【手続補正書】
【提出日】平成21年6月29日(2009.6.29)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）糖をエタノールに変換する酵素をコードする非相同性ポリヌクレオチド配列（ここにおいて、当該ホスト細胞は、当該細胞による主要発酵生成物としてのエタノールの産生を促進するのに十分な機能レベルで、当該非相同性ポリヌクレオチド配列を発現する）、及び
（ｂ）当該細胞の代謝経路において、糖からエタノール以外の生成物を産生するタンパク質をコードする少なくとも１つのポリヌクレオチド配列中の突然変異（ここにおける突然変異は、突然変異がない細胞によるエタノール産生に比べて、当該細胞による増大したエタノール産生をもたらす）、
を含んでなる、サッカライドを分解するのに適している組み換えホスト細胞。
【請求項２】
前記細胞が、線虫、昆虫、は虫類、鳥、両生動物、及び哺乳動物よりなる群から選ばれる高等真核生物のものである、請求項１に記載の組み換えホスト細胞。
【請求項３】
前記細胞が、単細胞又は多細胞の微生物のものである、請求項１に記載の組み換えホスト細胞。
【請求項４】
前記微生物が、細菌、真菌、又は酵母である、請求項３に記載の組み換えホスト細胞。
【請求項５】
酵母が、サッカロミセス属（Saccharomyces）、シゾサッカロミセス属（Schizosaccharomyces）、ハンゼヌラ属（Hansenula）、パチオソレン属（Pachyosolen）、クルベロミセス属（Kluyveromyces）、デバリオミセス属（Debaryomyces）、ヤロウイア属（Yarrowia）及びピキア属（Ｐichia）よりなる群から選ばれる酵母である、請求項４に記載の組み換えホスト細胞。
【請求項６】
前記非相同性ポリヌクレオチド配列が、アルコールデヒドロゲナーゼ及び／又はピルビン酸デカルボキシラーゼをコードする、請求項１〜５の何れか一項に記載の組み換えホスト細胞。
【請求項７】
（ａ）アルコールデヒドロゲナーゼ及びピルビン酸デカルボキシラーゼを、コードする非相同性ポリヌクレオチド配列（ここにおいて、当該細菌は、当該細菌による主要発酵生成物としてのエタノールの産生を促進するのに十分な機能レベルで、当該非相同性ポリヌクレオチド配列を発現する）、及び
（ｂ）当該細胞の代謝経路において、糖からエタノール以外の生成物を産生するタンパク質をコードする少なくとも１つのポリヌクレオチド配列中の突然変異（ここにおける突然変異は、当該タンパク質の発現を減少又は消去し、これにより突然変異がない組み換え細菌性ホスト細胞によるエタノール産生に比べて、前記組み換え細菌性ホスト細胞によるエタノール産生を増大させる）、
を含んでなる細菌である、サッカライドを分解するのに適している組み換えホスト細胞。
【請求項８】
（ａ）非相同性ヌクレオチド配列を含む突然変異のポリヌクレオチド配列、又は、
（ｂ）その突然変異を起こした配列、
であって、当該突然変異が、欠失、挿入又は塩基置換の突然変異であるポリヌクレオチド配列を含んでなる、請求項１〜７の何れか一項に記載の組み換えホスト細胞。
【請求項９】
前記細菌が、
（ａ）条件的嫌気性細菌、
（ｂ）グラム陰性細菌、
（ｃ）当該グラム陰性細菌が、腸内細菌科（family Enterobacteriaceae）より選ばれる細菌、又は、
（ｄ）前記（ｂ）又は（ｃ）の細菌が、エシェリキア属（Escherichia）、赤痢菌（Shigella）、シトロバクター属（Citrobacter）、サルモネラ属（Salmonella）、クレブシエラ属（Klebsiella）、エンテロバクター属（Enterobacter）、エルウィニア属（Erwinia）、クルイベラ属（Kluyvera）、セラチア属（Serratia）、セデセア属（Cedecea）、モルガネラ属（Morganella）、ハフニア属（Hafnia）、エドワードシエラ属（Edwardsiella）、プロビデンシア属（Providencia）、プロテウス属（Proteus）及びエルシニア属（Yersinia）からなる群から選ばれる細菌、
である請求項４〜８の何れか一項に記載の組み換えホスト細胞。
【請求項１０】
前記細菌が、
（ａ）グラム陽性細菌、又は、
（ｂ）グラム陽性細菌が、バチルス属（Bacillus）、ゲオバチルス属（Geobacillus）、クロストリジウム属（Clostridium）、連鎖球菌（Streptococcus）及びセルロモナス属（Cellulomonas）よりなる群から選ばれる細菌、
である請求項４〜８の何れか一項に記載の組み換えホスト細胞。
【請求項１１】
前記細菌が、エルウィニア属及びクレブシエラ属よりなる群から選ばれる、請求項４〜８の何れか一項に記載の組み換えホスト細胞。
【請求項１２】
前記細菌が、クレブシエラ・オキシトカ（Klebsiella oxytoca）株よりなる群から選ばれる、請求項１１に記載の組み換えホスト細胞。
【請求項１３】
前記ホスト細菌が、クレブシエラ・オキシトカＰ２株（ＡＴＣＣ５５３０７）である、請求項１２に記載の組み換えホスト細胞。
【請求項１４】
前記エタノール以外の生成物が、ホルメート、ラクテート、スクシネート、アセテート、アセトイン、ブタンジオール、２，３−ブタンジオール、キシリトール、ブチレート、ピルベート、プロピオネート、イソプロピルアルコール、１−プロパノール、２−プロパノール、プロパンジオール、シトレート、グルタメート及びアセトンよりなる群から選ばれる、請求項１〜１３の何れか一項に記載の組み換えホスト細胞。
【請求項１５】
前記ポリヌクレオチド配列が、ｂｕｄＡ、ｂｕｄＢ、ｂｕｄＲ及びｂｕｄＣ、並びにそれらのホモログ、オーソログ及び機能的断片よりなる群から選ばれる遺伝子由来のヌクレオチド配列を含んでなる、請求項１〜１４の何れか一項に記載の組み換えホスト細胞。
【請求項１６】
当該突然変異が、当該細胞中でのブタンジオールを産生する代謝経路に関わる酵素をコードする少なくとも１つのポリヌクレオチド配列中にある、請求項１５に記載の組み換えホスト細胞。
【請求項１７】
当該突然変異が、ｂｕｄＡ及びｂｕｄＢの遺伝子のうちの片方又は両方の中にある、請求項１〜１６の何れか一項に記載の組み換えホスト細胞。
【請求項１８】
前記突然変異が、当該細胞中でのα−アセトラクテート・デカルボキシラーゼ及び／又はα−アセトラクテート・シンターゼの発現を低減又は消去する、請求項１〜１７の何れか一項に記載の組み換えホスト細胞。
【請求項１９】
前記アルコールデヒドロゲナーゼ及びピルビン酸デカルボキシラーゼが、ザイモモナス属由来である、請求項６〜１８の何れか一項に記載の組み換えホスト細胞。
【請求項２０】
前記ザイモモナス属が、ザイモモナス・モビリスである、請求項１９に記載の組み換えホスト細胞。
【請求項２１】
ＢＷ１５（ＮＲＲＬＢ−３０８５７）、ＢＷ１９（ＮＲＲＬＢ−３０８５８）及びＢＷ２１（ＮＲＲＬＢ−３０８５９）よりなる群から選ばれるクレブシエラ・オキシトカ株からなる組み換えホスト細胞。
【請求項２２】
（ａ）アルコールデヒドロゲナーゼ及びピルビン酸デカルボキシラーゼをコードする非相同性ポリヌクレオチド配列（ここにおいて、当該ホスト細胞は、当該細胞による主要発酵生成物としてのエタノールの産生を促進するのに十分な機能レベルで、当該非相同性ポリヌクレオチド配列を発現する）、及び
（ｂ）当該代謝経路において、当該細胞でブタンジオールを産生するタンパク質をコードする少なくとも１つのポリヌクレオチド配列中の欠失突然変異（ここにおける突然変異は、当該タンパク質の発現を低減又は消去し、これにより突然変異がない細胞によるエタノール産生に比べて、当該細胞によるエタノール産生を増大させる）
を含んでなる、細菌性ホスト細胞がクレブシエラ・オキシトカである、組み換えホスト細胞。
【請求項２３】
サッカライド源を、請求項１〜２２の何れか一項に記載の組み換えホスト細胞と接触させ、これによりサッカライド源からエタノールを産生することを含んでなる、サッカライド源からエタノールを産生する方法。
【請求項２４】
（ａ）エタノール産生の親ホスト細胞に、当該親細胞によってエタノールを産生するのに適した条件下で、選択培地及びサッカライド源を接触させること、
（ｂ）前記条件下及び培地中で、サッカライド源から産生されるエタノールのレベルを測定すること、
（ｃ）前記条件下及び培地中で増大した発現を有する望ましくない副生成物を同定するために、前記サッカライド源から産生されるエタノール以外の少なくとも１つの生成物のレベルを測定すること、そして
（ｄ）代謝経路において、前記の望ましくない副生成物を産生する遺伝子産物をコードする遺伝子のポリヌクレオチド配列を突然変異させ（ここにおける突然変異は、代謝経路中の少なくとも１つの遺伝子産物の発現を低減又は消去して、突然変異なしの親細胞によるエタノール産生に比べて、当該細胞によるエタノール産生を増大させる）、これによりサッカライド源からのエタノール産生を最適化した組み換えホスト細胞を作製すること、
を含んでなる、サッカライド源からのエタノール産生を最適化した組み換えホスト細胞を作製する方法。
【請求項２５】
決められた窒素源；
複合の窒素源；
ホスフェイト源；及び
マグネシウム源：
を含んでなる、サッカライドを分解するのに適している組み換えホスト細胞による生育及びエタノール産生を支援する最小培地。
【請求項２６】
決められた窒素源が、尿素様化合物であり、その濃度が、約０．１ｍＭ〜約１００ｍＭ、約２ｍＭ〜約２０ｍＭ、又は約８ｍＭ〜約１２ｍＭである請求項２５に記載の最小培地。
【請求項２７】
複合の窒素源が、コーンスティープリカー（ＣＳＬ）、酵母自己消化物及び／又は抽出物、トウモロコシ加工副産物、大豆加工副産物、及び使用済みの発酵培養液よりなる群から選ばれる、請求項２５又は２６に記載の最小培地。
【請求項２８】
前記ＣＳＬの濃度が、約０．１ｇ／Ｌ〜約１００ｇ／Ｌ、約１ｇ／Ｌ〜約２０ｇ／Ｌ、又は約５ｇ／Ｌ〜約１０ｇ／Ｌである、請求項２７に記載の最小培地。
【請求項２９】
総ホスフェイト濃度が、約１ｍＭ〜約１００ｍＭ、又は約１０ｍＭ〜約１２ｍＭである、請求項２５〜２８の何れか一項に記載の最小培地。
【請求項３０】
マグネシウム濃度が、約０．１ｍＭ〜約５．０ｍＭ、又は約０．２５ｍＭ〜約１．０ｍＭである、請求項２５〜２９の何れか一項に記載の最小培地。
【請求項３１】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３又は４に記載のヌクレオチド配列を含んでなる、単離された核酸分子。
【請求項３２】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６又は７に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチド；ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６又は７に記載のアミノ酸配列を有するポリペプチドの天然型のアレル変異体；又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６又は７に記載のアミノ酸配列を包有するポリペプチドのホモログ；から選ばれるポリペプチドをコードする、単離された核酸分子。
【請求項３３】
（ａ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３若しくは４、又はこれらの補体のヌクレオチド配列に対して少なくとも８０％同一である、ヌクレオチド配列を含んでなる、核酸分子、
（ｂ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３若しくは４、又はこれらの補体のヌクレオチド配列を包含する核酸の少なくとも１００個のヌクレオチド断片を含んでなる、核酸分子、
（ｃ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６又は７のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％同一のアミノ酸配列を含んでなる、ポリペプチドをコードする核酸分子、及び
（ｄ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６又は７のアミノ酸配列を包含するポリペプチドの断片（ここにおける断片は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６又は７のアミノ酸配列の少なくとも１５個の連続したアミノ酸残基を包含する）をコードする、核酸分子、
よりなる群から選ばれる、単離された核酸分子。
【請求項３４】
（ａ）ストリージェントな条件下で、請求項３１〜３３の何れか一項に記載の核酸分子にハイブリダイズする、又は、
（ｂ）請求項３１〜３３の何れか一項に記載の核酸分子のヌクレオチド配列に相補的、
であるヌクレオチド配列を含んでなる、単離された核酸分子。
【請求項３５】
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５又は８に記載のヌクレオチド配列を含んでなる、単離された核酸分子。
【請求項３６】
（ａ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６又は７のアミノ酸配列を包含するポリペプチドの断片（ここにおける断片は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６又は７のアミノ酸の少なくとも１５個の連続したアミノ酸残基を包含する）、
（ｂ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６又は７のアミノ酸配列を包含するポリペプチドの天然型のアレル変異体（ここにおけるポリペプチドは、ストリージェントな条件下でＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３又は４を含む核酸分子にハイブリダイズする、核酸分子によってコードされる）、
（ｃ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３又は４のヌクレオチド配列を包含する核酸に対して少なくとも８０％同一であるヌクレオチド配列を含んでなる、核酸分子によってコードされるポリペプチド、及び
（ｄ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６又は７のアミノ酸配列に対して少なくとも５０％同一のアミノ酸配列を含んでなる、ポリペプチド、
よりなる群から選ばれる、単離されたポリペプチド。
【請求項３７】
α−アセトラクテート・デカルボキシラーゼ及びα−アセトラクテート・シンターゼタンパク質のうちの少なくとも１つをコードする細菌遺伝子中に突然変異を包含するポリヌクレオチド配列を含んでなる、ベクター（ここにおける当該ベクターは、細菌性ホスト細胞に組み入れられた場合に前記タンパク質の発現を低減又は消去する）。
【請求項３８】
（ａ）ポリヌクレオチド配列が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３又は４に記載のヌクレオチド配列、又はその機能的断片を包含する単離された核酸分子中に突然変異、又は、
（ｂ）当該突然変異が、欠失突然変異であるポリヌクレオチド配列、
である請求項３７に記載のベクター。
【請求項３９】
（ａ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５又は８に記載のポリヌクレオチド配列、又は、
（ｂ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５又は８に対して少なくとも８０％同一であるポリヌクレオチド配列中に突然変異を含んでなるポリヌクレオチド配列、
である請求項３７又は３８に記載のベクター。
【請求項４０】
ｐＬＯＩ３３１０又はｐＬＯＩ３３１３と命名されている、請求項３８又は３９に記載のプラスミドベクター。
【請求項４１】
請求項３１〜３５の何れか一項に記載の単離された核酸配列を含んでなる、ベクター。
【請求項４２】
（ａ）選択条件下での当該ホスト細胞による最適な生育及びエタノール産生を支援する選択培地を選択すること、
（ｂ）サッカライド源を添加すること、及び
（ｃ）選択培地及び条件でのエタノール産生のために最適化された組み換えホスト細胞を添加することであって、当該細胞は、糖をエタノールに変換する酵素をコードする非相同性ポリヌクレオチド配列を有し、当該細胞は、当該ホスト細胞による主要発酵生成物としてのエタノールの産生を促進するのに十分な機能レベルで、当該非相同性ポリヌクレオチド配列を発現し、さらに、当該細胞の代謝経路において、前記条件下及び培地中で当該オリゴサッカライド源からエタノール以外の生成物を産生するタンパク質をコードする少なくとも１つのポリヌクレオチド配列中の突然変異であって、当該突然変異が、当該タンパク質の発現を低減又は消去し、これにより当該ホスト細胞によるエタノール産生を、突然変異がない細胞によるエタノール産生に比べて増大させて、エタノール産生を最適化するものである、
を含んでなる、オリゴサッカライドを分解するのに適している組み換えホスト細胞によるオリゴサッカライド源から最適化されたエタノールを産生するための方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１７】
本発明による組み換え細菌性ホスト細胞のある好ましい態様は、ＢＷ１５（ＮＲＲＬＢ−３０８５７）、ＢＷ１９（ＮＲＲＬＢ−３０８５８）及びＢＷ２１（ＮＲＲＬＢ−３０８５９）を包含するクレブシエラ・オキシトカ株によって代表され、これらは国立農業利用研究センター（National Center for Agricultural Utilization Research；Peoria, IL, USA）の農業研究サービス培養コレクション（Agricultural Reserch Service Culture Collection; ＡＲＳＣＣ）に２００５年６月２８日付けで寄託された。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６２】
「同時糖化発酵」又は「ＳＳＦ」という用語は、複合糖の分解又は解重合、及び発酵によるその糖残基のエタノールへの生物変換を同時に行うための、１つ又はそれ以上の組み換えホスト（又は、それらの抽出物（精製又は未精製の抽出物を含む））の使用を含むことを意図している。ＳＳＦは、バイオマスを分解して、最終的に細菌でエタノールに変換されるポリサッカライドにすることができる、公知の方法である。バイオマスの分解が自然に起こるものと見なすと、ＳＳＦは、菌類（又は菌類から抽出されるセルラーゼのような酵素）の活性と、エタノール産生の細菌（又はそれから誘導される酵素）の活性を組み合わせて、リグノセルロースのような糖源をエタノールに最終的に変換可能な単糖に分解する。ＳＳＦ反応は一般に、高価な菌体酵素の使用を最適化するために酸性のｐＨで実施される。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１５５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１５５】
本発明による最適化培地のある態様は、リグノセルロースバイオマスのＳＳＦで用いられる方法及び条件に適している。上記に検討のように、動物には食べられないリグノセルロースは、エタノール産生用の豊富で安価な出発物質である。リグノセルロースの豊富な原料は、茎、葉、殻、さや、穂軸などの植物残渣、さらに木材、木材チップ、木材パルプ及び古紙も含む廃棄物に見い出せる。ＳＳＦは、リグノセルロースバイオマスをサッカライド源として用いて実施することができる。ＳＳＦ工程において、リグノセルロースを加水分解する菌体酵素（一般にセルラーゼ及びキシラナーゼ）によって可溶性の生成物が産生される。リグノセルロース生成物から生じる可溶性の生成物は、セロビオース、セロトリオース、キシロビオース、キシロトリオース及びアラビノシドを含有する。これらの可溶性の糖生成物は、同時に組み換え細菌のようなエタノール産生の微生物によってエタノールに変換される。重要なことは、ＳＳＦ反応を酸性のｐＨで行う必要があるので、この菌体酵素が、酸性のｐＨ（ｐＨ５．０近辺）で最適な性能を示すことである。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１６５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１６５】
ＳＳＦによるバイオマスの発酵の最適なエタノール産生の組み換え細菌株は、クレブシエラ・オキシトカＰ２である。ＳＳＦによるバイオマスの発酵のために最適化された本発明の組み換えホスト細胞の例は、ブタンジオール経路（アセトイン及び２，３−ブタンジオール）の副生成物を消去する欠失突然変異を有する点で親株と異なる、ＢＷ２１と称するクレブシエラ・オキシトカＰ２由来の改善されたエタノール産生の株である。本明細書の検討で示されるように、この経路は、決められた窒素源として尿素を含有する好ましい最小培地（ＯＵＭ１）中での発酵検討において、Ｐ２細胞を発育させて用いると、この経路が特異的に上方調節される。最適化されたＢＷ２１細胞中では、このような不要な遺伝子産物の発現が、遺伝子の欠失によって消去される。ＢＷ２１細胞によるエタノール産生のアッセイは、これらの細胞が、酸性ｐＨでの最小培地中で、親株Ｐ２よりも、更にＬ培地（Luria broth）のような富栄養培地中で生育させた場合よりも、エタノールを産生する優れた能力を有していることを実証した。従って、尿素様化合物を包含する最適な最小培地を、この特別な培地でエタノール産生に最適化された組み換えクレブシエラ株と組み合わせることにより、エタノール産生が、ＳＳＦに適した条件の酸性ｐＨでのシステムで、より高価な培地を用いて達成できるレベルまで最適化された。