(57)【要約】本発明は、配列番号１に相当する部分に変異を有する甘味成分高含有型ステビア植物体、その作出方法、スクリーニング方法等を提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験ステビア植物体のゲノムから、配列番号１に相当する部分における変異を検出する工程を含む、甘味成分高含有型ステビア植物体をスクリーニングする方法。
【請求項２】
配列番号１に相当する部分が、配列番号２〜８から選択されるフォワードプライマー及び配列番号９〜１５から選択されるリバースプライマーを用いたＰＣＲで増幅される被験ステビア植物のゲノムの部分である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
変異が、配列番号１の４９位に相当する位置におけるＣからＡへの変異を含む、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
変異を検出する工程が、ｄＣＡＰＳ法又はＴａｑＭａｎ  ＰＣＲ法を用いて行われる、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
変異が検出された被験ステビア植物組織の甘味成分の含有量を測定する工程をさらに含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
被験ステビア植物体が、少なくとも一方が配列番号１に相当する部分における変異をヘテロで有する交配親から得られた分離集団に属し、甘味成分高含有型ステビア植物体に含まれる甘味成分含有量が、前記分離集団に属する全個体の甘味成分含有量の平均値より高い、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
甘味成分がステビオール配糖体を含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
甘味成分高含有型ステビア植物体が、非遺伝子組換植物体である、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
被験ステビア植物体が、突然変異誘発処理を行ったステビア植物体及びその子孫植物体を含む、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
３’末端に位置する配列番号４７〜７０から選択される配列と、任意選択で前記配列の５’末端に付加される配列番号１の２８位から５’側に続く任意の連続する配列とを含むフォワードプライマーと、配列番号１の５０位より３’側に位置する任意の連続する２０塩基以上の配列に相補的な配列を含むリバースプライマーとを含む、プライマーセット。
【請求項１１】
請求項１０に記載のプライマーセットと制限酵素とを含むキットであって、フォワードプライマーが配列番号４７を含む場合、制限酵素はDdeIであり、フォワードプライマーが配列番号４８を含む場合、制限酵素はMaeI又はSpeIであり、フォワードプライマーが配列番号４９を含む場合、制限酵素はAflII又はMseIであり、フォワードプライマーが配列番号５０を含む場合、制限酵素はBce83Iであり、フォワードプライマーが配列番号５１を含む場合、制限酵素はBseMIIであり、フォワードプライマーが配列番号５２を含む場合、制限酵素はBsiIであり、フォワードプライマーが配列番号５３を含む場合、制限酵素はBspHI又はHpy178IIIであり、フォワードプライマーが配列番号５４を含む場合、制限酵素はSfeIであり、フォワードプライマーが配列番号５５を含む場合、制限酵素はSmlIであり、フォワードプライマーが配列番号５６を含む場合、制限酵素はEcoP15Iであり、フォワードプライマーが配列番号５７を含む場合、制限酵素はAvaIであり、フォワードプライマーが配列番号５８を含む場合、制限酵素はBclIであり、フォワードプライマーが配列番号５９を含む場合、制限酵素はBseRIであり、フォワードプライマーが配列番号６０を含む場合、制限酵素はCviRI又はPstIであり、フォワードプライマーが配列番号６１を含む場合、制限酵素はDrdIIであり、フォワードプライマーが配列番号６２を含む場合、制限酵素はEco57Iであり、フォワードプライマーが配列番号６３を含む場合、制限酵素はGsuIであり、フォワードプライマーが配列番号６４を含む場合、制限酵素はHphIであり、フォワードプライマーが配列番号６５を含む場合、制限酵素はHpy188Iであり、フォワードプライマーが配列番号６６を含む場合、制限酵素はMboIIであり、フォワードプライマーが配列番号６７を含む場合、制限酵素はPfl1108Iであり、フォワードプライマーが配列番号６８を含む場合、制限酵素はPsiIであり、フォワードプライマーが配列番号６９を含む場合、制限酵素はTaqI又はXhoIであり、フォワードプライマーが配列番号７０を含む場合、制限酵素はStySKIであるキット。
【請求項１２】
配列番号１に相当するゲノムの部分に変異を有する、甘味成分高含有型ステビア植物体。
【請求項１３】
変異が、配列番号１の４９位に相当する位置におけるＣからＡへの変異を含む、請求項１２に記載の植物体。
【請求項１４】
非遺伝子組換植物体である、請求項１２又は１３に記載の植物体。
【請求項１５】
請求項１２〜１４のいずれか一項に記載の植物体の種子、組織、乾燥葉、組織培養物又は細胞。
【請求項１６】
胚、分裂組織細胞、花粉、葉、根、根端、花弁、プロトプラスト、葉の切片及びカルスから選択される、請求項１５に記載の組織、組織培養物又は細胞。
【請求項１７】
請求項１２〜１４のいずれか一項に記載のステビア植物体と第２のステビア植物体とを交雑させる工程を含む、甘味成分高含有型ステビア植物体を作出する方法。
【請求項１８】
第２の植物体が請求項１２〜１４のいずれか一項に記載のステビア植物体である、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
ステビア植物体のゲノムの配列番号１の４９位に相当する位置にＣからＡへの変異を導入する工程を含む、甘味成分高含有型ステビア植物体を作出する方法。
【請求項２０】
変異の導入が、突然変異誘発処理によって行われる、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
請求項１２〜１４のいずれか一項に記載の植物体、請求項１５に記載の種子、組織、乾燥葉、組織培養物又は細胞、あるいは、請求項１６に記載の組織、組織培養物又は細胞の抽出物を提供する工程、及び
前記抽出物を、飲食品、甘味組成物、香料又は医薬品の原料に添加する工程
を含む、飲食品、甘味組成物、香料又は医薬品の製造方法 。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、甘味成分の含有量が高いステビア植物及びそのスクリーニング方法等に関する。
【背景技術】
【０００２】
多様化する消費者ニーズに対応すべく、様々な飲料が開発され、市販されている。ショ糖等の糖類は、甘味を与える等の目的で飲料にごく普通に配合される成分であるが、過剰摂取による健康への影響が指摘されてきており、より低カロリーであり、かつ天然由来の甘味料に対するニーズが高まりつつある。例えば特許文献１は、ビタミン、高甘味度甘味料、及び甘味改善組成物を含有する機能性甘味料組成物を開示している。【０００３】
レバウジオシド（Ｒｅｂａｕｄｉｏｓｉｄｅ、以下「Ｒｅｂ」ともいう）は、ステビア抽出物に含まれる甘味成分として知られている。ステビア抽出物は、ステビア乾燥葉から抽出、精製されたものである。ステビアは南米パラグアイを原産地とする菊科多年生植物で、学名をステビア・レバウディアナ・ベルトニー（Ｓｔｅｖｉａ Ｒｅｂａｕｄｉａｎａ Ｂｅｒｔｏｎｉ）という。ステビアは砂糖の約３００倍以上の甘味を持つ成分を含むので、この甘味成分を抽出して天然甘味料として用いるために栽培されている。Ｒｅｂとしては、ＲｅｂＡ、ＲｅｂＢ、ＲｅｂＣ、ＲｅｂＤ、ＲｅｂＥ、ＲｅｂＭ等、様々な配糖体の存在が報告されている（特表2012-504552）。様々なＲｅｂの中で、例えばＲｅｂＡは、高甘味度と良質甘味を有する甘味料として評価されており、広く用いられている。その他のＲｅｂについても、その独自の甘さ及び付随する味を有することが判明しつつある。【０００４】
そのような状況において、特定のレバウジオシドの含量が高いとされるステビア植物体が知られている（特許文献２〜４）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特表２００９−５１７０４３号明細書
【特許文献２】特表２０１６−５１５８１４号明細書
【特許文献３】国際出願公開パンフレットＷＯ２０１６／０９０４６０
【特許文献４】国際出願公開パンフレットＷＯ２０１８／１２４１４２
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
ステビア植物に含まれる甘味成分に対するニーズが高まっている。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、その一側面において、以下を提供する。
［１］  被験ステビア植物体のゲノムから、配列番号１に相当する部分における変異を検出する工程を含む、甘味成分高含有型ステビア植物体をスクリーニングする方法。
［２］  配列番号１に相当する部分が、配列番号２〜８から選択されるフォワードプライマー及び配列番号９〜１５から選択されるリバースプライマーを用いたＰＣＲで増幅される被験ステビア植物のゲノムの部分である、［１］に記載の方法。
［３］  変異が、配列番号１の４９位に相当する位置におけるＣからＡへの変異を含む、［１］又は［２］に記載の方法。
［４］  変異を検出する工程が、ｄＣＡＰＳ法又はＴａｑＭａｎ  ＰＣＲ法を用いて行われる、［１］〜［３］のいずれか一項に記載の方法。
［５］  変異が検出された被験ステビア植物組織の甘味成分の含有量を測定する工程をさらに含む、［１］〜［４］のいずれか一項に記載の方法。
［６］  被験ステビア植物体が、少なくとも一方が配列番号１に相当する部分における変異をヘテロで有する交配親から得られた分離集団に属し、甘味成分高含有型ステビア植物体に含まれる甘味成分含有量が、前記分離集団に属する全個体の甘味成分含有量の平均値より高い、［１］〜［５］のいずれか一項に記載の方法。【０００８】
［７］  甘味成分がステビオール配糖体を含む、［１］〜［６］のいずれか一項に記載の方法。
［８］  甘味成分高含有型ステビア植物体が、非遺伝子組換植物体である、［１］〜［７］のいずれか一項に記載の方法。
［９］  被験ステビア植物体が、突然変異誘発処理を行ったステビア植物体及びその子孫植物体を含む、［１］〜［８］のいずれか一項に記載の方法。
［１０］  ３’末端に位置する配列番号４７〜７０から選択される配列と、任意選択で前記配列の５’末端に付加される配列番号１の２８位から５’側に続く任意の連続する配列とを含むフォワードプライマーと、配列番号１の５０位より３’側に位置する任意の連続する２０塩基以上の配列に相補的な配列を含むリバースプライマーとを含む、プライマーセット。
［１１］  ［１０］に記載のプライマーセットと制限酵素とを含むキットであって、フォワードプライマーが配列番号４７を含む場合、制限酵素はDdeIであり、フォワードプライマーが配列番号４８を含む場合、制限酵素はMaeI又はSpeIであり、フォワードプライマーが配列番号４９を含む場合、制限酵素はAflII又はMseIであり、フォワードプライマーが配列番号５０を含む場合、制限酵素はBce83Iであり、フォワードプライマーが配列番号５１を含む場合、制限酵素はBseMIIであり、フォワードプライマーが配列番号５２を含む場合、制限酵素はBsiIであり、フォワードプライマーが配列番号５３を含む場合、制限酵素はBspHI又はHpy178IIIであり、フォワードプライマーが配列番号５４を含む場合、制限酵素はSfeIであり、フォワードプライマーが配列番号５５を含む場合、制限酵素はSmlIであり、フォワードプライマーが配列番号５６を含む場合、制限酵素はEcoP15Iであり、フォワードプライマーが配列番号５７を含む場合、制限酵素はAvaIであり、フォワードプライマーが配列番号５８を含む場合、制限酵素はBclIであり、フォワードプライマーが配列番号５９を含む場合、制限酵素はBseRIであり、フォワードプライマーが配列番号６０を含む場合、制限酵素はCviRI又はPstIであり、フォワードプライマーが配列番号６１を含む場合、制限酵素はDrdIIであり、フォワードプライマーが配列番号６２を含む場合、制限酵素はEco57Iであり、フォワードプライマーが配列番号６３を含む場合、制限酵素はGsuIであり、フォワードプライマーが配列番号６４を含む場合、制限酵素はHphIであり、フォワードプライマーが配列番号６５を含む場合、制限酵素はHpy188Iであり、フォワードプライマーが配列番号６６を含む場合、制限酵素はMboIIであり、フォワードプライマーが配列番号６７を含む場合、制限酵素はPfl1108Iであり、フォワードプライマーが配列番号６８を含む場合、制限酵素はPsiIであり、フォワードプライマーが配列番号６９を含む場合、制限酵素はTaqI又はXhoIであり、フォワードプライマーが配列番号７０を含む場合、制限酵素はStySKIであるキット。【０００９】
［１２］  配列番号１に相当するゲノムの部分に変異を有する、甘味成分高含有型ステビア植物体。
［１３］  変異が、配列番号１の４９位に相当する位置におけるＣからＡへの変異を含む、［１２］に記載の植物体。
［１４］  非遺伝子組換植物体である、［１２］又は［１３］に記載の植物体。
［１５］  ［１２］〜［１４］のいずれか一項に記載の植物体の種子、組織、乾燥葉、組織培養物又は細胞。
［１６］  胚、分裂組織細胞、花粉、葉、根、根端、花弁、プロトプラスト、葉の切片及びカルスから選択される、［１５］に記載の組織、組織培養物又は細胞。
［１７］  ［１２］〜［１４］のいずれか一項に記載のステビア植物体と第２のステビア植物体とを交雑させる工程を含む、甘味成分高含有型ステビア植物体を作出する方法。
［１８］  第２の植物体が［１２］〜［１４］のいずれか一項に記載のステビア植物体である、［１７］に記載の方法。
［１９］  ステビア植物体のゲノムの配列番号１の４９位に相当する位置にＣからＡへの変異を導入する工程を含む、甘味成分高含有型ステビア植物体を作出する方法。
［２０］  変異の導入が、突然変異誘発処理によって行われる、［１９］に記載の方法。
［２１］  ［１２］〜［１４］のいずれか一項に記載の植物体、［１５］に記載の種子、組織、乾燥葉、組織培養物又は細胞、あるいは、［１６］に記載の組織、組織培養物又は細胞の抽出物を提供する工程、及び
前記抽出物を、飲食品、甘味組成物、香料又は医薬品の原料に添加する工程
を含む、飲食品、甘味組成物、香料又は医薬品の製造方法 。
【発明の効果】
【００１０】
本発明は以下の１以上の効果を奏する。
（１）甘味成分の含有量が高いステビア植物の選抜を低コストで行うことができる。
（２）甘味成分の含有量が高いステビア植物の開発に要する時間を短縮化できる。
（３）甘味成分の含有量が高いステビア植物の開発の成功率を高めることができる。
（４）ステビア植物由来の甘味成分の生産効率を高めることができる。
（５）ステビア植物由来の甘味成分の生産コストを低減することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】図１はＭ１世代個体における甘味成分含有量の頻度分布を示した図である。縦軸は個体数、横軸は乾燥葉中の甘味成分濃度（％）を示す。
【図２】図２は分離集団Ａの変異Ｃ４９Ａ陽性個体（Ｃ４９Ａ＋）及び陰性個体(Ｃ４９Ａ−)における甘味成分含有量の分布を示した図である。縦軸は乾燥葉中の甘味成分濃度（％）を、点線は分離集団Ａに属する全個体の甘味成分濃度の平均値をそれぞれ示す。
【図３】図３は分離集団Ｂの変異Ｃ４９Ａ陽性個体（Ｃ４９Ａ＋）及び陰性個体(Ｃ４９Ａ−)における甘味成分含有量の分布を示した図である。縦軸は乾燥葉中の甘味成分濃度（％）を、点線は分離集団Ｂに属する全個体の甘味成分濃度の平均値をそれぞれ示す。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
以下、本発明を詳細に説明する。以下の実施の形態は、本発明を説明するための例示であり、本発明をそのような実施の形態のみに限定する趣旨ではない。本発明は、その要旨を逸脱しない限り、様々な形態で実施をすることができる。
なお、本明細書において引用した全ての文献、および公開公報、特許公報その他の特許文献は、参照として本明細書に組み込むものとする。また、本明細書は、２０１８年７月３１日に出願された本願優先権主張の基礎となる日本国特許出願（特願２０１８−１４４５１２号）の明細書および図面に記載の内容を包含する。
【００１３】
１．甘味成分高含有型ステビア植物体
本発明は、１つの側面において、配列番号１に相当するゲノムの部分に変異を有する、甘味成分高含有型ステビア植物体（以下、「本発明の植物体」と称することがある）を提供する。配列番号１が表す塩基配列は以下のとおりである。
【表１】
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本発明の植物体は、野生種のステビア植物体から派生した種であるが、甘味成分含量が高くなるように遺伝子に変異が生じたものである（以下、「本発明の変異」と称する場合がある）。
【００１４】
「配列番号１に相当するゲノムの部分に変異を有する」とは、ステビア植物体のゲノム中の配列番号１の塩基配列からなる部分、又は、配列番号１と実質的に同じ塩基配列からなる部分に変異を有することを意味する。配列番号１と実質的に同じ塩基配列とは、例えば、配列番号１の塩基配列に対し、６０％以上、７０％以上、７５％以上、８０％以上、８１％以上、８２％以上、８３％以上、８４％以上、８５％以上、８６％以上、８７％以上、８８％以上、８９％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９８．１％以上、９８．４％以上、９８．７％以上、９９％以上、９９．２％以上、９９．５％以上又は９９．８％以上の配列同一性を有する塩基配列を意味する。一部の態様において、配列番号１に相当するゲノムの部分には、配列番号１の５’末端から１５〜２５塩基長の部分にハイブリダイズするフォワードプライマーと、配列番号１の３’末端側から１５〜２５塩基長の部分の相補配列にハイブリダイズするリバースプライマーとにより増幅されるステビア植物体のゲノムの部分が含まれる。特定の態様において、配列番号１に相当するゲノムの部分には、配列番号２〜８から選択される塩基配列を有するフォワードプライマーと、配列番号９〜１５から選択される塩基配列を有するリバースプライマーとにより増幅されるステビア植物のゲノムの部分が含まれる。
【００１５】
「ゲノムの部分に変異を有する」とは、ステビア植物体の所定のゲノムの部分のメジャーな塩基配列（例えば、配列番号１）に対して１以上の塩基が異なっていることを意味する。変異は、ヌクレオチドの欠失、置換及び／又は付加を含む。また、変異は、遺伝子のコード領域又は非コード領域に位置してもよく、コード領域に位置する場合、変異はアミノ酸の変異を伴っても伴わなくてもよい。
【００１６】
一部の態様において、変異は、ステビア植物体のゲノムにおける、配列番号１６の１１位に相当する位置、配列番号１７の２１位に相当する位置、配列番号１８の３１位に相当する位置、配列番号１９の４１位に相当する位置、又は、配列番号１の４９位に相当する位置での変異を含む。ステビア植物のゲノムは配列番号１６、１７、１８、１９又は１と同一の塩基配列からなる部分を有しても、配列番号１６、１７、１８、１９又は１に相当する塩基配列からなる部分を有してもよい。前者の場合、変異はステビア植物体のゲノムにおける配列番号１６、１７、１８、１９又は１と同一の塩基配列からなる部分の５’側から１１位、２１位、３１位、４１位、又は４９位のヌクレオチドに存在する。一方、後者の場合、ステビア植物体のゲノムは配列番号１６、１７、１８、１９又は１と同一の塩基配列からなる部分を有しないため、変異は必ずしも配列番号１６、１７、１８、１９又は１に相当する部分の５’側から１１位、２１位、３１位、４１位、又は４９位に存在するわけではないが、配列番号１６、１７、１８、１９又は１の１１位、２１位、３１位、４１位、又は４９位の前後の塩基配列等を考慮し、ステビア植物のゲノムにおける配列番号１６、１７、１８、１９又は１の、１１位、２１位、３１位、４１位、又は４９位に相当する位置を特定することができる。例えば、ステビア植物のゲノムにおける配列番号１６、１７、１８、１９又は１に相当する部分の塩基配列と、配列番号１６、１７、１８、１９又は１の塩基配列とのアライメント解析により、ステビア植物のゲノムにおける配列番号１６、１７、１８、１９又は１の１１位、２１位、３１位、４１位、又は４９位に相当する位置を特定することができる。
【００１７】
特定の態様において、変異は、ステビア植物のゲノムにおける、配列番号１６の１１位に相当する位置、配列番号１７の２１位に相当する位置、配列番号１８の３１位に相当する位置、配列番号１９の４１位に相当する位置、又は、配列番号１の４９位に相当する位置でのヌクレオチドの置換である。より具体的な態様において、変異は、ステビア植物のゲノムにおける、配列番号１６の１１位に相当する位置、配列番号１７の２１位に相当する位置、配列番号１８の３１位に相当する位置、配列番号１９の４１位に相当する位置、又は、配列番号１の４９位に相当する位置でのＣ（シトシン）からＡ（アデニン）への置換である（以下、この変異を「Ｃ４９Ａ」と称することがある）。配列番号１の４９位がＣからＡに置換された配列を配列番号２０に示す。
【００１８】
本発明の植物体は、甘味成分高含有型である。甘味成分高含有型ステビア植物とは、本発明の変異を有しないステビア植物に比べ、甘味成分の含有量が高いことを意味する。甘味成分の含有量が高いとは、例えば、少なくともいずれか一方が本発明の変異をヘテロで有する２個体のステビア植物体の交配により得られた分離集団において、本発明の植物体（すなわち、本発明の変異を有するステビア植物体）の集団における甘味成分の含有量の平均値又は中央値が、本発明の変異を有しないステビア植物体の集団における甘味成分の含有量の平均値又は中央値に比べて高いこと、及び／又は、本発明の植物体が分離集団の全個体の平均値以上の甘味成分含有量を有することを意味する。一部の態様において、前記分離集団に属する本発明の植物体の集団における甘味成分の含有量の平均値は、同じ分離集団に属する本発明の変異を有しないステビア植物の集団における甘味成分の含有量の平均値より、約２５％以上、約５０％以上、約７０％以上、約８０％以上、約９０％以上、約１００％以上、約１１０％以上、約１２０％以上、約１２５％以上、約１３０％以上、約１４０％以上、約１５０％以上、約１６０％以上、約１７０％以上、約１８０％以上、約１９０％以上又は約１９５％以上高い。また、一部の態様において、前記分離集団に属する本発明の植物体の集団における甘味成分の含有量の中央値は、同じ分離集団に属する本発明の変異を有しないステビア植物の集団における甘味成分の含有量の中央値より、約２５％以上、約５０％以上、約７５％以上、約１００％以上、約１２５％以上、約１５０％以上、約１６０％以上、約１７０％以上、約１８０％以上、約１９０％以上、約１９５％以上、約２００％以上又は約２１０％以上高い。
【００１９】
甘味成分としては、ステビア植物に含まれる甘味成分であれば限定されず、例えば、１種以上のステビオール配糖体、又はその組合せが挙げられる。ステビオール配糖体としては、例えば、レバウジオシドＡ、レバウジオシドＢ、レバウジオシドＣ、レバウジオシドＤ、レバウジオシドＥ、レバウジオシドＦ、レバウジオシドＩ、レバウジオシドＪ、レバウジオシドＫ、レバウジオシドＮ、レバウジオシドＭ、レバウジオシドＯ、レバウジオシドＱ、レバウジオシドＲ、ズルコシドＡ、ルブソシド、ステビオール、ステビオールモノシド、ステビオールビオシド、ステビオシド等が挙げられる。一部の態様において、甘味成分は、レバウジオシドＡ、レバウジオシドＢ、レバウジオシドＣ、レバウジオシドＤ、レバウジオシドＥ、レバウジオシドＦ、レバウジオシドＩ、レバウジオシドＪ、レバウジオシドＫ、レバウジオシドＮ、レバウジオシドＭ、レバウジオシドＯ、レバウジオシドＱ、レバウジオシドＲ、ズルコシドＡ、ルブソシド、ステビオール、ステビオールモノシド、ステビオールビオシド及びステビオシドから選択される１種以上の成分からなる。特定の態様において、甘味成分は、レバウジオシドＡ、レバウジオシドＢ、レバウジオシドＣ、レバウジオシドＤ、レバウジオシドＦ、レバウジオシドＮ、レバウジオシドＭ及びレバウジオシドＯを含むか、又はこれらのステビオール配糖体からなる。
【００２０】
本発明のステビア植物体は、野生種のステビア植物体から派生した種であり、甘味成分含量が高くなるように遺伝子に前述の変異が生じたものである。当該遺伝子の変異は、遺伝子組換え的手法により生じたものであっても、非遺伝子組換え的手法により生じたものであってもよい。また、本発明のステビア植物体は前記遺伝子変異をヘテロ接合型で有していてもよく、あるいはホモ接合型で有していてもよい。
【００２１】
前記遺伝子変異は、ＰＣＲ法、TaqMan PCR法、シーケンス法、マイクロアレイ法、インベーダー法、TILLING法、ＲＡＤ（random amplified polymorphic DNA）法、法制限酵素断片長多型（ＲＦＬＰ）法、ＰＣＲ−ＳＳＣＰ法、ＡＦＬＰ（amplified fragment length polymorphism）法、ＳＳＬＰ（simple sequence length polymorphism）法、ＣＡＰＳ（cleaved amplified polymorphic sequence）法、ｄＣＡＰＳ（derived cleaved amplified polymorphic sequence）法、アレル特異的オリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）法、ＡＲＭＳ法、変性剤濃度勾配ゲル電気泳動（ＤＧＧＥ）法、ＣＣＭ（chemical cleavage of mismatch）法、ＤＯＬ法、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＭＳ法、ＴＤＩ法、パドロックプローブ法、分子ビーコン法、ＤＡＳＨ（dynamic allele specific hybridization）法、ＵＣＡＮ法、ＥＣＡ法、ＰＩＮＰＯＩＮＴ法、ＰＲＯＢＥ（primer oligo base extension）法、ＶＳＥＴ（very short extension）法、Survivor assay、Sniper assay、Luminex assay、ＧＯＯＤ法、ＬＣｘ法、ＳＮａＰｓｈｏｔ法、Mass ARRAY法、パイロシークエンス法、ＳＮＰ−ＩＴ法、融解曲線分析法等により検出することが可能であるが、検出方法はこれらに限定されるものではない。遺伝子変異の検出方法の詳細については後述する。
【００２２】
本明細書中、「非遺伝子組換え的手法」の例としては、外来遺伝子の導入を行わずに宿主細胞（又は宿主植物体）の遺伝子に変異を誘発する方法が挙げられる。そのような方法としては植物細胞の変異誘発剤を作用させる方法が挙げられる。そのような変異誘発剤としては、エチルメタンスルホン酸（ＥＭＳ）及びアジ化ナトリウム等が挙げられる。例えば、ＥＭＳは、０．１％、０．２％、０．３％、０．４％、０．５％、０．６％、０．７％、０．８％、０．９％、１．０％などの濃度で植物細胞を処理することができる。処理時間は約１時間〜約４８時間、約２時間〜約３６時間、約３時間〜約３０時間、約４時間〜約２８時間、約５時間〜約２６時間、約６時間〜約２４時間である。処理の手順自体は公知であるが、吸水過程を経た吸水種子を上記濃度で変異誘発剤を含む処理液に、上記処理時間浸漬することで行うことができる。
【００２３】
非遺伝子組換え的手法の別の例として、Ｘ線、γ線、紫外線などの放射線や光線を植物細胞に照射する方法が挙げられる。紫外線を照射する場合、適当な紫外線の照射量（紫外線ランプ強さ、距離、時間）を用いて照射した細胞を、選択培地などで培養した後、目的の形質を有する細胞、カルス、植物体を選択できる。その際の照射強度は０．０１〜１００Ｇｒ、０．０３〜７５Ｇｒ、０．０５〜５０Ｇｒ、０．０７〜２５Ｇｒ、０．０９〜２０Ｇｒ、０．１〜１５Ｇｒ、０．１〜１０Ｇｒ、０．５〜１０Ｇｒ、１〜１０Ｇｒであってよく、照射距離は１ｃｍ〜２００ｍ、５ｃｍ〜１００ｍ、７ｃｍ〜７５ｍ、９ｃｍ〜５０ｍ、１０ｃｍ〜３０ｍ、１０ｃｍ〜２０ｍ、１０ｃｍ〜１０ｍであってよく、照射時間は１分〜２年、２分〜１年、３分〜０．５年、４分〜１か月、５分〜２週間、１０分〜１週間であってよい。照射の強度、距離及び時間は、放射線や光線の種類や照射対象となる状態（細胞、カルス、植物体）により異なるが、当業者であれば適宜調整することができる。
【００２４】
また、細胞融合、葯培養（半数体育成）、遠縁交雑（半数体育成）などの手法も公知である。
一般に、植物細胞は、培養の間に変異を伴うことがあるため、より安定した形質維持のために植物個体に戻すことが好ましい。
非遺伝子組み換えステビア植物体を宿主として事後的に遺伝子組み換えを行って得られた植物体（例えば、本発明の植物体を宿主として遺伝子組み換えを行って、さらに別の形質を付加した植物体）も、本発明の範囲から除外されるものではない。
【００２５】
甘味成分は、本発明の植物体の新鮮葉又は乾燥葉に適切な溶媒（水等の水性溶媒又はアルコール、エーテル及びアセトン等の有機溶媒）を反応させることにより抽出液の状態で抽出することができる。抽出条件等は特表2012-504552に記載の方法や、後述の実施例に記載の方法を参照することができる。乾燥葉とは、新鮮葉を乾燥させることにより含水量を１０重量％以下、７重量％以下、５重量％以下、４重量％以下、３重量％以下、２重量％以下、１重量％以下にまで減らしたものをいう。好ましくは、本発明の植物体の乾燥葉の含水量は３〜４重量％である。
さらに、このようにして得られた抽出液に対し、酢酸エチルその他の有機溶媒：水の勾配、高速液体クロマトグラフィー（High Performance Liquid Chromatography：HPLC）、ガスクロマトグラフィー、飛行時間型質量分析（Time-of-Flight mass spectrometry：TOF-MS）、超高速液体クロマトグラフィー (Ultra （High）Performance Liquid chromatography：UPLC) 等の公知の方法を用いることにより甘味成分を精製することができる。
【００２６】
本発明に係る甘味成分含量は、特表2012-504552に記載の方法や、後述の実施例に記載の方法で測定することができる。具体的には、例えば、本発明のステビア植物体から新鮮葉をサンプリングし、LC/MS-MSを行うことなどにより測定することができる。
【００２７】
本発明の植物体には植物体全体のみならず、植物器官（例えば葉、花弁、茎、根、種子など）、植物組織（例えば表皮、師部、柔組織、木部、維管束、柵状組織、海綿状組織など）あるいは種々の形態の植物細胞（例えば、懸濁培養細胞）、プロトプラスト、葉の切片、カルスなどが含まれ得る。
【００２８】
また、本発明の植物体には、組織培養物又は植物培養細胞も含まれ得る。このような組織培養物又は植物培養細胞を培養することにより、植物体を再生することができるからである。本発明の植物体の組織培養物又は植物培養細胞の例としては、胚、分裂組織細胞、花粉、葉、根、根端、花弁、プロトプラスト、葉の切片及びカルス等が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００２９】
本発明の植物体はまた、本発明の変異に加え、他の変異、例えば、ＷＲＫＹ−０２−ＸｂａＩ、ＷＲＫＹ−０８−ＫｐｎＩ、ＷＲＫＹ−０９−ＡｆｌＩＩ、ＷＲＫＹ−１４及びＷＤ４０−０１−ＰｖｕＩからなる群より選択される少なくとも一つｄＣＡＰＳマーカーについて陽性となる変異を有していてもよい。これらのマーカーについて陽性の植物体は、陰性の植物体に比べ、ＲｅｂＭの含量が高い（以下、当該変異を「高ＲｅｂＭ含有型変異」と称することもある）。
【００３０】
ＷＲＫＹ−０２−ＸｂａＩについて陽性とは、候補植物体のゲノムＤＮＡに対し、配列番号２１に示す塩基配列を有するフォワードプライマー及び配列番号２２に示すリバースプライマーを用いてＰＣＲ増幅を行い、得られたＰＣＲ産物（約３８３ｂｐ長：例えば、配列番号２３又は２４）にＸｂａＩ制限酵素処理を行っても約３８３ｂｐ長のバンド（約３８３ｂｐ長：例えば、配列番号２３又は２４）しか得られないことを意味する。反対に、上記ＰＣＲ産物に対しＸｂａＩ制限酵素処理を行った場合に約３４４ｂｐの制限酵素処理産物（例えば、配列番号２５）を生じた場合、その候補植物体はＷＲＫＹ−０２−ＸｂａＩ陰性となる。
【００３１】
ＷＲＫＹ−０８−ＫｐｎＩについて陽性とは、候補植物体のゲノムＤＮＡに対し、配列番号２６に示す塩基配列を有するフォワードプライマー及び配列番号２７に示すリバースプライマーを用いてＰＣＲ増幅を行い、得られたＰＣＲ産物（２９７ｂｐ長）（例えば、配列番号２８又は２９）に対しＫｐｎＩ制限酵素処理を行っても約２９７ｂｐ長のバンド（例えば、配列番号２８又は２９）しか得られないことを意味する。反対に、約２５８ｂｐの制限酵素処理産物（例えば、配列番号３０）を生じる場合、その候補植物体はＷＲＫＹ−０８−ＫｐｎＩ陰性となる。
【００３２】
ＷＲＫＹ−０９−ＡｆｌＩＩについて陽性とは、候補植物体のゲノムＤＮＡに対し、配列番号３１に示す塩基配列を有するフォワードプライマー及び配列番号３２に示すリバースプライマーを用いてＰＣＲ増幅を行い、得られたＰＣＲ産物（約３９０ｂｐ長）（例えば、配列番号３３又は３４）に対しＡｆｌＩＩ制限酵素処理を行っても約３９０ｂｐ長のバンド（例えば、配列番号３３又は３４）しか得られないことを意味する。反対に、約３４７ｂｐの制限酵素処理産物（例えば、配列番号３５）を生じる場合、その候補植物体はＷＲＫＹ−０９−ＡｆｌＩＩ陰性となる。
【００３３】
ＷＲＫＹ−１４について陽性とは、候補植物体のゲノムＤＮＡに対し、配列番号３６に示す塩基配列を有するフォワードプライマー及び配列番号３７に示すリバースプライマーを用いてＰＣＲ増幅を行った場合に約１４０ｂｐのＰＣＲ産物（例えば、配列番号３８）のみを生じることを意味し、１４０ｂｐ（例えば、配列番号３８）及び１５８ｂｐ（例えば、配列番号３９）のＰＣＲ産物を生じる場合は陰性であることを意味する。
【００３４】
ＷＤ４０−０１−ＰｖｕＩについて陽性とは、候補植物体のゲノムＤＮＡに対し、配列番号４０に示す塩基配列を有するフォワードプライマー及び配列番号４１に示すリバースプライマーを用いてＰＣＲ増幅を行い、得られたＰＣＲ産物（約２８８ｂｐ長）（例えば、配列番号４２又は４３）に対しＰｖｕＩ制限酵素処理を行っても約２８８ｂｐ長のバンド（例えば、配列番号４２又は４３）しか得られないことを意味する。反対に、約２４０ｂｐの制限酵素処理産物（例えば、配列番号４４）を生じる場合、その候補植物体はＷＤ４０−０１−ＰｖｕＩ陰性となる。
上記ｂｐ長に関し、「約」とは、±５ｂｐを意味する。制限酵素処理は、使用する各制限酵素の販売元が推奨する条件に従って行うことができる。
【００３５】
本発明の植物体はまた、前述の変異、及び／又は、ｄＣＡＰＳマーカー陽性の遺伝的特徴に加え、配列番号４５に示す変異、すなわち、対応する野生型アレルの塩基配列（配列番号４６）の第６０番目の塩基配列における野生型のＡからＴへの変異を有していてもよい（特許文献４）。当該変異を有する植物体は、当該変異を有しない植物体に比べ、ＲｅｂＣの含量が高い（以下、「高ＲｅｂＣ含有型変異」と称することもある）。
本発明の変異を有する植物体は、甘味成分全体の含量が高まる傾向にあるため、上述の他の変異（例えば、高ＲｅｂＭ含有型変異及び／又は高ＲｅｂＣ含有型変異）と組み合わせることで、これら他の変異による効果を増強することができる。
【００３６】
２．本発明の植物体の作出方法
本発明は、別の実施態様において、本発明のステビア植物体と第２のステビア植物体とを交雑させる工程を含む、甘味成分高含有型ステビア植物体を作出する方法（以下、「本発明の作出方法」という）を提供する。
当該方法により作出される「甘味成分高含有型ステビア植物体」は、本発明の植物体と同じ表現型と遺伝的性質を有する。
【００３７】
具体的には、本発明の作出方法により作出される植物体の表現型は、本発明の植物体の項に記載した甘味成分高含有型の表現型である。本発明の作出方法により作出される植物体の遺伝的性質は、本発明の変異を有することである。本発明の作出方法により作出される植物体は前記変異をヘテロ接合型で有していてもよく、あるいはホモ接合型で有していてもよい。これらの変異の検出方法については、前述及び後述のとおりである。
【００３８】
本発明の作出方法において、「交雑させる」とは、本発明の植物体と、第２の植物体とを交配させることにより、その子植物体（本発明の作出方法により作出される植物体）を得ることを意味する。交雑方法としては、戻し交雑が好ましい。「戻し交雑」とは、本発明の植物体と第２の植物体との間に生まれた子植物体を、さらに本発明の植物体（つまり、本発明の遺伝子変異を有する植物体）と交雑させて、本発明の遺伝子変異のホモ接合型植物体を作出する手法である。本発明の作出方法に用いられる第２の植物体が、本発明の植物体と同じ表現型と遺伝的性質を有する場合には、実質的に戻し交雑となる。本発明の遺伝子変異はメンデルの法則に従って遺伝し、これに伴って当該遺伝子変異と相関する表現型、つまり甘味成分高含有という表現型も、メンデルの法則に従って遺伝する。
【００３９】
あるいは、本発明の植物体は自殖により作出することもできる。自殖は、本発明の植物体のおしべの花粉を本発明の植物体のめしべに自家受粉させることにより行うことができる。
【００４０】
本発明の作出方法により作出される植物体は、表現型及び遺伝的性質が本発明の植物体と同じであるため、本発明の作出方法により作出される植物体をさらに第３のステビア植物体とを交雑させることにより、甘味成分高含有型ステビア植物体を作出することも可能である。
【００４１】
別の態様として、本発明の植物体は、先に述べた組織培養物又は植物培養細胞を培養することにより植物体を再生することで作出することも可能である。培養条件については、野生型ステビア植物の組織培養物又は植物培養細胞を培養する条件と同じであり、公知である（Protocols for In Vitro cultures and secondary metabolite analysis of aromatic and medicinal plants, Method in molecular biology, vo. 1391, pp113-123.）。
さらに別の態様として、本発明の植物体は、ステビア植物体のゲノムの配列番号１の４９位に相当する位置にＣからＡへの変異を導入することで作出することも可能である。変異の導入は、遺伝子組換え的手法により行っても、非遺伝子組換え的手法により行ってもよい。非遺伝子組換え的手法は、本発明の植物体の項に記載した、変異誘発剤による処理や、放射線又は光線の照射による処理等の突然変異誘発処理を含む。
【００４２】
３．本発明の植物体のスクリーニング方法
本発明の植物体は、被験植物体の組織から本発明の変異を検出することによりスクリーニングすることができる。ここで、「スクリーニング」とは、本発明の植物体とそれ以外の植物体とを識別し、本発明の植物体を選択することを意味する。
したがって、本発明は、別の側面において、被験ステビア植物体のゲノムから、配列番号１に相当する部分における変異を検出する工程を含む、甘味成分高含有型ステビア植物体をスクリーニングする方法（以下、「本発明のスクリーニング方法」という）を提供する。「配列番号１に相当する部分における変異」（本発明の変異）、及び「甘味成分高含有型ステビア植物体」については、本発明の植物体について上記したとおりである。
【００４３】
本発明の変異の検出方法の具体例としては、ＰＣＲ法、TaqMan PCR法、シーケンス法、マイクロアレイ法、インベーダー法、TILLING法、ＲＡＤ法、ＲＦＬＰ法、ＰＣＲ−ＳＳＣＰ法、ＡＦＬＰ法、ＳＳＬＰ法、ＣＡＰＳ法、ｄＣＡＰＳ法、ＡＳＯ法、ＡＲＭＳ法、ＤＧＧＥ法、ＣＣＭ法、ＤＯＬ法、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＭＳ法、ＴＤＩ法、パドロックプローブ法、分子ビーコン法、ＤＡＳＨ法、ＵＣＡＮ法、ＥＣＡ法、ＰＩＮＰＯＩＮＴ法、ＰＲＯＢＥ法、ＶＳＥＴ法、Survivor assay、Sniper assay、Luminex assay、ＧＯＯＤ法、ＬＣｘ法、ＳＮａＰｓｈｏｔ法、Mass ARRAY法、パイロシークエンス法、ＳＮＰ−ＩＴ法、融解曲線分析法等が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００４４】
ＰＣＲ法の場合、３’末端部分が本発明の変異箇所に相補的な配列を有するようなプライマーを作製することが好ましい。このように設計されたプライマーを用いると、鋳型となるサンプルが変異を有する場合には、プライマーが完全に鋳型にハイブリダイズするため、ポリメラーゼ伸長反応が進むが、鋳型が本発明の変異を有しない場合には、プライマーの３’末端のヌクレオチドが鋳型とミスマッチを生じるので、伸長反応は起こらない。したがって、このようなプライマーを用いてＰＣＲ増幅を行い、増幅産物をアガロースゲル電気泳動などによって分析し、所定のサイズの増幅産物が確認できれば、サンプルである鋳型が変異を有していることになり、増幅産物が存在しない場合には、鋳型が変異を有していないものと判断できる。
あるいは、本発明の変異とプライマー配列とは重複させず、かつ本発明の遺伝子変異をＰＣＲ増幅させることが可能なようにプライマー配列を設計し、増幅されたヌクレオチド断片の塩基配列をシーケンスすることにより、本発明の遺伝子変異を検出することができる。
ＰＣＲ及びアガロースゲル電気泳動については、以下を参照：Sambrook, Fritsch and Maniatis, ”Molecular Cloning: A Laboratory Manual” 2nd Edition (1989), Cold Spring Harbor Laboratory Press。
【００４５】
TaqMan PCR法とは、蛍光標識したアレル特異的オリゴとTaq DNAポリメラーゼによるPCR反応とを利用した方法である（Livak, K.J. Genet. Anal. 14, 143 (1999); Morris T. et al., J. Clin.Microbiol. 34, 2933 (1996)）。
シークエンス法とは、変異を含む領域をPCRにて増幅させ、Dye Terminatorなどを用いてＤＮＡ配列をシークエンスすることで、変異の有無を解析する方法である（Sambrook, Fritsch and Maniatis, ”Molecular Cloning: A Laboratory Manual” 2nd Edition (1989), Cold Spring Harbor Laboratory Press）。
ＤＮＡマイクロアレイは、ヌクレオチドプローブの一端が支持体上にアレイ状に固定されたものであり、ＤＮＡチップ、Geneチップ、マイクロチップ、ビーズアレイ等を包含する。本発明の遺伝子変異と相補的な配列を含むプローブを用いることで、網羅的に本発明の遺伝子変異の有無を検出することができる。ＤＮＡチップなどのＤＮＡマイクロアレイアッセイとしてはGeneChipアッセイが挙げられる（Affymetrix社；米国特許第6,045,996号、同第5,925,525号、及び同第5,858,659号参照）。GeneChip技術は、チップに貼り付けたオリゴヌクレオチドプローブの小型化高密度マイクロアレイを利用するものである。
【００４６】
インベーダー法とは、ＳＮＰ等の遺伝子変異のそれぞれのアレルに特異的な２種類のレポータープローブ及び１種類のインベーダープローブの鋳型ＤＮＡへのハイブリダイゼーションと、ＤＮＡの構造を認識して切断するという特殊なエンドヌクレアーゼ活性を有するCleavase酵素によるＤＮＡの切断を組み合わせた方法である（Livak, K. J. Biomol. Eng. 14, 143-149 (1999); Morris T. et al., J. Clin.Microbiol. 34, 2933 (1996); Lyamichev, V. et al., Science, 260, 778-783 (1993)等）。
TILLING（Targeting Induced Local Lesions IN Genomes）法とは、変異導入した突然変異体集団のゲノム中の変異ミスマッチをＰＣＲ増幅とＣＥＬ  Ｉヌクレアーゼ処理によってスクリーニングする方法である。
【００４７】
一態様において、本発明の変異は、以下のプライマーセットと制限酵素とを用いたｄＣＡＰＳ法により検出することができる。
・プライマーセット：
３’末端に位置する配列番号４７〜７０から選択される配列と、任意選択で前記配列の５’末端に付加される配列番号１の２８位から５’側に続く任意の連続する配列（例えば、任意の長さの連続する配列）とを含むフォワードプライマーと、配列番号１の５０位より３’側に位置する任意の連続する２０塩基以上の配列に相補的な配列（例えば、配列番号１５、７１）を含むリバースプライマーとを含む、プライマーセット。プライマーの配列は、上記の条件を満たす範囲で最適化することができる。プライマー設計の最適化については、例えば、Sambrook and Russell, ”Molecular Cloning: A Laboratory Manual” 3rd Edition (2001), Cold Spring Harbor Laboratory Press等を参照のこと。また、上記各プライマーは、１５〜５０塩基長、１８〜４８塩基長、２０〜４５塩基長、３０〜６５塩基長等であってよい。
【００４８】
・制限酵素：
配列番号４７〜７０の各々に対応する制限酵素を以下に示す。なお、下記配列において、「Ｒ」はＡ又はＧを、「Ｙ」はＣ又はＴを表す。
【表２】
2020027155.tif 000003
【００４９】
特定の態様において、本発明の変異は、以下のプライマーセットと制限酵素とを用いたｄＣＡＰＳ法により検出することができる。
【表３】
2020027155.tif 000004
【００５０】
本発明のスクリーニング方法は、変異が検出された被験ステビア植物組織の甘味成分の含有量を測定する工程をさらに含んでもよい。甘味成分含有量の測定は、本発明の植物体の項に記載したとおりである。また、この態様において、変異が検出された被験ステビア植物体のうち、甘味成分の含有量が高い個体を選択して、これを他のステビア植物体と交配し、得られた子植物体について、本発明のスクリーニング方法を適用してもよい。したがって、本発明のスクリーニング方法は、以下の１以上の工程を含み得る。
（ｉ）被験ステビア植物のゲノムから、配列番号１に相当する部分における変異を検出する工程、
（ｉｉ）変異が検出された被験ステビア植物組織の甘味成分の含有量を測定する工程、
（ｉｉｉ）変異が検出された被験ステビア植物体のうち、甘味成分の含有量が高い個体を選択する工程、
（ｉｖ）選択した甘味成分の含有量が高い個体を他のステビア植物体と交配する工程、
（ｖ）交配により得られた子植物体のゲノムから、配列番号１に相当する部分における変異を検出する工程、
（ｖｉ）変異が検出された子植物組織の甘味成分の含有量を測定する工程、
（ｖｉｉ）変異が検出された子植物体のうち、甘味成分の含有量が高い個体を選択する工程。
【００５１】
選択する甘味成分の含有量が高い個体は、例えば、変異が検出された被験ステビア植物体のうち、甘味成分の含有量の高さに関し上位５０％まで、上位４０％まで、上位３０％まで、上位２０％まで、上位１０％まで、上位５％まで、上位４％まで、上位３％まで、上位２％まで又は上位１％までの個体などであってよい。また、交配する他のステビア植物体は、本発明の変異を含んでいても含んでいなくてもよい。上記態様において、工程（ｉｖ）〜（ｖｉｉ）は、複数回繰り返すことができる。このようにして、甘味成分の含有量がより高いステビア植物体をスクリーニングすることができる。
【００５２】
本発明のスクリーニング方法において、被験ステビア植物体は、天然植物体であっても、非遺伝子組換植物体であってもよい。非遺伝子組換植物体については、本発明の植物体の項に記載したとおりである。
本発明のスクリーニング方法において、被験ステビア植物体は、突然変異誘発処理を行ったステビア植物及びその子孫植物を含んでもよい。突然変異誘発処理については、本発明の植物体の項に記載したとおりであり、変異誘発剤による処理や、放射線又は光線の照射による処理等を含む。
【００５３】
一部の態様において、本発明のスクリーニング方法における被験ステビア植物体の交配親の少なくとも一方は、本発明の変異をヘテロで有し、かつ、被験ステビア植物体の交配親のいずれも、本発明の変異をホモでは有しない。この態様において、被験ステビア植物体は、少なくとも一方が本発明の変異をヘテロで有する２個体のステビア植物体の交配によって生じた分離集団に属する。より優れた品種、例えば、甘味成分含有量がより高い品種の開発において、甘味成分含有量の高い個体同士の交配、又は、甘味成分含有量が高い個体と、他の表現型を示す個体との交配などにより分離集団を得、その分離集団から甘味成分含有量の高い個体を選別していくことがあるが、分離集団の全個体について甘味成分含有量を定量することは、多大な時間、コスト、労力を要する。これに対し、遺伝的変異の検出は、甘味成分含有量の検出に比べ、より少ない時間、コスト、労力で行うことができる。本発明の変異は、少なくとも一方が本発明の変異をヘテロで有する２個体のステビア植物体の交配によって生じた分離集団において、平均値以上の甘味成分含有量を有する個体に含まれることが実験的に確認されており（実施例参照）、本発明の変異を検出することにより、前記分離集団から平均値以上の甘味成分含有量を有する個体を選別することができる。これにより、甘味成分含有量測定の対象となる個体数を大幅に低減することができ、甘味成分の含有量が高いステビア植物の育種開発の低コスト化、迅速化、効率化、成功率の向上などが可能となる。
【００５４】
本発明は、本発明の変異の存在又は不在を検出し得るプローブ（以下、「本発明のプローブ」と称する場合がある）を提供する。本発明のプローブは、本発明の変異の各種検出方法に適した構造を有し得る。例えば、本発明のプローブは、本発明の変異部位を含むゲノム又は転写物の部分に相補性を有する塩基配列を含み得る。かかるプローブの非限定例としては、配列番号１、１６〜２０、９９〜１０２から選択される塩基配列に特異的にハイブリダイズするものが挙げられる。これらの配列のうち、配列番号２０、９９〜１０２は本発明の変異を含む塩基配列であり、配列番号１、１６〜１９は、本発明の変異を含まない塩基配列である。好ましい態様において、本発明の変異の存在を検出し得るプローブは、配列番号２０、９９〜１０２から選択される塩基配列にハイブリダイズするが、配列番号１、１６〜１９から選択される塩基配列にはハイブリダイズしないハイブリダイゼーション条件を有する。好ましい態様において、本発明の変異の不在を検出し得るプローブは、配列番号１、１６〜１９から選択される塩基配列にハイブリダイズするが、配列番号２０、９９〜１０２から選択される塩基配列にはハイブリダイズしないハイブリダイゼーション条件を有する。
【００５５】
本発明の変異の存在は、本発明の変異を含む塩基配列の検出及び／又は本発明の変異を含まない塩基配列の非検出により検出することができ、本発明の変異の不在は、本発明の変異を含む塩基配列の非検出及び／又は本発明の変異を含まない塩基配列の検出により検出することができる。
本発明のプローブは、好ましくは標識を有する。かかる標識の非限定例としては、蛍光標識、発光標識、放射性標識、色素、酵素、クエンチャー、検出可能な標識との結合部分等が挙げられる。特定の態様において、本発明のプローブは、配列番号１、１６〜２０、９９〜１０２から選択される塩基配列に特異的にハイブリダイズする塩基配列と、標識とを有する。
【００５６】
本発明はまた、前記のフォワードプライマーとリバースプライマーとの組合せを含むプライマーセット、及び、前記プライマーセットと、これに対応する制限酵素とを含むキットを提供する。本発明はさらに、配列番号１、１６〜２０、９９〜１０２から選択される塩基配列を有する領域をＰＣＲにより増幅し得るプライマーセットと、本発明のプローブとを含むキットを提供する。これらのプライマーセット及びキットは、本発明の変異を検出するために用いること、本発明のスクリーニング方法に用いることなどが可能である。また、これらのプライマーセット及びキットには、本発明の変異の検出や、本発明のスクリーニング方法に関する説明を含む指示、例えば、使用説明書や、使用方法に関する情報を記録した媒体、例えば、フレキシブルディスク、ＣＤ、ＤＶＤ、ブルーレイディスク、メモリーカード、ＵＳＢメモリーなどが含まれていてもよい。
【００５７】
４．本発明の植物体由来抽出物及びそれを用いた製品
本発明のさらなる側面において、本発明の植物体、又は当該植物体の種子若しくは乾燥葉から抽出物を得る工程を含む、ステビア甘味成分含有抽出物の製造方法（以下、「本発明の抽出物の製造方法」という）が提供される。さらに、本発明の抽出物の製造方法により得られた抽出物からステビア甘味成分を精製する工程を含む、ステビア甘味成分の製造方法（以下、「本発明のステビア甘味成分の製造方法」という）が提供される。ステビア甘味成分には、上述のとおり、種々のステビオール配糖体が包含されるため、本発明のステビア甘味成分の製造方法は、個々のステビオール配糖体の製造方法を包含する。
【００５８】
ステビア甘味成分含有抽出物は、本発明の植物体の新鮮葉又は乾燥葉に適切な溶媒（水等の水性溶媒又はアルコール、エーテル及びアセトン等の有機溶媒）を反応させることにより得ることができる。抽出条件等は特表2012-504552に記載の方法や、後述の実施例に記載の方法を参照することができる。
また、ステビア甘味成分含有抽出物を酢酸エチルその他の有機溶媒：水の勾配、高速液体クロマトグラフィー（High Performance Liquid Chromatography：HPLC）、ガスクロマトグラフィー、飛行時間型質量分析（Time-of-Flight mass spectrometry：TOF-MS）、超高速液体クロマトグラフィー (Ultra （High）Performance Liquid chromatography：UPLC) 等の公知の方法を用いることによりステビア甘味成分を精製することができる。
【００５９】
本発明の抽出物の製造方法により得られた抽出物（以下、「本発明の抽出物」という）は、本発明の変異を含まないステビア植物体から同様の方法により得られた抽出物と比べ、甘味成分の含有量が高いことを特徴とする。ここで、「甘味成分の含有量が高い」とは、本発明の植物体の項に記載のとおりである。
【００６０】
本発明の抽出物及び／又は本発明のステビア甘味成分の製造方法により得られるステビア甘味成分（以下、「本発明のステビア甘味成分」という）と他の成分とを混合することにより、ステビア甘味成分の含量を高めた新規な医薬品、香料又は飲食品を製造することができる。そこで、本発明は、別の側面において、本発明の抽出物及び／又は本発明のステビア甘味成分と他の成分とを混合する工程を含む、医薬品、香料又は飲食品の製造方法を提供する。さらに、本発明は、前記製造方法により得られた、ステビア甘味成分の含量を高めた新規な医薬品、香料又は飲食品を提供する。ここで飲食品とは、飲料及び食品を意味する。したがって、一部の態様では、本発明は新規な医薬品、香料、飲料又は食品を提供し、また、当該医薬品、香料、飲料又は食品の製造方法を提供する。
【００６１】
５．本発明の植物体に係る塩基配列
本発明は、別の側面において、本発明のステビア植物体に係る塩基配列を提供する。本発明の変異を有するステビア植物体に係る塩基配列の特定の態様は、配列番号２０、９９〜１０２から選択される塩基配列を含む、又はそれからなる。
【実施例】
【００６２】
以下に本発明に関する実験例、実施例等を記載するが、本発明はこれらの具体的な態様に限定されるものではない。【００６３】
（１）甘味成分高含有個体の単離（Ｍ０世代）
野生型ステビア種子（市販品種、２０１４年８月に導入）約２０００個（重量換算）を３つに分けて、各々に対して０．１％、０．２％又は０．３％のエチルメタンスルホン酸（ＥＭＳ）処理を行って遺伝子改変を行った。
このＥＭＳ処理済み種子及び無処理の種子を、サントリー研究センター内温室にて播種し、ＥＭＳ処理当代（Ｍ０世代）苗を得た。処理濃度間での発芽率差異は見られなかった。
ＥＭＳ処理当代（Ｍ０世代）及び無処理個体より適量の新鮮葉をサンプリングし、ＬＣ／ＭＳ−ＭＳ（島津LCMS8050）にて甘味成分の濃度を定量した。具体的には、０．２５ｇの新鮮葉をフリーズドライにより乾燥し、破砕物乾物０．０５ｇを純水中に投入した。超音波処理２０分にて抽出し、遠心・濾過した後に０．３３ｍｌの抽出液を得た。この抽出液をLCMS8050イオンモード（島津LCMS8050）にてＬＣ／ＭＳ−ＭＳ分析を行い、ＲｅｂＡ、ＲｅｂＢ、ＲｅｂＣ、ＲｅｂＤ、ＲｅｂＦ、ＲｅｂＭ、ＲｅｂＮ及びＲｅｂＯの濃度を定量し、その合計を甘味成分の濃度とした。甘味成分濃度が約２０％の個体を親個体１（Ｐ１）とした。また、親個体２（Ｐ２）として、別のステビア植物体の集団に由来する、乾燥葉中の甘味成分濃度が５％の個体を選定した。【００６４】
（２）甘味成分高含有型個体の単離（Ｍ１世代）及び遺伝子解析
親個体１（Ｐ１）と親個体２（Ｐ２）との交配により処理第一代（Ｍ１世代）種子を採種し、サントリー研究センター内の温室内で播種し、Ｍ１世代苗を得た（１６０３個体の分離集団）。上記Ｍ１世代個体より適量の新鮮葉をサンプリングし、上記（１）と同様にLC/MS-MS（島津LCMS8050）にて甘味成分を定量した。結果を図１に示す。
甘味成分の含有量が最も高い３０個体（甘味成分高含有個体）と、最も低い３０個体（甘味成分低含有個体）の新鮮葉からゲノムＤＮＡを抽出し、両個体群のいずれか一方のみに存在する変異について調査した。ゲノム解析で検出した変異のうち、ゲノム情報量が十分あり（シーケンスカバレッジが×５以上）、変異が連続しておらず、配列の挿入や欠失のない３０６ヵ所の変異について、各変異がどの個体に存在するかを検討した。その結果、配列番号１の４９位におけるＣからＡへの変異（Ｃ４９Ａ）が、甘味成分高含有個体には存在するが、低含有個体には存在しないことが明らかとなった。【００６５】
（３）変異Ｃ４９Ａと甘味成分含有量との関係性の検証
変異Ｃ４９Ａをヘテロで有するステビア植物体と、変異Ｃ４９Ａを有しないステビア植物体とを交配し、２つの分離集団（分離集団Ａ（４４３個体）及び分離集団Ｂ（４４６個体））を得た。両分離集団の各個体における変異Ｃ４９Ａの有無と、甘味成分含有量とを調査した。変異Ｃ４９Ａの有無の調査にはｄＣＡＰＳ法を用いた。各個体からゲノムＤＮＡを抽出し、以下のプライマーを用いてＰＣＲを行い、ＰＣＲ産物に制限酵素（ＳｐｅＩ）を添加し、３７℃で酵素反応を行った。制限酵素処理後、マイクロチップ型電気泳動装置ＬａｂＣｈｉｐ  ＧＸ  Ｔｏｕｃｈ  ＨＴ（PerkinElmer）により電気泳動を行い、電気泳動後のバンドパターンによってマーカーの識別を行った。
フォワードプライマー：５’−ＴＴＡＴＴＴＡＡＴＧＡＴＣＣＡＡＴＧＧＡＧＧＧＧＧＴＧＡＴＴＣＡＧＧＴＡＡＴＡＡＡＡＧＧＣＡＣＴ−３’（配列番号７１）
リバースプライマー：５’−ＴＧＡＧＧＧＴＴＣＴＣＡＡＴＴＧＡＴＴＴＣＣＧＡＴＴＧＧ−３’（配列番号１５）
得られた約３６７ｂｐＰＣＲ産物（例えば、配列番号９６又は９７）に対しＳｐｅＩ制限酵素処理を行い、約３２１ｂｐの制限酵素処理産物（例えば、配列番号９８）を生じたものを変異Ｃ４９Ａ陽性とした。
甘味成分含有量の定量は（１）と同様に行った。
各分離集団の変異Ｃ４９Ａ陽性個体及び陰性個体における甘味成分含有量の分布を図２〜３に示す。これらの結果から、変異Ｃ４９Ａ陽性個体における甘味成分含有量は、各分離集団全体の甘味成分含有量の平均値より高いことが分かる。
【００６６】
また、各分離集団の変異Ｃ４９Ａ陽性個体及び陰性個体における甘味成分含有量の平均値及び中央値を以下にまとめる。
【表４】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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