(57)【要約】開示されているのは、以下の工程を含む、試料中の細胞濃度を測定する方法である：（１）フローサイトメーターを用いて、複数の既知濃度の標準試料中の細胞濃度を測定する工程、（２）工程（１）で測定した測定値と既知濃度とに基づいて検量線を作成する工程、（３）フローサイトメーターを用いて、未知濃度の試料中の細胞濃度を測定する工程、及び（４）工程（２）で作成した検量線を用いて、工程（３）で測定した測定値から細胞濃度を決定する工程。【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の工程を含む、試料中の細胞濃度を測定する方法：
（１）フローサイトメーターを用いて、複数の既知濃度の標準試料中の細胞濃度を測定する工程、
（２）工程（１）で測定した測定値と既知濃度とに基づいて検量線を作成する工程、
（３）フローサイトメーターを用いて、未知濃度の試料中の細胞濃度を測定する工程、及び
（４）工程（２）で作成した検量線を用いて、工程（３）で測定した測定値から細胞濃度を決定する工程。
【請求項２】
２種以上の既知濃度の標準試料を使用する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
各既知濃度に対して１個以上の標準試料を使用する、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
工程（２）において、既知濃度に対して誤差±３０％以内に収まった測定値を検量線の作成に使用する、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
工程（１）で測定した測定値の既知濃度に対する正確度が、全て±３０％以内である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記試料が血液である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記細胞がＴ細胞である、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、フローサイトメーターを使用した、試料中の細胞濃度を測定する方法に関する。
【発明の背景】
【０００２】
フローサイトメトリーは、水流中の粒子に励起光を照射し、個々の粒子から発する蛍光を測定するという原理によって、細胞集団中の個々の細胞の大きさ、DNA含量、膜抗原の発現量の分布などを測定する方法である。当該フローサイトメトリーを実施するための測定装置がフローサイトメーターと呼ばれる。
【０００３】
このようなフローサイトメトリーを利用して、細胞の絶対カウントを測定する方法が特許文献１により報告されている。特許文献１に記載の方法は、以下の工程を含むことを特徴としている。
（ａ）サンプル中に存在する各母集団中の細胞を細胞標識と既知数の蛍光微小粒子で標識するために、１つ又はそれ以上の細胞標識を含んでいるような希釈剤を含むチューブに、サンプルを加える；
（ｂ）蛍光トリガーをセットして、母集団中に存在するカウントしなければならない実質的に全ての微小粒子と細胞を算入する；
（ｃ）各細胞標識と微小粒子を識別するために、１つ又はそれ以上の蛍光ゲートをセットする；
（ｄ）蛍光トリガーに衝突したり又は該トリガーを乗越えたりしている工程（ｃ）からの細胞の数をカウントする；及び
（ｅ）工程（ｄ）からの各蛍光ゲートに対する微小粒子１個当たりの細胞数を計算し、そのそれぞれに微小粒子の濃度を掛けて、単位体積当たりの細胞数の絶対カウントを得る。
【０００４】
既知数の蛍光微小粒子は、内部標準となるビーズに該当する。特許文献１の方法では、サンプルチューブに既知数のビーズを入れ、標的細胞と一緒にフローサイトメーターに取り込ませ同時測定した後、標的細胞実測値をビーズ実測値でノーマライズすることで、サンプル間の測定バラツキを軽減している(精度(precision)の向上)。
【０００５】
一方、標的細胞がサンプル処理の過程でロスしていないか、フローサイトメーターで漏れなく測定できているかについては考慮されていない。そのため、特許文献１の方法では、上記のように「細胞の絶対カウントを測定する方法」とされているが、正確度(accuracy)が担保されているとはいえない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】日本国特開平4-252957号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
上記のように、特許文献１の方法では、精度の管理はできても、標的細胞の回収率を考慮していないため正確度は評価できない。正確度の評価には標的細胞の回収率を求める必要があり、回収率を求めるには検量線の作成が必要であるが、特許文献１には、標準物質の回収率、検量線、及び正確度の評価について何ら開示されていない。【０００８】
本発明は、正確度が高い細胞数の定量を可能とする、フローサイトメーターを使用した、試料中の細胞濃度を測定する方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、上記目的を達成すべく鋭意研究を重ねた結果、フローサイトメーターを用いて測定した標準試料中の細胞濃度と既知濃度とに基づいて検量線を作成し、当該検量線を使用し、フローサイトメーターを用いて測定した試料中の細胞濃度の測定値から細胞濃度を決定することにより、正確度が高い細胞数の定量が可能となるという知見を得た。【００１０】
本発明は、これら知見に基づき、更に検討を重ねて完成されたものであり、次の試料中の細胞濃度を測定する方法を提供するものである。【００１１】
項１．以下の工程を含む、試料中の細胞濃度を測定する方法：
（１）フローサイトメーターを用いて、複数の既知濃度の標準試料中の細胞濃度を測定する工程、
（２）工程（１）で測定した測定値と既知濃度とに基づいて検量線を作成する工程、
（３）フローサイトメーターを用いて、未知濃度の試料中の細胞濃度を測定する工程、及び
（４）工程（２）で作成した検量線を用いて、工程（３）で測定した測定値から細胞濃度を決定する工程。
項２．２種以上の既知濃度の標準試料を使用する、項１に記載の方法。
項３．各既知濃度に対して１個以上の標準試料を使用する、項１又は２に記載の方法。
項４．工程（２）において、既知濃度に対して誤差±３０％以内に収まった測定値を検量線の作成に使用する、項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
項５．工程（１）で測定した測定値の既知濃度に対する正確度が、全て±３０％以内である、項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
項６．前記試料が血液である、項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
項７．前記細胞がＴ細胞である、項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【発明の効果】
【００１２】
本発明の細胞濃度の測定方法によれば、フローサイトメーターを使用した正確度が高い定量が可能となる。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
以下、本発明の実施の形態について詳細に説明する。
【００１４】
なお、本明細書において「含む(comprise)」とは、「本質的にからなる(essentially consist of)」という意味と、「のみからなる(consist of)」という意味をも包含する。
【００１５】
本明細書で使用する「正確度(accuracy)」とは、値が真値に近い値であることを示す正確性の尺度である。すなわち、平均値が真値に近いものが「正確度」が高くなる。
【００１６】
本明細書で使用する「精度(precision)」とは、複数回の測定の値の間での互のバラツキの小ささの尺度である。
【００１７】
本発明の試料中の細胞濃度を測定する方法は、以下の工程を含むことを特徴とする。
（１）フローサイトメーターを用いて、複数の既知濃度の標準試料中の細胞濃度を測定する工程、
（２）工程（１）で測定した測定値と既知濃度とに基づいて検量線を作成する工程、
（３）フローサイトメーターを用いて、未知濃度の試料中の細胞濃度を測定する工程、及び
（４）工程（２）で作成した検量線を用いて、工程（３）で測定した測定値から細胞濃度を決定する工程。
【００１８】
本発明において、細胞濃度を測定する試料としては、フローサイトメーターで測定可能な試料であれば特に制限されず、例えば、血液、腫瘍、脳脊髄液、肝臓、肺、脾臓、胸腺、骨髄などが挙げられる。
【００１９】
フローサイトメーターでの測定の前に、試料は適宜、各種の前処理を行うことができる。例えば、試料として血液を使用する場合は、測定の前に溶血などの前処理を行うことができる。そのような溶血処理は公知の方法により行うことができ、例えば、赤血球を溶血させる方法としては、界面活性剤を添加することなどが挙げられる。その他の前処理としては、細胞の固定化が挙げられる。そのような細胞の固定化に使用される細胞固定剤としては、例えば、パラホルムアルデヒド、グルタルアルデヒド、メタノール等が挙げられる。
【００２０】
本発明において、濃度を測定する細胞としては、フローサイトメーターにより細胞数の測定が可能な細胞であれば特に制限されず、例えば、神経幹細胞、造血幹細胞、間葉系幹細胞、歯髄幹細胞、ＥＳ細胞、ｉＰＳ(induced pluripotent stem)細胞、組織前駆細胞、血液細胞(赤血球、白血球及び血小板)、上皮細胞、内皮細胞、筋肉細胞、線維芽細胞、平滑筋細胞、毛細胞、肝細胞、胃粘膜細胞、腸細胞、脾細胞、膵細胞、脳細胞、肺細胞、腎細胞、脂肪細胞、心筋細胞、骨芽細胞、神経細胞、血管内皮細胞、骨細胞、破骨細胞、軟骨細胞、軟骨前駆細胞、角膜細胞、網膜細胞、樹状細胞、初代培養細胞、継代細胞、株化細胞などが挙げられる。上記白血球としては、単球、リンパ球(Ｔ細胞、Ｂ細胞及びＮＫ細胞)、樹状細胞、マクロファージ、好酸球、好中球、好塩基球などが挙げられる。Ｔ細胞には、ヘルバーＴ細胞、細胞傷害性Ｔ細胞、制御性Ｔ細胞、サプレッサーＴ細胞、ＣＡＲ−Ｔ細胞(キメラ抗原受容体Ｔ細胞)などが包含される。
【００２１】
本発明で使用するフローサイトメーターは、特に制限されず、各種の市販品などを使用することができる。そのような市販品としては、例えば、ベックマン・コールスター社(例、Gallios、Navios、Navios EX、CytoFLEX、CytoFLEX S、CytoFLEX LX、Cytomics FC 500)、BDバイオサイエンス社(例、BD FACSCantoTM II フローサイトメーター、BD FACSVerseTM フローサイトメーター、BD FACSLyricTM フローサイトメーター、BD LSRFortessaTM フローサイトメーター、BD LSRFortessaTM X-20 フローサイトメーター)、サーモフィッシャーサイエンティフィック社(例、Attune フローサイトメーター)、ソニー社(例、SA3800、SP6800Z)などの製品が挙げられる。フローサイトメーターでの細胞濃度の測定は、公知の方法に従い実施することができ、例えば、フローサイトメーターのメーカーのマニュアルに従って実施することができる。
【００２２】
フローサイトメトリーでは、細胞の大きさ(前方散乱光: FSC)、細胞の密度(側方散乱光: SSC)、細胞表面抗原(蛍光標識抗体による蛍光)などを基準にして目的とする細胞を検出することができる。
【００２３】
フローサイトメーターでの測定の際に、目的とする細胞を検出することができる蛍光標識抗体を適宜選択して使用することができる。そのような蛍光標識抗体としては、例えば、各種のＣＤ抗原に特異的に結合する蛍光標識抗体が挙げられる。蛍光標識抗体は、多種の物が市販されているので市販品を使用することもできるし、抗体の調製及び蛍光標識化を行って得ることもできる。抗体を蛍光標識するための化合物としては、公知の蛍光標識化合物を広く使用することができる。
【００２４】
フローサイトメトリーでの測定の際に、内部標準となる蛍光性のビーズを使用することもできる(特許文献１参照)。このような既知数のビーズをサンプルチューブ中に入れておき、標的細胞と一緒にフローサイトメーターに取り込ませ同時測定することで、ビーズの測定値で標的細胞の測定値をノーマライズし、すなわちサンプルチューブ中のビーズの既知数で補正することにより、サンプルチューブ中に存在し得る標的細胞数を算出することが可能となる。
【００２５】
・工程（１）
工程（１）では、検量線を作成するために、フローサイトメーターを用いて、複数の既知濃度の標準試料中の細胞濃度の測定を行う。
【００２６】
工程（１）で使用する標準試料の濃度の数は、検量線を引くことが可能である限り特に限定されず、例えば、２種以上、好ましくは３種以上、より好ましくは４種以上、更に好ましくは５種以上、特に好ましくは６種以上であり、上限は、例えば、３０種である。
【００２７】
標準試料の調製方法としては、細胞の濃度を調整することが可能な方法を広く使用することができる。例えば、血球計算盤(ヘモサイトメーター)を用いて顕微鏡により目視でカウントする方法が挙げられる。１種の標準試料を調製できれば、その他の標準試料は段階的希釈を行うことにより調製することができる。
【００２８】
また、工程（１）で使用する、各既知濃度についての標準試料の数は、特に限定されず、例えば、１個以上、好ましくは２個以上、より好ましくは３個以上、更に好ましくは４種以上、特に好ましくは５個以上、最も好ましくは６個以上であり、上限は、例えば、９０個である。
【００２９】
工程（１）で測定した測定値の既知濃度に対する正確度は、好ましくは全て±３０％以内であり、より好ましくは全て±２５％以内であり、更に好ましくは全て±２０％以内であり、特に好ましくは全て±１５％以内である。ここでの「正確度」の値は、測定値の平均と既知濃度との差を既知濃度に対するパーセントで表したものである(相対誤差)。このような正確度を有する測定値を検量線の作成に使用することで、細胞濃度のより正確な定量が可能となる。
【００３０】
また、工程（１）で測定した測定値の既知濃度に対する精度は、好ましくは全て±３０％以内であり、より好ましくは全て±２５％以内であり、更に好ましくは全て±２０％以内であり、特に好ましくは全て±１５％以内である。ここでの「精度」の値は、変動係数(CV: coefficient of variation)を意味する。このような精度を有する測定値を検量線の作成に使用することで、細胞濃度のより正確な定量が可能となる。
【００３１】
・工程（２）
工程（２）では、工程（１）で測定した測定値と既知濃度とに基づいて検量線の作成を行う。
【００３２】
検量線は、最小二乗法などの常法によりソフトウェアなどを使用して作成することができる。作成された検量線の相関係数は１に近いほど望ましい。
【００３３】
このように検量線を作成することで、試料の調製手順中における標的細胞の回収率を求めることができるので、結果として正確度の評価を行うことが可能となる。
【００３４】
工程（２）において、(特に検量線の傾きがほぼ１となる場合は)既知濃度に対して誤差±３０％以内(好ましくは±２５％以内、より好ましくは±２０％以内、更に好ましくは±１５％以内)に収まった測定値を検量線の作成に使用することが望ましい。このような誤差範囲の測定値を検量線の作成に使用することで、細胞濃度のより正確な定量が可能となる。
【００３５】
なお、検量線の傾きが１とならない場合(例えば、細胞の回収率が１００％とならない場合など)は、検量線の数式を用い、測定値から細胞数を計算し、その計算値が既知濃度に対してどの程度の正確度かを検証することが望ましい。
【００３６】
・工程（３）
工程（３）では、フローサイトメーターを用いて、未知濃度の試料中の細胞濃度の測定を行う。
【００３７】
・工程（４）
工程（４）では、工程（２）で作成した検量線を用いて、工程（３）で測定した測定値から細胞濃度を決定する。
【００３８】
このように検量線を用いて細胞濃度を決定することで、フローサイトメーターを使用した正確度が高い定量を行うことが可能となる。
【実施例】
【００３９】
以下、本発明を更に詳しく説明するため実施例を挙げる。しかし、本発明はこれら実施例等になんら限定されるものではない。【００４０】
＜方法＞
50μLのC.B-17 SCIDマウスの血液を検体とし、そこに10、100、1,000及び10,000細胞のヒトＴ細胞(末梢血Ｔ細胞、Cryo-T8: Human CD8+ Negatively Selected (5-8M cells)、Precision Bioservices社)をそれぞれ添加したサンプル、並びにヒトＴ細胞溶解液非添加のサンプルを調製した。これらのサンプルを、市販のチューブ(TruCOUNT Tubes、BD Biosciences社)内で、BD TritestTM CD3/CD8/CD45 reagent (BD Biosciences社)と混合させた。本試薬には、fluorescein isothiocyanate (FITC)-labeled anti-CD3 antibody (clone SK7), phycoerythrin (PE)-labeled anti-CD8 antibody (clone SK1)及びperidinin chlorophyll protein (PerCP)-labeled anti-CD45 antibody (clone 2D1)が含まれている。【００４１】
15分間室温で静置した後、BD FACSTM lysing solution (BD Biosciences社)を用いて、血液を溶血させ、細胞を固定化した。さらに15分間静置した後、フローサイトメトリー定量を行った。フローサイトメトリー測定は、BD FACSLyricTM flow cytometer (BD Biosciences社)を用いて実施した。解析にはFlowJo software (version 10, BD Biosciences)を用い、ヒトCD45/CD3/CD8陽性細胞を標的細胞として検出した。各濃度において、n=3でサンプルを調製し測定を行った。【００４２】
＜結果＞
検量線の作成の結果を表１に示す。検量線の直線性は良好であり、回収率は概ね100%であった。日内及び日間の正確度(accuracy, Relative error)及び精度(precision, Coefficient of variation)も良好であった。定量下限は30 cells/50μLであった。【００４３】
【表１】
2020090852.tif 000002
【国際調査報告】
2020090852.tif 000003
2020090852.tif 000004
2020090852.tif 000005
2020090852.tif 000006