(57)【要約】  本発明の課題は、トリグリセリドの異性体の分析方法、トリグリセリドの異性体の含有量が異なる油脂の選別方法、トリグリセリドの異性体を分取できるトリグリセリドの製造方法を提供することである。  本発明は、トリグリセリドの異性体を超臨界流体クロマトグラフィーで分析する工程において、該超臨界液体クロマトグラフィーで、複数の種類の固定相を用い、該固定相のうち、少なくとも２つの固定相は、１つ以上の塩素が多糖類誘導体に結合した異なるキラルセレクターを有するものである、トリグリセリドの分析方法である。
2019194127.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
トリグリセリドの異性体を超臨界流体クロマトグラフィーで分析する工程において、
該超臨界液体クロマトグラフィーで、複数の種類の固定相を用い、
該固定相のうち、少なくとも２つの固定相は、１つ以上の塩素が多糖類誘導体に結合した異なるキラルセレクターを有するものである、
トリグリセリドの分析方法。
【請求項２】
前記固定相が、キラルセレクターであるアミロース誘導体もしくはセルロース誘導体を基材のシリカゲルに固定化もしくはコーティングしたものである、
請求項１に記載の分析方法。
【請求項３】
前記超臨界液体クロマトグラフィーにおいて、複数のカラムを直列に連結し、
少なくとも２つのカラムは、それぞれ異なる種類の固定相が充填されたものであり、
該固定相は、１つ以上の塩素が多糖類誘導体に結合したキラルセレクターを有する、
請求項１又は２に記載の分析方法。
【請求項４】
前記異なるキラルセレクターが、アミロース  トリス（３−クロロフェニルカルバメート）と、アミロース  トリス（３，５−ジクロロフェニルカルバメート）である、
請求項１〜３のいずれか１項に記載の分析方法。
【請求項５】
トリグリセリドの光学異性体、又は、位置異性体と光学異性体とを定量する、請求項１〜４のいずれか１項に記載の分析方法。
【請求項６】
油脂を選別する方法であって、
油脂を、請求項１〜５のいずれかに記載の方法に従い定量する工程を含み、
定量されたトリグリセリド成分に基づいて選別する、ことを特徴とする油脂の選別方法。
【請求項７】
トリグリセリドの異性体を超臨界流体クロマトグラフィーで分取する工程を含むトリグリセリドの製造方法であって、
該超臨界液体クロマトグラフィーで、複数の種類の固定相を用い、
該固定相のうち、少なくとも２つの固定相は、１つ以上の塩素が多糖類誘導体に結合した異なるキラルセレクターを有するものである、
トリグリセリドの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、トリグリセリドの分析方法、油脂の選別方法、及びトリグリセリドの製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
油脂の構成成分であるトリグリセリドは、グリセリンと脂肪酸のトリエステルであるが、異性体が存在する。これらの異性体は、物性に影響し、あるいは栄養に影響すると考えられ、油脂を製造・販売する過程で管理される必要がある。一般的にトリグリセリドの組成分析はガスクロマトグラフィーあるいは液体クロマトグラフィーを用いるが、位置異性体を分析する方法としては、銀イオンカラム−ＨＰＬＣ法等が知られていた（特許文献１）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】特開２０１３−１５０６２５号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
しかし、この方法では時間がかかるという問題があり、また、光学異性体に関しては、適切な分析方法がなかった。【０００５】
本発明は、上記の状況に鑑みてなされたものであり、トリグリセリドの異性体の分析方法を提供することを目的とする。また、本発明は、トリグリセリドの異性体の含有量が異なる油脂の選別方法を提供することを目的とする。さらに、本発明は、トリグリセリドの異性体を分取できるトリグリセリドの製造方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討した結果、トリグリセリドを超臨界流体クロマトグラフィーで定量することで、トリグリセリドの位置異性体を迅速に、また精度よく分析できることを見いだした。さらに、超臨界液体クロマトグラフィーで２種類以上のキラルカラムを用いることで、光学異性体も分析出来ることを見いだした。これらの知見から、本発明を完成させるに至った。
すなわち、本発明は下記に関するものである。
〔１〕  トリグリセリドの異性体を超臨界流体クロマトグラフィーで分析する工程において、該超臨界液体クロマトグラフィーで、複数の種類の固定相を用い、該固定相のうち、少なくとも２つの固定相は、１つ以上の塩素が多糖類誘導体に結合した異なるキラルセレクターを有するものである、トリグリセリドの分析方法。
〔２〕  前記固定相が、キラルセレクターであるアミロース誘導体もしくはセルロース誘導体を基材のシリカゲルに固定化もしくはコーティングしたものである、〔１〕の分析方法。
〔３〕前記超臨界液体クロマトグラフィーにおいて、複数のカラムを直列に連結し、少なくとも２つのカラムは、それぞれ異なる種類の固定相が充填されたものであり、該固定相は、１つ以上の塩素が多糖類誘導体に結合したキラルセレクターを有する、〔１〕又は〔２〕の分析方法。
〔４〕  前記異なるキラルセレクターが、アミロース  トリス（３−クロロフェニルカルバメート）と、アミロース  トリス（３，５−ジクロロフェニルカルバメート）である、〔１〕〜〔３〕のいずれかの分析方法。
〔５〕  トリグリセリドの光学異性体、又は、位置異性体と光学異性体とを定量する、〔１〕〜〔４〕のいずれかの分析方法。
〔６〕  油脂を選別する方法であって、油脂を、〔１〕〜〔５〕のいずれかの方法に従い定量する工程を含み、定量されたトリグリセリド成分に基づいて選別する、ことを特徴とする油脂の選別方法。
〔７〕  トリグリセリドの異性体を超臨界流体クロマトグラフィーで分取する工程を含むトリグリセリドの製造方法であって、該超臨界液体クロマトグラフィーで、複数の種類の固定相を用い、該固定相のうち、少なくとも２つの固定相は、１つ以上の塩素が多糖類誘導体に結合した異なるキラルセレクターを有するものである、トリグリセリドの製造方法。
【発明の効果】
【０００７】
後述の実施例で示されるように、本発明の方法によると、トリグリセリドの位置異性体及び／又は光学異性体を迅速で正確に測定できる。さらに、本発明の方法を用いて、油脂を選別することができる。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】超臨界液体クロマトグラフィー（カラムの充填剤：Amylose tris(3-chlorophenylcarbamate)immobilized to silica gel）でＯＰＯを分析したチャートである。
【図２】超臨界液体クロマトグラフィー（カラムの充填剤：Amylose tris(3-chlorophenylcarbamate)immobilized to silica gel）でｒａｃ−ＰＯＯを分析したチャートである。
【図３】超臨界液体クロマトグラフィー（カラムの充填剤：Amylose tris(3-chlorophenylcarbamate)immobilized to silica gel）でｒａｃ−ＰＯＯとＯＰＯの１：１混合物を分析したチャートである。
【図４】超臨界液体クロマトグラフィー（２本のカラム、カラムの充填剤１：Amylose tris(3-chlorophenylcarbamate)immobilized to silica gel、カラムの充填剤２：Amylose tris(3,5-dichlorophenylcarbamate)immobilized to silica gel）でｒａｃ−ＰＯＯとＯＰＯの１：１混合物を分析したチャートである。
【図５】超臨界液体クロマトグラフィー（２本のカラム、カラムの充填剤１：Amylose tris(3-chlorophenylcarbamate)immobilized to silica gel、カラムの充填剤２：Amylose tris(3,5-dimethylphenylcarbamate)immobilized to silica gel）でｒａｃ−ＰＯＯとＯＰＯの１：１混合物を分析したチャートである。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
「トリグリセリド」は、グリセリンと脂肪酸のトリエステルである。脂肪酸は、炭素数６〜２４の直鎖あるいは分岐の脂肪酸であってもよい。また、飽和脂肪酸あるいは不飽和脂肪酸のどちらでもよい。好ましくは、炭素数８〜２２の直鎖飽和脂肪酸及び／又は直鎖不飽和脂肪酸である。これらの脂肪酸として、特に限定するわけではないが、カプリル酸、カプリン酸、ラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、ベヘン酸、パルミトレイン酸、オレイン酸、リノール酸、リノレン酸、エルカ酸、アラキドン酸、ＤＨＡ、ＥＰＡ等を用いることができる。
【００１０】
本発明において、トリグリセリドの異性体を超臨界流体クロマトグラフィーで分析あるいは分取することができるが、異性体は、１位と２位の脂肪酸が逆になっている位置異性体のトリグリセリド，及び／又は２位の炭素が光学中心になっているラセミ体を分離することができる。従って、グリセリンの３つの炭素にそれぞれ異なる脂肪酸がエステル結合しているトリグリセリドの異性体や、グリセリンの３つの炭素に２種の異なる脂肪酸がエステル結合しているトリグリセリドの異性体を分離することができる。例えば、グリセリンに２つのオレイン酸と１つのパルミチン酸が結合している場合、１，３−ジオレオイル−２−パルミトイル−グリセロール（以下、ＯＰＯと略す）と１−パルミトイル−２，３−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロール（以下、ｓｎ−ＰＯＯと略す）と１，２−ジオレオイル−３−パルミトイル−ｓｎ−グリセロール（以下、ｓｎ−ＯＯＰと略す）が位置異性体として存在する。また、１−パルミトイル−２，３−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロールと１，２−ジオレオイル−３−パルミトイル−ｓｎ−グリセロールは、エナンチオマー（鏡像異性体）である（以下、このエナンチオマーの混合物をｒａｃ−ＰＯＯと略す）。
【００１１】
「油脂」は特に限定されないが、例えば植物性油脂や動物性油脂が挙げられるが、植物性油脂が好ましい。
植物性油脂としては、キャノーラ油や、パーム油等やこれらのエステル交換油が挙げられ、エステル交換油が好ましい。
また、油脂としては食用油脂が好ましい。
【００１２】
本実施の形態は、特に限定されるものではないが、天然由来の動植物油、あるいは合成油のグリセリドを分析に用いることができる。
【００１３】
＜トリグリセリドの分析方法＞
本実施の形態のトリグリセリドの分析方法は、トリグリセリドの異性体を超臨界流体クロマトグラフィーで分析する工程、を含む。
ここで、「超臨界流体クロマトグラフィー」とは、ＳＦＣとも呼ばれるカラムクロマトグラフィーの一種であり、移動相に超臨界流体を用いるものをいう。超臨界流体クロマトグラフィーでは、低粘度で拡散性が高いという特性を有する亜臨界流体や超臨界流体を移動相として用いることで、移動相に液体を用いる液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）に比べ、分解能や検出能を向上することができる。
超臨界流体クロマトグラフィーの「移動相」としては、特に限定されるものではないが、例えば、液化状態、亜臨界状態、又は、超臨界状態の二酸化炭素を用いることができる。移動相としては、これらを単独で用いることもできるが、これに加えて、有機溶媒（モディファイヤー）を併用することが好ましい。モディファイヤーの濃度を変えることで、トリグリセリドの溶出力や保持の強さを調整することができるからである。モディファイヤーとしては、特に限定されるものではないが、メタノール、エタノール、イソプロパノール、アセトニトリル、ジクロロメタン等の有機溶媒を用いることができる。
【００１４】
超臨界流体クロマトグラフィーの「固定相」としては、１つ以上の塩素が多糖類誘導体に結合した異なるキラルセレクターを有するものを、少なくとも２つ使用する。例えば、キラルセレクターであるアミロース誘導体もしくはセルロース誘導体を基材のシリカゲルに固定化もしくはコーティングした固定相を使用することができる。また、キラルセレクターとしては、アミロース  トリス（３−クロロフェニルカルバメート）、アミロース  トリス（３，５−ジクロロフェニルカルバメート）、アミロース  トリス（３−クロロ−４−メチルフェニルカルバメート）、アミロース  トリス（３−クロロ−５−メチルフェニルカルバメート）、アミロース  トリス（（Ｓ）−α−メチルベンジルカルバメート）等から選ばれるものを有する固定相が好ましい。キラルセレクターとして、アミロース  トリス（３−クロロフェニルカルバメート）と、アミロース  トリス（３，５−ジクロロフェニルカルバメート）をそれぞれ有する固定相の組合せがより好ましい。
【００１５】
本実施の形態において、異なる固定相は、単一のカラムあるいは別々のカラムに充填して用いることができる。通常、単一の固定相で充填されたカラムが市販されているので、異なる固定相が充填されたカラムを直列に連結して用いることが好ましい。
【００１６】
本実施の形態において、前述以外の固定相及びカラムをさらに追加して用いてもよい。
【００１７】
超臨界流体クロマトグラフィーの「検出器」としては、特に限定されるものではないが、例えば、紫外／可視吸光度検出器、ダイオードアレイ検出器、質量分析計、円二色性検出器等を用いることができる。
超臨界流体クロマトグラフィーの条件は、油脂の分析に用いられているものを特に制限なく採用することができる。
【００１８】
超臨界流体クロマトグラフィーに先立ち、油脂以外の成分を含有する組成物の場合、抽出等の前処理を行うことが好ましい。
例えば、抽出としては、特にこれに限定されるものではないが、水に溶解しにくい有機溶媒、例えば、エーテル、ヘキサン、ヘプタン、オクタン、石油エーテル、ベンゼン、トルエン、キシレン、ジクロロメタン等を用いて、有機溶媒に可溶な成分を抽出することができる。その後、抽出された成分を濃縮することができるように、沸点が１００℃以下の有機溶媒が好ましい。
さらに、抽出後に、有機相にアルカリ・酸がある場合、これらを除去するために、水洗を行ってもよい。
抽出液は、適宜、濃縮することができる。濃縮方法としては、特に限定するものではないが、無水硫酸ナトリウム、塩化カルシウム、モレキュラーシーブ等の乾燥剤で乾燥させた後、有機溶媒を蒸留することが挙げられる。
【００１９】
本実施の形態では、油脂中に含まれる多種のトリグリセリドの異性体を分析することができる。分析により、検体中のトリグリセリドの光学異性体の存在の有無、位置異性体の存在の有無、又は、位置異性体と光学異性体の存在の有無が確認でき、異性体間の相対的な量の大小を確認することもできる。さらに、通常、定量分析で行われている外部標準、もくしは内部標準を用いる方法により、検体中のトリグリセリドの光学異性体、位置異性体、又は、位置異性体と光学異性体とを定量することができる。
【００２０】
なお、トリグリセリドとしては、炭素数６〜２４の脂肪酸をトリグリセリドの構成脂肪酸とするものが挙げられる。炭素数６〜２４の脂肪酸は、飽和及び／又は不飽和の直鎖状脂肪酸であることが好ましく、カプロン酸、カプリル酸、カプリン酸、ラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、パルミトレン酸、ステアリン酸、リノール酸、リノレン酸、ベヘン酸、アラキドン酸、エルカ酸、ＤＨＡ、ＥＰＡ等がより好ましい。最も好ましくは、構成脂肪酸が２種からなるトリグリセリドの分析であり、例えば、トリグリセリドの構成脂肪酸が２つのパルミチン酸と１つのオレイン酸、及び／又は２つのオレイン酸と１つのパルミチン酸であるトリグリセリドであることが最も好ましい。
【００２１】
＜油脂の選別方法＞
本発明の油脂の選別方法において、油脂を前記＜トリグリセリドの分析方法＞に従い定量する工程を含み、定量されたトリグリセリド成分に基づいて選別する。
本発明において、定量する工程は、特に限定するものではないが、エステル交換油であれば、エステル交換後であればよく、精製工程の前、あるいは精製工程の途中でもよい
【００２２】
油脂としては、動植物油の他、動植物油を位置選択的エステル交換したエステル交換油を用いることができる。例えば、酵素で１，３位選択的エステル交換を行った場合、１，３位に特定の脂肪酸を導入することができるが、酵素の選択率により、２位に特定の脂肪酸が導入されるものもある。例えば、トリオレインに酵素で、パルミチン酸を１，３位選択的エステル交換を行った場合、目的物質のｒａｃ−ＰＯＯ（鏡像異性体の混合物）の他、位置異性体のＯＰＯ、副反応生成物の、１，３−ジパルミトイル−２−オレオイル−グリセロール、１，２−ジパルミトイル−３−オレオイル−ｓｎ−グリセロール、１−オレオイル−２，３−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロール等が生成する。前記＜トリグリセリドの分析方法＞に基づき、目的物質の多い製品を選別することができる。
【００２３】
＜トリグリセリドの製造方法＞
本実施の形態のトリグリセリドの製造方法は、トリグリセリドの異性体を超臨界流体クロマトグラフィーで分取する工程、を含む。超臨界液体クロマトグラフィーにおいて、複数の種類の固定相を用い、これら固定相のうち、少なくとも２つの固定相は、１つ以上の塩素が多糖類誘導体に結合した異なるキラルセレクターを有する。トリグリセリドを超臨界液体クロマトグラフィーで、異性体のピークを有する画分で分取する。分取した画分は必要に応じて水洗・乾燥し、また、溶媒を用いた場合は、溶媒を留去する。なお、超臨界液体クロマトグラフィーの条件等は、前記＜トリグリセリドの分析方法＞に詳細に記述した通りである。
【実施例】
【００２４】
以下、実施例により本発明を更に詳細に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。【００２５】
[実施例１]：トリグリセリドの分析
（サンプル調製）
標準物質：１，３−ジオレオイル−２−パルミトイル−グリセロール（ＯＰＯ：商品名「1,3-Olein-2-Palmitin」：Larodan社製）の１０質量ｐｐｍのアセトン溶液とした（ＯＰＯアセトン溶液）。１−パルミトイル−２，３−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロール（ｓｎ−ＰＯＯ）と１，２−ジオレオイル−３−パルミトイル−ｓｎ−グリセロール（ｓｎ−ＯＯＰ）の混合物（ｒａｃ−ＰＯＯ：商品名「1,2-Olein-3-Palmitin（rac）」：Larodan社製）を１０質量ｐｐｍのアセトン溶液とした（ｒａｃ−ＰＯＯアセトン溶液）。ＯＰＯアセトン溶液とｒａｃ−ＰＯＯアセトン溶液を１：１で混合した（ＯＰＯ＋ｒａｃ−ＰＯＯアセトン溶液）。【００２６】
（超臨界流体クロマトグラフィー操作）
各アセトン溶液を、下記条件下での超臨界流体クロマトグラフィー装置へ供した。
下記の超臨界液体クロマトグラフィーの条件（カラム（１）  カラムの充填剤：Amylose tris(3-chlorophenylcarbamate)immobilized to silica gel）でＯＰＯアセトン溶液を分析した結果（チャート）を図１に示した。
下記の超臨界液体クロマトグラフィーの条件（カラム（１）  カラムの充填剤：Amylose tris(3-chlorophenylcarbamate)immobilized to silica gel）でｒａｃ−ＰＯＯアセトン溶液を分析した結果（チャート）を図２に示した。
下記の超臨界液体クロマトグラフィーの条件（カラム（１）  カラムの充填剤：Amylose tris(3-chlorophenylcarbamate)immobilized to silica gel）でＯＰＯ＋ｒａｃ−ＰＯＯアセトン溶液を分析した結果（チャート）を図３に示した。
下記の超臨界液体クロマトグラフィーの条件（カラム（２）  ２本のカラム、カラムの充填剤１：Amylose tris(3-chlorophenylcarbamate)immobilized to silica gel、カラムの充填剤２：Amylose tris(3,5-dichlorophenylcarbamate)immobilized to silica gel）でＯＰＯ＋ｒａｃ−ＰＯＯアセトン溶液を分析した結果（チャート）を図４に示した。
下記の超臨界液体クロマトグラフィーの条件（カラム（２）  ２本のカラム、カラムの充填剤１：Amylose tris(3-chlorophenylcarbamate)immobilized to silica gel、カラムの充填剤２：Amylose tris(3,5-dimethylphenylcarbamate)immobilized to silica gel）でＯＰＯ＋ｒａｃ−ＰＯＯアセトン溶液を分析した結果（チャート）を図５に示した。【００２７】
（超臨界流体クロマトグラフィー条件）
超臨界流体クロマトグラフィー装置：Ｎｅｘｅｒａ  ＵＣ  （島津製作所社製）
カラム（１）：カラムＡ
カラム（２）：カラムＡとカラムＢの直列接続
カラム（３）：カラムＡとカラムＣの直列接続
移動相：超臨界流体ＣＯ２  （流量：１．２ｍＬ／ｍｉｎ）
モディファイヤー：アセトニトリル（流量：０．１８ｍＬ／ｍｉｎ）
メイクアップ溶媒：０．１％ギ酸アンモニウムを含むメタノール（流量：０．１ｍＬ／ｍｉｎ）
検出器：タンデム四重極ＭＳ
注入量：１μＬ【００２８】
※カラム
カラムＡ：CHIRALPAK ID-3/SFC  長さ１５０ｍｍ×内径4.6ｍｍ  粒子径３μｍ（Amylose tris(3-ｃhlorophenylcarbamate)immobilized to silica gel）、株式会社ダイセル製
カラムＢ：CHIRALPAK IE-3/SFC  長さ１５０ｍｍ×内径4.6ｍｍ  粒子径３μｍ（Amylose tris(3,5-dichlorophenylcarbamate)immobilized to silica gel）、株式会社ダイセル製
カラムＣ：CHIRALPAK IA-3/SFC  長さ１５０ｍｍ×内径4.6ｍｍ  粒子径３μｍ（Amylose tris(3,5-dimethylphenylcarbamate)immobilized to silica gel）、株式会社ダイセル製【００２９】
（質量分析条件）
質量分析装置：液体クロマトグラフ質量分析計ＬＣＭＳ−８０５０（島津製作所製）
イオン化モード：ＥＳＩ
インターフェース温度：４００℃
ヒーティングガス流量：１２Ｌ／ｍｉｎ
ネブライザーガス流量：２．５Ｌ／ｍｉｎ
Ｄｅｓｏｌｖａｔｉｏｎガス温度：２５０℃
ヒートブロック温度：４００℃
ドライインガス流量：５Ｌ／ｍｉｎ【００３０】
図３、図５は、ピークが２つしかなく、位置異性体と鏡像異性体が十分分離できていないことがわかる。
一方、図４は、ＯＰＯ、ｓｎ−ＰＯＯ、ｓｎ−ＯＯＰの３つピークが確認でき、位置異性体、鏡像異性体が分離されることがわかった。このことは、本実施例で用いた標準物質を外部標準として、検量線を作成することで、位置異性体、鏡像異性体の含有量が不明なサンプルの含有量が定量できることを示すものである。
【産業上の利用可能性】
【００３１】
本発明は、油脂分野で利用することができる。
【図１】
2019194127.tif 000003
【図２】
2019194127.tif 000004
【図３】
2019194127.tif 000005
【図４】
2019194127.tif 000006
【図５】
2019194127.tif 000007
【国際調査報告】
2019194127.tif 000008
2019194127.tif 000009
2019194127.tif 000010
2019194127.tif 000011