(57)【要約】  この出願は、哺乳類人工染色体ベクター内に、目的DNA配列、核マトリックス結合領域及び複製開始点を含み、かつ前記DNAを高発現するために使用されることを特徴とする核酸構築物、この核酸構築物を含む哺乳類細胞、ならびに、この哺乳類細胞において目的DNAがコードするタンパク質の高生産方法を提供する。
2019088257.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳類人工染色体ベクター内に、目的DNA配列、核マトリクス結合領域及び複製開始点を含み、かつ前記DNAを高発現するために使用されることを特徴とする核酸構築物。
【請求項２】
前記哺乳類人工染色体ベクターが、ヒト人工染色体ベクター又は齧歯類人工染色体ベクターである、請求項１に記載の核酸構築物。
【請求項３】
前記齧歯類人工染色体ベクターが、マウス人工染色体ベクターである、請求項２に記載の核酸構築物。
【請求項４】
前記齧歯類人工染色体ベクターが、ハムスター由来の人工染色体ベクターである。請求項２に記載の核酸構築物。
【請求項５】
前記ハムスター由来の人工染色体ベクターが、チャイニーズハムスター卵巣（CHO）細胞由来の人工染色体ベクターである、請求項４に記載の核酸構築物。
【請求項６】
前記核マトリクス結合領域が、Igκ遺伝子座の核マトリクス結合領域に由来する、請求項１〜５のいずれか１項に記載の核酸構築物。
【請求項７】
前記複製開始点が、ジヒドロ葉酸リダクターゼ遺伝子座の複製開始領域に由来する、請求項１〜６のいずれか１項に記載の核酸構築物。
【請求項８】
前記DNAが、タンパク質をコードする遺伝子もしくは遺伝子座、cDNA、組換えDNA又は修飾DNA、あるいは、遺伝子制御領域とレポーター遺伝子を含むDNAを含む、請求項１〜７のいずれか１項に記載の核酸構築物。
【請求項９】
前記目的DNA配列がコードするタンパク質が、ヒト由来である、請求項１〜８のいずれか１項に記載の核酸構築物。
【請求項１０】
請求項１〜９のいずれか１項に記載の核酸構築物を含む、DNA配列がコードするタンパク質を高発現するための哺乳類細胞。
【請求項１１】
チャイニーズハムスター卵巣（CHO）細胞である、請求項１０に記載の哺乳類細胞。
【請求項１２】
前記CHO細胞が、CHO K1細胞株である、請求項１１に記載の哺乳類細胞。
【請求項１３】
DNA配列がコードするタンパク質を高発現するための方法であって、請求項１０〜１２のいずれか１項に記載の哺乳類細胞を培地中で培養する工程を含む、前記方法。
【請求項１４】
DNA配列がコードするタンパク質を生産する方法であって、請求項１０〜１２のいずれか１項に記載の哺乳類細胞を培地中で培養する工程、ならびに、産生されたタンパク質を回収する工程を含む、前記方法。
【請求項１５】
請求項１〜９のいずれか１項に記載の核酸構築物を保持することを特徴とする、非ヒト動物。
【請求項１６】
齧歯動物である、請求項１５に記載の非ヒト動物。
【請求項１７】
前記齧歯動物がマウスである、請求項１６に記載の非ヒト動物。
【請求項１８】
前記齧歯動物がラットである、請求項１６に記載の非ヒト動物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、哺乳類人工染色体ベクター内に、目的DNA配列、核マトリックス結合領域及び複製開始点を含む核酸構築物を利用することによる安定な当該DNA配列の高発現方法および、ならびに、当該核酸構築物に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、タンパク質や核酸などの、所謂バイオ医薬は、有効な治療法がない難しい疾患や癌などの治療のために大きく期待されている。とりわけ抗体医薬については、高い効果と低い副作用のために、すでに臨床的に使用されているものや、臨床試験のステージにあるものが多く存在しており、世界の医薬品の売上高の上位を占めるものもいくつか含まれている。しかしながら、バイオ医薬は、低分子医薬と異なり、その製造プロセスが複雑であるうえに、高コストであるという課題を有している。再現性の高い、したがって安定供給可能であるとともに、低コスト化を実現するためには、高い生産技術を確立することが重要である。【０００３】
抗体などのタンパク質の生産は、化学的なタンパク質合成技術ではなく、遺伝子組換え技術を利用する方法が一般的に使用されている。この技術は、特定のタンパク質をコードするDNAを発現可能に、もしくは作動可能に、プラスミドなどのベクター内に挿入したのち、当該ベクターにより形質転換された原核生物細胞や真核生物細胞を培養し、生成されたタンパク質を回収し精製することを含む。【０００４】
清水ら（広島大学）は、癌細胞の遺伝子増幅メカニズムの研究において、核マトリックス結合領域（Matrix attachment region; MAR）／哺乳類複製開始領域（Mammalian replication initiation region; IR）を含むプラスミドが癌細胞等の細胞内で効率よく遺伝子増幅を起こすこと、ならびに、当該プラスミドは、染色体外のダブルマイニュート（Double minute；DM）の中に組み込まれることを見出した（非特許文献１、非特許文献２）。すなわち、そのようなDMを利用することにより、トランスフェクションした細胞内でプラスミドを多量体化させることが可能であるとともに、娘細胞に安定的に分配させることが可能であるため、哺乳類細胞内でプラスミドを高度に増幅させることができる、と言われている（特許文献１、非特許文献３）。【０００５】
清水らはさらに、哺乳動物細胞内で目的遺伝子を増幅するための方法をいくつか提案している。【０００６】
例えば、特許文献２には、複製開始領域からの複製フォークが、ベクターに組み込まれた任意の遺伝子からの複製と転写が正面衝突する領域にpoly（A）付加配列または複製フォーク阻害配列を存在させないこと、及びそのような領域に核マトリックス結合領域を含ませることを特徴とするベクターが開示されている。【０００７】
特許文献３及び特許文献４には、上記ベクターの他に、新たなエレメントとして、テロメア反復配列を含むポリヌクレオチド（500bp以上10,000bp以下）をさらに哺乳動物細胞へ同時に導入することが開示されている。【０００８】
特許文献５には、IR/MARを含む配列が片側ヘアピン構造又は両側ヘアピン構造をもつDMを形成することが開示されている。【０００９】
清水らはまた、上記の発明に関連する非特許文献４〜６も開示している。【００１０】
非特許文献７には、IR/MARプラスミドを用いて抗体生産を行ったとき、大腸癌細胞株COLO 320DM及びチャイニーズハムスター卵巣細胞株CHO DG44では抗体産生レベルが大きく増大したのに対し、CHO K1細胞株では、プラスミドがIR／MARを含んでいる場合であっても抗体産生レベルがかなり低いため、効率的な遺伝子増幅が認められなかったことが記載されている。【００１１】
さて、上記のIR／MAR遺伝子増幅法との関連で、上記の文献等には、本発明者らが開発した哺乳類人工染色体ベクター(特許文献６〜９、非特許文献８、９)の利用についてほとんど開示がない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１２】
【特許文献１】特許第3755028号公報
【特許文献２】特許第3882042号公報
【特許文献３】特許第5688771号公報
【特許文献４】特許第5688771号公報
【特許文献５】特許第5283044号公報
【特許文献６】特許第5557217号公報
【特許文献７】特許第4997544号公報
【特許文献８】特許第4895100号公報
【特許文献９】特開2011-549044号公報
【非特許文献】
【００１３】
【非特許文献１】Shimizu, N. et al., Cancer Res., 61:6987〜6990 (2001)
【非特許文献２】Shimizu, N. et al., Cancer Res., 63:5281〜5290 (2003)
【非特許文献３】Ohsaki, K. et al., PLos One, 12(4):e0175585 (2017)
【非特許文献４】Shimizu, N. et al., Exp. Cell Res., 302(2):233〜243 (2005)
【非特許文献５】Shimizu, N. et al., Nucleic Acids Res., 33(19):6296〜6307 (2005)
【非特許文献６】Hashidume, T. et al., J. Cell Biochem., 101:552〜565 (2007)
【非特許文献７】Araki, Y. et al., PLos One, 7(7):e41787 (2012)
【非特許文献８】Y.Yoshimura et al., Transgenic Research., 24:717-727（2015）
【非特許文献９】Y Iida et al., ACS Synth Biol., 21:83-90（2014）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
特許文献３及び４等に記載されるように、目的DNA(例えば、タンパク質をコードするDNA)を増幅するためには、IR／MARの他にDMの存在が必須である。DMは、染色体外の環状DNAであり、クロマチンを含み、複製が可能であるが、セントロメアとテロメアを含まない。しかし、IR/MARによって増幅した遺伝子はサイレンシングによる遺伝子の発現低下が顕著に起こることが問題点として挙げられており、その解決法として、IR/MARで作製した蛋白発現細胞ではサイレンシングを解除するためにヒストン脱アセチル酵素（HDAC）阻害剤（例えば、ブチレート（butyrate））の添加が不可欠である。それにより細胞増殖に影響が出る又は細胞がダメージを受けるため、IR/MARを利用したタンパク質生産技術は、連続培養系での利用には適していないという課題がある。【００１５】
上記課題を解決するために、本発明者らは、DMを必須エレメントとしないIR/MARシステムの構築を目的とし、具体的には、遺伝子の安定発現に適しているヒト人工染色体（HAC）もしくはマウス人工染色体（MAC）を含む哺乳類人工染色体ベクター（MMAC）内にIR／MARと目的DNA配列を挿入した新規IR/MAR-MMAC核酸構築物を作製し、当該核酸構築物を哺乳類細胞に導入し、当該DNA配列を高発現する方法を提供することを目的とする。このような方法については、これまで開示がなく、遺伝子増幅やタンパク質安定生産などの可能性について知られていない。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
本発明者らは、上記の課題に対し鋭意研究を行い、新規IR/MAR-MMAC核酸構築物を含む哺乳類細胞が、目的DNAを高発現することを今回見出した。【００１７】
したがって、本発明は、以下の特徴を包含する。
[1] 哺乳類人工染色体ベクター内に、目的DNA配列、核マトリクス結合領域及び複製開始点を含み、かつ前記DNAを高発現するために使用されることを特徴とする核酸構築物。
[2] 上記哺乳類人工染色体ベクターが、ヒト人工染色体ベクター又は齧歯類人工染色体ベクターである、[1]に記載の核酸構築物。
[3] 前記齧歯類人工染色体ベクターが、マウス人工染色体ベクターである、[2]に記載の核酸構築物。
[4] 上記齧歯類人工染色体ベクターが、ハムスター由来の人工染色体ベクターである。[2]に記載の核酸構築物。
[5] 上記ハムスター由来の人工染色体ベクターが、チャイニーズハムスター卵巣（CHO）細胞由来の人工染色体ベクターである、[4]に記載の核酸構築物。
[6] 上記核マトリクス結合領域が、Igκ遺伝子座の核マトリクス結合領域に由来する、[1]〜[5]のいずれかに記載の核酸構築物。
[7] 上記複製開始点が、ジヒドロ葉酸リダクターゼ遺伝子座の複製開始領域に由来する、[1]〜[6]のいずれかに記載の核酸構築物。
[8] 上記DNAが、タンパク質をコードする遺伝子もしくは遺伝子座、cDNA、組換えDNA又は修飾DNA、あるいは、遺伝子制御領域とレポーター遺伝子を含むDNAを含む、[1]〜[7]のいずれかに記載の核酸構築物。
[9] 上記目的DNA配列がコードするタンパク質が、ヒト由来である、[1]〜[8]のいずれかに記載の核酸構築物。
[10] [1]〜[9]のいずれかに記載の核酸構築物を含む、DNA配列がコードするタンパク質を高発現するための哺乳類細胞。
[11] チャイニーズハムスター卵巣（CHO）細胞である、[10]に記載の哺乳類細胞。
[12] 上記CHO細胞が、CHO K1細胞株である、[11]に記載の哺乳類細胞。
[13] DNA配列がコードするタンパク質を高発現するための方法であって、[10]〜[12]のいずれかに記載の哺乳類細胞を培地中で培養する工程を含む、上記方法。
[14] DNA配列がコードするタンパク質を生産する方法であって、[10]〜[12]のいずれかに記載の哺乳類細胞を培地中で培養する工程、ならびに、産生されたタンパク質を回収する工程を含む、上記方法。
[15] [1]〜[9]のいずれかに記載の核酸構築物を保持することを特徴とする、非ヒト動物。
[16] 齧歯動物である、[15]に記載の非ヒト動物。
[17] 上記齧歯動物がマウスである、[16]に記載の非ヒト動物。
[18] 上記齧歯動物がラットである、[16]に記載の非ヒト動物。【００１８】
本発明により、新規IR/MAR-MMAC核酸構築物による遺伝子増幅法が提供される。そのような遺伝子増幅法の応用として、例えば、有用な目的タンパク質をコードするDNAを含む当該核酸構築物によって形質転換された哺乳類細胞を培養することにより、当該タンパク質を安定的に高生産することが可能であるし、あるいは、当該DNAが例えばレポーター遺伝子である場合に細胞内での遺伝子発現を上昇させることにより、発現の変化を捉え易くなり、結果的に検出感度を向上させることが可能である。【００１９】
本明細書は本願の優先権の基礎となる日本国特許出願番号2017-213237号（出願日、2017年11月2日）の開示内容を包含する。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】IR/MAR-HAC核酸構築物による遺伝子増幅システムの作製手順（ステップ１、２及び３）を示す。図中、HACはヒト人工染色体ベクターを示し、loxPはHACへの遺伝子搭載用の配列を示し、MARは核マトリックス結合領域を示し、IRは複製開始点を示す。その他、EGFPは緑色蛍光タンパク質をコードするDNAを示す。
【図２】チャイニーズハムスター卵巣（CHO）細胞株であるK1株（A及びC）とDG44株（B及びD）の染色体（核型）の違いを示すFISH像である。図中、矢印は、大サイズの染色体を示す。そのような染色体の数が、CHO K1株で3個、CHO DG44株で2個である。
【図３】CHO K1株とCHO DG44株の全染色体のFISH像である。図中、矢印は大サイズの染色体を示す。
【図４】CHO DG44 N10細胞の２つのクローン、すなわちcl.10（A）及びcl.11（B）のなかに、正常なヒト人工染色体HAC（矢頭）が導入されていることを示すFISH像である。
【図５】pCX-EGFP CMV-loxPベクターの構造を示す。図中、CAG proは、サイトメガロウイルスエンハンサー（cytomegalovirus(CMV) enhancer）とニワトリβ−アクチンプロモーター（chicken β-actin promoter）のハイブリッドプロモーターである。CMVは、サイトメガロウィルスプロモーターである。loxPは、HACへの遺伝子搭載用の配列である。EGFPは高感度緑色蛍光タンパク質遺伝子である。b-globulin polyAは、βグロブリン遺伝子由来のpolyAシグナルである。
【図６】pCX-EGFP CMV-loxP Kmベクターの構造を示す。図中、pBR322 oriは、プラスミドpBR322のオリジンである。Kmは、カナマイシン耐性遺伝子である。
【図７】pCX-EGFP CMV-loxP dhfrベクターの構造を示す。図中、p-SRalphaは、SRalphaプロモーターである。pAは、ポリAである。BSRは、ブラストサイジン耐性遺伝子である。IRは、ジヒドロ葉酸リダクターゼ遺伝子の翻訳開始領域である。MARは免疫グロブリンκ遺伝子由来の核マトリックス結合領域である。Dhfrは、ジヒドロ葉酸リダクターゼ遺伝子である。SV40promは、SV40プロモーターである。pUC oriは、プラスミドpUCのオリジンである。
【図８】CHO DG44 N10 MAR-HAC細胞クローン1,2,3,10,11,12,13,14のNV1（内部標準）に対するEGFPのゲノム相対量(RQ)を示す。コントロール(Control)は、EGFP配列を1コピー搭載したHACを保持するCHO DG44細胞である。
【図９】CHO DG44 N10 EGFP-HAC(パネルA)とCHO DG44 N10 MAR-HAC(パネルB)におけるHAC上のEGFP遺伝子のゲノム量の違いを示すFISH像である。パネルBでは、クローン1(cl.1)とクローン3(cl.3)での結果を示す。矢頭は、HAC上のEGFPシグナルを示す。
【図１０】CHO DG44 N10 EGFP-HACとCHO DG44 N10 MAR-HACにおける、ウェスタンブロッティングによるEGFPの発現量（バンド）の比較（A）及び、蛍光顕微鏡によるEGFPシグナルの検出レベルの比較（B）を示す。図10Bにおけるパネル1,2,3はそれぞれCHO DG44 N10 MAR-HAC cl.1, cl.2 cl.3を示す。
【図１１】FISH解析による、CHO K1 N10 EGFP-HAC cl.27細胞の核内のHAC（矢頭）上のEGFP遺伝子の存在（A）及び、蛍光顕微鏡による高レベルのEGFPシグナルの存在（B）を示す。
【図１２】FISH解析による、CHO DG44 N10 EGFP-HAC細胞クローンcl.5（A）及びcl.6（B）における、HAC上のEGFPシグナルの存在を示す。
【図１３】ウェスタンブロッティング（WB）による、CHO K1株（CHO K1 N10 EGFP-HACクローン）とCHO DG44株（CHO DG44 N10 EGFP-HAC）におけるHAC上のEGFP遺伝子の発現レベル（バンド）の比較を示す。明らかにCHO K1株の方が外来遺伝子（EGFP）を効率よく発現させることを示す。
【図１４】CHO DG44株（MAR-HAC）内で増幅したEGFP遺伝子を搭載したHACを微小核細胞融合法（MMCT）によってCHO K1細胞に移入する手法を示す。移入後のCHO K1細胞は、CHO K1R MAR-HACである。矢頭は、HAC上のEGFPシグナルを示す。
【図１５】0.1μg/mlコルセミドで72時間処理した後のCHO DG44細胞における微小核細胞の誘導を示す顕微鏡像である。パネルA,B,C,Dはそれぞれ、×40,×100,×200,×200の倍率の画像である。矢印は、微小核細胞を示す。
【図１６】FISH解析による、CHO K1R N10 MAR-HAC細胞クローン cl.12、cl.13及びcl.18（それぞれ、パネルA,B,C）における、HAC上のEGFPシグナルを示すFISH像である。挿入図は、同倍率の拡大図である。
【図１７】CHO DG44 N10 MAR-HAC cl.1 (ドナー)からMAR-HACをCHO K1株に移入することによる、EGFPの発現量の増加を示す、CHO K1R N10 MAR-HACクローンcl.3,cl.7,cl.12,cl.13,cl.18のウェスタンブロット図である。
【図１８】CHO K1R N10 MAR-HAC細胞クローンcl.3,cl7,cl.12,cl.13及びcl.18におけるEGFPの発現レベルを示すウェスタンブロット図及びFISH像（A）、ならびにEGFPタンパク質の相対発現量のグラフ（B）である。コントロールは、CHO K1 N10 EGFP-HAC cl.27（EGFP遺伝子1コピー）である。
【図１９】CHO K1R MAR-HAC N10 cl.13細胞の、その培養期間をPDL（分裂回数）で表わしたときのPDL3,PDL30及びPDL50の段階でのウェスタンブロッティングによるEGFPの発現レベル（パネルAの上）とHAC上のEGFPシグナル（パネルAの下）及び、FISH像（パネルB）を示す。このクローンは、長期培養によって80％のEGFP発現量を維持できることを示す。
【図２０】IR/MAR-HAC核酸構築物による遺伝子増幅システムの作製手順（ステップ１、２及び３）を示す。図中、HACはヒト人工染色体ベクターを示し、loxPはHACへの遺伝子搭載用の配列を示し、MARは核マトリックス結合領域を示し、IRは複製開始点を示す。その他、A7はヒト11番染色体由来の遺伝子エンハンサー配列である。Hcは抗VEGF抗体遺伝子の重鎖タンパク質、Lcは抗VEGF抗体遺伝子の軽鎖タンパク質をコードするDNAを示す。
【図２１】pUCFa-RPS7-VEGF-HcとpUCFa-RPS7-VEGF-Lcベクターの構造を示す。図中、RPS7プロモーターは、ヒトRPS7(Ribosomal Protein S7)遺伝子のプロモーターである。Kozakは、真核細胞のリボソームにより認識され、翻訳開始のシグナルとなるDNA配列である。VEGF Hc ORFは、抗VEGF(Vascular endothelial growth factor)抗体遺伝子の重鎖タンパク質遺伝子である。VEGF Lc ORFは、抗VEGF(Vascular endothelial growth factor)抗体遺伝子の軽鎖タンパク質遺伝子である。
【図２２】pΔBN AR1-Dhfr loxG Km2 MSCベクターの構造を示す。図中、p-SRalpha（p-SRα）は、SRalphaプロモーターである。pAは、ポリAである。BSRは、ブラストサイジン耐性遺伝子である。IRは、ジヒドロ葉酸リダクターゼ遺伝子の翻訳開始領域である。MARは免疫グロブリンκ遺伝子由来の核マトリックス結合領域である。Dhfrは、ジヒドロ葉酸リダクターゼ遺伝子である。SV40promは、SV40プロモーターである。pUC oriは、プラスミドpUCのオリジンである。PstIは、PstIの制限酵素サイトである。AscIはAscIの制限酵素サイトである。 PacIはPacIの制限酵素サイトである。FseIは、FseIの制限酵素サイトである。 SacIIはSacIIの制限酵素サイトである。 PstIIはPstIIの制限酵素サイトである。
【図２３】A7-VEGF MARベクターの構造を示す。図中、polyAおよびpolyA2はともにポリAである。
【図２４】A7-VEGF loxGベクターの構造を示す。
【図２５】CHO DG44 VEGF MAR-HAC細胞クローン2,8,9,10,13のNV1（内部標準）に対する抗VEGF抗体遺伝子重鎖（パネル（A））および軽鎖(パネル（B）)のゲノム相対量(RQ)を示す。コントロール(Control)は、抗VEGF抗体遺伝子配列を1コピー搭載したHACを保持するCHO DG44細胞である。
【図２６】CHO DG44 VEGF-HAC(パネル（A）)とCHO DG44 VEGF MAR-HAC(パネル（B）)におけるHAC上の抗VEGF抗体遺伝子のゲノム量の違いを示すFISH像である。矢頭は、HAC上の抗VEGF抗体遺伝子シグナルを示す。
【図２７】CHO DG44 VEGF-HACとCHO DG44 VEGF MAR-HACにおけるHAC上の抗VEGF抗体遺伝子発現レベルの違いを示す図である。両細胞間で細胞増殖には大きな違いがないことを示し(パネル（A）)、抗体濃度測定により抗体産生量がVEGF-HACに比べてVEGF MAR-HACで高いことを示す(パネル（B）)。また、産生された抗体がVEGFタンパク質に特異的に結合していることを示すELISAの図である(パネル（C）及び(D))。
【図２８】IR/MAR-HAC核酸構築物による遺伝子増幅システムの作製手順（ステップ１、２及び３）を示す。図中、MACはマウス人工染色体ベクターを示し、loxPはMACへの遺伝子搭載用の配列を示し、MARは核マトリックス結合領域を示し、IRは複製開始点を示す。その他、EGFPは緑色蛍光タンパク質をコードするDNAを示す。
【図２９】CHO DG44 MAC細胞の２つのクローン、すなわちcl.611-1（A）及びcl.611-4（B）のなかに、正常なマウス人工染色体MAC（矢頭）が導入されていることを示すFISH像である。
【図３０】CHO DG44 MAR-MAC細胞クローン3のNV1（内部標準）に対するEGFPのゲノム相対量(RQ)を示す。コントロール(Control)は、EGFP配列を1コピー搭載したMACを保持するCHO DG44細胞である。
【図３１】CHO DG44 EGFP-MAC(パネル（A）)とCHO DG44 MAR-MAC(パネル（B）)におけるHAC上のEGFP遺伝子のゲノム量の違いを示すFISH像である。パネル（B）では、クローン(cl.3)での結果を示す。矢頭は、HAC上のEGFPシグナルを示す。
【図３２】CHO DG44 EGFP-MACとCHO DG44 MAR-MACにおける、ウェスタンブロッティングによるEGFPの発現量（バンド）の比較（A）及び、蛍光顕微鏡によるEGFPシグナルの検出レベルの比較（B）を示す。
【図３３】IR/MAR-HAC核酸構築物による遺伝子増幅システムの作製手順（ステップ１、２及び３）を示す。図中、tet-O HACはボトムアップ型ヒト人工染色体ベクターを示し、loxPはMACへの遺伝子搭載用の配列を示し、MARは核マトリックス結合領域を示し、IRは複製開始点を示す。その他、EGFPは緑色蛍光タンパク質をコードするDNAを示す。
【図３４】CHO DG44 tet-O HAC細胞の２つのクローン、すなわちcl.6（A）及びcl.9（B）のなかに、正常なボトムアップ型ヒト人工染色体tet-O HAC（矢頭）が導入されていることを示すFISH像である。
【図３５】CHO DG44 tetO-MAR HAC細胞クローン6-1,6-2,6-3,6-4,6-5, 6-6,6-7,6-8,9-1,9-2,9-3,9-4,9-5,9-6,9-7,9-8のNV1（内部標準）に対するEGFPのゲノム相対量(RQ)を示す。コントロール(Control)は、EGFP配列を1コピー搭載したHACを保持するCHO DG44細胞である。
【図３６】CHO DG44 EGFP-HAC(パネル（A）)とCHO DG44 MAR-tet-O HAC(パネル（B）)におけるHAC上のEGFP遺伝子のゲノム量の違いを示すFISH像である。パネル（B）では、クローン6-1(cl.6-1)とクローン9-7(cl.9-7)での結果を示す。矢頭は、HAC上のEGFPシグナルを示す。
【図３７】CHO MAR-tetO HAC細胞クローンcl.6-1,cl9-7におけるEGFPの発現レベルを示すウェスタンブロット図及びFISH像（A）、ならびにEGFPタンパク質の相対発現量のグラフ（B）である。コントロールは、CHO DG44 EGFP-HAC（EGFP遺伝子1コピー）である。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
本発明をさらに詳細に説明する。
【００２２】
１．IR/MAR-MMAC核酸構築物 
本発明のIR/MAR-MMAC核酸構築物は、宿主細胞の染色体から独立して維持され、搭載された目的DNAを安定に発現させることが可能である哺乳類人工染色体ベクター（「MMAC」という。）内に、少なくとも１つの目的DNA配列、核マトリックス結合領域（MAR）及び複製開始点（「複製開始領域」(IR)ともいう。）などのエレメントを含み、かつ上記目的DNAを高発現するために使用される。本明細書では、このようなエレメントを含むベクターを「IR/MAR-MMAC核酸構築物」（例えば、図7（ただしこの図では、外来DNAがEGFP遺伝子となっているが、この遺伝子を以下で例示するような他の目的DNAで置換しうる。））と称する。
【００２３】
上記の特定のエレメントを挿入する前の哺乳類人工染色体ベクター（MMAC）は、ある特定の哺乳類の１つの染色体由来のセントロメアを含む染色体断片と、当該染色体断片の末端に結合されたテロメアとを含む。
【００２４】
上記染色体断片は、例えば、WO00/10383等に記載のテロメアトランケーションにより作製することができる。具体的には、哺乳類染色体を保持する哺乳類細胞内での人工テロメア配列を保持するターゲティングベクターを用いる相同組換えとテロメアトランケーションにより目的の人工染色体ベクターが得られる。このとき、テロメアトランケーションにより、染色体のセントロメアに近い長腕部位と（もしあれば）短腕部位を切断し、この切断部位に上記テロメアが結合される。また、染色体断片には、内在遺伝子を実質的に含まないか、あるいは染色体断片から、それに生来存在する遺伝子数のうち99.9％以上、好ましくは99.99％以上の遺伝子が削除されることが好ましい。
【００２５】
ここで、「人工テロメア配列」は、例えばWO00/10383に記載されるようなテロメアトランケーションにより人工的に付加させたテロメア配列を意味する。例えば、ヒトテロメア配列及びマウステロメア配列はともに、TTAGGGの反復配列からなる。
【００２６】
本明細書中、哺乳類としては、特に限定されるものではないが、例えばヒト、サル、チンパンジー、ゴリラなどの霊長類、マウス、ラット、ハムスター、モルモットなどの齧歯類、ウシ、ヒツジ、ヤギなどの有蹄類、イヌ、ネコなど、好ましくはヒト、マウス及びラット、を挙げることができる。
【００２７】
上記哺乳類のいずれかの染色体を人工染色体ベクターの作製のために好ましく使用できる。また、染色体の種類として、形質転換される哺乳類細胞が人工染色体ベクターを安定的に受容しうるものを選択するのがよい。さらに哺乳類細胞として、例えば齧歯類細胞（例えば、CHO細胞株（例えば、K1、pro-3、DG44、DUKX-X11、S等）、マウス骨髄腫細胞株（例えば、NS0、Sp2/0等）、BHK細胞株（例えば、BHK21等））を使用するときには、齧歯類人工染色体ベクター（例えば、マウス人工染色体ベクター（MAC）、ハムスター由来の人工染色体ベクター（例えば、CHO由来の人工染色体ベクター）など）及びヒト人工染色体ベクター（HAC）のいずれか、好ましくはマウス人工染色体ベクター、を齧歯類細胞に導入することができる。また、ヒト細胞株を使用するときには、ヒト人工染色体ベクターをヒト細胞株に導入することがよい。
【００２８】
染色体について、例えばマウスの染色体は40個からなり、ラットの染色体は42個からなり、ヒトの染色体は46個からなる。いずれの染色体も、哺乳類人工染色体ベクター（MMAC）の作製のために使用できる。そのような染色体を使用した具体例として、本発明者らによってすでに開発された哺乳類人工染色体ベクター（MMAC）は、ヒト人工染色体ベクター（特許第4895100号）、マウス人工染色体ベクター（特許第5557217号及び特許4997544号）などを含み、これらのベクターに、上記の少なくとも１つの目的DNA配列、核マトリックス結合領域（MAR）及び複製開始点（IR）などのエレメントを挿入するために使用することができる。
【００２９】
哺乳類人工染色体ベクター（MMAC）は、具体的には、上に例示した特許文献等に記載された方法によって作製しうる。また、当該ベクターは、外来DNAを挿入するためのDNA配列挿入部位を有している。ここで、DNA配列挿入部位は、例えば、部位特異的組換え酵素の認識部位である。このような系として、例えば、バクテリオファージP1由来のCre酵素と、その認識部位であるloxP配列の系(Cre/loxP系)や、出芽酵母由来のFLP酵素と、その認識部位であるFRT配列の系(Flp/FRT系）や、ストレプトミセスファージ由来のφC31インテグレースと、その認識部位であるattB/attP配列の系などが挙げられる。
【００３０】
本明細書中、哺乳類人工染色体ベクターは、哺乳類染色体をベースに染色体改変を行うトップダウン法で作製されてもよいし、或いは哺乳類セントロメア配列を含むベクターを哺乳類細胞に導入することを含むボトムアップ法で作製してもよい（Yasuhiro Kazuki and Mitsuo Oshimura, The American Society of Gene & Cell Therapy 2011; doi:10.1038/mt.2011.136）。
【００３１】
本発明におけるIR/MAR-MMAC核酸構築物の作製において、例えば、哺乳類人工染色体ベクター（MMAC）中のDNA配列挿入部位（例えば、loxP配列）に、上記の目的DNA配列、核マトリックス結合領域（MAR）及び複製開始点（IR)を含むカセットを挿入することができる。通常、核マトリックス結合領域（MAR）と複製開始点（IR)は、5'側からこの順番で連結されるのがよく、このような配列を以下では「IR/MAR配列」と称する。
【００３２】
IR/MAR配列は、目的遺伝子とともに細胞内に導入することによって、細胞内でそのコピー数を増幅するために使用できることが知られている（特許文献1〜5等）。また、腫瘍細胞では、IR/MAR配列を含むプラスミドが多量体化（multimerization）を繰り返して大サイズの環状分子となり、これが腫瘍細胞内でDM（double minute）として維持され、さらにDMは、腫瘍細胞内の核の染色体長腕に取り込まれると、破壊−融合−架橋（breakage-fusion-bridge (BFB)）サイクルを開始してHSR（chromosomal homogeneously staining region）を形成し、これが腫瘍細胞内に遺伝子増幅の部位となることが知られている(非特許文献3)。しかし、従来法では、増幅遺伝子の発現を維持させるためにHDAC阻害剤等の薬剤の連続的な投与を必要とし、長期的な安定発現には課題があった。
【００３３】
一方、本発明におけるIR/MAR-MMAC核酸構築物は、メカニズムははっきりしないが、DM又はエピソームとは異なり、結果として核内で外来DNAが増幅された状態で哺乳類人工染色体ベクター（MMAC）上に存在しており、その最終形態はDMと明らかに異なっている。
【００３４】
本発明におけるIR/MAR-MMAC核酸構築物には、少なくとも１つの目的DNA配列、核マトリックス結合領域（MAR）及び複製開始点（IR)が含まれる。
【００３５】
核マトリックス結合領域（MAR）は、以下のものに限定的なものではないが、例えばIgκ(Immunoglobulin light chain)遺伝子座、SV40(Simian virus 40)初期領域、ジヒドロ葉酸リダクターゼ遺伝子座などの核マトリックス結合領域に由来するポリヌクレオチドが含まれる（Tsutsui, K. et al., J. Biol. Chem.; 268: 12886-12894 (1993)；Pommier, Y. et al., J. Virol.; 64:419-423 (1990)； Shimizu, N. et al., Cancer Res.; 61:6987-6990 (2001)）。
【００３６】
複製開始点（IR)は、以下のものに限定的されないが、例えばc-myc遺伝子座由来、ジヒドロ葉酸リダクターゼ（DHFR）遺伝子座由来、β-グロビン(β-globin)遺伝子座由来の複製開始領域などが含まれる（McWhinney, C. et al., Nucleic Acids Res.; 18:1233-1242 (1990)；Dijkwel, P.A. et al., Mol. Cell. Biol.; 8:5398-5409 (1988)；Aladjem, M. et al., Science; 281:1005-1009 (1998)）。
【００３７】
目的DNAは、例えば、遺伝子もしくは遺伝子座、cDNA、組換えDNA、修飾DNAなどの核酸を含む。
【００３８】
本明細書中の「タンパク質」という用語は、特に断らない限り、タンパク質、ポリペプチド及びペプチドを含み、それが産業上有用であれば、いずれのタンパク質でもよく、ヒト由来タンパク質が好ましい。当該タンパク質の例は、病気の治療や予防、あるいは病気の診断などに使用するための任意のタンパク質を含む。そのようなタンパク質の例として、関節リウマチ関連抗体、癌もしくは腫瘍関連抗体などの抗体医薬、赤血球生成因子（EPO）、G-CSF、GM-CSF、ヒト成長ホルモン、血液凝固系タンパク質、血小板産生促進因子、インターフェロンなどの治療用タンパク質、インターロイキン、その他のサイトカインなどが挙げられる。
【００３９】
本発明では哺乳類人工染色体ベクター（MMAC）を使用するため、遺伝子だけでなく遺伝子座をベクター内に挿入することができる。発現させるべきタンパク質が例えば抗体タンパク質である場合、V領域、D領域、J領域、C領域を含む、重鎖遺伝子座（ヒトでは第14番染色体に含まれる。）及び／又は軽鎖遺伝子座（ヒトでは第2番染色体(κ鎖)、第22番染色体（λ鎖）に含まれる。）を使用することができる。あるいは、組換え抗体、例えば重鎖可変領域（VH)と軽鎖可変領域(VL）が好ましくはリンカーを介して結合された単鎖抗体、を作製するときには、抗体をコードするDNAを使用することができる。その他、上に例示したような治療用タンパク質の作製のために、当該タンパク質をコードする遺伝子又はcDNA、場合により修飾DNA、を使用することができる。本明細書中「修飾DNA」は、タンパク質の少なくとも１つのアミノ酸の欠失、置換、付加もしくは挿入をコードするDNAを例示することができる。
【００４０】
IR/MAR-MMAC核酸構築物はさらに、任意の遺伝子のプロモーター、エンハンサー、ポリA配列、薬剤耐性遺伝子、レポーター遺伝子（例えば、蛍光タンパク質又は発光タンパク質をコードするDNA）、DNA配列挿入部位（例えば、loxP）、インシュレーターなどの同じもしくは異なる種類のエレメントの１つ又は2つ以上を含むことができる。エレメントは、目的タンパク質をコードするDNA等の核酸増幅を効率よく起こし得るのに適した位置に挿入するのがよい。例えば、プロモーター及びエンハンサーは、当該DNAの5'非翻訳領域の所定の位置に挿入することができる。プロモーターの例は、CMV、SV40、CAGなどのウイルスプロモーター、エロンゲーション・ファクター(EF)-1、マウスホスホグリセリン酸キナーゼ(PGK)などの非ウイルスプロモーターなどである。
【００４１】
２．IR/MAR-MMAC核酸構築物を含む哺乳類細胞
本発明はさらに、上記１で説明したIR/MAR-MMAC核酸構築物を含む、目的DNAを高発現するための哺乳類細胞を提供する。
【００４２】
哺乳類細胞は、目的DNAの核酸増幅を起こすことができるのであれば特に限定されない。その例として、チャイニーズハムスター卵巣（CHO）細胞、腫瘍細胞、COS細胞、NIH3T3細胞、BHK細胞などが挙げられる。CHO細胞としては、例えば、CHO K1細胞(ATCC CCL-61、RIKEN RCB0285、RIKEN RCB0403等)、CHO-oro-3細胞、CHO DG44細胞、CHO DUKX-X11細胞などが挙げられる。腫瘍細胞としては、ヒト大腸癌細胞（例えば、COLO 320HSR細胞(例えば、ATCC CCL-220.1)）、HeLa細胞、マウス骨髄腫細胞株（例えば、NS0細胞、Sp2/0細胞、等）などが挙げられる。遺伝子の増幅に好ましい哺乳類細胞は、CHO細胞であり、CHO DG44細胞がより好ましい。一方、遺伝子の発現に好ましい哺乳類細胞は、CHO細胞であり、CHO K1細胞がより好ましい。
【００４３】
目的DNA配列、核マトリックス結合領域（MAR）及び複製開始点（IR)を含むカセットを所望の哺乳類細胞に導入するには、例えばCre-loxPシステムを使用することができる。具体的には、上記１．に記載したように作製された哺乳類人工染色体ベクター（MMAC）を含む培養哺乳類細胞株（例えば、CHO細胞株）にCre酵素を作用させて、MMACのloxP部位に、目的DNA配列、核マトリックス結合領域（MAR）及び複製開始点（IR)を含むカセットを挿入して、IR/MAR-MMAC核酸構築物を含む哺乳類細胞株を得ることができる（例えば、図1）。さらに、得られた哺乳類細胞株から別の細胞株にIR/MAR-MMAC核酸構築物を移入するには、例えば微小核細胞融合法（MMCT）を使用して行うことができる（例えば、図14）。MMCT法では、上記哺乳類細胞株をコルセミドで処理して微小核細胞（ミクロセル）を形成し（例えば、図15）、この微小核細胞を、例えばポリエチレングリコールの存在下で、上記の別の細胞株と細胞融合させることによって、IR/MAR-MMAC核酸構築物を上記の別の細胞株に導入することができる（例えば、図17）。この方法により、目的遺伝子を人工染色体上で増幅させた後に、遺伝子発現の発現または機能解析により有利な細胞へ移し替えることが可能である。例えば、後述の実施例で実証されるように、CHO DG44株のようなCHO細胞株で哺乳類人工染色体ベクター（MMAC）上に遺伝子増幅を行い、その遺伝子増幅を行ったMMACをCHO K1株に移し替えるとき、非常に発現量の高いCHO細胞株を得ることができる。
【００４４】
本発明では、後述の実施例に示されるように、IR/MAR-MMAC核酸構築物を導入する哺乳類細胞株として、CHO K1株が好ましい。例えば図17に示されるように、CHO K1株での目的タンパク質（例えばEGFP）の発現量は、CHO DG44株での発現量の2〜3倍高い。また、CHO K1株での目的タンパク質（例えば図17ではEGFPである。）の発現について、長期培養での安定性試験では、PDL（分裂回数;population doubling level）50でもPDL3のときの80％の発現量を維持することが可能である（図19）。タンパク質の発現量は、例えばウェスタンブロッティング、ELISA、定量RT-PCRなどの方法で決定することができる。
【００４５】
３．タンパク質の高発現方法及び高生産方法
（A）タンパク質の高発現方法
本発明はさらに、上記のIR/MAR-MMAC核酸構築物を含む哺乳類細胞を培地中で培養する工程を含む、目的DNAがコードするタンパク質を高発現するための方法を提供する。
【００４６】
（A.1）タンパク質生産のための高発現
哺乳類細胞の培養培地は、使用する細胞の種類に適した培地が選択される。通常使用される基礎培地として、MEM培地、DMEM培地、RPMI培地、F12培地、Macy’s 5A培地、あるいはそれの混合培地（例えば、DMEM/F12）などを使用できる。基礎培地にはさらに、血清、血清代替品、抗生物質、グルタミン酸、ピルビン酸などのサプリメントなどの少なくとも１つの成分を補充することができる。培地のpHは、例えば、約7.0〜7.4である。
【００４７】
培養は、約2〜10％（通常、約5％）CO2含有空気の雰囲気下で行われ、温度は、約35〜40℃（通常、約37℃）が適する。
【００４８】
培養期間は、通常１日〜3ヶ月であり、好ましくは1日〜2ヶ月である。
【００４９】
培養方法は、バッチ培養、フラスコ培養、流加培養、連続培養、浮遊培養、振盪培養、攪拌培養、循環培養などのいずれでもよい。また、細胞凝集を抑制するために、培養中の培養液を中空糸繊維フィルターに通すなどして凝集体をバラバラにするなどの方法を用いることも可能である。
【００５０】
培養装置は、動物細胞培養に使用される装置を使用できる。装置には、通気、温調、攪拌、pH、DO調節機能を備えているのがよい。装置の例は、発酵槽型タンク培養装置、エアーリフト型培養装置、流動層型培養装置、ホロファイバー型培養装置、ローラーボトル型培養装置、充填槽型培養装置、バッグ式培養装置等を用いて培養することができる。
【００５１】
（A.2）細胞内での生物学的機能や挙動をモニターするための高発現
タンパク質の高発現の別の例として、哺乳動物細胞内での目的タンパク質の挙動や生物学的機能をモニターするレポーター遺伝子の高発現が挙げられる。例えば、目的DNAに、例えば、遺伝子制御配列（例えば、プロモーター、エンハンサーなど）を連結したレポーター遺伝子（例えば、蛍光タンパク質又は発光タンパク質をコードするDNA）を作動可能(operably)に挿入することができる。レポーター遺伝子が高発現することにより、レポーターアッセイの検出感度を上げることができる。これにより、細胞内である刺激により発現された目的DNAの挙動を蛍光もしくは発光を指標にして観察することができる。このような観察は、通常、ラボで行うことができるので、細胞の培養は、細胞の種類に応じた固体培地を用いて行うことができる。また、観察は、一般にカメラ付蛍光顕微鏡などを使用して行うことができる。
【００５２】
（B）タンパク質の高生産方法
本発明はさらに、上記のIR/MAR-MMAC核酸構築物を含む哺乳類細胞を培地中で培養する工程、ならびに、産生されたタンパク質を回収する工程を含む、目的タンパク質の生産方法を提供する。
培養工程は、上記（A.1）に記載したとおりである。
【００５３】
回収工程では、培養によって産生されたタンパク質を得るために、例えば遠心分離もしくは濾過後の上清又は細胞を、例えば、アフィニティークロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー等のカラムクロマトグラフィー、フィルター、限外濾過、塩析、透析、それらの組み合わせなどに掛けることができる。回収方法は、上記の方法に限定されないものとし、一般にタンパク質の精製に使用可能なあらゆる方法を包含する。
【００５４】
特にタンパク質が抗体などの糖タンパク質であれば、プロテインAカラム、プロテインGカラム又はプロテインLカラム、あるいはIgG結合ペプチドカラムを用いて回収することができる。
【００５５】
４．IR/MAR-MMAC核酸構築物を保持する非ヒト動物
本発明はさらに、上記のIR/MAR-MMAC核酸構築物を保持する非ヒト動物を提供する。
【００５６】
非ヒト動物の作出は、例えば、上記核酸構築物をES細胞又はiPS細胞に導入し、この細胞を胚盤胞に導入したのち、仮親の子宮に移植し、出産させて非ヒト動物を得ることができる。以下に、その作出方法について説明する。
【００５７】
ES細胞は、対象動物の受精卵の胚盤胞から内部細胞塊を取出し、マイトマイシンC処理マウス胎仔線維芽細胞をフィーダーにして樹立し維持することができる(M.J.Evans and M.H.Kaufman, Nature 292:154-156(1981))。
【００５８】
また、iPS細胞は、体細胞（体性幹細胞を含む）に、ある特定の再プログラム化因子（DNA又はタンパク質）を導入し、適当な培地にて培養、継代培養することによって約3〜5週間でコロニーを生成する。再プログラム化因子は、例えばOct3/4、Sox2、Klf4及びc-Mycからなる組み合わせ;Oct3/4、Sox2及びKlf4からなる組み合わせ;Oct4、Sox2、Nanog及びLin28からなる組み合わせ;あるいは、Oct3/4、Sox2、Klf4、c-Myc、Nanog及びLin28からなる組み合わせなどが知られている(K.Takahashi and S.Yamanaka,Cell 126:663-676(2006);WO2007/069666;M.Nakagawa et al.,Nat.Biotechnol.26:101-106(2008);K.Takahashi et al.,Cell 131:861-872(2007);J.Yu et al.,Science 318:1917-1920(2007);J.Liao et al.,Cell Res.18,600-603(2008))。培養例は、マイトマイシンC処理したマウス胎仔線維芽細胞株（例えばSTO）をフィーダー細胞とし、このフィーダー細胞層上でES細胞用培地を用いて、ベクター導入体細胞（約104〜105細胞/cm2)を約37℃の温度で培養することを含む。フィーダー細胞は必ずしも必要ではない（Takahashi,K.et al.,Cell 131:861-872(2007))。基本培地は、例えばダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）、ハムF-12培地、それらの混合培地などであり、ES細胞用培地は、マウスES細胞用培地、霊長類ES細胞用培地（リプロセル社、日本）などを使用することができる。
【００５９】
ES細胞及びiPS細胞は、生殖系列に寄与することが知られているので、目的DNA配列を含む上記IR/MAR-MMAC核酸構築物を導入したこれらの細胞を、当該細胞が由来する同種の哺乳動物の胚の胚盤胞に注入し、この胚を仮親の子宮に移植し、出産させることを含む手法によって、非ヒト動物（又は、トランスジェニック非ヒト動物）を作製することができる。さらにまた、得られた雌雄のトランスジェニック動物を交配することによって、ホモ接合性動物、さらにその子孫動物を作出することができる。
【００６０】
さらにまた、上記非ヒト動物を用いて、例えば目的DNAがコードする異種（例えばヒト）タンパク質を生産する場合、当該目的DNAに相当する内在性遺伝子が欠失されたもしくは完全に不活性化された動物を使用することができる。
【００６１】
非ヒト動物は、例えば齧歯動物、例えばマウス、ラット、ハムスターなどを含む。
【実施例】
【００６２】
以下の実施例を参照しながら、本発明をさらに具体的に説明するが、本発明の範囲は、これらの実施例によって制限されないものとする。【００６３】
[実施例1]ヒト21番染色体由来HACベクターを保持するCHO DG44細胞株の樹立
[A] ヒト21番染色体由来HACベクター含有CHO K1細胞からHACのCHO DG44細胞へ導入
IR/MAR配列による遺伝子増幅効率のよいCHO DG44細胞 (Y Araki et al. Plos. One. 7. 7. e41787. 2012)内のHAC上で目的遺伝子を挿入及び増幅するために、CHO DG44細胞にDNA配列挿入部位(loxP)をもつHACを導入する(図1、ステップ1)。【００６４】
[A.1]微小核細胞融合と薬剤耐性クローンの単離
染色体供与細胞として、ヒト21番染色体由来のHACベクターを保持するCHO K1細胞由来の細胞株CHO kkpqN cl.10 (以下 「CHO kkpqN10」と記載する（特開第2007-295860号公報)）を用いた。受容細胞としては、CHO DG44細胞(コロンビア大学のDr. LA. Chasinより分与された。)を用いた。25cm2遠心用フラスコ（ヌンク）12本に播種したCHO kkpqN10細胞にコルセミド（0.1μg/ml、ギブコ）を含む培地（20％FBS、F12）中で72時間培養して微小核細胞の形成を誘導した。予め保温（37℃）しておいたサイトカラシンB（F12中に10μg/ml、シグマ）溶液を遠心用フラスコに満たし、アクリル性遠心容器に遠心用フラスコを挿入し、37℃、8, 000rpm（11，899×g）、1時間の遠心を行った（JLA-10.5ローター、ベックマン）。ミクロセルを無血清培地（DMEM）に懸濁して回収し、孔径8μm、5μm、3μmのフィルター（ワットマン）を装着したSWINNEX-25（ミリポア）で順に濾過して精製した。精製した微小核細胞(ミクロセル)は、50μg/mlのフィトヘムアグルチニンP（Phytohemagglutinin-P、Difco）を含むF12, 2mlに再懸濁した。CHO DG44細胞を90％飽和の状態まで培養した6cm径ディッシュ2枚に1mlずつ再懸濁したミクロセルを加え、37℃にて15分間静置した。DMEM中にPEG1000（終濃度50％（W/V）、シグマ）およびDMSO（終濃度7％（W/V）、シグマ）を溶解し、ポアサイズ0.22μmフィルター（コーニング）にて濾過した溶液を1分間細胞に投与し、無血清DMEMにより洗浄した。10％FBSを含むF12培地にて24時間培養した後トリプシン処理により細胞を分散し、10cm径ディッシュ6枚に播種した。ブラストサイジン（4μg/ml）を含む選択培地（10％FBS、F12）で2週間培養した後、薬剤耐性コロニーを獲得した。2回の微小核細胞融合で12個の耐性コロニーを単離し増殖させ、以降の解析を行った(クローン名: CHO DG44 N10)。【００６５】
[A.2]耐性クローンの選別
[A.2.1]mono-color FISH解析
上記で得られたCHO DG44 N10細胞の12クローン中4クローンについてShinoharaらの報告(Human Molecular Genetics,10: 1163-1175,2001)に記された方法でヒトCot-1 DNAをプローブにしたFISH解析を行った。それぞれの核型の特徴により、CHO K1細胞由来のCHO kkpqN10とCHO DG44株を区別することが可能で、CHO K1細胞には大きな染色体が3本あるのに対してCHO DG44細胞は2本である(図2及び図3)。この核型解析に加えてプローブによるシグナルの結果から、CHO DG44 N10細胞の2クローン(cl.10,11)で90%以上の保持率で正常なHACが導入されていることを確認した(図4)。【００６６】
以上の結果から、CHO DG44株にDNA配列挿入部位をもつヒト人工染色体ベクターHACを導入できたと結論付けた。【００６７】
[実施例2]HACへのIR/MAR配列およびEGFP遺伝子の導入
[A]ヒト21番染色体由来HACベクターへIR/MAR配列とEGFP遺伝子を挿入する方法を示した。実施例１に記載のように、loxPサイトを導入したヒト21番染色体由来HACベクターを保持するCHO DG44細胞を用意した。一方でloxP配列およびIR/MAR配列およびEGFP遺伝子発現ユニットを含むプラスミドを準備し、Cre組換え酵素を一過性に発現させることでloxP配列間の部位特異的組換え反応によりヒト人工染色体に挿入することとした。組換え挿入体の選別は、G418耐性の獲得（プロモーター分断型のneo遺伝子発現ユニットの再構成）を指標とした。【００６８】
[A.1] loxP配列とEGFP遺伝子を搭載したプラスミドベクターの構築
[A.1.1]EGFP発現ベクターへのloxP配列の挿入
HAC搭載用のloxP配列は、pPAC4ベクター(Children’s Hospital Oakland Research InstituteのBAC PACリソースセンターより入手した。)を鋳型としてloxP配列を増幅した。【００６９】
GenBankのデータベースより入手した塩基配列(アクセッション番号:U75992.1)をもとに作製したプライマーオリゴヌクレオチドの配列を以下に示す:
CMV loxP stuI F: 5’-GAAGGCCTGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGT-3’（配列番号１）
CMV loxP stuI R: 5’-GAAGGCCTGGTGACCTAAGCTTGCATGCAACTTCGT-3’ （配列番号２）
PCRは、サーマルサイクラーとしてApplied Biosystems社製のProFlex PCR Systemを、TaqポリメラーゼはKOD-plus-（TOYOBO）を用い、バッファーやdNTP（dATP, dCTP , dGTP , dTTP）は添付のものを推奨される条件に従って用いた。温度、サイクル条件は94℃2分の熱変性後、98℃10秒、68℃50秒を16サイクル行った。PCR産物は、プロメガ社のWizard SV Gel and PCR Clean-Up Systemキットを用いて精製を行った。その後、制限酵素StuI（NEB）で切断し、1%のアガロースゲルで電気泳動後、ゲルから切り出してプロメガ社のWizard SV Gel and PCR Clean-Up Systemキットを用いて精製を行った。【００７０】
両端を制限酵素StuI(NEB)で消化して突出末端とした精製したloxP配列のDNA断片を、EGFP発現ユニットを持つpCX-EGFPプラスミドベクターのStuIサイトにTOYOBO社のligation high v2を用いて推奨プロトコールによりクローニングした。loxP配列がEGFP配列と逆方向にクローニングされたベクターをpCX-EGFP CMV loxPベクターとした(図5)。【００７１】
[A.1.2] pCX-EGFP CMV loxPベクターの薬剤選択マーカーの変換
pCX-EGFP CMV loxPベクターおよびIR/MAR配列が搭載されたpΔBN AR1-Dhfrベクター(広島大学、清水典明博士より分与された。)は、両方ともにアンピシリン耐性遺伝子(Amp)が搭載されているため、pCX-EGFP CMV loxPベクターをpΔBN AR1-Dhfrベクターへ挿入する際に、ベクター自身がライゲーションしてしまうセルフライゲーションのプラスミドがたくさん得られ、目的とするpCX-EGFP CMV loxPベクターの配列をpΔBN AR1-Dhfrベクターへクローニングされたプラスミドが得られないことが懸念された。そこで、pCX-EGFP CMV loxPベクターをIR/MAR配列が搭載されたpΔBN AR1-Dhfrへ挿入する際の効率を上げるために、pCX-EGFP CMV loxPベクターのアンピシリン耐性遺伝子(Amp)をカナマイシン耐性遺伝子(Km)に変換する実験を実施した。なお、pΔBN AR1-Dhfrプラスミドの詳細は、C. Noguchi et al. Plos One. 7. 12. e52990. 2012.に掲載されている。【００７２】
Km遺伝子は、pPAC4ベクター(前出)を鋳型として増幅した。GenBankのデータベースより入手した塩基配列(アクセッション番号:U75992.1)をもとに作製したプライマーオリゴヌクレオチドの配列を以下に示す:
Km SpeI PAC4 F: 5’- AAAAGTACTCCAATTAACCAATTCTGATTAGAAAAACT-3’ （配列番号３）
Km SpeI PAC4 R: 5’- GGACTAGTAAAGCCACGTTGTGTCTCAAAATCTCTGAT-3’ （配列番号４）
PCRは、サーマルサイクラーとしてApplied Biosystems社製のProFlex PCR Systemを、TaqポリメラーゼはKOD-plus-（TOYOBO）を用い、バッファーやdNTP（dATP, dCTP , dGTP , dTTP）は添付のものを推奨される条件に従って用いた。温度、サイクル条件は94℃2分の熱変性後、98℃30秒、60℃30秒、72℃1分10秒を16サイクル行った。PCR産物は、プロメガ社のWizard SV Gel and PCR Clean-Up Systemキットを用いて精製を行った。その後、制限酵素ScaI/SpeI（NEB）で切断し、1%のアガロースゲルで電気泳動後、ゲルから切り出してプロメガ社のWizard SV Gel and PCR Clean-Up Systemキットを用いて精製を行った。両端を制限酵素StuI(NEB)で消化して突出末端とした精製したKm遺伝子のDNA断片を、EGFP発現ユニットを持つpCX-EGFP CMV loxPのScaI/SpeIサイトにTOYOBO社のligation high v2を用いて推奨プロトコールによりクローニングした。Km遺伝子がクローニングされたベクターをpCX-EGFP CMV loxP Km2ベクターとした(図6)。【００７３】
[A.2]IR/MARベクターへのEGFP loxP配列の挿入
pCX-EGFP CMV loxP Km2ベクターを制限酵素PstI(NEB)で切断し、1%のアガロースゲルで電気泳動後、ゲルから切り出してプロメガ社のWizard SV Gel and PCR Clean-Up Systemキットを用いて精製を行った。線状化したpCX-EGFP CMV loxP Km2ベクターのDNA断片についてセルフライゲーションを抑制するためにDNA末端の脱リン酸化処理をrAPId Alkaline Phosphatase kit(Roche)を用いて推奨プロトコールに従って行った。pΔBN AR1-Dhfrベクターについても制限酵素PstI(NEB)で切断し、1%のアガロースゲルで電気泳動後、ゲルから切り出してプロメガ社のWizard SV Gel and PCR Clean-Up Systemキットを用いて精製を行った。次に、脱リン酸化処理を行ったpCX-EGFP CMV loxP Km2ベクターのDNA断片とpΔBN AR1-DhfrベクターのDNA断片をTOYOBO社のligation high v2を用いて推奨プロトコールによりライゲーションを行った。【００７４】
以上の工程により完成したEGFP遺伝子、loxP配列およびIR/MAR配列を含む、HAC搭載用プラスミドベクターをpCX-EGFP loxP dhfrベクターと名付けた(図7)。【００７５】
[A.3] Cre/loxPシステムを用いたpCX-EGFP loxP dhfrベクターのHACへの搭載
[A.3.1]遺伝子導入と薬剤耐性クローンの単離
遺伝子導入はリポフェクション法を用いて行い、90%コンフルエント状態になった6ウェル（well）のCHO DG44 N10 cl.11細胞に対して、Cre発現ベクターpBS185 CMV-Creベクター(Addgeneより入手可、プラスミドナンバー:#11916) 0.5μgとpCX-EGFP loxP dhfrベクター1μｇをlipofectamine LTX(インビトロジェン）のプロトコールに従い、遺伝子搭載用のHACベクターが保持されているCHO DG44 N10へ導入した。トランスフェクション24時間後に、F12培地に10%FBSとG418を300μg/ml添加した選択培養を用いて10cm dishを6枚に細胞を播種し、2週間培養すると、耐性コロニーが出現し、1回の導入で得たクローンが多数であった。その内、24クローンを単離し増殖させ、以後の解析を行った（クローン名：CHO DG44 N10 MAR-HAC）。【００７６】
また、IR/MAR配列を含まないコントロール用のHACの作製には、pCX-EGFP loxP dhfrベクターの代わりにpCX-EGFR loxP Km2ベクターを用いて上記の方法で同様にCHO DG44 N10 cl.11細胞へ遺伝子導入を行ったところ、3クローン単離し増殖させて、以後の実験を行った(クローン名: CHO DG44 N10 EGFP-HAC)。【００７７】
[A.4]薬剤耐性クローン選別
[A.4.1]PCR解析
G418耐性株のゲノムDNAを抽出して鋳型として組換え体を選別するため、以下のプライマーを用いてPCRを行い、ヒト人工染色体ベクターHAC上の部位特異的にEGFPおよびIR/MAR配列の挿入が起こっているかをloxP領域における組換えにより出現する2か所のJunction領域において確認した。そのプライマー配列を以下に示す。【００７８】
Neo Junction領域
CMV586: 5’-CGTAACAACTCCGCCCCATT-3’ （配列番号５）
Neo817: 5’-GCAGCCGATTGTCTGTTGTG-3’ （配列番号６）
Another Junction領域
CMV188: 5’-GGGCGTACTTGGCATATGAT-3’ （配列番号７）
CX-EGFP HAC Junc R1: 5’-ATCCGCTCACAATTCCACACA-3’ （配列番号８）【００７９】
PCRは、サーマルサイクラーとしてApplied Biosystems社製のProFlex PCR Systemを、TaqポリメラーゼはKOD-FX-(TOYOBO)を用い、バッファーやdNTP（dATP, dCTP , dGTP , dTTP）は添付のものを推奨される条件に従って用いた。温度、サイクル条件は95℃10分の熱変性後、94℃30秒、55℃30秒、72℃1分30秒を35サイクル行った。CHO DG44 N10 MAR-HACクローンでは単離した24クローンの内、12クローン解析を行ったところ、すべてのクローンにおいて陽性であった。上記の12クローンにおいてHAC上にEGFPおよびIR/MAR配列が挿入できたと判断し、後の解析に用いた(図1、ステップ2)。【００８０】
[B]HACベクター上でのIR/MAR配列によるEGFP遺伝子の増幅
[B.1.1]ゲノムPCR解析による遺伝子増幅の確認
IR/MAR配列のHACへの搭載により、EGFP遺伝子の増幅を確認するために、CHO DG44 N10 MAR-HACクローンよりゲノムを抽出し、EGFP遺伝子が1コピー搭載されているCHO DG44 N10 EGFP-HACクローンをコントロールとしてリアルタイムPCRによって比較解析を行った(（注）このPCR解析ではEGFPのコピー数の絶対量を測定する目的ではなく、コントロールと比較して増幅しているか否かを簡易的に測定する実験として行った。)。【００８１】
PCRは、サーマルサイクラーとしてApplied Biosystems社製のStepOneリアルタイムPCRシステムを、TaqおよびバッファーはPower SYBR Green PCR master Mix(ThermoFisher)を、推奨される条件に従って用いた。【００８２】
用いたプライマー配列を以下に示す。EGFP用と、ゲノムの内部標準としてNV1を用いた(Nissom PM et al. Biologicals. 35. 211-5. 2007)。
EGFP gqPCR F : 5’-CTTCTTCAAGTCCGCCATGC-3’ （配列番号９）
EGFP gqPCR R: 5’-GGTCTTGTAGTTGCCGTCGT-3’ （配列番号１０）
NV1 CHO gPCR ref F : 5’-ACAGGTTTCTGCTTCTGGCA-3’ （配列番号１１）
NV1 CHO gPCR ref R : 5’-CATCAGCTGACTGGTTCACA-3’ （配列番号１２）【００８３】
得られたCHO DG44 N10 MAR-HACのクローン24個の内、8クローンをリアルタイムPCRによって解析した結果、すべてのクローンでコントロールのCHO DG44 N10 EGFP-HACよりもEGFP配列が多い結果を得た。特に、多かったクローン3つ(cl.1,2,3)について今後の解析を行った(図8)。【００８４】
[B.1.2]two-color FISH解析
上記の結果から選んだ3クローンにおいて、two-color FISH解析を松原ら(FISH実験プロトコール、秀潤社（日本）、1994)に従い行った。ヒトcot-1 DNAおよびpCX-EGFPプラスミドをプローブにしてFISH解析を行ったところ、すべてのクローンにおいてコントロールと比較して、染色体が大きく、またヒトcot-1のシグナル上に多数のEGFPシグナルが観察された(図9)。これらの結果から、HAC上でEGFP遺伝子が増幅していると判断し、今後の発現解析に用いた。【００８５】
[B.2]ウェスタンブロッティングによるEGFP発現量の解析
CHO DG44 N10 MAR-HACクローンのEGFP発現が遺伝子配列の増幅にともなって、増加しているか確認するために、ウェスタンブロッティングによってタンパクの発現量を解析した。【００８６】
ウェスタンブロッティングは、細胞溶解液にはプロテイン分解阻害剤が入ったRIPAバッファー(ナカライ)を用いて行い、タンパクの泳動にはラピダス・ミニスラブ電気泳動槽(ATTO)を用いて、10%のSDSアクリルアミドゲル(ナカライテクス)で各クローン2μg/wellの量で泳動を行った。タンパクのへの転写には0.45ポアサイズのPVDFメンブレン(GEヘルスケア)を用いて、Xcell Sure Lockミニセル電気泳動システムによりメンブレンへのタンパクの転写を行った。次に、ウェスタンブロッキング試薬(ロシュ)を用いて、推奨のプロトコールに従い4℃オーバーナイトでブロッキング反応後、PBS-Tで10分、4回洗浄を行い、次の抗体反応に用いた。EGFPの検出には、1抗体は抗EGFPマウス抗体(abcam: ab184601)を用いて5000倍に希釈(0.2ng/μl)して1時間、室温で反応した。PBS-Tで10分、3回洗浄後、2抗体には抗マウスIgGヤギ抗体(abcam: ab6789)を用いて5000倍に希釈(0.2ng/μl)して45分反応させた。PBS-Tで10分、3回洗浄後、Pierce ECL Western Blotting Substrate(ThermoFisher)発光試薬で推奨のプロトコールで反応を行った。タンパクの検出には、ImageQuant LAS4000(富士フィルム)を用いて行った。また、内部標準用のチューブリン（tubulin）の検出には、抗体は抗αtubulinラビットHRP-DirecT抗体(MBL: PM054-7)を用いて5000倍に希釈(0.2ng/μl)して1時間、室温で反応した。PBS-Tで10分、3回洗浄後、Pierce ECL Western Blotting Substrate(ThermoFisher)発光試薬で推奨のプロトコールで反応を行った。タンパクの検出には、ImageQuant LAS4000(富士フィルム)を用いて行った。【００８７】
ウェスタンブロッティング解析の結果、コントロールに比べて、CHO DG44 N10 MAR-HACクローンでは高いタンパク発現量が確認できた(図10A)。また、蛍光顕微鏡による観察においてもウェスタンブロッティングの結果同様にコントロールと比較して、蛍光の輝度がCHO DG44 N10 MAR-HACクローンで高かった(図10B)。これらの結果から、IR/MAR配列とEGFP遺伝子をHACへ搭載することで、遺伝子を増幅することができ、さらに遺伝子増幅に起因してEGFPタンパクの発現量を上昇させることが可能であると判断した(図1、ステップ3)。この実験系をMAR-HACシステムによる遺伝子増幅法と名付けた。【００８８】
[実施例3]CHO K1細胞とCHO DG44細胞間における遺伝子発現量の比較
CHO K1細胞とCHO DG44細胞にそれぞれ1コピーのEGFPを搭載したHACを導入し、同じゲノム情報由来のEGFPの発現量を比較することで、細胞間におけるタンパク産生効率の比較を行った。【００８９】
[A]CHO K1細胞由来のCHO kkpqN10細胞内に保持されたHACへのEGFP遺伝子の搭載
遺伝子搭載用のHACを保持するCHO K1細胞であるCHO kkpqN10細胞に実施例1で用いたpCX-EGFP CMV loxP Km2を導入し、Cre/loxPシステムによる組換えにより、HAC上に1コピーのEGFP遺伝子を搭載する。【００９０】
[A.1.1]遺伝子導入と薬剤耐性クローンの単離
遺伝子導入はリポフェクション法を用いて行い、90%コンフルエント状態になった10cm dishの細胞に対して、Cre発現ベクターpBS185 CMV-Cre(Addgeneより入手可、プラスミドナンバー:#11916)5μgとpCX-EGFP CMV loxP Km2ベクター10μｇをlipofectamine 2000(インビトロジェン）のプロトコールに従い、遺伝子搭載用のHACベクターが保持されているCHO kkpqN10へ導入した（クローン名：CHO K1 N10 EGFP-HAC）。トランスフェクション24時間後に、F12培地に10%FBSとBlasticidin S (Bsd)を8μg/ml, G418を800μg/ml添加した選択培養を用いて10cm dishを20枚に細胞を播種し、2週間培養すると、耐性コロニーが出現し、1回の導入で得たクローンが多数であった。その内、42クローンを単離し増殖させ、以後の解析を行った。【００９１】
[A.2]薬剤耐性クローン選別
[A.2.1]PCR解析
Bsd, G418耐性株のゲノムDNAを抽出して鋳型として組換え体を選別するため、以下のプライマーを用いてPCRを行い、ヒト人工染色体ベクターHAC上の部位特異的にEGFP遺伝子の挿入が起こっているかをloxP領域における組換えにより出現する2か所のJunction領域において確認した。そのプライマー配列を以下に示す。【００９２】
Neo Junction領域
CMV586: 5’-CGTAACAACTCCGCCCCATT-3’ （配列番号５）
Neo817: 5’-GCAGCCGATTGTCTGTTGTG-3’ （配列番号６）
Another Junction領域
CMV188: 5’-GGGCGTACTTGGCATATGAT-3’ （配列番号７）
CX-EGFP HAC Junc R1: 5’-ATCCGCTCACAATTCCACACA-3’ （配列番号８）【００９３】
PCRは、サーマルサイクラーとしてApplied Biosystems社製のProFlex PCR Systemを、TaqポリメラーゼはKOD-FX-(TOYOBO)を用い、バッファーやdNTP（dATP, dCTP , dGTP , dTTP）は添付のものを推奨される条件に従って用いた。温度、サイクル条件は95℃10分の熱変性後、94℃30秒、55℃30秒、72℃1分30秒を35サイクル行った。CHO K1 EGFP-HACクローンでは単離した42クローン解析を行ったところ、陽性クローンは8クローンであった。上記の8クローンを今後の解析に用いた。【００９４】
[A.2.2]two-color FISH解析
上記の結果から選んだ8クローンの内5クローンにおいて、two-color FISH解析を松原ら(FISH実験プロトコール、秀潤社、1994)に従い行った。ヒトcot-1 DNAおよびpCX-EGFPプラスミドをプローブにしてFISH解析を行ったところ、1クローン(CHO K1 EGFP-HAC cl.27)でヒト人工染色体HACが100％の割合で保持されており、さらにHAC上にEGFP由来のシグナルが検出されたことから、部位特異的にHAC上へEGFP遺伝子が挿入されたと判断した(図11A)。加えて、CHO kkpqN10 pCX-EGFP HAC cl.27細胞はHACの保持率に相関して、蛍光顕微鏡下で高い割合でEGFPの蛍光を発していた(図11B)。これらの結果から、CHO K1 EGFP-HAC cl.27を今後の実験に用いた。【００９５】
[B]CHO K1 N10 EGFP-HAC cl.27細胞からCHO DG44細胞へのEGFP-HACの移入
[B.1]CHO DG44 EGFP-HACの樹立
染色体供与細胞として、CHO K1 N10 EGFP-HAC cl.27細胞を用いた。受容細胞としては、CHO DG44細胞(前出)を用いた。25cm2遠心用フラスコ（ヌンク）12本に播種したCHO K1 N10 EGFP-HAC cl.27細胞にコルセミド（0.1μg/ml、ギブコ）を含む培地（20％FBS、F12）中で72時間培養して微小核を誘導した。予め保温（37℃）しておいたサイトカラシンB（F12中に10μg/ml、シグマ）溶液を遠心用フラスコに満たし、アクリル性遠心容器に遠心用フラスコを挿入し、37℃、8，000rpm（11，899×g）、1時間の遠心を行った（JLA-10.5ローター、ベックマン）。ミクロセルを無血清培地（DMEM）に懸濁して回収し、孔径8μm、5μm、3μmのフィルター（ワットマン）を装着したSWINNEX-25（ミリポア）で順に濾過して精製した。精製したミクロセルは、50μg/mlのフィトヘムアグルチニンP（Phytohemagglutinin-P、Difco）を含むF12, 2mlに再懸濁した。CHO DG44細胞を90％飽和の状態まで培養した6cm径ディッシュ2枚に1mlずつ再懸濁したミクロセルを加え、37℃にて15分間静置した。DMEM中にPEG1000（終濃度50％（W/V）、シグマ）およびDMSO（終濃度7％（W/V）、シグマ）を溶解し、ポアサイズ0.22μmフィルター（コーニング）にて濾過した溶液を1分間細胞に投与し、無血清DMEMにより洗浄した。10％FBSを含むF12培地にて24時間培養した後トリプシン処理により細胞を分散し、10cm径ディッシュ6枚に播種した。ブラストサイジン（4μg/ml）を含む選択培地（10％FBS、F12）で2週間培養した後、薬剤耐性コロニーを獲得した。2回の微小核細胞融合で14個の耐性コロニーを単離し増殖させ、以降の解析を行った(クローン名: CHO DG44 EGFP-HAC)。【００９６】
[B.2]two-color FISH解析
上記の結果から選んだ14クローンの内3クローンにおいて、two-color FISH解析を松原ら(FISH実験プロトコール、秀潤社（日本）、1994)に従い行った。ヒトcot-1 DNAおよびpCX-EGFPプラスミドをプローブにしてFISH解析を行ったところ、2クローン(CHO DG44 EGFP- HAC cl.5およびcl.6)において、CHO DG44細胞の核型の特徴を呈し、かつヒト人工染色体HACが90％以上の割合で保持されており、さらにEGFP由来のシグナルが検出されたことから、CHO K1 N10 EGFP-HAC cl.27細胞からCHO DG44細胞へEGFP-HACが導入されたと判断した(図12)。【００９７】
[C] CHO K1細胞およびCHO DG44細胞間における、HAC由来EGFP遺伝子の発現量比較解析
比較細胞にはCHO K1細胞株由来のCHO K1 N10 EGFP-HAC cl.27細胞とCHO DG44細胞由来のCHO DG44 EGFP- HAC cl.6細胞を用いた。それぞれの細胞に保持されたHACは由来は同じであることから、細胞内環境におけるEGFP遺伝子の発現量比較が可能であると考えた。【００９８】
[C.1]ウェスタンブロッティングによるEGFP発現量の解析
ウェスタンブロッティングは、細胞溶解液にはプロテイン分解阻害剤が入ったRIPAバッファー(ナカライテスク)を用いて行い、タンパクの泳動にはラピダス・ミニスラブ電気泳動槽(ATTO)を用いて、10%のSDSアクリルアミドゲル(ナカライテスク)で各クローン2μg/wellの量で泳動を行った。タンパクのへの転写には0.45ポアサイズのPVDFメンブレン(GEヘルスケア)を用いて、Xcell Sure Lockミニセル電気泳動システムによりメンブレンへのタンパクの転写を行った。次に、ウェスタンブロッキング試薬(ロシュ)を用いて、推奨のプロトコールに従い4℃オーバーナイトでブロッキング反応後、PBS-Tで10分、4回洗浄を行い、次の抗体反応に用いた。EGFPの検出には、1抗体は抗EGFPマウス抗体(abcam: ab184601)を用いて5000倍に希釈(0.2ng/μl)して1時間、室温で反応した。PBS-Tで10分、3回洗浄後、2抗体には抗マウスIgGヤギ抗体(abcam: ab6789)を用いて5000倍に希釈(0.2ng/μl)して45分反応させた。PBS-Tで10分、3回洗浄後、Pierce ECL Western Blotting Substrate(ThermoFisher)発光試薬で推奨のプロトコールで反応を行った。タンパクの検出には、ImageQuant LAS4000(富士フィルム（日本）)を用いて行った。また、内部標準用のtubulinの検出には、抗体は抗αtubulinラビットHRP-DirecT抗体(MBL: PM054-7)を用いて5000倍に希釈(0.2ng/μl)して1時間、室温で反応した。PBS-Tで10分、3回洗浄後、Pierce ECL Western Blotting Substrate(ThermoFisher)発光試薬で推奨のプロトコールで反応を行った。タンパクの検出には、ImageQuant LAS4000(富士フィルム（日本）)を用いて行った。EGFPタンパクの定量は、Image Jソフトウェアを用いてバンドの面積を測定し、tubulinによる補正を行った値を用いて行った。【００９９】
ウェスタンブロッティング解析の結果、CHO K1 N10 EGFP-HACクローンの方がCHO DG44 EGFP-HACクローンより12.5倍高いタンパク発現量が確認できた(図13)。この結果から、CHO DG44細胞よりもCHO K1細胞の方がHACに搭載された遺伝子を効率よく発現できると判断された。【０１００】
[実施例4]MAR-HACシステムによって作製した遺伝子増幅HACの異種細胞への移入
実施例2で、MAR-HACシステムによってHAC上で増幅させたEGFP遺伝子を、実施例3で得られた知見から、CHO K1細胞へ移入することでEGFP遺伝子の発現量をさらに向上させることが可能か検討を行った(図14)。【０１０１】
[A]CHO DG44細胞を用いた微小核細胞融合法の確立
これまでCHO DG44細胞を用いての微小核細胞融合法の実績がなかったため、微小核細胞の形成能力について検討を行った。【０１０２】
[A.1]CHO DG44細胞における微小核細胞形成能の確認
CHO DG44細胞が微小核細胞形成能をもつか否かを確認するために、CHO DG44 N10 MAR-HAC cl.1細胞(前出)を用いて、コルセミド処理を行った。25cm2遠心用フラスコ（ヌンク）に播種したCHO DG44 N10 MAR-HAC cl.1細胞にコルセミド（0.1μg/ml、ギブコ）を含む培地（20％FBS、F12）中で72時間培養して微小核を誘導した。その結果、多数の微小核細胞の形成が確認できた(図15)。【０１０３】
この結果より、CHO DG44細胞は微小核形成能力をもつと判断し、次のCHO K1細胞への微小核細胞融合法によるMAR-HACの移入実験を行った。【０１０４】
[B] 微小核細胞融合法によるMAR-HACのCHO K1細胞への移入
[B.1] MAR-HACのCHO K1細胞への移入
染色体供与細胞として、増幅したEGFP遺伝子が搭載されたHACを保持するCHO DG44 N10 MAR-HAC cl.1細胞(前出)を用いた。受容細胞としては、CHO K1細胞由来のCHO kkpqN10細胞(前出)を用いた。25cm2遠心用フラスコ（ヌンク）12本に播種したCHO DG44 N10 MAR-HAC cl.1細胞にコルセミド（0.1μg/ml、ギブコ）を含む培地（20％FBS、F12）中で72時間培養して微小核を誘導した。予め保温（37℃）しておいたサイトカラシンB（F12中に10μg/ml、シグマ）溶液を遠心用フラスコに満たし、アクリル性遠心容器に遠心用フラスコを挿入し、37℃、8，000rpm（11，899×g）、1時間の遠心を行った（JLA-10.5ローター、ベックマン）。ミクロセルを無血清培地（DMEM）に懸濁して回収し、孔径8μm、5μm、3μmのフィルター（ワットマン）を装着したSWINNEX-25（ミリポア）で順に濾過して精製した。精製したミクロセルは、50μg/mlのフィトヘムアグルチニンP（Phytohemagglutinin-P、Difco）を含むF12, 2mlに再懸濁した。CHO kkpqN10細胞を90％飽和の状態まで培養した6cm径ディッシュ2枚に1mlずつ再懸濁したミクロセルを加え、37℃にて15分間静置した。DMEM中にPEG1000（終濃度50％（W/V）、シグマ）およびDMSO（終濃度7％（W/V）、シグマ）を溶解し、ポアサイズ0.22μmフィルター（コーニング）にて濾過した溶液を1分間細胞に投与し、無血清DMEMにより洗浄した。10％FBSを含むF12培地にて24時間培養した後トリプシン処理により細胞を分散し、10cm径ディッシュ6枚に播種した。G418（800μg/ml）を含む選択培地（10％FBS、F12）で1週間培養した後、薬剤耐性コロニーを獲得した。2回の微小核細胞融合で24個の耐性コロニーを単離し増殖させ、以降の解析を行った(クローン名: CHO K1R N10 MAR-HAC)。【０１０５】
[B.2]two-color FISH解析
上記の結果から選んだ24クローンの内5クローンにおいて、two-color FISH解析を松原ら(FISH実験プロトコール、秀潤社（日本）、1994)に従い行った。ヒトcot-1 DNAおよびpCX-EGFPプラスミドをプローブにしてFISH解析を行ったところ、全てのクローンにおいてCHO K1細胞の核型の特徴を呈し、通常のHACと比較して大きなヒトcot-1プローブで染色された染色体が確認され、さらにその上に複数のEGFP由来のシグナルが検出できた(図16)。【０１０６】
以上の結果からCHO DG44 MAR-HAC cl.1細胞からCHO kkpqN10細胞へMAR-HACが移入されたと判断した。【０１０７】
[C]EGFPタンパク発現量の比較解析
MAR-HACをCHO K1細胞へ移入することでEGFPの発現量が向上するかを確かめるために、CHO DG44 MAR-HAC cl.1細胞とCHO K1R N10 MAR-HAC細胞クローン間におけるEGFPタンパクの発現量を比較した。【０１０８】
[C.1]ウェスタンブロッティングによるEGFP発現量の解析
ウェスタンブロッティングは、細胞溶解液にはプロテイン分解阻害剤が入ったRIPAバッファー(ナカライ)を用いて行い、タンパクの泳動にはラピダス・ミニスラブ電気泳動槽(ATTO)を用いて、10%のSDSアクリルアミドゲル(ナカライテクス)で各クローン2μg/wellの量で泳動を行った。タンパクのへの転写には0.45ポアサイズのPVDFメンブレン(GEヘルスケア)を用いて、Xcell Sure Lockミニセル電気泳動システムによりメンブレンへのタンパクの転写を行った。次に、ウェスタンブロッキング試薬(ロシュ)を用いて、推奨のプロトコールに従い4℃オーバーナイトでブロッキング反応後、PBS-Tで10分、4回洗浄を行い、次の抗体反応に用いた。EGFPの検出には、1抗体は抗EGFPマウス抗体(abcam: ab184601)を用いて5000倍に希釈(0.2ng/μl)して1時間、室温で反応した。PBS-Tで10分、3回洗浄後、2抗体には抗マウスIgGヤギ抗体(abcam: ab6789)を用いて5000倍に希釈(0.2ng/μl)して45分反応させた。PBS-Tで10分、3回洗浄後、Pierce ECL Western Blotting Substrate(ThermoFisher)発光試薬で推奨のプロトコールで反応を行った。タンパクの検出には、ImageQuant LAS4000(富士フィルム（日本）)を用いて行った。また、内部標準用のtubulinの検出には、抗体は抗αtubulinラビットHRP-DirecT抗体(MBL: PM054-7)を用いて5000倍に希釈(0.2ng/μl)して1時間、室温で反応した。PBS-Tで10分、3回洗浄後、Pierce ECL Western Blotting Substrate(ThermoFisher)発光試薬で推奨のプロトコールで反応を行った。タンパクの検出には、ImageQuant LAS4000(富士フィルム（日本）)を用いて行った。EGFPタンパクの定量は、Image Jソフトウェアを用いてバンドの面積を測定し、tubulinによる補正を行った値を用いて行った。【０１０９】
ウェスタンブロッティング解析の結果、CHO K1R N10 MAR-HAC細胞のクローンの方がドナー細胞であるCHO DG44 MAR-HAC cl.1細胞より2.01倍から2.85倍、高いタンパク発現量が確認できた(図17)。この結果から、MAR-HACシステムによってCHO DG44細胞内で増幅させたEGFP遺伝子を搭載したHACを、CHO K1細胞へ移入することでEGFP遺伝子の発現量をさらに向上させることが可能であると判断した。【０１１０】
[C.2]EGFP遺伝子を1コピー含むHACとMAR-HACのEGFP発現量の比較  
MAR-HACシステムによる遺伝子増幅の効果を正確に測定することを目的に、EGFP遺伝子を1コピー搭載したHACと、MAR-HACシステムで増幅させたEGFP搭載HACにおけるEGFPの発現比較を、タンパク発現効率の良いCHO K1細胞を宿主として実験を行った。【０１１１】
[C.2.1]ウェスタンブロッティングによるEGFP発現量の解析
EGFP遺伝子を1コピー搭載したHACをもつ細胞として、CHO K1 N10 EGFP-HAC cl.27 細胞(前出)を用い、MAR-HACシステムでEGFPを増幅させたHACをもつ細胞としてはCHO K1R N10 MAR-HAC細胞のクローンを用いた。【０１１２】
ウェスタンブロッティングは、細胞溶解液にはプロテイン分解阻害剤が入ったRIPAバッファー(ナカライテスク)を用いて行い、タンパクの泳動にはラピダス・ミニスラブ電気泳動槽(ATTO)を用いて、10%のSDSアクリルアミドゲル(ナカライテスク)で各クローン2μg/wellの量で泳動を行った。タンパクのへの転写には0.45ポアサイズのPVDFメンブレン(GEヘルスケア)を用いて、Xcell Sure Lockミニセル電気泳動システムによりメンブレンへのタンパクの転写を行った。次に、ウェスタンブロッキング試薬(ロシュ)を用いて、推奨のプロトコールに従い4℃オーバーナイトでブロッキング反応後、PBS-Tで10分、4回洗浄を行い、次の抗体反応に用いた。EGFPの検出には、1抗体は抗EGFPマウス抗体(abcam: ab184601)を用いて5000倍に希釈(0.2ng/μl)して1時間、室温で反応した。PBS-Tで10分、3回洗浄後、2抗体には抗マウスIgGヤギ抗体(abcam: ab6789)を用いて5000倍に希釈(0.2ng/μl)して45分反応させた。PBS-Tで10分、3回洗浄後、Pierce ECL Western Blotting Substrate(ThermoFisher)発光試薬で推奨のプロトコールで反応を行った。タンパクの検出には、ImageQuant LAS4000(富士フィルム（日本）)を用いて行った。また、内部標準用のtubulinの検出には、抗体は抗αtubulinラビットHRP-DirecT抗体(MBL: PM054-7)を用いて5000倍に希釈(0.2ng/μl)して1時間、室温で反応した。PBS-Tで10分、3回洗浄後、Pierce ECL Western Blotting Substrate(ThermoFisher)発光試薬で推奨のプロトコールで反応を行った。タンパクの検出には、ImageQuant LAS4000(富士フィルム（日本）)を用いて行った。EGFPタンパクの定量は、Image Jソフトウェアを用いてバンドの面積を測定し、tubulinによる補正を行った値を用いて行った。【０１１３】
ウェスタンブロッティング解析の結果、CHO K1R N10 MAR-HAC細胞のクローンの方がCHO K1 N10 EGFP-HAC cl.27細胞より17.3倍から25.7倍高いタンパク発現量が確認できた(図18)。この結果から、MAR-HACシステムによってHACに搭載した遺伝子を増幅させることで、その発現量を最高で25.7倍に向上させることができると判断した。【０１１４】
[実施例5]長期培養によるタンパク発現の安定性評価
MAR-HACシステムにより構築したHAC上の増幅遺伝子が長期間安定的に発現可能かを検証するために、CHO K1R N10 MAR-HAC cl.13細胞(前出)を用いて、長期継代培養を行い、初期培養とEGFPの発現量を比較した。培養期間はPDL (Population doubling level :分裂回数)で計測し、PDL3, PDL30, PDL50の段階でウェスタンブロッティングによりEGFPの発現量の比較解析を行った。【０１１５】
[A]ウェスタンブロッティングによるEGFP発現量の解析
ウェスタンブロッティングは、細胞溶解液にはプロテイン分解阻害剤が入ったRIPAバッファー(ナカライテスク)を用いて行い、タンパクの泳動にはラピダス・ミニスラブ電気泳動槽(ATTO)を用いて、10%のSDSアクリルアミドゲル(ナカライテクス)で各クローン2μg/wellの量で泳動を行った。タンパクのへの転写には0.45ポアサイズのPVDFメンブレン(GEヘルスケア)を用いて、Xcell Sure Lockミニセル電気泳動システムによりメンブレンへのタンパクの転写を行った。次に、ウェスタンブロッキング試薬(ロシュ)を用いて、推奨のプロトコールに従い4℃オーバーナイトでブロッキング反応後、PBS-Tで10分、4回洗浄を行い、次の抗体反応に用いた。EGFPの検出には、1抗体は抗EGFPマウス抗体(abcam: ab184601)を用いて5000倍に希釈(0.2ng/μl)して1時間、室温で反応した。PBS-Tで10分、3回洗浄後、2抗体には抗マウスIgGヤギ抗体(abcam: ab6789)を用いて5000倍に希釈(0.2ng/μl)して45分反応させた。PBS-Tで10分、3回洗浄後、Pierce ECL Western Blotting Substrate(ThermoFisher)発光試薬で推奨のプロトコールで反応を行った。タンパクの検出には、ImageQuant LAS4000(富士フィルム)を用いて行った。また、内部標準用のチューブリン（tubulin）の検出には、抗体は抗αtubulinラビットHRP-DirecT抗体(MBL: PM054-7)を用いて5000倍に希釈(0.2ng/μl)して1時間、室温で反応した。PBS-Tで10分、3回洗浄後、Pierce ECL Western Blotting Substrate(ThermoFisher)発光試薬で推奨のプロトコールで反応を行った。タンパクの検出には、ImageQuant LAS4000(富士フィルム（日本）)を用いて行った。EGFPタンパクの定量は、Image Jソフトウェアを用いてバンドの面積を測定し、tubulinによる補正を行った値を用いて行った。【０１１６】
ウェスタンブロッティング解析の結果、PDL3と比較してPDL30では62%と低下傾向を示したが、PDL50では80%の発現量が維持されていた (図19)。この結果から、MAR-HACシステムによってHAC上で増幅させた遺伝子は、PDL50まで80%の発現量を維持できると判断した。【０１１７】
[実施例６] MAR-HACシステムを応用した抗VEGF抗体遺伝子の増幅と産生
[A]ヒト21番染色体由来HACベクターへIR/MAR配列と抗VEGF抗体遺伝子を挿入する方法を示した。実施例１に記載のように、loxPサイトを導入したヒト21番染色体由来HACベクターを保持するCHO DG44細胞を用意した(図20、step1)。一方でloxP配列およびIR/MAR配列および抗VEGF抗体遺伝子発現ユニットを含むプラスミドを準備し、Cre組換え酵素を一過性に発現させることでloxP配列間の部位特異的組換え反応によりヒト人工染色体に挿入することとした（図20、step2）。組換え挿入体の選別は、G418耐性の獲得（プロモーター分断型のneo遺伝子発現ユニットの再構成）を指標とした。【０１１８】
[A.1] 抗VEGF抗体遺伝子を搭載したプラスミドベクターの構築
遺伝子の発現を向上させる機能をもつエンハンサー配列A7をクローニングし、抗VEGF抗体の重鎖遺伝子と軽遺伝子を人工合成遺伝子で作製し、A7エレメントをもつ抗VEGF抗体産生ベクターを作製した。以下に詳細な作製方法を記載する。【０１１９】
[A.1.1] A7エレメントのクローニング
サブクローニング用ベクターの準備するために、inspB4ins2ベクター（鳥取大学研究推進機構基盤研究センター（日本） 大林徹也博士より分与された）をAvrII（NEB）とSpeI-HF（NEB）で消化したものを0.8%アガロースゲルで電気泳動し、MonoFas DNA精製キット（ジーエルサイエンス）で精製した。精製した断片をLigation High ver.2（TOYOBO）にてセルフライゲーションしサブクローニングベクターpB4ins1を作製した。なお、inspB4ins2ベクターの詳細はY.Yoshimura et al. Transgenic Research. 24. 4. p717-727. 2015.に掲載されている。【０１２０】
[A.1.2] A7エレメントのPCRによるクローニング
A7領域はヒト11番染色体88992123〜89000542に位置している8420bpのポリヌクレオチドである（アクセッション番号：AP003400.2）。配列情報をもとに以下のプライマーを設計した。
A7-PacI-41F: 5’-ATTAATTAATCTTAGTATGGTAAACCTTTTGAAGTAGATTC-3’（配列番号１３）
A7-MluI-45R: 5’-GTAACGCGTCAAGTTTTTATTTTGTTCTCACAATTAAGTCTATAC-3’（配列番号１４）【０１２１】
このプライマーを用い、ヒトIMR-90細胞(ATCCより入手)のゲノムDNAを鋳型としてKOD Fx DNAポリメラーゼ（TOYOBO）を使用し以下の条件でPCR反応を行なった（95℃ 2分の前変性後、98℃10秒、68℃10分を35サイクル）。得られた産物はMonoFas DNA精製キットにて精製した。精製産物をMluI（NEB）で消化し、pB4ins1をNruI（NEB）とMluIで消化したベクターへLigation High ver.2(TOYOBO)を使用し挿入しpB4-A7を作製した。【０１２２】
[A.1.3]VEGF抗体を産生する遺伝子の合成
抗VEGF抗体遺伝子に関して、重鎖遺伝子と軽鎖遺伝子のアミノ酸配列はGeneBankのデータベースより（アクセッション番号：KX119517およびKX119516）入手した。また、遺伝子を発現させるプロモーターにはGeneBankのデータベースより入手した塩基配列(アクセッション番号：NG_011744.1)をもとにヒトRPS7遺伝子のプロモーター配列を入手した。これらの配列情報をもとにファスマックス社に合成遺伝子の作製を委託し、抗VEGF抗体遺伝子を搭載した以下のプラスミドベクターを作製した(図21)。【０１２３】
抗VEGF重鎖遺伝子ベクター：pUCFa-RPS7-VEGF-Hc（配列番号１５）
ATCAGATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCTTCAATGGTATCGCCCAGATAGCTTGGCGTAATCATGGTCATGGTCATAGCTGTTTCCTGTGTGAAATTGTTATCCGCTCACAATTCCACACAACATACGAGCCGGAAGCATAAAGTGTAAAGCCTGGGGTGCCTAATGAGTGAGCTAACTCACATTAATTGCGTTGCGCTCACTGCCCGCTTTCCAGTCGGGAAACCTGTCGTGCCAGCTGCATTAATGAATCGGCCAACGCGCGGGGAGAGGCGGTTTGCGTATTGGGCGCTCTTCCGCTTCCTCGCTCACTGACTCGCTGCGCTCGGTCGTTCGGCTGCGGCGAGCGGTATCAGCTCACTCAAAGGCGGTAATACGGTTATCCACAGAATCAGGGGATAACGCAGGAAAGAACATGTGAGCAAAAGGCCAGCAAAAGGCCAGGAACCGTAAAAAGGCCGCGTTGCTGGCGTTTTTCCATAGGCTCCGCCCCCCTGACGAGCATCACAAAAATCGACGCTCAAGTCAGAGGTGGCGAAACCCGACAGGACTATAAAGATACCAGGCGTTTCCCCCTGGAAGCTCCCTCGTGCGCTCTCCTGTTCCGACCCTGCCGCTTACCGGATACCTGTCCGCCTTTCTCCCTTCGGGAAGCGTGGCGCTTTCTCATAGCTCACGCTGTAGGTATCTCAGTTCGGTGTAGGTCGTTCGCTCCAAGCTGGGCTGTGTGCACGAACCCCCCGTTCAGCCCGACCGCTGCGCCTTATCCGGTAACTATCGTCTTGAGTCCAACCCGGTAAGACACGACTTATCGCCACTGGCAGCAGCCACTGGTAACAGGATTAGCAGAGCGAGGTATGTAGGCGGTGCTACAGAGTTCTTGAAGTGGTGGCCTAACTACGGCTACACTAGAAGAACAGTATTTGGTATCTGCGCTCTGCTGAAGCCAGTTACCTTCGGAAAAAGAGTTGGTAGCTCTTGATCCGGCAAACAAACCACCGCTGGTAGCGGTGGTTTTTTTGTTTGCAAGCAGCAGATTACGCGCAGAAAAAAAGGATCTCAAGAAGATCCTTTGATCTTTTCTACGGGGTCTGACGCTCAGTGGAACGAAAACTCACGTTAAGGGATTTTGGTCATGAGATTATCAAAAAGGATCTTCACCTAGATCCTTTTAAATTAAAAATGAAGTTTTAAATCAATCTAAAGTATATATGAGTAAACTTGGTCTGACAGTTACCAATGCTTAATCAGTGAGGCACCTATCTCAGCGATCTGTCTATTTCGTTCATCCATAGTTGCCTGACTCCCCGTCGTGTAGATAACTACGATACGGGAGGGCTTACCATCTGGCCCCAGTGCTGCAATGATACCGCGAGACCCACGCTCACCGGCTCCAGATTTATCAGCAATAAACCAGCCAGCCGGAAGGGCCGAGCGCAGAAGTGGTCCTGCAACTTTATCCGCCTCCATCCAGTCTATTAATTGTTGCCGGGAAGCTAGAGTAAGTAGTTCGCCAGTTAATAGTTTGCGCAACGTTGTTGCCATTGCTACAGGCATCGTGGTGTCACGCTCGTCGTTTGGTATGGCTTCATTCAGCTCCGGTTCCCAACGATCAAGGCGAGTTACATGATCCCCCATGTTGTGCAAAAAAGCGGTTAGCTCCTTCGGTCCTCCGATCGTTGTCAGAAGTAAGTTGGCCGCAGTGTTATCACTCATGGTTATGGCAGCACTGCATAATTCTCTTACTGTCATGCCATCCGTAAGATGCTTTTCTGTGACTGGTGAGTACTCAACCAAGTCATTCTGAGAATAGTGTATGCGGCGACCGAGTTGCTCTTGCCCGGCGTCAATACGGGATAATACCGCGCCACATAGCAGAACTTTAAAAGTGCTCATCATTGGAAAACGTTCTTCGGGGCGAAAACTCTCAAGGATCTTACCGCTGTTGAGATCCAGTTCGATGTAACCCACTCGTGCACCCAACTGATCTTCAGCATCTTTTACTTTCACCAGCGTTTCTGGGTGAGCAAAAACAGGAAGGCAAAATGCCGCAAAAAAGGGAATAAGGGCGACACGGAAATGTTGAATACTCATACTCTTCCTTTTTCAATATTATTGAAGCATTTATCAGGGTTATTGTCTCATGAGCGGATACATATTTGAATGTATTTAGAAAAATAAACAAATAGGGGTTCCGCGCACATTTCCCCGAAAAGTGCCACCTGACGTCTAAGAAACCATTATTATCATGACATTAACCTATAAAAATAGGCGTATCACGAGGCCCTTTCGTCTCGCGCGTTTCGGTGATGACGGTGAAAACCTCTGACACATGCAGCTCCCGGAGACGGTCACAGCTTGTCTGTAAGCGGATGCCGGGAGCAGACAAGCCCGTCAGGGCGCGTCAGCGGGTGTTGGCGGGTGTCGGGGCTGGCTTAATTAAATGCCCCAAAACATCAGGTTAATGGCGTTCTTGATGTCATTCTCGCGATGCGACAGATCCGCAACCTCTTCGCCAATTACCGACACTGGTACTGACGCCATATCCGTGGTCATCATACGCCAGCTTTCATCCCCAATGTGGACAACCGGATAGAGTTCACGGGAAACTTTGTCGCTCAGTAACCGTGCAGAAGCCAACGGAATCACCGTGCGACGACCAGGAGTATCGATGATGTCGCTTTGCACATCCACAAACAGGCGATAGCGACTTTCGCGTTTGTAGGTGTAGACTTTGAACTGCGGTACGTTACAGAGAGCGCAACTGCTGTGACGGACGATCTGTACGCGCTTCTTCGCTATTCCGCCAACTCGCAAACGGAGGATGTGCTGCAAGGCGATTAAGTTGGGTAACGCCTGGGTTTTCCCAGTCACGACGTTGTAAAACGACGGCCAGTGAATTGTAATAGCTCTCTGAGTACGGAACACTCTTTCCCTTAACGACGCTCTTCCGATCTGATgaacgcgttccttaaggacggatcgggagatctcccgatcccctatgtctcagtacaatctgctctgatgccgcatagttaagccagtatctgctccctgcttgtgtgttggaggtcgctgagtagtgcgcgagcaaaatttaagctacaacaaggcaaggcttgaccgacaattgcatgaagaatctgcttagggttaggcgttttgcgctgcttcgcgatgtacgggccagatattgacattgattattgactaggcttttgcaaaaagcttgtttaaaccttgtatattaacagcacattaacagctaaaaagaaaaactcacataatcatattagttcatagaaacaatgcatttgacatactccaacatccattcatgattttattttattttttatttatatattttttttgagatggagtctcgctgtcacccaggctggagtgcaatggctcgatctcggctcactgcaggctccgcccccggcggttcacgccattctcctgcctcagcctcccgagtagctgggactacaggcgcccgccacctcgcccagctaattttttgtatttttagtagagacggggtttcaccgtgttagccaggatggtctcgatctcctgacctcgtgatccacccgcctcggcctcccaaagtgctgggattacaggcgtgagccaccgtgcccggcccatgattttaaaaaaacctctcagaaatagaaacagagggaacttcctgaatttgattaaaaatacctgcaaaatcctagagctaatattatacttaatggtgaaagactgaatggttttcccctaagatggagaacaaggcacggatgtccttgctcaccactcctattcaacaaaggactggaaaccagaaataactttaattttttttgttctcaagtgataggttcacagagaaaaagctttactggatgaacttttagattactacttttatagagcagcagagataaaagccaggtcgaaaagtgcatgtggagtaaggaaatggacctagttcgacaaaagggctcagaacgactgcccagatgagattgtagacgcagctgtagtttactttctatctggaagaaacttcaagttatccttaattttccaaggagacagtcacttaccttttaaaaaacattattagagaagcaccgggcgggagcatatctagcattaaaaatgtgggatgaataccatctctgcttggtaaaggtggttgggaatcctgagagagggcacctagtgtggcttctgcatttttcacagtgcctggaccacggctgaaagtaactcttgcatgacatttgacagaagaggaaaccgaagctcagattaaattccctgtccacagcgggatcattcggcacgagttcctccctgtctggaatgctcttccccagcaatagatcctgcggctcttccgtgtctcagtctaatgtcattccgttccaggattcccgacttcttaaagcataaataatccctccccaccctctcattgtactgttatgtaagttattacaatatgtcattatatatttagtcatactgctttaggtaatgtcttctccactgaactgtaagctccatgagggcaagagttcagtcggttttacttaataattagcacctagtacagtactagcatagaatgaaggcctcgcaattttttttaaatttatttttagacagggtcttgcgctgtcgcccaggctggagtgcagtggtgcaacctcggctcacggcagcctcgacctttcggctccagcgatcctcccgcgtcggcctccggggtagctgggactgcaggcgcgcaccaccatgactggctaatttttttttttttttttttgtagacatggggtctcgccatgttgcccaggctggttcctgagctcaagtgatcctcctgcctcggcctcccaaagtgctgggattacaggcgtgagcctcagcgcccagccaagttagccttttttaaacgtcctgtctccggaggttgccga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抗VEGF軽鎖遺伝子ベクター：pUCFa-RPS7-VEGF-Lc（配列番号１６）
ATCAGATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCTTCAATGGTATCGCCCAGATAGCTTGGCGTAATCATGGTCATGGTCATAGCTGTTTCCTGTGTGAAATTGTTATCCGCTCACAATTCCACACAACATACGAGCCGGAAGCATAAAGTGTAAAGCCTGGGGTGCCTAATGAGTGAGCTAACTCACATTAATTGCGTTGCGCTCACTGCCCGCTTTCCAGTCGGGAAACCTGTCGTGCCAGCTGCATTAATGAATCGGCCAACGCGCGGGGAGAGGCGGTTTGCGTATTGGGCGCTCTTCCGCTTCCTCGCTCACTGACTCGCTGCGCTCGGTCGTTCGGCTGCGGCGAGCGGTATCAGCTCACTCAAAGGCGGTAATACGGTTATCCACAGAATCAGGGGATAACGCAGGAAAGAACATGTGAGCAAAAGGCCAGCAAAAGGCCAGGAACCGTAAAAAGGCCGCGTTGCTGGCGTTTTTCCATAGGCTCCGCCCCCCTGACGAGCATCACAAAAATCGACGCTCAAGTCAGAGGTGGCGAAACCCGACAGGACTATAAAGATACCAGGCGTTTCCCCCTGGAAGCTCCCTCGTGCGCTCTCCTGTTCCGACCCTGCCGCTTACCGGATACCTGTCCGCCTTTCTCCCTTCGGGAAGCGTGGCGCTTTCTCATAGCTCACGCTGTAGGTATCTCAGTTCGGTGTAGGTCGTTCGCTCCAAGCTGGGCTGTGTGCACGAACCCCCCGTTCAGCCCGACCGCTGCGCCTTATCCGGTAACTATCGTCTTGAGTCCAACCCGGTAAGACACGACTTATCGCCACTGGCAGCAGCCACTGGTAACAGGATTAGCAGAGCGAGGTATGTAGGCGGTGCTACAGAGTTCTTGAAGTGGTGGCCTAACTACGGCTACACTAGAAGAACAGTATTTGGTATCTGCGCTCTGCTGAAGCCAGTTACCTTCGGAAAAAGAGTTGGTAGCTCTTGATCCGGCAAACAAACCACCGCTGGTAGCGGTGGTTTTTTTGTTTGCAAGCAGCAGATTACGCGCAGAAAAAAAGGATCTCAAGAAGATCCTTTGATCTTTTCTACGGGGTCTGACGCTCAGTGGAACGAAAACTCACGTTAAGGGATTTTGGTCATGAGATTATCAAAAAGGATCTTCACCTAGATCCTTTTAAATTAAAAATGAAGTTTTAAATCAATCTAAAGTATATATGAGTAAACTTGGTCTGACAGTTACCAATGCTTAATCAGTGAGGCACCTATCTCAGCGATCTGTCTATTTCGTTCATCCATAGTTGCCTGACTCCCCGTCGTGTAGATAACTACGATACGGGAGGGCTTACCATCTGGCCCCAGTGCTGCAATGATACCGCGAGACCCACGCTCACCGGCTCCAGATTTATCAGCAATAAACCAGCCAGCCGGAAGGGCCGAGCGCAGAAGTGGTCCTGCAACTTTATCCGCCTCCATCCAGTCTATTAATTGTTGCCGGGAAGCTAGAGTAAGTAGTTCGCCAGTTAATAGTTTGCGCAACGTTGTTGCCATTGCTACAGGCATCGTGGTGTCACGCTCGTCGTTTGGTATGGCTTCATTCAGCTCCGGTTCCCAACGATCAAGGCGAGTTACATGATCCCCCATGTTGTGCAAAAAAGCGGTTAGCTCCTTCGGTCCTCCGATCGTTGTCAGAAGTAAGTTGGCCGCAGTGTTATCACTCATGGTTATGGCAGCACTGCATAATTCTCTTACTGTCATGCCATCCGTAAGATGCTTTTCTGTGACTGGTGAGTACTCAACCAAGTCATTCTGAGAATAGTGTATGCGGCGACCGAGTTGCTCTTGCCCGGCGTCAATACGGGATAATACCGCGCCACATAGCAGAACTTTAAAAGTGCTCATCATTGGAAAACGTTCTTCGGGGCGAAAACTCTCAAGGATCTTACCGCTGTTGAGATCCAGTTCGATGTAACCCACTCGTGCACCCAACTGATCTTCAGCATCTTTTACTTTCACCAGCGTTTCTGGGTGAGCAAAAACAGGAAGGCAAAATGCCGCAAAAAAGGGAATAAGGGCGACACGGAAATGTTGAATACTCATACTCTTCCTTTTTCAATATTATTGAAGCATTTATCAGGGTTATTGTCTCATGAGCGGATACATATTTGAATGTATTTAGAAAAATAAACAAATAGGGGTTCCGCGCACATTTCCCCGAAAAGTGCCACCTGACGTCTAAGAAACCATTATTATCATGACATTAACCTATAAAAATAGGCGTATCACGAGGCCCTTTCGTCTCGCGCGTTTCGGTGATGACGGTGAAAACCTCTGACACATGCAGCTCCCGGAGACGGTCACAGCTTGTCTGTAAGCGGATGCCGGGAGCAGACAAGCCCGTCAGGGCGCGTCAGCGGGTGTTGGCGGGTGTCGGGGCTGGCTTAATTAAATGCCCCAAAACATCAGGTTAATGGCGTTCTTGATGTCATTCTCGCGATGCGACAGATCCGCAACCTCTTCGCCAATTACCGACACTGGTACTGACGCCATATCCGTGGTCATCATACGCCAGCTTTCATCCCCAATGTGGACAACCGGATAGAGTTCACGGGAAACTTTGTCGCTCAGTAACCGTGCAGAAGCCAACGGAATCACCGTGCGACGACCAGGAGTATCGATGATGTCGCTTTGCACATCCACAAACAGGCGATAGCGACTTTCGCGTTTGTAGGTGTAGACTTTGAACTGCGGTACGTTACAGAGAGCGCAACTGCTGTGACGGACGATCTGTACGCGCTTCTTCGCTATTCCGCCAACTCGCAAACGGAGGATGTGCTGCAAGGCGATTAAGTTGGGTAACGCCTGGGTTTTCCCAGTCACGACGTTGTAAAACGACGGCCAGTGAATTGTAATAGCTCTCTGAGTACGGAACACTCTTTCCCTTAACGACGCTCTTCCGATCTGATggttaattaaccgcgatcgcgcgcctgcaggactacgtagtcacgcgtgatccttaaggacggatcgggagatctcccgatcccctatgtctcagtacaatctgctctgatgccgcatagttaagccagtatctgctccctgcttgtgtgttggaggtcgctgagtagtgcgcgagcaaaatttaagctacaacaaggcaaggcttgaccgacaattgcatgaagaatctgcttagggttaggcgttttgcgctgcttcgcgatgtacgggccagatattgacattgattattgactaggcttttgcaaaaagcttgtttaaaccttgtatattaacagcacattaacagctaaaaagaaaaactcacataatcatattagttcatagaaacaatgcatttgacatactccaacatccattcatgattttattttattttttatttatatattttttttgagatggagtctcgctgtcacccaggctggagtgcaatggctcgatctcggctcactgcaggctccgcccccggcggttcacgccattctcctgcctcagcctcccgagtagctgggactacaggcgcccgccacctcgcccagctaattttttgtatttttagtagagacggggtttcaccgtgttagccaggatggtctcgatctcctgacctcgtgatccacccgcctcggcctcccaaagtgctgggattacaggcgtgagccaccgtgcccggcccatgattttaaaaaaacctctcagaaatagaaacagagggaacttcctgaatttgattaaaaatacctgcaaaatcctagagctaatattatacttaatggtgaaagactgaatggttttcccctaagatggagaacaaggcacggatgtccttgctcaccactcctattcaacaaaggactggaaaccagaaataactttaattttttttgttctcaagtgataggttcacagagaaaaagctttactggatgaacttttagattactacttttatagagcagcagagataaaagccaggtcgaaaagtgcatgtggagtaaggaaatggacctagttcgacaaaagggctcagaacgactgcccagatgagattgtagacgcagctgtagtttactttctatctggaagaaacttcaagttatccttaattttccaaggagacagtcacttaccttttaaaaaacattattagagaagcaccgggcgggagcatatctagcattaaaaatgtgggatgaataccatctctgcttggtaaaggtggttgggaatcctgagagagggcacctagtgtggcttctgcatttttcacagtgcctggaccacggctgaaagtaactcttgcatgacatttgacagaagaggaaaccgaagctcagattaaattccctgtccacagcgggatcattcggcacgagttcctccctgtctggaatgctcttccccagcaatagatcctgcggctcttccgtgtctcagtctaatgtcattccgttccaggattcccgacttcttaaagcataaataatccctccccaccctctcattgtactgttatgtaagttattacaatatgtcattatatatttagtcatactgctttaggtaatgtcttctccactgaactgtaagctccatgagggcaagagttcagtcggttttacttaataattagcacctagtacagtactagcatagaatgaaggcctcgcaattttttttaaatttatttttagacagggtcttgcgctgtcgcccaggctggagtgcagtggtgcaacctcggctcacggcagcctcgacctttcggctccagcgatcctcccgcgtcggcctccggggtagctgggactgcaggcgcgcaccaccatgactggctaatttttttttttttttttttgtagacatggggtctcgccatgttgcccaggctggttcctgagctcaagtgatcctcctgcctcggcctcccaaagtgctgggattacaggcgtgagcctcagcgcccagcc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[A.1.4]A7エレメントをもつ抗VEGF抗体産生ベクターの構築
合成軽鎖ベクターpUCFa-RPS7-VEGF-LcをAscI（NEB）とXhoI（NEB）で酵素消化、また合成重鎖ベクターpUCFa-RPS7-VEGF-HcをMluI-HF（NEB）とXhoIで酵素消化し、アガロースゲルで電気泳動した。目的のサイズ断片をMonoFas DNA精製キットにて精製し、Ligation High ver.2(TOYOBO)を使用しライゲーションしVEGF軽鎖と重鎖を繋いだベクターpUC-Fa-RPS7-VEGF-LcHcを作製した。
pB4-A7をNaeI（NEB）とMluIで消化、またpUC-Fa-RPS7-VEGF-LcHcをMluIとSnaBI（NEB）で消化し、アガロースゲルで電気泳動した。目的のサイズ断片をMonoFas DNA精製キットにて精製し、Ligation High ver.2(TOYOBO)を使用しライゲーションしA7エレメントを持つベクターpUC-Fa-A7-RPS7-VEGF-LcHcを作製した。【０１２６】
[A.1.5] IR/MARベクターへマルチクローニングサイトの導入
IR/MARベクターへ抗体遺伝子を挿入するために、pΔBN AR1-DhfrのPst1サイトに追加の制限酵素サイトとしてPacI, AscI, FseI, SacIIと組換え用のloxG配列を挿入したベクターを構築した。以下に、作製方法を記載する。【０１２７】
実施例2で使用したpCX-EGFP CMV loxG Kmベクターを鋳型に用いて、PCRによってloxP配列を含む配列をクローニングするとともに複数の制限酵素サイトを導入した。そのプライマー配列を以下に示す。
Pst1 loxG Km2 F: 5’-AACTGCAGGCCGGCCGCGGAGGCCTGGTGACCTAAGCTTGCATGC-3’ （配列番号１７）
Pst1 loxG Km2 R: 5’-ATTGGTTCTGCAGAGCTTGGCGCGCCAAGCTTAATTAAATGAGCCATATTCAACGGG-3’ （配列番号１８）【０１２８】
PCRは、サーマルサイクラーとしてApplied Biosystems社製のProFlex PCR Systemを、TaqポリメラーゼはKOD-FX-(TOYOBO)を用い、バッファーやdNTP（dATP, dCTP, dGTP, dTTP）は添付のものを推奨される条件に従って用いた。温度、サイクル条件は94℃2分の熱変性後、98℃10秒、68℃3分を20サイクル行った。PCR産物は、プロメガ社のWizard SV Gel and PCR Clean-Up Systemキットを用いて精製を行った。その後、制限酵素PstI（NEB）で切断し、1%のアガロースゲルで電気泳動後、ゲルから切り出してプロメガ社のWizard SV Gel and PCR Clean-Up Systemキットを用いて精製を行った。次に、このPCR産物をpΔBN AR1-DhfrベクターのPst1(NEB)サイトに以下の方法で導入した。pΔBN AR1-Dhfrベクターを制限酵素PstI(NEB)で切断し、1%のアガロースゲルで電気泳動後、ゲルから切り出してプロメガ社のWizard SV Gel and PCR Clean-Up Systemキットを用いて精製を行った。線状化したpΔBN AR1-DhfrベクターのDNA断片についてセルフライゲーションを抑制するためにDNA末端の脱リン酸化処理をrAPId Alkaline Phosphatase kit(Roche)を用いて推奨プロトコールに従って行った。次に、pCX-EGFP CMV loxG Kmベクター由来のloxPを含むDNA断片と脱リン酸化処理を行ったpΔBN AR1-DhfrベクターのDNA断片をTOYOBO社のligation high v2を用いて推奨プロトコールによりライゲーションを行った。完成したpΔBN AR1-DhfrのPst1サイトに追加の制限酵素サイト(PacI, AscI, FseI, SacII)とloxG配列を挿入した改良型のIR/MARベクターをpΔBN AR1-Dhfr loxG Km2 MSCベクターと名付けた(図22)。【０１２９】
[A.1.6]IR/MARベクターへの抗VEGF抗体遺伝子の導入
IR/MARベクター（pΔBN AR1-Dhfr loxG Km2 MSC）をAscI消化し、Antarctic Phosphatase（NEB）にて脱リン酸化処理した。pUC-Fa-A7-RPS7-VEGF-LcHcをAscIで消化し、共にアガロースゲル電気泳動にて分離した。これらのDNA断片をMonoFas DNA精製キットにて精製し、Ligation High ver.2を使用してライゲーションした。こうして得られた人工染色体搭載用VEGF抗体産生IR/MARベクターをA7-VEGF IR MAR（図23）とした。さらに、コントロール用としてIR/MAR領域を欠損するベクターを作製した。A7-VEGF IR MARをHpaI（NEB）とFseI（NEB）で消化し、Blunting high（TOYOBO）の方法に従って平滑化した。平滑化したプラスミドDNAをアガロースゲルで電気泳動し、目的断片をMonoFas DNA精製キットにて精製し、Ligation High ver.2を使用してライゲーションした。こうして得られたコントロールベクターをA7-VEGF loxG（図24）とした。【０１３０】
[A.2] Cre/loxPシステムを用いた抗VEGF抗体遺伝子ベクターのHACへの搭載
[A.2.1]遺伝子導入と薬剤耐性クローンの単離
遺伝子導入はリポフェクション法を用いて行い、90%コンフルエント状態になった6ウェル（well）のCHO DG44 N10 cl.11細胞に対して、Cre発現ベクターpBS185 CMV-Creベクター(Addgeneより入手可、プラスミドナンバー:#11916) 0.5μgとA7-VEGF IR MARベクター1μｇをlipofectamine LTX(インビトロジェン）のプロトコールに従い、遺伝子搭載用のHACベクターが保持されているCHO DG44 N10へ導入した。トランスフェクション24時間後に、F12培地に10%FBSとG418を300μg/ml添加した選択培養を用いて10cm dishを6枚に細胞を播種し、2週間培養すると、耐性コロニーが出現した。その内、18クローンを単離し増殖させ、以後の解析を行った（クローン名：CHO DG44 VEGF MAR-HAC）。
また、IR/MAR配列を含まないコントロール用のHACの作製には、A7-VEGF loxGベクターを用いて上記の方法で同様にCHO DG44 N10 cl.11細胞へ遺伝子導入を行ったところ、22クローン単離し増殖させて、以後の実験を行った(クローン名: CHO DG44 VEGF-HAC)。【０１３１】
[A.3]薬剤耐性クローン選別
[A.3.1]PCR解析
G418耐性株のゲノムDNAを抽出して鋳型として組換え体を選別するため、以下のプライマーを用いてPCRを行い、ヒト人工染色体ベクターHAC上の部位特異的にEGFPおよびIR/MAR配列の挿入が起こっているかをloxP領域における組換えにより出現する1か所のJunction領域において確認した。そのプライマー配列を以下に示す。
Neo Junction領域
CMV586: 5’-CGTAACAACTCCGCCCCATT-3’ （配列番号５）
Neo817: 5’-GCAGCCGATTGTCTGTTGTG-3’ （配列番号６）
Another Junction領域
CMV188: 5’-GGGCGTACTTGGCATATGAT-3’ （配列番号７）
MAR junction 5’-CAGTGCTGCAATGATACCGC-3’ （配列番号１９）【０１３２】
PCRは、サーマルサイクラーとしてApplied Biosystems社製のProFlex PCR Systemを、TaqポリメラーゼはKOD-FX-(TOYOBO)を用い、バッファーやdNTP（dATP, dCTP , dGTP , dTTP）は添付のものを推奨される条件に従って用いた。温度、サイクル条件は95℃10分の熱変性後、94℃30秒、55℃30秒、72℃1分30秒を35サイクル行った。CHO DG44 VEGF MAR-HACクローンでは単離した18クローンの内、9クローン解析を行ったところ、すべてのクローンにおいて陽性であった。上記の9クローンにおいてHAC上に抗VEGF抗体遺伝子およびIR/MAR配列が挿入できたと判断し、後の解析に用いた(図20、step2)。【０１３３】
[B4]HACベクター上でのIR/MAR配列による抗VEGF抗体遺伝子の増幅
[B.4.1]ゲノムPCR解析による遺伝子増幅の確認
IR/MAR配列のHACへの搭載により、抗VEGF抗体遺伝子の増幅を確認するために、CHO DG44 VEGF MAR-HACクローンよりゲノムを抽出し、抗VEGF抗体遺伝子が1コピー搭載されているCHO DG44 VEGF-HACクローンをコントロールとしてリアルタイムPCRによって比較解析を行った。(（注）このPCR解析では抗VEGF抗体遺伝子のコピー数の絶対量を測定する目的ではなく、コントロールと比較して増幅しているか否かを簡易的に測定する実験として行った。)【０１３４】
PCRは、サーマルサイクラーとしてApplied Biosystems社製のStepOneリアルタイムPCRシステムを、TaqおよびバッファーはPower SYBR Green PCR master Mix(ThermoFisher)を、推奨される条件に従って用いた。
用いたプライマー配列を以下に示す。抗VEGF抗体遺伝子の重鎖(Hc)と軽鎖(Lc)用と、ゲノムの内部標準としてNV1を用いた(Nissom PM et al. Biologiacls. 35. 211-5. 2007)。
VEGF Hc qRT F: 5’- CTGCACCTGAACTTTTGGGC-3’ （配列番号２０）
VEGF Hc qRT R: 5’- TCGGGTGTACGGGAGATCAT-3’ （配列番号２１）
VEGF Lc qRT F: 5’- CAGTACAGTACCGTGCCCTG-3’ （配列番号２２）
VEGF Lc qRT R: 5’- AATACAGATGGGGCTGCGAC-3’ （配列番号２３）
NV1 CHO gPCR ref F : 5’-ACAGGTTTCTGCTTCTGGCA-3’ （配列番号１１）
NV1 CHO gPCR ref R : 5’-CATCAGCTGACTGGTTCACA-3’ （配列番号１２）
得られたCHO DG44 VEGF MAR-HACのクローン9個の内、5クローンをリアルタイムPCRによって解析した結果、4つのクローンでコントロールの1コピーで抗VEGF抗体遺伝子を保持する細胞（CHO DG44 VEGF-HAC cl.7）よりも抗VEGF抗体遺伝子配列が多い結果を得た。特に、多かったクローン4つ(cl.8,9,10,13)について今後の解析を行った(図25)。【０１３５】
[B.4.2]two-color FISH解析
上記の結果から選んだ4クローンにおいて、two-color FISH解析を松原ら(FISH実験プロトコール、秀潤社（日本）、1994)に従い行った。ヒトcot-1 DNAおよびA7-VEGF-loxGプラスミドベクターをプローブにしてFISH解析を行ったところ、１つのクローン(CHO DG44 VEGF MAR-HAC cl.8)において細胞内で宿主染色体から独立して維持されており、なおかつコントロール(CHO DG44  VEGF-HAC cl.7)と比較して、染色体が大きく、またヒトcot-1のシグナル上に多数の抗VEGF抗体遺伝子のシグナルが観察された(図26)。これらの結果から、HAC上で抗VEGF抗体遺伝子が増幅していると判断し、今後の発現解析に用いた。また、HACの保持率は、両方のクローンにおいて、90%以上であることを確認した。【０１３６】
[B.5]培養上清からの抗体精製による抗VEGF抗体産生量の解析
CHO DG44 VEGF MAR-HACクローンの抗VEGF抗体の発現が遺伝子配列の増幅にともなって増加しているかを検討するために、培養上清より産生抗体を精製し濃度を測定し解析した。抗体の精製は、スピンカラム型IgG抗体精製キット(コスモバイオ（日本）:APK-10G)を用いて添付資料に従って行い、抗体濃度測定には、吸光度計測計(スクラム社: Denovix)を用いて測定した。コントロールにはCHO DG44 VEGF-HAC cl.7を、IR/MARを保持する細胞にはCHO DG44 VEGF MAR-HAC cl.8を使用した。DG44 培養上清は、6cm培養ディッシュに1X105個/mlになるように細胞を播種し、2日毎に3回行い、合計6日間の培養上清を用意し、抗体を精製し濃度を測定した。その結果、増殖速度は同程度であったが(図27A)、コントロールに比較してMAR-HACクローンでは6日目で約2倍、抗体産生量が高くなることが示された(図27B)。【０１３７】
[B.6]ELISAによる抗VEGF抗体の特異性の解析
DG44細胞から産生された抗体が特異的抗原であるVEGFタンパクを認識するかを確認するためにEnzyme Linked ImmunoSorubrnt Assay(ELISA)方によって行った。ELISAは、タンパクを固相化することが可能な96wellプレート(Thermo Fisher:442404)へ、50ng/wellになるようにPBSで希釈したVEGF抗原タンパク(Sino Biological:11086-HNAH)を100μlずつ加えて、1時間常温で静置することで抗原の固相化を行った。次にTBS-T(wako)で3回洗浄後、ブロッキングバッファーとして5% skim milk/T-BST(wako)を350μlずつ加え1時間常温で静置した。TBS-T(wako)で3回洗浄後、DG44細胞の各培養上清100μlを1次抗体として用い、1時間常温で静置した。その後、TBS-T(wako)で3回洗浄し、2次抗体としてヒト抗体に対する抗体(Goat anti-Human IgG HRP:BETHYL社：A80-119P)を1/50000倍希釈して100μlずつ加えて、30分常温で静置した。TBS-T(wako)で3回洗浄し、酵素基質としてOPDを0.5mg/mlとなるように基質バッファーに加えて(Thermo Fisher)、H2O2(Wako)を1/1000量添加した溶液を1000μlずつ加えて30分反応を行った。その後、1M H2SO4(wako)加えて反応を停止させて、吸光度測定プレートリーダー(Baio Tek社:EPOCH2)でA492nmの波長を計測し抗体反応を数値化した。
その結果、抗体濃度測定の結果(図27B)に相関して、VEGF抗原に特異的に反応する抗体が細胞から産生されていることが確認された。加えて、コントロールのVEGF-HACに比較してVEGF MAR-HACでは2倍以上の抗原特異的な抗体の結合反応が認められた(図27C及び27D)。これらの結果から、IR/MAR配列と抗VEGF抗体遺伝子をHACへ搭載することで、遺伝子を増幅することができ、さらに遺伝子増幅に起因して抗VEGF抗体の産生量を上昇させることが可能であると判断した(図20、ステップ3)。【０１３８】
[実施例７]マウス11番染色体由来MACベクターを保持するCHO DG44細胞株の樹立
[A] マウス11番染色体由来MACベクター含有CHO K1細胞からHACのCHO DG44細胞へ導入
遺伝子増幅システムをヒト人工染色体だけでなく、マウス人工染色体(MAC)への応用について検討した。MACベクターの詳細は特開2011-549044号公報に記載されている。IR/MAR配列による遺伝子増幅効率のよいCHO DG44細胞内のHAC上で目的遺伝子を挿入及び増幅するために、CHO DG44細胞にDNA配列挿入部位(loxP)をもつMACを導入する(図28、ステップ1)。【０１３９】
[A.1]微小核細胞融合と薬剤耐性クローンの単離
染色体供与細胞として、マウス11番染色体由来のMACベクターを保持するCHO K1細胞由来の細胞株CHO K1 MAC(以下「CHO K1 MAC」と記載する（特開2011-549044号公報)）を用いた。受容細胞としては、CHO DG44細胞(コロンビア大学のDr. LA. Chasinより分与された。)を用いた。25cm2遠心用フラスコ（ヌンク）12本に播種したCHO K1 MAC細胞にコルセミド（0.1μg/ml、ギブコ）を含む培地（20％FBS、F12）中で72時間培養して微小核細胞の形成を誘導した。予め保温（37℃）しておいたサイトカラシンB（F12中に10μg/ml、シグマ）溶液を遠心用フラスコに満たし、アクリル性遠心容器に遠心用フラスコを挿入し、37℃、8, 000rpm（11，899×g）、1時間の遠心を行った（JLA-10.5ローター、ベックマン）。ミクロセルを無血清培地（DMEM）に懸濁して回収し、孔径8μm、5μm、3μmのフィルター（ワットマン）を装着したSWINNEX-25（ミリポア）で順に濾過して精製した。精製した微小核細胞(ミクロセル)は、50μg/mlのフィトヘムアグルチニンP（Phytohemagglutinin-P、Difco）を含むF12, 2mlに再懸濁した。CHO DG44細胞を90％飽和の状態まで培養した6cm径ディッシュ2枚に1mlずつ再懸濁したミクロセルを加え、37℃にて15分間静置した。DMEM中にPEG1000（終濃度50％（W/V）、シグマ）およびDMSO（終濃度7％（W/V）、シグマ）を溶解し、ポアサイズ0.22μmフィルター（コーニング）にて濾過した溶液を1分間細胞に投与し、無血清DMEMにより洗浄した。10％FBSを含むF12培地にて24時間培養した後トリプシン処理により細胞を分散し、10cm径ディッシュ6枚に播種した。ブラストサイジン（4μg/ml）を含む選択培地（10％FBS、F12）で2週間培養した後、薬剤耐性コロニーを獲得した。この微小核細胞融合で4個の耐性コロニーを単離し増殖させ、以降の解析を行った(クローン名: CHO DG44 MAC)。【０１４０】
[A.2]耐性クローンの選別
[A.2.1]mono-color FISH解析
上記で得られたCHO DG44 MAC細胞の4クローンについてShinoharaらの報告(Human Molecular Genetics,10: 1163-1175,2001)に記された方法でマウスCot-1 DNAをプローブにしたFISH解析を行った。それぞれの核型の特徴により、CHO K1細胞由来のCHO K1 MACとCHO DG44株を区別することが可能で、CHO K1細胞には大きな染色体が3本あるのに対してCHO DG44細胞は2本である(図2及び図3)。この核型解析に加えてプローブによるシグナルの結果から、CHO DG44 MAC細胞の2クローン(cl.611-1および611-4)で少し低いが30%以上の保持率で正常なMACが導入されていることを確認した(図29)。【０１４１】
以上の結果から、CHO DG44株にDNA配列挿入部位をもつマウス人工染色体ベクターMACを導入できたと結論付けた。【０１４２】
[実施例８]MACへのIR/MAR配列およびEGFP遺伝子の導入
[A]マウス11番染色体由来MACベクターへIR/MAR配列とEGFP遺伝子を挿入する方法を示した。実施例7に記載のように、loxPサイトを導入したマウス11番染色体由来MACベクターを保持するCHO DG44 MAC細胞を用意した。一方でloxP配列およびIR/MAR配列およびEGFP遺伝子発現ユニットを含む実施例2で使用したpCX-EGFP loxP dhfrプラスミドベクターを準備し、Cre組換え酵素を一過性に発現させることでloxP配列間の部位特異的組換え反応によりマウス人工染色体に挿入することとした。組換え挿入体の選別は、G418耐性の獲得（プロモーター分断型のneo遺伝子発現ユニットの再構成）を指標とした。【０１４３】
[A.1] Cre/loxPシステムを用いたpCX-EGFP loxP dhfrベクターのMACへの搭載
[A.1.1]遺伝子導入と薬剤耐性クローンの単離
遺伝子導入はリポフェクション法を用いて行い、90%コンフルエント状態になった6ウェル（well）の遺伝子搭載用のMACベクターが保持されているCHO DG44 MAC cl.611-1およびcl.611-4細胞に対して、Cre発現ベクターpBS185 CMV-Creベクター(Addgeneより入手可、プラスミドナンバー:#11916) 0.5μgとpCX-EGFP loxP dhfrベクター1μｇをlipofectamine LTX(インビトロジェン）のプロトコールに従い導入した。トランスフェクション24時間後に、F12培地に10%FBSとG418を300μg/ml添加した選択培養を用いて10cm dishを6枚に細胞を播種し、2週間培養すると、耐性コロニーが出現し、1回の導入で得たクローンが多数であった。その内、6クローンを単離し増殖させ、以後の解析を行った（クローン名：CHO DG44 MAR-MAC）。【０１４４】
また、IR/MAR配列を含まないコントロール用のMACの作製には、pCX-EGFP loxP dhfrベクターの代わりにpCX-EGFR loxP Km2ベクターを用いて上記の方法で同様にcl.611-1およびcl.611-4細胞へ遺伝子導入を行ったところ、6クローン単離し増殖させて、以後の実験を行った(クローン名: CHO DG44 EGFP-MAC)。【０１４５】
[A.2]薬剤耐性クローン選別
[A.2.1]PCR解析
G418耐性株のゲノムDNAを抽出して鋳型として組換え体を選別するため、以下のプライマーを用いてPCRを行い、マウス人工染色体ベクターMAC上の部位特異的にEGFPおよびIR/MAR配列の挿入が起こっているかをloxP領域における組換えにより出現するJunction領域において確認した。そのプライマー配列を以下に示す。
Neo Junction領域
CMV586: 5’-CGTAACAACTCCGCCCCATT-3’ （配列番号５）
Neo817: 5’-GCAGCCGATTGTCTGTTGTG-3’ （配列番号６）【０１４６】
PCRは、サーマルサイクラーとしてApplied Biosystems社製のProFlex PCR Systemを、TaqポリメラーゼはKOD-FX-(TOYOBO)を用い、バッファーやdNTP（dATP, dCTP , dGTP , dTTP）は添付のものを推奨される条件に従って用いた。温度、サイクル条件は95℃10分の熱変性後、94℃30秒、55℃30秒、72℃1分30秒を35サイクル行った。CHO DG44 MAR-MACクローンでは単離した6クローン解析を行ったところ、6クローン全てにおいて陽性であった。上記の6クローンにおいてMAC上にEGFPおよびIR/MAR配列が挿入できたと判断し、後の解析に用いた(図28、ステップ2)。【０１４７】
[B]MACベクター上でのIR/MAR配列によるEGFP遺伝子の増幅
[B.1.1]ゲノムPCR解析による遺伝子増幅の確認
IR/MAR配列のMACへの搭載により、EGFP遺伝子の増幅を確認するために、CHO DG44 MAR-MACクローンよりゲノムを抽出し、EGFP遺伝子が1コピー搭載されているCHO DG44 EGFP-MACクローン(DG44 EGFP-MAC cl.12)をコントロールとしてリアルタイムPCRによって比較解析を行った。(（注）このPCR解析ではEGFPのコピー数の絶対量を測定する目的ではなく、コントロールと比較して増幅しているか否かを簡易的に測定する実験として行った。)【０１４８】
PCRは、サーマルサイクラーとしてApplied Biosystems社製のStepOneリアルタイムPCRシステムを、TaqおよびバッファーはPower SYBR Green PCR master Mix(ThermoFisher)を、推奨される条件に従って用いた。【０１４９】
用いたプライマー配列を以下に示す。EGFP用と、ゲノムの内部標準としてNV1を用いた(Nissom PM et al. Biologiacls. 35. 211-5. 2007)。
EGFP gqPCR F : 5’-CTTCTTCAAGTCCGCCATGC-3’ （配列番号９）
EGFP gqPCR R: 5’-GGTCTTGTAGTTGCCGTCGT-3’ （配列番号１０）
NV1 CHO gPCR ref F : 5’-ACAGGTTTCTGCTTCTGGCA-3’ （配列番号１１）
NV1 CHO gPCR ref R : 5’-CATCAGCTGACTGGTTCACA-3’ （配列番号１２）【０１５０】
得られたCHO DG44 MAR-MACの6クローンをリアルタイムPCRによって解析した結果、1つのクローンでコントロールのCHO DG44 EGFP-MAC cl.12よりもEGFP配列が多い結果を得た。このクローンを今後の解析を行った(図30)。【０１５１】
[B.1.2]two-color FISH解析
上記の結果から選んだ3クローンにおいて、two-color FISH解析を松原ら(FISH実験プロトコール、秀潤社（日本）、1994)に従い行った。マウスcot-1 DNAおよびpCX-EGFPプラスミドをプローブにしてFISH解析を行ったところ、1クローンにおいてコントロール(DG44 EGFP-MAC cl.12)と比較して、宿主染色体と独立して維持されており、かつ、染色体が大きく、またマウスcot-1のシグナル上に多数のEGFPシグナルが観察された(図31)。これらの結果から、MAC上でEGFP遺伝子が増幅していると判断し、今後の発現解析に用いた。【０１５２】
[B.2]ウェスタンブロッティングによるEGFP発現量の解析
CHO DG44 MAR-MACクローンのEGFP発現が遺伝子配列の増幅にともなって、増加しているか確認するために、ウェスタンブロッティングによってタンパクの発現量を解析した。【０１５３】
ウェスタンブロッティングは、細胞溶解液にはプロテイン分解阻害剤が入ったRIPAバッファー(ナカライ)を用いて行い、タンパクの泳動にはラピダス・ミニスラブ電気泳動槽(ATTO)を用いて、10%のSDSアクリルアミドゲル(ナカライテクス)で各クローン2μg/wellの量で泳動を行った。タンパクのへの転写には0.45ポアサイズのPVDFメンブレン(GEヘルスケア)を用いて、Xcell Sure Lockミニセル電気泳動システムによりメンブレンへのタンパクの転写を行った。次に、ウェスタンブロッキング試薬(ロシュ)を用いて、推奨のプロトコールに従い4℃オーバーナイトでブロッキング反応後、PBS-Tで10分、4回洗浄を行い、次の抗体反応に用いた。EGFPの検出には、1抗体は抗EGFPマウス抗体(abcam: ab184601)を用いて5000倍に希釈(0.2ng/μl)して1時間、室温で反応した。PBS-Tで10分、3回洗浄後、2抗体には抗マウスIgGヤギ抗体(abcam: ab6789)を用いて5000倍に希釈(0.2ng/μl)して45分反応させた。PBS-Tで10分、3回洗浄後、Pierce ECL Western Blotting Substrate(ThermoFisher)発光試薬で推奨のプロトコールで反応を行った。タンパクの検出には、ImageQuant LAS4000(富士フィルム)を用いて行った。また、内部標準用のチューブリン（tubulin）の検出には、抗体は抗αtubulinラビットHRP-DirecT抗体(MBL: PM054-7)を用いて5000倍に希釈(0.2ng/μl)して1時間、室温で反応した。PBS-Tで10分、3回洗浄後、Pierce ECL Western Blotting Substrate(ThermoFisher)発光試薬で推奨のプロトコールで反応を行った。タンパクの検出には、ImageQuant LAS4000(富士フィルム)を用いて行った。【０１５４】
ウェスタンブロッティング解析の結果、コントロールに比べて、CHO DG44 MAR-MACクローンでは高いタンパク発現量が確認できた(図32A)。また、蛍光顕微鏡による観察においてもウェスタンブロッティングの結果同様にコントロールと比較して、蛍光の輝度がCHO DG44 MAR-MACクローンで高かった(図32B)。これらの結果から、IR/MAR配列とEGFP遺伝子をMACへ搭載することで、遺伝子を増幅することができ、さらに遺伝子増幅に起因してEGFPタンパクの発現量を上昇させることが可能であると判断し、この遺伝子増幅法はヒトだけでなくマウス由来、ひいては哺乳類由来の染色体であれば応用可能であることが示された(図28、ステップ3)。【０１５５】
[実施例９]ボトムアップ型人工染色体(tet-O HAC)を保持するCHO DG44細胞株の樹立
[A] ボトムアップ型人工染色体(tet-O HAC)ベクター含有CHO K1細胞からHACのCHO DG44細胞へ導入
この実施例では、遺伝子増幅システムをトップダウン型の人工染色体だけでなく、ボトムアップ型人工染色体についても適応可能か検討を行った。なお、ボトムアップ型人工染色体tet-O HACベクターの詳細はY Iida et al. ACS Synth Biol.21. 3. P83-90. 2014に記載されている。IR/MAR配列による遺伝子増幅効率のよいCHO DG44細胞内のHAC上で目的遺伝子を挿入及び増幅するために、CHO DG44細胞にDNA配列挿入部位(loxP)をもつtet-O HACを導入する(図33、ステップ1)。【０１５６】
[A.1]微小核細胞融合と薬剤耐性クローンの単離
染色体供与細胞として、tet-O HACベクターを保持するCHO K1細胞由来の細胞株CHO K1 tet-O HACを用いた。受容細胞としては、CHO DG44細胞(コロンビア大学のDr. LA. Chasinより分与された。)を用いた。25cm2遠心用フラスコ（ヌンク）12本に播種したCHO kkpqN10細胞にコルセミド（0.1μg/ml、ギブコ）を含む培地（20％FBS、F12）中で72時間培養して微小核細胞の形成を誘導した。予め保温（37℃）しておいたサイトカラシンB（F12中に10μg/ml、シグマ）溶液を遠心用フラスコに満たし、アクリル性遠心容器に遠心用フラスコを挿入し、37℃、8, 000rpm（11，899×g）、1時間の遠心を行った（JLA-10.5ローター、ベックマン）。ミクロセルを無血清培地（DMEM）に懸濁して回収し、孔径8μm、5μm、3μmのフィルター（ワットマン）を装着したSWINNEX-25（ミリポア）で順に濾過して精製した。精製した微小核細胞(ミクロセル)は、50μg/mlのフィトヘムアグルチニンP（Phytohemagglutinin-P、Difco）を含むF12,2mlに再懸濁した。CHO DG44細胞を90％飽和の状態まで培養した6cm径ディッシュ2枚に1mlずつ再懸濁したミクロセルを加え、37℃にて15分間静置した。DMEM中にPEG1000（終濃度50％（W/V）、シグマ）およびDMSO（終濃度7％（W/V）、シグマ）を溶解し、ポアサイズ0.22μmフィルター（コーニング）にて濾過した溶液を1分間細胞に投与し、無血清DMEMにより洗浄した。10％FBSを含むF12培地にて24時間培養した後トリプシン処理により細胞を分散し、10cm径ディッシュ6枚に播種した。ブラストサイジン（4μg/ml）を含む選択培地（10％FBS、F12）で2週間培養した後、薬剤耐性コロニーを獲得した。この微小核細胞融合で多数の耐性コロニーが得られたので、12クローンを単離し増殖させ、以降の解析を行った(クローン名: CHO DG44 tet-O HAC)。【０１５７】
[A.2]耐性クローンの選別
[A.2.1]mono-color FISH解析
上記で得られたCHO DG44 tet-O HAC細胞の12クローン中9クローンについてShinoharaらの報告(Human Molecular Genetics,10: 1163-1175,2001)に記された方法でヒトCot-1 DNAをプローブにしたFISH解析を行った。それぞれの核型の特徴により、CHO K1細胞由来のCHO K1 tet-O HACとCHO DG44株を区別することが可能で、CHO K1細胞には大きな染色体が3本あるのに対してCHO DG44細胞は2本である(図2及び図3)。この核型解析に加えてプローブによるシグナルの結果から、CHO DG44 tet-O HAC細胞の2クローン(cl.6、cl.９)で90%以上の保持率で正常なtet-O HACが導入されていることを確認した(図34)。【０１５８】
以上の結果から、CHO DG44株にDNA配列挿入部位をもつボトムアップ型人工染色体tet-O HACベクターを導入できたと結論付けた。【０１５９】
[実施例１０] tet-O HACベクターへのIR/MAR配列およびEGFP遺伝子の導入
[A] tet-O HACベクターへIR/MAR配列とEGFP遺伝子を挿入する方法を示した。実施例9に記載のように、loxPサイトを導入したtet-O HACベクターを保持するCHO DG44 tet-O HAC細胞を用意した(cl.6、cl.９)。一方でloxP配列およびIR/MAR配列およびEGFP遺伝子発現ユニットを含む実施例2で使用したpCX-EGFP loxP dhfrプラスミドベクターを準備し、Cre組換え酵素を一過性に発現させることでloxP配列間の部位特異的組換え反応によりtet-O HACに挿入することとした。組換え挿入体の選別は、G418耐性の獲得（プロモーター分断型のneo遺伝子発現ユニットの再構成）を指標とした。【０１６０】
[A.1] Cre/loxPシステムを用いたpCX-EGFP loxP dhfrベクターのtet-O HACへの搭載
[A.1.1]遺伝子導入と薬剤耐性クローンの単離
遺伝子導入はリポフェクション法を用いて行い、90%コンフルエント状態になった6ウェル（well）のCHO DG44 tet-O HAC cl.6、cl.９細胞に対して、Cre発現ベクターpBS185 CMV-Creベクター(Addgeneより入手可、プラスミドナンバー:#11916) 0.5μgとpCX-EGFP loxP dhfrベクター1μｇをlipofectamine LTX(インビトロジェン）のプロトコールに従い導入した。トランスフェクション24時間後に、F12培地に10%FBSとG418を300μg/ml添加した選択培養を用いて10cm dishを6枚に細胞を播種し、2週間培養すると、耐性コロニーが出現し、1回の導入で得たクローンが多数であった。その内、16クローンを単離し増殖させ、以後の解析を行った（クローン名：CHO DG44 MAR-tet-O HAC）。【０１６１】
[A.2]薬剤耐性クローン選別
[A.2.1]PCR解析
G418耐性株のゲノムDNAを抽出して鋳型として組換え体を選別するため、以下のプライマーを用いてPCRを行い、マウス人工染色体ベクターMAC上の部位特異的にEGFPおよびIR/MAR配列の挿入が起こっているかをloxP領域における組換えにより出現するJunction領域において確認した。そのプライマー配列を以下に示す。
Neo Junction領域
CMV586: 5’-CGTAACAACTCCGCCCCATT-3’ （配列番号５）
Neo817: 5’-GCAGCCGATTGTCTGTTGTG-3’ （配列番号６）【０１６２】
PCRは、サーマルサイクラーとしてApplied Biosystems社製のProFlex PCR Systemを、TaqポリメラーゼはKOD-FX-(TOYOBO)を用い、バッファーやdNTP（dATP, dCTP , dGTP , dTTP）は添付のものを推奨される条件に従って用いた。温度、サイクル条件は95℃10分の熱変性後、94℃30秒、55℃30秒、72℃1分30秒を35サイクル行った。CHO DG44 tet-O HACクローンでは単離した12クローンの解析を行ったところ、12クローンにすべておいて陽性であった。したがって、上記の12クローンにおいてtet-O HAC上にEGFPおよびIR/MAR配列が挿入できたと判断し、後の解析に用いた(図33、ステップ2)。【０１６３】
[B] tet-O HACベクター上でのIR/MAR配列によるEGFP遺伝子の増幅
[B.1.1]ゲノムPCR解析による遺伝子増幅の確認
IR/MAR配列のMACへの搭載により、EGFP遺伝子の増幅を確認するために、CHO DG44 tet-O HACクローンよりゲノムを抽出し、EGFP遺伝子が1コピー搭載されているCHO DG44 N10 EGFP-HACをコントロールとしてリアルタイムPCRによって比較解析を行った。(（注）このPCR解析ではEGFPのコピー数の絶対量を測定する目的ではなく、コントロールと比較して増幅しているか否かを簡易的に測定する実験として行った。)【０１６４】
PCRは、サーマルサイクラーとしてApplied Biosystems社製のStepOneリアルタイムPCRシステムを、TaqおよびバッファーはPower SYBR Green PCR master Mix(ThermoFisher)を、推奨される条件に従って用いた。【０１６５】
用いたプライマー配列を以下に示す。EGFP用と、ゲノムの内部標準としてNV1を用いた(Nissom PM et al. Biologiacls. 35. 211-5. 2007)。
EGFP gqPCR F : 5’-CTTCTTCAAGTCCGCCATGC-3’ （配列番号９）
EGFP gqPCR R: 5’-GGTCTTGTAGTTGCCGTCGT-3’ （配列番号１０）
NV1 CHO gPCR ref F : 5’-ACAGGTTTCTGCTTCTGGCA-3’ （配列番号１１）
NV1 CHO gPCR ref R : 5’-CATCAGCTGACTGGTTCACA-3’ （配列番号１２）【０１６６】
得られたCHO DG44 tet-O HACのクローン16個のクローンをリアルタイムPCRによって解析した結果、すべてのクローンでコントロールのCHO DG44 N10 EGFP-HACよりもEGFP配列が多い結果を得た。特に、多かったクローン2つ(cl.6-1, cl.9-7)について今後の解析を行った(図35)。【０１６７】
[B.1.2]two-color FISH解析
上記の結果から選んだ2クローンにおいて、two-color FISH解析を松原ら(FISH実験プロトコール、秀潤社（日本）、1994)に従い行った。ヒトcot-1 DNAおよびpCX-EGFPプラスミドをプローブにしてFISH解析を行ったところ、両方のクローンにおいてコントロール(CHO DG44 N10 EGFP-HAC)と比較して、染色体が大きく、またヒトcot-1のシグナル上に多数のEGFPシグナルが観察された(図36)。これらの結果から、tet-O HAC上でEGFP遺伝子が増幅していると判断し、今後の発現解析に用いた。【０１６８】
[B.2]ウェスタンブロッティングによるEGFP発現量の解析
CHO DG44 tet-O HACクローン(cl.6-1,cl.9-7)のEGFP発現が遺伝子配列の増幅にともなって、増加しているか確認するために、ウェスタンブロッティングによってタンパクの発現量を解析した。【０１６９】
ウェスタンブロッティングは、細胞溶解液にはプロテイン分解阻害剤が入ったRIPAバッファー(ナカライ（日本）)を用いて行い、タンパクの泳動にはラピダス・ミニスラブ電気泳動槽(ATTO)を用いて、10%のSDSアクリルアミドゲル(ナカライテクス（日本）)で各クローン2μg/wellの量で泳動を行った。タンパクのへの転写には0.45ポアサイズのPVDFメンブレン(GEヘルスケア)を用いて、Xcell Sure Lockミニセル電気泳動システムによりメンブレンへのタンパクの転写を行った。次に、ウェスタンブロッキング試薬(ロシュ)を用いて、推奨のプロトコールに従い4℃オーバーナイトでブロッキング反応後、PBS-Tで10分、4回洗浄を行い、次の抗体反応に用いた。EGFPの検出には、1抗体は抗EGFPマウス抗体(abcam: ab184601)を用いて5000倍に希釈(0.2ng/μl)して1時間、室温で反応した。PBS-Tで10分、3回洗浄後、2抗体には抗マウスIgGヤギ抗体(abcam: ab6789)を用いて5000倍に希釈(0.2ng/μl)して45分反応させた。PBS-Tで10分、3回洗浄後、Pierce ECL Western Blotting Substrate(ThermoFisher)発光試薬で推奨のプロトコールで反応を行った。タンパクの検出には、ImageQuant LAS4000(富士フィルム（日本）)を用いて行った。また、内部標準用のチューブリン（tubulin）の検出には、抗体は抗αtubulinラビットHRP-DirecT抗体(MBL: PM054-7)を用いて5000倍に希釈(0.2ng/μl)して1時間、室温で反応した。PBS-Tで10分、3回洗浄後、Pierce ECL Western Blotting Substrate(ThermoFisher)発光試薬で推奨のプロトコールで反応を行った。タンパクの検出には、ImageQuant LAS4000(富士フィルム（日本）)を用いて行った。【０１７０】
ウェスタンブロッティング解析の結果、コントロールに比べて、CHO DG44 tet-O HAC クローンでは高いタンパク発現量が確認できた(図37A)。また、蛍光顕微鏡による観察においてもウェスタンブロッティングの結果同様にコントロールと比較して、蛍光の輝度がCHO DG44 tet-O HACクローンで高かった(図37B)。これらの結果から、IR/MAR配列とEGFP遺伝子をtet-O HACへ搭載することで、遺伝子を増幅することができ、さらに遺伝子増幅に起因してEGFPタンパクの発現量を上昇させることが可能であると判断し、この遺伝子増幅法はトップダウン型の人工染色体だけでなくボトムアップ型の人工染色体においても応用可能であることが示された(図33、ステップ3)。
【産業上の利用可能性】
【０１７１】
本発明により、目的遺伝子をコードするDNAを含むIR/MAR-MMAC核酸構築物によって形質転換された哺乳類細胞を培養することにより、当該遺伝子を安定的に高発現させることが可能である。
【配列表フリーテキスト】
【０１７２】
配列番号1〜4、9〜14、17、18、20〜23：プライマー
配列番号5〜8、19：結合領域
配列番号15：抗VEGF軽鎖遺伝子ベクター
配列番号16：抗VEGF軽鎖遺伝子ベクター
本明細書で引用した全ての刊行物、特許及び特許出願はそのまま引用により本明細書に組み入れられるものとする。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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