(57)【要約】本発明は、新規なＰＰＡＲδ（Peroxisome proliferator-activated receptor δ）のアゴニストを有効成分とするＰＰＡＲδ活性化剤、及びこれを有効成分とする運動耐性改善剤を提供する。本発明は、グアニジン誘導体又はビグアニジン誘導体を有効成分とし、ＰＰＡＲδの転写活性を活性化する、ＰＰＡＲδ活性化剤；前記グアニジン誘導体及び前記ビグアニジン誘導体は、グアニジノ基又はビグアニジノ基が、ＰＰＡＲδのリガンド結合ポケットの内部表面を構成するアミノ酸残基のうち、ヒトＰＰＡＲδのＨｉｓ４１３、Ｈｉｓ２８７、Ｔｈｒ２５３、及びＴｙｒ４３７にそれぞれ相当するアミノ酸残基と水素結合をした状態で、前記リガンド結合ポケットの内部に嵌まり込み得る、前記ＰＰＡＲδ活性化剤；並びに、前記いずれかのＰＰＡＲδ活性化剤を有効成分とする、運動耐性改善剤である。
2020085393.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
グアニジン誘導体又はビグアニジン誘導体を有効成分とし、ＰＰＡＲδ（Peroxisome proliferator-activated receptor δ）の転写活性を活性化する、ＰＰＡＲδ活性化剤。
【請求項２】
前記グアニジン誘導体及び前記ビグアニジン誘導体は、グアニジノ基又はビグアニジノ基が、ＰＰＡＲδのリガンド結合ポケットの内部表面を構成するアミノ酸残基のうち、ヒトＰＰＡＲδの４１３番目のヒスチジン、２８７番目のヒスチジン、２５３番目のスレオニン、及び４３７番目のチロシンにそれぞれ相当するアミノ酸残基と水素結合をした状態で、前記リガンド結合ポケットの内部に嵌まり込み得る、請求項１に記載のＰＰＡＲδ活性化剤。
【請求項３】
前記グアニジン誘導体が、下記一般式（１）
【化１】
2020085393.tif 000087
［式（１）中、Ｒ１は１価の有機基を表す。］
で表される化合物（但し、ビグアニジン誘導体を除く）である、請求項１又は２に記載のＰＰＡＲδ活性化剤。
【請求項４】
前記グアニジン誘導体が、下記一般式（１−１−１）〜（１−１−４）
【化２】
2020085393.tif 000088
［式（１−１−１）及び（１−１−２）中、Ｚ１１は酸素原子又は硫黄原子を表し、ｎ１は０又は１を表し、Ｒ１２は、炭素数１〜６の脂肪族炭化水素基を表し、ｎ１２は０〜２の整数を表し、Ｒ１３は水素原子又は炭素数１〜６の脂肪族炭化水素基を表し、Ｒ１４は置換基を有していてもよい芳香族炭化水素基を表し、ｐ１は１以上の整数を表す。］
【化３】
2020085393.tif 000089
［式（１−１−３）及び（１−１−４）中、Ｚ１１は酸素原子又は硫黄原子を表し、ｎ１は０又は１を表し、Ｒ１５は炭素数１〜６の脂肪族炭化水素基又はアルコキシ基を表し、ｎ１５は０〜２の整数を表し、Ｚ２は２価の連結基を表し、Ｒ５は置換基を有していてもよい芳香族炭化水素基、又は置換基を有していてもよい環式炭化水素基を表し、ｐ２は１以上の整数を表す。］
のいずれかで表される化合物である、請求項３に記載のＰＰＡＲδ活性化剤。
【請求項５】
前記グアニジン誘導体が、下記式（Ａ−１）〜（Ａ−４）、（Ｂ−１）〜（Ｂ−３）
【化４】
2020085393.tif 000090
【化５】
2020085393.tif 000091
のいずれかで表される化合物である、請求項１に記載のＰＰＡＲδ活性化剤。
【請求項６】
前記ビグアニジン誘導体が、下記一般式（２）
【化６】
2020085393.tif 000092
［式（２）中、Ｒ２及びＲ３は、それぞれ独立して、水素原子又は１価の有機基を表す。Ｒ２及びＲ３がいずれも１価の有機基の場合、両者が連結して環構造を形成していてもよい。］
で表される化合物である、請求項１〜３のいずれか一項に記載のＰＰＡＲδ活性化剤。
【請求項７】
メトホルミン、フェンホルミン、及びブホルミンからなる群より選択される１種以上を有効成分とする、請求項１に記載のＰＰＡＲδ活性化剤。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれか一項に記載のＰＰＡＲδ活性化剤を有効成分とする、運動耐性改善剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ペルオキシソーム増殖剤応答性受容体δ（peroxisome proliferator-activated receptor δ：ＰＰＡＲδ）の活性化剤に関する。
本願は、２０１８年１０月２３日に、日本に出願された特願２０１８−１９９５２３号に基づき優先権を主張し、その内容をここに援用する。
【背景技術】
【０００２】
ＰＰＡＲは、核内ホルモン受容体スーパーファミリーの一つであり、リガンド誘導性の転写因子である。哺乳類においては、ＰＰＡＲはα、γ、δのファミリーメンバーがある。ＰＰＡＲαは、遊離脂肪酸を内因性リガンドとし、脂肪分解に関連する種々の遺伝子の発現を調節しているため、高脂血症改善薬の標的とされている。ＰＰＡＲγは、長鎖脂肪酸やプラスタグランジンなどを内因性リガンドとし、脂肪細胞の分化を促進し、インスリン抵抗性改善薬であるチアゾリジンの標的物質とされている。ＰＰＡＲδは、様々な組織において広く発現しているが、その生理活性が証明された内在性リガンドは未知であり、それ故にorphan receptorと考えられている（例えば、非特許文献１参照）。ＰＰＡＲδは、リガンド非依存的な転写活性化能を持つN-terminal domain、ＤＮＡ結合領域を持つＺｉｎｃフィンガードメイン、及びリガンド依存的な転写活性化能を持つリガンド結合ドメイン（Ligand binding domain：ＬＢＤ）で構成される。ＰＰＡＲδのＬＢＤのアミノ酸配列は、ＰＰＡＲαのＬＢＤとは７０％、ＰＰＡＲγのＬＢＤとは６８％の相同性（配列同一性）がある（例えば、非特許文献２参照）。【０００３】
近年、ＰＰＡＲδは、脂質異化・輸送・蓄積等の制御において重要な転写調節因子であることが報告されており（例えば、非特許文献３参照）、代謝異常等の治療薬等の開発の分子標的として注目されている。例えば、ＰＰＡＲδのアゴニストの摂取によって、運動持久力のような運動誘導型の効果を高められること、及び、ＰＰＡＲδのアゴニストが、運動能力向上薬となること、が報告されている（例えば、特許文献１及び非特許文献４参照）。また、ＡＭＰＫ（5' AMP-activated protein kinase）のアゴニストとＰＰＡＲδのアゴニストとを併用することによって、被験者の運動効果がより向上する（例えば、特許文献２及び非特許文献４参照）。その他、ＰＰＡＲδのアゴニスト投与により、心筋症の発症に重要な役割を果たす脂質誘発性小胞体（ＥＲ）ストレスを抑制できること（例えば、非特許文献５）や、四塩化炭素投与により誘導された肝繊維症に対して、肝保護効果及び抗繊維化効果が得られること（例えば、非特許文献６）が報告されている。【０００４】
ＰＰＡＲδのアゴニストとしては、例えば、ＧＷ５０１５１６（CAS No.:317318-70-0）を代表とするフェノキシ酢酸（phenoxyacetic acid）誘導体がある。フェノキシ酢酸誘導体の基本骨格は、カルボキシル基（-COOH）に非極性炭化水素等の長鎖状の疎水性基が結合した化学構造である。ＰＰＡＲδとそのアゴニストであるフェノキシ酢酸誘導体との複合体の構造解析の結果から、ＰＰＡＲδのリガンド結合ポケットは、アームＩ、ＩＩ、ＩＩＩ（arm I、arm II、arm III）と呼ばれる３つのトンネル状の空洞からなるＹ字型のポケットであることが判明している（例えば、非特許文献７及び８参照）。ＰＰＡＲδのアゴニストとしては、ＧＷ２３３１（CAS No.:190844-95-2）のように疎水性基が枝分かれした骨格をもつ薬剤も開発されている。【０００５】
一方で、メトホルミン（Metformin）は、ビグアニド（biguanide、ビグアナイド）系薬剤の一つであり、経口糖尿病治療薬として広く使用されている。メトホルミンは、ＡＭＰＫを活性化することで、骨格筋における糖取り込みの亢進や、肝臓における脂肪酸β酸化を制御していることが知られている（例えば、非特許文献９）。また、肝臓でミトコンドリアの Glycerophosphate dehydrogenase を抑制して糖新生を抑え、血糖を下げることも報告されている（例えば、非特許文献１０）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特表２０１０−５１４８０４号公報
【特許文献２】特表２０１１−５０７９７０号公報
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Evans et al., Nature Medicine 2004, vol. 10(4), p.355-361.
【非特許文献２】Willson et al., Journal of Medicinal Chemistry, 2000, vol. 43(4), p.527-550.
【非特許文献３】Barish et al., The Journal of Clinical Investigation, 2006, vol.116(3), p.590-597.
【非特許文献４】Narkar et al., Cell, 2008, vol.134(3), p.405-415.
【非特許文献５】Palomer et al., International Journal of Cardiology, 2014, vol.174, p.110-118.
【非特許文献６】Iwaisako et al., Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 2012, vol.109(21), p.E1369-E1376.
【非特許文献７】Xu et al., Molecular Cell, 1999, vol.3(3), p.397-403.
【非特許文献８】Wu et al., Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 2017, vol.114(13), p.E2563-E2570.
【非特許文献９】Zhou et al., Journal of Clinical Investigation, 2001, vol.108(8), p.1167-1174.
【非特許文献１０】Madiraju et al., Nature, 2014, vol.510(7506), p.542-546.
【非特許文献１１】Eikawa et al., Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 2015, vol.112(6), p.1809-1814.
【非特許文献１２】Sugden et al., Pharmacological Research, 2009, vol.60, p.141-150.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、新規なＰＰＡＲδのアゴニストを有効成分とするＰＰＡＲδ活性化剤、及びこれを有効成分とする運動耐性改善剤を提供することを主たる目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、鋭意研究した結果、メトホルミンがＰＰＡＲδのアゴニストであり、ＰＰＡＲδの転写活性を活性化させることを見出した。さらに、メトホルミンとヒトＰＰＡＲδ（ｈＰＰＡＲδ）のＬＢＤとの共結晶構造解析の結果から、メトホルミンがＰＰＡＲδのリガンド結合ポケットに入り込み、メトホルミンのビグアニド骨格の２つのアミノ基がリガンド結合ポケットの開口部付近のアミノ酸残基と相互作用して結合することによってＰＰＡＲδのＬＢＤが活性型のコンホメーションをとることを見出し、本発明を完成させた。【００１０】
すなわち、本発明に係るＰＰＡＲδ活性化剤及び運動耐性改善剤は、下記［１］〜［８］である。
［１］  グアニジン誘導体又はビグアニジン誘導体を有効成分とし、ＰＰＡＲδ（Peroxisome proliferator-activated receptor δ）の転写活性を活性化する、ＰＰＡＲδ活性化剤。
［２］  前記グアニジン誘導体及び前記ビグアニジン誘導体は、グアニジノ基又はビグアニジノ基が、ＰＰＡＲδのリガンド結合ポケットの内部表面を構成するアミノ酸残基のうち、ｈＰＰＡＲδの４１３番目のヒスチジン、２８７番目のヒスチジン、２５３番目のスレオニン、及び４３７番目のチロシンにそれぞれ相当するアミノ酸残基と水素結合をした状態で、前記リガンド結合ポケットの内部に嵌まり込み得る、前記［１］のＰＰＡＲδ活性化剤。
［３］  前記グアニジン誘導体が、下記一般式（１）
［式（１）中、Ｒ１は１価の有機基を表す。］
で表される化合物（但し、ビグアニジン誘導体を除く）である、前記［１］又は［２］のＰＰＡＲδ活性化剤。【００１１】
【化１】
2020085393.tif 000003
【００１２】
［４］  前記グアニジン誘導体が、下記一般式（１−１−１）〜（１−１−４）
［式（１−１−１）及び（１−１−２）中、Ｚ１１は酸素原子又は硫黄原子を表し、ｎ１は０又は１を表し、Ｒ１２は、炭素数１〜６の脂肪族炭化水素基を表し、ｎ１２は０〜２の整数を表し、Ｒ１３は水素原子又は炭素数１〜６の脂肪族炭化水素基を表し、Ｒ１４は置換基を有していてもよい芳香族炭化水素基を表し、ｐ１は１以上の整数を表す。
式（１−１−３）及び（１−１−４）中、Ｚ１１は酸素原子又は硫黄原子を表し、ｎ１は０又は１を表し、Ｒ１５は炭素数１〜６の脂肪族炭化水素基又はアルコキシ基を表し、ｎ１５は０〜２の整数を表し、Ｚ２は２価の連結基を表し、Ｒ５は置換基を有していてもよい芳香族炭化水素基、又は置換基を有していてもよい環式炭化水素基を表し、ｐ２は１以上の整数を表す。］
のいずれかで表される化合物である、前記［３］のＰＰＡＲδ活性化剤。【００１３】
【化２】
2020085393.tif 000004
【００１４】
【化３】
2020085393.tif 000005
【００１５】
［５］  前記グアニジン誘導体が、下記式（Ａ−１）〜（Ａ−４）、（Ｂ−１）〜（Ｂ−３）のいずれかで表される化合物である、前記［１］のＰＰＡＲδ活性化剤。【００１６】
【化４】
2020085393.tif 000006
【００１７】
【化５】
2020085393.tif 000007
【００１８】
［６］  前記ビグアニジン誘導体が、下記一般式（２）
［式（２）中、Ｒ２及びＲ３は、それぞれ独立して、水素原子又は１価の有機基を表す。Ｒ２及びＲ３がいずれも１価の有機基の場合、両者が連結して環構造を形成していてもよい。］
で表される化合物である、前記［１］〜［３］のいずれかのＰＰＡＲδ活性化剤。【００１９】
【化６】
2020085393.tif 000008
【００２０】
［７］  メトホルミン、フェンホルミン、及びブホルミンからなる群より選択される１種以上を有効成分とする、前記［１］のＰＰＡＲδ活性化剤。
［８］  前記［１］〜［７］のいずれかのＰＰＡＲδ活性化剤を有効成分とする、運動耐性改善剤。
【発明の効果】
【００２１】
本発明に係るＰＰＡＲδ活性化剤は、ＰＰＡＲδの転写活性を活性化させることができ、ＰＰＡＲδにより転写調節されている各種生理作用に影響を与えることができる。このため、当該ＰＰＡＲδ活性化剤は、運動耐性改善剤の有効成分として有用であり、代謝異常等の治療又は予防のための医薬用組成物の有効成分として有用であることが期待できる。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】ｈＰＰＡＲδのリガンド結合ポケットのアミノ酸配列である。配列中、上部に黒丸が付されたアミノ酸残基が、ｈＰＰＡＲδのリガンド結合ポケットの内部表面を構成するアミノ酸残基を示し、四角で囲われたアミノ酸残基が、グアニジン誘導体中のグアニジノ基と水素結合するアミノ酸残基である。
【図２】一般式（１）で表されるグアニジン誘導体のうち、Ｒ１が矢印方向に枝分かれした有機基である化合物と、ｈＰＰＡＲδとの結合体の構造を模式的に示した図である。
【図３】実施例１において、ＣＯＯＨ  ＦＧビーズへのメトホルミンの固定化反応の模式図である。
【図４】実施例１のＭｅｔ−ビーズを用いたアフィニティ精製において、Ｍｅｔ−ビーズから溶出された上清（右図）とＮＣ−ビーズから溶出された上清（左図）の二次元電気泳動後のゲルの銀染色像である。
【図５】ＰＰＡＲδのアミノ酸配列と、実施例１においてＴＯＦ−ＭＳにより同定されたペプチドのアミノ酸配列部分を示した図である。
【図６】実施例１において、Ｍｙｃ−ｈＰＰＡＲδの精製物及びマウスの肝臓抽出液に対して、Ｍｅｔ−ビーズを添加して得られた免疫沈降物を、抗ＰＰＡＲδ抗体を用いたウェスタンブロッティングした結果を示した図である。
【図７】実施例１において、バイオセンサーに固定化されたメトホルミンと段階希釈した精製Ｍｙｃ−ｈＰＰＡＲδとの結合解離曲線を示した図である。
【図８】実施例１において使用したＰＰＡＲδの全長及び各変異体の模式図である。
【図９】実施例１において、Ｍｙｃ−ｈＰＰＡＲδ、Ｍｙｃ−ΔＮ−ｔｅｒｍ、及びＭｙｃ−ΔＬＢＤをそれぞれ強発現する細胞の細胞抽出液からＭｅｔ−ビーズを用いて得られた相対免疫沈降量（細胞抽出液中のＭｙｃタグ付きタンパク質量を１００％とする相対量）の定量結果を示した図である。
【図１０Ａ】ＰＰＡＲδ複合体（ｈＰＰＡＲδ、ＰＧＣ１α、ＲＸＲα）がＰＰＲＥを介して転写活性化するメカニズムとメトホルミンとの関係を模式的に示した図である。
【図１０Ｂ】実施例２において、メトホルミン処理又はＧＷ５０１５１６処理を行った細胞における、ＰＰＲＥ×２−ｔｋ−ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅを用いたルシフェラーゼアッセイの結果を示した図である。
【図１１】実施例２において、メトホルミン、ＧＷ５０１５１６、又はＤＭＳＯで処理したＭｙｃ−ｈＰＰＡＲδ、ＲＸＲα、及びＰＧＣ１αの強発現細胞の細胞抽出液に対して抗Ｍｙｃ抗体を用いた免疫沈降によるＰＧＣ１αの免疫沈降量（免疫沈降物におけるＭｙｃ−ｈＰＰＡＲδ量に対するＰＧＣ１α量：［ＰＧＣ１α量］／［Ｍｙｃ−ｈＰＰＡＲδ量］）の測定結果を示した図である。
【図１２】実施例３において、低血清刺激により筋分化誘導した分化６日目のＣ２Ｃ１２細胞における、メトホルミン、ＧＷ５０１５１６、又はＤＭＳＯで処理した場合のＰＰＡＲδの標的遺伝子の相対発現量（ＤＭＳＯ処理細胞の発現量を１とする）の測定結果を示した図である。
【図１３】実施例３において、低血清刺激による筋分化誘導の分化６日目にメトホルミン、ＧＷ５０１５１６、又はＤＭＳＯで処理したＣ２Ｃ１２−ＰＰＡＲδ細胞に対して、抗ＦＬＡＧ抗体を用いたクロマチン免疫沈降を行った結果を示した図である。
【図１４】実施性４において、メトホルミン又はＧＷ５０１５１６を加えたＣ２Ｃ１２細胞のミトコンドリア活性を測定した結果を示した図である。
【図１５】実施例５において、ＰＰＡＲδ−ＬＢＤとメトホルミンとの複合体結晶（Ａ）及びＰＰＡＲδ−ＬＢＤとフェンホルミンの複合体結晶（Ｂ）の顕微鏡写真である。
【図１６】実施例５において、ＰＰＡＲδ−ＬＢＤとメトホルミンとの複合体結晶の構造を示した図である。
【図１７】実施例５において、ＰＰＡＲδ−ＬＢＤとメトホルミンとの複合体結晶中のＰＰＡＲδ−ＬＢＤのリガンド結合ポケット中のメトホルミン分子を示した図である。
【図１８】実施例５において、ＰＰＡＲδ−ＬＢＤに結合したメトホルミンとフェンホルミンの構造を比較した図である。
【図１９】実施例６において、各群の、トレーニング開始から各経過時間における電極接触回数（ＮＯＳ）の測定結果を示した図である。図１９（Ａ）は、コントロール群（図中、「cont」）とメトホルミン投与群（図中、「met」）の結果を、図１９（Ｂ）は、トレーニング群（図中、「cont＋train」）とトレーニング＋メトホルミン投与群（図中、「met＋train」）の結果である。
【図２０】実施例７において、ＰＰＡＲδとメトホルミンとの複合体結晶の構造中の、メトホルミンのグアニジノ基とＰＰＡＲδのリガンド結合ポケットの内部表面のアミノ酸残基との相互作用を示した図である。
【図２１】実施例７において、メトホルミン、ＧＷ０７４２、又はＧＷ５０１５１６と、ｈＰＰＡＲδのリガンド結合ポケットにある７つのアミノ酸残基（Ｔｙｒ４３７、Ｌｅｕ４３３、Ｍｅｔ４１７、Ｈｉｓ２８７、Ｔｈｒ２５３、Ｇｌｎ２５０、Ｐｈｅ２４６）との相互作用エネルギーを計算した結果を示した図である。
【図２２】実施例９において、化合物（Ａ−４）処理を行った細胞における、ＰＰＲＥ×２−ｔｋ−ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅを用いたルシフェラーゼアッセイの結果を示した図である。
【図２３Ａ】実施例１０において、化合物（Ａ−４）又はＧＷ０７４２処理を行った細胞における、ａｎｇｐｔｌ４遺伝子の相対発現量の測定結果を示した図である。
【図２３Ｂ】実施例１０において、化合物（Ａ−４）又はＧＷ０７４２処理を行った細胞における、ｐｄｋ４遺伝子の相対発現量の測定結果を示した図である。
【図２３Ｃ】実施例１０において、化合物（Ａ−４）又はＧＷ０７４２処理を行った細胞における、ｃｐｔ１ａ遺伝子の相対発現量の測定結果を示した図である。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
ＰＰＡＲδは、リガンド非依存的な転写活性化能を持つN-terminal domain（Ｎ−ｔｅｒｍドメイン）、ＤＮＡ結合領域を持つＺｉｎｃフィンガードメイン、及びリガンド依存的な転写活性化能を持つリガンド結合ドメイン（ＬＢＤ：Ligand binding domain）で構成される。ＬＢＤは、１２個のα−へリックスと３個のβ−シートから成り、３個目から８個目のα−ヘリックスでリガンド結合ポケット（Ligand binding pocket）が構成されている。図１に、ｈＰＰＡＲδのリガンド結合ポケットのアミノ酸配列を示す。図１に示すアミノ酸配列中、リガンド結合ポケットの内部表面を構成するのは、以下の３３アミノ酸残基である：Ａｓｎ１９１、Ｍｅｔ１９２、Ｉｌｅ２１３、Ｌｅｕ２１９、Ｇｌｕ２２３、Ｔｒｐ２２８、Ｖａｌ２４５、Ｐｈｅ２４６、Ａｒｇ２４８、Ｃｙｓ２４９、Ｇｌｎ２５０、Ｔｈｒ２５２、Ｔｈｒ２５３、Ｇｌｕ２５５、Ｔｈｒ２５６、Ｇｌｕ２５９、Ｈｉｓ２８７、Ｉｌｅ２９０、Ｐｈｅ２９１、Ｌｅｕ２９４、Ｉｌｅ２９７、Ｌｅｕ３０３、Ｖａｌ３０５、Ａｌａ３０６、Ａｓｎ３０７、Ｖａｌ３１２、Ｐｈｅ３１６、Ｌｅｕ３１７、Ｉｌｅ３２７、Ｉｌｅ３２８、Ｈｉｓ４１３、Ｍｅｔ４１７、Ｌｅｕ４３３、Ｔｙｒ４３７。
【００２４】
ｈＰＰＡＲδとＧＷ５０１５１６の複合体の構造研究から、以下のことが明らかにされている。ＧＷ５０１５１６等のフェノキシ酢酸誘導体は、そのカルボキシル基が、ＰＰＡＲδのリガンド結合ポケットの入り口（アームＩ）のアミノ酸残基と、複数の水素結合を形成することによって特異的に結合する。当該結合によって、ＰＰＡＲδの１２番目のα−へリックス（ヘリックス−１２）が、リガンド結合ポケットに蓋をするように倒し込まれ、残りの疎水性基が、非極性ポケットの中にはまり込む。この倒されたヘリックス−１２が、リガンド結合ポケットの蓋になることによって、ＰＰＡＲδの転写活性が活性化する（非特許文献７及び８）。
【００２５】
本発明に係るＰＰＡＲδ活性化剤は、ＰＰＡＲδの転写活性を活性化する薬剤であって、グアニジン誘導体又はビグアニジン誘導体を有効成分とする。グアニジン誘導体とは、グアニジノ基を有する化合物を意味する。ビグアニジン誘導体とは、ビグアニジノ基を有する化合物を意味する。本発明に係るＰＰＡＲδ活性化剤の有効成分としては、ビグアニジノ基を有するグアニジン誘導体であってもよく、グアニジノ基を有するビグアニジン誘導体であってもよい。
【００２６】
本発明に係るＰＰＡＲδ活性化剤は、リガンド結合ポケットに嵌まり込み、ＰＰＡＲδのリガンド結合ポケットの入り口（アームＩ）のアミノ酸残基とグアニジノ基又はビグアニジノ基によって複数の水素結合を形成して、ヘリックス−１２をリガンド結合ポケットに蓋をするように倒し込む。本発明に係るＰＰＡＲδ活性化剤は、ＰＰＡＲδの転写活性の活性化に必要な構造変化（ヘリックス−１２の倒し込みと固定化）を、グアニジノ基又はビグアニジノ基のみによって達成することができる。
【００２７】
具体的には、本発明に係るＰＰＡＲδ活性化剤のグアニジノ基又はビグアニジノ基が、ＰＰＡＲδのリガンド結合ポケットの内部表面を構成するアミノ酸残基のうち、ｈＰＰＡＲδの４１３番目のヒスチジン（Ｈｉｓ４１３）、２８７番目のヒスチジン（Ｈｉｓ２８７）、２５３番目のスレオニン（Ｔｈｒ２５３）、及び４３７番目のチロシン（Ｔｙｒ４３７）にそれぞれ相当するアミノ酸残基と水素結合する。これらの水素結合により、本発明に係るＰＰＡＲδ活性化剤はＰＰＡＲδのリガンド結合ポケットの入り口に配置される。これにより、ヘリックス−１２が倒されてリガンド結合ポケットに蓋がされた状態で固定され、ＰＰＡＲδが活性化される。
【００２８】
本発明に係るＰＰＡＲδ活性化剤のグアニジノ基又はビグアニジノ基は、ＰＰＡＲδのリガンド結合ポケットの内部表面を構成するアミノ酸残基のうち、ｈＰＰＡＲδの２４６番目のフェニルアラニン（Ｐｈｅ２４６）、４１７番目のメチオニン（Ｍｅｔ４１７）、４３３番目のロイシン（Ｌｅｕ４３３）及び２５０番目のグルタミン（Ｇｌｎ２５０）にそれぞれ相当するアミノ酸残基とも相互作用する。グアニジノ基又はビグアニジノ基とＰＰＡＲδのリガンド結合ポケットの入り口（アームＩ）との相互作用は、カルボキシ基を介して結合するフェノキシ酢酸誘導体よりも安定であり、効率よくヘリックス−１２を倒して固定することができるため、フェノキシ酢酸誘導体よりもＰＰＡＲδの活性化作用が大きいと期待できる。
【００２９】
本発明に係るＰＰＡＲδ活性化剤の有効成分であるグアニジン誘導体は、グアニジノ基が、ｈＰＰＡＲδのＨｉｓ４１３、Ｈｉｓ２８７、Ｔｈｒ２５３、及びＴｙｒ４３７と水素結合を形成した状態で、ＰＰＡＲδのリガンド結合ポケットの内部に嵌まり込むことができる化合物であれば、特に限定されるものではない。同様に、本発明に係るＰＰＡＲδ活性化剤の有効成分であるビグアニジン誘導体は、ビグアニジノ基が、ｈＰＰＡＲδのＨｉｓ４１３、Ｈｉｓ２８７、Ｔｈｒ２５３、及びＴｙｒ４３７と水素結合を形成した状態でＰＰＡＲδのリガンド結合ポケットの内部に嵌まり込むことができる化合物であれば、特に限定されるものではない。
【００３０】
「化合物が、リガンド結合ポケットの内部に嵌まり込む」とは、当該化合物がリガンド結合ポケット内に収まっていればよく、ポケット全体を占拠してもよく、ポケットの一部のみを占拠するものであってもよい。本発明に係るＰＰＡＲδ活性化剤の有効成分としては、ＰＰＡＲδのアームＩの一部又は全部のみを占拠する化合物であってもよく、ＰＰＡＲδのアームＩとアームＩＩの一部又は全部のみとを占拠する化合物であってもよく、ＰＰＡＲδのアームＩとアームＩＩＩの一部又は全部のみとを占拠する化合物であってもよい。また、ＰＰＡＲδのアームＩとアームＩＩの一部又は全部とアームＩＩＩの一部又は全部とを占拠する分岐構造を備える化合物であってもよい。
【００３１】
本発明に係るＰＰＡＲδ活性化剤の有効成分のうちグアニジン誘導体としては、例えば、下記一般式（１）で表される化合物（但し、ビグアニジン誘導体を除く）（以下、「化合物（１）」）が挙げられる。本発明に係るＰＰＡＲδ活性化剤の有効成分のうちビグアニジン誘導体としては、例えば、下記一般式（２）で表される化合物（以下、「化合物（２）」）が挙げられる。一般式（１）中、Ｒ１は１価の有機基を表す。一般式（２）中、Ｒ２及びＲ３は、それぞれ独立して、水素原子又は１価の有機基を表す。なお、化合物（２）のうち、Ｒ２及びＲ３がいずれも水素原子の化合物がメトホルミンである。
【００３２】
【化７】
2020085393.tif 000009
【００３３】
Ｒ１、Ｒ２、及びＲ３の１価の有機基は、グアニジノ基又はビグアニジノ基が、ＰＰＡＲδのリガンド結合ポケットの内部表面を構成するアミノ酸残基のうち、ｈＰＰＡＲδのＨｉｓ４１３、Ｈｉｓ２８７、Ｔｈｒ２５３、及びＴｙｒ４３７に相当するアミノ酸残基と水素結合を形成した状態で、化合物全体がＰＰＡＲδのリガンド結合ポケットの内部に嵌まり込むことができる大きさや形状の有機基であれば、特に限定されるものではない。例えば、当該１価の有機基は、酸性基であってもよく、塩基性基であってもよい。また、親水性基であってもよく、疎水性基であってもよい。
【００３４】
当該１価の有機基は、直鎖状であってもよく、分岐鎖状であってもよく、環状構造を備えていてもよい。図２は、化合物（１）のうち、Ｒ１が、矢印方向に枝分かれした分岐鎖状の有機基である化合物とＰＰＡＲδとの結合体の構造を模式的に示した図である。この枝分かれした有機基は、アームＩＩとアームＩＩＩにそれぞれ伸びている。
【００３５】
当該１価の有機基としては、例えば、−（Ｚ１）−Ｒ４、（Ｚ１は、単結合、酸素原子、硫黄原子、−ＮＨ−、−Ｎ＝ＣＨ−、−ＣＯ−、−ＣＯ−Ｏ−、−Ｏ−ＣＯ−、−ＣＯ−ＮＨ−、又は−ＮＨ−ＣＯ−を表す。Ｒ４は、脂肪族炭化水素基、芳香族炭化水素基、又は複素環式基を表す。）、カルボキシ基、ニトロ基、シアノ基、ヒドロキシ基、アミノ基等が挙げられる。
【００３６】
Ｒ４が脂肪族炭化水素基の場合、当該脂肪族炭化水素基としては、特に限定されるものではなく、例えば、炭素数１〜２０の飽和又は不飽和の炭化水素基が挙げられる。当該１価の脂肪族炭化水素基としては、鎖状炭化水素基であってもよく、環式炭化水素基であってもよい。１価の鎖状炭化水素基としては、具体的にはメチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、ｎ−ブチル基、ｔ−ブチル基、ｎ−ペンチル基、イソペンチル基、ネオペンチル基、ｔｅｒｔ−ペンチル基、ｎ−ヘキシル基、イソヘキシル基、２−エチルヘキシル基、ｎ−ヘプチル基、ｎ−オクチル基、ｎ−ノニル基、ｎ−デシル基等が挙げられる。１価の環式炭化水素基としては、シクロプロパン、シクロブタン、シクロペンタン、シクロヘキサン、シクロヘプタン、シクロオクタン、アダマンタン、ジシクロペンタジエン等の脂環式化合物から１個の水素原子を除いた基が挙げられる。これらの脂肪族炭化水素基は、１個以上の置換基を有していてもよい。置換基としては、例えば、ハロゲン原子（フッ素原子、塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子）、トリフルオロメチル基、カルボキシ基、ニトロ基、シアノ基、ヒドロキシ基、アミノ基、ケトン基、アルコキシ基、芳香族炭化水素基、複素環式基、複数環連結基等が挙げられる。芳香族炭化水素基、複素環式基としては、後記のＲ４として取り得る基と同様のものが挙げられる。複数環連結基としては、後記の１価の有機基として取り得る複数環連結基と同様のものが挙げられる。また、アルコキシ基としては、具体的にはメトキシ基、エトキシ基、プロピルオキシ基、イソプロピルオキシ基、ｎ−ブトキシ基、ｔ−ブトキシ基、ｎ−ペンチルオキシ基、イソペンチルオキシ基、ネオペンチルオキシ基、ｔｅｒｔ−ペンチルオキシ基、ｎ−ヘキシルオキシ基、イソヘキシルオキシ基等が挙げられる。脂肪族炭化水素基が、置換基として芳香族炭化水素基、複素環式基、又は複数環連結基を有する場合、当該脂肪族炭化水素基は、炭素数１〜６であることが好ましい。
【００３７】
Ｒ４が芳香族炭化水素基の場合、当該芳香族炭化水素基としては、特に限定されるものではなく、例えば、ベンゼン、ナフタレン、アントラセン、フェナントレン等の芳香族環式化合物から１個の水素原子を除いた基が挙げられる。これらの芳香族炭化水素基は、１個以上の置換基を有していてもよい。置換基としては、例えば、ハロゲン原子、トリフルオロメチル基、カルボキシ基、ニトロ基、シアノ基、ヒドロキシ基、アミノ基、ケトン基、アルコキシ基、脂肪族炭化水素基等が挙げられる。脂肪族炭化水素基としては、前記のＲ４として取り得る基と同様のものが挙げられる。アルコキシ基としては、前記の脂肪族炭化水素基の置換基として挙げられた基と同様のものが挙げられる。
【００３８】
Ｒ４が複素環式基の場合、当該複素環式基としては、特に限定されるものではなく、例えば、ピロリジン、ピロール、イミダゾール、ピラゾール、イミダゾリン、トリアゾール、テトラゾール、オキサゾール、チアゾール、テトラヒドロフラン、フラン、ジオキソラン、テトラヒドロチオフェン、チオフェン等の５員複素環式化合物；ピペリジン、ピリジン、ピリミジン、ピラジン、ピリダジン、モルホリン、チアジン、オキサン、ピリリウムイオン、ジオキサン、チアン、チアピラン等の６員複素環式化合物；インドール、イソインドール、ベンゾイミダゾール、プリン、ベンゾトリアゾール、キノリン、イソキノリン、キナゾリン、キノキサリン、シンノリン、プテリジン、クロメン、イソクロメン、キサンテン、カルバゾール、ベンゾ−Ｃ−シンノリン等の縮合複素環式化合物等の複素環式化合物から１個の水素原子を除いた基が挙げられる。これらの複素環式基は、１個以上の置換基を有していてもよい。置換基としては、例えば、ハロゲン原子、トリフルオロメチル基、カルボキシ基、ニトロ基、シアノ基、ヒドロキシ基、アミノ基、ケトン基、アルコキシ基、脂肪族炭化水素基等が挙げられる。脂肪族炭化水素基としては、前記のＲ４として取り得る基と同様のものが挙げられる。アルコキシ基としては、前記の脂肪族炭化水素基の置換基として挙げられた基と同様のものが挙げられる。
【００３９】
当該１価の有機基としては、２以上の環が単結合又は２価の連結基で連結された基（複数環連結基）であってもよい。当該環としては、特に限定されるものではなく、脂環式化合物であってもよく、芳香族環式化合物であってもよく、複素環式化合物であってもよい。また、連結される環は、同種の環であってもよく、異種の環であってもよい。具体的には、前述の脂環式化合物、芳香族環式化合物、又は複素環式化合物と同様のものを用いることができる。
【００４０】
複数環連結基において、環同士を連結する２価の連結基としては、例えば、２価の鎖状脂肪族炭化水素基、−Ｏ−、−Ｓ−、−ＮＨ−、−Ｎ＝ＣＨ−、−ＣＯ−、及びこれらの２個以上が結合した基が挙げられる。当該２価の鎖状脂肪族炭化水素基としては、直鎖状であってもよく、分岐鎖状であってもよい。また、飽和結合のみからなる２価脂肪族炭化水素基であってもよく、１個以上の不飽和結合を有している２価脂肪族炭化水素基であってもよい。当該２価の鎖状脂肪族炭化水素基としては、例えば、炭素数１〜１０のアルキレン基、アルケニレン基等を用いることができる。
【００４１】
２価の鎖状脂肪族炭化水素基、−Ｏ−、−Ｓ−、−ＮＨ−、−Ｎ＝ＣＨ−、及び−ＣＯ−の２個以上が結合した基としては、例えば、−ＣＯ−Ｏ−、−Ｏ−ＣＯ−、−ＣＯ−ＮＨ−、−ＮＨ−ＣＯ−、−（ＣＨ２）ｎ−Ｏ−（ＣＨ２）ｍ−、−（ＣＨ２）ｎ−Ｓ−（ＣＨ２）ｍ−（ｎとｍはそれぞれ独立して０以上であり、ｎ＋ｍ≧１を満たす整数である。なお、−（ＣＨ２）０−は単結合を意味する。）等が挙げられる。
【００４２】
一般式（２）において、Ｒ２及びＲ３がいずれも１価の有機基の場合、両者が連結して環構造を形成していてもよい。Ｒ２及びＲ３が連結して形成される環としては、脂環式化合物であってもよく、芳香環式化合物であってもよく、複素環式化合物であってもよい。脂環式化合物、芳香環式化合物、複素環式化合物としては、それぞれ、前記のＲ４として取り得る基と同様のものが挙げられる。さらに、これらの環式化合物は、置換基を有していてもよい。当該置換基としては、前記Ｒ１、Ｒ２、及びＲ３における１価の有機基として取り得る基と同様のものが挙げられる。
【００４３】
化合物（１）としては、例えば、下記一般式（１−１）で表される化合物（化合物（１−１））が挙げられる。
【００４４】
【化８】
2020085393.tif 000010
【００４５】
一般式（１−１）中、Ｚ１１は酸素原子又は硫黄原子を表し、ｎ１は０又は１を表す。
一般式（１−１）中、Ｒ１１は、置換基を有していてもよい炭素数１〜６の脂肪族炭化水素基、置換基を有していてもよい芳香族炭化水素基、又は置換基を有していてもよい複数環連結基を表す。置換基を有していてもよい炭素数１〜６の脂肪族炭化水素基、及び置換基を有していてもよい芳香族炭化水素基としては、それぞれ、前記のＲ４として取り得る基と同様のものが挙げられる。置換基を有していてもよい複数環連結基としては、前記の１価の有機基として取り得る複数環連結基と同様のものが挙げられる。
【００４６】
化合物（１−１）としては、例えば、下記一般式（１−１−１）で表される化合物（化合物（１−１−１））及び一般式（１−１−２）で表される化合物（化合物（１−１−２））が挙げられる。
【００４７】
【化９】
2020085393.tif 000011
【００４８】
一般式（１−１−１）中、Ｚ１１及びｎ１は、一般式（１−１）と同じである。
一般式（１−１−２）中、ｐ１は、１以上の整数であり、１〜６の整数であることが好ましく、１〜３の整数であることがより好ましく、１が特に好ましい。
【００４９】
一般式（１−１−１）及び一般式（１−１−２）中、ｎ１２は、０〜２の整数を表す。
一般式（１−１−１）及び一般式（１−１−２）中、Ｒ１２は、炭素数１〜６の脂肪族炭化水素基を表す。当該脂肪族炭化水素基としては、前記のＲ４として取り得る基と同様のものが挙げられる。
一般式（１−１−１）及び一般式（１−１−２）中、Ｒ１３は、水素原子又は炭素数１〜６の脂肪族炭化水素基を表す。当該脂肪族炭化水素基としては、前記のＲ４として取り得る基と同様のものが挙げられる。
一般式（１−１−１）及び一般式（１−１−２）中、Ｒ１４は、置換基を有していてもよい芳香族炭化水素基を表す。当該芳香族炭化水素基としては、前記のＲ４として取り得る基と同様のものが挙げられる。
【００５０】
化合物（１−１−１）としては、Ｚ１１が酸素原子又は硫黄原子であり、ｎ１が１であり、ｎ１２が０又は１であり、Ｒ１２が、メチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、ｎ−ブチル基、ｔ−ブチル基、ｎ−ペンチル基、イソペンチル基、ネオペンチル基、ｔｅｒｔ−ペンチル基、ｎ−ヘキシル基、又はイソヘキシル基であり、Ｒ１３が水素原子、メチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、ｎ−ブチル基、ｔ−ブチル基、ｎ−ペンチル基、イソペンチル基、ネオペンチル基、ｔｅｒｔ−ペンチル基、ｎ−ヘキシル基、又はイソヘキシル基であり、Ｒ１４が置換基を有していてもよいフェニル基である化合物が好ましい。中でも、Ｚ１１が酸素原子又は硫黄原子であり、ｎ１が１であり、ｎ１２が０又は１であり、Ｒ１２が、メチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、ｎ−ブチル基、又はｔ−ブチル基であり、Ｒ１３が水素原子、メチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、ｎ−ブチル基、又はｔ−ブチル基であり、Ｒ１４が置換基を有していないフェニル基、又は、ハロゲン原子、トリフルオロメチル基、及びメチル基からなる群より選択される置換基を１若しくは２個有しているフェニル基である化合物が好ましく、Ｚ１１が酸素原子又は硫黄原子であり、ｎ１が１であり、ｎ１２が０又は１であり、Ｒ１２が、メチル基であり、Ｒ１３が水素原子又はメチル基であり、Ｒ１４が置換基を有していないフェニル基、又は、ハロゲン原子、トリフルオロメチル基、及びメチル基からなる群より選択される置換基を１若しくは２個有しているフェニル基である化合物がより好ましい。
【００５１】
化合物（１−１−２）としては、ｐ１が１であり、ｎ１２が０又は１であり、Ｒ１２が、メチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、ｎ−ブチル基、ｔ−ブチル基、ｎ−ペンチル基、イソペンチル基、ネオペンチル基、ｔｅｒｔ−ペンチル基、ｎ−ヘキシル基、又はイソヘキシル基であり、Ｒ１３が水素原子、メチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、ｎ−ブチル基、ｔ−ブチル基、ｎ−ペンチル基、イソペンチル基、ネオペンチル基、ｔｅｒｔ−ペンチル基、ｎ−ヘキシル基、又はイソヘキシル基であり、Ｒ１４が置換基を有していてもよいフェニル基である化合物が好ましい。中でも、ｐ１が１であり、ｎ１２が０又は１であり、Ｒ１２が、メチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、ｎ−ブチル基、又はｔ−ブチル基であり、Ｒ１３が水素原子、メチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、ｎ−ブチル基、又はｔ−ブチル基であり、Ｒ１４が置換基を有していないフェニル基、又は、ハロゲン原子、トリフルオロメチル基、及びメチル基からなる群より選択される置換基を１若しくは２個有しているフェニル基である化合物が好ましく、ｐ１が１であり、ｎ１２が０又は１であり、Ｒ１２が、メチル基であり、Ｒ１３が水素原子又はメチル基であり、Ｒ１４が置換基を有していないフェニル基、又は、ハロゲン原子、トリフルオロメチル基、及びメチル基からなる群より選択される置換基を１若しくは２個有しているフェニル基である化合物がより好ましい。
【００５２】
化合物（１−１−１）としては、例えば、下記式（Ａ−１）〜（Ａ−２）の化合物が挙げられる。化合物（１−１−２）としては、例えば、下記式（Ａ−３）〜（Ａ−４）の化合物が挙げられる。
【００５３】
【化１０】
2020085393.tif 000012
【００５４】
化合物（１−１）としては、例えば、下記一般式（１−１−３）で表される化合物（化合物（１−１−３））及び下記一般式（１−１−４）で表される化合物（化合物（１−１−４））も挙げられる。
【００５５】
【化１１】
2020085393.tif 000013
【００５６】
一般式（１−１−３）中、Ｚ１１及びｎ１は、一般式（１−１）と同じである。
一般式（１−１−４）中、ｐ２は、１以上の整数であり、１〜６の整数であることが好ましく、１〜３の整数であることがより好ましく、１が特に好ましい。
【００５７】
一般式（１−１−３）及び一般式（１−１−４）中、ｎ１５は、０〜２の整数を表す。
一般式（１−１−３）及び一般式（１−１−４）中、Ｒ１５は、炭素数１〜６の脂肪族炭化水素基又はアルコキシ基を表す。当該脂肪族炭化水素基としては、前記のＲ４として取り得る基と同様のものが挙げられる。アルコキシ基としては、前記の脂肪族炭化水素基の置換基として挙げられた基と同様のものが挙げられる。
【００５８】
一般式（１−１−３）及び一般式（１−１−４）中、Ｚ２は、２価の連結基である。当該２価の連結基としては、前記複数環連結基において環同士を連結する２価の連結基として挙げられた基と同様のものが挙げられる。化合物（１−１−３）及び化合物（１−１−４）としては、Ｚ２が、−（ＣＨ２）２−、−（ＣＨ２）３−、−Ｏ−ＣＨ２−、−ＣＨ２−Ｏ−、−ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ２−、−Ｓ−ＣＨ２−、−ＣＨ２−Ｓ−、−ＣＨ２−Ｓ−ＣＨ２−、−ＮＨ−ＣＨ２−、−ＣＨ２−ＮＨ−、又は−ＣＨ２−ＮＨ−ＣＨ２−である化合物が好ましい。
【００５９】
一般式（１−１−３）及び一般式（１−１−４）中、Ｒ５は、置換基を有していてもよい芳香族炭化水素基、又は置換基を有していてもよい環式炭化水素基である。置換基を有していてもよい芳香族炭化水素基としては、前記のＲ４として取り得る基と同様のものが挙げられる。置換基を有していてもよい複数環連結基としては、前記の１価の有機基として取り得る複数環連結基と同様のものが挙げられる。化合物（１−１−３）及び化合物（１−１−４）としては、Ｒ５が、置換基を有していてもよいフェニル基、又は置換基を有していてもよいシクロヘキシル基である化合物が好ましい。
【００６０】
化合物（１−１−３）としては、Ｚ１１が酸素原子又は硫黄原子であり、ｎ１が１であり、ｎ１５が０又は１であり、Ｒ１５が、メチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、メトキシ基、エトキシ基、又はプロピルオキシ基であり、Ｚ２が−（ＣＨ２）２−、−（ＣＨ２）３−、−Ｏ−ＣＨ２−、−ＣＨ２−Ｏ−、−ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ２−、−Ｓ−ＣＨ２−、−ＣＨ２−Ｓ−、−ＣＨ２−Ｓ−ＣＨ２−、−ＮＨ−ＣＨ２−、−ＣＨ２−ＮＨ−、又は−ＣＨ２−ＮＨ−ＣＨ２−であり、Ｒ５が置換基を有していてもよいフェニル基、又は置換基を有していてもよいシクロヘキシル基である化合物が好ましく、Ｚ１１が酸素原子又は硫黄原子であり、ｎ１が１であり、ｎ１５が０又は１であり、Ｒ１５が、メチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、メトキシ基、エトキシ基、又はプロピルオキシ基であり、Ｚ２が−（ＣＨ２）２−、−（ＣＨ２）３−、−Ｏ−ＣＨ２−、−ＣＨ２−Ｏ−、−ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ２−、−Ｓ−ＣＨ２−、−ＣＨ２−Ｓ−、又は−ＣＨ２−Ｓ−ＣＨ２−であり、Ｒ５が置換基を有していていないシクロヘキシル基、置換基を有していていないフェニル基、又はハロゲン原子、トリフルオロメチル基、及びメチル基からなる群より選択される置換基を１若しくは２個有しているフェニル基である化合物がより好ましい。特に、化合物（１−１−３）としては、Ｚ１１が硫黄原子であり、ｎ１が１であり、ｎ１５が０又は１であり、Ｒ１５が、メチル基又はメトキシ基であり、Ｚ２が−Ｏ−ＣＨ２−、−ＣＨ２−Ｏ−、又は−ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ２−であり、Ｒ５が置換基を有していていないシクロヘキシル基又は置換基を有していていないフェニル基である化合物が好ましい。
【００６１】
化合物（１−１−４）としては、ｐ２が１であり、ｎ１５が０又は１であり、Ｒ１５が、メチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、メトキシ基、エトキシ基、又はプロピルオキシ基であり、Ｚ２が−（ＣＨ２）２−、−（ＣＨ２）３−、−Ｏ−ＣＨ２−、−ＣＨ２−Ｏ−、−ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ２−、−Ｓ−ＣＨ２−、−ＣＨ２−Ｓ−、−ＣＨ２−Ｓ−ＣＨ２−、−ＮＨ−ＣＨ２−、−ＣＨ２−ＮＨ−、又は−ＣＨ２−ＮＨ−ＣＨ２−であり、Ｒ５が置換基を有していてもよいフェニル基、又は置換基を有していてもよいシクロヘキシル基である化合物が好ましく、ｐ２が１であり、ｎ１５が０又は１であり、Ｒ１５が、メチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、メトキシ基、エトキシ基、又はプロピルオキシ基であり、Ｚ２が−（ＣＨ２）２−、−（ＣＨ２）３−、−Ｏ−ＣＨ２−、−ＣＨ２−Ｏ−、−ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ２−、−Ｓ−ＣＨ２−、−ＣＨ２−Ｓ−、又は−ＣＨ２−Ｓ−ＣＨ２−であり、Ｒ５が置換基を有していていないシクロヘキシル基、置換基を有していていないフェニル基、又はハロゲン原子、トリフルオロメチル基、及びメチル基からなる群より選択される置換基を１若しくは２個有しているフェニル基である化合物がより好ましい。特に、化合物（１−１−３）としては、ｐ２が１であり、ｎ１５が０又は１であり、Ｒ１５が、メチル基又はメトキシ基であり、Ｚ２が−Ｏ−ＣＨ２−、−ＣＨ２−Ｏ−、又は−ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ２−であり、Ｒ５が置換基を有していていないシクロヘキシル基又は置換基を有していていないフェニル基である化合物が好ましい。
【００６２】
化合物（１−１−４）としては、例えば、Ｎ−（｛４−［（ベンジルオキシ）メチル］フェニル｝メチル）グアニジン臭化水素酸塩（PubChem CID:51131487）（以下、化合物（Ｂ−１））、Ｎ−（｛３−［（シクロヘキシルオキシ）メチル]フェニル｝メチル）グアニジンヨウ化水素（PubChem CID:53598567）（以下、化合物（Ｂ−２））、及びＮ−｛［４−（ベンジルオキシ）−３−メトキシフェニル］メチル｝グアニジンヨウ化水素（PubChem CID:16261695）（以下、化合物（Ｂ−３））等が挙げられる。
【００６３】
【化１２】
2020085393.tif 000014
【００６４】
化合物（２）としては、例えば、下記一般式（２−１）で表される化合物（化合物（２−１））が挙げられる。
【００６５】
【化１３】
2020085393.tif 000015
【００６６】
一般式（２−１）中、Ｒ２１及びＲ２２は、それぞれ独立して、水素原子又は置換基を有していてもよい炭素数１〜６の脂肪族炭化水素基を表す。当該脂肪族炭化水素基としては、前記のＲ４として取り得る基と同様のものが挙げられる。
【００６７】
化合物（２−１）としては、メトホルミン、ブホルミン（Buformin）、フェンホルミン（Phenformin）等が挙げられる。
【００６８】
ＰＰＡＲδのリガンド結合ポケットの結晶構造解析の結果は公開済である（非特許文献７又は８）。このため、化合物（１）又は化合物（２）が、ＰＰＡＲδのリガンド結合ポケットの内部に嵌まり込むことができる大きさや形状であるかどうかは、ＰＰＡＲδのリガンド結合ポケットの構造データを利用することにより、判別することができる。例えば、ｈＰＰＡＲδのリガンド結合ポケットの形状は、分子グラフィックスソフトウェアＰｙＭＯＬ（https://www.pymol.org）に、後記実施例５の表１〜６３のデータを組み込んで描画される３次元構造体の形状である。つまり、グアニジノ基とビグアニジノ基の少なくとも一方を備え、かつ当該３次元構造体に内包可能な形状の化合物は、本発明に係るＰＰＡＲδ活性化剤の有効成分に含まれる。
【００６９】
本発明に係るＰＰＡＲδ活性化剤を、ＰＰＡＲδを発現している細胞内に導入することにより、当該細胞内のＰＰＡＲδの転写活性を活性化させることができる。本発明に係るＰＰＡＲδ活性化剤で処理する細胞は、生体内に存在する細胞であってもよく、培養容器内で培養される細胞であってもよい。処理対象の細胞が培養容器内で培養されている細胞の場合には、当該細胞をＰＰＡＲδ活性化剤を含む培地中で培養することによって、エンドサイトーシスを利用して当該ＰＰＡＲδ活性化剤を細胞内に取り込ませることができる。その他、リポフェクション法、リン酸カルシウム沈殿法、酢酸リチウム法、エレクトロポレーション法等の公知の導入方法でＰＰＡＲδ活性化剤を細胞内に導入させてもよい。
【００７０】
ＰＰＡＲδ活性化剤により処理する細胞が動物の生体内の細胞の場合、ＰＰＡＲδ活性化剤を動物に投与する投与経路は、特に限定されるものではない。例えば、本発明に係るＰＰＡＲδ活性化剤の投与経路としては、経口投与、経静脈投与、腹腔内投与、注腸投与等が挙げられる。
【００７１】
本発明に係るＰＰＡＲδ活性化剤が投与される動物は、特に限定されるものではなく、ヒトであってもよく、ヒト以外の動物であってもよい。非ヒト動物としては、ウシ、ブタ、ウマ、ヒツジ、ヤギ、サル、イヌ、ネコ、ウサギ、マウス、ラット、ハムスター、モルモット等の家畜や実験動物が好ましい。
【００７２】
本発明に係るＰＰＡＲδ活性化剤は、通常の方法によって、散剤、顆粒剤、カプセル剤、錠剤、チュアブル剤、徐放剤などの経口用固形剤、溶液剤、シロップ剤などの経口用液剤、注射剤、注腸剤、スプレー剤、貼付剤、軟膏剤などに製剤化することができる。製剤化は、製剤上の必要に応じて、賦形剤、結合剤、滑沢剤、崩壊剤、流動化剤、溶剤、溶解補助剤、緩衝剤、懸濁化剤、乳化剤、等張化剤、安定化剤、防腐剤、抗酸化剤、矯味矯臭剤、着色剤等を配合して常法により行うことができる。
【００７３】
本発明に係るＰＰＡＲδ活性化剤の投与量は、投与された細胞のＰＰＡＲδの転写活性を投与前よりも強くさせるために十分な量であればよく、処理対象の動物の生物種、性別、年齢、体重、用法（投与経路、剤型、１日当たりの投与回数など）等を考慮して適宜決定される。例えば、成人（体重６０ｋｇとして）に対する有効成分の１日当たりの投与量は、ＰＰＡＲδ活性化剤の有効成分（グアニジン誘導体又はビグアニジン誘導体）として０．０１ｍｇ〜１０ｇが好ましく、１ｍｇ〜５ｍｇがより好ましく、１００ｍｇ〜１ｇがさらに好ましい。このような投与量を１回又は数回に分けて投与することができる。
【００７４】
本発明に係るＰＰＡＲδ活性化剤は、ＰＰＡＲδの転写活性を活性化することによって治療効果が期待できる各種疾患の治療又は予防のための医薬用組成物の有効成分として好適である。当該疾患としては、例えば、糖尿病、肥満等の各種の代謝異常疾患、心筋症等のＥＲストレスにより生ずる疾患、肝繊維症等が挙げられる。
【００７５】
本発明に係るＰＰＡＲδ活性化剤は、他のＰＰＡＲδアゴニストと同様に、運動耐性改善剤の有効成分として有用である。ＰＰＡＲδ活性化による運動耐性改善とは、運動耐性を改善し、運動した際の疲労を抑制するとともに、可能な運動量を増大し、また、一定の運動量がもたらす効果を増大させることを意味する。運動耐性改善剤を服薬することにより、服薬しない状態よりも、同等の負荷の運動をより長時間行うことができ、またその運動による効果が高められるようになる。その結果、肥満、糖尿病などの生活習慣病が改善すると期待される。加えて、運動効果を高めることは、健康増進にもつながることが期待できる。本発明に係るＰＰＡＲδ活性化剤を含む運動耐性改善剤は、ＡＭＰＫをも含有するか、ＡＭＰＫを併用することが好ましい。
【００７６】
ＰＰＡＲδ活性が向上すると、ミトコンドリア活性も向上する。このため、本発明に係るＰＰＡＲδ活性化剤は、ミトコンドリア活性が向上することによって治療効果が期待できる各種疾患の治療又は予防のための医薬用組成物の有効成分として好ましい。例えば、ミトコンドリア活性が向上すると、免疫細胞も活性化されることから、本発明に係るＰＰＡＲδ活性化剤は、免疫賦活化剤として有効であり、免疫療法のための医薬用組成物の有効成分とすることができる。また、本発明に係るＰＰＡＲδ活性化剤は、メトホルミン（非特許文献１１）と同様に、免疫チェックポイント阻害剤のようながん免疫治療薬との併用にも有効である。
【実施例】
【００７７】
次に、実施例等により本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらの例によって限定されるものではない。【００７８】
［実施例１］
メトホルミンを固定したＦＧ  ｂｅａｄｓ（登録商標）を用いたアフィニティ精製法により、メトホルミンの生体内での標的分子を探索した。メトホルミンの標的の探索には、ヒト肝臓癌由来細胞株ＨｅｐＧ２細胞の細胞抽出液を用いた。【００７９】
＜Ｍｅｔ−ビーズの作製＞
メトホルミンを固定化したＦＧ  ｂｅａｄｓ（以下、「Ｍｅｔ−ビーズ」と称する。）を作製した。固定化の方法は、ＣＯＯＨ  ＦＧビーズの製造元から供与されたプロトコールに従った。具体的には、まず、Ｎ，Ｎ’−ジメチルホルムアミドで平衡化したＣＯＯＨ  ＦＧビーズ（多摩川精機製社製）のリンカー末端のカルボン酸とＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）とを脱水縮合させることでＮＨＳ体を得た。次いで、得られたＮＨＳ体にメトホルミンを添加し、メトホルミンのＮＨ２基とＮＨＳエステルとを反応させてＣＯＯＨ  ＦＧビーズのＣＯＯＨ基とメトホルミンのＮＨ２基とをアミド結合させて固定化した。ＣＯＯＨ  ＦＧビーズへのメトホルミンの固定化反応の模式図を図３に示す。ＣＯＯＨ  ＦＧビーズのうち、メトホルミンに未結合のＣＯＯＨ基は、アミノエタノールによりマスキングした。マスキング後のＭｅｔ−ビーズは、洗浄した後に５０容量％メタノール水に懸濁して、以降の実験に用いた。【００８０】
また、対照として、ＣＯＯＨ  ＦＧビーズをアミノエタノールによりマスキングし、洗浄した後に５０容量％メタノール水に懸濁したものを、メトホルミン未固定のビーズ（以下、「ＮＣ−ビーズ」と称する。）として、以降の実験に用いた。【００８１】
＜Ｍｅｔ−ビーズを用いたアフィニティ精製＞
作製したＭｅｔ−ビーズを、ＫＣｌバッファー（１００ｍＭ  ＫＣｌ、０．１２６ｇ／ｍＬ  グリセロール、２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．９）、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２、２００μＭ  ＣａＣｌ２、０．２ｍＭ  ＥＤＴＡ、  ０．１％  ＮＰ−４０）に懸濁した後、磁気分離を行って上清を廃棄した。次いで、このＭｅｔ−ビーズに、２００μＬのＫＣｌバッファーを加えて超音波分散装置でビーズを分散させた後に磁気分離により上清を廃棄するという洗浄処理を３回繰り返した。【００８２】
ヒト肝臓癌由来細胞株ＨｅｐＧ２細胞の細胞抽出液を、タンパク質濃度が３ｍｇ／ｍＬになるように前記ＫＣｌバッファーで希釈し、得られた希釈液を遠心分離（５ｋｒｐｍ／４℃／３０分間）して上清を分取することで不溶性画分を除去した。この上清４００μＬに、洗浄後のＭｅｔ−ビーズを加えて分散させ、４℃のローテイターで４時間転倒攪拌して反応させた。反応後、磁気分離して上清を廃棄し、回収したＭｅｔ−ビーズに対して、２００μＬのＫＣｌバッファーを加えて超音波分散装置でビーズを分散させた後に磁気分離により上清を廃棄するという洗浄処理を４回繰り返した。洗浄後のＭｅｔ−ビーズに、２Ｄサンプルバッファー（６０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．８）、７Ｍ  Ｕｒｅａ、２Ｍ  Ｔｈｉｏｕｒｅａ、１％  ＣＨＡＰＳ、１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、１×ｐｒｏｔｅａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ、１０ｍＭ  ＤＴＴ、１×ＢＰＢ）を４０μＬ加えて撹拌し、室温で１０分間静置した。その後さらに、４μＬのアクリルアミド水溶液（７１ｍｇ／ｍＬ）を加えて懸濁し、室温で１０分間静置した後、磁気分離して上清を回収した。回収した上清を、アガーゲル（ＰＩ：ｐＨ３−１０、ｅ−ＰＡＧＥＬ、ＡＴＴＯ社製）を用いて二次元電気泳動し、泳動後のゲルを銀染色して、Ｍｅｔ−ビーズから溶出されたタンパク質を検出した。メトホルミン未固定のＮＣ−ビーズについても同様の実験を行い、銀染色後のゲルを比較して、Ｍｅｔ−ビーズ特異的にみられるスポットを目視により確認した。Ｍｅｔ−ビーズから溶出された上清（右図）とＮＣ−ビーズから溶出された上清（左図）の二次元電気泳動後のゲルの銀染色像を図４に示す。【００８３】
Ｍｅｔ−ビーズから溶出された上清の銀染色像には、ＮＣ−ビーズから溶出された上清の銀染色像にはみられない特異的な２個のスポット（図４中、矢頭で示したスポット）が観察された。この２個のスポットのゲルをそれぞれ切り出して回収し、ＴＯＦ−ＭＳ（飛行時間型質量分析計）により解析した。その結果、どちらのスポットのタンパク質も、ＰＰＡＲδ（Peroxisome proliferator-activated receptor δ）であると同定された。図５に、ｈＰＰＡＲδのアミノ酸配列（配列番号１）と、ＴＯＦ−ＭＳにより同定されたペプチドのアミノ酸配列を示す。図５中、下線が引かれた領域が、ＴＯＦ−ＭＳにより同定されたペプチドである。ＴＯＦ−ＭＳにより同定されたペプチドは、ｈＰＰＡＲδの全長の２６％をカバーしていた。【００８４】
＜メトホルミンとＰＰＡＲδの免疫沈降法による結合実験＞
ＰＰＡＲδとメトホルミンの結合を共免疫沈降法により確認した。ヒト胎児腎臓由来細胞株ＨＥＫ２９３細胞にＭｙｃタグ付きｈＰＰＡＲδ（Ｍｙｃ−ｈＰＰＡＲδ）を強発現させたＰＰＡＲδ強発現細胞の細胞抽出液から抗Ｍｙｃ抗体（ｓｃ−４０、SantaCruz社製）を用いた免疫沈降により精製したＭｙｃ−ｈＰＰＡＲδと、マウスの肝臓抽出液に対して、Ｍｅｔ−ビーズを用いた免疫沈降を行った。【００８５】
具体的には、まず、精製Ｍｙｃ−ｈＰＰＡＲδ及びマウスの肝臓抽出液に、それぞれＭｅｔ−ビーズを添加して転倒攪拌した後、磁気分離によりＭｅｔ−ビーズを回収した。回収されたＭｅｔ−ビーズから溶出したタンパク質に対して、内在性のＰＰＡＲδを認識する抗ＰＰＡＲδ抗体（ｓｃ−７４５１７、SantaCruz社製）を用いてウェスタンブロッティングを行った。ウェスタンブロッティングの結果を図６に示す。この結果、Ｍｙｃ−ｈＰＰＡＲδとマウスの肝臓抽出液中の内在性ＰＰＡＲδのいずれも、メトホルミンと結合することが確認された。【００８６】
＜メトホルミンとＰＰＡＲαとの結合の検証＞
ＰＰＡＲδは核内受容体スーパーファミリーの一つであり、他にα、γというファミリーメンバーがある。Ｍｅｔ−ビーズとＨｅｐＧ２細胞抽出液を用いてアフィニティ精製を行い、内在性のＰＰＡＲαとの結合を検証した。この結果、メトホルミンとＰＰＡＲαとの結合は確認できなかった。【００８７】
＜メトホルミンとＡＭＰＫとの結合の検証＞
メトホルミンは、ＡＭＰＫ（5’ AMP-activated protein kinase）を活性化することで、骨格筋での糖取り込みの亢進や肝臓での脂肪酸β酸化を制御していることが知られている。そこで、Ｍｅｔ−ビーズとＨｅｐＧ２細胞抽出液を用いてアフィニティ精製を行い、内在性のＡＭＰＫとメトホルミンとの結合を検証した。この結果、メトホルミンとＡＭＰＫとの結合は確認できなかった。【００８８】
＜メトホルミンとＰＰＡＲδの親和性の測定＞
メトホルミンとＰＰＡＲδの親和性を、分子間相互作用測定装置（製品名：ＢＬＩｔｚ（登録商標）、Pall ForteBio社製）を用いて測定した。メトホルミンを固定化したバイオセンサーと精製Ｍｙｃ−ｈＰＰＡＲδを用いて、メトホルミンとＭｙｃ−ｈＰＰＡＲδの分子間相互作用を計測した。分子間相互作用測定装置のバイオセンサーへのメトホルミンの固定化は、メトホルミンのＮＨ２基を介して行った。定に際しては、Ｍｙｃ−ＰＰＡＲδの濃度を６段階に希釈して、global fittingにより各濃度から算出された平均の分子間相互作用を算出した。バイオセンサーに固定化されたメトホルミンと段階希釈した精製Ｍｙｃ−ｈＰＰＡＲδとの結合解離曲線を図７に示す。図中、縦軸は、メトホルミンを固定化したセンサー先端からのＭｙｃ−ｈＰＰＡＲδタンパク質の距離（ｎｍ）であり、Ｍｙｃ−ｈＰＰＡＲδタンパク質のセンサー先端への結合量の指標となる。この結果、結合速度定数（ｋａ）は３．４０×１０４Ｍ-１Ｓ-１解離速度定数（ｋｄ）は１．０３×１０−６Ｓ-１解離定数（ＫＤ）３．３０×１０−１０Ｍと算出され、ＰＰＡＲδはメトホルミンへ強固に結合することが確認された。【００８９】
＜ＰＰＡＲδにおけるメトホルミンの結合部位の同定＞
ＰＰＡＲδにおけるメトホルミンの結合部位を決定するために、ＰＰＡＲδのＮ−ｔｅｒｍドメインを欠損させた変異体（ΔＮ−ｔｅｒｍ：１〜７０番目のアミノ酸領域を欠損させた変異体）と、ＬＢＤのα−ヘリックスを３個目までしか持たず、リガンド結合ポケットを完全に欠損させた変異体（ΔＬＢＤ：２３７〜４４１番目のアミノ酸領域を欠損させた変異体）を作製した。ＰＰＡＲδの全長及び各変異体の構造の模式図を図８に示す。【００９０】
Ｍｙｃ−ｈＰＰＡＲδを強発現するＰＰＡＲδ強発現細胞と同様にして、ＨＥＫ２９３細胞を用いて、Ｍｙｃタグ付きΔＮ−ｔｅｒｍ（Ｍｙｃ−ΔＮ−ｔｅｒｍ）を強発現するΔＮ−ｔｅｒｍ強発現細胞と、Ｍｙｃタグ付きΔＬＢＤ（Ｍｙｃ−ΔＬＢＤ）を強発現するΔＬＢＤ強発現細胞を製造した。これらの強発現細胞の細胞抽出液（Lysate）に、それぞれＭｅｔ−ビーズを反応させてアフィニティ精製し、回収されたＭｅｔ−ビーズから溶出したタンパク質に対して、抗Ｍｙｃ抗体を用いてウェスタンブロッティングを行って免疫沈降量の定量を行った。定量結果を図９に示す。この結果、細胞抽出液中のＭｙｃタグ付きタンパク質の量を１００％とした場合に、Ｍｅｔ−ビーズに結合したＭｙｃタグ付きタンパク質の相対量（相対免疫沈降量）（％）は、Ｍｙｃ−ｈＰＰＡＲδは約５８％、Ｍｙｃ−ΔＮ−ｔｅｒｍは約３４％、Ｍｙｃ−ΔＬＢＤは０％（ウェスタンブロッティングでバンドが確認できなかった）であった。これらの結果から、メトホルミンは、ＰＰＡＲδのＬＢＤに結合することがわかった。【００９１】
［実施例２］
ＰＰＡＲδは、核内で核内受容体ＲＸＲ（Retinoid X receptor）とヘテロダイマーを形成し、ＰＰＡＲδのリガンド存在下で転写活性化因子ＰＧＣ１α（peroxisome proliferative activated receptor gamma coactivator-1）と結合し、正の転写調節因子として働く。そこで、ルシフェラーゼアッセイを行い、メトホルミンがＰＰＡＲδの転写制御に与える影響について検証した。【００９２】
＜ＰＰＲＥ×２−ｔｋ−ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅを用いたルシフェラーゼアッセイ＞
メトホルミンによるＰＰＡＲδの転写活性化を調べるために、ＲＸＲα及びＰＧＣ１αと共に、ヒトＰＰＡＲδを、ヒト胎児腎臓由来培養細胞株ＨＥＫ２９３細胞に強発現させた。レポーターには、ＰＰＡＲδ／ＲＸＲα複合体が結合するＤＮＡ配列（ＰＰＡＲ−Ｒｅｓｐｏｎｓｅ  Ｅｌｅｍｅｎｔ）を２つ持つチミジンキナーゼプロモーター（ｔｋ）／ルシフェラーゼ遺伝子レポータープラスミドを使用し、ルシフェラーゼアッセイを行った。ＰＰＡＲδ活性化のポジティブコントロールとして、ＰＰＡＲδのアゴニストであるＧＷ５０１５１６（GlaxoSmithKline社製）を使用した。等量のＤＭＳＯを添加した反応液（コントロール）の発光量（Relative Light Unit；ＲＬＵ）に対する反応液の発光量の割合を、相対活性値とした。【００９３】
ルシフェラーゼアッセイの結果を図１０Ｂに示す。ＰＰＡＲδ複合体（ｈＰＰＡＲδ、ＰＧＣ１α、ＲＸＲα）存在下、メトホルミンは、ＰＰＲＥ（ＰＰＡＲ-Ｒｅｓｐｏｎｓｅ  Ｅｌｅｍｅｎｔ、ＰＰＡＲδ結合配列をも持つＰＰＡＲ応答配列）を介して転写を濃度依存的に活性化できた（図１０Ａ及びＢ）。また、この活性化能は、ＧＷ５０１５１６と同程度であった。これらの結果から、メトホルミンがｈＰＰＡＲδによる転写を活性化することが確認された。【００９４】
＜共免疫沈降法による、ＰＰＡＲδ／ＰＧＣ１α転写複合体形成の測定＞
ＰＰＡＲδのアゴニストによる転写活性化は、アゴニストがＰＰＡＲδのリガンド結合ポケットに結合し、転写共役因子であるＰＧＣ１αとの転写複合体の形成を誘導することによって起きていることが知られている。そこで、メトホルミン又はＧＷ５０１５１６で処理した細胞のＰＰＡＲδ／ＰＧＣ１α転写複合体量を定量した。対照として、ＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド）処理を行った。【００９５】
まず、ＨＥＫ２９３細胞を用いて、Ｍｙｃ−ｈＰＰＡＲδ、ＲＸＲα、及びＰＧＣ１αを強発現する強発現細胞を製造した。この強発現細胞を、メトホルミン、ＧＷ５０１５１６、又はＤＭＳＯで処理した後、細胞抽出液を調製した。得られた細胞抽出液に対して抗Ｍｙｃ抗体を用いて免疫沈降を行い、得られた免疫沈降物に対して抗ＰＧＣ１α抗体（ａｂ５４４８１、Abcam社製）を用いてウェスタンブロッティングを行い、ＰＧＣ１αの相対免疫沈降量（免疫沈降物（ＩＰｅｄ）におけるＭｙｃ−ｈＰＰＡＲδ量に対するＰＧＣ１α量：［免疫沈降物中のＰＧＣ１α量］／［免疫沈降物中のＭｙｃ−ｈＰＰＡＲδ量］）を測定した。結果を図１１に示す。メトホルミン処理細胞及びＧＷ５０１５１６処理細胞では、ＤＭＳＯ処理細胞と比較して、ＰＧＣ１αの免疫沈降量の増加が観察された。これにより、メトホルミンがＰＰＡＲδのリガンド結合ポケットに結合し、ＰＧＣ１αとの転写複合体の形成を誘導することが示された。【００９６】
［実施例３］
筋分化におけるＰＰＡＲδによる転写活性化に対するメトホルミンの影響を調べた。【００９７】
＜ＰＰＡＲδの標的遺伝子のｑＰＣＲ解析＞
マウス骨格筋由来筋芽細胞株Ｃ２Ｃ１２細胞を低血清刺激して筋分化を誘導し、分化６日目に、１００μＭ  メトホルミン、１μＭ  ＧＷ５０１５１６、又はＤＭＳＯで処理した。処理後の細胞について、ＰＰＡＲδの標的遺伝子の発現をｑＰＣＲにより解析した。標的遺伝子は、ａｎｇｐｔｌ４遺伝子、ｐｄｋ４遺伝子、ｐｌｉｎ遺伝子、及びｕｃｐ３遺伝子の４種を測定した。【００９８】
ＤＭＳＯ処理細胞の発現量を１とした場合の相対発現量の測定結果を図１２に示す。その結果、ＧＷ５０１５１６処理の場合の標的遺伝子誘導効率には劣るものの、メトホルミンは、ＰＰＡＲδの標的遺伝子の発現を誘導することができた。【００９９】
＜ＰＰＡＲδのＰＰＲＥへのリクルートに対するメトホルミンの影響の測定＞
メトホルミン処理により転写因子ＰＰＡＲδが標的遺伝子のプロモーターにリクルートされるかを調べた。
まず、Ｃ２Ｃ１２細胞にＦＬＡＧタグ付きのＰＰＡＲδ（ＦＬＡＧ−ＰＰＡＲδ）を恒常的に発現させたＣ２Ｃ１２−ＰＰＡＲδ細胞を作製した。Ｃ２Ｃ１２−ＰＰＡＲδ細胞を低血清刺激して筋分化を誘導し、分化６日目に、１００μＭ  メトホルミン、１μＭ  ＧＷ５０１５１６、又はＤＭＳＯで処理した。処理後の細胞について、ＦＬＡＧタグを認識する抗体を用いてクロマチン免疫沈降（Conventional ChIP）を行った。【０１００】
クロマチン免疫沈降により得られた免疫沈降物中のＡｎｇｐｔｌ４遺伝子、Ｐｄｋ４遺伝子、Ｐｌｉｎ２遺伝子、及びＵｃｐ３遺伝子のＤＮＡ量（インプットクロマチン量に対する各ＩＰで得られたクロマチン量の割合：％）の相対値（ＩｇＧコントロールの前記ＤＮＡ量を１とした）の測定結果を図１３に示す。この結果、遺伝子発現で観察された結果と同様に、メトホルミン処理又はＧＷ５０１５１６処理により、Ａｎｇｐｔｌ４遺伝子、Ｐｄｋ４遺伝子、Ｐｌｉｎ２遺伝子、及びＵｃｐ３遺伝子のプロモーター上のＰＰＲＥ（ＰＰＡＲ応答領域）近傍にＰＰＡＲδがリクルートされることが示された。【０１０１】
［実施例４］
ＰＰＡＲδは脂質代謝関連遺伝子の発現を誘導し、特に骨格筋において脂肪酸のβ酸化を亢進することが知られている。ＰＰＡＲδアゴニストには、ミトコンドリア活性を上げる作用効果を有することが期待される。そこで、メトホルミンが代謝、特にミトコンドリア活性に及ぼす影響を調べた。具体的には、Ｃ２Ｃ１２細胞を用いて、細胞代謝測定装置（Agilemt社製細胞外フラックスアナライザー）により細胞の酸素消費速度（ＯＣＲ：Oxygen Consumption Rate）を測定した。【０１０２】
この代謝測定では、４つの阻害剤を使用し、細胞内の代謝を強制的に変化させた（図１４）。まず、電子伝達系のComplex Vを阻害するOligomycinを添加した。OligomycinによりＡＴＰ産生が阻害され、ＯＣＲは減少した。次に、脱共役剤ＦＣＣＰ（Carbonyl cyanide-p-trifluoromethoxyphenylhydrazone）を加えた。ＦＣＣＰは、ミトコンドリア膜内の水素イオンを膜外に強制的に排出し、プロトン濃度勾配を解消する。ＡＴＰを産生するにはプロトン濃度勾配が必要なため、ＦＣＣＰにより勾配が強制的に解消されると、ＴＣＡサイクル及び電子伝達系が最大限まで活性化される。これにより、細胞の最大呼吸速度を測定することができる。脂肪酸酸化が亢進している細胞では、この時のＯＣＲはより上昇することが知られている。最後にRotenoneとAntimycinを加えた。Rotenoneは電子伝達系のComplex Iを、AntimycinはComplex IIIをそれぞれ阻害する。これらの阻害剤添加により、電子伝達系は完全に停止し、細胞のＯＣＲはほぼゼロになった。【０１０３】
Ｃ２Ｃ１２細胞に対して、溶媒（ＤＭＳＯ）、１００μＭ  メトホルミン、又は１０μＭ  ＧＷ５０１５１６を加えて２４時間処理し、前記の順番で阻害剤を添加し、ＯＣＲを計測した。ＯＣＲの測定結果を図１４に示す。その結果、阻害剤処理前のベースとなるＯＣＲ（ｐｍｏｌ／ｍｉｎ）は、メトホルミン処理とＧＷ５０１５１６処理のいずれにおいても変化がなかった。ＦＣＣＰ添加後には、ＤＭＳＯ処理細胞と比較して、メトホルミン処理細胞とＧＷ５０１５１６処理細胞では、ＯＣＲの上昇が観察された（図１４、矢印）。このことは、メトホルミンもＧＷ５０１５１６と同様にミトコンドリアの代謝活性（呼吸活性）を上昇させたことを示す。【０１０４】
［実施例５］
ＧＷ５０１５１６を代表とする従来開発されてきた一連のＰＰＡＲδの合成アゴニスト（ＧＷ系薬剤）は、フェノキシ酢酸誘導体であり、カルボキシル基（-COOH）に非極性炭化水素等の長鎖状の疎水性基が結合した化学構造を基本骨格としている。これに対して、メトホルミンは、ビグアニド（biguanide, ビグアナイド）系薬剤の一つであり、従来のＧＷ系薬剤と化学構造上の類似性はなく、ＧＷ系薬剤とＰＰＡＲδのリガンド結合ポケットの特異的結合に必須であるカルボキシル基と長鎖状の疎水性基の両方とも持っていない。また、従来のＧＷ系薬剤の物性は、酸性かつ非極性が特徴であるのに対して、メトホルミンは塩基性かつ水溶性である。加えて、従来のＧＷ系薬剤の分子の大きさは、ＰＰＡＲδのリガンド結合ポケットの大きさに対応しているが、メトホルミンは著しく小さい。例えば、代表的な合成アゴニストＧＷ５０１５１６やＧＷ２３３１の分子量は４５３．５と４９０．３であるが、メトホルミンは１６９．２であり、約３分の１である。このように、メトホルミンは従来のＰＰＡＲδを標的としたどの薬剤とも共通性がなく、どのようにＰＰＡＲδに結合するのかを、複合体構造既知の従来のアゴニストから予測することは不可能である。そこで、ＰＰＡＲδのＬＢＤとメトホルミンとの複合体の結晶を作製して、当該複合体の三次元構造をＸ線結晶解析で決定した。【０１０５】
＜ＰＰＡＲδのＬＢＤポリペプチドの生成＞
ＰＰＡＲδのアミノ酸配列の第１７０番目のグルタミンから第４４１番目のチロシン（カルボキシル末端、Ｃ−末端）までのポリペプチド（ＰＰＡＲδ−ＬＢＤ）とメトホルミンの複合体の結晶構造解析を行った。
ＰＰＡＲδ−ＬＢＤは、下記の通りにして調製した。まず、Ｈｉｓ×６タグ付きポリペプチドとして大腸菌に発現させた後、溶菌して不溶性画分を分取した。分取した不溶性画分を、可溶化溶液（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−Ｃｌ（ｐＨ７．５）、２Ｍ  尿素、２ｍＭ  ＤＴＴ、５００ｍＭ  ＮａＣｌ、０．５％  Ｔｗｅｅｎ２０）で可溶化した後、遠心分離（２５，０００ｒｐｍ、４５分間）で上清を分取した。得られた上清は、透析して尿素とＴｗｅｅｎ２０を除去した後、Ｎｉ−アフィニティーカラム（Ni-NTA Agarose、QIAGEN社製）を用いて精製した後、Ｈｉｓ×６タグをＨＲＶ３Ｃで切断した。切断後のポリペプチドを、アミコン（Amicon Ultra tube カットオフ分子量１０，０００、Merk Millipore社製）を用いて濃縮した後、展開溶液（２０ｍＭ  ＴｒｉｓＣｌ（ｐＨ７．５）、５００ｍＭ  ＮａＣｌ、０．５ｍＭ  Ｔｒｉｓ（２−ｃａｒｂｏｘｙｅｔｈｙｌ）ｐｈｏｓｐｈａｔｅ（ＴＣＥＰ））で平衡化したＳｕｐｅｒｄｅｘ ７５ｐｇゲル濾過カラム（GE Healthcare社製）で精製した。ＰＰＡＲδ−ＬＢＤを含む分画は、アミコンで１０ｍｇ／ｍＬまで濃縮して結晶化の試料とした。精製試料は、質量分析（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ、Bruker Daltonics社製）でＰＰＡＲδ−ＬＢＤであることを確認して、液体窒素で瞬間凍結して−８０℃の低温で保存した。【０１０６】
＜結晶の調製＞
ＰＰＡＲδ−ＬＢＤとメトホルミンとの複合体結晶は、ハンギングドロップ型の蒸気拡散平衡法で作製した。メトホルミン塩酸塩（LKT Laboratories社製）を蒸留精製水に溶かして１００ｍＭとしたメトホルミン水溶液を、精製したＰＰＡＲδ−ＬＢＤ試料と混合して結晶化用試料溶液（ＰＰＡＲδ−ＬＢＤ濃度が０．３ｍＭ、ＰＰＡＲδ−ＬＢＤ:メトホルミン＝１：１０（モル比）を調製した。結晶化は、結晶化用試料溶液１μＬとリザーバ溶液（４０ｍＭ  Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ−Ｐｒｏｐａｎｄｉｏｌ（ｐＨ６．８）、１０ｍＭ  ＤＴＴ、２．５％  ＥＤＴＡ（1,2-Propanediol,1 mM ethylenediaminetetraacetic acid）、０．５％  ＨＢＤＧ（detergent n-Heptyl-β-D-thioglucoside）、２００μＭ  ＫＣｌ、４％  ＰＥＧ８Ｋ）を混合して、リザーバ溶液に対して温度２０℃で蒸気平衡して、４日程度で結晶を得た。【０１０７】
得られたＰＰＡＲδ−ＬＢＤとメトホルミンとの複合体結晶の顕微鏡写真を図１５（Ａ）に示す。図中、スケールバーは１００μｍである。当該結晶は、単位格子定数が、ａは４９．３４Å；ｂは５７．８８Å；ｃは５９．１６Å；αは９８．０７°；βは９０．０８°；γは１０７．０２°であり、三斜晶系空間群Ｐ１に属する。当該結晶は、３０％グリセロールを抗凍結剤として液体窒素中で瞬間凍結した。【０１０８】
＜三次元構造座標の取得＞
Ｘ線強度データは、大型放射光施設ＳＰｒｉｎｇ−８のビームラインＢＬ４１ＸＵで、温度１００Ｋ℃でＭＸ３００ＨＥ検出器を用いて収集した。収集したＸ線強度データは、Ｘ線回折データ処理用ソフトウエア（ＤＥＮＺＯ／ＳＣＡＬＰＡＣＫ、ＨＫＬ２０００プログラム）で各種補正等を施して構造解析用のＸ線強度データセット（分解能：２．００Å）とした。構造解析は、ＲＣＳＢ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄａｔａ Ｂａｎｋ（Ｒｕｔｇｅｒｓ, ＵＣＳＤ）に登録されているＰＰＡＲδ−ＬＢＤの公開された構造（ＰＤＢコード５Ｕ３Ｑ）を元にして、プログラム（ＰＨＡＳＥＲ）を用いて分子置換法によって初期位相を決定した。構造モデルの修正や再構築は、分子グラフィックスプログラム（ＣＯＯＴ）を用いて行い、プログラム（ＰＨＥＮＩＸ）により精密化した。これらのモデル修正と精密化を反復して行い、Ｒ−ｆａｃｔｏｒ １８．４％、ＦｒｅｅＲ−ｆａｃｔｏｒ  ２１．４％の複合体の原子モデルを得るに至った。【０１０９】
ＰＰＡＲδ−ＬＢＤとフェンホルミン（phenformin）の複合体についても、メトホルミンと同様の実験を進めて、ＰＰＡＲδ−ＬＢＤとメトホルミンとの複合体とほぼ同型の結晶（単位格子定数が、ａは４９．２１Å；ｂは５７．６４Å；ｃは１０７．８２Å；αは９８．０２°；βは９０．０３°；γは１０７．０８°であり、三斜晶系空間群Ｐ１に属する）を得た。得られた結晶の顕微鏡写真を図１５（Ｂ）に示す。図中、スケールバーは１００μｍである。
さらに、メトホルミン複合体のＰＰＡＲδ−ＬＢＤ構造を用いて構造解析を進めた。この結果、分解能２．２９Å、Ｒ−ｆａｃｔｏｒ１９．３％、Ｆｒｅｅ Ｒ−ｆａｃｔｏｒ２２．０％の複合体の原子モデルを得た。【０１１０】
＜ＰＰＡＲδ−ＬＢＤとメトホルミンとの複合体結晶の三次元構造データ＞
ＰＰＡＲδ−ＬＢＤとメトホルミンとの複合体結晶の構造を図１６に示す。結晶中には、構造がほぼ同じ２分子のＰＰＡＲδ−ＬＢＤ（図中、Ｍｏｌｅｃｕｌｅ ＡとＭｏｌｅｃｕｌｅＢ）が存在しており、メトホルミンはそれぞれのドメインの中にあるリガンド結合ポケットに結合している。それぞれのＰＰＡＲδ−ＬＢＤの分子表面には、結晶化に用いた界面活性剤ＨＢＤＧが結合していた。【０１１１】
複合体結晶中のＰＰＡＲδ−ＬＢＤの構造は、１５本のα−ヘリックス（α-helix）Ｈ１−Ｈ１２、Ｈ２’、Ｈ２”、Ｈ３’と、３本のβ−鎖（β-strand）Ｓ１、Ｓ２、Ｓ３からなり、３本のβ−鎖は一枚の反平行β−シート（antiparallel β-sheet）を形成していた（図１６）。分子の中心には、Ｙ字型のリガンドが結合できる空洞（リガンド結合ポケット）があった。この全体構造は、これまで報告されているＰＰＡＲδ  ＬＢＤの基本構造と一致ほぼしていた（非特許文献７及び８）。また、ＰＰＡＲαのＬＢＤやＰＰＡＲγのＬＢＤの構造とも類似していた。【０１１２】
図１７は、複合体結晶中のリガンド結合ポケット中のメトホルミン分子を示した図である。図中、破線は水素結合を示し、付されている数値は距離を示す。Ｈ３、Ｈ４、Ｈ１１等は、リガンド結合ポケットを形成するα−ヘリックスを示す。このリガンド結合ポケットはＹ字型であり、３つのアームＩ、ＩＩ、ＩＩＩと呼ばれるトンネル状の空洞があった。メトホルミン分子は、α−ヘリックスＨ３、Ｈ４、Ｈ１１、及びＨ１２から形成されるアームＩに結合しており、メトホルミンのビグアニド骨格の２つのアミノ基が、それぞれのα−ヘリックスの残基、Ｔｈｒ２５３（α−ヘリックスＨ３）、Ｈｉｓ２８７（α−ヘリックスＨ４）、Ｈｉｓ４１３（α−ヘリックスＨ１１）、及びＴｙｒ４３７（α−ヘリックスＨ１２）と直接の水素結合を形成することで固定されていた。ＰＰＡＲの活性化に必須なＡＦ−２断片（activation function-2 segment）と呼ばれるペプチド領域（Ｌｅｕ４２９〜Ｍｅｄ４４１）は、α−ヘリックスＨ１２を形成してリガンド結合ポケットに蓋をするようにＬＢＤに結合していた。このことは、メトホルミンに結合したＰＰＡＲδのＬＢＤは、活性型のコンホメーションをとっていることを意味している。このα−ヘリックスＨ１２の形成は、上述のメトホルミンとの直接の相互作用で誘起されているため、メトホルミンがＰＰＡＲδのアゴニストであることによく対応している。【０１１３】
上記の水素結合等の極性の相互作用に加えて、メトホルミンはアームＩの先端部の狭い空間にはまり込むことによって、水素結合に加えて、全ての原子がＰＰＡＲδ−ＬＢＤの原子と接触しており、結合が安定化されていた。メトホルミンのビグアニド骨格は、Ｌｅｕ４３３、Ｐｈｅ２４６、Ｍｅｔ４１７と、非極性の接触をしていた。メトホルミンの２つのメチル基は、Ｔｈｒ２５３、Ｐｈｅ２９１、Ｃｙｓ２４９、Ｉｌｅ３２７と、非極性の接触をしていた。メトホルミンは小分子であり、ＰＰＡＲδ−ＬＢＤのリガンド結合ポケットを全て埋める大きさはない。メトホルミンの２つのメチル基の先端は、アームＩＩとアームＩＩＩの空洞につながっているが、これらのアームは空のままであった。【０１１４】
以上の相互作用の特性は、フェンホルミンとＰＰＡＲδ−ＬＢＤとの複合体の構造でも同様に観測された。図１８は、メトホルミンとＰＰＡＲδ−ＬＢＤとの複合体結晶の構造と、フェンホルミンとＰＰＡＲδ−ＬＢＤとの複合体結晶の構造と、を重ね合わせた図である。図中、破線は水素結合を示し、付されている数値は距離を示す。Ｈ３、Ｈ４、Ｈ１１、及びＨ１２は、リガンド結合ポケットを形成するα−ヘリックスを示す。フェンホルミンのビグアニド骨格がメトホルミンのビグアニド骨格とよく重なっており、メトホルミンの４つの水素結合と同様の水素結合をフェンホルミンも形成していた。フェンホルミンのフェニル基は、疎水性のリガンド結合ポケットの奥の広い空間に突出しているが、ＰＰＡＲδとの密な非極性接触はなかった。【０１１５】
ｈＰＰＡＲδのリガンド結合ポケットの形状は、分子グラフィックスソフトウェアＰｙＭＯＬに、表１〜６３のデータを組み込んで描画することができる。【０１１６】
【表１】
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【０１１７】
【表２】
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【０１１８】
【表３】
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【０１１９】
【表４】
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【０１２０】
【表５】
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【０１２１】
【表６】
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【０１２２】
【表７】
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【０１２３】
【表８】
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【０１２４】
【表９】
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【０１２５】
【表１０】
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【０１２６】
【表１１】
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【０１２７】
【表１２】
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【０１２８】
【表１３】
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【０１２９】
【表１４】
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【０１３０】
【表１５】
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【０１３１】
【表１６】
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【０１３２】
【表１７】
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【０１３３】
【表１８】
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【０１３４】
【表１９】
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【０１３５】
【表２０】
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【０１３６】
【表２１】
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【０１３７】
【表２２】
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【０１３８】
【表２３】
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【０１３９】
【表２４】
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【０１４０】
【表２５】
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【０１４１】
【表２６】
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【０１４２】
【表２７】
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【０１４３】
【表２８】
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【０１４４】
【表２９】
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【０１４５】
【表３０】
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【０１４６】
【表３１】
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【０１４７】
【表３２】
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【０１４８】
【表３３】
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【０１４９】
【表３４】
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【０１５０】
【表３５】
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【０１５１】
【表３６】
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【０１５２】
【表３７】
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【０１５３】
【表３８】
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【０１５４】
【表３９】
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【０１５５】
【表４０】
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【０１５６】
【表４１】
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【０１５７】
【表４２】
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【０１５８】
【表４３】
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【０１５９】
【表４４】
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【０１６０】
【表４５】
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【０１６１】
【表４６】
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【０１６２】
【表４７】
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【０１６３】
【表４８】
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【０１６４】
【表４９】
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【０１６５】
【表５０】
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【０１６６】
【表５１】
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【０１６７】
【表５２】
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【０１６８】
【表５３】
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【０１６９】
【表５４】
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【０１７０】
【表５５】
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【０１７１】
【表５６】
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【０１７２】
【表５７】
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【０１７３】
【表５８】
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【０１７４】
【表５９】
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【０１７５】
【表６０】
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【０１７６】
【表６１】
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【０１７７】
【表６２】
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【０１７８】
【表６３】
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【０１７９】
［実施例６］
メトホルミンが運動耐性を改善させることができるかを、マウスを用いて最終運動耐性テストを実施して検証した。【０１８０】
メトホルミン投与は、メトホルミン／ＰＢＳ液（メトホルミンをＰＢＳに溶解させた溶液）を、マウスの体重当たりのメトホルミン投与量が２５ｍｇ／ｋｇとなるように、腹腔内注射を行った。メトホルミン非投与群に対しては、メトホルミン／ＰＢＳ液に代えて等容量のＰＢＳを腹腔内投与した。【０１８１】
最終運動耐性テストのためのトレーニングは、トレッドミル装置を用いて１５ｍ／分の速度でスタートし、１０分ごとに１ｍ／分ずつ速度を上げ、２０ｍ／分に達した後に１０分間走らせる（計１時間）という条件に設定し、これを週に５回、計４週間行った。メトホルミン投与は毎回午後１０時、トレーニングはその１２時間後（午前１０時）に開始するプロトコールで行った。【０１８２】
まず、２０匹の１０週齢のオスのＣ５７ＢＬ／６マウスを４群（１群５匹）に分けた。この４群のうちの１群に対しては、トレーニングもメトホルミン投与も行わず（以下、「コントロール群」）、１群に対しては、メトホルミンを投与せずにトレーニングのみを行い（以下、「トレーニング群」）、１群に対しては、メトホルミンを投与し、トレーニングは行なわず（以下、「メトホルミン投与群」）、残る１群に対しては、メトホルミンを投与し、トレーニングも行った（以下、「トレーニング＋メトホルミン投与群」）。なお、マウス個体の運動に対するモチベーションや運動の好みが各グループで平均化するように、トレーニング馴化後に最初の運動耐性テストを行い、順位付けを行った後に、成績が均等になるように先の４群にグループ分けした。また、トレーニング期間後のテストは、テスト中の電極接触回数が５０回に達するまでの時間（Number of Shocks: ＮＯＳ５０）を走行時間とし、１５ｍ／分でスタートし、１０分ごとに１ｍ／分ずつ速度を上げ、最大速度の３０ｍ／分に達した後はＮＯＳ５０に達するまで走らせて、運動耐性を評価した。【０１８３】
各群の、トレーニング開始から各経過時間における電極接触回数（ＮＯＳ）の測定結果を図１９に示す。図１９（Ａ）に、コントロール群（図中、「cont」）とメトホルミン投与群（図中、「met」）の結果を示し、図１９（Ｂ）に、トレーニング群（図中、「cont＋train」）とトレーニング＋メトホルミン投与群（図中、「met＋train」）の結果を示す。図１９（Ａ）に示す通り、メトホルミン投与群はコントロール群と比較して運動耐性の向上は見られず、やや低下傾向を示した。これに対して、図１９（Ｂ）に示す通り、トレーニング＋メトホルミン投与群はトレーニング群よりも高い運動耐性を示していた。これらの結果から、メトホルミンは単独投与だけでは運動耐性を向上させることはできないが、メトホルミン投与とトレーニングを組み合わせることにより、運動耐性を向上させられることがわかった。【０１８４】
［実施例７］
メトホルミン／ＰＰＡＲδの共結晶構造のデータを利用して、新たなＰＰＡＲδ活性化剤を探索した。【０１８５】
具体的には、メトホルミン／ＰＰＡＲδの共結晶構造のデータに基づいて、メトホルミンとＰＰＡＲδ間のドッキングモード解析を行い、公知のグアニジン誘導体及びビグアニジン誘導体について、溶媒効果を考慮したドッキングモード予測計算を行うことにより、メトホルミンと同様にリガンド結合ポケットの内部に嵌まり込み得るグアニジン誘導体又はビグアニジン誘導体を探索した。予測は、Thermodynamic cycleに基づいて、結合自由エネルギーを計算して行い、分子動力学計算のトラジェクトリーを用いて精度を向上させた（ＭＭ−ＰＢＳＡ：Molecular Mechanic / Poisson Boltzmann Surface Area、ＭＭ−ＧＢＳＡ：Molecular Mechanic / Generalized Born Surface Area）。【０１８６】
図２０に示す通り、メトホルミンのグアニジノ基は、ｈＰＰＡＲδのリガンド結合ポケットにあるアミノ酸残基と相互作用して結合する（Ｔｙｒ４３７、Ｌｅｕ４３３、Ｍｅｔ４１７、Ｈｉｓ２８７、Ｔｈｒ２５３、Ｇｌｎ２５０、Ｐｈｅ２４６を図に示した）。Ｈｉｓ４１３は、図平面の手前に位置するため示されていない。また、分子動力学の計算の結果、溶媒条件等によって、図２に示したアミノ酸残基よりも、多くのアミノ酸残基と相互作用しえることがわかった。それぞれのアミノ酸との相互作用エネルギーを計算し、既知のＰＰＡＲδ合成アゴニストであるＧＷ系薬剤のうちのＧＷ５０１５１６及びＧＷ０７４２（CAS No.:317318-84-6）と比較した結果を図２１に示す。図２１に示すように、メトホルミンはＧＷ系薬剤と同様に、ｈＰＰＡＲδのリガンド結合ポケットにある前記７つのアミノ酸残基と、図示した結合エネルギーで結合できる。特にＭｅｔ４１７とＰｈｅ２４６との結合エネルギーは、メトホルミンのほうがＧＷ系薬剤よりも明らかに大きかった。これは、メトホルミンは、ＧＷ系薬剤よりも、リガンド結合ポケット入り口でより安定に固定され、かつヘリックス−１２の倒し込み活性が高く、アゴニストとしての活性が高いことを示している。【０１８７】
ドッキングモード解析により、グアニジノ基又はビグアニジノ基を分子端に持ち、このグアニジノ基等がｈＰＰＡＲδのＨｉｓ４１３、Ｈｉｓ２８７、Ｔｈｒ２５３、及びＴｙｒ４３７と水素結合をした状態で分子全体がｈＰＰＡＲδのリガンド結合ポケット内に入り込む化合物が選抜された。この選抜された化合物は、ＰＰＡＲδ活性化剤の候補化合物である。【０１８８】
［実施例８］
化合物（１−１−４）のうち、化合物（Ｂ−１）、化合物（Ｂ−２）、及び化合物（Ｂ−３）が、ＰＰＡＲδの転写制御に与える影響について調べた。ＰＰＡＲδの転写活性に対する影響は、ＤＭＳＯに溶解させた各化合物１０μＭで処理した細胞に対してルシフェラーゼアッセイを行うことによって測定した。【０１８９】
具体的には、アフリカミドリザル腎臓由来の培養細胞であるＣＶ１細胞を２４ウェルプレートに播種し（１×１０５細胞／ウェル）、７０％コンフルエントになるまで培養した。培養培地には、１０％ウシ胎児血清及び１％抗生物質を含有させたＤＭＥＭを用いた。目的の細胞密度に到達した後、培地を全量除去した後、各ウェルに対して、２μＬのＭＨ２００４（Ｇａｌ４活性化配列を上流にもつホタルルシフェラーゼ遺伝子をコードするプラスミド：１００ｎｇ／μＬ）、１μＬのｐＲＬ−ＣＭＶ（ＣＭＶプロモーター直下のウミシイタケルシフェラーゼ遺伝子をコードするプラスミド：１００ｎｇ／μＬ）、２μＬのＧＡＬ４−Ｐｐａｒｄ（Ｇａｌ４−ＤＮＡ結合領域とＰＰＡＲδ遺伝子をコードするプラスミド：１００ｎｇ／μＬ）、及び１．５μＬのＰＥＩ（ポリエチレンイミン：invitrogen社製)を、４５μＬの培養培地「Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ（登録商標）」（Thermo Fisher Scientific社製）に混合したものを添加し、３６時間程度培養した。その後、培地全量を、メトホルミン等のＰＰＡＲδの転写活性化能を調べる対象の被験物質を含む培地に交換した後、１２時間培養した。【０１９０】
その後、回収した細胞を細胞溶解バッファーにて溶解した後、発光基質（ホタルルシフェリン）と懸濁し、懸濁液の発光をルミノメーターで測定した。また、残りの懸濁液を使用して、ウミシイタケルシフェリンと混和して、発光量をルミノメーターで測定した。ウミシイタケによる発光量の結果を、遺伝子導入の内在性コントロールとした。最終的に、ホタルルシフェリンの発光量は、ウミシイタケルシフェリンの発光量で除算し、発光強度（ＲＬＵ）として算出した。【０１９１】
ルシフェラーゼアッセイの結果（ｎ＝３）を表６４に示す。等量のＤＭＳＯを添加した反応液（コントロール）の発光強度を１とした、各化合物処理した反応液の相対発光強度を、各化合物処理におけるＰＰＡＲδの転写活性化能として求めた。全ての化合物を添加した反応液で相対発光強度が１．１以上であり、ＰＰＡＲδの転写活性が増大してした。この結果から、これらの化合物がＰＰＡＲδ活性化剤となり得ることが示された。【０１９２】
【表６４】
2020085393.tif 000079
【０１９３】
［実施例９］
化合物（１−１−２）のうち、化合物（Ａ−４）（１−｛４−［（｛２−［３−フルオロ−４−（トリフルオロメチル）フェニル］４−メチルチアゾール−５−イル}メチル）チオ]−２−メチルベンジル}グアニジン）を合成し、そのＰＰＡＲδの転写制御に与える影響について調べた。【０１９４】
＜化合物（Ａ−４）の合成＞
（１）Ｓ−（４−シアノ−３−メチルフェニル）エタンチオエートの合成【０１９５】
【化１４】
2020085393.tif 000080
【０１９６】
４−フルオロ−２−メチルベンゾニトリル（CAS No.:147754-12-9、化合物１）（８ｇ、５９．２ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（９ｍＬ）に溶解させた溶液に、室温、窒素雰囲気下で、Ｎａ２Ｓ（５．０８ｇ、６５．１ｍｍｏｌ）を一度に加えた。この反応混合物を一晩撹拌した。得られた混合物は、０℃に冷却した後、無水酢酸（９ｍＬ）を滴下し、その後室温で１時間撹拌した。続いて、当該混合物に、酢酸エチル（１００ｍＬ）と水（３０ｍＬ）を添加した。全量を層分離し、有機層を飽和ブライン（３０ｍＬ×２）で洗浄した後、無水硫酸ナトリウムで乾燥させた。その後、溶媒を減圧下で除去し、残渣をカラムクロマトグラフィー（シリカゲル、ヘキサン中３％−４０％  酢酸エチルで溶出）で精製し、茶色の油として表題化合物（１．４ｇ、１２．４％収率）を得た。【０１９７】
１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）  δ  ７．６２（ｄ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，１Ｈ），７．３９（ｓ，１Ｈ），７．３３（ｄｄ，Ｊ＝８．０，１．１Ｈｚ，１Ｈ），２．５６（ｓ，３Ｈ），２．４５（ｓ，３Ｈ）．【０１９８】
（２）４−［（｛２−［３−フルオロ−４−（トリフルオロメチル）フェニル］−４−メチルチアゾール−５−イル｝メチル）チオ］−２−メチルベンゾニトリルの合成【０１９９】
【化１５】
2020085393.tif 000081
【０２００】
５−（クロロメチル）−２−［３−フルオロ−４−（トリフルオロメチル）フェニル］−４−メチルチアゾール（CAS No. 317319-33-8、米国特許公開公報2003/0203947A1、化合物１１）（２．２３ｇ、７．２２ｍｍｏｌ）、Ｓ−（４−シアノ−３−メチルフェニル）エタンチオエート（化合物２）（１．３８ｇ，７．２２ｍｍｏｌ）、及び炭酸カリウム（１．２２ｇ、８．６６ｍｍｏｌ）をメタノール（２０ｍＬ）に溶解させた溶液の混合物を、室温で１時間撹拌した。得られた混合物を、真空で濾過し、フィルターケーキを回収して、ジクロロメタン（２００ｍＬ）に溶解させた。得られた有機物を、水（３０ｍＬ）、ブライン（３０ｍＬ）で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、減圧下で濃縮して、表題化合物（１．８ｇ、収率５９．１％）を白色固体として得た。【０２０１】
１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）  δ  ７．７２（ｄｄ，Ｊ＝１３．８，９．８Ｈｚ，２Ｈ），７．６７−７．６１（ｍ，１Ｈ），７．５１（ｄ，Ｊ＝８．１Ｈｚ，１Ｈ），７．２２（ｓ，１Ｈ），７．１７（ｄ，Ｊ＝８．２Ｈｚ，１Ｈ），４．３２（ｓ，２Ｈ），２．５１（ｓ，３Ｈ），２．４３（ｓ，３Ｈ）．
ＭＳ−ＥＳＩ（ｍ／ｚ）４２３．１［Ｍ＋Ｈ］＋．【０２０２】
（３）４−［（｛２−［３−フルオロ−４−（トリフルオロメチル）フェニル］−４−メチルチアゾール−５−イル｝メチル）チオ］−２−メチルベンズアルデヒドの合成【０２０３】
【化１６】
2020085393.tif 000082
【０２０４】
４−［（｛２−［３−フルオロ−４−（トリフルオロメチル）フェニル］−４−メチルチアゾール−５−イル｝メチル）チオ］−２−メチルベンゾニトリル（化合物１２）（１．９８ｇ、４．６９ｍｍｏｌ）をジクロロメタン（２０ｍＬ）に溶解した溶液に、０℃で、ＤＩＢＡＬ−Ｈ（１．５Ｍのトルエン溶液、４．６９ｍＬ、７．０４ｍｍｏｌ）を滴下した。得られた反応混合物を、０℃で１時間撹拌した後、１０％  塩酸（３４ｍＬ）でクエンチした。得られた混合物を、３０分間激しく撹拌した。次に、得られた混合物を、２０％  酒石酸カリウムナトリウム（３４ｍＬ）で処理し、得られた混合物をさらに３０分間激しく撹拌した。反応混合物を、１５％  水酸化ナトリウムでｐＨ９に塩基性化した後、ジクロロメタン（６０ｍＬ×３）で抽出しました。得られた有機層を全て合わせ、ブライン（４０ｍＬ）で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、減圧下で濃縮した。残渣をカラムクロマトグラフィー（シリカゲル、ヘキサン中２％−１０％  酢酸エチルで溶出）で精製し、表題化合物（１．２８ｇ、収率６４．０％）を淡黄色固体として得た。【０２０５】
１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）  δ  １０．１９（ｓ，１Ｈ），７．７２（ｄｄ，Ｊ＝１５．８，７．６Ｈｚ，３Ｈ），７．６３（ｔ，Ｊ＝７．６Ｈｚ，１Ｈ），７．２４（ｓ，１Ｈ），７．１６（ｓ，１Ｈ），４．３５（ｓ，２Ｈ），２．６４（ｓ，３Ｈ），２．４５（ｓ，３Ｈ）．
ＭＳ−ＥＳＩ（ｍ／ｚ）  ４２６．１［Ｍ＋Ｈ］＋．【０２０６】
（４）｛４−［（｛２−［３−フルオロ−４−（トリフルオロメチル）フェニル］−４−メチルチアゾール−５−イル}メチル｝チオ）−２−メチルフェニル}メタノールの合成【０２０７】
【化１７】
2020085393.tif 000083
【０２０８】
４−［（｛２−［３−フルオロ−４−（トリフルオロメチル）フェニル］−４−メチルチアゾール−５−イル}メチル）チオ｝−２−メチルベンズアルデヒド（化合物１３）（１．５ｇ、３．５３ｍｍｏｌ）をメタノール（１５ｍＬ）に溶解させた溶液に、水素化ホウ素ナトリウム（ＮａＢＨ４）（２９５ｍｇ、７．７６ｍｍｏｌ）を、０℃で少しずつ添加した。得られた混合物を、０℃で３０分間撹拌した。当該混合物に、塩化アンモニウム水溶液（２０ｍＬ）を加えた後、酢酸エチルで抽出した（６０ｍＬ×２）。有機層を合わせ、ブライン（２０ｍＬ）で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、減圧下で濃縮して、表題化合物（１．４５ｇ、収率９６．０％）を淡黄色の固体として得た。【０２０９】
１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）  δ  ７．７５−７．６７（ｍ，２Ｈ），７．６５−７．５９（ｍ，１Ｈ），７．３０（ｄ，Ｊ＝７．７Ｈｚ，１Ｈ），７．１９（ｄ，Ｊ＝８．５Ｈｚ，２Ｈ），４．６８（ｄ，Ｊ＝５．４Ｈｚ，２Ｈ），４．２１（ｓ，２Ｈ），２．３０（ｓ，６Ｈ）．
ＭＳ−ＥＳＩ（ｍ／ｚ）４２８．１［Ｍ＋Ｈ］＋．【０２１０】
（５）５−（｛［４−（クロロメチル）−３−メチルフェニル］チオ]メチル｝−２−［３−フルオロ−４−（トリフルオロメチル）フェニル］−４−メチルチアゾールの合成【０２１１】
【化１８】
2020085393.tif 000084
【０２１２】
｛４−［（｛２−［３−フルオロ−４−（トリフルオロメチル）フェニル］−４−メチルチアゾール−５−イル｝メチル）チオ］−２−メチルフェニル｝メタノール（化合物１４）（１．４５ｇ、３．３９ｍｍｏｌ）をジクロロメタン（１４ｍＬ）に、０℃で、ＤＭＦ（１滴）及び塩化チオニル（０．３７ｍＬ、５．０９ｍｍｏｌ）を滴下した。得られた混合物を、０℃で１時間撹拌した。当該混合物に、水（１０ｍＬ）を添加し、次いで有機層を分離した。回収された有機層は、ブラインで洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、減圧下で濃縮して、表題化合物（１．４７ｇ、収率９７．０％）を黄色の固体として得た。【０２１３】
１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）  δ  ７．７６−７．６７（ｍ，２Ｈ），７．６２（ｔ，Ｊ＝７．６Ｈｚ，１Ｈ），７．２４（ｄ，Ｊ＝７．９Ｈｚ，１Ｈ）, ７．１９-７．１２（ｍ，２Ｈ），４．５７（ｓ，２Ｈ），４．２３（ｓ，２Ｈ），２．３８（ｓ，３Ｈ），２．３２（ｓ，３Ｈ）．
ＭＳ−ＥＳＩ（ｍ／ｚ）４４６．０［Ｍ＋Ｈ］＋．【０２１４】
（６）１，３−ジ−Ｂｏｃ−２−｛４−［（｛２−［３−フルオロ−４−（トリフルオロメチル）フェニル]−４−メチルチアゾール−５−イル］メチル｝チオ）−２−メチルベンジル］グアニジンの合成 【０２１５】
【化１９】
2020085393.tif 000085
【０２１６】
５−（｛［４−（クロロメチル）−３−メチルフェニル）チオ］メチル｝−２−［３−フルオロ−４−（トリフルオロメチル）フェニル］−４−メチルチアゾール（化合物１５）（１．４７ｇ、３．３ｍｍｏｌ）と、１，３−ビス（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）グアニジン（CAS No. 154476-57-0、化合物４）（１．２８ｇ、４．９５ｍｍｏＬ）と、ＤＭＦ（１５ｍＬ）に溶解させた炭酸カリウム（６８５ｍｇ、４．９５ｍｍｏｌ）とを含有する混合物を、窒素雰囲気下、７５℃で1時間加熱した。次いで、この混合物を水（６０ｍＬ）で希釈した。全量を酢酸エチル（６０ｍＬ×３）で抽出した。回収した有機層の全量を合わせて、ブラインで洗浄し、（３０ｍＬ×２）、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、減圧下で濃縮した。残渣をカラムクロマトグラフィー（シリカゲル、ヘキサン中１％−１０％  酢酸エチルで溶出）で精製して、表題化合物（１．６ｇ、収率７３％）を淡緑色固体として得た。【０２１７】
１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）  δ  ９．５０（ｓ，１Ｈ），９．３５（ｓ，１Ｈ），７．７０（ｔ，Ｊ＝１０．１Ｈｚ，２Ｈ），７．６２（ｔ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，１Ｈ），７．１４−７．１６（ｍ，２Ｈ），６．９０（ｄ，  Ｊ  ＝  ７．８  Ｈｚ，  １Ｈ），５．１２（ｓ，２Ｈ），４．１９（ｓ，２Ｈ），２．３０（ｓ，３Ｈ），２．２５（ｓ， ３Ｈ），１．４６（ｓ，９Ｈ），１．２２（ｓ，９Ｈ）．
ＭＳ−ＥＳＩ（ｍ／ｚ）６６９．３［Ｍ＋Ｈ］＋．【０２１８】
（７）１−｛４−［（｛２−［３−フルオロ−４−（トリフルオロメチル）フェニル］４−メチルチアゾール−５−イル}メチル）チオ]−２−メチルベンジル}グアニジンの合成【０２１９】
【化２０】
2020085393.tif 000086
【０２２０】
１，３−ジ−Ｂｏｃ−２−｛４−［（｛２−［３−フルオロ−４−（トリフルオロメチル）フェニル］−４−メチルチアゾール−５−イル｝メチル）チオ］−２−メチルベンジル｝グアニジン（化合物１６）（８００ｍｇ、１．２ｍｍｏｌ）を１，４−ジオキサン（８ｍＬ）に溶解させたものと、ＨＣｌ／１，４−ジオキサン（４．０Ｍ、３．０ｍＬ）との混合物を、５０℃で２時間撹拌した。次に、溶媒を減圧下で除去し、残渣をメタノール（６ｍＬ）に溶解し、炭酸ナトリウム水溶液でｐＨを８〜９に調整した。得られた混合物に、水（１５ｍＬ）を添加した後、真空濾過した。得られたフィルターケーキを、水（１０ｍＬ）で洗浄し、高真空で乾燥させて、表題の化合物（Ａ−４）（３５０ｍｇ、収率6２％）を白色の固体として得た。【０２２１】
１Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）：  δ  ７．９２−７．８４（ｍ，３Ｈ），７．５５−７．００（ｍ，５Ｈ），４．４８（ｓ，２Ｈ），４．２０（ｓ，２Ｈ），２．３１（ｓ，３Ｈ），２．２２（ｓ，３Ｈ）．
ＭＳ−ＥＳＩ（ｍ／ｚ）  ４６９．２［Ｍ＋Ｈ］＋．【０２２２】
得られた化合物（Ａ−４）のＰＰＡＲδ活性に対する影響を調べた。具体的には、被験物質として、ＤＭＳＯ（０．１％）に溶解させた化合物（Ａ−４）を反応系に添加し以外は、実施例８と同様にしてルシフェラーゼアッセイを行った（ｎ＝３）。ルシフェラーゼアッセイにより得られた相対転写活性化能の測定結果を図２２に示す。この結果、化合物（Ａ−４）の添加量依存的に、ＰＰＡＲδの転写活性は増大する傾向が観察された。ただし、添加量が５０μＭ以上では、細胞が死んでしまい、ＰＰＡＲδ転写活性は測定できなかった。これらの結果から、化合物（Ａ−４）がＰＰＡＲδ活性化剤となり得ることが示された。【０２２３】
［実施例１０］
ＰＰＡＲδにより発現誘導される遺伝子の発現に対する、化合物（Ａ−４）の影響を調べた。具体的には、マウス骨格筋由来の筋芽細胞株であるＣ２Ｃ１２細胞に化合物（Ａ−４）を添加し、ＰＰＡＲδにより発現誘導される遺伝子のうち、ａｎｇｐｔｌ４遺伝子、ｐｄｋ４遺伝子、及びｃｐｔ１ａ遺伝子（非特許文献１２）の発現量を測定した。また、内在性コントロールとして、Ｈｐｒｔ遺伝子を用い、ＰＰＡＲδ活性化のポジティブコントロールとして、ＧＷ０７４２を用いた。【０２２４】
まず、Ｃ２Ｃ１２細胞を２４ウェルプレートに播種し（１×１０５  細胞／ウェル）、８０〜９０％コンフルエントになるまで培養した。培養培地には、１０％ウシ血清及び１％抗生物質を含有させたＤＭＥＭを用いた。目的の細胞密度に到達した３６時間培養後、それぞれの濃度の化合物（Ａ−４）を含む血清不含ＤＭＥＭ培地に全量培地交換し、１６時間培養した（ｎ＝３）。培養後は、培地を廃棄した後、ＲＮＡ抽出用のｔｒｉｚｏｌ試薬（invitrogen社製）を各ウェルに直接添加して細胞を溶解した後、エタノール沈殿により、総ＲＮＡを抽出した。得られた総ＲＮＡを鋳型として、逆転写酵素「superscript」(biorad社製)を用いてｃＤＮＡを合成した。【０２２５】
得られたｃＤＮＡを鋳型として、定量ＰＣＲを行った。鋳型のｃＤＮＡと、測定対象の各遺伝子を増幅するプライマーと、定量ＰＣＲ用ポリメラーゼミックス「ssoFast EvaGreen supermix」（biorad社製）とを混合し、リアルタイムＰＣＲ検出システム「CFX connect（登録商標）」（biorad社製)を用いて、解析を行った。
得られた遺伝子発現データから、各遺伝子の発現量を、内在性コンロトール遺伝子の発現量で除算した相対発現量として算出した。【０２２６】
結果を図２３Ａ〜Ｃに示す。この結果、化合物（Ａ−４）を１０μＭ添加した細胞では、ＧＷ０７４２を添加した細胞と同様に、ａｎｇｐｔｌ４遺伝子、ｐｄｋ４遺伝子、及びｃｐｔ１ａ遺伝子の発現量が増大していた。当該結果からも、化合物（Ａ−４）が、ＰＰＡＲδの転写活性を活性化する作用があることが確認された。
【図１】
2020085393.tif 000093
【図２】
2020085393.tif 000094
【図３】
2020085393.tif 000095
【図４】
2020085393.tif 000096
【図５】
2020085393.tif 000097
【図６】
2020085393.tif 000098
【図７】
2020085393.tif 000099
【図８】
2020085393.tif 000100
【図９】
2020085393.tif 000101
【図１０Ａ】
2020085393.tif 000102
【図１０Ｂ】
2020085393.tif 000103
【図１１】
2020085393.tif 000104
【図１２】
2020085393.tif 000105
【図１３】
2020085393.tif 000106
【図１４】
2020085393.tif 000107
【図１５】
2020085393.tif 000108
【図１６】
2020085393.tif 000109
【図１７】
2020085393.tif 000110
【図１８】
2020085393.tif 000111
【図１９】
2020085393.tif 000112
【図２０】
2020085393.tif 000113
【図２１】
2020085393.tif 000114
【図２２】
2020085393.tif 000115
【図２３Ａ】
2020085393.tif 000116
【図２３Ｂ】
2020085393.tif 000117
【図２３Ｃ】
2020085393.tif 000118
【配列表】
2020085393000001.app
【国際調査報告】
2020085393.tif 000119
2020085393.tif 000120
2020085393.tif 000121
2020085393.tif 000122
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