(57)【要約】  Ｕｎｃ１１９のリン酸化状態を維持または亢進させる物質を有効成分として含有する、網膜および／または光受容に関連する症状の改善または予防用医薬、カルシニューリンを阻害する物質を選択する工程またはカゼインキナーゼ２を活性化する物質を選択する工程を含む、網膜および／または光受容に関連する症状を改善又は予防する物質のスクリーニング方法、ならびに、Ｕｎｃ１１９のリン酸化状態を維持または亢進させる物質を有効成分として含有する、網膜変性抑制剤および網膜保護剤を提供する。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｕｎｃ１１９のリン酸化状態を維持または亢進させる物質を有効成分として含有する、網膜および／または光受容に関連する症状の改善または予防用医薬。
【請求項２】
Ｕｎｃ１１９のリン酸化状態を維持または亢進させる物質が、カルシニューリン阻害剤またはカゼインキナーゼ２活性化剤である請求項１に記載の医薬。
【請求項３】
カルシニューリン阻害剤が、シクロスポリンまたはタクロリムスである請求項２に記載の医薬。
【請求項４】
網膜および／または光受容に関連する症状が、加齢黄斑変性、網膜色素変性症、レーベル黒内障、スタルガルト病、錐体桿体ジストロフィー、糖尿病網膜症、黄斑浮腫、網膜虚血、網膜動脈閉塞症、網膜静脈閉塞症、光過敏性発作、光感受性てんかん、精神疾患、光線黄斑症、眼精疲労、網膜機能低下、睡眠障害、片頭痛および光障害からなる群より選択される少なくとも１つの疾患である、請求項３に記載の医薬。
【請求項５】
網膜および／または光受容に関連する症状が、加齢黄斑変性、網膜色素変性症、レーベル黒内障、スタルガルト病、錐体桿体ジストロフィー、糖尿病網膜症、黄斑浮腫、網膜虚血、網膜動脈閉塞症、網膜静脈閉塞症、光線黄斑症、眼精疲労、網膜機能低下および光障害からなる群より選択される少なくとも１つの疾患である、請求項４に記載の医薬。
【請求項６】
カルシニューリンを阻害する物質を選択する工程を含む、網膜および／または光受容に関連する症状を改善又は予防する物質のスクリーニング方法。
【請求項７】
カルシニューリンとカルモジュリンとＵｎｃ１１９と被験物質を接触させる工程と、Ｕｎｃ１１９のリン酸化状態を確認する工程と、被験物質を接触させない場合のＵｎｃ１１９のリン酸化状態と比較してＵｎｃ１１９のリン酸化状態を増強させる被験物質を選択する工程とを含む、請求項６に記載のスクリーニング方法。
【請求項８】
カルシニューリンとカルモジュリンとＵｎｃ１１９と被験物質を接触させる工程が、カルシニューリンとカルモジュリンとＵｎｃ１１９を発現する細胞に被験物質を接触させる工程である、請求項７に記載のスクリーニング方法。
【請求項９】
カルシニューリンとカルモジュリンとＵｎｃ１１９と被験物質を接触させる工程と、カルシニューリンとＵｎｃ１１９との相互作用を確認する工程と、被験物質を接触させない場合のカルシニューリンとＵｎｃ１１９との相互作用と比較して両者の相互作用を減少させる被験物質を選択する工程とを含む、請求項６に記載のスクリーニング方法。
【請求項１０】
カゼインキナーゼ２を活性化する物質を選択する工程を含む、網膜および／または光受容に関連する症状を改善又は予防する物質のスクリーニング方法。
【請求項１１】
カゼインキナーゼ２とＵｎｃ１１９と被験物質をＡＴＰ存在下で接触させる工程と、Ｕｎｃ１１９のリン酸化状態を確認する工程と、被験物質を接触させない場合のＵｎｃ１１９のリン酸化状態と比較してＵｎｃ１１９のリン酸化状態を増強させる被験物質を選択する工程とを含む、請求項１０に記載のスクリーニング方法。
【請求項１２】
カゼインキナーゼ２とＵｎｃ１１９と被験物質をＡＴＰ存在下で接触させる工程が、カゼインキナーゼ２とＵｎｃ１１９を発現する細胞に被験物質をＡＴＰ存在下で接触させる工程である、請求項１１に記載のスクリーニング方法。
【請求項１３】
Ｕｎｃ１１９のリン酸化状態を維持または亢進させる物質を有効成分として含有する、網膜変性抑制剤。
【請求項１４】
視細胞変性が、光曝露による錐体視細胞の構造破壊、桿体視細胞の構造破壊および視細胞層の厚み減少から選択される少なくとも１つを伴う、請求項１３に記載の網膜変性抑制剤。
【請求項１５】
Ｕｎｃ１１９のリン酸化状態を維持または亢進させる物質を有効成分として含有する、網膜保護剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、網膜および／または光受容に関連する症状の改善または予防用医薬ならびに網膜および／または光受容に関連する症状を改善または予防する物質のスクリーニング方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
網膜は外界からの光情報を受容する中枢神経組織であり、ヒトでは外界から得る情報の８割以上を視覚から得ると言われている。現在に至るまで治療法がない代表的な視覚障害原因疾患として、網膜変性疾患が挙げられる。網膜変性は視細胞の脱落による不可逆的な視機能の喪失を特徴とするが、その原因疾患である網膜色素変性症はわが国の中途失明原因の第３位、黄斑変性（萎縮型）は第４位と、いずれも上位を占めており、患者数の多さや視覚障害の重症度から予防法・治療法の開発が望まれている。世界全体においても、網膜色素変性症や加齢黄斑変性は失明原因の上位を占めている。このような網膜変性疾患の病態進行の機序は遺伝、加齢、環境等複数あるが、視細胞死という共通の表現型を持つ。光の長期曝露は、代謝老廃物や細胞ストレスの蓄積を誘導し、視細胞や網膜色素上皮の老化や細胞死などを引き起こし、加齢黄斑変性症や網膜色素変性を含む網膜変性疾患の発症や増悪につながると考えられている。この現象は光障害として良く知られており、特に最近、コンピューターディスプレイなどから発せられる青色光による光障害が注目されている。光の長期曝露による光障害を減弱することは網膜保護や変性進行抑制の観点から重要である。【０００３】
本発明者らは、網膜に優位に発現しているユビキチン化酵素を同定し、この酵素のノックアウトマウスの解析から、この酵素が網膜視細胞の明暗順応（光応答感度）を制御していることを新たに見出した（特許文献１）。視細胞における明暗順応の分子機構は、ほとんど未解明であるが、網膜ユビキチン化酵素の機能解析から、視細胞におけるタンパク質ユビキチン化を介した明暗順応調節の新たな分子機構が明らかになれば、全く新しい分子メカニズムに基づく網膜色素変性症や加齢黄斑変性の進行抑制薬などの開発に繋がる可能性が期待される。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】国際公開ＷＯ２０１８／１６９０９０号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、網膜および／または光受容に関連する症状の改善または予防用医薬を提供することを課題とする。また、本発明は、網膜および／または光受容に関連する症状を改善又は予防する物質のスクリーニング方法を提供することを課題とする。さらに、本発明は、光曝露による網膜変性抑制剤および網膜保護剤を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は、上記の課題を解決するために以下の各発明を包含する。
［１］Ｕｎｃ１１９のリン酸化状態を維持または亢進させる物質を有効成分として含有する、網膜および／または光受容に関連する症状の改善または予防用医薬。
［２］Ｕｎｃ１１９のリン酸化状態を維持または亢進させる物質が、カルシニューリン阻害剤またはカゼインキナーゼ２活性化剤である前記［１］に記載の医薬。
［３］カルシニューリン阻害剤が、シクロスポリンまたはタクロリムスである前記［２］に記載の医薬。
［４］網膜および／または光受容に関連する症状が、加齢黄斑変性、網膜色素変性症、レーベル黒内障、スタルガルト病、錐体桿体ジストロフィー、糖尿病網膜症、黄斑浮腫、網膜虚血、網膜動脈閉塞症、網膜静脈閉塞症、光過敏性発作、光感受性てんかん、精神疾患、光線黄斑症、眼精疲労、網膜機能低下、睡眠障害、片頭痛及び光障害からなる群より選択される少なくとも１つの疾患である、前記［３］に記載の医薬。
［５］網膜および／または光受容に関連する症状が、加齢黄斑変性、網膜色素変性症、レーベル黒内障、スタルガルト病、錐体桿体ジストロフィー、糖尿病網膜症、黄斑浮腫、網膜虚血、網膜動脈閉塞症、網膜静脈閉塞症、光線黄斑症、眼精疲労、網膜機能低下および光障害からなる群より選択される少なくとも１つの疾患である、前記［４］に記載の医薬。
［６］カルシニューリンを阻害する物質を選択する工程を含む、網膜および／または光受容に関連する症状を改善又は予防する物質のスクリーニング方法。
［７］カルシニューリンとカルモジュリンとＵｎｃ１１９と被験物質を接触させる工程と、Ｕｎｃ１１９のリン酸化状態を確認する工程と、被験物質を接触させない場合のＵｎｃ１１９のリン酸化状態と比較してＵｎｃ１１９のリン酸化状態を増強させる被験物質を選択する工程とを含む、前記［６］に記載のスクリーニング方法。
［８］カルシニューリンとカルモジュリンとＵｎｃ１１９と被験物質を接触させる工程が、カルシニューリンとカルモジュリンとＵｎｃ１１９を発現する細胞に被験物質を接触させる工程である、前記［７］に記載のスクリーニング方法。
［９］カルシニューリンとカルモジュリンとＵｎｃ１１９と被験物質を接触させる工程と、カルシニューリンとＵｎｃ１１９との相互作用を確認する工程と、被験物質を接触させない場合のカルシニューリンとＵｎｃ１１９との相互作用と比較して両者の相互作用を減少させる被験物質を選択する工程とを含む、前記［６］に記載のスクリーニング方法。
［１０］カゼインキナーゼ２を活性化する物質を選択する工程を含む、網膜および／または光受容に関連する症状を改善又は予防する物質のスクリーニング方法。
［１１］カゼインキナーゼ２とＵｎｃ１１９と被験物質をＡＴＰ存在下で接触させる工程と、Ｕｎｃ１１９のリン酸化状態を確認する工程と、被験物質を接触させない場合のＵｎｃ１１９のリン酸化状態と比較してＵｎｃ１１９のリン酸化状態を増強させる被験物質を選択する工程とを含む、前記［１０］に記載のスクリーニング方法。
［１２］カゼインキナーゼ２とＵｎｃ１１９と被験物質をＡＴＰ存在下で接触させる工程が、カゼインキナーゼ２とＵｎｃ１１９を発現する細胞に被験物質をＡＴＰ存在下で接触させる工程である、前記［１１］に記載のスクリーニング方法。
［１３］Ｕｎｃ１１９のリン酸化状態を維持または亢進させる物質を有効成分として含有する、網膜変性抑制剤。
［１４］網膜変性が、光曝露による錐体視細胞の構造破壊、桿体視細胞の構造破壊および視細胞層の厚み減少から選択される少なくとも１つを伴う、前記［１３］に記載の網膜変性抑制剤。
［１５］Ｕｎｃ１１９のリン酸化状態を維持または亢進させる物質を有効成分として含有する、網膜保護剤。
【発明の効果】
【０００７】
本発明により、網膜および／または光受容に関連する症状の改善または予防用医薬を提供することができる。有効成分として既に臨床使用されているカルシニューリン阻害剤を用いることができるので、安全性の高い医薬を提供することができる。また、本発明のスクリーニング方法により、網膜および／または光受容に関連する症状の改善または予防に有用な物質を取得することができ、新規な網膜および／または光受容に関連する症状の改善または予防用医薬を提供することができる。さらに、本発明は、光曝露による網膜変性抑制剤および網膜保護剤を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】タクロリムス投与光障害誘発マウスの網膜における桿体視細胞の外節を蛍光免疫染色により観察した結果を示す図である。
【図２】タクロリムス投与光障害誘発マウスの網膜における錐体視細胞を蛍光免疫染色により観察した結果を示す図である。
【図３】タクロリムス投与光障害誘発マウスにおける網膜視細胞層の厚さを測定した結果を示す図である。
【図４】シクロスポリン投与光障害誘発マウスの網膜における桿体視細胞の外節を蛍光免疫染色により観察した結果を示す図である。
【図５】シクロスポリン投与光障害誘発マウスの網膜における錐体視細胞を蛍光免疫染色により観察した結果を示す図である。
【図６】シクロスポリン投与光障害誘発マウスにおける網膜視細胞層の厚さを測定した結果を示す図である。
【図７】試験管内キナーゼアッセイにより、カゼインキナーゼ２によるＵｎｃ１１９のリン酸化を確認した結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
本発明者らは、網膜に優位に発現しているユビキチン化酵素Ｋｌｈｌ１８を同定し、Ｋｌｈｌ１８のノックアウトマウスの解析から、Ｋｌｈｌ１８が網膜視細胞の明暗順応（光応答感度）を制御していることを見出した（特許文献１）。さらに、本発明者らは、Ｋｌｈｌ１８の標的タンパク質がＵｎｃ１１９であることを見出し、標的タンパク質のリン酸化および脱リン酸化によって標的タンパク質の分解が制御されていることを見出した。さらに、Ｕｎｃ１１９のリン酸化を触媒する酵素がカゼインキナーゼ２（Casein kinase 2、以下「ＣＫ２」とも表記する）であり、脱リン酸化を触媒する酵素がカルシニューリン（Calcineurin）であることを同定した。
【００１０】
〔医薬〕
本発明は、Ｕｎｃ１１９のリン酸化状態を維持または亢進させる物質を有効成分として含有する、網膜および／または光受容に関連する症状の改善または予防用医薬を提供する。なお、本発明において、「症状」には疾患等も含まれる。また、本発明において、「改善」には治療等も含まれ、その改善の程度は特に限定されず、症状の寛解、完治等も含む。「予防」も、その程度は特に限定されるものではなく、発症の阻止、進行の抑制を含む意味に用いる。
【００１１】
Ｕｎｃ１１９のリン酸化状態を維持または亢進させる物質は、リン酸化Ｕｎｃ１１９の脱リン酸化を阻害する物質であってもよく、Ｕｎｃ１１９のリン酸化を亢進する物質であってもよい。Ｕｎｃ１１９の脱リン酸化を触媒する酵素はカルシニューリンであるので、リン酸化Ｕｎｃ１１９の脱リン酸化を阻害する物質は、カルシニューリン阻害剤であってもよい。カルシニューリン阻害剤としては、公知のカルシニューリン阻害剤を好適に用いることができる。公知のカルシニューリン阻害剤は、シクロスポリンまたはタクロリムスであってもよい。また、Ｕｎｃ１１９のリン酸化を触媒する酵素はＣＫ２であるので、Ｕｎｃ１１９のリン酸化を亢進する物質は、ＣＫ２活性化剤であってもよい。
【００１２】
シクロスポリン（Ciclosporin）は免疫抑制剤の有効成分として周知であり、日本においても医療用医薬品として承認され、薬価収載されている。シクロスポリンは、サイクロスポリン（Cyclosporin）、シクロスポリンＡ、サイクロスポリンＡ、ＣｓＡなどとも称される。シクロスポリンは日本薬局方収載医薬品であり、日本薬局方には以下のとおり記載されている。
【００１３】
一般名：シクロスポリン（Ciclosporin）、別名：サイクロスポリンＡ
化学名：cyclo{-[(2S,3R,4R,6E)-3-Hydroxy-4-methyl-2-methylaminooct-6-enoyl]-L-2-aminobutanoyl-N-methylglycyl-N-methyl-L-leucyl-L-valyl-N-methyl-L-leucyl-L-alanyl-D-alanyl-N-methyl-L-leucyl-N-methyl-L-leucyl-N-methyl-L-valyl-}
分子式：C62H111N11O12
分子量：1202.61
構造式：
【００１４】
【化１】
2020080275.tif 000003
【００１５】
タクロリムス（tacrolimus）は免疫抑制剤の有効成分として周知であり、日本においても医療用医薬品として承認され、薬価収載されている。タクロリムスは、ＦＫ５０６とも称される。日本薬局方にはタクロリムス水和物として収載されており、本発明に使用するタクロリムスはタクロリムス水和物であってもよい。日本薬局方には以下のとおり記載されている。
【００１６】
一般名：タクロリムス水和物（Tacrolimus Hydrate）
化学名：(3S,4R,5S,8R,9E,12S,14S,15R,16S,18R,19R,26aS)-5,19-Dihydroxy-3-{(1E)-2-[(1R,3R,4R)-4-hydroxy-3-methoxycyclohexyl]-1-methylethenyl}-14,16-dimethoxy-4,10,12,18-tetramethyl-8-(prop-2-en-1-yl)-15,19-epoxy-5,6,8,11,12,13,14,15,16,17,18,19,24,25,26,26ahexadecahydro-3H-pyrido[2,1-c][1,4]oxaazacyclotricosine-1,7,20,21(4H,23H)-tetrone monohydrate
分子式：C44H69NO12・H2O
分子量：822.03
構造式：
【００１７】
【化２】
2020080275.tif 000004
【００１８】
網膜および／または光受容に関連する症状は、網膜に発現する症状でもよく、網膜以外の臓器や組織に発現する症状でもよい。網膜に発現する症状は、網膜に起因して網膜に発現する症状でもよく、網膜以外の臓器や組織に起因して網膜に発現する症状でもよい。網膜以外の臓器や組織に発現する症状は、網膜に起因するものに限られる。網膜に起因する症状は、例えば、日常生活において受ける光刺激または光ストレスが原因となる症状であってもよく、強い光を浴びることが原因となる症状等であってもよい。
【００１９】
網膜および／または光受容に関連する症状としては、加齢黄斑変性、網膜色素変性症、レーベル黒内障、スタルガルト病（若年性黄斑変性）、錐体桿体ジストロフィー、糖尿病網膜症、黄斑浮腫、網膜虚血、網膜動脈閉塞症、網膜静脈閉塞症、光過敏性発作、光感受性てんかん、精神疾患、光線黄斑症、眼精疲労、網膜機能低下（例えば、老化によるもの等）、睡眠障害、片頭痛、光障害（例えば、屋外明所での活動、スポーツ、登山、コンピューターディスプレイ等から発せられる青色光等による光障害）、感覚過敏、視覚認知障害を伴う精神疾患（例えば、鬱病、抑鬱状態、双極障害（躁鬱病）、自閉症、精神発達障害、統合失調症等）などが挙げられる。網膜に発現する症状としては、加齢黄斑変性、網膜色素変性症、レーベル黒内障、スタルガルト病、錐体桿体ジストロフィー、糖尿病網膜症、黄斑浮腫、網膜虚血、網膜動脈閉塞症、網膜静脈閉塞症、光線黄斑症、眼精疲労、網膜機能低下、光障害などが挙げられる。
【００２０】
本発明の網膜および／または光受容に関連する症状の改善または予防用医薬は、網膜保護用医薬、網膜変性抑制用医薬、網膜老化抑制用医薬、感覚過敏の改善または抑制用医薬、光誘発性疾患の改善または予防用医薬、光誘発性障害の改善または予防用医薬と称してもよい。
【００２１】
本発明の医薬は、上記の有効成分に薬学的に許容される担体、さらに添加剤を適宜配合して製剤化することができる。具体的には錠剤、被覆錠剤、丸剤、散剤、顆粒剤、カプセル剤、液剤、懸濁剤、乳剤等の経口剤；注射剤、輸液、坐剤、軟膏、パッチ剤等の非経口剤とすることができる。担体または添加剤の配合割合については、医薬品分野において通常採用されている範囲に基づいて適宜設定すればよい。配合できる担体または添加剤は特に制限されないが、例えば、水、生理食塩水、その他の水性溶媒、水性または油性基剤等の各種担体；賦形剤、結合剤、ｐＨ調整剤、崩壊剤、吸収促進剤、滑沢剤、着色剤、矯味剤、香料等の各種添加剤が挙げられる。
【００２２】
賦形剤としては、例えば乳糖、白糖、Ｄ−マンニトール、デンプン、結晶セルロース、軽質無水ケイ酸が挙げられ、結合剤としては、例えば、結晶セルロース、白糖、Ｄ−マンニトール、デキストリン、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリビニルピロリドン等の高分子化合物等が挙げられ、滑沢剤としては、例えば、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウム、タルク、コロイドシリカ等が挙げられ、崩壊剤としては、例えば、デンプン、カルボキシメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースカルシウム、クロスカルメロースナトリウム、カルボキシメチルスターチナトリウム等が挙げられ、湿潤剤としては、例えば、グリセリン、ブチレングリコール、プロピレングリコール、ソルビトール、トリアセチン等が挙げられるが、これらに限られない。必要に応じて、コーティング剤（白糖、ゼラチン、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレート等）で被覆していてもよいし、また２以上の層で被覆していてもよい。
【００２３】
注射剤の場合、有効成分を生理食塩水等の水性基剤または注射用に許容される油性基剤に溶解または分散させて、静脈内投与用、筋肉内投与用または皮下投与用の注射剤とすればよい。必要に応じて、緩衝剤、ｐＨ調整剤、等張化剤、溶解補助剤、懸濁化剤、安定化剤等の添加剤を適宜加えることができる。
【００２４】
注射剤の場合、水性基剤としては、例えば、生理食塩水、注射用水、リンゲル液等の輸液が挙げられる。油性基剤としては、例えば、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、ゴマ油、ダイズ油、トウモロコシ油、ラッカセイ油、綿実油、オリーブ油、プロピレングリコール脂肪酸エステル等が挙げられる。緩衝剤としては、例えば、リン酸塩、酢酸塩、炭酸塩、クエン酸塩、ホウ酸塩、グルタミン酸塩、イプシロンアミノカプロン酸塩、トリス緩衝液等の緩衝液等が挙げられる。ｐＨ調整剤としては、例えば、塩酸、リン酸、硫酸、炭酸等の無機酸、酢酸、酒石酸、乳酸、クエン酸、コハク酸等の有機酸、水酸化ナトリウム等の無機塩基、クエン酸ナトリウム、酒石酸ナトリウム等の有機塩基が挙げられる。等張化剤としては、例えば、塩化ナトリウム等の無機塩類、Ｄ−マンニトール、ソルビトール、キシリトール等の糖アルコール、フルクトース、グルコース、ガラストース、リボース、キシロース、マンノース、マルトトリオース、マルトテトラオース等の糖類、グリシン、アルギニン等のアミノ酸が挙げられる。溶解補助剤としては、例えば、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、Ｄ−マンニトール、安息香酸ベンジル、エタノール、トリスアミノメタン、コレステロール、トリエタノールアミン、炭酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム、レシチンや、ポリソルベート８０等の非イオン界面活性剤が挙げられる。懸濁化剤としては、例えば、ステアリルトリエタノールアミン、ラウリル硫酸ナトリウム、ラウリルアミノプロピオン酸、レシチン、モノステアリン酸グリセリン等の界面活性剤や、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、カルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、ヒドロキシメチルセルロース等が挙げられる。安定化剤としては、例えば、アルブミン、グロブリン、ゼラチン、ソルビトール、エチレングルコール、プロピレングリコール、アスコルビン酸等が挙げられる。
【００２５】
本発明の医薬の有効成分であるシクロスポリンおよびタクロリムスは、既に長年にわたり臨床で使用されているので、本発明の医薬は、ヒトや他の哺乳動物（例えば、ラット、マウス、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ネコ、イヌ、サルなど）に対して、安全に投与することができる。
【００２６】
有効成分としてシクロスポリンまたはタクロリムスを用いる場合、本発明の医薬の１日当たりの投与量は、臨床使用されているシクロスポリンまたはタクロリムスの１日当たりの投与量に準じて設定することができる。
【００２７】
〔網膜変性抑制剤、網膜保護剤〕
本発明は、Ｕｎｃ１１９のリン酸化状態を維持または亢進させる物質を有効成分として含有する、網膜変性抑制剤を提供する。また、本発明は、Ｕｎｃ１１９のリン酸化状態を維持または亢進させる物質を有効成分として含有する、網膜保護剤を提供する。本発明者らは、タクロリムスまたはシクロスポリンを投与したマウスに光障害を誘導し、網膜の凍結切片を作製して網膜視細胞層を共焦点レーザスキャン顕微鏡で観察したところ、錐体視細胞および桿体視細胞の構造が破壊されずに保持されており、視細胞層の厚みも減少せずに保持されていることを確認した（実施例１参照）。したがって、本発明の網膜変性抑制剤および網膜保護剤は、光障害の予防または治療に有効である。
【００２８】
本発明の網膜変性抑制剤および網膜保護剤は、上記医薬の実施形態において説明した物質を有効成分とすることができる。また、本発明の網膜変性抑制剤および網膜保護剤は、上記医薬の実施形態において説明したように、各種剤形に製剤化することができ、ヒトや他の哺乳動物（例えば、ラット、マウス、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ネコ、イヌ、サルなど）に対して、安全に投与することができる。
【００２９】
〔スクリーニング方法〕
本発明は、網膜および／または光受容に関連する症状を改善又は予防する物質のスクリーニング方法を提供する。本発明のスクリーニング方法は、カルシニューリンを阻害する物質を選択する方法であってもよく、ＣＫ２を活性化する物質を選択する方法であってもよい。カルシニューリンを阻害する物質は、カルシニューリンの基質の脱リン酸化を阻害する物質を選択する方法であってもよい。ＣＫ２を活性化する物質は、ＣＫ２の基質のリン酸化を亢進させる物質を選択する方法であってもよい。
【００３０】
本発明のスクリーニング方法において、網膜および／または光受容に関連する症状は、網膜に発現する症状でもよく、網膜以外の臓器や組織に発現する症状でもよい。網膜に発現する症状は、網膜に起因して網膜に発現する症状でもよく、網膜以外の臓器や組織に起因して網膜に発現する症状でもよい。網膜以外の臓器や組織に発現する症状は、網膜に起因するものに限られる。網膜および／または光受容に関連する症状の具体例としては、上記で例示した各症状が挙げられる。
【００３１】
本発明のスクリーニング方法に供される被験物質は特に限定されず、核酸、ペプチド、タンパク、非ペプチド性化合物、合成化合物、発酵生産物、細胞抽出液、細胞培養上清、植物抽出液、哺乳動物の組織抽出液、血漿等であってもよい。被験物質は、新規な物質であってもよいし、公知の物質であってもよい。これら被験物質は塩を形成していてもよい。被験物質の塩としては、生理学的に許容される酸や塩基との塩が好ましい。
【００３２】
本発明のスクリーニング方法は、カルシニューリンを阻害する物質を選択する工程を含むものであればよい。カルシニューリンを阻害する物質がカルシニューリンの基質の脱リン酸化を阻害する物質である場合、本発明のスクリーニング方法は、例えば、カルシニューリンとカルモジュリン（Calmodulin）と基質と被験物質を接触させる工程と、基質のリン酸化状態を確認する工程と、被験物質を接触させない場合の基質のリン酸化状態と比較して基質のリン酸化状態を増強させる被験物質を選択する工程とを含む方法であってもよい。また、例えば、カルシニューリンとカルモジュリンと基質と被験物質を接触させる工程と、カルシニューリンと基質との相互作用を確認する工程と、被験物質を接触させない場合のカルシニューリンと基質との相互作用と比較して両者の相互作用を減少させる被験物質を選択する工程とを含む方法であってもよい。
【００３３】
カルシニューリンの基質は、公知のカルシニューリンの基質から選択すればよい。カルシニューリンの基質としては、例えば、ＮＦＡＴＣ１（nuclear factor of activated T cells 1）、ＤＮＭ１（dynamin 1）などが挙げられるが、これに限定されない。好ましくは、網膜に優位に発現しているユビキチン化酵素Ｋｌｈｌ１８の標的タンパク質であるＵｎｃ１１９である。以下、本発明のスクリーニング方法において、カルシニューリンの基質がＵｎｃ１１９である場合について詳細に説明するが、Ｕｎｃ１１９以外の基質を用いる場合も同様に実施することができる。
【００３４】
本発明のスクリーニング方法は、カルシニューリンとカルモジュリンとＵｎｃ１１９と被験物質を接触させる工程と、Ｕｎｃ１１９のリン酸化状態を確認する工程と、被験物質を接触させない場合のＵｎｃ１１９のリン酸化状態と比較してＵｎｃ１１９のリン酸化状態を増強させる被験物質を選択する工程とを含む方法であってもよい。カルシニューリンとカルモジュリンとＵｎｃ１１９と被験物質を接触させる工程は、カルシニューリンとカルモジュリンとＵｎｃ１１９を含む溶液を調製し、その溶液に被験物質を添加する方法であってもよく、カルシニューリンとカルモジュリンとＵｎｃ１１９を発現する細胞を培養し、その培養液に被験物質を添加する方法であってもよい。
【００３５】
本発明のスクリーニング方法に用いるカルシニューリンは、どのような生物由来のカルシニューリンでもよく、哺乳動物のカルシニューリンであってもよい。哺乳動物としては、ヒト、チンパンジー、サル、イヌ、ウシ、マウス、ラット、モルモットなどが挙げられ、好ましくはヒトのカルシニューリンである。カルシニューリンは試薬として市販されている組換えカルシニューリンや、市販のキット（例えば、Enzo Life Sciences社製「カルシニューリン活性測定キット」）に含まれる組換えカルシニューリンを使用してもよく、公知の遺伝子組換え技術を用いて組換えカルシニューリンを製造して使用してもよい。
【００３６】
カルシニューリン（Protein phosphatase 2B (PP2B)、Protein phosphatase 3 (ppp3)とも称される）は、触媒サブユニットであるカルシニューリンＡと制御サブユニットであるカルシニューリンＢから構成されるヘテロ二量体であり、カルモジュリンが結合することで活性化される。したがって、カルシニューリンＡをコードする遺伝子とカルシニューリンＢをコードする遺伝子を適当な宿主細胞に導入してカルシニューリン発現細胞を作製することができる。作製したカルシニューリン発現細胞を培養し、その培養上清または細胞抽出物から公知の方法（例えば、アフィニティーカラム）を用いて、組換えカルシニューリンを取得することができる。
【００３７】
ヒトのカルシニューリンＡおよびカルシニューリンＢのアミノ酸配列およびそれをコードする遺伝子の塩基配列のアクセッション番号を表１に示す。表１に記載のＰＰＰ３ＣＡ、ＰＰＰ３ＣＢ、ＰＰＰ３ＣＣのいずれか１つと、ＰＰＰ３Ｒ１、ＰＰＰ３Ｒ２いずれか１つを選択して宿主細胞に導入することにより、カルシニューリン発現細胞を作製することができる。ヒト以外の生物のカルシニューリンＡおよびカルシニューリンＢの塩基配列情報およびアミノ酸配列情報は、公知のデータベース（DDBJ/GenBank/EMBL等）から取得することができる。
【００３８】
【表１】
2020080275.tif 000005
【００３９】
本発明のスクリーニング方法に用いるカルモジュリンは、どのような生物由来のカルモジュリンでもよく、哺乳動物のカルモジュリンであってもよい。哺乳動物としては、ヒト、チンパンジー、サル、イヌ、ウシ、マウス、ラット、モルモットなどが挙げられ、好ましくはヒトのカルモジュリンである。カルモジュリンは試薬として市販されている組換えカルモジュリンや、市販のキット（例えば、Enzo Life Sciences社製「カルシニューリン活性測定キット」）に含まれる組換えカルモジュリンを使用してもよく、公知の遺伝子組換え技術を用いて組換えカルモジュリンを製造して使用してもよい。
【００４０】
ヒトのカルモジュリンには、カルモジュリン１、カルモジュリン２およびカルモジュリン３の３種類があり、これらのいずれか１つをコードする遺伝子を宿主細胞に導入することにより、カルモジュリン発現細胞を作製することができる。カルモジュリン発現細胞を培養し、その培養上清または細胞抽出物から公知の方法（例えば、アフィニティーカラム）を用いて、組換えカルモジュリンを取得することができる。ヒトのカルモジュリン１、２、３のアミノ酸配列およびそれをコードする遺伝子の塩基配列のアクセッション番号を表２に示す。ヒト以外の生物のカルモジュリンの塩基配列情報およびアミノ酸配列情報は、公知のデータベース（DDBJ/GenBank/EMBL等）から取得することができる。
【００４１】
【表２】
2020080275.tif 000006
【００４２】
本発明のスクリーニング方法に用いるＵｎｃ１１９は、どのような生物由来のＵｎｃ１１９でもよく、哺乳動物のＵｎｃ１１９であってもよい。哺乳動物としては、ヒト、チンパンジー、サル、イヌ、ウシ、マウス、ラット、モルモットなどが挙げられ、好ましくはヒトのＵｎｃ１１９である。Ｕｎｃ１１９は、公知の遺伝子組換え技術を用いて組換えＵｎｃ１１９を製造して使用すればよい。Ｕｎｃ１１９発現細胞は、Ｕｎｃ１１９をコードする遺伝子を宿主細胞に導入することにより作製することができ、作製したＵｎｃ１１９発現細胞を培養して、その培養上清または細胞抽出物から公知の方法（例えば、アフィニティーカラム）を用いて、組換えＵｎｃ１１９を取得することができる。
【００４３】
ヒトＵｎｃ１１９のアミノ酸配列およびそれをコードする遺伝子の塩基配列のアクセッション番号は、それぞれNM_005148およびNP_005139である。ヒト以外の生物のＵｎｃ１１９の塩基配列情報およびアミノ酸配列情報は、公知のデータベース（DDBJ/GenBank/EMBL等）から取得することができる。
【００４４】
本発明のスクリーニング方法に用いるカルシニューリンとカルモジュリンとＵｎｃ１１９を発現する細胞は、内因性のカルシニューリンとカルモジュリンとＵｎｃ１１９を発現する細胞でもよく、導入された遺伝子由来の組換えカルシニューリンと組換えカルモジュリンと組換えＵｎｃ１１９を発現する細胞でもよく、内因性タンパク質と組換えタンパク質を組み合わせてカルシニューリンとカルモジュリンとＵｎｃ１１９を発現する細胞でもよい。好ましくは、組換えカルシニューリンと組換えカルモジュリンと組換えＵｎｃ１１９を発現する細胞である。当該細胞は、宿主細胞にカルシニューリンＡをコードする遺伝子、カルシニューリンＢをコードする遺伝子、カルモジュリンをコードする遺伝子、Ｕｎｃ１１９をコードする遺伝子を共導入することにより作製することができる。各遺伝子の塩基配列情報は上記のとおりである。宿主細胞は導入した各遺伝子産物を発現できる細胞であればよく、特に限定されない。例えば、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞、Ｎｅｕｒｏ２ａ細胞、ＮＩＨ３Ｔ３細胞などが挙げられる。上記の組換えカルシニューリン発現細胞、組換えカルモジュリン発現細胞、組換えＵｎｃ１１９発現細胞に使用する宿主細胞にも、これらの細胞を好適に使用することができる。
【００４５】
カルシニューリンとカルモジュリンとＵｎｃ１１９と被験物質を接触させる工程において、カルシニューリンとカルモジュリンとＵｎｃ１１９を含む溶液を調製し、その溶液に被験物質を添加する方法で行う場合、溶液に添加するカルシニューリン、カルモジュリンおよびＵｎｃ１１９の量は特に限定されないが、モル比として約１：１：１であってもよい。被験物質の添加量は、次の工程でＵｎｃ１１９のリン酸化状態を確認できる限り特に限定されない。被験物質は、濃度範囲を設定して複数の濃度で添加してもよい。
【００４６】
使用する溶液は特に限定されず、タンパク質のリン酸化反応に使用可能な公知の緩衝液を好適に使用することができる。例えば、1 mM CaCl2、100 mM NaCl、1 mg/ml BSA、0.025% NP-40、1 mM DTTを含有する50 mM Tris-HCl (pH 7.5)緩衝液が挙げられる。溶液の温度および接触時間は、カルシニューリンとカルモジュリンが複合体を形成し、Ｕｎｃ１１９の脱リン酸化を触媒できる条件であればよく。例えば、溶液温度３７℃、接触時間３０分であってもよい。
【００４７】
カルシニューリンとカルモジュリンとＵｎｃ１１９と被験物質を接触させる工程において、カルシニューリンとカルモジュリンとＵｎｃ１１９を発現する細胞を培養し、その培養液に被験物質を添加する方法で行う場合、被験物質の添加量は、細胞の増殖および組み換えタンパク質の発現を著しく阻害しない量であればよい。被験物質は、濃度範囲を設定して複数の濃度で添加してもよい。被験物質の添加時間は特に限定されず、約０．５時間〜約４８時間であってもよい。
【００４８】
カルシニューリンとカルモジュリンとＵｎｃ１１９を発現する細胞を用いた場合、Ｕｎｃ１１９のリン酸化量を測定するための細胞溶解液を調製して、次工程に供する。細胞溶解液の調製方法は特に限定されず、公知の方法から適宜選択すればよい。具体的には、例えば以下の方法で調製してもよい。
培養液を除き、細胞をＴＢＳ（Tris-buffered saline：20mM Tris-HCl pH 7.4, 150mM NaCl）で２回洗浄し、Ｌｙｓｉｓ ｂｕｆｆｅｒ（20mM Tris-HCl pH 7.4, 150mM NaCl, 1% NP-40, phosphatase inhibitor cocktail (Roche社)）でピペッティングにより溶解させ、氷上に１０分間静置する。遠心分離（14,000rpm、半径5.4cm、10分間、4℃）した後、上清を回収し、等量の２×サンプルバッファー（0.1M Tris-HCl pH6.8, 1％SDS, 5％ βメルカプトエタノール, 10％グリセロール, 0.02％BPB）を加え、室温で３０分間静置する。
【００４９】
Ｕｎｃ１１９のリン酸化状態を確認する工程では、公知の方法でＵｎｃ１１９のリン酸化量を測定すればよい。例えば、リン酸化／非リン酸化フォームを分離可能な電気泳動法、リン酸が標識されたＡＴＰを溶液に添加する方法、リン酸化を認識する抗体を用いる方法などであってもよい。具体的には、Ｐｈｏｓ−ｔａｇ ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（商品名、富士フィルム和光純薬社）、３２Ｐ標識ＡＴＰ（パーキンエルマー社、他）、抗リン酸化セリン抗体（abcam社、製品コード：ab9332）などを使用することができる。
【００５０】
被験物質を接触させない場合のＵｎｃ１１９のリン酸化状態と比較してＵｎｃ１１９のリン酸化状態を増強させる被験物質を選択する工程では、被験物質を接触させないサンプル（コントロール群）のＵｎｃ１１９のリン酸化量と、被験物質を接触させたサンプル（被験物質群）のＵｎｃ１１９のリン酸化量を比較して、リン酸化量が増加している被験物質を選択すればよい。被験物質がＵｎｃ１１９のリン酸化量を増加させる程度は特に限定されないが、例えば、被験物質を接触させないサンプルと比較して、１２０％以上、１３０％以上、１４０％以上、１５０％以上、１７０％以上、１８０％以上、１９０％以上、２００％以上増加させる被験物質を選択してもよい。
【００５１】
本発明のスクリーニング方法は、カルシニューリンとカルモジュリンとＵｎｃ１１９と被験物質を接触させる工程と、カルシニューリンとＵｎｃ１１９との相互作用を確認する工程と、被験物質を接触させない場合のカルシニューリンとＵｎｃ１１９との相互作用と比較して両者の相互作用を減少させる被験物質を選択する工程とを含む方法であってもよい。
【００５２】
本実施形態では、カルシニューリンとカルモジュリンとＵｎｃ１１９と被験物質を接触させる工程は、カルシニューリンとカルモジュリンとＵｎｃ１１９を含む溶液を調製し、その溶液に被験物質を添加する方法で行ってもよく、Ｕｎｃ１１９を固相化し、そこにカルシニューリンとカルモジュリンと被験物質を添加する方法で行ってもよい。カルシニューリン、カルモジュリンおよびＵｎｃ１１９の使用量、被験物質の添加量、溶液、溶液温度、接触時間については上記のとおりである。
【００５３】
カルシニューリンとＵｎｃ１１９との相互作用を確認する工程では、公知の方法でカルシニューリンとＵｎｃ１１９の相互作用を測定すればよい。具体的には、例えば、ＦＲＥＴ（蛍光共鳴エネルギー移動：Fluorescence Resonance Energy Transfer）、Ａｌｐｈａ ｓｃｒｅｅｎ（化学増幅型ルミネッセンスプロキシミティホモジニアスアッセイ：Amplified Luminescence Proximity Homogeneous Assay）、免疫沈降法、ＥＬＩＳＡ法などであってもよい。
【００５４】
被験物質を接触させない場合のカルシニューリンとＵｎｃ１１９との相互作用と比較して両者の相互作用を減少させる被験物質を選択する工程では、被験物質を接触させないサンプル（コントロール群）のＵｎｃ１１９のリン酸化量と、被験物質を接触させたサンプル（被験物質群）のカルシニューリンとＵｎｃ１１９との相互作用量を比較して、相互作用量が減少している被験物質を選択すればよい。カルシニューリンとＵｎｃ１１９との相互作用量を減少させる程度は特に限定されないが、例えば、被験物質を接触させないサンプルと比較して、９０％以下、８０％以下、７０％以下、６０％以下、５０％以下、４０％以下、３０％以下に減少させる被験物質を選択してもよい。
【００５５】
本発明のスクリーニング方法は、ＣＫ２を活性化する物質を選択する工程を含むものであればよい。ＣＫ２を活性化する物質がＣＫ２の基質のリン酸化を亢進させる物質である場合、本発明のスクリーニング方法は、例えば、ＣＫ２と基質と被験物質をＡＴＰ存在下で接触させる工程と、基質のリン酸化状態を確認する工程と、被験物質を接触させない場合の基質のリン酸化状態と比較して基質のリン酸化状態を増強させる被験物質を選択する工程とを含む方法であってもよい。
【００５６】
ＣＫ２の基質は、公知のＣＫ２の基質から選択すればよい。ＣＫ２の基質としては、例えば、ＢＲＤ４（bromodomain containing 4）、ＫＢＴＢＤ８（kelch repeat and BTB domain containing 8）などが挙げられるが、これに限定されない。好ましくは、網膜に優位に発現しているユビキチン化酵素Ｋｌｈｌ１８の標的タンパク質であるＵｎｃ１１９である。以下、本発明のスクリーニング方法において、ＣＫ２の基質がＵｎｃ１１９である場合について詳細に説明するが、Ｕｎｃ１１９以外の基質を用いる場合も同様に実施することができる。
【００５７】
本発明のスクリーニング方法は、ＣＫ２とＵｎｃ１１９と被験物質をＡＴＰ存在下で接触させる工程と、Ｕｎｃ１１９のリン酸化状態を確認する工程と、被験物質を接触させない場合のＵｎｃ１１９のリン酸化状態と比較してＵｎｃ１１９のリン酸化状態を増強させる被験物質を選択する工程とを含む方法であってもよい。ＣＫ２とＵｎｃ１１９と被験物質をＡＴＰ存在下で接触させる工程は、ＣＫ２とＵｎｃ１１９とＡＴＰを含む溶液を調製し、その溶液に被験物質を添加する方法であってもよく、ＣＫ２とＵｎｃ１１９を発現する細胞をＡＴＰを含む培養液で培養し、その培養液に被験物質を添加する方法であってもよい。
【００５８】
本発明のスクリーニング方法に用いるＵｎｃ１１９は、上記と同様に、公知の遺伝子組換え技術を用いて製造した組換えＵｎｃ１１９を好適に使用することができる。
【００５９】
本発明のスクリーニング方法に用いるＣＫ２は、どのような生物由来のＣＫ２でもよく、哺乳動物のＣＫ２であってもよい。哺乳動物としては、ヒト、チンパンジー、サル、イヌ、ウシ、マウス、ラット、モルモットなどが挙げられ、好ましくはヒトのＣＫ２である。ＣＫ２は試薬として市販されている組換えＣＫ２を使用してもよく、公知の遺伝子組換え技術を用いて組換えＣＫ２を製造して使用してもよい。
【００６０】
ＣＫ２は触媒サブユニットであるアルファ（αまたはα’）と制御サブユニットであるベータ（β）がヘテロ四量体を形成して活性を発現する。ヘテロ四量体は、ααββ、αα’ββ、α’α’ββのいずれであってもよい。したがって、ＣＫ２発現細胞は、宿主細胞に、αをコードする遺伝子とβをコードする遺伝子の２種類の遺伝子を導入することにより、または、α’をコードする遺伝子とβをコードする遺伝子の２種類の遺伝子を導入することにより、または、αをコードする遺伝子とα’をコードする遺伝子とβをコードする遺伝子の３種類の遺伝子を導入することにより、作製することができる。作製したＣＫ２発現細胞を培養し、その培養上清または細胞抽出物から公知の方法（例えば、アフィニティーカラム）を用いて、組換えＣＫ２を取得することができる。
【００６１】
ヒトのＣＫ２アルファサブユニット（α）、アルファサブユニット（α’）およびベータサブユニット（β）のアミノ酸配列およびそれをコードする遺伝子の塩基配列のアクセッション番号を表３に示す。ヒト以外の生物のＣＫ２の塩基配列情報およびアミノ酸配列情報は、公知のデータベース（DDBJ/GenBank/EMBL等）から取得することができる。
【００６２】
【表３】
2020080275.tif 000007
【００６３】
本発明のスクリーニング方法に用いるＣＫ２とＵｎｃ１１９を発現する細胞は、内因性のＣＫ２とＵｎｃ１１９を発現する細胞でもよく、導入された遺伝子由来の組換えＣＫ２と組換えＵｎｃ１１９を発現する細胞でもよく、内因性タンパク質と組換えタンパク質を組み合わせてＣＫ２とＵｎｃ１１９を発現する細胞でもよい。好ましくは、組換えＣＫ２と組換えＵｎｃ１１９を発現する細胞である。当該細胞は、宿主細胞にＣＫ２をコードする遺伝子、Ｕｎｃ１１９をコードする遺伝子を共導入することにより作製することができる。具体的には、ＣＫ２アルファサブユニット（α）をコードする遺伝子、ＣＫ２ベータサブユニット（β）をコードする遺伝子、Ｕｎｃ１１９をコードする遺伝子を共導入する、または、ＣＫ２アルファサブユニット（α’）をコードする遺伝子、ＣＫ２ベータサブユニット（β）をコードする遺伝子、Ｕｎｃ１１９をコードする遺伝子を共導入する、または、ＣＫ２アルファサブユニット（α）をコードする遺伝子、ＣＫ２アルファサブユニット（α’）をコードする遺伝子、ＣＫ２ベータサブユニット（β）をコードする遺伝子、Ｕｎｃ１１９をコードする遺伝子を共導入することにより作製することができる。宿主細胞として使用できる細胞は上記の通りである。
【００６４】
ＣＫ２とＵｎｃ１１９と被験物質をＡＴＰ存在下で接触させる工程において、ＣＫ２とＵｎｃ１１９とＡＴＰを含む溶液を調製し、その溶液に被験物質を添加する方法で行う場合、溶液に添加するＣＫ２およびＵｎｃ１１９の量は特に限定されないが、モル比として約１：１であってもよい。ＡＴＰの添加量は特に限定されないが、１０μＭ〜１０００μＭであってもよい。被験物質の添加量は、次の工程でＵｎｃ１１９のリン酸化状態を確認できる限り特に限定されない。被験物質は、濃度範囲を設定して複数の濃度で添加してもよい。
【００６５】
使用する溶液は特に限定されず、タンパク質のリン酸化反応に使用可能な公知の緩衝液を好適に使用することができる。例えば、４０μＭのＡＴＰを添加した「１×ＮＥＢｕｆｆｅｒ ｆｏｒ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｋｉｎａｓｅ」（ＮＥＢ社）が挙げられる。溶液の温度および接触時間は、ＣＫ２がＵｎｃ１１９のリン酸化を触媒できる条件であればよく。例えば、溶液温度３０℃、接触時間３０分であってもよい。
【００６６】
ＣＫ２とＵｎｃ１１９と被験物質をＡＴＰ存在下で接触させる工程において、ＣＫ２とＵｎｃ１１９を発現する細胞を、ＡＴＰを含む培養液で培養し、その培養液に被験物質を添加する方法で行う場合、ＡＴＰの添加量は特に限定されないが、１０μＭ〜１０００μＭであってもよい。被験物質の添加量は、細胞の増殖および組み換えタンパク質の発現を著しく阻害しない量であればよい。被験物質は、濃度範囲を設定して複数の濃度で添加してもよい。被験物質の添加時間は特に限定されず、約０．５時間〜約４８時間であってもよい。
【００６７】
ＣＫ２とＵｎｃ１１９を発現する細胞を用いた場合、Ｕｎｃ１１９のリン酸化量を測定するための細胞溶解液を調製して、次工程に供する。細胞溶解液の調製方法は特に限定されず、公知の方法から適宜選択すればよい。具体的には、上記に例示した方法で細胞溶解液を調製してもよい。
【００６８】
Ｕｎｃ１１９のリン酸化状態を確認する工程では、公知の方法でＵｎｃ１１９のリン酸化量を測定すればよい。例えば、リン酸化／非リン酸化フォームを分離可能な電気泳動法、リン酸が標識されたＡＴＰを溶液に添加する方法、リン酸化を認識する抗体を用いる方法などであってもよい。具体的には、Ｐｈｏｓ−ｔａｇ ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（商品名、富士フィルム和光純薬社）、３２Ｐ標識ＡＴＰ（パーキンエルマー社、他）、抗リン酸化セリン抗体（abcam社、製品コード：ab9332）などを使用することができる。
【００６９】
被験物質を接触させない場合のＵｎｃ１１９のリン酸化状態と比較してＵｎｃ１１９のリン酸化状態を増強させる被験物質を選択する工程では、被験物質を接触させないサンプル（コントロール群）のＵｎｃ１１９のリン酸化量と、被験物質を接触させたサンプル（被験物質群）のＵｎｃ１１９のリン酸化量を比較して、リン酸化量が増加している被験物質を選択すればよい。被験物質がＵｎｃ１１９のリン酸化量を増加させる程度は特に限定されないが、例えば、被験物質を接触させないサンプルと比較して、１２０％以上、１３０％以上、１４０％以上、１５０％以上、１７０％以上、１８０％以上、１９０％以上、２００％以上増加させる被験物質を選択してもよい。
【００７０】
本発明には、以下の各発明が含まれる。
（ａ）哺乳動物に対して、Ｕｎｃ１１９のリン酸化状態を維持または亢進させる物質の有効量を投与することを含む網膜および／または光受容に関連する症状の改善または予防方法。
（ｂ）網膜および／または光受容に関連する症状の改善または予防に使用するためのＵｎｃ１１９のリン酸化状態を維持または亢進させる物質。
（ｃ）網膜および／または光受容に関連する症状の改善または予防用医薬を製造するためのＵｎｃ１１９のリン酸化状態を維持または亢進させる物質の使用。
発明（ａ）、（ｂ）または（ｃ）において、Ｕｎｃ１１９のリン酸化状態を維持または亢進させる物質はカルシニューリン阻害剤またはカゼインキナーゼ２活性化剤であってもよく、カルシニューリン阻害剤はシクロスポリンまたはタクロリムスであってもよい。
発明（ａ）、（ｂ）または（ｃ）において、網膜および／または光受容に関連する症状は、加齢黄斑変性、網膜色素変性症、レーベル黒内障、スタルガルト病、錐体桿体ジストロフィー、糖尿病網膜症、黄斑浮腫、網膜虚血、網膜動脈閉塞症、網膜静脈閉塞症、光過敏性発作、光感受性てんかん、精神疾患、光線黄斑症、眼精疲労、網膜機能低下、睡眠障害、片頭痛および光障害からなる群より選択される少なくとも１つの疾患であってもよい。
【実施例】
【００７１】
以下、実施例により本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。【００７２】
［実施例１：カルシニューリン活性阻害物質を投与したマウスに対する光障害実験］
（１）光障害実験方法
４週齢のＢＡＬＢ／ｃマウス（日本ＳＬＣ社）を暗黒下で１２時間飼育し暗順応させた。暗順応開始から８時間後に、暗黒下でタクロリムス（FK506、abcam社）（投与量10mg/kg）またはシクロスポリン（Cyclosporine A、abcam社）（投与量100mg/kg）を背中部に皮下注射した。コントロールマウスには、ＤＭＳＯを投与した。暗順応終了３０分前に暗黒下で散瞳剤サイプレジン（参天製薬株式会社）を点眼した。次に、周囲の４面と床が鏡張りの箱の中にマウスを入れてブルーＬＥＤライトから青色光を照射した。ブルーＬＥＤライトの波長は約４５０ｎｍで、マウスに到達する光は約７０００ルクスである。３時間青色光を照射したのち通常の明環境（蛍光灯が点灯している約３０ルクスの環境）で９時間飼育した。これを１サイクルとし、６日間繰り返した。すなわち、６日間毎日薬剤投与と青色光照射（３時間）を行い、光障害を誘導した。【００７３】
（２）組織学的分析
（ａ）免疫蛍光染色
最終の青色光照射の翌日に、マウスを安楽死させ、眼球を摘出した。４％パラホルムアルデヒド／ＰＢＳ（Phosphate Buffer Saline）を用いて室温で５分間固定した。固定後の眼球をＰＢＳで洗浄し、Ｏ．Ｃ．Ｔ．コンパウンド（Sakura Finetek社製）を用いて、眼球を包埋した。クライオスタットにより２０μｍの厚さの網膜凍結切片を作製し、スライドグラス上に貼り付け、凍結切片を室温にて乾燥させた。切片をＰＢＳで２回洗浄した後、ブロッキングバッファー（5% Normal donkey serum/0.1％TritonX-100/PBS）で、室温１時間ブロッキングした。その後、一次抗体を４℃で一晩反応させた。切片をＰＢＳで３回洗浄した後、二次抗体を室温で２時間反応させた。一次抗体には、抗Ｒｈｏｄｏｐｓｉｎ抗体（ロドプシン、ウサギポリクローナル、Santa Cruz社製、1:500希釈)、抗Ｓ−ｏｐｓｉｎ抗体（S-オプシン（青色錐体オプシン）、ヤギポリクローナル、Santa Cruz社製、1:500希釈）および抗Ｍ−ｏｐｓｉｎ抗体（M-オプシン（緑色錐体オプシン、ウサギポリクローナル、Millipore社製、1:500希釈）を用い、二次抗体には、Ａｌｅｘａ Ｆｌｏｕｒ ４８８標識抗体（Thermo Fisher Scientific社製、1:500希釈）およびＣｙ３標識抗体（Jackson ImmunoResearch Laboratories社、1:500希釈）を使用した。二次抗体の反応終了後、ＰＢＳで３回洗浄し、封入剤を用いて封入した。また、いずれのサンプルについてもＤＡＰＩを用いて細胞核の染色を行った。全ての蛍光画像は、共焦点レーザスキャン顕微鏡（LSM700、Carl Zeiss社製）を用いて取得した。【００７４】
（ｂ）視細胞層の厚みの計測
上記と同様にして作製したマウスの網膜切片をＰＢＳで２回洗浄した後、ＤＡＰＩを用いて細胞核の染色を行い、視細胞層の厚みを視神経の距離に応じて計測した。具体的には、共焦点レーザスキャン顕微鏡（LSM700、Carl Zeiss社製）で画像を取得し、画像解析ソフトＭｅｔａｍｏｒｐｈ（Molecular Devices社）を用いて視細胞層の厚みを計測した。【００７５】
（３）タクロリムス投与の結果
（ａ）免疫蛍光染色
タクロリムスを投与したマウスの網膜視細胞層を観察した結果を図１および２に示した。図１は、抗Ｒｈｏｄｏｐｓｉｎ抗体を用いて桿体視細胞外節を染色した結果であり、図２は、抗Ｓ−ｏｐｓｉｎ抗体および抗Ｍ−ｏｐｓｉｎ抗体を用いて錐体視細胞を染色した結果である。図１から明らかなように、光障害誘発コントロールマウス（ＤＭＳＯ投与）では、桿体視細胞外節がダメージを受けていたが、光障害誘発タクロリムス投与マウスでは、光障害非誘発コントロールおよび光障害非誘発タクロリムス投与マウスと同程度に桿体視細胞外節の構造が保たれていることが観察された。また、図２から明らかなように、光障害誘発コントロールマウス（ＤＭＳＯ投与）では、錐体視細胞がダメージを受けていたが、光障害誘発タクロリムス投与マウスでは、光障害非誘発コントロールおよび光障害非誘発タクロリムス投与マウスと同程度に錐体視細胞の構造が保たれていることが観察された。【００７６】
（ｂ）視細胞層の厚みの計測
タクロリムスを投与したマウスの網膜視細胞層の厚みを測定した結果を図３に示した。図３から明らかなように、光障害誘発コントロールマウス（ＤＭＳＯ投与）では、視細胞層の厚みが顕著に薄くなっていたが、光障害誘発タクロリムス投与マウスでは、光障害非誘発コントロールおよび光障害非誘発タクロリムス投与マウスと同程度に視細胞層の厚みが保持されていることが観察された。
これらの結果から、タクロリムス投与により、光曝露による視細胞の変性が阻害され、視細胞の構造が維持されていることが明らかになった。【００７７】
（４）シクロスポリン投与の結果
（ａ）免疫蛍光染色
シクロスポリンを投与したマウスの網膜視細胞層を観察した結果を図４および５に示した。図４は、抗Ｒｈｏｄｏｐｓｉｎ抗体を用いて桿体視細胞外節を染色した結果であり、図５は、抗Ｓ−ｏｐｓｉｎ抗体および抗Ｍ−ｏｐｓｉｎ抗体を用いて錐体視細胞を染色した結果である。図４から明らかなように、光障害誘発コントロールマウス（ＤＭＳＯ投与）では、桿体視細胞外節がダメージを受けていたが、光障害誘発シクロスポリン投与マウスでは、光障害非誘発コントロールおよび光障害非誘発シクロスポリン投与マウスと同程度に桿体視細胞外節の構造が保たれていることが観察された。また、図５から明らかなように、光障害誘発コントロールマウス（ＤＭＳＯ投与）では、錐体視細胞がダメージを受けていたが、光障害誘発シクロスポリン投与マウスでは、光障害非誘発コントロールおよび光障害非誘発シクロスポリン投与マウスと同程度に錐体視細胞の構造が保たれていることが観察された。【００７８】
（ｂ）視細胞層の厚みの計測
シクロスポリンを投与したマウスの網膜視細胞層の厚みを測定した結果を図６に示した。図６から明らかなように、光障害誘発コントロールマウス（ＤＭＳＯ投与）では、視細胞層の厚みが顕著に薄くなっていたが、光障害誘発シクロスポリン投与マウスでは、光障害非誘発コントロールおよび光障害非誘発シクロスポリン投与マウスと同程度に視細胞層の厚みが保持されていることが観察された。
これらの結果から、シクロスポリン投与により、光曝露による視細胞の変性が阻害され、視細胞の構造が維持されていることが明らかになった。【００７９】
［実施例２：ＣＫ２によるＵｎｃ１１９のリン酸化］
（１）Ｕｎｃ１１９発現プラスミドの作製
Ｎ末端に６×Ｈｉｓ（６×ヒスチジン）タグが付加されたＵｎｃ１１９を発現するプラスミドを作製するために、ヒトＵｎｃ１１９の全長ｃＤＮＡフラグメントをＰｌａｓｍＩＤから購入したヒトＵｎｃ１１９クローン（HsCD00330844）をテンプレートとしてＰＣＲで増幅し、ｐＥＴ−２８ｂベクター（Novagen）に組み込んだ。【００８０】
（２）６×Ｈｉｓタグ付加Ｕｎｃ１１９の発現と精製
６×Ｈｉｓタグ付加Ｕｎｃ１１９タンパク質は大腸菌（BL21(DE3)）で発現させ、精製した。ｐＥＴ−２８ｂ−Ｕｎｃ１１９を導入した大腸菌をＬＢ培地でＯＤ６００ｎｍが０．６となるまで増殖させ、１ｍＭのＩＰＴＧで処理したのち２５℃で３時間３０分培養して遠心により菌体を回収した。集菌した大腸菌はｓｏｎｉｃａｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒ（20mM Tris-HCl pH 7.4, 1mM EDTA, 150mM NaCl, 1％TritonX-100, 1mM DTT, 50mM imidazole, 1mM PMSF, 2μg/ml leupeptin, 5μg/ml aprotinin, 3μg/ml pepstatinA）を用いて溶解した後、遠心した。上清はＮｉ−ＮＴＡ Ａｇａｒｏｓｅ（QIAGEN）と４℃で２時間混和した。ビーズはｗａｓｈ ｂｕｆｆｅｒ（20mM Tris-HCl pH 7.4, 1％NP-40, 150mM NaCl, 5mM EDTA）で洗い、ｅｌｕｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒ（200mM imidazole, 150mM NaCl, 20mM Tris-HCl, pH7.4, 0.1％ TritonX-100, 1mM DTT）で溶出した。【００８１】
（３）試験管内キナーゼアッセイ
２μｇの精製した６×Ｈｉｓタグ付加Ｕｎｃ１１９タンパク質を５０ユニットのＣＫ２（NEB）と４０μＭのＡＴＰを含む１×ＮＥＢｕｆｆｅｒ ｆｏｒ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｋｉｎａｓｅ（ＮＥＢ社）中において３０℃で３０分反応させた。反応は等量の２×サンプルバッファー（0.1M Tris-HCl pH6.8, 1％SDS, 5％ βメルカプトエタノール, 10％グリセロール, 0.02％BPB）を加え、室温で３０分間静置することによって終了した。【００８２】
（４）Ｐｈｏｓ−ｔａｇ ＳＤＳ−ＰＡＧＥ
試験管内キナーゼアッセイ後のサンプルは製品説明書に基づきＰｈｏｓ−ｔａｇアクリルアミド（Ｗａｋｏ）を用いたＳＤＳ−ＰＡＧＥによって検出した（参考文献１：Mol. Cell. Proteomics. 5(4):749-757(2006)、参考文献２：Proteomics 11 (2):319-323(2011)）。【００８３】
（５）結果
ＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を図７に示した。Ｐｈｏｓ−ｔａｇ ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって、ＣＫ２と反応させていないサンプルでは１本の６×Ｈｉｓタグ付加Ｕｎｃ１１９タンパク質のバンド（黒矢頭）が観察された一方で、ＣＫ２と反応させたサンプルでは黒矢頭のバンドに加え、シフトアップしたバンド（白矢頭）も観察され、ＣＫ２によるＵｎｃ１１９のリン酸化が確認された。【００８４】
なお本発明は上述した各実施形態および実施例に限定されるものではなく、請求項に示した範囲で種々の変更が可能であり、異なる実施形態にそれぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。また、本明細書中に記載された学術文献および特許文献の全てが、本明細書中において参考として援用される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【国際調査報告】
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