(57)【要約】  本発明により、消化管上皮細胞の膜を堅牢化させる性質を有する生理活性物質を含むコアと、コアの被覆剤とから構成される、被覆型の、家畜の増体効果または飼料効率向上剤を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
消化管上皮細胞の膜を堅牢化させる性質を有する生理活性物質を含むコアと、コアの被覆剤とから構成される、被覆型の、家畜の増体効果または飼料効率向上剤。
【請求項２】
前記生理活性物質が、バクテリオシン、ポリフェノール、アミノ酸又はその誘導体、有機酸又はその誘導体, HSP inducer, 抗酸化剤、及び多糖からなる群から選ばれる少なくとも1種を含む、請求項１記載の家畜の増体効果または飼料効率向上剤。
【請求項３】
前記生理活性物質が、Nisin, Subtilin, Plantaricin, 及びGassericinからなる群から選ばれる１以上のバクテリオシンである請求項１又は２記載の家畜の増体効果または飼料効率向上剤。
【請求項４】
前記生理活性物質が、該物質を産生する微生物の培養物として含まれる請求項１〜３のいずれか１項記載の家畜の増体効果または飼料効率向上剤。
【請求項５】
前記生理活性物質が、バチルス属（Bacillus）、ラクトコッカス属（Lactococcus lactis）、ラクトバチルス属（Lactbacillus）、ルコノストク属（Leuconostoc）、ペディオコッカス属（Pediococcus）からなる群から選ばれる１以上の微生物の培養物として含まれる、請求項１〜４のいずれか１項記載の家畜の増体効果または飼料効率向上剤。
【請求項６】
前記微生物が、バチルス サブチリス（Bacillus subtilis）、ラクトコッカス ラクチス（Lactococcus lactis）、又はラクトバチルス プランタム（Lactbacillus plantarum）である請求項５記載の家畜の増体効果または飼料効率向上剤。
【請求項７】
前記ポリフェノールがケルセチンまたはタンニンである請求項２記載の家畜の増体効果または飼料効率向上剤。
【請求項８】
前記アミノ酸がグルタミン、フェニルアラニン、トリプトファン、バリン及びチロシンからなる群から選ばれる少なくとも１種である請求項２記載の家畜の増体効果または飼料効率向上剤。
【請求項９】
前記HSP inducerがポリリン酸またはCompetence and sporulation factorである請求項２記載の家畜の増体効果または飼料効率向上剤。
【請求項１０】
前記被覆剤が、植物硬化油、シェラック、ツェイン、ヒドロキシプロピルメチルセルロース及びマルチトールからなる群から選ばれる少なくとも１種を含有する、請求項１〜９のいずれか１項記載の家畜の増体効果または飼料効率向上剤。
【請求項１１】
前記生理活性物質が、Nisin, Subtilin, Plantaricin, 及びGassericinからなる群から選ばれる１以上のバクテリオシンであり、被覆剤が、菜種硬化油及び／又はシェラックである、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の家畜の増体効果又は飼料効率向上剤。
【請求項１２】
前記被覆剤により形成される被覆層が、菜種硬化油から形成される層と、シェラックから形成される層の２層構造である、請求項１１に記載の家畜の増体効果又は飼料効率向上剤。
【請求項１３】
シェラックから形成される層がコアに接しており、その上に、菜種硬化油から形成される層が形成されている、請求項１２に記載の家畜の増体効果又は飼料効率向上剤。
【請求項１４】
請求項１〜１３のいずれか１項記載の家畜の増体効果または飼料効率向上剤を含有する飼料。
【請求項１５】
請求項１〜１３のいずれか１項記載の飼料効率向上剤又は請求項１４記載の飼料を家畜に投与することを含む、家畜の増体効果および飼料効率を増大する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、家畜、特に単胃動物に好適な飼料用添加剤及び前記添加剤を含有する飼料に関する。
【背景技術】
【０００２】
国連の「世界人口白書」の報告では、2011年には世界人口が70億人に到達したと推計され、さらに2050年には98億人にまで増加することが予想されている。これにともない食糧危機問題も深刻化し、特にBRICSを中心として食肉性蛋白質の需要が急激に増している。そのため、畜肉の生産性を改善する技術は必須である。
畜産動物の生産性を改善するひとつの技術として、成長促進用抗生物質（antibiotic growth promoter, AGP）がある。抗生物質は、元来、ペニシリンのように病原菌の増殖を阻害することを中心に治療用途として開発され、医薬品として広く使用されている。その後、抗生物質の用途が拡大し、1950年代後半からは畜産動物の成長促進目的での利用も広く行われるようになった。一方、薬剤耐性生菌の問題や環境汚染の観点から、2006年に欧州で成長促進用としての利用が禁止され、2015年に米国で規制強化が確定している。2016年、Colistin耐性遺伝子が可動性plasmid上に存在することが判明した（非特許文献１）。また2050年には、薬剤耐性菌はガン以上に大きなリスクとなり、この問題に対策を取らなければ、年間死亡率はガンを超えて1000万人に達する可能性があり、国際的な脅威となりうる（非特許文献２）。これに伴い、各国でも治療にも利用されているAGPや、ヒト・動物共通の治療薬は、規制強化にむけた緊急課題としてリスク判断している。また米国では、ファーストフード市場でも、抗生物質フリーの食肉提供が計画されている。【０００３】
ＡＧＰの代替候補の一つとして、バクテリオシンがある。バクテリオシンは、細菌類が産生する、おもに同種や類縁種に対する抗菌活性をもったタンパク質やペプチドの総称で、ナイシン（Nisin）やプランタリシン（Plantaricin）は、食品保存料として広く利用されている。しかしながら、消化酵素で容易に分解されるため、飼料用途では利用されていない。特許文献１には、ナイシン等のランチビオティックを、リゾチーム等の細胞壁溶解物質、キレート剤等の金属イオン封鎖剤、及び卵粉等の抗菌性物質と併用することにより、畜産動物の腸内病原菌の増殖や疾患を抑制する技術が報告されている。非特許文献３には、ナイシン産生菌から菌を分離した濃厚溶液を飼料として添加した技術が開示されている。
バクテリオシン以外については、非特許文献４に、飼料に対して500〜1,000ppmのケルセチン（フラボノイド化合物）を添加した結果、増体効果（増体効率ともいう）及び飼料消費量は増大せず、飼料効率はほとんど変わらないか微減だった、との報告がある。特許文献２は、エステル化ペクチンまたはその混合物を飼料に含ませた技術であるが、炎症性疾患に対処するものである。【０００４】
一方、少量で成長促進効果を示すAGPの作用機構については明確ではない。抗生物質が、なぜ飼料効率改善につながるのかに関しては諸説ある（非特許文献５）。
- 仮説１）AGPは潜在的な感染を予防し、免疫系が必要とする代謝コストを削減する。
- 仮説２) AGPが腸内菌叢を制御し、腸内細菌がアンモニア等の代謝物を抑制することで、ホスト動物の成長を促進する。
- 仮説３) AGPが腸内細菌の増殖を抑制し、微生物が利用する栄養を減少する。
- 仮説４) AGPは畜産動物の消化管壁を薄弱化し、栄養素の吸収を強化する。
これらの仮説に対して、T. A. Niewoldらは以下の反論をしている：１）AGPは動物の畜種によらず抗菌効果を発揮する。２）抗菌スペクトルが異なるAGPでも同様の成長促進効果を発揮する。３）治療用の抗生物質の中には成長促進効果効果を発揮しないものもある。４）AGPの使用濃度は最小増殖阻止濃度MIC以下である低容量での長期的な使用は耐性菌を発生させやすいはずである。５）抗菌作用を発揮する代替抗菌物質はその抗菌効果が高いにもかかわらず効果が安定しない（非特許文献５）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】国際公開第2004/026334号
【特許文献２】国際公開第2017/009257号
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Lancet Infect Dis (2016) vol.16 pp.161-165
【非特許文献２】chaired by Jim O'Neill, Review on Antimicrobial Resistance, May 2016
【非特許文献３】Damian Jozefiak et al, PLoS ONE 8(12): e85347, 2013
【非特許文献４】M. Goliomytis et al, Poult Sci (2014) volume 93(8):1957-62
【非特許文献５】T. A. Niewold, Poultry Science (2007) vol.86:pp605-609
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
以上の点から、AGPの作用機構が明確でないため、現時点でＡＧＰに代わる有効な成長促進物質は未だ存在しない。したがって、本発明の課題は、健康な家畜にも増体効果を示すことができ、かつ、経済的な飼料用添加剤及び該添加剤を含有する飼料を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らが鋭意検討した結果、AGPを低濃度で使用したときの効果のひとつが消化管上皮細胞の膜を堅牢化することであると突き止めた。さらにこのことより、消化管上皮細胞の膜を堅牢化させる性質を有する生理活性物質をコーティングして健康なニワトリに給餌することで、増体効果と飼料効率を高めることができることを見出した。この知見に基づき、コーティングすることで家畜の増体効果を高めることができる飼料用添加剤に係る発明を完成させた。すなわち、下記各発明を提供する。
１．  消化管上皮細胞の膜を堅牢化させる性質を有する生理活性物質を含むコアと、コアの被覆剤とから構成される、被覆型の、家畜の増体効果または飼料効率向上剤。
２．  前記生理活性物質が、バクテリオシン、ポリフェノール、アミノ酸又はその誘導体、有機酸又はその誘導体, HSP inducer, 抗酸化剤、及び多糖からなる群から選ばれる少なくとも1種を含む、前記１項記載の家畜の増体効果または飼料効率向上剤。
３．  前記生理活性物質が、Nisin, Subtilin, Plantaricin, 及びGassericinからなる群から選ばれる１以上のバクテリオシンである前記１又は２記載の家畜の増体効果または飼料効率向上剤。
４．  前記生理活性物質が、該物質を産生する微生物の培養物として含まれる前記１〜３のいずれか１項記載の家畜の増体効果または飼料効率向上剤。
５．  前記生理活性物質が、バチルス属（Bacillus）、ラクトコッカス属（Lactococcus lactis）、ラクトバチルス属（Lactbacillus）、ルコノストク属（Leuconostoc）、ペディオコッカス属（Pediococcus）からなる群から選ばれる１以上の微生物の培養物として含まれる、前記１〜４のいずれか１項記載の家畜の増体効果または飼料効率向上剤。
６．  前記微生物が、バチルス サブチリス（Bacillus subtilis）、ラクトコッカス ラクチス（Lactococcus lactis）、又はラクトバチルス プランタム（Lactbacillus plantarum）である前記５項記載の家畜の増体効果または飼料効率向上剤。
７．  前記ポリフェノールがケルセチンまたはタンニンである前記２項記載の家畜の増体効果または飼料効率向上剤。
８．  前記アミノ酸がグルタミン、フェニルアラニン、トリプトファン、バリン及びチロシンからなる群から選ばれる少なくとも１種である前記２項記載の家畜の増体効果または飼料効率向上剤。
９．  前記HSP inducerがポリリン酸である前記２項記載の家畜の増体効果または飼料効率向上剤。
１０．  前記被覆剤が、植物硬化油、シェラック、ツェイン、ヒドロキシプロピルメチルセルロース及びマルチトールからなる群から選ばれる少なくとも１種を含有する、前記１〜９のいずれか１項記載の家畜の増体効果または飼料効率向上剤。
１１．  前記生理活性物質が、Nisin, Subtilin, Plantaricin, 及びGassericinからなる群から選ばれる１以上のバクテリオシンであり、被覆剤が、菜種硬化油及び／又はシェラックである、前記１〜１０のいずれか１項に記載の家畜の増体効果又は飼料効率向上剤。
１２．  前記被覆剤により形成される被覆層が、菜種硬化油から形成される層と、シェラックから形成される層の２層構造である、前記１１項に記載の家畜の増体効果又は飼料効率向上剤。
１３．  シェラックから形成される層がコアに接しており、その上に、菜種硬化油から形成される層が形成されている、前記１２項に記載の家畜の増体効果又は飼料効率向上剤。
１４．  前記１〜１３のいずれか1項記載の家畜の増体効果または飼料効率向上剤を含有する飼料。
１５．  前記１〜１３のいずれか1項記載の飼料効率向上剤又は前記１４項記載の飼料を家畜に投与することを含む、家畜の増体効果および飼料効率を増大する方法。
【発明の効果】
【０００９】
本発明の被覆型飼料用添加剤及び飼料により、健康な家畜にも増体効果を示すことができ、かつ、経済的な飼料用添加剤及び飼料を提供することができる。本発明の飼料用添加剤及び飼料は、また、少量でも増体効果を発揮する。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１Ａ】図１Ａは、各種生理活性物質（ＡＧＰ）の種々の濃度におけるバリア機能の回復率を示す（実験例Ａ）。
【図１Ｂ】図１Ｂは、各種生理活性物質（バクテリオシン）の種々の濃度におけるバリア機能の回復率を示す（実験例Ａ）。
【図１Ｃ】図１Ｃは、各種生理活性物質（ポリフェノール）の種々の濃度におけるバリア機能の回復率を示す（実験例Ａ）。
【図１Ｄ】図１Ｄは、各種生理活性物質（アミノ酸）の種々の濃度におけるバリア機能の回復率を示す（実験例Ａ）。
【図１Ｅ】図１Ｅは、各種生理活性物質（有機酸）の種々の濃度におけるバリア機能の回復率を示す（実験例Ａ）。
【図１Ｆ】図１Ｆは、各種生理活性物質（HSP inducer）の種々の濃度におけるバリア機能の回復率を示す（実験例Ａ）。
【図１Ｇ】図１Ｇは、各種生理活性物質（抗酸化剤）の種々の濃度におけるバリア機能の回復率を示す（実験例Ａ）。
【図１Ｈ】図１Ｈは、各種生理活性物質（多糖）の種々の濃度におけるバリア機能の回復率を示す（実験例Ａ）。
【図２】図２は、胃液及び腸液条件下での、２層被覆型飼料用添加剤からのケルセチンの溶出率の経時変化を示す（実施例１・１-２）。
【図３】図３は、胃液及び腸液条件下での、２層被覆型飼料用添加剤からのチロシンの溶出率の経時変化を示す（実施例２・２-２）。
【図４】図４は、胃液及び腸液条件下での、２層被覆型飼料用添加剤からのNisinAの溶出率の経時変化を示す（実施例３・３-２）。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
〔コア〕
本発明者らが生理活性物質を網羅的に調べたところ、バクテリオシン、ポリフェノール、アミノ酸又はその誘導体、有機酸又はその誘導体、HSP inducer, 抗酸化剤、及び多糖からなる群から選ばれる少なくとも１種に、優れた膜堅牢化能が認められることを見出した。
バクテリオシンは、Paul D. Cotterの分類（Nat. Rev. Microbiol. 2005 Volume3 (10), pp777-88）によると、ClassIとClassIIとの２つのクラスに分類されている。
ClassIに属するバクテリオシンは、Lantibioticsとも呼ばれており、その構造中に翻訳後修飾によって生じる異常アミノ酸が存在している。具体例として、ナイシンＡ（NisinA）、ナイシンＺ（NisinZ）、ナイシンＱ（NisinQ）、サブチリン（Subtilin）、デュラマイシン（Duramycin）、メルサシジン（mersacidin）, ラクチシン-481（lacticin481）があげられる。
ClassIIは、その構造中に異常アミノ酸を含まないペプチドである。ClassIIはさらに３つのサブクラスａ〜ｃに分類される。ClassIIaに属するバクテリオシンの具体例として、ペディオシンPA-1（pediocinPA-1）, エンテロシンA（enterocin A）があげられる。ClassIIbに属するバクテリオシンは同時に産生される２つのペプチドであり、それらがお互いの効果を相乗的に高めることが知られている。具体例として、プランタリシン（Plantaricin：PlnE, PlnF）、エンテロシンX（enterocin X: Xalpha, Xbeta）, ラクトコシンQ（Lactococcin Q: Qalpha, Qbeta）があげられる。ClassIIcに属するバクテリオシンは、Ｎ末端とＣ末端がペプチド結合で連結した環状構造を有する。具体例として、ガセリシンＡ（GassericinA）、サーキュラリンＡ（CircularinA）、ラクトサイクリシンQ(lactocyclicinQ)があげられる。
【００１２】
本発明で用いるバクテリオシンとしては、ClassI、ClassIIb及びClassIIcに属するバクテリオシンが好ましい。本発明で用いるバクテリオシンとしては、ナイシン（Nisin）、ガセリシン（Gassericin）、プランタリシン（Plantaricin）、サブチリン（Subtilin）がより好ましい。
なお、各バクテリオシンの名前の後ろにアルファベットが附されていない場合、そのバクテリオシンの総称を意味する（例えば、用語「ナイシン」は、NisinA, NisinZ等を包含する概念である）。
本発明者らの実験により、ナイシンに膜堅牢化能が認められたので、膜堅牢化能を有するバクテリオシンをスクリーニングする指標を検討したところ、膜堅牢化能は、抗菌活性ないし抗菌スペクトルとは必ずしも相関しないことが分かった（後述する実験例Ｂ参照）。
【００１３】
AGPとして利用される抗生物質は、消化酵素で分解されないため、体内でも活性は持続し、糞便として排出後も抗菌活性があることが知られている。一方、蛋白質やペプチドであるバクテリオシンは、消化酵素で容易に分解されるため、消化管内で活性は失活する。飼料用途で用いる場合は、消化酵素で失活しないように、保護（コーティング）することが望ましく、保護されていれば、小腸で10〜100ppmあれば充分に膜堅牢化能を発揮する。その後、糞便中に移行したバクテリオシンは糞便中の酵素によって失活するため、安全である。したがって、ＡＧＰに代えてバクテリオシンを含む飼料用添加剤又は飼料を家畜に投与しても、薬剤耐性菌の問題を生じないという利点を有する。なお、本明細書において、「ppm」は「ppm by mass」を意味する。
【００１４】
本発明で用いるポリフェノールとしては、ケルセチン（Quercetin）、クルクミン（Curcumin）等があげられる。ケルセチンが好ましい。
本発明で用いるアミノ酸としては、グルタミン（Glutamine, Gln）、トリプトファン（Tryptophan, Trp）、バリン（Valine, Val）、チロシン（Tylosin, Tyr）、フェニルアラニン（phenylalanine, Phe）等があげられる。アミノ酸の誘導体としては、フェニルラクテート（Phenyllactate, PLA）等があげられる。
本発明で用いる有機酸としては、酪酸等があげられる。有機酸は、総炭素数が２〜５程度である。有機酸の誘導体としては、例えば炭素数１〜５のアルコールとのエステルがあげられる。
【００１５】
本発明で用いるHSP誘導剤（heat shock protein (HSP) inducer）としては、ポリリン酸（Poly-Phosphate）やBacillus subtilis由来の胞子形成因子（Competence and sporulation factor（CSF）)等があげられる。
本発明で用いる抗酸化剤としては、アスタキサンチン（Astaxanthin）等があげられる。
本発明で用いる多糖としては、アラビックガム（Arabic Gum）、プルラン（Pullulan）、ガラクトグルコマンナン（galactoglucomannan, GGM）、キサンタンガム（Xanthan Gum, XG）等があげられる。
本発明において、前記生理活性物質は、一種単独で使用しても、二種以上を組み合わせて使用してもよい。本発明で用いる生理活性物質としては、バクテリオシン、多糖、アミノ酸及びこれらの組合せが好ましく、Nisin、Tyr及びこれらの組合せがより好ましい。
【００１６】
ところで、ポリリン酸は、ヒートショックプロテイン（HSP inducer）の生産能を高めることでバリア機能を強化することが知られている（Shuichi Segawa et. al., PLoS ONE, 2011, 6(8): e23278）。ヒートショックプロテインに代表されるストレス応答タンパク質が誘導されると、細胞間バリア機能が増強されると考えられている。
一方、タイトジャンクションは、隣り合った細胞の細胞膜が密着し、その外葉が互いに融合して形成された層であり、上皮細胞の側底膜(basolateral membrane)と頂端膜(apical membrane)の境界に位置し、両者の間で膜蛋白質や脂質が混ざりあうのを防いでいると考えられている（岩波「生物学辞典」第４版ＣＤ-ＲＯＭ版、1998年）。
如何なる理論にも拘束されるものではないが、本発明において使用する生理活性物質は、タイトジャンクションによる物質拡散を妨げる機能と、ストレス応答タンパク質による細胞間バリア機能のいずれか一方又は両方による膜堅牢化能を有すると推測される。タイトジャンクションを堅牢化させると健康になると考えられるが、タイトジャンクションを堅牢化できる物質を腸まで届かせる飼料は存在しなかった。また、in vitroでタイトジャンクションを堅牢化させることができる抗菌剤を、家畜に投与した場合に増体効果を示すことは知られていなかった。なお、本明細書において、膜堅牢化能をバリア機能と称することもある。
【００１７】
本発明で用いる生理活性物質は、所望の効果が得られればその純度は制限されない。例えば、微生物に生産させて得られた生理活性物質を培養物ごと用いることができる。凍結乾燥にて発酵液中の固形物を得ることもできるし、噴霧造粒にて発酵液を固形物として得ることもできる。
あるいは、本発明で用いる生理活性物質は、植物、藻類、甲殻類、又は魚類からの分泌物や抽出物をそのまま用いることもできる。本発明で用いる生理活性物質としては、市販品をそのまま用いることもできる。
【００１８】
生理活性物質のうち、ポリフェノール（polyphenol）を含む植物として、ブドウ、ワイン、茶、リンゴ、ブルーベリー、柿、バナナ、ウコン、シナモン、コーヒー豆、柑橘類、タマネギ等があげられる。
生理活性物質のうち多糖を産生する微生物としては、例えば、リポマイセス スタルキー（Lypomyces Starkey）の産出するガラクトグルコマンナン（galactoglucomannan, GGM）は、特開平7-298873号公報、特開平9-131199号公報に記載の方法にて得ることができる。生理活性物質のうち、多糖を生産する微生物として、ザントモナス カンペストリス（Xanthomonas campestris）、アウレオバシジウム プルランス（Aureobasidium pullulans）、リポマイセス スタルキー（Lypomyces Starkey）、褐藻では昆布（Phaeophyta）、藻類ではEucheumaがあげられる。また植物では、アラビアゴム（Acacia senegal）やグアー豆（Cyamopsis tetragonoloba）、イバラノリ（Hypnea musciformis)、タラ（Tara spinosa）、ローカストビーン（Ceratonia siliqua）などがあげられる。
生理活性物質のうち、アミノ酸又はその誘導体を生産する微生物として、Brevibacterium flavum, Corynebacterium glutamicum, Bacillus subtilis, Escherichia coli などがあげ得られる。 
生理活性物質のうち、有機酸又はその誘導体を生産する微生物として、 ラクトバチルス属（Lactbacillus）ビフィズス属（Bifidobacterium）、クロストリジウム属（Clostridium）等があげられる。
生理活性物質のうち、HSP inducerを生産する微生物として、バチルス属（Bacillus）、ラクトコッカス属（Lactococcus lactis）、ラクトバチルス属（Lactbacillus）、ルコノストク属（Leuconostoc）、ペディオコッカス属（Pediococcus）があげられる。
生理活性物質のうち、抗酸化剤を生産する微生物として、Phaffia rhodozyma やPseudomonas thiazolinophilum,、藻類として、Hematococcus pluvialis）などがあげられる。
本発明で用いる生理活性物質のひとつであるバクテリオシンはまた、バチルス属（Bacillus）、ラクトコッカス属（Lactococcus lactis）、ラクトバチルス属（Lactbacillus）、ルコノストク属（Leuconostoc）、ペディオコッカス属（Pediococcus）からなる群から選ばれる１以上の微生物の培養産物であるのが好ましい。
【００１９】
なかでもバクテリオシンを産生する微生物として、米国飼料検査官協会（AAFCO）又は欧州食品安全機関（EFSA）に登録されている、バチルス サブチリス（Bacillus subtilis）、ラクトコッカス ラクチス（Lactococcus lactis）、ラクトバチルス プランタム（Lactbacillus plantarum）、ラクトバチルス・アシドフィラス（Lactobacillus acidophilus）、ラクトバチルス・アリメンタリアス（Lactobacillus alimentarius）、ラクトバチルス・アミロリティカス（Lactobacillus amylolyticus）、ラクトバチルス・アミロボラス（Lactobacillus amylovorus）、ラクトバチルス・アヴィアリエス（Lactobacillus aviaries）、ラクトバチルス・ブレビス（Lactobacillus brevis）、ラクトバチルス・バクネリ（Lactobacillus buchneri (cattle)）、ラクトバチルス・バルガリカス（Lactobacillus bulgaricus）、ラクトバチルス・カゼイ（Lactobacillus casei）、ラクトバチルス・セロビオサス（Lactobacillus cellobiosus）、ラクトバチルス・クリスパタス（Lactobacillus crispatus）、ラクトバチルス・クルバタス（Lactobacillus curvatus）、ラクトバチルス・デルブエッキ（Lactobacillus delbrueckii）、ラクトバチルス・ファルシミニス（Lactobacillus farciminis (swine)）、ラクトバチルス・ファーメンタム（Lactobacillus fermentum）、ラクトバチルス・ガリナラム（Lactobacillus gallinarum）、ラクトバチルス・ガセリ（Lactobacillus gasseri）、ラクトバチルス・ヘルベティカス（Lactobacillus helveticus）、ラクトバチルス・ヒルガルディ（Lactobacillus hilgardii）、ラクトバチルス・ジョンソニー（Lactobacillus johnsonii）、ラクトバチルス・ケフィラノファシエンス（Lactobacillus kefiranofaciens）、ラクトバチルス・ケフィリ（Lactobacillus kefiri）、ラクトバチルス・ラクチス（Lactobacillus lactis）、ラクトバチルス・ムコサエ（Lactobacillus mucosae）、ラクトバチルス・パニス（Lactobacillus panis）、ラクトバチルス・パラカセイ（Lactobacillus paracasei）、ラクトバチルス・パラプランタラム（Lactobacillus paraplantarum）、ラクトバチルス・ペントサス（Lactobacillus pentosus）、ラクトバチルス・ポンチス（Lactobacillus pontis）、ラクトバチルス・ルテリ（Lactobacillus reuteri）、ラクトバチルス・ラムノサス（Lactobacillus rhamnosus）、ラクトバチルス・サケイ（Lactobacillus sakei）、ラクトバチルス・サリバリウス（Lactobacillus salivarius）、ラクトバチルス・サンフランシセンシス（Lactobacillus sanfranciscensis）、ラクトバチルス・ゼアエ（Lactobacillus zeae）、ラクトコッカス・ラクチス（Lactococcus lactis）、ルコノストク・シトレウム（Leuconostoc citreum）、ルコノストク・ラクチス（Leuconostoc lactis）、ルコノストク・メセントロイデス（Leuconostoc mesenteroides）、ペディオコッカス・アシディラクチシ（Pediococcus acidilactici）、ペディオコッカス・セレビシエ／ダムノサス（Pediococcus cerevisiae /damnosus）、ペディオコッカス・デキストリニカス（Pediococcus dextrinicus）、ペディオコッカス・ペントサソス（Pediococcus pentosaceus）の培養産物であるのが好ましい。
【００２０】
特に、Lactococcus lactis、Bacillus subtilis、Lactococcus lactis、Lactobacillus plantarum、Lactobacillus gasseri、Clostridium beijerinickiiの培養産物が好ましい。なかでも、Lactococcus lactisの培養産物が好ましい。
とりわけ、Lactococcus lactis FERM  BP-8552（NisinZ生産菌)、Bacillus subtilis ATCC 6633（Subtilin生産菌）、Lactococcus lactis  NCIMB702054（NisinZ生産菌）、Lactobacillus plantarum JCM1057（Plantricin生産菌）、Lactobacillus gasseri LA39 JCM 11657（GassericinA生産菌）、Clostridium beijerinickii JCM 1390（CircularinA生産菌）の培養産物であるのが好ましい。Lactococcus lactis FERM  BP-8552（NisinZ生産菌)、Lactococcus lactis  NCIMB702054（NisinZ生産菌）が最も好ましい。
【００２１】
なお、Lactococcus lactis FERM  BP-8552は、２００３年１１月１９日に独立行政法人 産業技術総合研究所 特許生物寄託センター（日本国茨城県つくば市東１−１−１、郵便番号３０５−８５６６，現、独立行政法人 製品評価技術基盤機構、日本国千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８、郵便番号２９２−０８１８）に寄託されている。本明細書では、この菌株をAJ110212と称することもある。
Bacillus subtilis ATCC 6633は、American Type Culture Collection, Manassas, VA, USA.に寄託されている。
Lactococcus lactis  NCIMB702054は、National Collection of Industrial, Food and Marine Bacteria, NCIMB Ltd., Aberdeen, Scotland, UK. に寄託されている。
Lactobacillus plantarum JCM1057、Lactobacillus gasseri LA39 JCM 11657およびClostridium beijerinickii JCM 1390は、国立研究開発法人 理化学研究所  バイオリソース研究センター 微生物材料開発室（郵便番号305-0074、茨城県つくば市高野台3-1-1）に寄託されている。
【００２２】
コアは、保護剤を含んでもよい。保護剤としては、脱脂粉乳（スキムミルク）、グルタミン酸ナトリウム等のアミノ酸塩、ソルビトール等の糖アルコール、トレハロース及びスクロース等の二糖等があげられる。
コアは、賦形剤を含んでもよい。賦形剤としては、成形の向上のために一般に使用されるものであれば特に限定されないが、例えば炭酸カルシウム、二酸化ケイ素、ケイ酸カルシウム、ゼオライト、ソルビトール、コーンスターチ、タルク、酵母ベントナイト、もみ殻、流動パラフィン、グラム陰性細菌を凝集させる性質を有する多糖以外の多糖、単糖、二糖等があげられる。コアが賦形剤を含む場合、賦形剤の量は、コア１００質量部に対して、通常、0．1〜100質量部であるのが好ましい。
コアはまた、慣用の飼料に含まれ得る任意の添加剤を含んでもよい。コアが任意の添加剤を含む場合、任意の添加剤の量は、コア１００質量部に対して、通常、0．1〜100質量部であるのが好ましい。
【００２３】
〔被覆剤〕
被覆剤は、腸溶性被膜を形成し得る物質であって、家畜が摂取しても安全な物質であれば、特に制限なく用いることができる。被覆剤は、一種単独で使用しても、二種以上を組み合わせて使用してもよい。被覆剤は、取扱の容易性および経済性の観点から、植物硬化油や、錠剤の被覆剤として慣用の物質である、シェラック（セラック）、ツェイン、ヒドロキシプロピルメチルセルロース及びマルチトール等であるのが好ましい。植物硬化油としては、菜種油、亜麻仁油、サフラワー油、ひまわり油、大豆油、トウモロコシ油、落花生油、綿実油、ゴマ油、コメ油、オリーブ油、パーム油、パーム核油、又はヤシ油の硬化油があげられる。被覆剤としては、菜種硬化油及びシェラックが好ましい。菜種硬化油の層は、短時間でコアを溶出させることができるので好ましい。セラックの層は、（胃を通過後の）中性ないしアルカリ性でコアを溶出させることができるので好ましい。
あるいはまた、被覆剤は、そうした生理活性物質を産生する微生物そのものであってもよい。
【００２４】
被覆剤は、本発明の被覆型飼料用添加剤の全質量を基準として、５〜９０質量％となる量であるのが好ましく、２０〜３０質量％となる量であるのがより好ましい。被覆剤はまた、慣用の飼料に含まれ得る任意の添加剤を含んでもよい。
コーティングは、単層でもよく、２層以上の複数層でもよい。複数層コーティングの方が、体内での溶出率を制御しやすいので好ましい。特に、最も外側の層を菜種硬化油の層とし、コアに接する最も内側の層をセラックの層とすると、被覆剤が胃で溶けずに腸で溶けるので好ましい。
本発明の被覆型飼料用添加剤の胃液中の溶出率は50%未満が望ましく、また腸液中の溶出率と人工胃液中の溶出率の差が10%以上であることが望ましい。このような溶出率を達成するには、２層膜や多層膜にしたり、各層の被膜剤の種類や被膜厚さを制御したりすることにより調整することができる。
【００２５】
〔被覆方法〕
前記コアを被覆する方法は特に限定されないが、例えば、市販の流動層型噴霧造粒機にて、粉末ないし顆粒状のコアを流動させながら、融点より高い温度に加熱して液状とした被覆剤を噴霧することにより、被覆型飼料用添加剤を得ることができる。粉末ないし顆粒状の多糖から得られた被覆型飼料用添加剤が0．05〜5ｍｍ程度の大きさにすると、取扱が容易になるので好ましい。また、被覆剤を加熱するときの温度は、被覆剤の融点以上であれば特に制限されないが、被覆剤の融点より5℃〜15℃程度高いことが好ましい。
【００２６】
〔飼料〕
本発明の被覆型飼料用添加剤は、そのまま家畜に与えることもできるし、トウモロコシ、大豆粉、米ぬか、魚粉、ビール酵母等の賦形剤ないし希釈剤と一緒にして飼料とすることもできる。本発明の飼料はまた、飼料に含まれ得る任意の添加剤を含んでもよい。本発明の飼料は、毎日連続して摂取するのが適当である。飼料の摂取量は、家畜の大きさにより異なるが、例えばニワトリの場合、前記生理活性物質の１日あたりの摂取量が、被覆型飼料用添加剤以外の飼料に対して1〜200ppm程度、好ましくは10〜100ppmとなるように与えるのが望ましい。
本明細書において、「家畜」とは、人間に飼養される生き物を意味する。具体的には、牛、羊、山羊等の反芻動物、馬、豚、鶏、犬、魚等の単胃動物を含む。本発明の飼料を、単胃動物に与えるのが特に好ましい。
本発明の被覆型飼料用添加剤の給餌方法は特に制限されない。
【実施例】
【００２７】
実験例Ａ：膜堅牢化実験
J.Nutr.(2009) volume 139(5), pp965-974の記載に従って、試験物質の膜堅牢化能を評価した。
Caco-2 細胞（ヒト消化管上皮細胞（ECACC、Code86010202））を、二層式のTranswell システムに播種し，37℃においてDMEM培地で培養した。培養12日目に、TNF-αを添加し、Tight Junctionのバリア機能を低下させた。培養14日目に、試験物質を添加し、同じ温度において24時間培養後、Millicell ERS-2(Millipore社製)を用いて、経上皮電気抵抗値TER(Ω*cm2)を測定することにより、バリア機能の修復(recovery ratio%)を評価した。結果を図１Ａ〜図１Ｈに示す。
図１Ａに示したように、AGPであるAvilamycinやColistin等には低濃度でも、バリア機能を堅牢化する機能を有することを確認した。TNF-αのみの添加区を対照（control）として、回復対比率（Recovery ratio/control）で、1.1以上の場合に膜堅牢化能を有すると判断した。表１に、各生理活性物質の回復対比率が1.1前後のときのMaterial自体の濃度を示した。Qurcetin、Grape Seed Extract (味の素社製)、NisinA、Tyrosine (味の素社製)、Astaxanthin (DSM社製)などにもバリア機能を堅牢化する機能が観察された。【００２８】
【表１】
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【００２９】
実施例１：Coated-Quercetin
１-１：Coated-Quercetinの調製
コアとして、Quercetin（Tokyo Chemical Industry社製の試薬（純度95%)）を使用し、被覆剤として、菜種硬化油（融点67℃）及び天然樹脂Shellacを使用した。粉末ないし顆粒状にしたコアに、融点より高い温度に加熱することにより液状とした被覆剤の所定量を噴霧することにより、被覆型飼料用添加剤を得た。コーティングは、コア７７質量部に対して、第一層（内側層）としてShellacを５質量部、第２層(外側層)として菜種硬化油を１７質量部噴霧することにより行った。【００３０】
１−２：耐酸性及び腸溶性試験
（人工胃液処理）Merck Millipore社製の純水製造装置を用いて製造した純水に、0.2質量% NaClおよび0.2質量% pepsin（from Porcine stomach Mucosa, 1:5,000, 2,500unit/mg）を加え、pH2に調整後、前記１-１で調製した被覆型飼料用添加剤を投入し、37℃で２時間酵素処理を行った。この間の光学濃度を自動連続計測することで溶出率を測定した。なお、「２時間」は、飼料が鶏の胃に到達してから通過するまでの時間を想定している。
（人工腸液処理）人工胃液処理後、0.2% trypsin（from Porcine Pancreas,1:5,000;4,500unit/mg）を加え、pH6に調整後、37℃で２時間酵素処理を行った。この間の光学濃度を自動連続計測することで溶出率を測定した。なお、「２時間」は、飼料が鶏の腸に到達してから通過するまでの時間を想定している。
pH調整には塩酸及び水酸化ナトリウムを使用した。光学濃度は、ADVANTEC社製Biophoto-recorderTVS062CA を用いて、OD660nmで測定した。
結果を図２に示す。図２から、２層コーティングでは、胃液処理開始から２時間での溶出率が２５％に抑えられる一方、腸液処理では６５％溶出した。この結果から、外層に菜種硬化油層を、内層にShellac層を施した飼料用添加剤は、耐酸性及び腸溶性を有し、放出コントロールに優れることが分かった。【００３１】
１−３：トリ成長試験
前記１-１の2層コーティング法により調製したCoated-Qurcetinを、表２に示す組成の飼料マトリックス中に、コア剤の量が20ppm, 200ppmとなるように添加し、飼料組成物を得た。平飼い鶏舎にて、1区画、初生雛ブロイラー25羽を用い、飼料組成物を与え、３反復で0-21日齢を22日間飼育し、トリの増体（Body Weight Gain；BWG）及び飼料効率（Feed Conversion Ratio；FCR = Feed/BWG）を評価した。なお、陽性対照として、慣用の抗菌性発育促進物質（Antimicrobial Growth Promoter；AGP）であるAvilamycinを用いた。Avilamycinは、市販品（ELANCO社のSurmax200（登録商標）、被覆なし）をそのまま用いた。
結果は、陰性対照を１００として示した。結果を表３に示す。被覆していないQuercetinは腸内菌叢に負の作用を示すことが知られている（J. Nutr. 139: 965-974, 2009.）にも関わらず、Coated-Qurcetinに増体効果、飼料効率改善効果が観られた。なお、被覆していないQuercetinは腸内菌叢に負の作用を示すため、被覆していないQurcetinを用いたトリ成長試験は行なわなかった。【００３２】
【表２】
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【００３３】
【表３】
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【００３４】
実施例２：Coated-Phe及びCoated-Tyr
２-１：Coated-Phe及びCoated-Tyrの調製
実施例１・１-１の記載に従ってCoated-Phe及びCoated-Tyrを調製した。
２-２：耐酸性及び腸溶性試験
上で得られたCoated-Tyrを用い、実施例１・１-２と同様にして、耐酸性及び腸溶試験を行った。結果を図３に示す。
２-３：トリ成長試験
上で得られたCoated-Phe及びCoated-Tyrを、表２に示した組成の飼料マトリックス中に、コア材の量が200ppmとなるように添加し、実施例１・１-３に記載の方法に従ってトリの増体効果及び飼料効率を評価した。結果を表４に示す。
Phe及びTyrは被覆していなくても、ある程度の増体効果が確認されたが、メタボローム解析の結果では、腸管内容物や血液中に、Phe又はTyrは検出されなかった。したがって、Coated-Phe及びCoated-Tyrは、糞便中では腸内細菌によって資化され、また血液中でも速やかに代謝されていると考えられる。従って、被覆しないアミノ酸よりも被覆したアミノ酸の方が、より安定的に効果を発揮するものと考えられる。【００３５】
【表４】
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【００３６】
２-４：トリにおけるサルモネラ感染試験によるL-TyrおよびCoated-L-Tyrの評価
実施例２−１と同様にして調製したCoated-TyrおよびTyrを、表２に示す組成の飼料マトリックス中に、コア材の量が２００ｐｐｍとなるように添加した飼料を作製した。１日齢ブロイラーを感染試験用飼育設備へ導入後(6羽/反復、2反復/試験区)、Salmonella enterica(SE)を２日齢ブロイラーに経口投与し、試験飼料を21日間給与し、トリの増体効果及び飼料効率を評価した。なお、陽性対照として、慣用の抗菌性発育促進物質であるEnramycinを用いた。Enramycinは、市販品（（株）科学飼料研究所製の「エンラマイシン F-80」、被覆なし）をそのまま用いた。
結果は、陰性対照を１００として示した。結果を表５に示す。【００３７】
【表５】
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その結果、コーティングを施さないチロシン（「L-Tyr」）には効果はないが、Coated-Tyrにはエンラマイシンと同等の増体効果および飼料効率改善効果を示した。【００３８】
実施例３：Coated-NisinA
３-１：Coated-NisinAの調製
コアとしてNisinA（Sigma-Aldrich社製の試薬（Nisin含量2.5質量%, balance sodium chloride and denatured milk solids) を使用し、被覆剤として、菜種硬化油（融点67℃）及び天然樹脂Shellacを使用した。実施例１・１-１の記載に従って、二層コーティングの被覆型飼料用添加剤を得た。【００３９】
３-２：耐酸性及び腸溶性試験
上で調製したCoated-NisinAを用い、実施例１・１-２と同様にして、耐酸性及び腸溶試験を行った。結果を図４に示す。
３-３：トリ成長試験
３-１で調製したCoated-NisinAを、表２に示した組成の飼料マトリックス中に、コア材の量が1ppm, 10ppmとなるように添加し、トリの増体効果及び飼料効率を評価した。平飼い鶏舎にて、1区画、初生雛ブロイラー25羽を用い、３反復で0から21日齢まで飼育した。結果を表６に示す。ナイシンは胃酸で活性低下し消化酵素トリプシンにより完全に失活するにも関わらず、Coated-NisinAには増体効果、飼料効率改善効果が観察された。【００４０】
【表６】
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【００４１】
３-４：トリにおけるサルモネラ感染試験によるCoated-NisinAおよびCoated-プルランの評価
３-１で調製した調製したCoated-NisinAを単独、またはCoated-プルランと組合せ、表２に示した組成の飼料マトリックス中に、各コア剤の添加量が１０ｐｐｍとなるように添加した飼料を作製した。0日齢ブロイラーを感染試験用飼育設備へ導入後(2反復/試験区、6羽/反復)、Salmonella enterica（SE）を107個/羽、ゾンデで２日齢ブロイラーのそ嚢（そのう）内へ投与し、試験飼料を21日間給与し、増体効果及び飼料効率を評価した。表７に結果を示した。【００４２】
【表７】
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その結果、Coated-ナイシン区およびCoated-ナイシン＋Coated-プルラン区ともに、増体効果および飼料効率改善効果を示した。【００４３】
３-５：トリにおけるサルモネラ感染試験によるNisinAおよびCoated-NisinAの評価
実施例３−１と同様にして調製したCoated-NisinAおよびNisinAを飼料中に表２のように添加した飼料を作製した。0日齢ブロイラーを感染試験用飼育設備へ導入後(6羽/反復、2反復/試験区)、Salmonella enterica(SE)を２日齢ブロイラーに経口投与し、試験飼料を21日間給与し、増体効果及び飼料効率を評価した。なお、陽性対照として、慣用の抗菌性発育促進物質であるEnramycinを用いた。Enramycinは、市販品（（株）科学飼料研究所製の「エンラマイシン F-80」、被覆なし）をそのまま用いた。
結果を表８に示す。
【表８】
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その結果、コーティングを施さないNisinAには効果はないが、Coated-NisinAにはエンラマイシンと同等の増体効果および飼料効率改善効果を示した。【００４４】
実験例Ｂ： Bacteriocinの抗菌活性評価、抗菌スペクトル評価
Ｂ-１：最小生育阻止濃度の測定
AGPとNisinの最小生育阻止濃度を測定し、比較した。
NisinZ生産菌として、Lactococcus lactis AJ110212 (FERM  BP-8552)を用いた。５L容量の坂口フラスコに入れた培地（BD Difco 社製のLactobacilli MRS Broth１L）中で、前記NisinZ生産菌を、30℃において100rpmにて培養した。培養は、20時間を目安とし、培養液は、分光光度計（ADVANTEC社製Biophoto-recorderTVS062CA）にて波長610nmにてOptical densityを測定、26倍希釈で0.1以上となるよう調製した。得られた培養液を遠心分離（6,000G x10min, 4℃）にかけ、菌体画分（Wet Cell）を分離した。
検定菌として、以下の菌株を利用した。培地、培養温度は菌株の末尾のカッコ内に記載した。MRS培地はDifco 社製のLactobacilli MRS Brothを、GAM培地及びLB培地は、日水製薬社製のものを、NB培地はDifco社製のものを用いた。
グラム陽性細菌
・Lactobacillus acidophilus AJ13778（MRS,37℃、受託番号JCM1132で寄託されたものに相当）
・Lactobacillus salivarius AJ110152（MRS,37℃、受託番号JCM1231で寄託されたものに相当）
・Bifidobacterium thermophilum AJ110569（GAM,37℃、受託番号JCM1207で寄託されたものに相当）
・Bacteroides fragilis JCM11019（GAM,37℃）
・Escherichia coli MG1655 (LB, 37℃、受託番号ATCC700926で寄託されたものに相当) 
・Clostridium perfringens AJ3350（GAM,37℃、受託番号ATCC10873で寄託されたものに相当）
グラム陰性細菌
・Enterococcus faecalis AJ110149（MRS,30℃、受託番号JCM5803で寄託されたものに相当）
・Salmonella enterica AJ2785（NB，37℃、受託番号IAM1648で寄託されたものに相当）【００４５】
なお、JCMで始まる受託番号で特定された細菌の寄託機関は、国立研究開発法人 理化学研究所  バイオリソース研究センター 微生物材料開発室（郵便番号305-0074、茨城県つくば市高野台3-1-1）である。ATCCで始まる受託番号で特定された細菌の寄託機関は、American Type Culture Collection, Manassas, VA, USAである。IAMで始まる受託番号で特定された細菌の寄託機関は、IAM Culture Collection, Center for Cellular and Molecular Research, Institute of Molecular and Cellular Biosciences, The University of Tokyo, Tokyo, Japan (collection transferred to JCM)である。【００４６】
最小生育阻止濃度は、Mayr-Harting, A. et al., Methods Microbiol. 1972, 7A, pp315-422に記載のSpot-on-lawn methodによる抗菌活性測定により算出した。培養液を用いる場合は、阻止円の大きさで定性的な判断をした。結果を表９に示した。【００４７】
【表９】
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【００４８】
Ｂ-２：抗菌スペクトルの測定
試薬で入手困難な化合物は、下記の生産菌をDifco 社製のLactobacilli MRS Broth培地にて30℃で培養し、Bacteriocin含有培養液を調製した。
・Bacteriocin/ClassＩ:Nisinは、実施例３・３−１で用いたNisinAと、NisinZ（生産菌はLactococcus lactis  NCIMB702054）を用いた。Subtilin生産菌はBacillus subtilis ATCC 6633を用いた。DuramycinはSigma-Aldrich社製 (1mg/ml)試薬を用いた。
・Bacteriocin/ClassIIb: Plantricin生産菌は、Lactobacillus plantarum JCM1057を用いた。
・Bacteriocin/ClassIIc: GassericinA生産菌は、Lactobacillus gasseri LA39 JCM11657を、CircularinA 生産菌はClostridium beijerinickii JCM1390を用いた。
抗菌スペクトルは、培養液上清を10倍に濃縮した液を用いて、spot-on lawn methodにて評価した。探索の結果を表１０に示した。【００４９】
【表１０】
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【００５０】
表９および表１０と表1との比較から、膜堅牢化機能と抗菌活性の有無やその強弱とは関連しないことが分かった。【００５１】
実施例４：Coated-バクテリオシン生産菌Probiotics
４-１：バクテリオシン生産菌の培養
実施例３ではNisinA試薬を使用したが、実施例４では、NisinZ生産菌として、Lactococcus lactis FERM  BP-8552を用いた。５L容量の坂口フラスコに入れた培地（BD Difco 社製のLactobacilli MRS Broth１L）中で、前記NisinZ生産菌を、30℃において100rpmにて培養した。培養は、20時間を目安とし、培養液は、分光光度計（ADVANTEC社製Biophoto-recorderTVS062CA）にて波長610nmにてOptical densityを測定、26倍希釈で0.1以上となるよう調製した。
同様にして、Subtilin及びPlantaricinの菌体画分を得た。なお、Subtilin生産菌として、Bacillus subtilis ATCC 6633を用いた。Plantaricin生産菌として、Lactobacillus plantarum JCM1057 を用いた。【００５２】
４-２：バクテリオシン生産菌粉末の調製
４-１で得られたNisinZの菌体画分を保護剤120mlに添加し、Spray Dryer（入口温度80℃、出口温度50℃）もしくは凍結減圧乾燥にて粉体化した。保護剤は、以下の通りである。
（A）Skim milk 10質量%(BD社製)＋グルタミン酸ナトリウム塩3質量% (MSG,AJICO社製)
（B）MSG３質量％、Sorbitol 10質量%、Trehalose 10質量%, Sucrose 10質量%((MSGはAJICO社製、MSG以外は和光純薬社製)
得られたNisinZ生産菌粉末の生菌数を測定した。生菌数の測定は、粉体サンプル0.01ｇを生理食塩水１mlに懸濁し、順次、生理食塩水10倍希釈し、0.1mlをMRS寒天プレートに塗抹し、30℃で、24時間培養し、生成したコロニー数から、colony formed unit (cfu) /g を測定することにより行った。
同様にして、Subtilin及びPlantaricinの生産菌粉末を得、生産菌を測定した。【００５３】
４-３：Coated-NisinZ生産菌粉末、Coated-Subtilin生産菌粉末及びCoated-Plantaricin生産菌粉末の調製
４-２で調製したNisinZ生産菌粉末を、実施例１・１-１に記載したのと同様にして被覆し、Coated-NisinZ生産菌粉末を得た。
同様にして、Coated-Subtilin生産菌粉末及びCoated-Plantaricin生産菌粉末を調製した。【００５４】
４-４：耐酸性及び腸溶性試験
４-３で得られた、被覆したバクテリオシン生産菌粉末をそれぞれ、実施例１・１-２に記載した人工胃液処理及び人工腸液処理に供した。
耐酸性は、人工胃液処理及び人工腸液処理後の各バクテリオシンの生菌数及び抗菌活性を測定することにより評価した。生菌数は、４-２の記載に従って測定した。抗菌活性は、実験例Ｂ・Ｂ-２の記載に従って測定した。結果を表１１に示す。なお、表中の「+」等及び「ND」の意味は、表１０について記載したのと同じである。【００５５】
【表１１】
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【００５６】
４-５：Coated-NisinZ生産菌粉末を用いたトリ成長試験
４-３で調製したCoated-NisinZ生産菌粉末を、表２に示した飼料マトリックス中に、下表の生菌数となるよう添加し、実施例１・１-３に記載の方法に従ってトリの増体効果及び飼料効率を評価した。【００５７】
【表１２】
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【００５８】
実施例５：トリ成長試験
標準飼料に抗生物質（lasalocid 0.05質量%,avilamycin0.01質量%）を添加した有薬飼料（PC）、実施例４-１と同様にLactococcus lactis NCIMB8780を培養して得られたNisinA培養液を2%添加したPRB添加飼料（Nisin（Lc））、無薬飼料（標準飼料のみ）（NC）の３条件を調製し、初生雛へ投与した。なお1条件について、コッブブロイラ一雄初生雛10羽を用い、３反復で実験を行い、トリの増体効果及び飼料効率を評価した。無薬区（NC）は、標準飼料(ME3160kcal，CP 22質量% 抗生物質不使用)を用いた。PC及びNisin添加区は、標準飼料(ME3160kcal，CP 22質量%)に、それぞれ抗生物質（lasalocid及びavilamycin）又はNisinZ含有液を2質量%添加した。【００５９】
【表１３】
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【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図１Ｅ】
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【図１Ｆ】
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【図１Ｇ】
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【図１Ｈ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【国際調査報告】
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