(57)【要約】  分析方法は、分析対象のペプチドと、メチオニンの酸化を防止するための、タンパク質を備える酸化防止剤とを含む試料を調製することと、ペプチドをレーザー脱離イオン化法によりイオン化することと、イオン化されたペプチドを質量分離して検出することと、を備える。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
分析対象のペプチドと、メチオニンの酸化を防止するための、タンパク質を備える酸化防止剤とを含む試料を調製することと、
前記ペプチドをレーザー脱離イオン化法によりイオン化することと、
イオン化された前記ペプチドを質量分離して検出することと、を備える分析方法。
【請求項２】
請求項１に記載の分析方法において、
前記レーザー脱離イオン化法は、マトリックス支援レーザー脱離イオン化法である分析方法。
【請求項３】
請求項１に記載の分析方法において、
前記タンパク質の濃度は、２７．５ｎＭ以上２７５ｎＭ未満である分析方法。
【請求項４】
請求項３に記載の分析方法において、
前記タンパク質の濃度は、２６０ｎＭ未満である分析方法。
【請求項５】
請求項４に記載の分析方法において、
前記タンパク質の濃度は、４５．２ｎＭ以上１５１ｎＭ未満である分析方法。
【請求項６】
請求項１から５までのいずれか一項に記載の分析方法において、
前記酸化防止剤は、前記タンパク質の他に、アミノ酸および／または還元剤をさらに備える分析方法。
【請求項７】
請求項６に記載の分析方法において、
前記アミノ酸および／または還元剤は、メチオニン、ヒスチジン、システイン、トリプトファン、ジチオトレイトール、トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン、２−メルカプトエタノール、トリ‐ｎ‐ブチルフォスフィン、ジチオエリトリトール、アスコルビン酸、ポリフェノール、ピロ亜硫酸ナトリウム、クエン酸、グルコース、カロチン、トコフェノール、チオ−グリコール酸、Ｎ−アセチルシステイン、ヒドロキシルアミン、還元型グルタチオン、臭化２−アミノエチルイソチオウロニウム、およびチオグリセロールからなる群から選択される少なくとも１種類の化合物である分析方法。
【請求項８】
請求項６に記載の分析方法において、
前記アミノ酸および／または還元剤の濃度は、０．００１ｍＭ以上１０ｍＭ以下である分析方法。
【請求項９】
請求項１または２に記載の分析方法において、
前記ペプチドは、アフィニティ精製を用いて精製されたものであり、
前記タンパク質は、前記アフィニティ精製に用いたリガンドであり、
前記アフィニティ精製において、前記ペプチドを溶出液を用いて溶出する前、または溶出した後に、前記溶出液にアミノ酸および／または還元剤を加えることと、を備える分析方法。
【請求項１０】
請求項９に記載の分析方法において、
前記アミノ酸および／または還元剤は、メチオニン、ヒスチジン、システイン、トリプトファン、ジチオトレイトール、トリス（２‐カルボキシエチル)ホスフィン、２−メルカプトエタノール、トリ‐ｎ‐ブチルフォスフィン、ジチオエリトリトール、アスコルビン酸、ポリフェノール、ピロ亜硫酸ナトリウム、クエン酸、グルコース、カロチン、トコフェノール、チオ−グリコール酸、Ｎ−アセチルシステイン、ヒドロキシルアミン、還元型グルタチオン、臭化２−アミノエチルイソチオウロニウム、およびチオグリセロールからなる群から選択される少なくとも１種類の化合物である分析方法。
【請求項１１】
請求項９に記載の分析方法において、
前記アミノ酸および／または還元剤の濃度は、０．０００１ｍＭ以上１０ｍＭ以下である分析方法。
【請求項１２】
タンパク質を含み、
レーザー脱離イオン化法により分析対象のペプチドをイオン化する質量分析における試料の調製に用いる、メチオニンの酸化を防止するための質量分析用ペプチド酸化防止剤。
【請求項１３】
請求項１２に記載の質量分析用ペプチド酸化防止剤において、
前記タンパク質の濃度は、２７．５ｎＭ以上２７５ｎＭ未満である質量分析用ペプチド酸化防止剤。
【請求項１４】
請求項１２に記載の質量分析用ペプチド酸化防止剤において、
前記タンパク質の他に、アミノ酸および／または還元剤をさらに備える質量分析用ペプチド酸化防止剤。
【請求項１５】
請求項１４に記載の質量分析用ペプチド酸化防止剤において、
前記アミノ酸および／または還元剤は、メチオニン、ヒスチジン、システイン、トリプトファン、ジチオトレイトール、トリス（２‐カルボキシエチル)ホスフィン、２−メルカプトエタノール、トリ‐ｎ‐ブチルフォスフィン、ジチオエリトリトール、アスコルビン酸、ポリフェノール、ピロ亜硫酸ナトリウム、クエン酸、グルコース、カロチン、トコフェノール、チオ−グリコール酸、Ｎ−アセチルシステイン、ヒドロキシルアミン、還元型グルタチオン、臭化２−アミノエチルイソチオウロニウム、およびチオグリセロールからなる群から選択される少なくとも１種類の化合物である質量分析用ペプチド酸化防止剤。
【請求項１６】
請求項１２から１５までのいずれか一項に記載の質量分析用ペプチド酸化防止剤において、
前記レーザー脱離イオン化法は、マトリックス支援レーザー脱離イオン化法である質量分析用ペプチド酸化防止剤。
【請求項１７】
請求項１２から１６までのいずれか一項に記載の質量分析用ペプチド酸化防止剤と、
試料プレートおよびマトリックスからなる群から選択される少なくとも一つとを備える質量分析用キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、分析方法、質量分析用ペプチド酸化防止剤および質量分析用キットに関する。
【背景技術】
【０００２】
マトリックス支援レーザー脱離イオン化（ＭＡＬＤＩ）法等を利用した質量分析は、ペプチド等の生体分子を解析するための強力な手段である。しかし、ＭＡＬＤＩ法等により試料をイオン化する際、試料プレートに試料を配置した後、試料中のペプチドが酸化されることがあった。【０００３】
試料プレート上でのペプチドの酸化は、試料中の分子の濃度が低かったり、試料プレートに酸化を触媒する銅が不純物として含まれていたり、試料中の酸素濃度が高い場合等に起きやすい。このような試料プレート上でのペプチドの酸化が起きると、本来の試料の酸化状態よりも多く酸化されているように誤って分析されてしまう。【０００４】
特に、ペプチドの主鎖におけるメチオニン残基は、他のアミノ酸残基に比べ、酸化を受けやすい。このようなメチオニン残基の酸化では、多くの場合、側鎖の硫黄原子が酸化によりスルホキシド型に変換される。【０００５】
特許文献１では、タンパク質・ペプチド試料中のメチオニン含有化学種を、メチオニン酸化体として収束させることを目的とした方法が提案されている。このような方法は、試料の酸化状態は変化してしまう。非特許文献１では、インスリン等の３０００Ｄａ以上の高質量のペプチドに対する質量分析の感度を上げるために、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）やトランスフェリン等のタンパク質を添加しているが、酸化を抑える目的や効果は記載されていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】日本国特開２００７−２９２５２３号公報
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Gustavsson N, Kokke BP, Harndahl U, Silow M, Bechtold U, Poghosyan Z, Murphy D, Boelens WC, Sundby C. “A peptide methionine sulfoxide reductase highly expressed in photosynthetic tissue in Arabidopsis thaliana can protect the chaperone-like activity of a chloroplast-localized small heat shock protein,” The Plant Journal,(米国), Society for Experimental Biology, 2002年3月1日、Volume 29, Issue 5, pp.545-553
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
質量分析におけるペプチドのメチオニンの酸化を抑制する、効率的な方法が望ましい。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明の第1の態様によると、分析方法は、分析対象のペプチドと、メチオニンの酸化を防止するための、タンパク質を備える酸化防止剤とを含む試料を調製することと、  前記ペプチドをレーザー脱離イオン化法によりイオン化することと、イオン化された前記ペプチドを質量分離して検出することと、を備える。
本発明の第２の態様によると、第1の態様の分析方法において、前記レーザー脱離イオン化法は、マトリックス支援レーザー脱離イオン化法であることが好ましい。
本発明の第３の態様によると、第１または第２の態様の分析方法において、前記タンパク質の濃度は、２７．５ｎＭ以上２７５ｎＭ未満であることが好ましい。
本発明の第４の態様によると、第３の態様の分析方法において、前記タンパク質の濃度は、２６０ｎＭ未満であることが好ましい。
本発明の第５の態様によると、第４の態様の分析方法において、前記タンパク質の濃度は、４５．２ｎＭ以上１５１ｎＭ未満であることが好ましい。
本発明の第６の態様によると、第１から第５までのいずれかの態様の分析方法において、前記酸化防止剤は、前記タンパク質の他に、アミノ酸および／または還元剤をさらに備えることが好ましい。
本発明の第７の態様によると、第６の態様の分析方法において、前記アミノ酸および／または還元剤は、メチオニン、ヒスチジン、システイン、トリプトファン、ジチオトレイトール、トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン、２−メルカプトエタノール、トリ‐ｎ‐ブチルフォスフィン、ジチオエリトリトール、アスコルビン酸、ポリフェノール、ピロ亜硫酸ナトリウム、クエン酸、グルコース、カロチン、トコフェノール、チオ−グリコール酸、Ｎ−アセチルシステイン、ヒドロキシルアミン、還元型グルタチオン、臭化２−アミノエチルイソチオウロニウム、およびチオグリセロールからなる群から選択される少なくとも１種類の化合物であることが好ましい。
本発明の第８の態様によると、第６または第７の態様の分析方法において、前記アミノ酸および／または還元剤の濃度は、０．００１ｍＭ以上１０ｍＭ以下であることが好ましい。
本発明の第９の態様によると、第１または第２の態様の分析方法において、前記ペプチドは、アフィニティ精製を用いて精製されたものであり、前記タンパク質は、前記アフィニティ精製に用いたリガンドであり、前記アフィニティ精製において、前記ペプチドを溶出液を用いて溶出する前、または溶出した後に、前記溶出液にアミノ酸および／または還元剤を加えることと、を備えることが好ましい。
本発明の第１０の態様によると、第９の態様の分析方法において、前記アミノ酸および／または還元剤は、メチオニン、ヒスチジン、システイン、トリプトファン、ジチオトレイトール、トリス（２‐カルボキシエチル)ホスフィン、２−メルカプトエタノール、トリ‐ｎ‐ブチルフォスフィン、ジチオエリトリトール、アスコルビン酸、ポリフェノール、ピロ亜硫酸ナトリウム、クエン酸、グルコース、カロチン、トコフェノール、チオ−グリコール酸、Ｎ−アセチルシステイン、ヒドロキシルアミン、還元型グルタチオン、臭化２−アミノエチルイソチオウロニウム、およびチオグリセロールからなる群から選択される少なくとも１種類の化合物であることが好ましい。
本発明の第１１の態様によると、第９または第１０の態様の分析方法において、前記アミノ酸および／または還元剤の濃度は、０．０００１ｍＭ以上１０ｍＭ以下であることが好ましい。
本発明の第１２の態様によると、質量分析用ペプチド酸化防止剤は、メチオニンの酸化を防止するためのものであり、タンパク質を含み、レーザー脱離イオン化法により分析対象のペプチドをイオン化する質量分析における試料の調製に用いる。
本発明の第１３の態様によると、第１２の態様の質量分析用ペプチド酸化防止剤において、前記タンパク質の濃度は、２７．５ｎＭ以上２７５ｎＭ未満であることが好ましい。
本発明の第１４の態様によると、第１２または第１３の態様の質量分析用ペプチド酸化防止剤において、前記タンパク質の他に、アミノ酸および／または還元剤をさらに備えることが好ましい。
本発明の第１５の態様によると、第１４の態様の質量分析用ペプチド酸化防止剤において、前記アミノ酸および／または還元剤は、メチオニン、ヒスチジン、システイン、トリプトファン、ジチオトレイトール、トリス（２‐カルボキシエチル)ホスフィン、２−メルカプトエタノール、トリ‐ｎ‐ブチルフォスフィン、ジチオエリトリトール、アスコルビン酸、ポリフェノール、ピロ亜硫酸ナトリウム、クエン酸、グルコース、カロチン、トコフェノール、チオ−グリコール酸、Ｎ−アセチルシステイン、ヒドロキシルアミン、還元型グルタチオン、臭化２−アミノエチルイソチオウロニウム、およびチオグリセロールからなる群から選択される少なくとも１種類の化合物であることが好ましい。
本発明の第１６の態様によると、第１２から第１５までのいずれかの態様の質量分析用ペプチド酸化防止剤において、前記レーザー脱離イオン化法は、マトリックス支援レーザー脱離イオン化法であることが好ましい。
本発明の第１７の態様によると、質量分析用キットは、第１２から第１６までのいずれかの態様の質量分析用ペプチド酸化防止剤と、試料プレートおよびマトリックスからなる群から選択される少なくとも一つとを備える。
【発明の効果】
【００１０】
本発明によれば、質量分析におけるペプチドのメチオニンの酸化を効率的に抑制し、試料中のメチオニンの酸化状態を従来よりも正確に測定することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】図１は、第１実施形態の分析方法の流れを示すフローチャートである。
【図２】図２は、第１実施形態に係る質量分析用キットを示す概略図である。
【図３】図３は、ペプチドＡβ１−４０の濃度を変化させた場合のマススペクトルにおけるペプチドＡβ１−４０に対応するピークを示す図である。
【図４】図４は、ＢＳＡの濃度を変化させた場合のマススペクトルにおける各ペプチドに対応するピークを示す図である。
【図５】図５は、試料に加えられたＢＳＡの量と、マススペクトルに基づく各ペプチドの非酸化体に対する酸化体の比との関係を示すグラフである。
【図６】図６は、トランスフェリンの濃度を変化させた場合のマススペクトルにおける各ペプチドに対応するピークを示す図である。
【図７】図７は、試料に加えられたトランスフェリンの量と、マススペクトルに基づく各ペプチドの非酸化体に対する酸化体の比との関係を示すグラフである。
【図８】図８は、フェツインの濃度を変化させた場合のマススペクトルにおける各ペプチドに対応するピークを示す図である。
【図９】図９は、試料に加えられたフェツインの量と、マススペクトルに基づく各ペプチドの非酸化体に対する酸化体の比との関係を示すグラフである。
【図１０】図１０は、第２実施形態の分析方法の流れを示すフローチャートである。
【図１１】図１１は、第２実施形態に係る質量分析用キットを示す概略図である。
【図１２】図１２は、グリシンの濃度を変化させた場合のマススペクトルにおける各ペプチドに対応するピークを示す図である。
【図１３】図１３は、試料に加えられたグリシンの濃度と、マススペクトルに基づく各ペプチドの非酸化体に対する酸化体の比との関係を示すグラフである。
【図１４】図１４は、Ｌ−メチオニンの濃度を変化させた場合のマススペクトルにおける各ペプチドに対応するピークを示す図である。
【図１５】図１５は、試料に加えられたＬ−メチオニンの濃度と、マススペクトルに基づく各ペプチドの非酸化体に対する酸化体の比との関係を示すグラフである。
【図１６】図１６は、Ｌ−システインの濃度を変化させた場合のマススペクトルにおける各ペプチドに対応するピークを示す図である。
【図１７】図１７は、試料に加えられたＬ−システインの濃度と、マススペクトルに基づく各ペプチドの非酸化体に対する酸化体の比との関係を示すグラフである。
【図１８】図１８は、Ｌ−ヒスチジンの濃度を変化させた場合のマススペクトルにおける各ペプチドに対応するピークを示す図である。
【図１９】図１９は、試料に加えられたＬ−ヒスチジンの濃度と、マススペクトルに基づく各ペプチドの非酸化体に対する酸化体の比との関係を示すグラフである。
【図２０】図２０は、ＤＴＴの濃度を変化させた場合のマススペクトルにおける各ペプチドに対応するピークを示す図である。
【図２１】図２１は、試料に加えられたＤＴＴの濃度と、マススペクトルに基づく各ペプチドの非酸化体に対する酸化体の比との関係を示すグラフである。
【図２２】図２２は、Ｌ−メチオニンまたはＤＴＴを含む試料に、ＢＳＡが加えられた場合と、加えられなかった場合とにおける、マススペクトルに基づく各ペプチドの非酸化体に対する酸化体の比を示すグラフである。
【図２３】図２３は、第２実施形態の変形例の分析方法の流れを示すフローチャートである。
【図２４】図２４は、免疫沈降の溶出液のマススペクトルを示す図である。
【図２５】図２５は、免疫沈降の溶出液のＬ−メチオニン濃度と、マススペクトルに基づく各ペプチドの非酸化体に対する酸化体の比との関係を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
以下、図を参照して本発明を実施するための形態について説明する。
【００１３】
（第１実施形態）
第１実施形態の分析方法は、質量分析に用いられる試料に、タンパク質を酸化防止剤として加えることにより、試料中のペプチドのメチオニンの酸化を防ぐものである。
【００１４】
図１は、本実施形態の分析方法の流れを示すフローチャートである。ステップＳ１００１において、分析対象のペプチドと、メチオニンの酸化を防ぐための、タンパク質を備える酸化防止剤とを含む試料が調製される。分析対象のペプチド（以下、対象ペプチドと呼ぶ）は、アミノ酸配列が全体的または部分的に同定されていて、メチオニンを含むペプチドでもよいし、アミノ酸配列が未知のペプチドでもよい。対象ペプチドのアミノ酸配列の残基数等は特に限定されないが、後述の実施例で用いた各ペプチドのような１００以下、または５０以下の残基数を有するペプチドが好ましい。
【００１５】
後述の実施例ではウシ血清アルブミン（以下、ＢＳＡと呼ぶ）、トランスフェリン、フェツイン等のタンパク質が酸化防止剤として用いられているが、酸化防止剤として試料に加えるタンパク質（以下、酸化防止タンパク質と呼ぶ）の種類は特に限定されない。試料中に、対象ペプチドの他に、酸化されやすい分子が存在することで、酸化される対象が分散され、対象ペプチドの酸化が抑制されると考えられる。
【００１６】
より具体的には、ステップＳ１００１において、対象ペプチドを含む溶液（以下、試料溶液と呼ぶ）に、酸化防止タンパク質が、所定の濃度になるように加えられる。酸化防止剤タンパク質の濃度は、２７．５ｎＭ以上が好ましく、３５．０ｎＭ以上がより好ましく、３９．９ｎＭ以上がより一層好ましく、４５．２ｎＭ以上がさらに好ましい。酸化防止タンパク質の各ウェルあたりの物質量は、２７．５ｆｍｏｌ／ｗｅｌｌ以上が好ましく、３５．０ｆｍｏｌ／ｗｅｌｌ以上がより好ましく、３９．９ｆｍｏｌ／ｗｅｌｌ以上がより一層好ましく、４５．２ｆｍｏｌ／ｗｅｌｌ以上がさらに好ましい。酸化防止タンパク質の各ウェル当たりの量（質量換算）は、１ｎｇ／ｗｅｌｌ以上が好ましく、３ｎｇ／ｗｅｌｌ以上がさらに好ましい。酸化防止タンパク質の濃度が高いか、量が多い程、対象ペプチドの酸化を防止する効果が高くなるため好ましい。
【００１７】
酸化防止タンパク質の濃度は、２７５ｎＭ未満が好ましく、２６０ｎＭ未満がより好ましく、１５１ｎＭ未満がより一層好ましく、１３３ｎＭ未満がさらに好ましい。酸化防止タンパク質の各ウェル当たりの物質量は、２７５ｆｍｏｌ／ｗｅｌｌ未満が好ましく、２６０ｆｍｏｌ／ｗｅｌｌ未満がより好ましく、１５１ｆｍｏｌ／ｗｅｌｌ未満がより一層好ましく、１３３ｆｍｏｌ／ｗｅｌｌ未満がさらに好ましい。酸化防止タンパク質の各ウェル当たりの量（質量換算）は、３０ｎｇ／ｗｅｌｌ未満が好ましく、１０ｎｇ／ｗｅｌｌ以下がさらに好ましい。酸化防止タンパク質の濃度が高過ぎるか、量が多すぎると、酸化防止タンパク質によるイオン化抑制や夾雑物の生成が起こりやすくなるため、好ましくない。
【００１８】
さらに、マトリックスおよびマトリックス添加剤を含む溶液（以下、添加剤含有マトリックス溶液と呼ぶ）が調製される。マトリックスの種類は特に限定されず、α−ｃｙａｎｏ−４−ｈｙｄｒｏｘｙｃｉｎｎａｍｉｃ  ａｃｉｄ（以下、ＣＨＣＡと呼ぶ）、２，５−ｄｉｈｙｄｒｏｘｙｂｅｎｚｏｉｃ  ａｃｉｄ（以下、ＤＨＢと呼ぶ）、またはシナピン酸等を用いることができる。マトリックス添加剤の種類は特に限定されず、ｍｅｔｈｙｌｅｎｅｄｉｐｈｏｓｐｈｏｎｉｃ  ａｃｉｄ（以下、ＭＤＰＮＡと呼ぶ）等を用いることができる。ステップＳ１００１が終了したらステップＳ１００３が開始される。
【００１９】
ステップＳ１００３において、ステップＳ１００１で調製された試料が質量分析計の試料プレートに配置される。添加剤含有マトリックス溶液が試料プレートの各ウェルに配置され、乾固された後、酸化防止タンパク質が加えられた試料溶液が、乾固されたマトリックスに加えられ、乾固される。試料プレートは、ＭＡＬＤＩ用の試料プレートが用いられるが、マトリックスを用いない場合は、レーザー脱離イオン化用の試料プレートが用いられる。ステップＳ１００３が終了したら、ステップＳ１００５が開始される。
なお、質量分析用の試料の調製方法は上記の方法に限定されず、例えば、対象ペプチド、酸化防止タンパク質、マトリックスおよびマトリックス添加剤を含む溶液が調製された後、この溶液が試料プレートに配置されて乾固されてもよい。
【００２０】
ステップＳ１００５において、試料プレートに配置された試料がレーザー脱離イオン化法によりイオン化される。ステップＳ１００３で乾固された、試料プレート上のマトリックスと混合された試料に、質量分析計のレーザー装置から出射されたレーザー光が照射され、試料のイオン化が引き起こされる。レーザー光は波長３３７ｎｍの紫外光等が用いられるがイオン化が適切にされれば特に限定されない。本実施形態では、上述のようにマトリックスと試料とを混合した後にレーザーを照射してイオン化するＭＡＬＤＩ法の例を示したが、マトリックスを用いないレーザー脱離イオン化法にも本発明は適用可能である。ステップＳ１００５が終了したら、ステップＳ１００７が開始される。
【００２１】
ステップＳ１００７において、ステップＳ１００５でイオン化された試料が質量分離されて検出される。イオン化された試料の質量分離を行う質量分析計の種類は、対象ペプチドを所望の精度で検出することができれば特に限定されないが、ペプチドが数千Ｄａ以上の高質量の場合でも正確に質量分離する観点から、飛行時間型質量分析計が好ましい。質量分離されたイオンの強度を示す検出信号から、マススペクトルが作成される。例えば、飛行時間型質量分析計では、予め取得されている較正データに基づいて飛行時間がｍ／ｚに変換され、ｍ／ｚに対応する検出されたイオンの強度がマススペクトルに示される。その他、適宜質量分析により測定されたデータの解析が行われる。ステップＳ１００７が終了したら、処理を終了する。
【００２２】
図２は、本実施形態の分析方法に用いる試薬等を提供するための質量分析用キットを模式的に示す図である。質量分析用キット１は、酸化防止タンパク質１０と、マトリックス２０と、試料プレート３０とを備える。
【００２３】
酸化防止タンパク質１０は、レーザー脱離イオン化法、特にＭＡＬＤＩ法によりイオン化する試料の調製に用いられ、対象ペプチドのメチオニンの酸化を防止する質量分析用ペプチド酸化防止剤である。マトリックス２０は、上述したＣＨＣＡ、ＤＨＢ、またはシナピン酸等のマトリックスを含む。マトリックス２０は、固体状態でもよいし、水および／またはアセトニトリル等を含む任意の溶媒に溶解された状態でもよい。図２では、酸化防止タンパク質１０およびマトリックス２０はそれぞれ容器Ｃ１およびＣ２の内部に格納されているが、容器Ｃ１およびＣ２の種類、形状等は特に限定されない。試料プレート３０は、レーザー脱離イオン化用、特にＭＡＬＤＩ用の試料プレートであり、複数のウェル３１が形成されているが、ウェル３１の形状、個数、配置される位置等は特に限定されない。
なお、本実施形態に係る質量分析用キットは、少なくとも酸化防止タンパク質１０を備えていればよく、マトリックス２０および試料プレート３０については備えなくともよいし、いずれか一方または両方を備えていてもよい。
【００２４】
（第１実施形態の実施例）
以下に、本実施形態に係る実施例を示すが、本発明は下記の実施例に限定されるものではない。
【００２５】
＜１−１．酸化防止タンパク質を含む試料溶液の調製＞
3種類のペプチドＡβ１−４０（Anaspec）、Ａβ１−４２（Anaspec）、APP669-711（ペプチド研究所）の混合液に、BSA（ナカライテスク）、Human
transferrin（Sigma-Aldrich）、Bovine  fetuin（Sigma-Aldrich）のいずれかのタンパク質を添加した試料溶液と、タンパク質を添加していない試料溶液を調製した。試料溶液の溶媒には5  mM  塩酸を含有する70%(v/v)  アセトニトリルを使用した。試料溶液に添加して得られた上記タンパク質の濃度は0.1,  0.3,  1,  3,  10,  30,  100  ｎｇ／μＬであった。他に、上記3種類のタンパク質をいずれも含まず、Ａβ１−４０を10,100,1000  ｆｍｏｌ／μＬの各濃度で含む試料溶液（以下、Ａβ１−４０溶液と呼ぶ）を調製した。
【００２６】
分析対象のペプチド（対象ペプチド）の一文字表記のアミノ酸配列と、対応する配列表の配列番号を以下の表に示す。Ａβ１−４０とＡβ１−４２はメチオニン（M）が1残基含まれているため、側鎖の硫黄原子に対応する酸化されやすい部位は1箇所であり、APP669-711はメチオニンが2残基含まれているため酸化されやすい部位は2箇所である。
【表１】
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【００２７】
＜１−２．飛行時間型質量分析＞
質量分析用のマトリックスとしてCHCAを用いた。マトリックス溶液は、CHCA  1  mgを70%(v/v)  アセトニトリル  1  mLで溶解することによって調製した。マトリックス添加剤としてMDPNAを含む、0.4%(w/v)  MDPNA溶液をマトリックス添加剤溶液とした。マトリックス溶液とマトリックス添加剤溶液を等量混合して添加剤含有マトリックス溶液を調製した後、添加剤含有マトリックス溶液０．５μＬをMALDI用の試料プレート(μＦｏｃｕｓ  ＭＡＬＤＩ  ｐｌａｔｅ  ９００μｍ、Hudson  Surface  Technology,  Inc.,  Fort  Lee,  NJ)上の各ウェルに滴下し、乾固させた。その後、１−１で調製した試料溶液を１μＬ取り、上記の試料プレート上のマトリックスへ滴下して乾固させた。
【００２８】
MALDI法を用いた飛行時間型質量分析（以下、MALDI-TOF  MSと呼ぶ）はリニアモードで行い、AXIMA  Performance  (Shimadzu/KRATOS,  Manchester,  UK)を用いて、ポジティブイオンモードで検出した。m/z値はピークのアベレージマスで表示した。m/z値は外部標準としてhuman  angiotensin  II、human  ACTH  fragment  18-39、bovine  insulin  oxidized  beta-chain、およびbovine  insulinを用いて較正した。
【００２９】
＜１−３．ペプチドの濃度と酸化状態について＞
図３は、Ａβ１−４０溶液（１０〜１０００ｆｍｏｌ／μＬ）１μＬを試料プレートへ滴下し乾固させて得た試料（10~1000fmol/well  Ａβ１−４０）を質量分析して得たマススペクトルにおける、Ａβ１−４０に対応するピークを示す図である。ペプチドが低濃度になるほど非酸化体よりも酸化体が強く検出され、10fmol/wellでは同等のピークの高さになった。
【００３０】
＜１−４．タンパク質による酸化抑制の評価＞
図４、図６および図８は、それぞれBSA、transferrinおよびfetuinの各タンパク質の濃度を変化させた場合のマススペクトルにおける各ペプチドに対応するピークを示す図である。タンパク質を添加しない（図中「タンパク質添加なし」）で各ペプチド（各ペプチドの濃度５００ａｍｏｌ／μＬ）をMALDI-TOF  MSで分析すると、Ａβ１−４０とＡβ１−４２は酸化体が、APP669-711では二酸化体（図中「酸化体（２か所）」）のピークが突出して検出された（図４、図６、図８）。
【００３１】
0.1,  0.3,  1,  3,  10,  30,  100  ｎｇ／μＬの濃度で各タンパク質を添加した試料では、添加量を上げていくと非酸化体がメインのピークとなり、各ペプチドの酸化が抑制されていた。ここで、0.1,  0.3,  1,  3,  10,  30,  100ｎｇ／μＬの濃度で各タンパク質を添加した場合、試料プレート上には0.1,  0.3,  1,  3,  10,  30,  100  ng/wellのタンパク質が存在することになる。酸化抑制の効果は、使用したタンパク質、すなわちBSA、トランスフェリンおよびフェツインの全てにおいて観察された。しかし、添加量が多いと逆に非酸化体のピークが弱くなった。タンパク質の添加量が多過ぎてイオンサプレッションが起きていると考えられる。さらに、添加量が多すぎるとタンパク質由来の夾雑物に対応するピーク（夾雑物ピーク）が強く検出されてしまう。本実施例では夾雑物ピークと対象ペプチドに対応するピークのm/zが異なっていたが、もしm/zが近い値をとりこの2つのピークが重なる場合は対象ペプチドの特異性が低下する。この点を鑑み、対象ペプチドに対応するピークのm/zに応じて、添加するタンパク質の種類が適宜選択されることが好ましい。
【００３２】
酸化体に対応するピークよりも非酸化体に対応するピークの方が強度が高く、明確なピーク形状をしているタンパク質の量の範囲は、BSAでは3-10
ng/well（45.2-151  fmol/wellに対応）となり、試料溶液を試料プレート上に滴下する際の濃度としては３−１０ｎｇ／μＬ（45.2-151  nMに対応）となった。transferrinにおける上記範囲は3-10  ng/well（39.9-133  fmol/wellに対応）となり、試料溶液を試料プレート上に滴下する際の濃度としては３−１０ｎｇ／μＬ（39.9-133  nMに対応）となった。fetuinにおける上記範囲は1-10  ng/well（27.5-275  fmol/wellに対応）となり、試料溶液を試料プレート上に滴下する際の濃度としては１−１０ｎｇ／μＬ（27.5-275  nMに対応）となった。重さ（g）で比較すると、fetuinは他よりも3倍低い添加量の1  ng/wellでも酸化抑制効果が確認された。物質量（mol）で比較すると、BSAでは45.2  fmol/well、transferrinでは39.9  fmol/well、fetuinでは27.5  fmol/wellと、酸化抑制効果がある物質量（mol）の下限は同程度だった。つまり、酸化抑制効果は重さ（g）よりも物質量（mol）に依存していると考えられる。一方、ピーク形状が不明確になるタンパク質の量の範囲はBSA、transferrinおよびfetuinの全てにおいて30  ng/well以上であるので、イオンサプレッションは重さ（g）に依存していると考えられる。以上のデータから、酸化抑制のためのタンパク質添加量は27.5-275  fmol/well（27.5-275  nM）が適している。
【００３３】
図5,7,9は、それぞれ試料に加えられたBSA,  transferrinおよびfetuinの量と、マススペクトルに基づく各ペプチドの非酸化体に対する酸化体の比との関係を示すグラフである。タンパク質が添加されていない試料では、非酸化体に対する酸化体のピークはＡβ１−４０で8.5倍、Ａβ１−４２では6.1倍高く、APP669-711では、酸化体（一酸化体（1か所）と二酸化体（酸化体（2か所））とのピーク強度を合算した値が非酸化体よりも11.6倍高かった。一方、タンパク質を添加することにより非酸化体に対する酸化体の割合は減少し、最大96%の減少が確認された。以上の結果から、試料にタンパク質を添加することで酸化を抑制する効果があり、様々なタンパク質を使用しても効果があることが判明した
【００３４】
（第２実施形態）
第２実施形態の分析方法は、質量分析に用いられる試料に、タンパク質に加えてアミノ酸および／または還元剤を酸化防止剤として加えることにより、試料中のペプチドのメチオニンの酸化を防ぐものである。
【００３５】
図１０は、本実施形態の分析方法の流れを示すフローチャートである。ステップＳ２００１において、分析対象のペプチド（対象ペプチド）と、メチオニンの酸化を防ぐための、タンパク質ならびに、当該タンパク質以外のアミノ酸（遊離アミノ酸）および／または還元剤を備える酸化防止剤とを含む試料を調製する酸化防止剤とを含む試料が調製される。対象ペプチドは、アミノ酸配列が全体的または部分的に同定されていて、メチオニンを含むペプチドでもよいし、アミノ酸配列が未知のペプチドでもよい。対象ペプチドのアミノ酸配列の残基数等は特に限定されないが、実施例で用いた各ペプチドのような１００以下、または５０以下の残基数を有するペプチドが好ましい。
【００３６】
上記酸化防止剤に含まれるタンパク質（酸化防止タンパク質）の種類は特に限定されない。第１実施形態の場合と同様、試料中に、対象ペプチドの他に、酸化されやすい分子が存在することで、酸化される対象が分散され、対象ペプチドの酸化が抑制されると考えられる。
【００３７】
より具体的には、ステップＳ２００１において、対象ペプチドを含む溶液（試料溶液）に、酸化防止タンパク質が、所定の濃度になるように加えられる。酸化防止タンパク質の濃度は特に限定されないが、酸化防止タンパク質による酸化の防止を促進する観点から、上述の第１実施形態で好ましいとされた濃度、物質量または質量の範囲内が望ましい。
【００３８】
本実施形態に係る酸化防止剤は、酸化防止タンパク質に加え、アミノ酸および／または還元剤を含む。アミノ酸および／または還元剤は低分子化合物が好ましく、当該低分子化合物の分子量は、１００００未満が好ましく、５０００未満がより好ましい。また、当該低分子化合物の分子量は、上記酸化防止タンパク質の分子量より小さいことが好ましい。酸素を捕捉する低分子化合物が試料溶液中に存在することにより、酸化防止タンパク質のみでは防止できない対象ペプチドの酸化が抑制されると考えられる。以下では、本実施形態において酸化防止剤に含まれる遊離アミノ酸および／還元剤を、低分子酸素捕捉物質と呼ぶ。
【００３９】
低分子酸素捕捉物質の濃度は、０．００１ｍＭ以上が好ましく、０．０１ｍＭ以上がより好ましく、０．１ｍＭ以上がさらに好ましい。低分子酸素捕捉物質の各ウェルあたりの物質量は、１ｐｍｏｌ／ｗｅｌｌ以上が好ましく、１０ｐｍｏｌ／ｗｅｌｌ以上がより好ましく、１００ｐｍｏｌ／ｗｅｌｌ以上がさらに好ましい。低分子酸素捕捉物質の濃度が高いか、量が多い程、対象ペプチドの酸化を防止する効果が高くなるため好ましい。
【００４０】
低分子酸素捕捉物質の濃度は、１０ｍＭ未満が好ましく、１ｍＭ未満がより好ましい。低分子酸素捕捉物質の各ウェルあたりの物質量は、１０ｎｍｏｌ／ｗｅｌｌ未満が好ましく、１ｎｍｏｌ／ｗｅｌｌ未満がより好ましい。低分子酸素捕捉物質の濃度が高すぎたり、量が多過ぎると、イオン化抑制等が起こり質量分析における感度が低下する場合があるため、好ましくない。
【００４１】
低分子酸素捕捉物質におけるアミノ酸は、酸化されやすい側鎖を有するメチオニン、ヒスチジン、システインおよびトリプトファンの少なくとも一つが好ましい。これらのアミノ酸の側鎖が酸素を受け取ることにより、試料溶液内の酸化される対象が分散され、対象ペプチドが酸化されにくくなる。
【００４２】
低分子酸素捕捉物質における還元剤は、上述のように低分子化合物であることが好ましいが、特に限定されず、ジチオトレイトール（DTT）、トリス(2-カルボキシエチル)ホスフィン(TCEP)、２−メルカプトエタノール（2-ME）、トリ-n-ブチルホスフィン  (TBP)  、ジチオエリトリトール(DTE)、アスコルビン酸、ポリフェノール、ピロ亜硫酸ナトリウム、クエン酸、グルコース、カロチン、トコフェノール、チオ−グリコール酸、Ｎ−アセチルシステイン、ヒドロキシルアミン、還元型グルタチオン、臭化２−アミノエチルイソチオウロニウムおよびチオグリセロールからなる群から選択される少なくとも一つの化合物が好ましい。上記のうち、ポリフェノールは、カテキン、イソフラボン、エラグ酸、タンニンが特に好ましい。
【００４３】
さらに、マトリックスおよびマトリックス添加剤を含む溶液（添加剤含有マトリックス溶液）が調製される。マトリックスの種類は特に限定されず、ＣＨＣＡ、ＤＨＢまたはシナピン酸等を用いることができる。マトリックス添加剤の種類は特に限定されず、ＭＤＰＮＡ等を用いることができる。ステップＳ２００１が終了したらステップＳ２００３が開始される。
【００４４】
ステップＳ２００３において、ステップＳ２００１で調製された試料が質量分析計の試料プレートに配置される。添加剤含有マトリックス溶液が試料プレートの各ウェルに配置され、乾固された後、酸化防止タンパク質、ならびに、アミノ酸および／または還元剤が加えられた試料溶液が、乾固されたマトリックスに加えられ、乾固される。試料プレートは、レーザー脱離イオン化用であり、特にＭＡＬＤＩ用の試料プレートが好ましい。ステップＳ２００３が終了したら、ステップＳ２００５が開始される。
なお、質量分析用の試料の調製方法は上記の方法に限定されず、例えば、対象ペプチド、酸化防止タンパク質、アミノ酸および／または還元剤、マトリックスならびにマトリックス添加剤を含む溶液が調製された後、この溶液が試料プレートに配置されて乾固されてもよい。
【００４５】
ステップＳ２００５およびステップＳ２００７は、それぞれステップＳ１００５およびステップＳ１００７と同様であるため記載を省略する。ステップＳ２００７が終了したら、処理を終了する。
【００４６】
図１１は、本実施形態の分析方法に用いる試薬等を提供するための質量分析用キットを模式的に示す図である。本実施形態に係る質量分析用キット２は、酸化防止タンパク質１０と、マトリックス２０と、試料プレート３０と、アミノ酸および／または還元剤を含む低分子酸素捕捉物質４０とを備える。
【００４７】
酸化防止タンパク質１０ならびに、低分子酸素捕捉物質４０は、レーザー脱離イオン化法、特にＭＡＬＤＩ法によりイオン化する試料の調製に用いられ、対象ペプチドのメチオニンの酸化を防止する質量分析用ペプチド酸化防止剤である。マトリックス２０は、上述したＣＨＣＡ、ＤＨＢ、またはシナピン酸等のマトリックスを含む。マトリックス２０は、固体状態でもよいし、水および／またはアセトニトリル等を含む任意の溶媒に溶解された状態でもよい。図１１では、酸化防止タンパク質１０、マトリックス２０ならびに低分子酸素捕捉物質４０はそれぞれ容器Ｃ１、Ｃ２およびＣ３の内部に格納されているが、容器Ｃ１，Ｃ２およびＣ３の種類、形状等は特に限定されない。試料プレート３０は、レーザー脱離イオン化用の試料プレートであり、複数のウェル３１が形成されているが、ウェル３１の形状、個数、配置される位置等は特に限定されない。
なお、本実施形態に係る質量分析用キットは、少なくとも低分子酸素捕捉物質４０を備えていればよく、酸化防止タンパク質１０、マトリックス２０および試料プレート３０については備えなくともよいし、いずれか１つ、２つまたは全部を備えていてもよい。
【００４８】
（第２実施形態の実施例）
以下に、本実施形態に係る実施例を示すが、本発明は下記の実施例に限定されるものではない。第１実施形態の実施例では、Ａβ１−４０、Ａβ１−４２およびAPP669-711の混合液に、BSAを０．１、０．３、１、３、１０、３０、または１００ｎｇ／μＬ添加した試料溶液を作成して、質量分析を行い、ペプチドの酸化抑制を検討した（図４参照）。以下では、この試料溶液にさらにアミノ酸および／または還元剤を加えて、ペプチドの酸化抑制の評価を行った。
【００４９】
＜２−１．酸化防止タンパク質およびアミノ酸によるペプチドの酸化抑制の評価＞
3種類の合成ペプチドＡβ１−４０、Ａβ１−４２およびAPP669-711（第１実施形態の実施例の表参照）の混合液に、BSA  １０ｎｇ／μＬと共にアミノ酸を添加した試料溶液と、アミノ酸を添加していない試料溶液とを調製した。溶媒は5  mM  塩酸を含有する70%(v/v)  アセトニトリルを使用した。アミノ酸含有試料溶液は、アミノ酸としてグリシン（ナカライテスク）、L-メチオニン（ナカライテスク）、L-システイン（Thermo  Fisher  Scientific）およびL-ヒスチジン（Fluka）のいずれかが添加された。上述の通り、メチオニン、システインおよびヒスチジンは側鎖に酸化されやすい部位を有するが、グリシンは側鎖に酸化されやすい部位を有さない。従って、グリシンは比較例として用いた。添加されたアミノ酸の濃度は各アミノ酸毎に、0.0001、0.001、0.01、0.1、1および10  mMであった。これらの試料を第１実施形態の実施例と同様の条件で、MALDI-TOF  MSにより測定した。
【００５０】
図１２は、グリシンの濃度を変化させた場合のマススペクトルにおける各ペプチドに対応するピークを示す図である。図１３は、試料に加えられたグリシンの濃度と、マススペクトルに基づく各ペプチドの非酸化体に対する酸化体の比との関係を示すグラフである。BSAに加えてグリシンを様々な濃度で試料溶液へ添加しても、酸化体のピークに変化はなかった。つまり、グリシンの添加によるペプチドの酸化を抑制する効果は確認されなかった。
【００５１】
図１４、１６、１８は、それぞれL-メチオニン、L-システインおよびL-ヒスチジンの濃度を変化させた場合のマススペクトルにおける各ペプチドに対応するピークを示す図である。図１５、１７、１９は、それぞれ試料に加えられたL-メチオニン、L-システインおよびL-ヒスチジンの濃度と、マススペクトルに基づく各ペプチドの非酸化体に対する酸化体の比との関係を示すグラフである。L-メチオニン、L-システインおよびL-ヒスチジンを試料溶液に添加したそれぞれの場合では、酸化体のピークが低下し、非酸化体に対する酸化体のピークの割合は減少した。
【００５２】
酸化抑制の評価は、有意水準をp<0.05としてDunnett's  testにより行った。アミノ酸添加なしのコントロールと比べて、3種類のペプチドのうち少なくとも1種類で酸化体の割合が統計学的有意に減少していたアミノ酸濃度は、L-メチオニンの場合で0.001-10  mM、L-システインの場合で10  mM、L-ヒスチジンの場合で0.01-10  mMであった。グリシンの場合では統計学的有意な酸化体の減少は確認されなかった。最も酸化を抑制する効果の大きい濃度は、L-メチオニンの場合は１００μＭまたは1  mM、L-システインの場合は1  mM  または10  mM、L-ヒスチジンの場合は1  mMであった。L-ヒスチジンに関しては10  mMの高濃度になるとイオンサプレッションが強く、ピークは検出できなかった。L-メチオニンおよびL-システインの場合でも、10  mMの濃度では感度が低下する傾向があった。酸化抑制を示したアミノ酸に共通する点は、酸化を受けやすい側鎖を有している点である。つまり、側鎖が酸素を捕捉することにより、対象ペプチドの酸化を抑制していると考えられる。
【００５３】
＜２−２．酸化防止タンパク質および還元剤によるペプチドの酸化抑制の評価＞
3種類の合成ペプチドＡβ１−４０、Ａβ１−４２、APP669-711の混合液に、BSA  １０ｎｇ／μＬと共に還元剤DTTを添加した試料溶液と、DTTを添加していない試料溶液を調製した。溶媒は5  mM  塩酸を含有する70%(v/v)  アセトニトリルを使用した。添加されたDTT濃度は0.0001、0.001、0.01、0.1、1、10  mMであった。これらの試料を上記アミノ酸の場合（２−１）と同様の条件で、MALDI-TOF  MSにより測定した。
【００５４】
図２０は、DTTの濃度を変化させた場合のマススペクトルにおける各ペプチドに対応するピークを示す図である。図２１は、試料に加えられたDTTの濃度と、マススペクトルに基づく各ペプチドの非酸化体に対する酸化体の比との関係を示すグラフである。BSAに加えてDTTを様々な濃度で試料溶液へ添加すると、１０μＭ以上で酸化体のピークが低下し、非酸化体に対する酸化体のピークの割合は減少した。
【００５５】
酸化抑制の評価は、有意水準をp<0.05としてDunnett's  testにより行った。還元剤添加なしのコントロールと比べて、3種類のペプチドのうち少なくとも1種類で酸化体の割合が統計学的有意に減少していたDTTの濃度は10  mMだった。還元剤を添加した場合でも試料プレート上での酸化が抑制されることを示している。最も効果の大きい濃度は、10  mMだった。なお、10  mMの濃度では感度が低下する傾向があった。
【００５６】
＜２−３．試料溶液に酸化防止タンパク質を含まない場合の、アミノ酸または還元剤によるペプチドの酸化抑制の評価＞
3種類の合成ペプチドＡβ１−４０、Ａβ１−４２およびAPP669-711の混合液に、1  mM  L-メチオニンを含み酸化防止タンパク質が添加されていない試料溶液、および10  mM  DTTを含み酸化防止タンパク質が添加されていない試料溶液、ならびに、これらの試料溶液に１０ｎｇ／μＬ  BSAを添加した試料溶液を調製した。溶媒は5  mM  塩酸を含有する70%(v/v)  アセトニトリルを使用した。これらの試料を上記アミノ酸の場合（２−１）と同様の条件で、MALDI-TOF  MSにより測定した。
【００５７】
図２２は、L-メチオニンまたはDTTを含む試料に、BSAが加えられた場合と、加えられなかった場合とにおける、マススペクトルに基づく各ペプチドの非酸化体に対する酸化体の比を示すグラフである。試料溶液に1  mM  L-メチオニンや10  mM  DTTを単独で添加した場合でも、非酸化体に対する酸化体のピークの割合は減少し、酸化を抑制する効果が観察された。これらに加えてBSAも添加することで、非酸化体に対する酸化体のピークの割合は更に減少した。この結果は、アミノ酸や還元剤を含み酸化防止タンパク質を含まない試料溶液に、酸化防止タンパク質を添加することで、更にペプチドの酸化が抑制されることを示している。
【００５８】
（第３実施形態）
第３実施形態の分析方法は、第２実施形態の分析方法と同様、質量分析に用いられる試料に、タンパク質（酸化防止タンパク質）に加えてアミノ酸および／または還元剤を酸化防止剤として加えることにより、試料中のペプチドのメチオニンの酸化を防ぐものである。しかし、本実施形態の分析方法では、アフィニティ精製により分析対象のペプチド（対象ペプチド）が精製され、アフィニティ精製において溶出液に含まれるリガンドを酸化防止タンパク質として用いる。これにより、酸化防止タンパク質を試料溶液に加える操作を必要とせずに、対象ペプチドの酸化を効果的に抑制することができる。
【００５９】
図２３は、本実施形態の分析方法の流れを示すフローチャートである。ステップＳ３００１において、アフィニティ精製を用いて対象ペプチドが精製される。アフィニティ精製の方法は、支持体に結合されたリガンドとしてタンパク質を用いることができるものであれば特に限定されず、免疫沈降（ＩＰ）、クロマチン免疫沈降（ＣｈＩＰ）、プルダウン・アッセイまたはアフィニティ・クロマトグラフィ等を用いることができる。抗体をリガンドとして用いる場合には、当該抗体は、スピンカラム等を含む任意のカラムの他、ピペットチップやマイクロ流路に固定されたものでもよい。
【００６０】
アフィニティ精製では、対象ペプチドを含むペプチド溶液を、支持体に結合されたリガンドに接触させ、ペプチド溶液中の対象ペプチドをリガンドに結合させる。リガンドの種類は、支持体に結合可能で対象ペプチドと結合することができれば特に限定されず、対象ペプチドに特異的または非特異的に結合可能な抗体等を用いることができる。
【００６１】
対象ペプチドがリガンドに結合されたら、緩衝液を用いて当該結合を保ったまま支持体が洗浄され、リガンドに結合しなかったペプチド溶液の成分が除去される。その後、低ｐＨまたは高ｐＨの緩衝液等を含む溶出液と支持体とが接触されることにより、対象ペプチドが溶出される。ステップＳ３００１が終了したら、ステップＳ３００３が開始される。
【００６２】
ステップＳ３００３において、対象ペプチドを含むアフィニティ精製の溶出液にアミノ酸および／または還元剤が加えられ、試料溶液が調整される。アミノ酸および還元剤は、第２実施形態における低分子酸素捕捉物質の、アミノ酸および還元剤を用いることが好ましい。試料溶液には、アフィニティ精製で用いたリガンドが含まれる。上述の実施形態の場合と同様、試料中に、対象ペプチドの他に、酸化されやすい分子が存在することで、酸化される対象が分散され、対象ペプチドの酸化が抑制されると考えられる。
なお、アフィニティ精製において、上述の溶出液に低分子酸素捕捉物質のアミノ酸および還元剤を予め加えておいてもよい。これにより、溶出後に低分子酸素捕捉物質を加えることを必要とせず、対象ペプチドの酸化が抑制された試料溶液を調製することができる。
【００６３】
本実施形態における低分子酸素捕捉物質の濃度は、０．０００１ｍＭ以上が好ましく、０．０００６７ｍＭ以上がより好ましく、０．００６７ｍＭ以上がより一層好ましく、０．０６７ｍＭ以上がさらに好ましい。低分子酸素捕捉物質の濃度が高い程、対象ペプチドの酸化を防止する効果が高くなるため好ましい。本実施形態における低分子酸素捕捉物質の濃度は、１０ｍＭ未満が好ましく、１ｍＭ未満がより好ましい。低分子酸素捕捉物質の濃度が高過ぎると、イオン化抑制等が起こり質量分析における感度が低下する場合があるため、好ましくない。
【００６４】
また、マトリックスおよびマトリックス添加剤を含む溶液（添加剤含有マトリックス溶液）が調製される。マトリックスの種類は特に限定されず、ＣＨＣＡ、ＤＨＢまたはシナピン酸等を用いることができる。マトリックス添加剤の種類は特に限定されず、ＭＤＰＮＡ等を用いることができる。ステップＳ３００３が終了したらステップＳ３００５が開始される。
【００６５】
ステップＳ３００５において、ステップＳ３００３で調製された試料が質量分析計の試料プレートに配置される。添加剤含有マトリックス溶液が試料プレートの各ウェルに配置され、乾固された後、酸化防止タンパク質としての上記リガンド、ならびに、アミノ酸および／または還元剤が加えられた試料溶液が、乾固されたマトリックスに加えられ、乾固される。ステップＳ３００５が終了したら、ステップＳ３００７が開始される。
なお、質量分析用の試料の調製方法は上記の方法に限定されず、例えば、対象ペプチド、上記リガンド、アミノ酸および／または還元剤、マトリックスならびにマトリックス添加剤を含む溶液が調製された後、この溶液が試料プレートに配置されて乾固されてもよい。
【００６６】
ステップＳ３００７およびステップＳ３００９は、それぞれステップＳ１００５およびステップＳ１００７と同様であるため記載を省略する。ステップＳ３００９が終了したら、処理を終了する。
【００６７】
（第３実施形態の実施例）
以下に、本実施形態に係る実施例を示すが、本発明は下記の実施例に限定されるものではない。
【００６８】
＜３−１．免疫沈降法（ＩＰ）＞
抗Ａβ抗体（クローン6E10）をEpoxy磁性ビーズ（Thermo  Fisher  Scientific）に結合させ、免疫沈降用の抗Ａβ抗体ビーズを用意した。ヒト血漿に合成ペプチドＡβ１−４０（40  pM）、Ａβ１−４２（10  pM）、APP669-711（10  pM）を添加したものを試料として用意した。合成ペプチド（対象ペプチド）がスパイクされた血漿２５０μＬにDDMとNTMを含むTris緩衝液２５０μＬを混合させた後、氷上で5分静置させた。その血漿を抗Ａβ抗体ビーズと混ぜて、氷上で1時間振盪させた。その後、抗体ビーズをDDMとNTMを含むTris緩衝液１００μＬで3回洗浄し、50  mM  酢酸アンモニウム緩衝液５０μＬで2回洗浄した後、DDMを含むグリシン緩衝液により抗体ビーズに結合している対象ペプチドを溶出させた。その溶出液をDDMを含むTris緩衝液と混合させた後、抗体ビーズと混ぜて、氷上で1時間振盪させた。その後、抗体ビーズをDDMを含むTris緩衝液５０μＬで5回洗浄し、50  mM  酢酸アンモニウム緩衝液５０μＬで2回洗浄し、さらにH2O  ３０μＬで一回洗浄した後、溶出液（5  mM  塩酸を含有する70%(v/v)  アセトニトリル）５μＬにより抗体ビーズに結合しているペプチドを溶出させた。溶出液はL-メチオニンを含有しているものと、含有していないものを使用した。L-メチオニン濃度は、０．００６７〜６７μＭを使用した。免疫沈降により溶出させた対象ペプチドを第２実施形態の実施例（２−１）と同様の条件で、MALDI-TOF  MSにより測定した。
【００６９】
図２４は、免疫沈降の溶出液のマススペクトルを示す図である。図２４ではm/zが4000〜20000の範囲が示されており、Ａβ１−４０に対応するピークは図の左側に示されている。図２４の溶出液のマススペクトルにＩｇＧに対応するピークが観察されるように、ヒト血漿を免疫沈降で処理したサンプルには、抗体ビーズ由来のIgGが混入する。そのため、酸化防止を目的としてBSA等のタンパク質を添加する必要はないが、アミノ酸等の低分子酸素捕捉物質を添加することによりさらに酸化を抑制できる可能性が有る。そこで、メチオニンを添加することにより対象ペプチドの酸化が更に抑制されるかを評価した。
【００７０】
図２５は、免疫沈降の溶出液のL-メチオニンの濃度と、マススペクトルに基づく各ペプチドの非酸化体に対する酸化体の比との関係を示すグラフである。L-メチオニンが添加された溶出液では、L-メチオニンを添加しなかった溶出液と比べて、非酸化体に対する酸化体のピークの割合は減少した。酸化抑制の評価は、有意水準をp<0.05としてDunnett's  testにより行った。L-メチオニンの濃度が０．６７μＭ以上の場合に、アミノ酸添加なしのコントロールと比べて、3種類の対象ペプチドのうち少なくとも1種類で酸化体の割合が統計学的有意に減少していた。この結果は、免疫沈降後のサンプル中にL-メチオニンなどの低分子酸素捕捉物質が含まれていると、酸化が抑制されることを示している。
【００７１】
本発明は上記実施形態の内容に限定されるものではない。本発明の技術的思想の範囲内で考えられるその他の態様も本発明の範囲内に含まれる。
【００７２】
次の優先権基礎出願の開示内容は引用文としてここに組み込まれる。
日本国特許出願２０１８年第０１３０５２号（２０１８年１月２９日出願）
【符号の説明】
【００７３】
１，２…質量分析用キット、１０…酸化防止タンパク質、２０…マトリックス、３０…試料プレート、３１…ウェル、４０…低分子酸素捕捉物質、Ｃ１，Ｃ２，Ｃ３…容器。
【図１】
2019146780.tif 000004
【図２】
2019146780.tif 000005
【図３】
2019146780.tif 000006
【図４】
2019146780.tif 000007
【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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