(57)【要約】  本発明の課題は、光免疫療法において使用するための、ビオチン改変二量体とフタロシアニン染料とのコンジュゲートを提供することである。本発明によれば、下記式（１）で示される化合物又はその塩とフタロシアニン染料とのコンジュゲートが提供される。2020032165.tif 000029（式中、各記号の意味は本明細書において定義した通りである。）
2020032165.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記式（１）で示される化合物又はその塩とフタロシアニン染料とのコンジュゲート。
【化１】
2020032165.tif 000022
（式中、
Ｘ１ａ、Ｘ１ｂ、Ｘ２ａ及びＸ２ｂはそれぞれ独立にＯ又はＮＨを示し、
Ｙ１及びＹ２はそれぞれ独立にＣ又はＳを示し、
Ｚ１及びＺ２はそれぞれ独立にＯ、Ｓ又はＮＨを示し、
Ｖ１及びＶ２はそれぞれ独立にＳ又はＳ＋−Ｏ−を示し、ｎ１及びｎ２はそれぞれ独立に０又は１の整数を示し、
Ｌ１及びＬ２はそれぞれ独立に、２価の連結基を示し、
Ｌ３は、フタロシアニン染料と結合できる官能基を末端に含む基であり、
Ｌ４は、３価の連結基を示す。）
【請求項２】
下記式（１）で示される化合物が、下記式（２）で示される、請求項１に記載のコンジュゲート。
【化２】
2020032165.tif 000023
（式中の各記号の意味は請求項１と同義である。）
【請求項３】
Ｘ１ａ、Ｘ１ｂ、Ｘ２ａ及びＸ２ｂがＮＨを示し、Ｙ１及びＹ２がＣを示し、Ｚ１及びＺ２がＮＨを示し、Ｖ１及びＶ２がＳを示す、請求項１又は２に記載のコンジュゲート。
【請求項４】
Ｌ１及びＬ２がそれぞれ独立に、−ＣＯＮＨ−、−ＮＨＣＯ−、−ＣＯＯ−、−ＯＣＯ―、−ＣＯ−、−Ｏ−、及び炭素数１から１０のアルキレン基から選択される基の組み合わせからなる２価の連結基である、請求項１から３の何れか一項に記載のコンジュゲート。
【請求項５】
Ｌ３が、−ＣＯＮＨ−、−ＮＨＣＯ−、−ＣＯＯ−、−ＯＣＯ―、−ＣＯ−、−Ｏ−、及び炭素数１から１０のアルキレン基から選択される基の組み合わせからなる基であって、さらにアミノ基を末端に含む基である、請求項１から４の何れか一項に記載のコンジュゲート。
【請求項６】
フタロシアニン染料が、下記式（２１）で示される、請求項１から５の何れか一項に記載のコンジュゲート。
【化３】
2020032165.tif 000024
（式中、Ｌ２１は２価の連結基を示し、Ｒ２１は、式（１）で示される化合物又はその塩と結合できる官能基を示し、Ｘ及びＹはそれぞれ独立に親水性基、−ＯＨ、水素原子、又は置換基である。）
【請求項７】
Ｘ及び／又はＹで示される親水性基が、
【化４】
2020032165.tif 000025
である、請求項６に記載のコンジュゲート。
【請求項８】
Ｌ２１が、−ＣＯＮＨ−、−ＮＨＣＯ−、−ＣＯＯ−、−ＯＣＯ―、−ＣＯ−、−Ｏ−、及び炭素数１から１０のアルキレン基から選択される基の組み合わせからなる基である、請求項６又は７に記載のコンジュゲート。
【請求項９】
Ｒ２１が、活性エステル基である、請求項６から８の何れか一項に記載のコンジュゲート。
【請求項１０】
以下の何れかのコンジュゲート。
【化５】
2020032165.tif 000026
【化６】
2020032165.tif 000027
【化７】
2020032165.tif 000028
【請求項１１】
請求項１から１０の何れか１項に記載のコンジュゲートを含む、治療剤。
【請求項１２】
（１）請求項１から１０の何れか１項に記載のコンジュゲート、及び（ｂ）配列番号１に記載のアミノ酸配列を含むストレプトアビジン変異体と分子プローブとのコンジュゲート：を含む治療キット。
【請求項１３】
分子プローブが、抗ＥＲＥＧ抗体、抗ＣＥＡ抗体、または抗ＨＥＲ２抗体である、請求項１２に記載の治療キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ビオチン改変二量体とフタロシアニン染料とのコンジュゲート、並びにその利用に関する。
【背景技術】
【０００２】
アビジンとビオチン、あるいはストレプトアビジンとビオチンの間の親和性は非常に高く（Kd=10-15 から10-14M）、生体二分子間の相互作用としては、最も強い相互作用の一つである。現在、アビジン／ストレプトアビジン-ビオチン相互作用は、生化学、分子生物学、あるいは医学の分野で広く応用されている。アビジン／ストレプトアビジンとビオチンの高い結合能と抗体分子とを組み合わせたドラッグデリバリーの方法およびプレターゲティング法が考案されている。これらの研究に関連し、特許文献１には、天然ビオチンに対する親和性を低減させたストレプトアビジン変異体、並びにこの天然ビオチンに対する低親和性のストレプトアビジン変異体に対して高い親和性を有するビオチン改変二量体が報告されている。【０００３】
一方、 光免疫療法とは、体内で特定の細胞を破壊するために光増感剤及び照射光を使用する治療法である。光増感剤は、特異的な波長の光に晒されるとき、付近の細胞のアポトーシス、ネクローシス、及び／又は自食作用を誘発できる細胞傷害性の活性酸素種を生じる。例えば、特許文献２には、細胞を死滅させる方法であって、 細胞表面タンパク質を含む細胞を、治療有効量の１または複数の抗体−ＩＲ７００分子と接触させるステップであって、該抗体が該細胞表面タンパク質に特異的に結合するステップと；該細胞に、６６０〜７４０ｎｍの波長で、かつ少なくとも１Ｊｃｍ−２の線量で照射するステップと；該細胞に照射した約０〜８時間後に、該細胞を１または複数の治療剤と接触させ、これにより、該細胞を死滅させるステップとを含む方法が記載されている。特許文献３には、疾患又は病態を患っている対象において細胞毒性を誘発する方法であって、（ａ）対象の細胞に特異的に結合するプローブにコンジュゲートしたＩＲＤｙｅ（登録商標）７００ＤＸなどのフタロシアニン染料を包含する治療的に有効な薬剤を該対象に投与し；そして、（ｂ）細胞死を誘発するのに有効な量で適切な励起光を前記細胞に照射することを含む、方法が記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】国際公開ＷＯ２０１５／１２５８２０
【特許文献２】特許６１２７０４５号公報
【特許文献３】特表２０１７−５２４６５９号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、光免疫療法において使用するための、ビオチン改変二量体とフタロシアニン染料とのコンジュゲートを提供することを解決すべき課題とした。さらに本発明は、上記したビオチン改変二量体とフタロシアニン染料とのコンジュゲート、並びにストレプトアビジン変異体−分子プローブコンジュゲートの組み合わせを用いた治療キットを提供することを解決すべき課題とした。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者は上記課題を解決するために鋭意検討した結果、ビオチン改変二量体とフタロシアニン染料とのコンジュゲートを用いた光免疫療法により、がん細胞の増殖を抑制できることを見出し、本発明を完成するに至った。【０００７】
即ち、本発明によれば、以下の発明が提供される。
［１］  下記式（１）で示される化合物又はその塩とフタロシアニン染料とのコンジュゲート。
【化１】
2020032165.tif 000003
（式中、
Ｘ１ａ、Ｘ１ｂ、Ｘ２ａ及びＸ２ｂはそれぞれ独立にＯ又はＮＨを示し、
Ｙ１及びＹ２はそれぞれ独立にＣ又はＳを示し、
Ｚ１及びＺ２はそれぞれ独立にＯ、Ｓ又はＮＨを示し、
Ｖ１及びＶ２はそれぞれ独立にＳ又はＳ＋−Ｏ−を示し、ｎ１及びｎ２はそれぞれ独立に０又は１の整数を示し、
Ｌ１及びＬ２はそれぞれ独立に、２価の連結基を示し、
Ｌ３は、フタロシアニン染料と結合できる官能基を末端に含む基であり、
Ｌ４は、３価の連結基を示す。）【０００８】
［２］  下記式（１）で示される化合物が、下記式（２）で示される、［１］に記載のコンジュゲート。
【化２】
2020032165.tif 000004
（式中の各記号の意味は［１］  と同義である。）【０００９】
［３］  Ｘ１ａ、Ｘ１ｂ、Ｘ２ａ及びＸ２ｂがＮＨを示し、Ｙ１及びＹ２がＣを示し、Ｚ１及びＺ２がＮＨを示し、Ｖ１及びＶ２がＳを示す、［１］又は［２］に記載のコンジュゲート。
［４］  Ｌ１及びＬ２がそれぞれ独立に、−ＣＯＮＨ−、−ＮＨＣＯ−、−ＣＯＯ−、−ＯＣＯ―、−ＣＯ−、−Ｏ−、及び炭素数１から１０のアルキレン基から選択される基の組み合わせからなる２価の連結基である、［１］から［３］の何れか一に記載のコンジュゲート。
［５］  Ｌ３が、−ＣＯＮＨ−、−ＮＨＣＯ−、−ＣＯＯ−、−ＯＣＯ―、−ＣＯ−、−Ｏ−、及び炭素数１から１０のアルキレン基から選択される基の組み合わせからなる基であって、さらにアミノ基を末端に含む基である、［１］から［４］の何れか一に記載のコンジュゲート。【００１０】
［６］  フタロシアニン染料が、下記式（２１）で示される、［１］から［５］の何れか一に記載のコンジュゲート。
【化３】
2020032165.tif 000005
（式中、Ｌ２１は２価の連結基を示し、Ｒ２１は、式（１）で示される化合物又はその塩と結合できる官能基を示し、Ｘ及びＹはそれぞれ独立に親水性基、−ＯＨ、水素原子又は置換基である。）【００１１】
［７］  Ｘ及び／又はＹで示される親水性基が、
【化４】
2020032165.tif 000006
である、［６］に記載のコンジュゲート。【００１２】
［８］  Ｌ２１が、−ＣＯＮＨ−、−ＮＨＣＯ−、−ＣＯＯ−、−ＯＣＯ―、−ＣＯ−、−Ｏ−、及び炭素数１から１０のアルキレン基から選択される基の組み合わせからなる基である、［６］又は［７］に記載のコンジュゲート。
［９］  Ｒ２１が、活性エステル基である、［６］から［８］の何れか一に記載のコンジュゲート。【００１３】
［１０］  以下の何れかのコンジュゲート。
【化５】
2020032165.tif 000007
【化６】
2020032165.tif 000008
【化７】
2020032165.tif 000009
【００１４】
［１１］  ［１］から［１０］の何れか一に記載のコンジュゲートを含む、治療剤。
［１２］  （１）［１］から［１０］の何れか一に記載のコンジュゲート、及び（ｂ）配列番号１に記載のアミノ酸配列を含むストレプトアビジン変異体と分子プローブとのコンジュゲート：を含む治療キット。
［１３］  分子プローブが、抗ＥＲＥＧ抗体、抗ＣＥＡ抗体、または抗ＨＥＲ２抗体である、［１２］に記載の治療キット。
［１４］  配列番号１に記載のアミノ酸配列を含むストレプトアビジン変異体とＥＲＥＧ抗原を認識するｓｃＦｖ型抗体との融合タンパク質を発現することができる、配列番号２に記載の塩基配列によりコードされる融合タンパク質。
【発明の効果】
【００１５】
本発明によるビオチン改変二量体とフタロシアニン染料とのコンジュゲートを用いた光免疫療法により、がん細胞の増殖を抑制することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】図１は、本発明のコンジュゲートを用いた細胞増殖抑制実験の結果を示す。
【図２】図２は、本発明のコンジュゲートを用いた細胞増殖抑制実験の結果を示す。
【図３】図３は、ドメイン構造の概略を示す。
【図４】図４は、CEA-V2122のSDS-PAGE泳動CBB 染色像を示す。
【図５】図５は、CEA-Cupidの抗原（CEACAM5）との結合性能評価を示す。
【図６】図６は、CEA-Cupidのビオチン改変体との結合性能評価を示す。
【図７】図７は、FITC標識CEA-V2122による細胞染色像を示す。
【図８】図８は、FITC標識CEA-V2122による細胞染色像MKN45 cell 時系列データを示す。
【図９】図９は、光活性化化合物結合ビオチン改変体を示す。
【図１０】図１０は、CEA-Cupidと光活性化化合物結合ビオチン改変体とを組合わせた in vitro 細胞障害性を示す。
【図１１】図１１は、腫瘍塊の大きさの変化を示す。
【図１２】図１２は、CEA-Cupidと光活性化化合物結合ビオチン改変体とを組合わせた in vivo 細胞障害性を示す。
【図１３】図１３は、CEA-Cupidと光活性化化合物結合ビオチン改変体とを組合わせたin vivo 細胞障害性 病理組織像を示す。
【図１４】図１４は、抗CEACAM5抗体を用いた病理切片の解析を示す。
【図１５】図１５は、HER2-V2122構造図を示す。
【図１６】図１６は、HER2-V2122のSDS-PAGE泳動CBB 染色像を示す。
【図１７】図１７は、HER2-Cupid の抗原（HER2) との結合性能評価を示す。
【図１８】図１８は、HER2-Cupid のビオチン改変体との結合性能評価を示す。
【図１９】図１９は、HER2-Cupidと光活性化化合物結合ビオチン改変体とを組合わせた in vitro 細胞障害性を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
以下、本発明について更に詳細に説明する。
（１）ビオチン改変二量体
本発明は、ビオチン改変二量体とフタロシアニン染料とのコンジュゲートに関する。
ビオチン改変二量体は、下記式（１）で示される化合物又はその塩であり、好ましくは下記式（２）で示される化合物又はその塩である。ビオチン改変二量体は、国際公開ＷＯ２０１５／１２５８２０号に記載されている化合物を使用することができる。
【００１８】
【化８】
2020032165.tif 000010
【００１９】
【化９】
2020032165.tif 000011
【００２０】
式中、Ｘ１ａ、Ｘ１ｂ、Ｘ２ａ及びＸ２ｂはそれぞれ独立にＯ又はＮＨを示し、
Ｙ１及びＹ２はそれぞれ独立にＣ又はＳを示し、
Ｚ１及びＺ２はそれぞれ独立にＯ、Ｓ又はＮＨを示し、
Ｖ１及びＶ２はそれぞれ独立にＳ又はＳ＋−Ｏ−を示し、ｎ１及びｎ２はそれぞれ独立に０又は１の整数を示し、
Ｌ１及びＬ２はそれぞれ独立に、２価の連結基を示し、
Ｌ３は、フタロシアニン染料と結合できる官能基を末端に含む基であり、
Ｌ４は、３価の連結基を示す。
【００２１】
式（１）及び式（２）において、下記構造：
【化１０】
2020032165.tif 000012
で示される部分は好ましくは、
【化１１】
2020032165.tif 000013
の何れかであるが、これらに限定はされない。
【００２２】
Ｘ１ａ、Ｘ１ｂ、Ｘ２ａ及びＸ２ｂがＮＨを示すことが好ましく、Ｙ１及びＹ２がＣを示すことが好ましく、Ｚ１及びＺ２がＮＨを示すことが好ましく、Ｖ１及びＶ２がＳを示すことが好ましい。
【００２３】
Ｌ１及びＬ２はそれぞれ独立に、−ＣＯＮＨ−、−ＮＨＣＯ−、−ＣＯＯ−、−ＯＣＯ―、−ＣＯ−、−Ｏ−、及び炭素数１から１０のアルキレン基から選択される基の組み合わせからなる２価の連結基であることが好ましい。
Ｌ１及びＬ２はそれぞれ独立に、−ＣＯＮＨ−、−ＮＨＣＯ−、−Ｏ−、及び炭素数１から１０のアルキレン基から選択される基の組み合わせからなる２価の連結基であることが好ましい。
Ｌ１、及びＬ２はそれぞれ独立に、−ＣＯＮＨ−、−ＮＨＣＯ−、及び炭素数１から１０のアルキレン基から選択される基の組み合わせからなる２価の連結基であることが好ましい。
【００２４】
Ｌ４は、３価の連結基を示し、好ましくは、
【化１２】
2020032165.tif 000014
又は、
【化１３】
2020032165.tif 000015
である（ベンゼンに由来する３価の連結基または窒素原子）。
【００２５】
Ｌ３は、好ましくは、−ＣＯＮＨ−、−ＮＨＣＯ−、−ＣＯＯ−、−ＯＣＯ―、−ＣＯ−、−Ｏ−、及び炭素数１から１０のアルキレン基から選択される基の組み合わせからなる基であって、さらにアミノ基を末端に含む基である。
【００２６】
（２）フタロシアニン染料
フタロシアニン染料は、好ましくはシリコンフタロシアニン染料である。ＩＲＤｙｅ（登録商標）７００ＤＸのようなフタロシアニン染料の具体例は、例えば、米国特許第７，００５，５１８号に記載されている。
【００２７】
フタロシアニン染料としては、下記式（２１）で示される染料を使用することができ、一例としては、下記式（２２）で示される染料を使用することができ
【００２８】
【化１４】
2020032165.tif 000016
【００２９】
【化１５】
2020032165.tif 000017
【００３０】
式中、Ｌ２１は２価の連結基を示し、Ｒ２１は、式（１）で示される化合物又はその塩と結合できる官能基を示す。
【００３１】
Ｘ及びＹはそれぞれ独立に親水性基、−ＯＨ、水素原子又は置換基である。ここで言う置換基としては、ハロゲン原子（フッ素原子）、炭素原子を含む置換基（炭化水素基など）、窒素原子を含む置換基（アミノ基など）などを挙げることができるが、特に限定されない。
Ｘ及びＹの具体例としては、
（ｉ）Ｘ及びＹがともに親水性基である場合、
（ｉｉ）Ｘ及びＹの一方が親水性基であり、Ｘ及びＹの他方が−ＯＨ、又は水素原子である場合、
（ｉｉｉ）Ｘ及びＹが、−ＯＨ、又は水素原子である場合、
を挙げることができる。
【００３２】
Ｘ及び／又はＹで示される親水性基は特に限定されないが、一例を下記に示す。
【化１６】
2020032165.tif 000018
【００３３】
フタロシアニン染料としては、ＩＲＤｙｅ（登録商標）７００ＤＸなどの市販品を使用することができる。本発明においては、 ＩＲＤｙｅ（登録商標）７００ＤＸのＮＨＳエステルを使用して、これを、アミノ基を有するビオチン改変二量体と反応させることによりコンジュゲートを製造することができる。ＩＲＤｙｅ（登録商標）７００ＤＸの他のバリエーションは、米国特許第７，００５，５１８号に記載されており、それらを使用することもできる。
【００３４】
Ｒ２１は、式（１）で示される化合物又はその塩と結合できる官能基を示す。Ｒ２１は、好ましくは、ビオチン改変二量体上のカルボキシル基、アミン、又はチオール基と反応して結合できる官能基である。Ｒ２１は、好ましくは、活性化エステル、ハロゲン化アシル、ハロゲン化アルキル、適宜置換されたアミン、無水物、カルボン酸、カルボジイミド、ヒドロキシル、ヨードアセトアミド、イソシアネート、イソチオシアネート、マレイミド、ＮＨＳエステル、ホスホロアミダイト、スルホン酸エステル、チオール、又はチオシアネートなどが挙げられるが特に限定されない。
【００３５】
Ｌ２１は２価の連結基を示し、例えば、エーテル、チオエーテル、アミン、エステル、カルバマート、ウレア、チオウレア、オキシ又はアミド結合の任意の組み合わせ、又は一重、二重、三重若しくは芳香族炭素−炭素結合；又はリン−酸素、リン−硫黄、窒素−窒素、窒素−酸素、若しくは窒素−プラチナ結合；又は芳香族若しくは複素芳香族結合を含んでいてもよい。Ｌ２１は、好ましくは、−ＣＯＮＨ−、−ＮＨＣＯ−、−ＣＯＯ−、−ＯＣＯ―、−ＣＯ−、−Ｏ−、及び炭素数１から１０のアルキレン基から選択される基の組み合わせからなる基である。
【００３６】
−Ｌ２１−Ｒ２１は、ホスホロアミダイト基、ＮＨＳエステル、活性カルボン酸、チオシアネート、イソチオシアネート、マレイミド、及びヨードアセトアミドを含んでいてもよい。
【００３７】
Ｌ２１は、−（ＣＨ２）ｎ−基を含み、式中、ｎは１〜１０の整数であり、好ましくは、ｎは１〜４の整数である。一例としては、−Ｌ２１−Ｒ２１は、−Ｏ−（ＣＨ２）３−ＯＣ（Ｏ）−ＮＨ−（ＣＨ２）５−Ｃ（Ｏ）Ｏ−Ｎ−スクシンイミジルである。
【００３８】
（３）ビオチン改変二量体とフタロシアニン染料とのコンジュゲートを用いた治療キット
本発明によれば、本発明のビオチン改変二量体とフタロシアニン染料とのコンジュゲートと、ストレプトアビジン変異体―分子プローブコンジュゲートとを組み合わせた治療キットが提供される。
【００３９】
ストレプトアビジン変異体としては、国際公開ＷＯ２０１４／１２９４４６及び国際公開ＷＯ２０１５／１２５８２０に記載のストレプトアビジン変異体を使用することができる。特に好ましくは、国際公開ＷＯ２０１５／１２５８２０の実施例３（国際公開ＷＯ２０１５／１２５８２０の配列番号４）（本願明細書の配列番号１）に記載されているストレプトアビジン変異体LISA314-V2122を使用することができる。
【００４０】
分子プローブとしては、例えば抗体、ペプチド、核酸、アプタマー等を挙げることができ、具体的には、癌に特異的に発現する以下の抗原を標的とした抗体、ペプチド、核酸、アプタマー等を用いることができる。
【００４１】
エピレギュリン（EREG）、ROBO1,2,3,4、1-40-β-アミロイド, 4-1BB, 5AC, 5T4, ACVR2B, 腺がん抗原,  α-フェトプロテイン, アンギオポエチン2, 炭疽毒素, AOC3 (VAP-1), B-リンパ腫細胞, B7-H3, BAFF, βアミロイド, C242抗原, C5, CA-125, カルボニックアンヒドラーゼ9 (CA-IX), 心臓ミオシン, CCL11 (eotaxin-1), CCR4, CCR5, CD11, CD18, CD125, CD140a, CD147 (basigin), CD147 (basigin), CD15, CD152, CD154 (CD40L), CD154, CD19, CD2, CD20, CD200, CD22, CD221, CD23 (IgE受容体), CD25(IL-2受容体のα鎖), CD28, CD3, CD30 (TNFRSF8), CD33, CD37, CD38(サイクリックADPリボースヒドロラーゼ), CD4, CD40, CD41(インテグリンα-IIb), CD44 v6, CD5, CD51, CD52, CD56, CD6, CD70, CD74, CD79B, CD80, CEA, CFD, ch4D5, CLDN18.2, クロストリジウム・ディフィシレ（Clostridium difficile）,クランピング因子A, CSF2, CTLA-4, サイトメガロウイルス, サイトメガロウイルス糖タンパク質B, DLL4, DR5, E. coli 志賀毒素１型, E. coli志賀毒素２型、EGFL7, EGFR, エンドトキシン, EpCAM, エピシアリン（episialin）, ERBB3, 大腸菌（Escherichia coli）, 呼吸器合胞体｛こきゅうき ごうほうたい｝ウイルス（respiratory syncytial virus）のFタンパク質, FAP, フィブリンIIβ鎖, フィブロネクチンエクストラドメイン-B, 葉酸受容体1, Frizzled 受容体, GD2, GD3ガングリオシド, GMCSF受容体α鎖, GPNMB, Ｂ型肝炎表面抗原, Ｂ型肝炎ウイルス、HER1, HER2/neu, HER3, HGF, HIV-1, HLA-DRβ, HNGF, Hsp90, ヒトβアミロイド,ヒト分散因子（scatter factor）受容体キナーゼ, ヒトTNF, ICAM-1 (CD54), IFN-α, IFN-γ, IgE, IgE Fc 領域, IGF-1受容体, IGF-I, IgG4, IGHE, IL-1β, IL-12, IL-13, IL-17, IL-17A, IL-22, IL-23, IL-4, IL-5, IL-6, IL-6受容体, IL-9, ILGF2, インフルエンザA ヘマグルチニン, インスリン様増殖因子I受容体, インテグリンα4, インテグリンα4β7, インテグリンα5β1, インテグリンα7 β7, インテグリンαIIbβ3, インテグリンαvβ3, インテグリンγ誘導タンパク質,インターフェロン受容体, インターフェロンα/β受容体, ITGA2, ITGB2 (CD18), KIR2D, L-セレクチン(CD62L), Lewis-Y抗原, LFA-1 (CD11a), リポタイコ酸, LOXL2, LTA, MCP-1, メソテリン、MS4A1, MUC1, ムチンCanAg, ミオスタチン, N-グリコリルノイラミン酸, NARP-1, NCA-90 (顆粒球抗原), NGF, NOGO-A, NRP1, Oryctolagus cuniculus, OX-40, oxLDL, PCSK9, PD-1, PDCD1, PDGF-R α, フォスファチジルセリン,前立腺がん細胞、緑膿菌（Pseudomonas aeruginosa）,狂犬病｛きょうけんびょう｝ウイルス糖タンパク質、RANKL, 呼吸器合胞体｛こきゅうき ごうほうたい｝ウイルス, RHD, Ｒｈ（Rhesus）因子, RON, RTN4, スクレロスチン, SDC1, セレクチンP, SLAMF7, SOST, スフィンゴシン-1-ホスフェート, TAG-72, TEM1, テネイシンC, TFPI, TGFβ1, TGFβ2, TGF-β, TNF-α, TRAIL-R1, TRAIL-R2, 腫瘍抗原CTAA16.88,MUC1の腫瘍特異的グリコシル化, TWEAK受容体, TYRP1(グリコプロテイン75), VEGF-A, VEGFR-1, VEGFR2, ビメンチン, VWF
上記の中でも、エピレギュリン（EREG）、CEA、およびHER2が好ましい。
【００４２】
癌抗原特異的抗体分子などの分子プローブとストレプトアビジン変異体との融合体を調製し、患者に投与することで、癌細胞に特異的にストレプトアビジン変異体を集積できることができる。次に、上記ストレプトアビジン変異体に親和性を有するビオチン改変二量体とフタロシアニン染料とのコンジュゲートを患者に投与することによって、癌細胞へ的確にフタロシアニン染料を集積させることが可能になる。
【００４３】
あるいはまた、本発明においては、癌抗原特異的抗体分子などの分子プローブとストレプトアビジン変異体とのコンジュゲートと、ビオチン改変二量体とフタロシアニン染料とのコンジュゲートとを結合させた複合体を調製し、この複合体を患者に投与することもできる。
【００４４】
ストレプトアビジン変異体に結合させる抗体は種々の分子を用いることができる。ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体はどちらも使用することができる。抗体のサブクラスは特に問わないが、好ましくはＩｇＧ、特にＩｇＧ1が好適に用いられる。また、「抗体」は改変抗体および抗体断片の全てを含む。ヒト化抗体、ヒト型抗体、ヒト抗体、マウス、ウサギ、ラット、モルモット、サル等の各種動物由来抗体、ヒト抗体と各種動物由来抗体とのキメラ抗体、ｄｉａｂｏｄｙ、ｓｃＦｖ、Ｆｄ、Ｆａｂ、Ｆａｂ‘、Ｆ（ａｂ）’2が挙げられるが、これらに限らない。
【００４５】
ストレプトアビジン変異体と抗体の結合物は、当業者に公知の方法を用いて得ることができる。例えば、化学的結合方法（US5,608,060）によって得ることもできるし、ストレプトアビジン変異体をコードするＤＮＡと抗体をコードするＤＮＡを連結し、発現ベクター等を用いて宿主細胞に発現させることにより、融合タンパクとして得ることもできる。ストレプトアビジン変異体をコードするＤＮＡと抗体をコードするＤＮＡとの連結は、リンカーと呼ばれる適当なペプチドをコードするＤＮＡを介しても良い。ストレプトアビジン変異体―抗体結合物は、抗体と標的分子との特異的結合力を残して作製されることが望ましい。
【００４６】
（４）光免疫療法
本発明によるビオチン改変二量体とフタロシアニン染料とのコンジュゲートを対象に投与し、細胞増殖の抑制または細胞死を誘発するのに有効な量で励起光を細胞に照射することによって、細胞増殖の抑制または細胞死を誘発し、対象を治療することができる。
【００４７】
好ましくは、本発明によるビオチン改変二量体とフタロシアニン染料とのコンジュゲートと、ストレプトアビジン変異体―分子プローブコンジュゲートとの複合体を対象に投与し、細胞増殖の抑制または細胞死を誘発するのに有効な量で励起光を細胞に照射することによって、細胞増殖の抑制または細胞死を誘発し、対象を治療することができる。
【００４８】
対象としては、ヒトおよび非ヒト哺乳動物を包含し、ヒト、またはマウスなどの実験動物が挙げられる。対象としては、細胞増殖の抑制または細胞死の誘発が望まれる疾患を患っている対象が好ましく、例えば、がん又は固形腫瘍を有する対象を挙げることができる。
【００４９】
「がん」とは、癌腫、リンパ腫、芽細胞腫、肉腫、及び白血病又は悪性リンパ腫が挙げられる。がんの具体例としては、扁平上皮癌（例えば、上皮性扁平細胞癌）、小細胞肺癌を含めた肺癌、非小細胞肺癌（「ＮＳＣＬＣ」）、肺腺癌及び肺の扁平上皮癌、腹膜の癌、肝細胞性癌、消化器癌を含めた胃体又は胃癌、膵臓癌、神経膠芽腫、子宮頚癌、卵巣癌、肝臓癌、膀胱癌、肝細胞癌、乳癌、結腸癌、直腸癌、結腸直腸癌、子宮内膜又は子宮癌腫、唾液腺癌腫、腎臓又は腎臓部癌、前立腺癌、外陰部癌、甲状腺癌、肝細胞癌腫、肛門癌腫、陰茎癌腫、並びに頭頚部癌が挙げられる。
【００５０】
固形腫瘍とは、良性でも悪性でも、通常包嚢を含まない細胞の異常な塊を指す。固形腫瘍としては、神経膠腫、星状細胞腫、髄芽腫、頭蓋咽頭腫、上衣腫、松果体腫、血管芽腫、聴神経腫、希突起神経膠腫、髄膜腫、黒色腫、神経芽細胞腫、及び網膜芽細胞腫が挙げられる。
【００５１】
光免疫療法においては、「ビオチン改変二量体とフタロシアニン染料とのコンジュゲート」、又は「ビオチン改変二量体とフタロシアニン染料とのコンジュゲートと、ストレプトアビジン変異体―分子プローブコンジュゲートとの複合体」を対象に投与し、その後に、光を照射することにより、対象を処置することができる。
【００５２】
対象への投与方法としては、局所経路、注射（皮下注射、筋肉内注射、皮内注射、腹腔内注射、腫瘍内注射、および静脈内注射など）、経口経路、眼経路、舌下経路、直腸経路、経皮経路、鼻腔内経路、膣経路、および吸入経路などが挙げられるが、これらに限定されない。
【００５３】
「ビオチン改変二量体とフタロシアニン染料とのコンジュゲート」、又は「ビオチン改変二量体とフタロシアニン染料とのコンジュゲートと、ストレプトアビジン変異体―分子プローブコンジュゲートとの複合体」は、治療有効量で投与することが好ましい。治療有効量は、６０キログラム当たり少なくとも０．５ミリグラム（ｍｇ／６０ｋｇ）、少なくとも５ｍｇ／６０ｋｇ、少なくとも１０ｍｇ／６０ｋｇ、少なくとも２０ｍｇ／６０ｋｇ、少なくとも３０ｍｇ／６０ｋｇ、少なくとも５０ｍｇ／６０ｋｇである。例えば、静脈内投与される場合、１ｍｇ／６０ｋｇ、２ｍｇ／６０ｋｇ、５ｍｇ／６０ｋｇ、２０ｍｇ／６０ｋｇ、または５０ｍｇ／６０ｋｇの用量など、例えば、０．５〜５０ｍｇ／６０ｋｇである。別の例では、治療有効量は、少なくとも１００μｇ／ｋｇ、少なくとも５００μｇ／ｋｇまたは少なくとも５００μｇ／ｋｇなど、少なくとも１０μｇ／ｋｇ、例えば、腫瘍内投与または腹腔内投与される場合、１００μｇ／ｋｇ、２５０μｇ／ｋｇ、約５００μｇ／ｋｇ、７５０μｇ／ｋｇ、または１０００μｇ／ｋｇの用量など、例えば、１０μｇ／ｋｇ〜１０００μｇ／ｋｇである。一例では、治療有効量は、局所用溶液で投与される１０μｇ／ｍｌ、２０μｇ／ｍｌ、３０μｇ／ｍｌ、４０μｇ／ｍｌ、５０μｇ／ｍｌ、６０μｇ／ｍｌ、７０μｇ／ｍｌ、８０μｇ／ｍｌ、９０μｇ／ｍｌ、または１００μｇ／ｍｌなど、２０μｇ／ｍｌ〜１００μｇ／ｍｌの間など、少なくとも５００μｇ／ｍｌなど、少なくとも１μｇ／ｍｌである。
【００５４】
上記した投与量を、１回もしくは複数回にわたる分割用量（２、３、または４回の用量など）または単一の製剤で投与することができる。
【００５５】
「ビオチン改変二量体とフタロシアニン染料とのコンジュゲート」、又は「ビオチン改変二量体とフタロシアニン染料とのコンジュゲートと、ストレプトアビジン変異体―分子プローブコンジュゲートとの複合体」は、単独で投与することもでき、薬学的に許容されるキャリアの存在下で投与することもでき、他の治療剤（他の抗がん剤など）の存在下で投与することもできる。
【００５６】
「ビオチン改変二量体とフタロシアニン染料とのコンジュゲート」、又は「ビオチン改変二量体とフタロシアニン染料とのコンジュゲートと、ストレプトアビジン変異体―分子プローブコンジュゲートとの複合体」は、循環している腫瘍細胞又は固形腫瘍の細胞などの標的細胞又は標的組織に結合することができる。その後に、光を照射すると、上記コンジュゲート又は複合体は、光を吸収し、標的細胞又は組織を損傷又は破壊することができる。
【００５７】
光免疫療法において照射光の波長は、好ましくは６６０〜７４０ｎｍであり、例えば６６０ｎｍ、６７０ｎｍ、６８０ｎｍ、６９０ｎｍ、７００ｎｍ、７１０ｎｍ、７２０ｎｍ、７３０ｎｍ、又は７４０ｎｍの波長を有する。光の照射は、近赤外（ＮＩＲ）発光ダイオードを備えたデバイスを使用することによって行ってもよい。
【００５８】
光の照射量は、少なくとも１Ｊ／ｃｍ２、例えば、少なくとも４Ｊ／ｃｍ２、少なくとも１０Ｊ／ｃｍ２、少なくとも１５Ｊ／ｃｍ２、少なくとも２０Ｊ／ｃｍ２、少なくとも５０Ｊ／ｃｍ２、または少なくとも１００Ｊ／ｃｍ２、例えば、１〜５００Ｊ／ｃｍ２である。光照射は、複数回（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０回）実施してもよい。
【００５９】
以下の実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明は実施例によって限定されるものではない。
【実施例】
【００６０】
＜製造例１＞
【化１７】
2020032165.tif 000019
【００６１】
Psyche J (1.8 mg, 1.6 μmol) にIR Dye 700 NHS Ester (3.0 mg, 1.5μmol)、リン酸水素二ナトリウム緩衝液 (pH 8.4, 144 μL) とジメチルスルホキシド (120 μL) を加え、アルミホイルで光を遮蔽し室温で24時間攪拌した。反応液を水で500μLに希釈したものを逆相HPLC (グラジエント：0% for 5 min; 0-100% for 100 min アセトニトリル in 50 mM triethylammonium acetate 水溶液 (pH 6.5), 保持時間 = 47.2 min, YMC-Triart C18, flow rate = 3.5 mL/min)で精製することで標的化合物1 (深青緑色) を得た。IR700に対して報告されている水中694 nmのモル吸光係数165,000 (M-1 cm-1)から定量し、収率 (1.0 μmol, 72%) を算出した。
LRMS (ESI): m/z 1303 [M+2H]2+, 869 [M+3H]3+【００６２】
＜製造例２＞
【化１８】
2020032165.tif 000020
【００６３】
化合物1 (0.375 mg, 144 nmol) に 0.1% ギ酸水溶液 (266 μL) とアセトニトリル (133 μL) を加えてボルテックスミキサーで攪拌し、遠心した後、暗室37°Cの条件下で90 分静置した。その溶液を逆相HPLC (グラジエント：0% for 5 min; 0-100% for 100 min アセトニトリル in 50 mM triethylammonium acetate 水溶液 (pH 6.5), 保持時間 = 51.6 min, YMC-Triart C18, flow rate = 3.5 mL/min)で精製することで標的化合物2 (深青緑色)を得た。同様に定量し、収率（48 nmol, 33%）を算出した。
LRMS (ESI): m/z 1054 [M-H2O+2H]2+, 703 [M-H2O+3H]3+【００６４】
＜製造例３＞
【化１９】
2020032165.tif 000021
【００６５】
化合物1 (0.375 mg, 144 nmol) に 0.1% ギ酸水溶液 (266 μL) とアセトニトリル (133 μL) を加えてボルテックスミキサーで攪拌し、遠心した後、暗室37°Cの条件下で28時間静置した。その溶液を逆相HPLC (グラジエント：0% for 5 min; 0-100% for 100 min アセトニトリル in 50 mM triethylammonium acetate 水溶液 (pH 6.5), 保持時間 = 56.2 min, YMC-Triart C18, flow rate = 3.5 mL/min)で精製することで標的化合物 3 (深青緑色)を得た。同様に定量し、収率（15 nmol, 10%）を算出した。
LRMS (ESI): m/z 813 [M-H2O+2H]2+, 542 [M-H2O+3H]3+【００６６】
試験例１：
＜scFv-Cupid分子発現ベクターの調製＞
EREG抗原を認識するscFv型抗体をCupid分子（アミノ酸配列は配列表の配列番号１に示す）と融合し大腸菌にて融合タンパク質を発現する遺伝子配列、ST01（塩基配列及びアミノ酸配列を配列番号２及び配列番号３に示す）とシャペロン分子skpの遺伝子配列は人工合成することで入手した。大腸菌でのタンパク質発現にはpETDuet-1ベクターを使用した。具体的には、人工合成したシャペロンskp遺伝子配列（塩基配列及びアミノ酸配列を配列番号４及び配列番号５に示す）をプライマー（skp_Fw: tacatatgGATAAAATTGCCATTGTTAAT（配列番号６）, skp_Rv:TTTTATCcatatgtatatctccttc（配列番号７））にてPCRで増幅し、泳動によるバンドのき出し精製を行った。また、pETDuet-1ベクターは制限酵素Nde I処理にてMCS2のNde Iサイトで直鎖化されたベクターを作製した。In-Fusion HD Cloning Kit（タカラバイオ社）の用法用量に従いskpと直鎖化ベクターとをらいゲーションしクローニングおよびシーケンス解析により目的の配列が組み込まれていることを確認した。同ベクターのMCS2に組み込み発現ベクターを調製しpETDuet_skpとした。【００６７】
その後、pETDuet_skpに対しST01の組み込みは以下のように実施した。pETDuet_skpをテンプレートととしてプライマー（Linear1 Rv: ggtatatctccttcttaaag（配列番号８）, Linear1 Fw: aattcgagctcggcgcgcctg（配列番号９））でベクターの直鎖化を行った。また、人工合成したST01遺伝子をプライマー（ST01 Fw: agaaggagatataccATGAAATATCTGCTGCCGAC（配列番号１０）, ST01 Rv: cgccgagctcgaattTTAATGATGGTGATGATGATG（配列番号１１））にてPCRにて増幅を行いゲル切り出し精製をインサートの調製を実施した。直鎖化ベクターとインサートはIn-Fusion HD Cloning Kit（タカラバイオ社）の用法用量に従いクローニングを行いシーケンス解析により組み込まれた遺伝子が正しいことを確認しST01発現ベクターとした。【００６８】
＜scFv-Cupidタンパク質の発現と精製＞
クローニング、シーケンス解析を行い目的の遺伝子が組み込まれていることが確認されたプラスミドベクターをコンピテントセルBL21 (DE3)（ECOS Competent E.coli BL21 (DE3), ニッポンジーン社）に導入し形質転換を行った。100 mL の２xYT培地で一晩培養された培養液を１リットルの培養液に食菌し37℃にて培養を行い、600 nm のOD値が2.0を超えたところで最終濃度0.5 mM になるようにIPTGを添加しタンパク質の発現誘導を行った。
ST01はIPTG発現誘導後16℃で一晩培養を行った後、培養上清を回収した。【００６９】
回収した培養上清は、Ni-NTAレジン（cOmplete His-Tag Purification Resin, SIGMA-ALDRICH社）を使用しタンパク質C末端に付加してある6xHis-Tagによるアフィニティー精製をバッチ法にて行い粗精製物とした。さらにProtein Lレジン（Capto L, GEヘルスケア）を使用しκ軽鎖によるアフィニティー精製を行った。この時、結合・洗浄バッファーはPBSを使用し、溶出バッファーには10 mM, pH2.0 グリシン塩酸溶液を使用した。精製物は遠心ろ過フィルター（Vivaspi Turbo 15 100K MWCO, sartorius社）にて濃縮を行った。濃縮後、バッファー交換用ディスポーザブルカラム（PD-10, GEヘルスケア）を使用し、生成物のバッファーをPBSへと置換した。【００７０】
＜培養細胞の準備＞
DLD-1細胞(EREG陽性)（ヒト結腸腺癌由来の細胞）は10% FBS RPMI1640 (富士フイルム和光純薬株式会社) にて培養を行なった。細胞傷害性試験のために、96穴培養プレートに1ウエルあたり3 x 103 〜5 x 103個 の細胞を播種した。これらは細胞傷害性試験の前日に用意した。【００７１】
＜プレコンジュゲートの調製＞
各ST01と100% DMSOで溶解した化合物１、２、３は、培地希釈前にモル比1:2の割合でそれぞれ混合し室温で10分間インキュベーションしたのちに、scFv-Cupidが終濃度10μg/mL(60~61nM)、Psyche化合物が終濃度120nMとなるように培養液（10% FBS RPMI1640）で希釈を行い室温で10分間インキュベーションし試験溶液とした。なお、scFv-Cupid添加なしのコントロールとして培養液、化合物のコントロールとしてDMSOを用いた。【００７２】
＜細胞での試験＞
上述のように前日に培養した細胞の培養液を廃棄し、1ウエルあたり100 μL の容量で試験溶液を添加し、4時間培養し690 nm±10 nm のピーク波長の光を照射した。photo power meter PM121Dに400-1100nmのセンサー （共にTHORLABS社）を接続した測定器を用い培養プレート上での照射エネルギーを測定し、照射時間を決定した。1.1 J/cm2 (2 min)、4.5 J/cm2  (8 min)、18.4 J/cm2  (30 min)とした。各時間での照射後、5% CO2、37℃にて培養を行い48時間後にCell Counting Kit-8 (同仁化学社)をもちいて細胞増殖のアッセイを実施した。具体的には1ウエルあたり10 μL のCell Counting Kit-8溶液を入れて5% CO2、37℃にて1〜2時間インキュベーションを行った。その後、吸光度計にて450 nm の吸光度を測定した。培地のみのウエルをバックグラウンド(BG)、DMSOのみの添加ウエルを100%コントロール(Cont.)とした。各培養条件のCell Growth % の値は次の式から計算した。100 x (測定値A-BG)/(Cont.-BG) （単位は%）。【００７３】
図１ではST01とのプレインキュベーション依存的かつ光照射依存的な細胞増殖抑制が確認された。
図２では、ST01とのプレインキュベーションを行わない場合であっても、細胞増殖抑制が確認される場合があることが確認された。【００７４】
＜配列番号２：ST01の塩基配列＞
ATGAAATACCTATTGCCTACGGCAGCCGCTGGATTGTTATTACTCGCGGCCCAGCCGGCCATGGCCCAGGTGCAGCTGCAGCAGTCTGGCGCCGAAGTGAAGAAACCTGGCGCCTCCGTGAAGGTGTCCTGCAAGGCCTCCGGCTTCAACATCAAGGACACCTACATGCACTGGGTGCGACAGGCCCCTGAGCAGGGCCTGGAATGGATGGGCAGAATCGACCCCCTGAACGACAAGACTAAGTACGACCCCAAGTTCCAGGGCAGAGTGACCATCACCGCCGACACCTCTACCAACACCGCCTACCTGGAACTGTCCTCCCTGACCTCTGAGGACACCGCCGTGTACTACTGCGCTAGAGGCGGCGGAGATCCCGTGTTCGTGTATTGGGGCCAGGGCACCCTCGTGACCGTGTCTGCTTCTTCTGGCGGAGGCGGATCTGGGGGCGGAGGTTCTGGTGGTGGTGGAAGCGGTGGCGGTGGATCTGGCGGCGATATCCAGATGACCCAGTCCCCCAGCTCCCTGTCTGCCTCTGTGGGCGACCGCGTGACCATTACATGCAAGGCCAGCCAGGACATCAACAAGTACCTGGCCTGGTATCAGCACAAGCCCGGCCAGGCTCCTCGGCTGCTGATCCACTATACCTCCACCCTGCACCCCGGCATCCCTTCCAGATTCTCCGGCTCTGGCTCCGGCACCGACTTTACCTTCTCCATCTCCAGCCTGCAGCCCGAGGATATCGCTACCTACTACTGCCTGCAGTACGACAACCTGCGGACCTTCGGAGGCGGCACCAAGGTGGAAATCAAGCGGACCAGCGGCGGAGGTGGAAGCGGTGGAGGTGGAGCCGAAGCAGGTATTACCGGCACCTGGAGCGATCAGCTGGGCGATACCTTTATTGTGACCGCCGGCGCAGATGGTGCGCTGACCGGCACCTATGAAAATGCCGTGGGTGGTGCGGAAAGCCGTTATGTTCTGACCGGTCGTTATGATAGCGCACCGGCAACCGATGGCAGCGGCACCGCCCTGGGTTGGACCGTGGCGTGGAAAAACAATAGCAAAAACGCCCATAGCGCGACCACCTGGAGCGGCCAGTATGTTGGCGGTGCCGATGCGAAAATTAACACCCAGTGGCTGCTGACCAGCGGCACCACCAATGCCAATGCGTGGAAAAGCACCCTGGTGGGTCATGATACCTTTACCAAAGTTAAACCGAGCGCGGCCAGCCACCACCACCACCACCACTGA【００７５】
＜配列番号４：skpの塩基配列＞
GATAAAATTGCCATTGTTAATATGGGTAGCCTGTTTCAGCAGGTTGCACAGAAAACCGGTGTTAGCAATACCCTGGAAAATGAATTTAAAGGTCGTGCAAGCGAACTGCAGCGTATGGAAACCGATCTGCAGGCAAAAATGAAAAAACTGCAGAGCATGAAAGCAGGTAGCGATCGTACCAAACTGGAAAAAGATGTTATGGCACAGCGTCAGACCTTTGCCCAGAAAGCACAGGCATTTGAACAGGATCGTGCACGTCGTAGCAATGAAGAACGTGGTAAACTGGTTACCCGTATTCAGACCGCAGTTAAAAGCGTTGCAAATAGCCAGGATATTGATCTGGTTGTTGATGCAAATGCCGTTGCCTATAATAGCAGTGATGTGAAAGATATTACCGCAGACGTTCTGAAACAAGTGAAATAA【００７６】
実施例２：CEA-V2122タンパク質の発現と精製
V2122は、国際公開ＷＯ２０１５／１２５８２０の実施例３（国際公開ＷＯ２０１５／１２５８２０の配列番号４）に記載されているストレプトアビジン変異体である。V2122のアミノ酸配列（Ｃ末端に６×Ｈｉｓタグを有する配列）を配列表の配列番号１２に記載する。【００７７】
scFv-V2122は、上記のV2122に、CEACAM5に対する一本鎖抗体（scFv）を結合したものである。このscFv型の抗CEACAM5抗体は特許文献US7626011B2に記載されているscFv配列である。scFv型の抗CEACAM5抗体のアミノ酸配列を配列表の配列番号１３に記載する。また、scFv型の抗CEACAM5抗体とV2122とをアミノ酸リンカー(GGGGSGGGG)（配列番号２２）で結合したCEA-V2122のアミノ酸配列を配列表の配列番号１４に記載する。【００７８】
CEA-V2122融合タンパク質の発現のために、大腸菌にて分泌発現するためのpelBシグナルをN末端に、また6xHis-Tag配列をC末端に組み込んだCEA-V2122遺伝子配列のDNAコドンを大腸菌に最適化し人工遺伝子合成を行なった。このアミノ酸配列を配列表の配列番号１５、DNA配列を配列表の配列番号１６に記載する。また、ドメイン構造の概略を図３に示す。【００７９】
具体的なタンパク質発現ベクターは、pETDuet1ベクターのMCS2にシャペロンskp遺伝子が組み込まれたベクターを使用した。skp遺伝子は配列表の配列番号１７に記載されたアミノ酸配列を元にコドンを大腸菌に最適化したDNAの人工遺伝子合成を行った。合成されたskp遺伝子はプライマー（AAGGAGATATACATATGGATAAAATTGCCATTGTTAATAT（配列番号２３）, TTGAGATCTGCCATATGTTATTTCACTTGTTTCAGAACG（配列番号２４））を使用しPCRで増幅し、制限酵素NdeIで直鎖化されたpETDue1ベクターのMCS2にIn-Fusion HD Cloning Kitをもちいてクローニングを行い pETDuet_skp とした。次に、 pETDuet_skp のMCS1にCEA-V2122遺伝子を組み込んだ。具体的には、人工合成されたCEA-V2122遺伝子をプライマー（AGAAGGAGATATACCATGAAATATCTGCTGCCGAC（配列番号２５）、CGCCGAGCTCGAATTTTAATGATGGTGATGATGATG（配列番号２６））を用いPCRにて増幅した。また、 pETDuet_skp をプライマー（GGTATATCTCCTTCTTAAAGTTAAAC（配列番号２７）、AATTCGAGCTCGGCGCGCCTGCAG（配列番号２８））を使用しPCRにて直鎖化した。PCRにより増幅された CEA-V2122と直鎖化された pETDuet_skp を In-Fusion HD Cloning Kit をもちいてクローニングを行った。クローニングされたベクターはシーケンスにより組み込まれた遺伝子配列の確認を行い pETDuet_CEA-V2122_skp とした。【００８０】
タンパク質発現のために、pETDuet_CEA-V2122_skpをBL21(DE3)(ニッポン・ジーン社)に形質転換し 2xYT培地(SIGMA-ADLRICH社)、37°Cにて一晩、前培養を行った。前培養を行った培地を 新しい培地に100倍希釈になるように添加し、OD(600nm) = 0.5〜2.0になるまで37°Cで培養を行った。次に最終濃度0.5mM IPTGを添加し37°Cで4時間培養し培養上清を回収した後、4°Cで保存した。【００８１】
CEA-V2122タンパク質は、C末端に付加されている6xHis-Tagを利用し バッチ法で粗精製を行った。具体的にはバッファーA(50mM TrisHCl, 0.2M NaCl, 1mM ED TA, 5mM Imidazole, pH8.0)で平衡化したcOmplete His-Tag Purification Resin を4°C で保存した培養上清へ添加し、2時間から一晩、4°Cにて撹拌しレジンへのタンパク質結合処理を行った。次にレジンをカラムに回収し、バッファーAで20カラム容量の洗浄作業を行った。その後、バッファーB(50mM TrisHCl, 0.2M NaCl, 1mM EDTA, 400mM Imidazol e, pH8.0)で溶出しCEA-V2122の粗精製物の回収を行った。 【００８２】
次に、粗精製物についてProtein L カラムによる精製を行った。具体的にはCapto L (GE Healthcare Life Sciences) 1mLをPD-10カラムに充填し、10カラムボリュームのPBSで平衡化後、上述の粗精製物をアプライし、10カラムボリュームのPBSで洗浄後、10mM グリシン塩酸 pH2.0で溶出しVivaspin Turbo 15 (MWCO 100,000) による遠心濃縮を行なった。さらに PD-10 (GE Healthcare Life Sciences社) を用いてPBSへバッファー置換を行い、さらに Vivaspin Turbo 4  (MWCO 100,000) による遠心濃縮を行い最終精製物とした。SDS-PAGE電気泳動後、CBB染色により４量体CEA-V2122の純度の検定を行なった結果を図４に示す。SDS-PAGEゲルは Mini-PROTEAN TGX 4-15% (Bio-Rad社) を使用し CBB染色液はBullet CBB Stain One(Ready To Use) (ナカライテスク社）を使用した。
図４より精製されたCEA-V2122は約150kDaの４量体を主たる成分であることが確認された。【００８３】
実施例３：CEA-V2122のSPRでの性能評価
CEA-V2122と抗原CEACAM5との親和性を表面プラズモン共鳴（SPR）測定装置：Biacore T200 (GE Healthcare Life Sciences社) を用いて実施した。具体的には Recombinant Human CEACAM-5/CD66e Protein, CF (R&D SYSTEMS社) を Sensor Chip CM5 (GE Healthcare Life Sciences社) にアミンカップリングキット (GE Healthcare Life Sciences社) を用いて固定化操作を行い、リガンドの最終固定化量は279RUとなった。また、精製されたCEA-V2122は 1E-08 M から 6.25E-10 M までの２倍希釈系列をアナライトとして調整した。相互作用解析は Single-Cycle Kinetics 解析にてデータの取得を行った。得られたデータを Biacore T200 Evaluation Software, version 2.0 にて Bivalent Analyze モードによるカーブフィッティングを実施しka1=3.208E+5, kd1=3.461E-7の値を得た。また、Bivalent AnalyzeではKD＝kd1/ka1で評価できることからKD＝kd1/ka1= 3.461E-7/3.208E+5=1.078E-12の評価値を得た。それらの結果を図５に示す。
図５に示されるセンサーグラム、KD値よりCEA-V2122はCEACAM5に強く結合することが確認された。【００８４】
また、CEA-V2122とビオチン改変体との相互作用解析も Biacore T200 を用いて実施した。具体的なビオチン改変体は国際公開ＷＯ２０１８／０７２３９の実施例１に記載されている標題化合物14である。また具体的な解析方法は以下の通りである。アミンカップリングキットを使用し、Sensor Chip CM5 に目標値 5000RUとなるように設定し、精製された CEA-V2122 の固定化を行なった。アナライトの濃度は 1E-08 M から 6.25E-10 M までの２倍希釈系列５種類を使用した。相互作用解析はSingle-Cycle Kinetics 解析にてデータの取得を行った。得られたデータを Biacore T200 Evaluation Software, version 2.0 にて Bivalent Analyze モードによるカーブフィッティングを実施しka1=3.792E+4, kd1=4.424E-6の値を得た。また、Bivalent AnalyzeではKD＝kd1/ka1で評価できることからKD＝kd1/ka1= 3.792E+4/4.424E-6=1.167E-10の評価値を得た。それらの結果を図６に示す。
図６に示されるセンサーグラム、KD値よりCEA-V2122はビオチン改変体に強く結合することが確認された。【００８５】
実施例４：FITC標識CEA-V2122 を用いたCEACAM5発現細胞株の細胞染色
CEACAM5発現陽性のがん細胞株の染色のために、精製された CEA-V2122 タンパク質を100 μg 使用しFITC標識を行なった。具体的には、Fluorescein Labeling Kit - NH2 (同仁化学研究所) を用いて操作手順書の用法用量に従い標識を実施し、得られた産物を CEA-V2122-FITC とした。具体的なCEACAM5発現陽性のがん細胞株の染色は次のとおりである。 CELLSTAR, μClear, 96ウエルプレート (Greiner社) に2.0x104 cell/well となるようにCEACAM5陽性のヒト胃がん由来MKN-45細胞とCEACAM5陰性のヒト結腸がん由来DLD1細胞を播種し一晩培養した。次に 20 nM CEA-V2122-FITCと1μM Hoechist を含む培養液を100 μL/well となるように添加し4°Cにて30分間反応ののち、In Cell Analyzer 6000 (GE Healthcare Life Sciences社) にて画像の取得を行なった。その結果を図７および図８に示す。【００８６】
図７に示された結果より、CEA-V2122-FITCは細胞膜表面のCEACAM5を特異的に認識することが確認された。また、図８に示された結果より、CEACAM5はCEA-V2122-FITC結合後、細胞膜表面に滞留することが確認された。【００８７】
実施例５：CEA-V2122 と光活性化化合物標識ビオチン改変体を用いた in vitro 細胞傷害性試験
光活性化化合物標識ビオチン改変体、コンパウンド１、コンパウンド２およびコンパウンド３を用いて細胞傷害性試験を実施した。これらのコンパウンドは出願番号：特願2018-149295 に記載されている化合物である。コンパウンド１、コンパウンド２およびコンパウンド３を図９に示す。具体的にはMKN45細胞を細胞培養用96ウェルプレートに細胞数が 5x103 cells/well、培養液が 50 μL/well となるように播種し一晩培養した。CEA-V2122と光活性化化合物標識ビオチン改変体の複合体溶液は、CEA-V2122と各コンパウンドとのモル比が1:2となるように混合し室温で10分間インキュベーションをおこない、CEA-V2122の最終濃度10μg/mLとなるように培養液で濃度調製を行なった。希釈系列は20μg/mLを開始濃度とし、4倍希釈系列を４系列（5.0 μg/mL, 1.25 μg/mL, 0.312 μg/mL, 0.078μg/mL）を５系列の複合体希釈系列液とした。また、複合体を含まない培地のみをゼロコントロールとした。【００８８】
一晩培養した細胞に複合体希釈系列液を最終濃度（10 μg/mL, 2.5 μg/mL, 0.625 μg/mL, 0.156 μg/mL, 0.039 μg/mL）となるように 50 μL/well づつ各 well 添加した。複合体添加、1時間後、2時間後に 690 ± 10 nm の波長の光を出すLEDを用いて、100 J/cm2となるように細胞に光を照射した。その後、48時間培養しCell Counting Kit-8 (同仁化学社) を用いて生細胞数の比較を行なった。各条件は n=3 とした。用法用量は取扱説明書に従い試薬添加1時間半37°C、CO2 インキュベーターでインキュベーションしたのち、吸光度450nmを測定し、平均値を計算しバックグラウンド補正後、コントロールを100％として各条件のコントロールに対する細胞増殖の割合を計算した。その結果を図１０に示す。
図１０に示されるように、CEA-V2122とコンパウンド１、コンパウンド２、コンパウンド３との複合体の濃度依存的に細胞傷害性を示すことが確認された。【００８９】
実施例６：ゼノグラフトモデルマウスを用いたCEA-V2122 と光活性化化合物標識ビオチン改変体による in vivo 細胞傷害性試験
ヌードマウスにMKN45細胞を皮下に移植したゼノグラフトモデルマウスの作製を行なった。４週例のヌードマウス雌を購入し、１週間馴化後、１匹あたり細胞数 2x10^5 cells にて皮下に細胞を移植した。移植後、約10日に実験例４に記載されているCEA-V2122と光活性化化合物標識ビオチン改変体コンパウンド１の複合体を100 μg を尾静脈から投与した。波長690 nm の光を発生するLED光源(USHIO OPTO SMICONDUCTORS, INC., LD690D-66-60-550.), T-Cube LED Driver(THORLABS, NC0713145)およびT-CUBE 15V POWER SUPPLY(THORLABS, TPS001) を使用し、投与6時間後に690 nm の光を230 J/cm^2 となるように照射した。再度、複合体投与24時間後に690 nm の光を230 J/cm^2 となるように照射した。光源として腫瘍の体積の変化のグラフを図１１に示す。複合体投与５日後のマウス個体の写真を図１２に示す。また、複合体投与７日目にマウス個体を安楽死させ、解剖を行い腫瘍部分を病理解析した。具体的な手法は次のとおりである。マウス皮下腫瘍とその周囲組織を一塊として摘出し、4%パラホルムアルデヒド溶液(和光純薬, 163-20145)に室温で一晩浸漬して組織を固定した。固定後の皮下腫瘍組織に対して約3~5mm厚の割を入れてパラフィン包埋ブロックを作成し、ミクロトームによって4μm厚の薄切病理標本を作成した。【００９０】
ヘマトキシリン・エオジン染色については、薄切病理標本をキシレン溶液(和光純薬, 241-00091)に室温10分間浸漬して脱パラフィン処理を行った後にヘマトキシリン染色(サクラファインテック, #8650)およびエオジン染色(サクラファインテック, #8660)を実施した。この結果を図１３に示す。【００９１】
また、CEACAM5に対する免疫染色は以下のように実施した。薄切病理標本をキシレン溶液(和光純薬, 241-00091)に室温10分間浸漬して脱パラフィン処理を行った後に、クエン酸バッファー(pH=6.0)によるオートクレーブ処理(121℃, 5分)で抗原賦活化を行った。その後に0.3%過酸化水素(和光純薬, 081-04215)/メタノール(和光純薬, 137-01823)溶液に室温10分間浸漬し、内因性ペルオキシダーゼの除去を行った。非特異的反応のブロッキングは2% BSA(Sigma Aldrich, A1470)/Phosphate buffered saline溶液で実施した。抗CEACAM5抗体(R&D SYSTEMS, MAB41281), 濃度1/100)を4℃にて一晩反応させた後に、Histostar(商標)(MBL, #8460)およびDAB Substrate Solution (MBL, #8469)を用いて免疫染色シグナルを可視化し、最後にヘマトキシリン(サクラファインテック, #8650)による核染色を実施した。この結果を図１４に示す。
図１３及び図１４よりCEA-V2122とコンパウンド１との複合体を投与し、690 nm の光を照射することでゼノグラフトモデルマウスの腫瘍の壊死を誘導できることが確認された。【００９２】
実施例７：HER2-V2122タンパク質の発現と精製
V2122は、国際公開ＷＯ２０１５／１２５８２０の実施例３（国際公開ＷＯ２０１５／１２５８２０の配列番号４）に記載されているストレプトアビジン変異体である。V2122のアミノ酸配列を配列表の配列番号１２に記載する。
scFv-V2122は、上記のV2122に、HER2 (ERBB2) に対する一本鎖抗体（scFv）を結合したものである。このscFv型の抗HER2抗体は、Zhang H, et al.,Therapeutic potential of an anti-HER2 single chain antibody-DM1 conjugates for the treatment of HER2-positive cancer. Signal Transduct Target Ther. 2017 May 19;2:17015. doi: 10.1038/sigtrans.2017.15に記載されているscFv配列である。scFv型の抗HER2抗体のアミノ酸配列を配列表の配列番号１８に記載する。また、scFv型の抗HER2抗体とV2122とをアミノ酸リンカー(GGGGGSGGGGG)（配列番号２９）で結合したHER2-V2122の構造図を図１５、アミノ酸配列を配列表の配列番号１９に示す。【００９３】
HER2-V2122融合タンパク質の発現のために、大腸菌にて分泌発現するためのpelBシグナルをN末端に、また6xHis-Tag配列をC末端に組み込んだHER2-V2122遺伝子配列のDNAコドンを大腸菌に最適化し人工遺伝子合成を行なった。このアミノ酸配列を配列表の配列番号２０、DNA配列を配列表の配列番号２１に記載する。【００９４】
具体的なタンパク質発現ベクターは、pETDuet1ベクターのMCS2にシャペロンskp遺伝子が組み込まれたベクターを使用した。skp遺伝子は配列表の配列番号６に記載されたアミノ酸配列を元にコドンを大腸菌に最適化したDNAの人工遺伝子合成を行った。合成されたskp遺伝子はプライマー（AAGGAGATATACATATGGATAAAATTGCCATTGTTAATAT（配列番号２３）, TTGAGATCTGCCATATGTTATTTCACTTGTTTCAGAACG（配列番号２４））を使用しPCRで増幅し、制限酵素NdeIで直鎖化されたpETDue1ベクターのMCS2にIn-Fusion HD Cloning Kitをもちいてクローニングを行い pETDuet_skp とした。次に、 pETDuet_skp のMCS1にHER2-V2122遺伝子を組み込んだ。具体的には、人工合成されたHER2-V2122遺伝子をプライマー（AGAAGGAGATATACCATGAAATATCTGCTGCCGAC（配列番号２５）、CGCCGAGCTCGAATTTTAATGATGGTGATGATGATG（配列番号２６））を用いPCRにて増幅した。また、 pETDuet_skp をプライマー（GGTATATCTCCTTCTTAAAGTTAAAC（配列番号２７）、AATTCGAGCTCGGCGCGCCTGCAG（配列番号２８））を使用しPCRにて直鎖化した。PCRにより増幅された CEA-V2122と直鎖化された pETDuet_skp を In-Fusion HD Cloning Kit をもちいてクローニングを行った。クローニングされたベクターはシーケンスにより組み込まれた遺伝子配列の確認を行い pETDuet_HER-V2122_skp とした。【００９５】
タンパク質発現のために、pETDuet_HER2-V2122_skpをBL21(DE3)(ニッポン・ジーン社)に形質転換し 2xYT培地(SIGMA-ADLRICH社)、37°Cにて一晩、前培養を行った。前培養を行った培地を新しい培地に100倍希釈になるように添加し、OD(600nm) = 0.5〜2.0になるまで37°Cで培養を行った。次に最終濃度0.5mM IPTGを添加し37°Cで4時間培養し培養上清を回収した後、4°Cで保存した。【００９６】
HER2-V2122タンパク質は、C末端に付加されている6xHis-Tagを利用し バッチ法で粗精製を行った。具体的にはバッファーA(50mM TrisHCl, 0.2M NaCl, 1mM ED TA, 5mM Imidazole, pH8.0)で平衡化したcOmplete His-Tag Purification Resin を4°C で保存した培養上清へ添加し、2時間から一晩、4°Cにて撹拌しレジンへのタンパク質結合処理を行った。次にレジンをカラムに回収し、バッファーAで20カラム容量の洗浄作業を行った。その後、バッファーB(50mM TrisHCl, 0.2M NaCl, 1mM EDTA, 400mM Imidazol e, pH8.0)で溶出しHER2-V2122の粗精製物の回収を行った。 【００９７】
次に、粗精製物についてProtein L カラムによる精製を行った。具体的にはCapto L (GEヘルスケア)1mLをPD-10カラムに充填し、10カラムボリュームのPBSで平衡化後、上述の粗精製物をアプライし、10カラムボリュームのPBSで洗浄後、10mM グリシン塩酸 pH2.0で溶出しVivaspin Turbo 15 (MWCO 100,000) による遠心濃縮を行なった。さらに PD-10（GEヘルスケア）を用いてPBSへバッファー置換を行い、さらに Vivaspin Turbo 4  (MWCO 100,000) による遠心濃縮を行い最終精製物とした。精製物についてCBB染色により４量体HER2-V2122の純度の検定を行なった結果を図１６に示す。SDS-PAGEゲルは Mini-PROTEAN TGX 4-15% (Bio-Rad社) を使用し CBB染色液は Bullet CBB Stain One(Ready To Use) (ナカライテスク社）を使用した。
図１６より精製されたHER2-V2122は約150kDaの４量体を主たる成分であることが確認された。【００９８】
実施例８：HER2-V2122のSPRでの性能評価
HER2-V2122と抗原CEACAM5との親和性を表面プラズモン共鳴（SPR）測定装置：Biacore T200 (GE Healthcare Life Sciences社) を用いて実施した。具体的には ErbB2/Fcキメラ、ヒト、組換え体、キャリアフリー (R&D SYSTEMS、1129-ER-050) を Sensor Chip CM5 (GE Healthcare Life Sciences社) にアミンカップリングキット (GE Healthcare Life Sciences社) を用いて固定化操作を行い、リガンドの最終固定化量は279RUとなった。また、精製された HER2-V2122 は 1E-08 M から 6.25E-10 M までの２倍希釈系列をアナライトとして調整した。相互作用解析は Single-Cycle Kinetics 解析にてデータの取得を行った。得られたデータを Biacore T200 Evaluation Software, version 2.0 にて Bivalent Analyze モードによるカーブフィッティングを実施しka1=3.857E+5, kd1=1.710E-6の値を得た。また、Bivalent AnalyzeではKD＝kd1/ka1で評価できることからKD＝kd1/ka1=1.710E-6/3.857E+5=4.433E-12の評価値を得た。それらの結果を図１７に示す。
図１７に示されるセンサーグラムおよび計算されたKD値よりHER-V2122はErbB2を認識し強く結合することが確認された。【００９９】
また、HER2-V2122とビオチン改変体 (製造例１、化１７に示された化合物）との相互作用解析も Biacore T200 を用いて実施した。具体的には、 アミンカップリングキットを使用し、Sensor Chip CM5 に目標値 5000RUとなるように設定し、精製された HER2-V2122 の固定化を行なった。アナライトの濃度は 1E-08 M から 6.25E-10 M までの２倍希釈系列５種類を使用した。相互作用解析はSingle-Cycle Kinetics 解析にてデータの取得を行った。得られたデータを Biacore T200 Evaluation Software, version 2.0 にて Bivalent Analyze モードによるカーブフィッティングを実施しka1=1.4E+4, kd1=1.0E-3の値を得た。また、Bivalent AnalyzeではKD＝kd1/ka1で評価できることからKD＝kd1/ka1= kd1=1.0E-3/1.4E+4=7.4E-8の評価値を得た。それらの結果を図１８に示す。【０１００】
実施例９：HER2-V2122 と光活性化化合物標識ビオチン改変体を用いた in vitro 細胞傷害性試験
光活性化化合物標識ビオチン改変体、コンパウンド１、コンパウンド２およびコンパウンド３を用いて細胞傷害性試験を実施した。これらのコンパウンドは出願番号：特願2018-149295 に記載されている化合物である。コンパウンド１、コンパウンド２およびコンパウンド３を図９に示す。具体的には 10% FBSを含むMcCoy’s 培地にて培養したSK-BR-3細胞を細胞培養用96ウェルプレートに細胞数が 5.0x103 cells/well、培養液が 50 μL/well となるように播種し一晩培養した。CEA-V2122と光活性化化合物標識ビオチン改変体の複合体溶液は、CEA-V2122と各コンパウンドとのモル比が1:2となるように混合し室温で10分間インキュベーションをおこない、HER2-V2122の最終濃度10μg/mLとなるように培養液で濃度調製を行なった。希釈系列は20 μg/mLを開始濃度とし、4倍希釈系列を４系列（5.0 μg/mL, 1.25 μg/mL, 0.312 μg/mL, 0.078μg/mL）を５系列の複合体希釈系列液とした。また、複合体を含まない培地のみをゼロコントロールとした。【０１０１】
一晩培養した細胞に複合体希釈系列液を最終濃度（10 μg/mL, 2.5 μg/mL, 0.625 μg/mL, 0.156 μg/mL, 0.039 μg/mL）となるように 50 μL/well づつ各 well 添加した。複合体添加、1時間後、2時間後に 690 ± 10 nm の波長の光を出すLEDを用いて、100 J/cm2となるように細胞に光を照射した。その後、48時間培養しCell Counting Kit-8 (同仁化学社) を用いて生細胞数の比較を行なった。各条件は n=3 とした。用法用量は取扱説明書に従い試薬添加1時間半37°C、CO2 インキュベーターでインキュベーションしたのち、吸光度450nmを測定し、平均値を計算しバックグラウンド補正後、コントロールを100％として各条件のコントロールに対する細胞増殖の割合を計算した。その結果を図１９に示す。
図１９の結果より、HER2-Cupidと光活性化化合物標識ビオチン改変体との複合体は濃度依存的に細胞傷害性を有することが確認された。【０１０２】
配列番号１２
AEAGITGTWSDQLGDTFIVTAGADGALTGTYENAVGGAESRYVLTGRYDSAPATDGSGTALGWTVAWKNNSKNAHSATTWSGQYVGGADAKINTQWLLTSGTTNANAWKSTLVGHDTFTKVKPSAASHHHHHH【０１０３】
配列番号１３(sm3E-scFv配列)
QVKLEQSGAEVVKPGASVKLSCKASGFNIKDSYMHWLRQGPGQRLEWIGWIDPENGDTEYAPKFQGKATFTTDTSANTAYLGLSSLRPEDTAVYYCNEGTPTGPYYFDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSENVLTQSPSSMSVSVGDRVNIACSASSSVPYMHWLQQKPGKSPKLLIYLTSNLASGVPSRFSGSGSGTDYSLTISSVQPEDAATYYCQQRSSYPLTFGGGTKLEIK【０１０４】
配列番号１４
QVKLEQSGAEVVKPGASVKLSCKASGFNIKDSYMHWLRQGPGQRLEWIGWIDPENGDTEYAPKFQGKATFTTDTSANTAYLGLSSLRPEDTAVYYCNEGTPTGPYYFDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSENVLTQSPSSMSVSVGDRVNIACSASSSVPYMHWLQQKPGKSPKLLIYLTSNLASGVPSRFSGSGSGTDYSLTISSVQPEDAATYYCQQRSSYPLTFGGGTKLEIKGGGGSGGGGAEAGITGTWSDQLGDTFIVTAGADGALTGTYENAVGGAESRYVLTGRYDSAPATDGSGTALGWTVAWKNNSKNAHSATTWSGQYVGGADAKINTQWLLTSGTTNANAWKSTLVGHDTFTKVKPSAASHHHHHH【０１０５】
配列番号１５
MKYLLPTAAAGLLLLAAQPAMAQVKLEQSGAEVVKPGASVKLSCKASGFNIKDSYMHWLRQGPGQRLEWIGWIDPENGDTEYAPKFQGKATFTTDTSANTAYLGLSSLRPEDTAVYYCNEGTPTGPYYFDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSENVLTQSPSSMSVSVGDRVNIACSASSSVPYMHWLQQKPGKSPKLLIYLTSNLASGVPSRFSGSGSGTDYSLTISSVQPEDAATYYCQQRSSYPLTFGGGTKLEIKGGGGSGGGGAEAGITGTWSDQLGDTFIVTAGADGALTGTYENAVGGAESRYVLTGRYDSAPATDGSGTALGWTVAWKNNSKNAHSATTWSGQYVGGADAKINTQWLLTSGTTNANAWKSTLVGHDTFTKVKPSAASHHHHHH【０１０６】
配列番号１６
ATGAAATATCTGCTGCCGACCGCAGCAGCGGGTCTGCTGCTGCTGGCAGCACAGCCTGCAATGGCACAGGTTAAACTGGAACAGAGCGGTGCCGAAGTTGTTAAACCGGGTGCAAGCGTTAAACTGAGCTGTAAAGCAAGCGGCTTTAACATCAAAGATAGCTATATGCATTGGCTGCGTCAGGGTCCGGGTCAGCGTCTGGAATGGATTGGTTGGATTGATCCGGAAAATGGTGATACCGAATATGCACCGAAATTTCAGGGTAAAGCAACCTTTACCACCGATACCAGCGCAAATACCGCATATCTGGGTCTGAGCAGCCTGCGTCCGGAAGATACCGCAGTGTATTATTGTAATGAAGGCACCCCGACCGGTCCGTATTATTTCGATTATTGGGGTCAGGGCACCCTGGTTACCGTTAGCAGCGGTGGTGGTGGTAGTGGTGGCGGTGGTTCAGGCGGTGGCGGTAGCGAAAATGTTCTGACCCAGAGCCCGAGCAGCATGAGCGTTAGCGTTGGTGATCGTGTTAATATTGCATGTAGCGCAAGCAGCAGCGTTCCGTACATGCACTGGCTGCAGCAGAAACCGGGTAAAAGCCCGAAACTGCTGATTTATCTGACCAGCAATCTGGCAAGCGGTGTTCCGAGCCGTTTTAGCGGTAGCGGTAGTGGCACCGATTATAGCCTGACCATTAGCAGCGTGCAGCCTGAAGATGCAGCAACCTATTATTGTCAGCAGCGTAGCAGTTATCCGCTGACCTTTGGTGGTGGCACCAAACTGGAAATTAAAGGGGGTGGTGGCTCAGGTGGCGGAGGTGCAGAAGCAGGTATTACCGGTACATGGTCAGATCAGCTGGGTGATACCTTTATTGTTACCGCAGGCGCAGATGGTGCACTGACCGGCACCTATGAAAATGCAGTTGGTGGTGCAGAAAGCCGTTATGTGCTGACCGGTCGTTATGATAGCGCACCGGCAACCGATGGTAGCGGCACCGCACTGGGTTGGACCGTTGCATGGAAAAATAACAGCAAAAATGCACATAGCGCAACCACCTGGTCAGGTCAGTATGTGGGTGGTGCCGATGCCAAAATTAACACCCAGTGGCTGCTGACCAGCGGTACAACCAATGCAAATGCCTGGAAAAGTACCCTGGTTGGTCATGATACATTCACCAAAGTTAAACCGAGCGCAGCAAGCCATCATCATCACCATCATTAA【０１０７】
配列番号１７
MDKIAIVNMGSLFQQVAQKTGVSNTLENEFKGRASELQRMETDLQAKMKKLQSMKAGSDRTKLEKDVMAQRQTFAQKAQAFEQDRARRSNEERGKLVTRIQTAVKSVANSQDIDLVVDANAVAYNSSDVKDITADVLKQVK【０１０８】
配列番号１８
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNIKDTYIHWVRQAPGKGLEWVARIYPTNGYTRYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCSRWGGDGFYAMDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVNTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFSGSRSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQHYTTPPTFGQGTKVEIK【０１０９】
配列番号１９
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNIKDTYIHWVRQAPGKGLEWVARIYPTNGYTRYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCSRWGGDGFYAMDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVNTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFSGSRSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQHYTTPPTFGQGTKVEIKGGGGGSGGGGGAEAGITGTWSDQLGDTFIVTAGADGALTGTYENAVGGAESRYVLTGRYDSAPATDGSGTALGWTVAWKNNSKNAHSATTWSGQYVGGADAKINTQWLLTSGTTNANAWKSTLVGHDTFTKVKPSAASHHHHHH【０１１０】
配列番号２０
MKYLLPTAAAGLLLLAAQPAMAEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNIKDTYIHWVRQAPGKGLEWVARIYPTNGYTRYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCSRWGGDGFYAMDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVNTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFSGSRSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQHYTTPPTFGQGTKVEIKGGGGGSGGGGGAEAGITGTWSDQLGDTFIVTAGADGALTGTYENAVGGAESRYVLTGRYDSAPATDGSGTALGWTVAWKNNSKNAHSATTWSGQYVGGADAKINTQWLLTSGTTNANAWKSTLVGHDTFTKVKPSAASHHHHHH【０１１１】
配列番号２１
ATGAAATATCTGCTGCCGACCGCAGCAGCGGGTCTGCTGCTGCTGGCAGCACAGCCTGCAATGGCAGAAGTTCAGCTGGTTGAAAGCGGTGGTGGTCTGGTTCAGCCTGGTGGTAGCCTGCGTCTGAGCTGTGCAGCAAGCGGTTTTAACATTAAAGATACCTATATTCATTGGGTGCGTCAGGCACCTGGTAAAGGTCTGGAATGGGTTGCACGTATTTATCCGACCAATGGTTATACCCGTTATGCCGATAGCGTTAAAGGTCGTTTTACCATTAGCGCAGATACCAGCAAAAATACCGCATACCTGCAGATGAATAGTCTGCGTGCAGAGGATACCGCAGTGTATTATTGTAGCCGTTGGGGTGGTGATGGTTTTTATGCAATGGATTATTGGGGTCAGGGCACCCTGGTTACCGTTAGCTCAGGTGGAGGCGGTTCCGGTGGCGGAGGTTCCGGTGGAGGTGGCTCCGGTGGCGGAGGTTCCGATATTCAGATGACCCAGAGTCCGAGCAGCCTGAGCGCAAGCGTTGGTGATCGTGTGACCATTACCTGTCGTGCAAGCCAGGATGTTAATACAGCAGTTGCATGGTATCAGCAGAAACCGGGTAAAGCACCGAAACTGCTGATTTATAGCGCAAGCTTTCTGTATAGCGGTGTTCCGAGCCGTTTTAGCGGTAGCCGTAGCGGCACCGATTTTACCCTGACCATTAGCAGCCTGCAGCCGGAAGATTTTGCAACCTATTATTGTCAGCAGCATTACACCACACCGCCTACCTTTGGCCAGGGCACCAAAGTTGAAATTAAAGGAGGTGGCGGTGGATCCGGCGGAGGTGGCGGAGCAGAAGCAGGTATTACCGGTACATGGTCAGATCAGCTGGGTGATACCTTTATTGTTACCGCAGGCGCAGATGGTGCACTGACCGGCACCTATGAAAATGCAGTTGGTGGTGCAGAAAGCCGTTATGTGCTGACCGGTCGTTATGATAGCGCACCGGCAACCGATGGTAGCGGCACCGCACTGGGTTGGACCGTTGCATGGAAAAATAACAGCAAAAATGCACATAGCGCAACCACCTGGTCAGGTCAGTATGTGGGTGGTGCCGATGCCAAAATTAACACCCAGTGGCTGCTGACCAGCGGTACAACCAATGCAAATGCCTGGAAAAGTACCCTGGTTGGTCATGATACATTCACCAAAGTTAAACCGAGCGCAGCAAGCCATCATCATCACCATCATTAA【０１１２】
配列番号２２
GGGGSGGGG【０１１３】
配列番号２３
AAGGAGATATACATATGGATAAAATTGCCATTGTTAATAT【０１１４】
配列番号２４
TTGAGATCTGCCATATGTTATTTCACTTGTTTCAGAACG【０１１５】
配列番号２５
AGAAGGAGATATACCATGAAATATCTGCTGCCGAC【０１１６】
配列番号２６
CGCCGAGCTCGAATTTTAATGATGGTGATGATGATG【０１１７】
配列番号２７
GGTATATCTCCTTCTTAAAGTTAAAC【０１１８】
配列番号２８
AATTCGAGCTCGGCGCGCCTGCAG【０１１９】
配列番号２９
GGGGGSGGGGG
【図１】
2020032165.tif 000030
【図２】
2020032165.tif 000031
【図３】
2020032165.tif 000032
【図４】
2020032165.tif 000033
【図５】
2020032165.tif 000034
【図６】
2020032165.tif 000035
【図７】
2020032165.tif 000036
【図８】
2020032165.tif 000037
【図９】
2020032165.tif 000038
【図１０】
2020032165.tif 000039
【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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