(57)【要約】可食性色素染色剤であるクルクミン、赤色3号または赤色106号による臓器組織染色を行った後、レーザー照射により、臓器の漿膜側または管腔内でがん細胞と正常細胞とを識別する生体染色検査方法を提供する。【選択図】図１２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
レーザー照射により生体組織観察を可能にする細胞染色剤を臓器に投与した後、当該臓器に対して多光子レーザーまたは共焦点レーザーを照射することを特徴とする生体染色検査方法。
【請求項２】
臓器の漿膜側から当該臓器に対して多光子レーザーまたは共焦点レーザーを照射する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
臓器の管腔内から当該臓器に対して多光子レーザーまたは共焦点レーザーを照射する、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記細胞染色剤が、スルフレチン、クルクミン、赤色3号（エリスロシン）および赤色106号からなる群より選ばれる１種類以上の染色剤である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
細胞染色剤の投与が、臓器の漿膜側からの塗布、滴下または噴霧により行われる、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
細胞染色剤の投与が、臓器の管腔内からの塗布、滴下または噴霧により行われる、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
細胞染色剤の投与が、経口投与、静脈内投与、腹腔内投与、皮下注射投与、筋肉内注射投与、臓器内注射投与、胸腔内投与またはくも膜下投与である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
レーザー照射が、多光子レーザー顕微内視鏡、共焦点レーザー顕微内視鏡またはレーザー蛍光顕微内視鏡を用いて行われる、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
請求項８に記載の方法を使用し、がん細胞を可視化することを特徴とする、がん細胞の検出方法。
【請求項１０】
がんの存在が疑われる臓器において、がんが存在する場合に、所属リンパ節組織へのがんの浸潤を判定するための方法であって、リンパ節組織を覆う表面被膜の上から滴下、または、リンパ節内部に注射する方法でレーザー照射により生体組織観察を可能にする細胞染色剤を当該リンパ節組織に投与し、次に、当該リンパ節組織に対して多光子レーザーまたは共焦点レーザーを照射することを含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
がんの存在が疑われる臓器において、クルクミンまたはスルフレチンにより臓器組織の染色を行った後、多光子レーザー顕微内視鏡、共焦点レーザー顕微内視鏡またはレーザー蛍光顕微内視鏡を用いて漿膜側または管腔内から当該臓器組織に対してレーザー照射し、当該臓器組織内に存在する細胞の細胞質および核の形態について得られた可視化画像に基づいて細胞の種類を同定することを特徴とする、請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
さらに、正常細胞または組織と、がん細胞または組織とを識別することを含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
がんの存在が疑われる臓器において、赤色106号染色により臓器組織の染色を行った後、多光子レーザー顕微内視鏡、共焦点レーザー顕微内視鏡またはレーザー蛍光顕微内視鏡を用いて漿膜側または管腔内から当該臓器組織に対してレーザー照射し、可視化された当該臓器組織内に存在するがん細胞および正常細胞周囲の毛細血管の走行パターンを比較し、がん細胞周囲で見られる毛細血管の消失および／または変形に基づき、がん細胞を検出することを特徴とする、請求項９に記載の方法。
【請求項１４】
さらに、正常細胞または組織と、がん細胞または組織とを識別することを含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
臓器表面から0.05〜1.0 mmまでの深さの細胞形態を可視化することを含む、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
さらに、がん組織の位置を、臓器におけるがん組織辺縁を蛍光染色することにより特定することを含む、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
がんの存在が疑われる臓器において、クルクミンまたはスルフレチンにより臓器組織の染色を行った後、多光子レーザー顕微内視鏡、共焦点レーザー顕微内視鏡またはレーザー蛍光顕微内視鏡を用いて漿膜側または管腔内から当該臓器組織に対してレーザー照射し、当該臓器組織内に存在するマイスナー神経叢またはアウエルバッハ神経叢を可視化することを含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１８】
がんの原発巣が粘膜上皮である場合において、がん細胞がマイスナー神経叢に浸潤または到達している場合、当該がんが進行がんと判定されることを特徴とする、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
がんの原発巣が粘膜上皮である場合において、がん細胞がマイスナー神経叢および平滑筋層に浸潤または到達している場合、当該がんが進行がんと判定されることを特徴とする、請求項１７に記載の方法。
【請求項２０】
がんの原発巣が粘膜上皮である場合において、がん細胞がマイスナー神経叢に浸潤または到達していない場合、当該がんが早期がんと判定されることを特徴とする、請求項１７に記載の方法。
【請求項２１】
さらに、がん細胞が検出されたことを音または光により通知することを含む、請求項９〜２０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２２】
請求項９〜２１のいずれか１項に記載の方法を用いることを特徴とする、漿膜側または管腔内からがん細胞を一個単位で除去し、がん患者を治療する方法。
【請求項２３】
請求項９〜２１のいずれか１項に記載の方法を用いることを特徴とする、術後に漿膜側または管腔内から生体に残存するがん細胞を確認し、がん細胞一個単位で除去する方法。
【請求項２４】
請求項９〜２１のいずれか１項に記載の方法を用いることを特徴とする、大腸がん患者を治療する方法。
【請求項２５】
請求項９〜２１のいずれか１項に記載の方法を用いることを特徴とする、肺がん患者を治療する方法。
【請求項２６】
請求項９〜２１のいずれか１項に記載の方法を用いることを特徴とする、前立腺がん患者を治療する方法。
【請求項２７】
請求項９〜２１のいずれか１項に記載の方法を用いることを特徴とする、胃がん患者を治療する方法。
【請求項２８】
請求項９〜２１のいずれか１項に記載の方法を用いることを特徴とする、食道がん患者を治療する方法。
【請求項２９】
請求項９〜２１のいずれか１項に記載の方法を用いることを特徴とする、膀胱がん患者を治療する方法。
【請求項３０】
クルクミンまたはスルフレチンによる臓器組織の染色を行った後、多光子レーザー顕微内視鏡、共焦点レーザー顕微内視鏡またはレーザー蛍光顕微内視鏡を用いて漿膜側または管腔内から当該臓器組織に対してレーザー照射し、当該臓器組織内に存在する神経細胞の細胞質および核ならびに神経線維の形態、および/または神経線維・軸索を囲む髄鞘の形態について得られた可視化画像に基づいて、神経細胞の種類および神経ネットワークを同定する、請求項８に記載の方法。
【請求項３１】
前記神経細胞が自律神経細胞であり、前記神経ネットワークがアウエルバッハ神経叢である、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
クルクミンまたはスルフレチン、および赤色106号による臓器組織の二重染色を行った後、多光子レーザー顕微内視鏡、共焦点レーザー顕微内視鏡またはレーザー蛍光顕微内視鏡を用いて漿膜側から当該臓器組織に対してレーザー照射し、得られた細胞画像に基づいて、正常細胞または組織と、がん細胞または組織とを識別する、請求項９に記載の方法。
【請求項３３】
クルクミンまたはスルフレチン、および赤色106号による消化管組織の二重染色を行った後、多光子レーザー顕微内視鏡、共焦点レーザー顕微内視鏡またはレーザー蛍光顕微内視鏡を用いて漿膜側から当該臓器組織に対してレーザー照射し、可視化された当該消化管における５層構造（１．上皮と腺の層、２．粘膜筋板、３．粘膜下層、４．筋層、５．漿膜）について、正常組織とがん細胞の浸潤部の構造に関する画像の差異に基づいて、各層ごとに、がん浸潤の有無を判定する、請求項９に記載の方法。
【請求項３４】
請求項９に記載の方法を用いることを特徴とする、個体におけるがんの検出方法であって、可視化画像に基づき、正常細胞と比較して、細胞が異型であると判断された場合、個体ががんを有すると特定する工程、または、正常細胞と比較して、腺構造・陰窩構造の分布パターンの規則性が失われると判断された場合、個体ががんを有すると特定する工程を含む、がんの検出方法。
【請求項３５】
請求項１７に記載の方法を用いることを特徴とする、進行がんの診断方法であって、がんの原発巣が粘膜上皮である場合において、可視化画像に基づき、がん細胞がマイスナー神経叢に浸潤または到達している場合、当該がんが進行がんと判定される工程、またはがんの原発巣が粘膜上皮である場合において、がん細胞がマイスナー神経叢および平滑筋層に浸潤または到達している場合、当該がんが進行がんと判定される工程を含む、進行がんの診断方法。
【請求項３６】
請求項１７に記載の方法を用いることを特徴とする、早期がんの診断方法であって、がんの原発巣が粘膜上皮である場合において、可視化画像に基づき、がん細胞がマイスナー神経叢に浸潤または到達していない場合、当該がんが早期がんと判定される工程を含む、早期がんの診断方法。
【請求項３７】
請求項８に記載の方法を使用する、膵臓の外分泌細胞およびランゲルハン島の可視化方法。
【請求項３８】
請求項８に記載の方法を使用する、舌または軟口蓋に存在する味蕾の可視化方法。
【請求項３９】
請求項８に記載の方法を使用する、坐骨神経などの末梢神経の可視化方法。
【請求項４０】
請求項８に記載の方法を使用する、脳組織の可視化方法。
【請求項４１】
前記脳組織が大脳皮質、海馬、扁桃体、視床下部または小脳である、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
請求項４０または４１に記載の方法により得られた可視化画像を用いる、脳疾患または脳症状の判定方法。
【請求項４３】
前記脳疾患または脳症状が、アルツハイマー病、脳梗塞、脳出血、くも膜下出血、多発性硬化症および脊髄小脳変性症を含む、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
請求項８に記載の方法を使用する、眼組織の可視化方法。
【請求項４５】
前記眼組織が網膜である、請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
請求項４４または４５に記載の方法により得られた可視化画像を用いる、眼疾患または眼症状の判定方法。
【請求項４７】
前記眼疾患または眼症状が、黄斑変性、網膜変性、糖尿病性網膜症、網膜芽細胞腫、増殖性硝子体網膜症、緑内障、網膜剥離および網膜浮腫を含む、請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
請求項１０に記載の方法を用いることを特徴とする、、腹腔鏡外科手術中に、当該リンパ節にがん細胞が存在するか否かを、リンパ節切除前に判定する方法。
【請求項４９】
リンパ節に転移したがん細胞を、がん細胞だけを一個単位でレーザー蒸散で破壊して、がん細胞の死骸を免疫細胞に認識させて、活性化されたリンパ球に、がんの原発巣のがん細胞を攻撃させることを特徴とする、がん免疫療法。
【請求項５０】
クルクミンの経口投与、腹腔内投与で、消化管、全身の脳と網膜の神経細胞の細胞体、味、匂いの感覚細胞、内分泌細胞、リンパ節、骨格筋、肺、膵臓、肝臓の細胞構造を可視化し、可視化した細胞構造をレーザー顕微内視鏡と蛍光顕微鏡で画像化することで、細胞の位置、数、形、大きさ、配列に異常をきたす全ての疾患を診断する方法。
【請求項５１】
請求項５０に記載の方法を用いることを特徴とする、レーザー照射で、問題のある細胞を、一個単位で破壊・除去する方法。
【請求項５２】
再生医療で移植したiPS細胞が未分化細胞・がん細胞になったときには、それらの細胞のみを、レーザーで破壊する治療法。
【請求項５３】
請求項９〜２１のいずれか１項に記載の方法を用いることを特徴とする、子宮がん、卵巣がんのがん患者を治療する方法。
【請求項５４】
請求項９〜２１のいずれか１項に記載の方法を用いることを特徴とする、乳がんのがん患者を治療する方法。
【請求項５５】
請求項９〜２１のいずれか１項に記載の方法を用いることを特徴とする、膵臓がん、胆嚢がんのがん患者を治療する方法。
【請求項５６】
請求項９〜２１のいずれか１項に記載の方法を用いることを特徴とする、舌がん、咽喉がん、喉頭がん、甲状腺がんを治療する方法。
【請求項５７】
請求項９〜２１のいずれか１項に記載の方法を用いることを特徴とする、扁桃腺炎の原因を診断する方法。
【請求項５８】
扁桃腺に浸潤している白血球において、好中球が多く浸潤する場合は細菌感染性扁桃腺炎、好酸球が多く浸潤する場合はアレルギー性扁桃腺炎、リンパ球が多く浸潤する場合はウイルス感染性扁桃腺炎と判断する工程を含む、請求項５７に記載の方法。
【請求項５９】
請求項９〜２１,３８のいずれか１項に記載の方法を用いることを特徴とする、味蕾、嗅上皮の感覚細胞の形態を解析し、味覚異常および/または嗅覚異常を診断する方法。
【請求項６０】
請求項９〜２１のいずれか１項に記載の方法を用いることを特徴とする、骨格筋の形態を解析し、サルコペニアおよび/または重症筋無力症の病変を診断する方法。
【請求項６１】
請求項９〜２１のいずれか１項に記載の方法を用いることを特徴とする、膵臓のランゲルハンス島および/または甲状腺の内分泌細胞細胞の形態を解析し、糖尿病および/またはバセドー病を診断する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、可食性色素染色剤による臓器組織生体染色後、レーザー照射により、臓器においてがん細胞と正常細胞とを識別する生体染色検査方法および組織可視化方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
がんは、現在、わが国において、死亡原因の一位であり、国民のうち２人に１人ががんに罹患し、４人に１人ががんで死亡しているのが現状である。しかも、がんによる死亡者数は、現在、なお増加しており、がんによる死亡者を減少させることは、国民の悲願となっている。がん死亡を減少させる基本的な方策は、がんの早期発見であると考えられているが、現行の内視鏡検査では、がんが直径10〜20ミリ程度に成長したものでなければ発見困難であるという限界がある。従って、現在、大部分のがん患者は、外科的ながんの切除により治療されることが主流になっており、術前・術中の迅速判断支援技術の開発が急務となっている。【０００３】
外科的がん切除手術のゴールは、がん細胞の可及的完全な除去と病巣除去後の臓器機能の最大限の温存という、両立が極めて困難な目標の同時達成である。この非常に困難な目標達成のために、多くの外科技術的な改善・努力がなされている。外科手術的ながん治療の成績向上の鍵の一つとして、従来から迅速病理診断がある。術前・術中に執刀医が、がんを発生した臓器とその周辺の臓器やリンパ節および血管において、どの範囲までがん細胞が浸潤・転移しているかを病理診断レベルで正確に把握できることは、極めて大きな支援となる。【０００４】
クルクミン、スルフレチン、赤色3号、赤色106号等の可食性色素染色によりin vivoで消化管等の内腔面から染色し、内腔面よりレーザー顕微内視鏡などファイバーによりがん細胞と通常細胞を識別する方法が報告されている（特許文献１）。一方、術前・術中に消化管等の漿膜面または管腔内からがん細胞と通常細胞を識別する有効な方法はほとんどなく、そのような方法の開発が強く求められる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】国際公開第２０１４／１５７７０３号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
胸腔ないし腹腔の内視鏡下手術用ロボットの導入により、開腹をせずに侵襲性の小さい手術が実施され、患者への負担は大幅に軽減されている。一方、がんの場合には、微細浸潤による再発を避けるために、胸腔ないし腹腔の内視鏡下手術用ロボットを用いた場合でも、摘出部位は広範囲とならざるをえず、患者への負担軽減を図るためには、摘出範囲を小さくすることが求められる。当該手術は基本的に臓器の漿膜側より実施するため、漿膜側からがん細胞の浸潤範囲を術前・術中において、患部の切除前に予測できれば、摘出範囲を小さくすることが可能であり、胸腔ないし腹腔の内視鏡下手術用ロボットの利点と相まって、がん患者への負担が極めて小さくなる。そのためには、漿膜側からがん組織断端を明確にする技術が必要となる。また、例えばカプセル内視鏡を内服する場合には、消化管の内腔からのがん組織観察が必要となる。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
発明者らは、がん細胞特異的生体染色とレーザー顕微鏡を用いた術中の迅速病理診断システムの開発を行っており、クルクミンなどの特定の可食性色素を消化管粘膜表面に塗布後、レーザー顕微鏡で生体染色した細胞を観察すると、がん細胞が正常細胞より濃く染色されることを見いだした。当該染色により、がん細胞を迅速に検出し、さらに、細胞の核の形態を含めた細胞形態の明瞭な可視化が可能となった。その結果、病理診断において、細胞異型および構造異型の確実な判別が可能となり、微小がんを検出・治療できる方法の開発に成功した。当該方法は、クルクミンや赤色3号などのヒト経口摂取認可済み可食性色素を1 mg/mL程度の無菌溶液として、in vivoの消化管内腔面、リンパ節やex vivoの切除断端に塗布し、約1〜５分間静置し、レーザー顕微鏡によって数秒以内に画像化できるので、術中迅速病理診断に、大きく寄与できる技術である。【０００８】
胸腔ないし腹腔の内視鏡下手術用ロボット技術等は、基本的に臓器の漿膜側より実施するため、漿膜側からがん細胞の浸潤範囲を術前に予測し、術後のがん細胞の取り残しの有無を判断することができれば、がんの根治的切除を可能としつつ、摘出範囲は少なくて済み、患者負担は大幅に軽減される。【０００９】
そこで本発明は、クルクミンなどの特定の可食性色素を内腔面もしくは漿膜側から組織に塗布し、または経口摂取により、執刀部位近傍の生体染色した組織または細胞をレーザー顕微鏡で画像化し、がん組織またはがん細胞を識別する方法を提供する。
すなわち、本発明は以下の通りである。【００１０】
［１］
レーザー照射により生体組織観察を可能にする細胞染色剤を臓器に投与した後、当該臓器に対して多光子レーザーまたは共焦点レーザーを照射することを特徴とする生体染色検査方法。
［２］
臓器の漿膜側から当該臓器に対して多光子レーザーまたは共焦点レーザーを照射する、［１］に記載の方法。
［３］
臓器の管腔内から当該臓器に対して多光子レーザーまたは共焦点レーザーを照射する、［１］に記載の方法。
［４］
前記細胞染色剤が、スルフレチン、クルクミン、赤色3号（エリスロシン）および赤色106号からなる群より選ばれる１種類以上の染色剤である、［１］〜［３］のいずれかに記載の方法。
［５］
細胞染色剤の投与が、臓器の漿膜側からの塗布、滴下または噴霧により行われる、［１］〜［４］のいずれかに記載の方法。
［６］
細胞染色剤の投与が、臓器の管腔内からの塗布、滴下または噴霧により行われる、［１］〜［４］のいずれかに記載の方法。
［７］
細胞染色剤の投与が、経口投与、静脈内投与、腹腔内投与、皮下注射投与、筋肉内注射投与、臓器内注射投与、胸腔内投与またはくも膜下投与である、［１］〜［４］のいずれかに記載の方法。
［８］
レーザー照射が、多光子レーザー顕微内視鏡、共焦点レーザー顕微内視鏡またはレーザー蛍光顕微内視鏡を用いて行われる、［１］〜［７］のいずれかに記載の方法。
［９］
［８］に記載の方法を使用し、がん細胞を可視化することを特徴とする、がん細胞の検出方法。
［１０］
がんの存在が疑われる臓器において、がんが存在する場合に、所属リンパ節組織へのがんの浸潤を判定するための方法であって、リンパ節組織を覆う表面被膜の上から滴下、または、リンパ節内部に注射する方法で、レーザー照射により生体組織観察を可能にする細胞染色剤を当該リンパ節組織に投与し、次に、当該リンパ節組織に対して多光子レーザーまたは共焦点レーザーを照射することことを含む、［９］に記載の方法。
［１１］
がんの存在が疑われる臓器において、クルクミンまたはスルフレチンにより臓器組織の染色を行った後、多光子レーザー顕微内視鏡、共焦点レーザー顕微内視鏡またはレーザー蛍光顕微内視鏡を用いて漿膜側または管腔内から当該臓器組織に対してレーザー照射し、当該臓器組織内に存在する細胞の細胞質および核の形態について得られた可視化画像に基づいて細胞の種類を同定することを特徴とする、［９］に記載の方法。
［１２］
さらに、正常細胞または組織と、がん細胞または組織とを識別することを含む、［１１］に記載の方法。
［１３］
がんの存在が疑われる臓器において、赤色106号染色により臓器組織の染色を行った後、多光子レーザー顕微内視鏡、共焦点レーザー顕微内視鏡またはレーザー蛍光顕微内視鏡を用いて漿膜側または管腔内から当該臓器組織に対してレーザー照射し、可視化された当該臓器組織内に存在するがん細胞および正常細胞周囲の毛細血管の走行パターンを比較し、がん細胞周囲で見られる毛細血管の消失および／または変形に基づき、がん細胞を検出することを特徴とする、［９］に記載の方法。
［１４］
さらに、正常細胞または組織と、がん細胞または組織とを識別することを含む、［１３］に記載の方法。
［１５］
臓器表面から0.05〜1.0 mmまでの深さの細胞形態を可視化することを含む、［１］〜［１４］のいずれかに記載の方法。
［１６］
さらに、がん組織の位置を、臓器におけるがん組織辺縁を蛍光染色することにより特定することを含む、［１］〜［１５］のいずれかに記載の方法。
［１７］
がんの存在が疑われる臓器において、クルクミンまたはスルフレチンにより臓器組織の染色を行った後、多光子レーザー顕微内視鏡、共焦点レーザー顕微内視鏡またはレーザー蛍光顕微内視鏡を用いて漿膜側または管腔内から当該臓器組織に対してレーザー照射し、当該臓器組織内に存在するマイスナー神経叢またはアウエルバッハ神経叢を可視化することを含む、［９］に記載の方法。
［１８］
がんの原発巣が粘膜上皮である場合において、がん細胞がマイスナー神経叢に浸潤または到達している場合、当該がんが進行がんと判定されることを特徴とする、［１７］に記載の方法。
［１９］
がんの原発巣が粘膜上皮である場合において、がん細胞がマイスナー神経叢および平滑筋層に浸潤または到達している場合、当該がんが進行がんと判定されることを特徴とする、［１７］に記載の方法。
［２０］
がんの原発巣が粘膜上皮である場合において、がん細胞がマイスナー神経叢に浸潤または到達していない場合、当該がんが早期がんと判定されることを特徴とする、［１７］に記載の方法。
［２１］
さらに、がん細胞が検出されたことを音または光により通知することを含む、［９］〜［２０］のいずれかに記載の方法。
［２２］
［９］〜［２１］のいずれかに記載の方法を用いることを特徴とする、漿膜側または管腔内からがん細胞を一個単位で除去し、がん患者を治療する方法。
［２３］
［９］〜［２１］のいずれかに記載の方法を用いることを特徴とする、術後に漿膜側または管腔内から生体に残存するがん細胞を確認し、がん細胞一個単位で除去する方法。
［２４］
［９］〜［２１］のいずれかに記載の方法を用いることを特徴とする、大腸がん患者を治療する方法。
［２５］
［９］〜［２１］のいずれかに記載の方法を用いることを特徴とする、肺がん患者を治療する方法。
［２６］
［９］〜［２１］のいずれかに記載の方法を用いることを特徴とする、前立腺がん患者を治療する方法。
［２７］
［９］〜［２１］のいずれかに記載の方法を用いることを特徴とする、胃がん患者を治療する方法。
［２８］
［９］〜［２１］のいずれかに記載の方法を用いることを特徴とする、食道がん患者を治療する方法。
［２９］
［９］〜［２１］のいずれかに記載の方法を用いることを特徴とする、膀胱がん患者を治療する方法。
［３０］
クルクミンまたはスルフレチンによる臓器組織の染色を行った後、多光子レーザー顕微内視鏡、共焦点レーザー顕微内視鏡またはレーザー蛍光顕微内視鏡を用いて漿膜側または管腔内から当該臓器組織に対してレーザー照射し、当該臓器組織内に存在する神経細胞の細胞質および核ならびに神経線維の形態、および/または神経線維・軸索を囲む髄鞘の形態について得られた可視化画像に基づいて、神経細胞の種類および神経ネットワークを同定する、［８］に記載の方法。
［３１］
前記神経細胞が自律神経細胞であり、前記神経ネットワークがアウエルバッハ神経叢またはマイスナー神経叢である、［３０］に記載の方法。
［３２］
クルクミンまたはスルフレチン、および赤色106号による臓器組織の二重染色を行った後、多光子レーザー顕微内視鏡、共焦点レーザー顕微内視鏡またはレーザー蛍光顕微内視鏡を用いて漿膜側から当該臓器組織に対してレーザー照射し、得られた細胞画像に基づいて、正常細胞または組織と、がん細胞または組織とを識別する、［９］に記載の方法。
［３３］
クルクミンまたはスルフレチン、および赤色106号による消化管組織の二重染色を行った後、多光子レーザー顕微内視鏡、共焦点レーザー顕微内視鏡またはレーザー蛍光顕微内視鏡を用いて漿膜側から当該臓器組織に対してレーザー照射し、可視化された当該消化管における５層構造（１．上皮と腺の層、２．粘膜筋板、３．粘膜下層、４．筋層、５．漿膜）について、正常組織とがん細胞の浸潤部の構造に関する画像の差異に基づいて、各層ごとに、がん浸潤の有無を判定する、［９］に記載の方法。
［３４］
［９］に記載の方法を用いることを特徴とする、個体におけるがんの検出方法であって、可視化画像に基づき、正常細胞と比較して、細胞が異型であると判断された場合、個体ががんを有すると特定する工程、または、正常細胞と比較して、腺構造・陰窩構造の分布パターンの規則性が失われると判断された場合、個体ががんを有すると特定する工程を含む、がんの検出方法。
［３５］
［１７］
に記載の方法を用いることを特徴とする、進行がんの診断方法であって、がんの原発巣が粘膜上皮である場合において、可視化画像に基づき、がん細胞がマイスナー神経叢に浸潤または到達している場合、当該がんが進行がんと判定される工程、またはがんの原発巣が粘膜上皮である場合において、がん細胞がマイスナー神経叢および平滑筋層に浸潤または到達している場合、当該がんが進行がんと判定される工程を含む、進行がんの診断方法。
［３６］
［１７］に記載の方法を用いることを特徴とする、早期がんの診断方法であって、がんの原発巣が粘膜上皮である場合において、可視化画像に基づき、がん細胞がマイスナー神経叢に浸潤または到達していない場合、当該がんが早期がんと判定される工程を含む、早期がんの診断方法。
［３７］
［８］に記載の方法を使用する、膵臓の外分泌細胞およびランゲルハン島の可視化方法。
［３８］
［８］に記載の方法を使用する、舌または軟口蓋に存在する味蕾の可視化方法。
［３９］
［８］に記載の方法を使用する、坐骨神経などの末梢神経の可視化方法。
［４０］
［８］に記載の方法を使用する、脳組織の可視化方法。
［４１］
前記脳組織が大脳皮質、海馬、扁桃体、視床下部または小脳である、［４０］
に記載の方法。
［４２］
［４０］または［４１］に記載の方法により得られた可視化画像を用いる、脳疾患または脳症状の判定方法。
［４３］
前記脳疾患または脳症状が、アルツハイマー病、脳梗塞、脳出血、くも膜下出血、多発性硬化症および脊髄小脳変性症を含む、［４２］に記載の方法。
［４４］
［８］に記載の方法を使用する、眼組織の可視化方法。
［４５］前記眼組織が網膜である、［４４］に記載の方法。
［４６］
［４４］または［４５］に記載の方法により得られた可視化画像を用いる、眼疾患または眼症状の判定方法。
［４７］
前記眼疾患または眼症状が、黄斑変性、網膜変性、糖尿病性網膜症、網膜芽細胞腫、増殖性硝子体網膜症、緑内障、網膜剥離および網膜浮腫を含む、［４６］
に記載の方法。
［４８］
［１０］に記載の方法を用いることを特徴とする、、腹腔鏡外科手術中に、当該リンパ節にがん細胞が存在するか否かを、リンパ節切除前に判定する方法。
［４９］
リンパ節に転移したがん細胞を、がん細胞だけを一個単位でレーザー蒸散で破壊して、がん細胞の死骸を免疫細胞に認識させて、活性化されたリンパ球に、がんの原発巣のがん細胞を攻撃させることを特徴とする、がん免疫療法。
［５０］
クルクミンの経口投与、腹腔内投与で、消化管、全身の脳と網膜の神経細胞の細胞体、味、匂いの感覚細胞、内分泌細胞、リンパ節、骨格筋、肺、膵臓、肝臓の細胞構造を可視化し、可視化した細胞構造をレーザー顕微内視鏡と蛍光顕微鏡で画像化することで、細胞の位置、数、形、大きさ、配列に異常をきたす全ての疾患を診断する方法。
［５１］
［５０］に記載の方法を用いることを特徴とする、レーザー照射で、問題のある細胞を、一個単位で破壊・除去する方法。
［５２］
再生医療で移植したiPS細胞が未分化細胞・がん細胞になったときには、それらの細胞のみを、レーザーで破壊する治療法。
［５３］
［９］〜［２１］のいずれか１項に記載の方法を用いることを特徴とする、子宮がん、卵巣がんのがん患者を治療する方法。
［５４］
［９］〜［２１］のいずれか１項に記載の方法を用いることを特徴とする、乳がんのがん患者を治療する方法。
［５５］
［９］〜［２１］のいずれか１項に記載の方法を用いることを特徴とする、膵臓がん、胆嚢がんのがん患者を治療する方法。
［５６］
［９］〜［２１］のいずれか１項に記載の方法を用いることを特徴とする、舌がん、咽喉がん、喉頭がん、甲状腺がんを治療する方法。
［５７］
［９］〜［２１］のいずれか１項に記載の方法を用いることを特徴とする、扁桃腺炎の原因を診断する方法。
［５８］
扁桃腺に浸潤している白血球において、好中球が多く浸潤する場合は細菌感染性扁桃腺炎、好酸球が多く浸潤する場合はアレルギー性扁桃腺炎、リンパ球が多く浸潤する場合はウイルス感染性扁桃腺炎と判断する工程を含む、［５７］に記載の方法。
［５９］
［９］〜［２１］, ［３８］のいずれか１項に記載の方法を用いることを特徴とする、味蕾、嗅上皮の感覚細胞の形態を解析し、味覚異常および/または嗅覚異常を診断する方法。
［６０］
［９］〜［２１］のいずれか１項に記載の方法を用いることを特徴とする、骨格筋の形態を解析し、サルコペニアおよび/または重症筋無力症の病変を診断する方法。
［６１］
［９］〜［２１］のいずれか１項に記載の方法を用いることを特徴とする、膵臓のランゲルハンス島および/または甲状腺の内分泌細胞細胞の形態を解析し、糖尿病および/またはバセドー病を診断する方法。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によれば、漿膜側から組織内部の細胞および組織の状態を確認することが可能となる。【００１２】
本発明の方法により、ヒト経口摂取認可済み可食性色素であるスルフレチン、クルクミン、赤色3号または赤色106号溶液を、内腔側または漿膜側組織から噴霧し約1〜５分間静置後、またはクルクミン溶液を経口投与後、多光子レーザー顕微鏡または共焦点レーザーによって、漿膜側から細胞形態を画像化し識別することができる。なおクルクミンおよび赤色3号は、それぞれがん関連遺伝子産物のSTAT3およびRASを高発現した細胞を染色することができる。当該方法に従って色素を噴霧塗布した場合、画像取得までの時間は５分以内であり、外科医が注目する組織部位を複数箇所連続的に検索することができる。すなわち、本発明は、外科医が術中に即座に病理診断するために必要な、組織および細胞の識別方法を提供する。当該方法で得られる多光子レーザー顕微鏡または共焦点レーザー顕微鏡画像は極めて鮮明であり、個々の細胞の核の形態が明瞭に可視化されるため、がんの細胞異型と構造異型を確実に判断することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】消化管内壁面における生体細胞群の段階的ながん化遺伝子の変異および活性化と、がんの発達、浸潤および転移の過程を示した模式図である。
【図２】ヒトのがん細胞の増殖曲線の一例を示す図である。
【図３】マウス摘出大腸（正常粘膜組織およびがん腫瘍部）を、管腔側からクルクミン染色し、管腔側から多光子レーザー顕微鏡により撮影した写真である。（Ａ） 正常大腸粘膜（Ｂ）大腸がん腫瘍部
【図４】マウス摘出大腸（正常粘膜組織）を、管腔側からクルクミンおよび赤色106号で生体染色し、管腔側から多光子レーザー顕微鏡により撮影した写真である。
【図５ａ】正常大腸の組織構造について説明する図であり、食物が通過するルーメン（管腔）に面する表面から深部に向けて、（1）上皮と腺の層、（2）粘膜筋板、（3）粘膜下層、（4）筋層、（5）漿膜の５層を示す。
【図５ｂ】マウス摘出大腸（正常粘膜組織）を、管腔側からクルクミンで染色し、漿膜側から焦点距離を変えながら多光子レーザー顕微鏡により撮影した写真である。写真内の数値は、漿膜側からの焦点距離を示す。
【図５ｃ】マウス摘出大腸（正常粘膜組織）を、クルクミンによる漿膜側からの生体染色により、筋層内アウエルバッハ神経叢が陽性に染色された共焦点レーザー顕微鏡画像の弱拡大図である。本図は、（4）の筋層（図５ａを参照）に焦点を当てて撮影したものである。
【図５ｄ】マウス摘出大腸（正常粘膜組織）について、クルクミンによる漿膜側からの生体染色による筋層内アウエルバッハ神経叢の共焦点レーザー顕微鏡による可視化の例を強拡大し、神経細胞体が識別できることを示す図である。
【図５ｅ】マウス摘出大腸（正常粘膜組織）について、クルクミンによる漿膜側からの生体染色により、筋層内アウエルバッハ神経叢を可視化した、多光子レーザー顕微鏡画像を示す。
【図５ｆ】マウス摘出大腸（正常粘膜組織）について、赤色１０６号による生体染色および多光子レーザー顕微鏡による漿膜側からの画像化による、太い血管および平滑筋を可視化した図である。本図は、（4）筋層（図５ａを参照）に焦点を当てて撮影したものであり、赤色１０６号により、平滑筋と血管壁が染色されていることを示す。
【図５ｇ】マウス摘出大腸（正常粘膜組織）について、赤色１０６号による生体染色および多光子レーザー顕微鏡による漿膜側からの画像化による、腺構造および陰窩構造を可視化した図である。
【図６Ａ】および
【図６Ｂ】マウス腹部を切開した後、大腸（正常組織）の漿膜側から大腸組織をクルクミンおよび赤色106号で二重生体染色し、共焦点レーザー顕微鏡により、漿膜側から、（1）上皮と腺の層（図５ａを参照）に焦点を当てて、撮影した写真である。（Ａ）本図により、クルクミンは、腺細胞を陽性に染色することから腺構造が可視化され、赤色106号は、結合組織および毛細血管を円周状構造として陽性に染色することから、陰窩構造が識別できることが示される。（Ｂ）（1）上皮と腺の層および（2）粘膜筋板（図５ａを参照）に焦点を当てて撮影した写真である。本図により、クルクミンによって腺が染色され、赤色106号により結合組織および毛細血管が染色されることに加え、クルクミンにより平滑筋（粘膜筋板）が染色されることが示される。
【図７】マウス腹部を切開した後、大腸（正常組織）の管腔側から大腸組織をクルクミンおよび赤色106号で染色し、共焦点レーザー顕微鏡により漿膜側から、（1）上皮と腺の層および（2）粘膜筋板（図５ａを参照）に焦点を当てて撮影した写真である。本図により、管腔側から染色した場合であっても、クルクミンにより平滑筋（粘膜筋板）が染色され、赤色106号により結合組織および毛細血管が染色されていることが示される。
【図８】がんの局所浸潤および転移による進行度判定ならびに治療方針を示す概略図である。
【図９】本図は、がんの細胞構築および進行がんの局所浸潤を図解する。
【図１０Ａ】および
【図１０Ｂ】大腸がんマウス腹部を切開した後、大腸（がん腫瘍部）の漿膜側から大腸組織をクルクミンで染色し、共焦点レーザー顕微鏡により漿膜側から撮影した写真である。（Ａ）図中の２本の矢印は、それぞれ平滑筋層およびがん細胞を示す。（Ｂ）図中の３本の矢印は、それぞれ血管、平滑筋層およびがん細胞を示す。
【図１１Ａ】および
【図１１Ｂ】大腸がんマウス腹部を切開した後、大腸（がん腫瘍部）の管腔側から大腸組織をクルクミンで染色し、多光子レーザー顕微鏡により管腔側から撮影した写真である。
【図１２】大腸がんマウス腹部を切開した後、大腸（がん腫瘍部）の漿膜側から大腸組織を赤色106号で染色し、多光子レーザー顕微鏡により漿膜側から撮影した写真である。
【図１３】マウス胸部を切開した後、胸膜臓側表面側から正常肺組織をクルクミン（Ａ）または赤色106号（Ｂ）により染色し、マウス胸部に挿入した共焦点レーザー顕微鏡により胸膜臓側表面側から撮影し、肺胞構造が明瞭に観察されることを示す写真である。
【図１４】本実施の形態に係るがん検査装置２０１を示す図である。
【図１５】本図は、がん検査を図解する。
【図１６】クルクミンによる漿膜側からの生体染色を行った後、筋層内アウエルバッハ神経叢をレーザー顕微鏡により可視化した例を強拡大で示す図である。
【図１７】クルクミンによる漿膜側からの生体染色を行った後、筋層内自律神経叢（マイスナー神経叢）をレーザー顕微鏡により可視化した例を強拡大することにより、神経細胞体を識別できることを示す図である。
【図１８】がん細胞の浸潤の経過とがんのステージ分類を模式的に示す図である。
【図１９】クルクミンを腹腔内投与することにより生体染色を行った後、膵臓の外分泌細胞およびランゲルハンス島をレーザー顕微鏡により可視化した例を強拡大で示す図である。さらに、膵臓組織のヘマトキシリン・エオジン（ＨＥ）染色像を示す図である。
【図２０】クルクミンを舌粘膜上に塗布することにより生体染色を行った後、味覚の感覚装置である味蕾を、レーザー顕微鏡により可視化した例を強拡大で示す図である。
【図２１】クルクミンを舌粘膜上に塗布することにより生体染色を行った後、味覚の感覚装置である味蕾を、レーザー顕微鏡により可視化した例を強拡大で示す図である。
【図２２】クルクミンを舌粘膜上に塗布することにより生体染色を行った後、味覚の感覚装置である味蕾の感覚神経細胞を、レーザー顕微鏡により可視化した例を強拡大で示す図である。
【図２３】クルクミンを腹腔内投与することにより生体染色を行った後、により、網膜神経細胞群をレーザー顕微鏡により可視化した例を強拡大で示す図である。
【図２４】クルクミンを硝子体内注射することにより生体染色を行った後、網膜神経細胞群を、レーザー顕微鏡により可視化した例を強拡大で示す図である。
【図２５】クルクミンを腹腔内投与することにより生体染色を行った後、嗅神経線維を、レーザー顕微鏡により可視化した例を強拡大で示す図である。本図により、クルクミンがミエリン髄鞘を染色することが示される。
【図２６】クルクミンを鼻粘膜上に塗布することにより生体染色を行った後、匂いの感覚細胞である嗅覚受容神経細胞を、レーザー顕微鏡により可視化した例を強拡大で示す図である。
【図２７】クルクミンを腹腔内投与することにより生体染色を行った後、甲状腺を、レーザー顕微鏡により可視化した例を強拡大で示す図である。さらに、甲状腺組織のヘマトキシリン・エオジン（ＨＥ）染色像を示す図である。
【図２８】クルクミンを筋膜上に塗布することにより生体染色を行った後、骨格筋のアクチン・ミオシン横紋、核および筋線維を、レーザー顕微鏡により可視化した例を強拡大で示す図である。
【図２９】クルクミンをリンパ節上に塗布することにより生体染色を行った後、リンパ節の二次小節の明中心と暗殻の構造を、レーザー顕微鏡により可視化した例を強拡大で示す図である。
【図３０】マウス腹腔内にクルクミンを投与し、海馬の神経細胞の細胞体をレーザー顕微鏡により可視化した図である。
【図３１】マウス腹腔内にクルクミンを投与し、大脳皮質をレーザー顕微鏡により可視化した図である。
【図３２】マウス腹腔内にクルクミンを投与し、小脳の神経細胞の細胞体および血管を、レーザー顕微鏡により可視化した図である。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
次に、本発明の実施形態について、図表を参照しつつ説明する。しかしながら本発明の技術的範囲は、これらの実施形態によって限定されるものではなく、発明の要旨を変更することなく様々な形態で実施することができる。
【００１５】
本発明で用いられる細胞染色剤としては、可食性の１種類以上の色素化合物を含んで成る生体染色剤が挙げられる。色素化合物は、タール系色素（赤色３号（エリスロシン）、赤色１０４号（フロキシン）、赤色１０５号、赤色１０６号、緑色３号（ファストグリーンFCF）、赤色２号、赤色１０２号、青色２号（インジゴカルミン）、黄色４号（タートラジン）、黄色５号（サンセットイエローFCF）等）、イリドイド系色素（ハイメロンＰ−２（クチナシ青：ゲニポシド）、ハイブルーＡＴ（クチナシ青色素：ゲニポシド）等）、カロテノイド系色素（ハイメロンＰ−２（黄色素：クロシン）、アナトール（アンナットーＮ2Ｒ25、紅の木の実：ビキシン、ノルビキシン）、ハイメロンＰ−２（クチナシ青：ゲニポシド）、クロシンＧ１５０（クチナシ黄色素）、クロシンＬ（クチナシ黄色素）、βカロテン、アンナットーＷＡ−２０（アナトール色素、べにの木の種子：ノルビキシン）等）、フラボノイド系色素（ハイレッドＧ１５０（ブドウ果皮色素、アントシアニン）、ハイレッドRA200(赤大根色素：ペラルゴニジンアシルグリコシド)、ハイレッドV80(紫芋色素：シアニジンアシルグルコシドおよびペオニジンアシルグルコシド)、アピゲニニジン（コウリャン色素）、シアニジン、デルフィニジン（ナス色素）、フィセチニジン（モリシマアカシア色素）、マルビジン（青いスイートピー色素）、ペラルゴニジン、ロビネチニジン（ニセアカシアの木色素）、トリセチニジン（紅茶色素）、ペツニジン（レッドベリー色素）、カプサンチン（トウガラシ色素）、エピガロカテキンガレート、緑茶、サフラワーＹ１５００（ベニバナ色素、サフロミンA+B)、クルクミン、スルフレチン、ミリセチン（ブドウ、玉ねぎ色素）またはクェルセチン（玉ねぎ、柑橘類色素））、キノイド系色素（コチニール（コチニールレッドＡＬ、カルミン酸）、ハイレッドＳ（ラック色素・ラッカイン酸）等）、ベタライン系色素（ハイレッドＢＬ（赤ビート色素：ベタニン、イソベタニン）等）、インドシアニングリーンおよびジンゲロール（ショウガ辛み成分）を含む蛍光色素群から選択される。
【００１６】
本発明で用いられる細胞染色剤の好ましい例示としては、スルフレチン、クルクミン、赤色3号（エリスロシン）および赤色106号からなる群より選ばれる１種類以上の染色剤が挙げられる。
【００１７】
細胞染色剤の投与方法は特に限定されない。例えば、本発明の細胞染色剤を臓器の管腔内に直接投与または粘膜下投与してもよく、臓器の漿膜側から投与してもよい。これらの投与方法としては、塗布、滴下または噴霧による投与が採用できる。さらには、細胞染色剤の投与方法として、経口投与、静脈内投与、腹腔内投与、胸腔内投与またはくも膜下投与することもできる。投与方法は、染色の対象となる臓器または臓器の部位によって選択することができる。染色剤の染色性が弱い場合、粘膜表面をプロナーゼで処理することにより粘液を除去し、細胞構造の視認性を向上させることができる。管腔内壁に直接染色剤を投与する場合（例えば塗布または噴霧）、染色剤の剤形は液体であることが好ましいが、顆粒、錠剤等の形態でも使用することができる。また、剤形等に応じて適宜必要な追加成分、例えば等張化剤、pH調節剤、安定化剤、増粘剤、防腐剤、香料または粘着剤等の添加物を染色剤に配合することができる。例えば、本発明の染色剤に予めプロナーゼを配合してもよい。
【００１８】
図１は、消化管内壁面における生体細胞群の段階的がん化過程を示した模式図である。図１では、生体細胞群のがん化の過程が、第１段階、第２段階、第３段階および第４段階に順に分けて示されている。
【００１９】
第１段階は、生体細胞群の一部においてがん化が開始される段階である。第１段階は、ＡＰＣ／β-ｃａｔｅｎｉｎ系のがん関連遺伝子の活性が弱まり、細胞の増殖を抑制する機能が低下することにより起こると考えられる。この段階では、細胞の増殖はやや亢進し、少なくとも、将来的にがん細胞となり得る前がん状態が発現していることを示している。
【００２０】
第２段階は、第１段階よりもがん化が進んだ前がん状態である。第２段階は、ｒａｓ系のがん関連遺伝子の活性が強まり、細胞の増殖が亢進していると考えられる。また、ＳＴＡＴ３系のがん関連遺伝子もこの段階で活性化される可能性があると考えられる。がん細胞集団の大きさは小さく、その直径は、例えば0.1 mm以上0.4 mm以下である。がん細胞集団の直径とは、がん細胞集団を、がん細胞集団の面積と同じ面積を有する円とみなした場合の直径である。この段階は、患者の生命をすぐに脅かす段階ではないが、今後に備えて治療計画等を立てておくことが望ましい。
【００２１】
第３段階は、生体細胞群の一部が浸潤状態となり、がん細胞が顕在化した段階である。第３段階は、ｐ５３系のがん関連遺伝子の活性が弱まり、細胞の増殖を抑制する機能が低下することにより起こると考えられる。この段階は、ｐ５３系およびＡＰＣ／β-ｃａｔｅｎｉｎ系の両方のがん抑制遺伝子産物の活性が弱まり、細胞の増殖を抑制する機能が大きく低下した状態にある。このため、がん細胞の増殖が加速的に進み、がん細胞は周囲組織に浸潤する。第３段階まで進むと、がん細胞集団の直径は0.5 mm以上に達し、そのまま放置すると個体の死を誘発するがんが完成する。
【００２２】
第４段階は、第３段階で完成したがん細胞が、がんになった後、さらなる遺伝子変異を生じ、さらに細胞増殖、浸潤および転移が起こりやすい悪性のがんに進展した段階である。この段階は、消化管以外の他の遠隔臓器へのがん転移が始まる段階であり、患者の生命を脅かす危険な段階である。これら第１段階から第４段階への進行スピードは、がん関連遺伝子の活性状態により左右されると考えられる。
【００２３】
図２は、人のがん細胞の増殖曲線の一例を示す図である。図２に示されるように、一般的に、がん細胞の数は所定の増殖曲線に従って増加する。例えば、がん化が始まろうとしている段階の３年間（がん細胞集団の直径が0.2 mm未満の時期）は増殖曲線の傾きが小さいが、４年以降（がん細胞集団の直径が0.5 mm以上の時期）では増殖曲線の傾きが大きくなる。そして、７年半以降になると増殖曲線の傾きはやや小さくなる。なお、一般的にがんが臨床的に発見され、治療が行われるのは７年以降の時期である。これは、がん細胞集団の直径が10 mm以上とならなければ検出できないからである。現在のがんの治療は、一般的に、がんが直径２０ｍｍを超えてから発見されることが多いため、外科的な切除によるがん細胞の除去が主流である。
【００２４】
図２において注目すべきは、図２の増殖曲線の破線Ａで示される範囲では、がん細胞集団の大きさが指数関数的に増加している点である。この指数関数的な増加は、がん細胞集団のがん細胞で、起こるべき第１段階から第３段階までのがん性遺伝子変異が完了し、がん細胞が一定の均一な速度で分裂を繰り返していることを意味している。この指数関数的な増加の初期の段階、すなわち、がん関連遺伝子発現パターンは異常を生じているが、がん細胞集団自体は直径1 mm以下と小型である段階で、これらのがん細胞集団（超早期がん）を検出することができれば、これらの超早期がんは十分に小さいため、完全摘出が容易であるので、がんを根治できる。このように、超早期の段階で、がん化の悪性度レベルをがん関連遺伝子発現パターンの異常として把握することができれば、危険な段階となる前に、がんを根本治療することが可能となる。
【００２５】
発明者らは、超早期がんの検出のため、生体細胞群のがん関連遺伝子発現パターンを多光子レーザー顕微鏡または共焦点レーザー顕微鏡で撮像し、がん関連遺伝子の活性状態を視覚化することで、がん化の悪性度レベルを把握することを試みた。
【００２６】
発明者らは、生体細胞のがん関連遺伝子発現パターンを視覚化するにあたり、可食性の色素を含む染色剤を用いてがん関連遺伝子産物を有彩色に染色して撮像を行った。なお、可食性の色素とは、自然色素または人工合成色素のうち、ヒトへの投与が許可されている色素（例えば食品着色用の色素やサプリメントで服用可能な色素）である。
【００２７】
具体的には、ＳＴＡＴ３系のがん関連遺伝子産物を選択的に染色する染色剤として、クルクミン類（Ｃｕｒｃｕｍｉｎ、Ｃ２１Ｈ２０Ｏ６）を含む染色剤を用いることができる。また、ｒａｓ系のがん関連遺伝子発現パターンを選択的に染色する染色剤として、赤色3号（エリスロシン）を含む染色剤を用いることができる。
【００２８】
より具体的には、クルクミン類を含む染色剤として、クルクミンを１重量％含むクルクミン含有溶液を準備し、赤色3号を含む染色剤として、フロキシンを１重量％含む赤色3号含有溶液を準備した。なお、クルクミン類を含む染色剤としては、クルクミン溶液（例えば、原液は、クルクミンを５％、４５％グリセロール、５０％エタノールを含む液体）を生理食塩水で１／５〜１／１００希釈したものでもよい。１％赤色3号を含む染色剤としては、フロキシン溶液（原液 10 mg/mL）をそのままの濃度〜１／１０希釈したものでもよい。
(i)０．４５％グリセリン、０．５％エタノールの溶液に、化学合成クルクミンを１ｍｇ/ｍｌ程度まで希釈したものを用いる。
(ii)沖縄クルクミン粉末１gを１０ｍｌのPBSで溶かして、１ｍｇ／ｍｌ程度までに希釈したものを用いる。
(i)、(ii)ともに、使用直前に、滅菌フィルターで無菌化したものを、生体に投与する。
【００２９】
クルクミン類を含む染色剤を用いる場合、生体細胞内のＳＴＡＴ３系のがん関連遺伝子産物の発現を染色により視覚化することができる。また、赤色3号を含む染色剤を用いる場合、生体細胞内のｒａｓ系のがん関連遺伝子発現を染色により視覚化することができる。染色後、過剰な染色剤は洗浄することにより除去することができる。生理食塩水、りん酸緩衝生理食塩水などの細胞または生体組織に損傷を与えない生理的溶液で約１０秒間の洗浄を３回行うことにより、過剰な染色液を除去することができる。異なる染色剤により二重染色を行った場合、ＳＴＡＴ３系およびｒａｓ系のがん関連遺伝子産物の発現量の解析が、同時に可能となる。なお、各染色剤の染色時間はそれぞれ１〜５分間でよい。上記した濃度においては、染色開始後から１０分以内であれば細胞質に浸透しても細胞内の核に浸透しないため、細胞質に囲まれている核を鮮明に視覚化できることにより、分析がより明瞭にできるようになる。
観察までの染色時間は、粘膜表面または臓器表面に直接塗布する場合は投与後１〜３０分間、経口投与する場合は投与後３０分〜１時間、静脈内投与する場合は投与後３分〜１時間、腹腔内投与する場合は投与後３分〜１時間、皮下注射投与する場合は投与後３分〜１時間、筋肉内注射投与する場合は投与後３分〜１時間、臓器内注射投与する場合は投与後５分〜３０分間、胸腔内投与またはくも膜下投与する場合は投与後３分〜１時間とする。
【００３０】
上記の細胞染色剤によるがん細胞の染色は、直接臓器に対して行うことができる。臓器はヒトまたは動物に由来するものを用いることができる。染色の対象とする臓器は摘出したものでも、生体内にあるものでもよい。臓器としては、大腸、肺、前立腺、胃、食道、膀胱、リンパ節などが挙げられるが、これらに限定されない。リンパ節を染色する場合、染色液の浸透性を上げるため、リンパ節組織を覆う表面組織を剥離した後、染色液を適用することが好ましい。細胞染色剤により染色された細胞は、多光子レーザー顕微鏡または共焦点レーザー顕微鏡を用いて画像化することができる。多光子レーザーを用いる場合は、臓器表面からの十分な撮像可能深度および解像度を得るため、レーザー波長は600 nm〜1600 nmが好ましい。共焦点レーザーを用いる場合は、400 nm〜700 nmのレーザー波長が好ましい。
【００３１】
臓器に対する染色液の適用は、臓器表面を覆う漿膜側から行うことができる。大腸、胃、食道などの管状の臓器では、管腔側から行うこともできる。適用とは、細胞染色液溶液を臓器に対して塗布、滴下または噴霧することを意味する。手術後に切除した臓器に対する病理診断を目的とする場合は、摘出臓器が管状である場合、管腔側から組織染色を行うことができる。しかしながら、手術中に切除部位またはがんの浸潤部位を特定するためには、臓器の漿膜側から組織染色を行うことが望ましい。これは、例えば腹腔等の内視鏡下手術用ロボット技術等は、基本的に臓器の漿膜側より手術を行うため、漿膜側の組織染色が必要となるためである。漿膜側から染色液を適用する場合、手術野にある臓器漿膜に無菌化した染色液を塗布、滴下または噴霧し、染色液の適用後１０分以内、好ましくは１〜５分、さらに好ましくは１〜３分で、臓器を生理食塩水等で洗浄し、染色液を除去する。この後、直ちに、多光子レーザー顕微鏡または共焦点レーザー顕微鏡で染色像を観察することができる。また、手術前に染色剤を全身に投与し、手術中にレーザー顕微鏡で組織を観察することもできる。投与方法としては、経口投与でもよく、静脈内投与でもよい。
【００３２】
臓器組織の染色において、使用する染色剤により可視化される臓器内の対象物が異なる。例えば、クルクミンまたは赤色3号は、上皮および腺の細胞およびそれらからがん化したがん細胞の染色に適している。一方、赤色106号は、結合組織および毛細血管の染色に適している。レーザー照射により、クルクミンは緑色の蛍光色を与えるが、赤色3号および赤色106号は赤色の蛍光色を与える。したがって、クルクミンおよび赤色106号により二重染色を行うと、染色像を重ね合わせることにより、組織細胞構造の識別が容易となり、その結果、直径1 mm程度の微細ながん組織や浸潤しているがん細胞集団の検出が可能となる。
【００３３】
図４は、マウスの摘出大腸（正常粘膜組織）を、管腔側からクルクミンおよび赤色106号で生体染色し、管腔側から多光子レーザー顕微鏡により撮影した結果を示す。ぞの結果、クルクミンは上皮細胞および腺細胞の細胞質を染色し、赤色106号は結合組織、毛細血管ならびに上皮細胞および腺細胞の細胞膜を染色することから、二重染色により組織細胞構造が明瞭に識別できることが示される。
【００３４】
組織染色において、がん細胞が存在しない正常組織と、がん細胞の存在する腫瘍組織では、レーザー顕微鏡による観察像が異なることが分かった。例えば大腸粘膜をクルクミンにより染色した場合（図３参照）、正常な大腸の粘膜組織では、上皮細胞や腺細胞の細胞質が染色され、核は染色されない。このため、個々の細胞および核の形態が明瞭に視認される。一方、大腸がん腫瘍部の組織では、個々の細胞の大きさが不同であり、また核が大きく、細胞の配置または配列が不均一である。さらに細胞接着の解離が認められ、細胞異型と判断される。さらに、がん組織では、細胞集団が基底膜上に整列して配列されておらず、また腺構造を形成していないため、構造異型と判断される。本発明の方法によれば、正常組織とがん組織との上記の相違を示す画像に基づき、がん細胞の検出、すなわちがんの病理診断が可能となる。
【００３５】
また、がん細胞の浸潤は、正常大腸の５層構造との関連で検出できる。正常大腸の組織構造は図５ａに示され、５層構造は（1）〜（5）として示される。すなわち、共焦点レーザーおよび多光子レーザー顕微内視鏡によって画像化すると、正常大腸は、食物が通過するルーメン（管腔）に面する表面から深部に向けて、（1）上皮と腺の層、（2）粘膜筋板、（3）粘膜下層、（4）筋層、および（5）漿膜の５層の構造からなる、極めて規則的な層状の構造を持つことが示される。
【００３６】
ルーメンに面する表面は、（1）上皮と腺の層が上皮細胞によってくまなく覆われ、また、上皮細胞は蛸壺状に表面から垂直に陥没した腺の構造（この垂直に陥没した構造を陰窩構造とも呼ぶ。）を一定間隔ごとに形成している。上皮は、図５ａの焦点面Pで示すように、上皮細胞が隙間なく集合した細胞のシート状に見える。一方、腺の構造は、図５ａの焦点面Cで示すように、約10個程度の腺細胞が中心の開口部に向かって同心円状に配列し、その外側を直径10μｍ程度の毛細血管が円周状に取り囲んだ形状をしている。腺の高さは約0.5〜1.0 mmで、その深部側三分の一の部分は腺底部と呼ばれ、この部分の細胞が、細胞分裂し、腺細胞と上皮細胞を更新している。この腺底部の細胞の細胞分裂が異常に亢進することに起因して、がんが発生すると考えられている。（2）粘膜筋板は、腺構造の深部に存在する薄い平滑筋の層で、がんがこの粘膜筋板を超えて発達していない段階のものを早期がんという。（3）粘膜下層は、疎な結合組織の層である。（4）筋層は、厚い平滑筋の層であり、腸の蠕動運動を司る（焦点面Bで示すように、この層では、細長い平滑筋細胞の集団が認められる。）。この平滑筋層の内部には、この平滑筋の運動を制御する自律神経のネットワークが分布しており、これは、アウエルバッハの神経叢と呼ばれる。また、この筋層の内部には、上皮や腺の周囲の毛細血管に血液を供給する太い血管も存在する（焦点面Aで示すように、この層には、直径20μｍ以上の太い血管が認められる。）。（5）漿膜は、扁平な一層の細胞からなる層である。
【００３７】
上記の５層構造において、クルクミンは、（1）上皮と腺の層の腺細胞を強く陽性に、（2）粘膜筋板の平滑筋を強く陽性に、（4）筋層の平滑筋を弱く陽性に、また筋層内部のアウエルバッハ神経叢を強く陽性に染色することが判明し、赤色106号は、（1）上皮と腺の層の腺構造を取り囲む毛細血管の網の目構造を強く陽性に、（2）粘膜筋板の平滑筋を弱く陽性に、（4）筋層の平滑筋を弱く陽性に、また筋層内部の太い血管の壁を強く陽性に染色することが判明した。これらの生体染色剤による正常大腸の５層構造および主な細胞構築の可視化は、がんの浸潤範囲の判定において極めて有用な手がかりとなる。すなわち、上記の正常構造が、正常の分布パターンを持って正常の位置に存在しないという所見（がん部位において、赤色106号による腺底部における陰窩構造の規則的な分布の消失、図１２）と、正常の場合は存在するはずのない場所に、存在するはずのない細胞が存在するという所見（平滑筋層の内部に、クルクミン染色陽性の大型の細胞がび慢性に多数散在する。図１０ＡおよびＢを参照）の組み合わせによって、がんの浸潤の有無を正確に判断できる。
【００３８】
臓器組織の染色からレーザー顕微鏡による観察まで短時間で行うことができるため、がんの病理診断を手術中の体内迅速断探病理診断にも応用することができる。一般に、がんの病理組織診断は、細胞の大小不同や形の乱れ（細胞異型）と組織の構造の乱れ（構造異型）によって行われる。異型の強いものががん（悪性）であり、異型の弱いものが良性と判断される。
【００３９】
レーザー顕微鏡による組織観察では、レーザー顕微鏡の対物レンズの位置を操作することにより、臓器に対する焦点面を変動させることができる。この操作により、臓器表面から0.05〜1.0 mmの深さまでの細胞形態を断層画像として明瞭に観察することができる。例えば、大腸組織を漿膜側から観察する場合、漿膜から管腔方向に順次焦点深度を変動させた場合、漿膜に近い比較的太い血管、平滑筋層およびその内部に存在し、平滑筋の運動を制御しているアウエルバッハ神経叢、次に毛細血管を含む腺構造を観察することができる。平滑筋層が観察できることにより、平滑筋層の内部に浸潤したがん細胞であっても検出することができる。図５ｂは、マウスの摘出大腸（正常粘膜組織）を、管腔側からクルクミンで染色し、漿膜側から焦点距離を変えながら多光子レーザー顕微鏡により撮影した結果を示す。上記した大腸の組織構造において、焦点距離0μmでは（5）漿膜表面が、焦点距離50μm付近では（4）筋層の平滑筋が、焦点距離80〜160μmでは（1）上皮と腺の層の腺構造（陰窩構造）が明瞭に認められる。
【００４０】
一実施態様において、本発明の方法を用いることにより、神経叢を可視化することができる。図５ｃは、マウスの摘出大腸（正常粘膜組織）を、クルクミンにより漿膜側から生体染色し、共焦点レーザー顕微鏡で観察することにより得られた画像である。この図より、筋層内アウエルバッハ神経叢が陽性に染色されることが示される。すなわち、クルクミンは、神経細胞体を濃く、また神経線維を薄く染色することから、ネットワーク状構造としてアウエルバッハ神経叢を可視化していることが理解される。アウエルバッハ神経叢は自律神経系に属し、神経細胞体とそれらを結合する神経線維から成り立っている。
【００４１】
上記した筋層内アウエルバッハ神経叢の共焦点レーザー顕微鏡観察画像を強拡大したものが図５ｄである。この図により、神経細胞体をも識別できることが示される。神経細胞体について、クルクミンは細胞質のみを染色し、核は染色しないため、細胞質は陽性画像として、核は陰性画像として認識される。このことにより、神経細胞体の形態を正確に判定することができる。がん細胞は、（1）上皮と腺の層（図５ａ参照）で発生した後、それ以外の層に拡大し、移動する（この現象をがん細胞の浸潤という。）。浸潤するがん細胞は、血管や末梢神経に沿って移動する傾向があることが知られているが、クルクミンの生体染色により筋層内アウエルバッハ神経叢を可視化できるということは、がんの浸潤経路を可視化できるという結果を導き、がんの浸潤範囲の判断において有用である。
【００４２】
本発明の一実施態様において、筋層内アウエルバッハ神経叢を多光子レーザー顕微鏡で観察することができる。図５ｅは、クルクミンにより染色して、筋層内アウエルバッハ神経叢を可視化した図である。多光子レーザー顕微鏡画像では、多くの断層画像を重ね合わせできるため、アウエルバッハ神経叢のネットワーク構造をより広い範囲で可視化することができる。
【００４３】
本発明の一実施態様において、赤色１０６号により生体染色することにより、太い血管および平滑筋を可視化することができる。染色したマウスの摘出大腸（正常粘膜組織）を、多光子レーザー顕微鏡により漿膜側から（4）筋層（図５ａ参照）に焦点を当てて撮影した場合、平滑筋および血管壁が染色されていることが示される。
【００４４】
本発明の一実施態様において、赤色１０６号により染色した組織について、多光子レーザー顕微鏡により漿膜側から画像化し、腺構造および陰窩構造を可視化することができる。図５ｇは、（1）上皮と腺の層（図５ａ参照）に焦点を当てて撮影したものである。得られた画像より、結合組織および毛細血管が腺細胞の周囲を円周状に取り巻いて網の目状に走行していることから、規則的な腺構造および陰窩構造の分布パターンが可視化されている。この規則的な腺構造および陰窩構造の分布パターンは、正常な大腸の組織構造の大きな特徴であり、がんが発生すると、がんが存在する部位で、この腺構造および陰窩構造の形態における規則性が失われる。
【００４５】
上記のように、本発明の方法によってマウス大腸の正常粘膜組織を共焦点レーザーおよび多光子レーザー顕微内視鏡によって画像化すると、正常大腸の（1）上皮と腺の層、（2）粘膜筋板、（3）粘膜下層、（4）筋層、（5）漿膜の５層の構造について、クルクミンは、（1）上皮と腺の層の腺細胞を強く陽性に染色し、（2）粘膜筋板の平滑筋を強く陽性に染色し、（4）筋層の平滑筋を弱く陽性に染色し、また筋層内部のアウエルバッハ神経叢を強く陽性に染色することが判明した。一方、赤色106号は、（1）上皮と腺の層の腺構造を取り囲む毛細血管の網の目構造を強く陽性に染色し、（2）粘膜筋板の平滑筋を弱く陽性に染色し、（4）筋層の平滑筋を弱く陽性に染色し、また筋層内部の太い血管の壁を強く陽性に染色することが判明した。これらの生体染色剤による正常大腸の５層構造および主な細胞構築の可視化は、以下に述べるがんの浸潤範囲の判定において極めて有用な手がかりを与える。すなわち、上記の正常構造が正常の部位に存在しないという所見および正常構造の場合には存在しない細胞が存在するという所見の組み合わせによって、がんの存在を判定することができる。
【００４６】
図８を参照しながら、がんの局所浸潤および転移による進行度判定ならびに治療方針を説明する。がんは、一般的に、腺底部に存在する細胞で、正常であっても細胞分裂および増殖を行なう未分化な細胞が、図１に示される段階的な遺伝子変異を起こし、細胞分裂および増殖が異常に亢進することが原因で発生すると考えられている。がん細胞が上皮細胞の外に出ない段階は、上皮内がん０期、または超早期がんと定義される。がん細胞は、発生した局所において、上皮細胞が本来存する領域を超えて増殖するが、がん細胞が粘膜筋板を超えていない段階は、１期または早期がんと定義される。がん細胞が、粘膜筋板を超えて、粘膜下層および筋層に浸潤した段階は、２〜３期と定義される。がん細胞が、発生した局所の組織や臓器を超えて、他の臓器に転移した段階は、４期と定義される。一般的に、治療法は、０〜１期においては内視鏡によるがん組織の除去が、また２〜３期においては外科手術によるがん組織の除去が、また４期では化学療法および放射線療法ならびに免疫療法が主体となる。ここで本発明の有用性は、２〜３期のがんについて、外科手術によるがん組織の除去または切除を行なう場合、生体染色およびレーザー内視鏡を用いることにより、漿膜側から、がん細胞の浸潤範囲およびがん組織を除去または切除すべき領域を判定するための支援画像データを提示することにある。
【００４７】
進行がんの局所浸潤において、がん細胞は、平滑筋層の内部または粘膜下層の結合組織において、血管や神経に沿って、び慢性に拡散する（図９を参照）。この現象を、がん細胞の局所浸潤という。この局所浸潤の範囲を正確に判定することは、現行の肉眼による精査や触診による組織の硬さの変化などの方法では、極めて困難である。
【００４８】
しかしながら、大腸がんマウスのがん腫瘍部を、漿膜側からクルクミンで染色し、共焦点レーザー顕微鏡により漿膜側から観察することにより、がん細胞の存在を明瞭に視認することができる。図１０Ａを参照すると、平滑筋層の内部に、クルクミン染色陽性の大型の細胞が、び慢性に多数散在している。これらの細胞は、浸潤したがん細胞であると判断される。また、クルクミン染色により、これらの細胞の細胞質は周辺組織より濃く染色されて陽性画像として認識されるため、これらの細胞はがん細胞であると判断される。すなわち、正常の場合には存在するはずのない細胞が、存在するはずがない場所に存在するという所見によって、これらの細胞ががん細胞であると判断される。図１０Ｂを参照すると、血管ならびに平滑筋層およびその内部に浸潤したがん細胞が観察される。血管の周囲に一部のがん細胞が集合していることから、がん細胞は、血管に沿って移動し、浸潤する性質を持つことが示唆される。
【００４９】
図１１Ａおよび図１１Ｂは、大腸がんマウスのがん腫瘍部を、管腔側からクルクミンで染色し、多光子レーザー顕微鏡により管腔側から撮影した写真である。これらの写真から、がん細胞は、細胞質が強く陽性に染色され、また核は陰性に染色されることが示された。この結果、がんの構造異型と細胞異型とを識別することができる。
【００５０】
図１２は、大腸がんマウスのがん腫瘍部を、漿膜側から赤色106号で染色し、多光子レーザー顕微鏡により漿膜側から撮影した写真および進行がん浸潤の模式図である。正常組織では、陰窩構造が規則的に分布していることが確認できる。一方、がん組織では、陰窩構造の規則的な分布が消失しており、がんであると判定することができる。すなわち、正常構造が正常の場所にないという理由から、この部位にがん細胞が存在すると判断される。
【００５１】
本発明の一実施態様において、クルクミンによる生体染色後、レーザー顕微鏡により筋層内アウエルバッハ神経叢を可視化することができる。図１６は、マウス大腸を漿膜側からクルクミンにより生体染色を行った後、筋層内アウエルバッハ神経叢をレーザー顕微鏡により可視化した例である。図１６に基づけば、クルクミン染色により、神経細胞体を識別することができる。クルクミンは、神経細胞体において、細胞質のみを染色し、核は染色しないため、細胞質は陽性画像として、また核は陰性画像として視認され、神経細胞体の形態を正確に判定することができる。なお、がん細胞は、（1）上皮と腺の層（図５ａを参照）で発生した後、それ以外の層に拡大し、移動するが（これをがん細胞の浸潤という。）、その場合、血管や末梢神経に沿って移動する傾向があることが知られている。このため、クルクミンの生体染色により筋層内アウエルバッハ神経叢を可視化できるということは、がんの浸潤経路を可視化できるということを示し、がんの浸潤範囲を判断する上で有用である。また、早期がんおよび進行がんの判定が可能となる。
【００５２】
本発明の一実施態様において、クルクミンによる生体染色後、レーザー顕微鏡により筋層内自律神経叢（マイスナー神経叢）を可視化することができる。図１７は、マウス大腸を漿膜側からクルクミンにより生体染色を行った後、マイスナー神経叢をレーザー顕微鏡により可視化した例である。図１７に基づけば、クルクミン染色により、神経細胞体を識別することができる。マイスナー神経叢は粘膜下層に存在し、１個〜数個の神経細胞が集団を形成する。クルクミンは、神経細胞体において、細胞質のみを染色し、核は染色しないため、細胞質は陽性画像として、また核は陰性画像として視認され、神経細胞体の形態を正確に判定することができる。
【００５３】
図１８を参照して説明する。がんは、一般的に、粘膜上皮細胞から生じるので、原発巣は必然的に粘膜上皮内部にとどまっている。がん組織が発育すると、粘膜上皮内部から深部に向かってがん細胞が浸潤する。がん細胞が、粘膜筋板およびマイスナー神経叢にまだ浸潤または到達していない場合、がんは、早期がんと判定される。一方、がん細胞がマイスナー神経叢および平滑筋層に浸潤または到達している場合、がんは進行がんと判定される。
【００５４】
本発明に基づいて、様々な生体組織を可視化することができる。図１９は、マウスにクルクミンを腹腔内投与することにより生体染色を行った後、膵臓の外分泌細胞およびランゲルハンス島をレーザー顕微鏡により可視化した図である。図１９は、さらに、膵臓組織のヘマトキシリン・エオジン（ＨＥ）染色像を示す。その結果、細胞の大きさおよび配列により、外分泌細胞およびランゲルハンス島（破線内）の内分泌細胞を区別することができる。内分泌細胞は小型で、数十個がクス玉状に集合し、その内部は毛細血管に富むことが分かる。外分泌細胞は、内分泌細胞より大型で、細胞内に多数の分泌顆粒を持ち、数個ずつが房状に集合している。無菌化クルクミン溶液の腹腔投与により、膵臓のランゲルハンス島が可視化できることから、内分泌領域において、糖尿病やインスリノーマの診断に用いることができる。
【００５５】
図２０〜２２は、マウス舌粘膜上にクルクミンを塗布することにより生体染色を行った後、味覚の感覚装置である味蕾をレーザー顕微鏡により可視化した図である。図２０および２１は、さらに、味蕾のヘマトキシリン・エオジン染色像を示す。感覚神経細胞の核はクルクミンで染色されないため、黒い陰性画像として認識される。クルクミンを口腔粘膜上に塗布することにより、味の感覚装置である味蕾の神経細胞を可視化することができることから、耳鼻科領域において、味覚障害の検査が可能になる。
【００５６】
図２３および２４は、マウスにクルクミンを腹腔内投与することにより生体染色を行った後、網膜神経細胞群をレーザー顕微鏡により可視化した図である。これらの図には、網膜組織のヘマトキシリン・エオジン染色像が含まれる。図より、網膜神経細胞群およびシナプスを可視化できることが示された。クルクミンを、経口投与または硝子体内注射することによっても、膜神経細胞群およびシナプスの可視化が可能である。眼科領域において、例えば糖尿病性網膜症、黄斑変性、網膜変性、増殖性硝子体網膜症、緑内障および浮腫網膜芽細胞腫のステージ判断が可能になる。
【００５７】
さらに、クルクミンにより、嗅神経線維（図２５）および匂いの感覚細胞である嗅覚受容神経細胞（図２６）の染色が可能であり、レーザー顕微鏡により可視化することができる。図２６には、ヘマトキシリン・エオジン染色像が含まれる。クルクミンにより、嗅覚受容神経細胞の細胞質および匂い受容体を持つ繊毛が陽性に染色され、核は無染色であるため黒い陰性画像として視認される。クルクミンを鼻腔粘膜上に塗布することにより、匂いの感覚細胞である嗅覚受容神経細胞を可視化することができるため、嗅覚障害の検査が可能になる。
【００５８】
本発明の一実施態様において、クルクミンによる生体染色後、レーザー顕微鏡により甲状腺を可視化することができる（図２７）。甲状腺のクルクミン生体染色により、小胞の構造が染色される。甲状腺は種々の大きさの球形の小胞（follicles）によって形成されている。これらの小胞は、単層の扁平または立方上皮で縁取られ、ヘマトキシリン・エオジン染色により、内腔がエオジンにより均等に染まるコロイドで満たされている。小胞の周囲は密な毛細血管の網で取り囲まれていることが分かる。
【００５９】
本発明の一実施態様において、クルクミンを筋膜上に塗布することにより生体染色を行った後、レーザー顕微鏡により、骨格筋のアクチン・ミオシン横紋、核および筋線維を可視化することができる（図２８）。無菌化クルクミン溶液を筋膜上に塗布することにより、骨格筋の筋線維およびアクチン分子を可視化することができるため、筋力低下・フレイル症候群の形態学的な光バイオプシ診断に応用することができる可能性が示される。
【００６０】
本発明の一実施態様において、クルクミンをリンパ節上に塗布することにより生体染色を行った後、レーザー顕微鏡により、リンパ節の二次小節の明中心と暗殻の構造を可視化することができる（図２９）。明中心においては、大型の明るい核を持つ細胞が多数見られる。これらの細胞は、細網細胞および細胞分裂中の大型のリンパ球である。暗殻は、明中心で増殖した小リンパ球が明中心の周囲に集積した構造を持つ。無菌化クルクミン溶液の表面塗布により、リンパ節内部の細胞構造が可視化することができるため、泌尿器科領域および消化管外科領域において、腹腔鏡ロボット手術時に、がんのリンパ節転移の有無の判別が可能になる。
【００６１】
本発明の一実施態様において、クルクミンを腹腔内投与した後、レーザー顕微鏡により、海馬ＣＡ３野において錐体細胞の細胞体を可視化することができる（図３０）。大脳皮質においては、血管および錐体細胞の細胞体を可視化することができる（図３１）。小脳においては、血管およびプルキン細胞の細胞体を可視化することができる（図３２）。本発明を用いることにより、脳組織の変性を伴うアルツハイマー病、脳梗塞、脳出血、くも膜下出血、脊髄小脳変性症などの検査が可能になる。
【００６２】
本発明により、すべての臓器において、組織における細胞の形態、相対的な位置および配列、ならびに組織内の細胞数が、正常組織との比較において、変化または変動する疾患を、判定または診断をすることができる。該疾患には、がん、糖尿病、糖尿病性網膜症、黄斑変性、網膜変性、味覚障害、嗅覚障害、アルツハイマー病、脳梗塞など、上記に例示される疾患が含まれるが、それらに限定されない。一方、細胞の機能のみが変化または変動する疾患、例えば統合失調症は、本発明によって判定または診断をすることができない。
【００６３】
本発明の方法は、がんの存在が疑われる臓器の漿膜側から組織染色およびレーザー照射を行うことにより、手術前または手術中における患部切除前に、がん組織を視覚化できることが特徴である。実際の外科手術では、がん細胞の存在位置または浸潤範囲を視覚化した上で、臓器の切除部位、すなわちがん組織辺縁をマーキングすることが術者に対する大きな支援となる。このためには、がん細胞の存在位置または浸潤範囲を漿膜上に着色することが好ましい。かかる着色には、周知の手術用生体マーキングとして、手術用糸やテープを用いてもよく、マーキング色素を使用することもできる。手術用生体マーキング色素としては、例えば、スルホブロモフタレインナトリウム、インドシアニングリーン、フルオロレインナトリウム、メチレンブルー、インジゴカルミン、トルイジンブルー、ピオクタニンブルーなどが挙げられる。これらのマーキング色素は、増粘剤として、例えばカルボキシメチルセルロースナトリウム、ヒアルロン酸ナトリウム、アラビアゴムなどと混合することにより、組織付着性を高めることができる。
【００６４】
レーザー照射における先端プローブとしては、直径20 mm程度の通常の対物レンズに加えて、直径5 mm程度のスティック型対物レンズおよび直径0.3〜2 mm程度のニードル型対物レンズを使用することができる。
【００６５】
がん治療のための外科手術時において、がん細胞が検出されたことを術者に通知することは、術者に対してがん治療を成功に導く支援方法として有用である。かかる通知は、術者に対して音または光により行うことが可能である。特に、レーザー顕微鏡により撮像された画像を、予めデータベースに蓄えられたがん組織画像と照合することにより、がん組織の存在を通知するシステムは、がん組織の取り残しを防止する手段として好ましい。
【００６６】
上記の試験における試験条件、すなわち、細胞染色液の調製、使用動物、大腸がんモデルマウス作製法およびレーザー照射の条件は、下記のとおりである。
〔細胞染色液の調製〕
クルクミン（東京化成、カタログ番号C2302、純度97.0％）100 mgをエタノール5 mLに懸濁し、さらにエタノールで10倍希釈した。これを同量のグリセリンと混合し、さらにグリセリンで10倍希釈した。この混合液を同量の精製水と混合し、クルクミン染色液とした。赤色１０６号については、その粉末を生理的食塩水で１mg/mLに溶解した溶液を、染色液とした。
〔動物〕
試験には、日本エスエルシー株式会社から購入したC57BL/6Nマウスを用いた。性別は雄、８週齢、体重２０〜２５グラムのマウスを用いてすべての試験を行った。
〔大腸がんモデルマウス作製法〕
大腸がんモデルマウスは、C57BL/6Nマウスに、生理食塩水で溶解したアゾキシメタン（azoxymethane, AOM）10 mg/kgを週１回間隔で４回腹腔投与して作製した。
〔レーザー照射の条件〕
多光子レーザー顕微鏡はオリンパス社製FVMPE-RSを用い、照射波長は800 nmとした。レーザー照射は、フルパワー出力の5.8〜48.2％の出力で行った。共焦点レーザー顕微鏡はオリンパス社製FV1000を用い、照射波長は488nmおよび594nmとした。488nmのレーザー照射は、フルパワー出力の15〜29.4％の出力で、また594nmのレーザー照射は、フルパワー出力の13〜13.5％の出力で行った。照射の方向および漿膜側または内腔側からの染色については、図中に記載した。
【００６７】
本発明の一実施態様において、がん検査装置２０１は、図１４に示すように、レーザー発振器２１３と、ビーム径調節器２１５と、二次元走査器２１７と、ダイクロイックミラー２１９と、対物レンズ２２１と、集光深さ調節器２２３と、光検出器２２５と、蛍光画像生成部２２７と、モニター２２９と、制御部２３１とを備える。
【００６８】
レーザー発振器２１３としては、パルス幅が数十〜数百フェムト秒、パルスの繰り返し周波数が数十〜数百ＭＨｚの範囲でパルスレーザー光の出力を調節できるものが用いられる。
【００６９】
ビーム径調節器２１５は、制御部２３１からのビーム径調節信号に応じて、パルスレーザー光のビーム径を変化させるビームエクスパンダである。
【００７０】
二次元走査器２１７は、例えば、２枚のガルバノミラーにより構成され、パルスレーザー光の集光位置を光軸に対して垂直な２軸方向に変化させる。
【００７１】
ダイクロイックミラー２１９は、パルスレーザー光の照射により生体細胞のがん関連遺伝子産物において発生する蛍光を分離する。
【００７２】
対物レンズ２２１は、レーザー発振器２１３から出射されたパルスレーザー光を生体細胞に集光させる一方、多光子吸収現象によりがん関連遺伝子産物において発生した蛍光を集光する。なお、対物レンズ２２１は、制御信号に基づいて集光深さ調節器２２３によって光軸方向へ移動可能となっており、集光位置を調節することができる。
【００７３】
光検出器２２５は、がん関連遺伝子産物において発生した蛍光を検出し、蛍光強度に応じた電気信号に変換する。
【００７４】
二次元走査器２１７の走査状態および集光深さ調節器２２３の調節位置(深さ方向の位置)は、集光位置の座標を表すパラメータとなり、蛍光画像生成部２２７は、これら座標を表すパラメータと光検出器２２５から送られた電気信号（すなわち蛍光強度）とを対応付けて記憶し、これらのデータを処理して、蛍光画像を生成する。生成された蛍光画像は、モニター２２９上に表示される。
【００７５】
制御部２３１は、動作制御部２３３と、検査用パルス強度設定部２３５と、照射範囲設定部２３９と、照射時間設定部２４１とを含む。動作制御部２３３は、レーザー発振器２１３、ビーム径調節器２１５、二次元走査器２１７、集光深さ調節器２２３の動作を制御する。
【００７６】
検査用パルス強度設定部２３５は、検査を行うために、がん関連遺伝子発現パターンの蛍光画像を取得するのに適した強度のパルスレーザー光強度を設定する。
【００７７】
照射範囲設定部２３９は、生体細胞にパルスレーザー光を照射する範囲の設定を行う。そして、動作制御部２３３が、二次元走査器２１７や集光深さ調節器２２３の動作を制御することによって、設定された照射範囲および深さにパルスレーザー光を照射し、集光させる。照射時間設定部２４１は、生体細胞にパルスレーザー光を照射する時間の設定を行う。そして、動作制御部２３３がレーザー発振器２１３の出力を制御することによって、設定された時間だけ、パルスレーザー光を照射させる。
【００７８】
一実施態様において、制御部２３１は、記憶部５１および判定部５２を有している。すなわち、がん検査装置２０１は、撮像で得られた画像の生体細胞群の染色状態に基づき、生体細胞群のがん化の悪性度レベルや予後をリアルタイムで判定する。
【００７９】
このがん検査装置２０１では、生体細胞群のがん関連遺伝子発現パターンの染色状態に基づき、がん化の悪性度レベルを判定するので、生体細胞群のがん化を早い段階で把握することができる。また、がん化の悪性度レベルをがん関連遺伝子の発現状態で把握できるので、がん患者の予後を知ることができる。
【００８０】
なお、このがん検査装置２０１は、治療用パルス強度設定部２３７を備え、治療を行うために生体細胞を破壊するに十分な強度のパルスレーザー光強度を設定することができる。これにより、発見したがん細胞集団に対して、早期にがん治療を行うことができる。
【００８１】
その他、がん検査装置２０１は、様々な形態で使用することができる。
【００８２】
例えば、図１５に示されるように、レーザー光照射ヘッド２４３内に、ビーム径調節器２１５、二次元走査器２１７、ダイクロイックミラー２１９と対物レンズ２２１とその間の光路から構成される光学系、集光深さ調節器２２３とを設けるとともに、患者を載せるための患者固定台２４５と移動装置２４７とをさらに設け、がん検査を行うことができる。
【００８３】
また、例えば、患者から生体細胞群の一部を削り取り、削り取った生体細胞群をトレー（試料台）に入れた状態で、がん検査装置２０１を用いて撮像を行い、がん化の悪性度レベルを判定してもよい。この場合、生体細胞群への染色剤４５の塗布は、生体細胞群を削り取る前に行ってもよいし、生体細胞群を削り取った後、撮像する前に行ってもよい。さらに外科手術時にリアルタイムで正確にがん患部を切り取るため、または正確に切り取ったことを示す、切除後のがん検査装置としても活用することができる。外科手術用に用いる場合には、外科手術を行う部位を特定するために、予め通常の内視鏡、ＣＴ、Ｘ線撮像などでｃｍ単位での正確な位置が把握されている。外科手術時に本発明のがん検査装置を併用することで、正確にがん組織と正常組織との境界線を把握することができ、がんの根治的切除を可能としながら組織の摘出範囲を最小限にすることができるため、がん摘出手術を受ける患者負担は大幅に軽減される。
【００８４】
具体的には、図８〜図１３の模式図および撮像画を用いて説明されるように、予めクルクミン等により染色し、モニター２２９で確認することができるが、さらに警報部よりブザーなどの音、フラッシュおよびカラーライトなどの光で通知することもできる。この場合の効果は、進行がんの中心部より、正常細胞と早期がん部分の境界を、画像により明確に確定できることである。蛍光強度、蛍光色、細胞(核や陰窩等)の形状から早期がん細胞であるか、正常細胞であるか、神経細胞であるか、血管であるか、またはノイズであるかを、瞬時に判断できるため、前述したように、がん組織辺縁をマーキングすることによって、術者に対して大きな支援を与えることができる。この場合に、手術用生体マーキングとして、手術用糸またはテープを用いてもよいし、マーキング色素を使用してもよいが、図１４の２２１の対物レンズと連動したマーキング色素用ノズルを設けることは特に有用である。また、レーザー照射強度を上げて、がん組織周縁輪郭を部分的に焦がす、または破線状に蒸散させることも有効である。
【００８５】
周縁部を決定するに際しては、がん検査装置２０１の対物レンズを含む可動部を、Ｘ−Ｙ方向にがん中心部周縁部を含む距離を移動させ、最も蛍光密度の低くなる点をマーキングする。その後、可動部の角度を例えば５度程度回転させて同様な移動掃引を繰り返し行うことにより、進行がん含む切除されるべき最外周の周縁部をマーキングすることができる。
【００８６】
上記した様に、本発明は、外科医が術中に即座に病理診断するために必要な、組織および細胞の識別方法を提供することにより、がんの根治的切除を可能としながら組織の摘出範囲を最小限にすることができる。その結果、がん摘出手術を受ける患者負担が大幅に軽減される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５ａ】
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【図５ｂ】
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【図５ｃ】
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【図５ｄ】
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【図５ｅ】
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【図５ｆ】
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【図５ｇ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【国際調査報告】
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