(57)【要約】本発明は、肝指向性を低減させ、肝臓組織以外の標的疾患組織において生理活性を選択的に発現させることのできる肝細胞増殖因子又はその活性断片の改変体を提供することを目的としている。本発明は、肝細胞増殖因子又はその活性断片の末端に、プロテアーゼ感受性ペプチドを介してポリエチレングリコールが結合している、肝細胞増殖因子又はその活性断片のポリエチレングリコール修飾体を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
肝細胞増殖因子又はその活性断片の末端に、プロテアーゼ感受性ペプチドを介してポリエチレングリコールが結合している、肝細胞増殖因子又はその活性断片のポリエチレングリコール修飾体。
【請求項２】
前記プロテアーゼ感受性ペプチドは、ＡＤＡＭ１７感受性ペプチド又はトロンビン感受性ペプチドである、請求項１記載のポリエチレングリコール修飾体。
【請求項３】
前記プロテアーゼ感受性ペプチドは、配列表の配列番号８〜２０のいずれか一つで表されるアミノ酸配列である、請求項１記載のポリエチレングリコール修飾体。
【請求項４】
前記ポリエチレングリコールの数平均分子量は、２００００〜１０００００である、請求項１〜３のいずれか一項記載のポリエチレングリコール修飾体。
【請求項５】
前記肝細胞増殖因子の活性断片は、ＮＫ１である、請求項１〜４のいずれか一項記載のポリエチレングリコール修飾体。
【請求項６】
前記肝細胞増殖因子の活性断片は、配列表の配列番号２で表されるアミノ酸配列である、請求項１〜５のいずれか一項記載のポリエチレングリコール修飾体。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか一項記載のポリエチレングリコール修飾体を有効成分として含有する、医薬。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、肝細胞増殖因子又はその活性断片のポリエチレングリコール修飾体に関する。
【背景技術】
【０００２】
肝細胞増殖因子は、多様な薬理作用を有する増殖因子であり、当初見出された肝細胞増殖作用の他に、抗アポトーシス作用、血管新生作用、血管拡張作用、抗臓器線維化作用、抗上皮間葉転換作用等を有することが知られており、さまざまな疾患に対する臨床応用が試みられている。【０００３】
しかし、肝細胞増殖因子の生体内半減期は３０分程度と短いため、その薬理作用を持続させるためには、大量の肝細胞増殖因子を頻繁に投与する必要があることが示唆されている（非特許文献１）。その一方で、肝細胞増殖因子は肝指向性を有するため、大量に投与した場合にはその副作用として肝細胞増殖による肝肥大を誘発することが報告されている（非特許文献２）。【０００４】
肝細胞増殖因子の天然型スプライシングバリアントである活性断片として、非特許文献３ではＮドメインとクリングル１からなるＮＫ１、非特許文献４ではＮドメインとクリングル１及びクリングル２からなるＮＫ２が報告されている。また、非特許文献５では組換え技術によって作出された活性断片として、Ｎドメインとクリングル１、クリングル２、クリングル３及びクリングル４からなるＮＫ４が報告されており、これらの活性断片はｉｎ  ｖｉｔｒｏ及びｉｎ  ｖｉｖｏにおいて、肝細胞増殖因子受容体の受容体型チロシンキナーゼであるｃ−Ｍｅｔに対してアゴニスト活性あるいはアンタゴニスト活性を有していることが報告されている。また、ＮＫ１は肝指向性を有し、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて肝肥大を誘発することが報告されている（非特許文献３及び６）。【０００５】
これまでに、肝細胞増殖因子とその活性断片のひとつであるＮＫ４について、生体内半減期の延長効果を主目的としたポリエチレングリコール修飾体が報告されている（特許文献１及び２）。ポリエチレングリコールは、生体適合性の高いポリマー性高分子であり、タンパク質の生体内半減期延長や免疫原性低下を目的とした修飾剤として広く利用されている。【０００６】
タンパク質をポリエチレングリコールで化学修飾する場合、その修飾位置によっては、当該タンパク質の生理活性が低下又は消失することが知られている。例えば、肝細胞増殖因子を複数個のポリエチレングリコールでランダムに直接化学修飾した修飾体は、肝細胞増殖因子の生体内半減期の延長効果が達成できる一方で、その生理活性が３０％以上低下することが特許文献１で報告されている。【０００７】
また、非特許文献７には、薬物由来の毒性を試験的に制御する目的で緑膿菌由来のエキソトキシンＡを、ライノウイルス由来の３Ｃプロテアーゼに対するプロテアーゼ感受性ペプチドを介してポリエチレングリコールで化学修飾したプロドラッグについて報告されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】国際公開１９９６／２８４７５号
【特許文献２】特開２０１０−１７４０３４号公報
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Ｌｉｕ  Ｋ.Ｘ．ら、Ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ、１９９８年、第２７５巻、ｐ．Ｅ８３５−Ｅ８４２
【非特許文献２】Ｓａｋａｔａ  Ｈ．ら、Ｃｅｌｌ  Ｇｒｏｗｔｈ  ＆  Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ、１９９６年、第７巻、ｐ．１５１３−１５２３
【非特許文献３】Ｊａｋｕｂｃｚａｋ  Ｊ.Ｌ．ら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、１９９８年、第１８巻、第３号、ｐ．１２７５−１２８３
【非特許文献４】Ｏｔｓｕｋａ  Ｔ．ら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、２０００年、第２０巻、第６号、ｐ．２０５５−２０６５
【非特許文献５】Ｄａｔｅ  Ｋ．ら、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ、１９９７年、第４２０巻、第１号、ｐ．１−６
【非特許文献６】Ｒｏｓｓ  Ｊ．ら、Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ、２０１２年、第１４２巻、ｐ.８９７-９０６
【非特許文献７】Ｓｔｅｆａｎ  Ｎ．ら、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２０１４年、第２５巻、ｐ．２１４４−２１５６
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
しかしながら、非特許文献７では、緑膿菌由来の毒素タンパク質であるエキソトキシンＡのプロドラッグについてｉｎ  ｖｉｖｏ及びｅｘ  ｖｉｖｏでの機能検証は実施されていない。また、非特許文献７に開示されているエキソトキシンＡのプロドラッグは、エキソトキシンＡの生理活性を抑制するために、エキソトキシンＡの末端と配列途中の２箇所にプロテアーゼ感受性ペプチドを介してポリエチレングリコールを化学修飾しているが、一般的にタンパク質の配列途中へのペプチド付加やポリエチレングリコールによる化学修飾は製造の難易度が高く、プロテアーゼによる切断後にもプロテアーゼ感受性ペプチド由来の不要なアミノ酸配列が上記タンパク質の構造途中に残存するため、上記タンパク質が本来有する生理活性の維持の観点で不確実性がある。したがって、非特許文献７に記載の技術は、一般性に乏しく、他のタンパク質に容易に適用できるものではないと考えられる。【００１１】
なお、非特許文献７には、肝細胞増殖因子又はその活性断片のプロドラッグについて開示や示唆は一切なく、肝細胞増殖因子又はその活性断片由来の肝指向性の低減を目的としたプロドラッグの設計に活用可能な生体内プロテアーゼについても開示や示唆は一切ない。【００１２】
そのため、肝細胞増殖因子又はその活性断片由来の肝指向性を低減させ、肝臓組織以外の標的疾患組織において肝細胞増殖因子又はその活性断片の生理活性を選択的に発現させることができる肝細胞増殖因子又はその活性断片の改変体の創出が求められている。【００１３】
そこで本発明は、上記課題を解決した肝細胞増殖因子又はその活性断片の改変体を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明者らは上記課題を解決するために鋭意研究を重ねた結果、肝細胞増殖因子又はその活性断片を、プロテアーゼ感受性ペプチドを介してポリエチレングリコールで化学修飾することにより、肝細胞増殖因子又はその活性断片由来の肝指向性を低減でき、標的疾患組織においてプロテアーゼ感受性ペプチドが切断されることで肝細胞増殖因子又はその活性断片の生理活性を選択的に発現させることができることを見出し、本発明を完成させるに至った。【００１５】
すなわち、本発明は、以下の（１）〜（７）を包含する。
（１）  肝細胞増殖因子又はその活性断片の末端に、プロテアーゼ感受性ペプチドを介してポリエチレングリコールが結合している、肝細胞増殖因子又はその活性断片のポリエチレングリコール修飾体。
（２）  上記プロテアーゼ感受性ペプチドは、ＡＤＡＭ１７感受性ペプチド又はトロンビン感受性ペプチドである、（１）記載のポリエチレングリコール修飾体。
（３）  上記プロテアーゼ感受性ペプチドは、配列表の配列番号８〜２０のいずれか一つで表されるアミノ酸配列である、（１）記載のポリエチレングリコール修飾体。
（４）  上記ポリエチレングリコールの数平均分子量は、２００００〜１０００００である、（１）〜（３）のいずれかに記載のポリエチレングリコール修飾体。
（５）  前記肝細胞増殖因子の活性断片は、ＮＫ１である、（１）〜（４）のいずれかに記載のポリエチレングリコール修飾体。
（６）  前記肝細胞増殖因子の活性断片は、配列表の配列番号２で表されるアミノ酸配列である、（１）〜（５）のいずれかに記載のポリエチレングリコール修飾体。
（７）  （１）〜（６）のいずれかに記載のポリエチレングリコール修飾体を有効成分として含有する、医薬。
【発明の効果】
【００１６】
本発明の肝細胞増殖因子又はその活性断片のポリエチレングリコール修飾体は、肝細胞増殖因子又はその活性断片が本来持つ肝指向性を低減し、かつ、腎臓等の標的疾患組織で選択的に肝細胞増殖因子又はその活性断片の生理活性を発現してその薬理作用を発揮することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】腎臓病モデルマウス及び正常マウスの腎臓組織及び肝臓組織におけるＡＤＡＭ１７タンパク質の酵素活性の発現量を示す図である。
【図２】腎臓病モデルマウス及び正常マウスの腎臓組織及び肝臓組織におけるＡＤＡＭ１７タンパク質の発現量を示す図である。（ａ）はＡＤＡＭ１７タンパク質に対するウエスタンブロッティング像を示し、（ｂ）はそのバンド強度を数値化した図である。
【図３】プロテアーゼ処理によるプロドラッグ化ヒトＮＫ１からの活性体であるヒトＮＫ１放出を示す図である。
【図４】プロテアーゼ感受性ペプチド付加ヒトＮＫ１のプロドラッグ化によるヒトＮＫ１のＨＧＦ活性減弱を示す図である。
【図５】組織選択的なプロドラッグ化ヒトＮＫ１からの活性体であるヒトＮＫ１放出を示す図である。
【図６】プロドラッグ化ヒトＮＫ１のｉｎ  ｖｉｖｏにおける組織選択的な生理活性を示す図である。
【図７】ポリエチレングリコール修飾部位の違いによるプロドラッグ化ヒトＮＫ１の活性制御の比較を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
＜肝細胞増殖因子又はその活性断片のポリエチレングリコール修飾体＞
本発明に係る肝細胞増殖因子又はその活性断片のポリエチレングリコール修飾体（以下、ＨＧＦ又はその活性断片のＰＥＧ修飾体とも称する。）は、１分子の肝細胞増殖因子（ＨＥＰＡＴＯＣＹＴＥ  ＧＲＯＷＴＨ  ＦＡＣＴＯＲ、以下、ＨＧＦとも称する。）又はその活性断片の末端（アミノ末端、カルボキシル末端）に、プロテアーゼ感受性ペプチドを介してポリエチレングリコール（以下、ＰＥＧとも称する。）が共有結合している。
【００１９】
本発明に係るＨＧＦ又はその活性断片のＰＥＧ修飾体の実施形態の一つとしては、ＨＧＦ又はその活性断片の末端（アミノ末端又はカルボキシル末端）にプロテアーゼ感受性ペプチドを介して１分子又は複数分子のＰＥＧが共有結合したものが挙げられる。その際、上記ＨＧＦ又はその活性断片の末端と上記プロテアーゼ感受性ペプチドとの結合様式に特に制限はなく、両者は直接結合していてもよいし、任意でスペーサー配列を介して結合していてもよい。該プロテアーゼ感受性ペプチドと上記ＰＥＧとの結合様式に特に制限はなく、該プロテアーゼ感受性ペプチドに該ＰＥＧが直接結合してもよいし、該プロテアーゼ感受性ペプチドに人工的に付加したアミノ酸等を介して該ＰＥＧと結合していてもよく、さらに、該プロテアーゼ感受性ペプチドと人工的に付加したアミノ酸等の間に、精製用のプロテアーゼ感受性ペプチドや精製用のタグ配列が含まれていてもよい。例えば、プロテアーゼ感受性ペプチドのカルボキシル末端にＨＧＦ又はその活性断片の末端が共有結合し、該プロテアーゼ感受性ペプチドのアミノ末端にＰＥＧが共有結合したものやプロテアーゼ感受性ペプチドのアミノ末端にＨＧＦ又はその活性断片の末端が共有結合し、該プロテアーゼ感受性ペプチドのカルボキシル末端にＰＥＧが共有結合したものが挙げられ、プロテアーゼ感受性ペプチドのカルボキシル末端にＨＧＦ又はその活性断片の末端が共有結合し、該プロテアーゼ感受性ペプチドのアミノ末端にＰＥＧが共有結合したものが好ましい。
【００２０】
ＨＧＦ又はその活性断片のアミノ末端は、ＨＧＦ又はその活性断片の生理活性の制御に重要なＨＧＦ又はその活性断片の二量体化及び肝指向性の機能を担っていることから、ＨＧＦ又はその活性断片の持つ生理活性及び肝指向性を低減させるためには、ＨＧＦ又はその活性断片のアミノ末端にプロテアーゼ感受性ペプチドを介して１分子のＰＥＧが共有結合したものが好ましく、ＨＧＦ又はその活性断片のアミノ末端にプロテアーゼ感受性ペプチドのカルボキシル末端が共有結合し、さらに該プロテアーゼ感受性ペプチドのアミノ末端に１分子のＰＥＧが共有結合したものがより好ましく、ＨＧＦ又はその活性断片のアミノ末端にＡＤＡＭ１７感受性ペプチド又はトロンビン感受性ペプチドのカルボキシル末端が共有結合し、さらに該ＡＤＡＭ１７感受性ペプチド又は該トロンビン感受性ペプチドのアミノ末端に１分子のＰＥＧが共有結合したものがさらに好ましく、ＨＧＦの活性断片の一つであるＮＫ１のアミノ末端にＡＤＡＭ１７感受性ペプチド又はトロンビン感受性ペプチドのカルボキシル末端が共有結合し、さらに該ＡＤＡＭ１７感受性ペプチド又は該トロンビン感受性ペプチドのアミノ末端に、数平均分子量２００００〜１０００００のＰＥＧが１分子共有結合したものがさらに好ましく、ＮＫ１のアミノ末端にＡＤＡＭ１７感受性ペプチド又はトロンビン感受性ペプチドのカルボキシル末端が共有結合し、さらに該ＡＤＡＭ１７感受性ペプチド又は該トロンビン感受性ペプチドのアミノ末端に４分岐型、数平均分子量７００００〜９００００のＰＥＧが１分子共有結合したものが最も好ましい。なお、プロテアーゼによる切断効率を制御するため、ＨＧＦ又はその活性断片とプロテアーゼ感受性ペプチドの間に任意のスペーサー配列を付加することもできる。
【００２１】
本発明に係るＨＧＦ又はその活性断片のＰＥＧ修飾体の別の実施形態の一つとしては、ＨＧＦ又はその活性断片の配列途中にプロテアーゼ感受性ペプチドを介して１分子のＰＥＧが共有結合したものも挙げられる。
【００２２】
＜ＨＧＦ及びその活性断片＞
ＨＧＦは、アミノ末端側からＮドメイン、クリングル１、クリングル２、クリングル３、クリングル４及びＳＰＨドメインからなり、Ｎドメイン、クリングル１、クリングル２、クリングル３及びクリングル４がα鎖を構成し、ＳＰＨドメインがβ鎖を構成している。ＨＧＦは、発現時には一本鎖のｐｒｏ−ＨＧＦとして生合成されるが、分泌される際に分泌シグナル配列が除去された後、細胞外において開始メチオニンから第４９４番目のアルギニン残基と第４９５番目のバリン残基の間でプロテアーゼによるプロセッシングを受けて、α鎖とβ鎖とがジスルフィド結合によって結合したヘテロ二量鎖を形成し、活性型となる（Ｍｉｙａｚａｗａ  Ｋ．ら、Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、１９９６年、第２７１巻、第７号、ｐ．３６１５−３６１８）。本明細書においてＨＧＦとは、生理活性を有する活性型のＨＧＦを意味する。
【００２３】
ＨＧＦの持つ、肝細胞増殖作用、抗アポトーシス作用、血管新生作用、血管拡張作用、抗臓器線維化作用、抗上皮間葉転換作用等の多様な薬理作用は、ＨＧＦがＨＧＦ受容体の受容体型チロシンキナーゼであるｃ−Ｍｅｔに結合することによって誘導されることが知られている。ＨＧＦがｃ−Ｍｅｔに結合することにより、ｃ−Ｍｅｔの細胞内側の複数のチロシン残基がリン酸化され、リン酸化したチロシン残基へシグナル分子が結合することでシグナル経路が活性化される。その際に特に重要なリン酸化部位としてＹ１２３４／１２３５が知られている。
【００２４】
ヒトＨＧＦの場合、７２８アミノ酸残基（分泌シグナル配列（開始メチオニンから３１アミノ酸残基）を含む）（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：Ｍ２９１４５）からなる分泌タンパク質として生合成され、分泌される際に、分泌シグナル配列が除去された６９７アミノ酸残基からなるタンパク質となる（配列番号１）。
【００２５】
上記のＨＧＦは、天然に存在するＨＧＦ（以下、天然型ＨＧＦとも称する。）のアミノ酸配列と同じアミノ酸配列を持つものだけでなく、天然型ＨＧＦのアミノ酸配列に１個又は数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加（若しくは挿入）されたアミノ酸配列を有し、かつ、ＨＧＦとしての生理活性を有するＨＧＦのアミノ酸変異体を包含し、さらに、天然型ＨＧＦの糖鎖部分が改変されたＨＧＦ及び糖鎖部分を有しないＨＧＦをも包含する。ＨＧＦのアミノ酸変異体としては、天然型ＨＧＦのアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有する変異体が好ましく、９５％以上の配列同一性を有する変異体がより好ましく、９８％以上の配列同一性を有する変異体がさらに好ましい。ＨＧＦのアミノ酸変異体としては、例えば、クリングル１内の５アミノ酸残基が欠損したＨＧＦ（天然に存在する天然型変異体であり、以下、欠損型ＨＧＦとも称する。）（Ｋｉｎｏｓａｋｉ  Ｍ．ら、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ、第４３４巻、１９９８年、ｐ．１６５−１７０）が挙げられ、これは、ある細胞種においてヒトＨＧＦ（配列番号１）よりも比活性が高いことが報告されている。
【００２６】
保存的アミノ酸置換は、一般に、化学的性質、電気的性質（若しくは極性・疎水性）又は構造的性質が類似するアミノ酸間での置換をいう。このような置換では、天然型ＨＧＦを含むポリペプチドの立体構造（コンフォーメーション）の著しい変化を抑制することができるため、該ポリペプチドはその活性を大きく損なうことなく保持することができ、また、天然型より高い活性とすることができる場合もある。そのようなアミノ酸置換の具体例は、酸性アミノ酸間の置換（例えばアスパラギン酸（Ｄ）及びグルタミン酸（Ｅ））、塩基性アミノ酸間の置換（例えばヒスチジン（Ｈ）、リジン（Ｋ）及びアルギニン（Ｒ））、芳香族アミノ酸間の置換（例えばフェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）及びトリプトファン（Ｗ））、親水性アミノ酸間の置換（例えばシステイン（Ｃ）、アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）ヒスチジン（Ｈ）、リジン（Ｋ）、アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）、アルギニン（Ｒ）、セリン（Ｓ）及びスレオニン（Ｔ））、疎水性アミノ酸間の置換（例えばアラニン（Ａ）、フェニルアラニン（Ｆ）、イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、ノルロイシン（Ｎｌｅ）、メチオニン（Ｍ）、バリン（Ｖ）、トリプトファン（Ｗ）及びチロシン（Ｙ））等を含む。
【００２７】
上記のＨＧＦは、天然型ＨＧＦのアミノ酸配列又は塩基配列に基づいて、遺伝子組換え技術により作製された組換え型ＨＧＦも包含する。
【００２８】
本明細書で使用する「配列同一性」は、ＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡ等のアルゴリズムを使用して決定することができる２つの配列間の同一性を表し、一般に、２つの配列を、ギャップを含めて又はギャップを含めないで、最大の一致度となるように整列したとき、（ギャップを含めた）総アミノ酸数に対する一致したアミノ酸数の百分率（％）として算出されうる（Ａｌｔｓｃｈｕｌ  Ｓ．ら、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、１９９０年、第２１５巻、第３号ｐ．４０３−４１０；  Ａｌｔｓｃｈｕｌ  Ｓ．ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、１９９７年、第２５巻、第１７号ｐ．３３８９−３４０２）。
【００２９】
本明細書で使用する「数個」とは、２〜１０の整数、すなわち２、３、４、５、６、７、８、９又は１０をいう。
【００３０】
ＨＧＦの活性断片とは、ＨＧＦの構造の一部を含み、ｃ−Ｍｅｔに結合して、ＨＧＦとしての生理活性（アゴニスト活性）を発揮するタンパク質又はｃ−Ｍｅｔに対してアンタゴニストとして作用する（アンタゴニスト活性を発揮する）タンパク質をいう。
【００３１】
上記のＨＧＦの活性断片としては、例えば、ＨＧＦの天然型スプライシングバリアントであるＮＫ１若しくはＮＫ２又は組換え技術によって作出されたＮＫ４が挙げられる。ＮＫ１は、ＨＧＦのアミノ末端側のＮドメイン及びクリングル１からなり、ＮＫ２は、ＨＧＦのアミノ末端側のＮドメイン、クリングル１及びクリングル２からなる。これらはそれぞれ生体内において、ｃ−Ｍｅｔに対してアゴニスト又はアンタゴニストとして作用することが報告されている（Ｊａｋｕｂｃｚａｋ  Ｊ．Ｌ．ら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、第１８巻、第３号、１９９８年、ｐ．１２７５−１２８３；  Ｏｔｓｕｋａ  Ｔ．ら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、第２０巻、第６号、２０００年、ｐ．２０５５−２０６５）。また、ＮＫ１は肝指向性を有し、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて肝肥大を誘発することが報告されている（Ｊａｋｕｂｃｚａｋ  Ｊ．Ｌ．ら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、１９９８年、第１８巻、第３号、ｐ.１２７５−１２８３；Ｒｏｓｓ  Ｊ．ら、Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ、２０１２年、第１４２巻、ｐ.８９７-９０６）。ＮＫ４は、ＨＧＦのアミノ末端側のＮドメイン、クリングル１、クリングル２、クリングル３及びクリングル４からなり、ｃ−Ｍｅｔに対してアンタゴニストとして作用することが報告されている（Ｄａｔｅ  Ｋ．ら、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ、第４２０巻、第１号、１９９７年、ｐ．１−６）。
【００３２】
上記のＨＧＦの活性断片は、天然型ＨＧＦ由来のアミノ酸配列と同じアミノ酸配列を持つものだけでなく、天然型ＨＧＦのアミノ酸配列由来のアミノ酸配列に１個又は数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を有し、かつ、ＨＧＦとしての生理活性（アゴニスト活性）又はｃ−Ｍｅｔに対するアンタゴニスト活性を発揮する変異体も包含し、さらに、天然型ＨＧＦ由来の糖鎖部分が改変された、又は天然型ＨＧＦ由来の糖鎖部分を有しない変異体をも包含する。ＨＧＦの活性断片の変異体としては、天然型ＨＧＦ由来のアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有する変異体が好ましく、９５％以上の配列同一性を有する変異体がより好ましく、９８％以上の配列同一性を有する変異体がさらに好ましい。例えば、ＮＫ１高活性型変異体として、１Ｋ１（Ｌｉｅｔｈａ  Ｄ．ら、Ｔｈｅ  ＥＭＢＯ  Ｊｏｕｒｎａｌ、２００１年、第２０巻、第２０号、ｐ．５５４３−５５５５）やＭ２．２（Ｊｏｎｅｓ  Ｄ．Ｓ．  ２ｎｄ．ら、Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａ、２０１１年、第１０８巻、第３２号、ｐ．１３０３５−１３０４０）が挙げられる。
【００３３】
本発明に係るＨＧＦ又はその活性断片のＰＥＧ修飾体に含まれるＨＧＦ又はその活性断片は、天然型ＨＧＦ（欠損型ＨＧＦ等の変異体も含む）、ＮＫ１（変異体も含む）、ＮＫ２（変異体も含む）又はＮＫ４（変異体も含む）であることが好ましく、ＮＫ１（変異体も含む）又はＮＫ２（変異体も含む）であることがより好ましく、ＮＫ１（変異体も含む）であることがさらに好ましく、配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるヒトＮＫ１であることが最も好ましい。なお、配列番号２で表されるアミノ酸配列には、ヒトＨＧＦ由来の分泌シグナル配列（ＭＷＶＴＫＬＬＰＡＬＬＬＱＨＶＬＬＨＬＬＬＬＰＩＡＩＰＹＡＥＧ：配列番号３）は含まれない。
【００３４】
また、上記のＨＧＦ又はその活性断片は、哺乳動物由来のアミノ酸配列を包含するが、ヒト、ネコ又はイヌ由来のアミノ酸配列であることが好ましく、ヒト由来のアミノ酸配列であることがより好ましい。
【００３５】
ＨＧＦ又はその活性断片は、例えば、公知の遺伝子組み換え技術を用いて、ＨＧＦ又はその活性断片をコードする核酸配列（ＤＮＡ）を設計し、細胞に一過性又は安定的に導入し、発現させることで、取得することができる。
【００３６】
なお、ＨＧＦ又はその活性断片とプロテアーゼ感受性ペプチドとの間には、公知の遺伝子組換え技術を用いてスペーサー配列として１〜２０個のアミノ酸を付加してもよい。ＨＧＦ又はその活性断片とプロテアーゼ感受性ペプチドとの間にスペーサー配列を付加したＨＧＦ又はその活性断片は、例えば、公知の遺伝子組み換え技術を用いてＨＧＦ又はその活性断片をコードする核酸配列（ＤＮＡ）に連続して任意に選択したスペーサー配列をコードする核酸配列（ＤＮＡ）を付加し、さらに連続してプロテアーゼ感受性ペプチドをコードする核酸配列（ＤＮＡ）を付加し、細胞に一過性又は安定的に導入し、発現させることで、取得することができる。上記スペーサー配列に使用できるアミノ酸としては、例えば、アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）、ヒスチジン（Ｈ）、リジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）、フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）、アラニン（Ａ）、システイン（Ｃ）、アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）、セリン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）、イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、ノルロイシン（Ｎｌｅ）、メチオニン（Ｍ）、バリン（Ｖ）及びトリプトファン（Ｗ）が挙げられる。用いるスペーサー配列は、プロテアーゼ感受性ペプチドの切断効率や、ＰＥＧ修飾によるＨＧＦ又はその活性断片の活性制御の効率を考慮して適宜選択される。
【００３７】
＜プロテアーゼ感受性ペプチド＞
本発明に使用されるプロテアーゼ感受性ペプチドは、肝臓組織以外の標的疾患組織で発現が認められるとともに、肝臓組織での発現が相対的に低いプロテアーゼにより、切断されるペプチドを意味する。
【００３８】
プロテアーゼ感受性ペプチドに対応するプロテアーゼは、対象となる標的疾患組織により求められる酵素活性の相対差が変化するため、ウエスタンブロッティングや免疫組織染色等の方法で肝臓組織と標的疾患組織との相対的な酵素活性の差を評価し、適切なものを選択する必要がある。例えば、その一形態として標的疾患組織が腎臓組織の場合、肝臓組織での酵素活性に対する腎臓組織での酵素活性の相対差が３倍以上であるプロテアーゼである必要があり、１０倍以上であるプロテアーゼが好ましく、１００倍以上であるプロテアーゼがより好ましい。
【００３９】
本発明に係るＨＧＦ又はその活性断片のＰＥＧ修飾体において、上記のようなプロテアーゼ感受性ペプチドを選択することにより、上記ＰＥＧ修飾体は肝臓組織では、ＰＥＧで化学修飾されることによりＨＧＦ又はその活性断片の活性が減弱し、肝指向性が低減した状態となるため、肝臓組織でのＨＧＦ又はその活性断片由来の副作用低減が期待できる一方で、標的疾患組織では、これらのプロテアーゼ感受性ペプチドが対応するプロテアーゼにより切断され、ＰＥＧが遊離することによって、ＨＧＦ又はその活性断片の放出及びその生理活性の発現が期待できる。なお、対応するプロテアーゼによって切断されたプロテアーゼ感受性ペプチドの断片がＨＧＦ又はその活性断片に残存していてもよい。
【００４０】
肝臓組織以外の標的疾患組織で発現が認められるプロテアーゼとしては、例えば、腎疾患患者の腎臓において発現していると報告されているＡＤＡＭ１７（Ｍｅｌｅｎｈｏｒｓｔ Ｗ．Ｂ．ら、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ、２００９年、第２９７巻、第３号、ｐ．７８１−７９０）、Ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ａｃｔｉｖａｔｏｒ（ＨＧＦＡ）、その上流因子のトロンビン（Ｄａｖｉｄ  Ｃ．Ｊ．Ｈ．ら、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ、２００１年、第１５９巻、第４号、ｐ１３８３−１３９３）又はＭａｔｒｉｘ  ＭｅｔａｌｌｏＰｒｏｔｅａｓｅ（Ｊｕｎｗｅｉ  Ｙ．ら、Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ、２００２年、第１１０巻、ｐ．１５２５−１５３８）等が挙げられる。
【００４１】
ＡＤＡＭ１７は、細胞内で不活性型の前駆体として合成された後、Ｆｕｒｉｎにより切断されて成熟体となり、様々なタンパク質を切断する活性を示すようになる（Ａｌｄｏ  Ｂ．ら、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｏｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２００３年、第２７８巻、ｐ．２５９３３−２５９３９；Ｂｅｌｅｎ  Ｓ．Ｊ．ら、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｏｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２００７年、第２８２巻、ｐ．８３２５−８３３１）。本明細書において特に記載しない場合は、ＡＤＡＭ１７は、ＡＤＡＭ１７成熟体を示す。
【００４２】
本発明に係るＨＧＦ又はその活性断片のＰＥＧ修飾体に含まれるプロテアーゼ感受性ペプチドは、対応するプロテアーゼによる切断が報告されている既存の生体内在性ペプチドや、遺伝子組み換え技術を用いて作製した人工ペプチドを用いることができる。プロテアーゼ感受性ペプチドは、安定性、標的組織における切断効率及び種交差性を考慮して選択される。ＡＤＡＭ１７及びトロンビンは肝臓組織での発現が肝臓組織以外での標的疾患組織と比べ相対的に低いことが本発明者らにより見出されたことから、プロテアーゼ感受性ペプチドは、ＡＤＡＭ１７感受性ペプチド又はトロンビン感受性ペプチドが好ましい。ここで、ＡＤＡＭ１７感受性ペプチドは、ＡＤＡＭ１７により切断されるペプチドを意味し、トロンビン感受性ペプチドは、トロンビンにより切断されるペプチドを意味する。
【００４３】
ＡＤＡＭ１７感受性ペプチドのうち、生体内在性ペプチドの例としては、ＴＮＦ−ａｌｐｈａ由来のもの（ＳＰＬＡＱＡＶＲＳＳＳＲ、配列番号８）又はＬ−ｓｅｌｅｃｔｉｎ由来のもの（ＱＥＴＮＲＳＦＳＫ、配列番号１０）等が挙げられる。人工ペプチドの例としては、Ａｒｔｉｆｉｃａｌ  ＡＤＡＭ−１７  ｃｌｅａｖａｂｌｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ（ＰＲＡＡＡＶＫＳＰ、配列番号９）（Ｃａｅｓｕ  Ｃ.ｌ．ら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ、２００９年、第４２４巻、ｐ．７９−８８）等が挙げられる。ＡＤＡＭ１７感受性ペプチドとしては、配列番号８〜１６で表されるアミノ酸配列であるペプチドが好ましく、配列番号９で表されるアミノ酸配列であるペプチドがより好ましい。
【００４４】
トロンビン感受性ペプチドのうち、生体内在性ペプチドの例としては、Ｐｒｏｔｈｏｒｏｍｂｉｎ由来のもの（ＦＮＰＲＴＦＧＳ、配列番号１９）又はＨＧＦＡ由来のもの（ＬＲＰＲＩＩＧＧ、配列番号２０）等が挙げられる。人工ペプチドの例としては、Ａｒｔｉｆｉｃａｌ  Ｔｈｒｏｍｂｉｎ  ｃｌｅａｖａｂｌｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ（ＴＦＬＴＰＲＧＶＲＬＧ、配列番号１７及びＴＦＰＰＲＳＦＬＧ、配列番号１８）（Ｍａｉｋｅ  Ｇ．ら、ＰＬｏＳ  ＯＮＥ、２０１２年、第７巻ｐ．Ｅ３１７５６−３１７７１；Ｂｏ  Ｃ．ら、Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ、２０１２年、第３２巻、２２号ｐ．７６２２−７６３１）等が挙げられる。トロンビン感受性ペプチドとしては、配列番号１７〜２０で表されるアミノ酸配列であるペプチドが好ましく、配列番号１７で表されるアミノ酸配列であるペプチドがより好ましい。
【００４５】
プロテアーゼ感受性ペプチドは、１種又は複数種を用いることができる。同一のプロテアーゼに対して異なる切断活性を有するプロテアーゼ感受性ペプチドや、異なるプロテアーゼに対するプロテアーゼ感受性ペプチドを組み合わせて用いることにより、複数箇所をＰＥＧで化学修飾をすることや切断活性を制御することが可能となる。
【００４６】
プロテアーゼ感受性ペプチドは、例えば、公知の遺伝子組み換え技術を用いて、ＨＧＦ又はその活性断片をコードする核酸配列（ＤＮＡ）と連続してプロテアーゼ感受性ペプチド配列をコードする核酸配列（ＤＮＡ）を設計し、細胞に一過性又は安定的に導入し、発現させることで、プロテアーゼ感受性ぺプチドを付加したＨＧＦ又はその活性断片として取得することができる。
【００４７】
上記のプロテアーゼ感受性ペプチドは、精製等の目的でタグ配列等の人工配列が付加されたものであってもよい。タグ配列としては、例えば、６×Ｈｉｓタグ、ＨＡＴタグ、ｃ−Ｍｙｃタグ、ＦＬＡＧタグ、ＤＹＫＤＤＤＤＫタグ、Ｓｔｒｅｐタグ、ＨＡタグ、ＧＳＴタグ及びＭＢＰタグ等が挙げられる。さらに、プロテアーゼ感受性ペプチドを付加したＨＧＦ又はその活性断片の精製後にこれらタグ配列を除去するために、当該プロテアーゼ感受性ペプチド以外に、更に、精製のためのプロテアーゼ感受性ペプチドや精製のためのスペーサー配列等の配列を、当該プロテアーゼ感受性ペプチドとタグ配列との間に任意に挿入することも可能である。この場合、精製及びタグ配列の除去により得られたプロテアーゼ感受性ペプチドを付加したＨＧＦ又はその活性断片には、精製のためのプロテアーゼ切断ペプチドや精製のためのスペーサー配列等の配列の切断断片が含まれていてもよい。
【００４８】
上記のプロテアーゼ感受性ペプチドは、ＰＥＧ修飾等の目的でシステイン等の天然型アミノ酸やアジドフェニルアラニン等の非天然型アミノ酸が挿入されたものであってもよい。プロテアーゼ感受性ペプチドへの上記アミノ酸の挿入は、例えば、公知の遺伝子組み換え技術を用いて、プロテアーゼ感受性ペプチド配列をコードする核酸配列（ＤＮＡ）と連続して付加するアミノ酸をコードする核酸配列（ＤＮＡ）を設計し、細胞に一過性又は安定的に導入し、発現させることで実施可能である。ＰＥＧ修飾等を目的としたアミノ酸の挿入部位は、プロテアーゼ感受性ペプチドの末端（アミノ末端又はカルボキシル末端）が好ましい。
【００４９】
なお、上記のプロテアーゼ感受性ペプチドは、プロテアーゼ感受性ペプチドと、精製等を目的としたタグ配列等の人工配列又はＰＥＧ修飾等の目的で挿入されたアミノ酸と、の間に、公知の遺伝子組換え技術を用いてスペーサー配列として１〜２０個のアミノ酸が付加されたものであってもよい。プロテアーゼ感受性ペプチドと、精製等を目的としたタグ配列等の人工配列又はＰＥＧ修飾等の目的で挿入されたアミノ酸と、の間にスペーサー配列が付加されたプロテアーゼ感受性ペプチドは、例えば、公知の遺伝子組み換え技術を用いてプロテアーゼ感受性ペプチドをコードする核酸配列（ＤＮＡ）に連続して任意に選択したスペーサー配列をコードする核酸配列（ＤＮＡ）を付加し、さらに連続して精製等を目的としたタグ配列等の人工配列又はＰＥＧ修飾等を目的としたアミノ酸を挿入し、細胞に一過性又は安定的に導入し、発現させることで、取得することができる。上記スペーサー配列に使用できるアミノ酸としては、例えば、アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）、ヒスチジン（Ｈ）、リジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）、フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）、アラニン（Ａ）、システイン（Ｃ）、アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）、セリン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）、イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、ノルロイシン（Ｎｌｅ）、メチオニン（Ｍ）、バリン（Ｖ）及びトリプトファン（Ｗ）が挙げられる。この際、任意で付加されるスペーサー配列は、プロテアーゼ感受性ペプチドの末端に付加されていることが好ましく、ＨＧＦ又はその活性断片のアミノ末端に付加されたプロテアーゼ感受性ペプチドのアミノ末端にスペーサー配列のカルボキシル末端が付加されており、該スペーサー配列のアミノ末端に精製等を目的としたタグ配列等の人工配列又はＰＥＧ修飾等の目的で挿入されたアミノ酸が付加されていることがより好ましい。上記スペーサー配列は、プロテアーゼ感受性ペプチドの切断効率や、ＰＥＧ修飾によるＨＧＦ又はその活性断片の活性制御の効率を考慮して適宜選択される。
【００５０】
＜ＰＥＧ＞
ＰＥＧは、水溶性ポリ（エチレンオキシド）を含む、生体適合性の高いポリマー性高分子であり、タンパク質をＰＥＧで化学修飾することにより、該タンパク質に対して物理的安定性、熱安定性、タンパク質分解酵素に対する抵抗性、溶解性の向上、生体内での分布容積の低下、血中滞留性の向上等の臨床的な有用性が付加されることが知られている（Ｉｎａｄａら、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏａｃｔ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｔｉｂｌｅ  Ｐｏｌｙｍｅｒｓ、第５巻、１９９０年、ｐ．３４３；  Ｄｅｌｇａｄｏら、Ｃｒｉｔｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ｉｎ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｄｒｕｇ  Ｃａｒｒｉｅｒ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、第９巻、１９９２年、ｐ．２４９；  Ｋａｔｒｅ、Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、第１０巻、１９９３年、ｐ．９１）。
【００５１】
本発明に係るＨＧＦ又はその活性断片のＰＥＧ修飾体を作製するために用いるＰＥＧは、当技術分野で既知のものを用いることができる。典型的には、繰り返しユニット構造「−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−」を含み、末端基又はＰＥＧ全体の構造は、後述の通り変化し得る。例えば、末端の酸素原子の置換の有無によって、「−ＣＨ２ＣＨ２−Ｏ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−ＣＨ２ＣＨ２−」及び「−（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｎＯ−」を含み得る。本発明に係るＨＧＦ又はその活性断片のＰＥＧ修飾体を作製するために用いるＰＥＧは、末端がキャップされており、その具体例としては、ＰＥＧの一方の末端が反応性を有する官能基（例えばマレイミド基）でキャップされたものが挙げられる。また、ＰＥＧのもう一方の末端はキャップされていてもよいし、親水性を高めるために、例えばヒドロキシル基の導入等の修飾を受けたものでもよい。分岐構造を有するＰＥＧを用いる場合には、少なくとも一つの末端が上記のマレイミド基等の反応性を有する官能基でキャップされていればよく、その他の分岐鎖の各末端は修飾を受けたものでもよい。本発明において、プロテアーゼ感受性ペプチドを付加したＨＧＦ又はその活性断片をＰＥＧで化学修飾するために、ＰＥＧ末端がプロテアーゼ感受性ペプチドを付加したＨＧＦ又はその活性断片との共有結合反応性を示すよう官能基で活性化されたＰＥＧを用いることができる。
【００５２】
本発明に係るＨＧＦ又はその活性断片のＰＥＧ修飾体に含まれるＰＥＧは、その構造に特に制限はなく、直鎖構造でも分岐構造でも問題ないが、ＨＧＦ又はその活性断片の持つ肝指向性を低減させる点で分岐構造を有することが好ましい。分岐構造を有するＰＥＧとしては、例えば、２分岐型のＰＥＧ、３分岐型のＰＥＧ又は４分岐型のＰＥＧが挙げられ、分岐数はそれ以上の数も包含するが、なかでも４分岐型のＰＥＧであることが好ましい。より具体的には、官能基までのリンカー部分の末端から２分岐、３分岐又は４分岐した構造や、官能基までのリンカー部分の末端から分岐したＰＥＧ鎖からさらにＰＥＧ鎖が分岐した構造や、官能基までのリンカー部分の末端及びリンカー部分の途中からＰＥＧ鎖が分岐している構造が挙げられ、分岐したＰＥＧ鎖それぞれの数平均分子量は、同じでも異なっていてもよい。なかでも、官能基までのリンカー部分からＰＥＧ鎖が２分岐し、それぞれの分岐したＰＥＧ鎖からさらにＰＥＧ鎖が２分岐した構造が好ましく、官能基までのリンカー部分からＰＥＧ鎖が２分岐し、それぞれの分岐したＰＥＧ鎖からさらにＰＥＧ鎖が２分岐した、同じ数平均分子量のＰＥＧ鎖を計４本有する構造が最も好ましい。最も好ましい構造のＰＥＧとして、例えば、油化産業株式会社のＳＵＮＢＲＩＧＨＴ  ＧＬ４−８００ＭＡ（日油株式会社）が挙げられる。ＰＥＧの構造に係る好ましい態様と、ＰＥＧの数平均分子量に係る好ましい態様は、任意に組み合わせることができる。例えば、４分岐型であって、数平均分子量が２００００〜１０００００のＰＥＧ、官能基までのリンカー部分からＰＥＧ鎖が２分岐し、それぞれの分岐したＰＥＧ鎖からさらにＰＥＧ鎖が２分岐した、同じ数平均分子量のＰＥＧ鎖を計４本有する構造であって、数平均分子量が７００００〜９００００のＰＥＧが挙げられる。
【００５３】
ＰＥＧは、市販品、或るいは、公知の方法又はそれに準じた方法に従い、エチレンオキシドの開環重合により合成できる（Ｓａｎｄｌｅｒ  ａｎｄ  Ｋａｒｏ、Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、第３巻、ｐ．１３８−１６１）。
【００５４】
本発明に係るＨＧＦ又はその活性断片のＰＥＧ修飾体に含まれるＰＥＧの数平均分子量は、２００００〜１０００００が好ましく、４００００〜１０００００がより好ましく、ＨＧＦ活性を減弱させるために６００００〜１０００００がさらに好ましく、７００００〜９００００が最も好ましい。なお、ＰＥＧの化学修飾によるタンパク質等の生体内半減期の延長効果は、ＰＥＧの数平均分子量と相関することが知られており（Ｓｕｎｄｑｖｉｓｔ  Ｔ．ら、Ｃｏｍｐｕｔｅｒｓ  ａｎｄ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、１９８８年、第２１巻、第２号、ｐ．１１０−１１６）、一般的に、数平均分子量が２００００以上であれば生体内半減期の十分な延長効果が期待できる。
【００５５】
プロテアーゼ感受性ペプチドを付加したＨＧＦ又はその活性断片をＰＥＧで化学修飾するために、ＰＥＧの末端を活性化する必要がある。末端が活性化したＰＥＧの例としては、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、ニトロベンゼンスルホネートエステル、マレイミド、オルトピリジルジスルフィド、ビニルスルフォン、ヨードアセトアミド、カルボン酸、アジド、ホスフィン又はアミン構造で末端が活性化されたＰＥＧが挙げられ、これらは、市販品、又は、公知の方法に従い合成できる。例えば、各種反応性官能基により活性化されたＰＥＧとして、油化産業株式会社のＳＵＮＢＲＩＧＨＴ（登録商標、日油株式会社）シリーズが挙げられる。本明細書において、プロテアーゼ感受性ペプチドを付加したＨＧＦ又はその活性断片との共有結合反応性を示すようＰＥＧ末端に付加された反応性官能基を単に「官能基」、これら反応性官能基を末端に持つＰＥＧを「官能基により活性化されたＰＥＧ」と記載する。官能基は修飾部位により適宜選択されるが、例えば、アミノ基に対しては、官能基としてＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）エステル基を用いることで選択的な修飾が可能である。また、システイン残基の側鎖に存在するチオール基は、官能基としてマレイミド基を用いた選択的な修飾が可能である。そして、グルタミン酸の側鎖及びカルボキシル末端に存在するカルボキシル基に対しては、アミノ基等を用いて修飾が可能である。また、アジドフェニルアラニン等の非天然型アミノ酸に含まれるアジド基に対しては、トリアリルホスフィンを用いることで選択的な修飾が可能である。これらの場合、ＰＥＧで化学修飾されたプロテアーゼ感受性ペプチドを付加したＨＧＦ又はその活性断片、すなわち、本発明に係るＨＧＦ又はその活性断片のＰＥＧ修飾体には、ＰＥＧとプロテアーゼ感受性ペプチドとの共有結合反応により生じた官能基が含まれていてもよく、例えば、システインに含まれるチオール基とマレイミド基との共有結合反応の場合にはスクシンイミド基が含まれる。
【００５６】
上記のＨＧＦ又はその活性断片の好ましい態様、プロテアーゼ感受性ペプチドの好ましい態様、ＰＥＧの好ましい態様は、任意に組み合わせることができる。
【００５７】
＜製法＞
本発明に係るＨＧＦ又はその活性断片のＰＥＧ修飾体は、前述の通り、ＨＧＦ又はその活性断片の末端（アミノ末端、カルボキシル末端）に、プロテアーゼ感受性ペプチドを介してＰＥＧが共有結合している。その製法としては、例えば、プロテアーゼ感受性ペプチドを付加したＨＧＦ又はその活性断片とＰＥＧとを共有結合させる方法が挙げられる。
【００５８】
プロテアーゼ感受性ペプチドを付加したＨＧＦ又はその活性断片の製造方法の一例を以下に挙げる。ＨＧＦ又はその活性断片とプロテアーゼ感受性ペプチドは別々に調製せずに一分子のタンパク質として発現させることができ、例えば、プロテアーゼ感受性ペプチドを付加したＨＧＦ又はその活性断片は、後述の遺伝子組み換え技術を用いて、ＨＧＦ又はその活性断片をコードする核酸配列（ＤＮＡ）と連続してプロテアーゼ感受性ペプチド配列をコードする核酸配列（ＤＮＡ）を設計し、細胞に一過性又は安定的に導入し、発現させることで、取得することができる。なお、任意のスペーサー配列を含む核酸配列（ＤＮＡ）がＨＧＦ若しくはその活性断片とプロテアーゼ感受性ペプチドとの間、又は、プロテアーゼ感受性ペプチドと、精製等を目的としたタグ配列等の人工配列若しくはＰＥＧ修飾等の目的で挿入されたアミノ酸と、の間に連続して付加されるように設計することで、スペーサー配列も付加することができる。
【００５９】
当該プロテアーゼ感受性ペプチドを付加したＨＧＦ又はその活性断片の製造においては、例えば、遺伝子組換え技術を用いて、プロテアーゼ感受性ペプチドを付加した状態で発現させることにより得られる、プロテアーゼ感受性ペプチドを付加したＨＧＦ又はその活性断片を用いることが好ましい。その際、プロテアーゼ感受性ペプチドはＨＧＦ又はその活性断片のアミノ末端に直接結合していることが好ましく、プロテアーゼ感受性ペプチドのカルボキシル末端がＨＧＦ又はその活性断片のアミノ末端に直接結合していることが好ましい。
【００６０】
プロテアーゼ感受性ペプチドを付加したＨＧＦ又はその活性断片の精製又は濃縮は、公知の方法を用いて実施でき、例えば、イオン交換、ゲル濾過、疎水性担体若しくは親和性担体を用いたクロマトグラフィー等の方法、又はこれらの組み合わせにより、未反応のＨＧＦ又はその活性断片や官能基が活性化されたＰＥＧ、又は副生成物を除去して、プロテアーゼ感受性ペプチドを付加したＨＧＦ又はその活性断片を精製又は濃縮することができる。
【００６１】
ＨＧＦ又はその活性断片は、組織からの抽出、遺伝子組換え技術を用いたタンパク質合成、ＨＧＦ又はその活性断片を発現する組換え細胞（又はＨＧＦを発現する天然細胞）を用いた生物学的製造等の公知の方法を用いて得ることもできる。また、ＨＧＦ又はその活性断片として、市販のＨＧＦ又はその活性断片も用いることができる。
【００６２】
ＨＧＦ又はその活性断片は、原核生物細胞又は真核生物細胞を用いて発現可能であることが知られており、例えばＮＫ１であれば、公知の遺伝子組み換え技術を用いてＨＧＦの活性断片の一つであるＮＫ１をコードする核酸配列（ＤＮＡ）を細胞に一過性又は安定的に導入することでＮＫ１を発現させることで、取得することができる。
【００６３】
遺伝子組換え技術については、例えばＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ、２ｎｄ  ｅｄ．、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９８９）に記載された方法に従って行うことができる。上記技術の一例を以下に説明する。
【００６４】
ＨＧＦ又はその活性断片をコードするＤＮＡを準備する。該ＤＮＡは、ヒト組織や細胞から作製したｃＤＮＡライブラリーから選択して取り出し、ＰＣＲ法等のＤＮＡ増幅法に掛けることによって得ることができる。或いは、該ＤＮＡは、例えばホスホアミダイト法を利用したＤＮＡ合成機を使用して化学的に合成することができる。
【００６５】
上記のＤＮＡを適当なベクターに組み込み、発現ベクターを作製する。そのようなベクターは、該ＤＮＡを発現（必要に応じて、分泌）するために必要な調節配列等のエレメントを含む。エレメントの具体例は、翻訳開始コドン及び終始コドン、プロモーター、エンハンサー、ターミネーター、リボソーム結合部位（若しくは、シャイン・ダルガルノ配列）、選択マーカー配列、シグナル配列等を含み、ベクターには必要なエレメントが挿入される。
【００６６】
プロモーターとしては、宿主細胞に応じて適するプロモーターが選択され、例えば、原核生物であるエッシェリシア属（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）細菌の細胞に適するプロモーターは、例えばｔｒｐプロモーター、ｌａｃプロモーター、ｒｅｃＡプロモーター、λＰLプロモーター等であり、バチルス属(Ｂａｃｉｌｌｕｓ)細菌の細胞に適するプロモーターは、例えばＳＰＯ１プロモーター、ＳＰＯ２プロモーター、ｐｅｎＰプロモーター等である。酵母細胞に適したプロモーターは、例えばＰＨＯ５プロモーター、ＰＧＫプロモーター、ＧＡＰプロモーター、ＡＤＨプロモーター、ＡＯＸプロモーター等である。植物細胞に適したプロモーターは、例えばカリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）プロモーター等である。昆虫細胞に適したプロモーターは、例えばＰ１０プロモーター、ポリヘドリンプロモーター等である。哺乳動物細胞に適したプロモーターは、例えばラウス肉腫ウイルス、ポリオマーウイルス、鶏頭ウイルス、アデノウイルス、ウシパピローマウイルス、トリ肉腫ウイルス、サイトメガロウイルス（ＳＭＶ）、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）、ワクシニアウイルス等のウイルスのプロモーター、メロチオネインプロモーター、ヒートショックプロモーター等である。
【００６７】
選択マーカーとしては、例えば、ＨＩＳ３遺伝子、ＬＥＵ２遺伝子、ＴＲＰ１遺伝子、ＵＲＡ３遺伝子、ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子（メソトレキセート（ＭＴＸ）耐性）、アンピシリン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子等である。
【００６８】
発現ベクターとしては、宿主細胞に適したベクターが選択され、例えば、プラスミド、ファージ、コスミド、ウイルスベクター、人工染色体（例えばＢＡＣ、ＹＡＣ等）等が通常使用されるベクターである。原核生物用ベクターについては、大腸菌由来のプラスミド、例えば、ｐＣＲ系プラスミド、ｐＢＲ系プラスミド、ｐＵＣ系プラスミド等、枯草菌由来のプラスミド、例えば、ｐＵＢ１１０、ｐＴＰ５、ｐＣ１９４等である。酵母用ベクターについては、酵母由来プラスミド、例えば、ｐＳＨ系プラスミド等である。植物細胞用ベクターについては、バイナリーベクター等である。哺乳類細胞用ベクターについては、ｐＢＫ−ＣＭＶ、ｐｃＤＮＡ３．１、ｐＺｅｏＳＶ（インビトロゲン社、ストラジーン社）等の市販ベクター、ウイルスベクター（例えばアデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ポックスウイルス、単純ヘルペスウイルス、レンチウイルス、センダイウイルス、ワクシニアウイルス、ＳＶ４０等）である。
【００６９】
宿主細胞としては、例えば、大腸菌、枯草菌等の原核生物細胞、並びに、酵母、植物細胞、動物細胞（例えば哺乳類細胞、昆虫細胞等）等の真核生物細胞が挙げられる。上記発現ベクターを宿主細胞に形質転換又はトランスフェクションするときには、例えばエレクトロポレーション法、マイクロインジェクション法、細胞融合法、ＤＥＡＥデキストラン法、リン酸カルシウム法、パーティクルガン法等の公知の手法を使用できる。
【００７０】
プロテアーゼ感受性ペプチドを付加したＨＧＦ又はその活性断片とＰＥＧとを結合させる方法としては、例えば、上記のプロテアーゼ感受性ペプチドを付加したＨＧＦ又はその活性断片と官能基により活性化されたＰＥＧとを共有結合させる方法、言い換えると上記のプロテアーゼ感受性ペプチドを付加したＨＧＦ又はその活性断片を官能基により活性化されたＰＥＧで化学修飾する方法が挙げられる。
【００７１】
上記のプロテアーゼ感受性ペプチドを付加したＨＧＦ又はその活性断片をＰＥＧで化学修飾するには、該プロテアーゼ感受性ペプチドに含まれるアミノ酸、又は該プロテアーゼ感受性ペプチドに人工的に導入したシステインや非天然アミノ酸（例えば、アジドフェニルアラニン）に含まれる、アミノ基、チオール基、カルボキシル基又はアジド基等を用いることができる。上記のプロテアーゼ感受性ペプチドを付加したＨＧＦ又はその活性断片のＰＥＧによる化学修飾には公知の遺伝子組換え技術を用いることができる（米国特許第４９１７８８８号及び国際公開第１９８７／０００５６号、国際公開第１９９９／５５３７７号、Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ＆Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｌｅｔｔｅｒｓ、第１４巻、２００４年、ｐ．５７４３−５７４５）。例えば、ＨＧＦ又はその活性断片のアミノ末端又はカルボキシル末端に付加したプロテアーゼ感受性ペプチド内に人工的にシステインを挿入した場合、そのシステイン残基の側鎖に存在するチオール基は、分子内及び分子間ジスルフィド結合を形成していないことから、該チオール基に対して官能基としてマレイミド基を有するＰＥＧとの部位選択的な化学修飾をすることが可能である。また、プロテアーゼ感受性ペプチドを付加したＨＧＦ又はその活性断片中、該プロテアーゼ感受性ペプチドの末端に非天然型アミノ酸を挿入する方法としては、コドン改変によるアジドフェニルアラニン及びアジド−Ｚ−リジン等の導入方法が報告されており（特開２００９−２０７４９０号公報）、これら非天然型アミノ酸に含まれるアジド基に対して官能基としてトリアリルホスフィンを有するＰＥＧとの部位選択的な化学修飾をすることも可能である。また、該プロテアーゼ感受性ペプチドを公知のビオチン・リガーゼ発現システム（Ａｖｉｄｉｔｙ）を用いて細胞内でビオチン標識し、アビジンとの相互作用を利用してＰＥＧで化学修飾する部位として用いることもできる。
【００７２】
なかでも、官能基に選択的反応性を示すアミノ酸（天然型、非天然型）を、ＨＧＦ又はその活性断片の末端（アミノ末端、カルボキシル末端）に付加したプロテアーゼ感受性ペプチドの末端に人工的に挿入する方法が好ましい。官能基に選択的反応性を示すアミノ酸（天然型、非天然型）の挿入は、前述の遺伝子組換え技術を用いて実施可能である。特に、本発明に係るＨＧＦ又はその活性断片のＰＥＧ修飾体を作製する際には、システイン残基、アジドフェニルアラニン残基又はアジド−Ｚ−リジン残基を人工的に挿入することがより好ましく、システイン残基を人工的に挿入することがさらに好ましい。この場合、マレイミド基により活性化されたＰＥＧを用いることが好ましい。
【００７３】
本発明に係るＨＧＦ又はその活性断片のＰＥＧ修飾体の精製又は濃縮は、プロテアーゼ感受性ペプチドを介してＰＥＧで化学修飾した後、公知の方法を用いて実施できる。例えば、イオン交換、ゲル濾過、疎水性担体若しくは親和性担体を用いたクロマトグラフィー等の方法、又はこれらの組み合わせにより、未反応のＨＧＦ又はその活性断片や官能基が活性化されたＰＥＧ、又は副生成物を除去して、ＨＧＦ又はその活性断片のＰＥＧ修飾体を精製又は濃縮することができる。
【００７４】
＜医薬＞
本発明に係るＨＧＦ又はその活性断片のＰＥＧ修飾体は、ＰＥＧ修飾による生体内半減期の延長効果が期待できるのみならず、さらに特定のプロテアーゼを発現する標的疾患組織において上記ＰＥＧ修飾体に含まれるプロテアーゼ感受性ペプチドが切断されることで、ＨＧＦ又はその活性断片が本来備えている生理活性を発現することができるため、肝臓に対する副作用が低減された医薬（例えば、腎線維症等の臓器線維症の治療薬又は予防薬。）の有効成分として用いることができる。
【００７５】
上記のＨＧＦ又はその活性断片のＰＥＧ修飾体の生理活性は、培養細胞を用いて簡便に測定することが可能である。例えば、天然型ＨＧＦの薬理作用であるｃ−Ｍｅｔリン酸化誘導作用、細胞増殖作用、細胞遊走作用及び抗アポトーシス作用等を指標とすることができる（Ｒｕｂｉｎ  Ｊ．Ｓ.ら、Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２００１年、第２７６巻、３５号、ｐ．３２９７７−３２９８３；Ｌｉｅｔｈａ  Ｄ．ら、Ｔｈｅ  ＥＭＢＯ  Ｊｏｕｒｎａｌ、２００１年、第２０巻、第２０号、ｐ．５５４３−５５５５；Ｌｉｕ Ｙ．ら、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆＰｈｙｓｉｏｌｏｇｙ、１９９９年、第２７７巻、第４号、ｐ．６２４−６３３）。
【００７６】
また上記のＨＧＦ又はその活性断片のＰＥＧ修飾体からの、活性体であるＨＧＦ又はその活性断片の放出の挙動は、例えば、ＳＤＳ電気泳動によるＰＥＧ修飾体と活性体との分子量変化を指標として簡便に測定することが可能である。
【００７７】
また上記のＨＧＦ又はその活性断片のＰＥＧ修飾体の生体内半減期は、例えば、モデル動物に静脈内投与、腹腔内投与、皮下投与又は皮内投与した際の血中濃度を測定することで算出できる。特に、上記のＨＧＦ又はその活性断片のＰＥＧ修飾体を放射線標識することで簡便に測定することが可能である。
【００７８】
上記のＨＧＦ又はその活性断片のＰＥＧ修飾体を有効成分として含有する医薬は、ＨＧＦ又はその活性断片の薬理作用を利用可能な疾患（急性炎症性疾患、慢性炎症性疾患、急性虚血性疾患又は慢性虚血性疾患等）の治療に用いることができる。具体的な疾患としては、例えば、筋萎縮性側索硬化症、臓器線維症、糖尿病、脊髄損傷、腹膜癒着、移植治療、創傷治癒又は神経因性疼痛等の治療に用いることができる。
【００７９】
上記のＨＧＦ又はその活性断片のＰＥＧ修飾体を有効成分として含有する医薬において、例えば、プロテアーゼ感受性ペプチドがＡＤＡＭ１７感受性ペプチドである場合は、ＨＧＦ又はその活性断片の副作用が懸念される肝臓と比較してＡＤＡＭ１７の発現量が高い臓器（例えば、腎臓）で発症する疾患（例えば、腎線維症）に対する治療剤又は予防剤として用いることができる。また、健常人では肝臓と比較してＡＤＡＭ１７の発現量が同等又は低い臓器であっても、病変によりＡＤＡＭ１７の発現量が上昇し、肝臓と比較してその発現量が高くなる臓器に係る疾患であれば、上記のＨＧＦ又はその活性断片のＰＥＧ修飾体を有効成分として含有する医薬をその疾患に対する治療剤として用いることもできる。
【００８０】
上記の医薬は、哺乳動物（例えば、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、イヌ、ネコ、サル、ウシ、ヒツジ又はヒト）、特にヒトに対する有用な治療薬として用いることができる。上記医薬を、ヒトに対する有用な治療薬として用いる場合は、上記のＨＧＦ又はその活性断片は、ヒトのＨＧＦ由来のアミノ酸配列に基づくものであることが好ましい。
【００８１】
上記の医薬の投与形態としては、有効成分である上記のＨＧＦ又はその活性断片のＰＥＧ修飾体を、そのまま又は医薬として許容される担体を配合して、経口的又は非経口的に投与することができる。皮下、筋肉内又は静脈内注射により投与することが好ましい。
【００８２】
上記の医薬の経口投与のための剤型としては、例えば、錠剤、丸剤、カプセル剤、顆粒剤、シロップ剤、乳剤又は懸濁剤が挙げられ、これらは、公知の方法によって製造することができ、製剤分野において通常用いられる担体又は賦形剤及び必要に応じて添加剤を含有するものである。錠剤用の担体及び賦形剤としては、例えば、ラクトース、マルトース、サッカロース、澱粉又はステアリン酸マグネシウムが挙げられる。添加剤としては、結合剤、崩壊剤、保存剤、遅延放出剤、着色剤、風味剤、安定化剤、溶解剤、増粘剤、乳化剤等を挙げることができる。
【００８３】
上記の医薬の非経口投与のための剤型としては、例えば、注射剤、点眼剤、軟膏剤、湿布剤、坐薬、経鼻吸収剤、経肺吸収剤、経皮吸収剤又は局所徐放剤が挙げられ、これらは、公知の方法によって製造することができる。溶液製剤は、例えば、有効成分である上記のＨＧＦ又はその活性断片のＰＥＧ修飾体を、注射剤に用いられる無菌の水溶液に溶解又は抽出液に懸濁及び乳化して、リポソームに包埋させた状態で調製することができる。固体製剤は、例えば、有効成分である上記のＨＧＦ又はその活性断片のＰＥＧ修飾体に、マンニトール、トレハロース、ソルビトール、ラクトース又はグルコース等を賦形剤として加え、凍結乾燥物として調製することができる。さらにこれを粉体化して用いることもできる。また、これら粉体をポリ乳酸やグリコール酸等と混合し固体化して用いることもできる。ゲル化剤は、例えば、有効成分である上記のＨＧＦ又はその活性断片のＰＥＧ修飾体を、グリセリン、ＰＥＧ、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、ヒアルロン酸若しくはコンドロイチン硫酸等の増粘剤又は多糖に溶解して調製することができる。また、必要に応じて、製剤に上記の添加剤を加えることができる。
【００８４】
上記の医薬は、患者の年齢、体重、投与対象疾患、症状、投与形態、投与経路、ＰＥＧの分子量等に応じて、適宜決定されるが、一般的には０．００１ｍｇ〜１００ｍｇ／ｋｇ／回、好ましくは０．０１ｍｇ〜１０ｍｇ／ｋｇ／回で１回／月〜１回／日、好ましくは１回／月〜１回／週の範囲で投与されうる。
【００８５】
上記の医薬は、その治療若しくは予防効果の補完又は増強あるいは投与量の低減のために、他の薬剤と適量配合又は併用して使用しても構わない。
【００８６】
別の一態様として、本発明に係るＨＧＦ又はその活性断片のＰＥＧ修飾体は、ＨＧＦ又はその活性断片の形態形成誘導作用を利用して、ＨＧＦ又はその活性断片のＰＥＧ修飾体を含む、細胞の分化促進誘導剤として用いることができる。上記細胞としては、例えば、上皮系細胞、神経幹細胞が挙げられる。
【実施例】
【００８７】
以下、本発明に係るＨＧＦ又はその活性断片のＰＥＧ修飾体について、実施例により具体的に説明するが、本発明はこれらの例によって限定されるものではない。【００８８】
（実施例１）プロテアーゼ感受性ペプチド付加ヒトＮＫ１の発現：
分泌シグナル配列を除去したヒトＮＫ１のアミノ末端に、プロテアーゼ感受性ペプチドをそのカルボキシル末端から付加し（ＡＤＡＭ１７感受性ペプチドとして配列番号９、トロンビン感受性ペプチドとして配列番号１７）、プロテアーゼ感受性ペプチドのアミノ末端に６×Ｈｉｓタグ及びシステイン残基を順に付加（すなわち、プロテアーゼ感受性ペプチドに加えて、ＣＨＨＨＨＨＨ（配列番号４）を付加）したヒトＮＫ１をコードするＤＮＡを人工合成により作製し（ファスマック社）、発現ベクターであるＣｏｌｄ−ｓｈｏｃｋ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ／ｐＣｏｌｄＩＶ（タカラバイオ）に挿入した。作製した発現用プラスミドを、宿主である大腸菌ＳＨｕｆｆｌｅ  Ｔ７  Ｅｘｐｒｅｓｓ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）に遺伝子導入した。【００８９】
同様の方法で、分泌シグナル配列を除去したヒトＮＫ１のカルボキシル末端に、プロテアーゼ感受性ペプチドをそのアミノ末端から付加し（ＡＤＡＭ１７感受性ペプチドとして配列番号９）、プロテアーゼ感受性ペプチドのカルボキシル末端にシステイン残基及び６×Ｈｉｓタグを順に付加（すなわち、プロテアーゼ感受性ペプチドに加えて、ＨＨＨＨＨＨＣ（配列番号５）を付加）したヒトＮＫ１をコードするＤＮＡも遺伝子導入した。以下、プロテアーゼ感受性ペプチド（すなわち、ＡＤＡＭ１７感受性ペプチド又はトロンビン感受性ペプチド）に加えて、配列番号４又は５で表される順番で６×Ｈｉｓタグ及びシステイン残基を付加したヒトＮＫ１を総称してプロテアーゼ感受性ペプチド付加ヒトＮＫ１と記載する。【００９０】
上記の大腸菌を硫酸カナマイシン又はカルベニシリン含有ＬＢ寒天培地に塗布し、３７℃で１８〜２２時間培養して、第１段階選択培養した。得られたコロニーを硫酸カナマイシン又はカルベニシリン含有ＬＢ培地に植菌し、培養して第２段階選択培養した。この培養液を種培養液とした。【００９１】
種培養液を硫酸カナマイシン又はカルベニシリン、０．８％Ｇｌｕｃｏｓｅ、０．７％Ｇｌｙｃｅｒｏｌ、２％Ｂａｃｔｏ−Ｔｒｙｐｔｏｎｅ、１％Ｃａｓａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄ、１％Ｙｅａｓｔ  Ｅｘｔｒａｃｔ、１００ｍｍｏｌ／Ｌ  Ｐｏｔａｓｓｉｕｍ  Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ、１０ｍｍｏｌ／Ｌ  ＭｇＳＯ４及び０．５％  ＮａＣｌ含有培養液で培養した。培養にはガラスフラスコ又はミニジャーファーメンターを用いた。培養液の濁度が適当な値まで上昇したのを確認した後、１５℃以下でＣｏｌｄ―Ｓｈｏｃｋをかけた。Ｃｏｌｄ―Ｓｈｏｃｋと同時に、培養液にＩＰＴＧを添加した。Ｃｏｌｄ―Ｓｈｏｃｋから１．５〜３時間後に培養を終了し、培養液を回収し、遠心分離によりプロテアーゼ感受性ペプチド付加ヒトＮＫ１を発現した大腸菌沈査を得た。【００９２】
（実施例２）プロテアーゼ感受性ペプチド付加ヒトＮＫ１の精製：
実施例１で得た大腸菌沈査から、プロテアーゼ感受性ペプチド付加ヒトＮＫ１を次の方法により精製した。【００９３】
実施例１にて取得したプロテアーゼ感受性ペプチド付加ヒトＮＫ１を発現した大腸菌沈査を５０ｍｍｏｌ／Ｌ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、５ｍｍｏｌ／Ｌ  ＥＤＴＡ、１５０ｍｍｏｌ／Ｌ  ＮａＣｌ、１０ｍｍｏｌ／Ｌ  ＣａＣｌ２、１０ｍｍｏｌ／Ｌ  ＭｇＣｌ２に懸濁し、高圧型卓上ホモジナイザー（Ｎｉｒｏ  Ｓｏａｖｉ）を用いて破砕した後、遠心分離により破砕液を清浄化した。【００９４】
予めＰＢＳ（−）で平衡化させたヘパリン担体（ＨｉＴｒａｐＨｅｐａｒｉｎ；ＧＥヘルスケア）に、遠心清浄化した大腸菌破砕液を通過させることでヘパリン担体にプロテアーゼ感受性ペプチド付加ヒトＮＫ１を結合させた。続けて、ＰＢＳ（−）に含まれるＮａＣｌ濃度を１５０ｍｍｏｌ／Ｌ〜２０００ｍｍｏｌ／Ｌの濃度範囲で変化させたバッファーをＮａＣｌ濃度の昇順に通過させ、各溶出画分を得た。各溶出画分をＳＤＳ電気泳動し、プロテアーゼ感受性ペプチド付加ヒトＮＫ１溶出画分を確認した。【００９５】
次に、予め３００ｍｍｏｌ／Ｌ  ＮａＣｌ含有ＰＢＳ（−）で平衡化させたニッケル担体（ｃＯｍｐｌｅｔｅ（登録商標、ロシュ・ダイアグノスティックス株式会社）  Ｈｉｓ−Ｔａｇ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｒｅｓｉｎ；Ｒｏｃｈｅ)に、ヘパリンレジン精製で得たプロテアーゼ感受性ペプチド付加ヒトＮＫ１溶出画分を通過させることで、レジンにプロテアーゼ感受性ペプチド付加ヒトＮＫ１を結合させた。続けて、５００ｍＭ  ＮａＣｌ含有ＰＢＳ（−）にイミダゾール（０ｍｍｏｌ／Ｌ〜５００ｍｍｏｌ／Ｌの濃度範囲）を添加したバッファーを、イミダゾール濃度の昇順に通過させ、各溶出画分を得た。各溶出画分をＳＤＳ電気泳動し、プロテアーゼ感受性ペプチド付加ヒトＮＫ１溶出画分を確認した。得られたプロテアーゼ感受性ペプチド付加ヒトＮＫ１溶出画分は遠心式限外ろ過デバイス（Ａｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ−１５、ＭＷＣＯ＝１００００；メルクミリポア）を用いて濃縮し、プロテアーゼ感受性ペプチド付加ヒトＮＫ１を得た。【００９６】
（実施例３）プロドラッグ化ヒトＮＫ１の合成：
１分子のプロテアーゼ感受性ペプチド付加ヒトＮＫ１のアミノ末端のシステイン残基又はカルボキシル末端のシステイン残基に、プロテアーゼ感受性ペプチドを介して１分子のＰＥＧが共有結合したヒトＮＫ１（以下、プロドラッグ化ヒトＮＫ１とも称する。）を、次の方法により合成した。【００９７】
実施例２により得たプロテアーゼ感受性ペプチド付加ヒトＮＫ１を３００ｍｍｏｌ／ＬＮａＣｌ、２ｍｍｏｌ／Ｌ  ＥＤＴＡ含有１００ｍｍｏｌ／Ｌ  リン酸緩衝液（ｐＨ６．０）に溶媒置換し、モル比がプロテアーゼ感受性ペプチド付加ヒトＮＫ１に対して４０倍となるように官能基により活性化されたＰＥＧを添加した。２５℃で一晩インキュベートすることによりプロテアーゼ感受性ペプチド付加ヒトＮＫ１にＰＥＧを共有結合させ、プロドラッグ化ヒトＮＫ１を合成した。上記官能基により活性化されたＰＥＧとしては、ＳＵＮＢＲＩＧＨＴ  ＧＬ２−４００ＭＡ（２分岐型、数平均分子量４００００、油化産業）、ＳＵＮＢＲＩＧＨＴ  ＭＥ−４００ＭＡ（直鎖型、数平均分子量４００００、油化産業）及びＳＵＮＢＲＩＧＨＴ  ＧＬ４−８００ＭＡ（４分岐型、数平均分子量８００００、油化産業）を用いた。ＡＤＡＭ１７感受性ペプチド（配列番号９）をアミノ末端に付加したヒトＮＫ１は上記３種のＰＥＧにより化学修飾した（以下、総称としてＡＤＡＭ１７切断型プロドラッグ化ヒトＮＫ１とし、合わせて修飾に用いたＰＥＧの構造と数平均分子量を記載する）。ＡＤＡＭ１７感受性ペプチド（配列番号９）をカルボキシル末端に付加したヒトＮＫ１は４分岐型、数平均分子量８００００のＰＥＧにより化学修飾した。トロンビン感受性ペプチド（配列番号１７）をアミノ末端に付加したヒトＮＫ１は２分岐型、数平均分子量４００００のＰＥＧにより化学修飾した（以下、トロンビン切断型プロドラッグ化ヒトＮＫ１）。【００９８】
次に、プロドラッグ化ヒトＮＫ１を含む反応液をＮａＣｌ不含のＰＢＳ（−）で１０倍希釈した後、イオン交換担体（ＳＰ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ６  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ；ＧＥヘルスケア）に通過させ、該溶液から未反応の官能基が活性化されたＰＥＧを除去した。イオン交換担体に吸着したプロドラッグ化ヒトＮＫ１を１．０ｍｏｌ／Ｌ  ＮａＣｌ含有ＰＢＳ（−）で溶出した後、ヘパリン担体（Ｈｅｐａｒｉｎ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ；ＧＥヘルスケア）に通過させ、素通り液を回収して遠心式限外ろ過デバイス（Ａｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ−４、ＭＷＣＯ＝３００００；メルクミリポア）を用いて濃縮し、目的タンパク質であるプロドラッグ化ヒトＮＫ１を得た。【００９９】
（実施例４）プロドラッグ化ヒトＮＫ１の純度及びプロテアーゼ感受性ペプチド付加ヒトＮＫ１の混入率の測定：
プロドラッグ化ヒトＮＫ１の純度及びＰＥＧで化学修飾されていない前駆体プロテアーゼ感受性ペプチド付加ヒトＮＫ１の混入率は、高速液体クロマトグラフィーを用いた逆相クロマトグラフィーにて測定した。【０１００】
高速液体クロマトグラフィー（ＬＣ−１０ＡＤシステム；島津製作所）に逆相カラム（Ｉｎｔｒａｄａ  ＷＰ−ＲＰ；Ｉｍｔａｋｔ）を接続し、実施例３にて取得したＡＤＡＭ１７切断型プロドラッグ化ヒトＮＫ１（３種）を注入した。０．１％トリフルオロ酢酸含有蒸留水（アセトニトリル０％）からアセトニトリル比率を１００％まで経時的に増加させ、２８０ｎｍの波長でピークを検出した。メインピークであるプロドラッグ化ヒトＮＫ１に対して、相対保持時間０．６５分付近のピークをプロテアーゼ感受性ペプチド付加ヒトＮＫ１とし、プロドラッグ化ヒトＮＫ１の純度及びプロテアーゼ感受性配列付加ヒトＮＫ１の混入率を算出した。【０１０１】
その結果、２分岐型、数平均分子量４００００のＰＥＧを用いた化学修飾によるＡＤＡＭ１７切断型プロドラッグ化ヒトＮＫ１の純度は９８．９％（プロテアーゼ感受性ペプチド付加ヒトＮＫ１の混入率１．１％）であった。直鎖型、数平均分子量４００００のＰＥＧを用いた化学修飾によるＡＤＡＭ１７切断型プロドラッグ化ヒトＮＫ１の純度は９７．３％（プロテアーゼ感受性ペプチド付加ヒトＮＫ１の混入率２．７％）であった。４分岐型、数平均分子量８００００のＰＥＧを用いた化学修飾によるＡＤＡＭ１７切断型プロドラッグ化ヒトＮＫ１の純度は９７．９％（プロテアーゼ感受性ペプチド付加ヒトＮＫ１の混入率２．１％）であった。したがって、いずれのプロドラッグ化ヒトＮＫ１も高純度で取得できていることを確認した。【０１０２】
（実施例５）腎臓病モデルマウス組織におけるＡＤＡＭ１７の活性発現量の測定：
腎臓病モデルマウス組織におけるＡＤＡＭ１７の活性発現量を、ＡＤＡＭ１７活性測定キット（ＳＥＮＳＯＬＹＴＥＲ５２０  ＴＡＣＥ；ＡＮＡＳＰＥＣ）を用いて測定した。測定は、各条件２例で行った。【０１０３】
腎臓病モデルマウスとして片側尿管結紮モデルマウス（以下、ＵＵＯマウス）を作製した。ＩＣＲ系統の雄性マウス（日本チャールスリバー）の尿管をシルク糸で結紮した。切開部位を縫合し、１、７、１０及び１４日間飼育した後、マウスの腎臓及び肝臓を摘出した。無処置のマウス（以下、正常マウス）として、０日及び１４日飼育後のマウスの腎臓及び肝臓を摘出した。ＳＥＮＳＯＬＹＴＥＲ５２０  ＴＡＣＥ（Ａｎａｓｐｅｃ）添付のＣｏｍｐｏｎｅｎｔＣに０．１％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００を加えた溶媒を組織片に添加して、ハンディマイクロホモジナイザー（ヒストコロン）を用いて組織を破砕した。破砕した組織を４℃又は氷上で１５分間静置したものを、４℃、２０００×ｇで１５分間遠心分離し、上清を得た。【０１０４】
遠心上清の総タンパク量を、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｓｓａｙ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）試薬を用いて測定した。【０１０５】
遠心上清中のＡＤＡＭ１７活性を、４８５ｎｍで励起したときの５３５ｎｍの蛍光を測定することにより検出し、タンパク量１μｇあたりのＡＤＡＭ１７活性を算出した。【０１０６】
結果を図１に示す。縦軸は、各例のタンパク量１μｇあたりのＡＤＡＭ１７活性を示す。横軸の「Ｄａｙ０」、「Ｄａｙ１」、「Ｄａｙ７」、「Ｄａｙ１０」及び「Ｄａｙ１４」は、それぞれ０、１、７、１０、１４日間飼育したマウスの組織を示す。「正常」は正常マウスを、「ＵＵＯ」は、ＵＵＯマウスを示す。【０１０７】
ＵＵＯマウス及び正常マウスともに、腎臓組織では肝臓組織を上回るＡＤＡＭ１７活性を示した。また、尿管結紮後の日数経過とともにＡＤＡＭ１７の活性が増加したことから、腎臓病が進行した腎臓組織では、肝臓組織及び正常の腎臓組織と比べＡＤＡＭ１７活性が増加することが示された。したがって、ＨＧＦ又はその活性断片のプロドラッグ化において、その活性制御に用いる標的分子としてＡＤＡＭ１７が有用であることが示された。【０１０８】
（実施例６）腎臓病モデルマウス組織におけるＡＤＡＭ１７タンパク質の発現量の測定：
腎臓病モデルマウス組織におけるＡＤＡＭ１７タンパク質の発現量をウエスタンブロッティング法により評価した。評価は、各条件２例で行った。【０１０９】
実施例５と同様の方法で作製したＵＵＯマウス及び正常マウスから、該ＵＵＯマウスは尿管結紮の７及び１４日間後、該正常マウスはＵＵＯマウスの尿管結紮を実施した日（すなわち０日間飼育）に腎臓及び肝臓を摘出し、ＳＥＮＳＯＬＹＴＥ（登録商標、Ａｎａｓｐｅｃ）５２０  ＴＡＣＥ（Ａｎａｓｐｅｃ）添付のＣｏｍｐｏｎｅｎｔＣに０．１％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００を加えた溶媒を組織片に添加してハンディマイクロホモジナイザー（ヒストコロン）を用いて組織を破砕した。破砕した組織を４℃又は氷上で１５分間静置したものを、４℃、２０００×ｇで１５分間遠心分離し、上清を得た。【０１１０】
得られた上清を用いて、ウエスタンブロッティングを行った。ＡＤＡＭ１７前駆体及びＡＤＡＭ１７成熟体の検出には、一次抗体としてＡｎｔｉ−ＡＤＡＭ１７  ａｎｔｉｂｏｄｙ−Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｓｉｔｅ（ａｂｃａｍ）、二次抗体としてａｎｔｉ−Ｒａｂ  ＩｇＧ−ＨＲＰ（ＣＳＴ）用い、ＧＡＰＤＨの検出には一次抗体としてＨｕｍａｎ／Ｍｏｕｓｅ／Ｒａｔ  ＧＡＰＤＨ／Ｇ３ＰＨ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）、二次抗体としてｄｏｎｋｅｙ  ａｎｔｉ  ｇｏａｔ  ＩｇＧ−ＨＲＰ（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ）を用いた。【０１１１】
ＣｈｅｍｉＤｏｃ（登録商標、バイオ・ラッドラボラトリーズ）  ＸＲＳ＋システム（Ｂｉｏ−ＲａｄＲＡＤ）を用いて撮影した画像を解析し、ＡＤＡＭ１７前駆体又はＡＤＡＭ１７成熟体のバンド強度をＧＡＰＤＨのバンド強度で割った値を算出して組織中のＡＤＡＭ１７タンパク質の発現量の指標とした。【０１１２】
結果を図２に示す。（ａ）には各例のウエスタンブロッティング像、（ｂ）には各例のバンド強度から算出した組織中のＡＤＡＭ１７タンパク質の発現量から算出した平均値を示す。図中の「Ｄａｙ０」、「Ｄａｙ７」及び「Ｄａｙ１４」は、それぞれ、０、７及び１４日間飼育したマウスを示す。「正常」は正常マウスを、「ＵＵＯ」はＵＵＯマウスを示す。（ｂ）の縦軸は、組織中のＡＤＡＭ１７タンパク質の発現量を示す。【０１１３】
腎臓組織において、尿管結紮後経時的に、ＡＤＡＭ１７前駆体タンパク質の発現量の減少とＡＤＡＭ１７活性を示すＡＤＡＭ１７成熟体タンパク質の発現量の増加が認められた。【０１１４】
これらの結果から、腎臓病が進行した腎臓組織では、肝臓組織や正常の腎臓組織と比べてＡＤＡＭ１７成熟体タンパク質の発現量が増加していることが明らかとなった。【０１１５】
以上のことから、ＨＧＦ又はその活性断片のプロドラッグ化において、その活性制御に用いる標的分子としてＡＤＡＭ１７が有用であることが示された。【０１１６】
（実施例７）プロドラッグ化ヒトＮＫ１のプロテアーゼ処理による活性体放出の評価：
プロドラッグ化ヒトＮＫ１をプロテアーゼ処理することにより放出されたヒトＮＫ１（活性体）量をＳＤＳ電気泳動により評価した。【０１１７】
実施例３にて取得した、プロドラッグ化ヒトＮＫ１（ＡＤＡＭ１７切断型プロドラッグ化ヒトＮＫ１（３種）及びトロンビン切断型プロドラッグ化ヒトＮＫ１（１種））をＳＥＮＳＯＬＹＴＥ  ５２０  ＴＡＣＥ（Ａｎａｓｐｅｃ）添付のＣｏｍｐｏｎｅｎｔＣを用いて１０倍希釈した。ＡＤＡＭ１７切断型プロドラッグ化ヒトＮＫ１には、反応モル比がプロドラッグ化ヒトＮＫ１：ＡＤＡＭ１７＝５：１となるようＡＤＡＭ１７（ＴＡＣＥ，Ｈｉｓ  Ｔａｇ，Ｈｕｍａｎ  Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ；Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）を添加した。トロンビン切断型プロドラッグ化ヒトＮＫ１には、反応モル比がプロドラッグ化ヒトＮＫ１：トロンビン＝１：１０となるようトロンビン（Ｔｈｒｏｍｂｉｎ  ｆｒｏｍ  ｈｕｍａｎ  ｐｌａｓｍａ；Ｓｉｇｍａ）を添加した。実験のコントロールとして、対応するプロテアーゼを添加していないプロドラッグ化ヒトＮＫ１についても以下の操作を同様に行った。３７℃で１時間インキュベートした後、反応液をＴＣＡ沈殿し、ＳＤＳ電気泳動を行いＣＢＢ染色により得られたバンド位置を確認した。【０１１８】
結果を図３に示す。図中の「−」は、プロテアーゼ未添加のサンプルを示し、「＋」は、プロテアーゼ添加のサンプルを示す。また、「トロンビン切断型」はトロンビン切断型プロドラッグ化ヒトＮＫ１を示し、「ＡＤＡＭ１７切断型」はＡＤＡＭ１７切断型プロドラッグ化ヒトＮＫ１を示す。また、分子量は数平均分子量を示す。【０１１９】
プロドラッグ化ヒトＮＫ１をそれぞれ対応するプロテアーゼ（ＡＤＡＭ１７又はトロンビン）で処理することにより、各プロドラッグ化ヒトＮＫ１に含まれるプロテアーゼ感受性ペプチドが切断され、活性体であるヒトＮＫ１が放出されることが示された。【０１２０】
（実施例８）ＮＫ１をＰＥＧにより化学修飾することによる活性減弱の評価：
ＡＤＡＭ１７切断型プロドラッグ化ヒトＮＫ１のＨＧＦ活性の減弱の程度を、ヒト肺上皮細胞株Ａ５４９の細胞表面に存在するＨＧＦ受容体のリン酸化誘導量を指標として、Ｉｎ−Ｃｅｌｌ  ＥＬＩＳＡ法により評価した。【０１２１】
Ａ５４９細胞を１０％ＦＣＳ含有ＭＥＭ培地（ナカライテスク）に懸濁して、イメージング用９６ウェルプレート（ベクトン・ディッキンソン）に１．５×１０４／ウェルの密度で播種し、一昼夜培養した。細胞が７０％コンフルエント程度となった後、培地を血清不含ＭＥＭ培地（ナカライテスク）に交換し、１６時間以上培養することにより血清飢餓状態とした。血清飢餓状態にある細胞に、実施例７にてＡＤＡＭ１７処理をしたプロドラッグ化ヒトＮＫ１又はＡＤＡＭ１７処理をしていないプロドラッグ化ヒトＮＫ１を添加し、３７℃にて１０分間反応させた。本実施例では、プロドラッグ化ヒトＮＫ１として実施例３にて取得したアミノ末端修飾によるＡＤＡＭ１７切断型プロドラッグ化ＮＫ１（３種）を使用した。【０１２２】
細胞を４％ホルマリン含有ＰＢＳ（−）により固定し、続けて０．３％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ及び０．６％過酸化水素含有ＰＢＳ（−）により細胞膜を透過処理後、１０％ＢＳＡにより細胞をブロッキング処理した。ブロッキング処理後の細胞に、一次抗体としてａｎｔｉ−ｐＹｃＭｅｔ（ＣＳＴ）、二次抗体としてａｎｔｉ−Ｒａｂ  ＩｇＧ−ＨＲＰ（ＣＳＴ）を加えて反応させた後、１×ＱｕａｎｔａＲｅｄ  Ｅｎｈａｎｃｅｄ  Ｃｈｅｍｉｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ＨＲＰ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（サーモフィッシャーサイエンティフィック）を添加した。室温でインキュベーション後、波長５９０ｎｍにおける蛍光強度（ＲＦＵ）をプレートリーダー（Ｅｎｖｉｓｉｏｎ；パーキンエルマー）を用いて測定し、ＨＧＦ受容体リン酸化誘導量とした。【０１２３】
得られたＨＧＦ受容体リン酸化誘導量から、ＡＤＡＭ１７処理をしていないサンプルの濃度反応曲線のＥＣ５０をＰｒｉｓｍ４（ＧｒａｐｈＰａｄ、４パラメーター近似）を用いて算出した。次に、ＰＥＧ修飾によるＨＧＦ活性減弱の程度として、ＡＤＡＭ１７処理をしていないサンプルのＥＣ５０（ｎＭ）を、ＡＤＡＭ１７処理をしていないサンプルのＥＣ５０値と同じシグナル強度になる、ＡＤＡＭ１７処理をしたサンプルの濃度（ｎＭ）で割った値（活性変動値（以下、ｙ））を算出した。【０１２４】
次に、実施例７で得たＣＢＢ染色像をＣｈｅｍｉＤｏｃ  ＸＲＳ＋システム（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を用いて解析し、バンド強度から、ＡＤＡＭ１７処理をしたプロドラッグ化ヒトＮＫ１の切断効率（以下、ｗ）を下記式（１）に従い算出した。また実施例４で得たプロドラッグ化ＮＫ１の純度（％、以下、ｖ）を用いて、下記式（２）〜（５）により、それぞれ、プロテアーゼ感受性ペプチド付加ヒトＮＫ１（すなわち精製不良によりＡＤＡＭ１７を添加していないサンプルに含まれる前駆体）によるＨＧＦ活性（以下、ｐｒｅＮＫ１）、プロドラッグ化ヒトＮＫ１によるＨＧＦ活性（以下、Ｐｒｏ）、ＡＤＡＭ１７を添加したサンプルに含まれるＡＤＡＭ１７により切断されたプロドラッグ化ヒトＮＫ１によるＨＧＦ活性（以下、Ｐｒｏ・ｃｕｔ）、及びＡＤＡＭ１７により切断されなかった（すなわち切れ残った）プロドラッグ化ヒトＮＫ１によるＨＧＦ活性（以下、Ｐｒｏ・ｎｏｎｃｕｔ）を定義した。この際、プロテアーゼ感受性ペプチド付加ヒトＮＫ１の活性を１００とした時のプロドラッグ化ＮＫ１の相対活性（％）を、ｘ（代数）として表した。
プロドラッグ化ヒトＮＫ１の切断効率（％、ｗ）＝１００−（ＡＤＡＭ１７を添加したサンプルのプロドラッグ化ヒトＮＫ１のバンド強度／ＡＤＡＭ１７を添加していないサンプルのプロドラッグ化ヒトＮＫ１のバンド強度）×１００  ・・・式（１）
ＡＤＡＭ１７を添加していないサンプルに含まれるプロテアーゼ感受性ペプチド付加ヒトＮＫ１による活性（ｐｒｅＮＫ１）＝（１００−ｖ）／１００×１  ・・・式（２）
ＡＤＡＭ１７を添加していないサンプルに含まれるプロドラッグ化ヒトＮＫ１による活性（Ｐｒｏ）＝（ｖ／１００）×（ｘ／１００）  ・・・式（３）
ＡＤＡＭ１７を添加したサンプルに含まれる切断されたプロドラッグ化ヒトＮＫ１による活性（Ｐｒｏ・ｃｕｔ）＝（ｖ／１００）×（ｗ／１００）×１  ・・・式（４）
ＡＤＡＭ１７を添加したサンプルに含まれる切断されなかったプロドラッグ化ヒトＮＫ１による活性（Ｐｒｏ・ｎｏｎｃｕｔ）＝（ｖ／１００）×（１００−ｗ）／１００×（ｘ／１００）  ・・・式（５）
【０１２５】
ここで前記、活性変動値（ｙ）は、式（１）〜（５）により定義した式を用いて、式（６）のように記述できる。
活性変動値（ｙ）＝(ｐｒｅＮＫ１＋Ｐｒｏ・ｃｕｔ＋Ｐｒｏ・ｎｏｎｃｕｔ)／(ｐｒｅＮＫ１＋Ｐｒｏ)  ・・・式（６）
【０１２６】
式（６）を代数ｘについて解きなおすことで、以下の式（７）が得られる。式（７）にｖ、ｗ及びｙの実測値を代入することで、プロドラッグ化ＮＫ１の相対活性（％）ｘが算出される。
ｘ＝｛１０４×（１００−ｖ）＋１０２×ｖ×ｗ−１０４×ｙ×（１００−ｖ）｝／｛ｖ×（１０２×ｙ）−ｖ×（１００−ｗ）｝  ・・・式（７）
【０１２７】
結果を図４に示す。縦軸はＨＧＦ受容体リン酸化誘導量を表す蛍光強度（ＲＦＵ）を示し、横軸はプロドラッグ化ヒトＮＫ１の処理濃度（ｎｍｏｌ／Ｌ）を示す。図中の「ＡＤＡＭ１７−」は、ＡＤＡＭ１７処理をしていないプロドラッグ化ヒトＮＫ１のサンプルを示し、「ＡＤＡＭ１７＋」は、ＡＤＡＭ１７処理をしたプロドラッグ化ヒトＮＫ１のサンプルを示す。また、「ＡＤＡＭ１７切断型」は、ＡＤＡＭ１７切断型プロドラッグ化ヒトＮＫ１を示す。また、分子量は数平均分子量を示す。【０１２８】
いずれのＰＥＧを用いて化学修飾したＡＤＡＭ１７切断型プロドラッグ化ヒトＮＫ１においても、ＡＤＡＭ１７処理をしていないプロドラッグ化ヒトＮＫ１（ＡＤＡＭ１７−）ではＡＤＡＭ１７処理をしたプロドラッグ化ヒトＮＫ１（ＡＤＡＭ１７＋）と比べて活性が低く、ＰＥＧで化学修飾することによりＨＧＦ活性が減弱していることが示された。また、ＰＥＧで化学修飾していないプロテアーゼ感受性ペプチド付加ヒトＮＫ１に比べ、２分岐型、数平均分子量４００００のＰＥＧを用いた化学修飾によるＡＤＡＭ１７切断型プロドラッグ化ヒトＮＫ１は、ＨＧＦ活性が８０．１％減弱し、直鎖型、数平均分子量４００００のＰＥＧを用いた化学修飾によるＡＤＡＭ１７切断型プロドラッグ化ＮＫ１は、ＨＧＦ活性が７０．７％減弱し、４分岐型、数平均分子量８００００のＰＥＧを用いた化学修飾によるＡＤＡＭ１７切断型プロドラッグ化ＮＫ１は、ＨＧＦ活性が９７．１％減弱した。３種のＰＥＧのうち、４分岐型、数平均分子量８００００のＰＥＧを用いた化学修飾によるプロドラッグ化ヒトＮＫ１は最もＨＧＦ活性が減弱しており、そのＨＧＦ活性はＡＤＡＭ１７処理により放出されたヒトＮＫ１の３０分の１であった。【０１２９】
（実施例９）組織選択的なプロドラッグ化ヒトＮＫ１からの活性体の放出の評価：
プロドラッグ化ヒトＮＫ１を組織破砕液に暴露させ、放出されたヒトＮＫ１（活性体）量をＳＤＳ電気泳動により評価した。本実施例では、実施例３にて取得した４分岐型、数平均分子量８００００のＰＥＧを用いた修飾によるアミノ末端修飾ＡＤＡＭ１７切断型プロドラッグ化ヒトＮＫ１を使用した。評価は、各条件２例又は３例で行った。【０１３０】
Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ系統の雄性マウス（日本チャールスリバー）を用いて、実施例５と同様の方法でＵＵＯマウスを作製した。尿管結紮して１６日間飼育した後、ＵＵＯマウス及び正常マウスの腎臓及び肝臓をそれぞれ摘出した。【０１３１】
摘出したマウスの腎臓及び肝臓に、それぞれｐＨ７の５０ｍｍｏｌ／Ｌ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１０ｍｍｏｌ／Ｌ  ＣａＣｌ２及び０．０５％Ｂｒｉｊ３５含有緩衝液を添加し、実施例６と同様の方法で組織破砕液の上清を得た。Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｓｓａｙ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を用いて、組織破砕液の上清中のタンパク質量を測定した。【０１３２】
各々の組織破砕液の上清に、ＡＤＡＭ１７切断型プロドラッグ化ヒトＮＫ１を添加し、３７℃で３０分間インキュベートした。【０１３３】
インキュベートした試料を用い、ウエスタンブロッティングを行った。一次抗体としてＨＧＦα（Ｂ−３）ｍｏｕｓｅ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ＩｇＧ（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ）、二次抗体としてＰｅｒｏｘｉｄａｓｅ−ｃｏｎｊｕｇａｔｅ  ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅ  Ｄｏｎｋｅｙ  Ａｎｔｉ−Ｍｏｕｓｅ  ＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ）を用いた。なお、プロドラッグ化ＮＫ１のバンドはこの方法で検出することはできなかったことから、プロドラッグ化ヒトＮＫ１に含まれるプロテアーゼ感受性ペプチド付加ヒトＮＫ１（すなわち精製不良により混入した前駆体）及びＡＤＡＭ１７切断型プロドラッグ化ヒトＮＫ１から放出されたヒトＮＫ１のバンドを検出し、評価の指標とした。【０１３４】
各例のウエスタンブロッティング像を図５に示す。腎破砕液と混和したＡＤＡＭ１７切断型プロドラッグ化ヒトＮＫ１のサンプルでは活性体であるヒトＮＫ１のバンドが検出されており、そのバンド強度はプロドラッグ化ヒトＮＫ１に含まれるプロテアーゼ感受性ペプチド付加ヒトＮＫ１（すなわち精製不良により混入した前駆体）より強いことから、プロドラッグ化ヒトＮＫ１から放出された活性体であることが示された。また、ＡＤＡＭ１７活性の高いＵＵＯ腎破砕液ではヒトＮＫ１のバンド強度がより強くなっていることから、より多くのヒトＮＫ１が放出されていることが示された。それに対して、肝破砕液と混和したＡＤＡＭ１７切断型プロドラッグ化ヒトＮＫ１では、活性体であるヒトＮＫ１のバンドは検出されなかった。したがって、ＡＤＡＭ１７切断型プロドラッグ化ヒトＮＫ１は、腎臓組織選択的に活性体であるヒトＮＫ１を放出することが示された。【０１３５】
以上のことから、ＡＤＡＭ１７切断型プロドラッグ化ヒトＮＫ１は、肝臓組織ではＨＧＦ活性が低減し、ＡＤＡＭ１７が高発現している腎臓組織において肝臓組織を上回るＨＧＦ活性を示し、腎臓組織での薬効が期待できるとともに肝臓組織での副作用が低減可能であることが示された。【０１３６】
（実施例１０）プロドラッグ化ヒトＮＫ１のｉｎ  ｖｉｖｏにおける活性測定：
ｉｎ  ｖｉｖｏにおけるＡＤＡＭ１７切断型プロドラッグ化ヒトＮＫ１の組織選択的なｃ−Ｍｅｔのリン酸化誘導量を、ＡＤＡＭ１７切断型プロドラッグ化ヒトＮＫ１又はプロテアーゼ（ＡＤＡＭ１７）感受性ペプチド付加ヒトＮＫ１を投与したマウスの組織破砕液を用いたウエスタンブロッティング法にて評価した。本実施例では、実施例３にて取得した２分岐型、数平均分子量４００００のＰＥＧを用いた化学修飾によるアミノ末端修飾ＡＤＡＭ１７切断型プロドラッグ化ヒトＮＫ１、及び実施例２にて取得したプロテアーゼ（ＡＤＡＭ１７）感受性ペプチド付加ヒトＮＫ１を使用した。【０１３７】
実施例５と同様の方法でＵＵＯマウスを作製し、尿管結紮から１４日後に、プロテアーゼ（ＡＤＡＭ１７）感受性ペプチド付加ヒトＮＫ１（ＰＥＧ未修飾）又はＰＥＧが２分岐型、数平均分子量４００００のプロドラッグ化ヒトＮＫ１を、４００μｇ／ｋｇの用量で尾静脈から投与した。実験のコントロールとして、プロドラッグ化ヒトＮＫ１の溶媒（０．３ｍｏｌ／Ｌ  ＮａＣｌ含有ＰＢＳ（−））を投与した正常マウスとＵＵＯマウスについても以下の操作を同様に行った。投与から０．１８時間後にマウスから腎臓及び肝臓を摘出した。【０１３８】
マウスの腎臓及び肝臓を卓上型多検体細胞破砕装置（シェイクマスターネオ；バイオメディカルサイエンス）を用いてそれぞれ破砕し、ホスファターゼインヒビター及びプロテアーゼインヒビターを添加したＲＩＰＡ  Ｂｕｆｆｅｒを添加して氷上で２時間静置した後、遠心分離により上清を得て、実施例８と同様の方法でタンパク量を測定した。【０１３９】
上清を用い、ウエスタンブロッティングを行った。Ｔｏｔａｌ  ｃ−Ｍｅｔの検出には一次抗体としてａｎｔｉ−ｔｏｔａｌ  ｃＭｅｔ（ＣＳＴ）、二次抗体としてａｎｔｉ−Ｍｓ  ＩｇＧ−ＨＲＰ（Ｊａｃｋｓｏｎ）を用い、リン酸化ｃ−Ｍｅｔの検出には一次抗体としてａｎｔｉ−ｐＹｃＭｅｔ（ＣＳＴ）、二次抗体としてａｎｔｉ−Ｒａｂ  ＩｇＧ−ＨＲＰ（ＣＳＴ）を用いた。【０１４０】
ＣｈｅｍｉＤｏｃ  ＸＲＳ＋システム（Ｂｉｏ−ＲａｄＲＡＤ）を用いて撮影した画像を解析し、リン酸化ｃ−Ｍｅｔのバンド強度をＴｏｔａｌ  ｃ−Ｍｅｔのバンド強度で割った値を算出した。算出した値から、ＵＵＯマウス溶媒投与群の腎臓での値を１とした時の相対値を算出し、ＨＧＦ受容体リン酸化誘導量として、評価の指標とした。【０１４１】
結果を図６に示す。縦軸は、ＨＧＦ受容体リン酸化誘導量の値を示す。横軸の「正常＋溶媒」は、正常マウスに対する溶媒投与群を示し、「ＵＵＯ＋溶媒」は、ＵＵＯマウスに対する溶媒投与群を示し、「ＵＵＯ＋プロテアーゼ感受性ペプチド付加ヒトＮＫ１」は、ＵＵＯマウスに対するプロテアーゼ感受性ペプチド付加ヒトＮＫ１投与群を示し、「ＵＵＯ＋プロドラッグ化ヒトＮＫ１」は、ＵＵＯマウスに対するプロドラッグ化ヒトＮＫ１投与群を示す。【０１４２】
ＵＵＯマウスの腎臓組織では、プロテアーゼ感受性ペプチド付加ヒトＮＫ１投与群とプロドラッグ化ヒトＮＫ１投与群のＨＧＦ受容体リン酸化誘導量が同等であるのに対して、肝臓組織では、プロドラッグ化ヒトＮＫ１によるＨＧＦ受容体リン酸化誘導量が、プロテアーゼ感受性ペプチド付加ヒトＮＫ１に比べ６９％減弱していた。したがって、プロドラッグ化ヒトＮＫ１は生体内において標的疾患組織（すなわち、ＡＤＡＭ１７高発現組織である腎臓）選択的に生理活性を発揮し、プロテアーゼ感受性ペプチド付加ヒトＮＫ１が本来有する肝指向性が低減していることを示した。【０１４３】
（実施例１１）ＰＥＧ修飾部位の違いによるプロドラッグ化ヒトＮＫ１の活性制御の比較：
実施例２にて取得した、アミノ末端にＡＤＡＭ１７感受性ペプチドを付加したプロテアーゼ感受性ペプチド付加ヒトＮＫ１に対してＰＥＧ修飾する位置の違いによるＨＧＦ活性制御への影響を、ヒト肺上皮細胞株Ａ５４９の細胞表面に存在するＨＧＦ受容体のリン酸化誘導量を指標として、Ｉｎ−Ｃｅｌｌ  ＥＬＩＳＡ法により評価した。本実施例では、実施例３にて取得した、ヒトＮＫ１のアミノ末端をＡＤＡＭ１７感受性ペプチド（配列番号９）を介して２分岐型、数平均分子量４００００のＰＥＧにより化学修飾したＡＤＡＭ１７切断型プロドラッグ化ヒトＮＫ１（以下、アミノ末端修飾プロドラッグ化ヒトＮＫ１）及び実施例３にて取得した、ヒトＮＫ１のカルボキシル末端をＡＤＡＭ１７感受性ペプチド（配列番号９）を介して２分岐型、数平均分子量４００００のＰＥＧにより化学修飾したＡＤＡＭ１７切断型プロドラッグ化ヒトＮＫ１（以下、カルボキシル末端修飾プロドラッグ化ヒトＮＫ１）を使用した。【０１４４】
Ａ５４９細胞を１０％ＦＣＳ含有ＭＥＭ培地（ナカライテスク）に懸濁して、イメージング用９６ウェルプレート（ベクトン・ディッキンソン）に１．５×１０４／ウェルの密度で播種し、一昼夜培養した。細胞が７０％コンフルエント程度となった後、培地を血清不含ＭＥＭ培地（ナカライテスク）に交換し、１６時間以上培養することにより血清飢餓状態とした。血清飢餓状態にある細胞に、プロドラッグ化ヒトＮＫ１又はプロテアーゼ感受性ペプチド付加ヒトＮＫ１を添加し、３７℃にて１０分間反応させた。【０１４５】
細胞を４％ホルマリン含有ＰＢＳ（−）により固定し、続けて０．３％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ及び０．６％過酸化水素含有ＰＢＳ（−）により細胞膜を透過処理後、１０％ＢＳＡにより細胞をブロッキング処理した。ブロッキング処理後の細胞に、一次抗体としてａｎｔｉ−ｐＹｃＭｅｔ（ＣＳＴ）、二次抗体としてａｎｔｉ−Ｒａｂ  ＩｇＧ−ＨＲＰ（ＣＳＴ）を加えて反応させた後、１×ＱｕａｎｔａＲｅｄ  Ｅｎｈａｎｃｅｄ  Ｃｈｅｍｉｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ＨＲＰ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（サーモフィッシャーサイエンティフィック）を添加した。室温でインキュベーション後、波長５９０ｎｍにおける蛍光強度（ＲＦＵ）をプレートリーダー（Ｅｎｖｉｓｉｏｎ；パーキンエルマー）を用いて測定し、ＨＧＦ受容体リン酸化誘導量とした。【０１４６】
得られたＨＧＦ受容体リン酸化誘導量から、ヒトＮＫ１のアミノ末端又はカルボキシル末端にプロテアーゼ感受性ペプチド及びＰＥＧが付加されているプロドラッグ化ヒトＮＫ１のそれぞれにおいてＰＥＧ修飾していないプロテアーゼ感受性ペプチド付加ヒトＮＫ１の値を１００とした時の相対値を算出した。【０１４７】
結果を図７に示す。縦軸は、ＨＧＦ受容体リン酸化誘導量の値を示し、プロテアーゼ感受性ペプチド付加ヒトＮＫ１による処置時の値を１００とした時の相対値を示す。凡例の「アミノ末端修飾」は、ヒトＮＫ１のアミノ末端にプロテアーゼ感受性ペプチド及びＰＥＧが付加されているサンプルを示し、「カルボキシル末端修飾」は、ヒトＮＫ１のカルボキシル末端にプロテアーゼ感受性ペプチド及びＰＥＧが付加されているサンプルを示す。【０１４８】
プロドラッグ化ヒトＮＫ１のＨＧＦ受容体リン酸化誘導量（相対値）は、アミノ末端修飾プロドラッグ化ヒトＮＫ１が４１であるのに対し、カルボキシル末端修飾プロドラッグ化ヒトＮＫ１は５８であり、アミノ末端修飾プロドラッグ化ヒトＮＫ１はカルボキシル末端修飾プロドラック化ヒトＮＫ１と比較して、ＰＥＧによる化学修飾によって活性がより減弱していた。したがって、本発明のＨＧＦ又はその活性断片のＰＥＧ修飾体は、ＨＧＦ又はその活性断片のアミノ末端に修飾した方がその活性をより減弱させることができることが示された。
【産業上の利用可能性】
【０１４９】
本発明の肝細胞増殖因子又はその活性断片のポリエチレングリコール修飾体は、標的疾患組織選択的に肝細胞増殖因子又はその活性断片を放出することができるため、標的疾患組織で高い活性を示す一方、肝細胞増殖因子又はその活性断片由来の肝臓組織での副作用が低減された医薬として利用できる。
【配列表フリーテキスト】
【０１５０】
配列番号１：分泌シグナル配列を含まないヒトＨＧＦのアミノ酸配列
配列番号２：分泌シグナル配列を含まないヒトＮＫ１のアミノ酸配列
配列番号３：ヒトＨＧＦ由来の分泌シグナル配列
配列番号４：ヒトＮＫ１のアミノ末端に付加したシステイン残基及び６×Ｈｉｓタグのアミノ酸配列
配列番号５：ヒトＮＫ１のカルボキシル末端に付加した６×Ｈｉｓタグ及びシステイン残基のアミノ酸配列
配列番号６：ヒトＨＧＦ遺伝子の塩基配列
配列番号７：ヒトＨＧＦのアミノ酸配列 
配列番号８〜１６：ＡＤＡＭ１７感受性ペプチドのアミノ酸配列
配列番号１７〜２０：トロンビン感受性ペプチドのアミノ酸配列
【図１】
2020158691.tif 000002
【図２】
2020158691.tif 000003
【図３】
2020158691.tif 000004
【図４】
2020158691.tif 000005
【図５】
2020158691.tif 000006
【図６】
2020158691.tif 000007
【図７】
2020158691.tif 000008
【配列表】
2020158691000001.app
【国際調査報告】
2020158691.tif 000009
2020158691.tif 000010
2020158691.tif 000011
2020158691.tif 000012
2020158691.tif 000013