(57)【要約】  本発明は、ポリエチレングリコール修飾による生体内半減期の延長効果及び生理活性の保持を両立した肝細胞増殖因子又はその活性断片のポリエチレングリコール修飾体を提供することを目的とする。本発明は、１分子のフォーク型ポリエチレングリコールが２分子の肝細胞増殖因子又はその活性断片のそれぞれのカルボキシル末端領域に共有結合してホモ二量体を形成している肝細胞増殖因子又はその活性断片のポリエチレングリコール修飾体を提供する。【選択図】図２
2020158690.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
１分子のフォーク型ポリエチレングリコールが２分子の肝細胞増殖因子又はその活性断片のそれぞれのカルボキシル末端領域に共有結合してホモ二量体を形成している、肝細胞増殖因子又はその活性断片のポリエチレングリコール修飾体。
【請求項２】
一般式（Ｉ）で示される、請求項１記載の肝細胞増殖因子又はその活性断片のポリエチレングリコール修飾体。
【化１】
2020158690.tif 000011
［式中、ＰＥＧは、フォーク型ポリエチレングリコールの構造部分を表し、Ｌは、加水分解的に安定な分岐部分を表し、ＨＧＦは、肝細胞増殖因子又はその活性断片を表し、Ｘは、肝細胞増殖因子又はその活性断片に対するフォーク型ポリエチレングリコールの共有結合を提供する結合部分を表す。］
【請求項３】
一般式（Ｉ）において、ＰＥＧは、−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−を含む構造を表し、該構造が直鎖構造又は分岐構造を形成しており、ｎは、２〜２３００である、請求項２記載の肝細胞増殖因子又はその活性断片のポリエチレングリコール修飾体。
【請求項４】
一般式（ＩＩ）で示される、請求項１〜３のいずれか一項記載の肝細胞増殖因子又はその活性断片のポリエチレングリコール修飾体。
【化２】
2020158690.tif 000012
［式中、Ｘ及びＨＧＦは、前記定義のとおりである。］
【請求項５】
前記フォーク型ポリエチレングリコールの分岐部分の分岐原子と、前記肝細胞増殖因子又はその活性断片に対する前記フォーク型ポリエチレングリコールの共有結合を提供する官能基との距離が、２０Å以下である、請求項１〜４のいずれか一項記載の肝細胞増殖因子又はその活性断片のポリエチレングリコール修飾体。
【請求項６】
前記肝細胞増殖因子の活性断片は、ＮＫ１である、請求項１〜５のいずれか一項記載の肝細胞増殖因子又はその活性断片のポリエチレングリコール修飾体。
【請求項７】
前記ＮＫ１は、配列表の配列番号２で示されるアミノ酸配列、又は、該アミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなる、請求項６記載の肝細胞増殖因子又はその活性断片のポリエチレングリコール修飾体。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれか一項記載の肝細胞増殖因子又はその活性断片のポリエチレングリコール修飾体を有効成分として含有する、医薬。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、肝細胞増殖因子又はその活性断片のポリエチレングリコール修飾体に関する。
【背景技術】
【０００２】
肝細胞増殖因子は、多様な生理作用を有する増殖因子であり、最初に見出された肝細胞増殖作用の他に、抗アポトーシス作用、血管新生作用、血管拡張作用、抗臓器線維化作用、抗上皮間葉転換作用などを有することが知られており、さまざまな疾患に対する臨床応用が試みられている。しかし、肝細胞増殖因子の生体内半減期は３０分程度と短いため、その作用を持続させるためには、大量の肝細胞増殖因子を頻繁に投与する必要がある（非特許文献１）。【０００３】
また、肝細胞増殖因子の活性断片として、天然型スプライシングバリアントであるＮＫ１（非特許文献２）及びＮＫ２（非特許文献３）、並びに組換え技術によって作出されたＮＫ４（非特許文献４）が知られており、これらはｉｎ  ｖｉｔｒｏ及びｉｎ  ｖｉｖｏにおいて生理活性を有していることが明らかにされている。【０００４】
ポリエチレングリコールは生体適合性の高いポリマー性高分子であり、タンパク医薬の生体内半減期延長や免疫原性低下を目的として、タンパク質の修飾剤として広く利用されている。【０００５】
肝細胞増殖因子についても、ポリエチレングリコール修飾体が報告されている（特許文献１）。また、肝細胞増殖因子のアンタゴニスト断片であるＮＫ４のポリエチレングリコール修飾体も報告されている（特許文献２）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】米国特許第５，９７７，３１０号明細書
【特許文献２】特開２０１０−１７４０３４号公報
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ｌｉｕ  Ｋ．Ｘ．ら、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ、１９９８年、第２７５巻、ｐ．８３５−８４２
【非特許文献２】Ｊａｋｕｂｃｚａｋ  Ｊ．Ｌ．ら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、１９９８年、第１８巻、第３号、ｐ．１２７５−１２８３
【非特許文献３】Ｏｔｓｕｋａ  Ｔ．ら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、２０００年、第２０巻、第６号、ｐ．２０５５−２０６５
【非特許文献４】Ｄａｔｅ  Ｋ．ら、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ、１９９７年、第４２０巻、第１号、ｐ．１−６
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
しかしながら、ポリエチレングリコール修飾による望ましい効果の一方で、生理活性を有したタンパク質のポリエチレングリコール修飾においては、ポリエチレングリコールの結合位置に依存して生理活性が低下又は消失することが知られている。例えば、肝細胞増殖因子のランダムな箇所に複数個のポリエチレングリコールが結合した修飾体が記載されているが、その生体内半減期の延長効果は低く、さらには、３０％以上の生理活性低下が認められる（特許文献１）。【０００９】
したがって、従来の技術ではポリエチレングリコール修飾による生体内半減期の延長と生理活性の保持とは相反するものと考えられ、それらを同時に満たすポリエチレングリコール修飾体が望まれている。【００１０】
そこで本発明は、ポリエチレングリコール修飾による生体内半減期の延長効果及び生理活性の保持を両立した、肝細胞増殖因子又はその活性断片のポリエチレングリコール修飾体を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を重ねた結果、ポリエチレングリコール修飾による生体内半減期の延長効果及び生理活性の保持を両立した、肝細胞増殖因子又はその活性断片のポリエチレングリコール修飾体を見出し、本発明を完成させるに至った。【００１２】
本発明は、以下の特徴を包含する。
（１）  １分子のフォーク型ポリエチレングリコールが２分子の肝細胞増殖因子又はその活性断片のそれぞれのカルボキシル末端領域に共有結合してホモ二量体を形成している、肝細胞増殖因子又はその活性断片のポリエチレングリコール修飾体。
（２）  一般式（Ｉ）で示される、上記（１）記載の肝細胞増殖因子又はその活性断片のポリエチレングリコール修飾体。
【化１】
2020158690.tif 000003
［式中、ＰＥＧは、フォーク型ポリエチレングリコールの構造部分を表し、Ｌは、加水分解的に安定な分岐部分を表し、ＨＧＦは、肝細胞増殖因子又はその活性断片を表し、Ｘは、肝細胞増殖因子又はその活性断片に対するフォーク型ポリエチレングリコールの共有結合を提供する結合部分を表す。］
（３）  一般式（Ｉ）において、ＰＥＧは、−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−を含む構造を表し、該構造が直鎖構造又は分岐構造を形成しており、ｎは、２〜２３００である、上記（２）記載の肝細胞増殖因子又はその活性断片のポリエチレングリコール修飾体。
（４）  一般式（ＩＩ）で示される、上記（１）〜（３）のいずれか記載の肝細胞増殖因子又はその活性断片のポリエチレングリコール修飾体。
【化２】
2020158690.tif 000004
［式中、Ｘ及びＨＧＦは、上記定義のとおりである。］
（５）  上記フォーク型ポリエチレングリコールの分岐部分の分岐原子と、上記肝細胞増殖因子又はその活性断片に対する上記フォーク型ポリエチレングリコールの共有結合を提供する官能基との距離が、２０Å以下である、上記（１）〜（４）のいずれか記載の肝細胞増殖因子又はその活性断片のポリエチレングリコール修飾体。
（６）  上記肝細胞増殖因子の活性断片は、ＮＫ１である、上記（１）〜（５）のいずれか記載の肝細胞増殖因子又はその活性断片のポリエチレングリコール修飾体。
（７）  上記ＮＫ１は、配列表の配列番号２で示されるアミノ酸配列、又は、該アミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなる、上記（６）記載の肝細胞増殖因子又はその活性断片のポリエチレングリコール修飾体。
（８）  上記（１）〜（７）のいずれか記載の肝細胞増殖因子又はその活性断片のポリエチレングリコール修飾体を有効成分として含有する、医薬。
【発明の効果】
【００１３】
本発明の肝細胞増殖因子又はその活性断片のポリエチレングリコール修飾体は、生体内半減期が延長されるとともにその生理活性が保持されているため、非修飾体よりも少ない投与頻度でその薬効を発揮する医薬として利用できる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】Ｈｉｓ−Ｃｙｓ付加ヒトＮＫ１及びフォーク型ポリエチレングリコール修飾ＮＫ１二量体のＳＤＳ電気泳動像を示す図である。
【図２】ヘパリン二量体化ＮＫ１、フォーク型ポリエチレングリコール修飾ＮＫ１二量体及び直鎖型ポリエチレングリコール修飾ＮＫ１二量体の生理活性を示す図である。
【図３】Ｈｉｓ−Ｃｙｓ付加ヒトＮＫ１（点線）又はフォーク型ポリエチレングリコール修飾ＮＫ１二量体（実線）を尾静脈内投与した際のマウス血清中濃度の時間推移を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
本発明の肝細胞増殖因子又はその活性断片のポリエチレングリコール修飾体は、肝細胞増殖因子又はその活性断片がホモ二量体を形成しており、上記ホモ二量体の両方の単量体のカルボキシル末端領域に、１分子のフォーク型ポリエチレングリコールが共有結合することにより二量体を形成してなることを特徴とする。
【００１６】
＜肝細胞増殖因子及びその活性断片＞
肝細胞増殖因子（以下、「ＨＧＦ」とも称する。）は、多様な生理活性を有する増殖因子である。ＨＧＦは、アミノ末端側からＮドメイン、クリングル１、クリングル２、クリングル３、クリングル４及びＳＰＨドメインからなり、Ｎドメイン、クリングル１、クリングル２、クリングル３及びクリングル４がα鎖を構成し、ＳＰＨドメインがβ鎖を構成している。ＨＧＦは、発現時には一本鎖のｐｒｏ−ＨＧＦとして生合成されるが、分泌される際に分泌シグナル配列が除去された後、細胞外において開始メチオニンから数えて第４９４番目のアルギニン残基と第４９５番目のバリン残基の間でプロテアーゼによるプロセッシングを受けて、α鎖とβ鎖とがジスルフィド結合によって結合したヘテロ二量鎖を形成し、活性型となる（Ｍｉｙａｚａｗａ  Ｋ．ら、Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、１９９６年、第２７１巻、第７号、ｐ．３６１５−３６１８）。本発明のＨＧＦとは、生理活性を有する活性型のＨＧＦを意味する。
【００１７】
ヒト肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）の場合、７２８アミノ酸残基（分泌シグナル配列（開始メチオニンから３１アミノ酸残基）を含む）（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：Ｍ２９１４５）からなる分泌タンパク質として生合成され、分泌される際に、分泌シグナル配列が除去された６９７アミノ酸残基からなるタンパク質となる（配列番号１）。
【００１８】
上記の肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）は、天然に存在するＨＧＦ（以下、天然型ＨＧＦ）のアミノ酸配列と同じアミノ酸配列を持つものだけでなく、天然型ＨＧＦのアミノ酸配列に１個又は数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加（若しくは挿入）されたアミノ酸配列を有し、かつ、ＨＧＦとしての生理活性を有するＨＧＦのアミノ酸変異体を包含し、さらに、天然型ＨＧＦの糖鎖部分が改変されたＨＧＦ及び糖鎖部分を有しないＨＧＦをも包含する。ＨＧＦの変異体としては、天然型ＨＧＦのアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有する変異体が好ましく、９５％以上の配列同一性を有する変異体がより好ましく、９８％以上の配列同一性を有する変異体がさらに好ましい。例えば、クリングル１内の５アミノ酸残基が欠損した欠損型ＨＧＦ（天然に存在する天然型変異体である）（Ｋｉｎｏｓａｋｉ  Ｍ．ら、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ、１９９８年、第４３４巻、ｐ．１６５−１７０）が挙げられ、これは、ある細胞種において天然型ＨＧＦよりも比活性が高いことが報告されている。
【００１９】
本明細書で使用する「配列同一性」は、ＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡなどのアルゴリズムを使用して決定することができる２つの配列間の同一性を表し、一般に、２つの配列を、ギャップを含めて又はギャップを含めないで、最大の一致度となるように整列したとき、（ギャップを含めた）総アミノ酸数に対する一致したアミノ酸数の百分率（％）として算出されうる（Ａｌｔｓｃｈｕｌ  Ｓ．ら、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、１９９０年、第２１５巻、第３号、ｐ．４０３−４１０；Ａｌｔｓｃｈｕｌ  Ｓ．ら，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、１９９７年、第２５巻、第１７号、ｐ．３３８９−３４０２）。
【００２０】
本明細書で使用する「数個」とは、２〜１０の整数、すなわち１０、９、８、７、６、５、４、３、２をいう。
【００２１】
本明細書で使用するポリペプチドの「変異体」について、天然ポリペプチド（天然型肝細胞増殖因子（ＨＧＦ））のアミノ酸配列において１もしくは複数のアミノ酸の欠失、置換又は付加（もしくは挿入）により生じる該天然ポリペプチドの配列と異なるアミノ酸配列からなるポリペプチドを、該天然ポリペプチドの変異体という。このような変異体は、天然において生じる場合もあるし、或いは、遺伝子組換え技術などの一般的技術を用いて人工的に作製することもできる。人工的に変異体を作製するときにはポリペプチドの活性を損なわないことが重要である。そのためには、変異体を作製する際には、例えば、ポリペプチドの活性部位及び、必要であれば、該活性部位の近傍に変異を導入しないこと、置換する場合保存的アミノ酸置換を行うこと、アッセイにより変異体のＨＧＦ活性を確認することなどに留意する必要がある。
【００２２】
保存的アミノ酸置換は、一般に、化学的性質、電気的性質（若しくは極性・疎水性）又は構造的性質の類似するアミノ酸間での置換をいう。このような置換では、ポリペプチドの立体構造（コンフォーメーション）の著しい変化を抑制することができるため、該ポリペプチドはその活性を大きく損なうことなく保持することができるし、また、天然型より高い活性とすることができる場合もある。そのようなアミノ酸置換の具体例は、酸性アミノ酸間の置換（例えば、アスパラギン酸（Ｄ）とグルタミン酸（Ｅ））、塩基性アミノ酸間の置換（例えば、ヒスチジン（Ｈ）、リジン（Ｋ）及びアルギニン（Ｒ））、芳香族アミノ酸間の置換（例えば、フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）及びトリプトファン（Ｗ））、親水性アミノ酸間の置換（例えば、システイン（Ｃ）、アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）ヒスチジン（Ｈ）、リジン（Ｋ）、アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）、アルギニン（Ｒ）、セリン（Ｓ）及びスレオニン（Ｔ））、疎水性アミノ酸間の置換（例えば、アラニン（Ａ）、フェニルアラニン（Ｆ）、イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、ノルロイシン（Ｎｌｅ）、メチオニン（Ｍ）、バリン（Ｖ）、トリプトファン（Ｗ）及びチロシン（Ｙ））などを含む。
【００２３】
上記の肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）は、天然型ＨＧＦのアミノ酸配列又は塩基配列に基づいて、遺伝子組換え技術により作製された組換え型ＨＧＦも包含する。
【００２４】
肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）の受容体はｃ−Ｍｅｔであることが知られており、ＨＧＦの多様な生理活性は、ＨＧＦがＨＧＦ受容体であるｃ−Ｍｅｔに結合することによって誘導される。
【００２５】
上記の肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）の活性断片とは、ＨＧＦの一部の構造を含み、ＨＧＦ受容体に結合して、ＨＧＦとしての生理活性（アゴニスト活性）を発揮するタンパク質をいう。また、上記のＨＧＦの活性断片とは、ＨＧＦの一部の構造を含み、ＨＧＦ受容体に結合して、ＨＧＦのアンタゴニストとして作用する（アンタゴニスト活性を発揮する）タンパク質をも包含する。
【００２６】
肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）の活性断片としては、例えば、ＨＧＦの天然型スプライシングバリアントであるＮＫ１及びＮＫ２が挙げられる。ＮＫ１は、ＨＧＦのアミノ末端側のＮドメイン及びクリングル１からなり、ＮＫ２は、ＨＧＦのアミノ末端側のＮドメイン、クリングル１及びクリングル２からなる。これらはそれぞれ動物体内において、アゴニスト又はアンタゴニストとして作用することが報告されている（Ｊａｋｕｂｃｚａｋ  Ｊ．Ｌ．ら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、１９９８年、第１８巻、第３号、ｐ．１２７５−１２８３；  Ｏｔｓｕｋａ  Ｔ．ら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、２０００年、第２０巻、第６号、ｐ．２０５５−２０６５）。
【００２７】
また、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）の活性断片としては、例えば、組換え技術によって作出されたＮＫ４が挙げられる。ＮＫ４は、ＨＧＦのアミノ末端側のＮドメイン、クリングル１、クリングル２、クリングル３及びクリングル４からなり、アンタゴニストとして作用することが報告されている（Ｄａｔｅ  Ｋ．ら、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ、１９９７年、第４２０巻、第１号、ｐ．１−６）。
【００２８】
上記の肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）の活性断片は、天然型ＨＧＦのアミノ酸配列由来のアミノ酸配列と同じアミノ酸配列を持つものだけでなく、天然型ＨＧＦのアミノ酸配列由来のアミノ酸配列に１個又は数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を有し、かつ、ＨＧＦとしての生理活性（アゴニスト活性）又はＨＧＦのアンタゴニスト活性を有する変異体を包含し、さらに、天然型ＨＧＦ由来の糖鎖部分が改変された、又は天然型ＨＧＦ由来の糖鎖部分を有しない変異体をも包含する。ＨＧＦの活性断片の変異体としては、天然型ＨＧＦのアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有する変異体が好ましく、９５％以上の配列同一性を有する変異体がより好ましく、９８％以上の配列同一性を有する変異体がさらに好ましい。例えば、ＮＫ１高活性型変異体として、１Ｋ１（Ｌｉｅｔｈａ  Ｄ．ら、Ｔｈｅ  ＥＭＢＯ  Ｊｏｕｒｎａｌ、２００１年、第２０巻、第２０号、ｐ．５５４３−５５５５）及びＭ２．２（Ｊｏｎｅｓ  Ｄ．Ｓ．ら、Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａ、２０１１年、第１０８巻、第３２号、ｐ．１３０３５−１３０４０）が挙げられる。
【００２９】
上記の肝細胞増殖因子又はその活性断片は、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）（変異体も含む）、ＮＫ１（変異体も含む）、ＮＫ２（変異体も含む）又はＮＫ４（変異体も含む）であることが好ましく、天然型ＨＧＦ、欠損型ＨＧＦ（Ｋｉｎｏｓａｋｉ  Ｍ．ら、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ、１９９８年、第４３４巻、ｐ．１６５−１７０）、ＮＫ１（変異体も含む）、ＮＫ２（変異体も含む）又はＮＫ４（変異体も含む）であることが好ましく、ＮＫ１（変異体も含む）又はＮＫ２（変異体も含む）であることがより好ましく、ＮＫ１（変異体も含む）であることがさらに好ましく、配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるヒトＮＫ１であることが最も好ましい。なお、配列番号２には、ヒトＨＧＦ由来分泌シグナル配列（ＭＷＶＴＫＬＬＰＡＬＬＬＱＨＶＬＬＨＬＬＬＬＰＩＡＩＰＹＡＥＧ：配列番号３）を含まない。
【００３０】
また、上記の肝細胞増殖因子又はその活性断片は、哺乳動物由来のアミノ酸配列を包含するが、ヒト、ネコ又はイヌ由来のアミノ酸配列であることが好ましく、ヒト由来の配列であることがより好ましい。
【００３１】
上記の肝細胞増殖因子又はその活性断片は、タンパク質の精製等の目的でタグ配列等の人工配列が付加されたものであってもよい。タグ配列としては、例えば、６×Ｈｉｓタグ、ＨＡＴタグ、ｃ−Ｍｙｃタグ、ＦＬＡＧタグ、ＤＹＫＤＤＤＤＫタグ、Ｓｔｒｅｐタグ、ＨＡタグ、ＧＳＴタグ及びＭＢＰタグ等が挙げられる。さらに、精製後にこれらタグ配列を除去するために、さらにスペーサー配列又はプロテアーゼ切断配列等の人工配列を、上記のＨＧＦ又はその活性断片とタグとの間に挿入することも可能である。この場合、上記の肝細胞増殖因子又はその活性断片には、スペーサー配列又はプロテアーゼ切断配列等の人工配列の切断断片が含まれていてもよい。
【００３２】
上記の肝細胞増殖因子又はその活性断片は、組織からの抽出、遺伝子組換え技術を用いたタンパク質合成、肝細胞増殖因子又はその活性断片を発現する組換え細胞（又は肝細胞増殖因子を発現する天然細胞）を用いた生物学的製造等の公知の方法を用いて得ることができる。また、ＨＧＦ又はその活性断片として、市販の肝細胞増殖因子又はその活性断片も用いることができる。
【００３３】
遺伝子組換え技術については、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ、２ｎｄ  ｅｄ．、１９８９年、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙに記載された方法に従って行うことができる。このような技術の一例を以下に説明する。
ＨＧＦ又はその活性断片をコードするＤＮＡを準備する。該ＤＮＡは、ヒト組織や細胞から作製したｃＤＮＡライブラリーから選択して取り出し、ＰＣＲ法などのＤＮＡ増幅法に掛けることによって得ることができる。或いは、該ＤＮＡは、例えば、ホスホアミダイト法を利用したＤＮＡ合成機を使用して化学的に合成することができる。
【００３４】
上記のＤＮＡを適当なベクターに組み込み、発現ベクターを作製する。そのようなベクターは、該ＤＮＡを発現（必要に応じて、分泌）するために必要な調節配列等のエレメントを含む。エレメントの具体例は、翻訳開始コドン及び終始コドン、プロモーター、エンハンサー、ターミネーター、リボソーム結合部位（若しくは、シャイン・ダルガルノ配列）、選択マーカー配列、シグナル配列などを含み、ベクターには必要なエレメントが挿入される。
【００３５】
プロモーターについては、宿主細胞に応じて適するプロモーターが選択される。例えば、原核生物であるエッシェリシア属（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）細菌の細胞に適するプロモーターは、例えば、ｔｒｐプロモーター、ｌａｃプロモーター、ｒｅｃＡプロモーター、λＰLプロモーター等であり、バチルス属(Ｂａｃｉｌｌｕｓ)細菌の細胞に適するプロモーターは、例えば、ＳＰＯ１プロモーター、ＳＰＯ２プロモーター、ｐｅｎＰプロモーター等である。酵母細胞に適したプロモーターは、例えば、ＰＨＯ５プロモーター、ＰＧＫプロモーター、ＧＡＰプロモーター、ＡＤＨプロモーター、ＡＯＸプロモーター等である。植物細胞に適したプロモーターは、例えば、カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）プロモーター等である。昆虫細胞に適したプロモーターは、例えば、Ｐ１０プロモーター、ポリヘドリンプロモーター等である。哺乳動物細胞に適したプロモーターは、例えば、ラウス肉腫ウイルス、ポリオマーウイルス、鶏頭ウイルス、アデノウイルス、ウシパピローマウイルス、トリ肉腫ウイルス、サイトメガロウイルス（ＳＭＶ）、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）、ワクシニアウイルス等のウイルスのプロモーター、メロチオネインプロモーター、ヒートショックプロモーター等である。
【００３６】
選択マーカーについは、例えば、ＨＩＳ３遺伝子、ＬＥＵ２遺伝子、ＴＲＰ１遺伝子、ＵＲＡ３遺伝子、ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子（メソトレキセート（ＭＴＸ）耐性）、アンピシリン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子等である。
【００３７】
発現ベクターについては、宿主細胞に適したベクターが選択され、例えば、プラスミド、ファージ、コスミド、ウイルスベクター、人工染色体（例えば、ＢＡＣ、ＹＡＣ等）などが通常使用されるベクターである。原核生物用ベクターについては、大腸菌由来のプラスミド、例えば、ｐＣＲ系プラスミド、ｐＢＲ系プラスミド、ｐＵＣ系プラスミド等、枯草菌由来のプラスミド、例えば、ｐＵＢ１１０、ｐＴＰ５、ｐＣ１９４等である。酵母用ベクターについては、酵母由来プラスミド、例えば、ｐＳＨ系プラスミド等である。植物細胞用ベクターについては、バイナリーベクター等である。哺乳類細胞用ベクターについては、ｐＢＫ−ＣＭＶ、ｐｃＤＮＡ３．１、ｐＺｅｏＳＶ（インビトロゲン社、ストラジーン社）などの市販ベクター、ウイルスベクター（例えば、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ポックスウイルス、単純ヘルペスウイルス、レンチウイルス、センダイウイルス、ワクシニアウイルス、ＳＶ４０等である。
【００３８】
宿主細胞は、大腸菌、枯草菌等の原核生物細胞、並びに、酵母、植物細胞、動物細胞（例えば、哺乳類細胞、昆虫細胞等）などの真核生物細胞である。上記発現ベクターを宿主細胞に形質転換又はトランスフェクションするときには、例えば、エレクトロポレーション法、マイクロインジェクション法、細胞融合法、ＤＥＡＥデキストラン法、リン酸カルシウム法、パーティクルガン法、アグロバクテリウム法などの公知の手法を使用できる。
【００３９】
肝細胞増殖因子又はその活性断片は原核生物細胞又は真核生物細胞を用いて発現可能であることが知られており、ＮＫ１タンパク質をコードする核酸配列（ＤＮＡ）を細胞に一過性又は安定的に導入することで組換えタンパク質を発現させることができる。酵母発現系は培養上清中に組換えタンパク質を分泌発現し、ジスルフィド結合を有したタンパク質のフォールディングにも適している一方で、哺乳類細胞よりも簡便に培養することが可能である。したがって、分子内に複数のジスルフィド結合を有した肝細胞増殖因子又はその活性断片の発現に酵母発現系は好ましい。
【００４０】
本明細書における「ホモ二量体」とは、同一のアミノ酸配列を有する２分子のタンパク質が形成する二量体を意味する。また、本明細書における「単量体」とは、二量体を形成する一方のタンパク質を意味する。肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）は、同一のアミノ酸配列を有する２分子のＨＧＦがホモ二量体となって、ＨＧＦ受容体に結合し、その生理活性を発現する（Ｇｈｅｒａｒｄｉ  Ｅ．ら、Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａ、２００６年、第１０３巻、第１１号、ｐ．４０４６−４０５１）。また、ＨＧＦの活性断片は、ヘパリン様物質の存在下において同一のアミノ酸配列を有する２分子の活性断片がホモ二量体となって、ＨＧＦ受容体に結合し、その生理活性（アゴニスト活性）を発現する（Ｃｈｉｒｇａｄｚｅ  ＤＹ．ら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、１９９９年、第６巻、第１号、ｐ．７２−７９）。または、ＨＧＦの活性断片は、ヘパリン様物質の非存在下では単量体としてＨＧＦ受容体に結合し、アンタゴニスト活性を発現する。
【００４１】
例えば、ヒトＮＫ１の二量体結晶構造（ＰＤＢ  ＩＤ：３ＭＫＰ）（Ｃｈｉｒｇａｄｚｅ  ＤＹ．ら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、１９９９年、第６巻、第１号、ｐ．７２−７９）によれば、ヒトＮＫ１の２分子が左右対称に対合する形で二量体を形成しており、それぞれのクリングル構造内のアミノ酸配列が、ＨＧＦ受容体であるｃ−Ｍｅｔの細胞外ドメイン内の配列と結合することが示されている。
【００４２】
＜フォーク型ポリエチレングリコール＞
ポリエチレングリコール（以下、ＰＥＧ）は、生体適合性の高いポリマー性高分子であり、タンパク質にＰＥＧを結合することにより、物理的安定性、熱安定性、タンパク分解酵素に対する抵抗性、溶解性の向上、生体内での分布容積の低下、血中滞留性の向上などの効果がもたらされ、臨床的な有用性が付加されることが知られている（Ｉｎａｄａら、Ｊ．Ｂｉｏａｃｔ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｔｉｂｌｅ  Ｐｏｌｙｍｅｒｓ、１９９０年、第５巻、ｐ．３４３；Ｄｅｌｇａｄｏら、Ｃｒｉｔｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ｉｎ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｄｒｕｇ  Ｃａｒｒｉｅｒ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、１９９２年、第９巻、ｐ．２４９；Ｋａｔｒｅ、Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、１９９３年、第１０巻、ｐ．９１）。
【００４３】
ＰＥＧは、互換性がありかつ水溶性ポリ（エチレンオキシド）を含むものである。典型的には、ＰＥＧは、繰り返しユニット構造「−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−」を含み、末端基又はＰＥＧ部分全体の構造は、変化し得る。例えば、末端の酸素の置換の有無によって、「−ＣＨ２ＣＨ２−Ｏ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−ＣＨ２ＣＨ２−」及び「−（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｎＯ−」を含み得る。一般に使われるＰＥＧは、末端キャップされたＰＥＧであり、この末端キャップされたＰＥＧにおいて、ＰＥＧの一方の末端が比較的不活性な基（代表的にはメトキシ（−ＯＣＨ３）のようなアルコキシ基）でキャップされおり、それに対して、もう一方の末端は、任意に化学的に修飾できるヒドロキシル基などである。ＰＥＧは、市販品として入手でき、又は、既知の方法に従い、エチレンオキシドの開環重合により調製できる（Ｓａｎｄｌｅｒ  ａｎｄ  Ｋａｒｏ、Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、第３巻、ｐ．１３８−１６１）。
【００４４】
上記の肝細胞増殖因子又はその活性断片のＰＥＧ修飾体を作製するためのＰＥＧは、フォーク型ＰＥＧである。フォーク型ＰＥＧは、当技術分野で既知である。典型的には、フォーク型ＰＥＧは、ＰＥＧの一方の末端に、分岐部分及び分岐部分と連結した２個のヒドロキシル基（後に化学的改変を受け得る）を有する。例えば、フォーク型ＰＥＧは、国際特許公開ＷＯ９９／４５９６４号で説明されている。フォーク型ＰＥＧのＰＥＧ構造部分は、直鎖でも、分岐であってもよい。特に好ましいフォーク型ＰＥＧは、分岐型である。
【００４５】
上記の肝細胞増殖因子又はその活性断片のＰＥＧ修飾体のフォーク型ＰＥＧの分子量は、５，０００以上２４０，０００以下が好ましく、１０，０００以上８０，０００以下がより好ましく、２０，０００以上４５，０００以下がさらに好ましく、２０，０００が最も好ましい。ＰＥＧ修飾による生体内半減期の延長効果はＰＥＧの分子量と相関することが知られており（Ｓｕｎｄｑｖｉｓｔ  Ｔ．ら、Ｃｏｍｐｕｔｅｒｓ  ａｎｄ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、１９８８年、第２１巻、第２巻、ｐ．１１０−１１６）、２０，０００以上であれば生体内半減期の十分な延長効果が期待できる。一方で、高分子量のＰＥＧ修飾は組織移行性が低下することが知られているため、２０，０００が最も好ましい。
【００４６】
なお、ＰＥＧは、１個の分子が多数の繰り返しユニット構造「−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−」からできており、ＰＥＧの分子量は個々の分子により異なるのが一般的であるため、平均分子量で表される。したがって、本明細書におけるＰＥＧの分子量とは、平均分子量の意味である。
【００４７】
上記の肝細胞増殖因子又はその活性断片とＰＥＧとの結合の方法に応じて、共有結合反応に使用するＰＥＧの末端を活性化する必要があるが、末端がＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、ニトロベンゼンスルホネートエステル、マレイミド、オルトピリジルジスルフィド、ビニルスルフォン、ヨードアセトアミド、カルボン酸、アジド、ホスフィン又はアミン構造で活性化されたＰＥＧを用いることができ、これらの活性化されたＰＥＧは公知の方法により合成できる。また、市販品として入手もできる。例えば、活性化されたフォーク型ＰＥＧとして、油化産業株式会社のＳＵＮＢＲＩＧＨＴ（登録商標）ＰＴＥ２  Ｓｅｒｉｅｓが挙げられる。本明細書において、タンパク質との結合反応性を示すようＰＥＧ末端に付加された官能基を単に「官能基」又は「ＰＥＧ官能基」、これら末端構造を持つＰＥＧを「官能基により活性化されたＰＥＧ」、「活性化されたＰＥＧ」又は「官能基を含むＰＥＧ」と記載する。
【００４８】
上記の肝細胞増殖因子又はその活性断片のカルボキシル末端領域にフォーク型ＰＥＧを共有結合させるには、２個の官能基により活性化されたフォーク型ＰＥＧを用いる。官能基は、２個の同一官能基を有するホモ官能性及び２個の異なる官能基を有するヘテロ官能性のいずれでもよい。上記のフォーク型ＰＥＧは、好ましくは、２個の同一官能基により活性化されたフォーク型ＰＥＧである。より具体的には、２個の同一官能基により活性化されたフォーク型ＰＥＧは、下記式（ＩＩＩ）で示されることが好ましい。
【化３】
2020158690.tif 000005
【００４９】
式中、「−」は結合を表し、「ｎ」は一般に、２〜約２３００までの範囲である。所望のＰＥＧ分子量によって「ｎ」は適宜決定できる。
【００５０】
ここで、タンパク質にＰＥＧを結合させることを、タンパク質をＰＥＧで化学修飾する若しくは修飾する、又はＰＥＧ化するともいい、肝細胞増殖因子又はその活性断片とＰＥＧとが共有結合している共有結合体は、ＰＥＧで化学修飾した肝細胞増殖因子又はその活性断片、又は、肝細胞増殖因子又はその活性断片のＰＥＧ修飾体ともいう。
【００５１】
上記の肝細胞増殖因子又はその活性断片のカルボキシル末端領域にＰＥＧを共有結合させるには、肝細胞増殖因子又はその活性断片に含まれるアミノ酸、又は公知の遺伝子組換え技術を用いて肝細胞増殖因子又はその活性断片に人工的に導入したシステインや非天然アミノ酸の、アミノ基（−ＮＨ２）、チオール基（−ＳＨ）及びカルボキシル基（−ＣＯＯＨ）を用いることができる。例えば、アミノ基は、ヒト肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）の場合は、カルボキシル末端アミノ酸から４及び１０残基目のリジン残基の側鎖に存在し、ＰＥＧ官能基としてＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）エステル基を用いた選択的な修飾が可能である。また、例えば、チオール基は、人工的にカルボキシル末端領域に挿入されたシステイン残基の側鎖に存在し、同側鎖中のチオール基は分子内及び分子間ジスルフィド結合を形成していないことから、ＰＥＧ官能基としてマレイミド基を用いた選択的な修飾が可能である。また、例えば、カルボキシル基は、ヒトＮＫ１の場合は、カルボキシル末端アミノ酸から８残基目のアスパラギン酸の側鎖、カルボキシル末端アミノ酸から２残基目のグルタミン酸の側鎖又はカルボキシル末端アミノ酸であるグルタミン酸の側鎖及びカルボキシル末端に存在し、アミノ基等を用いた修飾が可能である。また、非天然型アミノ酸を肝細胞増殖因子又はその活性断片のカルボキシル末端領域に挿入する方法としては、コドン改変によりアジドフェニルアラニン及びアジド−Ｚ−リジン等の導入方法が報告されており（特開２００９−２０７４９０号公報）、これら非天然型アミノ酸に含まれるアジド基に対してトリアリルホスフィンを用いた選択的な修飾が可能である。
【００５２】
上記のＨＧＦ又はその活性断片のカルボキシル末端領域にＰＥＧを共有結合させるには、選択的反応性を示すアミノ酸を上記の肝細胞増殖因子又はその活性断片のカルボキシル末端領域に人工的に挿入することが好ましい。特に、上記の肝細胞増殖因子又はその活性断片のカルボキシル末端領域にシステイン残基、アジドフェニルアラニン残基又はアジド−Ｚ−リジン残基を人工的に挿入することがより好ましく、システイン残基を人工的に挿入することがさらに好ましい。この場合、ＰＥＧ官能基がマレイミド基である活性化されたＰＥＧを用いることが好ましく、これにより、肝細胞増殖因子又はその活性断片のカルボキシル末端領域に挿入したシステイン残基への部位選択的なＰＥＧ修飾が可能である。
【００５３】
＜肝細胞増殖因子又はその活性断片のＰＥＧ修飾体＞
上記の肝細胞増殖因子又はその活性断片のＰＥＧ修飾体は、ホモ二量体を形成している各単量体（すなわち１分子の肝細胞増殖因子又はその活性断片）のカルボキシル末端領域に１分子のフォーク型ＰＥＧが共有結合することにより二量体を形成している。上記の肝細胞増殖因子又はその活性断片のホモ二量体を形成している各単量体のアミノ末端同士は、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）受容体が存在する細胞膜側で近接しており、一方、各単量体のカルボキシル末端同士は細胞間隙側で近接している。よって、上記の肝細胞増殖因子又はその活性断片のＰＥＧ修飾体は、肝細胞増殖因子又はその活性断片のカルボキシル末端領域にＰＥＧが共有結合しているため、肝細胞増殖因子又はその活性断片の生理活性を保持することができる。肝細胞増殖因子又はその活性断片のアミノ末端又はその近傍へのＰＥＧ修飾では、所望の効果は得られない。
【００５４】
ＰＥＧが共有結合する、肝細胞増殖因子又はその活性断片のカルボキシル末端領域とは、肝細胞増殖因子又はその活性断片のカルボキシル末端アミノ酸又はその近傍を含む。すなわち、カルボキシル末端アミノ酸から１０残基目までのアミノ酸残基を含む。例えば、ヒト肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：Ｍ２９１４５(配列番号５（塩基配列）、配列番号６（アミノ酸配列））の場合、配列番号６のアミノ酸配列において、開始メチオニンを１番目として、第７１８番目から第７２８番目（カルボキシル末端アミノ酸）までのアミノ酸残基の領域に該当する。また例えば、ヒトＮＫ１（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：Ｍ２９１４５のうち、配列番号６のアミノ酸配列の第３２番目のグルタミンから第２１０番目のグルタミン酸までを指す）の場合、配列番号６のアミノ酸配列において、開始メチオニンを１番目として、第２００番目から第２１０番目（カルボキシル末端アミノ酸）までのアミノ酸残基の領域に該当する。このカルボキシル末端領域内のアミノ酸残基であれば、肝細胞増殖因子又はその活性断片（変異体も含む）に元来含まれるアミノ酸又は人工的に導入したアミノ酸であってよい。好ましくは、肝細胞増殖因子又はその活性断片のカルボキシル末端領域とは、カルボキシル末端アミノ酸から１０残基目までが好ましく、カルボキシル末端アミノ酸から４残基目までがより好ましく、カルボキシル末端アミノ酸が最も好ましい。
【００５５】
上記のＨＧＦ又はその活性断片のカルボキシル末端領域にＰＥＧを共有結合させるには、公知の方法で実施することができる。例えば、タンパク質のアミノ基にＰＥＧを共有結合する方法は、米国特許第４９１７８８８号及び国際公開第１９８７／０００５６号に記載されている。タンパク質のチオール基にＰＥＧを共有結合する方法は、国際公開第１９９９／５５３７７号に記載されている。タンパク質に導入した非天然アミノ酸にＰＥＧを共有結合する方法は、Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ＆Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｌｅｔｔｅｒｓ、２００４年、第１４巻、ｐ．５７４３−５７４５に記載されている。
【００５６】
上記の肝細胞増殖因子又はその活性断片のＰＥＧ修飾体の精製又は濃縮は、肝細胞増殖因子又はその活性断片とフォーク型ＰＥＧとの共有結合反応後、公知の方法を用いて実施できる。例えば、イオン交換、ゲル濾過、疎水若しくは親和性担体を用いたクロマトグラム等の方法、又はこれらの組み合わせにより、未反応の肝細胞増殖因子又はその活性断片やフォーク型ＰＥＧ、副生成物を除去して、肝細胞増殖因子又はその活性断片のＰＥＧ修飾体を精製又は濃縮することができる。
【００５７】
上記の肝細胞増殖因子又はその活性断片のＰＥＧ修飾体は、具体的には、下記式（Ｉ）で示される。
【化４】
2020158690.tif 000006
【００５８】
式中、「−」は結合を表し、「ＰＥＧ」はフォーク型ポリエチレングリコールの構造部分を表し、「Ｌ」は加水分解的に安定な分岐部分を表し、「Ｘ」は肝細胞増殖因子又はその活性断片に対するフォーク型ポリエチレングリコールの共有結合を提供する結合部分を表し、「ＨＧＦ」は肝細胞増殖因子又はその活性断片を表す。肝細胞増殖因子又はその活性断片とフォーク型ポリエチレングリコールとの結合（Ｘ）は加水分解的に安定である。
【００５９】
「ＰＥＧ」は、フォーク型ポリエチレングリコールの構造部分であり、ポリエチレングリコールの繰り返しユニット「−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−」を含む構造が直鎖構造を形成していても、分岐構造を形成していてもよい。分岐構造を有するものとしては、例えば、二鎖分岐型、三鎖分岐型、四鎖分岐型が挙げられ、分岐数はそれ以上の数も包含するが、二鎖分岐型であることが好ましい。分岐構造の分岐原子（分岐点）は「Ｌ」に含まれていてもよい。
【００６０】
「Ｌ」は、「−ＣＨ−」のような単一の基を表していてもよく、又は、「ＰＥＧ」側にさらにより長い原子鎖（例えば、アルキレン結合（−ＣＨ２−）、エーテル結合（−Ｏ−）、エステル結合（−Ｏ−ＣＯ−若しくは−ＣＯ−Ｏ−）、アミド結合（−ＣＯＮＨ−若しくは−ＮＨＣＯ−）又はこれらの組み合わせを含む）を含んでもよい。例えば、「Ｌ」基としては、リジン、グリセロール、ペンタエリスリトール又はソルビトールが挙げられる。分岐部分内における、典型的な特定の分岐原子（分岐点となる原子）は、炭素原子である。
【００６１】
「Ｘ」は、肝細胞増殖因子又はその活性断片に対するフォーク型ポリエチレングリコールの共有結合を提供する結合部分であり、分岐原子と官能基の距離が２０Å以下であることを条件として、上記式（ＩＩＩ）に示すような官能基由来の原子のみを表していてもよく、又は、官能基由来の原子の他に「Ｌ」側にさらにより長い原子鎖（例えば、アルキレン結合（−ＣＨ２−）、エーテル結合（−Ｏ−）、エステル結合（−Ｏ−ＣＯ−若しくは−ＣＯ−Ｏ−）、アミド結合（−ＣＯＮＨ−若しくは−ＮＨＣＯ−）又はこれらの組み合わせを含む）を含んでもよい。適切な官能基の選択は、前述したように、肝細胞増殖因子又はその活性断片との結合部位に依存する。得られた肝細胞増殖因子又はその活性断片のＰＥＧ修飾体において対応する「Ｘ」は、好ましくは、肝細胞増殖因子又はその活性断片の適切な反応部位と活性化されたフォーク型ＰＥＧとの反応の結果により生じる。例えば、活性化されたフォーク型ＰＥＧが、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルのような活性化エステルを含む場合、肝細胞増殖因子又はその活性断片のアミン部位を介した結合は、対応するアミド結合を形成する。
【００６２】
本明細書において「官能基」は、肝細胞増殖因子又はその活性断片との共有結合を提供するための、フォーク型ポリエチレングリコール末端部又は上記原子鎖末端部の反応性基である。
【００６３】
上記の肝細胞増殖因子又はその活性断片のＰＥＧ修飾体は、より具体的には、下記式（ＩＩ）で示されることが好ましい。
【化５】
2020158690.tif 000007
【００６４】
式中のＸ及びＨＧＦの定義は上記式（Ｉ）と同じである。なお、「−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−」のｎ数は所望のＰＥＧ分子量（上記）となるように適宜決定できる。
【００６５】
「加水分解的に安定な」結合とは、水中において実質的に安定である（すなわち、長時間に渡り、感知可能な程度には、生理的条件下では加水分解しない）化学結合（代表的には共有結合）を指す。加水分解的に安定な結合の例としては、炭素−炭素結合（例えば、脂肪族の鎖内）、エーテル結合、アミド結合、ウレタン結合などが挙げられる。一般に、加水分解に安定な結合は、生理的な条件下では１日につき約１〜２％未満の加水分解速度を示す結合である。
【００６６】
上記の肝細胞増殖因子又はその活性断片のＰＥＧ修飾体の、フォーク型ＰＥＧの分岐原子と、上記肝細胞増殖因子又はその活性断片に対する上記フォーク型ポリエチレングリコールの共有結合を提供する官能基（例えば、フォーク型ＰＥＧ官能基）との距離は、肝細胞増殖因子又はその活性断片のＰＥＧ修飾体がその生理活性を保持する距離である限りにおいて限定されないが、２０Å以下であることが好ましく、１．５〜１９Åであることがより好ましく、１．５〜８Åであることがさらに好ましく、７．２Åであることが最も好ましい。
【００６７】
ＰＥＧの分岐原子とは、上記式（Ｉ）における「Ｌ」内の分岐点となる原子、すなわち、分岐原子である。分岐原子としては、炭素原子が好ましい。
【００６８】
ＰＥＧの分岐原子とＰＥＧ官能基との距離とは、上記の分岐原子からＰＥＧ官能基の結合部位（例えば、マレイミド基の５員環窒素原子）の距離を意味する。すなわち、上記式（Ｉ）における、「Ｌ」内の分岐原子から「Ｘ」内の官能基の結合部位までの距離を示す。ＰＥＧの分岐原子とＰＥＧ官能基との距離は、例えば、構造シミュレーションにより算出することができる。また、肝細胞増殖因子又はその活性断片のＰＥＧ修飾体の観点からすると、ＰＥＧの分岐原子とＰＥＧ官能基との距離とは、肝細胞増殖因子又はその活性断片のＰＥＧ修飾体（ホモ二量体）を形成している各単量体（すなわち１分子の肝細胞増殖因子又はその活性断片）のカルボキシル末端間の距離の半分の距離を意味する。例えば、ＰＥＧの分岐原子とＰＥＧ官能基との距離が２０Åの場合は、各単量体のカルボキシル末端間の距離は４０Åである。
【００６９】
ＰＥＧ修飾によりホモ二量体を形成している上記の肝細胞増殖因子又はその活性断片のＰＥＧ修飾体がその生理活性を保持するためには、二量体を形成している各単量体（すなわち１分子の肝細胞増殖因子又はその活性断片）のカルボキシル末端間の距離が、肝細胞増殖因子又はその活性断片の二量体結晶構造を再現することが望ましい。
【００７０】
ヒトＮＫ１は、配列番号６のアミノ酸配列において第１番目の開始メチオニンから数えて第２０６番目のシステイン残基（配列番号２のアミノ酸配列の第１７５番目のシステイン残基に相当する。）が分子内でジスルフィド結合を形成しており、それ以降の第２０７番目のセリン残基から第２１０番目のグルタミン酸まで（配列番号２のアミノ酸配列の第１７６番目のセリン残基から第１７９番目のグルタミン酸に相当する。）が柔軟に可動できると推測して、ヒトＮＫ１二量体結晶構造（ＰＤＢ  ＩＤ：３ＭＫＰ）（Ｃｈｉｒｇａｄｚｅ  Ｄ．Ｙ．ら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、１９９９年、第６巻、第１号、ｐ．７２−７９）に基づき、Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐｕｔｉｎｇ  Ｇｒｏｕｐ社のＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｏｐｅｒａｔｉｎｇ  Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ（ｖｅｒｓｉｏｎ  ２０１３．０８）を用いて、上記第１番目の開始メチオニンから数えて第２０７番目のセリン残基から第２１０番目のグルタミン酸までが柔軟に可動した場合のヒトＮＫ１が二量体を形成した時の各単量体（すなわち１分子のヒトＮＫ１）のカルボキシル末端間の距離を構造シミュレーションしたところ、最小距離３Åであり最大距離３８Åであった（すなわち、ＰＥＧの分岐原子とＰＥＧ官能基との距離の許容される範囲は最小１．５Åであり最大１９Åとなる）。
【００７１】
また、上記の肝細胞増殖因子又はその活性断片のカルボキシル末端にタグ配列又はスペーサー配列等の人工配列を付加した場合には、上記の肝細胞増殖因子又はその活性断片が二量体を形成した時の各単量体のカルボキシル末端間の距離はさらに大きくなってもよい。例えば、６×ＨｉｓタグをヒトＮＫ１のカルボキシル末端に付加した場合、ヒトＮＫ１の配列番号２のアミノ酸配列の第１７６番目のセリン残基から第１７９番目のグルタミン酸（配列番号６のアミノ酸配列において第１番目の開始メチオニンから数えて第２０７番目のセリン残基〜第２１０番目のグルタミン酸）と６×Ｈｉｓタグ部分までが柔軟に可動できると推測して、上記と同様の構造シミュレーションを実施したところ、ヒトＮＫ１二量体のカルボキシル末端間距離は最小距離３Åであり最大距離８８Åであった（すなわち、ＰＥＧの分岐原子とＰＥＧ官能基との距離の許容される範囲は最小１．５Åであり最大４４Åとなる）。
【００７２】
したがって、上記の肝細胞増殖因子又はその活性断片のＰＥＧ修飾体は、二量体を形成した時の各単量体のカルボキシル末端間の距離が３〜３８Åであることがより好ましい。ただし、前述のように、各単量体のカルボキシル末端間の距離は、肝細胞増殖因子又はその活性断片のカルボキシル末端に人工配列を挿入した場合は、実質的に延長することが可能である。人工配列の例は、任意のアミノ酸からなるアミノ酸数２〜３０のペプチド、例えば、上記タグ配列を含むペプチド、例えば、配列番号４のペプチド（ＨＨＨＨＨＨＣ）である。
【００７３】
肝細胞増殖因子又はその活性断片をＰＥＧ修飾して二量体化するために、２個の官能基によりＰＥＧの両末端が活性化された直鎖型ＰＥＧを用いた場合は、官能基間が４０Å以下となるＰＥＧ鎖長であることが望ましいが、この場合のＰＥＧ分子量は１，０００以下となるため、生体内半減期の十分な延長効果は得られない。一方、２個の官能基により活性化されたフォーク型ＰＥＧを用いる本発明の場合は、ＰＥＧの分岐原子とＰＥＧ官能基との距離が好ましい範囲である２０Å以下であったとしても、ＰＥＧ分子量は制限を受けない。また、フォーク型ＰＥＧで肝細胞増殖因子又はその活性断片を修飾すれば、二量体を形成している各単量体（すなわち１分子の肝細胞増殖因子又はその活性断片）のカルボキシル末端間の距離を制御でき、ＰＥＧ修飾後も肝細胞増殖因子又はその活性断片の生理活性の維持が可能となる。
【００７４】
上記の肝細胞増殖因子又はその活性断片のＰＥＧ修飾体の好ましい実施形態は、肝細胞増殖因子又はその活性断片がホモ二量体を形成しており、該ホモ二量体の両方の単量体のカルボキシル末端領域に人工的に挿入したシステイン残基に、ＰＥＧの分岐原子とＰＥＧ官能基との距離が７．２ÅでありＰＥＧ分子量が２０，０００である１分子のフォーク型ＰＥＧが共有結合することにより二量体を形成している、肝細胞増殖因子又はその活性断片のＰＥＧ修飾体である。この肝細胞増殖因子又はその活性断片のＰＥＧ修飾体は、二量体を形成した時の各単量体のカルボキシル末端間の距離が制御されているため、生理活性が保持されており、さらに分子量２０，０００のＰＥＧで修飾されているため、生体内半減期の延長効果を有する。
【００７５】
上記の肝細胞増殖因子又はその活性断片のＰＥＧ修飾体のより好ましい実施形態は、下記式（ＩＶ）で示される。
【化６】
2020158690.tif 000008
肝細胞増殖因子又はその活性断片（式中の「ＨＧＦ」）とマレイミド基（官能基）との結合は、肝細胞増殖因子又はその活性断片のカルボキシル末端領域に人工的に挿入したシステイン残基が結合して、「−Ｓ−」結合している。なお、「−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−」のｎ数はＰＥＧ分子量（上記）により決まる。
【００７６】
＜医薬＞
上記の肝細胞増殖因子又はその活性断片のＰＥＧ修飾体は、肝細胞増殖因子又はその活性断片が本来備えている生理活性を保持し、さらにＰＥＧ修飾による生体内半減期の延長効果を有しているため、医薬（「治療薬」若しくは「医薬組成物」と置き換えることができる。）の有効成分として用いることができる。
【００７７】
上記の肝細胞増殖因子又はその活性断片のＰＥＧ修飾体の生理活性は、培養細胞を用いて簡便に測定することが可能である。例えば、天然型肝細胞増殖因子の作用であるｃ−Ｍｅｔリン酸化誘導作用、細胞増殖作用、細胞遊走作用及び抗アポトーシス作用等を指標とすることができる（Ｒｕｂｉｎ Ｊ．Ｓ.ら、Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２００１年、第２７６巻、３５号、ｐ．３２９７７−３２９８３；Ｌｉｅｔｈａ  Ｄ．ら、Ｔｈｅ  ＥＭＢＯ  Ｊｏｕｒｎａｌ、２００１年、第２０巻、第２０号、ｐ．５５４３−５５５５；Ｌｉｕ Ｙ、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ、１９９９年、第２７７巻、第４号、ｐ．６２４−６３３）。
【００７８】
また上記の肝細胞増殖因子又はその活性断片のＰＥＧ修飾体の生体内半減期は、モデル動物に静脈内投与、腹腔内投与、皮下投与又は皮内投与した際の血中濃度を測定することで算出できる。特に、上記の肝細胞増殖因子又はその活性断片のＰＥＧ修飾体を放射線標識することで簡便な測定が可能である。
【００７９】
上記の肝細胞増殖因子又はその活性断片のＰＥＧ修飾体を有効成分として含有する医薬は、肝細胞増殖因子又はその活性断片の生理活性を利用した種々の疾患の治療に用いることができる。例えば、急性炎症性疾患、慢性炎症性疾患、急性虚血性疾患、慢性虚血性疾患、筋萎縮性側索硬化症、臓器線維症、糖尿病、脊髄損傷、腹膜癒着、移植治療、創傷治癒、神経因性疼痛、等の治療に用いることができる。
【００８０】
上記の医薬は、哺乳動物（例えば、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、イヌ、ネコ、サル、ウシ、ヒツジ又はヒト）、特にヒトに対する有用な治療薬として用いることができる。上記医薬を、ヒトに対する有用な治療薬として用いる場合は、上記の肝細胞増殖因子又はその活性断片は、ヒトの肝細胞増殖因子由来のアミノ酸配列に基づくものであることが好ましい。
【００８１】
上記の医薬の投与形態としては、有効成分である上記の肝細胞増殖因子又はその活性断片のＰＥＧ修飾体を、そのまま又は医薬として許容される担体を配合して、経口的又は非経口的に投与することができる。皮下、筋肉内又は静脈内注射により投与することが好ましい。
【００８２】
上記の医薬の経口投与のための剤型としては、例えば、錠剤、丸剤、カプセル剤、顆粒剤、シロップ剤、乳剤又は懸濁剤が挙げられ、これらは、公知の方法によって製造することができ、製剤分野において通常用いられる担体又は賦形剤及び必要に応じて添加剤を含有するものである。錠剤用の担体及び賦形剤としては、例えば、ラクトース、マルトース、サッカロース、澱粉又はステアリン酸マグネシウムが挙げられる。添加剤としては、結合剤、崩壊剤、保存剤、遅延放出剤、着色剤、風味剤、安定化剤、溶解剤、増粘剤、乳化剤などを挙げることができる。
【００８３】
上記の医薬の非経口投与のための剤型としては、例えば、注射剤、点眼剤、軟膏剤、湿布剤、坐薬、経鼻吸収剤、経肺吸収剤、経皮吸収剤又は局所徐放剤が挙げられ、これらは、公知の方法によって製造することができる。溶液製剤は、例えば、有効成分である上記の肝細胞増殖因子又はその活性断片のＰＥＧ修飾体を、注射剤に用いられる無菌の水溶液に溶解又は抽出液に懸濁及び乳化して、リポソームに包埋させた状態で調製することができる。固体製剤は、例えば、有効成分である上記の肝細胞増殖因子又はその活性断片のＰＥＧ修飾体に、マンニトール、トレハロース、ソルビトール、ラクトース又はグルコース等を賦形剤として加え、凍結乾燥物として調製することができる。さらにこれを粉体化して用いることもできる。また、これら粉体をポリ乳酸やグリコール酸等と混合し固体化して用いることもできる。ゲル化剤は、例えば、有効成分である上記の肝細胞増殖因子又はその活性断片のＰＥＧ修飾体を、グリセリン、ＰＥＧ、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、ヒアルロン酸若しくはコンドロイチン硫酸等の増粘剤又は多糖に溶解して調製することができる。また、必要に応じて、製剤に上記の添加剤を加えることができる。
【００８４】
上記の医薬は、患者の年齢、体重、投与対象疾患、症状、投与形態、投与経路、ＰＥＧの分子量などに応じて、適宜決定されるが、一般的には０．００１ｍｇ〜１００ｍｇ／ｋｇ／回、好ましくは０．０１ｍｇ〜１０ｍｇ／ｋｇ／回で１回／月〜１回／日、好ましくは１回／月〜１回／週の範囲で投与されうる。
以下の実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明の技術的範囲は例示として提供する該実施例によって制限されないものとする。
【実施例】
【００８５】
（実施例１）  ヒトＮＫ１タンパク質の発現
市販の酵母発現キットＭｕｌｔｉ−Ｃｏｐｙ  Ｐｉｃｈｉａ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｋｉｔ（インビトロジェン）を用いて、組換えヒトＮＫ１タンパク質の発現を実施した。【００８６】
分泌シグナル配列を除去したヒトＮＫ１タンパク質のカルボキシル末端に６×Ｈｉｓタグ及びシステイン残基を順に付加（すなわち、ＨＨＨＨＨＨＣ（配列番号４）を付加）したヒトＮＫ１タンパク質（以下、Ｈｉｓ−Ｃｙｓ付加ヒトＮＫ１）をコードするＤＮＡを、Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ  ＨＤ  ｃｌｏｎｉｎｇ  ｋｉｔ（タカラバイオ）を用いて、Ｍｕｌｔｉ−Ｃｏｐｙ  Ｐｉｃｈｉａ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｋｉｔ（インビトロジェン）に添付のｐＰＩＣ９Ｋ発現ベクターに挿入した。作製した発現用プラスミドを制限酵素により線状化した後、上記ｋｉｔに添付のＧＳ１１５株にエレクトロポレーション法により遺伝子導入した。【００８７】
遺伝子導入後の菌体を、ヒスチジン欠損寒天培地で第１段階選択培養した後、生育したコロニーを４ｍｇ／ｍＬ  Ｇｅｎｅｔｉｃｉｎ（登録商標）（ロシュ）含有寒天培地で第２段階選択培養することで、目的遺伝子がマルチコピー導入された酵母株を単離した。単離株をＢＭＧＹ培地により３０℃恒温漕内で前培養した後、０．５％メタノールを含有したＢＭＭＹ培地に移行し、２０℃恒温漕内で３日間本培養することで目的タンパク質であるＨｉｓ−Ｃｙｓ付加ヒトＮＫ１の発現を誘導した。【００８８】
（実施例２）  ヒトＮＫ１タンパク質の精製
実施例１で得た酵母培養上清を遠心清浄化した後、ニッケルレジン及びヘパリンレジンを用いて上清中のＨｉｓ−Ｃｙｓ付加ヒトＮＫ１を精製した。【００８９】
予めＰＢＳ（−）で平衡化させたＨｅｐａｒｉｎレジン（ＧＥヘルスケア）に、遠心清浄化した酵母培養上清液を通過させることでヘパリンレジンにＨｉｓ−Ｃｙｓ付加ヒトＮＫ１を結合させた。続けて、ＰＢＳ（−）に含まれるＮａＣｌ濃度を１５０ｍＭ〜２０００ｍＭの濃度範囲で変化させたバッファーをＮａＣｌ濃度の昇順に通過させ、各溶出画分を得た。各溶出画分をＳＤＳ電気泳動し、Ｈｉｓ−Ｃｙｓ付加ヒトＮＫ１溶出画分を確認した。【００９０】
次に、予め３００ｍＭ  ＮａＣｌ含有ＰＢＳ（−）で平衡化させたｃＯｍｐｌｅｔｅ Ｈｉｓ−Ｔａｇ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｒｅｓｉｎ (Ｒｏｃｈｅ)に、ヘパリンレジン精製で得たＨｉｓ−Ｃｙｓ付加ヒトＮＫ１溶出画分を通過させることでレジンにＨｉｓ−Ｃｙｓ付加ヒトＮＫ１を結合させた。続けて、３００ｍＭ  ＮａＣｌ含有ＰＢＳ（−）にイミダゾール（０ｍＭ〜５００ｍＭの濃度範囲）を添加したバッファーを、イミダゾール濃度の昇順に通過させ、各溶出画分を得た。各溶出画分をＳＤＳ電気泳動し、Ｈｉｓ−Ｃｙｓ付加ヒトＮＫ１溶出画分を確認した。得られたＨｉｓ−Ｃｙｓ付加ヒトＮＫ１溶出画分はＡｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ−１５（ＭＷＣＯ＝１０，０００；メルクミリポア）を用いて濃縮し、目的タンパク質であるＨｉｓ−Ｃｙｓ付加ヒトＮＫ１を得た。【００９１】
（実施例３）ＰＥＧ修飾ＮＫ１二量体の合成
２分子のＨｉｓ−Ｃｙｓ付加ヒトＮＫ１のカルボキシル末端に１分子のＰＥＧが共有結合することにより二量体化されたＮＫ１（以下、ＰＥＧ修飾ＮＫ１二量体）を、次の方法により合成した。【００９２】
実施例２で作製したＨｉｓ−Ｃｙｓ付加ヒトＮＫ１を１．０ｍｇ／ｍＬに調整した溶液（以下、ＮＫ１溶液）（組成：１．０ｍｏｌ／Ｌ  ＮａＣｌ含有ＰＢＳ（−）、ｐＨ７．４）に、３８ｍｇ／ｍＬの２−メルカプトエチルアミン（以下、２−ＭＥＡ）溶液を０．０７倍量加えて、３７℃で３０分間インキュベーションした。インキュベーションしたＮＫ１溶液を、リン酸緩衝液（０．３ｍｏｌ／Ｌ  ＮａＣｌ、０．００２ｍｏｌ／Ｌ  ＥＤＴＡ、０．１ｍｏｌ／Ｌ  リン酸（ｐＨ６．０））で平衡化したゲルろ過カラム（Ｚｅｂａ  ｄｅｓａｌｔ  ｓｐｉｎ  ｃｏｌｕｍｎ  ７ＫＤａ；サーモフィッシャーサイエンティフィック）に通過させ、該溶液から２−ＭＥＡを除去した。【００９３】
２−ＭＥＡ除去処理後のＮＫ１溶液に、フォーク型ＰＥＧ（ＳＵＮＢＲＩＧＨＴ  ＰＴＥ２−２００ＭＡ２、２個の官能基、ＰＥＧ官能基＝マレイミド基、ＰＥＧの分岐原子とＰＥＧ官能基との距離＝７．２Å、分子量２０，０００；油化産業株式会社）又は、直鎖型ＰＥＧ（ＳＵＮＢＲＩＧＨＴ  ＤＥ−１００ＭＡ、２個の官能基、ＰＥＧ官能基＝マレイミド基、ＰＥＧ官能基間の距離＝約４００Å、分子量１０，０００；油化産業株式会社）を、反応モル比が５：１（ＰＥＧ：Ｈｉｓ−Ｃｙｓ付加ヒトＮＫ１）となるように添加した。２５℃で１６〜１８時間反応させ、ＰＥＧ修飾ＮＫ１二量体を作製した。なお、フォーク型ＰＥＧで修飾したＰＥＧ修飾ＮＫ１二量体をフォーク型ＰＥＧ修飾ＮＫ１二量体とよび、直鎖型ＰＥＧで修飾したＰＥＧ修飾ＮＫ１二量体を直鎖型ＰＥＧ修飾ＮＫ１二量体とよぶ。【００９４】
ＰＥＧ修飾ＮＫ１二量体を含む反応後の溶液を、ＮａＣｌ不含のＰＢＳ（−）で１０倍希釈した後、ＳＰ担体（ＳＰ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ６  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ；ＧＥヘルスケア）に通過させ、該溶液から未反応のＰＥＧ試薬を除去した。ＳＰ担体に吸着したＰＥＧ修飾ＮＫ１二量体を１．０ｍｏｌ／Ｌ  ＮａＣｌ含有ＰＢＳ（−）で溶出した後、Ａｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ−３０（ＭＷＣＯ＝３０，０００；メルクミリポア）により濃縮した。【００９５】
図１に、Ｈｉｓ−Ｃｙｓ付加ヒトＮＫ１及びフォーク型ＰＥＧ修飾ＮＫ１二量体のＳＤＳ電気泳動像を示す。【００９６】
フォーク型ＰＥＧ修飾ＮＫ１二量体又は直鎖型ＰＥＧ修飾ＮＫ１二量体は、２分子のＨｉｓ−Ｃｙｓ付加ヒトＮＫ１のカルボキシル末端に存在する人工的に付加したシステイン残基に１分子のＰＥＧが共有結合して二量体化している。フォーク型ＰＥＧ修飾ＮＫ１二量体は以下の式（Ｖ）で示され、直鎖型ＰＥＧ修飾ＮＫ１二量体は下記の式（ＶＩ）で示される
【化７】
2020158690.tif 000009
【００９７】
式中、「Ｃｙｓ−６×Ｈｉｓ−ＮＫ１」は、Ｈｉｓ−Ｃｙｓ付加ヒトＮＫ１を示し、ヒトＮＫ１カルボキシル末端に人工的に挿入したシステイン残基のチオール基（−ＳＨ）とマレイミド基（官能基）とが結合して、「−Ｓ−」結合している。なお、「−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−」のｎ数はＰＥＧ分子量により決まる。
【化８】
2020158690.tif 000010
【００９８】
式中、「Ｃｙｓ−６×Ｈｉｓ−ＮＫ１」及び「ＮＫ１−６×Ｈｉｓ−Ｃｙｓ」は、Ｈｉｓ−Ｃｙｓ付加ヒトＮＫ１を示し、ヒトＮＫ１カルボキシル末端に人工的に挿入したシステイン残基のチオール基（−ＳＨ）とマレイミド基（官能基）とが結合して、「−Ｓ−」結合している。なお、「−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−」のｎ数はＰＥＧ分子量により決まる。【００９９】
（実施例４）  ＰＥＧ修飾ＮＫ１二量体の生理活性
ＰＥＧ修飾ＮＫ１二量体の生理活性を、ヒト肺上皮細胞株Ａ５４９の細胞表面に存在するＨＧＦ受容体のリン酸化誘導活性を指標として、Ｉｎ−Ｃｅｌｌ  ＥＬＩＳＡ法により評価した。なお、生理活性の比較対照であるＨｉｓ−Ｃｙｓ付加ヒトＮＫ１は、予め１μｇ／ｍＬブタ精製ヘパリン（シグマ）含有ＭＥＭ培地と混和することで、ヘパリン依存的な二量体化を誘導し、二量体を形成させた（以下、ヘパリン二量体化ＮＫ１）。【０１００】
Ａ５４９細胞を１０％ＦＣＳ含有ＭＥＭ培地に懸濁して、イメージング用９６ウェルプレート（ベクトン・ディッキンソン）に１．５×１０４／ウェルの密度で播種し、一昼夜培養した。細胞が７０％コンフルエント程度となった後、培地を血清不含ＭＥＭ培地に交換し、１６時間以上培養することにより血清飢餓状態とした。血清飢餓状態にある細胞に、ヘパリン二量体化ＮＫ１、フォーク型ＰＥＧ修飾ＮＫ１二量体又は直鎖型ＰＥＧ修飾ＮＫ１二量体（１０又は２５０ｎｇ／ｍＬ）を添加後、３７℃にて１０分間反応させた。【０１０１】
細胞を４％ホルマリン含有ＰＢＳ（−）により固定し、続けて０．３％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ、０．６％過酸化水素含有ＰＢＳ（−）により細胞膜を透過処理後、１０％ＢＳＡにより細胞をブロッキング処理した。ブロッキング処理後の細胞に、一次抗体である抗リン酸化ｃ−Ｍｅｔ抗体及び二次抗体であるＨＲＰ標識二次抗体を加えて反応させた後、１×ＱｕａｎｔａＲｅｄ  Ｅｎｈａｎｃｅｄ  Ｃｈｅｍｉｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ＨＲＰ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（サーモフィッシャーサイエンティフィック）を添加した。室温でインキュベーション後、波長５９０ｎｍにおける蛍光強度（ＲＦＵ）をプレートリーダー（Ｅｎｖｉｓｉｏｎ；パーキンエルマー）を用いて測定し、ＨＧＦ受容体リン酸化誘導量とした。【０１０２】
その結果を図２に示す。図２の縦軸はＨＧＦ受容体リン酸化誘導量を表す蛍光強度（ＲＦＵ）を示し、横軸はヘパリン二量体化ＮＫ１、フォーク型ＰＥＧ修飾ＮＫ１二量体又は直鎖型ＰＥＧ修飾ＮＫ１二量体の処理濃度（ｎｇ／ｍＬ）を示す。【０１０３】
フォーク型ＰＥＧ修飾ＮＫ１二量体はヘパリン二量体化ＮＫ１と同等の生理活性を保持していたが、直鎖型ＰＥＧ修飾ＮＫ１二量体はヘパリン二量体化ＮＫ１と比較して生理活性が大きく減弱していた。したがって、ＮＫ１の生理活性を保持しながら、ＰＥＧ修飾により二量体化させるには、ＮＫ１のカルボキシル末端間の距離を制御できるフォーク型ＰＥＧを用いることが重要であることが示された。【０１０４】
（実施例５）フォーク型ＰＥＧ修飾ＮＫ１二量体の血中動態
フォーク型ＰＥＧ修飾ＮＫ１二量体の血中動態を、［１２５Ｉ］標識したフォーク型ＰＥＧ修飾ＮＫ１二量体をマウスに尾静脈内投与することにより評価した。なお、血中動態の比較対照として、Ｈｉｓ−Ｃｙｓ付加ヒトＮＫ１を用いた。【０１０５】
Ｈｉｓ−Ｃｙｓ付加ヒトＮＫ１又はフォーク型ＰＥＧ修飾ＮＫ１二量体の［１２５Ｉ］標識は、Ｎａ［１２５Ｉ］（Ｉｏｄｉｎｅ−１２５  Ｒａｄｉｏｎｕｃｌｉｄｅ；パーキンエルマー）を用いてＩＯＤＯ−ＢＥＡＤＳ法により行った。なお、ＴＣＡ沈殿後の上清及び沈査の放射線活性を測定し、投与に用いるタンパク質の［１２５Ｉ］標識率が９０％以上であることを確認した。【０１０６】
［１２５Ｉ］標識したＨｉｓ−Ｃｙｓ付加ヒトＮＫ１又はフォーク型ＰＥＧ修飾ＮＫ１二量体を、Ｃｒｌｊ：ＣＤ１（ＩＣＲ）系雄性マウスに尾静脈内投与（２５μｇ／０．５ＭＢｑ／ｋｇ）し、放射線活性を指標に投与後５分間〜２４時間の血清中濃度を測定した。【０１０７】
その結果を図３に示す。図３の縦軸はマウス血清中濃度（ｎｇ  ｅｑ．／ｍＬ）を示し、横軸は投与後の時間（ｈ）を示す。点線は、［１２５Ｉ］標識したＨｉｓ−Ｃｙｓ付加ヒトＮＫ１の結果を示し、実線は［１２５Ｉ］標識したフォーク型ポリエチレングリコール修飾ＮＫ１二量体の結果を示す。【０１０８】
フォーク型ＰＥＧ修飾ＮＫ１二量体は、投与後１時間まではＨｉｓ−Ｃｙｓ付加ヒトＮＫ１とほぼ同様の濃度推移を示したが、投与後４時間以降ではＨｉｓ−Ｃｙｓ付加ヒトＮＫ１と比較して血清中濃度の減少が緩和されていた。さらに、投与後２４時間ではＨｉｓ−Ｃｙｓ付加ヒトＮＫ１と比較して、約４．２倍濃度のフォーク型ＰＥＧ修飾ＮＫ１二量体が血清中に認められた。また、半減期（ｔ１／２）はＨｉｓ−Ｃｙｓ付加ヒトＮＫ１投与では７．９時間であったが、フォーク型ＰＥＧ修飾ＮＫ１二量体では１５．４時間と約２倍に延長された。したがって、フォーク型ＰＥＧ修飾ＮＫ１二量体は、ＰＥＧ修飾の効果である生体内半減期の延長効果も示すことが示された。
【産業上の利用可能性】
【０１０９】
本発明の肝細胞増殖因子又はその活性断片のポリエチレングリコール修飾体は、生体内半減期が延長されるとともにその生理活性が保持されているため、非修飾体よりも少ない投与頻度でその薬効を発揮する医薬として利用できる。
【配列表フリーテキスト】
【０１１０】
配列番号１：分泌シグナル配列を含まないヒトＨＧＦのアミノ酸配列
配列番号２：分泌シグナル配列を含まないヒトＮＫ１のアミノ酸配列
配列番号３：ヒトＨＧＦ由来の分泌シグナル配列
配列番号４：ヒトＮＫ１タンパク質のカルボキシル末端に付加した６×Ｈｉｓタグ及びシステイン残基のアミノ酸配列
配列番号５：ヒトＨＧＦの塩基配列
配列番号６：ヒトＨＧＦのアミノ酸配列
【図１】
2020158690.tif 000013
【図２】
2020158690.tif 000014
【図３】
2020158690.tif 000015
【配列表】
2020158690000001.app
【国際調査報告】
2020158690.tif 000016
2020158690.tif 000017
2020158690.tif 000018
2020158690.tif 000019