【手続補正書】
【提出日】平成21年7月17日(2009.7.17)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１６５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１６５】
ＬＹ２９４００２（１０ｍＭ）に関する実験では、細胞を一晩枯渇させ、播種前にさらに１時間チャンバー中でインキュベートした。インキュベーション後、顕微鏡（１０倍）での４つの独立した視野の計数によって細胞数を評価し、結果を標準誤差を含む平均値として示した。
ｉｎ  ｖｉｔｒｏ浸潤アッセイ
初期ボイデン・チェンバ浸潤アッセイは、腫瘍細胞と細胞外基質との間の相互作用を正確に再生するために脱上皮化マウスまたはラットの膀胱を使用した膀胱癌浸潤の三次元モデルと相関した。マウスおよびラットの膀胱を、小腹壁切開によって得て、尿路上皮を酵素消化を使用しない解剖鉗子によって除去した。膀胱を２つの部分に採取し、脱表皮下表面を上に向けて３０ｍｍコラーゲンコーティングしたインサート上に配置した。３７℃で３０分間のインキュベーション後、ヒト膀胱癌細胞（５×１０５細胞）を洗浄し、２ｍｌのＲＰＭＩ培地に再懸濁し、間質に配置した。さらに６ｍｌのＲＰＭＩ培地を培養インサートの外側の培養皿に添加して、各培養インサート内に空気−液体接触面を作製した。２４時間後、培地をインサートから除去した。培養皿中の６ｍｌの培地を、３日毎に交換した。７日目および１５日目に培養を停止させた。各膀胱サンプルを、１０％ホルマリン中で少なくとも１２時間固定し、次いで、パラフィン中に包埋した。各外植片の中央の組織学的切片を作製し、ヘマトキシリンを使用して評価した。癌細胞による間質浸潤の証拠を、顕微鏡（４０倍）で観察した。全実験を、３回繰り返した。
高リスクＴａおよびＴ１ヒト膀胱癌中のＮ−およびＥ−カドヘリン発現
本発明者らは、１２個の急速凍結した非浸潤性膀胱癌（１個のｐＴａ；１１個のｐＴ１）および５個の急速凍結した浸潤性膀胱癌（３個のｐＴ３；２個のｐＴ４）を分析した。患者に、書面によるインフォームドコンセントを行った。１９７３のＷＨＯ分類にしたがって腫瘍の悪性度を分類し、ＴＮＭ分類ガイドラインに従って病期を決定した。全腫瘍サンプルを、１９８８年と１９９７年との間の以前の処置を行わずに経尿道的切除物または根治的膀胱適除物から得た（Ｈｅｎｒｉ  Ｍｏｎｄｏｒ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ，Ｃｒｅｔｅｉｌ，Ｆｒａｎｃｅ）。組織学的コントロールのためにフラグメントを固定し、他の部分をチューブに慎重に採取し、液体窒素中で急速凍結し、タンパク質抽出のために−８０℃で保存した。組織サンプルを、抗プロテアーゼおよび抗ホスホリパーゼを補足したＲＩＰＡ溶解緩衝液で溶解した。タンパク質を抽出し、ＢＣＡキットで総タンパク質濃度を決定した。前述のようにこれらの標本のウェスタンブロット分析を行った。
浸潤性ヒト膀胱癌におけるＮ−およびＥ−カドヘリン発現患者
根治的膀胱適除によって処置された３０人の浸潤性膀胱癌患者のコホートを研究した。全患者を、各時点でサンプルを採取して手術当日から死亡日まで追跡した。腫瘍と無関係の他の原因で死亡する患者もいた。追跡に失敗した患者もいた。これらの患者を、生存分析で検閲した（７症例）。
ＤＮＡアレイデータ
本研究で使用したＤＮＡマイクロアレイは、２つのＧｅｎｅＣｈｉｐアレイ（Ｕ９５ＡおよびＵ９５Ａｖ２）からなり、ほぼ１２６００プローブ対を含むＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘヒトゲノムＵ９５組であった。各プローブ組は、２２個の異なるオリゴヌクレオチドからなる（そのうちの１１個は、標的転写物と完全に適合し、１１個は中央に１つのヌクレオチドミスマッチを有する）。これらの２２個のオリゴヌクレオチドを使用して、所与の転写物レベルを測定した。チップをスキャンし、各プローブ組の強度を、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ＭＡＳ５．０デフォルト設定を使用して計算した。本発明者らは、３０アレイの少なくとも５％（ほぼ８９００プローブ対）に「存在する」特壊死を有するプローブ対のみを保持した。各遺伝子「Ｘ」について、患者を以下の２つの群に分類した：遺伝子「Ｘ」の全測定値の中央値を超える発現測定値を有するもの、および中央値未満の発現測定値を有するもの。これにより、２つの群をそれぞれ「Ｘ」＋および「Ｘ」−に定義することができた。
ＲＴ−ＰＣＲ
総ＲＮＡを、塩化セシウム遠心分離によって抽出した。以前に記載のように、これを、ランダムプライミングによる第１のｃＤＮＡ鎖分析のためのテンプレートとして使用した（２３、２４）。Ｎ−カドヘリンｍＲＮＡ量を、内部コントロールとしてＴＢＰ（ＴＡＴＡ結合タンパク質）を使用した半定量的放射性ＲＴ−ＰＣＲによって決定した。使用プライマーは、Ｎ−カドヘリンについてはＧＣＴＧＧＡＣＣＡＴＴＴＧＣＴＴＴＴＧＡＴ（配列番号１０）およびＧＡＴＧＧＧＡＡＣＴＴＣＡＴＡＧＡＴＡＣＣ（配列番号１１）であり、ＴＢＰについてはＡＧＴＧＡＡＧＡＡＣＡＧＴＣＣＡＧＡＣＴＧ（配列番号１２）およびＣＣＡＧＧＡＡＡＴＡＡＣＴＣＴＧＧＣＴＣＡＴ（配列番号１３）であった。ＰＣＲ反応の指数関数部分となるようにサイクル数を選択した（２５サイクル）。ＰＣＲ産物を、８％ポリアクリルアミドゲルでの電気泳動に供した。シグナルを、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｙｎａｍｉｃｓ３００  ＰｈｏｓｐｈｏｒＩｍａｇｅｒ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｙｎａｍｉｃｓ，Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ）で定量した。
統計分析
Ｗｉｎｄｏｗｓ（登録商標）用のＲソフトウェアを使用して、統計分析を行った。カプラン・マイヤー法を使用して、生存曲線を評価した。ログランク検定を行って、２群間で生存の差異は存在しないという帰無仮説を検定した。０．０５未満のｐ値を、統計的に有意と見なした。本発明者らは、スピアマンの順位相関係数を使用して、相違測定値を相関させた。スチューデント検定を行って、相関の有意性を検定した。本発明者らは、データをログ化していない相関研究を除くログ化（ｌｏｇｇｅｄ）Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘデータを使用した。
（実施例２）膀胱癌細胞株中のＮ−カドヘリン発現は、Ａｋｔ活性化、Ｅ−カドヘリン喪失、および浸潤性挙動に関連する。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１８４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１８４】
【図１】ヒト膀胱癌細胞株における内因性カドヘリンプロフィール。Ａ．ウェスタンブロットは、Ｎ−カドヘリンタンパク質レベルがｐＡｋｔレベルと直接相関し、Ｅ−カドヘリン発現と逆相関することを証明する。Ｂ．ヒト膀胱癌細胞株のＰＴＥＮ状態。
【図２】種々のカドヘリンプロフィールを有するヒト膀胱癌細胞株のＭａｔｒｉｇｅｌ  ｉｎ−ｖｉｔｒｏ浸潤アッセイ。Ｅ−カドヘリンを発現する細胞株は、内因性Ｎ−カドヘリンを発現する細胞株よりも浸潤性が低かった。実験を三連で行い、平均を取った。
【図３】浸潤に及ぼすＮ−カドヘリン抗体中和の効果。Ａ．ヒト膀胱癌細胞株のＧＣ４  中和抗体（白）での処置対非処置（黒）での処置の比較。Ｂ．抗体中和によってＮ−カドヘリン発現Ｔ２４細胞株において内因性にｐＡＫＴ発現が減少し、Ｅ−カドヘリン発現が増加することを示すウェスタンブロット分析。浸潤アッセイデータは、三連で行い、平均を取った実験を示す。
【図４】ＰＩ３／Ａｋｔ経路は、内因性に発現するＮ−カドヘリン膀胱癌細胞株で見いだされる浸潤活性の全てではないかいくらかに寄与する。Ａ．Ｎ−カドヘリン陽性ＳＷ７８０細胞におけるレンチウイルス感染による強制的ｐＡｋｔ発現。Ｅ−カドヘリン発現の変化は認められない。Ｂ．ｐＡｋｔ発現が強制されたＳＷ７８０細胞株に浸潤活性の増加が認められる。Ｃ．Ｎ−カドヘリン陽性細胞株Ｔ２４を、ＡｋｔインヒビターＬＹ２９４００２で処置した。このインヒビターでの処置により、ｐＡｋｔ発現が減少した。Ｄ．Ｎ−カドヘリン中和抗体で処置したＴ２４細胞により、Ａｋｔインヒビターのみと比較した場合に浸潤可能性が増大した。
【図５】Ｎ−カドヘリン状態は、表在性および浸潤性膀胱癌患者の生存率の減少に相関する。Ａ．表在性および浸潤性ヒト膀胱腫瘍のカドヘリンプロフィールを示すウェスタンブロット。１７人の患者のうち１４人は、Ｎ−カドヘリンを発現した。Ｂ．浸潤性膀胱癌の根治的膀胱適除術後のＮ−カドヘリン状態に応じてグループ分けした患者の全生存率のカプラン・マイヤー曲線。Ｎ−カドヘリン発現を、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘチップによって収集し、ＲＮＡ発現に基づいてデータから決定した。統計分析は、Ｎ−カドヘリン陽性を示した患者（青色で示す）が、Ｎ−カドヘリン陰性患者（赤色で示す）と比較して生存率が減少することを証明した。
【図６】カドヘリン状態は、浸潤性膀胱癌患者の間の予後と相関する。Ｎ−カドヘリンおよびＥ−カドヘリンの両方に基づいて患者を階層化し、３つの群に分けた。Ｎ−カドヘリン陽性およびＥ−カドヘリン陰性腫瘍を有する患者を示すカプラン・マイヤー曲線は、最悪の全生存を示した。Ｅ−カドヘリン陽性Ｎ−カドヘリン陰性腫瘍を有する患者の生存率が最も高く、混合プロフィールの患者が中間であった。
【図７】ウェスタンブロット分析。これらの分析は、膀胱癌細胞株（Ｊ８２および６４７Ｖ）、前立腺癌細胞株（ＬＮＣａＰ、２２ＲＶ１、およびＰＣ３）、および前立腺癌異種移植片（ＬＡＰＣ−９  アンドロゲン依存性および非依存性）中でのＮ−カドヘリンおよびＥ−カドヘリン発現を示す。Ｊ８２ならびにアンドロゲン依存性株ＰＣ３、２２ＲＶ１、およびＬＡＰＣ−９  ＡＩ中のＮ−カドヘリンの発現に留意されたい。Ｎ−カドヘリンは、ＬＡＰＣ−４  ＡＩ中でも発現する（示さず）。Ｅカドヘリンは、ＰＣ３およびＪ８２中で下方制御されるが、２２ＲＶ１および９ＡＩ細胞株／異種移植片で下方制御されない。
【図８】Ｎ−カドヘリン発現のリアルタイムＰＣＲ分析。耐ホルモン性前立腺癌転移ならびに前立腺癌細胞株ＰＣ３、ＬＮＣａＰ、ＬＡＰＣ−４  ＡＤ、ＡＩ、ＬＡＰＣ  ９  ＡＤ、ＡＩ、および２２ＲＶ１におけるＮ−カドヘリン発現を評価した。発現レベルをＰＣ３（Ｎ−カドヘリン発現が非常に高い細胞株）に規準化する。２２  ＲＶ１発現は、より低いレベルのＮ−カドヘリンレベルを発現し、これをウェスタンによって検出可能である。５つの腫瘍がＰＣ３よりも４〜２５倍（００−０９０ＥＥおよび０１−０４６Ｃ）のレベルのＮ−カドヘリンを発現することに留意されたい。ＰＣ３と類似のレベルは、２１種中１６種で認められる。
【図９】Ｎ−カドヘリンを形質導入したＬＮＣａＰ細胞。Ｎ−カドヘリンを形質導入したＬＮＣａＰ細胞は、高レベルのＮ−カドヘリンを発現し、それにより、Ｅ−カドヘリンを下方制御し、ＥＭＴと一致する形態学的変化が起こる。ＬＮＣａＰ−Ｎ−カドヘリン細胞は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで浸潤性が高い。これらのＰＴＥＮヌル細胞においてＡｋｔは変化しない。
【図１０】マウスにおけるＬＮＣａＰ−ＩＮ−カドヘリン細胞。マウス中のＬＮＣａＰ−Ｎ−カドヘリン細胞は去勢マウスで腫瘍を急速に形成する一方で、コントロール細胞は成長せず、このことは、アンドロゲン非依存性表現型への変換と一致する。
【図１１】Ｎ−カドヘリン中の切断部位および抗体結合部位。
【図１２】ＬＮＣａＰ−Ｎ−カドヘリン細胞における浸潤活性に及ぼす影響による抗体のスクリーニング。
【図１３−１】Ｎ−カドヘリンのヌクレオチド配列（配列番号２）およびアミノ酸配列（配列番号１）の情報。
【図１３−２】Ｎ−カドヘリンのヌクレオチド配列（配列番号２）およびアミノ酸配列（配列番号１）の情報。
【図１４】Ｌｙ６−Ｅのヌクレオチド配列（配列番号４）およびアミノ酸配列（配列番号３）の情報。
【図１５−１】Ｅ−カドヘリンのヌクレオチド配列（配列番号７）およびアミノ酸配列（配列番号５および６）の情報。
【図１５−２】Ｅ−カドヘリンのヌクレオチド配列（配列番号７）およびアミノ酸配列（配列番号５および６）の情報。
【図１５−３】Ｅ−カドヘリンのヌクレオチド配列（配列番号７）およびアミノ酸配列（配列番号５および６）の情報。
【図１６−１】Ｎ−カドヘリン変異型の配列（配列番号８および９）および抗体結合情報。
【図１６−２】Ｎ−カドヘリン変異型の配列（配列番号８および９）および抗体結合情報。
【図１６−３】Ｎ−カドヘリン変異型の配列（配列番号８および９）および抗体結合情報。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2009530645000001.app
【手続補正４】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】全図
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３−１】
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【図１３−２】
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【図１４】
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【図１５−１】
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【図１５−２】
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【図１５−３】
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【図１６−１】
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【図１６−２】
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【図１６−３】
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