(57)【要約】下記化学式に示す配列を有する、抗グラム陰性菌化合物。下記化学式に示す配列を有する化合物を産生することができるBacillus subtilis。Bacillus subtilis MT2株（受託番号：NITE  BP-02767）。【化１】2020090045.tif 000009
2020090045.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記化学式に示すアミノ酸配列を有する、抗グラム陰性菌化合物。
【化１】
2020090045.tif 000005
【請求項２】
枯草菌(Bacillus subtilis)から産生される、請求項１に記載の抗グラム陰性菌化合物。
【請求項３】
Bacillus subtilis MT2株（受託番号：NITE  BP-02767）から産生される、請求項１に記載の抗グラム陰性菌化合物。
【請求項４】
前記グラム陰性菌が、ビブリオ属細菌である、請求項１から３のいずれか１項に記載の抗グラム陰性菌化合物。
【請求項５】
前記グラム陰性菌が、腸炎ビブリオである、請求項１から３のいずれか１項に記載の抗グラム陰性菌化合物。
【請求項６】
真菌に対しさらに抗菌作用を有する、請求項１から５のいずれか１項に記載の抗グラム陰性菌化合物。
【請求項７】
前記真菌が、トリコフィトン属菌である、請求項６に記載の抗グラム陰性菌化合物。
【請求項８】
前記真菌が、白癬菌である、請求項６に記載の抗グラム陰性菌化合物。
【請求項９】
前記真菌が、毛瘡菌又は趾間菌である、請求項６に記載の抗グラム陰性菌化合物。
【請求項１０】
グラム陽性菌に対しさらに抗菌作用を有する、請求項１から９のいずれか１項に記載の抗グラム陰性菌化合物。
【請求項１１】
グラム陰性菌に対する抗菌作用を補助する処置と併用されない、請求項１から１０のいずれか１項に記載の抗グラム陰性菌化合物。
【請求項１２】
前記処置が、保存料の添加である、請求項１１に記載の抗グラム陰性菌化合物。
【請求項１３】
前記保存料が、キレート剤である、請求項１２に記載の抗グラム陰性菌化合物。
【請求項１４】
請求項１から１３のいずれか１項に記載の抗グラム陰性菌化合物を含む抗グラム陰性菌薬。
【請求項１５】
請求項１から１３のいずれか１項に記載の抗グラム陰性菌化合物を含む飲料又は食料。
【請求項１６】
下記化学式に示すアミノ酸配列を有する化合物を産生することができる枯草菌(Bacillus subtilis)。
【化２】
2020090045.tif 000006
【請求項１７】
請求項１６に記載の枯草菌を含む抗グラム陰性菌薬。
【請求項１８】
請求項１６に記載の枯草菌を含む飲料又は食料。
【請求項１９】
Bacillus subtilis MT2株（受託番号：NITE  BP-02767）。
【請求項２０】
Bacillus subtilis MT2株（受託番号：NITE  BP-02767）を含む抗グラム陰性菌薬。
【請求項２１】
Bacillus subtilis MT2株（受託番号：NITE  BP-02767）を含む飲料又は食料。
【請求項２２】
枯草菌(Bacillus subtilis)を培養することと、
前記枯草菌が産生した下記化学式に示すアミノ酸配列を有する化合物を採取することと、
を含む、抗グラム陰性菌化合物の製造方法。
【化３】
2020090045.tif 000007
【請求項２３】
Bacillus subtilis MT2株（受託番号：NITE  BP-02767）を培養することと、
前記Bacillus subtilis MT2株（受託番号：NITE  BP-02767）が産生した下記化学式に示すアミノ酸配列を有する化合物を採取することと、
を含む、抗グラム陰性菌化合物の製造方法。
【化４】
2020090045.tif 000008
【請求項２４】
抗グラム陰性菌薬の製造における請求項１から１３のいずれか１項に記載の抗グラム陰性菌バクテリオシンの使用。
【請求項２５】
抗グラム陰性菌薬の製造における請求項１６に記載の枯草菌の使用。
【請求項２６】
抗グラム陰性菌薬の製造におけるBacillus subtilis MT2株（受託番号：NITE  BP-02767）の使用。
【請求項２７】
請求項１から１３のいずれか１項に記載の抗グラム陰性菌化合物を患者に投与することを含む、腸炎の治療方法。
【請求項２８】
請求項１６に記載の枯草菌を患者に投与することを含む、腸炎の治療方法。
【請求項２９】
Bacillus subtilis MT2株（受託番号：NITE  BP-02767）を患者に投与することを含む、腸炎の治療方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗グラム陰性菌化合物に関する。
【背景技術】
【０００２】
細菌が産生する抗菌作用を有するペプチドやタンパク質は、バクテリオシンとして知られている。バクテリオシンは天然由来物質であることから、合成物質からなる抗菌剤と比較して人体への影響が低いと考えられており、乳酸菌であるLactococcus lactisが産生するバクテリオシンであるナイシン(Nisin)は、世界の多くの国で、保存料として食品に添加することが認められている（例えば、特許文献１、２参照。）。【０００３】
バクテリオシンは、産生菌の類縁菌に対して抗菌作用を有することが知られている。そのため、一般に、グラム陽性菌由来のバクテリオシンは、グラム陽性菌である産生菌の類縁菌に対しては抗菌作用を有するが、グラム陰性菌に対しては抗菌作用を有しないものと考えられている。【０００４】
上述したナイシンも、グラム陽性菌に対しては抗菌作用を有するが、グラム陰性菌に対しては抗菌作用を有しない。そのため、ナイシンは、例えば魚介類による食中毒の原因菌である腸炎ビブリオに対する抗菌作用がない。ナイシン以外のバクテリオシンについても、例えば、サブチリン(Subtilin)及びエンチアニン(Entianin)は、グラム陽性菌に対しては抗菌作用を有するが、グラム陰性菌に対しては抗菌作用を有しない。これは、グラム陰性菌の外膜が、グラム陽性菌由来のバクテリオシンに対するバリアをなしているためと考えられている（例えば、非特許文献１から３参照。）。【０００５】
また、グラム陽性菌由来のバクテリオシンは、真菌に対しても抗菌作用を有しないものと考えられている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特許第４１１１４８９号公報
【特許文献２】特許第５７３８５６１号公報
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】J. Barbosa, et al., “Class I and Class II Lanthipeptides Produced by Bacillus spp.”, J. Nat. Prod. 2015, 78, 2850?2866
【非特許文献２】C. V. Prudencio, et al., “Strategies for the use of bacteriocins in Gram-negative bacteria: relevance in food microbiology”, J Food Sci Technol (September 2015), 52(9):5408-5417
【非特許文献３】善藤威史ら、「乳酸菌バクテリオシンの探索と利用」、Japanese Journal of Lactic Acid Bacteria, Vol. 25, No. 1, 2014, Japan Society for Lactic Acid Bacteria
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
上述したように、従来のバクテリオシンは、産生菌の類縁菌に対してのみ抗菌作用を有するため、抗菌スペクトルが狭い。本発明はこのような事情に鑑みてなされたものであり、抗菌スペクトルが広い抗菌化合物を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明の一側面に係る抗グラム陰性菌化合物は、下記化学式１に示すアミノ酸配列を有する。
【化１】
2020090045.tif 000003
【００１０】
また、本発明の一側面に係る抗グラム陰性菌薬は、上記化学式１に示すアミノ酸配列を有する抗グラム陰性菌化合物を含む。【００１１】
また、本発明の一側面に係る飲料又は食料は、上記化学式１に示すアミノ酸配列を有する抗グラム陰性菌化合物を含む。【００１２】
また、本発明の一側面に係る枯草菌(Bacillus subtilis)は、上記化学式１に示すアミノ酸配列を有する化合物を産生することができる枯草菌である。【００１３】
また、本発明の一側面に係る抗グラム陰性菌薬は、上記化学式１に示すアミノ酸配列を有する化合物を産生することができる枯草菌を含む。【００１４】
また、本発明の一側面に係る飲料又は食料は、上記化学式１に示すアミノ酸配列を有する化合物を産生することができる枯草菌を含む。【００１５】
また、本発明の一側面に係る枯草菌は、Bacillus subtilis MT2株（受託番号：NITE  BP-02767）である。【００１６】
また、本発明の一側面に係る抗グラム陰性菌薬は、Bacillus subtilis MT2株（受託番号：NITE  BP-02767）を含む。【００１７】
また、本発明の一側面に係る飲料又は食料は、Bacillus subtilis MT2株（受託番号：NITE  BP-02767）を含む。【００１８】
また、本発明の一側面に係る抗グラム陰性菌化合物の製造方法は、枯草菌を培養することと、枯草菌が産生した上記化学式１に示すアミノ酸配列を有する化合物を採取することと、を含む。【００１９】
また、本発明の一側面に係る抗グラム陰性菌化合物の製造方法は、Bacillus subtilis MT2株（受託番号：NITE  BP-02767）を培養することと、Bacillus subtilis MT2株（受託番号：NITE  BP-02767）が産生した上記化学式１に示すアミノ酸配列を有する化合物を採取することと、を含む。【００２０】
また、本発明の一側面に係る使用は、抗グラム陰性菌薬の製造における上記化学式１に示すアミノ酸配列を有する抗グラム陰性菌化合物の使用である。【００２１】
また、本発明の一側面に係る使用は、抗グラム陰性菌薬の製造における上記化学式１に示すアミノ酸配列を有する化合物を産生することができる枯草菌の使用である。【００２２】
また、本発明の一側面に係る使用は、抗グラム陰性菌薬の製造におけるBacillus subtilis MT2株（受託番号：NITE  BP-02767）の使用である。【００２３】
また、本発明の一側面に係る腸炎の治療方法は、上記化学式１に示すアミノ酸配列を有する抗グラム陰性菌化合物を患者に投与することを含む。【００２４】
また、本発明の一側面に係る腸炎の治療方法は、上記化学式１に示すアミノ酸配列を有する化合物を産生することができる枯草菌を患者に投与することを含む。【００２５】
また、本発明の一側面に係る腸炎の治療方法は、Bacillus subtilis MT2株（受託番号：NITE  BP-02767）を患者に投与することを含む。
【発明の効果】
【００２６】
本発明によれば、抗菌スペクトルが広い抗菌化合物を提供することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１】図１（ａ）はバクテリオシンの生産遺伝子を示し、図１（ｂ）はバクテリオシンのプレペプチドを示し、図１（ｃ）はバクテリオシン（活性ペプチド）を示す。
【図２】ＡＮＩ法によるBacillus subtilis MT2株の全ゲノム配列と、Bacillus subtilis subsp. subtilis 168の全ゲノム配列と、の相同解析の結果を示すグラフである。
【図３】ＡＮＩ法によるBacillus subtilis MT2株の全ゲノム配列と、Bacillus subtilis subsp. subtilis 6051-HGWの全ゲノム配列と、の相同解析の結果を示すグラフである。
【図４】ＡＮＩ法によるBacillus subtilis MT2株の全ゲノム配列と、Bacillus subtilis subsp. spizizenii W23の全ゲノム配列と、の相同解析の結果を示すグラフである。
【図５】ＡＮＩ法によるBacillus subtilis MT2株の全ゲノム配列と、Bacillus tequilensis FJAT-14262aの全ゲノム配列と、の相同解析の結果を示すグラフである。
【図６】バクテリオシンの質量分析結果を示すグラフである。
【図７】バクテリオシンの抗菌活性を示すグラフである。
【図８】バクテリオシンの抗菌活性を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００２８】
以下、本発明の実施の形態について詳細に説明する。なお以下の示す実施の形態は、この発明の技術的思想を具体化するための装置や方法を例示するものであって、この発明の技術的思想は構成部材の組み合わせ等を下記のものに特定するものではない。この発明の技術的思想は、特許請求の範囲において種々の変更を加えることができる。
【００２９】
本実施形態に係る抗グラム陰性菌化合物は、下記化学式２に示すアミノ酸配列を有する。下記化学式２に示すアミノ酸配列は、C150H231N39O38S5である。本実施形態に係る抗グラム陰性菌化合物は、グラム陰性菌、真菌、及びグラム陽性菌に対し抗菌作用を有する。
【化２】
2020090045.tif 000004
【００３０】
本実施形態に係る抗グラム陰性菌化合物が抗菌作用を示すグラム陰性菌の例としては、ビブリオ属細菌が挙げられる。ビブリオ属細菌の例としては、腸炎ビブリオ、コレラ菌、Ｎｏｎ  Ｏ１コレラ菌、ビブリオ・ミミカス(Vibrio mimicus)、ビブリオ・フルビアリス(Vibrio fluvialis)、ビブリオ・バルニフィカス(Vibrio vulnificus)、ビブリオ・アルギノリチカス(Vibrio alginolyticus)、ビブリオ・パラヘモリチカス(Vibrio parahaemolyticus)、及びビブリオ・ファニシイ(Vibrio furnissii)が挙げられる。
【００３１】
本実施形態に係る抗グラム陰性菌化合物が抗菌作用を示す真菌の例としては、トリコフィトン属菌が挙げられる。トリコフィトン属菌の例としては、白癬菌（紅色菌）(Trichophyton rubrum)、毛瘡菌、趾間菌(Trichophyton mentagrophytes)、トリコフィトン(Trichophyton spp.)、及びトリコフィトン・ベルコーズム(Trichophyton verrucosum)が挙げられる。
【００３２】
本実施形態に係る抗グラム陰性菌化合物が抗菌作用を示すグラム陽性菌の例としては、バシラス属菌が挙げられる。バシラス属菌の例としては、枯草菌(Bacillus subtilis)、セレウス菌(Bacillus cereus)、炭疸菌(Bacillus anthracis)、及びバシラス・ステアロサーモフィラス(Bacillus stearothermophilus)が挙げられる。枯草菌は、醤油や味噌の製造過程で有害である。
【００３３】
本実施形態に係る抗グラム陰性菌化合物は、例えば枯草菌から産生される。本実施形態に係る抗グラム陰性菌化合物は、グラム陽性菌である枯草菌由来であるが、グラム陰性菌及び真菌に対して、グラム陽性菌に対する抗菌作用と同等の抗菌作用を有する。そのため、本実施形態に係る抗グラム陰性菌化合物は、グラム陰性菌に対する抗菌作用を補助する処置と併用されなくともよい。
【００３４】
グラム陰性菌に対する抗菌作用を補助する処置としては、食品保存料等の保存料の添加が挙げられる。保存料としては、キレート剤、界面活性剤、酸及び塩が挙げられる。キレート剤の例としては、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）が挙げられる。界面活性剤の例としてはＴｗｅｅｎ  ８０が挙げられる。酸及び塩の例としては、乳酸、クエン酸、ピロリン酸、グルコン酸、酢酸、ニトリロ三酢酸、次亜塩素酸、ソルビン酸、安息香酸及びポリリン酸(polyphosphoric acid)、並びにそれらの塩や、リン酸三ナトリウム(tri-sodium phosphate)が挙げられる。
【００３５】
保存料は、グラム陰性菌の外膜を不安定化すると考えられている。従来、グラム陽性菌由来のバクテリオシンでグラム陰性菌を殺菌するためには、このような保存料との併用が必要と考えられていた。これに対し、本実施形態に係る抗グラム陰性菌化合物は、保存料と併用されなくても、グラム陰性菌に対する有効な抗菌作用を示すことが可能である。
【００３６】
また、グラム陰性菌に対する抗菌作用を補助する処置としては、植物精製油(plant essential oil)の添加が挙げられる。植物精製油の例としては、オレガノ精製油及びタイム精製油が挙げられる。植物精製油に含まれるチモールやカルバクロールが、グラム陰性菌の外膜を不安定化すると考えられている。しかし、本実施形態に係る抗グラム陰性菌化合物は、植物精製油と併用されなくても、グラム陰性菌に対する有効な抗菌作用を示すことが可能である。
【００３７】
また、グラム陰性菌に対する抗菌作用を補助する処置としては、高圧処理が挙げられる。高圧処理とは、例えば、３０ＭＰａ以上の圧力を加える処理である。高圧処理が、グラム陰性菌の外膜を不安定化すると考えられている。しかし、本実施形態に係る抗グラム陰性菌化合物は、高圧処理と併用されなくても、グラム陰性菌に対する有効な抗菌作用を示すことが可能である。
【００３８】
また、グラム陰性菌に対する抗菌作用を補助する処置としては、高温及び低温処理が挙げられる。高温及び低温処理が、グラム陰性菌の外膜を不安定化すると考えられている。また、グラム陰性菌に対する抗菌作用を補助する処置としては、パルス電界処理が挙げられる。パルス電界処理は、グラム陰性菌の温度を上げるため、高温処理と同様の効果があると考えられる。しかし、本実施形態に係る抗グラム陰性菌化合物は、高温処理、低温処理、又はパルス電界処理と併用されなくても、グラム陰性菌に対する有効な抗菌作用を示すことが可能である。
【００３９】
本実施形態に係る抗グラム陰性菌化合物を産生可能な枯草菌は、例えば、図１（ａ）及び配列番号１に示すバクテリオシンの生産遺伝子を有する。配列番号１において、１位から７２位は、リーダーペプチドをコードしている。当該リーダーペプチドをコードしている部分を除いた遺伝子配列を配列番号２に示す。本実施形態に係る抗グラム陰性菌化合物を産生可能な枯草菌は、配列番号２に示す遺伝子配列を有していてもよい。
【００４０】
図１（ａ）及び配列番号１に示す生産遺伝子が転写、翻訳され、図１（ｂ）及び配列番号３に示すバクテリオシンのプレペプチドが産生される。配列番号３において、１位から２４位は、リーダーペプチドである。当該リーダーペプチドを除いたアミノ酸配列を配列番号４に示す。
【００４１】
図１（ｂ）及び配列番号３に示すバクテリオシンのプレペプチドが翻訳後修飾され、リーダーペプチドが切断されることにより、図１（ｃ）及び上記化学式２に示す配列を有する活性型ペプチドが産生される。
【００４２】
配列番号４に示すプレペプチドの３位のセリンが、活性型ペプチドではアラニンに置換される。配列番号４に示すプレペプチドの５位のセリンが、活性型ペプチドではデヒドロアラニンに置換される。配列番号４に示すプレペプチドの７位のシステインが、活性型ペプチドではアラニンに置換される。配列番号４に示すプレペプチドの８位のトレオニンが、活性型ペプチドではアミノ酪酸に置換される。
【００４３】
配列番号４に示すプレペプチドの１１位のシステインが、活性型ペプチドではアラニンに置換される。配列番号４に示すプレペプチドの１３位のトレオニンが、活性型ペプチドではアミノ酪酸に置換される。配列番号４に示すプレペプチドの１８位のトレオニンが、活性型ペプチドではデヒドロブチリンに置換される。配列番号４に示すプレペプチドの１９位のシステインが、活性型ペプチドではアラニンに置換される。
【００４４】
配列番号４に示すプレペプチドの２３位のトレオニンが、活性型ペプチドではアミノ酪酸に置換される。配列番号４に示すプレペプチドの２５位のトレオニンが、活性型ペプチドではアミノ酪酸に置換される。配列番号４に示すプレペプチドの２６位のシステインが、活性型ペプチドではアラニンに置換される。配列番号４に示すプレペプチドの２８位のシステインが、活性型ペプチドではアラニンに置換される。配列番号４に示すプレペプチドの３１位のセリンが、活性型ペプチドではデヒドロアラニンに置換される。
【００４５】
活性型ペプチドにおいては、配列番号４に示すプレペプチドの３位のセリンに対応するアラニンと、配列番号４に示す７位のシステインに対応するアラニンと、が、チオエーテル結合して、ランチオニンをなしている。
【００４６】
活性型ペプチドにおいては、配列番号４に示すプレペプチドの８位のトレオニンに対応するアミノ酪酸と、配列番号４に示す１１位のシステインに対応するアラニンと、が、チオエーテル結合して、３−メチルランチオニンをなしている。
【００４７】
活性型ペプチドにおいては、配列番号４に示すプレペプチドの１３位のトレオニンに対応するアミノ酪酸と、配列番号４に示す１９位のシステインに対応するアラニンと、が、チオエーテル結合して、３−メチルランチオニンをなしている。
【００４８】
活性型ペプチドにおいては、配列番号４に示すプレペプチドの２３位のトレオニンに対応するアミノ酪酸と、配列番号４に示す２６位のシステインに対応するアラニンと、が、チオエーテル結合して、３−メチルランチオニンをなしている。
【００４９】
活性型ペプチドにおいては、配列番号４に示すプレペプチドの２５位のトレオニンに対応するアミノ酪酸と、配列番号４に示す２８位のシステインに対応するアラニンと、が、チオエーテル結合して、３−メチルランチオニンをなしている。
【００５０】
本実施形態に係る抗グラム陰性菌化合物を産生可能な枯草菌の一つであるBacillus subtilis MT2株は、独立行政法人製品評価技術基盤機構（日本、郵便番号２９２−０８１８、千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８  １２２号室）に国際寄託されており、受託番号はNITE  BP-02767である。Bacillus subtilis MT2株は、２０１８年８月２２日（国内寄託日）に、独立行政法人製品評価技術基盤機構（日本）に国内寄託されており、２０１８年１０月４日に、独立行政法人製品評価技術基盤機構（日本）に対し、ブダペスト条約に基づく国際寄託への移管請求をした。
【００５１】
本実施形態に係る抗グラム陰性菌化合物は、医薬品に含有されてもよい。本実施形態に係る抗グラム陰性菌化合物を含有する医薬品は、グラム陰性菌、グラム陽性菌及び真菌の消毒薬として使用可能である。また、本実施形態に係る抗グラム陰性菌化合物を含有する医薬品は、肺炎、食中毒及び腸炎の治療薬として使用可能である。さらに、本実施形態に係る抗グラム陰性菌化合物を含有する医薬品は、白癬、カンジダ症、クリプトコックス症、及びアスペルギルス症等の真菌症の治療薬として使用可能である。
【００５２】
医薬品は、有効量の本実施形態に係る抗グラム陰性菌化合物を含む。有効量とは、抗菌作用を奏するために必要な量であり、対象とする菌、症状、患者の年齢、患者の体重、及び患者の性別等によって適宜決定される。
【００５３】
本実施形態に係る抗グラム陰性菌化合物を含有する医薬品は、例えば、錠剤、カプセル、液体、クリーム、軟膏、硬膏、ジェル、ワックス、及びスプレーであってもよい。また、本実施形態に係る抗グラム陰性菌化合物を含有する医薬品は、例えば、消毒薬、内服薬、塗布治療薬等の皮膚外用薬、及び点眼剤として供される。本実施形態に係る抗グラム陰性菌化合物を含有する医薬品は、例えば、腸等の内蔵、手足指を含む人体の皮膚、毛、口腔、及び眼球等に適用される。また、本実施形態に係る抗グラム陰性菌化合物を含有する消毒薬は、例えば、食品、調理器具、病院等の建物の壁や床、及び机等の家具にも適用される。
【００５４】
本実施形態に係る抗グラム陰性菌化合物を含有する医薬品は、液体油脂、固体油脂、ロウ、炭化水素、高級脂肪酸、高級アルコール、エステル、シリコーン、保湿剤、水溶性高分子、増粘剤、被膜剤、金属イオン封鎖剤、低級アルコール、多価アルコール、糖類、アミノ酸類、有機アミン類、ｐＨ調整剤、皮膚栄養剤、ビタミン類、香料、粉体、色材、及び水等の医薬品の配合成分を目的に応じて適宜含んでいてもよい。
【００５５】
本実施形態に係る抗グラム陰性菌化合物は、飲料又は食料に含有されてもよい。また、本実施形態に係る抗グラム陰性菌化合物は、歯磨き粉及び口腔清浄剤等に含有されてもよい。
【００５６】
本実施形態に係る抗グラム陰性菌化合物を産生することができる枯草菌は、医薬品、飲料又は食品に含有されてもよい。例えば、医薬品、飲料又は食品に含有される枯草菌が抗グラム陰性菌化合物を産生し、グラム陰性菌、真菌、及びグラム陽性菌に対し抗菌作用を発揮する。本実施形態に係る抗グラム陰性菌化合物を産生することができる枯草菌を含有する医薬品の対象疾患、形状、及び用法等は、本実施形態に係る抗グラム陰性菌化合物を含有する医薬品と同様である。
【００５７】
Bacillus subtilis MT2株（受託番号：NITE  BP-02767）は、医薬品、飲料又は食品に含有されてもよい。Bacillus subtilis MT2株（受託番号：NITE  BP-02767）を含有する医薬品の対象疾患、形状、及び用法等は、本実施形態に係る抗グラム陰性菌化合物を含有する医薬品と同様である。
【００５８】
本実施形態に係る抗グラム陰性菌化合物は、例えば、枯草菌を培地中で培養し、枯草菌が培地中に産生した上記化学式２に示すアミノ酸配列を有するペプチドを採取することにより製造されてもよい。培地からペプチドを採取、精製する方法は、特に限定されない。本実施形態に係る抗グラム陰性菌化合物は、化学的に合成されてもよい。
【００５９】
以上のとおり、本発明の各実施形態に係る抗グラム陰性菌化合物等は、上述したいずれか１つ又は複数の組み合わせによる以下の例による構成及び作用効果を有する。
【００６０】
本実施形態に係る抗グラム陰性菌化合物は、上記化学式２に示すアミノ酸配列を有する、抗グラム陰性菌化合物である。本実施形態に係る抗グラム陰性菌化合物は、グラム陰性菌、グラム陽性菌、及び真菌に対して抗菌作用を有する。
【００６１】
本実施形態に係る抗グラム陰性菌化合物は、枯草菌(Bacillus subtilis)から産生されてもよい。また、本実施形態に係る抗グラム陰性菌化合物は、Bacillus subtilis MT2株（受託番号：NITE  BP-02767）から産生されてもよい。本実施形態に係る抗グラム陰性菌化合物は、グラム陽性菌である枯草菌由来であるにも関わらず、グラム陰性菌に対して抗菌作用を有する。
【００６２】
本実施形態に係る抗グラム陰性菌化合物が抗菌作用を示すグラム陰性菌は、ビブリオ属細菌であってもよい。ビブリオ属細菌は腸炎ビブリオであってもよい。
【００６３】
本実施形態に係る抗グラム陰性菌化合物が抗菌作用を示すグラム陰性菌が抗菌作用を示す真菌は、トリコフィトン属菌であってもよい。トリコフィトン属菌は、白癬菌と、毛瘡菌又は趾間菌と、であってもよい。
【００６４】
本実施形態に係る抗グラム陰性菌化合物は、グラム陰性菌に対する抗菌作用を補助する処置と併用されなくともよい。グラム陰性菌に対する抗菌作用を補助する処置が、保存料の添加であってもよい。保存料が、キレート剤であってもよい。本実施形態に係る抗グラム陰性菌化合物は、グラム陰性菌に対する抗菌作用を補助する処置と併用されなくとも、グラム陽性菌に対する抗菌作用と同等の、グラム陰性菌に対する抗菌作用を有する。
【００６５】
本実施形態に係る抗グラム陰性菌薬は、上記の抗グラム陰性菌化合物を含んでいてもよい。本実施形態に係る飲料又は食料は、上記の抗グラム陰性菌化合物を含んでいてもよい。
【００６６】
本実施形態に係る枯草菌(Bacillus subtilis)は、上記化学式２に示すアミノ酸配列を有する化合物を産生することができる枯草菌であってもよい。
【００６７】
本実施形態に係る抗グラム陰性菌薬は、上記化学式２に示すアミノ酸配列を有する化合物を産生することができる枯草菌を含んでいてもよい。本実施形態に係る飲料又は食料は、上記化学式２に示すアミノ酸配列を有する化合物を産生することができる枯草菌を含んでいてもよい。
【００６８】
本実施形態に係る枯草菌は、Bacillus subtilis MT2株（受託番号：NITE  BP-02767）であってもよい。
【００６９】
本実施形態に係る抗グラム陰性菌薬は、上記のBacillus subtilis MT2株（受託番号：NITE  BP-02767）を含んでいてもよい。本実施形態に係る飲料又は食料は、上記のBacillus subtilis MT2株（受託番号：NITE  BP-02767）を含んでいてもよい。
【００７０】
本実施形態に係る抗グラム陰性菌化合物の製造方法は、枯草菌(Bacillus subtilis)を培養することと、枯草菌が産生した上記化学式２に示すアミノ酸配列を有する化合物を採取することと、を含んでいてもよい。
【００７１】
本実施形態に係る抗グラム陰性菌化合物の製造方法は、Bacillus subtilis MT2株（受託番号：NITE  BP-02767）を培養することと、Bacillus subtilis MT2株（受託番号：NITE  BP-02767）が産生した上記化学式２に示すアミノ酸配列を有する化合物を採取することと、を含んでいてもよい。
【００７２】
本実施形態は、抗グラム陰性菌薬の製造における上記の抗グラム陰性菌バクテリオシンの使用であってもよい。
【００７３】
本実施形態は、抗グラム陰性菌薬の製造における上記化学式２に示すアミノ酸配列を有する化合物を産生することができる枯草菌の使用であってもよい。
【００７４】
本実施形態は、抗グラム陰性菌薬の製造におけるBacillus subtilis MT2株（受託番号：NITE  BP-02767）の使用であってもよい。
【００７５】
本実施形態に係る腸炎の治療方法は、上記の抗グラム陰性菌化合物を患者に投与することを含んでいてもよい。本実施形態に係る腸炎の治療方法は、上記化学式２に示すアミノ酸配列を有する化合物を産生することができる枯草菌を患者に投与することを含んでいてもよい。本実施形態に係る腸炎の治療方法は、Bacillus subtilis MT2株（受託番号：NITE  BP-02767）を患者に投与することを含んでいてもよい。腸炎が食中毒であってもよい。
【００７６】
なお、以上説明した各実施形態は、本発明の理解を容易にするためのものであり、本発明を限定して解釈するためのものではない。本発明は、その趣旨を逸脱することなく、変更／改良され得るととともに、本発明にはその等価物も含まれる。すなわち、各実施形態に当業者が適宜設計変更を加えたものも、本発明の特徴を備えている限り、本発明の範囲に包含される。例えば、各実施形態が備える各要素、材料、条件、及び形状などは、例示したものに限定されるわけではなく適宜変更することができる。また、各実施形態は例示であり、異なる実施形態で示した構成の部分的な置換または組み合わせが可能であることは言うまでもなく、これらも本発明の特徴を含む限り本発明の範囲に包含される。
【実施例】
【００７７】
以下に本発明の実施例を説明する。ただし、本発明は以下の実施例に限定されないことはもちろんである。【００７８】
（実施例１：ヨモギ発酵液の調製）
ヨモギの葉においては、一日のうち、日の出時間を挟む前後１時間、合計２時間の間に、乳酸菌の数が最大化するとされている。また、この時間帯以外においては、乳酸菌が減少し、光合成菌が増加するとされている。したがって、この２時間の間に、ヨモギの葉の先端から約２０ｃｍの部分を採取した。採取した６．３ｋｇのヨモギの葉を、すぐさま、中にビニールの袋を敷いた第１の漬物樽に入れ、ヨモギの葉に、３．２ｋｇの糖蜜と０．６ｋｇの粗塩を振りかけた後、ビニール袋の口を閉じて密封した。ビニール袋の上から、重石を載せ、ヨモギの葉を漬け込んだ。【００７９】
漬け汁がヨモギの葉の上まで上がった数日後、重石を外した。次に、第２の漬物樽に、すすぎ洗い出し用の塩素を含まない１０Ｌの水を入れ、水の中に、ヨモギの葉の漬物と、１０ｋｇの漬け汁を入れた。さらに、第３の漬物樽を用意し、第３の漬物樽の開口上に金網フィルターを載せた。第２の漬物樽から、手でもみ洗いしながら少しずつヨモギの葉を取り出し、第３の漬物樽の開口上の金網フィルターにヨモギの葉を軽く掌で押さえて、漬け汁を絞った。【００８０】
ヨモギの葉を全て絞った後、第２の漬物汁に残っていた漬け汁を金網フィルターに通してろ過した。次に、第３の漬物樽の中の漬け汁に、糖蜜（波照間黒糖）を終濃度が１０重量％となるよう、また粗塩を終濃度が３重量％となるよう溶かし入れた。その後、第３の漬物樽の周囲温度を約３０℃にすることにより、発酵を開始させた。最初に大きな泡の発泡が確認され、徐々に細かい泡の発泡に変わっていき、最後に発泡が収まった。約１週間後、発泡が収まった時のｐＨは、３．８付近であった。このときの漬け汁を、ヨモギ発酵液とした。【００８１】
（実施例２：枯草菌の調製）
ラクトバチリＭＲＳ培地（：プロテオースペプトン１％、牛肉エキス１％、酵母エキス０．５％、ブドウ糖２％、Ｔｗｅｅｎ  ８０  ０．１％、クエン酸アンモニウム０．５％、硫酸マグネシウム０．０１％、硫酸マンガン０．００５％、リン酸二カリウム０．２％、ディフコ社製）にヨモギ発酵液を滴下し、ヨモギ発酵液に含まれる細菌を培地中で培養し、必要に応じて数回の継代培養を行った。その後、培養された細菌を、ラクトバチリＭＲＳ寒天培地（上記のＭＲＳ培地に寒天３％を添加した培地）に塗抹培養し、生じたコロニーから細菌を採取した。【００８２】
次に、採取した細菌から、有胞子性乳酸菌であるバチルス・コアグランス(Bacillus coagulans)に対する抗菌活性を指標として、Ｓｐｏｔ  ｏｎ  ｌａｗｎ検定法によって、抗菌性物質生産能を有する株を、Bacillus subtilis MT2株として選択した。選択したBacillus subtilis MT2株の菌学的性質を調べたところ、１６ＳリボソームＤＮＡ（ｒＤＮＡ）の塩基配列の相同性の解析により、枯草菌(Bacillus subtilis)と同定された。【００８３】
Bacillus subtilis MT2株の全ゲノム配列と、既存の枯草菌株の一種であるBacillus subtilis subsp. subtilis 168の全ゲノム配列と、の相同値の平均値を、ＡＮＩ（Ａｖｅｒａｇｅ  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｉｄｅｎｔｉｔｙ）法で算出したところ、図２に示すように、９８．５％であり、１．５％異なっていた。【００８４】
Bacillus subtilis MT2株の全ゲノム配列と、既存の枯草菌株の一種であるBacillus subtilis subsp. subtilis 6051-HGWの全ゲノム配列と、の相同値の平均値を、ＡＮＩ法で算出したところ、図３に示すように、９８．４９％であり、１．５１％異なっていた。【００８５】
Bacillus subtilis MT2株の全ゲノム配列と、既存の枯草菌株の一種であるBacillus subtilis subsp. spizizenii W23の全ゲノム配列と、の相同値の平均値を、ＡＮＩ法で算出したところ、図４に示すように、９２．０３％であり、７．９７％異なっていた。【００８６】
Bacillus subtilis MT2株の全ゲノム配列と、既存の枯草菌株の一種であるBacillus tequilensis FJAT-14262aの全ゲノム配列と、の相同値の平均値を、ＡＮＩ法で算出したところ、図５に示すように、９８．４９％であり、１．５１％異なっていた。【００８７】
以上示した既存の枯草菌株との比較から、Bacillus subtilis MT2株は枯草菌の新株であると考えられた。Bacillus subtilis MT2株は、独立行政法人製品評価技術基盤機構（日本）に国際寄託されて、受託番号：NITE  BP-02767が付与された。Bacillus subtilis MT2株は、配列番号１、２に示す遺伝子配列を有していた。【００８８】
（実施例３：バクテリオシンの調製）
Bacillus subtilis MT2株を、ラクトバチリＭＲＳ培地中、３５℃以上３７℃以下で好気的に３日間、振とう培養した。その後、菌体を含む培地を、１００００ｒｐｍで、２０分間、２５℃で遠心分離した。さらに、遠心分離された培地を、目開き０．４５μｍの滅菌フィルターでろ過して菌体を除去し、培養上澄液を得た。【００８９】
逆相シリカゲルカートリッジ（Ｓｅｐ−Ｐａｃ  Ｃ１８、ミリポア社製）を用いて、培養上澄液に含まれていたバクテリオシンを濃縮した。さらに、Ｓｅｐｈａｓｉｌ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｃ１８５μＳＴ（ファルマシア社製）を用いた逆相カラムクロマトグラフィーによって、活性バクテリオシン画分を分画した。【００９０】
マトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間型質量分析計（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳ  ｕｌｔｒａｆｌｅＸ  ＩＩＩ、ブルカー社製）を用いて、分画された活性バクテリオシンの質量分析を行ったところ、図６に示すように、精密分子量は約３３４６であった。なお、ターゲットプレートには、ＭＴＰ３８４  ｇｒｏｕｎｄ  ｓｔｅｅｌ  （Ｂｒｕｋｅｒ  ｄａｌｔｏｎｉｃｓ）を使用した。また、マトリックスとしては、種々検討したうえで、α−シアノ−４−ヒドロキシケイ皮酸（ＨＣＣＡ）を使用した。分画された活性バクテリオシンのアミノ酸配列を解析したところ、上記化学式２に示すアミノ酸配列を有していた。【００９１】
（実施例４：バクテリオシンの抗菌活性）
グラム陽性菌として枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ，  ＮＢＲＣ  ３１３４）、グラム陰性菌として腸炎ビブリオ（Ｖｉｂｒｉｏ  ｐａｒａｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ，  １２７１１Ｔ）を用意した。実施例３で調製した活性バクテリオシンを含む、ｐＨが７．８の１０ｍＬの液に、上記の菌のいずれかを１０７個／ｍＬの濃度で含む０．１ｍＬの菌液を接種し、２５℃で２４時間後の菌の生菌数を測定した。また、コントロールとして、濃度が０．０６７ｍｏｌ／Ｌ、ｐＨ７．２の１０ｍＬのリン酸緩衝液に０．１ｍＬの腸炎ビブリオ（Ｖｉｂｒｉｏ  ｐａｒａｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ，  １２７１１Ｔ）の菌液を接種し、２５℃で２４時間後の菌の生菌数を測定した。その結果、図７に示すように、活性バクテリオシンは、枯草菌及び腸炎ビブリオの両方を同程度減少させた。【００９２】
さらに、真菌として白癬菌（Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ  ｍｅｎｔａｇｒｏｐｈｙｔｅｓ，  ＮＢＲＣ  ６１２４）  を用意した。実施例３で調製した活性バクテリオシンを含む、ｐＨが７．８の１０ｍＬの液に、白癬菌を１０７個／ｍＬの濃度で含む０．１ｍＬの菌液を接種し、２５℃で２４時間後の菌の生菌数を測定した。また、コントロールとして、濃度が０．０６７ｍｏｌ／Ｌ、ｐＨ７．２の１０ｍＬのリン酸緩衝液に０．１ｍＬの白癬菌（Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ  ｍｅｎｔａｇｒｏｐｈｙｔｅｓ，  ＮＢＲＣ  ６１２４）の菌液を接種し、２５℃で２４時間後の菌の生菌数を測定した。その結果、図８に示すように、活性バクテリオシンは、白癬菌を減少させた。
【図１】
2020090045.tif 000010
【図２】
2020090045.tif 000011
【図３】
2020090045.tif 000012
【図４】
2020090045.tif 000013
【図５】
2020090045.tif 000014
【図６】
2020090045.tif 000015
【図７】
2020090045.tif 000016
【図８】
2020090045.tif 000017
【配列表】
2020090045000001.app
【手続補正書】
【提出日】令和3年4月30日(2021.4.30)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記化学式に示すアミノ酸配列を有する、抗グラム陰性菌化合物であって、前記グラム陰性菌が、ビブリオ属細菌を含む、抗グラム陰性菌化合物。
【化１】
2020090045.tif 000018
【請求項２】
枯草菌(Bacillus subtilis)から産生される、請求項１に記載の抗グラム陰性菌化合物。
【請求項３】
Bacillus subtilis MT2株（受託番号：NITE  BP-02767）から産生される、請求項１に記載の抗グラム陰性菌化合物。
【請求項４】
前記グラム陰性菌が、腸炎ビブリオをさらに含む、請求項１から３のいずれか１項に記載の抗グラム陰性菌化合物。
【請求項５】
真菌に対しさらに抗菌作用を有する、請求項１から４のいずれか１項に記載の抗グラム陰性菌化合物。
【請求項６】
前記真菌が、トリコフィトン属菌である、請求項５に記載の抗グラム陰性菌化合物。
【請求項７】
前記真菌が、白癬菌である、請求項５に記載の抗グラム陰性菌化合物。
【請求項８】
前記真菌が、毛瘡菌又は趾間菌である、請求項５に記載の抗グラム陰性菌化合物。
【請求項９】
グラム陽性菌に対しさらに抗菌作用を有する、請求項１から８のいずれか１項に記載の抗グラム陰性菌化合物。
【請求項１０】
グラム陰性菌に対する抗菌作用を補助する処置と併用されない、請求項１から９のいずれか１項に記載の抗グラム陰性菌化合物。
【請求項１１】
前記処置が、保存料の添加である、請求項１０に記載の抗グラム陰性菌化合物。
【請求項１２】
前記保存料が、キレート剤である、請求項１１に記載の抗グラム陰性菌化合物。
【請求項１３】
請求項１から１２のいずれか１項に記載の抗グラム陰性菌化合物を含む抗グラム陰性菌薬。
【請求項１４】
請求項１から１２のいずれか１項に記載の抗グラム陰性菌化合物を含む飲料又は食料。
【請求項１５】
下記化学式に示すアミノ酸配列を有する化合物を産生することができる枯草菌(Bacillus subtilis)。
【化２】
2020090045.tif 000019
【請求項１６】
請求項１５に記載の枯草菌を含む抗グラム陰性菌薬であって、前記グラム陰性菌が、ビブリオ属細菌を含む、抗グラム陰性菌薬。
【請求項１７】
請求項１６に記載の抗グラム陰性菌薬を含む飲料又は食料。
【請求項１８】
Bacillus subtilis MT2株（受託番号：NITE  BP-02767）。
【請求項１９】
Bacillus subtilis MT2株（受託番号：NITE  BP-02767）を含む抗グラム陰性菌薬。
【請求項２０】
Bacillus subtilis MT2株（受託番号：NITE  BP-02767）を含む飲料又は食料。
【請求項２１】
枯草菌(Bacillus subtilis)を培養することと、
前記枯草菌が産生した下記化学式に示すアミノ酸配列を有する化合物を採取することと、
を含む、抗グラム陰性菌化合物の製造方法であって、前記グラム陰性菌が、ビブリオ属細菌を含む、抗グラム陰性菌化合物の製造方法。
【化３】
2020090045.tif 000020
【請求項２２】
Bacillus subtilis MT2株（受託番号：NITE  BP-02767）を培養することと、
前記Bacillus subtilis MT2株（受託番号：NITE  BP-02767）が産生した下記化学式に示すアミノ酸配列を有する化合物を採取することと、
を含む、抗グラム陰性菌化合物の製造方法。
【化４】
2020090045.tif 000021
【請求項２３】
抗グラム陰性菌薬の製造であって、前記グラム陰性菌が、ビブリオ属細菌を含む、抗グラム陰性菌薬の製造における請求項１から１２のいずれか１項に記載の抗グラム陰性菌化合物の使用。
【請求項２４】
抗グラム陰性菌薬の製造あって、前記グラム陰性菌が、ビブリオ属細菌を含む、抗グラム陰性菌薬の製造における請求項１５に記載の枯草菌の使用。
【請求項２５】
抗グラム陰性菌薬の製造におけるBacillus subtilis MT2株（受託番号：NITE  BP-02767）の使用。
【請求項２６】
請求項１から１２のいずれか１項に記載の抗グラム陰性菌化合物を含む、腸炎の治療薬。
【請求項２７】
請求項１５に記載の枯草菌を含む、腸炎の治療薬。
【請求項２８】
Bacillus subtilis MT2株（受託番号：NITE  BP-02767）を含む、腸炎の治療薬。
【国際調査報告】
2020090045.tif 000022
2020090045.tif 000023
2020090045.tif 000024
2020090045.tif 000025