(57)【要約】  ＮＡＤＨが蓄積する反応経路を経て出発物質から目的物質を製造する方法であって、細菌を好気的条件下でインキュベートすることと、その後、前記細菌を、前記出発物質と硝酸イオンとの存在下において、嫌気的条件下でインキュベートして、前記目的物質を生産することとを含む方法。
2020084713.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＮＡＤＨが蓄積する反応経路を経て出発物質から目的物質を製造する方法であって、
細菌を好気的条件下でインキュベートすることと、
その後、前記細菌を、前記出発物質と硝酸イオンとの存在下において、嫌気的条件下でインキュベートして、前記目的物質を生産することと
を含む方法。
【請求項２】
前記細菌は、乳酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼをコードする遺伝子、ピルビン酸オキシダーゼをコードする遺伝子、及びピルビン酸ギ酸リアーゼをコードする遺伝子からなる群より選択される１以上の遺伝子の機能が欠損している請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記細菌が前記硝酸イオンを還元することにより生成された亜硝酸イオンを、過酸化水素と反応させて、硝酸イオンに酸化することを更に含む請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
ＮＡＤＨが蓄積する反応経路を経て糖類からピルビン酸又はピルビン酸を中間代謝物として経由して生合成される化合物を製造する方法であって、
細菌を好気的条件下でインキュベートすることと、
その後、前記細菌を、糖類と硝酸イオンとの存在下において、嫌気的条件下でインキュベートして、ピルビン酸又はピルビン酸を中間代謝物として経由して生合成される化合物を生産することと
を含む方法。
【請求項５】
前記細菌は、乳酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼをコードする遺伝子、ピルビン酸オキシダーゼをコードする遺伝子、及びピルビン酸ギ酸リアーゼをコードする遺伝子からなる群より選択される１以上の遺伝子の機能が欠損している請求項４に記載の方法。
【請求項６】
ＮＡＤＨが蓄積する反応経路を経て糖類からピルビン酸又はピルビン酸を中間代謝物として経由して生合成される化合物を製造する方法であって、
乳酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼをコードする遺伝子、ピルビン酸オキシダーゼをコードする遺伝子、及びピルビン酸ギ酸リアーゼをコードする遺伝子からなる群より選択される１以上の遺伝子の機能が欠損している細菌を、糖類と硝酸イオンとの存在下において、嫌気的条件下でインキュベートして、ピルビン酸又はピルビン酸を中間代謝物として経由して生合成される化合物を生産することを含む方法。
【請求項７】
ピルビン酸を生産する請求項４乃至６の何れか１項に記載の方法。
【請求項８】
ピルビン酸を中間代謝物として経由して生合成される化合物を生産する請求項４乃至６の何れか１項に記載の方法。
【請求項９】
ピルビン酸を中間代謝物として経由して生合成される前記化合物は、酢酸である請求項４、５、６又は８に記載の方法。
【請求項１０】
前記細菌は、乳酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子の欠失株である請求項４乃至９の何れか１項に記載の方法。
【請求項１１】
前記細菌は、乳酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子及びホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼをコードする遺伝子の欠失株である請求項４乃至９の何れか１項に記載の方法。
【請求項１２】
前記細菌は、乳酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼをコードする遺伝子及びピルビン酸オキシダーゼをコードする遺伝子の欠失株である請求項４乃至９の何れか１項に記載の方法。
【請求項１３】
前記細菌は、コリネ型細菌である請求項４乃至１２の何れか１項に記載の方法。
【請求項１４】
前記細菌は、ピルビン酸ギ酸リアーゼをコードする遺伝子の欠失株である請求項４乃至９の何れか１項に記載の方法。
【請求項１５】
前記細菌は、ピルビン酸ギ酸リアーゼをコードする遺伝子及び乳酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子の欠失株である請求項４乃至９の何れか１項に記載の方法。
【請求項１６】
前記細菌は、大腸菌である請求項４乃至９、１４及び１５の何れか１項に記載の方法。
【請求項１７】
前記細菌が前記硝酸イオンを還元することにより生成された亜硝酸イオンを、過酸化水素と反応させて、硝酸イオンに酸化することを更に含む請求項４〜１６の何れか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＮＡＤＨが蓄積する反応経路を経て出発物質から目的物質を製造する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
細菌の増殖培養を好気的条件で行い、その後、物質生産を嫌気的条件で行う発酵技術は、現在、主にコリネバクテリウム属菌を用いて行われている（Inui M, Murakami S, Okino S, Kawaguchi H, Vertes A.A., Yukawa H, J Mol Microbiol Biotechnol. 2004; 7(4): 182-196.)。かかる発酵技術は、大腸菌を用いても行われている（Vemuri G.N., Eiteman M.A., Altman E., Appl Environ Microbiol. 2002 Apr; 68(4): 1715-1727.）。上述の発酵技術は、好気的条件下で細菌が増殖するため高濃度の菌体を調製することができるという点、および嫌気的条件下で細菌の増殖が実質的に起こらないため物質生産を効率良く行うことができるという点で優れている。
【発明の概要】
【０００３】
本発明は、細菌を用いて、ＮＡＤＨが蓄積する反応経路を経て出発物質から目的物質を効率良く製造する方法を提供することを目的とする。
【０００４】
一つの側面によれば、
ＮＡＤＨが蓄積する反応経路を経て出発物質から目的物質を製造する方法であって、
細菌を好気的条件下でインキュベートすることと、
その後、前記細菌を、前記出発物質と硝酸イオンとの存在下において、嫌気的条件下でインキュベートして、前記目的物質を生産することと
を含む方法が提供される。
【０００５】
本発明によれば、細菌を用いて、ＮＡＤＨが蓄積する反応経路を経て出発物質から目的物質を効率良く製造する方法が提供される。
【図面の簡単な説明】
【０００６】
【図１】図１は、コリネ型細菌がピルビン酸又はピルビン酸を中間代謝物として経由して生合成される化合物を生産するプロセスを示す模式図である。
【図２】図２は、大腸菌がピルビン酸又はピルビン酸を中間代謝物として経由して生合成される化合物を生産するプロセスを示す模式図である。
【発明を実施するための形態】
【０００７】
以下、本発明を詳細に説明するが、以下の説明は、本発明を詳説することを意図しており、本発明を限定することを意図していない。
【０００８】
１．目的物質の製造方法
本発明者は、細菌の解糖系を利用して嫌気的条件下でグルコースからピルビン酸を生産する際に、ピルビン酸の生産効率を妨げている原因を以下のとおり推測した。解糖系の反応経路でグルコースからピルビン酸が生産される間に、１モルのグルコースから２モルのＮＡＤＨが生産されるが、ＮＡＤＨを消費する反応が存在しないため、ＮＡＤＨが菌体内に蓄積する。しかし、嫌気的条件下での物質生産は、培養液中の溶存酸素の量が少なく、細菌が生産するＮＡＤＨを酸素によって酸化することができない。菌体内に蓄積したＮＡＤＨが、ＮＡＤＨを生産する酵素（ＧＡＰＤＨ）の活性を阻害し、解糖系の反応のスムーズな進行を妨げ、その結果、ピルビン酸の生産効率を妨げている。
【０００９】
本発明者は、上記推測に基づいて、硝酸塩の添加により、硝酸呼吸でＮＡＤＨを消費する反応をピルビン酸の生産と一緒に行ったところ、ピルビン酸の生産効率を向上させることができることを見出した。
【００１０】
また、ピルビン酸を中間代謝物として経由して生合成される化合物（以下、ピルビン酸誘導体ともいう）についても、グルコースからピルビン酸誘導体が生産される反応経路においてＮＡＤＨが菌体内に蓄積する場合、硝酸塩の添加により、硝酸呼吸でＮＡＤＨを消費し、これによりピルビン酸誘導体の生産効率を向上させることができることを本発明者は確認した。
【００１１】
ピルビン酸又はピルビン酸誘導体の生産効率の向上という上記効果は、硝酸塩の添加により、硝酸呼吸でＮＡＤＨを消費し、これによりＮＡＤＨの菌体内の蓄積を解消することに基づくものである。このことで、ＮＡＤＨの蓄積によって阻害されるすべての酵素の活性を回復することができる。したがって、本発明は、ピルビン酸又はピルビン酸誘導体の生産に限らず、「ＮＡＤＨが蓄積する反応経路を経て出発物質から目的物質を生産する任意の場合」に一般化することができる。
【００１２】
すなわち、一般化された発明によれば、
ＮＡＤＨが蓄積する反応経路を経て出発物質から目的物質を製造する方法であって、
細菌を好気的条件下でインキュベートすることと、
その後、前記細菌を、前記出発物質と硝酸イオンとの存在下において、嫌気的条件下でインキュベートして、前記目的物質を生産することと
を含む方法が提供される。
【００１３】
この方法に従って、細菌を、出発物質と硝酸イオンとの存在下において、嫌気的条件下でインキュベートすると、細菌は実質的に増殖しないため、出発物質を物質生産に効率良く利用することができるとともに、硝酸イオンの還元反応と共役して、物質生産の過程で蓄積するＮＡＤＨを酸化反応により消費し、ＮＡＤＨの菌体内の蓄積を解消することができる。これにより、目的物質を効率良く生産することができる。
【００１４】
細菌が、硝酸イオンを還元すると、亜硝酸イオンが生成される。亜硝酸イオンは、細胞毒性を示すことが知られている。したがって、この方法は、細菌が硝酸イオンを還元することにより生成された亜硝酸イオンを、過酸化水素と反応させて、硝酸イオンに酸化することを更に含んでいてもよい。
【００１５】
「ＮＡＤＨが蓄積する反応経路」は、具体的には、
ＮＡＤＨ産生を伴う反応（すなわち、ＮＡＤ＋のＮＡＤＨへの還元反応）を含むが、ＮＡＤＨ消費を伴う反応（すなわち、ＮＡＤＨのＮＡＤ＋への酸化反応）を含まない反応経路、又は
ＮＡＤＨ産生を伴う反応と、ＮＡＤＨ消費を伴う反応とを含み、ＮＡＤＨ産生を伴う反応において生産されるＮＡＤＨ分子の総数が、ＮＡＤＨ消費を伴う反応において消費されるＮＡＤＨ分子の総数より多い反応経路
である。ここで「ＮＡＤＨ分子の総数」は、「ＮＡＤＨ分子の総モル数」と言い換えることもできる。
【００１６】
前者の反応経路として、グルコースからピルビン酸を製造するための反応経路が挙げられる。グルコースからピルビン酸を製造するための反応経路は、ＮＡＤＨ産生を伴う反応を含むが、ＮＡＤＨ消費を伴う反応を含まず、１分子のグルコースを使用した場合、２分子のＮＡＤＨが生産される。後者の反応経路としてグルコースからアセチルＣｏＡを経てアセトアルデヒドを製造するための反応経路が挙げられる。グルコースからアセチルＣｏＡを経てアセトアルデヒドを製造するための反応経路は、ＮＡＤＨ産生を伴う反応と、ＮＡＤＨ消費を伴う反応とを含み、１分子のグルコースを使用した場合、４分子のＮＡＤＨが生産され、２分子のＮＡＤＨが消費される。
【００１７】
出発物質および目的物質の組合せは、出発物質から目的物質までの反応経路が「ＮＡＤＨが蓄積する反応経路」であれば、特に制限されない。出発物質および目的物質の組み合わせは、出発物質がグルコースで、目的物質がピルビン酸である場合や、出発物質がグルコースで、目的物質が酢酸である場合や、出発物質がグルコースで、目的物質がオキサロ酢酸である場合や、出発物質がエタノールで、目的物質がアセトアルデヒドである場合や、出発物質が乳酸で、目的物質がピルビン酸である場合や、出発物質がキシロースで、目的物質がセリンである場合や、出発物質がコハク酸で、目的物質がリンゴ酸である場合などが挙げられる。
【００１８】
この方法は、細菌の増殖培養を好気的条件で行い、その後、物質生産を嫌気的条件で行う公知の発酵技術を利用する。したがって、この方法は、嫌気条件下での物質生産を硝酸イオンの存在下で行うこと以外は、公知の発酵技術を利用して実施することができる。公知の発酵技術を利用すれば、製造したい目的物質の種類に応じて、使用する細菌の種類、増殖培養の条件、物質生産のための培養の条件などを適宜設定することができる。この方法を実施するために必要であれば、後述の「２．ピルビン酸又はピルビン酸誘導体の製造方法」の欄の記載を参照することもできる。
【００１９】
この方法において、「硝酸イオン」は、硝酸塩の形で培養液に添加することができる。硝酸塩は、培養液中で電離して硝酸イオンを生じさせることができる。硝酸塩としては、例えば、硝酸アンモニウム、硝酸ナトリウム、硝酸カリウム、またはこれらの組合せを使用することができる。
【００２０】
培養液中の硝酸塩の濃度は、添加された時点において、１０〜５００ｍＭの範囲内にあることが好ましく、１００〜５００ｍＭの範囲内にあることがより好ましく、２００〜３００ｍＭの範囲内にあることが更に好ましい。また、目的物質の生産に伴う硝酸イオンの減少に応じて、硝酸塩の追加添加を行ってもよい。
【００２１】
この方法において、細菌は、後述の「２．ピルビン酸又はピルビン酸誘導体の製造方法」の欄に記載したとおり、当該細菌が嫌気的条件下においてグルコースを原料として多量に生産する発酵物質（例えば、乳酸、酢酸、またはギ酸）を生産しないように遺伝子操作した細菌であることが好ましい。また、細菌は、後述の「２．ピルビン酸又はピルビン酸誘導体の製造方法」の欄に記載したとおり、グルコースからピルビン酸を生成する生体内の反応経路（すなわち解糖系）の中間代謝物が、解糖系の反応以外の反応によって代謝されないように遺伝子操作した細菌であることが好ましい。
【００２２】
したがって、細菌は、乳酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子（ldh）、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼをコードする遺伝子（ppc）、ピルビン酸オキシダーゼをコードする遺伝子（pox）、及びピルビン酸ギ酸リアーゼをコードする遺伝子（pfl）からなる群より選択される１以上の遺伝子の機能が欠損していることが好ましい。
【００２３】
後述の「２．ピルビン酸又はピルビン酸誘導体の製造方法」の欄に記載したとおり、細菌は、上記遺伝子のうちの何れかの遺伝子の機能が欠損していると、図１および２に示される各反応を進行させることができず、これにより、出発物質として加えた糖類を目的物質の生産に効率良く向かうようにすることができる。その結果、かかる遺伝子操作細菌は、遺伝子の機能を欠損させていない細菌と比較して、目的物質の生産効率を向上させることができる。
【００２４】
細菌が、上記遺伝子のうちの何れかの遺伝子の機能が欠損している場合、出発物質は、「糖類」であることが好ましく、目的物質は、「ピルビン酸」又は「解糖系の代謝産物を中間代謝物として経由して生合成される化合物」であることが好ましい。
【００２５】
「糖類」は、後述の「２．ピルビン酸又はピルビン酸誘導体の製造方法」の欄に記載される糖類を使用することができる。例えば、糖類としては、単糖、例えばフルクトースもしくはグルコース；二糖、例えばスクロース；多糖、例えば構成単糖としてグルコースを含む多糖；または植物（例えば非可食農産廃棄物またはエネルギー作物）を糖化酵素で処理することにより得られた糖化液が挙げられる。
【００２６】
「解糖系の代謝産物を中間代謝物として経由して生合成される化合物」は、グルコース−６−リン酸、フルクトース−６−リン酸、フルクトース−１，６−ビスリン酸、ジヒドロキシアセトンリン酸、グリセルアルデヒド−３−リン酸、１，３−ビスホスホグリセリン酸、３−ホスホグリセリン酸、ホスホエノールピルビン酸、およびピルビン酸からなる群より選択される「解糖系の代謝産物」を中間代謝物として経由して生合成される化合物である。「解糖系の代謝産物を中間代謝物として経由して生合成される化合物」は、例えば、３−ホスホグリセリン酸を中間代謝物として経由して生合成されるセリン、ホスホエノールピルビン酸を中間代謝物として経由して生合成されるオキサロ酢酸、ピルビン酸を中間代謝物として経由して生合成される酢酸、ピルビン酸を中間代謝物として経由して生合成されるアセトアルデヒドが挙げられる。
【００２７】
特定の実施形態において、出発物質を「糖類」とすることができ、目的物質を「ピルビン酸」又は「解糖系の代謝産物を中間代謝物として経由して生合成される化合物」とすることができる。すなわち、この実施形態によれば、
ＮＡＤＨが蓄積する反応経路を経て糖類から「ピルビン酸」又は「解糖系の代謝産物を中間代謝物として経由して生合成される化合物」を製造する方法であって、
細菌を好気的条件下でインキュベートすることと、
その後、前記細菌を、糖類と硝酸イオンとの存在下において、嫌気的条件下でインキュベートして、「ピルビン酸」又は「解糖系の代謝産物を中間代謝物として経由して生合成される化合物」を生産することと
を含む方法が提供される。
【００２８】
２．ピルビン酸又はピルビン酸誘導体の製造方法
以下、出発物質が「糖類」で、目的物質が「ピルビン酸」又は「ピルビン酸を中間代謝物として経由して生合成される化合物（以下、ピルビン酸誘導体ともいう）」である場合を例として、本発明を説明する。上述のとおり、本発明は、硝酸イオンの還元反応によりＮＡＤＨを消費し、ＮＡＤＨの菌体内の蓄積を解消し、これにより、「ＮＡＤＨが蓄積する反応経路を経て生産される物質」を効率良く生産することをコンセプトとしている。したがって、本発明は、ピルビン酸又はピルビン酸誘導体の生産に限定されるものでない。以下の説明は、本発明の理解を助けることを目的として記載する。
【００２９】
２−１．第１実施形態
第１実施形態によれば、ＮＡＤＨが蓄積する反応経路を経て糖類からピルピン酸又はピルビン酸を中間代謝物として経由して生合成される化合物を製造する方法は、
細菌を好気的条件下でインキュベートすることと、
その後、前記細菌を、糖類と硝酸イオンとの存在下において、嫌気的条件下でインキュベートして、ピルビン酸又はピルビン酸を中間代謝物として経由して生合成される化合物を生産することと
を含む。
【００３０】
この方法では、文言上規定されるとおり、「ピルビン酸」は、ＮＡＤＨが蓄積する反応経路を経て糖類から生産され、「ピルビン酸を中間代謝物として経由して生合成される化合物」は、ＮＡＤＨが蓄積する反応経路を経て、糖類からピルビン酸を経由して生産される。したがって、本明細書において「ピルビン酸を中間代謝物として経由して生合成される化合物」の用語は、「糖類からピルビン酸を経由して生産されるあらゆる化合物」ではなく、「ＮＡＤＨが蓄積する反応経路を経て、糖類からピルビン酸を経由して生産される化合物」を指す。「ピルビン酸を中間代謝物として経由して生合成される化合物」は、例えば、酢酸、アセトアルデヒトである。
【００３１】
この方法は、細菌の増殖培養を好気的条件で行い、その後、物質生産を嫌気的条件で行う公知の発酵技術を利用する。
【００３２】
＜細菌＞
細菌は、グルコースをピルビン酸へ分解する生体内の反応経路（すなわち解糖系）を有する任意の細菌を使用することができる。細菌は、一般的には、好気性細菌であり、例えば、コリネ型細菌または大腸菌（Escherichia coli）である。
【００３３】
コリネ型細菌とは、バージーズ・マニュアル・デターミネイティブ・バクテリオロジー〔Bargeys Manual of Determinative Bacteriology、Vol. 8、599（1974）〕に定義されている一群の微生物であり、通常の好気的条件で増殖するものならば特に限定されるものではない。具体例を挙げれば、コリネバクテリウム属菌、ブレビバクテリウム属菌、アースロバクター属菌、マイコバクテリウム属菌、マイクロコッカス属菌等が挙げられる。コリネ型細菌の中ではコリネバクテリウム属菌が好ましい。
【００３４】
コリネバクテリウム属菌としては、コリネバクテリウム  グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）、コリネバクテリウム  エフィシェンス（Corynebacterium efficiens）、コリネバクテリウム  アンモニアゲネス（Corynebacterium ammoniagenes）、コリネバクテリウム  ハロトレランス（Corynebacterium halotolerance）、コリネバクテリウム  アルカノリティカム（Corynebacterium alkanolyticum）等が挙げられる。中でも、コリネバクテリウム  グルタミカムが好ましい。好適な菌株として、コリネバクテリウム  グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）R株（FERM P-18976）、ATCC13032株、ATCC13869株、ATCC13058株、ATCC13059株、ATCC13060株、ATCC13232株、ATCC13286株、ATCC13287株、ATCC13655株、ATCC13745株、ATCC13746株、ATCC13761株、ATCC14020株、ATCC31831株、MJ-233（FERM BP-1497）、MJ-233AB-41（FERM BP-1498）等が挙げられる。中でも、R株（FERM P-18976）、ATCC13032株、ATCC13869株が好ましい。
【００３５】
なお、分子生物学的分類により、ブレビバクテリウム  フラバム（Brevibacterium flavum）、ブレビバクテリウム  ラクトファーメンタム（Brevibacterium lactofermentum）、ブレビバクテリウム  ディバリカタム（Brevibacterium divaricatum）、コリネバクテリウム  リリウム（Corynebacterium lilium）等のコリネ型細菌もコリネバクテリウム  グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）に菌名が統一されている〔Liebl, W. et al., Transfer of Brevibacterium divaricatum DSM 20297T, "Brevibacterium flavum" DSM 20411, "Brevibacterium lactofermentum" DSM 20412 and DSM 1412, and Corynebacterium glutamicum and their distinction by rRNA gene restriction patterns. Int J Syst Bacteriol. 41:255-260. (1991)、駒形和男ら, コリネフォルム細菌の分類, 発酵と工業, 45:944-963 (1987)〕。
【００３６】
旧分類のブレビバクテリウム  ラクトファーメンタムATCC13869株、ブレビバクテリウム  フラバムのMJ-233株（FERM BP-1497）、MJ-233AB-41株（FERM BP-1498）なども好適なコリネバクテリウム  グルタミカムである。
【００３７】
ブレビバクテリウム属菌としては、ブレビバクテリウム  アンモニアゲネス（Brevibacterium ammoniagenes）（例えばATCC6872株）等が挙げられる。
【００３８】
アースロバクター属菌としては、アースロバクター  グロビフォルミス（Arthrobacterglobiformis）（例えばATCC8010株、ATCC4336株、ATCC21056株、ATCC31250株、ATCC31738株、ATCC35698株）等が挙げられる。
【００３９】
マイコバクテリウム属菌としては、マイコバクテリウム  ボビス（Mycobacterium bovis）（例えばATCC19210株、ATCC27289株）等が挙げられる。
【００４０】
マイクロコッカス属菌としては、マイクロコッカス  フロイデンライヒ（Micrococcusfreudenreichii）（例えばNo. 239株（FERM P-13221））、マイクロコッカス  ルテウス（Micrococcus leuteus）（例えばNo. 240株（FERM P-13222））、マイクロコッカス  ウレアエ（Micrococcus ureae）（例えばIAM1010株）、マイクロコッカス  ロゼウス（Micrococcus roseus）（例えばIFO3764株）等が挙げられる。
【００４１】
細菌は、当該細菌が嫌気的条件下においてグルコースを原料として多量に生産する発酵物質（例えば、乳酸、酢酸、またはギ酸）を生産しないように遺伝子操作した細菌であることが好ましい。かかる遺伝子操作細菌としては、以下の細菌が挙げられる：
細菌（遺伝子操作前）が、嫌気的条件下で発酵物質として乳酸を生産する細菌（例えば、コリネ型細菌、大腸菌）である場合、乳酸発酵に関与する乳酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子（ldh）の機能を欠損するように遺伝子操作した細菌；
細菌（遺伝子操作前）が、嫌気的条件下で発酵物質として酢酸を生産する細菌（例えば、コリネ型細菌）である場合、酢酸発酵に関与するピルビン酸オキシダーゼをコードする遺伝子（pox）の機能を欠損するように遺伝子操作した細菌；および
細菌（遺伝子操作前）が、嫌気的条件下で発酵物質としてギ酸を生産する細菌（例えば、大腸菌）である場合、ギ酸発酵に関与するピルビン酸ギ酸リアーゼをコードする遺伝子（pfl）の機能を欠損するように遺伝子操作した細菌。
【００４２】
なお、細菌が、上述の酵素についてアイソザイムを有している場合、それらのうちの１つをコードする遺伝子の機能を欠損するように遺伝子操作すればよい。
【００４３】
また、細菌は、グルコースからピルビン酸を生成する生体内の反応経路（すなわち解糖系）の中間代謝物が、解糖系の反応以外の反応によって代謝されないように遺伝子操作した細菌であることが好ましい。かかる遺伝子操作細菌としては、例えば、ホスホエノールピルビン酸（解糖系ではピルビン酸の前駆体）がオキサロ酢酸に代謝されないように、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼをコードする遺伝子（ppc）の機能を欠損するように遺伝子操作した細菌が挙げられる。
【００４４】
したがって、細菌は、乳酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子（ldh）、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼをコードする遺伝子（ppc）、ピルビン酸オキシダーゼをコードする遺伝子（pox）、及びピルビン酸ギ酸リアーゼをコードする遺伝子（pfl）からなる群より選択される１以上の遺伝子の機能が欠損していることが好ましい。
【００４５】
乳酸デヒドロゲナーゼ（LDH）をコードする遺伝子（ldh）の機能が欠損している細菌は、ピルビン酸を乳酸に変換することができない（図１および２に記載される“LDH”を参照）。ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ（PPC）をコードする遺伝子（ppc）の機能が欠損している細菌は、ホスホエノールピルビン酸をオキサロ酢酸に変換することができない（図１および２に記載される“PPC”を参照）。ピルビン酸オキシダーゼ（POX）をコードする遺伝子（pox）の機能が欠損している細菌は、ピルビン酸を酢酸に変換することができない（図１および２に記載される“POX”を参照）。ピルビン酸ギ酸リアーゼ（PFL）をコードする遺伝子（pfl）の機能が欠損している細菌は、ピルビン酸をギ酸に変換することができない（図２に記載される“PFL”を参照）。
【００４６】
したがって、細菌は、上記遺伝子のうちの何れかの遺伝子の機能が欠損していると、図１および２に示される各反応を進行させることができず、これにより、出発物質として加えた糖類をピルビン酸又はピルビン酸誘導体の生産に効率良く向かうようにすることができる。その結果、かかる遺伝子操作細菌は、遺伝子の機能を欠損させていない細菌と比較して、ピルビン酸又はピルビン酸誘導体の生産効率を向上させることができる。
【００４７】
本明細書において「遺伝子の機能が欠損している」とは、遺伝子操作によりその遺伝子の機能が欠損していることに加えて、細菌が生来的にその遺伝子を含んでいないことによりその遺伝子の機能が欠損していることも包含する。
【００４８】
また、本明細書において「遺伝子操作によりその遺伝子の機能が欠損している」とは、
遺伝子の一部または全部を改変（例えば、欠失、置換および／または挿入）することにより、酵素タンパク質が発現しなかったり、遺伝子の発現産物が酵素として機能しなかったりすること、および
遺伝子のプロモーターの一部または全部を改変（例えば、欠失、置換および／または挿入）することにより、酵素タンパク質が発現しないこと
を包含する。
【００４９】
本明細書では、遺伝子の一部または全部を遺伝子操作で欠失させることにより遺伝子の機能が欠損している細菌を「欠失株」という。欠失株は、公知の方法に従って作製することができる。例えば、欠失株は、対象遺伝子によりコードされる酵素タンパク質を産生しないように改変した欠失型遺伝子を作製し、欠失型遺伝子を含むＤＮＡで野生型株を形質転換して、欠失型遺伝子と野生型株の染色体上の遺伝子との間で相同組換えを起こさせることにより、作製することができる。
【００５０】
細菌は、乳酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子（ldh）の欠失株であってもよいし、乳酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子（ldh）及びホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼをコードする遺伝子（ppc）の欠失株であってもよいし、乳酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子（ldh）、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼをコードする遺伝子（ppc）及びピルビン酸オキシダーゼをコードする遺伝子（pox）の欠失株であってもよい。これら欠失株は、好ましくはコリネ型細菌の欠失株である。
【００５１】
あるいは、細菌は、ピルビン酸ギ酸リアーゼをコードする遺伝子（pfl）の欠失株であってもよいし、ピルビン酸ギ酸リアーゼをコードする遺伝子（pfl）及び乳酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子（ldh）の欠失株であってもよい。これら欠失株は、好ましくは大腸菌の欠失株である。
【００５２】
＜好気的条件下でのインキュベーション＞
細菌は、まず、好気的条件下でインキュベートする。これにより、細菌は増殖し、高濃度の菌体を調製することができる。したがって、以下の説明において、好気的条件下でのインキュベーションは、「増殖培養」ともいう。
【００５３】
「好気的条件」は、具体的には、インキュベーション期間にわたって酸素が細菌の増殖に十分な量で培養液に供給されている条件をいう。好気的条件は、例えば、細菌含有培養液を収容した容器を、大気雰囲気下で振盪することにより実現することができる。あるいは、好気的条件は、例えば、空気を細菌含有培養液に通気しながら細菌含有培養液を攪拌することにより実現することができる。
【００５４】
増殖培養で使用される培養液は、細菌の増殖に適した培養液を用いることができ、具体的には、炭素源、窒素源、無機塩類などを含有する天然培地または合成培地を用いることができる。本明細書において、培養液中の各成分の濃度は、各成分が添加された時点における培養液中の最終濃度を指す。
【００５５】
「炭素源」としては、細菌が栄養源として利用することができる物質であれば任意の物質を使用することができる。炭素源としては、例えば、糖類（例えば、グルコース、フルクトース、マンノース、キシロース、アラビノース、ガラクトースなどの単糖；スクロース、マルトース、ラクトース、セロビオース、キシロビオース、トレハロースなどの二糖；セルロース、澱粉などの多糖；糖蜜）；マンニトール、ソルビトール、キシリトール、グリセリンなどの糖アルコール；酢酸、クエン酵、乳酸、フマル酸、マレイン酸、グルコン酸などの有機酸；エタノール、プロパノール、リビトールなどのアルコール；ノルマルパラフィンなどの炭化水素を使用することができる。炭素源は、１種を使用してもよく、又は２種以上を混合して使用してもよい。培養液中の炭素源の濃度は、通常、約０．１〜約３０（ｗ／ｖ）％、好ましくは、約１〜約１０（ｗ／ｖ）％とすることができる。また、培養に伴う炭素源の減少に応じて、炭素源の追加添加を行ってもよい。
【００５６】
「窒素源」としては、例えば、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、硝酸アンモニウム、硝酸ナトリウム、硝酸カリウム、酢酸アンモニウムなどの無機又は有機のアンモニウム塩；尿素；アンモニア水などを使用することができる。また、コーンスティープリカー、肉エキス、酵母エキス、ペプトン、NZ−アミン、大豆加水分解物、カゼイン分解物などの蛋白質加水分解物、アミノ酸などの含窒素有機化合物も使用できる。窒素源は、１種を使用してもよく、又は２種以上を混合して使用してもよい。培養液中の窒素源の濃度は、使用する窒素化合物によっても異なるが、通常、約０．１〜約１０（ｗ／ｖ）％とすることができる。
【００５７】
「無機塩類」としては、例えば、リン酸塩、硫酸塩、マグネシウム、カリウム、マンガン、鉄、亜鉛などの金属塩を使用することができる。具体的には、リン酸二水素カリウム、リン酸一水素カリウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硝酸第一鉄、硫酸鉄（II）、硫酸マンガン、硫酸亜鉛、硫酸コバルト、炭酸カルシウムなどを使用することができる。無機塩類は、１種を使用してもよく、２種以上を混合して使用してもよい。培養液中の無機塩類の濃度は、使用する無機塩類によっても異なるが、通常、約０．０１〜約１（ｗ／ｖ）％とすることができる。
【００５８】
さらに、必要に応じて、栄養物質を添加することもできる。栄養物質としては、例えば、肉エキス、ペプトン、ポリペプトン、酵母エキス、乾燥酵母、コーンスティープリカー、脱脂粉乳、脱脂大豆塩酸加水分解物、動植物又は微生物菌体のエキスやそれらの分解物が挙げられる。培養液中の栄養物質の濃度は、使用する栄養物質によっても異なるが、通常、約０．１〜約１０（ｗ／ｖ）％とすることができる。
【００５９】
さらに、必要に応じて、細菌の増殖を促進する因子、具体的には、ビタミン類、ヌクレオチドまたはアミノ酸を添加することもできる。ビタミン類としては、例えば、ビオチン、チアミン（ビタミンB1）、ピリドキシン（ビタミンB6）、パントテン酸、イノシトール、ニコチン酸が挙げられる。これらビタミン類は、肉エキス、酵母エキス、コーンスティープリカー、カサミノ酸等で代用することもできる。また、培養期間中における発泡を抑えるために、培養液には市販の消泡剤を適当な量で添加することができる。
【００６０】
さらに、必要に応じて、適当な抗生物質を添加することもできる。抗生物質としては、例えば、カナマイシンおよびスペクチノマイシンが挙げられる。
【００６１】
培養液のｐＨは、細菌の増殖に適したｐＨであれば、任意のｐＨであってもよい。培養液のｐＨは、例えば５〜９の範囲内、好ましくは６〜８の範囲内とすることができる。培養液のｐＨの調整は、無機あるいは有機の酸、水酸化カリウム水溶液等のアルカリ溶液、尿素、炭酸カルシウム、アンモニア、４−モルホリノプロパンスルホン酸等を含むｐＨ緩衝液を用いて行うことができる。増殖培養の間、必要に応じて培養液のｐＨを調整してもよい。
【００６２】
増殖培養は、細菌の増殖に適した温度で、細菌の増殖に必要な期間にわたって行うことができる。増殖培養における培養温度は、一般に２０〜４２℃が好適であり、好ましくは３０〜３９℃である。増殖培養における培養時間は、通常１〜６日間である。
【００６３】
＜嫌気的条件下でのインキュベーション＞
増殖培養の後、細菌を、糖類と硝酸イオンとの存在下において、嫌気的条件下でインキュベートする。これにより、細菌は、糖類からピルビン酸又はピルビン酸誘導体を生産することができる。したがって、以下の説明において、嫌気的条件下でのインキュベーションは、「生産培養」ともいう。
【００６４】
細菌は、嫌気的条件下に置かれると、実質的に増殖しないため、糖類を、増殖のためのエネルギー源としてではなく、物質生産の原料として効率良く利用することができる。また、細菌は、硝酸イオンの存在下に置かれると、下記の反応式（１）により硝酸イオンを亜硝酸イオンへ還元し、この反応の際にＮＡＤＨを消費することができる。
ＮＯ3− ＋ ＮＡＤＨ ＋ Ｈ+ → ＮＯ2− ＋ ＮＡＤ+ ＋ Ｈ2Ｏ  …（１）
【００６５】
この反応により、細菌は、グルコースからピルビン酸を生産する過程で生じるＮＡＤＨを消費し、ＮＡＤＨの菌体内の蓄積を解消し、これにより、糖類の菌体内への取り込みを促進するとともに、糖類からピルビン酸を生産する反応を促進することができる。
【００６６】
したがって、生産培養を、糖類と硝酸イオンとの存在下において、嫌気的条件下で行うことにより、細菌は、糖類からピルビン酸又はピルビン酸誘導体を効率良く生産することができる。
【００６７】
また、亜硝酸イオン（ＮＯ2−）は、細胞毒性を示すことが知られていることから、上述の反応式（１）の反応により蓄積した亜硝酸イオンは、過酸化水素水を添加することによって、下記の反応式（２）により再び硝酸イオン（ＮＯ3−）に戻すことができる。
ＮＯ2−  ＋  Ｈ2Ｏ2  →  ＮＯ3−  ＋  Ｈ2Ｏ  …（２）
【００６８】
すなわち、過酸化水素を使うことによって、反応式（１）と反応式（２）とからなるサイクルは永続的に繰り返すことが可能である。反応式（２）の反応は、過酸化水素による細胞への影響を考えると、細菌を、生産培養の培養液から分離した状態で行うことが望ましい。具体的には、生産培養の間に培養液中の亜硝酸イオンの濃度が高まったタイミングで、培養液から細菌を分離除去し、細菌を含まない培養液に過酸化水素水を添加して所定時間反応させ、その後、分離除去された細菌を培養液に戻して、生産培養を継続することができる。
【００６９】
したがって、ピルビン酸またはピルビン酸誘導体の製造方法は、細菌が硝酸イオンを還元することにより生成された亜硝酸イオンを、過酸化水素と反応させて、硝酸イオンに酸化することを更に含んでいてもよい。
【００７０】
以下、生産培養の培養条件について詳細に説明する。
生産培養は、糖類と硝酸イオンとの存在下において、嫌気的条件下で行われる。
【００７１】
「細菌を、糖類と硝酸イオンとの存在下においてインキュベートすること」は、細菌を、糖類および硝酸イオンを含む培養液中でインキュベートすることにより行うことができる。より具体的には、「細菌を、糖類と硝酸イオンとの存在下においてインキュベートすること」は、細菌を、糖類および硝酸塩を添加した培養液中でインキュベートすることにより行うことができる。
【００７２】
「嫌気的条件」は、具体的には、インキュベーション期間にわたって酸素が細菌含有培養液に積極的に供給されていない条件をいう。嫌気的条件は、より具体的には、培養液中の溶存酸素濃度が０〜２ｐｐｍの範囲内にある条件、好ましくは、培養液中の溶存酸素濃度が０〜１ｐｐｍの範囲内にある条件、より好ましくは、培養液中の溶存酸素濃度が０〜０．５ｐｐｍの範囲内にある条件をいう。培養液中の溶存酸素濃度は、例えば、溶存酸素計を用いて測定することができる。
【００７３】
「嫌気的条件」は、厳密にいうと、培養液中に、溶存酸素が存在しない条件を指す技術用語である。一方、生産培養で採用される「嫌気的条件」は、細菌の増殖を抑制し、ピルビン酸又はピルビン酸誘導体の生産効率を高めることができれば、培養液中に、溶存酸素が微量で存在している条件であっても差し支えない。したがって、本明細書において「嫌気的条件」の用語は、「培養液中に、溶存酸素が存在しない条件」だけでなく、「培養液中に、溶存酸素が微量で存在している条件」も包含する。
【００７４】
嫌気的条件は、例えば、大気雰囲気下で細菌含有培養液を振盪することなく静置し、所定時間経過後に培養液中の溶存酸素の量が減少することにより実現することができる。あるいは、嫌気的条件は、例えば、細菌含有培養液中に不活性ガス、具体的には窒素ガスを通気することにより実現することができる。あるいは、嫌気的条件は、例えば、細菌含有培養液を収容した容器を密閉することにより実現することができる。
【００７５】
生産培養は、好ましくは、細菌を培養液中に高密度に懸濁させた状態で行われる。このような状態で細菌を培養すると、一層効率的にピルビン酸又はピルビン酸誘導体を生産することができる。
【００７６】
「細菌を培養液中に高密度に懸濁させた状態」は、例えば、細菌を培養液中に、細菌の湿菌体重量％が１〜５０（ｗ／ｖ）％の範囲内になるように懸濁させた状態を指す。「細菌を培養液中に高密度に懸濁させた状態」は、好ましくは、細菌を培養液中に、細菌の湿菌体重量％が３〜３０（ｗ／ｖ）％の範囲内になるように懸濁させた状態を指す。
【００７７】
生産培養は、細菌を培養液中に高密度に懸濁させた状態で行うことが好ましいが、増殖培養は、細菌が増殖し易い環境下で行うことが好ましいため、細菌を、生産培養で採用される上記密度より低い密度で培養液中に懸濁させた状態で行うことが好ましい。
【００７８】
生産培養は、増殖培養の後、培養液の交換を行ってから行うことができる。具体的には、増殖培養の後、培養液と培養液中に懸濁された細菌とを含む容器を遠心分離機にかけて細菌を沈殿させ、その後、増殖培養用の培養液を容器から除去し、分離された細菌を生産培養用の培養液に懸濁することにより、生産培養を行うことができる。
【００７９】
あるいは、生産培養は、増殖培養の後、生産培養に必要な追加成分（すなわち、糖類および硝酸塩）を、細菌含有培養液に加えることにより、培養液の交換を行うことなく連続的に行うこともできる。
【００８０】
生産培養は、糖類と硝酸イオンとを含む培養液中で行うことができる。本明細書において、培養液中の各成分の濃度は、各成分が添加された時点における培養液中の最終濃度を指す。
【００８１】
「糖類」としては、細菌が、生体内に取り込むことができ、かつピルビン酸へと変換することができる糖類であれば任意の糖類を使用することができる。具体的には、糖類としては、グルコース、フルクトース、マンノース、キシロース、アラビノース、ガラクトースなどの単糖；スクロース、マルトース、ラクトース、セロビオース、キシロビオース、トレハロースなどの二糖；澱粉などの多糖；糖蜜等が挙げられる。中でも、単糖が好ましく、フルクトースおよびグルコースがより好ましく、グルコースがさらに好ましい。また、構成単糖としてグルコースを含む糖類も好ましく、具体的には、スクロース等の二糖、構成単糖としてグルコースを含むオリゴ糖、構成単糖としてグルコースを含む多糖も好ましい。糖類は、１種を使用してもよく、２種以上を混合して使用してもよい。また、糖類は、稲わら、バガス、コーンストーバー等の非可食農産廃棄物や、スイッチグラス、ネピアグラス、ミスキャンサス等のエネルギー作物を糖化酵素などで糖化することにより得られた糖化液（これは、グルコースやキシロース等の複数種類の糖類を含有する）の形で培養液に添加することもできる。
【００８２】
培養液中の糖類の濃度は、ピルビン酸又はピルビン酸誘導体の生産を阻害しない範囲で可能な限り高くすることができる。培養液中の糖類の濃度は、約０．１〜約４０（ｗ／ｖ）％の範囲内にあることが好ましく、約１〜約２０（ｗ／ｖ）％の範囲内にあることがより好ましい。また、ピルビン酸又はピルビン酸誘導体の生産に伴う糖類の減少に応じて、糖類の追加添加を行ってもよい。
【００８３】
「硝酸イオン」は、硝酸塩の形で培養液に添加することができる。硝酸塩は、培養液中で電離して硝酸イオンを生じさせることができる。硝酸塩としては、例えば、硝酸アンモニウム、硝酸ナトリウム、硝酸カリウム、またはこれらの組合せを使用することができる。
【００８４】
培養液中の硝酸塩の濃度は、１０〜５００ｍＭの範囲内にあることが好ましく、１００〜５００ｍＭの範囲内にあることがより好ましく、２００〜３００ｍＭの範囲内にあることが更に好ましい。また、ピルビン酸又はピルビン酸誘導体の生産に伴う硝酸イオンの減少に応じて、硝酸塩の追加添加を行ってもよい。
【００８５】
「糖類と硝酸イオンとを含む培養液」は、その他必要な成分を含有していてもよい。その他必要な成分としては、例えば、糖類以外の炭素源、硝酸塩以外の窒素源、又は無機塩類などが挙げられる。
【００８６】
「糖類以外の炭素源」としては、マンニトール、ソルビトール、キシリトール、グリセリンなどの糖アルコール；酢酸、クエン酵、乳酸、フマル酸、マレイン酸、グルコン酸などの有機酸；エタノール、プロパノール、リビトールなどのアルコール；ノルマルパラフィンなどの炭化水素、二酸化炭素や炭酸イオンを含んだ塩等が挙げられる。糖類以外の炭素源は、１種を使用してもよく、２種以上を混合して使用してもよい。糖類以外の炭素源は、培養液中、通常、約０．１〜約２０（ｗ／ｖ）％とすることができる。
【００８７】
「硝酸塩以外の窒素源」としては、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、酢酸アンモニウムなどの無機又は有機アンモニウム化合物、尿素、アンモニア水等が挙げられる。また、硝酸塩以外の窒素源は、コーンスティープリカー、肉エキス、酵母エキス、ペプトン、NZ−アミン、大豆加水分解物、カゼイン分解物などの蛋白質加水分解物、アミノ酸などの含窒素有機化合物等も使用できる。硝酸塩以外の窒素源は、１種を使用してもよく、２種以上を混合して使用してもよい。硝酸塩以外の窒素源は、使用する窒素化合物によっても異なるが、培養液中、通常、約０．１〜約１０（ｗ／ｖ）％とすることができる。
【００８８】
「無機塩類」としては、例えば、リン酸塩、硫酸塩、マグネシウム、カリウム、マンガン、鉄、亜鉛などの金属塩を使用することができる。具体的には、リン酸二水素カリウム、リン酸一水素カリウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸鉄（II）、硫酸マンガン、硫酸亜鉛、硫酸コバルト、炭酸カルシウム等が挙げられる。無機塩類は、１種を使用してもよく、２種以上を混合して使用してもよい。培養液中の無機塩類の濃度は、使用する無機塩類によっても異なるが、通常、約０．０１〜約１（ｗ／ｖ）％とすることができる。
【００８９】
さらに、必要に応じて、培養液は、ビタミン類を含有していてもよい。ビタミン類としては、ビオチン、チアミン（ビタミンB1）、ピリドキシン（ビタミンB6）、パントテン酸、イノシトール、ニコチン酸等が挙げられる。
【００９０】
培養液のｐＨは、ピルビン酸又はピルビン酸誘導体の生産に適したｐＨであれば、任意のｐＨであってもよい。培養液のｐＨは、好ましくは６〜８の範囲内とすることができる。培養液のｐＨの調整は、無機あるいは有機の酸、水酸化カリウム水溶液等のアルカリ溶液、尿素、炭酸カルシウム、アンモニア、４−モルホリノプロパンスルホン酸等を含むｐＨ緩衝液を用いて行うことができる。生産培養の間、必要に応じて培養液のｐＨを調整してもよい。
【００９１】
生産培養は、ピルビン酸又はピルビン酸誘導体の生産に適した温度で、ピルビン酸又はピルビン酸誘導体の生産に必要な期間にわたって行うことができる。生産培養における培養温度は、好ましくは約２０〜約５０℃、より好ましくは約２５〜約４７℃である。生産培養における培養時間は、約３時間〜７日間が好ましく、約１〜３日間がより好ましい。
【００９２】
生産培養は、バッチ式、流加式、連続式の何れでもよい。中でも、バッチ式が好ましい。
【００９３】
＜ピルビン酸又はピルビン酸誘導体の回収＞
上述の第１実施形態に従って、増殖培養およびその後の生産培養を行うと、培養液中にピルビン酸又はピルビン酸誘導体が生産される。
【００９４】
生産培養後に培養液を回収することによりピルビン酸又はピルビン酸誘導体を回収することができるが、さらに、公知の方法でピルビン酸又はピルビン酸誘導体を培養液から分離精製することもできる。そのような公知の方法として、蒸留法、濃縮法、イオン交換樹脂法、活性炭吸着溶離法、溶媒抽出法、晶析法等が挙げられる。回収したい物質の種類に応じて、適切な分離精製方法を選択することができる。例えば、ピルビン酸は、溶媒抽出法により分離精製することができる。例えば、酢酸は、蒸留法により分離精製することができる。
【００９５】
＜コリネ型細菌の反応経路＞
コリネ型細菌がピルビン酸又はピルビン酸誘導体を生産するプロセスを図１に示す。図１は、糖類の一例としてグルコースを使用する。
【００９６】
図１に示されるとおり、コリネ型細菌に取り込まれたグルコースは、解糖系を通じてピルビン酸に変換される。１モルのグルコースから２モルのピルビン酸が生産され、その生産プロセスにおいて、２モルのＮＡＤＨが生産される。グルコースからピルビン酸を生産するプロセスは、ＮＡＤＨ消費を伴う反応を含まない。したがって、グルコースからピルビン酸を生成する反応経路において、ＮＡＤＨは過剰に生産され、蓄積される。培養液中に硝酸塩を添加すると、硝酸イオンの亜硝酸イオンへの変換の際にＮＡＤＨが消費されるため、ＮＡＤＨの菌体内の蓄積が解消され、グルコースからピルビン酸を生成する反応がスムーズに進行し、結果としてピルビン酸の生産効率が高まると考えられる。
【００９７】
図１に示されるとおり、生産されたピルビン酸は、ピルビン酸オキシダーゼ（POX）により酢酸に変換される。１モルのグルコースから２モルの酢酸が生産され、その生産プロセスにおいて、４モルのＮＡＤＨが生産される。グルコースから酢酸を生産するプロセスは、ＮＡＤＨ消費を伴う反応を含まない。したがって、グルコースから酢酸を生成する反応経路において、ＮＡＤＨは過剰に生産され、蓄積される。培養液中に硝酸塩を添加すると、硝酸イオンの亜硝酸イオンへの変換の際にＮＡＤＨが消費されるため、ＮＡＤＨの菌体内の蓄積が解消され、グルコースから酢酸を生成する反応がスムーズに進行し、結果として酢酸の生産効率が高まると考えられる。
【００９８】
図１に示されるとおり、生産されたピルビン酸は、乳酸デヒドロゲナーゼ（LDH）により乳酸に変換される。１モルのグルコースから２モルの乳酸が生産され、その生産プロセスにおいて、２モルのＮＡＤＨが生産され、２モルのＮＡＤＨが消費される。したがって、グルコースから乳酸を生成する反応経路において、ＮＡＤＨの生産量と消費量は同じである。乳酸の生産については、ＮＡＤＨの過剰生産は起こっていないため、硝酸塩の添加による生産効率の向上効果を期待することはできない。
【００９９】
図１に示されるとおり、ピルビン酸の前駆物質であるホスホエノールピルビン酸は、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ（PPC）によりオキサロ酢酸に変換され、その後、コハク酸に変換される。１モルのグルコースから２モルのコハク酸が生産され、その生産プロセスにおいて、２モルのＮＡＤＨが生産され、４モルのＮＡＤＨが消費される。したがって、グルコースからコハク酸を生成する反応経路において、ＮＡＤＨは過剰に消費される。コハク酸の生産については、ＮＡＤＨの過剰生産は起こっていないため、硝酸塩の添加による生産効率の向上効果を期待することはできない。なお、コハク酸は、コハク酸を生成する上述の反応経路に加えて、弱い活性の反応経路であるが、ピルビン酸がピルビン酸カルボキシラーゼ（PYC）によりオキサロ酢酸に変換される反応経路によっても生産される。
【０１００】
＜大腸菌の反応経路＞
大腸菌がピルビン酸又はピルビン酸誘導体を生産するプロセスを図２に示す。図２は、糖類の一例としてグルコースを使用する。
【０１０１】
図２に示されるとおり、大腸菌に取り込まれたグルコースは、解糖系を通じてピルビン酸に変換される。１モルのグルコースから２モルのピルビン酸が生産され、その生産プロセスにおいて、２モルのＮＡＤＨが生産される。グルコースからピルビン酸を生産するプロセスは、ＮＡＤＨ消費を伴う反応を含まない。したがって、グルコースからピルビン酸を生成する反応経路において、ＮＡＤＨは過剰に生産され、蓄積される。培養液中に硝酸塩を添加すると、硝酸イオンの亜硝酸イオンへの変換の際にＮＡＤＨが消費されるため、ＮＡＤＨの菌体内の蓄積が解消され、グルコースからピルビン酸を生成する反応がスムーズに進行し、結果としてピルビン酸の生産効率が高まると考えられる。
【０１０２】
図２に示されるとおり、生産されたピルビン酸は、ピルビン酸オキシダーゼ（POX）により酢酸に変換される。１モルのグルコースから２モルの酢酸が生産され、その生産プロセスにおいて、４モルのＮＡＤＨが生産される。グルコースから酢酸を生産するプロセスは、ＮＡＤＨ消費を伴う反応を含まない。したがって、グルコースから酢酸を生成する反応経路において、ＮＡＤＨは過剰に生産され、蓄積される。培養液中に硝酸塩を添加すると、硝酸イオンの亜硝酸イオンへの変換の際にＮＡＤＨが消費されるため、ＮＡＤＨの菌体内の蓄積が解消され、グルコースから酢酸を生成する反応がスムーズに進行し、結果として酢酸の生産効率が高まると考えられる。
【０１０３】
図２に示されるとおり、生産されたピルビン酸は、乳酸デヒドロゲナーゼ（LDH）により乳酸に変換される。１モルのグルコースから２モルの乳酸が生産され、その生産プロセスにおいて、２モルのＮＡＤＨが生産され、２モルのＮＡＤＨが消費される。したがって、グルコースから乳酸を生成する反応経路において、ＮＡＤＨの生産量と消費量は同じである。乳酸の生産については、ＮＡＤＨの過剰生産は起こっていないため、硝酸塩の添加による生産効率の向上効果を期待することはできない。
【０１０４】
図２に示されるとおり、生産されたピルビン酸は、ピルビン酸ギ酸リアーゼ（PFL）によりギ酸に変換される。１モルのグルコースから２モルのギ酸が生産され、その生産プロセスにおいて、２モルのＮＡＤＨが生産され、２モルのＮＡＤＨが消費される。したがって、グルコースからギ酸を生成する反応経路において、ＮＡＤＨの生産量と消費量は同じである。ギ酸の生産については、ＮＡＤＨの過剰生産は起こっていないため、硝酸塩の添加による生産効率の向上効果を期待することはできない。また、ギ酸は硝酸存在下では二酸化炭素に変換されることも知られている。
【０１０５】
図２に示されるとおり、ピルビン酸の前駆物質であるホスホエノールピルビン酸は、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ（PPC）によりオキサロ酢酸に変換され、その後、コハク酸に変換される。１モルのグルコースから２モルのコハク酸が生産され、その生産プロセスにおいて、２モルのＮＡＤＨが生産され、４モルのＮＡＤＨが消費される。したがって、グルコースからコハク酸を生成する反応経路において、ＮＡＤＨは過剰に消費される。コハク酸の生産については、ＮＡＤＨの過剰生産は起こっていないため、硝酸塩の添加による生産効率の向上効果を期待することはできない。
【０１０６】
２−２．第２実施形態
第２実施形態によれば、ＮＡＤＨが蓄積する反応経路を経て糖類からピルピン酸又はピルビン酸を中間代謝物として経由して生合成される化合物（以下、ピルピン酸誘導体ともいう）を製造する方法は、
乳酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子（ldh）、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼをコードする遺伝子（ppc）、ピルビン酸オキシダーゼをコードする遺伝子（pox）、及びピルビン酸ギ酸リアーゼをコードする遺伝子（pfl）からなる群より選択される１以上の遺伝子の機能が欠損している細菌を、糖類と硝酸イオンとの存在下において、嫌気的条件下でインキュベートして、ピルビン酸又はピルビン酸を中間代謝物として経由して生合成される化合物を生産すること
を含む。
【０１０７】
第２実施形態に係る方法は、嫌気的条件下での生産培養を含み、好気的条件下での増殖培養を含んでいても含んでいなくてもよい。第２実施形態に係る方法は、上述の「ldh、ppc、pox及びpflからなる群より選択される１以上の遺伝子の機能が欠損している細菌」を使用することを除いて、第１実施形態に係る方法と同様の手順で実施することができる。
【０１０８】
「ldh、ppc、pox及びpflからなる群より選択される１以上の遺伝子の機能が欠損している細菌」は、「２−１．第１実施形態」の欄の説明を参照することができる。
【０１０９】
「ldh、ppc、pox及びpflからなる群より選択される１以上の遺伝子の機能が欠損している細菌」は、乳酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子（ldh）の欠失株であってもよいし、乳酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子（ldh）及びホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼをコードする遺伝子（ppc）の欠失株であってもよいし、乳酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子（ldh）、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼをコードする遺伝子（ppc）及びピルビン酸オキシダーゼをコードする遺伝子（pox）の欠失株であってもよい。これら欠失株は、好ましくはコリネ型細菌の欠失株である。
【０１１０】
あるいは、「ldh、ppc、pox及びpflからなる群より選択される１以上の遺伝子の機能が欠損している細菌」は、ピルビン酸ギ酸リアーゼをコードする遺伝子（pfl）の欠失株であってもよいし、ピルビン酸ギ酸リアーゼをコードする遺伝子（pfl）及び乳酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子（ldh）の欠失株であってもよい。これら欠失株は、好ましくは大腸菌の欠失株である。
【０１１１】
細菌として「ldh、ppc、pox及びpflからなる群より選択される１以上の遺伝子の機能が欠損している細菌」を使用すると、「２−１．第１実施形態」の欄で説明したとおり、出発物質として加えた糖類をピルビン酸又はピルビン酸誘導体の生産に効率良く向かうようにすることができる。
【０１１２】
また、細菌は、嫌気的条件下に置かれると、実質的に増殖しないため、糖類を、増殖のためのエネルギー源としてではなく、物質生産の原料として効率良く利用することができる。
【０１１３】
また、細菌は、硝酸イオンの存在下に置かれると、下記の反応式（１）により硝酸イオンを亜硝酸イオンへ還元し、この反応の際にＮＡＤＨを消費することができる。
ＮＯ3− ＋ ＮＡＤＨ ＋ Ｈ+ → ＮＯ2− ＋ ＮＡＤ+ ＋ Ｈ2Ｏ  …（１）
【０１１４】
この反応により、細菌は、グルコースからピルビン酸を生産する過程で生じるＮＡＤＨを消費し、ＮＡＤＨの菌体内の蓄積を解消し、これにより、糖類の菌体内への取り込みを促進するとともに、糖類からピルビン酸を生産する反応を促進することができる。
【０１１５】
したがって、第２実施形態に従って、特定の遺伝子の機能が欠損している細菌を、嫌気的条件下において、糖類と硝酸イオンとの存在下でインキュベートすると、細菌は、糖類からピルビン酸又はピルビン酸誘導体を効率良く生産することができる。
【０１１６】
３．好ましい実施形態
以下に、本発明の好ましい実施形態をまとめて示す。
【０１１７】
［Ａ１］ＮＡＤＨが蓄積する反応経路を経て出発物質から目的物質を製造する方法であって、
細菌を好気的条件下でインキュベートすることと、
その後、前記細菌を、前記出発物質と硝酸イオンとの存在下において、嫌気的条件下でインキュベートして、前記目的物質を生産することと
を含む方法。
［Ａ２］前記細菌を、前記出発物質と硝酸イオンとの存在下においてインキュベートすることは、前記細菌を、前記出発物質および硝酸イオンを含む培養液中でインキュベートすることにより行われる［Ａ１］に記載の方法。
［Ａ３］前記細菌を、前記出発物質と硝酸イオンとの存在下においてインキュベートすることは、前記細菌を、前記出発物質および硝酸塩を添加した培養液中でインキュベートすることにより行われる［Ａ１］または［Ａ２］に記載の方法。
【０１１８】
［Ａ４］前記硝酸塩は、硝酸アンモニウム、硝酸ナトリウム、硝酸カリウム、またはこれらの組合せである［Ａ３］に記載の方法。
［Ａ５］前記硝酸塩は、前記培養液中で１０〜５００ｍＭ、好ましくは１００〜５００ｍＭ、より好ましくは２００〜３００ｍＭの濃度になるように添加される［Ａ３］または［Ａ４］に記載の方法。
［Ａ６］前記細菌は、好気性細菌である［Ａ１］〜［Ａ５］の何れか１に記載の方法。
【０１１９】
［Ａ７］前記細菌は、コリネ型細菌、好ましくはコリネバクテリウム属（Corynebacterium）菌、より好ましくはコリネバクテリウム  グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）である［Ａ１］〜［Ａ６］の何れか１に記載の方法。
［Ａ８］前記細菌は、大腸菌（Escherichia coli）である［Ａ１］〜［Ａ６］の何れか１に記載の方法。
［Ａ９］前記細菌は、乳酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼをコードする遺伝子、ピルビン酸オキシダーゼをコードする遺伝子、及びピルビン酸ギ酸リアーゼをコードする遺伝子からなる群より選択される１以上の遺伝子の機能が欠損している［Ａ１］〜［Ａ８］の何れか１に記載の方法。
【０１２０】
［Ａ１０］前記出発物質は、糖類である［Ａ１］〜［Ａ９］の何れか１に記載の方法。
［Ａ１１］前記出発物質は、糖類であり、前記目的物質は、「ピルビン酸」又は「解糖系の代謝産物を中間代謝物として経由して生合成される化合物」である［Ａ１］〜［Ａ１０］の何れか１に記載の方法。
［Ａ１２］前記糖類は、単糖、例えばフルクトースもしくはグルコース；二糖、例えばスクロース；多糖、例えば構成単糖としてグルコースを含む多糖；または植物（例えば非可食農産廃棄物またはエネルギー作物）を糖化酵素で処理することにより得られた糖化液である［Ａ１０］または［Ａ１１］に記載の方法。
【０１２１】
［Ａ１３］前記糖類はグルコースである［Ａ１０］〜［Ａ１２］の何れか１に記載の方法。
［Ａ１４］前記細菌が前記硝酸イオンを還元することにより生成された亜硝酸イオンを、過酸化水素と反応させて、硝酸イオンに酸化することを更に含む［Ａ１］〜［Ａ１３］の何れか１に記載の方法。
［Ａ１５］前記細菌を嫌気的条件下でインキュベートすることは、前記細菌を培養液中に高密度に懸濁させた状態で行われる［Ａ１］〜［Ａ１４］の何れか１に記載の方法。
【０１２２】
［Ａ１６］前記細菌を嫌気的条件下でインキュベートすることは、前記細菌を培養液中に、細菌の湿菌体重量％が１〜５０（ｗ／ｖ）％、好ましくは３〜３０（ｗ／ｖ）％の範囲内になるように懸濁させた状態で行われる［Ａ１］〜［Ａ１５］の何れか１に記載の方法。
［Ａ１７］生産された前記目的物質を回収することを更に含む［Ａ１］〜［Ａ１６］の何れか１に記載の方法。
［Ａ１８］ＮＡＤＨが蓄積する前記反応経路は、
ＮＡＤＨ産生を伴う反応を含むが、ＮＡＤＨ消費を伴う反応を含まない反応経路、又は
ＮＡＤＨ産生を伴う反応と、ＮＡＤＨ消費を伴う反応とを含み、ＮＡＤＨ産生を伴う反応において生産されるＮＡＤＨ分子の総数が、ＮＡＤＨ消費を伴う反応において消費されるＮＡＤＨ分子の総数より多い反応経路
である［Ａ１］〜［Ａ１７］の何れか１に記載の方法。
【０１２３】
［Ｂ１］ＮＡＤＨが蓄積する反応経路を経て糖類からピルビン酸又はピルビン酸を中間代謝物として経由して生合成される化合物を製造する方法であって、
細菌を好気的条件下でインキュベートすることと、
その後、前記細菌を、糖類と硝酸イオンとの存在下において、嫌気的条件下でインキュベートして、ピルビン酸又はピルビン酸を中間代謝物として経由して生合成される化合物を生産することと
を含む方法。
［Ｂ２］前記細菌は、乳酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼをコードする遺伝子、ピルビン酸オキシダーゼをコードする遺伝子、及びピルビン酸ギ酸リアーゼをコードする遺伝子からなる群より選択される１以上の遺伝子の機能が欠損している［Ｂ１］に記載の方法。
【０１２４】
［Ｂ３］ＮＡＤＨが蓄積する反応経路を経て糖類からピルビン酸又はピルビン酸を中間代謝物として経由して生合成される化合物を製造する方法であって、
乳酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼをコードする遺伝子、ピルビン酸オキシダーゼをコードする遺伝子、及びピルビン酸ギ酸リアーゼをコードする遺伝子からなる群より選択される１以上の遺伝子の機能が欠損している細菌を、糖類と硝酸イオンとの存在下において、嫌気的条件下でインキュベートして、ピルビン酸又はピルビン酸を中間代謝物として経由して生合成される化合物を生産することを含む方法。
［Ｂ４］ピルビン酸を生産する［Ｂ１］〜［Ｂ３］の何れか１に記載の方法。
［Ｂ５］ピルビン酸を中間代謝物として経由して生合成される化合物を生産する［Ｂ１］〜［Ｂ３］の何れか１に記載の方法。
［Ｂ６］ピルビン酸を中間代謝物として経由して生合成される前記化合物は、酢酸である請求項［Ｂ１］、［Ｂ２］、［Ｂ３］又は［Ｂ５］に記載の方法。
【０１２５】
［Ｂ７］前記細菌は、乳酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子の欠失株である［Ｂ１］乃至［Ｂ６］の何れか１に記載の方法。
［Ｂ８］前記細菌は、乳酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子及びホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼをコードする遺伝子の欠失株である［Ｂ１］〜［Ｂ６］の何れか１に記載の方法。
［Ｂ９］前記細菌は、乳酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼをコードする遺伝子及びピルビン酸オキシダーゼをコードする遺伝子の欠失株である［Ｂ１］〜［Ｂ６］の何れか１に記載の方法。
【０１２６】
［Ｂ１０］前記細菌は、好気性細菌、好ましくはコリネ型細菌、より好ましくはコリネバクテリウム属（Corynebacterium）菌、更に好ましくはコリネバクテリウム  グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）である［Ｂ１］〜［Ｂ９］の何れか１に記載の方法。
［Ｂ１１］前記細菌は、ピルビン酸ギ酸リアーゼをコードする遺伝子の欠失株である［Ｂ１］〜［Ｂ６］の何れか１に記載の方法。
［Ｂ１２］前記細菌は、ピルビン酸ギ酸リアーゼをコードする遺伝子及び乳酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子の欠失株である［Ｂ１］〜［Ｂ６］の何れか１に記載の方法。
【０１２７】
［Ｂ１３］前記細菌は、好気性細菌、好ましくは大腸菌（Escherichia coli）である［Ｂ１］〜［Ｂ６］、［Ｂ１１］及び［Ｂ１２］の何れか１に記載の方法。
［Ｂ１４］前記細菌を、前記糖類と硝酸イオンとの存在下においてインキュベートすることは、前記細菌を、前記糖類および硝酸イオンを含む培養液中でインキュベートすることにより行われる［Ｂ１］〜［Ｂ１３］の何れか１に記載の方法。
［Ｂ１５］前記細菌を、前記糖類と硝酸イオンとの存在下においてインキュベートすることは、前記細菌を、前記糖類および硝酸塩を添加した培養液中でインキュベートすることにより行われる［Ｂ１］〜［Ｂ１４］の何れか１に記載の方法。
【０１２８】
［Ｂ１６］前記糖類は、前記培養液中で０．１〜４０（ｗ／ｖ）％、好ましくは１〜２０（ｗ／ｖ）％の濃度になるように添加される［Ｂ１５］に記載の方法。
［Ｂ１７］前記硝酸塩は、前記培養液中で１０〜５００ｍＭ、好ましくは１００〜５００ｍＭ、より好ましくは２００〜３００ｍＭの濃度になるように添加される［Ｂ１５］または［Ｂ１６］に記載の方法。
［Ｂ１８］前記糖類は、単糖、例えばフルクトースもしくはグルコース；二糖、例えばスクロース；多糖、例えば構成単糖としてグルコースを含む多糖；または植物（例えば非可食農産廃棄物またはエネルギー作物）を糖化酵素で処理することにより得られた糖化液である［Ｂ１］〜［Ｂ１７］の何れか１に記載の方法。
【０１２９】
［Ｂ１９］前記糖類はグルコースである［Ｂ１］〜［Ｂ１８］の何れか１に記載の方法。
［Ｂ２０］前記硝酸イオンは、硝酸塩の形態で培養液に添加され、前記硝酸塩は、硝酸アンモニウム、硝酸ナトリウム、硝酸カリウム、またはこれらの組合せである［Ｂ１］〜［Ｂ１９］の何れか１に記載の方法。
［Ｂ２１］前記細菌が前記硝酸イオンを還元することにより生成された亜硝酸イオンを、過酸化水素と反応させて、硝酸イオンに酸化することを更に含む［Ｂ１］〜［Ｂ２０］の何れか１に記載の方法。
【０１３０】
［Ｂ２２］前記細菌を嫌気的条件下でインキュベートすることは、前記細菌を培養液中に高密度に懸濁させた状態で行われる［Ｂ１］〜［Ｂ２１］の何れか１に記載の方法。
［Ｂ２３］前記細菌を嫌気的条件下でインキュベートすることは、前記細菌を培養液中に、細菌の湿菌体重量％が１〜５０（ｗ／ｖ）％、好ましくは３〜３０（ｗ／ｖ）％の範囲内になるように懸濁させた状態で行われる［Ｂ１］〜［Ｂ２２］の何れか１に記載の方法。
［Ｂ２４］生産されたピルビン酸又はピルビン酸を中間代謝物として経由して生合成される化合物を回収することを更に含む［Ｂ１］〜［Ｂ２３］の何れか１に記載の方法。
［Ｂ２５］ＮＡＤＨが蓄積する前記反応経路は、
ＮＡＤＨ産生を伴う反応を含むが、ＮＡＤＨ消費を伴う反応を含まない反応経路、又は
ＮＡＤＨ産生を伴う反応と、ＮＡＤＨ消費を伴う反応とを含み、ＮＡＤＨ産生を伴う反応において生産されるＮＡＤＨ分子の総数が、ＮＡＤＨ消費を伴う反応において消費されるＮＡＤＨ分子の総数より多い反応経路
である［Ｂ１］〜［Ｂ２４］の何れか１に記載の方法。
【実施例】
【０１３１】
１．ldh遺伝子の欠失株（Δldh）の作製
コリネバクテリウム  グルタミカム  ATCC13032における欠失株は以下の方法で作製した。【０１３２】
SacB遺伝子は、pNIC-Bsa4 (Source Bioscience)から、プライマー
5’ - GGGGAAGCTTGACGTCCACATATACCTGCC - 3’（配列番号１）
5’ - ATTCGGATCCGTATCCACCTTTAC - 3’（配列番号２）
を用い、酵素はPrimeStar MAX (TAKARA)を用いて、サーマルサイクラー  Ｔ１００TM （BIO-RAD） を使用して増幅した。得られたDNA断片およびプラスミドpHSG299 （TAKARA） を、BamHIおよびHindIII で制限酵素処理した後、DNA ligation Kit Ver. 2 (TAKARA)によりライゲーションを行い、pGE015を得た。【０１３３】
さらに、ATCC13032のゲノムDNAを鋳型として、ldh遺伝子の上流1000bpを、
5’ - GACGGCCAGTGAATTTTTCATACGACCACGGGCTA - 3’（配列番号３）
5’ - GACAATCTTGTTACCGACGG - 3’（配列番号４）
を用いて、下流1000bpを
5’ - GGTAACAAGATTGTCACCCTGCGCGAAATTCAGAA - 3’（配列番号５）
5’ - TACCGAGCTCGAATTGAACTCACTGAAAAATGCTG - 3’（配列番号６）
を用いて同様の方法で増幅した。得られたDNA断片を、pGE015をEcoRIで制限酵素処理したベクターに、In-Fusion cloning kit（TAKARA）を用いてクローニングをして、これをpGE033とした。【０１３４】
プラスミドpGE033は、ldh遺伝子の欠失した断片を含み、コリネバクテリウム属内で複製不可能なプラスミドである。プラスミドpGE033を、電気パルス法（2500V, 25μF, 200Ω；Van der Rest et al. Appl.Microbiol Biotechnol 52, 541-545, 1999）の方法に従って、コリネバクテリウム  グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）ATCC13032株へ導入し、カナマイシン25μｇ／ｍｌを含むＡ寒天培地（１Ｌ［組成：尿素：２ｇ，（ＮＨ４）２ＳＯ４：７ｇ，ＫＨ２ＰＯ４：０．５ｇ，Ｋ２ＨＰＯ４：０．５ｇ，ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ：０．５ｇ，ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ：６ｍｇ，ＭｎＳＯ４・ｎＨ２Ｏ：４．２ｍｇ，Ｄ−ビオチン：２００μｇ，塩酸チアミン：２００μｇ，酵母エキス：２ｇ，カザミノ酸：７ｇ，グルコース：２０ｇ，寒天：１６ｇを蒸留水に１０００ｍｌ溶解（ｐＨ６．６）］）に塗布した。【０１３５】
上記のカナマイシン５０μｇ／ｍｌを含むＡ寒天培地上で増殖した生育株は、pGE033が染色体上の野生型ｌｄｈ遺伝子と１点相同性組換えを起こして、プラスミドごとゲノムDNAに組み込まれた株である。この株を、１０％のスクロースを加えたLB寒天培地（バクトペプトン：１０g、酵母エキス：５g、塩化ナトリウム：１０g、寒天：１６g／１L）に塗布すると、SacB遺伝子をもった菌体は毒性の物質を細胞に溜めるため生きることができず、SacB遺伝子が抜け落ちた株のみ生き残る。このとき、もとのpGE033の形でプラスミドが抜け落ちる場合は野生型ATCC13032株に戻るが、ldh遺伝子を持ち込んでプラスミドが抜ける場合は、ldh遺伝子の欠失株が残る。【０１３６】
ldh遺伝子の欠失株の選択は、プライマーは上記の
5’ - GACGGCCAGTGAATTTTTCATACGACCACGGGCTA - 3’（配列番号３）
5’ - TACCGAGCTCGAATTGAACTCACTGAAAAATGCTG - 3’（配列番号６）
を用いてコロニーを鋳型としたPCR法（コロニーPCR）でおこなった。欠失株であれば、２kbのldh遺伝子が欠失したDNA断片が得られるはずであり、これをアガロース電気泳動法（Molecular Cloning, Sambrook et al., 1989 Cold Spring Harbor Laboratory Press）で確認して、欠失断片が確認されたコロニーを欠失株（ATCC13032Δldh）として選択した。【０１３７】
２．ldh遺伝子およびppc遺伝子の欠失株（ΔldhΔppc）の作製
ppc遺伝子の欠失は、ldh遺伝子の欠失と同様の方法に従って以下のとおり行った。ATCC13032のゲノムDNAを鋳型として、ppc遺伝子の上流1000bpを、
5’ - CCATGATTACGAATTCGGGAAACTTTTTTAAGAAA - 3’（配列番号７）
5’ - TAACTACTTTAAACACTCTT - 3’（配列番号８）
を用いて、下流1000bpを
5’ - TGTTTAAAGTAGTTATCCAGCCGGCTGGGTAGTAC - 3’（配列番号９）
5’ - TACCGAGCTCGAATTGAAGTATTCAAGGGGATTTC - 3’（配列番号１０）
を用いて同様の方法で増幅した。得られたDNA断片を、pGE015をEcoRIで制限酵素処理したベクターに、In-Fusion cloning kit（TAKARA）を用いてクローニングをして、これをpGE020とした。プラスミドpGE020を、電気パルス法の方法に従って、ATCC13032Δldh株に導入し、前述と同様の方法で、ldh遺伝子およびppc遺伝子の欠失株（ATCC13032ΔldhΔppc）を得た。【０１３８】
３．ldh遺伝子、ppc遺伝子およびpox遺伝子の欠失株（ΔldhΔppcΔpox）の作製
pox遺伝子の欠失は、ldh遺伝子の欠失と同様の方法に従って以下のとおり行った。ATCC13032のゲノムDNAを鋳型として、pox遺伝子の上流1000bpを、
5’ - GACGGCCAGTGAAAACGTTAATGAGGAAAACCG - 3’（配列番号１１）
5’ - AATTAATTGTTCTGCGTAGC - 3’（配列番号１２）
を用いて、下流1000bpを
5’ - GCAGAACAATTAATTCTCGAGTCGAACATAAGGAATATTCC - 3’（配列番号１３）
5’ - TACCGAGCTCGAATTTTCCAGGTACGGAAAGTGCC - 3’（配列番号１４）
を用いて同様の方法で増幅した。得られたDNA断片を、pGE15をEcoRIで制限酵素処理したベクターに、In-Fusion cloning kit（TAKARA）を用いてクローニングをして、これをpGE191とした。プラスミドpGE191を、電気パルス法の方法に従って、ATCC13032ΔldhΔppc株に導入し、前述と同様の方法で、ldh遺伝子、ppc遺伝子およびpox遺伝子の欠失株（ATCC13032ΔldhΔppcΔpoxB）を得た。【０１３９】
４．pflB遺伝子の欠失株（ΔpflB）の作製
大腸菌の欠失株の作製は、Datsenko and Wanner（Proc Natl Acad Sci U S A 2000, 97: 6640-6645.）の方法に従った。大腸菌BW25113株にpKD46 (Life Science Market)を形質転換した株を、３０℃で、100mlのLB培地に10mMのアラビノースを入れた培地で、OD600が0.6付近になるまで培養した。菌体は10%グルセロールで３回洗い、最終的に１mlの１０％グルセロールに懸濁した。pflB遺伝子欠失株の作製には、pKD13 (Life Science Market)を鋳型に以下のプライマーを用いて増幅した遺伝子断片を用いた。【０１４０】
5’-CGAAGTACGCAGTAAATAAAAAATCCACTTAAGAAGGTAGGTGTTACATGATTCCGGGGATCCGTCGACC-3’（配列番号１５）
5’-TTTTACTGTACGATTTCAGTCAAATCTAATTACATAGATTGAGTGAAGGTTGTAGGCTGGAGCTGCTTCG-3’（配列番号１６）
PCR産物はNucleoSpin Gel and PCR Clean-up (TAKARA)を用いて精製した。【０１４１】
上記で調製したコンピテントセル１５０μlに、上記で調製したPCR産物１０μlを加えて、電気パルス法（2500V, 25μF, 200Ω）で遺伝子導入を行った。カナマイシン５０μｇ／ｍｌを含むLB寒天培地上で増殖した生育株を選択した。欠失の確認は、菌体を培養し上清を有機酸分析して蟻酸を生産しなくなったことで行った。有機酸の測定には、TSKgel OApak (TOSOH)のカラムを用いてHPLC分析で同定した。【０１４２】
BW25113ΔpflB::Km株にpCP20 (Life Science Market)を３０℃で形質転換した株を、薬剤を含まないLBプレートにストリークして４２℃で培養した。pCP20は、高温でカナマイシン耐性遺伝子のカセットを抜け落とすFlpリコンビナーゼが発現するように設計されている。４２℃で培養したプレートから、カナマイシンに感受性になっているコロニーを選択してこれをpflB遺伝子の欠失株（BW25113ΔpflB）とした。【０１４３】
５．pflB遺伝子およびldhA遺伝子の欠失株（ΔpflBΔldh）の作製
BW25113ΔpflB株にpKD46 (Life Science Market)を形質転換した株を、上記の方法でコンピテントセルを調製し、ldhAをカナマイシン耐性遺伝子で置き換えたDNA断片を上記の方法で形質転換した。ldhAをカナマイシン耐性遺伝子で置き換えたDNA断片は、pKD13を鋳型に以下のプライマーでPCR反応を行い調製した。【０１４４】
5’-CTGCCGGGAAATGACTGTCCGCAAGGAAAAGAGTGTGAGGAAAAACAATGATTCCGGGGATCCGTCGACC-3’（配列番号１７）
5’-AAAGAAGTAATGTTTTCTTCATCATCACCTCAGAAAAGATCGCTACGAGTTGTAGGCTGGAGCTGCTTCG-3’（配列番号１８）
PCR産物はNucleoSpin Gel and PCR Clean-up (TAKARA)を用いて精製した。形質転換体の欠失の確認は、菌体を培養し上清を有機酸分析して乳酸を生産しなくなったことで行った。これにより、pflB遺伝子およびldhA遺伝子の欠失株（BW25113ΔpflBΔldh）を得た。【０１４５】
６．ピルビン酸およびピルビン酸誘導体の製造例１
コリネバクテリウム  グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）ATCC13032、ATCC13032Δldh、ATCC13032ΔldhΔppc、ATCC13032ΔldhΔppcΔpoxBをそれぞれ５mlのＡ培地で前培養（試験管）して、これを、２Lフラスコにいれた５００mlのＡ培地で３３℃、１８０rpmで２０時間振盪培養した（増殖培養）。【０１４６】
培養後、細胞は遠心して培養液を除き、５０mlのBT液（（ＮＨ４）２ＳＯ４：７ｇ，ＫＨ２ＰＯ４：０．５ｇ，Ｋ２ＨＰＯ４：０．５ｇ，ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ：０．５ｇ，ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ：６ｍｇ，ＭｎＳＯ４・ｎＨ２Ｏ：４．２ｍｇ/L）に懸濁し、ODが１００付近になるように調整した（湿菌体重量  １２（ｗ／ｖ）％）。これを、撹拌子を入れた１００mlメディウム瓶に移し、さらに2.5mlの５０％グルコースと、2.5mlの6M NaNO3（表１では「+NaNO3」と表記する）または2.5mlの水（表１では「-NaNO3」と表記する）の何れかを加えた。NaNO3は、培養液中、250mMであった。【０１４７】
このメディウム瓶を３３℃の恒温槽に入れ静置し、撹拌しながら反応させた（生産培養）。pHはpHコントローラーを使って、2.5N KOHでpH6.5に調節した。【０１４８】
１時間後、反応液を0.5mlとり遠心して上清をとり、消費したグルコースの量と生産した有機酸の量を測定した。【０１４９】
グルコースの測定は、バイオセンサーBF-7（王子計測機器株式会社）を用いて行った。有機酸の測定は、TSKgel OA-pack（東ソー株式会社）のカラムを有機酸分析HPLC装置（島津製作所）に取り付けて行った。【０１５０】
結果を以下の表に示す。【０１５１】
【表１】
2020084713.tif 000003
【０１５２】
表１に示されるとおり、ATCC13032、ldh遺伝子の欠失株（Δldh）、ldh遺伝子およびppc遺伝子の欠失株（ΔldhΔppc）、ldh遺伝子、ppc遺伝子およびpox遺伝子の欠失株（ΔldhΔppcΔpox）のいずれのコリネ型細菌を用いた場合も、硝酸ナトリウムを添加した場合、硝酸ナトリウムを添加しなかった場合と比べて、ピルビン酸の生産量および酢酸の生産量を増大させることができた。ただし、ΔldhΔppcΔpoxのみ、硝酸ナトリウムの添加により酢酸を生産することができなかったが、これは、pox遺伝子を欠失させたためである。この結果は、グルコースからアセチルＣｏＡを経て酢酸を生成する経路（pta-ackA, ctfA）は動いていないこと、並びに、９割以上の炭素がピルビン酸として排出されていることから考えても、ピルビン酸還元酵素（AceEF, Ldh）が働いていないことを示す。ＮＡＤＨの蓄積を解消することは、空気（酸素）を吹き込むことでも行うことができるが、この場合、ピルビン酸還元酵素が働き、ＴＣＡ回路も動いてしまう。一方、硝酸塩の添加によりＮＡＤＨの蓄積を解消することは、ピルビン酸還元酵素を動かすことなくＮＡＤＨの蓄積を解消できるという点において、極めて優れた方法である。【０１５３】
硝酸ナトリウムを添加した場合のデータから以下のことが分かる（表１の、ATCC13032(+NaNO3)、Δldh(+NaNO3)、ΔldhΔppc(+NaNO3)、およびΔldhΔppcΔpoxB(+NaNO3)のデータを参照）。ATCC13032のldh遺伝子を欠失させると、ピルビン酸の生産量を更に増大させることができた。ldh遺伝子の欠失株（Δldh）のppc遺伝子を欠失させると、ピルビン酸の生産量を更に増大させることができた。ldh遺伝子およびppc遺伝子の欠失株（ΔldhΔppc）のpox遺伝子を欠失させると、ピルビン酸の生産量を更に増大させることができた。【０１５４】
７．ピルビン酸およびピルビン酸誘導体の製造例２
製造例１では、生産培養は、増殖培養の後、培養液の交換を行ってから行ったが、製造例２では、生産培養は、増殖培養の後、培養液の交換を行うことなく、グルコースおよび硝酸ナトリウムを追加することにより行った。【０１５５】
ATCC13032ΔldhΔppcΔpoxBを５mlのＡ培地で前培養（試験管）して、これを500mLフラスコにいれた５０mlのＡ培地で３３℃、１８０rpmで２０時間振盪培養した（増殖培養）。【０１５６】
培養後BT液への置換は行わず、撹拌子を入れた１００mlメディウム瓶に移し、さらに１mlの５０％グルコースと、１mlの6M NaNO3（表２では「+NaNO3」と表記する）または１mlの水（表２では「-NaNO3」と表記する）の何れかを加えた。NaNO3は、培養液中、100mMであった。このメディウム瓶を３３℃の恒温槽に入れ静置し、撹拌しながら反応させた（生産培養）。pHはpHコントローラーを使って、2.5N KOHでpH6.5に調節した。【０１５７】
８時間後、反応液を0.5mlとり遠心して上清をとり、消費したグルコースの量と生産した有機酸の量を測定した。【０１５８】
結果を以下の表に示す。【０１５９】
【表２】
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【０１６０】
表２に示されるとおり、ldh遺伝子、ppc遺伝子およびpox遺伝子の欠失株（ΔldhΔppcΔpox）は、硝酸ナトリウムの添加を添加した場合、硝酸ナトリウムを添加しなかった場合と比べて、ピルビン酸の生産量を増大させることができた。ΔldhΔppcΔpoxは、硝酸ナトリウムの添加により酢酸を生産できなかったが、これは、pox遺伝子を欠失させたためである。【０１６１】
この結果から、増殖培養と生産培養の間で培地交換を行うことが必ずしも必要でないことが分かった。【０１６２】
８．ピルビン酸およびピルビン酸誘導体の製造例３
大腸菌BW25113、BW25113ΔpflB、BW25113ΔpflBΔldhA、をそれぞれ５mlのLB培地で前培養（試験管）して、これを５００mLフラスコにいれた１００mlのterrific培地(バクトペプトン：１２g、酵母エキス：２４g、グルセロール：４ml、ＫＨ２ＰＯ４：２.３１ｇ，Ｋ２ＨＰＯ４：１２.５４ｇ)で３７℃、１８０rpmで２０時間振盪培養した（増殖培養）。【０１６３】
培養後、細胞は遠心して培養液を除き、５０mlのBT液に懸濁してOD２４付近になるように濃度を調整した（湿菌体重量  ３（ｗ／ｖ）％）。これを、撹拌子を入れた１００mlメディウム瓶に移し、さらに１mlの５０％グルコースと、１mlの6M NaNO3（表３では「+NaNO3」と表記する）または１mlの水（表３では「-NaNO3」と表記する）の何れかを加えた。NaNO3は、培養液中、120mMであった。【０１６４】
このメディウム瓶を３７℃の恒温槽に入れ静置し、撹拌しながら反応させた（生産培養）。pHはpHコントローラーを使って、2.5N KOHでpH6.5に調節した。【０１６５】
４時間後、反応液を0.5mlとり遠心して上清をとり、消費したグルコースの量と生産した有機酸の量を測定した。【０１６６】
結果を以下の表に示す。【０１６７】
【表３】
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【０１６８】
表３に示されるとおり、BW25113、pflB遺伝子の欠失株（ΔpflB）、pflB遺伝子およびldh遺伝子の欠失株（ΔpflBΔldh）のいずれの大腸菌を用いた場合も、硝酸ナトリウムを添加した場合、硝酸ナトリウムを添加しなかった場合と比べて、ピルビン酸の生産量および酢酸の生産量を増大させることができた。【０１６９】
硝酸ナトリウムを添加した場合のデータから以下のことが分かる（表３の、BW25113(+NaNO3)、ΔpflB(+NaNO3)、およびΔpflBΔldh(+NaNO3)のデータを参照）。BW25113のpflB遺伝子を欠失させると、ピルビン酸の生産量を更に増大させることができた。pflB遺伝子の欠失株（ΔpflB）のldh遺伝子を欠失させると、ピルビン酸の生産量を更に増大させることができた。
【図１】
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【図２】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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