(57)【要約】本発明は、標的分子を特異的に認識する医薬の有効性を高精度に評価する方法を提供することを課題とする。標的分子に関する情報を得る工程（Ｐ）を含み、さらに、標的関連分子に関する情報を得るための工程（Ａ）、被験体の前記医薬の血中濃度を測定するための工程（Ｂ）、および前記医薬の到達細胞率を計測する工程（Ｃ）から選択される少なくとも１つの工程を含む（但し、工程（Ａ）のみ、および工程（Ｂ）のみを除く）評価方法により医薬の治療効果を評価することができる。
2019131727.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
標的分子を特異的に認識する医薬の評価方法であって、前記標的分子に関する情報を求める工程（Ｐ）を含み、さらに、
下記工程（Ａ）、（Ｂ）および（Ｃ）から選択される少なくとも１つの工程（但し、工程（Ａ）のみ、および工程（Ｂ）のみを除く）を含む、医薬の評価方法。
（Ａ）標的関連分子に関する情報を得る工程
（Ｂ）被験体における前記標的分子を特異的に認識する医薬の血中濃度を測定する工程
（Ｃ）前記標的分子を特異的に認識する医薬の到達細胞率を算出する工程
【請求項２】
前記標的関連分子に関する情報が、標的関連分子の発現量に関する情報および標的関連分子の局在に関する情報の少なくとも一方を含む、請求項１に記載の医薬の評価方法。
【請求項３】
前記標的分子に関する情報が標的分子の発現量に関する情報および標的分子の局在に関する情報の少なくとも一方を含む、請求項１または２に記載の医薬の評価方法。
【請求項４】
前記標的分子が、ＨＥＲ２、ＣＴＬＡ４、ＥＧＦＲ、ＰＤ−１、ＰＤＧＦＲＡ、ＰＤ−Ｌ１、ＶＥＧＦ、またはＶＥＧＦＲである、請求項１〜３のいずれか一項に記載の抗体医薬の評価方法。
【請求項５】
前記標的分子を特異的に認識する医薬が抗体医薬である請求項１〜４のいずれか一項に記載の医薬の評価方法。
【請求項６】
前記工程（Ｃ）が、ＥＬＩＳＡを用いて抗体医薬の血中濃度を定量化する工程である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の医薬の評価方法。
【請求項７】
前記標的分子を特異的に認識する医薬が核酸医薬である請求項１〜４のいずれか一項に記載の医薬の評価方法。
【請求項８】
前記標的分子が、ＰＤＧＦ−Ｂ、Ｃ５、ＭＣＰ−１、ＳＤＦ−１、Ｈｅｐｃｉｄｉｎ、ＲＴＰ８０１、Ｎｕｃｌｅｏｃａｐｓｉｄ、トランスサイレチン、またはＨＳＰ４７である、請求項７に記載の医薬の評価方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、医薬を評価する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
がんの治療薬としては従来から低分子医薬品が広く用いられてきたが、近年ではより血漿中での安定性が高く、選択性や治療効果が高く副作用の少ない抗体医薬が数多く開発され、臨床に用いられている。中でもＩｇＧ型の抗体医薬は多数上市されており、これらはがん細胞に発現している抗原に上記ＩｇＧが結合すると、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）、シグナル伝達の変化等により抗がん活性を発揮するという作用機序を有する。このようながん治療のための抗体医薬としては、これまでＣＤ２０抗原に対するリツキサン、ＥＧＦＲ抗原に対するセツキシマブ、ＨＥＲ２抗原に対するハーセプチン等が承認されている。【０００３】
また、特定の標的分子と結合するという、抗体と類似の性質を有するアプタマー医薬も注目されており、標的分子を特異的に認識する医薬はがん治療のための有効な手段と考えられている。【０００４】
標的分子を特異的に認識する医薬の有効性を判定する方法としては、標的となるがん細胞上の標的分子と医薬との相互作用等の情報を特定することが望まれる。例えば、乳がん治療における代表的な抗体医薬であるトラスツズマブ（ハーセプチン（Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ）登録商標）の有効性の判定方法として、トラスツズマブの標的分子（抗原）であるＨＥＲ２タンパク質の発現情報の解析が広く行われており、その方法としては、例えば、標的生体物質のタンパク質を染色する免疫組織染色〔Immunohistochemistry；ＩＨＣ〕法および、標的生体物質遺伝子を染色するＦＩＳＨ〔Fluorescence in situ hybridization〕法などが用いられている。乳がんの検査においてＩＨＣ法を用いる場合には、検体に含まれるＨＥＲ２タンパク質をＤＡＢ（3,3'-Diaminobenzidine；３，３’−ジアミノベンジジン）を用いて染色して検出する方法が広く用いられている。しかし、その判定基準は染色レベルをスコア０〜３とした４段階のみによる大雑把な判定基準であるため、定量性に欠けており、さらに病理医の熟練度により判定基準が左右されることから、臨床的に問題となっている。また、ＦＩＳＨ法を用いる場合には、１７番染色体上のＨＥＲ２タンパク質をコードする遺伝子を検出するプローブを用いて当該遺伝子を蛍光染色する方法が広く用いられている。ＦＩＳＨ法は定量的検査法ではあるが、ＨＥＲ２タンパク質の量や細胞内局在を直接評価する方法ではない。【０００５】
近年、タンパク質の発現量や細胞内局在をより正確に評価するため、ナノサイズの蛍光粒子、例えば樹脂等を母体として蛍光色素や量子ドットなどの蛍光体を集積させた粒子（蛍光体集積粒子、Phosphor Integrated Dot：ＰＩＤ）を用いて目的タンパク質を標識する染色方法が提案され、実用化が進められている。蛍光体集積粒子（他の文献において「蛍光体集積ナノ粒子」、「蛍光体内包粒子」等と呼ばれることもある。）を用いて目的タンパク質を標識し、粒子内に集積している蛍光体に適合する励起光を照射することで目的タンパク質を輝度の高い輝点として観察することが可能であり、また褪色しにくいため比較的長時間にわたって観察や撮像が可能となる。特許文献１、特許文献２には、蛍光体集積粒子を用いた免疫染色を行う方法が記載されている。【０００６】
さらに特許文献３には、蛍光体集積粒子により標識化した抗体医薬である抗体（トラスツズマブ等）を用い、その標的とする抗原（ＨＥＲ２等）に結合させることで行う、組織染色法が記載されており、さらにこのような方法が抗体医薬の有効性を判定する方法に応用できることが記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】国際公開第２０１３／０３５７０３号
【特許文献２】国際公開第２０１２／０２９７５２号
【特許文献３】国際公開第２０１２／１３３０４７号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、上記に鑑みてなされたものであり、標的分子を特異的に認識する医薬（以下、医薬Ｘともいう）の有効性を高精度に評価する方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者は、標的分子に関する情報、標的関連分子に関する情報、医薬Ｘの血中濃度、および医薬Ｘの到達細胞率などを組み合わせて解析を行うことにより、医薬Ｘの治療効果を評価できることを見出した。【００１０】
すなわち、本発明は次のような医薬の評価方法を提供する。【００１１】
[項１]
標的分子を特異的に認識する医薬の評価方法であって、前記標的分子に関する情報を求める工程（Ｐ）を含み、さらに、
下記工程（Ａ）、（Ｂ）および（Ｃ）から選択される少なくとも１つの工程（但し、工程（Ａ）のみ、および工程（Ｂ）のみを除く）を含む、医薬の評価方法。
（Ａ）標的関連分子に関する情報を得る工程
（Ｂ）被験体における前記標的分子を特異的に認識する医薬の血中内濃度を測定する工程
（Ｃ）前記標的分子を特異的に認識する医薬の到達細胞率を算出する工程【００１２】
[項２]
前記標的関連分子に関する情報が、標的関連分子の発現量に関する情報および標的関連分子の局在に関する情報の少なくとも一方を含む、項１に記載の医薬の評価方法。【００１３】
[項３]
前記標的分子に関する情報が標的分子の発現量に関する情報および標的分子の局在に関する情報の少なくとも一方を含む、項１または２に記載の医薬の評価方法。【００１４】
[項４]
前記標的分子が、ＨＥＲ２、ＣＴＬＡ４、ＥＧＦＲ、ＰＤ−１、ＰＤＧＦＲＡ、ＰＤ−Ｌ１、ＶＥＧＦ、またはＶＥＧＦＲである、項１〜３のいずれか一項に記載の医薬の評価方法。【００１５】
[項５]
前記標的分子を特異的に認識する医薬が抗体医薬である項１〜４のいずれか一項に記載の医薬の評価方法。【００１６】
[項６]
前記工程（Ｃ）が、ＥＬＩＳＡを用いて抗体医薬の血中濃度を定量化する工程である、項１〜５のいずれか一項に記載の医薬の評価方法。【００１７】
[項７]
前記標的分子を特異的に認識する医薬が核酸医薬である項１〜４のいずれか一項に記載の医薬の評価方法。【００１８】
[項８]
前記標的分子が、ＰＤＧＦ−Ｂ、Ｃ５、ＭＣＰ−１、ＳＤＦ−１、Ｈｅｐｃｉｄｉｎ、ＲＴＰ８０１、Ｎｕｃｌｅｏｃａｐｓｉｄ、トランスサイレチン、またはＨＳＰ４７である、項７に記載の医薬の評価方法。
【発明の効果】
【００１９】
本発明の評価方法により、医薬Ｘの治療効果を予測・評価することができ、医薬Ｘを用いた診断または治療のための有用な情報を取得できるようになり、投与適応患者をより正確に選定することが可能となり、また適切な投薬計画を構築することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】図１は実験例１で行ったトラスツズマブの血中濃度の測定結果をプロットしたグラフである。高濃度群の結果はそれぞれ黒丸で示され低濃度群の結果はそれぞれ白丸で示されている。
【図２】図２は検体をトラスツズマブ血中濃度に基づき高濃度群および低濃度群に分け、さらに高濃度群についてＨＥＲ３高発現群およびＨＥＲ３低発現群に分け、それぞれの群においてＨＥＲ２＋細胞の割合とトラスツズマブ到達細胞率をプロットしてグラフ化したものである。実線（太）が血中濃度高−ＨＥＲ３低発現群における線形近似曲線、実線（細）が血中濃度高−ＨＥＲ３高発現群における線形近似曲線、点線が血中濃度低濃度群における線形近似曲線を示す。
【図３】図３は各検体におけるトラスツズマブの到達細胞率とトラスツズマブの治療スコアをプロットし、線形近似によりグラフ化したものである。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
＜標的分子を特異的に認識する医薬＞
本発明における標的分子を特異的に認識する医薬（医薬Ｘ）は、タンパク質などの特定の分子を標的として認識する仕組みを利用した医薬であり、典型的な例として抗体医薬、核酸医薬、ペプチドアプタマーなどが挙げられる。中でも被験体血中での安定性が高いことから、核酸医薬、または抗体医薬が好ましく、抗体医薬がより好ましい。
【００２２】
本発明における抗体医薬は、抗原を認識する抗体（免疫グロブリン）を主成分とする医薬品である。本明細書における「抗体」という用語には、全長の抗体だけでなく、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ）’２、Ｆｖ、ｓｃＦｖなどの抗体断片およびキメラ抗体（ヒト化抗体等）、多機能抗体、Ａｎｔｉｂｏｄｙ−Ｄｒｕｇ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ（ＡＤＣ）などの誘導体が包含される。
【００２３】
本発明における核酸医薬は、天然型または化学修飾型ヌクレオチドを基本骨格とする医薬であり、遺伝子発現を介さずに直接生体に作用し、化学合成により製造されることを特徴とする。本発明に適応可能な核酸医薬は核酸アプタマー、デコイ、アンチセンス、ｓｉＲＮＡ、リボザイム、ｍｉＲＮＡ−ｍｉｍｉｃなどがあげられるが、標的分子であるタンパク質を特異的に認識できることから核酸アプタマーが好ましい。
【００２４】
アプタマーは、核酸（ＤＮＡまたはＲＮＡ）アプタマーとペプチドアプタマーに大別することができ、本発明では核酸アプタマー、ペプチドアプタマーのいずれであっても用いることができるが、アプタマー医薬開発に際してオリゴ核酸が入手容易であることから、核酸アプタマーが好ましい。
【００２５】
＜医薬Ｘの評価方法＞
本発明は、医薬Ｘの評価方法であって、標的分子に関する情報を得る工程（Ｐ）を含み、さらに、標的関連分子に関する情報を得るための工程（Ａ）、被験体の前記医薬Ｘの血中濃度を測定するための工程（Ｂ）、および医薬Ｘの前記到達細胞率を計測する工程（Ｃ）から選択される少なくとも１つの工程を含む。ただし本発明においては、工程（Ａ）のみ、および工程（Ｂ）のみを行う様態のものは含まれない。
【００２６】
工程（Ｐ）および工程（Ａ）は医薬Ｘ投与前の被験体に由来する検体に対して行われる工程であり、それぞれ同一の検体（組織切片等）に対して行われることが好ましい。工程（Ｂ）および工程（Ｃ）は医薬Ｘ投与後の被験体に由来する検体に対して行われる工程である。なお、各工程における検体は同一の被験体に由来する検体である。換言すると工程（Ｐ）および工程（Ａ）を行うための検体を採取した医薬Ｘ投与前の被験体に医薬Ｘを投与した後、工程（Ｂ）および工程（Ｃ）を行うための検体を採取する。
【００２７】
本発明における工程（Ｐ）、工程（Ａ）および、工程（Ｃ）は、それぞれ標的分子、標的関連分子、医薬Ｘを「定性的」ではなく「定量的」に観察できるという観点から、蛍光体集積粒子（ＰＩＤ）を用いた染色法により行うことが好ましく、特に医薬Ｘが抗体医薬である場合には免疫染色法により行うことが好ましい。具体的には標的分子、標的関連分子、抗体医薬を特異的に認識して結合するＩｇＧに、ＰＩＤを結合させたものを用いて免疫染色を行ってもよいし、標的分子、標的関連分子、抗体医薬を特異的に認識して結合するＩｇＧおよび抗体を特異的に認識して結合するＩｇＧにＰＩＤを結合させたものを用いて免疫染色を行ってもよい。
【００２８】
工程（Ｐ）、工程（Ａ）および、工程（Ｃ）のうち複数の工程においてＰＩＤを用いた免疫染色を行う場合、各工程においてはそれぞれ異なる波長の蛍光を発するＰＩＤを用いることが好ましい。
【００２９】
本発明における被験体はヒト（がん患者またはがんの罹患が疑われる者）であってもよいし、またヒト以外の動物であってもよい。ヒト以外の動物としては、例えば実験動物、典型的には担腫瘍動物、好ましくは担腫瘍マウスを用いることができる。担腫瘍マウスとして具体的には、ヒトから採取したがん細胞または腫瘍組織を獲得免疫不全マウスに移植することにより作製する、ＰＤＸ［Patient derived xenograft］モデルマウス、Ｉｍｍｕｎｏ−ａｖａｔａｒモデルマウス、造血リンパ系ヒト化［Hemato-lymphoid humanized］モデルマウス、Ｉｍｍｕｎｅ−ＰＤＸモデルマウスや、被験体から採取した腫瘍細胞に由来する培養細胞を獲得免疫不全マウスに移植することにより作製する、ＣＤＸ［Cell-line derived xenograft］モデルマウスなどが挙げられる。
【００３０】
前記担腫瘍マウスは、ヒト（がん患者）から採取した腫瘍（がん）組織または腫瘍細胞、あるいは患者から取り出した腫瘍細胞に由来する培養細胞が移植された第０世代の実験動物、およびそのような第０世代に移植された腫瘍組織または腫瘍細胞を起源とする、第ｎ−１世代の実験動物の体内で生長した腫瘍組織または増殖した腫瘍細胞が移植された第ｎ世代（ｎ≧１）の実験動物を包含する。
【００３１】
なお、本発明において評価の対象となる医薬Ｘは特に限定されるものではないが、適応疾患としてがんが含まれるものが好ましく、すでに上市され、臨床において用いられている医薬Ｘでもよいし、または臨床試験や治験において用いられる候補医薬としての医薬Ｘでもよい。
【００３２】
例えば抗体医薬の上市品として具体的には、ヒト化抗ＨＥＲ２抗体トラスツズマブ（ハーセプチン（登録商標））、抗ＣＤ３０モノクローナル抗体ブレンツキシマブ、抗ＶＥＧＦモノクローナル抗体ベバシズマブ、ヒト化抗ＣＤ３３抗体ゲムツズマブ、ヒト化抗ＰＤ−１抗体ペムブロリズマブとニボルマブ、抗ＣＴＬＡ−４イピリムマブモノクローナル抗体等が挙げられる。
【００３３】
核酸アプタマー医薬としては具体的には、ＰＤＧＦ−Ｂを標的とするＥ１００３０（Ｆｏｖｉｓｔａ（登録商標））、Ｃ５を標的とするＡＲＣ１９０５（Ｚｉｍｕｒａ（登録商標））、ＭＣＰ−１を標的とするＮＯＸ−Ｅ３６（Ｅｍａｏｔｉｃａｐ  Ｐｅｇｏｌ）、ＳＤＦ−１を標的とするＮＯＸ−Ａ１２（Ｏｌａｐｔｅｓｅｄ  Ｐｅｇｏｌ）、Ｈｅｐｃｉｄｉｎを標的とするＮＯＸ−Ｈ９４（Ｌｅｚａｐｔｅｉｄ  Ｐｅｇｏｌ等が挙げられる。
【００３４】
ｓｉＲＮＡ医薬としては具体的には、ＲＴＰ８０１を標的とするＰＦ−６５５、Ｎｕｃｌｅｏｃａｐｓｉｄを標的とするＡＬＮ−ＲＳＶ０１、ＨＳＰ４７を標的とするＮＤ−Ｌ０２−ｓ０２０１等が挙げられる。
【００３５】
＜工程（Ｐ）＞
本発明において工程（Ｐ）は、腫瘍組織由来の検体における標的分子に関する情報を得る工程であり、標的分子の発現量に関する情報および標的分子の局在に関する情報の少なくとも一方を含むことが好ましく、両方を含むことがより好ましい。前記標的分子の発現量に関する情報としては、例えば検体（組織スライド）における、標的分子を発現している細胞の種類・数・形態、検体における標的分子の単位面積あたりまたは１細胞あたりの発現量、標的分子の細胞あたりの発現量とそれに対応する細胞数によって表されるヒストグラムや曲線、などが挙げられる。前記標的分子の局在に関する情報としては、検体中における標的分子の局在、特定細胞群（例えば、がん細胞群）の注目領域内(ROI：region of interest) における局在などが挙げられる。これらの情報は、画像（デジタル画像として変換されたものを含む）として取得された情報に基づく情報であることが好ましく、さらに定量的なものであることが好ましい。発現状態の情報は上記のいずれか一つだけでなく、複数が組み合わされたものであってもよい。
【００３６】
本明細書において標的分子は、医薬Ｘの標的となる生体分子であり、典型的には医薬Ｘの構成成分である抗体や核酸等と特異的に結合するタンパク質（抗原）である。標的分子は腫瘍組織に存在し得るタンパク質であれば特に限定されず、例えば、免疫系タンパク質、がん細胞増殖因子，転移制御因子、血管増殖因子、サイトカイン、がん細胞増殖制御因子受容体、転移制御因子受容体、血管増殖因子受容体、およびサイトカイン受容体が挙げられ、好ましくシグナル伝達経路に関与する分子であることが好ましく、増殖シグナル伝達経路に関与する分子であることがより好ましい。本発明において標的分子としては、具体的には例えば、ＨＥＲ２、ＣＴＬＡ４、ＥＧＦＲ、ＰＤ−１、ＰＤＧＦＲＡ、ＰＤ−Ｌ１、ＶＥＧＦ、またはＶＥＧＦＲ等が挙げられる。また、医薬Ｘが核酸医薬である場合には、標的分子としては、具体的には例えば、ＰＤＧＦ−Ｂ、Ｃ５、ＭＣＰ−１、ＳＤＦ−１、Ｈｅｐｃｉｄｉｎ、ＲＴＰ８０１、Ｎｕｃｌｅｏｃａｐｓｉｄ、トランスサイレチン、またはＨＳＰ４７等が挙げられる。
【００３７】
＜工程（Ａ）＞
本発明における工程（Ａ）は、腫瘍組織由来の検体を用いて標的関連分子に関する情報を得る工程であり、標的関連分子の発現量に関する情報および標的関連分子の局在に関する情報の少なくとも一方を含むことが好ましく、両方を含むことがより好ましい。前記工程（Ａ）は前記工程（Ｐ）で用いた検体と同じものを用いてもよいし、別のものを用いてもよいが、好ましくは前記工程（Ｐ）で用いた検体を用いて工程（Ａ）を行うことが好ましい。
【００３８】
なお、本発明の医薬Ｘの評価方法において工程（Ａ）は上記工程（Ｐ）と、後述する工程（Ｂ）および工程（Ｃ）の少なくとも一方、好ましくは両方と、組み合わせて行われる。
【００３９】
前記標的関連分子の発現量に関する情報としては、例えば検体（組織スライド）における、標的関連分子を発現している細胞の種類・数・形態、検体における標的関連分子の単位面積あたりまたは１細胞あたりの発現量、標的関連分子の細胞あたりの発現量とそれに対応する細胞数によって表されるヒストグラムや曲線、などが挙げられ、標的関連分子の局在に関する情報としては、検体中における標的関連分子の局在、特定細胞群（例えば、がん細胞群）の注目領域内(ROI：region of interest) における局在などが挙げられる。これらの情報は、画像（デジタル画像として変換されたものを含む）として取得された情報に基づく情報であることが好ましく、さらに定量的なものであることが好ましい。発現状態の情報は上記のいずれか一つだけでなく、複数が組み合わされたものであってもよい。
【００４０】
本明細書において標的関連分子は、典型的には腫瘍細胞において標的分子が関与しているシグナル伝達経路に関与する分子であり、具体的には以下のように選択される。標的分子としてＨＥＲ２を選択するとき、標的関連分子は、ＨＥＲ３、ＥＧＦ、ＧＲＢ２、ＨＲＡＳ、ＫＲＡＳ、ＣＴＮＮＢ１、ＰＩＫ３ＣＡ、ＰＴＰＮ１１、ＥＧＦＲ、ＧＲＢ７、およびＢＴＣから選択されることが好ましい。標的分子としてＣＴＬＡ４を選択するとき、標的関連分子は、ＣＤ８６、ＣＤ８０、ＦＯＸＰ３、ＦＹＮ、ＰＴＰＮ１１、ＬＣＫ、ＮＦＡＴＣ２、ＡＫＴ１、ＩＣＯＳＬＧ、およびＬＹＮから選択されることが好ましい。標的分子としてＥＧＦＲを選択するとき、標的関連分子は、ＥＧＦ、ＫＲＡＳ、ＨＲＡＳ、ＧＲＢ２、ＳＨＣ１、ＴＰ５３、ＣＢＬ、ＰＩＫ３ＣＡ、ＴＧＦＡ、およびＰＴＰＮ１１から選択されることが好ましい。標的分子としてＰＤ−１を選択するとき、標的関連分子は、ＣＤ２７４、ＰＤＣＤ１ＬＧ２、ＨＬＡ−ＤＲＢ５、ＨＬＡ−ＤＲＡ、ＰＴＰＮ１１、ＰＴＰＮ６、ＨＬＡ−ＤＲＢ１、ＬＣＫ、ＣＤ４、およびＣＤ３Ｅから選択されることが好ましい。標的分子としてＰＤＧＦＲＡを選択するとき、標的関連分子は、ＰＤＧＦＡ、ＰＤＧＦＣ、ＰＩＫ３Ｒ１、ＳＴＡＴ３、ＣＲＫＬ、ＣＲＫ、ＰＤＧＦＢ、ＳＴＡＴ１、ＰＴＰＮ１１、およびＧＲＢ２から選択されることが好ましい。標的分子としてＰＤ−Ｌ１を選択するとき、標的関連分子は、ＰＤＣＤ１、ＰＴＰＮ１１、ＰＤＣＤ１ＬＧ２、ＬＣＫ、ＣＤ３Ｅ、ＣＤ４、ＨＬＡ−ＤＲＢ１、ＨＬＡ−ＤＰＢ１、ＨＬＡ−ＤＲＡ、およびＣＤ３Ｇから選択されることが好ましい。標的分子としてＶＥＧＦを選択するとき、標的関連分子は、ＦＬＴ１、ＫＤＲ、ＨＩＦ１Ａ、ＦＬＴ４、ＥＧＦ、ＴＨＢＳ１、ＩＧＦ１、ＨＧＦ、ＴＧＦＢ１、およびＰＩＫ３ＣＡから選択されることが好ましい。標的分子としてＶＥＧＦＲを選択するとき、標的関連分子は、ＶＥＧＦＣ、ＶＥＧＦＡ、ＣＤＨ５、ＦＩＧＦ、ＮＲＰ１、ＦＧＦ２、ＰＩＫ３ＣＡ、ＰＩＫ３ＣＢ、ＣＲＫ、およびＮＯＳ３から選択されることが好ましい。
【００４１】
＜工程（Ｂ）＞
本発明における工程（Ｂ）は、被験体の前記医薬Ｘの血中濃度を測定する工程である。
【００４２】
なお、本発明の医薬Ｘの評価方法において工程（Ｂ）は上記工程（Ｐ）と、工程（Ａ）および工程（Ｃ）の少なくとも一方、好ましくは両方と、組み合わせて行われる。
【００４３】
測定方法は特に限定されず、一般的な方法を用いることができ、被験体から採取した血液から遠心分離等により分離した血漿を検体として用い、測定された血漿内濃度を血中濃度とみなすことで、より正確な血中濃度を得ることができる。
【００４４】
前記医薬Ｘが抗体医薬である場合は、ＥＬＩＳＡを用いることが好ましい。
前記医薬Ｘが核酸医薬である場合は、核酸が相補鎖と二本鎖を形成する特性を利用するハイブリダイゼーション法を用いることが好ましい。核酸アプタマーの場合、核酸アプタマーの半分の配列と相補的な配列を固定用プローブ、残りの半分の配列を検出用プローブとして用いて、核酸アプタマーをハイブリダイゼーションさせることにより、その濃度を求める。
【００４５】
＜工程（Ｃ）＞
本発明における工程（Ｃ）は、医薬Ｘの到達細胞率を算出する工程である。
【００４６】
前記医薬Ｘの到達細胞率の算出は、組織内に取り込まれた医薬Ｘを可視化することにより行われることが好ましい。例えば、抗体医薬を投与した被験体から採取した、該抗体医薬の適応疾患に係る病変部（例えば腫瘍部）の組織から作製した組織切片を検体とした、蛍光体集積粒子（ＰＩＤ）を用いた免疫染色法により行われることが好ましい。例えば、抗体医薬として用いられる抗体を特異的に認識して結合する二次抗体にＰＩＤを直接的または間接的に結合させたものを用いて染色することができ、具体的にはヒト化抗ＨＥＲ２抗体であるトラスツズマブを抗体医薬として用いる場合には抗ヒトＩｇＧ抗体にＰＩＤを結合させたものを用いて染色を行うことで組織内のトラスツズマブを染色することができる。また、ヒトＨＥＲ２を認識する核酸アプタマーを核酸医薬として用いる場合には、核酸アプタマーに相補的な配列を有する核酸プローブにＰＩＤを結合させたものを用いて染色することができ、または第一生体物質を結合させた前記核酸プローブと、前記第一生体物質を特異的に認識して結合する第二生体物質にＰＩＤを直接的または間接的に結合させたものとを用いて染色することができる。
【００４７】
さらに、前記蛍光体集積粒子（ＰＩＤ）によって染色した検体に対してさらに明視野観察用の染色を行うことで、検体中の細胞数を併せて測定することができる。明視野観察用染色方法としては特に限定されないが、典型的にはヘマトキシリン・エオジン染色（ＨＥ染色）が行われる。このような明視野観察用染色を行う場合は、免疫染色工程の後に行うようにしてもよいし、免疫染色工程の前に行うようにしてもよい。細胞数の計測はソフトウェア等を用いてデジタル的に計測してもよいし、また目視で計測してもよい。このように検体全体または単位面積（または体積）に含まれる、トラスツズマブが染色された細胞数および全細胞数を計測することで、そこから全細胞数に対する輝点が観察された細胞数（抗体医薬が到達した細胞）の割合、すなわち抗体医薬の到達細胞率を算出することができる。また、抗体医薬が到達した細胞における、一細胞あたりの輝点数を併せて算出してもよい。
【００４８】
（検体）
本発明の評価方法は、以下のような検体を用いて、被験体の生体外において実施される。
【００４９】
工程（Ｂ）において用いられる検体（本明細書においては検体（ｉ）とする）は、医薬Ｘを投与された被験体の血液に由来するものであり、常法に従って採取した被験体の血液に対し遠心分離または科学的処理を行うことで分離した血漿であることが好ましい。検体（ｉ）は、さらに工程（Ｂ）で行う測定方法に従い適宜処理を行われたものであることが好ましく、また保存や測定の最適化のために適当な添加剤等を含んでいてもよい。
【００５０】
工程（Ｐ）、工程（Ａ）において用いられる検体（本明細書においては検体（ｉｉ）とする）、および工程（Ｃ）において用いられる検体（本明細書においては検体（ｉｉｉ）とする）とは、被験体から採取された組織切片や、被験体から採取された組織に含まれる細胞を培養した細胞であって、一般的には、免疫染色法により目的タンパク質の発現量を評価する場合などで慣用されているような、前記組織切片や細胞を載置した標本スライドの形態をとることが好ましい。なお、本明細書においては組織切片を載置した標本スライドを特に組織スライドと称する。
【００５１】
検体（ｉｉ）は医薬Ｘ投与前の被験体に由来する。
検体（ｉｉｉ）は医薬Ｘ投与後の被験体に由来する。
【００５２】
前記検体は、好ましくは病変組織由来、特に腫瘍組織由来である。「腫瘍組織」は、被験体から常法にしたがって採取した、がん細胞を含む組織であって、がん細胞に加えて、例えば正常細胞、血管、間質細胞（線維芽細胞、内皮細胞、白血球（リンパ球、単球、好中球、好酸球、好塩基球）等）等が含まれ得る。
【００５３】
「腫瘍」は、典型的には固形腫瘍（がん）であり、特に限定されるものではないが、例えば、細胞腫、黒色腫、肉腫、脳腫瘍、頭頸部がん、胃がん、肺がん、乳がん、肝がん、大腸がん、子宮頸がん、前立腺がん、膀胱がんなどの固形がん、白血病、リンパ腫、および多発性骨髄腫、などが挙げられる。
【００５４】
なお、「腫瘍組織由来の検体」とは、腫瘍を有する（または腫瘍を有する疑いのある）被験体の病変部から採取された腫瘍組織切片やがん細胞塊、または前記被験体から採取された腫瘍組織に含まれる腫瘍細胞を培養した細胞であり、好ましくは上述したような標本スライドの形態をとる。「腫瘍組織由来の検体」が腫瘍組織切片である場合、該検体には腫瘍組織に加えて周辺の正常組織も含まれ得る。本明細書においては腫瘍組織由来の検体中における腫瘍組織(がん細胞)を含む領域を「腫瘍領域」と称する。
【００５５】
組織切片および標本スライドの作製法は特に限定されず、一般的には、例えば、被験体から採取した組織を、ホルマリン等を用いて固定し、アルコールで脱水処理した後、キシレン処理を行い、高温のパラフィン中に浸すことでパラフィン包埋を行うことで作製した組織試料を３〜４μｍの切片にすることで得ることができ、該組織切片をスライドガラス上に載置して乾燥することで標本スライド（組織スライド）を作製することができる。
【００５６】
（免疫染色）
上述したように本発明における工程（Ｐ）、工程（Ａ）は、蛍光体集積粒子（ＰＩＤ）を用いた免疫染色法によりおこなわれることが好ましい。また、医薬Ｘが抗体医薬である場合、工程（Ｐ）、工程（Ａ）だけでなく、工程（Ｃ）も蛍光体集積粒子（ＰＩＤ）を用いた免疫染色法によりおこなわれることが好ましい。以下、本発明における実施態様の1例として、腫瘍組織由来の検体、具体的には腫瘍組織切片から作製した組織スライドを使用して、ＰＩＤを用いた免疫染色法の一例についてさらに詳細に説明する。
【００５７】
（１．標本スライド前処理工程）
（１−１．脱パラフィン処理）
キシレンを入れた容器に、切片を浸漬させ、パラフィン除去する。温度は特に限定されるものではないが、室温で行うことができる。浸漬時間は、３分以上３０分以下であることが好ましい。また必要により浸漬途中でキシレンを交換してもよい。
【００５８】
次いでエタノールを入れた容器に切片を浸漬させ、キシレン除去する。温度は特に限定されるものではないが、室温で行うことができる。浸漬時間は、３分以上３０分以下であることが好ましい。また必要により浸漬途中でエタノールを交換してもよい。
【００５９】
水を入れた容器に、切片を浸漬させ、エタノール除去する。温度は特に限定されるものではないが、室温で行うことができる。浸漬時間は、３分以上３０分以下であることが好ましい。また必要により浸漬途中で水を交換してもよい。
【００６０】
（１−２．賦活化処理）
公知の方法に倣い、目的物質の賦活化処理を行う。賦活化条件に特に定めはないが、賦活液としては、０．０１Ｍのクエン酸緩衝液（ｐＨ６．０）、１ｍＭのＥＤＴＡ溶液（ｐＨ８．０）、５％尿素、０．１Ｍのトリス塩酸緩衝液などを用いることができる。加熱機器はオートクレーブ、マイクロウェーブ、圧力鍋、ウォーターバスなどを用いることができる。温度は特に限定されるものではないが、室温で行うことができる。温度は５０〜１３０℃、時間は５〜３０分で行うことができる。
【００６１】
次いでＰＢＳを入れた容器に、賦活化処理後の切片を浸漬させ、洗浄を行う。温度は特に限定されるものではないが、室温で行うことができる。浸漬時間は、３分以上３０分以下であることが好ましい。また必要により浸漬途中でＰＢＳを交換してもよい。
【００６２】
（２．免疫染色工程）
免疫染色工程では、目的物質（例えば工程（Ｐ）における標的分子）を染色するために、目的物質に直接的または間接的に結合しうる部位を有する蛍光体集積粒子を希釈液に分散させた染色液を、組織切片に載せて、目的物質との反応を行う。
【００６３】
例えば、［アビジン］−［蛍光体集積粒子］を含有した染色液を用いる実施形態の場合、最初に一次抗体の溶液を組織スライドに滴下する処理を行い、次に二次抗体−ビオチン結合体の溶液を組織切片に滴下する処理を行い、最後にＰＩＤ染色液剤を組織切片に滴下する処理を行えばよい。このとき、染色後においては目的物質と蛍光体集積粒子とが、［目的物質］…［目的物質に対する一次抗体］…［一次抗体に対する抗体（二次抗体）］−［ビオチン］／［アビジン］−［蛍光体集積粒子］（ここで“…”は抗原抗体反応により結合していることを表し、“−”は必要に応じてリンカー分子を介していてもよい共有結合により結合していることを表し、“／”はアビジン・ビオチン反応により結合していることを表す。）となる。
【００６４】
免疫染色工程を行う上での条件、例えば組織スライドに染色液を滴下して反応させる際の温度および時間、組織スライドの洗浄時間などは、従来の免疫染色法に準じて、適切なシグナルが得られるよう適宜調整することができる。
【００６５】
温度は特に限定されるものではないが、室温で行うことができる。反応時間は、３０分以上２４時間以下であることが好ましい。
【００６６】
上述したような１次反応処理を行う前に、ＢＳＡ含有ＰＢＳなど公知のブロッキング剤やＴｗｅｅｎ２０などの界面活性剤を滴下することが好ましい。
【００６７】
（３．標本後処理工程）
免疫染色工程を終えた組織スライドは、観察に適したものとなるよう、固定化・脱水、透徹、封入などの処理を行うことが好ましい。
【００６８】
固定化・脱水処理は、組織スライドを固定処理液（ホルマリン、パラホルムアルデヒド、グルタールアルデヒド、アセトン、エタノール、メタノール等の架橋剤）に浸漬すればよい。透徹は、固定化・脱水処理を終えた組織スライドを透徹液（キシレン等）に浸漬すればよい。封入処理は、透徹処理を終えた組織スライドに封入液を滴下すればよい。これらの処理を行う上での条件、例えば組織スライドを所定の処理液に浸漬する際の温度および浸漬時間は、従来の免疫染色法に準じて、適切なシグナルが得られるよう適宜調整することができる。
【００６９】
（４．任意工程）
本発明の一実施形態として工程（Ｃ）を行わない場合においても、もしも必要であれば、明視野観察用の染色を行うことができる。明視野観察用染色方法としては特に限定されないが、典型的にはヘマトキシリン・エオジン染色（ＨＥ染色）が行われる。形態観察染色工程を含める場合は、免疫染色工程の後に行うようにしてもよいし、免疫染色工程の前に行うようにしてもよい。
【００７０】
（５．評価工程）
（５−１．観察・撮影）
観察・撮影工程では、所望の倍率における顕微鏡の同一視野において、免疫染色工程に用いられた目的物質を蛍光標識している蛍光体集積粒子に対応した励起光それぞれを標本サンプルに照射し、それらの蛍光体集積粒子から発せられた蛍光による免疫染色像それぞれを観察・撮影する。これらの励起光は、例えば、蛍光顕微鏡が備える超高圧水銀灯、Ｘｅランプ、ＬＥＤ（light emitting diode）、レーザー装置等の光源と、必要に応じて所定の波長を選択的に透過させる励起光用光学フィルターを用いることで照射することができる。互いに異なる蛍光体集積粒子を含む複数の染色液をもちいて免疫染色を行なったときは、それぞれの蛍光体集積粒子に対応した複数種類のフィルターセットを切り替えながら観察を行なう。免疫染色像の撮影は、例えば、蛍光顕微鏡が備えるデジタルカメラによって行うことができる。免疫染色像の撮影の際には、必要に応じて所定の波長を選択的に透過させる蛍光用光学フィルターを用いることで、目的とする蛍光のみを含み、目的としない蛍光やノイズとなる励起光およびその他の光を排除した免疫染色像を撮影することができる。
【００７１】
（５−２．画像処理・シグナル計測）
画像処理・計測工程では、目的物質に関して撮影された免疫染色像について、画像処理に基づき、目的物質に対応する蛍光標識シグナルに対応する蛍光標識シグナルを計測し、細胞膜の領域内にある前記目的生体物質に対応する蛍光標識シグナルを特定する。蛍光標識シグナルは、蛍光の輝点数として扱うことが好ましい。
【００７２】
画像処理に用いることができるソフトウェアとしては、例えば「ＩｍａｇｅＪ」（オープンソース）が挙げられる。このような画像処理ソフトウェアを利用することにより、免疫染色像から、所定の波長（色）の輝点を抽出してその輝度の総和の算出、所定の輝度以上の輝点の数の計測、複数の画像を重ね合わせる処理、画像に含まれる細胞数を計測する処理などを半自動的に、迅速に行うことができる。
【００７３】
また、輝点は蛍光体集積粒子１個に由来するので、大きさが一定であり顕微鏡観察で認識できる。大きさが一定値（例；観測される蛍光体集積粒子の平均値）より大きなシグナルは凝集輝点と判断する。この輝点と凝集輝点は、ソフトウェアを用いて半自動的に迅速に区別することができる。
【００７４】
（抗体）
本発明の評価方法における各工程において上述したような免疫染色を行う場合、用いる抗体は特異性の観点からモノクローナル抗体が好ましく用いられる。抗体を産生する動物（免疫動物）の種類は特に限定されるものではなく、従来と同様、マウス、ラット、モルモット、ウサギ、ヤギ、ヒツジなどから選択すればよい。
【００７５】
また前記抗体は、検出の目的となる物質（例えば工程（Ｐ）においては標的タンパク質）を特異的に認識して結合する能力を有するものであれば、天然の全長の抗体でなく、抗体断片または誘導体であってもよい。
【００７６】
（医薬Ｘが核酸医薬である場合の組織染色）
医薬Ｘが核酸医薬である場合、本発明における工程（Ｃ）は、核酸プローブ試薬を用いた染色法（ＦＩＳＨ）によりおこなわれることが好ましい。以下、本発明における実施態様の1例として、腫瘍組織由来の検体、具体的には腫瘍組織切片から作製した組織スライドを使用して、核酸プローブ試薬を用いた染色法の一例についてさらに詳細に説明するが、染色の方法は特に限定されず、公知の方法を用いることができる。
【００７７】
（１．核酸プローブの調製）
目的とする核酸医薬に対して相補的な配列を有する核酸分子であれば、ＤＮＡでもＲＮＡでもよく、また効率的にハイブリダイズするように配列の長さも適宜選択することができる。
【００７８】
（２．第１生体分子が結合した核酸プローブの調製）
第１生体分子を核酸分子に結合させる方法としては、第１生体分子を有する核酸基質を使用した、ＰＣＲラベリング法、ニックトランスレーション法、ランダムプライム法を使用することができる。ＰＣＲラベリング法では、核酸分子を鋳型として第１生体分子（例；ビオチン等）で標識された核酸基質（例；ｄＵＴＰ−ビオチン等）を使用したＰＣＲを行うことで核酸分子を第１生体分子で標識することができる。ニックトランスレーション法では、第１生体分子で標識された核酸基質（例；ｄＵＴＰ−ビオチン等）を使用してニックトランスレーションを行うことにより核酸分子を第１生体分子で標識することができる。または、ランダムプライム法では、長さの異なるプライマーを鋳型となる核酸分子に２本鎖を形成させて、これにクレノー酵素を第１生体分子で標識された核酸基質（例；ｄＵＴＰ−ビオチン）等の存在下で作用させることにより、核酸分子を第１生体分子で標識することができる。
【００７９】
第一生体分子としては低分子であるビオチン・FITC・Cy5・DNP・DIG等のハプテンを挙げることができる。
【００８０】
（３．脱パラフィン処理工程）
キシレンまたはその他の脱パラフィン剤を入れた容器に検体スライド上の組織切片を浸漬させ、パラフィンを除去する。このときの温度は特に限定されるものではないが、室温で行うことができる。浸漬時間は、３分以上３０分以下であることが好ましい。また、必要により浸漬途中でキシレンを交換してもよい。次いで、エタノールを入れた容器に該切片を浸漬させ、キシレンを除去する。温度は特に限定されるものではないが、室温で行うことができる。浸漬時間は、３分以上３０分以下であることが好ましい。また、必要により浸漬途中でエタノールを交換してもよい。次いで、水を入れた容器に該切片を浸漬させ、エタノールを除去する。温度は特に限定されるものではないが、室温で行うことができる。浸漬時間は、３分以上３０分以下であることが好ましい。また、必要により浸漬途中で水を交換してもよい。
【００８１】
（４．検体スライドの前処理）
プローブをハイブリダイゼーション反応に供する前に、前処理（加熱処理、酸処理）、酵素処理による処理など、プローブ試薬が効率的に組織切片上の核酸に到達できるようにするための前処理を施すことが知られている。これらの処理条件や組合せは、切片の種類・厚さ・スライド調整条件などにより、最適条件が異なるので、適宜手順を決定する必要がある。すべての処理を必ず実施する必要があるわけではなく、例えば酵素処理を実施しないという選択肢もありうる。
【００８２】
まず、公知の方法にならい、ＦＩＳＨを行う検体スライドの前処理を行う。前処理条件に特に定めはないが、例えば次のような手順で行うことができる。まず、検体スライドを塩酸（０．２ｍоｌ／Ｌ程度）に一定時間浸漬する。その後、水に浸漬し、さらに洗浄緩衝液（２×ＳＳＣ：ｓｔａｎｄａｒｄ  ｓａｉｌｉｎｅ  ｃｉｔｒａｔｅ）に浸漬して洗浄する。次に、加熱したＮａＳＣＮ溶液（例えば１Ｎ程度）に一定時間浸漬する。その後、水に浸漬し、さらに洗浄緩衝液に浸漬して洗浄し、これと同じ操作を２回繰り返す。また、前処理液として、上記のような２種類の溶液に変えて、０．０１Ｍクエン酸緩衝液（ｐＨ６．０）、１ｍＭＥＤＴＡ溶液（ｐＨ８．０）、５％尿素、０．１Ｍトリス塩酸緩衝液等を用い、加熱下に行うこともできる。加熱機器は、オートクレーブ、マイクロウェーブ、圧力鍋、ウォーターバス等を用いることができる。温度は特に限定されるものではないが、温度は５０−１３０℃、時間は５分以上３０分以下で行うことができる。
【００８３】
続いて、加水分解酵素（プロテアーゼ）を用いて、例えば以下のような手順で、細胞膜および核膜のタンパク質、特にコラーゲンを除去する酵素処理を行う。
【００８４】
まず、検体スライドをプロテアーゼ溶液に一定時間浸漬する。次いで、洗浄緩衝液に浸漬して洗浄し、この操作を２回繰り返す。
【００８５】
その後、検体スライドを風乾等により乾燥させる。なお、風乾に代えて７０〜１００％のエタノールを使用した公知の脱水処理を行ってもよい。
【００８６】
プロテアーゼとしては、タンパク質の加水分解に適したプロテイナーゼ、例えばペプシン、プロテイナーゼＫ等がしばしば使用される。なお、脱タンパク質の効率をどうするかは、ハイブリダイゼーション、すなわち、目的とする染色体との反応を最高にするプロテアーゼ濃度と分解時間との組合せを検討した上で、形態学的詳細(morphological detail)が損なわれないような条件設定で行われる。なお、最適の条件は組織型及び固定方法により異なる。また、プロテアーゼ処理後の付加的固定は有用である。
【００８７】
上記の酵素処理の後など必要であれば前処理の各ステップで、検体スライドを固定するため、例えば以下のような手順の処理を行う。まず、検体スライドをホルマリン溶液に一定時間浸漬する。次いで、洗浄緩衝液に浸漬して洗浄し、この操作を２回繰り返す。その後、検体スライドを風乾等により乾燥させる。
【００８８】
なお、固定処理は、通常、固定処理を全く実施せずに染色してみて、切片が剥がれたと思われる工程の後ろで固定処理を実施するプロセスとして追加し改善するため、全く実施しなくともよい場合もあれば、数か所で実施する場合もありうる。したがって、前処理以外の各ステップ以外のステップでも、必要に応じて核染色の前後で固定処理を実施しても構わない。例えば、ハイブリダイゼーションの前および/または後に検体の固定処理を行ってもよい。
【００８９】
（５．染色工程）
（５−１．ＤＮＡ変性処理）
上記の固定処理の後、切片上に存在するＤＮＡを変性する（二本鎖ＤＮＡから一本鎖ＤＮＡにする）ため、例えば以下のような手順の処理を行う。まず、検体スライドを変性溶液（ホルムアミド／ＳＳＣ溶液等）に７２℃程度で所定の時間、浸漬する。その後、検体スライドを取り出し、ホルムアミドを除去するため、濃度を徐々に高めた数段階のエタノール（例えば７０％エタノール水溶液、８０％エタノール水溶液および１００％エタノール）に浸漬する。その後、検体スライドを風乾等により乾燥させる。
【００９０】
（５−２．ハイブリダイゼーション処理）
目的の核酸医薬に対して相補的な配列を有する核酸分子（核酸プローブ）を含むプローブ試薬を用いて、公知のＦＩＳＨ（例えば「アジレントＦＩＳＨ Ｇｅｎｅｒａｌ ＰｕｒｐｏｓｅＲｅａｇｅｎｔｓプロトコル」や、「臨床ＦＩＳＨプロトコール―目で見る染色体・遺伝子診断法 (細胞工学別冊―実験プロトコールシリーズ」等）と同様に、ハイブリダイゼーション処理を行うことができる。ここで、用語「ハイブリダイゼーション」は、二本鎖分子の形成のための二本のＤＮＡ又はＤＮＡとＲＮＡ相補鎖の結合過程、または形成された２本鎖の分子を意味する。
【００９１】
上記ハイブリダイゼーションの１つの態様としては、先ず、核酸プローブと蛍光体集積粒子とが結合した複合体を含むプローブ試薬を用意し、該複合体をそれぞれ目的の核酸医薬に対して結合させるハイブリダイゼーションである。
【００９２】
上記ハイブリダイゼーションの別の１つの態様としては、核酸プローブ溶液と蛍光体集積粒子分散液とを分けて有するプローブ試薬を用意して核酸プローブのみを最初に目的の核酸医薬に対してハイブリダイゼーションさせた後に、ハイブリダイズした核酸プローブに結合している前記第一生体分子であるハプテンに対して抗ハプテン抗体を結合させ、さらに該抗体の結合している第二生体分子に対して、蛍光体ナノ粒子に結合している第三生体分子を結合させる、抗原抗体反応を介した動的なハイブリダイゼーションである。第二生体分子は第一生体分子と同様にハプテンから選択することができ、同じハプテンを選択することはこのましくない。  第三生体分子としては、例えば、高分子であるストレプトアビジン、アビジン、ニュートラアビジン等が挙げられる。このうち、ストレプアビジンを好適に用いることができる。
【００９３】
なお、ハイブリダイゼーションに使用する核酸分子の種類は１種に限定されず、２種以上でもよい。
【００９４】
また、目的の核酸医薬と相補鎖を形成した核酸プローブに対して蛍光体集積粒子をそれぞれ結合させることができれば、上記とは別のハイブリダイゼーションの態様であっても構わない。例えば、各結合（ハプテンー抗ハプテン抗体間の結合、前記プローブの第１生体分子−第２生体分子間の結合、第１結合基―第２結合基間の結合）、またはこれらの結合の組合せを利用して、核酸分子と蛍光体集積粒子とを直接にあるいは動的に結合してもよい。
【００９５】
（５−３．核染色処理）
ハイブリダイゼーション処理の後、通常はさらに、細胞数をカウントするための核染色処理を行う。核染色試薬としてはＤＡＰＩが一般的であるが、これ以外にもＨｏｅｃｈｓｔ ３３２５８、Ｈｏｅｃｈｓｔ ３３３４２などのビスベンズイミド誘導体やその他の核染色試薬を用いてもよい。例えば、核染色試薬としてＤＡＰＩを用いる場合は、次のような手順で核染色を行うことができる。まず、ハイブリダイゼーション処理を行った検体スライドを脱イオン水、リン酸液緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で順次洗浄する。次いで、ＤＡＰＩ染色試薬（２μｇ／ＰＢＳ）に一定時間浸漬する。
【００９６】
（５−４．封入処理）
ＦＩＳＨによる染色処理および核染色処理を終えた検体スライドは、ＰＢＳで数回洗浄し、風乾または脱水処理を行った後、組織切片上に封入剤を滴下し、カバーガラスを被せ、乾燥させる封入処理を行う。封入剤としては公知の油系封入剤（Entellan（登録商標）new等）または水系封入剤（Aquatex（登録商標）等）を使用することができる。以上の処理により作製された封入済みの検体スライドが、病理診断等を行うためのプレパラートとなる。
【００９７】
（６．観察工程）
（６−１．明視野観察）
明視野観察は、細胞または組織内の染色対象とする細胞器官の分布情報を取得するために必要に応じて行われる。明視野観察は、一般的な方法として、例えば、上記染色後、ヘマトキシリン・エオシン染色（ＨＥ染色）や前述したようなＤＡＰＩ染色を行った後に顕微鏡で観察を行うことが好ましい。
【００９８】
ＨＥ染色を行う場合、例えば、免疫染色した切片をマイヤーヘマトキシリン液で５分間染色してヘマトキシリン染色を行い、その後、該組織試料を４５℃の流水で３分間洗浄し、次に、１％エオシン液で５分間染色してエオシン染色を行う。
【００９９】
なお、形態観察染色に用いられるエオジンは、明視野において観察できるだけでなく、所定の波長の励起光を照射した時に自家蛍光も発するので、適切な波長および出力の励起光を染色された組織試料に照射することで、蛍光顕微鏡によっても観察できる。
【０１００】
一方、前記その他の染色として、例えば、乳がんにおけるＨＥＲ２タンパク質を検出対象の抗原として組織化学染色（ＤＡＢ染色等）をおこなった場合の明視野観察においては、適切な照明光の照射下で、光学顕微鏡の４倍対物レンズを使用して、検体組織内の癌細胞のＨＥＲ２タンパク陽性染色像、陽性染色の強度、陽性細胞率を観察する。次に対物レンズを１０倍に切り替え、陽性所見が細胞膜か細胞質に局在するかを確認し、必要に応じてさらに対物レンズ２０倍で検索する。
【０１０１】
（６−２．蛍光観察）
（免疫染色）の（５−２．画像処理・シグナル計測）と同様に実施することができる。
【０１０２】
（蛍光体集積粒子）
本発明における用いられる蛍光体集積粒子（ＰＩＤ）は、有機物または無機物でできた粒子を母体として、複数の蛍光体が母体内部に集積している（内包されている）および／または母体表面に吸着している構造を有する、ナノサイズの粒子である。蛍光体が母体に内包されている場合、蛍光体は母体内部に分散されていればよく、母体自体と化学的に結合していても、していなくてもよい。例えば、母体（例えば樹脂）と蛍光体が静電的相互作用により結合していてもよいし、共有結合していてもよい。
【０１０３】
なお、本明細書における「蛍光体」は、所定の波長の電磁波（Ｘ線、紫外線または可視光線）が照射されてそのエネルギーを吸収することで電子が励起し、その励起状態から基底状態に戻る際に余剰のエネルギーを電磁波として放出する、つまり「蛍光」を発する物質であって、生体物質認識物質（生体物質を特異的に認識可能な物質、例；ビオチン、アビジン、抗体等）と直接的、あるいは間接的に結合させることのできる物質を指す。また、「蛍光」は広義的な意味を持ち、励起のための電磁波の照射を止めても発光が持続する発光寿命の長い燐光と、発光寿命が短い狭義の蛍光とを包含する。
【０１０４】
蛍光体集積粒子を形作る母体のうち、有機物としては、メラミン樹脂、尿素樹脂、アニリン樹脂、グアナミン樹脂、フェノール樹脂、キシレン樹脂、フラン樹脂など、一般的に熱硬化性樹脂に分類される樹脂；スチレン樹脂、アクリル樹脂、アクリロニトリル樹脂、ＡＳ樹脂（アクリロニトリル−スチレン共重合体）、ＡＳＡ樹脂（アクリロニトリル−スチレン−アクリル酸メチル共重合体）など、一般的に熱可塑性樹脂に分類される樹脂；ポリ乳酸等のその他の樹脂；多糖を例示することができ、無機物としてはシリカ、ガラスなどを例示することができる。
【０１０５】
前記蛍光体としては半導体ナノ粒子や有機蛍光色素が好適に用いられる。半導体ナノ粒子としては、例えば、ＩＩ−ＶＩ族化合物、ＩＩＩ−Ｖ族化合物、またはＩＶ族元素を含有するものが挙げられ、具体的には、ＣｄＳｅ、ＣｄＳ、ＣｄＴｅ、ＺｎＳｅ、ＺｎＳ、ＺｎＴｅ、ＩｎＰ、ＩｎＮ、ＩｎＡｓ、ＩｎＧａＰ、ＧａＰ、ＧａＡｓ、Ｓｉ、Ｇｅなどが挙げられる。蛍光色素としては、例えば、ローダミン系色素分子、スクアリリウム系色素分子、シアニン系色素分子、芳香環系色素分子、オキサジン系色素分子、カルボピロニン系色素分子、ピロメセン系色素分子などが挙げられ、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標、インビトロジェン社製）系色素、ＢＯＤＩＰＹ（登録商標、インビトロジェン社製）系色素、Ｃｙ（登録商標、ＧＥヘルスケア社製）系色素、ＤＹ（登録商標、ＤＹＯＭＩＣＳ社製）系色素、ＨｉＬｙｔｅ（登録商標、アナスペック社製）系色素、ＤｙＬｉｇｈｔ（登録商標、サーモサイエンティフィック社製）系色素、ＡＴＴＯ（登録商標、ＡＴＴＯ−ＴＥＣ社製）系色素、ＭＦＰ（登録商標、Ｍｏｂｉｔｅｃ社製）系色素などを用いることができる。なお、このような色素の総称は、化合物中の主要な構造（骨格）または登録商標に基づき命名されており、それぞれに属する蛍光色素の範囲は当業者であれば過度の試行錯誤を要することなく適切に把握できるものである。
【０１０６】
蛍光体集積粒子に内包させる蛍光体の他の例としては、例えば、Ｙ2Ｏ3、Ｚｎ2ＳｉＯ4等を主成分とし、Ｍｎ2+，Ｅｕ3+等を賦活剤とする「長残光蛍光体」を挙げることができる。
【０１０７】
蛍光体集積粒子は、公知の方法（例えば特開２０１３−５７９３７号公報参照）に従って作製することができる。
【０１０８】
より具体的には、例えば、シリカを母体とし、その中に蛍光体が集積している蛍光体集積シリカ粒子は、無機半導体ナノ粒子、有機蛍光色素などの蛍光体と、テトラエトキシシランのようなシリカ前駆体とが溶解している溶液を、エタノールおよびアンモニアが溶解している溶液に滴下し、シリカ前駆体を加水分解することにより作製することができる。
【０１０９】
一方、樹脂を母体とし、蛍光体を樹脂粒子の表面に吸着させるか、樹脂粒子中に内包させるかした蛍光体集積樹脂粒子は、それらの樹脂の溶液ないし微粒子の分散液を先に用意しておき、そこに無機半導体ナノ粒子、有機蛍光色素などの蛍光体を添加して撹拌することにより作製することができる。あるいは、樹脂原料の溶液に蛍光色素を添加した後、重合反応を進行させることにより、蛍光体を内包した樹脂粒子を作製することもできる。例えば、母体となる樹脂としてメラミン樹脂のような熱硬化性樹脂を用いる場合、その樹脂の原料（モノマーまたはオリゴマーないしプレポリマー、例えばメラミンとホルムアルデヒドの縮合物であるメチロールメラミン）と、有機蛍光色素と、好ましくはさらに界面活性剤および重合反応促進剤（酸など）とを含有する反応混合物を加熱し、乳化重合法によって重合反応を進行させることにより、有機蛍光色素内包樹脂粒子を作製することができる。また、母体となる樹脂としてスチレン系共重合体のような熱可塑性樹脂を用いる場合、その樹脂の原料と、有機蛍光色素と（樹脂の原料モノマーとして、あらかじめ有機蛍光色素を共有結合などで結合させたモノマーを用いるようにしてもよい）、重合開始剤（過酸化ベンゾイル、アゾビスイソブチロニトリルなど）を含有する反応混合物を加熱し、ラジカル重合法またはイオン重合法によって重合反応を進行させることにより、有機蛍光色素内包樹脂粒子を作製することができる。
【０１１０】
蛍光体集積粒子の平均粒径は、標本スライドの免疫染色に適した粒径であれば特に限定されないが、輝点としての検出のしやすさなどを考慮すると、通常は１０〜５００ｎｍ、好ましくは５０〜２００ｎｍである。また、粒径のばらつきを示す変動係数は、通常は２０％以下であり、好ましくは５〜１５％である。このような条件を満たす蛍光体集積粒子は、製造条件を調整することにより製造することができる。例えば、乳化重合法により蛍光体集積粒子を作製する場合は、添加する界面活性剤の量によって粒径を調節することができ、一般的に、蛍光体集積粒子の母体原料の量に対する界面活性剤の量が相対的に多ければ粒径は小さくなり、その量が相対的に少なければ粒径は大きくなる傾向にある。
【０１１１】
なお、蛍光体集積粒子の粒径は、走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）を用いて電子顕微鏡写真を撮影して蛍光体集積粒子の断面積を計測し、その断面形状を円と仮定したときに、その断面積に相当する円の直径として算出することができる。複数の蛍光体集積粒子からなる集団の平均粒径および変動係数は、十分な数（例えば１０００個）の蛍光体集積粒子について上記のようにして粒径を算出した後、平均粒径はその算術平均として算出され、変動係数は式：１００×粒径の標準偏差／平均粒径、により算出される。
【実施例】
【０１１２】
以下、実施例に基づいて本発明の好適な態様をさらに具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されない。【０１１３】
［作製例１］
（ビオチン修飾ＩｇＧ抗体の作製）
５０ｍＭＴｒｉｓ溶液に、２次抗体として用いる抗ウサギＩｇＧ抗体（Gene Tex社： GTX40383）５０μｇを溶解した。この溶液に、最終濃度３ｍＭとなるようにＤＴＴ（ジチオトレイトール）溶液を添加、混合し、３７℃で３０分間反応させた。その後、反応溶液を脱塩カラム「Ｚｅｂａ  Ｄｅｓａｌｔ  Ｓｐｉｎ  Ｃｏｌｕｍｎｓ」（サーモサイエンティフィック社、Ｃａｔ．＃８９８８２）に通して、ＤＴＴで還元した２次抗体を精製した。精製した抗体全量のうち２００μＬを５０ｍＭＴｒｉｓ溶液に溶解して抗体溶液を調製した。その一方で、リンカー試薬「Ｍａｌｅｉｍｉｄｅ−ＰＥＧ２−Ｂｉｏｔｉｎ」（サーモサイエンティフィック社、製品番号２１９０１）を、ＤＭＳＯを用いて０．４ｍＭとなるように調整した。このリンカー試薬溶液８．５μＬを前記抗体溶液に添加、混合し、３７℃で３０分間反応させることにより、抗ウサギＩｇＧ抗体にＰＥＧ鎖を介してビオチンを結合させた。この反応溶液を脱塩カラムに通して精製した。脱塩した反応溶液について、波長３００ｎｍにおける吸光度を分光高度計（日立製「Ｆ−７０００」）を用いて測定することにより、反応溶液中のタンパク質（ビオチン修飾ＩｇＧ抗体）の濃度を算出し、５０ｍＭＴｒｉｓ溶液を用いて、ビオチン修飾抗ウサギＩｇＧ抗体の濃度を２５０μｇ／ｍＬに調整した。【０１１４】
また、抗ウサギＩｇＧ抗体の代わりに抗マウスＩｇＧ抗体（Abcam社：ab99601）を用いる以外は上記と同じ手法でビオチン修飾抗マウスＩｇＧ抗体を作製し、ビオチン修飾抗マウスＩｇＧ抗体の濃度を２５０μｇ／ｍＬに調整した。【０１１５】
［作製例２］
テキサスレッド色素分子「Ｓｕｌｆｏｒｈｏｄａｍｉｎｅ  １０１」（シグマアルドリッチ社）２．５ｍｇを純水２２．５ｍＬに溶解した後、ホットスターラーにより溶液の温度を７０℃に維持しながら２０分間撹拌した。撹拌後の溶液に、メラミン樹脂「ニカラックＭＸ−０３５」（日本カーバイド工業株式会社）１．５ｇを加え、さらに同一条件で５分間加熱撹拌した。撹拌後の溶液にギ酸１００μＬを加え、溶液の温度を６０℃に維持しながら２０分間攪拌した後、その溶液を放置して室温まで冷却した。冷却した後の溶液を複数の遠心用チューブに分注して、１２，０００ｒｐｍで２０分間遠心分離して、溶液に混合物として含まれるテキサスレッド色素内包メラミン樹脂粒子を沈殿させた。上澄みを除去し、沈殿した粒子をエタノールおよび水で洗浄した。得られた樹脂粒子の１０００個についてＳＥＭ観察を行い、上述のように平均粒子径を測定したところ、平均粒子径１５２ｎｍであった。このようにして作製されたテキサスレッド色素内包メラミン樹脂粒子を次の手順で表面修飾した。【０１１６】
得られた粒子０．１ｍｇをＥｔＯＨ１．５ｍＬ中に分散し、アミンプロピルトリメトキシシランＬＳ−３１５０（信越化学工業社製）２μＬを加えて８時間反応させて表面アミノ化処理を行なった。【０１１７】
次いで、上記表面アミノ化処理を行なった粒子をＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）を２ｍＭ含有したＰＢＳ（リン酸緩衝液生理的食塩水）を用いて３ｎＭに調整し、この溶液に最終濃度１０ｍＭとなるようＳＭ（ＰＥＧ）12（サーモサイエンティフィック社製、ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ−［（Ｎ−ｍａｌｅｉｍｉｄｏｐｒｏｐｉｏｎａｍｉｄｏ）−ｄｏｄｅｃａｅｔｈｙｌｅｎｅｇｌｙｃｏｌ］ｅｓｔｅｒ）を混合し、１時間反応させた。この混合液を１０，０００Ｇで２０分間遠心分離を行い、上澄みを除去した後、ＥＤＴＡを２ｍＭ含有したＰＢＳを加え、沈降物を分散させ、再度遠心分離を行った。同様の手順による洗浄を３回行うことでマレイミド修飾されたテキサスレッド集積メラミン粒子を得た。【０１１８】
一方、ストレプトアビジン（和光純薬社製）をＮ−ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ  Ｓ−ａｃｅｔｙｌｔｈｉｏａｃｅｔａｔｅ（ＳＡＴＡ）を用いてチオール基付加処理を行ったのち、ゲルろ過カラムによるろ過を行い、チオール修飾されたストレプトアビジンを得た。【０１１９】
上記のマレイミド修飾されたテキサスレッド集積メラミン粒子とチオール修飾されたストレプトアビジンとを、ＥＤＴＡを２ｍＭ含有したＰＢＳ中で混合し、室温で１時間反応させた。１０ｍＭメルカプトエタノールを添加し、反応を停止させた。得られた溶液を遠心フィルターで濃縮後、精製用ゲルろ過カラムを用いて未反応ストレプトアビジン等を除去し、得られたストレプトアビジン結合テキサスレッド集積メラミン粒子を回収した。得られたストレプトアビジン結合テキサスレッド集積メラミン粒子を蛍光体集積粒子用希釈液を用いて、０．０６ｎＭに希釈したものを実験例２、３における赤色ＰＩＤ染色液として使用した。【０１２０】
［作製例３］
作製例２に記載の手順に準じ、テキサスレッド色素分子「Ｓｕｌｆｏｒｈｏｄａｍｉｎｅ  １０１」（シグマアルドリッチ社）に代えてＦＩＴＣを用いることでＦＩＴＣ色素集積メラミン樹脂粒子を作製した。得られたストレプトアビジン結合ＦＩＴＣ集積メラミン樹脂粒子を蛍光体集積粒子用希釈液を用いて、０．０６ｎＭに希釈したものを実験例２、３における緑色ＰＩＤ染色液として使用した。【０１２１】
［作製例４］
作製例２に記載の手順に準じ、テキサスレッド色素分子「Ｓｕｌｆｏｒｈｏｄａｍｉｎｅ  １０１」（シグマアルドリッチ社）に代えて7-(Diethylamino)-３−Ｐｈｅｎｙｌｃｏｕｍａｒｉｎを用いることで7-(Diethylamino)-３−Ｐｈｅｎｙｌｃｏｕｍａｒｉｎ色素集積メラミン樹脂粒子を作製した。作製例１と同様の手法でマレイミド修飾を行った7-(Diethylamino)-３−Ｐｈｅｎｙｌｃｏｕｍａｒｉｎ色素集積メラミン樹脂粒子と、ストレプトアビジンに代えて抗トラスツズマブ抗体（Bio-rad社；HCA177）を作製例１と同様の手法でチオール修飾したものとを、作製例１と同様の手法で反応、処理させることで、抗トラスツズマブ抗体結合7-(Diethylamino)-３−Ｐｈｅｎｙｌｃｏｕｍａｒｉｎ色素集積メラミン樹脂粒子を作製し、これを蛍光体集積粒子用希釈液を用いて、０．０６ｎＭに希釈したものを実験例２における青色ＰＩＤ染色液として使用した。【０１２２】
［作製例５］
作製例２に記載の手順に準じ、テキサスレッド色素分子「Ｓｕｌｆｏｒｈｏｄａｍｉｎｅ  １０１」（シグマアルドリッチ社）に代えて7-(Diethylamino)-３−Ｐｈｅｎｙｌｃｏｕｍａｒｉｎを用いることで7-(Diethylamino)-３−Ｐｈｅｎｙｌｃｏｕｍａｒｉｎ色素集積メラミン樹脂粒子を作製した。得られたストレプトアビジン結合7-(Diethylamino)-３−Ｐｈｅｎｙｌｃｏｕｍａｒｉｎ集積メラミン樹脂粒子を蛍光体集積粒子用希釈液を用いて、０．０６ｎＭに希釈したものを実験例４における青色ＰＩＤ染色液として使用した。【０１２３】
＜評価準備１＞
乳がん患者複数名から採取した腫瘍組織を購入し、それぞれの患者に対応する２ｍｍ角の腫瘍組織を獲得免疫不全マウスの腰部皮下に移植することで、ＰＤＸモデルマウスを作製した。約３００ｍｍ3まで腫瘍組織が成長した時（移植１か月後）にトラスツズマブ(商品名;ハーセプチン（登録商標））の投与を開始した。投与条件は投与量３０ｍｇ／ｋｇ；投与回数１日１回、週２回とした。【０１２４】
投与前後のマウスについてそれぞれ以下の工程を行った。なお、各患者に対応するＰＤＸマウスであってトラスツズマブの代わりにＰＢＳを同条件で投与したマウスをコントロールマウスとして用いている。【０１２５】
（Ｉ）投与４０日後にマウスより採血し、ヘパリンNa注1万単位/10mL「モチダ」（持田製薬株式会社）を吸い上げたのちに吐出した注射針(テルモ株式会社)を用いて採血し、１２００ｇで２０分間遠心分離を行うことで血漿を分離した。0.3% BSA/0.05% tween20/140mM NaCl/25mM sodium phosphate（ｐＨ７．２）を希釈液として前記血漿を１００倍に希釈した。【０１２６】
（ＩＩ）初回投与直前に腫瘍の一部を針生検により採取して、各マウスにつきＦＦＰＥ（ホルマリン固定パラフィン包埋）組織スライドをそれぞれ数枚ずつ作成した。【０１２７】
（ＩＩＩ）投与４０日後に腫瘍の一部を針生検により採取して、各マウスにつきＦＦＰＥ（ホルマリン固定パラフィン包埋）組織スライドをそれぞれ数枚ずつ作成した。【０１２８】
（ＩＶ）初回投与直前、および投与４０日後の腫瘍体積を測定した。【０１２９】
［実験例１］
工程（Ｉ）で取得した希釈した血漿を検体として、Anti-Trastuzumab, ELISA Kit, ADA ELISA(somrubioscience)を用いて試験を行うことで、トラスツズマブの血中濃度を測定した。検体ごとの抗体医薬の血中濃度をプロットした図を図１に示す。各検体はトラスツズマブ血中濃度から高濃度群と低濃度群に分類できることがわかる。【０１３０】
［実験例２］
上記工程（ＩＩ）、工程（ＩＩＩ）で作製した組織スライドに関して、以下の手順で免疫染色を行った。【０１３１】
(標本の前処理）
作製したＦＦＰＥ組織スライドを脱パラフィン処理した後、水に置換する洗浄を行った。洗浄した組織スライドを１０ｍＭクエン酸緩衝液中（ｐＨ６．０）中で９５℃、４０分間加熱することで抗原の賦活化処理を行った。賦活化処理後の組織スライドをＰＢＳにより洗浄した。洗浄後の組織スライドに対して蛍光ナノ粒子用希釈液［（カゼイン（組成＝α−カゼイン：５０ｗ／ｗ％、β−カゼインＢＳＡ：５０ｗ／ｗ％）とＢＳＡを１％含有する溶液］を滴下することにより１５分間ブロッキング処理を行った。【０１３２】
(免疫染色Ａ)
工程（ＩＩ）で作製した組織スライドについては、前記標本前処理工程を行った組織スライドに、抗ＨＥＲ２ウサギモノクローナル抗体(Roche社；4B5)を５μｇ／μＬ含むように調製したＰＢＳを滴下し、４℃で１晩反応させた後ＰＢＳで洗浄した。洗浄後の組織スライドに作製例１で作製したビオチン修飾抗ウサギＩｇＧ抗体をさらに蛍光体集積粒子用希釈液を用いて２μｇ／ｍＬに希釈したものを滴下し、室温で３０分間反応させた。さらに組織スライドをＰＢＳで洗浄した後、作製例２で作製した赤色ＰＩＤ染色液を滴下し、室温で２時間反応させた。【０１３３】
ストレプトアビジン−ビオチンブロック処理をした後、前記組織スライドに、抗ＨＥＲ３抗体マウスモノクローナル抗体(Novus Biologicals社；RTJ2)を５μｇ／μＬ含むように調製したＰＢＳを滴下し、４℃で１晩反応させた後ＰＢＳで洗浄した。洗浄後の組織スライドに作製例１で作製したビオチン修飾抗マウスＩｇＧ抗体をさらに蛍光体集積粒子用希釈液を用いて２μｇ／ｍＬに希釈したものを滴下し、室温で３０分間反応させた。さらに組織スライドをＰＢＳで洗浄した後、作製例２で作製した緑色ＰＩＤ染色液を滴下し、室温で２時間反応させた。【０１３４】
(免疫染色Ｂ)
工程（ＩＩＩ）で作製した組織スライドについては、前記標本前処理工程を行った組織スライドに、作製例３で作製した青色ＰＩＤ染色液を滴下し、４℃で１晩反応させた。【０１３５】
(形態観察用染色処理)
前記免疫染色ＡまたはＢを行った組織スライドを、マイヤーヘマトキシリン液で5分間染色してヘマトキシリン染色を行った後、流水で10分間洗浄した。【０１３６】
(標本の後処理)
免疫染色を終えた組織スライドに対して、純エタノールに浸漬する操作を4回行う固定化・脱水処理を行った。続いて、キシレンに浸漬する操作を3回行う透徹処理を行った。最後に封入剤「マリノール」(武藤化学株式会社)を載せて、カバーガラスをかぶせる封入処理を行い、観察に用いる標本とした。【０１３７】
(観察・撮影・画像処理)
工程（ＩＩ）で作製した組織スライドについては、ＨＥＲ２の蛍光標識に用いたテキサスレッドおよびＨＥＲ３の蛍光標識に用いたＦＩＦＣ、工程（ＩＩＩ）で作製した組織スライドについては、トラスツズマブの蛍光標識に用いた7-(Diethylamino)-３−Ｐｈｅｎｙｌｃｏｕｍａｒｉｎについて、蛍光輝点数の測定を行った。【０１３８】
蛍光の観察には蛍光顕微鏡「BX-63」(オリンパス株式会社)を用い、蛍光画像(400倍)の撮影は、当該蛍光顕微鏡に取り付けた顕微鏡用デジタルカメラ「DP80」(オリンパス株式会社)を用いて、1つの組織スライドにつき５視野ずつ行った。【０１３９】
工程（ＩＩ）で作製した組織スライドについて、まず、ＨＥＲ２の蛍光標識に用いたテキサスレッドに対応する励起光を標本に照射して蛍光を発光させ、その状態の免疫染色像を撮影し、テキサスレッド集積メラミン粒子を表す輝点のうち輝度が所定の値以上のものの数を計測した。この際、励起光の波長は、蛍光顕微鏡が備える励起光用光学フィルターを用いて５７５〜６００ｎｍに設定し、観察する蛍光の波長は、蛍光用光学フィルターを用いて６１２〜６９２ｎｍに設定した。次にＨＥＲ３の蛍光標識に用いたＦＩＦＣに対応する励起光を標本に照射して蛍光を発光させ、その状態の蛍光画像を撮影し、ＦＩＦＣ集積メラミン粒子を表す輝点のうち輝度が所定の値以上のものの数を計測した。
この際、励起光の波長は、蛍光顕微鏡が備える励起光用光学フィルターを用いて４７０〜４９５ｎｍに設定し、観察する蛍光の波長は、蛍光用光学フィルターを用いて５１０〜５５０ｎｍに設定した。【０１４０】
工程（ＩＩＩ）で作製した組織スライドについて、トラスツズマブの蛍光標識に用いたＰｈｅｎｙｌｃｏｕｍａｒｉｎに対応する励起光を標本に照射して蛍光を発光させ、その状態の蛍光画像を撮影し、集積メラミン粒子を表す輝点のうち輝度が所定の値以上のものの数を計測した。この際、励起光の波長は、蛍光顕微鏡が備える励起光用光学フィルターを用いて３４０〜３９０ｎｍに設定し、観察する蛍光の波長は、蛍光用光学フィルターを用いて４２０〜４６０ｎｍに設定した。【０１４１】
蛍光顕微鏡による観察および画像撮影時の励起光の強度はいずれも、視野中心部付近の照射エネルギーが９００Ｗ／ｃｍ2となるように調整し、画像撮影時の露光時間は画像の輝度が飽和しないような範囲、例えば４０００μ秒に設定した。【０１４２】
上記蛍光観察および蛍光画像の撮影をおこなった同一の視野において、明視野における観察および画像撮影によりヘマトキシリン染色による染色画像を撮影した。【０１４３】
取得した蛍光画像および明視野画像を画像処理により重ねあわせ、各画像に含まれる細胞数、およびＨＥＲ２、ＨＥＲ３、またはトラスツズマブを標識した蛍光体集積粒子を示す輝点をそれぞれ計測した。また、画像に含まれる全細胞数に対し、ＨＥＲ２およびＨＥＲ３、またはトラスツズマブを標識した蛍光体集積粒子を示す輝点が含まれる細胞数の割合を算出した。【０１４４】
この工程における画像処理には、画像処理ソフトウェア「Ｉｍａｇｅ  Ｊ」（オープンソース）を用いた。
（評価工程）
各検体における実験例１および２の結果を表１に示す。ＨＥＲ２を標識した蛍光体集積粒子を示す輝点が含まれる細胞をＨＥＲ２＋細胞、ＨＥＲ３を標識した蛍光体集積粒子を示す輝点が含まれる細胞をＨＥＲ３＋細胞、トラスツズマブを標識した蛍光体集積粒子を示す輝点が含まれる細胞を薬剤到達細胞とする。【０１４５】
また、実験例１におけるトラスツズマブ血中濃度に基づき検体を高濃度群および低濃度群に分け、さらに高濃度群についてＨＥＲ３高発現群およびＨＥＲ３低発現群に分けたそれぞれの群において、ＨＥＲ２＋細胞の割合とトラスツズマブ到達細胞率をプロットしてグラフ化したものを図２に示す。【０１４６】
【表１】
2019131727.tif 000003
［実験例３］
前記工程（ＩＶ）で測定した初回投与直前の腫瘍体積および投与４０日後の腫瘍体積から、それぞれ初回投与直前の腫瘍体積に対する投与４０日後の腫瘍体積の割合を算出し、腫瘍体積増加率を算出した。【０１４７】
腫瘍体積増加率をそれぞれ同じ患者に由来する対照群（コントロールマウス）の腫瘍体積増加率と比較してその割合を算出し、以下の基準に基づいた４段階の治療スコアによりトラスツズマブの治療効果を評価した。【０１４８】
投与４０日後において腫瘍の完全退縮がみられたものを３、腫瘍体積増加率が対照群の５０％未満であるものを２、腫瘍体積増加率が対照群の５０％以上７５％未満であるものを１、腫瘍体積増加率が対照群の７５％〜１００％であるものを０とした。各検体における治療スコアを実験例１および２の結果と共に表２に示す。【０１４９】
また、横軸に実験例２で算出したトラスツズマブの到達細胞率を、縦軸にトラスツズマブの治療効果をプロットしたグラフを図３に示す。【０１５０】
【表２】
2019131727.tif 000004
（結果・考察）
図１からは、検体ごとにトラスツズマブの血中濃度が大きく異なることがわかる。これは検体ごとに抗体医薬に対する代謝速度がそれぞれ異なっていることに起因すると考えられる。【０１５１】
図２からは、ＨＥＲ２に対応するトラスツズマブ到達細胞率の上昇はＨＥＲ３低発現群、高発現群ともに観察されるが、ＨＥＲ２に対応するトラスツズマブ到達細胞率の上昇率はＨＥＲ３高発現群では抑えられていることがわかる。【０１５２】
これらの結果から、ＨＥＲ２の発現量が多くなることでそれを標的とするトラスツズマブが組織内に取り込まれやすくなることで到達細胞率が増加する、すなわち薬剤の到達細胞率が高くなるが、このＨＥＲ２によるトラスツズマブの取り込みはＨＥＲ３によって抑制されていると推測できる。また表１からは、同程度ＨＥＲ２を発現し、同程度のトラスツズマブの血中濃度が測定された検体間において、ＨＥＲ３が多い場合（Ｅ〜Ｈ）ではＨＥＲ３が少ない場合（Ａ〜Ｄ）に比べて到達細胞率が低いことが確認された。【０１５３】
以上より、抗体医薬投与前の腫瘍組織内におけるＨＥＲ２（標的分子）を定量することに加えて、標的関連分子の発現量、血中濃度、抗体医薬の到達細胞率を組み合わせることで、治療効果を評価できると推測することができる。具体的には、抗体医薬の到達細胞率と治療結果は相関しているため、抗体医薬の到達細胞率によって、治療効果を高精度に予想することが可能である。また、標的分子の定量に加えて、標的関連分子の発現量および、血中濃度から、抗体医薬の到達細胞率をより正確に予測することが可能である。【０１５４】
〔実験例４〕
＜評価準備２＞
トラスツズマブ(商品名;ハーセプチン（登録商標））の代わりにanti-HER2 aptamer-Aを投与した以外は評価準備１と同様に行った。
anti-HER2 aptamer-A（ＨＥＲ２抗原認識ＲＮＡアプタマー、RNA 5-AGCCGCGAGGGGAGGGAUAGGGUAGGGCGCGGCU-3、北海道システムサイエンス社に合成依頼して入手）を、ＰＤＸモデルマウスに３ｍｇ／ｋｇで投与した。【０１５５】
上記マウスから工程（Ｉ）と同様にして採血し、ハイブリダイゼーション法により、血中のanti-HER2 aptamer-Aを検出した。具体的には、以下の固相側（capture）プローブ（5’-NH2- GCGCUCCC-3、北海道システムサイエンス社に合成依頼して入手）を９６穴プレートにスポッターを用いて打ち付けて作成したハイブリダイゼーション用プレートに、NH2残基を有する検出側(detect)プローブ（5’-biotin-CCCGCGCC-3、北海道システムサイエンス社に合成依頼して入手）液を添加した。そこにマウス血漿を加えて反応させることにより、血中のanti-HER2 aptamer-Aを検出した。【０１５６】
また、工程（II）と同様にして組織スライドを作製し、免疫染色Ａと同様にしてＨＥ
Ｒ-２およびＨＥＲ−３について免疫染色を行った。
工程（III）と同様にして組織スライドを作製し、次の手順で染色を行った。【０１５７】
(標本の前処理）
作製したＦＦＰＥ組織スライドを脱パラフィン処理した後、水に置換する洗浄を行った。その後、プロテアーゼ酵素処理（30℃, 5min）、脱水処理を行った。
前記標本前処理工程を行った組織スライドに、作製例５で作製した青色ＰＩＤ染色液と上記検出側(detect)プローブと変性溶液（ホルムアミド／ＳＳＣ溶液等）とを予め混合した粒子溶液を滴下し、７５℃で5分続けて３７℃で16時間ハイブリダイゼーション反応を行った。stringency洗浄ののち、DAPI溶液で封入し、次工程の観察を行った。
実験例2と同様に(観察・撮影・画像処理)を実施した。
【産業上の利用の可能性】
【０１５８】
以上の結果から、標的分子の発現量、標的関連分子の発現量、血中濃度、医薬Ｘの到達細胞率から抗体医薬の治療効果を評価することができ、またそのような評価に基づいて臨床現場における医薬Ｘの選択や投薬計画の構築が可能になり得るといえる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【国際調査報告】
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2019131727.tif 000009
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