(57)【要約】  本開示は、埋め込み型バイオセンサのプローブに適用するために、検体の内部への侵入は阻害せず、かつ、酵素およびレドックスメディエータの外部への流出は防止する保護膜を提供する。より具体的には、本開示は、バイオセンサのプローブに有用な膜構造体として、検体応答性酵素を含む検知層と、前記検知層上に形成した保護膜と、を備え、前記保護膜は架橋剤およびポリ（スチレン-ran-4-ビニルピリジン-ran-プロピレングリコールメタクリレート）を単独で含む膜構造体または、ポリ(スチレン-ran-4-ビニルピリジン-ran-プロピレングリコールメタクリレート)と；ポリ(4-ビニルピリジン)-block-ポリ(C1-15アルキルメタクリレート)もしくはポリ(4-ビニルピリジン-ran-2-ヒドロキシエチルメタクリレート)とを含むコポリマー混合物を含む膜構造体を用いる。
2019146788.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも検体応答性酵素およびレドックスメディエータを含む検知層および前記検知層上に形成した保護膜を備え、前記保護膜は式（１）：
【化１】
2019146788.tif 000022
［式中、mは1〜20の整数を表し、x、yおよびzは、それぞれ、３種のモノマー単位：スチレン、4-ビニルピリジン、プロピレングリコールメタクリレートのモル分率を表しx+y+z=100であり、wは数平均分子量を表す。］で示されるポリ（スチレン-ran-4-ビニルピリジン-ran-プロピレングリコールメタクリレート）を含む、膜構造体。
【請求項２】
少なくとも検体応答性酵素およびレドックスメディエータを含む検知層および前記検知層上に形成した保護膜を備え、前記保護膜は、
式（１）：
【化２】
2019146788.tif 000023
［式中、mは1〜20の整数を表し、x、yおよびzは、それぞれ、３種のモノマー単位：スチレン、4-ビニルピリジン、プロピレングリコールメタクリレートのモル分率を表しx+y+z=100であり、wは数平均分子量を表す。］で示されるポリ(スチレン-ran-4-ビニルピリジン-ran-プロピレングリコールメタクリレート)と、
式（２）：
【化３】
2019146788.tif 000024
［式中、Ｒは、炭素数１〜１５のアルキル基を表し、pおよびqは、それぞれ、２種のモノマー単位：4-ビニルピリジン、C1-15アルキルメタクリレートの繰り返し単位を表し、wは数平均分子量を表す。］で示されるポリ(4-ビニルピリジン)-block-ポリ(C1-15アルキルメタクリレート)または
式（３）：
【化４】
2019146788.tif 000025
［式中、sおよびtは、それぞれ、２種のモノマー単位：4-ビニルピリジン、2-ヒドロキシエチルメタクリレートのモル分率を表しs+t=100であり、wは数平均分子量を表す。］で示されるポリ(4-ビニルピリジン-ran-2-ヒドロキシエチルメタクリレート)と、
を含むコポリマー混合物
を含む膜構造体。
【請求項３】
前記保護膜は、ポリ(2-メトキシエチルアクリレート)をさらに含有する、請求項１または２の膜構造体。
【請求項４】
絶縁性基板、前記絶縁性基板の両面に形成された導電性薄膜、前記絶縁性基板の表側の導電性薄膜上に形成された作用電極および参照電極、前記絶縁性基板の裏側の導電性薄膜上に形成された対極、前記作用電極上に形成された検知層ならびに前記作用電極、参照電極、対極および検知層を被覆する保護膜を備えるバイオセンサ用プローブであって、前記検知層は検体応答性酵素およびレドックスメディエータを含み、前記保護膜は式（１）：
【化５】
2019146788.tif 000026
［式中、mは1〜20の整数を表し、x、yおよびzは、それぞれ、３種のモノマー単位：スチレン、4-ビニルピリジン、プロピレングリコールメタクリレートのモル分率を表しx+y+z=100であり、wは数平均分子量を表す。］で示されるポリ（スチレン-ran-4-ビニルピリジン-ran-プロピレングリコールメタクリレート）を含む、バイオセンサ用プローブ。
【請求項５】
絶縁性基板、前記絶縁性基板の両面に形成された導電性薄膜、前記絶縁性基板の表側の導電性薄膜上に形成された作用電極および参照電極、前記絶縁性基板の裏側の導電性薄膜上に形成された対極、前記作用電極上に形成された検知層ならびに前記作用電極、参照電極、対極および検知層を被覆する保護膜を備えるバイオセンサ用プローブであって、前記検知層は検体応答性酵素およびレドックスメディエータを含み、前記保護膜は、
式（１）：
【化６】
2019146788.tif 000027
［式中、mは1〜20の整数を表し、x、yおよびzは、それぞれ、３種のモノマー単位：スチレン、4-ビニルピリジン、プロピレングリコールメタクリレートのモル分率を表しx+y+z=100であり、wは数平均分子量を表す。］で示されるポリ(スチレン-ran-4-ビニルピリジン-ran-プロピレングリコールメタクリレート)と、
式（２）：
【化７】
2019146788.tif 000028
［式中、Ｒは、炭素数１〜１５のアルキル基を表し、pおよびqは、それぞれ、２種のモノマー単位：4-ビニルピリジン、C1-15アルキルメタクリレートの繰り返し単位を表し、wは数平均分子量を表す。］で示されるポリ(4-ビニルピリジン)-block-ポリ(C1-15アルキルメタクリレート)または
式（３）：
【化８】
2019146788.tif 000029
［式中、sおよびtは、それぞれ、２種のモノマー単位：4-ビニルピリジン、2-ヒドロキシエチルメタクリレートのモル分率を表しs+t=100であり、wは数平均分子量を表す。］で示されるポリ(4-ビニルピリジン-ran-2-ヒドロキシエチルメタクリレート)と、
を含むコポリマー混合物
を含むバイオセンサ用プローブ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本開示は、バイオセンサを構成するプローブを保護するための膜材料に関する。より詳しくは、体内に挿入されるバイオセンサプローブを構成する酵素やメディエータの流出を防止することができる保護膜用ポリマー材料が提供される。
【背景技術】
【０００２】
バイオセンサとは、生体の有する分子認識能を利用または模倣して物質を計測するシステムであり、例えば、酵素−基質、抗原−抗体、ホルモン−レセプターなどの組合せのうち一方を検体（測定対象物質）とし、他方を受容体として、検体とその受容体との間の分子認識反応によって発生する化学的な変化をトランスデューサーで電気信号に変換し、得られた電気信号の強さに応じて検体の量を測定する測定装置である。【０００３】
バイオセンサに用いる生体分子として、上記以外にも遺伝子、糖鎖、脂質、ペプチド、細胞、組織なども含まれる。なかでも、酵素を用いたバイオセンサは最も開発が進んでおり、その代表例が、グルコース酸化酵素（Glucose oxidase; GOx）を用いたグルコースセンサである。【０００４】
自己血糖測定に用いられる電気化学式グルコースセンサは、概略、その表面に電極が形成された絶縁基板の上に、スペーサーを介してカバーが配置されている構成である。前記電極上には検体応答性酵素、レドックスメディエータ（電子伝達体）等を含む試薬が配置されており、この部分が分析部となる。この分析部には、血液を導入するための流路の一端が連通しており、前記流路の他端は外部に向かって開口しており、ここが血液供給口となる。このようなセンサを用いた血糖値の測定は、例えば、次のようにして行われる。すなわち、まず、前記センサを専用の測定装置（メータ）にセットする。そして、指先等をランセットで傷つけて出血させ、これに前記センサの血液供給口を接触させる。血液は、毛細管現象によりセンサの流路に吸い込まれ、これを通って分析部に導入され、ここで、前記試薬と接触する。そして、検体応答性酵素E（例えば、GOx、GDH）は、血液中のグルコースと特異的に反応することでグルコースを酸化する。レドックスメディエータMは、酸化によって発生した電子を受容する。電子を受容して還元されたレドックスメディエータMは、電極で電気化学的に酸化される。還元体レドックスメディエータMの酸化によって得られる電流値や電荷量などの大きさから、血液中のグルコース濃度、すなわち血糖値が簡便に検出される。【０００５】
このような電気化学式血糖センサは、糖尿病治療における血糖値管理に重要な役割を果たし、糖尿病患者は血糖値に基づく適切なインスリン投与や食事制限を行うことができる。しかしながら、一日に何度も血糖値を測定しなければならず、その都度血液採取をすることは患者に苦痛を強いることとなるので、生活の質（Quality of Life; QOL）を維持することが困難であった。【０００６】
すでに埋め込み型アンペロメトリックグルコースセンサが開発されている。このような埋め込み型アンペロメトリックグルコースセンサ1の本体10を生体2に貼り付けてプローブ部分11を生体内に挿入して継続的に血糖値の測定を行う（図１および２）。これにより、その都度血液採取することなく、長時間にわたり血糖値を測定することができる。【０００７】
厚生労働省は、「平成9年遠隔診療通知（平成9年12月24日付け健政発第1075号厚生省健康政策局長通知）」を行い、遠隔診療の基本的考え方や医師法第20条等との関係から留意すべき事項を示した。その後、情報通信機器の開発・普及の状況を踏まえ、２０１５年８月１０日付けで情報通信機器を用いた診療（いわゆる「遠隔診療」）について各都道府県知事に向けて事務連絡を行った。２０１５年通知により、遠隔診療は事実上解禁され、２０１６年には情報通信機器3（スマートフォン）と専用アプリケーションを用いて、バイオセンサ1と無線データ通信する遠隔診療ツールが世の中に出回り始めた（図３）。さらに、２０１７年７月１４日付けで、遠隔診療の取扱いについて、再度周知、明確化する趣旨で通知（医政発0714第4号）が行われた。２０１５年通知によれば、遠隔診療は、当事者が医師および患者本人であることが確認できる限り、テレビ電話や、電子メール、ソーシャルネットワーキングサービス等の情報通信機器を組み合わせた遠隔診療についても、直接の対面診療に代替し得る程度の患者の心身の状況に関する有用な情報が得られる場合には、直ちに医師法第20条等に抵触するものではない、とした。この２０１７年通知によって、情報通信機器を利用した遠隔診療がさらに発展するであろう。したがって、埋め込み型センサの需要はますます高まることが期待される。【０００８】
特許文献１は、無線送信機を使用して、患者に取り付けて皮膚に挿入する電気化学センサ制御装置を開示し、無線送信機を使用して、収集した検体量に関するデータを表示装置に伝送する技術を記載している。また、特許文献１は、このような電気化学センサに取り付けるビニルピリジンなどの複素環式窒素基を含む膜も開示する。これらの膜は、電気化学センサ中の作用電極への検体の拡散を制限する。膜を有さないグルコースセンサでは、グルコースの検知層への流量がグルコース濃度とともに直線的に増加し、検知層に到達する全てのグルコースが消費されるうちは、測定される出力信号はグルコースの流量に線形比例するが、グルコースの消費が検知層中で制限された場合、測定信号はグルコースの流量または濃度に線形比例せず、飽和が起こる。そこで、特許文献１では、ポリビニルピリジンなどの複素環式窒素基を含む拡散制限膜を検知層上に形成して、グルコースの検知層への流量を減少させることによって、センサの飽和を防止する技術を採用している。【０００９】
特許文献２は、少なくとも一つの親水性ブロックおよび少なくとも一つの疎水性ブロックを有する単一のブロックコポリマーを含む拡散バリアを開示し、この拡散バリアは特許文献１と同様に、電極システムの外側から酵素分子への分析物の拡散を制御するものである。また、このような酵素分子は、電極に固定化され酵素層を形成する。このような酵素層の製造は、例えば、特許文献３に開示されているように、作用電極に吸着や捕捉によって酵素を固定化し、グルタルアルデヒドなどで架橋することによってより強固に固定することができる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】特表第２０１０−５１７０５４号明細書
【特許文献２】特表第２０１５−５１５３０５号明細書
【特許文献３】国際公開第２００７／１４７４７５号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
埋め込み型センサは、そのプローブを長時間体内に挿入するので、構成要素である検体応答性酵素やレドックスメディエータが流出する機会が増大する。検体応答性酵素やレドックスメディエータがセンサ外部に流出すれば、センサ感度が劣化するのみならず、生体に対して害を与えることとなる。また、検体応答性酵素やレドックスメディエータが外部に流出すれば、センサの耐久性も低下する。したがって、検体応答性酵素やレドックスメディエータの流出を防止する対策が非常に重要である。【００１２】
埋め込み型バイオセンサのプローブを構成する検体応答性酵素およびレドックスメディエータの双方を固定化して流出を防止しようとすれば、用いることができる酵素およびメディエータポリマーの組合せや、センサの構造が限定されてしまう。したがって、酵素および／またはレドックスメディエータを含む検知層の上に形成して、酵素およびレドックスメディエータが外部へ流出することを防止できる膜の開発が望まれる。また、このような膜は、グルコースなどの検体が内部に侵入することを阻害するものであってはならない。そこで、本開示では、埋め込み型バイオセンサのプローブに適用するために、検体の内部への侵入は阻害せず、かつ、酵素およびレドックスメディエータの外部への流出を防止する保護膜を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本開示は、バイオセンサのプローブに有用な膜構造体として、少なくとも検体応答性酵素およびレドックスメディエータを含む検知層および前記検知層上に形成した保護膜を備え、前記保護膜は、
式（１）：【００１４】
【化１】
2019146788.tif 000003
［式中、mは1〜20の整数を表し、x、yおよびzは、それぞれ、３種のモノマー単位：スチレン、4-ビニルピリジン、プロピレングリコールメタクリレートのモル分率を表しx+y+z=100であり、wは数平均分子量を表す。］で示されるポリ（スチレン-ran-4-ビニルピリジン-ran-プロピレングリコールメタクリレート）を単独で含む膜構造体または、
式（１）で示されるポリ（スチレン-ran-4-ビニルピリジン-ran-プロピレングリコールメタクリレート）と、
式（２）：【００１５】
【化２】
2019146788.tif 000004
［式中、Ｒは、炭素数１〜１５のアルキル基を表し、pおよびqは、それぞれ、２種のモノマー単位：4-ビニルピリジン、C1-15アルキルメタクリレートの繰り返し単位を表し、wは数平均分子量を表す。］で示されるポリ(4-ビニルピリジン)-block-ポリ(C1-15アルキルメタクリレート)もしくは
式（３）：【００１６】
【化３】
2019146788.tif 000005
［式中、sおよびtは、それぞれ、２種のモノマー単位：4-ビニルピリジン、2-ヒドロキシエチルメタクリレートのモル分率を表しs+t=100であり、wは数平均分子量を表す。］で示されるポリ(4-ビニルピリジン-ran-2-ヒドロキシエチルメタクリレート)と、
を含むコポリマー混合物を含む膜構造体を提供する。なお、式中、モノマー間の斜線は、３種のモノマー単位が式中の記載順ではなく、モノマー単位間の反応性に起因する偏りを除外すれば無秩序に結合することを示している。【００１７】
前記式（１）で示されるポリマーは、スチレン、4-ビニルピリジン、プロピレングリコールメタクリレートをモノマー単位とするランダムコポリマーであり、スチレンのモル分率xは５〜３０であり、好ましくは１０〜３０であり、さらに好ましくは１５〜２５であり、4-ビニルピリジンのモル分率yは４５〜６５、好ましくは５０〜６０であり、プロピレングリコールメタクリレートのモル分率zは１５〜３０、好ましくは２０〜２５であって、x、yおよびzの合計が１００になるように定めれば、整数でなくてもよい。また、前記ポリマーの数平均分子量は、４０〜８０×１０３、好ましくは４５〜６５×１０３である。【００１８】
前記式（２）で示されるポリマーは、ポリ(4-ビニルピリジン)およびポリ(C1-15アルキルメタクリレート)からなるブロックコポリマーであり、ポリ(4-ビニルピリジン)を構成する4-ビニルピリジンの繰り返し単位pおよびポリ(C1-15アルキルメタクリレート)を構成するアルキルメタクリレートの繰り返し単位ｑは、それぞれ、前記ポリマーを構成する各ブロックの数平均分子量が、５０〜２００×１０３、好ましくは６０〜１００×１０３であるように定めればよい。【００１９】
前記式（２）で示されるポリマー中、ポリ(C1-15アルキルメタクリレート)のC1-15アルキルは、炭素数１〜１５のアルキル基を表し、例えば、メチル基、エチル基、プロピル基、ブチル基、ペンチル基、ヘキシル基、ヘプチル基、オクチル基、ノニル基、デシル基、ウンデシル基、ドデシル基、トリデシル基、テトラデシル基、ペンタデシル基およびそれらの異性体が挙げられ、好ましくは、C3-6アルキル基である。【００２０】
前記式（３）で示されるポリマーは、生体適合性を向上するためには有利であり、4-ビニルピリジン、2-ヒドロキシエチルメタクリレートをモノマー単位とするランダムコポリマーであり、4-ビニルピリジンのモル分率sは４０〜８０、好ましくは６０〜７０、2-ヒドロキシエチルメタクリレートのモル分率tは２０〜６０、好ましくは３０〜４０であって、sおよびtの合計が１００になるように定めれば、整数でなくてもよい。また、前記ポリマーの数平均分子量は、２０〜５００×１０３、好ましくは６０〜３００×１０３である。【００２１】
上記ポリマーは、ポリエチレングリコールジグリシジルエーテル (PEGDGE)などの架橋剤により架橋されていてもよい。【００２２】
前記保護膜は、添加剤として、例えば、ポリ(2-メトキシエチルアクリレート)をさらに含有してもよい。これにより、保護膜の生体適合性が向上する。
【発明の効果】
【００２３】
埋め込み型バイオセンサのプローブを構成する酵素やメディエータを含む検知層の上に、本開示のコポリマーまたはコポリマー混合物を用いて保護膜を形成すれば、グルコースなどの検体が内部に侵入することを阻害せず、かつ、検知層に含まれる酵素やメディエータが外部に流出することを防止することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】埋め込み型バイオセンサが生体（人体）に取り付けられた状態を示す概略図。
【図２】生体（人体）に取り付けられた状態の埋め込み型バイオセンサを示す断面図。
【図３】スマートフォンと測定データを無線通信する埋め込み型バイオセンサの概略図。
【図４】本開示のひとつの具体例の埋め込み型バイオセンサのプローブの製造工程。
【図５】本開示のひとつの具体例の埋め込み型バイオセンサのプローブの製造工程。
【図６】本開示のひとつの具体例の埋め込み型バイオセンサのプローブの製造工程。
【図７】本開示のひとつの具体例の埋め込み型バイオセンサのプローブ表側の上面図。
【図８】図７におけるＡ−Ａ’切断線での断面図。
【図９】図８におけるＢ−Ｂ’切断線での断面図。
【図１０】図８におけるＣ−Ｃ’切断線での断面図。
【図１１】本開示のコポリマーを保護膜に用いたプローブのグルコース応答特性を示すグラフ。
【図１２】本開示のコポリマーを保護膜に用いたプローブの耐久性を示すグラフ。
【図１３】本開示のコポリマー混合物を保護膜に用いたプローブのグルコース応答特性を示すグラフ。
【図１４】本開示のコポリマー混合物を保護膜に用いたプローブの耐久性を示すグラフ。
【図１５】本開示のコポリマー混合物を保護膜に用いたプローブのグルコース応答特性を示すグラフ。
【図１６】本開示のコポリマー混合物を保護膜に用いたプローブの耐久性を示すグラフ。
【図１７】比較例のポリマーを保護膜に用いたプローブのグルコース応答特性を示すグラフ。
【図１８】比較例のポリマーを保護膜に用いたプローブの耐久性を示すグラフ。
【図１９】参考例のポリマーを保護膜に用いたプローブのグルコース応答特性を示すグラフ。
【図２０】参考例のポリマーを保護膜に用いたプローブの耐久性を示すグラフ。
【発明を実施するための形態】
【００２５】
１．埋め込み型バイオセンサのプローブの製造方法
本開示の膜構造体を適用するある具体例の埋め込み型バイオセンサ1のプローブ11の製造方法を説明する。以下に示す構造および製造方法は、本開示のひとつの具体例であり、プローブとして用いることができれば、下記した構成に限定されるものではない。
【００２６】
（１）絶縁性基板の準備
埋め込み型バイオセンサ1は本体10とプローブ11を含み、プローブ11は、概略、生体内に挿入するセンシング部分およびバイオセンサ本体10の内部回路と電気的接続するための端子部分からなる鍵形状である。センシング部分は体内に挿入できるように細く形成され、端子部分はバイオセンサ本体10に挿入して電気的接続を形成するように一定の大きさを有する。したがって、まず、鍵形状の絶縁性基板111を準備する（図４ａ）。上段には表側から見た上面図を示し、下段には裏側から見た上面図を示す（以下、同様）。この絶縁性基板111は、生体内に挿入するプローブとして使用できる材料および厚さであれば、特に限定されることなく、例えば、約200 μm厚のポリエチレンテレフタレート (PET)を用いることができる。
（２）導電性薄膜の形成
絶縁性基板111の両面に、炭素または金、銀、白金もしくはパラジウムなどの金属よりなる群から選択される導電性金属材料をスパッタ法、蒸着法、イオンプレーティングなどにより堆積することによって導電性薄膜112を形成する（図４ｂ）。導電性薄膜の好ましい厚さは、10 nm〜数百nmである。
（３）電極リードの形成
絶縁性基板111の表側に形成した導電性薄膜112にレーザー描写することによって絶縁性基板111の表面に達する深さの溝113を形成して、作用電極リード112aと参照電極リード112bに分離して電気的絶縁する（図５ｃ）。
（４）絶縁性レジスト膜の形成
絶縁性基板111の表側に、作用電極114および参照電極115ならびに本体10と電気接続するための作用電極用端子114aおよび参照電極用端子115aとして用いる領域を除いた部分に、スパッタ法、スクリーン印刷法などにより、開口を有する絶縁性レジスト膜116aを形成し、絶縁性基板111の裏側に、対極117および本体10と電気接続するための対極用端子117aとして用いる領域を除いた部分に、スパッタ法、スクリーン印刷法などにより、開口を有する絶縁性レジスト膜116bを形成する（図５ｄ）。絶縁性レジスト膜の好ましい厚さは、5〜40 μmである。
（５）参照電極の形成
絶縁性基板111の表側に形成したレジスト膜116aの参照電極用の開口にAg/AgClをスクリーン印刷法やインクジェット法により堆積させて、参照電極115を形成する（図５ｅ）。参照電極の好ましい厚さは、5〜40 μmである。
（６）検知層の形成
作用電極114の上に、カーボン粒子などの導電性粒子の懸濁液、検体応答性酵素の水溶液およびレドックスメディエータの水溶液を塗布乾燥して、導電性粒子、検体応答性酵素およびレドックスメディエータを含む検知層118を形成する（図６ｆ）。本開示において、「検体応答性酵素」とは、検体の酸化または還元を特異的に触媒することのできる生化学物質を意味する。バイオセンサの検出目的に使用できれば、いかなる生化学物質でもよい。例えば、グルコースを検体とする場合、適した検体応答性酵素は、グルコース酸化酵素（Glucose oxidase; GOx）やグルコース脱水素酵素 (Glucose dehydrogenase; GDH)などである。「レドックスメディエータ」とは、電子伝達を仲介する酸化還元物質を意味し、バイオセンサにおいて、検体（アナライト）の酸化還元反応によって生じる電子の伝達を担う。例えば、フェナジン誘導体などが含まれるが、これに限定されず、バイオセンサの検出目的に使用できれば、いかなる酸化還元物質でもよい。検知層の好ましい厚さは、5〜80 μmである。
（７）保護膜の形成
センシング部分を、保護膜用ポリマーを含む溶液に浸漬して、センシング部分の両面、側面および先端に保護膜119を形成する（図６ｇ）。保護膜119は、作用電極用端子114a、参照電極用端子115aおよび対極用端子117aを被覆することなく、少なくとも、作用電極114、参照電極115、対極117および検知層118を被覆し、生体内に挿入される長さ以上に形成する。保護膜の好ましい厚さは、5〜200 μmである。
【００２７】
２．埋め込み型バイオセンサのプローブの内部構造
本開示の膜構造体を適用する埋め込み型バイオセンサのプローブの内部構造をさらに説明する。
【００２８】
図７のA-A’切断線での断面図を図８に示す。絶縁性基板111の両側に導電性薄膜112が形成されている。表側の導電性薄膜112では、溝113によって作用電極リード112aと参照電極リード112bの２つのリードに分離され、電気的に絶縁されている。作用電極リード112aの一部が作用電極114として機能し、作用電極114上に検知層118が形成されている。また、絶縁性レジスト膜116aの開口部分に参照電極115が形成されて、参照電極リード112bと電気的に接続している。裏側の導電性薄膜112は対極リード112cとなり、その一部が対極117として機能する。
【００２９】
図８のB-B’切断線での断面図を図９に示す。絶縁性基板111の表側に作用電極114が形成され、その上に検知層118が形成され、裏側に対極117が形成されている。さらに、センシング部分の周囲全体が本開示の保護膜119で被覆されていることが分かる。
【００３０】
図８のC-C’切断面での断面図を図１０に示す。絶縁性基板111の表側に、溝113で電気的に分離された作用電極リード112aと参照電極リード112bとが形成され、その上に絶縁性レジスト膜116aが形成されている。絶縁性レジスト膜116aの開口部に参照電極115が形成されている。基板111の裏側に対極リード112cが形成され、その上に絶縁性レジスト膜116bが形成されている。さらに、センシング部分の周囲全体が本開示の保護膜119で被覆されていることが分かる。
【実施例】
【００３１】
［実施例１］
＜プローブの作製＞
（１）絶縁性基板の準備
図５ａに示すように、ポリエチレンテレフタレート (PET)（東レ株式会社製ルミラーR E20 #188; 189 μm厚）を裁断して、鍵形状の絶縁性基板を準備した。【００３２】
（２）導電性薄膜の形成
図５ｂに示すように、前記絶縁性基板の両面に、スパッタ法により金を堆積することによって、導電性薄膜（厚さ30 nm）を形成した。【００３３】
（３）電極リードの形成
図５ｃに示すように、絶縁性基板の表側に形成した導電性薄膜にレーザー描写することによって絶縁性基板の表面に達する深さの溝を形成して、作用電極リードと参照電極リードに分離して電気的分離した。【００３４】
（４）絶縁性レジスト膜の形成
図５ｄに示すように、絶縁性基板の表側に、作用電極および参照電極ならびに、埋め込み型バイオセンサの本体と電気接続するための作用電極用端子および参照電極用端子として用いる領域を除いた部分に開口を有する絶縁性レジスト膜をスクリーン印刷法により形成し、絶縁性基板の裏側に、対極および本体と電気接続するための対極用端子として用いる領域を除いた部分に開口を有する絶縁性レジスト膜（厚さ10-15 μm）をスクリーン印刷法により形成した。【００３５】
（５）参照電極の形成
図５ｅに示すように、絶縁性基板の表側に形成したレジスト膜の参照電極用の開口にAg/AgClをスクリーン印刷法により堆積させて、参照電極（厚さ10-15 μm）を形成した。【００３６】
（６）検知層の形成
図６ｆに示すように、絶縁性基板の表側に形成した絶縁性レジスト膜の開口部から露出した導電性薄膜を作用電極とし、導電性粒子としてカーボン粒子の懸濁液、グルコースに対する検体応答性酵素としてグルコース酸化酵素（Glucose oxidase; GOx）の水溶液およびレドックスメディエータとしてフェナジン誘導体の水溶液を適量塗布し乾燥して、検知層（厚さ15 μm）を形成した。【００３７】
（７）保護膜の形成
図６ｇに示すように、センシング部分を、架橋剤および保護膜用ポリマーを含むエタノール溶液に浸漬して、センシング部分の両面、側面および先端に保護膜（厚さ5-40 μm）を形成した。
より具体的には、式（４）：【００３８】
【化４】
2019146788.tif 000006
で示されるポリ（スチレン-ran-4-ビニルピリジン-ran-プロピレングリコールメタクリレート） (Mw/Mn=1.8, m=2) ［コポリマー（４）］600 mg、架橋剤としてポリエチレングリコールジグリシジルエーテル (PEGDGE) (Mn=1000) 47 mgを溶媒（エタノール95%、4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジンエタンスルホン酸 (HEPES)緩衝液 （10 mM, pH8）5%）1 mLに溶かした溶液に、上記で製造したプローブを10分間隔で６回浸漬した。その後、室温にて48時間乾燥することによって、架橋した保護膜を形成して、プローブAを得た。上記保護膜の形成条件を表１にまとめた。【００３９】
＜プローブ特性の測定＞
［グルコース応答特性］
プローブAを埋め込み型アンペロメトリックグルコースセンサに取り付け、37℃のリン酸緩衝生理食塩水 (PBS, pH7)中にプローブを設置した。このPBS溶液に500秒ごとにグルコースを50、100、200、300、400、500 mg/dLずつ添加して、継続的に電流応答値（nA）を測定した。
グルコース濃度0〜500 mg/dLにおいて、高い直線性を示し、グルコース応答性は良好であった。結果を図１１に示し、表２にまとめた。【００４０】
［耐久性］
プローブAを37℃のリン酸緩衝生理食塩水 (PBS, pH7)中で保管した。保管前(0日目)および保管後7日目に、プローブAを埋め込み型アンペロメトリックグルコースセンサに取り付けて、37℃のリン酸緩衝生理食塩水 (PBS, pH7)中にプローブを設置した。このPBS溶液に500秒ごとにグルコースを50、100、200、300、400、500 mg/dLずつ添加して、継続的に電流応答値（nA）を測定した。0日目のグルコース濃度500 mg/dLでの電流応答値を100%として、各濃度での応答率 (%)を算出した。
保管後7日目の応答特性は、グルコース濃度0〜500 mg/dLにおいて高い直線性を示し、0日目とほとんど変化がなく、耐久性は良好であった。結果を図１２に示し、表２にまとめた。【００４１】
［実施例２］
＜プローブの作製＞
保護膜の形成において、保護膜用ポリマーを変更した以外は、実施例１と同様にして、プローブを作製した。
より具体的には、式（５）：【００４２】
【化５】
2019146788.tif 000007
で示されるポリ（スチレン-ran-4-ビニルピリジン-ran-プロピレングリコールメタクリレート） (Mw/Mn=1.6; m=約16) ［コポリマー（５）］600 mg、架橋剤としてポリエチレングリコールジグリシジルエーテル (PEGDGE) (Mn=1000) 47 mgを溶媒1 mLに溶かした溶液に、実施例１で製造したプローブを10分間隔で６回浸漬した。室温にて48時間乾燥することによって、保護膜を形成して、プローブBを得た。上記保護膜の形成条件を表１にまとめた。【００４３】
＜プローブ特性の測定＞
［グルコース応答特性］
プローブBのグルコース応答特性につき、実施例１と同様に測定を行った。
グルコース濃度0〜500 mg/dLにおいて、高い直線性を示し、グルコース応答性は良好であった。結果を図１１に示し、表２にまとめた。【００４４】
［耐久性］
プローブBの耐久性につき、実施例１と同様に測定を行った。
保管後7日目の応答特性は、グルコース濃度0〜500 mg/dLにおいて高い直線性を示し、0日目とほとんど変化がなく、耐久性は良好であった。結果を図１２に示し、表２にまとめた。【００４５】
［実施例３］
保護膜の形成において、保護膜用ポリマーを変更した以外は、実施例１と同様にして、プローブを作製した。
より具体的には、式（４）で示されるポリ（スチレン-ran-4-ビニルピリジン-ran-プロピレングリコールメタクリレート） (Mw/Mn=1.8, m=2) ［コポリマー（４）］300 mg、式（５）で示されるポリ（スチレン-ran-4-ビニルピリジン-ran-プロピレングリコールメタクリレート）(Mw/Mn=1.6; m=約16) ［コポリマー（５）］300 mg、架橋剤としてポリエチレングリコールジグリシジルエーテル (PEGDGE) (Mn=1000) 47 mgを溶媒1 mLに溶かした溶液に、実施例１で製造したプローブを10分間隔で６回浸漬した。室温にて48時間乾燥することによって、保護膜を形成し、プローブCを得た。上記保護膜の形成条件を表１にまとめた。【００４６】
＜プローブ特性の測定＞
［グルコース応答特性］
プローブCのグルコース応答特性につき、実施例１と同様に測定を行った。
グルコース濃度0〜500 mg/dLにおいて、高い直線性を示し、グルコース応答性は良好であった。結果を図１１に示し、表２にまとめた。【００４７】
［耐久性］
プローブCの耐久性につき、実施例１と同様に測定を行った。
保管後7日目の応答特性は、グルコース濃度0〜500 mg/dLにおいて高い直線性を示し、0日目とほとんど変化がなく、耐久性は良好であった。結果を図１２に示し、表２にまとめた。【００４８】
［実施例４］
＜プローブの作製＞
保護膜の形成において、保護膜用ポリマーを変更した以外は、実施例１と同様にして、プローブを作製した。
より具体的には、式（４）で示されるポリ(スチレン-ran-4-ビニルピリジン-ran-プロピレングリコールメタクリレート) (Mw/Mn=1.8, m=2) ［ランダムコポリマー（４）］300 mgおよび式（６）：【００４９】
【化６】
2019146788.tif 000008
で示されるポリ(4-ビニルピリジン)-block-ポリ(2,2-ジメチルエチルメタクリレート) (Mw/Mn=1.15; w’=77.0-g-80.0 x 103) ［ブロックコポリマー（６）］300 mg、架橋剤としてポリエチレングリコールジグリシジルエーテル (PEGDGE) (Mn=1000) 47 mgを溶媒（エタノール95%、4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジンエタンスルホン酸 (HEPES)緩衝液 （10 mM, pH8）5%）1 mLに溶かした溶液に、上記で製造したプローブを10分間隔で８回浸漬した。その後、室温にて48時間乾燥することによって、架橋した保護膜を形成して、プローブDを得た。上記保護膜の形成条件を表３にまとめた。【００５０】
＜プローブ特性の測定＞
［グルコース応答特性］
プローブDのグルコース応答特性につき、実施例１と同様に測定を行った。
グルコース濃度0〜500 mg/dLにおいて、高い直線性を示し、グルコース応答性は良好であった。結果を図１３に示し、表４にまとめた。【００５１】
［耐久性］
プローブDの耐久性につき、実施例１と同様に測定を行った。
保管後7日目の応答特性は、グルコース濃度0〜500 mg/dLにおいて高い直線性を示し、0日目とほとんど変化がなく、耐久性は良好であった。結果を図１４に示し、表４にまとめた。【００５２】
［実施例５］
＜プローブの作製＞
保護膜の形成において、保護膜用ポリマーを変更した以外は、実施例４と同様にして、プローブを作製した。
より具体的には、実施例４において、式（６）で示されるポリ(4-ビニルピリジン)-block-ポリ(2,2-ジメチルエチルメタクリレート)［ブロックコポリマー（６）］の代わりに、式（７）：【００５３】
【化７】
2019146788.tif 000009
で示されるポリ(4-ビニルピリジン)-block-ポリ(n-ブチルメタクリレート) (Mw/Mn=1.3; w”=6.0-g-4.5 x 103) ［ブロックコポリマー（７）］を用いる以外は、実施例４と同様に、保護膜を形成して、プローブEを得た。上記保護膜の形成条件を表３にまとめた。【００５４】
＜プローブ特性の測定＞
［グルコース応答特性］
プローブEのグルコース応答特性につき、実施例１と同様に測定を行った。
グルコース濃度0〜500 mg/dLにおいて、高い直線性を示し、グルコース応答性は良好であった。結果を図１３に示し、表４にまとめた。【００５５】
［耐久性］
プローブEの耐久性につき、実施例１と同様に測定を行った。
保管後7日目の応答特性は、グルコース濃度0〜500 mg/dLにおいて高い直線性を示し、0日目とほとんど変化がなく、耐久性は良好であった。結果を図１４に示し、表４にまとめた。【００５６】
［実施例６］
保護膜の形成において、保護膜用ポリマーを変更した以外は、実施例４と同様にして、プローブを作製した。
より具体的には、実施例４において、式（６）で示されるポリ(4-ビニルピリジン)-block-ポリ(2,2-ジメチルエチルメタクリレート)［ブロックコポリマー（６）］の代わりに、式（８）：【００５７】
【化８】
2019146788.tif 000010
で示されるポリ(4-ビニルピリジン-ran-2-ヒドロキシエチルメタクリレート) (Mw/Mn=1.2) ［ランダムコポリマー（８）］を用いる以外は、実施例４と同様に、保護膜を形成し、プローブFを得た。上記保護膜の形成条件を表３にまとめた。【００５８】
＜プローブ特性の測定＞
［グルコース応答特性］
プローブFのグルコース応答特性につき、実施例１と同様に測定を行った。
グルコース濃度0〜500 mg/dLにおいて、高い直線性を示し、グルコース応答性は良好であった。結果を図１３に示し、表４にまとめた。【００５９】
［耐久性］
プローブFの耐久性につき、実施例１と同様に測定を行った。
保管後7日目の応答特性は、グルコース濃度0〜500 mg/dLにおいて高い直線性を示し、0日目とほとんど変化がなく、耐久性は良好であった。結果を図１４に示し、表４にまとめた。【００６０】
［実施例７］
保護膜の形成において、保護膜用ポリマーを変更した以外は、実施例４と同様にして、プローブを作製した。
より具体的には、実施例４において、式（６）で示されるポリ(4-ビニルピリジン)-block-ポリ(2,2-ジメチルエチルメタクリレート)［ブロックコポリマー（６）］の代わりに、式（９）：【００６１】
【化９】
2019146788.tif 000011
で示されるポリ(4-ビニルピリジン-ran-2-ヒドロキシエチルメタクリレート) (Mw/Mn=1.6) ［ランダムコポリマー（９）］を用いる以外は、実施例４と同様に、保護膜を形成し、プローブGを得た。上記保護膜の形成条件を表３にまとめた。【００６２】
＜プローブ特性の測定＞
［グルコース応答特性］
プローブGのグルコース応答特性につき、実施例１と同様に測定を行った。
グルコース濃度0〜500 mg/dLにおいて、高い直線性を示し、グルコース応答性は良好であった。結果を図１３に示し、表４にまとめた。【００６３】
［耐久性］
プローブGの耐久性につき、実施例１と同様に測定を行った。
保管後7日目の応答特性は、グルコース濃度0〜500 mg/dLにおいて高い直線性を示し、0日目とほとんど変化がなく、耐久性は良好であった。結果を図１４に示し、表４にまとめた。【００６４】
［実施例８］
保護膜の形成において、保護膜用ポリマーを変更した以外は、実施例１と同様にして、プローブを作製した。
より具体的には、式（５）で示されるポリ(スチレン-ran-4-ビニルピリジン-ran-プロピレングリコールメタクリレート) (Mw/Mn=1.6, m=約16) ［ランダムコポリマー（５）］300 mgおよび式（６）で示されるポリ(4-ビニルピリジン)-block-ポリ(2,2-ジメチルエチルメタクリレート) (Mw/Mn=1.15; w’=77.0-g-80.0 x 103) ［ブロックコポリマー（６）］300 mg、架橋剤としてポリエチレングリコールジグリシジルエーテル (PEGDGE) (Mn=1000) 47 mgを溶媒（エタノール95%、4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジンエタンスルホン酸 (HEPES)緩衝液 （10 mM, pH8）5%）1 mLに溶かした溶液に、上記で製造したプローブを10分間隔で８回浸漬した。その後、室温にて48時間乾燥することによって、架橋した保護膜を形成して、プローブHを得た。上記保護膜の形成条件を表５にまとめた。【００６５】
＜プローブ特性の測定＞
［グルコース応答特性］
プローブHのグルコース応答特性につき、実施例１と同様に測定を行った。
グルコース濃度0〜500 mg/dLにおいて、高い直線性を示し、グルコース応答性は良好であった。結果を図１５に示し、表６にまとめた。【００６６】
［耐久性］
プローブHの耐久性につき、実施例１と同様に測定を行った。
保管後7日目の応答特性は、グルコース濃度0〜500 mg/dLにおいて高い直線性を示し、0日目とほとんど変化がなく、耐久性は良好であった。結果を図１６に示し、表６にまとめた。【００６７】
［実施例９］
保護膜の形成において、保護膜用ポリマーを変更した以外は、実施例８と同様にして、プローブを作製した。
より具体的には、実施例８において、式（６）で示されるポリ(4-ビニルピリジン)-block-ポリ(2,2-ジメチルエチルメタクリレート)［ブロックコポリマー（６）］の代わりに、式（７）で示されるポリ(4-ビニルピリジン)-block-ポリ(n-ブチルメタクリレート) (Mw/Mn=1.3; w”=6.0-g-4.5 x 103) ［ブロックコポリマー（７）］を用いる以外は、実施例８と同様に、保護膜を形成して、プローブIを得た。上記保護膜の形成条件を表５にまとめた。【００６８】
＜プローブ特性の測定＞
［グルコース応答特性］
プローブIのグルコース応答特性につき、実施例１と同様に測定を行った。
グルコース濃度0〜500 mg/dLにおいて、高い直線性を示し、グルコース応答性は良好であった。結果を図１５に示し、表６にまとめた。【００６９】
［耐久性］
プローブIの耐久性につき、実施例１と同様に測定を行った。
保管後7日目の応答特性は、グルコース濃度0〜500 mg/dLにおいて直線性を維持し、耐久性は良好であった。結果を図１６に示し、表６にまとめた。【００７０】
［実施例１０］
保護膜の形成において、保護膜用ポリマーを変更した以外は、実施例８と同様にして、プローブを作製した。
より具体的には、実施例８において、式（６）で示されるポリ(4-ビニルピリジン)-block-ポリ(2,2-ジメチルエチルメタクリレート)［ブロックコポリマー（６）］の代わりに、式（９）で示されるポリ(4-ビニルピリジン-ran-2-ヒドロキシエチルメタクリレート)［ランダムコポリマー（９）］を用いる以外は、実施例８と同様に、保護膜を形成し、プローブJを得た。上記保護膜の形成条件を表５にまとめた。【００７１】
＜プローブ特性の測定＞
［グルコース応答特性］
プローブJのグルコース応答特性につき、実施例１と同様に測定を行った。
グルコース濃度0〜500 mg/dLにおいて、高い直線性を示し、グルコース応答性は良好であった。結果を図１５に示し、表６にまとめた。【００７２】
［耐久性］
プローブKの耐久性につき、実施例１と同様に測定を行った。
保管後7日目の応答特性は、グルコース濃度0〜500 mg/dLにおいて直線性を維持し、耐久性は良好であった。結果を図１６に示し、表６にまとめた。【００７３】
［比較例１］
保護膜の形成において、保護膜用ポリマーを変更し、架橋剤溶液への浸漬回数を増やした以外は、実施例１と同様にして、プローブを作製した。
より具体的には、式（４）で示されるポリ(スチレン-ran-4-ビニルピリジン-ran-プロピレングリコールメタクリレート) (Mw/Mn=1.8, m=2) ［ランダムコポリマー（４）］300 mgおよびポリ(4-ビニルピリジン)（Mw=160,000）［P4VP］300 mg、架橋剤としてポリエチレングリコールジグリシジルエーテル (PEGDGE) (Mn=1000) 47 mgを溶媒（エタノール95%、4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジンエタンスルホン酸 (HEPES)緩衝液 （10 mM, pH8）5%）1 mLに溶かした溶液に、上記で製造したプローブを10分間隔で９回浸漬した。その後、室温にて48時間乾燥することによって、架橋した保護膜を形成して、プローブKを得た。上記保護膜の形成条件を表７にまとめた。【００７４】
＜プローブ特性の測定＞
［グルコース応答特性］
プローブKのグルコース応答特性につき、実施例１と同様に測定を行った。
グルコース濃度0〜500 mg/dLにおいて、高い直線性を示し、グルコース応答性は良好であった。結果を図１７に示し、表８にまとめた。【００７５】
［耐久性］
プローブKの耐久性につき、実施例１と同様に測定を行った。
保管後7日目の応答特性は、グルコース濃度100 mg/dLを超えると48%にまで低下し、耐久性が不良であった。結果を図１８に示し、表８にまとめた。【００７６】
［比較例２］
保護膜の形成において、保護膜用ポリマーを変更し、架橋剤溶液への浸漬回数を増やした以外は、実施例１と同様にして、プローブを作製した。
より具体的には、式（５）で示されるポリ(スチレン-ran-4-ビニルピリジン-ran-プロピレングリコールメタクリレート) (Mw/Mn=1.6, m=約16) ［ランダムコポリマー（５）］300 mgおよびポリ(4-ビニルピリジン)（Mw=160,000）［P4VP］300 mg、架橋剤としてポリエチレングリコールジグリシジルエーテル (PEGDGE) (Mn=1000) 47 mgを溶媒（エタノール95%、4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジンエタンスルホン酸 (HEPES)緩衝液 （10 mM, pH8）5%）1 mLに溶かした溶液に、上記で製造したプローブを10分間隔で９回浸漬した。その後、室温にて48時間乾燥することによって、架橋した保護膜を形成して、プローブLを得た。上記保護膜の形成条件を表７にまとめた。【００７７】
＜プローブ特性の測定＞
［グルコース応答特性］
プローブLのグルコース応答特性につき、実施例１と同様に測定を行った。
グルコース濃度0〜500 mg/dLにおいて、高い直線性を示し、グルコース応答性は良好であった。結果を図１７に示し、表８にまとめた。【００７８】
［耐久性］
プローブLの耐久性につき、実施例１と同様に測定を行った。
保管後7日目の応答特性は、グルコース濃度100 mg/dLを超えると36%にまで低下し、耐久性が不良であった。結果を図１８に示し、表８にまとめた。【００７９】
［比較例３］
保護膜の形成において、保護膜用ポリマーを変更し、架橋剤の量を増やし、架橋剤溶液への浸漬回数を増やした以外は、実施例１と同様にして、プローブを作製した。
より具体的には、ポリ(4-ビニルピリジン)（Mw=160,000）［P4VP］800 mg、架橋剤としてポリエチレングリコールジグリシジルエーテル (PEGDGE) (Mn=1000) 62 mgを溶媒（エタノール95%、4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジンエタンスルホン酸 (HEPES)緩衝液 （10 mM, pH8）5%）1 mLに溶かした溶液に、上記で製造したプローブを10分間隔で９回浸漬した。その後、室温にて48時間乾燥することによって、架橋した保護膜を形成して、プローブMを得た。上記保護膜の形成条件を表７にまとめた。【００８０】
＜プローブ特性の測定＞
［グルコース応答特性］
プローブMのグルコース応答特性につき、実施例１と同様に測定を行った。
グルコース濃度0〜500 mg/dLにおいて、高い直線性を示し、グルコース応答性は良好であった。結果を図１７に示し、表８にまとめた。【００８１】
［耐久性］
プローブMの耐久性につき、実施例１と同様に測定を行った。
保管後7日目の応答特性は、グルコース濃度100 mg/dLを超えると22%にまで低下し、耐久性が不良であった。結果を図１８に示し、表８にまとめた。【００８２】
［参考例１］
保護膜の形成において、保護膜用ポリマーを変更し、架橋剤の量を増やし、架橋剤溶液への浸漬回数を増やした以外は、実施例１と同様にして、プローブを作製した。
より具体的には、式（７）で示されるポリ(4-ビニルピリジン)-block-ポリ(n-ブチルメタクリレート) (Mw/Mn=1.3; w”=6.0-g-4.5 x 103) ［ブロックコポリマー（７）］800 mg、架橋剤としてポリエチレングリコールジグリシジルエーテル (PEGDGE) (Mn=1000) 62 mgを溶媒（エタノール95%、4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジンエタンスルホン酸 (HEPES)緩衝液 （10 mM, pH8）5%）1 mLに溶かした溶液に、上記で製造したプローブを10分間隔で１２回浸漬した。その後、室温にて48時間乾燥することによって、架橋した保護膜を形成して、プローブNを得た。上記保護膜の形成条件を表９にまとめた。【００８３】
＜プローブ特性の測定＞
［グルコース応答特性］
プローブNのグルコース応答特性につき、実施例１と同様に測定を行った。
グルコース濃度0〜500 mg/dLにおいて、高い直線性を示し、グルコース応答性は良好であった。結果を図１９に示し、表１０にまとめた。【００８４】
［耐久性］
プローブNの耐久性につき、実施例１と同様に測定を行った。
保管後7日目の応答特性は、グルコース濃度200 mg/dLを超えると46%にまで低下し、耐久性が不良であった。結果を図２０に示し、表１０にまとめた。【００８５】
［参考例２］
保護膜の形成において、保護膜用ポリマーを変更し、架橋剤の量を増やした以外は、実施例１と同様にして、プローブを作製した。
より具体的には、式（８）で示されるポリ(4-ビニルピリジン-ran-2-ヒドロキシエチルメタクリレート) ［ランダムコポリマー（８）］800 mg、架橋剤としてポリエチレングリコールジグリシジルエーテル (PEGDGE) (Mn=1000) 62 mgを溶媒（エタノール95%、4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジンエタンスルホン酸 (HEPES)緩衝液 （10 mM, pH8）5%）1 mLに溶かした溶液に、上記で製造したプローブを10分間隔で８回浸漬した。その後、室温にて48時間乾燥することによって、架橋した保護膜を形成して、プローブOを得た。上記保護膜の形成条件を表９にまとめた。【００８６】
＜プローブ特性の測定＞
［グルコース応答特性］
プローブOのグルコース応答特性につき、実施例１と同様に測定を行った。
グルコース濃度0〜500 mg/dLにおいて、高い直線性を示し、グルコース応答性は良好であった。結果を図１９に示し、表１０にまとめた。【００８７】
［耐久性］
プローブOの耐久性につき、実施例１と同様に測定を行った。
保管後7日目の応答特性は、グルコース濃度200 mg/dLを超えると25%にまで低下し、耐久性が不良であった。結果を図２０に示し、表１０にまとめた。【００８８】
［参考例３］
保護膜の形成において、保護膜用ポリマーを変更し、架橋剤の量を増やした以外は、実施例１と同様にして、プローブを作製した。
より具体的には、式（９）で示されるポリ(4-ビニルピリジン-ran-2-ヒドロキシエチルメタクリレート)［ランダムコポリマー（９）］800 mg、架橋剤としてポリエチレングリコールジグリシジルエーテル (PEGDGE) (Mn=1000) 62 mgを溶媒（エタノール95%、4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジンエタンスルホン酸 (HEPES)緩衝液 （10 mM, pH8）5%）1 mLに溶かした溶液に、上記で製造したプローブを10分間隔で８回浸漬した。その後、室温にて48時間乾燥することによって、架橋した保護膜を形成して、プローブPを得た。上記保護膜の形成条件を表９にまとめた。【００８９】
＜プローブ特性の測定＞
［グルコース応答特性］
プローブPのグルコース応答特性につき、実施例１と同様に測定を行った。
グルコース濃度0〜500 mg/dLにおいて、高い直線性を示し、グルコース応答性は良好であった。結果を図１９に示し、表１０にまとめた。【００９０】
［耐久性］
プローブPの耐久性につき、実施例１と同様に測定を行った。
保管後7日目の応答特性は、グルコース濃度200 mg/dLを超えると32%にまで低下し、耐久性が不良であった。結果を図２０に示し、表１０にまとめた。【００９１】
［参考例４］
保護膜の形成において、保護膜用ポリマーを変更し、架橋剤の量を増やした以外は、実施例１と同様にして、プローブを作製した。
より具体的には、式（８）で示されるポリ(4-ビニルピリジン-ran-2-ヒドロキシエチルメタクリレート) ［ランダムコポリマー（８）］400 mgおよび式（９）で示されるポリ(4-ビニルピリジン-ran-2-ヒドロキシエチルメタクリレート)［ランダムコポリマー（９）］400 mg、架橋剤としてポリエチレングリコールジグリシジルエーテル (PEGDGE) (Mn=1000) 62 mgを溶媒（エタノール95%、4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジンエタンスルホン酸 (HEPES)緩衝液 （10 mM, pH8）5%）1 mLに溶かした溶液に、上記で製造したプローブを10分間隔で８回浸漬した。その後、室温にて48時間乾燥することによって、架橋した保護膜を形成して、プローブQを得た。上記保護膜の形成条件を表９にまとめた。【００９２】
＜プローブ特性の測定＞
［グルコース応答特性］
プローブQのグルコース応答特性につき、実施例１と同様に測定を行った。
グルコース濃度0〜500 mg/dLにおいて、高い直線性を示し、グルコース応答性は良好であった。結果を図１９に示し、表１０にまとめた。【００９３】
［耐久性］
プローブQの耐久性につき、実施例１と同様に測定を行った。
保管後7日目の応答特性は、グルコース濃度200 mg/dLを超えると30%にまで低下し、耐久性が不良であった。結果を図２０に示し、表１０にまとめた。【００９４】
【表１】
2019146788.tif 000012
【００９５】
【表２】
2019146788.tif 000013
【００９６】
【表３】
2019146788.tif 000014
【００９７】
【表４】
2019146788.tif 000015
【００９８】
【表５】
2019146788.tif 000016
【００９９】
【表６】
2019146788.tif 000017
【０１００】
【表７】
2019146788.tif 000018
【０１０１】
【表８】
2019146788.tif 000019
【０１０２】
【表９】
2019146788.tif 000020
【０１０３】
【表１０】
2019146788.tif 000021
【０１０４】
本開示のポリマー混合物を用いた保護膜をプローブのセンシング部分に用いれば、グルコース応答性は良好で、かつ、従来のポリマーと比較して、耐久性が向上することが確認された。
【産業上の利用可能性】
【０１０５】
本開示の少なくとも検体応答性酵素およびレドックスメディエータを含む検知層および前記検知層上に形成した保護膜を備えた膜構造体は、埋め込み型バイオセンサのプローブに有用である。
【符号の説明】
【０１０６】
１        埋め込み型バイオセンサ
１０      本体
１１      プローブ
１１１    絶縁性基板
１１２    導電性薄膜
１１２ａ  作用電極リード
１１２ｂ  参照電極リード
１１２ｃ  対極リード
１１３    溝
１１４    作用電極
１１５    参照電極
１１６    絶縁性レジスト
１１７    対極
１１８    検知層
１１９    保護膜
２        生体
３        情報通信機器
【図１】
2019146788.tif 000030
【図２】
2019146788.tif 000031
【図３】
2019146788.tif 000032
【図４】
2019146788.tif 000033
【図５】
2019146788.tif 000034
【図６】
2019146788.tif 000035
【図７】
2019146788.tif 000036
【図８】
2019146788.tif 000037
【図９】
2019146788.tif 000038
【図１０】
2019146788.tif 000039
【図１１】
2019146788.tif 000040
【図１２】
2019146788.tif 000041
【図１３】
2019146788.tif 000042
【図１４】
2019146788.tif 000043
【図１５】
2019146788.tif 000044
【図１６】
2019146788.tif 000045
【図１７】
2019146788.tif 000046
【図１８】
2019146788.tif 000047
【図１９】
2019146788.tif 000048
【図２０】
2019146788.tif 000049
【手続補正書】
【提出日】令和2年7月28日(2020.7.28)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３０】
図８のC-C’切断面での断面図を図１０に示す。絶縁性基板111の表側に、溝113で電気的に分離された作用電極リード112aと参照電極リード112bとが形成され、その上に絶縁性レジスト膜116aが形成されている。絶縁性レジスト膜116aの開口部に参照電極115が形成されている。絶縁性基板111の裏側に対極リード112cが形成され、その上に絶縁性レジスト膜116bが形成されている。さらに、センシング部分の周囲全体が本開示の保護膜119で被覆されていることが分かる。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３１】
［実施例１］
＜プローブの作製＞
（１）絶縁性基板の準備
図４ａに示すように、ポリエチレンテレフタレート (PET)（東レ株式会社製ルミラーR E20 #188; 189 μm厚）を裁断して、鍵形状の絶縁性基板を準備した。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３２】
（２）導電性薄膜の形成
図４ｂに示すように、前記絶縁性基板の両面に、スパッタ法により金を堆積することによって、導電性薄膜（厚さ30 nm）を形成した。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４９】
［化６］
2019146788.tif 000050
で示されるポリ(4-ビニルピリジン)-block-ポリ(1,1-ジメチルエチルメタクリレート) (Mw/Mn=1.15; w’=77.0-g-80.0 x 103) ［ブロックコポリマー（６）］300 mg、架橋剤としてポリエチレングリコールジグリシジルエーテル (PEGDGE) (Mn=1000) 47 mgを溶媒（エタノール95%、4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジンエタンスルホン酸 (HEPES)緩衝液 （10 mM, pH8）5%）1 mLに溶かした溶液に、上記で製造したプローブを10分間隔で８回浸漬した。その後、室温にて48時間乾燥することによって、架橋した保護膜を形成して、プローブDを得た。上記保護膜の形成条件を表３にまとめた。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５２】
［実施例５］
＜プローブの作製＞
保護膜の形成において、保護膜用ポリマーを変更した以外は、実施例４と同様にして、プローブを作製した。
より具体的には、実施例４において、式（６）で示されるポリ(4-ビニルピリジン)-block-ポリ(1,1-ジメチルエチルメタクリレート)［ブロックコポリマー（６）］の代わりに、式（７）：
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５６】
［実施例６］
保護膜の形成において、保護膜用ポリマーを変更した以外は、実施例４と同様にして、プローブを作製した。
より具体的には、実施例４において、式（６）で示されるポリ(4-ビニルピリジン)-block-ポリ(1,1-ジメチルエチルメタクリレート)［ブロックコポリマー（６）］の代わりに、式（８）：
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６０】
［実施例７］
保護膜の形成において、保護膜用ポリマーを変更した以外は、実施例４と同様にして、プローブを作製した。
より具体的には、実施例４において、式（６）で示されるポリ(4-ビニルピリジン)-block-ポリ(1,1-ジメチルエチルメタクリレート)［ブロックコポリマー（６）］の代わりに、式（９）：
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６４】
［実施例８］
保護膜の形成において、保護膜用ポリマーを変更した以外は、実施例１と同様にして、プローブを作製した。
より具体的には、式（５）で示されるポリ(スチレン-ran-4-ビニルピリジン-ran-プロピレングリコールメタクリレート) (Mw/Mn=1.6, m=約16) ［ランダムコポリマー（５）］300 mgおよび式（６）で示されるポリ(4-ビニルピリジン)-block-ポリ(1,1-ジメチルエチルメタクリレート) (Mw/Mn=1.15; w’=77.0-g-80.0 x 103) ［ブロックコポリマー（６）］300 mg、架橋剤としてポリエチレングリコールジグリシジルエーテル (PEGDGE) (Mn=1000) 47 mgを溶媒（エタノール95%、4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジンエタンスルホン酸 (HEPES)緩衝液 （10 mM, pH8）5%）1 mLに溶かした溶液に、上記で製造したプローブを10分間隔で８回浸漬した。その後、室温にて48時間乾燥することによって、架橋した保護膜を形成して、プローブHを得た。上記保護膜の形成条件を表５にまとめた。
【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６７】
［実施例９］
保護膜の形成において、保護膜用ポリマーを変更した以外は、実施例８と同様にして、プローブを作製した。
より具体的には、実施例８において、式（６）で示されるポリ(4-ビニルピリジン)-block-ポリ(1,1-ジメチルエチルメタクリレート)［ブロックコポリマー（６）］の代わりに、式（７）で示されるポリ(4-ビニルピリジン)-block-ポリ(n-ブチルメタクリレート) (Mw/Mn=1.3; w”=6.0-g-4.5 x 103) ［ブロックコポリマー（７）］を用いる以外は、実施例８と同様に、保護膜を形成して、プローブIを得た。上記保護膜の形成条件を表５にまとめた。
【手続補正１０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００７０】
［実施例１０］
保護膜の形成において、保護膜用ポリマーを変更した以外は、実施例８と同様にして、プローブを作製した。
より具体的には、実施例８において、式（６）で示されるポリ(4-ビニルピリジン)-block-ポリ(1,1-ジメチルエチルメタクリレート)［ブロックコポリマー（６）］の代わりに、式（９）で示されるポリ(4-ビニルピリジン-ran-2-ヒドロキシエチルメタクリレート)［ランダムコポリマー（９）］を用いる以外は、実施例８と同様に、保護膜を形成し、プローブJを得た。上記保護膜の形成条件を表５にまとめた。
【手続補正１１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００７２】
［耐久性］
プローブJの耐久性につき、実施例１と同様に測定を行った。
保管後7日目の応答特性は、グルコース濃度0〜500 mg/dLにおいて直線性を維持し、耐久性は良好であった。結果を図１６に示し、表６にまとめた。
【手続補正１２】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
バイオセンサ用プローブに用いられる保護膜であって、前記保護膜は式（１）：
［化１］
2019146788.tif 000051
［式中、mは1〜20の整数を表し、x、yおよびzは、それぞれ、３種のモノマー単位：スチレン、4-ビニルピリジン、プロピレングリコールメタクリレートのモル分率を表しx+y+z=100であり、wは数平均分子量を表す。］で示されるポリ（スチレン-ran-4-ビニルピリジン-ran-プロピレングリコールメタクリレート）を含む、保護膜。
【請求項２】
バイオセンサ用プローブに用いられる保護膜であって、前記保護膜は、式（１）：
［化２］
2019146788.tif 000052
［式中、mは1〜20の整数を表し、x、yおよびzは、それぞれ、３種のモノマー単位：スチレン、4-ビニルピリジン、プロピレングリコールメタクリレートのモル分率を表しx+y+z=100であり、wは数平均分子量を表す。］で示されるポリ(スチレン-ran-4-ビニルピリジン-ran-プロピレングリコールメタクリレート)と、
式（２）：
［化３］
2019146788.tif 000053
［式中、Ｒは、炭素数１〜１５のアルキル基を表し、pおよびqは、それぞれ、２種のモノマー単位：4-ビニルピリジン、C1-15アルキルメタクリレートの繰り返し単位を表し、wは数平均分子量を表す。］で示されるポリ(4-ビニルピリジン)-block-ポリ(C1-15アルキルメタクリレート)または
式（３）：
［化４］
2019146788.tif 000054
［式中、sおよびtは、それぞれ、２種のモノマー単位：4-ビニルピリジン、2-ヒドロキシエチルメタクリレートのモル分率を表しs+t=100であり、wは数平均分子量を表す。］で示されるポリ(4-ビニルピリジン-ran-2-ヒドロキシエチルメタクリレート)と、
を含むコポリマー混合物を含む保護膜。
【請求項３】
前記式（１）中の前記スチレンのモル分率ｘは、５〜３０であり、かつ、前記スチレンのモル分率ｘ、前記4-ビニルピリジンのモル分率ｙおよび前記プロピレングリコールメタクリレートのモル分率ｚの関係が、x+y+z=100である、請求項１に記載の保護膜。
【請求項４】
前記式（１）中の前記スチレンのモル分率ｘは、１０〜３０である、請求項３に記載の保護膜。
【請求項５】
前記式（１）中の前記スチレンのモル分率ｘは、５〜２５である、請求項４に記載の保護膜。
【請求項６】
前記式（１）中の4-ビニルピリジンのモル分率ｙは、４５〜６０であり、かつ、前記スチレンのモル分率ｘ、前記4-ビニルピリジンのモル分率ｙおよび前記プロピレングリコールメタクリレートのモル分率ｚの関係が、x+y+z=100である、請求項１に記載の保護膜。
【請求項７】
前記式（１）中の前記4-ビニルピリジンのモル分率ｙは、５０〜６０である、請求項４に記載の保護膜。
【請求項８】
前記式（１）中の前記プロピレングリコールメタクリレートのモル分率ｚは、１５〜３０であり、かつ、前記スチレンのモル分率ｘ、前記4-ビニルピリジンのモル分率ｙおよび前記プロピレングリコールメタクリレートのモル分率ｚの関係が、x+y+z=100である、請求項１に記載の保護膜。
【請求項９】
前記式（１）中の前記プロピレングリコールメタクリレートのモル分率ｚは、２０〜２５である、請求項４に記載の保護膜。
【請求項１０】
前記式（１）で示される前記ポリマーの数平均分子量は４０〜８０×１０３である、請求項１に記載の保護膜。
【請求項１１】
前記式（１）で示される前記ポリマーの数平均分子量は４５〜６０×１０３である、請求項１に記載の保護膜。
【請求項１２】
前記保護膜は、ポリ(2-メトキシエチルアクリレート)をさらに含有する、請求項１に記載の保護膜。
【請求項１３】
前記式（１）中の前記スチレンのモル分率ｘは、５〜３０であり、かつ、前記スチレンのモル分率ｘ、前記4-ビニルピリジンのモル分率ｙおよび前記プロピレングリコールメタクリレートのモル分率ｚの関係が、x+y+z=100である、請求項２に記載の保護膜。
【請求項１４】
前記式（１）中の前記スチレンのモル分率ｘは、１０〜３０である、請求項１３に記載の保護膜。
【請求項１５】
前記式（１）中の前記スチレンのモル分率ｘは、５〜２５である、請求項１４に記載の保護膜。
【請求項１６】
前記式（１）中の4-ビニルピリジンのモル分率ｙは、４５〜６０であり、かつ、前記スチレンのモル分率ｘ、前記4-ビニルピリジンのモル分率ｙおよび前記プロピレングリコールメタクリレートのモル分率ｚの関係が、x+y+z=100である、請求項２に記載の保護膜。
【請求項１７】
前記式（１）中の前記4-ビニルピリジンのモル分率ｙは、５０〜６０である、請求項１４に記載の保護膜。
【請求項１８】
前記式（１）中の前記プロピレングリコールメタクリレートのモル分率ｚは、１５〜３０であり、かつ、前記スチレンのモル分率ｘ、前記4-ビニルピリジンのモル分率ｙおよび前記プロピレングリコールメタクリレートのモル分率ｚの関係が、x+y+z=100である、請求項２に記載の保護膜。
【請求項１９】
前記式（１）中の前記プロピレングリコールメタクリレートのモル分率ｚは、２０〜２５である、請求項１４に記載の保護膜。
【請求項２０】
前記式（１）で示される前記ポリマーの数平均分子量は４０〜８０×１０３である、請求項２に記載の保護膜。
【請求項２１】
前記式（１）で示される前記ポリマーの数平均分子量は４５〜６０×１０３である、請求項２に記載の保護膜。
【請求項２２】
前記式（２）で示される前記ポリマーを構成する各ブロックの数平均分子量は５０〜２００×１０３である、請求項２に記載の保護膜。
【請求項２３】
前記式（２）で示される前記ポリマーを構成する各ブロックの数平均分子量は６５〜１００×１０３である、請求項２に記載の保護膜。
【請求項２４】
前記式（３）中の前記4-ビニルピリジンのモル分率ｓは、４０〜８０であり、かつ、前記4-ビニルピリジンのモル分率ｓおよび前記2-ヒドロキシエチルメタクリレートのモル分率ｔの関係が、s+t=100である、請求項２に記載の保護膜。
【請求項２５】
前記式（３）中の前記4-ビニルピリジンのモル分率ｓは、６０〜７０である、請求項２４に記載の保護膜。
【請求項２６】
前記式（３）中の前記2-ヒドロキシエチルメタクリレートのモル分率ｔは、２０〜６０であり、かつ、前記4-ビニルピリジンのモル分率ｓおよび前記2-ヒドロキシエチルメタクリレートのモル分率ｔの関係が、s+t=100である、請求項２に記載の保護膜。
【請求項２７】
前記式（３）中の前記2-ヒドロキシエチルメタクリレートのモル分率ｔは、３０〜４０である、請求項２６に記載の保護膜。
【請求項２８】
前記式（３）中の前記2-ヒドロキシエチルメタクリレートのモル分率ｔは、２０〜６０であり、かつ、前記4-ビニルピリジンのモル分率ｓおよび前記2-ヒドロキシエチルメタクリレートのモル分率ｔの関係が、s+t=100である、請求項２４に記載の保護膜。
【請求項２９】
前記式（３）中の前記2-ヒドロキシエチルメタクリレートのモル分率ｔは、３０〜４０である、請求項２８に記載の保護膜。
【請求項３０】
前記式（３）中の前記2-ヒドロキシエチルメタクリレートのモル分率ｔは、２０〜６０であり、かつ、前記4-ビニルピリジンのモル分率ｓおよび前記2-ヒドロキシエチルメタクリレートのモル分率ｔの関係が、s+t=100である、請求項２５に記載の保護膜。
【請求項３１】
前記式（３）中の前記2-ヒドロキシエチルメタクリレートのモル分率ｔは、３０〜４０である、請求項３０に記載の保護膜。
【請求項３２】
前記保護膜は、ポリ(2-メトキシエチルアクリレート)をさらに含有する、請求項２に記載の保護膜。
【請求項３３】
作用電極、参照電極および対極、前記作用電極上に形成された検知層および前記検知層を被覆する保護膜を備え、前記検知層は検体応答性酵素およびレドックスメディエータを含み、前記保護膜は式（１）：
［化５］
2019146788.tif 000055
［式中、mは1〜20の整数を表し、x、yおよびzは、それぞれ、３種のモノマー単位：スチレン、4-ビニルピリジン、プロピレングリコールメタクリレートのモル分率を表しx+y+z=100であり、wは数平均分子量を表す。］で示されるポリ（スチレン-ran-4-ビニルピリジン-ran-プロピレングリコールメタクリレート）を含む、バイオセンサ用プローブ。
【請求項３４】
作用電極、参照電極および対極、前記作用電極上に形成された検知層および前記検知層を被覆する保護膜を備え、前記検知層は検体応答性酵素およびレドックスメディエータを含み、前記保護膜は、
式（１）：
［化６］
2019146788.tif 000056
［式中、mは1〜20の整数を表し、x、yおよびzは、それぞれ、３種のモノマー単位：スチレン、4-ビニルピリジン、プロピレングリコールメタクリレートのモル分率を表しx+y+z=100であり、wは数平均分子量を表す。］で示されるポリ(スチレン-ran-4-ビニルピリジン-ran-プロピレングリコールメタクリレート)と、
式（２）：
［化７］
2019146788.tif 000057
［式中、Ｒは、炭素数１〜１５のアルキル基を表し、pおよびqは、それぞれ、２種のモノマー単位：4-ビニルピリジン、C1-15アルキルメタクリレートの繰り返し単位を表し、wは数平均分子量を表す。］で示されるポリ(4-ビニルピリジン)-block-ポリ(C1-15アルキルメタクリレート)または
式（３）：
［化８］
2019146788.tif 000058
［式中、sおよびtは、それぞれ、２種のモノマー単位：4-ビニルピリジン、2-ヒドロキシエチルメタクリレートのモル分率を表しs+t=100であり、wは数平均分子量を表す。］で示されるポリ(4-ビニルピリジン-ran-2-ヒドロキシエチルメタクリレート)と、
を含むコポリマー混合物
を含むバイオセンサ用プローブ。
【国際調査報告】
2019146788.tif 000059
2019146788.tif 000060
2019146788.tif 000061