(57)【要約】細胞を含む細胞懸濁液を収容する培養容器を用い、上記培養容器内に配置されたスパージャーから酸素を３０体積％以上含むガスを上記細胞懸濁液に放出して細胞を培養することを含み、上記スパージャーにおけるガス放出部の平均孔径が１μｍ以上３００μｍ以下であり、上記スパージャーにおけるガス放出部の表面積Ａ  ｍ２と、上記培養容器内の上記細胞懸濁液の量Ｘ  ｍ３と、上記スパージャーから放出される上記ガスの流量Ｑ  ｍ３／ｍｉｎとが、特定の関係を満たす細胞培養方法、上記細胞培養方法を含む生産物の製造方法、及び、上記細胞培養方法を可能とする細胞培養装置を提供すること。【選択図】図２【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞を含む細胞懸濁液を収容する培養容器を用い、前記培養容器内に配置されたスパージャーから酸素を３０体積％以上含むガスを前記細胞懸濁液に放出して細胞を培養することを含み、
前記スパージャーにおけるガス放出部の平均孔径が１μｍ以上３００μｍ以下であり、
前記スパージャーにおけるガス放出部の表面積Ａ  ｍ２と、前記培養容器内の前記細胞懸濁液の量Ｘ  ｍ３と、前記スパージャーから放出される前記ガスの流量Ｑ  ｍ３／ｍｉｎとが、下記式１−１、下記式１−２及び下記式１−３を満たす
細胞培養方法。
式１−１：  ０．００４≦Ａ／Ｘ≦０．１
式１−２：  Ｘ≧０．５
式１−３：  ０．００１≦Ｑ／Ｘ≦０．１
【請求項２】
前記培養容器における前記細胞懸濁液を、１ｇ／Ｌのポロキサマー１８８と、７ｇ／Ｌの塩化ナトリウムと、２ｇ／Ｌの炭酸水素ナトリウムと、を含む純水である測定用溶液に入れ替え、前記培養における前記Ｑ  ｍ３／ｍｉｎと同じ流量の空気ガスを、前記スパージャーから前記測定用溶液に送り、前記スパージャーのガス放出口における泡径分布を測定した場合に、前記空気の泡の体積平均泡径Ｄｖ  μｍが下記式２−１を満たす、請求項１に記載の細胞培養方法。
式２−１：  ５０≦Ｄｖ≦８００
【請求項３】
前記培養容器における前記細胞懸濁液を、１ｇ／Ｌのポロキサマー１８８と、７ｇ／Ｌの塩化ナトリウムと、２ｇ／Ｌの炭酸水素ナトリウムと、を含む純水である測定用溶液に入れ替え、前記培養における前記Ｑ  ｍ３／ｍｉｎと同じ流量の空気ガスを、前記スパージャーから前記測定用溶液に送り、前記スパージャーのガス放出口における泡径分布を測定した場合に、前記泡径分布において、泡径が２０μｍ以上５００μｍ以下の前記空気の泡の積算体積の割合が、前記泡径分布における泡の全体積の３０体積％以上である、請求項１又は請求項２に記載の細胞培養方法。
【請求項４】
前記培養における前記スパージャーによる酸素移動容量係数ｋＬａ  １／ｈｒが１５以上である、請求項１〜請求項３のいずれか１項に記載の細胞培養方法。
【請求項５】
前記培養容器における前記細胞懸濁液を、１ｇ／Ｌのポロキサマー１８８と、７ｇ／Ｌの塩化ナトリウムと、２ｇ／Ｌの炭酸水素ナトリウムと、を含む純水である測定用溶液に入れ替え、前記培養における前記Ｑ  ｍ３／ｍｉｎと同じ流量の空気ガスを、前記スパージャーから前記測定用溶液に送り、前記スパージャーのガス放出口における泡径分布を測定した場合に、前記Ｑ  ｍ３／ｍｉｎと、前記Ａ  ｍ２と、前記測定用溶液の密度ρＬ  ｋｇ／ｍ３と、前記空気ガスの密度ρｇ  ｋｇ／ｍ３と、前記測定用溶液の粘度μＬ  ｋｇ／ｍ／ｓと、重力加速度ｇ  ｍ／ｓ２とが、下記式３−１を満たす、請求項１〜請求項４のいずれか１項に記載の細胞培養方法。
式３−１：  ０．１≦（Ｑ／Ａ／６０）／［｛３×１０−８×（ρＬ−ρｇ）×ｇ｝／（１８×μＬ）｝］≦５
【請求項６】
前記培養において、前記Ｑ  ｍ３／ｍｉｎと、前記Ａ  ｍ２とが下記式４−１を満たす、請求項１〜請求項５のいずれか１項に記載の細胞培養方法。
式４−１：  ０．１≦Ｑ／Ａ≦５
【請求項７】
前記培養容器における前記細胞懸濁液を、１ｇ／Ｌのポロキサマー１８８と、７ｇ／Ｌの塩化ナトリウムと、２ｇ／Ｌの炭酸水素ナトリウムと、を含む純水である測定用溶液に入れ替え、前記培養における前記Ｑ  ｍ３／ｍｉｎと同じ流量の空気ガスを、前記スパージャーから前記測定用溶液に送り、前記スパージャーのガス放出口における泡径分布を測定した場合に、前記培養における前記培養容器の内底面から前記細胞懸濁液の上面までの液面高さＺＬ  ｍと、前記培養容器内の培養容器の内底面からスパージャー設置面までの高さＺｓ  ｍと、前記泡径分布における泡の体積平均泡径Ｄｖ  μｍと、前記測定用溶液の密度ρＬ  ｋｇ／ｍ３と、前記空気ガスの密度ρｇ  ｋｇ／ｍ３と、重力加速度ｇ  ｍ／ｓ２と、前記測定用溶液の粘度μＬ  ｋｇ／ｍ／ｓとが、下記式５−１を満たす、請求項１〜請求項６のいずれか１項に記載の細胞培養方法。
式５−１：  ２≦（ＺＬ−Ｚｓ）／｛Ｄｖ２×１０−１２×（ρＬ−ρｇ）×ｇ／（１８×μＬ）｝≦３００
【請求項８】
前記Ｘ  ｍ３、前記培養容器の内底面から前記細胞懸濁液の上面までの液面高さＺＬ  ｍ、前記培養容器内の培養容器の内底面からスパージャー設置面までの高さＺｓ  ｍにおいて、下記式６−１、及び、式６−２を満たす、請求項１〜請求項７のいずれか１項に記載の細胞培養方法。
式６−１：  Ｚｓ／ＺＬ≦０．５
式６−２：  ０．５≦ＺＬ／（４×Ｘ／ＺＬ／３．１４）０．５≦４
【請求項９】
前記細胞懸濁液内の細胞濃度が４×１０７  ｃｅｌｌｓ／ｍＬ以上である、請求項１〜請求項８のいずれか１項に記載の細胞培養方法。
【請求項１０】
細胞を培養する方法が灌流培養である、請求項１〜請求項９のいずれか１項に記載の細胞培養方法。
【請求項１１】
前記培養容器がシングルユース培養槽である、請求項１〜請求項１０のいずれか１項に記載の細胞培養方法。
【請求項１２】
前記スパージャーが金属焼結スパージャーである、請求項１〜請求項１１のいずれか１項に記載の細胞培養方法。
【請求項１３】
前記スパージャーのガス放出部の形状が、円型の平面形状、多角形の平面形状、又は、円柱形状である、請求項１〜請求項１２のいずれか１項に記載の細胞培養方法。
【請求項１４】
前記スパージャーとして複数のスパージャーを含む、請求項１〜請求項１３のいずれか１項に記載の細胞培養方法。
【請求項１５】
前記スパージャーが、１以上のスパージャーを含むユニットを複数含む構成であり、前記各ユニット毎に前記ガスの流量を調整する、請求項１〜請求項１３のいずれか１項に記載の細胞培養方法。
【請求項１６】
請求項１〜請求項１５のいずれか１項に記載の細胞培養方法により細胞を培養すること、及び、培養された細胞により生産された生産物を得ることを含む
生産物の製造方法。
【請求項１７】
前記生産物が抗体である、請求項１６に記載の生産物の製造方法。
【請求項１８】
細胞を含む細胞懸濁液を収容し、細胞を培養する培養容器、及び、
前記培養容器内に前記細胞懸濁液中に酸素を３０体積％以上含むガスを放出するためのスパージャーを備え、
前記スパージャーの平均孔径が１μｍ以上３００μｍ以下であり、
前記スパージャーの面積Ａ  ｍ２、前記培養容器内に最大に充填できる前記細胞懸濁液量Ｘｍａｘ  ｍ３が下記式７−１及び式７−２を満たす
細胞培養装置。
式７−１：  ０．００４≦Ａ／Ｘｍａｘ≦０．１
式７−２：  Ｘｍａｘ≧０．５
【請求項１９】
前記培養容器の内底面から前記培養容器内に前記細胞懸濁液を最大に充填したときの前記細胞懸濁液の上面までの液面高さＺＬｍａｘ  ｍと、前記培養容器内の培養容器の内底面からスパージャー設置面までの高さＺｓ  ｍにおいて、下記式８−１を満たす、請求項１８に記載の細胞培養装置。
式８−１：  ２≦（ＺＬｍａｘ−Ｚｓ）／０．０２≦３００
【請求項２０】
前記Ｘｍａｘ  ｍ３、前記培養容器の内底面から前記培養容器内に前記細胞懸濁液を最大に充填したときの前記細胞懸濁液の上面までの液面高さＺＬｍａｘ  ｍ、前記培養容器内の培養容器の内底面からスパージャー設置面までの高さＺｓ  ｍが、下記式９−１及び式９−２を満たす、請求項１８又は請求項１９に記載の細胞培養装置。
式９−１：  Ｚｓ／ＺＬｍａｘ≦０．５
式９−２：０．５≦ＺＬｍａｘ／｛（４×Ｘｍａｘ／ＺＬｍａｘ／３．１４）０．５｝≦４
【請求項２１】
前記培養容器がシングルユース培養槽である、請求項１８〜請求項２０のいずれか１項に記載の細胞培養装置。
【請求項２２】
前記スパージャーが金属焼結スパージャーである、請求項１８〜請求項２１のいずれか１項に記載の細胞培養装置。
【請求項２３】
前記スパージャーのガス放出部の形状が円型の平面形状、多角形の平面形状、又は、円柱形状である、請求項１８〜請求項２２のいずれか１項に記載の細胞培養装置。
【請求項２４】
前記スパージャーとして複数のスパージャーを含む、請求項１８〜請求項２３のいずれか１項に記載の細胞培養装置。
【請求項２５】
前記スパージャーが、１以上のスパージャーを含むユニットを複数含む構成であり、前記各ユニット毎に前記ガスの流量を調整可能である、請求項１８〜請求項２３のいずれか１項に記載の細胞培養装置。
【請求項２６】
灌流細胞培養装置である、請求項１８〜請求項２５のいずれか１項に記載の細胞培養装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本開示は、細胞培養方法、生産物の製造方法、及び細胞培養装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
細胞の培養は、有用な性質を有する細胞を増加させるため、細胞に生産物を生産させるため等の目的で行われている。【０００３】
従来の細胞培養方法又は細胞培養に用いられる装置としては、特許文献１〜３に記載のものが挙げられる。
特許文献１には、少なくとも一部を培地で満たしたバイオリアクター中の細胞に、気体栄養素をバブル上で供給する方法において、バブルの滞留時間が培地中でのその溶解時間に等しいことを特徴とする方法が記載されている。
特許文献２には、栄養分を含む培養液中に酸素または二酸化炭素を溶解させて細胞または微生物の培養を行う培養方法において、多孔質体に酸素または二酸化炭素を含むガスを供給して体積基準の粒度分布における５０％径が２００μｍ以下の気泡を培養液中に発生させることにより、上記培養液に酸素または二酸化炭素を溶解させて細胞または微生物の培養を行う工程を含み、上記培養液中には、タンパク質加水分解物と細胞を保護するための細胞保護剤との少なくとも一方が含まれていることを特徴とする細胞または微生物の培養方法が記載されている。
特許文献３には、細胞培養時に用いられる曝気装置として、曝気装置であって、ベース部材と、上記ベース部材にそれぞれ着脱可能に装着される複数の曝気要素とを備え、上記曝気要素のそれぞれは、気体透過性材料と、気体源に接続するように構成された入口とを備え、上記入口は上記気体透過性材料と流体連通している曝気装置が記載されている。【０００４】
特許文献１：特表平５−５０３８４８号公報
特許文献２：国際公開第２０１１／０７０７９１号
特許文献３：特表２０１６−５３６１２２号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
細胞培養は、細胞を含む細胞懸濁液に対して酸素を含むガスを放出しながら行われる場合がある。上記放出により、細胞懸濁液には酸素が供給されると考えられる。
ここで、細胞培養を行う場合には、可能な限り細胞懸濁液中の細胞濃度を上げたいという要求がある。特に、例えばバイオ医薬品等の製造において、細胞培養により生産物（例えば、抗体など）を生産する場合に、生産物の生産性を向上するためには、細胞懸濁液中の細胞濃度を上げることが重要になる。
そのために細胞懸濁液中に多くの酸素を溶解し、高濃度の細胞に対して十分な量の酸素を供給する必要がある。【０００６】
細胞懸濁液に対して酸素を放出する方法としては、培養容器内にスパージャーを設置する方法が知られている。
細胞に十分な量の酸素放出を行うためには、スパージャーにおけるガス放出部の平均孔径を極力小さくすることで酸素の溶解性を向上し、かつ、酸素を含むガスの流量を増大させることで細胞懸濁液により多くの酸素を溶解させる技術が一般的であった（例えば、日揮技術ジャーナル  Ｖｏｌ．０１  Ｎｏ．０１(2011)  マイクロバブルの培養への適用を参照）。
しかしながら、本発明者らは、生産スケールのような細胞懸濁液量が多量である場合（例えば、細胞懸濁液量が０．５ｍ３以上など）においては、上記のような方法では細胞培養に十分な量の酸素を細胞懸濁液に溶解できず、また、細胞へのダメージも大きくなるため、高濃度の細胞培養は困難であることを見出した。
これは、上記方法では酸素が細胞懸濁液に溶解しにくく、酸素移動容量係数ｋＬａ（以下、単に「ｋＬａ」という場合がある。）がそれほど高くならないこと、上記スパージャーにおけるガス放出部の平均孔径が小さいほど、放出される泡による細胞へのダメージが増加すること、及び、多量の酸素を含むガスの放出により細胞へのダメージが増加することが原因であると考えられる。
具体的には、スパージャーから酸素を含むガスを放出すると、泡が細胞に衝突したり破泡したりするときのエネルギーで細胞がダメージを受けるが、スパージャー孔径が小さい、つまり泡径が小さい泡が存在するほど、また酸素を含むガスの流量が大きいほど、上記エネルギーが大きくなり、細胞へのダメージが増加すると推測される。
また、上記ｋＬａは、酸素ガスが細胞懸濁液内に溶解していく速度式の比例係数である。ｋＬａが高いほど酸素は早く細胞懸濁液に溶解し、より多くの酸素を細胞懸濁液に供給できるため、高濃度に細胞を培養できる。ｋＬａは泡径が小さいほど大きくなると考えられる。【０００７】
すなわち、ｋＬａを増大させることと、細胞へのダメージを抑制することは、従来技術においてはトレードオフの関係であり、これらを両立することは困難であった。【０００８】
本発明の実施形態が解決しようとする課題は、細胞懸濁液が多量である場合であっても、高濃度での細胞培養が可能であり、かつ、細胞へのダメージが抑制される細胞培養方法、上記細胞培養方法を含む生産物の製造方法、及び、上記細胞培養方法を可能とする細胞培養装置を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
上記課題を解決するための手段には、以下の態様が含まれる。
＜１＞  細胞を含む細胞懸濁液を収容する培養容器を用い、上記培養容器内に配置されたスパージャーから酸素を３０体積％以上含むガスを上記細胞懸濁液に放出して細胞を培養することを含み、
上記スパージャーにおけるガス放出部の平均孔径が１μｍ以上３００μｍ以下であり、
上記スパージャーにおけるガス放出部の表面積Ａ  ｍ２と、上記培養容器内の上記細胞懸濁液の量Ｘ  ｍ３と、上記スパージャーから放出される上記ガスの流量Ｑ  ｍ３／ｍｉｎとが、下記式１−１、下記式１−２及び下記式１−３を満たす
細胞培養方法。
式１−１：  ０．００４≦Ａ／Ｘ≦０．１
式１−２：  Ｘ≧０．５
式１−３：  ０．００１≦Ｑ／Ｘ≦０．１
＜２＞  上記培養容器における上記細胞懸濁液を、１ｇ／Ｌのポロキサマー１８８と、７ｇ／Ｌの塩化ナトリウムと、２ｇ／Ｌの炭酸水素ナトリウムと、を含む純水である測定用溶液に入れ替え、上記培養における上記Ｑ  ｍ３／ｍｉｎと同じ流量の空気ガスを、上記スパージャーから上記測定用溶液に送り、上記スパージャーのガス放出口における泡径分布を測定した場合に、上記空気の泡の体積平均泡径Ｄｖ  μｍが下記式２−１を満たす、上記＜１＞に記載の細胞培養方法。
式２−１：  ５０≦Ｄｖ≦８００
＜３＞  上記培養容器における上記細胞懸濁液を、１ｇ／Ｌのポロキサマー１８８と、７ｇ／Ｌの塩化ナトリウムと、２ｇ／Ｌの炭酸水素ナトリウムと、を含む純水である測定用溶液に入れ替え、上記培養における上記Ｑ  ｍ３／ｍｉｎと同じ流量の空気ガスを、上記スパージャーから上記測定用溶液に送り、上記スパージャーのガス放出口における泡径分布を測定した場合に、上記泡径分布において、泡径が２０μｍ以上５００μｍ以下の上記空気の泡の積算体積の割合が、上記泡径分布における泡の全体積の３０体積％以上である、上記＜１＞又は＜２＞に記載の細胞培養方法。
＜４＞  上記培養における上記スパージャーによる酸素移動容量係数ｋＬａ  １／ｈｒが１５以上である、上記＜１＞〜＜３＞のいずれか１つに記載の細胞培養方法。
＜５＞  上記培養容器における上記細胞懸濁液を、１ｇ／Ｌのポロキサマー１８８と、７ｇ／Ｌの塩化ナトリウムと、２ｇ／Ｌの炭酸水素ナトリウムと、を含む純水である測定用溶液に入れ替え、上記培養における上記Ｑ  ｍ３／ｍｉｎと同じ流量の空気ガスを、上記スパージャーから上記測定用溶液に送り、上記スパージャーのガス放出口における泡径分布を測定した場合に、上記Ｑ  ｍ３／ｍｉｎと、上記Ａ  ｍ２と、上記測定用溶液の密度ρＬ  ｋｇ／ｍ３と、上記空気ガスの密度ρｇ  ｋｇ／ｍ３と、上記測定用溶液の粘度μＬ  ｋｇ／ｍ／ｓと、重力加速度ｇ  ｍ／ｓ２とが、下記式３−１を満たす、上記＜１＞〜＜４＞のいずれか１つに記載の細胞培養方法。
式３−１：  ０．１≦（Ｑ／Ａ／６０）／［｛３×１０−８×（ρＬ−ρｇ）×ｇ｝／（１８×μＬ）｝］≦５
＜６＞  上記培養において、上記Ｑ  ｍ３／ｍｉｎと、上記Ａ  ｍ２が下記式４−１を満たす、上記＜１＞〜＜５＞のいずれか１つに記載の細胞培養方法。
式４−１：  ０．１≦Ｑ／Ａ≦５
＜７＞  上記培養容器における上記細胞懸濁液を、１ｇ／Ｌのポロキサマー１８８と、７ｇ／Ｌの塩化ナトリウムと、２ｇ／Ｌの炭酸水素ナトリウムと、を含む純水である測定用溶液に入れ替え、上記培養における上記Ｑ  ｍ３／ｍｉｎと同じ流量の空気ガスを、上記スパージャーから上記測定用溶液に送り、上記スパージャーのガス放出口における泡径分布を測定した場合に、上記培養における上記培養容器の内底面から上記細胞懸濁液の上面までの液面高さＺＬ  ｍと、上記培養容器内の培養容器の内底面からスパージャー設置面までの高さＺｓ  ｍと、上記泡径分布における泡の体積平均泡径Ｄｖ  μｍと、上記測定用溶液の密度ρＬ  ｋｇ／ｍ３と、上記空気ガスの密度ρｇ  ｋｇ／ｍ３と、重力加速度ｇ  ｍ／ｓ２と、上記測定用溶液の粘度μＬ  ｋｇ／ｍ／ｓとが、下記式５−１を満たす、上記＜１＞〜＜６＞のいずれか１つに記載の細胞培養方法。
式５−１：  ２≦（ＺＬ−Ｚｓ）／｛Ｄｖ２×１０−１２×（ρＬ−ρｇ）×ｇ／（１８×μＬ）｝≦３００
＜８＞  上記Ｘ  ｍ３、上記培養容器の内底面から上記細胞懸濁液の上面までの液面高さＺＬ  ｍ、上記培養容器内の培養容器の内底面からスパージャー設置面までの高さＺｓ  ｍにおいて、下記式６−１、及び、式６−２を満たす、上記＜１＞〜＜７＞のいずれか１つに記載の細胞培養方法。
式６−１：  Ｚｓ／ＺＬ≦０．５
式６−２：  ０．５≦ＺＬ／（４×Ｘ／ＺＬ／３．１４）０．５≦４
＜９＞  上記細胞懸濁液内の細胞濃度が４×１０７  ｃｅｌｌｓ／ｍＬ以上である、上記＜１＞〜＜８＞のいずれか１つに記載の細胞培養方法。
＜１０＞  細胞を培養する方法が灌流培養である、上記＜１＞〜＜９＞のいずれか１つに記載の細胞培養方法。
＜１１＞  上記培養容器がシングルユース培養槽である、上記＜１＞〜＜１０＞のいずれか１つに記載の細胞培養方法。
＜１２＞  上記スパージャーが金属焼結スパージャーである、上記＜１＞〜＜１１＞のいずれか１つに記載の細胞培養方法。
＜１３＞  上記スパージャーのガス放出部の形状が、円型の平面形状、多角形の平面形状、又は、円柱形状である、上記＜１＞〜＜１２＞のいずれか１つに記載の細胞培養方法。
＜１４＞  上記スパージャーとして複数のスパージャーを含む、上記＜１＞〜＜１３＞のいずれか１つに記載の細胞培養方法。
＜１５＞  上記スパージャーが、１以上のスパージャーを含むユニットを複数含む構成であり、上記各ユニット毎に上記ガスの流量を調整する、上記＜１＞〜＜１３＞のいずれか１つに記載の細胞培養方法。
＜１６＞  上記＜１＞〜＜１５＞のいずれか１つに記載の細胞培養方法により細胞を培養すること、及び、培養された細胞により生産された生産物を得ることを含む
生産物の製造方法。
＜１７＞  上記生産物が抗体である、上記＜１６＞に記載の生産物の製造方法。
＜１８＞  細胞を含む細胞懸濁液を収容し、細胞を培養する培養容器、及び、
上記培養容器内に上記細胞懸濁液中に酸素を３０体積％以上含むガスを放出するためのスパージャーを備え、
上記スパージャーの平均孔径が１μｍ以上３００μｍ以下であり、
上記スパージャーの面積Ａ  ｍ２、上記培養容器内に最大に充填できる上記細胞懸濁液量Ｘｍａｘ  ｍ３が下記式７−１及び式７−２を満たす
細胞培養装置。
式７−１：  ０．００４≦Ａ／Ｘｍａｘ≦０．１
式７−２：  Ｘｍａｘ≧０．５
＜１９＞  上記培養容器の内底面から上記培養容器内に上記細胞懸濁液を最大に充填したときの上記細胞懸濁液の上面までの液面高さＺＬｍａｘ  ｍと、上記培養容器内の培養容器の内底面からスパージャー設置面までの高さＺｓ  ｍにおいて、下記式８−１を満たす、上記＜１８＞に記載の細胞培養装置。
式８−１：  ２≦（ＺＬｍａｘ−Ｚｓ）／０．０２≦３００
＜２０＞  上記Ｘｍａｘ  ｍ３、上記培養容器の内底面から上記培養容器内に上記細胞懸濁液を最大に充填したときの上記細胞懸濁液の上面までの液面高さＺＬｍａｘ  ｍ、上記培養容器内の培養容器の内底面からスパージャー設置面までの高さＺｓ  ｍが、下記式９−１及び式９−２を満たす、上記＜１８＞又は＜１９＞に記載の細胞培養装置。
式９−１：  Ｚｓ／ＺＬｍａｘ≦０．５
式９−２：０．５≦ＺＬｍａｘ／｛（４×Ｘｍａｘ／ＺＬｍａｘ／３．１４）０．５｝≦４
＜２１＞  上記培養容器がシングルユース培養槽である、上記＜１８＞〜＜２０＞のいずれか１つに記載の細胞培養装置。
＜２２＞  上記スパージャーが金属焼結スパージャーである、上記＜１８＞〜＜２１＞のいずれか１つに記載の細胞培養装置。
＜２３＞  上記スパージャーのガス放出部の形状が円型の平面形状、多角形の平面形状、又は、円柱形状である、上記＜１８＞〜＜２２＞のいずれか１つに記載の細胞培養装置。
＜２４＞  上記スパージャーとして複数のスパージャーを含む、上記＜１８＞〜＜２３＞のいずれか１つに記載の細胞培養装置。
＜２５＞  上記スパージャーが、１以上のスパージャーを含むユニットを複数含む構成であり、上記各ユニット毎に上記ガスの流量を調整可能である、上記＜１８＞〜＜２３＞のいずれか１つに記載の細胞培養装置。
＜２６＞  灌流細胞培養装置である、上記＜１８＞〜＜２５＞のいずれか１つに記載の細胞培養装置。
【発明の効果】
【００１０】
本発明の実施形態によれば、細胞懸濁液が多量である場合であっても、高濃度での細胞培養を可能とし、かつ、細胞へのダメージが抑制される細胞培養方法、上記細胞培養方法を含む生産物の製造方法、及び、上記細胞培養方法を可能とする細胞培養装置が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】本開示において用いられるスパージャーの一例である金属焼結スパージャーの形成例の概略図である。
【図２】培養容器が複数のスパージャーを含む態様の一例を示す概略断面斜視図である。
【図３】本開示に係る生産物の製造方法の実施に適用可能な細胞培養装置の構成の一例を示す概略構成図である
【発明を実施するための形態】
【００１２】
以下、本開示に係る細胞培養方法、細胞培養装置、及び生産物の製造方法について説明する。但し、本開示に係る実施形態は以下の実施形態に何ら限定されるものではなく、適宜、変更を加えて実施することができる。
【００１３】
本開示において「〜」を用いて示された数値範囲は、「〜」の前後に記載される数値をそれぞれ最小値及び最大値として含む範囲を意味する。
本開示に段階的に記載されている数値範囲において、ある数値範囲で記載された上限値又は下限値は、他の段階的な記載の数値範囲の上限値又は下限値に置き換えてもよい。また、本開示に記載されている数値範囲において、ある数値範囲で記載された上限値又は下限値は、実施例に示されている値に置き換えてもよい。
本開示において、２以上の好ましい態様の組み合わせは、より好ましい態様である。
本開示において、各成分の量は、各成分に該当する物質が複数種存在する場合には、特に断らない限り、複数種の物質の合計量を意味する。
本開示において、同一の構成要件には同一の符号を付し、説明を省略する場合がある。
本開示において、図面は好ましい態様の一例を示すものであり、図面の内容により本開示に係る発明が限定されるものではない。
本開示において、「工程」との語は、独立した工程だけではなく、工程の所期の目的が達成される限りは、他の工程と明確に区別できない工程をも含む。
【００１４】
（細胞培養方法）
本開示に係る細胞培養方法は、細胞を含む細胞懸濁液を収容する培養容器を用い、上記培養容器内に配置されたスパージャーから酸素を３０体積％以上含むガスを上記細胞懸濁液に放出して細胞を培養すること（以下、「細胞培養工程」ともいう。）を含み、上記スパージャーにおけるガス放出部の平均孔径が１μｍ以上３００μｍ以下であり、上記スパージャーにおけるガス放出部の表面積Ａ  ｍ２と、上記培養容器内の上記細胞懸濁液の量Ｘ  ｍ３と、上記スパージャーから放出される上記ガスの流量Ｑ  ｍ３／ｍｉｎとが、下記式１−１、下記式１−２及び下記式１−３を満たす。
式１−１：  ０．００４≦Ａ／Ｘ≦０．１
式１−２：  Ｘ≧０．５
式１−３：  ０．００１≦Ｑ／Ｘ≦０．１
【００１５】
本開示に係る細胞培養方法は、細胞を含む細胞懸濁液を収容する培養容器を用い、上記培養容器内に配置されたスパージャーから酸素を３０体積％以上含むガスを上記細胞懸濁液に放出して細胞を培養することを含む。
上記酸素を３０体積％以上含むガスを放出することにより、細胞懸濁液に酸素が放出され、高濃度での細胞培養が可能となると考えられる。
また、本開示に係る細胞培養方法において用いられるガス放出部の平均孔径は、１μｍ以上３００μｍ以下である。上記平均孔径が１μｍ以上であることにより、酸素を含むガスの泡の泡径が小さくなりすぎず、細胞へのダメージが抑制されると考えられる。また、上記平均孔径が３００μｍ以下であることにより、泡径が大きくなりすぎず、ｋＬａが増大しやすいため、高濃度での細胞培養が可能となると考えられる。
更に、本開示に係る細胞培養方法においては、上記Ａ  ｍ２と上記Ｘ  ｍ３とが式１−１及び式１−２を満たす。
ここで、従来の培養容器の容量を変化させる場合、例えば培養容器の１辺の長さを１０倍にする場合には、細胞懸濁液量は１０×１０×１０＝１０００倍になる。その際には、スパージャーの１辺の長さを１０倍とし、スパージャーの面積を１０×１０＝１００倍とするのが一般的である（相似則）。
それに対して、本開示における細胞培養方法においては、上記Ａ／Ｘが特定の範囲内の値となる。これは、例えば細胞懸濁液量Ｘを１０００倍とする場合、スパージャーにおけるガス放出部の表面積Ａも１０００倍とすることを意味している。
更に、上記Ｑ／Ｘが０．００１以上であれば、細胞培養に必要な酸素が細胞懸濁液中に十分に供給され、細胞濃度が増加しやすいと考えられる。
また、上記Ｑ／Ｘが０．１以下であれば、細胞へのダメージが抑制されやすいと考えられる。
すなわち、本開示に係る細胞培養方法は、上記培養容器内の細胞懸濁液の液量Ｘ、上記スパージャーにおけるガス放出部の表面積Ａ、上記ガスの流量Ｑ及びスパージャーにおける上記ガス放出部の平均孔径を細胞懸濁液量に応じて調整することにより、上記Ｘが０．５ｍ３以上と多量である場合であっても、細胞へのダメージを抑制しつつ、かつ、高濃度での細胞培養が可能となるという、新たな知見に基づくものである。
特許文献１〜特許文献３のいずれの文献にも、上記Ａ／Ｘを特定の範囲内の値とし、かつ、スパージャーにおけるガス放出部の平均孔径を特定の範囲内の値とするという本開示に係る細胞培養方法における技術思想については記載も示唆もなく、上記Ａ／Ｘ及び上記平均孔径を特定の値とすることにより、細胞へのダメージを抑制しつつ、かつ、高濃度での細胞培養が可能となるという本開示に係る細胞培養方法における効果についても、記載も示唆もない。
以下、本開示に係る細胞培養方法における各要件について説明する。
【００１６】
＜細胞培養工程＞
本開示に係る細胞培養方法は細胞培養工程を含む。
細胞培養工程においては、細胞を含む細胞懸濁液を収容する培養容器であって、酸素を３０体積％以上含むガスを放出するためのスパージャーを備える培養容器が用いられる。
【００１７】
〔培養容器〕
培養容器としては、一般的な培養装置（バイオリアクターともいう。）、上記装置において用いられる公知の容器、又はそれ以外の好適な容器を特に制限なく用いることができる。培養装置としては、発酵槽型タンク培養装置、エアーリフト型培養装置、カルチャーフラスコ型培養装置、スピナーフラスコ型培養装置、マイクロキャリアー型培養装置、流動層型培養装置、ホロファイバー型培養装置、ローラーボトル型培養装置、充填槽型培養装置等を用いることができる。
また、培養容器は、培養環境の均質化等の観点からは、シングルユース培養槽であることが好ましい。
【００１８】
〔スパージャー〕
培養容器は、酸素を３０体積％以上含むガスを放出するスパージャーを備える。
酸素を３０体積％以上含むガスとしては、特に限定されないが、酸素を５０体積％以上含むガスが好ましく、酸素を７０体積％以上含むガスがより好ましく、酸素を９０体積％以上含むガスが更に好ましく、純酸素ガスが特に好ましい。
本開示における培養容器は、酸素を３０体積％以上含むガスを放出するスパージャー以外に、他のガス（例えば、空気、ＣＯ２ガス等）を含むガスを放出するスパージャーを更に備えていてもよい。
本開示において、単に「スパージャー」と記載した場合には、特別な記載がない限りにおいて「ガス放出部の平均孔径が１μｍ以上３００μｍ以下であり、酸素を３０体積％以上含むガスを放出するスパージャー」を意味するものとする。
すなわち、スパージャーにおけるガス放出部の表面積Ａ、上記スパージャーから放出される上記ガスの流量Ｑ  ｍ３／ｍｉｎ等の計算においては、上記平均孔径が上記範囲から外れるスパージャー、及び、上記他のガスを含むガスを放出するスパージャーは含まれないものとする。
スパージャーとしては、上述の平均孔径及び上述のＡ／Ｘを満たすものであれば、特に制限なく公知のスパージャーを用いることが可能であり、例えば、ノズル状であって開口部から泡を放出するノズルスパージャー、孔部を有するリング筒状であって上記孔部から泡を放出するリングスパージャー、気体を透過するシート、不織布状の高分子材料を用いたスパージャー、泡の放出部に金属焼結フィルタを有する金属焼結スパージャー等が挙げられ、上述の平均孔径を満たしやすい観点からは、金属焼結スパージャーが好ましい。
金属焼結スパージャーにおける金属焼結フィルタとしては、例えば、銅、ニッケル、チタン、タンタル、アルミニウム、白金、炭化タングステン、炭化チタン、ステンレス、又はこれらを含む合金などの微粉末を焼結することにより得られたものが用いられる。
【００１９】
図１に、本開示において用いられるスパージャーの一例である金属焼結スパージャーの形成例の概略図を示す。
図１（Ａ）において、金属焼結スパージャー１０は、円柱形状の金属焼結フィルタ１２と、支持部１４と、ガス供給部１６とを備える。金属焼結フィルタ１２は培養容器中で細胞懸濁液と接しており、ガス供給部１６より供給されたガスが、金属焼結フィルタ１２を通って細胞懸濁液へと放出される。
図１（Ｂ）においては、金属焼結スパージャー１０は、金属焼結フィルタ１２が円形の平面形状である以外は、図１（Ａ）における金属焼結スパージャー１０と同様の構成である。
図１（Ｃ）においては、金属焼結スパージャー１０は、金属焼結フィルタ１２が多角形（正方形）の平面形状である以外は、図１（Ａ）における金属焼結スパージャー１０と同様の構成である。
ここで、本開示において、スパージャーにおけるガス放出部の表面積Ａとは、図１においては金属焼結スパージャー１０における金属焼結フィルタ１２におけるガスが放出される部分の表面積（ｍ２）をいう。具体的には、図１（Ａ）においては円柱形状の金属焼結フィルタ１２の表面積を、図１（Ｂ）においては円形の平面形状の円の面積を、図１（Ｃ）においては多角形の平面形状の多角形の面積を、それぞれいう。
金属焼結フィルタ１２を有しない、例えばノズルスパージャー又はリングスパージャーにおいては、スパージャーにおけるガス放出部の表面積Ａとは、スパージャーの開口部の面積をいう。
本開示におけるガス放出部とは、金属焼結スパージャー１０においては金属焼結フィルタ１２をいい、ノズルスパージャー又はリングスパージャーにおいては、開口部をいう。
本開示におけるスパージャーのガス放出部の形状は、円形の平面形状、多角形の平面形状、又は円柱形状であることが好ましい。
これらの中でも、円形の平面形状が、均一に泡が噴出でき、泡の合一も抑制されるため好ましい。
【００２０】
また、本開示における好ましい態様の一つは、培養容器が複数のスパージャーを含む態様である。
培養容器が複数のスパージャーを含む場合、それぞれのスパージャーのガス放出部の形状は同一であってもよいし、異なっていてもよい。例えば、ガス放出部の形状が、円形の平面形状であるスパージャーと、多角形の平面形状であるスパージャーとを組み合わせて用いてもよい。スパージャーのガス放出部の形状が異なるものを組み合わせて用いる場合、円型の平面形状、多角形の平面形状、及び、円柱形状のもののうち少なくとも２つを組み合わせて用いることが好ましい。
上記態様におけるスパージャーの数は特に限定されないが、２〜１００であることが好ましく、２〜５０であることがより好ましく、２〜２０であることが更に好ましい。
更に、本開示における別の好ましい態様の別の一つは、上記スパージャーが、１以上のスパージャーを含むユニットを複数含む構成であり、上記各ユニット毎に上記ガスの流量を調整する態様である。
上記態様において、各ユニットに含まれるスパージャーの数は、特に限定されないが、１〜５０であることが好ましく、１〜２０であることがより好ましく、２〜１０であることが更に好ましいい。
また、上記態様において、上記ユニットの数は、特に限定されないが、２〜２０であることが好ましく、２〜１０であることがより好ましく、２〜５であることが更に好ましい。
図２は、培養容器が複数のスパージャーを含む態様の一例を示す概略断面斜視図である。
図２は、培養容器の鉛直方向を含む平面による断面図である。
図２において、培養容器１００は、細胞懸濁液１０２を収容している。また、培養容器１００の内底面１０４には、スパージャー１０を４つ含むスパージャーユニット１１０が３つ形成されている。スパージャー１０は、図１（Ａ）に記載した、ガス供給部が円柱状のスパージャーを示している。それぞれのスパージャーユニット１１０には、ガス供給部１１２が結合しており、それぞれのガス供給部１１２から供給されたガスが、それぞれのスパージャーユニット１１０から放出される。この複数のガス供給部１１２に供給するガス供給量をそれぞれ調製することにより、上記各ユニット毎に上記ガスの流量を調整することが可能となる。
【００２１】
培養容器が複数のスパージャーを含む場合、上記表面積Ａとは、すべてのスパージャーにおける上記表面積の合計値をいう。
また、本開示において、スパージャーにおけるガス放出部の平均孔径とは、金属焼結スパージャー１０における金属焼結フィルタ１２の平均孔径をいう。
金属焼結フィルタ１２の平均孔径は、９５％分離粒子径により求めることができる。すなわち、標準粒子による濾過試験を行い、阻止率９５％となる粒子径（すなわち、粒子透過試験による９５％分離粒子径）として算出できる。
金属焼結フィルタ１２を有しない、例えばノズルスパージャー又はリングスパージャーにおいては、スパージャーにおけるガス放出部の表面積Ａとは、ノズルの開口部の面積の和をいう。またその場合の平均孔径とは、ノズルの開口部の孔径の平均値をいう。
上記開口部の孔径は、上記開口部を適当な倍率で撮影し、画像解析することにより求めることができる。また、上記開口部の形状が円ではない場合、孔径は円相当径として求められる。本開示において、円相当径とは、開口部等の平面の面積と等しい面積を持つ円の直径である。
培養容器が複数のスパージャーを含む場合、少なくとも１つのスパージャーにおけるガス放出部の平均孔径が１μｍ以上３００μｍ以下であればよいが、上記平均孔径を満たすスパージャーにおけるガス放出部の表面積の合計値が、培養容器に含まれる酸素を３０体積％以上含むガスを放出する全てのスパージャーのガス放出部の表面積の合計値に対し、６０面積％以上であることが好ましく、８０面積％以上であることがより好ましく、９０面積％以上であることが更に好ましい。
また、培養容器が平均孔径の異なる金属焼結フィルタを有する２以上のスパージャーを含む場合、各金属焼結フィルタにおける平均孔径を各スパージャーにおける表面積比で重み付けすることにより、培養容器全体におけるスパージャーのガス放出部の平均孔径が算出される。具体的には、ガス放出部の平均孔径が１０μｍであり、ガス放出部の表面積が０．０１ｍ２であるスパージャーと、ガス放出部の平均孔径が１００μｍであり、ガス放出部の表面積が０．０２ｍ２であるスパージャーとを１つずつ含む場合には、表面積Ａは０．０３ｍ２であり、培養容器全体におけるスパージャーのガス放出部の平均孔径は（１０μｍ×０．０１ｍ２＋１００μｍ×０．０２ｍ２）／（０．０１ｍ２＋０．０２ｍ２）＝７０μｍとして求められる。
【００２２】
−ガス放出部の平均孔径−
スパージャーにおけるガス放出部の平均孔径は、細胞のダメージを抑制する観点からは、１μｍ以上であることが好ましく、２μｍ以上であることがより好ましく、１０μｍ以上であることが更に好ましい。
また、上記平均孔径は、ｋＬａを増大させ培養細胞濃度を増加させる観点からは、３００μｍ以下であることが好ましく、２００μｍ以下であることがより好ましく、１００μｍ以下であることが更に好ましい。
培養容器が複数のスパージャーを含む場合、上記表面積で重み付けされた培養容器全体におけるスパージャーのガス放出部の平均孔径が、上記範囲内に入ることが好ましく、複数のスパージャーのそれぞれの平均孔径の全てが上記範囲内に入ることがより好ましい。
【００２３】
またスパージャーの開口率に関しては、スパージャーのガス放出部における泡の合一を抑制し、泡径が大きくなることを抑制し、かつ、ｋＬａを増大させやすい観点から、５％以上が好ましく、１０％以上がより好ましく、１５％以上が更に好ましい。また、スパージャーの開口率は、スパージャーからの泡の不均一な噴出を抑制し、ｋＬａを増大させ、かつ、細胞ダメージを抑制しやすい観点からは、８０％以下が好ましく、６０％以下がより好ましく、５０％以下が更に好ましい。スパージャーの開口率は、スパージャーに使用される材料密度と、スパージャー自体の密度を測定することで以下のように算出できる。
スパージャーの開口率（％）＝（スパージャーに使用される材料密度−スパージャー自体の密度）／スパージャーに使用される材料密度×１００
【００２４】
−ガス放出部の表面積Ａと細胞懸濁液の量Ｘ−
上記スパージャーにおけるガス放出部の表面積Ａ  ｍ２と上記培養容器内の上記細胞懸濁液の量Ｘ  ｍ３とは、下記式１−１及び式１−２を満たす。
式１−１：  ０．００４≦Ａ／Ｘ≦０．１
式１−２：  Ｘ≧０．５
【００２５】
ここで、上記Ａ／Ｘは、スパージャーのガス放出部における泡の合一を抑制し、泡径が大きくなることを抑制し、ｋＬａを増大させやすい観点から、０．００４以上であればよく、０．００６以上であることが好ましく、０．００８以上であることがより好ましく、０．０１０以上であることが更に好ましい。
また、上記Ａ／Ｘは、泡の不均一な噴出を抑制し、ｋＬａを増大させ、かつ、細胞ダメージを抑制しやすい観点からは、０．１以下であればよく、０．０５以下であることが好ましく、０．０３以下であることがより好ましく、０．０２５以下であることが更に好ましい。
【００２６】
また、上記Ｘは、培養する細胞種及び培養目的に応じて設定すればよいが、本開示に係る細胞培養方法を生産物の製造方法に用いた場合に得られる生産物の量を増加させやすい観点、又は、大量の細胞が得られやすい観点からは、０．５ｍ２以上であればよく、１．０ｍ２以上であることが好ましく、１．１ｍ２以上であることがより好ましい。
また上記Ｘの上限は特に限定されないが、例えば１０ｍ２以下とすることができる。
【００２７】
−ガスの流量と細胞懸濁液の量−
上記培養において、上記スパージャーから放出される上記ガスの流量Ｑ  ｍ３／ｍｉｎと、上記培養容器内の上記細胞懸濁液の量Ｘ  ｍ３は下記式１−３を満たす。
式１−３：  ０．００１≦Ｑ／Ｘ≦０．１
培養容器が複数のスパージャーを含む場合、上記ガスの流量Ｑとは、すべてのスパージャーにおける上記ガスの流量の合計値をいう。
【００２８】
上記Ｑ／Ｘは、細胞培養に必要な酸素が細胞懸濁液中に十分に供給され、細胞濃度が増加しやすい観点からは、０．００１以上であればよく、０．００３以上であることが好ましく、０．００５以上であることがより好ましく、０．０１以上であることが更に好ましい。
また、上記Ｑ／Ｘは、細胞へのダメージが抑制されやすい観点からは、０．１以下であればよく、０．０７以下であることが好ましく、０．０５以下であることがより好ましく、０．０３以下であることが更に好ましい。
【００２９】
−泡の体積平均泡径Ｄｖ−
上記培養容器における上記細胞懸濁液を、１ｇ／Ｌのポロキサマー１８８と、７ｇ／Ｌの塩化ナトリウムと、２ｇ／Ｌの炭酸水素ナトリウムと、を含む純水である測定用溶液に入れ替え、上記培養におけるスパージャーから放出される酸素を３０体積％含むガスの流量と同じ流量の空気ガスを、上記スパージャーから上記測定用溶液に送り、上記スパージャーのガス放出口における泡径分布を測定した場合に、上記空気の泡の体積平均泡径Ｄｖ  μｍが下記式２−１を満たすことが好ましい。
式２−１：  ５０≦Ｄｖ≦８００
また、細胞懸濁液を用いた泡の泡径分布、泡の終末速度等を測定することが困難であるため、本開示においては、上記測定用溶液を用いて測定した値により泡の泡径分布、泡の終末速度等を規定する。
【００３０】
上記Ｄｖは、細胞へのダメージを抑制する観点からは、５０μｍ以上であることが好ましく、８０μｍ以上であることがより好ましく、１００μｍ以上であることが更に好ましい。
また、上記Ｄｖは、ｋＬａを増大させ、高濃度での細胞培養を可能とする観点からは、
８００μｍ以下であることが好ましく、６００μｍ以下であることがより好ましく、５００μｍ以下であることが更に好ましく、４００μｍ以下であることが特に好ましい。
【００３１】
上記泡径分布（累積体積分布）の詳細な測定方法は下記の通りである。
測定装置としては、メトラートレド社製  ＦＢＲＭ  Ｐａｒｔｉｃｌｅ  Ｔｒａｃｋ  Ｇ４００を使用する。
上記泡径分布は、上記培養容器における上記細胞懸濁液を、上記測定用溶液に入れ替えた培養容器において、スパージャーから培養容器の高さ方向（鉛直方向）に２０ｍｍ離れた位置に、培養容器の上部から上記ＦＢＲＭＧ４００の泡径センサーを挿入して測定を行う。
また、上記測定用溶液の量は、上記培養における上記細胞懸濁液の液量と同様にする。
測定条件としては、個数基準の測定モードを使用し、サンプリング間隔１０秒間、移動平均２０点の設定で測定を行う。また、測定レンズ表面上の固定点の検出を除去するために、Stuck Particle Correctionの機能を有効にした。また、測定レンジは１μｍ〜４０００μｍとし、データ間隔は対数基準で測定区間を２００間隔に分割する。この時、ｎ個目のある区間の測定径Ｄ（ｎ）に対し、次の区間の測定径をＤ（ｎ＋１）とすると、下記式Ａが成立する。
【００３２】
【数１】
2020003833.tif 000002
【００３３】
この設定条件を用いて、通気流量０条件のＢＬＡＮＫデータ、及び通気時のデータを測定する。通気時の測定データのあるデータ区間Ｄ（ｎ）における頻度をｆ（ｎ）、ＢＬＡＮＫデータのあるデータ区間Ｄ（ｎ）における頻度をｆ０（ｎ）としたときに、下記式Ｂに記載の処理を行うことでＢＬＡＮＫ処理データｇ（ｎ）を得る。
【００３４】
【数２】
2020003833.tif 000003
【００３５】
次に、下記式Ｃに記載の計算を行うことによって個数基準の測定データを体積基準の測定データＶ（ｎ）に換算する。
【００３６】
【数３】
2020003833.tif 000004
【００３７】
更に、下記式Ｄに記載の計算を行うことにより体積平均径Ｄｖを得る。
【００３８】
【数４】
2020003833.tif 000005
【００３９】
また、体積基準の積算分布Ｇ（ｎ）は下記Ｅにより得られる。
【００４０】
【数５】
2020003833.tif 000006
【００４１】
上記計算式を用いて、累積体積分布を作成できる。
【００４２】
−泡径分布−
上記泡径分布において、細胞ダメージを抑制する観点からは、泡径が２０μｍ以上５００μｍ以下の上記空気の泡の積算体積の割合が、上記泡径分布における泡の全体積の３０体積％以上であることが好ましい。
上記空気の泡の積算体積の割合は、式Ｅを用いて、泡径が５００μｍ以下の空気の泡の積算体積から泡径が２０μｍ未満の空気の泡の積算体積を減算した値を、泡の全体積で除算することにより求められる。
上記積算体積の割合は、細胞ダメージを抑制する観点からは、３０体積％以上であることが好ましく、５０体積％以上であることがより好ましく、７０体積％以上であることが更に好ましく、９０体積％以上であることが最も好ましい。
上記積算体積の割合の上限値は、特に限定されないが、例えば１００体積％以下であればよい。
【００４３】
−酸素移動容量係数ｋＬａ−
上記培養時における酸素移動容量係数ｋＬａは、培養細胞濃度を増加させ、かつ、細胞へのダメージを抑制しやすい観点からは、１／ｈｒが１５以上であることが好ましい。
また、上記ｋＬａは、培養細胞濃度を増加させ、かつ、細胞へのダメージを抑制しやすい観点からは、１５  １／ｈｒ以上であることがより好ましく、２０  １／ｈｒ以上であることが更に好ましく、２５  １／ｈｒ以上であることが特に好ましく、３０  １／ｈｒ以上であることが特に好ましい。
ｋＬａの上限値は、特に限定されないが、例えば１００  １／ｈｒ以下であればよい。
上記ｋＬａは、下記（１）〜（４）に記載した方法により測定することが可能である。
【００４４】
＜＜（１）液の準備＞＞
上述の泡径分布の測定と同様の方法により、上記培養容器における上記細胞懸濁液を、上記測定用溶液に入れ替えた培養容器を準備する。
【００４５】
＜＜（２）酸素濃度センサの準備＞＞
酸素濃度センサとしてはメトラートレド社製  Ｉｎｐｒｏ６８００／１２／２２０を使用する。センサ内部には、メトラートレド社製  メンブレン  Ｏ２  Ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｂｏｄｙ  Ｔ−９６を挿入し、更にその内部にメトラートレド社製のＯ２電解液  Ｏ２−Ｅｌｅｃｔｒｏｌｙｔｅを封入する。
酸素濃度の表示計はメトラートレド社のＭ４００  Ｔｙｐｅ３を使用する。
メトラートレド社製のＺｅｒｏ  ｏｘｙｇｅｎ  ｔａｂｌｅｔｓ  ｆｏｒ  ＩｎＬａｂ  ｓｅｎｓｏｒｓ（亜硫酸ナトリウムタブレット）を４０ｍＬの純水に溶かし５分待つ。
その液内に酸素濃度センサを入れ２０分間放置する。５分後に酸素濃度センサの０点校正を行う。
酸素濃度センサを上記測定用溶液の高さ方向中央部を０％、上記測定用溶液の液面を１００％、上記測定用溶液の液底面を−１００％として、−１００％から０％の高さの位置に挿入する。
上記測定用溶液を３７℃に加温保持する。
撹拌しながら、孔径２０μｍのスパージャーよりＡｉｒを０．０２ｖｖｍで２４時間通気する。本開示において「ｖｖｍ」とは、１分間で、液容量の何倍の通気をするかを示すものである。
（Ａｉｒで液を飽和できたらスパージャー孔径や流量は問わない）。
通気が完了したらＡｉｒを１００％として校正する。
【００４６】
＜＜（３）酸素脱気＞＞
上記測定用溶液を３７℃に加温保持する。
培養容器の上記測定用溶液内に孔径２０μｍのスパージャーよりＮ２を供給する（例えば０．０２ｖｖｍ）。
酸素濃度が３％以下になるのを待つ。
３％以下になったらＮ２を停止し、撹拌も停止する。
培養容器の上層の液がない部分の体積をＶ  Ｌとしたとき、培養容器上層にＶ／３  Ｌ／ｍｉｎの流量で１５分間供給し、上層のＮ２をＡｉｒに置換する。（なおＶの５倍分をＡｉｒで置換できたら、流量と時間は問わない。）
【００４７】
＜＜（４）測定＞＞
置換が完了したら、所定の撹拌条件、所定のガス通気条件に設定し、酸素濃度測定を行う。ガスとしては、Ａｉｒを用いる。横軸に時間（ｈ）を、縦軸に下記式ＫＬにより表される値をプロットし、溶液中の酸素濃度が、上記Ａｉｒを通気した場合の飽和酸素濃度の２０％〜８０％となった部分のグラフの傾きからｋＬａを算出する。
式ＫＬ：ｌｎ（Ｃ＊−Ｃ／Ｃ＊−Ｃ０）
上記式中、ｌｎは自然対数を、Ｃ＊は上記飽和酸素濃度を、Ｃ０は測定開始時点における酸素濃度を、Ｃは酸素濃度の測定値を、それぞれ表す。
また、ｋＬａは「DECHEMA Biotechnologie Recommendations for process engineering characterisation of single-use bioreactors and mixing systems by using experimental methods Publication date: January 2016」に記載の内容を参考に算出してもよい。
【００４８】
−ガスの放出速度−
培養工程においては、上記培養におけるスパージャーから放出される酸素を３０体積％含むガスの流量Ｑ  ｍ３／ｍｉｎと同じ流量の空気ガスを、上記スパージャーから上記測定用溶液に送り、上記スパージャーのガス放出口における泡径分布を測定した場合に、上記Ｑ  ｍ３／ｍｉｎと、上記Ａ  ｍ２と、上記測定用溶液の密度ρＬ  ｋｇ／ｍ３と、上記空気ガスの密度ρｇ  ｋｇ／ｍ３と、上記測定用溶液の粘度μＬ  ｋｇ／ｍ／ｓと、重力加速度ｇ  ｍ／ｓ２とが、下記式３−１を満たすことが好ましい。
式３−１：  ０．１≦（Ｑ／Ａ／６０）／［｛３×１０−８×（ρＬ−ρｇ）×ｇ｝／（１８×μＬ）｝］≦５
【００４９】
ここで、式３−１における（Ｑ／Ａ／６０）は、ガスの放出速度を表しており、｛３×１０−８×（ρＬ−ρｇ）×ｇ｝／（１８×μＬ）｝は、体積平均泡径Ｄｖが１７５μｍである場合の測定用溶液中における泡の終末速度を表している。
すなわち、式３−１は、ガスの放出速度と泡の終末速度の比（ガスの放出速度／泡の終末到達速度、「比Ａ」ともいう）が、０．１以上５以下であることを示している。
上記比Ａが０．１以上であれば、スパージャーに均一に圧力がかかりやすく、スパージャーのガス放出部から不均一に泡が放出されることが抑制されるため、ｋＬａが増大しやすく、また、細胞へのダメージが抑制されやすいと考えられる。
また、上記比Ａが５以下であれば、スパージャーから放出された泡が液中を上昇する前に、次の泡が放出されてしまい、スパージャー出口で泡が凝集、合一することが抑制されると考えられる。そのため、泡径が大きくなる、泡径分布が均一にならない等の事象の発生が抑制され、ｋＬａが増大しやすく、培養細胞濃度が増加しやすいと考えられる。
上記比Ａは、培養細胞濃度が増加しやすく、かつ、細胞へのダメージが抑制されやすい観点からは、０．１以上であることが好ましく、０．２以上であることがより好ましく、０．４以上であることが更に好ましく、０．５以上であることが最も好ましい。
また、上記比Ａは、培養細胞濃度が増加しやすい観点からは、５以下であることが好ましく、４以下であることがより好ましく、３以下であることが更に好ましく、２以下であることが最も好ましい。
【００５０】
上記培養時において、上記スパージャーから放出される上記ガスの流量Ｑ  ｍ３／ｍｉｎと、上記Ａ  ｍ２は、下記式４−１を満たすことが好ましい。
式４−１：  ０．１≦Ｑ／Ａ≦５
【００５１】
Ｑ／Ａは、上述の通りガスの放出速度（ｍ／ｍｉｎ）を表す。
上記Ｑ／Ａが０．１ｍ／ｍｉｎ以上であれば、スパージャーに均一に圧力がかかりやすく、スパージャーのガス放出部から不均一に泡が放出されることが抑制されるため、ｋＬａが増大しやすく、また、細胞へのダメージが抑制されやすいと考えられる。
上記Ｑ／Ａが５ｍ／ｍｉｎ以下であれば、スパージャー出口で泡が凝集、合一することが抑制されると考えられる。そのため、泡径が大きくなる、泡径分布が均一にならない等の事象の発生が抑制され、ｋＬａが増大しやすく、培養細胞濃度が増加しやすいと考えられる。
上記Ｑ／Ａは、培養細胞濃度が増加しやすく、かつ、細胞へのダメージが抑制されやすい観点からは、０．１以上であることが好ましく、０．２以上であることがより好ましく、０．４以上であることが更に好ましく、０．５以上であることが最も好ましい。い。
また、上記Ｑ／Ａは、培養細胞濃度が増加しやすい観点からは、５以下であることが好ましく、４以下であることがより好ましく、３以下であることが更に好ましく、２以下であることが最も好ましい。
【００５２】
−滞留時間−
上記培養における上記培養容器の内底面から上記細胞懸濁液の上面までの液面高さＺＬ  ｍと、上記培養容器内の培養容器の内底面からスパージャー設置面までの高さＺｓ  ｍと、上記泡径分布における泡の体積平均泡径Ｄｖと、上記測定用溶液の密度ρＬ  ｋｇ／ｍ３と、上記空気ガスの密度ρｇ  ｋｇ／ｍ３と、重力加速度ｇ  ｍ／ｓ２と、上記測定用溶液の粘度μＬ  ｋｇ／ｍ／ｓとは、下記式５−１を満たすことが好ましい。
式５−１：  ２≦（ＺＬ−Ｚｓ）／｛Ｄｖ２×１０−１２×（ρＬ−ρｇ）×ｇ／（１８×μＬ）｝≦３００
また、高さＺｓ  ｍは、上記培養容器内の培養容器の内底面からスパージャーのガス供給部における最上部との距離をいう。
【００５３】
式５−１において、（ＺＬ−Ｚｓ）は、スパージャーから放出された泡が液面まで到達するまでの移動距離を示している。
また、式５−１において、｛Ｄｖ２×１０−１２×（ρＬ−ρｇ）×ｇ／（１８×μＬ）｝は、体積平均泡径Ｄｖの泡の測定用溶液中における終末速度を示している。
すなわち、式５−１は、泡の移動距離を泡の終末速度で割った値であり、泡の測定用溶液中における滞留時間（ｓ）を示している。
上記滞留時間が２秒以上であれば、泡からの酸素の供給量が増加し、ｋＬａが増大しやすく、培養時における培養細胞濃度が増加しやすいと考えられる。
また、上記滞留時間が３００秒以下であれば、細胞へのダメージが抑制されやすいと考えられる。
上記滞留時間は、ｋＬａが増大しやすく、培養時における培養細胞濃度が増加しやすい観点からは、２秒以上であることが好ましく、１５秒以上であることがより好ましく、３０秒以上であることが更に好ましく、４０秒以上であることが特に好ましい。
上記滞留時間は、細胞へのダメージが抑制されやすい観点からは、３００秒以下であることが好ましく、２００秒以下であることがより好ましく、１５０秒以下であることが更に好ましく、１２０秒以下であることが特に好ましい。
【００５４】
−培養容器の形状−
上記Ｘ  ｍ３、上記ＺＬ  ｍ、上記Ｚｓ  ｍにおいて、下記式６−１及び式６−２よりなる群から選ばれた少なくとも１つを満たすことが好ましく、両方を満たすことがより好ましい。
式６−１：  Ｚｓ／ＺＬ≦０．５
式６−２：  ０．５≦ＺＬ／（４×Ｘ／ＺＬ／３．１４）０．５≦４
【００５５】
式６−１におけるＺｓ／ＺＬは、上記培養容器の内底面から上記細胞懸濁液の上面までの液面高さＺＬ  ｍと、上記培養容器内の培養容器の内底面からスパージャー設置面までの高さＺｓ  ｍとの比であり、上記比が０．５以下であるとは、培養容器内の高さ方向において、内底面から液面までの高さの中央部以下の位置にスパージャーが設置されていることを示している。
スパージャーの位置が低い方が、スパージャーから放出された泡の滞留時間が長くなるため、ｋＬａが増大しやすく、培養時における細胞濃度が増加しやすいと考えられる。
上記Ｚｓ／ＺＬは、培養時における胞濃度が増加しやすい観点からは、０．５以下であることが好ましく、０．３以下であることがより好ましく、０．２以下であることが更に好ましく、０．１以下であることが特に好ましい。
上記Ｚｓ／ＺＬの下限は特に限定されず、スパージャーが底面に形成されている態様（Ｚｓ／ＺＬ＝０）であってもよい。
【００５６】
式６−２における（４×Ｘ／ＺＬ／３．１４）０．５は、培養容器の内径が高さ方向の変化により変わらないと仮定した場合の、培養容器の底面と水平な平面における円相当径を示している。
すなわち、式６−２におけるＺＬ／（４×Ｘ／ＺＬ／３．１４）０．５は、培養容器における細胞懸濁液の液面の高さと、上記円相当径の比（上記液面の高さ／上記円相当径、「比Ｂ」ともいう。）の値を示している。
上記比Ｂが０．５以上であることにより、泡の滞留時間が増加し、ｋＬａが増大しやすく、培養時における培養細胞濃度が増加しやすいと考えられる。
上記比Ｂが４以下であることにより、酸素濃度を培養容器内に均一にしやすく、また必要な面積（上記表面積Ａ）のスパージャーを配置するのに十分な底面積を確保しやすいと考えられる。
上記比Ｂは、泡の滞留時間が増加し、ｋＬａが増大しやすく、培養時における培養細胞濃度が増加しやすい観点からは、０．５以上であることが好ましく、０．８以上であることがより好ましく、１．０以上であることが更に好ましく、１．２以上であることが特に好ましい。
また、上記比Ｂは、酸素濃度を培養容器内に均一にしやすく、また必要な面積（上記表面積Ａ）のスパージャーを配置するのに十分な底面積を確保しやすい観点からは、４以下であることが好ましく、３以下であることがより好ましく、２．５以下であることが更に好ましく、２以下であることが特に好ましい。
【００５７】
〔撹拌部材〕
本開示における培養容器は、撹拌部材を更に備えていてもよい。
撹拌部材により、培養容器が撹拌されることにより、スパージャーにより放出される泡も撹拌され、ｋＬａが増大しやすくなり、培養可能な培養細胞濃度が増加しやすいと考えられる。
撹拌部材としては特に限定されず、公知のスパージャーにおいて用いられる撹拌部材を用いることができるが、例えば、撹拌羽根を有する撹拌機が挙げられる。
上記撹拌羽根を有する撹拌機の位置、撹拌羽根のサイズ等は、特に限定されず、使用する細胞種、細胞懸濁液の量、供給する酸素の量、スパージャーの位置、数、サイズ、等に応じて設計すればよい。またスパージャーから出る泡を素早く撹拌し、泡の合一を抑制させるためには、スパージャーから近い位置に撹拌部材が配置されることが好ましい。
なお撹拌羽根を有する撹拌機以外では、例えば培養容器の振とうや、培養容器内の細胞懸濁液をポンプなどで循環する方法が挙げられる。
【００５８】
〔細胞〕
本開示に係る細胞培養方法において培養する細胞は、特に限定されず、例えば、動物細胞、植物細胞、酵母などの真核細胞、及び枯草菌、大腸菌などの原核細胞が挙げられる。細胞は、ＥＳ細胞、ｉＰＳ細胞、各種幹細胞などであってもよい。
本開示に係る細胞培養方法において培養する細胞は、生産物を生産する細胞であってもよい。生産物を生産する細胞を培養すると、細胞により生産物が生産され、これを回収すれば細胞を用いた物質生産を行うことができる。
すなわち、本開示に係る細胞培養方法の好ましい一態様は、本開示に係る細胞培養方法により細胞を培養し、培養された細胞により生産された生産物を得ることを含む生産物の製造方法である。
生産物を生産する細胞として用いられる細胞は、特に限定されず、動物細胞、植物細胞、昆虫細胞、酵母などの真核細胞、及び枯草菌、大腸菌などの原核細胞のいずれであってもよい。ＣＨＯ細胞、ＢＨＫ−２１細胞、Ｃ１２７細胞、ＮＳ０細胞及びＳＰ２／０−Ａｇ１４細胞などの動物細胞が好ましく、解析が多数行われ、遺伝子工学的な手法が確立している点でＣＨＯ細胞がより好ましい。所望の生産物を細胞が元々生産しない又は生産量が少ない場合であっても、例えば、生産物を生産するのに必要な蛋白質をコードするプラスミドなどの発現ベクターを細胞に導入することで、所望の生産物を効率よく生産させることができる。本開示における細胞によって生産される生産物は、上記の細胞が細胞懸濁液中に生産する物質であれば、特に限定されず、例えば、アルコール、酵素、抗生物質、核酸、組換えタンパク質、抗体などの物質が挙げられる。中でも生産物として、好ましくは、組み換えタンパク質又は抗体であり、より好ましくは抗体である。
また、生産物を得る方法としては、特に限定されず、公知の方法を用いることができる。
【００５９】
動物細胞に抗体を生産させる場合、抗体の種類は特に限定されず、例えば、抗ＩＬ−６レセプター抗体、抗ＩＬ−６抗体、抗グリピカン−３抗体、抗ＣＤ３抗体、抗ＣＤ２０抗体、抗ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ抗体、抗ＴＮＦ抗体、抗ＣＤ２５抗体、抗ＥＧＦＲ抗体、抗Ｈｅｒ２／ｎｅｕ抗体、抗ＲＳＶ抗体、抗ＣＤ３３抗体、抗ＣＤ５２抗体、抗ＩｇＥ抗体、抗ＣＤ１１ａ抗体、抗ＶＥＧＦ抗体、抗ＶＬＡ４抗体などが挙げられる。生産させる抗体の例には、ヒト、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、サル等の動物由来のモノクローナル抗体だけでなく、キメラ抗体、ヒト化抗体、二重特異性抗体など人為的に改変した抗体も含まれる。
【００６０】
培養容器に収容された細胞懸濁液中における細胞の濃度は特に限定されず、細胞種等を考慮して決定すればよい。ただし、培養容器に収容された細胞懸濁液中における細胞の濃度が高い方が、細胞数が多くなること、及び細胞が生産物を生産する場合には生産物の生産量が大きくなることからも、細胞の濃度が高いことが好ましい。
これらのことから、培養容器に収容された細胞懸濁液中における細胞の濃度は、４×１０７ｃｅｌｌｓ／ｍＬ以上であることが好ましく、５×１０７ｃｅｌｌｓ／ｍＬ以上であることがより好ましく、６×１０７ｃｅｌｌｓ／ｍＬ以上であることが更に好ましい。
また、細胞濃度の上限は特に限定されないが、例えば細胞の生存率を向上する観点からは、３０×１０７ｃｅｌｌｓ／ｍＬ以下が好ましい。
【００６１】
細胞の培養に用いる培地としては、細胞の培養に通常使用されている液体培地を用いることができる。例えば、ＯｐｔｉＣＨＯ（Ｌｉｆｅｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社、１２６８１０１１）培地、ダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）、イーグル最小必須培地（ＭＥＭ）、ＲＰＭＩ−１６４０培地、ＲＰＭＩ−１６４１培地、Ｆ−１２Ｋ培地、ハムＦ１２培地、イスコブ変法ダルベッコ培地（ＩＭＤＭ）、マッコイ５Ａ培地、ライボビッツＬ−１５培地、およびＥＸ−ＣＥＬＬ（商標）３００シリーズ（ＪＲＨ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）、ＣＨＯ−Ｓ−ＳＦＭＩＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）、ＣＨＯ−ＳＦ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社）、ＣＤ−ＣＨＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）、  ＩＳ  ＣＨＯ−Ｖ（Ｉｒｖｉｎｅ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）、ＰＦ−ＡＣＦ−ＣＨＯ  （Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社）などを使用することができる。
【００６２】
培地には牛胎児血清（ＦＣＳ）等の血清を添加してもよい。あるいは、培地は無血清培地、例えば完全合成培地であってもよい。
培地には、アミノ酸、塩、糖類、ビタミン、ホルモン、増殖因子、緩衝液、抗生物質、脂質、微量元素、植物タンパク質の加水分解物などの追加成分を補充してもよい。
【００６３】
培地のｐＨは培養する細胞により異なるが、一般的にはｐＨ６．０〜８．０であり、好ましくはｐＨ６．８〜７．６であり、より好ましくはｐＨ７．０〜７．４である。
培養温度は、一般的には３０℃〜４０℃であり、好ましくは３２℃〜３７℃であり、より好ましくは３６℃〜３７℃であり、培養中に培養温度を変更してもよい。
【００６４】
培養は、ＣＯ２濃度が０体積％〜４０体積％の雰囲気下で行ってもよく、ＣＯ２濃度が２体積％〜１０体積％の雰囲気下で行うことが好ましい。
培養においては、必要に応じて培地の交換、通気、攪拌を加えることができる。
【００６５】
〔灌流培養〕
細胞の培養は灌流培養であることが好ましい。灌流培養は、新鮮な培地を添加し、同時に使用済み培地を除去する培養法である。灌流培養によれば、１×１０８細胞／ｍＬを超える高い細胞濃度を達成することも可能である。典型的な灌流培養は、１日間又は２日間続くバッチ培養スタートアップで始まり、その後、培養物に新鮮な供給培地を連続的、段階的、及び／又は断続的に添加し、使用済み培地を同時に除去する。灌流培養においては、沈降、遠心分離または濾過などの方法を用いて、細胞濃度を維持しながら使用済み培地を除去することができる。灌流は、連続的、段階的、断続的またはこれらの組み合わせの何れの形態でもよい。灌流培養の日数は５日以上１５０日以下が好ましく、１０日以上１００日以下がより好ましく、２０日以上８０日以下が更に好ましい。培養日数を５日以上にすることは、得られる細胞数が多くなること、及び細胞が生産物を生産する場合には生産物の生産量が大きくなることから好ましい。培養日数は１５０日以下にすることは、灌流培養で使用される濾過膜の目詰まり防止や、コンタミを防止する観点で好ましい。
灌流培養は、例えば、後述する灌流細胞培養装置を用いて行うことが可能である。
【００６６】
培養容器からの細胞懸濁液の抜き出しは、通常、ポンプを用いて行うことができるが、利用可能な他の送液手段を用いてもよい。培養容器から抜き出された細胞懸濁液は、例えば、生産物の回収、死細胞の除去等の処理が行われる。培養容器から抜き出された細胞懸濁液は、生産物の回収、死細胞の除去等の処理後に、一部廃却してもよいし、培養容器へと戻してもよい。
上記処理により培地のロスが発生した場合、例えば、培養容器に新鮮培地を供給することにより補うことができる。
【００６７】
（生産物の製造方法）
本開示に係る生産物の製造方法は、
本開示に係る細胞培養方法により細胞を培養すること（以下、「細胞培養工程」ともいう。）、及び、
培養された細胞により生産された生産物を得ること（以下、「生産物回収工程」ともいう。）を含む。
本開示に係る生産物の製造方法においては、本開示に係る細胞培養方法を用いて培養を行うため、高濃度で細胞が培養され、かつ、細胞へのダメージが抑制されると考えられる。そのため、生産物の生産量を向上し、かつ、生産物の品質を向上することができると考えられる。
【００６８】
＜細胞培養工程＞
細胞培養工程は、上述の本開示に係る細胞培養方法における細胞培養工程度同様の工程である。
生産物を生産する細胞としては、先に例示した生産物を生産する細胞を用いることができ、また生産物としては先に例示した生産物とすることができる。生産物は抗体であることが好ましい。
【００６９】
＜生産物回収工程＞
生産物回収工程における生産物の回収としては、単に細胞懸濁液を回収してもよいし、例えば、フィルタ又は遠心分離機を用い、細胞懸濁液から細胞の少なくとも一部を除いた液体を回収してもよく、公知の方法が特に制限なく用いられる。生産物の純度を向上したり、溶媒を変更したり、例えば粉末状にするなど形態を変更したい場合には、細胞懸濁液又は上記液体をさらなる処理に供することができる。
また、細胞培養を上述の灌流培養により行う場合には、灌流しながら細胞懸濁液の一部を回収する、又は、灌流しながら灌流中の細胞懸濁液の一部に対してフィルタ又は遠心分離機を用い、細胞懸濁液から細胞の少なくとも一部を除いた液体を回収することも可能である。
【００７０】
例えば、生産物は、精製処理により精製することができる。得られた生産物は、高い純度にまで精製することができる。生産物が抗体又はその断片などのポリペプチドである場合、生産物の分離及び精製は通常のポリペプチドで使用されている分離及び精製方法を使用すればよい。例えば、アフィニティークロマトグラフィー等のクロマトグラフィーカラム、フィルタ、限外濾過、塩析、透析、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動及び等電点電気泳動等を適宜選択、組み合わせれば、ポリペプチドを分離及び精製することができるが、これらに限定されるものではない。得られたポリペプチドの濃度測定は吸光度の測定又は酵素結合免疫吸着検定法(Enzyme-linked immunosorbent assay；ELISA）等により行うことができる。
【００７１】
本開示に係る細胞培養装置は、細胞を含む細胞懸濁液を収容し、細胞を培養する培養容器、及び、上記培養容器内に上記細胞懸濁液中に酸素を３０体積％以上含むガスを放出するためのスパージャーを備え、上記スパージャーの平均孔径が１μｍ以上３００μｍ以下であり、上記スパージャーの面積Ａ  ｍ２、上記培養容器内に最大に充填できる上記細胞懸濁液量Ｘｍａｘ  ｍ３が下記式７−１及び式７−２を満たす。
式７−１：  ０．００４≦Ａ／Ｘｍａｘ≦０．１
式７−２：  Ｘｍａｘ≧０．５
【００７２】
本開示に係る細胞培養装置における培養容器、スパージャー等の各構成要件は、上述の本開示に係る細胞培養方法における各構成要件と同義であり、好ましい態様も同様である。
また、本開示に係る細胞培養装置の好ましい態様においては、本開示に係る細胞培養方法におけるＸを、後述するＸｍａｘと読み替えるものとする。
以下、本開示に係る細胞培養方法においては説明されていない点について説明する。
【００７３】
Ｘｍａｘは、例えば、細胞培養装置において通常用いられる細胞懸濁液量の最大値であり、細胞培養装置のカタログ等における細胞懸濁液の使用可能量の最大値として決定される。
また、細胞培養装置において特に細胞懸濁液の使用可能量が決められていない場合、培養容器の容量の８０体積％など、実際の実施態様を考慮して決定することができる。
【００７４】
ここで、上記Ａ／Ｘｍａｘは、スパージャーのガス放出部における泡の合一を抑制し、泡径が大きくなることを抑制し、ｋＬａを増大させやすい観点から、０．００４以上であることが好ましく、０．００６以上であることがより好ましく、０．００８以上であることが更に好ましく、０．０１以上であることが特に好ましい。
また、上記Ａ／Ｘｍａｘは、泡の不均一な噴出を抑制し、ｋＬａを増大させ、かつ、細胞ダメージを抑制しやすい観点からは、０．１以下であることが好ましく、０．０５以下であることがより好ましく、０．０３以下であることが更に好ましく、０．０２５以下であることが特に好ましい。
【００７５】
また、上記Ｘｍａｘは、培養する細胞種及び培養目的に応じて設計されるが、本開示に係る細胞培養方法を生産物の製造方法に用いた場合に得られる生産物の量を増加させやすい観点、又は、大量の細胞が得られやすい観点からは、０．５ｍ２以上であることが好ましく、１．０ｍ２以上であることが好ましく、１．１ｍ２以上であることがより好ましい。
また上記Ｘｍａｘの上限は特に限定されないが、例えば１０ｍ２以下とすることができる。
【００７６】
本開示に係る細胞培養装置は、上記培養容器の内底面から上記培養容器内に上記細胞懸濁液を最大に充填したときの上記細胞懸濁液の上面までの液面高さＺＬｍａｘ  ｍと、上記培養容器内の培養容器の内底面からスパージャー設置面までの高さＺｓ  ｍにおいて、下記式８−１を満たすことが好ましい。
式８−１：  ２≦（ＺＬｍａｘ−Ｚｓ）／０．０２≦３００
【００７７】
上記ＺＬｍａｘ−Ｚｓは、上記培養容器内に上記細胞懸濁液を最大に充填したときの上記細胞懸濁液の液面から、スパージャー接地面までの距離を示している。
上記（ＺＬｍａｘ−Ｚｓ）／０．０２が２以上であれば、スパージャーから放出された泡の滞留時間が長くなるため、ｋＬａが増大しやすく、培養時における細胞濃度が増加しやすいと考えられる。
また、上記（ＺＬｍａｘ−Ｚｓ）／０．０２が３００以下であれば泡の滞留時間が長くなりすぎず、細胞へのダメージが抑制されやすいと考えられる。
上記（ＺＬｍａｘ−Ｚｓ）／０．０２は、培養時における細胞濃度が増加しやすい観点から、２以上であることが好ましく、１５以上であることがより好ましく、３０以上であることが更に好ましく、４０以上であることが最も好ましい。
また、上記（ＺＬｍａｘ−Ｚｓ）／０．０２は、細胞へのダメージが抑制されやすい観点から、３００以下であることが好ましく、２００以下であることがより好ましく、１５０以下であることが更に好ましく、１２０以下であることが最も好ましい。
【００７８】
本開示に係る細胞培養装置は、上記Ｘｍａｘ  ｍ３、上記ＺＬｍａｘ  ｍ、上記Ｚｓ  ｍが、下記式９−１及び式９−２を満たすことが好ましい。
式９−１：  Ｚｓ／ＺＬｍａｘ≦０．５
式９−２：０．５≦ＺＬｍａｘ／｛（４×Ｘｍａｘ／ＺＬｍａｘ／３．１４）０．５｝≦４
【００７９】
上記式９−１におけるＺｓ／ＺＬｍａｘは、上記培養容器の内底面から上記培養容器内に上記細胞懸濁液を最大に充填したときの上記細胞懸濁液の上面までの液面高さＺＬ  ｍと、上記培養容器内の培養容器の内底面からスパージャー設置面までの高さＺｓ  ｍとの比であり、上記比が０．５以下であるとは、上記培養容器内に上記細胞懸濁液を最大に充填した場合に、培養容器内の高さ方向において、内底面から液面までの高さの中央部以下の位置にスパージャーが設置されていることを示している。
スパージャーの位置が低い方が、スパージャーから放出された泡の滞留時間が長くなるため、ｋＬａが増大しやすく、培養時における細胞濃度が増加しやすいと考えられる。
上記Ｚｓ／ＺＬｍａｘは、培養時における細胞濃度が増加しやすい観点からは、０．５以下であることが好ましく、０．３以下であることが好ましく、０．２以下であることがより好ましく、０．１以下であることが更に好ましい。
上記Ｚｓ／ＺＬの下限は特に限定されず、スパージャーが底面に形成されている態様（Ｚｓ／ＺＬｍａｘ＝０）であってもよい。
【００８０】
式６−２における（４×Ｘ／ＺＬｍａｘ／３．１４）０．５は、培養容器の内径が高さ方向の変化により変わらないと仮定した場合の、培養容器の底面と水平な平面における円相当径を示している。
すなわち、式６−２におけるＺＬ／（４×Ｘ／ＺＬ／３．１４）０．５は、培養容器における上記細胞懸濁液を最大に充填した場合の細胞懸濁液の液面の高さと、上記円相当径の比（上記液面の高さ／上記円相当径、「比Ｃ」ともいう。）の値を示している。
上記比Ｃが０．５以上であることにより、泡の滞留時間が増加し、ｋＬａが増大しやすく、培養時における細胞濃度が増加しやすいと考えられる。
上記比Ｃが４以下であることにより、酸素濃度を培養容器内に均一にしやすく、また必要な面積（上記表面積Ａ）のスパージャーを配置するのに十分な底面積を確保しやすいと考えられる。
上記比Ｃは、泡の滞留時間が増加し、ｋＬａが増大しやすく、培養時における細胞濃度が増加しやすい観点からは、０．５以上であることが好ましく、０．８以上であることが好ましく、１．０以上であることがより好ましく、１．２以上であることが更に好ましい。
また、上記比Ｃは、酸素濃度を培養容器内に均一にしやすく、また必要な面積のスパージャーを配置するのに十分な底面積を確保しやすい観点からは、４以下であることが好ましく、３以下であることが好ましく、２．５以下であることがより好ましく、２以下であることが更に好ましい。
【００８１】
本開示に記載の細胞培養装置は、灌流細胞培養装置であることが好ましい。
灌流細胞培養装置としては、上述の灌流培養を実現することができる装置であれば、特に制限されず、公知の設計とすることができる。
【００８２】
本開示に係る細胞培養方法、生産物の製造方法、及び細胞培養装置の一例について、図３においてまとめて説明する。図３は、本開示に係る生産物の製造方法の実施に適用可能な細胞培養装置２００の構成の一例を示す概略構成図である。
【００８３】
図３中、細胞培養装置２００は、細胞懸濁液を収容する培養容器１００と、培養容器１００から抜き出された細胞懸濁液に対して膜分離処理を施すフィルタ膜２４を有するフィルタ部２０と、フィルタ膜２４によって阻止された成分を培養容器１００に戻す流路５２と、フィルタ膜２４を透過した成分が通過する流路５３と、流路５３に接続された回収タンク４０とを有する。
【００８４】
培養容器１００の内部には、撹拌翼１１を有する撹拌装置、及び、スパージャー１０が設けられている。撹拌翼１１を回転させることで、培養容器１００の内部に収容された培地が撹拌され、培地の均質性が保たれる。また、スパージャー１０から放出された泡が撹拌されることにより、ｋＬａが増大しやすくなる。
スパージャー１０の数、位置等は、上述の本開示に係る細胞培養方法において説明した内容とすることが可能である。
【００８５】
流路５１は、一端が培養容器１００の底部に接続され、他端がフィルタ部２０の流入口２０ａに接続されている。矢印６６は、流路５１内における細胞懸濁液の流れる方向を示している。流路５１の途中には、培養容器１００に収容されている細胞懸濁液を抜き出して、フィルタ部２０に送るポンプＰＵ１が設けられている。ポンプＰＵ１として、例えば、磁気浮上型のポンプを用いることができる。送液圧力はポンプＰＵ１とフィルタ部２０との間に設置された圧力計６０によって測定することが可能である。ポンプＰＵ１の送液圧力は、流路５２上に設けられたピンチバルブＶの開度によって調整することが可能である。また送液流量はポンプＰＵ１の回転数によって調整することが可能である。
またポンプＰＵ１を往復動ポンプを用いることができる。ＰＵ１に往復動ポンプを用いた場合、流路５１の一端を培養容器１００の底部に接続する必要はない。ＰＵ１の往復動により、図に対して矢印６６、６８、７０が反転することで、培養容器から細胞懸濁液が抜き出され、矢印６６、６８、７０が図の方向に戻ることで、細胞懸濁液は培養容器内に戻される。
【００８６】
フィルタ部２０は、容器２１と、容器２１内の空間を供給側２２と透過側２３とに隔て、培養容器１００から抜き出された細胞懸濁液に対して膜分離処理を施すフィルタ膜２４と、を備える。矢印６８は、フィルタ部２０内における細胞懸濁液の流れる方向を示している。また、フィルタ部２０は、供給側２２において、細胞懸濁液が流入する流入口２０ａと細胞懸濁液が流出する流出口２０ｂとを有する。培養容器１００から抜き出された細胞懸濁液は、流入口２０ａから容器２１の内部に流入して流出口２０ｂから容器２１の外部に流出する間にフィルタ膜２４上を通過する。フィルタ部２０は、膜分離処理の対象となる液体をフィルタ膜２４の膜面に沿って（膜面と平行な方向に）流しながら、サイズの小さい成分を透過側２３に送るタンジェンシャルフロー方式による膜分離処理を行う。タンジェンシャルフロー方式による膜分離処理は、培養容器１００から抜き出された細胞懸濁液がフィルタ膜２４の膜面に沿って平行に一方向に循環する流れを形成するものであってもよいし、細胞懸濁液がフィルタ膜２４の膜面に沿って往復する流れを形成するものであってもよい。循環する流れを形成する場合、例えばスペクトラムラボラトリーズ社のKrosFlo灌流培養フローパス装置（KML-100、KPS-200、KPS-600）、Ｌｅｖｉｔｒｏｎｉｘ製のＰｕｒａＬｅｖシリーズ等を好適に用いることができる。また往復する流れを形成する場合、REPLIGEN社のATFsystemを好適に用いることができる。
【００８７】
細胞懸濁液に含まれる細胞は、フィルタ膜２４を透過せず、流出口２０ｂから容器２１の外部に流出し、流路５２を介して培養容器１００の内部に戻される。矢印７０は、流路５２内における細胞懸濁液が流れる方向を示している。一方、細胞懸濁液に含まれる抗体等の生産物は、フィルタ膜２４を透過して、透過側２３に設けられた排出口２０ｃから容器２１の外部に排出される。透過側２３には、ポンプＰＵ２が設けられた流路５３が接続されており、透過側２３に透過した生産物（例えば、抗体）を含む透過液は、流路５３を介して回収タンク４０に回収される。矢印７４は、流路５３内における透過液が流れる方向を示している。なお、ポンプＰＵ２は、ペリスタリックポンプであっても、磁気浮上型のポンプであってもよい。
【００８８】
フィルタ膜２４として、繊維状部材を網目状に織ることにより構成されるメッシュフィルタを用いることが可能である。メッシュフィルタを用いることで、中空糸膜を用いる場合と比較して、細胞の死骸及び細胞の破砕物を含む細胞培養に不要な成分の透過側への排出を促進させることができる。これにより、培養容器１００内から細胞培養に不要な成分を効果的に除去することができ、培養容器１００内における細胞の増殖性を高めることができる。
【００８９】
また、フィルタ膜２４として、中空糸膜を用いることができる。中空糸膜を用いることで、メッシュフィルタを用いる場合と比較して、細胞が透過側に透過するリスクを低減できる。また、フィルタ膜２４に細胞が入り込むことによる目詰まりの発生のリスクを低減できる。これらにより、細胞のロスを低減できる。
【００９０】
フィルタ膜２４を透過し、回収タンク４０に回収された透過液に含まれる生産物（例えば、抗体）は、流路５６を介して、生産物（例えば、抗体）の精製を行う精製処理部（図示せず）に送られる。回収された透過液は一度回収タンク４０に溜めてもよいし、タンクに溜めずに直接精製処理部に送ってもよい。回収タンク４０に貯めることで、透過液の流量が変動しても、精製処理部への影響を最小限にとどめることができる。
矢印７６は、流路５６内における透過液の流れる方向を示しており、Ｃは精製処理に用いられる透過液の移動を示している。
【００９１】
細胞培養装置２００は、新鮮な培地を培養容器１００に供給するための流路５４と、流路５４の途中に設けられたポンプＰＵ３を有する。Ａは新鮮な培地の供給口を示し、矢印６２は流路５４内における細胞懸濁液の流れる方向を示している。ポンプＰＵ３は、ペリスタリックポンプであっても、磁気浮上型のポンプであってもよい。
【００９２】
培養容器１００内の細胞の濃度が過度に高くなることを防止するために、培養期間中における適切なタイミングで培養容器１００内の細胞の一部を抜き取るセルブリード処理が行われる。セルブリード処理において、培養容器１００内の細胞は、流路５５を介して培養容器１００の外部に排出される。矢印６４は流路５５内における細胞懸濁液の流れる方向を示しており、Ｂはセルブリード処理に用いられる細胞懸濁液の移動を示している。
【００９３】
なお、図３に示す細胞培養装置２００は、分離処理をフィルタ部２０による膜分離処理によって行うものであるが、フィルタ部２０を、音波凝集法や遠心分離法等の公知の方法による分離処理を行う処理部に置き換えることも可能である。
【００９４】
以上説明したように、本開示によれば、高濃度での細胞培養を可能とし、かつ、細胞へのダメージが抑制される細胞培養方法、上記細胞培養方法を含む生産物の製造方法、及び、上記細胞培養方法を可能とする細胞培養装置を提供することができる。生産物の製造方法の場合、製造された生産物は、例えばバイオ医薬品及び再生医療等において用いることができる。
【実施例】
【００９５】
以下、実施例により本開示を詳細に説明するが、本開示はこれらの例に限定されるものではない。なお、本実施例において、「％」、「部」とは、特に断りのない限り、それぞれ「質量％」、「質量部」を意味する。【００９６】
（参考例１：参考例１−１〜１−４）
細胞へのダメージが抑制されるスパージャーにおけるガス供給部の平均孔径について調べるため、上記平均孔径を変化させながら１．２Ｌスケールのフェドバッチ培養を実施した。
細胞ダメージは培養後の細胞数と細胞生存率（バイアビリティ）で評価した。【００９７】
＜実験手順＞
全容量が３Ｌの培養容器に、Ｇｌｎ（グルタミン）を８ｍＭ（ｍｏｌ／Ｌ）の濃度になるように添加した培地（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社ＯｐｔｉＣＨＯ  Ｍｅｄｉｕｍ）を１．２Ｌ投入した。
上記投入された培地に、２×１０５  ｃｅｌｌｓ／ｍＬになるようにＣＨＯ細胞を播種した。
撹拌回転数  １８０ｒｐｍ（revolutions per minute）、上面ガス  Ａｉｒ  １５ｍＬ／ｍｉｎ、ＣＯ２  ０．７５ｍＬ／ｍｉｎの条件で３日間（７２時間）培養した。
上記３日間の培養後、細胞懸濁液中の酸素濃度が５０％（１００％をＡｉｒでの酸素飽和濃度として）に制御されるように、各スパージャーより酸素を放出した。その際、スパージャーからの合計のガス流量が０．０３  ｖｖｍになるように、酸素に加えて窒素をスパージャーから同様に流した。以降は培養終了まで終始上記条件で制御した。使用したスパージャーは直径６ｍｍの円型の平面形状のスパージャーで、面積は０．００００２８ｍ２である。
更に、ＧＥ社製Ｃｅｌｌｂｏｏｓｔ  ７ａ（ＦｅｅｄＡ）を細胞懸濁液量の２％に相当する液量で、ＧＥ社製Ｃｅｌｌｂｏｏｓｔ  ７ｂ（ＦｅｅｄＢ）を細胞懸濁液量の０．２％に相当する液量で、上記３日間の培養後から１日１回、毎日の添加を行った。
更に、上記培養は細胞懸濁液中のＧｌｃ（グルコース）及びＧｌｎ（グルタミン）を計測しながら行い、Ｇｌｃが４．０ｇ／Ｌを下回ったら４５０ｇ／Ｌ  Ｇｌｃ液を細胞懸濁液量の０．７５％、Ｇｌｎが１．５ｍＭを下回った場合２００ｍＭ  Ｇｌｎを細胞懸濁液量の０．５％の液量で、３日目より毎日１日１回添加した。
計１４日間の期間の培養を行い、日々、細胞数、細胞生存率を生死細胞オートアナライザーＶｉ−ＣＥＬＬ  ＸＲ（製品名、ベックマン・コールター（株）製）を用いてトリパンブルー法により評価した。
各スパージャーより酸素を送り始めてから１４日間での最高到達細胞密度と、１４日目の細胞生存率を評価し細胞ダメージを評価した。評価基準は下記の通りとし、培養条件の詳細、及び、評価結果は下記表１に記載した。【００９８】
〔評価基準〕
Ａ：細胞濃度２×１０７ｃｅｌｌｓ／ｍＬ以上かつ、細胞生存率８０％以上である。
Ｂ：Ａに該当せず、細胞濃度１×１０７ｃｅｌｌｓ／ｍＬ以上、かつ、細胞生存率５０％以上である。
Ｃ：ＡにもＢにも該当しない。【００９９】
【表１】
2020003833.tif 000007
【０１００】
（参考例２：参考例２−１〜２−６）
細胞へのダメージが抑制される培養容積あたりの酸素流量ｖｖｍについて調べるため、ガス通気流量違いで１．２Ｌスケールの培養を実施した。細胞ダメージは培養後の細胞数とバイアビリティで評価した。【０１０１】
＜実験手順＞
全容量が３Ｌの培養容器に、Ｇｌｎを８ｍＭの濃度になるようにＧｌｎを添加した培地（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社ＯｐｔｉＣＨＯ  Ｍｅｄｉｕｍ）を１．２Ｌ投入した。
上記培地に、２×１０５  ｃｅｌｌｓ／ｍＬになるようにＣＨＯ細胞を播種した。
撹拌回転数  １８０ｒｐｍ、上面ガス  Ａｉｒ  １５ｍＬ／ｍｉｎ、ＣＯ２  ０．７５ｍＬ／ｍｉｎの条件で３日間（７２時間）培養した。
３日目（７２時間後）より、細胞懸濁液中の酸素濃度が５０％（１００％をＡｉｒでの酸素飽和濃度として）に制御されるように、ガス供給部の平均孔径が２０μｍのスパージャーより酸素を放出した。その際、スパージャーからの合計のガス流量が表に記載の値になるように、酸素に加えて窒素をスパージャーから同様に流した。以降は培養終了まで終始上記条件で制御した。使用したスパージャーは直径６ｍｍの円型の平面形状のスパージャーで、面積は０．００００２８ｍ２である。
更に、ＧＥ社Ｃｅｌｌｂｏｏｓｔ  ７ａ（ＦｅｅｄＡ）を細胞懸濁液量の２％に相当する液量で、ＧＥ社Ｃｅｌｌｂｏｏｓｔ  ７ｂ（ＦｅｅｄＢ）を細胞懸濁液量の０．２％に相当する液量で、３日目より毎日１日１回添加した。
更に、上記培養は細胞懸濁液中のＧｌｃ及びＧｌｎを計測しながら行い、Ｇｌｃが４．０ｇ／Ｌを下回った場合には４５０ｇ／Ｌ  Ｇｌｃ液を細胞懸濁液量の０．７５％、Ｇｌｎが１．５ｍＭを下回った場合には２００ｍＭ  Ｇｌｎを細胞懸濁液量の０．５％の液量で、３日目より毎日１日１回添加した。
計１４日間の期間の培養を行い、日々、細胞数、細胞生存率を生死細胞オートアナライザーＶｉ−ＣＥＬＬ  ＸＲ（製品名、ベックマン・コールター（株）製）を用いてトリパンブルー法により評価した。
各スパージャーより酸素を送り始めてから１４日間での最高到達細胞密度と、１４日目の細胞生存率を評価し細胞ダメージを評価した。評価基準は下記の通りとし、培養条件の詳細、及び、評価結果は下記表２に記載した。
〔評価基準〕
Ａ：細胞濃度２×１０７ｃｅｌｌｓ／ｍＬ以上かつ、細胞生存率８０％以上である。
Ｂ：Ａに該当せず、細胞濃度２×１０７ｃｅｌｌｓ／ｍＬ以上、かつ、細胞生存率６０％以上である。
Ｃ：Ａに該当せず、細胞濃度１×１０７ｃｅｌｌｓ／ｍＬ以上、かつ、細胞生存率５０％以上である。
Ｄ：Ａ、Ｂ、及び、Ｃにも該当しない。【０１０２】
【表２】
2020003833.tif 000008
【０１０３】
（参考例１及び参考例２について）
参考例１及び参考例２は、培養における細胞懸濁液量を１．２Ｌ（＝０．００１２ｍ３）とした例である。
ここで、例えば参考例１又は参考例２において、細胞懸濁液量を０．５ｍ３へとスケールアップ（４１７倍）した場合、上述の相似則から、スパージャー面積Ａは＝｛（４１７）１／３｝２＝５５．８倍とするのが通常である。
その場合、Ａ／Ｘの値は（５５．８／４１７）倍となるため、現在の０．０２４から、０．００３２となる。
例えば後述する比較例３−７に示すように、Ａ／Ｘが０．００４未満である場合には酸素供給能力が低いことが示されている。
すなわち、例えば参考例１又は参考例２に記載の例を、従来の技術思想の元に単純にスケールアップしても、酸素供給能力が低い系となってしまい、本開示に係る細胞培養方法には想到できないことがわかる。【０１０４】
（実施例３−１〜３−１５及び比較例３−１〜３−８）
培養容器のサイズ及び形状、スパージャーの平均孔径、表面積、設置位置等を下記表３に記載のように変更した培養容器を用い、表３又は表４に記載の各パラメータの計測又は計算を行った。
培養容器としては、実施例３−１〜実施例３−５、実施例３−７〜実施例３−１５、及び、比較例３−１〜比較例３−６においては、シングルユース培養容器として、Ｒｅａｃｔｏｒ１を、実施例３−６及び比較例３−７〜比較例３−８においてはシングルユース培養容器としてＲｅａｃｔｏｒ２をベースとした装置をそれぞれ使用した。
・Ｒｅａｃｔｏｒ１
培養槽バッグ直径：１．２２ｍ、培養槽バッグ全高：２．３ｍ、培養槽内に最大に充填できる液量：２０００Ｌ、培養槽バッグ液面高さ（２０００Ｌ）：１．８３ｍ、撹拌羽根：４枚羽根（羽根の角度４０°）、撹拌直径４１９ｍｍ、スパージャー種類：焼結金属、スパージャー形状：平面型ディスク形状、スパージャー孔径：２０μｍ、スパージャーサイズ：φ２５ｍｍのディスクを８個、スパージャー設置位置：撹拌羽根の直下
・Ｒｅａｃｔｏｒ２
培養槽バッグ直径：０．９６ｍ、培養槽バッグ全高：１．８ｍ、培養槽内に最大に充填できる液量：１０００Ｌ、培養槽バッグ液面高さ（１０００Ｌ）：１．４５ｍ、撹拌羽根：３枚羽根（羽根の角度４０°）、撹拌直径３１８ｍｍ、スパージャー種類：焼結金属、スパージャー形状：平面型ディスク形状、スパージャー孔径：２０μｍ、スパージャーサイズ：φ２５ｍｍのディスクを８個、スパージャー設置位置：撹拌羽根の直下【０１０５】
泡径分布及びｋＬａについては上述の方法により測定した。
また、各実施例及び比較例において、スパージャーが複数のユニットにより構成されている場合、各ユニット毎にガスの流量を調整可能な構成とした。
また表３中、「撹拌回転」の欄の記載は撹拌羽根の回転数を表し、撹拌Ｐ／Ｖの欄の記載は、撹拌トルク（単位液量あたりの撹拌所要動力  （Ｗ／ｍ３））を表す。
表３中、「孔径」の欄の記載は上述のスパージャーにおけるガス放出部の平均孔径を表す。
表３中、「種類」の欄の「金属焼結」の記載は、スパージャーがガス放出部に金属焼結フィルタ（ＳＭＣ社焼結金属エレメント、ステンレス製）を有することを、「ポリエステルメッシュ」の記載は、スパージャーがガス放出部にポリエステルメッシュ（PETEX、07-350/34、Sefar Filtraiton Inc製）を有することを、「気体透過性フィルム」の記載は、スパージャーがガス放出部に気体透過性フィルム（Tyvek 1059B）を有することを、それぞれ示している。
表３中、「形状」の記載は、スパージャーにおけるガス供給部の形状を表し、「円筒」の記載は、スパージャーにおけるガス供給部が円柱形状であることを、「円形平面」の記載は、スパージャーのガス放出部の形状が円型の平面形状であることを、正方形平面の記載は、スパージャーのガス放出部の形状が正方形型の平面形状であることを、それぞれ示している。
表３中、「スパージャー１個の表面積」の欄の記載は、スパージャー１個当たりの表面積の平均値を示している。
表３中、「ユニット数」の欄の記載は、用いたスパージャーユニットの数を示している。
表３中、「ユニット毎スパージャー数」の欄の記載は、各スパージャーユニットに含まれるスパージャーの数を示している。
表３中、「スパージャー合計個数」の欄の記載は、培養容器に含まれる全てのスパージャーの数を示している。
表３中、「ユニット毎空気流量」の欄の記載は、各スパージャーユニットに供給される空気ガスの流量を示している。
表３中、Ｘ、ＺＬ、Ｄ、Ａ、Ｚｓ、Ｑと記載された欄の記載は、それぞれ上述の通りである。【０１０６】
＜細胞ダメージ評価＞
細胞へのダメージについては、下記評価基準に従って推定し、評価結果を下記表に記載した。上記参考例１及び参考例２の結果から、下記評価基準により細胞ダメージが推定できると考えられる。評価基準Ａ、Ｂ又はＣであることが好ましい。【０１０７】
〔評価基準〕
Ａ：スパージャー径が１０μｍ以上、かつ、酸素流量０．０３ｖｖｍ以下である。
Ｂ：Ａには該当せず、スパージャー径が２μｍ以上、かつ、酸素流量０．０５ｖｖｍ以下である。
Ｃ：Ａ及びＢには該当せず、スパージャー径が１μｍ以上、かつ、酸素流量０．１ｖｖｍ以下である。
Ｄ：Ａ、Ｂ、及び、Ｃのいずれにも該当しない。【０１０８】
＜酸素供給能力評価＞
酸素供給能力については、下記評価基準に従って推定し、評価結果を下記表に記載した。ｋＬａが高いほど、高い細胞濃度での培養が可能であると推測される。評価基準Ａ、Ｂ又はＣであることが好ましい。【０１０９】
〔評価基準〕
Ａ：ｋＬａが２５以上（細胞数約８×１０７ｃｅｌｌｓ／ｍＬ以上に相当）である。
Ｂ：ｋＬａが２０以上２５未満（細胞数約６×１０７ｃｅｌｌｓ／ｍＬ〜８×１０７ｃｅｌｌｓ／ｍＬに相当）である。
Ｃ：ｋＬａ１５が以上２０未満（細胞数約４×１０７ｃｅｌｌｓ／ｍＬ〜６×１０７ｃｅｌｌｓ／ｍＬに相当）である。
Ｄ：ｋＬａが１５未満である。【０１１０】
＜培養バッグ耐性＞
培養バッグの耐性を下記（１）〜（５）に記載の方法により評価した。
培養バッグとしては、上述のＲｅａｃｔｏｒ１又はＲｅａｃｔｏｒ２に記載した直径及び全高の培養槽バッグをそれぞれ使用した。ポリエチレン系のフィルムを２重にして使用し、具体的には、ＡＳＩ  ＰＬ−０１０２６（厚み約１５０μｍ）が接液面に、ＡＳＩ  ＰＬ−０１０２９（厚み約１５０μｍ）が外側の面になるようにバッグを製作した。
スパージャー面積が大きすぎると、スパージャーの質量が増加する、又は、スパージャーとバッグの接合面が増加する影響により、培養バッグに負荷がかかり破損しやすくなると考えられる。
（１）培養バッグを培養槽本体に設置する。
（２）培養バッグにバッグの最大充てん量の上記測定用溶液を送る。
（３）培養バッグから液を抜く。
（４）培養バッグを培養槽から取り外す。
（５）（１）〜（４）を培養バッグが破損するまで（穴があく及び／又は液が漏れる）繰り返す。
評価は、下記評価基準に従って行った。評価基準Ａ、Ｂ又はＣであることが好ましい。【０１１１】
〔評価基準〕
Ａ：培養バッグを３回培養槽から取り付け及び取り外ししても破損は認められない。
Ｂ：培養バッグを２回培養槽から取り付け及び取り外ししても破損は認められないが、３回培養槽から取り付け及び取り外しした際に破損が認められる。
Ｃ：培養バッグを１回培養槽から取り付け及び取り外ししても破損は認められないが、２回培養槽から取り付け及び取り外しした際に破損が認められる。
Ｄ：１回目の取り付け及び取り外し後に培養バッグに破損が認められる。【０１１２】
【表３】
2020003833.tif 000009
【０１１３】
【表４】
2020003833.tif 000010
【０１１４】
表４中、「培養容器直径」の欄の記載は、式（４×Ｘ／ＺＬ／３．１４）０．５により算出した培養容器の円相当径を示している。
表４中、「ＺＬ／Ｄ」の欄の記載は、上述の式６−２におけるＺＬ／（４×Ｘ／ＺＬ／３．１４）０．５の値を示している。
また表４中、「式３−１」の欄の記載は、上述の式３−１における（Ｑ／Ａ／６０）／［｛３×１０−８×（ρＬ−ρｇ）×ｇ｝／（１８×μＬ）｝］の値を示している。
表４中、「式５−１」の欄の記載は、上述の式５−１における（ＺＬ−Ｚｓ）／｛Ｄｖ２×１０−１２×（ρＬ−ρｇ）×ｇ／（１８×μＬ）｝の値を示している
表４中、計算には、重力加速度ｇ＝９．８ｍ／ｓ２、測定用溶液の密度ρＬ  ｋｇ／ｍ３＝１０００ｋｇ／ｍ３、上記空気ガスの密度ρｇ＝１．２９３  ｋｇ／ｍ３、測定用溶液の粘度μＬ＝８．９×１０−４ｋｇ／ｍ／ｓ、とした値をそれぞれ用いている。
表４中、「泡径２０μｍ〜５００μｍ積算体積率」の欄の記載は、泡径分布における泡の全体積に対する、泡径が２０μｍ以上５００μｍ以下の上記空気の泡の積算体積の割合を示している。
表４中、「対応する細胞濃度」の欄の記載は、上述の参考例１及び参考例２の内容及び測定されたｋＬａの値から推測される細胞濃度を示している。
表４中、Ａ／Ｘ、Ｑ／Ａ、Ｑ／Ｘ、Ｚｓ／ＺＬ、Ｄｖ、ｋＬａと記載された欄の記載は、それぞれ対応する上述のパラメータの値を示している。【０１１５】
表３及び表４に記載された結果から、本開示に係る細胞培養方法によれば、細胞懸濁液が多量である場合であっても、高濃度での細胞培養が可能であり、かつ、細胞へのダメージが抑制されることがわかる。【０１１６】
２０１８年６月２７日に出願された日本国特許出願第２０１８−１２２３２２号の開示は、その全体が参照により本明細書に取り込まれる。
本明細書に記載された全ての文献、特許出願、及び、技術規格は、個々の文献、特許出願、及び、技術規格が参照により取り込まれることが具体的かつ個々に記された場合と同程度に、本明細書中に参照により取り込まれる。
【符号の説明】
【０１１７】
１０  スパージャー（金属焼結スパージャー）
１１  撹拌翼
１２  金属焼結フィルタ
１４  支持部
１６  ガス供給部
２０  フィルタ部
２０ａ  流入口
２０ｂ  流出口
２０ｃ  排出口
２１  容器
２２  供給側
２３  透過側
２４  フィルタ膜
４０  回収タンク
５１〜５６  流路
６０  圧力計
６２、６４、６６、６８、７０、７４、７６  矢印
１００  培養容器
１０２  細胞懸濁液
１０４  内底面
１１０  スパージャーユニット
１１２  ガス供給部
２００  細胞培養装置
ＰＵ１〜ＰＵ３  ポンプ
Ａ  新鮮な培地の供給口
Ｂ  セルブリード処理に用いられる細胞懸濁液の移動
Ｃ  精製処理に用いられる透過液の移動
Ｖ  ピンチバルブ
【図１】
2020003833.tif 000011
【図２】
2020003833.tif 000012
【図３】
2020003833.tif 000013
【国際調査報告】
2020003833.tif 000014
2020003833.tif 000015
2020003833.tif 000016
2020003833.tif 000017