(57)【要約】金属製カラムハードウェアカラムを用いて高耐圧としながら、試料中の溶質の非特異的な金属配位吸着を防ぐと共に、塩基性の溶質の非特異的な吸着及び疎水性の強い溶質の非特異的な疎水性吸着を防ぐことを目的の１つとし、そのための手段の１つとして、液体クロマトグラフィー用カラムハードウェア１の金属製の移動相接液部３にＳｉＯ２を主成分とする第一の膜４１が積層され、第一の膜４１の表面４１１にＳｉＯ２表面のシラノール基がアルキルシリル化された第二の膜４２が積層されている液体クロマトグラフィー用カラムハードウェア１が提案される。
2020022226.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
液体クロマトグラフィー用カラムハードウェアの金属製の移動相接液部にＳｉＯ２の第一の膜が設けられ、前記第一の膜上に、ＳｉＯ２表面のシラノール基がアルキルシリル化されて作製された第二の膜が設けられていることを特徴とする液体クロマトグラフィー用カラムハードウェア。
【請求項２】
前記第二の膜は、前記第一の膜のＳｉＯ２表面のシラノール基がアルキルシリル化されて作製された膜で構成されていることを特徴とする請求項１に記載の液体クロマトグラフィー用カラムハードウェア。
【請求項３】
前記第一の膜の原料が、無機ポリシラザン、テトラアルコキシシラン、メチルトリアルコキシシラン、ジメチルジアルコキシシラン、トリメチルモノアルコキシシラン、エチルトリアルコキシシラン、ジエチルジアルコキシシラン、トリエチルモノアルコキシシラン、プロピルトリアルコキシシラン、ジプロピルジアルコキシシラン、トリプロピルモノアルコキシシラン、ヘキサメチルシクロトリシロキサンやオクタメチルシクロテトラシロキサン等のジメチル型環状シロキサン、ジエチル型環状シロキサン、ジプロピル型環状シロキサン、ヘキサメチルジシロキサン、オクタメチルトリシロキサンやデカメチルテトラシロキサン等の直鎖状ポリジメチルシロキサン、直鎖状ポリジエチルシロキサン、直鎖状ポリジプロピルシロキサンから選択される１種以上であることを特徴とする請求項１又は２に記載の液体クロマトグラフィー用カラムハードウェア。
【請求項４】
前記第一の膜の原料が、パーヒドロポリシラザン、テトラメトキシシラン、テトラエトキシシラン、テトラプロポキシシラン、メチルトリメトキシシラン、メチルトリエトキシシラン、メチルトリプロポキシシラン、ジメチルジメトキシシラン、ジメチルジエトキシシラン、ジメチルジプロポキシシラン、トリメチルメトキシシラン、トリメチルエトキシシラン、トリメチルプロポキシシランから選択される１種以上であることを特徴とする請求項３に記載の液体クロマトグラフィー用カラムハードウェア。
【請求項５】
前記第二の膜の原料が、アルキルトリアルコキシシラン、ジアルキルジアルコキシシラン、トリアルキルモノアルコキシシランから選択される１種以上であることを特徴とする請求項１から請求項４のうちいずれか１項に記載の液体クロマトグラフィー用カラムハードウェア。
【請求項６】
前記第二の膜の原料が、メチルトリメトキシシラン、メチルトリエトキシシラン、メチルトリプロポキシシラン、ジメチルジメトキシシラン、ジメチルジエトキシシラン、ジメチルジプロポキシシラン、トリメチルメトキシシラン、トリメチルエトキシシラン、トリメチルプロポキシシラン、エチルトリメトキシシラン、エチルトリエトキシシラン、エチルトリプロポキシシラン、ジエチルジメトキシシラン、ジエチルジエトキシシラン、ジエチルジプロポキシシラン、トリエチルメトキシシラン、トリエチルエトキシシラン、トリエチルプロポキシシランから選択される１種以上であることを特徴とする請求項５に記載の液体クロマトグラフィー用カラムハードウェア。
【請求項７】
前記第二の膜は、ＳｉＯ２表面のシラノール基がメチルシリル化されて作製された膜で構成されていることを特徴とする請求項１から請求項６のうちいずれか１項に記載の液体クロマトグラフィー用カラムハードウェア。
【請求項８】
前記第二の膜は、ＳｉＯ２表面のシラノール基がエチルシリル化されて作製された膜で構成されていることを特徴とする請求項１から請求項６のうちいずれか１項に記載の液体クロマトグラフィー用カラムハードウェア。
【請求項９】
前記液体クロマトグラフィー用カラムハードウェアを構成するカラム管の内径が１．０ｍｍ以上であり、長さは１０ｍ以下であることを特徴とする請求項１から請求項８のうちいずれか１項に記載の液体クロマトグラフィー用カラムハードウェア。
【請求項１０】
前記液体クロマトグラフィー用カラムハードウェアを構成するカラム管の内径が２．１ｍｍ以上であることを特徴とする請求項１から請求項９のうちいずれか１項に記載の液体クロマトグラフィー用カラムハードウェア。
【請求項１１】
前記第一の膜は、１種以上の原料から構成された第一の層の一層で構成されていることを特徴とする請求項１から請求項１０のうちいずれか１項に記載の液体クロマトグラフィー用カラムハードウェア。
【請求項１２】
前記第一の膜は、１種以上の原料から構成された第一の層に、前記第一の層を構成する原料とは異なる種の１種以上の原料から構成された第二の層が一層以上積層されて構成されていることを特徴とする請求項１から請求項１０のうちいずれか１項に記載の液体クロマトグラフィー用カラムハードウェア。
【請求項１３】
前記第一の膜の表面は、ジメチルジエトキシシランを原料とする前記第二の層で構成されていることを特徴とする請求項１２に記載の液体クロマトグラフィー用カラムハードウェア。
【請求項１４】
前記第二の膜の疎水性相互作用特性は、前記液体クロマトグラフィー用カラムハードウェアに充填される充填剤の疎水性相互作用特性以下の強さであることを特徴とする請求項１から請求項１３のうちいずれか１項に記載の液体クロマトグラフィー用カラムハードウェア。
【請求項１５】
移動相接液部がＳｉＯ２膜で被覆された液体クロマトグラフィー用カラムハードウェアの前記ＳｉＯ２膜の表面がアルキルシリル化されていることを特徴とする液体クロマトフラフィー用カラムハードウェア。
【請求項１６】
請求項１から請求項１５のうちいずれか１項に記載の液体クロマトグラフィー用カラムハードウェアに充填剤が充填されていることを特徴とする液体クロマトグラフィー用分離カラム。
【請求項１７】
液体クロマトグラフィー用カラムハードウェアの金属製の移動相接液部にＳｉＯ２の第一の膜を設け、前記第一の膜上に、ＳｉＯ２表面のシラノール基がアルキルシリル化された第二の膜を設けることを特徴とする液体クロマトグラフィー用カラムハードウェアの製造方法。
【請求項１８】
液体クロマトグラフィー用カラムハードウェアの金属製の移動相接液部をＳｉＯ２の第一の膜で被覆し、前記第一の膜のＳｉＯ２表面のシラノール基をアルキルシリル化して前記第二の膜を作製することを特徴とする請求項１７に記載の液体クロマトグラフィー用カラムハードウェアの製造方法。
【請求項１９】
前記第一の膜の原料が、無機ポリシラザン、テトラアルコキシシラン、メチルトリアルコキシシラン、ジメチルジアルコキシシラン、トリメチルモノアルコキシシラン、エチルトリアルコキシシラン、ジエチルジアルコキシシラン、トリエチルモノアルコキシシラン、プロピルトリアルコキシシラン、ジプロピルジアルコキシシラン、トリプロピルモノアルコキシシラン、ヘキサメチルシクロトリシロキサンやオクタメチルシクロテトラシロキサン等のジメチル型環状シロキサン、ジエチル型環状シロキサン、ジプロピル型環状シロキサン、ヘキサメチルジシロキサン、オクタメチルトリシロキサンやデカメチルテトラシロキサン等の直鎖状ポリジメチルシロキサン、直鎖状ポリジエチルシロキサン、直鎖状ポリジプロピルシロキサンから選択される１種以上であることを特徴とする請求項１７又は１８に記載の液体クロマトグラフィー用カラムハードウェアの製造方法。
【請求項２０】
前記第二の膜の原料が、アルキルトリアルコキシシラン、ジアルキルジアルコキシシラン、トリアルキルモノアルコキシシランから選択される１種以上であることを特徴とする請求項１７から請求項１９のうちいずれか１項に記載の液体クロマトグラフィー用カラムハードウェアの製造方法。
【請求項２１】
前記第一の膜の作製は、真空度−０．０９９ＭＰａ以上の真空中で、ＳｉＯ２の第一の膜の原料を希釈したガスを拡散させて前記移動相接液部に接触させ、酸素及び／又はオゾンを導入して前記移動相接液部に接触させ、３００℃以上の加熱を９０分間以上行うことを特徴とする請求項１７から請求項２０のうちいずれか１項に記載の液体クロマトグラフィー用カラムハードウェアの製造方法。
【請求項２２】
前記第二の膜の作製は、真空度−０．０９９ＭＰａ以上の真空中で、原料を希釈したガスを拡散させて第一の膜の表面に接触させ、３００℃以上の加熱を１時間以上行うことを特徴とする請求項１７から請求項２１のうちいずれか１項に記載の液体クロマトグラフィー用カラムハードウェアの製造方法。
【請求項２３】
請求項１７から請求項２２のうちいずれか１項に記載の液体クロマトグラフィー用カラムハードウェアの製造方法で製造した液体クロマトグラフィー用カラムハードウェアに充填剤を充填することを特徴とする液体クロマトグラフィー用分離カラムの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、液体クロマトグラフィー用カラムハードウェア及び分離カラムに関し、より詳細には、高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）又は超高性能液体クロマトグラフィー（ＵＨＰＬＣ）に用いるカラムハードウェア及び分離カラムに関し、更にはそれらの製造方法に関する。【０００２】
ここで、「高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）」は、最大４０ＭＰａの圧力下で実行される液体クロマトグラフィーを意味する。又、「超高性能液体クロマトグラフィー（ＵＨＰＬＣ）」は、４０ＭＰａより大きく１３０ＭＰａまでの圧力下で実行される液体クロマトグラフィーを意味する。又、「分離カラム」は、液体クロマトグラフィーにおいて使用される装置であり、以下、「分離カラム」を単に「カラム」ともいう。【０００３】
「カラムハードウェア」は、分離カラムの充填層以外の構成部分であり、試料を含む移動相が接液又は接触し、通り抜ける流路を持つ部品である、カラム管、フリット（フィルター）、エンドユニオン、分散盤、フィルターアセンブリ、フィルターインサートアセンブリの内の一部又は全部を備えて構成された、分離カラムの構成部分をいう。【０００４】
カラム管とエンドユニオンの接続は、カラム管の端部の外側と、エンドユニオンの内側にそれぞれ溝を切り、カラム管とエンドユニオンを螺合させて接続する場合がある。又、ナットとフェラルをカラム管の端部に通し、外側に溝を切ったエンドユニオンとフェラルを螺合することで、ナットで締められて固定されたカラム管とエンドユニオンを接続する場合がある。
【背景技術】
【０００５】
ＨＰＬＣ又はＵＨＰＬＣにおいて、分離の高速化、即ち、短時間に大きな理論段数を発生させて分離時間を短縮するためには、小さな充填剤が詰められたカラムを使用することが必要である。しかし、小さなカラム充填剤は、試料を含む移動相（以下単に「移動相」ともいう。）が通る流路を構成する充填剤の間隙を小さくするので、移動相の送液のために高い圧力を必要とする。そこで、充填剤が内部に入れられるカラム管をはじめとする移動相の流路を持つカラムハードウェアには、高い圧力に耐えられるように、ステンレス等の金属が用いられている。【０００６】
しかし、金属製のカラムハードウェアには、カラム管内壁やフリット表面等の移動相との接液部に金属の露出があるため、ＨＰＬＣ又はＵＨＰＬＣでの分析中に、金属製のカラムハードウェアの金属の露出部分に、試料中の溶質が非特異的な金属配位吸着を起こし、溶質のピーク形状が崩れることがある。【０００７】
上記の金属配位吸着を防ぐため、管腔、通路又は空洞を有する金属製の部品の管腔、通路又は空洞の内面を、気相処理により保護的なコーティングとしてＳｉＯ２等の酸化金属膜を形成する技術が提案されている（特許文献１）。【０００８】
又、液体クロマトグラフィーによってサンプルを分離するため、金属シートの拡散結合により作製されたマイクロ流体デバイスにおいて、分離中にデバイスが移動相で濡れる面と分析物又はサンプルとの相互作用が低減又は防止されるように、分離中にデバイスが移動相で濡れる面に化学気相成長により無機酸化物、典型的にはＳｉＯ２等の酸化金属膜を形成し、更に所望の疎水性又は親水性を有する有機材料を含む有機コーティングを共有結合させる技術が提案されている（特許文献２）。【０００９】
又、液体クロマトグラフ用カラム管をポリエーテルエーテルケトン（ＰＥＥＫ）樹脂で作製し、外表面を金属種の膜で被覆することで、カラムを高耐圧としながら、上記の金属配位吸着を防ぐ技術が提案されている（特許文献３）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】特開２０１５−２１９６５号公報
【特許文献２】特表２０１３−５２７４３２号公報
【特許文献３】特開２０１１−１０６８３３号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
しかし、特許文献１で開示されているように、移動相が接液する流路である金属製の部品の管腔、通路又は空洞の内面にＳｉＯ２等の酸化金属膜を形成した管腔、通路又は空洞を有する金属製の部品では、酸化金属膜を形成しない場合に比べて、試料中の溶質の非特異的な金属配位吸着を低減することは出来るが、形成した酸化金属膜の表面に露出する複数のヒドロキシル基、例えばシラノール基、と移動相中に溶けている金属が相互作用し、試料中の溶質の金属配位吸着の原因となる。このため、溶質の金属配位吸着によるピーク形状の崩れを防ぐことは出来ない。又、上記酸化金属膜の表面に露出するヒドロキシル基と、試料中の塩基性の溶質や分子中に塩基を持つ溶質が非特異的な吸着を起こし、溶質のピーク形状が崩れることがある。【００１２】
又、特許文献２で開示されているように、移動相が接液する流路であるデバイスが移動相で濡れる面に無機酸化物、典型的にはＳｉＯ２等の酸化金属膜を形成し、更に所望の疎水性又は親水性を有する有機材料を含む有機コーティングを共有結合させた金属製のマイクロ流体デバイスでは、試料中の溶質の非特異的な金属配位吸着を低減し、酸化金属膜の表面のヒドロキシル基を低減することで、溶質の金属配位吸着や、塩基性等の溶質の非特異的吸着によるピーク形状の崩れを防げる可能性がある。【００１３】
しかし、特許文献２で開示された技術では、有機コーティングを流路に施した後、その流路にどのような充填剤が詰められるべきかについては開示も示唆もされておらず、有機コーティングの種類によっては、充填剤よりも強い相互作用特性を持つことになり、流路からの試料中の溶質の溶出を妨げてしまう可能性がある。有機コーティングの例としてＣ８又はＣ１０脂肪族炭化水素鎖が挙げられているが、逆相クロマトグラフィーを行うための充填剤がブチルシリル化シリカゲルの場合は、有機コーティング層の方が充填剤よりも試料中の疎水性の溶質との疎水性相互作用特性が強くなり、充填剤に最適化された移動相では、試料中の溶質が溶出しない可能性や、試料中の溶質のピーク形状が崩れてしまう可能性がある。【００１４】
又、特許文献２で開示された技術では、酸化金属膜を作製するための原料及び有機コーティングのための原料、又はこれらの原料の組み合わせにより、移動相が接液する流路の表面に作製される膜の成分が変わり、上記ピーク形状の崩れをどれだけ防げるかが変化すると考えられるが、特許文献２には移動相が接液する流路の表面に作製される膜の具体的な原料や原料の組み合わせを始め、具体的な作製条件については開示も示唆もされておらず、上記ピーク形状の崩れを防ぐことが出来るか又は防げたとしてどれだけ防ぐことが出来るかが不明である。【００１５】
又、特許文献３で開示された技術のように、液体クロマトグラフ用カラム管をポリエーテルエーテルケトン（ＰＥＥＫ）樹脂で作製し、外表面を金属種の膜で被覆した場合では、ＨＰＬＣ又はＵＨＰＬＣでの分析中の、試料中の溶質の非特異的な金属配位吸着を防ぐことは出来るが、ＰＥＥＫ樹脂の影響で、試料中の疎水性の強い溶質が非特異的な吸着を起こし、溶質のピーク形状が崩れることがある。【００１６】
そこで、本発明は、ＨＰＬＣ又はＵＨＰＬＣでの分析において、金属製カラムハードウェアカラムを用いて高耐圧としながら、試料中の溶質の非特異的な金属配位吸着を防ぐと共に、塩基性の溶質の非特異的な吸着及び疎水性の強い溶質の非特異的な疎水性吸着を防ぐことを目的とする。又、溶質のピーク形状を良好とすることを目的とする。又、分離カラムに、低濃度の溶質を、高速で且つ正確に定性及び／又は定量が出来る性能を付与することを目的とする。又、クロマトグラフィー用充填剤が詰められたカラムハードウェアにおいて、試料中の溶質の溶出を妨げずに使用可能とすることを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１７】
上記課題を解決するための手段としての本発明は、金属製カラムハードウェアの移動相と接液する移動相接液部に、適切な材料を使用し、適切な作製条件でＳｉＯ２を含んだ膜を作製し、更に適切な材料を使用してＳｉＯ２のアルキルシリル化を行うものである。【００１８】
具体的には、液体クロマトグラフィー用カラムハードウェアの金属製の移動相接液部にＳｉＯ２の第一の膜が設けられ、前記第一の膜上に、ＳｉＯ２表面のシラノール基がアルキルシリル化されて作製された第二の膜が設けられていることを特徴とする液体クロマトグラフィー用カラムハードウェアである。【００１９】
又、上記液体クロマトグラフィー用カラムハードウェアにおいて、前記第二の膜は、前記第一の膜のＳｉＯ２表面のシラノール基がアルキルシリル化されて作製された膜で構成されていることを特徴とする液体クロマトグラフィー用カラムハードウェアである。【００２０】
又、上記液体クロマトグラフィー用カラムハードウェアにおいて、前記第一の膜の原料が、無機ポリシラザン、テトラアルコキシシラン、メチルトリアルコキシシラン、ジメチルジアルコキシシラン、トリメチルモノアルコキシシラン、エチルトリアルコキシシラン、ジエチルジアルコキシシラン、トリエチルモノアルコキシシラン、プロピルトリアルコキシシラン、ジプロピルジアルコキシシラン、トリプロピルモノアルコキシシラン、ヘキサメチルシクロトリシロキサンやオクタメチルシクロテトラシロキサン等のジメチル型環状シロキサン、ジエチル型環状シロキサン、ジプロピル型環状シロキサン、ヘキサメチルジシロキサン、オクタメチルトリシロキサンやデカメチルテトラシロキサン等の直鎖状ポリジメチルシロキサン、直鎖状ポリジエチルシロキサン、直鎖状ポリジプロピルシロキサンから選択される１種以上であることを特徴とする液体クロマトグラフィー用カラムハードウェアである。【００２１】
又、上記液体クロマトグラフィー用カラムハードウェアにおいて、前記第一の膜の原料が、パーヒドロポリシラザン、テトラメトキシシラン、テトラエトキシシラン、テトラプロポキシシラン、メチルトリメトキシシラン、メチルトリエトキシシラン、メチルトリプロポキシシラン、ジメチルジメトキシシラン、ジメチルジエトキシシラン、ジメチルジプロポキシシラン、トリメチルメトキシシラン、トリメチルエトキシシラン、トリメチルプロポキシシランから選択される１種以上であることを特徴とする液体クロマトグラフィー用カラムハードウェアである。【００２２】
又、上記液体クロマトグラフィー用カラムハードウェアにおいて、前記第二の膜の原料が、アルキルトリアルコキシシラン、ジアルキルジアルコキシシラン、トリアルキルモノアルコキシシランから選択される１種以上であることを特徴とする液体クロマトグラフィー用カラムハードウェアである。【００２３】
又、上記液体クロマトグラフィー用カラムハードウェアにおいて、前記第二の膜の原料が、メチルトリメトキシシラン、メチルトリエトキシシラン、メチルトリプロポキシシラン、ジメチルジメトキシシラン、ジメチルジエトキシシラン、ジメチルジプロポキシシラン、トリメチルメトキシシラン、トリメチルエトキシシラン、トリメチルプロポキシシラン、エチルトリメトキシシラン、エチルトリエトキシシラン、エチルトリプロポキシシラン、ジエチルジメトキシシラン、ジエチルジエトキシシラン、ジエチルジプロポキシシラン、トリエチルメトキシシラン、トリエチルエトキシシラン、トリエチルプロポキシシランから選択される１種以上であることを特徴とする液体クロマトグラフィー用カラムハードウェアである。【００２４】
又、上記液体クロマトグラフィー用カラムハードウェアにおいて、前記第二の膜は、ＳｉＯ２表面のシラノール基がメチルシリル化されて作製された膜で構成されていることを特徴とする液体クロマトグラフィー用カラムハードウェアである。【００２５】
又、上記液体クロマトグラフィー用カラムハードウェアにおいて、前記第二の膜は、ＳｉＯ２表面のシラノール基がエチルシリル化されて作製された膜で構成されていることを特徴とする液体クロマトグラフィー用カラムハードウェアである。【００２６】
又、上記液体クロマトグラフィー用カラムハードウェアにおいて、前記液体クロマトグラフィー用カラムハードウェアを構成するカラム管の内径が１．０ｍｍ以上であり、長さは１０ｍ以下であることを特徴とする液体クロマトグラフィー用カラムハードウェアである。【００２７】
又、上記液体クロマトグラフィー用カラムハードウェアにおいて、前記液体クロマトグラフィー用カラムハードウェアを構成するカラム管の内径が２．１ｍｍ以上であることを特徴とする液体クロマトグラフィー用カラムハードウェアである。【００２８】
又、上記液体クロマトグラフィー用カラムハードウェアにおいて、前記第一の膜は、１種以上の原料から構成された第一の層の一層で構成されていることを特徴とする液体クロマトグラフィー用カラムハードウェアである。【００２９】
又、上記液体クロマトグラフィー用カラムハードウェアにおいて、前記第一の膜は、１種以上の原料から構成された第一の層に、前記第一の層を構成する原料とは異なる種の１種以上の原料から構成された第二の層が一層以上積層されて構成されていることを特徴とする液体クロマトグラフィー用カラムハードウェアである。【００３０】
又、上記液体クロマトグラフィー用カラムハードウェアにおいて、前記第一の膜の表面は、ジメチルジエトキシシランを原料とする前記第二の層で構成されていることを特徴とする液体クロマトグラフィー用カラムハードウェアである。【００３１】
又、上記液体クロマトグラフィー用カラムハードウェアにおいて、前記第二の膜の疎水性相互作用特性は、前記液体クロマトグラフィー用カラムハードウェアに充填される充填剤の疎水性相互作用特性以下の強さであることを特徴とする液体クロマトグラフィー用カラムハードウェアである。【００３２】
又、上記液体クロマトグラフィー用カラムハードウェアにおいて、移動相接液部がＳｉＯ２膜で被覆された液体クロマトグラフィー用カラムハードウェアの前記ＳｉＯ２膜の表面がアルキルシリル化されていることを特徴とする液体クロマトフラフィー用カラムハードウェアである。【００３３】
又、上記の液体クロマトグラフィー用カラムハードウェアに充填剤が充填されていることを特徴とする液体クロマトグラフィー用分離カラムである。【００３４】
又、液体クロマトグラフィー用カラムハードウェアの金属製の移動相接液部にＳｉＯ２の第一の膜を設け、前記第一の膜上に、ＳｉＯ２表面のシラノール基がアルキルシリル化された第二の膜を設けることを特徴とする液体クロマトグラフィー用カラムハードウェアの製造方法である。【００３５】
又、上記液体クロマトグラフィー用カラムハードウェアの製造方法において、液体クロマトグラフィー用カラムハードウェアの金属製の移動相接液部をＳｉＯ２の第一の膜で被覆し、前記第一の膜のＳｉＯ２表面のシラノール基をアルキルシリル化して前記第二の膜を作製することを特徴とする液体クロマトグラフィー用カラムハードウェアの製造方法である。【００３６】
又、上記液体クロマトグラフィー用カラムハードウェアの製造方法において、前記第一の膜の原料が、無機ポリシラザン、テトラアルコキシシラン、メチルトリアルコキシシラン、ジメチルジアルコキシシラン、トリメチルモノアルコキシシラン、エチルトリアルコキシシラン、ジエチルジアルコキシシラン、トリエチルモノアルコキシシラン、プロピルトリアルコキシシラン、ジプロピルジアルコキシシラン、トリプロピルモノアルコキシシラン、ヘキサメチルシクロトリシロキサンやオクタメチルシクロテトラシロキサン等のジメチル型環状シロキサン、ジエチル型環状シロキサン、ジプロピル型環状シロキサン、ヘキサメチルジシロキサン、オクタメチルトリシロキサンやデカメチルテトラシロキサン等の直鎖状ポリジメチルシロキサン、直鎖状ポリジエチルシロキサン、直鎖状ポリジプロピルシロキサンから選択される１種以上であることを特徴とする液体クロマトグラフィー用カラムハードウェアの製造方法である。【００３７】
又、上記液体クロマトグラフィー用カラムハードウェアの製造方法において、前記第二の膜の原料が、アルキルトリアルコキシシラン、ジアルキルジアルコキシシラン、トリアルキルモノアルコキシシランから選択される１種以上であることを特徴とする液体クロマトグラフィー用カラムハードウェアの製造方法である。【００３８】
又、上記液体クロマトグラフィー用カラムハードウェアの製造方法において、前記第一の膜の作製は、真空度−０．０９９ＭＰａ以上の真空中で、ＳｉＯ２の第一の膜の原料を希釈したガスを拡散させて前記移動相接液部に接触させ、酸素及び／又はオゾンを導入して前記移動相接液部に接触させ、３００℃以上の加熱を９０分間以上行うことを特徴とする液体クロマトグラフィー用カラムハードウェアの製造方法である。【００３９】
又、上記液体クロマトグラフィー用カラムハードウェアの製造方法において、前記第二の膜の作製は、真空度−０．０９９ＭＰａ以上の真空中で、原料を希釈したガスを拡散させて第一の膜の表面に接触させ、３００℃以上の加熱を１時間以上行うことを特徴とする液体クロマトグラフィー用カラムハードウェアの製造方法である。【００４０】
又、上記液体クロマトグラフィー用カラムハードウェアの製造方法で製造した液体クロマトグラフィー用カラムハードウェアに充填剤を充填することを特徴とする液体クロマトグラフィー用分離カラムの製造方法である。
【発明の効果】
【００４１】
以上のような本発明によれば、カラムハードウェアの金属製の移動相接液部にＳｉＯ２の膜を作製し、続いてＳｉＯ２の膜上に、ＳｉＯ２表面のシラノール基がアルキルシリル化された第二の膜を設けることにより、ＨＰＬＣ又はＵＨＰＬＣでの分析において、カラムの高耐圧性を維持しながら、試料中の溶質の非特異的な金属配位吸着を防ぐと共に、塩基性の溶質の非特異的な吸着及び疎水性の強い溶質の非特異的な疎水性吸着を防ぐことが可能となった。又、溶質のピーク形状を良好とすることが可能となった。又、分離カラムに、低濃度の溶質を、高速で且つ正確に定性及び／又は定量が出来る性能を付与することが可能となった。又、クロマトグラフィー用充填剤が詰められたカラムハードウェアにおいて、試料中の溶質の溶出を妨げずに使用することが可能となった。
【図面の簡単な説明】
【００４２】
【図１】（Ａ）コーン（分散スペース）を含むカラムハードウェア入口側構造の概略図（Ｂ）分散盤を含むカラムハードウェア入口側構造の概略図
【図２】（Ａ）コーン（分散スペース）を含むカラムハードウェア入口側構造の移動相接液部を示す概略図（Ｂ）分散盤を含むカラムハードウェア入口側構造の移動相接液部を示す概略図
【図３】本発明のカラムハードウェアの移動相接液部に作製された膜の概念図
【図４】（Ａ）本発明のカラムハードウェアを用いた分析結果のクロマトグラム（Ｂ）比較例のカラムハードウェアを用いた分析結果のクロマトグラム（Ｃ）比較例のカラムハードウェアを用いた分析結果のクロマトグラム
【図５】本発明のカラムハードウェアを用いた分析結果のクロマトグラム
【図６】（Ａ）本発明のカラムハードウェアを用いた分析結果のクロマトグラム（Ｂ）比較例のカラムハードウェアを用いた分析結果のクロマトグラム
【図７】本発明の、第二の膜の作製時間を２時間としたカラムハードウェアを用いた分析結果から得られたピーク面積値の、比較例との相対値を示したグラフ
【図８】本発明のカラムハードウェアを用いた分析結果のクロマトグラム
【図９】（Ａ）本発明のカラムハードウェアを用いた分析結果のクロマトグラム（Ｂ）比較例のカラムハードウェアを用いた分析結果のクロマトグラム
【図１０】（Ａ）本発明のカラムハードウェアを用いた分析結果のクロマトグラム（Ｂ）比較例のカラムハードウェアを用いた分析結果のクロマトグラム（Ｃ）比較例のカラムハードウェアを用いた分析結果のクロマトグラム
【図１１】（Ａ）本発明のカラムハードウェアを用いた分析結果のクロマトグラム（Ｂ）比較例のカラムハードウェアを用いた分析結果のクロマトグラム（Ｃ）比較例のカラムハードウェアを用いた分析結果のクロマトグラム
【図１２】本発明のカラムハードウェアを用いた分析結果のクロマトグラム
【図１３】（Ａ）本発明のカラムハードウェアを用いた分析結果のクロマトグラム（Ｂ）比較例のカラムハードウェアを用いた分析結果のクロマトグラム
【図１４】（Ａ）本発明のカラムハードウェアを用いた分析結果のクロマトグラム（Ｂ）本発明のカラムハードウェアを用いた分析結果のクロマトグラム
【図１５】本発明のカラムハードウェアを用いた分析結果のクロマトグラム
【発明を実施するための形態】
【００４３】
以下、本発明の実施の形態を詳細に説明する。本発明は、液体クロマトグラフィー用カラムハードウェアの、試料を含む移動相と接液する部分である金属製の移動相接液部にＳｉＯ２の第一の膜が設けられ、第一の膜上にＳｉＯ２表面のシラノール基がアルキルシリル化された第二の膜が設けられた液体クロマトグラフィー用カラムハードウェアである。又、前記液体クロマトグラフィー用カラムハードウェアに充填剤が充填されている液体クロマトグラフィー用分離カラムである。又、液体クロマトグラフィー用カラムハードウェアの金属製の移動相接液部に、原料の酸化及び加熱により、ＳｉＯ２の第一の膜を作製し、第一の膜上に、ＳｉＯ２表面のシラノール基を、原料の加熱により、アルキルシリル化して、第二の膜を作製する液体クロマトグラフィー用カラムハードウェアの製造方法である。又、前記液体クロマトグラフィー用カラムハードウェアに充填剤が充填されて作製される液体クロマトグラフィー用分離カラムの製造方法である。
【００４４】
「カラムハードウェア」は、分離カラムの充填層以外の構成部分であり、試料を含む移動相が接液又は接触し、通り抜ける流路を持つ部品である、カラム管、フリット（フィルター）、エンドユニオン、分散盤、フィルターアセンブリ、フィルターインサートアセンブリ等の部品の内の一部又は全部を備えて構成された、分離カラムの構成部分をいう。カラムハードウェアを構成する部品が全て金属製であってもよいが、一部の部品が金属製で他の一部の部品が合成樹脂製等であって金属製でない構成のものを含む。
【００４５】
「移動相接液部」とは、液体クロマトグラフィー用カラムハードウェアにおいて、液体クロマトグラフィーによる分析時に、試料を含む移動相（溶離液）が接液する部分をいう。具体的には、移動相接液部には、カラム管、フリット（フィルター）、エンドユニオン、分散盤、フィルターアセンブリ及びフィルターインサートアセンブリの内表面、フリット（フィルター）及び分散盤の外表面が含まれる。
【００４６】
「金属製の移動相接液部」とは、金属製の部品における移動相接液部である。カラムハードウェアは、金属製の移動相接液部に第一の膜及び第二の膜が積層された構成であるが、金属製でない部品の移動相接液部には、第一の膜及び第二の膜が積層された構成でもよいが、積層されていない構成でもよい。
【００４７】
図１に、第一の膜及び第二の膜を作製していない状態の、カラムハードウェア１の一端部の概略図を示す。カラムハードウェア１は、図示はしないが、更にカラム管２１の他端部に同様な構成を備えて構成されている。図１（Ａ）は、カラム管２１、フリット（フィルター）２２、エンドユニオン２３を備え、エンドユニオン内流路２３０にコーン（分散スペース）２３１を備えたカラムハードウェア１１の入口側部分の構造の概略図であり、カラムハードウェア１１の出口側の構造にも同じ部品が使用されてカラムハードウェア１１が構成されている。図１（Ｂ）は、カラム管２１、フリット（フィルター）２２、エンドユニオン２３、分散盤２４を備えたカラムハードウェア１２の入口側部分の構造の概略図であり、カラムハードウェア１２の出口側の構造にも同じ部品が使用されてカラムハードウェア１２が構成されている。
【００４８】
図２（Ａ）は、図１（Ａ）に示した、コーン（分散スペース）２３１を備えたカラムハードウェア１１の入口側構造部分の、移動相接液部３を示す概略図であり、図２（Ｂ）は、図１（Ｂ）に示した、分散盤２４を含むカラムハードウェア１２の入口側構造部分の、移動相接液部３を示す概略図である。尚、図示はしないが、夫々出口側の構造部分にも同等の移動相接液部が構成されている。
【００４９】
図３に、カラムハードウェア１の金属製の移動相接液部３に作製された膜４の概念図を示す。移動相接液部３に第一の膜４１を備え、第一の膜４１上に、第二の膜４２を備えている。詳しくは、移動相接液部３には、移動相接液部３を被覆するＳｉＯ２の第一の膜４１が設けられ、更に、第一の膜４１上には、第一の膜４１を被覆する、詳しくは、第一の膜４１の移動相接液部３とは反対側の表面４１１を被覆する、ＳｉＯ２表面のシラノール基がアルキルシリル化されて構成された第二の膜４２が設けられている。このようにして、カラムハードウェア１は、カラムハードウェア１の移動相接液部３に第一の膜４１が積層され、第一の膜４１の表面４１１に第二の膜４２が積層された３層構造で構成されている。
【００５０】
ＳｉＯ２の第一の膜４１及びＳｉＯ２膜は、ＳｉＯ２が１００質量％で構成されている場合もあるが、ＳｉＯ２と不可避的不純物や他の成分を含んで構成される場合もある。第一の膜４１及びＳｉＯ２膜は後述するように、ＳｉＯ２を作製するための原料を移動相接液部３に接触させて処理することにより作製されるため、反応条件等によっては、ＳｉＯ２以外の組成も含まれる場合があるためである。従って、第一の膜はＳｉＯ２を含む第一の膜ともいえる。
【００５１】
第一の膜４１はＳｉＯ２以外の成分が含まれていても、移動相接液部３を被覆可能であれば、金属製の移動相接液部３に試料が接触することを防止することが出来る。
【００５２】
又、第二の膜４２も、第一の膜４１を被覆するＳｉＯ２表面のシラノール基をアルキルシリル化して作製されるため、反応条件等によっては、シラノール基が残存した構成となることもある。
【００５３】
金属以外の部品で構成された部分の移動相接液部には、第一の膜４１、更には第二の膜４２を構成してもよいが、しなくてもよい。
【００５４】
第一の膜４１は１種の原料から構成された第一の層の一層で構成してもよいが、２種以上の原料から構成された第一の層の一層で構成してもよい。又、１種以上の原料から構成された第一の層の表面に、第一の層を構成する原料とは異なる１種以上の原料から構成された第二の層を一層以上積層して、複数層により第一の膜４１を構成することとしてもよい。このように複数層を積層して第一の膜を構成する場合、第一の膜４１の表面４１１となる最上層は、ジメチルジエトキシシランを原料として作製された膜であることが好ましい。このような構成とすることで、ジメチルジエトキシシラン由来のメチル基の一部が第一の膜の表面に残ることにより、第一の膜の表面のＳｉＯ２表面のシラノール基の量が少なくなるからである。
【００５５】
第一の膜４１を作製するための原料は、酸化及び加熱により、移動相接液部３にＳｉＯ２を含む膜を作製出来るものであれば特に限定はされないが、無機ポリシラザン、テトラアルコキシシラン、メチルトリアルコキシシラン、ジメチルジアルコキシシラン、トリメチルモノアルコキシシラン、エチルトリアルコキシシラン、ジエチルジアルコキシシラン、トリエチルモノアルコキシシラン、プロピルトリアルコキシシラン、ジプロピルジアルコキシシラン、トリプロピルモノアルコキシシラン、ヘキサメチルシクロトリシロキサンやオクタメチルシクロテトラシロキサン等のジメチル型環状シロキサン、ジエチル型環状シロキサン、ジプロピル型環状シロキサン、ヘキサメチルジシロキサン、オクタメチルトリシロキサンやデカメチルテトラシロキサン等の直鎖状ポリジメチルシロキサン、直鎖状ポリジエチルシロキサン、直鎖状ポリジプロピルシロキサンから選択される１種以上を用いることが出来る。これらの原料は入手し易く、一般的によく使用されているので、これらの使用が好ましい。
【００５６】
無機ポリシラザンとしては特に限定はされないが、パーヒドロポリシラザンを用いることが出来る。
【００５７】
テトラアルコキシシランとしては特に限定はされないが、テトラメトキシシラン、テトラエトキシシラン、テトラプロポキシシランを用いることが出来る。エトキシ基の方がプロポキシ基よりも脱アルコール縮合の反応性が高く、メトキシ基の方がエトキシ基よりも脱アルコール縮合の反応性が高く、脱アルコール縮合の反応性が高いほど、より容易に第一の膜４１を作製することが出来、作製条件が同一であればより厚みを厚くすることが出来るので、テトラプロポキシシランよりテトラエトキシシランが好ましく、テトラエトキシシランよりテトラメトキシシランが好ましい。一方で脱アルコール縮合の副産物であるアルコールの毒性を考慮すると、エタノールが副産物であるテトラエトキシシランが好ましい。
【００５８】
メチルトリアルコキシシランとしては特に限定はされないが、メチルトリメトキシシラン、メチルトリエトキシシラン、メチルトリプロポキシシランを用いることが出来る。エトキシ基の方がプロポキシ基よりも脱アルコール縮合の反応性が高く、メトキシ基の方がエトキシ基よりも脱アルコール縮合の反応性が高く、脱アルコール縮合の反応性が高いほど、より容易に第一の膜４１を作製することが出来、作製条件が同一であればより厚みを厚くすることが出来るので、メチルトリプロポキシシランよりメチルトリエトキシシランが好ましく、メチルトリエトキシシランよりメチルトリメトキシシランが好ましい。一方で脱アルコール縮合の副産物であるアルコールの毒性を考慮すると、エタノールが副産物であるメチルトリエトキシシランが好ましい。
【００５９】
ジメチルジアルコキシシランとしては特に限定はされないが、ジメチルジメトキシシラン、ジメチルジエトキシシラン、ジメチルジプロポキシシランを用いることが出来る。エトキシ基の方がプロポキシ基よりも脱アルコール縮合の反応性が高く、メトキシ基の方がエトキシ基よりも脱アルコール縮合の反応性が高く、脱アルコール縮合の反応性が高いほど、より容易に第一の膜４１を作製することが出来、作製条件が同一であればより厚みを厚くすることが出来るので、ジメチルジプロポキシシランよりジメチルジエトキシシランが好ましく、ジメチルジエトキシシランよりジメチルジメトキシシランが好ましい。一方で脱アルコール縮合の副産物であるアルコールの毒性を考慮すると、エタノールが副産物であるジメチルジエトキシシランが好ましい。
【００６０】
又、トリメチルモノアルコキシシランとしては特に限定はされないが、トリメチルメトキシシラン、トリメチルエトキシシラン、トリメチルプロポキシシランを用いることが出来る。エトキシ基の方がプロポキシ基よりも脱アルコール縮合の反応性が高く、メトキシ基の方がエトキシ基よりも脱アルコール縮合の反応性が高く、脱アルコール縮合の反応性が高いほど、より容易に第一の膜４１を作製することが出来、作製条件が同一であればより厚みを厚くすることが出来るので、トリメチルプロポキシシランよりトリメチルエトキシシランが好ましく、トリメチルエトキシシランよりトリメチルメトキシシランが好ましい。一方で脱アルコール縮合の副産物であるアルコールの毒性を考慮すると、エタノールが副産物であるトリメチルエトキシシランが好ましい。
【００６１】
テトラアルコキシシラン、メチルトリアルコキシシラン、ジメチルジアルコキシシランについては、複数のアルコキシ基を持つため、複数の分子同士の脱アルコール縮合により、ＳｉＯ２を主成分とする膜が作製しやすい。よってこの観点からは、テトラアルコキシシラン、メチルトリアルコキシシラン、ジメチルジアルコキシシランの順でＳｉＯ２を主成分とする膜が作製しやすい。一方で上述のように、原料由来のメチル基の一部が第一の膜の表面に残った方が、第一の膜の表面のＳｉＯ２表面のシラノール基の量が少なくなるため、この観点を合わせると、複数の分子同士の脱アルコール縮合のために分子内に複数のアルコキシ基を持ち、且つ分子内にメチル基を持つメチルトリアルコキシシラン、ジメチルジアルコキシシランが好ましい。
【００６２】
パーヒドロポリシラザン、メチルトリエトキシシラン及びジメチルジエトキシシランでは、後述する実施例１〜実施例３の結果から、ジメチルジエトキシシランが好ましい。
【００６３】
第二の膜４２を作製するための原料は、第一の膜４１のＳｉＯ２表面のシラノール基と原料の、加熱による縮合反応により、アルキルシリル化出来るものであれば特に限定はされない。ヘキサアルキルジシロキサン、ジアルキルポリシロキサン所謂直鎖状ポリジアルキルシロキサン、ジアルキル型環状シロキサン、アルキルトリハロシラン、ジアルキルジハロシラン、トリアルキルモノハロシラン、ヘキサメチルジシラザン、Ｎ−トリメチルシリルイミダゾール、アルキルトリアルコキシシラン、ジアルキルジアルコキシシラン、トリアルキルモノアルコキシシランから選択される１種以上を用いることが出来るが、原料をカラムハードウェアの第一の膜のＳｉＯ２表面のシラノール基と縮合させ、緻密なアルキルシリル化を行うための条件の最適化には、不活性ガスで希釈した原料を拡散させて行い、原料の濃度や加熱時間を調整する方が最適化しやすく、又、縮合の副産物がハロゲン化水素、アンモニア、イミダゾールのような、酸や塩基等の危険性の高いものではない方が良いため、アルキルトリアルコキシシラン、ジアルキルジアルコキシシラン、トリアルキルモノアルコキシシランから選択される１種以上を用いることが好ましい。
【００６４】
アルキルトリアルコキシシラン、ジアルキルジアルコキシシラン、トリアルキルモノアルコキシとしては特に限定はされないが、原料となる分子中のアルキル基が短い方が、第一の膜４１のＳｉＯ２表面のシラノール基を立体障害が少なくアルキルシリル化出来、アルキルシリル化の被覆率が高まるため、メチルトリアルコキシシラン、ジメチルジアルコキシシラン、トリメチルモノアルコキシシランが最も好ましく、次にエチルトリアルコキシシラン、ジエチルジアルコキシシラン、トリエチルモノアルコキシシランが好ましい。
【００６５】
メチルトリアルコキシシランとしては特に限定はされないが、メチルトリメトキシシラン、メチルトリエトキシシラン、メチルトリプロポキシシランを用いることが出来る。エトキシ基の方がプロポキシ基よりも第一の膜のＳｉＯ２表面のシラノール基との脱アルコール縮合の反応性が高く、メトキシ基の方がエトキシ基よりも第一の膜のＳｉＯ２表面のシラノール基との脱アルコール縮合の反応性が高く、脱アルコール縮合の反応性が高いほど、より容易に第二の膜４２を作製することが出来、第一の膜の被覆率を増加させることが出来、これらの中ではメチルトリプロポキシシランが脱アルコール縮合の反応にエネルギーが一番必要であるので、メチルトリプロポキシシランよりメチルトリエトキシシランが好ましく、メチルトリエトキシシランよりメチルトリメトキシシランが好ましい。一方で脱アルコール縮合の副産物であるアルコールの毒性を考慮すると、エタノールが副産物であるメチルトリエトキシシランが好ましい。
【００６６】
エチルトリアルコキシシランとしては特に限定はされないが、エチルトリメトキシシラン、エチルトリエトキシシラン、エチルトリプロポキシシランを用いることが出来る。エトキシ基の方がプロポキシ基よりも第一の膜のＳｉＯ２表面のシラノール基との脱アルコール縮合の反応性が高く、メトキシ基の方がエトキシ基よりも第一の膜のＳｉＯ２表面のシラノール基との脱アルコール縮合の反応性が高く、脱アルコール縮合の反応性が高いほど、より容易に第二の膜４２を作製することが出来、第一の膜の被覆率を増加させることが出来、これらの中ではエチルトリプロポキシシランが反応にエネルギーが一番必要であるので、エチルトリプロポキシシランよりエチルトリエトキシシランが好ましく、エチルトリエトキシシランよりエチルトリメトキシシランが好ましい。一方で脱アルコール縮合の副産物であるアルコールの毒性を考慮すると、エタノールが副産物であるエチルトリエトキシシランが好ましい。
【００６７】
ジメチルジアルコキシシランとしては特に限定はされないが、ジメチルジメトキシシラン、ジメチルジエトキシシラン、ジメチルジプロポキシシランを用いることが出来る。エトキシ基の方がプロポキシ基よりも第一の膜のＳｉＯ２表面のシラノール基との脱アルコール縮合の反応性が高く、メトキシ基の方がエトキシ基よりも第一の膜のＳｉＯ２表面のシラノール基との脱アルコール縮合の反応性が高く、脱アルコール縮合の反応性が高いほど、より容易に第二の膜４２を作製することが出来、第一の膜の被覆率を増加させることが出来るので、ジメチルジプロポキシシランよりジメチルジエトキシシランが好ましく、ジメチルジエトキシシランよりジメチルジメトキシシランが好ましい。一方で脱アルコール縮合の副産物であるアルコールの毒性を考慮すると、エタノールが副産物であるジメチルジエトキシシランが好ましい。
【００６８】
ジエチルジアルコキシシランとしては特に限定はされないが、ジエチルジメトキシシラン、ジエチルジエトキシシラン、ジエチルジプロポキシシランを用いることが出来る。エトキシ基の方がプロポキシ基よりも第一の膜のＳｉＯ２表面のシラノール基との脱アルコール縮合の反応性が高く、メトキシ基の方がエトキシ基よりも第一の膜のＳｉＯ２表面のシラノール基との脱アルコール縮合の反応性が高く、脱アルコール縮合の反応性が高いほど、より容易に第二の膜４２を作製することが出来、第一の膜の被覆率を増加させることが出来るので、ジエチルジプロポキシシランよりジエチルジエトキシシランが好ましく、ジエチルジエトキシシランよりジエチルジメトキシシランが好ましい。一方で脱アルコール縮合の副産物であるアルコールの毒性を考慮すると、エタノールが副産物であるジエチルジエトキシシランが好ましい。
【００６９】
トリメチルモノアルコキシシランとしては特に限定はされないが、トリメチルメトキシシラン、トリメチルエトキシシラン、トリメチルプロポキシシランを用いることが出来る。エトキシ基の方がプロポキシ基よりも第一の膜のＳｉＯ２表面のシラノール基との脱アルコール縮合の反応性が高く、メトキシ基の方がエトキシ基よりも第一の膜のＳｉＯ２表面のシラノール基との脱アルコール縮合の反応性が高く、脱アルコール縮合の反応性が高いほど、より容易に第二の膜４２を作製することが出来、第一の膜の被覆率を増加させることが出来るので、トリメチルプロポキシシランよりトリメチルエトキシシランが好ましく、トリメチルエトキシシランよりトリメチルメトキシシランが好ましい。一方で脱アルコール縮合の副産物であるアルコールの毒性を考慮すると、エタノールが副産物であるトリメチルエトキシシランが好ましい。
【００７０】
トリエチルモノアルコキシシランとしては特に限定はされないが、トリエチルメトキシシラン、トリエチルエトキシシラン、トリエチルプロポキシシランを用いることが出来る。エトキシ基の方がプロポキシ基よりも第一の膜のＳｉＯ２表面のシラノール基との脱アルコール縮合の反応性が高く、メトキシ基の方がエトキシ基よりも第一の膜のＳｉＯ２表面のシラノール基との脱アルコール縮合の反応性が高く、脱アルコール縮合の反応性が高いほど、より容易に第二の膜４２を作製することが出来、第一の膜の被覆率を増加させることが出来るので、トリエチルプロポキシシランよりトリエチルエトキシシランが好ましく、トリエチルエトキシシランよりトリエチルメトキシシランが好ましい。一方で脱アルコール縮合の副産物であるアルコールの毒性を考慮すると、エタノールが副産物であるトリエチルエトキシシランが好ましい。
【００７１】
ジメチルジエトキシシラン及びトリメチルエトキシシランでは、後述する実施例３と実施例９の結果から、ジメチルジエトキシシランが好ましい。
【００７２】
次に、第一の膜の作製について説明する。第一の膜の作製にあたり、原料をカラムハードウェアの移動相接液部に接触させるためには、溶媒で希釈した原料を塗布してもよいし、不活性ガスで希釈した原料を拡散させてもよい。尚、カラムハードウェアの移動相接液部に第一の膜を作製する際に、その作製方法によっては、移動相接液部のみではなく、移動相接液部を含むカラムハードウェアの表面、例えばカラム管の外表面等に膜が作製されることもある。
【００７３】
第一の膜の作製は、原料が無機ポリシラザン、テトラアルコキシシランのように、Ｓｉ原子に直接共有結合したアルキル基（メチル基等）が無い場合には、空気中、不活性雰囲気下又は真空中で原料を塗布して又は拡散させてカラムハードウェアの移動相接液部に接触させ、空気中での加熱のみにより、空気中の酸素による酸化と縮合をして行ってもよい。又、空気中での加熱のみの工程による酸化と縮合に替えて、空気中、不活性雰囲気下又は真空中で、酸素及び／又はオゾンの供給と加熱による酸化と縮合を行ってもよい。尚、空気中での加熱をする場合、縮合反応による第一の膜の作製を促進出来るので、空気中で２５０℃以上の加熱を３時間以上行うことが好ましい。
【００７４】
又、第一の膜の作製は、原料がメチルトリアルコキシシラン、ジメチルジアルコキシシラン、トリメチルモノアルコキシシランのように、Ｓｉ原子に直接共有結合したメチル基がある場合には、空気中、不活性雰囲気下又は真空中で原料を塗布して又は拡散させてカラムハードウェアの移動相接液部に接触させ、空気中、不活性雰囲気下又は真空中で、酸素及び／又はオゾンの供給と加熱による酸化と縮合により行うことが出来る。
【００７５】
更に、第一の膜の作製は、原料がエチルトリアルコキシシラン、ジエチルジアルコキシシラン、トリエチルモノアルコキシシランのように、Ｓｉ原子に直接共有結合したエチル基がある場合には、空気中、不活性雰囲気下又は真空中で原料を塗布して又は拡散させてカラムハードウェアの移動相接液部に接触させ、空気中、不活性雰囲気下又は真空中で、酸素及び／又はオゾンの供給と加熱による酸化と縮合により行うことが出来る。
【００７６】
又、第一の膜の作製は、原料がプロピルトリアルコキシシラン、ジプロピルジアルコキシシラン、トリプロピルモノアルコキシシランのように、Ｓｉ原子に直接共有結合したプロピル基がある場合には、空気中、不活性雰囲気下又は真空中で原料を塗布して又は拡散させてカラムハードウェアの移動相接液部に接触させ、空気中、不活性雰囲気下又は真空中で、酸素及び／又はオゾンの供給と加熱による酸化と縮合により行うことが出来る。
【００７７】
第一の膜の作製は、真空度−０．０９９ＭＰａ以上の真空中で原料を拡散させてカラムハードウェアの移動相接液部表面に接触させ、真空度−０．０９９ＭＰａ以上の真空中で酸素及び／又はオゾンによる酸化と３００℃以上の加熱を９０分間以上行うことが好ましい。このような方法とすることで、絶対真空を含まない条件下であれば第一の膜の作製が出来、酸素及び／又はオゾンによる酸化と３００℃以上の加熱を行うことにより、縮合反応による第一の膜の作製を促進出来るからである。又、酸素及び／又はオゾンによる酸化と３００℃以上の加熱を９０分間以上行うことにより、金属製カラムハードウェアの移動相接液部の金属の影響を低減出来るからである。
【００７８】
更に、内径が小さく、長さが大きいカラムハードウェアへの第一の膜の作製は、原料がメチルトリアルコキシシラン、ジメチルジアルコキシシラン、トリメチルモノアルコキシシランのように、Ｓｉ原子に直接共有結合したメチル基がある場合には、真空度−０．０９９ＭＰａ以上の真空中で、原料を拡散させてカラムハードウェアの移動相接液部表面に接触させ、酸素及び／又はオゾンによる酸化と３００℃以上の加熱を４時間以上行うことにより行うことが出来る。
【００７９】
第一の膜の作製において、１種の原料で第一の膜を作製することが出来るが、２種以上の原料で一層の第一の膜を作製することが出来る。更に、１種以上の原料で作製された第一の層に、第一の層の原料とは異なる種の１種以上の原料で作製された第二の層を一層以上積層して第一の膜を作製することが出来る。このように複数層を積層して第一の膜を作製する場合、第一の膜の表面となる最上層は、ジメチルジエトキシシランを原料として作製することが好ましい。このような構成とすることで、ジメチルジエトキシシラン由来のメチル基の一部が第一の膜の表面に残った方が、第一の膜の表面のＳｉＯ２表面のシラノール基の量が少なくなるからである。
【００８０】
又、第一の膜の作製にあたり、液体クロマトグラフィー用カラムハードウェアに含まれるカラム管への、不活性ガスで希釈した原料の拡散については、カラム管が円筒管であるため、カラム管の内径が小さいほど、又、カラム管の長さが大きいほど、原料の拡散がし難くなり、第一の膜の作製のための空気中での加熱、又は空気中又は真空中での酸化と加熱のための時間を長くする必要がある。例えば、内径１．０ｍｍ、長さ１０ｍのカラム管の場合、内径２．１ｍｍ、長さ５ｃｍのカラム管又は内径２．１ｍｍ、長さ１５ｃｍのカラム管に９０分間の酸化と加熱で第一の膜を作製したカラム管と同等の性能を得る場合には、４時間の酸化と加熱を行えばよい。
【００８１】
又、内径２．１ｍｍのカラム管を用いたカラムハードウェアでは、厚さ１ｍｍ、孔径は１．９μｍ以下のフリットを使用することが出来、このように孔径が非常に小さいフリットであっても、９０分間の酸化と加熱で、所望の性能を得るための第一の膜を作製することが出来る。カラム管の内径が１．０ｍｍのカラムハードウェアでも、充填剤径が１．９μｍなら、上記内径２．１ｍｍのカラム管を用いたカラムハードウェアで使用するフリットと同じ厚さ及び孔径を備えたフリットを使用することが出来る。
【００８２】
内径２．１ｍｍのカラム管を用いたカラムハードウェアでは、内部加工可能な最も小さい内径の流路を持つエンドユニオンを使用することが出来、エンドユニオン内の流路は、９０分間の酸化と加熱で、所望の性能を得るための第一の膜を作製することが出来る。カラム管の内径が１．０ｍｍのカラムハードウェアでも、上記内径２．１ｍｍのカラム管を用いたカラムハードウェアで使用するエンドユニオン内流路と同じ内径及び長さの流路を備えたエンドユニオンを使用することが出来る。
【００８３】
つまり、内径１．０ｍｍ、長さ１０ｍのカラム管の移動相接液部に、４時間の酸化と加熱を行うことにより、内径２．１ｍｍ、長さ５ｃｍのカラム管及び内径２．１ｍｍ、長さ１５ｃｍのカラム管の移動相接液部に、９０分の酸化と加熱を行った場合と同等の性能を得るための第一の膜を作製出来る。
【００８４】
次に、第二の膜４２の作製について説明する。第二の膜４２の作製は、ＳｉＯ２を含む第一の膜４１表面部分のＳｉＯ２表面のシラノール基をメチルシリル化及びエチルシリル化を含むアルキルシリル化することにより行うことが出来る。又、第二の膜の作製のために、第一の膜４１の表面４１１上に、第一の膜とは別にＳｉＯ２の膜を作製することとしてもよい。例えば、第一の膜４１の表面４１１上に、第一の膜とは別にＳｉＯ２を含む膜を、溶媒に溶かした原料の塗布及び加熱や原料の物理蒸着等により作製し、作製したＳｉＯ２を含む膜の表面部分のＳｉＯ２表面のシラノール基をメチルシリル化及びエチルシリル化を含むアルキルシリル化することにより行うことが出来る。又、「第一の膜上に」とは、図３に示すように、第一の膜４１の表面４１１上に直接第二の膜４２が設けられている他、第一の膜の表面と第二の膜の間に他の膜が設けられ、膜が３層以上積層されている構成も含まれる。例えば、第一の膜４１の表面４１１上に、ＳｉＯ２とは別の組成の第三の膜を作製し、その第三の膜の表面上にＳｉＯ２を含む膜を作製し、作製したＳｉＯ２を含む膜の表面部分のＳｉＯ２表面のシラノール基をメチルシリル化及びエチルシリル化を含むアルキルシリル化することにより、第一の膜上に第二の膜の作製を行うことが出来る。第二の膜の作製にあたり、原料をカラムハードウェアの第一の膜の表面４１１、第一の膜の表面４１１上に作製された第一の膜とは別のＳｉＯ２を含む膜の表面、又は、第三の膜の表面上に作製されたＳｉＯ２を含む膜の表面に接触させるためには、不活性ガスで希釈した原料を拡散させて行うことが出来、又、溶媒で希釈した原料を塗布して行うことが出来る。尚、第二の膜は移動相接液部上の第一の膜を被覆すればよいが、第一の膜の作製方法及び第二の膜の作製方法によっては、移動相接液部上のみではなく、移動相接液部を含むカラムハードウェアの表面に作製された第一の膜上に作製されることもある。
【００８５】
第二の膜の作製は、空気中、不活性雰囲気下又は真空中で原料を塗布して又は拡散させて第一の膜の表面に接触させ、不活性雰囲気下又は真空中で加熱をして行うことが出来るが、真空中で原料を拡散させて第一の膜の表面に接触させ、真空中で加熱をして行うことが好ましい。このような方法によれば、原料が第一の膜の表面に接触する確率が高まり、縮合反応による第二の膜の作製を促進出来るからである。
【００８６】
又、第二の膜の作製は、真空度−０．０９９ＭＰａ以上の真空中で原料を拡散させて第一の膜の表面に接触させ、真空度−０．０９９ＭＰａ以上の真空中で３００℃以上の加熱を１時間以上行うことが好ましい。このような方法とすることで、絶対真空を含まない条件下であれば第二の膜の作製が出来、３００℃以上の加熱により、縮合反応による第二の膜の作製を促進出来ることに加え、第一の膜の表面のシラノール基同士が脱水縮合することも促進出来るからである。又、３００℃以上の加熱を１時間以上行うことにより、試料中の溶質の非特異的な吸着を低減し、試料中の低濃度の溶質の、正確な定性及び／又は定量に適したカラムハードウェアを作製出来るからである。
【００８７】
更に、第二の膜の作製は、真空度−０．０９９ＭＰａ以上の真空中で原料を拡散させて第一の膜の表面に接触させ、真空度−０．０９９ＭＰａ以上の真空中で３００℃以上の加熱を２時間以上行うことがより好ましい。このような方法とすることで、絶対真空を含まない条件下であれば第二の膜の作製が出来、３００℃以上の加熱により、縮合反応による第二の膜の作製を促進出来ることに加え、第一の膜の表面のシラノール基同士が脱水縮合することも促進出来るからである。又、３００℃以上の加熱を２時間以上行うことにより、試料中の溶質の非特異的な吸着を防ぎ、低濃度の溶質の、正確な定性及び／又は定量により適したカラムハードウェアを作製出来るからである。
【００８８】
又、第一の膜及び第二の膜の作製において、クロマトグラムは示していないが、後述する実施例３の第一の膜と第二の膜の作製条件の内、第一の膜の作製時の加熱温度のみを３００℃から３５０℃に変えてＵＨＰＬＣ用カラムを作製し、図６（Ａ）と同じ条件でクロマトグラムを採取して評価したところ、図６（Ａ）と同等のピーク形状、ピーク高さが得られた。
【００８９】
又、第一の膜及び第二の膜の作製において、クロマトグラムは示していないが、後述する実施例３の第一の膜と第二の膜の作製条件の内、第二の膜の作製時の加熱温度のみを３００℃から３５０℃に変えてＵＨＰＬＣ用カラムを作製し、図６（Ａ）と同じ条件でクロマトグラムを採取して評価したところ、図６（Ａ）と同等のピーク形状、ピーク高さが得られた。
【００９０】
第一の膜又は第二の膜の作製に使用する真空チャンバーが複数の部品から構成される場合、真空チャンバー内の真空度を保つためにＯリング（オーリング）等のシーリング材を使用することが多い。弾性、伸縮性があることから真空チャンバー内の真空度を保ち易く、且つ耐熱温度が高い市販の汎用シーリング材の樹脂素材としてはパーフルオロエラストマー等の加硫ゴムやフッ素ゴムがあるが、これらの樹脂素材の耐熱温度は３３０℃であるため、第一の膜又は第二の膜の作製時の加熱温度が３００℃であれば、これらの樹脂素材から成るシーリング材を使用しても、シーリング材を頻繁に交換することなく、第一の膜又は第二の膜の作製を複数回数行うことが出来る。
【００９１】
第一の膜又は第二の膜の作製時の加熱温度が３５０℃を超えた場合や４００℃以上の場合、上記の樹脂素材から成る市販の汎用シーリング材を使用すると、シーリング材の熱老化が起こり易く、第一の膜又は第二の膜の作製において真空チャンバー内の真空度を保つためには、シーリング材を頻繁に交換する必要がある。又、耐熱性の高い金属素材から成るシーリング材を使用しても、金属素材は復元応力や弾力が低いため、真空チャンバー内の真空度を一度下げてしまうと、次に真空チャンバー内に第一の膜又は第二の膜を作製するためのカラムハードウェアを入れて真空度を上げるためには、上記の金属素材から成るシーリング材を新品に交換する必要がある。
【００９２】
又、第一の膜の作製において、後述する実施例３の第一の膜と第二の膜の作製条件の内、第一の膜の作製時の加熱温度のみを３００℃から４００℃に変えてＵＨＰＬＣ用カラムを作製したところ、カラムハードウェアの外表面に第一の膜が作製される前に、カラムハードウェアの外表面が変色することにより、カラムハードウェアの外表面の見た目が汚くなり、外観を良くするためには研磨をする必要が生じた。
【００９３】
以上のことから、第一の膜又は第二の膜の作製時の加熱温度は夫々３００℃以上が好ましい。又、第一の膜の作製時の加熱温度は、３００℃を大きく超える加熱温度により得られる効果と、カラムハードウェアの外表面の見栄え又は見栄えを良くするためのコスト、時間、手数を考慮すると、３００℃以上４００℃未満が好ましい。
【００９４】
又、第一の膜又は第二の膜の作製時の加熱温度は夫々、３００℃を大きく超える加熱温度により得られる効果と、シーリング材の交換にかかるコスト、時間、手数、又はエネルギー効率等を考慮すると、高くても樹脂素材から成る市販の汎用シーリング材の交換頻度があまり頻繁ではなく許容範囲の３５０℃以下、更には樹脂素材から成る市販の汎用シーリング材の耐熱温度である３３０℃以下が好ましく、３００℃〜３２０℃がより好ましい。
【００９５】
次に、第二の膜の主な相互作用特性と、カラムハードウェアに詰められる液体クロマトグラフィー用充填剤の主な相互作用特性について説明する。液体クロマトグラフィー用充填剤の内、代表的なものは逆相クロマトグラフィー用充填剤であり、逆相クロマトグラフィー用充填剤には、オクタデシルシリル化シリカゲル（ＯＤＳ化シリカゲル）がよく使用されている。ＯＤＳ化シリカゲルの主な相互作用特性はオクタデシル基による疎水性相互作用特性であり、試料中の溶質の疎水性が高いものほどカラムから遅く溶出する。第二の膜の主な相互作用特性はアルキル基による疎水性相互作用特性であり、第二の膜のアルキル基はオクタデシル基であるか、もしくはオクタデシル基よりも短いアルキル基でないと、第二の膜の主な相互作用特性が充填剤（ＯＤＳ化シリカゲル）の主な相互作用特性を上回ってしまい、充填剤（ＯＤＳ化シリカゲル）に最適化された移動相では、試料中の一部の溶質が溶出しない可能性がある。又、第二の膜のアルキル基が短い方が充填剤のオクタデシル基による、カラムの疎水性の強さを変えてしまう影響が少ない。これらの観点からは、第二の膜のアルキル基はメチル基が最も好ましく、次にエチル基が好ましい。
【００９６】
又、逆相クロマトグラフィー用充填剤には、ＯＤＳ化シリカゲルの他に、メチルシリル化シリカゲル、ブチルシリル化シリカゲル、シアノプロピルシリル化シリカゲル、フェニルシリル化シリカゲル、オクチルシリル化シリカゲル、ドコシルシリル化シリカゲル、オクタコシルシリル化シリカゲル、トリアコンチルシリル化シリカゲル等の、シリカゲルを母体とする充填剤が使用されている。これらの充填剤が詰められたカラムハードウェアについても、充填剤の官能基による疎水性相互作用特性を上回ることなく、又、カラムの疎水性の強さを変えてしまう影響が少ないため、第二の膜のアルキル基はメチル基が適しており、メチルシリル化シリカゲル以外の充填剤が詰められたカラムハードウェアについては、第二の膜のアルキル基はメチル基が最も好ましく、次にエチル基が好ましい。
【００９７】
又、逆相クロマトグラフィー用充填剤には、スチレンジビニルベンゼン共重合体、ポリメタクリレート、ブチル基が修飾されたポリビニルアルコール、オクチル基が修飾されたポリビニルアルコール、オクタデシル基が修飾されたポリビニルアルコール等の、ポリマーを母体とする充填剤が使用されている。これらの充填剤が詰められたカラムハードウェアについても、充填剤による、カラムの疎水性の強さを変えてしまう影響が少ないため、第二の膜のアルキル基はメチル基が最も好ましく、次にエチル基が好ましい。
【００９８】
又、液体クロマトグラフィー用充填剤には、親水性相互作用クロマトグラフィー（Ｈｙｄｒｏｐｈｉｌｉｃ  Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ、ＨＩＬＩＣ）用充填剤や順相クロマトグラフィー用充填剤があり、共通して親水性の高い充填剤（未修飾シリカゲル、ジヒドロキシプロピルシリル化シリカゲル、アミノプロピルシリル化シリカゲル等）が使用されている。又、ＨＩＬＩＣ用充填剤として、親水性の高い充填剤である、アミド基やカルバモイル基が修飾されたシリカゲル等が使用されている。親水性の高い充填剤の主な相互作用特性は親水性相互作用特性であり、試料中の溶質のうち、親水性の高いものほどカラムから遅く溶出する。第二の膜には親水性相互作用を及ぼす官能基（シラノール等）は極微量しか残っておらず、アルキル基は親水性相互作用特性を持たないため、第二の膜のアルキル基の長さに関わらず、親水性の高い充填剤の主な相互作用特性への影響は少ないが、第二の膜のアルキル基が長いと、カラムに強い疎水性相互作用特性を加えることになるため、この観点からは、第二の膜のアルキル基はメチル基が最も好ましく、次にエチル基が好ましい。
【００９９】
又、液体クロマトグラフィー用充填剤には、サイズ排除クロマトグラフィー（Ｓｉｚｅ
Ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ、ＳＥＣ）用充填剤、イオン交換ク
ロマトグラフィー用充填剤、配位子交換クロマトグラフィー用充填剤、イオン排除クロマトグラフィー用充填剤等があり、いずれの充填剤でも第二の膜のアルキル基の長さに関わらず、充填剤の主な相互作用特性への影響は少ないが、第二の膜のアルキル基が長いと、カラムに強い疎水性相互作用特性を加えることになるため、この観点からは、第二の膜のアルキル基はメチル基が最も好ましく、次にエチル基が好ましい。
【０１００】
上記液体クロマトグラフィー用カラムハードウェアに充填剤が充填されて液体クロマトグラフィー用分離カラムが構成される。又、上記液体クロマトグラフィー用カラムハードウェアの製造方法で製造した液体クロマトグラフィー用カラムハードウェアに充填剤を充填することで液体クロマトグラフィー用分離カラムの製造を行うことが出来る。充填剤としては特に限定されず、液体クロマトグラフィーに用いられる充填剤から適宜選択することが出来る。又、充填剤の充填方法も特に限定されず、公知の充填方法を採用することが出来る。
【実施例】
【０１０１】
以下、本発明のカラムハードウェア及び分離カラム並びにカラムハードウェア及び分離カラムの製造方法について、実施例として比較例と比較して説明する。
【実施例１】
【０１０２】
汎用のＵＨＰＬＣ用カラムの、ステンレス製のカラムハードウェアの移動相接液部にパーヒドロポリシラザンを原料とする第一の膜を作製し、続いて第二の膜の作製、即ち第一の膜表面のメチルシリル化を行った。【０１０３】
詳しくは、ステンレス製のカラムハードウェアの移動相接液部にパーヒドロポリシラザンを原料とする第一の膜を作製したカラムハードウェアを、カラム２本分作製した。パーヒドロポリシラザンのイソプロピルアルコール溶液（１．０％、ｗ／ｖ）を１０００ｍＬトールビーカーで作製し、ステンレス製のカラムハードウェア（内径２．１ｍｍ、長さ５ｃｍのカラム管２個、フリット４個、エンドユニオン４個）を沈めた。超音波処理を３分間行い、カラムハードウェアを取り出し、産業用紙ワイパーを敷いた実験台上で１２時間、室温で乾燥させた。乾燥させたカラムハードウェアを２５０℃で安定化させたオーブン内に移し、２５０℃で３時間熱処理を行った。【０１０４】
ステンレス製のカラムハードウェアの移動相接液部にパーヒドロポリシラザンを原料とする第一の膜の作製を終えたカラムハードウェアの、化学蒸着を利用した第二の膜の作製、即ち第一の膜表面のメチルシリル化を行った。第一の膜の作製を終えたカラム１本分のカラムハードウェアを真空チャンバー内に入れ、真空チャンバーの扉を閉め、真空チャンバーを加熱し、３００℃で安定させた。又、真空チャンバーの真空度を−０．０９９ＭＰａで安定させた。続いて、ジメチルジエトキシシラン（ＤＭＤＥＳ）を窒素で０．０５％に希釈したガスを２００ｓｃｃｍ（ｓｃｃｍ：ｓｔａｎｄａｒｄ  ｃｃ／ｍｉｎ、１ａｔｍ、２５℃での、１分間当たりのガス流量を示す）で真空チャンバー内に導入し、２時間反応させた。【０１０５】
第一の膜の作製及び第一の膜表面のメチルシリル化（第二の膜の作製）を終えたカラムハードウェアにオクタデシルシリル化シリカゲル（ＩｎｅｒｔＳｕｓｔａｉｎＳｗｉｆｔ（登録商標）  Ｃ１８、１．９μｍ、ジーエルサイエンス社）を充填し、内径２．１ｍｍ、長さ５ｃｍのカラムを作製した。作製したカラムを使用し、以下の条件で、金属配位性で塩基を持つ化合物の分析を行い、ピーク形状を確認した（図４（Ａ））。【０１０６】
比較例として、ステンレス製のカラムハードウェアの移動相接液部にパーヒドロポリシラザンを原料とする第一の膜のみを作製し、実施例と同一のオクタデシルシリル化シリカゲルを充填し、内径２．１ｍｍ、長さ５ｃｍのカラムを作製し、金属配位性で塩基を持つ化合物の分析を行った（図４（Ｂ））。又、比較例として、未処理のステンレス製のカラムハードウェアに実施例と同一のオクタデシルシリル化シリカゲルを充填し、内径２．１ｍｍ、長さ５ｃｍのカラムを作製し、金属配位性で塩基を持つ化合物の分析を行った（図４（Ｃ））。【０１０７】
分析は、ＵＨＰＬＣ装置Ｎｅｘｅｒａ（登録商標）（島津製作所社）を使用し、移動相（５ｍＭ  ギ酸アンモニウムの水溶液）を０．４ｍＬ／ｍｉｎの流速で送液した。温度条件は４０℃とした。検出には、ＭＳ／ＭＳ検出器（ＬＣＭＳ−８０３０  ｐｌｕｓ、島津製作所社）を使用した。検出器のイオン化はポジティブモードで行い、検出にはＭＲＭ（Ｍｕｌｔｉ  Ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ  Ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ）を使用した。試料には、試料Ｉ：アデノシン三リン酸（ＡＴＰ、５００μｇ／Ｌ）、アデノシン二リン酸（ＡＤＰ、５００μｇ／Ｌ）、アデノシン一リン酸（ＡＭＰ、５００μｇ／Ｌ）の水溶液を使用した。試料注入容量は２μＬとした。【０１０８】
実施例のカラムで採取したクロマトグラムを図４（Ａ）に、比較例のカラムで採取したクロマトグラムを図４（Ｂ）、図４（Ｃ）に示す。図４（Ａ）では、ＡＴＰは溶出が不十分であったが、ＡＤＰ、ＡＭＰについてはいずれもテーリングはしたものの、ピークとして溶出した。又、図４（Ｂ）では、ＡＴＰ、ＡＤＰは溶出せず、ＡＭＰはピーク形状が崩れた形で一部溶出した。又、図４（Ｃ）では、ＡＴＰ、ＡＤＰは溶出せず、ＡＭＰはピーク形状が図４（Ｂ）よりも更に崩れた形となり、溶出も不十分であった。【０１０９】
ＡＴＰ、ＡＤＰ、ＡＭＰはそれぞれの分子中にリン酸基を持つため、金属配位性化合物である。ＡＴＰは三リン酸基、ＡＤＰは二リン酸基、ＡＭＰは一リン酸基を持つため、金属配位性の強さはＡＴＰ＞ＡＤＰ＞ＡＭＰである。又、ＡＴＰ、ＡＤＰ、ＡＭＰはそれぞれの分子中にアデニンという塩基を持つ。又、ＡＴＰ、ＡＤＰ、ＡＭＰはそれぞれの分子中に１０個の炭素原子を持つため疎水性を持つ。図４（Ｃ）では、ステンレス製カラムハードウェアの移動相接液部に露出している金属の影響で、金属配位性の強いＡＴＰ、ＡＤＰは溶出せず、ＡＭＰの溶出も不十分であったことが分かる。又、図４（Ｂ）では、ステンレス製カラムハードウェアの移動相接液部はパーヒドロポリシラザンを原料とし、ＳｉＯ２の第一の膜で被覆されているため、図４（Ｃ）に比べてＡＭＰは大きな面積値で溶出したことが分かる。しかし、パーヒドロポリシラザンを原料とし、ＳｉＯ２の第一の膜表面のシラノール基と移動相中に溶けている金属が相互作用し、試料中の溶質の金属配位吸着の原因となっているため、ＡＴＰ、ＡＤＰは溶出せず、ＡＭＰのピーク形状も大きく崩れていたことが分かる。又、図４（Ａ）では、ステンレス製カラムハードウェアの移動相接液部はパーヒドロポリシラザンを原料としたＳｉＯ２の第一の膜で被覆され、更に第一の膜の表面はメチルシリル化され、シラノール基が少なくなっているため、ＡＤＰ、ＡＭＰはいずれもテーリングしているものの、ピークとして溶出したことが分かる。
【実施例２】
【０１１０】
汎用のＵＨＰＬＣ用カラムの、ステンレス製のカラムハードウェアの移動相接液部にメチルトリエトキシシラン（ＭＴＥＳ）を原料とする第一の膜を作製し、続いて第二の膜の作製、即ち第一の膜表面のメチルシリル化を行った。【０１１１】
詳しくは、ステンレス製のカラムハードウェアの移動相接液部にＭＴＥＳを原料とし、化学蒸着を利用して第一の膜を作製したカラムハードウェアを、カラム１本分作製した。ステンレス製のカラムハードウェア（内径２．１ｍｍ、長さ５ｃｍのカラム管１個、フリット２個、エンドユニオン２個）を真空チャンバー内に入れ、真空チャンバーの扉を閉め、真空チャンバーを加熱し、３００℃で安定させた。又、真空チャンバーの真空度を−０．０９９ＭＰａで安定させた。続いて、ＭＴＥＳを窒素で０．０５％に希釈したガスを２００ｓｃｃｍで真空チャンバー内に導入し、又、オゾン発生機に酸素を２０００ｓｃｃｍで導入し、酸素とオゾンの比率が９８：２になったガスを真空チャンバー内に導入し、９０分間反応させた。【０１１２】
続いて、ステンレス製のカラムハードウェアの移動相接液部にＭＴＥＳを原料とする第一の膜の作製を終えたカラムハードウェアの、化学蒸着を利用した第二の膜の作製、即ち第一の膜表面部分のメチルシリル化を行った。第一の膜の作製後、ジメチルジエトキシシラン（ＤＭＤＥＳ）を窒素で０．０５％に希釈したガスを２００ｓｃｃｍで真空チャンバー内に導入し、酸素とオゾンの混合ガスの導入は止め、３００℃、真空度−０．０９９ＭＰａで２時間反応させた。【０１１３】
第一の膜の作製及び第一の膜表面のメチルシリル化（第二の膜の作製）を終えたカラムハードウェアに、オクタデシルシリル化シリカゲル（ＩｎｅｒｔＳｕｓｔａｉｎＳｗｉｆｔ  Ｃ１８、１．９μｍ、ジーエルサイエンス社）を充填し、内径２．１ｍｍ、長さ５ｃｍのカラムを１種類作製した。【０１１４】
作製したカラムを使用し、以下の条件で、金属配位性で塩基を持つ化合物の分析を行い、ピーク形状を確認した（図５）。ＵＨＰＬＣ装置Ｎｅｘｅｒａ（登録商標）（島津製作所社）を使用し、移動相（５ｍＭ  ギ酸アンモニウムの水溶液）を０．４ｍＬ／ｍｉｎの流速で送液した。温度条件は４０℃とした。検出には、ＭＳ／ＭＳ検出器（ＬＣＭＳ−８０３０  ｐｌｕｓ、島津製作所社）を使用した。検出器のイオン化はポジティブモードで行い、検出にはＭＲＭ（Ｍｕｌｔｉ  Ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ  Ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ）を使用した。試料には、試料Ｉ：アデノシン三リン酸（ＡＴＰ、５００μｇ／Ｌ）、アデノシン二リン酸（ＡＤＰ、５００μｇ／Ｌ）、アデノシン一リン酸（ＡＭＰ、５００μｇ／Ｌ）の水溶液を使用した。試料注入容量は２μＬとした。【０１１５】
実施例のカラムで採取したクロマトグラムを図５に示す。図５では、ＡＴＰ、ＡＤＰ、ＡＭＰはいずれもテーリングはしているものの、ピークとして溶出した。図５では、ステンレス製カラムハードウェアの移動相接液部はＭＴＥＳを原料とした第一の膜で被覆され、更に第一の膜の表面はメチルシリル化され、シラノール基が少なくなっているため、ＡＴＰ、ＡＤＰ、ＡＭＰはいずれもテーリングはしているものの、ピークとして溶出したことが分かる。
【実施例３】
【０１１６】
汎用のＵＨＰＬＣ用カラムの、ステンレス製のカラムハードウェアの移動相接液部にジメチルジエトキシシラン（ＤＭＤＥＳ）を原料とする第一の膜を作製し、続いて第二の膜の作製、即ち第一の膜表面のメチルシリル化を行った。【０１１７】
詳しくは、ステンレス製のカラムハードウェアの移動相接液部にＤＭＤＥＳを原料とし、化学蒸着を利用して第一の膜を作製したカラムハードウェアを、カラム１本分作製した。ステンレス製のカラムハードウェア（内径２．１ｍｍ、長さ５ｃｍのカラム管１個、フリット２個、エンドユニオン２個）を真空チャンバー内に入れ、真空チャンバーの扉を閉め、真空チャンバーを加熱し、３００℃で安定させた。又、真空チャンバーの真空度を−０．０９９ＭＰａで安定させた。続いて、ＤＭＤＥＳを窒素で０．０５％に希釈したガスを２００ｓｃｃｍで真空チャンバー内に導入し、又、オゾン発生機に酸素を２０００ｓｃｃｍで導入し、酸素とオゾンの比率が９８：２になったガスを真空チャンバー内に導入し、９０分間反応させた。【０１１８】
続いて、ステンレス製のカラムハードウェアの移動相接液部にＤＭＤＥＳを原料とする第一の膜の作製を終えたカラムハードウェアの、化学蒸着を利用した第二の膜の作製、即ち第一の膜表面のメチルシリル化を行った。上記第一の膜の作製後、ＤＭＤＥＳを窒素で０．０５％に希釈したガスを２００ｓｃｃｍで真空チャンバー内に導入し、酸素とオゾンの混合ガスの導入は止め、３００℃、真空度−０．０９９ＭＰａで２時間反応させた。【０１１９】
第一の膜の作製及び第一の膜表面のメチルシリル化（第二の膜の作製）を終えたカラムハードウェアにオクタデシルシリル化シリカゲル（ＩｎｅｒｔＳｕｓｔａｉｎＳｗｉｆｔ  Ｃ１８、１．９μｍ、ジーエルサイエンス社）を充填し、内径２．１ｍｍ、長さ５ｃｍのカラムを作製した。作製したカラムを使用し、以下の条件で、金属配位性で塩基を持つ化合物の分析を行い、ピーク形状を確認した（図６（Ａ））。【０１２０】
比較例として、移動相接液部がポリエーテルエーテルケトン（ＰＥＥＫ）製のカラムハードウェア（ＩＤＥＸ社）に、オクタデシルシリル化シリカゲル（ＩｎｅｒｔＳｕｓｔａｉｎＳｗｉｆｔ  Ｃ１８、１．９μｍ、ジーエルサイエンス社）を充填し、内径２．１ｍｍ、長さ５ｃｍのカラムを作製した。作製したカラムを使用し、以下の条件で、金属配位性で塩基を持つ化合物の分析を行った（図６（Ｂ））。【０１２１】
ＵＨＰＬＣ装置Ｎｅｘｅｒａ（登録商標）（島津製作所社）を使用し、移動相（５ｍＭ  ギ酸アンモニウムの水溶液）を０．４ｍＬ／ｍｉｎの流速で送液した。温度条件は４０℃とした。検出には、ＭＳ／ＭＳ検出器（ＬＣＭＳ−８０３０  ｐｌｕｓ、島津製作所社）を使用した。検出器のイオン化はポジティブモードで行い、検出にはＭＲＭ（Ｍｕｌｔｉ  Ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ  Ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ）を使用した。試料には、試料Ｉ：アデノシン三リン酸（ＡＴＰ、５００μｇ／Ｌ）、アデノシン二リン酸（ＡＤＰ、５００μｇ／Ｌ）、アデノシン一リン酸（ＡＭＰ、５００μｇ／Ｌ）の水溶液を使用した。試料注入容量は２μＬとした。【０１２２】
実施例のカラムで採取したクロマトグラムを図６（Ａ）、比較例のカラムで採取したクロマトグラムを図６（Ｂ）に示す。図６（Ａ）では、ＡＴＰ、ＡＤＰ、ＡＭＰはいずれも対称性の良いピークとして溶出し、ＡＤＰ、ＡＭＰのピーク高さは比較例の図６（Ｂ）に比べて高く、面積値は比較例の図６（Ｂ）に比べて多い。又、図６（Ｂ）では、ＡＴＰ、ＡＤＰ、ＡＭＰはいずれも対称性の良いピークとして溶出したが、ＡＤＰ、ＡＭＰのピーク高さは図６（Ａ）に比べて低く、面積値は図６（Ａ）に比べて少ない。【０１２３】
図６（Ａ）では、ステンレス製カラムハードウェアの移動相接液部はＤＭＤＥＳを原料とした第一の膜で被覆され、更に第一の膜の表面はメチルシリル化され、シラノール基がとても少なくなっているため、ＡＴＰ、ＡＤＰ、ＡＭＰはいずれも対称性の良いピークとして溶出したことが分かる。又、疎水性吸着の要因もとても少ないため、ＡＤＰ、ＡＭＰはＰＥＥＫ製のカラムでのピーク面積値を上回り、十分に溶出したことが分かる。又、図６（Ｂ）では、移動相接液部がＰＥＥＫ製のカラムハードウェアを使用していて、金属配位性吸着の要因は無いため、ＡＴＰ、ＡＤＰ、ＡＭＰはいずれも対称性の良いピークとして溶出したことが分かる。又、ＰＥＥＫは疎水性吸着の要因となるため、ＡＤＰ、ＡＭＰのピーク面積値は図６（Ａ）に比べて小さくなったことが分かる。【０１２４】
採取したクロマトグラムから計算した、実施例のカラムハードウェアを用いたカラムでの金属配位性で塩基を持つ化合物のピーク面積値を、比較例のＰＥＥＫ製のカラムでの金属配位性で塩基を持つ化合物のピーク面積値で除し、比較例のＰＥＥＫ製のカラムでの金属配位性で塩基を持つ化合物のピーク面積値との相対値を計算し、相対的なピーク面積値を示すグラフとして図７に示す。上記ＰＥＥＫ製のカラムでのピーク面積値は相対値１．００とした。【０１２５】
図７では、ステンレス製カラムハードウェアの第一の膜表面のメチルシリル化を行う時間が２時間の場合では、ＰＥＥＫ製のカラムでのピーク面積値より多かったことが確認出来た。【０１２６】
ステンレス製カラムハードウェアの移動相接液部がＤＭＤＥＳを原料とした第一の膜で被覆され、更に第一の膜の表面がメチルシリル化される時間が２時間を超えると、シラノール基がより少なくなり、又、ＰＥＥＫ製のカラムに比べて疎水性吸着の要因もとても少ないため、ＡＴＰ、ＡＤＰ、ＡＭＰいずれもＰＥＥＫ製のカラムでのピーク面積値を上回り、十分に溶出したことが分かる。
【実施例４】
【０１２７】
汎用のＵＨＰＬＣ用カラムの、ステンレス製のカラムハードウェアの移動相接液部に第一の膜を作製した。第一の膜の作製は、パーヒドロポリシラザンを原料とする第一の層を作製し、続いてパーヒドロポリシラザンを原料とする第一の層の表面にジメチルジエトキシシラン（ＤＭＤＥＳ）を原料とする第二の層を作製して、二層に積層して行った。続いて第二の膜の作製、即ち第一の膜表面の、詳しくはＤＭＤＥＳを原料とする第二の層の表面のメチルシリル化を行った。【０１２８】
詳しくは、ステンレス製のカラムハードウェアの移動相接液部にパーヒドロポリシラザンを原料とする第一の層を作製し、続いてＤＭＤＥＳを原料とする第二の層を作製して、第一の膜を作製し、続いて第二の膜の作製、即ち第一の膜表面のメチルシリル化、詳しくはＤＭＤＥＳを原料とする第二の層の表面のメチルシリル化を行ったカラムハードウェアを、カラム１本分作製した。【０１２９】
先ず、第一の膜の作製では、第一の膜の一層目の作製として、パーヒドロポリシラザンのイソプロピルアルコール溶液（１．０％、ｗ／ｖ）を１０００ｍＬトールビーカーで作製し、ステンレス製のカラムハードウェア（内径２．１ｍｍ、長さ５ｃｍのカラム管１個、フリット２個、エンドユニオン２個）を沈めた。超音波処理を３分間行い、カラムハードウェアを取り出し、産業用紙ワイパーを敷いた実験台上で１２時間、室温で乾燥させた。乾燥させたカラムハードウェアを２５０℃で安定化させたオーブン内に移し、２５０℃で３時間熱処理を行った。【０１３０】
更に、第一の膜の二層目の作製として、ステンレス製のカラムハードウェアの移動相接液部にパーヒドロポリシラザンを原料とする膜（第一の膜の一層目）の作製を終えたカラムハードウェアに、ＤＭＤＥＳを原料とする膜（第一の膜の二層目）の作製を化学蒸着を利用して行った。パーヒドロポリシラザンを原料とする膜の作製を終えたカラム１本分のカラムハードウェアを真空チャンバー内に入れ、真空チャンバーの扉を閉め、真空チャンバーを加熱し、３００℃で安定させた。又、真空チャンバーの真空度を−０．０９９ＭＰａで安定させた。続いて、ＤＭＤＥＳを窒素で０．０５％に希釈したガスを２００ｓｃｃｍで真空チャンバー内に導入し、又、オゾン発生機に酸素を２０００ｓｃｃｍで導入し、酸素とオゾンの比率が９８：２になったガスを真空チャンバー内に導入し、９０分間反応させた。【０１３１】
そして、ステンレス製のカラムハードウェアの移動相接液部にパーヒドロポリシラザンを原料とする第一の層、更にＤＭＤＥＳを原料とする第二の層の作製を終えたカラムハードウェアの、ＤＭＤＥＳを原料とする層（第一の膜の二層目）表面のメチルシリル化を化学蒸着を利用して行った。上記ＤＭＤＥＳを原料とする膜の作製に続き、ＤＭＤＥＳを窒素で０．０５％に希釈したガスを２００ｓｃｃｍで真空チャンバー内に導入し、酸素とオゾンの混合ガスの導入は止め、３００℃、真空度−０．０９９ＭＰａで２時間反応させた。【０１３２】
第一の膜の作製及び第一の膜表面のメチルシリル化（第二の膜の作製）を終えたカラムハードウェアにオクタデシルシリル化シリカゲルを充填してカラムを作製した。詳しくは、パーヒドロポリシラザンを原料とする第一の層の作製と、ＤＭＤＥＳを原料とする第二の層の作製と、ＤＭＤＥＳを原料とする第二の層表面、即ち第一の膜の表面のメチルシリル化を行ったカラムハードウェアに、オクタデシルシリル化シリカゲル（ＩｎｅｒｔＳｕｓｔａｉｎＳｗｉｆｔ  Ｃ１８、１．９μｍ、ジーエルサイエンス社）を充填し、内径２．１ｍｍ、長さ５ｃｍのカラムを作製した。【０１３３】
作製したカラムを使用し、以下の条件で、金属配位性で塩基を持つ化合物の分析を行い、ピーク形状を確認した（図８）。ＵＨＰＬＣ装置Ｎｅｘｅｒａ（登録商標）（島津製作所社）を使用し、移動相（５ｍＭ  ギ酸アンモニウムの水溶液）を０．４ｍＬ／ｍｉｎの流速で送液した。温度条件は４０℃とした。検出には、ＭＳ／ＭＳ検出器（ＬＣＭＳ−８０３０  ｐｌｕｓ、島津製作所社）を使用した。検出器のイオン化はポジティブモードで行い、検出にはＭＲＭ（Ｍｕｌｔｉ  Ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ  Ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ）を使用した。試料には、試料Ｉ：アデノシン三リン酸（ＡＴＰ、５００μｇ／Ｌ）、アデノシン二リン酸（ＡＤＰ、５００μｇ／Ｌ）、アデノシン一リン酸（ＡＭＰ、５００μｇ／Ｌ）の水溶液を使用した。試料注入容量は２μＬとした。【０１３４】
採取したクロマトグラムを図８に示す。図８では、ＡＴＰ、ＡＤＰ、ＡＭＰは対称性の良いピークとして溶出した。図８では、ステンレス製カラムハードウェアの移動相接液部はパーヒドロポリシラザンを原料とした層で被覆され、続いてＤＭＤＥＳを原料とした層で被覆され、即ち二層で構成された第一の膜で被覆され、更にＤＭＤＥＳを原料とした層の表面はメチルシリル化され、シラノール基がとても少なくなっているため、ＡＴＰ、ＡＤＰ、ＡＭＰは対称性の良いピークとして溶出したことが分かる。
【実施例５】
【０１３５】
汎用のＨＰＬＣ用カラムの、ステンレス製のカラムハードウェアの移動相接液部にジメチルジエトキシシラン（ＤＭＤＥＳ）を原料とする第一の膜を作製し、続いて第二の膜の作製、即ち第一の膜表面のメチルシリル化を行った。【０１３６】
詳しくは、ステンレス製のカラムハードウェアの移動相接液部にＤＭＤＥＳを原料とし、化学蒸着を利用して第一の膜を作製したカラムハードウェアを、カラム１本分作製した。ステンレス製のカラムハードウェア（内径２．１ｍｍ、長さ１５ｃｍのカラム管１個、フリット２個、エンドユニオン２個）を真空チャンバー内に入れ、真空チャンバーの扉を閉め、真空チャンバーを加熱し、３００℃で安定させた。又、真空チャンバーの真空度を−０．０９９ＭＰａで安定させた。続いて、ＤＭＤＥＳを窒素で０．０５％に希釈したガスを２００ｓｃｃｍで真空チャンバー内に導入し、又、オゾン発生機に酸素を２０００ｓｃｃｍで導入し、酸素とオゾンの比率が９８：２になったガスを真空チャンバー内に導入し、９０分間反応させた。【０１３７】
ステンレス製のカラムハードウェアの移動相接液部にＤＭＤＥＳを原料とする第一の膜の作製を終えたカラムハードウェアの、化学蒸着を利用した第二の膜の作製、即ち第一の膜表面のメチルシリル化を行った。上記第一の膜の作製に続き、ＤＭＤＥＳを窒素で０．０５％に希釈したガスを２００ｓｃｃｍで真空チャンバー内に導入し、酸素とオゾンの混合ガスの導入は止め、３００℃、真空度−０．０９９ＭＰａで２時間反応させた。【０１３８】
第一の膜の作製及び第一の膜表面のメチルシリル化（第二の膜の作製）を終えたカラムハードウェアにオクタデシルシリル化シリカゲル（ＩｎｅｒｔＳｕｓｔａｉｎＳｗｉｆｔ  Ｃ１８、３μｍ、ジーエルサイエンス社）を充填し、内径２．１ｍｍ、長さ１５ｃｍのカラムを作製した。作製したカラムを使用し、以下の条件で、金属配位性で塩基を持つ化合物の分析と、金属配位性で疎水性が強く、塩基を持つ化合物の分析を行い、ピーク形状を確認した（図９（Ａ）、図１０（Ａ）、図１１（Ａ））。【０１３９】
比較例として、移動相接液部表面がポリエーテルエーテルケトン（ＰＥＥＫ）製のカラムハードウェア（ＩＤＥＸ社）に実施例と同一のオクタデシルシリル化シリカゲルを充填し、内径２．１ｍｍ、長さ１５ｃｍのカラムを作製し、以下の条件で、金属配位性で塩基を持つ化合物の分析と、金属配位性で疎水性が強く、塩基を持つ化合物の分析を行った（図９（Ｂ）、図１０（Ｂ）、図１１（Ｂ））。又、比較例として、未処理のステンレス製のカラムハードウェアに実施例と同一のオクタデシルシリル化シリカゲルを充填し、内径２．１ｍｍ、長さ１５ｃｍのカラムを作製し、以下の条件で、金属配位性で疎水性が強く、塩基を持つ化合物の分析を行った（図１０（Ｃ）、図１１（Ｃ））。【０１４０】
分析は、ＵＨＰＬＣ装置Ｎｅｘｅｒａ（登録商標）（島津製作所社）を使用し、移動相（５ｍＭ  ギ酸アンモニウムの水溶液）を０．４ｍＬ／ｍｉｎの流速で送液した。温度条件は４０℃とした。検出には、ＭＳ／ＭＳ検出器（ＬＣＭＳ−８０３０  ｐｌｕｓ、島津製作所社）を使用した。検出器のイオン化はポジティブモードで行い、検出にはＭＲＭ（Ｍｕｌｔｉ  Ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ  Ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ）を使用した。試料には、試料ＩＩ：アデノシン一リン酸（ＡＭＰ、５００μｇ／Ｌ）の水溶液を使用した。試料注入容量は２μＬとした。未処理のカラムハードウェアでの測定は行わなかった。【０１４１】
又、作製したカラムを使用し、以下の条件で、金属配位性で疎水性が高く、塩基を持つ化合物の分析を行った。ＵＨＰＬＣ装置Ｎｅｘｅｒａ（登録商標）（島津製作所社）を使用し、移動相Ａ：０．１％（ｖ／ｖ）  ギ酸水溶液、移動相Ｂ：アセトニトリルを用いて、Ａ／Ｂ＝９９／１−（１０ｍｉｎ）−０／１００−（５ｍｉｎ）−０／１００−（０．１ｍｉｎ）−９９／１，ｖ／ｖを０．２ｍＬ／ｍｉｎの流速で送液した。温度条件は４０℃とした。検出には、ＭＳ／ＭＳ検出器（ＬＣＭＳ−８０３０  ｐｌｕｓ、島津製作所社）を使用した。検出器のイオン化はポジティブモードで行い、検出にはＭＲＭ（Ｍｕｌｔｉ  Ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ  Ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ）を使用した。試料には、試料ＩＩＩ：フラビンアデニンジヌクレオチド（ＦＡＤ、１．０ｍｇ／Ｌ）、フラビンモノヌクレオチド（ＦＭＮ、０．１ｍｇ／Ｌ）、リボフラビン（Ｒｉｂｏｆｌａｖｉｎ、１．０ｍｇ／Ｌ）の水溶液を使用した。試料注入容量は３μＬとした。【０１４２】
又、作製したカラムを使用し、以下の条件で、金属配位性で疎水性が高く、塩基を持つ化合物であるリン脂質の分析を行った。ＵＨＰＬＣ装置Ｎｅｘｅｒａ（登録商標）（島津製作所社）を使用し、移動相（５ｍＭ  ギ酸アンモニウムのメタノール溶液）を０．３ｍＬ／ｍｉｎの流速で送液した。温度条件は４０℃とした。検出には、ＭＳ／ＭＳ検出器（ＬＣＭＳ−８０３０  ｐｌｕｓ、島津製作所社）を使用した。検出器のイオン化はポジティブモードで行い、検出にはＭＲＭ（Ｍｕｌｔｉ  Ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ  Ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ）を使用した。試料には、試料ＩＶ：１．リゾフォスファチジン酸（ＬＰＡ、０．５ｍｇ／Ｌ）、２．フォスファチジルイノシトール（ＰＩ、０．１ｍｇ／Ｌ）、３．フォスファチジン酸（ＰＡ、０．１ｍｇ／Ｌ）、４．フォスファチジルセリン（ＰＳ、０．１ｍｇ／Ｌ）、５．フォスファチジルエタノールアミン（ＰＥ、０．１ｍｇ／Ｌ）、６．フォスファチジルコリン（ＰＣ、０．０５ｍｇ／Ｌ）、７．カルジオリピン（ＣＬ、０．５ｍｇ／Ｌ）のメタノール溶液を使用した。試料注入容量は１μＬとした。【０１４３】
試料ＩＩを用いて採取したクロマトグラムを図９（Ａ）、図９（Ｂ）に示す。図９（Ａ）では、ＡＭＰは対称性の良いピークとして溶出した。又、図９（Ｂ）では、ＡＭＰは対称性の良いピークとして溶出したが、ＡＭＰのピーク高さは図９（Ａ）に比べて低く、面積値は図９（Ａ）に比べて少ない。【０１４４】
図９（Ａ）では、ステンレス製カラムハードウェアの移動相接液部はＤＭＤＥＳを原料とした第一の膜で被覆され、更に第一の膜の表面はメチルシリル化され、シラノール基がとても少なくなっているため、ＡＭＰは対称性の良いピークとして溶出したことが分かる。又、図９（Ｂ）では、移動相接液部がＰＥＥＫ製のカラムハードウェアを使用していて、金属配位性吸着の要因は無いため、ＡＭＰは対称性の良いピークとして溶出したことが分かる。又、ＰＥＥＫは疎水性吸着の要因となるため、ＡＭＰのピーク面積値は図９（Ａ）に比べて小さくなったことが分かる。【０１４５】
試料ＩＩＩを用いて採取したクロマトグラムを図１０（Ａ）、図１０（Ｂ）、図１０（Ｃ）に示す。図１０（Ａ）では、ＦＡＤはテーリングしているが、１４５００のピーク高さで溶出し、ＦＭＮ、Ｒｉｂｏｆｌａｖｉｎは対称性の良いピークとして、それぞれ６５００、５０００のピーク高さで溶出した。又、図１０（Ｂ）では、Ｒｉｂｏｆｌａｖｉｎは図１０（Ａ）に比べて同等のピークとして溶出したが、ＦＡＤは図１０（Ａ）に比べてより強くテーリングしており、６５００のピーク高さで溶出し、ＦＭＮは図１０（Ａ）に比べてより幅の大きいピークとして、５５００のピーク高さで溶出した。又、図１０（Ｃ）では、Ｒｉｂｏｆｌａｖｉｎは図１０（Ａ）に比べて同等のピークとして溶出したが、ＦＡＤ、ＦＭＮは溶出が不十分であった。【０１４６】
ＦＡＤは分子中にリボフラビン（Ｒｉｂｏｆｌａｖｉｎ）とアデニンと二リン酸を持つため、塩基を含み、且つ金属配位性で、疎水性の高い化合物である。ＦＭＮは分子中にリボフラビン（Ｒｉｂｏｆｌａｖｉｎ）と一リン酸を持つため、金属配位性の化合物であり、疎水性はＦＡＤ程は高くない化合物である。リボフラビン（Ｒｉｂｏｆｌａｖｉｎ）は分子中にリン酸基は無いため、金属配位性の化合物では無く、疎水性はＦＭＮと同等の化合物である。【０１４７】
図１０（Ａ）では、ステンレス製カラムハードウェアの移動相接液部はＤＭＤＥＳを原料とした第一の膜で被覆され、更に第一の膜の表面はメチルシリル化され、シラノール基が少なくなっているため、又、疎水性の高い化合物が吸着する要因が少ないため、ＦＡＤはテーリングしているが、１４５００のピーク高さで溶出し、ＦＭＮは対称性の良いピークとして溶出したことが分かる。又、図１０（Ｂ）では、カラムハードウェアの移動相接液部であるＰＥＥＫは、金属配位性の化合物が吸着する要因にはならないが、疎水性の高い化合物が吸着する要因になるため、ＦＭＮは対称性の良いピークとして溶出し、ＦＡＤは図１０（Ａ）に比べてより強くテーリングしたことが分かる。又、図１０（Ｃ）では、未処理のカラムハードウェアの移動相接液部には金属が露出しているため、ＦＡＤ、ＦＭＮは溶出が不十分であったことが分かる。リボフラビン（Ｒｉｂｏｆｌａｖｉｎ）は金属配位性の化合物では無く、疎水性も高くないため、図１０（Ａ）、図１０（Ｂ）、図１０（Ｃ）のいずれでも同等のピークとして溶出したことが分かる。【０１４８】
試料ＩＶを用いて採取したクロマトグラムを図１１（Ａ）、図１１（Ｂ）、図１１（Ｃ）に示す。図１１（Ａ）では、試料ＩＶ中のＰＳは少しテーリングしているが、他の全ての溶質は対称性の良いピークとして溶出した。又、図１１（Ｂ）では、図１１（Ａ）に比べて全体的に保持時間が遅れており、ＰＣ以外の溶質は面積値が少なく溶出しているが、試料ＩＶ中の全ての溶質は対称性の良いピークとして溶出した。又、図１１（Ｃ）では、全ての溶質は溶出が不十分であった。【０１４９】
リン脂質は分子中にリン酸を持ち、脂肪酸がエステル結合した構造を持つため、金属配位性で、疎水性の高い化合物である。加えて、ＰＥは分子中にエタノールアミンという塩基を、ＰＣは分子中にコリンという塩基を持つ化合物である。【０１５０】
図１１（Ａ）では、ステンレス製カラムハードウェアの移動相接液部はＤＭＤＥＳを原料とした第一の膜で被覆され、更に第一の膜の表面はメチルシリル化され、シラノール基が少なくなっているため、又、疎水性の高い化合物が吸着する要因が少ないため、ＰＳは少しテーリングしているが、他の全ての溶質は対称性の良いピークとして溶出したことが分かる。又、図１１（Ｂ）では、カラムハードウェアの移動相接液部であるＰＥＥＫは、金属配位性の化合物が吸着する要因にはならないが、疎水性の高い化合物が吸着する要因になるため、図１１（Ａ）に比べて全体的に保持時間が遅れており、ＰＣ以外の溶質は面積値が少なく溶出したことが分かる。又、図１１（Ｃ）では、未処理のカラムハードウェアの移動相接液部には金属が露出しているため、全ての溶質は溶出が不十分であったことが分かる。
【実施例６】
【０１５１】
汎用のＨＰＬＣ用カラムの、ステンレス製のカラムハードウェアの移動相接液部にジメチルジエトキシシラン（ＤＭＤＥＳ）を原料とする第一の膜を作製し、続いて第二の膜の作製、即ち第一の膜表面のメチルシリル化を行った。メチルシリル化を行う時間を１時間としてカラムハードウェアを作製した。【０１５２】
詳しくは、ステンレス製のカラムハードウェアの移動相接液部にＤＭＤＥＳを原料とし、化学蒸着を利用して第一の膜を作製したカラムハードウェアを、カラム１本分作製した。ステンレス製のカラムハードウェア（内径２．１ｍｍ、長さ５ｃｍのカラム管１個、フリット２個、エンドユニオン２個）を真空チャンバー内に入れ、真空チャンバーの扉を閉め、真空チャンバーを加熱し、３００℃で安定させた。又、真空チャンバーの真空度を−０．０９９ＭＰａで安定させた。続いて、ＤＭＤＥＳを窒素で０．０５％に希釈したガスを２００ｓｃｃｍで真空チャンバー内に導入し、又、オゾン発生機に酸素を２０００ｓｃｃｍで導入し、酸素とオゾンの比率が９８：２になったガスを真空チャンバー内に導入し、９０分間反応させた。【０１５３】
続いて、ステンレス製のカラムハードウェアの移動相接液部にＤＭＤＥＳを原料とする第一の膜の作製を終えたカラムハードウェアの、化学蒸着を利用した第二の膜の作製、即ち第一の膜表面のメチルシリル化を１時間行った。上記第一の膜の作製後、ＤＭＤＥＳを窒素で０．０５％に希釈したガスを２００ｓｃｃｍで真空チャンバー内に導入し、酸素とオゾンの混合ガスの導入を止め、３００℃、真空度−０．０９９ＭＰａで１時間反応させた。【０１５４】
第一の膜の作製及び第一の膜表面のメチルシリル化（第二の膜の作製）を１時間行ったカラムハードウェアにオクタデシルシリル化シリカゲル（ＩｎｅｒｔＳｕｓｔａｉｎＳｗｉｆｔ  Ｃ１８、１．９μｍ、ジーエルサイエンス社）を充填し、内径２．１ｍｍ、長さ５ｃｍのカラムを作製した。【０１５５】
作製したカラムを使用し、以下の条件で、金属配位性で塩基を持つ化合物の分析を行った。ＵＨＰＬＣ装置Ｎｅｘｅｒａ（登録商標）（島津製作所社）を使用し、移動相（５ｍＭ  ギ酸アンモニウムの水溶液）を０．４ｍＬ／ｍｉｎの流速で送液した。温度条件は４０℃とした。検出には、ＭＳ／ＭＳ検出器（ＬＣＭＳ−８０３０  ｐｌｕｓ、島津製作所社）を使用した。検出器のイオン化はポジティブモードで行い、検出にはＭＲＭ（Ｍｕｌｔｉ  Ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ  Ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ）を使用した。試料には、試料Ｉ：アデノシン三リン酸（ＡＴＰ、５００μｇ／Ｌ）、アデノシン二リン酸（ＡＤＰ、５００μｇ／Ｌ）、アデノシン一リン酸（ＡＭＰ、５００μｇ／Ｌ）の水溶液を使用した。試料注入容量は２μＬとした。【０１５６】
実施例のカラムで採取したクロマトグラムを図１２に示す。図１２では、ＡＴＰにはテーリングが見られるが、ＡＤＰ、ＡＭＰはいずれも対称性の良いピークとして溶出した。図１２では、ステンレス製カラムハードウェアの移動相接液部はＤＭＤＥＳを原料とした第一の膜で被覆され、更に第一の膜の表面はメチルシリル化され、シラノール基が少なくなっているため、ＡＴＰにはテーリングが見られるが、ＡＤＰ、ＡＭＰはいずれも対称性の良いピークとして溶出したことが分かる。
【実施例７】
【０１５７】
本発明の液体クロマトグラフィー用カラムハードウェアによる金属配位性化合物と塩基性化合物の非特異的吸着の低減を確認するために、ガスクロマトグラフに接続し、金属配位性化合物と塩基性化合物の分析を行い、ピーク形状を確認した。【０１５８】
ステンレス製カラムハードウェアの移動相接液部にジメチルジエトキシシラン（ＤＭＤＥＳ）を原料とする第一の膜を作製し、続いて第二の膜の作製、即ち第一の膜表面のメチルシリル化を行った。比較例として、ステンレス製カラムハードウェアの移動相接液部にＤＭＤＥＳを原料とする第一の膜のみを作製した。【０１５９】
詳しくは、ステンレス製カラムハードウェアの移動相接液部にＤＭＤＥＳを原料とし、化学蒸着を利用して第一の膜を作製したカラムハードウェアを作製した。ステンレス製のカラムハードウェア（内径２．１ｍｍ、長さ５ｃｍのカラム管１個、フリット２個、エンドユニオン２個）を真空チャンバー内に入れ、真空チャンバーの扉を閉め、真空チャンバーを加熱し、３００℃で安定させた。又、真空チャンバーの真空度を−０．０９９ＭＰａで安定させた。続いて、ＤＭＤＥＳを窒素で０．０５％に希釈したガスを２００ｓｃｃｍで真空チャンバー内に導入し、又、オゾン発生機に酸素を２０００ｓｃｃｍで導入し、酸素とオゾンの比率が９８：２になったガスを真空チャンバー内に導入し、９０分間反応させた。【０１６０】
続いて、ステンレス製カラムハードウェアの移動相接液部にＤＭＤＥＳを原料とする第一の膜の作製を終えたカラムハードウェアの、化学蒸着を利用した第一の膜表面のメチルシリル化（第二の膜の作製）を行った。上記第一の膜の作製に続き、ＤＭＤＥＳを窒素で０．０５％に希釈したガスを２００ｓｃｃｍで真空チャンバー内に導入し、酸素とオゾンの混合ガスの導入は止め、３００℃、真空度−０．０９９ＭＰａで２時間反応させた。【０１６１】
比較例として、ステンレス製カラムハードウェアの移動相接液部にＤＭＤＥＳを原料とする第一の膜を作製したカラムハードウェアを、以下のように作製した。ステンレス製のカラムハードウェア（内径２．１ｍｍ、長さ５ｃｍのカラム管１個、フリット２個、エンドユニオン２個）を真空チャンバー内に入れ、真空チャンバーの扉を閉じ、真空チャンバーを加熱し、３００℃で安定させた。又、真空チャンバーの真空度を−０．０９９ＭＰａで安定させた。続いて、ＤＭＤＥＳを窒素で０．０５％に希釈したガスを２００ｓｃｃｍで真空チャンバー内に導入し、又、オゾン発生機に酸素を２０００ｓｃｃｍで導入し、酸素とオゾンの比率が９８：２になったガスを真空チャンバー内に導入し、９０分間反応させた。【０１６２】
第一の膜の作製及び第一の膜表面のメチルシリル化（第二の膜の作製）を終えた実施例のカラムハードウェア、又、第一の膜のみの作製を行った比較例のカラムハードウェアの両端を、夫々、１００％ジメチルポリシロキサンを固定相としてキャピラリー管の内壁に化学結合した低極性キャピラリーカラム（ＩｎｅｒｔＣａｐ（登録商標）  １、外径０．６８ｍｍ、内径０．５３ｍｍ、長さ１０ｃｍ、固定相膜厚１μｍ、ジーエルサイエンス社）と、ＩｎｅｒｔＣａｐ  １（外径０．６８ｍｍ、内径０．５３ｍｍ、長さ３０ｍ、固定相膜厚１μｍ、ジーエルサイエンス社）に接続した。外径１／１６インチ用リムーバブルフューズドシリカアダプター（ＦＳ１Ｒ．８−５（ナット、フェラル、ライナー）、ＶＩＣＩ社）を用いて、フェラルの内側のライナーの内側にキャピラリーカラムを通してナットを締め、カラムハードウェアとキャピラリーカラムを接続した。【０１６３】
注入口にＩｎｅｒｔＣａｐ  １（外径０．６８ｍｍ、内径０．５３ｍｍ、長さ１０ｃｍ、固定相膜厚１μｍ）−カラムハードウェア−ＩｎｅｒｔＣａｐ  １（外径０．６８ｍｍ、内径０．５３ｍｍ、長さ３０ｍ、固定相膜厚１μｍ）のように接続し、ＩｎｅｒｔＣａｐ  １（外径０．６８ｍｍ、内径０．５３ｍｍ、長さ３０ｍ、固定相膜厚１μｍ）の出口をＦＩＤ検出器（Ｆｌａｍｅ  Ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ  Ｄｅｔｅｃｔｏｒ、水素炎イオン化型検出器）の入口に接続した。【０１６４】
以下の条件で、実施例及び比較例のカラムハードウェアをガスクロマトグラフィー用カラムと接続し、金属配位性化合物と塩基性化合物の分析を行い、ピーク形状を確認した（図１３（Ａ）、図１３（Ｂ））。【０１６５】
ガスクロマトグラフＧＣ−４０００（ジーエルサイエンス社）を使用し、移動相（ヘリウム）を８０ｋＰａの圧力で送気した。温度条件は１３０℃とした。検出には、ＦＩＤ検出器（ＧＣ−４０００の一部、ジーエルサイエンス社）を使用した。ＦＩＤ検出器の温度は２５０℃とした。試料には、試料Ｖ：１．ｎ−Ｕｎｄｅｃａｎｅ、２．ｎ−Ｎｏｎａｎｏｌ、３．Ｎａｐｈｔｈａｌｅｎｅ、４．ｎ−Ｄｏｄｅｃａｎｅ、５．１，７−Ｈｅｐｔａｎｅｄｉｏｌ、６．ｎ−Ｄｅｃｙｌａｍｉｎｅ、７．ｎ−Ｔｒｉｄｅｃａｎｅ、８．Ｍｅｔｈｙｌ−ｎ−Ｄｅｃａｎｏａｔｅ、９．２，４，５−Ｔｒｉｃｈｌｏｒｏｐｈｅｎｏｌ、１０．ｎ−Ｔｅｔｒａｄｅｃａｎｅを各０．１％〜０．５％含有する、イソプロピルアルコール溶液（キャピラリーカラム検査試料Ｄ、ジーエルサイエンス社）をジクロロメタンで１００倍希釈した溶液を使用した。試料注入容量は０．４μＬとし、注入口の温度は２５０℃、注入口のスプリット比は１／３０とした。  【０１６６】
実施例のカラムで採取したクロマトグラムを図１３（Ａ）、比較例のカラムで採取したクロマトグラムを図１３（Ｂ）に示す。図１３（Ａ）では、塩基性化合物であるｎ−Ｄｅｃｙｌａｍｉｎｅは少しテーリングがあるが溶出し、他の全ての溶質が形状の良いピークとして溶出した。図１３（Ｂ）では、金属配位性化合物である１，７−Ｈｅｐｔａｎｅｄｉｏｌと、塩基性化合物であるｎ−Ｄｅｃｙｌａｍｉｎｅ以外の溶質は形状の良いピークとして溶出したが、金属配位性化合物である１，７−Ｈｅｐｔａｎｅｄｉｏｌと、塩基性化合物であるｎ−Ｄｅｃｙｌａｍｉｎｅは溶出しなかった。【０１６７】
図１３（Ａ）では、ステンレス製カラムハードウェアの移動相接液部はＤＭＤＥＳを原料とした第一の膜で被覆され、更に第一の膜の表面はメチルシリル化され、シラノール基が少なくなっているため、試料Ｖ中のｎ−Ｄｅｃｙｌａｍｉｎｅは少しテーリングがあるが溶出し、他の全ての溶質が形状の良いピークとして溶出したことが分かる。図１３（Ｂ）では、ステンレス製カラムハードウェアの移動相接液部はＤＭＤＥＳを原料とした第一の膜のみで被覆されているため、第一の膜表面のシラノール基の影響により、金属配位性化合物である１，７−Ｈｅｐｔａｎｅｄｉｏｌは溶出しなかったことが分かる。又、塩基性化合物であるｎ−Ｄｅｃｙｌａｍｉｎｅは第一の膜表面のシラノール基に吸着し、溶出しなかったことが分かる。
【実施例８】
【０１６８】
カラムハードウェアの長さが大きく、且つ内径が小さい場合であっても、本発明の液体クロマトグラフィー用カラムハードウェアとしての機能を発揮するカラムハードウェアが作製可能であるかを以下の実験を行い確認した。【０１６９】
ステンレス製カラム管の移動相接液部にジメチルジエトキシシラン（ＤＭＤＥＳ）を原料とする第一の膜を４時間かけて作製し、続いて第二の膜の作製、即ち第一の膜表面のメチルシリル化を２時間行った。又、ステンレス製カラム管の移動相接液部にＤＭＤＥＳを原料とする第一の膜を９０分間かけて作製し、続いて第二の膜の作製、即ち第一の膜表面のメチルシリル化を２時間行った。【０１７０】
詳しくは、ステンレス製カラム管の移動相接液部にＤＭＤＥＳを原料とし、化学蒸着を利用して第一の膜を作製したカラム管を作製した。ステンレス製カラム管（外径１／１６インチ、内径１．０ｍｍ、長さ１０ｍ、ジーエルサイエンス社）を真空チャンバー内に入れ、真空チャンバーの扉を閉め、真空チャンバーを加熱し、３００℃で安定させた。又、真空チャンバーの真空度を−０．０９９ＭＰａで安定させた。続いて、ＤＭＤＥＳを窒素で０．０５％に希釈したガスを２００ｓｃｃｍで真空チャンバー内に導入し、又、オゾン発生機に酸素を２０００ｓｃｃｍで導入し、酸素とオゾンの比率が９８：２になったガスを真空チャンバー内に導入し、４時間反応させた。【０１７１】
続いて、ステンレス製カラム管の移動相接液部にＤＭＤＥＳを原料とする第一の膜の作製を終えたカラム管の、化学蒸着を利用した第二の膜の作製、即ち第一の膜表面のメチルシリル化を２時間行った。上記第一の膜の作製に続き、ＤＭＤＥＳを窒素で０．０５％に希釈したガスを２００ｓｃｃｍで真空チャンバー内に導入し、酸素とオゾンの混合ガスの導入は止め、３００℃、真空度−０．０９９ＭＰａで２時間反応させた。【０１７２】
別途、ステンレス製カラム管の移動相接液部にＤＭＤＥＳを原料とし、化学蒸着を利用して第一の膜を作製したカラム管を作製した。ステンレス製カラム管（外径１／１６インチ、内径１．０ｍｍ、長さ１０ｍ、ジーエルサイエンス社）を真空チャンバー内に入れ、真空チャンバーの扉を閉じ、真空チャンバーを加熱し、３００℃で安定させた。又、真空チャンバーの真空度を−０．０９９ＭＰａで安定させた。続いて、ＤＭＤＥＳを窒素で０．０５％に希釈したガスを２００ｓｃｃｍで真空チャンバー内に導入し、又、オゾン発生機に酸素を２０００ｓｃｃｍで導入し、酸素とオゾンの比率が９８：２になったガスを真空チャンバー内に導入し、９０分間反応させた。【０１７３】
続いて、ステンレス製カラム管の移動相接液部にＤＭＤＥＳを原料とする第一の膜の作製を終えたカラム管の、化学蒸着を利用した第二の膜の作製、即ち第一の膜表面のメチルシリル化を２時間行った。上記第一の膜の作製に続き、ＤＭＤＥＳを窒素で０．０５％に希釈したガスを２００ｓｃｃｍで真空チャンバー内に導入し、酸素とオゾンの混合ガスの導入は止め、３００℃、真空度−０．０９９ＭＰａで２時間反応させた。【０１７４】
第一の膜の４時間をかけての作製と、第一の膜表面のメチルシリル化（第二の膜の作製）を２時間行ったカラム管、第一の膜の９０分間をかけての作製と、第一の膜表面のメチルシリル化（第二の膜の作製）を２時間行ったカラム管それぞれについて、カラム管の両端を、５％ジフェニル−９５％ジメチルポリシロキサンを固定相としてキャピラリー管内壁に化学結合した低極性キャピラリーカラム（ＩｎｅｒｔＣａｐ  ５、外径０．６８ｍｍ、内径０．５３ｍｍ、長さ１０ｃｍ、固定相膜厚５μｍ、ジーエルサイエンス社）と、ＩｎｅｒｔＣａｐ  ５（外径０．６８ｍｍ、内径０．５３ｍｍ、長さ３０ｍ、固定相膜厚５μｍ、ジーエルサイエンス社）に接続した。外径１／１６インチ用リムーバブルフューズドシリカアダプター（ＦＳ１Ｒ．８−５（ナット、フェラル、ライナー）、ＶＩＣＩ社）を用いて、フェラルの内側のライナーの内側にキャピラリーカラムを通してナットを締め、１／１６インチ用ステンレス製ユニオン（Ｕ−３２２、ＶＩＣＩ社）の一端とキャピラリーカラムを接続した。又、１／１６インチ用ステンレス製ユニオンのもう一端と、上記第一の膜、第二の膜を作製したカラム管を、ＬＺＮ１−１０（ロングナット１９ｍｍ、ＶＩＣＩ社）と、ＺＦ１Ｓ６−１０（フェラル、ＶＩＣＩ社）を用いて接続した。１／１６インチ用ステンレス製ユニオンは、移動相接液部を実施例７に記載した方法と同方法で、ＤＭＤＥＳを原料として９０分間反応させて第一の膜を作製し、続いてＤＭＤＥＳを原料として２時間反応させて第一の膜表面のメチルシリル化（第二の膜の作製）を行ったものを使用した。【０１７５】
注入口にＩｎｅｒｔＣａｐ  ５（外径０．６８ｍｍ、内径０．５３ｍｍ、長さ１０ｃｍ、固定相膜厚５μｍ）−ユニオン−第一の膜、第二の膜を作製したカラム管−ユニオン−ＩｎｅｒｔＣａｐ  ５（外径０．６８ｍｍ、内径０．５３ｍｍ、長さ３０ｍ、固定相膜厚５μｍ）のように接続し、ＩｎｅｒｔＣａｐ  ５（外径０．６８ｍｍ、内径０．５３ｍｍ、長さ３０ｍ、固定相膜厚５μｍ）の出口をＦＩＤ検出器（Ｆｌａｍｅ  Ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ  Ｄｅｔｅｃｔｏｒ、水素炎イオン化型検出器）の入口に接続した。【０１７６】
以下の条件で第一の膜を４時間かけて作製し、２時間のメチルシリル化を終えたカラム管の両端をガスクロマトグラフィー用カラムと接続し、金属配位性化合物と塩基性化合物の分析を行い、ピーク形状を確認した（図１４（Ａ））。又、第一の膜を９０分間かけて作製し、２時間のメチルシリル化を終えたカラム管の両端をガスクロマトグラフィー用カラムと接続し、金属配位性化合物と塩基性化合物の分析を行い、ピーク形状を確認した（図１４（Ｂ））。【０１７７】
ガスクロマトグラフＧＣ−４０００（ジーエルサイエンス社）を使用し、移動相（ヘリウム）を３０ｋＰａの圧力で送気した。温度条件は１５０℃とした。検出には、ＦＩＤ検出器（ＧＣ−４０００の一部、ジーエルサイエンス社）を使用した。ＦＩＤ検出器の温度は２６０℃とした。試料には、試料Ｖ：１．ｎ−Ｕｎｄｅｃａｎｅ、２．ｎ−Ｎｏｎａｎｏｌ、３．Ｎａｐｈｔｈａｌｅｎｅ、４．ｎ−Ｄｏｄｅｃａｎｅ、５．１，７−Ｈｅｐｔａｎｅｄｉｏｌ、６．ｎ−Ｄｅｃｙｌａｍｉｎｅ、７．ｎ−Ｔｒｉｄｅｃａｎｅ、８．Ｍｅｔｈｙｌ−ｎ−Ｄｅｃａｎｏａｔｅ、９．２，４，５−Ｔｒｉｃｈｌｏｒｏｐｈｅｎｏｌ、１０．ｎ−Ｔｅｔｒａｄｅｃａｎｅを各０．１％〜０．５％含有する、イソプロピルアルコール溶液（キャピラリーカラム検査試料Ｄ、ジーエルサイエンス社）を使用した。試料注入容量は０．２μＬとし、注入口の温度は２５０℃、注入口のスプリット比は１／３０とした。【０１７８】
採取したクロマトグラムを図１４（Ａ）及び図１４（Ｂ）に示す。第一の膜の４時間の作製と、第一の膜表面のメチルシリル化（第二の膜の作製）を２時間行ったカラム管を使用した図１４（Ａ）では、試料Ｖ中の全ての溶質が形状の良いピークとして溶出した。又、第一の膜の９０分間の作製と、第一の膜表面のメチルシリル化（第二の膜の作製）を２時間行ったカラム管を使用した図１４（Ｂ）では、特に金属配位性化合物である１，７−Ｈｅｐｔａｎｅｄｉｏｌは一部溶出しなかった。【０１７９】
図１４（Ａ）では、外径１／１６インチ、内径１．０ｍｍ、長さ１０ｍのステンレス製カラム管の移動相接液部はＤＭＤＥＳを原料とした第一の膜で４時間かけて被覆され、更に第一の膜の表面は２時間メチルシリル化され、シラノール基が少なくなっているため、試料Ｖ中の全ての溶質が形状の良いピークとして溶出したことが分かる。図１４（Ｂ）では、ステンレス製カラム管の移動相接液部はＤＭＤＥＳを原料とした第一の膜で９０分間かけて被覆され、更に第一の膜の表面は２時間メチルシリル化が施されているものの、図１４（Ａ）と比べるとＳｉＯ２の第一の膜の作製が十分でなく、ステンレス製カラム管の表面に露出している金属を被覆しきれていないため、金属配位性化合物である１，７−Ｈｅｐｔａｎｅｄｉｏｌは一部溶出しなかったことが分かる。【０１８０】
このことから、長さ１０ｍという長尺のカラム管であっても、更に内径１．０ｍｍのカラム管であっても、第一の膜の作製時間（反応時間）を増加させることにより、本発明の効果を奏することが出来ることが分かり、長さ１０ｍ以下、内径１．０ｍｍ以上のカラム管であれば、本発明のカラムハードウェアを構成可能であることが分かる。
【実施例９】
【０１８１】
汎用のＵＨＰＬＣ用カラムの、ステンレス製のカラムハードウェアの移動相接液部にジメチルジエトキシシラン（ＤＭＤＥＳ）を原料とする第一の膜を作製し、続いて第二の膜の作製、即ち第一の膜表面のメチルシリル化をトリメチルエトキシシラン（ＴＭＥＳ）を原料として行った。【０１８２】
詳しくは、ステンレス製のカラムハードウェアの移動相接液部にＤＭＤＥＳを原料とし、化学蒸着を利用して第一の膜を作製したカラムハードウェアを、カラム１本分作製した。ステンレス製のカラムハードウェア（内径２．１ｍｍ、長さ５ｃｍのカラム管１個、フリット２個、エンドユニオン２個）を真空チャンバー内に入れ、真空チャンバーの扉を閉め、真空チャンバーを加熱し、３００℃で安定させた。又、真空チャンバーの真空度を−０．０９９ＭＰａで安定させた。続いて、ＤＭＤＥＳを窒素で０．０５％に希釈したガスを２００ｓｃｃｍで真空チャンバー内に導入し、又、オゾン発生機に酸素を２０００ｓｃｃｍで導入し、酸素とオゾンの比率が９８：２になったガスを真空チャンバー内に導入し、９０分間反応させた。【０１８３】
続いて、ステンレス製のカラムハードウェアの移動相接液部にＤＭＤＥＳを原料とする第一の膜の作製を終えたカラムハードウェアの、化学蒸着を利用した第二の膜の作製、即ち第一の膜表面のメチルシリル化を行った。上記第一の膜の作製後、ＴＭＥＳを窒素で０．０５％に希釈したガスを２００ｓｃｃｍで真空チャンバー内に導入し、酸素とオゾンの混合ガスの導入は止め、３００℃、真空度−０．０９９ＭＰａで２時間反応させた。【０１８４】
第一の膜の作製及び第一の膜表面のメチルシリル化（第二の膜の作製）を終えたカラムハードウェアにオクタデシルシリル化シリカゲル（ＩｎｅｒｔＳｕｓｔａｉｎＳｗｉｆｔ  Ｃ１８、１．９μｍ、ジーエルサイエンス社）を充填し、内径２．１ｍｍ、長さ５ｃｍのカラムを作製した。作製したカラムを使用し、以下の条件で、金属配位性で塩基を持つ化合物の分析を行い、ピーク形状を確認した（図１５）。【０１８５】
ＵＨＰＬＣ装置Ｎｅｘｅｒａ（登録商標）（島津製作所社）を使用し、移動相（５ｍＭ  ギ酸アンモニウムの水溶液）を０．４ｍＬ／ｍｉｎの流速で送液した。温度条件は４０℃とした。検出には、ＭＳ／ＭＳ検出器（ＬＣＭＳ−８０３０  ｐｌｕｓ、島津製作所社）を使用した。検出器のイオン化はポジティブモードで行い、検出にはＭＲＭ（Ｍｕｌｔｉ  Ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ  Ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ）を使用した。試料には、試料Ｉ：アデノシン三リン酸（ＡＴＰ、５００μｇ／Ｌ）、アデノシン二リン酸（ＡＤＰ、５００μｇ／Ｌ）、アデノシン一リン酸（ＡＭＰ、５００μｇ／Ｌ）の水溶液を使用した。試料注入容量は２μＬとした。【０１８６】
採取したクロマトグラムを図１５に示す。図１５では、ＡＴＰにはテーリングが見られるが、ＡＤＰ、ＡＭＰはいずれも対称性の良いピークとして溶出した。【０１８７】
図１５では、ステンレス製カラムハードウェアの移動相接液部はＤＭＤＥＳを原料とした第一の膜で被覆され、更に第一の膜の表面はメチルシリル化され、シラノール基が少なくなっているため、ＡＴＰにはテーリングが見られるが、ＡＤＰ、ＡＭＰはいずれも対称性の良いピークとして溶出したことが分かる。【０１８８】
以上の結果より、以下のことがわかる。即ち、実施例１、実施例２、実施例３の結果（図４（Ａ）、図５、図６（Ａ））から、液体クロマトグラフィー用金属製カラムハードウェアの移動相接液部への、ＳｉＯ２の第一の膜の作製と、第一の膜の表面部分をメチルシリル化する第二の膜の作製では、第二の膜の原料をジメチルジエトキシシラン（ＤＭＤＥＳ）とし、反応時間を２時間とした場合、第一の膜の原料はＤＭＤＥＳが最も有効であり、メチルトリエトキシシラン（ＭＴＥＳ）が次に有効であり、パーヒドロポリシラザンがその次に有効であった。【０１８９】
又、実施例１、実施例３、実施例４の結果（図４（Ａ）、図６（Ａ）、図８（Ａ））から、第一の膜がパーヒドロポリシラザンを原料とする層とＤＭＤＥＳを原料とする層の積層により作製された場合、最終的にＤＭＤＥＳを原料とする層が第一の膜の表面となっていれば、その後作製される第二の膜の原料がＤＭＤＥＳの場合の結果（図８（Ａ））は、第一の膜の原料がパーヒドロポリシラザン、第二の膜の原料がＤＭＤＥＳの場合の結果（図４（Ａ））よりも、第一の膜の原料がＤＭＤＥＳ、第二の膜の原料がＤＭＤＥＳの場合の結果（図６（Ａ））と近くなった。【０１９０】
又、実施例３と実施例５の結果（図６（Ａ）、図６（Ｂ）、図９（Ａ）、図９（Ｂ））から、内径２．１ｍｍ、長さ５ｃｍのカラム管を含むカラムハードウェアと、内径２．１ｍｍ、長さ１５ｃｍのカラム管を含むカラムハードウェアでは、第一の膜の原料をＤＭＤＥＳとして９０分間反応させ、第二の膜の原料をＤＭＤＥＳとして２時間メチルシリル化する同じ作製方法により、同等の性能且つ十分な性能を得られるカラムハードウェアが作製出来た。【０１９１】
又、実施例６と実施例３の結果（図１２、図６（Ａ））から、同じ寸法のカラムハードウェアに同じ作製方法（第一の膜の原料をＤＭＤＥＳとして９０分間反応）で第一の膜を作製し、第二の膜の原料が同じＤＭＤＥＳの場合では、第二の膜を作製する反応時間が１時間よりも２時間と長い方が、金属配位性で塩基を持つ化合物の、カラムハードウェアへの非特異的吸着をより低減出来ることがわかった。【０１９２】
又、実施例７、実施例８の結果（図１３（Ａ）、図１４（Ａ）、図１４（Ｂ））から、内径２．１ｍｍ、長さ５ｃｍのカラム管を含むカラムハードウェアでは、第一の膜の原料をＤＭＤＥＳとして９０分間反応させ、第二の膜の原料をＤＭＤＥＳとして２時間メチルシリル化する作製方法で十分な性能を得られたが、内径１．０ｍｍ、長さ１０ｍのステンレス製カラム管では、第一の膜の原料をＤＭＤＥＳとして９０分間反応させ、第二の膜の原料をＤＭＤＥＳとして２時間メチルシリル化する作製方法では内径２．１ｍｍ、長さ５ｃｍのカラム管を含むカラムハードウェアとは同様の性能を得られず、同様の性能を得るためには、第一の膜の作製には４時間以上の反応が必要であることがわかった。【０１９３】
又、実施例３、実施例９の結果（図６（Ａ）、図１５）から、第一の膜の原料をＤＭＤＥＳとして９０分間反応させ、第二の膜の原料をＤＭＤＥＳとして２時間メチルシリル化する作製方法と、第一の膜の原料をＤＭＤＥＳとして９０分間反応させ、第二の膜の原料をＴＭＥＳとして２時間メチルシリル化する作製方法を比べると、第二の膜の原料がＤＭＤＥＳの方が、良い結果が得られた。【０１９４】
更に、実施例３と実施例５では、内径２．１ｍｍ、長さ５ｃｍのカラム管及び内径２．１ｍｍ、長さ１５ｃｍのカラム管で、アデノシン一リン酸（ＡＭＰ）のピーク高さが比較例のＰＥＥＫカラムでのＡＭＰのピーク高さを上回る程の性能を得るための第一の膜を９０分間の酸化と加熱により作製出来たが、実施例８では、内径１．０ｍｍ、長さ１０ｍのカラム管で、９０分間の酸化と加熱では実施例３と実施例５のカラム管とは同等の性能を得られず、４時間の酸化と加熱により、実施例３と実施例５のカラム管と同等の性能を得られた。このことから、第一の膜の作製にあたり、液体クロマトグラフィー用カラムハードウェアに含まれるカラム管への、不活性ガスで希釈した原料の拡散については、カラム管が円筒状であるため、内径が小さいほど、又、長さが大きいほど、原料の拡散がし難くなり、第一の膜の作製のための空気中での加熱、又は空気中又は真空中での酸化と加熱に時間を要することが分かる。【０１９５】
又、実施例３で使用した内径２．１ｍｍのカラム管を用いたカラムハードウェアでは、厚さ１ｍｍ、孔径は１．９μｍ以下のフリットを使用し、フリットの孔径が非常に小さいにも関わらず、９０分間の酸化と加熱で、アデノシン一リン酸（ＡＭＰ）のピーク高さが比較例のＰＥＥＫカラムでのＡＭＰのピーク高さを上回る程の性能を得るための第一の膜を作製出来ていることが分かる。カラムハードウェアのカラム管の内径が１．０ｍｍであった場合も、充填剤径が１．９μｍなら、内径２．１ｍｍのカラム管を用いたカラムハードウェアで使用するフリットと厚さ、孔径は同じフリットを使用することが出来る。【０１９６】
又、実施例３と実施例５で使用した内径２．１ｍｍのカラム管を用いたカラムハードウェアでは、内部加工可能な最も小さい内径の流路を持つエンドユニオンを使用し、エンドユニオン内の流路は、９０分間の酸化と加熱で、アデノシン一リン酸（ＡＭＰ）のピーク高さが比較例のＰＥＥＫカラムでのＡＭＰのピーク高さを上回る程の性能を得るための第一の膜を作製することが出来ている。カラムハードウェアの内径が１．０ｍｍであった場合も、上記内径２．１ｍｍのカラムハードウェアで使用するエンドユニオン内流路と同じ内径、長さの流路を持つエンドユニオンを使用することが出来る。【０１９７】
本発明では、液体クロマトグラフィー用カラムハードウェアの金属製の移動相接液部にＳｉＯ２の第一の膜が設けられ、第一の膜上に、ＳｉＯ２のシラノール基がアルキルシリル化されて作製された第二の膜が設けられていることを特徴とするが、第一の膜上に、ＳｉＯ２のシラノール基がアルキル基とは別の官能基を持つシリル化剤と縮合して第二の膜が設けられる場合には、充填剤の主な相互作用特性を阻害せず、且つシリル化の被覆率が下がらないように留意する必要がある。例えば、充填剤がアミノプロピルシリル化シリカゲルの場合は、第一の膜上に、ＳｉＯ２のシラノール基がアミノプロピルシリル化されて作製された第二の膜が設けられることが好ましい。又、充填剤がジヒドロキシプロピルシリル化シリカゲルの場合は、第一の膜上に、ＳｉＯ２のシラノール基がジヒドロキシプロピルシリル化されて作製された第二の膜が設けられることが好ましい。
【産業上の利用可能性】
【０１９８】
以上のような本発明によれば、液体クロマトグラフィーにおいて、カラムの性能の向上、即ち金属配位性化合物のカラムへの非特異的吸着の低減、及び塩基性化合物又は塩基を持つ化合物のカラムへの非特異的吸着の低減が可能となったので、物質の分析、分取効率が向上し、様々な分野の研究並びに応用において利用が可能である。
【符号の説明】
【０１９９】
１      カラムハードウェア
１１    カラムハードウェア
１２    カラムハードウェア
２１     カラム管
２２    フリット（フィルター）
２３    エンドユニオン
２４    分散盤
３      移動相接液部
４      膜
４１     第一の膜
４２    第二の膜
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【国際調査報告】
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