(57)【要約】  優れた標的細胞傷害性を有する変異型キメラ抗原受容体（CAR）発現細胞の作製。  ヒト顆粒球-マクロファージコロニー刺激因子（GM-CSF）受容体に特異的に結合する標的結合ドメインと、膜貫通ドメインと、細胞内シグナル伝達ドメインとを有するキメラ抗原受容体（CAR）タンパク質をコードするポリヌクレオチドが導入された遺伝子改変細胞であって、前記標的結合ドメインが、配列番号１に示すアミノ酸配列のうち第２１番目のグルタミン酸が他のアミノ酸に置換された変異体である、上記改変細胞を提供する。
2019177151.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒト顆粒球-マクロファージコロニー刺激因子（GM-CSF）受容体に特異的に結合する標的結合ドメインと、膜貫通ドメインと、細胞内シグナル伝達ドメインとを有するキメラ抗原受容体（chimeric antigen receptor：CAR）タンパク質をコードするポリヌクレオチドが導入された遺伝子改変細胞であって、前記標的結合ドメインが、配列番号１に示すアミノ酸配列のうち第２１番目のグルタミン酸が他のアミノ酸に置換された配列を有する変異体ポリペプチドである、上記改変細胞。
【請求項２】
GM-CSF受容体に結合するCARタンパク質を細胞膜上に発現する、請求項１記載の細胞。
【請求項３】
CARタンパク質が、更に共刺激ドメイン及び／又は細胞外スペーサードメインを含む、請求項１又は２に記載の細胞。
【請求項４】
細胞内シグナル伝達ドメインがヒトCD3ζである、請求項１〜３のいずれか１項記載の細胞。
【請求項５】
共刺激ドメインがヒトCD28又はヒト4-1BBである、請求項３又は４記載の細胞。
【請求項６】
細胞外スペーサードメインがヒトIgG1のヒンジ、CH2、及び／又はCH3領域若しくはその一部、及び／又は人工スペーサー配列を含む、請求項３〜５のいずれか１項記載の細胞。
【請求項７】
標的結合ドメインが、配列番号１に示すアミノ酸配列のうち第２１番目のグルタミン酸がアルギニン又はリシンに置換された配列を有する変異体ポリペプチドである、請求項１〜６のいずれか１項記載の細胞。
【請求項８】
ヒトGM-CSF受容体に特異的に結合するキメラ抗原受容体（CAR）タンパク質をコードするポリヌクレオチドをベクターを用いて細胞に導入することを含む、CARタンパク質発現細胞の作製方法であって、前記タンパク質が、配列番号１に示すアミノ酸配列のうち第２１番目のグルタミン酸が他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列を含む、上記方法。
【請求項９】
ヒトGM-CSF受容体に特異的に結合するキメラ抗原受容体（CAR）タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むベクターであって、前記タンパク質が、配列番号１に示すアミノ酸配列のうち第２１番目のグルタミン酸が他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列を含む、上記ベクター。
【請求項１０】
請求項１〜７のいずれか１項記載の細胞を含む、GM-CSF受容体発現細胞が関与する疾患に対する治療剤。
【請求項１１】
請求項１０記載の治療剤と、医薬上許容される担体とを含む、医薬組成物。
【請求項１２】
GM-CSF受容体発現細胞が関与する疾患が、若年性骨髄単球性白血病（JMML）、急性骨髄性白血病（AML）、神経膠腫（グリオーマ）、神経芽細胞腫、膠芽腫、脳腫瘍、直腸結腸腺がん、前立腺がん、腎臓がん、メラノーマ及び肺小細胞がんから選択される、請求項１０記載の治療剤又は請求項１１記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、養子免疫療法の分野において有用な、キメラ抗原受容体を発現する遺伝子改変細胞及びその作製方法に関する。【０００２】
さらに詳しく述べれば、本発明は、優れた標的細胞傷害性を有する、ヒト顆粒球-マクロファージコロニー刺激因子（GM-CSF）受容体特異的な変異型キメラ抗原受容体をコードするポリヌクレオチドが導入された遺伝子改変細胞及びこれらの作製方法及び医薬用途等に関する。
【背景技術】
【０００３】
腫瘍関連抗原を標的とするキメラ抗原受容体（chimeric antigen receptor : CAR）を発現させたT細胞（CAR-T）を使用した養子免疫療法は抗腫瘍効果が強力であることが報告され、近年開発が急速に進んでいる。特にB細胞上に発現しているCD19は造血幹細胞に発現せず、B系列腫瘍細胞に発現しているため、養子免疫療法の理想的な標的である。そのため、B細胞腫瘍への治療を目的としたCARの開発が進んでおり、臨床試験においても著効を示し、高い注目を集めている。【０００４】
一方、他の腫瘍細胞へのCAR-T療法の開発は途上である。例えば、若年性骨髄単球性白血病（JMML）あるいは急性骨髄性白血病（AML）は、予後不良な白血病として知られており、CAR-T療法の開発が期待される。これまでにCD33, CD123等を標的として臨床試験が行われている。また、若年性骨髄単球性白血病（JMML）あるいは急性骨髄性白血病（AML）の腫瘍細胞表面にGM-CSF受容体が高発現していることに着目したGM-CSF受容体特異的キメラ抗原受容体（以下、GMR.CAR）が報告されている（非特許文献１、２）。しかしながら、AMLに対するCAR-T療法は、臨床的に有効なものは未だ見出されておらず、腫瘍細胞を生体に生着した動物実験においても十分な効果は認められていない（非特許文献３、４）。JMMLあるいはAMLに対するCAR-T療法の開発が進まない理由として、例えば、標的抗原の選択が困難である点が挙げられる。【０００５】
骨髄系抗原をCAR-T療法の標的抗原とする場合、腫瘍細胞だけでなく、正常な骨髄球系細胞や樹状細胞などにも発現しており、on-target/off-tumor反応による問題が生じ得ることが知られている（非特許文献３、４、５）。そのため、前記疾患に対する新規標的抗原の探索と安全かつ生体内で優れた効果を有するCARの提供が求められている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Journal of Hematology & Oncology, 2016, 9:27, DOI 10.1186/s13045-016-0256-3
【非特許文献２】The 22nd Annual Meeting JSGCT2016: Japan Society of Gene and Cell Therapy Program and Abstracts, 2016. 07. 13, P0-70
【非特許文献３】Journal of Hematology & Oncology, 2017, 10:151, DOI 10.1186/s13045-017-0519-7
【非特許文献４】Blood, 2013, 122(18), 3138-3148
【非特許文献５】Blood Cancer Journal, 2016, 6, e458; doi: 10.1038/bcj.2016.61
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
上記の通り、骨髄系抗原等を標的とするCAR-T技術は未だ開発途上であり、安全性が高く、生体内での優れた効果を奏するCARの開発が望まれている。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究した。その結果、標的結合ドメインとしてGM-CSFポリペプチドのアミノ酸残基第２１番目のグルタミン酸が他のアミノ酸に置換された変異型GM-CSFを標的結合ドメインとして用いたGM-CSF受容体特異的な変異型キメラ抗原受容体（以下、「変異型GMR.CAR」と記載する）を遺伝子導入したT細胞（以下、「変異型GMR.CAR-T細胞」と記載する）が、AML等の治療において優れた細胞傷害活性と安全性を兼ね備えていることを見出した。【０００９】
すなわち、本発明は以下の通りである。
［１］  ヒト顆粒球-マクロファージコロニー刺激因子（GM-CSF）受容体に特異的に結合する標的結合ドメインと、膜貫通ドメインと、細胞内シグナル伝達ドメインとを有するキメラ抗原受容体（chimeric antigen receptor：CAR）タンパク質をコードするポリヌクレオチドが導入された遺伝子改変細胞であって、前記標的結合ドメインが、配列番号１に示すアミノ酸配列のうち第２１番目のグルタミン酸が他のアミノ酸に置換された配列を有する変異体ポリペプチドである、上記改変細胞。
［２］  GM-CSF受容体に結合するCARタンパク質を細胞膜上に発現する、上記［１］記載の細胞。
［３］  CARタンパク質が、更に共刺激ドメイン及び／又は細胞外スペーサードメインを含む、上記［１］又は［２］に記載の細胞。
［４］  細胞内シグナル伝達ドメインがヒトCD3ζである、上記［１］〜［３］のいずれか記載の細胞。
［５］  共刺激ドメインがヒトCD28又はヒト4-1BBである、上記［３］又は［４］記載の細胞。
［６］  細胞外スペーサードメインがヒトIgG1のヒンジ、CH2、及び／又はCH3領域若しくはその一部、及び／又は人工スペーサー配列を含む、上記［３］〜［５］のいずれか記載の細胞。
［７］  標的結合ドメインが、配列番号１に示すアミノ酸配列のうち第２１番目のグルタミン酸がアルギニン又はリシンに置換された配列を有する変異体ポリペプチドである、上記［１］〜［６］のいずれか記載の細胞。
［８］  ヒトGM-CSF受容体に特異的に結合するキメラ抗原受容体（CAR）タンパク質をコードするポリヌクレオチドをベクターを用いて細胞に導入することを含む、CARタンパク質発現細胞の作製方法であって、前記タンパク質が、配列番号１に示すアミノ酸配列のうち第２１番目のグルタミン酸が他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列を含む、上記方法。
［９］  ヒトGM-CSF受容体に特異的に結合するキメラ抗原受容体（CAR）タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むベクターであって、前記タンパク質が、配列番号１に示すアミノ酸配列のうち第２１番目のグルタミン酸が他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列を含む、上記ベクター。
［１０］  上記［１］〜［７］のいずれか記載の細胞を含む、GM-CSF受容体発現細胞が関与する疾患に対する治療剤。
［１１］  上記［１０］記載の治療剤と、医薬上許容される担体とを含む、医薬組成物。
［１２］  GM-CSF受容体発現細胞が関与する疾患が、若年性骨髄単球性白血病（JMML）、急性骨髄性白血病（AML）、神経膠腫（グリオーマ）、神経芽細胞腫、膠芽腫、脳腫瘍、直腸結腸腺がん、前立腺がん、腎臓がん、メラノーマ及び肺小細胞がんから選択される、上記［１０］記載の治療剤又は上記［１１］記載の組成物。
本明細書は本願の優先権の基礎となる日本国特許出願番号2018-050266号の開示内容を包含する。
【発明の効果】
【００１０】
本発明のGMR.CAR-T細胞は、急性骨髄性白血病（AML）を始めとする、GM-CSF受容体を細胞表面に発現している種々の細胞を標的とした養子免疫療法において、安全性に優れ、かつ強力な腫瘍細胞傷害作用を示す。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】CAR001のベクターマップを示す。
【図２】スペーサードメインを改変したGMR.CAR(CH2CH3部分欠失体、GMR.CAR dCH2CH3)のベクターマップの例を示す。
【図３】スペーサードメインを改変したGMR.CAR(CH2CH3部分欠失-(G4S)3挿入体、GMR.CAR dCH2CH3+(G4S)3)のベクターマップの例を示す。
【図４】スペーサードメインを改変した(E21R)GMR.CAR(CH2CH3部分欠失体、E21RGMR.CAR dCH2CH3)のベクターマップの例を示す。
【図５】スペーサードメインを改変した(E21K)GMR.CAR(CH2CH3部分欠失体、E21KGMR.CAR dCH2CH3)のベクターマップの例を示す。
【図６】スペーサードメインを改変した(E21R)GMR.CAR(CH2CH3部分欠失-(G4S)3挿入体、E21RGMR.CAR dCH2CH3+(G4S)3)のベクターマップの例を示す。
【図７】スペーサードメインを改変した(E21K)GMR.CAR(CH2CH3部分欠失-(G4S)3挿入体、E21KGMR.CAR dCH2CH3+(G4S)3)のベクターマップの例を示す。
【図８】CARをコードするポリヌクレオチドを導入したCAR-T細胞(CAR-T 001〜CAR-T 008)のday14におけるGM-CSF発現解析の結果を示す。
【図９】CAR-T 001〜CAR-T 008のTHP-1細胞に対する抗腫瘍細胞活性％を示す。
【図１０】CARをコードするポリヌクレオチドを導入したCAR-T細胞(CAR-T 001-A、CAR-T 009〜CAR-T 014)のday14におけるGM-CSF発現解析の結果を示す。
【図１１】CAR-T 001-A及びCAR-T 009〜CAR-T 014のTHP-1細胞に対する抗腫瘍細胞活性％を示す。
【図１２】CARをコードするポリヌクレオチドを導入したCAR-T細胞(CAR-T 010-A〜CAR-T 014-A)のday14におけるGM-CSF発現解析の結果を示す。
【図１３】CAR-T 010-A〜CAR-T 014-AのTHP-1細胞に対するE:T比＝１：１における持続的腫瘍細胞殺傷能を示す。
【図１４】CAR-T 010-A〜CAR-T 014-AのMV4-11細胞に対するE:T比＝１：１における持続的腫瘍細胞殺傷能を示す。
【図１５】CAR-T 010-A〜CAR-T 014-AのKasumi-1細胞に対するE:T比＝１：１における持続的腫瘍細胞殺傷能を示す。
【図１６】CAR-T 010-A〜CAR-T 014-AのshinAML-1細胞に対するE:T比＝１：１における持続的腫瘍細胞殺傷能を示す。
【図１７】図１３〜１６におけるウェル内の腫瘍細胞数を示す。
【図１８】CARをコードするポリヌクレオチドを導入したCAR-T細胞(CAR-T 001-B及びCAR-T 009-B〜CAR-T 014-B)のday14におけるGM-CSF発現解析の結果を示す。
【図１９】E:T比1:1及び1:10におけるMV4-11細胞に対する腫瘍生存細胞数相対比と末梢血細胞に対する生存細胞数相対比を示す。
【図２０】健常人由来骨髄細胞に対する各E:T比でプロットした点から描いたシグモイド曲線を示す。
【図２１】MV4-11細胞に対する各E:T比でプロットした点から描いたシグモイド曲線を示す。
【図２２】図２０より算出したIC50値、図２１より算出したEC50値を基に算出した安全域を示す。
【図２３】CARをコードするポリヌクレオチドを導入したCAR-T細胞(CAR-T 009-C、CAR-T 011-C及びCAR-T 012-C)のday14におけるGM-CSF発現解析の結果を示す。
【図２４】CAR-T 009-C、CAR-T 011-C及びCAR-T 012-CのTHP-1担癌マウスモデルにおける実験結果を示す。
【図２５】CARをコードするポリヌクレオチドを導入したCAR-T細胞(CAR-T 009-D〜CAR-T 014-D)のday14におけるGM-CSF発現解析の結果を示す。
【図２６】CAR-T 009-D、CAR-T 011-D及びCAR-T 012-DのMV4-11担癌マウスモデルにおける実験結果を示す。
【図２７】CAR-T 010-D、CAR-T 013-D及びCAR-T 014-DのMV4-11担癌マウスモデルにおける実験結果を示す。
【図２８】CAR-T 009-D〜CAR-T 014-Dのday52の末梢血中腫瘍の定量PCRの結果を示す。（NDは検出不能を示す）
【図２９】CARをコードするポリヌクレオチドを導入したCAR-T細胞(CAR-T 001-C、CAR-T 014-F、及び比較対照のCD19 T cell)のday14におけるGM-CSF発現解析の結果を示す。
【図３０】CAR-T 001-C及びCAR-T 014-FのMV4-11担癌マウスモデルにおける実験結果を示す。
【図３１】CARをコードするポリヌクレオチドを導入したCAR-T細胞(CAR-T 014-E)のday14におけるGM-CSF発現解析の結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本発明の実施の形態について、以下に詳細に説明する。
本明細書において「キメラ抗原受容体（CAR）」とは、標的特異性をT細胞（例えば、ナイーブT細胞、ステムセルメモリーT細胞、セントラルメモリーT細胞、エフェクターメモリーT細胞、又はそれらの組み合わせ等のT細胞）等の細胞に移植することができる改変受容体を指す。CARはまた、人工T細胞受容体、キメラT細胞受容体、又はキメラ免疫受容体としても知られる。
【００１３】
本明細書において「ドメイン」とは、ポリペプチド内の領域であって、他の領域とは独立して特定の構造に折りたたまれる領域を示す。
【００１４】
本明細書で使用される場合、「ポリヌクレオチド」には、天然又は合成のDNA及びRNA、例えばゲノムDNA、cDNA（相補DNA）、mRNA（メッセンジャーRNA）、rRNA（リボソームRNA）、shRNA（小ヘアピンRNA）、snRNA（核内低分子RNA）、snoRNA（核小体低分子RNA）、miRNA（マイクロRNA）、及び／又はtRNAが含まれるが、これらに限定されない。
【００１５】
本明細書において「コードする」とは、当分野において通常使用されているように、所定のヌクレオチド配列が所定のタンパク質又は（ポリ）ペプチドのアミノ酸配列情報を暗号化していることをいい、本明細書において、センス鎖及びアンチセンス鎖の両方を「コードする」との文脈において使用する。
【００１６】
上記の通り、本発明は、ヒト顆粒球-マクロファージコロニー刺激因子（GM-CSF）受容体に特異的に結合する標的結合ドメインと、膜貫通ドメインと、細胞内シグナル伝達ドメインとを有するキメラ抗原受容体（CAR）タンパク質をコードするポリヌクレオチドが導入された遺伝子改変細胞であって、前記標的結合ドメインが、配列番号１に示すアミノ酸配列のうち第２１番目のグルタミン酸が他のアミノ酸に置換された配列を有する変異体ポリペプチドである、上記改変細胞を提供する。
本明細書において、「〜配列を有する」とは、記載された配列以外の配列を含む場合も包含し、また記載された配列のみを含む場合（すなわち「〜配列からなる」）も包含し得る。
【００１７】
本発明のCARタンパク質はヒトGM-CSF受容体に特異的に結合する「標的結合ドメイン」を含む。標的（GM-CSF受容体）結合ドメインは、GM-CSF受容体に特異的な結合性を示し、GM-CSF受容体を細胞表面上に発現している標的細胞に対し、特異的な免疫応答を可能にする。
【００１８】
従って、GM-CSF受容体結合ドメインとして、配列番号１のアミノ酸配列を有するGM-CSF受容体に結合するサイトカインであるGM-CSFのアミノ酸残基第２１番目のグルタミン酸が他のアミノ酸に置換されたポリペプチドが使用できる。あるいは、GM-CSF受容体に対する結合能を保持している限り、他のアミノ酸残基部分にも置換がされた変異体も使用できる。更に、GM-CSF受容体に対する結合能を保持している限り、これらのポリペプチドの断片、すなわち結合性断片を使用しても良い。
【００１９】
GM-CSFのアミノ酸残基第２１番目のアミノ酸が他のアミノ酸へ置換されたポリペプチドとしては、GM-CSF受容体への結合活性が保持されるものであれば特に限定されないが、例えば、アルギニンへの置換（配列番号２のアミノ酸配列）、リシンへの置換（配列番号３のアミノ酸配列）、ヒスチジンへの置換（配列番号４のアミノ酸配列）、アスパラギン酸への置換（配列番号５のアミノ酸配列）、セリンへの置換（配列番号６のアミノ酸配列）、アラニンへの置換（配列番号７のアミノ酸配列）、フェニルアラニンへの置換（配列番号８のアミノ酸配列）等を使用することができる。
【００２０】
好ましい態様として、GM-CSFのアミノ酸残基第２１番目のアミノ酸が塩基性アミノ酸であるアルギニン、リシン、又はヒスチジンへ置換されたポリペプチドを使用することができる。
【００２１】
より好ましい態様として、GM-CSFのアミノ酸残基第２１番目のアミノ酸がアルギニン又はリシンへ置換されたポリペプチドを使用することができる。
【００２２】
ここで、「ヒトGM-CSF受容体に対する結合能」を有するとは、ヒトGM-CSF受容体に対する結合定数が例えば1 - 1000 nM以下であることを意図する。この結合能は、抗原と抗体との結合能と比較して相対的に弱い結合であって良い。
【００２３】
なお、標的結合ドメインは、ヒトGM-CSF受容体に対する結合能を保持しているものであれば、上記ポリペプチドに替えて使用することができる。例えば、GM-CSF受容体との結合能力を保持した抗体由来の一本鎖ポリペプチドである単鎖抗体（scFv）が使用でき、免疫グロブリン重鎖（H鎖）及び軽鎖（L鎖）フラグメントのFv領域を連結した抗体ポリペプチドを標的結合ドメインとして使用できる。
【００２４】
さらには、標的細胞上に発現する受容体タンパク質に特異的に結合するリガンド、例えばアフィボディ、天然型受容体由来のリガンド結合ドメイン、（例えば、腫瘍細胞上の）受容体の溶解性タンパク質/ペプチドリガンド、ペプチド、及び免疫応答を促すためのワクチン等を使用しても良い。
【００２５】
本明細書のCARタンパク質は、場合によって「細胞外スペーサードメイン」を含むことができる。細胞外スペーサードメインは、CARと抗原の結合を促進し、細胞内へのシグナル伝達を亢進する配列であることが望ましい。例えば、抗体のFcフラグメント、又はそのフラグメントもしくは誘導体、抗体のヒンジ領域、又はそのフラグメントもしくは誘導体、抗体のCH2領域、抗体のCH3領域、人工スペーサー配列、又はそれらの組み合わせを用いることができる。
【００２６】
本発明の一態様として、細胞外スペーサードメインとして、（i）IgG4のヒンジ、CH2、及びCH3領域、（ii）IgG4のヒンジ領域、(iii)IgG4のヒンジ及びCH2、(iv)CD8aのヒンジ領域、（v）IgG1のヒンジ、CH2、及びCH3領域、（vi）IgG1のヒンジ領域、もしくは(vii)IgG1のヒンジ及びCH2、又はそれらの組み合わせを使用することができる。例えば、IgG1のヒンジ領域として、配列番号９に示すヌクレオチド配列によってコードされる以下のアミノ酸配列（配列番号１０）を有するものを好適に使用することができるが、これに限定されるものではない。
2019177151.tif 000003
【００２７】
また、IgG1のCH2領域として、配列番号１１に示すヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列（配列番号１２）を有するもの、CH3領域として、配列番号１３に示すヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列（配列番号１４）を有するものをそれぞれ好適に使用することができる。
【００２８】
好ましい態様として、細胞外スペーサードメインはヒトIgG1のヒンジ、CH2、及びCH3領域又はその一部を使用することができる。
【００２９】
また、好ましい態様として、細胞外スペーサードメインは、（i）ヒトIgG1のヒンジ領域単独（配列番号１０）、（ii）ヒトIgG1のヒンジ領域（配列番号１０）及びCH２領域（配列番号１２）及びCH3領域（配列番号１４）の組み合わせ、（iii）ヒトIgG1のヒンジ領域（配列番号１０）及びCH3領域（配列番号１４）の組み合わせ、（iv）CH3領域単独（配列番号１４）、で使用することができる。
【００３０】
本発明の一態様として、細胞外スペーサードメインに用いる人工スペーサー配列として、式(G4S)nで表されるスペーサー配列を使用することができる。式中、ｎは、１〜１０であり、好ましくはｎ＝３である。例えば、配列番号１５を有するものを好適に使用することができる。このようなスペーサー配列を有するスペーサーは、ペプチドリンカーと呼ばれることもある。当分野において好適に使用されるペプチドリンカーを、本発明において適宜使用することができる。この場合、ペプチドリンカーの構成及び鎖長は、得られるCARタンパク質の機能を損なわない範囲で適切なものを選択することができる。
【００３１】
更に好ましい態様として、細胞外スペーサードメインは、ヒトIgG1のヒンジ領域（配列番号１０）及び(G4S)3のスペーサー配列（配列番号１５）の組み合わせを使用することができる。
【００３２】
細胞外スペーサードメインは、上記に例示したものから適宜選択して、又は当分野における技術常識に基づいて更に改変して、本発明のために使用することができる。
細胞外スペーサードメインは、標的結合ドメインと、膜貫通ドメインとの間に存在し得るように、それぞれのドメインのアミノ酸配列をコードする塩基配列を連結してベクターに挿入し、宿主細胞において発現させることができる。あるいはまた、細胞外スペーサードメインは、予め作製したプラスミドCARタンパク質をコードするポリヌクレオチドを鋳型として改変することもできる。
細胞外スペーサードメインの改変は、例えば、CARをコードするポリヌクレオチドを導入したCAR-T細胞の宿主細胞におけるCAR遺伝子発現率の向上、シグナル伝達、細胞の老化、腫瘍への分布、抗原認識又はin vivo活性への影響を考慮した場合に有用である。
【００３３】
本発明のCARタンパク質は、細胞膜上に存在し、標的結合ドメイン及び任意に細胞外スペーサードメインを含む細胞外ドメインと、膜貫通ドメインと、細胞内シグナル伝達ドメイン及び任意に共刺激ドメインを含む細胞内ドメインとを含む。当分野において周知であるように、「膜貫通ドメイン」は、細胞外ドメイン及び細胞内ドメインがいずれも親水性ドメインであるのに対して、細胞膜を構成する脂質二重層に対する親和性を有するドメインである。本発明のGMR.CARにおける膜貫通ドメインは、CARタンパク質が細胞膜上に存在でき、標的結合ドメインと細胞内シグナル伝達ドメインの機能を損なわない限り、特に限定するものではないが、後述する共刺激ドメインと同じタンパク質由来のポリペプチドが膜貫通ドメインとしての機能を果たす場合もあり得る。
【００３４】
本発明の一態様として、膜貫通ドメインは、例えば、CD28、CD3ε、CD8α、CD3、CD4又は4-1BBなどの膜貫通ドメインを用いることができる。
【００３５】
好ましい態様として、膜貫通ドメインは、ヒトCD28（Uniprot No. ：P10747（153‐179））を使用することができる。具体的には、配列番号１６に示すヌクレオチド配列（NCBI Accession No.: NM_006139.3 (679-759)）によってコードされるアミノ酸配列（配列番号１７）を有するものを膜貫通ドメインとして好適に使用することができる。
【００３６】
本発明のCARタンパク質は、場合によって「共刺激ドメイン」を含むことができる。共刺激ドメインは共刺激リガンドと特異的に結合し、それによって、これらに限定されないが、CAR-T細胞の増殖、サイトカイン産生、機能分化、標的細胞の細胞死のような、細胞による共刺激応答が媒介される。
【００３７】
本発明の一態様として、共刺激ドメインは、例えば、CD27、CD28、4-1BB (CD137)、CD134 (OX40)、Dap10、CD27、CD2、CD5、CD30、CD40、PD-1、ICAM-1、LFA-1 (CD11a/CD18)、TNFR-1、TNFR-II、Fas、Lckを用いることができる。
【００３８】
好ましい態様として、共刺激ドメインは、ヒトCD28（Uniprot No. ：P10747（180‐220））又は4-1BB（GenBank：U03397.1）等を使用することができる。具体的には、配列番号１８に示すヌクレオチド配列（NCBI Accession No.: NM_006139.3 (760-882)）によってコードされるアミノ酸配列（配列番号１９）を有するものを共刺激ドメインとして好適に使用することができる。
【００３９】
本発明のCARタンパク質は「細胞内シグナル伝達ドメイン」を含む。細胞内シグナル伝達ドメインは、免疫細胞のエフェクター機能の発揮に必要なシグナルを伝達する。
【００４０】
本発明の一態様として、細胞内シグナル伝達ドメインとしては、例えば、ヒトCD3ζ鎖、FcγRIII、FcεRI、Fc受容体の細胞質末端、免疫受容体チロシン活性化モチーフ(ITAM)を有する細胞質受容体又はそれらの組み合わせを用いることができる。
【００４１】
好ましい態様として、細胞内シグナル伝達ドメインは、ヒトCD3ζ鎖（例えばNCBI Accession No. NM＿000734.3のヌクレオチド299-637）を使用することができる。具体的には配列番号２０に示すヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列（配列番号２１）を有するものを細胞内シグナル伝達ドメインとして好適に使用することができる。
【００４２】
目的とするポリヌクレオチドは常法に従い、容易に作製することができる。各ドメインのアミノ酸配列を示すNCBI RefSeq IDやGenBankのAccession番号からアミノ酸配列をコードする塩基配列を取得することが可能であり、標準的な分子生物学的及び/又は化学的手順を用いて本発明のポリヌクレオチドを作製することができる。例えば、これらの塩基配列をもとに、核酸を合成することができ、また、cDNAライブラリーよりポリメラーゼ連鎖反応(PCR)を使用して得られるDNA断片を組み合わせて本発明のポリヌクレオチドを作製することができる。
【００４３】
従って、本発明のGMR.CARをコードするポリヌクレオチドは、上記のそれぞれのドメインをコードするポリヌクレオチドを連結して作製することができ、このポリヌクレオチドを適切な細胞に導入することによってGMR.CAR-T細胞を作製することができる。また、GMR.CARは、標的結合ドメイン以外の構成成分が同一である既存のCARタンパク質をコードするポリヌクレオチドを鋳型として、常法に従い、標的結合ドメインを組み替えることによっても作製することができる。
【００４４】
更に、目的に応じて、既存のCARタンパク質をコードするポリヌクレオチドを鋳型として、1以上のドメイン、例えば細胞外スペーサードメインを、inverse PCR（iPCR）法等を使用して、改変することができる。細胞外スペーサードメインの改変技術については、例えばOncoimmunology, 2016, Vol.5, No.12, e1253656等に記載されている。
【００４５】
本発明の一実施形態としては、
配列番号２又は配列番号３のアミノ酸配列を含むヒト顆粒球-マクロファージコロニー刺激因子（GM-CSF）受容体に特異的に結合する標的結合ドメインと、配列番号１７のアミノ酸配列を含む膜貫通ドメインと、配列番号２１のアミノ酸配列を含む細胞内シグナル伝達ドメインとを有するキメラ抗原受容体（CAR）タンパク質をコードするポリヌクレオチドが導入された遺伝子改変細胞を使用することができる。
【００４６】
本発明の一実施形態としては、
配列番号２又は配列番号３のアミノ酸配列を含むヒト顆粒球-マクロファージコロニー刺激因子（GM-CSF）受容体に特異的に結合する標的結合ドメインと、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４及び／又は配列番号１５のアミノ酸配列を含む細胞外スペーサードメインと、配列番号１７のアミノ酸配列を含む膜貫通ドメインと、配列番号２１のアミノ酸配列を含む細胞内シグナル伝達ドメインとを有するキメラ抗原受容体（CAR）タンパク質をコードするポリヌクレオチドが導入された遺伝子改変細胞を使用することができる。
【００４７】
尚、前記、「配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４及び／又は配列番号１５のアミノ酸配列を含む」とは、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４及び配列番号１５のアミノ酸配列のうち、任意の1又は２以上の組み合わせのいずれかを含むことを意味する。以下、本明細書において同様である。
【００４８】
上記のポリヌクレオチドが導入される細胞としては、哺乳動物、例えばヒト由来の細胞又はサル、マウス、ラット、ブタ、ウシ、イヌ等の非ヒト哺乳動物由来のT細胞又はT細胞を含む細胞集団が使用できる。例えば、血液（末梢血、臍帯血など）、骨髄などの体液、組織又は器官により採取、単離、精製、誘導された細胞を使用することができる。末梢血単核細胞（PBMC）、免疫細胞[樹状細胞、Ｂ細胞、造血幹細胞、マクロファージ、単球、NK細胞又は血球系細胞（好中球、好塩基球）]、臍帯血単核球、繊維芽細胞、前駆脂肪細胞、幹細胞、皮膚角化細胞、間葉系細胞、脂肪肝細胞、各種がん細胞株又は神経幹細胞を使用することができる。
【００４９】
本発明の好ましい実施態様の一つとしては、例えば、細胞傷害性タンパク質（パーフォリン、グランザイム等）を放出する細胞を用いることができる。具体的には、例えばT細胞、T細胞の前駆細胞（造血幹細胞、リンパ球前駆細胞等）、NK細胞、NK-T細胞又はこれらを含有する細胞集団を使用することができる。さらに、これらの細胞に分化し得る細胞としてES細胞、iPS細胞等の各種幹細胞が含まれる。T細胞には、CD8陽性T細胞、CD4陽性T細胞、制御性T細胞、細胞傷害性T細胞、又は腫瘍浸潤リンパ球が含まれる。T細胞及びT細胞の前駆細胞を含有する細胞集団には、PBMCが含まれる。前記の細胞は生体より採取されたもの、それを拡大培養したもの又は細胞株として樹立されたもののいずれでもよい。製造されたCARを発現する細胞又は当該細胞より分化させた細胞を生体に移植する場合には、その生体自身又は同種の生体から採取された細胞に核酸を導入することが望ましい。
【００５０】
本発明の遺伝子改変細胞のためにポリヌクレオチドが導入され、養子免疫療法に使用されるT細胞としては、持続的な抗腫瘍効果が期待されるT細胞、例えば、ステムセルメモリーT細胞を使用することができる。ステムセルメモリーT細胞の解析は、常法に従い、例えば、（Yang Xu, et al. blood. 2014; 123:3750-3759）等の記載に従って容易に確認することができる。
【００５１】
本発明の実施態様の一つとしては、CAR発現プラスミドで形質導入されたT細胞がCD45R0-、CD62L+、CD45RA+及びCCR7+である細胞が上記のポリヌクレオチドが導入される細胞として使用できる。
【００５２】
本発明のより好ましい実施態様の一つとしてはCD8+、CD45RA+、CCR7+、CD62L+である細胞が少なくとも５０％以上の細胞が上記のポリヌクレオチドが導入される細胞として使用できる。
【００５３】
遺伝子改変細胞を作製するためのポリヌクレオチドの導入方法は、通常使用されているものであればいずれでも良く、特に限定されるものではない。ベクターを用いて導入する場合、使用され得るベクターとしては、特に限定するものではないが、例えばレンチウイルスベクター、レトロウイルスベクター、泡沫状ウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター等が挙げられる。また、非ウイルス性の態様として、プラスミドトランスポゾンを使用することができ、sleeping beautyトランスポゾンシステム（例えばHuang X, Guo H, et al. Mol Ther. 2008; 16: 580-9；Singh H, Manuri PR, et al. Cancer Res. 2008; 68: 2961-71；Deniger DC, Yu J, et al. PLoS One. 2015; 10: e0128151；Singh H, Moyes JS, et al. Cancer Gene Ther. 2015; 22: 95-100；Hou X, Du Y, et al. Cancer Biol Ther. 2015; 16: 8-16；Singh H, Huls H, et al. Immunol Rev. 2014; 257: 181-90；及びMaiti SN, Huls H, et al. J Immunother. 2013; 36: 112-23に記載）又はpiggybacトランスポゾンシステム（Nakazawa Y, Huye LE, et al. J Immunother. 2009; 32: 826-36；Galvan DL, Nakazawa Y, et al. J Immunother. 2009; 32: 837-44；Nakazawa Y, Huye LE, et al. Mol Ther. 2011; 19: 2133-43；Huye LE, Nakazawa Y, et al. Mol Ther. 2011; 19: 2239-48；Saha S, Nakazawa Y, et al. J Vis Exp. 2012; (69): e4235；Nakazawa Y, Saha S, et al. J Immunother. 2013; 36: 3-10；及びSaito S, Nakazawa Y, et al. Cytotherapy. 2014; 16: 1257-69に記載）が好適に使用できる。
【００５４】
本発明の好ましい態様の一つとしては、非ウイルス性の態様、特にpiggybacトランスポゾンシステムを使用することができる。具体例は実施例に示す。
【００５５】
本発明の細胞は、GM-CSF受容体を表面に発現している標的細胞に対して、受容体特異的免疫応答を引き起こすことによって、細胞内にシグナルが伝達され、活性化される。CARを発現する細胞の活性化は、宿主細胞の種類やCARの細胞内ドメインによって異なるが、例えば、サイトカインの放出、細胞増殖率の向上、細胞表面分子の変化等を指標として確認することができる。細胞傷害性タンパク質の放出（パーフォリン、グランザイムなど）は、受容体を発現している細胞の破壊をもたらす。
【００５６】
本発明は更に、ヒトGM-CSF受容体に特異的に結合するキメラ抗原受容体（CAR）タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むベクターを提供する。本発明のベクターは、上記の本発明の遺伝子改変細胞を作製するために好適に使用することができる。
【００５７】
本発明のGMR.CARを発現する細胞は、安全性に優れた細胞であることが望ましい。安全性に優れた細胞であるためには、特に限定されないが、例えば、標的細胞に対し特異的な免疫応答を可能にする一方で、例えば、正常な造血幹細胞には影響を与えないことが望ましい。骨髄関連抗原が関与する疾患においては、重篤な副作用として、例えば、骨髄抑制が知られている。
【００５８】
従って、本発明のGMR.CARを発現する細胞としては、GMR.CARを発現する細胞が標的細胞を殺傷する投与量において、骨髄細胞を完全に駆逐しない細胞が望ましい。
本発明の一態様としては、本発明のGMR.CARを発現する細胞として、正常細胞に影響を与えないGMR.CARを発現する細胞を好適に使用できる。安全性の指標としては、特に限定されないが、例えば、影響を及ぼす末梢細胞及び／又は骨髄細胞に対する殺傷能と腫瘍細胞への殺傷能をIC50値で比較した場合に当該比が十分に大きいことを指標として確認することができる
【００５９】
本発明のGMR.CARを発現する細胞は、疾患の治療剤として使用することができる。従って、本発明は、上記の本発明の細胞を含む、GM-CSF受容体発現細胞が関与する疾患に対する治療剤を提供する。該治療剤は、CARタンパク質を発現する細胞を活性成分として含み、さらに、適当な賦形剤を含んでいても良い。本発明の治療剤による治療が期待される疾患としては、当該細胞に感受性を示す疾患であれば良く、限定されないが、例えば、GM-CSF受容体を発現する、特に高発現する細胞が関連する疾患、例えば血液がん（白血病）が挙げられ、具体的には、例えば若年性骨髄単球性白血病（JMML）、急性骨髄性白血病（AML）が挙げられる。さらには、固形がんが挙げられ、具体的には、例えば、神経膠腫（グリオーマ）、神経芽細胞腫、膠芽腫、脳腫瘍、直腸結腸腺がん、前立腺がん、腎臓がん、メラノーマ及び肺小細胞がん等が挙げられる。
【００６０】
固形がんに上記治療剤が適用される場合、GM-CSF受容体が標的細胞の微小環境を形成している細胞、例えば骨髄由来免疫抑制細胞（MDSCs）等に発現している疾患が含まれる。該疾患にあっては、標的細胞にGM-CSF受容体が発現していない場合であっても、例えば、腫瘍細胞傷害活性を高める目的で、他の治療剤と併用して用いることができる。
【００６１】
ここで、「GM-CSF受容体を発現する、特に高発現する」とは、発現強度が高い（例えば、平均蛍光強度（MFI）が高い）ことを意図する場合と、発現率（陽性率）が高いことを意図する場合があり得る。発現率が高い細胞を意図する場合、例えば、CD33/CD116発現率（陽性率）が少なくとも40％以上である細胞を意味する。腫瘍細胞に均質に発現しているという観点からは該発現率が80％以上の細胞が好ましい。より好ましくは、該発現率が90%以上の細胞を意味する。
【００６２】
本発明の治療剤の一態様は、GM-CSF受容体を発現する腫瘍細胞に対する抗癌剤である。本発明の治療剤又は抗癌剤は、単独で使用することもできるが、異なるメカニズムの薬剤及び／又は治療と組み合わせて使用することができる。
【００６３】
従って、本発明の治療剤は、単独又は他の有効成分と組み合わせて、医薬組成物の形態とすることができる。本発明の治療剤又は医薬組成物は、局所投与又は全身投与することができ、投与形態を限定するものではないが、例えば白血病の治療の場合には、静脈内投与とすることが好ましい。医薬組成物には、本発明の治療剤及び他の有効成分の他に、投与形態に応じて、当分野で通常使用される担体、賦形剤、緩衝剤、安定化剤等を含めることができる。本発明の治療剤の投与量は、患者の体重、年齢、疾患の重篤度等に応じて変動するものであり、特に限定するものではないが、例えば0.0001〜1mg/kg体重の範囲で１日１回〜数回、２日毎、３日毎、１週間毎、２週間毎、毎月、２カ月毎、３カ月毎に投与することが可能である。
【００６４】
本発明の治療剤の一態様は、患者に有効量の本発明の遺伝子改変細胞であるCARタンパク質を含む細胞を投与することを含む、細胞移植前に患者をコンディショニングする方法に関する。ある態様において、細胞移植は幹細胞移植である。幹細胞移植は造血幹細胞移植（骨髄移植、臍帯血移植、末梢血幹細胞移植）が好適に使用される。
【００６５】
本発明の治療剤の一態様は、細胞移植前の患者のコンディショニングとして患者におけるGM-CSF受容体発現細胞の数を減らすことが含まれる。患者におけるGM-CSF受容体発現細胞はGM-CSF受容体発現正常細胞又はGM-CSF受容体発現がん細胞である。前記患者におけるコンディショニングは、細胞移植前にGM-CSF受容体発現正常及びがん細胞の両者を減らすものであっても良い。
【実施例】
【００６６】
以下に実施例を挙げて本発明を更に具体的に説明するが、本発明は以下の実施例のみに限定されるものではない。【００６７】
［実施例１  GMR.CAR発現プラスミド（CAR 001）の作製］
ヒトGM-CSF（NCBI Accession No.: NM_000758の翻訳領域（配列番号２２、33〜464塩基：終始コドン前）の5’側にEcoRIサイト、3’側にIgG1のヒンジをコードする塩基配列及びBclIサイトをつけたPCR産物をpTA2クローニングベクター（TOYOBO）にサブクローニングした。ヒトGM-CSFとIgG1のヒンジ配列をサブクローニングしたpTA2クローニングベクターをEcoRIとBclIダブルダイジェストし、ヒトGM-CSFとIgG1のヒンジ配列を切り出した。一方、pSL1190ベクター（Amersham社）に、SFG-CD19.CAR（Savoldo et al. J Clin Invest 2011;121(5):1822-1826）をNcoIとSphIでダブルダイジェストすることで得られたanti-CD19 scFv (FMC63; Zola H. et al. Immunol Cell Biol. 1991;69(Pt6):411-412)-CD28-CD3zetaの断片をライゲーションすることでpSL1190-CD19.CARベクターを作製した。【００６８】
pSL1190-CD19.CARベクターをEcoRIとBamHIでダブルダイジェストした後、前述の切り出したヒトGM-CSFとIgG1のヒンジ配列をcompatible siteを使用してライゲーションすることでpSL1190-GMR.CARベクターを作製した。さらに、pIRII-CD19.CARベクター（Huye et al. Mol Ther 2011;19(12):2239-2248）をEcoRIとNotIでダブルダイジェストすることでCD19.CAR断片を除き、代わりにpSL1190-GMR.CARベクターをEcoRIとNotIでダブルダイジェストすることで得られた断片をライゲーションすることでGMR.CAR発現プラスミドを取得した（CAR 001）。図１に作製されたCAR 001のベクターマップを示す。【００６９】
［実施例２  変異型GMR.CAR発現プラスミドの作製（E21R, E21H, E21S, E21A）］
CAR 001を鋳型として、inverse-PCR法により変異型GMR.CARの発現プラスミドを作製した。
Inverse-PCRに用いる5’側PCRプライマーは、GM-CSFポリペプチド（配列番号１）の21番目のグルタミン酸（E）をアルギニン（R）、ヒスチジン（H）、セリン（S）又はアラニン（A）にそれぞれ置換するようデザインして合成した（配列番号２３〜２６、ユーロフィンジェノミクス株式会社に委託）。３’側プライマーはすべての変異型に共通のデザインのもの（配列番号２７）を合成した（ユーロフィンジェノミクス株式会社に委託）。【００７０】
E21R作製用フォワードプライマー：AGAGCCCGGCGTCTCCTGAACCTGAGTA（配列番号２３）
E21H作製用フォワードプライマー：CACGCCCGGCGTCTCCTGAACCTGAGTA（配列番号２４）
E21S作製用フォワードプライマー：AGCGCCCGGCGTCTCCTGAACCTGAGTA（配列番号２５）
E21A作製用フォワードプライマー：GCCGCCCGGCGTCTCCTGAACCTGAGTAGA（配列番号２６）
リバースプライマー：CTGGATGGCATTCACATCGAGGGTC（配列番号２７）【００７１】
CAR 001を50 ng/μLに調整して鋳型として用い、各PCRプライマーは反応液中濃度が0.2又は0.3μMになるように調整した。Inverse-PCRはKOD -Plus- Mutagenesis Kit（東洋紡績株式会社）を用い、反応組成はキット添付のプロトコールに従った。反応条件は、(i)94℃ 2分、(ii)98℃ 10秒、(iii)68℃ 7分で、(ii)及び(iii)を10サイクル行った。【００７２】
PCR反応後のサンプルの一部を1〜1.2%アガロースゲル電気泳動にて分離し、目的サイズの直鎖状のプラスミドの生成を確認した。残りのPCR反応後のサンプルをキット添付のプロトコールに従ってDpn I処理により、メチル化された鋳型プラスミドCAR 001を切断し排除する反応を行った。その後、直鎖状プラスミドをキット添付のT4 Polynucleotide Kinaseによりセルフライゲーションさせ、環状プラスミドとした。その後、環状プラスミドにより大腸菌DH5α（東洋紡績株式会社）を形質転換し、50μg/mLアンピシリン含有LB寒天培地上で約16時間培養した。【００７３】
出現したコロニーをさらに50μg/mLアンピシリン含有LB液体培地中で約16時間培養した。培養した大腸菌培養液からQIAprep Spin Miniprep Kit（キアゲン）を用いて各プラスミドを精製して塩基配列確認を行い、目的の塩基配列の置換が確認されたプラスミドをそれぞれCAR 002 (E21R GMR.CAR)、CAR 004 (E21H GMR.CAR)、CAR 006 (E21S GMR.CAR) 又はCAR 008 (E21A GMR.CAR)とした。【００７４】
[実施例３  変異型GMR.CAR発現プラスミドの作製（E21K, E21D, E21F）］
実施例２と同様にして、GM-CSFポリペプチド（配列番号１）の21番目のグルタミン酸（E）がリシン（K）、アスパラギン酸（D）又はフェニルアラニン（F）に置換されたプラスミドを作製した。具体的には、5’側に制限酵素XhoIで切断される配列と3’側に制限酵素DraIIIによって切断される配列を付加したXhoI - 分泌シグナル配列 - GM-CSF変異体 - ヒンジ配列- DraIIIの断片を人工合成した（ユーロフィンジェノミクス株式会社に委託）。この断片とCAR 001をXhoIとDraIIIで処理した断片とを結合させ、それぞれCAR 003(E21K GMR.CAR)、CAR 005 (E21D GMR.CAR)又はCAR 007 (E21F GMR.CAR)とした。【００７５】
［実施例４  変異型スペーサー改変GMR.CAR発現プラスミドの作製］
変異型スペーサー改変GMR.CAR発現プラスミドは、スペーサー改変GMR.CAR発現プラスミドを作製したのちに、それらを鋳型にして変異を組み込むことで作製した。
CAR 001を鋳型として、細胞外スペーサードメイン部分を改変したGMR.CAR発現プラスミドをinverse-PCR法により作製した。具体的には、図２〜３にベクターマップをそれぞれ示す、CH2CH3部分欠失体（図２）及びCH2CH3部分欠失と(G4S)3の挿入体（図３）を作製した。【００７６】
Inverse-PCRに用いるPCRプライマーは、以下に示すように、CH2CH3部分欠失体用プライマー（配列番号２８及び２９）及びCH2CH3部分欠失と(G4S)3の挿入体用プライマー（配列番号３０及び３１）をそれぞれデザインし、合成した（ユーロフィンジェノミクス株式会社に委託）。【００７７】
＜CH2CH3部分欠失体用プライマー＞
フォワードプライマー：5'- TTTTGGGTGCTGGTGGTGGTTGGTGGAGTC -3'（配列番号２８）
リバースプライマー：5'- TGGGCATGTGTGAGTTTTGTCAGGAGAT -3'（配列番号２９）【００７８】
＜CH2CH3部分欠失と(G4S)3の挿入体用プライマー＞
フォワードプライマー：
5'-GGTGGTGGTGGATCCGGCGGCGGCGGCTCCGGTGGTGGTGGTTCTAAAGATCCCAAATTTTGGGTGCTGG -3'（配列番号３０）
リバースプライマー：5'- TGGGCATGTGTGAGTTTTGTCAGGAGATTTGGGC -3'（配列番号３１）【００７９】
CAR 001を50 ng/μLに調整して鋳型として用い、各PCRプライマーは反応液中濃度が0.2又は0.3μMになるように調整した。Inverse-PCRはKOD -Plus- Mutagenesis Kit（東洋紡績株式会社）を用い、反応組成はキット添付のプロトコールに従った。反応条件は、(i)94℃ 2分、(ii)98℃ 10秒、(iii)68℃ 7分で、(ii)及び(iii)を10サイクル行った。【００８０】
PCR反応後のサンプルの一部を1〜1.2%アガロースゲル電気泳動にて分離し、目的のサイズの直鎖状のプラスミドの生成を確認した。次いで、残りのPCR反応後のサンプルをキット添付のプロトコールに従ってDpn I処理により、メチル化された鋳型プラスミドCAR 001を切断して排除する反応を行った。その後、直鎖状プラスミドをキット添付のT4 Polynucleotide Kinaseによりセルフライゲーションさせて環状プラスミドとした。得られた各環状プラスミドにより大腸菌DH5α（東洋紡績株式会社）を形質転換し、50μg/mLアンピシリン含有LB寒天培地上で約16時間培養した。【００８１】
出現したコロニーをさらに50μg/mLアンピシリン含有LB液体培地中で約16時間培養した。培養した大腸菌培養液からQIAprep Spin Miniprep Kit（キアゲン）を用いて各プラスミドを精製して塩基配列確認を行い、目的の塩基配列の改変が確認された変異型スペーサー改変GMR.CAR発現プラスミド：CAR 009(GMR.CAR dCH2CH3)及びCAR 010 (GMR.CAR dCH2CH3+(G4S)3)を取得した。【００８２】
作製したCAR 009及びCAR 010を鋳型として、変異型スペーサー改変GMR.CAR発現プラスミドをinverse-PCR法により作製した。作製したプラスミドのベクターマップを図４〜７にそれぞれ示す。GM-CSFポリペプチド（配列番号１）の21番目のEをRに置換したCH2CH3部分欠失体（図４）、21番目のEをKに置換したCH2CH3部分欠失体（図５）、21番目のEをRに置換したCH2CH3部分欠失と(G4S)3の挿入体（図６）及び21番目のEをKに置換したCH2CH3部分欠失と(G4S)3の挿入体（図７）を作製した。【００８３】
本実施例においてInverse-PCRに用いたPCRプライマーは、以下に示すように、EをRに置換するプライマー（配列番号３２及び３３）及びEをKに置換するプライマー（配列番号３４及び３３）をそれぞれデザインし、合成した（ユーロフィンジェノミクス株式会社に委託）。【００８４】
＜EをRに置換するプライマー＞
フォワードプライマー：5'- AGAGCCCGGCGTCTCCTGAACCTG -3'（配列番号３２）
リバースプライマー：5'- CTGGATGGCATTCACATGCTCCCAGGG -3'（配列番号３３）【００８５】
＜EをKに置換するプライマー＞
フォワードプライマー：5'- AAGGCCCGGCGTCTCCTGAACCTG -3'（配列番号３４）
リバースプライマー：5'- CTGGATGGCATTCACATGCTCCCAGGG -3'（配列番号３３）【００８６】
CAR 009及びCAR 010を50 ng/μLに調整して鋳型として用い、各PCRプライマーは反応液中濃度が0.2又は0.3μMになるように調整した。Inverse-PCRはKOD -Plus- Mutagenesis Kit（東洋紡績株式会社）を用い、反応組成はキット添付のプロトコールに従った。反応条件は、(i)94℃ 2分、(ii)98℃ 10秒、(iii)68℃ 7分で、(ii)及び(iii)を10サイクル行った。【００８７】
PCR反応後のサンプルの一部を1〜1.2%アガロースゲル電気泳動にて分離し、目的のサイズの直鎖状のプラスミドの生成を確認した。次いで、残りのPCR反応後のサンプルをキット添付のプロトコールに従ってDpn I処理により、メチル化された鋳型プラスミドを切断して排除する反応を行った。その後、直鎖状プラスミドをキット添付のT4 Polynucleotide Kinaseによりセルフライゲーションさせて環状プラスミドとした。得られた各環状プラスミドにより大腸菌DH5α（東洋紡績株式会社）を形質転換し、50μg/mLアンピシリン含有LB寒天培地上で約16時間培養した。【００８８】
出現したコロニーをさらに50μg/mLアンピシリン含有LB液体培地中で約16時間培養した。培養した大腸菌培養液からQIAprep Spin Miniprep Kit（キアゲン）を用いて各プラスミドを精製して塩基配列確認を行い、目的の塩基配列の改変が確認された変異型スペーサー改変GMR.CAR発現プラスミド：CAR 011 (E21R GMR.CAR  dCH2CH3)、CAR 012 (E21KGMR.CAR E dCH2CH3)、CAR 013 (E21RGMR.CAR dCH2CH3+(G4S)3)及びCAR 014 (E21KGMR.CAR dCH2CH3+(G4S)3)を取得した。【００８９】
［実施例５  GMR.CAR-T細胞の培養・増幅］
＜PBMCの分離と非特異的刺激OKT 3 blastの作製（Day 0）＞
健康成人ドナーから末梢血を採取し、D-PBS（和光純薬工業株式会社）で2倍に希釈した後、Ficoll-Paque PLUSに希釈末梢血を重層し、400 x g、30分の遠心分離を行い、PBMCを分取した。分取したPBMCをD-PBSで2回洗浄し、遠心分離により単離した。単離したPBMCを2〜4 x 106個/well/2 mLとなるように5 ng/mL IL-15含有TexMACS mediumに懸濁した。Anti-Human CD3抗体及びAnti-Human CD28抗体を含有するD-PBSで24ウェルノントリートメント培養プレートを37℃、2時間で抗体コーティングしたプレートを用意し、細胞懸濁液を2 mL/wellで播きT細胞の特異的刺激を行い、OKT3 blastの作製を開始した。【００９０】
Day 3にOKT3 blastの再刺激用の抗体固相プレートを作製した。具体的には、D-PBSで1 μg/mLに調製したAnti-human CD3抗体及びAnti-human CD28抗体を24ウェルノントリートメントプレート平底に500 μL/well添加し、4℃、オーバーナイトでインキュベートすることで、抗体をプレートに固相した。【００９１】
一方、Day 0から刺激をしていたOKT3 blastは抗体を固相していない24ウェル細胞培養用平底マルチウェルプレートに移すことで、一時的に刺激を行わなかった。【００９２】
Day 4に前日固相したプレートから上清を除き、OKT3 blastを添加することで、OKT3 blastのAnti-Human CD3抗体及びAnti-Human CD28抗体による再刺激を開始した。再刺激はDay 7まで実施したが、その期間中、適宜培地交換及びIL-15の添加を行った。【００９３】
＜PBMCのウイルスペプチドパルス（Day 0）＞
単離したPBMCにpeptivatorペプチドプール（登録商標、ミルテニーバイオテック）によるウイルスペプチド刺激を行った。具体的には、D-PBS 50μLにそれぞれ0.05μg/μLのAdV5 Hexon、CMV pp65、EBV BZLF1及びEBV EBNA-1を添加したペプチドプールにてPBMCを懸濁し、37℃で30分間ウイルスペプチド刺激を施した。30分後、PBMCに適量のD-PBSを加えて懸濁し、その後4分間のUV照射を行った。UV照射済みPBMCを回収し、細胞数をカウントした後、0.5〜6 x 106個/well/2 mLとなるように10 ng/mL IL-7及び5 ng/mL IL-15含有TexMACS medium中に懸濁し、フィーダー細胞として24ウェルトリートメント培養プレートに移した。【００９４】
＜GMR.CAR発現ベクターの電気的導入（Day 0）＞
変異型GMR.CAR発現プラスミドCAR 002 (E21R GMR.CAR)、CAR 003 (E21K GMR.CAR)、CAR 004 (E21H GMR.CAR)、CAR 005 (E21D GMR.CAR)、CAR 006(E21S GMR.CAR)、CAR 007(E21F GMR.CAR)又はCAR 008 (E21A GMR.CAR)のPBMCへの導入のために、それぞれのCAR 5μg、pCMV-piggyBacプラスミド5μg、P3 Primary Cell 4D-NucleofectorTMX Kit（ロンザジャパン株式会社）に付属するP3 Primary Cell solution 100 μLを混和し、10 x 106個のPBMCに添加した。【００９５】
次いで、細胞全量をNucleocuvetteに移し、4D-Nucleofection（Program No: FI-115）により電気的遺伝子導入を行った。電気的遺伝子導入を行った細胞を10分間室温に放置し、全量をフィーダー細胞の入った24ウェルトリートメント培養プレートに加えて培養を開始した。遺伝子導入操作を施さないMock-T細胞として、1〜15 x 106個の細胞を同様に培養した。培養中の培地の半量を廃棄し、2倍量すなわち20 ng/mL IL-7及び10 ng/mL IL-15含有のTexMACS mediumを半量添加する培地交換作業を適宜行った。Mock-T細胞は24ウェルトリートメント培養プレート上で培養を続け、細胞の増殖度合いにより培地交換と増幅を行った。【００９６】
＜CAR-T細胞の増幅（Day 7）＞
細胞懸濁液全量を、10 ng/mL IL-7及び5 ng/mL IL-15 含有のTexMACS medium 30 mL中に上記で作製したOKT 3 blastにペプチドパルスとUV照射を行ったフィーダー細胞2 x 106個を充填したG-Rex 10に移し、Day 14までGMR.CAR-T細胞の増幅を行った。Day 14まで増幅したGMR.CAR-T細胞の発現率を以下の方法にて測定した。【００９７】
＜GMR.CAR発現率の評価（Day 14）＞
細胞数をカウントし、1〜2 x 105個の細胞をフローサイトメトリー解析により、GMR.CAR-Tの発現率を評価した。1〜2 x 105個の細胞を採取し、PE Rat Anti-Human GM-CSF抗体（BD Pharmingen）2.5μL及びAPC Anti-Human CD3抗体（ミルテニーバイオテック） 5μLを加えて懸濁し、4℃、遮光にて20分間抗体標識反応を行った。20分後、D-PBS適量で細胞を洗浄し、遠心分離により細胞を沈殿させ上清を除去した後、D-PBS適量に再懸濁したサンプルについてFACSCalibur（ベクトン・ディッキンソン株式会社）を用いて解析し、IgG1/CD3陽性又はGM-CSF/CD3陽性を指標としてGMR.CARの発現率を測定した。【００９８】
GMR.CAR発現プラスミド（CAR 001）を用いてPBMCへの電気的導入操作及びT細胞の培養・増幅操作によって得られたGMR.CAR-T細胞を CAR-T 001とし、同様に、CAR 002 (E21R GMR.CAR)、CAR 003 (E21K GMR.CAR)、CAR 004 (E21H GMR.CAR) 、CAR 005 (E21D GMR.CAR)、CAR 006(E21S GMR.CAR)、CAR 007(E21F GMR.CAR)又はCAR 008 (E21A GMR.CAR)プラスミドを用いた操作によって得られたGMR.CAR-T細胞をそれぞれCAR-T 002(E21R)、CAR-T 003(E21K)、CAR-T 004(E21H)、CAR-T 005(E21D)、CAR-T 006(E21S)、CAR-T 007(E21F)、及びCAR-T 008(E21A)とした。【００９９】
CAR-T 001〜008のday 14における発現解析結果を図８に示す。各細胞群におけるGMR.CAR発現率はそれぞれ、CAR-T 001 : 20.89％、CAR-T 002(E21R): 16.68％、CAR-T 003(E21K): 15.94％、CAR-T 004(E21H): 17.89％、CAR-T 005(E21D): 19.83％、CAR-T 006(E21S): 21.00％、CAR-T 007(E21F): 20.47％、CAR-T 008(E21A): 20.01％であり、Mock-T細胞における発現率（5.66％）と比較していずれも高く、変異型GMR.CAR発現T細胞の作製に成功した。【０１００】
[実施例６  GMR.CAR-Tの抗腫瘍細胞活性］
実施例５で得られたCAR-T 001〜008の腫瘍細胞傷害活性を評価するため、腫瘍細胞との共培養試験を行った。具体的には、THP-1細胞（American Type Culture Collection（ATCC））を使用し、腫瘍細胞［ターゲット（Ｔ）］を5 x 105個/mLとなるように10％ FBS含有RPMI 1640培地（サーモフィッシャーサイエンティフィック）で調製し、48ウェルトリートメント培養プレートに500μL/wellで播種した。実施例５で取得したCAR-T 001〜CAR-T 008［エフェクター（Ｅ）］は、Ｅ：Ｔ比1 : 5〜1 : 100となるように10% FBS含有RPMI 1640培地で希釈した。【０１０１】
すなわち、E : T比＝１：５の場合、GMR.CAR-T細胞は1 x 105個/mLとなるように調製し、腫瘍細胞が播かれた48ウェルトリートメント培養プレートに500μL/wellで添加した。同様に、E : T比＝１：５０、１：１００の場合は、それぞれGMR.CAR-T細胞は0.1 x 105個/mL又は0.05 x 105個/mLとなるように調製し、腫瘍細胞が播かれた48ウェルトリートメント培養プレートに500μL/wellで添加した。共培養試験は5日間行った。Mock-T細胞についても同様な共培養試験を行い、コントロール群として、腫瘍細胞のみを同細胞数で培養した群も設定した（CAR-T非添加群）。【０１０２】
共培養試験5日目に各ウェルの細胞を回収し、遠心分離した細胞にAPC Anti-Human CD3抗体（ミルテニーバイオテック）5μL及びPE Anti-Human CD33抗体（ミルテニーバイオテック） 5μLを加え懸濁し、4℃、遮光にて20分間抗体標識反応を行った。20分後、D-PBS適量で細胞を洗浄し、遠心分離により細胞を沈殿させ上清を完全に除去した後、450 μLのD-PBSで再懸濁し、さらにCountBright absolute counting beads （インビトロジェン）を50 μL添加したサンプルについて、FACSCanto II（ベクトン・ディッキンソン株式会社）及びFLOWJO（ベクトン・ディッキンソン株式会社）を用いて解析し、CD33の陽性細胞数をカウンティングビーズをもとに算出した。以下の計算式によりCAR-T 001〜CAR-T 008及びMock-T細胞の抗腫瘍細胞活性％を算出した。【０１０３】
＜抗腫瘍細胞活性％の算出＞
計算式：
・抗腫瘍細胞活性％＝１００−（CAR-T添加群のCD33陽性細胞数）／（CAR-T非添加群のCD33陽性細胞数）ｘ１００【０１０４】
図９に、CAR-T 001〜CAR-T 008のTHP-1細胞に対する抗腫瘍細胞活性％の結果を示した。CAR-T 002〜CAR-T 008はいずれも、CAR-T 001と比較して同等以上のTHP-1細胞に対する抗腫瘍細胞活性が認められた。【０１０５】
［実施例７  変異型スペーサー改変GMR.CAR-T細胞の培養・増幅］
＜PBMCの分離と非特異的刺激OKT 3 blastの作製（Day 0）＞
健康成人ドナーから末梢血を採取し、D-PBS（和光純薬工業株式会社）で2倍に希釈した後、Ficoll-Paque PLUSに希釈末梢血を重層し、400 x g、30分の遠心分離を行い、PBMCを分取した。分取したPBMCをD-PBSで2回洗浄し、遠心分離により単離した。単離したPBMCを2〜4 x 106個/well/2 mLとなるように5 ng/mL IL-15含有TexMACS mediumに懸濁した。Anti-Human CD3抗体及びAnti-Human CD28抗体を含有するD-PBSで24ウェルノントリートメント培養プレートを37℃、2時間で抗体コーティングしたプレートを用意し、細胞懸濁液を2 mL/wellで播きT細胞の特異的刺激を行い、OKT3 blastの作製を開始した。【０１０６】
Day 3にOKT3 blastの再刺激用の抗体固相プレートを作製した。具体的には、D-PBSで1 μg/mLに調製したAnti-human CD3抗体及びAnti-human CD28抗体を24ウェルノントリートメントプレート平底に500 μL/well添加し、4℃、オーバーナイトでインキュベートすることで、抗体をプレートに固相した。
一方、Day 0から刺激をしていたOKT3 blastは抗体を固相していない24ウェル細胞培養用平底マルチウェルプレートに移すことで、一時的に刺激を行わなかった。【０１０７】
Day 4に前日固相したプレートから上清を除き、OKT3 blastを添加することで、OKT3 blastのAnti-Human CD3抗体及びAnti-Human CD28抗体による再刺激を開始した。再刺激はDay 7まで実施したが、その期間中、適宜培地交換及びIL-15の添加を行った。【０１０８】
＜PBMCのウイルスペプチドパルス（Day 0）＞
単離したPBMCにpeptivatorペプチドプール（登録商標、ミルテニーバイオテック）によるウイルスペプチド刺激を行った。具体的には、D-PBS 50μLにそれぞれ0.05μg/μLのAdV5 Hexon、CMV pp65、EBV BZLF1及びEBV EBNA-1を添加したペプチドプールにてPBMCを懸濁し、37℃で30分間ウイルスペプチド刺激を施した。30分後、PBMCに適量のD-PBSを加えて懸濁し、その後4分間のUV照射を行った。UV照射済みPBMCを回収し、細胞数をカウントした後、0.5〜6 x 106個/well/2 mLとなるように10 ng/mL IL-7及び5 ng/mL IL-15含有TexMACS medium中に懸濁し、フィーダー細胞として24ウェルトリートメント培養プレートに移した。【０１０９】
＜遺伝子導入操作（Day 0）＞
GMR.CAR発現プラスミドのPBMCへの導入のために、CAR 001及びCAR 009〜CAR 014のいずれかを5μg、pCMV-piggyBacプラスミド5μg、P3 Primary Cell 4D-NucleofectorTMX Kit（ロンザジャパン株式会社）に付属するP3 Primary Cell solution 100μLを混和し、10〜15 x 106個のPBMCに添加した。【０１１０】
次いで、細胞全量をNucleocuvetteに移し、4D-Nucleofection（Program No: FI-115）により電気的遺伝子導入を行った。電気的遺伝子導入を行った細胞を10分間室温に放置し、全量をフィーダー細胞の入った24ウェルトリートメント培養プレートに加え培養を開始した。遺伝子導入操作を施さないMock-T細胞として、1〜15 x 106個の細胞を同様に培養した。培養中の培地の半量を廃棄し、2倍量すなわち20 ng/mL IL-7及び10 ng/mL IL-15含有のTexMACS mediumを半量添加する培地交換作業を適宜行った。Mock-T細胞は24ウェルトリートメント培養プレート上で培養を続け、細胞の増殖度合いにより培地交換と増幅を行った。【０１１１】
＜CAR-T細胞の増幅（Day 7）＞
細胞懸濁液全量を、10 ng/mL IL-7及び5 ng/mL IL-15含有のTexMACS medium 30 mL中に上記で作製したOKT 3 blastにペプチドパルスとUV照射を行ったフィーダー細胞2〜10 x 106個を充填したG-Rex 10に移し、Day 14までGMR.CAR-T細胞の増幅を行った。Day 14まで増幅したGMR.CAR-T細胞の発現率を以下の方法にて測定した。【０１１２】
＜GMR.CAR発現率の評価（Day 14）＞
細胞数をカウントし、1〜2 x 105個の細胞をフローサイトメトリー解析により、GMR.CAR-Tの発現率を評価した。1〜2 x 105個の細胞を採取し、遠心分離した細胞にPE Rat Anti-Human GM-CSF抗体（ミルテニーバイオテック）5μL及びAPC mouse Anti-Human CD3抗体（ミルテニーバイオテック）5μLを加え懸濁し、4℃、遮光にて20分間抗体標識反応を行った。20分後、D-PBS適量で細胞を洗浄し、遠心分離により細胞を沈殿させ上清を除去した後、D-PBS適量に再懸濁したサンプルについてFACSCantoII(ベクトン・ディッキンソン株式会社)及びFLOWJO（ベクトン・ディッキンソン株式会社）を用いて解析し、GM-CSF/CD3陽性を指標としてGMR.CARの発現率を測定した。【０１１３】
本実施例において発現プラスミド(CAR 001及びCAR 009〜CAR 014)を用いてPBMCへの電気的導入操作及びT細胞の培養・増幅操作によって得られるGMR.CAR-T細胞をそれぞれ、CAR-T 001-A、CAR-T 009、CAR-T 010、CAR-T 011、CAR-T 012、CAR-T 013及びCAR-T 014とした。【０１１４】
CAR-T 001-A及びCAR-T 009〜CAR-T 014のday 14における発現解析結果を図１０に示す。GMR.CAR発現率はそれぞれ、CAR-T 001-A : 28.0％、CAR-T 009: 31.7％、CAR-T 010: 31.0％、CAR-T 011: 30.1％、CAR-T 012: 31.7％、CAR-T 013: 35.4％、CAR-T 014: 30.7％であり、Mock-T細胞における発現率0.54％と比較していずれも高く、スペーサー部位の異なるGMR.CAR発現T細胞の作製に成功した。作製したGMR.CAR発現T細胞をMock-T細胞で希釈することで発現率を28.0%に揃え、以下の実施例で抗腫瘍細胞活性及び安全性を評価した。【０１１５】
［実施例８  変異型スペーサー改変GMR.CAR-Tの抗腫瘍細胞活性］
実施例７で得られたCAR-T 001-A及びCAR-T 009〜CAR-T 014の腫瘍細胞傷害活性を評価するため、腫瘍細胞との共培養試験を行った。具体的には、THP-1細胞（American Type Culture Collection（ATCC））を使用し、THP-1細胞［ターゲット（T）］を4 x 105個/mLとなるように10％FBS含有RPMI 1640培地（サーモフィッシャーサイエンティフィック）で調製し、48ウェルトリートメント培養プレートに500 μL/wellで播種した（ウェル内の細胞数は2.0 x 105個となる）。【０１１６】
CAR-T 001-A及びCAR-T 009〜CAR-T 014［エフェクター（E）］は、E：T比1 : 25及び1 : 125となるように10％FBS含有RPMI 1640培地で希釈した。すなわち、E:T比1：25の場合、CAR-Tは0.16 x 105個/mLとなるように調製し、腫瘍細胞が播かれた48ウェルトリートメント培養プレートに500 μL/wellで添加した（ウェル内のCAR-T細胞数は0.08 x 105個となる）。同様に、E : T比1：125の場合、0.032 x 105個/mLとなるように調製し、腫瘍細胞が播かれた48ウェルトリートメント培養プレートに500 μL/wellで添加した（ウェル内のCAR-T細胞数は0.016 x 105個となる）。【０１１７】
抗腫瘍細胞活性％の算出は、実施例６と同様にして行った。図１１に、CAR-T 001-A、CAR-T 009〜CAR-T 014及びMock-T細胞のTHP-1細胞に対する抗腫瘍細胞活性％の結果を示した。CAR-T 009〜CAR-T 014はいずれも、CAR-T 001-Aと比較して同等以上のTHP-1細胞に対する抗腫瘍細胞活性が認められた。【０１１８】
［実施例９  変異型スペーサー改変GMR.CAR-T抗腫瘍細胞活性持続性評価］
養子免疫療法において効果が期待されるCAR-T細胞は、持続的な細胞傷害活性が要求される。したがって、GMR.CAR-Tの抗腫瘍細胞活性の持続性を評価するため下記の実験を行った。【０１１９】
実施例７と同様にして、発現プラスミド(CAR 010〜CAR 014)を用いてPBMCへの電気的導入操作及びT細胞の培養・増幅操作を行い、GMR.CAR-T細胞を新たに作製した（CAR-T 010-A〜CAR-T 014-A）。【０１２０】
本実施例で使用したCAR-T 010-A〜014-Aのday 14における発現解析結果を図１２に示す。GMR.CAR発現率はそれぞれ、CAR-T 010-A: 26.2％、CAR-T 011-A: 27.6％、CAR-T 012-A: 18.5％、CAR-T 013-A: 29.8％、CAR-T 014-A: 26.9％であり、Mock-T細胞における発現率（0.50％）と比較していずれも高く、スペーサー部位の異なるGMR.CAR発現T細胞の作製に成功した。
次いで、作製したGMR.CAR発現T細胞をMock-T細胞で希釈することで発現率を18.5%に揃えて連続的な抗腫瘍細胞活性を評価した。【０１２１】
CAR-T 010-A〜CAR-T 014-Aの腫瘍細胞傷害活性の持続性を評価するため、長期間の腫瘍細胞との共培養試験を行った。具体的には、THP-1、MV4-11、Kasumi-1細胞（American Type Culture Collection（ATCC））及びshinAML-1細胞（信州大学付属病院においてAML患者から樹立した細胞株）を使用し、各腫瘍細胞［ターゲット（T）］を5 x 105個/mLとなるように10％FBS含有RPMI 1640培地（サーモフィッシャーサイエンティフィック）で調製し、48ウェルトリートメント培養プレートに500 μL/wellで播種した（ウェル内の腫瘍細胞数は2.5 x 105個となる）。【０１２２】
CAR-T 010-A〜014-A ［エフェクター（E）］は、E：T比1 : 1となるように10％FBS含有RPMI 1640培地で希釈した。すなわち、CAR-T は5 x 105個/mLとなるように調製し、各腫瘍細胞が播かれた48ウェルトリートメント培養プレートに500μL/wellで添加した（ウェル内のCAR-T細胞数は2.5 x 105個となる）。なお、各群2ウェルずつ用意し、1ウェルはFACSCanto II（ベクトン・ディッキンソン株式会社）での「解析用」、もう1ウェルは次のタームで新しい腫瘍細胞へ添加するための「継続用」として用いた。【０１２３】
ターム1としての共培養試験は4日間行った。遺伝子導入を行っていないMock-T細胞についても同様の共培養試験を行い、また、コントロール群として、腫瘍細胞のみを同細胞数で培養した群も設定した（CAR-T非添加群）。【０１２４】
共培養試験4日目に「解析用」のウェルの細胞を回収し、遠心分離した細胞にAPC Anti-Human CD3抗体（ミルテニーバイオテック）5μL及びPE Anti-Human CD33抗体（ミルテニーバイオテック） 5μLを加え懸濁し、4℃、遮光にて20分間抗体標識反応を行った。20分後、D-PBS適量で細胞を洗浄し、遠心分離により細胞を沈殿させ上清を完全に除去した後、450 μLのD-PBSで再懸濁し、さらにCountBright absolute counting beads （インビトロジェン）を50 μL添加したサンプルについてFACSCanto II、FLOWJO（ベクトン・ディッキンソン株式会社）を用いて解析し、CD33の陽性細胞数をカウンティングビーズをもとに算出した。ここまでをターム1とする。【０１２５】
共培養開始時と比較して腫瘍細胞が殺傷された（腫瘍細胞数が減少した）群に関しては、次のターム2へ進めた。具体的には、予め2.5 x 105個/500 μL/wellで播種された腫瘍細胞を2ウェル用意し、そこへターム1で「継続用」として共培養しておいた培養液を500 μL/wellずつ等分に添加し、さらに4日間共培養した。この作業を培養期間4日又は3日で繰り返した。なお、共培養開始時と比較して腫瘍細胞数が増加した群に関しては、次のタームへは進めないこととした。【０１２６】
図１３〜図１７に各腫瘍細胞をターゲットとしたときの、それぞれ4日、8日、12日、15日、19日、22日目における抗腫瘍細胞活性評価の結果を示した。CAR-T 010-A〜CAR-T 014-Aはいずれの腫瘍細胞株に対しても持続的に殺傷効果を有することが確認された。【０１２７】
［実施例１０  GMR.CAR-Tの末梢細胞に関する作用］
本実施例で使用したGMR.CAR-T細胞（CAR-T 001-B及びCAR-T 009-B〜CAR-T 014-B）は下記の方法で新たに作製した。【０１２８】
＜遺伝子導入操作（Day 0）＞
実施例７と同様にしてOKT3 blastの作製を行った後、GMR.CAR発現プラスミドのPBMCへの導入のために、CAR 001及びCAR 009〜014のいずれかを5μg、pCMV-piggyBacプラスミド5μg、P3 Primary Cell 4D-NucleofectorTM X Kit（ロンザジャパン株式会社）に付属するP3 Primary Cell solution 100μLを混和し、15〜20 x 106個のPBMCに添加した。【０１２９】
細胞全量をNucleocuvetteに移し、4D-Nucleofection（Program No: FI-115）により電気的遺伝子導入を行った。電気的遺伝子導入を行った細胞を10分間室温に放置し、抗CD28抗体を含有するD-PBSで37℃、2時間で抗体コーティングした後、フィーダー細胞を入れた24ウェルノントリート培養プレートに加え培養を開始した。遺伝子導入操作を施さないMock-T細胞として、1〜20 x 106個の細胞を同様に培養した。Day3で細胞を24ウェルノントリートメントプレートから24wellトリートメント培養プレートに移し替え培養を続けた。【０１３０】
培養中の培地の半量を廃棄し、2倍量すなわち20 ng/mL IL-7及び10 ng/mL IL-15含有のTexMACS mediumを半量添加する培地交換作業を適宜行った。Mock-T細胞は24ウェルトリートメント培養プレート上で培養を続け、細胞の増殖度合いにより培地交換と増幅を行った。【０１３１】
次いで、実施例７と同様にしてCAR-T細胞の増幅及びGMR.CAR発現率の評価を行った。
本実施例で使用したCAR-T 001-B及びCAR-T 009-B〜CAR-T 014-Bのday 14における発現解析結果を図１８に示す。GMR.CAR発現率はそれぞれ、CAR-T 001-B: 45.9％、CAR-T 009-B: 37.2％、CAR-T 010-B: 42.4％、CAR-T 011-B: 46.4％、CAR-T 012-B:41.1％、CAR-T 013-B: 48.3％、CAR-T 014-B: 51.2％であり、Mock-T細胞における発現率0.56％と比較していずれも高く、GMR.CAR発現T細胞の作製に成功した。【０１３２】
次に、作製したGMR.CAR発現T細胞をMock-T細胞で希釈することで発現率を37.2％に揃えて末梢血細胞に対する影響を確認した。CAR-T 001-B及びCAR-T 009-B〜CAR-T 014-Bの末梢血細胞に対する影響を確認するため、末梢血細胞との共培養試験を実施した。【０１３３】
＜多形核白血球（PMN）、PBMCの分離＞
健常成人ドナーから末梢血を採取し、D-PBSで2倍に希釈した後、polymorph prep（AXS)に希釈末梢血を重層し、450×g、35分の遠心分離を行い、PMN及びPBMCを分取した。分取したPMNとPBMCをD-PBSで2回洗浄し、遠心分離により単離した。【０１３４】
CAR-T 001-B及びCAR-T 009-B〜CAR-T 014-Bを用い、単離したPMN、PBMC、腫瘍細胞株MV4-11との共培養試験を行った。具体的には、PMN、PBMC、MV4-11［ターゲット（T）］を2×105個/mLとなるように10%FBS含有RPMI 1640培地（サーモフィッシャーサイエンティフィック)で調製し、48ウェルトリートメント培養プレートに500μＬ/wellで播種した（ウェル内の細胞数は1×105個となる)。【０１３５】
CAR-T 001-B及びCAR-T 009-B〜CAR-T 014-B［エフェクター（E）］はE:T比1:1と1:10となるように10% FBS含有RPMI1640培地で希釈した。すなわちE:T比=1:1のサンプルのためのCAR-Tは2×105個/mLとなるように調製し、PMN又はPBMC、MV4-11が播かれた48ウェルトリートメント培養プレートに500μＬ/wellで添加した（ウェル内のCAR-T細胞数は1×105個)。【０１３６】
同様に、E:T比=1:10の場合はCAR-Tは0.2×105個/mLとなるように調製し、PMN又はPBMC、MV4-11が播かれた48ウェルトリートメント培養プレートに500μＬ/wellで添加した（ウェル内のCAR-T細胞数は0.1×105個)。【０１３７】
＜PMNとの共培養試験＞
共培養試験は3日間行った。Mock-T細胞についても同様な共培養試験を行い、コントロール群として、PMNを同細胞数で培養した群も設定した（CAR-T非添加群）。
共培養試験3日目に各ウェルの細胞を回収し、遠心分離した細胞にFITC Anti-Human CD3抗体（バイオレジェンド)0.1μＬ、PE Anti-Human GM-CSF抗体（ミルテニーバイオテック)5μＬ、APC Anti-Human CD11b抗体（バイオレジェンド)0.1μＬを加えて懸濁し、4℃、遮光にて20分間抗体標識反応を行った。20分後、D-PBS適量で細胞を洗浄し、遠心分離により細胞を沈殿させて上清を除去した後、D-PBS450μＬに再懸濁し、counting beads 50μＬを加えたサンプルをFACSCantoIIを用いて解析し、CD3-CD11b+を好中球として生細胞数を測定し、測定した細胞数を10倍した数値を生存細胞数として算出し、PMNのみで培養した値との相対比を算出した。【０１３８】
＜PBMCとの共培養試験＞
共培養試験は3日間行った。Mock-T細胞についても同様な共培養試験を行い、コントロール群として、PBMCを同細胞数で培養した群も設定した（CAR-T非添加群)。
共培養試験3日目に各ウェルの細胞を回収し、遠心分離した細胞にFITC Anti-Human CD3抗体0.1μＬ、PE Anti-Human GM-CSF抗体5μＬ、APC Anti-Human CD11b抗体0.1μＬPacific blue Anti-Human CD16抗体(バイオレジェンド)0.1μＬ、APC-cy7 Anti-Humn CD19抗体(バイオレジェンド)0.1μＬを加えて懸濁し、4℃、遮光にて20分間抗体標識反応を行った。20分後、D-PBS適量で細胞を洗浄し、遠心分離により細胞を沈殿させ上清を除去した後、D-PBS450μＬに再懸濁し、counting beads 50 μＬを加えたサンプルをFACSCantoIIを用いて解析し、CD3-CD11b＋を単球、CD3-CD16＋をNK細胞、CD3-CD19＋をB細胞として生細胞数を測定し、測定した細胞数を10倍した数値を生存細胞数として算出し、PBMCのみで培養した値との相対比を算出した。【０１３９】
＜MV4-11との共培養試験＞
共培養試験は3日間行った。Mock-T細胞についても同様な共培養試験を行い、コントロール群として、MV4-11を同細胞数で培養した群も設定した（CAR-T非添加群)。
共培養試験3日目に各ウェルの細胞を回収し、遠心分離した細胞にAPC Anti-Human CD33 5μＬ、FITC Anti-Human CD3 0.2μＬ、PE Anti-Human GM-CSF 5μＬと加えて懸濁し、4℃、遮光にて20分間抗体標識反応を行った。20分後、D-PBS適量で細胞を洗浄し、遠心分離により細胞を沈殿させ上清を除去した後、D-PBS 450μＬに再懸濁し、counting beads 50μＬを加えたサンプルをFACSCantoIIを用いて解析し、CD33+腫瘍生細胞を測定し、測定した細胞数を10倍した数値を腫瘍生存細胞数として算出し、MV4-11のみで培養した値との相対比を算出した。【０１４０】
図１９にE:T比1:1及び1:10でMV4-11をターゲットとしたときの腫瘍生存細胞数相対比と末梢血細胞PMN、PBMCをターゲットとしたときの生存細胞数相対比を示した。CAR-T 001-B及びCAR-T009-B〜CAR-T014-Bはいずれも、E:T比1:1では腫瘍をほぼすべて殺傷し、一方で、B細胞、NK細胞、好中球（neutrophil）などの末梢血細胞には影響を及ぼさなかった。E:T比1:10では、CAR-T 001-B及びCAR-T 009-B〜CAR-T 014-Bはいずれも、腫瘍も末梢血細胞も殺傷しなかった。この結果からCAR-T 001-B及びCAR-T 009-B〜CAR-T 014-Bは腫瘍殺傷能を持つ細胞数ではB細胞、NK細胞、好中球などの末梢血細胞には影響を及ぼさないことが示された。【０１４１】
［実施例１１  GMR.CAR-Tの骨髄細胞に関する作用］
実施例７で作製したCAR-T 001-A及びCAR-T 009〜CAR-T 014の正常骨髄細胞に対する影響を評価するため、骨髄細胞由来のコロニー形成試験を行った。
具体的には、健常人由来骨髄細胞のCD34陽性分画（ベリタス）［ターゲット（T）］を1 x 104個/mLとなるように10％FBS、20 ng/mLのIL-3、SCF及びTPO含有RPMI 1640培地（サーモフィッシャーサイエンティフィック）で調製した。同様にMV4-11［ターゲット（T）］を6 x 103個/mLとなるように10％FBS、20 ng/mLのIL-3、SCF及びTPO含有RPMI 1640培地（サーモフィッシャーサイエンティフィック）で調製した。【０１４２】
調製した各ターゲット細胞を96ウェル丸底プレートに50 μL/wellで播種した。そこへCAR-T 001-A及びCAR-T 009〜CAR-T 014 ［エフェクター（E）］を、健常人由来骨髄細胞のCD34陽性分画に対してはE：T比20 : 1、6 : 1、2 : 1、0.6 : 1、0.2 : 1となるように、MV4-11に対してはE：T比1 : 1、0.5 : 1、0.25 : 1、0.125 : 1となるように10％FBS含有RPMI 1640培地で希釈し、50μＬ/wellで播種した。すなわち、エフェクターとターゲットを96ウェル丸底プレートで100 μＬ/well、10%FBS、10 ng/mLのIL-3、SCF及びTPOを含有したRPMI 1640培地で上記のE:T比で共培養した。【０１４３】
共培養は2日間行った。遺伝子導入を行っていないMock-T細胞についても同様の共培養試験を行い、また、コントロール群として、健常人由来骨髄細胞のCD34陽性分画のみ、あるいはMV4-11のみを同細胞数で培養した群も設定した（CAR-T非添加群）。【０１４４】
2日後、共培養液100 μＬとMethoCult Classic（ベリタス）1 mLを混合し、SmartDish 6-Well Plates（ベリタス）へ播種した。播種して7日目以降にコロニー形成されたことを確認した後にカウントした。なおCD34陽性分画の場合、複数種類のコロニーが観察され、コロニーの判別が難しい理由から、自動コロニーカウント装置のSTEMvision（ベリタス）を用いてエリスロイド系コロニーとミエロイド系コロニーを分けてカウントした。一方、MV4-11のコロニーは１種類のみであるため判別する必要がなく、顕微鏡を用いて手動でカウントした。【０１４５】
図２０に、健常人由来骨髄細胞のCD34陽性分画をターゲットにした時に、各E:T比でプロットした点から描いたシグモイド曲線を示す。コントロール群以外は3ウェル平均値、コントロール群は6ウェル平均値を用いてプロットした。シグモイド曲線はGraphPad Prism 4 ver.4.03（GraphPad）を用いて出力し、パラメーターをTOP=100、BOTTOM≠0に設定した上で以下の式によりフィッティングを実施した。【０１４６】
【数１】
2019177151.tif 000004
【０１４７】
図２１に、MV4-11をターゲットにした時に、各E:T比でプロットした点から描いたシグモイド曲線を示す。プロットには2ウェル平均値を用いた。シグモイド曲線はパラメーターをTOP=100、BOTTOM=0に設定した上で上記の式によりフィッティングを実施した。
図２２に図２０より算出したIC50値、図２１より算出したEC50値、さらにそれらから算出される安全域を示す。その結果、影響の大きいミエロイド系に対して安全域が最も大きいのはCAR-T 014であった。【０１４８】
［実施例１２  GMR.CAR-Tのin vivoにおける効果１］
実施例１０と同様にして、発現プラスミド(CAR 009、CAR 011及びCAR 012）を用いてPBMCへの電気的導入操作及びT細胞の培養・増幅操作を行い、GMR.CAR-T細胞を新たに作製した（CAR-T 009-C、CAR-T 011-C及びCAR-T 012-C）。本実施例で使用したCAR-T 009-C、CAR-T 011-C及びCAR-T 012-Cのday 14における発現解析結果を図２３に示す。GMR.CAR発現率はそれぞれ、CAR-T 009-C: 25.7％、CAR-T 011-C: 32.1％、 CAR-T 012-C: 25.2％であった。【０１４９】
THP-1担癌マウスモデルにおけるこれらのGMR.CAR-T細胞の効果を確認するため、下記のin vivo実験を行った。マウスは7週齢の雌性NSGマウスNOD.Cg-Prkdc＜scid ＞Il2rg＜ tm1Wjl ＞/SzJ（日本チャールズリバー）を用い、6週齢で納品後、6日間馴化を行った後に実験に使用した。
Day0でTHP-1細胞株を1×106個/マウスとなるように150μLのD-PBSで懸濁してNSGマウスにイソフルラン麻酔下で頸静脈内投与した。
Day3で培養16日目のCAR-T細胞をtotal T細胞5×106個/マウスとなるように150μLのD-PBSで懸濁してNSGマウスにイソフルラン麻酔下で頸静脈から投与した。【０１５０】
マウスの状態を1〜2日おきにday148まで観察し、カプラン・マイヤー分析を行い、Log-rank（Cochran-Mantel-Haenszel)testsにより統計解析を行った。
またマウスの状態を観察し、以下に設定した人道的エンドポイントに達したと判断したマウスは安楽死させ、死亡とした。
人道的エンドポイント：
・下肢を引きずる
・腫瘤の直径が20mmとなる
・体重が7日間で25%以上減少する。【０１５１】
その結果、図２４に示すように、CAR-T 009-C（P値＝0.0086)、CAR-T 011-C（P値=0.0011)及びCAR-T 012-C（P値=0.0011)は、PBS投与群と比較して有意にマウスの生存期間を延長することが示された。【０１５２】
さらに、CAR-T 011-C及びCAR-T 012-C投与マウスとCAR-T 009-C投与マウス間の統計解析において、CAR-T 011-C（P値＝0.0042) 及びCAR-T 012-C（Ｐ値=0.0136)は、CAR-T 009-Cと比較して有意にマウスの生存期間を延長することが示された。
これらの結果から、THP-1担癌マウスモデルにおいては、CAR-T 011-C及びCAR-T 012-Cは、CAR-T 009-Cと比較して強い抗腫瘍効果を有することが示された。【０１５３】
［実施例１３  GMR.CAR-Tのin vivoにおける効果２］
実施例１０と同様にして、発現プラスミド(CAR 009〜CAR 014）を用いてPBMCへの電気的導入操作及びT細胞の培養・増幅操作を行い、GMR.CAR-T細胞を新たに作製した（CAR-T 009-D〜CAR-T 014-D）。本実施例で使用したCAR-T 009-D〜CAR-T 014-Dのday 14における発現解析結果を図２５に示す。GMR.CAR発現率はそれぞれ、CAR-T 009-D: 33.3％、CAR-T 010-D: 39.6％、CAR-T 011-D: 35.1％、CAR-T 012-D: 37.4％、CAR-T 013-D: 43.0％、CAR-T 014-D: 40.9％であった。【０１５４】
得られた発現率と細胞数からCAR陽性細胞数を算出し、各群に投与するCAR陽性細胞が1.2×106個となるようにした。MV4-11担癌マウスモデルにおける効果を確認するため、実施例１２と同様に下記のin vivo実験を行った。8週齢の雌性NSGマウスを用い、6週齢で納品後13日間馴化を行った後、実験に使用した。【０１５５】
Day0でMV4-11細胞株を1×106個/マウスとなるように150μLのD-PBSで懸濁してNSGマウスにイソフルラン麻酔下で頸静脈から投与した。
Day3で培養16日目のCAR-T細胞をCAR陽性細胞1.2×106個/マウスとなるように150μLのD-PBSで懸濁してNSGマウスにイソフルラン麻酔下で頸静脈から投与した。【０１５６】
マウスの状態を1〜2日おきにday116まで観察しカプラン・マイヤー分析を行い、Log-rank（Cochran-Mantel-Haenszel)testsにより統計解析を行った。またマウスの状態を観察し、実施例１２と同様に人道的エンドポイントに達したと判断したマウスは安楽死させ、死亡とした。
またDay52でEDTA-2Kが塗布されたヘマトクリット毛細管（東京硝子器械）を用いて、100μL程度採血を行い、委託業務による定量PCR（MLL-AF4キメラmRNA定量(SRL)）により血液中の腫瘍細胞の残存量を定量した。【０１５７】
その結果、図２６及び２７に示すように、CAR-T 009-D（P値＝0.0042)、CAR-T 011-D（P値=0.0216)、CAR-T 012-D（P値=0.0042)）、CAR-T 010-D（P値＝0.0042)、CAR-T 013-D（P値=0.0042)及びCAR-T 014-D（P値=0.0042)は、PBS投与群と比較して有意にマウスの生存期間を延長することが示された。【０１５８】
さらに、day116におけるカプランマイヤー分析、及び図２８に示すday52の末梢血中腫瘍の定量PCRの結果から、MV4-11担癌マウスモデルにおいて、CAR-T 010-D及びCAR-T 014-DがCAR-T 013-Dと比較して強い抗腫瘍効果を有することが示された。【０１５９】
［実施例１４  GMR.CAR-Tのin vivoにおける効果３］
実施例１０と同様にして、発現プラスミド(CAR 001及びCAR 014）を用いてPBMCへの電気的導入操作及びT細胞の培養・増幅操作を行い、GMR.CAR-T細胞を新たに作製した（CAR-T 001-C及びCAR-T 014-F）を新たに作製した。また、発現率算出のための比較対照用として、Morita.et.al.Molecular Therapy: Methods & Clinical Development Vol. 8 March 2018に記載のCH2CH3-free CD19.CAR プラスミドを用いてCD19.CAR-Tを同様に作製した。【０１６０】
本実施例で使用したCAR-T 001-C及びCAR-T 014-Fのday14における発現解析結果を図２９に示す。GMR.CAR発現率はそれぞれ、CAR-T 001-C: 32.3%とCAR-T 014-F: 14.1%であった。
得られた発現率と細胞数からCAR陽性細胞数を算出し、各群に投与するCAR陽性細胞が0.7×106個となるようにした。MV4-11担癌マウスモデルにおける効果を確認するため、実施例１２と同様に下記のin vivo実験を行った。7週齢の雌性NSGマウスを用い、6週齢で納品後6日間馴化を行った後、実験に使用した。【０１６１】
Day0でMV4-11細胞株を1×106個/マウスとなるように150μLのD-PBSで懸濁してNSGマウスに無麻酔で尾静脈から投与した。
Day3で培養16日目のCAR-T細胞をCAR陽性細胞0.7×106個/マウスとなるように150μLのD-PBSで懸濁してNSGマウスに無麻酔で尾静脈から投与した。
マウスの状態を1〜2日おきにday105まで観察してカプラン・マイヤー分析を行い、Log-rank (Cochoran-Mantel-Haenszel)testsにより統計解析を行った。またマウスの状態を観察し、実施例１２と同様に人道的エンドポイントに達したと判断したマウスは安楽死させ、死亡とした。【０１６２】
その結果、図３０に示すように、CAR-T 014-F（P値＝0.0050)は、PBS投与群と比較して有意にマウスの生存期間を延長することが示され、CAR-T 014-F（P値＝0.0081)はCAR-T 001-Cと比較しても有意にマウスの生存期間を延長することが示された。【０１６３】
［実施例１５  腫瘍細胞表面におけるGMRα（CD116）の発現解析］
上記実施例の抗腫瘍細胞活性評価に使用した腫瘍細胞株の細胞表面におけるGMRα（CD116）の発現率をフローサイトメトリーにより解析した。急性骨髄性白血病（AML）の細胞株であるTHP-1、Kasumi-1、shinAML-1、MV4-11株の解析を行った。具体的には、1〜2 x 105個の細胞を採取し、APC Anti-Human CD116抗体（ミルテニーバイオテック）5μL及びPE Anti-Human CD33抗体（ミルテニーバイオテック）5μLを加え懸濁し、4℃、遮光にて20分間抗体標識反応を行った。20分後、D-PBS適量で細胞を洗浄し、遠心分離により細胞を沈殿させ上清を除去した後、D-PBS適量に再懸濁したサンプルについてFACSCaliburを用いて解析し、CD33/CD116の発現率を測定した。【０１６４】
表１に各腫瘍細胞表面のCD33／CD116発現率を示した。THP-1、Kasumi-1、shinAML-1及びMV4-11すべてにおいてCD33／CD116陽性率は90％以上であった。【０１６５】
【表１】
2019177151.tif 000005
【０１６６】
［実施例１６  GMR.CAR発現T細胞のフェノタイプ解析］
実施例７と同様にして、発現プラスミドCAR 014を用いてPBMCへの電気的導入操作及びT細胞の培養・増幅操作を行い、GMR.CAR-T細胞を新たに作製した（CAR-T 014-E）。CAR-T 014-Eのday 14における発現解析結果を図３１に示す。GMR.CAR発現率は9.75%であり、Mock-T細胞における発現率（1.75%）と比較して高く、GMR.CAR発現T細胞の作製に成功した。【０１６７】
作製したGMR.CAR発現T細胞の細胞数をカウントし、1x 106個の細胞をフローサイトメトリー解析により、GMR.CAR-T細胞のフェノタイプを評価した。1 x 106個の細胞を採取し、遠心分離した細胞にHuman BD Fc Block (ベクトン・ディッキンソン株式会社)を添加することでFcレセプターのブロック処理をおこなった後、BB515 Mouse AntiHuman CD197抗体（ベクトン・ディッキンソン株式会社）、PE Mouse Aniti-Human CD27抗体（ベクトン・ディッキンソン株式会社）、APC Mouse Anti-Human CD62L抗体（ベクトン・ディッキンソン株式会社）、APC-H7 Mouse Anti-Human CD45RO抗体（ベクトン・ディッキンソン株式会社）、Brilliant Violet421 Mouse Anti-Human CD56抗体（ベクトン・ディッキンソン株式会社）、BV510 Mouse Anti-Human CD8抗体（ベクトン・ディッキンソン株式会社）、BV605 Mouse Anti-Human CD45RA抗体（ベクトン・ディッキンソン株式会社）、BV650 Mouse Anti-Human CD3抗体（ベクトン・ディッキンソン株式会社）及びBV786 Mouse Anti-Human CD4抗体（ベクトン・ディッキンソン株式会社）を適量加え懸濁し、4℃、遮光にて20分間抗体標識反応を行った。【０１６８】
20分後、3%FBS含有D-PBS適量で細胞を洗浄し、遠心分離により細胞を沈殿させ上清を除去した後、3%FBS含有D-PBS適量に再懸濁したサンプルについてFACSCelesta（ベクトン・ディッキンソン株式会社）及びFLOWJO（ベクトン・ディッキンソン株式会社）を用いて解析し、CD3陽性かつCD45RA/CD62L陽性又はCD3陽性かつCD45RA/CD197陽性を指標としてGMR.CARのフェノタイプを解析した。その結果、作製したGMR.CAR発現T細胞の6割以上がステムセルメモリーT細胞であった。
【産業上の利用可能性】
【０１６９】
本発明により、ヒト顆粒球-マクロファージコロニー刺激因子（GM-CSF）受容体を細胞表面に発現している標的細胞に特異的に結合し、優れた細胞傷害活性を付与するCAR-T細胞が提供される。本発明の細胞は、AML等の疾患に対する養子免疫治療に使用することができる。
本明細書で引用した全ての刊行物、特許及び特許出願はそのまま引用により本明細書に組み入れられるものとする。
【図１】
2019177151.tif 000006
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
2019177151.tif 000012
【図８】
2019177151.tif 000013
【図９】
2019177151.tif 000014
【図１０】
2019177151.tif 000015
【図１１】
2019177151.tif 000016
【図１２】
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【図１３】
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【図１３−１】
2019177151.tif 000019
【図１３−２】
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【図１４】
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【図１４−１】
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【図１４−２】
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【図１５】
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【図１５−１】
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【図１５−２】
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【図１６】
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【図１６−１】
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【図１６−２】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
2019177151.tif 000034
【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
2019177151.tif 000043
【図３１】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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