(57)【要約】本発明は、遺伝子発現を時間的及び空間的に正確に制御可能なように、光活性化が可能なＴｅｔ−ＯＦＦ／ＯＮシステムを提供する。本発明は、ＴｅｔＯ配列を含むＴＲＥと、前記ＴＲＥに制御されるプロモーターと、前記プロモーターに発現を制御される標的遺伝子と、を備える標的遺伝子発現カセットと、ＴｅｔＲ又はｒＴｅｔＲと第１のタンパク質とを含む第１の融合タンパク質をコードする遺伝子を備える第１融合タンパク質発現カセットと、ｐ６５ＡＤと第２のタンパク質とを含む第２の融合タンパク質をコードする遺伝子を備える第２融合タンパク質発現カセットと、を備え、前記第１のタンパク質と前記第２のタンパク質が、特定の波長が照射された状態でのみ互いに結合してヘテロ二量体を形成する、ＰＡ−Ｔｅｔ−ＯＦＦ／ＯＮシステム。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＴｅｔＯ配列を含むテトラサイクリン応答因子と、前記テトラサイクリン応答因子の下流に位置し、かつ前記テトラサイクリン応答因子に制御されるプロモーターと、前記プロモーターの下流に位置し、かつ前記プロモーターに発現を制御される標的遺伝子と、を備える標的遺伝子発現カセットと、
Ｔｅｔリプレッサータンパク質又はリバースＴｅｔリプレッサータンパク質と、第１のタンパク質とを含む第１の融合タンパク質をコードする遺伝子を備える第１融合タンパク質発現カセットと、
転写活性化因子ｐ６５の転写活性化ドメインと、第２のタンパク質とを含む第２の融合タンパク質をコードする遺伝子を備える第２融合タンパク質発現カセットと、
を備え、
前記第１のタンパク質と前記第２のタンパク質が、特定の波長が照射された状態でのみ互いに結合してヘテロ二量体を形成する、光活性化可能なテトラサイクリン遺伝子発現制御システム。
【請求項２】
前記Ｔｅｔリプレッサータンパク質又はリバースＴｅｔリプレッサータンパク質が、大腸菌の野生型Ｔｅｔリプレッサータンパク質の１９４番目のイソロイシンに相当するアミノ酸残基がトレオニン残基である、請求項１に記載の光活性化可能なテトラサイクリン遺伝子発現制御システム。
【請求項３】
前記第１の融合タンパク質において、Ｔｅｔリプレッサータンパク質又はリバースＴｅｔリプレッサータンパク質と、前記第１のタンパク質とが、ＳＰＫＫＫで表されるアミノ酸配列からなるペプチドリンカーにより連結されている、請求項１又は２に記載の光活性化可能なテトラサイクリン遺伝子発現制御システム。
【請求項４】
前記第１のタンパク質がＣＩＢ１又はその変異体であり、前記第２のタンパク質がＣｒｙ２又はその変異体である、又は、
前記第１のタンパク質がＣｒｙ２又はその変異体であり、前記第２のタンパク質がＣＩＢ１又はその変異体である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の光活性化可能なテトラサイクリン遺伝子発現制御システム。
【請求項５】
前記第１のタンパク質がＣＩＢ１又はその変異体であり、前記第２のタンパク質がＣｒｙ２又はその変異体である、請求項４に記載の光活性化可能なテトラサイクリン遺伝子発現制御システム。
【請求項６】
前記第１の融合タンパク質が、Ｔｅｔリプレッサータンパク質又はリバースＴｅｔリプレッサータンパク質のＣ末端側にＣＩＢ１又はその変異体が連結されている、請求項５に記載の光活性化可能なテトラサイクリン遺伝子発現制御システム。
【請求項７】
前記第１の融合タンパク質に含まれるＣＩＢ１又はその変異体が、シロイヌナズナの野生型ＣＩＢ１の１〜１７０番目のアミノ酸からなる領域に相当する部分タンパク質からなるＣＩＢ１のＣ末端欠損体、又は前記ＣＩＢ１のＣ末端欠損体中の核局在シグナルが欠損した変異体である、請求項５又は６に記載の光活性化可能なテトラサイクリン遺伝子発現制御システム。
【請求項８】
前記第１の融合タンパク質に含まれるＣＩＢ１又はその変異体が、シロイヌナズナの野生型ＣＩＢ１の１〜１７０番目のアミノ酸からなる領域に相当する部分タンパク質からなるＣＩＢ１のＣ末端欠損体の核局在シグナルが欠損した変異体であり、
前記第２の融合タンパク質が、Ｎ末端又はＣ末端に核局在シグナルを含む、請求項７に記載の光活性化可能なテトラサイクリン遺伝子発現制御システム。
【請求項９】
前記第２の融合タンパク質に含まれるＣｒｙ２又はその変異体が、Ｎ末端フォトポリアーゼ相同性領域を含むＣ末端欠損体、又は前記Ｃ末端欠損体のうち、シロイヌナズナの野生型Ｃｒｙ２の３４８番目のロイシンに相当するアミノ酸残基がフェニルアラニンに置換された変異体である、請求項５〜８のいずれか一項に記載の光活性化可能なテトラサイクリン遺伝子発現制御システム。
【請求項１０】
前記第１のタンパク質がＢｐｈｐ１又はその変異体であり、前記第２のタンパク質がＱ−ＰＡＳ１又はその変異体である、又は、
前記第１のタンパク質がＱ−ＰＡＳ１又はその変異体であり、前記第２のタンパク質がＢｐｈｐ１又はその変異体である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の光活性化可能なテトラサイクリン遺伝子発現制御システム。
【請求項１１】
前記第１のタンパク質がＢｐｈｐ１又はその変異体であり、前記第２のタンパク質がＱ−ＰＡＳ１又はその変異体である、請求項１０に記載の光活性化可能なテトラサイクリン遺伝子発現制御システム。
【請求項１２】
前記第２の融合タンパク質が、Ｎ末端に核局在シグナルを含み、かつ転写活性化因子ｐ６５の転写活性化ドメインのＣ末端側にＱ−ＰＡＳ１又はその変異体が連結されている、請求項１１に記載の光活性化可能なテトラサイクリン遺伝子発現制御システム。
【請求項１３】
前記第１の融合タンパク質が、Ｔｅｔリプレッサータンパク質又はリバースＴｅｔリプレッサータンパク質のＮ末端側に、Ｂｐｈｐ１又はその変異体が連結されており、
前記第２の融合タンパク質が、転写活性化因子ｐ６５の転写活性化ドメインのＣ末端側にＱ−ＰＡＳ１又はその変異体が連結されている、請求項１１又は１２に記載の光活性化可能なテトラサイクリン遺伝子発現制御システム。
【請求項１４】
前記標的遺伝子発現カセットと、
前記第１の融合タンパク質と前記第２の融合タンパク質がＴ２Ａ自己消化ペプチドで連結されたタンパク質の発現カセット、又は、前記第１の融合タンパク質と前記第２の融合タンパク質をバイシストロニック発現させる発現カセットと、
を備える、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の光活性化可能なテトラサイクリン遺伝子発現制御システム。
【請求項１５】
前記標的遺伝子が、ユビキチン修飾されたタンパク質をコードする遺伝子である、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の光活性化可能なテトラサイクリン遺伝子発現制御システム。
【請求項１６】
請求項１〜１５のいずれか一項に記載の光活性化可能なテトラサイクリン遺伝子発現制御システムを含む細胞。
【請求項１７】
請求項１６に記載の細胞に対して、青色光又は近赤外光の照射の有無、及びテトラサイクリン系化合物処理の有無を調整することにより、前記細胞における前記標的遺伝子の発現を制御する、標的遺伝子の発現制御方法。
【請求項１８】
ＴｅｔＯ配列を含むテトラサイクリン応答因子と、前記テトラサイクリン応答因子の下流に位置し、かつ前記テトラサイクリン応答因子に制御されるプロモーターと、前記プロモーターの下流に位置し、標的遺伝子を組み込むためのマルチクローニングサイトとを含む標的遺伝子発現用ベクターと、
Ｔｅｔリプレッサータンパク質又はリバースＴｅｔリプレッサータンパク質と、ＣＩＢ１又はその変異体とが連結された第１の融合タンパク質をコードする遺伝子を備える第１融合タンパク質発現カセットを含む第１の発現ベクターと、
転写活性化因子ｐ６５の転写活性化ドメインと、Ｃｒｙ２又はその変異体とが連結された第２の融合タンパク質をコードする遺伝子を備える第２融合タンパク質発現カセットを含む第２の発現ベクターと、
を含む、光活性化可能なテトラサイクリン遺伝子発現制御システム用キット。
【請求項１９】
ＴｅｔＯ配列を含むテトラサイクリン応答因子と、前記テトラサイクリン応答因子の下流に位置し、かつ前記テトラサイクリン応答因子に制御されるプロモーターと、前記プロモーターの下流に位置し、標的遺伝子を組み込むためのマルチクローニングサイトとを含む標的遺伝子発現用ベクターと、
Ｔｅｔリプレッサータンパク質又はリバースＴｅｔリプレッサータンパク質と、Ｂｐｈｐ１又はその変異体とが連結された第１の融合タンパク質をコードする遺伝子を備える第１融合タンパク質発現カセットを含む第１の発現ベクターと、
転写活性化因子ｐ６５の転写活性化ドメインと、Ｑ−ＰＡＳ１又はその変異体とが連結された第２の融合タンパク質をコードする遺伝子を備える第２融合タンパク質発現カセットを含む第２の発現ベクターと、
を含む、光活性化可能なテトラサイクリン遺伝子発現制御システム用キット。
【請求項２０】
前記第１の発現ベクターと前記第２の発現ベクターに代えて、
前記第１の融合タンパク質と前記第２の融合タンパク質がＴ２Ａ自己消化ペプチドで連結されたタンパク質の発現カセット、又は、前記第１の融合タンパク質と前記第２の融合タンパク質をバイシストロニック発現させる発現カセットを含む発現ベクターを含む、請求項１８又は１９に記載の光活性化可能なテトラサイクリン遺伝子発現制御システム用キット。
【請求項２１】
前記Ｔｅｔリプレッサータンパク質又はリバースＴｅｔリプレッサータンパク質が、大腸菌の野生型Ｔｅｔリプレッサータンパク質の１９４番目のイソロイシンに相当するアミノ酸残基がトレオニン残基である、請求項１８〜２０のいずれか一項に記載の光活性化可能なテトラサイクリン遺伝子発現制御システム用キット。
【請求項２２】
Ｔｅｔリプレッサータンパク質又はリバースＴｅｔリプレッサータンパク質と、ＣＩＢ１又はその変異体とが連結された融合タンパク質を発現させるための発現カセットを含む、発現ベクター。
【請求項２３】
転写活性化因子ｐ６５の転写活性化ドメインと、Ｃｒｙ２又はその変異体とが連結された融合タンパク質を発現させるための発現カセットを含む、発現ベクター。
【請求項２４】
Ｔｅｔリプレッサータンパク質又はリバースＴｅｔリプレッサータンパク質と、Ｂｐｈｐ１又はその変異体とが連結された融合タンパク質を発現させるための発現カセットを含む、発現ベクター。
【請求項２５】
転写活性化因子ｐ６５の転写活性化ドメインと、Ｑ−ＰＡＳ１又はその変異体とが連結された融合タンパク質を発現させるための発現カセットを含む、発現ベクター。
【請求項２６】
Ｔｅｔリプレッサータンパク質若しくはリバースＴｅｔリプレッサータンパク質とＣＩＢ１若しくはその変異体とが連結された融合タンパク質と、転写活性化因子ｐ６５の転写活性化ドメインとＣｒｙ２若しくはその変異体とが連結された融合タンパク質とが、Ｔ２Ａ自己消化ペプチドで連結されたタンパク質の発現カセット、又は、
Ｔｅｔリプレッサータンパク質若しくはリバースＴｅｔリプレッサータンパク質とＣＩＢ１若しくはその変異体とが連結された融合タンパク質と、転写活性化因子ｐ６５の転写活性化ドメインとＣｒｙ２若しくはその変異体とが連結された融合タンパク質とを、バイシストロニック発現させる発現カセット
を含む、発現ベクター。
【請求項２７】
Ｔｅｔリプレッサータンパク質若しくはリバースＴｅｔリプレッサータンパク質とＢｐｈｐ１若しくはその変異体とが連結された融合タンパク質と、転写活性化因子ｐ６５の転写活性化ドメインとＱ−ＰＡＳ１若しくはその変異体とが連結された融合タンパク質とが、Ｔ２Ａ自己消化ペプチドで連結されたタンパク質の発現カセット、又は、
Ｔｅｔリプレッサータンパク質若しくはリバースＴｅｔリプレッサータンパク質とＢｐｈｐ１若しくはその変異体とが連結された融合タンパク質と、転写活性化因子ｐ６５の転写活性化ドメインとＱ−ＰＡＳ１若しくはその変異体とが連結された融合タンパク質とを、バイシストロニック発現させる発現カセット
を含む、発現ベクター。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、標的遺伝子の発現を、光照射とテトラサイクリン（Ｔｅｔ）系化合物の両方で遺伝子発現の制御が可能なテトラサイクリン遺伝子発現制御システムに関する。
本願は、２０１８年８月３１日に、日本に出願された特願２０１８−１６３６１７号に基づき優先権を主張し、その内容をここに援用する。
【背景技術】
【０００２】
Ｔｅｔ−ＯＦＦ／ＯＮシステムは、Ｔｅｔオペレーター（ＴｅｔＯ）配列を含むＴｅｔ応答因子（ＴＲＥ）とＴｅｔリプレッサー（ＴｅｔＲ）との相互作用を利用しており、Ｔｅｔやより安定なＴｅｔアナログであるドキシサイクリン（Ｄｏｘ）で処理することによって、標的細胞内において外因性遺伝子の発現を調節する（例えば、非特許文献１参照。）。Ｔｅｔ−ＯＦＦシステムは、Ｄｏｘの非存在下で、ＴｅｔＲと転写活性化ドメインの融合タンパク質がＴＲＥに結合し、下流の遺伝子発現を制御する最小プロモーターを活性化する。Ｔｅｔ−ＯＮシステムは、Ｄｏｘの存在下で、リバースＴｅｔＲ（ｒＴｅｔＲ）と転写活性化ドメインの融合タンパク質がＴＲＥに結合し、下流の遺伝子発現を制御する最小プロモーターを活性化する。Ｔｅｔ−ＯＦＦ／ＯＮシステムは、哺乳動物細胞において最も一般的に使用される化学的に制御されたシステムであるが、発現制御を小分子であるＤｏｘによって行うため、標的遺伝子の発現を、限られた時間枠や、限定された空間内の細胞においてのみ行うことは困難であった。例えば、個体発生や組織の恒常性維持における幹細胞の維持・増殖・細胞分化の際には、幹細胞又は前駆細胞における動的な遺伝子発現が重要な役割を担うことが知られている。また、これらの現象は、概日リズム又は超日リズムを刻む時計遺伝子の機能と密接な相関があることが知られている。しかしながら、Ｔｅｔ−ＯＦＦ／ＯＮシステムは、これらの研究への適応に要求される時間分解能・空間分解能のよい操作を行うことが不可能なため、上記のような目的遺伝子の迅速な活性化又は非活性化を必要とする研究・実験には適さない。【０００３】
従来の化学的に制御された遺伝子発現システムの技術的限界を克服し、時間的・空間的制御が可能な遺伝子発現システムとして、光照射によって遺伝子発現の制御（ＯＮ／ＯＦＦ）が可能な、すなわち光活性化可能な（photoactivatable、ＰＡ）発現システムが開発された。遺伝子の発現制御を光で行うことにより、光照射する領域や照射強度を調整するだけで、特定の空間内の細胞のみに、限られた時間枠において、標的遺伝子の発現を誘導することが簡便に行うことができる。例えば、光活性化転写因子がＧＡＶＰＯであるＰＡ−Ｇａｌ４／ＵＡＳシステム（Ｌｉｇｈｔ−ＯＮシステム）を用いて、塩基性ヘリックスループ・ヘリックス（ｂＨＬＨ）転写の動的な遺伝子発現変化の機能的重要性を分析したことが報告されている（非特許文献２及び非特許文献３）。ＧＡＶＰＯは活性化及び非活性化の反応速度が迅速なため、光照射パターンを変化させることにより、神経幹細胞においてＡｓｃｌ１の遺伝子発現を様々な動態（例えば、持続的に又は振動性に）で人工的に誘導することができた。【０００４】
光依存的に相互作用するタンパク質モジュールとして、シロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）由来の青色光応答性ヘテロ二量体形成モジュールが挙げられる。当該モジュールは、Ｃｒｙ２（Cryptochrome 2）光受容体及びその特異的結合タンパク質であるＣＩＢ１（cryptochrome-interacting basic helix-loop-helix 1）からなる（例えば、非特許文献４〜８）。シロイヌナズナＣｒｙ２は、概日リズム調節を介して植物の発育及び成長を調節するフォトリアーゼ様光受容体である。Ｃｒｙ２は、Ｎ末端フォトポリアーゼ相同性領域（ＰＨＲ）及びＣｒｙｐｔｏｃｈｒｏｍｅ Ｃ末端伸長（ＣＣＥ又はＣＣＴ）の２つのドメインを有する。ＰＨＲは、発色団フラビンアデニンジヌクレオチド（ＦＡＤ）に非共有結合する発色団結合ドメインである。Ｃｒｙ２は、青色光特異的にｂＨＬＨ転写因子ＣＩＢ１に結合することができる。Ｃｒｙ２及びＣＩＢ１必須ドメインのトランケート型は、青色光依存性ヘテロ二量体形成モジュールとして作用する。また、Ｃｒｙ２のいくつかの点変異は、より速い又は遅い光サイクルを誘導することが示されている（非特許文献９、非特許文献１０、非特許文献１１）。【０００５】
また、近赤外光応答性ヘテロ二量体形成モジュールとして、光合成細菌ロドシュードモナス・パルストリス（Rhodopseudomonaspalustris）由来のフィトクロームであるＢｐｈＰ１及びその特異的結合タンパク質であるＰｐｓＲ２からなるタンパク質モジュールが挙げられる（例えば、非特許文献２７）。ＢｐｈＰ１及びＰｐｓＲ２に対して７４０〜７８０ｎｍの近赤外光を照射すると、両者は結合してヘテロ二量体を形成する。このヘテロ二量体は、哺乳類をはじめとする真核生物の内在性発色団であるＢｉｌｉｖｅｒｄｉｎ（ＢＶ）を使用して近赤外光を吸収することにより形成される。また、ＰｐｓＲ２は多数のドメインを持つ比較的大きなタンパク質である。そこで、ＢｐｈＰ１／ＰｐｓＲ２システムを改良して、Ｎ末端側とＣ末端側を欠損させ、Ｑ−ｌｉｎｋｅｒとその下流のＰＡＳ１ドメインのみからなるＰｐｓＲ２欠損変異体（Ｑ−ＰＡＳ１）を用いたＢｐｈＰ１／Ｑ−ＰＡＳ１システムが開発された（例えば、非特許文献２８〜２９）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Das et al.，Current gene therapy，2016，vol.16，p.156-167.
【非特許文献２】Imayoshi et al.，Science，2013，vol.342，p.1203-1208.
【非特許文献３】Imayoshi and Kageyama，Neuron，2014，vol.82，p.9-23.
【非特許文献４】Duan et al.，Nature Communications，2017，vol.8，Article number: 547.
【非特許文献５】Jeong et al.，Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America，2010，vol.107(30)，p.13538-13543.
【非特許文献６】Keller et al.，The Plant Journal，2011，vol.67(2)，p.195-207.
【非特許文献７】Wu and Yang，Molecular plant，2010，vol.3(3), p.539-548.
【非特許文献８】Yu et al.，The Arabidopsis Book，2010，vol.8，Article number: e0135.
【非特許文献９】Kennedy et al.，Nature Methods，2010，vol.7(12)，p.973-975.
【非特許文献１０】Liu et al.，Nature，2012，vol.484，p.381-385.
【非特許文献１１】Taslimi et al.，Nature chemical biology，2016，vol.12，p.425-430.
【非特許文献１２】Szulc et al.，Nature Methods，2006，vol.3(2)，p.109-116.
【非特許文献１３】Wang et al.，Nature Methods，2012，vol.9(3)，p.266-269.
【非特許文献１４】Hallett et al.，ACS Synthetic Biology，2016，vol.5，p.53-64.
【非特許文献１５】Mizushima and Nagata，Nucleic Acids Research，1990，vol.18(17)，p.5322.
【非特許文献１６】Masamizu et al.，Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America，2006，vol.103(5)，p.1313-1318.
【非特許文献１７】Miyoshi，’Chapter 28 Gene Delivery to Hematopoietic Stem Cells Using Lentiviral Vectors’, Methods in Molecular Biology，2004，vol.246（“Gene Delivery to Mammalian Cells  Volume 2: Viral Gene Transfer Techniques”），p.429-438.
【非特許文献１８】Kawashima et al，Nature Methods，2013，vol.10(9)，p.889-895.
【非特許文献１９】Pedelacq et al.，Nature Biotechnology，2006，vol.24(1)，p.79-88.
【非特許文献２０】Nonaka et al.，Neuron，2014，vol.84，p.92-106.
【非特許文献２１】Okuno et al.，Cell，2012，vol.149，p.886-898.
【非特許文献２２】Isomura et al.，Genes & Development，2017，vol.31，p.524-535.
【非特許文献２３】Hand et al.，Neuron，2005，vol.48，p.45-62.
【非特許文献２４】Peters et al.，Nature，2014，vol.510，p.263-267.
【非特許文献２５】Pathak et al.，ACS Synthetic Biology，2014，vol.3，p.832-838.
【非特許文献２６】Sano and Yokoi, Journal of Neuroscience, 2007, vol.27(26), p.6948-6955.
【非特許文献２７】Kaberniuk et al.，NATURE METHODS, 2016, vol.13, p.591-597.
【非特許文献２８】Redchuk, et al., Nature Chemical Biology, 2017, vol.13, p.633-639.
【非特許文献２９】Redchuk, et al., Nature Protocols, 2018, vol.13(5), p.1121-1136.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
遺伝子発現を時間的及び空間的に正確に制御可能なように、光活性化が可能なＴｅｔ−ＯＦＦ／ＯＮシステムを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、鋭意研究した結果、Ｔｅｔ−ＯＦＦ／ＯＮシステムに、Ｃｒｙ２／ＣＩＢ１からなる光活性化可能な結合スイッチ（以下、「Ｃｒｙ２／ＣＩＢ１−ＰＡ結合スイッチ」と称することがある。）又はＢｐｈＰ１／Ｑ−ＰＡＳ１からなる光活性化可能な結合スイッチ（以下、「ＢｐｈＰ１／Ｑ−ＰＡＳ１−ＰＡ結合スイッチ」と称することがある。）を組み込むことにより、光照射とＴｅｔ系化合物の両方によって標的遺伝子の発現を制御可能なシステム（以下、「ＰＡ−Ｔｅｔ−ＯＦＦ／ＯＮシステム」ということがある。）が得られることを見出し、本発明を完成させた。【０００９】
すなわち、本発明に係るＰＡ−Ｔｅｔ−ＯＦＦ／ＯＮシステム等は、下記［１］〜［２７］である。
［１］  ＴｅｔＯ配列を含むテトラサイクリン応答因子と、前記テトラサイクリン応答因子の下流に位置し、かつ前記テトラサイクリン応答因子に制御されるプロモーターと、前記プロモーターの下流に位置し、かつ前記プロモーターに発現を制御される標的遺伝子と、を備える標的遺伝子発現カセットと、
Ｔｅｔリプレッサータンパク質又はリバースＴｅｔリプレッサータンパク質と、第１のタンパク質とを含む第１の融合タンパク質をコードする遺伝子を備える第１融合タンパク質発現カセットと、
転写活性化因子ｐ６５の転写活性化ドメインと、第２のタンパク質とを含む第２の融合タンパク質をコードする遺伝子を備える第２融合タンパク質発現カセットと、
を備え、
前記第１のタンパク質と前記第２のタンパク質が、特定の波長が照射された状態でのみ互いに結合してヘテロ二量体を形成する、光活性化可能なテトラサイクリン遺伝子発現制御システム。
［２］  前記ＴｅｔＲ又はｒＴｅｔＲが、大腸菌の野生型ＴｅｔＲの１９４番目のイソロイシンに相当するアミノ酸残基がトレオニン残基である、前記［１］のＰＡ−Ｔｅｔ−ＯＦＦ／ＯＮシステム。
［３］  前記Ｔｅｔリプレッサータンパク質又はリバースＴｅｔリプレッサータンパク質が、大腸菌の野生型Ｔｅｔリプレッサータンパク質の１９４番目のイソロイシンに相当するアミノ酸残基がトレオニン残基である、前記［１］又は［２］の光活性化可能なテトラサイクリン遺伝子発現制御システム。
［４］  前記第１のタンパク質がＣＩＢ１又はその変異体であり、前記第２のタンパク質がＣｒｙ２又はその変異体である、又は、
前記第１のタンパク質がＣｒｙ２又はその変異体であり、前記第２のタンパク質がＣＩＢ１又はその変異体である、前記［１］〜［３］のいずれかの光活性化可能なテトラサイクリン遺伝子発現制御システム。
［５］  前記第１のタンパク質がＣＩＢ１又はその変異体であり、前記第２のタンパク質がＣｒｙ２又はその変異体である、前記［４］のＰＡ−Ｔｅｔ−ＯＦＦ／ＯＮシステム。
［６］  前記第１の融合タンパク質が、Ｔｅｔリプレッサータンパク質又はリバースＴｅｔリプレッサータンパク質のＣ末端側にＣＩＢ１又はその変異体が連結されている、前記［５］のＰＡ−Ｔｅｔ−ＯＦＦ／ＯＮシステム。
［７］  前記第１の融合タンパク質に含まれるＣＩＢ１又はその変異体が、シロイヌナズナの野生型ＣＩＢ１の１〜１７０番目のアミノ酸からなる領域に相当する部分タンパク質からなるＣＩＢ１のＣ末端欠損体、又は前記ＣＩＢ１のＣ末端欠損体中の核局在シグナルが欠損した変異体である、前記［５］又は［６］のＰＡ−Ｔｅｔ−ＯＦＦ／ＯＮシステム。
［８］  前記第１の融合タンパク質に含まれるＣＩＢ１又はその変異体が、シロイヌナズナの野生型ＣＩＢ１の１〜１７０番目のアミノ酸からなる領域に相当する部分タンパク質からなるＣＩＢ１のＣ末端欠損体の核局在シグナルが欠損した変異体であり、
前記第２の融合タンパク質が、Ｎ末端又はＣ末端に核局在シグナルを含む、前記［７］の光活性化可能なテトラサイクリン遺伝子発現制御システム。
［９］  前記第２の融合タンパク質に含まれるＣｒｙ２又はその変異体が、Ｎ末端フォトポリアーゼ相同性領域を含むＣ末端欠損体、又は前記Ｃ末端欠損体のうち、シロイヌナズナの野生型Ｃｒｙ２の３４８番目のロイシンに相当するアミノ酸残基がフェニルアラニンに置換された変異体である、前記［５］〜［８］のいずれかのＰＡ−Ｔｅｔ−ＯＦＦ／ＯＮシステム。
［１０］  前記第１のタンパク質がＢｐｈｐ１又はその変異体であり、前記第２のタンパク質がＱ−ＰＡＳ１又はその変異体である、又は、
前記第１のタンパク質がＱ−ＰＡＳ１又はその変異体であり、前記第２のタンパク質がＢｐｈｐ１又はその変異体である、前記［１］〜［３］のいずれかの光活性化可能なテトラサイクリン遺伝子発現制御システム。
［１１］  前記第１のタンパク質がＢｐｈｐ１又はその変異体であり、前記第２のタンパク質がＱ−ＰＡＳ１又はその変異体である、前記［１０］の光活性化可能なテトラサイクリン遺伝子発現制御システム。
［１２］  前記第２の融合タンパク質が、Ｎ末端に核局在シグナルを含み、かつ転写活性化因子ｐ６５の転写活性化ドメインのＣ末端側にＱ−ＰＡＳ１又はその変異体が連結されている、前記［１１］の光活性化可能なテトラサイクリン遺伝子発現制御システム。
［１３］  前記第１の融合タンパク質が、Ｔｅｔリプレッサータンパク質又はリバースＴｅｔリプレッサータンパク質のＮ末端側に、Ｂｐｈｐ１又はその変異体が連結されており、
前記第２の融合タンパク質が、転写活性化因子ｐ６５の転写活性化ドメインのＣ末端側にＱ−ＰＡＳ１又はその変異体が連結されている、前記［１１］又は［１２］の光活性化可能なテトラサイクリン遺伝子発現制御システム。
［１４］  前記標的遺伝子発現カセットと、
前記第１の融合タンパク質と前記第２の融合タンパク質がＴ２Ａ自己消化ペプチドで連結されたタンパク質の発現カセット、又は、前記第１の融合タンパク質と前記第２の融合タンパク質をバイシストロニック発現させる発現カセットと、
を備える、前記［１］〜［１３］のいずれかのＰＡ−Ｔｅｔ−ＯＦＦ／ＯＮシステム。
［１５］  前記標的遺伝子が、ユビキチン修飾されたタンパク質をコードする遺伝子である、前記［１］〜［１４］のいずれかのＰＡ−Ｔｅｔ−ＯＦＦ／ＯＮシステム。
［１６］  前記［１］〜［１５］のいずれかのＰＡ−Ｔｅｔ−ＯＦＦ／ＯＮシステムを含む細胞。
［１７］  前記［１６］の細胞に対して、青色光又は近赤外光の照射の有無、及びＴｅｔ系化合物処理の有無を調整することにより、前記細胞における前記標的遺伝子の発現を制御する、標的遺伝子の発現制御方法。
［１８］  ＴｅｔＯ配列を含むＴＲＥと、前記ＴＲＥの下流に位置し、かつ前記ＴＲＥに制御される最小プロモーターと、前記最小プロモーターの下流に位置し、標的遺伝子を組み込むためのマルチクローニングサイトとを含む標的遺伝子発現用ベクターと、
ＴｅｔＲ又はｒＴｅｔＲと、ＣＩＢ１又はその変異体とが連結された第１の融合タンパク質をコードする遺伝子を備える第１融合タンパク質発現カセットを含む第１の発現ベクターと、
転写活性化因子ｐ６５の転写活性化ドメインと、Ｃｒｙ２又はその変異体とが連結された第２の融合タンパク質をコードする遺伝子を備える第２融合タンパク質発現カセットを含む第２の発現ベクターと、
を含む、ＰＡ−Ｔｅｔ−ＯＦＦ／ＯＮシステム用キット。
［１９］  ＴｅｔＯ配列を含むテトラサイクリン応答因子と、前記テトラサイクリン応答因子の下流に位置し、かつ前記テトラサイクリン応答因子に制御されるプロモーターと、前記プロモーターの下流に位置し、標的遺伝子を組み込むためのマルチクローニングサイトとを含む標的遺伝子発現用ベクターと、
Ｔｅｔリプレッサータンパク質又はリバースＴｅｔリプレッサータンパク質と、Ｂｐｈｐ１又はその変異体とが連結された第１の融合タンパク質をコードする遺伝子を備える第１融合タンパク質発現カセットを含む第１の発現ベクターと、
転写活性化因子ｐ６５の転写活性化ドメインと、Ｑ−ＰＡＳ１又はその変異体とが連結された第２の融合タンパク質をコードする遺伝子を備える第２融合タンパク質発現カセットを含む第２の発現ベクターと、
を含む、光活性化可能なテトラサイクリン遺伝子発現制御システム用キット。
［２０］  前記第１の発現ベクターと前記第２の発現ベクターに代えて、
前記第１の融合タンパク質と前記第２の融合タンパク質がＴ２Ａ自己消化ペプチドで連結されたタンパク質の発現カセット、又は、前記第１の融合タンパク質及び前記第２の融合タンパク質をバイシストロニック発現させる発現カセットを含む発現ベクターを含む、前記［１８］又は［１９］のＰＡ−Ｔｅｔ−ＯＦＦ／ＯＮシステム用キット。
［２１］  前記ＴｅｔＲ又はｒＴｅｔＲが、大腸菌の野生型ＴｅｔＲの１９４番目のイソロイシンに相当するアミノ酸残基がトレオニン残基である、前記［１８］〜［２０］のＰＡ−Ｔｅｔ−ＯＦＦ／ＯＮシステム用キット。
［２２］  ＴｅｔＲ又はｒＴｅｔＲと、ＣＩＢ１又はその変異体とが連結された融合タンパク質を発現させるための発現カセットを含む、発現ベクター。
［２３］  転写活性化因子ｐ６５の転写活性化ドメインと、Ｃｒｙ２又はその変異体とが連結された融合タンパク質を発現させるための発現カセットを含む、発現ベクター。
［２４］  Ｔｅｔリプレッサータンパク質又はリバースＴｅｔリプレッサータンパク質と、Ｂｐｈｐ１又はその変異体とが連結された融合タンパク質を発現させるための発現カセットを含む、発現ベクター。
［２５］  転写活性化因子ｐ６５の転写活性化ドメインと、Ｑ−ＰＡＳ１又はその変異体とが連結された融合タンパク質を発現させるための発現カセットを含む、発現ベクター。
［２６］  Ｔｅｔリプレッサータンパク質若しくはリバースＴｅｔリプレッサータンパク質とＣＩＢ１若しくはその変異体とが連結された融合タンパク質と、転写活性化因子ｐ６５の転写活性化ドメインとＣｒｙ２若しくはその変異体とが連結された融合タンパク質とが、Ｔ２Ａ自己消化ペプチドで連結されたタンパク質の発現カセット、又は、
Ｔｅｔリプレッサータンパク質若しくはリバースＴｅｔリプレッサータンパク質とＣＩＢ１若しくはその変異体とが連結された融合タンパク質と、転写活性化因子ｐ６５の転写活性化ドメインとＣｒｙ２若しくはその変異体とが連結された融合タンパク質とを、バイシストロニック発現させる発現カセット
を含む、発現ベクター。
［２７］  Ｔｅｔリプレッサータンパク質若しくはリバースＴｅｔリプレッサータンパク質とＢｐｈｐ１若しくはその変異体とが連結された融合タンパク質と、転写活性化因子ｐ６５の転写活性化ドメインとＱ−ＰＡＳ１若しくはその変異体とが連結された融合タンパク質とが、Ｔ２Ａ自己消化ペプチドで連結されたタンパク質の発現カセット、又は、
Ｔｅｔリプレッサータンパク質若しくはリバースＴｅｔリプレッサータンパク質とＢｐｈｐ１若しくはその変異体とが連結された融合タンパク質と、転写活性化因子ｐ６５の転写活性化ドメインとＱ−ＰＡＳ１若しくはその変異体とが連結された融合タンパク質とを、バイシストロニック発現させる発現カセット
を含む、発現ベクター。
【発明の効果】
【００１０】
本発明に係るＰＡ−Ｔｅｔ−ＯＦＦ／ＯＮシステムは、従来のＴｅｔ−ＯＦＦ／ＯＮシステムとＣｒｙ２／ＣＩＢ１−ＰＡ結合スイッチ又はＢｐｈＰ１／Ｑ−ＰＡＳ１−ＰＡ結合スイッチが組み込あわされており、標的遺伝子の発現を、従来のＴｅｔ系化合物処理のみならず、青色光又は近赤外光の照射処理によっても制御できる。このため、当該システムは、遺伝子発現を時間的及び空間的に正確に制御することができ、空間的な発現制御や迅速な活性制御が要求される各種生物実験のツールとして有用である。
また、本発明に係るＰＡ−Ｔｅｔ−ＯＦＦ／ＯＮシステム用キットや発現ベクターを用いることにより、より簡便に、前記システムを実施して標的遺伝子の発現を制御することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】実施例１において使用したＰＡ−Ｔｅｔ−ＯＦＦ候補コンストラクトを模式的に示した図である。
【図２】（Ａ）は、実施例１においてＰＡ−Ｔｅｔ−ＯＦＦコンストラクトであることが確認されたＴ８６コンストラクトを含む発現カセットの模式図を示し、（Ｂ）は、実施例１で使用したｐＴＲＥｔｉｇｈｔ−Ｕｂ−ＥＬｕｃレポーターのＵｂ−Ｅｌｕｃ発現カセットの模式図を示し、（Ｃ）は、ＴｅｔＲ（Ｉ１９４Ｔ、１−２０６）−ＣＩＢ１（−ＮＬＳ）融合コンストラクトとＣｒｙ２  ＰＨＲ（Ｌ３４８Ｆ）−ｐ６５ＡＤ−ＮＬＳ×２融合コンストラクトを、Ｔ２Ａ自己切断ペプチドで連結したタンパク質［ＴｅｔＲ（Ｉ１９４Ｔ、１−２０６）−ＣＩＢ１（−ＮＬＳ）−Ｔ２Ａ−Ｃｒｙ２  ＰＨＲ（Ｌ３４８Ｆ）−ｐ６５ＡＤ−ＮＬＳ×２融合コンストラクト］の発現カセットの模式図を示す。
【図３】実施例２において、Ｔ８６コンストラクトを用いて、ＴｅｔＲとＣＩＢ１誘導体のリンカー配列のＰＡ−Ｔｅｔ制御発現効率に対する影響を調べた結果を示した図である。
【図４】実施例２において、Ｔ８６コンストラクトを用いて、ＴｅｔＲのＩ１９４のアミノ酸置換のＰＡ−Ｔｅｔ制御発現効率に対する影響を調べた結果を示した図である。
【図５】実施例３において、Ｔ８６コンストラクト中のＴｅｔＲ（Ｉ１９４Ｔ、１−２０６）に変異を導入して得たＴｅｔ非依存性コンストラクト及びＰＡ−Ｔｅｔ−ＯＮコンストラクトについて、暗条件下及び青色光照射時にＤｏｘ投与又は非投与の条件下でルシフェラーゼアッセイを行って定量された発光シグナル強度の測定結果を示した図である。
【図６】実施例３において、Ｔ８６コンストラクトに変異を導入して得たＰＡ−Ｔｅｔ−ＯＦＦ−Ｔ２Ａコンストラクト及びＰＡ−Ｔｅｔ−ＯＮ−Ｔ２Ａコンストラクト、並びに従来のＴｅｔ−ＯＦＦ／ＯＮシステムのコンストラクト（ｔＴＡ−Ａｄコンストラクト及びＴｅｔ−ＯＮ  ３Ｇコンストラクト）について、暗条件下及び青色光照射時にＤｏｘ投与又は非投与の条件下でルシフェラーゼアッセイを行って定量された発光シグナル強度の測定結果を示した図である。
【図７】実施例３において、トランジェントにトランスフェクトされたＨＥＫ２９３Ｔ細胞における、ＰＡ−Ｔｅｔ−ＯＦＦシステム（Ａ）及びＰＡ−Ｔｅｔ−ＯＮシステム（Ｂ）のＤｏｘ濃度依存性転写活性を調べた図である。
【図８】実施例４において、ＰＡ−Ｔｅｔ−ＯＦＦ／ＯＮシステムの安定発現株の作製に使用したＰＡ−Ｔｅｔ−ＯＦＦコンストラクト／ＰＡ−Ｔｅｔ−ＯＮコンストラクトの発現カセット（Ａ）及びＴＲＥ３Ｇ−Ｕｂ−ＮＬＳ−ｌｕｃ２−Ｈｅｓ１ ３’ＵＴＲレンチウイルスベクター中のＵｂ−ＮＬＳ−ｌｕｃ２発現カセット（Ｂ）の模式図を示す。
【図９】実施例４において、レンチウイルスベクターで安定的に形質導入されたＥｐｈ４細胞におけるＰＡ−Ｔｅｔ−ＯＦＦシステムの青色光強度依存性転写活性を調べた図である。
【図１０】実施例４において、レンチウイルスベクターで安定的に形質導入されたＥｐｈ４細胞におけるＰＡ−Ｔｅｔ−ＯＮシステムの、青色光強度依存性及びＤｏｘ濃度依存性を調べた図である。（Ａ）は青色光強度ごとにまとめて示した図であり、（Ｂ）はＤｏｘ濃度ごとにまとめて示した図であり、（Ｃ）は、Ｙ軸方向に青色光強度、Ｘ軸方向にＤｏｘ濃度、Ｚ軸方向に転写活性（発光シグナル強度）をとったマトリクスである。
【図１１】実施例４において、ＰＡ−Ｔｅｔ−ＯＮシステム安定株に対して、６日間、１日１回青色光を照射し、かつ１、３、５日目にのみ、Ｄｏｘ（１，０００ｎｇ／ｍＬ）を培地に添加した実験における、青色光の露光のタイミング（矢頭）とＤｏｘの培地添加のタイミング（上段）、及びＰＡ−Ｔｅｔ−ＯＮシステム安定株の転写活性（発光シグナル強度）の測定結果（下段）を示した図である。
【図１２】実施例５において、ＰＡ−Ｔｅｔ−ＯＦＦ安定株（Ｕｂ−ＮＬＳ−ｌｕｃ２レポーター）（Ａ）及びＰＡ−Ｔｅｔ−ＯＦＦ安定株（ｌｕｃ２レポーター）（Ｂ）に、青色光パルスを照射し、発光シグナル強度をリアルタイムでモニターした結果を示した図である。
【図１３】実施例５において、各ＰＡ−Ｔｅｔ−ＯＦＦ／ＯＮシステム安定株について、ＰＡ−Ｔｅｔ−ＯＦＦ／ＯＮシステムにおけるＰＡ−Ｔｅｔ制御遺伝子発現のスイッチオン反応速度の半減期（Ａ）及びスイッチオフ反応速度の半減期（Ｂ）の結果を示した図である。
【図１４】実施例５において、ＰＡ−Ｔｅｔ−ＯＦＦ安定株（Ｕｂ−ＮＬＳ−ｌｕｃ２レポーター）に対して、３時間間隔（Ａ）、６時間間隔（Ｂ）、１２時間間隔（Ｃ）、及び２４時間間隔（Ｄ）で青色光パルスに繰り返し暴露し、発光シグナル強度をリアルタイムでモニターした結果を示した図である。
【図１５】実施例６において、ＰＡ−Ｔｅｔ−ＯＦＦ安定株（Ｕｂ−ＮＬＳ−ｌｕｃ２レポーター）に照射したパターン化した青色光の、照射領域と照射タイミングを示した図である。
【図１６】実施例６において、青色光パルスを照射した１０個の標的細胞のｍＣｈｅｒｒｙ蛍光画像及び生物発光画像（Ａ）と、標的細胞と未照射細胞の発光シグナル強度をモニターした結果を示した図（Ｂ）である。
【図１７】実施例７において、ＰＡ−Ｔｅｔ−ＯＦＦシステムを導入し、青色光を６時間間隔で周期的に照射した発生中のマウス脳の切片の発光シグナル画像を示した図である。
【図１８】実施例７において、ＰＡ−Ｔｅｔ−ＯＦＦシステムを導入し、青色光を６時間間隔で周期的に照射した発生中のマウス脳の切片の発光シグナル強度をリアルタイムでモニターした結果を示した図である。
【図１９】実施例７において、ＰＡ−Ｔｅｔ−ＯＦＦ／ＯＮシステムの導入に使用したＰＡ−Ｔｅｔ−ＯＦＦ／ＯＮシステムの導入に使用した２種のコンストラクト、ＣＡＧ−ＦＬＡＧ−ＴｅｔＲ（又はｒＴｅｔＲ）−ＣＩＢＮ（−ＮＬＳ）−Ｔ２Ａ−ｍＣｈｅｒｒｙＮＬＳコンストラクト（図中、「Ｖｉｒｕｓ  １」）及びＣＡＧ−ＮＬＳ−ａｔｔａｃｈｅｄ  Ｃｒｙ２  ＰＨＲ（Ｌ３４８Ｆ）−ｐ６５ ＡＤＮ末融合コンストラクト（図中、「Ｖｉｒｕｓ  ２」）、並びに、２種のレポーター、ＴＲＥ３Ｇ−Ｕｂ−ＮＬＳ−ｌｕｃ２−Ｈｅｓ１  ３’ＵＴＲレポーター（図中、「Ｖｉｒｕｓ  ３」）及びＴｅｔＯ−ＧＦＰトランスジェニックレポーターマウス系統において発現しているレポーター（図中、「Ｔｇ  ｍｏｕｓｅ」）の概略図である。
【図２０】実施例７において、ＰＡ−Ｔｅｔ−ＯＦＦシステムのコンストラクトが導入された形質転換ニューロンの、青色光パルス照射開始（０時間目）から２１時間目までのルシフェラーゼ発現による発光シグナル画像である。
【図２１】実施例７において、ＰＡ−Ｔｅｔ−ＯＦＦシステムのコンストラクトが導入された形質転換ニューロンの、ルシフェラーゼ発現による発光シグナル強度を経時的に測定した結果を示した図である。
【図２２】実施例７において、ＰＡ−Ｔｅｔ−ＯＮシステムのコンストラクトが導入された形質転換ニューロンの、ルシフェラーゼ発現による発光シグナル強度を経時的に測定した結果を示した図である。
【図２３】実施例７において、ＴＲＥ−ＧＦＰトランスジェニックマウスの海馬にＰＡ−Ｔｅｔ−ＯＦＦシステムを導入したマウス成体脳の海馬ニューロンに対して、青色光を照射する態様を模式的に示した図である。
【図２４】実施例７において、図２３に示した方法で青色光を照射し、青色光の露光開始から１２時間後の脳のうち、青色光を照射しなかった領域の蛍光画像（左列：Ｄａｒｋ）と、青色光を照射した領域の蛍光画像（右列：Ｌｉｇｈｔ）である。
【図２５】実施例７において、ＰＡ−Ｔｅｔ−ＯＦＦシステムを導入した後に青色光パルス照射処理を行った仔マウスの脳ニューロンの、ルシフェラーゼ発現による発光シグナル強度を測定した結果を示した図である。
【図２６】実施例７において、ＰＡ−Ｔｅｔ−ＯＮシステムを導入した後に青色光パルス照射処理を行った仔マウスの脳ニューロンの、ルシフェラーゼ発現による発光シグナル強度を測定した結果を示した図である。
【図２７】実施例７において、Ｄｏｘ処理から１時間後、１日後、２日後、３日後、４日後、及び５日後に青色光パルス照射処理を行ったＰＡ−Ｔｅｔ−ＯＦＦシステム導入脳ニューロンの、ルシフェラーゼ発現による発光シグナル強度を測定した結果を示した図である。
【図２８】実施例８において、ＰＡ−Ｔｅｔ−ＯＦＦ安定株（Ｕｂ−ＮＬＳ−ｌｕｃ２レポーター）が移植された成体マウス背部皮膚の皮下組織の、暗条件（「Ｄａｒｋ」）又は青色光照射後（「Ｌｉｇｈｔ」）のルシフェラーゼ発現による発光シグナル強度を測定した結果を示した図である。
【図２９】実施例８において、ＰＡ−Ｔｅｔ−ＯＦＦ安定株（Ｕｂ−ＮＬＳ−ｌｕｃ２レポーター）が移植された成体マウス背部皮膚の皮下組織の、Ｄｏｘ非存在下（「Ｌｉｇｈｔ」）又はＤｏｘ存在下（「Ｌｉｇｈｔ＋Ｄｏｘ」）における青色光照射後のルシフェラーゼ発現による発光シグナル強度を測定した結果を示した図である。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本発明に係るＰＡ−Ｔｅｔ−ＯＦＦ／ＯＮシステムは、従来のＴｅｔ−ＯＦＦ／ＯＮシステムのうち、ＴｅｔＲ（ＰＡ−Ｔｅｔ−ＯＮシステムの場合には、ｒＴｅｔＲ）と転写活性化ドメインの融合タンパク質に代えて、ＴｅｔＲと転写活性化ドメインとをそれぞれ別の分子とし、両分子の複合体化を、光応答性結合スイッチを利用して制御する。ここで、光応答性結合スイッチは、特定の波長の光が照射された状態でのみ互いに結合してヘテロ二量体を形成する２種類のタンパク質からなるモジュールである。本願明細書においては、ヘテロ二量体を形成する一方のタンパク質を第１のタンパク質、他方のタンパク質を第２のタンパク質という。本発明においては、ＴｅｔＲを第１のタンパク質及び第２のタンパク質のいずれか一方と融合タンパク質としたものを第１の融合タンパク質、転写活性化ドメインを残る他方と融合タンパク質としたものを第２の融合タンパク質とする。第１の融合タンパク質と第２の融合タンパク質に、第１のタンパク質と第２のタンパク質をヘテロ二量体化させる特定の波長の光を照射すると、このヘテロ二量体化を介して第１の融合タンパク質と第２の融合タンパク質が複合体を形成する結果、ＴｅｔＲと転写活性化ドメインが複合体を形成し、Ｔｅｔ系化合物非存在下でＴＲＥの下流の標的遺伝子が発現する。当該特定の波長の光を照射していない環境下では、第１のタンパク質と第２のタンパク質のヘテロ二量体は形成されず、標的遺伝子の発現も誘導されない。このように、本発明に係るＰＡ−Ｔｅｔ−ＯＦＦ／ＯＮシステムは、ＴｅｔＲと転写活性化ドメインの複合体化を光照射によって制御することにより、光照射とＴｅｔ系化合物の両方によって標的遺伝子の発現を制御できる。
【００１３】
例えば、本発明に係るＰＡ−Ｔｅｔ−ＯＦＦ／ＯＮシステムは、Ｃｒｙ２／ＣＩＢ１−ＰＡ結合スイッチを利用して制御する。すなわち、第１のタンパク質と第２のタンパク質のいずれか一方をＣｒｙ２又はその変異体とし、他方をＣＩＢ１又はその変異体とする。Ｃｒｙ２／ＣＩＢ１−ＰＡ結合スイッチは、シロイヌナズナ由来の青色光応答性ヘテロ二量体形成モジュールであり、青色光を照射すると、Ｃｒｙ２の二量体とＣＩＢ１の二量体からなる複合体を形成する。本発明においては、ＴｅｔＲをＣｒｙ２及びＣＩＢ１のいずれか一方と融合タンパク質とし、転写活性化ドメインをＣｒｙ２及びＣＩＢ１のうちの残る他方と融合タンパク質とする。このため、例えば、ＰＡ−Ｔｅｔ−ＯＦＦシステムは、青色光非照射条件下では、ＴｅｔＲと転写活性化ドメインは複合体を形成せず、Ｔｅｔ系化合物非存在下でもＴＲＥの下流の標的遺伝子は発現しないが、青色光を照射すると、Ｃｒｙ２／ＣＩＢ１がヘテロ二量体を形成する結果、ＴｅｔＲと転写活性化ドメインが複合体を形成し、Ｔｅｔ系化合物非存在下でＴＲＥの下流の標的遺伝子が発現する。ただし、Ｔｅｔ系化合物存在下では、ＴｅｔＲと転写活性化ドメインの複合体はＴＲＥに結合できず、標的遺伝子は発現しない。
【００１４】
例えば、本発明に係るＰＡ−Ｔｅｔ−ＯＦＦ／ＯＮシステムは、ＢｐｈＰ１／Ｑ−ＰＡＳ１−ＰＡ結合スイッチを利用して制御する。すなわち、第１のタンパク質と第２のタンパク質のいずれか一方をＢｐｈＰ１又はその変異体とし、他方をＱ−ＰＡＳ１又はその変異体とする。ＢｐｈＰ１／Ｑ−ＰＡＳ１−ＰＡ結合スイッチは、ロドシュードモナス・パルストリス由来の近赤外光応答性ヘテロ二量体形成モジュールであり、近赤外光を照射すると、ＢｐｈＰ１とＱ−ＰＡＳ１からなるヘテロ二量体を形成する。本発明においては、ＴｅｔＲをＢｐｈＰ１及びＱ−ＰＡＳ１のいずれか一方と融合タンパク質とし、転写活性化ドメインをＢｐｈＰ１及びＱ−ＰＡＳ１のうちの残る他方と融合タンパク質とする。このため、例えば、ＰＡ−Ｔｅｔ−ＯＦＦシステムは、近赤外光非照射条件下では、ＴｅｔＲと転写活性化ドメインは複合体を形成せず、Ｔｅｔ系化合物非存在下でもＴＲＥの下流の標的遺伝子は発現しないが、近赤外光を照射すると、ＢｐｈＰ１／Ｑ−ＰＡＳ１がヘテロ二量体を形成する結果、ＴｅｔＲと転写活性化ドメインが複合体を形成し、Ｔｅｔ系化合物非存在下でＴＲＥの下流の標的遺伝子が発現する。ただし、Ｔｅｔ系化合物存在下では、ＴｅｔＲと転写活性化ドメインの複合体はＴＲＥに結合できず、標的遺伝子は発現しない。
【００１５】
具体的には、本発明に係るＰＡ−Ｔｅｔ−ＯＦＦ／ＯＮシステムは、ＴｅｔＯ配列を含むＴＲＥと、前記ＴＲＥの下流に位置し、かつ前記ＴＲＥに制御される最小プロモーターと、前記最小プロモーターの下流に位置し、かつ前記最小プロモーターに発現を制御される標的遺伝子と、を備える標的遺伝子発現カセットと、ＴｅｔＲ又はｒＴｅｔＲを含む第１の融合タンパク質をコードする遺伝子を備える第１融合タンパク質発現カセットと、転写活性化因子ｐ６５の転写活性化ドメイン（ヒトｐ６５の２８６〜５５０残基に相当する領域。以下、「ｐ６５ＡＤ」と示す。）を含む第２の融合タンパク質をコードする遺伝子を備える第２融合タンパク質発現カセットと、を備える。本発明においては、転写活性化ドメインとしてｐ６５ＡＤを用いることにより、ＶＰ１６の転写活性化ドメインを用いた場合より標的遺伝子の誘導発現量が高い。
【００１６】
第１の融合タンパク質は、ＴｅｔＲ又はｒＴｅｔＲと第１のタンパク質を含む、すなわち、ＴｅｔＲ又はｒＴｅｔＲと第１のタンパク質とが直接又は間接的に連結されている。第１の融合タンパク質中、ＴｅｔＲ又はｒＴｅｔＲと第１のタンパク質は、どちらがＮ末端側であってもよい。第２の融合タンパク質は、ｐ６５ＡＤと第２のタンパク質を含む、すなわち、ｐ６５ＡＤと第２のタンパク質とが直接又は間接的に連結されている。第２の融合タンパク質中、ｐ６５ＡＤと第２のタンパク質は、どちらがＮ末端側であってもよい。
【００１７】
本発明に係るＰＡ−Ｔｅｔ−ＯＦＦ／ＯＮシステムが、Ｃｒｙ２／ＣＩＢ１−ＰＡ結合スイッチを利用する場合には、ＴｅｔＲ又はｒＴｅｔＲを含む第１の融合タンパク質がＣＩＢ１又はその変異体を含む場合には、ｐ６５ＡＤを含む第２の融合タンパク質がＣｒｙ２又はその変異体を含む。ＴｅｔＲ又はｒＴｅｔＲを含む第１の融合タンパク質がＣｒｙ２又はその変異体を含む場合には、ｐ６５ＡＤを含む第２の融合タンパク質がＣＩＢ１又はその変異体を含む。
【００１８】
本発明に係るＰＡ−Ｔｅｔ−ＯＦＦ／ＯＮシステムが、ＢｐｈＰ１／Ｑ−ＰＡＳ１−ＰＡ結合スイッチを利用する場合には、ＴｅｔＲ又はｒＴｅｔＲを含む第１の融合タンパク質がＢｐｈＰ１又はその変異体を含む場合には、ｐ６５ＡＤを含む第２の融合タンパク質がＱ−ＰＡＳ１又はその変異体を含む。ＴｅｔＲ又はｒＴｅｔＲを含む第１の融合タンパク質がＱ−ＰＡＳ１又はその変異体を含む場合には、ｐ６５ＡＤを含む第２の融合タンパク質がＢｐｈＰ１又はその変異体を含む。
【００１９】
本発明及び本願明細書において、Ｔｅｔ系化合物とは、Ｔｅｔと同様に、ＴｅｔＲとｐ６５ＡＤの複合体に結合することによって当該複合体がＴｅｔＯ配列に結合することを阻害し、また、ｒＴｅｔＲとｐ６５ＡＤの複合体に結合することによって当該複合体をＴｅｔＯ配列に結合させる機能を備える化合物であり、Ｔｅｔとその類縁体が含まれる。Ｔｅｔ類縁体としては、Ｄｏｘ、アンヒドロテトラサイクリン、シアノテトラサイクリン等が挙げられる。
【００２０】
本発明において用いられるＴｅｔＲは、Ｔｅｔと結合しない状態でＴＲＥと結合し、Ｔｅｔと結合した状態でＴＲＥと結合しないタンパク質である。ＴｅｔＲとしては特に限定されるものではなく、例えば、従来のＴｅｔ−ＯＦＦ／ＯＮシステムで使用可能なＴｅｔＲの中から適宜選択して用いることができる。具体的には、Ｔｅｔ耐性微生物が有するＴｅｔ耐性オペロンのＴｅｔＲ又はその改変体が挙げられ、大腸菌のＴｅｔＲ又はその改変体が従来のＴｅｔ−ＯＦＦ／ＯＮシステムでの使用実績が高く好ましい。
【００２１】
本発明において用いられるＴｅｔＲとしては、自然界に存在するいずれかのＴｅｔ耐性微生物の野生型ＴｅｔＲであってもよいが、大腸菌の野生型ＴｅｔＲ（tetracycline repressor protein class B from transposon Tn10）の１９４番目のイソロイシンに相当するアミノ酸残基がトレオニン残基である変異型ＴｅｔＲ（以下、「ＴｅｔＲ（Ｉ１９４Ｔ）」ということがある。）であることが好ましい。ＴｅｔＲ（Ｉ１９４Ｔ）は、従来のＴｅｔ−ＯＦＦ／ＯＮシステムではＴｅｔ系化合物により誘導される発現効率は野生型ＴｅｔＲと同程度にすぎないが、本発明に係るＰＡ−Ｔｅｔ−ＯＦＦ／ＯＮシステムでは、野生型ＴｅｔＲよりもＰＡ−Ｔｅｔ制御発現効率が優れている変異型である。従来のＴｅｔ−ＯＦＦ／ＯＮシステムで使用されているＴｅｔＲに対して、大腸菌の野生型ＴｅｔＲの１９４番目のイソロイシンに相当するアミノ酸残基をトレオニン残基に置換することにより、本発明に係るＰＡ−Ｔｅｔ−ＯＦＦ／ＯＮシステムに好適なＴｅｔＲが得られる。
【００２２】
本発明において用いられるｒＴｅｔＲは、Ｔｅｔと結合した状態でＴＲＥと結合し、Ｔｅｔと結合しない状態でＴＲＥと結合しないタンパク質である。ｒＴｅｔＲは、ＴｅｔＲに、リバース表現型となる変異を導入することにより得られる。リバース表現型となる変異としては、例えば、ｒｔＴＡ（Ｅ７１Ｋ、Ｄ９５Ｎ、Ｌ１０１Ｓ、Ｇ１０２Ｄ）、Ｓ２（Ｅ１９Ｇ、Ａ５６Ｐ、Ｄ１４８Ｅ、Ｈ１７９Ｒ）、Ｍ２（Ｓ１２Ｇ、Ｅ１９Ｇ、Ａ５６Ｐ  、Ｄ１４８Ｅ、Ｈ１７９Ｒ）、Ｖ１０（Ｅ１９Ｇ、Ａ５６Ｐ、Ｆ６７Ｓ、Ｆ８６Ｙ、Ｄ１４８Ｅ、Ｒ１７１Ｋ、Ｈ１７９Ｒ）、Ｖ１６（Ｖ９Ｉ、Ｅ１９Ｇ、Ａ５６Ｐ、Ｆ６７Ｓ、Ｆ８６Ｙ、Ｄ１４８Ｅ、Ｒ１７１Ｋ、Ｈ１７９Ｒ）（非特許文献１）等が挙げられる。なお、これらの変異は、大腸菌の野生型ＴｅｔＲのアミノ酸配列に基づく。本発明において用いられるｒＴｅｔＲとしては、標的遺伝子のＰＡ−Ｔｅｔ制御発現効率をより高められることから、Ｍ２、Ｖ１０、又はＶ１６の変異が導入されていることが好ましく、Ｖ１０変異が導入されていることがより好ましい。
【００２３】
Ｉ１９４Ｔ変異によるＰＡ−Ｔｅｔ制御発現効率の改善効果は、ＴｅｔＲのみならずｒＴｅｔＲでも奏される。このため、本発明において用いられるｒＴｅｔＲとしては、ＴｅｔＲに、Ｉ１９４Ｔとリバース表現型となる変異とが導入されたものが好ましく、Ｉ１９４ＴとＭ２、Ｖ１０、又はＶ１６の変異とが導入されたものがより好ましく、Ｉ１９４ＴとＶ１０変異とが導入されたものがさらに好ましい。
【００２４】
本発明及び本願明細書において、標的遺伝子とは、ＰＡ−Ｔｅｔ−ＯＦＦ／ＯＮシステムによって発現を制御する目的の遺伝子である。標的遺伝子は、自然界に存在するいずれかの生物又はウイルスが備える天然の遺伝子であってもよく、これを人工的に改変した遺伝子であってもよく、人工的に設計し合成した遺伝子であってもよい。天然の遺伝子を人工的に改変する方法としては、特に限定されるものではなく、天然の遺伝子がコードするタンパク質の１又は複数個のアミノ酸を置換、付加、又は欠失させたタンパク質をコードする遺伝子へと改変する方法や、２以上のタンパク質を直接又は適当なリンカーを介して連結させた融合タンパク質をコードする遺伝子へと改変する方法等が挙げられる。これらは、遺伝子組換技術を用いて常法により行うことができる。
【００２５】
本発明及び本願明細書において、標的遺伝子としては、発現の有無の識別が容易であるため、蛍光タンパク質や、ルシフェラーゼ、β−ガラクトシダーゼ等の酵素マーカーを直接、又はＴ２Ａ自己消化ペプチドを介して連結させたタンパク質をコードする遺伝子であってもよい。また、当該標的遺伝子は、蛍光タンパク質や酵素マーカーをコードする遺伝子とＩＲＥＳ（Internal Ribosomal Entry Site）等のバイシストロニック発現エレメントで連結されていてもよい。その他、発現させる目的のタンパク質をユビキチン修飾したタンパク質をコードする遺伝子を標的遺伝子とすることにより、当該タンパク質の細胞内における長期蓄積を抑制することができ、標的遺伝子の発現の時間的制御をより厳密に行うこともできる。
【００２６】
本発明及び本願明細書において、発現カセットとは、タンパク質を発現するために必要なＤＮＡであり、少なくとも、当該タンパク質をコードする遺伝子と、当該遺伝子の発現を制御するプロモーターとを含む。本発明において用いられる各種の発現カセットが備えるプロモーターとしては、ＰＡ−Ｔｅｔ−ＯＦＦ／ＯＮシステムを導入して標的遺伝子を発現させる発現系（宿主発現系）の系内で機能するプロモーターであればよく、宿主発現系が由来する細胞が本来有するプロモーターであってもよく、当該細胞以外の生物種の細胞に由来するプロモーターであってもよく、人工的に合成されたプロモーターであってもよい。本発明において用いられる各種の発現カセットが備えるプロモーターとしては、例えば、ｈＣＭＶプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＣＡＧプロモーター、ＥＦ１αプロモーター等の、各種発現ベクターで使用されているプロモーターが挙げられる。
【００２７】
発現カセットには、さらに、発現させる目的の遺伝子の下流にターミネーターが含まれていてもよく、５’−非翻訳領域（ＵＴＲ）、３’−ＵＴＲのいずれか１つ以上が含まれていてもよい。さらに、宿主発現系が真核細胞の発現系の場合、当該遺伝子の下流にポリアデニル化配列を含んでいてもよい。発現カセットに含まれるターミネーター、５’−ＵＴＲ及び３’−ＵＴＲ等は、細胞等を用いたタンパク質発現の分野で一般的に使用されているものの中から適宜選択して用いることができる。
【００２８】
本発明において用いられる標的遺伝子発現カセットは、ＴＲＥと、ＴＲＥの下流に位置する最小プロモーターと、当該最小プロモーターによって転写開始部位が決定される評定遺伝子と、を備える。最小プロモーターとは、転写の開始部位を決定するが、単独では転写を開始することができない部分的プロモーターを意味する。標的遺伝子発現カセット中の最小プロモーターは、ＴＲＥにＴｅｔＲと転写活性化ドメインの複合体又はｒＴｅｔＲと転写活性化ドメインの複合体が結合していない状態では標的遺伝子を発現させることができず、ＴｅｔＲと転写活性化ドメインの複合体又はｒＴｅｔＲと転写活性化ドメインの複合体が結合したＴＲＥによって活性化されてはじめて標的遺伝子の転写を開始させることができる。標的遺伝子発現カセットが備える最小プロモーターとしては、特に限定されるものではなく、例えば、ｈＣＭＶプロモーター、ＳＶ４０プロモーター等のタンパク質発現において汎用されているプロモーターの部分プロモーターを用いることができる。
【００２９】
本発明において用いられる標的遺伝子発現カセットは、当該最小プロモーターの上流に位置し、その転写活性を制御するＴＲＥと、を備える。ＴＲＥとしては、１個以上のＴｅｔＯ配列を含むものであれば、特に限定されるものではなく、ＴｅｔＯ配列のみからなるものであってもよく、それ以外の領域を含んでいてもよい。ＴＲＥが複数のＴｅｔＯ配列を備える場合、ＴｅｔＯ配列は直接タンデムに連結されていてもよく、適当なＤＮＡリンカーを介して連結されていてもよい。また、ＴＲＥ中の複数のＴｅｔＯ配列は、全て同一のＴｅｔＯ配列であってもよく、互いに異なる種類のＴｅｔＯ配列であってもよい。例えば、標的遺伝子発現カセット中のＴＲＥとしては、従来のＴｅｔ−ＯＦＦ／ＯＮシステムで使用可能なＴＲＥの中から適宜選択して用いることができる。
【００３０】
ＴｅｔＯ配列としては、Ｃｒｙ２／ＣＩＢ１のヘテロ二量体若しくはＢｐｈＰ１／Ｑ−ＰＡＳ１のヘテロ二量体を介して形成されたＴｅｔＲとｐ６５ＡＤの複合体がＴｅｔ系化合物非存在下で結合可能なＤＮＡ配列、又はＣｒｙ２／ＣＩＢ１のヘテロ二量体若しくはＢｐｈＰ１／Ｑ−ＰＡＳ１のヘテロ二量体を介して形成されたｒＴｅｔＲとｐ６５ＡＤの複合体がＴｅｔ系化合物存在下で結合可能なＤＮＡ配列であればよい。ＴｅｔＲとｐ６５ＡＤの複合体又はｒＴｅｔＲとｐ６５ＡＤの複合体がＴｅｔＯ配列を介してＴＲＥに結合すると、ＴＲＥの下流にある最小プロモーターが活性化され、標的遺伝子が発現する。本発明において用いられる標的遺伝子発現カセットに含まれるＴｅｔＯ配列は、特に限定されるものではなく、公知のＴｅｔＯ配列の中から適宜選択して用いることができる。ＴｅｔＯ配列としては、Ｔｅｔ耐性微生物が有するＴｅｔ耐性オペロンのＴｅｔＯ配列又はその改変体が挙げられ、大腸菌のＴｅｔＯ配列又はその改変体が従来のＴｅｔ−ＯＦＦ／ＯＮシステムでの使用実績が高く好ましい。
【００３１】
本発明において用いられる第１融合タンパク質発現カセットは、ＴｅｔＲ又はｒＴｅｔＲと第１のタンパク質とを含む第１融合タンパク質を発現させるための発現カセットである。また、第２融合タンパク質発現カセットは、ｐ６５ＡＤと第２のタンパク質とを含む第２融合タンパク質を発現させるための発現カセットである。
【００３２】
本発明に係るＰＡ−Ｔｅｔ−ＯＦＦ／ＯＮシステムが、Ｃｒｙ２／ＣＩＢ１−ＰＡ結合スイッチを利用する場合には、第１のタンパク質と第２のタンパク質のいずれか一方をＣｒｙ２又はその変異体とし、他方をＣＩＢ１又はその変異体とする。本発明において用いられる第１融合タンパク質発現カセットは、ＴｅｔＲ又はｒＴｅｔＲと、ＣＩＢ１若しくはその変異体又はＣｒｙ２若しくはその変異体と、を含む第１融合タンパク質を発現させるための発現カセットである。また、第２融合タンパク質発現カセットは、ｐ６５ＡＤと、ＣＩＢ１若しくはその変異体又はＣｒｙ２若しくはその変異体と、を含む第２融合タンパク質を発現させるための発現カセットである。第１融合タンパク質が、ＴｅｔＲ又はｒＴｅｔＲと、ＣＩＢ１又はその変異体とを含む融合タンパク質である場合、第２融合タンパク質は、ｐ６５ＡＤと、Ｃｒｙ２又はその変異体とを含む融合タンパク質である。逆に、第１融合タンパク質が、ＴｅｔＲ又はｒＴｅｔＲと、Ｃｒｙ２又はその変異体とを含む融合タンパク質である場合、第２融合タンパク質は、ｐ６５ＡＤと、ＣＩＢ１又はその変異体とを含む融合タンパク質である。
【００３３】
本発明において用いられるＣＩＢ１としては、シロイヌナズナの野生型ＣＩＢ１（ＡｔＣＩＢ１：全長３３５アミノ酸）又はそのホモログタンパク質が挙げられる。本発明において用いられるＣＩＢ１の変異体としては、これらのＣＩＢ１のＣ末端欠損体や、核局在シグナル（ＮＬＳ）の欠損体が挙げられる。ＮＬＳは、ＡｔＣＩＢ１の９３〜１０７番目の領域であり、ＮＬＳ欠損体としては、ＮＬＳ中の１以上のアミノ酸を置換した変異体であってもよく、ＮＬＳ自体を削除した変異体であってもよい。ＣＩＢ１のＣ末端欠損体としては、ＡｔＣＩＢ１の１〜１７０番目のアミノ酸からなる領域に相当するＮ末部分タンパク質からなるＣ末端欠損体、ＡｔＣＩＢ１の１〜８１番目のアミノ酸からなる領域に相当するＮ末部分タンパク質からなるＣ末端欠損体が挙げられる。本発明において用いられるＣＩＢ１又はその変異体としては、ＣＩＢ１の全長タンパク質、ＣＩＢ１のＮＬＳ欠損体、ＡｔＣＩＢ１の１〜１７０番目のアミノ酸からなる領域に相当するＮ末部分タンパク質からなるＣ末端欠損体、ＡｔＣＩＢ１の１〜１７０番目のアミノ酸からなる領域に相当するＮ末部分タンパク質からなり、ＮＬＳを欠損させたＣ末端欠損体、ＡｔＣＩＢ１の１〜８１番目のアミノ酸からなる領域に相当するＮ末部分タンパク質からなるＣ末端欠損体が挙げられる。ＰＡ−Ｔｅｔ制御発現効率がより高いことから、本発明において用いられるＣＩＢ１又はその変異体としては、ＡｔＣＩＢ１の１〜１７０番目のアミノ酸からなる領域に相当するＮ末部分タンパク質からなるＣＩＢ１のＣ末端欠損体、又は当該Ｃ末端欠損体中のＮＬＳが欠損した変異体であることが好ましい。
【００３４】
本発明において用いられるＣｒｙ２としては、シロイヌナズナの野生型Ｃｒｙ２（ＡｔＣｒｙ２：全長６１２アミノ酸）又はそのホモログタンパク質が挙げられる。本発明において用いられるＣｒｙ２の変異体としては、これらのＣｒｙ２のＮ末端ＰＨＲを含むＣ末端欠損体や、当該Ｃ末端欠損体のうち、ＡｔＣｒｙ２の３４８番目のロイシンに相当するアミノ酸残基がフェニルアラニンに置換された変異体である、が挙げられる。Ｃｒｙ２のＮ末端ＰＨＲを含むＣ末端欠損体としては、ＡｔＣｒｙ２の１〜５３５番目のアミノ酸からなる領域に相当するＮ末部分タンパク質からなるＣｒｙ２のＣ末端欠損体、ＡｔＣｒｙ２の１〜４９６番目のアミノ酸からなる領域に相当するＮ末部分タンパク質からなるＣｒｙ２のＣ末端欠損体等が挙げられる。ＰＡ−Ｔｅｔ制御発現効率がより高いことから、本発明において用いられるＣｒｙ２又はその変異体としては、ＡｔＣｒｙ２の１〜５３５番目のアミノ酸からなる領域に相当するＮ末部分タンパク質からなるＣｒｙ２のＣ末端欠損体、ＡｔＣｒｙ２の１〜４９６番目のアミノ酸からなる領域に相当するＮ末部分タンパク質からなるＣｒｙ２のＣ末端欠損体、又は、ＡｔＣｒｙ２の１〜５３５番目のアミノ酸からなる領域に相当するＮ末部分タンパク質に、ＡｔＣｒｙ２の３４８番目のロイシンに相当するアミノ酸残基をフェニルアラニンに置換する点変異が導入されたＣｒｙ２のＣ末端欠損体が好ましい。
【００３５】
本発明において用いられる第１の融合タンパク質は、ＴｅｔＲ又はｒＴｅｔＲと、ＣＩＢ１若しくはその変異体、又はＣｒｙ２若しくはその変異体とが、直接又は１個以上のアミノ酸からなるペプチドリンカーによって連結されたタンパク質である。第１の融合タンパク質において、ＣＩＢ１等は、ＴｅｔＲ又はｒＴｅｔＲのＣ末端側に連結されていてもよく、Ｎ末端側に連結されていてもよい。ペプチドリンカーの長さは特に限定されるものではなく、例えば、１〜２５アミノ酸とすることができる。
【００３６】
本発明において用いられる第２の融合タンパク質は、ｐ６５ＡＤと、ＣＩＢ１若しくはその変異体、又はＣｒｙ２若しくはその変異体とが、直接又は１個以上のアミノ酸からなるペプチドリンカーによって連結されたタンパク質である。第２の融合タンパク質において、ＣＩＢ１等は、ｐ６５ＡＤのＣ末端側に連結されていてもよく、Ｎ末端側に連結されていてもよい。
【００３７】
ＰＡ−Ｔｅｔ制御発現効率がより高いことから、本発明において用いられる第１の融合タンパク質としては、ＴｅｔＲ又はｒＴｅｔＲのＣ末端側にＣＩＢ１又はその変異体が、直接又は１個以上のアミノ酸からなるペプチドリンカーによって連結されたタンパク質であることが好ましく、ＴｅｔＲ又はｒＴｅｔＲのＣ末端側に、ＡｔＣＩＢ１の１〜１７０番目のアミノ酸からなる領域に相当するＮ末部分タンパク質からなるＣＩＢ１のＣ末端欠損体、又は当該Ｃ末端欠損体中のＮＬＳが欠損した変異体が直接又は１個以上のアミノ酸からなるペプチドリンカーによって連結されたタンパク質であることがより好ましく、ＴｅｔＲ又はｒＴｅｔＲのＣ末端側に、ＡｔＣＩＢ１の１〜１７０番目のアミノ酸からなる領域に相当するＮ末部分タンパク質からなるＣＩＢ１のＣ末端欠損体、又は当該Ｃ末端欠損体中のＮＬＳが欠損した変異体が、ＳＰＫＫＫ（配列番号１３）で表されるアミノ酸配列からなるペプチドリンカーにより連結されたタンパク質であることがさらに好ましい。
【００３８】
ＰＡ−Ｔｅｔ制御発現効率がより高いことから、本発明において用いられる第２の融合タンパク質としては、ｐ６５ＡＤのＮ末端側又はＣ末端側に、Ｃｒｙ２又はその変異体が、直接又は１個以上のアミノ酸からなるペプチドリンカーによって連結されたタンパク質であることが好ましく、ｐ６５ＡＤのＮ末端側又はＣ末端側に、Ｃｒｙ２のＮ末端ＰＨＲを含むＣ末端欠損体又は当該Ｃ末端欠損体にＡｔＣｒｙ２の３４８番目のロイシンに相当するアミノ酸残基をフェニルアラニンに置換する点変異が導入された変異体が、直接又は１個以上のアミノ酸からなるペプチドリンカーによって連結されたタンパク質であることがより好ましく、ｐ６５ＡＤのＮ末端側又はＣ末端側に、ＡｔＣｒｙ２の１〜５３５番目のアミノ酸からなる領域に相当するＮ末部分タンパク質からなるＣｒｙ２のＣ末端欠損体、ＡｔＣｒｙ２の１〜４９６番目のアミノ酸からなる領域に相当するＮ末部分タンパク質からなるＣｒｙ２のＣ末端欠損体、又は、ＡｔＣｒｙ２の１〜５３５番目のアミノ酸からなる領域に相当するＮ末部分タンパク質に、ＡｔＣｒｙ２の３４８番目のロイシンに相当するアミノ酸残基をフェニルアラニンに置換する点変異が導入されたＣｒｙ２のＣ末端欠損体が、直接又は１個以上のアミノ酸からなるペプチドリンカーによって連結されたタンパク質であることがさらに好ましく、ｐ６５ＡＤのＣ末端側に、ＡｔＣｒｙ２の１〜５３５番目のアミノ酸からなる領域に相当するＮ末部分タンパク質からなるＣｒｙ２のＣ末端欠損体、又はＡｔＣｒｙ２の１〜４９６番目のアミノ酸からなる領域に相当するＮ末部分タンパク質からなるＣｒｙ２のＣ末端欠損体が、直接又は１個以上のアミノ酸からなるペプチドリンカーによって連結されたタンパク質であることがよりさらに好ましく、ｐ６５ＡＤのＮ末端側に、ＡｔＣｒｙ２の１〜５３５番目のアミノ酸からなる領域に相当するＮ末部分タンパク質に、ＡｔＣｒｙ２の３４８番目のロイシンに相当するアミノ酸残基をフェニルアラニンに置換する点変異が導入されたＣｒｙ２のＣ末端欠損体が、直接又は１個以上のアミノ酸からなるペプチドリンカーによって連結されたタンパク質であることも好ましい。
【００３９】
本発明に係るＰＡ−Ｔｅｔ−ＯＦＦ／ＯＮシステムが、ＢｐｈＰ１／Ｑ−ＰＡＳ１−ＰＡ結合スイッチを利用する場合には、第１のタンパク質と第２のタンパク質のいずれか一方をＢｐｈＰ１又はその変異体とし、他方をＱ−ＰＡＳ１又はその変異体とする。本発明において用いられる第１融合タンパク質発現カセットは、ＴｅｔＲ又はｒＴｅｔＲと、ＢｐｈＰ１若しくはその変異体又はＱ−ＰＡＳ１若しくはその変異体と、を含む第１融合タンパク質を発現させるための発現カセットである。また、第２融合タンパク質発現カセットは、ｐ６５ＡＤと、ＢｐｈＰ１若しくはその変異体又はＱ−ＰＡＳ１若しくはその変異体と、を含む第２融合タンパク質を発現させるための発現カセットである。第１融合タンパク質が、ＴｅｔＲ又はｒＴｅｔＲと、ＢｐｈＰ１又はその変異体とを含む融合タンパク質である場合、第２融合タンパク質は、ｐ６５ＡＤと、Ｑ−ＰＡＳ１又はその変異体とを含む融合タンパク質である。逆に、第１融合タンパク質が、ＴｅｔＲ又はｒＴｅｔＲと、Ｑ−ＰＡＳ１又はその変異体とを含む融合タンパク質である場合、第２融合タンパク質は、ｐ６５ＡＤと、ＢｐｈＰ１又はその変異体とを含む融合タンパク質である。
【００４０】
本発明において用いられるＢｐｈＰ１としては、ロドシュードモナス・パルストリスの野生型ＢｐｈＰ１（ＲｐＢｐｈＰ１：配列番号２１、非特許文献２７）又はそのホモログタンパク質が挙げられる。本発明において用いられるＢｐｈＰ１の変異体としては、これらのＢｐｈＰ１のＱ−ＰＡＳ１とのヘテロ二量体形成に影響しない領域の欠損体や当該領域に変異を導入した変異体が挙げられる。導入される変異としては、例えば、１又は複数のアミノ酸を置換、挿入、欠損させる変異が挙げられる。
【００４１】
本発明において用いられるＱ−ＰＡＳ１としては、ロドシュードモナス・パルストリスの野生型ＰｐｓＲ２（ＲｐＰｐｓＲ２：非特許文献２６）のＱ−ｌｉｎｋｅｒとＰＡＳ１からなる領域、具体的には、１０１〜２５１番目のアミノ酸残基からなる部分タンパク質ＲｐＱ−ＰＡＳ１（配列番号２２、非特許文献２８及び２９）、又はＲｐＰｐｓＲ２のホモログタンパク質の、Ｑ−ｌｉｎｋｅｒとＰＡＳ１からなる領域に相当する部分タンパク質が挙げられる。
【００４２】
本発明において用いられる第１の融合タンパク質は、ＴｅｔＲ又はｒＴｅｔＲと、ＢｐｈＰ１若しくはその変異体、又はＱ−ＰＡＳ１若しくはその変異体とが、直接又は１個以上のアミノ酸からなるペプチドリンカーによって連結されたタンパク質である。第１の融合タンパク質において、ＢｐｈＰ１等は、ＴｅｔＲ又はｒＴｅｔＲのＣ末端側に連結されていてもよく、Ｎ末端側に連結されていてもよい。ペプチドリンカーの長さは特に限定されるものではなく、例えば、１〜２５アミノ酸とすることができる。
【００４３】
本発明において用いられる第２の融合タンパク質は、ｐ６５ＡＤと、ＢｐｈＰ１若しくはその変異体、又はＱ−ＰＡＳ１若しくはその変異体とが、直接又は１個以上のアミノ酸からなるペプチドリンカーによって連結されたタンパク質である。第２の融合タンパク質において、ＢｐｈＰ１等は、ｐ６５ＡＤのＣ末端側に連結されていてもよく、Ｎ末端側に連結されていてもよい。
【００４４】
ＰＡ−Ｔｅｔ制御発現効率がより高いことから、本発明において用いられる第１の融合タンパク質としては、ＴｅｔＲ又はｒＴｅｔＲのＮ末端側又はＣ末端側にＢｐｈＰ１又はその変異体が、直接又は１個以上のアミノ酸からなるペプチドリンカーによって連結されたタンパク質であることが好ましく、ＴｅｔＲ又はｒＴｅｔＲのＮ末端側に、ＢｐｈＰ１が直接又は１個以上のアミノ酸からなるペプチドリンカーによって連結されたタンパク質であることがより好ましく、ＴｅｔＲ又はｒＴｅｔＲのＮ末端側に、ＲｐＢｐｈＰ１が、ＳＰＫＫＫ、ＨＭＥＦ（配列番号２３）、ＴＳＴＲ（配列番号２４）、ＳＰＫＫＫＨＭＥＦ（配列番号２５）で表されるアミノ酸配列からなるペプチドリンカーにより連結されたタンパク質であることがさらに好ましい。
【００４５】
ＰＡ−Ｔｅｔ制御発現効率がより高いことから、本発明において用いられる第２の融合タンパク質としては、ｐ６５ＡＤのＮ末端側又はＣ末端側に、Ｑ−ＰＡＳ１又はその変異体が、直接又は１個以上のアミノ酸からなるペプチドリンカーによって連結されたタンパク質であることが好ましく、ｐ６５ＡＤのＮ末端側に、Ｑ−ＰＡＳ１が、直接又は１個以上のアミノ酸からなるペプチドリンカーによって連結されたタンパク質であることがより好ましく、ｐ６５ＡＤのＮ末端側に、ＲｐＱ−ＰＡＳ１が、直接又は１個以上のアミノ酸からなるペプチドリンカーによって連結されたタンパク質であることがさらに好ましく、ｐ６５ＡＤのＮ末端側に、ＲｐＱ−ＰＡＳ１が、ＨＭＥＦ又はＴＳＴＲで表されるアミノ酸配列からなるペプチドリンカーによって連結されたタンパク質であることがよりさらに好ましい。
【００４６】
本発明で用いられる第１の融合タンパク質及び第２の融合タンパク質は、本発明の効果を損なわない限り、その他のペプチド及びタンパク質が付加されていてもよい。例えば、第１の融合タンパク質が、ＴｅｔＲ又はｒＴｅｔＲのＣ末端側に、ＡｔＣＩＢ１の１〜１７０番目のアミノ酸からなる領域に相当するＮ末部分タンパク質中のＮＬＳを欠損させた変異体が直接又は１個以上のアミノ酸からなるペプチドリンカーによって連結されたタンパク質である場合、第２の融合タンパク質としては、Ｎ末端又はＣ末端に１個以上のＮＬＳが付加されたタンパク質であることが好ましい。また、第２の融合タンパク質が、ｐ６５ＡＤとＱ−ＰＡＳ１が直接又は１個以上のアミノ酸からなるペプチドリンカーによって連結されたタンパク質である場合、第２の融合タンパク質としては、Ｎ末端又はＣ末端に１個以上のＮＬＳが付加されたタンパク質であることが好ましく、Ｎ末端に１個以上のＮＬＳが付加されたタンパク質であることがより好ましい。
【００４７】
本発明に係るＰＡ−Ｔｅｔ−ＯＦＦ／ＯＮシステムは、第１融合タンパク質発現カセットと第２融合タンパク質発現カセットに代えて、第１の融合タンパク質と第２の融合タンパク質がＴ２Ａ自己消化ペプチドで連結されたタンパク質の発現カセットを備えていてもよい。第１の融合タンパク質の下流にＴ２Ａ自己消化ペプチドを介して第２の融合タンパク質が連結されていてもよく、第２の融合タンパク質の下流にＴ２Ａ自己消化ペプチドを介して第１の融合タンパク質が連結されていてもよい。また、Ｔ２Ａ自己消化ペプチドで連結される第１の融合タンパク質と第２の融合タンパク質としては、いずれも前記の通りのものを用いることができる。
【００４８】
本発明に係るＰＡ−Ｔｅｔ−ＯＦＦ／ＯＮシステムは、第１融合タンパク質発現カセットと第２融合タンパク質発現カセットに代えて、第１の融合タンパク質と第２の融合タンパク質をバイシストロニック発現させる発現カセットを備えていてもよい。第１の融合タンパク質と第２の融合タンパク質をバイシストロニック発現させる発現カセットは、第１の融合タンパク質をコードする領域と前記第２の融合タンパク質をコードする領域とを、ＩＲＥＳ等のバイシストロニック発現エレメントで連結する等の常法により製造できる。第１の融合タンパク質をコードする領域の下流にバイシストロニック発現エレメントを介して第２の融合タンパク質をコードする領域が連結されていてもよく、第２の融合タンパク質をコードする領域の下流にバイシストロニック発現エレメントを介して第１の融合タンパク質をコードする領域が連結されていてもよい。バイシストロニック発現させる第１の融合タンパク質と第２の融合タンパク質としては、いずれも前記の通りのものを用いることができる。
【００４９】
本発明に係るＰＡ−Ｔｅｔ−ＯＦＦ／ＯＮシステムを導入した発現系に対して、青色光又は近赤外光の照射の有無、及びＴｅｔ系化合物処理の有無を調整することにより、当該発現系における標的遺伝子の発現を制御することができる。第１の融合タンパク質がＴｅｔＲを含むＰＡ−Ｔｅｔ−ＯＦＦシステムを導入した発現系の場合には、Ｔｅｔ系化合物非存在下で青色光又は近赤外光を照射することにより、標的遺伝子を発現させることができ、照射する青色光又は近赤外光の照射強度を高めることにより、標的遺伝子の発現効率を向上させることができる。第１の融合タンパク質がｒＴｅｔＲを含むＰＡ−Ｔｅｔ−ＯＮシステムを導入した発現系の場合には、Ｔｅｔ系化合物を添加し、かつ青色光又は近赤外光を照射することにより、標的遺伝子を発現させることができ、照射する青色光又は近赤外光の照射強度を高めたり、Ｔｅｔ系化合物の濃度を高めたりすることにより、標的遺伝子の発現効率を向上させることができる。
【００５０】
本発明に係るＰＡ−Ｔｅｔ−ＯＦＦ／ＯＮシステムを導入する発現系としては、細胞であってもよく、セルフリー系であってもよい。また、細胞の場合、培養細胞であってもよく、動物の生体内の細胞であってもよく、動物から採取された組織中の細胞であってもよい。本発明に係るＰＡ−Ｔｅｔ−ＯＦＦ／ＯＮシステムは、動物細胞又は動物細胞に由来するセルフリー発現系での発現に好適であり、哺乳動物細胞又は哺乳動物細胞に由来するセルフリー発現系での発現に特に好適である。
【００５１】
本発明に係るＰＡ−Ｔｅｔ−ＯＦＦ／ＯＮシステムは、青色光又は近赤外光を照射した領域でのみ標的遺伝子の発現が誘導される。このため、例えば、青色光等を照射する領域や照射タイミングを適宜調整することにより、限定された空間内においてのみ、所望のタイミングで標的遺伝子の発現を誘導することができる。
【００５２】
本発明に係るＰＡ−Ｔｅｔ−ＯＦＦ／ＯＮシステムが、ＢｐｈＰ１／Ｑ−ＰＡＳ１−ＰＡ結合スイッチを利用する場合、ＢｐｈＰ１とＱ−ＰＡＳ１のヘテロ二量体は、ＢＶを使用して形成される。この際用いられるＢＶは、真核生物の内在性ＢＶを用いることができるが、外部からＢＶを導入することも好ましい。十分なＢＶが存在することにより、近赤外光に対してより高感度にヘテロ二量体を形成でき、標的遺伝子を発現させることができる。標的遺伝子を発現させる対象の細胞内へのＢＶの導入は、ＢＶ自体をマイクロインジェクション等で直接導入してもよく、細胞内においてＢＶの生合成を促進する機能を持つタンパク質をコードする遺伝子を導入してもよい。
【００５３】
本発明に係るＰＡ−Ｔｅｔ−ＯＦＦ／ＯＮシステムを発現系へ導入する方法は、特に限定されるものではない。例えば、各発現カセットを、適切なベクターに組み込み、これらのベクターを発現系に常法により導入させることにより、本発明に係るＰＡ−Ｔｅｔ−ＯＦＦ／ＯＮシステムを発現系へ導入できる。例えば、前記標的遺伝子発現カセットを組み込んだ発現ベクターと、前記第１融合タンパク質発現カセットを含む発現ベクターと、前記第２融合タンパク質発現カセットを含む発現ベクターと、を発現系へ導入する。また、前記標的遺伝子発現カセットを組み込んだ発現ベクターと、前記第１の融合タンパク質と前記第２の融合タンパク質がＴ２Ａ自己消化ペプチドで連結されたタンパク質をコードする遺伝子の発現カセットを含む発現ベクターと、を発現系へ導入してもよく、前記標的遺伝子発現カセットを組み込んだ発現ベクターと、前記第１の融合タンパク質及び前記第２の融合タンパク質をバイシストロニック発現させる発現カセットを含む発現ベクターと、を発現系へ導入してもよい。
【００５４】
発現系がセルフリー発現系の場合、各発現カセットをそのまま発現系に添加することができる。発現系が動物細胞の場合、動物細胞の種類に応じて、適切なベクターを選択し、遺伝子組換技術によって各発現カセットを組み込んだベクターを、リン酸カルシウム法、リポフェクション法、電気穿孔法（electroporation）法等の一般的に使用されている方法で目的の細胞に導入することができる。当該ベクターとしては、プラスミドベクター、レトロウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター等の公知のベクターを利用することができる。
【００５５】
本発明に係るＰＡ−Ｔｅｔ−ＯＦＦ／ＯＮシステムを構成する各発現カセットの全部又は一部は、動物細胞の染色体内に組み込まれていてもよい。各発現カセットの染色体への組み込みは、相同組み換え法等の通常のノックイン技術で行うことができる。
【００５６】
前記第１融合タンパク質発現カセットを含む発現ベクターと前記第２融合タンパク質発現カセットを含む発現ベクターに、ＴＲＥと、当該ＴＲＥの下流に位置し、かつ当該ＴＲＥに制御される最小プロモーターと、当該最小プロモーターの下流に位置し、標的遺伝子を組み込むためのマルチクローニングサイトとを含む標的遺伝子発現用ベクターを組み合わせたキットは、標的遺伝子を発現させるＰＡ−Ｔｅｔ−ＯＦＦ／ＯＮシステムを構築するためのキットとして有用である。標的遺伝子発現用ベクターとしては、従来のＴｅｔ−ＯＦＦ／ＯＮシステムで使用されていたＴＲＥ搭載ベクターと同様のものをそのまま用いることもできる。
【００５７】
本発明に係るＰＡ−Ｔｅｔ−ＯＦＦ／ＯＮシステムが、Ｃｒｙ２／ＣＩＢ１−ＰＡ結合スイッチを利用する場合には、ＰＡ−Ｔｅｔ制御発現効率がより高いことから、ＰＡ−Ｔｅｔ−ＯＦＦ／ＯＮシステム用キットに含まれる前記第１融合タンパク質発現カセットを含む発現ベクターとしては、ＴｅｔＲ又はｒＴｅｔＲと、ＣＩＢ１又はその変異体とが連結された第１の融合タンパク質をコードする遺伝子を備える第１融合タンパク質発現カセットを含む発現ベクターが好ましく、前記第２融合タンパク質発現カセットを含む発現ベクターとしては、ｐ６５ＡＤと、Ｃｒｙ２又はその変異体とが連結された第２の融合タンパク質をコードする遺伝子を備える第２融合タンパク質発現カセットを含む発現ベクターが好ましい。また、前記第１融合タンパク質発現カセットを含む発現ベクター及び前記第２融合タンパク質発現カセットを含む発現ベクターに代えて、ＴｅｔＲ又はｒＴｅｔＲとＣＩＢ１又はその変異体とが連結された融合タンパク質と、ｐ６５ＡＤとＣｒｙ２又はその変異体とが連結された融合タンパク質とが、Ｔ２Ａ自己消化ペプチドで連結されたタンパク質の発現カセットを含む発現ベクターを含むキットも好ましい。前記第１融合タンパク質発現カセットを含む発現ベクター及び前記第２融合タンパク質発現カセットを含む発現ベクターに代えて、ＴｅｔＲ又はｒＴｅｔＲとＣＩＢ１又はその変異体とが連結された融合タンパク質と、ｐ６５ＡＤとＣｒｙ２又はその変異体とが連結された融合タンパク質とをバイシストロニック発現させる発現カセットを含む発現ベクターを含むキットも好ましい。
【００５８】
本発明に係るＰＡ−Ｔｅｔ−ＯＦＦ／ＯＮシステムが、ＢｐｈＰ１／Ｑ−ＰＡＳ１−ＰＡ結合スイッチを利用する場合には、ＰＡ−Ｔｅｔ制御発現効率がより高いことから、ＰＡ−Ｔｅｔ−ＯＦＦ／ＯＮシステム用キットに含まれる前記第１融合タンパク質発現カセットを含む発現ベクターとしては、ＴｅｔＲ又はｒＴｅｔＲと、ＢｐｈＰ１又はその変異体とが連結された第１の融合タンパク質をコードする遺伝子を備える第１融合タンパク質発現カセットを含む発現ベクターが好ましく、前記第２融合タンパク質発現カセットを含む発現ベクターとしては、ｐ６５ＡＤと、Ｑ−ＰＡＳ１又はその変異体とが連結された第２の融合タンパク質をコードする遺伝子を備える第２融合タンパク質発現カセットを含む発現ベクターが好ましい。また、前記第１融合タンパク質発現カセットを含む発現ベクター及び前記第２融合タンパク質発現カセットを含む発現ベクターに代えて、ＴｅｔＲ又はｒＴｅｔＲとＢｐｈＰ１又はその変異体とが連結された融合タンパク質と、ｐ６５ＡＤとＱ−ＰＡＳ１又はその変異体とが連結された融合タンパク質とが、Ｔ２Ａ自己消化ペプチドで連結されたタンパク質の発現カセットを含む発現ベクターを含むキットも好ましい。前記第１融合タンパク質発現カセットを含む発現ベクター及び前記第２融合タンパク質発現カセットを含む発現ベクターに代えて、ＴｅｔＲ又はｒＴｅｔＲとＢｐｈＰ１又はその変異体とが連結された融合タンパク質と、ｐ６５ＡＤとＱ−ＰＡＳ１又はその変異体とが連結された融合タンパク質とをバイシストロニック発現させる発現カセットを含む発現ベクターを含むキットも好ましい。
【実施例】
【００５９】
次に、実施例等により本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらの例によって限定されるものではない。【００６０】
＜コンストラクト＞
以降の実験において用いたコンストラクトは、以下の通りに作製した。
ＰＡ−Ｔｅｔ−ＯＦＦ候補コンストラクトの機能的スクリーニングのために、ＴｅｔＲ（配列番号１）のＤＮＡ結合、二量体化、及びＴｅｔ結合ドメイン（ＴｅｔＲの１〜２０６残基。以下、「ＴｅｔＲ（１−２０６）」と示す。）、及びｐ６５ＡＤ（配列番号２）を、それぞれｐＬＶＰＴ−ｔＴＲ−ＫＲＡＢ（プラスミド＃11642、Addgene社製）（非特許文献１２）及びｐＥＦ−ｈＧＡＶＰＯ（非特許文献２及び１３）を用いて増幅した。Ｃｒｙ２（配列番号３）の変異体（Ｃｒｙ２ ＰＨＲ、Ｃｒｙ２ ＰＨＲ（Ｌ３４８Ｆ）、Ｃｒｙ２ ５３５、及びＣｒｙ２５３５（Ｌ３４８Ｆ））とＣＩＢ１（配列番号４）及びその変異体（核局在配列［ＮＬＳ］なしのＣＩＢ１、ＣＩＢＮ、ＮＬＳなしのＣＩＢＮ、及びＣＩＢ８１）とをコードする哺乳類コドンに最適化された配列からなる核酸は、FASMAC社によって合成された（非特許文献１０、１１、及び１４）。フレキシブルリンカーの配列を検証するために、Ｓ２Ａ点突然変異を有するｔＴＡ−Ａｄ（pTet-OFF Advanced、Clontech/TAKARA社製）由来の配列を使用した。ｔＴＡ−Ａｄ（Ｓ２Ａ、１〜２０６残基）によってコードされたアミノ酸配列は、ＴｅｔＲ（１〜２０６残基）のアミノ酸配列と同一であった。これらの配列を用いて、ＴｅｔＲ（１〜２０６残基）又はｐ６５ＡＤを、Ｃｒｙ２変異体又はＣＩＢ１変異体に融合させ、さらなる点変異、ＮＬＳ、Ｔ２Ａ、又はＦＬＡＧ（登録商標）タグの配列を、コンベンショナルオーバーラップポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）伸長、制限酵素消化、及びライゲーション法により、導入又は付加した。これらのコンストラクトを、ヒト伸長因子１ａプロモーター配列及びポリアデニル化配列を含む発現ベクタープラスミド（ｐＥＦ−ＢＯＳ）及びその変異体（非特許文献１５）にクローニングした。全ての調製されたコンストラクトは、ＤＮＡ配列決定により確認した。【００６１】
ＰＡ−Ｔｅｔ−ＯＮ候補コンストラクトを生成するために、以下のリバース表現型（変異型）突然変異を有するＴｅｔＲ配列を合成した：ｒｔＴＡ（Ｅ７１Ｋ、Ｄ９５Ｎ、Ｌ１０１Ｓ、Ｇ１０２Ｄ）、Ｓ２（Ｅ１９Ｇ、Ａ５６Ｐ、Ｄ１４８Ｅ、Ｈ１７９Ｒ）、Ｍ２（Ｓ１２Ｇ、Ｅ１９Ｇ、Ａ５６Ｐ  、Ｄ１４８Ｅ、Ｈ１７９Ｒ）、Ｖ１０（Ｅ１９Ｇ、Ａ５６Ｐ、Ｆ６７Ｓ、Ｆ８６Ｙ、Ｄ１４８Ｅ、Ｒ１７１Ｋ、Ｈ１７９Ｒ）、Ｖ１６（Ｖ９Ｉ、Ｅ１９Ｇ、Ａ５６Ｐ、Ｆ６７Ｓ、Ｆ８６Ｙ、Ｄ１４８Ｅ、Ｒ１７１Ｋ、Ｈ１７９Ｒ）（非特許文献１）。次に、これらの配列を、ＰＡ−Ｔｅｔ−ＯＦＦプラスミドのＴｅｔＲ配列と置換した。ＰＡ−Ｔｅｔ−ＯＦＦ／ＯＮ活性のためのレポータープラスミドは、Pyrearinus termitilluminansエメラルドルシフェラーゼ（Ｅｌｕｃ）（TOYOBO社製）を用いて作製した。Ｅｌｕｃを迅速に分解させて細胞内におけるレポーターの長期蓄積を防ぐために、ＥｌｕｃのＮ末端に、１コピーの変異型ユビキチン（Ｇ７６Ｖ）に融合させた（非特許文献１６）。Ｕｂ−Ｅｌｕｃコード配列をＴＲＥｔｉｇｈｔプラスミド（Clontech/TAKARA社製）に挿入した（ｐＴＲＥｔｉｇｈｔ−Ｕｂ−ＥＬｕｃレポーター）。【００６２】
レンチウイルスベクターのためのプラスミド構築において、ＰＡ−Ｔｅｔコンストラクトのコード配列を、ＣＳＩＩ−ＥＦ−ＭＣＳプラスミド、ＣＳＩＩ−ＥＦ−ＭＣＳ−ＩＲＥＳ２−Ｂｓｄプラスミド、ＣＳＩＩ−ＥＦ−ＭＣＳ−ＩＲＥＳ２−ｍＣｈｅｒｒｙＮＬＳプラスミド、又はＣＳＩＩ−ＣＡＧ−ＭＣＳプラスミドのマルチクローニングサイトに挿入した（非特許文献２及び１７）。Ｂｓｄはブラストサイジン耐性遺伝子である。 ＣＳＩＩ−ＥＦ−ＭＣＳは、伸長因子（ＥＦ）プロモーターを除去するためにＡｇｅＩで消化し、ＬＴＲ（long terminal repeat）を介した転写の影響をさけるために、ＴＲＥ３Ｇ配列（Clontech/TAKARA社製）及びマウスＨｅｓ１遺伝子の３’−非翻訳領域（ＵＴＲ）を逆向きにクローニングした。Ｕｂ−ＮＬＳ−ｌｕｃ２（ユビキチン化し、ＮＬＳを付加した、不安定化ホタルルシフェラーゼ）又はｌｕｃ２をコードする配列を、ＴＲＥ３Ｇ配列の直後に挿入した。以下、Ｕｂ−ＮＬＳ−ｌｕｃ２をコードする配列を挿入したものをＴＲＥ３Ｇ−Ｕｂ−ＮＬＳ−ｌｕｃ２−Ｈｅｓ１ ３’ＵＴＲレンチウイルスベクターといい、ｌｕｃ２をコードする配列を挿入したものをＴＲＥ３Ｇ−ｌｕｃ２−Ｈｅｓ１ ３’ＵＴＲレンチウイルスベクターという。【００６３】
アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターのプラスミドコンストラクトにおいて、ＦＬＡＧ−ＴｅｔＲ（Ｉ１９４Ｔ、１〜２０６残基）−ＣＩＢＮ（ＮＬＳなし）−Ｔ２Ａ−ｍＣｈｅｒｒｙＮＬＳコンストラクト又はＮＬＳ付加Ｃｒｙ２ ＰＨＲ（Ｌ３４８Ｆ）−ｐ６５ ＡＤのＮ末融合コンストラクトを、ｐＡＡＶ−ＣＡＧ−ＡｒｃｈＴ−ＧＦＰ（plasmid #29777、Addgene社製）のマルチクローニングサイトに、ＢａｍＨＩ及びＥｃｏＲＩ消化によってＡｒｃｈＴ−ＧＦＰ配列を除去して挿入した。ＴＲＥによって制御されたＧＦＰレポータープラスミドは、ＩＴＲ（inverted terminal repeats）に隣接した発現カセットを作成するために、ｐＦＢＡＡＶベクター（非特許文献１８）に、ＴＲＥ３Ｇｓ配列と、不安定化シグナルを含むｓｆＧＦＰ（非特許文献１９）のｃＤＮＡと、ポリＡシグナル配列とを挿入することにより構築した（ｐＦＢＡＡＶ−ＴＲＥ３Ｇ−ＧＦＰ−ｐｅｓｔ−ＳＶ４０ｐＡ）。【００６４】
また、ＲｐＢｐｈＰ１（非特許文献２７）及びＱ−ＰＡＳ１（非特許文献２８及び２９）をコードする哺乳類コドンに最適化された配列からなる核酸は、FASMAC社によって合成された。これらの核酸を用いて、ＴｅｔＲ（１〜２０６残基）及びｐ６５ＡＤ又はこれらの各種改変体と融合させたコンストラクトを、ｐＥＦ−ＢＯＳ及びその変異体にクローニングした。全ての調製されたコンストラクトは、ＤＮＡ配列決定により確認した。その他のウイルスベクターも前記と同様にして作製した。【００６５】
＜細胞培養＞
以降の実験において、特段の記載がない限り、細胞培養は以下の通りに行った。
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞及びＥｐｈ４細胞（ＡＴＣＣ[American Type Culture Collection]）は、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）（Hyclone、Thermo社製）及び１００ｕｎｉｔｓ／ｍＬのペニシリン及び１００ｍｇ／ｍＬのストレプトマイシン（いずれも、ナカライテスク社製）を補充したダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）（ナカライテスク社製又はGIBCO社製）中で、３７℃及び５％ＣＯ２環境下で培養した。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞及びＥｐｈ４細胞は、それぞれ、０．０５％及び０．２５％のトリプシン／ＥＤＴＡ（ナカライテスク社製又はGIBCO社製）を用いて継代した。【００６６】
＜レンチウイルスのパッケージング＞
以降の実験において、特段の記載がない限り、レンチウイルスのパッケージングは以下の通りに行った。
レンチウイルス粒子は、非特許文献２及び非特許文献１７等に記載された方法を使用して、パッケージングプラスミドをリン酸カルシウムコトランスフェクション又はリポフェクションを介して導入したＨＥＫ２９３Ｔ細胞によって産生された。上清の回収はトランスフェクションの２４時間後から開始し、３６時間まで行い、６，０００ｇで１６時間遠心分離して濃縮した。 得られたウイルスペレットを、最初の容量の１／１００から１／５００でリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）又は生理食塩水に再懸濁し、ウイルスアリコートを凍結させた。ウイルス力価は約１０８〜１０９ＩＵ（infectious units）／ｍＬであった。 培養細胞を、ＭＯＩ（multiplicity of infection）が１０〜２０の精製レンチウイルス粒子に感染させた。形質導入された細胞は、Ｂｓｄを共発現するレンチウイルスベクターについてはブラストサイジンＳ（２μｇ/ｍＬ、Invitrogen社製）により、ｍＣｈｅｒｒｙを共発現するレンチウイルスベクターについては蛍光活性化細胞選別によって選択した。【００６７】
＜光源＞
以降の実験において、特段の記載がない限り、光源は以下のものを使用した。
ＣＯ２インキュベーター内で培養細胞を青色光照射するために、ＬＥＤ光源（LEDB-SBOXH、OptoCode社製）を使用した。 顕微鏡下での青色光照明（パターン化された光のアプリケーションを除く。）では、４７０ｎｍのＬＡＭを備えたｐＥ−２ ＬＥＤ励起システム（CoolLED）によって青色光が生成された。脳の神経細胞に青色光（４６５ｎｍ）を当てるためには、ペンライト（Handy Blue Pro Plus、RelyOn社製）又はPlexBright（Plexon社製）によって青色光を送達した。【００６８】
＜パターン化された光のアプリケーション＞
青色発光ダイオード（X-Cite（登録商標）120LED、Excelitas Technologies社製）に備えられたモザイク３パターンイルミネータ（Andor Instruments、Belfast社製）を顕微鏡に取り付け、対物レンズを通しての光の供給に使用した。【００６９】
＜ルシフェラーゼアッセイ＞
以降の実験において、特段の記載がない限り、溶解した細胞のルシフェラーゼ活性は、ルシフェラーゼアッセイシステム（Promega社製）を用い、この製造業者のプロトコールに従ってアッセイした。【００７０】
＜ルシフェラーゼ活性の生細胞モニタリング＞
以降の実験において、特段の記載がない限り、ルシフェラーゼ活性の生細胞モニタリングは、以下の通りに行った。
集団レベルでの発光シグナルは、高感度光電子増倍管（ＰＭＴ）及びＬＥＤ青色光源（LEDB-SBOXH、OptoCode社製）を備えた生細胞モニタリングシステム（CL24B-LIC/B、Churitsu Electric 社製）によって記録した。細胞は、１ｍＭ  ルシフェリン含有培地を含む黒色２４ウェルプレート上に播種し、光子計数測定を行った。【００７１】
＜ＰＡ−Ｔｅｔ制御遺伝子発現の活性化及び不活性化の反応速度の推定＞
ＰＡ−Ｔｅｔ−ＯＦＦシステム及びＰＡ−Ｔｅｔ−ＯＮシステムにおけるＰＡ−Ｔｅｔ制御遺伝子発現のスイッチオン／オフの反応速度の半減期は、以下の３つのステップを用いて決定した。
第１に、光刺激とは独立した活動の線形傾向を除去するために、各波形を割り出した。デトレンド処理では、波形の中央絶対偏差よりも少ないデータ点で線形回帰を行い、回帰によって予測された値を波形の全ての点から差し引いた。第２に、光刺激によって誘導されたイベントエポックは、波形の各値を確率的閾値と比較することによって推定された。確率的閾値では、波形ベクトルの長さが同じ乱数をガウス分布から生成した。確率的閾値は、全ての分析において同じ方法によって生成された。波形の各値は、対応する時点での閾値と比較された。このプロセスを１００回反復し、閾値を超える確率が５０％を超える時点を事象（すなわちＰＡ−Ｔｅｔ制御遺伝子発現）として処理した。最後に、τｏｎとτｏｆｆの値は、イベントエポックの開始からピークまでの期間、及びイベントエポックのピークから終了までの期間として推定された。ＰＡ−Ｔｅｔ制御遺伝子発現のスイッチオン／オフ反応速度の半減期は、τｏｎ及びτｏｆｆ値を用いて計算した。【００７２】
＜ルシフェラーゼイメージング＞
以降の実験において、特段の記載がない限り、ルシフェラーゼイメージングは、以下の通りに行った。
細胞を５０〜６０％コンフルエントで３５ｍｍガラスベースディッシュ上に播種し、３７℃及び５％ＣＯ２でインキュベートした。次いで、１ｍＭ  ルシフェリンを培地に添加した。 バイオルミネセンス画像を、２０倍又は４０倍のディッピング対物レンズを備えた直立顕微鏡（IX83、Olympus社製）によって取得した。冷却したＣＣＤカメラ（iKon-M DU934P-BV、Andor社製）を用いてデジタル画像を取得した。フィルタ及びカメラコントロールは、ソフトウェア（MetaMorph（登録商標）、Universal Imaging社製）を用いて自動的に調節された。迷光は、電気システムをオフにすることによって除去された。イメージングシステムは、暗室で使用した。【００７３】
＜画像解析と定量＞
以降の実験において、特段の記載がない限り、画像解析と定量は、以下の通りに行った。
画像解析は、ImageJソフトウェアとカスタムプラグイン（非特許文献２及び２２）を使用して行った。この調査で使用されているImageJプラグインのカスタムコードは、要望に応じて入手できる。生物発光イメージングシーケンスファイルを解析するために、スタックファイルに「スパイクノイズフィルタ」を適用して宇宙線に起因するノイズ信号を除去した。ＣＣＤ読み出しノイズも「時間的バックグラウンド低減フィルタ」によって除去された。この正規化手順では、各時間フレームの撮像領域の外で測定されたバックグラウンド値を信号強度から差し引いた。「サーカディアン遺伝子発現」（ＣＧＥ）（http://bigwww.epfl.ch/sage/soft/circadian/）は、個々の細胞を追跡して生物発光シグナルを定量した。核局在ｍＣｈｅｒｒｙを共発現させ、動く細胞を検出して追跡するために使用した。核内の平均シグナル強度を測定し、Prism（登録商標）5.0ソフトウェア（GraphPad Software社製）で解析した。【００７４】
＜免疫蛍光染色＞
以降の実験において、特段の記載がない限り、免疫蛍光染色は、以下の通りに行った。
細胞又は組織をＰＢＳで洗浄し、室温で２０分間、４％  パラホルムアルデヒド／ＰＢＳで固定した。固定した細胞をＰＢＳで洗浄し、室温で２０分間、５％正常ロバ血清（ＮＤＳ）及び０．１％  Triton X-100／ＰＢＳでブロック及び透過処理し、１％  ＮＤＳを含むＰＢＳで希釈した一次抗体と４℃で一晩インキュベートした。次いで、ＰＢＳで洗浄し、Alexa 405、Alexa 488、又はAlexa 594（Invitrogen社製）に結合した通常の二次抗体と室温で１時間インキュベートした。染色された細胞又は組織を、LSM510又はLSM780共焦点顕微鏡（Zeiss社製）で撮影した。一次抗体は以下のものを使用した：マウスモノクローナル抗ＭＡＰ２抗体（M4403、Sigma社製）、ウサギポリクローナル抗ＧＦＰ抗体（A11122、ThermoFisher社製）、及びマウスモノクローナル抗ＮｅｕＮ抗体（MAB377、Millipore社製）。【００７５】
＜ＰＡ−Ｔｅｔ−ＯＦＦ／ＯＮの特性評価＞
以降の実験において、特段の記載がない限り、ＰＡ−Ｔｅｔ−ＯＦＦ／ＯＮの特性評価は以下の通りに行った。【００７６】
（１）ＰＡ−Ｔｅｔ−ＯＦＦ候補コンストラクトの機能スクリーニング
ＰＡ−Ｔｅｔ−ＯＦＦ候補コンストラクトの機能スクリーニングのために、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を５〜９×１０４細胞／ウェルで２４ウェルプレートに播種し、３７℃、５％ＣＯ２で２４時間培養した。次に、当該細胞を、製造者のプロトコールに従ってLipofectamine（登録商標）LTX（Invitrogen社製）又はポリエチレンイミン（Polysciences社製）でトランスフェクトした。Ｃｒｙ２／ＣＩＢ変異体と融合したｐＥＦ−ＴｅｔＲ（１−２０６）、Ｃｒｙ２／ＣＩＢ変異体と融合したｐＥＦ−ｐ６５ＡＤ、及びｐＴＲＥｔｉｇｈｔ−Ｕｂ−ＥＬｕｃレポーターの３つのプラスミドを、２５：２５：８（質量比）でコトランスフェクトした。ＤＮＡの総量は０．５８μｇ／ウェルとした。トランスフェクションから４８時間後、細胞を青色光（７．２Ｗ／ｍ２；１分ごとに２秒間パルス）に３時間曝露した。その後、当該細胞を溶解し、それらのルシフェラーゼ活性をプレートリーダー（ARVO X3、Perkin Elmer社製）で測定した。対照細胞は、プラスミドトランスフェクション後に暗所に保持した。Ｔ２Ａ配列を有するコンストラクトの分析のために、発現ベクター、ｐＢＳ（ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔプラスミド）、及びレポーターを２５：２５：８（質量比）で混合し、コトランスフェクトした。ｐＢＳを用いて、トランスフェクトされたＤＮＡの総量を調整した。【００７７】
（２）光照射強度と誘導された遺伝子発現レベルとの関係の分析
光照射強度と誘導された遺伝子発現レベルとの関係を分析するために、ＰＡ−Ｔｅｔ−ＯＦＦ及びＴＲＥ３Ｇ−Ｕｂ−ＮＬＳ−ｌｕｃ２−Ｈｅｓ１ ３’ＵＴＲレンチウイルスベクター（図８（Ｂ））で形質導入したＥｐｈ４細胞安定クローンを、５〜９×１０４細胞／ウェルで２４ウェルプレートに播種し、２４時間培養し、候補コンストラクトスクリーニングと同一の方法でアッセイした。青色光（７．２Ｗ／ｍ２；１分ごとに２秒間パルス）を、細胞に３時間、０、１．７、３．５、５．５、及び７．０Ｗ／ｍ２の放射照度で照射した。【００７８】
（３）Ｄｏｘ濃度と誘導された遺伝子発現レベルとの関係の分析
Ｄｏｘ濃度と誘導された遺伝子発現レベルとの関係を分析するために、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、５〜９×１０４細胞／ウェルで２４ウェルプレートに播種し、トランスフェクトし、候補コンストラクトスクリーニングと同様にアッセイした。Ｄｏｘを、ＰＡ−Ｔｅｔ−ＯＦＦコンストラクトについては０、１、７．５、１５、２０、５０、及び１００ｎｇ／ｍＬの濃度で、ＰＡ−Ｔｅｔ−ＯＮ構築物については０、１０、１５、２０、３０、３５、４０、５０、７５，１００、及び２５０ｎｇ／ｍＬの濃度で、細胞にアプライした。青色光（７．２Ｗ／ｍ２；１分ごとに２秒間パルス）は、細胞に３時間照射した。【００７９】
（４）光強度及びＤｏｘ濃度による二重対照の分析
光強度及びＤｏｘ濃度による二重対照を調べるために、ＰＡ−Ｔｅｔ−ＯＮ及びＴＲＥ３Ｇ−Ｕｂ−ＮＬＳ−ｌｕｃ２−Ｈｅｓ１ ３’ＵＴＲレンチウイルスベクターで形質導入した安定細胞クローンを、１×１０５細胞／ウェルで２４ウェルプレートに播種し、２４時間培養した。Ｄｏｘを、０、５０、７５、８７．５、９２．５、１００、２５０、及び５００ｎｇ／ｍＬの濃度で、細胞にアプライした。 青色光（７．２Ｗ／ｍ２；１分ごとに２秒間パルス）は、細胞に３時間、０、１．８、３．６、５．９、及び７．１Ｗ／ｍ２の放射照度で照射した。【００８０】
（５）ＰＡ−Ｔｅｔ−ＯＦＦ／ＯＮの時間的特性の評価
ＰＡ−Ｔｅｔ−ＯＦＦ／ＯＮの時間的特性を調べるために、トランスフェクトしたＨＥＫ２９３Ｔ細胞又はレンチウイルス形質導入Ｅｐｈ４細胞を使用した。細胞を、１×１０４細胞／ウェルで黒色２４ウェルプレート上に播種し、１〜２分間青色光（７．２Ｗ／ｍ２）に曝露した。集団レベルでの発光シグナルを、生細胞モニタリングシステム（CL24B-LIC/B、Churitsu Electric社製）によって記録した。【００８１】
（６）遺伝子発現を空間的に制御するＰＡ−Ｔｅｔ−ＯＦＦ／ＯＮシステムの能力の測定
標的細胞における遺伝子発現を空間的に制御するＰＡ−Ｔｅｔ−ＯＦＦ／ＯＮシステムの能力を調べるために、レンチウイルスで形質導入されたＥｐｈ４細胞を、５０〜６０％コンフルエントで３５ｍｍガラスベースのディッシュ（Cat ＃3910-035、IWAKI社製）に播種し、光照射前に、顕微鏡のチャンバーステージで３７℃及び５％ＣＯ２でインキュベートした。パターン化された光は、MOSAIC 3デバイスによって生成され、細胞にアプライされた。光（１０ｍｓパルス）を細胞に５０回加え、発光シグナルの時間的変化を得た。青色光源パワーを１００％に設定し、４０×対物レンズ（UApo 40×Oil Iris3/340、オリンパス社製）（ＮＡを０．５５に変更）を通して２００画素×２００画素領域を対象としたところ、測定された光エネルギーは１．３Ｗ／ｍ２であった。【００８２】
＜統計解析＞
以降の実験において、特段の記載がない限り、統計解析は、Prism（登録商標）5.0又は6.0ソフトウェア（GraphPad社製）を用いて行った。０．０５未満のＰ値を有意とみなした。【００８３】
＜ニューロン初代培養＞
以降の実験において、特段の記載がない限り、ニューロン初代培養は以下の通りに行った。
海馬ニューロンは、非特許文献２０又は非特許文献２１に記載されている方法をわずかに改変して、１日齢の（Ｐ１）仔マウスの海馬のCA1/CA3/歯状回から得た。完結には、解離した細胞を、マトリゲル（Invitrogen社製）でコートしたカバースリップ（Assistant、Karl Hecht社製）上に播種し、１ｍＭのGlutaMAX（商標）-Iと２５μｇ／ｍＬのインスリンと２％のＧＳ２１神経栄養サプリメント（GlobalStem社製）と５％のＦＢＳ（Hyclone、Thermo社製）とを補充した最小必須培地で培養した。グリア増殖は、播種後２４〜４８時間の培地に４μＭのシトシンアラビノシド（Sigma社製）を添加することによって抑制した。【００８４】
＜組換えＡＡＶ産生＞
以降の実験において、特段の記載がない限り、組換えＡＡＶ産生は以下の通りに行った。
血清型ＤＪ／８  ＡＡＶは、ＩＴＲ含有ＡＡＶベクターをパッケージングベクターｐＡＡＶ−ＤＪ／８及びｐＨｅｌｐｅｒ（Cell Biolabs社製）と共にトランスフェクトしたＨＥＫ２９３Ｔ細胞において産生された。組換えＡＡＶ粒子を、トランスフェクトした細胞から抽出キット（AAVpro抽出溶液、TaKaRa Bio社製）を用いて集めた。回収されたＡＡＶ粒子は、超遠心分離を伴う不連続イオジキサノール勾配（OptiPrep、Alere Technologies AS社製）を用いてさらに精製され、限外濾過によってＰＢＳ中で濃縮された。精製されたＡＡＶのウイルス力価をｑＰＣＲによって測定し、ミリリットル当たり２〜１０×１０１２ゲノムコピー（ｇｃ／ｍＬ）に調節した。【００８５】
＜マウスの研究＞
以降の動物実験はいずれも、京都大学アニマルケア委員会により承認され、全ての関連規制基準に適合していた。【００８６】
（１）発生中のマウス脳の神経幹／前駆細胞におけるＰＡ−Ｔｅｔ−ＯＦＦ／ＯＮシステムの検証
発生中のマウス脳の神経幹／前駆細胞におけるＰＡ−Ｔｅｔ−ＯＦＦ／ＯＮシステムの検証のために、ｐＥＦ−ｍＣｈｅｒｒｙＮＬＳ、ｐＥＦ−ＰＡ−Ｔｅｔ−ＯＦＦ、及びＣＳＩＩ−ＴＲＥ３Ｇ−ＮＬＳ−Ｕｂ−ｌｕｃ２−Ｈｅｓ１  ３’ＵＴＲプラスミドを１：２：２（質量比）で混合し、子宮外電気穿孔法（非特許文献２及び２３）によってＥ１４．５背側終脳前駆細胞にコトランスフェクションした。終脳の脳室にプラスミドＤＮＡ（２．５μｇ／μＬ）をマイクロインジェクションし、新皮質の脳室表面における神経幹／前駆細胞へプラスミドをトランスフェクションするために、子宮外電気穿孔法（６パルス、５０ｍＶ、方形波ジェネレーター（CUY21、BEX社製）、５ｍｍパドル電極）を行った。脳を直ちに解剖し、非特許文献２及び非特許文献２３に記載の方法で、３％低融点アガロースに包埋し、ビブラトーム（VT1000、Leica社製）を用いて２５０μｍの器官型切片に切断し、１２ｍｍウェルカルチャーインサート（Millicell、PICM01250、Merck社製）に移し、切片培養培地中で培養した。切片は、周期的青色光照射下、３７℃、５％  ＣＯ２でインキュベートした。【００８７】
（２）成体脳のニューロンにおけるＰＡ−Ｔｅｔ−ＯＦＦ／ＯＮシステムの検証
成体脳のニューロンにおけるＰＡ−Ｔｅｔ−ＯＦＦ／ＯＮシステムの検証のために、非特許文献１８及び非特許文献２４に記載されているように、先鋭なガラスのマイクロピペットを用いて、マウスに定位ウイルス注射を行った。マウス（１０〜１４週齢）は、４４０ｍｇ／ｋｇの抱水クロラール（東京化成工業社製）を腹腔内注射して麻酔した。乾燥防止のためにペトロラタムを両眼にアプライし、頭皮を脱毛クリームで処理した。次いで、マウスを小動物定位固定装置（David Kopf Instruments社製）に固定した。頭皮を正中線で切断し、外科用ナイフを用いて骨膜を除去した。頭蓋骨をドリルで薄くし、２７ゲージの針を用いて小さな開頭術を行った。ウイルスは、シリンジポンプ装置（World Precision Instruments社製）を用いてポンプ輸送されたハミルトンシリンジ（Hamilton Company）に連結された引っ張られたガラスマイクロピペットを通して注入された。定位注射は、定位注射を、適切な座標で次の組織に投与した：海馬の歯状回（Ａ／Ｐ：ブレグマから−１．９４ｍｍ、Ｍ／Ｌ：ブレグマから±１．３ｍｍ、Ｄ／Ｖ：軟膜表面から−１．８２ｍｍ）。２つのＡＡＶベクター（ＣＡＧ−ＦＬＡＧ−ＴｅｔＲ（Ｉ１９４Ｔ，１−２０６）−ＣＩＢＮ（−ＮＬＳ）−Ｔ２Ａ−ｍＣｈｅｒｒｙＮＬＳコンストラクトを含むＡＡＶ２−ＤＪ／８ベクター及びＣＡＧ−ＮＬＳ−ａｔｔａｃｈｅｄ  Ｃｒｙ２  ＰＨＲ（Ｌ３４８Ｆ）−ｐ６５  ＡＤＮ末融合コンストラクトを含むＡＡＶ２−ＤＪ／８ベクター）は、１：１の比率（タイター比）でコトランスフェクションした。ウイルス溶液を０．５〜１．５μＬの容量で０．１μＬ／分の速度で注入し、注射後、ピペットを除去する前にさらに１０分間定位置に保持した。マイクロピペットの除去後、皮膚切開部を縫合し、抗生物質クリームで処置し、鎮痛剤を皮下注射して手術後の痛みを和らげた。インジェクション後の動物は、青色光暴露前に通常２週間飼育した。皮質ニューロンへのＡＡＶ形質導入のために、カスタムヘッドプレートを接着し、頭蓋骨に固定した。視覚野の領域に亘って、頭蓋切開（約３．５ｍｍ）を行った。３つのＡＡＶベクター（ＣＡＧ−ＦＬＡＧ−ＴｅｔＲ（Ｉ１９４Ｔ，１−２０６）−ＣＩＢＮ（−ＮＬＳ）−Ｔ２Ａ−ｍＣｈｅｒｒｙＮＬＳコンストラクトを含むＡＡＶ２−ＤＪ／８ベクター、ＣＡＧ−ＮＬＳ−ａｔｔａｃｈｅｄ  Ｃｒｙ２  ＰＨＲ（Ｌ３４８Ｆ）−ｐ６５  ＡＤＮ末融合コンストラクトを含むＡＡＶ２−ＤＪ／８ベクター、及びＴＲＥ３Ｇ−ｌｕｃ２−  Ｈｅｓ１  ３’  ＵＴＲコンストラクトを含むＡＡＶ２−ＤＪ／８ベクター）は、１：１：１の比率（タイター比）でコトランスフェクションした。【００８８】
（３）ＡＡＶ形質導入後の光刺激
ＡＡＶ形質導入の１４日後に、光刺激を開始した。 
皮質光照射の場合には、カスタムヘッドプレート及び慢性頭窓を移植し、マウスを青色ペンライト下で固定した。背側皮質を青色光（１００Ｗ／ｍ２；３０分ごとに３分間のパルス）で６時間照射した。【００８９】
成体マウスの海馬への光照射の場合には、覚醒して自由に動くマウスを、ファイバパッチケーブル及び回転ジョイントを介して光学インプラントに接続された青色ＬＥＤ（PlexBright、Plexon社製）を用いて、８５．６Ｗ／ｍ２の強度、１．６％のデューティサイクル（０．０１６Ｈｚで１秒間パルス）で、１２時間処理した。青色光照射後、マウスを直ちに屠殺し、灌流した。切開した脳を免疫組織化学に供した。【００９０】
マウス仔の脳への光照射の場合には、麻酔したマウスを、青色ＬＥＤ（PlexBright、Plexon社製）を用いて光ファイバーを介して刺激した。 青色光（４０Ｗ／ｍ２；１５秒ごとに１秒間のパルス；３時間持続）を照射後、マウスを直ちに屠殺し、青色光を照射した右脳を直ちに抽出し、溶解させ、それらのルシフェラーゼ活性を測定した。【００９１】
（４）Ｄｏｘ処理
マウスへのＤｏｘ処理は、長期のＤｏｘ投与の場合には、５質量％ショ糖溶液中に１ｍｇ／ｍＬのＤｏｘを含む飲料水をマウスに与えた。Ｄｏｘパルス処置の場合には、１回の腹腔内注射によりマウスに０．１ｍｇ／ｇ体重のＤｏｘを与えた。【００９２】
（５）皮下組織における分析
まず、レンチウイルスベクターを用いたＰＡ−Ｔｅｔ−ＯＦＦ形質導入Ｅｐｈ４細胞の安定細胞クローンを、成体マウスの背皮の皮下組織に移植した。移植は、当該安定細胞クローンの２〜５×１０６個の細胞を、皮下組織に注射することにより行った。Ｅｐｈ４細胞注射の２４時間後に、さらに２００ｍｇ／ｇ体重のルシフェリンを腹腔内、皮下、及び筋肉内に注射したマウスを、ＣＣＤカメラ（iXon3、ANDOR社製）で画像化した。麻酔した後に、マウスの背部皮膚の移植領域に青色光（２００Ｗ／ｍ２；１分間）を照射して、マウス体内のルシフェリン基質の変動によって生じるルシフェラーゼシグナルを測定した。Ｄｏｘ処理を行う場合には、Ｄｏｘ（０．１ｍｇ／ｇ体重）を、青色光照射の１時間前に腹腔内注射した。ルシフェラーゼシグナルの変化を補正するために、ｐＥＦ−ｌｕｃ２発現ベクターでトランスフェクションしたＥｐｈ４細胞を、独立してマウスに移植した。これらの対照マウスを、ＰＡ−Ｔｅｔ−ＯＦＦ導入Ｅｐｈ４細胞で移植したマウスと共に画像化した。対照マウスの発光データを、移植されたＰＡ−Ｔｅｔ−ＯＦＦ導入Ｅｐｈ４細胞における光誘導転写の補正に使用した。青色光照射後３０〜６０分間の発光シグナルの平均値を棒グラフでプロットした。【００９３】
［実施例１］
Ｔｅｔ−ＯＦＦシステムに、Ｃｒｙ２／ＣＩＢ１−ＰＡ結合スイッチを組み込むことにより、光照射とＴｅｔ系化合物により標的遺伝子の発現を誘導するＰＡ−Ｔｅｔ−ＯＦＦシステムの構築を試みた。構築には、不死化ヒト胚性腎臓細胞株ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を用い、哺乳動物細胞において最適なＰＡ−Ｔｅｔ遺伝子発現系を調べた。具体的には、Ｔｅｔオペレーターと、Ｔｅｔオペレーターの下流に位置し、かつ当該Ｔｅｔオペレーターに制御されるプロモーターと、当該プロモーターの下流に位置し、かつ当該プロモーターに発現を制御されるＵｂ−Ｅｌｕｃ遺伝子とを備える発現カセットを含むレポータープラスミド（ｐＴＲＥｔｉｇｈｔ−Ｕｂ−ＥＬｕｃレポーター）と、ＴｅｔＲにＣｒｙ２及びＣＩＢ１のいずれか一方を融合させた融合タンパク質の発現カセットを含むプラスミドと、ｐ６５ＡＤタンパク質にＣｒｙ２及びＣＩＢ１の残る他方を融合させた融合タンパク質の発現カセットを含むプラスミドと、をＨＥＫ２９３Ｔ細胞に導入し、得られた形質転換細胞に対して、Ｔｅｔ系化合物非存在下で青色光を照射し、Ｕｂ−ＥＬｕｃの相対発現レベルを調べた。【００９４】
図１に、使用したＰＡ−Ｔｅｔ−ＯＦＦ候補コンストラクトを模式的に示した図である。図中、「ＰＨＲ」はフォトリアーゼ相同領域を示し、「ＮＬＳ」は核局在シグナルを示す。また、ＴｅｔＲとしては、ＴｅｔＲ（１−２０６）のうち、１９４番目のイソロイシン残基がトレオニン残基に置換された点変異体（「ＴｅｔＲ（Ｉ１９４Ｔ、１−２０６）」と示す。）を用いた。【００９５】
図１（Ａ）は、Ｃｒｙ２及びその変異体のアミノ酸配列を、図１（Ｂ）は、ＣＩＢ１及びその変異体のアミノ酸配列を、それぞれ模式的に示した図である。図１（Ｂ）中、「（ｗｉｔｈｏｕｔ  ＮＬＳ）」はＮＬＳ欠損体を意味し、ＣＩＢ１のＮＬＳ配列（９３番目〜１０７番目のアミノ酸領域）のうち、９３番目のリジン、９４番目のアルギニン、１０６番目のリジン及び１０７番目のリジンがいずれもアラニンに置換された変異体を示す。なお、使用したＣｒｙ２及びその変異体、並びにＣＩＢ１及びその変異体の全ては、哺乳動物細胞における効率的な発現のためにコドンを最適化した。【００９６】
図１（Ｃ）〜（Ｆ）は、各試験で使用したＴｅｔＲを含む融合タンパク質とｐ６５ＡＤタンパク質を含む融合タンパク質の組み合わせを模式的に示した図である。図１（Ｃ）は、ＴｅｔＲ（Ｉ１９４Ｔ、１−２０６）−Ｃｒｙ２変異体融合コンストラクトと、ｐ６５ＡＤ−ＣＩＢ１変異体融合コンストラクトの組み合わせを示す。図１（Ｄ）は、ＴｅｔＲ（Ｉ１９４Ｔ、１−２０６）−Ｃｒｙ２変異体融合コンストラクトと、ＣＩＢ１変異体−ｐ６５ＡＤＮ末端融合コンストラクトの組み合わせを示す。図１（Ｅ）は、ＴｅｔＲ（Ｉ１９４Ｔ、１−２０６）−ＣＩＢ１変異体融合コンストラクトと、ｐ６５ＡＤ−Ｃｒｙ２変異体融合コンストラクトの組み合わせを示す。図１（Ｆ）は、ＴｅｔＲ（Ｉ１９４Ｔ、１−２０６）−ＣＩＢ１変異体融合コンストラクトと、Ｃｒｙ２変異体−ｐ６５ＡＤＮ末端融合コンストラクトの組み合わせを示す。【００９７】
それぞれの候補コンストラクトの光依存性転写活性をアッセイした。なお、青色光照射は、細胞溶解の３時間前にのみ、パルス青色光（例えば、１分ごとに２秒間のパルス）を細胞に曝露した。全ての実験は独立した３回の試行（３バッチ）を行い、同等の結果を得た。結果を表１〜４に示す。表１は図１（Ｃ）に示す候補コンストラクトの結果を、表２は図１（Ｄ）に示す候補コンストラクトの結果を、表３は図１（Ｅ）に示す候補コンストラクトの結果を、表４は図１（Ｆ）に示す候補コンストラクトの結果を、それぞれ示す。表１〜４中、「Element #1」欄の「linker」は、ＴｅｔＲ（Ｉ１９４Ｔ、１−２０６）とそのＣ末端側に融合させるＣｒｙ２変異体又はＣＩＢ１変異体とを連結するリンカーのアミノ酸配列を示す。また、「An initial construct screening result」欄は最初の１バッチの結果を示し、当該欄中、「Dark」及び「Light」は、それぞれ、暗条件下及び青色光照射時にルシフェラーゼアッセイを行い、画像解析により定量された発光シグナル強度（Ｕｂ−ＥＬｕｃの相対発現レベル）の相対値（Negative Controlの暗条件下での発光シグナル強度を１とする）を示し、「Light/ Dark」は両者の比を示す。「Three independent data sets to confirm reproducibility」欄中、「Average of the Light/Dark ratio」は独立した３バッチの、「Light/ Dark」比率の平均値を示し、「S.D. of the Light/Dark ratio」はその標準偏差を示す。【００９８】
【表１】
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【００９９】
【表２】
2020045651.tif 000003
【０１００】
【表３】
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【０１０１】
【表４】
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【０１０２】
表１〜４に示す通り、ＴｅｔＲ（Ｉ１９４Ｔ、１−２０６）をＣｒｙ２及びその変異体のＮ末端側に連結させたコンストラクト（図１（Ｃ）及び（Ｄ））を用いた場合よりも、ＴｅｔＲ（Ｉ１９４Ｔ、１−２０６）をＣＩＢ１及びその変異体のＮ末端側に連結させたコンストラクト（図１（Ｅ）及び（Ｆ））を用いた場合のほうが、暗条件下のＵｂ−Ｅｌｕｃ発現量に対する光照射時のＵｂ−Ｅｌｕｃ発現量の比（表中、「Average of the Light/Dark ratio」の欄の値。以下、「Light/Dark比率」ということがある。）が大きく、青色光照射によるＵｂ−Ｅｌｕｃの発現誘導がより効率的になされることがわかった。特に、ＴｅｔＲ（Ｉ１９４Ｔ、１−２０６）−ＣＩＢ１変異体融合コンストラクトとｐ６５ＡＤ−Ｃｒｙ２変異体融合コンストラクトの組み合わせ（図１（Ｅ））は、ＴｅｔＲ（Ｉ１９４Ｔ、１−２０６）−ＣＩＢ１変異体融合コンストラクトとＣｒｙ２変異体−ｐ６５ＡＤＮ末端融合コンストラクトの組み合わせ（図１（Ｆ））よりも、Light/Dark比率がより大きく、ＰＡ−Ｔｅｔ制御発現効率が高い傾向にあった。なかでも、ＣＩＢ１変異体としてＣＩＢＮ（ＣＩＢ１の１〜１７０残基の部分コンストラクト）又はＣＩＢＮ（−ＮＬＳ）（ＣＩＢＮのＮＬＳに変異を入れて核局在シグナルを除いたコンストラクト）を用い、Ｃｒｙ２変異体としてＣｒｙ２  ＰＨＲ（Ｃｒｙ２の１〜４９６残基の部分コンストラクト）又はＣｒｙ２  ５３５（Ｃｒｙ２の１〜５３５残基の部分コンストラクト）を用いたコンストラクト（コンストラクトＩＤがＴ５３、Ｔ５５、Ｔ５７、Ｔ５９、Ｔ６１、Ｔ６３のコンストラクト）が、ＰＡ−Ｔｅｔ制御発現効率が他の候補コンストラクトよりも顕著に高かった。また、Ｔ５９コンストラクトとＴ６３コンストラクトとの比較、及び、Ｔ６０コンストラクトとＴ６４コンストラクトとの比較から、ＣＩＢ１変異体としてＣＩＢＮ（−ＮＬＳ）を用いた場合には、ｐ６５ＡＤのＮ末端側に核移行シグナルを２つタンデムに連結させる（表中、「ＮＬＳ×２」）ことにより、さらにＰＡ−Ｔｅｔ制御発現効率が改善されることもわかった。【０１０３】
［実施例２］
実施例１においてＰＡ−Ｔｅｔ−ＯＦＦコンストラクトであることが確認されたＴ８６コンストラクト（Ｅｌｅｍｅｎｔ＃１：配列番号５、Ｅｌｅｍｅｎｔ＃２：配列番号６）を用いて、ＴｅｔＲとＣＩＢ１誘導体のリンカー配列のＰＡ−Ｔｅｔ制御発現効率に対する影響と、ＴｅｔＲのＩ１９４のアミノ酸置換のＰＡ−Ｔｅｔ制御発現効率に対する影響と、を調べた。対照として、表４に記載の「Negative control」のコンストラクト（Ｅｌｅｍｅｎｔ＃１：配列番号７、Ｅｌｅｍｅｎｔ＃２：配列番号８）を用いた。また、Ｔ８６コンストラクトのうち、ＴｅｔＲ（Ｉ１９４Ｔ、１−２０６）を野生型のＴｅｔＲ（１−２０６）としたコンストラクトについても同様に試験し、リンカー配列の影響を調べた。【０１０４】
図２（Ａ）に、実施例１で使用したＴ８６コンストラクトを含む発現カセットの模式図を示し、図２（Ｂ）に、実施例１で使用したｐＴＲＥｔｉｇｈｔ−Ｕｂ−ＥＬｕｃレポーターのＵｂ−Ｅｌｕｃ発現カセットの模式図を示す。また、図２（Ｃ）に、ＴｅｔＲ（Ｉ１９４Ｔ、１−２０６）−ＣＩＢ１（−ＮＬＳ）融合コンストラクトとＣｒｙ２  ＰＨＲ（Ｌ３４８Ｆ）−ｐ６５ＡＤ−ＮＬＳ×２融合コンストラクトを、Ｔ２Ａ自己切断ペプチドで連結したタンパク質［ＴｅｔＲ（Ｉ１９４Ｔ、１−２０６）−ＣＩＢ１（−ＮＬＳ）−Ｔ２Ａ−Ｃｒｙ２  ＰＨＲ（Ｌ３４８Ｆ）−ｐ６５ＡＤ−ＮＬＳ×２融合コンストラクト］（配列番号９）の発現カセットの模式図を示す。Ｔ８６コンストラクトは、実施例１のようにＴｅｔＲ（Ｉ１９４Ｔ、１−２０６）−ＣＩＢ１（−ＮＬＳ）融合コンストラクトの発現カセット（配列番号１０）を含むプラスミドと、Ｃｒｙ２  ＰＨＲ（Ｌ３４８Ｆ）−ｐ６５ＡＤ−ＮＬＳ×２融合コンストラクトの発現カセット（配列番号１１）を含むプラスミドを細胞内へ共発現させた場合よりも、ＴｅｔＲ（Ｉ１９４Ｔ、１−２０６）−ＣＩＢ１（−ＮＬＳ）−Ｔ２Ａ−Ｃｒｙ２  ＰＨＲ（Ｌ３４８Ｆ）−ｐ６５ＡＤ−ＮＬＳ×２融合コンストラクトの発現カセット（配列番号１２）を含むプラスミドを細胞内へ発現させた場合のほうが、ＰＡ−Ｔｅｔ制御発現効率が高かった。このため、リンカー配列の効果の検証とＴｅｔＲのＩ１９４のアミノ酸置換の効果の検証には、ＴｅｔＲ（Ｉ１９４Ｔ、１−２０６）−ＣＩＢ１（−ＮＬＳ）−Ｔ２Ａ−Ｃｒｙ２  ＰＨＲ（Ｌ３４８Ｆ）−ｐ６５ＡＤ−ＮＬＳ×２融合コンストラクトを適宜改変したものを使用した。【０１０５】
図３に示すタンパク質又はその変異体をコードする遺伝子の発現カセットを含むプラスミドを、ｐＴＲＥｔｉｇｈｔ−Ｕｂ−ＥＬｕｃレポーターと共にＨＥＫ２９３Ｔ細胞に導入し、得られた形質転換細胞に対して、Ｔｅｔ系化合物非存在下で青色光を照射し、Ｕｂ−ＥＬｕｃの光依存性転写活性を調べた。【０１０６】
ＴｅｔＲとＣＩＢ１誘導体のリンカー配列の効果の検証において、リンカー配列としては、２アミノ酸からなるＧＰ、５アミノ酸からなるＳＰＫＫＫ（配列番号１３）、２４アミノ酸からなるＴＧＮＳＡＤＧＧＧＧＳＧＧＳＧＧＳＧＧＧＳＴＱＧ（配列番号１４）、１６アミノ酸からなるＬＥＡＳＰＳＮＰＧＡＳＮＧＳＧＴ（配列番号１５）、１０アミノ酸からなるＧＹＰＳＨＷＲＰＬＥ（配列番号１６）、及び１０アミノ酸からなるＬＥＡＳＴＧＧＳＧＴ（配列番号１７）を用いた。各コンストラクトについて、暗条件下（図中、「Ｄａｒｋ」）と青色光照射時（図中、「Ｌｉｇｈｔ」）にルシフェラーゼアッセイを行い、画像解析により定量された発光シグナル強度を測定した。測定結果を図４に示す。図中のデータは、平均値±標準偏差（ｎ＝３）を表す。また、全ての実験は３回繰り返し、同等の結果を得た。【０１０７】
図３に示すように、ＴｅｔＲ（１−２０６）を用いたコンストラクトよりも、ＴｅｔＲ（Ｉ１９４Ｔ、１−２０６）を用いたコンストラクトのほうが、青色光照射時に発現誘導されたＵｂ−ＥＬｕｃの量が多く、ＰＡ−Ｔｅｔ制御発現効率が高いことがわかった。また、ＴｅｔＲ（Ｉ１９４Ｔ、１−２０６）とＣＩＢ１（−ＮＬＳ）とを連結するリンカー配列の種類によって、ＰＡ−Ｔｅｔ制御発現効率が影響を受けることがわかった。特に、リンカー配列がＳＰＫＫＫの場合に、青色光照射時にＵｂ−ＥＬｕｃの発現が充分に高く、かつ暗条件下でＵｂ−ＥＬｕｃの発現がほとんど観察されず、ＰＡ−Ｔｅｔ制御発現効率が特に優れていた。【０１０８】
ＴｅｔＲのＩ１９４のアミノ酸置換の効果の検証においては、ＴｅｔＲのＩ１９４を図４に示すアミノ酸に置換した変異体を用いた。各コンストラクトについて、同様にしてルシフェラーゼアッセイを行い、画像解析により定量された発光シグナル強度を測定した。測定結果を図４に示す。図中のデータは、平均値±標準偏差（ｎ＝３）を表す。また、全ての実験は３回繰り返し、同等の結果を得た。この結果、トレオニンに置換したＴｅｔＲ（Ｉ１９４Ｔ、１−２０６）が、顕著にＰＡ−Ｔｅｔ制御発現効率が優れていることがわかった。【０１０９】
［実施例３］
実施例１においてＰＡ−Ｔｅｔ−ＯＦＦコンストラクトであることが確認されたＴ８６コンストラクトを用いて、Ｔｅｔ系化合物非依存性のＰＡ発現制御システム（ＰＡ−Ｔｅｔ非依存性システム）と、ＰＡ−Ｔｅｔ−ＯＮシステムの構築を試みた。Ｔｅｔ系化合物としてＤｏｘを用いた。【０１１０】
ＰＡ−Ｔｅｔ非依存性システムのコンストラクトは、図２（Ｃ）に示すＴ８６コンストラクト中のＴｅｔＲ（Ｉ１９４Ｔ、１−２０６）に、Ｈ１００Ｙ（１００番目のヒスチジン残基をチロシンに置換する点変異、以下同様。）を導入することにより構築した。また、ＰＡ−Ｔｅｔ−ＯＮシステムのコンストラクトは、図２（Ｃ）に示すＴ８６コンストラクト中のＴｅｔＲ（Ｉ１９４Ｔ、１−２０６）に、ＴｅｔＲについて公知の以下の５種の逆表現型突然変異（Reverse Tet mutation）を導入することにより構築した：ｒｔＴＡ（Ｅ７１Ｋ、Ｄ９５Ｎ、Ｌ１０１Ｓ、Ｇ１０２Ｄ）、Ｓ２（Ｅ１９Ｇ、Ａ５６Ｐ、Ｄ１４８Ｅ、Ｈ１７９Ｒ）、Ｍ２（Ｓ１２Ｇ、Ｅ１９Ｇ、Ａ５６Ｐ、Ｄ１４８Ｅ、Ｈ１７９Ｒ）、Ｖ１０（Ｅ１９Ｇ、Ａ５６Ｐ、Ｆ６７Ｓ、Ｆ８６Ｙ、Ｄ１４８Ｅ、Ｒ１７１Ｋ、Ｈ１７９Ｒ）、Ｖ１６（Ｖ９Ｉ、Ｅ１９Ｇ、Ａ５６Ｐ、Ｆ６７Ｓ、Ｆ８６Ｙ、Ｄ１４８Ｅ、Ｒ１７１Ｋ、Ｈ１７９Ｒ）。比較対象として、図２（Ａ）に示すＴ８６コンストラクトも用いた。【０１１１】
各コンストラクトについて、その発現カセットを含むプラスミドを、ｐＴＲＥｔｉｇｈｔ−Ｕｂ−ＥＬｕｃレポーターと共にＨＥＫ２９３Ｔ細胞に導入し、得られた形質転換細胞に対して、Ｄｏｘ非存在下又はＤｏｘ存在下で青色光を照射し、Ｕｂ−ＥＬｕｃの光依存性転写活性を調べた。全ての実験は独立した３回の試行（３バッチ）を行い、同等の結果を得た。暗条件下及び青色光照射時にルシフェラーゼアッセイを行い、画像解析により定量された発光シグナル強度（Ｕｂ−ＥＬｕｃの相対発現レベル）の測定値（Ａ．Ｕ．）を図５に示す。また、表５中、「An initial construct screening result」欄は最初の１バッチの結果を示し、当該欄中、「Dark」及び「Light」は、それぞれ、暗条件下及び青色光照射時の発光シグナル強度（Ｕｂ−ＥＬｕｃの発現レベル）の相対値（実施例１のNegative Controlの暗条件下での発光シグナル強度を１とする）を示し、「Light/ Dark」はLight/Dark比率を示す。「Three independent data sets to confirm reproducibility」欄には、独立した３バッチのLight/Dark比率の平均値及びその標準偏差を示す。【０１１２】
【表５】
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【０１１３】
実施例２と同様に、Ｄｏｘ非存在下においては、図２（Ａ）に示すＴ８６コンストラクト（図５中、「ＰＡ−Ｔｅｔ−ＯＦＦ（Ｔ８６）」）を用いた場合よりも、図２（Ｃ）に示すＴ８６コンストラクト（図５中、「ＰＡ−Ｔｅｔ−ＯＦＦ−Ｔ２Ａ」）を用いた場合のほうが、青色光照射による発現誘導効率が顕著に高かった。これらのコンストラクトの青色光依存性転写活性は、Ｄｏｘの存在下で消滅した。ＴｅｔＲ（Ｉ１９４Ｔ、Ｈ１００Ｙ、１−２０６）を用いたコンストラクト（ＰＡ−Ｔｅｔ−Ｈ１００Ｙ）では、Ｄｏｘの存在下と非存在下の両方でＵｂ−Ｅｌｕｃの発現が確認され、青色光照射によってのみ発現が誘導されており、Ｄｏｘの影響を受けないことが確認された。一方で、ＴｅｔＲ（Ｉ１９４Ｔ、１−２０６）に逆表現型突然変異を導入した変異体は、いずれもＤｏｘ非存在下では青色光の照射の有無にかかわらずＵｂ−Ｅｌｕｃの発現は確認されなかったが、Ｄｏｘ存在下では、Ｍ２変異体、Ｖ１０変異体及びＶ１６変異体で青色光照射によりＵｂ−Ｅｌｕｃの発現が誘導された。特に、Ｖ１０変異体が、青色光照射時にＵｂ−ＥＬｕｃの発現が充分に高く、かつ暗条件下でＵｂ−ＥＬｕｃの発現がほとんど観察されず、ＰＡ−Ｔｅｔ制御発現効率が特に優れていた。【０１１４】
次いで、ＰＡ−Ｔｅｔ−ＯＦＦ／ＯＮシステムと、従来のＴｅｔ−ＯＦＦ／ＯＮシステムを比較した。ＰＡ−Ｔｅｔ−ＯＦＦ／ＯＮシステムとしては、ＰＡ−Ｔｅｔ−ＯＦＦ−Ｔ２Ａコンストラクト及びＰＡ−Ｔｅｔ−ＯＮ−Ｔ２Ａコンストラクトを用いた。従来のＴｅｔ−ＯＦＦ／ＯＮシステムとしては、市販の「ｔＴＡ−Ａｄ」コンストラクト及び「Ｔｅｔ−ＯＮ  ３Ｇ」コンストラクト（いずれも、Clontech/TAKARA社製）を用いた。各コンストラクトについて、その発現カセットを含むプラスミドを、ｐＴＲＥｔｉｇｈｔ−Ｕｂ−ＥＬｕｃレポーターと共にＨＥＫ２９３Ｔ細胞に導入し、得られた形質転換細胞に対して、Ｄｏｘ非存在下又はＤｏｘ存在下で青色光を照射し、Ｕｂ−ＥＬｕｃの光依存性転写活性を調べた。なお、青色光照射は、青色光パルス（３０秒ごとに１秒間のパルス）を３６時間、細胞に曝露した。【０１１５】
全ての実験は独立した３回の試行（３バッチ）を行い、同等の結果を得た。暗条件下及び青色光照射時にルシフェラーゼアッセイを行い、画像解析により定量された発光シグナル強度（Ｕｂ−ＥＬｕｃの相対発現レベル）の測定値（Ａ．Ｕ．）を図６に示す。また、表６中、「An initial construct screening result」欄及び「Three independent data sets to confirm reproducibility」欄は、表５と同様である。この結果、青色光照射時間が長くなると、ＰＡ−Ｔｅｔ−ＯＦＦ／ＯＮシステムによる誘導されたルシフェラーゼレポーター活性は、従来のＴｅｔのみで制御されたシステムと遜色ない程度にまで劇的に増加した。【０１１６】
【表６】
2020045651.tif 000007
【０１１７】
また、ＰＡ−Ｔｅｔ−ＯＦＦ−Ｔ２Ａコンストラクトを用いたＰＡ−Ｔｅｔ−ＯＦＦシステム及びＰＡ−Ｔｅｔ−Ｈ１００Ｙコンストラクトを用いたＰＡ−Ｔｅｔ非依存性システムに対して、ＰＡ−Ｔｅｔ制御発現効率に対するＤｏｘの濃度の影響を調べた。結果を図７（Ａ）に示す。また、ＰＡ−Ｔｅｔ−ＯＦＦ−Ｔ２ＡコンストラクトにＶ１０変異を導入したコンストラクト（ＰＡ−Ｔｅｔ−ＯＮ−Ｔ２Ａコンストラクト）を用いたＰＡ−Ｔｅｔ−ＯＮシステムに対して、ＰＡ−Ｔｅｔ制御発現効率に対するＤｏｘの濃度の影響を調べた。結果を図７（Ｂ）に示す。データは、１回の実験からの平均値±標準偏差（ｎ＝３）を表す。図７（Ａ）及び（Ｂ）中、「*」は、ｐ＜０．０５（両側スチューデントt検定）を意味する。【０１１８】
Ｄｏｘは、ＰＡ−Ｔｅｔ−ＯＦＦシステムにおいて、濃度依存的にＰＡ−Ｔｅｔ制御遺伝子発現を弱めた（図７（Ａ））。逆に、ＰＡ−Ｔｅｔ制御遺伝子発現は、Ｄｏｘ濃度が０〜２５０ｎｇ／ｍＬにおいては、ＰＡ−Ｔｅｔ−ＯＮシステムにおけるＤｏｘ濃度と相関して増加した（図７（Ｂ））。特に、Ｄｏｘ濃度が非常に低い（ＰＡ−Ｔｅｔ−ＯＦＦシステムでは１ｎｇ／ｍＬ、ＰＡ−Ｔｅｔ−ＯＮシステムでは１０ｎｇ／ｍＬ）条件でも、両方のシステムでＤｏｘによる効果が観察された。一方で、ＰＡ−Ｔｅｔ非依存性システムでは、Ｄｏｘ濃度依存性は確認できなかった。なお、ＰＡ−Ｔｅｔ−ＯＮシステムにおいては、２５０ｎｇ／ｍＬより高いＤｏｘ濃度では、誘導されたルシフェラーゼ活性はわずかに減少しており、Ｄｏｘ濃度に至適濃度が存在することが示唆された。最大遺伝子発現のＤｏｘ濃度は、細胞種及び遺伝子送達方法に依存する。【０１１９】
［実施例４］
レンチウイルスベクターを用いてＰＡ−Ｔｅｔ−ＯＦＦシステム及びＰＡ−Ｔｅｔ−ＯＮシステムをＥｐｈ４細胞に導入し、これらのシステムの安定発現株を作製し、そのＤｏｘ濃度依存性及び青色光強度依存性を調べた。【０１２０】
ＰＡ−Ｔｅｔ−ＯＦＦ／ＯＮシステムの安定発現株の作製に使用したＰＡ−Ｔｅｔ−ＯＦＦコンストラクト／ＰＡ−Ｔｅｔ−ＯＮコンストラクトの発現カセットの模式図を図８（Ａ）に、ＴＲＥ３Ｇ−Ｕｂ−ＮＬＳ−ｌｕｃ２−Ｈｅｓ１ ３’ＵＴＲレンチウイルスベクター中のＵｂ−ＮＬＳ−ｌｕｃ２発現カセットの模式図を図８（Ｂ）に、それぞれ示す。Ｅｐｈ４細胞にこれらを形質導入して、ＰＡ−Ｔｅｔ−ＯＦＦシステム安定株及びＰＡ−Ｔｅｔ−ＯＮシステム安定株を作製した。【０１２１】
ＰＡ−Ｔｅｔ−ＯＦＦシステム安定株の転写活性の青色光強度依存性を調べた結果を図９に示し、ＰＡ−Ｔｅｔ−ＯＮシステム安定株の転写活性の青色光強度依存性及びＤｏｘ濃度依存性を調べた結果を図１０に示す。放射エネルギーは０〜７．１Ｗ／ｍ２の範囲で変化させた。Ｄｏｘ濃度は、０〜５００ｎｇ／ｍＬの範囲で変化させた。両図のデータは、１回の実験からの平均値±標準偏差（ｎ＝３）を表す。いずれの安定株も光強度依存的に転写活性が高くなっており、光強度依存的に発現が誘導されることが確認された。また、ＰＡ−Ｔｅｔ−ＯＮシステム安定株では、Ｄｏｘ濃度依存的に発現が誘導されることが確認された。図１０の結果、特に図１０（Ｃ）に示すように、ＰＡ−Ｔｅｔ−ＯＮシステムを用いた場合には、青色光強度とＴｅｔ系化合物濃度を適宜調整することによって、標的遺伝子の転写活性を所望のレベルに調整できる。すなわち、ＰＡ−Ｔｅｔ−ＯＦＦ／ＯＮシステムでは、遺伝子発現を光強度とＴｅｔ系化合物濃度の両方で制御することができ、遺伝子発現レベルを厳密に制御することが必要な各種生物学的実験に特に有用である。【０１２２】
次いで、ＰＡ−Ｔｅｔ−ＯＮシステム安定株に対して、６日間、１日１回青色光（パルス光）を照射し、かつ１、３、５日目にのみ、Ｄｏｘ（１，０００ｎｇ／ｍＬ）を培地に添加した。青色光の露光のタイミング（矢頭）とＤｏｘの培地添加のタイミングを図１１の上段に、ＰＡ−Ｔｅｔ−ＯＮシステム安定株の転写活性（発光シグナル強度）を下段に、それぞれ示す。【０１２３】
ほとんどのＰＡ−Ｔｅｔ制御遺伝子発現システムは、少量の光で活性化され、室内照明への短時間の暴露は、転写活性を活性化するのに十分である（非特許文献２、１３、及び２５）。したがって、ＰＡ−Ｔｅｔ制御遺伝子発現システムを有する細胞は、絶対的な暗闇又は特殊な赤色若しくは遠赤色の照明器具の下で一貫して維持されなければならない。さらに、細胞は光照射実験の開始前に、暗条件下で準備されなければならず、数時間又は数日かかることがある。これに対して、ＰＡ−Ｔｅｔ−ＯＦＦ／ＯＮシステムの光依存活性は、Ｔｅｔ系化合物への曝露又は洗浄除去によって条件的に誘導され得る。例えば、ＰＡ−Ｔｅｔ−ＯＮシステム安定株では、光依存性遺伝子発現はＤｏｘの非存在下では持続しなかった（図１１）。逆に、青色光照射の直前にＤｏｘを導入することにより、１週間の実験の期間中、光依存性遺伝子発現が誘導できた（図１１）。このようにＰＡ−Ｔｅｔ−ＯＦＦ／ＯＮシステムにおけるＴｅｔ系化合物による制御は、特に長期間の実験において、望ましくない遺伝子誘導を排除することができる。【０１２４】
［実施例５］
Ｃｒｙ２は光照射によって急速に活性化され、約５．５分の半減期でＣＩＢ１から自発的に解離する（非特許文献９、非特許文献１１）。Ｃｒｙ２／ＣＩＢ１系の迅速な活性化及び不活性化の動態は、周期的な振動又は段階的に増加した遺伝子発現パターンのような、ＰＡ−Ｔｅｔ−ＯＦＦ／ＯＮシステムにおける下流の標的遺伝子発現の動的変化を可能にし得る。そこで、ＰＡ−Ｔｅｔ−ＯＦＦ／ＯＮシステム安定株に対して短いパルス光（１又は２分間）を照射し、ＴＲＥ配列の制御下にあるルシフェラーゼ発現レベルをリアルタイムでモニターすることによって、ＰＡ−Ｔｅｔ−ＯＦＦ／ＯＮシステムの時間的特性を検証した。【０１２５】
ＰＡ−Ｔｅｔ−ＯＦＦシステム安定株としては、実施例４で作製したＰＡ−Ｔｅｔ−ＯＦＦシステム安定株（レポーターコンストラクトとしてＴＲＥ３Ｇ−Ｕｂ−ＮＬＳ−ｌｕｃ２−Ｈｅｓ１ ３’ＵＴＲレンチウイルスベクターを使用。以下、「ＰＡ−Ｔｅｔ−ＯＦＦ安定株（Ｕｂ−ＮＬＳ−ｌｕｃ２レポーター）」ということがある。）と、図８（Ａ）に記載のＰＡ−Ｔｅｔ−ＯＦＦコンストラクトとＴＲＥ３Ｇ−ｌｕｃ２−Ｈｅｓ１ ３’ＵＴＲレンチウイルスベクターをＥｐｈ４細胞に形質導入して得たＰＡ−Ｔｅｔ−ＯＦＦシステム安定株（以下、「ＰＡ−Ｔｅｔ−ＯＦＦ安定株（ｌｕｃ２レポーター）」ということがある。）の２種類を用いた。同様に、ＰＡ−Ｔｅｔ−ＯＮシステム安定株としては、実施例４で作製したＰＡ−Ｔｅｔ−ＯＮシステム安定株（レポーターコンストラクトとしてＴＲＥ３Ｇ−Ｕｂ−ＮＬＳ−ｌｕｃ２−Ｈｅｓ１ ３’ＵＴＲレンチウイルスベクターを使用。以下、「ＰＡ−Ｔｅｔ−ＯＮ安定株（Ｕｂ−ＮＬＳ−ｌｕｃ２レポーター）」ということがある。）と、図８（Ａ）に記載のＰＡ−Ｔｅｔ−ＯＮコンストラクトとＴＲＥ３Ｇ−ｌｕｃ２−Ｈｅｓ１ ３’ＵＴＲレンチウイルスベクターをＥｐｈ４細胞に形質導入して得たＰＡ−Ｔｅｔ−ＯＮシステム安定株（以下、「ＰＡ−Ｔｅｔ−ＯＮ安定株（ｌｕｃ２レポーター）」ということがある。）の２種類を用いた。【０１２６】
各ＰＡ−Ｔｅｔ−ＯＦＦ／ＯＮシステム安定株に、青色光を短いパルス光（１又は２分間）で照射し、発光シグナル強度をリアルタイムでモニターした。ＰＡ−Ｔｅｔ−ＯＦＦ安定株（Ｕｂ−ＮＬＳ−ｌｕｃ２レポーター）の結果を図１２（Ａ）に、ＰＡ−Ｔｅｔ−ＯＦＦ安定株（ｌｕｃ２レポーター）の結果を図１２（Ｂ）に、それぞれ示す。図中、垂直点線がパルス光を照射した時点を示す。青色光照射から発光シグナル強度がピークに達するまでをオンフェーズ、ピークに達してから発光シグナル強度が青色光照射前のレベルにまで戻った時点までをオフフェーズとした。図１２（Ａ）に示すように、ＰＡ−Ｔｅｔ−ＯＦＦ安定株（Ｕｂ−ＮＬＳ−ｌｕｃ２レポーター）では、青色光パルスにより誘導されたルシフェラーゼ活性は、青色光パルスから約１．１時間後に観察され、その後３時間以内にはバックグラウンドレベルにまで戻った。また、青色光照射前は、ほとんど発光シグナルは観察されなかった。これに対して、ＰＡ−Ｔｅｔ−ＯＦＦ安定株（ｌｕｃ２レポーター）では、青色光照射前から発光シグナルが観察されており、オンフェーズとオフフェーズは共にＰＡ−Ｔｅｔ−ＯＦＦ安定株（Ｕｂ−ＮＬＳ−ｌｕｃ２レポーター）よりも長かった（図１２（Ｂ））。【０１２７】
また、各ＰＡ−Ｔｅｔ−ＯＦＦ／ＯＮシステム安定株について、発光シグナル強度のモニター結果からキモグラフ分析を用いて、ＰＡ−Ｔｅｔ−ＯＦＦ／ＯＮシステムにおけるＰＡ−Ｔｅｔ制御遺伝子発現のスイッチオン／オフ反応速度の半減期を決定した。スイッチオン反応速度の半減期の結果を図１３（Ａ）に、スイッチオフ反応速度の半減期の結果を図１３（Ｂ）に、それぞれ示す。データは平均値±標準偏差（ｎ＝３）を表す。図中、「*」は、ｐ＜０．０５（両側スチューデントt検定）を意味する。【０１２８】
ＰＡ−Ｔｅｔ−ＯＦＦ安定株（Ｕｂ−ＮＬＳ−ｌｕｃ２レポーター）に対して、３時間間隔（図１４（Ａ））、６時間間隔（図１４（Ｂ））、１２時間間隔（図１４（Ｃ））、及び２４時間間隔（図１４（Ｄ））で青色光パルスに繰り返し暴露し、発光シグナル強度をリアルタイムでモニターした。図中、青色光パルスの照射時点を、垂直点線で示す。実験を少なくとも３回繰り返し、同様の結果を得た。この結果、青色光パルスを周期的に暴露することにより、青色光パルスの周期と同じ周期の強い振動性の発現が誘導された。３時間という非常に短い間隔での周期的青色光パルスによっても、Ｕｂ−ＮＬＳ−ｌｕｃ２レポーターの蓄積は観察されなかった。これは、３’ＵＴＲ配列を有する不安定化したルシフェラーゼレポーターは半減期が短いためであり、短い半減期のレポーターがこの迅速な超日リズム生成のために不可欠であった。逆に、正常で安定なルシフェラーゼレポーターは、概日リズムにわたる典型的な時計遺伝子の発現を模倣した、より長い期間にわたる周期的な遺伝子発現実験に適している可能性がある。実際に、図１３に示すように、正常で安定なルシフェラーゼを用いたレポーターコンストラクトを使用したＰＡ−Ｔｅｔ−ＯＦＦ／ＯＮ安定株（ｌｕｃ２レポーター）では、ＰＡ−Ｔｅｔ制御遺伝子発現のスイッチオン／オフ反応速度の半減期が延長されていた。【０１２９】
［実施例６］
光制御システムのもう一つの大きな利点は、標的細胞において遺伝子発現を空間的に限定する能力である。そこで、ＰＡ−Ｔｅｔ−ＯＦＦ安定株（Ｕｂ−ＮＬＳ−ｌｕｃ２レポーター）を用いて、この遺伝子発現を空間的に限定する能力について調べた。標的細胞におけるこのような空間的に限定された遺伝子発現を調べるために、光の空間パターンを生成するためのデジタルミラーデバイス（ＤＭＤ）を備えた生物発光イメージング顕微鏡を用いた。【０１３０】
ＰＡ−Ｔｅｔ−ＯＦＦ安定株（Ｕｂ−ＮＬＳ−ｌｕｃ２レポーター）の集団に、ＤＭＤ付き生物発光イメージング顕微鏡に設置し、ＤＭＤにより生成されたパターン化された光を照射した。具体的には、異なる円形細胞集団を異なる時間に順次活性化した。図１５（Ａ）に、ＰＡ−Ｔｅｔ−ＯＦＦ安定株（Ｕｂ−ＮＬＳ−ｌｕｃ２レポーター）に照射したパターン化した青色光について、照射領域と照射タイミングを示す。図１５（Ａ）中、各細胞画像の「ｔ」は実験開始からの時間（時分）を示し、白抜きの円で囲われた領域が、その時点における青色光の照射領域を示す。この光パターンは、３つの関心領域（ＲＯＩ−１〜ＲＯＩ−３）について、照射タイミングをずらして照射する。すなわち、ＲＯＩ−１に対しては、実験開始から０分後（＃１）、７時間３５分後（＃４）、９時間５０分後（＃７）、及び１２時間１０分後（＃８）に照射した。ＲＯＩ−２に対しては、照射開始から２時間３０分後（＃２）、８時間２０分後（＃５）、及び１２時間１０分後（＃８）に、ＲＯＩ−３に対しては、照射開始から５時間後（＃３）、９時間５分後（＃６）、及び１２時間１０分後（＃８）に、それぞれ照射した。【０１３１】
図１５（Ｂ）に、照射開始から１３時間２０分後の各関心領域のｍＣｈｅｒｒｙ蛍光シグナル（上段）と発光シグナル（下段）の画像を示す。また、図１５（Ｃ）に、各関心領域の発光シグナル強度のモニタリングした結果を示す。青色光パルスの照射時点を、垂直点線で示す。図１５（Ｂ）に示すように、青色光パルスが照射されたＲＯＩ−１〜ＲＯＩ−３に含まれる細胞のみでルシフェラーゼのＰＡ−Ｔｅｔ制御発現が観察されていた。また、図１５（Ｃ）に示すように、青色光パルスが照射されたタイミングで、ルシフェラーゼのＰＡ−Ｔｅｔ制御発現が観察されていた。【０１３２】
次いで、青色光パルスを、１０個の標的細胞（図１６（Ａ）中、「１」〜「１０」で示す細胞）のみに同時に照射し、それらの光誘発レポーター発現をモニターした。図１６（Ａ）中、「ｔ」はパルス照射からの時間（時分）を示し、左図はパルス照射から０分後、中図は１時間５分後、右図が４時間後の画像である。青色光パルス照射から１時間５分後には、青色光を照射した１０個の標的細胞でのみ、ルシフェラーゼのＰＡ−Ｔｅｔ制御発現が観察され、隣接する未照射細胞ではルシフェラーゼの発現は誘導されなかった。また、４時間後には全ての標的細胞でルシフェラーゼのＰＡ−Ｔｅｔ制御発現は終了していた。【０１３３】
照射された標的細胞のうち、標的細胞９を除く９個の細胞について、発光シグナル強度を定量、平均化した。標的細胞９は、時間経過イメージング実験中に細胞分裂が生じたため、発光シグナル強度の平均化処理から除いた。同様に、標的細胞に隣接する未照射細胞から９個をランダムに選択し、発光シグナル強度を定量し、平均化した。結果を図１６（Ｂ）に示す。データは、１回の実験からの平均値±標準偏差を表す。図中、実線が平均値であり、点線で囲われた領域が、平均値±標準偏差の範囲である。実験を少なくとも３回繰り返し、同様の結果を得た。これらの結果から、ＰＡ−Ｔｅｔ−ＯＦＦ／ＯＮシステムでは、光照射領域を厳密に制御することにより、限定された空間内の細胞に対してのみ、標的遺伝子の発現を誘導させられることが確認された。【０１３４】
［実施例７］
発生中のマウス脳及び成体マウス脳において、ＰＡ−Ｔｅｔ−ＯＦＦ／ＯＮシステムを検証した。【０１３５】
（１）発生中のマウス脳の神経幹／前駆細胞におけるＰＡ−Ｔｅｔ−ＯＦＦシステムの検証
子宮外電気穿孔法により、発生中のマウス脳の神経幹／前駆細胞に対して、ＰＡ−Ｔｅｔ−ＯＦＦシステムを導入した。電気穿孔された脳は、直ちに胚から抽出され、切片として組織培養薄膜に乗せられた。この切片に、青色光を６時間間隔で周期的に照射し、レポーター活性をモニターした。図１７に、この切片のルシフェラーゼ発現による発光シグナル画像を示す（ＭＺ：辺縁帯、ＣＰ：皮質プレート、ＶＺ：脳室、ＳＶＺ：脳室下帯）。図１８に、この切片の発光シグナル強度をリアルタイムでモニターした結果を示す。図中、青色光パルスの照射時点を、垂直点線で示す。青色光照射から１時間２０分後、すなわち、青色光照射開始から１時間２０分後、７時間２０分後、及び１３時間２０分後には、ＶＺ及びＳＶＺの神経幹／前駆細胞において青色ＰＡ−Ｔｅｔ制御ルシフェラーゼ発現が観察された（図１７）。ＶＺ及びＳＶＺは、神経幹／前駆細胞が分裂してニューロンを産生する領域である。全ての実験は独立した２回の試行を行い、同等の結果を得た。【０１３６】
（２）マウス仔の海馬由来の初代培養ニューロンにおけるＰＡ−Ｔｅｔ−ＯＦＦシステムの検証
ＡＡＶベクターを用いて、分化したニューロンにＰＡ−Ｔｅｔ−ＯＦＦシステムを導入した。【０１３７】
ＰＡ−Ｔｅｔ−ＯＦＦ／ＯＮシステムの導入に使用した２種のコンストラクト、ＣＡＧ−ＦＬＡＧ−ＴｅｔＲ（又は  ｒＴｅｔＲ）−ＣＩＢＮ（−ＮＬＳ）−Ｔ２Ａ−ｍＣｈｅｒｒｙＮＬＳコンストラクト（図中、「Ｖｉｒｕｓ  １」）（配列番号１８）及びＣＡＧ−ＮＬＳ−ａｔｔａｃｈｅｄ  Ｃｒｙ２  ＰＨＲ（Ｌ３４８Ｆ）−ｐ６５ ＡＤＮ末融合コンストラクト（図中、「Ｖｉｒｕｓ  ２」）（配列番号１９）、並びに、ＴＲＥ３Ｇ−Ｕｂ−ＮＬＳ−ｌｕｃ２−Ｈｅｓ１  ３’ＵＴＲレポーター（図中、「Ｖｉｒｕｓ  ３」）（配列番号２０）及びＴｅｔＯ−ＧＦＰトランスジェニックレポーターマウス系統において発現しているＴｅｔＯ−ＧＦＰレポーター（図中、「Ｔｇ  ｍｏｕｓｅ」）（非特許文献２６）の概略図を図１９に示す。なお、図１９の「Ｖｉｒｕｓ  １」コンストラクト中の「ＴｅｔＲ（又は  ｒＴｅｔＲ）」は、ＰＡ−Ｔｅｔ−ＯＦＦシステムの場合にはＴｅｔＲ（Ｉ１９４Ｔ，１−２０６）であり、ＰＡ−Ｔｅｔ−ＯＮシステムの場合にはｒＴｅｔＲ（Ｉ１９４Ｔ，１−２０６）である。【０１３８】
まず、マウス海馬に由来する初代培養３日目のニューロンに、Ｖｉｒｕｓ  １のコンストラクトを発現するＡＡＶベクター及びＶｉｒｕｓ  ２のコンストラクトを発現するＡＡＶベクターを形質導入し、得られたＡＡＶ形質転換ニューロンを、ＭＡＰ２（Microtubule Associated Protein 2）に対する抗体で蛍光免疫染色した。大部分のＭＡＰ２陽性ニューロンでは、形質導入マーカーであるｍＣｈｅｒｒｙの蛍光が観察され、導入したＡＡＶベクターによって形質導入されたことが確認できた。【０１３９】
次いで、マウス海馬に由来する初代培養３日目のニューロンに、Ｖｉｒｕｓ  １のコンストラクトを発現するＡＡＶベクター及びＶｉｒｕｓ  ２のコンストラクトを発現するＡＡＶベクターを形質導入し、初代培養７日目に、Ｖｉｒｕｓ  ３のレポーターレンチウイルスを形質導入した。その後、初代培養２０日目のニューロンに対して、青色光パルスを３時間ごとに周期的に照射し、ルシフェラーゼ発現により発する蛍光シグナルを調べることでレポーター活性をモニターした。ＰＡ−Ｔｅｔ−ＯＮシステムのコンストラクトが導入された形質転換ニューロンに対しては、Ｄｏｘ（５００ｎｇ／ｍＬ）を添加した状態で青色光パルスを３時間ごとに周期的に照射した。【０１４０】
図２０に、ＰＡ−Ｔｅｔ−ＯＦＦシステムのコンストラクトが導入された形質転換ニューロンの、青色光パルス照射開始（０時間目）から２１時間目までのルシフェラーゼ発現による発光シグナル画像を示す。また、図２１に、ＰＡ−Ｔｅｔ−ＯＦＦシステムのコンストラクトが導入された形質転換ニューロンの、ルシフェラーゼ発現による発光シグナル強度を経時的に測定した結果を示す。図２２に、ＰＡ−Ｔｅｔ−ＯＮシステムのコンストラクトが導入された形質転換ニューロンの、ルシフェラーゼ発現によるＤｏｘ存在下での発光シグナル強度を経時的に測定した結果を示す。図２１及び２２中、青色光パルスの照射タイミングは矢頭で示す。全ての実験は独立した２回の試行を行い、同等の結果を得た。この結果、初代培養細胞でも、ＰＡ−Ｔｅｔ−ＯＦＦ／ＯＮシステムを形質導入することで、外来遺伝子の発現を光照射とＤｏｘによって制御できることが確認された。【０１４１】
（３）成体脳のニューロンにおけるＰＡ−Ｔｅｔ−ＯＦＦシステムの検証
ＡＡＶベクターを用いて、分化したニューロンにＰＡ−Ｔｅｔ−ＯＦＦシステムを導入した。【０１４２】
ＴＲＥ−ＧＦＰトランスジェニックマウス（非特許文献２６）の海馬に、Ｖｉｒｕｓ  １のコンストラクトを発現するＡＡＶベクター及びＶｉｒｕｓ  ２のコンストラクトを発現するＡＡＶベクターを共に形質導入した結果を図２３及び２４に示す。図２３は、ＡＡＶ形質導入後の海馬ニューロンに対して、青色光を照射する態様を模式的に示した図である。図２４は、青色光の露光開始から１２時間後の脳のうち、青色光を照射しなかった領域の蛍光画像（左列、「Ｄａｒｋ」）と、青色光を照射した領域の蛍光画像（右列、「Ｌｉｇｈｔ」）である（スケールバー：１００μｍ）。ＧＦＰレポーター発現は、海馬（ＣＡ１）及び歯状回（Dentral gyrus：ＤＧ）領域のニューロンにおいて青色光依存的に増加した。青色光を照射した海馬では、海馬ニューロンの４２．８±２．３％及び歯状回の顆粒細胞の３６．７±６．０％が、ＧＦＰ発現を示した。対照的に、暗条件では、海馬ニューロンの４．７±１．４％及び歯状回ニューロンの４．４±１．６％のみが、ＧＦＰ発現を示した。【０１４３】
次いで、脳のニューロンにおけるＰＡ−Ｔｅｔ−ＯＦＦシステムの転写活性におけるＤｏｘ依存性抑制を分析した。出生後１日以内にＡＡＶ形質導入を行ったマウスに対して、１２〜１５日齢時に青色光パルス照射処理を行った。光照射処理は、カスタムメードのステージ上に載せて固定したマウスの脳内のｍＣｈｅｒｒｙ発現領域に、光度４０Ｗ／ｍ２、デューティサイクル７．１％（０．０７１Ｈｚで１秒間パルス）で３時間青色光パルスを照射して行った。光照射処理後の脳細胞のルシフェラーゼ発現による発光シグナル強度を測定した。また、光照射処理の１時間前にＤｏｘ処理（０．１ｍｇ／ｇ体重）を行ったマウスについても同様に発光シグナル強度を測定した。測定結果を図２５に示す。光照射処理したマウス脳ニューロン（図中、「Ｌｉｇｈｔ」）では、ルシフェラーゼ発現が活性化し、発光シグナル強度が増大したが、光照射の１時間前にＤｏｘ処理した脳ニューロン（図中、「Ｌｉｇｈｔ＋Ｄｏｘ」）では、光照射なしの脳ニューロン（図中、「Ｄａｒｋ」）と同程度にまで、すなわち、バックグラウンドレベルまで大きく減衰した。【０１４４】
ＰＡ−Ｔｅｔ−ＯＮシステムのコンストラクトを用いて同様にして、脳のニューロンにおけるＰＡ−Ｔｅｔ−ＯＮシステムの転写活性におけるＤｏｘ依存性抑制を分析した。測定結果を図２６に示す。Ｄｏｘ処理（０．１ｍｇ／ｇ体重）を行った１時間後に光照射処理を行ったマウス脳ニューロン（図中、「Ｌｉｇｈｔ＋Ｄｏｘ」）では、ルシフェラーゼ発現が活性化し、発光シグナル強度が増大した。一方で、Ｄｏｘ処理を行わずに光照射処理した脳ニューロン（図中、「Ｌｉｇｈｔ」）では、Ｄｏｘ処理を行った１時間後に光照射処理を行わなかったマウス脳ニューロン（図中、「Ｄａｒｋ＋Ｄｏｘ」）と同様にルシフェラーゼ発現の活性化は観察されなかった。すなわち、青色光依存性転写は、Ｄｏｘの存在下でのみ観察された。【０１４５】
さらに、ＰＡ−Ｔｅｔ−ＯＦＦシステムを導入した細胞における、Ｄｏｘ除去後の光誘導性転写活性の回復を分析した。具体的には、出生後１日以内にＡＡＶ形質導入を行ったマウスに対して、１２〜１５日齢時に、Ｄｏｘ処理（０．１ｍｇ／ｇ体重）を行い、Ｄｏｘ処理から１時間後、１日後、２日後、３日後、４日後、及び５日後に青色光パルス照射処理を行った。光照射処理後の脳細胞のルシフェラーゼ発現による発光シグナル強度を測定した。Ｄｏｘ処理、青色光パルス照射処理、及びルシフェラーゼ発現による発光シグナル強度の測定は、前記と同様にして行った。測定結果を図２７に示す。光誘起ルシフェラーゼ発現の抑制は、Ｄｏｘ単発投与から４日間持続し、５日目にはＤｏｘ未処理細胞と同程度にまでルシフェラーゼレポーター活性は回復していた。これらの結果から、ＰＡ−Ｔｅｔ−ＯＦＦ／ＯＮシステムは、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいても、光とＴｅｔの両方での遺伝子発現制御が可能であることが示された。【０１４６】
［実施例８］
マウスの皮下組織におけるＰＡ−Ｔｅｔ−ＯＦＦ／ＯＮシステムを検証した。
まず、実施例４において得られた、ＰＡ−Ｔｅｔ−ＯＦＦ安定株（Ｕｂ−ＮＬＳ−ｌｕｃ２レポーター）（ＰＡ−Ｔｅｔ−ＯＦＦシステムがレンチウイルスベクターで安定的に形質導入されたＥｐｈ４細胞）を、成体マウス背部皮膚の皮下組織に移植した。細胞移植から２４時間後にＤｏｘ処理を行い、その１時間後に、麻酔したマウスの背部皮膚の移植領域に青色光照射処理（２００Ｗ／ｍ２；１分間）を行った。青色光照射後のマウスをＣＣＤカメラで撮像し、ルシフェラーゼシグナルの動的変化を画像化した。【０１４７】
Ｄｏｘ処理を行わなかった皮下組織の暗条件下（図中、「Ｄａｒｋ」）又は青色光照射後３０〜６０分間（図中、「Ｌｉｇｈｔ」）の発光シグナルの平均値を図２８に示す。また、Ｄｏｘ処理を行わなかった皮下組織（図中、「Ｌｉｇｈｔ」）とＤｏｘ処理を行なった皮下組織（図中、「Ｌｉｇｈｔ＋Ｄｏｘ」）の、青色光照射後の発光シグナルの平均値を図２９に示す。この結果、Ｄｏｘ非存在下では、暗条件の皮下組織ではルシフェラーゼシグナルは増加せず、青色光照射した皮下組織ではルシフェラーゼシグナルの増加が確認された（図２８）。また、青色光照射によるルシフェラーゼシグナルの活性化は、Ｄｏｘ処理によって完全に消失した（図２９）。これらの結果から、ＰＡ−Ｔｅｔ−ＯＦＦ／ＯＮシステムは、皮下組織をはじめとする脳以外の組織でも機能することが確認された。【０１４８】
［実施例９］
Ｔｅｔ−ＯＦＦシステムに、Ｂｐｈｐ１／Ｑ−ＰＡＳ１−ＰＡ結合スイッチを組み込むことにより、光照射とＴｅｔ系化合物により標的遺伝子の発現を誘導するＰＡ−Ｔｅｔ−ＯＦＦシステムの構築を試みた。構築には、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を用い、哺乳動物細胞において最適なＰＡ−Ｔｅｔ遺伝子発現系を調べた。【０１４９】
具体的には、レポータープラスミド（ｐＴＲＥｔｉｇｈｔ−Ｕｂ−ＥＬｕｃレポーター）と、ＴｅｔＲにＢｐｈｐ１及びＱ−ＰＡＳ１のいずれか一方を融合させた融合タンパク質の発現カセットを含むプラスミドと、ｐ６５ＡＤタンパク質にＢｐｈｐ１及びＱ−ＰＡＳ１の残る他方を融合させた融合タンパク質の発現カセットを含むプラスミドとを、ポリＬ−リジンでコートした２４ウェルプレートに播種したＨＥＫ２９３Ｔ細胞に導入し、得られた形質転換細胞に対して、Ｔｅｔ系化合物非存在下で近赤外光を照射し、Ｕｂ−ＥＬｕｃの相対発現レベルを調べた。プラスミドのトランスフェクションからルシフェラーゼの測定は、トランスフェクションから６時間後に２５μＭのＢＶを含有する培地に交換したこと、近赤外光（７５０ｎｍ、４．０ｍＷｃｍ２）を１８０秒おきに３０秒間の照射を４２時間行ったこと、光源は７５０ｎｍ  ＬＥＤ（SMBB750D-1100、USHIO社製）を用いたこと以外は、前記の「ＰＡ−Ｔｅｔ−ＯＦＦ候補コンストラクトの機能スクリーニング」と同様にして行った。全ての実験は独立した３回の試行（３バッチ）を行い、同等の結果を得た。【０１５０】
【表７】
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【０１５１】
結果を表７に示す。表７中、「Element #1」欄の「Ｉ１９４Ｔ」は、ＴｅｔＲ（Ｉ１９４Ｔ、１−２０６）を示す。また、「An initial construct screening result」欄中、「Dark」、「Light」、及び「Light/ Dark」と、「Three independent data sets to confirm reproducibility」欄中、「Average of the Light/Dark ratio」、「Light/ Dark」、及び「S.D. of the Light/Dark ratio」は表１等と同じである。表７に示す通り、コンストラクトＩＤがＱＴ４、ＱＴ７及びＱＴ８が、Light/ Dark比率が１０以上であり、ＰＡ−Ｔｅｔ制御発現効率が他の候補コンストラクトよりも顕著に高かった。この結果、ＴｅｔＲのＮ末端側又はＣ末端側にＢｐｈＰ１が連結された融合タンパク質と、ｐ６５ＡＤのＣ末端側にＱ−ＰＡＳ１が連結された融合タンパク質の組み合わせが、ＰＡ−Ｔｅｔ制御発現効率に優れること、特に、ｐ６５ＡＤのＮ末端側に核移行シグナルを２つタンデムに連結させることによりさらにＰＡ−Ｔｅｔ制御発現効率が改善されることがわかった。【０１５２】
なお、ｐ６５の転写活性化ドメインに代えて、Ｔｅｔシステムで汎用されているＶＰ１６又はＶＰ６４の転写活性化ドメインに変更し、同様のコンストラクトを作成してLight/ Dark比率を調べたところ、いずれもｐ６５を用いたコンストラクトよりもＰＡ−Ｔｅｔ制御発現効率は低かった。ＰＡ−Ｔｅｔシステムにおいては、ＴｅｔＲ又はｒＴｅｔＲとｐ６５の転写活性化ドメインとの組み合わせが最もＰＡ−Ｔｅｔ制御発現効率に優れることがわかった。【０１５３】
コンストラクトＩＤがＱＴ４（Ｅｌｅｍｅｎｔ＃１：配列番号２６、Ｅｌｅｍｅｎｔ＃２：配列番号２７）、ＱＴ７（Ｅｌｅｍｅｎｔ＃１：配列番号２８、Ｅｌｅｍｅｎｔ＃２：配列番号２９）、及びＱＴ８（Ｅｌｅｍｅｎｔ＃１：配列番号２８、Ｅｌｅｍｅｎｔ＃２：配列番号２７）について、トランスフェクションから６時間後の培地交換を、２５μＭ  ＢＶ含有培地又はＢＶ不含培地で実施し、ＰＡ−Ｔｅｔ制御発現効率を調べた。結果を表８に示す。表中、「HEK293T(-)BV」がＢＶ不含培地で培地交換した細胞の結果であり、「HEK293T(+)BV」がＢＶ含有培地で培地交換した細胞の結果である。ＢＶ含有培地で培養して、外因性ＢＶを導入した細胞のほうが、ＰＡ−Ｔｅｔ制御発現効率が改善されることがわかった。【０１５４】
【表８】
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【０１５５】
次いで、ＱＴ４、ＱＴ７及びＱＴ８コンストラクトについて、Ｄｏｘ濃度と遺伝子発現誘導の関係を調べた。具体的には、２４ウェルプレートにＨＥＫ２９３Ｔ細胞を６×１０４個／ウェルとなるように播種し、トランスフェクションから６時間経過後に、２５μＭのＢＶと表９に記載の濃度のＤｏｘを含有する培地に交換したこと、近赤外光（７５０ｎｍ、４．０ｍＷｃｍ２）を１８０秒おきに３０秒間の照射を４２時間行ったこと、光源は７５０ｎｍ  ＬＥＤ（SMBB750D-1100、USHIO社製）を用いたこと以外は、前記の「ＰＡ−Ｔｅｔ−ＯＦＦ候補コンストラクトの機能スクリーニング」と同様にして行った。全ての実験は独立した３回の試行（３バッチ）を行い、同等の結果を得た。【０１５６】
【表９】
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【０１５７】
結果を表９に示す。３つのコンストラクト全てにおいて、近赤外光照射後であっても、Ｄｏｘ濃度依存的にLight/ Dark比率が低下していた。これらの結果から、この３つのコンストラクトが、Ｄｏｘ非存在下で近赤外光照射によって遺伝子発現が誘導されるＰＡ−Ｔｅｔ−ＯＦＦシステムとして有用であることが示された。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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