〜５０：１、さらに好ましくは１：１０〜１０：１、よりさらに好ましくは、１：５〜５：１である。
【実施例】
【００４４】
次に、実施例を挙げて本発明を説明するが、本発明は、これらに限定されるものではない。【００４５】
試験例１
ピラジン誘導体と代謝拮抗剤を組み合わせた時のＲＮＡウイルスに対する効果を、ウイルスのＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ（ＲｄＲｐ）複合体のレプリコン活性により調べた。レプリコン活性評価のため、公知の方法（Ｎｅｕｍａｎｎ, Ｇ.ら、Ｊ. Ｖｉｒｏｌ. ７４： ５４７−５５１ （２０００））を参考に、細胞を用いたレポーターアッセイ系を構築した。このアッセイ系では、レポータータンパク質であるルシフェラーゼ（Ｌｕｃ）の活性により、レプリコン活性を評価した。【００４６】
ピラジン誘導体として、６−フルオロ−３−ヒドロキシ−２−ピラジンカルボキサミド（Ｔ−７０５）を選択した。代謝拮抗剤として、葉酸拮抗剤のメトトレキサート及びプララトレキサート、チオプリン系代謝拮抗剤として、６−メルカプトプリン、アザチオプリン及びチオグアノシンを選択した。ＲＮＡウイルスとして、インフルエンザウイルスを選択した。【００４７】
（１）レポーターアッセイ系の構築
（１−１）野生型ウイルスタンパク質遺伝子のクローニング
上記公知文献に記載の方法で、ウイルスタンパク質ＰＡ、ＰＢ１、ＰＢ２、ＮＰをコードする遺伝子を、Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ Ａ／ＰＲ／８／３４（Ｈ１Ｎ１）株からＲＴ−ＰＣＲ法により増幅し、ｐｃＤＮＡ３．１ベクターにクローニングした。得られたｐｃＤＮＡ３．１／ＰＲ８＿ＰＡプラスミドＤＮＡ、ｐｃＤＮＡ３．１／ＰＲ８＿ＰＢ１プラスミドＤＮＡ、ｐｃＤＮＡ３．１／ＰＲ８＿ＰＢ２プラスミドＤＮＡ及びｐｃＤＮＡ３．１／ＰＲ８＿ＮＰプラスミドＤＮＡは、それぞれ野生型ＰＡ ＤＮＡ、野生型ＰＢ１ ＤＮＡ、野生型ＰＢ２ ＤＮＡ及び野生型ＮＰ ＤＮＡと命名した。【００４８】
（１−２）レポータープラスミドの作成
次に、レポーター遺伝子を含むプラスミドＤＮＡを作製した。具体的には、５´末端から３´末端にかけて、ヒト由来ポリメラーゼＩプロモーターをコードする領域（Ｊｏｎｅｓ, Ｍ. Ｈ.ら、Ｐｒｏｃ. Ｎａｔｌ. Ａｃａｄ. Ｓｃｉ. ＵＳＡ ８５： ６６９−６７３ （１９８８））、Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ Ａ／ＰＲ／８／３４（Ｈ１Ｎ１）株のＮＴＲで挟まれたＬｕｃ遺伝子、マウス由来ポリメラーゼＩターミネーターをコードする領域（Ｇｒｕｍｍｔ, Ｉ.ら、Ｃｅｌｌ ４５： ８３７−８４６ （１９８６））でつなげたＤＮＡを作製し、ｐｃＤＮＡ３．１ベクターにクローニングし、レポータープラスミドｐｃＤＮＡ３．１／ｐｏｌＩ＿ＮＴＲ＿ＲｈＬｕｃを得た。【００４９】
（１−３）２９３Ｔ細胞の調整
（１−３−１）２９３Ｔ細胞の培養
細胞は、ＳＶ４０ ｌａｒｇｅ Ｔ抗原を発現しているヒト胎児腎細胞２９３Ｔ細胞（以下、２９３Ｔ細胞とする）を用いた。１０％ウシ胎児血清添加ＤＭＥＭ培地中、５％二酸化炭素条件下、３７℃で継代培養されている２９３Ｔ細胞を、エチレンジアミン四酢酸トリプシン法によって剥離し、２．４×１０７ｃｅｌｌｓ／２２５ｃｍ２フラスコとなるように播種した。その後、５％二酸化炭素条件下、３７℃で一夜培養し、単層の２９３Ｔ細胞を得た。【００５０】
（１−３−２）２９３Ｔ細胞への形質導入
Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）３ｍＬに対し野生型ＰＡ ＤＮＡを０．９６μｇ、野生型ＰＢ１ ＤＮＡを９．６μｇ、野生型ＰＢ２ ＤＮＡを９．６μｇ、野生型ＮＰ ＤＮＡを９．６μｇ及び２種のレポータープラスミドｐｃＤＮＡ３．１／ｐｏｌＩ＿ＮＴＲ＿ＲｈＬｕｃを９．６μｇ、（ＤＮＡ導入の成否を確認するため）ｐＧＬ４．５４（プロメガ社製、＃Ｅ５０６１）を９．６μｇとなるように調整し、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ＬＴＸ Ｒｅａｇｅｎｔ ｗｉｔｈ ＰＬＵＳ Ｒｅａｇｅｎｔ（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）に添付のＰＬＵＳ Ｒｅａｇｅｎｔ ４９μＬを添加した。またＯｐｔｉ−ＭＥＭ ２．９ｍＬにＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ＬＴＸ Ｒｅａｇｅｎｔ ０．２３ｍＬを添加し５分間放置した。その後、二液を体積比で１対１となるように混ぜ合わせ、室温で１５分放置した。上記混合液を、６ｍＬ／２２５ｃｍ２フラスコとなるように２９３Ｔ細胞の培養フラスコへ添加し、約６時間放置して、インフルエンザウイルスのＲｄＲｐ、ＮＰ及びレポータープラスミドを細胞に導入した。【００５１】
（２）Ｔ−７０５と代謝拮抗剤の組み合わせによるレプリコン阻害活性の測定
（２−１）細胞への薬剤添加及び培養【００５２】
形質導入した２９３Ｔ細胞をエチレンジアミン四酢酸トリプシン法によって剥離し、以下（Ａ）〜（Ｄ）いずれかの試験液を１０μＬ／ウェルで添加した３８４ウェルプレート（コーニング社製、＃３７０７）に１．５×１０４ｃｅｌｌｓ／１０μＬ/ウェルとなるように播種した。また、細胞を添加しないブランクとして、以下（Ａ）又は（Ｄ）の液をウェルに添加したブランクウェルを設けた。その後、５％二酸化炭素条件下、３７℃で約２０時間培養した。【００５３】
（Ａ）１０μＭ Ｔ−７０５及び０．１％ＤＭＳＯ含有培地
（Ｂ）代謝拮抗剤単剤（最終濃度：１０μＭ〜０．０８μＭ，１０μＭから公比５で５段階希釈）及び０．１％ＤＭＳＯ含有培地
（Ｃ）Ｔ−７０５（最終濃度：１０μＭ）、代謝拮抗剤（最終濃度：１０μＭ〜０．０８μＭ，１０μＭから公比５で５段階希釈）及び０．１％ＤＭＳＯ含有培地
（Ｄ）０．１％ＤＭＳＯ含有培地
（Ａ）〜（Ｄ）のいずれも、１０％ウシ胎児血清添加ＤＭＥＭ培地で希釈及び混合した。【００５４】
（２−２）Ｌｕｃ活性の測定及びレプリコン阻害活性の評価
Ｌｕｃ活性の測定には、Ｄｕａｌ−Ｇｌｏ Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ａｓｓａｙ Ｓｙｓｔｅｍ（プロメガ社製）を用いた。約２０時間の培養後に、該Ｓｙｓｔｅｍに添付のＤｕａｌ−Ｇｌｏ Ｒｅａｇｅｎｔを２０μＬ／ウェル添加し、１０分以上室温で撹拌させ、細胞を溶解した。その後、マイクロプレートリーダー（パーキンエルマー社製、２１０４ ＥｎＶｉｓｉｏｎ）にて発光強度を測定した。続いて、該Ｓｙｓｔｅｍに添付のＳｔｏｐ ＆ Ｇｌｏ Ｒｅａｇｅｎｔを２０μＬ／ウェル添加し、１０分以上室温で攪拌後、マイクロプレートリーダー（同上）にて発光強度を測定した。例数は１で実施した。以下に示す式から、レプリコン反応率及びレプリコン阻害率を算出した。【００５５】
［Ｔ−７０５非添加時レプリコン反応率（％）］＝［（代謝拮抗剤添加ウェルの平均発光強度）−（０．１％ＤＭＳＯ含有培地添加ウェルの平均発光強度）］／［（薬剤非添加ウェルの平均発光強度）−（０．１％ＤＭＳＯ含有培地添加ウェルの平均発光強度）］×１００【００５６】
［Ｔ−７０５添加時レプリコン反応率（％）］＝［（代謝拮抗剤とＴ−７０５添加ウェルの平均発光強度）−（１０μＭ Ｔ−７０５及び０．１％ＤＭＳＯ含有培地添加ウェルの平均発光強度）］／［Ｔ−７０５添加ウェルの平均発光強度）−（１０μＭ Ｔ−７０５及び０．１％ＤＭＳＯ含有培地添加ウェルの平均発光強度）］×１００【００５７】
レプリコン阻害率（％）＝１００−［レプリコン反応率（％）］【００５８】
その結果、表１で示すように、Ｔ−７０５単剤では阻害しない濃度であっても葉酸拮抗剤もしくはチオプリン製剤を添加することにより、Ｔ−７０５のレプリコン阻害率を向上させることが分かった。なお、チオグアノシンは６−チオグアニンにリボース環が結合した化合物である。細胞内で、６−チオグアニンはチオグアノシン（又はチオグアノシンの代謝産物）に代謝されると考えられるので、６−チオグアニンもチオグアノシンと同様、Ｔ−７０５のレプリコン阻害率を向上させると考えられる。
【表１】
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【００５９】
（３）Ｔ−７０５と代謝拮抗剤の組み合わせによるレプリコン５０％阻害濃度の測定
（２−１）と同様に、以下（Ｅ）〜（Ｈ）の試験液を用いて、細胞への薬剤添加と培養を行った。（２−２）と同様に、レプリコン阻害活性を評価した。【００６０】
（Ｅ）Ｔ−７０５単剤（最終濃度：１．４μＭ〜１０００μＭ，１０００μＭから公比３で８段階希釈）及び０．１％ＤＭＳＯ含有培地
（Ｆ）代謝拮抗剤単剤（最終濃度：０．０３μＭ〜２００μＭ，２００μＭから公比３で１０段階希釈、又は２０μＭから公比２で１０段階希釈）及び０．１％ＤＭＳＯ含有培地
（Ｇ）Ｔ−７０５、（最終濃度：１．４μＭ〜１０００μＭ，１０００μＭから公比３で８段階希釈）代謝拮抗剤（最終濃度：０．０３μＭ〜２００μＭ，２００μＭから公比３で１０段階希釈、又は２０μＭから公比２で１０段階希釈）及び０．１％ＤＭＳＯ含有培地
（Ｈ）０．１％ＤＭＳＯ含有培地【００６１】
５０％阻害濃度の算出には、ＸＬｆｉｔ（ｖｅｒｓｉｏｎ ５．３．１．３）のＤｏｓｅ Ｒｅｓｐｏｎｓｅ Ｏｎｅ Ｓｉｔｅ（Ｓｉｇｍｏｉｄａｌ Ｄｏｓｅ−Ｒｅｓｐｏｎｓｅ Ｍｏｄｅｌ；［ｆｉｔ＝（Ａ＋（（Ｂ−Ａ）／（１＋（（Ｃ／ｘ）＾Ｄ））））］）を用いた。各代謝拮抗剤と併用したＴ−７０５の５０％阻害濃度を表２に示す。Ｔ−７０５と代謝拮抗剤の組み合わせで、Ｔ−７０５単剤より低い５０％阻害濃度を示すことが分かった。
【表２】
2020138067.tif 000017
【００６２】
本試験系では、６−メルカプトプリン単剤（＜２００μＭ）、メトトレキサート単剤（＜２０μＭ）、プララトレキサート単剤（＜２０μＭ）では、レプリコン阻害率が５０％に至らず、阻害活性が認められなかった。Ｔ−７０５及び代謝拮抗剤の組み合わせにより、Ｔ−７０５単剤の場合に比べ、レプリコン阻害活性が著しく増強された。【００６３】
試験例２
ピラジン誘導体と代謝拮抗剤の併用効果について、ウイルスの細胞感染モデルで、さらに試験を行った。【００６４】
ピラジン誘導体として、Ｔ−７０５を選択した。代謝拮抗剤として、６−メルカプトプリンを選択した。ＲＮＡウイルスとして、インフルエンザウイルスを選択した。【００６５】
（１）ＭＤＣＫ細胞の培養
培養液１０％ウシ胎児血清添加イーグルＭＥＭ培地中、５％二酸化炭素条件下、３７℃で継代培養されているマージン−ダービー イヌ腎（Ｍａｄｉｎ−Ｄａｒｂｙ Ｃａｉｎｅ Ｋｉｄｎｅｙ）（以下、ＭＤＣＫとする）細胞をエチレンジアミン四酢酸トリプシン法によって剥離し、同培地で１００μＬに２×１０４個の細胞を含むように調製した懸濁液を９６ウェルプレートに播種した。５％二酸化炭素条件下、３７℃で一夜培養し、単層となったＭＤＣＫ細胞を得た。【００６６】
（２）インフルエンザウイルス感染及び薬剤添加
試験培地として、カナマイシン６０μｇ／ｍＬを加えたイーグルＭＥＭ培地に１μｇ／ｍＬとなるようＬ−１−トシルアミド−２−フェニルエチルクロロメチルケトン（ＴＰＣＫ）処理トリプシンを加えた培地を用いた。（１）で得られたＭＤＣＫ細胞の培養上清を取り除き、イーグルＭＥＭ培地ですすいだ後、各ウェルに、以下（Ａ）〜（Ｃ）を加えた。薬剤添加後、５％二酸化炭素条件下、３５℃で３〜４日間培養した。【００６７】
（Ａ）カナマイシン６０μｇ／ｍＬを加えたイーグルＭＥＭ培地を１００μＬ
（Ｂ）試験培地の４倍濃度のＴＰＣＫ処理トリプシンを含むイーグルＭＥＭ培地で４．０×１０３ＰＦＵ／ｍＬに調整したインフルエンザウイルス（ＰＲ／８（Ｈ１Ｎ１））液を５０μＬ
（Ｃ）設定濃度の４倍濃度のＴ−７０５及び６−メルカプトプリンの、各設定濃度の組み合わせを含むイーグルＭＥＭ培地を５０μＬ
Ｔ−７０５設定濃度（μＭ）：０, ０．０１，１，３，１０，３０
６−メルカプトプリン設定濃度（μＭ）：０, ０．１，０．３，１，３，１０【００６８】
（３）細胞変性効果（ＣＰＥ）の判定
インフルエンザウイルスの増殖に伴って認められる細胞変性効果（ＣＰＥ）を、以下の方法で判定した。【００６９】
培養終了後、各ウェルに１００％ホルマリン液を５０μＬ加え、ウイルスの不活性化及び細胞固定した。２時間以上室温で静置後、０．００５％メチレンブルー液を１００μＬ／ウェルを加え１時間室温で静置した。０．００５％メチレンブルー液を除去し、水で軽く洗浄した後、風乾させた。その後、マイクロプレートリーダー（Ｔｅｃａｎ社製、ｉｎｆｉｎｉｔ Ｍ２００）にて吸光度（６６０ｎｍ）を測定した。非感染コントロールは、インフルエンザウイルス液の代わりに試験培地の４倍濃度のＴＰＣＫ処理トリプシンを含むイーグルＭＥＭ培地５０μＬを加え、試験群と同様の操作を行い、吸光度を測定した。ブランクには、ＭＤＣＫ細胞を播種しないウェルに非感染対照と同様の操作を加え、吸光度を測定した。【００７０】
試験は例数１で３回（感染コントロールは例数８）実施した。平均値を用い、ブランクの値を差引いた数値を吸光度とした。非感染コントロールの吸光度から感染コントロールの吸光度を差引いた値をウイルス増殖の完全抑制値とし、以下に示す式から各試験のＣＰＥ阻害率を算出した。【００７１】
ウイルス増殖抑制率＝［（単剤及び併用作用時の吸光度）−（感染コントロールの吸光度）］／［（非感染コントロールの吸光度）−（感染コントロールの吸光度）］【００７２】
５０％阻害濃度の算出には、ＭｉｃｒｏｓｏｆｔＯｆｆｉｃｅ Ｅｘｃｅｌ ２００７のＦＯＲＥＣＡＳＴ関数（一次回帰法）を用いた。【００７３】
６−メルカプトプリン添加時のＴ−７０５の５０％ＣＰＥ阻害濃度変化を表３に示す。Ｔ−７０５単剤と比較し、６−メルカプトプリンとの組み合わせにおいて、Ｔ−７０５の５０％阻害濃度は低値となった。なお本試験系では、６−メルカプトプリン（１０μＭ）単剤で、ＣＰＥ阻害効果は示さなかった。
【表３】
2020138067.tif 000018
【００７４】
Ｔ−７０５単剤の場合に比べ、Ｔ−７０５と代謝拮抗剤の組み合わせで抗ウイルス活性が増強されることを、細胞感染モデルでも確認できた。【００７５】
試験例３
試験例２と同じインフルエンザウイルス細胞感染モデルを用いて、ピラジン誘導体と代謝拮抗剤と他のＲＮＡウイルス感染症治療剤の併用効果について、さらに試験を行った。【００７６】
ピラジン誘導体として、Ｔ−７０５を選択した。代謝拮抗剤として、６−メルカプトプリンを選択した。他のＲＮＡウイルス感染症治療剤としてリバビリンを選択し、薬剤の設定濃度及びＣＰＥの判定に関して以下のようにし、試験を行った。【００７７】
薬剤の設定濃度に関して、以下のように設定した。
Ｔ−７０５設定濃度（μＭ）：０, ０．０１，０．０３，０．１，０．３，１，３，１０，３０
リバビリン設定濃度（μＭ）：０, ０．１，０．３，１，３，１０，３０，１００
６−メルカプトプリン設定濃度（μＭ）：０, １０【００７８】
ＣＰＥの判定に関して、メチレンブルー液で染色したプレートを目視確認することで、完全ＣＰＥ抑制効果を示す最小薬剤濃度を判定した。【００７９】
Ｔ−７０５及びリバビリン単剤時における完全ＣＰＥ抑制効果を示す最小薬剤濃度は、それぞれ３、３０（μＭ）であった。また、６−メルカプトプリン（１０μＭ）添加時のＴ−７０５の完全ＣＰＥ抑制効果を示す最小薬剤濃度は、０．３（μＭ）であった。さらに、６−メルカプトプリン（１０μＭ）及びリバビリン（３μＭ）添加時のＴ−７０５の完全ＣＰＥ抑制効果を示す最小薬剤濃度は、０．１（μＭ）であった。【００８０】
Ｔ−７０５単剤及びＴ−７０５と代謝拮抗剤の組み合わせの場合に比べ、Ｔ−７０５と代謝拮抗剤と他のＲＮＡウイルス感染症治療剤の組み合わせで抗ウイルス活性がさらに増強されることを、細胞感染モデルで確認できた。【００８１】
試験例４
インフルエンザ以外のウイルスの細胞感染モデルで、ブニヤウイルスであるＰｕｎｔａ  Ｔｏｒｏウイルスを用いて試験例２と同様の試験を行った。ピラジン誘導体として、Ｔ−７０５を選択した。化合物として、６−メルカプトプリン、アザチオプリン、テモゾロミド、テオフィリン及びチアゾフリンを選択した。【００８２】
（１）２９３Ｔ細胞の培養
細胞は、２９３Ｔ細胞を用いた。１０％ウシ胎児血清添加ＤＭＥＭ培地中、５％二酸化炭素条件下、３７℃で継代培養されている２９３Ｔ細胞を、エチレンジアミン四酢酸トリプシン法によって剥離し、同培地で１ｍＬに１×１０５個の細胞を含むように調製した懸濁液を２４ウェルプレートに播種し、５％二酸化炭素条件下、３７℃で一夜培養した。【００８３】
（２）Ｐｕｎｔａ  Ｔｏｒｏウイルス感染及び薬剤添加
（１）で得られた２９３Ｔ細胞の培養上清を取り除き、イーグルＭＥＭ培地ですすいだ後、各ウェルに１．０×１０３ＰＦＵ／ｍＬに調整したＰｕｎｔａ  Ｔｏｒｏウイルス液を０．１ｍＬずつ添加し、５％二酸化炭素条件下、３７℃で１時間培養した。ウイルス液を除去後、Ｔ−７０５単剤（最終濃度：２０μＭ）、代謝拮抗剤（最終濃度：１０μＭ）又はＴ−７０５単剤（最終濃度：２０μＭ）と代謝拮抗剤（最終濃度：１０μＭ）を混合した１％ウシ胎児血清添加イーグルＭＥＭ培地を加え、５％二酸化炭素条件下、３７℃で３日間培養した。また、感染コントロールとして、薬剤を含む培地の代わりに、１％ウシ胎児血清添加イーグルＭＥＭ培地を加えた。【００８４】
（３）Ｐｕｎｔａ  Ｔｏｒｏウイルスの定量
（３−１）Ｖｅｒｏ細胞の培養
培養液１０％ウシ胎児血清添加イーグルＭＥＭ培地中、５％二酸化炭素条件下、３７℃で継代培養されているサル腎Ｖｅｒｏ細胞をエチレンジアミン四酢酸トリプシン法によって剥離し、２％ウシ胎児血清添加イーグルＭＥＭ培地で１００μＬに２×１０４個の細胞を含むように調製した懸濁液を９６ウェルプレートに播種した。５％二酸化炭素条件下、３７℃で一夜培養し、単層となったＶｅｒｏ細胞を得た。【００８５】
（３−２）ウイルスの定量
（３−１）で得られたＶｅｒｏ細胞に（２）で取得したウイルス培養液をイーグルＭＥＭ培地で公比１０、５段階に希釈し、原液及び希釈液を５０μＬずつ添加した（ｎ＝４）。５％二酸化炭素条件下、３７℃で３〜４日間培養した。【００８６】
（３−３）ウイルス量の計算
培養終了後、各ウェルに１００％ホルマリン液を５０μＬ加え、ウイルスの不活性化及び細胞固定した。２時間以上室温で静置後、０．００５％メチレンブルー液を１００μＬ／ウェルを加え１時間室温で静置した。０．００５％メチレンブルー液を除去し、水で軽く洗浄した後、風乾させた。その後、各サンプルの５０％感染量の対数値（ＬｏｇＴＣＩＤ５０）を以下のＢｏｈｒｅｎｓ−Ｋａｒｂｅｒ法の式を用いて算出した。感染コントロールに対するウイルス量低下効果をΔＬｏｇＴＣＩＤ５０で示した。【００８７】
ＬｏｇＴＣＩＤ５０＝Ｄ＋ｈ×ｄ＋０．５×ｄ
Ｄ：全ウェル（ｎ＝４）がＣＰＥ陽性（陽性率=１）であった最高希釈倍率の常用対数
ｈ：各ウェルのＣＰＥ陽性率 (<1の場合)
ｄ：試料の希釈倍率の常用対数【００８８】
結果を表４に示す。Ｔ−７０５と化合物を併用することで、ΔＬｏｇＴＣＩＤ５０が増加したことが確認できた。
【表４】
2020138067.tif 000019
【００８９】
試験例２のインフルエンザウイルスに加え、Ｐｕｎｔａ  Ｔｏｒｏウイルスにおいても、Ｔ−７０５と代謝拮抗剤の併用で抗ウイルス活性が増強されることを確認できた。また、テモゾロミド、テオフィリン及びチアゾフリンも、Ｔ−７０５と併用することで、優れたウイルス量低下効果を示すことが分かった。【００９０】
試験例５
ピラジン誘導体として、Ｔ−１１０５を、化合物として、６−メルカプトプリンを選択し、試験例４と同様の試験を行った。結果を表５に示す。
【表５】
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【００９１】
Ｔ−７０５と同様、Ｔ−１１０５も代謝拮抗剤との併用で抗ウイルス効果が増強されることを確認できた。【００９２】
試験例６
前記の通り、ピラジン誘導体又はその塩は、細胞内でリボシルリン酸化を受ける。例えばＴ−７０５は、リボシルリン酸化により生じるＴ−７０５−４−ｒｉｂｏｆｕｒａｎｏｓｙｌ−５−ｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ（Ｔ−７０５ＲＴＰ）がウイルスのＲｄＲｐタンパク質を阻害することによって抗ウイルス作用を示すことが知られている。試験例１で見られた６−メルカプトプリンによるＴ−７０５の活性増強効果は、Ｔ−７０５ＲＴＰ量の変化によるものかどうかを確認するため、２９３Ｔ細胞における６―メルカプトプリン処理下でのＴ−７０５ＲＴＰ量を測定した。【００９３】
（１）２９３Ｔ細胞における６−メルカプトプリン処理下でのＴ−７０５ＲＴＰ量測定
（１−１）細胞内Ｔ−７０５ＲＴＰの抽出
６ウェルプレートの各ウェルに５×１０５ｃｅｌｌｓ播種した２９３Ｔ細胞をｖｅｈｉｃｌｅ（０．３％ＤＭＳＯ）又は様々な濃度の６−メルカプトプリン、Ｔ−７０５、又は両薬剤に５％二酸化炭素条件下、３７℃で２４時間培養した。【００９４】
培養後、２ｍｌ ＰＢＳで洗浄した後に、３００μｌトリプシンを入れて３７℃、５ｍｉｎ静置して細胞を剥がした。次に細胞に４００μｌトリプシンインヒビターを加えて懸濁し、１．５ｍｌチューブに回収した。細胞懸濁液を１，０００ｒｐｍ、４℃、２ｍｉｎ（ＭＸ−３０１、ＴＯＭＹ）遠心し、５００μｌ上清を除いた。次に細胞に１ｍｌ ＰＢＳを加えて再懸濁し、このうち６０μｌを１．５ｍｌチューブに取り分け細胞数測定用のサンプルとした。残りの細胞懸濁液から１ｍｌをＴ−７０５ＲＴＰ抽出用に１．５ｍｌチューブに取り分けた。取り分けた細胞懸濁液を２，０００×ｇ、４℃、２ｍｉｎ遠心し上清９００μｌを除いた。次にＴ−７０５ＲＴＰを抽出するために、懸濁液に５００μｌメタノールを加えてよく懸濁した。遠心エバポレーター（ＣＶＥ−３１００、ＥＹＥＬＡ）を用いて３７℃で蒸発乾固させた。サンプルはその後ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ分析に用いた。【００９５】
（１−２）細胞数の測定及びＬＣ／ＭＳ／ＭＳ分析
細胞数の測定及びＬＣ／ＭＳ／ＭＳ分析を行い、各サンプル中のＴ−７０５ＲＴＰ量を測定した。試験方法は、Ｍａｔｓｕｄａ Ｓ, Ｋａｓａｈａｒａ Ｔ. Ｇｅｎｅｓ Ｅｎｖｉｒｏｎ. ４０：１３.（２０１８）に従って実施した。Ｔ−７０５ＲＴＰ量の変化を図１に示す。６−メルカプトプリンにより、Ｔ−７０５処理後の細胞内Ｔ−７０５ＲＴＰ量が増加したことが分かった。【００９６】
Ｔ−７０５の作用メカニズム、すなわち、細胞内でＴ−７０５ＲＴＰに変換された後に抗ウイルス活性を示すことは、Ｔ−７０５が効果を有するウイルスであれば、ウイルス種を問わず当てはまる。代謝拮抗剤により細胞内Ｔ−７０５ＲＴＰ量が増加したことから、Ｔ−７０５と代謝拮抗剤の組み合わせは、Ｔ−７０５が効果を有する複数のＲＮＡウイルスに対する抗ウイルス活性を同時に増強するといえる。【００９７】
このメカニズムは、Ｔ−７０５だけでなく、一般式［１］で表されるピラジン誘導体又はその塩にも広く当てはまる。例えば、Ｔ−７０５以外に、一般式［１］の化合物において、Ｒ１が、水素原子；Ｒ２が、水素原子；Ｒ３が水素原子である化合物（３−ヒドロキシ−ピラジンカルボキサミド）が抗ウイルス活性を示すこと（Ａｎｔｉｖｉｒａｌ  Ｒｅｓ．  ２００９；８２（３）：９５−１０２．）、細胞内でリボース三リン酸体に変化することが示唆されている（Ｍｏｌ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．２０１３；８４（４）：６１５−２９．）。すなわち、ピラジン誘導体又はその塩と、ピラジン誘導体リボース三リン酸体の量を増加させる化合物とを組み合わせることで、ピラジン誘導体又はその塩が効果を有する複数のＲＮＡウイルスに対する抗ウイルス活性を同時に増強することができる。
【産業上の利用可能性】
【００９８】
ピラジン誘導体又はその塩と、葉酸拮抗剤、チオプリン系代謝拮抗剤、チアゾフリン、アルキル化剤およびキサンチン誘導体からなる群から選ばれる一種以上の化合物とを組み合わせてなるＲＮＡウイルス感染症治療剤は、増強した抗ウイルス活性を示し、医薬産業の分野で有用である。
【図１】
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【国際調査報告】
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