(57)【要約】  この発光体３は、ＡｇＩｎＳｅ系化合物半導体からなるナノ粒子４を有し、該ナノ粒子４の表面には超音波照射により親水性が付与された被膜５が形成されている。被膜５は、アルキルチオール９を含有した第１の有機分子膜６と、脂肪酸１０を主成分とする第２の有機分子膜７とを備えた二重構造とされている。この発光体３は、発光量子収率が１０％以上、好ましくは３０％以上であり、発光強度のピーク波長が、６５０ｎｍ〜１０００ｎｍの範囲にあり、かつピーク波長の半値幅ΔＨが１００ｎｍ以下である。この発光体３は水中に分散しており、生体物質標識剤は発光体３を備えている。これにより発光効率が良好で近赤外領域で強く発光し、多くの生体情報の検出が可能で、低毒性のバイオイメージングに好適な発光体、及び発光体の製造方法、並びにこの発光体を備えた生体物質標識剤を提供することを実現する。
2020246297.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくともＡｇ成分、Ｉｎ成分、及びＳｅ成分を含む化合物半導体からなるナノ粒子を含有した発光体であって、
親水性が付与された被膜が、前記ナノ粒子の表面に形成されて水中に分散し、
発光量子収率が１０％以上であることを特徴とする発光体。
【請求項２】
前記発光量子収率が５０％以下であることを特徴とする請求項１記載の発光体。
【請求項３】
発光強度のピーク波長が、６５０ｎｍ〜１０００ｎｍの範囲にあり、かつ前記ピーク波長における半値幅が１００ｎｍ以下であることを特徴とする請求項１又は請求項２記載の発光体。
【請求項４】
少なくともＡｇ成分、Ｉｎ成分、及びＳｅ成分を含む化合物半導体からなるナノ粒子を含有した発光体であって、
親水性が付与された被膜が、前記ナノ粒子の表面に形成されて水中に分散し、
発光強度のピーク波長が、６５０ｎｍ〜１０００ｎｍの範囲にあり、かつ前記ピーク波長における半値幅が１００ｎｍ以下であることを特徴とする発光体。
【請求項５】
発光量子収率が１０％以上５０％以下であることを特徴とする請求項４記載の発光体。
【請求項６】
前記被膜は、少なくともアルキルチオールを含有した第１の有機分子膜と、複数のアルキル基を含有した脂肪酸を主成分とする第２の有機分子膜とを備えた二重構造とされると共に、前記親水性は超音波照射により付与されていることを特徴とする請求項１乃至請求項５のいずれかに記載の発光体。
【請求項７】
前記アルキルチオールは、１−ドデカンチオールであることを特徴とする請求項６記載の発光体。
【請求項８】
前記脂肪酸は、オレイン酸であることを特徴とする請求項６又は請求項７記載の発光体。
【請求項９】
前記脂肪酸に含有されるアルキル基の鎖長は、前記アルキルチオールに含有されるアルキル基の鎖長に比べて長いことを特徴とする請求項６乃至請求項８のいずれかに記載の発光体。
【請求項１０】
前記第１の有機分子膜は、チオグリコール酸ｎ−オクチルを含有した表面保護剤を含むことを特徴とする請求項６乃至請求項９のいずれかに記載の発光体。
【請求項１１】
前記第１の有機分子膜は、１−ドデカンチオールを含有した表面保護剤を含むことを特徴とする請求項６乃至請求項９のいずれかに記載の発光体。
【請求項１２】
前記発光量子効率が、３０％以上であることを特徴とする請求項１乃至１１のいずれかに記載の発光体。
【請求項１３】
前記ナノ粒子が、Ｇａ成分を含有し、前記ピーク波長が、前記Ｇａ成分の含有量に応じて制御されることを特徴とする請求項１乃至請求項１２のいずれかに記載の発光体。
【請求項１４】
透過率は、１０００〜１１００ｎｍの波長範囲で９０％以上であることを特徴とする請求項１乃至請求項１３のいずれかに記載の発光体。
【請求項１５】
前記Ｉｎ成分は、化学量論組成に対し多く含有されていることを特徴とする請求項１乃至請求項１４のいずれかに記載の発光体。
【請求項１６】
前記被膜は、主成分がカチオン性を有する膜透過性ペプチドで形成された表面修飾剤で被覆されていることを特徴とする請求項１乃至請求項１５のいずれかに記載の発光体。
【請求項１７】
前記膜透過性ペプチドは、オクタアルギニンであることを特徴とする請求項１６記載の発光体。
【請求項１８】
モル濃度換算で１６０ｎｍｏｌ／Ｌを脂肪組織由来幹細胞に導入したときに、細胞生存率が８０％以上であることを特徴とする請求項１６又は請求項１７記載の発光体。
【請求項１９】
少なくともＡｇ成分、Ｉｎ成分、及びＳｅ成分を含む化合物半導体からなるナノ粒子を非極性溶媒に分散させたナノ粒子分散非極性溶液を作製する工程と、
少なくともアルキルチオールを含む有機分子を前記ナノ粒子分散非極性溶液に添加し、前記ナノ粒子の表面に第１の有機分子膜を形成して前駆体分散溶液を作製する工程と、
アルカリの存在下、複数のアルキル基を含有した脂肪酸を水に溶解させた脂肪酸水溶液を作製する工程と、
前記前駆体分散溶液と前記脂肪酸水溶液とを混ぜ合わせ、非極性溶媒相と水相とに相分離した相分離溶液を作製する工程と、
前記相分離溶液に超音波を照射し、親水性が付与された被膜を前記ナノ粒子の表面に形成する工程と、
前記ナノ粒子を水中に分散させてナノ粒子分散水溶液を作製する工程とを含むことを特徴とする発光体の製造方法。
【請求項２０】
前記被膜を前記ナノ粒子の表面に形成する工程は、前記超音波照射により水中油滴型のマイクロエマルジョンを形成する工程を含み、前記第１の有機分子膜が形成された前記ナノ粒子と前記脂肪酸とを前記マイクロエマルジョン内に閉じ込め、前記ナノ粒子の表面に前記脂肪酸を吸着させることを特徴とする請求項１６記載の発光体の製造方法。  
【請求項２１】
前記ナノ粒子分散非極性溶液を作製する工程は、Ａｇ化合物とＩｎ化合物とを溶媒に溶解させてＡｇ−Ｉｎ溶液を作製する工程と、Ｓｅ粉末を溶媒に溶解させてＳｅ溶液を作製する工程と、前記Ａｇ−Ｉｎ溶液を所定温度に加熱した状態で前記Ｓｅ溶液を前記Ａｇ−Ｉｎ溶液に注入し、混合溶液を作製する工程と、前記混合溶液を前記所定温度よりも高温の反応温度で所定の反応時間加熱し、表面保護剤で被覆された化合物半導体からなるナノ粒子を作製する工程とを含むことを特徴とする請求項１９又は請求項２０記載の発光体の製造方法。
【請求項２２】
前記ナノ粒子分散非極性溶液を作製する工程は、Ａｇ化合物、Ｉｎ化合物、及びＧａ化合物を溶媒に溶解させてＡｇ−Ｉｎ−Ｇａ溶液を作製する工程と、Ｓｅ粉末を溶媒に溶解させてＳｅ溶液を作製する工程と、前記Ａｇ−Ｉｎ−Ｇａ溶液を所定温度に加熱した状態で前記Ｓｅ溶液を前記Ａｇ−Ｉｎ−Ｇａ溶液に注入し、混合溶液を作製する工程と、前記混合溶液を前記所定温度よりも高温の反応温度で所定の反応時間加熱し、表面保護剤で被覆された化合物半導体からなるナノ粒子を作製する工程とを含むことを特徴とする請求項１９又は請求項２０記載の発光体の製造方法。
【請求項２３】
前記被膜が形成された前記ナノ粒子と、主成分がカチオン性を有する膜透過性ペプチドで形成された表面修飾剤とを混合する工程を含み、前記被膜の表面を前記表面修飾剤で被覆することを特徴とする請求項１９乃至請求項２２のいずれかに記載の発光体の製造方法。
【請求項２４】
前記膜透過性ペプチドが、オクタアルギニンであることを特徴とする請求項１２３記載の発光体の製造方法。
【請求項２５】
請求項１乃至請求項１８のいずれかに記載の発光体を備えていることを特徴とする生体物質標識剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、発光体、発光体の製造方法、及び生体物質標識剤に関し、より詳しくは、生体を構成する生体物質の標識（バイオマーカー）に適した発光体とその製造方法、及びこの発光体を備えた生体物質標識剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、バイオメディカル分野では、生体物質に蛍光性を付与して高感度かつ多色でもって画像を動的に解析し、再生医療やがん治療等で投薬の効果や細胞の状態を確認するバイオイメージング技術が注目されている。このバイオイメージング技術では、超微粒化された半導体ナノ粒子からなる発光体を生体組織に吸着させ、該発光体に光を照射して発光体を発光させ、生体情報を検出している。したがって、生体内の発光体に光を照射するのみで生体物質の状態を確認できることから、ＰＥＴ（Positron Emission Tomography；陽電子放射断層撮影）やＣＴ（Computed Tomography；コンピュータ断層撮影）に比べて簡便かつ安全な検診の実現が期待されている。【０００３】
この種のバイオイメージング技術では、従来より、波長が７００〜１７００ｎｍの近赤外領域で蛍光現象が生じる発光体を使用するのが好ましいとされている。すなわち、近赤外領域よりも波長が短い４００ｎｍから７００ｎｍ未満の可視光領域ではヘモグロビン等の生体構成物質の吸収が大きい。また、波長が１７００ｎｍを超えて長くなると水分の吸収が大きくなり、光が生体内を高効率で透過するのが困難となる。これに対し波長が７００〜１７００ｎｍの近赤外領域、特に波長が７００〜１０００ｎｍの領域は、生体内での光透過性が高く、バイオイメージング技術に適していると考えられている。【０００４】
一方、半導体ナノ粒子については、従来より、様々な技術分野で盛んに研究・開発されており、その中でもＩ−III−VI族の元素で構成されるカルコパイライト型結晶構造の化合物半導体は、光の吸収により電子と正孔が再結合して発光する直接遷移型半導体であり、Ｃｄ等の有害元素を含まず、低毒性で環境負荷が低いことから、新規機能性材料として有望視されている。【０００５】
例えば、特許文献１には、Ａｇ成分、Ｉｎ成分、及びＳｅ成分を含有した化合物半導体からなるナノ粒子で形成され、発光強度のピーク波長が、７００ｎｍ〜１４００ｎｍの範囲にあり、かつ前記ピーク波長の半値幅ΔＨが、１００ｎｍ以下の発光体が提案されている。【０００６】
この特許文献１では、１−ドデカンチオールやオレイルアミン等の溶媒を使用し、ＡｇＩｎＳｅ系化合物半導体からなるナノ粒子をクロロホルム等の非極性溶媒に分散させている。特許文献１の実施例によれば、発光強度のピーク波長を７００〜１０００ｎｍの範囲で制御することができ、ピーク波長の半値幅ΔＨも１００ｎｍ以下と小さく良好な発光特性を得ることが可能である。さらに、発光効率の指標となる発光量子収率は、ＡｇとＩｎとの配合比率、すなわちＡｇ／Ｉｎ比が１／２のときが最大となり、１２％の発光量子収率を得ている。【０００７】
また、非特許文献１は、バイオイメージングと細胞標的化のための二重層カプセル化量子ドット（ＤＬ−Ｑdots）の形成について報告している。【０００８】
非特許文献１では、まず、１−ドデカンチオールやオクタデセン等の溶媒を使用し、表面が前記溶媒に由来する有機配位子で被覆されたＡｇＩｎＳ２／ＺｎＳ量子ドット（ナノ粒子）を合成し、該ＡｇＩｎＳ２／ＺｎＳ量子ドットを非極性溶媒としてのヘキサンに分散させ、これにより分散溶液を作製している。そして、この分散溶液にラウリン酸（ドデカン酸）溶液を加え、ヘキサン相と水相に相分離した相分離溶液を作製した後、超音波を照射し、これにより前記溶媒に由来する有機配位子とラウリン酸に由来するアルキル−キャッピング配位子とでＡｇＩｎＳ２／ＺｎＳ量子ドットの表面を被覆し、親水性が付与された量子ドットを得ている（同文献、スキーム１）。【０００９】
この非特許文献１では、超音波の照射前後において、発光強度のピーク波長はいずれも５５０ｎｍであり、半値幅ΔＨについても大きな変動がないことが記載されている（同文献、図３）。また、発光量子収率は、超音波照射前は７８％であったが、超音波照射後はラウリン酸を使用してアルキル−キャッピング配位子を形成した場合で２７．７％に低下している。また、ラウリン酸以外の脂肪酸を使用してアルキル−キャッピング配位子を形成した場合でも、発光量子収率は親水化前に比べて大幅に低下することが報告されている（同文献、図４）。【００１０】
また、発光材料にシリコンナノ粒子を使用し、近赤外領域で発光させるようにした発光体も開発されている。【００１１】
例えば、特許文献２には、ダイヤモンド構造を有する一つまたは複数のシリコンナノ結晶と、前記シリコンナノ結晶のそれぞれの表面を覆う炭化水素膜、前記表面が炭素水素膜で覆われた一つまたは複数のシリコンナノ結晶を覆うブロック共重合体を設けた水溶性であり、励起光の照射により近赤外域で発光するシリコンナノ粒子が提案されている。【００１２】
この特許文献２では、シリコンナノ結晶の粒子径を調整することで、７００〜１０００ｎｍの近赤外域において、半値幅ΔＨが１５０〜３００ｎｍ、発光量子収率が３０％以上の水溶性シリコンナノ粒子を得ている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１３】
【特許文献１】国際公開第２０１７／１２６１６４号（請求項１、７、段落［００６６］〜[００７３]、［００９０］〜［０１００］、［０１０７］〜［０１１２］、表１等）
【特許文献２】特開２０１６−１７６０３９号公報（請求項１、図５等）
【非特許文献】
【００１４】
【非特許文献１】M. Z. Fahmi et al.、“Forming double layer-encapsulated quantum dots for bio-imaging and cell targeting”、 Nanoscale、 2013、 5、 pp. 1517 - 1528
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
しかしながら、特許文献１は、近赤外領域において半値幅ΔＨが１００ｎｍ以下の良好な発光スペクトルを得ているものの、以下のような問題があった。【００１６】
すなわち、バイオイメージングの分野では、上述したようにナノ粒子からなる発光体を生体組織に吸着させ、発光体を発光させて生体情報を検出しているが、特許文献１ではナノ粒子を非極性の有機溶媒中に分散させている。したがって、細胞に有害な非極性の有機溶媒が生体構成物質に吸着されることとなり、細胞を標的化したバイオイメージング用の発光体には適さないという問題があった。【００１７】
また、非特許文献１は、超音波照射により親水性が付与されたＡｇＩｎＳ２／ＺｎＳ量子ドットを得ているものの、発光強度のピーク波長が５５０ｎｍであり可視光領域で発光している。その理由は以下のように考えられる。【００１８】
すなわち、ＡｇＩｎＳ２は、特許文献１のようなＡｇＩｎＳｅ２とは異なり、バルク状態でのバンドギャップエネルギーが１．８７ｅＶ（波長換算で６６０ｎｍ）と大きく、このバンドギャップエネルギーはナノ粒子化すると量子サイズ効果によって更に大きくなることから可視光領域で発光し易くなる。しかも、非特許文献１ではバンドギャップエネルギーが３．９１ｅＶ（波長換算で３１７ｎｍ）と大きいＺｎＳをＡｇＩｎＳｅ系量子ドットに注入している。このＺｎＳは表面不活性化には寄与するが、上述したようにバンドギャップエネルギーが大きいことから、発光波長はより短波長側にシフトし、このため５５０ｎｍの可視光領域で発光したものと考えられる。【００１９】
このように非特許文献１は、可視光領域で発光することから、ヘモグロビン等の生体構成物質の吸収が大きくなり、画像を高精度に解析することができず、所望の生体情報を得るのが困難となる。しかも、ＡｇＩｎＳ２／ＺｎＳ量子ドットでは、超音波照射後の発光量子収率は、超音波照射前に比べ大幅に低下し、発光効率の低下を招いている。【００２０】
また、特許文献２は、３０％以上の発光量子収率を有する近赤外領域で発光する発光体を得ているものの、ピーク波長の半値幅ΔＨが１５０〜３００ｎｍと大きく、このため分解能に劣り、所望の高精度な生体情報を得られなくなるおそれがある。【００２１】
本発明はこのような事情に鑑みなされたものであって、発光効率が良好で近赤外領域で強く発光し、多くの生体情報の検出が可能であり、低毒性でバイオイメージングに好適な発光体、及び発光体の製造方法、並びにこの発光体を備えた生体物質標識剤を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００２２】
上述したようにＡｇＩｎＳｅ系の化合物半導体は、Ｃｄ系に比べて低毒性であり、ナノ粒子化することにより所望の近赤外領域で半値幅ΔＨの小さいピーク波長を有する発光体を得ることが可能である。【００２３】
しかしながら、［発明が解決しようとする課題］の項でも述べたように、特許文献１では、ナノ粒子をクロロホルム等の非極性の有機溶媒に分散させているため、このままの状態で生体物質標識剤に使用したのでは、細胞に有害な有機溶媒が生体組織に吸着されることとなり、バイオイメージング用の発光体としては好ましくない。【００２４】
そこで、本発明者らは鋭意研究を行い、ＡｇＩｎＳｅ系化合物半導体からなるナノ粒子の表面に１−ドデカンチオール等のアルキルチオールを配位させた後、複数のアルキル基を含有したオレイン酸等の脂肪酸水溶液とナノ粒子が非極性の有機溶媒に分散した分散溶液とを混ぜ合わせ、相分離溶液を作製し、該相分離溶液に超音波照射を行い、親水性が付与された被膜をナノ粒子の表面に形成した。そして、このナノ粒子の発光スペクトル及び発光量子収率を測定したところ、発光強度のピーク波長や半値幅は超音波照射前を維持しつつ、発光量子収率を１０％以上、好ましくは３０％以上とすることができ、これにより発光スペクトル特性を損なうことなく発光効率を向上させることができるという知見を得た。しかも、被膜には親水性が付与されていることから、発光スペクトル特性及び発光効率の良好な発光体を水中に分散させた状態で使用することができ、低毒性でバイオイメージングに好適な発光体を実現することができる。【００２５】
本発明はこのような知見に基づきなされたものであって、本発明に係る発光体は、少なくともＡｇ成分、Ｉｎ成分、及びＳｅ成分を含む化合物半導体からなるナノ粒子を含有した発光体であって、親水性が付与された被膜が、前記ナノ粒子の表面に形成されて水中に分散し、発光量子収率が１０％以上であることを特徴としている。【００２６】
また、本発明の発光体は、前記発光量子収率が５０％以下であるのが好ましい。【００２７】
さらに、本発明の発光体は、発光強度のピーク波長が、６５０ｎｍ〜１０００ｎｍの範囲にあり、かつ前記ピーク波長における半値幅が１００ｎｍ以下であるのが好ましい。【００２８】
これにより近赤外領域での分解能が高く、発光スペクトル特性を損なうことなく、発光効率が良好な親水性が付与された発光体を得ることができる。【００２９】
また、本発明に係る発光体は、少なくともＡｇ成分、Ｉｎ成分、及びＳｅ成分を含む化合物半導体からなるナノ粒子を含有した発光体であって、親水性が付与された被膜が、前記ナノ粒子の表面に形成されて水中に分散し、発光強度のピーク波長が、６５０ｎｍ〜１０００ｎｍの範囲にあり、かつ前記ピーク波長における半値幅が１００ｎｍ以下であることを特徴としている。【００３０】
これによりナノ粒子の表面に親水性が付与された場合であっても、近赤外領域で良好な半値幅を有し、分解能の高い良好な発光スペクトル特性を有するバイオイメージングに好適な発光体を得ることができる。【００３１】
また、本発明の発光体は、発光量子収率が１０％以上５０％以下であるのが好ましい。【００３２】
これにより発光スペクトル特性と発光効率とが両立した親水性が付与された高性能の発光体を得ることができる。【００３３】
また、本発明の発光体は、上述したように、ナノ粒子の表面にアルキルチオールを配位させた後、該ナノ粒子が非極性溶媒中に分散した分散溶液と脂肪酸水溶液とを混ぜ合わせ、相分離溶液を作製し、該相分離溶液に超音波照射を行っていることから、前記被膜は、超音波照射により親水性が付与されると共に、構造的にはアルキルチオールを含有した第１の有機分子膜と脂肪酸を主成分とする第２の有機分子膜とからなる二重構造を有し、ナノ粒子の表面に高密度で形成されているものと考えられる。【００３４】
すなわち、本発明の発光体は、前記被膜が、少なくともアルキルチオールを含有した第１の有機分子膜と、複数のアルキル基を含有した脂肪酸を主成分とする第２の有機分子膜とを有する二重構造とされると共に、前記親水性が超音波照射により付与されているのが好ましい。【００３５】
これにより被膜が高密度に形成されることから、ナノ粒子の表面欠陥を効果的にキャッピングすることができると考えられる。そして、超音波照射により親水性を付与していることから、配位子置換反応で親水性を付与する場合とは異なり、新たな表面欠陥の形成を抑制することができる。これにより発光量子収率が１０％以上の良好な発光効率を有し、親水性付与と発光効率とが両立したバイオイメージングに好適な発光体を得ることが可能となる。【００３６】
また、本発明の発光体は、前記アルキルチオールが、１−ドデカンチオールであるのが好ましく、前記脂肪酸は、オレイン酸であるのが好ましい。【００３７】
さらに、本発明の発光体は、前記脂肪酸に含有されるアルキル基の鎖長は、前記アルキルチオールに含有されるアルキル基の鎖長に比べて長いのが好ましい。【００３８】
このようにアルキル基の鎖長を調整することにより、より良好な発光効率を得ることが可能となる。【００３９】
また、本発明の発光体は、前記第１の有機分子膜が、チオグリコール酸ｎ−オクチル、又は１−ドデカンチオールを含有した表面保護剤を含むのも好ましい。【００４０】
このようにナノ粒子の表面を保護する所望の表面保護剤を必要に応じて選択することにより、６５０〜１０００ｎｍの近赤外領域で発光強度のピーク波長を調整することが可能となる。【００４１】
また、上記本発明の発光体は、好ましくは発光量子効率が３０％以上の発光効率を有する。【００４２】
さらに、本発明の発光体は、前記ナノ粒子が、Ｇａ成分を含有し、前記ピーク波長が、前記Ｇａ成分の含有量に応じて制御されるのも好ましい。【００４３】
このようにＧａ成分をナノ粒子に含有させ、かつその含有量を異ならせることによっても半値幅や発光効率を損なうことなく、発光強度のピーク波長を制御することができる。【００４４】
また、本発明の発光体は、透過率が１０００〜１１００ｎｍの波長範囲で９０％以上であるのが好ましい。【００４５】
このように１０００〜１１００ｎｍの波長範囲で透過率を９０％以上とすることにより、ナノ粒子は水中で凝集することなく超微粒の状態で分散する。【００４６】
また、本発明の発光体は、前記Ｉｎ成分は、化学量論組成に対し多く含有されているのが好ましい。【００４７】
このように組成をＩｎリッチとすることにより、吸収−発光過程での無放射失活過程が抑制されると考えられることから、より良好な発光特性を得ることが可能となる。【００４８】
さらに、本発明者らは鋭意研究を進め、上述したナノ粒子を発光源とする発光体の生体物質標識剤への実用性ついて検討したところ、カチオン性を有するオクタアルギニン（以下、「Ｒ８」という。）等の膜透過性ペプチドを主成分とした表面修飾剤で前記被膜を被覆することにより、前記発光体を効率良く生体物質内に導入することができることが分かった。【００４９】
したがって、本発明の発光体においては、前記被膜は、主成分がカチオン性を有する膜透過性ペプチドで形成された表面修飾剤で被覆されているのが好ましい。【００５０】
これにより発光体は表面修飾剤が正電荷を帯びることから、発光体は負電荷を帯びている細胞膜に吸引されて生体物質表面に移動する。そして、いわゆるエンドサイトーシス過程を経て発光体を容易に生体物質内に導入することができ、これにより発光体に光を照射するのみで生体情報を効率よく検出することが可能となる。【００５１】
さらに、本発明の発光体は、前記膜透過性ペプチドが、Ｒ８であるのが好ましい。  【００５２】
また、本発光体は、発光源となるナノ粒子が上述したようにＡｇＩｎＳｅ系の化合物半導体で形成されていることから、Ｃｄを含有した化合物半導体に比べて低毒性であり、生体物質内に導入した場合に細胞生存率の向上に寄与することができると考えられる。【００５３】
そこで、本発明者らは、近年、再生医療等で注目されている脂肪組織由来幹細胞（Adipose-derived Stem Cells、以下、「ＡＳＣｓ」という。）を使用し、更に鋭意研究を進めたところ、モル濃度換算で１６０ｎｍｏｌ／Ｌの発光体をＡＳＣｓに導入しても８０％以上の細胞生存率を確保することができるということが分かった。【００５４】
すなわち、本発明の発光体は、モル濃度換算で１６０ｎｍｏｌ／ＬをＡＳＣｓ中に導入したときに、細胞生存率が８０％以上であるのが好ましい。【００５５】
これによりＡＳＣｓ中にモル濃度換算で１６０ｎｍｏｌ／Ｌの高濃度の発光体を導入しても細胞の死滅が抑制されて細胞生存率を良好に維持することができ、より多くの生体情報を取得することが可能となる。【００５６】
また、本発明に係る発光体の製造方法は、少なくともＡｇ成分、Ｉｎ成分、及びＳｅ成分を含む化合物半導体からなるナノ粒子を非極性溶媒に分散させたナノ粒子分散非極性溶液を作製する工程と、少なくともアルキルチオールを含む有機分子を前記ナノ粒子分散非極性溶液に添加し、前記ナノ粒子の表面に第１の有機分子膜を形成して前駆体分散溶液を作製する工程と、アルカリの存在下、複数のアルキル基を含有した脂肪酸を水に溶解させた脂肪酸水溶液を作製する工程と、前記前駆体分散溶液と前記脂肪酸水溶液とを混ぜ合わせ、非極性溶媒相と水相とに相分離した相分離溶液を作製する工程と、前記相分離溶液に超音波を照射し、親水性が付与された被膜を前記ナノ粒子の表面に形成する工程と、前記ナノ粒子を水中に分散させてナノ粒子分散水溶液を作製する工程とを含むことを特徴としている。【００５７】
すなわち、少なくともアルキルチオールを含む有機分子を前記ナノ粒子分散非極性溶液に添加することにより、ナノ粒子の表面欠陥にアルキルチオールのチオール基が吸着して前記ナノ粒子の表面に第１の有機分子膜が形成され、前駆体分散溶液が作製される。その後、前駆体分散溶液と脂肪酸水溶液とを混ぜ合わせて相分離溶液を作製し、この相分離溶液に超音波を照射することにより脂肪酸のアルキル基がアルキルチオールのアルキル基との疎水性相互作用によってナノ粒子の表面に吸着する。そして、被膜は親水性基である脂肪酸のカルボキシル基によって親水性が付与されることから、超音波照射後に再び相分離した相分離溶液では、発光体を水中に分散させることができ、これにより発光スペクトル特性及び発光効率の良好な発光体を得ることができる。【００５８】
また、本発明の発光体の製造方法は、前記被膜を前記ナノ粒子の表面に形成する工程が、前記超音波照射により水中油滴型のマイクロエマルジョンを形成する工程を含み、前記第１の有機分子膜が形成された前記ナノ粒子と前記脂肪酸とを前記マイクロエマルジョン内に閉じ込め、前記ナノ粒子の表面に前記脂肪酸を吸着させるのが好ましい。【００５９】
すなわち、超音波照射によりマイクロエマルジョンには大きな衝撃力が負荷され、マイクロエマルジョンは照射時間の経過に伴って徐々に小さくなる。そして、ナノ粒子の表面に吸着された脂肪酸は自己組織化されて第２の有機分子膜となり、さらに親水性が付与されていることから、超音波照射後は発光体を水中に分散して存在させることが可能となる。【００６０】
また、本発明の発光体の製造方法は、前記ナノ粒子分散非極性溶液を作製する工程が、Ａｇ化合物とＩｎ化合物とを溶媒に溶解させてＡｇ−Ｉｎ溶液を作製する工程と、Ｓｅ粉末を溶媒に溶解させてＳｅ溶液を作製する工程と、前記Ａｇ−Ｉｎ溶液を所定温度に加熱した状態で前記Ｓｅ溶液を前記Ａｇ−Ｉｎ溶液に注入し、混合溶液を作製する工程と、前記混合溶液を前記所定温度よりも高温の反応温度で所定の反応時間加熱し、表面保護剤で被覆された化合物半導体からなるナノ粒子を作製する工程とを含むのが好ましい。さらに、前記ナノ粒子分散非極性溶液を作製する工程が、Ａｇ化合物、Ｉｎ化合物、及びＧａ化合物を溶媒に溶解させてＡｇ−Ｉｎ−Ｇａ溶液を作製する工程と、Ｓｅ粉末を溶媒に溶解させてＳｅ溶液を作製する工程と、前記Ａｇ−Ｉｎ−Ｇａ溶液を所定温度に加熱した状態で前記Ｓ該混合溶液を前記所定温度よりも高温の反応温度で所定の反応時間加熱し、表面保護剤で被覆された化合物半導体からなるナノ粒子を作製する工程とを含むのも好ましい。【００６１】
このように所定温度で化合物半導体を作製した後、前記所定温度よりも高い反応温度で所定の反応時間加熱することにより、ナノ粒子同士が凝集するのを極力抑制されると共にナノ粒子の結晶性が向上してエネルギー損失が抑制され、バンド端発光が可能な発光体を高効率で得ることができる。【００６２】
また、本発明の発光体の製造方法は、前記被膜が形成された前記ナノ粒子と、主成分がカチオン性を有する膜透過性ペプチドで形成された表面修飾剤とを混合する工程を含み、前記被膜の表面を前記膜透過性ペプチドで被覆するのが好ましく、さらに前記膜透過性ペプチドが、オクタアルギニンであるのが好ましい。【００６３】
これにより上述したように発光体を容易に生体物質内に導入することが可能となる。【００６４】
本発明に係る生体物質標識剤は、上述した発光体を備えていることを特徴としている。【００６５】
これにより発光体には親水性が付与されており、かつ良好な発光スペクトル特性と発光効率を有することから、有機溶媒のような有害物質が生体組織に吸着することもなく、所望の高感度かつ多色でもって生体画像を動的に高効率で解析することができ、バイオイメージングのバイオマーカーに適した生体物質標識剤を得ることができる。特に、主成分がカチオン性（正電荷）を有する膜透過性ペプチドで形成された表面修飾剤で被膜が被覆されている場合は、負電荷に帯電している細胞膜と、カチオン性（正電荷）を有する膜透過性ペプチドとの間で静電相互作用が生じ、発光体が細胞膜の表面に移動した後、エンドサイトーシス過程により発光体を容易に生体物質内に導入することができ、生体物質を効果的に標識することが可能となる。すなわち、生体物質内に導入された発光体に光を照射するのみで生体物質の状態が確認することが可能となる。
【発明の効果】
【００６６】
本発明の発光体によれば、少なくともＡｇ成分、Ｉｎ成分、及びＳｅ成分を含む化合物半導体からなるナノ粒子を含有した発光体であって、親水性が付与された被膜が、前記ナノ粒子の表面に形成されて水中に分散し、発光量子収率が１０％以上であるので、細胞に有害な非極性の有機溶媒が生体組織に吸着することもなく、良好な発光効率を有するバイオイメージングに好適な発光体を得ることができる。【００６７】
また、本発明の発光体によれば、少なくともＡｇ成分、Ｉｎ成分、及びＳｅ成分を含む化合物半導体からなるナノ粒子を含有した発光体であって、親水性が付与された被膜が、前記ナノ粒子の表面に形成されて水中に分散し、発光強度のピーク波長が、６５０ｎｍ〜１０００ｎｍの範囲にあり、前記ピーク波長における半値幅が１００ｎｍ以下であるので、ナノ粒子の表面を親水化した場合であっても、近赤外領域で半値幅を損なうことなく、分解能の高い良好な発光スペクトル特性を有するバイオイメージングに好適な発光体を得ることができる。【００６８】
さらに、本発明の発光体の製造方法によれば、少なくともＡｇ成分、Ｉｎ成分、及びＳｅ成分を含む化合物半導体からなるナノ粒子を非極性溶媒に分散させたナノ粒子分散非極性溶液を作製する工程と、少なくともアルキルチオールを含む有機分子を前記ナノ粒子分散非極性溶液に添加し、前記ナノ粒子の表面に第１の有機分子膜を形成して前駆体分散溶液を作製する工程と、アルカリの存在下、複数のアルキル基を含有した脂肪酸を水に溶解させた脂肪酸水溶液を作製する工程と、前記前駆体分散溶液と前記脂肪酸水溶液とを混ぜ合わせ、非極性溶媒相と水相とに相分離した相分離溶液を作製する工程と、前記相分離溶液に超音波を照射し、親水性が付与された被膜を前記ナノ粒子の表面に形成する工程と、前記ナノ粒子を水中に分散させてナノ粒子分散水溶液を作製する工程とを含むので、まず、ナノ粒子の表面欠陥にアルキルチオールのチオール基が吸着して前記ナノ粒子の表面に第１の有機分子膜が形成され、前駆体分散溶液が作製される。その後、前駆体分散溶液と脂肪酸水溶液とを混ぜ合わせて相分離溶液を作製し、この相分離溶液に超音波を照射することにより脂肪酸のアルキル基がアルキルチオールのアルキル基との疎水性相互作用によってナノ粒子の表面に吸着する。そして、被膜は親水性基である脂肪酸のカルボキシル基によって親水性が付与され、超音波照射後に再び相分離した相分離溶液において、親水性被膜が形成されたナノ粒子は水相側に移動して水中を分散し、これにより発光スペクトル特性及び発光効率の良好な発光体を得ることができる。【００６９】
また、本発明に係る生体物質標識剤は、上述した発光体を備えているので、発光体には親水性が付与されており、かつ良好な発光スペクトル特性と発光効率を有することから、有機溶媒のような有害物質が生体組織に吸着することもなく、所望の高感度かつ多色でもって生体画像を動的に高効率で解析することができ、低毒性でバイオイメージングのバイオマーカーに適した生体物質標識剤を得ることができる。特に、主成分がカチオン性（正電荷）を有する膜透過性ペプチドで形成された表面修飾剤で被膜が被覆されている場合は、負電荷に帯電している細胞表面とカチオン性（正電荷）を有する膜透過性ペプチドとの間で静電相互作用が生じ、これにより発光体を容易に生体物質の細胞内に導入することができ、生体物質を効果的に標識することが可能となる。すなわち、生体内に導入された発光体に光を照射するのみで生体物質の状態が確認することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００７０】
【図１】本発明に係る発光体が水中に分散している状態を模式的に示す図である。
【図２】上記発光体の発光スペクトルの要部を示すプロファイルである。
【図３】上記発光体の一実施の形態（第１の実施の形態）を模式的に示す図である。
【図４】本発明に係る発光体の製造方法の一実施の形態を説明する工程図（１／６）である。
【図５】本発明に係る発光体の製造方法の一実施の形態を説明する工程図（２／６）である。
【図６】本発明に係る発光体の製造方法の一実施の形態を説明する工程図（３／６）である。
【図７】本発明に係る発光体の製造方法の一実施の形態を説明する工程図（４／６）である。
【図８】本発明に係る発光体の製造方法の一実施の形態を説明する工程図（５／６）である。
【図９】本発明に係る発光体の製造方法の一実施の形態を説明する工程図（６／６）である。
【図１０】本発明に係る発光体の第２の実施の形態を模式的に示す断面図である。
【図１１】上記第２の実施の形態の製造過程の要部を示す模式図である。
【図１２】本発明の発光体の生体物質への導入過程を示す図である。
【図１３】実施例１の超音波照射前と超音波照射後における相分離溶液を示す写真である。
【図１４】実施例１の吸収スペクトル及び透過スペクトルを示すプロファイルである。
【図１５】実施例１の試料番号１１（超音波照射前）及び試料番号１２（超音波照射後）における発光スペクトルを示すプロファイルである。
【図１６】実施例１の試料番号１１（超音波照射前）及び試料番号１２（超音波照射後）における吸収スペクトルを示すプロファイルである。
【図１７】実施例１の試料番号１１（親水化前）及び試料番号１２（親水化後）のＳＴＥＭ像を示す図である。
【図１８】実施例２における超音波照射前後の試料番号２１及び試料番号２２の発光スペクトルを示すプロファイルである。
【図１９】実施例３における試料番号３１〜３３の発光スペクトルを示すプロファイルである。
【図２０】実施例３における試料番号３２及び３３における超音波照射前後発光スペクトルを示すプロファイルである。
【図２１】実施例３における試料番号３１〜３３の吸収スペクトルを示すプロファイルである。
【図２２】実施例４における試料番号４１の発光スペクトルを試料番号１２と共に示すプロファイルである。
【図２３】実施例４の試料番号１２ａにおけるモル濃度と細胞生存率との関係を示す図である。
【図２４】実施例４の試料番号４１ａにおけるモル濃度と細胞生存率との関係を示す図である。
【図２５】実施例４の試料番号１２及び試料番号４１の蛍光強度を示す図である。
【図２６】実施例４で試料番号１２ａの試料をマウス皮下に注入した場合のモル濃度と蛍光状態との関係を示す図である。
【図２７】実施例４における試料番号１２ｂの蛍光強度を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００７１】
次に、本発明の実施の形態を詳説する。
【００７２】
＜発光体とその製造方法＞
（第１の実施の形態）
図１は、本発明に係る一実施の形態（第１の実施の形態）としての発光体が水中に分散している状態を模式的に示す図である。
【００７３】
すなわち、容器１には水２が貯留されており、発光体３は、水中に分散した状態で存在している。具体的には、この発光体３は、透過スペクトルにおいて、１０００ｎｍ〜１１００ｎｍの波長域で９０％以上の透過率を有しており、水中で凝集等が抑制された良好な分散状態とされている。
【００７４】
この発光体３は、Ａｇ成分、Ｉｎ成分、Ｓｅ成分を含有したＡｇＩｎＳｅ系化合物半導体からなるナノ粒子４を有し、該ナノ粒子４の表面には超音波照射により親水性が付与された被膜５が形成されている。また、被膜５は、少なくともアルキルチオールを含有した第１の有機分子膜６と、複数のアルキル基を含有した脂肪酸を主成分とする第２の有機分子膜７とを備えた二重構造とされている。
【００７５】
そして、この発光体３は、発光量子収率が１０％以上、好ましくは３０％以上であり、しかも、発光強度のピーク波長が、６５０ｎｍ〜１０００ｎｍの範囲にあり、かつピーク波長の半値幅ΔＨが１００ｎｍ以下を満足する発光スペクトル特性を有している。
【００７６】
このように本発光体３は、超音波照射により被膜５に親水性が付与され、かつ被膜５が二重構造とされているので、高密度の被膜５が形成されることとなり、表面欠陥が良好にキャッピングされることから、発光量子収率が１０％以上、好ましくは３０％以上とすることができる。また、この被膜５は親水性が付与されていることから、水中に分散させた状態で使用することができ、細胞に有害な非極性の有機溶媒が生体組織に吸着することもなく、発光スペクトル特性と発光効率とが両立したバイオイメージングに好適な発光体３を得ることができる。
【００７７】
次に、本実施の形態で、ナノ粒子材料、発光スペクトル特性（発光強度のピーク波長及び半値幅ΔＨ）、及び発光量子収率を上述のように規定した理由を詳述する。
【００７８】
（１）ナノ粒子材料
上述したようにカルコパイライト型結晶構造を有するＡｇＩｎＳｅ系半導体化合物は、ＣｄＳｅやＣｄＴｅのようなＣｄ系材料とは異なって低毒性であり、組成を調整して固溶体を形成することにより発光波長の制御が可能である。しかも、このＡｇＩｎＳｅ系半導体化合物、例えばＡｇＩｎＳｅ２はバンドギャップエネルギーがバルク状態で１．２４ｅＶ（波長換算で１０００ｎｍ）であり、バンドギャップエネルギーが小さく近赤外領域で発光する。したがってＡｇＩｎＳｅ系半導体化合物をナノ粒子化し、粒径を制御することにより量子サイズ効果を発揮することから、同一組成であっても近赤外領域において種々の波長で発光する。
【００７９】
そこで、本実施の形態では、発光体３のコアとなるナノ粒子材料にＡｇＩｎＳｅ系化合物半導体を使用している。
【００８０】
尚、ＡｇＩｎＳｅ系化合物半導体の各成分の組成比は、発光スペクトル特性を損なわないのであれば特に限定されるものではないが、Ｉｎ成分を化学量論組成よりも多く含有させるのが好ましい。
【００８１】
すなわち、Ａｇ成分とＩｎ成分の化学量論組成は１：１であるが、製造時のＩｎ成分を化学量論組成よりも多く含有させることにより、励起された電子が基底状態に戻るときに光を放出しない無放射失活過程を抑制することが可能となり、より強度の向上した発光ピークを得ることができると考えられる。ただし、製造時のＩｎ成分を化学量論組成よりも過度に過剰に含有させた場合は、異相等の不純物が生成されるおそれがあり、このため純度の低下を招き、却って発光ピークの強度が低下するおそれがある。斯かる点を考慮すると、製造時のＩｎ成分を化学量論組成よりも多く含有させる場合は、Ａｇ成分に対するＩｎ成分の配合比率は、モル比換算で１．５〜３が好ましい。
【００８２】
また、ナノ粒子４の平均粒径は、６５０〜１０００ｎｍの波長域で量子サイズ効果を発現するのであれば特に限定されるものではなく、例えば０．１〜２０ｎｍの範囲に作製される。
【００８３】
（２）発光スペクトル特性（発光強度のピーク波長及び半値幅ΔＨ）
図２は、本発光体３の発光スペクトルの要部を模式的に示すプロファイルであり、横軸は波長（ｎｍ）、縦軸は発光強度（ａ．ｕ．）を示している。
【００８４】
[背景技術]の項でも述べたように、近赤外よりも波長の短い７００ｎｍ未満、特に６５０ｎｍ未満の可視光領域ではヘモグロビン等の生体構成物質の吸収が大きい。一方、波長が１７００ｎｍを超えて長くなると水分の吸収が大きくなり、このため光が生体内を高効率で透過することができず、生体内で発光しても所望の生体情報を得るのが困難である。
【００８５】
これに対し波長が７００〜１７００ｎｍの近赤外領域では生体に対する光透過性が良好であり、バイオイメージング技術を利用した生体組織の動的な画像解析に適している。特に波長が６５０〜１０００ｎｍの範囲は生体に対する光透過性が良好であり、斯かる範囲で発光強度がピーク波長を有する発光スペクトルを得ることにより、所望の生体情報を取得することが可能となる。
【００８６】
さらに、バイオイメージング技術を使用して所望の生体情報を得るためには、発光体３を強く発光させて分解能を高める必要があり、そのためには発光スペクトルのピーク波長近傍のプロファイルが急峻で尖鋭である必要がある。そして、ピーク波長の急峻性・尖鋭性は、発光強度のピーク波長Ｐの１／２Ｐにおける波長幅、すなわち半値幅ΔＨで評価することができる。すなわち、前記半値幅ΔＨが１００ｎｍを超えるとピーク波長が急峻性・尖鋭性を欠き、分解能の低下を招くおそれがある。
【００８７】
そこで、本実施の形態では、発光強度のピーク波長が６５０〜１０００ｎｍの範囲に出現し、かつピーク波長の半値幅ΔＨが１００ｎｍ以下となるように規定している。尚、前記半値幅ΔＨの下限値は、特に限定されるものではないが、過度に小さくなると標的からの「ずれ」が生じ易く、的確な生体情報を検出できなくなるおそれがあることから、１０ｎｍ以上であるのが好ましい。
【００８８】
このように本実施の形態では、発光強度のピーク波長及び半値幅ΔＨを上述のように規定することにより、再生医療やがん治療等で投薬の効果や細胞の状態を確認するバイオイメージングのバイオマーカーに適した発光体を得ることができ、生体物質に蛍光性を付与して高感度かつ多色で動的に画像を解析することが可能となる。
【００８９】
（３）発光量子収率
ナノ粒子４は、ナノレベルで超微粒化していることから、多量の原子がナノ粒子表面に位置する。このため表面欠陥が多く、発光が妨げられて発光効率の低下を招き、十分な発光量子収率（ナノ粒子が吸収する光子のうち、発光して放出される光子の割合）を得ることできない。
【００９０】
すなわち、従来より、有機溶媒の配位力に着目し、ナノ粒子素材を有機溶媒に溶解させ、ナノ粒子４の合成と同時に表面を有機配位子からなる表面保護剤で被覆し、これにより表面欠陥をキャッピングし、該表面欠陥を極力取り除くことにより、発光量子収率を向上させようとしている。
【００９１】
しかしながら、表面保護剤で表面欠陥を取り除く手法には自ずと限界があり、したがって表面保護剤によるキャッピングのみでは発光量子収率を十分に向上させることができない。
【００９２】
そこで、本実施の形態では、ナノ粒子４の合成後に該ナノ粒子の表面に少なくともアルキルチオールを含有した有機分子で第１の有機分子膜６を形成して表面欠陥を更に低減させ、その後、超音波照射により脂肪酸を主成分とする第２の有機分子膜７をナノ粒子４の表面に形成し、第１の有機分子膜６と第２の有機分子膜７とからなる二重構造の被膜５をナノ粒子４の表面に形成している。これにより高密度の被膜５を形成することができることから、表面欠陥を効果的にキャッピングすることができると共に、表面不活性化にも寄与することができ、エネルギー損失を抑制することができる。その結果、発光量子収率が１０％以上、好ましくは３０％以上に向上し、二重構造の被膜５が形成されなかった場合と比べ２．５倍以上の良好な発光量子収率を得ている。
【００９３】
しかも、超音波照射により被膜５には親水性が付与されることから、バイオイメージング用の生体物質標識剤に適用しても、細胞に有害な非極性の有機溶媒が生体構成物質に吸着されることもなく、バイオイメージングに好適な発光体３を実現することが可能となる。
【００９４】
すなわち、本実施の形態では、上記被膜５を、超音波照射で形成すると共に上述のような二重構造とすることにより、１０％以上、好ましくは３０％以上の発光量子収率の取得を実現し、超音波照射前に比べて２．５倍以上の良好な発光量子収率を得ている。発光量子収率の上限は、特に限定されるものではないが、通常は５０％以下である。
【００９５】
尚、非特許文献１のようにナノ粒子の合成時に表面保護剤を形成し、その後アルキルチオールを添加することなく、直ちに脂肪酸を添加して超音波照射した場合は、被膜に親水性を付与することができても、キャッピングされていない多くの表面欠陥が残存し、このため良好な発光量子収率を得ることができない。
【００９６】
また、親水性の付与方式として、超音波照射の他、親水性を有するチオール基（−ＳＨ）やカルボキシル基（−ＣＯＯＨ）で表面保護剤の有機配位子を配位子置換することも考えられる。しかしながら、この場合も親水性は付与できたとしても発光量子収率を向上させるのは困難である。すなわち、この場合、配位子置換に際し、脱離した配位子と共にナノ粒子表面の原子までが取り除かれて新たな表面欠陥が形成されたり、或いは配位子置換されるべき配位子がナノ粒子表面に十分存在せず、該ナノ粒子表面は反応性に富んで十分に不活性化することができず、このため発光量子収率を向上させることができず、所望の発光効率を得ることができない。
【００９７】
したがって、発光量子収率を１０％以上、好ましくは３０％以上に向上させるためには、第２の有機分子膜６の形成時に超音波を照射すると共に、被膜５を第１の有機分子膜６と第２の有機分子膜７とからなる二重構造とし、表面欠陥を十分にキャッピングしてエネルギー損失を抑制することが肝要である。
【００９８】
次に、本発明の一実施の形態としての上記発光体３の構成をより詳細に説明する。
【００９９】
図３は、発光体３を模式的に示した拡大図であり、該発光体３は、上述したようにナノ粒子４の表面に、有機配位子からなる表面保護剤８が形成されている。すなわち、ナノ粒子４の表面には、上述したように多くの表面欠陥が形成されており、反応性が高くナノ粒子４同士が凝集し易い。このため、通常、ナノ粒子４の合成時に、有機配位子として作用する表面保護剤８をナノ粒子４の表面に配位させ、これにより表面欠陥を或る程度キャッピングして該表面欠陥を取り除き、不動態化を促進させている。
【０１００】
具体的には、表面保護剤８は、アルキル基（−ＣＨ２）等の疎水性基と、チオール基（−ＳＨ）、カルボキシル基（−ＣＯＯＨ）、アミノ基（−ＮＨ２）等の親水性基とを有する有機配位子で構成され、親水性基がナノ粒子４の表面に吸着し、疎水性基が外側に位置するように配位する。
【０１０１】
この表面保護剤８は、ナノ粒子４の合成時に使用される溶媒が、合成後には有機配位子となってナノ粒子４の表面に形成される。したがって、表面保護剤８としては、溶媒として沸点が高く化学的に安定し、ナノ粒子４同士の凝集を抑制し、表面不活性化に寄与するものを使用することができる。
【０１０２】
このような表面保護剤８としては、例えばチオグリコール酸ｎ−オクチル（ＣＨ３（ＣＨ２）７ＯＣ（＝Ｏ）ＣＨ２ＳＨ）、１−ドデカンチオール（ＣＨ３（ＣＨ２）11ＳＨ）、ｎ−ヘキサンチオール（ＣＨ３（ＣＨ２）５ＳＨ）等のアルキルチオール、オレイルアミン（Ｈ２Ｎ（ＣＨ２）８ＨＣ＝ＣＨ（ＣＨ２）７ＣＨ３）等のアルキルアミン、ｎ−オクチルエーテル（Ｈ３Ｃ（ＣＨ２）７Ｏ（ＣＨ２）７ＣＨ３）等を使用することができる。特に、表面保護剤８は、その配位力がナノ粒子４の粒子径に影響を及ぼすことから、要求される粒子径に応じて選択するのが好ましい。例えば、近赤外領域においてより短波長側で発光させる場合は、５ｎｍ程度の平均粒径が得られるチオグリコール酸ｎ−オクチルとオレイルアミンとの組み合わせを使用するのが好ましく、長波長側で発光させる場合は、６〜７ｎｍ程度の平均粒径が得られる１−ドデカンチオールとオレイルアミンとの組み合わせを使用するのが好ましい。
【０１０３】
また、ナノ粒子４の表面であって表面保護剤８間にはアルキルチオール（一般式ＣＨ３（ＣＨ２）ｎＳＨ）９が吸着されている。すなわち、ナノ粒子４は表面保護剤８のみでは十分に表面欠陥を取り除くことができないことから、本実施の形態では表面保護剤８間に存在する表面欠陥をアルキルチオール９で更にキャッピングして取り除いている。
【０１０４】
具体的には、親水性基であるアルキルチオール９のチオール基（−ＳＨ）が表面保護剤８間に存在するナノ粒子４の表面欠陥に吸着し、疎水性基であるアルキル基（−ＣＨ２）が外側に位置するよう配位し、これにより有機配位子からなる表面保護剤８と該表面保護剤８間に配位したアルキルチオール９とで第１の有機分子膜６を形成し、表面欠陥を効果的にキャッピングしている。
【０１０５】
さらに、ナノ粒子４の表面には、第１の有機分子膜６と二重構造となるように複数のアルキル基を有する脂肪酸（一般式ＣｎＨｍＣＯＯＨ）１０を主成分とする第２の有機分子膜７が形成され、第１及び第２の有機分子膜６、７で被膜５を形成している。すなわち、ナノ粒子４の表面であって第１の有機分子膜６間には、後述する疎水性相互作用により疎水性基である脂肪酸１０のアルキル基（−ＣＨ２）が吸着され、親水性基である末端のカルボキシル基（−ＣＯＯＨ）が終端に位置するように配位されている。そして、これにより被膜５は、第１の有機分子膜５と第２の有機分子膜６とでナノ粒子４上に二重構造を形成し、高密度の被膜５が形成されることから表面不活性化に寄与すると共に表面欠陥がより効果的に取り除かれる。また、超音波照射により脂肪酸１０のカルボキシル基が終端に位置して被膜５には親水性が付与されることから、発光体３は水中に分散可能とされている。
【０１０６】
ここで、アルキルチオール９としては特に限定されるものではなく、チオグリコール酸ｎ−オクチル（ＣＨ３（ＣＨ２）７ＯＣ（＝Ｏ）ＣＨ２ＳＨ）、１−ドデカンチオール（ＣＨ３（ＣＨ２）11ＳＨ）、ｎ−ヘキサンチオール（ＣＨ３（ＣＨ２）５ＳＨ）等を使用することができる。
【０１０７】
また、脂肪酸１０についても複数のアルキル基を含有するものであれば、特に限定されるものではなく、オレイン酸（ＣＨ３（ＣＨ２）７ＨＣ＝ＣＨ（ＣＨ２）７ＣＯＯＨ）、ラウリン酸（ＣＨ３（ＣＨ２）10ＣＯＯＨ）、オクタン酸（ＣＨ３（ＣＨ２）６ＣＯＯＨ）等を使用することができる。
【０１０８】
ただし、発光量子収率を向上させる観点からは、脂肪酸１０は、アルキルチオール９のアルキル基の鎖長よりも長い鎖長を有するアルキル基を含有しているのが好ましい。例えば、アルキルチオール９としてアルキル基の個数が「１２」の１−ドデカンチオールを使用する場合は、脂肪酸１０としてはアルキル基の個数が「１５」のオレイン酸を使用するのが好ましく、アルキルチオール９としてアルキル基の個数が「８」のチオグリコール酸ｎ−オクチルを使用する場合は、脂肪酸１０としてアルキル基の個数が「１１」のラウリン酸やアルキル基の個数が「１５」のオレイン酸を使用するのが好ましい。
【０１０９】
このように本発光体３は、ＡｇＩｎＳｅ系化合物半導体からなるナノ粒子４を含有し、親水性が付与された被膜５が、発光量子収率が１０％以上であるので、細胞に有害な非極性の有機溶媒が生体組織に吸着することもなく、良好な発光効率を有するバイオイメージングに好適な発光体３を得ることができる。
【０１１０】
また、本発光体３は、発光強度のピーク波長が、６５０ｎｍ〜１０００ｎｍの範囲にあり、前記ピーク波長における半値幅が１００ｎｍ以下であるので、ナノ粒子４の表面を親水化した場合であっても、近赤外領域での半値幅ΔＨが良好で発光スペクトル特性を損なうことなく、分解能が高く良好な発光スペクトル特性を有するバイオイメージングに好適な発光体を得ることができ、発光スペクトル特性と発光効率とが両立した発光体を得ることができる。
【０１１１】
特に、被膜５が、少なくともアルキルチオール９を含有した第１の有機分子膜６と、複数のアルキル基を含有した脂肪酸１０を主成分とする第２の有機分子膜７とを有する二重構造とすることにより、被膜５を高密度に形成することが可能となり、ナノ粒子４の表面欠陥を効果的にキャッピングすることができ、表面不活性化にも寄与すると考えられる。そして、被膜５は、上述したように超音波照射により親水性が付与されていることから、配位子置換反応で親水性が付与されている場合とは異なり、新たな表面欠陥の形成を抑制することができる。そしてこれにより発光量子収率が１０％以上、好ましくは３０％以上の良好な発光効率を有し、親水性付与と発光効率とが両立したバイオイメージングに好適な発光体を得ることができる。
【０１１２】
次に、上記発光体の製造方法の一実施の形態を、図４〜図９を参照しながら詳述する。
【０１１３】
［ナノ粒子分散非極性溶液の作製］
図４（ａ）は、ナノ粒子分散非極性溶液１２を示し、表面保護剤８が形成されたナノ粒子４が非極性溶媒１１中に分散している。図４（ｂ）はナノ粒子４の詳細を模式的に示す拡大図である。
【０１１４】
このナノ粒子分散非極性溶液１２は以下のようにして作製することができる。
【０１１５】
まず、Ａｇ成分を含有したＡｇ化合物、及びＩｎ成分を含有したＩｎ化合物を用意し、合成後のＡｇ成分とＩｎ成分との配合比率、すなわちＩｎ／Ａｇ比が好ましくは１．５〜３程度に化学量論組成よりも多くとなるようにＡｇ化合物、及びＩｎ化合物をそれぞれ秤量する。このようにＩｎ／Ａｇ比を調整することにより、発光強度のピーク波長が急峻で半値幅ΔＨが小さく、尖鋭な発光スペクトルを得ることができる。
【０１１６】
尚、Ａｇ化合物やＩｎ化合物に使用される化合物種は特に限定されるものではないが、比較的安価で化学的に安定し、かつ入手が容易な金属錯体、例えば酢酸イオン等の脂肪酸イオンを配位子とした酢酸銀（Ａｇ（ＯＣＯＣＨ３）や酢酸インジウム（Ｉｎ（ＯＣＯＣＨ３）３）を好んで使用することができる。
【０１１７】
次に、これら秤量物を溶媒に溶解させ、Ａｇ−Ｉｎ溶液を作製する。この溶媒は、上述したように合成後に有機配位子として表面保護剤８を形成することから、例えば、上記したチオグリコール酸ｎ−オクチル、１−ドデカンチオール、オレイルアミン及びｎ−オクチルエーテルの中から選択された少なくとも１種を含む混合溶液を使用することができる。
【０１１８】
次に、Ｓｅ粉末を用意し、このＳｅ粉末を溶媒に溶解させてＳｅ溶液を作製する。この場合も溶媒としては、例えば上記した１−ドデカンチオール、ヘキサンチオール等のアルキルチオールとオレイルアミン等のアルキルアミンとの混合溶液や、トリブチルホスフィン、トリオクチルホスフィン等のホスフィン類を使用することができる。
【０１１９】
次いで、Ａｇ−Ｉｎ溶液を容器に入れ、減圧脱気した後、窒素置換し、その後、加熱処理を行って反応場の温度を室温から所定温度（例えば、１００℃〜１５０℃）に昇温させる。
【０１２０】
次に、前記所定温度に加熱されたＡｇ−Ｉｎ溶液にＳｅ溶液を注入し、その後、さらに所定の反応温度まで加熱し、斯かる反応温度（例えば、２００℃以上）で所定の反応時間（例えば、３０〜１２０分）保持し、これにより反応物を得る。
【０１２１】
次いで、この反応物を室温に達するまで放置して冷却し、その後、遠心分離処理を行って上澄み液と沈殿物とに分離し、上澄み液を回収すると共に沈殿物を廃棄する。そして、メタノール、エタノール、アセトン、アセトニトリル等の貧溶媒を上澄み液に加えて沈殿物を生成し、再び遠心分離処理を行って沈殿物を分離回収する。以降、貧溶媒の添加→遠心分離処理→沈殿物の回収という操作を複数回繰り返し、異相等の不純物を含まない高純度の沈殿物、すなわち表面保護剤８で被覆されたＡｇＩｎＳｅ系化合物半導体からなるナノ粒子４を作製する。次いで、このナノ粒子４をクロロホルム、トルエン、ヘキサン等の非極性溶媒中に分散させ、これにより図４（ａ）に示すようなナノ粒子分散非極性溶液１２を作製する。
【０１２２】
［前駆体分散溶液の作製］
ナノ粒子分散非極性溶液１２にアルキルチオール９を添加する。すると図５（ｂ）に示すように、アルキルチオール９は、親水性基である末端のチオール基がナノ粒子４の表面に吸着し、疎水性基であるアルキル基が外側に位置するように配位する。そしてこれによりアルキルチオール９がナノ粒子４の表面欠陥をキャッピングし、表面保護剤８とアルキルチオール９とで第１の有機分子膜６を形成し、図５（ａ）に示すように、第１の有機分子膜５で被覆されたナノ粒子４が非極性溶媒１１中に分散し、これにより前駆体分散溶液１４を作製する。
【０１２３】
［脂肪酸水溶液の作製］
図６に示すように、ＮａＯＨやＫＯＨ等のアルカリが添加された水溶液１５にオレイン酸等の脂肪酸１０を溶解させ、脂肪酸水溶液１６を作製する。
【０１２４】
［相分離溶液の作製］
脂肪酸水溶液１６を全体が泡立つ程度に撹拌した後、該脂肪酸水溶液１６と前駆体分散溶液１４とを混ぜ合わせる。すると図７に示すように、脂肪酸１０は非極性溶媒相１８中に分散し、水相１７と非極性溶媒相１８とに分離した相分離溶液１９が得られる。
【０１２５】
［超音波照射］
相分離溶液１９に超音波２０を照射する。すると相分離溶液１９には大きな衝撃力が負荷され、図８（ａ）に示すように、水相１７と非極性溶媒相１８とが混ざり合って均一な水溶液２１を形成すると共に、水溶液２１内には水中油滴型のマイクロエマルジョン２２が形成される。この際、図８（ｂ）に示すように、第１の有機分子膜６が形成されたナノ粒子４と脂肪酸１０とはマイクロエマルジョン２２内に閉じ込められる。
【０１２６】
水溶液２１に超音波２０を照射し続けると、図８（ｃ）〜（ｄ）に示すように、マイクロエマルジョン２２は、照射時間の経過に伴って徐々に小さくなり、ナノ粒子４の表面には第１の有機分子膜６と二重構造を形成するように第２の有機分子膜７を形成する。すなわち、マイクロエマルジョン２２が形成された直後は、脂肪酸１０は、上記図８（ｂ）に示すように、マイクロエマルジョン２２内を浮遊しているが、超音波２０を照射し続け、マイクロエマルジョン２２に大きな衝撃力が負荷されると、マイクロエマルジョン２２は徐々に小さくなる。そして、マイクロエマルジョン２２が小さくなるのに伴い、脂肪酸１０の一部はナノ粒子４に近接し、脂肪酸１０のアルキル基は、図８（ｃ）に示すように、第１の有機分子膜６のアルキル基との間でファン・デア・ワールス力に起因する疎水性相互作用により、ナノ粒子４の表面に吸着し、これにより脂肪酸１０の末端のカルボキシル基は外側に位置するように配される。そして、超音波２０を更に照射し続けると、図８（ｄ）に示すように、マイクロエマルジョン２２が更に小さくなると共に、脂肪酸１０のナノ粒子４への吸着が進行しかつ自己組織化され、脂肪酸１０は第２の有機分子膜７となって第１の有機分子膜６間に存在する表面欠陥を効果的にキャッピングする。
【０１２７】
このように脂肪酸１０は、疎水性基であるアルキル基（−ＣＨ２）がナノ粒子４の表面に吸着される一方、親水性基である末端のカルボキシル基（−ＣＯＯＨ）が外側に位置するように配され、カルボキシル基によって被膜５には親水性が付与される。すなわち、ナノ粒子４の表面には第１の有機分子膜６と第２の有機分子膜７とが高密度に配位され、親水性が付与された二重構造の被膜５が形成されることとなる。
【０１２８】
［ナノ粒子分散水溶液の作製］
マイクロエマルジョン２２が十分に小さくなった時点で超音波照射を終了する。すると水溶液２１は、図９に示すように、再び水相１７と非極性溶媒相１８に相分離して相分離溶液１９を形成する。そして、親水性が付与された被膜５を有する発光体３は、水相１７側に移動し、該水相１７内に分散する。
【０１２９】
その後、適量のクロロホルム等の有機溶媒を添加して遠心分離処理を繰り返し行って水相１７を回収し、さらに回収した水相１７にヘキサン等の有機溶媒を添加して再び遠心分離処理を繰り返し行って水相１７を回収し、これによりナノ粒子が水中に分散した高純度のナノ粒子分散水溶液を作製することができる。
【０１３０】
このように本発光体の製造方法によれば、まず、ナノ粒子４の表面欠陥にアルキルチオール９のチオール基が吸着して前記ナノ粒子４の表面に第１の有機分子膜６が形成され、前駆体分散溶液１４が作製される。その後、脂肪酸水溶液１６と前駆体分散溶液１４とを混ぜ合わせて相分離溶液１９を作製し、この相分離溶液１９に超音波２０を照射することにより、マイクロエマルジョン２２を形成すると共に、該マイクロエマルジョン２２内にナノ粒子４と脂肪酸１０とが閉じ込められる。そして、脂肪酸１０のアルキル基がアルキルチオール９のアルキル基との疎水性相互作用によってナノ粒子４の表面に吸着し、ナノ粒子４の表面には第１の有機分子膜６と重なるような形態で脂肪酸１０を主成分とする第２の有機分子膜７が形成され、これによりナノ粒子４の表面には第１の有機分子膜６と第２の有機分子膜７とからなる二重構造の被膜５が形成される。そして、被膜５は脂肪酸１０末端のカルボキシル基によって親水性が付与されることから、超音波照射後に再び相分離した相分離溶液１９において、親水性の被膜５を形成したナノ粒子４は水相１７側に移動して水中を分散し、これにより発光スペクトル特性及び発光効率の良好な生体物質標識剤に適した発光体３を得ることができる。
【０１３１】
（第２の実施の形態）
上記第１の実施の形態では、ナノ粒子４はＡｇＩｎＳｅ系化合物半導体で形成されているが、本第２の実施の形態では、ナノ粒子４はＡｇＩｎＳｅ系化合物半導体にＧａ成分を注入したＡｇＩｎＧａＳｅ系化合物半導体で形成されている。
【０１３２】
ＡｇＩｎＧａＳｅ系化合物半導体は、ＡｇＩｎＳｅ系化合物半導体に比べてバンドギャップエネルギーが若干大きく、吸収端が短波長側にシフトすることから、半値幅ΔＨを１００ｎｍ以下に維持しつつより短波長側の近赤外領域で発光させることが可能である。特に、ＧａとＩｎとの配合比率、すなわち、Ｇａ／Ｉｎ比を異ならせることにより、平均粒径を異ならせなくとも発光強度のピーク波長を制御することが可能になる。
【０１３３】
本第２の実施の形態に係る発光体の製造方法についても、Ａｇ化合物及びＩｎ化合物に加えＧａ化合物を溶媒に溶解させてＡｇ−Ｉｎ−Ｇａ溶液を作製する以外は、上記実施の形態と同様である。
【０１３４】
ここで、Ｇａ化合物としては特に限定されるものではなく、例えば、化学式（１）で示されるガリウムアセチルアセトナートを使用することができる。
【０１３５】
【化１】
2020246297.tif 000003
【０１３６】
（第３の実施の形態）  
図１０は本発明に係る発光体の第３の実施の形態を模式的に示す断面図である。
【０１３７】
この第３の実施の形態では、第１の実施の形態に加え、被膜５がカチオン性の膜透過性ペプチドを主成分とする表面修飾剤３１で被覆されている。
【０１３８】
すなわち、カチオン性を有する膜透過性ペプチドは、後述するように静電相互作用により生体物質表面の負電荷を帯びている細胞膜に吸引され、発光体３２はエンドサイトーシス過程を経て容易に生体物質内に導入することができる。そして、これにより発光体３２に光を照射するのみで、様々な生体情報を検出することが可能である。
【０１３９】
しかも、本発光体３２の発光源となるＡｇＩｎＳｅ系化合物半導体は、Ｃｄ系化合物半導体とは異なり、低毒性であることから、より多量の発光体を生体物質に導入しても、細胞の死滅が抑制され、したがって細胞生存率を良好に維持することができる。因みに、後述するように本発明者らがＡＳＣｓ（脂肪組織由来幹細胞）の細胞培養液についてモル濃度の異なる発光体３２を種々添加したところ、モル濃度換算で１６０ｎｍｏｌ／Ｌの発光体３２を細胞内に導入しても、８０％以上の細胞生存率を得ることができることが確認されている。
【０１４０】
ここで、膜透過性ペプチドとしては、カチオン性を有し、エンドサイトーシスを促進するものであれば特に限定されるものではないが、好ましくは化学式（２）で示すアルギニン（Ｒ）が分子内に８個配列されたオクタアルギニン（Ｒ８：ＲＲＲＲＲＲＲＲ）を使用することができる。
【０１４１】
【化２】
2020246297.tif 000004
【０１４２】
本第３の実施の形態の発光体は、以下のようにして作製することができる。
【０１４３】
図１１は、本発光体の製造過程の要部を示す模式図である。
【０１４４】
まず、第１の実施の形態と同様の方法・手順で、被膜５で被覆されたナノ粒子４を作製する。
【０１４５】
すなわち、このナノ粒子４はＡｇＩｎＳｅ系化合物半導体で形成され、ナノ粒子４の表面には第１の有機分子膜６と第２の有機分子膜７とからなる被膜５が形成されている。また、第１の有機分子膜６はチオール基等の親水性基がナノ粒子４の表面に吸着され、アルキル基等の疎水性基が外側に配されている。第２の有機分子膜７は、脂肪酸１０で形成され、該脂肪酸１０を形成するアルキル基が疎水性相互作用により第１の有機分子膜６間であってナノ粒子４の表面に吸着され、末端のカルボキシル基が外側に配され、これにより親水性が付与されている。
【０１４６】
次いで、被膜５が形成されたナノ粒子４と主成分がＲ８等のカチオン性を有する膜透過性ペプチドで形成された表面修飾剤３１とを混合する。具体的にはナノ粒子４に対する膜透過性ペプチドの混合比率が十分に過剰となるように、例えば、モル比換算で前記混合比率が１００００倍程度となるように、前記ナノ粒子４と前記表面修飾剤３１とを液相で混合する。これにより第２の有機分子膜７の表面が表面修飾剤３１で被覆され、本発光体３２が形成される。例えば、カチオン性を有する膜透過性ペプチドとしてＲ８を使用した場合、被膜５が形成されたナノ粒子４と大量のＲ８とを混合すると、被膜５中の第２の有機分子膜７を形成するカルボキシル基（−ＣＯＯＨ）とＲ８を形成するグアジニノ基（−ＮＨ−（Ｃ＝ＮＨ）−ＮＨ２）とが反応してペプチド結合（−ＮＨＣＯ−）を形成し、これにより第２の有機分子膜７とＲ８とが結合することから、被膜５がＲ８で被覆され、該Ｒ８で表面修飾された発光体３２を作製することができる。そして、この場合もＲ８の末端に位置するカルボキシル基が外部と接することから、親水性を確保することができる。
【０１４７】
＜生体物質標識剤＞
本発光体３、３２は親水性が付与されており、かつ良好な発光スペクトル特性と発光効率を有することから、斯かる発光体３、３２を生体物質内に導入しても有機溶媒のような有害物質が生体組織に吸着することもなく、所望の高感度かつ多色でもって生体画像を動的に高効率で解析することができ、また、Ｃｄ等の有害元素を含まないことから低毒性でバイオイメージングのバイオマーカーに適した生体物質標識剤を得ることができる。
【０１４８】
図１２は、発光体の生体物質の導入過程を示す模式図であって、本発光体は第３の実施の形態のものを示している。
【０１４９】
すなわち、被膜５を被覆する表面修飾剤３１は、カチオン性を有することから表面が正電荷を帯びている。したがって、生体物質表面の負電荷を帯びている細胞膜３４との間で静電相互作用が生じ、表面修飾剤３１は細胞膜３４の表面に吸引され、この図１２に示すように、発光体３２は細胞膜３４上に移動する。その後、いわゆるエンドサイトーシス過程により発光体３２は細胞膜３４の内部に輸送され、細胞膜３４内に取り込まれることから、発光体３２は光を照射するのみで蛍光し、これにより生体物質標識剤として活用することができる。
【０１５０】
尚、上記実施の形態では、発光体３２が表面修飾剤３１で被覆されている場合について説明したが、表面修飾剤で被覆されていない第１及び第２の実施の形態のような発光体３であっても、エンドサイトーシスによって発光体３を細胞内に導入することが可能である。すなわち、この場合は発光体３の表面の第２の有機分子膜７が細胞膜上の受容体と結合し、斯かる受容体を介在させることにより、エンドサイトーシス過程を経て発光体３を生体物質内に取り込むことができ、生体物質標識剤として活用することができる。
【０１５１】
このように本発光体３、３２には親水性が付与されており、かつ良好な発光スペクトル特性と発光効率を有することから、有機溶媒のような有害物質が生体組織に吸着することもなく、生体内に導入された発光体に光を照射するのみで生体物質の状態が確認可能となる。すなわち、生体画像を所望の高感度かつ多色でもって動的に高効率で解析することができ、バイオイメージングのバイオマーカーに適した生体物質標識剤を得ることができる。
【０１５２】
尚、本発明は上記実施の形態に限定されるものではない。上記実施の形態は、本発明の一実施の形態であり、要旨を変更しない限り変更可能であるのはいうまでもない。例えば、上記第３の実施の形態では、ナノ粒子としてＡｇＩｎＳｅ系化合物半導体を使用したが、第２の実施の形態に示すようなＡｇＩｎＧａＳｅ系化合物半導体を使用しても同様である  のはいうまでもなない。
【０１５３】
また、本発明の発光体は、上述したように生体物質標識剤に使用できる他、生体内の標識を励起させるための光源に利用することも可能である。例えば、青色発光ダイオードや紫外発光ダイオードの封止部に本発明の発光体を充填することにより、本発明の発光体は青色発光ダイオードや紫外発光ダイオードによって励起されて６５０〜１０００ｎｍの近赤外領域で出射することから、斯かる波長領域で生体内の標識を励起させる光として利用することができる。
【０１５４】
次に、本発明の実施例を具体的に説明する。
【実施例１】
【０１５５】
〔試料の作製〕
＜ナノ粒子分散非極性溶液の作製＞
ナノ粒子材料として純度９９．９９％のＳｅ粉末（シグマーアルドリッチ社製）、純度９９％の酢酸銀（ナカライテスク社製）及び純度９９．９９％の酢酸インジウム（アルファエイサー社製）をそれぞれ用意し、溶媒として純度９５％のチオグリコール酸ｎ−オクチル（東京化成工業社製）、純度８０％のオレイルアミン（アクロスオーガニックス社製）、純度９５％のｎ−オクチルエーテル（東京化成工業社製）をそれぞれ用意した。【０１５６】
そして、合成後のＡｇ／Ｉｎ比が１／２となるようにこれら酢酸銀０．１３３ｍｍｏｌ及び酢酸インジウム０．２６７ｍｍｏｌを秤量し、この秤量物を内容量が５０ｍＬの三口フラスコにスターラーチップと共に投入し、次いで、チオグリコール酸ｎ−オクチル１ｍＬ及びｎ−オクチルエーテル９ｍＬを添加して撹拌し、Ａｇ−Ｉｎ溶液を作製した。【０１５７】
また、Ｓｅ粉末０．４ｍｍｏｌをチオグリコール酸ｎ−オクチル１ｍＬ及びオレイルアミン１ｍＬに溶解させ、８０℃に加熱し、Ｓｅ溶液を作製した。【０１５８】
次いで、Ａｇ−Ｉｎ溶液が貯留された三口フラスコを減圧脱気した後、窒素置換し、その後三口フラスコをヒータで加熱し、室温から１００℃まで昇温させた。そして、反応場の温度が１００℃になった時点で三口フラスコにＳｅ溶液を注入し、反応場の温度を２００℃まで昇温させ、この温度で６０分間加熱処理を行って反応物を得た。【０１５９】
次いで、この反応物を室温に達するまで空冷し、その後回転数５０００ｒｐｍで５分間遠心分離処理を行って上澄み液と沈殿物とに分離し、上澄み液を回収し、沈殿物は廃棄した。【０１６０】
次に、上澄み液の容量の約３倍のエタノール（純度９９．５％、関東化学社製）を添加し、ＡｇＩｎＳｅ系のナノ粒子を沈殿させた。その後、再び遠心分離処理を行って上記ナノ粒子を回収し、回収したナノ粒子にエタノール５ｍＬを添加し、ボルテックスミキサーで沈殿したナノ粒子を分散させた後、回転数５０００ｒｐｍで５分間遠心分離処理を行って再び結晶粒子を回収した。その後、メタノール添加→遠心分離処理→ナノ粒子の回収という操作を複数回繰り返し、得られた高純度のナノ粒子を非極性溶媒としてのクロロホルム（純度９９％、ナカライテスク社製）中に分散させ、これによりナノ粒子分散非極性溶液を得た。このように非極性溶液中に分散している超音波処理前のナノ粒子を試料番号１１とした。【０１６１】
＜前駆体分散溶液〜相分離溶液の作製＞
アルキルチオールとして純度９５％の１−ドデカンチオール（東京化成工業社製）、脂肪酸として純度９０％のオレイン酸（シグマーアルドリッチ社製）を用意した。【０１６２】
また、上記ナノ粒子分散非極性溶液を波長４００ｎｍにおける吸光度が１０となるように調整した。そして、このナノ粒子分散非極性溶液１ｍＬに１−ドデカンチオール１６ｍｇを添加し、ナノ粒子の表面欠陥をキャッピングし、これにより第１の有機分子膜を形成し、該第１の有機分子膜が形成されたナノ粒子を非極性溶液に分散させて前駆体分散溶液を作製した。【０１６３】
次いで、５０ｍＬのビーカーに純水２０ｍＬと１Ｍの水酸化ナトリウム（純度９７％、ナカライテスク社製）２５μＬを添加してアルカリ水溶液とし、これにオレイン酸４０μＬを添加し、全体が泡立つように５分間激しく撹絆し、これにより脂肪酸水溶液を作製した。【０１６４】
その後、前駆体分散溶液と前記脂肪酸水溶液とを混ぜ合わせ、クロロホルム相と水相に相分離した相分離溶液を作製した。【０１６５】
＜超音波照射＞
超音波ホモジナイザー（三井電気精機社製、ＵＸ−３００）を使用し、相分離溶液に超音波を照射した。【０１６６】
この超音波ホモジナイザーは発振機と振動子とで構成され、発振機から送られた出力が振動子で振動エネルギーに変換され、振動子先端のチップが縦振動し、相分離溶液に大きな衝撃波が負荷される。すなわち、超音波照射により大きな衝撃波が負荷されて均一な水溶液が形成され、水溶液中には水中油滴型のマイクロエマルジョンを形成することができる。【０１６７】
ここで、前記チップは直径１２φのものを使用し、プローブを１ｃｍ程度、相分離溶液に浸入させて連続３０分間超音波を照射した。超音波ホモジナイザーの出力は、該超音波ホモジナイザーの運転画面の出力表示部バーグラフ（出力電力）が５０％程度となるように設定した。【０１６８】
＜ナノ粒子分散水溶液の作製＞
超音波照射が終了すると、水溶液は再び水相とクロロホルム相とに相分離し、親水性が付与されたナノ粒子は水相に移動した。【０１６９】
次いで、水相にクロロホルム１０ｍＬを添加して撹絆した後、回転数５０００ｒｐｍで遠心分離処理を２分間行い、水相を回収する一連の作業を２回行った。次に、回収した水相に純度９６％のヘキサン（ナカライテスク社製）１０ｍＬを加えて撹絆し、その後、回転数５０００ｒｐｍで遠心分離処理を２分間行う作業を２回行って洗浄し、これにより高純度のナノ粒子分散水溶液を作製した。このように水溶液中に分散している超音波処理後のナノ粒子を試料番号１２とした。【０１７０】
〔試料の評価〕
図１３は、超音波照射前後における相分離溶液を示している。【０１７１】
図中、（ａ）は超音波照射前、（ｂ）は超音波照射後であり、超音波照射の前後のいずれにおいても溶液は水相とクロロホルム相とに相分離している。そして、発光体のコアとなるナノ粒子は、超音波照射前は、図１３（ａ）に示すように、非極性溶媒であるクロロホルム相内を分散し、超音波処理後は、図１３（ｂ）に示すように、水相内を分散している。このようにナノ粒子は、超音波照射後は、超音波照射前のクロロホルム相から水相に移動し、発光体には親水性が付与されていることが確認された。【０１７２】
次に、紫外可視近赤外分光光度計（日立ハイテクノロジーズ社製、Ｕ４１００）を使用し、光路長１ｃｍ、測定波長域３００ｎｍ〜１５００ｎｍの測定条件で、超音波処理後の試料番号１２について、吸収スペクトル及び透過スペクトルを測定した。【０１７３】
図１４は、試料番号１２について、波長４００ｎｍにおける吸光度が０．１となるように正規化した場合の吸収スペクトルと透過スペクトルを示している。図中、横軸は波長（ｎｍ）であり、左縦軸が吸光度（ａ．ｕ．）、右縦軸が透過率（％）である。尚、この図１４では溶媒であるクロロホルム及び水の超音波照射前後における吸収を除いて示している。【０１７４】
この図１４から明らかなように、透過率は、１０００〜１１００ｎｍの波長域でほぼ１００％であることから、発光体は高精度に水中で分散していることが分かった。【０１７５】
次に、絶対発光量子収率測定装置（浜松ホトニクス社製Ｃ９９２０−０２）を使用し、試料番号１１及び試料番号１２の発光量子収率及び発光スペクトルを２５℃の室温で測定した。【０１７６】
その結果、発光量子収率は、試料番号１１（超音波照射前）は９％であったのに対し、試料番号１２（超音波照射後）は４４％となり、超音波照射後の発光量子収率は、超音波照射前に比べて４．９倍となって格段に向上することが分かった。【０１７７】
図１５は、試料番号１１及び１２の発光スペクトルを示している。図中、横軸が波長（ｎｍ）、縦軸が発光強度（ａ．ｕ．）である。【０１７８】
この図１５から明らかなように、試料番号１１及び１２のいずれにおいても発光強度のピーク波長は７８０ｎｍであり、半値幅△Ｈは７０ｎｍであり、超音波照射を行なっても発光スペクトル特性は損なわれないことが確認された。【０１７９】
図１６は、試料番号１１（超音波照射前）の吸収スペクトルを試料番号１２（超音波照射後）の吸収スペクトル（図１４）との対比で示したプロファイルである。図中、横軸が波長（ｎｍ）、縦軸が吸光度（ａ．ｕ．）である。【０１８０】
この図１６から明らかなように、超音波照射の前後で吸収端波長に殆ど変化がなく、超音波照射を行なってもナノ粒子のバンドギャップエネルギーに影響を及ぼさないことが分かった。【０１８１】
次に、試料番号１１及び１２の各試料について、走査型透過電子顕微鏡（Scanning Transmission Electron Microscope、以下「ＳＴＥＭ」という。）（日立ハイテクノロジーズ社製、ＨＤ−２３００Ａ）を使用し、倍率６００ｋでＳＴＥＭ像を撮像した。【０１８２】
図１７は、その撮像結果を示している。【０１８３】
この図１７から明らかなように、超音波照射前後（親水化前後）でナノ粒子の平均粒径はいずれも５ｎｍ程度であり、形状や大きさに変化が認められないことが確認された。【０１８４】
以上よりナノ粒子に超音波を照射して親水化することにより、発光強度のピーク波長や半値幅△Ｈ、及び平均粒径を維持しつつ、発光量子収率を飛躍的に向上させることができることが分かった。
【実施例２】
【０１８５】
〔実施例試料の作製〕
チオグリコール酸ｎ−オクチルに代えて１−ドデカンチオール（純度９５％、東京化成工業社製）を使用し、ナノ粒子分散非極性溶液を作製した。【０１８６】
すなわち、合成後のＡｇ／Ｉｎ比が１／２となるように、酢酸銀０．０６７ｍｍｏｌ及び酢酸インジウム０．１３４ｍｍｏｌを秤量し、この秤量物を内容量が５０ｍＬの三口フラスコにスターラーチップと共に投入し、次いで、１−ドデカンチオール１ｍＬ及びｎ−オクチルエーテル８ｍＬを添加して撹絆し、Ａｇ−Ｉｎ溶液を作製した。【０１８７】
また、Ｓｅ粉末０．２ｍｍｏｌを１−ドデカンチオール１ｍＬ及びオレイルアミン１ｍＬに溶解させ、８０℃に加熱し、Ｓｅ溶液を作製した。【０１８８】
次いで、Ａｇ−Ｉｎ溶液が貯留された三口フラスコ内を減圧脱気した後、窒素置換し、その後三口フラスコをヒータで加熱し、室温から１５０℃まで昇温させた。【０１８９】
そして、反応場の温度が１５０℃になった時点で三口フラスコにＳｅ溶液を注入し、反応場の温度を２００℃まで昇温させ、この温度で１２０分間加熱処理を行って反応物を得た。【０１９０】
次いで、この反応物を室温に達するまで空冷し、その後回転数５０００ｒｐｍで５分間遠心分離処理を行って上澄み液と沈殿物とに分離し、上澄み液を回収し、沈殿物は廃棄した。【０１９１】
次に、上澄み液の容量の約３倍のエタノールを添加し、ＡｇＩｎＳｅ系のナノ粒子を沈殿させた。その後、再び遠心分離処理を行って上記ナノ粒子を回収し、回収したナノ粒子にエタノール５ｍＬを添加し、ボルテックスミキサーで沈殿したナノ粒子を分散させた後、回転数５０００ｒｐｍで５分間遠心分離処理を行って再びナノ粒子を回収した。その後、エタノール添加→遠心分離処理→ナノ粒子の回収という操作を複数回繰り返し、得られた高純度のナノ粒子をクロロホルム中に分散させ、ナノ粒子分散非極性溶液を得た。このように非極性溶媒中に分散した超音波照射前のナノ粒子を試料番号２１とした。【０１９２】
その後は実施例１と同様の方法・手順でナノ粒子分散水溶液を作製し、この水溶液中に分散した超音波処理後のナノ粒子を試料番号２２とした。【０１９３】
〔比較例試料の作製〕
上記実施例試料と同様の方法・手順でナノ粒子分散非極性溶液を作製した。【０１９４】
次に、３-メルカプトプロピオン酸（ＨＳ（ＣＨ２）２ＣＯＯＨ）（純度９８％、ナカライテスク社製）４ｍＬと２Ｍの水酸化カリウム（ＫＯＨ）（純度８５％、ナカライテスク社製）１５ｍＬとを混合し、調製した。そして、この調製された溶液０．５ｍＬとエタノール１ｍＬとを試験管に入れた。【０１９５】
次に、ナノ粒子分散非極性溶液を波長４００ｎｍでの吸光度が１となるように調整し、このナノ粒子分散非極性溶液１ｍＬを上記試験管に添加し、閉栓した。その後、６０℃の温度に調整されたホットスターラーで一晩撹拌し、３−メルカプトプロピオン酸と１−ドデカンチオール及びオレイルアミンとの間で配位子置換反応を生じさせ、ナノ粒子の表面に親水性を付与した。そして空冷後、５０００ｒｐｍで遠心分離処理を５分間行い、沈殿物であるナノ粒子を回収した。このナノ粒子にエタノールを５ｍＬ加え、ボルテックスミキサーで分散後、再び５０００ｒｐｍで遠心分離処理を５分間行い、ナノ粒子を回収することで洗浄した。得られたナノ粒子を純水に分散させた後、５０００ｒｐｍで遠心分離処理を５分間行い、上澄み液を回収し、これによりナノ粒子分散水溶液を作製した。この水溶液中に分散したナノ粒子を試料番号２３とした。【０１９６】
〔試料の評価〕
試料番号２１〜２３の各試料について、発光スペクトル及び発光量子収率を実施例１と同様の方法・手順で測定した。【０１９７】
図１８は試料番号２１〜２３の発光スペクトルを示している。図中、横軸が波長（ｎｍ）、縦軸は発光強度（ａ．ｕ）である。【０１９８】
表１は、試料番号２１〜２３の発光強度のピーク波長（ｎｍ）、半値幅△Ｈ、及び発光量子収率（％）を示している。【０１９９】
【表１】
2020246297.tif 000005
【０２００】
表１及び図１８から明らかなように、試料番号２３は、発光スペクトルは極めて緩やかな曲線は描き、正確な半値幅ΔＨを測定することができなかった。また、発光量子収率も３％であり低かった。【０２０１】
また、試料番号２１は、ピーク波長は８２０ｎｍであり、半値幅ΔＨは７０ｎｍとなって１００ｎｍ以下であり、急峻性・尖鋭性は良好であるが、発光量子収率は１２％と低かった。【０２０２】
これに対し試料番号２２は、ピーク波長及び半値幅ΔＨは、試料番号２１と同様であって超音波照射前後で変動はなく、発光量子収率が３８％となって超音波照射前に比べ、３倍以上に向上することが分かった。【０２０３】
すなわち、試料番号２３のように配位子置換を行って親水性を付与しても発光量子収率を向上させることができなかったが、試料番号２２のように超音波照射を行なった場合は発光強度のピーク波長及び半値幅△Ｈについては超音波照射前の特性を維持しつつ発光量子収率が向上することができた。したがって、発光量子収率を向上させるためには超音波照射を施すことが重要であることが確認された。
【実施例３】
【０２０４】
純度９９．９９％のガリウムアセチルアセトナート（ストレム・ケミカルズ社製）を用意し、ＡｇＩｎＳｅにＧａを注入し、Ｇａ含有量の異なるＡｇＩｎＧａＳｅ系ナノ粒子を作製し、発光スペクトル及び発光量子収率を評価した。【０２０５】
すなわち、酢酸銀０．１３３ｍｍｏｌ及び酢酸インジウム０．２６７ｍｍｏｌを秤量し、さらにＧａ／Ｉｎ比が０、１、２となるようにガリウムアセチルアセトナートを秤量した。そしてこの秤量物を内容量が５０ｍＬの三口フラスコにスターラーチップと共に投入し、次いで、チオグリコール酸ｎ−オクチル２ｍＬ及びｎ−オクチルエーテル９ｍＬを添加して撹絆し、ＡｇＩｎＧａ溶液を作製した。【０２０６】
また、Ｓｅ粉末０．４ｍｍｏｌをチオグリコール酸ｎ−オクチル２ｍＬ及びオレイルアミン２ｍＬに溶解させ、８０℃に加熱し、Ｓｅ溶液を作製した。【０２０７】
次いで、ＡｇＩｎＧａ溶液が貯留された三口フラスコ内を減圧脱気した後、窒素置換し、その後三口フラスコをヒータで加熱し、室温から１００℃まで昇温させた。そして、反応場の温度が１００℃になった時点で三口フラスコにＳｅ溶液を注入し、反応場の温度を２００℃まで昇温させ、この温度で６０分間加熱処理を行って反応物を得た。【０２０８】
次いで、この反応物を室温に達するまで空冷し、その後回転数５０００ｒｐｍで  ５分間遠心分離処理を行って上澄み液と沈殿物とに分離し、上澄み液を回収し、沈殿物は廃棄した。【０２０９】
次に、上澄み液の容量の約３倍のエタノールを添加し、ＡｇＩｎＧａＳｅ系のナノ粒子を沈殿させた。その後、再び遠心分離処理を行って上記ナノ粒子を回収し、回収したナノ粒子にエタノール５ｍＬを添加し、ボルテックスミキサーで沈殿したナノ粒子を分散させた後、回転数５０００ｒｐｍで５分間遠心分離処理を行って再び結晶粒子を回収した。その後、エタノール添加→遠心分離処理→ナノ粒子の回収という操作を複数回繰り返し、得られた高純度のナノ粒子を非極性溶媒としてのクロロホルム中に分散させ、ナノ粒子分散非極性溶液を得た。【０２１０】
その後は、実施例１と同様の方法・手順で超音波照射を含む一連の工程を行い、試料番号３１（Ｉｎ／Ｇａ＝０）、試料番号３２（Ｉｎ／Ｇａ ＝１）、及び試料番号３３（Ｉｎ／Ｇａ ＝２）のナノ粒子分散水溶液を作製した。【０２１１】
〔試料の評価〕
試料番号３１〜３３について、発光スペクトル及び発光量子収率を実施例１と同様の方法・手順で測定した。また、試料番号３２及び３３については超音波照射前についても発光スペクトル及び発光量子収率を測定した。【０２１２】
図１９は試料番号３１〜３３における超音波照射後の発光スペクトルの測定結果を示し、図２０は試料番号３２、３３における超音波照射前と超音波照射後の発光スペクトルの測定結果を示している。図中、横軸が波長（ｎｍ）、縦軸は発光強度（ａ．ｕ）である。【０２１３】
表２は試料番号３１〜３３の超音波照射前後における発光強度のピーク波長（ｎｍ）、半値幅△Ｈ、及び発光量子収率（％）を示している。【０２１４】
【表２】
2020246297.tif 000006
【０２１５】
表２及び図１９に示すように、発光強度のピーク波長は試料番号３１が７８０ｎｍ、試料番号３２は７５０ｎｍ、試料番号３３は７００ｎｍであり、いずれも近赤外領域で発光している。そして、Ｉｎに対するＧａの配合比率、すなわちＧａ／Ｉｎ比が大きくなるのに伴い発光強度のピーク波長は短波長側シフトしており、Ｇａの含有量に応じてピーク波長を制御できることが分かった。【０２１６】
また、表２及び図２０に示すように、Ｇａ／Ｉｎ比が一定であれば、超音波照射の前後でピーク波長や半値幅△Ｈに変動はないが、発光量子収率は、超音波照射前ではそれぞれ９％、９％、４％であったのが、超音波処理後には４４％、４０％、１０％となって超音波照射前に比べて２．５倍以上となった。【０２１７】
次に、試料番号３１〜３３について、実施例１と同様の方法・手順で吸収スペクトルを測定した。【０２１８】
図２１はその測定結果を示しており、横軸が波長（ｎｍ）、縦軸は吸光度（ａ．ｕ．）である。【０２１９】
この図２１から明らかなように、Ｇａの含有量が増加するのに伴い吸収端波長は短波長側にシフトしており、Ｇａ成分の注入によりバンドギャップが大きくなると考えられる。【０２２０】
以上よりＡｇＩｎＳｅ系化合物半導体にＧａを注入した場合、Ｇａの含有量に応じてピーク波長は短波長側にシフトするものの、超音波処理によって発光波長と半値幅ΔＨを維持しつつ発光効率を向上させることができることが分かった。
【実施例４】
【０２２１】
実施例１で作製した試料番号１２の試料について、in vivoイメージング技術を使用し、比較例試料と対比しつつ特性を評価した。【０２２２】
[比較例試料]
比較例試料としてインビトロジェン社製、Ｑdot800ＩＴＫカルボキシル量子ドット（以下、「Ｑdot800」という。）を使用した。【０２２３】
Ｑdot800は、ナノ粒子が、高毒性とされるＣｄを含むＣｄ、Ｓｅ及びＴｅを構成元素に有するコアと、ＺｎＳからなるシェルとで形成されたア−シェル構造を有し、ＺｎＳの表面がカルボキシレート基（−ＣＯＯ）を含有した高分子化合物で被覆されている。また、Ｑdot800は、平均粒径が約１５ｎｍであり、この比較例試料であるＱdot800を試料番号４１とした。【０２２４】
この試料番号４１の試料について、実施例１と同様の方法・手順で発光量子収率を測定したところ、５８％であった。尚、試料番号１２の発光量子収率は、実施例１に記載した通り４４％である。【０２２５】
また、試料番号４１について、実施例１と同様の方法・手順で発光スペクトルを測定した。【０２２６】
図２２は、試料番号４１の発光スペクトルを示すプロファイルであり、比較のために試料番号１２（図１４）の発光スペクトルを再掲している。図中、横軸が波長（ｎｍ）、縦軸が発光強度（ａ．ｕ．）である。【０２２７】
この図２２から明らかなように、試料番号４１の発光強度のピーク波長は約８００ｎｍであり、半値幅△Ｈは試料番号１２に比べると若干大きくなっているが、１００ｎｍ以下である。したがって試料番号４１も試料番号１２と同様、半値幅ΔＨは本発明範囲内であることが確認された。【０２２８】
［毒性評価］
表面修飾剤としてシグマーアルドリッチ社製のＲ８（オクタアルギニン）を使用し、試料番号１２及び試料番号４１とＲ８とのそれぞれの混合溶液をＡＳＣｓ培養液に添加し、ＡＳＣｓに対する毒性を評価した。【０２２９】
すなわち、まず、培養基材としてダルベッコ改変イーグル培地（Dulbeco’s Modified Eagle’s  Medium ; 以下、「ＤＭＥＭ」という。）及び栄養混合物Ｆ１２ハム（Nutrient mixture Hams’F12；以下、「Ｆ１２」という。）、サプリメントとしてウシ胎児血清（Fetal Bovine Serum；以下、「ＦＢＳ」という。）、抗生物質としてペニシリン−ストレプトマイシンをそれぞれ用意した。尚、これらＤＭＥＭ、Ｆ１２、ＦＢＳ、及びペニシリン−ストレプトマイシンは、いずれもサーモ・フィッシャー・サイエンティフィック社製のものを使用した。【０２３０】
そして、ＤＭＥＭとＦ１２をそれぞれ等量混合したものを基礎培地とし、この基礎培地に２０％ＦＢＳ及び１％ペニシリン−ストレプトマイシンを混合し、培養培地を作製した。【０２３１】
また、上記基礎培地に２％ＦＢＳ及び１％ペニシリン-ストレプトマイシンを混合し、ＡＳＣｓ維持培地（以下、単に「維持培地」という。）を作製した。【０２３２】
また、細胞培養用マイクロプレートとしてコーニング社製の９６ウェルプレート（縦×横：８×１２、１ウェル当たりの容量：３６０μＬ）を用意した。【０２３３】
そして、マウス脂肪組織から幹細胞を分離調製し、細胞数が１×１０４ cells / wellとなるように前記幹細胞を９６ウェルプレートに播種し、３７℃の温度下、ＣＯ２濃度が５％に調整されたインキュベーター内で２４時間培養し、これにより第１のＡＳＣｓ培養液を作製した。【０２３４】
次に、維持培地を使用し、試料番号１２又は試料番号４１の各試料のモル濃度がそれぞれ所定濃度となるようにＲ８と試料番号１２又は試料番号４１とを混合し、３０分間静置した。具体的には、試料番号１２のモル濃度が０〜５１２ｎｍｏｌ／Ｌとなるように維持培地で希釈し、ＡｇＩｎＳｅ溶液を作製した。次いで、試料番号１２の試料とＲ８との混合比率がモル比で試料番号１２：Ｒ８＝１：１００００となるように、Ｒ８を維持培地で希釈し、Ｒ８溶液を作製した。そして、このＡｇＩｎＳｅ溶液とＲ８溶液とを混合し、３０分間静置し、ＡｇＩｎＳｅ−Ｒ８混合溶液からなる試料番号１２ａの試料を作製した。【０２３５】
同様に、試料番号４１についてもモル濃度が０〜６４ｎｍｏｌ／Ｌとなるように維持培地で希釈し、Ｑdot800溶液を作製した。次いで、Ｑdot800とＲ８との混合比率がモル比でＱdot800：Ｒ８＝１：１００００となるように、Ｒ８を維持培地で希釈し、Ｒ８溶液を作製した。そして、このＱdot800溶液とＲ８溶液とを混合し、３０分間静置し、Ｑdot800−Ｒ８混合溶液からなる試料番号４１ａの試料を作製した。【０２３６】
次に、前記第１のＡＳＣｓ培養液を試料番号１２ａの試料に交換し、培養培地にて２４時間培養し、第２のＡＳＣｓ培養液を作製した。同様に前記第１のＡＳＣｓ培養液を試料番号４１ａに交換し、培養培地にて２４時間培養し、第３のＡＳＣｓ培養液を作製した。【０２３７】
そして、試料番号１２ａ及び試料番号４１ａの各試料について、生細胞数測定キット（同仁化学研究所社製、Cell Counting Kit-8）を使用し、無添加の細胞群の細胞生存率を１００％とした場合の細胞生存率を求めた。【０２３８】
図２３は試料番号１２ａの測定結果を示し、図２４は試料番号４１ａの測定結果を示している。図２３及び図２４中、横軸はモル濃度（ｎｍｏｌ/Ｌ）であり、縦軸は細胞生存率（％）である。【０２３９】
図２３及び図２４から明らかなように、試料番号４１ａでは、８０％以上の細胞生存率を得るためにはモル濃度を２３ｎｍｏｌ／Ｌ以下とする必要があるのに対し、試料番号１２ａではモル濃度が１６０ｎｍｏｌ／Ｌの場合であっても８０％以上の細胞生存率を得ることができた。すなわち、試料番号１２ａは試料番号４１ａに比べ約７倍の高濃度での添加が可能であることが分かった。これは、試料番号４１ａはナノ粒子が高毒性とされるＣｄを含有しているため、試料番号４１ａを細胞中に少量添加した場合であっても死滅する細胞が多いのに対し、試料番号１２ａはナノ粒子が低毒性のＡＩＳｅ系化合物半導体で形成されているため、モル濃度が試料番号４１ａに比べ相当程度に高い場合であっても細胞の死滅を効果的に抑制することができ、これにより滅細胞生存率を高く維持できたものと思われる。【０２４０】
尚、図２３及び図２４では、細胞生存率が１００％を超えている場合があり、また、図２３では９６ｎｍｏｌ／Ｌのモル濃度で細胞生存率が８０％を下回っているが、これは９６穴のウェルプレートの各ウェルにおける細胞増殖性のバラツキや細胞の疲弊度等の因子が影響しているものと思われる。しかしながら、図２３及び図２４のグラフの特性を全体的に見れば、細胞生存率について上述のように評価することができる。【０２４１】
[試料の蛍光強度]
細胞洗浄溶液として広く使用されているシグマーアルドリッチ社製のリン酸緩衝生理食塩水（Phosphate-Buffered Saline ; 以下、「ＰＢＳ」という。）を使用し、試料番号１２のモル濃度が１６０ｎｍｏｌ／Ｌとなるように希釈した。また、試料番号４１についても、ＰＢＳを使用し、モル濃度が２３ｎｍｏｌ／Ｌとなるように希釈した。    【０２４２】
そして、これら希釈された試料番号１２及び試料番号４１について、パーキンエルマー社製のＩＶＩＳスペクトラムＣＴを使用し、励起光：７１０ｎｍ、検出フィルターの波長：８００ｎｍの条件下、蛍光強度を測定した。【０２４３】
図２５は試料番号１２及び試料番号４１の各試料の蛍光強度を示しており、縦軸が蛍光強度（p/s）/（μW/cm２）である。各蛍光強度は、ＰＢＳ単体の蛍光強度を減算した値を示しており、発光源そのものの蛍光性を評価している。【０２４４】
すなわち、蛍光強度は、試料番号１２が９．０×１０10（p/s）/（μＷ/cm２）であり、試料番号４１は９．６×１０10（p/s）/（μＷ/cm２）であった。したがって、試料番号１２は試料番号４１の約９４％に相当する蛍光強度を有しており、本発明試料である試料番号１２は、比較例試料である試料番号４１（Ｑdot800）と同程度に十分な蛍光強度を有することが確認された。【０２４５】
次に、試料番号１２の試料をモル濃度が０ｎｍｏｌ／Ｌ、２０ｎｍｏｌ／Ｌ、４０ｎｍｏｌ／Ｌ、８０ｎｍｏｌ／Ｌ、及び１６０ｎｍｏｌ／ＬとなるようにＰＢＳで希釈し、斯かる希釈された各試料をマウス皮下の所定箇所に注入した。そして、上述と同様、励起光：７１０ｎｍ、検出フィルターの波長：８００ｎｍの条件下、ＩＶＩＳスペクトラムＣＴで蛍光強度を測定した。【０２４６】
図２６は試料番号１２の蛍光状態を示す顕微鏡写真である。図中、〇印は、各モル濃度の試料を添加した周辺領域を示している。原画はカラー画像であり、図２６はカラー画像をモノクロ画像に変換して表示している。原画では、蛍光強度の低い領域が青色表示され、蛍光強度の高い領域が黄色表示され、強度差が多色で表現されているが、モノクロ画像に変換された図２６では、蛍光強度の強度差が濃淡表示されている。尚、図中、「ｍｏｌ／Ｌ」を単に「Ｍ」と表記している。【０２４７】
この図２６から明らかなように、試料番号１２が無添加、すなわち、モル濃度が０ｎｍｏｌ／Ｌの場合は蛍光を発せず、モル濃度が２０ｎｍｏｌ／Ｌ及び４０ｎｍｏｌ／Ｌの場合は、添加領域全体の色調が濃く、蛍光強度が低いことを示している。これに対しモル濃度が８０ｎｍｏｌ／Ｌ及び１６０ｎｍｏｌ／Ｌの場合は、周辺部は色調が濃く蛍光強度が低いが、中心部は色調が淡く蛍光強度が高くなっていることが分かる。そしてこれにより細胞内に注入される試料のモル濃度と蛍光強度には正の相関関係があることが確認された。【０２４８】
[標識性の評価]
上述した培養培地を使用し、ＡＳＣｓを２５ｍＬのセルカルチャーフラスコ (コーニング社製)に１×１０５cellsを播種し、３７℃の温度下、ＣＯ２濃度が５％に調製されたインキュベーター内で２４時間培養し、第４のＡＳＣｓ培養液を作製した。その後、試料番号１２の試料のモル濃度が１５ｎｍｏｌ／Ｌとなるように維持培地で希釈し、ＡｇＩｎＳｅ溶液を作製した。また、Ｒ８のモル比が試料番号１２の１００００倍となるようにＲ８を維持培地で希釈し、Ｒ８溶液を作製した。次いで、このＡｇＩｎＳｅ溶液とＲ８溶液とを混合し、３０分間静置し、ＡｇＩｎＳｅ−Ｒ８混合溶液からなる試料番号１２ｂの試料を作製した。その後、前記第４のＡＳＣｓ培養液を、試料番号１２ｂの試料に交換して２４時間培養し、第５のＡＳＣｓ培養液を作製した。次に、トリプシン−ＥＤＴＡ溶液（シグマーアルドリッチ社製）を使用し、細胞から試料番号１２ｂを剥離し、回収した。次いで、５×１０４cellsをＰＢＳで希釈し、上述と同様、励起光：７１０ｎｍ、検出フィルターの波長：８００ｎｍの条件下、ＩＶＩＳスペクトラムＣＴで試料番号１２ｂ及びＰＢＳの蛍光強度を測定した。【０２４９】
図２７はその測定結果を示している。縦軸が蛍光強度（p/s）/（μＷ/cm２）であり、試料番号１２ｂからＰＢＳ単体の蛍光強度を減算した値を示している。【０２５０】
この図２７から明らかなように、試料番号１２ｂは、蛍光強度が１．４×１０７（p/s）/（μＷ/cm２）であり、ＡｇＩｎＳｅ系ナノ粒子の蛍光が確認されたことから、良好な標識性が得られていることが分かった。【０２５１】
［試料の元素濃度］
上述した培養培地を使用し、ＡＳＣｓを上記２５ｍＬのセルカルチャーフラスコに７×１０５cellsを播種し、上述と同様に培養し、第６のＡＳＣｓ培養液を作製した。次いで、試料番号１２のモル濃度が１０ｎｍｏｌ／Ｌとなるように維持培地で希釈し、ＡｇＩｎＳｅ溶液を作製した。また、モル比が試料番号１２の試料の１００００倍となるようにＲ８を維持培地で希釈し、Ｒ８溶液を作製した。次いで、このＡｇＩｎＳｅ溶液とＲ８溶液とを混合し、３０分間静置し、ＡｇＩｎＳｅ−Ｒ８混合溶液からなる試料番号１２ｃの試料を作製した。【０２５２】
その後、第６のＡＳＣｓ培養液を、試料番号１２ｃの試料に交換して２４時間培養した。次に上記トリプシン−ＥＤＴＡ溶液を使用し、細胞から試料番号１２ｃを剥離し、回収した。【０２５３】
また、ＡｇＩｎＳｅ溶液をＲ８溶液と混合しなかった以外は、上記試料番号１２ｃと同様の方法・手順で、Ｒ８で表面修飾されなかった試料番号１２ｄの試料を作製した。【０２５４】
さらに、ＡｇＩｎＳｅ−Ｒ８混合溶液を添加しなかった以外は上記試料番号１２ｃと同様の方法・手順で細胞のみからなる試料番号４２の試料を作製した。【０２５５】
次いで、試料番号１２ｃ、試料番号１２ｄ及び試料番号４２を水中に分散にさせ、ＩＣＰ−ＭＳ（Inductively Coupled Plasma−Mass Spectrometry；誘導結合プラズマ質量分析計）を使用し、元素濃度を測定した。【０２５６】
表３はその測定結果を示している。【０２５７】
【表３】
2020246297.tif 000007
【０２５８】
この表３から明らかなように、試料番号４２は、細胞のみであるためＡｇやＩｎは検出限界以下であった。一方、試料番号１２ｃ及び１２ｄはいずれもＡｇＩｎＳｅナノ粒子が添加されていることから、Ａｇ及びＩｎが検出されている。そして、Ｒ８で表面修飾された試料番号１２ｃはＲ８で表面修飾されていない試料番号１２ｄに比べてＡｇ及びＩｎの元素濃度が２．３〜２．６倍に向上している。したがって、ＡｇＩｎＳｅ系ナノ粒子の表面をＲ８で修飾することにより該ＡｇＩｎＳｅ系ナノ粒子が細胞内に効果的に導入できることが確認された。【０２５９】
尚、試料番号１２ｃ、１２ｄ及び４２の各試料は、いずれもＺｎが検出されているが、これは細胞構成成分として微量に含まれるＺｎ成分が検出されたものと思われる。
【産業上の利用可能性】
【０２６０】
発光量子収率が１０％以上、好ましくは３０％以上であって、６５０〜１０００ｎｍの近赤外領域で半値幅ΔＨが１００ｎｍ以下と小さく強く発光し、水中で分散する発光体を実現し、低毒性でバイオイメージングのバイオマーカーに適した生体物質標識剤を得る。
【符号の説明】
【０２６１】
２  水
３、３２  発光体
４  ナノ粒子
５  被膜
６  第１の有機分子膜
７  第２の有機分子膜
８  表面保護剤
９  アルキルチオール
１０  脂肪酸
１１  非極性溶媒
１６  脂肪酸水溶液
１７  水相
１８  非極性溶媒相
１９  相分離溶液
２０  超音波
３１  表面修飾剤
３４  細胞
【図１】
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【図２】
2020246297.tif 000009
【図３】
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【図４】
2020246297.tif 000011
【図５】
2020246297.tif 000012
【図６】
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【図７】
2020246297.tif 000014
【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
2020246297.tif 000019
【図１３】
2020246297.tif 000020
【図１４】
2020246297.tif 000021
【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【国際調査報告】
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