(57)【要約】  本発明は、ウイルスに対する液性免疫反応及び細胞性免疫反応を誘導する、融合ポリペプチドであって、以下の(a)及び(b)の抗原又はその断片を含み、且つオリゴマー化活性を有する、融合ポリペプチド：(a) 該ウイルスのサブタイプ間で保存されたＢ細胞エピトープを含有する、該ウイルスの抗原又はその断片；及び(b) 該ウイルスのサブタイプ間で保存されたＴ細胞エピトープを含有する、該ウイルスの抗原又はその断片（ここで、(a)及び／又は(b)の抗原又はその断片がオリゴマー化活性を有するか、該融合ポリペプチドが、(a)及び(b)の抗原又はその断片に加えて、(c) オリゴマー化活性を有するポリペプチドを更に含む）を提供する。
2019124557.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ウイルスに対する液性免疫反応及び細胞性免疫反応を誘導する、融合ポリペプチドであって、以下の(a)及び(b)の抗原又はその断片を含み、且つオリゴマー化活性を有する、融合ポリペプチド：
(a) 該ウイルスのサブタイプ間で保存されたＢ細胞エピトープを含有する、該ウイルスの抗原又はその断片；及び
(b) 該ウイルスのサブタイプ間で保存されたＴ細胞エピトープを含有する、該ウイルスの抗原又はその断片
（ここで、(a)及び／又は(b)の抗原又はその断片がオリゴマー化活性を有するか、該融合ポリペプチドが、(a)及び(b)の抗原又はその断片に加えて、
(c) オリゴマー化活性を有するポリペプチド
を更に含む）。
【請求項２】
ウイルスがＡ型インフルエンザウイルスである、請求項1記載の融合ポリペプチド。
【請求項３】
(a)の抗原又はその断片が、ヘマグルチニン又はその断片である、請求項2記載の融合ポリペプチド。
【請求項４】
(a)の抗原又はその断片が、頭部欠損ヘマグルチニンである、請求項3記載の融合ポリペプチド。
【請求項５】
配列番号１で表されるアミノ酸配列のGln 310〜Asp 390からなる部分配列を含む、請求項3又は4記載の融合ポリペプチド。
【請求項６】
(b)の抗原又はその断片が、マトリックスタンパク質1又はその断片である、請求項2〜5の何れか１項記載の融合ポリペプチド。
【請求項７】
(b)の抗原又はその断片が、オリゴマー化活性を有する、請求項6記載の融合ポリペプチド。
【請求項８】
該Ｔ細胞エピトープが、配列番号３で表されるアミノ酸配列を含む、請求項6又は7記載の融合ポリペプチド。
【請求項９】
請求項6〜8の何れか1項記載の融合ポリペプチド、及びヌクレオキャプシドを含む、複合体。
【請求項１０】
ウイルスがデングウイルスである、請求項1記載の融合ポリペプチド。
【請求項１１】
(a)の抗原又はその断片が、Eタンパク質又はその断片である、請求項10記載の融合ポリペプチド。
【請求項１２】
(a)の抗原又はその断片が、Eタンパク質のDI及びDIIドメインを含む、請求項11記載の融合ポリペプチド。
【請求項１３】
(b)の抗原又はその断片が、NS3又はその断片である、請求項10〜12の何れか1項記載の融合ポリペプチド。
【請求項１４】
(a)及び(b)の抗原又はその断片に加えて、オリゴマー化活性を有する、マトリックスタンパク質1又はその断片を含む、請求項10〜13の何れか１項記載の融合ポリペプチド。
【請求項１５】
請求項1〜8及び10〜14の何れか1項記載の融合ポリペプチド、又は請求項9記載の複合体がオリゴマー化することにより形成される、該融合ポリペプチド又は該複合体の多量体。
【請求項１６】
請求項1〜8及び10〜14の何れか1項記載の融合ポリペプチド、請求項9記載の複合体、又は請求項15記載の多量体を含む、医薬組成物。
【請求項１７】
該ウイルスに対する免疫反応を誘導するためのものである、請求項16記載の医薬組成物。
【請求項１８】
該ウイルスの感染症の予防又は治療用である、請求項16記載の医薬組成物。
【請求項１９】
有効量の請求項1〜8及び10〜14の何れか1項記載の融合ポリペプチド、請求項9記載の複合体、又は請求項15記載の多量体を哺乳動物に対して投与することを含む、該哺乳動物において該ウイルスに対する免疫反応を誘導する方法。
【請求項２０】
有効量の請求項1〜8及び10〜14の何れか1項記載の融合ポリペプチド、請求項9記載の複合体、又は請求項15記載の多量体を哺乳動物に対して投与することを含む、該哺乳動物における該ウイルスの感染症の予防又は治療方法。
【請求項２１】
該ウイルスに対する免疫反応の誘導において使用するための、請求項1〜8及び10〜14の何れか1項記載の融合ポリペプチド、請求項9記載の複合体、又は請求項15記載の多量体。
【請求項２２】
該ウイルスの感染症の予防又は治療において使用するための、請求項1〜8及び10〜14の何れか1項記載の融合ポリペプチド、請求項9記載の複合体、又は請求項15記載の多量体。
【請求項２３】
請求項1〜8及び10〜14の何れか1項記載の融合ポリペプチド、又は請求項9記載の複合体をオリゴマー化し、該融合ポリペプチド又は該複合体の多量体を得ることを含む、該ウイルスに対する免疫反応を誘導するための、或いは該ウイルスの予防又は治療用の医薬組成物の調製方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ウイルスに対する免疫反応を誘導する融合ポリペプチド、該融合ポリペプチドの多量体、該融合ポリペプチド及びその多量体の医薬用途、該多量体の調製方法等に関する。
【背景技術】
【０００２】
抗原変異を繰り返すウイルスや血清型サブタイプが複数存在するウイルスに対する種々のワクチンの開発が行われてきた。例えば、インフルエンザウイルスの場合、インフルエンザウイルス粒子の外皮膜に存在するHA抗原が、季節性インフルエンザウイルスA型HAスプリットワクチンとして上市されている。インフルエンザウイルスHA遺伝子は、A亜型間で遺伝的交換が起こり、また塩基配列の突然変異により抗原変異が生じるが、HAタンパク質3次元構造の頭部に変異が集中して生じる。HAの頭部が主要な中和抗体エピトープのため、上市されているHAスプリットワクチンおよびウイルス不活化ワクチンは新しい変異株に対し効果がほとんどない。一方、ステム領域は変異が少ないが免疫原性が低いためA亜型のワクチン抗原としての利用は行われていなかった。阪大微研の奥野らは1993年に初めてインフルエンザウイルスA1型株とA2型株に交差して中和できる抗ステム抗体が誘導されることを報告した（非特許文献1）。また同グループは1996年HA遺伝子の頭部領域を欠損させたHAで免疫した動物で1型および2型を中和できる抗ステム抗体が誘導されることを報告した（非特許文献2）。以来、世界でステム抗原による万能ワクチンの開発が進められている（非特許文献3、4、5、6）。一方、単量体（モノマー）抗原タンパク質は免疫原性が低いため、HAスプリットワクチンは効果が低いことが弱点となっている。免疫原性と抗原構造との関係をM.F.Bachmannらは解析し、高度に組織化（多量体化、オリゴマー化）された抗原は免疫原性が高く、メモリーB細胞の誘導も行えることから、ワクチン抗原は組織化されることが重要であることを報告した（非特許文献7、8、9）。HAとフェリチンの融合タンパク質は、フェリチンのオリゴマー化活性により多量体を形成することによりHAの免疫原性が強化されることが報告された（非特許文献10、11）。インフルエンザウイルスHAスプリットワクチンおよび不活化ワクチンによる宿主免疫応答は、主としてHA抗原に対する抗体の誘導によりウイルスを中和する液性免疫であるが、一方、感染細胞を破壊しウイルス感染拡大を押さえるもう一つの免疫応答は細胞性免疫である。現在市販されているインフルエンザウイルスワクチンには細胞性免疫誘導能がほとんど無い。感染細胞の主要組織適合抗原クラス1分子に結合し細胞障害性T細胞(CTL)のT細胞受容体で認識されるインフルエンザウイルス抗原（CTLエピトープ)が、マトリックス(M1)タンパク質及びヌクレオキャプシド(NP)タンパク質にあることが報告されている（非特許文献12、13、14）。マトリックス(M1)タンパク質とヌクレオキャプシド(NP)タンパク質は、A亜型間でアミノ酸配列が保存されているので、A亜型間で交差細胞性免疫が成立する。M1タンパク質は重合体（オリゴマー）形成能を有し、またNPと結合する（非特許文献15、16）。インフルエンザウイルスA型ワクチンの開発状況は、非特許文献17、18を参照のこと。【０００３】
一方、デングウイルスの場合は、4つの血清型サブタイプD1、D2、D3及びD4があり、一つの型が感染し抗体が誘導されている患者に他の型が感染すると、抗体が二次感染のウイルス増殖を増強し、重度のデング出血熱やデングショック症候群を引き起こす（非特許文献19,20）。従って単純なD1,2,3,4の4価の不活化あるいは4価のウイルス粒子表面タンパク質エンベロープ抗原ワクチンはリスクがあるため開発されていない。【０００４】
インフルエンザウイルスやデングウイルスに対する種々のワクチンが報告されている（特許文献1-8）。【０００５】
上述の通り、抗原変異を繰り返すウイルスや血清型サブタイプが複数存在するウイルスの流行を予測するのは困難なため、変異体ウイルスや多様な血清型のウイルスをカバーする十分に有効なワクチンの開発には至っていない。変異体ウイルスや、広範な血清型サブタイプに対して有効な交差免疫を付与する抗ウイルスワクチンの開発が望まれている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開2017-19796号公報
【特許文献２】特開2017-31225号公報
【特許文献３】特開2001-46061号公報
【特許文献４】特開2010-268804号公報
【特許文献５】特表2013-542224号公報
【特許文献６】特表2015-524422号公報
【特許文献７】特開2016-33151号公報
【特許文献８】特表2017-520252号公報
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Y.Okuno et al, A common neutralizing epitope conserved between the hemagglutinins of Influenza A virus H1 and H2 strains J.Virol,67, 2552-2558(1993)
【非特許文献２】H.Sagawa et al, The immunological activity of a deletion mutant of influenza virus haemagglutinin lacking the globular region.J.Gen.Virol, 77, 1483-1487(1996)
【非特許文献３】J.Steelet al, Influenza virus vaccine based on conserved hemagglutinin stalk domain. mBio, 1, 1-9(2010)
【非特許文献４】F.Krammer et al, Chimeric hemagglutinin influenza virus Vaccine constructs elicit broadly protective stalk-specific antibodies. J.Virol, 87, 6542-6550(2013)
【非特許文献５】V.V.A.Mallajosyula et al, Influenza hemagglutinin stem-fragment immunogen elicites broadly neutralizing antibodies and confers heterologous protection. PNAS, E2514-E2523(2014)
【非特許文献６】A.H.Ellebedy et al, Induction of broadly cross-reactive antibody responses to the influenza HA stem region following H5N1 vaccination in humans. PNAS, 111, 13133-13138(2014)
【非特許文献７】M.F.Bachmann et al, The influence of antigen organization on B cell responsiveness. Science, 262, 1448-1451(1993)
【非特許文献８】M.F.Bachmann et al, T helper cell-independent neutralizing B cell response against vesicular stomatitis virus: role of antigen patterns in B cell induction? Eur. J. Immunol, 25, 3445-3451(1995)
【非特許文献９】M.F.Bachmann and R.M.Zinkernagel, Neutralizing antiviral B cell responses. Ann, Rev.Immunol, 15, 235-270(1997)
【非特許文献１０】M.Kanekiyo et al, Self-assembling influenza nanoparticle vaccines elicit broadly neutralizing H1N1 antibodies. Nature, 499, 102-108(2013)
【非特許文献１１】H.M.Yassine et al, Hemagglutinin-stem nanoparticles generate heterosubtypic influenza protection. Nature Medicine, online publication, doi:10. 1038/nm. 3927(2015)
【非特許文献１２】A.C.Hayward et al, Natural cell-mediated protection against seasonal and pandemic influenza, American J. Respiratory and Critical Care Medicine, 191, 1422-1431(2015)
【非特許文献１３】G.F.Rimmelzwaan, J. H.C.M Kreijtz, R. Bodewes, R. A .M Fouchier and A. D.M. E Osterhaus, Influenza virus CTL epitopes, remarkably conserved and remarkably variable. Vaccine, 27, 6363-6365 (2009)
【非特許文献１４】C.E.van de Sandt et al, Differential recognition of influenza A virus by M158-66 epitope-specific CD8+ T cells is determinant by extraepitopic amino acid residues. J.Virol, 90, 1009-1022(2016)
【非特許文献１５】S.L.Noton et al, Identification of the domains of the influenza A virus M1 matrix protein required for NP binding, oligomerization and incorporation into virions. J. Gen. Virol, 88, 2280-2290(2007)
【非特許文献１６】K.Zhang et al, Dissection of influenza A virus M1 protein: pH-dependent oligomerization of N-terminal domain and dimerization of C-terminal domain.PLOS ONE, 7, e37786, 1-12(2012)
【非特許文献１７】S-S Wong and R.J.Webby, Traditional and new influenza vaccines. Clinical Microbiology Reviews 26, 476-492(2013)
【非特許文献１８】A.Y.Egorov. The challenges of creating a universal influenza vaccine. MIR J., 5, 32-41(2016)
【非特許文献１９】J.Cockburn et al, Structural insights into the neutralization mechanism of a higher primate antibody against dengue virus. EMBO J, 31, 767-779(2012)
【非特許文献２０】H-E. Lin et al, Analysis of epitopes on dengue virus envelope protein recognized by monoclonal antibodies and polyclonal human sera by a high throughput assay. PLOS Neglected Tropical Diseases, 6, e1447, 1-12(2012)
【非特許文献２１】R. de Alwis et al, Identification of human neutralizing antibodies that bind to complex epitopes on dengue virions. PNAS, 109, 7439-7444(2012)
【非特許文献２２】O.Vratskikh, et al, Dissection of antibody specificities induced by yellow fever vaccination. PLOS Pathogens, 9, e1003458, 1-12(2013)
【非特許文献２３】W.B.Messer, et al, Dengue virus envelope protein domainI/II hinge determines long-lived serotype-specific dengue immunity. PNAS, 111, 1939-1944(2014)
【非特許文献２４】L.Dai, et al, Structure of the Zika virus envelope protein and its complex with a flavivirus broadly protective antibody. Cell Host & Microbe, 19, 1-9(2016)
【非特許文献２５】A.Mathew, et al, Elucidating the role of T cells in protection against and pathogenesis of dengue virus infections. Future Microbiol. 9, 411-425(2014)
【非特許文献２６】P.S. Lee and I.A. Wilson, Structural characterization of viral epitopes recognized by broadly cross-reactive antibodies. Curr. Top. Microbiol. Immunol. 386, 323-341(2015)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、変異体ウイルスや、広範なサブタイプに対する交差免疫を効果的に付与する抗ウイルスワクチンを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者は、鋭意検討の結果、サブタイプ間で保存されたB細胞エピトープを含有するウイルス抗原又はその断片（以下、「サブタイプ間で保存されたＢ細胞エピトープ」を「保存B細胞エピトープ」、「サブタイプ間で保存されたＢ細胞エピトープを含有する抗原」を「保存B細胞エピトープ含有抗原」等と称することがある。）、及びサブタイプ間で保存されたＴ細胞エピトープを含有する抗原又はその断片（以下、「サブタイプ間で保存されたＴ細胞エピトープ」を「保存Ｔ細胞エピトープ」、「サブタイプ間で保存されたＴ細胞エピトープを含有する抗原」を「保存Ｔ細胞エピトープ含有抗原」等と称することがある。）、を含み、オリゴマー化活性を有する融合ポリペプチドをオリゴマー化することにより得られる融合ポリペプチド多量体をワクチンとして哺乳動物に投与すれば、広範なサブタイプのウイルスに対して、効果的に液性免疫反応（抗体産生）及び細胞性免疫反応（細胞傷害性Ｔ細胞増殖）を誘導し得ることを見出した。【００１０】
インフルエンザウイルスにおいては、HAのステム領域内に、サブタイプ間で高度に保存された中和抗体を誘導するB細胞エピトープが含まれるので、HA又は当該保存B細胞エピトープを含むHAの断片（例：HAのステム領域からなる断片、高頻度に変異を生じる「頭部領域」をHAから欠損させた頭部領域欠損HA、当該保存B細胞エピトープからなる断片）を、保存B細胞エピトープ含有抗原又はその断片として使用し得る。また、マトリックスタンパク質1（M1）内に、サブタイプ間で高度に保存された細胞傷害性Ｔ細胞エピトープが含まれるので、M1又は当該保存Ｔ細胞エピトープを含むM1の断片（例：当該保存Ｔ細胞エピトープからなる断片）を、保存Ｔ細胞エピトープ含有抗原として使用し得る。M1は、オリゴマー化活性を有するので、サブタイプ間で保存されたＴ細胞エピトープを含有する抗原又はその断片として、オリゴマー化活性を有するM1又はその断片を使用することにより、融合ポリペプチドは、オリゴマー化活性を有することとなり、該オリゴマー化活性により多量体を容易に形成する。また、ヌクレオキャプシドタンパク質(NP)内にも、サブタイプ間で高度に保存された細胞傷害性Ｔ細胞エピトープが含まれるので、NP又は当該保存Ｔ細胞エピトープを含むNPの断片（例：当該保存Ｔ細胞エピトープからなる断片）を、保存Ｔ細胞エピトープ含有抗原又はその断片として使用し得る。NPはM1と会合することができるので、NPを融合タンパク質内に組み込まずに、融合タンパク質内のM1抗原残基と会合させてもよい。【００１１】
デングウイルスにおいては、Eタンパク質のDI及びDIIドメイン内に、サブタイプ間で高度に保存された中和抗体を誘導するB細胞エピトープが含まれるので、Eタンパク質、又はDI及びDIIドメインを含むEタンパク質断片（例、DI及びDIIドメインからなる断片）を、保存B細胞エピトープ含有抗原又はその断片として使用し得る。更に、デングウイルスN3内に、サブタイプ間で高度に保存された細胞傷害性Ｔ細胞エピトープが含まれるので、N3、又は当該保存Ｔ細胞エピトープを含むN3の断片（例：当該保存Ｔ細胞エピトープからなる断片）を保存CTLエピトープ含有抗原残基として使用し得る（非特許文献25）。マトリックスタンパク質（M1）等のオリゴマー化活性を有するポリペプチドを、融合ポリペプチド内に組み込むことにより、融合ポリペプチドがオリゴマー化活性を奏し、多量体を容易に形成する。【００１２】
本発明者は、上記知見に基づき更に検討を加え、本発明を完成するに至った。
即ち、本発明は下記の通りである：【００１３】
［1］ウイルスに対する液性免疫反応及び細胞性免疫反応を誘導する、融合ポリペプチドであって、以下の(a)及び(b)の抗原又はその断片を含み、且つオリゴマー化活性を有する、融合ポリペプチド：
(a) 該ウイルスのサブタイプ間で保存されたＢ細胞エピトープを含有する、該ウイルスの抗原又はその断片；及び
(b) 該ウイルスのサブタイプ間で保存されたＴ細胞エピトープを含有する、該ウイルスの抗原又はその断片
（ここで、(a)及び／又は(b)の抗原又はその断片がオリゴマー化活性を有するか、該融合ポリペプチドが、(a)及び(b)の抗原又はその断片に加えて、(c) オリゴマー化活性を有するポリペプチドを更に含む）。
［2］ウイルスがＡ型インフルエンザウイルスである、［1］記載の融合ポリペプチド。
［3］(a)の抗原又はその断片が、ヘマグルチニン又はその断片である、［2］記載の融合ポリペプチド。
［4］(a)の抗原又はその断片が、頭部欠損ヘマグルチニンである、［3］記載の融合ポリペプチド。
［5］配列番号１で表されるアミノ酸配列のGln 310〜Asp 390からなる部分配列を含む、［3］又は［4］記載の融合ポリペプチド。
［6］(b)の抗原又はその断片が、マトリックスタンパク質1又はその断片である、［2］〜［5］の何れか記載の融合ポリペプチド。
［7］(b)の抗原又はその断片が、オリゴマー化活性を有する、［6］記載の融合ポリペプチド。
［8］該Ｔ細胞エピトープが、配列番号３で表されるアミノ酸配列を含む、［6］又は［7］記載の融合ポリペプチド。
［9］［6］〜［8］の何れか記載の融合ポリペプチド、及びヌクレオキャプシドを含む、複合体。
［10］ウイルスがデングウイルスである、［1］記載の融合ポリペプチド。
［11］(a)の抗原又はその断片が、Eタンパク質又はその断片である、［10］記載の融合ポリペプチド。
［12］(a)の抗原又はその断片が、Eタンパク質のDI及びDIIドメインを含む、［11］記載の融合ポリペプチド。
［13］(b)の抗原又はその断片が、NS3又はその断片である、［10］〜［12］の何れか記載の融合ポリペプチド。
［14］(a)及び(b)の抗原又はその断片に加えて、オリゴマー化活性を有する、マトリックスタンパク質1又はその断片を含む、［10］〜［13］の何れか記載の融合ポリペプチド。
［15］［1］〜［8］及び［10］〜［14］の何れか記載の融合ポリペプチド、又は［9］記載の複合体がオリゴマー化することにより形成される、該融合ポリペプチド又は該複合体の多量体。
［16］［1］〜［8］及び［10］〜［14］の何れか記載の融合ポリペプチド、［9］記載の複合体、又は［15］記載の多量体を含む、医薬組成物。
［17］該ウイルスに対する免疫反応を誘導するためのものである、［16］記載の医薬組成物。
［18］該ウイルスの感染症の予防又は治療用である、［16］記載の医薬組成物。
［19］有効量の［1］〜［8］及び［10］〜［14］の何れか記載の融合ポリペプチド、［9］記載の複合体、又は［15］記載の多量体を哺乳動物に対して投与することを含む、該哺乳動物において該ウイルスに対する免疫反応を誘導する方法。
［20］有効量の［1］〜［8］及び［10］〜［14］の何れか記載の融合ポリペプチド、［9］記載の複合体、又は［15］記載の多量体を哺乳動物に対して投与することを含む、該哺乳動物における該ウイルスの感染症の予防又は治療方法。
［21］該ウイルスに対する免疫反応の誘導において使用するための、［1］〜［8］及び［10］〜［14］の何れか記載の融合ポリペプチド、［9］記載の複合体、又は［15］記載の多量体。
［22］該ウイルスの感染症の予防又は治療において使用するための、［1］〜［8］及び［10］〜［14］の何れか記載の融合ポリペプチド、［9］記載の複合体、又は［15］記載の多量体。
［23］［1］〜［8］及び［10］〜［14］の何れか記載の融合ポリペプチド、又は［9］記載の複合体をオリゴマー化し、該融合ポリペプチド又は該複合体の多量体を得ることを含む、該ウイルスに対する免疫反応を誘導するための、或いは該ウイルスの予防又は治療用の医薬組成物の調製方法。
【発明の効果】
【００１４】
本発明により、変異体ウイルスや、広範なサブタイプに対して有効な交差免疫を付与する抗ウイルスワクチンが提供される。本発明によれば、季節性インフルエンザウイルスおよび予想される高病原性パンデミックインフルエンザウイルスを含む広範囲のA亜型インフルエンザウイルスに交差して有効なワクチンを提供することが期待できる。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】インフルエンザウイルスＡ型ワクチン抗原融合ポリペプチド（HA-M1融合ポリペプチド、NPが会合したHA-MI融合ポリペプチド）の模式図を示す。
【図２】インフルエンザウイルスＡ型ミシガン株（H1N1）のHA抗原、M1抗原及びNP抗原のアミノ酸配列を示す。
【図３】インフルエンザウイルスＡ型ワクチン抗原融合ポリペプチド（HA-M1融合ポリペプチド、頭部欠損HA-M1融合ポリペプチド）のアミノ酸配列の例を示す。
【図４】コムギ無細胞系で発現させたインフルエンザウイルスＡ型ワクチン抗原融合ポリペプチド（頭部欠損HA-M1融合タンパク質（+GSリンカー+6×His Tag））のSDS-PAGE（A）およびNative-PAGE（B）の結果を示す。
【図５】HA-M1抗原を接種したマウスのリンパ節から細胞を採取し、HA-M1抗原を添加し(0(対照)、25、50、または100μg/ml)、92時間培養後、上清のサイトカイン（IL-10およびIFN-γ）の定量を行った結果を示す図である。
【図６】HA-M1抗原を接種したマウスのリンパ節から細胞を採取し、HA-M1抗原を添加し(0(対照)、25、50、または100μg/ml)、92時間培養後、細胞数をカウントした結果を示す図である。
【図７】本発明の抗原タンパク質を用いて免疫したマウスが、インフルエンザウイルスに対して抵抗性を獲得し、生存率が高まることを示す。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
１．ポリペプチド
本発明は、ウイルスに対する液性免疫反応及び細胞性免疫反応を誘導する、融合ポリペプチドであって、以下の(a)及び(b)の抗原又はその断片を含み、且つオリゴマー化活性を有する、融合ポリペプチドを提供する：
(a) 該ウイルスのサブタイプ間で保存されたＢ細胞エピトープを含有する、該ウイルスの抗原又はその断片；及び
(b) 該ウイルスのサブタイプ間で保存されたＴ細胞エピトープを含有する、該ウイルスの抗原又はその断片
（ここで、(a)及び／又は(b)の抗原又はその断片がオリゴマー化活性を有するか、該融合ポリペプチドが、(a)及び(b)の抗原又はその断片に加えて、
(c) オリゴマー化活性を有するポリペプチド
を更に含む）。
【００１７】
本発明を適用可能なウイルスとしては、オルソミクソウイルス科（Orthomyxoviridae）、フラビウイルス科（Flaviviridae）、ヘルペスウイルス科（Herpesviridae）、アデノウイルス科（Adenoviridae）、パピローマウイルス科（Papillomaviridae）、ポリオーマウイルス科（Polyomaviridae）、ポックスウイルス科（Poxviridae）、レオウイルス科（Reoviridae）、コロナウイルス科（Coronaviridae）、ピコルナウイルス科（Picornaviridae）、トガウイルス科（Togaviridae）、カリシウイルス科（Caliciviridae）、アストロウイルス科（Astroviridae）、パラミクソウイルス科（Paramyxoviridae）、ラブドウイルス科（Rhabdoviridae）、フィロウイルス科（Filoviridae）、アレナウイルス科（Arenaviridae）、ブニヤウイルス科（Bunyaviridae）、レトロウイルス科（Retroviridae）等に属するウイルスを例示することができるが、これらに限定されない。好適には、本発明を適用するウイルスは、オルソミクソウイルス科に属するウイルス、又はフラビウイルス科に属するウイルスである。オルソミクソウイルス科に属するウイルスとしては、インフルエンザウイルス（Ａ型、Ｂ型、Ｃ型）等が挙げられ、これらに限定されないが、好適にはＡ型インフルエンザウイルスである。フラビウイルス科に属するウイルスとしては、デングウイルス、日本脳炎ウイルス、黄熱病ウイルス、西ナイル熱ウイルス等が挙げられ、これらに限定されないが、好適にはデングウイルスである。好ましい態様においては、本発明を適用するウイルスは、Ａ型インフルエンザウイルス又はデングウイルスである。
【００１８】
ウイルスに対する液性免疫反応とは、ウイルスに対する抗体産生の誘導を意味する。該抗体は、中和抗体であり得る。中和抗体は、ウイルス抗原に結合し、該ウイルスの感染や増殖を阻害し、又は該ウイルスの生体外への排除を促進する。ウイルスに対する細胞性免疫反応とは、ウイルス感染細胞を殺傷する細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）の増殖を意味する。細胞傷害性Ｔ細胞は、主要組織適合抗原クラス1分子に提示されたウイルス抗原由来ペプチドをＴ細胞受容体により認識し、該ペプチドが提示されたウイルス感染細胞を破壊することにより、ウイルス感染拡大を抑止する。本発明の融合ポリペプチドは、
（ａ）ウイルスのサブタイプ間で保存されたＢ細胞エピトープを含有する、該ウイルスの抗原又はその断片（保存Ｂ細胞エピトープ含有抗原又はその断片）；及び
（ｂ）ウイルスのサブタイプ間で保存されたＴ細胞エピトープを含有する、該ウイルスの抗原又はその断片（保存Ｔ細胞エピトープ含有抗原又はその断片）
を含むことにより、該ウイルスに対する液性免疫反応及び細胞性免疫反応を誘導する活性を有する。
【００１９】
本発明において、Ｂ細胞エピトープとは、ウイルスが感染した宿主哺乳動物において誘導されるウイルス抗原に対する抗体（好ましくは中和抗体）が認識して結合する該ウイルス抗原の特定の構造単位をいう。本発明においては、ウイルスのサブタイプ間で保存されたＢ細胞エピトープが用いられる。即ち、本発明において用いられるＢ細胞エピトープは、特定のウイルスの少なくとも２つ（例えば、３以上、４以上、５以上、６以上、７以上、８以上）のサブタイプにおいて、アミノ酸配列又は３次元構造が保存され（即ち、同一であり）、変異を含まない。このように保存されたＢ細胞エピトープを用いることにより、抗原変異を繰り返すウイルスや血清型サブタイプが複数存在するウイルスに対して、交差して液性免疫反応（抗体産生）を誘導することができる。各ウイルスにおいて、サブタイプ間で保存されたＢ細胞エピトープを含有する種々のウイルス抗原が研究されており、本発明に使用することができる。例えば、Ａ型インフルエンザウイルスにおいては、ヘマグルチニン（ＨＡ）をサブタイプ間で保存されたＢ細胞エピトープを含有するウイルス抗原として使用することができる。また、デングウイルスにおいては、エンベロープタンパク質（Ｅタンパク質）を、サブタイプ間で保存されたＢ細胞エピトープを含有するウイルス抗原として使用することができる。
【００２０】
Ａ型インフルエンザウイルスのＨＡ遺伝子においては、サブタイプ間での遺伝的交換が生じ、塩基配列の突然変異により抗原変異が生じるが、その変異は、ＨＡの３次元構造の頭部に集中する。一方、ステム領域は変異が少なくサブタイプ間でアミノ酸配列が保存されており、A亜型HAステム領域に対する共通のエピトープは膜融合ドメインを含む３次元構造がエピトープであると考えられている（非特許文献26）。このステム領域内の、３次元構造エピトープがインフルエンザウイルスＡ亜型間で保存され、亜型間で交差して中和できる抗体を誘導することが報告されている（非特許文献26）。インフルエンザウイルスＡ型のＨＡは、系統発生学的にグループ１（H1、H2、H5、H6、H8、H9、H11、H12、H13、H16、H17及びH18）とグループ2（H3、H4、H7、H10、H14及びH15）とに分類することができ、ステム領域内の３次元構造エピトープは、特にこの各グループ内において良く保存されている（非特許文献26）。
【００２１】
Ａ型インフルエンザウイルスのＨＡのアミノ酸配列の一例（ＨＡ  ミシガン株（Ｈ１Ｎ１））を図２及び配列番号１に示す。
配列番号１のMet 1〜Ala 17は、シグナルペプチド領域である。
配列番号１のAsp 18〜Arg 344は、H1領域である。
配列番号１のGly 76〜Gln 308は、H1領域中の頭部領域である。
配列番号１のGly 345〜Tyr 528は、H2領域である。
配列番号１のGly 345〜Val 399は、H2領域中の膜融合領域である。
配列番号１のGln 529〜Met 554は、膜貫通領域である。
配列番号１のCys 555〜Ile 566は、細胞質領域である。
配列番号１からシグナルペプチド領域（Met 1〜Ala 17）を除いた配列が、成熟型のＡ型インフルエンザウイルスのＨＡのアミノ酸配列に相当する。
【００２２】
Ａ型インフルエンザウイルスのＨＡのアミノ酸配列は、変異によりサブタイプ間や株間で異なり得るが、仮に配列番号１とは異なるアミノ酸配列を有するＡ型インフルエンザウイルスＨＡであっても、上記の記載に基づき、当業者であれば、配列番号１とのアライメントを行うことにより、
配列番号１のMet 1〜Ala 17に相当する領域として、シグナルペプチド領域を、
配列番号１のAsp 18〜Arg 344に相当する領域として、H1領域を、
配列番号１のGly 76〜Gln 308に相当する領域として、頭部領域を、
配列番号１のGly 345〜Tyr 528に相当する領域として、H2領域を、
配列番号１のGly 345〜Val 399に相当する領域として、膜融合領域を、
配列番号１のGln 529〜Met 554に相当する領域として、膜貫通領域を、
配列番号１のCys 555〜Ile 566に相当する領域として、細胞質領域を、
それぞれ、容易に、特定することができる。
【００２３】
配列番号１のGln 310〜Asp 390は、ステム領域である。インフルエンザウイルスＡ１型株とＡ３型株との間、或いはグループ１のＨＡ（H1、H2、H5、H6、H8、H9、H11、H12、H13、H16、H17及びH18）の何れかを有するインフルエンザウイルスＡ亜型間で保存された、３次元構造Ｂ細胞エピトープが、配列番号１のGln 310〜Asp 390（ステム領域）内に位置する。仮に配列番号１とは異なるアミノ酸配列を有するＡ型インフルエンザウイルスＨＡであっても、上記の記載に基づき、当業者であれば、配列番号１とのアライメントを行うことにより、配列番号１のGln 310〜Asp 390に相当する領域として、ステム領域を容易に特定することができる。
【００２４】
サブタイプ間で保存されたＢ細胞エピトープが存在すれば、該サブタイプのウイルスに交差して液性免疫反応（抗体産生）を誘導することができるので、Ａ型インフルエンザウイルスのサブタイプ間で保存されたＢ細胞エピトープ（例、ステム領域内の３次元構造エピトープ）を含有するＨＡの断片を本発明に使用することができる。ステム領域内の３次元構造エピトープを含有する、Ａ型インフルエンザウイルスＨＡの断片を使用する場合、該断片の長さは、ステム領域内の３次元構造エピトープを認識して結合する抗体を誘導する限り特に限定されないが、例えば、５００アミノ酸以下、４００アミノ酸以下、３００アミノ酸以下、２００アミノ酸以下、１００アミノ酸以下、９０アミノ酸以下、８０アミノ酸以下、７０アミノ酸以下、６０アミノ酸以下、５０アミノ酸以下、４０アミノ酸以下、３０アミノ酸以下、２０アミノ酸以下、１５アミノ酸以下、又は１０アミノ酸以下である。ステム領域内の３次元構造エピトープを含有するＨＡの断片としては、配列番号１で表されるアミノ酸配列のGln 310〜Asp 390を含む、配列番号１で表されるアミノ酸配列の部分配列からなるポリペプチドを挙げることができる。該部分配列の長さは、ステム領域内の３次元構造エピトープを認識して結合する抗体を誘導する限り特に限定されないが、例えば、５００アミノ酸以下、４００アミノ酸以下、３００アミノ酸以下、２００アミノ酸以下、１００アミノ酸以下、９０アミノ酸以下、又は８０アミノ酸以下である。Ａ型インフルエンザウイルスのＨＡのステム領域からなるポリペプチド（例、配列番号１で表されるアミノ酸配列のGln 310〜Asp 390からなるポリペプチド）も、本発明に使用できる。上述の通り、インフルエンザウイルスのＨＡ遺伝子の変異は頭部領域に集中するので、好ましい態様において、Ａ型インフルエンザウイルスのサブタイプ間で保存されたＢ細胞エピトープ（例、ステム領域内の３次元構造エピトープ）を含有するＨＡの断片は、この頭部領域の全部又は一部を含まない。Ａ型インフルエンザウイルスのサブタイプ間で保存されたＢ細胞エピトープ（例、ステム領域内の３次元構造エピトープ）を含有し、頭部領域の全部又は一部を含まないＨＡの断片としては、ステム領域からなるポリペプチドを挙げることができる。ＨＡの全長から、頭部領域を欠損させた、頭部欠損ＨＡ、及びステム領域内の３次元構造エピトープを含有するその断片も、好適なＨＡ断片として本発明において使用できる。頭部欠損ＨＡのアミノ酸配列の例を配列番号２に示す。配列番号２からシグナルペプチド領域（Met 1〜Ala 17）を除いた配列が、成熟型のＡ型インフルエンザウイルスの頭部欠損ＨＡのアミノ酸配列に相当する。
【００２５】
デングウイルスにおいては、Eタンパク質のDI及びDIIドメイン内に、サブタイプ間で高度に保存された中和抗体を誘導するB細胞エピトープが含まれるので、Eタンパク質、又はDI及びDIIドメインを含むEタンパク質断片（例、DI及びDIIドメインからなる断片）を、サブタイプ間で保存されたＢ細胞エピトープを含有するウイルス抗原又はその断片として使用することができる（非特許文献21、22、23、24）。
【００２６】
保存Ｂ細胞エピトープ含有抗原又はその断片の大きさは、特に限定されないが、通常２０００アミノ酸以下（例えば、１０００アミノ酸以下、７５０アミノ酸以下、６００アミノ酸以下、５００アミノ酸以下、４００アミノ酸以下、又は３００アミノ酸以下）である。
【００２７】
本発明において、Ｔ細胞エピトープとは、ウイルスが感染した宿主哺乳動物において誘導される細胞傷害性Ｔ細胞表面のＴ細胞受容体が、認識して結合するウイルス抗原の特定の構造単位をいう。細胞傷害性Ｔ細胞は、主要組織適合抗原クラス1分子に提示されたＴ細胞エピトープを含むペプチド（又はＴ細胞エピトープからなるペプチド）をＴ細胞受容体により認識し、該ペプチドが提示されたウイルス感染細胞を破壊する。本発明においては、ウイルスのサブタイプ間で保存されたＴ細胞エピトープが用いられる。即ち、本発明において用いられるＴ細胞エピトープは、特定のウイルスの少なくとも２つ（例えば、３以上、４以上、５以上、６以上、７以上、８以上）のサブタイプにおいて、アミノ酸配列が保存され（即ち、同一であり）、変異を含まない。このように保存されたＴ細胞エピトープを用いることにより、抗原変異を繰り返すウイルスや血清型サブタイプが複数存在するウイルスに対して、交差して細胞性免疫反応（ＣＴＬ増殖）を誘導することができる。各ウイルスにおいて、サブタイプ間で保存されたＴ細胞エピトープを含有する種々のウイルス抗原が研究されており、本発明に使用することができる。例えば、Ａ型インフルエンザウイルスにおいては、マトリックスタンパク質1（Ｍ１）やヌクレオキャプシド（ＮＰ）をサブタイプ間で保存されたＴ細胞エピトープを含有するウイルス抗原として使用することができる。また、デングウイルスにおいては、ＮＳ３を、サブタイプ間で保存されたＴ細胞エピトープを含有するウイルス抗原として使用することができる。
【００２８】
感染細胞の主要組織適合抗原クラス1分子に結合し細胞障害性T細胞(CTL)のT細胞受容体で認識されるＴ細胞エピトープが、Ａ型インフルエンザウイルスのＭ１及びＮＰに存在することが報告されている（非特許文献12、13、14）。Ｍ１及びＮＰは、Ａ型インフルエンザウイルスのサブタイプ間でアミノ酸配列が保存されているので、サブタイプ間で交差細胞性免疫が成立する。Ａ型インフルエンザウイルスのＭ１及びＮＰの代表的なアミノ酸配列を、図２、配列番号４及び配列番号６にそれぞれ示す。Ａ型インフルエンザウイルスH1N1とH3N2のＭ１の保存Ｔ細胞エピトープの配列は、例えばgilgfvftl（配列番号３）であり、Ｍ１の全長アミノ酸配列（配列番号４）の58-66に位置する（非特許文献１４）。Ａ型インフルエンザウイルスH1N2とH3N2のＮＰの保存Ｔ細胞エピトープの配列は、例えばsrywairtr（配列番号５）であり、ＮＰの全長アミノ酸配列（配列番号６）の383-391に位置する（非特許文献１３）。ただし、ヒトの抗原提示分子である主要組織適合抗原HLAの遺伝子型は多様であるため、HLAに結合するT細胞エピトープペプチド配列も上記の配列には限定されるものではない。
【００２９】
サブタイプ間で保存されたＴ細胞エピトープが存在すれば、該サブタイプのウイルスに交差して細胞性免疫反応（ＣＴＬ増殖）を誘導することができるので、Ａ型インフルエンザウイルスの保存Ｔ細胞エピトープを含有するＭ１やＮＰの断片を本発明に使用することができる。保存Ｔ細胞エピトープを含有するＭ１の断片としては、配列番号３で表されるアミノ酸配列を含む、配列番号４で表されるアミノ酸配列の部分配列からなるポリペプチドを挙げることができる。該部分配列の長さは、配列番号３で表されるアミノ酸配列からなるＴ細胞エピトープを認識するＣＴＬを誘導する限り特に限定されないが、例えば、５００アミノ酸以下、４００アミノ酸以下、３００アミノ酸以下、２００アミノ酸以下、１００アミノ酸以下、９０アミノ酸以下、８０アミノ酸以下、７０アミノ酸以下、６０アミノ酸以下、５０アミノ酸以下、４０アミノ酸以下、３０アミノ酸以下、２０アミノ酸以下、１５アミノ酸以下、又は１０アミノ酸以下である。配列番号３で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドも、保存Ｔ細胞エピトープを含有するＭ１の断片として本発明に使用できる。
保存Ｔ細胞エピトープを含有するＮＰの断片としては、配列番号５で表されるアミノ酸配列を含む、配列番号６で表されるアミノ酸配列の部分配列からなるポリペプチドを挙げることができる。該部分配列の長さは、配列番号５で表されるアミノ酸配列からなるＴ細胞エピトープを認識するＣＴＬを誘導する限り特に限定されないが、例えば、５００アミノ酸以下、４００アミノ酸以下、３００アミノ酸以下、２００アミノ酸以下、１００アミノ酸以下、９０アミノ酸以下、８０アミノ酸以下、７０アミノ酸以下、６０アミノ酸以下、５０アミノ酸以下、４０アミノ酸以下、３０アミノ酸以下、２０アミノ酸以下、１５アミノ酸以下、又は１０アミノ酸以下である。配列番号５で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドも、保存Ｔ細胞エピトープを含有するＮＰの断片として本発明に使用できる。
【００３０】
デングウイルスにおいては、Ｎ３内に、サブタイプ間で保存されたＴ細胞エピトープが含まれるので、Ｎ３又は当該保存Ｔ細胞エピトープを含むＮ３断片を、サブタイプ間で保存されたＴ細胞エピトープを含有するウイルス抗原又はその断片として使用することができる。
【００３１】
保存Ｔ細胞エピトープ含有抗原又はその断片の大きさは、特に限定されないが、通常２０００アミノ酸以下（例えば、１０００アミノ酸以下、７５０アミノ酸以下、６００アミノ酸以下、５００アミノ酸以下、４００アミノ酸以下、又は３００アミノ酸以下）である。
【００３２】
本発明の融合ポリペプチドは、オリゴマー化活性を有する。本発明において、オリゴマー化活性とは、同一分子同士が非共有結合的に会合してオリゴマーを形成する活性を意味する。即ち、本発明の融合ポリペプチドは、同一分子同士が会合して、オリゴマーを形成する活性を意味する。該オリゴマーの大きさ（１つのオリゴマーを構成するモノマーの数）は、通常2〜50量体、好ましくは8〜25量体であるが、特に限定されない。
Ｍ１は通常2〜20量体を形成するので、保存Ｔ細胞エピトープ含有抗原としてＭ１を使用する場合、オリゴマーの大きさは、通常2〜20量体、好ましくは8〜20量体であり得る。ＨＡは、天然では3量体を形成するので、保存Ｂ細胞エピトープ含有抗原としてＨＡを使用する場合、オリゴマーの大きさは、通常3の倍数、例えば3〜21量体、好ましくは9〜21量体であり得る。
【００３３】
一態様において、上記（ａ）保存Ｂ細胞エピトープ含有抗原又はその断片、及び／又は（ｂ）保存Ｔ細胞エピトープ含有抗原又はその断片が、オリゴマー化活性を有することにより、本発明の融合ポリペプチド自体がオリゴマー化活性を有する。例えば、Ａ型インフルエンザウイルスのＭ１は、オリゴマー化活性を有する。上述の様に（ｂ）保存Ｔ細胞エピトープ含有抗原又はその断片として、Ｍ１又はその断片を使用する場合、これがオリゴマー化活性を有することにより、本発明の融合ポリペプチド自体もオリゴマー化活性を有する。Ａ型インフルエンザウイルスのＭ１のオリゴマー化活性領域は、主として配列番号４の87−165の領域（オリゴマー化領域）（配列番号７）に存在することが知られているので（非特許文献15）、Ｍ１の断片を、保存Ｔ細胞エピトープ含有抗原の断片として使用する場合、該断片は、保存Ｔ細胞エピトープ（配列番号３）に加えて、オリゴマー化領域（配列番号７）を含むことが好ましい。本発明の融合ポリペプチドは、オリゴマー化されることにより、モノマーの場合と比較して、高い免疫原性を有することが期待できる。
【００３４】
一態様において、本発明の融合ポリペプチドは、（ａ）保存Ｂ細胞エピトープ含有抗原又はその断片、及び（ｂ）保存Ｔ細胞エピトープ含有抗原又はその断片に加えて、（ｃ）オリゴマー化活性を有するポリペプチドを含むことにより、本発明の融合ポリペプチド自体がオリゴマー化活性を有する。本態様は、（ａ）保存Ｂ細胞エピトープ含有抗原又はその断片、及び／又は（ｂ）保存Ｔ細胞エピトープ含有抗原又はその断片が、オリゴマー化活性を有していない場合に、本発明の融合ポリペプチドにオリゴマー化活性を付与する方法論として有用である。オリゴマー化活性を有するポリペプチドとしては、Ａ型インフルエンザウイルスのＭ１又はオリゴマー化活性を有するその断片、フェリチン、熱ショックタンパク質、補体タンパク質ファミリー、レクチンタンパク質ファミリー、アクチン等を挙げることができるが、これらに限定されない。
【００３５】
オリゴマー化活性を有するポリペプチドの大きさは、特に限定されないが、通常２０００アミノ酸以下（例えば、１０００アミノ酸以下、７５０アミノ酸以下、６００アミノ酸以下、５００アミノ酸以下、４００アミノ酸以下、又は３００アミノ酸以下）である。
【００３６】
本発明の融合ポリペプチドにおいて、
（ａ）保存Ｂ細胞エピトープ含有抗原又はその断片、及び
（ｂ）保存Ｔ細胞エピトープ含有抗原又はその断片
の、いずれがＮ末端側に位置していてもよい。即ち、（ａ）及び（ｂ）の部位が、Ｎ末端側からＣ末端側に向かって、（ａ）→（ｂ）及び（ｂ）→（ａ）のいずれの順序で位置していてもよい。
【００３７】
本発明の融合ポリペプチドが（ｃ）オリゴマー化活性を有するポリペプチドを含む場合、
（ａ）保存Ｂ細胞エピトープ含有抗原又はその断片、
（ｂ）保存Ｔ細胞エピトープ含有抗原又はその断片、及び
（ｃ）オリゴマー化活性を有するポリペプチド
が配列する順序は特に限定されない。即ち、（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）の部位が、Ｎ末端側からＣ末端側に向かって、（ａ）→（ｂ）→（ｃ）、（ａ）→（ｃ）→（ｂ）、（ｂ）→（ａ）→（ｃ）、（ｂ）→（ｃ）→（ａ）、（ｃ）→（ａ）→（ｂ）及び（ｃ）→（ｂ）→（ａ）のいずれの順序で位置していてもよい。
【００３８】
（ａ）及び（ｂ）（及び、任意的に（ｃ））の部位同士は、結合手により直接連結されていてもよいし、リンカーポリペプチドを介して連結されていてもよい。立体障害によりエピトープへアクセスできなくなることを回避する観点から、（ａ）及び（ｂ）（及び、任意的に（ｃ））の部位同士はリンカーポリペプチドを介して連結されることが好ましい。リンカーポリペプチドの長さは、本発明の融合ポリペプチドが、目的とするウイルスに対する液性免疫反応及び細胞性免疫反応を誘導する限り、特に限定されないが、あまり長すぎると、リンカーポリペプチドに起因した不必要な免疫誘導を生じるリスクが上昇する。従って、リンカーポリペプチドの長さは、通常、1〜100アミノ酸、好ましくは1〜50アミノ酸、より好ましくは1〜25アミノ酸、更に好ましくは1〜15アミノ酸に設定するのが好ましい。リンカーポリペプチドの例としては、グリシンやセリン等がペプチド結合して構成された、二次構造を有さないフレキシブルなペプチドが、複数個タンデムに連結されたリンカーペプチドで、例えば(GlyGlyGlyGlySer)nを挙げることが出来るが、これらに限定されない。
【００３９】
本発明の融合ポリペプチドは、（ａ）及び（ｂ）（及び、任意的に（ｃ））の部位うち、最もＮ末端側に位置する部位の更にＮ末端側、並びに／或いは（ａ）及び（ｂ）（及び、任意的に（ｃ））の部位うち、最もＣ末端側に位置する部位の更にＣ末端側に、付加配列を有していてもよい。該付加配列の長さは、本発明の融合ポリペプチドが、目的とするウイルスに対する液性免疫反応及び細胞性免疫反応を誘導する限り、特に限定されないが、あまり長すぎると、付加配列に起因した不必要な免疫誘導を生じるリスクが上昇する。従って、付加配列の長さは、通常、1〜100アミノ酸、好ましくは1〜50アミノ酸、より好ましくは1〜25アミノ酸、更に好ましくは1〜15アミノ酸である。
【００４０】
一態様において、該付加配列は、本発明の融合ポリペプチドの精製や検出を容易にするためのタグ配列であり得る。タグ配列の種類としては、特に限定されないが、例えば、FLAG（Hopp, T. P. et al.， BioTechnology （1988） 6, 1204-1210）、6〜10個のHis（ヒスチジン）残基からなる6×His〜10×His、ヒトc-mycの断片、α-tubulinの断片、B-tag、Protein Cの断片、GST（グルタチオン−S−トランスフェラーゼ）、β−ガラクトシダーゼ、MBP（マルトース結合タンパク質）等が挙げられる。
【００４１】
一態様において、本発明の融合ポリペプチドは、（ａ）及び（ｂ）（及び、任意的に（ｃ））の部位うち、最もＮ末端側に位置する部位の更にＮ末端側、並びに／或いは（ａ）及び（ｂ）（及び、任意的に（ｃ））の部位うち、最もＣ末端側に位置する部位の更にＣ末端側に、付加配列を有さない。
【００４２】
本発明の融合ポリペプチドの長さは、目的とするウイルスに対する液性免疫反応及び細胞性免疫反応を誘導する限り、特に限定されないが、通常１００００アミノ酸以下（例えば、８０００アミノ酸以下、６０００アミノ酸以下、４０００アミノ酸以下、２０００アミノ酸以下、又は１０００アミノ酸以下）である。
【００４３】
本発明の融合ポリペプチドは、周知の組換えタンパク質産生方法を用いることにより製造することができる。
【００４４】
また、本発明は、上記本発明の融合ポリペプチドのオリゴマーをも提供する。本発明の融合ポリペプチドは、オリゴマー化活性を有するので、本発明の融合ポリペプチドは、水溶液中で非共有結合的に会合してオリゴマーを形成する。本発明のオリゴマーの大きさ（１つのオリゴマーを構成するモノマー（本発明の融合ポリペプチド）の数）は、通常 2〜50 量体、好ましくは 8〜20量体であるが、特に限定されない。Ｍ１は通常2〜20量体を形成するので、保存Ｔ細胞エピトープ含有抗原としてＭ１を使用する場合、オリゴマーの大きさは、通常2〜20量体、好ましくは8〜20量体であり得る。ＨＡは、天然では3量体を形成するので、保存Ｂ細胞エピトープ含有抗原としてＨＡを使用する場合、オリゴマーの大きさは、通常3の倍数、例えば3〜21量体、好ましくは9〜21量体であり得る。本発明のオリゴマーは、本発明の融合ポリペプチドのモノマーと比較して、高い免疫原性を有することが期待できる。
【００４５】
好ましい一態様において、本発明は、Ａ型インフルエンザウイルスに対する液性免疫反応及び細胞性免疫反応を誘導する、融合ポリペプチドであって、以下の（ａ１）及び（ｂ１）の抗原又はその断片を含み、且つオリゴマー化活性を有する、融合ポリペプチドを提供する：
（ａ１）配列番号１で表されるアミノ酸配列のGln 310〜Asp 390からなるステム領域を含有する、Ａ型インフルエンザウイルスＨＡ又はその断片；及び
（ｂ１）配列番号３で表されるアミノ酸配列からなるＴ細胞エピトープを含有する、Ａ型インフルエンザウイルスＭ１又はその断片
（ここで、（ｂ１）のＡ型インフルエンザウイルスＭ１又はその断片がオリゴマー化活性を有する）。
【００４６】
該融合ポリペプチドは、配列番号１で表されるアミノ酸配列のGln 310〜Asp 390からなるステム領域内の３次元構造エピトープを含有するＨＡ、及び配列番号３で表されるアミノ酸配列からなるＴ細胞エピトープを含有するＭ１を有するＡ型インフルエンザウイルスに対し、液性免疫反応及び細胞性免疫反応を誘導し得る。該Ａ型インフルエンザウイルスは、Ａ１型及びＡ3型であり得る。該融合ポリペプチドは、配列番号１で表されるアミノ酸配列のGln 310〜Asp 390からなるステム領域内の３次元構造エピトープを認識して結合する抗Ａ型インフルエンザウイルスＨＡ抗体、及び配列番号３で表されるアミノ酸配列からなるＴ細胞エピトープを認識するＣＴＬを誘導する。
【００４７】
（ａ１）において、配列番号１で表されるアミノ酸配列のGln 310〜Asp 390からなるステム領域内の３次元構造エピトープを含有する、Ａ型インフルエンザウイルスＨＡの断片を使用する場合、該断片の長さは、配列番号１で表されるアミノ酸配列のGln 310〜Asp 390からなるステム領域内の３次元構造エピトープを認識して結合する抗体を誘導する限り特に限定されないが、例えば、５００アミノ酸以下、４００アミノ酸以下、３００アミノ酸以下、２００アミノ酸以下、１００アミノ酸以下、９０アミノ酸以下、８０アミノ酸以下、７０アミノ酸以下、６０アミノ酸以下、５０アミノ酸以下、４０アミノ酸以下、３０アミノ酸以下、２０アミノ酸以下、１５アミノ酸以下、又は１０アミノ酸以下である。該断片としては、配列番号１で表されるアミノ酸配列のGln 310〜Asp 390からなるステム領域を含む、配列番号１で表されるアミノ酸配列の部分配列からなるポリペプチドを挙げることができる。該部分配列の長さは、配列番号１で表されるアミノ酸配列のGln 310〜Asp390からなるステム領域内の３次元構造エピトープを認識して結合する抗体を誘導する限り特に限定されないが、例えば、５００アミノ酸以下、４００アミノ酸以下、３００アミノ酸以下、２００アミノ酸以下、１００アミノ酸以下、９０アミノ酸以下、８０アミノ酸以下、７０アミノ酸以下、６０アミノ酸以下、５０アミノ酸以下、４０アミノ酸以下、３０アミノ酸以下、２０アミノ酸以下、１５アミノ酸以下、又は１０アミノ酸以下である。配列番号１で表されるアミノ酸配列のGln 310〜Asp 390からなるポリペプチドも、ＨＡ断片として本発明に使用できる。好適なＨＡ断片として、ＨＡの全長から、シグナルペプチド及び頭部領域を欠損させた、頭部欠損ＨＡ、及び配列番号１で表されるアミノ酸配列のGln 310〜Asp 390からなるステム領域内の３次元構造エピトープを含有するその断片を挙げることができる。頭部欠損ＨＡのアミノ酸配列の例を配列番号２に示す。
【００４８】
（ｂ１）において、配列番号３で表されるアミノ酸配列からなるＴ細胞エピトープを含有する、Ａ型インフルエンザウイルスＭ１の断片を使用する場合、該断片の長さは、配列番号３で表されるアミノ酸配列からなるＴ細胞エピトープを認識するＣＴＬを誘導する限り特に限定されないが、例えば、５００アミノ酸以下、４００アミノ酸以下、３００アミノ酸以下、２００アミノ酸以下、１００アミノ酸以下、９０アミノ酸以下、８０アミノ酸以下、７０アミノ酸以下、６０アミノ酸以下、５０アミノ酸以下、４０アミノ酸以下、３０アミノ酸以下、２０アミノ酸以下、１５アミノ酸以下、又は１０アミノ酸以下である。該断片としては、配列番号３で表されるアミノ酸配列を含む、配列番号４で表されるアミノ酸配列の部分配列からなるポリペプチドを挙げることができる。該部分配列の長さは、配列番号３で表されるアミノ酸配列からなるＴ細胞エピトープを認識するＣＴＬを誘導する限り特に限定されないが、例えば、５００アミノ酸以下、４００アミノ酸以下、３００アミノ酸以下、２００アミノ酸以下、１００アミノ酸以下、９０アミノ酸以下、８０アミノ酸以下、７０アミノ酸以下、６０アミノ酸以下、５０アミノ酸以下、４０アミノ酸以下、３０アミノ酸以下、２０アミノ酸以下、１５アミノ酸以下、又は１０アミノ酸以下である。配列番号３で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドも、保存Ｔ細胞エピトープを含有するＭ１の断片として本発明に使用できる。
【００４９】
（ｂ１）のＡ型インフルエンザウイルスＭ１又はその断片は、Ｍ１のオリゴマー化領域（配列番号７）を含むことにより、オリゴマー化活性を有する。
【００５０】
本態様の融合ポリペプチドにおいて、（ａ１）及び（ｂ１）の部位のいずれがＮ末端側に位置していてもよい。即ち、（ａ１）及び（ｂ１）の部位が、Ｎ末端側からＣ末端側に向かって、（ａ１）→（ｂ１）及び（ｂ１）→（ａ１）のいずれの順序で位置していてもよい。
【００５１】
（ａ１）及び（ｂ１）の部位は、結合手により直接連結されていてもよいし、リンカーポリペプチドを介して連結されていてもよい。立体障害によりエピトープへアクセスできなくなることを回避する観点からは、（ａ１）及び（ｂ１）の部位同士はリンカーポリペプチドを介して連結されることが好ましい。リンカーポリペプチドの長さは、通常、1〜100アミノ酸、好ましくは1〜50アミノ酸、より好ましくは1〜25アミノ酸、更に好ましくは1〜15アミノ酸である。
【００５２】
本態様の融合ポリペプチドは、（ａ１）及び（ｂ１）の部位うち、最もＮ末端側に位置する部位の更にＮ末端側、並びに／或いは（ａ１）及び（ｂ１）の部位うち、最もＣ末端側に位置する部位の更にＣ末端側に、付加配列を有していてもよい。付加配列の長さは、通常、1〜100アミノ酸、好ましくは1〜50アミノ酸、より好ましくは1〜25アミノ酸、更に好ましくは1〜15アミノ酸である。該付加配列は、本発明の融合ポリペプチドの精製や検出を容易にするためのタグ配列であり得る。
【００５３】
一態様において、本態様の融合ポリペプチドは、（ａ１）及び（ｂ１）の部位うち、最もＮ末端側に位置する部位の更にＮ末端側、並びに／或いは（ａ１）及び（ｂ１）の部位うち、最もＣ末端側に位置する部位の更にＣ末端側に、付加配列を有さない。
【００５４】
本態様の融合ポリペプチドの長さは、Ａ型インフルエンザウイルスに対する液性免疫反応及び細胞性免疫反応を誘導する限り、特に限定されないが、通常１００００アミノ酸以下（例えば、８０００アミノ酸以下、６０００アミノ酸以下、４０００アミノ酸以下、２０００アミノ酸以下、又は１０００アミノ酸以下）である。
【００５５】
本態様の融合ポリペプチドの具体例を、図３に示す。図３の上段（配列番号８）は、成熟型のインフルエンザウイルスＨＡとＭ１の融合ポリペプチドのアミノ酸配列の１例である。図３の下段（配列番号９）は、成熟型の頭部欠損インフルエンザウイルスＨＡとＭ１の融合ポリペプチドのアミノ酸配列の１例である。
【００５６】
Ａ型インフルエンザウイルスのヌクレオキャプシドタンパク質（ＮＰ）は、中性ｐＨにおいてＭ１と会合する。従って、本態様の融合ポリペプチドと、Ａ型インフルエンザウイルスＮＰとを中性ｐＨ中で混合することにより、本態様の融合ポリペプチドとＮＰとの複合体が形成される。ＮＰとＭ１とは１：１の比で会合するので、混合モル比（融合ポリペプチド：ＮＰ）は、通常１：０．５〜２、好ましくは１：１である。本発明は、このような複合体をも提供する。本発明の複合体は、
（ａ１）配列番号１で表されるアミノ酸配列のGln 310〜Asp 390からなるステム領域内の３次元構造エピトープを含有する、Ａ型インフルエンザウイルスＨＡ又はその断片；及び（ｂ１）配列番号３で表されるアミノ酸配列からなるＴ細胞エピトープを含有する、Ａ型インフルエンザウイルスＭ１又はその断片に加えて、ＮＰを含む。上述のように、ＮＰ内にＡ型インフルエンザウイルスのサブタイプ間で保存されたＴ細胞エピトープが含まれるので、本発明の複合体は、Ａ型インフルエンザウイルスに対し、液性免疫反応及び細胞性免疫反応をより強力に誘導することが期待できる。該Ａ型インフルエンザウイルスは、Ａ１型（例、H1N1）及びＡ3型（例、H3N2）であり得る。本発明の複合体は、配列番号１で表されるアミノ酸配列のGln 310〜Asp 390からなるステム領域内の３次元構造エピトープを認識して結合する抗Ａ型インフルエンザウイルスＨＡ抗体、配列番号３で表されるアミノ酸配列からなるＴ細胞エピトープを認識するＣＴＬ、及びＮＰ内のＴ細胞エピトープを認識するＣＴＬを誘導する。
【００５７】
また、本発明は、上記本態様の融合ポリペプチド又は複合体のオリゴマーを提供する（図１）。本態様の融合ポリペプチドは、Ｍ１又はその断片を含むことにより、オリゴマー化活性を有するので、本態様の融合ポリペプチドは、水溶液中で非共有結合的に会合してオリゴマーを形成する。ＨＡも天然で３量体を形成するので、Ｍ１のオリゴマー化活性との相乗効果により、本態様の融合ポリペプチドは、容易にオリゴマー化が進行することが期待できる。上記複合体をオリゴマー化する際には、まず、本態様の融合ポリペプチドをオリゴマー化して、該融合ポリペプチドのオリゴマーを得る。そして中性ｐＨ（例、ｐＨ６．５〜７．５）で本態様の融合ポリペプチドのオリゴマーとＮＰとを混合し、ＮＰを該融合ポリペプチド内のＭ１又はその断片と会合させることにより、複合体化させ、結果として、上記複合体のオリゴマーを得る（図１）。混合モル比（融合ポリペプチド：ＮＰ）は、通常１：０．５〜２、好ましくは１：１である。本態様のオリゴマーの大きさ（１つのオリゴマーを構成するモノマー（本態様の融合ポリペプチド又は複合体）の数）は、通常3〜21量体、好ましくは9〜21量体であるが、特に限定されない。本態様のオリゴマーは、本態様の融合ポリペプチド又は複合体のモノマーと比較して、高い免疫原性を有することが期待できる。
【００５８】
２．医薬組成物
本発明は、上記本発明の融合ポリペプチド、複合体又はそれらのオリゴマーを含む、医薬組成物を提供するものである。本発明の医薬組成物は、上記の融合ポリペプチド、複合体又はそれらのオリゴマーを常套手段に従って製剤化することにより得ることができる。本発明の医薬組成物は、本発明の融合ポリペプチド、複合体又はそれらのオリゴマーと医薬上許容され得る担体を含む。
【００５９】
医薬上許容され得る担体としては、例えば、ショ糖、デンプン、マンニット、ソルビット、乳糖、グルコース、セルロース、タルク、リン酸カルシウム、炭酸カルシウム等の賦形剤、セルロース、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ゼラチン、アラビアゴム、ポリエチレングリコール、ショ糖、デンプン等の結合剤、デンプン、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルスターチ、ナトリウム−グリコール−スターチ、炭酸水素ナトリウム、リン酸カルシウム、クエン酸カルシウム等の崩壊剤、ステアリン酸マグネシウム、エアロジル、タルク、ラウリル硫酸ナトリウム等の滑沢剤、クエン酸、メントール、グリチルリチン・アンモニウム塩、グリシン、オレンジ粉等の芳香剤、安息香酸ナトリウム、亜硫酸水素ナトリウム、メチルパラベン、プロピルパラベン等の保存剤、クエン酸、クエン酸ナトリウム、酢酸等の安定剤、メチルセルロース、ポリビニルピロリドン、ステアリン酸アルミニウム等の懸濁剤、界面活性剤等の分散剤、水、生理食塩水等の希釈剤、カカオ脂、ポリエチレングリコール、白灯油等のベースワックスなどが挙げられるが、それらに限定されるものではない。
【００６０】
本発明の医薬組成物は、本発明の融合ポリペプチド、複合体又はそれらのオリゴマーの免疫反応誘導効果を増強するため、アジュバントを更に含有してもよい。アジュバントとしては、水酸化アルミニウム、完全フロイントアジュバント、不完全フロイントアジュバント、百日咳菌アジュバント、ポリ（Ｉ：Ｃ）、ＣｐＧ−ＤＮＡ等が挙げられるが、これらに限定されない。
【００６１】
このような医薬組成物は、経口又は非経口投与（好ましくは非経口投与）に適する剤形として提供される。
【００６２】
非経口投与のための組成物としては、例えば、注射剤、坐剤等が用いられ、注射剤は静脈注射剤、皮下注射剤、皮内注射剤、筋肉注射剤、点滴注射剤等の剤形を包含しても良い。このような注射剤は、公知の方法に従って調製できる。注射剤の調製方法としては、例えば、上記本発明のオリゴデオキシヌクレオチド又は複合体を通常注射剤に用いられる無菌の水性溶媒に溶解又は懸濁することによって調製できる。注射用の水性溶媒としては、例えば、蒸留水；生理的食塩水；リン酸緩衝液、炭酸緩衝液、トリス緩衝液、酢酸緩衝液等の緩衝液等が使用できる。このような水性溶媒のpHは5〜10が挙げられ、好ましくは6〜8である。調製された注射液は、適当なアンプルに充填されることが好ましい。
【００６３】
また、本発明の融合ポリペプチド、複合体又はそれらのオリゴマーの溶液又は懸濁液を、真空乾燥、凍結乾燥等の処理に付すことにより、本発明の融合ポリペプチド、複合体又はそれらのオリゴマーの粉末製剤を調製することもできる。本発明の融合ポリペプチド、複合体又はそれらのオリゴマーを粉末状態で保存し、使用時に該粉末を注射用の水性溶媒で分散することにより、使用に供することができる。
【００６４】
医薬組成物中の本発明の融合ポリペプチド、複合体又はそれらのオリゴマーの含有量は、通常、医薬組成物全体の約0.1〜100重量%、好ましくは約1〜99重量%、さらに好ましくは約10〜90重量%程度である。
【００６５】
３．医薬用途
本発明の融合ポリペプチド、複合体又はそれらのオリゴマーは、ウイルスに対する免疫反応（液性免疫反応及び細胞性免疫反応）を誘導し、該ウイルス感染症を予防又は治療する。本発明の融合ポリペプチド、複合体、それらのオリゴマー、又は医薬組成物を哺乳動物（ヒト等の霊長類、マウス等のげっ歯類等）に投与することにより、該哺乳動物において、該ウイルスに対する免疫反応（液性免疫反応及び細胞性免疫反応）を誘導し、該ウイルスの感染症を予防又は治療することができる。本発明の融合ポリペプチドは、ウイルスのサブタイプ間で保存されたＢ細胞エピトープを含有する抗原又はその断片と、該ウイルスのサブタイプ間で保存されたＴ細胞エピトープを含有する抗原又はその断片を含むことにより、変異体ウイルスや広範なサブタイプに対して有効な交差反応性を有する液性免疫反応（抗体（好適には、中和抗体）産生）及び細胞性免疫反応（ＣＴＬ増殖）を誘導するので、様々なサブタイプのウイルスに交差して有効なワクチンとして、該ウイルスの感染症を予防又は治療することができる。
【００６６】
例えば、本発明の融合ポリペプチド、複合体、それらのオリゴマー、又は医薬組成物を、該ウイルス感染症の患者や、該ウイルスに感染する可能性がある哺乳動物（ヒト等の霊長類、マウス等のげっ歯類等）に投与することにより、該投与を受けた対象において、該ウイルスに対する液性免疫反応及び細胞性免疫を誘導し、即ち、該哺乳動物の防御免疫反応を誘導することにより、該ウイルス感染症を予防又は治療することができる。本発明の融合ポリペプチド、複合体、それらのオリゴマー、又は医薬組成物を、該ウイルスに感染する可能性がある哺乳動物（ヒト等の霊長類、マウス等のげっ歯類等）に投与することにより、該投与を受けた対象において、該ウイルスに対する液性免疫反応及び細胞性免疫を誘導し、即ち、該哺乳動物の防御免疫反応を誘導することにより、該ウイルスに感染するリスクを低減させることができる。
【００６７】
例えば、Ａ型インフルエンザウイルスに対する液性免疫反応及び細胞性免疫反応を誘導する、融合ポリペプチドであって、以下の（ａ１）及び（ｂ１）の抗原又はその断片を含み、且つオリゴマー化活性を有する、融合ポリペプチド：
（ａ１）配列番号１で表されるアミノ酸配列のGln 310〜Asp 390からなるステム領域内の３次元構造エピトープを含有する、Ａ型インフルエンザウイルスＨＡ又はその断片；及び（ｂ１）配列番号３で表されるアミノ酸配列からなるＴ細胞エピトープを含有する、Ａ型インフルエンザウイルスＭ１又はその断片（ここで、（ｂ１）のＡ型インフルエンザウイルスＭ１又はその断片がオリゴマー化活性を有する）；
該融合ポリペプチドとＡ型インフルエンザウイルスＮＰとの複合体：
該融合ポリペプチド又は複合体のオリゴマー；
或いは、該融合ポリペプチド、該複合体、又は該オリゴマーを含む医薬組成物を、Ａ型インフルエンザウイルス感染症の患者や、Ａ型インフルエンザウイルスに感染する可能性がある哺乳動物（ヒト等の霊長類、マウス等のげっ歯類等）に投与することにより、該哺乳動物において、Ａ型インフルエンザウイルスに対する免疫反応（液性免疫反応及び細胞性免疫反応）を誘導し、Ａ型インフルエンザウイルスの感染症を予防又は治療することができる。より詳細には、配列番号１で表されるアミノ酸配列からなるＢ細胞エピトープを含有するＨＡ、及び配列番号３で表されるアミノ酸配列からなるＴ細胞エピトープを含有するＭ１を有するＡ型インフルエンザウイルス（例、インフルエンザウイルスＡ１型（例、H1N1）及びＡ3型（例、H3N2））に対する液性免疫反応及び細胞性免疫反応（配列番号１で表されるアミノ酸配列のGln 310〜Asp 390からなるステム領域内の３次元構造エピトープを認識して結合する抗Ａ型インフルエンザウイルスＨＡ抗体産生、及び配列番号３で表されるアミノ酸配列からなるＴ細胞エピトープを認識するＣＴＬの増殖）を誘導することにより、該Ａ型インフルエンザウイルスの感染症を予防又は治療することができる。該融合ポリペプチド、該複合体、又は該オリゴマーを含む医薬組成物を、Ａ型インフルエンザウイルスに感染する可能性がある哺乳動物（ヒト等の霊長類、マウス等のげっ歯類等）に投与することにより、該哺乳動物において、Ａ型インフルエンザウイルスに対する免疫反応（液性免疫反応及び細胞性免疫反応）を誘導し、Ａ型インフルエンザウイルスに感染するリスクを低減させることができる。該融合ポリペプチド、該複合体、又は該オリゴマーを含む医薬組成物は、季節性インフルエンザウイルスおよび予想される高病原性パンデミックインフルエンザウイルスを含む広範囲のA亜型インフルエンザウイルスに交差して有効性が期待できるワクチンとして有用である。
【００６８】
以下の実施例において本発明を更に具体的に説明するが、本発明はこれらの例によってなんら限定されるものではない。
【００６９】
[遺伝子の合成]
インフルエンザウイルス・ミシガン株の配列から、間にGSリンカー(配列番号12)をコードするヌクレオチドを挟んで、頭部欠損型のヘマグルチニンをコードするヌクレオチドと、マトリックスタンパクをコードするヌクレオチドを連結させ、さらにC末端に6×Hisタグ(配列番号13)をコードするヌクレオチドを付加した遺伝子をデザインした（配列番号10）。この配列から、5’末端にEcoRV配列と開始コドン（ATG）を、3’末端に終止コドン（TGA）とNotI配列を付加した配列を人工合成した。合成した配列は、付加した制限酵素部位を利用し、コムギ無細胞系専用のタンパク質発現ベクターであるpEU-EU1-MCS（セルフリーサイエンス社）のMCS内にあるEcoRVとNotIの間に挿入した。挿入された配列は、シーケンス解析により変異がないことを確認した。得られたプラスミドは、大腸菌DH5を用いて大量調製した。
【００７０】
[抗原タンパク質の合成]
プラスミドを鋳型に、プラスミド上のSP6プロモーターを利用して、37℃、6時間の転写反応を行ない、mRNAを合成した。合成したmRNAを用い、反応スケール6mLスケール×12反応の重層法にて15℃、20時間で翻訳反応を行なった。コムギ胚芽抽出液は、Hisタグ融合タンパク質の合成／精製に至適化されたWEPRO7240Hを使用した。合成されたタンパク質（crude）溶液は、遠心処理（21,600xg、4℃、10分間）後、沈殿画分を翻訳バッファーで2回洗浄した。この沈殿画分について、可溶化剤にて可溶化し、抗原タンパク質(頭部欠損HA-M1融合タンパク質(+GSリンカー+6×Hisタグ)、配列番号11)とした（図4）。
【００７１】
[インフルエンザウイルス抗原（HA-M1抗原）に対するT細胞の抗原特異的反応挙動の解析]
試験方法
BALB/cAJclマウス(♀)を5頭用意し、HA-M1/Coplete Freund Ajuvant（250μg/ml）をfoot-padに各25μl、base of tailに50μl で皮下免疫した。7日目に解剖し、鼠径リンパ節および膝窩リンパ節を採取した。採材したリンパ節をメッシュにてすり潰し、細胞分散液を作成した。共培養用の抗原希釈液を作成しWell内の濃度を100、50、25、0μg/mlとした。単細胞分散液（5×105cells/well）をHA-M1抗原液 (0、25、50、100μg/ml)で92時間刺激した後、リンパ節細胞の増殖程度を評価した。また、培養上清中のIL-10およびIFN-γの濃度をELISA法にて測定した。即ち上清回収後、培地を補充し、各wellに培地で2倍希釈したCCK-8（Cell Counting Kit-8：株式会社同仁化学）を20μl/wellで添加し、添加3時間後の吸光値（450nm）を測定することで、各well内の細胞数を計算した。一方培養上清を2倍(IL-10)および20倍（IFN-γ）希釈し、Mouse IL-10 Duoset ELISA(R&D)、Mouse IFN-γ Duoset ELISA(R&D)キットを用い測定を行った。
【００７２】
結果
HA-M1抗原特異的T細胞の活性化に関する結果を図5に示す。T細胞サブセットであるTh1はIFN-γをTh2はIL-10を産生するのでこれらのサイトカインの濃度を測定したところ抗原特異的にこれらサイトカイン生産が劇的に亢進されたことから本HA-M1抗原は液性免疫および細胞性免疫を誘導し得るワクチン抗原として優れた候補と考えられる。また、HA-M1抗原特異的リンパ節細胞増殖に関する結果を図6に示す。HA-M1抗原で免疫したマウスのリンパ節細胞にHA-M1抗原を添加し培養を行ったところ25,50,100μg/mlの抗原濃度でいずれも顕著に細胞増殖が見られた。抗原濃度による細胞増殖活性化に大きな差はないため抗原濃度は飽和していると考えられるが、培養細胞中に存在する抗原提示細胞がHA-M1抗原を取り込み消化しペプチド抗原とし組織適合性抗原（MHC クラスI）により提示された結果T細胞が活性化されることが示された。
【００７３】
[HA-M1抗原投与マウス血清のインフルエンザウイルス中和活性]
方法
各試験区に対してBALB/cAJclマウス(♀)を3頭用意し、HA-M1抗原液を50,又は100 μg/head＋Alum 2 mg/head(Imject alum, Thermo:#77161, Lot TE267860B)で腹腔内に投与し、感作を行った。感作は0日目と11日目の2回にわたり実施した。試験区は、初回感作日より14日目に採血を行う群(#1〜#3)、21日目に採血を行う群(#4〜#6)、及び、対照群((#7〜#9))の3群とした。血清は麻酔下にて全採血を行い採取した。得られた血清は、56℃ 45分間インキュベートし非動化した。
各血清の10倍希釈液から2倍段階希釈を行い50μlの血清希釈液と200TCID50のインフルエンザウイルスA1型（A/Michigan/45/2015(H1N1pdm09)）およびインフルエンザウイルスA3型（A/Hong Kong/4801/2014(H3N2)）50μlをそれぞれ混合し37℃ 30分反応させた後、48穴プレートで培養したMDCK細胞に感染させ、トリプシン添加培地100μlを加え4日間培養を行い細胞変性の有無で中和抗体価を測定した。
【００７４】
結果
14日目に採血した抗原投与群ではA型インフルエンザウイルス亜型H1N1型及びH3N2型に対する中和活性は対照群と差が見られないが、21日目に採血した抗原投与群では優位な中和活性が得られた(表1)。A型H1N1の頭部欠損HAとM1の融合タンパク質抗原の免疫によりH3N2型に交差する中和活性が得られたことから、本発明で構築した抗原がA型インフルエンザウイルスの亜型に共通の中和エピトープを有することが確認された。
【００７５】
【表１】
2019124557.tif 000003
【００７６】
[インフルエンザウイルス感染マウスによる薬効試験]
マウス（BALB/c、メス、5週齢）を用い、以下の4群の試験を実施した。
【００７７】
試験区1：抗原タンパク質投与×H1N1型インフルエンザウイルス接種(6頭)
試験区2：リン酸緩衝生理食塩水投与×H1N1型インフルエンザウイルス接種(5頭)
試験区3：抗原タンパク質投与×H3N2型インフルエンザウイルス接種(6頭)
試験区4：リン酸緩衝生理食塩水投与×H3N2型インフルエンザウイルス接種(5頭)
【００７８】
マウスは、3-5頭／ケージで、室温24±3℃、湿度50±20%、換気10-25回/時間、照明12時間の環境下で飼育した。飼料はMF（オリエンタル酵母工業）を自由摂取させることによって給餌した。抗原タンパク質の投与法としては、抗原タンパク質（タンパク質濃度250μg/mL）に、等量のImject Alum Adjuvant（サーモフィッシャーサイエンティフィック社）を加えたものを調製し、マウス1頭あたり0.2mLを、7日の間を開けて2回、計0.4mL を皮下注射にて投与した。試験区2及び4は、リン酸緩衝生理食塩水に、試験区1及び3と同じアジュバントを加え、同様に投与した。インフルエンザウイルス接種は、2回目の抗原タンパク質投与後7日目に、イソフルラン麻酔下で、接種ウイルスを50μL経鼻接種した。インフルエンザウイルスは、H1N1（株名：A/PR/8/34、ATCC No.：VR-1469、BSL：2、ウイルス力価：1.6 x 108TCID50/mL）およびH3N2（株名：A/Port Chalmers/1/73、ATCC No.：VR-810、BSL：2、ウイルス力価：1.3 x 107TCID50/mL）の2亜型を用いた。マウスの状態把握のため、マウスの入荷日、ウイルス接種の14日前(Day-14)、7日前(Day-7)、ウイルス接種日(Day0)、ウイルス接種日から3日後(Day3)、7日後(Day7)、10日後(Day10)、14日後(Day14)に体重測定を行なった。また、ウイルス接種日の14日前からウイルス接種日14日後までの期間、マウスの一般状態（活動性の低下及び被毛の粗剛）についても評価した。
【００７９】
結果を、以下の表2-1及び表2-2（一般状態）、表3(体重)、及び表4(生存率)に示す。また、生存率に関するグラフを図7に示す。
【００８０】
【表２−１】
2019124557.tif 000004
【００８１】
【表２−２】
2019124557.tif 000005
【００８２】
【表３】
2019124557.tif 000006
【００８３】
【表４】
2019124557.tif 000007
【００８４】
表2-1、2-2、3、4、及び図7に示される通り、本発明の抗原タンパク質を接種したマウス（1群及び3群）は、該抗原タンパク質を接種されていない群(2群及び4群)と比較して、インフルエンザウイルス(H1N1型及びH3N2型)に対する抵抗性を獲得しており、従って、本発明の抗原タンパク質はA型インフルエンザウイルス亜型間で交差免疫を付与し得るワクチンとして有用であることが示された。
【産業上の利用可能性】
【００８５】
本発明により、変異体ウイルスや、広範なサブタイプに対して有効な交差免疫を付与する抗ウイルスワクチンが提供される。本発明によれば、季節性インフルエンザウイルスおよび予想される高病原性パンデミックインフルエンザウイルスを含む広範囲のA亜型インフルエンザウイルスに交差して有効なワクチンを提供することが期待できる。【００８６】
本出願は、日本で出願された特願2017-245606（出願日：2017年12月21日）を基礎としており、その内容は本明細書に全て包含されるものである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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