(57)【要約】  ステロールの製造法を提供する。２４−デヒドロコレステロールレダクターゼ（DHCR24）、７−デヒドロコレステロールレダクターゼ（DHCR7）、またはステロール２４−Ｃ−メチルトランスフェラーゼ（SMT1）の活性が低下するように改変されたステロール生産能を有するラビリンチュラ類微生物を培養し、培養物からステロールを回収することにより、ステロールを製造する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ラビリンチュラ類微生物であって、
ステロール生産能を有し、
オーランチオキトリウム（Aurantiochytrium）sp.1であり、
２４−デヒドロコレステロールレダクターゼの活性が非改変株と比較して低下するように改変されており、
前記ステロールが、植物ステロールおよび真菌ステロールから選択される少なくとも１種のステロールである、微生物。
【請求項２】
２４−デヒドロコレステロールレダクターゼをコードする遺伝子の発現を低下させることにより、または該遺伝子を破壊することにより、２４−デヒドロコレステロールレダクターゼの活性が低下した、請求項１に記載の微生物。
【請求項３】
２４−デヒドロコレステロールレダクターゼのアミノ酸配列の一部または全部の欠失により、２４−デヒドロコレステロールレダクターゼの活性が低下した、請求項１または２に記載の微生物。
【請求項４】
前記ステロールが、スティグマステロールおよび／またはブラシカステロールである、請求項１〜３のいずれか一項に記載の微生物。
【請求項５】
ラビリンチュラ類微生物であって、
ステロール生産能を有し、
オーランチオキトリウム（Aurantiochytrium）sp.1であり、
７−デヒドロコレステロールレダクターゼの活性が非改変株と比較して低下するように改変されており、
前記ステロールが、７−デヒドロコレステロールおよび／またはエルゴステロールである、微生物。
【請求項６】
７−デヒドロコレステロールレダクターゼをコードする遺伝子の発現を低下させることにより、または該遺伝子を破壊することにより、７−デヒドロコレステロールレダクターゼの活性が低下した、請求項５に記載の微生物。
【請求項７】
７−デヒドロコレステロールレダクターゼのアミノ酸配列の一部または全部の欠失により、７−デヒドロコレステロールレダクターゼの活性が低下した、請求項５または６に記載の微生物。
【請求項８】
さらに、ステロール２４−Ｃ−メチルトランスフェラーゼの活性が非改変株と比較して低下するように改変されている、請求項５〜７のいずれか一項に記載の微生物。
【請求項９】
ラビリンチュラ類微生物であって、
ステロール生産能を有し、
オーランチオキトリウム（Aurantiochytrium）sp.1であり、
ステロール２４−Ｃ−メチルトランスフェラーゼの活性が非改変株と比較して低下するように改変されており、
前記ステロールが、動物ステロールから選択される少なくとも１種のステロールである、微生物。
【請求項１０】
前記ステロール２４−Ｃ−メチルトランスフェラーゼが、下記（ａ）、（ｂ）、または（ｃ）に記載のタンパク質である、請求項８または９に記載の微生物：
（ａ）配列番号３８または５６に示すアミノ酸配列を含むタンパク質；
（ｂ）配列番号３８または５６に示すアミノ酸配列において、１〜１０個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、および／または付加を含むアミノ酸配列を含み、且つ、ステロール２４−Ｃ−メチルトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質；
（ｃ）配列番号３８または５６に示すアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、且つ、ステロール２４−Ｃ−メチルトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質。
【請求項１１】
ステロール２４−Ｃ−メチルトランスフェラーゼをコードする遺伝子の発現を低下させることにより、または該遺伝子を破壊することにより、ステロール２４−Ｃ−メチルトランスフェラーゼの活性が低下した、請求項８〜１０のいずれか一項に記載の微生物。
【請求項１２】
ステロール２４−Ｃ−メチルトランスフェラーゼのアミノ酸配列の一部または全部の欠失により、ステロール２４−Ｃ−メチルトランスフェラーゼの活性が低下した、請求項８〜１１のいずれか一項に記載の微生物。
【請求項１３】
前記ステロールが、コレステロールおよび／または７−デヒドロコレステロールである、請求項９〜１２のいずれか一項に記載の微生物。
【請求項１４】
前記ステロールが、コレステロールである、請求項９〜１３のいずれか一項に記載の微生物。
【請求項１５】
さらに、下記性質（Ａ）、（Ｂ）、および（Ｃ）から選択される少なくとも１つの性質を有する、請求項９〜１４のいずれか一項に記載の微生物：
（Ａ）前記微生物が、ステロールＣ−２２デサチュラーゼの活性が非改変株と比較して低下するように改変されている；
（Ｂ）前記微生物が、２４−デヒドロコレステロールレダクターゼの活性が非改変株と比較して増大するように改変されている；
（Ｃ）前記微生物が、７−デヒドロコレステロールレダクターゼの活性が非改変株と比較して増大するように改変されている。
【請求項１６】
前記ステロールＣ−２２デサチュラーゼが、下記（ａ）、（ｂ）、または（ｃ）に記載のタンパク質である、請求項１５に記載の微生物：
（ａ）配列番号４２に示すアミノ酸配列を含むタンパク質；
（ｂ）配列番号４２に示すアミノ酸配列において、１〜１０個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、および／または付加を含むアミノ酸配列を含み、且つ、ステロールＣ−２２デサチュラーゼ活性を有するタンパク質；
（ｃ）配列番号４２に示すアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、且つ、ステロールＣ−２２デサチュラーゼ活性を有するタンパク質。
【請求項１７】
前記２４−デヒドロコレステロールレダクターゼが、下記（ａ）、（ｂ）、または（ｃ）に記載のタンパク質である、請求項１〜４、１５、および１６のいずれか一項に記載の微生物：
（ａ）配列番号４０に示すアミノ酸配列を含むタンパク質；
（ｂ）配列番号４０に示すアミノ酸配列において、１〜１０個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、および／または付加を含むアミノ酸配列を含み、且つ、２４−デヒドロコレステロールレダクターゼ活性を有するタンパク質；
（ｃ）配列番号４０に示すアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、且つ、２４−デヒドロコレステロールレダクターゼ活性を有するタンパク質。
【請求項１８】
前記７−デヒドロコレステロールレダクターゼが、下記（ａ）、（ｂ）、または（ｃ）に記載のタンパク質である、請求項５〜８および１５〜１７のいずれか一項に記載の微生物：
（ａ）配列番号３９に示すアミノ酸配列を含むタンパク質；
（ｂ）配列番号３９に示すアミノ酸配列において、１〜１０個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、および／または付加を含むアミノ酸配列を含み、且つ、７−デヒドロコレステロールレダクターゼ活性を有するタンパク質；
（ｃ）配列番号３９に示すアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、且つ、７−デヒドロコレステロールレダクターゼ活性を有するタンパク質。
【請求項１９】
18S rDNAの塩基配列が、配列番号３に対して９７％以上の同一性を有する、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の微生物。
【請求項２０】
Aurantiochytrium sp.1 AJ7869株（FERM BP-22342）、AJ7868株（FERM BP-22290）、またはAJ7879株（FERM BP-22367）に由来する改変株である、請求項１〜１９のいずれか一項に記載の微生物。
【請求項２１】
ステロールの製造方法であって、
請求項１〜２０のいずれか一項に記載の微生物を培地で培養すること、および
前記培養により生成した菌体から前記ステロールを回収すること、
を含む、方法。
【請求項２２】
前記ステロールが、遊離型のステロール、ステロールエステル、ステリルグルコシド、アシルステリルグルコシド、またはそれらの混合物である、請求項２１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ラビリンチュラ類微生物を利用したステロールの製造法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ステロールは、動物、植物、真菌等の各種生物において見出されるステロイド誘導体である。ステロールは、例えば、それらステロールを有する生物資源からの抽出により製造されている。また、従属栄養微生物であるラビリンチュラ類の中にはコレステロール等のステロールを生産するものが知られている（非特許文献１）。また、ラビリンチュラ類微生物の改変株を用いたステロールの製造法も報告されている。【０００３】
例えば、７−デヒドロコレステロールレダクターゼ（7-dehydrocholesterol reductase；「DHCR7」ともいう）の活性を低下させたオーランチオキトリウム・リマシナム（Aurantiochytrium limacinum）等のラビリンチュラ類微生物を用いた７−デヒドロコレステロールの製造法が報告されている（特許文献１）。【０００４】
また、例えば、ステロール２４−Ｃ−メチルトランスフェラーゼ（sterol 24-C-methyltransferase；「SMT1」ともいう）の活性を低下させたオーランチオキトリウム・リマシナム等のラビリンチュラ類微生物を用いた７−デヒドロコレステロールの製造法が報告されている（特許文献２）。特許文献２によれば、SMT1の活性の低下により、７−デヒドロコレステロールの蓄積は増大するが、コレステロールの蓄積は減少することが示されている。【０００５】
SMT1は、ステロールのＣ２４位にメチル基を導入する酵素である（EC 2.1.1.41）。SMT1は、ステロールの生合成に関与する酵素の１つであり、具体的には、植物ステロールおよび真菌ステロールの生合成に関与する。SMT1の活性を低下させたラビリンチュラ類微生物を用いたコレステロールの製造法は知られていない。【０００６】
DHCR7は、ステロールのＣ７位の二重結合を還元する酵素である（EC 1.3.1.21）。DHCR7は、ステロールの生合成に関与する酵素の１つであり、具体的には、コレステロールや７−デヒドロコレステロール等の動物ステロールの生合成に関与する。【０００７】
２４−デヒドロコレステロールレダクターゼ（24-dehydrocholesterol reductase；「DHCR24」ともいう）は、ステロールのＣ２４位の二重結合を還元する酵素である（EC 1.3.1.72）。DHCR24は、ステロールの生合成に関与する酵素の１つであり、具体的には、コレステロールや７−デヒドロコレステロール等の動物ステロールの生合成に関与する。DHCR24の活性を低下させたラビリンチュラ類微生物を用いた植物ステロールまたは真菌ステロールの製造法は知られていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】WO2015/108058
【特許文献２】WO2016/056610
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Weete JD, et al., Lipids and ultrastructure of Thraustochytrium sp. ATCC 26185., Lipids. 1997 Aug;32(8):839-45.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明は、ステロールの製造法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者は、上記課題を解決するために鋭意研究を行った結果、DHCR24、DHCR7、またはSMT1の活性が低下するようにラビリンチュラ類微生物を改変することにより同微生物のステロール生産能を向上させることができることを見出し、本発明を完成させた。【００１２】
すなわち、本発明は以下の通り例示できる。
［１］
ラビリンチュラ類微生物であって、
ステロール生産能を有し、
オーランチオキトリウム（Aurantiochytrium）sp.1であり、
２４−デヒドロコレステロールレダクターゼの活性が非改変株と比較して低下するように改変されており、
前記ステロールが、植物ステロールおよび真菌ステロールから選択される少なくとも１種のステロールである、微生物。
［２］
２４−デヒドロコレステロールレダクターゼをコードする遺伝子の発現を低下させることにより、または該遺伝子を破壊することにより、２４−デヒドロコレステロールレダクターゼの活性が低下した、前記微生物。
［３］
２４−デヒドロコレステロールレダクターゼのアミノ酸配列の一部または全部の欠失により、２４−デヒドロコレステロールレダクターゼの活性が低下した、前記微生物。
［４］
前記ステロールが、スティグマステロールおよび／またはブラシカステロールである、前記微生物。
［５］
ラビリンチュラ類微生物であって、
ステロール生産能を有し、
オーランチオキトリウム（Aurantiochytrium）sp.1であり、
７−デヒドロコレステロールレダクターゼの活性が非改変株と比較して低下するように改変されており、
前記ステロールが、７−デヒドロコレステロールおよび／またはエルゴステロールである、微生物。
［６］
７−デヒドロコレステロールレダクターゼをコードする遺伝子の発現を低下させることにより、または該遺伝子を破壊することにより、７−デヒドロコレステロールレダクターゼの活性が低下した、前記微生物。
［７］
７−デヒドロコレステロールレダクターゼのアミノ酸配列の一部または全部の欠失により、７−デヒドロコレステロールレダクターゼの活性が低下した、前記微生物。
［８］
さらに、ステロール２４−Ｃ−メチルトランスフェラーゼの活性が非改変株と比較して低下するように改変されている、前記微生物。
［９］
ラビリンチュラ類微生物であって、
ステロール生産能を有し、
オーランチオキトリウム（Aurantiochytrium）sp.1であり、
ステロール２４−Ｃ−メチルトランスフェラーゼの活性が非改変株と比較して低下するように改変されており、
前記ステロールが、動物ステロールから選択される少なくとも１種のステロールである、微生物。
［１０］
前記ステロール２４−Ｃ−メチルトランスフェラーゼが、下記（ａ）、（ｂ）、または（ｃ）に記載のタンパク質である、前記微生物：
（ａ）配列番号３８または５６に示すアミノ酸配列を含むタンパク質；
（ｂ）配列番号３８または５６に示すアミノ酸配列において、１〜１０個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、および／または付加を含むアミノ酸配列を含み、且つ、ステロール２４−Ｃ−メチルトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質；
（ｃ）配列番号３８または５６に示すアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、且つ、ステロール２４−Ｃ−メチルトランスフェラーゼ活性を有するタンパク質。
［１１］
ステロール２４−Ｃ−メチルトランスフェラーゼをコードする遺伝子の発現を低下させることにより、または該遺伝子を破壊することにより、ステロール２４−Ｃ−メチルトランスフェラーゼの活性が低下した、前記微生物。
［１２］
ステロール２４−Ｃ−メチルトランスフェラーゼのアミノ酸配列の一部または全部の欠失により、ステロール２４−Ｃ−メチルトランスフェラーゼの活性が低下した、前記微生物。
［１３］
前記ステロールが、コレステロールおよび／または７−デヒドロコレステロールである、前記微生物。
［１４］
前記ステロールが、コレステロールである、前記微生物。
［１５］
さらに、下記性質（Ａ）、（Ｂ）、および（Ｃ）から選択される少なくとも１つの性質を有する、前記微生物：
（Ａ）前記微生物が、ステロールＣ−２２デサチュラーゼの活性が非改変株と比較して低下するように改変されている；
（Ｂ）前記微生物が、２４−デヒドロコレステロールレダクターゼの活性が非改変株と比較して増大するように改変されている；
（Ｃ）前記微生物が、７−デヒドロコレステロールレダクターゼの活性が非改変株と比較して増大するように改変されている。
［１６］
前記ステロールＣ−２２デサチュラーゼが、下記（ａ）、（ｂ）、または（ｃ）に記載のタンパク質である、前記微生物：
（ａ）配列番号４２に示すアミノ酸配列を含むタンパク質；
（ｂ）配列番号４２に示すアミノ酸配列において、１〜１０個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、および／または付加を含むアミノ酸配列を含み、且つ、ステロールＣ−２２デサチュラーゼ活性を有するタンパク質；
（ｃ）配列番号４２に示すアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、且つ、ステロールＣ−２２デサチュラーゼ活性を有するタンパク質。
［１７］
前記２４−デヒドロコレステロールレダクターゼが、下記（ａ）、（ｂ）、または（ｃ）に記載のタンパク質である、前記微生物：
（ａ）配列番号４０に示すアミノ酸配列を含むタンパク質；
（ｂ）配列番号４０に示すアミノ酸配列において、１〜１０個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、および／または付加を含むアミノ酸配列を含み、且つ、２４−デヒドロコレステロールレダクターゼ活性を有するタンパク質；
（ｃ）配列番号４０に示すアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、且つ、２４−デヒドロコレステロールレダクターゼ活性を有するタンパク質。
［１８］
前記７−デヒドロコレステロールレダクターゼが、下記（ａ）、（ｂ）、または（ｃ）に記載のタンパク質である、前記微生物：
（ａ）配列番号３９に示すアミノ酸配列を含むタンパク質；
（ｂ）配列番号３９に示すアミノ酸配列において、１〜１０個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、および／または付加を含むアミノ酸配列を含み、且つ、７−デヒドロコレステロールレダクターゼ活性を有するタンパク質；
（ｃ）配列番号３９に示すアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、且つ、７−デヒドロコレステロールレダクターゼ活性を有するタンパク質。
［１９］
18S rDNAの塩基配列が、配列番号３に対して９７％以上の同一性を有する、前記微生物。
［２０］
Aurantiochytrium sp.1 AJ7869株（FERM BP-22342）、AJ7868株（FERM BP-22290）、またはAJ7879株（FERM BP-22367）に由来する改変株である、前記微生物。
［２１］
ステロールの製造方法であって、
前記微生物を培地で培養すること、および
前記培養により生成した菌体から前記ステロールを回収すること、
を含む、方法。
［２２］
前記ステロールが、遊離型のステロール、ステロールエステル、ステリルグルコシド、アシルステリルグルコシド、またはそれらの混合物である、前記方法。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００１４】
＜１＞本発明の微生物
本発明の微生物は、DHCR24、DHCR7、またはSMT1の活性が低下するように改変された、ステロール生産能を有するラビリンチュラ類微生物である。
【００１５】
＜１−１＞ラビリンチュラ類微生物
本発明において用いられるラビリンチュラ類微生物は、Aurantiochytrium sp.1である。「Aurantiochytrium sp.1」とは、Aurantiochytrium属の特定の１種をいい、具体的には、Aurantiochytrium sp.1 AJ7869株（FERM BP-22342）が属する種をいう。言い換えると、「Aurantiochytrium sp.1」とは、具体的には、Aurantiochytrium sp.1 AJ7869株および同株と同種に属する株で構成される一群の微生物をいう。Aurantiochytrium sp.1 AJ7869株と同種に属する株としては、18S rDNAの塩基配列が、Aurantiochytrium sp.1 AJ7869株の18S rDNAの塩基配列（配列番号３）に対して９７％以上の同一性を有する株が挙げられる。Aurantiochytrium sp.1として、具体的には、例えば、AJ7869株に加えて、AJ7867株（FERM BP-22304）、AJ7868株（FERM BP-22290）、AJ7879株（FERM BP-22367）、BURABG162株、SKE217株、SKE218株が挙げられる。また、上記例示したAurantiochytrium sp.1に属する株に由来する株（例えば改変株）は、いずれも、Aurantiochytrium sp.1に包含される。
【００１６】
AJ7869株は、2017年8月8日に、独立行政法人製品評価技術基盤機構  特許生物寄託センター（郵便番号292-0818、日本国千葉県木更津かずさ鎌足2-5-8  120号室）に受託番号FERM P-22342として寄託され、2018年7月8日にブダペスト条約に基づく国際寄託に移管され、受託番号FERM BP-22342が付与されている。
【００１７】
AJ7868株は、2015年8月5日に、独立行政法人製品評価技術基盤機構  特許生物寄託センター（郵便番号292-0818、日本国千葉県木更津かずさ鎌足2-5-8  120号室）に受託番号FERM P-22290として寄託され、2016年8月31日にブダペスト条約に基づく国際寄託に移管され、受託番号FERM BP-22290が付与されている。
【００１８】
AJ7879株は、2018年8月27日に、独立行政法人製品評価技術基盤機構  特許生物寄託センター（郵便番号292-0818、日本国千葉県木更津かずさ鎌足2-5-8  120号室）にブダペスト条約に基づく国際寄託として原寄託され、受領番号FERM BP-22367が付与されている。
【００１９】
これらの菌株は、例えば、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（住所12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852 P.O. Box 1549, Manassas, VA 20108, United States of America）より分譲を受けることができる。すなわち各菌株に対応する登録番号が付与されており、この登録番号を利用して分譲を受けることができる（http://www.atcc.org/参照）。各菌株に対応する登録番号は、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションのカタログに記載されている。また、これらの菌株は、例えば、各菌株が寄託された寄託機関から入手することができる。
【００２０】
本発明の微生物は、上記例示したようなラビリンチュラ類微生物を適宜改変することにより得ることができる。すなわち、本発明の微生物は、上記例示したようなラビリンチュラ類微生物に由来する改変株であってよい。本発明の微生物は、特に、Aurantiochytrium sp.1 AJ7869株、AJ7868株、またはAJ7879株に由来する改変株であってもよい。本発明の微生物は、さらに特には、Aurantiochytrium sp.1 AJ7869株に由来する改変株であってもよい。
【００２１】
＜１−２＞ステロール生産能
本発明の微生物は、ステロール生産能を有する。「ステロール生産能を有する微生物」とは、培地で培養したときに、目的とするステロールを生成し、回収できる程度に菌体内に蓄積する能力を有する微生物をいう。
【００２２】
本発明の微生物は、本来的にステロール生産能を有するものであってもよく、ステロール生産能を有するように改変されたものであってもよい。例えば、上記例示したようなラビリンチュラ類微生物を、そのまま、あるいはステロール生産能を付与または増強して、ステロール生産能を有する微生物として用いることができる。ステロール生産能を付与または増強する方法は特に制限されない。例えば、後述するように、DHCR24、DHCR7、またはSMT1の活性が低下するようにラビリンチュラ類微生物を改変することにより、ステロール生産能を付与または増強することができる。また、例えば、コレステロールの生合成に関与する酵素の発現を増強すること等により、コレステロールの生産能を付与または増強することができる（WO2016/056610）。
【００２３】
本発明の微生物がDHCR24の活性が低下するように改変されている場合の目的とするステロールとしては、植物ステロールや真菌ステロールが挙げられる。本発明の微生物がDHCR24の活性が低下するように改変されている場合の目的とするステロールとしては、特に、植物ステロールが挙げられる。生産されるステロールの総量に対する生産される植物ステロールおよび真菌ステロールの総量は、例えば、９０％（ｗ／ｗ）以上、９５％（ｗ／ｗ）以上、９７％（ｗ／ｗ）以上、または９９％（ｗ／ｗ）以上であってよい。「植物ステロール」および「真菌ステロール」とは、それぞれ、植物および真菌において見出されるステロールをいう。植物ステロールとしては、７−デヒドロポリフェラステロール、スティグマステロール、４−メチル−７，２２−スティグマスタジエノール、β−シトステロール、ブラシカステロール、カンペステロール、ジオスゲニン、オレアノール酸、ベツリン酸、ウルソール酸、ヘコゲニン、サルササポゲニン、イソフコステロール、アベナステロール、Δ７−スティグマステノール、Δ７−カンペステノール、フコステロール、サルガステロールが挙げられる。植物ステロールとしては、特に、Ｃ２４位がメチルまたはエチルであるものが挙げられる。植物ステロールとして、さらに特には、スティグマステロールやブラシカステロールが挙げられる。真菌ステロールとしては、エルゴステロールや７−ジヒドロエルゴステロールが挙げられる。真菌ステロールとしては、特に、エルゴステロールが挙げられる。
【００２４】
本発明の微生物がDHCR7の活性が低下するように改変されている場合の目的とするステロールとしては、プロビタミンＤ類が挙げられる。プロビタミンＤ類としては、７−デヒドロコレステロール（プロビタミンＤ３）やエルゴステロール（プロビタミンＤ２）が挙げられる。プロビタミンＤ類としては、特に、７−デヒドロコレステロールが挙げられる。生産されるステロールの総量に対する生産されるプロビタミンＤ類の量は、例えば、５０％（ｗ／ｗ）以上、７０％（ｗ／ｗ）以上、８０％（ｗ／ｗ）以上、または８５％（ｗ／ｗ）以上であってよい。
【００２５】
本発明の微生物がSMT1の活性が低下するように改変されている場合の目的とするステロールとしては、動物ステロールが挙げられる。生産されるステロールの総量に対する生産される動物ステロールの量は、例えば、９０％（ｗ／ｗ）以上、９５％（ｗ／ｗ）以上、９７％（ｗ／ｗ）以上、または９９％（ｗ／ｗ）以上であってよい。「動物ステロール」とは、動物において見出されるステロールをいう。動物ステロールとしては、コレステロール、７−デヒドロコレステロール、グリココール酸、タウロコール酸、コール酸、エストラジオール、エストロン、エチニルエストラジオール、エストリオール、デヒドロエピアンドロステロン、メチルアンドロステンジオール、５β−プレグナン−３α，２０α−ジオール、プレグネノロン、ケノデオキシコール酸、デヒドロコール酸、ジヒドロキシコレステロール、ジギトキシゲニン、デスモステロール、ラソステロールが挙げられる。動物ステロールとしては、特に、コレステロールや７−デヒドロコレステロールが挙げられる。動物ステロールとして、さらに特には、コレステロールが挙げられる。
【００２６】
本発明の微生物が２つまたはそれ以上の改変を有する場合、目的とするステロールは、改変の組み合わせ等の諸条件に応じて適宜選択できる。例えば、本発明の微生物がDHCR7およびSMT1の活性が低下するように改変されている場合の目的とするステロールとしては、７−デヒドロコレステロール（プロビタミンＤ３）が挙げられる。また、例えば、本発明の微生物がSMT1およびsterol C-22 desaturaseの活性が低下するように改変されている場合の目的とするステロールとしては、コレステロール等の動物ステロールが挙げられる。また、例えば、本発明の微生物がSMT1の活性が低下し、且つDHCR24の活性が増大するように改変されている場合の目的とするステロールとしては、コレステロール、ラソステロール、７−デヒドロコレステロール等の一部の動物ステロールが挙げられる。また、例えば、本発明の微生物がSMT1の活性が低下し、且つDHCR7の活性が増大するように改変されている場合の目的とするステロールとしては、コレステロールが挙げられる。
【００２７】
本発明の微生物は、１種のステロールの生産能を有していてもよく、２種またはそれ以上のステロールの生産能を有していてもよい。
【００２８】
ステロールは、遊離型に限られず、各種派生物の形態でも存在し得る。よって、「ステロール」とは、特記しない限り、遊離型のステロールおよびその派生物を総称してよい。すなわち、「ステロール」とは、特記しない限り、遊離型のステロール、その派生物、またはそれらの混合物を意味してよい。ステロールの派生物としては、ステロールエステル、ステリルグルコシド、アシルステリルグルコシドが挙げられる。すなわち、「ステロール」とは、具体的には、例えば、遊離型のステロール、ステロールエステル、ステリルグルコシド、アシルステリルグルコシド、またはそれらの混合物を意味してもよい。
【００２９】
「ステロールエステル」とは、遊離型ステロールのアシルエステル、すなわち、遊離型ステロールと脂肪酸がエステル結合で結合した構造を有する化合物をいう。言い換えると、ステロールエステルは、互いにエステル結合で結合した、遊離型ステロールに相当する部位と脂肪酸に相当する部位を有する。遊離型ステロールに相当する部位を「ステロール部位」ともいう。脂肪酸に相当する部位を「脂肪酸部位」または「アシル基」ともいう。エステル結合は、ステロールのＣ３位の水酸基と脂肪酸のカルボキシル基との間で形成することができる。よって、ステロールがエステルの形態で存在する場合、Ｃ３位の水酸基は残存していなくてよい。アシル基の種類は、特に制限されない。すなわち、アシル基の鎖長や不飽和度は、可変である。アシル基の鎖長は、例えば、C14〜C26（例えば、C14、C16、C18、C20、C22、C24、またはC26）であってよい。アシル基は、飽和であってもよく、不飽和であってもよい。アシル基は、１つまたはそれ以上（例えば、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、または６つ）の不飽和二重結合を有していてよい。アシル基に対応する脂肪酸として、具体的には、例えば、ミリスチン酸（14:0）、パルミチン酸（16:0）、ステアリン酸（18:0）、アラキジン酸（20:0）、ベヘン酸（22:0）、リグノセリン酸（24:0）、セロチン酸（26:0）、ミリストレイン酸（14:1）、パルミトレイン酸（16:1）、オレイン酸（18:1）、リノール酸（18:2）、リノレン酸（18:3）、アラキドン酸（20:4）、エイコサペンタエン酸（EPA, 20:5）、ドコサペンタエン酸（DPA, 22:5）、ドコサヘキサエン酸（DHA, 22:6）が挙げられる。アシル基に対応する脂肪酸としては、特に、ドコサヘキサエン酸（DHA, 22:6）、ドコサペンタエン酸（DPA, 22:5）、パルミチン酸（16:0）が挙げられる。
【００３０】
「ステリルグルコシド」とは、遊離型ステロールの配糖体をいう。「アシルステリルグルコシド」とは、ステロールエステルの配糖体をいう。
【００３１】
＜１−３＞DHCR24、DHCR7、またはSMT1の活性低下
本発明の微生物は、DHCR24、DHCR7、またはSMT1の活性が低下するように改変されている。本発明の微生物は、具体的には、DHCR24、DHCR7、またはSMT1の活性が非改変株と比較して低下するように改変されている。DHCR24、DHCR7、またはSMT1の活性が低下するようにラビリンチュラ類微生物を改変することにより、同微生物のステロール生産能を向上させることができる、すなわち、同微生物によるステロールの生産を増大させることができる。ステロール生産の増大としては、ステロール生産量の増大、ステロール生産速度の増大、ステロール収率の増大が挙げられる。ステロール生産量の増大としては、菌体重量当たりのステロール生産量の増大や、培養液量当たりのステロール生産量の増大が挙げられる。また、ステロール生産の増大としては、ステロールの総生産量に対する目的のステロールの生産量の比率の増大も挙げられる。ステロールの総生産量に対する目的のステロールの生産量の比率は、例えば、５０％（ｗ／ｗ）以上、７０％（ｗ／ｗ）以上、８０％（ｗ／ｗ）以上、８５％（ｗ／ｗ）以上、９０％（ｗ／ｗ）以上、９５％（ｗ／ｗ）以上、９７％（ｗ／ｗ）以上、または９９％（ｗ／ｗ）以上であってよい。具体的には、DHCR24の活性低下により、植物ステロールおよび／または真菌ステロールの生産を増大させることができる。また、具体的には、DHCR7の活性低下により、プロビタミンＤ類の生産を増大させることができる。また、具体的には、SMT1の活性低下により、動物ステロールの生産を増大させることができる。
【００３２】
DHCR7とSMT1の活性は、組み合わせて低下させてもよい。言い換えると、DHCR7の活性を低下させる場合において、さらにSMT1の活性を低下させてもよい。また、SMT1の活性を低下させる場合において、さらにDHCR7の活性を低下させてもよい。DHCR7とSMT1の活性低下により、例えば、７−デヒドロコレステロール（プロビタミンＤ３）の生産が増大してよい。
【００３３】
本発明の微生物は、ステロール生産能を有するラビリンチュラ類微生物を、DHCR24、DHCR7、またはSMT1の活性が低下するように改変することによって得ることができる。また、本発明の微生物は、DHCR24、DHCR7、またはSMT1の活性が低下するようにラビリンチュラ類微生物を改変した後に、ステロール生産能を付与することによっても得ることができる。あるいは、本発明の微生物は、DHCR24、DHCR7、またはSMT1の活性が低下するように改変されたことにより、ステロール生産能が付与されたものであってもよい。また、DHCR24、DHCR7、またはSMT1の活性が低下するように改変される前の株は、目的のステロール以外のステロールの生産能を有していてもよい。すなわち、例えば、動物ステロールの生産能を有するラビリンチュラ類微生物をDHCR24の活性が低下するように改変してもよい。また、例えば、コレステロールの生産能を有するラビリンチュラ類微生物をDHCR7の活性が低下するように改変してもよい。また、例えば、植物ステロールおよび／または真菌ステロールの生産能を有するラビリンチュラ類微生物をSMT1の活性が低下するように改変してもよい。本発明において、本発明の微生物を構築するための改変は、任意の順番で行うことができる。
【００３４】
以下、DHCR24、DHCR7、およびSMT1、並びにそれらをコードする遺伝子について説明する。なお、以下の説明は、本発明の微生物において活性が低下するDHCR24、DHCR7、およびSMT1に加えて、後述するその他の改変として活性が増大するDHCR24およびDHCR7の説明を兼ねる。本発明の微生物において活性が低下するDHCR24、DHCR7、およびSMT1は、いずれも、改変されるラビリンチュラ類微生物が有するものである。
【００３５】
「２４−デヒドロコレステロールレダクターゼ（DHCR24）」とは、ステロールのＣ２４位の二重結合（Ｃ２４−Ｃ２５二重結合）を還元する反応を触媒する活性を有するタンパク質（酵素）をいう（EC 1.3.1.72）。同活性を、「２４−デヒドロコレステロールレダクターゼ活性（DHCR24活性）」ともいう。また、DHCR24をコードする遺伝子を「２４−デヒドロコレステロールレダクターゼ遺伝子（DHCR24遺伝子）」または「dhcr24遺伝子」ともいう。ここでいう「Ｃ２４位」とは、ザイモステロール（zymosterol）のＣ２４位に相当する炭素を意味する。
【００３６】
DHCR24活性は、例えば、電子供与体の存在下で酵素を基質（Ｃ２４位に二重結合を有するステロール）とインキュベートし、酵素および基質依存的な産物（Ｃ２４位の二重結合が還元されたステロール）の生成を測定することにより、測定できる。電子供与体としては、例えば、NADPHが挙げられる。基質および産物としては、例えば、それぞれ、ザイモステロール（zymosterol）および５ａ−コレスタ−８−エン−３ｂ−オール（5a-cholest-8-en-3b-ol）が挙げられる。
【００３７】
「７−デヒドロコレステロールレダクターゼ（DHCR7）」とは、ステロールのＣ７位の二重結合（Ｃ７−Ｃ８二重結合）を還元する反応を触媒する活性を有するタンパク質（酵素）をいう（EC 1.3.1.21）。同活性を、「７−デヒドロコレステロールレダクターゼ活性（DHCR7活性）」ともいう。また、DHCR7をコードする遺伝子を「７−デヒドロコレステロールレダクターゼ遺伝子（DHCR7遺伝子）」または「dhcr7遺伝子」ともいう。ここでいう「Ｃ７位」とは、７−デヒドロコレステロールのＣ７位に相当する炭素を意味する。
【００３８】
DHCR7活性は、例えば、電子供与体の存在下で酵素を基質（Ｃ７位に二重結合を有するステロール）とインキュベートし、酵素および基質依存的な産物（Ｃ７位の二重結合が還元されたステロール）の生成を測定することにより、測定できる。電子供与体としては、例えば、NADPHが挙げられる。基質および産物としては、例えば、それぞれ、７−デヒドロコレステロールおよびコレステロールが挙げられる。
【００３９】
「ステロール２４−Ｃ−メチルトランスフェラーゼ（SMT1）」とは、ステロールのＣ２４位にメチル基を導入する反応を触媒する活性を有するタンパク質（酵素）をいう（EC 2.1.1.41）。同活性を、「ステロール２４−Ｃ−メチルトランスフェラーゼ活性（SMT1活性）」ともいう。また、SMT1をコードする遺伝子を「ステロール２４−Ｃ−メチルトランスフェラーゼ遺伝子（SMT1遺伝子）」または「smt1遺伝子」ともいう。SMT1の基質となるステロールとしては、Ｃ２４位に二重結合（Ｃ２４−Ｃ２５二重結合）を有するステロールが挙げられる。メチル基の導入は、Ｃ２４位の二重結合の還元を伴ってよい。また、導入されたメチル基は、メチレン基に変換されて残存してもよい。言い換えると、SMT1の産物は、Ｃ２４位の二重結合が還元され、且つＣ２４位にメチレン基が導入されたステロールであってもよい。ここでいう「Ｃ２４位」とは、ザイモステロール（zymosterol）のＣ２４位に相当する炭素を意味する。
【００４０】
SMT1活性は、例えば、メチル基供与体の存在下で酵素を基質（ステロール）とインキュベートし、酵素および基質依存的な産物（Ｃ２４位にメチル基またはメチレン基が導入されたステロール）の生成を測定することにより、測定できる。メチル基供与体としては、例えば、Ｓ−アデノシル−Ｌ−メチオニン（S-adenosyl-L-methionine）が挙げられる。基質および産物としては、例えば、それぞれ、ザイモステロール（zymosterol）およびフェコステロール（fecosterol）が挙げられる。
【００４１】
DHCR24、DHCR7、またはSMT1の活性が低下したことは、後述するように、それらの活性を測定すること等により、確認することができる。また、DHCR24、DHCR7、またはSMT1の活性が低下したことは、目的のステロールの生産の増大を指標として確認することもできる。また、DHCR24、DHCR7、またはSMT1の活性が低下したことは、目的のステロール以外のステロールの生産の低下を指標としてすることもできる。
【００４２】
DHCR24、DHCR7、およびSMT1、並びにそれらをコードする遺伝子としては、ラビリンチュラ類微生物等の各種生物のものが挙げられる。ラビリンチュラ類微生物等の各種生物が有するDHCR24遺伝子、DHCR7遺伝子、およびSMT1遺伝子の塩基配列、並びにそれらにコードされるDHCR24、DHCR7、およびSMT1のアミノ酸配列は、例えば、NCBI（National Center for Biotechnology Information）等の公開データベースから取得できる。Aurantiochytrium sp.1 AJ7869株のDHCR24遺伝子の塩基配列、及び同遺伝子がコードするDHCR24のアミノ酸配列を、それぞれ配列番号２９および４０に示す。すなわち、DHCR24遺伝子は、例えば、配列番号２９に示す塩基配列を有する遺伝子であってよい。また、DHCR24は、例えば、配列番号４０に示すアミノ酸配列を有するタンパク質であってよい。また、Aurantiochytrium sp.1 AJ7869株のDHCR7遺伝子の塩基配列、及び同遺伝子がコードするDHCR7のアミノ酸配列を、それぞれ配列番号１８および３９に示す。すなわち、DHCR7遺伝子は、例えば、配列番号１８に示す塩基配列を有する遺伝子であってよい。また、DHCR7は、例えば、配列番号３９に示すアミノ酸配列を有するタンパク質であってよい。また、Aurantiochytrium sp.1 AJ7869株のSMT1遺伝子の塩基配列、及び同遺伝子がコードするSMT1のアミノ酸配列を、それぞれ配列番号７および３８に示す。また、Aurantiochytrium sp.1 AJ7868株およびAJ7879株のSMT1遺伝子の塩基配列、及び同遺伝子がコードするSMT1のアミノ酸配列を、それぞれ配列番号５５および５６に示す。なお、Aurantiochytrium sp.1 AJ7868株は、２コピーのSMT1遺伝子を有する。すなわち、SMT1遺伝子は、例えば、配列番号７または５５に示す塩基配列を有する遺伝子であってよい。また、SMT1は、例えば、配列番号３８または５６に示すアミノ酸配列を有するタンパク質であってよい。なお、「（アミノ酸または塩基）配列を有する」という表現は、特記しない限り、当該「（アミノ酸または塩基）配列を含む」ことを意味し、当該「（アミノ酸または塩基）配列からなる」場合も包含する。
【００４３】
DHCR24遺伝子は、元の機能が維持されている限り、上記例示したDHCR24遺伝子（例えば配列番号２９に示す塩基配列を有する遺伝子）のバリアントであってもよい。同様に、DHCR24は、元の機能が維持されている限り、上記例示したDHCR24（例えば配列番号４０に示すアミノ酸配列を有するタンパク質）のバリアントであってもよい。また、DHCR7遺伝子は、元の機能が維持されている限り、上記例示したDHCR7遺伝子（例えば配列番号１８に示す塩基配列を有する遺伝子）のバリアントであってもよい。同様に、DHCR7は、元の機能が維持されている限り、上記例示したDHCR7（例えば配列番号３９に示すアミノ酸配列を有するタンパク質）のバリアントであってもよい。また、SMT1遺伝子は、元の機能が維持されている限り、上記例示したSMT1遺伝子（例えば配列番号７または５５に示す塩基配列を有する遺伝子）のバリアントであってもよい。同様に、SMT1は、元の機能が維持されている限り、上記例示したSMT1（例えば配列番号３８または５６に示すアミノ酸配列を有するタンパク質）のバリアントであってもよい。なお、そのような元の機能が維持されたバリアントを「保存的バリアント」という場合がある。「DHCR24遺伝子」、「DHCR7遺伝子」、および「SMT1遺伝子」という用語は、それぞれ、上記例示したDHCR24遺伝子、DHCR7遺伝子、およびSMT1遺伝子に加えて、それらの保存的バリアントを包含するものとする。同様に、「DHCR24」、「DHCR7」、および「SMT1」という用語は、それぞれ、上記例示したDHCR24、DHCR7、およびSMT1に加えて、それらの保存的バリアントを包含するものとする。保存的バリアントとしては、例えば、上記例示したDHCR24遺伝子、DHCR7遺伝子、およびSMT1遺伝子並びにDHCR24、DHCR7、およびSMT1のホモログや人為的改変体が挙げられる。
【００４４】
「元の機能が維持されている」とは、遺伝子またはタンパク質のバリアントが、元の遺伝子またはタンパク質の機能（活性や性質）に対応する機能（活性や性質）を有することをいう。遺伝子についての「元の機能が維持されている」とは、遺伝子のバリアントが、元の機能が維持されたタンパク質をコードすることをいう。すなわち、DHCR24遺伝子についての「元の機能が維持されている」とは、遺伝子のバリアントがDHCR24活性を有するタンパク質をコードすることをいう。また、DHCR24についての「元の機能が維持されている」とは、タンパク質のバリアントがDHCR24活性を有することをいう。また、DHCR7遺伝子についての「元の機能が維持されている」とは、遺伝子のバリアントがDHCR7活性を有するタンパク質をコードすることをいう。また、DHCR7についての「元の機能が維持されている」とは、タンパク質のバリアントがDHCR7活性を有することをいう。また、SMT1遺伝子についての「元の機能が維持されている」とは、遺伝子のバリアントがSMT1活性を有するタンパク質をコードすることをいう。また、SMT1についての「元の機能が維持されている」とは、タンパク質のバリアントがSMT1活性を有することをいう。
【００４５】
以下、保存的バリアントについて例示する。
【００４６】
DHCR24遺伝子、DHCR7遺伝子、もしくはSMT1遺伝子のホモログまたはDHCR24、DHCR7、もしくはSMT1のホモログは、例えば、上記例示したDHCR24遺伝子、DHCR7遺伝子、もしくはSMT1遺伝子の塩基配列または上記例示したDHCR24、DHCR7、もしくはSMT1のアミノ酸配列を問い合わせ配列として用いたBLAST検索やFASTA検索によって公開データベースから容易に同定することができる。また、DHCR24遺伝子、DHCR7遺伝子、またはSMT1遺伝子のホモログは、例えば、ラビリンチュラ類微生物等の生物の染色体を鋳型にして、これら公知のDHCR24遺伝子、DHCR7遺伝子、またはSMT1遺伝子の塩基配列に基づいて作製したオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いたPCRにより取得し同定することができる。
【００４７】
DHCR24遺伝子、DHCR7遺伝子、またはSMT1遺伝子は、元の機能が維持されている限り、上記アミノ酸配列（例えば、DHCR24について配列番号４０に示すアミノ酸配列、DHCR7について配列番号３９に示すアミノ酸配列、SMT1について配列番号３８または５６に示すアミノ酸配列）において、１若しくは数個の位置での１又は数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする遺伝子であってもよい。例えば、コードされるタンパク質は、そのＮ末端および／またはＣ末端が、延長または短縮されていてもよい。なお上記「１又は数個」とは、アミノ酸残基のタンパク質の立体構造における位置やアミノ酸残基の種類によっても異なるが、具体的には、例えば、１〜５０個、１〜４０個、１〜３０個、好ましくは１〜２０個、より好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは１〜５個、特に好ましくは１〜３個を意味する。
【００４８】
上記の１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、および／または付加は、タンパク質の機能が正常に維持される保存的変異である。保存的変異の代表的なものは、保存的置換である。保存的置換とは、置換部位が芳香族アミノ酸である場合には、Phe、Trp、Tyr間で、置換部位が疎水性アミノ酸である場合には、Leu、Ile、Val間で、極性アミノ酸である場合には、Gln、Asn間で、塩基性アミノ酸である場合には、Lys、Arg、His間で、酸性アミノ酸である場合には、Asp、Glu間で、ヒドロキシル基を持つアミノ酸である場合には、Ser、Thr間でお互いに置換する変異である。保存的置換とみなされる置換としては、具体的には、AlaからSer又はThrへの置換、ArgからGln、His又はLysへの置換、AsnからGlu、Gln、Lys、His又はAspへの置換、AspからAsn、Glu又はGlnへの置換、CysからSer又はAlaへの置換、GlnからAsn、Glu、Lys、His、Asp又はArgへの置換、GluからGly、Asn、Gln、Lys又はAspへの置換、GlyからProへの置換、HisからAsn、Lys、Gln、Arg又はTyrへの置換、IleからLeu、Met、Val又はPheへの置換、LeuからIle、Met、Val又はPheへの置換、LysからAsn、Glu、Gln、His又はArgへの置換、MetからIle、Leu、Val又はPheへの置換、PheからTrp、Tyr、Met、Ile又はLeuへの置換、SerからThr又はAlaへの置換、ThrからSer又はAlaへの置換、TrpからPhe又はTyrへの置換、TyrからHis、Phe又はTrpへの置換、及び、ValからMet、Ile又はLeuへの置換が挙げられる。また、上記のようなアミノ酸の置換、欠失、挿入、または付加には、遺伝子が由来する生物の個体差、種の違いに基づく場合などの天然に生じる変異（mutant又はvariant）によって生じるものも含まれる。
【００４９】
また、DHCR24遺伝子、DHCR7遺伝子、またはSMT1遺伝子は、元の機能が維持されている限り、上記アミノ酸配列全体に対して、例えば、50%以上、65%以上、80%以上、好ましくは90%以上、より好ましくは95%以上、さらに好ましくは97%以上、特に好ましくは99%以上の相同性を有するアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする遺伝子であってもよい。尚、本明細書において、「相同性」（homology）は、「同一性」（identity）を意味する。
【００５０】
また、DHCR24遺伝子、DHCR7遺伝子、またはSMT1遺伝子は、元の機能が維持されている限り、上記塩基配列（例えば、DHCR24遺伝子について配列番号２９に示す塩基配列、DHCR7遺伝子について配列番号１８に示す塩基配列、SMT1遺伝子について配列番号７または５５に示す塩基配列）から調製され得るプローブ、例えば上記塩基配列の全体または一部に対する相補配列、とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNAであってもよい。「ストリンジェントな条件」とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。一例を示せば、相同性が高いDNA同士、例えば、50%以上、65%以上、80%以上、好ましくは90%以上、より好ましくは95%以上、さらに好ましくは97%以上、特に好ましくは99%以上の相同性を有するDNA同士がハイブリダイズし、それより相同性が低いDNA同士がハイブリダイズしない条件、あるいは通常のサザンハイブリダイゼーションの洗いの条件である60℃、1×SSC、0.1% SDS、好ましくは60℃、0.1×SSC、0.1% SDS、より好ましくは68℃、0.1×SSC、0.1% SDSに相当する塩濃度および温度で、１回、好ましくは２〜３回洗浄する条件を挙げることができる。
【００５１】
上述の通り、上記ハイブリダイゼーションに用いるプローブは、遺伝子の相補配列の一部であってもよい。そのようなプローブは、公知の遺伝子配列に基づいて作製したオリゴヌクレオチドをプライマーとし、上述の遺伝子を含むDNA断片を鋳型とするPCRによって作製することができる。例えば、プローブとしては、300 bp程度の長さのDNA断片を用いることができる。プローブとして300 bp程度の長さのDNA断片を用いる場合には、ハイブリダイゼーションの洗いの条件としては、50℃、2×SSC、0.1% SDSが挙げられる。
【００５２】
また、DHCR24遺伝子、DHCR7遺伝子、またはSMT1遺伝子は、任意のコドンをそれと等価のコドンに置換したものであってもよい。すなわち、DHCR24遺伝子、DHCR7遺伝子、またはSMT1遺伝子は、遺伝コードの縮重による上記例示したDHCR24遺伝子、DHCR7遺伝子、またはSMT1遺伝子のバリアントであってもよい。
【００５３】
２つの配列間の配列同一性のパーセンテージは、例えば、数学的アルゴリズムを用いて決定できる。このような数学的アルゴリズムの限定されない例としては、Myers and Miller (1988) CABIOS 4:11-17のアルゴリズム、Smith et al (1981) Adv. Appl. Math. 2:482の局所ホモロジーアルゴリズム、Needleman and Wunsch (1970) J. Mol. Biol. 48:443-453のホモロジーアライメントアルゴリズム、Pearson and Lipman (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. 85:2444-2448の類似性を検索する方法、Karlin and Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5877に記載されているような、改良された、Karlin and Altschul (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2264のアルゴリズムが挙げられる。
【００５４】
これらの数学的アルゴリズムに基づくプログラムを利用して、配列同一性を決定するための配列比較（アラインメント）を行うことができる。プログラムは、適宜、コンピュータにより実行することができる。このようなプログラムとしては、特に限定されないが、PC/GeneプログラムのCLUSTAL（Intelligenetics, Mountain View, Calif.から入手可能）、ALIGNプログラム（Version 2.0）、並びにWisconsin Genetics Software Package, Version 8（Genetics Computer Group (GCG), 575 Science Drive, Madison, Wis., USAから入手可能）のGAP、BESTFIT、BLAST、FASTA、及びTFASTAが挙げられる。これらのプログラムを用いたアライメントは、例えば、初期パラメーターを用いて行うことができる。CLUSTALプログラムについては、Higgins et al. (1988) Gene 73:237-244、Higgins et al. (1989) CABIOS 5:151-153、Corpet et al. (1988) Nucleic Acids Res. 16:10881-90、Huang et al. (1992) CABIOS 8:155-65、及びPearson et al. (1994) Meth. Mol. Biol. 24:307-331によく記載されている。
【００５５】
対象のタンパク質をコードするヌクレオチド配列と相同性があるヌクレオチド配列を得るために、具体的には、例えば、BLASTヌクレオチド検索を、BLASTNプログラム、スコア＝100、ワード長＝12にて行うことができる。対象のタンパク質と相同性があるアミノ酸配列を得るために、具体的には、例えば、BLASTタンパク質検索を、BLASTXプログラム、スコア＝50、ワード長＝3にて行うことができる。BLASTヌクレオチド検索やBLASTタンパク質検索については、http://www.ncbi.nlm.nih.govを参照されたい。また、比較を目的としてギャップを加えたアライメントを得るために、Gapped BLAST（BLAST 2.0）を利用できる。また、PSI-BLAST（BLAST 2.0）を、配列間の離間した関係を検出する反復検索を行うのに利用できる。Gapped BLASTおよびPSI-BLASTについては、Altschul et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25:3389を参照されたい。BLAST、Gapped BLAST、またはPSI-BLASTを利用する場合、例えば、各プログラム（例えば、ヌクレオチド配列に対してBLASTN、アミノ酸配列に対してBLASTX）の初期パラメーターが用いられ得る。アライメントは、手動にて行われてもよい。
【００５６】
２つの配列間の配列同一性は、２つの配列を最大一致となるように整列したときに２つの配列間で一致する残基の比率として算出される。なお、アミノ酸配列間の「同一性」とは、具体的には、特記しない限り、blastpによりデフォルト設定のScoring Parameters（Matrix：BLOSUM62；Gap Costs：Existence＝11, Extension＝1；Compositional Adjustments：Conditional compositional score matrix adjustment）を用いて算出されるアミノ酸配列間の同一性を意味してよい。また、塩基配列間の「同一性」とは、具体的には、特記しない限り、blastnによりデフォルト設定のScoring Parameters（Match/Mismatch Scores＝1,-2；Gap Costs＝Linear）を用いて算出される塩基配列間の同一性を意味してよい。
【００５７】
なお、上記の遺伝子やタンパク質のバリアントに関する記載は、任意のタンパク質およびそれらをコードする遺伝子にも準用できる。
【００５８】
＜１−４＞その他の改変
本発明の微生物は、ステロール生産能が損なわれない限り、さらに、その他の改変を有していてもよい。その他の改変としては、ステロール生産能が増強される改変が挙げられる。その他の改変として、具体的には、ステロールＣ−２２デサチュラーゼ（sterol C-22 desaturase）の活性の低下、DHCR24の活性の増大、およびDHCR7の活性の増大が挙げられる。これらの改変により、ステロール生産能が増強され得る。これらの改変は、製造するステロールの種類等の諸条件に応じて適宜選択できる。これらの改変は、単独で、あるいは適宜組み合わせて、利用することができる。すなわち、本発明の微生物は、これらの改変から選択される１つまたはそれ以上の改変を有していてよい。
【００５９】
これらの改変は、いずれも、例えば、SMT1活性の低下と組み合わせて利用することができる。すなわち、本発明の微生物は、例えば、SMT1の活性が低下するように改変されており、さらに、これらの改変から選択される１つまたはそれ以上の改変を有していてよい。ただし、本発明の微生物がSMT1とDHCR7の活性が低下するように改変されている場合、その他の改変としてDHCR7の活性の増大は選択しないものとする。
【００６０】
このように、本発明の微生物は、sterol C-22 desaturaseの活性が低下するよう改変されていてよい。本発明の微生物は、具体的には、sterol C-22 desaturaseの活性が非改変株と比較して低下するよう改変されていてよい。sterol C-22 desaturaseの活性低下により、例えば、コレステロール等の動物ステロールの生産が増大してよい。sterol C-22 desaturaseの活性低下により、具体的には、例えば、動物ステロールからのＣ２２不飽和ステロール（Ｃ２２位に二重結合を有するステロール）の副生が低減され、以て動物ステロールの生産が増大してもよい。
【００６１】
また、本発明の微生物は、DHCR24の活性が増大するよう改変されていてよい。本発明の微生物は、具体的には、DHCR24の活性が非改変株と比較して増大するよう改変されていてよい。DHCR24の活性増大により、例えば、コレステロール、ラソステロール、７−デヒドロコレステロール等の一部の動物ステロールの生産が増大してよい。
【００６２】
また、本発明の微生物は、DHCR7の活性が増大するよう改変されていてよい。本発明の微生物は、具体的には、DHCR7の活性が非改変株と比較して増大するよう改変されていてよい。DHCR7の活性増大により、例えば、コレステロールの生産が増大してよい。
【００６３】
「ステロールＣ−２２デサチュラーゼ（sterol C-22 desaturase）」とは、ステロールのＣ２２位に二重結合（Ｃ２２−Ｃ２３二重結合）を導入する反応を触媒する活性を有するタンパク質（酵素）をいう（EC 1.14.19.41）。同活性を、「ステロールＣ−２２デサチュラーゼ活性（sterol C-22 desaturase活性）」ともいう。また、sterol C-22 desaturaseをコードする遺伝子を「ステロールＣ−２２デサチュラーゼ遺伝子（sterol C-22 desaturase遺伝子）」ともいう。ここでいう「Ｃ２２位」とは、ザイモステロール（zymosterol）のＣ２２位に相当する炭素を意味する。
【００６４】
sterol C-22 desaturase活性は、例えば、電子供与体と酸素の存在下で酵素を基質（Ｃ２２位に二重結合を有さないステロール）とインキュベートし、酵素および基質依存的な産物（Ｃ２２位に二重結合が導入されたステロール）の生成を測定することにより、測定できる。電子供与体としては、例えば、NADPHが挙げられる。基質および産物としては、例えば、それぞれ、エルゴスタ−５，７，２４（２８）−トリエン−３−ベータ−オール（ergosta-5,7,24(28)-trien-3-beta-ol）およびエルゴスタ−５，７，２２，２４（２８）−テトラエン−３−ベータ−オール（ergosta-5,7,22,24(28)-tetraen-3-beta-ol）が挙げられる。sterol C-22 desaturase活性は、具体的には、例えば、既報（Morikawa T et al. Cytochrome P450 CYP710A encodes the sterol C-22 desaturase in Arabidopsis and tomato. Plant Cell. 2006 Apr;18(4):1008-22.）の手順に従って測定できる。
【００６５】
ラビリンチュラ類微生物が有するsterol C-22 desaturase遺伝子およびsterol C-22 desaturaseの塩基配列およびアミノ酸配列は、例えば、NCBI（National Center for Biotechnology Information）等の公開データベースから取得できる。Aurantiochytrium sp.1 AJ7869株のsterol C-22 desaturase遺伝子（cyp710a遺伝子）の塩基配列、及び同遺伝子がコードするsterol C-22 desaturase（CYP710A）のアミノ酸配列を、それぞれ配列番号４１および４２に示す。すなわち、sterol C-22 desaturase遺伝子は、例えば、配列番号４１に示す塩基配列を有する遺伝子であってよい。また、sterol C-22 desaturaseは、例えば、配列番号４２に示すアミノ酸配列を有するタンパク質であってよい。
【００６６】
sterol C-22 desaturase遺伝子およびsterol C-22 desaturaseは、それぞれ、上記例示したsterol C-22 desaturase遺伝子およびsterol C-22 desaturaseの保存的バリアント（例えば、配列番号４１に示す塩基配列および配列番号４２に示すアミノ酸配列を有する遺伝子およびタンパク質の保存的バリアント）であってもよい。sterol C-22 desaturase遺伝子およびsterol C-22 desaturaseの保存的バリアントについては、SMT1遺伝子およびSMT1等の保存的バリアントについての記載を準用できる。sterol C-22 desaturaseについての「元の機能が維持されている」とは、タンパク質のバリアントがsterol C-22 desaturase活性を有することをいう。sterol C-22 desaturase遺伝子は、例えば、元の機能が維持されている限り、上記例示したアミノ酸配列において、１若しくは数個の位置での１又は数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする遺伝子であってもよい。また、sterol C-22 desaturase遺伝子は、例えば、元の機能が維持されている限り、上記例示したアミノ酸配列全体に対して、例えば、50%以上、65%以上、80%以上、好ましくは90%以上、より好ましくは95%以上、さらに好ましくは97%以上、特に好ましくは99%以上の相同性を有するアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする遺伝子であってもよい。
【００６７】
DHCR24およびDHCR7については上述した通りである。活性を増大させるDHCR24およびDHCR7は、いずれも、改変されるラビリンチュラ類微生物が有するものに限られず、任意のものを利用することができる。
【００６８】
＜１−５＞タンパク質の活性を低下させる手法
以下に、DHCR24、DHCR7、SMT1、sterol C-22 desaturase等のタンパク質の活性を低下させる手法について説明する。
【００６９】
「タンパク質の活性が低下する」とは、同タンパク質の活性が非改変株と比較して低下することを意味する。「タンパク質の活性が低下する」とは、具体的には、同タンパク質の細胞当たりの活性が非改変株と比較して低下することを意味する。ここでいう「非改変株」とは、標的のタンパク質の活性が低下するように改変されていない対照株を意味する。非改変株としては、野生株や親株が挙げられる。非改変株として、具体的には、ラビリンチュラ類微生物の説明において例示した菌株が挙げられる。すなわち、一態様において、タンパク質の活性は、Aurantiochytrium sp.1 AJ7869株と比較して低下してよい。また、別の態様において、タンパク質の活性は、Aurantiochytrium sp.1 AJ7868株と比較して低下してもよい。また、別の態様において、タンパク質の活性は、Aurantiochytrium sp.1 AJ7879株と比較して低下してもよい。なお、「タンパク質の活性が低下する」ことには、同タンパク質の活性が完全に消失している場合も包含される。「タンパク質の活性が低下する」とは、より具体的には、非改変株と比較して、同タンパク質の細胞当たりの分子数が低下していること、および／または、同タンパク質の分子当たりの機能が低下していることを意味してよい。すなわち、「タンパク質の活性が低下する」という場合の「活性」とは、タンパク質の触媒活性に限られず、タンパク質をコードする遺伝子の転写量（ｍＲＮＡ量）または翻訳量（タンパク質の量）を意味してもよい。なお、「タンパク質の細胞当たりの分子数が低下している」ことには、同タンパク質が全く存在していない場合も包含される。また、「タンパク質の分子当たりの機能が低下している」ことには、同タンパク質の分子当たりの機能が完全に消失している場合も包含される。タンパク質の活性の低下の程度は、タンパク質の活性が非改変株と比較して低下していれば特に制限されない。タンパク質の活性は、例えば、非改変株の、５０％以下、２０％以下、１０％以下、５％以下、または０％に低下してよい。
【００７０】
タンパク質の活性が低下するような改変は、例えば、同タンパク質をコードする遺伝子の発現を低下させることにより達成できる。「遺伝子の発現が低下する」とは、同遺伝子の発現が非改変株と比較して低下することを意味する。「遺伝子の発現が低下する」とは、具体的には、同遺伝子の細胞当たりの発現量が非改変株と比較して低下することを意味する。「遺伝子の発現が低下する」とは、より具体的には、遺伝子の転写量（ｍＲＮＡ量）が低下すること、および／または、遺伝子の翻訳量（タンパク質の量）が低下することを意味してよい。「遺伝子の発現が低下する」ことには、同遺伝子が全く発現していない場合も包含される。なお、「遺伝子の発現が低下する」ことを、「遺伝子の発現が弱化される」ともいう。遺伝子の発現は、例えば、非改変株の、５０％以下、２０％以下、１０％以下、５％以下、または０％に低下してよい。
【００７１】
遺伝子の発現の低下は、例えば、転写効率の低下によるものであってもよく、翻訳効率の低下によるものであってもよく、それらの組み合わせによるものであってもよい。遺伝子の発現の低下は、例えば、遺伝子の発現調節配列を改変することにより達成できる。「発現調節配列」とは、プロモーター等の、遺伝子の発現に影響する部位の総称である。発現調節配列は、例えば、プロモーター検索ベクターやＧＥＮＥＴＹＸ等の遺伝子解析ソフトを用いて決定することができる。発現調節配列を改変する場合には、発現調節配列は、好ましくは１塩基以上、より好ましくは２塩基以上、特に好ましくは３塩基以上が改変される。遺伝子の転写効率の低下は、例えば、染色体上の遺伝子のプロモーターをより弱いプロモーターに置換することにより達成できる。「より弱いプロモーター」とは、遺伝子の転写が、もともと存在している野生型のプロモーターよりも弱化するプロモーターを意味する。より弱いプロモーターとしては、例えば、誘導型のプロモーターが挙げられる。すなわち、誘導型のプロモーターは、非誘導条件下（例えば、誘導物質の非存在下）でより弱いプロモーターとして機能し得る。また、発現調節配列の一部または全部の領域を欠失（欠損）させてもよい。また、遺伝子の発現の低下は、例えば、発現制御に関わる因子を操作することによっても達成できる。発現制御に関わる因子としては、転写や翻訳制御に関わる低分子（誘導物質、阻害物質など）、タンパク質（転写因子など）、核酸（siRNAなど）等が挙げられる。また、遺伝子の発現の低下は、例えば、遺伝子のコード領域に遺伝子の発現が低下するような変異を導入することによっても達成できる。例えば、遺伝子のコード領域のコドンを、宿主においてより低頻度で利用される同義コドンに置き換えることによって、遺伝子の発現を低下させることができる。また、例えば、後述するような遺伝子の破壊により、遺伝子の発現自体が低下し得る。
【００７２】
また、タンパク質の活性が低下するような改変は、例えば、同タンパク質をコードする遺伝子を破壊することにより達成できる。「遺伝子が破壊される」とは、正常に機能するタンパク質を産生しないように同遺伝子が改変されることを意味する。「正常に機能するタンパク質を産生しない」ことには、同遺伝子からタンパク質が全く産生されない場合や、同遺伝子から分子当たりの機能（活性や性質）が低下又は消失したタンパク質が産生される場合が包含される。
【００７３】
遺伝子の破壊は、例えば、染色体上の遺伝子を欠失（欠損）させることにより達成できる。「遺伝子の欠失」とは、遺伝子のコード領域の一部又は全部の領域の欠失をいう。さらには、染色体上の遺伝子のコード領域の前後の配列を含めて、遺伝子全体を欠失させてもよい。遺伝子のコード領域の前後の配列には、例えば、遺伝子の発現調節配列が含まれてよい。タンパク質の活性の低下が達成できる限り、欠失させる領域は、Ｎ末端領域（タンパク質のＮ末端側をコードする領域）、内部領域、Ｃ末端領域（タンパク質のＣ末端側をコードする領域）等のいずれの領域であってもよい。通常、欠失させる領域は長い方が確実に遺伝子を不活化することができる。欠失させる領域は、例えば、遺伝子のコード領域全長の１０％以上、２０％以上、３０％以上、４０％以上、５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上、または９５％以上の長さの領域であってよい。また、欠失させる領域の前後の配列は、リーディングフレームが一致しないことが好ましい。リーディングフレームの不一致により、欠失させる領域の下流でフレームシフトが生じ得る。
【００７４】
また、遺伝子の破壊は、例えば、染色体上の遺伝子のコード領域にアミノ酸置換（ミスセンス変異）を導入すること、終止コドン（ナンセンス変異）を導入すること、または１〜２塩基の付加または欠失（フレームシフト変異）を導入すること等によっても達成できる（Journal of Biological Chemistry 272:8611-8617(1997), Proceedings of the National Academy of Sciences, USA 95 5511-5515(1998), Journal of Biological Chemistry 26 116, 20833-20839(1991)）。
【００７５】
また、遺伝子の破壊は、例えば、染色体上の遺伝子のコード領域に他の塩基配列を挿入することによっても達成できる。挿入部位は遺伝子のいずれの領域であってもよいが、挿入する塩基配列は長い方が確実に遺伝子を不活化することができる。また、挿入部位の前後の配列は、リーディングフレームが一致しないことが好ましい。リーディングフレームの不一致により、挿入部位の下流でフレームシフトが生じ得る。他の塩基配列としては、コードされるタンパク質の活性を低下又は消失させるものであれば特に制限されないが、例えば、抗生物質耐性遺伝子等のマーカー遺伝子や目的物質の生産に有用な遺伝子が挙げられる。
【００７６】
遺伝子の破壊は、特に、コードされるタンパク質のアミノ酸配列が欠失（欠損）するように実施してよい。言い換えると、タンパク質の活性が低下するような改変は、例えば、タンパク質のアミノ酸配列（アミノ酸配列の一部または全部の領域）を欠失させることにより、具体的には、アミノ酸配列（アミノ酸配列の一部または全部の領域）を欠失したタンパク質をコードするように遺伝子を改変することにより、達成できる。なお、「タンパク質のアミノ酸配列の欠失」とは、タンパク質のアミノ酸配列の一部または全部の領域の欠失をいう。また、「タンパク質のアミノ酸配列の欠失」とは、タンパク質において元のアミノ酸配列が存在しなくなることをいい、元のアミノ酸配列が別のアミノ酸配列に変化する場合も包含される。すなわち、例えば、フレームシフトにより別のアミノ酸配列に変化した領域は、欠失した領域とみなしてよい。タンパク質のアミノ酸配列の欠失により、典型的にはタンパク質の全長が短縮されるが、タンパク質の全長が変化しないか、あるいは延長される場合もあり得る。例えば、遺伝子のコード領域の一部又は全部の領域の欠失により、コードされるタンパク質のアミノ酸配列において、当該欠失した領域がコードする領域を欠失させることができる。また、例えば、遺伝子のコード領域への終止コドンの導入により、コードされるタンパク質のアミノ酸配列において、当該導入部位より下流の領域がコードする領域を欠失させることができる。また、例えば、遺伝子のコード領域におけるフレームシフトにより、当該フレームシフト部位がコードする領域を欠失させることができる。アミノ酸配列の欠失における欠失させる領域の位置および長さについては、遺伝子の欠失における欠失させる領域の位置および長さの説明を準用できる。
【００７７】
染色体上の遺伝子を上記のように改変することは、例えば、正常に機能するタンパク質を産生しないように改変した破壊型遺伝子を作製し、該破壊型遺伝子を含む組換えＤＮＡで宿主を形質転換して、破壊型遺伝子と染色体上の野生型遺伝子とで相同組換えを起こさせることにより、染色体上の野生型遺伝子を破壊型遺伝子に置換することによって達成できる。その際、組換えＤＮＡには、宿主の栄養要求性等の形質にしたがって、マーカー遺伝子を含ませておくと操作がしやすい。破壊型遺伝子としては、遺伝子のコード領域の一部又は全部の領域を欠失した遺伝子、ミスセンス変異を導入した遺伝子、ナンセンス変異を導入した遺伝子、フレームシフト変異を導入した遺伝子、トランスポゾンやマーカー遺伝子等の挿入配列を挿入した遺伝子が挙げられる。破壊型遺伝子によってコードされるタンパク質は、生成したとしても、野生型タンパク質とは異なる立体構造を有し、機能が低下又は消失する。相同組換えに用いる組換えＤＮＡの構造は、所望の態様で相同組換えが起こるものであれば特に制限されない。例えば、破壊型遺伝子を含む線状ＤＮＡであって、両端に染色体上の野生型遺伝子の上流および下流の配列をそれぞれ備える線状ＤＮＡで宿主を形質転換して、野生型遺伝子の上流および下流でそれぞれ相同組換えを起こさせることにより、野生型遺伝子を破壊型遺伝子に置換することができる。なお、このような相同組み換えを利用した染色体の改変手法は、標的遺伝子の破壊に限られず、発現調節配列の改変等の、染色体の任意の改変に利用できる。
【００７８】
なお、宿主が標的タンパク質をコードする遺伝子を２コピーまたはそれ以上有する場合、所望の程度に当該タンパク質の活性が低下する限り、それら２コピーまたはそれ以上の遺伝子の全てを改変（破壊等）してもよく、それら２コピーまたはそれ以上の遺伝子の一部のみを改変（破壊等）してもよい。
【００７９】
また、タンパク質の活性が低下するような改変は、例えば、突然変異処理により行ってもよい。突然変異処理としては、Ｘ線の照射、紫外線の照射、ならびにＮ−メチル−Ｎ'−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン（ＭＮＮＧ）、エチルメタンスルフォネート（ＥＭＳ）、およびメチルメタンスルフォネート（ＭＭＳ）等の変異剤による処理が挙げられる。
【００８０】
上記のようなタンパク質の活性を低下させる手法は、単独で用いてもよく、任意の組み合わせで用いてもよい。
【００８１】
タンパク質の活性が低下したことは、同タンパク質の活性を測定することで確認できる。
【００８２】
タンパク質の活性が低下したことは、同タンパク質をコードする遺伝子の発現が低下したことを確認することによっても、確認できる。遺伝子の発現が低下したことは、同遺伝子の転写量が低下したことを確認することや、同遺伝子から発現するタンパク質の量が低下したことを確認することにより確認できる。
【００８３】
遺伝子の転写量が低下したことの確認は、同遺伝子から転写されるmRNAの量を非改変株と比較することによって行うことができる。mRNAの量を評価する方法としては、ノーザンハイブリダイゼーション、RT−PCR、マイクロアレイ、RNA-seq等が挙げられる（Molecular cloning（Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor (USA), 2001））。mRNAの量（例えば、細胞当たりの分子数）は、例えば、非改変株の、５０％以下、２０％以下、１０％以下、５％以下、または０％に低下してよい。
【００８４】
タンパク質の量が低下したことの確認は、SDS-PAGEを行い、分離されたタンパク質バンドの強度を確認することによって行うことができる。また、タンパク質の量が低下したことの確認は、抗体を用いてウェスタンブロットによって行うことができる（Molecular cloning（Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor (USA), 2001））。タンパク質の量（例えば、細胞当たりの分子数）は、例えば、非改変株の、５０％以下、２０％以下、１０％以下、５％以下、または０％に低下してよい。
【００８５】
遺伝子が破壊されたことは、破壊に用いた手段に応じて、同遺伝子の一部または全部の塩基配列、制限酵素地図、または全長等を決定することで確認できる。
【００８６】
形質転換は、例えば、ラビリンチュラ類微生物の形質転換に通常用いられる手法により行うことができる。そのような手法としては、エレクトロポレーション法が挙げられる。
【００８７】
上記したタンパク質の活性を低下させる手法は、任意のタンパク質の活性低下や任意の遺伝子の発現低下に利用できる。
【００８８】
＜１−６＞タンパク質の活性を増大させる手法
以下に、DHCR24やDHCR7等のタンパク質の活性を増大させる手法について説明する。
【００８９】
「タンパク質の活性が増大する」とは、同タンパク質の活性が非改変株と比較して増大することを意味する。「タンパク質の活性が増大する」とは、具体的には、同タンパク質の細胞当たりの活性が非改変株に対して増大していることを意味する。ここでいう「非改変株」とは、標的のタンパク質の活性が増大するように改変されていない対照株を意味する。非改変株としては、野生株や親株が挙げられる。非改変株として、具体的には、ラビリンチュラ類微生物の説明において例示した菌株が挙げられる。すなわち、一態様において、タンパク質の活性は、Aurantiochytrium sp.1 AJ7869株と比較して増大してよい。また、別の態様において、タンパク質の活性は、Aurantiochytrium sp.1 AJ7868株と比較して増大してもよい。また、別の態様において、タンパク質の活性は、Aurantiochytrium sp.1 AJ7879株と比較して増大してもよい。なお、「タンパク質の活性が増大する」ことを、「タンパク質の活性が増強される」ともいう。「タンパク質の活性が増大する」とは、より具体的には、非改変株と比較して、同タンパク質の細胞当たりの分子数が増加していること、および／または、同タンパク質の分子当たりの機能が増大していることを意味してよい。すなわち、「タンパク質の活性が増大する」という場合の「活性」とは、タンパク質の触媒活性に限られず、タンパク質をコードする遺伝子の転写量（ｍＲＮＡ量）または翻訳量（タンパク質の量）を意味してもよい。また、「タンパク質の活性が増大する」ことには、もともと標的のタンパク質の活性を有する菌株において同タンパク質の活性を増大させることだけでなく、もともと標的のタンパク質の活性が存在しない菌株に同タンパク質の活性を付与することも包含される。また、結果としてタンパク質の活性が増大する限り、宿主が本来有する標的のタンパク質の活性を低下または消失させた上で、好適な標的のタンパク質の活性を付与してもよい。
【００９０】
タンパク質の活性の増大の程度は、タンパク質の活性が非改変株と比較して増大していれば特に制限されない。タンパク質の活性は、例えば、非改変株の、１．５倍以上、２倍以上、または３倍以上に上昇してよい。また、非改変株が標的のタンパク質の活性を有していない場合は、同タンパク質をコードする遺伝子を導入することにより同タンパク質が生成されていればよいが、例えば、同タンパク質はその活性が測定できる程度に生産されていてよい。
【００９１】
タンパク質の活性が増大するような改変は、例えば、同タンパク質をコードする遺伝子の発現を上昇させることによって達成できる。「遺伝子の発現が上昇する」とは、同遺伝子の発現が野生株や親株等の非改変株と比較して増大することを意味する。「遺伝子の発現が上昇する」とは、具体的には、同遺伝子の細胞当たりの発現量が非改変株と比較して増大することを意味する。「遺伝子の発現が上昇する」とは、より具体的には、遺伝子の転写量（ｍＲＮＡ量）が増大すること、および／または、遺伝子の翻訳量（タンパク質の量）が増大することを意味してよい。なお、「遺伝子の発現が上昇する」ことを、「遺伝子の発現が増強される」ともいう。遺伝子の発現は、例えば、非改変株の、１．５倍以上、２倍以上、または３倍以上に上昇してよい。また、「遺伝子の発現が上昇する」ことには、もともと標的の遺伝子が発現している菌株において同遺伝子の発現量を上昇させることだけでなく、もともと標的の遺伝子が発現していない菌株において、同遺伝子を発現させることも包含される。すなわち、「遺伝子の発現が上昇する」とは、例えば、標的の遺伝子を保持しない菌株に同遺伝子を導入し、同遺伝子を発現させることを意味してもよい。
【００９２】
遺伝子の発現の上昇は、例えば、遺伝子のコピー数を増加させることにより達成できる。
【００９３】
遺伝子のコピー数の増加は、宿主の染色体へ同遺伝子を導入することにより達成できる。染色体への遺伝子の導入は、例えば、相同組み換えを利用して行うことができる。具体的には、標的遺伝子を含む組換えＤＮＡで宿主を形質転換し、宿主の染色体上の標的部位と相同組み換えを起こすことにより、該遺伝子を宿主の染色体上に導入することができる。相同組換えに用いる組換えＤＮＡの構造は、所望の態様で相同組換えが起こるものであれば特に制限されない。例えば、標的遺伝子を含む線状ＤＮＡであって、該遺伝子の両端に染色体上の標的部位の上流および下流に相同な塩基配列をそれぞれ備える線状ＤＮＡで宿主を形質転換して、標的部位の上流および下流でそれぞれ相同組換えを起こさせることにより、標的部位を該遺伝子に置換することができる。相同組換えに用いる組換えＤＮＡは、形質転換体を選択するためのマーカー遺伝子を備えていてよい。マーカー遺伝子としては、ハイグロマイシン耐性遺伝子（HygR）、ネオマイシン耐性遺伝子（NeoR）、ブラストサイジン耐性遺伝子（BlaR）等の抗生物質耐性遺伝子が挙げられる。遺伝子は、１コピーのみ導入されてもよく、２コピーまたはそれ以上導入されてもよい。例えば、染色体上に多数のコピーが存在する塩基配列を標的として相同組み換えを行うことで、染色体へ遺伝子の多数のコピーを導入することができる。なお、このような相同組み換えを利用した染色体の改変手法は、標的遺伝子の導入に限られず、発現調節配列の改変等の、染色体の任意の改変に利用できる。
【００９４】
染色体上に標的遺伝子が導入されたことの確認は、同遺伝子の全部又は一部と相補的な配列を持つプローブを用いたサザンハイブリダイゼーション、又は同遺伝子の配列に基づいて作成したプライマーを用いたPCR等によって確認できる。
【００９５】
また、遺伝子のコピー数の増加は、同遺伝子を含むベクターを宿主に導入することによっても達成できる。例えば、標的遺伝子を含むＤＮＡ断片を、宿主で機能するベクターと連結して同遺伝子の発現ベクターを構築し、当該発現ベクターで宿主を形質転換することにより、同遺伝子のコピー数を増加させることができる。標的遺伝子を含むＤＮＡ断片は、例えば、標的遺伝子を有する微生物のゲノムＤＮＡを鋳型とするＰＣＲにより取得できる。ベクターとしては、宿主の細胞内において自律複製可能なベクターを用いることができる。ベクターは、シングルコピーベクターであってもよく、マルチコピーベクターであってもよい。ベクターは、形質転換体を選択するためのマーカー遺伝子を備えていてよい。
【００９６】
遺伝子を導入する場合、遺伝子は、発現可能に宿主に保持されていればよい。具体的には、遺伝子は、宿主で機能するプロモーターによる制御を受けて発現するように保持されていればよい。プロモーターは、宿主において機能するものであれば特に制限されない。「宿主において機能するプロモーター」とは、宿主においてプロモーター活性を有するプロモーターをいう。プロモーターは、宿主由来のプロモーターであってもよく、異種由来のプロモーターであってもよい。プロモーターは、導入する遺伝子の固有のプロモーターであってもよく、他の遺伝子のプロモーターであってもよい。プロモーターとして、具体的には、例えば、アクチン遺伝子プロモーター、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子プロモーター、ピルビン酸キナーゼ遺伝子プロモーター、伸長因子１α（EF1α）遺伝子プロモーター、ユビキチンプロモーター（UbiP）、シミアンウィルス４０プロモーター（SV40P）、チューブリン遺伝子プロモーター、ウィルス前初期遺伝子プロモーター（Smp1P）が挙げられる（特開2018-064551、特開2006-304686、WO2016/056610、WO02/083869）。また、プロモーターとしては、例えば、後述するような、より強力なプロモーターを利用してもよい。
【００９７】
遺伝子の下流には、転写終結用のターミネーターを配置することができる。ターミネーターは、宿主において機能するものであれば特に制限されない。ターミネーターは、宿主由来のターミネーターであってもよく、異種由来のターミネーターであってもよい。ターミネーターは、導入する遺伝子の固有のターミネーターであってもよく、他の遺伝子のターミネーターであってもよい。ターミネーターとして、具体的には、例えば、アクチン遺伝子ターミネーター、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子ターミネーター、ピルビン酸キナーゼ遺伝子ターミネーター、伸長因子１α（EF1α）遺伝子ターミネーター、ユビキチンターミネーター（UbiT）、シミアンウィルス４０ターミネーター（SV40T）が挙げられる（特開2018-064551、特開2006-304686、WO2016/056610）。
【００９８】
各種微生物において利用可能なベクター、プロモーター、ターミネーターに関しては、例えば「微生物学基礎講座８  遺伝子工学、共立出版、1987年」に詳細に記載されており、それらを利用することが可能である。
【００９９】
また、２またはそれ以上の遺伝子を導入する場合、各遺伝子が、発現可能に宿主に保持されていればよい。例えば、各遺伝子は、全てが単一の発現ベクター上に保持されていてもよく、全てが染色体上に保持されていてもよい。また、各遺伝子は、複数の発現ベクター上に別々に保持されていてもよく、単一または複数の発現ベクター上と染色体上とに別々に保持されていてもよい。また、２またはそれ以上の遺伝子でオペロンを構成して導入してもよい。
【０１００】
導入される遺伝子は、宿主で機能するタンパク質をコードするものであれば特に制限されない。導入される遺伝子は、宿主由来の遺伝子であってもよく、異種由来の遺伝子であってもよい。導入される遺伝子は、例えば、同遺伝子の塩基配列に基づいて設計したプライマーを用い、同遺伝子を有する生物のゲノムDNAや同遺伝子を搭載するプラスミド等を鋳型として、PCRにより取得することができる。また、導入される遺伝子は、例えば、同遺伝子の塩基配列に基づいて全合成してもよい（Gene, 60(1), 115-127 (1987)）。取得した遺伝子は、そのまま、あるいは適宜改変して、利用することができる。すなわち、遺伝子を改変することにより、そのバリアントを取得することができる。遺伝子の改変は公知の手法により行うことができる。例えば、部位特異的変異法により、DNAの目的部位に目的の変異を導入することができる。すなわち、例えば、部位特異的変異法により、コードされるタンパク質が特定の部位においてアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、および／または付加を含むように、遺伝子のコード領域を改変することができる。部位特異的変異法としては、PCRを用いる方法（Higuchi, R., 61, in PCR technology, Erlich, H. A. Eds., Stockton press (1989)；Carter, P., Meth. in Enzymol., 154, 382 (1987)）や、ファージを用いる方法（Kramer,W. and Frits, H. J., Meth. in Enzymol., 154, 350 (1987)；Kunkel, T. A. et al., Meth. in Enzymol., 154, 367 (1987)）が挙げられる。あるいは、遺伝子のバリアントを全合成してもよい。
【０１０１】
また、遺伝子の発現の上昇は、遺伝子の転写効率を向上させることにより達成できる。また、遺伝子の発現の上昇は、遺伝子の翻訳効率を向上させることにより達成できる。遺伝子の転写効率や翻訳効率の向上は、例えば、発現調節配列の改変により達成できる。「発現調節配列」とは、プロモーター等の、遺伝子の発現に影響する部位の総称である。発現調節配列は、例えば、プロモーター検索ベクターやＧＥＮＥＴＹＸ等の遺伝子解析ソフトを用いて決定することができる。
【０１０２】
遺伝子の転写効率の向上は、例えば、染色体上の遺伝子のプロモーターをより強力なプロモーターに置換することにより達成できる。「より強力なプロモーター」とは、遺伝子の転写が、もともと存在している野生型のプロモーターよりも向上するプロモーターを意味する。より強力なプロモーターとしては、例えば、天然の高発現プロモーターを用いることができる。また、より強力なプロモーターとしては、例えば、在来のプロモーターの高活性型のものを取得して用いてもよい。在来のプロモーターの高活性型のものは、例えば、各種レポーター遺伝子を用いることにより取得することができる。
【０１０３】
遺伝子の翻訳効率の向上は、例えば、コドンの改変によっても達成できる。例えば、遺伝子中に存在するレアコドンを、より高頻度で利用される同義コドンに置き換えることにより、遺伝子の翻訳効率を向上させることができる。すなわち、導入される遺伝子は、例えば、使用する宿主のコドン使用頻度に応じて最適なコドンを有するように改変されてよい。コドンの置換は、例えば、部位特異的変異法により行うことができる。また、コドンが置換された遺伝子断片を全合成してもよい。種々の生物におけるコドンの使用頻度は、「コドン使用データベース」（http://www.kazusa.or.jp/codon; Nakamura, Y. et al, Nucl. Acids Res., 28, 292 (2000)）に開示されている。
【０１０４】
また、遺伝子の発現の上昇は、遺伝子の発現を上昇させるようなレギュレーターを増幅すること、または、遺伝子の発現を低下させるようなレギュレーターを欠失または弱化させることによっても達成できる。
【０１０５】
上記のような遺伝子の発現を上昇させる手法は、単独で用いてもよく、任意の組み合わせで用いてもよい。
【０１０６】
また、タンパク質の活性が増大するような改変は、例えば、タンパク質の比活性を増強することによっても達成できる。比活性が増強されたタンパク質は、例えば、種々の生物を探索し取得することができる。また、在来のタンパク質に変異を導入することで高活性型のものを取得してもよい。導入される変異は、例えば、タンパク質の１若しくは数個の位置での１又は数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、又は付加されるものであってよい。変異の導入は、例えば、上述したような部位特異的変異法により行うことができる。また、変異の導入は、例えば、突然変異処理により行ってもよい。突然変異処理としては、Ｘ線の照射、紫外線の照射、ならびにＮ−メチル−Ｎ'−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン（ＭＮＮＧ）、エチルメタンスルフォネート（ＥＭＳ）、およびメチルメタンスルフォネート（ＭＭＳ）等の変異剤による処理が挙げられる。また、in vitroでDNAを直接ヒドロキシルアミンで処理し、ランダム変異を誘発してもよい。比活性の増強は、単独で用いてもよく、上記のような遺伝子の発現を増強する手法と任意に組み合わせて用いてもよい。
【０１０７】
形質転換は、例えば、ラビリンチュラ類微生物の形質転換に通常用いられる手法により行うことができる。そのような手法としては、エレクトロポレーション法が挙げられる。
【０１０８】
タンパク質の活性が増大したことは、同タンパク質の活性を測定することで確認できる。
【０１０９】
タンパク質の活性が増大したことは、同タンパク質をコードする遺伝子の発現が上昇したことを確認することによっても、確認できる。遺伝子の発現が上昇したことは、同遺伝子の転写量が上昇したことを確認することや、同遺伝子から発現するタンパク質の量が上昇したことを確認することにより確認できる。
【０１１０】
遺伝子の転写量が上昇したことの確認は、同遺伝子から転写されるmRNAの量を野生株または親株等の非改変株と比較することによって行うことができる。mRNAの量を評価する方法としてはノーザンハイブリダイゼーション、RT-PCR、マイクロアレイ、RNA-seq等が挙げられる（Sambrook, J., et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual/Third Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor (USA), 2001）。mRNAの量（例えば、細胞当たりの分子数）は、例えば、非改変株の、１．５倍以上、２倍以上、または３倍以上に上昇してよい。
【０１１１】
タンパク質の量が上昇したことの確認は、抗体を用いてウェスタンブロットによって行うことができる（Molecular Cloning（Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor (USA), 2001））。タンパク質の量（例えば、細胞当たりの分子数）は、例えば、非改変株の、１．５倍以上、２倍以上、または３倍以上に上昇してよい。
【０１１２】
上記したタンパク質の活性を増大させる手法は、任意のタンパク質の活性増強や任意の遺伝子の発現増強に利用できる。
【０１１３】
＜２＞ステロールの製造法
本発明の方法は、本発明の微生物を培地で培養すること、および前記培養により生成した菌体からステロールを回収すること、を含む、ステロールの製造方法である。本発明の方法においては、１種のステロールが製造されてもよく、２種またはそれ以上のステロールが製造されてもよい。本発明の微生物が有する改変と製造されるステロールの組み合わせの例は、ステロール生産能の説明において上述した通りである。
【０１１４】
使用する培地は、本発明の微生物が増殖でき、ステロールが生産される限り、特に制限されない。培地としては、例えば、ラビリンチュラ類等の従属栄養微生物の培養に用いられる通常の培地を用いることができる。培地は、炭素源、窒素源、リン酸源、硫黄源、その他の各種有機成分や無機成分から選択される成分を必要に応じて含有してよい。培地として、具体的には、例えば、0〜1×人工海水で調製したGY培地が挙げられる。
【０１１５】
炭素源として、具体的には、例えば、グルコース、フルクトース、スクロース、ラクトース、ガラクトース、キシロース、アラビノース、廃糖蜜、澱粉加水分解物、バイオマスの加水分解物等の糖類、酢酸やクエン酸等の有機酸類、エタノール、グリセロール、粗グリセロール等のアルコール類、脂肪酸類が挙げられる。炭素源としては、１種の炭素源を用いてもよく、２種またはそれ以上の炭素源を組み合わせて用いてもよい。
【０１１６】
窒素源として、具体的には、例えば、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム等のアンモニウム塩、ペプトン、酵母エキス、肉エキス、大豆タンパク質分解物等の有機窒素源、アンモニア、ウレアが挙げられる。pH調整に用いられるアンモニアガスやアンモニア水を窒素源として利用してもよい。窒素源としては、１種の窒素源を用いてもよく、２種またはそれ以上の窒素源を組み合わせて用いてもよい。
【０１１７】
リン酸源として、具体的には、例えば、リン酸２水素カリウム、リン酸水素２カリウム等のリン酸塩、ピロリン酸等のリン酸ポリマーが挙げられる。リン酸源としては、１種のリン酸源を用いてもよく、２種またはそれ以上のリン酸源を組み合わせて用いてもよい。
【０１１８】
硫黄源として、具体的には、例えば、硫酸塩、チオ硫酸塩、亜硫酸塩等の無機硫黄化合物、システイン、シスチン、グルタチオン等の含硫アミノ酸が挙げられる。硫黄源としては、１種の硫黄源を用いてもよく、２種またはそれ以上の硫黄源を組み合わせて用いてもよい。
【０１１９】
その他の各種有機成分や無機成分として、具体的には、例えば、塩化ナトリウム、塩化カリウム等の無機塩類；鉄、マンガン、マグネシウム、カルシウム等の微量金属類；ビタミンB1、ビタミンB2、ビタミンB6、ニコチン酸、ニコチン酸アミド、ビタミンB12等のビタミン類；アミノ酸類；核酸類；これらを含有するペプトン、カザミノ酸、酵母エキス、大豆タンパク質分解物等の有機成分が挙げられる。その他の各種有機成分や無機成分としては、１種の成分を用いてもよく、２種またはそれ以上の成分を組み合わせて用いてもよい。
【０１２０】
培養条件は、本発明の微生物が増殖でき、ステロールが生産される限り、特に制限されない。培養は、例えば、ラビリンチュラ類等の従属栄養微生物の培養に用いられる通常の条件で行うことができる。
【０１２１】
培養は、液体培地を用いて行うことができる。培養の際には、本発明の微生物を寒天培地等の固体培地で培養したものを直接液体培地に接種してもよく、本発明の微生物を液体培地で種培養したものを本培養用の液体培地に接種してもよい。すなわち、培養は、種培養と本培養とに分けて行われてもよい。その場合、種培養と本培養の培養条件は、同一であってもよく、そうでなくてもよい。培養開始時に培地に含有される本発明の微生物の量は特に制限されない。本培養は、例えば、本培養の培地に、種培養液を1〜50％（v/v）植菌することにより行ってよい。
【０１２２】
培養は、回分培養（batch culture）、流加培養（Fed-batch culture）、連続培養（continuous culture）、またはそれらの組み合わせにより実施することができる。なお、培養開始時の培地を、「初発培地」ともいう。また、流加培養または連続培養において培養系（発酵槽）に供給する培地を、「流加培地」ともいう。また、流加培養または連続培養において培養系に流加培地を供給することを、「流加」ともいう。なお、培養が種培養と本培養とに分けて行われる場合、例えば、種培養と本培養を、共に回分培養で行ってもよい。また、例えば、種培養を回分培養で行い、本培養を流加培養または連続培養で行ってもよい。
【０１２３】
培養は、例えば、好気条件で行うことができる。好気条件とは、液体培地中の溶存酸素濃度が、酸素膜電極による検出限界である0.33ppm以上であることをいい、好ましくは1.5ppm以上であることであってよい。酸素濃度は、例えば、飽和酸素濃度の5〜50％、好ましくは10％程度に制御されてもよい。好気条件での培養は、具体的には、通気培養、振盪培養、撹拌培養、またはそれらの組み合わせで行うことができる。培地のpHは、例えば、pH3〜10、好ましくはpH4.0〜9.5であってよい。培養中、必要に応じて培地のpHを調整することができる。培地のpHは、アンモニアガス、アンモニア水、炭酸ナトリウム、重炭酸ナトリウム、炭酸カリウム、重炭酸カリウム、炭酸マグネシウム、水酸化ナトリウム、水酸化カルシウム、水酸化マグネシウム、塩酸、硫酸等の各種アルカリ性または酸性物質を用いて調整することができる。培養温度は、例えば、20℃〜35℃、好ましくは25℃〜35℃であってよい。培養期間は、例えば、10時間〜120時間であってよい。培養は、例えば、培地中の炭素源が消費されるまで、あるいは本発明の微生物の活性がなくなるまで、継続してもよい。このような条件下で本発明の微生物を培養することにより、ステロールを含有する菌体が生成する。
【０１２４】
ステロールは菌体から適宜回収することができる。すなわち、菌体からステロールを抽出して回収することができる。菌体は、培養液に含有されたままステロールの抽出に供してもよく、培養液から回収してからステロールの抽出に供してもよい。また、菌体（例えば、菌体を含有する培養液や培養液から回収された菌体）は、適宜、希釈、濃縮、凍結、融解、乾燥等の処理に供してから、ステロールの抽出に供してもよい。これらの処理は、単独で、あるいは適宜組み合わせて行ってもよい。これらの処理は、ステロールの抽出法の種類等の諸条件に応じて適宜選択することができる。
【０１２５】
菌体を培養液から回収する手法は特に制限されず、例えば公知の手法（Grima, E. M. et al. 2003. Biotechnol. Advances 20: 491-515）を利用できる。具体的には、例えば、自然沈降、遠心分離、濾過等の手法により、菌体を培養液から回収することができる。また、その際、凝集剤（flocculant）を利用してもよい。回収した菌体は、適当な媒体を用いて適宜洗浄することができる。また、回収した菌体は、適当な媒体を用いて適宜再懸濁することができる。洗浄や懸濁に利用できる媒体としては、例えば、水や水性緩衝液等の水性媒体（水性溶媒）、メタノール等の有機媒体（有機溶媒）、およびそれらの混合物が挙げられる。媒体は、ステロールの抽出法の種類等の諸条件に応じて適宜選択することができる。
【０１２６】
ステロールを抽出する手法は特に制限されず、例えば公知の手法を利用できる。そのような手法としては、例えば、一般的な藻類等の微生物の菌体から脂質を抽出する手法が挙げられる。そのような手法として、具体的には、例えば、有機溶剤処理、超音波処理、ビーズ破砕処理、酸処理、アルカリ処理、酵素処理、水熱処理、超臨界処理、マイクロ波処理、電磁場処理、圧搾処理が挙げられる。これらの手法は、単独で、あるいは適宜組み合わせて利用することができる。
【０１２７】
有機溶剤処理に用いられる有機溶剤は、菌体からステロールを抽出できるものであれば特に制限されない。有機溶剤としては、例えば、メタノール、エタノール、２−プロパノール、ブタノール、ペンタノール、ヘキサノール、ヘプタノール、オクタノール等のアルコール類、アセトン等のケトン類、ジメチルエーテル、ジエチルエーテル等のエーテル類、酢酸メチル、酢酸エチル等のエステル類、ｎ−ヘキサン等のアルカン類、クロロホルムが挙げられる。有機溶剤による脂質の抽出法としては、Bligh-Dyer法やFolch法が挙げられる。有機溶剤としては、１種の有機溶剤を用いてもよく、２種またはそれ以上の有機溶剤を組み合わせて用いてもよい。
【０１２８】
アルカリ処理のpHは、菌体からステロールを抽出できるpHであれば特に制限されない。アルカリ処理のpHは、通常にはpH 8.5以上、好ましくはpH 10.5以上、さらに好ましくはpH 11.5以上であってよく、pH 14以下であってよい。アルカリ処理の温度は、通常には30℃以上、好ましくは50℃以上、さらに好ましくは70℃以上であってよい。アルカリ処理の温度は、好ましくは120℃以下であってよい。アルカリ処理の時間は、通常には10分以上、好ましくは30分以上、さらに好ましくは50分以上であってよい。アルカリ処理の時間は、好ましくは150分以下であってよい。アルカリ処理には、NaOHやKOH等のアルカリ性物質を利用することができる。
【０１２９】
抽出したステロールの回収は、化合物の分離精製に用いられる公知の手法により行うことができる。そのような手法としては、例えば、イオン交換樹脂法や膜処理法が挙げられる。これらの手法は、単独で、あるいは適宜組み合わせて用いることができる。
【０１３０】
回収されたステロールは、ステロール以外に、菌体、培地成分、水分、抽出処理に用いられた成分、本発明の微生物の代謝副産物等の成分を含んでいてよい。ステロールは、所望の程度に精製されていてよい。ステロールの純度は、例えば、1％（w/w）以上、2％（w/w）以上、5％（w/w）以上、10％（w/w）以上、30％（w/w）以上、50％（w/w）以上、70％（w/w）以上、90％（w/w）以上、または95％（w/w）以上であってよい。
【０１３１】
ステロールの種類および量は、化合物の検出または同定に用いられる公知の手法により決定することができる。そのような手法としては、例えば、HPLC、LC/MS、GC/MS、NMRが挙げられる。これらの手法は、単独で、あるいは適宜組み合わせて用いることができる。
【０１３２】
回収されるステロールは、例えば、遊離型のステロール、その派生物（ステロールエステル、ステリルグルコシド、アシルステリルグルコシド、等）、またはそれらの混合物であってよい。また、ステロールがこれら派生物の形態で存在する場合、加水分解により遊離型のステロールを生成することもできる。加水分解は常法により実施できる。例えば、ステロールエステルはエステラーゼにより、ステリルグルコシドやアシルステリルグルコシドはグリコシダーゼにより、それぞれ酵素的に加水分解できる。
【０１３３】
ステロールは、種々の用途に利用できる。ステロールの用途は特に制限されない。ステロールは、例えば、そのまま単独で、あるいは他の成分と配合して、あるいは他の成分の原料として、利用できる。ステロールの用途としては、食品添加物、飼料添加物、健康食品、医薬品、化成品、化粧品成分、それらの原料が挙げられる。飼料としては、畜産飼料や水産飼料が挙げられる。
【実施例】
【０１３４】
以下、本発明を非限定的な実施例により更に具体的に説明する。【０１３５】
〔実施例１〕ラビリンチュラのステロール蓄積株の取得
沖縄県の川の水を含んだ葉の腐敗物のサンプルを採取した。サンプルに松の花粉（宮崎県で採取）を適量添加し、室温で８日間静置した。0.5×人工海水で調製した0.1×ライヒマニ保存用培地（ニッスイ）に終濃度がそれぞれ50mg/LとなるようにペニシリンGカルシウムやストレプトマイシン硫酸塩を加え、さらに終濃度がそれぞれ2mg/L、0.01mg/L、0.01mg/LとなるようにビタミンB1（ナカライ）、ビタミンB2（ナカライ）、及びビタミンB12（ナカライ）を加えた培地のプレートに、前記静置後のサンプルを100μl播種した。各々のプレートを、28℃で4日間培養し、得られたコロニーを同培地で画線分離し、コロニーの純化を実施した。このようにして取得した株をAJ7869株（FERM BP-22342）と命名した。また、同様の手順で、AJ7868株（FERM BP-22290）を得た（WO2017/065293）。また、同様の手順で、AJ7879株（FERM BP-22367）を得た。尚、1×ライヒマニ保存用培地（ニッスイ）と1×人工海水の組成は以下のとおりである。【０１３６】
＜1×ライヒマニ保存用培地（ニッスイ）の組成＞
酵母エキス             8.5 g
ペプトン               8.5 g
グルコース            11 g
リン酸二水素カリウム   2.0 g
トマトジュース末       3.7 g
ポリソルベート80       1.0 g
寒天                  15 g
超純水              1000 ml【０１３７】
＜1×人工海水の組成＞
NaCl                   30 g
KCl                     0.7 g
MgCl2・6H2O            10.8 g
MgSO4・7H2O             5.4 g
CaCl2・2H2O             1 g
超純水               1000 ml【０１３８】
〔実施例２〕ステロール蓄積株の18S rDNA解析
上記のようにして単離されたAJ7869株について、ラビリンチュラの18S rDNA領域増幅用ユニバーサルプライマー（配列番号１、２）を用いて、18S rDNA領域の塩基配列を決定した。また、AJ7868株及びAJ7879株について、イルミナ社製のMiseqによる解析から18SrDNA領域の塩基配列を決定した。AJ7869株の18S rDNA領域の塩基配列を、配列番号３に示す。AJ7868株の18S rDNA領域の塩基配列を、配列番号４３に示す。AJ7879株の18S rDNA領域の塩基配列を、配列番号４４に示す。AJ7869株、AJ7868株、及びAJ7879株の18S rDNAは、いずれも、Aurantiochytrium sp. BURABG162株（配列番号４）、Aurantiochytrium sp. SKE217株（配列番号５）、及びAurantiochytrium sp. SKE218株（配列番号６）の18S rDNAの塩基配列とそれぞれ99%、98%、及び99%の高い同一性を示した。上記の3株は上田らの報告でAurantiochytrium sp.1に属することが報告されている（Mayumi Ueda, et al., Seasonal dynamics of culturable thraustochytrids (Labyrinthulomycetes, Stramenopile) in estuarine and coastal waters., Aquatic Microbial Ecology. 2015 ;74:187-204）。この結果、AJ7869株、AJ7868株、及びAJ7879株はAurantiochytrium sp.1と類縁関係にあることが明らかになったため、これらの株を、それぞれ、Aurantiochytrium sp.1 AJ7869株、AJ7868株、及びAJ7879株と命名した。【０１３９】
〔実施例３〕smt1遺伝子欠損株の構築と培養評価（１）
AJ7869株を親株として、以下の手順で、smt1遺伝子（配列番号７）の欠損株を構築した。【０１４０】
AJ7869株のゲノムＤＮＡを鋳型として、配列番号８と９のプライマーを用いてＰＣＲを行い、smt1遺伝子の上流領域を含むＤＮＡ断片を増幅した。AJ7869株のゲノムＤＮＡを鋳型として、配列番号１０と１１のプライマーを用いてＰＣＲを行い、smt1遺伝子の下流領域を含むＤＮＡ断片を増幅した。ブラストサイジンＳ耐性遺伝子発現カセット（Keishi Sakaguchi, et al., Versatile Transformation system that is Applicable to both multiple transgene expression and gene targeting for thraustochytrids., Applied and Environmental Microbiology. 2012 ;78(9):3193-3202.）を鋳型として、配列番号１２と１３のプライマーを用いてＰＣＲを行い、ブラストサイジンＳ耐性遺伝子を含むＤＮＡ断片を増幅した。プラスミドpUC19を鋳型として、配列番号１４と１５のプライマーを用いてＰＣＲを行い、pUC19の直鎖ＤＮＡ断片を増幅した。それらＤＮＡ断片をIn-fusion（タカラ社）を用いて結合させ、得られたプラスミドをpUC19smt1-blaと名付けた。pUC19smt1-blaを鋳型として配列番号１６と１７のプライマーを用いてＰＣＲを行い、smt1遺伝子の上流領域及び下流領域並びにその間にブラストサイジンＳ耐性遺伝子を含むＤＮＡ断片を得た。当該ＤＮＡ断片をエレクトロポレーション法（Keishi Sakaguchi, et al., Versatile Transformation system that is Applicable to both multiple transgene expression and gene targeting for thraustochytrids., Applied and Environmental Microbiology. 2012 ;78(9):3193-3202）でAJ7869株に導入してブラストサイジンＳ耐性株を取得した。取得した株を、AJ7870株と名付けた。この株は、smt1遺伝子がブラストサイジンＳ耐性遺伝子に置換されたsmt1遺伝子の欠損株である。【０１４１】
AJ7869株とAJ7870株を、0.5×人工海水で調製した0.2×ライヒマニ保存用培地（ニッスイ）に終濃度がそれぞれ2mg/L、0.01mg/L、0.01mg/LとなるようにビタミンB1（ナカライ）、ビタミンB2（ナカライ）、及びビタミンB12（ナカライ）を加えた培地のプレートに播種し、28.5℃で60時間培養した。そのプレート培地上の細胞を5白金耳分掻き取り、下記組成の0.25×人工海水で調製したGY培地50mLを入れた500ml容量バッフル付の三角フラスコに植菌し、培養温度28.5℃、撹拌120rpm（ロータリー）にて、24時間培養を行った。得られた培養液を0.25×人工海水で調製したGTY培地48.5mlを入れた500ml容量バッフル付の三角フラスコに1.5ml植菌し、培養温度28.5℃、撹拌120rpm（ロータリー）にて、48時間培養を行った。【０１４２】
＜GY培地の組成＞
（Ａ区）
グルコース            30 g/L
（Ｂ区）
酵母エキス            10 g/L
（Ｃ区）
ビタミンB1            2 mg/L
ビタミンB2            0.01 mg/L
ビタミンB12           0.01 mg/L
（Ｄ区）
PIPES                 13.6 g/L
Ｂ区はHClを用いてpH6.5に調整した後、A区はpH無調整にて、それぞれ120℃で10分オートクレーブした。D区はNaOHを用いてpH6.5に調整した後、C区はpH無調整にて、それぞれフィルター濾過を行った。A区とB区を室温に冷却後、４区を混合した。【０１４３】
＜GTY培地の組成＞
（Ａ区）
グルコース            50 g/L
（Ｂ区）
トリプトン            10 g/L
酵母エキス            5 g/L
（Ｃ区）
ビタミンB1            2 mg/L
ビタミンB2            0.01 mg/L
ビタミンB12           0.01 mg/L
（Ｄ区）
PIPES                 13.6 g/L
Ｂ区はHClを用いてpH6.5に調整した後、A区はpH無調整にて、それぞれ120℃で10分オートクレーブした。D区はNaOHを用いてpH6.5に調整した後、C区はpH無調整にて、それぞれフィルター濾過を行った。A区とB区を室温に冷却後、４区を混合した。【０１４４】
培養終了後、培養液0.5mlを遠心分離し、得られた沈殿物からBligh-Dyer法を利用して脂質の抽出を行い、脂質抽出物を得た。脂質抽出物中のステロールエステルを加水分解するために、脂肪酸をメチル化する一方でステロールエステルを加水分解できる脂肪酸メチル化キット（ナカライ）を用いた。得られたヘキサン層をガスクロマトグラフィーにアプライして各ステロールの定量を実施した。また、乾燥藻体重量（DCW）は、培養液0.5mlを遠心分離し、得られた沈殿物を50℃で3日間乾燥させた後に重量測定した値からエッペンチューブの重量を差し引いて算出した。結果を表１に示す。AJ7870株では、スティグマステロールの蓄積が消失し、コレステロールの蓄積量がAJ7869株の約2.1倍に増加した。従って、smt1遺伝子の欠損は、コレステロール蓄積に有効であることが示された。【０１４５】
【表１】
2019078359.tif 000002
【０１４６】
〔実施例４〕dhcr7遺伝子欠損株の構築と培養評価
AJ7869株とAJ7870株を親株として、以下の手順で、dhcr7遺伝子（配列番号１８）の欠損株を構築した。【０１４７】
AJ7869株のゲノムＤＮＡを鋳型として、配列番号１９と２０のプライマーを用いてＰＣＲを行い、dhcr7遺伝子の上流領域を含むＤＮＡ断片を増幅した。AJ7869株のゲノムＤＮＡを鋳型として、配列番号２１と２２のプライマーを用いてＰＣＲを行い、dhcr7遺伝子の下流領域を含むＤＮＡ断片を増幅した。ゼオシン耐性遺伝子発現カセット（Keishi Sakaguchi, et al., Versatile Transformation system that is Applicable to both multiple transgene expression and gene targeting for thraustochytrids., Applied and Environmental Microbiology. 2012 ;78(9):3193-3202.）を鋳型として、配列番号２３と２４のプライマーを用いてＰＣＲを行い、ゼオシン耐性遺伝子を含むＤＮＡ断片を増幅した。プラスミドpUC19を鋳型として、配列番号２５と２６のプライマーを用いてＰＣＲを行い、pUC19の直鎖ＤＮＡ断片を増幅した。それらＤＮＡ断片をIn-fusion（タカラ社）を用いて結合させ、得られたプラスミドをpUC19dhcr7-zeoと名付けた。pUC19dhcr7-zeoを鋳型として配列番号２７と２８のプライマーを用いてＰＣＲを行い、dhcr7遺伝子の上流領域及び下流領域並びにその間にゼオシン耐性遺伝子を含むＤＮＡ断片を得た。当該ＤＮＡ断片をエレクトロポレーション法（Keishi Sakaguchi, et al., Versatile Transformation system that is Applicable to both multiple transgene expression and gene targeting for thraustochytrids., Applied and Environmental Microbiology. 2012 ;78(9):3193-3202）でAJ7869株とAJ7870に導入してゼオシン耐性株を取得した。取得した株を、それぞれAJ7872株とAJ7871株と名付けた。これらの株は、いずれも、dhcr7遺伝子がゼオシン耐性遺伝子に置換されたdhcr7遺伝子の欠損株である。【０１４８】
AJ7869株、AJ7870株、AJ7872、及びAJ7871株を、0.5×人工海水で調製した0.2×ライヒマニ保存用培地（ニッスイ）に終濃度がそれぞれ2mg/L、0.01mg/L、0.01mg/LとなるようにビタミンB1（ナカライ）、ビタミンB2（ナカライ）、及びビタミンB12（ナカライ）を加えた培地のプレートに播種し、28.5℃で60時間培養した。そのプレート培地上の細胞を5白金耳分掻き取り、下記組成の0.25×人工海水で調製したGY培地50mLを入れた500ml容量バッフル付の三角フラスコに植菌し、培養温度28.5℃、撹拌120rpm（ロータリー）にて、24時間培養を行った。得られた培養液を0.25×人工海水で調製したGTY培地48.5mlを入れた500ml容量バッフル付の三角フラスコに1.5ml植菌し、培養温度28.5℃、撹拌120rpm（ロータリー）にて、48時間培養を行った。【０１４９】
培養終了後、培養液0.5mlを遠心分離し、得られた沈殿物からBligh-Dyer法を利用して脂質の抽出を行い、脂質抽出物を得た。脂質抽出物中のステロールエステルを加水分解するために、脂肪酸をメチル化する一方でステロールエステルを加水分解できる脂肪酸メチル化キット（ナカライ）を用いた。得られたヘキサン層をガスクロマトグラフィーにアプライして各ステロールの定量を実施した。また、乾燥藻体重量（DCW）は、培養液0.5mlを遠心分離し、得られた沈殿物を50℃で3日間乾燥させた後に重量測定した値からエッペンチューブの重量を差し引いて算出した。結果を表２に示す。AJ7870株、AJ7872株、AJ7871株では、いずれも、AJ7869株では見られなかった７−デヒドロコレステロール（プロビタミンＤ３）の蓄積が確認された。また、AJ7871株では、７−デヒドロコレステロール蓄積量がAJ7870株およびAJ7872株と比較して増加した。従って、smt1遺伝子の欠損およびdhcr7遺伝子の欠損は、いずれも、７−デヒドロコレステロール蓄積に有効であることが示された。また、エルゴステロール（プロビタミンＤ２）の蓄積がAJ7869株では確認できない一方で、AJ7872株では確認された。さらに、AJ7872株では、プロビタミンＤ６の蓄積量がAJ7869株の1.4倍に増加した（表には示さず）。従って、dhcr7遺伝子の欠損は、プロビタミンＤ類の蓄積に有効であることが示された。【０１５０】
【表２】
2019078359.tif 000003
【０１５１】
〔実施例５〕dhcr24遺伝子欠損株の構築と培養評価
AJ7869株を親株として、以下の手順で、dhcr24遺伝子（配列番号２９）の欠損株を構築した。【０１５２】
AJ7869株のゲノムＤＮＡを鋳型として、配列番号３０と３１のプライマーを用いてＰＣＲを行い、dhcr24遺伝子の上流領域を含むＤＮＡ断片を増幅した。AJ7869株のゲノムＤＮＡを鋳型として、配列番号３２と３３のプライマーを用いてＰＣＲを行い、dhcr24遺伝子の下流領域を含むＤＮＡ断片を増幅した。ゼオシン耐性遺伝子発現カセット（Keishi Sakaguchi, et al., Versatile Transformation system that is Applicable to both multiple transgene expression and gene targeting for thraustochytrids., Applied and Environmental Microbiology. 2012 ;78(9):3193-3202.）を鋳型として、配列番号３４と３５のプライマーを用いてＰＣＲを行い、ゼオシン耐性遺伝子を含むＤＮＡ断片を増幅した。プラスミドpUC19を鋳型として、配列番号３６と３７のプライマーを用いてＰＣＲを行い、pUC19の直鎖ＤＮＡ断片を増幅した。それらＤＮＡ断片をIn-fusion（タカラ社）を用いてクローニングしたプラスミドをpUC19dhcr24-zeoと名付けた。pUC19dhcr24-zeoを鋳型として配列番号３０と３３のプライマーを用いてＰＣＲを行い、dhcr24遺伝子の上流及び下流領域並びにその間にゼオシン耐性遺伝子を含むＤＮＡ断片を得た。当該ＤＮＡ断片をエレクトロポレーション法（Keishi Sakaguchi, et al., Versatile Transformation system that is Applicable to both multiple transgene expression and gene targeting for thraustochytrids., Applied and Environmental Microbiology. 2012 ;78(9):3193-3202）でAJ7869株に導入してゼオシン耐性株を取得した。取得した株を、AJ7873株と名付けた。この株は、dhcr24遺伝子がゼオシン耐性遺伝子に置換されたdhcr24遺伝子の欠損株である。【０１５３】
AJ7869株とAJ7873株を、0.5×人工海水で調製した0.2×ライヒマニ保存用培地（ニッスイ）に終濃度がそれぞれ2mg/L、0.01mg/L、0.01mg/LとなるようにビタミンB1（ナカライ）、ビタミンB2（ナカライ）、及びビタミンB12（ナカライ）を加えた培地のプレートに播種し、28.5℃で60時間培養した。そのプレート培地上の細胞を5白金耳分掻き取り、下記組成の0.25×人工海水で調製したGY培地50mLを入れた500ml容量バッフル付の三角フラスコに植菌し、培養温度28.5℃、撹拌120rpm（ロータリー）にて、24時間培養を行った。得られた培養液を0.25×人工海水で調製したGTY培地48.5mlを入れた500ml容量バッフル付の三角フラスコに1.5ml植菌し、培養温度28.5℃、撹拌120rpm（ロータリー）にて、48時間培養を行った。【０１５４】
培養終了後、培養液0.5mlを遠心分離し、得られた沈殿物からBligh-Dyer法を利用して脂質の抽出を行い、脂質抽出物を得た。脂質抽出物中のステロールエステルを加水分解するために、脂肪酸をメチル化する一方でステロールエステルを加水分解できる脂肪酸メチル化キット（ナカライ）を用いた。得られたヘキサン層をガスクロマトグラフィーにアプライして各ステロールの定量を実施した。また、乾燥藻体重量（DCW）は、培養液0.5mlを遠心分離し、得られた沈殿物を50℃で3日間乾燥させた後に重量測定した値からエッペンチューブの重量を差し引いて算出した。結果を表３に示す。AJ7873株では、コレステロールの蓄積が消失し、スティグマステロール及びブラシカステロールの蓄積量がそれぞれAJ7869株の1.4倍及び2.2倍に増加した。従って、dhcr24遺伝子の欠損は、Ｃ24位がメチルまたはエチルであるステロール類の蓄積に有効であることが示された。【０１５５】
【表３】
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【０１５６】
〔実施例６〕smt1遺伝子欠損株の構築と培養評価（２）
AJ7879株およびAJ7868株を親株として、以下の手順で、smt1遺伝子（配列番号５５）の欠損株を構築した。【０１５７】
実施例３に記載の手順で、smt1遺伝子の上流領域及び下流領域並びにその間にブラストサイジンＳ耐性遺伝子を含むＤＮＡ断片を得た。【０１５８】
AJ7869株のゲノムＤＮＡを鋳型として、配列番号８と９のプライマーを用いてＰＣＲを行い、smt1遺伝子の上流領域を含むＤＮＡ断片を増幅した。AJ7869株のゲノムＤＮＡを鋳型として、配列番号１０と１１のプライマーを用いてＰＣＲを行い、smt1遺伝子の下流領域を含むＤＮＡ断片を増幅した。ネオマイシン耐性遺伝子発現カセット（Keishi Sakaguchi, et al., Versatile Transformation system that is Applicable to both multiple transgene expression and gene targeting for thraustochytrids., Applied and Environmental Microbiology. 2012 ;78(9):3193-3202.）を鋳型として、配列番号１２と１３のプライマーを用いてＰＣＲを行い、ネオマイシン耐性遺伝子を含むＤＮＡ断片を増幅した。プラスミドpUC19を鋳型として、配列番号１４と１５のプライマーを用いてＰＣＲを行い、pUC19の直鎖ＤＮＡ断片を増幅した。それらＤＮＡ断片をIn-fusion（タカラ社）を用いて結合させ、得られたプラスミドをpUC19smt1-neoと名付けた。pUC19smt1-neoを鋳型として配列番号１６と１７のプライマーを用いてＰＣＲを行い、smt1遺伝子の上流領域及び下流領域並びにその間にネオマイシン耐性遺伝子を含むＤＮＡ断片を得た。【０１５９】
smt1遺伝子の上流領域及び下流領域並びにその間にブラストサイジンＳ耐性遺伝子を含むＤＮＡ断片をエレクトロポレーション法（Keishi Sakaguchi, et al., Versatile Transformation system that is Applicable to both multiple transgene expression and gene targeting for thraustochytrids., Applied and Environmental Microbiology. 2012 ;78(9):3193-3202）でAJ7879株に導入してブラストサイジンＳ耐性株を取得した。取得した株を、AJ7880株と名付けた。この株は、smt1遺伝子がブラストサイジンＳ耐性遺伝子に置換されたsmt1遺伝子の欠損株である。【０１６０】
smt1遺伝子の上流領域及び下流領域並びにその間にブラストサイジンＳ耐性遺伝子を含むＤＮＡ断片をエレクトロポレーション法（Keishi Sakaguchi, et al., Versatile Transformation system that is Applicable to both multiple transgene expression and gene targeting for thraustochytrids., Applied and Environmental Microbiology. 2012 ;78(9):3193-3202）でAJ7868株に導入してブラストサイジンＳ耐性株を取得した。取得した株を、AJ7868ブラストサイジンＳ耐性株と名付けた。この株は、染色体上に２つ存在するsmt1遺伝子の１つがブラストサイジンＳ耐性遺伝子に置換されたsmt1遺伝子の欠損株である。この株に、さらに、smt1遺伝子の上流領域及び下流領域並びにその間にネオマイシン耐性遺伝子を含むＤＮＡ断片をエレクトロポレーション法で導入してネオマイシン耐性株を取得した。取得した株を、AJ7878株と名付けた。この株は、染色体上に２つ存在するsmt1遺伝子がブラストサイジンＳ耐性遺伝子とネオマイシン耐性遺伝子にそれぞれ置換されたsmt1遺伝子の欠損株である。【０１６１】
AJ7879株、AJ7880株、AJ7868株、及びAJ7878株を、0.5×人工海水で調製した0.2×ライヒマニ保存用培地（ニッスイ）に終濃度がそれぞれ2mg/L、0.01mg/L、0.01mg/LとなるようにビタミンB1（ナカライ）、ビタミンB2（ナカライ）、及びビタミンB12（ナカライ）を加えた培地のプレートに播種し、28.5℃で60時間培養した。そのプレート培地上の細胞を5白金耳分掻き取り、下記組成の0.25×人工海水で調製したGY培地50mLを入れた500ml容量バッフル付の三角フラスコに植菌し、培養温度28.5℃、撹拌120rpm（ロータリー）にて、24時間培養を行った。得られた培養液を0.25×人工海水で調製したGTY培地48.5mlを入れた500ml容量バッフル付の三角フラスコに1.5ml植菌し、培養温度28.5℃、撹拌120rpm（ロータリー）にて、48時間培養を行った。【０１６２】
培養終了後、培養液0.5mlを遠心分離し、得られた沈殿物からBligh-Dyer法を利用して脂質の抽出を行い、脂質抽出物を得た。脂質抽出物中のステロールエステルを加水分解するために、脂肪酸をメチル化する一方でステロールエステルを加水分解できる脂肪酸メチル化キット（ナカライ）を用いた。得られたヘキサン層をガスクロマトグラフィーにアプライして各ステロールの定量を実施した。また、乾燥藻体重量（DCW）は、培養液0.5mlを遠心分離し、得られた沈殿物を50℃で3日間乾燥させた後に重量測定した値からエッペンチューブの重量を差し引いて算出した。結果を表４に示す。AJ7880株では、スティグマステロールの蓄積が消失し、コレステロールの蓄積量がAJ7879株の約1.9倍に増加した。また、AJ7878株でも、スティグマステロールの蓄積が消失し、コレステロールの蓄積量がAJ7868株の約2.2倍に増加した。従って、Aurantiochytrium sp.1の他の株においても、smt1遺伝子の欠損は、コレステロール蓄積に有効であることが示された。【０１６３】
【表４】
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【０１６４】
〔実施例７〕dhcr24遺伝子とdhcr7遺伝子の二重発現強化株の構築
AJ7870を親株として、以下の手順で、dhcr24遺伝子（配列番号２９）とdhcr7遺伝子（配列番号１８）の二重強化株を構築した。【０１６５】
ネオマイシン耐性遺伝子‐dhcr7遺伝子発現カセットを含むプラスミド（配列番号４５）とゼオシン耐性遺伝子‐dhcr24遺伝子の発現カセットを含むプラスミド（配列番号４６）をそれぞれ鋳型として、配列番号４７と配列番号４８のプライマーを用いてＰＣＲを行い、ネオマイシン耐性遺伝子‐dhcr7遺伝子の発現カセットを含むＤＮＡ断片とゼオシン耐性遺伝子‐dhcr24遺伝子の発現カセットを含むＤＮＡ断片を増幅した。これらのＤＮＡ断片をエレクトロポレーション法（Keishi Sakaguchi, et al., Versatile Transformation system that is Applicable to both multiple transgene expression and gene targeting for thraustochytrids., Applied and Environmental Microbiology. 2012 ;78(9):3193-3202）でAJ7870株に導入してネオマイシンとゼオシンの両方に耐性な株を取得した。取得した株を、AJ7882株と名付けた。この株は、dhcr24遺伝子及びdhcr7遺伝子がゲノム中にランダムに挿入されたdhcr24遺伝子とdhcr7遺伝子の二重発現強化株である。【０１６６】
〔実施例８〕cyp710a遺伝子欠損株の構築と培養評価
AJ7882株（dhcr24遺伝子とdhcr7遺伝子の二重発現強化株）を親株として、以下の手順で、sterol C-22 desaturaseをコードするcyp710a遺伝子（配列番号４１）の欠損株を構築した。【０１６７】
AJ7869株のゲノムＤＮＡを鋳型として、配列番号４９と５０のプライマーを用いてＰＣＲを行い、cyp710a遺伝子の上流領域を含むＤＮＡ断片を増幅した。ハイグロマイシン耐性遺伝子発現カセット（pUC19 pUBI-HygR-SV40；Keishi Sakaguchi, et al., Versatile Transformation system that is Applicable to both multiple transgene expression and gene targeting for thraustochytrids., Applied and Environmental Microbiology. 2012 ;78(9):3193-3202.）を鋳型として、配列番号５１と５２のプライマーを用いてＰＣＲを行い、ハイグロマイシン耐性遺伝子を含むＤＮＡ断片を増幅した。AJ7869株のゲノムＤＮＡを鋳型として、配列番号５３と５４のプライマーを用いてＰＣＲを行い、cyp710a遺伝子の下流領域を含むＤＮＡ断片を増幅した。それらＤＮＡ断片を鋳型として、配列番号４９と配列番号５４のプライマーを用いてクロスオーバーPCRを行い、cyp710a遺伝子の上流領域及び下流領域並びにその間にハイグロマイシン耐性遺伝子を含むＤＮＡ断片を得た。当該ＤＮＡ断片をエレクトロポレーション法（Keishi Sakaguchi, et al., Versatile Transformation system that is Applicable to both multiple transgene expression and gene targeting for thraustochytrids.,Applied and Environmental Microbiology. 2012 ;78(9):3193-3202）でAJ7882株に導入してハイグロマイシン耐性株を取得した。取得した株を、AJ7881株と名付けた。この株は、cyp710a遺伝子がハイグロマイシン耐性遺伝子に置換されたcyp710a遺伝子の欠損株である。【０１６８】
AJ7870株、AJ7881株、及びAJ7882株を、0.5×人工海水で調製した0.2×ライヒマニ保存用培地（ニッスイ）に終濃度がそれぞれ2mg/L、0.01mg/L、0.01mg/LとなるようにビタミンB1（ナカライ）、ビタミンB2（ナカライ）、及びビタミンB12（ナカライ）を加えた培地のプレートに播種し、28.5℃で60時間培養した。そのプレート培地上の細胞を5白金耳分掻き取り、下記組成の0.25×人工海水で調製したGY培地50mLを入れた500ml容量バッフル付の三角フラスコに植菌し、培養温度28.5℃、撹拌120rpm（ロータリー）にて、24時間培養を行った。得られた培養液を0.25×人工海水で調製したGTY培地48.5mlを入れた500ml容量バッフル付の三角フラスコに1.5ml植菌し、培養温度28.5℃、撹拌120rpm（ロータリー）にて、48時間培養を行った。【０１６９】
培養終了後、培養液0.5mlを遠心分離し、得られた沈殿物からBligh-Dyer法を利用して脂質の抽出を行い、脂質抽出物を得た。脂質抽出物中のステロールエステルを加水分解するために、脂肪酸をメチル化する一方でステロールエステルを加水分解できる脂肪酸メチル化キット（ナカライ）を用いた。得られたヘキサン層をガスクロマトグラフィーにアプライして各ステロールの定量を実施した。また、乾燥藻体重量（DCW）は、培養液0.5mlを遠心分離し、得られた沈殿物を50℃で3日間乾燥させた後に重量測定した値からエッペンチューブの重量を差し引いて算出した。結果を表５に示す。AJ7882株（Δsmt1／dhcr24＋dhcr7二重発現強化株）では、コレステロールの蓄積量がAJ7870株（Δsmt1）の約1.3倍に増加した。さらに、AJ7881株（Δsmt1Δcyp710a／dhcr24＋dhcr7二重発現強化株）では、コレステロールの蓄積量がAJ7882株（Δsmt1／dhcr24＋dhcr7二重発現強化株）の約1.2倍に増加した。従って、smt1遺伝子欠損株で、dhcr7やdhcr24などのコレステロール生合成経路を強化すること、およびcyp710a遺伝子の破壊によってＣ２２不飽和ステロール類の副生を抑制することは、コレステロール蓄積に有効であることが示された。【０１７０】
【表５】
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【産業上の利用可能性】
【０１７１】
本発明により、ラビリンチュラ類微生物のステロール生産能を向上させることができ、ステロールを効率よく製造することができる。【０１７２】
＜配列表の説明＞
配列番号１〜２：プライマー
配列番号３：Aurantiochytrium sp.1 AJ7869株の18S rDNA領域の塩基配列
配列番号４：Aurantiochytrium sp.1 BURABG162株の18S rDNA領域の塩基配列
配列番号５：Aurantiochytrium sp.1 SKE217株の18S rDNA領域の塩基配列
配列番号６：Aurantiochytrium sp.1 SKE218株の18S rDNA領域の塩基配列
配列番号７：Aurantiochytrium sp.1 AJ7869株のSMT1遺伝子の塩基配列
配列番号８〜１７：プライマー
配列番号１８：Aurantiochytrium sp.1 AJ7869株のDHCR7遺伝子の塩基配列
配列番号１９〜２８：プライマー
配列番号２９：Aurantiochytrium sp.1 AJ7869株のDHCR24遺伝子の塩基配列
配列番号３０〜３７：プライマー
配列番号３８：Aurantiochytrium sp.1 AJ7869株のSMT1のアミノ酸配列
配列番号３９：Aurantiochytrium sp.1 AJ7869株のDHCR7のアミノ酸配列
配列番号４０：Aurantiochytrium sp.1 AJ7869株のDHCR24のアミノ酸配列
配列番号４１：Aurantiochytrium sp.1 AJ7869株のcyp710a遺伝子の塩基配列
配列番号４２：Aurantiochytrium sp.1 AJ7869株のCYP710Aのアミノ酸配列
配列番号４３：Aurantiochytrium sp.1 AJ7868株の18S rDNA領域の塩基配列
配列番号４４：Aurantiochytrium sp.1 AJ7879株の18S rDNA領域の塩基配列
配列番号４５：ネオマイシン耐性遺伝子‐dhcr7遺伝子発現カセットの塩基配列
配列番号４６：ゼオシン耐性遺伝子‐dhcr24遺伝子の発現カセットの塩基配列
配列番号４７〜５４：プライマー
配列番号５５：Aurantiochytrium sp.1 AJ7868株およびAJ7879株のSMT1遺伝子の塩基配列
配列番号５６：Aurantiochytrium sp.1 AJ7868株およびAJ7879株のSMT1のアミノ酸配列
【配列表】
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【国際調査報告】
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