(57)【要約】本発明は、iPS細胞を介して、初期化前のT細胞集団の遺伝的多様性を維持し、かつ抗原に対する指向性を有する再生T細胞集団を製造する方法を提供する。該方法は、（１）T細胞集団を、１種以上の腫瘍関連抗原または１種以上の腫瘍関連抗原を含む生体組織もしくはその破砕物もしくは溶解物と接触させ、前記腫瘍関連抗原に対する指向性を有するT細胞集団を濃縮する工程、（２）前記濃縮したT細胞集団をiPS細胞へと初期化し、前記濃縮したT細胞集団の遺伝的多様性を維持したまま培養する工程、および、（３）前記培養したiPS細胞から再生T細胞集団を製造する工程を含む。【選択図】なし
2020027094.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
iPS細胞を介して再生T細胞集団を製造する方法であって、
（工程１）T細胞集団を、１種以上の腫瘍関連抗原または１種以上の腫瘍関連抗原を含む生体組織もしくはその破砕物もしくはその溶解物と接触させ、前記腫瘍関連抗原に対する指向性を有するT細胞集団を濃縮する工程、
（工程２）前記濃縮したT細胞集団をiPS細胞へと初期化し、前記濃縮したT細胞集団の遺伝的多様性を維持したまま培養する工程、および、
（工程３）前記培養したiPS細胞から再生T細胞集団を製造する工程、
を含む、方法。
【請求項２】
前記再生T細胞集団が、前記濃縮したT細胞集団の遺伝的多様性を維持し、かつ前記腫瘍関連抗原に対する指向性を有する再生T細胞集団である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記工程１におけるT細胞集団が、哺乳動物に由来する、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記哺乳動物がヒトである、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記ヒトが、がん患者または非がん患者である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記がん患者また非がん患者が、がんワクチンを以前に投与されたことがあるか、現在投与されているか、または今後投与される予定である、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記工程１におけるT細胞集団が、体液由来である、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記体液が、血液、リンパ液、組織液、ならびに腹水、胸水、心嚢液、脳脊髄液、関節液および眼房水を含む体腔液、ならびに鼻汁および尿からなる群より選ばれる、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記工程１におけるT細胞集団が、腫瘍組織由来T細胞である、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
前記工程１におけるT細胞集団が、αβT細胞、γδT細胞、ヘルパーT細胞、レギュラトリーT細胞、細胞傷害性T細胞、ナチュラルキラーT細胞またはこれらの混合物である、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
前記工程１における生体組織が、がん原発組織およびがん転移組織である、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
前記工程１におけるT細胞集団を濃縮する工程が、１種以上の腫瘍関連抗原と接触させることにより活性化し、増殖したT細胞を分離する工程を含む、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
前記工程１におけるT細胞集団を濃縮する工程が、前記Ｔ細胞集団より、CD137発現Ｔ細胞を選択する工程およびIFN-γ産生Ｔ細胞を選択する工程からなる群より選ばれる１以上の工程を含む、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
前記工程１におけるT細胞集団を濃縮する工程が、前記Ｔ細胞集団より、CD137発現Ｔ細胞を選択する工程、IFN-γ産生Ｔ細胞を選択する工程、および抗原ペプチド‐HLA複合体が結合するT細胞を選択する工程からなる群より選ばれる１以上の工程を含む、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
前記工程２が、iPS細胞をクローン化することなく回収し、継代するステップを含む、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
前記工程３で得られた再生T細胞集団が、T細胞補充療法に使用するものである、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
前記再生T細胞集団は、維持されるVβの種類が、２種類以上である、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
請求項１〜１７のいずれか１項に記載の方法により製造された再生T細胞集団。
【請求項１９】
生体内に存在するT細胞集団の遺伝的多様性を維持している、請求項１８に記載の再生T細胞集団。
【請求項２０】
請求項１８または１９に記載の再生T細胞集団を含有する医薬組成物。
【請求項２１】
自家的または同種的な移植によりがん治療対象を処置するための、請求項２０に記載の医薬組成物。
【請求項２２】
請求項２０または２１に記載の医薬組成物を用いる、がん治療方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、遺伝的多様性を有する再生T細胞集団を製造する方法、該方法により製造された再生T細胞集団および該再生T細胞集団を含有する医薬組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
T細胞は、細菌もしくはウイルス等の外来病原体またはがん細胞等の異常な細胞に対する免疫応答において中心的な役割を果たしている。このため、T細胞の機能低下は、病原体感染やがんの発生に寄与すると考えられている。T細胞の機能低下に起因する疾患に対して、T細胞の補充や再生は、疾患の病態改善や治療に極めて有効な手段となり得る。【０００３】
iPS細胞等の多能性幹細胞から誘導したT細胞を用いたT細胞補充療法が提案されている。iPS細胞を作製するための原料として、目的の抗原に対して特異的なT細胞を使用することにより、元のT細胞と同じ抗原特異性を示す再生T細胞を製造することが可能である（非特許文献１；本文献の内容は、その全体が参照により本明細書に援用される。）。この方法によれば、樹立されたiPS細胞は、単一細胞由来の細胞集団（コロニー）単位で初期化される。この方法により、細胞性状が安定しており、目的の細胞・組織への分化効率が良く、変異や異常のないことが遺伝子解析等により確認されたiPS細胞株を利用することが可能になる。ここで、クローンの品質や患者に対する適合性を確認するためには、クローンを１個ずつ検査する必要があり、このためクローン化は重要な工程と考えられている。【０００４】
一方、ヒトおよびマウスを用いた研究において、感染症や腫瘍に対するT細胞補充療法を行う際、遺伝的多様性を有するT細胞集団を用いる方法により、目的とする組織や抗原に対する多角的な免疫反応を誘導することができると同時に、この方法は、抗原の発現低下や変異による免疫逃避（イミューンエスケープ）の影響を受けにくいため、高い治療効果が得られることが知られている。【０００５】
従来技術として、T細胞へのT細胞受容体（T cell receptor：TCR）やキメラ抗原受容体（chimeric antigen receptor：CAR)の遺伝子を導入した遺伝子改変Ｔ細胞が報告されているが、導入される前記受容体の遺伝子配列は単一である（特許文献１〜３）。また、末梢血Ｔ細胞から作製したiPS細胞を再分化させ、元のＴ細胞と同一の抗原特異性を有するＴ細胞を製造する方法が報告されているが、遺伝的多様性の付与については示されていない（特許文献４）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特表2017-534261
【特許文献２】特表2017-530694
【特許文献３】特表2018-514204
【特許文献４】特開2017-158559
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Nishimura T, et al. Generation of rejuvenated antigen-specific T cells by reprogramming to pluripotency and redifferentiation. Cell Stem Cell. 2013 Jan 3; 12(1): 114-126.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
通常、iPS細胞株を利用する方法では、クローン化を行うが、クローン化するということは、選択したクローン以外を除くことを意味している。従って、Ｔ細胞より樹立されたiPS細胞をクローン化した場合、元のT細胞集団に存在する遺伝的多様性は完全に失われてしまうことになる。これは、単一の抗原エピトープを対象とした免疫反応しか利用できないということを意味する。しかしながら、単一の抗原エピトープを対象とする免疫反応では、抗原分子の発現低下や変異による免疫逃避（イミューンエスケープ）の影響を受けやすく、T細胞補充療法において高い治療効果を得にくいのではないかという問題が生じる。一方、従来から行われているT細胞補充療法では、遺伝的多様性を有するT細胞集団を用いることができるが、体外でのT細胞集団の増幅によりT細胞が疲弊し、抗原に対する免疫反応が低下するという問題がある。そのため、T細胞補充療法への利用を目的として、遺伝的多様性を有する再生T細胞集団を製造する新たな方法の開発が望まれる。【０００９】
本発明の目的は、iPS細胞を介して遺伝的多様性を有する再生T細胞集団を製造する方法および該方法により製造された再生T細胞集団を提供することにある。本発明は、該再生T細胞集団を提供することにより、単一の抗原エピトープを対象とする上記課題およびT細胞集団の疲弊による上記課題を解決することを目的とする。さらに本発明は、該再生T細胞集団を含有する医薬組成物および該医薬組成物を用いるがん治療方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明の目的は、以下の発明により達成される。
〔１〕
iPS細胞を介して再生T細胞集団を製造する方法であって、
（工程１）T細胞集団を、１種以上の腫瘍関連抗原または１種以上の腫瘍関連抗原を含む生体組織もしくはその破砕物もしくはその溶解物と接触させ、前記腫瘍関連抗原に対する指向性を有するT細胞集団を濃縮する工程、
（工程２）前記濃縮したT細胞集団をiPS細胞へと初期化し、前記濃縮したT細胞集団の遺伝的多様性を維持したまま培養する工程、および、
（工程３）前記培養したiPS細胞から再生T細胞集団を製造する工程、
を含む、方法。
〔２〕
前記再生T細胞集団が、前記濃縮したT細胞集団の遺伝的多様性を維持し、かつ前記腫瘍関連抗原に対する指向性を有する再生T細胞集団である、〔１〕に記載の方法。
〔３〕
前記工程１におけるT細胞集団が、哺乳動物に由来する、〔１〕または〔２〕に記載の方法。
〔４〕
前記哺乳動物がヒトである、〔３〕に記載の方法。
〔５〕
前記ヒトが、がん患者または非がん患者である、〔４〕に記載の方法。
〔６〕
前記がん患者また非がん患者が、がんワクチンを以前に投与されたことがあるか、現在投与されているか、または今後投与される予定である、〔５〕に記載の方法。
〔７〕
前記工程１におけるT細胞集団が、体液由来である、〔１〕〜〔６〕のいずれかに記載の方法。
〔８〕
前記体液が、血液、リンパ液、組織液、ならびに腹水、胸水、心嚢液、脳脊髄液、関節液および眼房水を含む体腔液、ならびに鼻汁および尿からなる群より選ばれる、〔７〕に記載の方法。
〔９〕
前記工程１におけるT細胞集団が、腫瘍組織由来T細胞である、〔１〕〜〔６〕のいずれかに記載の方法。
〔１０〕
前記工程１におけるT細胞集団が、αβT細胞、γδT細胞、ヘルパーT細胞、レギュラトリーT細胞、細胞傷害性T細胞、ナチュラルキラーT細胞またはこれらの混合物である、〔１〕〜〔９〕のいずれかに記載の方法。
〔１１〕
前記工程１における生体組織が、がん原発組織およびがん転移組織である、〔１〕〜〔１０〕のいずれかに記載の方法。
〔１２〕
前記工程１におけるT細胞集団を濃縮する工程が、１種以上の腫瘍関連抗原と接触させることにより活性化し、増殖したT細胞を分離する工程を含む、〔１〕〜〔１１１〕のいずれかに記載の方法。
〔１３〕
前記工程１におけるT細胞集団を濃縮する工程が、前記Ｔ細胞集団より、CD137発現Ｔ細胞を選択する工程およびIFN-γ産生Ｔ細胞を選択する工程からなる群より選ばれる１以上の工程を含む、〔１〕〜〔１２〕のいずれかに記載の方法。
〔１４〕
前記工程１におけるT細胞集団を濃縮する工程が、前記Ｔ細胞集団より、CD137発現Ｔ細胞を選択する工程、IFN-γ産生Ｔ細胞を選択する工程、および抗原ペプチド‐HLA複合体が結合するT細胞を選択する工程からなる群より選ばれる１以上の工程を含む、〔１〕〜〔１２〕のいずれかに記載の方法。
〔１５〕
前記工程２が、iPS細胞をクローン化することなく回収し、継代するステップを含む、〔１〕〜〔１４〕のいずれかに記載の方法。
〔１６〕
前記工程３で得られた再生T細胞集団が、T細胞補充療法に使用するものである、〔１〕〜〔１５〕のいずれかに記載の方法。
〔１７〕
前記再生T細胞集団は、維持されるVβの種類が、２種類以上である、〔１〕〜〔１６〕のいずれかに記載の方法。
〔１８〕
〔１〕〜〔１７〕のいずれかに記載の方法により製造された再生T細胞集団。
〔１９〕
生体内に存在するT細胞集団の遺伝的多様性を維持している、〔１８〕に記載の再生T細胞集団。
〔２０〕
〔１８〕または〔１９〕に記載の再生T細胞集団を含有する医薬組成物。
〔２１〕
自家的または同種的な移植によりがん治療対象を処置するための、〔２０〕に記載の医薬組成物。
〔２２〕
〔２０〕または〔２１〕に記載の医薬組成物を用いる、がん治療方法。
【発明の効果】
【００１１】
本発明により、iPS細胞を介して抗原に対する指向性および遺伝的多様性を有する再生T細胞集団を製造することが可能となる。生体内に存在するT細胞集団を腫瘍関連抗原で刺激することにより、該腫瘍関連抗原に対する指向性および遺伝的多様性を有するT細胞を濃縮することができるが、この濃縮されたT細胞集団をiPS細胞へと初期化し、さらにT細胞集団へ再分化させることにより、濃縮されたT細胞集団の該腫瘍関連抗原に対する指向性および遺伝的多様性を維持した再生T細胞集団を得ることができる。このようにして得られた再生T細胞集団は、T細胞補充療法において高い治療効果を示すことが可能である。特に、腫瘍浸潤T細胞（Tumor Infiltrating Lymphocyte : TIL）は、腫瘍に対して特異的であり、かつ多様な抗原を認識することが知られているが、TILからiPS細胞への初期化を介して再生TIL集団を製造することにより、遺伝的多様性を有し、若返ったT細胞による腫瘍特異的かつ効果的なT細胞補充療法が可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】肺癌患者の摘出腫瘍から分離されたT細胞集団が、TCRβ鎖の多様性を有することを示す図である。本図横軸の Vβ1〜Vβ23 はTCRβ鎖の種類（24種類）を示し、縦軸はそれぞれのTCRβ鎖を有するT細胞が含まれる割合を示す。Vβの種類ごとに、含まれる割合は異なるものの（約1〜12%）、T細胞集団中には全てのVβが存在している。ただし、本例で使用したTCRレパトアキットの検出限界により、検出されないVβが存在するため、本図の割合を足しても100%とはならない。
【図２】肺癌患者の摘出腫瘍から分離されたT細胞集団からiPS細胞を介して製造された再生T細胞集団が、TCRβ鎖の多様性を有することを示す図である。元のT細胞集団中には24種類全てのVβが存在していたのに対し(図1)、再生されたT細胞集団中に含まれるVβは13種類（Vβ1、Vβ5.1、Vβ5.2、Vβ5.3、Vβ9、Vβ11、Vβ13.1、Vβ13.2、Vβ13.6、Vβ17、Vβ18、Vβ22、Vβ23）であり、約54%のVβの多様性が保存されている。
【図３】GPC3ペプチドを用いて増幅培養し、活性化マーカーを発現させたT細胞集団をフローサイトメーターにより解析した結果を示す図である。CD4およびCD14のいずれも発現していない分画（左図）にゲーティングをし、CD8およびCD137で展開した（右図）。本図より、GPC3に指向性を有するCD8／CD137ダブルポジティブ細胞が高い割合で増幅されていることが示される。
【図４】GPC3ペプチドを用いて増幅培養し、活性化マーカーを発現させたT細胞集団について、CD8およびCD137の両方を発現している細胞集団を濃縮し、図３と同様にして、フローサイトメーターによりで解析した結果を示す図である。CD8ネガティブセレクションにより、図３と比較すると、CD4を発現している細胞が除去されていることが示される（左図）。また、CD137ポジティブセレクションにより、CD137を発現していない細胞も除去されていることが示される（右図）。従って、GPC3に指向性を有するCD8／CD137ダブルポジティブ細胞が高い割合で濃縮されていることが示される。
【図５】GPC3に指向性を持つT細胞集団から初期化されたiPS細胞を、再びCD8シングルポジティブT細胞へと再分化誘導を行った結果を示す図である。再分化誘導を行った細胞に対し、抗体（CD3-APC/Cy7、CD4-BV421、CD8-PerCP/Cy5.5、TCRab-FITC、CD45-BV510、およびGPC3-HLA複合体(Dextramer)-APC）で染色し、フローサイトメーター（BD FACSAria（登録商標）II）を用いて、GPC3指向性を持つT細胞集団の割合を解析した。
【図６】非がん患者（健常人）の末梢血単核球に対して、WT1オーバーラップペプチドを用いて増幅培養し、活性化マーカーを発現させたT細胞集団を、図３と同様にして解析を行った結果を示す図である。本図より、WT1に指向性を有するCD8／CD137ダブルポジティブ細胞が高い割合で増幅されていることが示される。
【図７】WT1 オーバーラップペプチドを用いて増幅培養し、活性化マーカーを発現させたT細胞集団に対し、図４と同様にして解析を行った結果を示す図である。本図より、WT1に指向性を有するCD8／CD137ダブルポジティブ細胞が高い割合で濃縮されていることが示される。
【図８】非がん患者（健常人）の末梢血単核球に対して、EBV LMP2Aオーバーラップペプチドを用いて増幅培養し、活性化マーカーを発現させたT細胞集団を、図３と同様にして解析を行った結果を示す図である。本図より、EBV LMP2Aに指向性を有するCD8／CD137ダブルポジティブ細胞が高い割合で増幅されていることが示される。
【図９】EBV LMP2A オーバーラップペプチドを用いて増幅培養し、活性化マーカーを発現させたT細胞集団に対し、図４と同様にして解析を行った結果を示す図である。本図より、EBV LMP2Aに指向性を有するCD8／CD137ダブルポジティブ細胞が高い割合で濃縮されていることが示される。
【図１０】GPC3に指向性を持つT細胞集団から初期化されたiPS細胞を、CD8シングルポジティブT細胞へ再分化誘導することにより得た再生T細胞集団が、GPC3ペプチドを発現した標的細胞に対して特異的な細胞傷害活性を有することを示す図である。（Ａ）再生T細胞集団をフローサイトメトリー 解析した結果を示す図である。（Ｂ）再生T細胞集団の細胞傷害活性を、GPC3ペプチドを発現した、または発現しない標的細胞で比較した結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本発明は、iPS細胞を介して再生T細胞集団を製造する方法を提供する。該方法は、（工程１）T細胞集団を、１種以上の腫瘍関連抗原または１種以上の腫瘍関連抗原を含む生体組織もしくはその破砕物もしくはその溶解物と接触させ、前記腫瘍関連抗原に対する指向性を有するT細胞集団を濃縮する工程、（工程２）前記濃縮したT細胞集団をiPS細胞へと初期化し、前記濃縮したT細胞集団の遺伝的多様性を維持したまま培養する工程、および、（工程３）前記培養したiPS細胞から再生T細胞集団を製造する工程を含む。さらに本発明は、本発明で得られた再生T細胞集団が、前記濃縮したT細胞集団の遺伝的多様性を維持し、かつ前記腫瘍関連抗原に対する指向性を有することが特徴である。
【００１４】
本発明において、「iPS細胞を介して再生T細胞集団を製造する方法」とは、遺伝的多様性を有するT細胞集団から、iPS細胞への初期化を介して、遺伝的多様性を維持しつつ、かつ抗原に対する指向性を有するT細胞集団を再生する方法である。本発明において、該方法により製造されたT細胞集団を、「再生T細胞集団」と称する。なお「T細胞」とは、細胞表面にT細胞受容体（T cell receptor：TCR）と呼ばれる抗原受容体を発現している細胞を指す。
【００１５】
〔工程１〕
本発明の工程１は、遺伝的多様性を有するT細胞集団を、１種以上の腫瘍関連抗原または１種以上の腫瘍関連抗原を含む生体組織またはその破砕物もしくは溶解物と接触させ、該腫瘍関連抗原に対する指向性を有するT細胞集団を濃縮する工程である。
【００１６】
本発明において、「T細胞集団」とは、CD3およびCD45が陽性であるリンパ球であり、抗原を認識するT細胞受容体（TCR）の遺伝子配列が集団として多様な細胞集団である。従って、生体から採取されたT細胞は、多様な抗原に対する特異性を有するT細胞集団である。生体内に存在するT細胞は、T前駆細胞が胸腺内で発生分化する際に、TCR遺伝子のランダムな組み換えが生じることにより、個々のT細胞が異なるTCR遺伝子配列を有し、あらゆる抗原に対して免疫反応を引き起こすことが可能となっている。個々のT細胞が有するTCRはそれぞれ特異的に認識する抗原またはペプチド配列が決定しているものの、T細胞を集団として捉えることにより、そのT細胞集団が、多様な抗原を免疫対象とすることが理解できる。従って、生体から採取されたT細胞集団は、その意味で、遺伝的多様性を有するT細胞集団である。このようなT細胞集団から樹立されたiPS細胞は、TCR遺伝子を発現していないが、組み換えが生じたTCRの遺伝子情報は、iPS細胞のDNAに保持されている。遺伝的多様性を維持するiPS細胞とは、遺伝的多様性を有するT細胞集団から樹立されたiPS細胞であり、個々の細胞については、TCRの遺伝子配列が異なる細胞集団を指す。
【００１７】
本発明において、T細胞は哺乳動物由来であることが好ましく、ヒト（がん患者また非がん患者）由来であることがより好ましい。前記がん患者また非がん患者は、がんワクチンを投与されたことがあるか、現在投与されているか、または今後投与される予定の患者が好ましい。投与されるがんワクチンは、１種類またはそれ以上投与されてもよい。T細胞としては、特に限定されないが、例えば、αβT細胞、γδT細胞、ヘルパーT細胞、レギュラトリーT細胞、細胞傷害性T細胞、およびナチュラルキラー（NK）T細胞が挙げられる。また、T細胞の採取源としては、侵襲性が低いことから末梢血が好ましいが、それに限定されない。その他の好ましい採取源として、がん組織もしくは腫瘍組織もしくはその他の組織もしくは臓器、または血液、臍帯血、リンパ液、組織液（組織間液、細胞間液および間質液）、体腔液（腹水、胸水、心嚢液、脳脊髄液、関節液および眼房水）、鼻汁、尿等の体内のすべての採取源が挙げられる。本発明の一態様において、好ましいT細胞は、腫瘍組織由来T細胞である。腫瘍組織由来T細胞は、通常、腫瘍浸潤T細胞である。
【００１８】
「がんワクチン」とは、がんもしくは腫瘍特異的タンパク質またはペプチドであって、がんまたは腫瘍関連抗原に由来し、がんまたは腫瘍特異的免疫応答を誘導するためのワクチン抗原を含む組成物である。がんもしくは腫瘍に特異的な抗原であるがん組織またはタンパク質もしくはペプチドで抗原パルスされた樹状細胞等の細胞ワクチン、投与された生体内で抗原を発現するウイルスDNAまたはRNAワクチン、および、増殖を抑制したがんもしくは腫瘍細胞およびこれらの破砕物もしくは溶解物を含む組成物も「がんワクチン」に含まれる。さらに、細菌菌体、細菌抽出物およびβグルカン等の非特異的免疫賦活剤、ならびにアデノウイルス等の腫瘍溶解性ウイルスも「がんワクチン」に含まれる。通常、がんワクチンは、ワクチン抗原が誘導する特異的免疫応答を増強するためのアジュバントを含んでいる。がんワクチンに含まれるワクチン抗原は、生体に投与された後、抗原提示細胞（主として樹状細胞およびマクロファージ）に貪食され、その細胞内部で処理されて、8〜30残基程度のアミノ酸からなるエピトープペプチドとなり、主要組織適合遺伝子複合体（major histocompatibility complex：MHC）クラスIまたはクラスIIと結合した複合体として、抗原提示細胞の表面で提示される。エピトープペプチドの長さは、MHCクラスIの場合はアミノ酸8〜11残基、またMHCクラスIIの場合はアミノ酸13〜30残基である。細胞傷害性T細胞およびヘルパーT細胞の表面に発現するT細胞受容体（TCR）は、それぞれMHCクラスI／ペプチド複合体またはMHCクラスII／ペプチド複合体を特異的に認識する。その結果、これらT細胞は活性化されて抗腫瘍効果を発揮する。即ち、細胞傷害性T細胞はワクチン抗原に含まれているものと同じエピトープペプチドを提示するがん細胞を認識・破壊し、ヘルパーT細胞はインターフェロン（IFN）-γやインターロイキン（IL）-2等のサイトカインおよびケモカインの分泌を通じて細胞傷害性T細胞の働きを増強する。ヘルパーT細胞には、CD40リガンド（CD40L）／CD40経路を介して抗原提示細胞の抗原提示能力やB細胞の抗原特異的免疫グロブリン（Ig）G抗体産生を増強する働きもある。
【００１９】
本発明の遺伝的多様性を有する再生T細胞集団は、どのような抗原または組織に対しても作用することが可能である。特に、本発明の再生T細胞集団をT細胞補充療法に用いる場合は、採取したT細胞集団が、治療対象のがん、腫瘍、腫瘍関連抗原もしくはその変異抗原またはウイルス等に対する指向性を有することが好ましい。治療対象のがんまたは腫瘍としては、乳がん、肺がん、肝がん、口腔がん、上咽頭がん、頭頸部がん、胃がん、食道がん、大腸がん、皮膚がん、悪性黒色腫、腎がん、膵がん、脳腫瘍、前立腺がん、卵巣がん、子宮頸がん、結腸直腸がん、膀胱がん、滑膜肉腫、白血病、悪性リンパ腫および多発性骨髄腫等が挙げられるが、これらに限定されない。
【００２０】
上記の腫瘍関連抗原またはその変異抗原としては、各腫瘍に特異的または非特異的に発現するWT1、GPC3、XAGE1、MUC1、MUC5AC、MUC6、EGFRvIII、HER-2/neu、MAGE A3、MAGE A1、テロメラーゼ、PRAME、SSX2/4、PSCA、CTLA-4、gp100、GD2、GD3、フコシルGM1、GM3、sLe (a)、糖脂質F77、メソテリン、PD-L1、trp1、trp2、CD19、CD20、CD22、ROR1、CD33、c-Met、p53、p53変異体、NY-ESO-1、PSMA、ETV6-AML、CEA、PSA、AFP、hTERT、EpCAM、ALK、アンドロゲン受容体、EphA2、CYP1B1、OY-TES-1、MAD-CT-2、MelanA/MART1、サバイビン、Ras、Ras変異体、ERG、bcr-abl、XBP１、ならびに、遺伝子変異およびスプライス異常による新規腫瘍抗原（Neoantigen）等の腫瘍関連抗原があげられるが、これらに限定されない。またウイルス抗原としては、不活化HBVおよびHPV等の不活化ウイルス、ならびに、各種ウイルス由来のタンパク質であるEBV LMP1、EBV LMP2、EBNA（EBV nuclear antigen）、HPV E1、HPV E2、HPV E6、HPV E7、HBV HBs、HTLV-1 TaxおよびHBZ（HTLV-1 bZIP factor）等が挙げられるが、これらに限定されない。さらに、タンパク質抗原である場合には、これをペプチド断片化したものであってもよい。
【００２１】
本発明の工程１において、生体組織とは、哺乳動物、特にヒトの上皮組織、結合組織、筋組織、神経組織、体液等を指す。腫瘍関連抗原を含む生体組織は、がん原発組織およびがん転移組織を含む。これらの組織は、ホモジナイザー、超音波発生器、凍結破砕機等により物理的に破砕し、破砕物とすることができる。また、これらの組織は、リン酸平衡緩衝液等の溶媒により、または界面活性剤、例えば、両イオン性界面活性剤であるCHAPSや非イオン性界面活性剤であるTriton XおよびTween 20等により溶解し、溶解液とすることができる。
【００２２】
生体内には、あらゆる抗原に対して反応できるように、非常に多様なT細胞が存在しているが、大部分はT細胞補充療法において標的とする抗原とは無関係なT細胞である。そのため、iPS細胞への初期化を介して製造するT細胞の原料としては、T細胞補充療法の対象となるがん、腫瘍またはウイルスに反応性のあるT細胞集団をあらかじめ濃縮しておくことにより、再生T細胞集団による治療効果が飛躍的に高まると同時に、想定外の抗原に対する免疫反応を抑制し安全性を高めることが可能となる。
【００２３】
本発明の一態様において、工程１におけるT細胞集団を濃縮する工程は、１種以上の腫瘍関連抗原と接触させることにより活性化し、増殖したT細胞を分離する工程を含む。T細胞を腫瘍関連抗原と接触させると、T細胞受容体による腫瘍関連抗原の認識および共刺激シグナルを受けることにより、T細胞は活性化する。接触させる方法としては、例えば、腫瘍関連抗原または腫瘍関連抗原を含む生体組織もしくはその破砕物もしくはその溶解物を添加した培養液を用いて、抗原提示細胞およびT細胞を含む末梢血単核球の培養を行う。培養液中には、IL-２、IL-7、IL-15、IL-21等のサイトカインを加えることにより、効率的に目的のT細胞を増幅させることが可能である。増幅培養後に、腫瘍関連抗原に対する指向性を有するT細胞の濃縮を目的として上記の刺激を加えることにより、活性化したT細胞は細胞膜表面にCD137分子やIFN-γ等の機能性分子を発現する。これらの機能性分子に対して、蛍光タンパク質または磁気ビーズにより標識した特異的抗体で染色し、フローサイトメーターを用いたソーティング、または磁石を用いた分離により、目的の腫瘍関連抗原に対する指向性を有するT細胞を濃縮することができる。
【００２４】
本発明の工程１において、「腫瘍関連抗原に対する指向性を有する」とは、個々のT細胞がそれぞれ別々の抗原エピトープまたはペプチド配列を特異的に認識しつつ、T細胞集団としては、標的とする組織または抗原に対する免疫反応を示すことである。
【００２５】
本発明の一態様において、標的とする組織または抗原に対する指向性を有するT細胞集団の濃縮方法としては、例えば、抗原タンパク質またはペプチドをT細胞と接触させ、T細胞集団を活性化し、増殖したT細胞を分離する方法が挙げられる。この方法においては、抗原提示細胞を含む単核球分画を培養し、抗原タンパク質またはペプチドを培養液中に添加する。繰り返して抗原タンパク質またはペプチドとT細胞を接触させることにより、反応性のT細胞は増殖し、T細胞集団全体に対する割合が上昇する。一方、添加した抗原タンパク質またはペプチドに反応しないT細胞は活性化されることがなく、in vitroでの培養中に徐々に割合が低下し、最終的には死滅する。このため、一定期間の培養後には、培養液中に添加した抗原タンパク質またはペプチドに特異的な反応性を有しつつ、認識する抗原エピトープまたはペプチド配列において多様性を有するT細胞集団が濃縮して得られる。
【００２６】
本発明の一態様において、T細胞集団の濃縮方法として、T細胞集団を活性化後、CD137発現Ｔ細胞を選択する方法およびIFN-γ産生Ｔ細胞を選択する方法が挙げられる。これらの方法においては、CD137またはIFN-γに特異的な抗体を結合させた上で、磁気ビーズを用いた磁気的分離または蛍光標識を用いたフローサイトメーターによる選択的な分離に供することもできる。IFN-γ産生細胞を二重特異性抗体（T細胞およびIFN-γに対する二重特異性抗体）で捕捉する系を使用してもよい。さらに、本発明の別の実施態様において、抗原ペプチド‐HLA（human leukocyte antigen、ヒト白血球抗原）複合体のオリゴマーが結合するT細胞を選択する方法も挙げられる。この方法では、特定のHLA型およびそのHLAが提示可能な標的抗原ペプチドの複合体からなるオリゴマーを蛍光色素で標識し、オリゴマーが結合した細胞を、フローサイトメーターを用いてソーティングすることにより、標的とする組織または抗原に対する指向性を有するT細胞を得ることができる。T細胞集団を濃縮するに当たり、これらの方法は、単独または組み合わせて使用してもよい。
【００２７】
〔工程２〕
本発明の工程２は、前記濃縮したT細胞集団をiPS細胞へと初期化し、前記濃縮したT細胞集団の遺伝的多様性を維持したまま培養する工程である。
【００２８】
iPS細胞の製造方法は当該分野で公知である。本発明において、iPS細胞は、好ましくは、工程１で濃縮したT細胞集団へ初期化因子を導入することによって製造される。ここで、初期化因子としては、例えば、Oct3/4、Sox2、Sox1、Sox3、Sox15、Sox17、Klf4、Klf2、c-Myc、N-Myc、L-Myc、Nanog、Lin28、Fbx15、ERas、ECAT15-2、Tcl1、beta-catenin、Lin28b、Sall1、Sall4、Esrrb、Nr5a2、Tbx3またはGlis1等の遺伝子または遺伝子産物が挙げられ、これらの初期化因子は、単独で用いてもよく、また組み合わせて用いてもよい。
【００２９】
生体内に存在するT細胞集団は、TCR遺伝子配列が集団として多様であり、その意味で遺伝子多様性を有している。このT細胞集団から樹立されたiPS細胞は、この遺伝的多様性を維持したまま培養する。iPS細胞を培養する場合、好ましくは、継代が行われる。しかしながら、一般的な継代方法では、継代に用いる細胞以外の細胞は破棄されるので、遺伝的多様性を有するT細胞集団から樹立されたiPS細胞の多様性が徐々に失われる。これに対して、本発明においては、好ましくは、iPS細胞を樹立した後、培養器を洗浄して、好ましくはiPS細胞以外の細胞を除去し、iPS細胞をクローン化することなく回収し、別の培養器に継代する。そして係る継代を繰り返す。
【００３０】
本発明の工程２において用いられる培養液としては、特に限定されないが、動物細胞の培養に用いられる培養液を基礎培養液とし、これにiPS細胞の未分化能を維持するためのサイトカイン類を添加して調製することができる。基礎培養液としては、例えばIscove's Modified Dulbecco's Medium（IMDM）培養液、Medium 199培養液、Eagle's Minimum Essential Medium（EMEM）培養液、αMEM培養液、Dulbecco's modified Eagle's Medium（DMEM）培養液、Ham's F12培養液、RPMI 1640培養液、Fischer'培養液、Neurobasal Medium (ライフテクノロジーズ社)、StemFit（登録商標）AK03N（味の素ヘルシーサプライ社）およびこれらの混合培養液が挙げられる。培養液には、血清を添加してもよく、または無血清であってもよい。サイトカイン類としては、好ましくは、bFGFが挙げられ、培養液中におけるその濃度は、例えば、1〜100μg/mL（好ましくは50μg/mL）である。
【００３１】
本発明の一態様において、iPS細胞の培養方法は、接着培養または浮遊培養であってもよいが、接着培養が好ましい。iPS細胞の分離方法としては、例えば、セルスクレーパー等により力学的に分離する方法、プロテアーゼ活性を有する分離溶液、コラゲナーゼ活性を有する分離溶液、またはプロテアーゼ活性およびコラゲナーゼ活性を有する分離溶液（例えば、Accutase（登録商標）およびAccumax（登録商標）等）を用いた分離方法が挙げられる。
【００３２】
本発明の一態様において、iPS細胞は、好ましくは、1×103〜1×104 cells/cm2、1×104〜1×105 cells/cm2または1×105〜1×106 cells/cm2の細胞密度に到達した場合に、別の培養器に継代される。継代の回数は、T細胞補充療法に必要な量のiPS細胞が得られれば何回でもよく、好ましくは、1〜5回または5〜10回である。
【００３３】
本発明の一態様において、得られた遺伝的多様性を有するiPS細胞は、そのまま使用してもよいし、または必要な時まで凍結保存してもよい。細胞の凍結保存方法は、当業者に周知である。
【００３４】
〔工程３〕
本発明の工程３は、前記培養したiPS細胞から再生T細胞集団を製造する工程である。本発明の一態様において、該再生T細胞は、工程１において濃縮されたT細胞集団の遺伝的多様性を維持し、かつ工程１において使用された腫瘍関連抗原に対する指向性を有する。
【００３５】
本発明の一態様において、再生T細胞集団は、好ましくは、本発明の工程２において培養したiPS細胞から、造血前駆細胞を経てCD4／CD8ダブルポジティブT細胞に分化することによって得られ、または本発明の工程２において培養したiPS細胞から、造血前駆細胞およびCD4／CD8ダブルポジティブT細胞を経て、CD8シングルポジティブT細胞に分化することによって得られる。
【００３６】
造血前駆細胞（hematopoietic progenitor cells、HPC）とは、リンパ球、好酸球、好中球、好塩基球、赤血球、または巨核球等の血球系細胞に分化可能な細胞である。本発明の一態様において、造血前駆細胞と造血幹細胞は、区別されるものではなく、特に断らない限り同一の細胞を指す。造血幹細胞／前駆細胞は、例えば、表面抗原であるCD34および／またはCD43がポジティブであることによって認識される。
【００３７】
本発明の一態様において、造血前駆細胞は、好ましくは、ビタミンC類を添加した培養液中でiPS細胞を培養することによって製造される。ここで、「ビタミンC類」とは、L-アスコルビン酸およびその誘導体を指し、「L-アスコルビン酸誘導体」とは、生体内で酵素反応によりビタミンCに変換されるものを意味する。L-アスコルビン酸の誘導体としては、例えば、リン酸ビタミンC、アスコルビン酸グルコシド、アスコルビルエチル、ビタミンCエステル、テトラヘキシルデカン酸アスコルビル、ステアリン酸アスコルビルおよびアスコルビン酸-2リン酸-6パルミチン酸が挙げられる。L-アスコルビン酸の誘導体は、好ましくは、リン酸ビタミンCであり、例えば、リン酸-Lアスコルビン酸ナトリウムまたはリン酸-L-アスコルビン酸マグネシウム等のリン酸-Lアスコルビン酸塩が挙げられる。ビタミンC類は、例えば、培養液において、5〜500μg/mLの濃度で含有される。
【００３８】
本発明の一態様において、造血前駆細胞の製造に用いる培養液は、特に限定されないが、動物細胞の培養に用いられる培養液を基礎培養液とし、これにビタミンC類等を添加して調製することができる。基礎培養液としては、例えば、Iscove's Modified Dulbecco's Medium（IMDM）培養液、Medium 199培養液、Eagle's Minimum Essential Medium（EMEM）培養液、αMEM培養液、Dulbecco's modified Eagle's Medium（DMEM）培養液、Ham's F12培養液、RPMI 1640培養液、Fischer's培養液、Neurobasal Medium（ライフテクノロジーズ社）、StemPro34（ライフテクノロジーズ社）およびこれらの混合培養液が挙げられる。培養液には、血清が含有されていてもよく、または無血清であってもよい。必要に応じて、基礎培養液は、例えば、アルブミン、インスリン、トランスフェリン、セレン、脂肪酸、微量元素、2-メルカプトエタノール、チオールグリセロール、脂質、アミノ酸、L-グルタミン、非必須アミノ酸、ビタミン、増殖因子、低分子化合物、抗生物質、抗酸化剤、ピルビン酸、緩衝剤、無機塩類、およびサイトカイン等から選ばれる1つ以上の物質も含有し得る。
【００３９】
本発明の一態様において、造血前駆細胞の製造に用いる培養液には、BMP4（Bone morphogenetic protein 4）、VEGF（vascular endothelial growth factor）、bFGF（basic fibroblast growth factor）、SCF（stem cell factor）、TPO（トロンボポエチン）、およびFLT-3L（Flt3 ligand）からなる群より選ばれるサイトカインをさらに添加してもよい。
【００４０】
本発明の一態様において、これらの濃度は、例えば、BMP4は1〜100 ng/mLであり、VEGFは1〜100 ng/mLであり、bFGFは1〜100 ng/mLであり、SCFは10〜100 ng/mLであり、TPOは1〜100 ng/mLであり、またFLT-3Lは1〜100 ng/mLである。
【００４１】
本発明の一態様において、TGFβ阻害剤を培養液に添加してもよい。「TGFβ阻害剤」とは、TGFβファミリーのシグナル伝達に干渉する低分子阻害剤であり、例えばSB431542およびSB202190（R.K.Lindemann et al., Mol. Cancer 2: 20 (2003))、SB505124 (GlaxoSmithKline)、NPC30345、SD093、SD908およびSD208 (Scios)、ならびにLY2109761、LY364947およびLY580276（Lilly Research Laboratories）が挙げられ、培養液への添加濃度は、好ましくは0.5〜100μMである。
【００４２】
本発明の一態様において、iPS細胞を、C3H10T1/2（Takayama N., et al. J Exp Med. 2817-2830, 2010）、または異種由来のストローマ細胞（Niwa A et al. J Ce11 Physiol. 2009 Nov; 221 (2) :367-77）等のフィーダー細胞と共培養してもよいが、好ましくは、フィーダー細胞を使用せずにiPS細胞の培養が行われる。
【００４３】
本発明の一態様において、造血前駆細胞の製造時のiPS細胞の培養方法は、接着培養または浮遊培養であってもよいが、浮遊培養が好ましい。例えば、iPS細胞は、使用したディッシュに対して80％コンフルエントになるまで培養されたコロニーを分離し、単細胞に解離させたのちに、浮遊培養に供することができる。iPS細胞の分離方法としては、例えば、セルスクレーパー等で力学的に分離する方法、プロテアーゼ活性およびコラゲナーゼ活性を有する分離溶液（例えば、Accutase（登録商標）およびAccumax（登録商標）等)、またはコラゲナーゼ活性を有する分離溶液を用いた分離方法が挙げられる。
【００４４】
浮遊培養とは、細胞を培養容器に対して非接着の状態で培養することである。本発明の一態様において、浮遊培養は、特に限定はされないが、細胞との接着性を向上させる目的で人工的な処理（例えば、細胞外マトリックス等によるコーティング処理）が施されていない培養容器、または人工的に接着を抑制する処理（例えば、ポリヒドロキシエチルメタクリル酸（po1y-HEMA）もしくは非イオン性の界面活性ポリオール（Pluronic F-127等）によるコーティング処理）した培養容器を使用して行うことができる。浮遊培養の際には、胚様体（EB）を形成させて培養することが好ましい。
【００４５】
本発明の別の一態様では、造血前駆細胞は、iPS細胞を培養することにより得られるネット様構造物（iPS-sacとも称する）から調製することもできる。ここで、「ネット様構造物」とは、iPS細胞由来の立体的な嚢状（内部に空間を伴うもの）構造体で、内皮細胞集団等で形成され、内部に造血前駆細胞を含む構造体である。
【００４６】
本発明の一態様において、iPS細胞から造血前駆細胞を製造するために培養する際の温度条件は、特に限定されないが、例えば、約37℃〜約42℃程度、好ましくは約37℃〜約39℃程度である。また、培養期間については、当業者であれば造血前駆細胞の細胞数等をモニターしながら、適宜決定することが可能である。造血前駆細胞が得られる限り、培養日数は特に限定されないが、例えば、少なくとも6日以上、7日以上、8日以上、9日以上、10日以上、11日以上、12日以上、13日以上、または14日以上であり、好ましくは14日である。培養期間が長いことについては、造血前駆細胞の製造において問題とされない。また、低酸素条件で培養してもよく、本発明の一態様において、低酸素条件としては、例えば、15％、10％、9％、8％、7％、6％、5％またはそれら未満の酸素濃度が挙げられる。
【００４７】
本発明において、「CD4／CD8ダブルポジティブT細胞」とは、T細胞のうち、表面抗原のCD4およびCD8が共に陽性である細胞（CD8+ CD4+）を指し、T細胞は、表面抗原であるCD3およびCD45が陽性であることによって認識できることから、CD4／CD8ダブルポジティブT細胞は、CD4、CD8、CD3およびCD45が陽性である細胞として同定することができる。CD4／CD8ダブルポジティブT細胞は、誘導によってCD4シングルポジティブ細胞またはCD8シングルポジティブ細胞へと分化させることができる。
【００４８】
本発明の一態様において、CD4／CD8ダブルポジティブT細胞は、p38阻害剤および／またはSDF-1を添加した培養液中で造血前駆細胞を培養する工程を含む方法によって製造することができる。
【００４９】
本発明において、「p38阻害剤」とは、p38タンパク質（p38MAPキナーゼ）の機能を阻害する物質として定義される。本発明の一態様において、p38阻害剤は、例えばp38の化学的阻害剤、p38のドミナントネガティブ変異体、またはそれをコードする核酸が挙げられるが、これらに限定されない。
【００５０】
本発明の一態様において、p38の化学的阻害剤としては、SB203580(4-(4-フルオロフェニル)-2-(4-メチルスルホニルフェニル)-5-(4-ピリジル)-1H-イミダゾール)およびその誘導体、SB202190 (4-(4-フルオロフェニル)-2-(4-ヒドロキシフェニル)-5-(4-ピリジル)-1H-イミダゾール)およびその誘導体、SB239063 (trans-4-[4-(4-フルオロフェニル)-5-(2-メトキシ-4-ピリミジニル)-1H-イミダゾール-1-イル]シクロヘキサノール)およびその誘導体、SB220025およびその誘導体、PD169316、RPR200765A、AMG-548、BIRB-796、SCl0-469、SCIO-323、VX-702、またはFR167653が挙げられるが、これらに限定されない。これらの化合物は市販されており、例えばSB203580、SB202190、SC239063、SB220025およびPD169316についてはCalbiochem社、SCl0-469およびSCIO-323についてはScios社等から入手可能である。
【００５１】
本発明の一態様において、p38のドミナントネガティブ変異体としては、p38のDNA結合領域に位置する180位のスレオニンをアラニンに点変異させたp38T180A、ならびにヒトおよびマウスにおけるp38の182位のチロシンをフェニルアラニンに点変異させたp38Y182F等が挙げられる。
【００５２】
p38阻害剤は、例えば、約1μM〜約50μMの範囲で培養液に添加する。
【００５３】
本発明の一態様において、SDF-1（Stromal cell-derived factor 1）は、SDF-1αまたはその成熟型だけでなく、SDF-1β、SDF-1γ、SDF-1δ、SDF-1εもしくはSDF-1φ等のアイソフォーム、またはそれらの成熟型であってもよく、もしくはこれらの任意の割合の混合物等であってもよい。好ましくは、SDF-1αが使用される。なお、SDF-1は、CXCL-12またはPBSFと称される場合もある。
【００５４】
本発明の一態様において、SDF-1は、そのケモカインとしての活性を有する限り、そのアミノ酸配列中の1または数個のアミノ酸が置換、欠失および／または付加されていてもよく、また同様に糖鎖が置換、欠失および／または付加されていてもよい。SDF-1において少なくとも4つのシステイン残基（ヒトSDF-1αの場合、Cys30、Cys32、Cys55およびCys71）が保持されており、かつ天然体のアミノ酸配列に対して90％以上の同一性を有する範囲であれば、アミノ酸変異が許容される。SDF-1は、哺乳動物、例えば、ヒト、例えば、サル、ヒツジ、ウシ、ウマ、ブタ、イヌ、ネコ、ウサギ、ラット、またはマウス等の非ヒト哺乳動物のものであってもよい。例えば、ヒトのSDF-1αとして、GenBank登録番号:NP_954637で登録されているタンパク質が使用でき、SDF-1βとして、GenBank登録番号:NP_000600で登録されているタンパク質が使用できる。
【００５５】
本発明の一態様において、SDF-1は、市販のものを使用してもよいし、天然から精製されたものを使用してもよいし、またはペプチド合成や遺伝子工学的手法によって製造されたものを使用してもよい。
【００５６】
本発明の一態様において、SDF-1は、例えば、約10 ng/mL〜約100 ng/mLの範囲で培養液に添加される。
【００５７】
本発明の一態様において、CD4／CD8ダブルポジティブT細胞の製造に用いる培養液は、特に限定されないが、動物細胞の培養に用いられる培養液を基礎培養液とし、これにp38阻害剤および／またはSDF-1、さらに好ましくはビタミンC類を添加して調製することができる。なお、CD4／CD8ダブルポジティブT細胞の製造工程で使用されるビタミンC類の種類は、例えば上述のとおりであるが、ビタミンC類の濃度は、例えば、5〜200μg/mLである。基礎培養液としては、例えばIscove's Modified Dulbecco's Medium（IMDM）培養液、Medium 199培養液、Eagle's Minimum Essential Medium（EMEM）培養液、αMEM培養液、Dulbecco's modified Eagle's Medium（DMEM）培養液、Ham's F12培養液、RPMI 1640培養液、Fischer's培養液、OP9培養液、Neurobasal Medium（ライフテクノロジーズ社）、およびこれらの混合培養液が挙げられる。培養液には、血清を添加してもよく、または無血清であってもよい。必要に応じて、基礎培養液には、例えば、アルブミン、インスリン、トランスフェリン、セレン、脂肪酸、微量元素、2-メルカプトエタノール、チオールグリセロール、脂質、アミノ酸、L-グルタミン、非必須アミノ酸、ビタミン、増殖因子、低分子化合物、抗生物質、抗酸化剤、ピルビン酸、緩衝剤、無機塩類、およびサイトカイン等から選ばれる1つ以上の物質も含有し得る。
【００５８】
本発明の一態様において、CD4／CD8ダブルポジティブT細胞の製造に用いる培養液には、SCF、TPO（トロンボポエチン）、FLT-3LおよびIL-7からなる群より選ばれるサイトカインをさらに添加してもよい。これらの濃度は、例えば、SCFは10〜100 ng/mLであり、TPOは1O〜200 ng/mLであり、FLT-3Lは1〜100 ng/mLであり、IL-7は1〜100 ng/mLである。
【００５９】
本発明の一態様において、CD4／CD8ダブルポジティブT細胞の製造時に、造血前駆細胞はフィーダー細胞を用いて培養してもよいが、好ましくはフィーダー細胞を用いずに培養を行う。
【００６０】
本発明の一態様において、造血前駆細胞は、接着培養または浮遊培養してもよいが、本工程では接着培養が好ましい。接着培養の場合、培養容器をコーティングして用いてもよい。例えば、コーティング剤としては、マトリゲル（Niwa A, et al. PLoS One. 6(7):e22261, 2011）、コラーゲン、ゼラチン、ラミニン、ヘパラン硫酸プロテオグリカン、レトロネクチン、Fc-DLL4またはエンタクチン、およびこれらの組み合わせが挙げられる。
【００６１】
本発明の別の一態様において、胚様体を浮遊培養して造血前駆細胞を得た場合は、これを単細胞に解離させたのちに、接着培養を行うことが好ましい。
【００６２】
本発明の一態様において、CD4／CD8ダブルポジティブT細胞を製造するために造血前駆細胞を培養する際の培養温度条件は、特に限定されないが、例えば、約37℃〜約42℃程度が好ましく、約37℃〜約39℃程度がより好ましい。また、培養期間については、当業者であれば、CD4／CD8ダブルポジティブT細胞の細胞数等をモニターしながら、適宜決定することが可能である。CD4／CD8ダブルポジティブT細胞が得られる限り、培養日数は特に限定されないが、例えば、少なくとも10日以上、12日以上、14日以上、16日以上、18日以上、20日以上、22日以上、または23日以上であり、好ましくは23日である。
【００６３】
本発明の一態様において、得られたCD4／CD8ダブルポジティブT細胞は、単離して用いても良く、他の細胞種が含有される細胞集団として用いても良い。単離する場合、CD4、CD8、CD3およびCD45からなる群より選ばれる、いずれか一つの指標を用いて単離することができる。当該単離の方法は、当業者に周知の方法を用いることができ、例えば、CD4、CD8、CD3またはCD45に対する抗体により標識し、フローサイトメーターを用いて単離する方法、または所望の抗原を固定化したアフィニティカラム等を用いて精製する方法が挙げられる。
【００６４】
「CD8シングルポジティブT細胞」とは、T細胞のうち、表面抗原のCD8が陽性である細胞（CD8+ CD4-）を指し、細胞傷害性T細胞とも呼ばれる。T細胞は、表面抗原であるCD3およびCD45が陽性であることによって認識できることから、CD8シングルポジティブT細胞は、CD8、CD3およびCD45が陽性であり、CD4が陰性である細胞として同定することができる。
【００６５】
本発明の一態様において、CD8シングルポジティブT細胞は、副腎皮質ホルモン剤を添加した培養液中で、CD4／CD8ダブルポジティブT細胞を培養する工程を含む方法によって製造することができる。
【００６６】
本発明の一態様において、副腎皮質ホルモン剤は、好ましくは、糖質コルチコイドまたはその誘導体であり、例えば、酢酸コルチゾン、ヒドロコルチゾン、酢酸フルドロコルチゾン、プレドニゾロン、トリアムシノロン、メチルプレドニゾロン、デキサメタゾン、ベタメタゾン、またはプロピオン酸ベクロメタゾンが挙げられる。好ましくは、副腎皮質ホルモン剤は、デキサメタゾンである。培養液中におけるその濃度は、例えば、1〜100 nMである。
【００６７】
本発明の一態様において、CD8シングルポジティブT細胞の製造に用いる培養液は、特に限定されないが、動物細胞の培養に用いられる培養液を基礎培養液とし、これに副腎皮質ホルモン剤を添加して調製することができる。基礎培養液としては、例えばIscove's Modified Dulbecco's Medium（IMDM）培養液、Medium 199培養液、Eagle's Minimum Essential Medium（EMEM）培養液、αMEM培養液、Dulbecco's modified Eagle's Medium（DMEM）培養液、Ham's F12培養液、RPMI 1640培養液、Fischer's培養液、Neurobasal Medium（ライフテクノロジーズ社）、およびこれらの混合培養液が挙げられる。培養液には、血清を添加してもよく、または無血清であってもよい。必要に応じて、基礎培養液は、例えば、アルブミン、インスリン、トランスフェリン、セレン、脂肪酸、微量元素、2-メルカプトエタノール、チオールグリセロール、脂質、アミノ殿、L-グルタミン、非必須アミノ酸、ビタミン、増殖因子、低分子化合物、抗生物質、抗酸化剤、ピルビン酸、緩衝剤、無機塩類、およびサイトカイン等から選ばれる1つ以上の物質も含有し得る。
【００６８】
本発明の一態様において、CD8シングルポジティブT細胞の製造に用いる培養液は、抗CD3抗体、ビタミンC類、またはサイトカインをさらに含有することが好ましい。当該サイトカインとしては、例えば、IL-2およびIL-7等が挙げられる。
【００６９】
本発明の一態様において、抗CD3抗体としては、CD3を特異的に認識する抗体であれば特に限定されないが、例えば、OKT3クローンから産生される抗体が挙げられる。抗CD3抗体の培養液中における濃度は、例えば、10〜1000 ng/mLである。
【００７０】
本発明の一態様において、CD8シングルポジティブT細胞の製造に用いるビタミンC類は、例えば上述したものであり、上述と同じ条件で用いることができる。
【００７１】
本発明の一態様において、CD8シングルポジティブT細胞の製造に用いるサイトカインの培養液中における濃度は、例えば、IL-2は10〜1000 U/mLであり、IL-7は1〜100 ng/mLである。
【００７２】
本発明の一態様において、CD8シングルポジティブT細胞を製造するためのCD4／CD8ダブルポジティブT細胞を培養する際の温度条件は、特に限定されないが、例えば、約37℃〜約42℃程度が好ましく、約37℃〜約39℃程度がより好ましい。また、培養期間については、当業者であればCD8シングルポジティブT細胞の細胞数等をモニターしながら、適宜決定することが可能である。CD8シングルポジティブT細胞が得られる限り、培養日数は特に限定されないが、例えば、少なくとも1日以上、2日以上、3日以上、4日以上、または5日以上であり、好ましくは3日である。
【００７３】
本発明の一態様において、維持される遺伝的多様性の程度は、維持されるVβの種類は、好ましくは２種類以上であり、より好ましくは３種類以上、さらに好ましくは４種類以上である。
【００７４】
本発明の一態様において、製造された再生T細胞集団は、好ましくは、T細胞補充療法に使用される。本発明において、T細胞補充療法とは、T細胞を生体に補充する治療法を意味し、本発明の一態様において、T細胞補充療法としては、好ましくは、再生したT細胞の輸注、腫瘍内注入、動注、門脈注等を含む細胞移植による治療法が挙げられる。
【００７５】
本発明によって得られる再生T細胞集団をT細胞補充療法に使用する場合において、同種的な移植である場合、拒絶反応を起こしにくいという観点から、T細胞を採取されるがん患者または非がん患者は、がん治療のために本発明によって得られたT細胞を投与されるがん患者と、HLAの型が一致していることが好ましい。また、本発明によって得られたT細胞が投与されるがん患者と、T細胞を採取されるがん患者とは同一人であることがより好ましい。すなわち、自家的な移植によるがん治療がより好ましい。
【００７６】
本発明は、生体内に存在するT細胞集団の遺伝的多様性を維持している、iPS細胞を介して得られる再生T細胞集団を含む。本発明の再生T細胞集団を含む医薬組成物は、がん治療対象を処置するために使用することができる。本発明の一態様には、本発明の医薬組成物を用いるがん治療方法が含まれる。本発明の医薬組成物は、薬学的に許容される添加剤を含んでいてもよい。該添加剤としては、例えば、細胞培養液、リン酸緩衝食塩水等が挙げられる。
【００７７】
本発明を以下の実施例でさらに具体的に説明するが、本発明の範囲はそれら実施例に限定されない。
【実施例】
【００７８】
〔工程１の具体的手順〕
腫瘍関連抗原を培養液に添加してT細胞集団と接触させ、200 U/mL IL-2、10 ng/mL IL-15および10 ng/mL IL-21を添加したRPMI-1640培養液（10％ヒトAB血清、1％ペニシリン−ストレプトマイシン−グルタミンを含む）中で12日間培養を行った。培養液に添加する腫瘍関連抗原は、ペプチドの場合は1〜100 mg/mLの濃度で添加し、また、腫瘍関連抗原として生体組織またはその破砕物を用いる場合は、1〜2 mm角に細断した組織片を、培養液を含むチューブあたり１〜5個程度添加してT細胞集団と接触させることが好ましい。生体組織の溶解物の場合は、該溶解物を培養液に添加してT細胞集団と接触させることが好ましい。培養後12日目に、同一の腫瘍関連抗原ペプチドを再度接触させ、さらに24時間培養することにより、腫瘍関連抗原に指向性を有するT細胞に対して活性化マーカーを発現させた。培養した細胞集団に対し、CD8分子以外の血球分画マーカーを用いたネガティブセレクション（CD8+ T cell isolation kit, Miltenyi Biotech社）、および活性化マーカーであるCD137またはIFN-γに対するポジティブセレクション（CD137 MicorBead KitまたはCytokine capture system-IFN-γ, Miltenyi Biotech社）を行うことにより、腫瘍関連抗原に指向性を有するCD8シングルポジティブT細胞のみを濃縮した。【００７９】
工程１において抗原ペプチド-HLA複合体を用いる場合、使用するT細胞集団は、上記腫瘍関連抗原と接触させて12日間の培養を行った細胞集団、または該培養を行なっていない細胞集団のいずれであってもよい。得られた細胞集団に、蛍光標識された目的の抗原ペプチド-HLA複合体を加えて先に30分間染色後、その他の血球マーカー（CD8、CD4およびCD14）に対する蛍光標識抗体を加えてさらに30分間染色を行った。染色後、回収した細胞をリン酸緩衝液で洗浄した後、フローサイトメーターを用いて、抗原ペプチド-HLA複合体およびCD8分子を発現している細胞のみをソーティングすることにより、目的の腫瘍関連抗原に対する指向性を有するT細胞を濃縮した。【００８０】
〔工程２の具体的手順：iPS細胞への初期化〕
続いて、T細胞を15mlチューブに回収し、約250μLのRPMI-1640培養液に浮遊させた後、CytoTune-iPS 2.0キット（株式会社IDファーマ社：カタログ番号DV-0304）を用いて、MOI=5となる力価で初期化に必要な4因子（Oct3/4、Sox2、Klf4およびc-Myc）を含むセンダイウイルスを培養液に添加し、37℃で2時間インキュベートした。インキュベーション後には、RPMI-1640培養液を用いてT細胞を洗浄し、培養液中からウイルスを除去した。【００８１】
続いて磁気ビーズを除くため、ピペッティングによりビーズと細胞とを分離させた後、磁石付きのスタンドにチューブを静置することにより、培養液中に浮遊したT細胞のみを回収した。【００８２】
得られたT細胞を、iMatrix-511（nippi社：カタログ番号892011）を0.5μg/cm2でコーティングした6 cmディッシュ上に播種し、RPMI-1640培養液中で、37℃、5％CO2に設定したインキュベーターを用いて培養を開始した。【００８３】
6 cmディッシュ上で培養を開始した翌日から、細胞が含まれていない培養上清を半量除去し、StemFit（登録商標）AK03N（味の素ヘルシーサプライ社）に1 mMバルプロ酸を添加した樹立用培養液を、除去した培養液と同量加えた。【００８４】
以降、同様の半量培養液交換を毎日行いながら、20〜40日間培養を続けることにより、6 cmディッシュ中に多数のiPS細胞コロニーを得た。一定量のコロニーが得られた段階で、樹立用培養液からiPS細胞用培養液（StemFit AK03Nのみ）に交換して培養を継続した。【００８５】
〔工程２の具体的手順：樹立したiPS細胞の遺伝的多様性を維持したままの培養〕
iPS細胞のコロニーが肉眼で確認できる程度に成長した段階で、iPS細胞を、新しくiMatrix-511をコーティングした6 cmディッシュへと継代した。【００８６】
継代においては、ディッシュに接着しているiPS細胞をPBS（‐）により洗浄した後、TrypLeSelect（ライフテクノロジーズ社：A12859-01）を添加して約7分間インキュベートすることにより、iPS細胞を剥離し、単一の細胞へと分散させた。細胞を、iPS細胞用培養液で洗浄し、細胞数を計測した。次に、分散させた細胞を、新たにiMatrix-511コートした6 cmディッシュに1500 cells/cm2の密度で播種した。ここで、回収されたiPS細胞は破棄することなく、すべて新たなディッシュへ播種した。【００８７】
回収した細胞をすべて植え継ぐことにより、徐々に培養スケールが拡大する。そこで、樹立後から3〜5継代を行い、iPS細胞を用いたT細胞補充療法に必要な量のiPS細胞が得られた段階で、以下の手順で細胞を凍結保存した。【００８８】
継代と同じ手順でiPS細胞を回収したのち、TCプロテクター（DSファーマ社：カタログ番号KBTCP001）等の細胞凍結液に細胞を浮遊させ、−1℃／分の速さで−80℃まで温度を下げてiPS細胞を凍結した。iPS細胞を安定的かつ長期間保存するためには、さらに液体窒素（−196℃）中で保存することが望ましい。【００８９】
〔工程３の具体的手順〕
超低接着処理された6ウェルプレート（CORNING社：カタログ番号3471）に、工程２で得られたiPS細胞を3×105〜6×105個／ウェルで播種し（DayO）、EB培養液（10μg/mL ヒトインスリン、5.5μg/mL ヒトトランスフェリン、5 ng/mL 亜セレン酸ナトリウム、2 mM L-グルタミン、45 mM α-モノチオグリセロールおよび50μg/mL アスコルビン酸を含むStemPro34）に10 ng/mL BMP4、5 ng/mL bFGF、15 ng/mL VEGF、2μM SB431542を加えて、低酸素条件下（5％O2）で5日間培養した（Day5）。【００９０】
続いて、50 ng/mL SCF、30 ng/mL TPO、10 ng/mL Flt3Lを添加し、さらに5〜9日間培養した（〜Day14）。【００９１】
得られた造血前駆細胞は、Fc-DLL4（5μg/mL）（Sino Biological Inc.)およびRetronectin（5μg/mlL）（タカラバイオ株式会社）でコーティングした4ウェルプレート上で、50 ng/mL SCF、50 ng/mL IL-7、50 ng/mL Flt3L、100 ng/mL TPO、15μM SB203580（Tocris Bioscience）および30 ng/mL SDF-1α（PeproTech）を添加したOP9培養液（15％ FBS、2 mM L-グルタミン、100 U/mLペニシリン、100 ng/mL ストレプトマイシン、55μM 2-メルカプトエタノール、50μg/ml アスコルビン酸、10μg/mL ヒトインスリン、5.5μg/mL ヒトトランスフェリンおよび5 ng/mL 亜セレン酸ナトリウムを含む）中で21日間培養を行った（Day35）。【００９２】
Day35において、CD45、CD3、CD4およびCD8のすべてが陽性の画分を、FACSを用いて単離し、CD4／CD8ダブルポジティブ細胞（DP細胞という）を得た。【００９３】
得られたCD4／CD8ダブルポジティブ細胞を、96ウェルプレート上で、15％ウシ胎児血清、500 ng/mL 抗CD3抗体（eBioscience）、200 U/mL IL-2、10 ng/mL IL-7および10 nMデキサメタゾンを添加したRPMI 1640培養液中で2日間培養した（Day37）。細胞を、15％ウシ胎児血清を添加したRPMI 1640培養液で洗浄することにより抗体を除去し、15％ウシ胎児血清および10 ng/mL IL-7を添加したRPMI 1640培養液でさらに5日間培養することにより、CD8シングルポジティブT細胞を得た（Day42）。
【実施例１】
【００９４】
前記の方法に基づき、肺がん患者の摘出腫瘍から分離された遺伝的多様性を有するT細胞集団からiPS細胞を樹立し、遺伝的多様性を有するT細胞へと再分化誘導を行った。【００９５】
T細胞が発現するT細胞受容体（TCR）の遺伝的多様性は、一般的にDNAやRNAのシークエンス解析により決定されるが、TCRのVβ鎖の各セグメントに特異的に結合する抗体パネルを用いて、簡易に検出することも可能である。【００９６】
TCRVβ解析キット（BECKMAN COULTER社：カタログ番号IM-3497）を用いて、肺がん患者の摘出腫瘍から分離されたT細胞集団のTCRレパトアを解析した（図１）。患者検体中には、約1〜13％の割合で、それぞれのVβ鎖を発現する細胞が含まれており、遺伝的多様性を有するT細胞集団であることが確認された。これらのT細胞集団を上記の方法によりiPS細胞へと初期化した。【００９７】
iPS細胞は多能性を有する幹細胞であり、TCR遺伝子を含むT細胞関連の遺伝子は発現していない。即ち、TCR遺伝子の多様性を未分化なiPS細胞の段階で解析することは困難である。樹立されたiPS細胞は、遺伝的多様性を失わないように継代したのち、造血前駆細胞段階を経てT細胞へと分化誘導を行った。【００９８】
再生されたT細胞が発現するTCRのレパトアを、上記のキットを用いて解析した（図２）。iPS細胞の樹立およびT細胞の分化誘導に伴って、Vβの2、3、4、7.1、7.2、8、12、14、16、20および21.3のセグメントを発現するT細胞の多様性は失われたが、約半数のVβレパトアが保存されており、再生されたT細胞が遺伝的多様性を有するT細胞集団であることが確認された。 
【実施例２】
【００９９】
腫瘍抗原の1つであるGPC3に対し、ペプチドワクチンを投与された患者から末梢血を採取し、密度勾配遠心法を用いて単核球分細胞集団を分離した。この細胞集団の2×106細胞を、24ウェルプレートに加え、10 mg/mLの濃度のGPC3ペプチドを用いて、上記の「工程１の具体的手順」に従って、GPC3に指向性を有するT細胞を増幅培養した。培養した細胞を再びGPC3ペプチドと接触させ、24時間培養することにより活性化マーカーを発現させた。この細胞集団を、抗体（CD4-BV421、CD8-PerCP/Cy5.5、CD14-FITCおよびCD137-PE）で染色し、フローサイトメーター（BD FACSAria（登録商標）II）を用いて、GPC3指向性を有するT細胞集団の割合を解析した。（図３）。その結果、GPC3に指向性を有するCD8／CD137ダブルポジティブ細胞が高い割合で増幅されていることが示された。この細胞集団に対し、磁気ビーズを用いて、CD8およびCD137の両方を発現し、GPC3に指向性を有するT細胞集団を濃縮した（図４）。この細胞集団を、上記の「工程２の具体的手順（iPS細胞への初期化および樹立したiPS細胞の遺伝的多様性を維持したままの培養）」に従ってiPS細胞へと初期化した後、上記の「工程３の具体的手順」に従って、CD8シングルポジティブ細胞へと再分化誘導を行った。得られた再生CD8シングルポジティブ細胞は、GPC3 ペプチド-HLA複合体（Dextramer）に高い割合で染色されることから、GPC3に指向性を有するT細胞集団であることが示される（図５）。
【実施例３】
【０１００】
非がん患者（健常人）の末梢血から単核球を分離し、腫瘍抗原の1つであるWT1のオーバーラップペプチド（PepTivator WT1, Miltenyi Biotech社）と接触させることにより、実施例２と同様にして、WT1に指向性を有するT細胞集団を増幅培養した。WT1オーバーラップペプチドは、1μg/mLで培養液に添加した。培養した細胞を、再びWT1オーバーラップペプチドと接触させることにより、活性化マーカーを発現させた。それを解析した結果、WT1に指向性を有するCD8／CD137ダブルポジティブ細胞が高い割合で増幅されていることが示された（図６）。この細胞集団に対し、磁気ビーズを用いて、CD8およびCD137の両方を発現し、WT1に指向性を有するT細胞集団を濃縮した（図７）。
【実施例４】
【０１０１】
非がん患者（健常人）の末梢血から単核球を分離し、ウイルス抗原の1つであるEBV LMP2Aのオーバーラップペプチド（PepTivator EBV LMP2A, Miltenyi Biotech社）と接触させることにより、実施例２と同様にして、EBV LMP2Aに指向性を有するT細胞集団を増幅培養した。EBV LMP2Aオーバーラップペプチドは、1μg/mLで培養液に添加した。培養した細胞を、再びEBV LMP2Aオーバーラップペプチドと接触させることにより、活性化マーカーを発現させた。それを解析した結果、EBV LMP2Aに指向性を有するCD8／CD137両陽性細胞が高い割合で増幅されていることが示された（図８）。この細胞集団に対し、磁気ビーズを用いて、CD8およびCD137の両方を発現し、EBV LMP2Aに指向性を有するT細胞集団を濃縮した（図９）。
【実施例５】
【０１０２】
GPC3に指向性を持つT細胞集団から、iPS細胞を経由して作製された再生T細胞集団が、GPC3ペプチドを発現する標的細胞に対して特異的な細胞傷害活性を有することを確認した。【０１０３】
肝臓がん患者の末梢血から単核球を分離し、実施例２と同様にして、GPC3ペプチドと接触させることにより、GPC3に指向性を有するT細胞集団を増幅培養し、さらに濃縮した。この濃縮した細胞集団を、上記の工程２および３に従ってiPS細胞へと初期化した後、上記の工程４に従って、CD8シングルポジティブ細胞への再分化誘導を行った。得られた再生T細胞集団は、フローサイトメトリー解析により、CD8は、CD8αβヘテロダイマーとして存在することが確認された（図１０Ａ）。【０１０４】
標的細胞として、EBウイルスに感染させて不死化させたB細胞を用いた。この標的細胞をGPC3ペプチド（1μM）存在下または非存在下で培養し、GPC3ペプチド発現細胞およびGPC3ペプチド非発現細胞を作製した。標的細胞に対する再生T細胞集団の細胞傷害活性は、N-SPC非RI細胞障害性アッセイキット（テクノ・スズタ社）を用いて測定した。GPC3ペプチド発現または非発現標的細胞をBM-HT Reagentで処理し、BM-HT Reagentを細胞内に取り込ませた。その後、標的細胞を洗浄し、過剰のBM-HT Reagentを除去した。この標的細胞と再生T細胞集団とを2時間共培養し、培養上清をEu solution（ユーロピウム溶液）に添加した。傷害された標的細胞から培養液中に漏出するHTキレートはHT/Eu複合体となり、これをレーザー光で励起し、時間分解蛍光を測定することにより細胞傷害活性を評価した。細胞傷害活性は、次式により算出した。
細胞傷害活性（％）＝［（再生T細胞存在下での培養上清中の蛍光量）−（再生T細胞非存在下での培養上清中の蛍光量）］／［（全標的細胞を溶解した溶解液中の蛍光量）−（再生T細胞非存在下での培養上清中の蛍光量）］×100
共培養時の再生T細胞と標的細胞との細胞数比は、20：1、10：1および5：1とした。その結果、GPC3ペプチド発現標的細胞に対する再生T細胞集団の細胞傷害活性が示され、その活性は標的細胞に対する再生T細胞の細胞数の増加に応じて増強された（図１０Ｂ）。一方、再生T細胞集団は、GPC3ペプチドを発現しない標的細胞に対して、細胞傷害活性を示さなかった（図１０Ｂ）。これらの結果から、得られた再生T細胞集団は、GPC3に対する抗原特異性を維持し、GPC3を発現する標的細胞に対する抗原特異的な細胞傷害活性を有することか示される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【国際調査報告】
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