(57)【要約】本開示において、ＴＣＲ遺伝子の導入の際の内因性のＴＣＲによる影響を排除する技術が提供される。ゲノム編集酵素であって、そのＤＮＡ結合ドメインに含まれるＤＮＡ結合モジュールにおける２つの特定の位置のアミノ酸が、４つのＤＮＡ結合モジュールごとに異なる繰り返し様式を呈することを１つの特徴とする、ゲノム編集酵素を用いてＴＣＲ遺伝子を編集する。内因性ＴＣＲとのミスペアリングによる導入ＴＣＲ発現効率の低下や、自己反応性ＴＣＲの出現を回避する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＤＮＡ結合ドメインおよび機能ドメインを含むポリペプチドまたは該ポリペプチドをコードする核酸を含む、ＴＣＲ遺伝子を編集するための組成物であって、
ここで、該ＤＮＡ結合ドメインと該機能ドメインは、３５〜５５のアミノ酸からなるポリペプチドにより接続されており、
ＤＮＡ結合ドメインは、複数のＤＮＡ結合モジュールをＮ末端側から連続的に含み、
Ｎ末端から４ｎ−３番目のＤＮＡ結合モジュールにおけるｘ番目のアミノ酸とｙ番目のアミノ酸の組合せは、任意のｎに関して同一であり、
Ｎ末端から４ｎ−２番目のＤＮＡ結合モジュールにおけるｘ番目のアミノ酸とｙ番目のアミノ酸の組合せは、任意のｎに関して同一であり、
Ｎ末端から４ｎ−１番目のＤＮＡ結合モジュールにおけるｘ番目のアミノ酸とｙ番目のアミノ酸の組合せは、任意のｎに関して同一であり、
Ｎ末端から４ｎ番目のＤＮＡ結合モジュールにおけるｘ番目のアミノ酸とｙ番目のアミノ酸の組合せは、任意のｎに関して同一であり、
Ｎ末端から４ｎ−３番目のＤＮＡ結合モジュールにおけるｘ番目のアミノ酸とｙ番目のアミノ酸の組合せ、Ｎ末端から４ｎ−２番目のＤＮＡ結合モジュールにおけるｘ番目のアミノ酸とｙ番目のアミノ酸の組合せ、Ｎ末端から４ｎ−１番目のＤＮＡ結合モジュールにおけるｘ番目のアミノ酸とｙ番目のアミノ酸の組合せ、およびＮ末端から４ｎ番目のＤＮＡ結合モジュールにおけるｘ番目のアミノ酸とｙ番目のアミノ酸の組合せは、互いに異なり、
ここで、ｎは、１〜１０の自然数であり、ｘは、１〜４０の自然数であり、ｙは、１〜４０の自然数であり、ｘとｙは、異なる自然数である、組成物。
【請求項２】
前記ＤＮＡ結合ドメインと前記機能ドメインは、４０〜５０のアミノ酸からなるポリペプチドにより接続されており、
該ＤＮＡ結合ドメインは、３４のアミノ酸からなる１６〜２０のＤＮＡ結合モジュールをＮ末端側から連続的に含み、
Ｎ末端から４ｎ−３番目のＤＮＡ結合モジュールにおける４番目のアミノ酸と３２番目のアミノ酸の組合せは、任意のｎに関して同一であり、
Ｎ末端から４ｎ−２番目のＤＮＡ結合モジュールにおける４番目のアミノ酸と３２番目のアミノ酸の組合せは、任意のｎに関して同一であり、
Ｎ末端から４ｎ−１番目のＤＮＡ結合モジュールにおける４番目のアミノ酸と３２番目のアミノ酸の組合せは、任意のｎに関して同一であり、
Ｎ末端から４ｎ番目のＤＮＡ結合モジュールにおける４番目のアミノ酸と３２番目のアミノ酸の組合せは、任意のｎに関して同一であり、
Ｎ末端から４ｎ−３番目のＤＮＡ結合モジュールにおける４番目のアミノ酸と３２番目のアミノ酸の組合せ、Ｎ末端から４ｎ−２番目のＤＮＡ結合モジュールにおける４番目のアミノ酸と３２番目のアミノ酸の組合せ、Ｎ末端から４ｎ−１番目のＤＮＡ結合モジュールにおける４番目のアミノ酸と３２番目のアミノ酸の組合せ、およびＮ末端から４ｎ番目のＤＮＡ結合モジュールにおける４番目のアミノ酸と３２番目のアミノ酸の組合せは、互いに異なり、
ここで、ｎは、１〜５の自然数であり、
該ＤＮＡ結合ドメインの由来は、ＴＡＬＥである、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記機能ドメインがＤＮＡ切断ドメインである、請求項１または２に記載の組成物。
【請求項４】
前記ＤＮＡ結合ドメインがＴＣＲα遺伝子またはＴＣＲβ遺伝子に特異的に結合する、請求項１〜３のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項５】
前記ＤＮＡ結合ドメインが、ＴＲＡＣ  エクソン１、ＴＲＢＣ１  エクソン１、またはＴＲＢＣ２  エクソン１に特異的に結合する、請求項１〜４のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項６】
前記ＤＮＡ結合ドメインが、配列番号８０の核酸配列、配列番号８１の核酸配列、配列番号８２の核酸配列、配列番号８３の核酸配列、配列番号８４の核酸配列、または配列番号８５の核酸配列に特異的に結合する、請求項１〜５のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項７】
前記ポリペプチドをコードする前記核酸を含む発現ベクターを含む、請求項１〜６のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項８】
前記ポリペプチドをコードする前記核酸を、ｍＲＮＡの形で含む、請求項１〜６のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項９】
請求項１〜８のいずれか１項に記載の組成物を細胞に導入する工程を含む、ＴＣＲ遺伝子を編集する方法。
【請求項１０】
前記ＤＮＡ結合ドメインがＴＣＲα遺伝子に特異的に結合する、請求項１〜６のいずれか１項に記載の組成物を細胞に導入する工程と、
前記ＤＮＡ結合ドメインがＴＣＲβ遺伝子に特異的に結合する、請求項１〜６のいずれか１項に記載の組成物を細胞に導入する工程と
を含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記ＴＣＲ遺伝子の編集が、内因性ＴＣＲ遺伝子の除去である、請求項９または１０に記載の方法。
【請求項１２】
外因性ＴＣＲ遺伝子を前記細胞に導入する工程をさらに含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記外因性ＴＣＲが、ＮＹ−ＥＳＯ−１に対する特異性を有する、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
請求項１３に記載の方法により作製された、ＴＣＲ改変Ｔ細胞。
【請求項１５】
対象においてがんを処置するための、請求項１４に記載のＴＣＲ改変Ｔ細胞を含む組成物。
【請求項１６】
前記がんが、ＮＹ−ＥＳＯ−１陽性のがんである、請求項１５に記載の組成物。
【請求項１７】
ＤＮＡ結合ドメインを含むポリペプチドをコードする核酸を含む、ＴＣＲ遺伝子を編集するための組成物であって、
ここで、該ＤＮＡ結合ドメインは、複数のＤＮＡ結合モジュールをＮ末端側から連続的に含み、
Ｎ末端から４ｎ−３番目のＤＮＡ結合モジュールにおけるｘ番目のアミノ酸とｙ番目のアミノ酸の組合せは、任意のｎに関して同一であり、
Ｎ末端から４ｎ−２番目のＤＮＡ結合モジュールにおけるｘ番目のアミノ酸とｙ番目のアミノ酸の組合せは、任意のｎに関して同一であり、
Ｎ末端から４ｎ−１番目のＤＮＡ結合モジュールにおけるｘ番目のアミノ酸とｙ番目のアミノ酸の組合せは、任意のｎに関して同一であり、
Ｎ末端から４ｎ番目のＤＮＡ結合モジュールにおけるｘ番目のアミノ酸とｙ番目のアミノ酸の組合せは、任意のｎに関して同一であり、
Ｎ末端から４ｎ−３番目のＤＮＡ結合モジュールにおけるｘ番目のアミノ酸とｙ番目のアミノ酸の組合せ、Ｎ末端から４ｎ−２番目のＤＮＡ結合モジュールにおけるｘ番目のアミノ酸とｙ番目のアミノ酸の組合せ、Ｎ末端から４ｎ−１番目のＤＮＡ結合モジュールにおけるｘ番目のアミノ酸とｙ番目のアミノ酸の組合せ、およびＮ末端から４ｎ番目のＤＮＡ結合モジュールにおけるｘ番目のアミノ酸とｙ番目のアミノ酸の組合せは、互いに異なり、
ここで、ｎは、１〜１０の自然数であり、ｘは、１〜４０の自然数であり、ｙは、１〜４０の自然数であり、ｘとｙは、異なる自然数であり、
該組成物は、機能ドメインを含むポリペプチドをコードする核酸と組み合わせて用いられることを特徴とする、組成物。
【請求項１８】
機能ドメインを含むポリペプチドをコードする核酸を含む、ＴＣＲ遺伝子を編集するための組成物であって、ＤＮＡ結合ドメインを含むポリペプチドをコードする核酸と組み合わせて用いられることを特徴とし、
ここで、該ＤＮＡ結合ドメインは、複数のＤＮＡ結合モジュールをＮ末端側から連続的に含み、
Ｎ末端から４ｎ−３番目のＤＮＡ結合モジュールにおけるｘ番目のアミノ酸とｙ番目のアミノ酸の組合せは、任意のｎに関して同一であり、
Ｎ末端から４ｎ−２番目のＤＮＡ結合モジュールにおけるｘ番目のアミノ酸とｙ番目のアミノ酸の組合せは、任意のｎに関して同一であり、
Ｎ末端から４ｎ−１番目のＤＮＡ結合モジュールにおけるｘ番目のアミノ酸とｙ番目のアミノ酸の組合せは、任意のｎに関して同一であり、
Ｎ末端から４ｎ番目のＤＮＡ結合モジュールにおけるｘ番目のアミノ酸とｙ番目のアミノ酸の組合せは、任意のｎに関して同一であり、
Ｎ末端から４ｎ−３番目のＤＮＡ結合モジュールにおけるｘ番目のアミノ酸とｙ番目のアミノ酸の組合せ、Ｎ末端から４ｎ−２番目のＤＮＡ結合モジュールにおけるｘ番目のアミノ酸とｙ番目のアミノ酸の組合せ、Ｎ末端から４ｎ−１番目のＤＮＡ結合モジュールにおけるｘ番目のアミノ酸とｙ番目のアミノ酸の組合せ、およびＮ末端から４ｎ番目のＤＮＡ結合モジュールにおけるｘ番目のアミノ酸とｙ番目のアミノ酸の組合せは、互いに異なり、
ここで、ｎは、１〜１０の自然数であり、ｘは、１〜４０の自然数であり、ｙは、１〜４０の自然数であり、ｘとｙは、異なる自然数である、組成物。
【請求項１９】
ＤＮＡ結合ドメインを含むポリペプチドをコードする核酸と、機能ドメインを含むポリペプチドをコードする核酸とを含む、ＴＣＲ遺伝子を編集するための組み合わせ物であって、
ここで、該ＤＮＡ結合ドメインは、複数のＤＮＡ結合モジュールをＮ末端側から連続的に含み、
Ｎ末端から４ｎ−３番目のＤＮＡ結合モジュールにおけるｘ番目のアミノ酸とｙ番目のアミノ酸の組合せは、任意のｎに関して同一であり、
Ｎ末端から４ｎ−２番目のＤＮＡ結合モジュールにおけるｘ番目のアミノ酸とｙ番目のアミノ酸の組合せは、任意のｎに関して同一であり、
Ｎ末端から４ｎ−１番目のＤＮＡ結合モジュールにおけるｘ番目のアミノ酸とｙ番目のアミノ酸の組合せは、任意のｎに関して同一であり、
Ｎ末端から４ｎ番目のＤＮＡ結合モジュールにおけるｘ番目のアミノ酸とｙ番目のアミノ酸の組合せは、任意のｎに関して同一であり、
Ｎ末端から４ｎ−３番目のＤＮＡ結合モジュールにおけるｘ番目のアミノ酸とｙ番目のアミノ酸の組合せ、Ｎ末端から４ｎ−２番目のＤＮＡ結合モジュールにおけるｘ番目のアミノ酸とｙ番目のアミノ酸の組合せ、Ｎ末端から４ｎ−１番目のＤＮＡ結合モジュールにおけるｘ番目のアミノ酸とｙ番目のアミノ酸の組合せ、およびＮ末端から４ｎ番目のＤＮＡ結合モジュールにおけるｘ番目のアミノ酸とｙ番目のアミノ酸の組合せは、互いに異なり、
ここで、ｎは、１〜１０の自然数であり、ｘは、１〜４０の自然数であり、ｙは、１〜４０の自然数であり、ｘとｙは、異なる自然数である、組み合わせ物。
【請求項２０】
ＤＮＡ結合ドメインおよび機能ドメインを含むポリペプチドであって、
ここで、該ＤＮＡ結合ドメインと該機能ドメインは、３５〜５５のアミノ酸からなるポリペプチドにより接続されており、
ＤＮＡ結合ドメインは、複数のＤＮＡ結合モジュールをＮ末端側から連続的に含み、
Ｎ末端から４ｎ−３番目のＤＮＡ結合モジュールにおけるｘ番目のアミノ酸とｙ番目のアミノ酸の組合せは、任意のｎに関して同一であり、
Ｎ末端から４ｎ−２番目のＤＮＡ結合モジュールにおけるｘ番目のアミノ酸とｙ番目のアミノ酸の組合せは、任意のｎに関して同一であり、
Ｎ末端から４ｎ−１番目のＤＮＡ結合モジュールにおけるｘ番目のアミノ酸とｙ番目のアミノ酸の組合せは、任意のｎに関して同一であり、
Ｎ末端から４ｎ番目のＤＮＡ結合モジュールにおけるｘ番目のアミノ酸とｙ番目のアミノ酸の組合せは、任意のｎに関して同一であり、
Ｎ末端から４ｎ−３番目のＤＮＡ結合モジュールにおけるｘ番目のアミノ酸とｙ番目のアミノ酸の組合せ、Ｎ末端から４ｎ−２番目のＤＮＡ結合モジュールにおけるｘ番目のアミノ酸とｙ番目のアミノ酸の組合せ、Ｎ末端から４ｎ−１番目のＤＮＡ結合モジュールにおけるｘ番目のアミノ酸とｙ番目のアミノ酸の組合せ、およびＮ末端から４ｎ番目のＤＮＡ結合モジュールにおけるｘ番目のアミノ酸とｙ番目のアミノ酸の組合せは、互いに異なり、
ここで、ｎは、１〜１０の自然数であり、ｘは、１〜４０の自然数であり、ｙは、１〜４０の自然数であり、ｘとｙは、異なる自然数であり、
該ＤＮＡ結合ドメインがＴＣＲα遺伝子またはＴＣＲβ遺伝子に特異的に結合する、
ポリペプチド。
【請求項２１】
前記ＤＮＡ結合ドメインと前記機能ドメインは、４０〜５０のアミノ酸からなるポリペプチドにより接続されており、
該ＤＮＡ結合ドメインは、３４のアミノ酸からなる１６〜２０のＤＮＡ結合モジュールをＮ末端側から連続的に含み、
Ｎ末端から４ｎ−３番目のＤＮＡ結合モジュールにおける４番目のアミノ酸と３２番目のアミノ酸の組合せは、任意のｎに関して同一であり、
Ｎ末端から４ｎ−２番目のＤＮＡ結合モジュールにおける４番目のアミノ酸と３２番目のアミノ酸の組合せは、任意のｎに関して同一であり、
Ｎ末端から４ｎ−１番目のＤＮＡ結合モジュールにおける４番目のアミノ酸と３２番目のアミノ酸の組合せは、任意のｎに関して同一であり、
Ｎ末端から４ｎ番目のＤＮＡ結合モジュールにおける４番目のアミノ酸と３２番目のアミノ酸の組合せは、任意のｎに関して同一であり、
Ｎ末端から４ｎ−３番目のＤＮＡ結合モジュールにおける４番目のアミノ酸と３２番目のアミノ酸の組合せ、Ｎ末端から４ｎ−２番目のＤＮＡ結合モジュールにおける４番目のアミノ酸と３２番目のアミノ酸の組合せ、Ｎ末端から４ｎ−１番目のＤＮＡ結合モジュールにおける４番目のアミノ酸と３２番目のアミノ酸の組合せ、およびＮ末端から４ｎ番目のＤＮＡ結合モジュールにおける４番目のアミノ酸と３２番目のアミノ酸の組合せは、互いに異なり、
ここで、ｎは、１〜５の自然数であり、
該ＤＮＡ結合ドメインの由来は、ＴＡＬＥである、請求項２０に記載のポリペプチド。
【請求項２２】
前記機能ドメインがＤＮＡ切断ドメインである、請求項２０または２１に記載のポリペプチド。
【請求項２３】
前記ＤＮＡ結合ドメインが、ＴＲＡＣ  エクソン１、ＴＲＢＣ１  エクソン１、またはＴＲＢＣ２  エクソン１に特異的に結合する、請求項２０〜２２のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項２４】
前記ＤＮＡ結合ドメインが、配列番号８０の核酸配列、配列番号８１の核酸配列、配列番号８２の核酸配列、配列番号８３の核酸配列、配列番号８４の核酸配列、または配列番号８５の核酸配列に特異的に結合する、請求項２０〜２３のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項２５】
前記ＤＮＡ結合ドメインが、配列番号８６のアミノ酸配列、配列番号８７のアミノ酸配列、配列番号８８のアミノ酸配列、配列番号８９のアミノ酸配列、配列番号９０のアミノ酸配列、または配列番号９１のアミノ酸配列を含む、請求項２０〜２４のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項２６】
請求項２０〜２５のいずれか１項に記載のポリペプチドの全部または一部をコードする核酸。
【請求項２７】
請求項１〜１３に記載の組成物または請求項１４に記載の組み合わせ物と、
内因性ＴＣＲ遺伝子の変異を確認する手段、および／または内因性ＴＣＲ遺伝子の除去を確認する手段と
を備える、ＴＣＲ遺伝子を編集するためのキット。
【請求項２８】
請求項１〜１３に記載の組成物または請求項１４に記載の組み合わせ物と、
外因性ＴＣＲ遺伝子を導入する手段、および／または遺伝子が導入された細胞を検出する手段と
を備える、ＴＣＲ遺伝子を編集するためのキット。
【請求項２９】
内因性ＴＣＲ遺伝子を外因性ＴＣＲ遺伝子で置換するための、請求項２７または２８に記載のキット。
【請求項３０】
ＴＣＲ改変制御性Ｔ細胞を製造するための、請求項２７〜２９のいずれか１項に記載のキット。
【請求項３１】
ＮＹ−ＥＳＯ−１に対する特異性を有する外因性ＴＣＲを発現するＴＣＲ改変Ｔ細胞を製造するための、請求項２７〜２９のいずれか１項に記載のキット。
【請求項３２】
目的の外因性ＴＣＲを含む細胞の細胞集団であって、該細胞集団において、該目的の外因性ＴＣＲ以外の外因性ＴＣＲを含む細胞の割合が１０％未満である、細胞集団。
【請求項３３】
前記外因性ＴＣＲは、ＮＹ−ＥＳＯ−１に対する特異性を有する、請求項３２に記載の細胞集団。
【請求項３４】
請求項３２に記載の細胞集団を作出する方法であって、
細胞から内因性ＴＣＲを除去する工程と、
前記外因性ＴＣＲをコードする核酸を該内因性ＴＣＲが除去された該細胞に導入する工程と
を含む、方法。
【請求項３５】
前記外因性ＴＣＲはＮＹ−ＥＳＯ−１に対する特異性を有する、請求項３４に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ｔ細胞における生物工学的な操作に関する。
【背景技術】
【０００２】
抗原特異的なＴ細胞受容体（ＴＣＲ）遺伝子の導入技術は、悪性腫瘍やウイルス感染症に対するエフェクターＴ細胞（Ｔｅｆｆ）の養子移入免疫療法の手段として近年需要が高まっている。しかし、これまでに開発された方法では、Ｔ細胞に内在するＴＣＲと導入された新規ＴＣＲとの共発現の影響を完全に回避することができない。【０００３】
また、制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）は生体内における免疫応答調節に主要な役割を果たす細胞集団であり、その調節作用は抗原非特異的とされてきたが、近年、特定の自己抗原や同種抗原に反応して免疫制御作用を発揮する抗原特異的Ｔｒｅｇの存在が明らかにされている。抗原特異的Ｔｒｅｇは、自己免疫疾患のモデルにおいて、従来のＴｒｅｇよりも高い有効性を発揮することが報告されている。しかし、任意の所望の抗原に対して、該抗原に特異的なＴｒｅｇを作製する際に、内因性のＴＣＲとの共発現の影響を防止しながらＴｒｅｇに外因性ＴＣＲを導入する技術はこれまで開発されていない。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本開示の１つの局面では、内因性ＴＣＲ遺伝子を編集するための、ゲノム編集酵素改変ＴＡＬＥＮまたはそれを含む組成物が提供される。改変ＴＡＬＥＮによって内因性ＴＣＲ遺伝子を編集し、切断することによって、内因性ＴＣＲを発現しないＴ細胞を作出することが可能となる。１つの実施形態では、改変ＴＡＬＥＮとしてＰｌａｔｉｎｕｍ  ＴＡＬＥＮと称されるＴＡＬＥＮを用いる。Ｐｌａｔｉｎｕｍ  ＴＡＬＥＮは、そのＤＮＡ結合ドメインに含まれるＤＮＡ結合モジュールにおける２つの特定の位置のアミノ酸が、４つのＤＮＡ結合モジュールごとに異なる繰り返し様式を呈することを１つの特徴とする。Ｐｌａｔｉｎｕｍ  ＴＡＬＥＮは、機能ドメインによる機能の高さとＤＮＡ配列に対する認識特異性の高さを両立していることを特徴としている。【０００５】
本開示の１つの局面では、本発明の改変ＴＡＬＥＮを用いて制御性Ｔ細胞における内因性ＴＣＲ遺伝子を除去する工程を含む方法が提供される。例えば、末梢血から分離したＴｒｅｇのＴＣＲ遺伝子を改変ＴＡＬＥＮを用いて切断し、内因性ＴＣＲの発現を抑止することができる。本発明の改変ＴＡＬＥＮは、高い切断効率によって内因性ＴＣＲの発現をより完全に抑止することができることに加えて、配列の認識特異性が高いため、Ｔ細胞におけるオフターゲットの遺伝子改変による危険性を低く抑えることができる。【０００６】
本開示の１つの局面では、本発明の改変ＴＡＬＥＮによって内因性ＴＣＲ遺伝子を除去したＴｒｅｇに、ＴＣＲ遺伝子を導入する工程を含む方法が提供され得る。本発明の改変ＴＡＬＥＮは、上記の特性から、ＴＣＲの編集と併せて新たなＴＣＲを導入する場合に有用であると考えることができる。これにより、所望抗原特異的に高結合能を示すＴＣＲを発現するＴｒｅｇを作出することができる。【０００７】
１つの局面において、本開示ではＴＣＲ遺伝子を編集するための組成物またはキットが提供される。さらなる局面において、ＴＣＲ改変Ｔ細胞を製造するための組成物またはキットが提供される。【０００８】
本開示において、本開示の方法を用いて製造されたＴ細胞（例えば、制御性Ｔ細胞）も提供される。かかる制御性Ｔ細胞は、免疫抑制が所望される様々な状況において有用である。例えば、本発明の制御性Ｔ細胞を、自己免疫疾患、アレルギー疾患、または移植の際の移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）、拒絶反応もしくは生着不全の処置または予防に用いることができる。本開示において、本開示の方法において用いるための物も提供される。【０００９】
本開示の改変ＴＡＬＥＮはまた、上記の特性から、以下のような特徴を有する方法における使用において有用である。本発明の改変ＴＡＬＥＮは、Ｔ細胞（例えば、制御性Ｔ細胞）において、エフェクターＴ細胞のＴ細胞レセプター（ＴＣＲ）を発現させることを特徴とする方法における使用において有用である。１つの実施形態において、本開示の方法は、制御性Ｔ細胞にＴＣＲ遺伝子の全部または一部を導入する工程であって、ＴＣＲαおよびＴＣＲβが対になって発現されるように導入する工程を含む。所望の抗原に反応するエフェクターＴ細胞において、抗原結合能の高いＴＣＲを同定および／または単離し、Ｔ細胞への導入に用いてもよい。本開示の１つの実施形態は、本開示の改変ＴＡＬＥＮによって内因性のＴＣＲを欠損させた制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）に、所望の抗原に反応するエフェクターＴ細胞（Ｔｅｆｆ）から得られた抗原結合能の高いＴＣＲのみを発現させることを１つの特徴とする。抗原結合能の高いＴＣＲの同定は、抗原に特異的なエフェクターＴ細胞集団に存在するＴ細胞レセプター（ＴＣＲ）クローンの頻度に基づいて行うことができる。ＴＣＲの同定には、ＴＣＲの核酸配列を非バイアス的に増幅するステップを含む、ＴＣＲのレパトアを測定する方法を用いることができる。本開示においては、抗原結合能の高いＴＣＲαおよびＴＣＲβの対を同定および／または単離する方法を用いることができる。例えば、所望の抗原に特異的に反応するエフェクターＴ細胞（Ｔｅｆｆ）群をＨＬＡテトラマー等を用いて分離し、それらが発現するＴＣＲα鎖・ＴＣＲβ鎖の抗原認識領域を含む遺伝子配列を取得することができる。さらに、得られたＴＣＲクロノタイプそれぞれの所望の抗原に対する結合能の評価を行うことができる。【００１０】
例えば、本開示は以下の発明を提供する。
（項目１）  ＤＮＡ結合ドメインおよび機能ドメインを含むポリペプチドまたは該ポリペプチドをコードする核酸を含む、ＴＣＲ遺伝子を編集するための組成物であって、
ここで、該ＤＮＡ結合ドメインと該機能ドメインは、３５〜５５のアミノ酸からなるポリペプチドにより接続されており、
ＤＮＡ結合ドメインは、複数のＤＮＡ結合モジュールをＮ末端側から連続的に含み、
Ｎ末端から４ｎ−３番目のＤＮＡ結合モジュールにおけるｘ番目のアミノ酸とｙ番目のアミノ酸の組合せは、任意のｎに関して同一であり、
Ｎ末端から４ｎ−２番目のＤＮＡ結合モジュールにおけるｘ番目のアミノ酸とｙ番目のアミノ酸の組合せは、任意のｎに関して同一であり、
Ｎ末端から４ｎ−１番目のＤＮＡ結合モジュールにおけるｘ番目のアミノ酸とｙ番目のアミノ酸の組合せは、任意のｎに関して同一であり、
Ｎ末端から４ｎ番目のＤＮＡ結合モジュールにおけるｘ番目のアミノ酸とｙ番目のアミノ酸の組合せは、任意のｎに関して同一であり、
Ｎ末端から４ｎ−３番目のＤＮＡ結合モジュールにおけるｘ番目のアミノ酸とｙ番目のアミノ酸の組合せ、Ｎ末端から４ｎ−２番目のＤＮＡ結合モジュールにおけるｘ番目のアミノ酸とｙ番目のアミノ酸の組合せ、Ｎ末端から４ｎ−１番目のＤＮＡ結合モジュールにおけるｘ番目のアミノ酸とｙ番目のアミノ酸の組合せ、およびＮ末端から４ｎ番目のＤＮＡ結合モジュールにおけるｘ番目のアミノ酸とｙ番目のアミノ酸の組合せは、互いに異なり、
ここで、ｎは、１〜１０の自然数であり、ｘは、１〜４０の自然数であり、ｙは、１〜４０の自然数であり、ｘとｙは、異なる自然数である、組成物。
（項目２）  前記ＤＮＡ結合ドメインと前記機能ドメインは、４０〜５０のアミノ酸からなるポリペプチドにより接続されており、
該ＤＮＡ結合ドメインは、３４のアミノ酸からなる１６〜２０のＤＮＡ結合モジュールをＮ末端側から連続的に含み、
Ｎ末端から４ｎ−３番目のＤＮＡ結合モジュールにおける４番目のアミノ酸と３２番目のアミノ酸の組合せは、任意のｎに関して同一であり、
Ｎ末端から４ｎ−２番目のＤＮＡ結合モジュールにおける４番目のアミノ酸と３２番目のアミノ酸の組合せは、任意のｎに関して同一であり、
Ｎ末端から４ｎ−１番目のＤＮＡ結合モジュールにおける４番目のアミノ酸と３２番目のアミノ酸の組合せは、任意のｎに関して同一であり、
Ｎ末端から４ｎ番目のＤＮＡ結合モジュールにおける４番目のアミノ酸と３２番目のアミノ酸の組合せは、任意のｎに関して同一であり、
Ｎ末端から４ｎ−３番目のＤＮＡ結合モジュールにおける４番目のアミノ酸と３２番目のアミノ酸の組合せ、Ｎ末端から４ｎ−２番目のＤＮＡ結合モジュールにおける４番目のアミノ酸と３２番目のアミノ酸の組合せ、Ｎ末端から４ｎ−１番目のＤＮＡ結合モジュールにおける４番目のアミノ酸と３２番目のアミノ酸の組合せ、およびＮ末端から４ｎ番目のＤＮＡ結合モジュールにおける４番目のアミノ酸と３２番目のアミノ酸の組合せは、互いに異なり、
ここで、ｎは、１〜５の自然数であり、
該ＤＮＡ結合ドメインの由来は、ＴＡＬＥである、前記項目に記載の組成物。
（項目３）  前記機能ドメインがＤＮＡ切断ドメインである、前記項目のいずれかに記載の組成物。
（項目４）  前記ＤＮＡ結合ドメインがＴＣＲα遺伝子またはＴＣＲβ遺伝子に特異的に結合する、前記項目のいずれかに記載の組成物。
（項目５）  前記ＤＮＡ結合ドメインが、ＴＲＡＣ  エクソン１、ＴＲＢＣ１  エクソン１、またはＴＲＢＣ２  エクソン１に特異的に結合する、前記項目のいずれかに記載の組成物。
（項目６）  前記ＤＮＡ結合ドメインが、配列番号８０の核酸配列、配列番号８１の核酸配列、配列番号８２の核酸配列、配列番号８３の核酸配列、配列番号８４の核酸配列、または配列番号８５の核酸配列に特異的に結合する、前記項目のいずれかに記載の組成物。
（項目７）  前記ポリペプチドをコードする前記核酸を含む発現ベクターを含む、前記項目のいずれかに記載の組成物。
（項目８）  前記ポリペプチドをコードする前記核酸を、ｍＲＮＡの形で含む、前記項目のいずれかに記載の組成物。
（項目９）  前記項目のいずれかに記載の組成物を細胞に導入する工程を含む、ＴＣＲ遺伝子を編集する方法。
（項目１０）  前記ＤＮＡ結合ドメインがＴＣＲα遺伝子に特異的に結合する、前記項目のいずれかに記載の組成物を細胞に導入する工程と、
前記ＤＮＡ結合ドメインがＴＣＲβ遺伝子に特異的に結合する、前記項目のいずれかに記載の組成物を細胞に導入する工程と
を含む、前記項目に記載の方法。
（項目１１）  前記ＴＣＲ遺伝子の編集が、内因性ＴＣＲ遺伝子の除去である、前記項目のいずれかに記載の方法。
（項目Ａ１）  外因性ＴＣＲ遺伝子を前記細胞に導入する工程をさらに含む、前記項目のいずれかに記載の方法。
（項目Ａ１−１）  前記導入する工程が、マイクロホモロジー媒介末端結合（ＭＭＥＪ）を介して前記外因性ＴＣＲ遺伝子を前記細胞のゲノムにノックインすることを含む、前記項目のいずれかに記載の方法。
（項目Ａ１−２）  前記導入する工程が、前記外因性ＴＣＲ遺伝子をコードするベクターを前記細胞に導入することを含む、前記項目のいずれかに記載の方法。
（項目Ａ２）  前記外因性ＴＣＲが、ＮＹ−ＥＳＯ−１に対する特異性を有する、前記項目のいずれかに記載の方法。
（項目Ａ３）  前記項目のいずれかに記載の方法により作製された、ＴＣＲ改変Ｔ細胞。
（項目Ａ４）  対象においてがんを処置するための、前記項目のいずれかに記載のＴＣＲ改変Ｔ細胞を含む組成物。
（項目Ａ５）  前記がんが、ＮＹ−ＥＳＯ−１陽性のがんである、前記項目のいずれかに記載の組成物。
（項目１２）  ＤＮＡ結合ドメインを含むポリペプチドをコードする核酸を含む、ＴＣＲ遺伝子を編集するための組成物であって、
ここで、該ＤＮＡ結合ドメインは、複数のＤＮＡ結合モジュールをＮ末端側から連続的に含み、
Ｎ末端から４ｎ−３番目のＤＮＡ結合モジュールにおけるｘ番目のアミノ酸とｙ番目のアミノ酸の組合せは、任意のｎに関して同一であり、
Ｎ末端から４ｎ−２番目のＤＮＡ結合モジュールにおけるｘ番目のアミノ酸とｙ番目のアミノ酸の組合せは、任意のｎに関して同一であり、
Ｎ末端から４ｎ−１番目のＤＮＡ結合モジュールにおけるｘ番目のアミノ酸とｙ番目のアミノ酸の組合せは、任意のｎに関して同一であり、
Ｎ末端から４ｎ番目のＤＮＡ結合モジュールにおけるｘ番目のアミノ酸とｙ番目のアミノ酸の組合せは、任意のｎに関して同一であり、
Ｎ末端から４ｎ−３番目のＤＮＡ結合モジュールにおけるｘ番目のアミノ酸とｙ番目のアミノ酸の組合せ、Ｎ末端から４ｎ−２番目のＤＮＡ結合モジュールにおけるｘ番目のアミノ酸とｙ番目のアミノ酸の組合せ、Ｎ末端から４ｎ−１番目のＤＮＡ結合モジュールにおけるｘ番目のアミノ酸とｙ番目のアミノ酸の組合せ、およびＮ末端から４ｎ番目のＤＮＡ結合モジュールにおけるｘ番目のアミノ酸とｙ番目のアミノ酸の組合せは、互いに異なり、
ここで、ｎは、１〜１０の自然数であり、ｘは、１〜４０の自然数であり、ｙは、１〜４０の自然数であり、ｘとｙは、異なる自然数であり、
該組成物は、機能ドメインを含むポリペプチドをコードする核酸と組み合わせて用いられることを特徴とする、組成物。
（項目１２Ａ）  前記項目のいずれか１つまたは複数に記載の特徴を有する、前記項目に記載の組成物。
（項目１３）  機能ドメインを含むポリペプチドをコードする核酸を含む、ＴＣＲ遺伝子を編集するための組成物であって、ＤＮＡ結合ドメインを含むポリペプチドをコードする核酸と組み合わせて用いられることを特徴とし、
ここで、該ＤＮＡ結合ドメインは、複数のＤＮＡ結合モジュールをＮ末端側から連続的に含み、
Ｎ末端から４ｎ−３番目のＤＮＡ結合モジュールにおけるｘ番目のアミノ酸とｙ番目のアミノ酸の組合せは、任意のｎに関して同一であり、
Ｎ末端から４ｎ−２番目のＤＮＡ結合モジュールにおけるｘ番目のアミノ酸とｙ番目のアミノ酸の組合せは、任意のｎに関して同一であり、
Ｎ末端から４ｎ−１番目のＤＮＡ結合モジュールにおけるｘ番目のアミノ酸とｙ番目のアミノ酸の組合せは、任意のｎに関して同一であり、
Ｎ末端から４ｎ番目のＤＮＡ結合モジュールにおけるｘ番目のアミノ酸とｙ番目のアミノ酸の組合せは、任意のｎに関して同一であり、
Ｎ末端から４ｎ−３番目のＤＮＡ結合モジュールにおけるｘ番目のアミノ酸とｙ番目のアミノ酸の組合せ、Ｎ末端から４ｎ−２番目のＤＮＡ結合モジュールにおけるｘ番目のアミノ酸とｙ番目のアミノ酸の組合せ、Ｎ末端から４ｎ−１番目のＤＮＡ結合モジュールにおけるｘ番目のアミノ酸とｙ番目のアミノ酸の組合せ、およびＮ末端から４ｎ番目のＤＮＡ結合モジュールにおけるｘ番目のアミノ酸とｙ番目のアミノ酸の組合せは、互いに異なり、
ここで、ｎは、１〜１０の自然数であり、ｘは、１〜４０の自然数であり、ｙは、１〜４０の自然数であり、ｘとｙは、異なる自然数である、組成物。
（項目１３Ａ）  前記項目のいずれか１つまたは複数に記載の特徴を有する、前記項目に記載の組成物。
（項目１４）  ＤＮＡ結合ドメインを含むポリペプチドをコードする核酸と、機能ドメインを含むポリペプチドをコードする核酸とを含む、ＴＣＲ遺伝子を編集するための組み合わせ物であって、
ここで、該ＤＮＡ結合ドメインは、複数のＤＮＡ結合モジュールをＮ末端側から連続的に含み、
Ｎ末端から４ｎ−３番目のＤＮＡ結合モジュールにおけるｘ番目のアミノ酸とｙ番目のアミノ酸の組合せは、任意のｎに関して同一であり、
Ｎ末端から４ｎ−２番目のＤＮＡ結合モジュールにおけるｘ番目のアミノ酸とｙ番目のアミノ酸の組合せは、任意のｎに関して同一であり、
Ｎ末端から４ｎ−１番目のＤＮＡ結合モジュールにおけるｘ番目のアミノ酸とｙ番目のアミノ酸の組合せは、任意のｎに関して同一であり、
Ｎ末端から４ｎ番目のＤＮＡ結合モジュールにおけるｘ番目のアミノ酸とｙ番目のアミノ酸の組合せは、任意のｎに関して同一であり、
Ｎ末端から４ｎ−３番目のＤＮＡ結合モジュールにおけるｘ番目のアミノ酸とｙ番目のアミノ酸の組合せ、Ｎ末端から４ｎ−２番目のＤＮＡ結合モジュールにおけるｘ番目のアミノ酸とｙ番目のアミノ酸の組合せ、Ｎ末端から４ｎ−１番目のＤＮＡ結合モジュールにおけるｘ番目のアミノ酸とｙ番目のアミノ酸の組合せ、およびＮ末端から４ｎ番目のＤＮＡ結合モジュールにおけるｘ番目のアミノ酸とｙ番目のアミノ酸の組合せは、互いに異なり、
ここで、ｎは、１〜１０の自然数であり、ｘは、１〜４０の自然数であり、ｙは、１〜４０の自然数であり、ｘとｙは、異なる自然数である、組み合わせ物。
（項目１４Ａ）  前記項目のいずれか１つまたは複数に記載の特徴を有する、前記項目に記載の組み合わせ物。
（項目１５）  ＤＮＡ結合ドメインおよび機能ドメインを含むポリペプチドであって、
ここで、該ＤＮＡ結合ドメインと該機能ドメインは、３５〜５５のアミノ酸からなるポリペプチドにより接続されており、
ＤＮＡ結合ドメインは、複数のＤＮＡ結合モジュールをＮ末端側から連続的に含み、
Ｎ末端から４ｎ−３番目のＤＮＡ結合モジュールにおけるｘ番目のアミノ酸とｙ番目のアミノ酸の組合せは、任意のｎに関して同一であり、
Ｎ末端から４ｎ−２番目のＤＮＡ結合モジュールにおけるｘ番目のアミノ酸とｙ番目のアミノ酸の組合せは、任意のｎに関して同一であり、
Ｎ末端から４ｎ−１番目のＤＮＡ結合モジュールにおけるｘ番目のアミノ酸とｙ番目のアミノ酸の組合せは、任意のｎに関して同一であり、
Ｎ末端から４ｎ番目のＤＮＡ結合モジュールにおけるｘ番目のアミノ酸とｙ番目のアミノ酸の組合せは、任意のｎに関して同一であり、
Ｎ末端から４ｎ−３番目のＤＮＡ結合モジュールにおけるｘ番目のアミノ酸とｙ番目のアミノ酸の組合せ、Ｎ末端から４ｎ−２番目のＤＮＡ結合モジュールにおけるｘ番目のアミノ酸とｙ番目のアミノ酸の組合せ、Ｎ末端から４ｎ−１番目のＤＮＡ結合モジュールにおけるｘ番目のアミノ酸とｙ番目のアミノ酸の組合せ、およびＮ末端から４ｎ番目のＤＮＡ結合モジュールにおけるｘ番目のアミノ酸とｙ番目のアミノ酸の組合せは、互いに異なり、
ここで、ｎは、１〜１０の自然数であり、ｘは、１〜４０の自然数であり、ｙは、１〜４０の自然数であり、ｘとｙは、異なる自然数であり、
該ＤＮＡ結合ドメインがＴＣＲα遺伝子またはＴＣＲβ遺伝子に特異的に結合する、
ポリペプチド。
（項目１５Ａ）  前記項目のいずれか１つまたは複数に記載の特徴を有する、前記項目に記載のポリペプチド。
（項目１６）  前記ＤＮＡ結合ドメインと前記機能ドメインは、４０〜５０のアミノ酸からなるポリペプチドにより接続されており、
該ＤＮＡ結合ドメインは、３４のアミノ酸からなる１６〜２０のＤＮＡ結合モジュールをＮ末端側から連続的に含み、
Ｎ末端から４ｎ−３番目のＤＮＡ結合モジュールにおける４番目のアミノ酸と３２番目のアミノ酸の組合せは、任意のｎに関して同一であり、
Ｎ末端から４ｎ−２番目のＤＮＡ結合モジュールにおける４番目のアミノ酸と３２番目のアミノ酸の組合せは、任意のｎに関して同一であり、
Ｎ末端から４ｎ−１番目のＤＮＡ結合モジュールにおける４番目のアミノ酸と３２番目のアミノ酸の組合せは、任意のｎに関して同一であり、
Ｎ末端から４ｎ番目のＤＮＡ結合モジュールにおける４番目のアミノ酸と３２番目のアミノ酸の組合せは、任意のｎに関して同一であり、
Ｎ末端から４ｎ−３番目のＤＮＡ結合モジュールにおける４番目のアミノ酸と３２番目のアミノ酸の組合せ、Ｎ末端から４ｎ−２番目のＤＮＡ結合モジュールにおける４番目のアミノ酸と３２番目のアミノ酸の組合せ、Ｎ末端から４ｎ−１番目のＤＮＡ結合モジュールにおける４番目のアミノ酸と３２番目のアミノ酸の組合せ、およびＮ末端から４ｎ番目のＤＮＡ結合モジュールにおける４番目のアミノ酸と３２番目のアミノ酸の組合せは、互いに異なり、
ここで、ｎは、１〜５の自然数であり、
該ＤＮＡ結合ドメインの由来は、ＴＡＬＥである、前記項目のいずれかに記載のポリペプチド。
（項目１７）  前記機能ドメインがＤＮＡ切断ドメインである、前記項目のいずれかに記載のポリペプチド。
（項目１８）  前記ＤＮＡ結合ドメインが、ＴＲＡＣ  エクソン１、ＴＲＢＣ１  エクソン１、またはＴＲＢＣ２  エクソン１に特異的に結合する、前記項目のいずれかに記載のポリペプチド。
（項目１９）  前記ＤＮＡ結合ドメインが、配列番号８０の核酸配列、配列番号８１の核酸配列、配列番号８２の核酸配列、配列番号８３の核酸配列、配列番号８４の核酸配列、または配列番号８５の核酸配列に特異的に結合する、前記項目のいずれかに記載のポリペプチド。
（項目２０）  前記ＤＮＡ結合ドメインが、配列番号８６のアミノ酸配列、配列番号８７のアミノ酸配列、配列番号８８のアミノ酸配列、配列番号８９のアミノ酸配列、配列番号９０のアミノ酸配列、または配列番号９１のアミノ酸配列を含む、前記項目のいずれかに記載のポリペプチド。
（項目２１）  前記項目のいずれかに記載のポリペプチドの全部または一部をコードする核酸。
（項目２２）  前記項目のいずれかに記載の組成物または前記項目のいずれかに記載の組み合わせ物と、
内因性ＴＣＲ遺伝子の変異を確認する手段、および／または内因性ＴＣＲ遺伝子の除去を確認する手段と
を備える、ＴＣＲ遺伝子を編集するためのキット。
（項目２３）  前記項目のいずれかに記載の組成物または前記項目のいずれかに記載の組み合わせ物と、
外因性ＴＣＲ遺伝子を導入する手段、および／または遺伝子が導入された細胞を検出する手段と
を備える、ＴＣＲ遺伝子を編集するためのキット。
（項目２４）  内因性ＴＣＲ遺伝子を外因性ＴＣＲ遺伝子で置換するための、前記項目のいずれかに記載のキット。
（項目２５）  ＴＣＲ改変制御性Ｔ細胞を製造するための、前記項目のいずれかに記載のキット。
（項目２５Ａ）  前記項目のいずれか１つまたは複数に記載の特徴を有する、前記項目に記載のキット。
（項目Ｂ１）  ＮＹ−ＥＳＯ−１に対する特異性を有する外因性ＴＣＲを発現するＴＣＲ改変Ｔ細胞を製造するための、前記項目のいずれかに記載のキット。
（項目Ｘ）  目的の外因性ＴＣＲを含む細胞の細胞集団であって、該細胞集団において、該目的の外因性ＴＣＲ以外の外因性ＴＣＲを含む細胞の割合が１０％未満である、細胞集団。
（項目Ｘ１）  前記外因性ＴＣＲは、ＮＹ−ＥＳＯ−１に対する特異性を有する、前記項目のいずれかに記載の細胞集団。
（項目Ｘ２）  前記項目のいずれかに記載の細胞集団を作出する方法であって、
細胞から内因性ＴＣＲを除去する工程と、
前記外因性ＴＣＲをコードする核酸を該内因性ＴＣＲが除去された該細胞に導入する工程と
を含む、方法。
（項目Ｘ２−１）  前記導入する工程が、マイクロホモロジー媒介末端結合（ＭＭＥＪ）を介して前記外因性ＴＣＲ遺伝子を前記細胞のゲノムにノックインすることを含む、前記項目のいずれかに記載の方法。
（項目Ｘ２−２）  前記導入する工程が、前記外因性ＴＣＲ遺伝子をコードするベクターを前記細胞に導入することを含む、前記項目のいずれかに記載の方法。
（項目Ｘ３）  前記外因性ＴＣＲはＮＹ−ＥＳＯ−１に対する特異性を有する、前記項目のいずれかに記載の方法。【００１１】
本開示において、上記１または複数の特徴は、明示された組み合わせに加え、さらに組み合わせて提供され得ることが意図される。本開示のなおさらなる実施形態および利点は、必要に応じて以下の詳細な説明を読んで理解すれば、当業者に認識される。
【発明の効果】
【００１２】
Ｔ細胞における内因性のＴＣＲα鎖、ＴＣＲβ鎖とのミスペアリングによる導入ＴＣＲ発現効率の低下や、自己反応性ＴＣＲの出現を低減または回避することができる。これにより、特定のＴＣＲ遺伝子をＴ細胞（例えば、ヒトＴ細胞）に導入し、所望のＴＣＲを発現させることができる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】図１は、単一細胞のＣＭＶ  ＮＬＶ特異的ＴＣＲαおよびＴＣＲβレパトアを示す図である。２名のＨＬＡ  Ａ２抗原陽性およびＣＭＶ抗体陽性の健康なドナー（Ｖ００１およびＶ００４）から得られた細胞のＣＭＶ  ＮＬＶ特異的ＴＣＲαおよびＴＣＲβの対を示す。Ｖ００１およびＶ００４からそれぞれ１１８個および２９個のＴ細胞を分析し、それぞれ３種（ＴＣＲ  ＩＤ；００１−１７、４８および４１）と、６種（ＴＣＲ  ＩＤ；  ００４−６６、２２、６３、３０、２８および７１）のＣＤＲ３αおよびＣＤＲ３βの対を同定した。各ＣＤＲ３配列は、配列番号９３〜１１０に対応する。
【図２】図２は、各ＴＣＲ対のＴＣＲレパトアにおける存在頻度と、抗原への親和性との関係を示す散布図である。縦軸はリードにおける頻度であり、横軸は結合親和性を示す。
【図３】図３は、内因性ＴＣＲ遺伝子を、ＴＡＬＥＮによって除去した際の、対照と比較したＣＤ３発現の変化を示すヒストグラムである（右パネル）。図３左には、ＴＡＬＥＮ−ＴＣＲ  ｍＲＮＡを用いた実験スキーム、ならびにＧＦＰ−ＡおよびＳＳＣ−ＡによるＦＡＣＳ分析結果を示す。ＣＤ３発現はＴＣＲ発現のマーカーとして利用可能であり、対照と比較してＣＤ３発現が陰性にシフトしていることから、内因性ＴＣＲ遺伝子の除去が成功裡に行われたことが示される。
【図４】図４は、ＴＡＬＥＮによるＴＣＲ遺伝子の切断成功を示すＴ７Ｅ１アッセイの結果を示す電気泳動図である。ヒトＴ細胞由来のＪｕｒｋａｔ細胞株において、ＴＲＡ・ＴＲＢ遺伝子が切断されたことが示される（それぞれ左パネル・右パネル）。
【図５】図５は、ＴＣＲの導入に用いる発現ベクターの１つの例の模式図である。
【図６】図６は、内因性ＴＣＲの除去および外因性抗原特異的ＴＣＲの導入によって、多クローン性ＴｒｅｇのＴＣＲを抗原特異的ＴＣＲで完全に置換することができることを示す図である。
【図７】図７は、本発明の方法による内因性ＴＣＲの除去および外因性抗原特異的ＴＣＲの導入の手順を示す模式図である。各工程での細胞のＣＤ３発現の状態が示される。中段はＣＤ３発現によるソーティング前の細胞集団のＣＤ３発現の分布を示し、下段はＣＤ３発現によってソーティングした後の細胞集団のＣＤ３発現の分布を示している。
【図８】図８は、ポリクローナルの制御性Ｔ細胞（Ｐｏｌｙ−Ｔｒｅｇ）と、ＣＤ８＋Ｔ細胞が認識するＣＭＶ抗原（ＱＹＤ５１６）特異的ＴＣＲを導入した制御性Ｔ細胞（ＱＹＤ−Ｔｒｅｇ）との、抗原（ＱＹＤ５１６）への親和性を比較した図である。左列はＧＦＰ標識、右列はＱＹＤ−テトラマー標識を示す。各々の細胞集団の機能性亜集団（ＣＤ４＋）において、ポリクローナルと比較し、抗原特異的ＴＣＲを導入した群では、抗原への親和性を獲得していることが理解される。
【図９】図９は、本開示の技術を用いたサイトメガロウイルス特異的細胞傷害性Ｔ細胞の作成（ヒト末梢血Ｔ細胞）を示す。細胞傷害性Ｔ細胞に対して、ＴＣＲ導入を行った結果が示される。上段は、ＴＣＲαβの発現量での分析、下段はＣＭＶ抗原結合能をＮＬＶ−テトラマーで分析した結果を示す。左列は内因性ＴＣＲを有するＴ細胞での分析を示し、右列は内因性ＴＣＲを除去してＮＬＶ特異的ＴＣＲを導入したＴ細胞での分析を示す。内因性ＴＣＲの干渉を受けずＴＣＲの入れ替えが可能であったことが理解される。
【図１０】図１０は、抗原特異的制御性Ｔ細胞（右端列）、ポリクローナル制御性Ｔ細胞（左から２列目）およびＴＣＲノックアウト制御性Ｔ細胞（右から２列目）と、対照（ＣＤ２５が陰性のＣＤ４陽性Ｔ細胞分画；左端列）との、表面マーカーの発現を示すドットプロットである。上段はＣＤ１２７とＣＤ２５での分析、上から２段目はＣＤ２５とＦｏｘＰ３での分析、上から３段目はＦｏｘＰ３とＣＴＬＡ４での分析、および上から４段目はＦｏｘＰ３とＨＥＬＩＯＳでの分析を示す。
【図１１】図１１は、抗原特異的制御性Ｔ細胞、ポリクローナル制御性Ｔ細胞およびＴＣＲノックアウト制御性Ｔ細胞と、対照（ＣＤ２５が陰性のＣＤ４陽性Ｔ細胞分画）との、表面マーカーの発現を示すヒストグラムである。上段は左からＣＤ２５、ＣＤ１２７、ＦｏｘＰ３での分析を示し、下段は左からＣＴＬＡ４、ＨＥＬＩＯＳでの分析を示す。
【図１２】図１２は、抗原刺激による抗原特異的エフェクターＴ細胞の増殖を示す図である。左からそれぞれ０日目、３日目、５日目を示す。抗原刺激に応答して、ＱＹＤ−５１６特異的エフェクターＴ細胞が増殖したことが理解される。
【図１３】図１３は、抗原刺激に応答したＱＹＤ−５１６特異的Ｔｒｅｇの増殖を示す。ＱＹＤ５１６−特異的Ｔｒｅｇが抗原提示細胞による抗原刺激に応答して増殖したことが示される。制御性Ｔ細胞の増殖は、ポリクローナル制御性Ｔ細胞では観察されなかったが、抗原特異的制御性Ｔ細胞集団で観察された。
【図１４】図１４は、抗原刺激による抗原特異的エフェクターＴ細胞の増殖が、抗原特異的制御性Ｔ細胞によって抑制されることを示す図である。ＱＹＤ−Ｔｒｅｇは、ＱＹＤ−Ｔｅｆｆ増殖の抑制において、Ｐｏｌｙ−Ｔｒｅｇよりも優れていたことが示される。
【図１５】図１５は、抗原刺激による抗原特異的エフェクターＴ細胞の増殖が、抗原特異的制御性Ｔ細胞によって抑制されることを示す図である。ＱＹＤ−Ｔｒｅｇは、ＱＹＤ−Ｔｅｆｆ増殖の抑制において、Ｐｏｌｙ−Ｔｒｅｇよりも優れていたことが示される。
【図１６】図１６は、実施例６における動物モデルを用いた実験の概要を示す図である。
【図１７】図１７は、いくつかの改変ＴＡＬＥＮの例を示す図である。ＤＮＡ結合ドメインにおける結合モジュールの部分について、具体的配列の例が示されている。下線はＲＶＤであり、図ではＨＤ（塩基Ｃに対応するＲＶＤ）を一例として記載している。Ｖｏｙｔａｓ  ＴＡＬＥＮや、Ｖｏｙｔａｓ  ＴＡＬＥＮの結合モジュールの４番目および３２番目のアミノ酸配列を変化させたＺｈａｎｇ  ＴＡＬＥＮの構造の例が示されているが、これらのＴＡＬＥＮでは全てのモジュールでこれらの部分のアミノ酸残基は同一である。他方、Ｐｌａｔｉｎｕｍ  ＴＡＬＥＮでは、結合モジュールの４番目および３２番目のアミノ酸配列が、モジュール毎に周期的に変化している。図中、Ｖｏｙｔａｓ  ＴＡＬＥＮのＤＮＡ結合モジュールの例およびＰｌａｔｉｎｕｍ  ＴＡＬＥＮのＤＮＡ結合モジュールの例の上から１つ目は配列番号１に対応し、以下上から順に配列番号１１１〜１１４に対応する。
【図１８】図１８は、本発明の好ましい実施形態の一例を示す図である。本開示により、例えば、高機能ＴＣＲを用いた抗原特異的Ｔｒｅｇ移入療法を実現することができる。
【図１９】図１９Ａは、ドロマイトバイオ社製シングルセルＲＮＡ−Ｓｅｑシステムを示す。図１９Ｂは、オリゴビーズの概略を示す。オリゴビーズ中のＳＭＡＲＴ配列は、配列番号４５に対応する。図１９Ｃは、顕鏡下のオリゴビーズを示す。図１９Ｄは、マイクロチップ内のビーズフローとドロップレットを示す。中央のライン（黄）をビーズが流れ、２本の細胞ライン（白）と混合された後に、オイルライン（赤）に注入されることでドロップレットが形成される（左図）。ビーズが通過したタイミングで、ランダムにドロップレットに封入される。回収されたドロップレット（白色）はオイル層（透明）と分離され、容易に回収できる。
【図２０】図２０は、本発明の改変ＴＡＬＥＮの作製方法を示す模式図である。
【図２１】図２１は、Ｓｔｅｐｗｉｓｅ  ＴＣＲ  ｇｅｎｏｍｅ  ｅｄｉｔｉｎｇ法による１Ｇ４  ＴＣＲ発現Ｔ細胞の作出の手順を示す模式図である。各工程での細胞のＣＤ３発現の状態が示される。中段はＣＤ３発現によるソーティング前の細胞集団のＣＤ３発現の分布を示し、下段はＣＤ３発現によってソーティングした後の細胞集団のＣＤ３発現の分布を示している。
【図２２】図２２は、ＴＣＲ非発現Ｔ細胞株（αβ  ｎｕｌｌ  Ｊｕｒｋａｔ  細胞）への１Ｇ４  ＴＣＲの導入の結果を示す図である。左図は導入したＴＣＲの発現効率を示し、右図はＴＣＲ導入細胞のＳＬＬペプチドテトラマーへの結合能を示している。左図と右図で同様の効率が得られていることから、発現したＴＣＲのほぼ全てがＳＬＬペプチドを認識していることが示される。これにより、ゲノム編集Ｔ細胞へのｐＭＸベクターの適合性が示される。
【図２３】図２３は、ヒト末梢血Ｔ細胞への１Ｇ４  ＴＣＲの導入の結果を示す図である。
【図２４】図２４は、ＴＡＬ−ＰＩＴＣｈベクターの設計を示す模式図である。図中の配列は、それぞれ配列番号１２０および１２１に対応する。
【図２５】図２５は、ＴＡＬ−ＰＩＴＣｈベクターの設計を示す模式図である。図中の配列は、それぞれ配列番号１２０および１２１に対応する。
【図２６】図２６は、１Ｇ４発現ゲノム編集Ｔ細胞のＳＬＬペプチド発現ＬＣＬに対する特異的殺細胞活性を示す図である。１Ｇ４発現ゲノム編集Ｔ細胞が、細胞数依存的にＮＹ−ＥＳＯ−１由来ＳＬＬペプチド発現ＬＣＬに対する細胞傷害活性を発揮していることが示されている。
【図２７】図２７は、ＴＡＬ−ＰＩＴＣｈベクターを用いて内在性ＴＣＲ欠損ＮＹ−ＥＳＯ−１特異的Ｔ細胞を作成した結果を示す図である。内在性ＴＣＲ欠損細胞の１５.７％にＴＡＬ−ＰＩＴＣｈベクターに組み込まれた１Ｇ４  ＴＣＲが発現していることが示されている。
【図２８】図２８は、マウスＴＣＲ切断用に作成した３種類のｐｌａｔｉｎｕｍ  ＴＡＬＥＮ（ＴＲＡ２−ＴＡＬＥＮ、ＴＲＢ１―ＴＡＬＥＮ、ＴＲＢ２−ＴＡＬＥＮ）のレポータープラスミドを用いたアッセイ法（ＳＳＡアッセイ）による切断活性の評価結果を示す図である。Ｚｉｎｃ  ｆｉｎｇｅｒ  ｎｕｃｌｅａｓｅコントロール（ｐＳＴＬ−ＺＦＡ３６／ＺＦＡ３６）の切断活性を１とする時、マウスＴＲＡ２−ＴＡＬＥＮ、マウスＴＲＢ１−ＴＡＬＥＮ、マウスＴＲＢ２−ＴＡＬＥＮの標的切断部位に対する活性は、それぞれ３．０９倍、３．７９倍、３．４１倍であることがわかる。ｐＳＴＬはＺＦＡ３６の陰性コントロールであり、ＴＲＡ２、ＴＲＢ１、ＴＲＢ２はそれぞれＴＡＬＥＮ非存在下のレポーターのみの陰性コントロール、ＴＲＡ２−ＴＡＬＥＮ／ＺＦＡ３６、ＴＲＢ１−ＴＡＬＥＮ／ＺＦＡ３６、ＴＲＢ２−ＴＡＬＥＮ／ＺＦＡ３６はそれぞれレポーター遺伝子がＺＦＡ３６の場合の陰性コントロールである。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
以下、本発明を最良の形態を示しながら説明する。本明細書の全体にわたり、単数形の表現は、特に言及しない限り、その複数形の概念をも含むことが理解されるべきである。したがって、単数形の冠詞（例えば、英語の場合は「ａ」、「ａｎ」、「ｔｈｅ」など）は、特に言及しない限り、その複数形の概念をも含むことが理解されるべきである。また、本明細書において使用される用語は、特に言及しない限り、当該分野で通常用いられる意味で用いられることが理解されるべきである。したがって、他に定義されない限り、本明細書中で使用される全ての専門用語および科学技術用語は、本発明の属する分野の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。矛盾する場合、本明細書（定義を含めて）が優先する。
【００１５】
（１．定義および基本技術の説明）
以下に本明細書において特に使用される用語の定義および／または基本的技術内容を適宜説明する。
【００１６】
本明細書において、「エフェクターＴ細胞」とは、樹状細胞やマクロファージ、Ｂ細胞などの抗原提示細胞によって提示された抗原をＴ細胞受容体を介して認識し、分化活性化されたＴ細胞をいう。本明細書において、「Ｔｅｆｆ」などの表記がなされる場合もある。
【００１７】
本明細書において、「制御性Ｔ細胞（Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  Ｔ  ｃｅｌｌ）」とは、Ｆｏｘｐ３発現が陽性であり、免疫抑制作用を示すＣＤ４陽性Ｔ細胞である。本明細書において、「Ｔｒｅｇ」とも称される場合がある。ＣＤ２５強陽性およびＣＤ１２７発現弱陽性を制御性Ｔ細胞の指標として用いることも可能である。Ｔｒｅｇは内因性Ｔ細胞（Ｎａｔｕｒａｌｌｙ  Ｏｃｃｕｒｒｉｎｇ  Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  Ｔ  ｃｅｌｌ、ｎＴｒｅｇ）と、ナイーブＣＤ４陽性Ｔ細胞から分化する自己認識能の低い誘導性Ｔ細胞（Ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ  Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  Ｔ  ｃｅｌｌ、ｉＴｒｅｇ）に大別される。
【００１８】
本明細書において「フローサイトメトリー」とは、液体中に懸濁する細胞，個体およびその他の生物粒子の粒子数，個々の物理的・化学的・生物学的性状を計測する技術をいう。この技術を用いた装置は、「フローサイトメーター」という。
【００１９】
本明細書において、「クロノタイプ」とは、Ｔ細胞受容体もしくは免疫グロブリン分子またはそれらの一部分をコードするＴ細胞またはＢ細胞由来の組換え配列を指す。通常の体細胞のゲノム配列は個体中において同一であるが、Ｔ細胞またはＢ細胞の受容体のコード配列においては、各細胞において再編成が生じるため、個体中のＴ細胞またはＢ細胞においては複数のクロノタイプが存在する。
【００２０】
本明細書において、「優勢」クローンとは、当業者が適宜設定できる一定の閾値より多い頻度で、クローンの集団中に存在するクローンを指す。
【００２１】
本明細書において「Ｔ細胞レセプター（ＴＣＲ）」とは、Ｔ細胞に存在するレセプターをいう。ＴＣＲは、２つのＴＣＲポリペプチド鎖からなるヘテロダイマー受容体分子であり、通常のＴ細胞が発現するαβ型ＴＣＲと特殊な機能をもつγδ型ＴＣＲが存在する。αおよびβ鎖ＴＣＲ分子は複数のＣＤ３分子（ＣＤ３ζ鎖、ＣＤ３ε鎖、ＣＤ３γ鎖、ＣＤ３δ鎖）と複合体を形成し、抗原認識後の細胞内シグナルを伝達し、様々な免疫応答を開始させる。ウイルス感染に伴い細胞内で増殖したウイルス抗原やがん細胞由来のがん抗原などの内因性抗原は、ＭＨＣクラスＩ分子上に抗原ペプチドとして提示される。また、外来微生物由来の抗原はエンドサイトーシスにより抗原提示細胞に取り込まれ、プロセシングを受けたのちにＭＨＣクラスＩＩ分子上に提示される。これらの抗原は、それぞれＣＤ８＋  Ｔ細胞あるいはＣＤ４＋Ｔ細胞の発現するＴＣＲにより認識される。ＴＣＲ分子を介した刺激には、ＣＤ２８、ＩＣＯＳ、ＯＸ４０分子などの共刺激分子が重要であることも知られている。本明細書において主要な目的の一つとされるαβ型ＴＣＲについてみると、αおよびβの各々の遺伝子産物は、ユニークな組み合わせにより、特異性を発現するとされる。
【００２２】
免疫システムによる生体防御機構は、主にＴ細胞やＢ細胞によって担われる特異的免疫に大きく依存している。Ｔ細胞やＢ細胞は原則として自己の細胞や分子には反応せず、ウイルスや細菌などの外来性の病原体を特異的に認識して攻撃することができる。そのために、Ｔ細胞やＢ細胞は細胞表面上に発現した受容体分子によって自己抗原とともに他の生物由来の多様な抗原を認識し、識別できる機構を有している。Ｔ細胞ではＴ細胞受容体（Ｔ  ｃｅｌｌ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ，  ＴＣＲ）が抗原受容体として働く。それら抗原受容体からの刺激によって細胞内シグナルが伝達され、炎症性サイトカインやケモカインなどの産生が亢進し、細胞増殖が増進され、様々な免疫応答が開始される。
【００２３】
ＴＣＲは、抗原提示細胞上に発現する主要組織適合遺伝子複合体（Ｍａｊｏｒ  ｈｉｓｔｏｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ  ｃｏｍｐｌｅｘ，ＭＨＣ）のペプチド結合溝に結合したペプチド（ｐｅｐｔｉｄｅ−ＭＨＣ  ｃｏｍｐｌｅｘ，  ｐＭＨＣ）を認識することで、自己と非自己を識別するとともに抗原ペプチドを認識している（Cell  1994,  76,  287-299）。
【００２４】
ＴＣＲ遺伝子は、ゲノム上では異なる領域にコードされた多数のＶ領域（ｖａｒｉａｂｌｅ  ｒｅｇｉｏｎ、Ｖ）、Ｊ領域（ｊｏｉｎｉｎｇ  ｒｅｇｉｏｎ、Ｊ）、Ｄ領域（ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｒｅｇｉｏｎ、Ｄ）と定常領域のＣ領域（ｃｏｎｓｔａｎｔ  ｒｅｇｉｏｎ，  Ｃ）から成る。Ｔ細胞の分化過程において、これら遺伝子断片が様々な組み合わせで遺伝子再構成され、α鎖およびγ鎖ＴＣＲはＶ−Ｊ−Ｃから成る遺伝子を、β鎖およびδ鎖ＴＣＲはＶ−Ｄ−Ｊ−Ｃから成る遺伝子を発現する。これら遺伝子断片の再構成により多様性が創出されるとともに、ＶとＤあるいはＤとＪ遺伝子断片の間に１つ以上の塩基の挿入や欠失が起こることにより、ランダムなアミノ酸配列が形成され、より多様性の高いＴＣＲ遺伝子配列が作り出されている。
【００２５】
ＴＣＲ分子とｐＭＨＣ複合体表面が直接結合する領域（ＴＣＲフットプリント）は、Ｖ領域内の多様性に富んだ相補性決定領域（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ  ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ  ｒｅｇｉｏｎ、ＣＤＲ）ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３領域から構成される。中でもＣＤＲ３領域はＶ領域の一部、ランダム配列により形成されるＶ−Ｄ領域（α鎖およびγ鎖）またはＶ−Ｄ−Ｊ領域（β鎖およびδ鎖）とＪ領域の一部を含み、最も多様性に富んだ抗原認識部位を形成している。一方、他の領域はＦＲ（ｆｒａｍｅｗｏｒｋ  ｒｅｇｉｏｎ）と呼ばれ、ＴＣＲ分子の骨格となる構造を形成する役割を果たしている。胸腺におけるＴ細胞の分化成熟過程において、β鎖ＴＣＲが最初に遺伝子再構成され、ｐＴα分子と会合してｐｒｅ−ＴＣＲ複合体分子を形成する。その後、α鎖ＴＣＲが再構成され、αβＴＣＲ分子が形成されるとともに、機能的αβＴＣＲが形成されない場合はもう一方のα鎖ＴＣＲ遺伝子アレルにおいて再構成が起こる。胸腺における正・負の選択を受け、適切な親和性をもったＴＣＲが選択され、抗原特異性を獲得することが知られる（Annual  Review  Immunology,  1993,  6,309-326）。
【００２６】
Ｔ細胞は、特定の抗原に対し高い特異性を持った１種類のＴＣＲを産生する。生体には多数の抗原特異的Ｔ細胞が存在することで、多様なＴＣＲレパートリー（レパトア）が形成され、様々な病原体に対する防御機構として有効に機能することができる。
【００２７】
本明細書において、「高機能ＴＣＲ」とは、ある抗原に対して結合性を有するＴＣＲのうち、他のＴＣＲよりも高い結合性を持つＴＣＲをいい、あるＴＣＲが高機能ＴＣＲかどうかは、例えば、そのＴＣＲを発現させた細胞を一定濃度（例えば、１０μｇ／ｍｌ）の抗原テトラマー−ＰＥ複合体とインキュベートした後に、ＴＣＲαβ陽性細胞におけるＭＦＩ（平均蛍光強度）が一定の数値（例えば、５０００）を超えるような親和性でその抗原と結合することができるかを測定することで判定することができる。
【００２８】
（２．好ましい実施形態）
以下に本開示の好ましい実施形態を説明する。以下に提供される実施形態は、本開示のよりよい理解のために提供されるものであり、本開示の範囲は以下の記載に限定されるべきでないことが理解される。従って、当業者は、本明細書中の記載を参照して、本開示の範囲内で適宜改変を行うことができることは明らかである。また、本開示の以下の実施形態は単独でも使用されあるいはそれらを組み合わせて使用することができることが理解される。
【００２９】
また、以下で説明する実施の形態は、いずれも包括的または具体的な例を示すものである。以下の実施の形態で示される数値、形状、材料、構成要素、構成要素の配置位置及び接続形態、ステップ、ステップの順序などは、一例であり、請求の範囲を限定する主旨ではない。また、以下の実施の形態における構成要素のうち、最上位概念を示す独立請求項に記載されていない構成要素については、任意の構成要素として説明される。
【００３０】
（２．１．１．改変ＴＡＬＥＮ）
本発明の１つの局面において、ＤＮＡ結合ドメインおよび機能ドメインを含むポリペプチドまたは該ポリペプチドをコードする核酸を含む、ＴＣＲ遺伝子を編集するための組成物が提供される。ＤＮＡ結合ドメインと機能ドメインとは別個に提供されてもよい。そのため、本発明の１つの実施形態においては、ＤＮＡ結合ドメインを含むポリペプチドをコードする核酸を含む、ＴＣＲ遺伝子を編集するための組成物であって、機能ドメインを含むポリペプチドをコードする核酸と組み合わせて用いられることを特徴とする、組成物が提供される。あるいは、機能ドメインを含むポリペプチドをコードする核酸を含む、ＴＣＲ遺伝子を編集するための組成物であって、ＤＮＡ結合ドメインを含むポリペプチドをコードする核酸と組み合わせて用いられることを特徴とする、組成物が提供される。さらなる実施形態においては、ＤＮＡ結合ドメインを含むポリペプチドをコードする核酸と、機能ドメインを含むポリペプチドをコードする核酸とを含む、ＴＣＲ遺伝子を編集するための組み合わせ物が提供される。本発明におけるゲノム編集酵素は、好ましくはＴＡＬＥＮであり、より好ましくはＰｌａｔｉｎｕｍ  ＴＡＬＥＮである。
【００３１】
Ｐｌａｔｉｎｕｍ  ＴＡＬＥＮは、ＴＡＬＥＮのＤＮＡ結合リピートに含まれる３４アミノ酸のうち、４番目と３２番目のアミノ酸にバリエーションをもたせた周期的配置にすることで、Ｖｏｙｔａｓ  ＴＡＬＥＮよりも活性を上昇させている（Ｓａｋｕｍａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｃｉ  Ｒｅｐ，  ２０１３）。本開示の方法において、好ましくは、Ｐｌａｔｉｎｕｍ  ＴＡＬＥＮを用いて内因性ＴＣＲ遺伝子を編集する。Ｐｌａｔｉｎｕｍ  ＴＡＬＥＮについては、特開２０１６−１７５９２２に記載されており、その内容の全体は本明細書において参考として援用される。本開示の改変ＴＡＬＥＮは、例えば、以下に記載するような特徴を有するものであり得る。
【００３２】
本開示の１つの実施形態では、機能ドメインによる機能の高さとＤＮＡ配列に対する認識特異性の高さを両立し、所望の機能を高確率で安全に発揮させることができ、しかも、簡便な操作で作製することができるポリペプチドまたはそれをコードする核酸を用いて内因性ＴＣＲ遺伝子の改変を行う。
【００３３】
ＤＮＡ結合ドメインと機能ドメインが、３５〜５５のアミノ酸からなるポリペプチドにより接続され、かつ、ＤＮＡ結合ドメインに含まれるＤＮＡ結合モジュールにおける２つの特定の位置のアミノ酸が、４つのＤＮＡ結合モジュールごとに異なる繰り返し様式を呈するポリペプチドは、機能ドメインによる機能の高さとＤＮＡ配列に対する認識特異性の高さを両立することができる。当該ポリペプチドを発現させるためのベクターは、特定の特徴を有するベクターセット、および特定の特徴を有するベクターライブラリーを用いることによって簡便に作製することができる。
【００３４】
本開示の１つの実施形態において、本発明は、ＤＮＡ結合ドメインおよび機能ドメインを含むポリペプチドを利用することができる。このポリペプチドでは、ＤＮＡ結合ドメインと機能ドメインは、３５〜５５のアミノ酸からなるポリペプチドにより接続されており、ＤＮＡ結合ドメインは、複数のＤＮＡ結合モジュールをＮ末端側から連続的に含み、Ｎ末端から４ｎ−３番目のＤＮＡ結合モジュールにおけるｘ番目のアミノ酸とｙ番目のアミノ酸の組合せは、任意のｎに関して同一であり、Ｎ末端から４ｎ−２番目のＤＮＡ結合モジュールにおけるｘ番目のアミノ酸とｙ番目のアミノ酸の組合せは、任意のｎに関して同一であり、Ｎ末端から４ｎ−１番目のＤＮＡ結合モジュールにおけるｘ番目のアミノ酸とｙ番目のアミノ酸の組合せは、任意のｎに関して同一であり、Ｎ末端から４ｎ番目のＤＮＡ結合モジュールにおけるｘ番目のアミノ酸とｙ番目のアミノ酸の組合せは、任意のｎに関して同一であり、Ｎ末端から４ｎ−３番目のＤＮＡ結合モジュールにおけるｘ番目のアミノ酸とｙ番目のアミノ酸の組合せ、Ｎ末端から４ｎ−２番目のＤＮＡ結合モジュールにおけるｘ番目のアミノ酸とｙ番目のアミノ酸の組合せ、Ｎ末端から４ｎ−１番目のＤＮＡ結合モジュールにおけるｘ番目のアミノ酸とｙ番目のアミノ酸の組合せ、およびＮ末端から４ｎ番目のＤＮＡ結合モジュールにおけるｘ番目のアミノ酸とｙ番目のアミノ酸の組合せは、互いに異なり、ここで、ｎは、１〜１０の自然数であり、ｘは、１〜４０の自然数であり、ｙは、１〜４０の自然数であり、ｘとｙは、異なる自然数である、ポリペプチドまたはそれをコードする核酸を用いることができる。機能ドメインは、ＤＮＡ切断ドメインであり得る。ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む。
【００３５】
本発明はまた、上記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むベクターを作製するためのベクターライブラリーを利用することができ、ここで、ベクターライブラリーは、５’末端から順に、第１の制限酵素切断部位、４つのＤＮＡ結合モジュールをコードするポリヌクレオチド、および第２の制限酵素切断部位を有する複数のベクターによって構成され、ここで、第１の制限酵素切断部位および第２の制限酵素切断部位の組合せは、Ａ型の制限酵素切断部位およびＢ型の制限酵素切断部位の組合せ、Ａ型の制限酵素切断部位およびＣ型の制限酵素切断部位の組合せ、Ａ型の制限酵素切断部位およびＤ型の制限酵素切断部位の組合せ、Ａ型の制限酵素切断部位およびＥ型の制限酵素切断部位の組合せ、Ｂ型の制限酵素切断部位およびＣ型の制限酵素切断部位の組合せ、Ｃ型の制限酵素切断部位およびＤ型の制限酵素切断部位の組合せ、ならびにＤ型の制限酵素切断部位およびＥ型の制限酵素切断部位の組合せのいずれかであり、ここで、Ａ型の制限酵素切断部位〜Ｅ型の制限酵素切断部位は、同一の制限酵素による切断によって、いずれも、互いに異なる切断末端を生じさせるものであり、４つのＤＮＡ結合モジュールのうち、５’末端から１番目のＤＮＡ結合モジュールにおけるｘ番目のアミノ酸とｙ番目のアミノ酸の組合せは、任意のベクターに関して同一であり、５’末端から２番目のＤＮＡ結合モジュールにおけるｘ番目のアミノ酸とｙ番目のアミノ酸の組合せは、任意のベクターに関して同一であり、５’末端から３番目のＤＮＡ結合モジュールにおけるｘ番目のアミノ酸とｙ番目のアミノ酸の組合せは、任意のベクターに関して同一であり、５’末端から４番目のＤＮＡ結合モジュールにおけるｘ番目のアミノ酸とｙ番目のアミノ酸の組合せは、任意のベクターに関して同一であり、５’末端から１番目のＤＮＡ結合モジュールにおけるｘ番目のアミノ酸とｙ番目のアミノ酸の組合せ、５’末端から２番目のＤＮＡ結合モジュールにおけるｘ番目のアミノ酸とｙ番目のアミノ酸の組合せ、５’末端から３番目のＤＮＡ結合モジュールにおけるｘ番目のアミノ酸とｙ番目のアミノ酸の組合せ、および５’末端から４番目のＤＮＡ結合モジュールにおけるｘ番目のアミノ酸とｙ番目のアミノ酸の組合せは、互いに異なり、ここで、ｘは、１〜４０の自然数であり、ｙは、１〜４０の自然数であり、ｘとｙは、異なる自然数である。
【００３６】
本発明はさらに、上記ベクターライブラリーを作製するためのベクターセットを利用することができる。ここで、このベクターセットは、５’末端から順に、１番目の制限酵素切断部位、ＤＮＡ結合モジュール、および２番目の制限酵素切断部位を含む複数のベクターを含み、１番目の制限酵素切断部位、および２番目の制限酵素切断部位は、同一の制限酵素による切断によって、互いに異なる切断末端を生じさせるものであり、ＤＮＡ結合モジュールにおけるｘ番目のアミノ酸とｙ番目のアミノ酸の組合せは、４つの異なる組合せのいずれかであり、ここで、ｘは、１〜４０の自然数であり、ｙは、１〜４０の自然数であり、ｘとｙは、異なる自然数である。
【００３７】
上記ポリペプチドは、機能ドメインによる高い機能を実現すると同時に、ＤＮＡ配列に対する高い認識特異性を実現するため、上記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むベクターを細胞に導入することによって、安全に、かつ高確率で、所望のＴＣＲ遺伝子の改変を実現することができる。また、上記ベクターライブラリーを用いれば、機能ドメインによる高い機能とＤＮＡ配列に対する高い認識特異性を両立するポリペプチド発現用ベクターを、簡便かつ迅速に調製することができる。
【００３８】
ＤＮＡ結合ドメインの由来としては、植物病原菌ＸａｎｔｈｏｍｏｎａｓのＴＡＬＥ（Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ａｃｔｉｖａｔｏｒ−Ｌｉｋｅ  Ｅｆｆｅｃｔｏｒ）、ジンクフィンガー（Ｚｉｎｃ  ｆｉｎｇｅｒ）などが挙げられる。
【００３９】
機能ドメインとしては、酵素、転写調節因子、レポータータンパク質などをコードするドメインが挙げられる。酵素としては、リコンビナーゼ、ヌクレアーゼ、リガーゼ、キナーゼ、フォスファターゼなどのＤＮＡ修飾酵素；ラクタマーゼなどのその他の酵素が挙げられる。本明細書においては、ヌクレアーゼをコードするドメインを、ＤＮＡ切断ドメインと称する。転写調節因子としては、アクチベーター、リプレッサーなどが挙げられる。レポータータンパク質としては、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、ヒト化ウミシイタケ緑色蛍光タンパク質（ｈｒＧＦＰ）、増強緑色蛍光タンパク質（ｅＧＦＰ）、増強青色蛍光タンパク質（ｅＢＦＰ）、増強シアン蛍光タンパク質（ｅＣＦＰ）、増強黄色蛍光タンパク質（ｅＹＦＰ）、赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰまたはＤｓＲｅｄ）、ｍＣｈｅｒｒｙなどの蛍光タンパク質；ホタルルシフェラーゼ、ウミシイタケルシフェラーゼなどの生物発光タンパク質；アルカリホスファターゼ、ペルオキシダーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、β−ガラクトシダーゼなどの化学発光基質を変換する酵素などが挙げられる。ＤＮＡ切断ドメインは、好ましくは、他のＤＮＡ切断ドメインと接近して多量体を形成し、向上したヌクレアーゼ活性を取得するものである。このようなＤＮＡ切断ドメインとしては、ＦｏｋＩに由来するものなどが挙げられる。
【００４０】
ＤＮＡ結合ドメインと機能ドメインは、３５〜５５、好ましくは、４０〜５０、より好ましくは、４５〜４９、最も好ましくは、４７のアミノ酸からなるポリペプチドにより接続されている。
【００４１】
ＤＮＡ結合ドメインは、複数のＤＮＡ結合モジュールをＮ末端側から連続的に含み得る。１つのＤＮＡ結合モジュールは、１つの塩基対を特異的に認識する。ＤＮＡ結合ドメインに含まれるＤＮＡ結合モジュールの数は、機能ドメインの機能の高さとＤＮＡ配列認識特異性の高さの両立性の観点から、好ましくは、８〜４０、より好ましくは、１２〜２５、さらにより好ましくは、１５〜２０である。ＤＮＡ結合モジュールとしては、たとえば、ＴＡＬエフェクターリピート（ｅｆｆｅｃｔｏｒ  ｒｅｐｅａｔ）などが挙げられる。１つのＤＮＡ結合モジュールの長さとしては、例えば、２０〜４５、３０〜３８、３２〜３６、または３４などが挙げられる。ＤＮＡ結合ドメインに含まれるＤＮＡ結合モジュールの長さは、好ましくは、全てのＤＮＡ結合モジュールに関して同一である。ＤＮＡ結合モジュールとしては、例えば、LTPDQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQDHG（配列番号１）の配列が挙げられる。例えば、本配列の１２番目のアミノ酸と１３番目のアミノ酸が、順にＨ、Ｄである場合には、当該ＤＮＡ結合ドメインは、塩基としてＣを認識し、順にＮ、Ｇである場合には、当該ＤＮＡ結合ドメインは、塩基としてＴを認識し、順にＮ、Ｉである場合には、当該ＤＮＡ結合ドメインは、塩基としてＡを認識し、順にＮ、Ｎである場合には、当該ＤＮＡ結合ドメインは、塩基としてＧを認識すると考えられる。また、ＤＮＡ結合モジュールとしては、例えば、配列番号１のアミノ酸配列と、８５％、９０％、９５％、または９７％の同一性を有し、１つの塩基対を認識する機能を実質的に保持するポリペプチドが挙げられる。
【００４２】
Ｎ末端から４ｎ−３番目のＤＮＡ結合モジュールにおけるｘ番目のアミノ酸とｙ番目のアミノ酸の組合せは、任意のｎに関して同一であり得る。また、Ｎ末端から４ｎ−２番目のＤＮＡ結合モジュールにおけるｘ番目のアミノ酸とｙ番目のアミノ酸の組合せは、任意のｎに関して同一であり得る。また、Ｎ末端から４ｎ−１番目のＤＮＡ結合モジュールにおけるｘ番目のアミノ酸とｙ番目のアミノ酸の組合せは、任意のｎに関して同一であり得る。また、Ｎ末端から４ｎ番目のＤＮＡ結合モジュールにおけるｘ番目のアミノ酸とｙ番目のアミノ酸の組合せは、任意のｎに関して同一であり得る。ここで、ｎは、１〜１０の自然数、好ましくは、１〜７の自然数、より好ましくは、１〜５の自然数であり得る。ｎは、好ましくは、ＤＮＡ結合ドメインに含まれるＤＮＡ結合モジュールの全てを指し示すに足りる自然数である。また、ｘは、１〜４０の自然数、好ましくは、１〜１０の自然数、より好ましくは、２〜６の自然数、さらにより好ましくは、３〜５の自然数、最も好ましくは、自然数４である。また、ｙは、１〜４０の自然数、好ましくは、２５〜４０の自然数、より好ましくは、３０〜３６の自然数、さらにより好ましくは、３１〜３３の自然数、最も好ましくは、自然数３２である。ｘとｙは、異なる自然数である。ｘおよびｙの数値は、用いるＤＮＡ結合モジュールの長さによって異なりうる。ｘは、好ましくは、３４のアミノ酸からなるＤＮＡ結合モジュールにおける２番目のアミノ酸に相当する位置を示す数値である。ｙは、好ましくは、３４のアミノ酸からなるＤＮＡ結合モジュールにおける３２番目のアミノ酸に相当する位置を示す数値である。
【００４３】
Ｎ末端から４ｎ−３番目のＤＮＡ結合モジュールにおけるｘ番目のアミノ酸とｙ番目のアミノ酸の組合せ、Ｎ末端から４ｎ−２番目のＤＮＡ結合モジュールにおけるｘ番目のアミノ酸とｙ番目のアミノ酸の組合せ、Ｎ末端から４ｎ−１番目のＤＮＡ結合モジュールにおけるｘ番目のアミノ酸とｙ番目のアミノ酸の組合せ、およびＮ末端から４ｎ番目のＤＮＡ結合モジュールにおけるｘ番目のアミノ酸とｙ番目のアミノ酸の組合せは、互いに異なり得る。ここで、ｎは、１〜１０の自然数、好ましくは、１〜７の自然数、より好ましくは、１〜５の自然数である。ｎは、好ましくは、ＤＮＡ結合ドメインに含まれるＤＮＡ結合モジュールの全てを指し示すに足りる自然数である。また、ｘは、１〜４０の自然数、好ましくは、１〜１０の自然数、より好ましくは、２〜６の自然数、さらにより好ましくは、３〜５の自然数、最も好ましくは、自然数４である。また、ｙは、１〜４０の自然数、好ましくは、２５〜４０の自然数、より好ましくは、３０〜３６の自然数、さらにより好ましくは、３１〜３３の自然数、最も好ましくは、自然数３２である。ｘとｙは、異なる自然数である。好ましくは、Ｎ末端から４ｎ−３番目のＤＮＡ結合モジュールにおけるｘ番目のアミノ酸とｙ番目のアミノ酸の組合せ、Ｎ末端から４ｎ−２番目のＤＮＡ結合モジュールにおけるｘ番目のアミノ酸とｙ番目のアミノ酸の組合せ、およびＮ末端から４ｎ番目のＤＮＡ結合モジュールにおけるｘ番目のアミノ酸とｙ番目のアミノ酸の組合せは、それぞれ、ｘとｙの順にＤとＤの組合せ、ＥとＡの組合せ、ＤとＡの組合せ、およびＡとＤの組合せからなる群から選ばれ得る。
【００４４】
使用され得るベクターとしては、プラスミドベクター、コスミドベクター、ウイルスベクター、人工染色体ベクターなどが挙げられる。人工染色体ベクターとしては、酵母人工染色体ベクター（ＹＡＣ）、細菌人工染色体ベクター（ＢＡＣ）、Ｐ１人工染色体ベクター（ＰＡＣ）、マウス人工染色体ベクター（ＭＡＣ）、ヒト人工染色体ベクター（ＨＡＣ）が挙げられる。また、ベクターの成分としては、ＤＮＡ、ＲＮＡなどの核酸、ＧＮＡ、ＬＮＡ、ＢＮＡ、ＰＮＡ、ＴＮＡなどの核酸アナログなどが挙げられる。ベクターは、糖類などの核酸以外の成分によって修飾されていてもよい。
【００４５】
ベクターを、細胞などに導入して、発現させることによって、上記ポリペプチドを調製することができる。また、ベクターを、細胞などに導入して、発現させることによって、細胞内において、ＤＮＡ組換え、ＤＮＡ切断などのＤＮＡ修飾；転写調節などのその他の酵素活性の発現；レポータータンパク質によるＤＮＡ領域の標識化などの機能ドメインに応じた所望の機能を発揮させることができる。機能ドメインがＤＮＡ切断ドメインである場合には、複数の、好ましくは、２つのベクターを、細胞などに導入して、発現させることによって、ベクターを導入した細胞のゲノムＤＮＡ上において塩基配列特異的な二本鎖切断を生じさせることができ、細胞のゲノム上に変異を導入することができる。ベクターを導入する細胞の由来としては、ショウジョウバエ、ゼブラフィッシュ、マウスなどの哺乳類などの動物、シロイヌナズナなどの植物、ＥＳ細胞、ｉＰＳ細胞などの培養細胞などが挙げられる。
【００４６】
（２．１．２．改変ＴＡＬＥＮの製造スキーム）
ある認識配列に対応するＰｌａｔｉｎｕｍ  ＴＡＬＥＮは、予め用意したか、または新たに作製したベクターライブラリー中のベクターを組み合わせて、Ｐｌａｔｉｎｕｍ  ＴＡＬＥＮをコードする核酸を調製することによって製造することができる。例えば、Ｐｌａｔｉｎｕｍ  ＴＡＬＥＮの作製キット（Ｐｌａｔｉｎｕｍ  Ｇａｔｅ  ＴＡＬＥＮ  Ｋｉｔ、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ａｄｄｇｅｎｅ．ｏｒｇ／ｋｉｔｓ／ｙａｍａｍｏｔｏ−ｐｌａｔｉｎｕｍｇａｔｅ／）を用いて所望の認識配列に対応するＰｌａｔｉｎｕｍ  ＴＡＬＥＮを製造することができる。新規にＰｌａｔｉｎｕｍ  ＴＡＬＥＮのベクターセットを立ち上げる場合、図２０に示される作製スキームに従って製造することができる。
【００４７】
ベクターライブラリー中の各ベクターは、例えば、４つのＤＮＡ結合モジュールを含み得る。１つのベクター中の４つのＤＮＡ結合モジュールは、上記のようなＰｌａｔｉｎｕｍ  ＴＡＬＥＮの周期的な配列の変化（例えば、結合モジュールの４番目および３２番目のアミノ酸の変化）の一周期分の変化を有し得る。各ＤＮＡ結合モジュールは、有するＲＶＤに応じて対応する認識塩基が規定される。４つのＤＮＡ結合モジュールによって認識され得る塩基配列は、４４＝２５６通りの配列が存在し得、４塩基配列を認識するベクターが網羅的にベクターライブラリー中に存在してよいが、所望の結合ドメインの作製に必要なもののみが存在すれば十分である。
【００４８】
具体的には、所望の認識配列に結合するＤＮＡ結合ドメインに含まれるＤＮＡ結合モジュールの配列に対応するベクターを、ベクターライブラリーから選択し、選択したベクターを、Ａ型の制限酵素切断部位〜Ｅ型の制限酵素切断部位を切断する制限酵素によって消化して、消化によって得られたベクター断片を接続することによって、ＤＮＡドメインをコードするベクターを作製することができる。ベクターライブラリーを構成する全てのベクターは、同一の制限酵素によって切断される制限酵素切断部位を２つ有し、かつ、その制限酵素切断部位は、当該酵素による切断によって互いに異なる切断末端を生じさせる。したがって、Ｐｌａｔｉｎｕｍ  ＴＡＬＥＮをコードするベクターの作製において、選択したベクターの消化、およびベクター断片の接続は、それぞれ、同一の反応液において行うことができる。そのため、ベクターライブラリーを用いて、極めて簡便に、Ｐｌａｔｉｎｕｍ  ＴＡＬＥＮをコードするベクターを作製することができる。
【００４９】
なお、制限酵素切断部位についてのＡ型〜Ｅ型は、制限酵素切断部位の性質の相違を示すために本明細書において便宜的に設定した表記である。型が異なる場合には、制限酵素切断部位の性質が互いに異なり、および型が同一である場合には、制限酵素切断部位の性質が共通であることを示す。ベクターライブラリーにおいて、Ａ型の制限酵素切断部位〜Ｅ型の制限酵素切断部位は、同一の制限酵素によって切断されるものである。また、Ａ型の制限酵素切断部位〜Ｅ型の制限酵素切断部位は、同一の制限酵素による切断によって、いずれも、互いに異なる切断末端を生じさせるものである。このような制限酵素切断部位としては、制限酵素による認識部位に隣接する任意の部位を切断する制限酵素（たとえば、ＢｓａＩ、ＢｂｓI、ＢｓｍＢＩなど）による切断部位が挙げられる。
【００５０】
５’末端から１番目のＤＮＡ結合モジュールにおけるｘ番目のアミノ酸とｙ番目のアミノ酸の組合せは、ベクターライブラリーを構成する任意のベクターに関して同一である。同様に、５’末端から２番目のＤＮＡ結合モジュールにおけるｘ番目のアミノ酸とｙ番目のアミノ酸の組合せは、ベクターライブラリーを構成する任意のベクターに関して同一である。また、５’末端から３番目のＤＮＡ結合モジュールにおけるｘ番目のアミノ酸とｙ番目のアミノ酸の組合せは、ベクターライブラリーを構成する任意のベクターに関して同一である。また、５’末端から４番目のＤＮＡ結合モジュールにおけるｘ番目のアミノ酸とｙ番目のアミノ酸の組合せは、ベクターライブラリーを構成する任意のベクターに関して同一である。
【００５１】
（２．２．内因性ＴＣＲ遺伝子の除去）
（２．２．１  内因性ＴＣＲの除去の機構）
本発明の改変ＴＡＬＥＮは、内因性ＴＣＲを除去するために用いることができる。以下、内因性ＴＣＲの除去について説明する。
【００５２】
ＴＣＲの導入においては、内因性ＴＣＲを除去することが好ましい場合がある。内因性ＴＣＲが存在する場合、ＴＣＲの導入により、混合ダイマーが形成され、新規の抗原反応性が出現し得ることが、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ．  ２０１０  Ｊｕｎ  １５；１０７（２４）：１０９７２−７（ＰＭＩＤ：２０５３４４６１）において報告されている。
【００５３】
ＴＣＲ混合ダイマー（内因性ＴＣＲ鎖と外因性ＴＣＲ鎖の対）が形成されると、導入したＴＣＲ鎖および内因性ＴＣＲ鎖の発現が減少し特異的な反応性が損なわれるのみではなく、この混合ダイマーは、潜在的に有害な特異性を有している可能性がある。上記文献において、ＴＣＲの導入によって新規の反応性が出現し、ほとんどの新規の反応性はアロ−ＨＬＡ反応性であったものの、自己反応活性を有するものも見出されたことが報告されている。また、Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  Ｒｅｐ．  ２０１０  Ｄｅｃ；３７（８）：３９５１−６（ＰＭＩＤ：２０３７３０２７）においては、ミスペアリングによって生じたＴＣＲを定量的に検出する技術としてＦＲＥＴ法が記載されている。
【００５４】
内因性ＴＣＲの除去は、内因性ＴＣＲ遺伝子の改変によって行うことができる。内因性ＴＣＲの除去は、例えば、内因性ＴＣＲ遺伝子のノックダウンによって行うことができ、アンチセンス法や、ＲＮＡｉなどを利用することができる。内因性ＴＣＲの除去はまた、内因性ＴＣＲ遺伝子のノックアウトによって行うことができる。内因性ＴＣＲ遺伝子の改変は、例えば、コード領域の全部または一部の欠失、調節領域への変異の導入、ナンセンスまたはミスセンス変異の導入などによって行うことができる。
【００５５】
好ましくは、ゲノム編集技術を用いて内因性ＴＣＲ遺伝子の改変を行うことができる。ゲノム編集は、部位特異的なヌクレアーゼを利用して、標的遺伝子を改変する技術である。ゲノム編集技術としては、ＺＦＮ、ＴＡＬＥＮ、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９等が挙げられる。それぞれ所望の配列へのＤＮＡ配列特異的な結合を実現する結合ドメインと、所望の配列の部位でＤＮＡを切断する切断ドメインを有する。
【００５６】
ＺＦＮはジンクフィンガードメインとＤＮＡ切断ドメインを含む人工制限酵素である。ジンクフィンガードメインは任意のＤＮＡ塩基配列を認識するように改変可能で、これによってジンクフィンガーヌクレアーゼが複雑なゲノム中の単一の配列を標的とすることが可能となる。
【００５７】
ＣＲＩＳＰＲ（Ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ  Ｒｅｇｕｌａｒｌｙ  Ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ  Ｓｈｏｒｔ  Ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ  Ｒｅｐｅａｔｓ）／Ｃａｓ９  （Ｃｒｉｓｐｒ  ＡＳｓｏｃｉａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ９）システムは、ＺＦＮ、ＴＡＬＥＮが基本的に一つのタンパク質として使用されるのに対して、ガイドＲＮＡとＣａｓ９の２つの別々の分子を含む。ＤＮＡの標的部位と相補的な配列をガイドＲＮＡに含めることにより、ガイドＲＮＡは標的部位に特異的に結合できる。そうするとガイドＲＮＡとＤＮＡを覆うようにＣａｓ９タンパク質が結合して、ＤＮＡを切断する。Ｃａｓ９自体は使い回しができて、標的部位によってガイドＲＮＡだけを作成すれば済むため、多重化が容易であるとされる。
【００５８】
ＴＡＬＥＮ（転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ）は、制限酵素であるＦｏｋＩをＤＮＡ切断ドメインとして、植物病原細菌キサントモナス属（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ）から分泌されるＴＡＬＥタンパク質のＤＮＡ結合ドメインを融合させた人工酵素である。ＴＡＬＥタンパク質のＤＮＡ結合ドメインは３４個程度のアミノ酸の繰返し構造をとっている。この繰返しの単位をモジュールとよぶ。その中で、アミノ酸第１２位と１３位が可変となっており、標的配列と結合する部分で「反復可変二残基」（ＲＶＤ）と呼ばれる。ＴＡＬＥＮは、Ｌ  ＴＡＬＥＮとＲ  ＴＡＬＥＮのペアとして、標的ＤＮＡの反対鎖にそれぞれ結合する分子を用いる。ＦｏｋＩが切断活性を示すためにはＴＡＬＥＮが、適切な距離を維持して二量体を形成する必要がある。ＴＡＬＥＮにおけるミスマッチ寛容やオフターゲット活性はほとんど報告されておらず、高い特異性が特徴である。Ｔ細胞の改変にあたり、オフターゲットでの改変が生じた場合、予期しない有害作用を引き起こし得ることから、高い特異性を有するＴＡＬＥＮを用いることは、本開示において好ましい。
【００５９】
従来型のＴＡＬＥＮに加えて、様々な改変ＴＡＬＥＮが作製されている。このようなＴＡＬＥＮにより内因性ＴＣＲ遺伝子の改変を行うことは、高い特異性および改変効率の高さから好ましい。本明細書の実施例においては、改変ＴＡＬＥＮを用いて、Ｔ細胞の内因性ＴＣＲの完全な除去が実現できたことが実証されている。
【００６０】
改変ＴＡＬＥＮの一部の例は図１７に示される。例えば、ＳｕｐｅｒＴＡＬＥＮは、モジュールの４番目と３２番目のアミノ酸が改変されており、特定の改変型リピートのみをアセンブルして使用している（ＰＣＴ／ＪＰ２０１４／０７１１１６、その全体が本明細書において参考として援用される）。このＳｕｐｅｒＴＡＬＥＮによって改変する２つのアミノ酸を、ＥとＡとに改変したものが、Ｚｈａｎｇ  ＴＡＬＥＮ（ＥＡ型のＳｕｐｅｒＴＡＬＥＮ）であり、図１７に示されるＥＡ型の他、ＱＡ型によっても活性が上昇することが報告されている。
【００６１】
（２．２．２  改変ＴＡＬＥＮの標的）
本開示のゲノム編集酵素（改変ＴＡＬＥＮともいう。）は、ＴＣＲ遺伝子を標的とするように設計され得る。したがって、ＤＮＡ結合ドメインは、ＴＣＲα遺伝子またはＴＣＲβ遺伝子に特異的に結合し得る。ＴＣＲ遺伝子上でＤＮＡ結合ドメインが結合する部分については、例えば、ＴＲＡＣ  エクソン１、ＴＲＢＣ１  エクソン１、またはＴＲＢＣ２  エクソン１などが挙げられるが、これらに限定されるものではない。上記のとおり、ＤＮＡ結合ドメインは、各モジュールに存在するＲＶＤを選択することで、所望の配列に対して特異性を有するように設計することが可能であり、本明細書に開示される任意の標的配列に対して、当業者は特異的なＤＮＡ結合ドメインを設計することができる。
【００６２】
ＤＮＡ結合ドメインは、例えば、以下：
【化１】
2019073964.tif 000002
のような配列を標的として設計することができる。本明細書の実施例２において、このような位置を標的としたＤＮＡ結合ドメインを有するゲノム編集酵素によって内因性ＴＣＲ遺伝子を除去することができたことが実証されている。なお、各標的配列の左端のＴの塩基は、ＴＡＬＥのＮ末ドメイン（ＤＮＡ結合リピートの外側の領域）によって認識されるＴである。このＴの塩基は、「ＤＮＡ結合リピートの認識配列」としては含まれないと考えられるが、「ＴＡＬＥＮの標的配列」としては含まれると考えられる。
【００６３】
例えば、上記のような配列を標的とするＰｌａｔｉｎｕｍ  ＴＡＬＥＮのＤＮＡ結合ドメインは、以下のようなパターン配列を有するものが挙げられる。このようなＤＮＡ結合ドメインを有するＴＡＬＥＮを用いて、Ｔ細胞の内因性ＴＣＲ遺伝子を成功裡に除去できたことが本明細書の実施例２において実証されている。なお、ＤＮＡ結合モジュールの最終リピートはｈａｌｆ  ｒｅｐｅａｔと呼ばれるトランケート型のリピートになっている。
【化２】
2019073964.tif 000003
【化３】
2019073964.tif 000004
【化４】
2019073964.tif 000005
【化５】
2019073964.tif 000006
【化６】
2019073964.tif 000007
【化７】
2019073964.tif 000008
【００６４】
本開示において、ＴＣＲα遺伝子を標的化するためのＴＡＬＥＮプラスミドの例としては、ＴＡＬＥＮ−ＴＣＲ−ａｌｐｈａ２＿Ｌ１９（配列番号４６）およびＴＡＬＥＮ−ＴＣＲ−ａｌｐｈａ２＿Ｒ１９（配列番号４７）が挙げられる。これらの配列は、対として使用することができる。
【００６５】
本開示において、ＴＣＲβ遺伝子を標的化するためのＴＡＬＥＮプラスミドの例としては、ＴＡＬＥＮ−ＴＣＲ−ｂｅｔａ１＿Ｌ１９（配列番号４８）およびＴＡＬＥＮ−ＴＣＲ−ｂｅｔａ１＿Ｒ１９（配列番号４９）の対、またはＴＡＬＥＮ−ＴＣＲ−ｂｅｔａ３＿Ｌ１９（配列番号５０）およびＴＡＬＥＮ−ＴＣＲ−ｂｅｔａ３＿Ｒ１９（配列番号５１）の対が挙げられる。
【００６６】
本開示において、具体的に示される配列については、所望の活性を維持する限りで改変を加えたものを使用できることに留意すべきである。例えば、本開示において、具体的に示された配列に対して、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％または少なくとも約９９％の同一性を有する配列を使用できる。
【００６７】
改変アミノ酸配列は、１または複数個（好ましくは１もしくは数個または１、２、３、もしくは４個）の保存的置換を有するアミノ酸配列であってもよい。ここで「保存的置換」とは、タンパク質の機能を実質的に改変しないように、１または複数個のアミノ酸残基を、別の化学的に類似したアミノ酸残基で置き換えることを意味する。例えば、ある疎水性残基を別の疎水性残基によって置換する場合、ある極性残基を同じ電荷を有する別の極性残基によって置換する場合などが挙げられる。このような置換を行うことができる機能的に類似のアミノ酸は、アミノ酸毎に当該分野において公知である。具体例を挙げると、非極性（疎水性）アミノ酸としては、アラニン、バリン、イソロイシン、ロイシン、プロリン、トリプトファン、フェニルアラニン、メチオニンなどが挙げられる。極性（中性）アミノ酸としては、グリシン、セリン、スレオニン、チロシン、グルタミン、アスパラギン、システインなどが挙げられる。陽電荷をもつ（塩基性）アミノ酸としては、アルギニン、ヒスチジン、リジンなどが挙げられる。また、負電荷をもつ（酸性）アミノ酸としては、アスパラギン酸、グルタミン酸などが挙げられる。
【００６８】
複数の遺伝子コドンによって同一のアミノ酸がコードされ得ることから、同一のアミノ酸配列をコードする複数の核酸配列が存在し得、アミノ酸配列のコードを目的とする限りにおいて、異なる核酸配列を利用し得る。
【００６９】
（２．３  抗原特異的制御性Ｔ細胞）
１つの局面では、本開示の改変ＴＡＬＥＮは、内因性ＴＣＲ遺伝子を除去する工程を含む、抗原に特異的な制御性Ｔ細胞を生産する方法に用いることができる。例えば、本開示は、抗原に特異的な制御性Ｔ細胞を生産する方法であって、エフェクターＴ細胞ドナーにおける該抗原に特異的なエフェクターＴ細胞集団において、ＴＣＲレパトアを測定する工程であって、非バイアス的にＴＣＲ遺伝子を増幅することを含む、工程と、該エフェクターＴ細胞集団におけるＴＣＲαおよびＴＣＲβの対を同定する工程と、該同定されたＴＣＲαおよびＴＣＲβの対が、抗原に対する親和性を有するかを確認する工程と、該同定されたＴＣＲαおよびＴＣＲβの対におけるＴＣＲαの核酸配列の全部または一部およびＴＣＲβの核酸配列の全部または一部をクローニングする工程と、改変ＴＡＬＥＮを用いて制御性Ｔ細胞の内因性ＴＣＲ遺伝子を除去する工程と、該制御性Ｔ細胞に、該クローニングされたＴＣＲαの核酸配列の全部または一部およびＴＣＲβの核酸配列の全部または一部を導入する工程であって、該ＴＣＲαおよび該ＴＣＲβが対になって発現されるように導入する工程とを含む、方法を提供する。
【００７０】
１つの好ましい実施形態は、図１８に記載されるようなものである。高機能ＴＣＲを同定し、かかる高機能ＴＣＲをドナーから得られた抗原非特異的ポリクローナル制御性Ｔ細胞に導入する。この際に、Ｐｌａｔｉｎｕｍ  ＴＡＬＥＮを用いて内因性ＴＣＲ遺伝子を編集することができる。好ましくは、上記ＴＣＲが対になって発現されるように、上記ＴＣＲを導入する。得られた抗原特異的モノクローナルまたはオリゴクローナル制御性Ｔ細胞を体外で増幅し、レシピエントに移入する。本開示によって得られた抗原特異的制御性Ｔ細胞は、未知の抗原反応性を有しないため安全であると考えられ、高機能ＴＣＲを使用することによって、高い抗原特異的免疫抑制能力を示すと考えられる。レシピエントは、制御性Ｔ細胞のドナーと同一の個体であってもよく、異なる個体であってもよい。
【００７１】
本開示において、本開示の方法において使用するための任意の物も提供され得る。例えば、本開示において、本開示の方法において使用するための、前記ＴＣＲαおよび前記ＴＣＲβが対となって発現するように構成されるベクターを含む組成物が提供され得る。本開示の方法において使用するための、ＭＨＣテトラマーを含む組成物もまた提供され得る。
【００７２】
さらに、本開示の方法において使用するための、ＤＮＡ結合ドメインおよび機能ドメインを含むポリペプチドまたは該ポリペプチドをコードする核酸を含む組成物であって、該ＤＮＡ結合ドメインは、ＴＣＲ遺伝子に特異的に結合する、組成物もまた提供され得る。
【００７３】
本開示の方法によって同定されるエフェクターＴ細胞集団のＴＣＲレパトアまたはその一部、あるいはそれをコードする核酸もまた本開示の範囲内である。エフェクターＴ細胞集団のＴＣＲレパトアまたはその一部、あるいはそれをコードする核酸を含む、ＴＣＲ改変Ｔ細胞を製造するための組成物もまた提供される。好ましくは、ＴＣＲ改変Ｔ細胞は、ＴＣＲ改変制御性Ｔ細胞を含む。
【００７４】
（２．４  Ｔ細胞内因性ＴＣＲ遺伝子改変）
本開示の１つの局面において、本開示の改変ＴＡＬＥＮは、Ｔ細胞の内因性ＴＣＲ遺伝子を改変する方法において用いることができる。この方法は、好ましくは、内因性ＴＣＲが発現されないようにＴ細胞を改変する工程を含み得る。
【００７５】
かかる工程は、本開示の組成物を細胞に導入することによって行い得る。本開示の改変ＴＡＬＥＮは、ＴＣＲα遺伝子および／またはＴＣＲβ遺伝子を標的化できるため、ＴＣＲα遺伝子およびＴＣＲβ遺伝子のそれぞれに特異的な改変ＴＡＬＥＮを同時に、または逐次的に細胞に導入することができる。逐次的に導入を行う場合、その順序は問わない。したがって、Ｔ細胞を改変する工程は、ＴＣＲα遺伝子に特異的に結合するＤＮＡ結合ドメインを有するポリペプチドまたはそれをコードする核酸を含む組成物を細胞に導入する工程と、ＴＣＲβ遺伝子に特異的に結合するＤＮＡ結合ドメインを有するポリペプチドまたはそれをコードする核酸を含む組成物を細胞に導入する工程とを含み得る。
【００７６】
本開示の別の局面では、Ｔ細胞に外因性のＴＣＲを導入する（例えば、核酸を導入することによって）工程が含まれ得る。本開示の対象となるＴ細胞としては、限定されるものではないが、制御性Ｔ細胞、エフェクターＴ細胞、ヘルパーＴ細胞、ナチュラルキラーＴ細胞（ＮＫＴ細胞）、γδＴ細胞等が挙げられる。制御性Ｔ細胞のＴＣＲの改変／導入は、抗原特異的な免疫寛容を含めた免疫調節につながるため好ましい。ＮＫＴ細胞またはγδＴ細胞は、それら自体が抗原非特異的なキラー活性を有するため、本開示の方法により抗原特異的なＴＣＲαβを導入することは有意義である。例えば、γδＴ細胞については、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ２００９  Ｊａｎ  １；１８２（１）：１６４−７０．（ＰＭＩＤ：  １９１０９１４７）に記載されるように、γδＴ細胞に対してＴＣＲαβを形質導入することにより、抗原特異的なエフェクターＴ細胞を生成することが可能であることが示されており、本開示により同定されるような高機能ＴＣＲをγδＴ細胞に導入することは有効である。
【００７７】
Ｔ細胞またはＴ細胞集団は、常法によって、被験体から得られたサンプル等から単離することができる。例えば、被験体の末梢血、骨髄、腫瘍組織、造血組織、脾臓、正常組織、リンパ液等から行うことができる。末梢血からのサンプル採取は、非侵襲的で簡便であるため、有利であり得る。Ｔ細胞集団の分取は、フローサイトメトリーを用いたソーティングの他、磁気を用いた細胞分離を利用することもできる。
【００７８】
本開示においては、内因性ＴＣＲ遺伝子を改変しようとする第１のＴ細胞と、導入しようとするＴＣＲを有する第２のＴ細胞とを利用し得る。ここで、第１のＴ細胞と第２のＴ細胞とは、同一の被験体から得てもよく、異なる被験体（第１のドナーおよび第２のドナー）から得てもよい。さらに、改変した第１のＴ細胞を用いて同一の被験体への処置を行ってもよく、いずれのドナーとも異なる被験体（レシピエント）への処置を行ってもよい。１つの好ましい実施形態では、第１のＴ細胞は制御性Ｔ細胞であり、第２のＴ細胞はエフェクターＴ細胞である。
【００７９】
本開示の一部の実施形態において、改変されたＴ細胞またはそれを含む組成物が提供される。１つの実施形態では、内因性ＴＣＲ遺伝子を含まない制御性Ｔ細胞が提供される。かかるＴ細胞は、ＴＣＲ遺伝子のミスペアリングを生じず、所望の抗原特異性を安全に付与することができる。
【００８０】
さらなる実施形態では、エフェクターＴ細胞ドナーにおけるエフェクターＴ細胞集団に存在するＴ細胞レセプター（ＴＣＲ）クローンに含まれるＴＣＲα遺伝子の核酸配列の全部または一部およびＴＣＲβ遺伝子の核酸配列の全部または一部を含む、制御性Ｔ細胞が提供される。ドナーにおけるＴ細胞集団に存在するＴ細胞レセプター（ＴＣＲ）クローンは高機能であるといえ、そのようなＴＣＲを有する制御性Ｔ細胞は、抗原特異的な免疫抑制を示すと考えられる。内因性ＴＣＲ遺伝子を含まず、エフェクターＴ細胞ドナーにおけるエフェクターＴ細胞集団に存在するＴ細胞レセプター（ＴＣＲ）クローンに含まれるＴＣＲα遺伝子の核酸配列の全部または一部およびＴＣＲβ遺伝子の核酸配列の全部または一部を含む、制御性Ｔ細胞もまた提供される。
【００８１】
（２．５  Ｔ細胞亜集団の組成の分析）
本開示の改変ＴＡＬＥＮを用いる際に、Ｔ細胞亜集団の組成の分析を行いうる。
【００８２】
サンプルまたはＴ細胞集団中における所望のＴ細胞亜集団の組成は当業者が常法によって測定することができる。一般的には、サンプルまたはＴ細胞集団中の目的とする細胞亜集団を規定するマーカー、または所望の特徴と相関するマーカー（例えば、ＣＤ３）について陽性である細胞の数を、フローサイトメトリーなどを用いて測定することが可能である。また、フローサイトメトリー技術では、同時に所望の細胞亜集団を分取することが可能である。フローサイトメトリーの利点としては、例えば、所望の遺伝子が導入された細胞の占める割合を把握しやすいこと、特異性および感度が高いこと、再現性が高いこと、多数の細胞を解析することができること、所要時間が短いことなどが挙げられる。
【００８３】
フローサイトメーターは、細胞の均一な浮遊液より、浮遊物（細胞）の光学特性を測定する機器である。細胞は液流に乗ってレーザー光の焦点を通過するが、その通過時に毎秒５００〜４，０００個の細胞より前方散乱光、側方散乱光、及び１つ以上の異なる波長の蛍光の光学特性を、個々の細胞について同時に測定し、それら細胞の大きさ、内部構造、及び細胞膜・細胞質・核内に存在する種々の抗原あるいは核酸量等の、生物学的特性を迅速、かつ正確に測定することができる。
【００８４】
散乱光とは、レーザーが細胞に当たって周囲に散乱した光である。前方散乱光（Ｆｏｒｗａｒｄ  Ｓｃａｔｔｅｒ：ＦＳＣ）はレーザー光軸に対して前方で検出し、散乱光強度は細胞の表面積に比例する。すなわち、相対的にＦＳＣの値が大きければ細胞も大きく、ＦＳＣの値が小さければ細胞も小さいと考えられる。側方散乱光（Ｓｉｄｅ  Ｓｃａｔｔｅｒ：ＳＳＣ）はレーザー光軸に対して９０度（直角）の位置で検出し、細胞の顆粒や細胞内構造の状態に散乱光強度が比例する。すなわち、相対的にＳＳＣの値が大きければ細胞の内部構造は複雑であり、ＳＳＣの値が小さければ細胞の内部構造は単純であると考えられる。
【００８５】
フローサイトメトリーの結果は、代表的には、ＦＳＣをＸ軸に、ＳＳＣをＹ軸にとったドットプロットとして表現され得る。各細胞は図の中の一つのドット（点）で示されており、それらの位置は、ＦＳＣとＳＳＣとの相対値によって決められる。比較的サイズが小さく内部構造が単純なリンパ球は左下部に、サイズが大きく内部に顆粒を持つ顆粒球は右上部に、またサイズは大きいが内部構造が単純な単球はリンパ球と顆粒球の間に、それぞれお互いに分離した集団を作って表示される。
【００８６】
蛍光とは、細胞に標識されている蛍光色素が照射されたレーザー光によって励起され、エネルギーを放出する際生じた光をいう。フローサイトメーター（例えば、製品名：Ｂｅｃｔｏｎ  ＆  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ）は、代表的には、４８８ｎｍの単一波長レーザー光と６３５ｎｍの単一波長レーザー光とを照射する。細胞はそれ自体も弱い蛍光を発する性質を有しているが（自家蛍光）、実際に細胞の持つ分子を蛍光を用いて特異的に検出しようとする場合は、あらかじめ何らかの形で細胞あるいはその持つ分子に蛍光色素を結合させる必要がある。例えば、ＦＩＴＣ（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ  ｉｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ）は、４８８ｎｍの励起光を吸収し、主に５３０ｎｍの蛍光（緑色）を発する。抗体にあらかじめＦＩＴＣを標識しておけば、細胞の表面に存在する抗原量に応じて結合する抗体量に差が生じ、その結果ＦＩＴＣの蛍光強度が異なってくるため、その細胞の表面に存在する抗原量を推定することができる。例示的に使用され得るＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒは、異なる蛍光波長域を検出できる４本の蛍光検出器を搭載しており、異なった波長の光を発する複数の蛍光色素を用意しておけば、最大４つの異なる抗原を同時に検出することが可能である。４８８ｎｍの単一波長レーザー光によって励起されるＦＩＴＣ以外の蛍光色素として、ＰＥ（ｐｈｙｃｏｅｒｙｔｈｒｉｎ）は主に５８５ｎｍの蛍光を発し、ＰｅｒＣＰ（ｐｅｒｉｄｉｎｉｎ  ｃｈｌｏｒｏｐｈｙｌｌ  ｐｒｏｔｅｉｎ）およびＰＥ−Ｃｙ５（ｃａｒｂｏｃｙａｎｉｎ−５）は主に６７０ｎｍの蛍光を発する。６３５ｎｍの単一波長レーザー光によって励起される蛍光色素であるＡＰＣ（ａｌｌｏｐｈｙｃｏｃｙａｎｉｎ）は、主に６７０ｎｍの蛍光を発する。これらの蛍光色素が種々の抗体と組み合わされ、細胞の二重染色や三重染色に用いられる。Ｔリンパ球の表面に発現しているＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ２５、ＴＣＲ、細胞内に発現するＦｏｘｐ３分子などを、これらと特異的に反応するモノクローナル抗体で検出することができる。
【００８７】
厳密にいうと、フローサイトメーターには、細胞を解析するだけの機器と、解析した細胞を分取（ソーティング）することが可能な機器の２種類があり、後者は「ＦＡＣＳ」と呼ばれる。本明細書において「ＦＡＣＳ」とは、ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｃｅｌｌ  ｓｏｒｔｅｒの略で、レーザー光線を使ってリンパ球などの遊離細胞の表面抗原の解析をしたり、表面抗原の有無などによって、ある特定の細胞を分取する方法において用いられる装置をいう。
【００８８】
フローサイトメトリーの結果は、ヒストグラム、ドットプロットなどで表すことができる。本明細書において「ヒストグラム」とは、フローサイトメーターを用いた蛍光測定において、各パラメータの光信号の強度をＸ軸に、細胞数をＹ軸にとったグラフをいう。このような形態により、総計で１万個以上の細胞を計数することが可能である。
【００８９】
本明細書において「ドットプロット」とは、二種類の蛍光色素の蛍光強度をＸ軸とＹ軸にとったプロットをいう。二重染色および三重染色をした場合には、それぞれの蛍光強度をＸあるいはＹ軸におき、個々の細胞が二次元グラフ上の一つ一つの点に対応するような表示方法を用いて解析することができる。
【００９０】
例えば、末梢血もしくは骨髄液を採取後、溶血法か比重遠心法にて赤血球を除いた後に蛍光標識抗体（目的とする抗原に対する抗体とそのコントロール抗体）と反応させ、十分に洗浄してからフローサイトメトリーを用いて観察することができる。検出された散乱光や蛍光は電気信号に変換されコンピュータにより解析される。その結果は、ＦＳＣの強さは細胞の大きさを表しＳＳＣの強さは細胞内構造を表すことによりリンパ球、単球、顆粒球を区別することが可能である。その後、必要に応じて目的とする細胞集団にゲートをかけて、それらの細胞における抗原発現様式を検討する。
【００９１】
本開示の方法の実施において、当業者は、示される細胞の表面マーカーを適切に識別して、細胞を分画または計数することが可能である。ＣＤ抗原は、国際ワークショップによって、主にそれが認識する抗原の生化学的特徴（とくに分子量）を基準として群別（ｃｌｕｓｔｅｒ）して分類する（ｃｌｕｓｔｅｒｉｎｇ）ことが合意された。これがＣＤ分類（ＣＤ  ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ）とよばれるもので、これにより特定の白血球分化抗原を認識する多くの種類のモノクローナル抗体は、ＣＤに続けて番号すなわちＣＤ番号（ＣＤ  ｎｕｍｂｅｒ）をつけた形（例えばＣＤ１、ＣＤ２など）の統一的な名称がつけられている。
【００９２】
ＣＤ３分子は細胞膜に存在し、ＴＣＲと複合体を形成するため、ＴＣＲの発現のマーカーとして使用可能である。
【００９３】
インターロイキン−２受容体α鎖であるＣＤ２５分子を高発現するＣＤ４＋Ｔ細胞が自己免疫疾患を抑制する機能を有することが明らかにされ、ＣＤ４およびＣＤ２５は制御性Ｔ細胞のマーカーとして使用されている。近年、転写因子であるＦｏｘｐ３がＴｒｅｇ分化のマスター遺伝子であることが明らかになり、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔｒｅｇを同定する分子マーカーとして広く利用されるようになっている。また、Ｆｏｘｐ３以外のＴｒｅｇの細胞表面メーカーとして、ＣＤ１２７が用いられており、ＣＤ４＋ＣＤ２５強陽性ＣＤ１２７陰性または弱陽性のＴ細胞分画にＴｒｅｇが豊富に存在することが明らかとなっている。
【００９４】
（２．６．ＴＣＲレパトアの解析）
本開示の改変ＴＡＬＥＮは、ＴＣＲレパトア解析で得られた情報に基づいてＴＣＲを改変する際に用いることができる。
【００９５】
本開示の１つの実施形態においては、Ｔ細胞集団のＴＣＲレパトアを測定することを含む方法が提供される。ドナーにおける抗原に特異的なエフェクターＴ細胞集団に存在するＴＣＲクローンを同定するにあたり、エフェクターＴ細胞集団に存在する各ＴＣＲクローン（α鎖またはβ鎖）の存在頻度を測定することにより、高機能なＴＣＲクローンを同定できることが見出されている。本開示の改変ＴＡＬＥＮは、ＴＣＲクローンをＴ細胞に導入する際に、内因性ＴＣＲ遺伝子による干渉を防ぐことができる点で有用である。そのため、高機能ＴＣＲクローンを同定し、かかるＴＣＲクローン（その核酸配列の全部または一部）を導入する工程を含む方法において、本開示の改変ＴＡＬＥＮを使用することができ、かかる方法における使用のための組成物もまた提供される。
【００９６】
ＴＣＲレパトアを測定する方法の１つとしては、試料中のＴ細胞が個々のＶ鎖をどれくらい使用するかを、特定のＶβ鎖特異的抗体を用いて、個々のＶβ鎖を発現するＴ細胞の割合をフローサイトメトリーで解析する方法（ＦＡＣＳ解析）がある。
【００９７】
その他に、ヒトゲノム配列から入手されるＴＣＲ遺伝子の情報をもとに、分子生物学的手法によるＴＣＲレパトア解析が考案されてきた。細胞試料からＲＮＡを抽出し、相補的ＤＮＡを合成後、ＴＣＲ遺伝子をＰＣＲ増幅して定量する方法がある。
【００９８】
細胞試料からの核酸の抽出は、ＲＮｅａｓｙ  Ｐｌｕｓ  Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ  （ＱＩＡＧＥＮ）などの当技術分野で公知のツールを用いて行うことができる。ＴＲＩｚｏｌ  ＬＳ試薬に溶解した細胞からＲＮｅａｓｙ  Ｐｌｕｓ  Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ  （ＱＩＡＧＥＮ）を用いて全ＲＮＡの抽出および精製を行うことができる。
【００９９】
抽出されたＲＮＡからの相補的ＤＮＡの合成は、Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  ＩＩＩＴＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）などの、当技術分野で公知の任意の逆転写酵素を用いて行うことができる。
【０１００】
ＴＣＲ遺伝子のＰＣＲ増幅は、当技術分野で公知の任意のポリメラーゼを用いて、当業者が適宜行うことができる。しかしながら、ＴＣＲ遺伝子のような変動の大きい遺伝子の増幅においては、「非バイアス」で増幅することができれば、正確な測定のためには有利な効果があるといえる。
【０１０１】
ＰＣＲ増幅のために用いるプライマーとしては、個々のＴＣＲ  Ｖ鎖特異的プライマーを多数設計して、別個にリアルタイムＰＣＲ法等で定量する方法、あるいはそれら特異的プライマーを同時に増幅する方法（Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ＰＣＲ）法が用いられてきた。しかしながら、各Ｖ鎖について内因性コントロールを用いて定量する場合でも、利用するプライマーが多いと正確な解析ができない。さらに、Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ＰＣＲ法ではプライマー間の増幅効率の差が、ＰＣＲ増幅時のバイアスを引き起こす欠点がある。このＭｕｌｔｉｐｌｅ  ＰＣＲ法の欠点を克服するため、鶴田らはＴＣＲ遺伝子の二本鎖相補的ＤＮＡの５’末端にアダプターを付加した後に、共通のアダプタープライマーとＣ領域特異的プライマーによってすべてのγδＴＣＲ遺伝子を増幅するＡｄａｐｔｏｒ−ｌｉｇａｔｉｏｎ  ＰＣＲ法を報告した（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ，  １９９４，１６９，  １７−２３）。さらに、αβＴＣＲ遺伝子の増幅にも応用し、個々のＶ鎖に特異的なオリゴプローブによって定量するＲｅｖｅｒｓｅ  ｄｏｔ  ｂｌｏｔ法（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ，  １９９７，２０１，  １４５−１５．）やＭｉｃｒｏｐｌａｔｅ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ａｓｓａｙ法（Ｈｕｍａｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，  １９９７，  ５６，  ５７−６９）が開発された。
【０１０２】
本開示の好ましい実施形態では、ＷＯ２０１５／０７５９３９（Ｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅ  Ｇｅｎｅｓｉｓ  Ｉｎｃ．、本明細書において、その全体が参考として援用される）に記載されているような、１種のフォーワードプライマーと１種のリバースプライマーからなる１セットのプライマーですべてのアイソタイプやサブタイプ遺伝子を含むＴＣＲ遺伝子を、存在頻度を変えることなく増幅して、ＴＣＲ多様性を決定する。以下のようなプライマー設計は、非バイアス的な増幅に有利である。
【０１０３】
ＴＣＲあるいはＢＣＲ遺伝子の遺伝子構造に着目し、高度な多様性をもつＶ領域にプライマーを設定することなく、その５’末端にアダプター配列を付加することにより、すべてのＶ領域を含む遺伝子を増幅する。このアダプターは塩基配列上において任意の長さと配列であり、２０塩基対程度が最適であるが、１０塩基から１００塩基までの配列を使用することができる。３’末端に付加されたアダプターは制限酵素により除去され、２０塩基対のアダプターと同一配列のアダプタープライマーと共通配列であるＣ領域に特異的なリバースプライマーにより増幅することですべてのＴＣＲ遺伝子を増幅する。
【０１０４】
ＴＣＲあるいはＢＣＲ遺伝子メッセンジャーＲＮＡから逆転写酵素により相補鎖ＤＮＡを合成し、続いて二本鎖相補的ＤＮＡを合成する。逆転写反応や二本鎖合成反応によって異なる長さのＶ領域を含む二本鎖相補的ＤＮＡが合成され、それら遺伝子の５’末端部に２０塩基対と１０塩基対からなるアダプターをＤＮＡリガーゼ反応によって付加する。
【０１０５】
ＴＣＲのα鎖、β鎖、γ鎖、δ鎖のＣ領域にリバースプライマーを設定し、これらの遺伝子を増幅することができる。Ｃ領域に設定されるリバースプライマーは、ＴＣＲの各Ｃβ、Ｃα、Ｃγ、Ｃδの配列に一致し、かつ他のＣ領域配列にはプライミングしない程度のミスマッチをもつプライマーを設定する。Ｃ領域のリバースプライマーはアダプタープライマーとの増幅ができるように、塩基配列、塩基組成、ＤＮＡ融解温度（Ｔｍ）、自己相補配列の有無を考慮し、最適に作製する。Ｃ領域配列におけるアレル配列間で異なる塩基配列を除く領域にプライマーを設定することで、すべてのアレルを均一に増幅することができる。増幅反応の特異性を高めるため、複数段階のｎｅｓｔｅｄ  ＰＣＲを行う。
【０１０６】
いずれのプライマーもアレル配列間で異なる配列を含まない配列に対して、プライマー候補配列の長さ（塩基数）は、特に制限されないが、１０〜１００塩基数であり、好ましくは、１５〜５０塩基数であり、より好ましくは、２０〜３０塩基数である。
【０１０７】
このような非バイアス的な増幅を用いることは、低頻度（１／１０，０００〜１／１００，０００またはそれ以下）の遺伝子の同定に有利であり、好ましい。以上のように増幅したＴＣＲ遺伝子をシークエンシングすることによって、得られたリードデータからＴＣＲレパトアを決定することができる。
【０１０８】
ヒト試料からＴＣＲ遺伝子をＰＣＲ増幅し、次世代シーケンス解析技術を利用することで、従来は小規模かつＶ鎖使用頻度など限られた情報を得るＴＣＲレパトア解析から、クローンレベルのより詳細な遺伝子情報を入手して解析する大規模高効率ＴＣＲレパトア解析が実現できるようになった。
【０１０９】
シークエンシングの手法は、核酸試料の配列を決定することができる限り限定されず、当技術分野で公知の任意のものを利用することができるが、次世代シークエンシング（ＮＧＳ）を用いることが好ましい。次世代シークエンシングとしては、パイロシーケンシング、合成によるシークエンシング（シークエンシングバイシンセシス）、ライゲーションによるシーケンシング、イオン半導体シーケンシングなどが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【０１１０】
得られたリードデータを、Ｖ、Ｄ、Ｊ遺伝子を含む参照配列にマッピングすることで、ユニークリード数を導出して、ＴＣＲ多様性を決定することができる。
【０１１１】
１つの実施形態では、使用される参照データベースは、Ｖ、Ｄ、Ｊ遺伝子領域ごとに準備する。典型的にはＩＭＧＴより公開されている領域ごと、アリルごとの核酸配列データセットを使用するが、それに限らず、各配列に一意のＩＤが割り振られているデータセットであれば利用可能である。
【０１１２】
得られたリードデータ（トリミングなどの適当な処理を必要に応じて行ったものを含む）を入力配列セットとして、遺伝子領域ごとの参照データベースと相同性検索し、最も近しい参照アリルおよびその配列とのアラインメントを記録する。ここで相同性検索には、Ｃを除きミスマッチ許容性の高いアルゴリズムを使用することになる。例えば相同性検索プログラムとして一般的なＢＬＡＳＴを使用する場合、ウィンドウサイズの短縮、ミスマッチペナルティの低減、ギャップペナルティの低減といった設定を、領域ごとに行うことになる。最も近しい参照アリルの選択においては、相同性スコア、アラインメント長、カーネル長（連続して一致する塩基列の長さ）、一致塩基数を指標とし、これらを定められた優先順位にしたがって適用する。本開示で使用されるＶおよびＪが確定した入力配列については、参照Ｖ上のＣＤＲ３先頭および参照Ｊ上のＣＤＲ３末尾を目印に、ＣＤＲ３配列を抽出する。これをアミノ酸配列に翻訳することで、Ｄ領域の分類に使用する。Ｄ領域の参照データベースが準備できている場合は、相同性検索結果とアミノ酸配列翻訳結果の組合せを分類結果とすることができる。
【０１１３】
上記により、入力セット中の各配列についてＶ、Ｄ、Ｊの各アリルがアサインされる。続いて、入力セット全体でＶ、Ｄ、Ｊの各出現頻度、もしくはその組合せの出現頻度を算出することで、ＴＣＲレパトアを導出する。分類に要請される精確さに応じて、出現頻度はアリル単位もしくは遺伝子名単位で算出される。後者は、各アリルを遺伝子名に翻訳することで可能となる。
【０１１４】
リードデータにＶ領域、Ｊ領域、Ｃ領域がアサインされたのち、一致するリードを集計し、ユニークリード（他に同じ配列をもたないリード）別に、試料中に検出されたリード数および全リード数に占める割合（頻度）を算出することができる。  サンプル数、リード種類、リード数などのデータを使って、ＥＳＴＩＭＡＴＥＳあるいはＲ（ｖｅｇａｎ）などの統計解析ソフトウェアを用いて多様性指数あるいは類似性指数を算出することができる。好ましい実施形態では、ＴＣＲレパトア解析ソフトウェア（Ｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅ  Ｇｅｎｅｓｉｓ  Ｉｎｃ．）を用いる。
【０１１５】
本開示の好ましい実施形態では、大規模高効率ＴＣＲレパトア解析を用いてＴＣＲ多様性を測定する。本明細書において、「大規模高効率レパトア解析」とは、ＷＯ２０１５／０７５９３９（この文献の開示は本明細書においてその全体が必要に応じて参考として援用される。）に記載されており、対象がＴＣＲの場合「大規模高効率ＴＣＲレパトア解析」と称する。この方法は、（１）非バイアス的に増幅したＴ細胞レセプター（ＴＣＲ）の核酸配列を含む核酸試料を提供する工程；（２）該核酸試料に含まれる該核酸配列を決定する工程；および（３）決定された該核酸配列にもとづいて、各遺伝子の出現頻度またはその組み合わせを算出し、該エフェクターＴ細胞集団のＴＣＲレパトアを導出する工程を包含し得る。
【０１１６】
別の実施形態においては、（１）非バイアス的に増幅したＴＣＲの核酸配列を含む核酸試料を提供する工程は、以下の工程：
（１−１）標的となる細胞に由来するＲＮＡ試料を鋳型として相補的ＤＮＡを合成する工程；
（１−２）該相補的ＤＮＡを鋳型として二本鎖相補的ＤＮＡを合成する工程；
（１−３）該二本鎖相補的ＤＮＡに共通アダプタープライマー配列を付加してアダプター付加二本鎖相補的ＤＮＡを合成する工程；
（１−４）該アダプター付加二本鎖相補的ＤＮＡと、該共通アダプタープライマー配列からなる共通アダプタープライマーと、第１のＴＣＲのＣ領域特異的プライマーとを用いて第１のＰＣＲ増幅反応を行う工程であって、
該第１のＴＣＲのＣ領域特異的プライマーは、該ＴＣＲの目的とするＣ領域に十分に特異的であり、かつ、他の遺伝子配列に相同性のない配列を含み、かつ、増幅された場合に下流にサブタイプ間に不一致塩基を含むよう設計される、工程
（１−５）（１−４）のＰＣＲ増幅産物と、該共通アダプタープライマーと、第２のＴＣＲのＣ領域特異的プライマーとを用いて第２のＰＣＲ増幅反応を行う工程であって、該第２のＴＣＲのＣ領域特異的プライマーは、該第１のＴＣＲのＣ領域特異的プライマーの配列より下流の配列において該ＴＣＲのＣ領域に完全マッチの配列を有するが他の遺伝子配列に相同性のない配列を含み、かつ、増幅された場合に下流にサブタイプ間に不一致塩基を含むよう設計される、工程；および
（１−６）（１−５）のＰＣＲ増幅産物と、該共通アダプタープライマーの核酸配列に第１の追加アダプター核酸配列を含む付加共通アダプタープライマーと、第２の追加アダプター核酸配列を第３のＴＣＲのＣ領域特異的配列に付加したアダプター付の第３のＴＣＲのＣ領域特異的プライマーとを用いて第３のＰＣＲ増幅反応を行う工程であって、
該第３のＴＣＲのＣ領域特異的プライマーは、該第２のＴＣＲのＣ領域特異的プライマーの配列より下流の配列において該ＴＣＲのＣ領域に完全マッチの配列を有するが他の遺伝子配列に相同性のない配列を含み、かつ、増幅された場合に下流にサブタイプ間に不一致塩基を含むよう設計される、工程；
を包含し得る。この方法の具体的な詳細はＷＯ２０１５／０７５９３９に記載されており、当業者はこの文献および本明細書の実施例等を適宜参照して解析を実施することができる。
【０１１７】
（２．７．ＴＣＲペア同定）
本開示の改変ＴＡＬＥＮは、ＴＣＲペア同定を行い、所望のＴＣＲを導入する際においても利用することができる。
【０１１８】
本開示の１つの実施形態においては、Ｔ細胞集団中に存在するＴＣＲクローンとして、ＴＣＲα鎖とＴＣＲβ鎖の対が同定される。ＴＣＲは、α鎖とβ鎖の対として抗原特異性を発揮していると考えられ、同定された対を用いることにより、ＴＣＲの対を導入することによるＴ細胞への抗原特異性の付与をより確実に行うことができる。したがって、ＴＣＲクローンを同定する工程において、同一の細胞に由来するＴＣＲα遺伝子およびＴＣＲβ遺伝子を増幅し、Ｔ細胞集団におけるＴＣＲαおよびＴＣＲβの対を同定することが含まれ得る。さらなる実施形態では、方法は、同定されたＴＣＲαおよびＴＣＲβの対が抗原に対する親和性を有するかを確認する工程をさらに含み得る。なおさらなる実施形態においては、同定されたＴＣＲαおよびＴＣＲβの対におけるＴＣＲαの核酸配列の全部または一部およびＴＣＲβの核酸配列の全部または一部をクローニングする工程をさらに含み得る。
【０１１９】
本開示の改変ＴＡＬＥＮは、内因性ＴＣＲによって生じ得るミスペアリングを防止することができるため、同定された対をＴ細胞に導入するにあたり、対が有する抗原特異性を適切に発揮させることができ、好適である。
【０１２０】
例えば、そのようなペア同定の技術としては、Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  １９，  １５４２〜１５４６（２０１３）に記載されているものを用いることができる。ヒトＴＣＲ  ｃＤＮＡを単一の細胞から増幅し、発現ベクターにクローニングし、ＴＣＲ陰性Ｔ細胞（例えば、ＴＧ４０細胞株）に形質導入する。ＭＨＣテトラマーによって当該Ｔ細胞を染色するか、またはＣＤ６９発現をモニタリングすることによってＴＣＲの抗原特異性を評価する。このようなプロセスの全体は、１０日以内に行うことが可能である。
【０１２１】
また、例えば、J  Clin  Invest.  2011  Jan;121(1):288-95.  doi:  10.1172/JCI44752.  Epub  2010  Dec  6.（PMID:21135507）やPloS  one  [23  May  2012,  7(5):e37338]（PMID:  22649519）などにも記載されているような、multiplex  PCRによってα鎖とβ鎖を同時に増幅する技術により、単一細胞からのペア同定が理論的に可能である。
【０１２２】
ＴＣＲのペアリングの技術については、すでに商業化されているものもあり、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  ２０１７  Ｍａｒ；３５（３）：２０３−２１４．  ｄｏｉ：  １０．１０１６／ｊ．ｔｉｂｔｅｃｈ．２０１６．０９．０１０．  Ｅｐｕｂ  ２０１６  Ｏｃｔ  ２６．（ＰＭＩＤ：  ２８３４１０３６）などの総説にも記載されている。当該文献の表２には、一般的なシングルセルのシークエンシング技術が記載されており、例えば、連続流微小流体を用いた技術（Ｆｌｕｉｄｉｇｍ、Ｋｏｌｏｄｚｉｅｊｃｚｙｋ，  Ａ．Ａ．  ｅｔ  ａｌ．  （２０１５）  Ｔｈｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｓｉｎｇｌｅ−ｃｅｌｌ  ＲＮＡ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ．  Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ  ５８，  ６１０-６２０）、プレートをベースにした技術（Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ／ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、  ６５．  Ｆａｎ，  Ｈ．Ｃ．  ｅｔ  ａｌ．  （２０１５）  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ．  Ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ  ｌａｂｅｌｉｎｇ  ｏｆ  ｓｉｎｇｌｅ  ｃｅｌｌｓ  ｆｏｒ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ．  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３４７，１２５８３６７）、ドロップレット（液滴）ベースの微小流体を用いた技術（１０Ｘ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ、７６．  Ｍｕｒｐｈｙ，  Ｋ．Ｍ．  ｅｔ  ａｌ．  （２０１６）  Ｊａｎｅｗａｙ’ｓ  Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ．  （９ｔｈ），  Ｇａｒｌａｎｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ）などが記載されている。それ以外にも、Ｓｃｉ  Ｔｒａｎｓｌ  Ｍｅｄ．  ２０１５  Ａｕｇ  １９；７（３０１）：３０１ｒａ１３１．  ｄｏｉ：  １０．１１２６／ｓｃｉｔｒａｎｓｌｍｅｄ．ａａｃ５６２４．（ＰＭＩＤ：２６２９０４１３）に記載されているような、単一細胞の単離を必要としないＴＣＲの高スループットペアリングの技術を用いてもよい。当業者は、このような手法を用いてＴＣＲのペアを同定することも可能である。
【０１２３】
代表的なＴＣＲの対を同定する技術としては、単一の細胞に由来するＴＣＲを解析することが挙げられ、例えば、フローサイトメーターによるソーティング後の解析や、ドロップレット作成装置を用いたシングルセルＲＮＡ−ｓｅｑが存在する。例えば、SMART法によるシングル・セル解析キットが、SMARTer（登録商標）  Human  scTCR  a/b  Profiling  Kitとして販売されている。逆転写（ＲＴ）反応、テンプレートスイッチ（ＴＳ）反応および、PCR反応によって、5’端側の配列が未知であったり、共通配列をもたないRNAを増幅することができる。このような方法の改良法も使用可能である。
【０１２４】
フローサイトメーターによるソーティング後の解析では、目的とする抗原ペプチドが分かっている、または予想される場合には、１００〜３００個程度のシングル・セル解析で、テトラマーを使ってその抗原ペプチドに反応するＴＣＲを保有するＴ細胞をＦＡＣＳでソートし、α鎖とβ鎖を決定し、抗原ペプチドに反応するＴＣＲのペアを同定することができる。抗原ペプチドが不明な場合であっても、α鎖のみ、およびβ鎖のみの解析データから確認される保有率の高いα鎖、および保有率の高いβ鎖の情報からその組み合わせを考慮できる場合は、この方法で主要なペアを決定することが可能となる。
【０１２５】
ドロップレット作成装置を用いたシングルセルＲＮＡ−ｓｅｑは、〜１００００個のシングル・セル解析が可能であり、上記抗原ペプチドが不明な場合にフローサイトメーターを用いる方法で行うような、二段階での解析を行う必要がなく、〜１００００個以上のシングル・セルを一回で解析することが可能である。
【０１２６】
これらの手法は、目的によって使い分けることができる。多くの細胞を解析できるドロップレットベースの方法によりペア同定を行う事で本工程の目的は達成できるが、抗原ペプチドが分かっている、または想定された抗原ペプチドの場合は、テトラマーを作成して１００〜３００個程度のシングル・セルを解析することでも本工程の目的を達成することができる。高機能ＴＣＲを見出すことが目的であれば、高々数百個以内のシングルセル解析が対費用効果的にも優れており、低頻度に存在するＴＣＲを（ナイーブ分画のＴＣＲやｓｈａｒｅｄ  ＴＣＲなど）網羅的に解析することが目的であれば、費用はかかるものの、ドロップレットによる解析が有利であると考えられる。
【０１２７】
シングルセルＲＮＡ−Ｓｅｑ法が近年開発され様々な研究に用いられるようになっている（Ｈａｓｈｉｍｓｈｏｎｙ  Ｔ  ｅｔ  ａｌ：  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐ，  ２（３）：  ６６６−６７３，  ２０１２、Ｈａｓｈｉｍｓｈｏｎｙ  Ｔ  ｅｔ  ａｌ：  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｂｉｏｌ，  １７：  ７７，  ２０１６）。シングルセル解析にはＦＡＣＳソーティング、マイクロウェルまたはマイクロ流体回路など様々な分離装置が用いられる。ドロップレット分離装置を用いた方法は高効率かつ簡便にシングルセルライブラリを作成できる。
【０１２８】
ドロップレット作製装置を用いたシングルセルＲＮＡ−ＳｅｑによりシングルセルレベルのＴＣＲ解析が可能である。ドロップレット法は１００μｍ程度の油中水滴型ドロップレットにオリゴプローブを固相化した担体と細胞を高速に封入することで、３０分程度で１０，０００細胞ものシングルセルライブラリを作成できる。２０１６年Ｃｅｌｌ誌においてＭｏｃｏｓｋｏらはオリゴビーズを用いたＤｒｏｐ−Ｓｅｑ法（Ｍａｃｏｓｋｏ  ＥＺ  ｅｔ  ａｌ：  Ｃｅｌｌ，  １６１（５）：  １２０２−１２１４，  ２０１５）を、Ｋｌｅｉｎらはハイドロジェルを用いたＩｎＤｒｏｐ法（Ｋｌｅｉｎ  ＡＭ  ｅｔ  ａｌ：  Ｃｅｌｌ，  １６１（５）：１１８７−１２０１，  ２０１５）を報告した。いずれもセルバーコード（ＣＢＣ）と分子識別配列（ＵＭＩ）を付加したｐｏｌｙ（Ｔ）プローブを担体に結合し、マイクロチップを用いてドロップレット中にオリゴ担体と細胞を封入する。その後、ｃＤＮＡ合成、ＰＣＲ、シーケンスを実施することでｓｃＲＮＡ−Ｓｅｑが可能になった。
【０１２９】
さらに、Ｄｒｏｐ−Ｓｅｑ法を改良し、高効率にＴＣＲペア遺伝子を決定するＧｅｎｅ  Ｃａｐｔｕｒｅ  Ｄｒｏｐ−ＳｅｑＴＭ法が開発されている。Ｇｅｎｅ  Ｃａｐｔｕｒｅ  Ｄｒｏｐ−ＳｅｑＴＭ法は、バーコード標識したαおよびβ鎖ＴＣＲオリゴマーをマイクロビーズに結合し、ドロップレット内でＴＣＲ  ｍＲＮＡを選択的にキャプチャーすることで、高効率にＴＣＲペア遺伝子を決定する技術である。Ｇｅｎｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｐｒｏｂｅを用いてセルバーコード配列とＣＤＲ３配列を同時にシーケンスし、ペア遺伝子を決定する方法はハイスペックなシーケンサを必要とすることなく、効率的に多数のペア遺伝子を同定することができる。本技術は、抗体遺伝子の重鎖および軽鎖ペアの決定や特定遺伝子の発現に絞ったサブセット解析にも応用することができる有用なシングルセル解析法である。当業者は、上記のような技術を用いて、Ｔ細胞集団中に存在するＴＣＲクローンとして、ＴＣＲα鎖とＴＣＲβ鎖の対を同定することができる。
【０１３０】
（２．８．高機能ＴＣＲ）
本開示の改変ＴＡＬＥＮは、高機能ＴＣＲの提供において使用することができる。
【０１３１】
異なる個体間で高頻度に共有されているＴ細胞クロノタイプのＴＣＲが、全ての機能的Ｔ細胞サブセット（ナイーブ、ＳＣＭ、ＣＭ、ＥＭ、およびＥＦＦ）のレパトアにおいて、そして、抗原特異的Ｔ細胞レパトア中において一貫して検出されることが見出されている。本明細書の実施例１において実証されているように、より優勢な抗原特異的ＴＣＲが、より高いエピトープ結合親和性を有し、そして、より高度に共有されているクロノタイプに由来することが見出された（図２）。さらに、実施例１においては、このような抗原特異的ＴＣＲは、他のＴ細胞に導入した場合も抗原親和性を保持していることが実証されている。
【０１３２】
優勢なＣＭＶ  ＮＬＶ特異的クロノタイプのエピトープ結合親和性がより高かったこと、そして、優勢なクロノタイプが、異なる個体間で比較的高い頻度で存在するＴＣＲクロノタイプを共有して含有していることが示されている（例えば、Scientific  Reports  7,  Article  number:  3663  (2017)も参照。その全体は、本明細書において全ての目的のために参考として援用される）。より優勢なＣＭＶ  ｐｐ６５特異的クロノタイプがより高いエピトープ結合親和性を有し、より高度に共有されたクロノタイプに由来することが示されている。また、この観察から、所与の個体中に存在する機能的ＴＣＲクロノタイプは比較的少数であるものの、これらのクロノタイプは異なる個体間でも高頻度に共有されていることが示唆されている。
【０１３３】
本開示の１つの実施形態においては、Ｔ細胞集団に存在するＴＣＲクローン（核酸配列の全部または一部）をＴ細胞に導入する工程を含む工程が提供される。上述のように、個体の抗原特異的Ｔ細胞集団において優勢に存在するクローンは抗原親和性が高く、このようなクローンの使用は、改変しようとする細胞の抗原特異性の付与において有利である。ただし、抗原特異的なＴ細胞集団中に存在しているクローンは、比較的少数のクロノタイプで構成されており、そこに含まれるクローンであれば、優勢とは言えない場合であっても抗原特異性の付与において利用可能である。好ましくは、Ｔ細胞集団は、抗原特異的なエフェクターＴ細胞集団である。
【０１３４】
導入するクローンは、抗原特異的Ｔ細胞集団における各クローンの存在頻度の平均より、大きい頻度で存在するクローンであり得る。例えば、導入するクローンは、抗原特異的Ｔ細胞集団における各クローンの存在頻度の平均より、１標準偏差以上、２標準偏差以上または３標準偏差以上大きい頻度で存在し得る。
【０１３５】
導入するＴＣＲクローンは、Ｔ細胞集団において、約１、約２、約５、約８、約１０％、約１２％または約１５％以上の頻度で存在し得る。
【０１３６】
上記のとおり、本開示の改変ＴＡＬＥＮは、ＴＣＲクローンをＴ細胞に導入する際に、内因性ＴＣＲ遺伝子による干渉を防ぐことができる点で有用である。上述の高機能ＴＣＲクローンを同定し、かかるＴＣＲクローン（その核酸配列の全部または一部）を導入する工程を含む方法において、本開示の改変ＴＡＬＥＮを使用することができ、かかる方法における使用のための組成物もまた提供される。
【０１３７】
（２．９．外因性ＴＣＲの導入）
本開示の１つの実施形態において、本開示の改変ＴＡＬＥＮは、ＴＣＲをＴ細胞に導入する工程を含む方法において使用することができる。Ｔ細胞は、好ましくは制御性Ｔ細胞である。本開示の改変ＴＡＬＥＮは、内因性ＴＣＲの影響を排除することができるため、かかる方法において用いるのに好適である。本開示の一部の実施形態において、ＴＣＲをＴ細胞に導入する工程を含む方法において使用するための改変ＴＡＬＥＮを含む組成物が提供される。
【０１３８】
導入する工程は、ＴＣＲα遺伝子の核酸配列の全部または一部およびＴＣＲβ遺伝子の核酸配列の全部または一部を導入する工程であり得る。好ましくは、本明細書において記載される高機能のＴＣＲをＴ細胞に導入する。高機能のＴＣＲは、ＴＣＲの対として同定され得、好ましくは、そのようなＴＣＲα鎖とＴＣＲβ鎖とが対になって発現されるように導入する。
【０１３９】
対になって発現されるような導入については、Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．  ２０１６  Ｊｕｎ；６５（６）：６３１−４９（ＰＭＩＤ：２７１３８５３２）などに記載されている。対になって発現されるような導入については、Ｃｙｓ化（Ｃｙｓ残基の導入）によるジスルフィド結合形成以外の方法としてコドン最適化・細胞内領域へのロイシンジッパーの導入・ＴＣＲの糖鎖改変などの技術が存在する。
ＴＣＲ導入ベクターに応用されているミスペアリング回避既存技術としては、例えば、
１）Ｃｙｓの導入（Ｂｌｏｏｄ．１０９：２３３１，  ２００７．）
２）Ｌｅｕｃｉｎ  ｚｉｐｐｅｒ  （Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ．  ９１：１１４０８，  １９９４．）
３）２Ａ配列を用いたα・β鎖の均等発現（必要に応じてコドン最適化）  （Ｊ  Ｍｏｌ  Ｍｅｄ  ８８：１１１３，  ２０１０）
４）特定のＮ−ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ部位の除去（Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ．  ２０６：４６３，  ２００９．）
５）マウス等の細胞内ドメイン使用（Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  ６６：８８７８，  ２００６；Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １８４：６２２３，２０１０）
６）単鎖ＴＣＲの使用（α−β−Ｃｏｎｓｔａｎｔ）（Ｂｌｏｏｄ．  １１５：５１５４，  ２０１０）
などが存在する。
【０１４０】
そのような発現を可能にするようなベクターを用いてＴＣＲを導入することができ、例えば、ベクターは、発現されるＴＣＲαおよびＴＣＲβの間にジスルフィド結合が形成されるようにＣｙｓをコードする核酸配列を含むか、ＴＣＲαおよびＴＣＲβのコード配列がコドン最適化されているか、ＴＣＲαおよびＴＣＲβの細胞内領域へロイシンジッパーが導入されるように構成されているか、または、ＴＣＲαおよびＴＣＲβが糖鎖改変されて発現されるように構成されていてもよい。
【０１４１】
本開示においては、同定したＴＣＲクローンの核酸の全部を導入してもよく、また、結合親和性が維持されれば、一部のみを導入してもよい。１つの実施形態では、Ｖα−ＪαのＣＤＲ３領域に対応する配列を含むＴＣＲα遺伝子の核酸配列の一部を導入することができる。また、Ｖβ−Ｄ−ＪβのＣＤＲ３領域に対応する配列を含むＴＣＲβ遺伝子の核酸配列の一部を導入することができる。Ｖα−Ｊα−ＣαのｃＤＮＡ配列を含むＴＣＲα遺伝子の核酸配列の一部を導入することができる。Ｖβ−Ｄ−Ｊβ−ＣβのｃＤＮＡ配列を含むＴＣＲβ遺伝子の核酸配列の一部を導入することができる。
【０１４２】
本開示の１つの実施形態では、内因性ＴＣＲの完全置換のため、内因性ＴＣＲ遺伝子の除去と、ＴＣＲの導入を２ステップで行ってもよい。例えば、Ｔ細胞において、内因性ＴＣＲαまたは内因性ＴＣＲβ遺伝子のいずれか一方を除去する工程と、ＴＣＲα遺伝子の核酸配列の全部または一部およびＴＣＲβ遺伝子の核酸配列の全部または一部を該Ｔ細胞に導入する工程と、該Ｔ細胞において、内因性ＴＣＲαまたは内因性ＴＣＲβ遺伝子のいずれか他方を除去する工程と、ＴＣＲα遺伝子の核酸配列の全部または一部およびＴＣＲβ遺伝子の核酸配列の全部または一部を、該Ｔ細胞に再度導入する工程とを含む、方法が提供される。
【０１４３】
内因性ＴＣＲの完全置換において、ウイルスベクターを用いずに、外因性ＴＣＲをゲノムにノックインして導入してもよい。ノックイン技術としては、相同組み換え（ＨＲ）によるものが知られている。また、相同組み換え（ＨＲ）ではなく、マイクロホモロジー媒介末端結合（ＭＭＥＪ）を介する方法を用いてもよい。ＭＭＥＪは、真核生物が持つＤＮＡ修復機構の一つであり、二本鎖切断の際に生じた切断両末端間で、相補的な配列（５〜２５塩基対）同士で結合し、修復される機構である。ＭＭＥＪ修復機構を利用して外来遺伝子を挿入するにあたり、ドナーベクターに人工ヌクレアーゼの認識配列を加え、当該配列は、二本鎖切断時に染色体上標的部位とベクターの切断末端とで相補結合するようにする。このドナーベクターを人工ヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮおよびＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓなど）と一緒に導入することにより、標的部位に遺伝子をノックインすることができる（それぞれＴＡＬ−ＰＩＴＣｈ法およびＣＲＩＳ−ＰＩＴＣｈ法と称される）（Nature  Communications  volume  5,  Article  number:  5560  (2014)）。ウイルスベクターを用いて外因性ＴＣＲを導入する場合、実際的に問題となる確率ではないとしても、理論的には発がん性が存在することから、ウイルスベクターを用いないことは、かかるリスクを回避できる点で有利であり得る。
【０１４４】
（２．１０  細胞集団）
本開示の１つの実施形態では、目的の外因性ＴＣＲを含む細胞の細胞集団であって、当該目的の外因性ＴＣＲ以外の外因性ＴＣＲを含む細胞の割合が低減されている細胞集団が提供される。本発明の細胞集団において、目的の外因性ＴＣＲ以外の外因性ＴＣＲを含む細胞の割合は、例えば、約２０％、約１５％、約１２％、約１０％、約７％、約５％、約３％、約２％または約１％未満であるか、本発明の細胞集団は、目的の外因性ＴＣＲ以外の外因性ＴＣＲを含む細胞を実質的に含まない。目的の外因性ＴＣＲの非限定的な例としては、ＮＹ−ＥＳＯ−１に対する特異性を有するものが挙げられる。
【０１４５】
目的の外因性ＴＣＲ以外の外因性ＴＣＲは、目的の外因性ＴＣＲのα鎖とβ鎖の対以外のＴＣＲを包含し、例えば、導入したＴＣＲ鎖と内因性ＴＣＲ鎖との意図しない対合（ミスペアリング）の結果発現しているＴＣＲが包含される。従来、外因性ＴＣＲを含む細胞の細胞集団を作出する際には、内因性ＴＣＲとのミスペアリングが生じること、これにより、抗原特異性の喪失および／または意図しない抗原特異性の出現の可能性が報告されており、かかるミスペアリングを低減する方法が検討されていたが、例えば、内因性ＴＣＲの発現をｓｉＲＮＡにより抑制し、ＴＣＲ導入ベクターにおいてＣｙｓ修飾を用いたとしても、ＴＣＲミスペアリングの割合は１２〜２２％程度までの低減に留まることが報告されている（Ｏｋａｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ-Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  （２０１２）  １，  ｅ６３）。
【０１４６】
本開示の１つの実施形態は、上述の細胞集団を作出する方法であって、細胞から内因性ＴＣＲを除去する工程と、外因性ＴＣＲをコードする核酸を内因性ＴＣＲが除去された細胞に導入する工程とを含む、方法を提供する。本方法における内因性ＴＣＲを除去する工程および外因性ＴＣＲをコードする核酸を内因性ＴＣＲが除去された細胞に導入する工程は、本明細書に記載されるか、または当業者に周知の技術を用いてよい。例えば、内因性ＴＣＲの除去は、本明細書に記載される改変ＴＡＬＥＮによって行ってよい。例えば、外因性ＴＣＲをコードする核酸の導入は、本明細書に記載されるＣｙｓ修飾を有するベクターを用いて行ってよい。
【０１４７】
（２．１１  その他の応用例）
このほか、本開示の改変ＴＡＬＥＮは、Ｔ細胞の特異性を操作するのに有用である。本開示の改変ＴＡＬＥＮを用いてミスペアリング／オフターゲットが生じないように外因性ＴＣＲを発現するように操作されたＴ細胞を養子免疫療法等に利用することができる。
【０１４８】
本開示の制御性Ｔ細胞を、自己免疫疾患、アレルギー疾患、または移植の際の移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）、拒絶反応もしくは生着不全の処置、治療または予防に用いることができる。抗原特異的制御性Ｔ細胞は、当該抗原に対する免疫応答の抑制に有効であると考えられるからである。
【０１４９】
自己免疫疾患としては、例えば、関節リウマチ（ＲＡ）、シェーグレン症候群、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、抗リン脂質症候群、多発性筋炎・皮膚筋炎、全身性硬化症、混合結合組織病、血管炎症候群、Ｉ型糖尿病、グレーブス病、橋本病、特発性アジソン病、自己免疫性肝炎、グッドパスチャー症候群、糸球体腎炎、自己免疫性溶血性貧血（ＡＩＨＡ）、自己免疫性血小板減少性紫斑病、自己免疫性好中球減少症、重症筋無力症、天疱瘡、白斑、特発性無精子症、などが挙げられるが、これらに限定されない。アレルギー疾患としては、花粉症、アレルギー性鼻炎、気管支喘息、アトピー性皮膚炎などが挙げられるが、これらに限定されない。その他、特定の抗原への異常な免疫応答が発症や病態の進展に関与する疾患に対して、本開示の抗原特異的制御性Ｔ細胞による処置や予防を用いることが可能である。
【０１５０】
（３．キット）
本開示において、ＴＣＲ遺伝子を編集するためのキットもまた提供される。キットは、本開示の改変ＴＡＬＥＮを含む組成物または組み合わせ物と、内因性ＴＣＲ遺伝子の変異を確認する手段、および／または内因性ＴＣＲ遺伝子の除去を確認する手段とを備え得る。
【０１５１】
さらなる実施形態では、キットは、本開示の改変ＴＡＬＥＮを含む組成物または組み合わせ物と、外因性ＴＣＲ遺伝子を導入する手段、および／または遺伝子が導入された細胞を検出する手段とを備え得る。さらに、キットは、内因性ＴＣＲ遺伝子を外因性ＴＣＲ遺伝子で置換するためのものであり得る。また、キットは、ＴＣＲ改変Ｔ細胞を製造するために用いることができ、ＴＣＲ改変Ｔ細胞は、例えば、ＴＣＲ改変制御性Ｔ細胞である。
【０１５２】
本明細書において「または」は、文章中に列挙されている事項の「少なくとも１つ以上」を採用できるときに使用される。「もしくは」も同様である。本明細書において「２つの値の範囲内」と明記した場合、その範囲には２つの値自体も含む。
【０１５３】
本明細書において引用された、科学文献、特許、特許出願などの参考文献は、その全体が、各々具体的に記載されたのと同じ程度に本明細書において参考として援用される。
【０１５４】
以上、本発明を、理解の容易のために好ましい実施形態を示して説明してきた。以下に、実施例に基づいて本発明を説明するが、上述の説明および以下の実施例は、例示の目的のみに提供され、本発明を限定する目的で提供したのではない。従って、本発明の範囲は、本明細書に具体的に記載された実施形態にも実施例にも限定されず、特許請求の範囲によってのみ限定される。
【実施例】
【０１５５】
以下に実施例を記載する。以下の実施例で用いる対象の取り扱いは、必要な場合、国の定めるヒトゲノム遺伝子・解析研究に関する倫理指針、人を対象とする医学系研究に関する倫理指針、広島大学において規定される基準を遵守し、明示していない場合であっても、動物実験が関与する場合は、動物愛護精神および関連する法規に従って行った。【０１５６】
（実施例１：高アフィニティクローンの同定・クローニング）
（概要）
本実施例は、免疫学的に優勢なクローンは高アフィニティクローンであることおよびかかるクローンの同定・クローニングの方法を実証することを目的とする。【０１５７】
Ｔ細胞集団を抗原刺激した後の、抗原特異的なＴ細胞集団におけるＴＣＲクローンの存在頻度の分布を測定し、各ＴＣＲクローンについてクローニングを行った。各ＴＣＲクローンの抗原への結合能を測定したところ、Ｔ細胞集団において優勢なクローンが高い抗原結合能を有していることが見出された。本実施例に関する情報については、Scientific  Reports  7,  Article  number:  3663  (2017)にも記載されており、その全体は、本明細書において全ての目的のために参考として援用される。【０１５８】
（材料および方法）
［ドナーサンプル］
本実施例は、ヘルシンキ宣言の原則に従って行われ、ヒトサンプルを用いる全ての実験は、広島大学の倫理委員会の承認を受けたプロトコルに従ってなされた。書面による同意を提供した５人の健康なドナーから、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を得た。全てのドナーをＣＭＶ血清状態についてスクリーニングし、そして、高解像度Ｌｕｍｉｎｅｘ法を用いて、ＨＬＡ−Ａ、−Ｂ、−Ｃ、−ＤＲＢ１、−ＤＱＢ１および−ＤＰＢ１アレルについてジェノタイピングした。ＰＢＭＣを、標準Ｆｉｃｏｌｌ勾配分離プロトコルを使用して単離し、そして、液体窒素中で保管した。【０１５９】
［フローサイトメトリー分析およびセルソーティング］
細胞表面分子の発現を、以下の蛍光標識モノクローナル抗体（ｍＡｂ）を用いて決定した：アロフィコシアニン（APC）コンジュゲートもしくはフルオロセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）コンジュゲート抗ＣＤ８、アロフィコシアニン−ｈｉｌｉｔｅ７（ＡＰＣ−Ｈ７）コンジュゲート抗ＣＤ３、フィコエリスリン−ｃｙａｎｉｎｅ７（ＰＥ−Ｃｙ７）コンジュゲート抗ＣＤ４５ＲＯｍＡｂ、ｂｒｉｌｌｉａｎｔ  ｖｉｏｌｅｔ  ５１０（ＢＶ５１０）コンジュゲート抗ＣＤ６２ＬｍＡｂ、ｂｒｉｌｌｉａｎｔ  ｖｉｏｌｅｔ  ４２１（ＢＶ４２１）コンジュゲート抗ＣＤ１９７ｍＡｂ、ＡＰＣコンジュゲート抗ＣＤ９５およびＡＰＣコンジュゲート抗ＴＣＲαβ。これらの抗体は、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  （Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，  ＣＡ）から購入した。ＣＭＶ  ｐｐ６５特異的Ｔ細胞を、フィコエリスリン（ＰＥ）コンジュゲートＨＬＡ−Ａ＊０２−ペプチドテトラマーと、Kuzushima,  K.  et  al.  Tetramer-assisted  identification  and  characterization  of  epitopes  recognized  by  HLA  A*2402-restricted  Epstein-Barr  virus-specific  CD8+  T  cells.  Blood  101,  1460-1468  (2003)に記載されるように反応させた。テトラマーのＭＨＣ−Ｉ上のＣＤ８結合部位はインタクトであった。本発明者らは、ＨＬＡ−Ａ＊０２拘束性ＣＭＶｐｐ６５ペプチド（ＮＬＶペプチド）のＮＬＶＰＭＶＡＴＶ（配列番号２）配列をモデル抗原として選択した。ＭＨＣテトラマー染色を室温で１５分間行い、その後、細胞表面染色を、４℃で３０分間行った。全ての実験で用いたテトラマーの濃度は、系列希釈実験を除いて、１０μｇ／ｍｌであった。非特異的テトラマー染色を、ネガティブコントロールテトラマー（ＨＬＡ−Ａ２−ＨＩＶ（ＫＬＴＰＬＣＶＴＬ（配列番号３））テトラマー−ＰＥ）を用いてチェックした。【０１６０】
フローサイトメトリー分析およびセルソーティングは、それぞれＦＡＣＳＣａｎｔｏ  ＩＩ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，  Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，  ＣＡ）およびＦＡＣＳＡｒｉａ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，  Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，  ＣＡ）を用いて行った。全てのフローサイトメトリーデータは、ＦｌｏｗＪｏソフトウェア（Ｔｒｅｅ  Ｓｔａｒ，  Ａｓｈｌａｎｄ，  ＯＲ）を用いて分析した。７−ＡＡＤを用いて死細胞および損傷細胞を除去し、そして、ＦＳＣ−Ａ／ＦＳＣ−ＨおよびＳＳＣ−Ａ／ＳＳＣ−Ｈを用いてダブレット細胞を除去した。ＣＤ３＋ＣＤ８＋Ｔ細胞を、さらに以下に示す機能的サブセットに分画した：ナイーブ、ＣＤ４５ＲＯ−ＣＤ６２Ｌ＋ＣＣＲ７＋ＣＤ９５−；ＳＣＭ、ＣＤ４５ＲＯ−ＣＤ６２Ｌ＋ＣＣＲ７＋ＣＤ９５＋；ＣＭ、ＣＤ４５ＲＯ＋ＣＤ６２Ｌ＋ＣＣＲ７＋；ＥＭ、ＣＤ４５ＲＯ＋ＣＤ６２Ｌ−ＣＣＲ７−；ＥＦＦ、ＣＤ４５ＲＯ−ＣＤ６２Ｌ−ＣＣＲ７−。【０１６１】
［細胞培養］
ＰＢＭＣおよびソートしたＣＤ８＋Ｔ細胞は、１０％  ＡＢ血清、２ｍｍｏｌ／ｌ  Ｌ−グルタミンおよび１％  ペニシリン／ストレプトマイシンを含有するＸ−ＶＩＶＯ２０（Ｌｏｎｚａ，  Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ，  ＭＤ）中で培養した。Ｂリンパ芽球細胞株（Ｂ−ＬＣＬ）は、１０％  ＦＢＳ、２ｍｍｏｌ／ｌ  Ｌ−グルタミンおよび１％  ペニシリン／ストレプトマイシンを含有するＲＰＭＩ１６４０（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，  Ｓｔ  Ｌｏｕｉｓ，  ＭＯ）中で培養した。全ての細胞は、５％ＣＯ２含有雰囲気中、３７℃で加湿インキュベーター内で培養した。【０１６２】
５μｇ／ｍｌ  ＰＨＡ−Ｌ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，  Ｓｔ  Ｌｏｕｉｓ，  ＭＯ）を含有するＣＴＬ培地においてＰＢＭＣを培養することにより、フィトヘマグルチニン（ＰＨＡ）芽球を生成し、翌日、）ＩＬ−２（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ，  Ｒｏｃｋｙ  Ｈｉｌｌ，  ＮＪ）を５０Ｕ／ｍｌの最終濃度まで添加した。次いで、培地の半分を、ＩＬ−２（５０Ｕ／ｍｌ）およびＩＬ−７（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ，  Ｒｏｃｋｙ  Ｈｉｌｌ，  ＮＪ）（２０ｎｇ／ｍｌ）を含有する新鮮な培地で、各週２回置換した。ＰＨＡ芽球は、培養開始の１４日後に使用した。【０１６３】
ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９によってＴＣＲ発現を欠損するように操作されたＪｕｒｋａｔ細胞は以下のとおり確立した。簡潔には、内因性ＴＣＲα鎖のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９媒介ノックアウトの後、ＣＤ３陰性細胞をフローソーティングによって富化した。ソートした細胞を、ＴＣＲα鎖を含むエピソームベクターで形質導入し、次いで、ＣＤ３陽性細胞（形質導入されたα鎖および内因性β鎖を有するＪｕｒｋａｔ細胞）をフローソーティングによって富化した。ソートした細胞の内因性ＴＣＲβをＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９でノックアウトし、次いで、ＣＤ３陰性細胞（内因性ＴＣＲαおよびＴＣＲβを有しないＪｕｒｋａｔ細胞）を富化した。次いで、フローサイトメトリーによるシングルセルソーティング法を用いて、Ｊｕｒｋａｔ細胞のシングルセルクローニングを行った。最後に、クローニングしたＪｕｒｋａｔ細胞にＴＣＲβ鎖を形質導入し、次いで、内因性ＴＣＲα、内因性ＴＣＲβおよび形質導入ＴＣＲαの全てが陰性のＪｕｒｋａｔクローンを選択した。クローンのＴＣＲα陰性は、ＴＣＲβをクローンに形質導入することによって確認し、そして、クローンのＴＣＲβ陰性は、ＴＣＲαをクローンに形質導入することによって確認した。このクローンを、ｐＭＸ−ＣＤ８α発現ベクターによっても形質導入し、抗ＣＤ８ｍＡｂによって明るく染色した。【０１６４】
［ＣＭＶｐｐ６５特異的Ｔ細胞のｉｎ  ｖｉｔｒｏ刺激］
ＣＤ８マイクロビーズを用いて、ＰＢＭＣからＣＤ８＋Ｔ細胞を単離した。ＣＤ４＋  Ｔ−ｃｅｌｌ  ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ｋｉｔ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ，  Ａｕｂｕｒｎ，  ＣＡ）を用いて、残りの細胞から、ＣＤ４＋Ｔ細胞を除去した。残りのＣＤ４／ＣＤ８ダブルネガティブ細胞を、抗原提示細胞（ＡＰＣ）として使用した。放射線照射（３５Ｇｙ）後、ＡＰＣを、室温で２時間ＮＬＶペプチドに曝露し、ＩＬ−２およびＩＬ−７を含有するＣＴＬ培地中で、等数のＣＤ８＋Ｔ細胞と共培養した。合成ＮＬＶペプチドは、ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，  ＮＪ）から購入した。培地の半分を、各週２回交換した。【０１６５】
［高スループットＮＧＳを用いたＴＣＲレパトアの半定量的解析］
アダプターライゲーションＰＣＲを用いた非バイアス的遺伝子増幅法およびＮＧＳを用いた網羅的ＴＣレパトア解析は、簡潔には以下のとおり行った。総ＲＮＡをＰＢＭＣ（５×１０６）、またはソートされたＴ細胞から抽出し、ポリ（Ｔ）１８およびＮｏｔＩ部位を含むＢＳＬ−１８Ｅプライマーを用いてｃＤＮＡに変換した。その後、二本鎖（ｄｓ）ＤＮＡを合成し、Ｔ４  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて平滑末端化した。Ｐ１０ＥＡ／Ｐ２０ＥＡアダプターをｄｓＤＮＡの５’末端にライゲーションし、次いで、ＮｏｔＩで切断した。アダプターおよびプライマーを除去した後、ＴＲＡ定常領域特異的プライマーまたはＴＲＢ定常領域特異的プライマーと、Ｐ２０ＥＡとを用いてＰＣＲを行った。第２のＰＣＲを、同一のＰＣＲ条件を用いて、定常領域特異的Ｐ２０ＥＡプライマーによって行った。第２のＰＣＲの産物を、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  Ｍｉｓｅｑプラットフォームを用いる高スループットシーケンシングのために用いた。低クオリティスコアの配列を除去した後、ＴＣＲレパトア分析を、Ｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅ  Ｇｅｎｅｓｉｓ  Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ  （Ｉｂａｒａｋｉ，  Ｊａｐａｎ）によって作成されたバイオインフォマティクスソフトウェアを用いて行った。個々の手順のさらなる詳細は、下記の項目に記載される。【０１６６】
［ＴＣＲ遺伝子の非バイアス的増幅］
ＲＮｅａｓｙ  Ｌｉｐｉｄ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ，  Ｈｉｌｄｅｎ，  Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて、Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｅｒ’ｓ  ｉｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎに従って、総ＲＮＡをＰＢＭＣまたはソートしたＴ細胞から抽出した。ＲＮＡ量および純度を、Ａｇｉｌｅｎｔ  ２２００  ＴａｐｅＳｔａｔｉｏｎ（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，  Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，  ＣＡ）を用いて測定した。１μｇの総ＲＮＡを、Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  ＩＩＩ  ｒｅｖｅｒｓｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，  Ｃａｒｌｓｂａｄ，  ＣＡ）を用いてｃＤＮＡに変換した。ｃＤＮＡ合成には、ポリ（Ｔ）１８およびＮｏｔＩ部位を含むＢＳＬ−１８Ｅプライマーを用いた。ｃＤＮＡの合成後、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｉ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、Ｅ．  ｃｏｌｉ  ＤＮＡ  Ｌｉｇａｓｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）およびＲＮａｓｅ  Ｈ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて二本鎖（ｄｓ）ｃＤＮＡを合成した。ｄｓｃＤＮＡの末端は、Ｔ４  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて平滑末端化した。ｄｓｃＤＮＡの５’末端にＰ１０ＥＡ／Ｐ２０ＥＡアダプターをライゲーションし、次いで、ＮｏｔＩで切断した。ＭｉｎＥｌｕｔｅ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｃｌｅａｎｕｐ  ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）によるアダプターおよびプライマーの除去後、ＴＣＲα鎖定常領域特異的プライマー（ＣＡ１）またはＴＣＲβ鎖定常領域特異的プライマー（ＣＢ１）のいずれかと、Ｐ２０ＥＡとのプライマーを用いてＰＣＲを行った。ＰＣＲ条件は、９５℃（３０秒）、５５℃（３０秒）および７２℃（１分）を２０サイクルであった。第２のＰＣＲを、ＣＡ２またはＣＢ２のいずれかと、Ｐ２０ＥＡとのプライマーにより、同一のＰＣＲ条件を用いて行った。【０１６７】
用いたプライマーは、以下の表に示される。
【表１】
2019073964.tif 000009
【０１６８】
［Ｒｏｃｈｅ  ４５４シーケンシングシステムを用いたアンプリコンシーケンシング］
ＮＧＳのためのアンプリコンは、第２のＰＣＲの産物から、Ｐ２０ＥＡプライマーおよび融合タグプライマー（表１）を用いて調製した。融合タグプライマーは、Ａアダプター配列（ＣＣＡＴＣＴＣＡＴＣＣＣＴＧＣＧＴＧＴＣＴＣＣＧＡＣ（配列番号３４））、４塩基のシーケンスキー（ＴＣＡＧ）、および分子同定（ＭＩＤ）タグ配列（１０ヌクレオチド）を含んだ。ＴＣＲ定常領域特異的配列は、Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｅｒ’ｓ  ｉｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎに従って設計した。ＰＣＲ増幅の後、アンプリコンを、アガロースゲル電気泳動を用いて評価した。不完全フラグメントまたはプライマーは、Ａｇｅｎｃｏｕｒｔ  ＡＭＰｕｒｅ  ＸＰ（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ，  Ｂｒｅａ，  ＣＡ）を用いて、Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｅｒ’ｓ  ｉｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎに従って除去した。精製したアンプリコンの量は、Ｑｕａｎｔ−ｉＴ  ＰｉｃｏＧｒｅｅｎ  ｄｓＤＮＡ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，  Ｃａｒｌｓｂａｄ，  ＣＡ）を用いて定量した。異なる融合タグプライマーにより１０サンプルから得られた各アンプリコンを、等モル濃度で混合した。エマルジョンＰＣＲ（ｅｍＰＣＲ）を、アンプリコン混合物を用いて、ＧＳ  Ｊｕｎｉｏｒ  Ｔｉｔａｎｉｕｍ  ｅｍＰＣＲ  Ｌｉｂ−Ｌ  ｋｉｔ（Ｒｏｃｈｅ  ４５４  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，  Ｂｒａｎｆｏｒｄ，  ＣＴ）により、Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｅｒ’ｓ  ｉｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎに従って行った。【０１６９】
［ＴＲＶおよびＴＲＪセグメントの割り当て］
全ての配列リードは、そのＭＩＤタグ配列に従って分類した。人工的に付加した配列（タグ、アダプターおよびキー）および低クオリティスコアの配列を、４５４  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍとともに提供されているソフトウェアを用いて配列リードの量末端から除去した。残りの配列を、ＴＣＲα配列のＴＲＡＶおよびＴＲＡＪ、ならびにＴＣＲβ配列のＴＲＢＶおよびＴＲＢＪの割り当てに使用した。配列の割り当ては、ＩｍＭｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（ＩＭＧＴ）データベース（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｉｍｇｔ．ｏｒｇ）から利用可能であるリファレンス配列（５４のＴＲＡＶ、６１のＴＲＡＪ、６５のＴＲＢＶおよび１４のＴＲＢＪ遺伝子（偽遺伝子およびオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）リファレンス配列を含む）のデータセットにおける、最も高いパーセント同一性を有するものを決定することによって行った。データ処理、割り当て、およびデータ集約は、Ｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅ  Ｇｅｎｅｓｉｓ  Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｏｓａｋａ，  Ｊａｐａｎ）によって独自に開発されたレパトア解析ソフトウェア（Ｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅ  Ｇｅｎｅｓｉｓ，  ＲＧ）を用いて自動的に行った。ＲＧは、まずＢＬＡＳＴＮおよびＩＭＧＴデータセットを用いてＴＲＶおよびＴＲＪアレルをクエリに割り当てる。クエリおよびリファレンス配列の間の同一性をこのステップで算出した。感度および正確性を増加させるパラメータ（Ｅ値閾値、ミニマムカーネル、高スコアセグメントペア（ＨＳＰ）スコア）ｗｐ、各レパトア解析について最適化した。次いで、ＲＧは、クエリのＣＤＲ３領域を、翻訳されるリーディングフレームを検討することにより推定する。次いで、ＲＧは、ＴＲＶ−ＣＤＲ３−ＴＲＪパターンの分布を算出し、グラフィック（例えば、ＴＲＶ−ＴＲＪ使用ヒストグラムやＣＤＲ３長分布チャート）を生成する。これらのステップは、クエリの入力後自動で行われた。【０１７０】
［データ分析］
ＣＤＲ３領域の翻訳されたヌクレオチド配列は、ＩＭＧＴ命名法に従って、保存されているＣｙｓ１０４から、保存されているＰｈｅ１１８またはＧｌｙ１１９の範囲にわたった。ユニーク配列リード（ＵＳＲ）は、ＴＲＶ、ＴＲＪおよび他の配列リードのＣＤＲ３ドメインの演繹アミノ酸配列に対して０％の同一性として定義した。ＲＧソフトウェアは、自動的に各サンプル中の同一のＵＣＲのコピー数をカウントし、次いで、コピー数の順にそれらをランク付けた。ＴＲＡＶ、ＴＲＡＪ、ＴＲＢＶおよびＴＲＢＪ遺伝子の配列リードのパーセンテージ頻度を算出した。【０１７１】
［シングルセルソーティングおよびＲＴ−ＰＣＲ］
単一の細胞によって発現されるＣＭＶ  ＮＬＶ特異的ＴＣＲαβ対を同定および特徴付けるため、本発明者らは、以下のとおり改変したｈＴＥＣ１０システム（Kobayashi,  E.  et  al.  A  new  cloning  and  expression  system  yields  and  validates  TCRs  from  blood  lymphocytes  of  patients  with  cancer  within  10  days.  Nat.  Med.  19,  1542-1546  (2013).、Hamana,  H.,  Shitaoka,  K.,  Kishi,  H.,  Ozawa,  T.  &  Muraguchi,  A.  A  novel,  rapid  and  efficient  method  of  cloning  functional  antigenspecific  T-cell  receptors  from  single  human  and  mouse  T-cells.  Biochem.  Biophys.  Res.  Commun.  474,  709-714  (2016).）を用いた。ＣＤ８／ＮＬＶテトラマーダブルポジティブ細胞を、９６ウェルＰＣＲプレートの各ウェルにソートした。マルチプレックスＲＴ−ＰＣＲを用いて、ｃＤＮＡを合成・増幅した。ＴＣＲα鎖およびＴＣＲβ鎖をコードする配列を増幅するために用いた遺伝子特異的プライマーは、ＩＭＧＴデータベース（http://www.imgt.org/）から得られたリーダーペプチド配列から設計した。ＰＣＲ反応については、以下の「ＴＣＲＡおよびＴＣＲＢ対のＲＴ−ＰＣＲ分析」で詳述する。ＴＣＲレパトア分析を、IMGT/V-Quest  tool（http://www.imgt.org/）を用いて行った。【０１７２】
［ＴＣＲＡおよびＴＣＲＢ対のＲＴ−ＰＣＲ分析］
ＲＴ−ＰＣＲは、０．１μｌの４０Ｕ／μｌ  ＲＮａｓｅ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（ＮＥＢ，  Ｉｐｓｗｉｃｈ，  ＭＡ）、０．１μｌの２００Ｕ／μｌ  ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＲＴａｓｅ（ＴａＫａＲａ，  Ｏｔｓｕ，  Ｊａｐａｎ）、０．４μｌのプライマー混合物、０．０２５μｌの２．５Ｕ／μｌ  ＰｒｉｍｅＳｔａｒ  ＨＳ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＴａＫａＲａ）、０．４μｌの２．５ｍＭ  ｄＮＴＰおよび２．５μｌの５×ＰｒｉｍｅＳｔａｒ  ＧＣ  ｂｕｆｆｅｒ（ＴａＫａＲａ）を含有する反応混合物中で行った。ＤＥＰＣ処置したＨ２Ｏを加え、最終体積を５μｌにした。ＲＴ反応は、４５℃で４０分間行い、その後、以下のＰＣＲ反応を行った：９８℃で１分間、その後、９８℃で１０秒、５５℃で５秒、および７２℃で１分を３０サイクル。ＰＣＲ反応物は、水で１０倍に希釈し、その後のネステッドＰＣＲのためのテンプレートＤＮＡとして用いた。ＴＣＲＡおよびＴＣＲＢの増幅のためのネステッドＰＣＲは、異なる９６ウェルＰＣＲプレートで行った。反応混合物は、第１のＰＣＲ反応からの２μｌのＤＮＡテンプレート、０．４μｌの１０μＭのそれぞれの特異的プライマーセット（ＴＣＲαについてＡ−ＡＤおよびＡ−ＲＶ２プライマー、ＴＣＲβについてＢ−ＡＤおよびＢ１−ＲＶ２プライマー、Ｂ２−ＲＶ２プライマー）、０．１μｌの２．５Ｕ／μｌ  ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ  ＨＳ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ、１．６μｌの２．５ｍＭ  ｄＮＴＰ、１０μｌの５×ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ  ＧＣ  Ｂｕｆｆｅｒ、０．１μｌの２．５Ｕ／μｌおよびＨ２Ｏ（最終体積２０μｌまで添加）を含んだ。ＰＣＲサイクルは、以下のとおりであった：９８℃で１分間、その後、９８℃で１０秒、５５℃で５秒、および７２℃で１分間を３５サイクル。ＴＣＲＡおよびＴＣＲＢのＰＣＲ産物を、サンガーシーケンシングで分析した。【０１７３】
［クローニングされたＴＣＲの結合能の確認］
１）上記クローニングされた各ＴＣＲαβペア遺伝子（ＣＭＶｐｐ６５  ＮＬＶＰＭＶＡＴＶ  ：  ＮＬＶ特異性）をＴＣＲαβ欠損  Ｊｕｒｋａｔ  ｃｅｌｌにレトロウイルスベクター（ｐＭＸｓ−ＩＲＥＳ  ＧＦＰ）を用いて遺伝子導入した。【０１７４】
２）各ＴＣＲ遺伝子が導入されたＪｕｒｋａｔ  ｃｅｌｌからセルソーター（ＡｒｉａＩＩ）を用いてＧＦＰ陽性細胞を分離した。【０１７５】
３）各ＴＣＲが導入されたＪｕｒｋａｔ  ｃｅｌｌを、濃度が２、４、６、８、１０μｇ／ｍｌと段階希釈されたＮＬＶテトラマーで染色した。【０１７６】
４）フローサイトメトリーを用いてテトラマー陽性細胞の蛍光強度（ＭＦＩ）を測定し各ＴＣＲのテトラマーとの結合力を解析した。【０１７７】
（結果）
結果は、図１および図２に示される。ドナーＶ００１およびＶ００４について、図１に示されるクロノタイプを有するＴ細胞クローンが、抗原特異的なクロノタイプとして同定された。非常に少数のクローンによって抗原特異的なクローンの集団が構成されていることが見出された。【０１７８】
さらに、上記方法により測定した各ＴＣＲクローンの存在頻度と、抗原への結合性の比較を図２に示す。結果から、存在頻度と結合親和性との直線的な相関がみられ、抗原特異的Ｔ細胞集団内で優勢なクローンが高アフィニティクローンであることが理解される。【０１７９】
（実施例１−２）
上記実施例１における［高スループットＮＧＳを用いたＴＣＲレパトアの半定量的解析］の工程を、異なるシーケンサ（Ｍｉｓｅｑ，  Ｉｌｌｕｍｉｎａ）を用いて、以下の手順で行った。【０１８０】
［実験プロトコールの変更点の概要］
ＲＮＡ〜二本鎖ＤＮＡ合成までは実施例１と同一工程で行った。ＰＣＲは１ｓｔ  ＰＣＲ、２ｎｄ  ＰＣＲまで同一工程で、それ以降をＭｉｓｅｑ用のＰＣＲ（Ｔａｇ  ＰＣＲとＩｎｄｅｘ  ＰＣＲ）として行った。試薬の変更点として、次世代シーケンスのＰＣＲ酵素として推奨されるＫＡＰＡ  ＨｉＦｉ  ＨｏｔＳｔａｒｔ  ＲｅａｄｙＭｉｘを使用した。【０１８１】
３−２−９：サンプル操作７（１ｓｔ、２ｎｄ  ＰＣＲ）
※ヒトＴＣＲαβの２遺伝子を解析するための流れを記載する。【０１８２】
＜１ｓｔ  ＰＣＲ＞
１サンプル分の試薬量を示す。
１０μＬの２×ＫＡＰＡ  ＨｉＦｉ  Ｈｏｔ  Ｓｔａｒｔ  Ｒｅａｄｙ  Ｍｉｘを、それぞれαもしくはβチューブに加える。
７．６μＬのＤＷ（ＤＮＡ専用、ボトル）を、それぞれαもしくはβチューブに加える。０．２μＬ  １０μＭ  Ｐ２０ＥＡ  ｐｒｉｍｅｒを、それぞれαもしくはβチューブに加える。
０．２μＬ  １０μＭ  ＣＡ１  ｐｒｉｍｅｒをαチューブに、０．２μＬの１０μＭ  ＣＢ１  ｐｒｉｍｅｒをβチューブに加える。
αもしくはβ液が入ったチューブに、各ｄｓＤＮＡサンプルを２μＬずつ加える。
サーマルサイクラーより該当する設定（プログラム名：ＫＡＰＡ２０、条件は９５℃  ３ｍｉｎ、２０ｃｙｃｌｅｓ（９８℃  ２０ｓｅｃ、６５℃  ３０ｓｅｃ、７２℃  １ｍｉｎ）、７２℃  ２ｍｉｎ、最後、１２℃  ｆｏｒｅｖｅｒ）を選択する。【０１８３】
＜２ｎｄ  ＰＣＲ＞
１サンプル分の試薬量を示す。
１０μＬの２×ＫＡＰＡ  ＨｉＦｉ  Ｈｏｔ  Ｓｔａｒｔ  Ｒｅａｄｙ  Ｍｉｘを、それぞれαもしくはβチューブに加える。
６μＬのＤＷを、それぞれαもしくはβチューブに加える。
１μＬの１０μＭ  Ｐ２０ＥＡ  ｐｒｉｍｅｒを、それぞれαもしくはβチューブに加える。
１μＬの１０μＭ  ＣＡ２  ｐｒｉｍｅｒをαチューブに、１μＬの１０μＭ  ＣＢ２  ｐｒｉｍｅｒをβチューブに加える。
αもしくはβの１ｓｔＰＣＲ産物を、それぞれのαもしくはβＰＣＲ用２ｎｄＰＣＲチューブに２μＬずつ加える。
サーマルサイクラーより該当する設定（プログラム名：ＫＡＰＡ２０、条件は９５℃  ３ｍｉｎ、２０ｃｙｃｌｅｓ（９８℃  ２０ｓｅｃ、６５℃  ３０ｓｅｃ、７２℃  １ｍｉｎ）、７２℃  ２ｍｉｎ、最後、１２℃  ｆｏｒｅｖｅｒ）を選択する。【０１８４】
＜ＤＮＡ精製１＞
３−２−１０：サンプル操作８（ＡＭｐｕｒｅ  精製１）
本工程ではＢＥＣＫＭＡＮ  ＣＯＵＬＴＥＲ社のＡｇｅｎｃｏｕｒｔ  ＡＭＰｕｒｅ  ＸＰを用いる。
ＡＭＰｕｒｅ  ＸＰビーズを均一になる迄よく混和し、８μＬをチューブ分注する。
１０μＬの２ｎｄＰＣＲ産物をＡＭＰｕｒｅ  ＸＰビーズを分注したチューブに加え、ＭＭ−Ｓｅｐａｒａｔｅｒ  Ｍ９６（マグネットプレート）にセットし、磁気ビーズを集める。
上清を除去し、７０％エタノールを２００  μＬでリンス、ＭＭ−Ｓｅｐａｒａｔｅｒ  Ｍ９６にセットし、磁気ビーズを集める。
上清を完全に除去し、３０μＬのＤＷ（ＤＮＡ用、ボトル）分注し、ボルテックスする。ＭＭ−Ｓｅｐａｒａｔｏｒ  Ｍ９６にセットして磁気ビーズを集める。
上清を２５μＬ回収する。【０１８５】
＜Ｔａｇ  ＰＣＲ＞
３−２−１１：サンプル操作９（Ｔａｇ  ＰＣＲ）
１０μＬの２×ＫＡＰＡ  ＨｉＦｉ  Ｈｏｔ  Ｓｔａｒｔ  Ｒｅａｄｙ  Ｍｉｘを、それぞれαもしくはβチューブに加える。
４．２μＬのＤＷ（ＤＮＡ専用、ボトル）を、それぞれαもしくはβチューブに加える。０．４μＬ  １０μＭ  Ｐ２２ＥＡ−ＳＴ１−Ｒ  ｐｒｉｍｅｒを、それぞれαもしくはβチューブに加える。
０．４μＬ  １０μＭ  ＣＡ−ＳＴ１−Ｒ  ｐｒｉｍｅｒをαチューブに、０．４μＬ  の１０μＭ  ＣＢ−ＳＴ１−Ｒ  ｐｒｉｍｅｒをβチューブに加える。
αもしくはβ試薬混合液が入ったチューブに、各２ｎｄＰＣＲ精製済みサンプルを５μＬずつ加える。
サーマルサイクラーより該当する設定（プログラム名：ＫＡＰＡ２０、条件は９５℃  ３ｍｉｎ、２０ｃｙｃｌｅｓ（９８℃  ２０ｓｅｃ、６５℃  ３０ｓｅｃ、７２℃  １ｍｉｎ）、７２℃  ２ｍｉｎ、最後、１２℃  ｆｏｒｅｖｅｒ）を選択する。【０１８６】
＜ＤＮＡ精製２＞
３−２−１４：サンプル操作１１（ＡＭｐｕｒｅ精製２）※
※本項の操作は、プロトコール「３−２−１０：サンプル操作８（ＡＭｐｕｒｅ  精製１）」と同一である。【０１８７】
＜複数検体を１回のシーケンスで解析するためのＩｎｄｅｘ  ＰＣＲの設計＞
３−２−１５：サンプル操作１２（Ｉｎｄｅｘ  ＰＣＲに必要なシートの作成）
３−２−１５−１：要点
Ｉｎｄｅｘ  ＰＣＲは各サンプルにインデックス配列、およびＰ５／Ｐ７配列（フローセルに結合する部分）を付加するために行うものである。
予めサンプルとプライマーの並び順（マトリックス）を決め、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ  Ｍａｎａｇｅｒでサンプルシートを作成する。
インデックスプライマーはイルミナの既製品（Ｎｅｘｔｅｒａ  ＸＴ  Ｉｎｄｅｘ  Ｋｉｔ  ｖ２  Ｓｅｔ  Ａ）を用いる。【０１８８】
＜Ｉｎｄｅｘ  ＰＣＲ＞
３−２−１６：サンプル操作１３（Ｉｎｄｅｘ  ＰＣＲ）
本手順書では１サンプル分の試薬量を示す。
１０μＬの２×ＫＡＰＡ  ＨｉＦｉ  Ｈｏｔ  Ｓｔａｒｔ  Ｒｅａｄｙ  Ｍｉｘをチューブに加える。
４μＬのＤＷ（ＤＮＡ用、ボトル）を、チューブに加える。
ＰＣＲ８連チューブに１４μＬ分注していく。
２μＬずつＮプライマーを分注していく。
２μＬずつＳプライマーを分注していく。
Ｔａｇ  ＰＣＲ精製済みサンプルを所定のチューブに２μＬずつ分注していく。
サーマルサイクラーより該当する設定（プログラム名：ＩＮＤＥＸ１２、条件は９５℃  ３ｍｉｎ、１２ｃｙｃｌｅｓ（９５℃  ３０ｓｅｃ、５５℃  ３０ｓｅｃ、７２℃  ３０ｓｅｃ）、７２℃  ５ｍｉｎ、最後、４℃  ｆｏｒｅｖｅｒ）を選択する。【０１８９】
＜電気泳動＞
３−２−１７：サンプル操作１４（電気泳動と評価２）
※ＴＣＲ遺伝子の場合はおよそ６５０ｂｐとなる。
１．５％アガロースゲル調製し、染色はＡｔｌａｓ  ＣｌｅａｒＳｉｇｈｔを用いる。
泳動槽にゲルを設置し、４μＬのｉｎｄｅｘ  ＰＣＲ産物を１００ｂｐ  ＤＮＡラダー、１０ｘ  Ｄｙｅとともに電気泳動（１００Ｖで３０分間）し、ＵＶトランスイルミネーターやデジカメを用いて増幅結果を評価する。
※著しく薄い場合は、プロトコール「３−２−１６：サンプル操作１３（Ｉｎｄｅｘ  ＰＣＲ）」に戻り、ＰＣＲ条件を変更する（１５サイクルに増やす）必要がある。【０１９０】
＜濃度測定１＞
３−３−３：サンプル操作１（ＱｕｂｉｔによるＤＮＡ濃度測定）
Ｉｎｄｅｘ  ＰＣＲ産物を用いてＤＷ（ＤＮＡ用、ボトル）で１０倍希釈する。
Ｑｕｂｉｔ  ｄｓＤＮＡ  ＨＳ  Ａｓｓａｙ  ｋｉｔに付属のｄｙｅを、付属のｂｕｆｆｅｒで２００倍希釈する。
５００μＬ専用チューブ２本（Ｓｔａｎｄａｒｄ用）に１９０μＬ、検体用は１９８μＬのｄｙｅ希釈液を加える。
ｄｙｅ希釈液１９０μＬを加えた５００μＬ専用チューブ（２本）に、Ｑｕｂｉｔ  ｄｓＤＮＡ  ＨＳ  Ａｓｓａｙ  ｋｉｔに付属のＳｔａｎｄａｒｄ＃１、Ｓｔａｎｄａｒｄ＃２を、それぞれ１０μＬ加える。
ｄｙｅ希釈液１９８μＬを加えた５００μＬ専用チューブ（１０本）に、Ｉｎｄｅｘ  ＰＣＲ産物を２μＬ加える。
Ｑｕｂｉｔを起動し、測定モード「ｄｓＤＮＡ」を選択、続いて「Ｈｉｇｈ  Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ」を選択する。
測定画面に移動し、一番下の「Ｒｅａｄ  ｓｔａｎｄａｒｄｓ」を選択する。
順番にＳｔａｎｄａｒｄ＃１、Ｓｔａｎｄａｒｄ＃２を測定し、値として「数十」、「数万」になることを確認する。
検体のインプット量を２μＬ設定し、測定する。
※測定範囲が０．１〜５０ｎｇ／μＬであるため、レンジを超えた場合は希釈して測定を再度行う。
測定結果をもとに、複数の検体（通常Ｍｉｓｅｑのシーケンスでは５０〜６０検体を同時に測定する）から等量のＤＮＡ量が混合できるように別チューブに分注し、プール検体とする。【０１９１】
＜ＤＮＡ精製３＞
３−２−１８：サンプル操作１５（ＡＭｐｕｒｅ精製３）
※本項の操作は、プロトコール「３−２−１０：サンプル操作８（ＡＭｐｕｒｅ  精製１）」と操作は同一であるが、プール検体の液量に合わせて調整する。【０１９２】
＜濃度測定２＞
３−３−３：サンプル操作１（ＱｕｂｉｔによるＤＮＡ濃度測定と希釈）と同様の操作となる。
Ｍｉｓｅｑでシーケンスに用いる検体濃度は４ｎＭ（６５０ｂｐの場合は１．７２ｎｇ）であるため、測定後に指定濃度まで希釈する。【０１９３】
＜Ｍｉｓｅｑを用いたシーケンスラン＞
３−３：ＭｉＳｅｑシーケンス解析
３−３−４：サンプル操作２（Ｐｈｉ−Ｘ、ＤＮＡライブラリーの変性）
５μＬの０．２Ｎ−ＮａＯＨと、５μＬの４ｎＭに調製されたプール検体（ＤＮＡ）を混合する
５μＬの０．２Ｎ−ＮａＯＨと、５μＬの４ｎＭに調製されたＰｈｉＸ（シーケンス安定化試薬、ランダムな塩基が入っている）を混合する。
それぞれにＨｙｂ−Ｂｕｆｆｅｒを分注し、最終濃度が１０ｐＭ、ＤＮＡ：ＰｈｉＸ＝４：１（ＰｈｉＸが２０％）になるように混合、最終調製する。【０１９４】
３−３−５：サンプル操作３（Ｍｉｓｅｑ  ラン）
シーケンス解析ではイルミナ社のＭｉｓｅｑを用い、主なシーケンス試薬はＭｉＳｅｑ  Ｒｅａｇｅｎｔ  Ｋｉｔ  ｖ３（６００サイクル）ＭＳ−１０２−３００３を使用する。操作方法は、解凍した試薬カセットに、最終調整した検体を指定されたウェルに分注し、機器にセットする。
以下にプライマー配列等の情報を記載する。
【表２】
2019073964.tif 000010
【０１９５】
Ｉｎｄｅｘ  ＰＣＲ  ｐｒｉｍｅｒのさらなる情報については、https://support.illumina.com/content/dam/illumina-support/documents/documentation/chemistry_documentation/experiment-design/illumina-adapter-sequences_1000000002694-01.pdfを参照のこと。【０１９６】
（実施例１−３）
実施例１における［シングルセルソーティングおよびＲＴ−ＰＣＲ］、［ＴＣＲＡおよびＴＣＲＢ対のＲＴ−ＰＣＲ分析］の部分を以下のような手順で行うことも可能である。本手順は、Ｄｒｏｐ−Ｓｅｑ法を改良し、高効率にＴＣＲペア遺伝子を決定するＧｅｎｅ  Ｃａｐｔｕｒｅ  Ｄｒｏｐ−ＳｅｑＴＭ法として開発されたものである。ＴＣＲ特異的オリゴビーズの作製法とＧｅｎｅ  Ｃａｐｔｕｒｅ  Ｄｒｏｐ−ＳｅｑＴＭ法を用いたシングルセルＴＣＲペア遺伝子決定法が記載される。本手順のさらなる詳細は、羊土社「実験医学・別冊」シングルセル解析プロトコール（２０１７年１０月１０日号）に記載されており、当該文献は、その全体が本明細書において参考として援用される。【０１９７】
［準備］
（機器）
□  ドロマイトバイオ社製シングルセルＲＮＡ−Ｓｅｑシステム（図１９Ａ）
（Ｐポンプ３台、流量計３セット、細胞撹拌機、デジタル顕微鏡、シングルセルＲＮＡ−Ｓｅｑチップ）
□  ＭｉＳｅｑシーケンサ（イルミナ社）
□  Ｑｕｂｉｔ  ３．０フルオロメーター（サーモフィッシャー  サイエンティフィック社）【０１９８】
シングルセル分離装置（ドロマイトバイオ社）は、Ｐポンプ３台、流量計３セット、細胞撹拌機、デジタル顕微鏡、シングルセルＲＮＡ−Ｓｅｑチップから構成される。モニタを装備しており、ドロップレット形成をリアルタイムで確認でき、様々なアッセンブルが可能な拡張性の高い仕様となっている。【０１９９】
（試薬）
１．ビーズオリゴ作成
□  ＴＥ  １０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、１ｍＭ  ＥＤＴＡ
□  ＴＥ／ＴＷ  １０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．１％  Ｔｗｅｅｎ２０
□  ＴＥ／ＳＤＳ  １０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．５％  ＳＤＳ
□  Ｂｓｔ反応停止液  １００ｍＭ  ＫＣｌ、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、５０ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．１％  Ｔｗｅｅｎ２０
□  ＮａＯＨ洗浄液  Ｉ  １５０ｍＭ  ＮａＯＨ、０．５％  Ｂｒｉｊ３５Ｐ
□  ＮａＯＨ洗浄液  ＩＩ  １００ｍＭ  ＮａＯＨ、０．５％  Ｂｒｉｊ３５Ｐ
□  中和緩衝液  １００ｍＭ  ＮａＣｌ、１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１０ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．１％  Ｔｗｅｅｎ２０
□  オリゴ固相化ビーズ（カスタム合成、Ｃｈｅｍｇｅｎｅ社）１    （図１９Ｂ）
□  合成ＤＮＡ
□  Ｂｓｔ  ３．０  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＮＥＢ）
□  Ｅｘｏｎｕｃｌｅａｓｅ  Ｉ（ＮＥＢ）【０２００】
１オリゴビーズは米国ＣｈｅｍＧｅｎｅ社へ合成委託する。ＭｏｃｏｓｋｏらのＲＮＡ−Ｓｅｑ用オリゴビーズはＳＭＡＲＴ配列（配列番号４５）に続き、１２塩基のミックス＆プール塩基（セルバーコード配列、Ｊ）、８塩基のランダム配列（分子識別配列、Ｎ）および３０塩基のＰｏｌｙ（Ｔ）配列から成る。Ｇｅｎｅ  ＣａｐｔｕｒｅにはＰｏｌｙ（Ｔ）配列の代わりにアニーリング配列を付加し、エクステンション反応によりシングルビーズにＴＣＲα鎖Ｃ領域特異的プローブとＴＣＲβ鎖Ｃ領域特異的プローブの両プローブを結合させる。【０２０１】
プローブオリゴはエクステンション反応によりビーズに結合される。アニーリング配列をもつＧｅｎｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｐｒｏｂｅ（ＧＳＰ）を合成し、伸長反応を行うことで目的遺伝子のオリゴビーズを作成することができる。ペアとなる２つの遺伝子には同じセルバーコード配列がついており、シーケンス配列からペア遺伝子を決定することができる。【０２０２】
２．細胞分離
□  血清培地  ＲＰＭＩ１６４０（和光純薬）、１０％ＦＣＳ、ペニシリン・ストレプトマイシン（和光純薬）、５０μＭ  ２−メルカプトエタノール
□  ＡＣＫ溶解緩衝液  ０．１５Ｍ  ＮＨ４Ｃｌ、０．０１Ｍ  ＫＨＣＯ３、０．１ｍＭ
Ｎａ２ＥＤＴＡ、ｐＨ７．２〜７．４
□  ７０μｍ  セルストレイナー（コーニング社）
□  ＭＡＣＳ分離用磁気装置（ミルテニー  バイオテク社）
□  ＣＤ８ａ＋  Ｔ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｔｉｎ−Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｃｏｃｋｔａｉｌ（ミルテニー  バイオテク社）
□  Ａｎｔｉ−Ｂｉｏｔｉｎ  ＭｉｃｒｏＢｅａｄｓ（ミルテニー  バイオテク社）
□  ＭＡＣＳ  ＬＳカラム（ミルテニー  バイオテク社）
□  ＭＡＣＳ緩衝液  ＰＢＳ、２ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．５％  ＢＳＡ【０２０３】
３．シングルセル分離
□  １００μｍ  フィルター
□  ４０μｍ  フィルター
□  細胞溶解液  ２００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、６％フィコールＰＭ４００（ＧＥヘルスケア社）、０．２％サルコシル（２０％  Ｎ−Ｌａｕｒｏｙｌｓａｒｃｏｓｉｎｅ  ｓｏｄｉｕｍ  ｓａｌｔ、シグマ  アルドリッチ社）、２０ｍＭ  ＥＤＴＡ、１．５Ｍ  Ｂｅｔａｉｎｅ、０．２  ×ＳＳＣ、５％  ＤＭＳＯ
□  １Ｍ  ＤＴＴ
□  細胞用緩衝液  ＰＢＳ、０．０１％  ＢＳＡ
□  Ｄｒｏｐｌｅｔ  Ｇｅｎｅｒａｔｏｒ  オイル  ｆｏｒ  ＥｖａＧｒｅｅｎ（バイオラッド社）
□  パーフルオロオクタノール  （ＰＦＯ、シグマ  アルドリッチ社）
□  ６×ＳＳＣ【０２０４】
４．テンプレートスイッチ逆転写反応
□  Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  ＩＶ  （サーモフィッシャー  サイエンティフィック社）□  １０ｍＭ  ｄＮＴＰｓ（プロメガ社）
□  ＲＮａｓｉｎ（登録商標）  Ｐｌｕｓ  ＲＮａｓｅ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（プロメガ社）
□  ＫＡＰＡ  ＨｉＦｉ  ＨｏｔＳｔａｒｔ  ＲｅａｄｙＭｉｘ（ＫＡＰＡバイオサイセンス社）
□  ＴＳＯオリゴ：ＧＴＣＧＣＡＣＧＧＴＣＣＡＴＣＧＣＡＧＣＡＧＴＣＡＣＡＧＧ（ｌＧ）、ｌＧ：ＬＮＡオリゴ（配列番号４０）
□  ＴＳＯ  ＰＣＲプライマー：ＧＴＣＧＣＡＣＧＧＴＣＣＡＴＣＧＣＡＧＣＡＧＴＣ（配列番号４１）
□  ＳＭＡＲＴ  ＰＣＲプライマー：ＡＡＧＣＡＧＴＧＧＴＡＴＣＡＡＣＧＣＡＧＡＧＴ（配列番号４２）
□  ＴＳＯ＿ＴＡＧプライマー：ＧＴＣＴＣＧＴＧＧＧＣＴＣＧＧＡＧＡＴＧＴＧＴＡＴＡＡＧＡＧＡＣＡＧＣＧＴＣＧＣＡＣＧＧＴＣＣＡＴＣＧＣＡＧＣＡＧＴＣ（配列番号４３）
□  ＳＭＡＲＴ＿ＴＡＧプライマー：ＴＣＧＴＣＧＧＣＡＧＣＧＴＣＡＧＡＴＧＴＧＴＡＴＡＡＧＡＧＡＣＡＧＡＡＧＣＡＧＴＧＧＴＡＴＣＡＡＣＧＣＡＧＡＧＴ（配列番号４４）
□  Ｎｅｘｔｅｒａ  ＸＴ  Ｉｎｄｅｘ  Ｋｉｔ  ｖ２  ＳｅｔＡ（ｉｌｌｕｍｉｎａ社）
□  Ａｇｅｎｃｏｕｒｔ  ＡＭＰｕｒｅ  ＸＰ（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ社）
□  ＥＢ緩衝液（５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．５）
□  Ｑｕｂｉｔ  ｄｓＤＮＡアッセイキット（サーモフィッシャー  サイエンティフィック社）【０２０５】
（細胞）
Ｔリンパ腫細胞株（ＥＬ−４）
マウス脾臓細胞（Ｃ５７ＢＬ／６）【０２０６】
［プロトコール］
１．  オリゴビーズの作成
（１）  ＣｈｅｍＧｅｎｅ社より入手したカスタムオリゴビーズ（１０μｍｏｌｅスケール）を３０ｍＬのＴＥ／ＴＷに懸濁し、１，０００ｇ、１分間遠心を行って洗浄する（２回繰り返し）。ビーズの洗浄および回収は、緩衝液に懸濁した後に１，０００ｇ、１分間の遠心により容易に回収できる。スイングロータを用い、ビーズを吸い込まないよう慎重に緩衝液を除去する
（２）  ビーズ数を血球計数盤を用いてカウントする（図１９Ｃ）。５００，０００ビーズ／ｍＬになるようにＴＥ／ＴＷ溶液で懸濁し、冷蔵保存する。ＴＥ／ＴＷ中で長期間冷蔵保存できる。ＣｈｅｍＧｅｎｅ社製ビーズはトヨパールＨＷを使用しており、ビーズは約３０μｍ径である。
（３）  ビーズ懸濁液１ｍＬ（５００，０００ビーズ）をエッペンドルフチューブに分取し、１，０００ｇ、１分間遠心する。
（４）  ５００μＬの１×Ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ緩衝液（ＮＥＢ社）に懸濁し、１，０００ｇ、１分間遠心する（次のエクステンション反応用緩衝液での前洗浄を行うため）。
（５）  次のオリゴエクステンション反応液を準備し、（４）のビーズに加える。
【表３】
2019073964.tif 000011
（６）  ８５℃、２分間保温した後、６０℃、２０分間保温する。
（７）  ２μＬ  Ｂｓｔ  ３．０ポリメレース（８００Ｕ／μＬ）を添加し、６０℃、１時間３０分間、加温ローテーターで反応する。酵素反応中にビーズが沈降するため、均一な反応を保つため加温ローテーターの使用が望まれる。
（８）  １ｍＬのＢｓｔ反応停止液を加え、３０分間インキュベートし、１，０００ｇ、１分間遠心する（２回繰り返す）。
（９）  エキソヌクレアーゼＩ処理をおこなうため、１ｍＬの１×エキソヌクレアーゼ緩衝液を加え前洗浄し、１，０００ｇで１分間遠心する（未反応のビーズ結合オリゴを除去するため、一本鎖ＤＮＡを分解処理する）。
（１０）  次のエキソヌクレアーゼＩ反応液を調製し、ビーズを懸濁する。
【表４】
2019073964.tif 000012
（１１）  終濃度１Ｕ／μＬになるように２．５μＬ  エキソヌクレアーゼＩ（２０Ｕ／μＬ）を加え、３７℃、４５分間、加温ローテーターで反応させる。
（１２）  １ｍＬのＴＥ／ＳＤＳに懸濁し、１，０００ｇ、１分間遠心する（２度繰り返す）。
（１３）  １ｍＬのＮａＯＨ洗浄液Ｉに懸濁し、１，０００ｇ、１分間遠心する（アルカリ洗浄によりビーズに結合する二本鎖ＤＮＡを変性して、一本鎖ＤＮＡプローブにする）。
（１４）  １ｍＬのＮａＯＨ洗浄液ＩＩに懸濁し、１，０００ｇ、１分間遠心する（２度繰り返す）。
（１５）  １ｍＬのＴＥ／ＴＷに懸濁し、１，０００ｇ、１分間遠心する（２度繰り返す）。最終的に、５×１０５ビーズ／ｍＬとなるようにＴＥ／ＴＷに懸濁し、使用するまで冷蔵保存する。【０２０７】
２．  細胞の調製
＜マウスＴ細胞株＞
（１）  血清培地で培養したマウスＴリンパ腫細胞株を８００ｇ、５分間遠心、細胞を回収する。
（２）  １０ｍＬの血清培地で洗浄する。
（３）  １０ｍＬの血清培地に懸濁し、７５μｍセルストレイナーを通してろ過する。細胞を血球計数盤でカウントする。【０２０８】
＜マウス脾細胞＞
（１）  マウス（Ｃ５７ＢＬ／６、６週齢）を解剖し、脾臓を摘出する。細胞の調製は、細胞のダメージを軽減するため、できるだけシングルセル分離直前に行う。
（２）  １０ｍＬの血清培地を含む培養皿上で、スライドグラスのフロスト部を使って脾臓を軽くすりつぶす。
（３）  １５ｍＬ遠沈管に血清培地を移し、デブリスが沈降するのを待つ。
（４）  上清を別の遠沈管に移し、８００ｇ、５分間遠心する。
（５）  上清を除いた後、２ｍＬ  ＡＣＫ溶解緩衝液を加え懸濁し、室温２分間放置して、赤血球を壊す。
（６）  １０ｍＬの血清培地を加え溶血を止め、８００ｇ、５分間遠心する。
（７）  １０ｍＬの血清培地に懸濁し、７５μｍセルストレイナーを通してろ過する。細胞を血球計数盤でカウントする。【０２０９】
＜マウス脾臓ＣＤ８陽性細胞＞
（１）  １×１０８細胞溶液を分取し、８００ｇ、５分間遠心する。
（２）  １０ｍＬの氷冷ＭＡＣＳ緩衝液に懸濁した後、８００ｇ、５分間遠心する。
（３）  ４００μＬのＣＤ８α＋  Ｔ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｔｉｎ−Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｃｏｃｋｔａｉｌを加え、氷上５分間静置する。
（４）  ３００μＬのＭＡＣＳ緩衝液を加え、次いで２００μＬのＡｎｔｉ−Ｂｉｏｔｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｅａｄｓを加え、氷上で１０分間静置する。
（５）  その間、ＬＳカラムを磁気分離装置に装着し、３ｍＬのＭＡＣＳ緩衝液を加え、カラムを再生する。
（６）  １ｍＬの細胞懸濁液をＬＳカラムにロードし、通過画分（ｆｌｏｗ−ｔｈｒｏｕｇｈ）を集める。
（７）  さらに、３ｍＬのＭＡＣＳ緩衝液を加え、すべての通過画分を回収する。
（８）  ６ｍＬの血清培地を加え、８００ｇ、５分間遠心する。
（９）  １０ｍＬの血清培地を加え、８００ｇ、５分間遠心する。
（１０）  ４ｍＬ血清培地を加え、細胞をカウントする。【０２１０】
３．  シングルセルの分離
３−１．ドロマイトバイオ社シングルセル分離装置のセットアップ（微細繊維の混入がラインを詰まらせる原因になるので、埃などが落ちないように実験台を清潔にし、クリーンルーム用無塵ワイパー等を用いるとよい。）
（１）  コンプレッサーを起動し、ＰＣと制御用専用ソフト（Ｍｉｔｏｓ  Ｆｌｏｗ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｃｅｎｔｅｒ）を起動する
（２）  各ラインの接合を確認するともに、マイクロスコープ下で流路がモニタで確認できるようマイクロチップを装着する
（３）  Ｐポンプ内のボトルに、ろ過滅菌水およびコントロールオイルをセットする。ラインに入れるすべての試薬はあらかじめフィルターろ過をしておく。界面活性剤を含むＥｖａＧｒｅｅｎ  Ｄｒｏｐｌｅｔ  Ｏｉｌは高価なため、試行時にはＮｏｖｅｃ７７００やＦＣ４０（スリーエム社）を用いるとよい。
（４）  細胞用ラインおよびビーズ用ラインは流速４０μＬ／分に、オイル用ラインは２００μＬ／分にセットし、テストフローを実施する。流速を変えることでドロップレットサイズを調整できる。本条件では８５μｍ程度であるが、３０μＬ／分（細胞）、３０μＬ／分（ビーズ）、１６６μＬ／分（オイル）では１００μｍ径程度に調整できる。
（５）  マイクロスコープにてドロップレットが問題なく形成されていることを確認する。【０２１１】
３−２．ビーズの準備
（６）  １．５×１０５ビーズを分取し、１，０００ｇ、１分間遠心し、ペレットダウンする。
（７）  ５００μＬの溶解緩衝液を加え、ビーズを前洗浄し、１，０００ｇ、１分間遠心する。
（８）  ５００μＬの溶解緩衝液を加え、３×１０５ビーズ／ｍＬに調整する。
（９）  ７０ｕｍフィルターでろ過した後、１ｍＬシリンジで吸引する。
（１０）  ５００μＬのサンプルループにビーズを注入するためバルブを切り替え、シリンジを転倒混和しながらが、ゆっくりとビーズを注入する。ビーズが沈殿しないようにシリンジを転倒混和しながら操作する。
（１１）  ビーズラインの流速は４０μＬ／分にセットし、バルブは閉めた状態でスタンバイする。【０２１２】
３−３．細胞の準備
（１２）  血清培地に懸濁した１×１０６細胞を分取し、８００ｇ、５分間遠心する。
（１３）  １０ｍＬ  ＰＢＳ／ＢＳＡに懸濁し、８００ｇ、５分間遠心する。
（１４）  ３×１０５細胞／ｍＬになるようにＰＢＳ／ＢＳＡに懸濁し、７０μｍフィルターでろ過した後にＰポンプ内にボトルをセットする。細胞が劣化しないよう氷冷する。（１５）  スターラーバーで攪拌しながら、流速４０μＬ／分でＲＵＮする。【０２１３】
３−４．オイルの準備
（１６）  コントロールオイルが入ったボトルを取り出し、ドロップレット用Ｄｒｏｐｌｅｔ  Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  Ｏｉｌ  ｆｏｒ  ＥｖａＧｒｅｅｎをＰポンプ内に設置する。
（１７）  流速を２００μＬ／分にセットし、オイルが流れドロップレットが形成されていることを確認する。【０２１４】
３−５．アウトプットラインの準備
（１８）  マイクロチップから出るドロップレットを回収するため、アウトプットラインをチューブにセットする。
（１９）  ビーズラインを開放し、マイクロチップ内にビーズを流す。モニタ画面を見ながら、ビーズが流れ、ドロップレットが形成されていることを確認する（図１９Ｄ）。この条件で４，０００／秒のドロップレットが形成され、２０ドロップレットのうち１つにビーズが封入される。
（２０）  １５分から２０分間ドロップレットを回収する。モニタ画面上でビーズがなくなったことを確認する。回収したドロップレット溶液は、上層ドロップレット、下層オイルの２層が確認できる。【０２１５】
４．  ドロップレットの破壊
（１）  ドロップレットをチューブに回収し、下層のオイルを除去する。チップの先でオイルを吸い取ることで除去する。以降の操作はできるだけ迅速に行う。
（２）  上層（白色）のドロップレットをすべて８連マイクロチューブに分注する。
（３）  ドロップレットを７５℃２分、６５℃から５０℃まで３０秒間隔で１℃温度を下げていきアニーリングを行う。完了後、氷上で保管する。
（４）  すべてのドロップレットを５０ｍＬコニカルチューブに移し、冷却した１０ｍＬの６×ＳＳＣ溶液を加える。
（５）  ５００μＬのパーフルオロオクタノール（ＰＦＯ）を加え、激しくボルテックスする。
（６）  １，０００ｇで１分間遠心し、上清を慎重に除去する。ビーズは白色の層を形成する。６×ＳＳＣ中でビーズが浮き上がることがあるので注意する。ビーズが沈降しない場合は、再度遠心するか、２５μｍフィルターで回収することができる。同時に、底部にたまったオイル層（透明）も除去する。
（７）  １０ｍＬの６×ＳＳＣを加え、激しくボルテックスした後、再度１，０００ｇ、１分間遠心する。上清を慎重に取り除き、ビーズを洗浄する（２度繰り返す）。
（８）  白色ビーズをエッペンドルフチューブに移し、１，０００ｇ、１分間遠心し、上清を除去する。【０２１６】
５．  テンプレートスイッチ逆転写反応
（１）  ビーズペレットに１００μＬの５×ＲＴ緩衝液を加え、１，０００ｇ、１分間遠心して前洗浄する。
（２）  次の逆転写反応液を調製し、ビーズに加える。
【表５】
2019073964.tif 000013
（３）  ２μＬのＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  ＩＶ（２００Ｕ／μＬ）を加え、ヒートローテーターで１時間３０分間、５０℃で保温する。
（４）  １００μＬのＴＥ／ＳＤＳ溶液を加え、１，０００ｇ、１分間遠心して上清を除去する。
（５）  １００μＬのＴＥ／ＴＷ溶液を加え、１，０００ｇ、１分間遠心して上清を除去する（２度繰り返す）。
（６）  １００μＬの１×エキソヌクレアーゼ緩衝液を加え、１，０００ｇ、１分間遠心して前洗浄する。
（７）  次のエキソヌクレアーゼ反応液をビーズに加える。
【表６】
2019073964.tif 000014
（８）  １μＬのエキソヌクレアーゼ（２０Ｕ／μＬ）を添加し、３７℃で３０分間ヒートローテーターで保温する。
（９）  １００μＬのＴＥ／ＳＤＳ溶液を加え、１，０００ｇ、１分間遠心して上清を除去する（２度繰り返す）。
（１０）  １００μＬのＴＥ／ＴＷ溶液を加え、１，０００ｇ、１分間遠心して上清を除去する（２度繰り返す）。【０２１７】
６．  ＰＣＲ反応
（１）  １００μＬのＤＷを加え、１，０００ｇ、１分間遠心して上清を除去する。
（２）  次のプレＰＣＲ反応液を調製し、ビーズに加える
【表７】
2019073964.tif 000015
（３）  １５μＬのＰＣＲ産物に１２μＬのＡｍｐｕｒｅビーズを加え、室温５分静置する。
（４）  マグネットプレート上で室温２分間静置し、上清を除去する。
（５）  ２００μＬの７０％エタノールで洗浄する（２度繰り返す）。
（６）  完全に７０％エタノールを除去した後、１分間ドライアップする。
（７）  １５μＬのＥＢ緩衝液（５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．５）を添加して、ボルテックスして１分間静置する
（８）  マグネットプレート上で室温２分間静置し、上清を新しいチューブに回収する
（９）  次のＰＣＲ反応液を調製し、２μＬの精製したプレＰＣＲ反応液を加え、次のサイクルでＰＣＲを行う。
【表８】
2019073964.tif 000016
（１０）  ＰＣＲ産物を２％アガロースゲル電気泳動で確認する。
（１１）  （３）〜（８）同様のＡｍｐｕｒｅビーズによる精製によりＰＣＲ産物を回収する。
（１２）  ＩＮＤＥＸタグ付加用ＰＣＲ反応液を調製し、２μＬの精製したＰＣＲ反応液を加え、次のサイクルでＰＣＲを行う。
【表９】
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（１３）  （３）〜（８）同様のＡｍｐｕｒｅビーズによる精製によりＰＣＲ産物を回収する。
（１４）  ＩＮＤＥＸ  ＰＣＲ用のＰＣＲ反応液を調製する。２μＬの精製したタグＰＣＲ反応液を加え、次のサイクルでＰＣＲを行う。
【表１０】
2019073964.tif 000018
（１５）  （３）〜（８）同様のＡｍｐｕｒｅビーズによる精製によりＰＣＲ産物を回収する。
（１６）  精製したＩＮＤＥＸ  ＰＣＲ産物について、Ｑｕｂｉｔ  ｄｓＤＮＡアッセイキットを用いてＱｕｂｉｔ３．０フルオロメーターにてＤＮＡ量を測定する。
（１７）４ｐＭになるようにＰＣＲ産物を希釈し、３０万から１００万リードを目標にＭｉＳｅｑにてシーケンスを実施する。【０２１８】
７．  ＴＣＲレパトア
シーケンスデータのマウスＴＣＲリファレンス配列によるＶ，Ｄ，Ｊ領域配列のアサインメント、リード集計などの解析はＲｅｐｅｒｔｏｉｒｅ  Ｇｅｎｅｓｉｓ社が開発したレパトア解析用専用ソフトウェアにより行われた。入手可能なＴＣＲ解析ソフトとしては、ＭｉＸＣＲやＩＭＧＴが提供するＨｉｇｈＶＱｕｅｓｔなどが知られており、それらのソフトウェアを用いることもできる。リード配列間のバーコードマッチングはＲのＢｉｏｓｔｒｉｎｇｓや類似のパッケージを用いて行うことができる。【０２１９】
［考察］
実施例１−１で用いたフローサイトメーターによるソーティング後の解析と、実施例１−３に記載されたドロップレットベースの手法とは、目的によって使い分けることができる。高機能ＴＣＲを見出すことが目的であれば、高々数百個以内のシングルセル解析が対費用効果的にも優れており、低頻度に存在するＴＣＲを（ナイーブ分画のＴＣＲやｓｈａｒｅｄ  ＴＣＲなど）網羅的に解析することが目的であれば、費用はかかるものの、ドロップレットによる解析が有利であると考えられる。【０２２０】
（実施例２：内因性ＴＣＲの除去）
（概要）
本実施例では、ＴＣＲ遺伝子を標的としたゲノム編集による内因性ＴＣＲ遺伝子の完全な除去を実証する。【０２２１】
（材料および方法）
［Ｐｌａｔｉｎｕｍ  ＴＡＬＥＮの作製］
Ｐｌａｔｉｎｕｍ  ＴＡＬＥＮの作製キット（Ｐｌａｔｉｎｕｍ  Ｇａｔｅ  ＴＡＬＥＮ  Ｋｉｔ、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ａｄｄｇｅｎｅ．ｏｒｇ／ｋｉｔｓ／ｙａｍａｍｏｔｏ−ｐｌａｔｉｎｕｍｇａｔｅ／）を用いて、製造者のプロトコール（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ａｄｄｇｅｎｅ．ｏｒｇ／ｋｉｔｓ／ｙａｍａｍｏｔｏ−ｐｌａｔｉｎｕｍｇａｔｅ／＃ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ−ａｎｄ−ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ）に従い、内因性ＴＣＲ遺伝子を標的とするＰｌａｔｉｎｕｍ  ＴＡＬＥＮを作製した。【０２２２】
［Ｐｌａｔｉｎｕｍ  ＴＡＬＥＮからのｍＲＮＡ合成］
（１）ＴＲＡあるいはＴＲＢ遺伝子切断用のＬｅｆｔ（Ｌ）−ＴＡＬＥＮとＲｉｇｈｔ（Ｒ）−ＴＡＬＥＮのプラスミドをＳｍａＩで３０℃ｘ２時間処理した。
（２）Ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ  Ｋで５０℃ｘ２０分処理したのち、ＱＩＡＧＥＮ  ＰＣＲ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔにて精製した。
（３）ｍＭＥＳＳＡＧＥ  ＭＡＣＨＩＮＥ  Ｔ７  Ｋｉｔ（Ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、続いてｐｏｌｙ（Ａ）  Ｔａｉｌｉｎｇ  Ｋｉｔ（Ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）にてｍＲＮＡを合成しＬｉＣｌ沈殿法で精製（Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｅ’ｓ  ｉｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎの通り）した。【０２２３】
本実施例において、ＴＣＲα遺伝子を標的化するために、ＴＡＬＥＮ−ＴＣＲ−ａｌｐｈａ２＿Ｌ１９およびＴＡＬＥＮ−ＴＣＲ−ａｌｐｈａ２＿Ｒ１９の対を用いた。これらのプラスミドの全長配列は、配列番号４６および配列番号４７で表される。また、ＴＡＬＥＮ−ＴＣＲ−ａｌｐｈａ２＿Ｌ１９のＴＡＬＥＮコーディング配列は配列番号５２で表され、当該ＴＡＬＥＮのアミノ酸配列は配列番号５３で表される。ＴＡＬＥＮ−ＴＣＲ−ａｌｐｈａ２＿Ｒ１９のＴＡＬＥＮコーディング配列は配列番号５４で表され、当該ＴＡＬＥＮのアミノ酸配列は配列番号５５で表される。【０２２４】
本実施例において、ＴＣＲβ遺伝子を標的化するために、ＴＡＬＥＮ−ＴＣＲ−ｂｅｔａ１＿Ｌ１９およびＴＡＬＥＮ−ＴＣＲ−ｂｅｔａ１＿Ｒ１９の対、またはＴＡＬＥＮ−ＴＣＲ−ｂｅｔａ３＿Ｌ１９およびＴＡＬＥＮ−ＴＣＲ−ｂｅｔａ３＿Ｒ１９の対を用いた。これらのプラスミドの全長配列は、記載順に配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０および配列番号５１で表される。また、ＴＡＬＥＮ−ＴＣＲ−ｂｅｔａ１＿Ｌ１９のＴＡＬＥＮコーディング配列は配列番号５６で表され、当該ＴＡＬＥＮのアミノ酸配列は配列番号５７で表される。ＴＡＬＥＮ−ＴＣＲ−ｂｅｔａ１＿Ｒ１９のＴＡＬＥＮコーディング配列は配列番号５８で表され、当該ＴＡＬＥＮのアミノ酸配列は配列番号５９で表される。また、ＴＡＬＥＮ−ＴＣＲ−ｂｅｔａ３＿Ｌ１９のＴＡＬＥＮコーディング配列は配列番号６０で表され、当該ＴＡＬＥＮのアミノ酸配列は配列番号６１で表される。ＴＡＬＥＮ−ＴＣＲ−ｂｅｔａ３＿Ｒ１９のＴＡＬＥＮコーディング配列は配列番号６２で表され、当該ＴＡＬＥＮのアミノ酸配列は配列番号６３で表される。【０２２５】
［Ｐｌａｔｉｎｕｍ  ＴＡＬＥＮ  ｍＲＮＡを用いたＴＣＲ欠損Ｔ細胞の調製］
（１）Ｊｕｒｋａｔ細胞を、ＲＰＭＩ１６４０＋  １０％ＦＢＳ＋  ２ｍｍｏｌ／ｌ  Ｌ−Ｇｌｕｔａｍｉｎ＋  １％  ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ／ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ  で３日間培養した。
（２）以下の手順により、ＴＣＲα遺伝子を標的にする場合には、ＴＡＬＥＮ−ＴＣＲ−ａｌｐｈａ２＿Ｌ１９（ＴＣＲα−Ｌ−ＴＡＬＥＮ）  ｍＲＮＡおよびＴＡＬＥＮ−ＴＣＲ−ａｌｐｈａ２＿Ｒ１９（ＴＣＲα−Ｒ−ＴＡＬＥＮ）  ｍＲＮＡそれぞれ１０μｇずつを、ＴＣＲβ遺伝子を標的にする場合にはＴＡＬＥＮ−ＴＣＲ−ｂｅｔａ１＿Ｌ１９（ＴＣＲβ１−Ｌ−ＴＡＬＥＮ）  ｍＲＮＡおよびＴＡＬＥＮ−ＴＣＲ−ｂｅｔａ１＿Ｒ１９（ＴＣＲβ１−Ｒ−ＴＡＬＥＮ）  ｍＲＮＡの対、またはＴＡＬＥＮ−ＴＣＲ−ｂｅｔａ３＿Ｌ１９（ＴＣＲβ３−Ｌ−ＴＡＬＥＮ）  ｍＲＮＡおよびＴＡＬＥＮ−ＴＣＲ−ｂｅｔａ３＿Ｒ１９（ＴＣＲβ３−Ｒ−ＴＡＬＥＮ）  ｍＲＮＡの対を培養Ｊｕｒｋａｔ細胞に導入（ＳＥ  ＣｅｌｌＬｉｎｅ  ４Ｄ−ＮｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒTM  Ｘ  Ｋｉｔ
Ｓ））した。
（２−１）Ｊｕｒｋａｔ細胞５×１０５〜１×１０６ｃｅｌｌを遠心（４００Ｇ、１０分、室温）により細胞ペレットにした。
（２−２）１反応あたりＮｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ  ＳＥ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ  １６．４μｌにＳｕｐｐｌｅｍｅｎｔ  ３．６μｌを加え合計２０μｌのＮｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ  ｓｏｌｕｔｉｏｎで細胞ペレットを懸濁した。
（２−３）ＴＣＲα遺伝子標的用あるいはＴＣＲβ遺伝子標的用TALEN  ｍＲＮＡ
の対をそれぞれ１０μｇずつ添加した。
（２−４）Ａｍａｘａ  ４Ｄ−Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（プログラム：プログラム：ＣＬ−１２０）を用いてＮｕｃｌｅｏｆｅｃｔｉｏｎを行った。【０２２６】
［内因性ＴＣＲ除去の確認］
Ｊｕｒｋａｔ細胞にＴＡＬＥＮ  ｍＲＮＡを導入後にＦＡＣＳで確認されたＣＤ３陰性分画が出現しているのを確認した。ＣＤ３陰性分画をソーティングした細胞はＦＡＣＳでＴＣＲ（内因性）も陰性となっていることを確認した。ＦＡＣＳで得られたＣＤ３の発現強度は、ＦＡＣＳ解析ソフト（Ｆｌｏｗ  Ｊｏ）で解析した。【０２２７】
さらに、出現したＣＤ３／ＴＣＲ陰性分画がＴＡＬＥＮの導入によって得られたものであるかについて、Ｔ７  Ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ  Ｉ（Ｔ７Ｅ１）アッセイにより切断断片の存在の確認を行った。【０２２８】
［Ｔ７  Ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ  Ｉアッセイ］
（１）抽出したゲノムＤＮＡを用いてＰＣＲを行った。ＰＣＲは最終濃度１ｘバッファー、２００μＭ  ｄＮＴＰ、０．４μＭ  プライマー、２．５〜５ｎｇ  ＤＮＡ、Ｅｘｃｅｌｌｅｎｔ  Ｔａｑ  ＨＳ（アプロサイエンス）の反応混合物中で、９４℃  １０分の後、９４℃  ３０秒、５５℃  ３０秒、７２℃  １分を３０サイクルし、さらに７２℃  ５分の反応を行った。
（２）プライマー配列は以下の通りであった。
【化８】
2019073964.tif 000019
（３）１％  ａｇａｒｏｓｅ  ゲルで電気泳動し、ＤＮＡをＧｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いて抽出した。
（４）抽出したＤＮＡを２００〜２５０ｎｇを９５℃  ５分加熱した後、室温に戻して再アニーリングした。
（５）Ｔ７  Ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ  Ｉを加え、３７℃で３０分処理した。その後２％ゲルで電気泳動して確認した。【０２２９】
（結果）
結果は、図３に示される。それぞれのＴＣＲ遺伝子を標的としたゲノム編集により、各内因性ＴＣＲ遺伝子がノックアウトされたことが理解される。また、図４には、Ｔ７Ｅ１アッセイの結果を示しており、図４から、ＴＣＲ遺伝子のノックアウトがゲノム編集によるものであることが理解される。【０２３０】
（実施例３：ＴＣＲの導入）
（概要）
本実施例では、システイン変異ＴＣＲ導入ベクターを用いて、ミスペアリングを生じずにＴＣＲ遺伝子をＴ細胞に発現させることができることを実証する。また、実施例２で実証した内因性ＴＣＲ遺伝子の除去と併せてＴＣＲ遺伝子の導入を行い、導入ＴＣＲのみを発現するＴ細胞を作出できることを実証する。【０２３１】
（材料および方法）
（１）Ｔ細胞をＣＤ３／２８ビーズで刺激し、Ｘ−ＶＩＶＯ２０＋  １０％ＡＢ  ｓｅｒｕｍ＋  ２ｍｍｏｌ／ｌ  Ｌ−Ｇｌｕｔａｍｉｎ＋  １％  ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ／ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ  で３日間培養した。
（２）Ａｍａｘａ  ４Ｄ−Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒを用いて、以下の手順によりＴＣＲα−Ｌ−ＴＡＬＥＮ  ｍＲＮＡとＴＣＲα−Ｒ−ＴＡＬＥＮ  ｍＲＮＡを培養Ｔ細胞に導入（Ｐ３  Ｐｒｉｍａｒｙ  Ｃｅｌｌ  ４Ｄ−ＮｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒTM  Ｘ  Ｋｉｔ  Ｓ）した。
（２−１）Ｔ細胞５×１０５〜１×１０６ｃｅｌｌを遠心（４００Ｇ、１０分、室温）により細胞ペレットにした。
（２−２）１反応あたりＮｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ  Ｐ３  ｓｏｌｕｔｉｏｎ  １６．４μｌにＳｕｐｐｌｅｍｅｎｔ  ３．６μｌを加え合計２０μｌのＮｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ  ｓｏｌｕｔｉｏｎで細胞ペレットを懸濁した。
（２−３）ＴＣＲα−Ｌ−ＴＡＬＥＮ  ｍＲＮＡ、ＴＣＲα−Ｒ−ＴＡＬＥＮ  ｍＲＮＡをそれぞれ１０μｇずつ添加した。
（２−４）Ｎｕｃｅｏｆｅｃｔｉｏｎ（プログラム：ＥＯ−１１５）を行った。
（２−５）再び培養を継続した。
（２−６）Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｉｏｎの３日後にＴＣＲ遺伝子の切断効率をフローサイトメトリーによるＣＤ３およびＴＣＲαまたはβの発現喪失で確認した。
（３）ＣＤ３陰性分画をマグネットソーティングあるいはＦＡＣＳ（ＡｒｉａＩＩ）により回収した。
（４）（３）で得られたＣＤ３陰性Ｔ細胞に、下記で詳述する手順に従って、目的のＴＣＲ遺伝子をレトロウイルスベクターで導入した。
（５）翌日にＦＡＣＳでＴＣＲ陽性ＣＤ３陽性分画が出現していることを確認した。
（６）ＣＤ３陽性分画をマグネットソーティングあるいはＦＡＣＳ（ＡｒｉａＩＩ）により回収した。
（７）（６）で得られたＣＤ３陽性Ｔ細胞に（２）と同じ手法でＴＣＲβ３−Ｌ−ＴＡＬＥＮ  ｍＲＮＡとＴＣＲβ３−Ｒ−ＴＡＬＥＮ  ｍＲＮＡを導入した。
（８）ＣＤ３陰性分画をマグネットソーティングあるいはＦＡＣＳ（ＡｒｉａＩＩ）により回収した。
（９）（８）で得られたＣＤ３陰性Ｔ細胞に再度同様の手順により目的のＴＣＲ遺伝子をレトロウイルスベクターで導入した。
（１０）ＣＤ３陽性分画が出現していることを確認しマグネットソーティングあるいはＦＡＣＳ（ＡｒｉａＩＩ）により回収した。【０２３２】
［ＴＣＲ欠損Ｔ細胞への所望のＴＣＲの導入］
上記手順中のＴＣＲ遺伝子の導入は、以下の手順で行った。
Ｄａｙ１：
（１）ＰＬＡＴ−ＧＰを１０ｃｍデッシュにまき７０％コンフルエントにした。
（２）ＯＰＴＩ−ＭＥＭＩ  １．４ｍｌにベクター１０μｇ、ＶＳＶ−Ｇ  ５μｇを加え室温５分静置した。
（３）ＯＰＴＩ−ＭＥＭＩ  １．４ｍｌにＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００を５０μｌ加え室温５分静置した。
（４）上記の（２）と（３）を混合し室温２０分静置した。
（５）（４）の混合液をＰＬＡＴ−ＧＰの培養液に加え４８時間培養した。【０２３３】
Ｄａｙ  ４−１：
（１）ＰＬＡＴ−ＧＰから上清を回収し遠心（１５００  ｒｐｍ  ｘ５  ｍｉｎ，  ４℃）した。
（２）上清を０．４５μＭフィルターに通してさらに遠心（６０００Ｇ  ｘ１６  ｈｒ，  ４℃）した。【０２３４】
Ｄａｙ  ４−２：
培養中のＴＣＲ欠損Ｔ細胞を、２４ｗｅｌｌプレートに５×１０５／ｗｅｌｌとなるように分注した。【０２３５】
Ｄａｙ  ５：
（１）Ｄａｙ  ４−１（２）の遠心ｔｕｂｅの上清を除きペレットをＸ−ＶＩＶＯ２０
５００μｌで懸濁し、ウイルス液を作成した。
（２）前日に分注したＴＣＲ欠損細胞の培地にウイルス液を加えて遠心（２０００  ｒｐｍ  ｘ３０  ｍｉｎ，  ３２℃）した後、２４時間培養を継続した。翌日に生細胞中のＧＦＰ陽性細胞（フローサイトメトリー）の比率により感染効率を確認した。【０２３６】
［ＴＣＲ遺伝子のｐＭＸｓ−ＩＲＥＳ−ＧＦＰベクターへのクローニング］
（１）ｐＭＸｓ−ＩＲＥＳ−ＧＦＰベクターをＢａｍＨＩとＮｏｔＩで切断した。
（２）各結合部にｏｖｅｒｌａｐ配列が来るようプライマーをデザインした。具体的には以下のとおり：
【化９】
2019073964.tif 000020
（３）各断片を（２）のプライマーを用いてＰＣＲで増幅した。
（４）（１）と（３）で得られた断片を精製した。
（１）の断片（ベクター）を２５ｎｇ／μｌとなるよう精製した。
（２）の断片（Ｖα、Ｃα、Ｖβ、Ｃβ）がそれぞれ１０ｎｇ／μｌとなるよう精製した。
（５）Ｇｉｂｓｏｎ  ａｓｓｅｍｂｌｙ  ｒｅａｃｔｉｏｎ  （ＮＥＢ，  Ｇｉｂｓｏｎ  Ａｓｓｅｍｂｌｙ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ，  Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｅ’ｓ  Ｉｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ通り）を行った。Ｇｉｂｓｏｎ  Ａｓｓｅｍｂｌｙ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ  ５μｌにベクター  １μｌ、Ｖα０．７５μｌ、Ｖβ０．７５μｌ、Ｃα０．７５μｌ、Ｃβ０．７５μｌを加えて５０℃  １時間。
（６）（５）の反応液を４倍希釈しコンピテントセル（ＪＭ１０９）に形質転換した。
（７）ＭｉｎｉｐｒｅｐでＤＮＡを精製しシーケンスで確認した。【０２３７】
［導入ベクター］
導入ベクターとしては、ｐＭＸｓ−ＩＲＥＳ−ＧＦＰ  Ｒｅｔｒｏｖｉｒａｌ  Ｖｅｃｔｏｒ（Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌａｂｓ，  Ｉｎｃ．）をバックボーンとして用いた。ベクターの模式図は図５に示されている。導入しようとするＴＣＲβ鎖のＶ領域と、ＴＣＲβ鎖の定常領域（Ｃβ）と、Ｐ２Ａ配列と、導入しようとするＴＣＲα鎖のＶ領域と、ＴＣＲα鎖の定常領域（Ｃα）を、この順にｐＭＸｓ−ＩＲＥＳ−ＧＦＰ  Ｒｅｔｒｏｖｉｒａｌ  Ｖｅｃｔｏｒの導入配列部分に組み込んで使用した。このようなベクターの作製については、Incorporation  of  Transmembrane  Hydrophobic  Mutations  in  the  TCR  Enhance  Its  Surface  Expression  and  T  Cell  Functional  Avidity  Astar  Haga-Friedman,  Miryam  Horovitz-Fried  and  Cyrille  J.  Cohen  J  Immunol  2012;  188:5538-5546;  Prepublished  online  27  April  2012に記載されている。【０２３８】
Enhanced  antitumor  activity  of  T  cells  engineered  to  express  T-cell  receptors  with  a  second  disulfide  bond.  Cohen  CJ,  Li  YF,  El-Gamil  M,  Robbins  PF,  Rosenberg  SA,  Morgan  RA.Cancer  Res.  2007  Apr  15;67(8):3898-903.を参考として、C領域に追加のCysを導入しＳ−Ｓ結合を１つ追加した。さらに、Incorporation  of  Transmembrane  Hydrophobic  Mutations  in  the  TCR  Enhance  Its  Surface  Expression  and  T  Cell  Functional  Avidity  Astar  Haga-Friedman,  Miryam  Horovitz-Fried  and  Cyrille  J.  Cohen  J  Immunol  2012;  188:5538-5546;  Prepublished  online  27  April  2012を参考として、膜貫通領域に疎水性アミノ酸への変異を導入した。【０２３９】
自己切断性のリンカーとして、Ｐ２Ａ配列を用いた（J.H.  Kim,  S.R.  Lee,  L.H.  Li,  H.J.  Park,  J.H.  Park,  K.Y.  Lee,  et  al.,  High  cleavage  efficiency  of  a  2A  peptide  derived  from  porcine  teschovirus-1  in  human  cell  lines,  zebrafish  and  mice,  PLoS  One.  6  (2011)  1-8.  doi:10.1371/journal.pone.0018556.）【０２４０】
なお、用いたＴＣＲα鎖およびＴＣＲβ鎖の定常領域のアミノ酸配列は以下のとおりであった。
【化１０】
2019073964.tif 000021
【０２４１】
［導入ＴＣＲ遺伝子］
健常者末梢血に存在するＣＭＶｐｐ６５  ＱＹＤ抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞からｈＴＥＣ１０を用いてＱＹＤ特異的ＴＣＲαβ遺伝子を取得し、導入遺伝子として用いた。【０２４２】
［Ｔｒｅｇの抗原特異性］
導入を行ったＴ細胞のＱＹＤ抗原に対する結合性を測定し、ＴＣＲの導入を確認した。Ｔｒｅｇ（ＱＹＤ−Ｔｒｅｇ）の抗原特異性があるかをＱＹＤテトラマー染色で確認した。【０２４３】
（結果）
制御性Ｔ細胞に対して導入を行った結果は、図５および６に示される。フローサイトメトリー分析の結果から、改変後のＴ細胞において、導入されたＴＣＲのみが発現されていることが理解される。【０２４４】
ＱＹＤへの結合性を測定した結果を、図８に示した。ポリクローナルのＴｒｅｇと比較して、ＱＹＤ特異的ＴＣＲを導入したＴｒｅｇでは、ＱＹＤへの結合性が上昇していた。【０２４５】
また、細胞傷害性Ｔ細胞に対して、同様にＴＣＲ導入を行った結果を、図９に示した。内因性のＴＣＲの干渉を受けずＴＣＲの入れ替えが可能であったことが理解される。【０２４６】
ＴＣＲ−特異的ＴＡＬＥＮによる内因性ＴＣＲのノックダウンとＣｙｓ−ＴＣＲによる遺伝子導入により、高アフィニティのＣＭＶ  ｐｐ６５  ＮＬＶ特異的ＴＣＲ発現Ｔ細胞を樹立することが可能であった。【０２４７】
（実施例４：作製した抗原特異的制御性Ｔ細胞の性質）
（概要）
実施例３の手法に従って作製した抗原特異的制御性Ｔ細胞の性質を以下のとおり評価した。【０２４８】
［Ｔｒｅｇ固有形質の保持の確認］
実施例３の手法に従って作製した抗原特異的制御性Ｔ細胞、ポリクローナル制御性Ｔ細胞およびＴＣＲノックアウト制御性Ｔ細胞と、対照（ＣＤ２５が陰性のＣＤ４陽性Ｔ細胞分画）を下記の抗体で染色し、ＦＡＣＳで測定し蛍光強度をＦＡＣＳ解析ソフト（ｆｌｏｗ  ｊｏ）で解析し、ＴＣＲを置換したＴｒｅｇとポリクローナルＴｒｅｇ（ＴＣＲ置換前）の性質に差がないかを検証した。
抗体：Anti-human  CD25  antibody、Anti-human  CD127  antibody、Anti-human  FoxP3  antibody、Anti-human  CTLA-4  antibody、Anti-human  HELIOS  antibody。【０２４９】
結果を、図１０および１１に示した。これらの細胞の表面マーカー発現には、有意な差がなく、本発明のＴＣＲ除去およびＴＣＲ導入では、制御性Ｔ細胞に固有の形質は保持されることがわかった。【０２５０】
［抗原刺激に対する増殖］
実施例３でＴＣＲ置換によって得られたＴｒｅｇ（ＱＹＤ−Ｔｒｅｇ）がＱＹＤペプチド抗原を認識し増殖するかを確認した。より詳細には、以下のとおりである。
（１）ＱＹＤ−Ｔｒｅｇを遠心によりペレットにＰＢＳ  １ｍｌで懸濁した。
（２）１μＬのＣｅｌｌ  ｔｒａｃｅ  ｖｉｏｌｅｔを加え（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，  ＣｅｌｌＴｒａｃｅ  Ｖｉｏｌｅｔ  Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ，  ｃａｔ＃Ｃ３４５５７  ）、３７℃で２０分暗所で静置した。
（３）ＰＢＳで２回洗浄（３００Ｇ，  １０ｍｉｎ，  室温）した。
（４）ペプチドパルスした抗原提示細胞とｃｅｌｌ  ｔｒａｃｅ  ｖｏｌｅｔで標識したＱＹＤ−Ｔｒｅｇの細胞数が１：１となるようにＴ  ｃｅｌｌ培地中（Ｘ−ＶＩＶＯ２０＋  １０％ＡＢ  ｓｅｒｕｍ＋  ２ｍｍｏｌ／ｌ  Ｌ−Ｇｌｕｔａｍｉｎ＋  １％  ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ／ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ）で混合し９６ｗｅｌｌプレート内で５日間培養した。
（５）ＦＡＣＳでＣｅｌｌ  ｔｒａｃｅ  ｖｉｏｌｅｔの蛍光強度が減弱しＱＹＤ−Ｔｒｅｇが分裂していることを確認した。【０２５１】
結果は、図１２および１３に示される。５日間の培養後、Ｃｅｌｌ  ｔｒａｃｅ  ｖｉｏｌｅｔの蛍光強度が減弱しており、ＱＹＤ−Ｔｒｅｇが抗原提示細胞による抗原刺激に応答して増殖したことが理解される。この増殖は、ＱＹＤ刺激を行わなかった群、およびポリクローナル制御性Ｔ細胞の群では観察されず、本発明の方法によって、製造された制御性Ｔ細胞の抗原への特異的反応性の高さが実証されている。【０２５２】
［抗原特異的制御性Ｔ細胞による抗原特異的エフェクターＴ細胞抑制］
ＴＣＲ置換によって得られたＴｒｅｇ（ＱＹＤ−Ｔｒｅｇ）がＱＹＤ−Ｔｅｆｆの抗原特異的増殖を抑制するかを確認した。より詳細には、以下のとおりである。【０２５３】
Ａ．抗原提示細胞の分離（ＣＤ４陰性ＣＤ８陰性細胞の分離）
Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  ＣＤ８  マイクロビーズ，  ヒト（１３０−０４５−２０１）を使用Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  ＣＤ４＋  Ｔ  Ｃｅｌｌ  アイソレーションキット，  ヒト（１３０−０９６−５３３）を使用：
（１）末梢血５０ｍＬからＦｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ  ＰＲＥＭＩＵＭでＰＢＭＣｓを分離し、遠心（４００Ｇ，  １０ｍｉｎ，  室温）により細胞ペレットを作成した。
（２）ペレットを８０μＬのＭＡＣＳ  Ｂｕｆｆｅｒで懸濁し、２０μＬのＣＤ８  ＭｉｃｒｏＢｅａｄｓを加えた。
（３）４℃で１５分静置した。
（４）ＭＡＣＳ  Ｂｕｆｆｅｒで洗浄した（３００Ｇ，  １０  ｍｉｎ，  室温）。
（５）計５００μＬとなるようにＭＡＣＳ  Ｂｕｆｆｅｒを加え、Ｍａｇｎｅｔｉｃ  ｓｅｐａｒａｔｉｏｎによりＣＤ８−の分画を回収し遠心（４００Ｇ，  １０ｍｉｎ，  室温）により細胞ペレットを作成した。
（６）ペレットを４０μＬのＭＡＣＳ  Ｂｕｆｆｅｒで懸濁し、１０μＬのＴ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｔｉｎ−Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｃｏｃｋｔａｉｌを加えた。
（７）４℃で５分静置した。
（８）３０μＬのＭＡＣＳ  Ｂｕｆｆｅｒと２０μＬのＣＤ４＋Ｔ  Ｃｅｌｌ  ＭｉｃｒｏＢｅａｄ  Ｃｏｃｋｔａｉｌを添加した
（９）４℃で１０分静置した。
（１０）合計５００μＬとなるようにＭＡＣＳ  Ｂｕｆｆｅｒを加え、Ｍａｇｎｅｔｉｃ  ｓｅｐａｒａｔｉｏｎによりＣＤ４−の分画を回収（ＣＤ４−８−Ｔ細胞となっている）した。【０２５４】
Ｂ．抗原提示細胞をペプチドパルス
（１）Ａ．で回収したＣＤ４−８−  ｃｅｌｌを１ｍｌのＸ−ＸＩＶＯ２０で懸濁した。
（２）ペプチド（ここではＱＹＤＰＶＡＡＬＦ：ＱＹＤ（配列番号９２））を１μＭとなるよう加えた。
（３）室温で２時間静置した。
（４）３５Ｇｙのγ線照射を行った。【０２５５】
Ｃ．Ｔｒｅｇ  ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｓｓａｙ
（１）ＱＹＤ−ＴＣＲを遺伝子導入したＣＤ８＋  Ｔ  ｃｅｌｌ（ＱＹＤ−Ｔ  ｅｆｆ）を遠心によりペレットにＰＢＳ  １ｍｌで懸濁した。
（２）１μＬのＣｅｌｌ  ｔｒａｃｅ  ｖｉｏｌｅｔを加え（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，
ＣｅｌｌＴｒａｃｅ  Ｖｉｏｌｅｔ  Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ，  ｃａｔ＃Ｃ３４５５７  ）、３７℃で２０分暗所で静置した。
（３）ＰＢＳで２回洗浄した（３００Ｇ，  １０ｍｉｎ，  室温）。
（４）Ｂ．の工程でペプチドパルスした抗原提示細胞とｃｅｌｌ  ｔｒａｃｅ  ｖｉｏｌｅｔで標識したＱＹＤ−Ｔｅｆｆの細胞数が２：１となるようにＴ  ｃｅｌｌ  培地中（Ｘ−ＶＩＶＯ２０＋  １０％ＡＢ  ｓｅｒｕｍ＋  ２ｍｍｏｌ／ｌ  Ｌ−Ｇｌｕｔａｍｉｎ＋  １％  ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ／ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ）  で混合し９６  ｗｅｌｌプレートにまいた。
（５）Ｃ．（４）の各ｗｅｌｌにＴｒｅｇ（所望のＴＣＲが導入されたＴｒｅｇ，）の細胞数を調整し、ＣＤ８＋  Ｔ  ｃｅｌｌとの細胞数の比が１６：１、８：１、４：１、２：１、１：１となるように加えた。
（６）５、７日目にＦＡＣＳで各細胞比率の条件でのｃｅｌｌ  ｔｒａｃｅ  ｖｉｏｌｅｔの蛍光強度を測定しＱＹＤ−Ｔｅｆｆの増殖抑制を確認した。【０２５６】
結果を、図１４および１５に示した。ポリクローナルの制御性Ｔ細胞と比較して、抗原特異的制御性Ｔ細胞は、著しく高いエフェクターＴ細胞の増殖抑制を示した。【０２５７】
（実施例５：ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの抗原特異的制御性Ｔ細胞による免疫抑制）
（概要）
本実施例は、本発明の方法に従って製造した抗原特異的制御性Ｔ細胞が自己免疫疾患への応用可能性を有することを、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで実証することを目的とする。【０２５８】
皮膚色素細胞の自己抗原であるＭＡＲＴ−１抗原は皮膚科領域の難治性自己免疫疾患である尋常性白斑の原因となる標的抗原である。また健常者末梢血中にもこの抗原を認識するＴ細胞は存在している。【０２５９】
（材料および方法）
（１）健常者の検体から、ｈＴＥＣ１０を用いてＭＡＲＴ−１特異的ＴＣＲαβペア遺伝子をクローニングする。
（２）Ｐｌａｔｉｎｕｍ  ＴＡＬＥＮにより、制御性Ｔ細胞のＴＣＲゲノムを編集し、内因性ＴＣＲの発現を排除する。
（３）ゲノム編集後の制御性Ｔ細胞を増殖させる。
（４）増殖させた制御性Ｔ細胞へクローニングしたＴＣＲαβペア遺伝子を導入する。
（５）ＴＣＲ遺伝子を導入した制御性Ｔ細胞と共培養することによる、ＭＡＲＴ−１抗原特異的なエフェクターＴ細胞などのＭＡＲＴ−１抗原への応答性の変化を評価する。【０２６０】
（結果）
２人の健常者の検体から、ｈＴＥＣ１０を用いて１８種類以上のＭＡＲＴ−１特異的ＴＣＲαβペア遺伝子をクローニングすることが可能である。これらのＭＡＲＴ−１特異的ＴＣＲのＭＡＲＴ−１に対する結合性を評価し、最も高機能なＴＣＲを選択するとともに、該ＴＣＲの遺伝子を導入したＭＡＲＴ−１抗原特異的Ｔｒｅｇの作成が可能であり、自己免疫疾患のモデル抗原としてのＭＡＲＴ−１抗原に対する免疫応答を、上記のＴＣＲ置換Ｔｒｅｇが抑制する。【０２６１】
（実施例６：自己免疫疾患マウスモデルに対するＴｅｆｆ→Ｔｒｅｇの有効性の検討）
（概要）
本実施例では、ｉｎ  ｖｉｖｏでの抗原特異的制御性Ｔ細胞の自己免疫疾患への応用可能性の実証を目的として、製造した抗原特異的制御性Ｔ細胞による免疫抑制を動物モデルで示す。本実施例の概要は、図１６に示される。【０２６２】
（材料および方法）
以下のマウスおよび自己抗原を用いて、以下のモデル疾患への応用可能性を検証する。モデルマウス：ＮＯＤ（ｎｏｎ−ｏｂｅｓｅ  ｄｉａｂｅｔｉｃ）マウス
モデル自己抗原：ＧＡＤ６５
モデル疾患：Ｉ型糖尿病【０２６３】
動物実験を以下のように実施する。
（１）７日齢のＮＯＤマウスにＧＡＤ６５由来のペプチド抗原ｐ５４６（３０μｇ）を出生後７日目、９日目、１１日目に経鼻的に投与する。
（２）（１）の方法で免疫した４週齢の雌マウスから、Ｈ−２Ｋｄ／ｐ５４６テトラマーを用いてｐ５４６反応性エフェクターＣＤ８＋Ｔ細胞（ｐ５４６−Ｔｅｆｆ）をフローサイトメトリーで分離する。
（３）ｐ５４６−ＴｅｆｆのＴＲＡＶ、ＴＲＢＶを次世代シーケンサーで網羅的に同定し、高頻度クロノタイプの存在を確認した後、単一細胞クローニングによりペア同定する。（４）上記の（１）−（３）の過程によって同定されたｐ５４６抗原反応性ＴＣＲ（ｐ５４６−ＴＣＲｅｆｆを、内因性ＴＣＲの発現を欠いたマウスＴ細胞株にレトロウイルスベクターを用いて導入し、それらの機能的階層性を決定する。
（５）４週齢の雄ＮＯＤマウスの脾・リンパ節・末梢血より、ビーズカラム法によってＣＤ４＋ＣＤ２５＋制御性Ｔ細胞を分離し、Ｐｌａｔｉｎｕｍ  ＴＡＬＥＮを用いてＴＣＲをノックアウトする。
（６）（４）の過程によって得られた高機能ｐ５４６−Ｔｅｆｆ−ＴＣＲの候補を、ＴＣＲをノックアウトしたＣＤ４＋ＣＤ２５＋制御性Ｔ細胞に導入する（ｐ５４６−Ｔｅｆｆ−ＴＣＲ発現Ｔｒｅｇ）。
（７）Ｍｏｃｋベクターを導入したＴｒｅｇおよびｐ５４６−ＴＣＲｅｆｆを導入したＴｒｅｇを抗ＣＤ３／ＣＤ２８抗体およびＩＬ−２存在下に増幅し、Ｉ型糖尿病を発症したＮＯＤマウスに輸注し、膵臓β細胞傷害および耐糖能傷害の改善が得られるかを比較する。【０２６４】
（結果）
Ｍｏｃｋベクターを導入したＴｒｅｇを輸注したＮＯＤマウスにおいては、膵臓β細胞傷害および耐糖能傷害の改善が見られないが、ｐ５４６−ＴＣＲｅｆｆを導入したＴｒｅｇを輸注したＮＯＤマウスにおいては膵臓β細胞傷害および耐糖能傷害の改善が見られる。【０２６５】
（実施例６−２：マウスＴＣＲの切断）
（概要）
マウスＴＣＲ切断用にＰｌａｔｉｎｕｍ  ＴＡＬＥＮを作成し、レポータープラスミドを用いたアッセイ法（ＳＳＡアッセイ）により切断活性を評価した。【０２６６】
（材料および方法）
マウスＴＣＲ切断用に、３種類のPｌａｔｉｎｕｍ  ＴＡＬＥＮ（ＴＲＡ２−ＴＡＬＥＮ、ＴＲＢ１−ＴＡＬＥＮ、ＴＲＢ２−ＴＡＬＥＮ）を作成した。
マウスＴＲＡ２−ＴＡＬＥＮ、マウスＴＲＢ１―ＴＡＬＥＮ、マウスＴＲＢ２−ＴＡＬＥＮは、それぞれ、マウスのＴＲＡ遺伝子Ｃα２領域、ＴＲＢ遺伝子Ｃβ１領域、ＴＲＢ遺伝子Ｃβ２領域内に切断部位を含むように設計した。それぞれの標的配列は、
マウスＴＲＡ２−ＴＡＬＥＮ：左側TCTGCCTGTTCACCGACT（配列番号１３０）および右側AATGTGCCGAAAACCATGGA（配列番号１３１）、
マウスＴＲＢ１―ＴＡＬＥＮ：左側TGACTCCACCCAAGGTCTCC（配列番号１３２）および右側AAAAGCAGAGATTGCAAACA（配列番号１３３）、
マウスＴＲＢ２−ＴＡＬＥＮ：左側TGTGCTTGGCCAGGGGCTTC（配列番号１３４）および右側GGAGCTGAGCTGGTGGGTGA（配列番号１３５）
であった。Pｌａｔｉｎｕｍ  ＴＡＬＥＮの調製手順は、（実施例２：内因性ＴＣＲの除去）の［Ｐｌａｔｉｎｕｍ  ＴＡＬＥＮの作製］に従った。【０２６７】
以下のＵＲＬに記載されている方法により、ヒト胎児腎由来細胞株ＨＥＫ２９３Ｔを用いたＳＳＡアッセイを行った（Ｓａｋｕｍａ  Ｔ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｇｅｎｅｓ  ｔｏ  Ｃｅｌｌｓ  ２０１３）。ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｍｌｓ．ｓｃｉ．ｈｉｒｏｓｈｉｍａ−ｕ．ａｃ．ｊｐ／ｓｍｇ／ｇｅｎｏｍｅ＿ｅｄｉｔｉｎｇ／ｄｏｃｕｍｅｎｔｓ／６−ｍｏｄｕｌｅ．ｐｄｆ【０２６８】
（結果）
結果を図２８に示す。Ｚｉｎｃ  ｆｉｎｇｅｒ  ｎｕｃｌｅａｓｅコントロール（ｐＳＴＬ−ＺＦＡ３６／ＺＦＡ３６）の切断活性を１とする時、マウスＴＲＡ２−ＴＡＬＥＮ，  マウスＴＲＢ１−ＴＡＬＥＮ，  マウスＴＲＢ２−ＴＡＬＥＮの標的切断部位に対する活性は、それぞれ３．０９倍、３．７９倍、３．４１倍であることがわかる。ｐＳＴＬはＺＦＡ３６の陰性コントロールであり、ＴＲＡ２，  ＴＲＢ１，  ＴＲＢ２はそれぞれＴＡＬＥＮ非存在下のレポーターのみの陰性コントロール、ＴＲＡ２−ＴＡＬＥＮ／ＺＦＡ３６，  ＴＲＢ１−ＴＡＬＥＮ／ＺＦＡ３６，  ＴＲＢ２−ＴＡＬＥＮ／ＺＦＡ３６はそれぞれレポーター遺伝子がＺＦＡ３６の場合の陰性コントロールである。【０２６９】
（実施例７：製品化例）
本発明の方法に用いるために、以下のようなコンポーネントの１つまたは複数を含む製品を提供する。【０２７０】
ＴＣＲ遺伝子を編集する手段：ＴＣＲ遺伝子を編集するための組成物などの形で提供する。ＴＣＲ遺伝子を標的化するゲノム編集酵素（ＴＡＬＥＮ、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９、ＺＦＮ）などを用いる。標的化部位と機能的ドメインとを一緒に提供する。あるいは、標的化部位と機能的ドメインとを別個にも提供する。ゲノム編集酵素を核酸の形で提供する。あるいは、ゲノム編集酵素をポリペプチドの形で提供する。ゲノム編集酵素を、ｍＲＮＡの形で提供する。ゲノム編集酵素を、導入用ベクターと一緒に提供する。【０２７１】
内因性ＴＣＲ遺伝子の変異を確認する手段：内因性ＴＣＲ遺伝子に特異的なＰＣＲ用プライマーを提供する。ゲノム編集を行う前に、標的化される部位に変異が存在せず、特異的な編集を行うことができることを確認できる。【０２７２】
内因性ＴＣＲ遺伝子の除去を確認する手段：内因性ＴＣＲが除去された場合の変化の測定に用いられる抗体を提供する。抗ＣＤ３抗体または抗ＴＣＲ抗体を提供する。標識した抗体を提供する。【０２７３】
外因性ＴＣＲを導入する手段：ＴＣＲを導入するためのベクター等を提供する。Ｖｅｎｕｓのように細胞毒性の少ない蛍光色素を組み込んだレンチウイルス系ベクターや、トランスポゾンを利用したＳｌｅｅｐｉｎｇ  Ｂｅａｕｔｙなどの非ウイルス系ベクターを用いる。【０２７４】
遺伝子が導入された細胞を検出する手段：内因性ＴＣＲが導入された場合の変化の測定に用いられる抗体を提供する。抗ＣＤ３抗体または抗ＴＣＲ抗体を提供する。標識した抗体を提供する。【０２７５】
（実施例８：がん抗原特異的ＴＣＲを発現するＴ細胞の作出）
（概要）
本実施例において、本明細書に記載の方法に従って、がん抗原特異的ＴＣＲを発現するＴ細胞を作出し、当該細胞の殺細胞活性を検証した。【０２７６】
（方法および材料）
標的エピトープとして、ＨＬＡ−Ａ＊０２０１−ｒｅｓｔｒｉｃｔｅｄ  ＮＹ−ＥＳＯ−１１５７−１６５（ＳＬＬＭＷＩＴＱＣ）（配列番号１１５）を選択した。かかるエピトープに特異性を有するＴＣＲとして、可変領域の各セグメントにおいて以下の構成を有する１Ｇ４  ＴＣＲを用いた。
【表１１】
2019073964.tif 000022
【０２７７】
［ｐＭＸｓベクターを用いた１Ｇ４  ＴＣＲ導入用ベクターの作出］
（１）１Ｇ４  ＴＣＲのＶαカセット、Ｖβカセットを準備した（各塩基配列は下記）。
【化１１】
2019073964.tif 000023
（２）ｐＭＸｓ−ＩＲＥＳ−ＧＦＰベクターをＢａｍＨＩとＮｏｔＩで切断した。
（３）各結合部にｏｖｅｒｌａｐ配列が来るようプライマーをデザインした。具体的には以下のとおり：
【化１２】
2019073964.tif 000024
（４）各断片を（３）のプライマーを用いてＰＣＲで増幅した。
（５）（２）と（４）で得られた断片を精製した。
（２）の断片（ベクター）を２５ｎｇ／μｌとなるよう精製した。
（４）の断片（Ｖα、Ｃα、Ｖβ、Ｃβ）がそれぞれ１０ｎｇ／μｌとなるよう精製した。
（６）Ｇｉｂｓｏｎ  ａｓｓｅｍｂｌｙ  ｒｅａｃｔｉｏｎ  （ＮＥＢ，  Ｇｉｂｓｏｎ  Ａｓｓｅｍｂｌｙ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ，  Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｅ’ｓ  Ｉｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ通り）を行った。Ｇｉｂｓｏｎ  Ａｓｓｅｍｂｌｙ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ  ５μｌにベクター  １μｌ、Ｖα０．７５μｌ、Ｖβ０．７５μｌ、Ｃα０．７５μｌ、Ｃβ０．７５μｌを加えて５０℃  １時間。
（７）（６）の反応液を４倍希釈しコンピテントセル（ＪＭ１０９）に形質転換した。
（８）ＭｉｎｉｐｒｅｐでＤＮＡを精製しシーケンスで確認した。【０２７８】
［ＴＣＲ−ｎｕｌｌ  Ｊｕｒｋａｔ細胞およびｐｒｉｍａｒｙ  Ｔ細胞への１Ｇ４  ＴＣＲの導入］
以下の手順で細胞への１Ｇ４  ＴＣＲの導入を行った。ＴＣＲ−ｎｕｌｌ  Ｊｕｒｋａｔ細胞は、Ｍｉｙａｍａ  ｅｔ  ａｌ．  Ｓｃｉ  Ｒｅｐ  ２０１７に記載される手順に基づき、ＣＲＩＳＰＲ系を用いて作出した。ｐｒｉｍａｒｙ  Ｔ細胞は、ドナー末梢血から分離したＴ細胞を使用した。なお、ＴＣＲ−ｎｕｌｌ  Ｊｕｒｋａｔ細胞の作製過程でのＣＤ３発現の変化については、図２１に示している。【０２７９】
Ｄａｙ１：
（１）ＰＬＡＴ−ＧＰを１０ｃｍデッシュにまき７０％コンフルエントにした。
（２）ＯＰＴＩ−ＭＥＭＩ  １．４ｍｌにｐＭＸｓ−ＩＲＥＳ−１Ｇ４ベクター１０μｇ、ＶＳＶ−Ｇ  ５μｇを加え室温５分静置した。
（３）ＯＰＴＩ−ＭＥＭＩ  １．４ｍｌにＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００を５０μｌ加え室温５分静置した。
（４）上記の（２）と（３）を混合し室温２０分静置した。
（５）（４）の混合液をＰＬＡＴ−ＧＰの培養液に加え４８時間培養した。【０２８０】
Ｄａｙ４−１：
（１）ＰＬＡＴ−ＧＰから上清を回収し遠心（１５００  ｒｐｍ  ｘ５  ｍｉｎ，  ４℃）した。
（２）上清を０．４５μＭフィルターに通してさらに遠心（６０００Ｇ  ｘ１６ｈｒ，
４℃）した。【０２８１】
Ｄａｙ４−２：
培養中のＴＣＲ−ｎｕｌｌ  Ｊｕｒｋａｔ細胞あるいはｐｒｉｍａｒｙ  Ｔ細胞を、２４ｗｅｌｌプレートに５×１０５／ｗｅｌｌとなるように分注した。【０２８２】
Ｄａｙ５：
（１）Ｄａｙ４−１−（２）の遠心ｔｕｂｅの上清を除きペレットをＸ−ＶＩＶＯ２０
５００μｌで懸濁し、ウイルス液を作成した。
（２）前日に分注したＴＣＲ−ｎｕｌｌ  Ｊｕｒｋａｔ細胞あるいはｐｒｉｍａｒｙ  Ｔ細胞の培地にウイルス液を加えて遠心（２０００  ｒｐｍ  ｘ３０ｍｉｎ，  ３２℃）した後、２４時間培養を継続した。翌日に生細胞中のＧＦＰ陽性細胞（フローサイトメトリー）の比率により感染効率を確認した。【０２８３】
［Ｂ−ＬＣＬ（Ｂ−ｌｙｍｐｈｏｂｌａｓｔｏｉｄ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅｓ）を用いたＮＹ−ＥＳＯ−１  ＳＬＬ特異的ＴＣＲ−Ｔのｋｉｌｌｉｎｇ  ａｓｓａｙ］
以下に示す手順により、作出したがん抗原特異的ＴＣＲを発現するＴ細胞の殺細胞活性を検証した。【０２８４】
Ｂ−ＬＣＬ（ターゲット細胞）の準備：
Ｂ−ＬＣＬ  ２Ｘ１０６を２４ｗｅｌｌプレートに準備し、５０μｌの５１ＣｒとＮＹ−ＥＳＯ−１エピトープペプチド（ＳＬＬＭＷＩＴＱＣ（配列番号１１５））（最終濃度１ｎｇ／μｌ）を加え１時間培養した。
ＲＰＭＩ１６４０にて２回洗浄（３００Ｇ，  １０  ｍｉｎ，  ４℃）した。
ＳＬＬペプチド添加Ｂ−ＬＣＬを１Ｘ１０４／１００μｌ  ＲＰＭＩ１６４０に調整した。
同様にエピトープペプチドを添加していないＢ−ＬＣＬ  １Ｘ１０４／１００μｌ  ＲＰＭＩ１６４０をコントロール用に調整した。【０２８５】
ＮＹ−ＥＳＯ−１  ＳＬＬ特異的ＴＣＲ−Ｔ（エフェクター細胞）、およびポジティブコントロール、ネガティブコントロールの準備：
培養中のＮＹ−ＥＳＯ−１  ＳＬＬ特異的ＴＣＲ−Ｔを、最終的にエフェクター（ＮＹ−ＥＳＯ−１  ＳＬＬ特異的ＴＣＲ−Ｔ）：ターゲット（Ｂ−ＬＣＬ）比が３０：１、１０：１、３：１、１：１になるように細胞数を調整（３Ｘ１０５／１００μｌ  ＲＰＭＩ１６４０、１Ｘ１０５／１００μｌ  ＲＰＭＩ１６４０、３Ｘ１０４／１００μｌ  ＲＰＭＩ１６４０、１Ｘ１０４／１００μｌ  ＲＰＭＩ１６４０）し、９６ｗｅｌｌプレートに分注した。
ポジティブコントロールとして、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００  １００μｌを９６ｗｅｌｌプレートに分注した。
ネガティブコントロールとして、ＲＰＭＩ１６４０  １００μｌを９６ｗｅｌｌプレートに分注した。【０２８６】
Ｃｈｒｏｍｉｕｍ−５１  ｒｅｌｅａｓｅ  ａｓｓａｙ：
２．で準備した９６ｗｅｌｌプレートの各ｗｅｌｌに１．で準備したＢ−ＬＣＬを１００μｌ分注し４時間培養した。
各ｗｅｌｌから１００μｌの上清をとってマイクロチューブに移し、各ｗｅｌｌの上清中に放出された５１Ｃｒのガンマ値をガンマカウンターで計測した。
｛（各ｗｅｌｌのガンマ値）−（ネガティブコントロールのガンマ値）｝／（ポジティブコントロールのガンマ値）の計算式により、各ｗｅｌｌのポジティブコントロールに対する殺細胞効果の割合（％ｌｙｓｉｓ）を計算しグラフ化した。【０２８７】
（結果）
ＴＣＲ−ｎｕｌｌ  Ｊｕｒｋａｔ細胞およびｐｒｉｍａｒｙ  Ｔ細胞への１Ｇ４  ＴＣＲの導入結果は、それぞれ図２２および図２３に示される。図２２左図において、導入したＴＣＲの発現効率は４６．２％であり、図２２右図において、ＳＬＬペプチドテトラマーへの結合能を有するＴＣＲ導入細胞の割合は４６．８％であった。これらの双方で同様の効率が得られていることから、ＴＣＲ−ｎｕｌｌ  Ｊｕｒｋａｔ細胞に導入し、発現させたＴＣＲのほぼ全てがＳＬＬペプチドを認識していること、すなわち、ミスペアリングなく発現していることが示される。このことは、ゲノム編集を行ったＴ細胞に対して、ｐＭＸベクターが適合性であることを示している。ｐｒｉｍａｒｙ  Ｔ細胞については６．２８％の導入効率であった（図２３）。【０２８８】
ネガティブコントロールではいずれの濃度比率においても殺細胞活性（細胞からの５１Ｃｒの放出）は観測されなかったが、作出したがん抗原特異的ＴＣＲ発現Ｔ細胞は、濃度依存的に殺細胞活性を示した（図２６）。【０２８９】
（実施例９：ＴＡＬ−ＰＩＴＣｈ法によるＴＣＲの置換）
（概要）
本発明の改変Ｔ細胞は、ＴＡＬ−ＰＩＴＣｈ法によって、ウイルスベクターを用いずに作出することができる。【０２９０】
（材料および方法）
ＴＡＬ−ＰＩＴＣｈ法を用いた内在性ＴＣＲ欠損ＮＹ−ＥＳＯ−１特異的Ｔ細胞の作成
以下に記載される手順に従って、内在性ＴＣＲ欠損ＮＹ−ＥＳＯ−１特異的Ｔ細胞を作成した。【０２９１】
１．Ｐｌａｔｉｎｕｍ  ＴＡＬＥＮからのｍＲＮＡ合成：
（１）ＴＲＡあるいはＴＲＢ遺伝子切断用のＬｅｆｔ（Ｌ）−ＴＡＬＥＮとＲｉｇｈｔ（Ｒ）−ＴＡＬＥＮのプラスミドをＳｍａＩで３０℃ｘ２時間処理する。
（２）Ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ  Ｋで５０℃ｘ２０分処理したのち、ＱＩＡＧＥＮ  ＰＣＲ
Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔにて精製する。
（３）ｍＭＥＳＳＡＧＥ  ＭＡＣＨＩＮＥ  Ｔ７  Ｋｉｔ（Ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、続いてｐｏｌｙ（Ａ）  Ｔａｉｌｉｎｇ  Ｋｉｔ（Ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）にてｍＲＮＡを合成しＬｉＣｌ沈殿法で精製（Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｅ’ｓ  ｉｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎの通り）する。【０２９２】
２．ＴＡＬ−ＰＩＴＣｈベクターの設計：
ＴＡＬ−ＰＩＴＣｈベクターは、ＴＲＡ遺伝子切断用のＬｅｆｔ（Ｌ）−ＴＡＬＥＮとＲｉｇｈｔ（Ｒ）−ＴＡＬＥＮで導入遺伝子の両端を切断され、マイクロホモロジー媒介末端結合（ＭＭＥＪ）修復により目的遺伝子がＴＲＡ遺伝子切断部位に組み込まれるように設計する（図２４；四角で囲まれた部分がマイクロホモロジー配列を示す）。ＴＲＡ遺伝子切断部位に目的遺伝子が組み込まれた後は、両端にＴＡＬＥＮ結合部位が存在するも、切断部位までの十分なスペースがないためＤＮＡ二重鎖切断（ＤＳＢ）は起こらない（図２５）。ＴＡＬ−ＰＩＴＣｈベクターは、ＴＲＡ遺伝子の両アレルが切断されたことをフローサイトメトリーで確認するためＥＧＦＰを組み込んだベクターとｍＫａｔｅ２を組み込んだベクターを準備する（図２４および２５ではＥＧＦＰを組み込んだベクターを示す）。臨床応用の際には選択マーカーとしてＥＧＦＰ、ｍＫａｔｅ２をそれぞれＣＤ２０、ＣＤ３４に置き換えたベクターを作成する。【０２９３】
３．Ｐｌａｔｉｎｕｍ  ＴＡＬＥＮ  ｍＲＮＡを用いたＴＲＢ遺伝子切断Ｔ細胞の調製：
（１）末梢血Ｔ細胞をＣＤ３／２８ビーズで刺激し、Ｘ−ＶＩＶＯ２０＋  １０％ＡＢ  ｓｅｒｕｍ＋  ２ｍｍｏｌ／ｌ  Ｌ−Ｇｌｕｔａｍｉｎ＋  １％  ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ／ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ  で３日間培養する。
（２）Ａｍａｘａ  ４Ｄ−Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒを用いてＴＣＲβ−Ｌ−ＴＡＬＥＮ
ｍＲＮＡとＴＣＲβ−Ｒ−ＴＡＬＥＮ  ｍＲＮＡを培養Ｔ細胞に導入する（Ｐ３  Ｐｒｉｍａｒｙ  Ｃｅｌｌ  ４Ｄ−ＮｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒTM  Ｘ  Ｋｉｔ  Ｓ）。
１）Ｔ細胞５×１０５〜１×１０６ｃｅｌｌを遠心（４００Ｇ、１０分、室温）により細胞ペレットにする．
２）１反応あたりＮｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ  Ｐ３  ｓｏｌｕｔｉｏｎ  １６．４μｌにＳｕｐｐｌｅｍｅｎｔ  ３．６μｌを加え合計２０μｌのＮｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ  ｓｏｌｕｔｉｏｎで細胞ペレットを懸濁する。
３）ＴＣＲβ−Ｌ−ＴＡＬＥＮ  ｍＲＮＡ、ＴＣＲβ−Ｒ−ＴＡＬＥＮ  ｍＲＮＡをそれぞれ１０μｇずつ添加する。
４）Ｎｕｃｅｏｆｅｃｔｉｏｎ（プログラム：ＥＯ−１１５）を行う。
５）再び培養を継続する。
６）Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｉｏｎの３日後にＴＣＲ遺伝子の切断効率をフローサイトメトリーによるＣＤ３およびＴＣＲαβの発現喪失で確認する。
（３）ＣＤ３陰性分画をマグネットソーティングあるいはＦＡＣＳ（ＡｒｉａＩＩ）により回収する。【０２９４】
４．ＴＡＬ−ＰＩＴＣｈ法を用いたＴＲＡ遺伝子切断部位へのＮＹ−ＥＳＯ−１特異的ＴＣＲ（１Ｇ４）の導入：
（１）２．で得られたＴＲＢ遺伝子切断Ｔ細胞をＣＤ３／２８ビーズで刺激し、Ｘ−ＶＩＶＯ２０＋１０％ＡＢ  ｓｅｒｕｍ＋２ｍｍｏｌ／ｌ  Ｌ−Ｇｌｕｔａｍｉｎ＋１％  ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ／ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎで３日間培養する。
（２）Ａｍａｘａ  ４Ｄ−Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒを用いてＴＣＲα−Ｌ−ＴＡＬＥＮ
ｍＲＮＡとＴＣＲα−Ｒ−ＴＡＬＥＮ  ｍＲＮＡおよび２種類のＴＡＬ−ＰＩＴＣｈベクター（１Ｇ４−ＥＧＦＰと１Ｇ４−ｍＫａｔｅ２）を培養Ｔ細胞に導入する（Ｐ３  Ｐｒｉｍａｒｙ  Ｃｅｌｌ  ４Ｄ−ＮｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒTM  Ｘ  Ｋｉｔ  Ｓ）。
１）Ｔ細胞５×１０５〜１×１０６  ｃｅｌｌを遠心（４００Ｇ、１０分、室温）により細胞ペレットにする．
２）１反応あたりＮｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ  Ｐ３  ｓｏｌｕｔｉｏｎ  １６．４μｌにＳｕｐｐｌｅｍｅｎｔ  ３．６μｌを加え合計２０μｌのＮｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ  ｓｏｌｕｔｉｏｎで細胞ペレットを懸濁する。
３）ＴＣＲα−Ｌ−ＴＡＬＥＮ  ｍＲＮＡ、ＴＣＲα−Ｒ−ＴＡＬＥＮ  ｍＲＮＡ、１Ｇ４−ＥＧＦＰ  ＴＡＬ−ＰＩＴＣｈベクターおよび１Ｇ４−ｍＫａｔｅ２  ＴＡＬ−ＰＩＴＣｈベクターをそれぞれ１０μｇずつ添加する。
４）Ｎｕｃｅｏｆｅｃｔｉｏｎ（プログラム：ＥＯ−１１５）を行う。
５）再び培養を継続する。
６）Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｉｏｎの３日後に１Ｇ４−ＥＧＦＰおよび１Ｇ４−ｍＫａｔｅ２の導入効率をフローサイトメトリーによるＥＧＦＰおよびｍＫａｔｅ２の発現で確認する。
（３）ＥＧＦＰとｍＫａｔｅ２がともに陽性である分画をＦＡＣＳ（ＡｒｉａＩＩ）により回収する。【０２９５】
（結果）
図２７に示されるように、１Ｇ４ＴＣＲを発現する細胞集団を得ることができた。ＴＡＬ−ＰＩＴＣｈ法によって、ウイルスベクターを用いずに内在性ＴＣＲ欠損ＮＹ−ＥＳＯ−１特異的Ｔ細胞を作出することができることが理解される。ＮＹ−ＥＳＯ−１特異的ＴＣＲに換えて、所望の外因性ＴＣＲを導入することによって、所望の抗原特異性を有するＴＣＲを発現する内在性ＴＣＲ欠損Ｔ細胞をウイルスベクターを用いずに作出することができる。【０２９６】
（実施例１０：作出細胞の全ゲノムシーケンシング）
以下に示す方法によって、作出細胞を限界希釈法等によってクローン化した後、全ゲノムシーケンシングを行い、細胞の特性を評価することができる。【０２９７】
［ＱＩＡａｍｐ  ＤＮＡ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔを用いたＤＮＡの抽出］（Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｅ’ｓ  ｉｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎの通り）
１．  １．５ｍｌマイクロチューブの底にＱＩＡＧＥＮ  Ｐｒｏｔｅａｓｅ  ２０μｌをピペッティング。
２．  このマイクロチューブにＰＢＳ  ２００μｌに懸濁した１Ｘ１０５個のＴ細胞を添加。
３．  サンプルに２００μｌのＢｕｆｆｅｒ  ＡＬを添加。
４．  ５６℃で１０分間インキュベート。
５．  １．５ｍｌマイクロチューブを数秒間スピンダウンして蓋の内側についた溶液を収集する。
６．  サンプルにエタノール２００μｌを添加し、１５秒間ボルテックスした後、１．５ｍｌマイクロチューブを数秒間スピンダウンして蓋の内側についた溶液を収集する。
７．  ステップ６の混合液をＱＩＡａｍｐ  Ｍｉｎｉ  Ｓｐｉｎ  Ｃｏｌｕｍｎにアプライする。蓋を閉めて６，０００ｘｇで１分間遠心分離する。ＱＩＡａｍｐ  Ｍｉｎｉ  Ｓｐｉｎ  Ｃｏｌｕｍｎを新しい２ｍｌコレクションチューブに移し、ろ液の入っているコレクションチューブは捨てる。
８．  ＱＩＡａｍｐ  Ｍｉｎｉ  Ｓｐｉｎ  Ｃｏｌｕｍｎを開き、５００μｌのＢｕｆｆｅｒ  ＡＷ１を添加する。蓋を閉めて６，０００ｘｇで１分間遠心分離する。ＱＩＡａｍｐ  Ｍｉｎｉ  Ｓｐｉｎ  Ｃｏｌｕｍｎを新しい２ｍｌコレクションチューブに移し、ろ液の入っているコレクションチューブは捨てる。
９．  ＱＩＡａｍｐ  Ｍｉｎｉ  Ｓｐｉｎ  Ｃｏｌｕｍｎを開き、５００μｌのＢｕｆｆｅｒ  ＡＷ２を添加する。蓋を閉めて２０，０００ｘｇで３分間遠心分離。
１０．  ＱＩＡａｍｐ  Ｍｉｎｉ  Ｓｐｉｎ  Ｃｏｌｕｍｎを新しい１．５ｍｌマイクロチューブに移し、ろ液の入っているコレクションチューブは捨てる。ＱＩＡａｍｐ  Ｍｉｎｉ  Ｓｐｉｎ  Ｃｏｌｕｍｎを開き、２００μｌ精製水を添加。室温（２０℃）で１分間インキュベートした後、６，０００ｘｇで１分間遠心しＤＮＡを抽出する。【０２９８】
［ＰＣＲフリーライブラリーの作成と全ゲノムシーケンシング］
１．  １μｇの高分子量ＤＮＡをＢｉｏｒｕｐｔｏｒ  Ｐｉｃｏ（Ｄｉａｇｅｎｏｄｅ，  Ｂｅｌｇｉｕｍ）で平均３００ｂｐ程度に断片化処理し、Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，  ＵＳＡ）で処理後の状態を確認する。
２．  断片化後のＤＮＡにエンドリペア、Ａ−テーリング、インデックスアダプターライゲーションを行い、Ａｇｅｎｔｃｏｕｒｔ  ＡＭＰｕｒｅ  ＸＰ  ｂｅａｄｓ（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ，  ＵＳＡ）で純化する。
３．  調整済みＤＮＡライブラリーのサイズと濃度をＡｇｉｌｅｎｔ  Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，  ＵＳＡ）とＢｉｏ−Ｒａｄ  ｒｅａｌ  ｔｉｍｅ  ＰＣＲ  ｓｙｓｔｅｍで品質確認する。
４．  ＤＮＡライブラリーのシーケンスをｍａｎｕｆａｃｔｕｒｅ’ｓ  ｉｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎにしたがってＨｉＳｅｑ  Ｘｔｅｎ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ，  ＵＳＡ）で行い、Ｑ３０％以上かつカバレージ３０ｘで得られたユニークリードの配列に基づき、全ゲノム配列を決定する。【０２９９】
［注記］
以上のように、本発明の好ましい実施形態を用いて本発明を例示してきたが、本発明は、請求の範囲によってのみその範囲が解釈されるべきであることが理解される。本明細書において引用した特許、特許出願および文献は、その内容自体が具体的に本明細書に記載されているのと同様にその内容が本明細書に対する参考として援用されるべきであることが理解される。本発明は、日本国特許庁に２０１７年１０月１０日に出願された特願２０１７−１９７０１０および日本国特許庁に２０１８年９月７日に出願された特願２０１８−１６７９５４に対して優先権主張を伴うものであり、それらの内容の全体が本明細書において参考として援用される。
【産業上の利用可能性】
【０３００】
本発明は、Ｔ細胞の生物工学的操作において利用可能であり、ミスペアリング／オフ・ターゲットのない高機能ＴＣＲ遺伝子導入Ｔ細胞療法を実現することができる。
【配列表フリーテキスト】
【０３０１】
配列番号１：ＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合モジュールのアミノ酸配列の例
配列番号２：ＨＬＡ−Ａ＊０２拘束性ＣＭＶｐｐ６５ペプチド
配列番号３：ＨＬＡ−Ａ２−ＨＩＶ
配列番号４：ＢＳＬ−１８Ｅプライマー
配列番号５：Ｐ２０ＥＡプライマー
配列番号６：Ｐ１０ＥＡプライマー
配列番号７：ＣＡ１プライマー
配列番号８：ＣＡ２プライマー
配列番号９：ＣＢ１プライマー
配列番号１０：ＣＢ２プライマー
配列番号１１：ＨｕＶａＦプライマー
配列番号１２：ＨｕＶｂＦプライマー
配列番号１３：Ｂ−Ｐ２０ＥＡプライマー
配列番号１４：ＭＩＤ１
配列番号１５：ＭＩＤ２
配列番号１６：ＭＩＤ３
配列番号１７：ＭＩＤ４
配列番号１８：ＭＩＤ５
配列番号１９：ＭＩＤ６
配列番号２０：ＭＩＤ７
配列番号２１：ＭＩＤ８
配列番号２２：ＭＩＤ１０
配列番号２３：ＭＩＤ１１
配列番号２４：ＭＩＤ１５
配列番号２５：ＭＩＤ１６
配列番号２６：ＭＩＤ１７
配列番号２７：ＭＩＤ１８
配列番号２８：ＭＩＤ１９
配列番号２９：ＭＩＤ２０
配列番号３０：ＭＩＤ２１
配列番号３１：ＭＩＤ２２
配列番号３２：ＭＩＤ２３
配列番号３３：ＭＩＤ２４
配列番号３４：Ａアダプター配列
配列番号３５：Ｐ２２ＥＡ−ＳＴ１−Ｒプライマー
配列番号３６：Ｔａｇ−１プライマー
配列番号３７：Ｔａｇ−２プライマー
配列番号３８：ＣＡ−ＳＴ１−Ｒ
配列番号３９：ＣＢ−ＳＴ１−Ｒ
配列番号４０：ＴＳＯオリゴ
配列番号４１：ＴＳＯ  ＰＣＲプライマー
配列番号４２：ＳＭＡＲＴ  ＰＣＲプライマー
配列番号４３：ＴＳＯ＿ＴＡＧプライマー
配列番号４４：ＳＭＡＲＴ＿ＴＡＧプライマー
配列番号４５：オリゴビーズ中のＳＭＡＲＴ配列
配列番号４６：ＴＡＬＥＮ−ＴＣＲ−ａｌｐｈａ２＿Ｌ１９  プラスミド全長
配列番号４７：ＴＡＬＥＮ−ＴＣＲ−ａｌｐｈａ２＿Ｒ１９  プラスミド全長
配列番号４８：ＴＡＬＥＮ−ＴＣＲ−ｂｅｔａ１＿Ｌ１９  プラスミド全長
配列番号４９：ＴＡＬＥＮ−ＴＣＲ−ｂｅｔａ１＿Ｒ１９  プラスミド全長
配列番号５０：ＴＡＬＥＮ−ＴＣＲ−ｂｅｔａ３＿Ｌ１９  プラスミド全長
配列番号５１：ＴＡＬＥＮ−ＴＣＲ−ｂｅｔａ３＿Ｒ１９  プラスミド全長
配列番号５２：ＴＡＬＥＮ−ＴＣＲ−ａｌｐｈａ２＿Ｌ１９  ＴＡＬＥＮコーディング配列
配列番号５３：ＴＡＬＥＮ−ＴＣＲ−ａｌｐｈａ２＿Ｌ１９  ＴＡＬＥＮアミノ酸配列
配列番号５４：ＴＡＬＥＮ−ＴＣＲ−ａｌｐｈａ２＿Ｒ１９  ＴＡＬＥＮコーディング配列
配列番号５５：ＴＡＬＥＮ−ＴＣＲ−ａｌｐｈａ２＿Ｒ１９  ＴＡＬＥＮアミノ酸配列
配列番号５６：ＴＡＬＥＮ−ＴＣＲ−ｂｅｔａ１＿Ｌ１９  ＴＡＬＥＮコーディング配列
配列番号５７：ＴＡＬＥＮ−ＴＣＲ−ｂｅｔａ１＿Ｌ１９  ＴＡＬＥＮアミノ酸配列
配列番号５８：ＴＡＬＥＮ−ＴＣＲ−ｂｅｔａ１＿Ｒ１９  ＴＡＬＥＮコーディング配列
配列番号５９：ＴＡＬＥＮ−ＴＣＲ−ｂｅｔａ１＿Ｒ１９  ＴＡＬＥＮアミノ酸配列
配列番号６０：ＴＡＬＥＮ−ＴＣＲ−ｂｅｔａ３＿Ｌ１９  ＴＡＬＥＮコーディング配列
配列番号６１：ＴＡＬＥＮ−ＴＣＲ−ｂｅｔａ３＿Ｌ１９  ＴＡＬＥＮアミノ酸配列
配列番号６２：ＴＡＬＥＮ−ＴＣＲ−ｂｅｔａ３＿Ｒ１９  ＴＡＬＥＮコーディング配列
配列番号６３：ＴＡＬＥＮ−ＴＣＲ−ｂｅｔａ３＿Ｒ１９  ＴＡＬＥＮアミノ酸配列
配列番号６４：ＴＣＲ−ａｌｐｈａ２−ｆ  プライマー
配列番号６５：ＴＣＲ−ａｌｐｈａ２−ｒ  プライマー
配列番号６６：ＴＣＲ−ｂｅｔａ１−ｃ１−ｆ  プライマー
配列番号６７：ＴＣＲ−ｂｅｔａ１−ｃ１−ｒ  プライマー
配列番号６８：ＴＣＲ−ｂｅｔａ１−ｃ２−ｆ  プライマー
配列番号６９：ＴＣＲ−ｂｅｔａ１−ｃ２−ｒ  プライマー
配列番号７０：Ｖαクローニング用フォワードプライマー
配列番号７１：Ｖαクローニング用リバースプライマー
配列番号７２：Ｃαクローニング用フォワードプライマー
配列番号７３：Ｃαクローニング用リバースプライマー
配列番号７４：Ｖβクローニング用フォワードプライマー
配列番号７５：Ｖβクローニング用リバースプライマー
配列番号７６：Ｃβクローニング用フォワードプライマー
配列番号７７：Ｃβクローニング用リバースプライマー
配列番号７８：導入用ＴＣＲα定常領域
配列番号７９：導入用ＴＣＲβ定常領域
配列番号８０：α２Ｌの標的配列
配列番号８１：α２Ｒの標的配列
配列番号８２：β１Ｌの標的配列
配列番号８３：β１Ｒの標的配列
配列番号８４：β３Ｌの標的配列
配列番号８５：β３Ｒの標的配列
配列番号８６：ＴＡＬＥＮ＿α２Ｌ結合ドメイン
配列番号８７：ＴＡＬＥＮ＿α２Ｒ結合ドメイン
配列番号８８：ＴＡＬＥＮ＿β１Ｌ結合ドメイン
配列番号８９：ＴＡＬＥＮ＿β１Ｒ結合ドメイン
配列番号９０：ＴＡＬＥＮ＿β３Ｌ結合ドメイン
配列番号９１：ＴＡＬＥＮ＿β３Ｒ結合ドメイン
配列番号９２：ＱＹＤペプチド
配列番号９３〜１１０：ヒトＴＲＡまたはＴＲＢのＣＤＲ３配列の例
配列番号１１１〜１１３：Ｐｌａｔｉｎｕｍ  ＴＡＬＥＮのＤＮＡ結合モジュールのアミノ酸配列の例
配列番号１１４：Ｚｈａｎｇ  ＴＡＬＥＮのＤＮＡ結合モジュールのアミノ酸配列の例
配列番号１１５：ＨＬＡ−Ａ＊０２０１−ｒｅｓｔｒｉｃｔｅｄ  ＮＹ−ＥＳＯ−１１５７−１６５
配列番号１１６：１Ｇ４  ＴＣＲＡ  ＣＤＲ３
配列番号１１７：１Ｇ４  ＴＣＲＢ  ＣＤＲ３
配列番号１１８：１Ｇ４  ＴＣＲのＶαカセット
配列番号１１９：１Ｇ４  ＴＣＲのＶβカセット
配列番号１２０〜１２９：図２４および２５中の塩基配列
配列番号１３０：マウスＴＲＡ２−ＴＡＬＥＮ左側の標的配列
配列番号１３１：マウスＴＲＡ２−ＴＡＬＥＮ右側の標的配列
配列番号１３２：マウスＴＲＢ１―ＴＡＬＥＮ左側の標的配列
配列番号１３３：マウスＴＲＢ１−ＴＡＬＥＮ右側の標的配列
配列番号１３４：マウスＴＲＢ２―ＴＡＬＥＮ左側の標的配列
配列番号１３５：マウスＴＲＢ２−ＴＡＬＥＮ右側の標的配列
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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