(57)【要約】  抗体またはその抗原結合断片に対して、所望の抗原に対する結合性を付加可能な複合体化タンパク質を提供する。  本発明の複合体化タンパク質は、第１の抗原結合ドメインと、第２の抗原結合ドメインとを含み、前記第１の抗原結合ドメインは、免疫グロブリンに結合可能であり、前記第２の抗原結合ドメインは、所望の抗原に結合可能である。
2020166714.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
第１の抗原結合ドメインと、第２の抗原結合ドメインとを含み、
前記第１の抗原結合ドメインは、免疫グロブリンに結合可能であり、
前記第２の抗原結合ドメインは、所望の抗原に結合可能である、複合体化タンパク質。
【請求項２】
前記第１の抗原結合ドメインは、免疫グロブリンの定常（Ｆｃ）領域に結合可能である、請求項１記載の複合体化タンパク質。
【請求項３】
前記第１の抗原結合ドメインは、Ｆｃ領域のＥＵナンバリングで表される部位のうち、２３７〜４４７位の領域内にエピトープを有する、請求項２記載の複合体化タンパク質。
【請求項４】
前記第１の抗原結合ドメインは、第１の重鎖可変領域および第１の軽鎖可変領域を含む、請求項１から３のいずれか一項に記載の複合体化タンパク質。
【請求項５】
前記第１の重鎖可変領域は、重鎖相補性決定領域（ＣＤＲＨ）１、ＣＤＲＨ２、およびＣＤＲＨ３を含み、
前記第１の軽鎖可変領域は、軽鎖相補性決定領域（ＣＤＲＬ）１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３を含み、
ＣＤＲＨ１が、下記（H1-A）のアミノ酸配列を含むポリペプチドであり、
ＣＤＲＨ２が、下記（H2-A）のアミノ酸配列を含むポリペプチドであり、
ＣＤＲＨ３が、下記（H3-A）のアミノ酸配列を含むポリペプチドであり、
ＣＤＲＬ１が、下記（L1-A）のアミノ酸配列を含むポリペプチドであり、
ＣＤＲＬ２が、下記（L2-A）のアミノ酸配列を含むポリペプチドであり、
ＣＤＲＬ３が、下記（L3-A）のアミノ酸配列を含むポリペプチドである、請求項４記載の複合化タンパク質：
（H1-A）下記（H1-A1）、（H1-A2）または（H1-A3）のアミノ酸配列
（H1-A1）配列番号１のアミノ酸配列
（H1-A2）配列番号１のアミノ酸配列に対して、８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列
（H1-A3）配列番号１のアミノ酸配列において、１個または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列；
（H2-A）下記（H2-A1）、（H2-A2）または（H2-A3）のアミノ酸配列
（H2-A1）配列番号２のアミノ酸配列
（H2-A2）配列番号２のアミノ酸配列に対して、８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列
（H2-A3）配列番号２のアミノ酸配列において、１個または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列；
（H3-A）下記（H3-A1）、（H3-A2）または（H3-A3）のアミノ酸配列
（H3-A1）配列番号３のアミノ酸配列
（H3-A2）配列番号３のアミノ酸配列に対して、８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列
（H3-A3）配列番号３のアミノ酸配列において、１個または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列；
（L1-A）下記（L1-A1）、（L1-A2）または（L1-A3）のアミノ酸配列
（L1-A1）配列番号４のアミノ酸配列
（L1-A2）配列番号４のアミノ酸配列に対して、８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列
（L1-A3）配列番号４のアミノ酸配列において、１個または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列；
（L2-A）下記（L2-A1）、（L2-A2）または（L2-A3）のアミノ酸配列
（L2-A1）配列番号５のアミノ酸配列
（L2-A2）配列番号５のアミノ酸配列に対して、８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列
（L2-A3）配列番号５のアミノ酸配列において、１個または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列；
（L3-A）下記（L3-A1）、（L3-A2）または（L3-A3）のアミノ酸配列
（L3-A1）配列番号６のアミノ酸配列
（L3-A2）配列番号６のアミノ酸配列に対して、８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列
（L3-A3）配列番号６のアミノ酸配列において、１個または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列。
【請求項６】
前記第１の抗原結合ドメインは、一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）を含む、請求項１から５のいずれか一項に記載の複合体化タンパク質。
【請求項７】
前記所望の抗原は、Ｔ細胞に発現する抗原である、請求項１から６のいずれか一項に記載の複合体化タンパク質。
【請求項８】
前記Ｔ細胞に発現する抗原は、ＣＤ３である、請求項７記載の複合体化タンパク質。
【請求項９】
前記第２の抗原結合ドメインは、第２の重鎖可変領域および第２の軽鎖可変領域を含む、請求項１から８のいずれか一項に記載の複合体化タンパク質。
【請求項１０】
前記第２の重鎖可変領域は、重鎖相補性決定領域（ＣＤＲＨ）１、ＣＤＲＨ２、およびＣＤＲＨ３を含み、
前記第２の軽鎖可変領域は、軽鎖相補性決定領域（ＣＤＲＬ）１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３を含み、
ＣＤＲＨ１が、下記（H1-B）のアミノ酸配列を含むポリペプチドであり、
ＣＤＲＨ２が、下記（H2-B）のアミノ酸配列を含むポリペプチドであり、
ＣＤＲＨ３が、下記（H3-B）のアミノ酸配列を含むポリペプチドであり、
ＣＤＲＬ１が、下記（L1-B）のアミノ酸配列を含むポリペプチドであり、
ＣＤＲＬ２が、下記（L2-B）のアミノ酸配列を含むポリペプチドであり、
ＣＤＲＬ３が、下記（L3-B）のアミノ酸配列を含むポリペプチドである、請求項９記載の複合化タンパク質：
（H1-B）下記（H1-B1）、（H1-B2）または（H1-B3）のアミノ酸配列
（H1-B1）配列番号７のアミノ酸配列
（H1-B2）配列番号７のアミノ酸配列に対して、８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列
（H1-B3）配列番号７のアミノ酸配列において、１個または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列；
（H2-B）下記（H2-B1）、（H2-B2）または（H2-B3）のアミノ酸配列
（H2-B1）配列番号８のアミノ酸配列
（H2-B2）配列番号８のアミノ酸配列に対して、８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列
（H2-B3）配列番号８のアミノ酸配列において、１個または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列；
（H3-B）下記（H3-B1）、（H3-B2）または（H3-B3）のアミノ酸配列
（H3-B1）配列番号９のアミノ酸配列
（H3-B2）配列番号９のアミノ酸配列に対して、８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列
（H3-B3）配列番号９のアミノ酸配列において、１個または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列；
（L1-B）下記（L1-B1）、（L1-B2）または（L1-B3）のアミノ酸配列
（L1-B1）配列番号１０のアミノ酸配列
（L1-B2）配列番号１０のアミノ酸配列に対して、８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列
（L1-B3）配列番号１０のアミノ酸配列において、１個または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列；
（L2-B）下記（L2-B1）、（L2-B2）または（L2-B3）のアミノ酸配列
（L2-B1）配列番号１１のアミノ酸配列
（L2-B2）配列番号１１のアミノ酸配列に対して、８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列
（L2-B3）配列番号１１のアミノ酸配列において、１個または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列；
（L3-B）下記（L3-B1）、（L3-B2）または（L3-B3）のアミノ酸配列
（L3-B1）配列番号１２のアミノ酸配列
（L3-B2）配列番号１２のアミノ酸配列に対して、８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列
（L3-B3）配列番号１２のアミノ酸配列において、１個または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列。
【請求項１１】
前記第２の抗原結合ドメインは、一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）を含む、請求項１から１０のいずれか一項に記載の複合体化タンパク質。
【請求項１２】
前記免疫グロブリンと架橋可能な光反応性架橋部を含む、請求項１から１１のいずれか一項に記載の複合体化タンパク質。
【請求項１３】
前記第１の抗原結合ドメインを構成するアミノ酸が、前記光反応性架橋部として、光活性型の反応性官能基を有する、請求項１２記載の複合体化タンパク質。
【請求項１４】
標的抗原に結合可能な抗体またはその抗原結合断片と、複合体化タンパク質とを含み、
前記複合体化タンパク質は、請求項１から１３のいずれか一項の複合体化タンパク質であり、
前記複合体化タンパク質は、その第１の抗原結合ドメインより前記抗体またはその抗原結合断片と結合し、複合体化している、抗体複合体。
【請求項１５】
前記抗体またはその抗原結合断片と、前記複合体化タンパク質とは、架橋されている、請求項１４記載の抗体複合体。
【請求項１６】
前記標的抗原は、疾患に関連する抗原である、請求項１４または１５記載の抗体複合体。
【請求項１７】
前記標的抗原は、腫瘍抗原である、請求項１４から１６のいずれか一項に記載の抗体複合体。
【請求項１８】
請求項１から１３のいずれか一項に記載の複合体化タンパク質を含む、医薬組成物。
【請求項１９】
標的抗原に結合可能な抗体またはその抗原結合断片を含む、請求項１８記載の医薬組成物。
【請求項２０】
前記複合体化タンパク質は、その第１の抗原結合ドメインにより前記抗体またはその抗原結合断片と結合し、複合体化している、請求項１９記載の医薬組成物。
【請求項２１】
請求項１から１３のいずれか一項に記載の複合体化タンパク質をコードする、核酸。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、複合体化タンパク質、抗体複合体、医薬組成物、および核酸に関する。
【背景技術】
【０００２】
多重特異性抗体では、１つの抗体分子が、異なる抗原に対して結合性を示す抗原結合ドメインを有する。前記多重特異性抗体を、腫瘍抗原とＣＤ３εとに結合する抗体とすることにより、Ｔ細胞を介した細胞傷害を誘導できることから、前記多重特異性抗体は、抗癌剤としての臨床開発が進められている。また、前記多重特異性抗体によれば、複数のタンパク質を近傍に配置することも可能になるため、血液凝固因子をターゲットとした血友病治療薬が開発され、販売されている。【０００３】
しかしながら、多重特異性抗体は、その製造効率が極めて低く、またその製造が困難であるという問題がある。例えば、二重特異性抗体は、２種類の重鎖（Ｈ鎖）および２種類の軽鎖（Ｌ鎖）から構成される。また、２種類のＨ鎖および２種類のＬ鎖を発現させ、前記二重特異性抗体を製造する場合、発現する抗体における２つのＨ鎖および２つのＬ鎖の組合せは１０通りとなり、目的とする二重特異性抗体以外に９種類もの不要な抗体が製造されることとなる（特許文献１）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】国際公開第２０１３／０６５７０８号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
そこで、本発明は、抗体またはその抗原結合断片に対して、所望の抗原に対する結合性を付加可能な複合体化タンパク質の提供を目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
前記目的を達成するため、本発明の複合体化タンパク質は、第１の抗原結合ドメインと、第２の抗原結合ドメインとを含み、
前記第１の抗原結合ドメインは、免疫グロブリンに結合可能であり、
前記第２の抗原結合ドメインは、所望の抗原に結合可能である。【０００７】
本発明の抗体複合体は、標的抗原に結合可能な抗体またはその抗原結合断片と、複合体化タンパク質とを含み、
前記複合体化タンパク質は、前記本発明の複合体化タンパク質であり、
前記複合体化タンパク質は、その第１の抗原結合ドメインより前記抗体またはその抗原結合断片と結合し、複合体化している。【０００８】
本発明の医薬組成物は、前記本発明の複合体化タンパク質を含む。【０００９】
本発明の核酸は、前記本発明の複合体化タンパク質をコードする。
【発明の効果】
【００１０】
本発明の複合体化タンパク質によれば、抗体またはその抗原結合断片に対して、所望の抗原に対する結合性を付加できる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】図１は、本発明の一例を示す模式図であり、（Ａ）は、本発明の複合体化タンパク質の一例を示す模式図であり、（Ｂ）は、本発明の複合体化タンパク質と免疫グロブリンとの複合体の複合体の形成および得られた抗体複合体一例を示す模式図である。
【図２】図２は、実施例１における抗体複合体と細胞との結合を示すヒストグラムである。
【図３】図３は、実施例１におけるサイトカイン産生細胞の割合を示すグラフである。
【図４】図４は、実施例１におけるサイトカイン産生細胞の割合を示すグラフである。
【図５】図５は、実施例２における抗体複合体と細胞との結合を示すヒストグラムである。
【図６】図６は、実施例２におけるサイトカイン産生細胞の割合を示すグラフである。
【図７】図７は、実施例２におけるサイトカイン産生細胞の割合を示すグラフである。
【図８】図８は、実施例３におけるＣＦＳＥが減衰している細胞の割合を示すグラフである。
【図９】図９は、実施例３における活性化しているＣＤ４＋Ｔ細胞（ＣＤ４＋ＣＤ２５＋）および制御性Ｔ細胞（ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＣＤ４５ＲＡ＋ＦｏｘＰ３＋）の割合を示すグラフである。
【図１０】図１０は、実施例４におけるＩＦＮ−γの産生細胞の割合およびＣＤ１０７ａの発現上昇の割合を示すグラフである。
【図１１】図１１は、実施例４におけるＩＦＮ−γの産生細胞の割合およびＣＤ１０７ａの発現上昇の割合を示すグラフである。
【図１２】図１２は、実施例４におけるＮＫ細胞およびＴ細胞の活性化を示すグラフである。
【図１３】図１３は、実施例４におけるＮＫ細胞およびＴ細胞の活性化を示すグラフである。
【図１４】図１４は、実施例４におけるＮＫ細胞およびＴ細胞の活性化を示すグラフである。
【図１５】図１５は、実施例４における細胞傷害性を示すグラフである。
【図１６】図１６は、実施例５における相対的な産生細胞の割合を示すグラフである。
【図１７】図１７は、実施例６における生体における抗腫瘍活性に関する図である。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
＜複合体化タンパク質＞
本発明の複合体化タンパク質は、前述のように、第１の抗原結合ドメインと（以下、「第１の結合ドメイン」ともいう）、第２の抗原結合ドメイン（以下、「第２の結合ドメイン」ともいう）とを含み、前記第１の抗原結合ドメインは、免疫グロブリンに結合可能であり、前記第２の抗原結合ドメインは、所望の抗原に結合可能である。本発明の複合体化タンパク質は、前記第１の抗原結合ドメインは、免疫グロブリンに結合可能であり、前記第２の抗原結合ドメインは、所望の抗原に結合可能であることが特徴であり、その他の構成および条件は、特に制限されない。
【００１３】
本発明の複合体化タンパク質は、図１（Ａ）に示すように、前記第１の結合ドメインにより、免疫グロブリン、すなわち、抗体またはその抗原結合断片と結合できる。また、本発明の複合体化タンパク質は、前記第２の抗原結合ドメインにより、所望の抗原に結合できる。このため、図１（Ｂ）に示すように、本発明の複合体化タンパク質を免疫グロブリンと接触させると、前記複合体化タンパク質が免疫グロブリンと結合することにより、複合体化する。この結果、形成された抗体複合体は、抗原結合ドメインとして、免疫グロブリンの抗原結合ドメインに加え、前記複合体化タンパク質の第２の結合ドメインを含む。すなわち、前記複合体化タンパク質は、前記免疫グロブリンと複合体化することにより、前記免疫グロブリンに対して、前記第２の結合ドメインという新たな抗原結合ドメインを付与できる。また、前記第２の結合ドメインが結合する対象は、所望の抗原とできる。このため、本発明の複合体化タンパク質によれば、抗体またはその抗原結合断片に対して、所望の抗原に対する結合性を付加できる。したがって、本発明の複合体化タンパク質によれば、多重特異性抗体と同様の機能を有する抗体複合体を簡便に製造できる。また、本発明の複合体化タンパク質では、前記第２の結合ドメインの結合対象、すなわち、前記所望の抗原を制御し、前記免疫グロブリンと組合せて使用することで前述の多重特異性抗体と同様の機能を発揮できる。具体例として、前記第２の結合ドメインが結合する所望の抗原をＣＤ３等のＴ細胞上に発現する抗原とし、前記免疫グロブリンの結合ドメインの結合対象を腫瘍抗原とすることにより、前記複合体化タンパク質と前記免疫グロブリンとの抗体複合体は、例えば、がん細胞に結合し、かつＴ細胞とＮＫ細胞とをリクルートできるため、多重特異性抗体を含む抗癌剤と同様の機能を発揮する抗癌剤として使用できる。また、前記抗体複合体は、前記第２の結合ドメインの結合対象と、前記免疫グロブリンの結合対象とを近傍に配置することができ、前記抗体複合体は、例えば、前述の血友病治療薬と同様の機能を発揮する血友病治療薬として使用できる。前記抗体複合体は、前記第２の結合ドメインの結合対象と、前記免疫グロブリンの結合対象とを近傍に配置することができるため、例えば、複合体を形成している受容体等を離隔し、受容体を介したシグナルを抑制することができる。さらに、前記抗体複合体は、例えば、複数の抗原に結合可能であるため、複数の抗原の除去にも使用でき、例えば、疾患の原因物質となる抗原の除去にも使用できる。
【００１４】
本発明において、「ドメイン」は、例えば、ポリペプチドにおいて、立体構造または機能的にまとまった領域を意味する。前記ポリペプチドは、例えば、１０アミノ酸以上の長さを有するペプチドがあげられる。
【００１５】
本発明において、「結合可能」は、結合物である抗体等が、前記結合物に結合される結合対象物に対して実際に結合することを意味してもよいし、分子ドッキング法等を用いたシミュレーションにおいて結合することを意味してもよいが、好ましくは、前者である。前記結合物と前記結合対象物との結合は、例えば、タンパク質間相互作用の解析方法を利用して検出でき、例えば、共免疫沈降、プルダウンアッセイ、ＥＬＩＳＡ法、フローサイトメトリー等の抗体抗原反応を利用した方法を利用して検出できる。具体例として、前記結合物と前記結合対象物との結合は、例えば、前記結合対象物を発現する細胞と、標識化した結合物とを接触後、前記細胞において、標識を検出することにより検出できる。
【００１６】
本発明において、前記免疫グロブリンは、抗体でもよいし、その抗原結合断片でもよいが、好ましくは、定常領域（Ｆｃ領域）を含む抗体またはその抗原結合断片であり、生体における安定性が高いことから、より好ましくは、抗体である。前記免疫グロブリンは、例えば、可溶型免疫グロブリンということもできる。以下、特に言及しない限り、本発明の複合体化タンパク質の結合対象である抗体またはその抗原結合断片について、「抗体等」ともいう。前記抗体等の結合対象は、特に制限されず、任意の抗原とできる。前記抗体等は、例えば、１つまたは複数の抗原に結合可能である。後者の場合、前記抗体等は、例えば、二重特異性抗体等の多重特異性抗体またはその抗原結合断片ということもできる。前記抗体の種類は、例えば、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、またはＩｇＭがあげられる。ＩｇＡは、例えば、ＩｇＡ１またはＩｇＡ２があげられる。ＩｇＧは、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４があげられる。前記抗原結合断片は、例えば、前記抗体の一部、より具体的には、前記抗体の結合領域または可変領域を含むポリペプチドである。前記抗原結合断片は、例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ断片、ｒＩｇＧ（半ＩｇＧ）断片、一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）、二重可変ドメイン抗体（ＤＶＤ−Ｉｇ（商標））、ダイアボディ（diabody）、トリアボディ（triabody）、テトラボディ（tetrabody）、タンダブ（tanda）、ｓｃＦｖとダイアボディとの組合せであるフレキシボディ（flexibody）、タンデム（tandem）ｓｃＦｖ（例えば、ＢｉＴＥ（登録商標）、Micromet社），ＤＡＲＴ（登録商標）（MacroGenics社）、Ｆｃａｂ（商標）またはｍＡｂ２（商標）（F-star社）、Fc engineering抗体（Xencor社）またはDuoBody（登録商標）（Ｇｅｎｍａｂ社）等があげられる。前記免疫グロブリンは、公知の免疫グロブリン、すなわち、公知の抗体またはその抗原結合断片を用いてもよいし、任意の抗原を免疫することにより得られる、新たな抗体またはその抗原結合断片を用いてもよい。
【００１７】
前記抗体等の由来は、特に制限されず、例えば、ヒトまたは非ヒト動物があげられる。前記非ヒト動物は、例えば、マウス、ラット、イヌ、サル、ウサギ、ヒツジ、ウマ、ブタ等の哺乳類；ニワトリ、エミュー等の鳥類；等があげられる。前記抗体等は、例えば、複数の動物に由来してもよい。すなわち、前記抗体等は、キメラ抗体またはその抗原結合断片でもよいし、ヒト化抗体またはその抗原結合断片でもよい。
【００１８】
前記第１の結合ドメインは、前記免疫グロブリン（抗体等）に結合可能であればよい。前記抗体等における第１の結合ドメインの結合位置、すなわち、前記抗体等における第１の結合ドメインのエピトープの位置は、特に制限されず、前記抗体等と、前記抗体等の抗原との結合を阻害しない範囲で、任意に設定できる。前記第１の結合ドメインは、例えば、前記抗体等における結合領域または可変領域以外の領域内にエピトープを有し、好ましくは、定常（Ｆｃ）領域内にエピトープを有する。前記Ｆｃ領域は、重鎖のＦｃ領域でもよいし、軽鎖のＦｃ領域でもよい。前記重鎖のＦｃ領域は、例えば、ＣＨ１領域、ＣＨ２領域、またはＣＨ３領域があげられる。前記軽鎖のＦｃ領域は、例えば、ＣＬ領域があげられる。前記第１の結合ドメインは、例えば、抗体を介した補体活性または細胞傷害活性の低下を抑制できることから、前記免疫グロブリンにおけるＦｃ受容体の結合領域以外の領域内にエピトープを有することが好ましく、具体例として、ＣＨ１領域またはＣＨ３領域があげられる。前記抗体等がＩｇＧまたはその抗原結合断片の場合、前記第１の結合ドメインは、例えば、Ｆｃ領域のＥＵナンバリングで表される部位のうち２３２〜２３６位以外の領域内にエピトープを有し、好ましくは、２３７〜４４７位、２３７〜３４０位、３４１〜４４７位、２５０〜４４７位、２６０〜４４７位、２７０〜４４７位、２８０〜４４７位、２９０〜４４７位、３００〜４４７位、３１０〜４４７位、３２０〜４４７位、３３０〜４４７位、３４０〜４４７位、３５０〜４４７位、３６０〜４４７位、３７０〜４４７位、３８０〜４４７位、３９０〜４４７位、４００〜４４７位、４１０〜４４７位、４２０〜４４７位、または４３０〜４４７位の領域内にエピトープを有する。前記ＥＵナンバリングは、下記参考文献１に準じて決定できる。
参考文献１：Edelman, G.M. et al., Proc. Natl. Acad. USA, 63, 78-85 (1969)
【００１９】
前記免疫グロブリンにおけるＦｃ受容体の結合領域は、例えば、ＮＫ細胞が抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）活性を示す際に、そのＦｃ受容体を介して結合する領域である。前記免疫グロブリンにおけるＦｃ受容体の結合領域以外の領域は、例えば、Ｆｃ領域において、ＮＫ細胞のＡＤＣＣ活性を阻害しない領域ということもできる。また、前記免疫グロブリンにおけるＦｃ受容体の結合領域以外の領域は、例えば、ＮＫ細胞のＡＤＣＣ活性が、抑制されるか否かを指標に検討できる。具体例として、抗体と、前記抗体が結合する抗原を発現する細胞（標的細胞）と、対象の第１の結合ドメインを有する複合体化タンパク質と、ＮＫ細胞とを共存して培養した際に示すＮＫ細胞の傷害活性が、抗体と、前記抗体が結合する抗原を発現する細胞（標的細胞）と、ＮＫ細胞とを共存して培養した際に示すＮＫ細胞の傷害活性を基準として、有意差がない場合、前記複合体化タンパク質における対象の第１の結合ドメインは、前記免疫グロブリンにおけるＦｃ受容体の結合領域以外の領域に結合しているといえる。前記免疫グロブリンにおけるＦｃ受容体の結合領域は、例えば、Ｆｃ領域のＥＵナンバリングで表される部位のうち、２３３〜２３７位（ＥＬＬＧＧ）、２３９位（Ｓ）、２６５位（Ｄ）、２６９位（Ｅ）、２９４位（Ｅ）、２９６〜２９８位（ＹＮＳ）、３２８位（Ｌ）および３２９位（Ｐ）である。前記標的細胞の数およびＮＫ細胞の数、ならびに培養条件は、例えば、後述の実施例に準じて設定できる。
【００２０】
前記第１の結合ドメインは、前述のように、免疫グロブリンに結合可能であればよく、例えば、免疫グロブリンに結合可能なポリペプチドの構造を採用できる。具体例として、前記第１の結合ドメインは、例えば、前記抗体等に結合する受容体、前記抗体等に結合する、抗体またはその抗原結合断片があげられる。本発明において「結合」は、例えば、測定対象の抗体等と抗原とを接触後、得られた複合体をフローサイトメトリーで測定した際に、前記抗原と結合しないコントロールの抗体と比較して、有意に蛍光強度が上昇していることを意味する。
【００２１】
前記第１の結合ドメインが抗体等に結合する受容体の場合、前記第１の結合ドメインは、例えば、Ｆｃ受容体があげられる。前記Ｆｃ受容体の種類は、特に制限されず、例えば、前記免疫グロブリンの種類に応じて適宜設定できる。前記Ｆｃ受容体は、例えば、FcαRI（ＣＤ８９）、Fcα/μR等のＦｃαＲ；FcεRI等のＦｃεＲ；FcγRIa（ＣＤ６４）、FcγRIIa（ＣＤ３２）、FcγRIIb1（ＣＤ３２）、FcγRIIb2（ＣＤ３２）、FcγRIIIa（ＣＤ１６）、FcγRIIIbのＦｃγＲ；Fcα/μR等のＦｃμＲ；ＦｃＲｎ（neonatal Fc receptor）；等があげられる。前記免疫グロブリンがＩｇＧの場合、前記Ｆｃ受容体は、例えば、ＦｃγＲ等があげられる。前記第１の結合ドメインは、前記Ｆｃ受容体の全アミノ酸配列からなるポリペプチドでもよいし、その部分配列からなるポリペプチドでもよい。後者の場合、前記部分配列からなるポリペプチドは、前記免疫グロブリンに結合可能である、すなわち、前記Ｆｃ受容体のリガンド結合ドメインを含む。
【００２２】
前記第１の結合ドメインが抗体等に結合する、抗体またはその抗原結合断片である場合、前記第１の結合ドメインは、前述の抗体またはその抗原結合断片と同様の構造を採用でき、例えば、重鎖可変領域および軽鎖可変領域を有する。以下、前記第１の結合ドメインの重鎖可変領域および軽鎖可変領域を、それぞれ、第１の重鎖可変領域および第１の軽鎖可変領域ともいう。前記第１の重鎖可変領域および前記第１の軽鎖可変領域は、抗体分子における重鎖可変領域および軽鎖可変領域と同様の構造を有する。一般に、抗体分子の重鎖可変領域および軽鎖可変領域は、それぞれ、３ヶ所の相補性決定領域（ＣＤＲ：Complemetarity determining region）を有している。ＣＤＲは、超可変領域（hypervariable domain）ともいう。ＣＤＲは、前記重鎖および軽鎖の可変領域でも、特に一次構造の変異性が高い領域であり、一次構造上において、通常、３ヶ所に分離している。本発明において、重鎖可変領域における３ヶ所のＣＤＲを、重鎖可変領域のアミノ酸配列におけるアミノ末端（Ｎ末端）側から、重鎖ＣＤＲ１（ＣＤＲＨ１）、重鎖ＣＤＲ２（ＣＤＲＨ２）、および重鎖ＣＤＲ３（ＣＤＲＨ３）と表し、軽鎖可変領域における３ヶ所のＣＤＲを、軽鎖可変領域のアミノ酸配列におけるアミノ末端側から、軽鎖ＣＤＲ１（ＣＤＲＬ１）、軽鎖ＣＤＲ２（ＣＤＲＬ２）、および軽鎖ＣＤＲ３（ＣＤＲＬ３）と表す。これらの部位は、立体構造の上で相互に近接し、結合する抗原に対する特異性を決定している。前記抗原結合断片は、前述の説明を援用できる。前記第１の結合ドメインは、ｓｃＦｖを含むことが好ましい、すなわち、前記免疫グロブリンに結合可能なｓｃＦｖを含むことが好ましい。前記ｓｃＦｖは、例えば、重鎖可変領域と、軽鎖可変領域とをリンカーペプチドで連結することにより調製できる。前記リンカーペプチドのアミノ酸配列は、特に制限されない。
【００２３】
前記第１の結合ドメインが前記第１の重鎖可変領域および第１の軽鎖可変領域を有する場合、前記第１の重鎖可変領域および第１の軽鎖可変領域は、例えば、前記抗体等に結合する抗体の重鎖可変領域および軽鎖可変領域に由来してもよいし、前記抗体等で免疫し、得られた抗体等に結合可能な抗体の重鎖可変領域および軽鎖可変領域に由来してもよいし、ファージディスプレイ等のスクリーニング方法により得られた、抗体等に結合可能な抗体の重鎖可変領域および軽鎖可変領域に由来してもよい。
【００２４】
抗体の抗原に対する結合性には、前述のように、重鎖可変領域および軽鎖可変領域における相補性決定領域（ＣＤＲ）が重要である。このため、前記第１の重鎖可変領域のＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、およびＣＤＲＨ３は、それぞれ、前記抗体等に結合する抗体の重鎖可変領域のＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、およびＣＤＲＨ３のアミノ酸配列からなるポリペプチドでもよいし、前記抗体等に結合する抗体の重鎖可変領域のＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、およびＣＤＲＨ３のアミノ酸配列を含むポリペプチドでもよい。また、前記第１の軽鎖可変領域のＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３は、それぞれ、前記抗体等に結合する抗体の軽鎖可変領域のＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３のアミノ酸配列からなるポリペプチドでもよいし、前記抗体等に結合する抗体の軽鎖可変領域のＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３のアミノ酸配列を含むポリペプチドでもよい。
【００２５】
前記第１の重鎖可変領域において、ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、およびＣＤＲＨ３以外の領域、すなわち、フレームワーク領域（ＦＲ）は、例えば、前記抗体等に結合する抗体における重鎖可変領域のＦＲを含んでもよい。前記ＦＲは、一次構造上において、通常、４ヶ所に分離している。本発明において、前記重鎖可変領域における４ヶ所のＦＲを、前記重鎖可変領域のアミノ酸配列におけるＮ末端側から、重鎖ＦＲ１（ＦＲＨ１）、重鎖ＦＲ２（ＦＲＨ２）、重鎖ＦＲ３（ＦＲＨ３）、および重鎖ＦＲ４（ＦＲＨ４）と表す。なお、前記各ＣＤＲＨと、前記各ＦＲＨとは、例えば、前記重鎖可変領域のアミノ酸配列におけるＮ末端側から、ＦＲＨ１、ＣＤＲＨ１、ＦＲＨ２、ＣＤＲＨ２、ＦＲＨ３、ＣＤＲＨ３、およびＦＲＨ４の順序で配置されている。前記第１の重鎖可変領域におけるＦＲＨ１、ＦＲＨ２、ＦＲＨ３、およびＦＲＨ４は、例えば、それぞれ、前記抗体等に結合する抗体のＦＲＨ１、ＦＲＨ２、ＦＲＨ３、およびＦＲＨ４のアミノ酸配列からなるポリペプチドでもよいし、前記抗体等に結合する抗体のＦＲＨ１、ＦＲＨ２、ＦＲＨ３、およびＦＲＨ４のアミノ酸配列を含むポリペプチドでもよい。前記各ＣＤＲＨの説明における「抗体等に結合する抗体」と、前記各ＦＲＨの説明における「抗体等に結合する抗体」とは、同じ抗体等であることが好ましい。
【００２６】
前記第１の軽鎖可変領域において、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３以外の領域、すなわち、フレームワーク領域（ＦＲ）は、例えば、前記抗体等に結合する抗体における軽鎖可変領域のＦＲを含んでもよい。前記ＦＲは、一次構造上において、通常、４ヶ所に分離している。本発明において、前記軽鎖可変領域における４ヶ所のＦＲを、前記軽鎖可変領域のアミノ酸配列におけるＮ末端側から、軽鎖ＦＲ１（ＦＲＬ１）、軽鎖ＦＲ２（ＦＲＬ２）、軽鎖ＦＲ３（ＦＲＬ３）、および軽鎖ＦＲ４（ＦＲＬ４）と表す。なお、前記各ＣＤＲＬと、前記各ＦＲＬとは、例えば、前記軽鎖可変領域のアミノ酸配列におけるＮ末端側から、ＦＲＬ１、ＣＤＲＬ１、ＦＲＬ２、ＣＤＲＬ２、ＦＲＬ３、ＣＤＲＬ３、およびＦＲＬ４の順序で配置されている。前記第１の軽鎖可変領域におけるＦＲＬ１、ＦＲＬ２、ＦＲＬ３、およびＦＲＬ４は、例えば、それぞれ、前記抗体等に結合する抗体のＦＲＬ１、ＦＲＬ２、ＦＲＬ３、およびＦＲＬ４のアミノ酸配列からなるポリペプチドでもよいし、前記抗体等に結合する抗体のＦＲＬ１、ＦＲＬ２、ＦＲＬ３、およびＦＲＬ４のアミノ酸配列を含むポリペプチドでもよい。前記各ＣＤＲＬの説明における「抗体等に結合する抗体」と、前記各ＦＲＬの説明における「抗体等に結合する抗体」とは、同じ抗体等であることが好ましい。また、前記各ＣＤＲＨの説明における「抗体等に結合する抗体」と、前記各ＣＤＲＬの説明における「抗体等に結合する抗体」とは、同じ抗体等であることが好ましい。
【００２７】
前記抗体等に結合する抗体は、特に制限されず、例えば、抗体等の種類に応じて適宜選択できる。前記抗体等に結合する抗体は、公知の抗体等に結合する抗体でもよいし、前記抗体等で免疫し、得られた抗体等に結合可能な抗体でもよい。前記抗体がヒトＩｇＧの場合、ヒトＩｇＧに結合する抗体は、例えば、下記参考文献２および参考文献３に記載されている抗体があげられる。具体例として、前記抗体がヒトＩｇＧの場合、ヒトＩｇＧに結合する抗体（クローン名）は、例えば、ＨＰ６０１７、ＨＰ６０００、ＨＰ６０１８、ＨＰ６０４３、ＨＰ６０５２、ＨＰ６０６４、ＨＰ６０６５、ＨＰ６０８７、ＨＰ６０９２、ＨＰ６０４４、ＨＰ６０４６、ＨＰ６０６３等があげられる。前記各種クローンの抗体を産生するハイブリドーマは、例えば、American Type Culture Collection (ATCC)等の寄託機関から入手できる。
参考文献２：Jefferis, R et.al., “Evaluation of monoclonal antibodies having specificity for human IgG sub-classes: results of an IUIS/WHO collaborative study.”, Immunol Lett., 1985, volume 10, Issues 3-4, pages 223-52
参考文献３： Reimer CB et.al, “Evaluation of thirty-one mouse monoclonal antibodies to human IgG epitopes.”, Hybridoma., 1984, volume 3, Isuue 3, pages 263-75
【００２８】
前記抗体等がヒトＩｇＧの場合、前記第１の結合ドメインは、例えば、ヒトＩｇＧ抗体と抗体複合体を形成した際に、前記抗体複合体にＦｃγ受容体を介してヒトＮＫ細胞が結合し、前記ヒトＮＫ細胞がＡＤＣＣ活性を発揮可能であることから、下記第１の重鎖可変領域および第１の軽鎖可変領域を含むことが好ましい。
（第１の重鎖可変領域）
ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、およびＣＤＲＨ３を含み、
ＣＤＲＨ１が、下記（H1-A）のアミノ酸配列を含むポリペプチドであり、
ＣＤＲＨ２が、下記（H2-A）のアミノ酸配列を含むポリペプチドであり、
ＣＤＲＨ３が、下記（H3-A）のアミノ酸配列を含むポリペプチドである。
（第１の軽鎖可変領域）
ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３を含み、
ＣＤＲＬ１が、下記（L1-A）のアミノ酸配列を含むポリペプチドであり、
ＣＤＲＬ２が、下記（L2-A）のアミノ酸配列を含むポリペプチドであり、
ＣＤＲＬ３が、下記（L3-A）のアミノ酸配列を含むポリペプチドである。
【００２９】
（H1-A）下記（H1-A1）、（H1-A2）または（H1-A3）のアミノ酸配列
（H1-A1）配列番号１（GYTFTNYW）のアミノ酸配列
（H1-A2）配列番号１のアミノ酸配列に対して、８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列
（H1-A3）配列番号１のアミノ酸配列において、１個または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列
（H2-A）下記（H2-A1）、（H2-A2）または（H2-A3）のアミノ酸配列
（H2-A1）配列番号２（IYPGGGIT）のアミノ酸配列
（H2-A2）配列番号２のアミノ酸配列に対して、８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列
（H2-A3）配列番号２のアミノ酸配列において、１個または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列
（H3-A）下記（H3-A1）、（H3-A2）または（H3-A3）のアミノ酸配列
（H3-A1）配列番号３（SRSYGKYFDY）のアミノ酸配列
（H3-A2）配列番号３のアミノ酸配列に対して、８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列
（H3-A3）配列番号３のアミノ酸配列において、１個または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列
【００３０】
（L1-A）下記（L1-A1）、（L1-A2）または（L1-A3）のアミノ酸配列
（L1-A1）配列番号４（QDIKSY）のアミノ酸配列
（L1-A2）配列番号４のアミノ酸配列に対して、８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列
（L1-A3）配列番号４のアミノ酸配列において、１個または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列
（L2-A）下記（L2-A1）、（L2-A2）または（L2-A3）のアミノ酸配列
（L2-A1）配列番号５（YST）のアミノ酸配列
（L2-A2）配列番号５のアミノ酸配列に対して、８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列
（L2-A3）配列番号５のアミノ酸配列において、１個または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列
（L3-A）下記（L3-A1）、（L3-A2）または（L3-A3）のアミノ酸配列
（L3-A1）配列番号６（LQHDESPFT）のアミノ酸配列
（L3-A2）配列番号６のアミノ酸配列に対して、８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列
（L3-A3）配列番号６のアミノ酸配列において、１個または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列。
【００３１】
前記各ＣＤＲにおいて、「同一性」は、例えば、比較する配列同士を適切にアライメントしたときの同一性の程度であり、前記配列間のアミノ酸の正確な一致の出現率（％）を意味する。前記「同一性」は、それぞれ、例えば、７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上である。前記同一性は、例えば、ＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡ等の解析ソフトウェアを用いて、デフォルトのパラメータにより算出できる（以下、同様）。
【００３２】
前記各ＣＤＲにおいて、置換等に関する「１個または数個」は、それぞれ、例えば、１〜１０個、１〜７個、１〜５個、１〜４個、１〜３個、１または２個、１個である。
【００３３】
前記アミノ酸の置換は、例えば、保存的置換であってもよい（以下、同様）。前記保存的置換は、タンパク質の機能を実質的に改変しないように、１個または数個のアミノ酸を、他のアミノ酸および／またはアミノ酸誘導体に置換することを意味する。「置換するアミノ酸」と「置換されるアミノ酸」とは、例えば、性質および／または機能が類似していることが好ましい。具体的には、例えば、疎水性および親水性の指標（ハイドロパシー）、極性、電荷等の化学的性質、または、二次構造等の物理的性質等が類似していることが好ましい。前記性質および／または機能が類似するアミノ酸またはアミノ酸誘導体は、例えば、当該技術分野において公知である。具体例として、非極性アミノ酸（疎水性アミノ酸）は、例えば、アラニン、バリン、イソロイシン、ロイシン、プロリン、トリプトファン、フェニルアラニン、メチオニン等があげられ、極性アミノ酸（中性アミノ酸）は、グリシン、セリン、スレオニン、チロシン、グルタミン、アスパラギン、システイン等があげられ、陽電荷を有するアミノ酸（塩基性アミノ）酸は、アルギニン、ヒスチジン、リジン等があげられ、負電荷を有するアミノ酸（酸性アミノ酸）は、アスパラギン酸、グルタミン酸等があげられる。
【００３４】
前記第１の重鎖可変領域は、例えば、下記（H-A）のアミノ酸配列からなるポリペプチドを含むことが好ましい。また、前記第２の軽鎖可変領域は、例えば、下記（L-A）のアミノ酸配列からなるポリペプチドを含むことが好ましい。
【００３５】
（H-A）下記（H-A1）、（H-A2）または（H-A3）のアミノ酸配列
（H-A1）配列番号１３のアミノ酸配列
配列番号１３：QVQLQQPGAELVKPGASVKMSCKASGYTFTNYWINWVKQRPGQGLEWIGDIYPGGGITNYNEKFKTKATLTLDTSSSTVYMQLSSLTSEDSAVYYCSRSYGKYFDYWGQGTTLIVSS
（H-A2）配列番号１３のアミノ酸配列に対して、８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列
（H-A3）配列番号１３のアミノ酸配列において、１個または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列
【００３６】
（L-A）下記（L-A1）、（L-A2）または（L-A3）のアミノ酸配列
（L-A1）配列番号１４のアミノ酸配列
配列番号１４：DIKMTQSPSSMYASVGERVTITCKASQDIKSYLTWYQKKPWKSPRTLIFYSTRLADGVPSRFSGSGSGQDFSLTISSLESDDTATYYCLQHDESPFTFGGGTKLEIK
（L-A2）配列番号１４のアミノ酸配列に対して、８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列
（L-A3）配列番号１４のアミノ酸配列において、１個または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列
【００３７】
前記（H-A1）のアミノ酸配列は、例えば、ＣＤＲＨ１の（H1-A1）、ＣＤＲＨ２の（H2-A1）、およびＣＤＲＨ３の（H3-A1）のアミノ酸配列を含む配列である。前記（H-A2）のアミノ酸配列は、例えば、ＣＤＲＨ１の（H1-A1）、ＣＤＲＨ２の（H2-A1）、およびＣＤＲＨ３（H3-A1）のアミノ酸配列を含み、且つ、配列番号１３のアミノ酸配列に対して、７０％以上の同一性を有するアミノ酸配列であってもよい。前記（H-A3）のアミノ酸配列は、例えば、ＣＤＲＨ１の（H1-A1）、ＣＤＲＨ２の（H2-A1）、およびＣＤＲＨ３（H3-A1）のアミノ酸配列を含み、且つ、配列番号１３のアミノ酸配列において、１個または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列であってもよい。
【００３８】
前記（L-A1）のアミノ酸配列は、例えば、ＣＤＲＬ１の（L1-A1）、ＣＤＲＬ２の（L2-A1）、およびＣＤＲＬ３の（L3-A1）のアミノ酸配列を含む配列である。前記（L-A2）のアミノ酸配列は、例えば、ＣＤＲＬ１の（L1-A1）、ＣＤＲＬ２の（L2-A1）、およびＣＤＲＬ３の（L3-A1）のアミノ酸配列を含み、且つ、配列番号１４のアミノ酸配列に対して、７０％以上の同一性を有するアミノ酸配列であってもよい。前記（L-A3）のアミノ酸配列は、例えば、ＣＤＲＬ１の（L1-A1）、ＣＤＲＬ２の（L2-A1）、およびＣＤＲＬ３の（L3-A1）のアミノ酸配列を含み、且つ、配列番号１４のアミノ酸配列において、１個または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列であってもよい。
【００３９】
前記重鎖可変領域のアミノ酸配列および前記軽鎖可変領域のアミノ酸配列において、前記「同一性」は、それぞれ、例えば、７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上である。
【００４０】
前記重鎖可変領域のアミノ酸配列および前記軽鎖可変領域のアミノ酸配列において、置換等に関する「１個または数個」は、それぞれ、例えば、１〜３０個、１〜２０個、１〜１５個、１〜１０個、１〜９個、１〜８個、１〜７個、１〜６個、１〜５個、１〜４個、１〜３個、１または２個、１個である。
【００４１】
前記抗体等がヒトＩｇＧの場合、前記第１の結合ドメインは、例えば、ヒトＩｇＧ抗体と抗体複合体を形成した際に、前記抗体複合体にＦｃγ受容体を介してヒトＮＫ細胞が結合し、前記ヒトＮＫ細胞がＡＤＣＣ活性を発揮可能であることから、下記第１のｓｃＦｖのアミノ酸配列からなるポリペプチドを含むことが好ましい。下記（S-A2）および（S-A3）のアミノ酸配列からなるポリペプチドは、例えば、ヒトＩｇＧに結合可能である。
【００４２】
（第１のｓｃＦｖ）
（S-A）下記（S-A1）、（S-A2）または（S-A3）のアミノ酸配列
（S-A1）配列番号１５のアミノ酸配列
配列番号１５：DIKMTQSPSSMYASVGERVTITCKASQDIKSYLTWYQKKPWKSPRTLIFYSTRLADGVPSRFSGSGSGQDFSLTISSLESDDTATYYCLQHDESPFTFGGGTKLEIKGGGGSGGGGSGGGGSQVQLQQPGAELVKPGASVKMSCKASGYTFTNYWINWVKQRPGQGLEWIGDIYPGGGITNYNEKFKTKATLTLDTSSSTVYMQLSSLTSEDSAVYYCSRSYGKYFDYWGQGTTLIVSS
（S-A2）配列番号１５のアミノ酸配列に対して、８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列
（S-A3）配列番号１５のアミノ酸配列において、１個または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列
【００４３】
前記（S-A1）のアミノ酸配列は、例えば、ＣＤＲＨ１の（H1-A1）、ＣＤＲＨ２の（H2-A1）、およびＣＤＲＨ３の（H3-A1）のアミノ酸配列を含む配列である。前記（S-A2）のアミノ酸配列は、例えば、ＣＤＲＨ１の（H1-A1）、ＣＤＲＨ２の（H2-A1）、およびＣＤＲＨ３（H3-A1）のアミノ酸配列を含み、且つ、配列番号１５のアミノ酸配列に対して、７０％以上の同一性を有するアミノ酸配列であってもよい。前記（S-A3）のアミノ酸配列は、例えば、ＣＤＲＨ１の（H1-A1）、ＣＤＲＨ２の（H2-A1）、およびＣＤＲＨ３（H3-A1）のアミノ酸配列を含み、且つ、配列番号１５のアミノ酸配列において、１個または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列であってもよい。
【００４４】
前記（S-A1）のアミノ酸配列は、例えば、第１の重鎖可変領域の（H-A1）のアミノ酸配列を含む配列である。前記（S-A2）のアミノ酸配列は、例えば、第１の重鎖可変領域の（H-A1）のアミノ酸配列を含み、且つ、配列番号１５のアミノ酸配列に対して、７０％以上の同一性を有するアミノ酸配列であってもよい。前記（S-A3）のアミノ酸配列は、例えば、第１の重鎖可変領域の（H-A1）のアミノ酸配列を含み、且つ、配列番号１５のアミノ酸配列において、１個または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列であってもよい。
【００４５】
前記（S-A1）のアミノ酸配列は、例えば、ＣＤＲＬ１の（L1-A1）、ＣＤＲＬ２の（L2-A1）、およびＣＤＲＬ３の（L3-A1）のアミノ酸配列を含む配列である。前記（S-A2）のアミノ酸配列は、例えば、ＣＤＲＬ１の（L1-A1）、ＣＤＲＬ２の（L2-A1）、およびＣＤＲＬ３の（L3-A1）のアミノ酸配列を含み、且つ、配列番号１５のアミノ酸配列に対して、７０％以上の同一性を有するアミノ酸配列であってもよい。前記（S-A3）のアミノ酸配列は、例えば、ＣＤＲＬ１の（L1-A1）、ＣＤＲＬ２の（L2-A1）、およびＣＤＲＬ３の（L3-A1）のアミノ酸配列を含み、且つ、配列番号１５のアミノ酸配列において、１個または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列であってもよい。
【００４６】
前記（S-A1）のアミノ酸配列は、例えば、第１の軽鎖可変領域の（L-A1）のアミノ酸配列を含む配列である。前記（S-A2）のアミノ酸配列は、例えば、第１の軽鎖可変領域の（L-A1）のアミノ酸配列を含み、且つ、配列番号１５のアミノ酸配列に対して、７０％以上の同一性を有するアミノ酸配列であってもよい。前記（S-A3）のアミノ酸配列は、例えば、第１の軽鎖可変領域の（L-A1）のアミノ酸配列を含み、且つ、配列番号１５のアミノ酸配列において、１個または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列であってもよい。
【００４７】
前記（S-A2）のアミノ酸配列において、前記「同一性」は、それぞれ、例えば、７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上である。
【００４８】
前記（S-A3）のアミノ酸配列において、置換等に関する「１個または数個」は、それぞれ、例えば、１〜７２個、１〜６０個、１〜４８個、１〜４０個、１〜２４個、１〜２０個、１〜１５個、１〜１０個、１〜９個、１〜８個、１〜７個、１〜６個、１〜５個、１〜４個、１〜３個、１または２個、１個である。
【００４９】
前記第２の結合ドメインは、前述のように、所望の抗原に結合可能である。前記所望の抗原は、例えば、免疫細胞に発現する抗原（タンパク質）、体液中の抗原（タンパク質）腫瘍抗原、ウイルス抗原、細菌抗原、寄生虫抗原、自己免疫疾患に関連する抗原、糖鎖抗原等があげられる。前記腫瘍抗原は、例えば、細胞のがん化により、新たに発現する抗原、発現量が増加する抗原等の抗原性を有する生体分子を意味する。前記腫瘍抗原は、例えば、腫瘍特異的抗原でもよいし、腫瘍関連抗原でもよい。前記所望の抗原は、例えば、前記抗体等が結合可能な抗原と異なることが好ましい。
【００５０】
前記免疫細胞に発現する抗原は、例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、またはＮＫＴ細胞に発現する抗原があげられる。前記Ｔ細胞に発現する抗原は、例えば、Ｔ細胞の活性化タンパク質またはＴ細胞の活性化抑制タンパク質あげられる。前記Ｔ細胞活性化タンパク質としては、例えば、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８α、ＣＤ８β、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ１３４（ＯＸ４０）、ＣＤ１３７（４−１ＢＢ）、ＣＤ１５４、ＧＩＴＲ、ＩＣＯＳ等があげられ、好ましくは、ＣＤ３である。前記ＣＤ３は、例えば、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε、ＣＤ３ζ、ＣＤ３η等があげられ、好ましくは、ＣＤ３εである。前記Ｔ細胞の活性化抑制タンパク質は、例えば、ＣＴＬＡ４、ＰＤ−１、ＬＡＧ３、Ｂ７−Ｈ３、ＴＩＭ３、ＴＩＧＩＴ等があげられる。前記ＮＫ細胞に発現する抗原は、例えば、ＮＫ細胞の活性化タンパク質またはＮＫ細胞の活性化抑制タンパク質があげられる。前記ＮＫ細胞の活性化タンパク質は、例えば、ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ｃ、ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ｅ、ＮＫＧ２Ｄ／ＮＫＧ２Ｄ等があげられる。前記ＮＫ細胞の活性化抑制タンパク質は、例えば、ＫＩＲ２ＤＬ１、ＫＩＲ２ＤＬ２、ＫＩＲ２ＤＬ３、ＫＩＲ３ＤＬ１、ＫＩＲ３ＤＬ２、ＫＩＲ２ＤＬ４、ＫＩＲ２ＤＬ５、ＫＩＲ３ＤＬ３等があげられる。前記ＮＫＴ細胞に発現する抗原は、例えば、ＮＫＴ細胞の活性化タンパク質またはＮＫＴ細胞の活性化抑制タンパク質であり、具体例として、前記Ｔ細胞に発現する抗原および前記ＮＫ細胞に発現する抗原の説明を援用できる。
【００５１】
前記体液中の抗原は、例えば、サイトカイン、血液凝固因子等があげられる。前記サイトカインは、例えば、ＴＮＦ−α、ＴＮＦ−β等のＴＮＦ（Tumor Necrosis Factor）；リンフォトキシン；ＩＬ−１〜ＩＬ−３８（例えば、ＩＬ−１α、ＩＬ−１β、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１７、ＩＬ−１８、ＩＬ−２３、ＩＬ−３３、ＩＬ−３６等）のインターロイキン；ケモカイン；造血因子；細胞増殖因子；アディポカイン；ＶＥＧＦ等の成長因子；等があげられる。
【００５２】
前記腫瘍抗原は、例えば、５Ｔ４、α５β１−インテグリン、７０７−ＡＰ、αフェトプロテイン（ＡＦＰ）、レクチン反応性ＡＦＰ、ＡＲＴ−４、ＡＵＲＫＡ（AURORA A）、Ｂ７Ｈ４、ＢＡＧＥ、β−カテニン、ＢＣＭＡ、Ｂｃｒ−ａｂｌ、ＢＴＡＡ、ＭＮ／ＣＡ  ＩＸ抗原、ＣＡ１２５、ＣＡ１９−９、ＣＡ７２−４、ＣＡＭＥＬ、ＣＡＰ−１、ＣＡＳＰ−８、ＣＤ４、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２５、ＣＤ２７、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ４７、ＣＤ５２、ＣＤ５６、ＣＤ８０、ＣＤ９６、ＣＤ１２３、ＣＤＫ４、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、ＣＬＬ１、ＣＴ、Cyclin A1、Ｃｙｐ−Ｂ、ＤＡＭ、ＥＧＦＲ、ＥｒｂＢ３、ＥＬＦ２Ｍ、ＥＭＭＰＲＩＮ、ＥｐＣａｍ、ＥＴＶ６−ＡＭＬ１、Ｇ２５０、ＧＡＧＥ（ＧＡＧＥ−１、ＧＡＧＥ−２等）、ＧＤ２（Ganglioside G2）、ＧｎＴ−Ｖ、Ｇｐ１００、ＧＰＡ３３、ＧＰＣ３、ＨＡＧＥ、β−ヒト絨毛性ゴナドトロピン（ＨＣＧ）、ＨＥＲ２／ｎｅｕ、ＨＬＡ−Ａ＊０２０１−Ｒ１７０Ｉ、ＨＰＶ−Ｅ７、ＨＳＰ７０−２Ｍ、ＨＳＴ−２、ｉＣＥ、インスリン増殖因子（ＩＧＦ）−１、ＩＧＦ−２、ＩＧＦ−１Ｒ、ＩＬ−２Ｒ、ＩＬ−５、ＫＩＡＡ０２０５、Ｋ−Ｒａｓ、ＬＡＧＥ、ＬＤＬＲ／ＦＵＴ、ＭＡＧＥ（ＭＡＧＥ−３、ＭＡＧＥ−４、ＭＡＧＥ−５、ＭＡＧＥ−６等）、ＭＡＲＴ−１／ｍｅｌａｎ−Ａ、ＭＡＲＴ−２／Ｓｋｉ、ＭＣ１Ｒ、mesothelin（ＭＳＬＮ）、ミオシン、ＭＵＣ１、ＭＵＭ−１、ＭＵＭ−２、ＭＵＭ−３、ＮＡ８８−Ａ、前立腺酸性フォスファターゼ（ＰＡＰ）、プロテイナーゼ−３、ＰＲＡＭＥ（Melanoma antigen preferentially expressed in tumors）、ｐ５３、ｐ１９０マイナーｂｃｒ−ａｂｌ、Ｐｍｌ／ＲＡＲα、前立腺腫瘍抗原−１（ＰＣＴＡ−１）、ＰＲＡＭＥ、前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）、ＰＳＭ、ＰＳＭＡ、ＲＡＧＥ、ＲＡＳ、ＲＨＡＭＭ（ＣＤ１６８）、ＲＵ１、ＲＵ２、ＳＡＧＥ、ＳＡＲＴ−１、ＳＡＲＴ−３、サイログロブリン、サバイビン、テロメラーゼ逆転写酵素（ＴＥＲＴまたはＴＲＴ）、ＴＥＬ／ＡＭＬ１、ＴＧＦβ、ＴＩＭ３、ＴＰＩ／ｍ、ＴＲＰ−１、ＴＲＰ−２、ＴＲＰ−２／ＩＮＴ２、ＶＥＧＦ、ＷＴ１、ＮＹ−Ｅｓｏ−１、ＮＹ−Ｅｓｏ−Ｂ等があげられる。
【００５３】
前記ウイルス抗原は、例えば、アデノウイルス（adenovirus）等のアデノウイルス科（Adenoviridae）；コロナウイルス（coronavirus）等のコロナウイルス科（Coronaviridae）；エボラウイルス属（Ebolavirus）等のフィロウイルス科（Filoviridae）；Ｃ型肝炎ウイルス（HCV：hepatitis C virus）、デングウイルス(Dengue virus)、日本脳炎ウイルス（Japanese encephalitis virus）、西ナイルウイルス（west Nile virus）、黄熱ウイルス（yellow fever virus）等のフラビウイルス科（Flaviviridae）；Ｂ型肝炎ウイルス（HVB：Hepatitis B Virus）等のヘパドナウイルス科（Hepadnaviridae）；単純ヘルペスウイルス１型（HSV-1：herpes simplex virus-1）、単純ヘルペスウイルス２型（HSV-2：herpes simplex virus-2）、水痘・帯状疱疹ウイルス（VZV：varicella zoster virus）、ヒトサイトメガロウイルス（HCMV：human cytomegalovirus）、ＥＢウイルス（EBV：Epstein-Barr virus）、カポジ肉腫関連ヘルペスウイルス（KSHV：Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus）等のヘルペスウイルス科（Herpesviridae）；Ａ型インフルエンザウイルス属（Influenzavirus A）、Ｂ型インフルエンザウイルス属（Influenzavirus B）、Ｃ型インフルエンザウイルス属（Influenzavirus C）等のオルソミクソウイルス科（Orthomyxoviridae）；麻疹ウイルス（measles virus）、ヒトパラインフルエンザウイルス１〜４型（Human parainfluenza virus 1〜4）、ムンプスウイルス（Mumps virus）、RSウイルス（Respiratory syncytial virus）等のパラミクソウイルス科（Paramyxoviridae）；パルボウイルスＢ１９（Parvovirus B19）等のパルボウイルス科（Parvoviridae）；エンテロウイルス（enterovirus）、ポリオウイルス（poliovirus）、ヒトライノウイルスＡ〜Ｂ（human rhinovirus Ａ〜Ｂ）、Ａ型肝炎ウイルス（hepatitis A virus）、コクサッキーウイルス（coxsackievirus）、エコーウイルス（echo virus）等のピコルナウイルス科（Picornaviridae）；天然痘ウイルス（variola virus）、ワクチニアウイルス（Vaccinia virus）等のポックスウイルス科（Poxviridae）；ヒト免疫不全ウイルス（HIV：human immunodeficiency virus）-1, 2、ヒトＴリンパ好性ウイルス（HTLV：human T-lymphocytropic virus）-I,II等のレトロウイルス科（Retroviridae）；狂犬病ウイルス（Rabies virus）、水疱性口内炎ウイルス（Vesicular stomatitis virus）等のラブドウイルス科（Rhabdoviridae）；風疹ウイルス（Rubella virus）、チクングニアウイルス（Chikungunya virus）等のトガウイルス科（Togaviridae）；等のウイルス由来の抗原があげられる。
【００５４】
前記細菌抗原は、例えば、破傷風菌（Clostridium tetani）等のクロストリジウム属（Clostridium）；大腸菌（Escherichia coli）等のエスケリキア属（Escherichia）；ヘリコバクター・ピロリ（Helicobacter pyloris）等のヘリコバクター属（Helicobacter）；レジオネラ・ニューモフィリア（Legionella pneumophila）等のレジオネラ属（Legionella）；リステリア・モノサイトゲネス（Listeria monocytogenes）等のリステリア属（Listeria）；結核菌（Mycobacterium tuberculosis）、ライ菌（Mycobacterium leprae）、マイコバクテリウム・アビウム（Mycobacterium avium）、マイコバクテリウム・イントラセルラーエ（Mycobacterium intracellulare）、マイコバクテリウム・カンサシ（Mycobacterium kansasii）、マイコバクテリウム・ゴルドネ（Mycobacterium gordonae）等のマイコバクテリウム属（Mycobacterium）；淋菌（Neisseria gonorrhoeae）、髄膜炎菌（Neisseria meningitidis）等のナイセリア属（Neisseria）；緑膿菌（Pseudomonas aeruginosa）等のシュードモナス属（Pseudomonas）；チフス菌（Salmonella enterica serovar Typhi）、パラチフス菌（Salmonella enterica serovar Paratyphi A）等のサルモネラ属（Salmonella）；黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）等のブドウ球菌属（Staphylococcus）；肺炎レンサ球菌（Streptococcus pneumoniae）、化膿レンサ球菌（Streptococcus pyogenes）等のレンサ球菌属（Streptococcus）；等の細菌由来の抗原があげられる。
【００５５】
前記寄生虫抗原は、例えば、肝吸虫（Clonorchis sinensis）、日本住血吸虫（Schistosoma japonicum）、ヒトカイチュウ（Ascaris lumbricoides）、ヒト蟯虫（Enterobius vermicularis）、有鉤嚢虫（Cysticercus cellulosae）、広節裂頭条虫（Diphyllobothrium latum）、エキノコックス（Echinococcus）、赤痢アメーバ（Entamoeba histolytica）、マラリア原虫（Plasmodium）等の寄生虫由来の抗原があげられる。
【００５６】
前記第２の結合ドメインは、例えば、前記所望の抗原に結合する受容体またはリガンドでもよいし、前記所望の抗原に結合する、抗体またはその抗原結合断片があげられる。
【００５７】
前記第２の結合ドメインが所望の抗原に結合するリガンドまたは受容体の場合、前記第１の結合ドメインは、例えば、前記リガンドに結合する受容体または前記受容体に結合するリガンドがあげられ、前記リガンドまたは受容体の種類に応じて、適宜設定できる。具体例として、前記リガンドがＣＴＬＡ４リガンドの場合、前記受容体は、例えば、ＣＴＬＡ４があげられる。前記リガンドがＰＤ−１リガンドの場合、前記受容体は、ＰＤ−１があげられる。
【００５８】
前記第２の結合ドメインが所望の抗原に結合する抗体またはその抗原結合断片である場合、前記第２の結合ドメインは、前述の抗体またはその抗原結合断片と同様の構造を採用でき、例えば、重鎖可変領域および軽鎖可変領域を有する。以下、前記第２の結合ドメインの重鎖可変領域および軽鎖可変領域を、それぞれ、第２の重鎖可変領域および第２の軽鎖可変領域ともいう。前記抗原結合断片は、前述の説明を援用できる。前記第２の結合ドメインは、ｓｃＦｖを含むことが好ましい、すなわち、前記所望の抗原に結合可能なｓｃＦｖを含むことが好ましい。
【００５９】
前記第２の結合ドメインが前記第２の重鎖可変領域および第２の軽鎖可変領域を有する場合、前記第２の重鎖可変領域および第２の軽鎖可変領域は、例えば、前記所望の抗原に結合する抗体の重鎖可変領域および軽鎖可変領域に由来してもよいし、前記所望の抗原で免疫し、得られた所望の抗原に結合可能な抗体の重鎖可変領域および軽鎖可変領域に由来してもよいし、ファージディスプレイ等のスクリーニング方法により得られた、抗体等に結合可能な抗体の重鎖可変領域および軽鎖可変領域に由来してもよい。
【００６０】
抗体の抗原に対する結合性には、前述のように、重鎖可変領域および軽鎖可変領域における相補性決定領域（ＣＤＲ）が重要である。このため、前記第２の重鎖可変領域のＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、およびＣＤＲＨ３は、それぞれ、前記所望の抗原に結合する抗体の重鎖可変領域のＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、およびＣＤＲＨ３のアミノ酸配列からなるポリペプチドでもよいし、前記所望の抗原に結合する抗体の重鎖可変領域のＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、およびＣＤＲＨ３のアミノ酸配列を含むポリペプチドでもよい。また、前記第２の軽鎖可変領域のＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３は、それぞれ、前記所望の抗原に結合する抗体の軽鎖可変領域のＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３のアミノ酸配列からなるポリペプチドでもよいし、前記所望の抗原に結合する抗体の軽鎖可変領域のＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３のアミノ酸配列を含むポリペプチドでもよい。
【００６１】
前記第２の重鎖可変領域において、ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、およびＣＤＲＨ３以外の領域、すなわち、フレームワーク領域（ＦＲ）は、例えば、前記所望の抗原に結合する抗体における重鎖可変領域のＦＲを含んでもよい。前記第２の重鎖可変領域におけるＦＲＨ１、ＦＲＨ２、ＦＲＨ３、およびＦＲＨ４は、例えば、それぞれ、前記所望の抗原に結合する抗体のＦＲＨ１、ＦＲＨ２、ＦＲＨ３、およびＦＲＨ４のアミノ酸配列からなるポリペプチドでもよいし、前記所望の抗原に結合する抗体のＦＲＨ１、ＦＲＨ２、ＦＲＨ３、およびＦＲＨ４のアミノ酸配列を含むポリペプチドでもよい。前記各ＣＤＲＨの説明における「所望の抗原に結合する抗体」と、前記各ＦＲＨの説明における「所望の抗原に結合する抗体」とは、同じ抗体等であることが好ましい。
【００６２】
前記第２の軽鎖可変領域において、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３以外の領域、すなわち、フレームワーク領域（ＦＲ）は、例えば、前記所望の抗原に結合する抗体における軽鎖可変領域のＦＲを含んでもよい。前記第２の軽鎖可変領域におけるＦＲＬ１、ＦＲＬ２、ＦＲＬ３、およびＦＲＬ４は、例えば、それぞれ、前記所望の抗原に結合する抗体のＦＲＬ１、ＦＲＬ２、ＦＲＬ３、およびＦＲＬ４のアミノ酸配列からなるポリペプチドでもよいし、前記所望の抗原に結合する抗体のＦＲＬ１、ＦＲＬ２、ＦＲＬ３、およびＦＲＬ４のアミノ酸配列を含むポリペプチドでもよい。前記各ＣＤＲＬの説明における「所望の抗原に結合する抗体」と、前記各ＦＲＬの説明における「所望の抗原に結合する抗体」とは、同じ抗体等であることが好ましい。また、前記各ＣＤＲＨの説明における「所望の抗原に結合する抗体」と、前記各ＣＤＲＬの説明における「所望の抗原に結合する抗体」とは、同じ抗体等であることが好ましい。
【００６３】
前記第２の結合ドメインが前記第２の重鎖可変領域および第２の軽鎖可変領域を有する場合、前記第２の重鎖可変領域および第２の軽鎖可変領域は、例えば、前記所望の抗原に結合する抗体の重鎖可変領域および軽鎖可変領域を用いてもよいし、前記所望の抗原により免疫し、得られた前記所望の抗原結合可能な抗体の重鎖可変領域および軽鎖可変領域を用いてもよい。具体例として、前記所望の抗原がヒトＣＤ３εの場合、ヒトＣＤ３εに結合する抗体（クローン名）は、例えば、ＯＫＴ３抗体、ＵＣＨＴ１抗体、Ｌ２Ｋ抗体、ＨＩＴ３a抗体、２８Ｆ１１抗体、２７Ｈ５抗体等があげられる。
【００６４】
前記所望の抗原がＣＤ３εの場合、前記第２の結合ドメインは、例えば、前記抗体等と抗体複合体を形成した際に、前記抗体複合体に前記第２の結合ドメインを介してＴ細胞が結合し、前記Ｔ細胞が細胞傷害活性を発揮可能であることから、下記第２の重鎖可変領域および第２の軽鎖可変領域を含むことが好ましい。
（第２の重鎖可変領域）
ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、およびＣＤＲＨ３を含み、
ＣＤＲＨ１が、下記（H1-B）のアミノ酸配列を含むポリペプチドであり、
ＣＤＲＨ２が、下記（H2-B）のアミノ酸配列を含むポリペプチドであり、
ＣＤＲＨ３が、下記（H3-B）のアミノ酸配列を含むポリペプチドである。
（第２の軽鎖可変領域）
ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３を含み、
ＣＤＲＬ１が、下記（L1-B）のアミノ酸配列を含むポリペプチドであり、
ＣＤＲＬ２が、下記（L2-B）のアミノ酸配列を含むポリペプチドであり、
ＣＤＲＬ３が、下記（L3-B）のアミノ酸配列を含むポリペプチドである。
【００６５】
（H1-B）下記（H1-B1）、（H1-B2）または（H1-B3）のアミノ酸配列
（H1-B1）配列番号７（GYTFTRYT）のアミノ酸配列
（H1-B2）配列番号７のアミノ酸配列に対して、８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列
（H1-B3）配列番号７のアミノ酸配列において、１個または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列
（H2-B）下記（H2-B1）、（H2-B2）または（H2-B3）のアミノ酸配列
（H2-B1）配列番号８（INPSRGYT）のアミノ酸配列
（H2-B2）配列番号８のアミノ酸配列に対して、８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列
（H2-B3）配列番号８のアミノ酸配列において、１個または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列
（H3-B）下記（H3-B1）、（H3-B2）または（H3-B3）のアミノ酸配列
（H3-B1）配列番号９（ARYYDDHYCLDY）のアミノ酸配列
（H3-B2）配列番号９のアミノ酸配列に対して、８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列
（H3-B3）配列番号９のアミノ酸配列において、１個または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列
【００６６】
（L1-B）下記（L1-B1）、（L1-B2）または（L1-B3）のアミノ酸配列
（L1-B1）配列番号１０（SSVSY）のアミノ酸配列
（L1-B2）配列番号１０のアミノ酸配列に対して、８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列
（L1-B3）配列番号１０のアミノ酸配列において、１個または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列
（L2-B）下記（L2-B1）、（L2-B2）または（L2-B3）のアミノ酸配列
（L2-B1）配列番号１１（DTS）のアミノ酸配列
（L2-B2）配列番号１１のアミノ酸配列に対して、８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列
（L2-B3）配列番号１１のアミノ酸配列において、１個または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列
（L3-B）下記（L3-B1）、（L3-B2）または（L3-B3）のアミノ酸配列
（L3-B1）配列番号１２（QQWSSNPFT）のアミノ酸配列
（L3-B2）配列番号１２のアミノ酸配列に対して、８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列
（L3-B3）配列番号１２のアミノ酸配列において、１個または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列。
【００６７】
前記各ＣＤＲにおいて、前記「同一性」は、それぞれ、例えば、７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上である。
【００６８】
前記各ＣＤＲにおいて、置換等に関する「１個または数個」は、それぞれ、例えば、１〜１０個、１〜７個、１〜５個、１〜４個、１〜３個、１または２個、１個である。
【００６９】
前記第２の重鎖可変領域は、例えば、下記（H-B）のアミノ酸配列からなるポリペプチドを含むことが好ましい。また、前記第２の軽鎖可変領域は、例えば、下記（L-B）のアミノ酸配列からなるポリペプチドを含むことが好ましい。
【００７０】
（H-B）下記（H-B1）、（H-B2）または（H-B3）のアミノ酸配列
（H-B1）配列番号１６のアミノ酸配列
配列番号１６：QVQLQQSGAELARPGASVKMSCKASGYTFTRYTMHWVKQRPGQGLEWIGYINPSRGYTNYNQKFKDKATLTTDKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARYYDDHYCLDYWGQGTTLTVSS
（H-B2）配列番号１６のアミノ酸配列に対して、８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列
（H-B3）配列番号１６のアミノ酸配列において、１個または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列
【００７１】
（L-B）下記（L-B1）、（L-B2）または（L-B3）のアミノ酸配列
（L-B1）配列番号１７のアミノ酸配列
配列番号１７：QIVLTQSPAIMSASPGEKVTMTCSASSSVSYMNWYQQKSGTSPKRWIYDTSKLASGVPAHFRGSGSGTSYSLTISGMEAEDAATYYCQQWSSNPFTFGSGTKLEIN
（L-B2）配列番号１７のアミノ酸配列に対して、８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列
（L-B3）配列番号１７のアミノ酸配列において、１個または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列
【００７２】
前記（H-B1）のアミノ酸配列は、例えば、ＣＤＲＨ１の（H1-B1）、ＣＤＲＨ２の（H2-B1）、およびＣＤＲＨ３の（H3-B1）のアミノ酸配列を含む配列である。前記（H-B2）のアミノ酸配列は、例えば、ＣＤＲＨ１の（H1-B1）、ＣＤＲＨ２の（H2-B1）、およびＣＤＲＨ３（H3-B1）のアミノ酸配列を含み、且つ、配列番号１６のアミノ酸配列に対して、７０％以上の同一性を有するアミノ酸配列であってもよい。前記（H-B3）のアミノ酸配列は、例えば、ＣＤＲＨ１の（H1-B1）、ＣＤＲＨ２の（H2-B1）、およびＣＤＲＨ３（H3-B1）のアミノ酸配列を含み、且つ、配列番号１６のアミノ酸配列において、１個または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列であってもよい。
【００７３】
前記（L-B1）のアミノ酸配列は、例えば、ＣＤＲＬ１の（L1-B1）、ＣＤＲＬ２の（L2-B1）、およびＣＤＲＬ３の（L3-B1）のアミノ酸配列を含む配列である。前記（L-B2）のアミノ酸配列は、例えば、ＣＤＲＬ１の（L1-B1）、ＣＤＲＬ２の（L2-B1）、およびＣＤＲＬ３の（L3-B1）のアミノ酸配列を含み、且つ、配列番号１７のアミノ酸配列に対して、７０％以上の同一性を有するアミノ酸配列であってもよい。前記（L-B3）のアミノ酸配列は、例えば、ＣＤＲＬ１の（L1-B1）、ＣＤＲＬ２の（L2-B1）、およびＣＤＲＬ３の（L3-B1）のアミノ酸配列を含み、且つ、配列番号１７のアミノ酸配列において、１個または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列であってもよい。
【００７４】
前記重鎖可変領域のポリペプチドおよび前記軽鎖可変領域のポリペプチドにおいて、前記「同一性」は、それぞれ、例えば、７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上である。
【００７５】
前記重鎖可変領域のポリペプチドおよび前記軽鎖可変領域のポリペプチドにおいて、置換等に関する「１個または数個」は、それぞれ、例えば、１〜３０個、１〜２０個、１〜１５個、１〜１０個、１〜９個、１〜８個、１〜７個、１〜６個、１〜５個、１〜４個、１〜３個、１または２個、１個である。
【００７６】
前記所望の抗原がＣＤ３εの場合、前記第２の結合ドメインは、例えば、前記抗体等と抗体複合体を形成した際に、前記抗体複合体に前記第２の結合ドメインを介してＴ細胞が結合し、前記Ｔ細胞が細胞傷害活性を発揮可能であることから、下記第２のｓｃＦｖのアミノ酸配列からなるポリペプチドを含むことが好ましい。下記（S-B2）および（S-B3）のアミノ酸配列からなるポリペプチドは、例えば、ＣＤ３εに結合可能である。
【００７７】
（第２のｓｃＦｖ）
（S-B）下記（S-B1）、（S-B2）または（S-B3）のアミノ酸配列
（S-B1）配列番号１８のアミノ酸配列
配列番号１８：QVQLQQSGAELARPGASVKMSCKASGYTFTRYTMHWVKQRPGQGLEWIGYINPSRGYTNYNQKFKDKATLTTDKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARYYDDHYCLDYWGQGTTLTVSSGGGGSGGGGSGGGGSQIVLTQSPAIMSASPGEKVTMTCSASSSVSYMNWYQQKSGTSPKRWIYDTSKLASGVPAHFRGSGSGTSYSLTISGMEAEDAATYYCQQWSSNPFTFGSGTKLEIN
（S-B2）配列番号１８のアミノ酸配列に対して、８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列
（S-B3）配列番号１８のアミノ酸配列において、１個または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列
【００７８】
前記（S-B1）のアミノ酸配列は、例えば、ＣＤＲＨ１の（H1-B1）、ＣＤＲＨ２の（H2-B1）、およびＣＤＲＨ３の（H3-B1）のアミノ酸配列を含む配列である。前記（S-B2）のアミノ酸配列は、例えば、ＣＤＲＨ１の（H1-B1）、ＣＤＲＨ２の（H2-B1）、およびＣＤＲＨ３（H3-B1）のアミノ酸配列を含み、且つ、配列番号１８のアミノ酸配列に対して、７０％以上の同一性を有するアミノ酸配列であってもよい。前記（S-B3）のアミノ酸配列は、例えば、ＣＤＲＨ１の（H1-B1）、ＣＤＲＨ２の（H2-B1）、およびＣＤＲＨ３（H3-B1）のアミノ酸配列を含み、且つ、配列番号１８のアミノ酸配列において、１個または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列であってもよい。
【００７９】
前記（S-B1）のアミノ酸配列は、例えば、第２の重鎖可変領域の（H-B1）のアミノ酸配列を含む配列である。前記（S-B2）のアミノ酸配列は、例えば、第２の重鎖可変領域の（H-B1）のアミノ酸配列を含み、且つ、配列番号１８のアミノ酸配列に対して、７０％以上の同一性を有するアミノ酸配列であってもよい。前記（S-B3）のアミノ酸配列は、例えば、第２の重鎖可変領域の（H-B1）のアミノ酸配列を含み、且つ、配列番号１８のアミノ酸配列において、１個または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列であってもよい。
【００８０】
前記（S-B1）のアミノ酸配列は、例えば、ＣＤＲＬ１の（L1-B1）、ＣＤＲＬ２の（L2-B1）、およびＣＤＲＬ３の（L3-B1）のアミノ酸配列を含む配列である。前記（S-B2）のアミノ酸配列は、例えば、ＣＤＲＬ１の（L1-B1）、ＣＤＲＬ２の（L2-B1）、およびＣＤＲＬ３の（L3-B1）のアミノ酸配列を含み、且つ、配列番号１８のアミノ酸配列に対して、７０％以上の同一性を有するアミノ酸配列であってもよい。前記（S-B3）のアミノ酸配列は、例えば、ＣＤＲＬ１の（L1-B1）、ＣＤＲＬ２の（L2-B1）、およびＣＤＲＬ３の（L3-B1）のアミノ酸配列を含み、且つ、配列番号１８のアミノ酸配列において、１個または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列であってもよい。
【００８１】
前記（S-B1）のアミノ酸配列は、例えば、第２の軽鎖可変領域の（L-B1）のアミノ酸配列を含む配列である。前記（S-B2）のアミノ酸配列は、例えば、第２の軽鎖可変領域の（L-B1）のアミノ酸配列を含み、且つ、配列番号１８のアミノ酸配列に対して、７０％以上の同一性を有するアミノ酸配列であってもよい。前記（S-B3）のアミノ酸配列は、例えば、第２の軽鎖可変領域の（L-B1）のアミノ酸配列を含み、且つ、配列番号１８のアミノ酸配列において、１個または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列であってもよい。
【００８２】
前記（S-B2）のアミノ酸配列において、前記「同一性」は、それぞれ、例えば、７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上である。
【００８３】
前記（S-B3）のアミノ酸配列において、置換等に関する「１個または数個」は、それぞれ、例えば、１〜７２個、１〜６０個、１〜４８個、１〜４０個、１〜２４個、１〜２０個、１〜１５個、１〜１０個、１〜９個、１〜８個、１〜７個、１〜６個、１〜５個、１〜４個、１〜３個、１または２個、１個である。
【００８４】
前記第１の結合ドメインおよび前記第２の結合ドメインは、直接または間接的に連結されていてもよいし、前記第１の結合ドメインと前記第２の結合ドメインとを共存させた場合、両者が会合（結合）するように形成してもよい。前記間接的な連結の場合、前記第１の結合ドメインおよび前記第２の結合ドメインは、リンカーペプチド（ドメインリンカー）により連結されていることが好ましい。前記ドメインリンカーは、例えば、１〜４０個、１〜１８個、１〜１５個、１〜７個、１〜３個、１個または２個のアミノ酸から構成される。前記ドメインリンカーは、例えば、グリシンおよびセリン等のアミノ酸から構成されており、具体例として、（ＧｍＳ）ｎがあげられる。前記ｍは、正の整数であり、例えば、１〜６の整数である。前記ｎは、正の整数であり、例えば、１〜６の整数である。前記ｍとｎとは、同じでもよいし、異なってもよい。具体例として、ドメインリンカーは、下記配列番号１９のアミノ酸配列からなるポリペプチドがあげられる。前記会合は、例えば、アミノ酸側鎖の電荷を利用できる。具体例として、前記会合は、例えば、一方の結合ドメインに正の電荷を有するアミノ酸のドメインを付加し、他方の結合ドメインに負の電荷を有するアミノ酸のドメインを付加することにより、誘導できる。また、前記会合は、例えば、タグ配列とタグ配列を認識するポリペプチドの組合せ等も利用できる。
ドメインリンカー（配列番号１９）:SGSG
【００８５】
本発明の複合体化タンパク質は、例えば、腫瘍抗原に結合可能な抗体と組合せて利用することにより、ＮＫ細胞およびＴ細胞をリクルートでき、腫瘍に対する細胞傷害活性を誘導できることから、下記（Ｂ）のアミノ酸配列からなるポリペプチドが好ましい。下記（Ｂ２）および（Ｂ３）のアミノ酸配列からなるポリペプチドは、例えば、ヒトＩｇＧおよび／またはＣＤ３εに結合可能である。
【００８６】
（Ｂ）下記（Ｂ１）、（Ｂ２）、（Ｂ３）のアミノ酸配列
（Ｂ１）配列番号２０のアミノ酸配列
配列番号２０：MMRPIVLVLLFATSAAADIKMTQSPSSMYASVGERVTITCKASQDIKSYLTWYQKKPWKSPRTLIFYSTRLADGVPSRFSGSGSGQDFSLTISSLESDDTATYYCLQHDESPFTFGGGTKLEIKGGGGSGGGGSGGGGSQVQLQQPGAELVKPGASVKMSCKASGYTFTNYWINWVKQRPGQGLEWIGDIYPGGGITNYNEKFKTKATLTLDTSSSTVYMQLSSLTSEDSAVYYCSRSYGKYFDYWGQGTTLIVSSSGSGQVQLQQSGAELARPGASVKMSCKASGYTFTRYTMHWVKQRPGQGLEWIGYINPSRGYTNYNQKFKDKATLTTDKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARYYDDHYCLDYWGQGTTLTVSSGGGGSGGGGSGGGGSQIVLTQSPAIMSASPGEKVTMTCSASSSVSYMNWYQQKSGTSPKRWIYDTSKLASGVPAHFRGSGSGTSYSLTISGMEAEDAATYYCQQWSSNPFTFGSGTKLEIN
（Ｂ２）配列番号２０のアミノ酸配列に対して、８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列
（Ｂ３）配列番号２０のアミノ酸配列において、１個または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列
【００８７】
前記（Ｂ１）のアミノ酸配列は、例えば、ＣＤＲＨ１の（H1-A1）、ＣＤＲＨ２の（H2-A1）、およびＣＤＲＨ３の（H3-A1）のアミノ酸配列を含む配列である。前記（Ｂ２）のアミノ酸配列は、例えば、ＣＤＲＨ１の（H1-A1）、ＣＤＲＨ２の（H2-A1）、およびＣＤＲＨ３（H3-A1）のアミノ酸配列を含み、且つ、配列番号２０のアミノ酸配列に対して、７０％以上の同一性を有するアミノ酸配列であってもよい。前記（Ｂ３）のアミノ酸配列は、例えば、ＣＤＲＨ１の（H1-A1）、ＣＤＲＨ２の（H2-A1）、およびＣＤＲＨ３（H3-A1）のアミノ酸配列を含み、且つ、配列番号２０のアミノ酸配列において、１個または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列であってもよい。
【００８８】
前記（Ｂ１）のアミノ酸配列は、例えば、第１の重鎖可変領域の（H-A1）のアミノ酸配列を含む配列である。前記（Ｂ２）のアミノ酸配列は、例えば、第１の重鎖可変領域の（H-A1）のアミノ酸配列を含み、且つ、配列番号２０のアミノ酸配列に対して、７０％以上の同一性を有するアミノ酸配列であってもよい。前記（Ｂ３）のアミノ酸配列は、例えば、第１の重鎖可変領域の（H-A1）のアミノ酸配列を含み、且つ、配列番号２０のアミノ酸配列において、１個または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列であってもよい。
【００８９】
前記（Ｂ１）のアミノ酸配列は、例えば、ＣＤＲＬ１の（L1-A1）、ＣＤＲＬ２の（L2-A1）、およびＣＤＲＬ３の（L3-A1）のアミノ酸配列を含む配列である。前記（Ｂ２）のアミノ酸配列は、例えば、ＣＤＲＬ１の（L1-A1）、ＣＤＲＬ２の（L2-A1）、およびＣＤＲＬ３の（L3-A1）のアミノ酸配列を含み、且つ、配列番号２０のアミノ酸配列に対して、７０％以上の同一性を有するアミノ酸配列であってもよい。前記（Ｂ３）のアミノ酸配列は、例えば、ＣＤＲＬ１の（L1-A1）、ＣＤＲＬ２の（L2-A1）、およびＣＤＲＬ３の（L3-A1）のアミノ酸配列を含み、且つ、配列番号２０のアミノ酸配列において、１個または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列であってもよい。
【００９０】
前記（Ｂ１）のアミノ酸配列は、例えば、第１の軽鎖可変領域の（L-A1）のアミノ酸配列を含む配列である。前記（Ｂ２）のアミノ酸配列は、例えば、第１の軽鎖可変領域の（L-A1）のアミノ酸配列を含み、且つ、配列番号２０のアミノ酸配列に対して、７０％以上の同一性を有するアミノ酸配列であってもよい。前記（Ｂ３）のアミノ酸配列は、例えば、第１の軽鎖可変領域の（L-A1）のアミノ酸配列を含み、且つ、配列番号２０のアミノ酸配列において、１個または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列であってもよい。
【００９１】
前記（Ｂ１）のアミノ酸配列は、例えば、ＣＤＲＨ１の（H1-B1）、ＣＤＲＨ２の（H2-B1）、およびＣＤＲＨ３の（H3-B1）のアミノ酸配列を含む配列である。前記（Ｂ２）のアミノ酸配列は、例えば、ＣＤＲＨ１の（H1-B1）、ＣＤＲＨ２の（H2-B1）、およびＣＤＲＨ３（H3-B1）のアミノ酸配列を含み、且つ、配列番号２０のアミノ酸配列に対して、７０％以上の同一性を有するアミノ酸配列であってもよい。前記（Ｂ３）のアミノ酸配列は、例えば、ＣＤＲＨ１の（H1-B1）、ＣＤＲＨ２の（H2-B1）、およびＣＤＲＨ３（H3-B1）のアミノ酸配列を含み、且つ、配列番号２０のアミノ酸配列において、１個または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列であってもよい。
【００９２】
前記（Ｂ１）のアミノ酸配列は、例えば、第２の重鎖可変領域の（H-B1）のアミノ酸配列を含む配列である。前記（Ｂ２）のアミノ酸配列は、例えば、第２の重鎖可変領域の（H-B1）のアミノ酸配列を含み、且つ、配列番号２０のアミノ酸配列に対して、７０％以上の同一性を有するアミノ酸配列であってもよい。前記（Ｂ３）のアミノ酸配列は、例えば、第２の重鎖可変領域の（H-B1）のアミノ酸配列を含み、且つ、配列番号２０のアミノ酸配列において、１個または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列であってもよい。
【００９３】
前記（Ｂ１）のアミノ酸配列は、例えば、ＣＤＲＬ１の（L1-B1）、ＣＤＲＬ２の（L2-B1）、およびＣＤＲＬ３の（L3-B1）のアミノ酸配列を含む配列である。前記（Ｂ２）のアミノ酸配列は、例えば、ＣＤＲＬ１の（L1-B1）、ＣＤＲＬ２の（L2-B1）、およびＣＤＲＬ３の（L3-B1）のアミノ酸配列を含み、且つ、配列番号２０のアミノ酸配列に対して、７０％以上の同一性を有するアミノ酸配列であってもよい。前記（Ｂ３）のアミノ酸配列は、例えば、ＣＤＲＬ１の（L1-B1）、ＣＤＲＬ２の（L2-B1）、およびＣＤＲＬ３の（L3-B1）のアミノ酸配列を含み、且つ、配列番号２０のアミノ酸配列において、１個または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列であってもよい。
【００９４】
前記（Ｂ１）のアミノ酸配列は、例えば、第２の軽鎖可変領域の（L-B1）のアミノ酸配列を含む配列である。前記（Ｂ２）のアミノ酸配列は、例えば、第２の軽鎖可変領域の（L-B1）のアミノ酸配列を含み、且つ、配列番号２０のアミノ酸配列に対して、７０％以上の同一性を有するアミノ酸配列であってもよい。前記（Ｂ３）のアミノ酸配列は、例えば、第２の軽鎖可変領域の（L-B1）のアミノ酸配列を含み、且つ、配列番号２０のアミノ酸配列において、１個または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列であってもよい。
【００９５】
前記（Ｂ２）のアミノ酸配列において、前記「同一性」は、それぞれ、例えば、７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上である。
【００９６】
前記（Ｂ３）のアミノ酸配列において、置換等に関する「１個または数個」は、それぞれ、例えば、１〜７２個、１〜６０個、１〜４８個、１〜４０個、１〜２４個、１〜２０個、１〜１５個、１〜１０個、１〜９個、１〜８個、１〜７個、１〜６個、１〜５個、１〜４個、１〜３個、１または２個、１個である。
【００９７】
本発明の複合体化タンパク質は、前記第２の結合ドメインを１つまたは複数有する。後者の場合、各第２の結合ドメインは、同じ抗原に結合してもよいし、異なる抗原に結合してもよい。また、各第２の結合ドメインが同じ抗原に結合する場合、各第２の結合ドメインは、同じ抗原の同一のエピトープに結合してもよいし、同じ抗原の異なるエピトープに結合してもよい。
【００９８】
本発明の複合体化タンパク質は、前記免疫グロブリンと架橋可能な架橋部を有することが好ましい。このような構成を有することにより、本発明の複合体化タンパク質は、前記免疫グロブリンと複合体化後に、前記免疫グロブリンと架橋することで、得られた抗体複合体を安定化できる。このため、前記架橋部を有する複合体化タンパク質によれば、前記抗体複合体を生体に投与した際に、前記免疫グロブリンと前記複合体化タンパク質との解離を防止でき、医薬組成物として効果的に使用できる。前記架橋部は、光の照射により、架橋反応が生じる光反応性架橋部が好ましい。本発明の複合体化タンパク質が光反応性架橋部を有する場合、前記複合体化タンパク質を構成するアミノ酸の一部または全部が、例えば、前記光反応性架橋部として、光活性型の反応基を有し、好ましくは、前記第１の結合ドメインを構成するアミノ酸の一部または全部が、前記光反応性架橋部として、光活性型の反応基を有する。前記光活性型の反応基を有するアミノ酸は、例えば、L-photo-ロイシン、L-photo-イソロイシン、L-photo-メチオニン等があげられる。前記光活性型の反応基を有するアミノ酸を有する複合体化タンパク質は、例えば、前記複合体化タンパク質の発現系において、対応するアミノ酸に加えてまたは代えて、前記光活性型の反応基を有するアミノ酸を発現系に添加し、前記複合体化タンパク質を発現させることにより、調製できる。前記光活性型の反応基を有するアミノ酸およびそれを用いた架橋方法は、下記参考文献４を参照できる。
参考文献４：Monika Suchanek et.al., “Photo-leucine and photo-methionine allow identification of protein-protein interactions in living cells.”, Nature Method, 2005, DOI:10.1038/NMETH752
【００９９】
本発明において、前記複合体化タンパク質の第１の結合ドメインは、抗体等に結合するが、前記抗体等が付加配列を有する場合、前記第１の結合ドメインは、前記付加配列に結合可能でもよい。前記付加配列は、例えば、ペプチドタグ、プロテインタグ等のタグ等があげられる。前記タグは、例えば、ＦＬＡＧ（登録商標）タグ、ＨＡタグ、Ｈｉｓタグ、Ｍｙｃタグ、Ｖ５タグ、切断型のＮＧＦＲ（nerve growth factor receptor）等があげられる。前記付加配列は、例えば、本発明の複合体化タンパク質のＮ末端およびＣ末端の少なくとも一方に付加される。前記付加配列がＨｉｓタグの場合、前記Ｈｉｓタグは、例えば、本発明の複合体化タンパク質のＣ末端に付加される。本発明の複合体化タンパク質と前記付加配列とは、前述のリンカーペプチドにより連結されてもよい。
【０１００】
本発明の複合体化タンパク質の製造方法は、特に制限されず、例えば、前述のアミノ酸配列情報に基づいて、遺伝子工学的に製造することができる。具体的には、例えば、以下のようにして行うことができる。なお、本発明は、この例示には限定されない。
【０１０１】
まず、本発明の複合体化タンパク質をコードする核酸を含む発現ベクターを宿主に導入し、形質転換体を得る。そして、前記形質転換体を培養し、前記複合体化タンパク質を発現する形質転換体を得る。そして、前記形質転換体を培養し、前記複合体化タンパク質を含む画分を回収し、得られた回収画分から、前記複合体化タンパク質を単離または精製する。
【０１０２】
前記発現ベクターは、例えば、前記複合体化タンパク質をコードする核酸を含むベクター等があげられる。前記発現ベクターは、例えば、前記複合体化タンパク質をコードする核酸を連結用ベクターに連結することで調製できる。前記連結用ベクターの種類は、特に制限されず、例えば、オンコレトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、シュードタイプベクター等のレトロウイルスベクター；アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター、シミアンウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター、センダイウイルスベクター、エプスタイン・バー・ウイルス（ＥＢＶ）ベクター、ＨＳＶベクター等のウイルスベクターがあげられる。具体例として、前記連結用ベクターは、例えば、ｐＵＣ、ｐＣＭＶ、ｐＭＸ、ｐＥＬＰがあげられる。前記連結用ベクターは、例えば、前記発現ベクターを導入する宿主に応じて、適宜設定することもできる。前記宿主は、特に制限されず、例えば、ＨＥＫ細胞、ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ細胞、ＮＳＯ細胞等の哺乳類由来の培養細胞等があげられる。
【０１０３】
前記発現ベクターは、例えば、前記複合体化タンパク質をコードする核酸の発現を調節する、調節配列を有することが好ましい。前記調節配列は、例えば、プロモーター、ターミネーター、エンハンサー、ポリアデニル化シグナル配列、複製起点配列（ｏｒｉ）等があげられる。前記発現ベクターにおいて、前記調節配列の配置は特に制限されない。前記発現ベクターにおいて、前記調節配列は、例えば、前記複合体化タンパク質の発現を、機能的に調節できるように配置されていればよく、公知の方法に基づいて配置できる。前記調節配列は、例えば、前記連結ベクターが予め備える配列を利用してもよいし、前記連結ベクターに、さらに、前記調節配列を挿入してもよいし、前記連結ベクターが備える調節配列を、他の調節配列に置き換えてもよい。
【０１０４】
前記発現ベクターは、例えば、さらに、選択マーカーのコード配列を有してもよい。前記選択マーカーは、例えば、薬剤耐性マーカー、蛍光タンパク質マーカー、酵素マーカー、細胞表面レセプターマーカー等があげられる。
【０１０５】
前記形質転換体の培養方法は、特に制限されず、前記宿主の種類に応じて、適宜決定できる。前記複合体化タンパク質を含む画分は、例えば、培養した前記形質転換体を破砕し、液体画分として回収できる。前記複合体化タンパク質の単離または精製は、特に制限されず、公知の方法が採用できる。
【０１０６】
本発明の複合体化タンパク質は、後述の本発明の抗体複合体の製造に使用できる。また、本発明の複合体化タンパク質は、例えば、前記抗体等と複合体を形成させることにより、医薬組成物として使用できる。
【０１０７】
＜抗体複合体＞
本発明の抗体複合体は、前述のように、標的抗原に結合可能な抗体またはその抗原結合断片と、複合体化タンパク質とを含み、前記複合体化タンパク質は、前記本発明の複合体化タンパク質であり、前記複合体化タンパク質は、その第１の抗原結合ドメインより前記抗体またはその抗原結合断片と結合し、複合体化している。本発明の抗体複合体は、前記本発明の複合体化タンパク質を含み、前記本発明の複合体化タンパク質が、標的抗原に結合可能な抗体またはその抗原結合断片と複合体を形成していることが特徴であり、その他の構成および条件は、特に制限されない。本発明の抗体複合体は、前記抗体またはその抗原結合断片の抗原結合ドメインに加えて、本発明の複合体化タンパク質の第２の抗原結合ドメインを含む。このため、本発明の抗体複合体は、例えば、前述の多重特異性抗体と同様の機能を発揮できる。具体例として、前記第２の結合ドメインが結合する所望の抗原をＣＤ３等のＴ細胞上に発現する抗原とし、前記抗体等の結合ドメインの結合対象を腫瘍抗原とすることにより、本発明の抗体複合体は、例えば、がん細胞に結合し、かつＴ細胞とＮＫ細胞とをリクルートできるため、多重特異性抗体を含む抗癌剤と同様の機能を発揮する抗癌剤として使用できる。また、本発明の抗体複合体は、前記第２の結合ドメインの結合対象と、前記免疫グロブリンの結合対象とを近傍に配置することができ、前記抗体複合体は、例えば、前述の血友病治療薬と同様の機能を発揮する血友病治療薬として使用できる。本発明の抗体複合体は、前記第２の結合ドメインの結合対象と、前記免疫グロブリンの結合対象とを近傍に配置することができるため、例えば、複合体を形成している受容体等を離隔し、受容体を介したシグナルを抑制することができる。さらに、本発明の抗体複合体は、例えば、複数の抗原に結合可能であるため、複数の抗原の除去にも使用でき、例えば、疾患の原因物質となる抗原の除去にも使用できる。本発明の抗体複合体は、前記本発明の複合体化タンパク質の説明を援用できる。
【０１０８】
前記標的抗原は、特に制限されず、任意の抗原とできる。前記標的抗原は、例えば、疾患に関連する抗原であり、具体例として、前記所望の抗原の説明を援用できる。前記疾患に関連する抗原は、例えば、前記疾患の発症または症状の進行に関係する抗原、疾患の治療に有効な抗原、疾患において発現が上昇または減少している抗原、疾患の原因となる細胞に発現する抗原等があげられる。前記疾患は、特に制限されず、例えば、悪性リンパ腫、白血病、骨髄腫、肺がん、乳がん、腎がん、大腸がん、卵巣がん等の腫瘍；アレルギー疾患または自己免疫疾患等の免疫疾患；血友病、特発性血小板減少性紫斑病、フォンビルブランド病等の遺伝子疾患；アルツハイマー病、多発性硬化症、ギランバレー症候群等の神経疾患；等があげられる。本発明の抗体複合体をがん治療薬として用いる場合、前記標的抗原は、例えば、Angiopoietin、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ３０、ＣＤ３８、ＣＤ１２３、ＣＥＡ、ｃＭＥＴ、ＥｐＣａｍ、ＧＰＡ３３、ＧＰＣ３、Ｈｅｒ１、Ｈｅｒ２、Ｈｅｒ２、ＩＧＦ１Ｒ、ＰＳＭＡ、ＶＥＧＦ、ＥＧＦＲ、ＢＣＭＡ等があげられる。また、本発明の抗体複合体を血友病治療薬として用いる場合、前記標的抗原は、例えば、factor IXa、factor X、vWF、IIb/IIIa等の血液凝固因子等があげられる。本発明の抗体複合体を抗原の除去による治療薬として用いる場合、前記標的抗原は、ＩＬ−１α、ＩＬ−１β、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−１３、ＩＬ−１７、ＩＬ−２３、ＴＮＦ−α等があげられる。前記標的抗原は、前記所望の抗原と異なることが好ましい。
【０１０９】
前記抗体等は、例えば、公知の標的抗原に結合する抗体でもよいし、前記標的抗原で免疫し、得られた抗体等に結合可能な抗体でもよい。具体例として、前記標的抗原がＣＤ１９の場合、前記抗体等（クローン名）は、例えば、ＦＭＣ６３抗体、ＳＪ２５Ｃ１等があげられる。前記標的抗原がＣＤ２０の場合、前記抗体等は、例えば、リツキシマブ（Rituximab）、オビヌツズマブ（Obinutuzumab）等があげられる。前記標的抗原がＣＤ３８の場合、前記抗体等（クローン名）は、例えば、ダラツムマブ（Daratumumab）等があげられる。前記抗体等は、好ましくは、Ｆｃ領域を含む抗体またはその抗原結合断片であり、より好ましくは、抗体である。
【０１１０】
前述のように、前記複合体化タンパク質において、前記第１の結合ドメインは、免疫グロブリンに結合可能である。このため、本発明の抗体複合体において、前記複合体化タンパク質は、その第１の結合ドメインにより前記抗体またはその抗原結合断片と結合している。すなわち、本発明の抗体複合体において、前記抗体等と、前記複合体化タンパク質とは複合体を形成している。ただし、本発明はこれに限定されず、前記複合体化タンパク質と、前記抗体等は、未結合の状態でもよい。この場合、本発明の抗体複合体は、例えば、抗体複合体形成用組成物、または抗体複合体形成用キットということもできる。
【０１１１】
本発明の抗体複合体において、前記抗体等と、前記複合体化タンパク質とは、架橋されていることが好ましい。本発明の抗体複合体が架橋されることにより、例えば、生体への投与時に、前記抗体複合体が、前記抗体等と、前記複合体化タンパク質とに分離することを抑制できる。前記架橋は、例えば、前記複合体化タンパク質の説明における架橋部を用いて形成でき、前記架橋部の説明を援用できる。
【０１１２】
本発明の抗体複合体の製造方法は、例えば、前記標的抗原に結合可能な抗体またはその抗原結合断片と、前記複合体化タンパク質とを接触させる接触工程を含む。前記接触工程では、前記標的抗原に結合可能な抗体またはその抗原結合断片と、前記複合体化タンパク質とが接触することにより、前記複合体化タンパク質における第１の結合ドメインが、前記抗体等に結合し、前記抗体複合体を形成する。前記接触工程における温度は、例えば、０〜４０℃、４〜３７℃である。前記接触工程における接触時間は、例えば、１０〜１８０分、３０〜６０分である。前記接触工程における前記標的抗原に結合可能な抗体またはその抗原結合断片のモル数（ＭＡｂ）と、前記複合体化タンパク質のモル数（ＭＣＯ）との比（ＭＡｂ：ＭＣＯ）は、特に制限されず、例えば、１：０．０１〜１００、０．１〜１０である。前記比（ＭＡｂ：ＭＣＯ）は、例えば、前記接触工程後において、遊離している複合体化タンパク質を低減でき、前記抗体複合体を生体に投与した際の副反応を抑制できることから、好ましくは、１：１以下であり、より好ましくは、１：０．０１〜１、１：０．１〜１、１：０．１〜０．９、１：０．１〜０．８、１：０．１〜０．７、１：０．１〜０．６、１：０．１〜０．５である。
【０１１３】
本発明の抗体複合体の製造方法は、例えば、前記複合体化タンパク質が架橋部を有する場合、前記抗体等と前記複合体化タンパク質とを架橋する架橋工程を含んでもよい。前記架橋工程は、例えば、前記参考文献４を参照できる。
【０１１４】
本発明の抗体複合体の製造方法は、例えば、前記接触工程後または前記架橋工程後に、前記抗体複合体を精製する精製工程を含んでもよい。前記精製工程における精製方法は、特に制限されない。前記抗体複合体は、前記抗体等および前記複合体化タンパク質と比較して、分子量が大きくなっている。このため、前記精製工程では、ゲル濾過クロマトグラフィー等の分子排斥クロマトグラフィーまたは分子篩クロマトグラフィー等により実施できる。前記抗体複合体は、例えば、前記抗体等または前記複合体化タンパク質の抗原を利用して、アフィニティークロマトグラフィー等で精製してもよい。
【０１１５】
本発明の抗体複合体は、医薬組成物として使用できる。
【０１１６】
＜医薬組成物＞
本発明の医薬組成物は、前述のように、前記本発明の複合体化タンパク質を含む。本発明の医薬組成物は、前記本発明の複合体化タンパク質を含むことが特徴であり、その他の構成および条件は、特に制限されない。本発明の医薬組成物は、前記本発明の複合体化タンパク質および抗体複合体の説明を援用できる。本発明の医薬組成物は、例えば、後述の本発明の治療方法に用いることができる。
【０１１７】
本発明の医薬組成物は、例えば、標的抗原に結合可能な抗体またはその抗原結合断片を含んでもよい。この場合、前記複合体化タンパク質と、前記抗体等とは、複合体を形成してもよいし、形成しなくてもよい。前者の場合、前記複合体化タンパク質は、その第１の結合ドメインにより前記抗体またはその抗原結合断片と結合している。後者の場合、前記複合体化タンパク質と、前記抗体等とは、例えば、未混合の状態で有ることが好ましい。また、この場合、本発明の医薬組成物は、例えば、医薬キットということもできる。
【０１１８】
本発明の医薬組成物は、例えば、薬学的に許容される担体、希釈物等のその他の成分を含んでもよい。前記その他の成分は、特に制限されず、例えば、保存剤、抗酸化剤、キレート剤、安定化剤、乳化剤、分散剤、懸濁化剤、増粘剤等があげられる。前記保存剤は、例えば、チメロサール、２−フェノキシエタノール等があげられる。前記キレート剤は、例えば、エチレンジアミン４酢酸、グリコールエーテルジアミン４酢酸等があげられる。
【０１１９】
本発明の医薬組成物の投与条件は、特に制限されず、例えば、対象となる疾患の種類、患者の年齢等に応じて、投与形態、投与方法、投与時期、投与量等を適宜設定できる。本発明の医薬組成物の使用方法は、特に制限されず、例えば、前記投与対象に、本発明の医薬組成物を投与すればよい。
【０１２０】
前記投与対象は、例えば、細胞、組織または器官があげられる。前記投与対象は、例えば、ヒト、ヒトを除く非ヒト動物があげられる。前記非ヒト動物は、前記非ヒト動物は、例えば、マウス、ラット、イヌ、サル、ウサギ、ヒツジ、ウマ、ブタ等の哺乳類等があげられる。前記投与は、例えば、ｉｎ ｖｉｖｏでもｉｎ ｖｉｔｒｏでもよい。
【０１２１】
本発明の医薬組成物の投与形態（剤型）は、特に制限されず、例えば、注射剤（埋め込み注射、持続性注射剤、輸液剤（点滴用製剤等）、凍結乾燥注射剤、粉末注射剤、充填済シリンジ剤、カートリッジ剤等）等の注射投与用製剤等の液剤等である。
【０１２２】
前記投与方法は、特に制限されず、例えば、投与対象に応じて適宜決定できる。前記投与方法は、例えば、非経口投与、経口投与等があげられる。前記非経口投与は、例えば、局所投与、皮下投与、皮内投与、筋肉内投与、腹腔内投与、静脈内投与、リンパ管内投与、腫瘍内投与等があげられる。
【０１２３】
本発明の医薬組成物において、前記複合体化タンパク質の投与量は、特に制限されない。本発明の医薬組成物をｉｎ ｖｉｖｏで使用する場合、例えば、投与対象の種類、症状、年齢、投与方法等により適宜決定できる。具体例として、ヒトに投与する場合、１回あたりの前記複合体化タンパク質の投与量は、例えば、１〜１５００ｍｇ、２５〜３７５ｍｇ、７５〜２００ｍｇ、約１２５ｍｇ（例えば、１００〜１５０ｍｇ）である。具体例として、ヒトに投与する場合、１回あたりの前記抗体等の投与量は、例えば、１〜５０００ｍｇ、７５〜１１２５ｍｇ、２２５〜６００ｍｇ、約３７５ｍｇ（例えば、３００〜４５０ｍｇ）である。本発明の医薬組成物として、前記抗体複合体を投与する場合、前記抗体複合体の投与量は、特に制限されない。具体例として、ヒトに投与する場合、１回あたりの前記抗体複合体の投与量は、例えば、１〜７５００ｍｇ、１００〜１５００ｍｇ、３５０〜８００ｍｇ、約５００ｍｇ（例えば、４００〜６００ｍｇ）である。本発明の医薬組成物の投与回数は、例えば、１週間〜６週間に１回である。本発明の医薬組成物において、前記複合体化タンパク質または前記抗体複合体の配合量は、例示した投与条件を実現できるような濃度または量でバイアル等の容器に含まれていることが好ましい。
【０１２４】
＜核酸＞
本発明の核酸は、前記本発明の複合体化タンパク質をコードする。本発明の核酸は、前記本発明の複合体化タンパク質をコードすることが特徴であり、その他の構成および条件は、特に制限されない。本発明の核酸は、本発明の複合体化タンパク質、抗体複合体、および医薬組成物の説明を援用できる。本発明の核酸によれば、本発明の複合体化タンパク質を製造できる。
【０１２５】
本発明の核酸は、例えば、前記本発明の複合体化タンパク質のアミノ酸配列に基づき、常法により調製できる。具体例として、前記本発明の複合体化タンパク質をコードする核酸は、例えば、前述の各ドメインの前記アミノ酸配列をコードする塩基配列を取得し、前記塩基配列に基づき、分子生物学的手法および／または化学的合成方法により調製できる。前記核酸の塩基配列は、例えば、本発明の複合体化タンパク質を発現させる細胞の由来に応じて、コドン最適化してもよい。
【０１２６】
前記複合体化タンパク質は、前述のように、第１の結合ドメインおよび第２の結合ドメインを含む。このため、本発明の核酸は、前記第１の結合ドメインをコードする核酸配列（ポリヌクレオチド）および前記第２の結合ドメインをコードする核酸配列（ポリヌクレオチド）を含む。
【０１２７】
前記第１の結合ドメインをコードするポリヌクレオチドは、具体例として、例えば、下記（s-a）のポリヌクレオチドがあげられる。
（s-a）下記（s-a1）、（s-a2）、（s-a3）、（s-a4）、（s-a5）、または（s-a6）のポリヌクレオチド（核酸）
（s-a1）配列番号１５のアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
（s-a2）配列番号１５のアミノ酸配列に対して、８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、ヒトＩｇＧに結合するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
（s-a3）配列番号１５のアミノ酸配列において、１個または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、ヒトＩｇＧに結合するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
（s-a4）配列番号２１の塩基配列からなるポリヌクレオチド
（s-a5）配列番号２１の塩基配列に対して、８０％以上の同一性を有する塩基配列からなり、ヒトＩｇＧに結合するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
（s-a6）配列番号２１の塩基配列において、１個または数個の塩基が欠失、置換、挿入および／または付加された塩基配列からなり、ヒトＩｇＧに結合するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
【０１２８】
配列番号２１の塩基配列からなるポリヌクレオチド
5'-GACATCAAGATGACACAGAGCCCCAGCTCTATGTACGCCAGCGTGGGAGAGAGAGTGACCATTACCTGCAAGGCCAGCCAGGACATCAAGTCCTACCTGACCTGGTATCAGAAGAAGCCCTGGAAGTCCCCTCGGACACTGATCTTCTACAGCACCAGACTGGCCGATGGCGTGCCCAGCAGATTTTCTGGCTCTGGCAGCGGCCAGGACTTCAGCCTGACAATCAGCAGCCTGGAAAGCGACGACACCGCCACCTACTACTGCCTGCAGCACGACGAGAGCCCCTTCACATTTGGCGGAGGCACCAAGCTGGAAATCAAAGGAGGTGGAGGCTCTGGAGGTGGAGGCTCTGGAGGCGGTGGATCCCAAGTTCAGCTTCAGCAACCTGGCGCCGAGCTGGTTAAGCCTGGCGCCTCTGTGAAGATGAGCTGCAAAGCCAGCGGCTACACCTTCACCAACTACTGGATCAACTGGGTCAAGCAGCGGCCTGGCCAAGGCCTGGAATGGATCGGCGATATCTATCCTGGCGGCGGAATCACCAATTACAACGAGAAGTTCAAGACCAAGGCCACACTGACCCTGGACACCAGCAGCTCCACAGTGTACATGCAGCTGAGCAGCCTGACCAGCGAGGATAGCGCCGTGTACTACTGCAGCAGAAGCTACGGCAAGTACTTCGACTACTGGGGCCAGGGCACCACACTGATTGTGTCCTCG-3'
【０１２９】
前記（s-a1）〜（s-a3）のポリヌクレオチドは、それぞれ、前記（S-A1）〜（S-A3）のポリペプチドをコードする核酸であり、前記（S-A1）〜（S-A3）のポリペプチドの説明を援用できる。
【０１３０】
前記（s-a4）のポリヌクレオチドは、前記本発明の複合体化タンパク質における配列番号１３および１４のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドである。前記（s-a5）および（s-a6）のポリヌクレオチドにおいて、前記配列番号２１の塩基配列のＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、ＣＤＲＨ３、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３に対応するアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドは、例えば、保存されている。前記配列番号２１の塩基配列における各ＣＤＲのアミノ酸配列をコードする塩基配列は、例えば、それぞれ、前記本発明の複合体化タンパク質における第１の結合ドメインの重鎖可変領域および軽鎖可変領域における各ＣＤＲのアミノ酸配列を参照できる。
【０１３１】
前記（s-a5）の塩基配列において、前記「同一性」は、それぞれ、例えば、７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上である。
【０１３２】
前記（s-a6）の塩基酸配列において、置換等に関する「１個または数個」は、それぞれ、例えば、１〜２１６個、１〜１８０個、１〜１４４個、１〜１２０個、１〜９０個、１〜７２個、１〜６０個、１〜４５個、１〜３０個、１〜２０個、１〜１０個、１〜９個、１〜８個、１〜７個、１〜６個、１〜５個、１〜４個、１〜３個、１または２個、１個である。
【０１３３】
前記第２の結合ドメインをコードするポリヌクレオチドは、具体例として、例えば、下記（s-b）のポリヌクレオチドがあげられる。
（s-b）下記（s-b1）、（s-b2）、（s-b3）、（s-b4）、（s-b5）、または（s-b6）のポリヌクレオチド（核酸）
（s-b1）配列番号１８のアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
（s-b2）配列番号１８のアミノ酸配列に対して、８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、ＣＤ３εに結合するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
（s-b3）配列番号１８のアミノ酸配列において、１個または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、ＣＤ３εに結合するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
（s-b4）配列番号２２の塩基配列からなるポリヌクレオチド
（s-b5）配列番号２２の塩基配列に対して、８０％以上の同一性を有する塩基配列からなり、ＣＤ３εに結合するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
（s-b6）配列番号２２の塩基配列において、１個または数個の塩基が欠失、置換、挿入および／または付加された塩基配列からなり、ＣＤ３εに結合するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
【０１３４】
配列番号２２の塩基配列からなるポリヌクレオチド
5'-CAGGTCCAGTTGCAACAGTCTGGCGCTGAACTGGCTAGACCTGGCGCTAGCGTGAAGATGTCTTGCAAGGCCTCCGGATACACATTCACCCGGTACACCATGCATTGGGTTAAGCAGAGGCCCGGACAGGGACTTGAGTGGATCGGCTACATCAACCCCAGCCGGGGCTACACAAACTACAATCAGAAGTTTAAGGACAAGGCTACCCTCACCACCGACAAGAGCAGCAGCACAGCCTATATGCAGCTGTCCTCTCTGACCTCCGAGGACTCCGCCGTGTATTATTGCGCCCGGTACTACGACGACCACTACTGTCTGGATTATTGGGGACAGGGAACAACCCTGACCGTGTCCTCTGGTGGAGGAGGCTCAGGAGGAGGTGGCTCTGGTGGTGGAGGCTCGCAAATTGTGCTGACCCAGTCTCCTGCCATCATGAGCGCTAGCCCTGGCGAGAAAGTGACAATGACCTGTAGCGCCAGCAGCAGCGTGTCCTACATGAATTGGTATCAACAGAAGTCCGGCACAAGCCCCAAGAGATGGATCTACGACACCTCCAAGCTGGCCTCTGGCGTGCCAGCTCACTTTAGAGGAAGCGGCAGCGGCACCAGCTACTCCCTGACAATTTCTGGCATGGAAGCCGAGGACGCCGCTACCTACTATTGTCAGCAGTGGTCCAGCAATCCCTTCACCTTCGGCTCCGGAACAAAACTCGAAATCAAC-3'
【０１３５】
前記（s-b1）〜（s-b3）のポリヌクレオチドは、それぞれ、前記（S-B1）〜（S-B3）のポリペプチドをコードする核酸であり、前記（S-B1）〜（S-B3）のポリペプチドの説明を援用できる。
【０１３６】
前記（s-b4）のポリヌクレオチドは、前記本発明の複合体化タンパク質における配列番号１６および１７のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドである。前記（s-b5）および（s-b6）のポリヌクレオチドにおいて、前記配列番号２２の塩基配列のＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、ＣＤＲＨ３、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３に対応するアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドは、例えば、保存されている。前記配列番号２２の塩基配列における各ＣＤＲのアミノ酸配列をコードする塩基配列は、例えば、それぞれ、前記本発明の複合体化タンパク質における第２の結合ドメインの重鎖可変領域および軽鎖可変領域における各ＣＤＲのアミノ酸配列を参照できる。
【０１３７】
前記（s-b5）の塩基配列において、前記「同一性」は、それぞれ、例えば、７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上である。
【０１３８】
前記（s-b6）の塩基酸配列において、置換等に関する「１個または数個」は、それぞれ、例えば、１〜２１６個、１〜１８０個、１〜１４４個、１〜１２０個、１〜９０個、１〜７２個、１〜６０個、１〜４５個、１〜３０個、１〜２０個、１〜１０個、１〜９個、１〜８個、１〜７個、１〜６個、１〜５個、１〜４個、１〜３個、１または２個、１個である。
【０１３９】
前記複合体化タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、具体例として、例えば、下記（ｂ）のポリヌクレオチドがあげられる。
（ｂ）下記（ｂ１）、（ｂ２）、（ｂ３）、（ｂ４）、（ｂ５）、または（ｂ６）のポリヌクレオチド（核酸）
（ｂ１）配列番号２０のアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
（ｂ２）配列番号２０のアミノ酸配列に対して、８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、ヒトＩｇＧおよび／またはＣＤ３εに結合するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
（ｂ３）配列番号２０のアミノ酸配列において、１個または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、ヒトＩｇＧおよび／またはＣＤ３εに結合するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
（ｂ４）配列番号２３の塩基配列からなるポリヌクレオチド
（ｂ５）配列番号２３の塩基配列に対して、８０％以上の同一性を有する塩基配列からなり、ヒトＩｇＧおよび／またはＣＤ３εに結合するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
（ｂ６）配列番号２３の塩基配列において、１個または数個の塩基が欠失、置換、挿入および／または付加された塩基配列からなり、ヒトＩｇＧおよび／またはＣＤ３εに結合するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
【０１４０】
配列番号２３の塩基配列からなるポリヌクレオチド
5'-ATGATGAGGCCCATCGTGCTGGTGCTGCTGTTTGCTACATCTGCGGCCGCCGACATCAAGATGACACAGAGCCCCAGCTCTATGTACGCCAGCGTGGGAGAGAGAGTGACCATTACCTGCAAGGCCAGCCAGGACATCAAGTCCTACCTGACCTGGTATCAGAAGAAGCCCTGGAAGTCCCCTCGGACACTGATCTTCTACAGCACCAGACTGGCCGATGGCGTGCCCAGCAGATTTTCTGGCTCTGGCAGCGGCCAGGACTTCAGCCTGACAATCAGCAGCCTGGAAAGCGACGACACCGCCACCTACTACTGCCTGCAGCACGACGAGAGCCCCTTCACATTTGGCGGAGGCACCAAGCTGGAAATCAAAGGAGGTGGAGGCTCTGGAGGTGGAGGCTCTGGAGGCGGTGGATCCCAAGTTCAGCTTCAGCAACCTGGCGCCGAGCTGGTTAAGCCTGGCGCCTCTGTGAAGATGAGCTGCAAAGCCAGCGGCTACACCTTCACCAACTACTGGATCAACTGGGTCAAGCAGCGGCCTGGCCAAGGCCTGGAATGGATCGGCGATATCTATCCTGGCGGCGGAATCACCAATTACAACGAGAAGTTCAAGACCAAGGCCACACTGACCCTGGACACCAGCAGCTCCACAGTGTACATGCAGCTGAGCAGCCTGACCAGCGAGGATAGCGCCGTGTACTACTGCAGCAGAAGCTACGGCAAGTACTTCGACTACTGGGGCCAGGGCACCACACTGATTGTGTCCTCGAGCGGATCTGGCCAGGTCCAGTTGCAACAGTCTGGCGCTGAACTGGCTAGACCTGGCGCTAGCGTGAAGATGTCTTGCAAGGCCTCCGGATACACATTCACCCGGTACACCATGCATTGGGTTAAGCAGAGGCCCGGACAGGGACTTGAGTGGATCGGCTACATCAACCCCAGCCGGGGCTACACAAACTACAATCAGAAGTTTAAGGACAAGGCTACCCTCACCACCGACAAGAGCAGCAGCACAGCCTATATGCAGCTGTCCTCTCTGACCTCCGAGGACTCCGCCGTGTATTATTGCGCCCGGTACTACGACGACCACTACTGTCTGGATTATTGGGGACAGGGAACAACCCTGACCGTGTCCTCTGGTGGAGGAGGCTCAGGAGGAGGTGGCTCTGGTGGTGGAGGCTCGCAAATTGTGCTGACCCAGTCTCCTGCCATCATGAGCGCTAGCCCTGGCGAGAAAGTGACAATGACCTGTAGCGCCAGCAGCAGCGTGTCCTACATGAATTGGTATCAACAGAAGTCCGGCACAAGCCCCAAGAGATGGATCTACGACACCTCCAAGCTGGCCTCTGGCGTGCCAGCTCACTTTAGAGGAAGCGGCAGCGGCACCAGCTACTCCCTGACAATTTCTGGCATGGAAGCCGAGGACGCCGCTACCTACTATTGTCAGCAGTGGTCCAGCAATCCCTTCACCTTCGGCTCCGGAACAAAACTCGAAATCAAC-3'
【０１４１】
前記（ｂ１）〜（ｂ３）のポリヌクレオチドは、それぞれ、前記（Ｂ１）〜（Ｂ３）のポリペプチドをコードする核酸であり、前記（Ｂ１）〜（Ｂ３）のポリペプチドの説明を援用できる。
【０１４２】
前記（ｂ４）のポリヌクレオチドは、前記本発明の複合体化タンパク質における配列番号１５および１８のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドである。前記（ｂ５）および（ｂ６）のポリヌクレオチドにおいて、前記配列番号２３の塩基配列のＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、ＣＤＲＨ３、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３に対応するアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドは、例えば、保存されている。前記配列番号２３の塩基配列における各ＣＤＲのアミノ酸配列をコードする塩基配列は、例えば、それぞれ、前記本発明の複合体化タンパク質における第１の結合ドメインの重鎖可変領域および軽鎖可変領域と、第２の結合ドメインの重鎖可変領域および軽鎖可変領域とにおける各ＣＤＲのアミノ酸配列を参照できる。
【０１４３】
前記（ｂ５）の塩基配列において、前記「同一性」は、それぞれ、例えば、７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上である。
【０１４４】
前記（ｂ６）の塩基配列において、置換等に関する「１個または数個」は、それぞれ、例えば、１〜４５０個、１〜４００個、１〜３５０個、１〜３００個、１〜２５０個、１〜２１６個、１〜１８０個、１〜１４４個、１〜１２０個、１〜７２個、１〜６０個、１〜４５個、１〜３０個、１〜２０個、１〜１０個、１〜９個、１〜８個、１〜７個、１〜６個、１〜５個、１〜４個、１〜３個、１または２個、１個である。
【０１４５】
＜治療方法＞
本発明の標的抗原に関連する疾患の治療方法は、患者に、本発明の複合体化タンパク質と、標的抗原に結合可能な抗体またはその抗原結合断片とを投与する（投与工程）。本発明の治療方法は、前記本発明の複合体化タンパク質を患者に投与することが特徴であり、その他の工程および条件は、特に制限されない。本発明の治療方法は、前記本発明の複合体化タンパク質、抗体複合体、および医薬組成物の説明を援用できる。本発明の治療方法によれば、前記標的抗原に関連する疾患を治療できる。
【０１４６】
前記投与工程において、前記複合体化タンパク質と、前記抗体等とは別々に投与してもよいし、同時に投与してもよい。後者の場合、前記投与工程では、前記複合体化タンパク質と前記抗体等との抗体複合体を投与してもよい。この場合、前記複合体化タンパク質は、その第１の抗原結合ドメインにより前記抗体等と結合し、複合体化している。前記投与工程では、例えば、前記複合体化タンパク質として、前記複合体化タンパク質をコードする核酸を投与してもよい。
【０１４７】
前記標的抗原に関連する疾患は例えば、特に制限されず、例えば、悪性リンパ腫、白血病、骨髄腫、肺がん、乳がん、腎がん、大腸がん、卵巣がん等の腫瘍；アレルギー疾患または自己免疫疾患等の免疫疾患；血友病、特発性血小板減少性紫斑病、フォンビルブランド病等の遺伝子疾患；アルツハイマー病、多発性硬化症、ギランバレー症候群等の神経疾患；等があげられる。
【０１４８】
前記標的抗原と、前記疾患との組合せは、特に制限されない。具体例として、前記疾患ががん（腫瘍）である場合、前記標的抗原は、腫瘍抗原である。この場合、前記複合体化タンパク質における所望の抗原は、例えば、前記免疫細胞に発現する抗原であり、好ましくは、ＣＤ３である。前記疾患がＢ細胞リンパ腫である場合、前記標的抗原は、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ３８等のＢ細胞に発現する抗原である。この場合、前記複合体化タンパク質における所望の抗原は、例えば、前記免疫細胞に発現する抗原であり、好ましくは、ＣＤ３である。前記疾患がアレルギー疾患である場合、前記標的抗原は、例えば、アレルゲンまたはサイトカインである。この場合、前記複合体化タンパク質における所望の抗原は、例えば、アレルゲンまたはサイトカインであり、好ましくは、前記標的抗原と異なる抗原である。前記疾患が血友病である場合、前記標的抗原は、例えば、前述の血液凝固因子である。この場合、前記複合体化タンパク質における所望の抗原は、例えば、前述の血液凝固因子であり、好ましくは、前記標的抗原と異なる抗原である。
【０１４９】
＜複合体化タンパク質または抗体複合体の使用＞
本発明は、標的抗原に関連する疾患の治療方法に使用するための、前記本発明の複合体化タンパク質または抗体複合体である。また、本発明は、標的抗原に関連する疾患の治療用医薬の製造のための前記本発明の複合体化タンパク質または抗体複合体の使用である。本発明の使用は、本発明の複合体化タンパク質、抗体複合体、および医薬組成物の説明を援用できる。
【実施例】
【０１５０】
次に、本発明の実施例について説明する。ただし、本発明は、下記実施例により制限されない。市販の試薬は、特に示さない限り、それらのプロトコルに基づいて使用した。【０１５１】
［実施例１］
本発明の複合体化タンパク質を調製後、抗体複合体を調製し、前記抗体複合体は、所望の抗原に対する結合性が付与されていること、および前記抗体複合体は、多重特異性抗体と同様の機能を発揮することを確認した。【０１５２】
（１）B-BiTEの調製
まず、ヒトＩｇＧに結合可能な第１の結合ドメインと、ＣＤ３εに結合可能な第２の結合ドメインとを有する複合体化タンパク質（以下、「B-BiTE」ともいう）を調製した。具体的には、B-BiTEをコードするポリヌクレオチドを、人工遺伝子合成サービス（GeneArt（商標）、Thermo Fisher Scientifics社製）を利用して合成した。B-BiTEをコードするポリヌクレオチドは、以下のようにして設計した。まず、マウス抗ヒトＩｇＧ mAb（クローン：HP6017）由来の重鎖可変領域および軽鎖可変領域を、リンカーペプチド（GGGGSGGGGSGGGGS：配列番号２４）により連結し、ヒトＩｇＧに結合可能なｓｃＦｖ（第１の結合ドメイン）を設計した。なお、HP6017抗体は、ヒトＩｇＧの全てのサブクラスに結合可能であることが知られている。【０１５３】
つぎに、ヒトＣＤ３ε mAb（クローン：OKT3）由来の重鎖可変領域および軽鎖可変領域を、リンカーペプチド（GGGGSGGGGSGGGGS：配列番号２４）により連結し、ヒトＣＤ３εに結合可能なｓｃＦｖ（第２の結合ドメイン）を設計した。さらに、前記第１の結合ドメインと、前記第２の結合ドメインとを、ドメインリンカー（SGSG：配列番号１９）を介して、Ｎ末端からこの順序で連結し、さらに、そのＣ末端に前記ドメインリンカーを介してＨｉｓタグ（Ｈｉｓ×６タグ）を連結することにより、B-BiTEを設計した。そして、設計されたB-BiTEのアミノ酸配列（配列番号２５）から、B-BiTEをコードするポリヌクレオチド（配列番号２６）の塩基配列を決定した。そして、B-BiTEをコードするポリヌクレオチドを合成した。【０１５４】
B-BiTEのアミノ酸配列（配列番号２５）
MMRPIVLVLLFATSAAADIKMTQSPSSMYASVGERVTITCKASQDIKSYLTWYQKKPWKSPRTLIFYSTRLADGVPSRFSGSGSGQDFSLTISSLESDDTATYYCLQHDESPFTFGGGTKLEIKGGGGSGGGGSGGGGSQVQLQQPGAELVKPGASVKMSCKASGYTFTNYWINWVKQRPGQGLEWIGDIYPGGGITNYNEKFKTKATLTLDTSSSTVYMQLSSLTSEDSAVYYCSRSYGKYFDYWGQGTTLIVSSSGSGQVQLQQSGAELARPGASVKMSCKASGYTFTRYTMHWVKQRPGQGLEWIGYINPSRGYTNYNQKFKDKATLTTDKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARYYDDHYCLDYWGQGTTLTVSSGGGGSGGGGSGGGGSQIVLTQSPAIMSASPGEKVTMTCSASSSVSYMNWYQQKSGTSPKRWIYDTSKLASGVPAHFRGSGSGTSYSLTISGMEAEDAATYYCQQWSSNPFTFGSGTKLEINSGSGHHHHHH【０１５５】
B-BiTEをコードするポリヌクレオチド（配列番号２６、終止コドン含）
5'-ATGATGAGGCCCATCGTGCTGGTGCTGCTGTTTGCTACATCTGCGGCCGCCGACATCAAGATGACACAGAGCCCCAGCTCTATGTACGCCAGCGTGGGAGAGAGAGTGACCATTACCTGCAAGGCCAGCCAGGACATCAAGTCCTACCTGACCTGGTATCAGAAGAAGCCCTGGAAGTCCCCTCGGACACTGATCTTCTACAGCACCAGACTGGCCGATGGCGTGCCCAGCAGATTTTCTGGCTCTGGCAGCGGCCAGGACTTCAGCCTGACAATCAGCAGCCTGGAAAGCGACGACACCGCCACCTACTACTGCCTGCAGCACGACGAGAGCCCCTTCACATTTGGCGGAGGCACCAAGCTGGAAATCAAAGGAGGTGGAGGCTCTGGAGGTGGAGGCTCTGGAGGCGGTGGATCCCAAGTTCAGCTTCAGCAACCTGGCGCCGAGCTGGTTAAGCCTGGCGCCTCTGTGAAGATGAGCTGCAAAGCCAGCGGCTACACCTTCACCAACTACTGGATCAACTGGGTCAAGCAGCGGCCTGGCCAAGGCCTGGAATGGATCGGCGATATCTATCCTGGCGGCGGAATCACCAATTACAACGAGAAGTTCAAGACCAAGGCCACACTGACCCTGGACACCAGCAGCTCCACAGTGTACATGCAGCTGAGCAGCCTGACCAGCGAGGATAGCGCCGTGTACTACTGCAGCAGAAGCTACGGCAAGTACTTCGACTACTGGGGCCAGGGCACCACACTGATTGTGTCCTCGAGCGGATCTGGCCAGGTCCAGTTGCAACAGTCTGGCGCTGAACTGGCTAGACCTGGCGCTAGCGTGAAGATGTCTTGCAAGGCCTCCGGATACACATTCACCCGGTACACCATGCATTGGGTTAAGCAGAGGCCCGGACAGGGACTTGAGTGGATCGGCTACATCAACCCCAGCCGGGGCTACACAAACTACAATCAGAAGTTTAAGGACAAGGCTACCCTCACCACCGACAAGAGCAGCAGCACAGCCTATATGCAGCTGTCCTCTCTGACCTCCGAGGACTCCGCCGTGTATTATTGCGCCCGGTACTACGACGACCACTACTGTCTGGATTATTGGGGACAGGGAACAACCCTGACCGTGTCCTCTGGTGGAGGAGGCTCAGGAGGAGGTGGCTCTGGTGGTGGAGGCTCGCAAATTGTGCTGACCCAGTCTCCTGCCATCATGAGCGCTAGCCCTGGCGAGAAAGTGACAATGACCTGTAGCGCCAGCAGCAGCGTGTCCTACATGAATTGGTATCAACAGAAGTCCGGCACAAGCCCCAAGAGATGGATCTACGACACCTCCAAGCTGGCCTCTGGCGTGCCAGCTCACTTTAGAGGAAGCGGCAGCGGCACCAGCTACTCCCTGACAATTTCTGGCATGGAAGCCGAGGACGCCGCTACCTACTATTGTCAGCAGTGGTCCAGCAATCCCTTCACCTTCGGCTCCGGAACAAAACTCGAAATCAACAGCGGCTCCGGCCACCACCACCATCACCATTAA-3'【０１５６】
前記B-BiTEをコードするポリヌクレオチドをｐＭＸ発現ベクター（B-BiTE発現ベクター）に導入した。つぎに、前記B-BiTE発現ベクターを、トランスフェクション試薬（TransIT293、Takara Bio社製）を用いて、Plat-A細胞（東大医科研より供与）に導入することにより、レトロウイルスを調製した。前記レトロウイルスを２９３Ｔ細胞に感染させることにより、B-BiTEをコードするポリヌクレオチドを２９３Ｔ細胞に導入し、B-BiTEを産生する２９３Ｔ細胞（293T/B-BiTE細胞）を調製した。前記Ｐｌａｔ−Ａ細胞は、１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）、１μｇ／ｍＬピューロマイシン、１０μｇ／ｍＬブラストサイジン含有ＤＭＥＭ培地で維持したものを使用した。得られた293T/B-BiTE細胞について、培養を行ない、得られた培養上清から、ヒスタグを利用したカラム（His GraviTrap column、GE healthcare社製）を用いて、B-BiTEを生成した。293T/B-BiTE細胞の培養液は、Ultra Low IgG FBS（Thermo Fisher Scientific社製）を添加したＤＭＥＭ培地とした。なお、２９３Ｔ細胞およびPlat-A細胞の培養条件は、３７℃、５％ＣＯ２とし、湿潤雰囲気下とした。以下、特に言及しない限り細胞の培養条件は同様とした。【０１５７】
（２）B-BiTEの結合能
つぎに、B-BiTEが、ヒトＩｇＧおよびヒトＣＤ３εに結合することを、標的抗原をＣＤ１９として確認した。まず、B-BiTEと、抗ＣＤ１９抗体（ヒトＩｇＧ１キメラ抗体、clone FMC63）またはコントロール抗体（ヒトＩｇＧ１キメラ抗体、clone MOPC21）とで抗体複合体を形成させた。なお、各抗体の可変領域は、マウス抗体であり、定常領域は、ヒト抗体である。具体的には、血清不含のリン酸緩衝液（ＰＢＳ）に、B-BiTEと、抗ＣＤ１９抗体またはコントロールの抗体とを、B-BiTEの濃度（Ｂ）と前記抗体の濃度（Ａ）との濃度比（Ｂ：Ａ）が、１：３となるように添加し、１時間室温（約２５℃）でインキュベートした。なお、B-BiTEの濃度（Ｂ）と前記抗体の濃度（Ａ）を１：３とすることにより、前記比（ＭＡｂ：ＭＣＯ）は、１：約１となる。そして、得られた混合液を抗体複合体（CD19/B-BiTEまたはisotype/B-BiTE）として用いた。なお、B-BiTEの濃度は、１０μｇ／ｍＬとし、抗体の濃度は、３０μｇ／ｍＬとした。【０１５８】
抗体複合体と反応させる細胞は、ＫＴ１細胞（ＣＤ３−ＣＤ１９−細胞、慢性骨髄性白血病由来細胞株（国立大学法人愛媛大学医学部第一内で樹立））、ＫＴ１／ＣＤ１９細胞（ＣＤ３−ＣＤ１９＋細胞）、Ｋ５６２細胞（ＣＤ３−ＣＤ１９−細胞、ＡＴＣＣより入手）、Ｋ５６２／ＣＤ１９細胞（ＣＤ３−ＣＤ１９＋細胞）、Ｒａｊｉ細胞（ＣＤ３−ＣＤ１９＋細胞）、Ｊｕｒｋａｔ７６細胞（ＣＤ３−ＣＤ１９−細胞）、およびＪｕｒｋａｔ細胞（ＣＤ３＋ＣＤ１９−細胞）とした。ＫＴ１／ＣＤ１９細胞およびＫ５６２／ＣＤ１９細胞は、それぞれ、ＫＴ１細胞およびＫ５６２細胞に、レトロウイルスを用いてヒトＣＤ１９をコードするポリヌクレオチドを導入することにより調製した。具体的には、前記B-BiTE発現ベクターに代えて、ヒトＣＤ１９をコードするポリヌクレオチド（配列番号２７）を含むｐＭＸ発現ベクターを導入した以外は、同様にしてレトロウイルスを調製した。得られたレトロウイルスをＫＴ１細胞およびＫ５６２細胞に感染させることにより、ＫＴ１／ＣＤ１９細胞およびＫ５６２／ＣＤ１９細胞を調製した。また、ＫＴ１細胞およびＫＴ１／ＣＤ１９細胞の培養液は、１０％ＦＣＳ含有ＲＰＭＩ培地とした。Ｋ５６２細胞、Ｋ５６２／ＣＤ１９細胞、Ｒａｊｉ細胞、Ｊｕｒｋａｔ７６細胞、およびＪｕｒｋａｔ細胞と、後述のＫ５６２／ＣＤ２０細胞およびＫ５６２／ＣＤ３８細胞の培養液は、１０％ＦＣＳ含有ＲＰＭＩ１６４０培地とした。【０１５９】
ヒトＣＤ１９をコードするポリヌクレオチド（配列番号２７）
5'-ATGCCACCTCCTCGCCTCCTCTTCTTCCTCCTCTTCCTCACCCCCATGGAAGTCAGGCCCGAGGAACCTCTAGTGGTGAAGGTGGAAGAGGGAGATAACGCTGTGCTGCAGTGCCTCAAGGGGACCTCAGATGGCCCCACTCAGCAGCTGACCTGGTCTCGGGAGTCCCCGCTTAAACCCTTCTTAAAACTCAGCCTGGGGCTGCCAGGCCTGGGAATCCACATGAGGCCCCTGGCCATCTGGCTTTTCATCTTCAACGTCTCTCAACAGATGGGGGGCTTCTACCTGTGCCAGCCGGGGCCCCCCTCTGAGAAGGCCTGGCAGCCTGGCTGGACAGTCAATGTGGAGGGCAGCGGGGAGCTGTTCCGGTGGAATGTTTCGGACCTAGGTGGCCTGGGCTGTGGCCTGAAGAACAGGTCCTCAGAGGGCCCCAGCTCCCCTTCCGGGAAGCTCATGAGCCCCAAGCTGTATGTGTGGGCCAAAGACCGCCCTGAGATCTGGGAGGGAGAGCCTCCGTGTCTCCCACCGAGGGACAGCCTGAACCAGAGCCTCAGCCAGGACCTCACCATGGCCCCTGGCTCCACACTCTGGCTGTCCTGTGGGGTACCCCCTGACTCTGTGTCCAGGGGCCCCCTCTCCTGGACCCATGTGCACCCCAAGGGGCCTAAGTCATTGCTGAGCCTAGAGCTGAAGGACGATCGCCCGGCCAGAGATATGTGGGTAATGGAGACGGGTCTGTTGTTGCCCCGGGCCACAGCTCAAGACGCTGGAAAGTATTATTGTCACCGTGGCAACCTGACCATGTCATTCCACCTGGAGATCACTGCTCGGCCAGTACTATGGCACTGGCTGCTGAGGACTGGTGGCTGGAAGGTCTCAGCTGTGACTTTGGCTTATCTGATCTTCTGCCTGTGTTCCCTTGTGGGCATTCTTCATCTTCAAAGAGCCCTGGTCCTGAGGAGGAAAAGAAAGCGAATGACTGACCCCACCAGGAGATTCTTCAAAGTGACGCCTCCCCCAGGAAGCGGGCCCCAGAACCAGTACGGGAACGTGCTGTCTCTCCCCACACCCACCTCAGGCCTCGGACGCGCCCAGCGTTGGGCCGCAGGCCTGGGGGGCACTGCCCCGTCTTATGGAAACCCGAGCAGCGACGTCCAGGCGGATGGAGCCTTGGGGTCCCGGAGCCCGCCGGGAGTGGGCCCAGAAGAAGAGGAAGGGGAGGGCTATGAGGAACCTGACAGTGAGGAGGACTCCGAGTTCTATGAGAACGACTCCAACCTTGGGCAGGACCAGCTCTCCCAGGATGGCAGCGGCTACGAGAACCCTGAGGATGAGCCCCTGGGTCCTGAGGATGAAGACTCCTTCTCCAACGCTGAGTCTTATGAGAACGAGGATGAAGAGCTGACCCAGCCGGTCGCCAGGACAATGGACTTCCTGAGCCCTCATGGGTCAGCCTGGGACCCCAGCCGGGAAGCAACCTCCCTGGGGTCCCAGTCCTATGAGGATATGAGAGGAATCCTGTATGCAGCCCCCCAGCTCCGCTCCATTCGGGGCCAGCCTGGACCCAATCATGAGGAAGATGCAGACTCTTATGAGAACATGGATAATCCCGATGGGCCAGACCCAGCCTGGGGAGGAGGGGGCCGCATGGGCACCTGGAGCACCAGG-3'【０１６０】
ＫＴ１細胞、ＫＴ１／ＣＤ１９細胞、Ｋ５６２細胞、Ｋ５６２／ＣＤ１９細胞、Ｒａｊｉ細胞、Ｊｕｒｋａｔ７６細胞、およびＪｕｒｋａｔ細胞と、CD19/B-BiTEまたはisotype/B-BiTEを含む混合液とを混合し、３０分間４℃でインキュベートした。前記インキュベート後、各細胞を洗浄し、ＰＥ標識抗Ｈｉｓ抗体（clone GG11-8F3.5.1）で染色した。そして、染色後の各細胞について、フローサイトメーター（Gallios flow cytometer、Beckman Coulter社製）を用いて各細胞と前記抗体複合体との結合を検討した。コントロールは、前記抗体複合体を添加しなかった以外は同様にして測定した。これらの結果を図２に示す。【０１６１】
図２は、抗体複合体と細胞との結合を示すヒストグラムである。図２において、（Ａ）が、ＫＴ１細胞、（Ｂ）が、ＫＴ１／ＣＤ１９細胞、（Ｃ）が、Ｋ５６２細胞、（Ｄ）が、Ｋ５６２／ＣＤ１９細胞、（Ｅ）が、Ｒａｊｉ細胞、（Ｆ）が、Ｊｕｒｋａｔ７６細胞、（Ｇ）が、Ｊｕｒｋａｔ細胞の結果を示す。図２（Ａ）〜（Ｇ）において、横軸は、抗Ｈｉｓ抗体の蛍光強度を示し、縦軸は、カウント数の相対値を示す。図２（Ａ）〜（Ｇ）に示すように、コントロールでは、結合が観察されなかった。また、図２（Ｇ）に示すように、複合体化タンパク質とコントロール抗体との抗体複合体（isotype/B-BiTE）は、ＣＤ３εに対して結合性を示すため、Ｊｕｒｋａｔ細胞に対して結合した。さらに、図２（Ｂ）、（Ｄ）、（Ｅ）および（Ｇ）に示すように、複合体化タンパク質と抗ＣＤ１９抗体との抗体複合体（CD19/B-BiTE）は、ＣＤ１９およびＣＤ３εに対して結合性を示すため、ＫＴ１／ＣＤ１９細胞、Ｋ５６２／ＣＤ１９細胞、Ｒａｊｉ細胞およびＪｕｒｋａｔ細胞に結合した。これらの結果から、本発明の複合体化タンパク質によれば、結合対象の抗体に対して、所望の抗原に対する結合性を付加可能であることがわかった。【０１６２】
（３）抗体複合体の機能
二重特異性抗体は、標的抗原を発現する細胞にＴ細胞をリクルートし、Ｔ細胞を活性化できる。このため、B-BiTE/CD19についても同様の機能を有するか検討した。具体的には、B-BiTEの濃度を２．５μｇ／ｍＬとし、抗体の濃度を７．５μｇ／ｍＬとした以外は、前記実施例１（２）と同様にして、CD19/B-BiTEまたはisotype/B-BiTEを調製した。【０１６３】
つぎに、末梢血中のＣＤ４＋Ｔ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞を調製した。具体的には、健常者からヒト末梢血を回収した。つぎに、前記末梢血から、ヒト末梢血単核球を抽出後、得られたヒト末梢血単核球と、Ｔ細胞精製キット（Pan T cell isolation kit 、Miltenyi Biotec社製）を用いて、ＣＤ３＋Ｔ細胞を精製した。そして、２．５×１０５個のＴ細胞と、５．０×１０４個のターゲット細胞とを、前記CD19/B-BiTEまたはisotype/B-BiTEの存在下、２時間培養した（ｎ＝３）。前記ターゲット細胞は、Ｋ５６２細胞、Ｋ５６２／ＣＤ１９細胞およびＲａｊｉ細胞とした。前記培養後、５μｇ／ｍＬとなるように、Brefeldin A（BFA）を添加し、さらに、１８時間培養した。そして、Ｔ細胞を回収後、１％パラホルムアルデヒド（PFA）で固定後、細胞膜の透過処理を行い、ＰＥ標識抗ヒトＴＮＦ−α抗体（clone MAb11）、ＡＰＣ標識抗ヒトＩＬ−２抗体（clone MQ1-17H12）およびＰＣ７標識抗ヒトＩＦＮ−γ抗体（clone B27）と、ＰＣ５標識抗ヒトＣＤ８抗体（clone B9.11）、ＦＩＴＣ標識抗ＣＤ４抗体（clone OKT4）およびＶ４５０抗ヒトＣＤ３抗体（clone UCHT1）で染色した。前記染色後のＴ細胞について、前記フローサイトメーターで測定し、各サイトカインを産生している細胞の割合を算出した。これらの結果を図３および４に示す。【０１６４】
図３および４は、サイトカイン産生細胞の割合を示すグラフである。図３および４において、横軸は、抗体または抗体複合体の種類を示し、縦軸は、各サイトカイン産生細胞の割合を示す。図３は、ターゲット細胞がＫ５６２細胞またはＫ５６２／ＣＤ１９細胞の場合の結果を示し、図４は、ターゲット細胞がＲａｊｉ細胞の場合の結果を示す。図３に示すように、ＣＤ１９およびＣＤ３を発現していないＫ５６２細胞をターゲット細胞とした場合、CD19/B-BiTEおよびisotype/B-BiTE添加群では、サイトカイン産生は見られなかった。これに対して、ＣＤ１９を発現しているＫ５６２／ＣＤ１９細胞をターゲット細胞とした場合、CD19/B-BiTE添加群は、isotype/B-BiTE添加群と比較して有意にサイトカイン産生細胞の割合が増加していた。また、図４に示すように、ＣＤ１９を発現しているＲａｊｉ細胞をターゲット細胞とした場合、CD19/B-BiTE添加群は、isotype/B-BiTE添加群と比較して有意にサイトカイン産生細胞の割合が増加していた。これらの結果から、本発明の抗体複合体は、二重特異性抗体と同様に、標的抗原を発現する細胞にＴ細胞をリクルートし、Ｔ細胞を活性化できることがわかった。【０１６５】
以上のことから、本発明の複合体化タンパク質は、抗体複合体を形成し、前記抗体複合体は、所望の抗原に対する結合性が付与されていること、および前記抗体複合体は、多重特異性抗体と同様の機能を発揮することをがわかった。【０１６６】
［実施例２］
本発明の抗体複合体を調製し、前記抗体複合体は、所望の抗原に対する結合性が付与されていること、および前記抗体複合体は、多重特異性抗体と同様の機能を発揮することがわかった。【０１６７】
前記抗ＣＤ１９抗体に代えて、抗ＣＤ２０抗体（Rituximab）または抗ＣＤ３８抗体（Daratumumab）を用いた以外は、前記実施例１（２）と同様にして、抗体複合体（CD20/B-BiTEまたはCD38/B-BiTE）を調製した。【０１６８】
抗体複合体と反応させる細胞は、Ｋ５６２細胞（ＣＤ３−ＣＤ２０−ＣＤ３８−細胞、ＡＴＣＣより入手）、Ｋ５６２／ＣＤ２０細胞（ＣＤ３−ＣＤ２０＋ＣＤ３８−細胞）、Ｋ５６２／ＣＤ３８細胞（ＣＤ３−ＣＤ２０−ＣＤ３８＋細胞）、Ｒａｊｉ細胞（ＣＤ３−ＣＤ２０＋ＣＤ３８＋細胞）、Ｊｕｒｋａｔ７６細胞（ＣＤ３−ＣＤ２０−ＣＤ３８−細胞）、およびＪｕｒｋａｔ細胞（ＣＤ３＋ＣＤ２０−ＣＤ３８−細胞）とした。Ｋ５６２／ＣＤ２０細胞およびＫ５６２／ＣＤ３８細胞は、それぞれ、前記ヒトＣＤ１９をコードするポリヌクレオチドに代えて、ヒトＣＤ２０をコードするポリヌクレオチドおよびヒトＣＤ３８をコードするポリヌクレオチドを用いた以外は、レトロウイルスを用いて前記実施例１（２）と同様にして調製した。【０１６９】
ヒトＣＤ２０をコードするポリヌクレオチド（配列番号２８、終止コドン含）
5’-ATGACAACACCCAGAAATTCAGTAAATGGGACTTTCCCGGCAGAGCCAATGAAAGGCCCTATTGCTATGCAATCTGGTCCAAAACCACTCTTCAGGAGGATGTCTTCACTGGTGGGCCCCACGCAAAGCTTCTTCATGAGGGAATCTAAGACTTTGGGGGCTGTCCAGATTATGAATGGGCTCTTCCACATTGCCCTGGGGGGTCTTCTGATGATCCCAGCAGGGATCTATGCACCCATCTGTGTGACTGTGTGGTACCCTCTCTGGGGAGGCATTATGTATATTATTTCCGGATCACTCCTGGCAGCAACGGAGAAAAACTCCAGGAAGTGTTTGGTCAAAGGAAAAATGATAATGAATTCATTGAGCCTCTTTGCTGCCATTTCTGGAATGATTCTTTCAATCATGGACATACTTAATATTAAAATTTCCCATTTTTTAAAAATGGAGAGTCTGAATTTTATTAGAGCTCACACACCATATATTAACATATACAACTGTGAACCAGCTAATCCCTCTGAGAAAAACTCCCCATCTACCCAATACTGTTACAGCATACAATCTCTGTTCTTGGGCATTTTGTCAGTGATGCTGATCTTTGCCTTCTTCCAGGAACTTGTAATAGCTGGCATCGTTGAGAATGAATGGAAAAGAACGTGCTCCAGACCCAAATCTAACATAGTTCTCCTGTCAGCAGAAGAAAAAAAAGAACAGACTATTGAAATAAAAGAAGAAGTGGTTGGGCTAACTGAAACATCTTCCCAACCAAAGAATGAAGAAGACATTGAAATTATTCCAATCCAAGAAGAGGAAGAAGAAGAAACAGAGACGAACTTTCCAGAACCTCCCCAAGATCAGGAATCCTCACCAATAGAAAATGACAGCTCTCCTTAA-3’【０１７０】
ヒトＣＤ３８をコードするポリヌクレオチド（配列番号２９、終止コドン含）
5'-ATGGCCAACTGCGAGTTCAGCCCGGTGTCCGGGGACAAACCCTGCTGCCGGCTCTCTAGGAGAGCCCAACTCTGTCTTGGCGTCAGTATCCTGGTCCTGATCCTCGTCGTGGTGCTCGCGGTGGTCGTCCCGAGGTGGCGCCAGCAGTGGAGCGGTCCGGGCACCACCAAGCGCTTTCCCGAGACCGTCCTGGCGCGATGCGTCAAGTACACTGAAATTCATCCTGAGATGAGACATGTAGACTGCCAAAGTGTATGGGATGCTTTCAAGGGTGCATTTATTTCAAAACATCCTTGCAACATTACTGAAGAAGACTATCAGCCACTAATGAAGTTGGGAACTCAGACCGTACCTTGCAACAAGATTCTTCTTTGGAGCAGAATAAAAGATCTGGCCCATCAGTTCACACAGGTCCAGCGGGACATGTTCACCCTGGAGGACACGCTGCTAGGCTACCTTGCTGATGACCTCACATGGTGTGGTGAATTCAACACTTCCAAAATAAACTATCAATCTTGCCCAGACTGGAGAAAGGACTGCAGCAACAACCCTGTTTCAGTATTCTGGAAAACGGTTTCCCGCAGGTTTGCAGAAGCTGCCTGTGATGTGGTCCATGTGATGCTCAATGGATCCCGCAGTAAAATCTTTGACAAAAACAGCACTTTTGGGAGTGTGGAAGTCCATAATTTGCAACCAGAGAAGGTTCAGACACTAGAGGCCTGGGTGATACATGGTGGAAGAGAAGATTCCAGAGACTTATGCCAGGATCCCACCATAAAAGAGCTGGAATCGATTATAAGCAAAAGGAATATTCAATTTTCCTGCAAGAATATCTACAGACCTGACAAGTTTCTTCAGTGTGTGAAAAATCCTGAGGATTCATCTTGCACATCTGAGATCTGA-3'【０１７１】
そして、ＫＴ１細胞、ＫＴ１／ＣＤ１９細胞、およびＫ５６２／ＣＤ１９細胞に代えて、Ｋ５６２／ＣＤ２０細胞およびＫ５６２／ＣＤ３８細胞を用い、CD19/B-BiTEに代えて、CD20/B-BiTEまたはCD38/B-BiTEを用いた以外は、前記実施例１（２）と同様にして、各細胞と前記抗体複合体との結合を検討した。コントロールは、前記抗体複合体を添加しなかった以外は同様にして測定した。これらの結果を図５に示す。【０１７２】
図５は、抗体複合体と細胞との結合を示すヒストグラムである。図５において、（Ａ）が、Ｋ５６２細胞、（Ｂ）が、Ｋ５６２／ＣＤ２０細胞、（Ｃ）が、Ｋ５６２／ＣＤ３８細胞、（Ｄ）が、Ｒａｊｉ細胞、（Ｅ）が、Ｊｕｒｋａｔ細胞、（Ｆ）が、Ｊｕｒｋａｔ７６細胞の結果を示す。図５（Ａ）〜（Ｆ）において、横軸は、抗Ｈｉｓ抗体の蛍光強度を示し、縦軸は、カウント数の相対値を示す。図５（Ａ）〜（Ｆ）に示すように、コントロールでは、結合が観察されなかった。また、図５（Ｅ）に示すように、複合体化タンパク質とコントロール抗体との抗体複合体（isotype/B-BiTE）は、ＣＤ３εに対して結合性を示すため、Ｊｕｒｋａｔ細胞に対して結合した。さらに、図５（Ｂ）、（Ｄ）、および（Ｅ）に示すように、複合体化タンパク質と抗ＣＤ２０抗体との抗体複合体（CD20/B-BiTE）は、ＣＤ２０およびＣＤ３εに対して結合性を示すため、Ｋ５６２／ＣＤ２０細胞、Ｒａｊｉ細胞およびＪｕｒｋａｔ細胞に結合した。そして、図５（Ｃ）〜（Ｅ）に示すように、複合体化タンパク質と抗ＣＤ３８抗体との抗体複合体（CD38/B-BiTE）は、ＣＤ３８およびＣＤ３εに対して結合性を示すため、Ｋ５６２／ＣＤ３８細胞、Ｒａｊｉ細胞およびＪｕｒｋａｔ細胞に結合した。これらの結果から、本発明の複合体化タンパク質によれば、結合対象の抗体に対して、所望の抗原に対する結合性を付加可能であることがわかった。【０１７３】
つぎに、CD20/B-BiTEおよびCD38/B-BiTEが、二重特異性抗体と同様の機能を発揮するか検討した。具体的には、前記抗ＣＤ１９抗体に代えて、抗ＣＤ２０抗体（Rituximab）または抗ＣＤ３８抗体（Daratumumab）を用い、B-BiTEの濃度を２．５μｇ／ｍＬとし、抗体の濃度を７．５μｇ／ｍＬとした以外は、前記実施例１（２）と同様にして、CD20/B-BiTEまたはCD38/B-BiTEを調製した。【０１７４】
つぎに、CD19/B-BiTEに代えて、CD20/B-BiTEまたはCD38/B-BiTEを用い、Ｋ５６２／ＣＤ１９細胞に代えて、Ｋ５６２／ＣＤ２０細胞またはＫ５６２／ＣＤ３８細胞を用いた以外は、前記実施例１（３）と同様にして、サイトカインを産生している細胞の割合を算出した。これらの結果を図６および７に示す。【０１７５】
図６および７は、サイトカイン産生細胞の割合を示すグラフである。図６および７において、横軸は、抗体または抗体複合体の種類を示し、縦軸は、各サイトカイン産生細胞の割合を示す。図６は、ターゲット細胞がＫ５６２細胞、Ｋ５６２／ＣＤ２０細胞またはＫ５６２／ＣＤ３８細胞の場合の結果を示し、図７は、ターゲット細胞がＲａｊｉ細胞の場合の結果を示す。図６に示すように、ＣＤ２０、ＣＤ３８およびＣＤ３を発現していないＫ５６２細胞をターゲット細胞とした場合、CD20/B-BiTE、CD38/B-BiTEおよびisotype/B-BiTE添加群では、サイトカイン産生は見られなかった。これに対して、ＣＤ２０を発現しているＫ５６２／ＣＤ２０細胞をターゲット細胞とした場合、CD20/B-BiTE添加群は、isotype/B-BiTE添加群と比較して有意にサイトカイン産生細胞の割合が増加していた。また、ＣＤ３８を発現しているＫ５６２／ＣＤ３８細胞をターゲット細胞とした場合、CD38/B-BiTE添加群は、isotype/B-BiTE添加群と比較して有意にサイトカイン産生細胞の割合が増加していた。さらに、図７に示すように、ＣＤ２０およびＣＤ３８を発現しているＲａｊｉ細胞をターゲット細胞とした場合、CD20/B-BiTE添加群およびCD38/B-BiTE添加群は、isotype/B-BiTE添加群と比較して有意にサイトカイン産生細胞の割合が増加していた。これらの結果から、本発明の抗体複合体は、二重特異性抗体と同様に、標的抗原を発現する細胞にＴ細胞をリクルートし、Ｔ細胞を活性化できることがわかった。【０１７６】
以上のことから、本発明の複合体化タンパク質は、抗体複合体を形成し、前記抗体複合体は、所望の抗原に対する結合性が付与されていること、および前記抗体複合体は、多重特異性抗体と同様の機能を発揮することがわかった。【０１７７】
［実施例３］
本発明の抗体複合体により、制御性Ｔ細胞の増殖を実質的に抑制しつつ、他のＴ細胞の増殖を誘導できることを確認した。【０１７８】
前記抗ＣＤ１９抗体に代えて、抗ＣＤ２０抗体（Rituximab）または抗ＣＤ３８抗体（Daratumumab）を用いた以外は、前記実施例１（２）と同様にして、抗体複合体（CD20/B-BiTEまたはCD38/B-BiTE）を調製した。【０１７９】
前記実施例１（３）と同様にして、ＣＤ３＋Ｔ細胞を調製した。得られたＴ細胞について、０．５μｍｏｌ／Ｌ  ＣＦＳＥ（5-(and -6)-Carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester）を含むＰＢＳ内で、１５分間３７℃でインキュベートし、Ｔ細胞をＣＦＳＥで標識した。【０１８０】
つぎに、２．０×１０５個のCFSE標識Ｔ細胞と、２．０×１０４個のターゲット細胞とを、前記CD20/B-BiTE、CD38/B-BiTE、またはisotype/B-BiTEの存在下、５日間培養した（ｎ＝３）。前記ターゲット細胞は、Ｋ５６２／ＣＤ１９細胞、Ｋ５６２／ＣＤ２０細胞、Ｋ５６２／ＣＤ３８細胞およびＲａｊｉ細胞とした。前記培養後、Ｔ細胞を、Alexa647標識抗ヒトFoxP3抗体（clone 206D）、ＰＥ標識抗ヒトＣＤ４５ＲＡ抗体（clone HI100）、前記ＰＣ５標識抗ヒトＣＤ８抗体（clone B9.11）、ＡＰＣ−Ｃｙ７標識抗ヒトＣＤ４抗体（clone OKT4）、ＢＶ４２１抗ヒトＣＤ２５抗体（clone BC96）で染色した。前記染色後のＴ細胞について、前記フローサイトメーターで測定し、Ｔ細胞におけるＣＦＳＥが減衰している細胞の割合および制御性Ｔ細胞の割合を測定した。これらの結果を図８および９に示す（n.s.：not siginificant、*：p<0.05、**：p<0.01、***：p<0.001、以下、同様）。【０１８１】
図８は、ＣＦＳＥが減衰している細胞の割合を示すグラフである。図８において、横軸は、抗体複合体の種類を示し、縦軸は、増殖した細胞の割合を示す。図８のドットプロットに示すように、isotype/B-BiTEでは、Ｔ細胞の増殖が生じないため、図中の矢印で示すように、ＣＦＳＥ強陽性の細胞となる。他方、Ｋ５６２／ＣＤ３８細胞およびCD38/B-BiTEでは、Ｔ細胞の増殖が生じることにより、ＣＦＳＥの減衰が生じるため、増殖した細胞は、図中の矢印で示すように、ＣＦＳＥ弱陽性の細胞となる。そして、ＣＤ１９を発現しているＫ５６２／ＣＤ１９細胞をターゲット細胞とした場合、CD19/B-BiTE添加群は、isotype/B-BiTE添加群と比較して有意に増殖したＣＤ４＋Ｔ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞の割合が増加していた。また、ＣＤ２０を発現しているＫ５６２／ＣＤ２０細胞をターゲット細胞とした場合、CD20/B-BiTE添加群は、isotype/B-BiTE添加群と比較して有意に増殖したＣＤ４＋Ｔ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞の割合が増加していた。さらに、ＣＤ３８を発現しているＫ５６２／ＣＤ３８細胞をターゲット細胞とした場合、CD38/B-BiTE添加群は、isotype/B-BiTE添加群と比較して有意に増殖したＣＤ４＋ＴおよびＣＤ８＋Ｔ細胞の割合が増加していた。そして、ＣＤ１９、ＣＤ２０およびＣＤ３８を発現しているＲａｊｉ細胞をターゲット細胞とした場合、CD19/B-BiTE添加群、CD20/B-BiTE添加群およびCD38/B-BiTE添加群は、isotype/B-BiTE添加群と比較して有意に増殖したＣＤ４＋Ｔ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞の割合が増加していた。【０１８２】
図９は、活性化しているＣＤ４＋Ｔ細胞（ＣＤ４＋ＣＤ２５＋）および制御性Ｔ細胞（ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＣＤ４５ＲＡ＋ＦｏｘＰ３＋）の割合を示すグラフである。図９において、横軸は、抗体複合体の種類、または制御性Ｔ細胞のサブセットを示し、縦軸は、活性化しているＣＤ４＋Ｔ細胞（ＣＤ４＋ＣＤ２５＋）の割合、または活性化しているＣＤ４＋Ｔ細胞（ＣＤ４＋ＣＤ２５＋）における制御性Ｔ細胞のサブセットの割合を示す。なお、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋細胞を、ＣＤ４５ＲＡとＦｏｘＰ３との発現で展開し、ＣＤ４５ＲＡ＋ＦｏｘＰ３＋の細胞群と、ＣＤ４５ＲＡ−ＦｏｘＰ３＋＋＋の細胞群とを制御性Ｔ細胞と定義した。また、ＣＤ４５ＲＡ−ＦｏｘＰ３＋の細胞群は、下記参考文献５に基づき、活性化Ｔ細胞と判断した。本実施例では、培養後の末梢血Ｔ細胞においてＣＤ４５ＲＡ−ＦｏｘＰ３＋＋＋の細胞群を認めなかった。ＣＤ１９を発現しているＫ５６２／ＣＤ１９細胞をターゲット細胞とした場合、CD19/B-BiTE添加群は、isotype/B-BiTE添加群と比較して有意に活性化しているＣＤ４＋Ｔ細胞の割合が増加していたが、ナイーブな制御性Ｔ細胞（ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＦｏｘＰ３＋ＣＤ４５ＲＡ＋）および活性化Ｔ細胞（ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＦｏｘＰ３＋ＣＤ４５ＲＡ−）の割合は変化しなかった。また、ＣＤ２０を発現しているＫ５６２／ＣＤ２０細胞をターゲット細胞とした場合、CD20/B-BiTE添加群は、isotype/B-BiTE添加群と比較して有意に活性化しているＣＤ４＋Ｔ細胞の割合が増加していたが、ナイーブな制御性Ｔ細胞（ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＦｏｘＰ３＋ＣＤ４５ＲＡ＋）の割合は変化せず、活性化Ｔ細胞（ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＦｏｘＰ３＋ＣＤ４５ＲＡ−）の割合は若干増加した。さらに、ＣＤ３８を発現しているＫ５６２／ＣＤ３８細胞をターゲット細胞とした場合、CD38/B-BiTE添加群は、isotype/B-BiTE添加群と比較して有意に活性化しているＣＤ４＋Ｔ細胞の割合が増加していたが、ナイーブな制御性Ｔ細胞（ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＦｏｘＰ３＋ＣＤ４５ＲＡ＋）の割合は変化せず、活性化Ｔ細胞（ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＦｏｘＰ３＋ＣＤ４５ＲＡ−）の割合は若干増加した。そして、ＣＤ１９、ＣＤ２０およびＣＤ３８を発現しているＲａｊｉ細胞をターゲット細胞とした場合、CD19/B-BiTE添加群、CD20/B-BiTE添加群およびCD38/B-BiTE添加群は、isotype/B-BiTE添加群と比較して有意に活性化しているＣＤ４＋Ｔ細胞の割合が増加していたが、ナイーブな制御性Ｔ細胞（ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＦｏｘＰ３＋ＣＤ４５ＲＡ＋）の割合は変化せず、活性化Ｔ細胞（ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＦｏｘＰ３＋ＣＤ４５ＲＡ−）の割合は、CD19/B-BiTE添加群において若干増加した。
参考文献５：Makoto Miyara et.al., “Functional Delineation and Differentiation Dynamics of Human CD4+ T Cells Expressing the FoxP3 Transcription Factor”, Immunity, 2009, volume 30, pages 899-911 【０１８３】
これらの結果から、本発明の抗体複合体により、制御性Ｔ細胞の増殖を実質的に抑制しつつ、他のＴ細胞の増殖を誘導できることがわかった。【０１８４】
［実施例４］
本発明の抗体複合体により、ＮＫ細胞単独またはＮＫ細胞およびＴ細胞を活性化できることを確認した。【０１８５】
（１）ＮＫ細胞の活性化
前記抗ＣＤ１９抗体に代えて、抗ＣＤ２０抗体（Rituximab）または抗ＣＤ３８抗体（Daratumumab）を用い、B-BiTEの濃度を２．５μｇ／ｍＬとし、抗体の濃度を７．５μｇ／ｍＬとした以外は、前記実施例１（２）と同様にして、抗体複合体（CD20/B-BiTEまたはCD38/B-BiTE）を調製した。【０１８６】
つぎに、ＮＫ細胞を末梢血から調製した。具体的には、健常者からヒト末梢血を回収した。つぎに、前記末梢血から、ヒト末梢血単核球を抽出後、得られたヒト末梢血単核球と、ＮＫ細胞精製キット（NK cell isolation kit、Miltenyi Biotec社製）を用いて、ＮＫ細胞を精製した。そして、１×１０５個のＮＫ細胞と１．０×１０５個のターゲット細胞とを、前記抗ＣＤ２０抗体、抗ＣＤ３８抗体、コントロール抗体、CD20/B-BiTE、CD38/B-BiTE、またはisotype/B-BiTE、および１００Ｕ／ｍＬ  ＩＬ−２および１０ｎｇ／ｍＬ  ＩＬ−１５の存在下、１時間培養した（ｎ＝３）。前記抗体の濃度は、抗体単独の場合、７．５μｇ／ｍＬとした。前記ターゲット細胞は、Ｋ５６２／ＣＤ２０細胞、Ｋ５６２／ＣＤ３８細胞およびＲａｊｉ細胞とした。前記培養後、５μｍｏｌ／ＬとなるようにＢＦＡを添加し、さらに４時間培養した。そして、ＮＫ細胞を、１％PFAで固定後、細胞膜の透過処理を行い、さらに、ＡＰＣ標識抗ヒトＣＤ１０７ａ（clone H4A3）、前記ＰＣ７標識抗ヒトＩＦＮ−γ抗体、ＦＩＴＣ標識抗ヒトＣＤ１６抗体（clone 3G8）、およびＰＥ標識抗ヒトＣＤ５６抗体（clone HCD56）で染色した。前記染色後のＮＫ細胞について、前記フローサイトメーターで測定した。コントロールは、前記ターゲット細胞を添加しなかった以外は同様に測定した。そして、コントロールにおけるＣＤ１０７ａの発現を基準として、ＣＤ１０７ａの発現上昇の割合を算出した。これらの結果を図１０および１１に示す。【０１８７】
図１０および１１は、ＩＦＮ−γの産生細胞の割合およびＣＤ１０７ａの発現上昇の割合を示すグラフである。図１０および１１において、横軸は、抗体または抗体複合体の種類を示し、縦軸は、ＩＦＮ−γの産生細胞の割合またはＣＤ１０７ａの発現上昇の割合を示す。図１０および１１に示すように、標的抗原であるＣＤ２０またはＣＤ３８を発現するターゲット細胞が存在し、かつ前記標的抗原に結合する抗体が存在する場合、標的抗原を発現しないターゲットが存在する場合および標的抗原に結合しない抗体が存在する場合と比較して、ＩＦＮ−γの産生細胞の割合の上昇およびＣＤ１０７ａの発現上昇が生じ、ＮＫ細胞が活性化していることがわかった。また、同様に、標的抗原であるＣＤ２０またはＣＤ３８を発現するターゲット細胞が存在し、かつ前記標的抗原に結合する抗体複合体が存在する場合、標的抗原を発現しないターゲットが存在する場合および標的抗原に結合しない抗体複合体が存在する場合と比較して、ＩＦＮ−γの産生細胞の割合の上昇およびＣＤ１０７ａの発現上昇が生じ、ＮＫ細胞が活性化していることがわかった。また、抗ＣＤ２０抗体添加群と、CD20/B-BiTE添加群では、ＩＦＮ−γの産生細胞の割合の上昇およびＣＤ１０７ａの発現上昇に差が見られなかった。抗ＣＤ３８抗体添加群と、CD38/B-BiTE添加群では、ＩＦＮ−γの産生細胞の割合の上昇およびＣＤ１０７ａの発現上昇に差が見られなかった。これらのことから、本発明の抗体複合体は、抗体と同様に、ＮＫ細胞の活性化を誘導できることがわかった。【０１８８】
（２）ＮＫ細胞およびＴ細胞の活性化
前記抗ＣＤ１９抗体に加えて、抗ＣＤ２０抗体（Rituximab）または抗ＣＤ３８抗体（Daratumumab）を用い、B-BiTEの濃度を２．５μｇ／ｍＬとし、抗体の濃度を７．５μｇ／ｍＬとした以外は、前記実施例１（２）と同様にして、抗体複合体（CD19/B-BiTE、CD20/B-BiTEまたはCD38/B-BiTE）を調製した。【０１８９】
健常者からヒト末梢血を回収した。つぎに、前記末梢血から、ヒト末梢血単核球を抽出後、得られたヒト末梢血単核球と、Ｂ細胞除去キット（CD19 microbeads、Miltenyi Biotec社製）を用いて、Ｂ細胞を除去することにより、ＮＫ細胞、Ｔ細胞および単球を含む細胞群を精製した。前記精製後、２×１０５個の細胞群と２．０×１０５個のターゲット細胞とを、前記抗ＣＤ１９抗体、抗ＣＤ２０抗体、抗ＣＤ３８抗体、コントロール抗体、CD19/B-BiTE、CD20/B-BiTE、CD38/B-BiTE、またはisotype/B-BiTEの存在下、５時間培養した（ｎ＝３）。前記抗体の濃度は、抗体単独の場合、７．５μｇ／ｍＬとした。前記ターゲット細胞は、Ｋ５６２／ＣＤ１９細胞、Ｋ５６２／ＣＤ２０細胞およびＫ５６２／ＣＤ３８細胞とした。前記培養後、５μｍｏｌ／ＬとなるようにＢＦＡを添加し、さらに５時間培養した。そして、培養後の細胞を、１％PFAで固定後、細胞膜の透過処理を行った。さらに、ＡＰＣ−Ｃｙ７抗ヒトＣＤ４抗体（clone RPA-T4）、Alexa700標識抗ヒトＣＤ５６抗体（clone 5.1H11）、V450抗ヒトＣＤ107a抗体（clone H4A3）、ＰＥ標識抗ヒトＴＮＦ−α抗体（clone MAb11）、ＡＰＣ標識抗ヒトＩＬ−２抗体（clone MQ1-17H12）、ＰＣ７標識抗ヒトＩＦＮ−γ抗体（clone B27）、ＰＣ５標識抗ヒトＣＤ８抗体（clone B9.11）、およびＦＩＴＣ標識抗ヒトＣＤ１６抗体（clone 3G8）で染色した。前記染色後の細胞について、前記フローサイトメーターで測定した。そして、ターゲット細胞がコントロールにおけるサイトカイン発現およびＣＤ１０７ａの発現を基準として、ＣＤ１０７ａの発現上昇の割合を算出した。これらの結果を図１２〜１４に示す。【０１９０】
図１２〜１４は、ＮＫ細胞およびＴ細胞の活性化を示すグラフである。図１２〜１４において、横軸は、抗体または抗体複合体の種類を示し、縦軸は、各サイトカインの産生細胞の割合またはＣＤ１０７ａの発現上昇の割合を示す。図１２〜１４に示すように、標的抗原であるＣＤ１９、ＣＤ２０またはＣＤ３８を発現するターゲット細胞が存在し、かつ前記標的抗原に結合する抗体が存在する場合、標的抗原を発現しないターゲットが存在する場合および標的抗原に結合しない抗体が存在する場合と比較して、ＮＫ細胞のＩＦＮ−γの産生細胞の割合の上昇およびＣＤ１０７ａの発現上昇が生じ、ＮＫ細胞が活性化していることがわかった。また、同様に、標的抗原であるＣＤ１９、ＣＤ２０またはＣＤ３８を発現するターゲット細胞が存在し、かつ前記標的抗原に結合する抗体複合体が存在する場合、標的抗原を発現しないターゲットが存在する場合および標的抗原に結合しない抗体複合体が存在する場合と比較して、ＣＤ４＋Ｔ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞におけるＩＬ−２、ＩＦＮ−γおよびＴＮＦ−αの産生細胞の割合の上昇およびＣＤ１０７ａの発現上昇が生じ、ＮＫ細胞におけるＩＦＮ−γの産生細胞の割合の上昇およびＣＤ１０７ａの発現上昇が生じた。すなわち、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞およびＮＫ細胞が活性化していることがわかった。これらのことから、本発明の抗体複合体は、抗体と同様に、ＮＫ細胞およびＴ細胞の活性化を誘導できることがわかった。【０１９１】
（３）ＮＫ細胞およびＴ細胞の傷害活性の誘導
前記抗ＣＤ１９抗体に代えて、抗ＣＤ２０抗体（Rituximab）または抗ＣＤ３８抗体（Daratumumab）を用い、B-BiTEの濃度を１μｇ／ｍＬとし、抗体の濃度を３μｇ／ｍＬとした以外は、前記実施例１（２）と同様にして、抗体複合体（CD19/B-BiTE、CD20/B-BiTEまたはCD38/B-BiTE）を調製した。【０１９２】
つぎに、５．０×１０３個のターゲット細胞であるＫ５６２細胞、Ｋ５６２／ＣＤ２０細胞、Ｋ５６２／ＣＤ３８細胞およびＲａｊｉ細胞について、クロム５１（５１Ｃｒ）存在下で、１．５時間培養することにより、クロム５１でラベルした。つぎに、前記実施例４（１）で精製した細胞群（Ｅ）と、前記クロム５１でラベルしたターゲット細胞（Ｔ）について、Ｅ：Ｔが、２０：１、１０：１、５：１または２．５：１となるように、前記ターゲット細胞を培養しているウェルに、前記精製した細胞群を添加した。さらに、前記抗ＣＤ２０抗体、抗ＣＤ３８抗体、コントロール抗体、isotpye/B-BiTE、CD20/B-BiTEまたはCD38/B-BiTEを添加した。前記抗体の濃度は、３μｇ／ｍＬとした。そして、１８時間培養後、上清を回収し、１分間あたりの放射線の計数率（ＣＰＭ：count per minute）を、AccuFLEXg7010（HITACHI社製）を用いて測定した。また、コントロールは、前記精製した細胞群を添加しなかった以外は、同様にして測定した。そして、下記式（１）に基づき、細胞傷害性（特異的融解の割合）を測定した。これらの結果を、図１５に示す。
Ｋ＝（ＬＥ−ＬＳ）／（ＬＭａｘ−ＬＳ）×１００（％）    ・・・（１）
Ｋ：細胞傷害性
ＬＥ：ＣＰＭの測定値
ＬＳ：ターゲット細胞のみの場合のＣＰＭの測定値
ＬＭａｘ：ターゲット細胞のみのウェルに0.2%Triton-X含有PBSを添加した場合のＣＰＭの測定値【０１９３】
図１５は、細胞傷害性を示すグラフである。図１５において、横軸はＥ／Ｔ比を示し、縦軸は、細胞傷害性を示す。図１５に示すように、標的抗原であるＣＤ２０およびＣＤ３８を発現しないＫ５６２をターゲット細胞として用いた場合、特異的な細胞傷害は生じず、各群における細胞傷害性は同等であった。他方、標的抗原であるＣＤ２０またはＣＤ３８を発現するＫ５６２およびＲａｊｉ細胞をターゲット細胞として用いた場合、前記標的抗原に結合する抗体または抗体複合体が存在すると、エフェクターの量比依存的に細胞傷害性が増大した。また、抗体添加群と、抗体複合体添加群とを比較すると、抗体複合体添加群は、抗体添加群と比較して、細胞傷害性が増大した。これらの結果から、本発明の抗体複合体は、細胞傷害活性を誘導できることおよびその誘導能は抗体単独より増強されていることがわかった。【０１９４】
［実施例５］
本発明の抗体複合体が、濃度依存的に、Ｔ細胞のサイトカイン産生を誘導することを確認した。【０１９５】
前記抗ＣＤ１９抗体に加えて、抗ＣＤ２０抗体（Rituximab）または抗ＣＤ３８抗体（Daratumumab）を用い、B-BiTEの濃度を２．５μｇ／ｍＬとし、抗体の濃度を７．５μｇ／ｍＬとした以外は、前記実施例１（２）と同様にして、抗体複合体（CD19/B-BiTE、CD20/B-BiTEまたはCD38/B-BiTE）を調製した。【０１９６】
前記実施例１（３）と同様にしてＣＤ３＋Ｔ細胞を精製した。２．５×１０５個のＣＤ３＋Ｔ細胞と５．０×１０４個のターゲット細胞とを、所定濃度（B-BiTEおよび抗体の総濃度；１０μｇ／ｍＬ）のCD19/B-BiTE、CD20/B-BiTE、CD38/B-BiTE、またはisotype/B-BiTEの存在下、２時間培養した（ｎ＝３）。前記ターゲット細胞は、Ｋ５６２／ＣＤ１９細胞、Ｋ５６２／ＣＤ２０細胞またはＫ５６２／ＣＤ３８細胞とした。前記培養後、５μｍｏｌ／ＬとなるようにＢＦＡを添加し、さらに１８時間培養した。そして、培養後の細胞を、１％PFAで固定後、細胞膜の透過処理を行った。さらに、前記実施例１（３）と同様にして、各サイトカインを産生している細胞の割合を算出した。そして、ＣＤ４＋Ｔ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞の各サイトカインにおいて、１０μｇ／ｍＬの抗体複合体添加時のサイトカインを産生している細胞の割合を１００％として、相対的な産生細胞の割合を算出した。これらの結果を図１６に示す。【０１９７】
図１６は、相対的な産生細胞の割合を示すグラフである。図１６において、上段は、ＣＤ８＋Ｔ細胞の結果を示し、下段は、ＣＤ４＋Ｔ細胞の結果を示す。図１６において、横軸は、B-BiTEおよび抗体の総濃度を示し、縦軸は、相対的な産生細胞の割合を示す。また、各グラフにおける抗体複合体の名称に隣接して記載されている数値は、ＥＣ５０を示す。図１６に示すように、抗体複合体の濃度依存的に、ＣＤ８＋Ｔ細胞およびＣＤ４＋Ｔ細胞は、各サイトカインを産生する細胞の割合が増加した。これらの結果から、本発明の抗体複合体が、濃度依存的に、Ｔ細胞のサイトカイン産生を誘導することがわかった。【０１９８】
［実施例６］
本発明の抗体複合体が、生体内において、抗腫瘍活性を示すことを確認した。【０１９９】
ＳＬＲを発現するＲａｊｉ細胞（Ｒａｊｉ／ＳＬＲ細胞）は、Ｋ５６２細胞に代えて、Ｒａｊｉ細胞を用い、ヒトＣＤ１９をコードするポリヌクレオチドに代えて、ＳＬＲをコードするポリヌクレオチドを用いた以外は、前記実施例１（２）と同様にして、調製した。なお、ＳＬＲは細胞内タンパク質であるため、ＳＬＲをコードするポリヌクレオチドには、切断型のＮＧＦＲ遺伝子（ΔNGFR）をコードするポリヌクレオチドを、フーリン（furin）切断部位（RAKR：配列番号３２）、スペーサー配列（SGSG（ドメインリンカーと同配列））およびコドン最適化Ｐ２Ａ配列（ATNFSLLKQAGDVEENPGP：配列番号３３）をコードするポリヌクレオチドを介して、連結した。【０２００】
ＳＬＲタンパク質（SLR/furin-sgsg-p2a/dNGFR、配列番号３０）
MEEENIVNGDRPRDLVFPGTAGLQLYQSLYKYSYITDGIIDAHTNEVISYAQIFETSCRLAVSLEKYGLDHNNVVAICSENNIHFFGPLIAALYQGIPMATSNDMYTEREMIGHLNISKPCLMFCSKKSLPFILKVQKHLDFLKKVIVIDSMYDINGVECVFSFVSRYTDHAFDPVKFNPKEFDPLERTALIMTSSGTTGLPKGVVISHRSITIRFVHSSDPIYGTRIAPDTSILAIAPFHHAFGLFTALAYFPVGLKIVMVKKFEGEFFLKTIQNYKIASIVVPPPIMVYLAKSPLVDEYNLSSLTEIACGGSPLGRDIADKVAKRLKVHGILQGYGLTETCSALILSPNDRELKKGAIGTPMPYVQVKVIDINTGKALGPREKGEICFKSQMLMKGYHNNPQATRDALDKDGWLHTGDLGYYDEDRFIYVVDRLKELIKYKGYQVAPAELENLLLQHPNISDAGVIGIPDEFAGQLPSACVVLEPGKTMTEKEVQDYIAELVTTTKHLRGGVVFIDSIPKGPTGKLMRNELRAIFAREQAKSKLRAKRSGSGATNFSLLKQAGDVEENPGPMDGPRLLLLLLLGVSLGGAKEACPTGLYTHSGECCKACNLGEGVAQPCGANQTVCEPCLDSVTFSDVVSATEPCKPCTECVGLQSMSAPCVEADDAVCRCAYGYYQDETTGRCEACRVCEAGSGLVFSCQDKQNTVCEECPDGTYSDEANHVDPCLPCTVCEDTERQLRECTRWADAECEEIPGRWITRSTPPEGSDSTAPSTQEPEAPPEQDLIASTVAGVVTTVMGSSQPVVTRGTTDNLIPVYCSILAAVVVGLVAYIAFKRWNS【０２０１】
ＳＬＲをコードするポリヌクレオチド（配列番号３１）
5'-ATGGAAGAAGAGAACATCGTGAATGGCGATCGCCCTCGGGATCTGGTGTTCCCTGGCACAGCCGGCCTGCAGCTGTATCAGTCCCTGTATAAATACTCTTACATCACCGACGGAATCATCGACGCCCACACCAACGAGGTGATCTCCTATGCCCAGATTTTCGAAACAAGTTGCCGCCTGGCCGTGAGCCTGGAGAAGTATGGCCTGGATCACAACAACGTGGTGGCCATTTGCAGCGAGAACAACATCCACTTCTTCGGCCCTCTGATCGCTGCCCTATACCAGGGGATTCCAATGGCCACATCCAACGATATGTACACCGAGAGGGAGATGATCGGCCACCTGAACATCTCCAAGCCATGTCTGATGTTCTGTTCCAAGAAGTCCCTGCCATTCATCCTGAAGGTGCAGAAGCACCTGGACTTTCTCAAGAAGGTGATCGTGATCGACAGCATGTACGACATCAACGGCGTGGAGTGCGTGTTCAGTTTCGTGTCCCGGTACACCGATCATGCGTTCGATCCAGTGAAGTTCAACCCTAAAGAGTTTGATCCCCTGGAGAGAACCGCGCTGATCATGACATCCTCTGGAACAACCGGCCTGCCTAAGGGCGTGGTGATCAGCCACAGGAGCATCACCATCAGATTCGTCCACAGCAGCGATCCCATCTACGGCACCCGCATCGCCCCAGATACATCCATCCTGGCCATCGCCCCTTTCCACCACGCCTTCGGACTGTTTACCGCCCTGGCTTACTTTCCAGTGGGCCTGAAGATCGTGATGGTGAAAAAGTTTGAGGGCGAGTTCTTCCTGAAGACCATCCAGAACTACAAGATCGCTTCTATCGTGGTGCCTCCTCCAATCATGGTGTATCTGGCCAAGAGCCCTCTGGTGGATGAGTACAATCTGTCCAGCCTGACAGAGATCGCCTGTGGCGGCTCCCCTCTGGGCAGAGACATCGCCGACAAGGTGGCCAAGAGACTGAAGGTCCACGGCATCCTGCAGGGCTATGGCCTGACCGAGACCTGTAGCGCCCTGATCCTGAGCCCCAACGATAGAGAGCTGAAGAAGGGCGCCATCGGCACCCCTATGCCCTATGTCCAGGTGAAGGTGATTGACATCAACACCGGCAAAGCCCTGGGACCAAGAGAGAAGGGCGAGATTTGCTTCAAGAGCCAGATGCTGATGAAGGGCTACCACAACAACCCACAGGCCACCAGGGATGCCCTGGACAAGGACGGGTGGCTGCACACCGGCGATCTGGGCTACTACGACGAGGACAGATTCATCTATGTGGTGGATCGGCTGAAAGAACTCATCAAGTACAAGGGCTACCAGGTGGCCCCTGCCGAGCTGGAGAACTTGCTTCTGCAGCACCCTAACATCTCTGATGCCGGCGTCATCGGCATCCCAGACGAGTTTGCCGGCCAGCTGCCTTCCGCCTGTGTCGTGCTGGAGCCTGGCAAGACCATGACCGAGAAGGAGGTGCAGGATTATATCGCCGAGCTGGTGACCACCACCAAGCACCTGCGGGGCGGCGTGGTGTTCATCGACAGCATTCCGAAAGGCCCAACAGGCAAGCTGATGAGAAACGAGCTGAGGGCCATCTTTGCCCGCGAGCAGGCCAAGTCCAAGCTGAGGGCCAAGCGGTCCGGATCCGGAGCCACCAACTTCAGCCTGCTGAAGCAGGCCGGCGACGTGGAGGAGAACCCCGGCCCCATGGACGGGCCGCGCCTGCTGCTGTTGCTGCTTCTGGGGGTGTCCCTTGGAGGTGCCAAGGAGGCATGCCCCACAGGCCTGTACACACACAGCGGTGAGTGCTGCAAAGCCTGCAACCTGGGCGAGGGTGTGGCCCAGCCTTGTGGAGCCAACCAGACCGTGTGTGAGCCCTGCCTGGACAGCGTGACGTTCTCCGACGTGGTGAGCGCGACCGAGCCGTGCAAGCCGTGCACCGAGTGCGTGGGGCTCCAGAGCATGTCGGCGCCATGCGTGGAGGCCGACGACGCCGTGTGCCGCTGCGCCTACGGCTACTACCAGGATGAGACGACTGGGCGCTGCGAGGCGTGCCGCGTGTGCGAGGCGGGCTCGGGCCTCGTGTTCTCCTGCCAGGACAAGCAGAACACCGTGTGCGAGGAGTGCCCCGACGGCACGTATTCCGACGAGGCCAACCACGTGGACCCGTGCCTGCCCTGCACCGTGTGCGAGGACACCGAGCGCCAGCTCCGCGAGTGCACACGCTGGGCCGACGCCGAGTGCGAGGAGATCCCTGGCCGTTGGATTACACGGTCCACACCCCCAGAGGGCTCGGACAGCACAGCCCCCAGCACCCAGGAGCCTGAGGCACCTCCAGAACAAGACCTCATAGCCAGCACGGTGGCAGGTGTGGTGACCACAGTGATGGGCAGCTCCCAGCCCGTGGTGACCCGAGGCACCACCGACAACCTCATCCCTGTCTATTGCTCCATCCTGGCTGCTGTGGTTGTGGGTCTTGTGGCCTACATAGCCTTCAAGAGGTGGAACAGCTGA-3'【０２０２】
５週齢のＮＯＧマウス（NOD/Shi-scid,IL-2RγKO・Jicマウス、In-Vivo Science社から購入）に１．５Ｇｙのγ線を照射した。つぎに、図１７（Ａ）に示すように、前記ＮＯＧマウスに、５×１０５個のＲａｊｉ／ＳＬＲ細胞を静脈投与し、移植した。前記移植後を０日目として、６日目および１１日目に、５×１０６個のＴ細胞およびＮＫ細胞を含む活性化エフェクター細胞と、３０μｇ／１５０μＬの前記抗ＣＤ２０抗体または４０μｇ／１５０μＬのCD20/B-BiTEとを、静脈投与した。エフェクター細胞は、１．０×１０６個の末梢血単核球を、IL-2 100 U/mLおよび抗CD3抗体 (clone OKT3) 50 ng/mLの存在下、7日-10日前後培養して調製した。CD20/B-BiTEは、３０μｇの抗ＣＤ２０抗体と、１０μｇのB-BiTEとを室温で１時間混合した後、ＰＢＳにより４０μｇ／１５０μＬとなるように希釈し、調製した。そして、前記移植後５、８日および１２日目における腫瘍の大きさをイメージアナライザー（AEQUORIA-2D/8600 bioluminescence imaging assays、Hamamatsu Photonics社製）により測定した。コントロールは、前記抗体および抗体複合体を投与しなかった以外は、同様にして測定した。これらの結果を図１７に示す。【０２０３】
図１７は、生体における抗腫瘍活性に関する図である。図１７において、（Ａ）は、プロトコルを示し、（Ｂ）は、イメージアナライザーで測定された写真であり、（Ｃ）は、腫瘍の大きさを示すグラフである。図１７（Ｂ）において、白線で囲った領域は、腫瘍が存在する領域である。図１７（Ｂ）および（Ｃ）に示すように、前記抗ＣＤ２０抗体または抗体複合体投与群は、コントロールと比較して、腫瘍の大きさが縮小した。また、前記抗体複合体投与群は、前記抗ＣＤ２０抗体投与群と比較して、腫瘍が有意に縮小した。これらの結果から、本発明の抗体複合体が、生体内において、抗腫瘍活性を示すこと、および抗体単独より抗腫瘍活性が高いことがわかった。なお、抗ＣＤ２０抗体として用いてるリツキシマブは、ＮＫ細胞によるＡＤＣＣ活性が高い抗体として知られている。ＡＤＣＣ活性が低く治療効果の弱い抗体製剤を複合体化タンパク質と組合わせた場合は、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて、抗体単独と比較してより明確に抗腫瘍効果を高めることができると推察される。【０２０４】
以上のことから、本発明の抗体複合体が、生体内において、抗腫瘍活性を示すことがわかった。【０２０５】
以上、実施形態を参照して本発明を説明したが、本発明は、上記実施形態に限定されるものではない。本発明の構成や詳細には、本発明のスコープ内で当業者が理解しうる様々な変更をすることができる。【０２０６】
この出願は、２０１９年２月１５日に出願された日本出願特願２０１９−０２４９７６を基礎とする優先権を主張し、その開示のすべてをここに取り込む。【０２０７】
＜付記＞
上記の実施形態および実施例の一部または全部は、以下の付記のように記載されうるが、以下には限られない。
（付記１）
第１の抗原結合ドメインと、第２の抗原結合ドメインとを含み、
前記第１の抗原結合ドメインは、免疫グロブリンに結合可能であり、
前記第２の抗原結合ドメインは、所望の抗原に結合可能である、複合体化タンパク質。
（付記２）
前記第１の抗原結合ドメインは、免疫グロブリンの定常（Ｆｃ）領域に結合可能である、付記１記載の複合体化タンパク質。
（付記３）
前記第１の抗原結合ドメインは、Ｆｃ領域のＥＵナンバリングで表される部位のうち、２３７〜４４７位の領域内にエピトープを有する、付記２記載の複合体化タンパク質。
（付記４）
前記第１の抗原結合ドメインは、第１の重鎖可変領域および第１の軽鎖可変領域を含む、付記１から３のいずれかに記載の複合体化タンパク質。
（付記５）
前記第１の重鎖可変領域は、重鎖相補性決定領域（ＣＤＲＨ）１、ＣＤＲＨ２、およびＣＤＲＨ３を含み、
前記第１の軽鎖可変領域は、軽鎖相補性決定領域（ＣＤＲＬ）１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３を含み、
ＣＤＲＨ１が、下記（H1-A）のアミノ酸配列を含むポリペプチドであり、
ＣＤＲＨ２が、下記（H2-A）のアミノ酸配列を含むポリペプチドであり、
ＣＤＲＨ３が、下記（H3-A）のアミノ酸配列を含むポリペプチドであり、
ＣＤＲＬ１が、下記（L1-A）のアミノ酸配列を含むポリペプチドであり、
ＣＤＲＬ２が、下記（L2-A）のアミノ酸配列を含むポリペプチドであり、
ＣＤＲＬ３が、下記（L3-A）のアミノ酸配列を含むポリペプチドである、付記４記載の複合化タンパク質：
（H1-A）下記（H1-A1）、（H1-A2）または（H1-A3）のアミノ酸配列
（H1-A1）配列番号１のアミノ酸配列
（H1-A2）配列番号１のアミノ酸配列に対して、８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列
（H1-A3）配列番号１のアミノ酸配列において、１個または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列
（H2-A）下記（H2-A1）、（H2-A2）または（H2-A3）のアミノ酸配列
（H2-A1）配列番号２のアミノ酸配列
（H2-A2）配列番号２のアミノ酸配列に対して、８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列
（H2-A3）配列番号２のアミノ酸配列において、１個または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列
（H3-A）下記（H3-A1）、（H3-A2）または（H3-A3）のアミノ酸配列
（H3-A1）配列番号３のアミノ酸配列
（H3-A2）配列番号３のアミノ酸配列に対して、８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列
（H3-A3）配列番号３のアミノ酸配列において、１個または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列
（L1-A）下記（L1-A1）、（L1-A2）または（L1-A3）のアミノ酸配列
（L1-A1）配列番号４のアミノ酸配列
（L1-A2）配列番号４のアミノ酸配列に対して、８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列
（L1-A3）配列番号４のアミノ酸配列において、１個または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列
（L2-A）下記（L2-A1）、（L2-A2）または（L2-A3）のアミノ酸配列
（L2-A1）配列番号５のアミノ酸配列
（L2-A2）配列番号５のアミノ酸配列に対して、８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列
（L2-A3）配列番号５のアミノ酸配列において、１個または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列
（L3-A）下記（L3-A1）、（L3-A2）または（L3-A3）のアミノ酸配列
（L3-A1）配列番号６のアミノ酸配列
（L3-A2）配列番号６のアミノ酸配列に対して、８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列
（L3-A3）配列番号６のアミノ酸配列において、１個または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列。
（付記６）
前記第１の抗原結合ドメインは、一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）を含む、付記１から５のいずれかに記載の複合体化タンパク質。
（付記７）
前記所望の抗原は、Ｔ細胞に発現する抗原である、付記１から６のいずれかに記載の複合体化タンパク質。
（付記８）
前記Ｔ細胞に発現する抗原は、ＣＤ３である、付記７記載の複合体化タンパク質。
（付記９）
前記第２の抗原結合ドメインは、第２の重鎖可変領域および第２の軽鎖可変領域を含む、付記１から８のいずれかに記載の複合体化タンパク質。
（付記１０）
前記第２の重鎖可変領域は、重鎖相補性決定領域（ＣＤＲＨ）１、ＣＤＲＨ２、およびＣＤＲＨ３を含み、
前記第２の軽鎖可変領域は、軽鎖相補性決定領域（ＣＤＲＬ）１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３を含み、
ＣＤＲＨ１が、下記（H1-B）のアミノ酸配列を含むポリペプチドであり、
ＣＤＲＨ２が、下記（H2-B）のアミノ酸配列を含むポリペプチドであり、
ＣＤＲＨ３が、下記（H3-B）のアミノ酸配列を含むポリペプチドであり、
ＣＤＲＬ１が、下記（L1-B）のアミノ酸配列を含むポリペプチドであり、
ＣＤＲＬ２が、下記（L2-B）のアミノ酸配列を含むポリペプチドであり、
ＣＤＲＬ３が、下記（L3-B）のアミノ酸配列を含むポリペプチドである、付記９記載の複合化タンパク質：
（H1-B）下記（H1-B1）、（H1-B2）または（H1-B3）のアミノ酸配列
（H1-B1）配列番号７のアミノ酸配列
（H1-B2）配列番号７のアミノ酸配列に対して、８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列
（H1-B3）配列番号７のアミノ酸配列において、１個または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列
（H2-B）下記（H2-B1）、（H2-B2）または（H2-B3）のアミノ酸配列
（H2-B1）配列番号８のアミノ酸配列
（H2-B2）配列番号８のアミノ酸配列に対して、８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列
（H2-B3）配列番号８のアミノ酸配列において、１個または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列
（H3-B）下記（H3-B1）、（H3-B2）または（H3-B3）のアミノ酸配列
（H3-B1）配列番号９のアミノ酸配列
（H3-B2）配列番号９のアミノ酸配列に対して、８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列
（H3-B3）配列番号９のアミノ酸配列において、１個または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列
（L1-B）下記（L1-B1）、（L1-B2）または（L1-B3）のアミノ酸配列
（L1-B1）配列番号１０のアミノ酸配列
（L1-B2）配列番号１０のアミノ酸配列に対して、８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列
（L1-B3）配列番号１０のアミノ酸配列において、１個または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列
（L2-B）下記（L2-B1）、（L2-B2）または（L2-B3）のアミノ酸配列
（L2-B1）配列番号１１のアミノ酸配列
（L2-B2）配列番号１１のアミノ酸配列に対して、８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列
（L2-B3）配列番号１１のアミノ酸配列において、１個または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列
（L3-B）下記（L3-B1）、（L3-B2）または（L3-B3）のアミノ酸配列
（L3-B1）配列番号１２のアミノ酸配列
（L3-B2）配列番号１２のアミノ酸配列に対して、８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列
（L3-B3）配列番号１２のアミノ酸配列において、１個または数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列。
（付記１１）
前記第２の抗原結合ドメインは、一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）を含む、付記１から１０のいずれかに記載の複合体化タンパク質。
（付記１２）
前記免疫グロブリンと架橋可能な光反応性架橋部を含む、付記１から１１のいずれかに記載の複合体化タンパク質。
（付記１３）
前記第１の抗原結合ドメインを構成するアミノ酸が、前記光反応性架橋部として、光活性型の反応性官能基を有する、付記１２記載の複合体化タンパク質。
（付記１４）
標的抗原に結合可能な抗体またはその抗原結合断片と、複合体化タンパク質とを含み、
前記複合体化タンパク質は、付記１から１３のいずれかの複合体化タンパク質であり、
前記複合体化タンパク質は、その第１の抗原結合ドメインより前記抗体またはその抗原結合断片と結合し、複合体化している、抗体複合体。
（付記１５）
前記抗体またはその抗原結合断片と、前記複合体化タンパク質とは、架橋されている、付記１４記載の抗体複合体。
（付記１６）
前記標的抗原は、疾患に関連する抗原である、付記１４または１５記載の抗体複合体。
（付記１７）
前記標的抗原は、腫瘍抗原である、付記１４から１６のいずれかに記載の抗体複合体。
（付記１８）
付記１から１３のいずれかに記載の複合体化タンパク質を含む、医薬組成物。
（付記１９）
標的抗原に結合可能な抗体またはその抗原結合断片を含む、付記１８記載の医薬組成物。
（付記２０）
前記複合体化タンパク質は、その第１の抗原結合ドメインにより前記抗体またはその抗原結合断片と結合し、複合体化している、付記１９記載の医薬組成物。
（付記２１）
付記１から１３のいずれかに記載の複合体化タンパク質をコードする、核酸。
（付記２２）
患者に、付記１から１３のいずれかに記載の複合体化タンパク質と、標的抗原に結合可能な抗体またはその抗原結合断片とを投与する、標的抗原に関連する疾患の治療方法。
（付記２３）
前記複合体化タンパク質は、その第１の抗原結合ドメインにより前記抗体またはその抗原結合断片と結合し、複合体化している、付記２２記載の治療方法。
（付記２４）
前記標的抗原は、腫瘍抗原であり、
前記標的抗原に関連する疾患は、がんである、付記２２または２３記載の治療方法。
【産業上の利用可能性】
【０２０８】
以上説明したように、本発明の複合体化タンパク質によれば、抗体またはその抗原結合断片に対して、所望の抗原に対する結合性を付加できる。このため、本発明は、医薬分野等において、極めて有用といえる。
【図１】
2020166714.tif 000003
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
2020166714.tif 000009
【図８】
2020166714.tif 000010
【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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