(57)【要約】  本発明は、環状化合物を、その薬理活性を抑制しつつ、目的の細胞又は組織まで送達する薬物送達システムを提供する。本発明によれば、環状化合物と該環状化合物を担持するための軸部を有する輸送担体との複合体であって、該軸部が該環状化合物に包接されることによって複合体化している、複合体が提供される。
2020116635.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
環状化合物と該環状化合物を担持するための軸部を有する輸送担体との複合体であって、
該軸部が該環状化合物に包接されることによって複合体化している、複合体。
【請求項２】
前記輸送担体が、側鎖を有するポリマーであり、
少なくとも１つの側鎖が、前記軸部を有する、請求項１に記載の複合体。
【請求項３】
前記ポリマーが、親水性ポリマーセグメントと疎水性ポリマーセグメントとを有し、
該疎水性ポリマーセグメントの側鎖が、前記軸部を有する、請求項２に記載の複合体。
【請求項４】
前記軸部と前記ポリマー主鎖との間に、生体内で開裂し得る結合が存在している、請求項２又は３に記載の複合体。
【請求項５】
前記輸送担体が、前記軸部と、その両端に配置されて前記環状化合物が前記軸部から脱離することを防止する蓋部と、を有する、請求項１に記載の複合体。
【請求項６】
前記蓋部が、親水性ポリマーを含む、請求項５に記載の複合体。
【請求項７】
前記軸部と前記蓋部との間に、生体内で開裂し得る結合が存在している、請求項５又は６に記載の複合体。
【請求項８】
前記軸部が、ヒドララジン、ジヒドララジン、１−ナフチルヒドララジンおよびジエチレントリアミンから選択される少なくとも１種の残基である、請求項１から７のいずれかに記載の複合体。
【請求項９】
前記環状化合物が、バリノマイシン、バシトラシンおよびエリスロマイシンから選択される少なくとも１種である、請求項１から８のいずれかに記載の複合体。
【請求項１０】
請求項２から４のいずれかに記載の複合体を含む、ポリマー粒子組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、環状化合物と該環状化合物を担持するための軸部を有する輸送担体との複合体に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、薬物の徐放、血中安定性の向上、可溶化、副作用の低減等を目的として、種々の薬物送達システム（ＤＤＳ）が開発されている（例えば、特許文献１、２）。【０００３】
また近年、タンパク質に結合して不活性化する阻害能を有する環状化合物が薬物として研究されている。環状化合物は、直鎖状化合物と比べて立体的に構造が決定されることから、タンパク質の結合部位に作用しやすく、その結果、タンパク質に対する高い選択性及び阻害能を示すとの報告がなされている（非特許文献１）。また、環状化合物は、一般に、低分子薬物と生体分子薬物との中間である５００〜２０００の分子量を有し、低分子薬物の特徴である膜透過性及び生体分子薬物であるタンパク質の選択的結合性の２つを併せ持つことから、広い適用範囲が期待される。その一方で、環状化合物は水に難溶であり、また、従来の輸送担体との結合に適した官能基を有さない場合が多い。【０００４】
よって、環状化合物を可溶化し、非共有結合によりその薬理活性を抑制しつつ、目的の細胞又は組織まで送達する薬物送達システムの開発が求められている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】ＷＯ２００６／０８５６６４  Ａ１
【特許文献２】ＷＯ２００９／１５７２７９
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｆ．  Ａｌｂｅｒｉｃｉｏ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｆｕｔｕｒｅ  Ｍｅｄ．  Ｃｈｅｍ．，  ４（２０１２）１５２７−１５３１
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、上記課題を解決するためになされたものであり、その主たる目的は、環状化合物を、その薬理活性を抑制しつつ、目的の細胞又は組織まで送達する薬物送達システムを提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明の１つの局面によれば、環状化合物と該環状化合物を担持するための軸部を有する輸送担体との複合体であって、該軸部が該環状化合物に包接されることによって複合体化している、複合体が提供される。
１つの実施形態においては、上記輸送担体が、側鎖を有するポリマーであり、少なくとも１つの側鎖が、上記軸部を有する。
１つの実施形態においては、上記ポリマーが、親水性ポリマーセグメントと疎水性ポリマーセグメントとを有し、該疎水性ポリマーセグメントの側鎖が、上記軸部を有する。
１つの実施形態においては、上記軸部と上記ポリマー主鎖との間に、生体内で開裂し得る結合が存在している。
１つの実施形態においては、上記輸送担体が、上記軸部と、その両端に配置されて上記環状化合物が上記軸部から脱離することを防止する蓋部と、を有する。
１つの実施形態においては、上記蓋部が、親水性ポリマーを含む。
１つの実施形態においては、上記軸部と上記蓋部との間に、生体内で開裂し得る結合が存在している。
１つの実施形態においては、上記軸部が、ヒドララジン、ジヒドララジン、１−ナフチルヒドララジンおよびジエチレントリアミンから選択される少なくとも１種の残基である。
１つの実施形態においては、上記環状化合物が、バリノマイシン、バシトラシンおよびエリスロマイシンから選択される少なくとも１種である。
本発明の別の局面によれば、上記複合体を含む、ポリマー粒子組成物が提供される。
【発明の効果】
【０００９】
本発明においては、環状化合物を担持するための軸部を有する輸送担体を用い、環状化合物に該軸部を包接させて複合体化することによって、環状化合物を、その薬理活性を抑制しつつ、目的の細胞又は組織まで送達することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】第１の実施形態における複合体を説明するイメージ図である。
【図２】第２の実施形態における複合体を説明するイメージ図である。
【図３Ａ】１Ｈ−ＮＭＲによるバリノマイシンとヒドララジンのホストゲスト相互作用の評価結果を示すチャートである。
【図３Ｂ】１Ｈ−ＮＭＲによるバリノマイシンとヒドララジンのホストゲスト相互作用の評価結果を示すチャートである。
【図３Ｃ】１Ｈ−ＮＭＲによるバリノマイシンとヒドララジンのホストゲスト相互作用の評価結果を示すチャートである。
【図３Ｄ】１Ｈ−ＮＭＲによるバリノマイシンとヒドララジンのホストゲスト相互作用の評価結果を示すチャートである。
【図３Ｅ】１Ｈ−ＮＭＲによるバリノマイシンとヒドララジンのホストゲスト相互作用の評価結果を示すチャートである。
【図４】バリノマイシン内包高分子ミセルの安定性試験の結果を示すグラフである。
【図５】バリノマイシン内包高分子ミセルのバリノマイシン放出率の評価結果を示すグラフである。
【図６】バリノマイシン内包高分子ミセルの血中滞留性及び組織透過性の評価結果を示すグラフである。
【図７】バリノマイシン内包高分子ミセルの生体内分布の評価結果を示すグラフである。
【図８】バリノマイシン内包高分子ミセルの抗腫瘍効果の評価結果を示すグラフである。
【図９】培養細胞に対するｕＨＧＣの毒性試験の結果を示すグラフである。
【図１０Ａ】１Ｈ−ＮＭＲによるエリスロマイシンとジエチレントリアミンのホストゲスト相互作用の評価結果を示すチャートである。
【図１０Ｂ】１Ｈ−ＮＭＲによるエリスロマイシンとジエチレントリアミンのホストゲスト相互作用の評価結果を示すチャートである。
【図１０Ｃ】１Ｈ−ＮＭＲによるエリスロマイシンとジエチレントリアミンのホストゲスト相互作用の評価結果を示すチャートである。
【図１０Ｄ】１Ｈ−ＮＭＲによるエリスロマイシンとジエチレントリアミンのホストゲスト相互作用の評価結果を示すチャートである。
【図１０Ｅ】１Ｈ−ＮＭＲによるエリスロマイシンとジエチレントリアミンのホストゲスト相互作用の評価結果を示すチャートである。
【図１１Ａ】１Ｈ−ＮＭＲによるバシトラシンとジヒドララジンのホストゲスト相互作用の評価結果を示すチャートである。
【図１１Ｂ】１Ｈ−ＮＭＲによるバシトラシンとジヒドララジンのホストゲスト相互作用の評価結果を示すチャートである。
【図１１Ｃ】１Ｈ−ＮＭＲによるバシトラシンとジヒドララジンのホストゲスト相互作用の評価結果を示すチャートである。
【図１１Ｄ】１Ｈ−ＮＭＲによるバシトラシンとジヒドララジンのホストゲスト相互作用の評価結果を示すチャートである。
【図１１Ｅ】１Ｈ−ＮＭＲによるバシトラシンとジヒドララジンのホストゲスト相互作用の評価結果を示すチャートである。
【図１２Ａ】１Ｈ−ＮＭＲによるバシトラシンと１−ナフチルヒドララジンのホストゲスト相互作用の評価結果を示すチャートである。
【図１２Ｂ】１Ｈ−ＮＭＲによるバシトラシンと１−ナフチルヒドララジンのホストゲスト相互作用の評価結果を示すチャートである。
【図１２Ｃ】１Ｈ−ＮＭＲによるバシトラシンと１−ナフチルヒドララジンのホストゲスト相互作用の評価結果を示すチャートである。
【図１２Ｄ】１Ｈ−ＮＭＲによるバシトラシンと１−ナフチルヒドララジンのホストゲスト相互作用の評価結果を示すチャートである。
【図１２Ｅ】１Ｈ−ＮＭＲによるバシトラシンと１−ナフチルヒドララジンのホストゲスト相互作用の評価結果を示すチャートである。
【図１３Ａ】１Ｈ−ＮＭＲによるバシトラシンとジエチレントリアミンのホストゲスト相互作用の評価結果を示すチャートである。
【図１３Ｂ】１Ｈ−ＮＭＲによるバシトラシンとジエチレントリアミンのホストゲスト相互作用の評価結果を示すチャートである。
【図１３Ｃ】１Ｈ−ＮＭＲによるバシトラシンとジエチレントリアミンのホストゲスト相互作用の評価結果を示すチャートである。
【図１３Ｄ】１Ｈ−ＮＭＲによるバシトラシンとジエチレントリアミンのホストゲスト相互作用の評価結果を示すチャートである。
【図１３Ｅ】１Ｈ−ＮＭＲによるバシトラシンとジエチレントリアミンのホストゲスト相互作用の評価結果を示すチャートである。
【図１３Ｆ】１Ｈ−ＮＭＲによるバシトラシンとジエチレントリアミンのホストゲスト相互作用の評価結果を示すチャートである。
【図１４Ａ】１Ｈ−ＮＭＲによるバリノマイシンとジヒドララジンのホストゲスト相互作用の評価結果を示すチャートである。
【図１４Ｂ】１Ｈ−ＮＭＲによるバリノマイシンとジヒドララジンのホストゲスト相互作用の評価結果を示すチャートである。
【図１４Ｃ】１Ｈ−ＮＭＲによるバリノマイシンとジヒドララジンのホストゲスト相互作用の評価結果を示すチャートである。
【図１４Ｄ】１Ｈ−ＮＭＲによるバリノマイシンとジヒドララジンのホストゲスト相互作用の評価結果を示すチャートである。
【図１４Ｅ】１Ｈ−ＮＭＲによるバリノマイシンとジヒドララジンのホストゲスト相互作用の評価結果を示すチャートである。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
以下、本発明の好ましい実施形態について説明するが、本発明はこれらの実施形態には限定されない。また、各実施形態は、適宜組み合わせることができる。
【００１２】
Ａ．複合体
本発明の１つの実施形態による複合体は、環状化合物と該環状化合物を担持するための軸部を有する輸送担体との複合体であって、該軸部が該環状化合物に包接されることによって複合体化している。
【００１３】
Ａ−１.第１の実施形態における複合体
図１は、本発明の第１の実施形態における複合体を説明するイメージ図である。図１に示されるとおり、複合体１００は、側鎖に軸部１２を有するポリマー（輸送担体）１０と環状化合物２０との複合体であり、環状化合物２０が軸部１２を包接することによって両者が複合体化している。
【００１４】
上記複合体１００において、１分子のポリマー１０に担持される環状化合物２０の分子数は、例えば１〜２００、好ましくは５〜１００、より好ましくは１０〜６０であり得る。
【００１５】
なお、上記図示例においては、ポリマー１０は、親水性ポリマーセグメント１０ａと疎水性ポリマーセグメント１０ｂとを有するブロックコポリマーであり、疎水性ポリマーセグメント１０ｂのみが側鎖に軸部１２を有するが、本発明は、当該実施形態に限定されない。例えば、側鎖に軸部を有するポリマーセグメント（例えば、後述する疎水性ポリマーセグメント）のみからなるポリマーを輸送担体として用いてもよい。
【００１６】
また、上記図示例においては、軸部１２とポリマー主鎖との間に、生体内で開裂し得る結合１４が存在しているが、本発明は、当該実施形態に限定されない。具体的には、軸部は、生体内で開裂し得る結合を介して又は介することなく側鎖に導入されることができる。
【００１７】
上記図示例の複合体においては、ポリマーの側鎖末端に設けられた軸部を環状化合物が包接している。このような構成を有する複合体によれば、従来のＤＤＳへの適用が困難であった環状化合物を、その薬理活性を抑制しつつ、目的の細胞又は組織まで送達することができる。さらに、ポリマーとして、親水性ポリマーセグメントと疎水性ポリマーセグメントとを有するブロックコポリマーを用いることにより、極性媒体中で、薬物を担持する疎水性ポリマーセグメントを内側に向け、親水性ポリマーセグメントを外側に向けた高分子ミセル（Ｐｏｌｙｍｅｒｉｃ  ｍｉｃｅｌｌｅｓ）を形成し得る。このような構成を有する高分子ミセルは、生体適合性及び血中安定性に優れることから、ＤＤＳとして有用である。
【００１８】
Ａ−１−１．環状化合物
上記環状化合物としては、所望の薬理活性を有する任意の適切な化合物が用いられ得る。環状化合物が有する環は、軸部を包接し得る寸法と形状を有し、例えば８員以上、好ましくは１０員以上、より好ましくは１２員以上、さらに好ましくは１６員〜５０員の単素環又は複素環であり得る。複素環が含むヘテロ原子は、例えば酸素又は窒素であり得る。これらのヘテロ原子は、軸部との間で非共有結合的な相互作用（例えば、水素結合、配位結合、イオン結合、ファンデルワールス力、ＸＨ／π相互作用（Ｘ＝Ｃ、Ｎ、Ｏ）等）を発揮する観点から、有用である。
【００１９】
上記環状化合物の具体例としては、バリノマイシン、アウレオバシジンＡ、ＨＵＮ−７２９３、ノナクチン、ラパマイシン、タクロリムス、エリスロマイシン、クラリスロマイシン、ロキシスロマイシン、アジスロマイシン、ジョサマイシン、ロキタマイシン、キタサマイシン、アセチルスピラマイシン、テリスロマイシン、リンコマイシン、クリンダマイシン、リファブチン、リファンピシン、リファペンチン、リファキシミン、タクロリムス、ピメクロリムス、パクリチニブ、テムシロリムス、ゾタロリムス、エベロリムス、リファラジル、リダフォロリムス、テリスロマイシン、シメプレビル、ダノプレビル、バニプレビル等のマクロライド；シクロスポリン、ミクロシスチン、バシトラシン、ボクロスポリン、リノプリスチン、フロプリスチン等の環状ポリペプチド；クラウンエーテル；ポルフィリン；シアノスター、シクロデキストリン等が挙げられる。環状化合物は、１種のみを単独で用いてもよく、２種以上を組み合わせて用いてもよい。
【００２０】
Ａ−１−２．側鎖に軸部を有するポリマー
上記側鎖に軸部を有するポリマーとしては、任意の適切なポリマーが用いられ得る。上記ポリマーが、親水性ポリマーセグメントと疎水性ポリマーセグメントとが直列に連結されたブロックコポリマーである場合、親水性ポリマーセグメントを構成するポリマーとしては、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、ポリ（２−オキサゾリン）、ポリサッカライド、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリアクリルアミド、ポリメタクリルアミド、ポリアクリル酸エステル、ポリメタクリル酸エステル等が挙げられ、ポリエチレングリコールが好ましく用いられ得る。親水性ポリマーセグメントは、直鎖状であってもよく、分岐鎖状であってもよい。
【００２１】
上記親水性ポリマーセグメントを構成するポリマーにおけるモノマー単位の繰り返し数（分岐鎖の場合は、各鎖における繰り返し数）は、例えば２０〜２０，０００であり得る。
【００２２】
疎水性ポリマーセグメントを構成するポリマーとしては、ブロックコポリマーが極性溶媒中で親水性ポリマーセグメントを外側に向け、疎水性ポリマーセグメントを内側に向けた状態のミセルを形成可能な程度に親水性ポリマーセグメントよりも低い親水性度を有するポリマーが選択される。このようなポリマーとしては、例えば、ポリグリコール酸（ＰＧＡ）、ポリ乳酸（ＰＬＡ）及びその共重合体（ＰＬＧＡ）、ポリアミノ酸、ポリエーテル等が挙げられる。なかでも、ポリアミノ酸が好ましく用いられ得る。
【００２３】
上記ポリアミノ酸としては、ポリ（アスパラギン酸）及び／又はその誘導体（例えば、ポリ（アルキルアスパルテート）、ポリ（アリールアスパルテート）、ポリ（アラルキルアスパルテート）、及びこれらとポリ（アスパラギン酸）とのコポリマー等）、ポリ（グルタミン酸）及び／又はその誘導体（例えば、ポリ（アルキルグルタメート）、ポリ（アリールグルタメート）、ポリ（アラルキルグルタミド）、及びこれらとポリ（グルタミン酸）とのコポリマー）並びにポリ（リジン）及び／又はその誘導体であって、少なくとも１つの側鎖に軸部が導入されているものが挙げられる。
【００２４】
疎水性ポリマーセグメントを構成するポリマーがポリアミノ酸である場合、アミノ酸残基の繰り返し数は、例えば５〜３００であり、好ましくは１０〜２５０であり、より好ましくは２０〜２００である。また、軸部の導入率（軸部を有する側鎖の数／疎水性ポリマーセグメント中の側鎖の総数×１００）は、例えば５％〜１００％、好ましくは１０％〜９０％、より好ましくは３０％〜７０％であり得る。
【００２５】
１分子のポリマーが有する軸部の数は、１以上であり、好ましくは５以上、より好ましくは１０以上、さらに好ましくは１５〜１５０、さらにより好ましくは２０〜１００である。
【００２６】
上記軸部は、環状化合物によって包接される部分であり、環状化合物の環内に包接され得る寸法と形状とを有する。好ましくは、軸部は、環状化合物と非共有結合的に、例えば、疎水性相互作用や水素結合等により、相互作用し得る基をさらに有する。当該軸部と環状化合物との非共有結合的な相互作用は、いわゆるホストゲスト相互作用とも称され得る。軸部は、環状化合物の環の大きさ、環内の電気的雰囲気等に対応した構造を有し、環状化合物に分子認識され得る。
【００２７】
上記軸部は、代表的には、軸部を有する化合物とポリマー側鎖との反応により、ポリマー側鎖に導入される。軸部を有する化合物としては、軸部及びポリマー側鎖との反応に利用可能な官能基を有する化合物が選択される。
【００２８】
ホストゲスト相互作用に着目して軸部を有する化合物（ゲスト分子）を決定する方法の一例を以下に説明する。
［ゲスト分子の決定方法］
（工程１）送達対象の環状化合物（ホスト分子）の構造を解析する（例：化学構造、立体構造、環の大きさ等）。
（工程２）ゲスト分子候補を探索する（条件：化学構造、立体構造、分子の大きさ、分子内に窒素原子のような非共有電子対をもつドナー原子があること、ポリマー側鎖に導入するための官能基を有すること、等）。
（工程３）分子モデリングプログラム「Ｍａｅｓｔｒｏ」（Ｓｃｈｒｏｄｉｎｇｅｒ社製）等を用いて、ゲスト分子がホスト分子内に入るかどうか検討する。
（工程４）実際に、水または有機溶媒においてゲスト分子(またはゲスト分子がコンジュゲートされたポリマー)とホスト分子を単純混合することによりホストゲスト相互作用を起こし、安定化するホストゲスト複合体の組み合わせを見つける。
【００２９】
上記安定化するホストゲスト複合体を形成する組み合わせは、例えば、以下の工程ＡおよびＢを含む方法によって決定することができる。
（工程Ａ）互いに分子認識する官能基が存在することを１Ｈ−ＮＭＲスペクトルにおけるピークシフトにより確認する。
（工程Ｂ）結合定数（Ｋ）をＵＶスペクトルから算出し、結合定数の大きい組み合わせ（例えば、結合定数（会合定数）が、１０Ｍ−１〜１０００Ｍ−１である組み合わせ、また例えば１０Ｍ−１〜１００Ｍ−１である組み合わせ）を探索する。
【００３０】
なお、上記では、軸部を有する化合物（ゲスト分子）の決定方法として、分子モデリングプログラム「Ｍａｅｓｔｒｏ」（Ｓｃｈｒｏｄｉｎｇｅｒ社製）を用いた方法を例示したが、当該方法に限定されず、ホストゲスト化学に基づく種々の分子認識技術、分子設計技術等を利用して目的の環状化合物（ホスト分子）に包接され得る軸部を有する化合物（ゲスト分子）を決定することができる。
【００３１】
ホストゲスト相互作用によって包接体を形成可能な環状化合物と軸部（軸部を有する化合物）との組合せとしては、バリノマイシンとヒドララジン、バリノマイシンとジヒドララジン、シクロスポリンとジヒドララジン、エリスロマイシンとヒドララジン、ロルラチニブとヒドララジン、β−ベンジル−Ｌ−アスパラギン酸とリファンピシン、１，５−ジアミノペンタンとエリスロマイシン、ジアミノペンタンとロルラチニブ、ジエチレントリアミンとバリノマイシン、ジエチレントリアミンとリファンピシン、ジエチレントリアミンとエリスロマイシン、バシトラシンとジエチレントリアミン、バシトラシンとジヒドララジン、バシトラシンと１−ナフチルヒドララジン等が挙げられる。
【００３２】
上記軸部は、好ましくは生体内で開裂し得る結合を介して上記側鎖の末端に導入される。生体内で開裂し得る結合としては、ＤＤＳにおいて利用可能な任意の適切な化学結合が採用され得る。このような結合の代表例としては、ジスルフィド結合、アセタール結合、ケタール結合、ヒドラゾン結合、エノールエーテル結合、エノールエステル結合、アミド結合、イミン結合、イミニウム結合、エナミン結合、シリルエーテル結合、シラザン結合、シリルエノールエーテル結合、ジオール結合、ジアゾ結合、エステル結合、スルホン結合、及びケイ素−炭素結合が挙げられる。好ましくは、ジスルフィド結合、アセタール結合、ヒドラゾン結合である。
【００３３】
上記ジスルフィド結合（−Ｓ−Ｓ−）は、還元的環境下において容易に開裂する。このような特性を利用することにより、細胞への効率的な薬物送達を達成することができる。具体的には、生体内においては、グルタチオンの濃度差に起因して、細胞外では非還元的環境であり（約１０μＭ）、細胞内では還元的環境である（約１０ｍＭ）。したがって、上記複合体は、細胞に達するまでは環状化合物に軸部を包接させた形態を維持することができ、細胞に取り込まれた後は、ジスルフィド結合におけるイオウ原子間の結合が開裂することにより、軸部と環状化合物との包接体を細胞内にスムーズかつ効率的に放出することができる。その後、細胞内において当該包接体から軸部が脱離することにより、環状化合物がその薬理活性を発揮することができる。
【００３４】
上記アセタール結合及びヒドラゾン結合は、細胞内外のｐＨの差により容易に開裂する。具体的には、生体内においては、細胞外のｐＨは約７であるのに対し、細胞内後期エンドソーム内のｐＨは４〜５である。アセタール結合及びヒドラゾン結合は、細胞外では結合を維持し、細胞内後期エンドソーム内では容易に開裂する。その結果、ジスルフィド結合の場合と同様に、上記複合体は、細胞に達するまでは環状化合物に軸部を包接させた形態を維持することができ、細胞に取り込まれた後は、軸部と環状化合物との包接体を細胞内にスムーズかつ効率的に放出することができる。
【００３５】
上記ポリマー複合体の具体例を以下の式（Ｉ）又は（ＩＩ）に示す。
【化１】
2020116635.tif 000003
【化２】
2020116635.tif 000004
（式（Ｉ）又は（ＩＩ）中、
Ｒ１及びＲ９は、相互に独立して、水素原子あるいは未置換もしくは置換された炭素数１〜１２の直鎖又は分枝状のアルキル基を表し、
Ｒ２は、水素原子、未置換又は置換された直鎖もしくは分枝の炭素数１〜１２のアルキル基あるいは未置換又は置換された直鎖もしくは分枝の炭素数１〜２４のアルキルカルボニル基を表し、
Ｒ３ａ、Ｒ３ｂ、Ｒ４ａ及びＲ４ｂは、相互に独立して、メチレン基又はエチレン基を表し、
Ｒ５ａ、Ｒ５ｂ、Ｒ７ａ及びＲ７ｂは、相互に独立して、−Ｏ−又はＮＨ−を表し、
Ｒ６ａ及びＲ６ｂは、相互に独立して、水素原子又は疎水性有機基を表し、
Ｒ８ａ及びＲ８ｂは、相互に独立して、直鎖もしくは分枝の炭素数１〜１２のアルキレン基、炭素数６〜１２のアリーレン基又はこれらの組合せからなる基を表し、
Ｒ１０は、水酸基、オキシベンジル基、−Ｏ−Ｒ１０ａ又は‐ＮＨ−Ｒ１０ｂ基を表し、ここでＲ１０ａ又はＲ１０ｂはそれぞれ独立して、未置換又は置換された直鎖もしくは分枝の炭素数１〜１２アルキル基を表し、
Ｌ１及びＬ２はそれぞれ独立して、二価の連結基を表し、
Ｂは、生体内で開裂し得る結合を表し、
Ａは、軸部を表し、
ｋは、２０〜２０，０００の整数を表し、
ａ、ｂ、ｃ及びｄは、それぞれ独立して、０〜３００の整数であり、
ただし、５≦ａ＋ｂ＋ｃ＋ｄ≦３００の関係を満たし、
１≦ｃ＋ｄの関係を満たし、
上記各アミノ酸繰り返し単位の結合順は任意であり、
Ｒ６ａ、Ｒ６ｂ、Ｒ８ａ及びＲ８ｂは、ポリマー分子内のアミノ酸繰り返し単位毎に任意に選択可能である。）
【００３６】
上記Ｒ１、Ｒ２、Ｒ９、Ｒ１０ａ及びＲ１０ｂの基で定義する、炭素数１〜１２の直鎖又は分枝状のアルキル基としては、例えば、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基、ｎ−ブチル基、ｓｅｃ−ブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基、ｎ−ヘキシル基、デシル基、及びウンデシル基等を挙げることができる。
【００３７】
Ｒ２の基で定義する、炭素数１〜２４の直鎖又は分枝状のアルキルカルボニル基の内の炭素数１〜１２の直鎖又は分枝状のアルキル部分は上述した例示を参考にでき、炭素数１３以上のアルキル部分は、例えば、トリデシル基、テトラデシル基、ペンタデシル基、ノナデシル基、ドコサニル基及びテトラコシル基等を挙げることができる。
【００３８】
上記アルキル基又はアルキル部分について、「置換された」場合の置換基としては、限定されるものでないが、Ｃ１−６アルコキシ基、アリールオキシ基、アリールＣ１−３オキシ基、シアノ基、カルボキシル基、アミノ基、Ｃ１−６アルコキシカルボニル基、Ｃ２−７アシルアミド基、トリ−Ｃ１−６アルキルシロキシ基、シロキシ基、シリルアミノ基を示すか、又はアセタール化ホルミル基、ホルミル基、塩素又はフッ素等のハロゲン原子を挙げることができる。ここで、例えば、Ｃ１−６のごとき表示は、炭素数１〜６を意味する。
【００３９】
上記Ｒ１及びＲ９の基は、標的結合部位を含む基によって置換されていてもよい。標的結合部位を親水性ポリマーセグメントの末端に導入することにより、標的となる所望の部位への到達性を向上できる。標的結合部位を含む基としては、標的となる組織に対する指向性又は機能性を有する限りにおいて任意の適切な基であり得、例えば、抗体もしくはその断片、又はその他の機能性もしくは標的指向性を有するタンパク質、ペプチド、アプタマー、ラクトース等の糖、葉酸といった生理活性物質及びその誘導体に由来する基であり得る。
【００４０】
上記Ｒ６ａ及びＲ６ｂの基で定義する疎水性有機基は、例えば、炭素数６〜２７の飽和もしくは不飽和の直鎖又は分枝状の脂肪族炭化水素基、炭素数６〜２７のアリール基又はアラルキル基、あるいはステロールに由来する残基である。疎水性有機基の代表例としては、ベンジル基又はフェニル基が挙げられる。
【００４１】
上記Ｒ８ａ及びＲ８ｂの基で定義する直鎖もしくは分枝の炭素数１〜１２のアルキレン基、炭素数６〜１２のアリーレン基又はこれらの組合せからなる基としては、例えば、Ｃ１−１０アルキレン基、Ｃ６−１２アリーレン基、Ｃ１−６アルキレン−Ｃ６−１２アリーレン基又はＣ１−６アルキレン−Ｃ６−１２アリーレン−Ｃ１−６アルキレン基、好ましくはＣ１−８アルキレン基、Ｃ６−１０アリーレン基、Ｃ１−４アルキレン−Ｃ６−１０アリーレン基又はＣ１−４アルキレン−Ｃ６−１０アリーレン−Ｃ１−４アルキレン基が挙げられる。
【００４２】
上記Ｌ１は、例えば、−ＮＨ−、−Ｏ−、−Ｏ−Ｌ１ａ−ＮＨ−、−ＣＯ−、−ＣＨ２−、及びＯ−Ｌ１ａ−Ｓ−Ｌ１ａ−ＮＨ−（ここで、Ｌ１ａは独立して炭素数１〜６のアルキレン基である）から選ばれる連結基であり得る。
【００４３】
上記Ｌ２は、例えば、−ＯＣＯ−Ｌ２ａ−ＣＯ−、及びＮＨＣＯ−Ｌ２ａ−ＣＯ−（ただし、Ｌ２ａは炭素数１〜６のアルキレン基である）から選ばれる連結基であり得る。
【００４４】
上記Ｂは、好ましくはアセタール結合、ヒドラゾン結合又はジスルフィド結合であり、より好ましくはヒドラゾン結合である。
【００４５】
各アミノ酸残基の繰り返し数を表すａ、ｂ、ｃ及びｄは、それぞれ独立して好ましくは０〜２００の整数、より好ましくは０〜１００の整数である。また、ポリアミノ酸の重合度（ａ＋ｂ＋ｃ＋ｄ）は、好ましくは１０〜２５０の整数、より好ましくは２０〜２００の整数である。また、軸部を有する側鎖の総数（ｃ＋ｄ）は、好ましくは５以上、より好ましくは１０以上、さらに好ましくは１５〜１５０、さらにより好ましくは２０〜１００である。
【００４６】
エチレングリコールの繰り返し数を表すｋは、好ましくは５０〜２，０００、より好ましくは１００〜１，０００の整数を表す。
【００４７】
上記式（Ｉ）又は（ＩＩ）に示されるポリマーは、任意の適切な方法によって合成され得る。一例として、少なくとも１つの側鎖にヒドラゾン結合を介して軸部が導入されたポリエチレングリコール−ポリ（ベンジルアスパルテート）ブロックコポリマーの合成方法を以下に説明する。最初に、末端に一級アミノ基を有するポリエチレングリコールを開始剤として、β−ベンジル−Ｌ−アスパルテート−Ｎ−カルボン酸無水物を重合させてポリエチレングリコール−ポリ（β−ベンジル−Ｌ−アスパルテート）ブロックコポリマーを合成する。次いで、ヒドロキシル基又はアミノ基とカルボニル基とを有する化合物を用いてエステル交換又はアミノリシスを行って、側鎖にカルボニル基を導入する。代替的に、ヒドロキシル基又はアミノ基とアセタール基とを有する化合物を用いてエステル交換又はアミノリシスを行い、次いで、酸触媒下でアセタール基をカルボニル基に変換してもよい。その後、当該カルボニル基と軸部を有する化合物としてのヒドララジン誘導体とを反応させる。これにより、少なくとも１つの側鎖にヒドラゾン結合を介して軸部が導入されたブロックコポリマーが得られ得る。
【００４８】
Ａ−１−３．複合体の調製方法
上記複合体は、例えば、上記側鎖に軸部を有するポリマーに該ポリマーを溶解可能な水溶性有機溶媒を加えて溶解後、環状化合物を添加し、次いで、水又は緩衝液等の水性媒体に対して透析することによって調製することができる。ここで、水溶性有機溶媒としては、メタノール、エタノール、アセトニトリル、ジメチルスルホキシド、Ｎ,Ｎ−ジメチルホルムアミド、Ｎ,Ｎ−ジメチルアセトアミド等が挙げられる。側鎖に軸部を有するポリマーと環状化合物との混合割合は、目的に応じて適切に設定され得る。該混合割合は、例えば、Ｊｏｂｓ−ｐｌｏｔ法を用いて軸部と環状化合物とが効率よく複合体を形成し得る割合に設定され得る。混合物中における軸部に対する環状化合物のモル比は、例えば軸部のモルを１とすると０．１〜５．０、好ましくは０．２〜２．０となるように設定され得る。
【００４９】
上記調製方法における環状化合物の担持割合（１分子のポリマーに担持される環状化合物の分子数／１分子のポリマー中の軸部の数×１００）は、例えば１０％以上、好ましくは２０％以上、より好ましくは４０％〜１００％であり得る。
【００５０】
Ａ−２．第２の実施形態における複合体
図２は、本発明の第２の実施形態における複合体を説明するイメージ図である。図２に示されるとおり、複合体２００は、軸部３２とその両端側に配置された蓋部３４ａ、３４ｂとを有する輸送担体３０と、環状化合物２０と、の複合体であり、環状化合物２０が軸部３２を包接するとともに、蓋部３４ａ、３４ｂが環状化合物２０の軸部３２からの脱離を防止することによって両者が複合体化している。
【００５１】
上記複合体２００において、１分子の輸送担体３０に担持される環状化合物２０の分子数は、１又は２以上であってよい。
【００５２】
上記図示例においては、軸部３２と蓋部３４ａとの間及び軸部３２と蓋部３４ｂとの間にそれぞれ、生体内で開裂し得る結合３６ａ、３６ｂが存在しているが、本発明は、当該実施形態に限定されない。例えば、いずれか一方の軸部と蓋部との間にのみ生体内で開裂し得る結合が存在していてもよい。あるいは、蓋部は、生体内で開裂し得る結合を介することなく直接軸部と結合していてもよい。
【００５３】
第２の実施形態における複合体においては、軸部を環状化合物が包接し、当該環状化合物の軸部からの脱離を蓋部が防止することができる。このような構成を有する複合体によれば、従来のＤＤＳへの適用が困難であった環状化合物を、その薬理活性を抑制しつつ、目的の細胞又は組織まで送達することができる。また、このような構成を有する複合体によれば、嵩高い蓋部を採用することにより、二次会合してミセル等の凝集体を構成することなく、複合体単体で血中に安定的に存在することができ、その小さいサイズに起因して、優れた組織浸透性を示すことが期待される。なお、第２の実施形態における複合体において、環状化合物による軸部の包接は、第１の実施形態における複合体と同様に、環状化合物をホスト分子とし、軸部をゲスト分子とするホストゲスト相互作用を利用して行われ得る。
【００５４】
Ａ−２−１．環状化合物
上記環状化合物としては、Ａ−１−１項に記載の環状化合物が挙げられる。
【００５５】
Ａ−２−２．輸送担体
上記輸送担体は、軸部と、好ましくはその両端に直接又は生体内で開裂し得る結合を介して結合された蓋部とを有する。
【００５６】
蓋部は、環状化合物が軸部から脱離することを防止可能な程度の嵩高さを有することが好ましい。蓋部を構成する材料としては、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、ポリ（２−オキサゾリン）、ポリサッカライド、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリアクリルアミド、ポリメタクリルアミド、ポリアクリル酸エステル、ポリメタクリル酸エステル等の親水性ポリマーが挙げられる。なかでも、生体適合性に優れること、極性溶媒中における分子鎖の広がりが大きいこと等の観点から、ポリエチレングリコールが好ましく用いられ得る。親水性ポリマーは、直鎖状であってもよく、分岐鎖状であってもよい。
【００５７】
上記親水性ポリマーセグメントを構成するポリマーにおけるモノマー単位の繰り返し数（分岐鎖の場合は、各鎖における繰り返し数）は、例えば２０〜２０，０００、好ましくは２００〜２，０００、より好ましくは４００〜１，０００である。
【００５８】
上記軸部は、環状化合物によって包接される部分であり、環状化合物の環内に包接され得る寸法と形状を有する。好ましくは、軸部は、環状化合物と非共有結合的に、例えば、疎水性相互作用や水素結合等により、相互作用し得る基をさらに有する。当該軸部と環状化合物との非共有結合的な相互作用は、いわゆるホストゲスト相互作用とも称され得る。軸部は、環状化合物の環の大きさ、環内の電気的雰囲気等に対応した構造を有し、環状化合物に分子認識され得る。
【００５９】
上記軸部は、代表的には、軸部を有する化合物と蓋部を構成する材料（例えば、上記親水性ポリマー）との反応により輸送担体に導入される。軸部を有する化合物としては、軸部及び軸部を介在する２か所に蓋部を構成する材料との反応に利用可能な官能基を有する化合物が選択される。軸部を有する化合物を決定する方法としては、Ａ−１−２項で記載した方法と同様の方法を用いることができる。
【００６０】
上記生体内で開裂し得る結合については、Ａ−１−２項で記載したとおりである。
【００６１】
Ａ−２−３．複合体の調製方法
上記複合体は、任意の適切な方法によって調製され得る。例えば、軸部とその両末端にヒドラゾン結合を介して結合しているポリエチレングリコールとを有する輸送担体と、環状化合物と、の複合体は、水溶性有機溶媒に、環状化合物と、片末端にアルデヒド基を有するポリエチレングリコールと、軸部を有する化合物としてのジヒドララジン化合物とを添加及び混合して反応させた後、水又は緩衝液等の水性媒体に対して透析することによって調製することができる。上記水溶性有機溶媒としては、メタノール、エタノール、アセトニトリル、ジメチルスルホキシド、Ｎ,Ｎ−ジメチルホルムアミド、Ｎ,Ｎ−ジメチルアセトアミド等が挙げられる。上記軸部を有する化合物と環状化合物とポリエチレングリコールとの混合割合は、目的に応じて適切に設定され得る。該混合割合は、例えば、混合物中における軸部を有する化合物に対する環状化合物のモル比が軸部のモルを１とすると０．１〜５．０、好ましくは０．２〜２．０となるように、また、軸部を有する化合物に対するポリエチレングリコールのモル比が１．０〜５．０、好ましくは１．０〜２．０となるように、設定され得る。
【００６２】
Ｂ．ポリマー粒子組成物
本発明の１つの実施形態によるポリマー粒子組成物は、上記Ａ−１項に記載の複合体を含む。上記複合体は、極性媒体中で会合して好適にポリマー粒子を形成し得る。例えば、複合体を形成する輸送担体が、親水性ポリマーセグメントと疎水性ポリマーセグメントとを有するブロックコポリマーである場合、当該複合体は、環状化合物を担持する疎水性ポリマーセグメントを内側に向け、親水性ポリマーセグメントを外側に向けた高分子ミセルを形成し得る。なお、本発明においては、複数の複合体が粒子状に集合した集合体も粒子に含めるものとし、このような集合体もポリマー粒子と称する。
【００６３】
上記ポリマー粒子の平均粒子径は、例えば１０００ｎｍ以下、好ましくは４００ｎｍ以下、２００ｎｍ以下、１５０ｎｍ以下、１００ｎｍ以下又は８０ｎｍ以下であり、例えば２０ｎｍ以上又は３０ｎｍ以上である。当該粒子の平均粒子径は、市販の動的光散乱（ＤＬＳ）測定装置を用いて測定することができる。
【００６４】
上記ポリマー粒子組成物は、本発明の効果が得られる範囲において、Ａ−１項に記載の複合体に加えて他のポリマーを含み得る。このような他のポリマーとしては、例えば、親水性ポリマーセグメントと疎水性ポリマーセグメントとを有するブロックコポリマーが挙げられる。このようなブロックコポリマーは、極性媒体中で好適に会合して安定なポリマー粒子（例えば、高分子ミセル）を形成し得るので、これらを共存させることにより安定性に優れたポリマー粒子組成物が得られ得る。このような効果は親水性ポリマー鎖セグメントを有さないポリマーを輸送担体として用いた複合体を含むポリマー粒子組成物において、特に好適に奏され得る。上記他のブロックコポリマーとしては、例えばＷＯ２００７／０９９６６０、ＷＯ２００７／０９９６６１、ＷＯ２０１０／０９３０３６、ＷＯ２０１２／０９６３９９、ＷＯ２０１４／１３３１７２、ＷＯ２０１５／１７０７５７等に記載のポリマーが挙げられる。
【００６５】
上記ポリマー粒子組成物は、任意の適切な方法によって調製され得る。例えば、側鎖に軸部を有するポリマーと環状化合物と任意成分である上記他のポリマーとを、水溶性有機溶媒に添加及び混合して会合させた後、水又は緩衝液等の水性媒体に対して透析することによって調製することができる。上記水溶性有機溶媒としては、メタノール、エタノール、アセトニトリル、ジメチルスルホキシド、Ｎ,Ｎ−ジメチルホルムアミド、Ｎ,Ｎ−ジメチルアセトアミド等が挙げられる。
【００６６】
Ｃ．使用方法
上記Ａ項に記載の複合体及びＢ項に記載のポリマー粒子組成物は、担持する環状化合物を用いた処置を必要とする個体に対して投与される。投与対象の個体としては、例えばヒト又はヒト以外の哺乳動物が挙げられる。投与方法は、好ましくは非経口投与であり、皮下投与、筋肉内投与、静脈内投与、腹腔内投与、髄腔内投与等が例示できる。
【実施例】
【００６７】
以下、実施例によって本発明を具体的に説明するが、本発明はこれら実施例によって限定されるものではない。【００６８】
［実験例１］１Ｈ−ＮＭＲによるバリノマイシン（Ｖａｌ）とヒドララジン（Ｈｙｄ）の相互作用の評価
環状化合物として、Ｖａｌを選択し、分子モデリングプログラム「Ｍａｅｓｔｒｏ」（Ｓｃｈｒｏｄｉｎｇｅｒ社製）を用いてその構造を解析したところ、環の径は６Åであった。分子径が６Å未満であること、分子内に窒素原子のような非共有電子対をもつドナー原子があること、疎水性相互作用のための疎水性官能基があること、ポリマー側鎖にｐＨ応答性の官能基を介して導入するための１級アミンを有することを条件として、Ｖａｌとホストゲスト相互作用を生じ得るゲスト分子（軸部）候補を探索したところ、Ｈｙｄが選択された。
【化３】
2020116635.tif 000005
【００６９】
次いで、以下のようにして、ＶａｌとＨｙｄの相互作用を評価した。Ｖａｌ（１０ｍｇ／ｍＬ）とＨｙｄ（１．４４ｍｇ／ｍＬ）を重ＤＭＳＯ中で混合し、１Ｈ−ＮＭＲにより化学シフトを測定し、各ピークを帰属させた。コントロールとしてバリノマイシン（１０ｍｇ／ｍＬ）単体とヒドララジン（１．４４ｍｇ／ｍＬ）単体の化学シフトもそれぞれ測定し、各ピークを帰属させた。さらに、バリノマイシン単体の場合とヒドララジンと共存している場合との比較において、化学シフトが変化したものについては、その変化量を求めた。結果を図３Ａ−３Ｅ及び表１に示す。【００７０】
【表１】
2020116635.tif 000006
【００７１】
表１に示されるとおり、バリノマイシンが単体で存在している場合とヒドララジンと共存している場合とでは０ｐｐｍ〜０．０１ｐｐｍの化学シフト変化がみられた。このことから、バリノマイシンがヒドララジンによって影響を受けており、バリノマイシンとヒドララジンとが相互作用していることがわかる。また、化合物間の近接したプロトンを検出するＲＯＥＳＹ（Ｒｏｔａｔｉｎｇ  ｆｒａｍｅ  ｎｕｃｌｅａｒ  Ｏｖｅｒｈａｕｓｅｒ  ｅｆｆｅｃｔ  ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ）測定を行ったところ、バリノマイシンのアミンの水素とヒドララジンｅのベンゼン環の水素が近接していることによる交差したピークが見られた。【００７２】
［実験例２］ＵＶ−Ｖｉｓ法によるＶａｌとＨｙｄの混合比の最適化
Ｖａｌ（１０ｍｇ／ｍＬ）とＨｙｄ（１．４４ｍｇ／ｍＬ）をアセトニトリルに溶解し、種々の混合比（［Ｖａｌ］：［Ｈｙｄ］＝９：１、８：２、７：３、６：４、５：５、４：６、３：７、２：８、１：９）で混合した。その後、ＵＶ−Ｖｉｓ法による溶液のスペクトルを測定し、２７２ｎｍにおける吸光度からＪｏｂｓ−ｐｌｏｔ法によりＶａｌとＨｙｄとが最も効率的に相互作用する混合比を決定した。具体的には、溶液の吸光度とコントロール溶液（バリノマイシン溶液）の吸光度の差分をとり、溶液中のバリノマイシンのモル分率をかけたものが最大値になる時のモル分率を計算した。その結果、ＶａｌとＨｙｄとが最も効率的に相互作用する混合比（［Ｖａｌ］：［Ｈｙｄ］）は、１：１．２２であった。【００７３】
［実験例３］ｐｏｌｙ（ｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｇｌｙｃｏｌ）−ｐｏｌｙ（β−ｂｅｎｚｙｌ−Ｌ−ａｓｐａｒｔａｔｅ）（ＰＥＧ−ＰＢＬＡ）の合成
ＰＥＧ−ＮＨ２（ＰＥＧ分子量：１２ｋＤａ）をジクロロメタン（ＤＣＭ、６６ｍｇ／ｍＬ）に溶解し、ＤＣＭ／Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）混合溶媒  （［ＤＣＭ］／［ＤＭＦ］＝１０、６６ｍｇ／ｍＬ）に溶解したβ−ベンジル−Ｌ−アスパラギン酸−Ｎ−カルボン酸無水物（ＢＬＡ−ＮＣＡ、６０当量）を添加した。３５℃で３日間の反応後、反応溶液をジエチルエーテルに添加し、減圧乾燥によりＰＥＧ−ＰＢＬＡ（ＰＢＬＡ重合度：４０）を得た。重ＤＭＳＯ中での１Ｈ−ＮＭＲから、収率は６８％であった。【００７４】
［実験例４］ＰＥＧ−ＰＢＬＡ−Ａｃｅｔｙｌ（ＰＥＧ−ＰＢＬＡ−Ａｃ）の合成
ＰＥＧ−ＰＢＬＡをＤＭＦ（１０ｍｇ／ｍＬ）に溶解し、Ｎ，Ｎ−ジメチル−４−アミノピリジン（ＤＭＡＰ、１０当量）、トリエチルアミン（ＴＥＡ、１当量）、無水酢酸（１０当量）を添加した。室温で３時間の反応後、反応溶液をジエチルエーテルに添加し、減圧乾燥によりＰＥＧ−ＰＢＬＡ−Ａｃを得た。重ＤＭＳＯ中での１Ｈ−ＮＭＲから、収率は８１％であった。【００７５】
［実験例５］ＰＥＧ−ｐｏｌｙ（ａｓｐａｒｔａｔｅ−ｂｅｎｚｙｌ  ａｌｄｅｈｙｄｅ）（ＰＥＧ−Ｐ（Ａｓｐ−ＢＡ））の合成
ＰＥＧ−ＰＢＬＡ−ＡｃをＤＭＦ（６０ｍｇ／ｍＬ）に溶解し、４，４−ジメトキシメチルフェニルメタンアミンを添加した。３５℃で４日間の反応後、反応溶液に１Ｍ  ＨＣｌ溶液（１００μＬ）を添加し、室温で１時間反応した。その後、反応溶液を純水に対して透析（ＭＷＣＯ：６，０００−８，０００）し、凍結乾燥によりＰＥＧ−Ｐ（Ａｓｐ−ＢＡ）を得た。重ＤＭＳＯ中での１Ｈ−ＮＭＲから、ＢＡの導入率は６３％であった。【００７６】
［実験例６］ＰＥＧ−ｐｏｌｙ（Ａｓｐ−ｂｅｎｚｙｌ  ｈｙｄｒａｌａｚｉｎｅ）（ＰＥＧ−Ｐ（Ａｓｐ−ＢＨ））の合成
ＰＥＧ−Ｐ（Ａｓｐ−ＢＡ）をＤＭＳＯ（２０ｍｇ／ｍＬ）に溶解し、トリエチルアミン（１７０当量）及びＨｙｄ（１７０当量）を添加した。３５℃で４日間の反応後、反応溶液をメタノールに対して透析（ＭＷＣＯ：６，０００−８，０００）し、減圧乾燥及び凍結乾燥により、以下に示すＰＥＧ−Ｐ（Ａｓｐ−ＢＨ）を得た。重ＤＭＳＯ中での１Ｈ−ＮＭＲから、Ｈｙｄの導入率は６３％であった。
【化４】
2020116635.tif 000007
（式中、ｍ２＝１５、ｍ３＝２５）【００７７】
［実験例７］ＰＥＧ−Ｐ（Ａｓｐ−ａｌｉｐｈａｔｉｃ  ｋｅｔｏｎｅ）（ＰＥＧ−Ｐ（Ａｓｐ−ＡＫ））の合成
ＰＥＧ−ＰＢＬＡ−ＡｃをＤＭＦ（６０ｍｇ／ｍＬ）に溶解し、４，４−ジメトキシペンタン−１−アミンを添加した。３５℃で４日間の反応後、反応溶液に１Ｍ  ＨＣｌ溶液（１００μＬ）を添加し、室温で１時間反応した。その後、反応溶液を純水に対して透析（ＭＷＣＯ：６，０００−８，０００）し、凍結乾燥によりＰＥＧ−Ｐ（Ａｓｐ−ＡＫ）を得た。重ＤＭＳＯ中での１Ｈ−ＮＭＲから、ＡＫの導入率は８７％であった。【００７８】
［実験例８］ＰＥＧ−Ｐ（Ａｓｐ−ａｌｉｐｈａｔｉｃ  ｈｙｄｒａｌａｚｉｎｅ）（ＰＥＧ−Ｐ（Ａｓｐ−ＡＨ））の合成
ＰＥＧ−Ｐ（Ａｓｐ−ＡＫ）をＤＭＳＯ（２０ｍｇ／ｍＬ）に溶解し、トリエチルアミン（１７０当量）及びＨｙｄ（１７０当量）を添加した。３５℃で４日間の反応後、反応溶液をメタノールに対して透析（ＭＷＣＯ：６，０００−８，０００）し、減圧乾燥及び凍結乾燥により、以下に示すＰＥＧ−Ｐ（Ａｓｐ−ＡＨ）を得た。重ＤＭＳＯ中での１Ｈ−ＮＭＲから、ＡＨの導入率は８８％であった。
【化５】
2020116635.tif 000008
（式中、ｎ２＝１０、ｎ３＝２８）【００７９】
［実験例９］Ｖａｌ内包高分子ミセルの調製
ＰＥＧ−ＰＢＬＡ、ＰＥＧ−Ｐ（Ａｓｐ−ＢＨ）又はＰＥＧ−Ｐ（Ａｓｐ−ＡＨ）をＮ，Ｎ−ジメチルアセトアミド（ＤＭＡｃ、０．５ｍｇ／ｍＬ）に溶解し、Ｖａｌ（［Ｖａｌ］／［ＡＨ］＝０、０．３、０．５、１．０又は［Ｖａｌ］／［ＢＨ］＝０、０．２５、０．７５）を添加した。室温で２４時間撹拌後、１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）に対して透析（ＭＷＣＯ：６，０００−８，０００）し、フィルターにより精製した。得られた高分子ミセルの粒径及び多分散度を動的光散乱（ＤＬＳ）法により評価した。結果を表２に示す。【００８０】
［実験例１０］Ｖａｌ内包高分子ミセルの薬物担持量の評価
実験例９で得られた高分子ミセル溶液（１ｍＬ、０．５ｍｇ／ｍＬ）からミセルを凍結乾燥により回収し、アセトニトリル（０．５ｍｇ／ｍＬ）に溶解した。３０分間の超音波破砕後、溶液をジエチルエーテルに添加し、濾液の減圧乾燥によりＶａｌを得た。次いで、ＰＥＧ−Ｐ（Ａｓｐ−ＢＨ）を用いた高分子ミセル試料については、１Ｈ−ＮＭＲによって薬物担持量（ポリマー１ｍｇあたりのＶａｌ担持量（ｍｇ））を算出した。一方、ＰＥＧ−Ｐ（Ａｓｐ−ＡＨ）を用いた高分子ミセル試料については、アセトニトリル中での２２０ｎｍにおけるＵＶの吸光度から薬物担持量（ポリマー１ｍｇあたりのＶａｌ担持量（ｍｇ））を算出した。また、ミセル調製時のＶａｌの添加量に対するポリマーに担持されたＶａｌの量の割合を薬物担持効率（％）として算出した。結果を表２に示す。【００８１】
【表２】
2020116635.tif 000009
【００８２】
表２に示されるとおり、Ｖａｌ内包高分子ミセルは、粒径４５ｎｍ〜６０ｎｍ程度の単峰性の粒子であった。また、０．３等量のＶａｌを添加した高分子ミセルが最も効率よくＶａｌを担持していることが確認された。一方で、Ｈｙｄ残基を側鎖構造に有さないＰＥＧ−ＰＢＬＡから調製したミセル（［Ｖａｌ］／［Ａｓｐ］＝０．３：１）においては、バリノマイシンの内包が確認されなかった。このことから、Ｈｙｄ残基とバリノマイシンの相互作用によるミセルへの内包が示唆された。【００８３】
［実験例１１］生理条件下におけるＶａｌ内包高分子ミセルの安定性試験
ＰＥＧ−Ｐ（Ａｓｐ−ＢＨ）に対して０．３等量のＶａｌを添加して調製したＶａｌ内包高分子ミセル溶液（１ｍｇ／ｍＬ）を１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４、５．５、３．０）に対して透析（ＭＷＣＯ：３，５００）し、各時間（１、３、６、２４時間後）におけるポリマー由来の散乱強度をＤＬＳ法により測定した。結果を図４に示す。【００８４】
図４に示されるとおり、Ｖａｌ内包高分子ミセルは、ｐＨ７．４及びｐＨ５．５の条件下で高い安定性を示した。【００８５】
［実験例１２］Ｖａｌ内包高分子ミセルのＶａｌ放出率の評価
ＰＥＧ−Ｐ（Ａｓｐ−ＡＨ）に対して０．３等量のＶａｌを添加して調製したＶａｌ内包高分子ミセル溶液（２ｍＬ、０．５ｍｇ／ｍＬ）を１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４、５．０）に対して透析（ＭＷＣＯ：３，５００）し、各時間（１、３、６、２４時間後）における外液中のＶａｌ量をＨＰＬＣ法により測定した。ミセルに担持されたＶａｌ量に対する外液中に放出されたＶａｌ量の割合を放出率として算出した。結果を図５に示す。【００８６】
図５に示されるとおり、Ｖａｌ内包高分子ミセル溶液は、生理的ｐＨ（７．４）においてＶａｌを安定に担持する一方で、エンドソーム内ｐＨ（５．０）でＶａｌを放出した。【００８７】
［実験例１３］培養細胞に対するＶａｌ内包高分子ミセルの毒性試験
ヒトすい腺がん細胞（ＢｘＰＣ３細胞、Ｐａｎｃ−１細胞、ＭｉａＰａＣａ細胞）を９６ウェルプレートに播種（５，０００ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ）した。２４時間後にＰＥＧ−Ｐ（Ａｓｐ−ＢＨ）に対して０．３等量のＶａｌを添加して調製したＶａｌ内包高分子ミセル溶液又はＶａｌ単体を種々のＶａｌ濃度となるように添加した。４８時間後にＰＢＳにより細胞を洗浄し、培地を添加した。その後、Ｃｅｌｌ  Ｃｏｕｎｔｉｎｇ  Ｋｉｔ−８（ＣＣＫ−８、１０μＬ／ｗｅｌｌ）を培地に添加し、３０分後に４５０ｎｍにおけるＵＶの吸光度を測定した。薬物の代わりにバッファーのみを添加した群を１００％、無細胞群を０％として、吸光度から細胞生存率を算出し、ＩＣ５０（Ｖａｌ濃度）を求めた。結果を表３に示す。【００８８】
【表３】
2020116635.tif 000010
【００８９】
表３に示されるとおり、Ｖａｌを高分子ミセルに内包することにより、バリノマイシンの放出が制御され、その毒性が抑制されたことがわかる。【００９０】
［実験例１４］Ｖａｌ内包高分子ミセルの血中滞留性及び組織透過性の評価
Ｃｙ５により蛍光標識したＰＥＧ−Ｐ（Ａｓｐ−ＢＨ）−Ｃｙ５と０．３等量のＶａｌを用いて調製したＶａｌ内包高分子ミセル溶液を皮下腫瘍モデルマウス（ＢｘＰＣ３）の尾静脈から静脈投与し（Ｖａｌの投与量：１．５ｍｇ／ｋｇ）、生体共焦点レーザー顕微鏡（ＩＶ−ＣＬＳＭ）法により静脈及び腫瘍組織における蛍光強度を測定した。ミセル投与前の蛍光強度を０、投与直後の蛍光強度を１００として、血中滞留性を評価した。結果を図６に示す。【００９１】
図６に示されるとおり、Ｖａｌ内包高分子ミセルは高い血中安定性を示し、時間の経過とともに組織に浸透していくことがわかる。【００９２】
［実験例１５］Ｖａｌ内包高分子ミセルの生体内分布の評価
Ｃｙ５により蛍光標識したＰＥＧ−Ｐ（Ａｓｐ−ＢＨ）−Ｃｙ５と０．３等量のＶａｌを用いて調製したＶａｌ内包高分子ミセル溶液を皮下腫瘍モデルマウス（ＢｘＰＣ３）の尾静脈から静脈投与し（Ｖａｌの投与量：１．５ｍｇ／ｋｇ）、ＩＶ−ＣＬＳＭ法により腫瘍内の蛍光強度を経時的に観察した。また、投与２４時間後に臓器（肝臓、腎臓、脾臓、心臓、肺）及び腫瘍を摘出し、回収した臓器及び腫瘍内の蛍光強度をＩＶＩＳ法により測定した。腫瘍内の経時的な蛍光強度を図７（ａ）に示し、回収した臓器及び腫瘍内の蛍光強度を図７（ｂ）に示す。【００９３】
図７（ａ）に示されるとおり、Ｖａｌ内包高分子ミセルは経時的に腫瘍内に集積していくことがわかる。また、図７（ｂ）に示されるとおり、投与２４時間後において、腫瘍へのミセルの集積が確認された。【００９４】
［実験例１６］担がんマウスに対するＶａｌ内包高分子ミセルの抗腫瘍効果の評価
ＰＥＧ−Ｐ（Ａｓｐ−ＢＨ）を用いて調製したＶａｌ内包高分子ミセル溶液（Ｖａｌの投与量：１．５ｍｇ／ｋｇ）、バリノマイシン溶液（１．５ｍｇ／ｋｇ）、ゲムシタビン溶液（８０ｍｇ／ｋｇ）を、０日目、２日目及び４日目に皮下腫瘍モデルマウス（ＢｘＰＣ３）の尾静脈から静脈投与（バリノマイシン溶液のみ腹腔内投与）し、各時間後における腫瘍のサイズ及びマウスの体重を測定した（ｎ＝４）。結果を図８に示す。【００９５】
図８に示されるとおり、Ｖａｌ内包高分子ミセル溶液投与群では、コントロール群（生理食塩水投与群）及びゲムシタビン溶液投与群に比べて腫瘍の増大が顕著に抑制されていた一方で、体重の大きな変化は認められなかった。なお、バリノマイシン溶液投与群はすべて、初回投与後２４時間以内に死亡した。【００９６】
［実験例１７］ユニットホストゲスト複合体（ｕＨＧＣ）の調製
ＶａｌをＤＭＳＯ（１０ｍｇ／ｍＬ）に溶解し、２ｋＤａのＰＥＧ−ＣＨＯ（１０当量）及びジヒドララジン（５当量）を添加した。室温で２４時間反応後、メタノールに対して透析（ＭＷＣＯ：１，０００）し、減圧乾燥により以下に示す輸送担体とＶａｌとの複合体（ｕＨＧＣ）を得た。重ＤＭＳＯ中での１Ｈ−ＮＭＲから、Ｖａｌ導入率（Ｈｙｄ量に対する輸送担体に担持されたＶａｌの量の割合）を算出したところ、６３％であった。
【化６】
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【００９７】
［実験例１８］培養細胞に対するｕＨＧＣの毒性試験
ヒトすい腺がん細胞（ＢｘＰＣ３細胞）を９６ウェルプレートに播種（５，０００ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ）し、２４時間後にｕＨＧＣを添加した。４８時間後にＰＢＳにより細胞を洗浄し、培地を添加した。その後、Ｃｅｌｌ  Ｃｏｕｎｔｉｎｇ  Ｋｉｔ−８（ＣＣＫ−８、１０μＬ／ｗｅｌｌ）を培地に添加し、３０分後に４５０ｎｍにおけるＵＶの吸光度を測定した。バッファーのみを添加した群を１００％、無細胞群を０％として、吸光度から細胞生存率を算出した。結果を図９に示す。【００９８】
図９に示されるとおり、ｕＨＧＣ添加群は１μＭのＶａｌ濃度で約７０％の細胞生存率を示し、このことから、複合体化することによってＶａｌの毒性を抑制できることがわかる。一方で、高濃度のｕＨＧＣの添加により細胞生存率の低下がみられたことから、内包されたバリノマイシンの放出による細胞死の誘導が示唆された。【００９９】
［実験例１９］ホスト−ゲスト相互作用を生じる組み合せの検証１
環状化合物として、エリスロマイシンを選択した。エリスロマイシンの化学構造および１Ｈ−ＮＭＲ測定結果を以下に示す。
【化７】
2020116635.tif 000012
【０１００】
エリスロマイシンの環の径は３Åであるため、分子径が３Å未満であること、および、エリスロマイシンの分子内に窒素原子のような非共有電子対をもつドナー原子があることを条件として、エリスロマイシンとホストゲスト相互作用を生じ得るゲスト分子（軸部）候補を探索したところ、ジエチレントリアミン（ＤＥＴ）が選択された。ＤＥＴの化学構造および１Ｈ−ＮＭＲ測定結果を以下に示す。
【化８】
2020116635.tif 000013
【０１０１】
次いで、以下のようにして、エリスロマイシンとＤＥＴの相互作用を評価した。エリスロマイシン（１０ｍｇ／ｍＬ）とＤＥＴ（１．４１ｍｇ／ｍＬ）を重ＤＭＳＯ中で混合し、１Ｈ−ＮＭＲにより化学シフトを測定し、各ピークを帰属させた。コントロールとしてエリスロマイシン（１０ｍｇ／ｍＬ）単体とＤＥＴ（１．４１ｍｇ／ｍＬ）単体の化学シフトもそれぞれ測定し、各ピークを帰属させた。結果を図１０Ａ〜１０Ｅに示す。【０１０２】
図１０Ａ〜１０Ｅに示されるとおり、ＤＥＴと共存している場合には、エリスロマイシンの環内の化学シフトに変化が生じており、このことから、ＤＥＴがエリスロマイシンの環構造に分子間相互作用を及ぼしていることが分かる。【０１０３】
［実験例２０］ホスト−ゲスト相互作用を生じる組み合せの検証２
環状化合物として、バシトラシンを選択した。バシトラシンの化学構造および１Ｈ−ＮＭＲ測定結果を以下に示す。
【化９】
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【０１０４】
バシトラシンの環の径は８Åであるため、分子径が８Å未満であること、および、分子内に窒素原子のような非共有電子対をもつドナー原子があることを条件として、バシトラシンとホストゲスト相互作用を生じ得るゲスト分子（軸部）候補を探索したところ、ジヒドララジン、１−ナフチルヒドララジン、ＤＥＴが選択された。ジヒドララジンおよび１−ナフチルヒドララジンの化学構造ならびに１Ｈ−ＮＭＲ測定結果を以下に示す。
【化１０】
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【化１１】
2020116635.tif 000016
【０１０５】
次いで、実験例１９と同様にして、バシトラシンとジヒドララジン、１−ナフチルヒドララジンまたはＤＥＴとの相互作用を、１Ｈ−ＮＭＲ測定における化学シフトの変化に基づいて評価した。結果をそれぞれ、図１１Ａ〜１１Ｅ、図１２Ａ〜１２Ｅおよび図１３Ａ〜１３Ｆに示す。【０１０６】
図１１Ａ〜１１Ｅ、図１２Ａ〜１２Ｅおよび図１３Ａ〜１３Ｆに示されるとおり、ジヒドララジン、１−ナフチルヒドララジンまたはＤＥＴと共存している場合には、バシトラシンの環内の化学シフトに変化が生じており、このことから、ジヒドララジン、１−ナフチルヒドララジンまたはＤＥＴがバシトラシンの環構造に分子間相互作用を及ぼしていることが分かる。【０１０７】
［実験例２１］Ｖａｌとジヒドララジン間のホスト−ゲスト相互作用の検証
Ｖａｌ（１０ｍｇ／ｍＬ）とジヒドララジン（２．６ｍｇ／ｍＬ）を重ＤＭＳＯ中で混合し、１Ｈ−ＮＭＲにより化学シフトを測定し、各ピークを帰属させた。コントロールとしてＶａｌ（１０ｍｇ／ｍＬ）単体とジヒドララジン（２．６ｍｇ／ｍＬ）単体の化学シフトもそれぞれ測定し、各ピークを帰属させた。結果を図１４Ａ〜１４Ｅに示す。【０１０８】
図１４Ａ〜１４Ｅに示されるとおり、ジヒドララジンと共存している場合にはヒドララジンと共存している場合と同様に、Ｖａｌの水素のピークに変化が生じており、このことから、Ｖａｌとヒドララジンとの間に分子間相互作用が生じていることが分かる。
【産業上の利用可能性】
【０１０９】
本発明は、例えば、ＤＤＳ分野において好適に用いられ得る。
【図１】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図３Ｅ】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１０Ｃ】
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【図１０Ｄ】
2020116635.tif 000033
【図１０Ｅ】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１１Ｃ】
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【図１１Ｄ】
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【図１１Ｅ】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１２Ｃ】
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【図１２Ｄ】
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【図１２Ｅ】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１３Ｃ】
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【図１３Ｄ】
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【図１３Ｅ】
2020116635.tif 000049
【図１３Ｆ】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１４Ｃ】
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【図１４Ｄ】
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【図１４Ｅ】
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【国際調査報告】
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