(57)【要約】  本発明の課題は、ヒトＡ１アストロサイト以外のヒトアストロサイトから、ヒトＡ１アストロサイトを誘導することを含む、ヒトＡ１アストロサイトの製造方法；上記したヒトＡ１アストロサイトの製造方法により得られるヒトＡ１アストロサイト；及び上記したヒトＡ１アストロサイトを用いた、被験物質の評価方法を提供することである。本発明によれば、ヒトＡ１アストロサイト以外のヒトアストロサイトを、ＴＮＦα及びＩＦＮγの存在下において培養する工程ａを含む、ヒトＡ１アストロサイトの製造方法が提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトＡ１アストロサイト以外のヒトアストロサイトを、ＴＮＦα及びＩＦＮγの存在下において培養する工程ａを含む、ヒトＡ１アストロサイトの製造方法。
【請求項２】
前記工程ａを、さらにＩＬ−１α、ＩＬ−１β及びＣ１ｑからなる群から選択される少なくとも一つのサイトカイン及び／又は補体の存在下で行う、請求項１に記載のヒトＡ１アストロサイトの製造方法。
【請求項３】
前記工程ａを、下記のいずれかの存在下で行う、請求項１又は２に記載のヒトＡ１アストロサイトの製造方法。
（１）ＴＮＦα、ＩＦＮγ、ＩＬ−１α、ＩＬ−１β
（２）ＴＮＦα、ＩＦＮγ、ＩＬ−１α、Ｃ１ｑ
（３）ＴＮＦα、ＩＦＮγ、ＩＬ−１β、Ｃ１ｑ
（４）ＴＮＦα、ＩＦＮγ、ＩＬ−１α、ＩＬ−１β、Ｃ１ｑ
（５）ＴＮＦα、ＩＦＮγ
【請求項４】
前記工程ａが、
ヒト多能性幹細胞又はヒトアストロサイトに分化できる細胞を、ヒトＡ１アストロサイト以外のヒトアストロサイトへと分化させる工程ａ１；及び工程ａ１で得られたヒトＡ１アストロサイト以外のヒトアストロサイトをＴＮＦα及びＩＦＮγの存在下において培養する工程ａ２：
を含む、請求項１から３のいずれか一項に記載のヒトＡ１アストロサイトの製造方法。
【請求項５】
前記工程ａで培養する、ヒトＡ１アストロサイト以外のヒトアストロサイトが、ヒトＡ２アストロサイトである、請求項１から４のいずれか一項に記載のヒトＡ１アストロサイトの製造方法。
【請求項６】
前記工程ａが、無血清培地における培養である、請求項１から５のいずれか一項に記載のヒトＡ１アストロサイトの製造方法。
【請求項７】
前記工程ａにおいて、ＴＮＦαの培地中濃度が、０．０１ｎｇ／ｍＬ〜３０ｎｇ／ｍＬである、請求項１から６いずれか一項に記載のヒトＡ１アストロサイトの製造方法。
【請求項８】
前記工程ａにおいて、ＩＦＮγの培地中濃度が、０．１ｎｇ／ｍＬ〜２０ｎｇ／ｍＬである、請求項１から７のいずれか一項に記載のヒトＡ１アストロサイトの製造方法。
【請求項９】
前記工程ａにおいて、ＴＮＦαの培地中濃度とＩＦＮγの培地中濃度の比が、１００：１〜１：１００である、請求項１から８のいずれか一項に記載のヒトＡ１アストロサイトの製造方法。
【請求項１０】
請求項１から９のいずれか一項に記載のヒトＡ１アストロサイトの製造方法により得られる単離されたヒトＡ１アストロサイト。
【請求項１１】
請求項１０に記載のヒトＡ１アストロサイトと被験物質とを接触させることを含む、被験物質の評価方法。
【請求項１２】
請求項１０に記載のヒトＡ１アストロサイトと被験物質とを接触させた後に、前記ヒトＡ１アストロサイトが有する神経障害性の変化を評価する、請求項１１に記載の被験物質の評価方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒトＡ１アストロサイトの製造方法及びヒトＡ１アストロサイトに関する。さらに本発明は、製造したヒトＡ１アストロサイトを用いた被験物質のスクリーニング方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
脳を構成するグリア細胞の一種であるアストロサイトは、ニューロンへの栄養供給、シナプス形成や除去など、中枢神経系の恒常性を維持する様々な役割を果たしており、疾病のメカニズム解明や創薬の観点から注目を集めている。【０００３】
アストロサイトは、神経疾病や老化等により活性化することが分かっている。活性化アストロサイトには、神経障害性のＡ１アストロサイトと、神経保護性のＡ２アストロサイトの二種類が存在することが近年報告されている（非特許文献１及び特許文献１）。ヒトのＡ１アストロサイトは、神経傷害を抑制する薬剤のスクリーニングに利用できるなど、創薬研究の面から価値が大きい。【０００４】
アストロサイトの活性化について、非特許文献１には、マウスの（活性化されていない）アストロサイトをＴＮＦα、ＩＬ−１α、Ｃ１ｑの三成分によりＡ１アストロサイトに誘導することが記載されている。しかし、マウスとヒトのアストロサイトでは種差があることが報告されており（非特許文献２）、ヒトアストロサイトにおいて同様に誘導できるかは不明である。【０００５】
特許文献２には、ＴＮＦαやＩＦＮγのような炎症性サイトカインがアストロサイトの活性化に関与していることの示唆や、ＴＮＦα、ＩＦＮγ及びＭＰＴＰの三成分でマウスの（活性化されていない）アストロサイトを活性化したことが記載されている。しかし、アストロサイトの活性化の結果、Ａ１アストロサイトまたはＡ２アストロサイトの何れに誘導されるかについては不明であり、またヒトアストロサイトにおいても同様の活性化が起きるかについても不明であった。【０００６】
非特許文献３には、ＩＦＮγ及びＩＬ−１βがヒトのアストロサイトの活性化に関与することが記載されている。しかし、アストロサイト活性化の結果、Ａ１アストロサイトまたはＡ２アストロサイトの何れに誘導されるかについては不明であった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】米国特許出願公開ＵＳ２０１６／０３４０６４８
【特許文献２】米国特許出願公開ＵＳ２０１０／００８７５０４
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Ｎａｔｕｒｅ，２０１７年，５４１巻，４８１−４８７頁
【非特許文献２】Ｎｅｕｒｒｏｎ，２０１６年，８９巻，１号，３７−５３頁
【非特許文献３】ＧｌｉＡ２０１４年，６２巻，９９９−１０１３頁
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
ヒトのＡ１アストロサイトは創薬研究の面から価値が大きく、ヒトのＡ１アストロサイトを容易に入手するための方法が求められている。上記の通り、アストロサイトの活性化及び誘導に関して一定の成果が得られているが、ヒトアストロサイトからヒトＡ１アストロサイトへ確実に誘導するための方法は見出されていない。本発明は、ヒトＡ１アストロサイト以外のヒトアストロサイトから、ヒトＡ１アストロサイトを誘導することを含む、ヒトＡ１アストロサイトの製造方法を提供することを解決すべき課題とする。本発明はさらに、上記したヒトＡ１アストロサイトの製造方法により得られるヒトＡ１アストロサイトを提供することを解決すべき課題とする。本発明はさらに、上記したヒトＡ１アストロサイトを用いた、被験物質の評価方法を提供することを解決すべき課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは上記課題を解決するために鋭意検討した結果、ＴＮＦα及びＩＦＮγの存在下で、ヒトＡ１アストロサイト以外のヒトアストロサイトを培養することによって、上記ヒトアストロサイトをヒトＡ１アストロサイトに誘導できることを見出した。本発明はこれらの知見に基づいて完成したものである。【００１１】
即ち、本発明によれば、以下の発明が提供される。
＜１＞  ヒトＡ１アストロサイト以外のヒトアストロサイトを、ＴＮＦα及びＩＦＮγの存在下において培養する工程ａを含む、ヒトＡ１アストロサイトの製造方法。
＜２＞  上記工程ａを、さらにＩＬ−１α、ＩＬ−１β及びＣ１ｑからなる群から選択される少なくとも一つのサイトカイン及び／又は補体の存在下で行う、＜１＞に記載のヒトＡ１アストロサイトの製造方法。
＜３＞  上記工程ａを、下記のいずれかの存在下で行う、＜１＞又は＜２＞に記載のヒトＡ１アストロサイトの製造方法。
（１）ＴＮＦα、ＩＦＮγ、ＩＬ−１α、ＩＬ−１β
（２）ＴＮＦα、ＩＦＮγ、ＩＬ−１α、Ｃ１ｑ
（３）ＴＮＦα、ＩＦＮγ、ＩＬ−１β、Ｃ１ｑ
（４）ＴＮＦα、ＩＦＮγ、ＩＬ−１α、ＩＬ−１β、Ｃ１ｑ
（５）ＴＮＦα、ＩＦＮγ
＜４＞  上記工程ａが、
ヒト多能性幹細胞又はヒトアストロサイトに分化できる細胞を、ヒトＡ１アストロサイト以外のヒトアストロサイトへと分化させる工程ａ１；及び工程ａ１で得られたヒトＡ１アストロサイト以外のヒトアストロサイトをＴＮＦα及びＩＦＮγの存在下において培養する工程ａ２：
を含む、＜１＞から＜３＞のいずれか一に記載のヒトＡ１アストロサイトの製造方法。
＜５＞  上記工程ａで培養する、ヒトＡ１アストロサイト以外のヒトアストロサイトが、ヒトＡ２アストロサイトである、＜１＞から＜４＞のいずれか一に記載のヒトＡ１アストロサイトの製造方法。
＜６＞  上記工程ａが、無血清培地における培養である、＜１＞から＜５＞のいずれか一に記載のヒトＡ１アストロサイトの製造方法。
＜７＞  上記工程ａにおいて、ＴＮＦαの培地中濃度が、０．０１ｎｇ／ｍＬ〜３０ｎｇ／ｍＬである、＜１＞から＜６＞のいずれか一に記載のヒトＡ１アストロサイトの製造方法。
＜８＞  上記工程ａにおいて、ＩＦＮγの培地中濃度が、０．１ｎｇ／ｍＬ〜２０ｎｇ／ｍＬである、＜１＞から＜７＞のいずれか一に記載のヒトＡ１アストロサイトの製造方法。
＜９＞  上記工程ａにおいて、ＴＮＦαの培地中濃度とＩＦＮγの培地中濃度の比が、１００：１〜１：１００である、＜１＞から＜８＞のいずれか一に記載のヒトＡ１アストロサイトの製造方法。
＜１０＞  ＜１＞から＜９＞のいずれか一に記載のヒトＡ１アストロサイトの製造方法により得られる単離されたヒトＡ１アストロサイト。
＜１１＞  ＜１０＞に記載のヒトＡ１アストロサイトと被験物質とを接触させることを含む、被験物質の評価方法。
＜１２＞  ＜１０＞に記載のヒトＡ１アストロサイトと被験物質とを接触させた後に、上記ヒトＡ１アストロサイトが有する神経障害性の変化を評価する、＜１１＞に記載の被験物質の評価方法。
【発明の効果】
【００１２】
本発明によれば、ヒトアストロサイトからヒトＡ１アストロサイトを製造することができる。本発明のヒトＡ１アストロサイト及び本発明の被験物質の評価方法は、創薬研究などにおいて有用である。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】図１は、ヒトアストロサイトを特定の組み合わせの化合物の存在下で培養した後の様子を示す。
【図２】図２は、ヒトアストロサイト（アストロサイト前駆細胞から誘導）を特定の組み合わせの化合物の存在下で培養した後の様子を示す。
【図３】図３は、ヒトアストロサイトを特定の組み合わせの化合物の存在下で培養した後にＧＢＰ２及びＣＸＣＬ１０の発現を定量した結果を示す。
【図４】図４は、ヒトアストロサイトを特定の組み合わせの化合物の存在下で培養した後にＣ３の発現を定量した結果を示す。
【図５】図５は、ヒトアストロサイト（アストロサイト前駆細胞から誘導）を特定の組み合わせの化合物の存在下で培養した後にＣ３の発現を定量した結果を示す。
【図６】図６は、ヒトアストロサイト（初代培養）を特定の組み合わせの化合物の存在下で培養した後にＣ３の発現を定量した結果を示す。
【図７】図７は、神経細胞（ニューロンとも表記する）を、未処置のヒトアストロサイトと共に培養した場合、または特定の組み合わせの化合物の存在下で培養するヒトアストロサイトと共に培養した場合における、神経細胞の様子を示す。
【図８】図８は、神経細胞（ニューロンとも表記する）を、未処置のヒトアストロサイトと共に培養した場合、または特定の組み合わせの化合物の存在下で培養するヒトアストロサイトと共に培養した場合における、神経細胞死の評価結果を示す。
【図９】図９は、神経細胞を、未処置のヒトアストロサイト（アストロサイト前駆細胞から誘導）と共に培養した場合、または特定の組み合わせの化合物の存在下で培養するヒトアストロサイト（アストロサイト前駆細胞から誘導）と共に培養した場合における、神経細胞の様子及び神経突起の長さを示す。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
以下、本発明の実施の形態について詳細に説明する。
ＴＮＦαは、腫瘍壊死因子α（Tumor Necrosis Factorα)を示す。
ＩＦＮγは、インターフェロンγ（Interferonγ）を示す。
ＩＬ−１αは、インターロイキン１α（Interleukin-1α）を示す。
ＩＬ−１βは、インターロイキン１β（Interleukin-1β）を示す。
Ｃ１ｑは、補体Ｃ１ｑを示す。
ＭＰＴＰは、1-メチル-4-フェニル-1,2,3,6-テトラヒドロピリジンを示す。
ＥＭＰ１は、上皮膜タンパク質１（Epithelial membrane protein 1)を示す。
ＣＤ１０９は、分化抗原群１０９（Cluster of Differentiation 109）を示す。
ＧＢＰ２は、グアニレート結合プロテイン２（guanylate binding protein 2）を示す。
Ｃ３は、補体分子Ｃ３を示す。
ＣＸＣＬ１０は、Ｃ−Ｘ−Ｃ  モチーフケモカイン１０（C-X-C motif chemokine 10）を示す。
ＧＡＰＤＨは、グリセルアルデヒド３リン酸脱水素酵素を示す。
ＨＢＥＧＦは、ヘパリン結合上皮成長因子様増殖因子（heparin binding-epidermal growth factor-like growth factor ）を示す。
ＷＳＴは、水溶性テトラゾリウム塩（Water soluble Tetrazolium salts）を示す。
【００１５】
本発明は、ヒトＡ１アストロサイト以外のヒトアストロサイトを、ＴＮＦα及びＩＦＮγの存在下において培養する工程ａを含む、ヒトＡ１アストロサイトの製造方法に関する。
【００１６】
工程ａは、ＴＮＦα及びＩＦＮγの存在下、または、ＴＮＦα及びＩＦＮγに加え、ＩＬ−１α、ＩＬ−１β及びＣ１ｑからなる群から選択される少なくとも一つのサイトカイン及び／又は補体の存在下において、ヒトＡ１アストロサイト以外のヒトアストロサイトを培養する工程である。
工程ａは、好ましくは、下記の何れかの存在下において、ヒトＡ１アストロサイト以外のヒトアストロサイトを培養する工程である。
（１）ＴＮＦα、ＩＦＮγ、ＩＬ−１α、ＩＬ−１β
（２）ＴＮＦα、ＩＦＮγ、ＩＬ−１α、Ｃ１ｑ
（３）ＴＮＦα、ＩＦＮγ、ＩＬ−１β、Ｃ１ｑ
（４）ＴＮＦα、ＩＦＮγ、ＩＬ−１α、ＩＬ−１β、Ｃ１ｑ
（５）ＴＮＦα、ＩＦＮγ
【００１７】
工程ａは、特に好ましくは、下記の何れかの存在下において、ヒトＡ１アストロサイト以外のヒトアストロサイトを培養する工程である。
（４）ＴＮＦα、ＩＦＮγ、ＩＬ−１α、ＩＬ−１β、Ｃ１ｑ
（５）ＴＮＦα、ＩＦＮγ
【００１８】
工程ａは、好ましくは、ＭＰＴＰの非存在下において、ヒトＡ１アストロサイト以外のヒトアストロサイトを培養する工程である。
【００１９】
＜ヒトアストロサイト＞
「ヒトアストロサイト」とは、ヒトのアストロサイトである。
本発明で用いる「ヒトＡ１アストロサイト以外のヒトアストロサイト」の入手方法としては、例えば、患者から外科的に取得した大脳皮質や脊髄等から分離すること、ヒトアストロサイトに分化できる細胞から誘導すること、ヒト多能性幹細胞から誘導すること等により入手することが挙げられる。これらのヒトアストロサイトはいずれも、本発明の方法における「ヒトＡ１アストロサイト以外のヒトアストロサイト」として使用することができる。
本発明で用いる「ヒトＡ１アストロサイト以外のヒトアストロサイト」としては、好ましくは、ヒト多能性幹細胞から誘導したヒトアストロサイト及びヒトアストロサイトに分化できる細胞から誘導したヒトアストロサイトを使用することができる。
【００２０】
ヒトＡ１アストロサイト以外のヒトアストロサイトは、単離した状態でも、他の細胞と混ざった状態でも、本発明の方法において使用することができる。また、多能性幹細胞からヒトアストロサイトへの誘導と、ヒトアストロサイトからヒトＡ１アストロサイトへの誘導を連続的に行うことも想定することができる。この場合、工程ａは、ヒト多能性幹細胞又はヒトアストロサイトに分化できる細胞を、ヒトＡ１アストロサイト以外のヒトアストロサイトへと分化させる工程ａ１、及び工程ａ１で得られたヒトＡ１アストロサイト以外のヒトアストロサイトをＴＮＦα及びＩＦＮγの存在下において培養する工程ａ２を含む。
ヒト多能性幹細胞としては、ヒトｉＰＳ細胞（human induced pluripotent stem cells）、ヒトES細胞(human embryonic stem cells)、ヒト間葉系幹細胞などを挙げることができるが特に限定されない。
ヒトアストロサイトに分化できる細胞としては、神経幹細胞、グリア系神経前駆細胞、グリア前駆細胞、アストロサイト前駆細胞、線維芽細胞などを挙げることができるが特に限定されない。
【００２１】
＜活性化ヒトアストロサイト＞
「活性化ヒトアストロサイト」とは、神経疾病等の影響により活性化したヒトアストロサイトである。活性化ヒトアストロサイトには、神経障害性が特徴であるヒトＡ１アストロサイトと、神経保護性のヒトＡ２アストロサイトが知られている。活性化ヒトアストロサイトも、本発明のヒトアストロサイトに含まれる。
【００２２】
＜ヒトＡ１アストロサイト＞
「ヒトＡ１アストロサイト」とは、活性化されたヒトアストロサイトの一種である。
本発明の方法により製造されるヒトＡ１アストロサイトは、例えば、細胞の形態的変化、ヒトＡ１アストロサイトの特徴的性質や特異的マーカーを利用して、検出、確認及び分離を行うことができる。
ヒトＡ１アストロサイトは、肥大型の特徴的な外観を有する。従って、顕微鏡による観察で、ヒトＡ１アストロサイトを検出することができる。
ヒトＡ１アストロサイトの特異的マーカーとしては、ＧＢＰ２、ＣＸＣＬ１０及びＣ３等が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００２３】
特異的マーカーの検出には、検疫的方法（抗体による検出）を利用できるが、タンパク質分子に関してはそのｍＲＮＡ量の定量により検出を実施してもよい。
【００２４】
ヒトＡ１アストロサイトは、神経細胞障害性を示す。従って、ヒトＡ１アストロサイトを神経細胞と共培養し、神経細胞に対する障害作用を利用して、検出することができる。
【００２５】
＜ヒトＡ２アストロサイト＞
「ヒトＡ２アストロサイト」とは、活性化されたヒトアストロサイトの一種である。
Ａ２アストロサイトは様々な神経栄養因子が発現上昇しており、神経細胞に保護的に作用する。Ａ２アストロサイトの特異的マーカーとしてはＥＭＰ１やＣＤ１０９等が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
ヒトＡ２アストロサイトは、星型の外観を有する。
本発明においては、工程ａで培養する、ヒトＡ１アストロサイト以外のヒトアストロサイトとして、ヒトＡ２アストロサイトを使用することができる。
【００２６】
＜ＴＮＦα＞
ＴＮＦαとは、サイトカインの一種であり、炎症時における生体防御や免疫機構の賦活化に広く関わる物質である。「ＴＮＦαの存在下」の培養条件を達成するための手段は特に限定はなく、例えばＴＮＦαを培地に加えること、ＴＮＦαを産生する細胞と共培養すること、ＴＮＦαを産生する細胞の培養上清を加えることで達成される。
【００２７】
ＴＮＦαの濃度は適宜決定すればよく、特に限定されないが、例えば、０．０１ｎｇ／ｍＬ〜３０ｎｇ／ｍＬ、好ましくは０．５ｎｇ／ｍＬ〜１０ｎｇ／ｍＬの範囲で使用することができる。
【００２８】
＜ＩＦＮγ＞
ＩＦＮγとは、細胞媒介性免疫の誘導を司っているサイトカインである。「ＩＦＮγの存在下」の培養条件を達成するための手段は特に限定はなく、例えばＩＦＮγを培地に加えること、ＩＦＮγを産生する細胞と共培養すること、ＩＦＮγを産生する細胞の培養上清を加えることで達成される。
ＩＦＮγの濃度は適宜決定すればよく、特に限定されないが、例えば、０．１ｎｇ／ｍＬ〜２０ｎｇ／ｍＬ、好ましくは０．５ｎｇ／ｍＬ〜１０ｎｇ／ｍＬの範囲で使用することができる。
【００２９】
培地中におけるＴＮＦαの濃度とＩＦＮγの濃度の比は特に限定されないが、好ましくは１００：１〜１：１００であり、より好ましくは１０：１〜１：１０であり、さらに好ましくは５：１〜１：５であり、特に好ましくは３：１〜１：１である。
【００３０】
＜ＩＬ−１α＞
ＩＬ−１αとは、白血球から分泌されるサイトカインであるインターロイキンの一種である。「ＩＬ−１αの存在下」の培養条件を達成するための手段は特に限定はなく、例えばＩＬ−１αを培地に加えること、ＩＬ−１αを産生する細胞と共培養すること、ＩＬ−１αを産生する細胞の培養上清を加えることで達成される。
ＩＬ−１αの濃度は適宜決定すればよく、特に限定されないが、例えば、１ｐｇ／ｍＬ〜５ｎｇ／ｍＬ、好ましくは０．０５ｎｇ／ｍＬ〜３ｎｇ／ｍＬの範囲で使用することができる。
【００３１】
＜ＩＬ−１β＞
ＩＬ−１βとは、白血球から分泌されるサイトカインであるインターロイキンの一種である。「ＩＬ−１βの存在下」の培養条件を達成するための手段は特に限定はなく、例えばＩＬ−１βを培地に加えること、ＩＬ−１βを産生する細胞と共培養すること、ＩＬ−１βを産生する細胞の培養上清を加えることで達成される。
ＩＬ−１βの濃度は適宜決定すればよく、特に限定されないが、例えば、１ｐｇ／ｍＬ〜１０ｎｇ／ｍＬ、好ましくは０．５ｎｇ／ｍＬ〜５ｎｇ／ｍＬの範囲で使用することができる。
【００３２】
＜Ｃ１ｑ＞
Ｃ１ｑとは、補体の一つである。補体活性化の経路の一つとして古典経路があるが、Ｃ１ｑはこの経路の起点となる因子である。「Ｃ１ｑの存在下」の培養条件を達成するための手段は特に限定はなく、例えばＣ１ｑを培地に加えること、Ｃ１ｑを産生する細胞と共培養すること、Ｃ１ｑを産生する細胞の培養上清を加えることで達成される。
Ｃ１ｑの濃度は適宜決定すればよく、特に限定されないが、例えば、１０ｎｇ／ｍＬ〜１０μｇ／ｍＬ、好ましくは５０ｎｇ／ｍＬ〜３００ｎｇ／ｍＬの範囲で使用することができる。
【００３３】
＜ヒトアストロサイトの培養＞
本発明におけるヒトアストロサイトの培養は、使用するヒトアストロサイトの由来及び状態に応じた培地、温度、その他の条件を選択し、上記の各種サイトカイン及び／又は補体の存在下において実施すればよい。本発明におけるヒトアストロサイトの培養を妨害しない限り、培地中には上記の各種サイトカイン及び／又は補体以外の成分が含まれていてもよい。培地は、公知の培地又は市販の培地から選択することができる。例えば、一般的な培地であるＭＥＭ（最少必須培地）、ＤＭＥＭ（ダルベッコ改変イーグル培地）、ＤＭＥＭ／Ｆ１２、又はこれらを改変した培地に、適切な成分（血清、タンパク質、アミノ酸、糖類、ビタミン類、脂肪酸類、抗生物質等）を添加して使用することができる。培地としては、血清を含まない培地（無血清培地）を使用することが好ましい。
【００３４】
培養条件としては、一般的な細胞培養の条件を選択すればよい。３７℃、５％ＣＯ2の条件などが例示される。培養中は適切な間隔（好ましくは１日から７日に１回、より好ましくは２日から３日に１回）で培地を交換することが好ましい。ヒトアストロサイトを材料として本発明の方法を実施する場合、３７℃、５％ＣＯ2の条件では１日間から１週間でヒトＡ１アストロサイトが出現する。
【００３５】
体細胞の培養には、プレート、ディッシュ、セルカルチャーインサート、細胞培養用フラスコ、細胞培養用バッグ等の細胞培養容器を使用することができる。なお、細胞培養用バッグとしては、ガス透過性を有するものが好適である。大量の細胞を必要とする場合には、大型培養槽を使用してもよい。培養は開放系又は閉鎖系のどちらでも実施することができる。
本発明の方法においては、上記した各種のサイトカイン及び／又は補体を含む培地においてヒトアストロサイトを培養することにより、ヒトＡ１アストロサイトを製造することができる。
【００３６】
＜ヒトＡ１アストロサイト及びそれを用いた被験物質の評価方法＞
本発明によれば、本発明によるヒトＡ１アストロサイトの製造方法により得られる単離されたヒトＡ１アストロサイトが提供される。
本発明の方法により製造されるヒトＡ１アストロサイトは、ヒトＡ１アストロサイトに作用する医薬候補化合物のスクリーニングや医薬候補化合物の安全性評価のために使用することもできる。
【００３７】
本発明によれば、本発明のヒトＡ１アストロサイトと被験物質とを接触させることを含む、被験物質の評価方法が提供される。例えば、ヒトＡ１アストロサイトと被験物質とを接触させた後に、ヒトＡ１アストロサイトが有する神経細胞障害性の変化を評価することによって、被験物質を評価してもよい。ヒトＡ１アストロサイトが有する神経細胞障害性の変化は、例えば、後記の実施例に記載の方法に準じて、ヒトＡ１アストロサイトを神経細胞と共培養し、神経細胞に対する障害作用を利用して、評価することができる。
【００３８】
以下の実施例により本発明を具体的に説明するが、本発明は実施例の範囲に限定されるものではない。
【実施例】
【００３９】
試験例１：ヒトアストロサイトからヒトＡ１アストロサイトへの誘導
（１）ヒトアストロサイト
（１−１）ヒトｉＰＳ細胞由来アストロサイト
ヒトアストロサイトは、セルラー・ダイナミクス・インターナショナル・ジャパンの、ヒトｉＰＳ細胞由来アストロサイトであるｉＣｅｌｌ（登録商標）Ａｓｔｒｏｃｙｔｅｓ（ＣＤＩ，  ＡＳＣ−１００−０２０−００１−ＰＴ）を購入して使用した。ｉＣｅｌｌ（登録商標）Ａｓｔｒｏｃｙｔｅｓは、その外観から、ヒトＡ１アストロサイト以外のヒトアストロサイトであることを確認した。
（１−２）アストロサイト前駆細胞から誘導したアストロサイト
また、ヒトアストロサイトとして、市販のヒトアストロサイト前駆細胞（Ａｘｏｌ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、ＡＸ００８３）をキットに添付の方法等の条件で誘導したものも使用した。誘導したヒトアストロサイトは、その外観から、ヒトＡ１アストロサイト以外のヒトアストロサイトであることを確認した。
（１−３）ヒト由来の初代培養アストロサイト
さらに、市販の初代培養ヒトアストロサイト（ＬＯＮＺＡ、ＣＣ−２５６５）も使用した。【００４０】
（２）ヒトＡ１アストロサイトへの誘導
ヒトＡ１アストロサイトへの誘導は、実施例１〜４及び比較例１〜４は誘導手法１で行い、実施例５は誘導手法２で行った。実施例６及び７は誘導手法３で行った。【００４１】
誘導手法１
ＤＭＥＭ（Ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，１１９６０−０４４）で１２０倍希釈したＭａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）基底膜マトリックス（Ｃｏｒｎｉｎｇ，３５６２３４）を６ウエルプレートに１．５ｍＬ／ウエルにて添加し、４℃に静置した。２４時間後、以下の無血清培地（Ｓｅｒｕｍ−ｆｒｅｅ  ｍｅｄｉｕｍ）に置換して使用した。【００４２】
無血清培地の組成
Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ（登録商標）ｍｅｄｉｕｍ（５０％，Ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，２１１０３０４９）
ＤＭＥＭ（５０％）
Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ／Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ  （×１００）（１×，Ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，  １５１４０−１２２）
Ｓｏｄｉｕｍ  ｐｙｒｕｖａｔｅ（１ｍＭ，Ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，１１３６０−０７０）
Ｌ−ｇｌｕｔａｍｉｎｅ（２９２μｇ／ｍＬ，Ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，２５０３０−０８１）
Ｎ２  Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ  ｗｉｔｈ  Ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎ（Ａｐｏ）（１×，Ｗａｋｏ，１４１−０９０４１）Ｎ−ａｃｅｔｙｌ  ｃｙｓｔｅｉｎｅ（５μｇ／ｍＬ，Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ａ８１９９）
ＨＢＥＧＦ（５ｎｇ／ｍＬ，Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ，１００−４７）【００４３】
ｉＣｅｌｌ（登録商標）ａｓｔｒｏｃｙｔｅｓを無血清培地に懸濁し，６ウエルプレートに３０ｘ１０4ｃｅｌｌｓ／ウエルの密度で播種し、３７℃，５％ＣＯ2条件下で２４時間培養した。【００４４】
上記アストロサイトを、表１に記載した化合物（ＴＮＦα（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，８９０２ＳＣ）、ＩＦＮγ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，２８５−ＩＦ）、ＩＬ−１α（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，ＳＲＰ３３１０）、ＩＬ−１β（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，２０１−ＬＢ）、Ｃ１ｑ（ＭｙＢｉｏＳｏｕｒｃｅ，ＭＢＳ１４３１０５））の内２〜５つを無血清培地に加えた培地に交換し、３７℃、５％ＣＯ2条件下で１日間培養した。【００４５】
誘導手法２
ＤＭＥＭ（Ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，１１９６０−０４４）で１２０倍希釈したＭａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）基底膜マトリックス （Ｃｏｒｎｉｎｇ，３５６２３４）を９６ウエルプレートに６５μＬ／ウエルにて添加し、４℃に静置した。２４時間後、誘導手法１と同様の無血清培地に置換して使用した。【００４６】
ｉＣｅｌｌ（登録商標）ａｓｔｒｏｃｙｔｅｓを無血清培地に懸濁し、９６ウエルプレートに３ｘ１０4ｃｅｌｌｓ／ウエルの密度で播種し、３７℃、５％ＣＯ2条件下で２４時間培養した。
上記アストロサイトを、表１に記載した化合物の内２つを無血清培地に加えた培地に交換し、３７℃、５％ＣＯ2条件下で１日間培養した。【００４７】
誘導手法３
ＤＭＥＭ（Ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，１１９６０−０４４）で１２０倍希釈したＭａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）基底膜マトリックス （Ｃｏｒｎｉｎｇ，３５６２３４）を９６ウエルプレートに６５μＬ／ウエルにて添加し、４℃に静置し、２４時間後に使用した。【００４８】
実施例６では、市販のヒトアストロサイト前駆細胞から誘導したアストロサイトを、実施例７では、初代培養ヒトアストロサイトを、９６ウエルプレートに３ｘ１０４ｃｅｌｌｓ／ウエルの密度で播種し、３７℃、５％ＣＯ2条件下で２４時間培養した。
上記アストロサイトを、表１に記載した化合物の内２つを加えた培地に交換し、３７℃、５％ＣＯ2条件下で１日間培養した。【００４９】
免疫染色
実施例６では、免疫染色によりアストロサイトのマーカーであるＧＦＡＰ染色を行った。誘手法３で誘導したヒトアストロサイト前駆細胞から誘導したアストロサイトに８０％エタノールを１００μＬ／ウエル加え、−３０℃で２４時間固定した。ＰＢＳで３回洗浄後、ＰＢＳに１％のＢＳＡを加えたもの（１％ＢＳＡ）を加えてブロッキングし、一次抗体（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、ＭＡＢ３４０２）を１％ＢＳＡに３０００倍希釈したものを４℃で２４時間処置した。ＰＢＳで３回洗浄後、二次抗体（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ａ１１００５）を１％ＢＳＡに１０００倍希釈したものを室温で１時間処置した。ＰＢＳで３回洗浄後、ＩｎｃｕＣｙｔｅ  Ｓ３（Ｅｓｓｅｎ  ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅ、４６４７）を用いて撮影し画像を取得した。【００５０】
【表１】
2019235576.tif 000002
【００５１】
（３）細胞の形態の評価
培養後の細胞の形態を顕微鏡又は撮影画像にて観察した。結果を図１、図２に示す。また、図１、図２から形態を評価した結果を下記表に示す。形態の判定は典型的な細胞を１０細胞／視野選択し、長軸と短軸を比較して行った。長軸／短軸が１０以下のものを肥大型とし、１０を超え線維状の形状のものを線維型とし、１０を超え突起が複数ある形状のものを星型とした。長軸／短軸の評価結果の数値は図１、図２に示す。図２の枠中で拡大して示したのは、典型的な星型（図左側）、肥大型（図右側）の細胞である。【００５２】
【表２】
2019235576.tif 000003
【００５３】
図１、図２及び表２から、実施例１〜６では、ほぼすべての細胞が、ヒトＡ１アストロサイトに特徴的な肥大型の形態を示していることが分かる。一方、比較例１〜４の場合、肥大型の形態を示している細胞は存在しないか、ごくわずかであることが分かる。【００５４】
（４）ｍＲＮＡ発現量の評価
培養後の細胞が発現する遺伝子の量を定量ＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ）で測定した。定量ＰＣＲは、実施例１〜４及び比較例１〜４は定量ＰＣＲ手法１で行い、実施例５〜７は定量ＰＣＲ手法２で行った。【００５５】
定量ＰＣＲ手法１
誘導１日後の細胞からＴｏｔａｌ  ＲＮＡを抽出した。Ｔｏｔａｌ  ＲＮＡの抽出にはＲＮｅａｓｙ（登録商標）ｍｉｎｉ  ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ，７４１０４）を添付文書に従い使用した。Ｔｏｔａｌ  ＲＮＡの逆転写にはＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ（登録商標）ＲＴ  ｒｅａｇｅｎｔ  Ｋｉｔ  ｗｉｔｈ  ｇＤＮＡ  Ｅｒａｓｅｒ（Ｐｅｒｆｅｃｔ  Ｒｅａｌ  Ｔｉｍｅ）（タカラバイオ，ＲＲ０４７Ａ）を添付文書に従い使用した。定量ＰＣＲはＴＢ  Ｇｒｅｅｎ  Ｐｒｅｍｉｘ  Ｅｘ  ＴａｑＩＩ（Ｔｌｉ  ＲＮａｓｅＨ  Ｐｌｕｓ）（タカラバイオ，ＲＲ８２０Ｂ）を添付のプロトコールに従って使用した。サイクルプログラムはＭｘ３００５Ｐ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を用いて９５℃３０秒を１サイクル、９５℃５秒、６０℃３０秒を４５サイクル実施した。プライマーの配列を以下に示す。【００５６】
ＧＢＰ２フォワードプライマー：tttcaccctggaactggaag（配列番号１）
リバースプライマー：gacgaagcacttcctcttgg（配列番号２）【００５７】
ＣＸＣＬ１０フォワードプライマー：ccacgtgttgagatcattgc（配列番号３）
リバースプライマー：cctctgtgtggtccatcctt（配列番号４）【００５８】
ＧＡＰＤＨ
フォワードプライマー：gtcagtggtggacctgacct（配列番号５）
リバースプライマー：tgctgtagccaaattcgttg（配列番号６）【００５９】
定量ＰＣＲ手法２
誘導１日後の細胞からＦａｓｔＬａｎｅ  ｃｅｌｌ  Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ  ＮＲ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ，２１６５１３）を添付文書に従い用いてｍＲＮＡの定量を実施した。プライマー及び蛍光プローブはＤｕａｌ  Ｌａｂｅｌｅｄ  Ｐｒｏｂｅデザインセット  （タカラバイオ）にて合成した。サイクルプログラムはＣＦＸ３８４  ＴｏｕｃｈリアルタイムＰＣＲ解析システム（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を用いて５０℃２０分、９５℃１５分を１サイクル、９４℃４５秒、６０℃７５秒を４５サイクル実施した。プライマー及び蛍光プローブの配列を以下に示す。【００６０】
Ｃ３プローブ: 5’-(FAM)CACAGCGGCACAGTTCATCACGGCA(BHQ1)-3’ （配列番号７）
フォワードプライマー: GCCTATTACAACCTGGAGGAAAG（配列番号８）
リバースプライマー: GTGACCTTGTCATCCGACTTTTG（配列番号９）【００６１】
ＣＸＣＬ１０プローブ: 5’-(Cyanine5)TCTGACTCTAAGTGGCATTCAAGGAGTACCT(BHQ1)-3’ （配列番号１０）
フォワードプライマー: GCCATTCTGATTTGCTGCCTTA（配列番号１１）
リバースプライマー: ACAGGTTGATTACTAATGCTGATGC（配列番号１２）【００６２】
ＧＡＰＤＨプローブ: 5’-(HEX)CATCAGCAATGCCTCCTGCACCACCAA(BHQ1)-3’ （配列番号１３）
フォワードプライマー: GAACCATGAGAAGTATGACAACAGC（配列番号１４）
リバースプライマー: TGGGTGGCAGTGATGGCA（配列番号１５）【００６３】
ＧＡＰＤＨを内部標準として、ｍＲＮＡの発現量をΔΔＣｔ法（比較Ｃｔ法）にて定量した。結果を図３、図４、図５及び図６に示す。【００６４】
図３から、実施例１〜４では、ＧＢＰ２及びＣＸＣＬ１０のいずれも十分に発現していることが分かる。一方、比較例１〜４では、ＧＢＰ２、ＣＸＣＬ１０のいずれもほとんど発現していないか、発現しているとしても実施例と比べ少量であることが分かる。図４から実施例１及び５においてＣ３の発現が刺激により発現上昇していることが分かる。図５、図６から、実施例６及び７においてＣ３の発現が刺激により発現上昇していることが分かる。【００６５】
試験例２：ヒトＡ１アストロサイトと神経細胞の共培養
（１）セルカルチャーインサートへのヒトアストロサイトの播種
ヒトアストロサイトは、試験例１と同様ｉＣｅｌｌ（登録商標）ａｓｔｒｏｃｙｔｅｓを使用した。
ＤＭＥＭで１２０倍希釈したｍａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）をセルカルチャーインサート（Ｃｏｒｎｉｎｇ，３５３１０４）に１００μＬ／ウエルにて添加し、４℃に静置した。２４時間後、誘導手法１と同様の無血清培地に置換した。ｉＣｅｌｌ（登録商標）ａｓｔｒｏｃｙｔｅｓを無血清培地に懸濁し、セルカルチャーインサートに５ｘ１０4ｃｅｌｌｓ／ウエルの密度で播種し、３７℃、５％ＣＯ2条件下で培養した。【００６６】
２４時間後、無血清培地または無血清培地にＩＬ−１α（０．７５ｎｇ／ｍＬ）、ＴＮＦα（７．５ｎｇ／ｍＬ）、Ｃ１ｑ（１００ｎｇ／ｍＬ）、ＩＬ−１β（２．５ｎｇ／ｍＬ）、ＩＦＮγ（５ｎｇ／ｍＬ）を加えた培地に交換した。【００６７】
（２）培養プレートへの神経細胞の播種
リン酸緩衝液（ＰＢＳ）で１０倍希釈したＰｏｌｙ−Ｌ−Ｌｙｓｉｎｅ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｓｉｇｍａ  ａｌｄｒｉｃｈ，Ｐ４７０７）を２４ウエルプレートに５００μＬ／ウエルにて添加し、室温に静置した。２４時間後、ＰＢＳで１６６倍希釈したｉＭａｔｒｉｘ−５１１（ニッピ，８９２０１２）を２４ウエルプレートに５００μＬ／ウエルにて添加し、３７℃で１時間インキュベート後、無血清培地に置換した。【００６８】
ＷＯ２０１４／１４８６４６Ａ１に記載の方法に従い、Ｎｅｕｒｏｇｅｎｉｎ２を強制発現することで、ｉＰＳ細胞を神経細胞に分化した。得られた神経細胞を無血清培地に懸濁し、２４ウエルプレートに１０ｘ１０4ｃｅｌｌｓ／ウエルの密度で播種し３７℃、５％ＣＯ2条件下で培養した。【００６９】
（３）神経細胞との共培養
ヒトアストロサイトを播種したセルカルチャーインサートと神経細胞を播種した培養プレートの培地を無血清培地、もしくは５つの化合物を加えた無血清培地に交換し、組み合わせて共培養を開始した。対照として、神経細胞の単独培養も同時に開始した。３７℃、５％ＣＯ2条件下で５日間培養したのち、神経細胞の様子を観察した。結果を図７に示す。【００７０】
無血清培地にて置換したヒトアストロサイトは神経細胞に保護的に作用し、共培養した神経細胞は神経細胞単独と比較して生細胞数が多く、神経突起もしっかりしているのが分かる。一方、５つの化合物を加えた無血清培地に置換したヒトアストロサイトは神経毒性を示し、共培養した神経細胞は無血清培地に置換したアストロサイトと共培養した神経細胞に比べ死細胞が多く、生細胞、及び神経突起が減少しているのが分かる。【００７１】
（４）神経細胞死の定量評価
５日間共培養した後に生細胞をＷＳＴ試験、及び生細胞数のカウントにて定量評価した。ＷＳＴ試験はＣｅｌｌ  Ｃｏｕｎｔｉｎｇ  Ｋｉｔ−８（同仁化学研究所，ＣＫ０４）を用いて評価した。セルカルチャーインサートを取り除いた後、Ｃｅｌｌ  Ｃｏｕｎｔｉｎｇ  Ｋｉｔ溶液を５０μＬずつ培養プレートに加え、３７℃、５％ＣＯ2条件下で１〜４時間呈色反応を行った。その後１００μＬの反応液をマイクロプレートリーダーを用いて４５０ｎｍ、及び６５０ｎｍの吸光度を測定し、４５０ｎｍの値から６５０ｎｍの値を引いた値にて定量を行った。生細胞数はＷＳＴ試験実施後のサンプルを使用してＣｅｌｌｓｔａｉｎ（登録商標）ＣｙｔｏＲｅｄ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ（同仁化学研究所，Ｃ４１０）、及びＩｎｃｕＣｙｔｅ（登録商標）Ｓ３（エッセンバイオサイエンス，４６４７）を用いて評価した。１ｍｍｏｌ／ｌのＣｙｔｏＲｅｄ溶液を０．５ μＬずつ培養プレートに加え、３７℃、５％ＣＯ2条件下で３０分〜２時間呈色反応を行うことで生細胞を染色した。その後ＩｎｃｕＣｙｔｅ（登録商標）Ｓ３を用いて生細胞数をカウントした。【００７２】
結果を図８に示す。
ＷＳＴ試験、及び生細胞数の定量の結果、無血清培地にて置換したヒトアストロサイトと共培養した神経細胞は神経細胞単独と比較して生細胞が多いことが確認できた。一方、５つの化合物を加えた無血清培地に置換したヒトアストロサイトと共培養した神経細胞は無血清培地に置換したアストロサイトと共培養した神経細胞と比べ生細胞が減少していることが確認できた。【００７３】
試験例３：各種ヒトアストロサイトの神経障害性
（１）ヒトアストロサイト前駆細胞から誘導したアストロサイトの播種
ＤＭＥＭ（Ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，１１９６０−０４４）で１２０倍希釈したＭａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）基底膜マトリックス （Ｃｏｒｎｉｎｇ，３５６２３４）を９６ウエルプレートに６５μＬ／ウエルにて添加し、４℃に静置した。２４時間後、市販のヒトアストロサイト前駆細胞から誘導したアストロサイトを５ｘ１０４ｃｅｌｌｓ／ウエルの密度で播種した。【００７４】
（Ａ）無刺激、（Ｂ）ＴＮＦα（７．５ｎｇ／ｍＬ）、ＩＦＮγ（５ｎｇ／ｍＬ）にて刺激、又は（Ｃ）ＴＮＦα（７．５ｎｇ／ｍＬ）、ＩＬ−１α（０．７５ｎｇ／ｍＬ）、Ｃ１ｑ（１００ｎｇ／ｍＬ）にて刺激し、４８時間後に神経細胞を播種した。【００７５】
（２）培養プレートへの神経細胞の播種
ＷＯ２０１４／１４８６４６Ａ１に記載の方法に従い、Ｎｅｕｒｏｇｅｎｉｎ２を強制発現することで、ｉＰＳ細胞を神経細胞に分化した。得られた神経細胞をＡ１誘導後のアストロサイトの上に３ｘ１０４ｃｅｌｌｓ／ウエルの密度で播種し、３日間３７℃、５％ＣＯ2条件下で培養した。【００７６】
（３）免疫染色
３日間培養した細胞に８０％エタノールを１００μＬ／ウエル加え、−３０℃で２４時間固定した。ＰＢＳで３回洗浄後、１％ＢＳＡを加えてブロッキングし、一次抗体（Ｃｏｖａｎｃｅ、ＭＲＢ−４３５Ｐ）を１％ＢＳＡに２０００倍希釈したものを４℃で２４時間処置した。ＰＢＳで３回洗浄後、二次抗体（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ａ１１００８）を１％ＢＳＡに１０００倍希釈したものを室温で１時間処置した。ＰＢＳで３回洗浄後、ＩｎｃｕＣｙｔｅ  Ｓ３（Ｅｓｓｅｎ  ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅ、４６４７）を用いて撮影し画像を取得した。結果を図９に示す。【００７７】
（Ａ）無刺激のヒトアストロサイト、（Ｂ）にて刺激したヒトアストロサイト、（Ｃ）にて刺激したヒトアストロサイトそれぞれと共培養した神経細胞を比較すると、（Ｂ）と共培養した神経細胞は、神経突起が減少していることが確認できた。
【図１】
2019235576.tif 000004
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
2019235576.tif 000011
【図９】
2019235576.tif 000012
【配列表】
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【国際調査報告】
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2019235576.tif 000014
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