(57)【要約】  本発明の目的は、ペプチド配列を抗体に挿入することにより、抗体に別の結合活性を付与するための、効率的かつ汎用的な方法を提供することである。本発明は、抗体のＦｃ領域に、当該抗体の認識する第一の標的分子とは異なる第二の標的分子に対する結合能を有する環状ペプチドの内部ペプチド配列を挿入することにより、抗体に第二の標的分子に対する結合能を付与する方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗体のＦｃ領域に、当該抗体の認識する第一の標的分子とは異なる第二の標的分子に対する結合能を有する環状ペプチドの内部ペプチド配列を挿入することにより、抗体に第二の標的分子に対する結合能を付与する方法。
【請求項２】
抗体のＦｃ領域が、ヒト、マウス、ラット、ウサギ、ウマ又はイヌ由来である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
内部ペプチド配列を挿入する部位が、Ｆｃ領域における分子表面に露出しているループ部分である、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
環状ペプチドが、ディスプレイ型探索システムにより得られる環状ペプチドである、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
抗体のＦｃ領域に、該抗体の認識する第一の標的分子とは異なる第二の標的分子に対する結合能を有する環状ペプチドの内部ペプチド配列が挿入された、第一及び第二の標的分子に対する結合能を有する改変型抗体。
【請求項６】
第一及び第二の標的分子に対して同時に結合する、請求項５に記載の改変型抗体。
【請求項７】
第一及び第二の標的分子が、それぞれ異なる細胞表面分子であり、２つの異なる細胞表面分子との結合を介して異種細胞同士の接着を誘導する、請求項５又は６に記載の改変型抗体。 
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新たな結合特異性を抗体に付与する超汎用法等に関する。
【背景技術】
【０００２】
抗体の機能は、本質的に、標的分子として、ただ一つの抗原分子に特異的に結合することである。タンパク質工学的手法により得られる改変型抗体として、二つ以上の異なる抗原分子を認識する抗体（多重特異性抗体：ＭｓＡｂ）がある。
ＭｓＡｂは、一つの抗体が二つ以上の標的分子に同時に結合するので、がん細胞とリンパ球のような異種細胞同士を架橋して抗がん作用を発揮する医薬として利用できる。また、抗体固有の第一の結合特異性を有する抗体に、第二の結合特異性を付与することで、ＭｓＡｂを望みの組織や細胞に集積させることも可能である。
加えて、例えば、免疫チェックポイント阻害抗体とアポトーシス誘導抗体と、本来なら二つの抗体を併用しなければならないような場合にも、ＭｓＡｂを用いることで、二つの抗体の投与を一つの抗体の投与で代替することが可能であり、コストを低減する効果も期待できる。
このように、ＭｓＡｂは、抗体医薬の開発において極めて重要視されている。【０００３】
ＭｓＡｂとして、二つの抗原認識Ｆａｂ領域を異なる抗体由来のもので組み合わせる形の二重特異性抗体（ＢｓＡｂ）に対して、Ｆａｂ領域以外の場所に第二の結合特異性を埋め込むことでＩｇＧ型のＢｓＡｂを創生したのがＦｃａｂと呼ばれる技術である（非特許文献１）。
Ｆｃａｂにおいて、二つのＦａｂ領域は元の抗体のままであるため、抗体が本来有する第一の結合特異性に関しては、野生型ＩｇＧ抗体と同様に二価の結合が保証される。
Ｆｃａｂにおいて、第二の結合特異性は、Ｆｃ領域の特定のループ構造をランダム化し、その中から標的分子への親和性を獲得したものを選択するという方法で得られている。この場合、元のＩｇＧ抗体に比較してＦｃ領域内の複数の領域で合計３０残基以下程度のアミノ酸変異を持つことになるが、第二の結合特異性はＦａｂ領域とは独立なＦｃ領域に付与されるため、いったん結合特異性をもつＦｃ配列が入手できれば、それを複数の抗体（のＦａｂ）と組み合わせることで多様なＢｓＡｂを創成することができる可能性がある。
しかしながら、ランダム化ループライブラリーからの特異的なバインダーの選択は一般に成功確率が極めて低く、膨大な試行錯誤を必要とし、しかも多くの場合、弱いバインダー配列をもとに人工分子進化等により段階を経て実用レベルに耐える親和性のバインダーを探索するという工程が必要とされる。さらに、このようにしてＩｇＧ抗体に付与できる新たな結合特異性は一般に一つである。よって、第三、第四の結合特異性付与を実現した例はない。【０００４】
ＢｓＡｂの製造を目的とするものではないものの、一般に体内での安定性が低い生理活性ペプチドについて、体内寿命を延ばすなどの目的で抗体のＦｃ領域を利用する技術も開示されている。
例えば、標的タンパク質に対して特異的な結合ペプチドを安定化する方法として、特許文献１には、該ペプチドが天然アミノ酸のみで構成されている場合には、Ｆｃ領域の末端に付加する形で融合物として遺伝子組み換えにより、発現生産することが開示されている。しかしながら、当該方法では、Ｆｃ領域の末端に付加するため、標的に対する高い結合親和性と特異性を担保するためのペプチド固有の三次元構造を制御することは一般に不可能である。【０００５】
また、特許文献２では、Ｆｃ領域のループ構造に、ペプチドを挿入する技術が開示されている。しかしながら、ペプチドの挿入部位としてＦｃ領域のループ構造上の多くの部位を検証したにもかかわらず、挿入されたペプチドが十分な活性を保持していたのは、特定の１カ所（Ｌ１３９／Ｔ１４０）に挿入された場合のみであり、他の部位に挿入された場合には、融合ペプチドの大腸菌における発現や標的分子への結合活性に問題があることが開示されている（実施例１３、表１２〜１４）。さらに、そのような限定されたＦｃ領域のループ構造に対し、どのような生理活性ペプチドを挿入すればその活性が再現できるのかに関する条件は明示されておらず、膨大な数存在する天然及び非天然（人工的）の標的結合性ペプチドの中から高い成功率でＭｓＡｂの創成に資するものを選択することは困難である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】国際公開第２００１／０８３５２５号
【特許文献２】国際公開第２００６／０３６８３４号
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Protein Eng Des Sel. 2010; 23(4):289-297
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
上述のように、抗体に対して生理活性ペプチド等を導入する技術は知られているものの、抗体に別の結合特異性を付与できる効率的かつ汎用的な方法は存在していないのが現状である。
そこで、本発明は、上記従来技術が有する問題に鑑みてなされたものであり、その目的は、ペプチド配列を抗体に挿入することにより、抗体に別の結合活性を付与するための、効率的かつ汎用的な方法を提供することにある。また、本発明は、当該方法により得られる改変型抗体を提供することをも目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らが、鋭意検討した結果、ペプチド配列として、環状ペプチドの内部配列を用いることにより、上記課題を解決し得ることを見出し、本発明を完成した。【００１０】
本発明は、以下のとおりである。
（１）
抗体のＦｃ領域に、当該抗体の認識する第一の標的分子とは異なる第二の標的分子に対する結合能を有する環状ペプチドの内部ペプチド配列を挿入することにより、抗体に第二の標的分子に対する結合能を付与する方法。
（２）
抗体のＦｃ領域が、ヒト、マウス、ラット、ウサギ、ウマ又はイヌ由来である、（１）に記載の方法。
（３）
内部ペプチド配列を挿入する部位が、Ｆｃ領域における分子表面に露出しているループ部分である、（１）又は（２）に記載の方法。
（４）
環状ペプチドが、ディスプレイ型探索システムにより得られる環状ペプチドである、（１）〜（３）のいずれかに記載の方法。
（５）
抗体のＦｃ領域に、該抗体の認識する第一の標的分子とは異なる第二の標的分子に対する結合能を有する環状ペプチドの内部ペプチド配列が挿入された、第一及び第二の標的分子に対する結合能を有する改変型抗体。
（６）
第一及び第二の標的分子に対して同時に結合する、（５）に記載の改変型抗体。
（７）
第一及び第二の標的分子が、それぞれ異なる細胞表面分子であり、２つの異なる細胞表面分子との結合を介して異種細胞同士の接着を誘導する、（５）又は（６）に記載の改変型抗体。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によれば、環状ペプチドの内部配列を、抗体に挿入するペプチド配列として用いて、抗体に挿入することにより、抗体に別の結合活性を自在に付与することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】実施例で用いた環状ペプチドの構造を示す。環状ペプチドを示す一般式において、ＳはＣｙｓのチオール基に由来する硫黄原子を意味する。Ｘａａは任意のアミノ酸を示し、ｓは任意の０以上の整数である。Ｖａｒｉａｂｌｅ  ｒｅｇｉｏｎ（可変領域）は、一文字標記により、環状ペプチドの内部構造を構成するアミノ酸配列を示し、小文字で示したアミノ酸（ｗ、ｙなど）はそれぞれ、Ｄ体のアミノ酸（Ｄ−Ｔｒｐ、Ｄ−Ｔｙｒ）を示す。配列番号：１〜５は、Ｖａｒｉａｂｌｅ  ｒｅｇｉｏｎ（可変領域）として示されるアミノ酸配列のうち、Ｄ体のアミノ酸を除いたアミノ酸配列を示す。
【図２】ヒトＩｇＧ由来Ｆｃ領域の立体構造を示す（ＰＤＢ  ＩＤ：１ＦＣ１）。Ｆｃ領域を構成する一方の重鎖を表面モデルで（奥側）、他方の重鎖をリボンモデルで示す（手前側）。新たな特性を付与できる表在性ループ構造はリボンモデルで示した重鎖において、９カ所の黒いＣα球として示す。
【図３】ヒトＩｇＧ１のヒンジ領域及びＦｃ領域のアミノ酸配列を示す（配列番号：６）。新たな特異性を付与できるループ構造は黒い背景で示す。アミノ酸番号はＣｈｏｔｈｉａらの番号付けを用いた。下線を付した部分は、ＩｇＧ分子のなかでＦｃ領域とＦａｂ領域をつなぐヒンジ領域を示す。
【図４】Ｅｘｐｉ２９３Ｆ細胞から発現・分泌させた抗ニューロピリン１抗体（Ｎ１  ＩｇＧ）及びその環状ペプチド（プレキシンＢ１結合ペプチドｍＰ６−９）挿入改変型抗体のＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す。例えば、ｍＰ６−９＿Ｔ１との記載は、図２におけるＴ１サイトに、図１における環状ペプチドのｍＰ６−９を挿入していることを示す。
【図５】抗ニューロピリン１抗体（Ｎ１  ＩｇＧ）及びその環状ペプチド（プレキシンＢ１結合ペプチドｍＰ６−９）挿入改変型抗体の、プレキシンＢ１発現細胞への結合をＦＡＣＳで評価した結果を示す。ペプチド挿入前の野性型Ｎ１  ＩｇＧの結合ヒストグラムをグレーで、ｍＰ６−９挿入改変型抗体（挿入サイトは各パネル上部に表示）の結合ヒストグラムを太い実線で示す。
【図６】Ｅｘｐｉ２９３Ｆ細胞から発現・分泌させた抗ニューロピリン１抗体（Ｎ１  ＩｇＧ）及びそのＢ１サイトに様々な環状ペプチドを挿入した改変型抗体のＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す。
【図７】抗ニューロピリン１抗体（Ｎ１  ＩｇＧ）及びそのＢ１サイトに様々な環状ペプチドを挿入した改変型抗体の、環状ペプチドに対応する第二の標的分子への結合をＦＡＣＳで評価した結果を示す。コントロール細胞への結合ヒストグラムをグレーで、第二の標的分子（ｍＰ６−９についてはプレキシンＢ１、ａＭＤ５についてはＭｅｔ、Ａ６−２ｆについてはＥＧＦＲ、ｔｒｋＤ５についてはＴｒｋＢ）を発現する細胞への結合ヒストグラムを太い実線で示す。
【図８】Ｅｘｐｉ２９３Ｆ細胞から発現・分泌させた抗ニューロピリン１抗体（Ｎ１  ＩｇＧ）及びその環状ペプチド挿入改変型抗体のＳＤＳ−ＰＡＧＥ（Ａ）と、ＦＡＣＳによるそれらの対応標的分子への結合ヒストグラム（Ｂ）を示す。標的分子への結合は、抗体なしのヒストグラム（ｃｏｎｔｒｏｌ）の平均蛍光強度（ｍｅａｎ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ）に対して１０倍以上のシグナルが得られたときを陽性（＋）とし、それ以外を陰性（−）とした。
【図９】Ｅｘｐｉ２９３Ｆ細胞から発現・分泌させた抗ＰＤ−Ｌ１抗体（Ａｖｅ  ＩｇＧ）及びその環状ペプチド挿入改変型抗体のＳＤＳ−ＰＡＧＥ（Ａ）と、ＦＡＣＳによるそれらの対応標的分子への結合ヒストグラム（Ｂ）を示す。標的分子への結合は、抗体なしのヒストグラム（ｃｏｎｔｒｏｌ）の平均蛍光強度（ｍｅａｎ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ）に対して１０倍以上のシグナルが得られたときを陽性（＋）とし、それ以外を陰性（−）とした。
【図１０】Ｅｘｐｉ２９３Ｆ細胞から発現・分泌させた抗ＣＤ３抗体（ＯＫＴ３  ＩｇＧ）及びその環状ペプチド挿入改変型抗体のＳＤＳ−ＰＡＧＥ（Ａ）と、ＦＡＣＳによるそれらの対応標的分子への結合ヒストグラム（Ｂ）を示す。標的分子への結合は、抗体なしのヒストグラム（ｃｏｎｔｒｏｌ）の平均蛍光強度（ｍｅａｎ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ）に対して１０倍以上のシグナルが得られたときを陽性（＋）とし、それ以外を陰性（−）とした。
【図１１】Ｅｘｐｉ２９３Ｆ細胞から発現・分泌させた抗トランスフェリン受容体抗体（８Ｄ３  ＩｇＧ）及びその環状ペプチド挿入改変型抗体のＳＤＳ−ＰＡＧＥ（Ａ）と、ＦＡＣＳによるそれらの対応標的分子への結合ヒストグラム（Ｂ）を示す。標的分子への結合は、抗体なしのヒストグラム（ｃｏｎｔｒｏｌ）の平均蛍光強度（ｍｅａｎ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ）に対して１０倍以上のシグナルが得られたときを陽性（＋）とし、それ以外を陰性（−）とした。
【図１２】Ｅｘｐｉ２９３Ｆ細胞から発現・分泌させた抗ニューロピリン１抗体（Ｎ１  ＩｇＧ）及びその環状ペプチド挿入改変型抗体のＦＡＣＳによるそれらの対応標的分子への結合ヒストグラムを示す。標的分子への結合は、それら分子を一過性発現させた細胞への結合の陽性率が１０％を超えるものを陽性（＋）とし、それ以外を陰性（?）とした。
【図１３】本発明の改変型抗体が二種の標的分子を同時に結合することを示すサンドイッチ測定系の原理（Ａ）と、そのデータ（Ｂ）を示す。用いたオリジナル抗体と第一の標的分子（抗原）のアルカリフォスファターゼ（ＡＰ）融合タンパク質の組み合わせをグラフ上段に、マイクロタイタープレートにコートした環状ペプチドに対する第二の標的分子はグラフ下段に、添加した抗体又はＡｄｄｂｏｄｙ名と、得られたＡＰ基質の発色度（Ａ４０５）を中段にそれぞれ示す。
【図１４】ＣＤ３／Ｍｅｔ二重特異性抗体（ＯＫＴ３−Ａｄｄｂｏｄｙ）による異種細胞の接着誘導試験の原理（Ａ）と、そのデータ（Ｂ、Ｃ）を示す。（Ｂ）に示す蛍光顕微鏡像ではプレート上に接着したＭｅｔ発現細胞（赤色蛍光色素Ｄｉｌでラベル）とＣＤ３発現Ｊｕｒｋａｔ細胞（緑色蛍光色素ＤｉＯでラベル）が異種細胞接着をしている部分を白丸で示し、その計測結果（ｎ＝１０）を（Ｃ）に示す。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本発明を、発明を実施するための形態により具体的に説明するが、本発明は、以下の発明を実施するための形態に限定されるものではなく、種々変形して実施することができる。
【００１４】
本発明は、抗体のＦｃ領域に、当該抗体の認識する第一の標的分子（抗原とも理解される）とは異なる第二の標的分子に対する結合能（結合特異性ともいう）を有する環状ペプチドの内部ペプチド配列を挿入することにより、抗体に第二の標的分子に対する結合能を付与する方法である。
本発明の方法によれば、特定の標的分子を認識する任意の抗体に対して新たな結合特異性を付与することが可能であり、得られる改変型抗体は、元の抗体の第一の標的分子に対しての結合能だけでなく、新たに付与した環状ペプチドの第二の標的分子に対する結合能も有することとなる。
すなわち、本発明の方法においては、環状ペプチドの内部配列を、抗体に挿入するペプチド配列として用いて、抗体に挿入することにより、抗体に別の結合活性を自在に付与することができる。また、本発明の方法においては、標的分子に対して結合能を有することが知られた環状ペプチドを自在に選択することができる。
【００１５】
本発明において用いられる環状ペプチドとしては、標的分子に対する結合能を有することが知られた環状ペプチドであれば、特に限定されるものではないが、天然型の環状ぺプチドを用いてもよく、非天然型の環状ペプチドを用いてもよい。
ここで、天然型の環状ペプチドとしては、天然に存在する環状ペプチドや、天然アミノ酸により構成される環状ペプチド等が挙げられ、非天然型の環状ペプチドとしては、非天然アミノ酸を用いて、人工的に合成した環状ペプチド等が挙げられる。
天然型の環状ペプチドをタンパク質上に提示する場合には、アミノ酸残基同士を結合するいずれの結合も、分子内環状構造を形成するための化学架橋構造といえるため、いずれの結合も挿入するペプチド配列とするために分子内環状構造（閉環構造）を切断する結合として採用することもできるが、天然型環状ペプチドにおける活性部位と考えられる領域を保存する形態で、抗体に環状ぺプチドは挿入される。
【００１６】
本発明において、環状ペプチドは、標的分子に対する結合能を有するが、当該標的分子は、挿入される抗体が本来有する結合能を有する標的分子とは異なる。
本発明においては、抗体の標的分子を、第一の標的分子といい、環状ペプチドの標的分子を、第二の標的分子という。第一の標的分子と、第二の標的分子は、異なる。
なお、２つ以上の同種の環状ペプチドを用いることもできるが、２つ以上の異なる環状ペプチドが用いられる場合、第二の標的分子に対する結合能を有する環状ペプチド以外の環状ペプチドの標的分子として、第三の標的分子、第四の標的分子、あるいは第三及び第四の標的分子以外の標的分子等が挙げられる。異なる環状ペプチドにおいては、それらの環状ペプチドが結合能を有する標的分子は、同じであってもよいが、異なることが好ましい。
【００１７】
環状ペプチドは、４以上のアミノ酸残基により形成される環状構造を分子内に少なくとも有することを意味する。４以上のアミノ酸残基により形成される環状アミノ酸における環状構造は、直鎖状ペプチドにおいて、２アミノ酸以上離れた２つのアミノ酸残基が直接に、又はリンカー等を介して結合することによって分子内に形成される閉環構造である。
２つのアミノ酸残基が２アミノ酸以上離れていることは、２つのアミノ酸残基の間に少なくとも２つのアミノ酸残基が存在していることと同義であり、２つのアミノ酸残基は、その間に２つ以上のアミノ酸を介して結合することとなる。
【００１８】
環状構造における閉環構造は、特に限定されないが、２つのアミノ酸が、共有結合することにより形成される。
２つのアミノ酸間の共有結合としては、例えば、ジスルフィド結合、ペプチド結合、アルキル結合、アルケニル結合、エステル結合、チオエステル結合、エーテル結合、チオエーテル結合、ホスホネートエーテル結合、アゾ結合、Ｃ−Ｓ−Ｃ結合、Ｃ−Ｎ−Ｃ結合、Ｃ＝Ｎ−Ｃ結合、アミド結合、ラクタム架橋、カルバモイル結合、尿素結合、チオ尿素結合、アミン結合、及びチオアミド結合等が挙げられる。
２つのアミノ酸がアミノ酸の主鎖において結合すると、ペプチド結合により閉環構造が形成されるが、２つのアミノ酸の側鎖同士、側鎖と主鎖の結合等により、２つのアミノ酸間の共有結合は形成されてもよい。
【００１９】
環状構造は、直鎖状ペプチドのＮ末端とＣ末端のアミノ酸の結合に限られず、末端のアミノ酸と末端以外のアミノ酸の結合、又は末端以外のアミノ酸同士の結合により形成されてもよい。環状構造を形成のために結合するアミノ酸の一方が末端アミノ酸で、他方が非末端アミノ酸である場合、環状ペプチドは、環状構造からの鎖状の分岐鎖として、環状構造に直鎖のペプチドが尾のように付いた構造を有する。
【００２０】
環状構造を形成するアミノ酸としては、タンパク質性アミノ酸に加え、人工のアミノ酸変異体や誘導体を含み、例えば、タンパク質性Ｌ−アミノ酸、アミノ酸の特徴である当業界で公知の特性を有する化学的に合成された化合物等が挙げられる。
タンパク質性アミノ酸（ｐｒｏｔｅｉｎｏｇｅｎｉｃ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄｓ）は、当業界に周知の３文字表記により表すと、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｃｙｓ、Ｇｌｙ、Ｐｒｏ、Ａｌａ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、及びＶａｌである。
非タンパク質性アミノ酸（ｎｏｎ−ｐｒｏｔｅｉｎｏｇｅｎｉｃ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄｓ）としては、タンパク質性アミノ酸以外の天然又は非天然のアミノ酸を意味する。
非天然アミノ酸としては、例えば、主鎖の構造が天然型と異なる、α，α−二置換アミノ酸（α−メチルアラニンなど）、Ｎ−アルキル−α−アミノ酸、Ｄ−アミノ酸、β−アミノ酸、α−ヒドロキシ酸や、側鎖の構造が天然型と異なるアミノ酸（ノルロイシン、ホモヒスチジンなど）、側鎖に余分のメチレンを有するアミノ酸（「ホモ」アミノ酸、ホモフェニルアラニン、ホモヒスチジンなど）、及び側鎖中のカルボン酸官能基がスルホン酸基で置換されるアミノ酸（システイン酸など）等が挙げられる。非天然アミノ酸の具体例としては、国際公開第２０１５／０３００１４号に記載のアミノ酸が挙げられる。
【００２１】
環状構造を形成するアミノ酸の数は４以上であれば特に限定されないが、例えば、５以上、８以上、１０以上であってもよく、３０以下、２５以下、２０以下、１５以下であってもよい。
環状構造を形成するアミノ酸の数としては、４以上３０以下であることが好ましく、４以上３０以下の範囲内で、環状構造を形成するアミノ酸の数を５以上、８以上、１０以上としてもよく、２５以下、２０以下、１５以下としてもよい。
環状構造を形成するアミノ酸の数は、８以上２０以下としてもよく、１０以上２０以下としてもよく、１０以上１５以下としてもよい。
【００２２】
本発明において用いられる環状ペプチドは、公知のペプチド合成技術を用いて製造することのできる環状ペプチドである。
環状ペプチドの製造方法としては、例えば、液相法、固相法、液相法と固相法を組み合わせたハイブリッド法等の化学合成法、遺伝子組み換え法、無細胞翻訳系による翻訳合成法等が挙げられる。
【００２３】
本発明において、環状ぺプチドは、ディスプレイ型探索システムにより得られる環状ペプチドであることが好ましい。ディスプレイ型探索システムにより、標的分子に対する結合能を有する環状ペプチドを選択することができる。
【００２４】
環状ペプチドは、一般的なｍＲＮＡディスプレイ法により製造されるペプチドであってよく、ＴＲＡＰ法やＲａＰＩＤ法のようなｍＲＮＡディスプレイ法で製造されるペプチドであってもよく、また、ファージディスプレイ法により製造されるペプチドであってもよい。また、これらの変法におり製造されるペプチドであってもよい。
環状ペプチドは、分子内環状構造を形成するための化学架橋構造として、例えば、チオエーテル結合又はジスルフィド結合を含む。
通常、ＲａＰＩＤ法やＴＲＡＰ法のようなｍＲＮＡディスプレイ法やファージディスプレイ法により選択される環状ペプチドは、チオエーテル結合又はジスルフィド結合といった分子内環状構造を形成するための化学架橋構造以外の構造が、生理活性を有する活性点であることが多い。
そうすると、環状ペプチドのチオエーテル結合又はジスルフィド結合を、ループ構造を有するタンパク質との結合に置き換えることにより、通常、ＲａＰＩＤ法やＴＲＡＰ法のようなｍＲＮＡディスプレイ法やファ−ジディスプレイ法により得られる環状ペプチドの高い特異性と親和性を、所望のタンパク質の所望のループ構造内に付与することができる。また。特に限定されるものではないが、チオエーテル結合又はジスルフィド結合を分子内環状構造として有する環状ペプチドを融合することにより、環状ペプチドを汎用性をもって融合させることができる。
【００２５】
ＲａＰＩＤ法においては、例えば、下記表１に示す官能基１を有するアミノ酸と、対応する官能基２を有するアミノ酸が環状化した環状ペプチドとすることができる。
官能基１と２はどちらがＮ末端側にきてもよく、Ｎ末端とＣ末端に配置してもよいし、一方を末端アミノ酸、他方を非末端アミノ酸としてもよいし、両方を非末端アミノ酸としてもよい。
【００２６】
【表１】
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式中、Ｘ1は脱離基であり、脱離基としては、例えば、Ｃｌ、Ｂｒ及びＩ等のハロゲン原子が挙げられ、Ａｒは置換基を有していてもよい芳香環である。
【００２７】
ファージディスプレイ法においては、Ｃｙｓ同士が結合して環状化した環状ペプチドとすることができるため、官能基１としての−ＳＨと官能基２としてのＨＳ−によるジスルフィド結合を有する環状ペプチドとすることができる。
【００２８】
（Ａ−１）の官能基を有するアミノ酸としては、例えば、クロロアセチル化したアミノ酸を用いることができる。クロロアセチル化アミノ酸としては、N-chloroacetyl-L-alanine、N-chloroacetyl-L-phenylalanine、N-chloroacetyl-L-tyrosine、N-chloroacetyl-L-tryptophan、N-3-(2-chloroacetamido)benzoyl-L-phenylalanine、N-3-(2-chloroacetamido)benzoyl-L-tyrosine、N-3-(2-chloroacetamido)benzoyl-L-tryptophan、β-N-chloroacetyl-L-diaminopropanoic acid、γ-N-chloroacetyl-L-diaminobutyric acid、σ-N-chloroacetyl-L-ornithine、ε-N-chloroacetyl-L-lysine、及びこれらに対応するＤ−アミノ酸誘導体等が挙げられる。
（Ａ−１）の官能基を有するアミノ酸としては、N-chloroacetyl-L-tryptophan及びN-chloroacetyl-L-tyrosineが好適に用いられ、Ｄ体であることがより好適である。
なお、本明細書において、Ｌ体であることを明示して記載する場合があるが、Ｌ体であってもよく、Ｄ体であってもよいことを意味し、また、Ｌ体とＤ体の任意の割合での混合物であってもよい。Ｌ体及びＤ体であることを明示して記載していない場合についても、Ｌ体であってもよく、Ｄ体であってもよいことを意味し、また、Ｌ体とＤ体の任意の割合での混合物であってもよい。
【００２９】
（Ａ−２）の官能基を有するアミノ酸としては、例えばcysteine、homocysteine、mercaptonorvaline、mercaptonorleucine、2-amino-7-mercaptoheptanoic acid、及び2-amino-8-mercaptooctanoic acid等が挙げられる。
（Ａ−２）の官能基を有するアミノ酸としては、cysteineが好適に用いられる。
【００３０】
（Ａ−１）の官能基を有するアミノ酸と（Ａ−２）の官能基を有するアミノ酸による環状化方法は、例えば、Kawakami, T. et al., Nature Chemical Biology 5, 888-890 (2009)；Yamagishi, Y. et al., ChemBioChem 10, 1469-1472 (2009)；Sako, Y. et al., Journal of American Chemical Society 130, 7932-7934 (2008)；Goto, Y. et al., ACS Chemical Biology 3, 120-129 (2008)；Kawakami T. et al, Chemistry & Biology 15, 32-42 (2008)、及び国際公開第２００８／１１７８３３号等に記載された方法が挙げられる。
【００３１】
（Ｂ−１）の官能基を有するアミノ酸としては、例えば、propargylglycine、homopropargylglycine、2-amino-6-heptynoic acid、2-amino-7-octynoic acid、及び2-amino-8-nonynoic acid等が挙げられる。
4-pentynoyl化や5-hexynoyl化したアミノ酸を用いてもよい。
4-pentynoyl化アミノ酸としては、例えば、N-(4-pentenoyl)-L-alanine、N-(4-pentenoyl)-L-phenylalanine、N-(4-pentenoyl)-L-tyrosine、N-(4-pentenoyl)-L-tryptophan、N-3-(4-pentynoylamido)benzoyl-L-phenylalanine、N-3-(4-pentynoylamido)benzoyl-L-tyrosine、N-3-(4-pentynoylamido)benzoyl-L-tryptophan、β-N-(4-pentenoyl)-L-diaminopropanoic acid、γ-N-(4-pentenoyl)-L-diaminobutyric acid、σ-N-(4-pentenoyl)-L-ornithine、ε-N-(4-pentenoyl)-L-lysine、及びこれらに対応するD-アミノ酸誘導体等が挙げられる。
5-hexynoyl化アミノ酸としては、4-pentynoyl化アミノ酸として例示した化合物において、4-pentynoyl基が、5-hexynoyl基に置換されたアミノ酸が挙げられる。
【００３２】
（Ｂ−２）の官能基を有するアミノ酸としては、例えば、azidoalanine、2-amino-4-azidobutanoic acid、azidoptonorvaline、azidonorleucine、2-amino-7-azidoheptanoic acid、及び2-amino-8-azidooctanoic acid等が挙げられる。
azidoacetyl化や3-azidopentanoyl化したアミノ酸を用いることもできる。
azidoacetyl化アミノ酸としては、例えば、N-azidoacetyl-L-alanine、N-azidoacetyl-L-phenylalanine、N-azidoacetyl-L-tyrosine、N-azidoacetyl-L-tryptophan、N-3-(4-pentynoylamido)benzoyl-L-phenylalanine、N-3-(4-pentynoylamido)benzoyl-L-tyrosine、N-3-(4-pentynoylamido)benzoyl-L-tryptophan、β-N-azidoacetyl-L-diaminopropanoic acid、γ-N-azidoacetyl-L-diaminobutyric acid、σ-N-azidoacetyl-L-ornithine、ε-N-azidoacetyl-L-lysine、及びこれらに対応するD-アミノ酸誘導体等が挙げられる。
3-azidopentanoyl化アミノ酸としては、azidoacetyl化アミノ酸として例示した化合物において、azidoacetyl基が、3-azidopentanoyl基に置換されたアミノ酸が挙げられる。
【００３３】
（Ｂ−１）の官能基を有するアミノ酸と（Ｂ−２）の官能基を有するアミノ酸による環状化方法は、例えば、Sako, Y. et al., Journal of American Chemical Society 130, 7932-7934 (2008)、及び国際公開第２００８／１１７８３３号等に記載された方法が挙げられる。
【００３４】
（Ｃ−１）の官能基を有するアミノ酸としては、例えば、N-(4-aminomethyl-benzoyl)-phenylalanine (AMBF)及び3-aminomethyltyrosine等が挙げられる。
（Ｃ−２）の官能基を有するアミノ酸としては、例えば、5-hydroxytryptophan(WOH)等が挙げられる。
（Ｃ−１）の官能基を有するアミノ酸と（Ｃ−２）の官能基を有するアミノ酸による環状化方法は、例えば、Yamagishi, Y. et al., ChemBioChem 10, 1469-1472 (2009)及び国際公開第２００８／１１７８３３号に記載された方法等が挙げられる。
【００３５】
（Ｄ−１）の官能基を有するアミノ酸としては、例えば、2-amino-6-chloro-hexynoic acid、2-amino-7-chloro-heptynoic acid、及び2-amino-8-chloro-octynoic acid等が挙げられる。
（Ｄ−２）の官能基を有するアミノ酸としては、例えばcysteine、homocysteine、mercaptonorvaline、mercaptonorleucine、2-amino-7-mercaptoheptanoic acid、及び2-amino-8-mercaptooctanoic acid等が挙げられる。
（Ｄ−１）の官能基を有するアミノ酸と（Ｄ−２）の官能基を有するアミノ酸による環状化方法は、例えば、国際公開第２０１２／０７４１２９号に記載された方法等が挙げられる。
【００３６】
（Ｅ−１）のアミノ酸としては、例えば、N-3-chloromethylbenzoyl-L-phenylalanine、N-3-chloromethylbenzoyl-L-tyrosine、N-3-chloromethylbenzoyl-L-tryptophan、及びこれらに対応するD-アミノ酸誘導体等が挙げられる。
（Ｅ−２）のアミノ酸としては、例えば、cysteine、homocysteine、mercaptonorvaline、 mercaptonorleucine、2-amino-7-mercaptoheptanoic acid、及び2-amino-8-mercaptooctanoic acid等が挙げられる。
（Ｅ−１）の官能基を有するアミノ酸と（Ｅ−２）の官能基を有するアミノ酸による環状化方法は、例えば、（Ａ−１）と（Ａ−２）の環状化方法や（Ｄ−１）と（Ｄ−２）の環状化方法を参考にして行うことができる。
【００３７】
環形成アミノ酸としては、（Ａ−１）の官能基を有するアミノ酸と（Ａ−２）の官能基を有するアミノ酸との組み合わせが好ましく、脱離基でＨが置換されたＮ−アセチルトリプトファンとcysteineの組み合わせがより好ましく、N-haloacetyl-D-tyrosine又はN-haloroacetyl-D-tryptophan、好適にはN-chloroacetyl-D-tyrosine又はN-chloroacetyl-D-tryptophanとcysteine(Cys)の組み合わせがさらに好ましい。
【００３８】
本発明においては、ディスプレイ型探索システムにより得られる環状ペプチドであれば、所定の標的分子に対して結合能を有する環状ペプチドとして用いることができる。
環状ペプチドは、ＲａＰＩＤ法やＴＲＡＰ法のようなｍＲＮＡディスプレイ法やファージディスプレイ法により製造される環状ペプチドであることが好適である。
ＲａＰＩＤ法やＴＲＡＰ法のようなｍＲＮＡディスプレイ法やファージディスプレイ法により好適に製造できる、官能基１及び官能基２により形成される環状ペプチドであることが好適である。
【００３９】
本発明において、環状ぺプチドが、標的分子に対して結合能を有するとは、環状ペプチドが、標的分子に結合することができれば特に限定されるものではないが、通常抗体がその標的分子に対して示すのと同等な親和性値（ＫD値でおよそ１μＭ以下）をもつことが好ましい。
また、環状ペプチドが、標的分子に結合能を有すると共に、阻害剤や活性化剤として機能してもよく、アゴニスト活性やアンタゴニスト活性を有していてもよい。
【００４０】
環状ペプチドに対応する第二の標的分子に対する結合活性として、本発明の改変型抗体は、元の環状ペプチドにおける第二の標的分子への結合活性の、好ましくは１０％以上を有するが、例えば、２０％以上、３０％以上、４０％以上、５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、１００％以上有していてもよい。
【００４１】
標的分子としては、第一の標的分子であっても、第二の標的分子であっても、また、それら以外の標的分子であっても、特に限定されるものではないが、細胞表面の分子、例えば、細胞接着受容体、サイトカイン受容体、成長因子受容体、免疫受容体、シグナル分子受容体、Ｇタンパク質共役型受容体、トランスフェリン受容体、トランスポーター、チャンネル分子、あるいは可溶性分子、例えば、成長因子、サイトカイン、シグナル分子、トランスフェリン、血液凝固因子、細胞外マトリックスタンパク質等が挙げられる。
【００４２】
本発明において用いられる環状ペプチドについて、ＲａＰＩＤ法により製造される環状ペプチドを例に、以下説明する。
本発明において、ＲａＰＩＤ法により製造される環状ペプチドとしては、特に限定されるものではないが、以下の一般式で表される環状ペプチドが挙げられる。
【化１】
2020027224.tif 000003
上記一般式で表される環状ペプチドは、例示となるが、表１に記載の官能基１及び官能基２として、（Ａ）である場合の構造を有する。
ここで、一般式において、ＳはＣｙｓのチオール基に由来する硫黄原子を意味する。Ｘａａは任意のアミノ酸を示し、ｓは任意の０以上の整数である。Ｖａｒｉａｂｌｅ  ｒｅｇｉｏｎ（可変領域）は、環状アミノ酸を構成するＣｙｓ以外のアミノ酸配列を示す。Ｖａｒｉａｂｌｅ  ｒｅｇｉｏｎ（可変領域）のＮ末端のアミノ酸は、上記（Ａ−１）の官能基を有するアミノ酸であることが好ましい。
Ｖａｒｉａｂｌｅ  ｒｅｇｉｏｎ（可変領域）のアミノ酸配列は、ＲａＰＩＤ法により製造される環状ペプチドにおける部分アミノ酸配列であり、環状ペプチドを構成する限り、任意のアミノ酸配列であり得る。
【００４３】
環状ペプチド（Ｃｙｃｌｉｃ  Ｐｅｐｔｉｄｅとして、「ＣＰ」と記載する場合がある。）として、上記一般式で表されるペプチドが用いられる場合には、Ｖａｒｉａｂｌｅ  ｒｅｇｉｏｎのＮ末端のアミノ酸残基を、ＣＰＮとし、Ｃｙｓを、ＣＰＣとする。
ＣＰＮが、例えば、非タンパク質性アミノ酸であるＮ−ｈａｌｏｒｏａｃｅｔｙｌ−Ｄ−ｔｒｙｐｔｏｐｈａｎである場合には、タンパク質性アミノ酸であるＬ−ｔｒｙｐｔｏｐｈａｎに置換して、例えば、非タンパク質性アミノ酸であるＮ−ｃｈｌｏｒｏａｃｅｔｙｌ−Ｄ−ｔｙｒｏｓｉｎｅである場合には、タンパク質性アミノ酸であるＬ−ｔｙｒｏｓｉｎｅに置換して環状ペプチドが融合されることが好適である。また、ＣＰＮをタンパク質性アミノ酸であるＣｙｓに置換してもよい。ＣＰＣが、例えば、Ｃｙｓである場合には、ＣＰＣを欠失させて環状ペプチドが融合されることが好適であるし、また、ＣＰＣがＣｙｓである場合に、ＣＰＣであるＣｙｓをも融合させる場合には、ＣＰＮをＣｙｓに置換して融合することも好ましい。一般式で表される環状ペプチドが挿入される場合、所望により、Ｄ−アミノ酸は、Ｌ−アミノ酸に置換されるものの、環状ペプチドの環状構造を構成するアミノ酸配列の部分アミノ酸配列として、Ｖａｒｉａｂｌｅ  ｒｅｇｉｏｎ（可変領域）のアミノ酸配列が抗体に挿入されることが好ましい。
本発明においては、Ｖａｒｉａｂｌｅ  ｒｅｇｉｏｎ（可変領域）のアミノ酸配列の一部が、例えば、ＣＰＮが非タンパク質性アミノ酸である場合に、タンパク質性アミノ酸に置換されている場合も、Ｖａｒｉａｂｌｅ  ｒｅｇｉｏｎ（可変領域）のアミノ酸配列が抗体に挿入されていると理解される。Ｖａｒｉａｂｌｅ  ｒｅｇｉｏｎ（可変領域）とＣＰＣであるＣｙｓが共に、融合されていてもよい。
【００４４】
ＲａＰＩＤ法やＴＲＡＰ法のようなｍＲＮＡディスプレイ法やファージディスプレイ法により好適に製造できる環状ペプチドを抗体に挿入する場合には、具体的には、以下のような改変を行うことも好適である。
（１）ＲａＰＩＤ法やＴＲＡＰ法のようなｍＲＮＡディスプレイ法やファージディスプレイ法における分子内環状構造を形成するための化学架橋構造に関与するアミノ酸残基、例えば、表１に記載の官能基を有するアミノ酸残基であって、具体的には、（Ａ−１）〜（Ｅ−２）として記載されるアミノ酸をそれぞれ置換又は削除して、環状ペプチドの内部アミノ酸配列を、抗体に挿入してもよい。
具体的には、ＲａＰＩＤ法による環状ペプチドにおいては、官能基１を有するアミノ酸残基をタンパク質性アミノ酸に置換し、官能基２を有するアミノ酸残基をそれぞれ欠失して、抗体に挿入する。官能基１を有するアミノ酸残基として、Ｄ−アミノ酸等の非・BR>^ンパク質性アミノ酸が用いられることがある。
ファージディスプレイ法による環状ぺプチドにおいては、化学架橋構造であるＳ−Ｓ結合を構成するＣｙｓ残基を削除して、抗体に挿入してもよい。
より具体的には、ＲａＰＩＤ法において、官能基１として（Ａ−１）の構造が採用されている場合、一般に、（Ａ−１）の構造を有するアミノ酸としては、ＣｌＡｃ−Ｄ−ＴｒｐやＣｌＡｃ−Ｄ−Ｔｙｒが用いられていることが多いが、抗体への挿入の際には、該アミノ酸残基をＬ−ＴｒｐやＬ−Ｔｙｒに置換することが好ましい。また、ＣｌＡｃ−Ｄ−ＴｒｐやＣｌＡｃ−Ｄ−Ｔｙｒを欠失させてもよい。
また、（Ａ−２）の構造を有するアミノ酸としては、Ｃｙｓが用いられていることが多いが、抗体への挿入の際には、該Ｃｙｓ残基を欠失させてもよい。
（２）（１）において、環状ペプチドは有さないが、Ｓｅｒ、Ｇｌｙ及びＣｙｓといったアミノ酸残基からなるアミノ酸配列を環状ペプチドと抗体とのリンカー配列として用いて、環状ペプチド由来のアミノ酸残基と、抗体由来のアミノ酸残基との間に挿入してもよい。
（３）分子内環状構造を形成するための化学架橋構造に関与するアミノ酸残基をＬ−Ｃｙｓに変換し、環状ペプチドを抗体に挿入した改変型抗体において、ジスルフィド結合により架橋構造を形成させると共に、Ｓｅｒ及びＧｌｙといったアミノ酸残基からなるアミノ酸配列を環状ペプチドと抗体との結合におけるリンカー配列として用いて、環状ペプチド由来のアミノ酸残基と、抗体由来のアミノ酸残基との間に挿入してもよい。
リンカー配列を構成するアミノ酸残基の数は、１以上のアミノ酸残基であればよく、アミノ酸残基の数は、特に限定されるものではない。
【００４５】
環状ペプチドの内部ペプチド配列とは、環状ペプチドを構成するペプチド配列であって、少なくとも、標的分子に対する結合能を有する領域を含んでいれば特に限定されない。
環状ペプチドの一次配列をＣＰＮ−（Ｘａａ１）ｍ−ＣＰＣであるとして、以下説明する。
環状ペプチドとしては、ＣＰＮ−（Ｘａａ１）ｍ−ＣＰＣとして表されるアミノ酸残基のうち、ＣＰＮとＣＰＣとが、好適には、共有結合して環状構造を形成する。
なお、一次配列において、環状ペプチドを形成し得る限り、Ｘａａ１は、任意のアミノ酸残基であり、ｍは、２以上の任意の整数である。
環状ペプチドは、分子内環状構造以外にも環状構造からの鎖状の分岐鎖を有していてもよい。
環状ペプチドの内部ペプチド配列とは、ＣＰＮ−（Ｘａａ１）ｍ−ＣＰＣの一次配列そのものであってもよく、ＣＰＮ−（Ｘａａ１）ｍ−ＣＰＣにおけるアミノ酸残基の一部が置換又は欠失されていてもよく、ＣＰＮ−（Ｘａａ１）ｍが一部が欠失されたアミノ酸として例示される。
また、環状ペプチドの内部ペプチド配列は、ＣＰＮ−（Ｘａａ１）ｍ−ＣＰＣとして表されるｍ＋２のアミノ酸残基のうち、少なくともｍ＋２のアミノ酸残基の一部を含んでいればよく、ＣＰＮ−（Ｘａａ１）ｍ１、（Ｘａａ１）ｍ１−ＣＰＣ、（Ｘａａ１）ｍ１を環状ペプチドの内部ペプチド配列として用いることができる。
ここで、ｍ１は、ｍ以下の整数である。
【００４６】
環状ペプチドの内部ペプチド配列を抗体に挿入する場合には、所望によりリンカー配列を介して、抗体に挿入されてもよい。
環状ぺプチドが、内部ペプチド配列に非タンパク質性アミノ酸を含む場合には、非タンパク質性アミノ酸は、タンパク質性アミノ酸に置換されていることが好ましく、ＣＰＮ及び／又はＣＰＣがＣｙｓである場合には、ＣＰＮ及び／又はＣＰＣを欠失させてもよく、ＣＰＣがＣｙｓである場合には、ＣＰＮは、Ｃｙｓに置換して、環状ペプチドが挿入されていてもよい。
環状ペプチドの内部ペプチド配列を抗体に挿入する際に、環状ペプチドに由来するアミノ酸は、ＣＰＮで結合していてもよく、ＣＰＮでリンカー配列を介して結合していてもよく、ＣＰＮから任意の数で表される番目のＸａａ１で結合していてもよく、ＣＰＮから任意の数で表される番目のＸａａ１でリンカー配列を介して結合していてもよい。中でも、ＣＰＮが非タンパク質性アミノ酸である場合には、ＣＰＮをタンパク質性アミノ酸に置換して、所望によりリンカー配列を介して結合していてもよい。
また、環状ペプチドの内部ペプチド配列を抗体に挿入する際に、環状ペプチドに由来するアミノ酸は、ＣＰＣで結合していてもよく、ＣＰＣでリンカー配列を介して結合していてもよく、ＣＰＣから任意の数で表される番目のＸａａ１で結合していてもよく、ＣＰＣから任意の数で表される番目のＸａａ１でリンカー配列を介して結合していてもよい。中でも、ＣＰＣを欠失させて、ＣＰＣから数えて１番目のＸａａ１で、すなわち、ＣＰＣと結合するＸａａ１で、所望によりリンカー配列を介して結合していてもよい。
【００４７】
本発明において、環状ペプチドの内部ペプチド配列が挿入される抗体としては、特に限定されるものではない。
抗体は、免疫グロブリンとも呼ばれ、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥの５種類に分類される。
本発明において、環状ペプチドの挿入される抗体としては、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥのいずれであってもよいが、ＩｇＧが好適に用いられる。
ＩｇＧとしては、多数のサブクラスが知られている。ＩｇＧのサブクラスとして、例えば、ヒトではＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４の４種類のサブクラスが、マウスではＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ３の４種類が、ラットではＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ２ｃの４種類が知られているが、いずれであってもよい。
【００４８】
抗体は、本質的に、標的分子として、ただ一つの抗原分子に特異的に結合するため、抗体の認識する抗原が、本発明における第一の標的分子といえる。
抗体は、それぞれ、抗原を認識する部位といえる可変領域と、それ以外の部分である定常領域を有する重鎖と軽鎖とを２本ずつ有する。
抗体をタンパク質分解酵素であるパパイン消化した際に、Ｈ鎖−Ｈ鎖を繋ぐジスルフィド結合（ヒンジ部位）の間が切断され、抗体は３つの断片に分かれ、Ｎ末端側の２つの断片をＦａｂ領域、Ｃ末端側の断片をＦｃ領域という。
一般にＦｃ領域は、同じサブクラスであれば抗体間でその構造が同一である。
本発明において用いられる抗体は、Ｎ末端側の２つの断片であるＦａｂ領域を少なくとも１つと、Ｆｃ領域とを含む。Ｆａｂ領域を２つ含む抗体である場合、２つのＦａｂ領域は同一であってもよく、異なっていてもよく、Ｆａｂ領域が異なる場合、抗体の認識する標的分子は、同一でも異なっていてもよい。
Ｆａｂ領域が異なり、抗体の認識する標的分子が異なっている場合、抗体の標的分子は、第一の標的分子として、２種の標的分子（第一の標的分子とそれと異なる標的分子）への結合能を保持することとなるが、環状ペプチドが有する第二の標的分子への結合能は、第一の標的分子への結合能と異なっているが、第一の標的分子と異なる標的分子への結合能であってもよいものの、抗体の標的分子となる第一の標的分子及びそれと異なる標的分子への結合能と異なっていることが好ましい。環状ペプチドが第二の標的分子以外の標的分子への結合能を有している場合、第三、第四、あるいはそれら以外の標的分子も第一の標的分子同様に抗体の認識する標的分子と異なっていてよい。
【００４９】
本発明においては、環状ペプチドの内部ペプチド配列は、抗体のＦｃ領域に挿入される。
本発明においては、環状ペプチドの内部ペプチド配列を挿入するため、抗体のＦｃ領域における挿入部位が特に限定されるものではないが、抗体の第一の標的分子への結合能を保持したまま、環状ペプチドの第二の標的分子への結合能を付与するためには、Ｆｃ領域における分子表面に露出しているループ部分であることが好適である。
ループ部分は、Ｆｃ領域において、２つのβストランド間を連結するポリぺプチド鎖領域であって、折れ曲がり構造を有し、抗体分子表面に露出している構造であることが好ましい。
【００５０】
本発明においては、抗体に、環状ペプチドを挿入する際、環状ペプチドに由来するアミノ酸残基と抗体に由来するアミノ酸残基との結合は、共有結合であることが好ましい。
また、環状ペプチドに由来するアミノ酸残基と、抗体に由来するアミノ酸残基との間に、リンカーとなるペプチド鎖が挿入されていてもよい。
環状ペプチドの内部ペプチド配列が挿入されるループ部分は、抗体のＦｃ領域におけるループ構造において、特に限定されるものではなく、汎用性をもってループ構造中の任意の部位を選択してよい。
ループ構造における任意の部位とは、環状ペプチドを挿入するための２つのアミノ酸残基が、ループ構造内から選択される部位であることを意味する。
【００５１】
特に限定されるものではないが、図２及び図３を用いて説明する。
図２は、ヒトＩｇＧ由来Ｆｃ領域の立体構造を示す。Ｆｃを構成する一方の重鎖を表面モデルで（奥側）、もう一方をリボンモデルで示している（手前側）。
本発明において、環状ペプチドの挿入部位として、好適に選択されるループ部分を、図２において示すが、Ｔ１〜Ｔ３、Ｍ１〜Ｍ３、Ｂ１〜Ｂ３として示される部分が当該部分である。
図３は、ヒトＩｇＧ１由来Ｆｃ領域のアミノ酸配列を示し、環状ペプチドの挿入部位として、好適に選択されるループ部分を、黒い背景で示している。
好適に選択されるループ部分は、配列番号：７で示されるヒトＩｇＧ１由来Ｆｃ領域の
Ｔ１（ＳＨＥＤＰ、配列番号：８）：２６７〜２７１位
Ｔ２（ＹＮＳＴ、配列番号：９）：２９６〜２９９位
Ｔ３（ＮＫＡＬＰＡＰ、配列番号：１０）：３２５〜３３１位
Ｍ１（ＶＤＧＶ、配列番号：１１）：２７９〜２８２位
Ｍ２（ＫＧＱ、配列番号：１２）：３４０〜３４２位
Ｍ３（ＳＤＧＳ、配列番号：１３）：４００〜４０３位
Ｂ１（ＴＫＮＱ、配列番号：１４）：３５９〜３６２位
Ｂ２（ＳＮＧ、配列番号：１５）：３８３〜３８５位
Ｂ３（ＱＱＧＮＶ、配列番号：１６）：４１８〜４２２位
が好適に挙げられる。
Ｔ１を例にすれば、２６７〜２７１位は、配列番号：６においては、４７位〜５１位に相当し、配列番号：７においては、２８位〜３２位に相当する。すなわち、Ｔ２〜Ｔ３、Ｍ１〜Ｍ３、Ｂ１〜Ｂ３として示される部分は、配列番号：６においては、２２０減じた位置のアミノ酸が対応し、配列番号：７においては、２３９減じた位置のアミノ酸が対応する。
また、環状ペプチドの挿入部位は、アミノ酸残基の位置により表されるループ構造内から選択される部位であってよい。Ｔ１を例にすれば、ループ構造内から選択される部位として、２６７位と２６８位、２６８位と２６９位、２６９位と２７０位、２７０位と２７１位、２６７位と２６９位、２６８位と２７０位、２６９位と２７１位、２６７位と２７０位、２６８位と２７１位、２６７位と２７１位が選択され得、これら選択されたアミノ酸残基の位置が、抗体における環状ペプチドの内部アミノ酸配列の挿入部位であってよい。
ヒトＩｇＧ１以外の抗体においては、配列番号：６又は配列番号：７で示されるアミノ酸配列とアラインメントして、Ｔ１〜Ｔ３、Ｍ１〜Ｍ３、Ｂ１〜Ｂ３として示される部分に対応する部分を、環状ペプチドの挿入部位とすることができる。
【００５２】
より好適には、配列番号：７で示されるヒトＩｇＧ１由来Ｆｃ領域のループ部分において、
Ｔ１（ＳＨ＊ＥＤＰ）：２６７〜２７１位
Ｔ２（Ｙ＊ＮＳＴ）：２９６〜２９９位
Ｔ３（ＮＫＡＬＰ＊ＡＰ）：３２５〜３３１位
Ｍ１（ＶＤ＊ＧＶ）：２７９〜２８２位
Ｍ２（Ｋ＊ＧＱ）：３４０〜３４２位
Ｍ３（ＳＤ＊ＧＳ）：４００〜４０３位
Ｂ１（ＴＫ＊ＮＱ）：３５９〜３６２位
Ｂ２（Ｓ＊ＮＧ）：３８３〜３８５位
Ｂ３（ＱＱ＊ＧＮＶ）：４１８〜４２２位
＊印を付したアミノ酸残基間の位置が、環状ペプチドを挿入するのにより好適な部位である。
【００５３】
環状ペプチドの内部ペプチド配列が挿入されることにより環状ペプチドに由来するアミノ酸残基、あるいは、リンカーのアミノ酸残基と結合する抗体のループ部分の２つのアミノ酸残基は、ループ構造において、隣接していてもよく、不連続であって、抗体のＦｃ領域において、２つのアミノ酸残基の間に１〜１５アミノ酸残基が存在する関係にあるアミノ酸残基であってもよい。
【００５４】
本発明においては、特に限定されないが、好適に挿入部位として選択されるループ部分に異なる環状ペプチドに由来する内部ペプチド配列を挿入することにより、抗体の有する固有の結合能に加え、環状ペプチドが結合能を有する第二、第三、第四、第一〜第四以外といった標的分子への結合特異性を付与することができる。
多重特異性抗体を得るために、元となる既存抗体はどのような型であってもよく、第二の標的分子への結合能が知られていれば環状ペプチドもどのような環状ペプチドであってもよい。
用いる抗体と、挿入する環状ペプチドの内部ペプチド配列、およびその挿入部位はどのような組み合わせも可能であるため、様々な抗原に結合する抗体および環状ペプチドを用意しておけば、望みの多重特異性をもった改変型抗体を極めて簡便に創生することができる。
本発明により得られる多重特異性抗体は、単一のＩｇＧ抗体を２種類併用した抗体医薬と同等な効能をもつものや、異なる細胞上の標的分子を同時に認識して異種細胞の架橋を誘導するものなど、様々な医薬として用いる事ができる。
【００５５】
本発明において用いられる抗体としては、特に限定されるものではなく、マウス抗体、ラット抗体、ウサギ抗体、ウマ抗体、イヌ抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、完全ヒト抗体等が挙げられる。
環状ペプチドを挿入する抗体のＦｃ領域は、ヒト、マウス、ラット、ウサギ、ウマ及びイヌのいずれか由来であることが好ましい。
【００５６】
本発明における抗体のＦｃ領域への環状ペプチドの内部ペプチド配列の挿入について、より具体的に説明する。
本発明において、抗体のＦｃ領域に存在する環状ペプチドの内部ペプチド配列と結合する２つのアミノ酸残基のうち、Ｎ末端側に位置するアミノ酸残基をＡＢＮ、Ｃ末端側のアミノ酸残基をＡＢＣとする場合、環状ペプチドの挿入される内部ペプチド配列は、ＡＢＮと結合していてもよく、ＡＢＮとリンカー配列を介して結合していてもよい。
また、環状ペプチドの挿入される内部ペプチド配列は、ＡＢＣと結合していてもよく、ＡＢＣとリンカー配列を介して結合していてもよい。
ＡＢＮとＡＢＣとは、Ｆｃ領域においてループ構造として連続していてもよく、不連続であってもよい。
不連続である場合、ＡＢＮとＡＢＣとの間に、１〜５アミノ酸残基含むことが好ましい。
【００５７】
本発明においては、環状ペプチドを抗体のＦｃ領域に挿入して、抗体に挿入する環状ペプチドの有する標的分子に対する結合能を付与するが、環状ペプチドを抗体のＦｃ領域に挿入させるには、通常の遺伝子工学技術を用いて行うことができる。
本発明においては、環状ペプチドを抗体のＦｃ領域に挿入させる方法と共に、環状ペプチドを、抗体のＦｃ領域に挿入させて環状ペプチドの内部ペプチド配列が挿入された改変型抗体及びその製造方法をも提供する。
本発明における、改変型抗体の製造方法は、
環状ペプチドとして、挿入する抗体の認識する第一の標的分子とは異なる第二の標的分子に対する結合能を有する環状ペプチドを選択し、好適には、ディスプレイ型探索システムにより得られる環状ペプチドを選択し、
選択した環状ペプチドのアミノ酸配列から、抗体に挿入する内部アミノ酸配列を選択し、該内部アミノ酸配列に相当する塩基配列を選択し、
抗体のＦｃ領域において内部アミノ酸配列を挿入する２つのアミノ酸残基を選択し、
抗体のＦｃ領域のアミノ酸配列に相当する塩基配列を選択し、必要に応じて、当該２つのアミノ酸残基間に存在するアミノ酸残基に相当する塩基配列を削除し、選択された環状ペプチドの内部アミノ酸配列に相当する塩基配列を挿入して組み込んだ塩基配列を有する核酸を準備し、
該核酸を翻訳する、改変型抗体の製造方法である。
選択された環状ペプチドの内部アミノ酸配列に相当する塩基配列を挿入して組み込んだ塩基配列とする際に、リンカーに相当する塩基配列を挿入して組み込んでもよい。
【００５８】
環状ペプチドとしては、ＲａＰＩＤ法やＴＲＡＰ法のようなｍＲＮＡディスプレイ法又はファージディスプレイ法により選択される環状ペプチドを用いることが好ましく、ｍＲＮＡディスプレイ法によることがより好ましく、ｍＲＮＡディスプレイ法等によれば、環状ペプチドのうち、挿入すべき内部アミノ酸配列の塩基配列は容易に理解することができる。
【００５９】
抗体のＦｃ領域における環状ペプチドを挿入する部位を構成する２つのアミノ酸配列に相当する塩基配列を選択し、該選択された塩基配列間に存在する塩基を必要に応じて削除する方法や、選択された環状ペプチドの内部アミノ酸配列に相当する塩基配列を挿入して組み込んだ塩基配列（所望によりリンカーに相当する塩基配列をも含む）を有する核酸を準備する方法は、特に限定されるものではなく、従来公知の方法を援用して実施することができる。
また、準備された核酸の翻訳方法は、本発明の属する技術分野において、既に周知な事項であるので、それら周知な方法を適宜適用して、核酸の翻訳を行えばよい。
【００６０】
本発明により得られる改変型抗体は、抗体のＦｃ領域に、該抗体の認識する第一の標的分子とは異なる第二の標的分子に対する結合能を有する環状ペプチドの内部ペプチド配列が挿入された、第一及び第二の標的分子に対する結合能を有する。
第一及び第二の標的分子に対して同時に結合することが好ましく、第一及び第二の標的分子に対して同時に結合し、かつ、第一及び第二の標的分子が、それぞれ異なる細胞表面分子である場合には、本発明の改変型抗体は、２つの異なる細胞表面分子との結合を介して異種細胞同士の接着を誘導することが可能である。
本発明においては、例えば、がん細胞の抗原を第一の標的とし、Ｔリンパ球やＮＫ細胞上の抗原を第二の標的とすることにより、本発明の改変型抗体は、がん細胞に対する免疫攻撃を誘導し、がんを特異的かつ効果的に傷害、殺すことができる。また、例えば、治療用の抗体を脳内に届けるために血液脳関門を通過させるため、脳の血管に発現している分子（トランスフェリン受容体等）を第二の標的としてもよい。
【００６１】
本発明は、
（１）元となる既存抗体（第一の結合特異性を規定する）のＩｇＧ型や抗原特異性を選ばず、
（２）抗体自身の部分ランダム配列ライブラリーを元にした選択工程を含まず、
（３）最終産物である改変型抗体の製造工程と効率が元の野生型抗体と同等であり、
（４）ＲａＰＩＤ法などで高親和性で結合する環状ペプチドが得られる対象である限りいかなるタンパク質でも多重特異性の標的とすることが可能で、かつ、
（５）同時に最大９つの独立な追加結合特異性を既存抗体に付与できる、という特性を有する。
【実施例】
【００６２】
以下、実施例を示して具体的に本発明を説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。【００６３】
標的タンパク質に対する高親和性の環状ペプチドは、国際公開第２０１１／０４９１５７号及び特開２０１３−４６６３７号公報等に基づいてＲａＰＩＤシステムを実施することにより得た。ヒト由来の受容体であるプレキシンＢ１、Ｍｅｔ、ＥＧＦ受容体、及びＴｒｋＢに対してそれぞれに特異的に結合する環状ペプチドを用いた。環状ペプチドの構造を図１に示す。【００６４】
図１において、それぞれの環状ペプチド由来の可変部配列を、抗体のＦｃ領域に挿入した。ただし、アミノ酸配列のＮ末端アミノ酸としてｗ及びｙと小文字で示されるＤ−アミノ酸は、それぞれＬ−アミノ酸に置換して、あるいは、欠失させて、Ｆｃ領域に導入した。挿入の際には、上記の可変部配列を挟む形で０〜４残基のリンカー配列を追加した。【００６５】
〔実施例１〕ニューロピリン１抗体へのプレキシンＢ１結合特異性の付与
１．ペプチド挿入のデザイン
標的結合活性を保ったまま環状ペプチドの内部配列を抗体のＦｃ領域に提示するため、抗体のＦｃ領域の立体構造を参考に挿入部位を探索した。Ｆｃ領域の中から分子表面に露出し、二次構造部分を連結するループ部分を９カ所選択した。選択したループ部分を図２に示す。選択したループは、Ｆｃ領域のヒンジに近いＴｏｐ部分から３カ所（Ｔ１〜３）、Ｍｉｄｄｌｅ部分から３カ所（Ｍ１〜３）、そしてＢｏｔｔｏｍ部分から３カ所（Ｂ１〜３）である。それらの全Ｆｃアミノ酸配列上での位置を図３に示す。【００６６】
２．二重特異性抗体の調製
ペプチド挿入の土台となる抗体は、ニューロピリン１に対するＮ１抗体（クローン別名ＹＷ６４．３）を用いた（Ｌｉａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．２００７）。Ｎ１抗体の重鎖可変部をヒトＩｇＧ１重鎖定常部をコードするＤＮＡにつなぎ、これを発現ベクターｐ３ＸＦＬＡＧ−ＣＭＶ−１４（シグマアルドリッチ社製）に組み込んだ。軽鎖についてはその全長をコードするＤＮＡを同じｐ３ＸＦＬＡＧ−ＣＭＶ−１４ベクターに組み込んだ。【００６７】
Ｎ１重鎖発現ベクターを元に、図３に示すＦｃ領域内の９つのループ構造の中央付近（＊）に、ｍＰ６−９ペプチド配列を挿入した発現ベクターを作製した。挿入配列部分はｅｘｔｅｎｓｉｏｎ  ＰＣＲ法を用いて増幅した。こうして得られるペプチド挿入型抗体はそれぞれＮ１  ＩｇＧ（ｍＰ６−９＿Ｔ１）のように「抗体名（環状ペプチド名＿挿入サイト）」と表記することにした。【００６８】
Ｅｘｐｉ２９３Ｆ細胞（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）を３ｍＬのＥｘｐｉ２９３  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｍｅｄｉｕｍ（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）を用いて、細胞が３ｘ１０6ｃｅｌｌｓ／ｍＬになるように播種した。その後、常法に従い、ＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅ  ２９３  Ｒｅａｇｅｎｔ（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）を用いて、１．５μｇずつの抗体軽鎖および抗体重鎖（あるいはその挿入体）発現用ベクターを、Ｅｘｐｉ２９３Ｆ細胞へ遺伝子導入した。
遺伝子導入後、３７℃、８％ＣＯ2条件下、１２５ｒｐｍで細胞を１８時間振とう培養した。その後、ＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｍｅ  ２９３  Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  Ｅｎｈａｎｃｅ  ｅｒ  １及びＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｍｅ  ２９３  Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  Ｅｎｈａｎｃｅｒ  ２（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）をそれぞれ１５μＬ、１５０μＬ添加し、３７℃、８％ＣＯ2条件下、１２５ｒｐｍで３日間振とう培養し、培養上清を回収した。【００６９】
回収した培養上清０．３ｍＬにプロテインＡ−セファロース（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）を３０μＬ加え、２時間回転混和した。遠心分離によってセファロースを沈殿させて上清を除き、１ｍＬのＴｒｉｓ−ｂｕｆｆｅｒｅｄ  ｓａｌｉｎｅ（ＴＢＳ，２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，１５０ｍＭ  ＮａＣｌ，ｐＨ７．５）で３回セファロースを洗浄し、ＳＤＳサンプルバッファー２０μＬを加えて９５℃で２分間加熱して試料を溶出した。溶出した試料の５μＬを還元条件下で電気泳動に供し、クマシーブリリアントブルーで染色した。【００７０】
電気泳動の結果を図４に示す。図４において、サンプル番号は、丸数字で示す。Ｎ１  ＩｇＧ（サンプル番号１）は重鎖と軽鎖に相当するバンドが予想される分子量（５０ｋＤａおよび２５ｋＤａ）の位置にバンドが見られ、すべてのペプチド挿入型抗体（サンプル番号２〜１０）の重鎖はそれよりも若干高い分子量を示し、全体のアミノ酸長として１６〜１７残基長いことに呼応していた。いずれもペプチド挿入の無いＮ１  ＩｇＧと遜色ない量の挿入型抗体がＥｘｐｉ２９３Ｆ細胞から発現・分泌していることが確認された。【００７１】
３．ニューロピリン１抗体へのプレキシンＢ１結合能の付与
Ｆｃ上の様々な位置にｍＰ６−９ペプチドを挿入したＮ１  ＩｇＧについて、環状のｍＰ６−９ペプチドが有していたプレキシンＢ１に対する結合能を保持しているかどうかを調べるため、フローサイトメトリーによる結合試験を行った。Ｎ１  ＩｇＧ  および９種類のｍＰ６−９ペプチド挿入体の発現上清を、プレキシンＢ１安定発現細胞（Ｃｅｌｌ  Ｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｌ，  ２０１６，  ２３，  １３４１−１３５０に記載）と反応させ、結合したＩｇＧをＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８標識ヤギ抗ヒトＩｇＧ二次抗体（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ社製）で染色し、ＥＣ８００型フローサイトメーター（ＳＯＮＹ社製）で分析した。【００７２】
フローサイトメトリーの結果を図５に示す。未改変のＮ１抗体はプレキシンＢ１安定発現細胞に対してバックグラウンドレベルのわずかな結合をするにとどまったが（パネル１、図では丸数字で示す。）、ｍＰ６−９を挿入したすべてのＮ１抗体はその１．５〜１０倍の結合量を示し、これらの抗体がすべて、ニューロピリン１に加えて新たにプレキシンＢ１への結合特異性を獲得したことが示された。【００７３】
〔実施例２〕ニューロピリン１抗体への様々な結合特異性の付与
１．ペプチド挿入のデザインと抗体の調製
ペプチド挿入位置としては実施例１に示した「Ｂ１ループ」を採用し、ここに図１に示した４種類の環状ペプチドの内部配列を実施例１の方法に沿って挿入した発現ベクターを用い、組み換え抗体の調製とその発現評価も実施例１と同様に行った。【００７４】
電気泳動の結果を図６に示す。図６において、サンプル番号は、丸数字で示す。Ｎ１  ＩｇＧ（サンプル番号１）は重鎖と軽鎖に相当するバンドが予想される分子量（５０ｋＤａおよび２５ｋＤａ）の位置にバンドが見られ、すべてのペプチド挿入型抗体（サンプル番号２〜１０）において重鎖はＮ１  ＩｇＧ（サンプル番号１）のそれよりも若干高い分子量を示し、全体のアミノ酸長として１７〜２１残基長いことに呼応していた。いずれもペプチド挿入の無いＮ１  ＩｇＧと遜色ない量の環挿入型抗体がＥｘｐｉ２９３Ｆ細胞から発現・分泌していることが確認された。【００７５】
２．ニューロピリン１抗体への様々な結合能の付与
様々なペプチドを挿入したＮ１  ＩｇＧについて、それぞれの環状ペプチドが有していた分子結合能を保持しているかどうかを調べるため、フローサイトメトリーによる結合試験を行った。Ｎ１  ＩｇＧの４種類のペプチド挿入体の発現上清を、コントロールのＨＥＫ２９３細胞（ｍｏｃｋ  ｃｅｌｌ）もしくは様々な受容体を発現する細胞と反応させ、結合したＩｇＧをＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８標識ヤギ抗ヒトＩｇＧ二次抗体（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ社製で染色し、ＥＣ８００型フローサイトメーター（ＳＯＮＹ社製）で分析した。【００７６】
フローサイトメトリーの結果を図７に示す。使用した受容体発現細胞は、プレキシンＢ１安定発現細胞（パネル１、図では丸数字で示す。）、Ｍｅｔ安定発現細胞（パネル２）、ＥＧＦＲ一過性発現細胞（パネル３）、ＴｒｋＢ一過性発現細胞（パネル４）である。すべてのペプチド挿入型Ｎ１抗体において、コントロール細胞に比してそれぞれの標的分子を発現する細胞に対して明確に増大した結合ヒストグラムが得られたことから、ペプチドの挿入によって環状ペプチドバインダーの結合特性をニューロピリン１抗体に新たに付与できることが示された。【００７７】
〔実施例３〕様々な抗体への様々な結合特異性の付与
１．二重特異性抗体の調製
実施例１および２で用いたニューロピリン１抗体の他に、２種のヒトＩｇＧ１型抗体（ヒトＰＤ−Ｌ１抗体ＡｖｅｌｕｍａｂおよびヒトＣＤ３抗体ＯＫＴ３）と１種のマウスＩｇＧ１型抗体（マウストランスフェリン受容体抗体８Ｄ３）を用いてペプチド挿入型二重特異性抗体を作製した。Ａｖｅｌｕｍａｂ、ＯＫＴ３，８Ｄ３の可変部アミノ酸配列はそれぞれＷＯ２０１３０７９１７４Ａ１、Ａｒａｋａｗａ  ｅｔ  ａｌ，  Ｊ  Ｂｉｏｃｈｅｍｅ  １９９６、Ｂｏａｄｏ  ｅｔ  ａｌ，  Ｂｉｏｔｅｃｈ  Ｂｉｏｅｎｇ．  ２００８に記載されたものを利用し、対応するＤＮＡを合成して実施例１と同様に重鎖と軽鎖を発現ベクターｐ３ＸＦＬＡＧ−ＣＭＶ−１４（シグマアルドリッチ社製）に組み込んだ。ただし、８Ｄ３については、重鎖および軽鎖の定常領域はマウスＩｇＧ１由来のものを用いた。【００７８】
２．ニューロピリン１抗体を元にした二重特異性抗体の評価
Ｎ１  ＩｇＧのＢ１ループにＭｅｔ結合性ペプチド配列（ａＭＤ５）およびＥＧＦ受容体結合配列（Ａ６−２ｆ）を挿入した抗体の組換え発現を、実施例２に示した方法で行った。電気泳動の結果を図８Ａに示す。ペプチド挿入体は未挿入のＮ１抗体と同程度の発現効率を示した。これらの標的分子への結合は実施例２と同様なフローサイトメトリーで評価した。【００７９】
フローサイトメトリーの結果を図８Ｂに示す。その結果、Ｎ１抗体の第１の結合特異性であるニューロピリン１への結合は、ニューロピリン１を一過性発現させたＨＥＫ細胞に対して等しく観察され（二段目のパネル）、ペプチド挿入によってオリジナルの結合特性が失われないことが示された。さらに、ａＭＤ５あるいはＡ６−２ｆペプチドをＢ１ループに挿入した変異型抗体は、それぞれＭｅｔ（３段目のパネル）およびＥＧＦ受容体発現細胞（４段目のパネル）において強い陽性シグナルを示し、二重特異性抗体が構築できたことが確認できた。【００８０】
３．ＰＤ−Ｌ１抗体Ａｖｅｌｕｍａｂを元にした二重特異性抗体の評価
Ａｖｅｌｕｍａｂ  ＩｇＧのＢ１もしくはＢ２ループにプレキシンＢ１結合性ペプチド配列（ｍＰ６−９）、Ｍｅｔ結合性ペプチド配列（ａＭＤ５）およびＥＧＦ受容体結合配列（Ａ６−２ｆ）を挿入した抗体の組換え発現を、実施例２に示したのと同じ方法で行った。電気泳動の結果を図９Ａに示す。ペプチド挿入体は未挿入のＡｖｅｌｕｍａｂ抗体と同程度の発現効率を示した。これらの標的分子への結合は実施例２と同様なフローサイトメトリーで評価した。【００８１】
フローサイトメトリーの結果を図９Ｂに示す。その結果、Ａｖｅｌｕｍａｂ抗体の第１の結合特異性であるＰＤ−Ｌ１への結合は、ＰＤ−Ｌ１を恒常的に発現する細胞株（ヒト乳がん細胞ＭＤＡ−ＭＢ−２３１）に対して等しく観察され（二段目のパネル）、ペプチド挿入によってオリジナルの結合特性が失われないことが示された。さらに、ｍＰ６−９、ａＭＤ５あるいはＡ６−２ｆペプチドをＢ１もしくはＢ２ループに挿入した変異型抗体は、それぞれＰｌｅｘｉｎＢ１安定発現細胞（３段目のパネル）、Ｍｅｔ安定発現細胞（４段目のパネル）およびＥＧＦ受容体一過性発現細胞（５段目のパネル）において強い陽性シグナルを示し、二重特異性抗体が構築できたことが確認できた。【００８２】
４．ＣＤ３抗体ＯＫＴ３を元にした二重特異性抗体の評価
ＯＫＴ３  ＩｇＧのＢ２ループにプレキシンＢ１結合性ペプチド配列（ｍＰ６−９）あるいはＭｅｔ結合性ペプチド配列（ａＭＤ４）を挿入した抗体の組換え発現を、実施例２に示したのと同じ方法で行った。電気泳動の結果を図１０Ａに示す。ペプチド挿入体は未挿入のＯＫＴ３抗体と同程度の発現効率を示した。これらの標的分子への結合は実施例２と同様なフローサイトメトリーで評価した。【００８３】
フローサイトメトリーの結果を図１０Ｂに示す。その結果、ＯＫＴ３抗体の第１の結合特異性であるヒトＣＤ３への結合は、ＣＤ３を恒常的に発現する細胞株（Ｊｕｒｋａｔ細胞）に対して等しく観察され（二段目のパネル）、ペプチド挿入によってオリジナルの結合特性が失われないことが示された。さらに、ｍＰ６−９、あるいはａＭＤ４ペプチドをＢ２ループに挿入した変異型抗体は、それぞれＰｌｅｘｉｎＢ１安定発現細胞（３段目のパネル）、Ｍｅｔ安定発現細胞（４段目のパネル）において強い陽性シグナルを示し、二重特異性抗体が構築できたことが確認できた。【００８４】
５．トランスフェリン受容体抗体８Ｄ３を元にした二重特異性抗体の評価
マウスＩｇＧ１である８Ｄ３抗体については、マウス重鎖でＢ１〜Ｂ３に相当するループ位置を図３を参考に特定し、実施例１と同様な手法によりプレキシンＢ１結合性ペプチド配列（ｍＰ６−９）を挿入した発現ベクターを調製した後、軽鎖（マウスｋａｐｐａ鎖）の発現ベクターとともにＥｘｐｉ２９３Ｆ細胞にトランスフェクションした。上清中に発現分泌された組み換え抗体はプロテインＧ−セファロース（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）を用いて沈降させ、電気泳動によって分析した。【００８５】
電気泳動の結果を図１１Ａに示す。ペプチド挿入体は未挿入の８Ｄ３抗体と同程度の発現効率を示した。これらの標的分子への結合を評価するため、フローサイトメトリーによる結合試験を行った。８Ｄ３  ＩｇＧおよび３種類のペプチド挿入体の発現上清を、様々な受容体を発現する細胞と反応させ、結合したマウスＩｇＧをＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８標識ヤギ抗マウスＩｇＧ二次抗体（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ社製）で染色し、ＥＣ８００型フローサイトメーター（ＳＯＮＹ社製）で分析した。【００８６】
フローサイトメトリーの結果を図１１Ｂに示す。その結果、８Ｄ３抗体の第１の結合特異性であるマウストランスフェリン受容体への結合は、ＴｆＲを一過性に発現する細胞（ＴｆＲ  ｃｅｌｌｓ）に対して等しく観察され（二段目のパネル）、ペプチド挿入によってオリジナルの結合特性が失われないことが示された。さらに、ｍＰ６−９ペプチドをＢ１〜Ｂ３ループに挿入した変異型抗体は、ＰｌｅｘｉｎＢ１安定発現細胞（３段目のパネル）において強い陽性シグナルを示し、二重特異性抗体が構築できたことが確認できた。【００８７】
６．ニューロピリン１抗体を元にした多重特異性抗体の評価
これまで個別に試してきた様々な特異性の賦与を、一つの抗体に対して同時に２つ以上行ったものの活性を評価した。Ｎ１  ＩｇＧをもちい、その様々なループにプレキシンＢ１結合性ペプチド配列（ｍＰ６−９）、Ｍｅｔ結合性ペプチド配列（ａＭＤ４）、およびＥＧＦ受容体結合配列（Ａ６−２ｆ）を種々の組み合わせで挿入した抗体の組換え発現を、実施例２に示した方法で行ない、これらの標的分子への結合を５．までと同様なフローサイトメトリーで評価した。【００８８】
フローサイトメトリーの結果を図１２に示す。その結果、Ｎ１抗体の第１の結合特異性であるニューロピリン１への結合は、ニューロピリン１を一過性発現させたＨＥＫ細胞に対して等しく観察され（二段目のパネル）、ペプチド挿入によってオリジナルの結合特性が失われないことが再び示された。さらに、ｍＰ６−９、ａＭＤ４あるいはＡ６−２ｆペプチドを挿入した変異型抗体は、それぞれＰｌｅｘｉｎＢ１（３段目のパネル）、Ｍｅｔ（４段目のパネル）、そしてＥＧＦ受容体（５段目のパネル）をそれぞれ一過性に発現させたＨＥＫ細胞にたいして強い陽性シグナルを示し、しかもその結合は挿入サイトや同時に挿入した他のペプチドの存在に依存しなかった。結果として、これらの改変型抗体は、もともとの単一の抗原特異性に加え、１種類のペプチドを挿入すると二重特異性、２種類のペプチドを挿入すると三重特異性、そして３種類のペプチドを挿入すると四重特異性を獲得できたことが確認できた。【００８９】
〔実施例４〕ペプチド挿入型ＩｇＧの２標的同時結合能の確認
１．サンドイッチ型分子間架橋試験の原理と標的抗原の調製
ペプチド挿入型ＩｇＧについて、第１及び第２結合特異性の個別の評価は実施例３までに示したが、ペプチド挿入型ＩｇＧが２つの標的に同時に結合できることを示すため、サンドイッチＥＬＩＳＡタイプのアッセイ系を構築した。原理を図１３Ａに示す。まずＰｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐ．  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ，  ２０１４，  ９５，  ２４０−２４７に記載された方法に準じて、３種類の第２標的抗原・BR>Iすべて一回膜貫通型の受容体）の細胞外領域のＣ末端にＰＡタグ（和光純薬工業社製）が付加された融合タンパク質をコードするコンストラクトを作成し、これを発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）に組み込んだ。このベクターを用いて実施例１と同様の方法によりＥｘｐｉ２９３Ｆ細胞で一過性発現させ、可溶性受容体断片であるＰｌｅｘｉｎＢ１−ＰＡ、Ｍｅｔ−ＰＡ、及びＥＧＦＲ−ＰＡをそれぞれ含む培養上清を調製し、それらをＰｒｏｔｅｉｎＡセファロースを用いて精製した。第１抗原側は、ＡＰ融合発現ベクターであるｐＡＰｔａｇ−５（ＧｅｎＨｕｎｔｅｒ社）を用いてＡＰのＮ末端（ニューロピリン１およびＰＤ−Ｌ１）あるいはＣ末端（トランスフェリン受容体）にその細胞外領域の配列を融合し、実施例１と同様の方法によりＥｘｐｉ２９３Ｆ細胞で一過性発現させ、可溶性受容体―ＡＰ融合物であるＮｒｐ−１ｅｃ−ＡＰ、ＰＤ−Ｌ１ｅｃ−ＡＰ、およびＡＰ−ＴｆＲｅｃをそれぞれ含む培養上清を調製した。【００９０】
２．サンドイッチ型結合試験
ペプチド挿入型ＩｇＧによる標的分子間の架橋は、図１３Ａに示す原理に基づき、以下のプロトコールに従って評価した。
（１）１０μｇ／ｍＬに希釈した精製第２標的抗原溶液５０μＬを９６ｗｅｌｌプレートに加え４℃、１６時間静置した。
（２）アスピレーターで吸引し、５％  スキムミルク  ｉｎ  Ｔｒｉｓ−ｂｕｆｆｅｒｅｄ  ｓａｌｉｎｅ  （ＴＢＳ；  ２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，  １５０ｍＭ  ＮａＣｌ，  ｐＨ  ７．５）を２００μＬ／ｗｅｌｌ加えて室温で１時間静置した。
（３）種々のＡｄｄｂｏｄｙ発現上清を５０μＬ加えて室温で１時間静置した。
（４）２００μＬ／ｗｅｌｌのＴＢＳで３回洗浄した。
（５）ＡＰ融合第１標的抗原を発現する上清を５０μＬ加えて室温で３０分静置した。
（６）２００μＬ／ｗｅｌｌのＴＢＳで４回洗浄した。
（７）発色基質（Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ  ｓｕｂｓｔｒａｔｅ、シグマアルドリッチ社製）を１００μＬ／ｗｅｌｌで加え、室温で５〜６０分静置後、各ｗｅｌｌ中の溶液の４０５ｎｍの吸光度を測定した。【００９１】
結果を図１３Ｂに示す。ニューロピリン抗体Ｎ１、ＰＤ−Ｌ１抗体Ａｖｅｌｕｍａｂ、およびトランスフェリン受容体抗体８Ｄ３のすべてにおいて、ペプチド挿入型ＩｇＧはそれぞれの第２標的抗原を固定化したプレートにキャプチャーされ、後から加えた第１標的抗原−ＡＰ融合タンパク質を結合して基質を発色させた（灰色のバー）。一方、ペプチド挿入をしていないプレーンなＩｇＧは陽性シグナルを与えなかった（黒いバー）。このことは、各Ａｄｄｂｏｄｙが第１及び第２標的に対して個別にでは無く、同時に結合できることを示している。【００９２】
〔実施例５〕ペプチド挿入型ＩｇＧによる異種細胞間接着の誘導
１．異種細胞間接着試験の原理と細胞の調製
ペプチド挿入型ＩｇＧの第１及び第２標的分子が、異なる細胞上に存在する受容体であるとき、ペプチド挿入型ＩｇＧは異種細胞間の近接および接着を誘導する効果が期待出来る。これを調べるため、ＣＤ３抗体であるＯＫＴ３のＢ２ループにＭｅｔバインダーであるａＭＤ４ペプチド配列を挿入したＯＫＴ３（ａＭＤ４＿Ｂ２）を用いて、図１４Ａに示すような原理に基づいた実験をおこなった。ＣＤ３発現細胞としてはヒト急性Ｔ細胞性白血病由来細胞株Ｊｕｒｋａｔを用い、Ｍｅｔ発現細胞としてはヒトＭｅｔ受容体を安定的に高発現するチャイニーズハムスター卵巣細胞（Ｍｅｔ−ＣＨＯ細胞）を用いた。Ｍｅｔ−ＣＨＯ細胞を赤色蛍光色素ＤｉＤ（Ｂｉｏｔｉｕｍ社製）で標識し、９６ウェルプレートに播種して１０％血清入り培地中で３時間培養、接着させた。Ｊｕｒｋａｔ細胞は緑色蛍光色素Ｎｅｕｒｏ  ＤｉＯ（Ｂｉｏｔｉｕｍ社製）で標識後、実施例３と同じ方法で調製した野生型ＯＫＴ３もしくはペプチド挿入型ＯＫＴ３（ａＭＤ４＿Ｂ２）発現上清と氷上で３０分間反応させ、一回洗浄した後に上記Ｍｅｔ−ＣＨＯ細胞の上に播種した。１ｍｇ／ｍｌのＢＳＡを含む無血清培地中で１７時間培養したのち、２００μＬ／ｗｅｌｌの無血清培地で２回洗浄し、デジタル蛍光顕微鏡（ＢＺ−Ｘ７００、キーエンス社製）にて蛍光および位相差画像を記録した。【００９３】
結果の写真を図１４Ｂに示す。赤色蛍光画像（励起波長６２０ｎｍ、蛍光波長７００ｎｍ）ではプレートに接着したＭｅｔ−ＣＨＯ細胞が、緑色蛍光画像（励起波長４７０ｎｍ、蛍光波長５２５ｎｍ）ではプレートもしくはＭｅｔ−ＣＨＯ細胞の上に接着したＪｕｒｋａｔ細胞が、それぞれ可視化されている。両画像をオーバーレイし、異種細胞同士の接着部位（すなわち赤と緑の細胞が重なっている部分）を白丸でマークした。また、複数のウェルから合計１０個の視野を選び、Ｍｅｔ−ＣＨＯ細胞に接着したＪｕｒｋａｔ細胞の単位面積あたりの数を定量したグラフを図１４Ｃに示す。これにより、ペプチド挿入型ＯＫＴ３がＭｅｔ−ＣＨＯ細胞上のＭｅｔ分子とＪｕｒｋａｔ細胞上のＣＤ３分子を同時に認識し、その相互作用により両細胞の間を架橋していることが示された。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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