【手続補正書】
【提出日】平成20年12月18日(2008.12.18)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ホルムアルデヒドおよびシアン化水素からグリコール酸を製造するための方法であって、
（ａ）特定可能な時間にわたって約９０℃〜約１５０℃の温度に加熱された水性ホルムアルデヒド供給流れを提供するステップと、
（ｂ）（ａ）の加熱された水性供給流れをグリコロニトリル合成に適切な温度でシアン化水素と接触させ、それによってグリコロニトリルが製造されるステップと、
（ｃ）ステップ（ｂ）のグリコロニトリルを適切な水性反応混合物中でニトリラーゼ活性を有するポリペプチドを含む酵素触媒と接触させるステップであって、前記ポリペプチドが、
１）アミノ酸残基１６８でのリシン、メチオニン、トレオニン、またはバリンによる置換、および
２）アミノ酸残基２０１でのグルタミン、グリシン、ヒスチジン、リシン、アスパラギン、セリン、アラニン、システイン、またはトレオニンによる置換
からなる群から選択される少なくとも１つのアミノ酸置換された配列番号６のアミノ酸配列を有し、それによってグリコール酸が製造されるステップと、
（ｄ）塩または酸の形で（ｃ）において製造されるグリコール酸を回収するステップを含み、前記酵素触媒が、同一の反応条件下でグリコロニトリルをグリコール酸に変換する場合、アシドボラックス・ファシリス（Ａｃｉｄｏｖｏｒａｘ  ｆａｃｉｌｉｓ）７２Ｗニトリラーゼのニトリラーゼ活性に対してニトリラーゼ活性の少なくとも１．５倍の増加を提供することを特徴とする方法。
【請求項２】
ホルムアルデヒドおよびシアン化水素からグリコール酸を製造するための方法であって、
（ａ）特定可能な時間にわたって約９０℃〜約１５０℃の温度に加熱された水性ホルムアルデヒド供給流れを提供するステップと、
（ｂ）（ａ）の加熱された水性供給流れをグリコロニトリル合成に適切な温度でシアン化水素と接触させ、それによってグリコロニトリルが製造されるステップと、
（ｃ）ステップ（ｂ）のグリコロニトリルを適切な水性反応混合物中でニトリラーゼ活性を有するポリペプチドを含む酵素触媒と接触させ、それによってグリコール酸が製造されるステップと、
（ｄ）イオン交換によって（ｃ）において製造されたグリコール酸を回収するステップを含み、前記グリコール酸が少なくとも９９．９％の純度を有する方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０４３５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０４３５】
【表１】
2008525031.tif 000001
本出願は、特許請求に記載の発明を含め、以下の発明を包含する。
（１）  ホルムアルデヒドおよびシアン化水素からグリコール酸を製造するための方法であって、
（ａ）特定可能な時間にわたって約９０℃〜約１５０℃の温度に加熱された水性ホルムアルデヒド供給流れを提供するステップと、
（ｂ）（ａ）の加熱された水性供給流れをグリコロニトリル合成に適切な温度でシアン化水素と接触させ、それによってグリコロニトリルが製造されるステップと、
（ｃ）ステップ（ｂ）のグリコロニトリルを適切な水性反応混合物中でニトリラーゼ活性を有するポリペプチドを含む酵素触媒と接触させるステップであって、前記ポリペプチドが、
１）アミノ酸残基１６８でのリシン、メチオニン、トレオニン、またはバリンによる置換、および
２）アミノ酸残基２０１でのグルタミン、グリシン、ヒスチジン、リシン、アスパラギン、セリン、アラニン、システイン、またはトレオニンによる置換
からなる群から選択される少なくとも１つのアミノ酸置換された配列番号６のアミノ酸配列を有し、それによってグリコール酸が製造されるステップと、
（ｄ）塩または酸の形で（ｃ）において製造されるグリコール酸を回収するステップを含み、前記酵素触媒が、同一の反応条件下でグリコロニトリルをグリコール酸に変換する場合、アシドボラックス・ファシリス（Ａｃｉｄｏｖｏｒａｘ  ｆａｃｉｌｉｓ）７２Ｗニトリラーゼのニトリラーゼ活性に対してニトリラーゼ活性の少なくとも１．５倍の増加を提供することを特徴とする方法。
（２）  前記グリコール酸が、反応性溶媒抽出、イオン交換、電気透析、重合、熱分解、アルコール分解、およびそれらの組合せからなる群から選択される回収方法を使用して回収されることを特徴とする（１）に記載の方法。
（３）  前記回収方法がイオン交換および反応性溶媒抽出からなる群から選択されることを特徴とする（２）に記載の方法。
（４）  ある量の水酸化ナトリウムが水性ホルムアルデヒド供給流れを加熱する前に水性ホルムアルデヒド供給流れに添加され、水酸化ナトリウムとホルムアルデヒドとのモル比が約１：５０〜約１：２０００であることを特徴とする（１）に記載の方法。
（５）  シアン化水素とホルムアルデヒドとのモル比が少なくとも１．０１〜約１．１５：１であることを特徴とする（１）に記載の方法。
（６）  加熱された水性ホルムアルデヒド供給流れが約０℃〜約７０℃の反応温度でシアン化水素と反応されることを特徴とする（１）に記載の方法。
（７）  加熱された水性ホルムアルデヒド供給流れが約１０℃〜約３０℃の反応温度でシアン化水素と反応されることを特徴とする（６）に記載の方法。
（８）  水性ホルムアルデヒド供給流れが約０．１ｗｔ％〜約１５ｗｔ％メタノールを含むことを特徴とする（１）に記載の方法。
（９）  前記アミノ酸配列が配列番号８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、および３２からなる群から選択されることを特徴とする（１）に記載の方法。
（１０）  前記酵素触媒が、同一の反応条件下でアシドボラックス・ファシリス（Ａｃｉｄｏｖｏｒａｘ  ｆａｃｉｌｉｓ）７２Ｗ（ＡＴＣＣ５５７４６）ニトリラーゼの活性に対して、グリコロニトリルをグリコール酸に変換する場合に、ニトリラーゼ活性の少なくとも約２倍の改善を提供することを特徴とする（１）に記載の方法。
（１１）  前記酵素触媒が、同一の反応条件下でアシドボラックス・ファシリス（Ａｃｉｄｏｖｏｒａｘ  ｆａｃｉｌｉｓ）７２Ｗ（ＡＴＣＣ５５７４６）ニトリラーゼの活性に対して、グリコロニトリルをグリコール酸に変換する場合に、ニトリラーゼ活性の少なくとも約４倍の改善を提供することを特徴とする（１０）に記載の方法。
（１２）  前記酵素触媒が全微生物細胞、透過性微生物細胞、微生物細胞抽出物の１つまたは複数の成分、部分的に精製された酵素、または精製酵素の形であることを特徴とする（１）に記載の方法。
（１３）  前記全微生物細胞が前記ポリペプチドを組換え発現する形質転換微生物宿主細胞であることを特徴とする（１２）に記載の方法。
（１４）  前記形質転換微生物宿主細胞が、コマモナス（Ｃｏｍａｍｏｎａｓ）種、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）種、ブレビバクテリウム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）種、ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）種、アゾトバクター（Ａｚｏｔｏｂａｃｔｅｒ）種、シトロバクター（Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ）種、エンテロバクター（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ）種、クロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）種、クレブシエラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）種、サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）種、ラクトバチルス（Ｌａｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）種、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）種、サッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）種、チゴサッカロミセス（Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）種、ピチア（Ｐｉｃｈｉａ）種、クルイベロミセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）種、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）種、ハンセニュウラ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）種、デュナリエラ（Ｄｕｎａｌｉｅｌｌａ）種、デバリオミセス（Ｄｅｂａｒｙｏｍｙｃｅｓ）種、ケカビ（Ｍｕｃｏｒ）種、トルロプシス（Ｔｏｒｕｌｏｐｓｉｓ）種、メチロバクテリア（Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉａ）種、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）種、エシェリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）種、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）種、リゾビウム（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）種、およびストレプトミセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）種からなる群から選択されることを特徴とする（１３）に記載の方法。
（１５）  前記形質転換微生物宿主細胞が大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）であることを特徴とする（１４）に記載の方法。
（１６）  前記形質転換微生物宿主細胞が、国際寄託番号ＡＴＣＣ４７０７６を有する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＭＧ１６５５および国際寄託番号ＡＴＣＣ５３９１１を有する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＦＭ５からなる群から選択される大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）株であることを特徴とする（１５）に記載の方法。
（１７）  前記酵素触媒が可溶性または不溶性支持体中にもしくはその上で固定化されることを特徴とする（１２）から（１６）のいずれか一項に記載の方法。
（１８）  前記水性反応混合物において製造されるグリコール酸アンモニウムの濃度が約０．０２ｗｔ％〜約９０ｗｔ％であることを特徴とする（１）に記載の方法。
（１９）  前記水性反応混合物において製造されるグリコール酸アンモニウムの濃度が約０．０２ｗｔ％〜約４０ｗｔ％であることを特徴とする（１８）に記載の方法。
（２０）  前記水性反応混合物におけるグリコロニトリル濃度が約５ｍＭ〜約１Ｍの範囲であることを特徴とする（１）に記載の方法。
（２１）  前記水性反応混合物におけるグリコロニトリル濃度が連続的またはアリコート添加によって維持されることを特徴とする（２０）に記載の方法。
（２２）  前記水性反応混合物におけるｐＨが約５．５〜約７．７に維持されることを特徴とする（１）に記載の方法。
（２３）  グリコロニトリルのグリコール酸への酵素変換が実質的に酸素を含まない条件下で起こることを特徴とする（１）に記載の方法。
（２４）  前記水性反応混合物が、５ｗｔ％未満の濃度でチオ硫酸カリウムおよび亜ジオチオン酸ナトリウムからなる群から選択される安定剤をさらに含むことを特徴とする（１）に記載の方法。
（２５）  前記水性反応混合物が、５ｗｔ％未満の濃度でチオ硫酸カリウムおよび亜ジオチオン酸ナトリウムからなる群から選択される安定剤をさらに含むことを特徴とする（１）に記載の方法。
（２６）  前記酵素触媒が、酵素触媒のグラム乾燥細胞重量当たり少なくとも３００グラムのグリコール酸の触媒生産性を提供することを特徴とする（１）に記載の方法。
（２７）  前記酵素触媒が、酵素触媒のグラム乾燥細胞重量当たり少なくとも４５０グラムのグリコール酸の触媒生産性を提供することを特徴とする（２６）に記載の方法。
（２８）  前記酵素触媒が、酵素触媒のグラム乾燥細胞重量当たり少なくとも１０００グラムのグリコール酸の触媒生産性を提供することを特徴とする（２７）に記載の方法。
（２９）  ホルムアルデヒドおよびシアン化水素からグリコール酸を製造するための方法であって、
（ａ）特定可能な時間にわたって約９０℃〜約１５０℃の温度に加熱された水性ホルムアルデヒド供給流れを提供するステップと、
（ｂ）（ａ）の加熱された水性供給流れをグリコロニトリル合成に適切な温度でシアン化水素と接触させ、それによってグリコロニトリルが製造されるステップと、
（ｃ）ステップ（ｂ）のグリコロニトリルを適切な水性反応混合物中でニトリラーゼ活性を有するポリペプチドを含む酵素触媒と接触させ、それによってグリコール酸が製造されるステップと、
（ｄ）イオン交換によって（ｃ）において製造されたグリコール酸を回収するステップを含み、前記グリコール酸が少なくとも９９．９％の純度を有する方法。
（３０）  前記ポリペプチドが、配列番号３９のアミノ酸配列を有する触媒部位を含むことを特徴とする（２９）に記載の方法。
（３１）  ニトリラーゼ活性を有する前記酵素触媒が、
（ａ）アミノ酸残基１６８でのリシン、メチオニン、トレオニン、またはバリンによる置換、および
（ｂ）アミノ酸残基２０１でのグルタミン、グリシン、ヒスチジン、リシン、アスパラギン、セリン、アラニン、システイン、またはトレオニンによる置換
からなる群から選択される少なくとも１つのアミノ酸置換された配列番号６のアミノ酸配列を含むポリペプチドを含むことを特徴とする（３０）に記載の方法。