(57)【要約】   タンパク質の安定性を向上させる効果のある両性イオンを有しており、少量の添加でタンパク質安定化効果のある高分子タンパク質安定化剤であり、同時に抗酸化性を有する両性イオンポリマーおよび、その製造方法を提供する。  上述の課題は、下記式（１）で表される繰り返し単位を含み、数平均分子量が１，０００〜１，０００，０００である両性イオンポリマーにより解決された。【化１】2019131757.tif 000043（式（１）中、Ｒ１、Ｒ２は、それぞれ独立に水素原子、炭素数が１〜６の直鎖、分岐、もしくは環状アルキル基、炭素数が６〜２０の芳香族基、あるいは、Ｒ１とＲ２とが互いに連結された炭素数１〜６のアルキレン基から選択される。Ｒ３は、水素原子もしくはメチル基を表す。）
2019131757.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記式（１）で表される繰り返し単位を含み、数平均分子量が１，０００〜１，０００，０００である両性イオンポリマー。
【化１】
2019131757.tif 000038
（式（１）中、Ｒ１、Ｒ２は、それぞれ独立に水素原子、炭素数が１〜６の直鎖、分岐、もしくは環状アルキル基、炭素数が６〜２０の芳香族基、あるいは、Ｒ１とＲ２とが互いに連結された炭素数１〜６のアルキレン基から選択される。Ｒ３は、水素原子もしくはメチル基を表す。）
【請求項２】
前記式（１）中、Ｒ１、Ｒ２がともに水素原子である、請求項１に記載の両性イオンポリマー。
【請求項３】
（メタ）アクリル酸エステルに由来の構成単位をさらに有し、前記式（１）で表される繰り返し単位のモル数ｘと、（メタ）アクリル酸エステルに由来の構成単位のモル数ｙとの比が、ｘ：ｙ＝１０：９０〜９５：５の範囲内である、請求項１に記載の両性イオンポリマー。
【請求項４】
下記〔工程Ａ〕、及び〔工程Ｂ〕をこの順で行うことを特徴とする、請求項１に記載の両性イオンポリマーの製造方法。
〔工程Ａ〕
下記式（２）で表されるスルフィドアクリルアミドモノマーをラジカル重合する工程。
【化２】
2019131757.tif 000039
（式中、Ｒ１は、水素原子、炭素数が１〜６の直鎖、分岐、もしくは環状アルキル基、あるいは、炭素数が６〜２０の芳香族基を表す。Ｒ３は、水素原子もしくはメチル基を表す。）
〔工程Ｂ〕
前記〔工程Ａ〕で得られたポリマーと、下記式（３）で表されるスルフィド反応性化合物とを反応させる工程。
【化３】
2019131757.tif 000040
（式中、Ｘは、塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子、メシル基（メタンスルフォニル基）、トシル基（ｐ−トルエンスルホニル基）、あるいは、トリフルオロメタンスルホニル基を表す。Ｒ２は、水素原子、炭素数が１〜６の直鎖、分岐、もしくは環状アルキル基、あるいは、炭素数が６〜２０の芳香族基を表す。）
【請求項５】
下記式（４）で表される両性イオンモノマーを水系溶媒中、６０℃以下でラジカル重合する工程を含むことを特徴とする、請求項１に記載の両性イオンポリマーの製造方法。
【化４】
2019131757.tif 000041
（式中、Ｒ１、Ｒ２は、それぞれ独立に水素原子、炭素数が１〜６の直鎖、分岐、もしくは環状アルキル基、炭素数が６〜２０の芳香族基、あるいは、Ｒ１とＲ２とが互いに連結された炭素数１〜６のアルキレン基を表す。式中、Ｒ３は、水素原子もしくはメチル基を表す。）
【請求項６】
下記式（４）で表される両性イオンモノマー。
【化５】
2019131757.tif 000042
（式中、Ｒ１、Ｒ２は、それぞれ独立に水素原子、炭素数が１〜６の直鎖、分岐、もしくは環状アルキル基、炭素数が６〜２０の芳香族基、あるいは、Ｒ１とＲ２とが互いに連結された炭素数１〜６のアルキレン基を表す。式中、Ｒ３は、水素原子もしくはメチル基を表す。）
【請求項７】
請求項１〜３のいずれかに記載の両性イオンポリマーを含む、タンパク質安定化剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、両性イオンポリマー、特に、タンパク質の安定性を向上させる両性イオンポリマーと、その製造方法、及び、タンパク質安定化剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、医薬品、臨床検査、診断薬の分野において、抗体、酵素、サイトカイン等の生理活性を有するタンパク質が広く利用されている。医薬品としてタンパク質・抗体を投与する場合や、抗体を用いた高感度なタンパク検出を行うためには、タンパク質の構造または酵素活性を長期間保持することが必要となる。しかしながら、ほとんどのタンパク質は温度、凍結、ｐＨ、振動、塩濃度といったストレスやヒドロキシルラジカル、一重項酸素、一酸化窒素などによる酸化ストレスによって容易に変性、失活する。そのためタンパク質を保存する場合には、各種タンパク質安定化剤と、抗酸化剤を添加する必要がある。【０００３】
タンパク質安定化剤としては、低分子から高分子まで幅広い種類の化合物が使用されている。タンパク質安定化剤には親水性の化合物が用いられ、タンパク質表面を親水化することで安定性を向上させる。低分子タンパク質安定化剤としてはグリシンやアルギニンといったアミノ酸、ショ糖やトレハロースといった糖類、ｎｏｎ−ｄｅｔｅｒｇｅｎｔ  ｓｕｌｐｈｏｂｅｔａｉｎｅ（ＮＤＳＢ）といった両性イオン化合物が用いられる。しかし、一般的に低分子安定化剤を用いてタンパク質の安定化を行う場合、数十重量％といった高濃度での添加が必要であり、添加したことにより生化学的な測定の正確性に問題が生じる恐れがある。さらにこれらの低分子タンパク質安定化剤には抗酸化剤としての機能はないため、別途、抗酸化剤を添加する必要がある。【０００４】
一方で高分子タンパク安定化剤としてウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）やポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などを用いることが一般に知られている。これらの高分子タンパク質安定化剤は、０．０１〜数重量％の低濃度でタンパク質を安定化することが可能であるものの、ＢＳＡはウシ由来の原料であり、医薬品に添加する場合、牛海綿状脳症（ＢＳＥ）への感染が懸念されている。さらにこれら高分子タンパク安定化剤には抗酸化剤としての機能はないため、別途抗酸化剤を添加する必要がある。【０００５】
タンパク質安定化剤と抗酸化剤の機能を併せ持つ低分子化合物としてはジメチルスルホニオプロピオネート（ＤＭＳＰ）が知られている。ＤＭＳＰは海洋藻類から放出される化合物であり、カチオン部に三級スルホニウム基を、アニオン部にカルボキシル基を有する両性イオン化合物である。しかしながら、低分子化合物であるためタンパク質の安定化には高濃度での添加が必要であり、添加したことにより生化学的な測定の正確性に問題が生じる恐れがある。【０００６】
このＤＭＳＰに類似の構造を持つ両性イオンポリマーとして、非特許文献（Ｔｏｄｄ  Ｅｍｒｉｃｋ，  Ｊ．ｐｏｌｙｍ．Ｓｃｉ．，Ｐａｒｔ  Ａ，２０１７，５５，ｐ８３−９２）には式（５）に示すように、カチオン部に三級スルホニウム基を、アニオン部にスルホン酸を有する両性イオンポリマーが開示されている。このポリマーは上限臨界溶解温度（ＵＣＳＴ）を有しており、一般的にタンパク質を扱う温度（４−２５℃）において、水に溶解しないことが記載されている。よって、上記ポリマーは、タンパク質安定化剤として使用することはできない。
【化１】
2019131757.tif 000003
【０００７】
また特許文献（ＷＯ２０１３−１４８７２７Ａ１）には式（６）に示すようなカチオン部に三級スルホニウム基を、アニオン部にカルボキシル基を持つ両性イオンポリマーが開示されている。しかし、特許文献に記載のポリマーを医薬品、診断薬用のタンパク質安定化剤として用いた場合、ポリマー側鎖が分解し、タンパク質表面の置換基と反応性のあるクロロ酢酸等が遊離する恐れがある。
さらに主鎖にペプチド結合が含まれるため、プロテアーゼ等の分解酵素の安定化に用いたとしても分解し、タンパク質安定化効果を発揮できない恐れがあるほか、抗体の安定化を行う場合にも、抗体に誤認識され、抗体自体の活性を低下させる恐れがある。
【化２】
2019131757.tif 000004
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
以上示したように、タンパク質の安定性を向上させる効果のある両性イオンを有しており、少量の添加でタンパク質を安定化する効果のある高分子タンパク質安定化剤であり、同時に抗酸化性を有するタンパク質安定化剤はこれまで知られていない。【０００９】
本発明の課題は、タンパク質の安定性を向上させる効果のある両性イオンを有しており、少量の添加でもタンパク質を安定化する効果があり、同時に抗酸化性を有する両性イオンポリマー、そのような両性ポリマーを含む高分子タンパク質安定化剤、および、その両性イオンポリマーの製造方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、前記目的を達成するべく鋭意研究を重ねた結果、タンパク質の安定性を向上させる効果のある両性イオンを有しており、少量の添加でタンパク質安定化効果のある両性イオンポリマーであり、同時に抗酸化性を有する両性イオンポリマー、およびそのような両性イオンポリマーを含む高分子タンパク質安定化剤が、前記課題を解決できることを見出した。
すなわち、本発明は下記の［１］〜［６］を提供する。【００１１】
［１］下記式（１）で表される繰り返し単位を含み、数平均分子量は１，０００〜１，０００，０００である、両性イオンポリマー。
【化３】
2019131757.tif 000005
（式（１）中Ｒ１、Ｒ２は、それぞれ独立に水素原子、炭素数が１〜６の直鎖、分岐、もしくは環状アルキル基、炭素数が６〜２０の芳香族基、あるいは、Ｒ１とＲ２とが互いに連結された炭素数１〜６のアルキレン基を表す。Ｒ３は、水素原子もしくはメチル基を表す。）【００１２】
［２］前記式（１）中、Ｒ１、Ｒ２がともに水素原子である、上記［１］の両性イオンポリマー。【００１３】
［３］（メタ）アクリル酸エステルに由来の構成単位をさらに有し、前記式（１）で表される繰り返し単位のモル数ｘと、（メタ）アクリル酸エステルに由来の構成単位のモル数ｙとの比が、ｘ：ｙ＝１０：９０〜９５：５の範囲内である、上記［１］に記載の両性イオンポリマー。【００１４】
［４］下記〔工程Ａ〕、及び、〔工程Ｂ〕をこの順で行う、前記式（１）で表される両性イオンポリマーの製造方法。
〔工程Ａ〕
下記式（２）で表されるスルフィドアクリルアミドモノマーをラジカル重合する工程。
【化４】
2019131757.tif 000006
（式中、Ｒ１は水素原子、炭素数が１〜６の直鎖、分岐、もしくは環状アルキル基、あるいは、炭素数が６〜２０の芳香族基を表す。Ｒ３は、水素原子もしくはメチル基を表す。）
〔工程Ｂ〕
前記〔工程Ａ〕で得られたポリマーと、下記式（３）で表されるスルフィド反応性化合物とを反応させる工程。
【化５】
2019131757.tif 000007
（式中、Ｘは、塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子、メシル基（メタンスルフォニル基）、トシル基（ｐ−トルエンスルホニル基）、あるいは、トリフルオロメタンスルホニル基を表す。Ｒ２は、水素原子、炭素数が１〜６の直鎖、分岐、もしくは環状アルキル基、あるいは、炭素数が６〜２０の芳香族基を表す。）【００１５】
［５］下記式（４）で表される両性イオンモノマーを水系溶媒中、６０℃以下でラジカル重合する工程を有することを特徴とする、前記式（１）で表される両性イオンポリマーの製造方法。
【化６】
2019131757.tif 000008
（式中、Ｒ１、Ｒ２は、それぞれ独立に水素原子、炭素数が１〜６の直鎖、分岐、もしくは環状アルキル基、炭素数が６〜２０の芳香族基、あるいは、Ｒ１とＲ２とが互いに連結された炭素数１〜６のアルキレン基を表す。式中、Ｒ３は、水素原子もしくはメチル基を表す。）【００１６】
［６］前記式（１）で表される両性イオンポリマーの中間体である、前記式（４）で表される両性イオンモノマー。【００１７】
［７］前記式（１）で表される両性イオンポリマーを含む、タンパク質安定化剤。
【発明の効果】
【００１８】
タンパク質の安定性を向上させる効果のある両性イオンを有しており、少量の添加でタンパク質安定化効果のある高分子タンパク質安定化剤であり、同時に抗酸化性を有する両性イオンポリマーおよび、その製造方法を提供することができる。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
以下、本発明の好適な実施形態について詳細に説明する。
＜両性イオンポリマー＞
本発明における両性イオンポリマーとは、式（１）で表される繰り返し単位を含む両性イオンポリマーのことであり、側鎖に三級スルホニウム基とカルボキシル基を有する両性イオンポリマーのことである。前記三級スルホニウム基とは、硫黄原子に３つ炭素原子がそれぞれ単結合により結合している置換基であり、カチオン性を示す置換基である。
【化７】
2019131757.tif 000009
式（１）中、Ｒ１、Ｒ２はそれぞれ独立した置換基であり、特に限定されないが、水素原子、炭素数が１〜６の直鎖、分岐、あるいは環状のアルキル基、炭素数６〜２０の芳香族基、あるいはＲ１とＲ２が互いに連結された炭素数１〜６のアルキレン基から選択される。
直鎖アルキル基とは、例えば、メチル基、エチル基、プロピル基、ｎ−ブチル基、ペンチル基、ヘキシル基であり、分岐アルキル基とは例えば、イソプロピル基、２−ブチル基であり、環状アルキル基とは、例えば、シクロペンチル基、シクロヘキシル基である。アルキル基の炭素数は、好ましくは１〜４であり、より好ましくは１〜３である。
炭素数６〜２０の芳香族基とは、例えば、フェニル基、ｐ−ニトロフェニル基、ブロモフェニル基、フェニルボロン酸、ヒドロキシフェニル基、ジヒドロキシフェニル基、トリヒドロキシフェニル基である。芳香族基の炭素数は、好ましくは６〜１２であり、より好ましくは６〜１０である。
Ｒ１とＲ２が互いに連結された炭素数１〜６のアルキレン基とは例えば、下記式（７）に示す置換基のアルキレン基である。式（１）のポリマーをタンパク質安定化剤として用いるためにポリマーの水への親和性を向上させるという観点から、Ｒ１、Ｒ２は、水素原子、メチル基、エチル基、又はプロピル基であることが好ましい。
【化８】
2019131757.tif 000010
（式（７）中、ｍは、１から６の整数を表し、好ましくは２〜６、より好ましくは２〜４の整数である。）
【００２０】
前記式（１）中、Ｒ３は、水素原子もしくはメチル基を表す。
【００２１】
前記式（１）で表される繰り返し単位を含む両性イオンポリマーとしては、例えば、Ｒ１、Ｒ２が共に水素原子であり、Ｒ３が水素原子である両性イオンポリマー、Ｒ１がプロピル基、Ｒ２が水素原子であり、Ｒ３が水素原子である両性イオンポリマー、Ｒ１がベンジル基、Ｒ２が水素原子であり、Ｒ３が水素原子である両性イオンポリマーが挙げられるが、合成の容易さから、Ｒ１、Ｒ２が共に水素原子であり、Ｒ３が水素原子である両性イオンポリマーが好ましい。
【００２２】
前記式（１）で表される繰り返し単位を含む両性イオンポリマーとしては、単一のモノマーから構成されるだけでなく、他のモノマーとの共重合体であってもよい。すなわち、前記式（１）で表される複数の種類のモノマーから構成されていても良く、また、前記式（１）で表されるモノマーとは異なる他のモノマー（コモノマー）を含んでいても良い。また、両性イオンポリマーは、例えば、２種類以上のモノマーのランダム共重合体である。
前記他のモノマーとしては用途によって適宜選択可能であり、例えば、ジエチルアミノエチル（メタ）アクリレート、ポリエチレングリコールモノ（メタ）アクリレート、グリセロール（メタ）アクリレート、（メタ）アクリロイルオキシエチルホスフェート、（メタ）アクリロイルオキシエチルホスホリルコリン、Ｎ-メチルカルボキシベタイン（メタ）アクリレート、Ｎ−メチルスルホベタイン（メタ）アクリレート、メチル（メタ）アクリレート、エチル（メタ）アクリレート、プロピル（メタ）アクリレート、ブチル（メタ）アクリレート、ペンチル（メタ）アクリレート、ヘキシル（メタ）アクリレート、ステアリル（メタ）アクリレート、グリシジル（メタ）アクリレート、ジメチルアミノエチル（メタ）アクリレート、２−ヒドロキシエチルメタクリレート、２−メトキシエチル（メタ）アクリレート等の各種（メタ）アクリル酸エステル；メチルビニルエーテル等の各種ビニルエーテル；その他、アクリルアミド、Ｎ，Ｎ’−ジメチルアクリルアミド、Ｎ−イソプロピル（メタ）アクリルアミド、（メタ）アクリル酸、アリルアルコール、アクリロニトリル、アクロレイン、酢酸ビニル、ビニルスルホン酸ナトリウム、スチレン、クロロスチレン、ビニルフェノール、ビニルシンナメート、塩化ビニル、ビニルブロミド、ブタジエン、ビニレンカーボネート、イタコン酸、イタコン酸エステル、フマル酸、フマル酸エステル、マレイン酸、マレイン酸エステル等の各種ラジカル重合性モノマーが挙げられるが、前記式（１）で表される繰り返し単位を含む両性イオンポリマーをタンパク質安定化剤として用いる場合、溶媒への溶解性の観点からのバランスから他のモノマーとしては、Ｎ，Ｎ’−ジメチルアクリルアミド、あるいは、ブチル（メタ）アクリレート、ポリエチレングリコールモノ（メタ）アクリレート等の（メタ）アクリル酸エステルが好ましい。また、他のモノマーの配合量は任意であり、適宜選択できるが、前記式（１）で表される繰り返し単位を含む両性イオンポリマーの性能を引き出すためには、配合される前記他のモノマーの含有量が９０モル％以下であることが好ましく、より好ましくは７０モル％以下である。
【００２３】
また、前記式（１）で表される繰り返し単位を含む両性イオンポリマーは、他のモノマーとのブロック共重合体であってもよい。他のモノマーの種類としてはランダム共重合の場合と同様であり、前記式（１）で表される繰り返し単位を含む両性イオンポリマーをタンパク質安定化剤として用いる場合、他のモノマーとしては、溶媒への溶解性の観点からブチル（メタ）アクリレート、ポリエチレングリコールモノ（メタ）アクリレートが好ましい。また、他のモノマーの配合量は任意であり、適宜選択できるが、前記式（１）で表される繰り返し単位を含む両性イオンポリマーの性能を引き出すためには、配合される前記他のモノマーが９０モル％以下であることが好ましく、より好ましくは７０モル％以下である。
両性イオンポリマーにおける前記式（１）で表される繰り返し単位（両性繰り返し単位）のモル数ｘと、他のモノマーに由来する繰り返し単位のモル数ｙとの比率ｘ：ｙの範囲は、例えば、ｘ：ｙ＝１０：９０〜９５：５であり、好ましくは２０：８０〜９２：８であり、より好ましくは３０：７０〜９０：１０であり、さらに好ましくは、３２：６８〜８２：１４である。
【００２４】
前記式（１）で表される両性繰り返し単位を含む両性イオンポリマーの分子量としては、要求される性能が発揮しうるように重合条件等を調製して適宜決定できるが、通常、数平均分子量で１０００〜１００００００程度であり、前記ポリマーをタンパク質安定化剤として用いる場合には、水への溶解性の観点から、数平均分子量が２０００〜１０００００であることが好ましく、より好ましくは３０００〜５００００、さらに好ましくは４０００〜４００００である。
【００２５】
＜両性イオンポリマーの製造方法＞
本発明の側鎖に三級スルホニウム基とカルボキシル基を有する両性イオンポリマーは、少なくとも下記の〔工程Ａ〕、及び〔工程Ｂ〕をこの順で行う製造方法により製造する事ができる。
【００２６】
〔工程Ａ〕
下記式（２）で表されるスルフィド（メタ）アクリルアミドモノマーのラジカル重合を行い、中間体であるスルフィドポリマーを得る工程。
【化９】
2019131757.tif 000011
【００２７】
前記式（２）中、Ｒ１は、特に限定されないが、式（１）におけるＲ１と同様に定義され得る。
すなわち、式（２）中、Ｒ１は、水素原子、炭素数が１〜６の直鎖、分岐、もしくは環状のアルキル基、あるいは炭素数が６〜２０の芳香族基から選択される。直鎖アルキル基とは例えば、メチル基、エチル基、プロピル基、ｎ−ブチル基、ペンチル基、ヘキシル基であり、分岐アルキル基とは例えば、イソプロピル基、２−ブチル基であり、環状アルキル基とは例えば、シクロペンチル基、シクロヘキシル基である。アルキル基の炭素数は、好ましくは１〜４であり、より好ましくは１〜３である。
芳香族基は、例えば、フェニル基、ｐ−ニトロフェニル基、ブロモフェニル基、フェニルボロン酸、ヒドロキシフェニル基、ジヒドロキシフェニル基、トリヒドロキシフェニル基である。芳香族基の炭素数は、好ましくは６〜１２であり、より好ましくは６〜１０である。
タンパク質安定化剤として用いるにはポリマーの水への親和性を向上させるという観点から、Ｒ１は、水素原子、メチル基、エチル基、又はプロピル基であることが好ましい。
【００２８】
前記式（２）中、Ｒ３は、水素原子もしくはメチル基を表す。
【００２９】
前記式（２）で表されるスルフィドモノマーとしては、例えば、Ｒ１が共に水素原子であり、Ｒ３が水素原子であるスルフィドモノマー、Ｒ１がプロピル基、Ｒ３が水素原子であるスルフィドモノマー、Ｒ１がベンジル基、Ｒ３が水素原子であるスルフィドモノマーが挙げられるが、合成の容易さからＲ１が水素原子であり、Ｒ３が水素原子であるスルフィドモノマーが好ましい。
【００３０】
前記式（２）で表されるスルフィドモノマーのうち、Ｒ１が水素原子であるスルフィドモノマーについては、合成の容易さの観点から、非特許文献Ｊ．  Ｍｏｒｃｅｌｌｅｔ．，Ｍａｋｒｏｍｏｌ．  Ｃｈｅｍ．，１９８１，  １８２，９４９に記載の（メタ）アクリル酸クロライドを用いて、メチオニンの（メタ）アクリル化を行うのが好ましい。またＲ１が、炭素数が１〜６の直鎖、分岐、もしくは環状のアルキル基、あるいは芳香族基であるスルフィドモノマーは、それぞれに対応するアルキルハライド、芳香族ハライドとシステインの反応を行った後に（メタ）アクリル化に供することで得られる。
【００３１】
前記式（２）で表されるスルフィドモノマーをラジカル重合することにより得られる前記スルフィドポリマーの分子量は、特に限定されず、後続の［工程Ｂ］後、両性イオンポリマーとして要求される性能が発揮しうるように重合条件等を調製して適宜決定できるが、通常、数平均分子量で１０００〜１００００００程度であり、前記スルフィドポリマーをタンパク質安定化剤として用いる場合には、数平均分子量が２０００〜１０００００であることが好ましい。数平均分子量は、より好ましくは３０００〜５００００であり、さらに好ましくは４０００〜４００００である。
【００３２】
前記式（２）で表されるスルフィドモノマーは、単独で、すなわち、１種類または２種類以上の式（２）のスルフィドモノマーのみを重合しても良く、または、前記式（２）で表されるスルフィドモノマーと共重合が可能な他のモノマー（コモノマー）との混合物を重合することもできる。  前記他のモノマーとしては用途によって適宜選択可能であり、例えば、ジエチルアミノエチル（メタ）アクリレート、ポリエチレングリコールモノ（メタ）アクリレート、グリセロール（メタ）アクリレート、（メタ）アクリロイルオキシエチルホスフェート、（メタ）アクリロイルオキシエチルホスホリルコリン、Ｎ-メチルカルボキシベタイン（メタ）アクリレート、Ｎ−メチルスルホベタイン（メタ）アクリレート、メチル（メタ）アクリレート、エチル（メタ）アクリレート、プロピル（メタ）アクリレート、ブチル（メタ）アクリレート、ペンチル（メタ）アクリレート、ヘキシル（メタ）アクリレート、ステアリル（メタ）アクリレート、グリシジル（メタ）アクリレート、ジメチルアミノエチル（メタ）アクリレート、２−ヒドロキシエチルメタクリレート、２−メトキシエチル（メタ）アクリレート等の各種（メタ）アクリル酸エステル；メチルビニルエーテル等の各種ビニルエーテル；その他、アクリルアミド、Ｎ，Ｎ’−ジメチルアクリルアミド、Ｎ−イソプロピル（メタ）アクリルアミド、（メタ）アクリル酸、アリルアルコール、アクリロニトリル、アクロレイン、酢酸ビニル、ビニルスルホン酸ナトリウム、スチレン、クロロスチレン、ビニルフェノール、ビニルシンナメート、塩化ビニル、ビニルブロミド、ブタジエン、ビニレンカーボネート、イタコン酸、イタコン酸エステル、フマル酸、フマル酸エステル、マレイン酸、マレイン酸エステル等の各種ラジカル重合性モノマーが挙げられるが、前記式（１）で表される繰り返し単位を含む両性イオンポリマーをタンパク質安定化剤として用いる場合、溶媒への溶解性の観点からのバランスから他のモノマーとしてはＮ，Ｎ’−ジメチルアクリルアミド、ブチル（メタ）アクリレート、ポリエチレングリコールモノ（メタ）アクリレートが好ましい。また、他のモノマーの配合量は任意であり、適宜選択できるが、前記式（１）で表される繰り返し単位を含む両性イオンポリマーの性能を引き出すためには、配合される前記他のモノマーが９０モル％以下で含まれていることが好ましく、より好ましくは７０モル％以下である。
【００３３】
前記式（２）で表されるスルフィドモノマーは、そのままバルク状態で重合に用いてよく、また溶媒を加えた溶液重合や懸濁重合、乳化重合に供することもできる。また溶媒としては前記式（２）で表されるスルフィドモノマーが溶解するものであれば特に限定されず、一般的な溶媒が使用可能である。たとえば、アセトン、ジオキサン、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）などの極性非プロトン性溶媒、メタノール、水などの極性プロトン溶媒性溶媒から選択される。
【００３４】
前記式（２）で表されるスルフィドモノマーのラジカル重合は、熱重合または光重合により行うことができる。前記熱重合は、熱重合開始剤を用いて行うことができる。熱重合開始剤としては、たとえば、過酸化物系ラジカル開始剤（過酸化ベンゾイル、過硫酸アンモニウム等）または、アゾ系ラジカル開始剤（アゾビスイソブチロニトリル（ＡＩＢＮ）、２，２’−アゾビス−ジメチルバレロニトリル（ＡＤＶＮ）等）、２，２’−アゾビスシアノ吉草酸（ＡＣＶＡ）、アゾビス［２−（２−イミダゾリン−２−イル）プロパン]二塩酸塩（ＶＡ−０４４）、水溶性あるいは油溶性のレドックス系ラジカル開始剤（ジメチルアニリンと過酸化ベンゾイルからなる）が使用できる。
ラジカル開始剤の使用量は、前記式（２）で表されるスルフィドモノマー１００質量部に対して通常０．０１から１０質量部であることが好ましく、より好ましくは０．０１から５質量部である。重合温度および重合時間はラジカル開始剤の種類や他のモノマーの有無や種類などによって適宜選択して決定することができる。例えば、前記式（２）で表されるスルフィドモノマー単独での重合を、ＡＩＢＮを重合開始剤として用いて行う場合、重合温度は４０〜９０℃、好ましくは５０〜８０℃、より好ましくは６０〜７０℃である。重合時間は１〜４８時間、好ましくは１〜２４時間、より好ましくは２〜２４時間である。
【００３５】
前記光重合は、例えば、波長２５４ｎｍの紫外線（ＵＶ）または加速電圧１５０〜３００ｋＶの電子線（ＥＢ）照射等により実施することができる。この際、光重合開始剤の使用は任意であるが、反応時間の点からは使用することが好ましい。光重合開始剤としては、２−ヒドロキシ−２−メチル−１−フェニル−１−プロパノン、１−ヒドロキシ−シクロヘキシルフェニルケトンなどが挙げられるが、溶解性等の点から２−ヒドロキシ−２−メチル−１−フェニル−１−プロパノンが好ましい具体例として挙げられる。
【００３６】
前記式（２）で表されるスルフィドモノマーのラジカル重合においては、連鎖移動剤を用いることもできる。前記連鎖移動剤としては、２−メルカプトエタノール、１−メルカプト−２−プロパノール、３−メルカプト−１−プロパノール、ｐ−メルカプトフエノール、メルカプト酢酸、２−メルカプトプロピオン酸、３−メルカプトプロピオン酸、２−メルカプトニコチン酸などが挙げられる。例えば、Ｒ３が水酸基である前記式（２）で表されるスルフィドモノマーを用いる場合、重合溶媒への溶解性の観点から、２−メルカプトエタノールが好ましい。
【００３７】
前記式（２）で表されるスルフィドモノマーのラジカル重合は、リビングラジカル重合法により行うことも可能であり、具体的には原子移動ラジカル重合法（ＡＴＲＰ法）、可逆的付加開裂連鎖移動重合法（ＲＡＦＴ重合法）、及びニトロキシドを介した重合法（ＮＭＰ法）などが利用可能である。特にタンパク質安定化剤の用途では金属を使用せず、酵素活性を低下させないといった理由で、可逆的付加開裂連鎖移動重合法（ＲＡＦＴ重合法）が好ましい。前記ＲＡＦＴ重合の方法としては公知の方法が利用可能であり、例えばＷＯ９９／３１１４４、ＷＯ９８／０１４７８及び米国特許第６，１５３，７０５号、Ｈ．  Ｍｏｒｉ， Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｒａｐｉｄ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ, ２０１２，  ３３，  １０９０‐１１０７ に記載されている方法が有効である。
ＲＡＦＴ重合を用いて、前記式（２）で表されるスルフィドモノマーの重合を行う場合、通常のラジカル重合にＲＡＦＴ剤を添加することができる。前記ＲＡＦＴ剤としては、４−シアノペンタン酸ジチオベンゾエート、２−シアノ−２−プロピルベンゾジチオエート、ベンジルベンゾジチオエート、２−フェニル−２−プロピルベンゾジチオエート、メチル２−フェニル−２−（フェニル−カーボノチオイルチオ）アセテート、４−シアノ−４−（フェニルカルボノチオイルチオ）ペンタン酸Ｎ−スクシンイミジルエステル、４−シアノ−４−（ドデシルスルファニル−チオカルボニル）スルファニルペンタン酸、４−シアノ−４−（ドデシルスルファニル−チオカルボニル）スルファニルペンタノール、２−シアノ−２−プロピルドデシルトリチオカーボネート、２−（ドデシルチオカルボニルチオイルチオ）−２−メチルプロピオン酸、４−シアノ−４−（ドデシルスルファニル−チオカルボニル）スルファニルペンタン酸ポリエチレングリコールメチルエーテルエステル、２−（ドデシルチオカルボニルチオイルチオ）−２−メチルプロピオン酸３−アジド−１−プロパノールエステル、ベンジル１Ｈ−ピロール−１−カルボジチオエート、２−シアノプロパン−２−イル−Ｎ−メチル−Ｎ−ピリジン４−イルカルボジチオエート、プロピオン酸エチル−２−エチルザンテートから選択され、例えばＲ３が水酸基である前記式（２）で表されるスルフィドモノマーを用いる場合には、重合制御可能なモノマーとＲＡＦＴ剤の組み合わせの観点から、４−シアノペンタン酸ジチオベンゾエート、４−シアノ−４−（ドデシルスルファニル−チオカルボニル）スルファニルペンタン酸、ベンジル１Ｈ−ピロール−１−カルボジチオエートが好ましい。
ＲＡＦＴ剤の使用量としては、前記式（２）で表されるスルフィドモノマー１００質量部に対して通常０．０１から２０質量部が好ましく、より好ましくは０．０１から５質量部である。
【００３８】
前記式（２）で表されるモノマーから、特に限定されないが前記リビングラジカル重合法を用いることで、ブロック共重合体を得ることができる。例えば、前記式（２）で表されるモノマーもしくは前記他のモノマーをリビングラジカル重合法によりブロックＡを製造し、得られたブロックＡをマクロ重合開始剤として、前記式（２）で表されるスルフィドモノマーもしくは前記他のモノマーをリビングラジカル重合法により重合することにより、ブロックＡに繋がるブロックＢを製造することができる。前記式（１）で表される繰り返し単位を含む両性イオンポリマーをタンパク質安定化剤として用いる場合、他のモノマーとしては、溶媒への溶解性の観点から、ブチル（メタ）アクリレート、ポリエチレングリコールモノ（メタ）アクリレートが好ましい。また、他のモノマーの配合量は任意であり、適宜選択できるが、前記式（１）で表される繰り返し単位を含む両性イオンポリマーの性能を引き出すためには、配合される前記他のモノマーが９０モル％以下であることが好ましく、より好ましくは７０モル％以下である。
【００３９】
前記式（２）で表されるスルフィドモノマーを重合して得られる、前記スルフィドポリマーはそのまま未精製で用いられるほか、好ましくは、過剰な溶媒の減圧留去、再沈殿、カゲルろ過クロマトグラフィーや透析などの処理により単離、精製を行うこともできる。
【００４０】
〔工程Ｂ〕
〔工程Ｂ〕は、上記〔工程Ａ〕で得られたスルフィドポリマーと、式（３）で表されるスルフィド反応性化合物とを反応させる工程である。
【化１０】
2019131757.tif 000012
【００４１】
前記式（３）中、Ｘはスルフィドポリマーと反応できるものなら、特に限定されず、塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子、メシル基（メタンスルフォニル基）、トシル基（ｐ−トルエンスルホニル基）、及び、トリフルオロメタンスルホニル基から選択され、好ましくは、臭素原子、あるいはヨウ素原子であり、さらに好ましくはヨウ素原子である。
前記式（３）中、Ｒ２は特に限定されないが、式（１）におけるＲ１と同様に定義され得る。式（３）中、Ｒ２は、水素原子、炭素数が１〜６の直鎖、分岐、もしくは環状のアルキル基、あるいは炭素数が６〜２０の芳香族基から選択される。
直鎖アルキル基とは例えば、メチル基、エチル基、プロピル基、ｎ−ブチル基、ペンチル基、ヘキシル基であり、分岐アルキル基とは例えば、イソプロピル基、２−ブチル基であり、環状アルキル基とは例えば、シクロペンチル基、シクロヘキシル基である。アルキル基の炭素数は、好ましくは１〜４であり、より好ましくは１〜３である。
また、芳香族置換基とは例えば、フェニル基、ｐ−ニトロフェニル基、ブロモフェニル基、フェニルボロン酸、ヒドロキシフェニル基、ジヒドロキシフェニル基、トリヒドロキシフェニル基である。芳香族基の炭素数は、好ましくは６〜１２であり、より好ましくは６〜１０である。
タンパク質安定化剤として用いるにはポリマーの水への親和性を向上させるという観点から、Ｒ２は、水素原子、メチル基、エチル基、プロピル基であることが好ましい。
【００４２】
前記式（３）で表されるスルフィド反応性化合物としては、例えば、両性イオンポリマーの水への親水性を維持する観点から、ヨードメタン、ヨードエタン、ヨードプロパン、ヨードブタンが好ましい。
【００４３】
前記スルフィドポリマーと前記式（３）で表されるスルフィド反応性化合物との反応に用いられる溶媒としては、前記スルフィドポリマーと前記スルフィド反応性化合物が溶解するものであれば特に限定されず、一般的な溶媒が使用可能である。たとえばアセトン、ジオキサン、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）などの極性非プロトン性溶媒、メタノールなどの極性プロトン溶媒性溶媒から選択される。溶媒の使用量は、前記スルフィドポリマーに対して質量比で１〜１００倍量、好ましくは１〜５０倍量、もっとも好ましくは１〜３０倍量である。
【００４４】
前記式（３）で表されるスルフィド反応性化合物の使用量は、前記スルフィドポリマーに対して質量比で０．１〜１００倍量、好ましくは０．１〜５０倍量、もっとも好ましくは０．１〜３０倍量である。
【００４５】
前記スルフィドポリマーと前記式（３）で表されるスルフィド反応性化合物との反応温度は、使用する溶媒にもよるものの、通常−２０〜１００℃、好ましくは０〜７０℃、もっとも好ましくは２０〜５０℃の範囲である。反応時間は、反応温度、用いる前記スルフィドポリマーの分子量、前記スルフィド反応性化合物の種類により異なるが、通常１〜７２時間程度が好ましく、より好ましくは１〜２４時間である。
【００４６】
以上のように、前記スルフィドポリマーと、前記式（３）で表されるスルフィド反応性化合物とを反応させて、前記式（１）で表される繰り返し単位を含む両性イオンポリマーを得ることができる。得られた両性イオンポリマーはそのまま未精製で用いられるほか、好ましくは過剰な前記スルフィド反応性化合物の減圧留去、再沈殿、ゲルろ過クロマトグラフィーや透析などの処理により単離、精製を行うこともできる。
【００４７】
＜両性イオンモノマーの重合＞
本発明の両性イオンポリマーは、下記式（４）で表される両性イオンモノマーをラジカル重合することによっても得ることが出来る。
【化１１】
2019131757.tif 000013
【００４８】
式（４）中、Ｒ１、Ｒ２はそれぞれ独立した置換基であり、特に限定されないが、水素原子、炭素数が１〜６の直鎖、分岐、あるいは環状のアルキル基、炭素数６〜２０の芳香族基、あるいはＲ１とＲ２が互いに連結された炭素数１〜６のアルキレン基から選択される。
直鎖アルキル基とは例えば、メチル基、エチル基、プロピル基、ｎ−ブチル基、ペンチル基、ヘキシル基であり、分岐アルキル基とは例えば、イソプロピル基、２−ブチル基であり、環状アルキル基とは例えば、シクロペンチル基、シクロヘキシル基である。アルキル基の炭素数は、好ましくは１〜４であり、より好ましくは１〜３である。
また、芳香族基とは例えば、フェニル基、ｐ−ニトロフェニル基、ブロモフェニル基、フェニルボロン酸、ヒドロキシフェニル基、ジヒドロキシフェニル基、トリヒドロキシフェニル基である。芳香族基の炭素数は、好ましくは６〜１２であり、より好ましくは６〜１０である。
Ｒ１とＲ２が互いに連結された炭素数１〜６のアルキレン基とは例えば、下記式（７）に示す置換基である。
タンパク質安定化剤として用いるにはポリマーの水への親和性を向上させるという観点から、Ｒ１、及びＲ２は、水素原子、メチル基、エチル基、プロピル基のいずれかであることが好ましい。
【化１２】
2019131757.tif 000014
（式（７）中、ｍは１から６の整数を表し、好ましくは２〜６、より好ましくは２〜４の整数である。）
【００４９】
前記式（４）中、Ｒ３は水素原子もしくはメチル基を表す。
【００５０】
前記式（４）で表される両性イオンモノマーとしては、例えば、Ｒ１、Ｒ２が共に水素原子であり、Ｒ３が水素原子である両性イオンモノマー、Ｒ１がプロピル基、Ｒ２が水素原子であり、Ｒ３が水素原子である両性イオンモノマー、Ｒ１がベンジル基、Ｒ２が水素原子であり、Ｒ３が水素原子である両性イオンモノマーが挙げられるが、合成の容易さから、Ｒ１、Ｒ２が共に水素原子であり、Ｒ３が水素原子である両性イオンモノマーが好ましい。
【００５１】
前記式（４）で表される両性イオンモノマーは、前記式（２）で表されるスルフィドモノマーと前記式（３）で表されるスルフィド反応性化合物とを反応させることで製造できる。
【００５２】
前記式（２）で表されるスルフィドモノマーと前記式（３）で表されるスルフィド反応性化合物との反応に用いられる溶媒としては、前記スルフィドモノマーと前記スルフィド反応性化合物が溶解するものであれば特に限定されず、一般的な溶媒が使用可能である。たとえばアセトン、ジオキサン、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）などの極性非プロトン性溶媒、メタノールなどの極性プロトン溶媒性溶媒から選択される。溶媒の使用量は、前記スルフィドポリマーに対して質量比で１〜１００倍量、好ましくは１〜５０倍量、もっとも好ましくは１〜３０倍量である。
【００５３】
前記式（３）で表されるスルフィド反応性化合物の使用量は、前記式（２）で表されるスルフィドモノマーに対して質量比で０．１〜１００倍量、好ましくは０．１〜５０倍量、もっとも好ましくは０．１〜３０倍量である。
【００５４】
前記式（２）で表されるスルフィドモノマーと、前記式（３）で表されるスルフィド反応性化合物との反応温度は、使用する溶媒にもよるものの通常−２０〜１００℃、好ましくは０〜７０℃、もっとも好ましくは２０〜５０℃の範囲である。反応時間は反応温度、用いる前記スルフィドモノマーの分子量、前記スルフィド反応性化合物の種類により異なるが、通常１〜７２時間程度が好ましく、より好ましくは１〜２４時間である。
【００５５】
以上のように、前記式（２）で表されるスルフィドモノマーと前記式（３）で表されるスルフィド反応性化合物とを反応させて、前記式（４）で表される両性イオンモノマーを得ることができる。得られた両性イオンモノマーは、そのまま未精製で用いられるほか、好ましくは過剰な前記スルフィド反応性化合物の減圧留去、再沈殿、カラムクロマトグラフィーなどの処理により単離、精製を行うこともできる。
【００５６】
前記式（４）で表される両性イオンモノマーは、前記式（２）で表されるモノマーと同様に単独で、すなわち、１種類または２種類以上の式（２）のモノマーのみを重合しても良く、または前記式（４）で表される両性イオンモノマーと共重合が可能な他のモノマーとの混合物を重合することもできる。
前記他のモノマーとしては用途によって適宜選択可能であり、例えば、ジエチルアミノエチル（メタ）アクリレート、ポリエチレングリコールモノ（メタ）アクリレート、グリセロール（メタ）アクリレート、（メタ）アクリロイルオキシエチルホスフェート、（メタ）アクリロイルオキシエチルホスホリルコリン、Ｎ-メチルカルボキシベタイン（メタ）アクリレート、Ｎ−メチルスルホベタイン（メタ）アクリレート、エチル（メタ）アクリレート、プロピル（メタ）アクリレート、ブチル（メタ）アクリレート、ペンチル（メタ）アクリレート、ヘキシル（メタ）アクリレート、ステアリル（メタ）アクリレート、グリシジル（メタ）アクリレート、ジメチルアミノエチル（メタ）アクリレート、２−ヒドロキシエチルメタクリレート、２−メトキシエチル（メタ）アクリレート等の各種（メタ）アクリル酸エステル；メチルビニルエーテル等の各種ビニルエーテル；その他、アクリルアミド、Ｎ，Ｎ’−ジメチルアクリルアミド、Ｎ−イソプロピル（メタ）アクリルアミド、（メタ）アクリル酸、アリルアルコール、アクリロニトリル、アクロレイン、酢酸ビニル、ビニルスルホン酸ナトリウム、スチレン、クロロスチレン、ビニルフェノール、ビニルシンナメート、塩化ビニル、ビニルブロミド、イタコン酸、イタコン酸エステル、フマル酸、マレイン酸、等の各種ラジカル重合性モノマーが挙げられるが、前記式（１）で表される繰り返し単位を含む両性イオンポリマーをタンパク質安定化剤として用いる場合、溶媒への溶解性の観点からのバランスから他のモノマーとしてはＮ，Ｎ’−ジメチルアクリルアミド、ポリエチレングリコールモノ（メタ）アクリレートが好ましい。また、他のモノマーの配合量は任意であり、適宜選択できるが、前記式（１）で表される繰り返し単位を含む両性イオンポリマーの性能を引き出すためには、配合される前記他のモノマーが９０モル％以下であることが好ましく、より好ましくは７０モル％以下である。
【００５７】
前記式（４）で表される両性イオンモノマーは、溶媒を加えた溶液重合や懸濁重合、乳化重合に供することもできる。溶媒は、前記式（４）で表される両性イオンモノマーを溶解、重合が進行すれば特に制限はなく、例えば、メタノールなどのアルコール系溶媒と水の混媒を使用することが出来る。アルコールと水との混媒の比率は、アルコール系溶媒が体積％で５０％以下が好ましく、更に好ましくは１０％以下である。
【００５８】
前記式（４）で表される両性イオンモノマーの重合は、熱重合または光重合により行うことができる。前記熱重合は、熱重合開始剤を用いて行うことができる。熱重合開始剤としては、たとえば過酸化物系ラジカル開始剤（過酸化ベンゾイル、過硫酸アンモニウム等）または、アゾ系ラジカル開始剤（アゾビスイソブチロニトリル（ＡＩＢＮ）、２，２’−アゾビス−ジメチルバレロニトリル（ＡＤＶＮ）等）、２，２’−アゾビスシアノ吉草酸（ＡＣＶＡ）、アゾビス［２−（２−イミダゾリン−２−イル）プロパン]二塩酸塩（ＶＡ−０４４）から選択されるが、好ましくは水系溶媒への溶解性の観点からＡＣＶＡ、ＶＡ−０４４であり、更に好ましくはＶＡ−０４４である。ラジカル開始剤の使用量は前記式（４）で表される両性イオンモノマー１００質量部に対して通常０．０１から１０質量部であることが好ましく、より好ましくは０．０１から５質量部である。重合温度および重合時間は、ラジカル開始剤の種類や他のモノマーの有無や種類などによって適宜選択して決定することができる。例えば、前記式（４）で表される両性イオンモノマー単独での重合を、ＶＡ−０４４を用いて行う場合、重合温度は３０〜７０℃、好ましくは３５〜６５℃、より好ましくは３５〜５０℃である。重合時間は１〜４８時間、好ましくは１〜２４時間、より好ましくは２〜２４時間である。
【００５９】
前記光重合は、例えば、波長２５４ｎｍの紫外線（ＵＶ）または加速電圧１５０〜３００ｋＶの電子線（ＥＢ）照射等により実施することができる。この際、光重合開始剤の使用は任意であるが、反応時間の点からは使用することが好ましい。光重合開始剤としては、２−ヒドロキシ−２−メチル−１−フェニル−１−プロパノン、１−ヒドロキシ−シクロヘキシルフェニルケトン、フェニル（２，４，６−トリメチルベンゾイル）ホスフィン酸リチウムなどが挙げられるが、水系溶媒への溶解性等の点からフェニル（２，４，６−トリメチルベンゾイル）ホスフィン酸リチウムが好ましい具体例として挙げられる。
【００６０】
前記式（４）で表される両性イオンモノマーのラジカル重合は、連鎖移動剤を用いることもできる。前記連鎖移動剤としては、２−メルカプトエタノール、１−メルカプト−２−プロパノール、３−メルカプト−１−プロパノール、ｐ−メルカプトフエノール、メルカプト酢酸、２−メルカプトプロピオン酸、３−メルカプトプロピオン酸、２−メルカプトニコチン酸などが挙げられる。例えば、Ｒ３が水酸基である前記式（４）で表される両性イオンモノマーを用いる場合、重合溶媒への溶解性の観点から、メルカプト酢酸、又は２−メルカプトプロピオン酸が好ましい。
【００６１】
前記式（４）で表される両性イオンモノマーのラジカル重合は、リビングラジカル重合法により行うことも可能である。具体的には、原子移動ラジカル重合法（ＡＴＲＰ法）、可逆的付加開裂連鎖移動重合法（ＲＡＦＴ重合法）、及びニトロキシドを介した重合法（ＮＭＰ法）などが利用可能である。特にタンパク質安定化剤の用途では金属を使用せず、酵素活性を低下させないといった理由で、可逆的付加開裂連鎖移動重合法（ＲＡＦＴ重合法）が好ましい。前記ＲＡＦＴ重合の方法としては公知の方法が利用可能であり、例えばＷＯ９９／３１１４４、ＷＯ９８／０１４７８及び米国特許第６，１５３，７０５号に記載されている方法が有効である。
【００６２】
ＲＡＦＴ重合を用いて、前記式（４）で表される両性イオンモノマーの重合を行う場合、通常のラジカル重合にＲＡＦＴ剤を添加することができる。前記ＲＡＦＴ剤としては４−シアノペンタン酸ジチオベンゾエート、２−シアノ−２−プロピルベンゾジチオエート、ベンジルベンゾジチオエート、２−フェニル−２−プロピルベンゾジチオエート、メチル２−フェニル−２−（フェニル−カーボノチオイルチオ）アセテート、４−シアノ−４−（フェニルカルボノチオイルチオ）ペンタン酸Ｎ−スクシンイミジルエステル、４−シアノ−４−（ドデシルスルファニル−チオカルボニル）スルファニルペンタン酸、４−シアノ−４−（ドデシルスルファニル−チオカルボニル）スルファニルペンタノール、２−シアノ−２−プロピルドデシルトリチオカーボネート、２−（ドデシルチオカルボニルチオイルチオ）−２−メチルプロピオン酸、４−シアノ−４−（ドデシルスルファニル−チオカルボニル）スルファニルペンタン酸ポリエチレングリコールメチルエーテルエステル、２−（ドデシルチオカルボニルチオイルチオ）−２−メチルプロピオン酸３−アジド−１−プロパノールエステル、ベンジル１Ｈ−ピロール−１−カルボジチオエート、２−シアノプロパン−２−イル−Ｎ−メチル−Ｎ−ピリジン４−イルカルボジチオエート、プロピオン酸エチル−２−エチルザンテートから選択され、例えばＲ３が水酸基である前記式（４）で表される両性イオンモノマーを用いる場合にはＲＡＦＴ剤の溶解性の観点から、４−シアノペンタン酸ジチオベンゾエート、４−シアノ−４−（ドデシルスルファニル−チオカルボニル）スルファニルペンタン酸、４−シアノ−４−（ドデシルスルファニル−チオカルボニル）スルファニルペンタン酸ポリエチレングリコールメチルエーテルエステルが好ましい。
ＲＡＦＴ剤の使用量としては、前記式（４）で表される両性イオンモノマー１００質量部に対して通常０．０１から２０質量部が好ましく、より好ましくは、０．０１から１０質量部である。
【００６３】
前記式（４）で表される両性イオンモノマーから、特に限定されないが前記リビングラジカル重合法を用いることで、ブロック共重合体を得ることができる。例えば、前記式（４）で表される両性イオンモノマーもしくは前記他のモノマーをリビングラジカル重合法によりブロックＡを製造し、得られたブロックＡをマクロ重合開始剤として、前記式（４）で表される両性イオンモノマーもしくは前記他のモノマーをリビングラジカル重合法により重合することにより、ブロックＡに繋がるブロックＢを製造することができる。前記式（１）で表される繰り返し単位を含む両性イオンポリマーをタンパク質安定化剤として用いる場合、他のモノマーとしては、溶媒への溶解性の観点から、Ｎ，Ｎ’−ジメチルアクリルアミド、ブチル（メタ）アクリレート、ポリエチレングリコールモノ（メタ）アクリレートが好ましい。また、他のモノマーの配合量は任意であり、適宜選択できるが、前記式（１）で表される繰り返し単位を含む両性イオンポリマーの性能を引き出すためには、配合される前記他のモノマーが９０モル％以下であることが好ましく、より好ましくは７０モル％以下である。
【００６４】
前記式（４）で表される両性イオンモノマーを重合して得られる、前記式（１）で表される繰り返し単位を含む両性ポリマーは、そのまま未精製で用いられるほか、好ましくは過剰な溶媒の減圧留去、再沈殿、カゲルろ過クロマトグラフィーや透析などの処理により単離、精製を行うこともできる。
【００６５】
＜タンパク質安定化剤＞
本発明のタンパク質安定化剤は、前記式（１）で表される繰り返し単位を有する両性イオンポリマーを含む。タンパク質安定化剤は、好ましくは両性イオンポリマーの水溶液であり、水としては、精製水、純水、イオン交換水等が好ましく、水を含有する各種緩衝液がより好ましい。各種緩衝液としては、タンパク質の酵素活性、抗原性等の生理活性を失わせるようなものでなければ、通常この分野で用いられる緩衝液を用いることができる。例えば、リン酸緩衝液、トリス緩衝液、グッド緩衝液、グリシン緩衝液、ホウ酸緩衝液、酢酸緩衝液等が挙げられ、リン酸緩衝液、酢酸緩衝液が特に好ましい。
【００６６】
タンパク質安定化剤溶液中に含有される、前記式（１）で表される繰り返し単位を含む両性イオンポリマーは、０．０１質量％以上であることが好ましく、０．１質量％以上であることがより好ましい。上限値としては、主溶媒である水に溶解する限り特に制限はないが、例えば、２０質量％以下、好ましくは１０質量％以下である。これらの範囲であれば、タンパク質安定化剤溶液は有効なタンパク質安定化効果を示し、かつ、タンパク質の溶解、又はタンパク質溶液との混合を良好に実施できる。
【００６７】
本発明のタンパク質安定化剤が、安定化させるタンパク質としては、特に限定されないが、アセチルコリンエステラーゼ、アルカリ性ホスファターゼ、β−Ｄ−ガラクトシターゼ、グルコアミラーゼ、グルコースオキシダーゼ、グルコース−６−リン酸脱水素酵素、ヘキソキナーゼ、ペニシリナーゼ、ペルオキシダーゼ、リゾチーム等が挙げられ、好ましくは、酵素免疫測定法にて汎用されるペルオキシダーゼやアルカリ性ホスファダーゼ等が挙げられる。
【００６８】
本発明のタンパク質安定化剤は、タンパク質溶液に添加して用いることができる。あるいは、本発明のタンパク質安定化剤は、タンパク質安定化剤溶液として、対象のタンパク質を溶解させてもよい。またさらに、タンパク質溶液とタンパク質安定化剤溶液とを調製し、両溶液を混合してもよい。
本発明のタンパク質安定化剤によってタンパク質を安定化させるにあたって、タンパク質安定化溶液を保持する温度は、２℃〜４０℃が好ましい。２℃以下であるとタンパク質安定化溶液が凍結する可能性があり、４０℃以上になると、タンパク質を安定化できる期間が短くなり得るからである。
【実施例】
【００６９】
以下、実施例に基づいて本発明をより具体的に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。なお各合成例において、核磁気共鳴（１Ｈ−ＮＭＲ）には日本電子社製ＪＭＴＣ−４００を用いた。【００７０】
＜実施例１：ポリマーＡの合成＞
（合成例１−１：モノマー２の合成）
【化１３】
2019131757.tif 000015
四つ口フラスコにＬ−メチオニン（１）（１５．０ｇ，７４．０ｍｍｏｌ）を入れ、５質量％水酸化カリウム水溶液２００ｍｌに溶解させた。反応溶液を０℃まで冷却し、アクリル酸クロライド（１５．０ｍｌ，  １４１ｍｍｏｌ）を１５分かけて滴下した。その後、反応系を室温まで昇温し、２時間攪拌した。反応溶液に４Ｎ塩酸５０ｍｌを加え、ｐＨ２．０に調整し、酢酸エチル１００ｍｌで三回、有機相を抽出した。有機相を飽和食塩水１００ｍｌで二回洗浄した後、硫酸マグネシウムで乾燥し、溶媒を減圧留去した。得られた混合物をシリカゲルクロマトグラフィー（酢酸エチル／メタノール＝１／１  ｖ／ｖ）により精製し、モノマー２を得た。
収量  ９．９ｇ
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤ３ＯＤ、４００ＭＨｚ）
６．２−６．４ｐｐｍ（ＣＨ２＝ＣＨ，ｍ，２Ｈ），５．６５ｐｐｍ（ＣＨ２＝ＣＨ，ｔ，１Ｈ），  ４．６３ｐｐｍ（ＮＨ−ＣＨ−ＣＯＯＨ，ｔ，１Ｈ），２．４−２．６ｐｐｍ（ＣＨ２−ＣＨ２−Ｓ，ｍ，２Ｈ），２．０−２．２ｐｐｍ（ＣＨ２−ＣＨ２−Ｓ，ｍ，２Ｈ），１．９２ｐｐｍ（Ｓ−ＣＨ３，ｓ，３Ｈ）【００７１】
（合成例１−２：ポリマー３の合成）
【化１４】
2019131757.tif 000016
二口フラスコにモノマー２（１．５０ｇ,７．５０ｍｍｏｌ）、アゾビスイソブチロニトリル（１２  ｍｇ，０．０８ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（４ｍｌ）に溶解させた。１５分窒素バブリング後、反応系を６５℃まで昇温し、重合を開始させた。２０時間後の反応溶液をＭＴＢＥ２００ｍｌで再沈殿させ、ポリマー３を得た。
収量  １．４ｇ
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤ３ＯＤ、４００ＭＨｚ）
４．３−４．６ｐｐｍ（ＮＨ−ＣＨ−ＣＯＯＨ），２．６−２．８ｐｐｍ（ＣＨ２−ＣＨ２−Ｓ），２．０−２．６ｐｐｍ（ＣＨ２−ＣＨ２−Ｓ，Ｓ−ＣＨ３），１．６−２．６ｐｐｍ（ポリマー主鎖）【００７２】
（合成例１−３：ポリマーＡの合成）
【化１５】
2019131757.tif 000017
ナスフラスコにポリマー３（１．０ｇ）をいれ、ＤＭＦ３ｍｌに溶解した。反応溶液にヨードメタン１  ｍｌを加え、室温で２０時間攪拌した。反応溶液をアセトン５０ｍｌで再沈殿させ、ポリマーＡを得た。
収量１．１ｇ
１Ｈ−ＮＭＲ（Ｄ２Ｏ、４００ＭＨｚ）
４．３−４．６ｐｐｍ（ＮＨ−ＣＨ−ＣＯＯＨ），３．２−３．４ｐｐｍ（ＣＨ２−ＣＨ２−Ｓ（ＣＨ３）２），２．８−３．０ｐｐｍ（ＣＨ２−Ｓ（ＣＨ３）２），１．４−２．４ｐｐｍ（ＣＨ２−ＣＨ２−Ｓ、ポリマー主鎖）
得られたポリマーＡの数平均分子量および分子量分布（重量平均分子量／数平均分子量）は、検出器に示差屈折率計を用いたゲル浸透クロマトグラフィー測定によりもとめた。ポンプに島津製作所（株）社製  ＬＣ−７２０ＡＤを、検出器（示差屈折率計）に島津製作所（株）社製  ＲＩＤ１０Ａを、検出器（ＵＶ）にＳＰＤ−２０Ａを用いた。カラムには、東ソー（株）社製ＴＳＫＧｅｌ  Ｇ３０００ＰＷＸＬとＴＳＫＧｅｌ  Ｇ５０００ＰＷＸＬ（カラムサイズ  ４．６ｍｍ×２５ｃｍ）とを二本連結したものを用いた。展開溶媒は、ｐＨ９．０に調製した５０ｍＭリン酸バッファー／アセトニトリル（９／１  ｖ／ｖ）を用いた。測定条件は、流速  ０．６ｍｌ／ｍｉｎ、カラム温度  ４０℃、サンプル濃度  ０．２ｍｇ／ｍｌ、注入量  ７０μＬであった。スタンダートとしてポリエチレングリコールを用いた。ゲル浸透クロマトグラフィー測定の結果、ポリマーＡの数平均分子量は１９０００、分子量分布は１．９５であった。  【００７３】
＜実施例２：ポリマーＢの合成＞
（合成例２−１：ポリマー４の合成）
【化１６】
2019131757.tif 000018
二口フラスコにモノマー２（１．５０ｇ,７．５０ｍｍｏｌ）、ベンジル１Ｈ−ピロール−１−カルボジチオエート（３４．５ｍｇ，０．１５ｍｍｏｌ）、アゾビスイソブチロニトリル（１２ｍｇ，０．０８ｍｍｏｌ）を入れ、ＤＭＦ（４ｍｌ）に溶解させた。１５分窒素バブリング後、反応系を６５℃まで昇温し、重合を開始させた。２０時間後の反応溶液をＭＴＢＥ２００ｍｌで再沈殿させ、ポリマー４を得た。
収量  １．４ｇ
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤ３ＯＤ、４００ＭＨｚ）
４．３−４．６ｐｐｍ（ＮＨ−ＣＨ−ＣＯＯＨ），２．６−２．８ｐｐｍ（ＣＨ２−ＣＨ２−Ｓ），２．０−２．６ｐｐｍ（ＣＨ２−ＣＨ２−Ｓ，Ｓ−ＣＨ３），１．６−２．６ｐｐｍ（ポリマー主鎖）【００７４】
（合成例２−２：ポリマーＢの合成）
【化１７】
2019131757.tif 000019
ナスフラスコにポリマー４（１．０ｇ）をいれ、ＤＭＦ３ｍｌに溶解した。反応溶液にヨードメタン１ｍｌを加え、室温で２０時間攪拌した。反応溶液をアセトン５０ｍｌで再沈殿させ、ポリマーＢを得た。
収量 １．１ｇ
１Ｈ−ＮＭＲ（Ｄ２Ｏ、４００ＭＨｚ）
４．３−４．６ｐｐｍ（ＮＨ−ＣＨ−ＣＯＯＨ），３．２−３．４ｐｐｍ（ＣＨ２−ＣＨ２−Ｓ（ＣＨ３）２），２．８−３．０ｐｐｍ（ＣＨ２−Ｓ（ＣＨ３）２），１．４−２．４ｐｐｍ（ＣＨ２−ＣＨ２−Ｓ、ポリマー主鎖）
得られたポリマーＢの数平均分子量および分子量分布（重量平均分子量／数平均分子量）は、合成例３と同様にして求めた。ゲル浸透クロマトグラフィー測定の結果、ポリマーＡの数平均分子量は７９００、分子量分布は１．２５であった。  【００７５】
＜実施例３：ポリマーＣの合成＞
【化１８】
2019131757.tif 000020
ナスフラスコにポリマー５（１．０ｇ）をいれ、ＤＭＦ３ｍｌに溶解した。反応溶液にヨードブタン１ｍｌを加え、室温で２０時間攪拌した。反応溶液をアセトン５０ｍｌで再沈殿させ、ポリマーＣを得た。
収量 １．１ｇ
１Ｈ−ＮＭＲ（Ｄ２Ｏ、４００ＭＨｚ）
４．３−４．６ｐｐｍ（ＮＨ−ＣＨ−ＣＯＯＨ），３．２−３．４ｐｐｍ（ＣＨ２−ＣＨ２−Ｓ（ＣＨ３）２），２．８−３．０ｐｐｍ（ＣＨ２−Ｓ（ＣＨ３）２），０．８−２．４ｐｐｍ（ブチル基、ＣＨ２−ＣＨ２−Ｓ、ポリマー主鎖）
得られたポリマーＣの数平均分子量および分子量分布は前記実施例１と同様にして求めた。ポリマーＣの数平均分子量は８１００、分子量分布は１．２３であった。【００７６】
＜実施例４：ポリマーＤの合成＞
（合成例４−１：ポリマー５の合成）
【化１９】
2019131757.tif 000021
二口フラスコにモノマー２（６０ｍｇ,０．３０ｍｍｏｌ）、ブチルアクリレート（９０ｍｇ，  ０．７０ｍｍｏｌ）、アゾビスイソブチロニトリル（０．１ｍｇ，０．０１ｍｍｏｌ）をエタノール（１ｍｌ）に溶解させた。１５分窒素バブリング後、反応系を６５℃まで昇温し、重合を開始させた。２０時間後の反応溶液をＭＴＢＥ２０ｍｌで再沈殿させ、ポリマー５を得た。
組成比（モル比）  ｘ：ｙ＝３２：６８
収量  １４０ｍｇ
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３、４００ＭＨｚ）
４．１−４．６ｐｐｍ（ＮＨ−ＣＨ−ＣＯＯＨ），３．９−４．１（ＣＯＯ−ＣＨ２−ＣＨ２（ＢＡ）），２．６−２．８ｐｐｍ（ＣＨ２−ＣＨ２−Ｓ），２．０−２．６ｐｐｍ（ＣＨ２−ＣＨ２−Ｓ，Ｓ−ＣＨ３），１．６−２．６ｐｐｍ（ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ３（ＢＡ）、ポリマー主鎖），０．８−１．０ｐｐｍ（ＣＨ２−ＣＨ３（ＢＡ））【００７７】
（合成例４−２：ポリマーＤの合成）
【化２０】
2019131757.tif 000022
ナスフラスコにポリマー５（１００ｍｇ）をいれ、エタノール１ｍｌに溶解した。反応溶液にヨードメタン１００μｌを加え、室温で２０時間攪拌した。溶媒を減圧留去し、ポリマーＤを得た。
収量 １００ｍｇ
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤ３ＯＤ、４００ＭＨｚ）
４．１−４．６ｐｐｍ（ＮＨ−ＣＨ−ＣＯＯＨ、ＣＯＯ−ＣＨ２−ＣＨ２（ＢＡ）），３．２−３．４ｐｐｍ（ＣＨ２−ＣＨ２−Ｓ（ＣＨ３）２），２．８−３．０ｐｐｍ（ＣＨ２−Ｓ（ＣＨ３）２），１．０−２．４ｐｐｍ（ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ３（ＢＡ）、ＣＨ２−ＣＨ２−Ｓ、ポリマー主鎖），０．８−１．０ｐｐｍ（ＣＨ２−ＣＨ３（ＢＡ））  得られたポリマーＤの数平均分子量および分子量分布（重量平均分子量／数平均分子量）は、検出器に示差屈折率計を用いたゲル浸透クロマトグラフィー測定によりもとめた。
使用した機器は、前記実施例１と同様であった。カラムとしては、Ａｇｉｌｅｎｔ社製  Ｍｉｘｅｄ−Ｄ（粒子径  ５μｍ、カラムサイズ  ４．６ｍｍ×２５ｃｍ）を二本連結したものを用いた。展開溶媒には、０．５質量％  臭化リチウム含有クロロホルム／メタノール＝６／４  （ｖ／ｖ）を用いた。測定条件は、流速  ０．６ｍｌ／ｍｉｎ、カラム温度  ４０℃、サンプル濃度  ０．２ｍｇ／ｍｌ、注入量  ７０μｌであった。スタンダートとしてポリエチレングリコールを用いた。ゲル浸透クロマトグラフィー測定の結果、ポリマーＤの数平均分子量は２１０００、分子量分布は２．０６であった。【００７８】
＜実施例５：ポリマーＥの合成＞
（合成例５−１：ポリマー６の合成）
【化２１】
2019131757.tif 000023
二口フラスコにモノマー２（２００ｍｇ,１．００ｍｍｏｌ）、ポリエチレングリコールモノアクリレート（４８０ｍｇ，  １．００ｍｍｏｌ）、ベンジル１Ｈ−ピロール−１−カルボジチオエート（９．３ｍｇ，０．０４ｍｍｏｌ）、アゾビスイソブチロニトリル（３．３ｍｇ，０．０２ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（１ｍｌ）に溶解させた。１５分窒素バブリング後、反応系を６５℃まで昇温し、重合を開始させた。２０時間後の反応溶液をＭＴＢＥ２０ｍｌで再沈殿させ、ポリマー６を得た。
収量  ６４０ｍｇ
組成比（モル比）  ｘ：ｙ＝４４：５６
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３、４００ＭＨｚ）
４．１−４．６ｐｐｍ（ＮＨ−ＣＨ−ＣＯＯＨ，ＣＯＯ−ＣＨ２−ＣＨ２（ＰＥＧＡ）），３．８−３．９ｐｐｍ（ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−（ＰＥＧＡ）），３．４ｐｐｍ（Ｏ−ＣＨ３（ＰＥＧＡ）），２．６−２．８ｐｐｍ（ＣＨ２−ＣＨ２−Ｓ），２．０−２．６ｐｐｍ（ＣＨ２−ＣＨ２−Ｓ，Ｓ−ＣＨ３），１．６−２．６ｐｐｍ（ポリマー主鎖）【００７９】
（合成例５−２：ポリマーＥの合成）
【化２２】
2019131757.tif 000024
ナスフラスコにポリマー６（１００ｍｇ）をいれ、エタノール１ｍｌに溶解した。反応溶液にヨードメタン１００μｌを加え、室温で２０時間攪拌した。溶媒を減圧留去し、ポリマーＥを得た。
収量  １００ｍｇ
１Ｈ−ＮＭＲ（Ｄ２Ｏ、４００ＭＨｚ）
４．１−４．６ｐｐｍ（ＮＨ−ＣＨ−ＣＯＯＨ，ＣＯＯ−ＣＨ２−ＣＨ２（ＰＥＧＡ）），，３．８−３．９ｐｐｍ（ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−（ＰＥＧＡ）），３．２−３．４ｐｐｍ（Ｏ−ＣＨ３（ＰＥＧＡ），ＣＨ２−ＣＨ２−Ｓ（ＣＨ３）２），２．８−３．０ｐｐｍ（ＣＨ２−Ｓ（ＣＨ３）２），１．６−２．４ｐｐｍ（ポリマー主鎖）
得られたポリマーＥの数平均分子量および分子量分布（重量平均分子量／数平均分子量）は、検出器に示差屈折率計を用いたゲル浸透クロマトグラフィー測定によりもとめた。
使用した機器は前記実施例１と同様に行った。カラムとしては、Ａｇｉｌｅｎｔ社製  Ｍｉｘｅｄ−Ｄ（粒子径  ５μｍ、カラムサイズ  ４．６ｍｍ×２５ｃｍ）を二本連結したものを用いた。展開溶媒には、１１．５ｍＭ  臭化リチウム含有ジメチルホルムアミドを用いた。測定条件は、流速  ０．６ｍｌ／ｍｉｎ、カラム温度  ４０℃、サンプル濃度  ０．２ｍｇ／ｍｌ、注入量  ７０μＬであった。スタンダートとしてポリエチレングリコールを用いた。ゲル浸透クロマトグラフィー測定の結果、ポリマーＥの数平均分子量は１５０００、分子量分布は１．３０であった。【００８０】
＜実施例６：ポリマーＦの合成＞
（合成例６−１：モノマー７の合成）
【化２３】
2019131757.tif 000025
ナスフラスコにモノマー２（６０９ｍｇ，３．００ｍｍｏｌ）をいれ、ＤＭＦ６ｍｌに溶解した。反応溶液にヨードメタン（２１０μｌ，３．３０ｍｍｏｌ）を加え、室温で２０時間攪拌した。ＭＴＢＥ１００ｍｌに反応溶液を加え、結晶化させた。得られた化合物をメタノール４ｍｌに溶解し、再度ＭＴＢＥ１００ｍｌで結晶化し、モノマー７を得た。
収量  ６００ｍｇ
１Ｈ−ＮＭＲ（Ｄ２Ｏ、４００ＭＨｚ）
６．２−６．４ｐｐｍ（ＣＨ２＝ＣＨ，ｍ，２Ｈ），５．６５ｐｐｍ（ＣＨ２＝ＣＨ，ｔ，１Ｈ），  ４．６３ｐｐｍ（ＮＨ−ＣＨ−ＣＯＯＨ，ｔ，１Ｈ），３．４８ｐｐｍ（ＣＨ２−ＣＨ２−Ｓ，ｔ，２Ｈ），３．０５ｐｐｍ（ＣＨ２−Ｓ（ＣＨ３）２，ｓ，６Ｈ），  ２．２−２．５ｐｐｍ（ＣＨ２−ＣＨ２−Ｓ，ｍ，２Ｈ）【００８１】
（合成例６−２：ポリマーＦの合成）
【化２４】
2019131757.tif 000026
二口フラスコにモノマー１２（１００ｍｇ,０．５０ｍｍｏｌ）、アゾビス［２−（２−イミダゾリン−２−イル）プロパン]二塩酸塩（ＶＡ−０４４）（１．６ｍｇ，５．０μｍｏｌ）をＨ２Ｏ（０．５ｍｌ）に溶解させた。１５分窒素バブリング後、反応系を４５℃まで昇温し、重合を開始させた。２０時間後の反応溶液をアセトン１０ｍｌで再沈殿させ、ポリマーＦを得た。
収量  １００ｍｇ
１Ｈ−ＮＭＲ（Ｄ２Ｏ、４００ＭＨｚ）
４．３−４．６ｐｐｍ（ＮＨ−ＣＨ−ＣＯＯＨ），３．２−３．４ｐｐｍ（ＣＨ２−ＣＨ２−Ｓ（ＣＨ３）２），２．８−３．０ｐｐｍ（ＣＨ２−Ｓ（ＣＨ３）２），１．４−２．４ｐｐｍ（ＣＨ２−ＣＨ２−Ｓ、ポリマー主鎖）
得られたポリマーＦの数平均分子量および分子量分布（重量平均分子量／数平均分子量）は、検出器に前記実施例１と同様に、示差屈折率計を用いたゲル浸透クロマトグラフィー測定によりもとめた。ポリマーＦの数平均分子量は４９００、分子量分布は２．５３であった。【００８２】
＜実施例７：ポリマーＧの合成＞
（合成例７−１：ポリマー８の合成）
【化２５】
2019131757.tif 000027
二口フラスコにＮ，Ｎ−ジメチルアクリルアミド（２．５２ｇ,２５．４ｍｍｏｌ）、ベンジル１Ｈ−ピロール−１−カルボジチオエート（９３．０ｍｇ，０．４０ｍｍｏｌ）、アゾビスイソブチロニトリル（３２．８ｍｇ，０．２０ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（１２ｍｌ）に溶解させた。１５分窒素バブリング後、反応系を６５℃まで昇温し重合を開始させた。１．５時間後の反応溶液をＭＴＢＥ２００ｍｌで再沈殿させ、ポリマー８を得た。
収量  １．４ｇ
１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤ３ＣＮ、４００ＭＨｚ）
７．２−７．４ｐｐｍ（フェニル基，  ５Ｈ），６．４ｐｐｍ（ピロール基，  ２Ｈ），２．３−３．０ｐｐｍ（ＣＯＮＨ（ＣＨ３）２），１．１−１．９ｐｐｍ（ポリマー主鎖）
得られたポリマー８の数平均分子量および分子量分布（重量平均分子量／数平均分子量）は、検出器に示差屈折率計を用いたゲル浸透クロマトグラフィー測定によりもとめた。
使用した機器は、前記実施例１と同様であった。カラムとしては、Ａｇｉｌｅｎｔ社製  Ｍｉｘｅｄ−Ｄ（粒子径  ５μｍ、カラムサイズ  ４．６ｍｍ×２５ｃｍ）を二本連結したものを用いた。展開溶媒には、１１．５ｍＭ  臭化リチウム含有ジメチルホルムアミドを用いた。測定条件は、流速  ０．６ｍｌ／ｍｉｎ、カラム温度  ４０℃、サンプル濃度  ０．２ｍｇ／ｍｌ、注入量  ７０μＬであった。スタンダートとしてポリエチレングリコールを用いた。ゲル浸透クロマトグラフィー測定の結果、ポリマー８の数平均分子量は５３００、分子量分布は１．１１であった。【００８３】
（合成例７−２：ポリマーＧの合成）
【化２６】
2019131757.tif 000028
二口フラスコにモノマー１２（１００ｍｇ,０．５０ｍｍｏｌ）、ポリマー１６（５３ｍｇ，１０．０μｍｏｌ）、アゾビス［２−（２−イミダゾリン−２−イル）プロパン]二塩酸塩（ＶＡ−０４４）（１．６ｍｇ，５．０μｍｏｌ）をＨ２Ｏ（０．５ｍｌ）に溶解させた。１５分窒素バブリング後、反応系を４５℃まで昇温し、重合を開始させた。２０時間後の反応溶液をアセトン１０ｍｌで再沈殿させ、ポリマーＧを得た。
収量  １２０ｍｇ
１Ｈ−ＮＭＲ（Ｄ２Ｏ、４００ＭＨｚ）
４．３−４．６ｐｐｍ（ＮＨ−ＣＨ−ＣＯＯＨ），３．２−３．４ｐｐｍ（ＣＨ２−ＣＨ２−Ｓ（ＣＨ３）２），２．８−３．０ｐｐｍ（ＣＯＮＨ（ＣＨ３）２（ＤＭＡＡｍ），ＣＨ２−Ｓ（ＣＨ３）２），１．４−２．４ｐｐｍ（ＣＨ２−ＣＨ２−Ｓ、ポリマー主鎖）
得られたポリマーＧの数平均分子量および分子量分布（重量平均分子量／数平均分子量）は、実施例１と同様にして求めた。ゲル浸透クロマトグラフィー測定の結果、ポリマーＧの数平均分子量は８３００、分子量分布は１．２０であった。  【００８４】
＜実施例８−１＞
（タンパク質安定化剤の調製）
実施例１で合成したポリマーＡを濃度が１質量％となるようにリン酸バッファー（ｐＨ＝７．４）に溶解させ、２種類の濃度のタンパク質安定化剤溶液を調製した。【００８５】
（タンパク質溶液の調製）
西洋わさび由来のペルオキシダーゼを、濃度が２ｕｇ／ｍｌとなるようにリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）に溶解させ、タンパク質溶液を調製した。【００８６】
（タンパク質安定化効果の評価）
前記タンパク質安定化剤溶液１ｍｌに前記タンパク質溶液５０μｌを加え、評価用溶液を調整した。前記評価用溶液を４℃で保存し，２．５日後、９６ウェルプレートに１０μｌずつ加え、そこにＡＢＴＳ（２，２‘−アゾビス（３−エチルベンゾチアゾリン−６−スルホン酸）アンモニウム塩）溶液（ＳｅｒａＣａｒｅ  Ｌｉｆｅｓｃｉｅｎｃｅ社）１００μｌを加え、室温で３０分振とうした。振とう後、１質量％のドデシル硫酸ナトリウム溶液１００μｌを加え、反応を停止した。４１０ｎｍにおける吸光度を測定し、タンパク質安定化効果の評価を行った。
すなわち評価用溶液調製直後の吸光度と前記保存による２．５日後の吸光度を測定し、下記数式（数式１）により、酵素活性残存率（％）を算出した。タンパク質安定化効果は、酵素活性残存率により評価し、酵素活性残存率が高いほどタンパク質安定化効果が高いことを表す。評価結果を表１に示す。
測定機器：ＤＳファーマバイオメディカル社製プレートリーダー
測定条件：室温  ４１０ｎｍ【００８７】
【数１】
2019131757.tif 000029
【００８８】
＜実施例８−２＞
タンパク質安定化剤としてポリマーＢを使用し、濃度が1質量％および０．１質量％となるようにリン酸バッファー（ｐＨ＝７．４）に溶解させてタンパク質安定化剤溶液を調製したこと以外は、実施例８−１と同様にしてタンパク質安定化効果の評価を行った。評価結果を表１に示す。【００８９】
＜実施例９＞
（凍結融解安定化効果の評価）
実施例８−２に記載のタンパク質安定化剤溶液１ｍｌに前記タンパク質溶液５０μｌを加え、凍結融解安定性評価用溶液を調整した。凍結融解安定性評価用溶液を−７８℃で凍結、４℃で融解を３回〜１０回繰り返した後、９６ウェルプレートに１０μｌずつ加え、そこにＡＢＴＳ（２，２’−アゾビス（３−エチルベンゾチアゾリン−６−スルホン酸）アンモニウム塩）溶液（ＳｅｒａＣａｒｅ  Ｌｉｆｅｓｃｉｅｎｃｅ社）１００μｌを加え、室温で３０分振とうした。振とう後、１質量％のドデシル硫酸ナトリウム溶液１００μｌを加え、反応を停止した。４１０ｎｍにおける吸光度を測定し、凍結融解安定化効果の評価を行った。
すなわち、凍結融解安定性評価用の溶液を調製した直後の吸光度と、前記凍結融解を３〜１０回繰り返した後の吸光度を測定し、下記数式（数式２）により、酵素活性残存率（％）を算出した。凍結融解安定化効果は酵素活性残存率により評価し、酵素活性残存率が高いほど凍結融解安定化効果が高いことを表す。評価結果を表２に示す。
測定機器：ＤＳファーマバイオメディカル社製プレートリーダー
測定条件：室温  ４１０ｎｍ【００９０】
【数２】
2019131757.tif 000030
【００９１】
＜実施例１０＞
（タンパク質安定化剤溶液の調製）
実施例２で合成したポリマーＢを、濃度が０．２、０．１、０．０５質量％となるように５０体積％エタノール水溶液に溶解させたタンパク質安定化剤溶液を調製した。【００９２】
（ＤＰＰＨ溶液の調製）
ＤＰＰＨ（１，１−ジフェニル−２−ピクリルヒドラジル）を濃度が０．２５  ｍＭとなるようにエタノールに溶解させ、ＤＰＰＨ溶液を調製した。【００９３】
（抗酸化性の評価）
９６ウェルプレートに上記各濃度の前記タンパク質安定化剤溶液５０μｌずつ加え、そこに０．２５Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ５．５）１００μｌと前記ＤＰＰＨ溶液１００μｌを加え、抗酸化性評価溶液を調製した。抗酸化性評価溶液を調製後、３０分間、暗所で静置し、５４０ｎｍにおける吸光度を測定した。  前記抗酸化性評価溶液の調製と同様に、ただし前記タンパク質安定化剤溶液の代わりに５０％エタノール水溶液５０μｌを加え、ブランク溶液１とした。
前記抗酸化性評価溶液の調製と同様に、ただし前記ＤＰＰＨ溶液の代わりにエタノール１００μｌを加え、ブランク溶液２とした。
前記抗酸化性評価溶液の調製と同様に、ただし前記タンパク質安定化剤溶液の代わりに５０％エタノール水溶液５０μｌを加え、前記ＤＰＰＨ溶液の代わりにエタノール１００μｌを加え、ブランク溶液３とした。
そして、タンパク質安定化剤溶液の吸光度と前記ブランク溶液１、２、３の吸光度を測定し、下記数式（数式３）により、ＤＰＰＨラジカル消去率（％）を算出した。抗酸化性はＤＰＰＨラジカル消去率により評価し、ＤＰＰＨラジカル消去率が高いほど抗酸化性が高いことを表す。評価結果を表３に示す。
測定機器：ＤＳファーマバイオメディカル社製プレートリーダー
測定条件：室温  ５４０ｎｍ【００９４】
【数３】
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【００９５】
＜比較例１−１＞
（合成例６−２の重合溶媒をＤＭＦ中重合温度７０℃で行った場合）
二口フラスコにモノマー７（１００ｍｇ,０．５０ｍｍｏｌ）、４，４’−アゾビス（４−シアノ吉草酸）（１．６ｍｇ，５．０μｍｏｌ）をＤＭＦ（０．５ｍｌ）に溶解させた。１５分窒素バブリング後、反応系を７０℃まで昇温し重合を開始させた。２０時間後の反応溶液をアセトン１０  ｍｌで再沈殿させたが、ポリマーを得ることができなかった。【００９６】
＜比較例１−２＞
（合成例６−２の重合温度７０℃で行った場合）
二口フラスコにモノマー７（１００ｍｇ,０．５０ｍｍｏｌ）、４，４’−アゾビス（４−シアノ吉草酸）（１．６ｍｇ，５．０μｍｏｌ）をＨ２Ｏ（０．５ｍｌ）に溶解させた。１５分窒素バブリング後、反応系を７０℃まで昇温し重合を開始させた。２０時間後の反応溶液をアセトン１０  ｍｌで再沈殿させたが、ポリマーを得ることができなかった。【００９７】
＜比較例２−１＞
タンパク質安定化剤を用いずにリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）のみを使用したこと以外は、実施例８−１と同様にしてタンパク質安定化効果の評価を行った。評価結果を表１に示す。【００９８】
＜比較例２−２＞
タンパク質安定化剤としてＤＭＳＰを使用し、濃度が０．１質量％となるようにリン酸バッファー（ｐＨ＝７．４）に溶解させてタンパク質安定化剤溶液を調製したこと以外は、実施例８−１と同様にしてタンパク質安定化効果の評価を行った。評価結果を表１に示す。【００９９】
＜比較例２−３＞
タンパク質安定化剤としてポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を使用し、濃度が０．１質量％および０．１質量％となるようにリン酸バッファー（ｐＨ＝７．４）に溶解させてタンパク質安定化剤溶液を調製したこと以外は、実施例８−１と同様にしてタンパク質安定化効果の評価を行った。評価結果を表１に示す。【０１００】
＜比較例２−４＞
タンパク質安定化剤としてＢＳＡ（牛血清アルブミン）を使用し、濃度が１質量％となるようにリン酸バッファー（ｐＨ＝７．４）に溶解させてタンパク質安定化剤溶液を調製したこと以外は、実施例８−１と同様にしてタンパク質安定化効果の評価を行った。評価結果を表１に示す。【０１０１】
表１に示すとおり、実施例８−１のポリマーＡおよび実施例８−２のポリマーＢをタンパク質安定化剤として用いた場合、比較例と比較して顕著なタンパク質安定化効果を示していることがわかる。【０１０２】
＜比較例３−１＞
タンパク質安定化剤を用いずにリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）のみを使用したこと以外は、実施例９と同様にして凍結融解安定化効果の評価を行った。評価結果を表２に示す。【０１０３】
＜比較例３−２＞
タンパク質安定化剤としてＤＭＳＰを使用し、濃度が０．１質量％となるようにリン酸バッファー（ｐＨ＝７．４）に溶解させてタンパク質安定化剤溶液を調製したこと以外は、実施例９と同様にして凍結融解安定化効果の評価を行った。評価結果を表２に示す。【０１０４】
＜比較例３−３＞
タンパク質安定化剤としてＢＳＡ（牛血清アルブミン）を使用し、濃度が１質量％となるようにリン酸バッファー（ｐＨ＝７．４）に溶解させてタンパク質安定化剤溶液を調製したこと以外は、実施例９と同様にして凍結融解安定化効果の評価を行った。評価結果を表２に示す。【０１０５】
表２に示すとおり、ポリマーＢをタンパク質安定化剤として用いた場合、比較例と比較して顕著な凍結融解安定化効果を示していることがわかる。【０１０６】
＜比較例４−１＞
抗酸化剤としてＤＭＳＰを使用し、濃度が０．２、０．１、０．０５質量％となるように５０％エタノール水溶液に溶解させて抗酸化剤溶液を調製したこと以外は、実施例１０と同様にして抗酸化性の評価を行った。評価結果を表３に示す。【０１０７】
＜比較例４−２＞
抗酸化剤としてＰＥＧ（分子量：４０００）を使用し、濃度が０．２、０．１、０．０５質量％となるように５０％エタノール水溶液に溶解させて抗酸化剤溶液を調製したこと以外は、実施例１０と同様にして抗酸化性の評価を行った。評価結果を表３に示す。【０１０８】
表３に示すとおり、ポリマーＢをタンパク質安定化剤として用いた場合、比較例と比較して顕著な抗酸化性を示していることがわかる。【０１０９】
以上のことから、タンパク質の安定性を向上させる効果のある両性イオンを有しているポリマーＢは、少量の添加でタンパク質安定化効果のある高分子タンパク質安定化剤として機能しており、同時に、抗酸化性を有する両性イオンポリマーであることが確認された。【０１１０】
＜実施例１１：ポリマーＨの合成＞
（合成例８−１：ポリマー９の合成）
【化２７】
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二口フラスコにモノマー２（１．８ｇ，９．０ｍｍｏｌ）、ブチルアクリレート（１２８ｍｇ，１．０ｍｍｏｌ）、ベンジル１Ｈ−ピロール−１−カルボジチオエート（４６．６ｍｇ，０．２０ｍｍｏｌ）、アゾビスイソブチロ二トリル（１６．４ｍｇ，０．１０ｍｍｏｌ）をエタノール（１ｍｌ）に溶解させた。１５分窒素バブリング後、反応系を６５℃まで昇温し、重合を開始させた。２０時間後の反応溶液をＭＴＢＥ／Ｈｅｘａｎｅ混合溶媒２００ｍｌで再沈殿させ、ポリマー９を得た。
組成比（モル比）  ｘ：ｙ＝８６：１４
収量  １．８ｇ  【０１１１】
（合成例８−２：ポリマーＨの合成）  
ナスフラスコにポリマー９（１．００ｇ）をいれ、エタノール１０ｍｌに溶解した。反応溶液にヨードメタン２ｍＬを加え、室温で２０時間攪拌した。溶媒を減圧留去し、ポリマーＨを得た。
収量 １．８ｇ
得られたポリマーＨの数平均分子量および分子量分布（重量平均分子量／数平均分子量）は、前記実施例１と同様にしてもとめた。
ポリマーＨの数平均分子量は８３００、分子量分布は１．３１であった。【０１１２】
＜実施例１２：ポリマーＩの合成＞
（合成例９−１：ポリマー１０の合成）
モノマー２（１．４ｇ，７．０ｍｍｏｌ）、ブチルアクリレート（３８４ｍｇ，３．０ｍｍｏｌ）を用いたこと以外は合成例８−１と同様にしてポリマー１０を得た。
組成比（モル比）  ｘ：ｙ＝６８：３２
収量  １．７ｇ【０１１３】
（合成例９−２：ポリマーＩの合成）
合成例８−２と同様にしてポリマー１０からポリマーＩを得た。
収量 １．８ｇ
得られたポリマーＩの数平均分子量および分子量分布（重量平均分子量／数平均分子量）は、前記実施例４と同様にしてもとめた。
ポリマーＩの数平均分子量は１３２００、分子量分布は１．０８であった。【０１１４】
＜実施例１３：ポリマーＪの合成＞
（合成例１０−１：ポリマー１１の合成）
モノマー２（１．０ｇ，５．０ｍｍｏｌ）、ブチルアクリレート（６４０ｍｇ，５．０ｍｍｏｌ）を用いたこと以外は合成例８−１と同様にしてポリマー１１を得た。
組成比（モル比）  ｘ：ｙ＝５０：５０
収量  １．６ｇ【０１１５】
（合成例１０−２：ポリマーＪの合成）
合成例８−２と同様にしてポリマー１１からポリマーＪを得た。
収量 １．７ｇ
得られたポリマーＪの数平均分子量および分子量分布（重量平均分子量／数平均分子量）は、前記実施例４と同様にしてもとめた。
ポリマーＪの数平均分子量は１４０００、分子量分布は１．１０であった。【０１１６】
＜実施例１４：ポリマーＫの合成＞
（合成例１１−１：ポリマー１２の合成）
モノマー２（０．６ｇ，３．０ｍｍｏｌ）、ブチルアクリレート（８９６ｍｇ，７．０ｍｍｏｌ）を用いたこと以外は合成例８−１と同様にしてポリマー１２を得た。
組成比（モル比）  ｘ：ｙ＝３２：６８
収量  １．４ｇ【０１１７】
（合成例１１−２：ポリマーＫの合成）
合成例８−２と同様にしてポリマー１２からポリマーＫを得た。
収量 １．５ｇ
得られたポリマーＫの数平均分子量および分子量分布（重量平均分子量／数平均分子量）は、前記実施例４と同様にしてもとめた。
ポリマーＪの数平均分子量は１３０００、分子量分布は１．１６であった。
なお、実施例１１〜１４にて、得られたポリマー９〜１２、及び、ポリマーＨ，Ｉ，Ｊ，及びＫにおける、両性ｘとｙの構成単位のモル比は、以下の表５に示す通りである。【０１１８】
＜実施例１５＞
＜実施例１５−１＞
ポリマーＢのタンパク質安定化効果は４℃での保存期間を１３日、２８日、６２日間とした以外は実施例８−２と同様して評価を行った。評価結果を表４に示す。【０１１９】
＜実施例１５−２＞
タンパク質安定化剤としてポリマーＢの代わりにポリマーＨを用いたこと以外は前記実施例１５−１と同様にしてタンパク質安定化剤溶液を調製した。評価結果を表４に示す。【０１２０】
＜実施例１５−３＞
タンパク質安定化剤としてポリマーＢの代わりにポリマーＩを用いたこと以外は前記実施例１５−１と同様にしてタンパク質安定化剤溶液を調製した。評価結果を表４に示す。【０１２１】
＜実施例１５−４＞
タンパク質安定化剤としてポリマーＢの代わりにポリマーＪを用いたこと以外は前記実施例１５−１と同様にしてタンパク質安定化剤溶液を調製した。評価結果を表４に示す。【０１２２】
＜実施例１５−５＞
タンパク質安定化剤としてポリマーＢの代わりにポリマーＫを用いたこと以外は前記実施例１５−１と同様にしてタンパク質安定化剤溶液を調製した。評価結果を表４に示す。【０１２３】
＜比較例５＞
タンパク質安定化剤を用いずにリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）のみを使用したこと以外は前記実施例１５−１と同様にしてタンパク質安定化剤溶液を調製した。評価結果を表４に示す。【０１２４】
表４に示すとおり、ブチルアクリレートと共重合することで、長期間のタンパク質安定化効果を示すことがわかる。【０１２５】
【表１】
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【０１２６】
【表２】
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【０１２７】
【表３】
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【０１２８】
【表４】
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【０１２９】
【表５】
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【産業上の利用可能性】
【０１３０】
以上説明したように、本発明によれば、タンパク質の安定性を向上させる効果のある両性イオンを有しており、少量の添加でタンパク質安定化効果のある高分子タンパク質安定化剤を提供できる。そして、本発明の両性イオンポリマーは上記安定化効果と同時に抗酸化性を有するものあるため、高分子タンパク質安定化剤の抗酸化性を向上させることもできる。本発明の両性イオンポリマーを含むタンパク質安定化剤は、タンパク質の低温下、例えば４℃での長期保存に対する安定性や、凍結融解操作に対する安定性を特に向上することができる。
【国際調査報告】
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