(57)【要約】  本発明は、新たなｍｉＲＮＡの抽出方法、および、該ｍｉＲＮＡの抽出方法で抽出したｍｉＲＮＡを解析する解析方法を提供する。本発明によれば、例えば、細胞外小胞を捕捉できるデバイスを用いたサンプル液中の細胞外小胞からのｍｉＲＮＡの抽出方法であって、該ｍｉＲＮＡの抽出方法は、サンプル液とデバイスとを接触させることで、サンプル液中の細胞外小胞をデバイスに捕捉する細胞外小胞捕捉工程、細胞外小胞を捕捉したデバイスを細胞外小胞の破砕液と接触させることで、細胞外小胞を破砕し、細胞外小胞からｍｉＲＮＡを破砕液中に抽出するｍｉＲＮＡ抽出工程、を含む、ｍｉＲＮＡの抽出方法が提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞外小胞を捕捉できるデバイスを用いたサンプル液中の細胞外小胞からのｍｉＲＮＡの抽出方法であって、該ｍｉＲＮＡの抽出方法は、
サンプル液とデバイスとを接触させることで、サンプル液中の細胞外小胞をデバイスに捕捉する細胞外小胞捕捉工程、
細胞外小胞を捕捉したデバイスを細胞外小胞の破砕液と接触させることで、細胞外小胞を破砕し、細胞外小胞からｍｉＲＮＡを破砕液中に抽出するｍｉＲＮＡ抽出工程、
を含む、ｍｉＲＮＡの抽出方法。
【請求項２】
前記細胞外小胞捕捉工程と前記ｍｉＲＮＡ抽出工程との間に、細胞外小胞を捕捉したデバイスを洗浄するデバイス洗浄工程、
を含む、請求項１に記載のｍｉＲＮＡの抽出方法。
【請求項３】
前記デバイスが、破砕液に対して耐久性がある材料で形成されている、
請求項１または２に記載のｍｉＲＮＡの抽出方法。
【請求項４】
該デバイスは、セルロースファイバーで構成された不織布を含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載ｍｉＲＮＡの抽出方法。
【請求項５】
セルロースファイバーが、セルロースナノファイバーである、請求項４に記載のｍｉＲＮＡの抽出方法。
【請求項６】
前記デバイスが、
ナノワイヤ、
セルロースファイバーを用いて作製した構造体、および、
セルロースナノファイバーを用いて作製した構造体、
から選択される何れか一つを含む、
請求項３に記載のｍｉＲＮＡの抽出方法。
【請求項７】
前記デバイスが、セルロースナノファイバーを用いて作製した構造体である、
請求項６に記載のｍｉＲＮＡの抽出方法。
【請求項８】
前記サンプル液が、非侵襲性の生体サンプル液である、
請求項１〜７の何れか一項に記載のｍｉＲＮＡの抽出方法。
【請求項９】
前記サンプル液が、唾液である、
請求項８に記載のｍｉＲＮＡの抽出方法。
【請求項１０】
請求項１〜９の何れか一項に記載のｍｉＲＮＡの抽出方法で抽出した破砕液中に含まれるｍｉＲＮＡを解析する解析工程を含む、
サンプル液中の細胞外小胞に含まれるｍｉＲＮＡの解析方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願における開示は、ｍｉＲＮＡの抽出方法、および、ｍｉＲＮＡの解析方法に関する。特に、細胞外小胞（Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｖｅｓｉｃｌｅｓ、エクソソーム；以下、「ＥＶｓ」と記載することがある。）を捕捉できるデバイスを用い、サンプル液中のＥＶｓからｍｉＲＮＡを抽出するｍｉＲＮＡの抽出方法、および、ｍｉＲＮＡの抽出方法で得られた抽出液中に含まれるｍｉＲＮＡを解析するｍｉＲＮＡの解析方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＥＶｓは、生体内の細胞から分泌される４０〜１０００ｎｍ程の大きさを持った膜小胞体であり、血液、尿、唾液、精液などの体液中に存在している。その表面には、分泌細胞由来の膜タンパク質や接着分子、酵素等が存在し、内部にはｍＲＮＡやｍｉＲＮＡといった核酸が含まれている。そのため、他の細胞に伝播し、取り込まれることで受容細胞へ影響を与える。【０００３】
近年、ＥＶｓの生体内での機能の一つとして、がん転移の誘発性があることが明らかとなり、注目を集めている。がん転移とは、がん細胞が、がんの発生部位から血管やリンパを媒介して他の臓器へ伝播し増殖することを言い、がんによる死亡率が高いこともこの転移に起因する。このがん転移の発生に関して、がん原発巣のがん細胞由来のＥＶｓが、血管を通って他の臓器へ伝播し、がん転移性ニッチを形成することや、がん細胞由来のＥＶｓが、正常細胞の異常な増殖を誘発し、がん腫瘍形成へと発展させることなど、ＥＶｓとがん転移に関する研究が報告されている（非特許文献１参照）。【０００４】
また、ＥＶｓ中の含まれるｍｉＲＮＡが、疾患に対するバイオマーカーとして用いられることも知られている（非特許文献２および３参照）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Ｓｏｎｉａ  Ａ．  Ｍｅｌｏ，ｅｔ  ａｌ．，“Ｃａｎｃｅｒ  Ｅｘｏｓｏｍｅｓ  Ｐｅｒｆｏｒｍ  Ｃｅｌｌ−Ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ＭｉｃｒｏＲＮＡ  Ｂｉｏｇｅｎｅｓｉｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｍｏｔｅ  Ｔｕｍｏｒｉｇｅｎｅｓｉｓ”，  Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌ  ２６，  ７０７−７２１，  Ｎｏｖｅｍｂｅｒ  １０，  ２０１４  ｈｔｔｐ：／／ｄｘ．ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０１６／ｊ．ｃｃｅｌｌ．２０１４．０９．００５
【非特許文献２】Ａｍａｎｄａ  Ｍｉｃｈａｅｌ，ｅｔ  ａｌ．，  “Ｅｘｏｓｏｍｅｓ  ｆｒｏｍ  Ｈｕｍａｎ  Ｓａｌｉｖａ  ａｓ  ａ  Ｓｏｕｒｃｅ  ｏｆ  ｍｉｃｒｏＲＮＡ  Ｂｉｏｍａｒｋｅｒｓ”，  Ｏｒａｌ  Ｄｉｓ．  ２０１０  Ｊａｎｕａｒｙ；１６（１）：３４−３８．  ｄｏｉ：１０．１１１１／ｊ．１６０１−０８２５．２００９．０１６０４．ｘ．
【非特許文献３】Ｋａｚｕｙａ  Ｉｗａｉ、ｅｔ  ａｌ．，  “Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｓａｌｉｖａｒｙ  ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｖｅｓｉｃｌｅｓ  ｂｙ  ｉｏｄｉｘａｎｏｌ  ｄｅｎｓｉｔｙ  ｇｒａｄｉｅｎｔ  ｕｌｔｒａｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｔｈｅｉｒ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎｓ”，  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｖｅｓｉｃｌｅｓ  ２０１６，５：３０８２９−ｈｔｔｐ：／／ｄｘ．ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．３４０２／ｊｅｖ．ｖ５．３０８２９
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
上記非特許文献２および３に記載されているとおり、サンプル中（非特許文献２および３では唾液）のＥＶｓに含まれるｍｉＲＮＡを、疾患に対するバイオマーカーとして用いることは知られている。ところで、非特許文献２および３には、サンプル液を超遠心分離することで、サンプル液中からＥＶｓを回収することが記載されている。しかしながら、超遠心による分離は、超遠心後にＥＶｓを含む画分を回収する必要がある。【０００７】
そのため、超遠心分離工程が必須となり、作業手順が増えるという問題がある。更に、サンプル液の量が少ない場合、サンプル液中に含まれる微量のｍｉＲＮＡまで解析するためには、サンプル液中に含まれるＥＶｓを回収する際に、ロスを少なくする必要がある。しかしながら、超遠心分離によりＥＶｓを回収する方法では、ＥＶｓを含む画分を採取する操作過程で、サンプル中に含まれるＥＶｓの一部を捨ててしまう恐れがあるという問題がある。また、サンプル液中のＥＶｓの分離方法としては、超遠心法以外にも、市販のキットを用いた、凝集試薬法も知られている。しかしながら、凝集試薬法に関しても、サンプル液中のＥＶｓを凝集した後は、遠心分離等により凝集したＥＶｓを分離する必要があり、作業手順が増えるとともに、ＥＶｓの分離作業中にロスが生じるという問題がある。したがって、サンプル液から、作業手順が簡単で且つ効率的にＥＶｓを回収する方法が求められる。【０００８】
本出願における開示は、上記問題点を解決するためになされたものであり、鋭意研究を行ったところ、［１］ＥＶｓを捕捉できるデバイスとサンプル液を接触させることで、ＥＶｓをデバイスに捕捉させ、［２］ＥＶｓを捕捉したデバイスを直接ＥＶｓの破砕液と接触させることで、［３］デバイスで捕捉したＥＶｓを分離する工程を要せず、デバイスに捕捉したＥＶｓから直接ｍｉＲＮＡを抽出できること、を新たに見出した。【０００９】
すなわち、本出願における開示の目的は、新たなｍｉＲＮＡの抽出方法、および、該ｍｉＲＮＡの抽出方法で抽出したｍｉＲＮＡを解析する解析方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本出願における開示は、以下に示す、ｍｉＲＮＡの抽出方法、および、ｍｉＲＮＡの解析方法に関する。【００１１】
（１）細胞外小胞を捕捉できるデバイスを用いたサンプル液中の細胞外小胞からのｍｉＲＮＡの抽出方法であって、該ｍｉＲＮＡの抽出方法は、
サンプル液とデバイスとを接触させることで、サンプル液中の細胞外小胞をデバイスに捕捉する細胞外小胞捕捉工程、
細胞外小胞を捕捉したデバイスを細胞外小胞の破砕液と接触させることで、細胞外小胞を破砕し、細胞外小胞からｍｉＲＮＡを破砕液中に抽出するｍｉＲＮＡ抽出工程、
を含む、ｍｉＲＮＡの抽出方法。
（２）前記細胞外小胞捕捉工程と前記ｍｉＲＮＡ抽出工程との間に、細胞外小胞を捕捉したデバイスを洗浄するデバイス洗浄工程、
を含む、上記（１）に記載のｍｉＲＮＡの抽出方法。
（３）前記デバイスが、破砕液に対して耐久性がある材料で形成されている、
上記（１）または（２）に記載のｍｉＲＮＡの抽出方法。
（４）該デバイスは、セルロースファイバーで構成された不織布を含む、上記（１）〜（３）のいずれかに記載ｍｉＲＮＡの抽出方法。
（５）セルロースファイバーが、セルロースナノファイバーである、上記（４）に記載のｍｉＲＮＡの抽出方法。
（６）前記デバイスが、
ナノワイヤ、
セルロースファイバーを用いて作製した構造体、および、
セルロースナノファイバーを用いて作製した構造体、
から選択される何れか一つを含む、
上記（３）に記載のｍｉＲＮＡの抽出方法。
（７）前記デバイスが、セルロースナノファイバーを用いて作製した構造体である、
上記（６）に記載のｍｉＲＮＡの抽出方法。
（８）前記サンプル液が、非侵襲性の生体サンプル液である、
上記（１）〜（７）の何れか一つに記載のｍｉＲＮＡの抽出方法。
（９）前記サンプル液が、唾液である、
上記（８）に記載のｍｉＲＮＡの抽出方法。
（１０）上記（１）〜（９）の何れか一つに記載のｍｉＲＮＡの抽出方法で抽出した破砕液中に含まれるｍｉＲＮＡを解析する解析工程を含む、
サンプル液中の細胞外小胞に含まれるｍｉＲＮＡの解析方法。
【発明の効果】
【００１２】
本出願で開示するｍｉＲＮＡの抽出方法により、超遠心分離等によりサンプル液中のＥＶｓを分離する工程を要せず、デバイスに捕捉したＥＶｓから直接ｍｉＲＮＡを抽出できる。また、ｍｉＲＮＡの抽出方法により抽出したｍｉＲＮＡを解析することで、微量のｍｉＲＮＡも解析できる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】図１は、抽出方法の第１の実施形態のフローチャートである。
【図２】図２Ａ乃至図２Ｄは、第３の実施形態に係るデバイス１の一例を示す図である。
【図３】図３は、第３の実施形態に係るデバイス１の一例である、ナノワイヤ３を基板２の第１面に形成したデバイス１ａの作製工程の一例を説明するための図である。
【図４】図４Ａ乃至図４Ｃはカバー部材４の各種態様を示す図である。図４Ｄは第１面にナノワイヤを形成した基板２を表す。
【図５】図５は、第４の実施形態に係るデバイス１ｂの作製工程の一例を説明するための図である。
【図６】図６Ａ乃至図６Ｅは、図面代用写真で、それぞれ、作製したデバイス１乃至５の写真である。
【図７】図７Ａ及び図７Ｂは、図面代用写真で、（ａ）ｍｉＲＮＡ抽出後にデバイスを遠沈管から取り出した後の遠沈管の写真、（ｂ）遠沈管から取り出したデバイスの写真である。
【図８】図８Ａ及び図８Ｂは、図面代用写真で、（ａ）ｍｉＲＮＡ抽出工程終了直後の遠沈管の写真、（ｂ）ｍｉＲＮＡ抽出後にデバイスを遠沈管から取り出した後の遠沈管の写真、（ｃ）遠沈管から取り出したデバイスの写真である。
【図９】図９は、デバイス１乃至４を用いて抽出したｍｉＲＮＡ抽出液中に含まれる、ｍｉＲＮＡの種類を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
以下、図面を参照しつつ、ｍｉＲＮＡの抽出方法（以下、単に「抽出方法」と記載することがある。）、および、ｍｉＲＮＡの解析方法（以下、単に「解析方法」と記載することがある。）について、詳しく説明する。なお、本明細書において、同種の機能を有する部材には、同一または類似の符号が付されている。そして、同一または類似の符号の付された部材について、繰り返しとなる説明が省略される場合がある。
【００１５】
（抽出方法の第１の実施形態）
図１を参照して、抽出方法の第１の実施形態について説明する。図１は、抽出方法の第１の実施形態のフローチャートである。抽出方法の第１の実施形態は、細胞外小胞（ＥＶｓ）捕捉工程（ＳＴ１）、ｍｉＲＮＡ抽出工程（ＳＴ２）を含んでいる。細胞外小胞（ＥＶｓ）捕捉工程（ＳＴ１）では、サンプル液とＥＶｓを捕捉できるデバイスとを接触させることで、サンプル液中のＥＶｓをデバイスに捕捉する。ｍｉＲＮＡ抽出工程（ＳＴ２）では、ＥＶｓを捕捉したデバイスをＥＶｓの破砕液と接触させることでＥＶｓを破砕し、ＥＶｓからｍｉＲＮＡを破砕液中に抽出する。
【００１６】
サンプル液としては、ＥＶｓを含むものであれば特に制限はなく、血液、リンパ液、骨髄液、精液、母乳、羊水、尿、唾液、鼻水、汗、涙、胆液、脳脊髄液等の生体サンプル液が挙げられる。また、生体サンプル液以外のサンプル液としては、細胞培養上清、培地または緩衝液等にＥＶｓを添加した実験用のサンプル液、等が挙げられる。サンプル液として生体サンプル液を用いた場合、患者負担の軽減を考慮すると、尿、唾液、鼻水、汗、涙等の非侵襲性サンプル液が好ましい。
【００１７】
なお、後述する実施例に示すとおり、本出願で開示する抽出方法の第１の実施形態で抽出したｍｉＲＮＡを解析すると、多くの種類のｍｉＲＮＡを解析することができた。換言すると、従来の方法では解析できなかった微量のｍｉＲＮＡも解析することができた。したがって、同じ種類のサンプル液であれば、少ない量で抽出方法を実施することができる。また、超遠心分離によりＥＶｓを分画・回収するためには、数ｍｌ程度のサンプル液が必要とされている。しかしながら、例えば、唾液や涙等、数ｍｌの量を採取することが患者にとって大きな負担になる生体サンプル液もある。抽出方法の第１の実施形態では、従来の超遠心分離による方法と比較して、サンプル液の量が少なくてもｍｉＲＮＡを抽出できるので、唾液中のＥＶｓに含まれるｍｉＲＮＡの抽出に特に有用である。
【００１８】
ＥＶｓの破砕液は、ＥＶｓが破砕できれば特に制限はなく、例えば、市販の細胞溶解バッファー（Ｃｅｌｌ  Ｌｙｓｉｓ  Ｂｕｆｆｅｒ）を用いればよい。細胞溶解バッファーとしては、細胞溶解バッファーＭ（富士フィルム和光純薬株式会社製、０３８−２１１４１）、ＲＩＰＡ  Ｂｕｆｆｅｒ（富士フィルム和光純薬株式会社製、１８２−０２４５１）等が挙げられる。なお、デバイスを破砕液に浸漬する時間は、ＥＶｓを破砕してｍｉＲＮＡを取り出すことができれば特に制限はない。なお、デバイスについては後述する。
【００１９】
（抽出方法の第２の実施形態）
抽出方法の第２の実施形態は、図１に示す細胞外小胞（ＥＶｓ）捕捉工程（ＳＴ１）とｍｉＲＮＡ抽出工程（ＳＴ２）の間に、ＥＶｓを捕捉したデバイスを洗浄するデバイス洗浄工程を含む点で抽出方法の第１の実施形態と異なり、その他の点は抽出方法の第１の実施形態と同様である。生体から抽出した生体サンプル液、例えば、唾液、汗、鼻水等には、外部から侵入したウイルス等から生体を守るため、ウイルス等の異物のＲＮＡを分解する酵素であるＲＮａｓｅを含んでいる。そのため、唾液、汗、鼻水等のＲＮａｓｅを含む生体サンプル液からｍｉＲＮＡを抽出する場合、細胞外小胞捕捉工程の際に、デバイスにＲＮａｓｅが吸着する恐れがある。そして、ＲＮａｓｅが吸着したデバイスでｍｉＲＮＡ抽出工程を実施すると、ＥＶｓから抽出したｍｉＲＮＡがＲＮａｓｅにより分解される恐れがある。
【００２０】
そのため、デバイス洗浄工程では、ＥＶｓを捕捉したデバイスを洗浄することで、デバイスからＲＮａｓｅを除去する。デバイス洗浄工程では、ＥＶｓを捕捉したデバイスを洗浄液に所定時間浸漬し、洗浄すればよい。洗浄時間は特に制限はないが、短すぎると洗浄効果がなく、長すぎると捕捉したＥＶｓが剥がれるとの問題が発生する。例えば、デバイスを洗浄液に、１〜２０００秒程度、浸漬すればよい。洗浄液としては、純水、ＰＢＳ、ＮａＣｌ、生理食塩水、ＰＢＳ等の各種緩衝液等が挙げられる。なお、洗浄液として純水を用いた場合、長時間洗浄を行うと、浸透圧の関係で捕捉したＥＶｓがバーストする恐れがある。したがって、洗浄液として純水を用いた場合は、緩衝液等と比較して、洗浄時間は短めに設定することが望ましい。
【００２１】
（ｍｉＲＮＡの解析方法の実施形態）
ｍｉＲＮＡの解析方法の実施形態は、抽出方法の第１または第２の実施形態により抽出した破砕液中のｍｉＲＮＡを解析する解析工程を含んでいる。ｍｉＲＮＡの解析は、公知のｍｉＲＮＡ解析方法を用いればよい。例えば、（１）ｍｉＲｎｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いてｍｉＲＮＡを含む全ＲＮＡを抽出し、３Ｄ−Ｇｅｎｅ（登録商標）ｍｉＲＮＡチップを用いて約２５００種のｍｉＲＮＡの中から網羅的解析を行い、チップ画像を数値化し、発現比の算出、変動遺伝子解析、クラスター解析を行う、（２）ｍｉＲＮｅａｓｙ  Ｓｅｒｕｍ／Ｐｌａｓｍａ  ｋｉｔ  （Ｑｉａｇｅｎ）を用いて、破砕液中の全ｍｉＲＮＡを単離し、ｍｉＳｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＲＴ  Ｋｉｔ  （Ｑｉａｇｅｎ）を用いｃＤＮＡを合成し、次いで、定量的リアルタイムＰＣＲで定量する、等の方法が挙げられる。
【００２２】
以下に、本出願で開示するｍｉＲＮＡの抽出方法に用いることができるデバイスについて説明する。デバイスは、ＥＶｓを捕捉することができれば特に制限はないが、ＥＶｓの捕捉効率等の向上のため、デバイスは「ナノ構造体」を含むことができる。なお、本明細書において「ナノ構造体」とは、相互作用によりＥＶｓを吸着することができ、且つ、同種で同量の材料の最小となる面積と比較して、比表面積を大きくすることでＥＶｓの吸着効率を高めた構造体を意味する。ナノ構造体は、例えば、微細な孔（ナノポア）を有する材料を用いる、または、微細な繊維（ワイヤ）を凝集（密集）させる等により作製することができる。また、ナノ構造体の形状に特に制限はなく、例えば、フィルム状；糸（紐）状；円柱状、角柱状、或いは、不定形状等の立体形状；等の何れであってもよい。以下に、フィルム状およびナノワイヤを用いたデバイスの各実施形態を説明するが、以下のデバイスの実施形態は単なる例示であって、デバイスは以下に例示する実施形態に限定されない。
【００２３】
（デバイスの第１の実施形態）
デバイスの第１の実施形態は、セルロースナノファイバーを用いて作製したフィルムをナノ構造体として用いる。セルロースナノファイバーを得るためには、先ず、木材チップから木材繊維（セルロースファイバー）を取り出してパルプ化する。このセルロースファイバーは、無数のセルロースナノファイバーが束になって構成されている。次に、このセルロースファイバーを、ＴＥＭＰＯ触媒の存在下で、溶媒中で高圧で繊維同士を衝突させ、束になっているセルロースファイバーを解すことでセルロースナノファイバーを得ることができる。なお、前記のセルロースナノファイバーの作製方法は単なる例示で、その他の方法であってもよい。第１の実施形態に係るデバイスは、得られたセルロースナノファイバーを含む溶媒を吸引濾過することで、セルロースナノファイバー同士が表面張力により凝集・フィルム化することで作製できる。セルロースナノファイバーを分散する溶媒としては、水等が挙げられる。
【００２４】
なお、第１の実施形態に係るデバイスは、作製したフィルムのセルロースナノファイバー同士が隙間（ナノポア）を有するようにしてもよい。ナノポアのサイズを調整することで、ＥＶｓの捕捉効率を向上することができる。ナノポアのサイズは、例えば、約１ｎｍ〜２００ｎｍ、約１ｎｍ〜１００ｎｍとすることができる。ナノポアの平均サイズは、水銀圧入法で測定することができる。ナノポアは、吸引濾過して凝集した湿潤状態のセルロースナノファイバーに、ターシャリーブチルアルコール、エタノール、イソプロパノール等の表面張力の低い液体を加えて引き続き吸引し、凝集したセルロースナノファイバーの塊に含まれる溶媒を、これら低表面張力の溶媒で置換・乾燥することで形成できる。ナノポアのサイズは、加える溶媒を変えることで調整できる。なお、上記のナノポアの形成およびサイズの調整は、単なる例示であって、その他の方法でナノポアの形成およびサイズの調整を行ってもよい。例えば、セルロースファイバーを解す高圧処理条件や、パルプの種類・バクテリア・ホヤといったセルロース原料を変えることでセルロースナノファイバーの幅を変え、ナノポアのサイズを調整してもよい。ある態様では、作製したフィルムは不織布であり得る。ナノポアを設けた場合、捕捉するＥＶｓが増え、多くの種類のｍｉＲＮＡの解析ができる。
【００２５】
（デバイスの第２の実施形態）
デバイスの第２の実施形態は、セルロースナノファイバーに代え、セルロースファイバー（パルプ）を用いて作製したフィルムをナノ構造体として用いている点で、第１の実施形態と異なる。第２の実施形態に係るデバイスは、セルロースナノファイバーに代え、セルロースファイバー（パルプ）を溶媒に分散する以外は、デバイスの第１の実施形態と同様の手順で作製すればよい。セルロースファイバー同士の隙間、および、セルロースファイバー表面に存在するセルロースナノファイバー同士の隙間も、第１の実施形態と同様の手順で作製およびサイズの調整ができる。なお、セルロースナノファイバーの幅は約３ｎｍ〜１００ｎｍであることから、約１ｎｍ〜２００ｎｍ程度のサイズのナノポアが形成される。一方、セルロースファイバーの幅は約２０μｍ〜４０μｍである。したがって、隙間のサイズは、第１の実施形態と異なり、ｎｍ〜μｍオーダーで、約１ｎｍ〜２００ｎｍ、および、約１μｍ〜１００μｍのマルチスケールである。
【００２６】
第１および第２の実施形態に係るデバイスは、作製したフィルムを適当なサイズに切断してそのまま用いることができる。或いは、後述するｍｉＲＮＡ抽出工程の際に用いる遠沈管等に切断したデバイスを貼り付ける、マスクに貼り付けることで咳中のＥＶｓを捕捉する、タオル等に貼り付け汗中のＥＶｓを捕捉できるようにしてもよい。また、デバイスの第１および第２の実施形態はフィルム状であるが、その他の形状であってもよい。例えば、糸（紐）状にする場合は、吸引濾過する際に糸（紐）状に溝が形成されている型（吸引濾過フィルター）を用いればよい。また、セルロース（ナノ）ファイバーが分散した溶媒をアセトン等の凝固浴に射出して紡糸してもよい。所定の立体形状にする場合は、所定の形状が形成されている型（吸引濾過フィルター）を用いて吸引濾過すればよい。また、不定形の立体形状にする場合は、先ず、吸引濾過フィルターの一部のみにセルロース（ナノ）ファイバーが分散した溶媒を投入し、吸引濾過によりセルロース（ナノ）ファイバーが凝集した塊を作製し、前記セルロース（ナノ）ファイバーが凝集した塊の作製を繰り返すことで、不定形の立体形状のナノ構造体を作製することができる。また、セルロース（ナノ）ファイバーが分散した溶媒を所望の形状の容器に入れ、凍結乾燥処理することによっても立体形状のナノ構造体を作製することができる。また、デバイスは、セルロース（ナノ）ファイバーのみで作製してもよいし、本開示の目的を損なわない範囲内であれば充填剤等を添加してもよい。例えば、湿潤紙力増強剤としてのポリアミドアミンエピクロロヒドリンといった充填剤の添加、ナノワイヤ（ナノワイヤは後述する第３の実施形態を参照）を単体で添加、等が挙げられる。
【００２７】
（デバイスの第３の実施形態）
デバイスの第３の実施形態は、ナノワイヤをデバイスとして用いている。図２Ａ乃至図２Ｄは、第３の実施形態に係るデバイス１の一例を示す図である。図２Ａはデバイス１ａの上面図、図２Ｂは図２ＡのＸ−Ｘ’断面図、図２Ｃは図２ＡのＹ−Ｙ’断面である。また、図２Ｄは図２Ｃに示す実施形態の変形例の断面図である。デバイス１ａは、基板２、ナノワイヤ３、カバー部材４を少なくとも含み、図２Ｂ乃至図２Ｄ（以下、図２に共通する説明は、単に「図２」と記載することがある。以下の段落においても同様である。）に示すデバイス１ａでは、ナノワイヤ３を形成するための触媒層５を含んでいる。デバイス１ａは、基板２上にナノワイヤ３を形成するための触媒層５が形成され、触媒層５の上にナノワイヤ３が形成されている。なお、本明細書において「第１面」とは、基板２のナノワイヤ３が形成されている側の面の最表面を意味する。したがって、後述するとおり、基板２の「第１面」とカバー部材の「第２面」が液密に密着と記載した場合、「第１面」の部材は、製法により、基板２、触媒層５または被覆層になる。さらに、カバー部材の「第２面」と密着する「第１面」にナノワイヤが成長している場合もあるが、その場合はナノワイヤの根元にある平坦部を「第１面」とする。また、本明細書においてナノワイヤの「先端」とは、ナノワイヤの両方の端部の内、基板２の第１面から離れた方のナノワイヤの端部を意味し、基板２の第１面側のナノワイヤの端部は、本明細書ではそのまま「端部」と記載する。
【００２８】
カバー部材４は、カバー部材用基材４１、カバー部材用基材４１に形成された流路４２を含む。なお、本明細書において「第２面」とは、カバー部材用基材４１の流路４２が形成される側の面（流路４２の開口部分を仮想平面とした場合、該仮想平面に続く面）を意味する。図２Ｂに示す例では、カバー部材用基材４１の触媒層５と接している面が第２面に相当する。また、図２Ｃに示す例では、カバー部材４は、サンプル投入孔４３およびサンプル回収孔４４を含んでいる。サンプル投入孔４３およびサンプル回収孔４４は、図２Ｃに示すように、流路４２と第２面とは反対側の面４５を貫通するようにカバー部材用基板４１に形成されている。なお、図２Ｃに示す例は、サンプル液をデバイス１ａの上方から投入および回収する例を示しているが、サンプル投入孔４３およびサンプル回収孔４４の位置は、投入したサンプル液がナノワイヤ３を形成した領域を通過し、通過後にサンプル液を回収できれば特に制限はない。例えば、図２Ｄに示すように、流路４２の側壁にサンプル投入孔４３およびサンプル回収孔４４を形成してもよい。
【００２９】
第３の実施形態に係るデバイス１ａは、フォトリソグラフィ技術を用いて作製することができる。図３は第３の実施形態に係るデバイス１の一例である、ナノワイヤ３を基板２の第１面に形成したデバイス１ａの作製工程の一例を説明するための図である。なお、図３は、図２ＡのＸ−Ｘ’方向の断面図を表している。
【００３０】
（１）基板２を準備する。
（２）基板２上に、ナノワイヤ３作製用の粒子をＥＣＲ（Ｅｌｅｃｔｒｏｎ  Ｃｙｃｌｏｔｒｏｎ  Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ）スパッタリング、又は触媒をＥＣＲスパッタリング、ＥＢ（Ｅｌｅｃｔｒｏｎ  Ｂｅａｍ）蒸着、ＰＬＤ（Ｐｕｌｓｅｄ  Ｌａｓｅｒ  Ｄｅｐｏｓｉｔｉｏｎ）、ＡＬＤ（Ａｔｏｍｉｃ  Ｌａｙｅｒ  Ｄｅｐｏｓｉｔｉｏｎ）、することで触媒層５を形成する。なお、本明細書において「触媒層」と記載した場合、ナノワイヤ作製用の「粒子」又は「触媒」の「層」を意味する。
（３ａ、３ｂ）フォトリソグラフィ用のレジスト６を塗布し、ナノワイヤ３を成長させる場所をフォトリソグラフィでパターニングする。フォトリソグラフィのパターニングは、ナノワイヤ３を成長させたいパターンで形成すればよい。例えば、ナノワイヤ３をランダムに成長させたい場合は、基板２上のナノワイヤ３を形成する領域の触媒層５が全て露出するようにパターニングすればよい（３ａ参照）。また、所定間隔でナノワイヤ３を成長させる場合は、所定間隔のドット状に触媒層５が露出するようにパターニングあるいは、フォトリソグラフィによる描画をすればよい（３ｂ参照）。フォトリソグラフィでパターニング、あるいは描画した後は、パターニングあるいは描画した部分のレジスト６を現像・除去する。
（４ａ、４ｂ）レジストが除去され、触媒層５が露出した場所からナノワイヤ３を成長させる。
（５ａ、５ｂ）残りのレジストを除去することで、第１面に形成した触媒層５上にナノワイヤ３を形成した基板２を作製できる。
【００３１】
図４Ａ乃至図４Ｃはカバー部材４の各種態様を示す図である。カバー部材４は、カバー部材用基材４１の第２面４７を切削、或いは、カバー部材用基材４１の材料に凸状の鋳型を押し付けることで、簡単に作製できる。また、凸状の鋳型を押し付けることでカバー部材４を作製した場合、サンプル投入孔４３およびサンプル回収孔４４は、転写後に生検トレパン、超音波ドリル等を用いて形成すればよい。カバー部材４は、切削範囲、鋳型の形状を変えることで、例えば、図４Ａおよび図４Ｂに示すように、流路４２の断面積を簡単に変えることができる。また、図４Ｃに示すように、流路４２の任意の面に、通過するサンプル液に乱流を発生させるための非平面領域４６を形成することもできる。非平面領域４６は、通過するサンプル液に乱流を発生できれば特に制限はなく、例えば、凸部等を形成すればよい。カバー部材４は、流路４２の断面積や形状が異なる複数種類を準備することができる。
【００３２】
そして、図３に示す工程により作製した第１面にナノワイヤ３を形成した基板２（図４Ｄ）に、所期の断面積や形状の流路４２を有するカバー部材４を被せることで、デバイス１ａを作製することができる。
【００３３】
基板２は、触媒層５を積層することができれば特に制限はない。例えば、シリコン、石英ガラス、パイレックス（登録商標）ガラス等が挙げられる。
【００３４】
触媒層５に関し、ナノワイヤ３作製用の粒子としては、例えば、ＺｎＯが挙げられる。また、ナノワイヤ３作製用の触媒としては、例えば、金、プラチナ、アルミニウム、銅、鉄、コバルト、銀、錫、インジウム、亜鉛、ガリウム、クロム、および、それらの酸化物等が挙げられる。
【００３５】
フォトリソグラフィ用のレジスト６としては、ＯＦＰＲ８６００ＬＢ、ＳＵ−８等、半導体分野で一般的に用いられているものであれば特に制限はない。また、レジスト６の除去液としては、ジメチルホルムアミドとアセトン等、半導体分野で一般的な除去液であれば特に制限はない。
【００３６】
ナノワイヤ３は、触媒層５から公知の方法で成長させればよい。例えば、触媒層５としてＺｎＯ微粒子を用いた場合は、水熱合成方法を用いて作製することができる。具体的には、硝酸亜鉛六水和物（Ｚｎ（ＮＯ３）２・６Ｈ２Ｏ）、ヘキサメチレンテトラミン（Ｃ６Ｈ１２Ｎ４）を脱イオン水に溶解した前駆体溶液に、加熱した基板２を浸漬させることで、ＺｎＯ粒子（触媒層５）が露出している部分から、ＺｎＯナノワイヤ３を成長させることができる。
【００３７】
触媒層５として触媒を用いる場合は、次の工程でナノワイヤ３を作製することができる。
（ａ）ＳｉＯ２、Ｌｉ２Ｏ、ＭｇＯ、Ａｌ２Ｏ３、ＣａＯ、ＴｉＯ２、Ｍｎ２Ｏ３、Ｆｅ２Ｏ３、ＣｏＯ、ＮｉＯ、ＣｕＯ、ＺｎＯ、Ｇａ２Ｏ３、ＳｒＯ、Ｉｎ２Ｏ３、ＳｎＯ２、Ｓｍ２Ｏ３、ＥｕＯ等の材料を用い、パルスレーザーデポジション、ＶＬＳ（Ｖａｐｏｒ−Ｌｉｑｕｉｄ−Ｓｏｌｉｄ）法等の物理蒸着法でコアナノワイヤを形成する。
（ｂ）ＳｉＯ２、ＴｉＯ２等を用い、スパッタリング、ＥＢ（Ｅｌｅｃｔｒｏｎ  Ｂｅａｍ）蒸着、ＰＶＤ（Ｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｖａｐｏｒ  Ｄｅｐｏｓｉｔｉｏｎ）、ＡＬＤ（Ａｔｏｍｉｃ  Ｌａｙｅｒ  Ｄｅｐｏｓｉｔｉｏｎ）等の一般的な蒸着法により、コアナノワイヤの周囲に被覆層を形成する。なお、上記（ｂ）の被覆層は必須ではなく、必要に応じて実施すればよい。
【００３８】
ナノワイヤ３の直径は目的に応じて適宜調整すればよい。ナノワイヤ３の直径は、ＺｎＯ微粒子を用いて形成する場合は、ＺｎＯ微粒子のサイズを変更すればよい。また、作製したナノワイヤ３に被覆層を形成する場合は、被覆層を形成する際の蒸着時間を変えることで直径を適宜調整することができる。
【００３９】
カバー部材４を作製するための材料としては、切削または鋳型を転写できるものであれば特に制限はない。例えば、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリ塩化ビニル、ポリ塩化ビニリデン、ポリスチレン、ポリ酢酸ビニル、ポリテトラフルオロエチレン、ＡＢＳ（アクリロニトリルブタジエンスチレン）樹脂、ＡＳ（アクリロニトリルスチレン）樹脂、アクリル樹脂（ＰＭＭＡ）等の熱可塑性樹脂；フェノール樹脂、エポキシ樹脂、メラミン樹脂、尿素樹脂、不飽和ポリエステル樹脂、アルキド樹脂、ポリウレタン、熱硬化性ポリイミド、シリコーンゴム等の熱硬化性樹脂が挙げられる。
【００４０】
なお、図２乃至図４に示す例は、デバイス１の単なる例示に過ぎず、基板２にナノワイヤが形成されていれば特に制限はない。例えば、国際公開第２０１５／１３７４２７号に記載の手順により、基板２上に形成した流路内にナノワイヤを形成してもよい。
【００４１】
（デバイスの第４の実施形態）
第４の実施形態に係るデバイス１ｂは、ナノワイヤ３の端部が基板２ａの第１面に埋め込まれている点、および、基板２ａを作製する材料が第３の実施形態に係るデバイス１ａと違う点、で異なり、その他の点では、第３の実施形態に係るデバイス１ａと同じである。
【００４２】
図５は、第４の実施形態に係るデバイス１ｂの作製工程の一例を説明するための図である。
（５）第３の実施形態に係るデバイス１ａで作製した、第１面にナノワイヤ３を形成した基板２を鋳型として準備する。
（６）基板２ａを形成する材料を、鋳型に塗布する。
（７）基板２ａを鋳型から剥離することで、第１面にナノワイヤ３の一部が埋め込まれた基板２ａを形成する。
（８）基板２ａの第１面に埋め込まれたナノワイヤ３を更に成長させることで、ナノワイヤ３の端部が第１面に埋め込まれた基板２ａを作製する。ナノワイヤ３の成長は第１の実施形態と同様の手順で行うことができる。
そして、図示は省略するが、第３の実施形態と同様の手順で作製したカバー部材４を基板２ａに被せることで、デバイス１ｂを作製できる。
【００４３】
基板２ａを形成する材料は、ナノワイヤ３を埋め込むことができれば特に制限はなく、例えば、カバー部材４と同様の材料が挙げられる。
【００４４】
デバイスとして、第１及び第２の実施形態に示すフィルム状のデバイスを用いた場合は、細胞外小胞捕捉工程（ＳＴ１）において、フィルムにサンプル液を滴下、或いは、サンプル液中にフィルムを浸漬すればよい。また、デバイスとして、第３及び第４の実施形態の基板上にナノワイヤを形成したデバイス１ａ、１ｂを用いた場合は、細胞外小胞捕捉工程（ＳＴ１）において、サンプル投入孔からサンプル液を投入すればよい。
【００４５】
そして、デバイスとして、第１及び第２の実施形態に示すフィルム状のデバイスを用いた場合は、ｍｉＲＮＡ抽出工程（ＳＴ２）において、フィルムを破砕液に浸漬すればよい。また、デバイスとして、第３及び第４の実施形態の基板上にナノワイヤを形成したデバイスを用いた場合は、ｍｉＲＮＡ抽出工程（ＳＴ２）において、サンプル投入孔から破砕液を投入し、抽出したｍｉＲＮＡを含む破砕液を回収すればよい。
【００４６】
なお、上記第３及び第４の実施形態に係るデバイス１ａ、１ｂは、カバー部材４が形成されているが、カバー部材４を設けなくてもよい。その場合は、細胞外小胞捕捉工程（ＳＴ１）において、サンプル液をナノワイヤに滴下、或いは、サンプル液を入れた容器にナノワイヤが接触するようにデバイスを浸漬すればよい。また、ｍｉＲＮＡ抽出工程（ＳＴ２）では、破砕液が入っている容器に、ナノワイヤ部分を浸漬すればよい。
【００４７】
更に、上記第３及び第４の実施形態に係るデバイス１ａ、１ｂは、基板の第１面にナノワイ３が形成されているが、ナノワイヤ３を単独でデバイスとしてもよい。その場合は、細胞外小胞捕捉工程（ＳＴ１）において、サンプル液を入れたチューブ等にナノワイヤを投入することで、ナノワイヤとサンプル液が接触するようにすればよい。また、ｍｉＲＮＡ抽出工程（ＳＴ２）では、サンプル液をチューブから除去した後に、破砕液をチューブに投入すればよい。ナノワイヤ３を単独でデバイスとして用いた場合でも、デバイスに捕捉したＥＶｓから直接ｍｉＲＮＡを抽出できる。ナノワイヤ３を単独でデバイスとする場合は、例えば、基板の第１面からナノワイ３を回収すればよい。
【００４８】
後述する実施例に示すとおり、上記各実施形態に示したデバイスは、サンプル液中のＥＶｓを捕捉することができる。なお、ＥＶｓを破砕液で破砕し、抽出したｍｉＲＮＡを網羅的に解析する場合、破砕液によりデバイスが破壊されると、解析工程に破壊された残渣が悪影響を及ぼすことがある。したがって、デバイスは、破砕液に対して耐久性がある、例えば、少なくとも５分、好適には３０分以上の、破砕液に対する耐久性があれば良い。上記の実施形態では、ナノワイヤまたはセルロースナノファイバーで構成したフィルムは、破砕液に対して耐久性があるので、より好ましいデバイスといえる。
【００４９】
なお、上記のデバイスは、単なる例示であり、ＥＶｓを吸着できれば（好ましくは破砕液に対して耐久性がある）、上記の実施形態のデバイスに限定されない。そのようなデバイスとしては、表面に小孔が多数存在するポーラス材料が挙げられる。具体的には、活性炭やゼオライト等のミクロポーラス材料、二酸化ケイ素（メソポーラスシリカ）や酸化アルミニウム等のメソポーラス材料、軽石等のマクロポーラス材料等が挙げられる。また、ポーラス材料以外では、溶融ガラスやポリマーから作製したフィルターが挙げられる。
【００５０】
以下に実施例を掲げ、本出願で開示する実施形態を具体的に説明するが、この実施例は単に実施形態の説明のためのものである。本出願で開示する発明の範囲を限定したり、あるいは制限することを表すものではない。
【実施例】
【００５１】
〔デバイスの作製〕【００５２】
＜デバイス１＞
以下の手順により、セルロースナノファイバーから、ナノポアを有するフィルム状のデバイスを作製した。
（１）針葉樹漂白クラフトパルプをスギノマシン社製の湿式微粒化装置（スターバースト  ＨＪＰ−２５００５Ｅ）で処理して得られた幅１５〜１００ｎｍのナノセルロース４００ｍｇを２００ｍＬの水に投入し、ナノセルロース水分散液を得た。
（２）上記のナノセルロース水分散液を、濾過装置（ＫＧ−９０、アドバンテック東洋濾紙株式会社）と吸引装置（アスピレーター  ＡＳ−０１、アズワン株式会社）を用い、親水性ポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）メンブレンフィルター（Ｈ０２０Ａ０９０Ｃ、アドバンテック東洋濾紙株式会社）を介して、濾過脱水を行った。
（３）続いて、脱水処理したナノセルロース集合体上にターシャリーブチルアルコール（ｔＢｕＯＨ、０６１０４−２５、ナカライテスク株式会社）を２００ｍＬ滴下して濾過する溶媒置換工程を行った。
（４）得られた湿潤状態のナノセルロース集合体を１１０℃、１ＭＰａ、１５ｍｉｎの条件でホットプレス乾燥処理（ＡＹＳＲ−５、神藤金属工業所株式会社）した後、ＰＴＦＥメンブレンフィルターから剥離することでフィルムを得た。
（５）作製したフィルムを、１辺が１ｃｍの正方形にカットすることで、デバイス１を作製した。図６Ａは、作製したデバイス１のＳＥＭ写真である。作製したフィルムのナノポアのサイズは、約数ｎｍ〜１００ｎｍであった。【００５３】
＜デバイス２＞
デバイス１のｔＢｕＯＨによる置換工程を実施しなかった以外は、デバイス１と同様の手順で、セルロースナノファイバーから、フィルム状のデバイスを作製した。図６Ｂは、作製したデバイス２のＳＥＭ写真である。写真から明らかなように、デバイス２は、セルロースナノファイバー同士の間にナノポアが形成されなかった。【００５４】
＜デバイス３＞
以下の手順により、パルプ（セルロースファイバー）から、マイクロサイズのポアを有するフィルム状のデバイスを作製した。
（１）針葉樹漂白クラフトパルプ４００ｍｇを水２００ｍＬに投入し、パルプ水分散液を得た。
（２）上記のパルプ水分散液を、濾過装置（ＫＧ−９０、アドバンテック東洋濾紙株式会社）と吸引装置（アスピレーター  ＡＳ−０１、アズワン株式会社）を用い、ステンレスメッシュフィルター（ＳＵＳ３０４、３００メッシュ、株式会社くればぁ）を介して、濾過脱水を行った。
（３）続いて、脱水処理したパルプ集合体上にターシャリーブチルアルコール（ｔＢｕＯＨ、０６１０４−２５、ナカライテスク株式会社）を２００ｍＬ滴下して濾過する溶媒置換工程を行った。
（４）得られた湿潤状態のパルプ集合体を１１０℃、１ＭＰａ、１５ｍｉｎの条件でホットプレス乾燥処理（ＡＹＳＲ−５、神藤金属工業所株式会社）した後、ステンレスメッシュフィルターから剥離することでフィルムを得た。
（５）作製したフィルムを、１辺が１ｃｍの正方形にカットすることで、デバイス３を作製した。図６Ｃは、作製したデバイス３の写真である。作製したフィルムのポアのサイズは、約数ｎｍ〜１００ｎｍ、および、約１μｍ〜１００μｍのマルチスケールであった。【００５５】
＜デバイス４＞
デバイス３のｔＢｕＯＨによる置換工程を実施しなかった以外は、デバイス３と同様の手順で、パルプ（セルロースファイバー）から、フィルム状のデバイスを作製した。図６Ｄは、作製したデバイス４の写真である。作製したフィルムのポアのサイズは、約１μｍ〜１００μｍであった。【００５６】
＜デバイス５＞
以下の手順により、ナノワイヤを基板に形成した流路に埋め込んだデバイスを作製した。
（１）先ず、Ｓｉ（１００）基板（Ａｄｖａｎｔｅｃｈ  Ｃｏ．，Ｌｔｄ．）にＰＤＭＳ埋め込み型ナノワイヤデバイスの流路パターニングを行った。Ｓｉ基板表面にポジティブレジスト（ＯＦＰＲ−８６００  ＬＢ，Ｔｏｋｙｏ  Ｏｈｋａ  Ｋｏｇｙｏ  Ｃｏ．  Ｌｔｄ．）を５００ｒｐｍ（５ｓｅｃ）、３０００ｒｐｍ（１２０ｓｅｃ）の条件でスピンコーター（ＭＳ−Ａ１００、ミカサ株式会社）によって回転塗布した後、ホットプレート上にて９０℃、１２ｍｉｎ加熱することで溶媒を蒸発させてレジストを基板上に固定させた。加熱後の基板上にガラスマスクをのせ、露光機で６００ｍＪ／ｃｍ２のｉ線を照射することによってレジストの軟化を行った。最後にこの基板を現像液（ＮＭＤ−３、Ｔｏｋｙｏ  Ｏｈｋａ  Ｋｏｇｙｏ  Ｃｏ．，Ｌｔｄ．）に１０秒ほど浸漬することで軟化したレジストのはく離を行い、現像液から基板を取り出し流水洗浄を行った。次いで、ホットプレートにて９０℃、５ｍｉｎ加熱することでパターニングを完了した。【００５７】
（２）次に、基板表面にナノワイヤ成長のシード層となるＣｒ層の作製を行った。Ｃｒ層作製のスパッタリング装置（ＥＩＳ−２００ＥＲＴ−ＹＮ、エリオニクス株式会社）の条件は、１．２×１０−２Ｐａ、１４ｍｉｎで、１３５ｎｍのＣｒ層を堆積させた。この基板をホットプレート上で、７０℃に温めた２−プロパノールに４０ｍｉｎ浸した後に、超音波機器による２ｍｉｎの超音波処理を行うことで流路外のレジストを大まかに取り除いた。その後、別の容器に入れた７０℃の２−プロパノールに基板を移し、１０ｍｉｎ浸漬した後に１ｍｉｎの超音波処理を行うことで流路外のレジストを完全に取り除いた。最後にさらに別の容器に入れた７０℃の２−プロパノールで濯ぐことで、基板上に乗った細かいＣｒ粒子を取り除いた。これらの手順によって、基板上では流路部分にのみＣｒ層が堆積している状態となった。この基板を４００℃の電気炉で２ｈ加熱することによってＣｒ層を酸化させ、ナノワイヤ成長のシード層作製を完了した。【００５８】
（３）超純水２００ｍＬに対して、ヘキサメチレンテトラミン（ＨＭＴＡ；０８５−００３３５，Ｗａｋｏ  Ｐｕｒｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ，  Ｌｔｄ．）が１５ｍＭとなるように溶解し、スターラーによって７ｍｉｎ撹拌した。その後、さらに硝酸亜鉛六水和物（１２３２３，Ａｌｆａ  Ａｅｓａｒ）が１５ｍＭとなるように溶解した後に、７ｍｉｎ撹拌することでナノワイヤ成長溶液とした。ここで７６ｍｍ×５２ｍｍ×０．８〜１．０ｍｍのスライドガラスに、上記の手順によって準備された流路の形に酸化Ｃｒ層が蒸着した基板２枚をカーボンテープにて貼り合わせ、成長溶液中に浸し、送風定温高温器にて９５℃、３ｈ加熱することで、ナノワイヤを成長させた。その後、ビーカーから基板を取り出し、非特異的に成長したナノワイヤを除去するために超純水にて洗い流した。【００５９】
（４）上記（３）で作製したナノワイヤが成長した基板をシャーレの上に貼り付けた。そのシャーレへ、ＰＤＭＳプレポリマー（Ｓｉｌｐｏｔ  １８４、Ｄｏｗ  Ｃｏｒｎｉｎｇ  Ｔｏｒａｙ  Ｉｎｄ．，Ｌｔｄ．）と硬化剤（Ｓｉｌｐｏｔ  １８４  ＣＡＴ，Ｄｏｗ  Ｃｏｒｎｉｎｇ  Ｔｏｒａｙ  Ｉｎｄ．，Ｌｔｄ．）を重量比１０：１で容器に入れた後、２０００ｒｐｍ、２ｍｉｎ、２２００ｒｐｍ、６ｍｉｎの条件で混合したものを注ぎ込んだ。これを２ｈ真空引きすることでポリマー中の気泡を取り除き、次いで、８０℃のホットプレート上で２ｈ加熱することで重合を進行させてポリマーを硬化させた。これらの操作によってＳｉ基板上のナノワイヤがＰＤＭＳ中へと埋め込まれた。このナノワイヤが埋め込まれたＰＤＭＳをＳｉ基板から剥離させ、スライドガラスにＰＤＭＳ埋め込み型ナノワイヤを貼り付けた。そして、上記（３）と同様の条件で、ＰＤＭＳ埋め込まれたナノワイヤを成長させた。成長後、ビーカーから埋め込み型ナノワイヤを取り出し、非特異的に成長したナノワイヤを超純水によって洗い流すことによって取り除くことでＰＤＭＳ埋め込み型ナノワイヤの作製を完了した。【００６０】
（５）Ｓｉ基板上にネガ型フォトレジスト（ＳＵ−８  ３０２５、日本化薬株式会社）をスピンコーターで塗布し、流路部分が露光できる形状のフォトマスクを被せ、露光・現像することで、流路を形成する部分が凸状となる鋳型を作製した。次に、作製した鋳型をシャーレに入れた。次に、上記（４）と同様のＰＤＭＳプレポリマーと硬化剤を重量比１０：１で容器に入れた後、２０００ｒｐｍで２ｍｉｎ、２２００ｒｐｍで６ｍｉｎの条件で混合したものを、シャーレに注ぎ込み、２ｈ真空引きすることでポリマー中の気泡を取り除いた。２ｈ経過後、８０℃のホットプレート上で２ｈ加熱することで重合を進行させてポリマーを硬化させた。この硬化させたポリマーを切り抜き、流路に０．３２ｍｍのパンチで投入孔および回収孔をあけることで、カバー部材を作製した。
（６）最後に、上記（４）で作製したナノワイヤを有する基板上に、上記（５）作製したカバー部材を被せた。また、投入孔および回収孔にＰＥＥＫチューブを挿入し、接着剤で固定することで、デバイス５を作製した。図６Ｅは、作製したデバイス５のナノワイヤの拡大写真である。【００６１】
［ｍｉＲＮＡの抽出および解析］
＜実施例１＞
サンプル液として唾液を用い、デバイスにはデバイス１乃至４を用い、以下の手順で、唾液中に含まれるＥＶｓからｍｉＲＮＡの抽出および解析を行った。
（１）サンプル液の調整
被検者から唾液を収集した。実施例１では唾液をそのまま用いたが、唾液中の不純物を取り除くため、必要に応じて唾液を遠沈管に入れ、遠心分離により不純物を取り除いてもよい。なお、この遠心分離は、あくまでも不純物を取り除くためで、ＥＶｓを分画・回収するための超遠心分離とは異なる。【００６２】
（２）サンプル中のＥＶｓの捕捉
唾液サンプル１０μｌを、デバイス１乃至４に滴下して、約１０秒間放置することで、唾液サンプル中のＥＶｓをデバイスに捕捉した。次に、デバイスをピンセットで摘み、ＰＢＳに約１０秒間浸漬することで、ＲＮａｓｅ等の洗浄を行った。【００６３】
（３）ｍｉＲＮＡの抽出
破砕液として、細胞溶解バッファーＭ（０３８−２１１４１，Ｗａｋｏ）を用いた。遠沈管に破砕液１ｍｌを入れ、次いで、上記（２）でＥＶｓを捕捉したデバイスを遠沈管に投入し、ボルテックスで約３秒攪拌した後、５分間静置することで、ＥＶｓを捕捉したデバイスから直接ＥＶｓを溶解し、ｍｉＲＮＡの抽出を行った。図７Ａはデバイス１を用いた際の写真で、（ａ）ｍｉＲＮＡ抽出後にデバイス１を遠沈管から取り出した後の遠沈管の写真、（ｂ）遠沈管から取り出したデバイス１の写真である。図７Ｂはデバイス２を用いた際の写真で、（ａ）ｍｉＲＮＡ抽出後にデバイス２を遠沈管から取り出した後の遠沈管の写真、（ｂ）遠沈管から取り出したデバイス２の写真である。図８Ａはデバイス３を用いた際の写真で、（ａ）ｍｉＲＮＡ抽出工程終了直後の遠沈管の写真、（ｂ）ｍｉＲＮＡ抽出後にデバイス３を遠沈管から取り出した後の遠沈管の写真、（ｃ）遠沈管から取り出したデバイス３の写真である。図８Ｂはデバイス４を用いた際の写真で、（ａ）ｍｉＲＮＡ抽出工程終了直後の遠沈管の写真、（ｂ）ｍｉＲＮＡ抽出後にデバイス４を遠沈管から取り出した後の遠沈管の写真、（ｃ）遠沈管から取り出したデバイス４の写真である。図７Ａ及び図７Ｂに示すように、セルロースナノファイバーから作製したデバイス１及びデバイス２を用いた場合は、破砕液でＥＶｓを破砕した後でも、遠沈管内にデバイス由来の繊維等は見られず、また、取り出したデバイスは元の形状を維持していた。そのため、ｍｉＲＮＡの抽出後は、ピンセットでデバイスを取り除くだけで、ｍｉＲＮＡ抽出液を作製できた。【００６４】
一方、図８Ａ及び図８Ｂに示すように、パルプ（セロロースファイバー）から作製したデバイス３及びデバイス４を用いた場合は、遠沈管内にデバイスから分離した繊維が見られ、取り出したデバイスは一部が欠損していた。そのため、デバイス３及びデバイス４を用いた場合は、後述するｍｉＲＮＡ解析の際に不純物として邪魔になるデバイス由来の繊維を、遠心分離で除去した。【００６５】
（４）ｍｉＲＮＡの解析
次に、ｍｉＲＮＡ抽出液に含まれるｍｉＲＮＡの種類を、３Ｄ−Ｇｅｎｅ（登録商標）（東レ株式会社製）ヒトｍｉＲＮＡチップを用い、以下の手順で解析を行った。
（ａ）ｍｉＲＮＡ抽出液を、キット製造者の取扱説明書に従い、ＳｅｒａＭｉ  Ｅｘｏｓｏｍｅ  ＲＮＡ精製カラムキット（Ｓｙｓｔｅｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｉｎｃ．）を用いて精製した。
（ｂ）精製したｍｉＲＮＡ抽出液１５μｌを、マイクロアレイおよび３Ｄ−ＧｅｎｅＨｕｍａｎ  ｍｉＲＮＡ  Ｏｌｉｇｏチップｖｅｒ．２１（Ｔｏｒａｙ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ）を使用してｍｉＲＮＡプロファイリングを分析した。３Ｄ−Ｇｅｎｅは、２５６５ヒトｍｉＲＮＡプローブを含んでおり、ｍｉＲＮＡ抽出液から、最大２５６５種類のｍｉＲＮＡの発現を解析できる。
（ｃ）ｍｉＲＮＡ抽出液中の各ｍｉＲＮＡの発現レベルは、各マイクロアレイ中のすべてのｍｉＲＮＡのバックグラウンドを差し引いたシグナル強度を計算し、その後にグローバルノーマライゼイションすることで解析した。【００６６】
図９は、デバイス１乃至４を用いて抽出したｍｉＲＮＡ抽出液中に含まれる、ｍｉＲＮＡの種類を示すグラフである。なお、各デバイスとも、３回の解析結果の平均値である。図９に示す通り、デバイス１乃至４の何れのデバイスを用いた時でも、デバイスに捕捉したＥＶｓから直接ｍｉＲＮＡを抽出できることを確認した。また、図７および図８に示すとおり、パルプから作製したデバイス３及びデバイス４は、ＥＶｓを破砕中にデバイスの一部が欠損し、遠沈管内にデバイスから分離した繊維が見られた。したがって、サンプル液からのｍｉＲＮＡの抽出に続き、ｍｉＲＮＡの解析を行う場合は、デバイス１及びデバイス２の方が好ましいことが明らかとなった。【００６７】
なお、従来の唾液を超遠心分離してＥＶｓを分離し、ｍｉＲＮＡを解析する方法では、上記非特許文献２では、１０頁に記載されているとおり２７種類であった。また、上記非特許文献３では、Ｆｉｇ．７に記載されているとおり、解析できたｍｉＲＮＡは９３種類であった。加えて、非特許文献３に記載の方法では、唾液を５ｍｌ、或いは、１５ｍｌも使用することが記載されているが、そのような大量の唾液を採取することは被検者（患者）の負担が非常に大きい。一方、デバイス１乃至４を用いた場合は、わずか１０μｌの唾液を用いて、７００種類を超えるｍｉＲＮＡの解析に成功した。換言すると、含有量が微量のｍｉＲＮＡに関しても、解析できたことを意味する。【００６８】
以上の結果より、デバイス１乃至デバイス４を用いると、従来の超遠心分離を用いたＥＶｓの分離方法等と比較して、唾液サンプル液中のＥＶｓからのｍｉＲＮＡの抽出作業手順を簡略化できる。また、ＥＶｓを捕捉したデバイスから直接ｍｉＲＮＡを抽出できる（及び、高割合で唾液中のＥＶｓをデバイスに捕捉できる）ので、ｍｉＲＮＡ抽出作業中のロスが少なくなり、高精度のｍｉＲＮＡ解析ができるという顕著な効果を確認した。したがって、本出願で開示するｍｉＲＮＡの抽出方法は、サンプル液中に含まれるｍｉＲＮＡの解析方法の際のサンプル調整方法として非常に有用である。また、生体サンプル液として、被侵襲性で且つ大量の採取が難しい唾液から高精度のｍｉＲＮＡの解析ができたことから、健康診断等の際に、デバイス１乃至デバイス４を舌に接触することで、がん診断を併せて実施することが期待される。【００６９】
＜実施例２＞
サンプル液として尿を用い、デバイスにはデバイス５を用い、以下の手順で、尿中に含まれるＥＶｓからｍｉＲＮＡの抽出および解析を行った。
（１）サンプルの調整
市販の尿（Ｐｒｏｔｅｏｇｅｎｅｘ、ＢｉｏｒｅｃｌａｍａｔｉｏｎＩＶＴ、ＥＷ  Ｂｉｏｐｈａｒｍａ）１ｍＬを、１．５ｍＬ遠沈管に分注し、この遠沈管を冷却遠心機にセットし、３０００×ｇ、１５ｍｉｎ、４℃の条件で遠心分離することによって不純物を沈殿させた。以下では、この不純物を除いた上澄み部分のことを尿サンプルと記載する。【００７０】
（２）尿サンプル中のＥＶｓの捕捉
上記尿サンプル１ｍＬを、シリンジポンプによって流量５０μＬ／ｍｉｎの条件で、デバイス５に導入し、ナノワイヤに尿サンプル中のＥＶｓを捕捉させた。
（３）ｍｉＲＮＡの抽出
破砕液として、実施例１と同様の細胞溶解バッファーＭを用い、破砕液１ｍＬをデバイスに導入することで捕捉したＥＶｓを溶解し、ｍｉＲＮＡ抽出液を作製した。
（４）ｍｉＲＮＡの解析
実施例１と同様の手順で解析を行った。【００７１】
同一の手順で２２８回実験を行ったこところ、デバイス５を用い、平均１１４４種類のｍｉＲＮＡを検出できた。以上の結果より、ナノワイヤに捕捉したＥＶｓから直接ｍｉＲＮＡを抽出できたことを確認した。【００７２】
更に、従来の超遠心分離によりＥＶｓを分離し、ｍｉＲＮＡを解析する方法では、同一の手順で３回実験を行ったところ、解析できたｍｉＲＮＡは１７１、２６１、３５２種類であった。また、樹脂ベースのＥＶｓ吸着担体を用いた市販のＥＶｓ濃縮キットであるＥｘｏＱｕｉｃｋ（フナコシ株式会社製）を用いた実験では、解析できたｍｉＲＮＡの種類は、３３７、３５５、４９１種類であった。【００７３】
以上の結果より、唾液以外の生体サンプル、また、木材繊維から作製したデバイス以外のＥＶｓ捕捉用デバイスを用いた場合にも、実施例１に記載と同様の顕著な効果を確認した。【００７４】
以上の結果より、唾液以外の生体サンプル、また、木材繊維から作製したデバイス以外のＥＶｓ捕捉用デバイスを用いた場合にも、実施例１に記載と同様の顕著な効果を確認した。
【産業上の利用可能性】
【００７５】
本出願で開示するｍｉＲＮＡの抽出方法、および、ｍｉＲＮＡの解析方法は、サンプル液中から簡単且つ高精度にｍｉＲＮＡを抽出および解析できる。したがって、医療機関、大学、企業、研究機関等において、細胞実験等に有用である。
【符号の説明】
【００７６】
１、１ａ〜１ｂ…デバイス、２、２ａ…基板、３…ナノワイヤ、４…カバー部材、５…触媒層、６…レジスト、４１…カバー部材用基材、４２…流路、４３…サンプル投入孔、４４…サンプル回収孔、４５…第２面とは反対側の面、４６…非平面領域、４７…第２面
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【国際調査報告】
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