(57)【要約】  本発明は、細胞への核酸、タンパク質またはこれらの複合体等の導入効率に優れた手段、特に形質導入用溶液を用いた方法を提供する。本発明に係る、細胞と、関心対象分子および形質導入用溶液とを接触させる工程を含む、該細胞に該関心対象分子を形質導入するための方法では、前記形質導入用溶液が、下記（Ａ１）〜（Ａ５）の少なくとも１つと、（Ｂ）塩とを含む、前記方法：（Ａ１）所定の化合物を除く、下記一般式（Ｉ）で表される化合物またはその塩；（Ａ２）下記一般式（ＩＩ）で表される化合物またはその塩；（Ａ３）核酸塩基等、あるいはその塩；（Ａ４）リンゴ酸を除く、一般式（ＩＩＩ）で表される化合物またはその塩；（Ａ５）クレアチニン、ヒドロキシプロリン、１，３−ブタンジオール、トリエンチン、Ｄ−セロビオース、１，３−ジメチルウレア、パントラクトンおよびトリメタジオンからなる群より選択される少なくとも１種またはその塩である。2020111229.tif 000025
2020111229.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞と、関心対象分子および形質導入用溶液とを接触させる工程を含む、該細胞に該関心対象分子を形質導入するための方法であって、
前記形質導入用溶液は、下記（Ａ１）〜（Ａ５）の少なくとも１つと、（Ｂ）塩とを含む、前記方法：
（Ａ１）生体のタンパク質の構成ユニットとなるＬ−アミノ酸２０種およびＳ−メチル−Ｌ−メチオニンを除く、下記一般式（Ｉ）で表される化合物またはその塩：
【化１】
2020111229.tif 000019
［式中、ｎは、０または１であり、
Ｒ１およびＲ２はそれぞれ独立して、水素原子またはＣＯＲ３を示し、
Ｒ０は、Ｃ１−６アルキル基を除く、置換基を有していてもよいＣ１−６アルキル基を有していてもよい生体のタンパク質の構成ユニットとなるアミノ酸を構成する側鎖を示し、
ただし、Ｒ０が水素原子の場合、Ｒ１はＣＯＲ３を示し、Ｒ２は水素原子を示し、
Ｒ３は、置換基（チオール基およびジスルフィド基を除く）を有していてもよいＣ１−６アルキル基（メチル基を除く）、またはＮＲ４Ｒ５を示し、
Ｒ４およびＲ５はそれぞれ独立して、水素原子またはＣ１−４アルキル基を示す。］、
（Ａ２）下記一般式（ＩＩ）で表される化合物またはその塩：
【化２】
2020111229.tif 000020
［式中、Ｘは酸素原子またはＮＲ１１を示し、
Ｒ１１は、水素原子、置換基を有していてもよいＣ１−４アルキル基またはＣＯＲ１２を示し、
Ｒ１２はＣ１−６アルキル基を示し、
Ｙは水素原子またはＯＲ１０を示し、
Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８およびＲ１０はそれぞれ独立して水素原子またはホスホン酸基を示し、
Ｒ９は水素原子、水酸基またはリン酸基を示し、
Ｒ１０が水素原子のとき、ＯＲ６、ＯＲ７、ＯＲ８、Ｒ９のうち少なくとも１つはリン酸基である。］、
但し、一般式（ＩＩ）で表される化合物には、水溶液中で一般式（ＩＩ）と平衡関係にある鎖状構造を取っているものも含まれるものとする、
（Ａ３）核酸塩基、ヌクレオシドまたはヌクレオチド、あるいはその塩、
（Ａ４）リンゴ酸を除く、一般式（ＩＩＩ）で表される化合物またはその塩：
Ｒｘ−ＣＲｙＲｚＣＯＯＨ      III
［式中、Ｒｘは、Ｃ１−６アルキル基、置換されていてもよい水酸基、オキソ基およびカルボキシル基からなる群より選択される少なくとも１種で置換されている直鎖状Ｃ２−４アルキル基を示し、
ＲｙおよびＲｚは、それぞれ独立して水素原子または水酸基を示す（但し、少なくとも１つは水酸基である）か一緒になってオキソ基を示す。］、
（Ａ５）クレアチニン、ヒドロキシプロリン、１，３−ブタンジオール、トリエンチン、Ｄ−セロビオース、１，３−ジメチルウレア、パントラクトンおよびトリメタジオンからなる群より選択される少なくとも１種またはその塩。
【請求項２】
（Ａ１）がアルギニノコハク酸、１−メチル−Ｌ−ヒスチジン、パントテン酸、Ｌ−カルノシン、Ｎ−カルバミル−Ｌ−アスパラギン酸より選択される化合物またはその塩であり；
（Ａ２）がミグリトール、２−デオキシ−Ｄ−グルコース−６−リン酸、α−Ｄ−グルコース１−リン酸、１−デオキシノジリマイシンより選択される化合物またはその塩であり；
（Ａ３）がシトシン、シチジン、デオキシウリジン、デオキシシチジン、５’−イノシン酸より選択される化合物またはその塩であり；
（Ａ４）が６−ホスホ−Ｄ−グルコン酸、３−メチル−２−オキソブタン酸、２−ヒドロキシグルタル酸より選択される化合物またはその塩であり；
（Ａ５）がクレアチニン、ヒドロキシプロリン、１，３−ブタンジオール、１，３−ジメチルウレア、Ｄ−セロビオース、１，３−ジメチルウレア、パントラクトン、トリメタジオンより選択される化合物またはその塩である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
（Ａ１）〜（Ａ５）の少なくとも１つが、１−メチル−Ｌ−ヒスチジン、Ｎ−カルバミル−Ｌ−アスパラギン酸、デオキシシチジン、２−デオキシ−Ｄ−グルコース−６−リン酸、６−ホスホ−Ｄ−グルコン酸より選択される化合物またはその塩である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記塩（Ｂ）が、塩化ナトリウム、塩化マグネシウムおよび塩化カリウムからなる群より選択される少なくとも１種である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記関心対象分子が、タンパク質および／または核酸を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記関心対象分子が、Ｃａｓタンパク質および／またはｇＲＮＡを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記細胞が生体内に存在する、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記細胞が、筋細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
細胞と、関心対象分子および形質導入用溶液とを接触させる工程を含む、該関心対象分子が形質導入された細胞の製造方法であって、
前記形質導入用溶液は、下記（Ａ１）〜（Ａ５）の少なくとも１つと、（Ｂ）塩とを含む、前記製造方法：
（Ａ１）生体のタンパク質の構成ユニットとなるＬ−アミノ酸２０種およびＳ−メチル−Ｌ−メチオニンを除く、下記一般式（Ｉ）で表される化合物またはその塩：
【化３】
2020111229.tif 000021
［式中、ｎは、０または１であり、
Ｒ１およびＲ２はそれぞれ独立して、水素原子またはＣＯＲ３を示し、
Ｒ０は、Ｃ１−６アルキル基を除く、置換基を有していてもよいＣ１−６アルキル基を有していてもよい生体のタンパク質の構成ユニットとなるアミノ酸を構成する側鎖を示し、
ただし、Ｒ０が水素原子の場合、Ｒ１はＣＯＲ３を示し、Ｒ２は水素原子を示し、
Ｒ３は、置換基（チオール基およびジスルフィド基を除く）を有していてもよいＣ１−６アルキル基（メチル基を除く）、またはＮＲ４Ｒ５を示し、
Ｒ４およびＲ５はそれぞれ独立して、水素原子またはＣ１−４アルキル基を示す。］、
（Ａ２）下記一般式（ＩＩ）で表される化合物またはその塩：
【化４】
2020111229.tif 000022
［式中、Ｘは酸素原子またはＮＲ１１を示し、
Ｒ１１は、水素原子、置換基を有していてもよいＣ１−４アルキル基またはＣＯＲ１２を示し、
Ｒ１２はＣ１−６アルキル基を示し、
Ｙは水素原子またはＯＲ１０を示し、
Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８およびＲ１０はそれぞれ独立して水素原子またはホスホン酸基を示し、
Ｒ９は水素原子、水酸基またはリン酸基を示し、
Ｒ１０が水素原子のとき、ＯＲ６、ＯＲ７、ＯＲ８、Ｒ９のうち少なくとも１つはリン酸基である。］、
但し、一般式（ＩＩ）で表される化合物には、水溶液中で一般式（ＩＩ）と平衡関係にある鎖状構造を取っているものも含まれるものとする、
（Ａ３）核酸塩基、ヌクレオシドまたはヌクレオチド、あるいはその塩、
（Ａ４）リンゴ酸を除く、一般式（ＩＩＩ）で表される化合物またはその塩：
Ｒｘ−ＣＲｙＲｚＣＯＯＨ      III
［式中、Ｒｘは、Ｃ１−６アルキル基、置換されていてもよい水酸基、オキソ基およびカルボキシル基からなる群より選択される少なくとも１種で置換されている直鎖状Ｃ２−４アルキル基を示し、
ＲｙおよびＲｚは、それぞれ独立して水素原子または水酸基を示す（但し、少なくとも１つは水酸基である）か一緒になってオキソ基を示す。］、
（Ａ５）クレアチニン、ヒドロキシプロリン、１，３−ブタンジオール、トリエンチン、Ｄ−セロビオース、１，３−ジメチルウレア、パントラクトンおよびトリメタジオンからなる群より選択される少なくとも１種またはその塩。
【請求項１０】
（Ａ１）がアルギニノコハク酸、１−メチル−Ｌ−ヒスチジン、パントテン酸、Ｌ−カルノシン、Ｎ−カルバミル−Ｌ−アスパラギン酸より選択される化合物またはその塩であり；
（Ａ２）がミグリトール、２−デオキシ−Ｄ−グルコース−６−リン酸、α−Ｄ−グルコース１−リン酸、１−デオキシノジリマイシンより選択される化合物またはその塩であり；
（Ａ３）がシトシン、シチジン、デオキシウリジン、デオキシシチジン、５’−イノシン酸より選択される化合物またはその塩であり；
（Ａ４）が６−ホスホ−Ｄ−グルコン酸、３−メチル−２−オキソブタン酸、２−ヒドロキシグルタル酸より選択される化合物またはその塩であり；
（Ａ５）がクレアチニン、ヒドロキシプロリン、１，３−ブタンジオール、１，３−ジメチルウレア、Ｄ−セロビオース、１，３−ジメチルウレア、パントラクトン、トリメタジオンより選択される化合物またはその塩である、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
（Ａ１）〜（Ａ５）の少なくとも１つが、１−メチル−Ｌ−ヒスチジン、Ｎ−カルバミル−Ｌ−アスパラギン酸、デオキシシチジン、２−デオキシ−Ｄ−グルコース−６−リン酸、６−ホスホ−Ｄ−グルコン酸より選択される化合物またはその塩である、請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
前記塩（Ｂ）が、塩化ナトリウム、塩化マグネシウムおよび塩化カリウムからなる群より選ばれる少なくとも１種である、請求項９に記載の方法。
【請求項１３】
前記関心対象分子が、タンパク質および／または核酸を含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１４】
前記関心対象分子が、Ｃａｓタンパク質および／またはｇＲＮＡを含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１５】
前記細胞が生体内に存在する細胞である、請求項９に記載の方法。
【請求項１６】
前記細胞が、筋細胞である、請求項９に記載の方法。
【請求項１７】
下記（Ａ１）〜（Ａ５）の少なくとも１つと、（Ｂ）塩とを含む、形質導入用溶液：
（Ａ１）生体のタンパク質の構成ユニットとなるＬ−アミノ酸２０種およびＳ−メチル−Ｌ−メチオニンを除く、下記一般式（Ｉ）で表される化合物またはその塩：
【化５】
2020111229.tif 000023
［式中、ｎは、０または１であり、
Ｒ１およびＲ２はそれぞれ独立して、水素原子またはＣＯＲ３を示し、
Ｒ０は、Ｃ１−６アルキル基を除く、置換基を有していてもよいＣ１−６アルキル基を有していてもよい生体のタンパク質の構成ユニットとなるアミノ酸を構成する側鎖を示し、
ただし、Ｒ０が水素原子の場合、Ｒ１はＣＯＲ３を示し、Ｒ２は水素原子を示し、
Ｒ３は、置換基（チオール基およびジスルフィド基を除く）を有していてもよいＣ１−６アルキル基（メチル基を除く）、またはＮＲ４Ｒ５を示し、
Ｒ４およびＲ５はそれぞれ独立して、水素原子またはＣ１−４アルキル基を示す。］、
（Ａ２）下記一般式（ＩＩ）で表される化合物またはその塩：
【化６】
2020111229.tif 000024
［式中、Ｘは酸素原子またはＮＲ１１を示し、
Ｒ１１は、水素原子、置換基を有していてもよいＣ１−４アルキル基またはＣＯＲ１２を示し、
Ｒ１２はＣ１−６アルキル基を示し、
Ｙは水素原子またはＯＲ１０を示し、
Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８およびＲ１０はそれぞれ独立して水素原子またはホスホン酸基を示し、
Ｒ９は水素原子、水酸基またはリン酸基を示し、
Ｒ１０が水素原子のとき、ＯＲ６、ＯＲ７、ＯＲ８、Ｒ９のうち少なくとも１つはリン酸基である。］、
但し、一般式（ＩＩ）で表される化合物には、水溶液中で一般式（ＩＩ）と平衡関係にある鎖状構造を取っているものも含まれるものとする、
（Ａ３）核酸塩基、ヌクレオシドまたはヌクレオチド、あるいはその塩、
（Ａ４）リンゴ酸を除く、一般式（ＩＩＩ）で表される化合物またはその塩：
Ｒｘ−ＣＲｙＲｚＣＯＯＨ      III
［式中、Ｒｘは、Ｃ１−６アルキル基、置換されていてもよい水酸基、オキソ基およびカルボキシル基からなる群より選択される少なくとも１種で置換されている直鎖状Ｃ２−４アルキル基を示し、
ＲｙおよびＲｚは、それぞれ独立して水素原子または水酸基を示す（但し、少なくとも１つは水酸基である）か一緒になってオキソ基を示す。］、
（Ａ５）クレアチニン、ヒドロキシプロリン、１，３−ブタンジオール、トリエンチン、Ｄ−セロビオース、１，３−ジメチルウレア、パントラクトンおよびトリメタジオンからなる群より選択される少なくとも１種またはその塩。
【請求項１８】
（Ａ１）がアルギニノコハク酸、１−メチル−Ｌ−ヒスチジン、パントテン酸、Ｌ−カルノシン、Ｎ−カルバミル−Ｌ−アスパラギン酸より選択される化合物またはその塩であり；
（Ａ２）がミグリトール、２−デオキシ−Ｄ−グルコース−６−リン酸、α−Ｄ−グルコース１−リン酸、１−デオキシノジリマイシンより選択される化合物またはその塩であり；
（Ａ３）がシトシン、シチジン、デオキシウリジン、デオキシシチジン、５’−イノシン酸より選択される化合物またはその塩であり；
（Ａ４）が６−ホスホ−Ｄ−グルコン酸、３−メチル−２−オキソブタン酸、２−ヒドロキシグルタル酸より選択される化合物またはその塩であり；
（Ａ５）がクレアチニン、ヒドロキシプロリン、１，３−ブタンジオール、１，３−ジメチルウレア、Ｄ−セロビオース、１，３−ジメチルウレア、パントラクトン、トリメタジオンより選択される化合物またはその塩である、請求項１７に記載の形質導入用溶液。
【請求項１９】
（Ａ１）〜（Ａ５）の少なくとも１つが、１−メチル−Ｌ−ヒスチジン、Ｎ−カルバミル−Ｌ−アスパラギン酸、デオキシシチジン、２−デオキシ−Ｄ−グルコース−６−リン酸、６−ホスホ−Ｄ−グルコン酸より選択される化合物またはその塩である、請求項１７に記載の形質導入用溶液。
【請求項２０】
前記塩（Ｂ）が、塩化ナトリウム、塩化マグネシウムおよび塩化カリウムからなる群より選ばれる少なくとも１種である、請求項１７に記載の形質導入用溶液。
【請求項２１】
請求項１７に記載の形質導入用溶液および関心対象分子を含む、医薬組成物。
【請求項２２】
前記関心対象分子が、タンパク質および／または核酸を含む、請求項２１に記載の医薬組成物。
【請求項２３】
前記関心対象分子が、Ｃａｓタンパク質および／またはｇＲＮＡを含む、請求項２１に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞に関心対象分子（核酸、タンパク質等）を送達して形質導入するための溶液に関する。さらに本発明は、そのような溶液を用いた、細胞に関心対象分子を形質導入する方法、および関心対象分子が形質導入された細胞の製造方法に関する。【０００２】
［発明の背景］
核酸、タンパク質、またはこれらの複合体等を細胞内へ効率的にトランスフェクションするために、様々な細胞内デリバリーシステムが本領域において研究されている。【０００３】
特許文献１には、（i）形質導入化合物、（ii）塩、またはナトリウム-水素輸送体の活性化因子/増強因子、および好ましくは（iii）浸透圧保護剤を含む、形質導入バッファーが記載されている。形質導入化合物としては、ベタイン（例：非界面活性剤スルホベタイン）、GABA（γ-アミノ酪酸）等が記載されている。また、実施例として、gRNAおよびCas9タンパク質をKBM7細胞中に形質導入し、WDR85遺伝子の切断が認められたことが記載されている。【０００４】
非特許文献１には、特許文献１に記載されている特定の化合物（GABAおよびNon-detergent Sulfobetaine 201 (NDSB-201)等）を用いてsgRNA-Cas9 proteinを形質導入し、WDR85遺伝子の切断が認められたことが記載されている。【０００５】
特許文献２には、（i）形質導入化合物、（ii）一以上の塩（Na, Rb, Li, K or Cs）250 - 2500 mM、（iii）浸透圧誘導剤（浸透圧：500 - 5000 mOsmol/kg）および（iv）浸透圧保護剤を含む、形質導入バッファーが記載されている。また、実施例として、gRNAおよびCas9タンパク質をKBM7細胞中に形質導入し、標的遺伝子の切断が認められたことが記載されている。【０００６】
非特許文献２には、Cas9タンパク質のN末端にSV40 NLSを1-4個付加することにより、Cas9／gRNA複合体の形質導入による標的遺伝子の切断が、in vitro（神経前駆細胞）およびin vivo（マウス脳内へのインジェクション）において認められたことが記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】国際公開第2015/028969号
【特許文献２】国際公開第2017/093326号
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】D’Astolfo et al., Cell, 161, 674-690, Apr. 23, 2015
【非特許文献２】Brett T Staahl et al., Nature Biotechnology, 35, 431-434, 2017
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明の目的は、細胞への核酸、タンパク質またはこれらの複合体等の導入効率に優れた手段、特に形質導入用溶液を用いた方法を提供することにある。また、別の観点では、本発明の目的は、そのような手段を利用した形質導入された細胞の製造方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らが上記課題を解決すべく鋭意検討を行った結果、特定の化合物または分子等の溶液を用いることにより、高い効率で核酸、タンパク質またはこれらの複合体等を細胞内に導入することができ、上記課題を解決可能であることを見出し、本発明を完成するに至った。【００１１】
すなわち、本発明は少なくとも以下の発明に関する。
［１］
細胞と、関心対象分子および形質導入用溶液とを接触させる工程を含む、該細胞に該関心対象分子を形質導入するための方法であって、
前記形質導入用溶液は、下記（Ａ１）〜（Ａ５）の少なくとも１つと、（Ｂ）塩とを含む、前記方法：
（Ａ１）生体のタンパク質の構成ユニットとなるＬ−アミノ酸２０種およびＳ−メチル−Ｌ−メチオニンを除く、下記一般式（Ｉ）で表される化合物またはその塩：
【化１】
2020111229.tif 000003
［式中、ｎは、０または１であり、
Ｒ１およびＲ２はそれぞれ独立して、水素原子またはＣＯＲ３を示し、
Ｒ０は、Ｃ１−６アルキル基を除く、置換基を有していてもよいＣ１−６アルキル基を有していてもよい生体のタンパク質の構成ユニットとなるアミノ酸を構成する側鎖を示し、
ただし、Ｒ０が水素原子の場合、Ｒ１はＣＯＲ３を示し、Ｒ２は水素原子を示し、
Ｒ３は、置換基（チオール基およびジスルフィド基を除く）を有していてもよいＣ１−６アルキル基（メチル基を除く）、またはＮＲ４Ｒ５を示し、
Ｒ４およびＲ５はそれぞれ独立して、水素原子またはＣ１−４アルキル基を示す。］、
（Ａ２）下記一般式（ＩＩ）で表される化合物またはその塩：
【化２】
2020111229.tif 000004
［式中、Ｘは酸素原子またはＮＲ１１を示し、
Ｒ１１は、水素原子、置換基を有していてもよいＣ１−４アルキル基またはＣＯＲ１２を示し、
Ｒ１２はＣ１−６アルキル基を示し、
Ｙは水素原子またはＯＲ１０を示し、
Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８およびＲ１０はそれぞれ独立して水素原子またはホスホン酸基を示し、
Ｒ９は水素原子、水酸基またはリン酸基を示し、
Ｒ１０が水素原子のとき、ＯＲ６、ＯＲ７、ＯＲ８、Ｒ９のうち少なくとも１つはリン酸基である。］、
但し、一般式（ＩＩ）で表される化合物には、水溶液中で一般式（ＩＩ）と平衡関係にある鎖状構造を取っているものも含まれるものとする、
（Ａ３）核酸塩基、ヌクレオシドまたはヌクレオチド、あるいはその塩、
（Ａ４）リンゴ酸を除く、一般式（ＩＩＩ）で表される化合物またはその塩：
Ｒｘ−ＣＲｙＲｚＣＯＯＨ      III
［式中、Ｒｘは、Ｃ１−６アルキル基、置換されていてもよい水酸基、オキソ基およびカルボキシル基からなる群より選択される少なくとも１種で置換されている直鎖状Ｃ２−４アルキル基を示し、
ＲｙおよびＲｚは、それぞれ独立して水素原子または水酸基を示す（但し、少なくとも１つは水酸基である）か一緒になってオキソ基を示す。］、
（Ａ５）クレアチニン、ヒドロキシプロリン、１，３−ブタンジオール、トリエンチン、Ｄ−セロビオース、１，３−ジメチルウレア、パントラクトンおよびトリメタジオンからなる群より選択される少なくとも１種またはその塩。
［２］
（Ａ１）がアルギニノコハク酸、１−メチル−Ｌ−ヒスチジン、パントテン酸、Ｌ−カルノシン、Ｎ−カルバミル−Ｌ−アスパラギン酸より選択される化合物またはその塩であり；
（Ａ２）がミグリトール、２−デオキシ−Ｄ−グルコース−６−リン酸、α−Ｄ−グルコース１−リン酸、１−デオキシノジリマイシンより選択される化合物またはその塩であり；
（Ａ３）がシトシン、シチジン、デオキシウリジン、デオキシシチジン、５’−イノシン酸より選択される化合物またはその塩であり；
（Ａ４）が６−ホスホ−Ｄ−グルコン酸、３−メチル−２−オキソブタン酸、２−ヒドロキシグルタル酸より選択される化合物またはその塩であり；
（Ａ５）がクレアチニン、ヒドロキシプロリン、１，３−ブタンジオール、１，３−ジメチルウレア、Ｄ−セロビオース、１，３−ジメチルウレア、パントラクトン、トリメタジオンより選択される化合物またはその塩である、項１に記載の方法。
［３］
（Ａ１）〜（Ａ５）の少なくとも１つが、１−メチル−Ｌ−ヒスチジン、Ｎ−カルバミル−Ｌ−アスパラギン酸、デオキシシチジン、２−デオキシ−Ｄ−グルコース−６−リン酸、６−ホスホ−Ｄ−グルコン酸より選択される化合物またはその塩である、項１に記載の方法。
［４］
前記塩（Ｂ）が、塩化ナトリウム、塩化マグネシウムおよび塩化カリウムからなる群より選択される少なくとも１種である、項１に記載の方法。
［５］
前記関心対象分子が、タンパク質および／または核酸を含む、項１に記載の方法。
［６］
前記関心対象分子が、Ｃａｓタンパク質および／またはｇＲＮＡを含む、項１に記載の方法。
［７］
前記細胞が生体内に存在する、項１に記載の方法。
［８］
前記細胞が、筋細胞である、項１に記載の方法。
［９］
細胞と、関心対象分子および形質導入用溶液とを接触させる工程を含む、該関心対象分子が形質導入された細胞の製造方法であって、
前記形質導入用溶液は、下記（Ａ１）〜（Ａ５）の少なくとも１つと、（Ｂ）塩とを含む、前記製造方法：
（Ａ１）生体のタンパク質の構成ユニットとなるＬ−アミノ酸２０種およびＳ−メチル−Ｌ−メチオニンを除く、下記一般式（Ｉ）で表される化合物またはその塩：
【化３】
2020111229.tif 000005
［式中、ｎは、０または１であり、
Ｒ１およびＲ２はそれぞれ独立して、水素原子またはＣＯＲ３を示し、
Ｒ０は、Ｃ１−６アルキル基を除く、置換基を有していてもよいＣ１−６アルキル基を有していてもよい生体のタンパク質の構成ユニットとなるアミノ酸を構成する側鎖を示し、
ただし、Ｒ０が水素原子の場合、Ｒ１はＣＯＲ３を示し、Ｒ２は水素原子を示し、
Ｒ３は、置換基（チオール基およびジスルフィド基を除く）を有していてもよいＣ１−６アルキル基（メチル基を除く）、またはＮＲ４Ｒ５を示し、
Ｒ４およびＲ５はそれぞれ独立して、水素原子またはＣ１−４アルキル基を示す。］、
（Ａ２）下記一般式（ＩＩ）で表される化合物またはその塩：
【化４】
2020111229.tif 000006
［式中、Ｘは酸素原子またはＮＲ１１を示し、
Ｒ１１は、水素原子、置換基を有していてもよいＣ１−４アルキル基またはＣＯＲ１２を示し、
Ｒ１２はＣ１−６アルキル基を示し、
Ｙは水素原子またはＯＲ１０を示し、
Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８およびＲ１０はそれぞれ独立して水素原子またはホスホン酸基を示し、
Ｒ９は水素原子、水酸基またはリン酸基を示し、
Ｒ１０が水素原子のとき、ＯＲ６、ＯＲ７、ＯＲ８、Ｒ９のうち少なくとも１つがリン酸基である。］、
但し、一般式（ＩＩ）で表される化合物には、水溶液中で一般式（ＩＩ）と平衡関係にある鎖状構造を取っているものも含まれるものとする、
（Ａ３）核酸塩基、ヌクレオシドまたはヌクレオチド、あるいはその塩、
（Ａ４）リンゴ酸を除く、一般式（ＩＩＩ）で表される化合物またはその塩：
Ｒｘ−ＣＲｙＲｚＣＯＯＨ      III
［式中、Ｒｘは、Ｃ１−６アルキル基、置換されていてもよい水酸基、オキソ基およびカルボキシル基からなる群より選択される少なくとも１種で置換されている直鎖状Ｃ２−４アルキル基を示し、
ＲｙおよびＲｚは、それぞれ独立して水素原子または水酸基を示す（但し、少なくとも１つは水酸基である）か一緒になってオキソ基を示す。］、
（Ａ５）クレアチニン、ヒドロキシプロリン、１，３−ブタンジオール、トリエンチン、Ｄ−セロビオース、１，３−ジメチルウレア、パントラクトンおよびトリメタジオンからなる群より選択される少なくとも１種またはその塩。
［１０］
（Ａ１）がアルギニノコハク酸、１−メチル−Ｌ−ヒスチジン、パントテン酸、Ｌ−カルノシン、Ｎ−カルバミル−Ｌ−アスパラギン酸より選択される化合物またはその塩であり；
（Ａ２）がミグリトール、２−デオキシ−Ｄ−グルコース−６−リン酸、α−Ｄ−グルコース１−リン酸、１−デオキシノジリマイシンより選択される化合物またはその塩であり；
（Ａ３）がシトシン、シチジン、デオキシウリジン、デオキシシチジン、５’−イノシン酸より選択される化合物またはその塩であり；
（Ａ４）が６−ホスホ−Ｄ−グルコン酸、３−メチル−２−オキソブタン酸、２−ヒドロキシグルタル酸より選択される化合物またはその塩であり；
（Ａ５）がクレアチニン、ヒドロキシプロリン、１，３−ブタンジオール、１，３−ジメチルウレア、Ｄ−セロビオース、１，３−ジメチルウレア、パントラクトン、トリメタジオンより選択される化合物またはその塩である、項９に記載の方法。
［１１］
（Ａ１）〜（Ａ５）の少なくとも１つが、１−メチル−Ｌ−ヒスチジン、Ｎ−カルバミル−Ｌ−アスパラギン酸、デオキシシチジン、２−デオキシ−Ｄ−グルコース−６−リン酸、６−ホスホ−Ｄ−グルコン酸より選択される化合物またはその塩である、項９に記載の方法。
［１２］
前記塩（Ｂ）が、塩化ナトリウム、塩化マグネシウムおよび塩化カリウムからなる群より選ばれる少なくとも１種である、項９に記載の方法。
［１３］
前記関心対象分子が、タンパク質および／または核酸を含む、項９に記載の方法。
［１４］
前記関心対象分子が、Ｃａｓタンパク質および／またはｇＲＮＡを含む、項９に記載の方法。
［１５］
前記細胞が生体内に存在する、項９に記載の方法。
［１６］
前記細胞が、筋細胞である、項９に記載の方法。
［１７］
下記（Ａ１）〜（Ａ５）の少なくとも１つと、（Ｂ）塩とを含む、形質導入用溶液：
（Ａ１）生体のタンパク質の構成ユニットとなるＬ−アミノ酸２０種およびＳ−メチル−Ｌ−メチオニンを除く、下記一般式（Ｉ）で表される化合物またはその塩：
【化５】
2020111229.tif 000007
［式中、ｎは、０または１であり、
Ｒ１およびＲ２はそれぞれ独立して、水素原子またはＣＯＲ３を示し、
Ｒ０は、Ｃ１−６アルキル基を除く、置換基を有していてもよいＣ１−６アルキル基を有していてもよい生体のタンパク質の構成ユニットとなるアミノ酸を構成する側鎖を示し、
ただし、Ｒ０が水素原子の場合、Ｒ１はＣＯＲ３を示し、Ｒ２は水素原子を示し、
Ｒ３は、置換基（チオール基およびジスルフィド基を除く）を有していてもよいＣ１−６アルキル基（メチル基を除く）、またはＮＲ４Ｒ５を示し、
Ｒ４およびＲ５はそれぞれ独立して、水素原子またはＣ１−４アルキル基を示す。］、
（Ａ２）下記一般式（ＩＩ）で表される化合物またはその塩：
【化６】
2020111229.tif 000008
［式中、Ｘは酸素原子またはＮＲ１１を示し、
Ｒ１１は、水素原子、置換基を有していてもよいＣ１−４アルキル基またはＣＯＲ１２を示し、
Ｒ１２はＣ１−６アルキル基を示し、
Ｙは水素原子またはＯＲ１０を示し、
Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８およびＲ１０はそれぞれ独立して水素原子またはホスホン酸基を示し、
Ｒ９は水素原子、水酸基またはリン酸基を示し、
Ｒ１０が水素原子のとき、ＯＲ６、ＯＲ７、ＯＲ８、Ｒ９のうち少なくとも１つがリン酸基である。］、
但し、一般式（ＩＩ）で表される化合物には、水溶液中で一般式（ＩＩ）と平衡関係にある鎖状構造を取っているものも含まれるものとする、
（Ａ３）核酸塩基、ヌクレオシドまたはヌクレオチド、あるいはその塩、
（Ａ４）リンゴ酸を除く、一般式（ＩＩＩ）で表される化合物またはその塩：
Ｒｘ−ＣＲｙＲｚＣＯＯＨ      III
［式中、Ｒｘは、Ｃ１−６アルキル基、置換されていてもよい水酸基、オキソ基およびカルボキシル基からなる群より選択される少なくとも１種で置換されている直鎖状Ｃ２−４アルキル基を示し、
ＲｙおよびＲｚは、それぞれ独立して水素原子または水酸基を示す（但し、少なくとも１つは水酸基である）か一緒になってオキソ基を示す。］、
（Ａ５）クレアチニン、ヒドロキシプロリン、１，３−ブタンジオール、トリエンチン、Ｄ−セロビオース、１，３−ジメチルウレア、パントラクトンおよびトリメタジオンからなる群より選択される少なくとも１種またはその塩。
［１８］
（Ａ１）がアルギニノコハク酸、１−メチル−Ｌ−ヒスチジン、パントテン酸、Ｌ−カルノシン、Ｎ−カルバミル−Ｌ−アスパラギン酸より選択される化合物またはその塩であり；
（Ａ２）がミグリトール、２−デオキシ−Ｄ−グルコース−６−リン酸、α−Ｄ−グルコース１−リン酸、１−デオキシノジリマイシンより選択される化合物またはその塩であり；
（Ａ３）がシトシン、シチジン、デオキシウリジン、デオキシシチジン、５’−イノシン酸より選択される化合物またはその塩であり；
（Ａ４）が６−ホスホ−Ｄ−グルコン酸、３−メチル−２−オキソブタン酸、２−ヒドロキシグルタル酸より選択される化合物またはその塩であり；
（Ａ５）がクレアチニン、ヒドロキシプロリン、１，３−ブタンジオール、１，３−ジメチルウレア、Ｄ−セロビオース、１，３−ジメチルウレア、パントラクトン、トリメタジオンより選択される化合物またはその塩である、項１７に記載の形質導入用溶液。
［１９］
（Ａ１）〜（Ａ５）の少なくとも１つが、１−メチル−Ｌ−ヒスチジン、Ｎ−カルバミル−Ｌ−アスパラギン酸、デオキシシチジン、２−デオキシ−Ｄ−グルコース−６−リン酸、６−ホスホ−Ｄ−グルコン酸より選択される化合物またはその塩である、項１７に記載の形質導入用溶液。
［２０］
前記塩（Ｂ）が、塩化ナトリウム、塩化マグネシウムおよび塩化カリウムからなる群より選ばれる少なくとも１種である、項１７に記載の形質導入用溶液。
［２１］
項１７に記載の形質導入用溶液および関心対象分子を含む、医薬組成物。
［２２］
前記関心対象分子が、タンパク質および／または核酸を含む、項２１に記載の医薬組成物。
［２３］
前記関心対象分子が、Ｃａｓタンパク質および／またはｇＲＮＡを含む、項２１に記載の医薬組成物。【００１２】
なお、本明細書において、「一般式（Ｉ）で表される化合物」、「一般式（ＩＩ）で表される化合物」、「一般式（ＩＩＩ）で表される化合物」を、それぞれ「化合物（Ｉ）」、「化合物（ＩＩ）」、「化合物（ＩＩＩ）」と記載することがある。前記（Ａ１）〜（Ａ５）の項に記載された化合物およびその塩等を、それぞれ「（Ａ１）の化合物」〜「（Ａ５）の化合物」と記載することがある。前記（Ａ１）〜（Ａ５）の少なくとも１つと、（Ｂ）塩とを、「成分（Ａ１）〜（Ａ５）および（Ｂ）」と記載することがある。
【発明の効果】
【００１３】
本発明の形質導入方法により、核酸、タンパク質またはそれらの複合体等を高い効率で細胞内に導入することが可能となる。例えば、ＣＲＩＳＰＲシステムで用いられているｇＲＮＡおよびＣａｓ９タンパク質の複合体を本発明の形質導入方法により高い効率で細胞内に導入することにより、ＣＲＩＳＰＲシステムによる高いＤＮＡ切断活性が達成できる。このような本発明の形質導入方法を利用することにより、形質導入された細胞を効率的に製造することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】図１は、ＥＧＦＰレポーター細胞の樹立のレポーターカセットを示す。
【図２】図２は、ＥＧＦＰレポーター細胞のＥＧＦＰ、ＨＯＥＣＨＳＴ及び可視光でスキャンを行った画像解析の結果を示す。
【図３】図３は、Ｃａｓ９タンパク質の発現部分を示す。
【図４−１】図４（図４−１および図４−２）は、種々の濃度の（Ａ１）〜（Ａ５）の化合物を用いた場合のＥＧＦＰ陽性率およびＨＯＥＣＨＳＴ細胞数の測定結果を示す（実施例１参照）。
【図４−２】同上。
【図５】図５は、（Ａ１）〜（Ａ５）の化合物について、それぞれ特定の濃度で用いた場合のＥＧＦＰ陽性率およびＨＯＥＣＨＳＴ細胞数の測定結果を示す（実施例１参照）。
【図６】図６は、（Ａ１）〜（Ａ５）の化合物について、それぞれ特定の濃度で用いた場合のＥＧＦＰ陽性率およびＨＯＥＣＨＳＴ細胞数の測定結果を示す（実施例２参照）。
【図７】図７は、種々の濃度の（Ｂ）の塩を用いた場合のＥＧＦＰ陽性率およびＨＯＥＣＨＳＴ細胞数の測定結果を示す（実施例３参照）。
【図８】図８は、（Ａ１）〜（Ａ５）の化合物について、塩（Ｂ）としての塩化ナトリウムの濃度を変化させた場合の、ＥＧＦＰ陽性率の測定結果を示す（実施例４参照）。
【図９】図９は、（Ａ３）の化合物である２’−デオキシシチジンと、種々の濃度の塩化ナトリウムと、ｍＲｏｓａ２６ ｇＲＮＡおよびＣａｓ９タンパク質の複合体とを含む投与液（投与液１）をマウス右下肢腓腹筋に局所投与したときの、変異導入効率（indel (%)）の測定結果を示す（実施例５参照）。
【図１０】図１０は、各種の（Ａ１）〜（Ａ５）の化合物と、塩化ナトリウムと、ｍＲｏｓａ２６ ｇＲＮＡおよびＣａｓ９タンパク質の複合体とを含む投与液（投与液２）をマウス右下肢腓腹筋に局所投与したときの、変異導入効率（indel (%)）の測定結果を示す（実施例６参照）。
【図１１】図１１は、種々の濃度の６−ホスホ−Ｄ−グルコン酸またはＮ−カルバミル−Ｌ−アスパラギン酸と、塩化ナトリウムと、ｍＲｏｓａ２６ ｇＲＮＡおよびＣａｓ９タンパク質の複合体とを含む投与液（投与液３）をマウス前脛骨筋に局所投与したときの、スキッピング効率（skipping efficiency (%)）の測定結果を示す（実施例７参照）。
【図１２】図１２は、６−ホスホ−Ｄ−グルコン酸またはＮ−カルバミル−Ｌ−アスパラギン酸（あるいは対照としてのＧＡＢＡ）と、塩化ナトリウムとを含む形質導入用溶液を用いて、蛍光標識デキストランの細胞内取り込み評価を行ったときの、蛍光顕微鏡写真である（実施例８参照）。蛍光顕微鏡写真中の明部が細胞内に取り込まれた蛍光標識デキストランを表す。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
本明細書において、「形質導入」（トランスフェクション）とは、任意の物質を細胞の内部に導入することを意味する。細胞の内部には、少なくとも、細胞質内及び核内が包含される。
【００１６】
「培養（Culture)」又は「培養する」とは、組織外又は体外で、例えば、ディッシュ、シャーレ、フラスコ、あるいは培養槽（タンク）中で細胞を維持し、増殖させ、かつ／又は分化させることを意味する。
【００１７】
「〜を含む（comprise(s)又はcomprising）」とは、その語句に続く要素の包含を示すがこれに限定されないことを意味する。したがって、その語句に続く要素の包含は示唆するが、他の任意の要素の除外は示唆しない。
「〜からなる（consist(s) of又はconsisting of）」とは、その語句に続くあらゆる要素を包含し、かつ、これに限定されることを意味する。したがって、「〜からなる」という語句は、列挙された要素が要求されるか又は必須であり、他の要素は実質的に存在しないことを示す。「〜から本質的になる」とは、その語句に続く任意の要素を包含し、かつ、その要素について本開示で特定された活性又は作用に影響しない他の要素に限定されることを意味する。したがって、「〜から本質的になる」という語句は、列挙された要素が要求されるか又は必須であるが、他の要素は任意選択であり、それらが列挙された要素の活性又は作用に影響を及ぼすかどうかに応じて、存在させる場合もあり、存在させない場合もあることを示す。
【００１８】
本明細書において、クラスタ化調節的散在型短パリンドローム反復配列（ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ  ｒｅｇｕｌａｒｌｙ  ｉｎｔｅｒｓｐｅｒｓｅｄ  ｓｈｏｒｔ  ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ  ｒｅｐｅａｔｓ：ＣＲＩＳＰＲ）／ＣＲＩＳＰＲ−関連（ＣＲＩＳＰＲ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ：Ｃａｓ）システムを「ＣＲＩＳＰＲシステム」と記載する。
【００１９】
以下、本明細書中で用いられる各置換基の定義について詳述する。特記しない限り各置換基は以下の定義を有する。
【００２０】
本明細書中、「Ｃ１−４アルキル基」としては、例えば、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチルが挙げられる。
【００２１】
本明細書中、「Ｃ１−６アルキル基」としては、例えば、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ペンチル、イソペンチル、ネオペンチル、１−エチルプロピル、ヘキシル、イソヘキシル、１，１−ジメチルブチル、２，２−ジメチルブチル、３，３−ジメチルブチル、２−エチルブチルが挙げられる。
【００２２】
本明細書中、「直鎖状Ｃ２−４アルキル基」としては、例えば、エチル、プロピル、ブチルが挙げられる。
【００２３】
本明細書中、Ｃ１−６アルキル基またはＣ１−４アルキル基が有していてもよい「置換基」としては、例えば、Ｃ１−６アルキル基、水酸基、アミノ基、カルボキシル基が挙げられる。本明細書中で特別に規定されている場合を除き、Ｃ１−６アルキル基またはＣ１−４アルキル基は、置換可能な任意の部位に、１つの置換基、または互いに独立な複数の置換基を有することができる。
【００２４】
以下、本発明の形質導入用溶液について説明する。
【００２５】
本発明の形質導入用溶液は、下記（Ａ１）〜（Ａ５）の少なくとも１つと、（Ｂ）塩とを含む。
【００２６】
（Ａ１）の化合物は、生体のタンパク質の構成ユニットとなるＬ−アミノ酸２０種およびＳ−メチル−Ｌ−メチオニンを除く、下記一般式（Ｉ）で表される化合物またはその塩である。（Ａ１）の化合物は、水和物であってもよい。（Ａ１）の化合物は、いずれか１種を単独で用いても、２種以上を組み合わせて用いてもよい。
【００２７】
【化７】
2020111229.tif 000009
【００２８】
式（Ｉ）中、
ｎは、０または１であり、
Ｒ１およびＲ２はそれぞれ独立して、水素原子またはＣＯＲ３を示し、
Ｒ０は、Ｃ１−６アルキル基を除く、置換基を有していてもよいＣ１−６アルキル基を有していてもよい生体のタンパク質の構成ユニットとなるアミノ酸を構成する側鎖を示し、
ただし、Ｒ０が水素原子の場合、Ｒ１はＣＯＲ３を示し、Ｒ２は水素原子を示し、
Ｒ３は、置換基（チオール基およびジスルフィド基を除く）を有していてもよいＣ１−６アルキル基（メチル基を除く）、またはＮＲ４Ｒ５を示し、
Ｒ４およびＲ５はそれぞれ独立して、水素原子またはＣ１−４アルキル基を示す。
なお、Ｒ０の定義に係る「生体のタンパク質の構成ユニットとなるアミノ酸を構成する側鎖」には、ピロリンの一部を構成する、Ｒ０が結合している炭素原子およびＲ１が結合している窒素原子と一体となって形成される環（ピロリジン環）は含まれない。
【００２９】
式（Ｉ）におけるｎ、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ０、Ｒ４およびＲ５の各々の好ましい例は次の通りである。
ｎは、好ましくは０または１である。
Ｒ１は、好ましくは水素原子またはＣＯＲ３である。
Ｒ２は、好ましくは水素原子である。
Ｒ３は、好ましくは置換基（チオール基およびジスルフィド基を除く）を有していてもよいＣ１−６アルキル基（メチル基を除く）、またはＮＲ４Ｒ５である。
Ｒ０は、好ましくは水素原子、または置換基を有していてもよいＣ１−６アルキル基を有していてもよい、アルギニン、ヒスチジン、アスパラギン酸、アスパラギン、グルタミン酸、グルタミン、リシン、フェニルアラニン、セリン、トレオニン、トリプトファン、チロシン、システインもしくはメチオニンを構成する側鎖である。
Ｒ４は、好ましくは水素原子またはＣ１−４アルキル基である。
Ｒ５は、好ましくは水素原子またはＣ１−４アルキル基である。
【００３０】
化合物（Ｉ）の好適な具体例は次の通りである。下記の化合物は、塩および／または水和物であってもよい。
化合物（Ｉ−ｉ）：ｎが０または１であり、Ｒ１が水素原子またはＣＯＲ３であり、Ｒ２が水素原子であり、Ｒ３が置換基（チオール基およびジスルフィド基を除く）を有していてもよいＣ１−６アルキル基（メチル基を除く）であり、Ｒ０が水素原子、または置換基を有していてもよいＣ１−６アルキル基を有していてもよい、アルギニン、ヒスチジン、アスパラギン酸、アスパラギン、グルタミン酸、グルタミン、リシン、フェニルアラニン、セリン、トレオニン、トリプトファン、チロシン、システインもしくはメチオニンを構成する側鎖である化合物。
化合物（Ｉ−ｉｉ）：ｎが０または１であり、Ｒ１がＣＯＲ３であり、Ｒ２が水素原子であり、Ｒ３が置換基（チオール基およびジスルフィド基を除く）を有していてもよいＣ１−６アルキル基（メチル基を除く）であり、Ｒ０が水素原子、または置換基を有していてもよいＣ１−６アルキル基を有していてもよい、アルギニン、ヒスチジン、アスパラギン酸、アスパラギン、グルタミン酸、グルタミン、リシン、フェニルアラニン、セリン、トレオニン、トリプトファン、チロシン、システインもしくはメチオニンを構成する側鎖である化合物。
化合物（Ｉ−ｉｉｉ）：ｎが０または１であり、Ｒ１がＣＯＲ３であり、Ｒ２が水素原子であり、Ｒ３がＮＲ４Ｒ５であり、Ｒ０が水素原子、または置換基を有していてもよいＣ１−６アルキル基を有していてもよい、アルギニン、ヒスチジン、アスパラギン酸、アスパラギン、グルタミン酸、グルタミン、リシン、フェニルアラニン、セリン、トレオニン、トリプトファン、チロシン、システインもしくはメチオニンを構成する側鎖であり、Ｒ４が水素原子であり、Ｒ５が水素原子である化合物。
【００３１】
化合物（Ｉ）のより好適な具体例は次の通りである。下記の化合物は、塩および／または水和物であってもよい。
化合物（Ｉ−ａ）：ｎが０であり、Ｒ１が水素原子であり、Ｒ２が水素原子であり、Ｒ０が置換基を有していてもよいＣ１−６アルキル基を有していてもよいアルギニンを構成する側鎖である化合物、例えば、アルギニノコハク酸。
化合物（Ｉ−ｂ）：ｎが０であり、Ｒ１が水素原子であり、Ｒ２が水素原子であり、Ｒ０がＣ１−６アルキル基を有していてもよいヒスチジンを構成する側鎖である化合物、例えば、１−メチル−Ｌ−ヒスチジン。
化合物（Ｉ−ｃ）：ｎが１であり、Ｒ１がＣＯＲ３であり、Ｒ２が水素原子であり、Ｒ３がＣ１−６アルキル基または水酸基を有していてもよいプロピル基であり、Ｒ０が水素原子である化合物、例えば、パントテン酸。
化合物（Ｉ−ｄ）：ｎが０であり、Ｒ１がＣＯＲ３であり、Ｒ２が水素原子であり、Ｒ３がアミノ基を有していてもよいエチル基であり、Ｒ０がＣ１−６アルキル基を有していてもよいヒスチジンを構成する側鎖である化合物、例えば、Ｌ−カルノシン。
化合物（Ｉ−ｅ）：ｎが０であり、Ｒ１がＣＯＲ３であり、Ｒ２が水素原子であり、Ｒ３がＮＲ４Ｒ５であり、Ｒ０がＣ１−６アルキル基を有していてもよいアスパラギン酸を構成する側鎖であり、Ｒ４が水素原子であり、Ｒ５が水素原子である化合物、例えば、Ｎ−カルバミル−Ｌ−アスパラギン酸（Ｎ−カルバモイル−Ｌ−アスパラギン酸と呼ばれることもある）。
【００３２】
本発明の一側面において、（Ａ１）は、アルギニノコハク酸、１−メチル−Ｌ−ヒスチジン、パントテン酸、Ｌ−カルノシン、Ｎ−カルバミル−Ｌ−アスパラギン酸より選択される化合物またはその塩（水和物であってもよい。）であること、中でもアルギニノコハク酸、１−メチル−Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−カルノシン、Ｎ−カルバミル−Ｌ−アスパラギン酸より選択される化合物またはその塩（水和物であってもよい。）であることが、特に好ましい。
本発明の他の一側面において、（Ａ１）は、１−メチル−Ｌ−ヒスチジン、Ｎ−カルバミル−Ｌ−アスパラギン酸より選択される化合物またはその塩（水和物であってもよい。）であることが特に好ましい。
【００３３】
（Ａ２）の化合物は、下記一般式（ＩＩ）で表される化合物またはその塩である。（Ａ２）の化合物は、水和物であってもよい。（Ａ２）の化合物は、いずれか１種を単独で用いても、２種以上を組み合わせて用いてもよい。
【００３４】
【化８】
2020111229.tif 000010
【００３５】
式（ＩＩ）中、
Ｘは酸素原子またはＮＲ１１を示し、
Ｒ１1は、水素原子、置換基を有していてもよいＣ１−４アルキル基またはＣＯＲ１２を示し、
Ｒ１２はＣ１−６アルキル基を示し、
Ｙは水素原子またはＯＲ１０を示し、
Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８およびＲ１０はそれぞれ独立して水素原子またはホスホン酸基（−Ｐ(＝Ｏ)(ＯＨ)２）を示し、
Ｒ９は水素原子、水酸基またはリン酸基（−Ｏ−Ｐ(＝Ｏ)(ＯＨ)２）を示し、
Ｒ１０が水素原子のとき、ＯＲ６、ＯＲ７、ＯＲ８、Ｒ９のうち少なくとも１つがリン酸基である。
但し、一般式（ＩＩ）で表される化合物には、水溶液中で一般式（ＩＩ）と平衡関係にある鎖状構造を取っているものも含まれるものとする。
【００３６】
式（ＩＩ）におけるＸ，Ｙ，Ｒ１１、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９およびＲ１０の各々の好ましい例は次の通りである。
Ｘは、好ましくは酸素原子またはＮＲ１１である。
Ｙは、好ましくは水素原子またはＯＲ１０である。
Ｒ１１は、好ましくは水素原子または置換基を有していてもよいＣ１−４アルキル基である。
Ｒ６は、好ましくは水素原子またはホスホン酸基である。
Ｒ７は、好ましくは水素原子またはホスホン酸基である。
Ｒ８は、好ましくは水素原子またはホスホン酸基である。
Ｒ９は、好ましくは水素原子、水酸基またはリン酸基である。
Ｒ１０は、好ましくは水素原子またはホスホン酸基である。
【００３７】
化合物（ＩＩ）の好適な具体例は次の通りである。下記の化合物は、塩および／または水和物であってもよい。
化合物（ＩＩ−ｉ）：ＸがＮＲ11であり、Ｙが水素原子であり、Ｒ6が水素原子またはホスホン酸基であり、Ｒ7が水素原子またはホスホン酸基であり、Ｒ8が水素原子またはホスホン酸基であり、Ｒ9が水酸基またはリン酸基であり、Ｒ10が水素原子またはホスホン酸基であり、Ｒ11が水素原子または置換基を有していてもよいＣ１−４アルキル基である化合物。
化合物（ＩＩ−ｉｉ）：Ｘが酸素原子であり、ＹがＯＲ10であり、Ｒ6が水素原子またはホスホン酸基であり、Ｒ7が水素原子またはホスホン酸基であり、Ｒ8が水素原子またはホスホン酸基であり、Ｒ9が水素原子、水酸基またはリン酸基であり、Ｒ10が水素原子またはホスホン酸基である化合物。
【００３８】
化合物（ＩＩ）のより好適な具体例は次の通りである。下記の化合物は、塩および／または水和物であってもよい。
化合物（ＩＩ−ａ）：ＸがＮＲ11であり、Ｙが水素原子であり、Ｒ6が水素原子であり、Ｒ7が水素原子であり、Ｒ8が水素原子であり、Ｒ9が水酸基であり、Ｒ11が２−ヒドロキシエチル基である化合物、例えば、ミグリトール。
化合物（ＩＩ−ｂ）：Ｘが酸素原子であり、ＹがＯＲ10であり、Ｒ6がリン酸基であり、Ｒ7が水素原子であり、Ｒ8が水素原子であり、Ｒ9が水素原子であり、Ｒ10が水素原子である化合物、例えば、２−デオキシ−Ｄ−グルコース−６−リン酸。
化合物（ＩＩ−ｃ）：Ｘが酸素原子であり、ＹがＯＲ10であり、Ｒ6が水素原子であり、Ｒ7が水素原子であり、Ｒ8が水素原子であり、Ｒ9が水酸基であり、Ｒ10がホスホン酸基である化合物、例えば、α−Ｄ−グルコース１−リン酸。
化合物（ＩＩ−ｄ）：ＸがＮＲ11であり、Ｙが水素原子であり、Ｒ6が水素原子であり、Ｒ7が水素原子であり、Ｒ8が水素原子であり、Ｒ9が水酸基であり、Ｒ11が水素原子である化合物、例えば、１−デオキシノジリマイシン。
【００３９】
本発明の一側面において、（Ａ２）は、ミグリトール、２−デオキシ−Ｄ−グルコース−６−リン酸、α−Ｄ−グルコース１−リン酸、１−デオキシノジリマイシンより選択される化合物またはその塩（水和物であってもよい。）であることが特に好ましい。
本発明の他の一側面において、（Ａ２）は、２−デオキシ−Ｄ−グルコース−６−リン酸またはその塩（水和物であってもよい。）であることが特に好ましい。
【００４０】
（Ａ３）の化合物は、核酸塩基、ヌクレオシドまたはヌクレオチド、あるいはその塩である。（Ａ３）の化合物は、水和物であってもよい。（Ａ３）の化合物は、いずれか１種を単独で用いても、２種以上を組み合わせて用いてもよい。
【００４１】
なお、一実施形態において関心対象分子は「核酸」であってもよいが、その「核酸」がポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドであるのに対し、（Ａ３）の化合物としての「ヌクレオチド」はモノヌクレオチドまたはジヌクレオチドである点で、両者は区別される。
【００４２】
核酸塩基としては、アデニン、グアニン、シトシン、チミンおよびウラシル、ならびにこれらの修飾塩基等、例えばメチル化シトシン、ヒドロキシメチル化シトシン、メチル化グアニン、ヒポキサンチン（脱アミノ化したアデニン、６−ヒドロキシプリン）、シュードウラシル、ジヒドロウラシル、チオウラシル、メチルアミノセレノウラシル、タウリノメチルウラシル、リジシン、アグマチニルシトシン、アーキオシン、キューオシン、ワイオシン、その他のゲノムＤＮＡ、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡなどに含まれている修飾核酸塩基等が挙げられる。
【００４３】
ヌクレオシドは、塩基にリボースまたはその他の糖が結合した化合物であり、リボヌクレオシド、デオキシリボヌクレオシド等が包含される。リボヌクレオシドとしては、アデノシン、グアノシン、シチジン、ウリジン、５−メチルウリジン、およびその他の前記修飾核酸塩基等にリボースが結合した化合物が挙げられる。デオキシリボヌクレオチドとしては、デオキシアデノシン、デオキシグアノシン、デオキシシチジン、チミジン、デオキシウリジン、およびその他の前記修飾核酸塩基等にデオキシリボースが結合した化合物が挙げられる。ヌクレオシドには、イノシン（ヒポキサンチンにリボースが結合した化合物）、リボフラビン（ビタミンＢ２、ジメチルイソアロキサジンに還元されて鎖状になったリボース（リビトール）が結合した化合物）なども包含される。
【００４４】
ヌクレオチドは、リボヌクレオシド、デオキシリボヌクレオシド等の糖残基にリン酸基が結合した化合物である。ヌクレオチドとしては、アデノシン一リン酸（ＡＭＰ）、アデノシン二リン酸（ＡＤＰ）、アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）、グアノシン一リン酸（ＧＭＰ）、グアノシン二リン酸（ＧＤＰ）、グアノシン三リン酸（ＧＴＰ）、シチジン一リン酸（ＣＭＰ）、シチジン二リン酸（ＣＤＰ）、シチジン三リン酸（ＣＴＰ）、ウリジン一リン酸（ＵＭＰ）、ウリジン二リン酸（ＵＤＰ）、ウリジン三リン酸（ＵＴＰ）、その他のリボヌクレオシドにリン酸基が１つ以上結合した化合物；デオキシアデノシン一リン酸（ｄＡＭＰ）、デオキシアデノシン二リン酸（ｄＡＤＰ）、デオキシアデノシン三リン酸（ｄＡＴＰ）、デオキシグアノシン一リン酸（ｄＧＭＰ）、デオキシグアノシン二リン酸（ｄＧＤＰ）、デオキシグアノシン三リン酸（ｄＧＴＰ）、デオキシシチジン一リン酸（ｄＣＭＰ）、デオキシシチジン二リン酸（ｄＣＤＰ）、デオキシシチジン三リン酸（ｄＣＴＰ）、チミジン一リン酸（ｄＴＭＰ）、チミジン二リン酸（ｄＤＭＰ）、チミジン三リン酸（ｄＴＭＰ）、デオキシウリジン一リン酸（ｄＵＭＰ）、デオキシウリジン二リン酸（ｄＵＤＰ）、デオキシウリジン三リン酸（ｄＵＴＰ）、その他のデオキシリボヌクレオシドにリン酸基が１つ以上結合した化合物が挙げられる。ヌクレオチドには、イノシン酸（イノシン一リン酸）、フラビンモノヌクレオチド（ＦＭＮ）、フラビンアデニンジヌクレオチド（ＦＡＤ）なども包含される。また、サイクリックＡＭＰ（ｃＡＭＰ）、サイクリックＧＭＰ（ｃＧＭＰ）のように、ヌクレオシドに環状のリン酸基が結合した化合物も、ヌクレオチドに包含される。
【００４５】
（Ａ３）の化合物の好適な具体例は次の通りである。下記の化合物は、塩および／または水和物であってもよい。
核酸塩基：アデニン、グアニン、シトシン、チミン、ウラシルおよびヒポキサンチン。
ヌクレオシド：アデノシン、グアノシン、シチジン、ウリジン、５−メチルウリジン、デオキシアデノシン、デオキシグアノシン、デオキシシチジン、チミジン、デオキシウリジン、イノシン。
ヌクレオチド：アデノシン一リン酸、グアノシン一リン酸、シチジン一リン酸、ウリジン一リン酸、デオキシアデノシン一リン酸、デオキシアデノシン二リン酸、デオキシグアノシン一リン酸、デオキシシチジン一リン酸、デオキシシチジン二リン酸、チミジン一リン酸、デオキシウリジン一リン酸、イノシン酸。
【００４６】
（Ａ３）の化合物のより好適な具体例は次の通りである。下記の化合物は、塩および／または水和物であってもよい。
核酸塩基：シトシン。
ヌクレオシド：シチジン、デオキシウリジン、デオキシシチジン。
ヌクレオチド：５’−イノシン酸。
【００４７】
本発明の一側面において、（Ａ３）は、シトシン、シチジン、デオキシウリジン、デオキシシチジン、５’−イノシン酸より選択される化合物またはその塩（水和物であってもよい。）であること、中でもシチジン、デオキシシチジン、５’−イノシン酸より選択される化合物またはその塩（水和物であってもよい。）であることが、特に好ましい。
本発明の他の一側面において、（Ａ３）は、デオキシシチジンまたはその塩（水和物であってもよい。）であることが特に好ましい。
【００４８】
（Ａ４）の化合物は、リンゴ酸を除く、一般式（ＩＩＩ）で表される化合物またはその塩である。（Ａ４）の化合物は、水和物であってもよい。（Ａ４）の化合物は、いずれか１種を単独で用いても、２種以上を組み合わせて用いてもよい。
Ｒｘ−ＣＲｙＲｚＣＯＯＨ      III
【００４９】
式（ＩＩＩ）中、
Ｒｘは、Ｃ１−６アルキル基、置換されていてもよい水酸基、オキソ基およびカルボキシル基からなる群より選択される少なくとも１種で置換されている直鎖状Ｃ２−４アルキル基を示し、
ＲｙおよびＲｚは、それぞれ独立して水素原子または水酸基を示す（但し、少なくとも１つは水酸基である）か一緒になってオキソ基を示す。
【００５０】
Ｒｘにおける置換されていてもよい水酸基としては、例えば、ホスホン酸基で置換されていてもよい水酸基が挙げられる。
【００５１】
式（ＩＩＩ）におけるＲｘ、ＲｙおよびＲｚの各々の好ましい例は次の通りである。
Ｒｘは、好ましくはＣ１−６アルキル基、水酸基、リン酸基、オキソ基およびカルボキシル基からなる群より選択される少なくとも１種で置換されている直鎖状Ｃ２−４アルキル基である。
Ｒｙは、好ましくは水酸基、あるいはＲｚとオキソ基を形成している。
Ｒｚは、好ましくは水素原子、あるいはＲｙとオキソ基を形成している。
【００５２】
化合物（ＩＩＩ）の好適な具体例は次の通りである。
化合物（ＩＩＩ−ｉ）：ＲｘがＣ１−６アルキル基、水酸基、リン酸基、オキソ基およびカルボキシル基からなる群より選択される少なくとも１種で置換されている直鎖状Ｃ２−４アルキル基であり、Ｒｙが水酸基であり、Ｒｚが水素原子である化合物。
化合物（ＩＩＩ−ｉｉ）：ＲｘがＣ１−６アルキル基、水酸基、オキソ基およびカルボキシル基からなる群より選択される少なくとも１種で置換されている直鎖状Ｃ２−４アルキル基であり、ＲｙとＲｚがオキソ基を形成している化合物。
【００５３】
化合物（ＩＩＩ）のより好適な具体例は次の通りである。
化合物（ＩＩＩ−ａ）：Ｒｘが水酸基およびリン酸基で置換されているブチル基であり、Ｒｙが水酸基であり、Ｒｚが水素原子である化合物、例えば、６−ホスホ−Ｄ−グルコン酸。
化合物（ＩＩＩ−ｂ）：ＲｘがＣ１−６アルキル基で置換されているエチル基であり、ＲｙとＲｚがオキソ基を形成している化合物、例えば、３−メチル−２−オキソブタン酸。
化合物（ＩＩＩ−ｃ）：Ｒｘがカルボキシル基で置換されているエチル基であり、Ｒｙが水酸基であり、Ｒｚが水素原子である化合物、例えば、２−ヒドロキシグルタル酸。
【００５４】
本発明の一側面において、（Ａ４）は、６−ホスホ−Ｄ−グルコン酸、３−メチル−２−オキソブタン酸、２−ヒドロキシグルタル酸より選択される化合物またはその塩（水和物であってもよい。）であることが特に好ましい。
本発明の他の一側面において、（Ａ４）は、６−ホスホ−Ｄ−グルコン酸またはその塩（水和物であってもよい。）であることが特に好ましい。
【００５５】
（Ａ５）の化合物は、クレアチニン、ヒドロキシプロリン、１，３−ブタンジオール、トリエンチン、Ｄ−セロビオース、１，３−ジメチルウレア、パントラクトンおよびトリメタジオンからなる群より選択される少なくとも１種またはその塩である。（Ａ５）の化合物は、水和物であってもよい。
【００５６】
本発明の一側面において、（Ａ５）は、クレアチニン、ヒドロキシプロリン、１，３−ブタンジオール、１，３−ジメチルウレア、パントラクトン、トリメタジオンより選択される化合物またはその塩（水和物であってもよい。）であることが特に好ましい。
【００５７】
（Ａ１）〜（Ａ５）の各定義に含まれる塩としては、薬理学的に許容される塩が好ましく、例えば、無機塩基との塩、有機塩基との塩、無機酸との塩、有機酸との塩、塩基性または酸性アミノ酸との塩が挙げられる。
【００５８】
無機塩基との塩の好適な例としては、ナトリウム塩、カリウム塩等のアルカリ金属塩；カルシウム塩、マグネシウム塩等のアルカリ土類金属塩；アルミニウム塩、アンモニウム塩が挙げられる。好ましくは、ナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩、マグネシウム塩であり、より好ましくは、ナトリウム塩、カリウム塩、マグネシウム塩である。
【００５９】
有機塩基との塩の好適な例としては、トリメチルアミン、トリエチルアミン、ピリジン、ピコリン、エタノールアミン、ジエタノールアミン、トリエタノールアミン、トロメタミン［トリス（ヒドロキシメチル）メチルアミン]、tert−ブチルアミン、シクロヘキシルアミン、ベンジルアミン、ジシクロヘキシルアミン、Ｎ,Ｎ−ジベンジルエチレンジアミンとの塩が挙げられる。
【００６０】
無機酸との塩の好適な例としては、フッ化水素酸、塩酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸、硝酸、硫酸、リン酸との塩が挙げられる。好ましくは、塩酸との塩、リン酸との塩である。
【００６１】
有機酸との塩の好適な例としては、ギ酸、酢酸、トリフルオロ酢酸、フタル酸、フマル酸、シュウ酸、酒石酸、マレイン酸、クエン酸、コハク酸、リンゴ酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、p−トルエンスルホン酸との塩が挙げられる。
【００６２】
塩基性アミノ酸との塩の好適な例としては、アルギニン、リジン、オルニチンとの塩が挙げられる。
【００６３】
酸性アミノ酸との塩の好適な例としては、アスパラギン酸、グルタミン酸との塩が挙げられる。
【００６４】
（Ｂ）の塩は、（Ａ１）〜（Ａ５）の各定義に含まれる塩とは別に、本発明の形質導入用溶液が含有する化合物である。本発明において、（Ａ１）〜（Ａ５）に該当する塩は、（Ｂ）の塩からは除外される。
【００６５】
（Ｂ）の塩としては、例えば、リチウム塩、ナトリウム塩、マグネシウム塩、カリウム塩、カルシウム塩、ルビジウム塩、セシウム塩などのアルカリ金属塩およびアルカリ土類金属塩；炭酸塩、スルホン酸塩、硫酸塩などの無機酸塩；アスパラギン酸塩などの有機酸塩；硫化物；塩化物、臭化物、ヨウ化物、フッ化物などのハロゲン化物が挙げられる。（Ｂ）の塩のうち、アルカリ金属塩およびアルカリ土類金属塩、有機酸塩ならびに塩化物が好ましく、例えば、塩化ナトリウム、塩化マグネシウム、塩化カリウム、アスパラギン酸マグネシウムなどのように、アルカリ金属またはアルカリ土類金属（陽イオン）と有機酸またはハロゲン原子（陰イオン）とによって形成される塩がより好ましい。（Ｂ）の塩は、これらの２種類以上の組み合わせであることが好ましい。２種類以上の（Ｂ）の塩の組合せとしては特に限定されないが、塩化ナトリウム、塩化マグネシウムおよび塩化カリウムの３種類の組み合わせが好ましい。塩化ナトリウム、塩化マグネシウムおよび塩化カリウムの３種類の組み合わせを用いる場合、そのモル比としては、塩化ナトリウムが０．７５〜０．９５、塩化マグネシウムが０．０５〜０．１５、塩化カリウムが０．０２５〜０．０７５が好ましい。
【００６６】
本発明の形質導入用溶液に含まれる成分（Ａ１）〜（Ａ５）および（Ｂ）として用いる化合物の種類（組み合わせ）およびその濃度は、細胞内への関心対象分子の導入効率等の観点から、例えば対象細胞の種類に応じて、適宜調節することができ、特に限定されるものではない。
【００６７】
（Ａ１）〜（Ａ５）の化合物の形質導入用溶液中の濃度は、通常０．１ｍＭ〜１０００ｍＭであるが、形質導入物質により最適濃度が異なる。２’−デオキシシチジンの場合は１２．５ｍＭ以上が好ましく、１００ｍＭ〜２５０ｍＭがより好ましい。パントテン酸カルシウムの場合は１６０ｍＭから２５０ｍＭが好ましい。アルギニノコハク酸二ナトリウム水和物の場合は３０ｍＭ以上が好ましく、１００ｍＭ〜２５０ｍＭがより好ましい。３−メチル２−オキソブタン酸ナトリウムの場合は４０ｍＭ以上が好ましく、１００ｍＭ〜２００ｍＭがより好ましい。１，３−ブチレングリコールの場合は０．６ｍＭ以上が好ましく０．６ｍＭ〜３ｍＭがより好ましい。１，３−ジメチルウレアの場合は３０ｍＭ以上が好ましく、６０ｍＭ〜５００ｍＭがより好ましい。２’−デオキシウリジンの場合は１０ｍＭ以上が好ましく、１００ｍＭ以上がより好ましい。６−ホスホ−Ｄ−グルコン酸の場合は６０ｍＭ以上が好ましく、１００ｍＭ〜５００ｍＭがより好ましい。クレアチニンの場合は５ｍＭ以上が好ましく、１００ｍＭ〜５００ｍＭがより好ましい。シトシンの場合は２０ｍＭ以上が好ましく、２５ｍＭ〜２５０ｍＭがより好ましい。Ｄ(＋)−セロビオースの場合は３ｍＭ以上が好ましく、２００ｍＭ〜５００ｍＭがより好ましい。２−デオキシ−Ｄ−グルコース−６−リン酸の場合は３０ｍＭ以上が好ましく、１２５ｍＭ〜５００ｍＭがより好ましい。α−Ｄ−グルコース−１−リン酸は、６０ｍＭ以上が好ましく、１２５ｍＭ〜５００ｍＭがより好ましい。Ｎ−カルバミル−Ｌ−アスパラギン酸の場合は６０ｍＭ以上が好ましく、１２５ｍＭ〜５００ｍＭがより好ましい。Ｌ−カルノシンの場合は１ｍＭ以上が好ましく、６０ｍＭ〜５００ｍＭがより好ましい。ミグリトールの場合は１ｍＭ以上が好ましく、６０ｍＭ〜２５０ｍＭがより好ましい。イノシン５’−リン酸二ナトリウム水和物の場合は１００ｍＭ以上が好ましく２５０ｍＭ〜５００ｍＭがより好ましい。２−ヒドロキシグルタル酸の場合は１ｍＭ以上が好ましく、６０ｍＭ〜５００ｍＭがより好ましい。１−メチル−Ｌ−ヒスチジンの場合は１０ｍＭ以上が好ましく、１００ｍＭ〜２５０ｍＭがより好ましい。シチジンの場合は１００ｍＭ以上が好ましく、１２５ｍＭ〜５００ｍＭがより好ましい。６−ホスホ−Ｄ−グルコン酸の場合は３０ｍＭ以上が好ましく、１００ｍＭ〜２５０ｍＭがより好ましい。
【００６８】
（Ｂ）の塩の形質導入用溶液中の濃度において、１種類、または２種類以上組み合わせた場合の合計濃度は、通常２００ｍＭ以上であり、好ましくは２００〜２０００ｍＭであり、より好ましくは３００ｍＭ〜９００ｍＭである。
【００６９】
（Ａ１）〜（Ａ５）の化合物および（Ｂ）の塩は、公知の方法によって製造（合成、単離、精製等）することが可能であり、また市販されている製品を用いることもできる。
【００７０】
本発明の形質導入用溶液は、（Ａ１）〜（Ａ５）の少なくとも１つの化合物と、（Ｂ）の塩とを、適切な溶媒に溶解させることによって調製することができる。
【００７１】
成分（Ａ１）〜（Ａ５）および（Ｂ）を溶解するための溶媒は、これらの成分を所定の量で溶解することのできるものであれば特に限定されないが、緩衝液（バッファー）が好適である。緩衝液としては、例えば、酢酸緩衝液、クエン酸緩衝液、２−モルホリノエタンスルホン酸（ＭＥＳ）緩衝液、リン酸緩衝液などの酸性緩衝液；および４−(２−ヒドロキシエチル)−１−ピペラジンエタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）緩衝液、トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン（Ｔｒｉｓ）緩衝液、リン酸緩衝液、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）などの中性緩衝液が挙げられる。
【００７２】
本発明の形質導入溶液の浸透圧は、特に限定されるものではないが、通常３００ｍＯｓｍｏｌ／ｋｇ以上だが、好ましくは３００〜２０００ｍＯｓｍｏｌ／ｋｇ、より好ましくは７００〜１７００ｍＯｓｍｏｌ／ｋｇである。
【００７３】
なお、本発明では、公知の形質導入（トランスフェクション）方法で用いられている、ウイルスプラスミド、ナノ粒子、リポソーム、カチオン性脂質、外膜小胞もしくは他の脂質小胞等（ミセルを含む）、細胞膜透過性ペプチドなどから選択される膜貫通担体を伴わなくても、本発明としての作用効果を奏することができ、関心対象分子を高い効率で細胞内に導入することができる。
【００７４】
以下、本発明の形質導入方法について説明する。
【００７５】
本発明の形質導入方法は、少なくとも、細胞と、関心対象分子および形質導入用溶液とを接触させる工程（本明細書において「接触工程」と称する）を含み、必要に応じてさらに、細胞内に関心対象分子を導入することに関するその他の工程を含んでいてもよい。また、本発明の形質導入方法は、細胞内に関心対象分子を導入するために本明細書に記載した所定の形質導入用溶液を用いるが、それ以外の技術的事項は基本的に、従来の溶液を用いて細胞内に関心対象分子を導入する方法に準じたものとすることが可能である。
【００７６】
なお、本発明では、公知の形質導入（トランスフェクション）方法で用いられている、エレクトロポレーションなどの特殊な処理を行わなくても、本発明としての作用効果を奏することができ、関心対象分子を高い効率で細胞内に導入することができる。
【００７７】
・関心対象分子
本発明において、形質導入用溶液を用いて細胞内に導入する関心対象分子は、細胞内で所期の目的を果たすことのできるものであればよく、特に限定されるものではない。関心対象分子としては、例えば、核酸、タンパク質、およびそれらの複合体、ならびに高分子化合物（例：デキストラン）が挙げられ、好ましい関心対象分子としては、例えば、核酸、タンパク質およびそれらの複合体が挙げられる。
【００７８】
「核酸」とは、ヌクレオチドおよび該ヌクレオチドと同等の機能を有する分子が重合した分子であればいかなるものでもよく、例えば、リボヌクレオチドの重合体であるＲＮＡ、デオキシリボヌクレオチドの重合体であるＤＮＡ、リボヌクレオチドおよびデオキシリボヌクレオチドが混合した重合体、および、ヌクレオチド類似体を含むヌクレオチド重合体を挙げることができ、さらに、核酸誘導体を含むヌクレオチド重合体であってもよい。また、核酸は、一本鎖核酸または二本鎖核酸であってもよい。また二本鎖核酸には、一方の鎖に対し、他方の鎖がストリンジェントな条件でハイブリダイズする二本鎖核酸も含まれる。
【００７９】
ヌクレオチド類似体としては、ＲＮＡまたはＤＮＡと比較して、ヌクレアーゼ耐性の向上または、安定化させるため、相補鎖核酸とのアフィニティーを上げるため、あるいは細胞透過性を上げるため、あるいは可視化させるために、リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、ＲＮＡまたはＤＮＡに修飾を施した分子であればいかなる分子でもよい。ヌクレオチド類似体としては、天然に存在する分子でも非天然の分子でもよく、例えば、糖部修飾ヌクレオチド類似体やリン酸ジエステル結合修飾ヌクレオチド類似体等が挙げられる。
【００８０】
糖部修飾ヌクレオチド類似体としては、ヌクレオチドの糖の化学構造の一部あるいは全てに対し、任意の化学構造物質を付加あるいは置換したものであればいかなるものでもよく、その具体例としては、２’−Ｏ−メチルリボースで置換されたヌクレオチド類似体、２’−Ｏ−プロピルリボースで置換されたヌクレオチド類似体、２’−メトキシエトキシリボースで置換されたヌクレオチド類似体、２’−Ｏ−メトキシエチルリボースで置換されたヌクレオチド類似体、２’−Ｏ−[２−(グアニジウム)エチル]リボースで置換されたヌクレオチド類似体、２’−フルオロリボースで置換されたヌクレオチド類似体、糖部をモルフォリノ環に置換した核酸類縁体（モルフォリノ核酸）、糖部に架橋構造を導入することにより２つの環状構造を有する架橋構造型人工核酸（Bridged Nucleic Acid）（ＢＮＡ）、より具体的には、２’位の酸素原子と４’位の炭素原子がメチレンを介して架橋したロックド人工核酸（Locked Nucleic Acid）（ＬＮＡ）、およびエチレン架橋構造型人工核酸（Ethylene bridged nucleic acid）（ＥＮＡ）［Nucleic Acid Research, 32, e175(2004)］、２’位の炭素原子と４’位の炭素原子がアミド結合を介して架橋したアミド架橋構造型人工核酸（Amido‐Bridged Nucleic Acids）(ＡｍＮＡ)が挙げられ、さらにペプチド核酸（ＰＮＡ）［Acc. Chem. Res., 32, 624(1999)］、オキシペプチド核酸（ＯＰＮＡ）［J. Am．Chem. Soc., 123， 4653 (2001)］、およびペプチドリボ核酸（ＰＲＮＡ）［J．Am. Chem. Soc., 122, 6900 (2000)］等を挙げることができる。
【００８１】
リン酸ジエステル結合修飾ヌクレオチド類似体としては、ヌクレオチドのリン酸ジエステル結合の化学構造の一部あるいは全てに対し、任意の化学物質を付加あるいは置換したものであればいかなるものでもよく、その具体例としては、ホスホロチオエート結合に置換されたヌクレオチド類似体、Ｎ３’−Ｐ５’ホスホアミデート結合に置換されたヌクレオチド類似体等を挙げることができる［細胞工学， 16, 1463-1473 (1997)］［RNAi法とアンチセンス法、講談社(2005)］。
【００８２】
核酸誘導体としては、核酸に比べ、ヌクレアーゼ耐性を向上させるため、安定化させるため、相補鎖核酸とのアフィニティーを上げるため、細胞透過性を上げるため、あるいは可視化させるために、該核酸に別の化学物質を付加した分子であればいかなる分子でもよく、その具体例としては、５’−ポリアミン付加誘導体、コレステロール付加誘導体、ステロイド付加誘導体、胆汁酸付加誘導体、ビタミン付加誘導体、Ｃｙ５付加誘導体、Ｃｙ３付加誘導体、６−ＦＡＭ付加誘導体、およびビオチン付加誘導体等を挙げることができる。
【００８３】
核酸の具体例としては、ｍＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ  ｍｉｍｉｃ、アンチセンス核酸、リボザイム、デコイ核酸、アプタマー、プラスミドＤＮＡ、Ｃｏｓｍｉｄ  ＤＮＡ、ＢＡＣ  ＤＮＡならびにＣＲＩＳＰＲシステムにおけるガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）が挙げられる。これらの核酸は、人工的な修飾が施された類似体もしくは誘導体であってもよい。
【００８４】
タンパク質の具体例としては、酵素、転写因子、サイトカイン、組織成長因子、抗体、治療用タンパク質が挙げられる。酵素としては、例えば、制限酵素、エンドヌクレアーゼ、Ｃｒｅリコンビナーゼ、フリッパーゼなど、核酸（特に標的細胞内のゲノムＤＮＡ）を標的とし、その塩基配列を改変するための酵素が挙げられる。エンドヌクレアーゼとしては、例えば、ＴＡＬエフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、メガヌクレアーゼ（ホーミングヌクレアーゼ）、ガイド分子（ＲＮＡ）誘導型エンドヌクレアーゼ（例：Ｃａｓ９、Ｃａｓ１２ａ）、その他のゲノム編集システムで用いられるエンドヌクレアーゼが挙げられる。
【００８５】
本発明における関心対象分子の好適な具体例としては、細胞中の標的遺伝子座における遺伝子改変を誘導するための、いわゆるゲノム編集用の物質、特にＣＲＩＳＰＲシステムによって遺伝子改変を誘導するため物質が挙げられる。具体的には、本発明の好ましい一実施形態において、核酸は、ＣＲＩＳＰＲシステムにおけるガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）であり、タンパク質は、ＣＲＩＳＰＲシステムにおけるＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼである。本発明の好ましい一実施形態において、関心対象分子は、ＣＲＩＳＰＲシステムにおけるｇＲＮＡとＣａｓ９等のＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼとの複合体である。
【００８６】
ＣＲＩＳＰＲシステムに関する基本的な事項は周知であり、様々な応用的な事項も公知になっている。当業者であれば、目的に応じて、ＣＲＩＳＰＲシステムの核酸、タンパク質、その他の各要素について、適切なものを設計、選択、製造し、それらを用いてＣＲＩＳＰＲシステムによる遺伝子改変を行うことが可能である。
【００８７】
「ガイドＲＮＡ」は、ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡが連結された１本のＲＮＡの形態、すなわちキメラＲＮＡ（シングルガイドＲＮＡ、ｓｇＲＮＡなどと呼ばれることもある）であってもよいし、連結されていないそれぞれ１本ずつのＲＮＡ（２本のＲＮＡの組み合わせ、またはそれ以上の本数のＲＮＡの組み合わせ）の形態であってもよい。また、ガイドＲＮＡは、１つの塩基配列を標的とする形態（１本のｓｇＲＮＡ、または１組のｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡ）であってもよいし、２つ以上の塩基配列を標的とする形態（２本以上のｓｇＲＮＡ、または２組以上のｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡ）であってもよい。
【００８８】
ｃｒＲＮＡは、細胞内のゲノムまたは遺伝子座位において遺伝子改変のための標的とする塩基配列（本明細書中「標的配列」と称することがある）にハイブリダイズする、１７〜２０塩基程度の核酸配列（本明細書中「標的認識配列」と称することがある）を含む。標的配列は、ＣＲＩＳＰＲシステムにより認識される短い配列（ＰＡＭ（プロトスペーサー隣接モチーフ））と隣接する。ＰＡＭの配列および長さの条件は、使用されるヌクレアーゼの種類に応じて異なるが、ＰＡＭは、典型的には、標的配列に隣接する２〜５塩基対配列である。
【００８９】
標的配列は、上記のＰＡＭの条件を満たす限り特に限定されるものではなく、目的に応じて適宜選択することができる。標的配列は、典型的には、遺伝子疾患に関与しており、遺伝子治療の対象となり得る遺伝子座に含まれる配列、あるいは、細菌やウイルスなどの病原体の感染に関与している遺伝子座に含まれる配列である。
【００９０】
本発明の好ましい一実施形態において、標的配列は、ジストロフィン遺伝子が含まれる遺伝子座の塩基配列である。より具体的には、標的配列は、その塩基配列に対する改変（欠失または挿入）によりジストロフィン遺伝子のフレームシフト変異またはナンセンス変異を修復することによって、ジストロフィン異常症（例えば筋ジストロフィー（例：デュシェンヌ型筋ジストロフィー、ベッカー型筋ジストロフィー）、ジストロフィン遺伝子拡張型心筋症）を予防または治療することができる塩基配列である。あるいは、標的配列は、フレームシフト変異またはナンセンス変異の修復により修復型ジストロフィンタンパク質を産生することができる、ジストロフィン遺伝子上の塩基配列である。
【００９１】
ジストロフィン異常症とは、ジストロフィン遺伝子変異が原因で、機能欠損型または機能異常型ジストロフィンタンパク質によって引き起こされる種々の疾患を指し、デュシェンヌ（Ｄｕｃｈｅｎｎｅ）型筋ジストロフィー、ベッカー（Ｂｅｃｋｅｒ）型筋ジストロフィー、ジストロフィン遺伝子関連拡張型心筋症などが含まれる。骨格筋障害が主な症状である場合が多いが、骨格筋症状が見られないケースも存在する。高ＣＫ血症、ミオグロビン尿症、拡張型心筋症、認知機能障害、などを伴う場合もある。
【００９２】
筋ジストロフィーとは、「骨格筋の変性、壊死を主病変とし、臨床的には進行性の筋力低下をみる遺伝性の疾患」と定義されている。筋ジストロフィーとしては、デュシェンヌ型筋ジストロフィー、ベッカー型筋ジストロフィー、エミリ・ドレフェス型筋ジストロフィー、肢帯型筋ジストロフィー、先天性筋ジストロフィー、三好型筋ジストロフィー、遠位型筋ジストロフィー、顔面肩甲上腕型筋ジストロフィー、そして筋強直性ジストロフィーなどが知られている。
【００９３】
デュシェンヌ型筋ジストロフィーは小児の筋ジストロフィーの中でもっとも患者数の多い疾患であり、有病率は人口１０万人当たり４〜５名とされている。進行性の筋萎縮を主症状とし、Ｘ染色体上のジストロフィン遺伝子が変異により機能不全となることが原因である。デュシェンヌ型筋ジストロフィーでは、半分以上の患者が単一、または複数のエクソンの欠損を持っている。ジストロフィン遺伝子変異によってタンパク質読み枠のずれが生じ、途中に終始コドンが現れ、ジストロフィンタンパク質が合成されなくなることで一連の症状が引き起こされる。
【００９４】
ジストロフィン遺伝子は、Ｘ染色体上に存在する、２２０万塩基を超える巨大な遺伝子である。転写開始点の違いにより、様々なアイソフォームが存在し、全身で発現するＤｐ７１、末端神経細胞で発現するＤｐ１１６、脳や腎臓で発現するＤｐ１４０、網膜で発現するＤｐ２６０、プルキンエ神経細胞で発現するＤｐ４１７ｐ、脳で発現するＤｐ４２７ｂ、そして骨格筋で発現するＤｐ４２７ｍなどが知られている。この中でも、Ｄｐ４２７ｍアイソフォームから産生されるジストロフィンタンパク質は、主に筋細胞内に発現するタンパク質であり、Ｎ末端側に存在するアクチン結合ドメインで細胞骨格アクチンと結合し、Ｃ末端側に存在する高システインドメインによってジストログリカン複合体とも結合しアクチンと共に細胞骨格を構成している。Ｄｐ４２７ｍアイソフォームのジストロフィン遺伝子は７９個のエクソンにより構成されている。
【００９５】
デュシェンヌ型筋ジストロフィー患者の場合、ジストロフィン遺伝子のいずれかのエクソンの欠損または重複変異を持つことにより、あるいはエクソン中の塩基の点変異（ナンセンス変異）または挿入欠損変異（フレームシフト変異）によって、機能性のジストロフィンタンパク質はほとんど発現していない（ウェスタンブロット法による検出で健常人の３％以下のタンパク質量）。一方で、デュシェンヌ型筋ジストロフィーよりも比較的軽症なベッカー型筋ジストロフィーの患者の場合、エクソンの欠失や塩基の点変異が存在してもストップコドンが途中に生じていない場合には、正常なジストロフィンタンパク質よりアミノ酸配列が短い、または一部のアミノ酸が置換されたジストロフィンタンパク質を発現している。
【００９６】
ジストロフィン遺伝子の変異としては、デュシェンヌ型筋ジストロフィーおよびベッカー型筋ジストロフィーにおいて、単一または複数のエクソンの欠失が半分以上を占める。特に欠失が多く見られる部位として、エクソン４４とエクソン５５の間が知られている。ジストロフィン遺伝子の欠損エクソンの部位に応じて、例えば既報の論文等（例えば、ｖａｎ  Ｄｅｕｔｅｋｏｍ  ＪＣ，  ｖａｎ  Ｏｍｍｅｎ  ＧＪ．，  Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｇｅｎｅｔ．  ２００３）を参照することによって、どのエクソンを対象としてエクソンスキッピングを行えば適切な修復型ジストロフィンを発現させることができるか確認することができる。また、ゲノム編集を用いた修復型ジストロフィンの発現方法としては、エクソンスキッピング以外でも、ジストロフィン遺伝子中に微小欠損または挿入を導入してリーディングフレームを調節する方法、または欠損しているエクソンを相同組換え等により挿入することによっても実施可能である。
【００９７】
上記のようなジストロフィン遺伝子に異常が起きている場合、（i）１つまたは２つ以上のエクソンをｍＲＮＡに組み込まない（スキップする）ことにより、フレームシフトが起きないようにその前後のエクソン同士を連結させる、（ii）１つまたは２つ以上の塩基を挿入または欠失させることにより、フレームシフトを修正する、（iii）欠損したエクソンをノックインする、などのいずれかの操作によりその異常を修正することができる。上記（i）または（ii）の場合、正常なジストロフィンタンパク質よりもアミノ酸配列が短いもしくは長い、または一部のアミノ酸が置換されたジストロフィンタンパク質が産生される。また、上記（ii）または（iii）によって、正常なジストロフィンタンパク質を産生することもできる。このようなジストロフィン遺伝子の修正により、筋ジストロフィー等の疾患を予防または治療することが可能となる。
【００９８】
ヒトのジストロフィン遺伝子のヌクレオチド配列は、例えば、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎから、入手可能である（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/1756）。
【００９９】
修復型ジストロフィンタンパク質とは、ゲノム編集の結果、発現が回復したジストロフィンタンパク質を指す。特に、フレームシフト変異またはナンセンス変異を持つジストロフィン遺伝子に対し、ゲノム編集を用いることにより発現が回復した、Ｎ末端のアクチン結合ドメインと、Ｃ末端の高システインドメインを保持したジストロフィンタンパク質を指す。エクソン重複によりフレームシフト変異が生じている場合、ゲノム編集により当該重複エクソンの片方をスキップした場合、健常型と１００％相同性をもつ修復型ジストロフィンタンパク質の発現を回復させる場合もあり得る。修復型ジストロフィンタンパク質としては、特に、エクソン４４を欠失したヒトジストロフィン遺伝子においてエクソン４５がスキップされ、エクソン４３とエクソン４６とが連結したｍＲＮＡから翻訳されるヒトジストロフィンタンパク質を指す。この他にも、例えば、エクソン１２−４４、１８−４４、４６−４７、４６−４８、４６−４９、４６−５１、４６−５３、または４６−５５を欠失したヒトジストロフィン遺伝子において、それぞれ所定のエクソンをスキップすることにより産生されるヒトジストロフィンタンパク質も修復型ジストロフィンタンパク質に含まれるが、これらに限定されるものではない。修復型ジストロフィンタンパク質が産生されるようになったか否かは、例えば、細胞内における修復型ジストロフィンタンパク質をコードするｍＲＮＡをＰＣＲにより検出することにより確認することができる。あるいは、ジストロフィンタンパク質を認識する抗体を用いてウェスタンブロット法を行い、ジストロフィンタンパク質の分子量から確認することもできる。
【０１００】
また、別の本発明の好ましい一実施形態において、標的配列は、ミオスタチン遺伝子が含まれる遺伝子座の塩基配列である。より具体的には、標的配列は、その塩基配列に対する改変（欠失または挿入）によりミオスタチン遺伝子のフレームシフト変異またはナンセンス変異を誘導することによって、ミオスタチンタンパク質の機能を欠損または減弱することにより、筋肥大を誘導することができる塩基配列である。
【０１０１】
本発明の一実施形態において、ガイドＲＮＡの少なくとも一部は、本明細書に記載したようなヌクレオチド類似体とすることが好ましい。ヌクレオチド類似体としては、糖部修飾ヌクレオチドおよびリン酸ジエステル結合修飾ヌクレオチドが好ましく、より具体的には２’−Ｏ−メチルリボースおよびリン酸ジエステル結合のホスホロチオエート結合への置換体が好ましい。ガイドＲＮＡにおいて、少なくとも配列の３’および５’の両末端の一塩基ずつがヌクレオチド類似体であることが好ましく、少なくとも配列の３’および５’の両末端の二塩基ずつまたは三塩基ずつがヌクレオチド類似体であることがより好ましい。
【０１０２】
ガイドＲＮＡがｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡのキメラＲＮＡである場合には、少なくともその配列の３’および５’の両末端一塩基ずつをヌクレオチド類似体とすることが好ましい。ガイドＲＮＡが、ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡが連結されていないそれぞれ１本ずつのＲＮＡ（２本のＲＮＡの組み合わせ）またはそれ以上の本数のＲＮＡの形態である場合には、少なくともそれぞれのＲＮＡの配列の３’および５’の両末端の一塩基ずつをヌクレオチド類似体とすることが好ましい（例えば、ｃｒＲＮＡの３’および５’の両末端、および、ｔｒａｃｒＲＮＡの３’および５’の両末端をヌクレオチド類似体とすることが好ましい）。
【０１０３】
「ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼ」は、少なくとも１つのヌクレアーゼドメインおよびｇＲＮＡと相互作用する少なくとも１つのドメインを含み、ｇＲＮＡと複合体を形成することによって標的部位に誘導されるタンパク質である。
【０１０４】
ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼは、ＣＲＩＳＰＲシステムに由来しうる。ＣＲＩＳＰＲシステムは、クラス１の中のタイプＩ、タイプＩＩＩ、タイプＩＶ、あるいはクラス２の中のタイプＩＩ、タイプＶ、およびタイプＶＩシステムとすることができる。適当なＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質の非限定的な例には、Ｃａｓ３、Ｃａｓ４、Ｃａｓ５、Ｃａｓ５ｅ（又は、ＣａｓＤ）、Ｃａｓ６、Ｃａｓ６ｅ、Ｃａｓ６ｆ、Ｃａｓ７、Ｃａｓ８ａ１、Ｃａｓ８ａ２、Ｃａｓ８ｂ、Ｃａｓ８ｃ、Ｃａｓ９、Ｃａｓ１０、Ｃａｓ１０ｄ、Ｃａｓ１２ａ（又は、Ｃｐｆ１）、Ｃａｓ１２ｂ（又は、Ｃ２ｃ１）、Ｃａｓ１２ｃ、Ｃａｓ１３ａ１（又は、Ｃ２ｃ２）、Ｃａｓ１３ａ２、Ｃａｓ１３ｂ、ＣａｓＦ、ＣａｓＧ、ＣａｓＨ、Ｃｓｙ１、Ｃｓｙ２、Ｃｓｙ３、Ｃｓｅ１（又は、ＣａｓＡ）、Ｃｓｅ２（又は、ＣａｓＢ）、Ｃｓｅ３（又は、ＣａｓＥ）、Ｃｓｅ４（又は、ＣａｓＣ）、Ｃｓｃ１、Ｃｓｃ２、Ｃｓａ５、Ｃｓｎ２、Ｃｓｍ２、Ｃｓｍ３、Ｃｓｍ４、Ｃｓｍ５、Ｃｓｍ６、Ｃｍｒ１、Ｃｍｒ３、Ｃｍｒ４、Ｃｍｒ５、Ｃｍｒ６、Ｃｓｂ１、Ｃｓｂ２、Ｃｓｂ３，Ｃｓｘ１７、Ｃｓｘ１４、Ｃｓｘ１０、Ｃｓｘ１６、ＣｓａＸ、Ｃｓｘ３、Ｃｓｚ１、Ｃｓｘ１５、Ｃｓｆ１、Ｃｓｆ２、Ｃｓｆ３、Ｃｓｆ４及びＣｕ１９６６が含まれる。
【０１０５】
一態様において、ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼは、クラス２タイプＩＩのＣＲＩＳＰＲシステム由来である。特定の態様において、ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼは、Ｃａｓ９タンパク質に由来する。Ｃａｓ９タンパク質は、化膿性レンサ球菌（ストレプトコッカス・ピオゲネス）、ストレプトコッカス・サーモフィルス、ストレプトコッカス属、黄色ブドウ球菌、スタフィロコッカス属、ノカルジオプシス・ダッソンビエイ、ストレプトマイセス・プリスチナエスピラリス、ストレプトマイセス・ビリドクロモゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｖｉｒｉｄｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ）、ストレプトスポランギウム・ロセウム、アリサイクロバチルス・アシドカルダリウス、バチルス・シュードマイコイデス、バチルス・セレニティレドセンス、イグジォバクテリウム・シビリカム（Ｅｘｉｇｕｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｉｂｉｒｉｃｕｍ）、フランシセラ・ノビシダ（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ  ｎｏｖｉｃｉｄａ）、ラクトバチラス・デルブリッキー、ラクトバチルス・サリヴァリゥス、ゲオバチルス・ステアロサーモフィルス、マイクロシーラ・マリナ、バークホルデリア細菌、ポラロモナス・ナフタレニボランス、ポラロモナス種、クロコスファエラ・ワストニイ（Ｃｒｏｃｏｓｐｈａｅｒａ  ｗａｔｓｏｎｉｉ）、シアノセイス属、ミクロシスティス・アエルギノーサ（Ｍｉｃｒｏｃｙｓｔｉｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、シネココッカス属、アセトハロビウム・アラバチカム、アモニフェクス・デジェンシー（Ａｍｍｏｎｉｆｅｘ  ｄｅｇｅｎｓｉｉ）、カルジセルロシルプトル・ベクシ（Ｃａｌｄｉｃｅｌｌｕｌｏｓｉｒｕｐｔｏｒ  ｂｅｃｓｃｉｉ）、カンピロバクター・ジェジュニ（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｊｅｊｕｎｉ）、カンピロバクター・コリー（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｃｏｌｉ）、ナイセリア・メニンギティディス（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ   ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｅｓ）カンジダ・デスルフォルディス（Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ  Ｄｅｓｕｌｆｏｒｕｄｉｓ）、クロストリジウム・ボツリヌス、クロストリジウム・ディフィシル、フィネゴルディア・マグナ、ナトラナエロビウス・テルモフィルスム（Ｎａｔｒａｎａｅｒｏｂｉｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓｍ）、ペロトマキュラム・サーモプロピオニカム、アシディチオバチルス・カルダス、アシディチオバチルス・フェロオキシダンス、アロクロマチウム・ビノスム、マリノバクター属、ニトロソコッカス・ハロフィルス（Ｎｉｔｒｏｓｏｃｏｃｃｕｓ  ｈａｌｏｐｈｉｌｕｓ）、ニトロソコッカス・ワッソニ（Ｎｉｔｒｏｓｏｃｏｃｃｃｕｓ  ｗａｔｓｏｎｉ）、シュードアルテロモナス・ハロプランクティス、クテドノバクテル・ラセミファー（Ｋｔｅｄｏｎｏｂａｃｔｅｒ  ｒａｃｅｍｉｆｅｒ）、メタノハロビウム・エベスチガタム（Ｍｅｔｈａｎｏｈａｌｂｉｕｍ  ｅｖｅｓｔｉｇａｔｕｍ）、アナベナ・バリアビリス、ノジュラリア・スプミゲナ、ノストック属、アルスロスピラ・マキシマ、アルスロスピラ・プラテンシス、アルスロスピラ属、リングビア属、ミクロコレス・クソノプラステス（Ｍｉｃｒｏｃｏｌｅｕｓ  ｃｈｔｈｏｎｏｐｌａｓｔｅｓ）、オシラトリア属、ペトロトガ・モビリス、サーモシホ・アフリカヌ���、又はアカリオクロリス・マリーナに由来していてよい。
【０１０６】
一態様において、ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼは、クラス２タイプＶのＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ１２ａ／Ｃｐｆ１システム由来である。特定の態様において、ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼは、Ｃｐｆ１タンパク質に由来する。Ｃｐｆ１タンパク質は、Ａｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ、Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ、Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ、又はＦｒａｎｃｉｓｅｌｌａ ｎｏｖｉｃｉｄａに由来していてよい。
【０１０７】
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質は、野生型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質、修飾型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質、又は、野生型もしくは修飾型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質のフラグメントでありうる。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質は、核酸結合親和性及び／又は特異性を増大し、酵素活性を変更し、あるいはタンパク質の別の特性を変更するために修飾されていてよい。
【０１０８】
ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼは、Ｃａｓヌクレアーゼ又はＣａｓニッカーゼであってよい。ここで、Ｃａｓヌクレアーゼ又はＣａｓニッカーゼとは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムにおいて必須のタンパク質成分を指し、ＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）及びトランス活性化ｃｒＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）と呼ばれる２つのＲＮＡと複合体を形成した場合に、活性を有するエンドヌクレアーゼ又はニッカーゼを意味する。ニッカーゼは、一方のＤＮＡ鎖のみにニック（ｎｉｃｋ）を入れるＤＮＡ切断酵素をいう。一般的に、Ｃａｓ９タンパク質は、少なくとも２つのヌクレアーゼ（すなわち、ＤＮａｓｅ）ドメインを含む。例えば、Ｃａｓ９タンパク質は、ＲｕｖＣ様ヌクレアーゼドメインおよびＨＮＨ様ヌクレアーゼドメインを含み得る。ＲｕｖＣおよびＨＮＨドメインは、ＤＮＡ中に二本鎖の切断を行うために、一本鎖を切断するのに協働する（Jinek et al., Science, 337: 816-821）。ある態様において、Ｃａｓ９由来のタンパク質は、１つの機能的ヌクレアーゼドメイン（ＲｕｖＣ様またはＨＮＨ様ヌクレアーゼドメインのいずれか）のみを含むように修飾されていてよい。例えば、Ｃａｓ９由来のタンパク質は、ヌクレアーゼドメインの１つが、それがもはや機能しない（すなわち、ヌクレアーゼ活性が存在しない）ように欠失または変異するように修飾されていてよい。ヌクレアーゼドメインの１つが不活性である態様において、Ｃａｓ９由来のタンパク質は、二本鎖核酸にニックを導入することができるが、二本鎖ＤＮＡを切断することはできない。例えば、ＲｕｖＣ様ドメインにおけるアスパラギン酸からアラニンへの変換（Ｄ１０Ａ）は、Ｃａｓ９由来のタンパク質をニッカーゼに変換する。同様に、ＨＮＨドメインにおけるヒスチジンからアラニンへの変換（Ｈ８４０ＡまたはＨ８３９Ａ）は、Ｃａｓ９由来のタンパク質をニッカーゼに変換する。各ヌクレアーゼドメインは、部位特異的突然変異誘発法、ＰＣＲ仲介性突然変異誘発法、および全遺伝子合成、ならびに当技術分野で公知の他の方法のような周知の方法を用いて修飾され得る。
【０１０９】
ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼには、特にストレプトコッカス属菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ.）又はスタフィロコッカス属菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．）フランシセラ・ノビシダ（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ  ｎｏｖｉｃｉｄａ）、カンピロバクター・ジェジュニ（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｊｅｊｕｎｉ）由来のＣａｓヌクレアーゼ又はＣａｓニッカーゼが用いられうる。このうち、由来元としては、ストレプトコッカス属菌においては、化膿性レンサ球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）が好ましく、スタフィロコッカス属菌においては、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）が好ましい。化膿性レンサ球菌由来のＣａｓ９ヌクレアーゼ又はＣａｓ９ニッカーゼは、ＰＡＭ配列としてＮＧＧまたはＮＡＧトリヌクレオチドを認識する。
【０１１０】
ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼとしては、Ｃａｓ９が好ましい。本発明の好ましい一実施形態において、Ｃａｓ９は、化膿性レンサ球菌（化膿性レンサ球菌）（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）由来Ｃａｓ９（ＳｐＣａｓ９）である。Ｃａｓ９としては様々な細菌または古細菌に由来するものが知られており、本発明ではＳｐＣａｓ９以外にも、例えば黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）由来Ｃａｓ９（ＳａＣａｓ９）など、所望のヌクレアーゼ活性を有するＣａｓ９を用いることができる。
【０１１１】
本発明の形質導入方法における関心対象分子の使用量は、形質導入の条件や目的などによって変動しうるものであり、当業者であれば適宜調節することができる。例えば、関心対象分子がｇＲＮＡである場合の使用量は、１×１０４個の細胞に対して、通常１０ｎｇ〜５１０ｎｇ、好ましくは１６ｎｇ〜２５５ｎｇであり、関心対象分子がＣａｓ９タンパク質である場合の使用量は、通常６０ｎｇ〜３２００ｎｇ、好ましくは１００ｎｇ〜１６００ｎｇである。
【０１１２】
・細胞
本発明の形質導入用溶液によって関心対象分子を導入する対象とする細胞は特に限定されるものではなく、目的に応じて適宜選択することができる。対象細胞としては、例えば、間葉系幹細胞、神経幹細胞、皮膚幹細胞、牌細胞、神経細胞、グリア細胞、膵臓Ｂ細胞、骨髄細胞、メサンギウム細胞、ランゲルハンス細胞、表皮細胞、上皮細胞、内皮細胞、繊維芽細胞、繊維細胞、筋細胞（例、骨格筋細胞、心筋細胞、筋芽細胞、筋衛星細胞、平滑筋細胞）、脂肪細胞、血球細胞（例、マクロファージ、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラー細胞、肥満細胞、白血球、好中球、好塩基球、好酸球、単球、巨核球、造血幹細胞）、滑膜細胞、軟骨細胞、骨細胞、骨芽細胞、破骨細胞、乳腺細胞、肝細胞、間質細胞、卵細胞および精細胞、ならびにこれら細胞に分化誘導可能な前駆細胞、幹細胞（例えば、人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）を含む）、始原生殖細胞、卵母細胞および受精卵が挙げられる。これらの細胞は、癌化した細胞（癌細胞）であってもよい。
【０１１３】
本発明の形質導入方法を生体外（ex vivo）または培養環境下（in vitro）で行う場合に対象細胞が由来する、あるいは本発明の形質導入方法を生体内（in vivo）で行う場合に対象細胞が存在する、組織または臓器は、対象細胞を含む組織または臓器であれば特に限定されるものではない。対象細胞を含む組織または臓器としては、例えば、脳、脳の各部位（例、嗅球、扁頭核、大脳基底球、海馬、視床、視床下部、視床下核、大脳皮質、延髄、小脳、後頭葉、前頭葉、側頭葉、被殻、尾状核、脳染、黒質）、脊髄、下垂体、胃、膵臓、腎臓、肝臓、生殖腺、甲状腺、胆のう、骨髄、副腎、皮膚、肺、消化管（例、大腸、小腸）、血管、心臓、胸腺、牌臓、顎下腺、末梢血、末梢血球、前立腺、胎盤、子宮、骨、関節及び、筋肉（例、骨格筋、平滑筋、心筋）等が挙げられる。本発明の好ましい一実施形態において、対象細胞を含む組織または臓器は筋肉、脳、および脳の各部位である。本発明のより好ましい一実施形態において、対象細胞を含む組織または臓器は筋肉である。これらの組織または臓器は、癌化した組織または臓器（癌組織等）であってもよい。
【０１１４】
対象細胞は、ヒト由来の細胞であってもよいし、ヒト以外の哺乳動物（非ヒト哺乳動物）由来の細胞であってもよい。非ヒト哺乳動物としては、例えば、マウス、ラット、ハムスター、モルモット、ウサギ、イヌ、ネコ、ブタ、ウシ、ウマ、ヒツジ、ヒト以外の霊長類（非ヒト霊長類、例：カニクイザル、アカゲザル、チンパンジー）が挙げられる。
【０１１５】
本発明の好ましい一実施形態において、対象細胞は筋細胞（例：心筋細胞、骨格筋細胞、筋衛星細胞）、神経幹細胞、神経細胞、グリア細胞、線維芽細胞、間葉系幹細胞、血球細胞またはｉＰＳ細胞である。本発明のより好ましい一実施形態において、対象細胞は筋細胞、とりわけ、骨格筋細胞または筋衛星細胞である。筋細胞としては、例えば、ヒト（患者もしくは健常者）またはその他の哺乳動物（例えば非ヒト霊長類（例：カニクイザル、アカゲザル、チンパンジー）、ウシ、ブタ、マウス、ラット等の疾患モデル動物）から採取された筋細胞、生体内に存在する（例：ヒト等の生体内の組織中の）筋細胞、筋細胞株、および幹細胞（例：ｉＰＳ細胞、ＥＳ細胞）から分化誘導された筋細胞が挙げられる。
【０１１６】
・細胞と関心対象分子および形質導入用溶液とを接触させる工程
本発明の形質導入方法において、細胞と関心対象分子および形質導入用溶液とを接触させる様式は特に限定されるものではなく、所望の効率で細胞内に関心対象分子を導入することができる、各種の様式を選択することができる。
【０１１７】
本発明の形質導入方法を生体外（ex vivo）または培養環境下（in vitro）で行う場合、関心対象分子および形質導入用溶液を（必要に応じてそれらをあらかじめ混合した溶液の形態で）培地に添加し、その培地で対象とする細胞を培養することにより、関心対象分子および形質導入用溶液を細胞に接触させることができる。
【０１１８】
培地としては、対象細胞を含む細胞集団の培養にとって適切な、従来公知の培地を用いることができる。例えば、BME培地、BGJb培地、CMRL 1066培地、Glasgow MEM培地、Improved MEM（IMEM）培地、Improved MDM（IMDM）培地、Medium 199培地、Eagle MEM培地、αMEM培地、DMEM培地（High glucose、Low glucose）、DMEM/F12培地、ハム培地、RPMI 1640培地、Fischer's培地、StemFit AK02N、Primate ES Cell Medium及びこれらの混合培地などが用いられる。培地の種類および使用量は、当業者であれば、細胞や培養条件に応じて適宜設定することができる。
【０１１９】
培地には、必要に応じて、必須または非必須アミノ酸、GlutaMAX（製品名）、ビタミン、抗生物質（例えば、ペニシリン、ストレプトマイシン、又はこれらの混合物）、抗菌剤（例えば、アンホテリシンＢ）、抗酸化剤、ピルビン酸、緩衝剤、無機塩類等の添加物を添加してもよい。添加物の種類および使用量は、当業者であれば、細胞や培養条件に応じて適宜設定することができる。
【０１２０】
培養環境下（in vitro）で細胞と関心対象分子および形質導入用溶液とを接触させる場合、その工程の時間（期間）は特に限定されるものではなく、所望の導入効率を達成するに適したものとすることができるが、通常１０分〜１８０分、好ましくは１５分〜６０分である。期間（時間）以外の各種の培養条件、例えば温度、雰囲気（二酸化炭素濃度）などについても、当業者であれば適宜調節することができる。
【０１２１】
本発明の形質導入方法を生体内（in vivo）で行う場合、関心対象分子を形質導入用溶液に混合して、静脈内注射、動脈内注射、筋肉内注射、皮下注射、腹腔内注射などの注射剤を調製して生体に投与することにより、関心対象分子および形質導入用溶液を対象とする細胞に接触させることができる。そのような実施形態で用いられる形質導入用溶液は、成分（Ａ１）〜(Ａ５)および（Ｂ）に加えて、注射剤として薬学的に許容される添加剤、例えば、生理食塩水、緩衝生理食塩水、注射用水、安定剤、可溶化剤、界面活性剤、緩衝剤、防腐剤、等張化剤、充填剤、潤滑剤、増粘剤などを含んでいてもよい。
【０１２２】
本発明の好ましい一実施形態において、形質導入方法は、筋細胞においてＣＲＩＳＰＲシステムによりジストロフィン遺伝子を改変するために、換言すればＣＲＩＳＰＲシステムによりジストロフィン遺伝子が改変された細胞を製造するために、あるいはジストロフィン遺伝子の改変により修復型ジストロフィンタンパク質を産生するために、利用される。
【０１２３】
以下、本発明の細胞製造方法について説明する。
【０１２４】
本発明の細胞製造方法は、少なくとも、細胞と、関心対象分子および形質導入用溶液とを接触させる工程（接触工程）を含み、必要に応じてさらに、関心対象分子が形質導入された細胞を製造することに関するその他の工程を含んでいてもよい。また、本発明の細胞製造方法は、細胞内に関心対象分子を導入するために本明細書に記載した所定の形質導入用溶液を用いるが、それ以外の技術的事項は基本的に、従来の溶液を用いて関心対象分子が導入された細胞を製造する方法に準じたものとすることが可能である。
【０１２５】
本発明の細胞製造方法が含む接触工程は、本発明の形質導入方法との関係で本明細書に記載した接触工程と同様である。
【０１２６】
本発明の細胞製造方法が必要に応じてさらに含んでいてもよい、関心対象分子が形質導入された細胞を製造することに関するその他の工程としては、例えば、（ａ）接触工程の後に行われる、関心対象分子が導入された細胞を選択する工程、（ｂ）接触工程の前に行われる、ｉＰＳ細胞等の多能性幹細胞またはその他の幹細胞等から対象細胞を分化誘導する工程、が挙げられる。
【０１２７】
上記工程（ａ）における、関心対象分子が導入された細胞の選択は、公知の手法を用いて行うことができる。例えば、関心対象分子がＣＲＩＳＰＲシステム用のもの（代表的にはｇＲＮＡおよびＣａｓ９タンパク質の複合体）である場合、塩基配列のＰＣＲおよびシーケンス確認によって、または電気泳動による発現タンパク質の確認によって、関心対象分子が導入され、所期の遺伝子の改変が行われた細胞を選択することができる。あるいは、関心対象分子と共に、薬剤耐性遺伝子、蛍光タンパク質をコードする遺伝子、その他の陽性選択マーカー遺伝子または陰性選択マーカー遺伝子を細胞に導入し、それぞれの遺伝子に対応した処理を行う（例えば、薬剤耐性遺伝子に対応する薬剤を培地に添加する、または蛍光タンパク質に対応する励起波長の光を照射し、その照射により発せられる蛍光を蛍光顕微鏡、セルソーター等で検出する、あるいは、遺伝子より生成されるタンパク質を認識する抗体を添加し、結合した抗体を蛍光標識して発した蛍光を蛍光顕微鏡、セルソーター等で検出する）ことで、関心対象分子が導入された細胞を選択することができる。
【０１２８】
上記工程（ｂ）における、ｉＰＳ細胞等の多能性幹細胞またはその他の幹細胞等からの対象細胞への分化誘導は、公知の手法を用いて行うことができる。例えば、多能性幹細胞から対象細胞への分化誘導方法としては、Laflamme MAらにより報告された方法が挙げられる（Laflamme MA ＆ Murry CE, Nature 2011, Review）。なお、対象細胞がそのような分化誘導によって得られるものである場合、対象細胞を含む細胞集団は胚様体であってもよい。
【０１２９】
以下、本発明の医薬組成物について説明する。なお、当業者であれば、以下の記載およびその他の明細書中の記載や技術常識に基づいて、「医薬組成物」に係る本発明を、例えば「治療方法」（例えば、ヒトまたはその他の動物に形質導入用溶液および関心対象分子の有効量を投与する工程を含む方法）に係る発明などに、さらに変換することができることができる。
【０１３０】
本発明の医薬組成物は、本発明の形質導入用溶液および関心対象分子を含む。「形質導入用溶液」および「関心対象分子」の詳細、好ましい実施形態等については、本明細書において別途記載されている通りである。
【０１３１】
本発明の医薬組成物の用途は、そこに含まれる関心対象分子に応じたものとなる。関心対象分子の選択によって、様々な用途を有する医薬組成物を調製することが可能である。
【０１３２】
本発明の好ましい一実施形態において、医薬組成物は、ジストロフィン異常症の予防・治療薬、または修復型ジストロフィンタンパク産生薬である。この実施形態において、関心対象分子は、ストロフィン遺伝子が含まれる遺伝子座の塩基配列を標的とし、その塩基配列を改変するためのＣＲＩＳＰＲシステムを構成する要素、例えば所定の塩基配列を標的とするｇＲＮＡと、Ｃａｓタンパク質との複合体とすることができる。
【０１３３】
本発明の医薬組成物の剤形は特に限定されるものではなく、用途に応じて適宜選択することができる。例えば、本発明の形質導入方法との関係で前述したように、本発明の医薬組成物は、静脈内注射、動脈内注射、筋肉内注射、皮下注射、腹腔内注射などの注射剤として調製することができる。
【０１３４】
本発明の医薬組成物は、剤形に応じて、形質導入用溶液および関心対象分子以外にも、製薬学的に許容できる添加剤等の物質をさらに含むことができる。本発明の医薬組成物における活性成分（関心対象分子）の量ないし濃度は、所望の予防または治療の効果にとって有効な量の活性成分が目的とする細胞に送達できるよう、剤型、投与経路、１回あたりの投与量、一定期間中の投与回数等を勘案しながら、適宜調節することができる。
【実施例】
【０１３５】
以下の実施例では、下記表に示す化合物を用いた。【０１３６】
【表１−１】
2020111229.tif 000011
【表１−２】
2020111229.tif 000012
【表１−３】
2020111229.tif 000013
【表１−４】
2020111229.tif 000014
【表１−５】
2020111229.tif 000015
【０１３７】
材料
BL21(DE3) Competent E. coli (NEB, C2527)
Ni-NTA Superflow Cartridges (GE, 30765)
HiLoad 26/60 Superdex 200pg (GE, 17-1071-01)
Resource S (GE, 17-1180-01)
TEV protease (Sigma, T4455)
Complete, EDTA free (Roche, 1873580)
SEM Nuclease, recombinant, solution (WAKO, 196-16181)
DTT (WAKO, 049-08972)
イミダゾール (WAKO, 095-00015)
1M 塩化マグネシウム水溶液 (WAKO, 310-90361)
アスパラギン酸マグネシウム (MP Biomedicals Inc., 150496)
10× TBS (Takarabio, T9141)
1M HEPES buffer (ナカライテスク, 17557-94)
0.5M EDTA solution (Invitrogen, 15575-038)
LB 培地(Lennox), (Sigma, L7275-500TAB)
2× YT 培地, (Sigma, Y2627-1kg)
IPTG (WAKO, 096-05143)
アンピシリンナトリウム(WAKO, 014-23302)
塩化カリウム (WAKO, 161-03541)
Pierce 660nm protein assay (Thermo scientific, 22660)
D-MEM (High Glucose) with L-Glutamine and Phenol Red (WAKO, 044-29765)
0.25w/v% Trypsin-1mmol/l EDTA・4Na Solution with Phenol Red (WAKO, 201-16945)
D-PBS(-) , (WAKO, 043-29791)
5M 塩化ナトリウム, (Invitrogen, AM9759)
UltraPure DNase/RNase-Free Distilled Water (Invitrogen, 10977015)
Fetal Bovine Serum, qualified, USDA-approved regions (Gibco, 10437028)
CellCarrier Ultra PDL coated 96-well plate (PerkinElmer, 6055500)
HOECHST(登録商標)33342 (ThermoFisher, H3570)
C2C12 (ATCC(登録商標), CRL-1772(商標))
Millex-GV 0.22μm PVDF 4mm EtO Ster滅菌済 (Merck, SLGV004SL)
3-(1-ピリジノ)プロパンスルホン酸 (NDSB-201) (TCI-JP, S0813)
グリセロール (WAKO, 075-00616)
グリシン (WAKO, 070-05281)
L-グルタミン水溶液, ×100 (WAKO, 073-05391)
NEAA, ×100 (Life technologies, 11140-035)
N2 supplement, ×100 (Gibco, 17502-048)
B27 Supplement (Gibco, 12587-010)
EGF (WAKO, 059-07873)
bFGF (WAKO, 064-05381)
Opti-MEM(商標) I Reduced Serum Medium (Life technologies, 31985-062)
10×PBS - Phosphate-Buffered Saline (10×) pH 7.4, RNase-free (Invitrogen)
Amicon(R) Ultra 2 mL Centrifugal Filters 10kDa (Merck)
Dextran, Alexa FluorTM 488; 10,000 MW, Anionic, Fixable (Thermo Scientific)
4% パラホルムアルデヒド・りん酸緩衝液 (WAKO)
ProLongTM Glass Antifade Mountant with NucBlueTM Stain (Thermo Scientific)【０１３８】
ｃｒＲＮＡおよびｇＲＮＡの塩基配列
MmDmdEx51 crRNA (GeneDesign, Inc)：配列番号１
5’- mC*mA*mC*UAGAGUAACAGUCUGACGUUUUAGAGCUAUGCUGUmU*mU*mU*G -3’
（mN:2’-Oメチル RNA修飾、*:Phosphorothioate修飾）
tracrRNA (GeneDesign, Inc)：配列番号２
5’- mC*mA*mA*AACAGCAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGmG*mU*mG*C -3’
（mN:2’-Oメチル RNA修飾、*:Phosphorothioate修飾）
MmDmd Ex51 gRNA#1 (mod)：配列番号３
5’- mU*mC*mA*CUAGAGUAACAGUCUGACGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCmU*mU*mU*U -3’
（mN:2’-Oメチル RNA修飾、*:Phosphorothioate修飾、GeneDesign, Inc）
mRosa26 gRNA (mod)：配列番号４
5’- mG*mA*mU*GGGCGGGAGUCUUCUGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGmG*mU*mG*C -3’
（mN:2’-Oメチル RNA修飾、*:Phosphorothioate修飾、GeneDesign, Inc,もしくはSumitomokagaku, Inc. ）
hEx45#1 gRNA (mod)：配列番号５
5’- mU*mG*mG*UAUCUUACAGGAACUCCGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGmG*mU*mG*C -3’
（mN:2’-Oメチル RNA修飾、*:Phosphorothioate修飾、GeneDesign, Inc）
hEx45#23 gRNA (mod)：配列番号６
5’- mA*mG*mC*UGUCAGACAGAAAAAAGGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGmG*mU*mG*C -3’
（mN:2’-Oメチル RNA修飾、*:Phosphorothioate修飾、GeneDesign, Inc)【０１３９】
＜備品＞
FACS Asia(商標) (BD)
NEPA21 transfection sysytem (NEPA GENE)
AKTAprime (GE)
Opera Phenix(商標) High-Content Screening System (PerkinElmer)
Harmony(商標) (PerkinElmer)【０１４０】
＜化合物＞
化合物の購入先とカタログ番号および化合物ストック溶液の濃度は表１にまとめた。【０１４１】
＜用いた用語の説明＞
EGFP-SSAアッセイ：EGFP-single strand annealing アッセイの略。EGFPレポーター細胞には図１のレポーターカセットが挿入されており、このEGFP配列の真ん中にはMmDMD-Ex51配列が挿入されている。通常、このMmDMD-Ex51配列がありEGFP ORFが分断されているためにEGFPタンパク質は翻訳されない。だがCas9タンパク質/gRNA複合体によりMmDMD-Ex51のターゲット配列が切断されると、EGFP ORFの上流（EG部位）と下流（FP部位）が相同領域を介して一本鎖アニーリングを起こし、全長型のEGFP ORFが出現し、EGFPタンパク質が産生される。この原理を利用してEGFP-SSAアッセイはEGFP産生細胞数の割合を調べることで、Cas9タンパク質/gRNA複合体の細胞内送達量を予測する。【０１４２】
＜試薬の準備、反応液および投与液の調製＞
Lysis buffer
終濃度1×TBS、20 mM イミダゾール、0.005 U/μL SEM nuclease、1 mM DTT、0.5 mM EDTA 2Na、1 mM 塩化マグネシウムとなるように、10×TBSを20 mL、500 U/μL SEM nucleaseを0.002 mL、0.5 M EDTA solutionを0.2mL、1 M 塩化マグネシウム水溶液を0.2 mL、DTTを30.85 mg、イミダゾールを272.308 mg加えmilliQ水で溶解したのち200 mLまでメスアップした。Complete EDTA freeを6錠加え攪拌した後、ポアサイズ0.22 μmフィルターを用いてフィルター滅菌した。【０１４３】
GF buffer
終濃度20 mM HEPES、150 mM 塩化カリウム、1 mM DTT (pH 7.5)となるように、1 M HEPES solutionを20 mL、塩化カリウムを11.182 g、DTTを154.25 mg加え、milliQ水で溶解した。pH 7.5に調製した後、1000 mLまでメスアップしポアサイズ0.22 μmフィルターを用いてフィルター滅菌した。【０１４４】
C2C12（マウス横紋筋細胞）細胞培地
10% FBS（容積/容積）を含有するD-MEM (High Glucose) with L-Glutamine and Phenol Red培地。【０１４５】
ストック化合物溶液
化合物の購入先とストック化合物の終濃度を表１に記す。各化合物を秤量し表１の終濃度となるようにUltraPure  DNase/RNase-Free Distilled Waterで溶解後、0.22 μmフィルターを用いてフィルター滅菌しストック化合物溶液とした。【０１４６】
反応液1
終濃度8 ng/μL Cas9タンパク質、0.68 ng/μL tracr RNA、0.59 ng/μL MmDmd Ex51 crRNA、1 mM HEPES、550 mM塩化ナトリウム、250 mM 化合物となるように、Cas9タンパク質 0.4 μg、tracrRNA 34.18 ng、MmDmd Ex51 crRNA 29.48 ng、1 M HEPES buffer 0.05 μL、5 M塩化ナトリウム水溶液5.5 μLを混合し、UltraPure DNase/RNase-Free Distilled Waterで液量を 37.5 μLに調整した。この溶液に対して1000 mM 化合物溶液を12.5 μL加え、常温で15分間インキュベーションした。なお、化合物の終濃度が0.1 mM、0.15 mM、0.34 mM、0.69 mM、1 mM、1.38 mM、5 mM、6.38 mM、10 mM、20 mM、40 mM、60 mM、80 mM、100 mM、125 mM、200 mM、500 mMの場合は、ストック化合物溶液をUltraPure DNase/RNase-Free Distilled Waterで0.4 mM、0.6 mM、1.36 mM、2.76 mM、4 mM、5.52 mM、20 mM、25.5 mM、40 mM、80 mM、160 mM、240 mM、320 mM、400 mM、500 mM、800 mM、2000 mMの濃度にそれぞれ希釈して加えた。【０１４７】
反応液2
終濃度8 ng/μL Cas9タンパク質、0.68 ng/μL tracr RNA、0.59 ng/μL MmDmd Ex51 crRNA、50 mM HEPES、485 mM塩化ナトリウム、250 mM 化合物となるように、Cas9タンパク質 0.4 μg、tracrRNA 34.18 ng、MmDmd Ex51 crRNA 29.48 ng、1 M HEPES buffer 2.5 μL、5 M塩化ナトリウム水溶液4.85 μLを混合し、UltraPure DNase/RNase-Free Distilled Waterで液量を 37.5 μLに調整した。この溶液に対して1000 mM化合物溶液を12.5 μL加え、常温で15分インキュベーションした。なお、化合物の終濃度が0.69 mM、25 mM、100 mM、125 mM、160 mM、200 mM、500 mMの場合は、ストック化合物溶液をUltraPure  DNase/RNase-Free Distilled Waterで2.76 mM、100 mM、400 mM、500 mM、640 mM、800 mM、2000 mMの濃度にそれぞれ希釈して加えた。【０１４８】
iTOP-1250 buffer
特許文献２に従い、iTOP-1250 bufferを作製した。Opti-MEMベースの溶液に対して、終濃度が200 mM GABA、50 mM NDSB-201、15 mM グリシン、30 mM グリセロール、425 mM 塩化ナトリウム、0.75×グルタミン、0.75×Non-Essential amino Acids、0.75×N-2サプリメント、0.75×B-27サプリメント、100 ng/μL FGF2、100 ng/μL EGF、8 ng/μL Cas9タンパク質、0.68 ng/μL tracrRNA、0.59 ng/μL MmDmd Ex51 crRNAとなるよう各試薬を添加し15分間常温でインキュベーションした。調製の際は非特許文献１を参考にした。iTOP-1250 bufferにはOpti-MEMが60%含まれている。【０１４９】
反応液3-1
終濃度8 ng/μL Cas9タンパク質、0.68 ng/μL tracr RNA、0.59 ng/μL MmDmd Ex51 crRNA、50 mM HEPES、250 mM GABA、367 mM塩化ナトリウムとなるように、Cas9タンパク質 2.0 μg、tracrRNA 170.9 ng、MmDmd Ex51 crRNA 147.4 ng、1 M HEPES buffer 12.5 μL、5 M塩化ナトリウム水溶液18.35 μL、1 M GABA水溶液 62.5 μLを混合し、UltraPure DNase/RNase-Free Distilled Waterで液量を 250 μLに調整した。常温で15分インキュベーションした。なお485 mM 塩化ナトリウムの場合は5 M塩化ナトリウム水溶液の添加量を24.25 μL、同様に550 mM 塩化ナトリウムの場合は27.5 μLに変更した。【０１５０】
反応液3-2
終濃度8 ng/μL Cas9タンパク質、0.68 ng/μL tracr RNA、0.59 ng/μL MmDmd Ex51 crRNA、50 mM HEPES、250 mM GABA、367mM塩化カリウムとなるように、Cas9タンパク質 2.0 μg、tracrRNA 170.9 ng、MmDmd Ex51 crRNA 147.4 ng、1 M HEPES buffer 12.5 μL、1 M塩化カリウム水溶液91.75 μL、1 M GABA水溶液 62.5 μLを混合し、UltraPure DNase/RNase-Free Distilled Waterで液量を 250 μLに調整した。常温で15分インキュベーションした。なお485 mM 塩化カリウムの場合は1 M塩化カリウム水溶液の添加量を121.25 μL、同様に550 mM 塩化カリウムの場合は137.5 μLにそれぞれ変更した。【０１５１】
反応液3-3
終濃度8 ng/μL Cas9タンパク質、0.68 ng/μL tracr RNA、0.59 ng/μL MmDmd Ex51 crRNA、50 mM HEPES、250 mM GABA、367 mM塩化マグネシウムとなるように、Cas9タンパク質 2.0 μg、tracrRNA 170.9 ng、MmDmd Ex51 crRNA 147.4 ng、1 M HEPES buffer 12.5 μL、1 M塩化マグネシウム水溶液91.75 μL、1 M GABA水溶液 62.5 μLを混合し、UltraPure DNase/RNase-Free Distilled Waterで液量を 250 μLに調整した。常温で15分インキュベーションした。なお323 mM 塩化マグネシウムの場合は1 M塩化マグネシウム水溶液の添加量を80.75 μL、同様に485 mM 塩化マグネシウムの場合は121.25 μL、550 mM 塩化マグネシウムの場合は137.5 μLにそれぞれ変更した。【０１５２】
反応液3-4
終濃度8 ng/μL Cas9タンパク質、0.68 ng/μL tracrRNA、0.59 ng/μL MmDmd Ex51 crRNA、50 mM HEPES、250 mM GABA、485 mMアスパラギン酸マグネシウムとなるように、Cas9タンパク質 2.0 μg、tracr RNA 170.9 ng、MmDmd Ex51 crRNA 147.4 ng、1 M HEPES buffer 12.5 μL、1 M アスパラギン酸マグネシウム水溶液121.25 μL、1 M GABA水溶液 62.5 μLを混合し、UltraPure  DNase/RNase-Free Distilled Waterで液量を 250 μLに調整した。常温で15分インキュベーションした。なお550 mMアスパラギン酸マグネシウムの場合は1 M アスパラギン酸マグネシウム水溶液の添加量を137.5 μLに変更した。【０１５３】
反応液3-5
終濃度8 ng/μL Cas9タンパク質、0.68 ng/μL tracr RNA、0.59 ng/μL MmDmd Ex51 crRNA、50 mM HEPES、250 mM GABA、395.8 mM 塩化ナトリウム、45.2 mM 塩化マグネシウム、21.4 mM 塩化カリウムとなるように、Cas9タンパク質 2.0 μg、tracrRNA 170.9 ng、MmDmd Ex51 crRNA 147.4 ng、1 M HEPES buffer 12.5 μL、5 M 塩化ナトリウム水溶液19.8 μL、1 M 塩化マグネシウム水溶液11.3 μL、1 M 塩化カリウム水溶液5.4 μL、1 M GABA水溶液 62.5 μLを混合し、UltraPure  DNase/RNase-Free Distilled Waterで液量を 250 μLに調整した。常温で15分インキュベーションした。【０１５４】
反応液3-6
終濃度8 ng/μL Cas9タンパク質、0.68 ng/μL tracrRNA、0.59 ng/μL MmDmd Ex51 crRNA、50 mM HEPES、250 mM GABA、447.4 mM 塩化ナトリウム、51.1 mM 塩化マグネシウム、24.2 mM 塩化カリウムとなるように、Cas9タンパク質 2.0 μg、tracrRNA 170.9 ng、MmDmd Ex51 crRNA 147.4 ng、1 M HEPES buffer 12.5 μL、5 M 塩化ナトリウム水溶液22.4 μL、1 M 塩化マグネシウム水溶液12.8 μL、1 M 塩化カリウム水溶液6.1 μL、1 M GABA水溶液 62.5 μLを混合し、UltraPure  DNase/RNase-Free Distilled Waterで液量を 250 μLに調整した。常温で15分インキュベーションした。【０１５５】
反応液4
終濃度16 ng/μL Cas9タンパク質、4 ng/μL MmDmd Ex51 gRNA、1 mM HEPES、550 mM塩化ナトリウム、250 mM 化合物となるように、Cas9タンパク質 800 ng、MmDmd Ex51 gRNA 200 ng、1 M HEPES buffer 0.05 μL、5 M塩化ナトリウム水溶液5.5 μLを混合し、UltraPure DNase/RNase-Free Distilled Waterで液量を 25 μLに調整した。この溶液に対して化合物ストック溶液を終濃度250mMになるよう所定の量を加え、常温で15分インキュベーションした。なお塩化ナトリウムの終濃度が150 mM、350 mMの場合は、5M塩化ナトリウム水溶液を1.5μL、3.5μLずつ加えた。【０１５６】
反応液5
終濃度1mg/mL Fluorescein isothiocyanate-dextran, average mol wt 70,000 (FITC-Dextran)、1 mM HEPES、550 mM塩化ナトリウム、250 mM 化合物となるように、100mg/mL FITC-Dextran 2.5 μL、1 M HEPES buffer 0.25 μL、5 M塩化ナトリウム水溶液27.5 μLを混合し、UltraPure DNase/RNase-Free Distilled Waterで液量を 250 μLに調整した。この溶液に対して化合物ストック溶液を終濃度になるよう所定の量を加え、反応液を調製した。【０１５７】
投与液1
終濃度400 ng/μL Cas9タンパク質、100 ng/μL mRosa26 gRNA、533 mM塩化ナトリウム、250 mM 2’-デオキシシチジン水溶液となるように、Cas9タンパク質 20 μg、mRosa26 gRNA 5 μg、10×PBS 5 μL、2.0M 2’-デオキシシチジン水溶液 6.25 μLを混合し、5 M塩化ナトリウム水溶液を用いて533mMに濃度調製したのち、UltraPure DNase/RNase-Free Distilled Waterで液量を 50 μLに調整し常温で15分インキュベーションした。なお5M 塩化ナトリウムの添加量は終濃度が163 mM、233 mM、333 mM、433mMの場合に合わせ適宜調整した。また使用したCas9タンパク質はAmicon(R) Ultra 2 mL Centrifugal Filters を用いて250 mM 塩化ナトリウムにバッファー置換を行ったものを使用した。【０１５８】
投与液2
終濃度800 ng/μL Cas9タンパク質、200 ng/μL mRosa26 gRNA、533 mM塩化ナトリウム、250 mM 化合物となるように、Cas9タンパク質 40 μg、mRosa26 gRNA 10 μg、10×PBS 5 μL、500 M 化合物ストック溶液 25 μLを混合し、5 M塩化ナトリウム水溶液を用いて533mMに濃度調製したのち、UltraPure DNase/RNase-Free Distilled Waterで液量を 50 μLに調整し常温で15分インキュベーションした。なお終濃度が25mM 化合物の場合は500 mM 化合物ストック溶液2.5μLを添加した。使用したCas9タンパク質はAmicon(R) Ultra 2 mL Centrifugal Filters を用いて500 mM 塩化ナトリウムにバッファー置換を行ったものを使用した。【０１５９】
投与液3
終濃度2400 ng/μL Cas9タンパク質、300 ng/μL hDMD Ex45#1 gRNA、300 ng/μL hDMD Ex45#23 gRNA、158 mM塩化ナトリウム、25 mM もしくは250mM 化合物となるように、Cas9タンパク質 120 μg、hDMD Ex45#1 gRNA 15 μg、hDMD Ex45#23 gRNA 15 μg、10×PBS 25 μLを混合し、25mMもしくは250mMになるよう500 mM化合物ストック溶液を添加したのち、UltraPure DNase/RNase-Free Distilled Waterで液量を 250 μLに調整し常温で15分インキュベーションした。使用したCas9タンパク質はAmicon(R) Ultra 2 mL Centrifugal Filters を用いて250 mM 塩化ナトリウムにバッファー置換を行ったものを使用した。【０１６０】
＜方法＞
EGFP-SSAレポーター細胞の樹立
細胞内へのCas9の取り込みを評価するため、EGFP-SSAレポーター細胞株を樹立した。エレクトロポレーション法（NEPA21 transfection system）により、EF1α-EGxxFP-MmDMD-Ex51のレポーターカセットを含むプラスミドを、C2C12細胞にトランスフェクションした（図１）。NEPA21を用いたエレクトロポレーションには1×106の細胞を使用し、200 V、5 msのポアーリングパルス条件で行った。その後、ピューロマイシンを1 mg/mLの濃度で培地に加え、EF1α-EGxxFP-MmDMD-Ex51のレポーターカセットを含む細胞のセレクションを行い、さらにEGFP陰性細胞をクローン化するため、セルソーター（FACS Aria,BD）で分取した（図２）。【０１６１】
Cas9タンパク質の発現・精製
関心対象の遺伝子を有するタンパク質発現プラスミドは下記論文（Jinek, et al. 2012）のpMJ806を参考に構築した。具体的にはS.pyogenes Cas9 遺伝子に6×Hisタグ配列、MBP配列、TEVプロテアーゼ切断配列と２つのSV40由来核移行(NLS)配列を発現するベクターを構築した（図３）。このベクターを大腸菌系統BL21(DE3)コンピテントセルに形質転換しタンパク質を過剰発現させた。形質転換はメーカーのプロトコルに従って行った。培養および精製プロトコルは（Jinek, et al. 2012）を参照した。形質転換体を0.1 mg/mL アンピシリンナトリウムを添加したLB培地にて37℃で一晩振とう培養し、その培養液を2×YT培地に添加しOD 0.6まで37℃で振とう培養した。IPTGを添加し氷上で30分間静置した後、16℃でさらに18時間振とう培養し、遠心して得た菌体をLysis bufferで溶菌した。溶解物を遠心分離により浄化し、Ni-NTA Superflow Cartridgesにロードし、メーカーのプロトコル（Ni-NTA Superflow Cartridge Handbook）に従ってイミダゾール勾配によりHisタグの付加したCas9タンパク質を溶出した。この溶出画分のイミダゾールを除去するためにHiLoad 26/60 Superdex 200pgをもちいたゲル濾過クロマトグラフィーを行い、タンパク質分子量画分をプールした。このタンパク質画分にメーカーの指示書に従ってTEV消化を行い、6×His-MBPタグとCas9タンパク質を切断分離した。TEV消化タンパク質液をNi-NTAカラムにロードしてメーカーのプロトコルに従い6×His-MBPタグを吸着除去し、フロースルーからCas9タンパク質を含む画分を回収した。この回収画分をResource Sカラムにロードし、塩化カルシウム勾配にてCas9タンパク質を溶出した。溶出バッファー中の塩化カルシウムを除去するためにGF bufferで平衡化したHiLoad 26/60 Superdex 200pgカラムにてゲル濾過クロマトグラフィーを行い、Cas9タンパク質画分を回収した。溶出画分はPierce 660nm protein assay法、およびSDSゲル電気泳動とクマシー染色によりタンパク質測定を実施して、タンパク質の濃度および純度を判定した。純度判定後、フィルター滅菌を行った。【０１６２】
実施例の参考にした論文
Jinek, Martin, Krzysztof Chylinski, Ines Fonfara, Michael Hauer, Jennifer A Doudna, and Emmanuelle Charpentier. "A Programmable Dual-RNA-Guided DNA Endonuclease in Adaptive Bacterial Immunity." Science, 2012: 816-821【０１６３】
EGFP-SSAアッセイ
EGFPレポーター細胞を該当培地に1×104 /wellで96 well plateに播種し、24時間、5 % CO2にて37℃で培養した。PBS 100 μL/wellで洗浄後、反応液1または反応液2を50 μL/wellで添加し、5 % CO2にて30分間37℃でインキュベーションした。その後、C2C12細胞培地 100 μL/wellに置き換えて5 % CO2にて37℃で48時間培養した。HOECHST(登録商標)33342を1/2000量加えたC2C12細胞培地に交換し5 % CO2、37℃で1時間培養後、Opera Phenix(商標)にてEGFP/HOECHST/可視光でScanを行った。得られた画像を付属のHarmony(商標)で解析をおこない、HOECHSTにより染色された核のカウント、EGFP陽性細胞のカウントを行った。EGFP陽性細胞のカウントは、HOECHSTで染色された細胞領域にEGFPが検出されるかどうかで判定した。wellあたりのEGFP陽性率は、下記式から算出した。
EGFP陽性率 (%) = (EGFP陽性細胞数/ HOECHST検出数) ×100【０１６４】
ヒトＤＭＤ エクソン ４５ノックイン−マウスＤｍｄ エクソン ４４ノックアウトマウスの作製
１０ μｇのヒトＤＭＤ エクソン４５およびその５’側０．７ ｋｂ、３’側０．６ ｋｂを含む配列１．５ｋｂ、ＦＲＴ配列で挟まれたネオマイシン耐性遺伝子発現ユニットおよびマウスＤｍｄ イントロン ４４とイントロン ４５由来配列各１．５ ｋｂからなるノックインベクターを、２．５ μｇのｐＣＡＧ−Ｃａｓ９発現ベクターおよび２種類の２．５ μｇのｐＵ６−ｓｇＲＮＡ発現ベクター（ターゲット配列；配列番号７および配列番号８）とともに、５×１０５個のＣ５７ＢＬ／６Ｊマウス由来のＥＳ細胞にエレクトロポレーションし、ＰＣＲおよびシーケンス確認により相同組み換え細胞株を選抜した。Ｆｌｐｅ（フリッパーゼ）処理によりネオマイシン耐性ユニットを除去した後、当該ＥＳ細胞株をＩＣＲマウスの４倍体胚盤胞に顕微注入し、キメラマウスを取得した。キメラマウスと雌性Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスとの体外受精により雌性ヒトＤＭＤ エクソン４５ヘテロノックインマウスを取得した。続いて、雄性Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスと雌性ヒトＤＭＤ エクソン４５ヘテロノックインマウスの受精卵に１００ ｎｇ／μＬのＣａｓ９ ｍＲＮＡ（ＴｒｉＬｉｎｋ ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、２種類のマウスＤｍｄ エクソン ４４ノックアウト用ｓｇＲＮＡ（ターゲット配列；配列番号９および配列番号１０、株式会社ＦＡＳＭＡＣ）およびｓｓＯＤＮ ５０ ｎｇ／μＬ（配列番号１１、ユーロフィンジェノミクス株式会社）を顕微注入し、得られた雄性産仔について、ＰＣＲおよびシーケンス確認による遺伝子判定を行い、ヒトＤＭＤ エクソン４５ノックイン−マウスＤｍｄ エクソン４４ノックアウトマウスを選抜した。【０１６５】
配列番号７
5’- ATGAATGTGCCTACATATGG -3’
配列番号８
5’- CATAGCATGCATTTGGCTTC -3’
配列番号９
5’- GAATGAGGTAGTGTTGTAGG -3’
配列番号１０
5’- GCAGGAAATCATCTTATAGC -3’
配列番号１１
5’- GAGCAAGCTGGGTTAGAACAAAGGTCTGTCAGAGTCAGCATGGGAATGAGGTAGTGTTGTAGCAGGAAATAGTGTGGTTTAGGTCTCTCCCCGCCCTCTGTGTATGTGTGTGTGTGTGTT -3’【０１６６】
Ｃ５７ＢＬ／６ＪマウスにおけるｍＲｏｓａ２６ ｇＲＮＡを用いたＤＮＡ変異導入効率評価
９週齡の雄性Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス（日本クレア）の右下肢腓腹筋に、投与液１もしくは投与液２、ＰＢＳを５０ μＬ投与した。投与液１は同じ個所に一日１回、合計３回投与した。投与液２は１回投与のみ行った。最終投与から４日後に３．５％イソフルラン麻酔下で頸椎脱臼にて安楽死させた後、右下肢腓腹筋組織を摘出しドライアイスで速やかに凍結させた。凍結筋組織からＱＩＡａｍｐ Ｆａｓｔ ＤＮＡ Ｔｉｓｓｕｅ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いてゲノムＤＮＡを抽出精製し、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ ＧＸＬ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＴＡＫＡＲＡ）を用いてＰＣＲ（Ｆｏｒｗａｒｄ ｐｒｉｍｅｒ；配列番号１２、Ｒｅｖｅｒｓｅ ｐｒｉｍｅｒ；配列番号１３）を行った。ＰＣＲ産物をＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）で精製し、Ｔ７ Ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ Ｉ（ＮＥＢ）で処理後、Ａｇｉｌｅｎｔ ４２００ ＴａｐｅＳｔａｔｉｏｎ（Ａｇｉｌｅｎｔ）を用いて解析した。得られた数値を用いて、変異導入効率を下記の計算式（数１）で求めた。【０１６７】
配列番号１２
5’- CTCCGAGGCGGATCACAAGCAATAATAACCTGTAG -3’
配列番号１３
5’- TGCAAGCACGTTTCCGACTTGAGTTGCCTCAAGAG -3’【０１６８】
【数１】
2020111229.tif 000016
【０１６９】
ヒトＤＭＤ エクソン ４５ノックイン−マウスＤｍｄ エクソン ４４ノックアウトマウスの骨格筋におけるエクソンスキッピング効率評価
４週齡の雄性ヒトＤＭＤ エクソン ４５ノックイン−マウスＤｍｄ エクソン ４４ノックアウトマウスの前脛骨筋に、投与液３をそれぞれ５０ μＬずつ１回投与した。投与から７日後に前脛骨筋組織を摘出しドライアイスで速やかに凍結させた。凍結筋組織にＱＩＡｚｏｌ Ｌｙｓｉｓ Ｒｅａｇｅｎｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を加え組織を破砕した後、クロロフォルム（ＷＡＫＯ）を添加し、混合・遠心後にＲＮＡを含む水槽を分離回収し、Ｔｏｔａｌ ＲＮＡをＨｉｇｈ Ｃａｐａｃｉｔｙ ＲＮＡ−ｔｏ−ｃＤＮＡ ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ．Ｉｎｃ）を用いて逆転写した。続けて、スキップされた産物の定量測定にはＦａｓｔＳｔａｒｔ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ Ｐｒｏｂｅ Ｍａｓｔｅｒ（Ｒｏｃｈｅ）と配列番号１４、１５のプライマーおよび配列１６のプローブを用いた。またスキップされていない産物の定量測定にはＦａｓｔＳｔａｒｔ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ Ｐｒｏｂｅ Ｍａｓｔｅｒ（Ｒｏｃｈｅ）と配列番号１７、１８のプライマーおよび配列１９のプローブを用いた。各ＰＣＲ産物の測定はＶｉｉＡ７TMリアルタイムＰＣＲシステムを用いて行った。いずれの増幅時にも濃度が定められている標準産物を同時に増幅させることで絶対量を算出した。算出には付属のソフトウエアを用いた。得られえた数値を用いてエクソンスキッピング効率（ｅｘｏｎ ｓｋｉｐｐｉｎｇ ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ）を下記の計算式（数２）で求めた。【０１７０】
配列番号１４
5’- CGTGGCACAGATGGATTTCC -3’
（mEx43-46skipTaqF114: Thermo Fisher Scientific）
配列番号１５
5’- TTCTTTTGTTCTTCAATCCCTTGTC -3’
（mEx43-46skipTaqR191: Thermo Fisher Scientific)
配列番号１６
5’- ACTTCATAGAATGTACAAGGAA -3’
（FAM label, mEx43-46skipTaqP144: Thermo Fisher Scientific）
配列番号１７
5’- TCCTCAAAAACAGATGCCAGTATTC -3’
（hEx45 TaqF252: Thermo Fisher Scientific）
配列番号１８
5’- TCCTGCCACCGCAGATTC -3’
（hEx45 TaqR316: Thermo Fisher Scientific）
配列番号１９
5’- ACAGGAAAAATTGGGAAGC -3’
（FAM label, hEx45 TaqP278: Thermo Fisher Scientific）【０１７１】
【数２】
2020111229.tif 000017
【０１７２】
デキストランを用いた細胞内取り込み評価
Ｃ２Ｃ１２細胞細胞を１×１０４ ／ｗｅｌｌで８ウェルチャンバースライドに播種し、翌日反応液５を２５０ μＬを添加して５％ ＣＯ２にて３７℃で３０分インキュベーションした。培地で２回洗浄後、培地にて３０分もしくは９０分インキュベーションした。さらに４％パラホルムアルデヒド・りん酸緩衝液で室温１５分静置して固定したサンプルをＰｒｏＬｏｎｇTM Ｇｌａｓｓ Ａｎｔｉｆａｄｅ Ｍｏｕｎｔａｎｔ ｗｉｔｈ ＮｕｃＢｌｕｅTM Ｓｔａｉｎで包埋し、共焦点レーザー顕微鏡で検鏡を行った。【０１７３】
統計処理
図１０および図１１において、ＧＡＢＡと各化合物条件の統計的有意差を調べるために、ＤＮＡ変異導入効率Ｉｎｄｅｌ（％）、およびエクソンスキッピング効率（ｅｘｏｎ ｓｋｉｐｐｉｎｇ ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ）をもちいてＤｕｎｎｅｔｔ ｔｙｐｅ多重比較検定を実施した。Ｐ値が０．０５未満のときに統計的有意差があると判断した。統計処理はＥＸＳＵＳ Ｖｅｒ ８．０を用いた。【０１７４】
［実施例１］
下記の手順で、各種の（Ａ１）〜（Ａ５）の化合物と（Ｂ）の塩とを含む形質導入用溶液を調製し、その溶液にｇＲＮＡとＣａｓ９タンパク質の複合体をさらに溶解した後、in vitroでマウス筋芽細胞（Ｃ２Ｃ１２細胞）と接触させて、標的遺伝子切断活性および細胞生存率を評価した。【０１７５】
形質導入化合物の活性評価およびGABAとの相対比較
化合物ごとの活性をCas9タンパク質/gRNA複合体を用いたEGFP-SSAアッセイで評価した。EGFPレポーター細胞を1×104 /wellで96 well plateに播種し、翌日反応液1 50 μLを添加して5% CO2にて30分間37℃でインキュベーションした。以降の操作はEGFP-SSAアッセイに従った。化合物は終濃度が 0.1 mM,から500 mMの範囲となるようストック化合物溶液をUltraPure DNase/RNase-Free Distilled Waterで希釈して調製した。化合物の希釈系列は化合物ごとに同一plateで評価した。各Plateには250 mM GABA、および化合物なし（溶媒であるH2Oのみ）の条件を3 wellずつ用意した。WellごとのHOECHST検出数、EGFP陽性細胞数から化合物濃度ごとのEGFP陽性率を算出した。その結果を図４に記す。【０１７６】
表２は、図４−１および図４−２の矢印で表記された濃度におけるEGFP陽性率とHOECHST細胞数、また該当する化合物と同じPlate上に設定されたポジティブコントロールのEGFP陽性率とHOECHST細胞数を記載した。下記の(1)、(2)の式により化合物ごとの相対活性を算出し、図５のグラフを作成した。
EGFP陽性率(GABA相対比) = 化合物の記載濃度でのEGFP陽性率(%) 
/ 同一PlateのポジティブコントロールのEGFP陽性率(%)・・・・・(1)
HOECHST検出数(GABA相対比) = 化合物の記載濃度でのHOECHST検出数 
/ 同一PlateのポジティブコントロールのHOECHST検出数・・・・・(2)【０１７７】
【表２】
2020111229.tif 000018
【０１７８】
GABAよりもEGFP陽性率（形質導入効率）が1.2倍以上高かった化合物は、４-ヒドロキシプロリン、Ｎ-カルバミル-Ｌ-アスパラギン酸、１-メチル-Ｌ-ヒスチジン、６-ホスホ-Ｄ-グルコン酸、１,３-ブチレングリコール、２-ヒドロキシグルタル酸、１,３-ジメチルウレア、クレアチニン、ミグリトール、α-Ｄ-グルコ-ス-１-リン酸、アルギニノコハク酸二ナトリウム水和物、Ｌ-カルノシン、シチジン、３-メチル-２-オキソブタン酸ナトリウム、イノシン５’-リン酸二ナトリウム水和物、であった。【０１７９】
［実施例２］形質導入化合物についてiTOP-1250との活性比較
化合物ごとのCas9タンパク質/gRNA複合体の細胞内導入効率をEGFP-SSAアッセイで評価した。EGFPレポーター細胞を1×104 /wellで96 well plateに播種し、翌日反応液2 50 μLを添加して5% CO2にて30分間37℃でインキュベーションした。同様にiTOP-1250 50μLを添加してインキュベーションしたWellを用意した。以降の操作はEGFP-SSAアッセイ法に従った。化合物は表２の終濃度となるようストック化合物溶液をUltraPure DNase/RNase-Free Distilled Waterで希釈して調製した。各Plateには250 mM GABA、および化合物なし（溶媒であるH2Oのみ）の条件のWellを用意した。得られたHOECHST検出数、EGFP陽性細胞率について（１）（２）の式を用いて化合物ごとのGABAとの相対比を算出した。同一Plate内で3 wellずつで行い、その平均値をプロットし標準偏差をエラーバーとして図６に表示した。化合物名で記載したものは反応液2で処理した細胞である。ポジティブコントロールとネガティブコントロールのEGFP陽性率の比が2以上であったため試験成立と判定した。未処理はCas9/gRNAを添加せずPBS洗浄のみ行ったウェルである。iTOP-1250よりもEGFP陽性率が1.2倍以上高かった化合物は、Ｎ-カルバミル-Ｌ-アスパラギン酸、３-メチル-２-オキソブタン酸ナトリウム、２-ヒドロキシグルタル酸、アルギニノコハク酸二ナトリウム水和物、２’-デオキシシチジン、イノシン５’-リン酸二ナトリウム水和物、１-デオキシノジリマイシン、２-デオキシ-Ｄ-グルコース-６-リン酸、Ｌ-カルノシン、α-Ｄ-グルコ-ス １-リン酸、クレアチニン、(Ｒ)-パントラクトン、トリメタジオン、６-ホスホ-Ｄ-グルコン酸、であった。【０１８０】
［実施例３］
（Ｂ）の塩におけるCas9タンパク質/gRNA複合体の細胞内導入効率をEGFP-SSAアッセイで評価した。EGFPレポーター細胞を1×104 /wellで96 well plateに播種し、翌日反応液3-1、3-2、3-3、3-4、3-5、または3-6をそれぞれ50 μLを添加して5% CO2にて30分間37℃でインキュベーションした。同様にiTOP-1250 50μLを添加してインキュベーションしたWellを用意した。以降の操作はEGFP-SSAアッセイ法に従った。得られたHOECHST検出数、EGFP陽性細胞率を図７に示した。塩化ナトリウムの項目は反応液3-1、塩化カリウムの項目は反応液3-2、塩化マグネシウムの項目は反応液3-3、アスパラギン酸マグネシウムの項目は反応液3-4、混合液の低濃度の項目は反応液3-5、高濃度の項目は反応液3-6、iTOP-1250の項目はiTOP-1250 bufferを用いた。同一Plate内で3 wellずつで行い、その平均値をプロットし標準偏差をエラーバーで表示した。また反応液中に含まれる無機塩のイオン(Na+, Mg2+, K+, Cl-)の電解質濃度についてミリ当量(mEq/L)で表示した。どの塩も電解質濃度が高くなるに従いEGFP陽性率が上昇している。最も活性が高いのは塩化ナトリウム、塩化カリウムおよび塩化マグネシウムの３種類の塩を混合した条件であり、iTOP-1250と比較しても活性が高い。また塩化ナトリウムと塩化マグネシウムは、同じ電解質濃度で比較した場合、ほぼ同等の活性を有した。【０１８１】
［実施例４］塩化ナトリウムの各濃度におけるＣａｓ９／ｇＲＮＡ 複合体の細胞内導入評価
（Ｂ）の塩化ナトリウムの各濃度における化合物ごとのＣａｓ９タンパク質／ｇＲＮＡ複合体の細胞内導入効率をＥＧＦＰ−ＳＳＡアッセイで評価した。ＥＧＦＰレポーター細胞を１×１０４ ／ｗｅｌｌで９６ ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅに播種し、翌日反応液３−７を５０μＬを添加して５％ ＣＯ２にて３０分間３７℃でインキュベーションした。以降の操作はＥＧＦＰ−ＳＳＡアッセイ法に従った。（Ａ）の化合物は終濃度２５０ｍＭとなるよう添加した。Ｐｌａｔｅには２５０ｍＭ ＧＡＢＡ、化合物なし（溶媒であるＨ２Ｏのみ）の条件のＷｅｌｌを用意した。同一Ｐｌａｔｅ内で３ ｗｅｌｌずつで行い、EGFP陽性率の平均値をプロットし標準偏差をエラーバーとして図８に表示した。塩化ナトリウム濃度が１５０ｍＭ〜５５０ｍＭにおいて化合物なしではＥＧＦＰ陽性率は１％未満であった。ＧＡＢＡは塩化ナトリウム濃度５５０ｍＭにおいてＥＧＦＰ陽性率１．４％を示したものの、１５０ｍＭ、３５０ｍＭでは陽性率は１％未満であった。それに比べて塩化ナトリウム濃度１５０ｍＭでＥＧＦＰ陽性率が１％を超えた化合物はＮ−カルバミル−Ｌ−アスパラギン酸、６−ホスホ−Ｄ−グルコン酸であり、特に６−ホスホ−Ｄ−グルコン酸のＥＧＦＰ陽性率は２．２％とＧＡＢＡよりも高い活性が確認された。３５０ｍＭ塩化ナトリウム濃度において、ＧＡＢＡのＥＧＦＰ陽性率１．４％よりも高い活性を示した化合物はアルギニノコハク酸二ナトリウム水和物、Ｎ−カルバミル−Ｌ−アスパラギン酸、α−Ｄ−グルコ−ス １−りん酸、６−ホスホ−Ｄ−グルコン酸、２−デオキシ−Ｄ−グルコース−６−リン酸、イノシン５’−りん酸二ナトリウム水和物であった。５５０ｍＭ 塩化ナトリウム濃度における化合物のＥＧＦＰ陽性率は、４−ヒドロキシプロリンを除くいずれの化合物もＧＡＢＡよりも高い活性を示した。【０１８２】
［実施例５］Ｃ５７ＢＣ／６Ｊマウスをもちいた（Ｂ）の塩濃度におけるＤＮＡ変異導入効率評価
（Ａ３）の化合物である２’−デオキシシチジンと、（Ｂ）の塩である塩化ナトリウムとを含む形質導入用溶液を調製し、その溶液にｍＲｏｓａ２６ ｇＲＮＡとＣａｓ９タンパク質の複合体をさらに溶解したものを、実施例５の投与液（投与液１、前記調製参照）として用いた。投与液１をマウス右下肢腓腹筋に局所投与して、標的遺伝子切断活性を評価した。投与液１は塩化ナトリウム濃度が１６３ｍＭ、２３３ｍＭ、３３３ｍＭ、４３３ｍＭもしくは５３３ｍＭとなるよう調製した。投与液は１回５０μＬ、３日間連続で投与し、最終投与から４日目に右下肢腓腹筋組織を抽出し、Ｔ７Ｅ１アッセイを行った。その結果を図９に示す。いずれの塩濃度においても正常マウスにおいてゲノム編集が確認された。【０１８３】
［実施例６］Ｃ５７ＢＣ／６Ｊマウスをもちいた（Ａ）の各化合物濃度におけるＤＮＡ変異導入効率評価
各種の（Ａ１）〜（Ａ５）の化合物と、（Ｂ）の塩である塩化ナトリウムとを含む形質導入用溶液を調製し、その溶液にｍＲｏｓａ２６ ｇＲＮＡとＣａｓ９タンパク質の複合体をさらに溶解したものを、実施例６の投与液（投与液２、前記調製参照）として用いた。投与液２をマウス右下肢腓腹筋に局所投与して、標的遺伝子切断活性を評価した。投与液２は、化合物として２’−デオキシシチジン、６−ホスホ−Ｄ−グルコン酸、Ｎ−カルバミル−Ｌ−アスパラギン酸または２−デオキシ−Ｄ−グルコース−６−リン酸を含み、投与液中の終濃度が２５ｍＭまたは２５０ｍＭになるよう調製した。投与液２は５０μＬを１回投与し、４日目に右下肢腓腹筋組織を抽出し、Ｔ７Ｅ１アッセイを行った。その結果を図１０に示す。いずれの化合物も正常マウスにおいて対照化合物である２５０ｍＭ ＧＡＢＡと同等もしくはそれ以上のゲノム編集効率を示した。特にＮ−カルバミル−Ｌ−アスパラギン酸、２−デオキシ−Ｄ−グルコース−６−リン酸はＧＡＢＡと比較して統計的に有意な結果が得られた。【０１８４】
［実施例７］ヒトＤＭＤエクソン４５ノックイン−マウスＤｍｄ エクソン４４ノックアウトマウスにおけるｈ ＤＭＤ Ｅｘ４５＃１ ｇＲＮＡ、ｈＤＭＤ Ｅｘ４５＃２３ ｇＲＮＡを用いたエクソンスキッピング効果
各種の（Ａ１）、（Ａ４）の化合物と、（Ｂ）の塩である塩化ナトリウムとを含む形質導入用溶液を調製し、その溶液にｈＥｘ４５＃１ ｇＲＮＡ、ｈＥｘ４５＃２３ ｇＲＮＡとＣａｓ９タンパク質の複合体をさらに溶解したものを、実施例７の投与液（投与液３、前記調製参照）として用いた。投与液３をマウス前脛骨筋に局所投与して、ヒトＤＭＤエクソン４５配列のスキッピング効率を評価した。投与液３は、化合物として６−ホスホ−Ｄ−グルコン酸またはＮ−カルバミル−Ｌ−アスパラギン酸、あるいは対照化合物としてＧＡＢＡを含み、投与液中の終濃度が２５ｍＭまたは２５０ｍＭになるよう調製した。投与液３は５０μＬを１回投与し、７日目に前脛骨筋組織を抽出し、エクソンスキッピング効率の測定を行った。その結果を図１１に示す。いずれの化合物もｈＥｘ４５ＫＩ−ｍｄｘ４４マウスにおいて２５０ｍＭ ＧＡＢＡより高い標的遺伝子（ジストロフィン遺伝子）のＥｘｏｎ Ｓｋｉｐｐｉｎｇ活性を示した。特に２５ｍＭ Ｎ−カルバミル−Ｌ−アスパラギン酸は２５０ｍＭ ＧＡＢＡと比較して統計的に有意な結果が得られた。【０１８５】
［実施例８］デキストランを用いた細胞内取り込み試験
蛍光標識したデキストラン（ＦＩＴＣ−Ｄｅｘｔｒａｎ）を用いてＣ２Ｃ１２細胞の細胞内取り込み評価を行った。塩化ナトリウム濃度は５５０ｍＭであり、化合物の終濃度は２５０ｍＭ ＧＡＢＡ（対照）、１２５ｍＭ Ｎ−カルバミル−Ｌ−アスパラギン酸、２５０ｍＭ ２−デオキシ−Ｄ−グルコース−６−リン酸である。各化合物を添加した反応液５を細胞に添加し３０分後、培地に切り替えて３０分もしくは９０分インキュベーションした結果を図１２に表示した。本発明で規定する化合物を塩と併用することにより、蛍光標識デキストランの細胞内透過が促進された。本発明により、タンパク質（Ｃａｓ９）、核酸（ｇＲＮＡ）だけでなく、デキストランのような高分子化合物も高効率に送達できることが確認された。
【産業上の利用可能性】
【０１８６】
本発明の形質導入用溶液、およびそれを用いる本発明の形質導入方法は、核酸、タンパク質等の関心対象分子を高い効率で種々の細胞内に導入することを可能とする。例えば、ＣＲＩＳＰＲシステムに用いられるｇＲＮＡおよびＣａｓタンパク質の複合体を、本発明の形質導入用溶液と一緒に細胞に接触させることによってその細胞内に高効率で導入し、ＣＲＩＳＰＲシステムによるゲノム編集を行うことができる。また、本発明の形質導入方法により、核酸、タンパク質等の関心対象分子が形質導入された細胞を効率的に製造することができる。
【図１】
2020111229.tif 000026
【図２】
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【図３】
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【図４−１】
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【図４−２】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
2020111229.tif 000033
【図８】
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【図９】
2020111229.tif 000035
【図１０】
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【図１１】
2020111229.tif 000037
【図１２】
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【配列表】
2020111229000001.app
【国際調査報告】
2020111229.tif 000039
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