(57)【要約】  本発明は、加熱式喫煙物品の煙中の粒子状物質を抽出する方法、抽出容器、抽出液、並びに抽出液を用いる毒性試験方法を提供することを目的とする。  本発明の方法は、（１）加熱式喫煙物品の煙中の粒子状物質を、粒子状物質を捕捉可能なフィルターを２枚以上に捕集し、（２）前記２枚以上のフィルターを重ね、そして、（３）重ねたフィルターを圧搾することによりフィルターに付着した成分を抽出する、ことを含む。本発明の抽出容器１ａは、２枚以上のフィルター７を重ねた状態で収容可能な収容部８と、収容部８に重ねた状態で収容されたフィルター７を圧搾する１または複数の圧搾部材（２ａ、３ａ）と、収容部８と連通するリザーバー１０とを含む。
2020080529.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
加熱式喫煙物品の煙中の粒子状物質を抽出する方法であって、
（１）加熱式喫煙物品の煙中の粒子状物質を、粒子状物質を捕捉可能なフィルターを２枚以上に捕集し、
（２）前記２枚以上のフィルターを重ね、そして、
（３）重ねたフィルターを圧搾することによりフィルターに付着した成分を抽出する、
ことを含む、前記方法。
【請求項２】
（３）の工程を、
（３−ｉ）前記重ねたフィルターを圧縮し、復帰させる、
（３−ｉｉ）前記重ねたフィルターを圧縮してフィルターに付着した成分を抽出し、抽出液を重ねたフィルターにかけて、再び圧縮する、あるいは、
（３−ｉｉｉ）（３−ｉ）と（３−ｉｉ）を組み合わせて行う
ことによって行う、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
（３−ｉ）の前記重ねたフィルターの圧縮復帰を２回以上繰り返す、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
（３−ｉ）および／または（３−ｉｉ）の工程の際に、フィルターと抽出液とを振とうする、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
（３−ｉｉ）前記重ねたフィルターを圧縮してフィルターに付着した成分を抽出し、抽出液を重ねたフィルターにかけ戻して、再び圧縮することを、２回以上繰り返す、請求項２に記載の方法。
【請求項６】
工程（３）を、２つの圧搾面を有する抽出容器内にフィルターを収めて行う、請求項１−５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
工程（３）において、圧搾により抽出された抽出液を流動または循環させる、請求項１−６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
フィルターを３枚以上使用する、請求項１−７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
フィルターを１０枚−１５枚使用する、請求項１−８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
重ねたフィルターの厚さが工程（３）を行う前の１／３以下になるまで、工程（３）を繰り返す、請求項１−９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
工程（３）において溶媒を使用しない、請求項１−１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
工程（３）において、フィルター容積に対して０％（重量／容積）より多く、４００％（重量／容積）以下の量の両親媒性溶媒を加える、請求項１−１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
圧縮を１０ＭＰａ以下で行う、請求項１−１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
フィルターがガラス繊維フィルターである、請求項１−１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
フィルターが、定格風量で、粒径が０．３μｍの粒子に対して９９％以上の粒子捕集率を有するフィルターである、請求項１−１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
さらに、
（４）フィルターを遠心分離し分離液を得る；そして
（５）工程（３）で得られた抽出液に分離液を混合する
ことを含む、請求項１−１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
２枚以上のフィルターを重ねた状態で収容可能な収容部と、
前記収容部に重ねた状態で収容されたフィルターを圧搾する１または複数の圧搾部材と、
前記収容部と連通するリザーバーと
を含む、抽出容器。
【請求項１８】
前記圧搾部材によりフィルターを圧搾する圧搾面の形状が、平面、錐形の斜面または凸状若しくは凹状の曲面、のいずれかである、請求項１７の抽出容器。
【請求項１９】
前記圧搾部材によりフィルターを圧搾する圧搾面が２面ある、請求項１７または１８の抽出容器。
【請求項２０】
２つの前記圧搾面が互いに回転摺動する、請求項１９の抽出容器。
【請求項２１】
前記リザーバーが、前記収容部の上方および下方の少なくともいずれかに配置される、請求項１７−２０に記載の抽出容器。
【請求項２２】
前記リザーバーが前記収容部の外周に設けられている、請求項１７−２０のいずれか１項に記載の抽出容器。
【請求項２３】
前記リザーバーは前記圧搾面の少なくとも１つを貫通する細管を通して前記収容部と連通している、請求項１７−２１のいずれか１項に記載の抽出容器。
【請求項２４】
前記圧搾部材の圧搾面に溝が設けられている、請求項１７−２３のいずれか１項に記載の抽出容器。
【請求項２５】
前記圧搾部材を２つ有し、該２つの圧搾部材は各々の圧搾面を対向させた状態で移動可能であり、
前記２つの圧搾部材の各々対向する圧搾面の間の空間が前記収容部を画成する、請求項１７−２４のいずれか１項に記載の抽出容器。
【請求項２６】
前記２つの圧搾部材のうち一方が凹部を有し、該凹部の内側底面が圧搾面を形成し、
前記２つの圧搾部材のうち他方がその圧搾面を前記内側底面に向けた状態で前記凹部内を液密に摺動可能である、請求項２５に記載の抽出容器。
【請求項２７】
注射器型のシリンダー部材と、
前記シリンダー部材の中空空間を基端側空間と先端側空間とに仕切るように配置された、細孔を有するふるい部材と、
前記シリンダー部材の前記基端側空間を液密に摺動可能なピストン部材と、
を備え、
前記ふるい部材および前記ピストン部材は、それらの内側対向する面が圧搾面を各々形成して前記圧搾部材を構成し、
前記ピストン部材の圧搾面と前記ふるい部材の圧搾面との間の前記基端側空間の少なくとも一部が前記収容部を画成し、
前記先端側空間が前記リザーバーを画成する、
請求項１７−２０のいずれか１項に記載の抽出容器。
【請求項２８】
リザーバーに回収された抽出液が流動または循環される、請求項１７−２７のいずれか１項に記載の抽出容器。
【請求項２９】
請求項１−１６のいずれか１項に記載の方法に使用するための請求項１７−２８のいずれか１項に記載の抽出容器。
【請求項３０】
請求項１−１６のいずれか１項に記載の方法によって得られた、加熱式喫煙物品の煙中の粒子状物質を含む抽出液。
【請求項３１】
溶媒を含まない、請求項３０に記載の抽出液。
【請求項３２】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏの毒性試験に用いるための請求項３０または３１に記載の抽出液。
【請求項３３】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏの毒性試験が、小核試験またはエームズ試験である、請求項３２に記載の抽出液。
【請求項３４】
請求項１−１６のいずれか１項に記載の方法によって得られた、加熱式喫煙物品の煙中の粒子状物質を含む抽出液を用いる、ｉｎ ｖｉｔｒｏの毒性試験方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、たばこ製造業分野における毒性科学分野に携わる当業者が実施する喫煙物品の煙中の粒子状物質を抽出する方法のうち、加熱式喫煙物品の煙中の粒子状物質を抽出する方法、抽出容器、抽出液、並びに抽出液を用いる毒性試験方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
紙巻たばこなどの可燃性喫煙物品は通常、たばこロッドを形成する紙ラッパーに囲まれた細かく切られたたばこ（普通はカットフィラーの形態）を備える。紙巻たばこは、その一方の端に点火し、細かく切られたたばこロッドを燃焼することにより、消費者によって使用される。消費者は、燃焼された紙巻たばこの反対側の端（口側の端またはフィルター端）で引き込むことによって主流煙を受ける。【０００３】
一方、たばこなどのニコチン含有エアロゾル形成基質が燃焼式ではなく加熱式である、「加熱式喫煙物品」も種々のものが提案されている。加熱式喫煙物品では、エアロゾルはエアロゾル形成基質の加熱によって生成される。公知の加熱式喫煙物品には、例えば、エアロゾルが電気的に加熱されるか、あるいは、可燃性燃料要素または熱源からエアロゾル形成基質への熱の移動によって生成されるような喫煙物品が含まれる。さらに、別の一態様では、電気的熱源または化学反応による熱源で、アルコール・エタノール・グリセリン・プロピレングリコールまたはそれらの混合溶液を含浸させた多孔質または繊維質の物体を直接的にまたは間接的に加熱して蒸気を発生させる。この態様では、発生した蒸気と粒子状物質が混合した気体が、喫煙物品を通して引き込まれた空気中に混入され、さらに蒸気と粒子状物質と空気の混合気体が、上述のたばこに加え葉タバコ・刻みたばこ・再構成たばこ・再構成たばこシート・再構成たばこ顆粒に通過される。この通過の際に、当該混合気体には、たばこ・葉タバコ・刻みたばこ・再構成たばこ類が含む香喫味成分、ニコチンや各種の天然香料からなる揮発性化合物を含む気体が混入される。当該態様の加熱式喫煙物品においては、当該揮発性化合物を含む気体を含む混合気体、即ち、エアロゾル（粒子相成分）とガス相成分との混合気体が、消費者によって吸引される。通常、消費者は、加熱式喫煙物品の端（口側の端またはフィルター端、マウスピース端）で引き込むことによって、当該混合気体を吸引する。【０００４】
紙巻たばこなどの喫煙物品から生じる煙には、タール、ニコチン等の物質が含まれている。喫煙物品については、煙成分中の粒子状物質を例えばフィルター等の担体に捕捉して、成分を分析評価することが重要である。例えば、紙巻きたばこの煙成分の捕集および分析の基準として、カナダ保健省の示す方法が知られている（Ｈｅａｌｔｈ  Ｃａｎａｄａ−ＴｏｂａｃｃｏＲｅｐｏｒｔｉｎｇ  Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎｓ  ＳＯＲ／２０００−２７３、Ｊｕｌｙ  ２０１８）（非特許文献１）。【０００５】
加熱式喫煙物品は、一般に、紙巻たばこなどの可燃性喫煙物品よりも、煙成分中の粒子状物質が少なく、十分な量、濃度で粒子状物質を捕捉することができない。そのため、たばこ製造業において煙成分の分析業務に携わる当業者、特に毒性科学分野に携わる当業者に、慣例的にまたは公的に求められる適切な毒性試験の結果を得難い。【０００６】
加熱式喫煙物品についても、たばこ製造業において煙成分の分析業務に携わる当業者、特に毒性科学分野に携わる当業者に、慣例的にまたは公的に求められる適切な毒性試験の結果を得るために、十分な量、濃度で粒子状物質を捕捉して試料を調製することが重要である。１つの方法として、１つの捕捉用担体に大量の加熱式喫煙物品から発生させた煙成分を連続的に捕捉させて抽出する、連続抽出法が考えられる。例えば、１フィルターに１００本の喫煙物品の煙成分を捕捉させる、というものである。これにより、例えば、１０ｍｇ／ｍＬ程度しか捕捉できなかったものが、５０−１００ｍｇ／ｍＬ程度の高濃度に粒子状物質を捕捉できる可能性がある。しかしながら、この方法には、膨大な時間がかかり、その間に捕捉された粒子状物質から成分が揮散する可能性を否定することはできず、さらに、大量の加熱式喫煙物品を用いるため濃縮による過大評価の誤差が生じうる。あるいは、別の方法として、大量の溶媒を用いる方法が考えられる。しかしながら溶媒を大量に用いる場合、低毒性溶媒であっても、粒子状物質を高濃度に調製しようとするほど溶媒が濃縮され高濃度となる。例えば、たばこの煙成分の捕捉には、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）が用いられることがある。しかしながら、ＤＭＳＯにも弱い細胞毒性がある。原核生物や真核生物の培養細胞等を用いた毒性試験（ｉｎ ｖｉｔｒｏの毒性試験）において培地に高濃度でＤＭＳＯが含まれると細胞の生理活性に影響がおよぶ。ｉｎ ｖｉｔｒｏの毒性試験を行う場合、溶媒として用いることが可能なＤＭＳＯ上限は培地に対する体積百分率で２％程度までと規定されている（非特許文献２、３）。捕捉した粒子状物質を用いてｉｎ  ｖｉｔｒｏの毒性試験を行う場合、培地に規定以上のＤＭＳＯが含まれていると、粒子状物質に関係なくＤＭＳＯが原因で細胞の生理活性が低下する、細胞が死ぬなどの可能性があり、有効な毒性試験を適切に行うことができない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開２０１８−５７４０３
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Ｈｅａｌｔｈ  Ｃａｎａｄａ−ＴｏｂａｃｃｏＲｅｐｏｒｔｉｎｇ  Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎｓ  ＳＯＲ／２０００−２７３、Ｊｕｌｙ  ２０１８
【非特許文献２】「化学試験の試験に関するＯＥＣＤガイドライン」の「細菌復帰突然変異試験」（ＯＥＣＤ／ＯＣＤＥ  ＴＧ４７１）（１９９７年７月２１日採択）
【非特許文献３】「化学試験の試験に関するＯＥＣＤガイドライン」の「ＩＮ  ＶＩＴＲＯ  哺乳類細胞小核試験」（ＯＥＣＤ／ＯＣＤＥ  ＴＧ４８７）（２０１４年９月２６日採択）
【非特許文献４】ＣＯＲＥＳＴＡ  ＲＥＣＯＭＭＥＮＤＥＤ  ＭＥＴＨＯＤ  Ｎｏ．８１  ＲＯＵＴＩＮＥ  ＡＮＡＬＹＴＩＣＡＬ  ＭＡＣＨＩＮＥ  ＦＯＲ  Ｅ−ＣＩＧＡＲＥＴＴＥ  ＡＥＲＯＳＯＬ  ＧＥＮＥＲＡＴＩＯＮ  ＡＮＤ  ＣＯＬＬＥＣＴＩＯＮ−ＤＥＦＩＮＩＴＩＯＮＳ  ＡＮＤ  ＳＴＡＮＤＡＲＤ  ＣＯＮＤＩＴＩＯＮＳ  （Ｊｕｎｅ  ２０１５）
【非特許文献５】ＩＳＯ  ３４０２
【非特許文献６】ＩＳＯ  ３３０８
【非特許文献７】ＩＳＯ４３８７
【非特許文献８】Ｈｅａｌｔｈ  Ｃａｎａｄａ  Ｏｆｆｉｃｉａｌ  Ｍｅｔｈｏｄ  Ｔ−５０１  Ｂａｃｔｅｒｉａｌ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｍｕｔａｔｉｏｎ  Ａｓｓａｙ  ｆｏｒ  Ｍａｉｎｓｔｒｅａｍ  Ｔｏｂａｃｃｏ  Ｓｍｏｋｅ
【非特許文献９】ＣＯＲＥＳＴＡ  Ｒｅｃｏｍｍｅｎｄｅｄ  Ｍｅｔｈｏｄ  Ｎｏ．  ８４  ＤＥＴＥＲＭＩＮＡＴＩＯＮ  ＯＦ  ＧＬＹＣＥＲＩＮ，  ＰＲＯＰＹＬＥＮＥ  ＧＬＹＣＯＬ，  ＷＡＴＥＲ，  ＡＮＤ  ＮＩＣＯＴＩＮＥ  ＩＮ  ＴＨＥ  ＡＥＲＯＳＯＬ  ＯＦ  Ｅ−ＣＩＧＡＲＥＴＴＥＳ  ＢＹ  ＧＡＳ  ＣＨＲＯＭＡＴＯＧＲＡＰＨＩＣ  ＡＮＡＬＹＳＩＳ
【非特許文献１０】Ｍａｔｓｕｓｈｉｍａ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９９，  Ｅｎｖｉｒｏｎ．  Ｐｏｌｌｕｔ．  ６４，  １２１−１３２
【非特許文献１１】Ｈｅａｌｔｈ  Ｃａｎａｄａ  Ｏｆｆｉｃｉａｌ  Ｍｅｔｈｏｄ  Ｔ−５０２，Ｎｅｕｔｒａｌ  Ｒｅｄ  Ｕｐｔａｋｅ  Ａｓｓａｙ  ｆｏｒ  Ｍａｉｎｓｔｒｅａｍ  Ｔｏｂａｃｃｏ  Ｓｍｏｋｅ  （Ｈｅａｌｔｈ  Ｃａｎａｄａ，  ２００４ｃ）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、加熱式喫煙物品の煙中の粒子状物質を抽出する方法を提供することを目的とする。【００１０】
本発明はまた、抽出容器を提供することを目的とする。抽出容器は、加熱式喫煙物品の煙中の粒子状物質を抽出する方法に用いることができる。【００１１】
本発明はさらに、加熱式喫煙物品の煙中の粒子状物質を含む抽出液を提供することを目的とする。【００１２】
本発明はさらにまた、加熱式喫煙物品の煙中の粒子状物質を含む抽出液を用いる、ことを含む、ｉｎ ｖｉｔｒｏの毒性試験方法に関する。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明者らは、鋭意研究に務めた結果、粒子状物質をフィルターに捕捉したものを２枚以上重ね、重ねたフィルターを圧搾することにより、フィルターに捕捉された成分が高効率で抽出されることを見出し、本発明を想到した。【００１４】
限定されるわけではないが、本発明は以下の態様を含む。
［態様１］
加熱式喫煙物品の煙中の粒子状物質を抽出する方法であって、
（１）加熱式喫煙物品の煙中の粒子状物質を、粒子状物質を捕捉可能なフィルターを２枚以上に捕集し、
（２）前記２枚以上のフィルターを重ね、そして、
（３）重ねたフィルターを圧搾することによりフィルターに付着した成分を抽出する、
ことを含む、前記方法。
［態様２］
（３）の工程を、
（３−ｉ）前記重ねたフィルターを圧縮し、復帰させる、
（３−ｉｉ）前記重ねたフィルターを圧縮してフィルターに付着した成分を抽出し、抽出液を重ねたフィルターにかけて、再び圧縮する、あるいは、
（３−ｉｉｉ）（３−ｉ）と（３−ｉｉ）を組み合わせて行う
ことによって行う、態様１に記載の方法。
［態様３］
（３−ｉ）の前記重ねたフィルターの圧縮復帰を２回以上繰り返す、態様２に記載の方法。
［態様４］
（３−ｉ）および／または（３−ｉｉ）の工程の際に、フィルターと抽出液とを振とうする、態様２に記載の方法。
［態様５］
（３−ｉｉ）前記重ねたフィルターを圧縮してフィルターに付着した成分を抽出し、抽出液を重ねたフィルターにかけ戻して、再び圧縮することを、２回以上繰り返す、態様２に記載の方法。
［態様６］
工程（３）を、２つの圧搾面を有する抽出容器内にフィルターを収めて行う、態様１−５のいずれか１項に記載の方法。
［態様７］
工程（３）において、圧搾により抽出された抽出液を流動または循環させる、態様１−６のいずれか１項に記載の方法。
［態様８］
フィルターを３枚以上使用する、態様１−７のいずれか１項に記載の方法。
［態様９］
フィルターを１０枚−１５枚使用する、態様１−８のいずれか１項に記載の方法。
［態様１０］
重ねたフィルターの厚さが工程（３）を行う前の１／３以下になるまで、工程（３）を繰り返す、態様１−９のいずれか１項に記載の方法。
［態様１１］
工程（３）において溶媒を使用しない、態様１−１０のいずれか１項に記載の方法。
［態様１２］
工程（３）において、フィルター容積に対して０％（重量／容積）より多く、４００％（重量／容積）以下の量の両親媒性溶媒を加える、態様１−１０のいずれか１項に記載の方法。
［態様１３］
圧縮を１０ＭＰａ以下で行う、態様１−１２のいずれか１項に記載の方法。
［態様１４］
フィルターがガラス繊維フィルターである、態様１−１３のいずれか１項に記載の方法。
［態様１５］
フィルターが、定格風量で、粒径が０．３μｍの粒子に対して９９％以上の粒子捕集率を有するフィルターである、態様１−１４のいずれか１項に記載の方法。
［態様１６］
さらに、
（４）フィルターを遠心分離し分離液を得る；そして
（５）工程（３）で得られた抽出液に分離液を混合する
ことを含む、態様１−１５のいずれか１項に記載の方法。
［態様１７］
２枚以上のフィルターを重ねた状態で収容可能な収容部と、
前記収容部に重ねた状態で収容されたフィルターを圧搾する１または複数の圧搾部材と、
前記収容部と連通するリザーバーと
を含む、抽出容器。
［態様１８］
前記圧搾部材によりフィルターを圧搾する圧搾面の形状が、平面、錐形の斜面または凸状若しくは凹状の曲面、のいずれかである、態様１７の抽出容器。
［態様１９］
前記圧搾部材によりフィルターを圧搾する圧搾面が２面ある、態様１７または１８の抽出容器。
［態様２０］
２つの前記圧搾面が互いに回転摺動する、態様１９の抽出容器。
［態様２１］
前記リザーバーが、前記収容部の上方および下方の少なくともいずれかに配置される、態様１７−２０に記載の抽出容器。
［態様２２］
前記リザーバーが前記収容部の外周に設けられている、態様１７−２０のいずれか１項に記載の抽出容器。
［態様２３］
前記リザーバーは前記圧搾面の少なくとも１つを貫通する細管を通して前記収容部と連通している、態様１７−２１のいずれか１項に記載の抽出容器。
［態様２４］
前記圧搾部材の圧搾面に溝が設けられている、態様１７−２３のいずれか１項に記載の抽出容器。
［態様２５］
前記圧搾部材を２つ有し、該２つの圧搾部材は各々の圧搾面を対向させた状態で移動可能であり、
前記２つの圧搾部材の各々対向する圧搾面の間の空間が前記収容部を画成する、態様１７−２４のいずれか１項に記載の抽出容器。
［態様２６］
前記２つの圧搾部材のうち一方が凹部を有し、該凹部の内側底面が圧搾面を形成し、
前記２つの圧搾部材のうち他方がその圧搾面を前記内側底面に向けた状態で前記凹部内を液密に摺動可能である、態様２５に記載の抽出容器。
［態様２７］
注射器型のシリンダー部材と、
前記シリンダー部材の中空空間を基端側空間と先端側空間とに仕切るように配置された、細孔を有するふるい部材と、
前記シリンダー部材の前記基端側空間を液密に摺動可能なピストン部材と、
を備え、
前記ふるい部材および前記ピストン部材は、それらの内側対向する面が圧搾面を各々形成して前記圧搾部材を構成し、
前記ピストン部材の圧搾面と前記ふるい部材の圧搾面との間の前記基端側空間の少なくとも一部が前記収容部を画成し、
前記先端側空間が前記リザーバーを画成する、
態様１７−２０のいずれか１項に記載の抽出容器。
［態様２８］
リザーバーに回収された抽出液が流動または循環される、態様１７−２７のいずれか１項に記載の抽出容器。
［態様２９］
態様１−１６のいずれか１項に記載の方法に使用するための態様１７−２８のいずれか１項に記載の抽出容器。
［態様３０］
態様１−１６のいずれか１項に記載の方法によって得られた、加熱式喫煙物品の煙中の粒子状物質を含む抽出液。
［態様３１］
溶媒を含まない、態様３０に記載の抽出液。
［態様３２］
ｉｎ  ｖｉｔｒｏの毒性試験に用いるための態様３０または３１に記載の抽出液。
［態様３３］
ｉｎ  ｖｉｔｒｏの毒性試験が、小核試験またはエームズ試験である、態様３２に記載の抽出液。
［態様３４］
態様１−１６のいずれか１項に記載の方法によって得られた、加熱式喫煙物品の煙中の粒子状物質を含む抽出液を用いる、ｉｎ ｖｉｔｒｏの毒性試験方法。
【発明の効果】
【００１５】
本発明の抽出方法により、加熱式喫煙物品の煙から従来の抽出方法と比較して高効率で粒子状物質の抽出が可能になった。本発明の方法によれば、無溶媒または少量の溶媒での抽出が可能である。よって、溶媒の影響を排除した状態で、ｉｎ ｖｉｔｒｏの毒性試験を実施できる。さらに、溶媒を任意に添加することで溶媒の影響を把握することもでき、種々のタイプの加熱式喫煙物品の比較試験を行うこともできる。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】図１は、本発明の第１の実施形態に係る抽出容器の断面図である。
【図２】図２は、第１の実施形態に係る抽出容器を構成する第２の圧搾部材の圧搾面の平面図であって、（ａ）は当該圧搾面が平面である例、（ｂ）は当該圧搾面に放射状の溝が形成された例を示す。
【図３】図３は、第１の実施形態に係る抽出容器を構成する圧搾部材を駆動させる駆動手段を備えた状態での当該抽出容器の断面図である。
【図４】図４は、本発明の第２の実施形態に係る抽出容器の図であって、（ａ）は、当該抽出容器の断面図、（ｂ）は、抽出液体を循環させる循環装置を備えた抽出容器の概略図である。
【図５】図５は、本発明の第３の実施形態に係る、第１の構成例による抽出容器の断面図である。
【図６】図６は、本発明の第３の実施形態に係る、第２の構成例による抽出容器の断面図である。
【図７】図７は、本発明の第４の実施形態に係る、第１の構成例による抽出容器の断面図である。
【図８】図８は、本発明の第４の実施形態に係る、第２の構成例による抽出容器の断面図である。
【図９】図９は、本発明の第５の実施形態に係る抽出容器の断面図である。
【図１０】図１０は、本発明の各実施形態に係る抽出容器を用いてフィルターから液体を抽出する一方法を示すフローチャートである。
【図１１】図１１は、フィルターに与えた圧縮および復帰の圧力（ＭＰａ）（４回）と、フィルターの厚さ（ｍｍ）および抽出液量との関係を示す。フィルターの厚さを白丸、抽出液量を黒三角で示す。
【図１２】図１２は、Ａｍｅｓ試験の結果を示す。横軸に、試料の添加用量（μｇ総粒子物質（ＴＰＭ）  ｅｑ．／ｍＬ）、縦軸に、試料添加前の生細胞数に対する試料添加後の生細胞数（細胞復帰突然変異を起こした細胞）の割合（％）をプロットしたものである。
【図１３】図１３は、ＭＮ試験の結果を示す。横軸に、試料の添加用量（μｇ総粒子物質（ＴＰＭ）  ｅｑ．／ｍＬ）、縦軸に、小核（ＭＮ）の発生頻度（ＭＮ誘発が生じた）割合（％）をプロットしたものである。
【図１４Ａ】図１４Ａは、ＤＭＳＯ抽出試料（慣用法）のニュートラルレッド取込活性試験結果を示す。横軸に試料の添加用量、縦軸に試料無添加の細胞のニュートラルレッド取込量に対する試料に曝露した細胞のニュートラルレッド取込量の百分率をプロットした。試験試料としては、紙巻きたばこ３Ｒ４Ｆ（白抜き三角形）、加熱型喫煙物品のＭａｒｌｂｏｌｏ  ｆｏｒ  ｉＱＯＳ  ＲＥＧＵＬＡＲ（商標）（サンプルＡ）（黒丸）、加熱型喫煙物品Ｂ（サンプルＢ）（白抜き丸）、Ｍｅｖｉｕｓ（登録商標）  Ｒｅｇｕｌａｒ  ｆｏｒ  Ｐｌｏｏｍ  Ｔｅｃｈ（黒三角形）を用いた。
【図１４Ｂ】図１４Ｂは、ＳＥＰ法のニュートラルレッド取込活性試験結果を示す。横軸に試料の添加用量、縦軸に試料無添加の細胞のニュートラルレッド取込量に対する試料に曝露した細胞のニュートラルレッド取込量の百分率をプロットした。試験試料としては、加熱型喫煙物品のＭａｒｌｂｏｌｏ  ｆｏｒ  ｉＱＯＳ  ＲＥＧＵＬＡＲ（商標）（サンプルＡ）（黒丸）、加熱型喫煙物品Ｂ（サンプルＢ）（白抜き丸）、Ｍｅｖｉｕｓ（登録商標）  Ｒｅｇｕｌａｒ  ｆｏｒ  Ｐｌｏｏｍ  Ｔｅｃｈ（黒三角形）を用いた。
【図１４Ｃ】図１４Ｃは、ＳＥＰ法のニュートラルレッド取込活性試験結果を示す。横軸に試料の添加用量、縦軸に試料無添加の細胞のニュートラルレッド取込量に対する試料に曝露した細胞のニュートラルレッド取込量の百分率をプロットした。試験試料としては、加熱型喫煙物品のＭａｒｌｂｏｌｏ  ｆｏｒ  ｉＱＯＳ  ＲＥＧＵＬＡＲ（商標）（サンプルＡ）（黒丸）、加熱型喫煙物品Ｂ（サンプルＢ）（白抜き丸）、Ｍｅｖｉｕｓ（登録商標）  Ｒｅｇｕｌａｒ  ｆｏｒ  Ｐｌｏｏｍ  Ｔｅｃｈ（黒三角形）を用いた。
【図１４Ｄ】図１４Ｄは、ＳＥＰ法のニュートラルレッド取込活性試験結果を示す。横軸に試料の添加用量、縦軸に試料無添加の細胞のニュートラルレッド取込量に対する試料に曝露した細胞のニュートラルレッド取込量の百分率をプロットした。試験試料としては、加熱型喫煙物品のＭａｒｌｂｏｌｏ  ｆｏｒ  ｉＱＯＳ  ＲＥＧＵＬＡＲ（商標）（サンプルＡ）（黒丸）、加熱型喫煙物品Ｂ（サンプルＢ）（白抜き丸）、Ｍｅｖｉｕｓ（登録商標）  Ｒｅｇｕｌａｒ  ｆｏｒ  Ｐｌｏｏｍ  Ｔｅｃｈ（黒三角形）を用いた。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
１．加熱式喫煙物品の煙中の粒子状物質を抽出する方法
本発明の第１の形態は、加熱式喫煙物品の煙中の粒子状物質を抽出する方法に関する。
一態様において、加熱式喫煙物品の煙中の粒子状物質を抽出する方法は、
（１）加熱式喫煙物品の煙中の粒子状物質を、粒子状物質を捕捉可能なフィルターを２枚以上に捕集し、
（２）前記２枚以上のフィルターを重ね、そして、
（３）重ねたフィルターを圧搾することによりフィルターに付着した成分を抽出する、
ことを含む。
【００１８】
紙巻たばこなどの可燃性喫煙物品に対し、たばこなどのニコチン含有エアロゾル形成基質が燃焼式ではなく加熱式である「加熱式喫煙物品」が多く開発されている。加熱式喫煙物品では、エアロゾルはエアロゾル形成基質の加熱によって生成される。公知の加熱式喫煙物品には、例えば、エアロゾルが電気的に加熱されるか、あるいは、可燃性燃料要素または熱源からエアロゾル形成基質への熱の移動によって生成されるような喫煙物品が含まれる。喫煙中、熱源からの熱伝達によってエアロゾル形成基質から揮発性化合物が放出され、喫煙物品を通して引き込まれた空気中に混入される。放出された化合物が冷めるにつれて凝結してエアロゾルを形成し、これが消費者によって吸い込まれる。
【００１９】
さらに加熱式喫煙物品の別の一態様も知られている。当該態様の加熱式喫煙物品は、たばこを燃焼させることなく、上述の電気的熱源または化学反応による熱源で、アルコール・エタノール・グリセリン・プロピレングリコールまたはそれらの混合溶液を含浸させた多孔質または繊維質の物体を直接的にまたは間接的に加熱して発生させた蒸気と粒子状物質が混合した気体が、喫煙物品を通して引き込まれた空気中に混入される。さらに蒸気と粒子状物質と空気の混合気体が、上述のたばこに加え葉タバコ・再構成たばこ・再構成たばこシート・再構成たばこ顆粒に通過されて、たばこ・葉タバコ・再構成たばこ類が含む香喫味成分、ニコチンや各種の天然香料からなる揮発性化合物を含む気体が混入される。当該態様の加熱式喫煙物品においては、当該揮発性化合物を含む気体を含む混合気体、即ち、エアロゾル（粒子相成分）とガス相成分との混合気体が、消費者によって吸引される。通常、消費者は、加熱式喫煙物品の端（口側の端またはフィルター端、マウスピース端）で引き込むことによって、当該混合気体を吸引する。
【００２０】
さらにまた、本明細書において、ニコチン含有エアロゾルがたばこ材料、たばこ抽出物、またはその他のニコチン源から、一部の場合に加熱することなく、例えば化学反応によって生成される非燃焼型喫煙物品も含めて、「加熱式喫煙物品」と呼称する。
【００２１】
本明細書において、「加熱式喫煙物品」は、特に明記した場合を除き、上述した全ての態様の加熱式喫煙物品を含む。
【００２２】
「加熱式喫煙物品の煙中の粒子状物質」とは、加熱式喫煙物品から発生する煙中のガス状、揮発性の物質を除く全ての物質を意味し、総粒子状物質（ＴＰＭ、ｔｏｔａｌ  ｐａｒｔｉｃｌｅ  ｍａｔｔｅｒ）と呼称される場合もある。一態様において、加熱式喫煙物品の煙中の粒子状物質には、水蒸気、ニコチン、プロピレングリコール、グリセリン、メントール等を含む。加熱式喫煙物品の1つであるフィリップモリス・プロダクツ・ソシエテ・アノニム社の加熱式喫煙物品（商品名  Ｍａｒｌｂｏｒｏ（登録商標） ＨｅａｔＳｔｉｃｋｓ（登録商標）ＳＭＯＯＴＨ  ＆  ＰＵＲＰＬＥ、同ＰＵＲＰＬＥ  ＭＥＮＴＨＯＬ、同ＲＥＧＵＬＡＲ、同ＢＡＬＡＮＣＥＤ  ＲＥＧＵＬＡＲ、同ＭＥＮＴＨＯＬ、同ＭＩＮＴ（商標）））を専用の加熱式喫煙具（商品名ｉＱＯＳ（登録商標）、ｉＱＯＳ２．４、ｉＱＯＳ２．４ｐｌｕｓ）に適用した場合に発生する煙中の粒子状物質には、ニコチン、プロピレングリコール、グリセリン、フルクトース、グルコース、定量限界以下の微量の一酸化炭素等を含む。成分の種類に応じてガスクロマトグラフィー質量分析法（ＧＣ／ＭＳ）等により分析をすることができる。
【００２３】
「粒子状物質を捕捉可能なフィルター」は、加熱式喫煙物品の煙中の粒子状物質を捕捉可能なものであれば、材質も、形状も、特に限定されない。使用可能なフィルターとしてガラス繊維フィルター、ＨＥＰＡフィルター、ＵＬＰＡフィルター、ケンブリッジフィルター等が含まれる。好ましくは、ガラス繊維フィルターである。形状は、好ましくは、直径１０ｍｍから１００ｍｍ程度の平たい円形である。より好ましくは、直径４０ｍｍから５０ｍｍの平たい円形である。より好ましくは、直径４４ｍｍの平たい円形である。円形以外の形状、四角、菱形、三角等も使用可能である。１枚当たりのフィルターの厚さは、好ましくは４ｍｍ以下、より好ましくは、２ｍｍ以下である。
【００２４】
一態様において、「粒子状物質を捕捉可能なフィルター」には、空気中からゴミ、塵埃などを取り除くことが可能なエアフィルターの一種である、ＨＥＰＡフィルター（Ｈｉｇｈ  Ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ  Ｐａｒｔｉｃｕｌａｔｅ  Ａｉｒ  Ｆｉｌｔｅｒ）が含まれる。ＨＥＰＡフィルターは、ＪＩＳ  Ｚ  ８１２２によって「定格風量で、粒径が０．３μｍの粒子に対して９９％以上の粒子捕集率をもち、かつ初期圧力損失が２４５Ｐａ以下の性能を持つエアフィルター」と規定されている。一態様において、「粒子状物質を捕捉可能なフィルター」は、「定格風量で、粒径が０．３μｍの粒子に対して９９％以上の粒子捕集率を有する」とフィルターである。ＨＥＰＡフィルターよりもさらに、粒子捕集効率の高いフィルターに、ＵＬＰＡフィルター  （Ｕｌｔｒａ  Ｌｏｗ  Ｐｅｎｅｔｒａｔｉｏｎ  Ａｉｒ  Ｆｉｌｔｅｒ）がある。ＵＬＰＡフィルターは、ＪＩＳ  Ｚ  ８１２２で、「定格風量で粒径が０．１５μｍの粒子に対して９９．９９９５％以上の粒子捕集率をもち、かつ初期圧力損失が２４５Ｐａ以下の性能を持つエアフィルター」と規定されている。ＨＥＰＡフィルターやＵＬＰＡフィルターと同様の性質を有するフィルターも使用可能である。
【００２５】
一態様において、「粒子状物質を捕捉可能なフィルター」としてケンブリッジフィルターを使用可能である。ケンブリッジフィルターは、直径約４４または９２ｍｍ、厚さ１．５  ｍｍの平たい円形のガラス繊維のフィルターで、粒子状物質を捕捉可能なフィルターとして、当業者に周知であり汎用されている。ケンブリッジフィルターは、日本ケンブリッジフィルター株式会社、Ｂｏｒｇｗａｌｔ社（カタログ番号８０２０  ２８５  ２）等より入手可能である。
【００２６】
「粒子状物質を捕捉可能なフィルターを２枚以上に捕集」することは、例えば、加熱式喫煙物品から煙を発生させ、発生した煙をフィルターに直接吹き付けることによって行ってもよい。加熱式喫煙物品からの煙の発生は、例えば、コレスタ推奨法Ｎｏ．８１（非特許文献４）に従い、所定の機械喫煙方法（例えば、機械喫煙装置の陰圧、吸引時間、吸引量、吸引動作間隔３０秒±０．５秒）に従い行うことができる。
加熱式喫煙物品からの煙の発生は、例えば、ＩＳＯ（ｔｈｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  Ｓｔａｎｄａｒｄｉｚａｔｉｏｎ）  ３４０２：１９９９（非特許文献５）が定める加熱式喫煙物品の調湿・調和法に従い用意した試料を用い、ＩＳＯ  ３３０８：２０１２（非特許文献６）が定める喫煙機の所定の吸引方式（例えば、吸引量５５ｍＬ／回、吸引時間：２．０秒／回、吸引間隔：３０秒毎）および吸引の開始および終了の条件に従い行うことができる。
【００２７】
より多くの粒子状物質をフィルターに捕捉するためには、非限定的に、１枚目のフィルターに捕捉される粒状状物質の量が一定程度に達した時点で次のフィルターに交換し、次のフィルターに同様に煙を吹き付ける、ことを繰り返すというように、フィルターに１枚ずつ煙を吹き付けることが好ましい。一態様において、１枚目のフィルターに捕捉される粒子状物質が３００ｍｇ／ｐａｄ以上、４００ｍｇ／ｐａｄ以上、４５０ｍｇ／ｐａｄ以上、５００ｍｇ／ｐａｄ以上に達した時点で交換を行う。一態様において、１枚目のフィルターに捕捉される粒子状物質が８００ｍｇ／ｐａｄ以下、７５０ｍｇ／ｐａｄ以下、７００ｍｇ／ｐａｄ以下、６５０ｍｇ／ｐａｄ以下で交換を行う。一態様において、１枚目のフィルターに捕捉される粒子状物質が５００−６５０ｍｇ／ｐａｄの範囲でフィルターを交換する。
【００２８】
非限定的に、一態様において、フィルターを３枚以上、５枚以上、７枚以上、９枚以上、１０枚以上使用する。一態様において、フィルターを２５枚以下、２３枚以下、２０枚以下、１８枚以下、１５枚以下使用する。一態様において、フィルターを１０枚−１５枚使用する。
【００２９】
加熱式喫煙物品の煙中の粒子状物質を抽出する方法において、「（３）重ねたフィルターを圧搾することによりフィルターに付着した成分を抽出する。」
理論に縛られるわけではないが、当該方法は、圧搾によりフィルターをもみほぐし、滲み出た液体（圧搾液）でフィルターに捕捉された粒子状物質（フィルターに付着した成分）をフィルターから脱離させ、滲み出た液体（圧搾液）に脱離した粒子状物質を溶解させる、というものである。「圧搾」の手段は、フィルターをもみほぐし、液体を滲み出させることができる手段であれば、特に限定されない。
【００３０】
一態様において、（３）の工程を、
（３−ｉ）前記重ねたフィルターを圧縮し、復帰させる、
（３−ｉｉ）前記重ねたフィルターを圧縮してフィルターに付着した成分を抽出し、抽出液を重ねたフィルターにかけて、再び圧縮する、あるいは、
（３−ｉｉｉ）（３−ｉ）と（３−ｉｉ）を組み合わせて行う。
【００３１】
一態様において、工程（３−ｉ）の重ねたフィルターの圧縮復帰を２回以上繰り返してもよい。非限定的に、好ましくは、重ねたフィルターの圧縮復帰を２回以上、３回以上、４回以上繰り返す。
【００３２】
一態様において、好ましくは、圧縮は０．０１ＭＰａ以上、０．1ＭＰ以上、０．５ＭＰ以上、２．０ＭＰ以上で行う。一態様において、好ましくは、圧縮を０．５ＭＰａ以下、２．０ＭＰａ以下、５．０ＭＰａ以下、１０．０ＭＰａ以下で行う。圧搾液の流動性が無くならない程度の圧力が望ましい。例えば０Ｍｐａより圧搾を開始し、徐々に圧搾の圧力を高めてもよい。圧搾は例えば、０ＭＰａ−１０．０ＭＰａの範囲で行う。工程（３−ｉ）の圧縮復帰を２回以上行う場合、各回の圧力は同じであっても異なってもよい。回を重ねる毎に徐々に圧搾の圧力を高めてもよい。
【００３３】
一態様において、工程（３−ｉｉ）の重ねたフィルターを圧縮してフィルターに付着した成分を抽出し、抽出液を重ねたフィルターにかけ戻して、再び圧縮することを、２回以上繰り返してもよい。非限定的に、好ましくは、工程（３−ｉｉ）を２回以上、３回以上、４回以上繰り返す。
【００３４】
（３−ｉ）と（３−ｉｉ）は、単独で行ってもよく、あるいは、組み合わせてもよい。（３−ｉｉ）を（３−ｉ）と組み合わせることにより、（３−ｉ）の圧縮（加圧）の圧力、回数を減らすことができる。
【００３５】
一態様において、（３−ｉ）および／または（３−ｉｉ）の工程の際に、フィルターと抽出液とを振とうしてもよい。振とうの度合い（強度）は、非限定的に、振幅２ｃｍ〜６ｃｍ、毎分１００〜３００往復であってもよい。一態様において、４ｃｍ、毎分２００往復であってもよい。フィルターと抽出液とを振とうさせることによって、抽出液に振動する流れが生じ、当該流れが圧搾されたフィルターと衝突を繰り返すことによって抽出効果をさらに向上させることができる。
【００３６】
一態様において、工程（３）を、２つの圧搾面を有する抽出容器内にフィルターを収めて行う。
【００３７】
一態様において、工程（３）において、圧搾により抽出された抽出液を流動または循環させる。
【００３８】
一態様において、重ねたフィルターの厚さが所定の厚さ以下になるまで、工程（３）を繰り返すことが好ましい。好ましくは、工程（３）を行う前の１／２以下になるまで、１／３以下になるまで、１／４の以下になるまで、工程（３）を繰り返す。好ましくは、圧搾によりフィルターがぐちゃぐちゃになるまで工程（３）を繰り返す。
【００３９】
加熱式喫煙物品の煙中の粒子状物質を抽出する方法は、一態様において、工程（３）において溶媒を使用しない。一態様において、工程（３）において少量の両親媒性溶媒を加えてもよい。加える両親媒性溶媒の量は特に限定されない。一態様において、フィルター容積に対し４００％（重量／容積）以下、より好ましくは、２００％（重量／容積）以下である。一態様において、加える両親媒性溶媒の量は、０％（重量／容積）より多く、または１０％（重量／容積）以上である。
【００４０】
両親媒性溶媒は、非限定的に、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、エタノール、メタノール、イソプロパノール、アセトン等を含む。
【００４１】
工程（３）において、溶媒を使用しない、または、少量の両親媒性溶媒のみしか使用しないことにより、例えば、後述するｉｎ ｖｉｔｒｏ毒性試験方法における溶媒の影響を排除した状態で、生体への種々の影響の検討できる。あるいは、溶媒を任意に添加することで溶媒の影響を把握することもでき、種々のタイプの加熱式喫煙物品の比較試験を行うこともできる。液体タイプの電子たばこにおいては、原液（リキッド）と喫煙後に捕集されるエアロゾルの比較等の効果が得られる。
【００４２】
工程（３）のあとに、さらに
（４）フィルターを遠心分離し分離液を得る；そして
（５）工程（３）で得られた抽出液に分離液を混合する
ことを含んでもよい。
【００４３】
遠心分離は、圧搾後もフィルターに残っている液体成分を分離できる程度であれば、強さ（回転数、時間）は特に限定されない。回転数は、例えば、１，０００ｒｐｍ−６，０００ｒｐｍ、好ましくは、３，５００ｒｐｍ−５，０００ｒｐｍである。時間は、例えば、１分以上、好ましくは、５分以上である。一態様において、例えば、４０００ｒｐｍ回転数で、５分の遠心分離を行っても良い。
【００４４】
遠心分離によって得られた分離液を、工程（３）で得られた圧搾液と混合して抽出液とした。
【００４５】
本明細書において、工程（３）で得られた液体を「圧搾液」または「抽出液」と呼称する。文意により「圧搾液」に遠心分離によって得られる「分離液」を混合したものを「抽出液」と呼称する場合もある。
【００４６】
２．抽出容器
本発明の第２の形態は、抽出容器に関する。抽出容器は、加熱式喫煙物品の煙中の粒子状物質を抽出するのに有用である。一態様において、抽出容器は、本明細書に記載の加熱式喫煙物品の煙中の粒子状物質を抽出する方法に使用されうる。以下、本発明の第２の形態である「抽出容器」の第１から第５の実施形態について各々説明する。
【００４７】
（第１の実施形態）
図１には、第１の実施形態に係る抽出容器１ａが示されている。抽出容器１ａは、第１の圧搾部材２ａと、第２の圧搾部材３ａとを備えている。
【００４８】
第１の圧搾部材２ａは、略円柱状の凹部６を備えており、該凹部６の内側底面が第１の圧搾面４を形成している。第２の圧搾部材３ａは、第１の圧搾部材２ａの凹部６内に挿入可能に形成された先端部１１を有し、該先端部１１には、その側面外周に沿って溝９が形成され、該溝９には、凹部６の内側面と係合するようにＯリング１２が嵌合されている。すなわち、第２の圧搾部材３ａは、第１の圧搾部材２ａの凹部６内を液密に摺動可能に形成されている。
【００４９】
第１の圧搾面４と、該第１の圧搾面４と対向するように配置された第２の圧搾部材の第２の圧搾面５とは、それらの間に収容部８を画成しており、該収容部８は、２枚以上のフィルター部材７を重ねた状態で収容可能である。なお、「抽出容器」を上記した本発明の第１の形態である「加熱式喫煙物品の煙中の粒子状物質を抽出する方法」で使用する場合には、フィルター部材７として本発明の第１および第３の形態並びに実施例で説明されるフィルターを用いることができる。
【００５０】
第２の圧搾部材３ａには、リザーバー１０が形成されており、該リザーバー１０は、該リザーバー１０から延在する細管１３を介して収容部８と連通している。細管１３には、第２の圧搾面４の近傍で、収容部８内の液体を収集しやすくするため、ラッパ状の開口部１４が形成されていてもよい。
【００５１】
第２の圧搾部材３ａの第２の圧搾面５は、開口部１４以外の領域で、図２（ａ）に示されるように平面状に形成されてもよい。より好ましくは、図２（ｂ）に示されるように、開口部１４を中心として、径方向に放射状に複数の溝１５が形成される。
【００５２】
上述した通り第２の圧搾部材３ａは、第１の圧搾部材２ａの凹部６内を液密に摺動可能であるため、第１の圧搾部材２ａと第２の圧搾部材３ａとは、互いに対して相対移動、すなわち第１および第２の圧搾面４、５を接近させたり引き離したりすることが可能となる。この相対移動をもたらす、第１および第２の圧搾部材２ａ、３ａの駆動手段として、例えば図３に示される構成等が考えられる。
【００５３】
図３に示されるように、駆動手段を備えた抽出容器１ａは、抽出容器１ａを収容するハウジング２０と、ハウジング２０の蓋部２１と、蓋部２１の中央部に形成されたネジ貫通孔２２と、内側面にネジ山が形成されたネジ貫通孔２２に螺合するネジロッド２３と、ネジロッド２３のハウジング２０から突出する側の端部に取り付けられたハンドル２４と、ネジロッド２３のハウジング２０内の端部を回転可能に軸支すると共に第２の圧搾部材３ａのリザーバー１０の開口頂部に固定された、ベアリング部２５と、を備えている。
【００５４】
抽出容器１ａの第１の圧搾部材２ａは、ハウジング２０の底板にボルト３０により固定され、第２の圧搾部材３ａは、ベアリング部２５の張り出した底板２６にボルト３１により固定され、蓋部２１は、ハウジング２０にボルト３２により固定されている。
【００５５】
ネジロッド２４がハウジング２０内に引き込まれる方向（図３のＡ方向）にハンドル２４を回転させるとき、Ａ方向に移動するネジロッド２４は、ベアリング部２５を介して第２の圧搾部材３ａを下方向に移動させる。このとき、第２の圧搾面５は第１の圧搾面４に接近するため、第１および第２の圧搾面４、５の間に配置されている、重ねた複数のフィルター部材７を圧縮させる。図３の駆動手段では、大きな直径のハンドル２４を用いたネジロッド２３のネジ孔２２内へのネジ込みに伴う圧力をフィルター部材７の圧縮力として利用できるため、大きい圧縮力を得ることができる。
【００５６】
一方、ネジロッド２４がハウジング２０から引き出される方向（図３のＢ方向）にハンドル２４を回転させるとき、Ｂ方向に移動するネジロッド２４は、ベアリング部２５を介して第２の圧搾部材３ａを上方向に移動させる。このとき、第２の圧搾面５は第１の圧搾面４から離れていくため、第１および第２の圧搾面４、５の間に配置されている、重ねた複数のフィルター部材７は、上記の圧縮状態から復帰される。
【００５７】
次に、図３に示される駆動手段を用いた抽出容器を用いてフィルター部材７から液体を抽出する方法を図１０のフローチャートを用いて説明する。
【００５８】
図１０に示されるように、先ず、粒子状物質を捕捉した２枚以上のフィルター部材７を重ねて収容部８に配置する（ステップ１００）。
【００５９】
次に、第１の圧搾面４および第２の圧搾面５を接近させ、重ねたフィルター部材７を圧縮させる（ステップ１０２）。図３に示される駆動手段を用いた場合、ステップ１０２は、上記したように、ネジロッド２４がハウジング２０内に引き込まれる方向（図３のＡ方向）にハンドル２４を回転させることによって行われる。
【００６０】
次に、第１の圧搾面４および第２の圧搾面５を引き離して、重ねたフィルター部材７を圧縮状態から復帰させる（ステップ１０４）。図３に示される駆動手段を用いた場合、ステップ１０４は、上記したように、ネジロッド２４がハウジング２０から引き出される方向（図３のＢ方向）にハンドル２４を回転させることによって行われる。ステップ１０２の圧縮工程およびステップ１０４の復帰工程は、１つの圧縮―復帰サイクルとカウントされる。なお、圧縮および復帰の際の好ましい圧力としては、本発明の第１の形態で上述された圧力や、本発明の第３の形態で後述される圧力が用いられる。
【００６１】
次に、ステップ１０２および１０４で実行された圧縮―復帰サイクルの回数がＭより少ないか否かを判定する（ステップ１０６）。ここでＭは２以上の整数に設定される。
【００６２】
圧縮―復帰サイクルの回数がＭより少ない場合（ステップ１０６の肯定判定）、ステップ１０２に戻り、圧縮―復帰サイクルを再び繰り返す。圧縮―復帰サイクルを繰り返すことによって、フィルター部材７は圧搾され、捕捉された粒子状物質を含む液体が抽出される。この抽出液は、開口部１４から細管１３を通ってリザーバー１０へと浸出する。このとき第２の圧搾面５が図２（ｂ）に示されるように溝１５を備えている場合、抽出液は、よりスムーズに溝１５を通って開口部１４から細管１３を通り、リザーバー１０へと浸出する。
【００６３】
圧縮―復帰サイクルの回数がＭに達した場合（ステップ１０６の否定判定）、次のステップ１０８に移行する。ステップ１０８では、リザーバー１０に浸出した抽出液を回収し、収容部８内のフィルター部材７にかけ戻しをする。このかけ戻し工程を１回とカウントする。リザーバー１０に浸出した抽出液の回収およびかけ戻しは、例えばピペット等を使用して行われる。また、抽出液を回収するときは、第１の圧搾面４および第２の圧搾面５を引き離した状態から接近した状態に戻すことによって、より多くの抽出液をリザーバー１０に浸出させてから行うのが好ましい。
【００６４】
次に、ステップ１０８で実行された、かけ戻しの回数がＮより少ないか否かを判定する（ステップ１１０）。ここでＮは２以上の整数に設定される。
【００６５】
抽出液のかけ戻しの回数がＮより少ない場合（ステップ１１０の肯定判定）、再びステップ１０２に戻り、圧縮―復帰サイクルをＭ回繰り返し、抽出液の回収およびかけ戻しを実行する。
【００６６】
抽出液のかけ戻しの回数がＮに達した場合（ステップ１１０の否定判定）、リザーバー１０に浸出した抽出液をピペット等で最終的に回収する。回収された抽出液は微粒子物質の分析のために使用される。
【００６７】
図１０のフローチャートにおいて、次の変更を適用することも可能である（以下に述べる他の実施形態においても同様である）。
【００６８】
図１０のステップ１０２および１０４の圧縮―復帰サイクルの後に、抽出容器１ａを振とうさせる工程を追加することが可能である。抽出容器１ａを振とうさせる方向としては、例えば、圧搾面に沿った横方向（図３の例では、ネジロッド２３の軸方向に垂直な方向）が好ましいが、これに限定されるものではない。抽出容器１ａを振とうさせることによって、抽出液に振動する流れが生じ、当該流れが圧搾されたフィルター部材７と衝突を繰り返すことによって抽出効果をさらに向上させることができる。
【００６９】
また、図１０のステップ１０２において、圧搾面４、５の接近による圧縮だけでなく、圧搾面４、５を互いに相対回転させる工程を追加してもよい。圧搾面４、５を互いに相対回転させることによって、重ねたフィルター部材７に、圧縮力だけでなく、ねじり力が加わり、液体の抽出効果をさらに向上させることができる。
【００７０】
またさらに、図１０のステップ１０２において、「加熱式喫煙物品の煙中の粒子状物質を抽出する方法」で上述した通り、両親媒性溶媒をフィルター部材７に加えて、圧縮を行ってもよい。勿論、溶媒を使用しない圧縮もあり得る。
【００７１】
さらに、図１０の例では、Ｍ回の圧縮―復帰サイクル毎に、かけ戻し工程をＮ回行い、すなわち計Ｍ×Ｎ回の圧縮―復帰サイクルを行うようになっているが、圧縮―復帰サイクル内で、かけ戻し工程を実行してもよい。この場合、図１０のフローチャートでは、ステップ１０８がステップ１０４と１０６の間に移動し、ステップ１１０が削除されることになる。なお、かけ戻し工程のタイミングについては、これ以外にも適宜変更可能であり、本発明の実施形態は、圧縮―復帰サイクルとかけ戻し工程との任意の組み合わせを含むものである。
【００７２】
また、図３に示された駆動手段では、人力によるハンドル２４の回転操作により圧搾を行っていたが、ハンドル２４に代えてモータ等の電動駆動手段を用いてもよい。また、圧電アクチュエータにより直接あるいは間接的に圧搾部材によるフィルター部材７の圧搾を行ってもよい。
【００７３】
さらに、上記例では、第２の圧搾部材３ａを移動させていたが、第１の圧搾部材２ａを移動させても、或いは、第１および第２の圧搾部材の両方を移動させてもよい。
【００７４】
さらにまた、ステップ１０６において、重ねたフィルター部材７の厚さが圧縮―復帰サイクルを開始する前の所定比率（例えば１／３）以下の厚さになるまで圧縮―復帰サイクルを続けるように条件を変更することもできる。
【００７５】
抽出容器１ａに関しては、リザーバー１０が第２の圧搾部材３ａの内部に形成されていたが、リザーバー１０は第１の圧搾部材２ａの内部に形成されていてもよく、或いは、第１の圧搾部材２ａおよび第２の圧搾部材３ａの両方に形成されてもよい。
【００７６】
（第２の実施形態）
第１の実施形態では、リザーバー１０に抽出液体を貯蔵した後、貯蔵された抽出液体をピペット等を用いて再びフィルター部材７にかけ戻すという作業を行っていた。第２の実施形態は、ピペットを用いずに抽出液を循環させる機構を備えた抽出容器に関しており、以下、図４を用いて説明する。なお、第１の実施形態と同様の構成要件については、同様の符号を附して詳細な説明を省略し、異なる部分についてのみ説明する。
【００７７】
図４（ａ）に示されるように、第２の実施形態に係る抽出容器１ｂは、第１の圧搾部材２ｂと、第２の圧搾部材３ｂとを備えている。第２の圧搾部材３ｂは、第１の圧搾部材２ｂの凹部６内を液密に摺動可能に形成され、第１の圧搾面４と第２の圧搾面５とが、それらの間に収容部８を画成し、該収容部８は、２枚以上のフィルター部材７を重ねた状態で収容可能である点は第１の実施形態と同様である。
【００７８】
第１の圧搾部材２ｂは、後述する循環用チューブのチューブコネクターとして機能する第１の空洞部４０を有し、第２の圧搾部材３ｂは、循環用チューブのチューブコネクターとして機能する第２の空洞部４５を有する。
【００７９】
第１の空洞部４０には、３つの異なる直径を各々備えた、大径部４１、中径部４２および小径部４３が形成されている。大径部４１は、第１の圧搾部材２ｂの底部で開口すると共に、第１の圧搾部材２ｂの側面に切り欠きとして形成された循環用チューブの逃げ口４４と接続されている。小径部４３は、第１の圧搾面４で開口しており、これによって第１の空洞部４０は、収容部８と連通する。
【００８０】
同様に、第２の空洞部４５には、３つの異なる直径を各々備えた、大径部４６、中径部４７および小径部４８が形成されている。大径部４６は、第２の圧搾部材３ｂの頂部で開口すると共に、第２の圧搾部材３ｂの側面に切り欠きとして形成された循環用チューブの逃げ口４９と接続されている。小径部４８は、第２の圧搾面５で開口しており、これによって第２の空洞部４５は、収容部８と連通する。
【００８１】
図４（ｂ）には、循環用チューブ５０を抽出容器１ｂに装着した状態が示されている。図４（ｂ）に示されるように、循環用チューブ５０の一方の端部５１を第１の空洞部４０の大径部４１に挿入し、循環用チューブ５０の他方の端部５２を第２の空洞部４５の大径部４６に挿入することによって、循環用チューブ５０は抽出容器１ｂに装着される。循環用チューブ５０には、ペリスタポンプ５３が取り付けられている。ペリスタポンプ５３を駆動させることにより循環用チューブ５０の一方の端部５１から吸引すると、収容部８内の抽出液は第１の空洞部４０の小径部４３および中径部４２を経て循環用チューブ５０に吸引され、循環用チューブ５０内を通って他方の端部５２から排出され、第２の空洞部４５の中継部４７および小径部４８を経て再び収容部８内へと流入する。勿論、循環用チューブ５０の他方の端部５２から抽出液を吸引するようにすることも同様に可能である。ペリスタポンプ５３を駆動している間、抽出液が、圧搾されたフィルター部材７内を流動し、循環するので、液体の抽出効果をよりいっそう向上させることができる。
【００８２】
第２の実施形態に係る抽出容器１ｂにも、例えば図３に示された駆動手段を取り付けてもよい。このとき、循環用チューブ５０の一方の端部５１を逃げ口４４で折り曲げることによって、循環用チューブの方向を変更することができる。よって、第１の圧搾部材２ｂの底面が例えば図３のハウジング２０に取り付けられていても、これを回避して循環用チューブ５０を適切に配置することができる。同様に、循環用チューブ５０の他方の端部５２を逃げ口４９で折り曲げることによって、第２の圧搾部材３ｂの頂部に例えば図３のベアリング部２５が取り付けられていても、これを回避して循環用チューブ５０を適切に配置することができる。
【００８３】
第２の実施形態に係る抽出容器１ｂでは、第１の空洞部４０および第２の空洞部４５、特に、中径部４２、４７および小径部４３、４８が、第１の実施形態におけるリザーバー１０としての役割も果たすことになる。第２の実施形態では、第１の実施形態における、「抽出液のかけ戻し」を循環用ホース５０およびペリスタポンプ５３を用いて、より効率的かつ効果的に実行することが可能となる。
【００８４】
第２の実施形態に係る抽出容器１ｂを用いて、図１０のフローチャートに従って、フィルター部材７から液体を抽出することができる。この場合、図１０のステップ１０８における「抽出液の回収およびフィルターへのかけ戻し」がペリスタポンプ５３による「循環用ホース５０および収容部８を通る抽出液の循環」に相当することとなる。また、ステップ１１０の「抽出液のかけ戻し回数」は、例えば、「所定時間ペリスタポンプ５３を駆動させて抽出液を循環させた」ことを１回とカウントする場合の回数、或いは、「抽出液を収容部８から循環用チューブ５０を介して収容部８へと一巡」したことを１回とカウントしてもよい。
【００８５】
ステップ１１２では、抽出液の排出側にある循環用チューブ５０の端部５１および５２のいずれかを抽出容器１ｂから取り外し、取り外された当該端部からペリスタポンプ５３を用いて抽出液を例えば分析用の容器等に排出することにより、抽出液を最終的に回収する。
【００８６】
上述のように第２の実施形態では、抽出効果が向上するので、例えばステップ１０６の閾値Ｍ、ステップ１１０の閾値Ｎを小さく設定することも可能となる。
【００８７】
（第３の実施形態）
第１および第２の実施形態では、リザーバーが第１の圧搾部材或いは第２の圧搾部材の内部に形成されていた。第３の実施形態は、リザーバーがフィルター部材７の収容部８の外周に設けられている構成を有するもので、以下、図５および図６を用いて説明する。なお、第１の実施形態と同様の構成要件については、同様の符号を附して詳細な説明を省略し、異なる部分についてのみ説明する。
【００８８】
図５には、第３の実施形態の第１の構成例に係る抽出容器１ｃが示されている。抽出容器１ｃは、第１の実施形態と同様に、第１の圧搾部材２ｃと、第２の圧搾部材３ｃとを備えている。第２の圧搾部材３ｃは、第１の圧搾部材２ｃの凹部６内を液密に摺動可能に形成され、第１の圧搾面４と第２の圧搾面５とが、それらの間に収容部８を画成し、該収容部８は、２枚以上のフィルター部材７を重ねた状態で収容可能である点は第１の実施形態と同様である。
【００８９】
第３の実施形態では、収容部８の外周に空きスペースが存在しており、このスペース全体がリザーバー５４を形成している。リザーバー５４は、第１の圧搾面４の外周に形成された環状溝５５を有している。フィルター部材７がつぶされて液体が抽出されたとき、リザーバー５４のうちフィルター部材７の真横のスペース部分の体積が小さくなって抽出液を貯蔵できなくなり得るが、そのような場合でも、環状溝５５内に抽出液を貯蔵することが可能となる。
【００９０】
図６には、第３の実施形態の第２の構成例に係る抽出容器１ｄが示されている。抽出容器１ｄは、第１の圧搾部材２ｄと、第２の圧搾部材３ｄとを備え、収容部８の外周にリザーバー５６を有する。抽出容器１ｄのリザーバー５６は、第１の構成例が第１の圧搾面４に環状溝５５が形成されていたのに対して、第２の圧搾面５の外周に環状溝５７を有している。それ以外の点は、第１の構成例と同様である。
【００９１】
（第４の実施形態）
第１から第３の実施形態では、圧搾面４、５が平面として形成されていたが、本発明は、この例に限定されない。圧搾面が平面以外の例を第４の実施形態として、図７および図８を用いて説明する。
【００９２】
図７には、第４の実施形態の第１の構成例に係る抽出容器１ｅが示されている。抽出容器１ｅは、図５に示される抽出容器１ｃと基本的な構成は同様であるが、第１の圧搾面４ｅおよび第２の圧搾面５ｅが平面ではなく、球面で構成されている。図７の例では、第１の圧搾面４ｅの球面が凹で、第２の圧搾面５ｅの球面が凸に形成されているが、その逆に構成してもよい。また、好ましくは、第１の圧搾面４ｅおよび第２の圧搾面５ｅの球面の半径は両圧搾面が嵌合可能に実質的に同一であるのがよい。なお、第４の実施形態でいう「球面」は全体的に凸状（若しくは凹状）の曲面であればよく、楕円面、放物面、双曲面等の他の２次曲面や、２次以上の高次曲面を用いてもよい。
【００９３】
図８には、第４の実施形態の第２の構成例に係る抽出容器１ｆが示されている。抽出容器１ｆは、図６に示される抽出容器１ｄと基本的な構成は同様であるが、第１の圧搾面４ｆおよび第２の圧搾面５ｆが平面ではなく、錐形の斜面で構成されている。図８の例では、第１の圧搾面４ｆの錐形の斜面が凹で、第２の圧搾面５ｆの錐形の斜面が凸に形成されているが、その逆に構成してもよい。また、好ましくは、第１の圧搾面４ｆおよび第２の圧搾面５ｆの斜面角度は両圧搾面が嵌合可能に実質的に同一であるのがよい。
【００９４】
第４の実施形態に係る第１および第２の圧搾面の形状は、第３の実施形態だけでなく、他の実施形態にも適用可能であることはいうまでもない。
【００９５】
（第５の実施形態）
第５の実施形態は、注射器型の抽出容器に関するものであり、以下、図９を用いて説明する。
【００９６】
図９に示されるように、第５の実施形態に係る抽出容器１ｇは、中空空間６ｇ（凹部）を有する、注射器型のシリンダー部材（第１の圧搾部材）２ｇと、ピストン部材（第２の圧搾部材）３ｇと、を備えている。
【００９７】
シリンダー部材（第１の圧搾部材）２ｇは、中空空間６ｇ（凹部）を基端側空間６２と先端側空間（リザーバー）１０ｇとに仕切るように配置された、細孔（細管）を有する、ふるい部材６０と、抽出液を噴射するための管が形成された先端部６１と、を備えている。
【００９８】
ピストン部材（第２の圧搾部材）３ｇには、その側面外周に沿って溝９が形成され、該溝９には、基端側空間６２の内側面と係合するようにＯリング１２が嵌合されている。すなわち、ピストン部材（第２の圧搾部材）３ｇは、シリンダー部材（第１の圧搾部材）２ｇの基端側空間６２を液密に摺動することができる。
【００９９】
ふるい部材６０およびピストン部材（第２の圧搾部材）３ｇは、それらの内側対向する面が第１の圧搾面４ｇおよび第２の圧搾面５ｇを各々形成している。第１の圧搾面４ｇおよび第２の圧搾面５ｇの間の基端側空間６２の少なくとも一部が、重ねたフィルター部材７の収容部８ｇを画成している。
【０１００】
第５の実施形態に係る注射器型の抽出容器１ｇにおいても、ピストン部材（第２の圧搾部材）３ｇを、シリンダー部材（第１の圧搾部材）２ｇ内で摺動させることによって、収容部８ｇ内のフィルター部材７に対して、第１の実施形態の図１０で説明した圧縮―復帰サイクルを実行することができる。圧縮―復帰サイクルを受けたフィルター部材７から液体が抽出され、当該抽出液は、ふるい部材６０の細孔から先端側空間（リザーバー）１０ｇへと浸出する。このとき、抽出容器１ｇを先端部６１が下方向に向くように配置し、先端部６１の開口を閉鎖しておけば、先端側空間（リザーバー）１０ｇ内に抽出液を貯蔵することが可能となる。図１０のステップ１０８のかけ戻し工程においては、抽出容器１ｇを先端部６１が下方向に向くように逆に配置すれば、重力により先端側空間（リザーバー）１０ｇに貯蔵された抽出液は、ふるい部材６０の細孔を通過して、再び、フィルター部材７へとかけ戻される。
【０１０１】
第５の実施形態に係る抽出容器１ｇは、注射器型に構成されたため、非常に簡便に、圧縮―復帰サイクルおよびかけ戻し工程を実行することができ、操作性を大幅に向上させることができる。
【０１０２】
以上が本発明の各実施形態であるが、上記例にのみ限定されるものではなく、本発明の範囲内で任意好適に変更可能である。
【０１０３】
３．加熱式喫煙物品の煙中の粒子状物質を含む抽出液
本発明の第３の形態は、加熱式喫煙物品の煙中の粒子状物質を抽出する方法によって得られた、加熱式喫煙物品の煙中の粒子状物質を含む抽出液に関する。
【０１０４】
一態様において、抽出液は、後述するｉｎ ｖｉｔｒｏ毒性試験等に供するのに有効な十分な濃度で、加熱式喫煙物品の煙中の粒子状物質を含む。「ｉｎ ｖｉｔｒｏ毒性試験等に供するのに有効な十分な濃度」とは、例えば、最高濃度において、所定の細胞毒性パラメータを用いて細胞毒性が５５±５％になるような濃度である。
【０１０５】
一態様において、抽出液に含まれる加熱式喫煙物品の煙中の粒子状物質は、水蒸気、ニコチン、プロピレングリコール、グリセリン、メントール、フルクトース、グルコースおよび一酸化炭素から選択される物質の１以上を含む。好ましくは、抽出液は、これらの粒子状物質を加熱式喫煙物品の煙中に含まれる割合を反映する割合で含む。
【０１０６】
一態様において、抽出液は、「グリセリン＋ＰＧ＋水」を４０％（重量／重量）以上、好ましくは４５％（重量／重量）以上含む。
【０１０７】
一態様において、抽出液は溶媒を含まない。一態様において、抽出液は少量の両親媒性溶媒のみを含んでもよい。一態様において、抽出液は、４００重量％以下、好ましくは２００重量％以下の両親媒性溶媒を含んでもよい。溶媒を含まない、または、少量の両親媒性溶媒のみしか含まない抽出液は、例えば、後述するｉｎ ｖｉｔｒｏ毒性試験方法における溶媒の影響を避けることができる。さらに、溶媒を任意に添加することで溶媒の影響を把握することもでき、種々のタイプの加熱式喫煙物品の比較試験を行うこともできる。
【０１０８】
一態様において、抽出液は、ｉｎ ｖｉｔｒｏの毒性試験に用いるためのものである。一態様において、ｉｎ ｖｉｔｒｏの毒性試験は、小核試験またはエームズ試験である。「ｉｎ ｖｉｔｒｏの毒性試験については、「４．ｉｎ ｖｉｔｒｏの毒性試験方法」において詳述する。
【０１０９】
４．ｉｎ ｖｉｔｒｏの毒性試験方法
本発明は、ｉｎ ｖｉｔｒｏの毒性試験方法にも関する。ｉｎ ｖｉｔｒｏの毒性試験方法は、本発明の方法によって得られた、加熱式喫煙物品の煙中の粒子状物質を含む抽出液を用いる、ことを含む。
【０１１０】
ｉｎ ｖｉｔｒｏの毒性試験方法は、細菌復帰突然変異試験（Ａｍｅｓ試験、エームズ試験）および小核試験（ＭＮ試験）、ニュートラルレッド試験等を含む。
【０１１１】
細菌復帰突然変異試験（Ａｍｅｓ試験、エームズ試験）は、アミノ酸要求性のサルモネラ菌と大腸菌の株を用いて点変異を検出する。この点変異には、１ないし２、３のＤＮＡ塩基対の置換、付加または欠失が係る。本試験の原則は、試験菌株の持つ突然変異が復帰して必須アミノ酸を合成する機能的な能力を回復した突然変異を検出することである。復帰細菌株は、親試験株が要求するアミノ酸非存在下で増殖する能力によって検出される。アミノ酸合成ができないように改良した菌が突然変異により菌が本来有しているアミノ酸合成ができるように復帰するという意味から細胞復帰突然変異試験と名付けられている。Ａｍｅｓ試験と呼称される場合もあるが、この名称は本試験を胚発した米国カルフォルニア大学のＡｍｅｓ教授に由来する。Ａｍｅｓ試験は、例えば、「化学試験の試験に関するＯＥＣＤガイドライン」の「細菌復帰突然変異試験」（ＯＥＣＤ／ＯＣＤＥ  ＴＧ４７１）（１９９７年７月２１日採択）に従って行うことができる。
【０１１２】
小核試験（ＭＮ試験）は、間期細胞の細胞室内における小核（ＭＮ）の検出を目的とする遺伝毒性試験である。小核は無動原体染色体断片（セントロメアが欠如していること）、または細胞分裂後期に細胞の極への移動ができない染色体全体から生じる。本試験では、細胞分裂を行っている細胞に被験物質を暴露させ、暴露中または暴露後における当該化学物質の染色体異常誘発活性、または異数性誘発活性を検出する。ＭＮ試験は、例えば、「化学試験の試験に関するＯＥＣＤガイドライン」の「ＩＮ ＶＩＴＲＯ哺乳類細胞小核試験」（ＯＥＣＤ／ＯＣＤＥ  ＴＧ４８７）（２０１４年９月２６日採択）に従って行うことができる。
【実施例】
【０１１３】
以下、実施例に基づいて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。当業者は本明細書の記載に基づいて容易に本発明に修飾・変更を加えることができ、それらは本発明の技術的範囲に含まれる。【０１１４】
実施例１  無溶媒抽出法による加熱式喫煙物品の煙中の粒子状物質の抽出
本実施例では、無溶媒抽出法（ＳＥＰ）による加熱式喫煙物品の煙中の粒子状物質の抽出による水回収率および主成分組成を調べた。【０１１５】
喫煙器（Ｂｏｒｇｗａｌｔ社製、製品名Ｓｍｏｋｉｎｇ  Ｍａｃｈｉｎｅ、製品番号ＲＭ２０Ｈ）を用いて、所定の吸引方式（吸引量５５ｍＬ／回、吸引時間：２秒／回、吸引間隔：３０秒）で、加熱式喫煙物品（熱源からエアロゾル形成基質への熱の移動によって生成されるタイプ、フィリップモリス・プロダクツ・ソシエテ・アノニム社の加熱式喫煙物品（商品名  Ｍａｒｌｂｏｒｏ（登録商標） ＨｅａｔＳｔｉｃｋｓ（登録商標）ＳＭＯＯＴＨ ＲＥＧＵＬＡＲ、）を専用の加熱式喫煙具（商品名ｉＱＯＳ（登録商標）、ｉＱＯＳ２．４、フィリップモリス社）から煙を発生させた。煙成分をケンブリッジフィルター（ＣＦ）（Ｂｏｒｇｗａｌｔ社より入手）に吹き付けて捕集した。具体的には、１枚目のＣＦが５００−６５０ｍｇ／ｐａｄに達した時点で次のＣＦに交換し、これを繰り返すことにより、連続して１０〜１５枚のＣＦに煙成分を捕集した。【０１１６】
得られた１０〜１５枚のＣＦを重ねて、ＣＦの最大寸法よりも２０ｍｍ大きい内寸法を有する密封加圧容器（図５、６、７、８）に収容した。収容されたＣＦに対して図１１に示したスケジュールで圧縮（ｐｒｅｓｓ、右向き矢印）および復帰（ｒｅｌｅａｓｅ、左向き矢印）を４回繰り返すことにより圧搾した。密封加圧容器内でＣＦと圧搾によりＣＦから出てくる圧搾液を特に振とうした。振とうは、４ｃｍ、毎分２００往復で行った。圧搾後、ＣＦを溶液外に取り出し、遠心分離（４０００ｒｐｍ、５分）し、分離液を得た。圧搾液と分離液を混合して抽出液とした。【０１１７】
圧縮復帰１回目−４回目の各回のＣＦの厚さ、抽出液量（ｍＬ）の変化を図１１に示す。図１１の結果は、３回実験を行った平均値である。本実験では、圧縮が過剰になると振とうの際に圧搾液の流動性がなくなるため、１０Ｍｐａが上限であった。【０１１８】
本実施例において、粒子状物質を１０００ｍｇ／ｍＬの濃度で含む抽出液が調製された。【０１１９】
実施例２  無溶媒抽出法による加熱式喫煙物品の煙中の粒子状物質の抽出における水回収率
実施例１の抽出方法において、密封加圧容器内に８.０００ｍＬの水を添加し、上記抽出方法を用いた場合の水添加回収率を調べた。【０１２０】
【表１】
2020080529.tif 000003
【０１２１】
表１に記載の通り、水添加回収率は３回の平均で９１，５％で、溶液の回収率は９０％以上であった。これは従来の例えばＤＭＳＯを用いた抽出方法と同等の回収率である。【０１２２】
実施例３  加熱式喫煙物品の煙から抽出された粒子状物質の主成分組成
本実施例では、各種方法により加熱式喫煙物品の煙から抽出された粒子状物質の主成分組成を調べた。
加熱式喫煙物品は、加熱式喫煙物品（熱源からエアロゾル形成基質への熱の移動によって生成されるタイプ、ｉＱＯＳ、フィリップモリス社）を用いた。【０１２３】
無溶媒抽出法（ＳＥＰ）は、実施例１と同様に行った。ＣＦは１２枚用い、圧縮復帰１回目−４回目は実施例１と同様に４回行った。【０１２４】
イソプロパノール（ＩＰＡ）による抽出は、ＩＳＯ  ４３８７：２０１７（非特許文献７）の７．９．１  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅに従い行った。【０１２５】
ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）（低濃度）による抽出はＨＣＩ  Ｒｅｇｉｍｅ  Ｔ−５０１（Ｈｅａｌｔｈ  Ｃａｎａｄａ  Ｏｆｆｉｃｉａｌ  Ｍｅｔｈｏｄ  Ｔ−５０１  Ｂａｃｔｅｒｉａｌ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｍｕｔａｔｉｏｎ  Ａｓｓａｙ  ｆｏｒ  Ｍａｉｎｓｔｒｅａｍ  Ｔｏｂａｃｃｏ  Ｓｍｏｋｅ）（非特許文献８）に従い行った。【０１２６】
連続抽出とは複数枚のガラス繊維フィルターを同一抽出液で抽出する作業をいう。１回の抽出で所定濃度に達しない場合連続抽出を実施する。ＤＭＳＯによる連続抽出を以下のように行った。【０１２７】
ＤＭＳＯ連続抽出では、抽出された粒子状物質の濃度が最終的に２００ｍｇ／ｍＬになるように調製した。一枚目のＣＦの振とう抽出、遠心分離が終了した後、抽出液全量を新たなＣＦが入ったデュラン瓶に加え、振とう抽出・遠心分離を行う。本操作を所定の枚数分を繰返す。
抽出された粒子状物質の主成分組成を、コレスタ推奨法８４番（非特許文献９）の方法により分析した。結果を表２に示す。【０１２８】
【表２】
2020080529.tif 000004
【０１２９】
表２中、「ＰＧ」はプロピレングリコール、「Ｇ」はグリセリンである。ＳＥＰにより抽出された粒子状物質の主成分組成は、ＩＰＡ抽出，ＤＭＳＯ抽出（低濃度）と同様であり、ＳＥＰを加熱式喫煙物品の煙中の粒子状物質の主成分を適切に抽出していることを示唆する。【０１３０】
実施例４  細菌復帰突然変異試験および小核試験
本実施例では、実施例３で得られた、無溶媒抽出法（ＳＥＰ）により抽出された加熱式喫煙物品の煙中の粒子状物質を含む抽出液を用いて、細菌復帰突然変異試験（Ａｍｅｓ試験、エームズ試験）および小核試験（ＭＮ試験）を行った。
Ａｍｅｓ試験およびＭＮ試験の被験物質として、以下の試料を準備した。
ＳＥＰ試料：ｉＱＯＳ（１０００ｍｇ／ｍＬ）（ＳＥＰ中溶媒：ＰＧ／Ｇ／水）（１．２％添加）
ＤＭＳＯ抽出試料：ｉＱＯＳ（２００ｍｇ／ｍＬ）（ＤＭＳＯによる１０回連続抽出）（１％添加）（ＤＭＳＯによる通常の抽出では１００ｍｇ／ｍＬが限界）【０１３１】
（１）Ａｍｅｓ試験
Ａｍｅｓ試験は、「化学試験の試験に関するＯＥＣＤガイドライン」の「細菌復帰突然変異試験」（ＯＥＣＤ／ＯＣＤＥ  ＴＧ４７１）（１９９７年７月２１日採択）に従って行った。具体的には、以下のように行った。【０１３２】
国立医薬品食品衛生研究所（神奈川、日本）より取得した５種の試験用細菌株（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ  ＴＡ９８、ＴＡ１００、ＴＡ１５３５、ＴＡ１５３７およびＴＡ１０２）を用いて、代謝活性系の存在下および非存在下で、総粒子状物質（ＴＰＭ）画分の変異原性を試験した。【０１３３】
細菌培養物の約１×１０９の細胞、連続的に希釈した試験試料（ＳＥＰ試料またはＤＭＳＯ抽出試料）、および、フェノバルビタール／５，６−ベンゾフラボン誘導されたラットの肝臓ホモジェネートを含むＳ９ミックス若しくはＰＢＳを含む反応混合物を、３７℃±１℃で、２０分±１分インキュベートした。【０１３４】
代謝活性化を伴わない試験において、陽性コントロールとして、ＴＡ９８、ＴＡ１００、ＴＡ１０２には、フリルフルアミド（富士フィルム和光純薬株式会社、東京、日本）を、ＴＡ１５３５にはアジ化ナトリウム（富士フィルム和光純薬株式会社、東京、日本）を、そして、ＴＡ１５３７にはＩＣＲ−１９１（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ；Ｓｔ．  Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ） を使用した。代謝活性化試験においては、ＴＡ１０２、ＴＡ１５３５には２−アミノアントラセン（富士フィルム和光純薬株式会社、東京、日本）を、そして、ＴＡ９８、ＴＡ１００およびＴＡ１５３７には、ベンゾピレン（富士フィルム和光純薬株式会社、東京、日本）を使用した。溶媒コントロールとしてＤＭＳＯのみを使用した。【０１３５】
インキュベーション後、反応混合物を融解した上層寒天（トップアガー）と混合し、最小グルコース寒天プレート上に播いた。プレートを３７℃±１℃で、４８−７２時間インキュベートし、１プレートあたりの復帰変異体を自動的に計数した。３つのプレートの結果に基づき、復帰変異体の平均数を計算した。独立に調製した試験試料を用いて２回または３回の独立した試験を行った。【０１３６】
全ての細菌株＋Ｓ９の組み合わせにおいて、再現可能なように、復帰変異体が用量依存的増加し、そして、試験試料の１以上の濃度において、１以上のうちＴＡ９８、ＴＡ１００およびＴＡ１０２が溶媒コントロールに対し少なくとも２倍増加するか、もしくは、試験試料の１以上の濃度において、ＴＡ１５３５およびＴＡ１５３７が溶媒コントロールに対し少なくとも３倍増加する場合に、その試料は変異原性である、と評価した。【０１３７】
試験試料間で免疫原性を比較するために、ＪＭＰ  ｖｅｒｓｉｏｎ  １０．０．２（ＳＡＳ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  Ｊａｐａｎ、東京、日本）を用いて、用量曲線の直線部分に対する線形回帰分析に基づき、勾配パラメーター（即ち、一次係数）を計算した。【０１３８】
（２）ＭＮ試験
ＭＮ試験は、「化学試験の試験に関するＯＥＣＤガイドライン」の「ＩＮ  ＶＩＴＲＯ哺乳類細胞小核試験」（ＯＥＣＤ／ＯＣＤＥ  ＴＧ４８７）（２０１４年９月２６日採択）に従って行った。具体的には、以下のように行った。【０１３９】
Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ）から購入したＣＨＯ±Ｕ細胞系を分析に用いた。細胞を、１０％ウシ胎児血清（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ）を補足したＤＭＥＭ中、３７℃±２℃で５％ＣＯ２インキュベーター内に維持した。【０１４０】
代謝活性化を伴わない短期間曝露、代謝活性化を伴う短期間曝露および代謝活性化を伴わない長期間曝露、の３種類の処理スケジュールにおいて総粒子状物質（ＴＰＭ）画分を分析した。【０１４１】
細胞縣濁液（２×１０４細胞／ウェル）を処理前に２４時間±３時間、プレインキュベートした。短期間曝露のために、細胞培養物を、Ａｒｃｏｌｏｒ１２５４−誘導されたラットの肝臓ホモジェネートを含むＳ９ミックスを伴い、または、伴わずに、試験試料（ＳＥＰ試料またはＤＭＳＯ抽出試料）で３時間±１５分処理した。試験試料の除去後、細胞を２１時間±１時間インキュベートした。長期間曝露のために、代謝活性化系の非存在下で、細胞を２４時間±１時間インキュベートした。陽性コントロールとして、代謝活性化非存在の場合には、マイトマイシンＣ（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ）を、そして、、代謝活性化存在の場合には、シクロフォスファミド（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ）を適用した。溶媒コントロールとしてＤＭＳＯのみを使用した。【０１４２】
氷酢酸／メタノール（１：９９、ｖ／ｖ）の溶液で細胞を固定し、エタノール／水（７０％、ｖ／ｖ）の溶液で洗浄し、そして、ＤＡＰＩ溶液およびＣｅｌｌＭａｓｋオレンジ溶液（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ；  Ｗａｌｔｈａｍ，  ＭＡ，  ＵＳＡ）で染色した。【０１４３】
染色した細胞を含む全てのウェルをＡｒｒａｙ  Ｓｃａｎ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）によってスキャンした。２０００細胞あたり（１０００細胞／スライド、２重培養）小核化した細胞の数を計数し、小核細胞頻度（％ＭＮ）を計算した。実験は独立に２回行った。【０１４４】
各試料の遺伝毒性をＭａｔｓｕｓｈｉｍａ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９９，  Ｅｎｖｉｒｏｎ．  Ｐｏｌｌｕｔ．  ６４，  １２１−１３２（非特許文献１０）に記載された方法に従って評価した。コクラン−アーミテージ２項検定を用いて、ＭＮ頻度の用量依存性を調べた。フィッシャーの正確検定を用いて、併行した溶媒コントロールに対して、試験試料の１以上の濃度において、ＭＮ頻度が有意に増加するかを評価した。【０１４５】
双方の統計検定の結果が、２つの独立した実験において有意であり、そして再現可能な場合、試験試料を遺伝毒性がある、と判定した。試験試料間の遺伝毒性の比較のために、ＭＮ頻度が最高値に達する濃度までのデータで、ロジスティック回帰分析を行った。ロジスティック計数の勾配パラメーターを遺伝毒性活性として同定した。ＪＭＰ  ｖｅｒｓｉｏｎ  １０．０．２（ＳＡＳ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  Ｊａｐａｎ、東京、日本）を用いてデータ分析を行った。【０１４６】
（３）結果
図１２は、Ａｍｅｓ試験の結果を示す。横軸に、試料の添加用量（μｇ総粒子物質（ＴＰＭ）  ｅｑ．／ｍＬ）、縦軸に、試料添加前の生細胞数に対する試料添加後の生細胞数（細胞復帰突然変異を起こした細胞）の割合（％）をプロットしたものである。【０１４７】
図１３は、ＭＮ試験の結果を示す。横軸に、試料の添加用量（μｇ総粒子物質（ＴＰＭ）  ｅｑ．／ｍＬ）、縦軸に、小核（ＭＮ）の発生頻度（ＭＮ誘発が生じた）割合（％）をプロットしたものである。【０１４８】
ＤＭＳＯ抽出試料を用いた場合、ＭＮ試験に関するＯＥＣＤガイドライン、ＯＥＣＤ／ＯＣＤＥ  ＴＧ４８７の項目２８に「最大濃度は、５５．５±５％の細胞毒性を生じる程度のものとする。」「被験物質の濃度は、５５．５±５％の細胞毒性を生じるものから、ほとんどまたはまったく細胞毒性をしめさないものまでの範囲をカバーできるように選択する必要がある。」と記載されているところ、細胞毒性４０％程度までしか曝露できなかった（図１２、通常）。用量２０００μｇ  ＴＰＭｅｑ．／ｍｌより高い用量はＤＭＳＯ溶媒の細胞毒性が混在し得る添加用量２％を超えるためである。そして、ＤＭＳＯ抽出試料を用いた場合、ＭＮ誘発のダウンターンまでは確認できなかった。（図１３、通常、）。いずれも、ＭＮ試験としては不十分な結果である。【０１４９】
これに対し、ＳＥＰによる試料を用いた場合、ほぼ細胞毒性１００％まで曝露可能であった（図１２、ＳＥＰ）。そして、ＭＮ誘発についてもピーク〜ダウンターンが確認できた（図１３、ＳＥＰ，用量６０００μｇ  ＴＰＭ  ｅｑ．／ｍｌより高用量）。ＭＮ試験に関するＯＥＣＤガイドライン、ＯＥＣＤ／ＯＣＤＥ  ＴＧ４８７の項目２８には、「最大濃度は、５５．５±５％の細胞毒性を生じる程度のものとする。」「被験物質の濃度は、５５．５±５％の細胞毒性を生じるものから、ほとんどまたはまったく細胞毒性をしめさないものまでの範囲をカバーできるように選択する必要がある。」と記載されている。ＳＥＰによる試料を用いることにより、よりＯＥＣＤガイドラインに準拠した試験実施が可能であることがわかった。【０１５０】
実施例５  ニュートラルレッド取込活性試験
（１）材料等
（試験試料）
紙巻きたばこ試料：ケンタッキーリファレンスシガレット（Ｋｅｎｔｕｃｋｙ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ）３Ｒ４Ｆは、研究目的でケンタッキー大学（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｋｅｎｔｕｃｋｙ）のタバコおよび健康研究機関（Ｔｏｂａｃｃｏ  ａｎｄ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）によって提供されてきたフィルタ付きシガレットである（特表２００８−５４４９３８より一部改変）。【０１５１】
加熱型喫煙物品：
サンプルＡ＝加熱型喫煙物品の内部に挿入された熱源からエアロゾル形成基質への熱の移動によってエアロゾルが生成されるタイプ、フィリップモリス・プロダクツ・ソシエテ・アノニム社の加熱式喫煙物品（商品名  Ｍａｒｌｂｏｌｏ  ｆｏｒ  ｉＱＯＳ  ＲＥＧＵＬＡＲ（商標））を専用の加熱式喫煙具（商品名ｉＱＯＳ２．４（登録商標））、フィリップモリス・プロダクツ・ソシエテ・アノニム社製）を用いた。
サンプルＢ＝加熱型喫煙物品の外周に配置された熱源からエアロゾル形成基質への熱の移動によってエアロゾルが生成されるタイプ、を専用の加熱式喫煙具を用いた。
サンプルＣ＝加熱型喫煙物品Ｍｅｖｉｕｓ（登録商標）  Ｒｅｇｕｌａｒｆｏｒ  Ｐｌｏｏｍ  Ｔｅｃｈ（日本たばこ産業株式会社製）を，同封のカートマイザーと専用の喫煙具（Ｐｌｏｏｍ（登録商標）  Ｔｅｃｈ）を用いた。試料は次の調湿・調和を開始する直前まで４℃で保存した。【０１５２】
（調湿・調和）全ての試料は，定法ＩＳＯ３４０２:１９９９（非特許文献５）に従い，調湿・調和した。
（吸引条件）定法ＨＣＩ
（吸引終了）定法ＩＳＯ４３８７：２０１７（非特許文献７）【０１５３】
（煙・エアロゾル捕集）
ＳＥＰ法により捕集したＡＣＭ（ａｅｒｏｓｏｌ  ｃｏｌｌｅｃｔｅｄ  ｍａｓｓ）（非燃焼型のシガレットより発生したエアロゾルの量）を、ケンブリッジフィルターとともに電子天秤で秤量し，ケンブリッジフィルターの風袋を差し引いてＡＣＭ重量を得た。【０１５４】
（煙・エアロゾルの抽出）
慣用法において、ＣＦＰに捕集された煙の総粒子状物・エアロゾル捕集物は，慣用法に沿って濃度１００ｍｇ／ｍＬになるようにＤＭＳＯを添加し、抽出した。【０１５５】
（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ試験試料の調製）
慣用法により抽出した煙・エアロゾルのＤＭＳＯ抽出溶液は，本実施例で予め秤量したＴＰＭ・ＡＣＭ重量に換算して１００ｍｇ／ｍＬとなるようＤＭＳＯ溶媒を加えて調整した。【０１５６】
ＳＥＰ法により抽出した煙・エアロゾル液は，調整せずｉｎ  ｖｉｔｒｏ試験試料とした。【０１５７】
（２）ニュートラルレッド取込活性試験
ニュートラルレッド取込活性試験は、ＣＨＯ−Ｋ１細胞を用い，操作手順はＨｅａｌｔｈ  Ｃａｎａｄａ  Ｏｆｆｉｃｉａｌ  Ｍｅｔｈｏｄ  Ｔ−５０２，Ｎｅｕｔｒａｌ  Ｒｅｄ  Ｕｐｔａｋｅ  Ａｓｓａｙ  ｆｏｒ  Ｍａｉｎｓｔｒｅａｍ  Ｔｏｂａｃｃｏ  Ｓｍｏｋｅ  （Ｈｅａｌｔｈ  Ｃａｎａｄａ，  ２００４ｃ）（非特許文献１１）に従って行った。【０１５８】
１０％ＦＢＳ（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ；Ｓｔ．  Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ）を補足したハムＦ１２栄養素混合培地（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ；  Ｗａｌｔｈａｍ，  ＭＡ，  ＵＳＡ）において、３７℃±２℃で５％ＣＯ２インキュベーター内に維持した。【０１５９】
ＣＨＯ−Ｋ１細胞懸濁液（１．０×１０４細胞／ウェル）を９６ウェルマイクロタイタープレート中、２４時間±２時間、プレインキュベートした。細胞を総粒子物質（ＴＰＭ）画分で２４時間処理した。陽性コントロールとして、ドデシル硫酸ナトリウムを用いた。ＴＰＭまたはＧＶＰ試験の溶媒コントロールとして、各々、ＤＭＳＯまたはＣＭＦ−ＰＢＳ（ｃａｌｃｉｕｍ−ｍａｇｎｅｓｉｕｍ  ｆｒｅｅ−ＰＢＳ）のみ用いた。【０１６０】
１回の実験において、１試験試料あたり、３個の９６ウェルプレートを分析した。上記のように処理した細胞を、１８μｇ／ｍＬのニュートラルレッド染料を含む培地で３時間インキュベートした。対で、細胞を１％ホルマリンで１−２分、固定した。固定剤を除去した後、１％（ｖ／ｖ）を含む酢酸５０％エタノールを添加することにより、生細胞により取り込まれたニュートラルレッド染料を抽出し、マイクロプレートリーダー用いて、５４０ｎｍの吸光度を測定した。独立した実験を３回行った。【０１６１】
各処理レベルの細胞毒性を、同時併行の溶媒コントロールとの相対吸光度として表した。弛緩試料間の細胞毒性活性の比較のためのＩＣ５０値を算出するために、ロジスティック係数を用いた最小二乗法に基づき、相対吸光度と濃度の間の関係について非線形回帰分析を行った。吸光度が、同時併行の溶媒コントロールの値の５０％まで減少した時点の、有効濃度の逆推定により、ＩＣ５０値を算出した。ＪＭＰ  ｖｅｒｓｉｏｎ  １０．０．２（ＳＡＳ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  Ｊａｐａｎ、東京、日本）を用いて計算を行った。【０１６２】
結果を図１４に示す。図１４は、横軸に試料の添加用量、縦軸に試料無添加の細胞のニュートラルレッド取込量に対する試料に曝露した細胞のニュートラルレッド取込量の百分率をプロットしたものである。慣用法（ＤＭＳＯ）を１回（図１４Ａ）、ＳＥＰ法を３回（図１４Ｂ−図１４Ｄの３回の独立した試験）を行った。【０１６３】
ＤＭＳＯ抽出試料を用いた場合、紙巻きたばこ試料についてはニュートラルレッド取込活性がほぼ消失する程度まで曝露できた。一方、加熱型喫煙物品試料については、サンプルＡ加熱型喫煙物品ｉＱＯＳおよびサンプルＢ加熱型喫煙物品Ｂいずれについてもニュートラルレッド取込活性７０％程度までしか曝露できなかった（図１４Ａ）。加熱型喫煙物品Ｐｌｏｏｍ  Ｔｅｃｈについては、ニュートラルレッド取込活性は変化がなかった（図１４Ａ）。いずれの加熱型喫煙物品試料においても、ＤＭＳＯ抽出試料を調整できる技術的限界はＴＰＭ１０００μｇ／ｍｌであった。【０１６４】
これに対し、ＳＥＰ法による試料を用いた場合、加熱型喫煙物品試料は、サンプルＡ加熱型喫煙物品ｉＱＯＳおよびサンプルＢ加熱型喫煙物品Ｂいずれについても、ニュートラルレッド取込活性が消失する程度まで曝露できた（図１４Ｂ，同Ｃ，同Ｄ）。サンプルＣ加熱型喫煙物品Ｐｌｏｏｍ  Ｔｅｃｈについては、ニュートラルレッド取込活性９０％程度まで曝露できた（図１４Ｂ，同Ｃ，同Ｄ）。ＳＥＰ法は、抽出原理的に加熱型喫煙物品が発生するエアロゾルの原液を抽出する方法であるが、Ｐｌｏｏｍ  Ｔｅｃｈ試料の原液でもＴＰＭ２００００μｇ／ｍｌが上限であるからである。すなわち、ＳＥＰ法により得られた試料で、加熱型喫煙物品のエアロゾル成分を試料としたニュートラルレッド取込活性試験が完遂できることが示された。図１４で明らかなとおり、加熱型喫煙物品の内部に挿入された熱源からエアロゾル形成基質への熱の移動によってエアロゾルが生成される加熱型喫煙物品、加熱型喫煙物品の外周に配置された熱源からエアロゾル形成基質への熱の移動によってエアロゾルが生成される加熱型喫煙物品、インフューズド型加熱型喫煙物品、種々のタイプの加熱式喫煙物品の比較試験を行うことができた。
【符号の説明】
【０１６５】
１ａ〜１ｆ    抽出容器
２ａ〜２ｆ    第１の圧搾部材
３ａ〜３ｆ    第２の圧搾部材
４、４ｅ、４ｆ、４ｇ    第１の圧搾面
５、５ｅ、５ｆ、５ｇ    第２の圧搾面
６、６ｇ    凹部
７    重ねたフィルター部材
８、８ｇ    収容部
９    溝
１０、１０ｇ、（４０、４５）、５４    リザーバー
１１    第２の圧搾部材の先端部
１２    Ｏリング
１３    細管
１４    ラッパ状の開口部
２０    ハウジング
２１    蓋部
２２    ネジ貫通孔
２３    ネジロッド
２４    ハンドル
２５    ベアリング部
２６    ベアリング部の張り出した底板
３０、３１、３２    ボルト
４０    第１の空洞部（リザーバー、チューブコネクタ）
４５    第２の空洞部（リザーバー、チューブコネクタ）
４１、４６    大径部
４２、４７    中径部
４３、４８    小径部
４４、４９    循環用チューブの逃げ口
５０    循環用チューブ
５１    循環用チューブ５０の一方の端部
５２    循環用チューブ５０の他方の端部
５３    ペリスタポンプ
５５    環状溝
６０    ふるい部材
６１    先端部
６２    基端側空間
【図１】
2020080529.tif 000005
【図２】
2020080529.tif 000006
【図３】
2020080529.tif 000007
【図４】
2020080529.tif 000008
【図５】
2020080529.tif 000009
【図６】
2020080529.tif 000010
【図７】
2020080529.tif 000011
【図８】
2020080529.tif 000012
【図９】
2020080529.tif 000013
【図１０】
2020080529.tif 000014
【図１１】
2020080529.tif 000015
【図１２】
2020080529.tif 000016
【図１３】
2020080529.tif 000017
【図１４Ａ】
2020080529.tif 000018
【図１４Ｂ】
2020080529.tif 000019
【図１４Ｃ】
2020080529.tif 000020
【図１４Ｄ】
2020080529.tif 000021
【手続補正書】
【提出日】令和2年3月9日(2020.3.9)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
加熱式喫煙物品の煙中の粒子状物質を抽出する方法であって、
（１）加熱式喫煙物品の煙中の粒子状物質を、粒子状物質を捕捉可能なフィルターを２枚以上に捕集し、
（２）前記２枚以上のフィルターを重ね、そして、
（３）重ねたフィルターを圧搾することによりフィルターに付着した成分を抽出する、
ことを含む、前記方法。
【請求項２】
（３）の工程を、
（３−ｉ）前記重ねたフィルターを圧縮し、復帰させる、
（３−ｉｉ）前記重ねたフィルターを圧縮してフィルターに付着した成分を抽出し、抽出液を重ねたフィルターにかけて、再び圧縮する、あるいは、
（３−ｉｉｉ）（３−ｉ）と（３−ｉｉ）を組み合わせて行うことによって行う、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
（３−ｉ）の前記重ねたフィルターの圧縮復帰を２回以上繰り返す、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
（３−ｉ）および／または（３−ｉｉ）の工程の際に、フィルターと抽出液とを振とうする、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
（３−ｉｉ）前記重ねたフィルターを圧縮してフィルターに付着した成分を抽出し、抽出液を重ねたフィルターにかけ戻して、再び圧縮することを、２回以上繰り返す、請求項２に記載の方法。
【請求項６】
工程（３）を、２つの圧搾面を有する抽出容器内にフィルターを収めて行う、請求項１−５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
工程（３）において、圧搾により抽出された抽出液を流動または循環させる、請求項１−６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
フィルターを３枚以上使用する、請求項１−７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
フィルターを１０枚−１５枚使用する、請求項１−８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
重ねたフィルターの厚さが工程（３）を行う前の１／３以下になるまで、工程（３）を繰り返す、請求項１−９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
工程（３）において溶媒を使用しない、請求項１−１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
工程（３）において、フィルター容積に対して０％（重量／容積）より多く、４００％（重量／容積）以下の量の両親媒性溶媒を加える、請求項１−１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
圧縮を１０ＭＰａ以下で行う、請求項１−１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
フィルターがガラス繊維フィルターである、請求項１−１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
フィルターが、定格風量で、粒径が０．３μｍの粒子に対して９９％以上の粒子捕集率を有するフィルターである、請求項１−１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
さらに、
（４）フィルターを遠心分離し分離液を得る；そして
（５）工程（３）で得られた抽出液に分離液を混合する
ことを含む、請求項１−１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
（削除）
【請求項１８】
（削除）
【請求項１９】
（削除）
【請求項２０】
（削除）
【請求項２１】
（削除）
【請求項２２】
２枚以上のフィルターを重ねた状態で収容可能な収容部と、
前記収容部に重ねた状態で収容されたフィルターを圧搾する１または複数の圧搾部材と、
前記収容部と連通するリザーバーと
を含む、抽出容器であって、
前記リザーバーが前記収容部の外周に設けられている、
前記抽出容器。
【請求項２３】
（削除）
【請求項２４】
（削除）
【請求項２５】
（削除）
【請求項２６】
（削除）
【請求項２７】
（削除）
【請求項２８】
（削除）
【請求項２９】
（削除）
【請求項３０】
請求項１−１６のいずれか１項に記載の方法によって得られた、加熱式喫煙物品の煙中の粒子状物質を含む抽出液。
【請求項３１】
溶媒を含まない、請求項３０に記載の抽出液。
【請求項３２】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏの毒性試験に用いるための請求項３０または３１に記載の抽出液。
【請求項３３】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏの毒性試験が、小核試験またはエームズ試験である、請求項３２に記載の抽出液。
【請求項３４】
請求項１−１６のいずれか１項に記載の方法によって得られた、加熱式喫煙物品の煙中の粒子状物質を含む抽出液を用いる、ｉｎ  ｖｉｔｒｏの毒性試験方法。
【手続補正書】
【提出日】令和3年5月14日(2021.5.14)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
加熱式喫煙物品の煙中の粒子状物質を抽出する方法であって、
（１）加熱式喫煙物品の煙中の粒子状物質を、粒子状物質を捕捉可能なフィルターを２枚以上に捕集し、
（２）前記２枚以上のフィルターを重ね、そして、
（３）重ねたフィルターを圧搾することによりフィルターに付着した成分を抽出する、
ことを含む、前記方法。
【請求項２】
（３）の工程を、
（３−ｉ）前記重ねたフィルターを圧縮し、復帰させる、
（３−ｉｉ）前記重ねたフィルターを圧縮してフィルターに付着した成分を抽出し、抽出液を重ねたフィルターにかけて、再び圧縮する、あるいは、
（３−ｉｉｉ）（３−ｉ）と（３−ｉｉ）を組み合わせて行う
ことによって行う、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
（３−ｉ）の前記重ねたフィルターの圧縮復帰を２回以上繰り返す、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
（３−ｉ）および／または（３−ｉｉ）の工程の際に、フィルターと抽出液とを振とうする、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
（３−ｉｉ）前記重ねたフィルターを圧縮してフィルターに付着した成分を抽出し、抽出液を重ねたフィルターにかけ戻して、再び圧縮することを、２回以上繰り返す、請求項２に記載の方法。
【請求項６】
工程（３）を、２つの圧搾面を有する抽出容器内にフィルターを収めて行う、請求項１−５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
工程（３）において、圧搾により抽出された抽出液を流動または循環させる、請求項１−６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
フィルターを３枚以上使用する、請求項１−７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
フィルターを１０枚−１５枚使用する、請求項１−８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
重ねたフィルターの厚さが工程（３）を行う前の１／３以下になるまで、工程（３）を繰り返す、請求項１−９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
工程（３）において溶媒を使用しない、請求項１−１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
工程（３）において、フィルター容積に対して０％（重量／容積）より多く、４００％（重量／容積）以下の量の両親媒性溶媒を加える、請求項１−１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
圧縮を１０ＭＰａ以下で行う、請求項１−１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
フィルターがガラス繊維フィルターである、請求項１−１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
フィルターが、定格風量で、粒径が０．３μｍの粒子に対して９９％以上の粒子捕集率を有するフィルターである、請求項１−１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
さらに、
（４）フィルターを遠心分離し分離液を得る；そして
（５）工程（３）で得られた抽出液に分離液を混合する
ことを含む、請求項１−１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
２枚以上のフィルターを重ねた状態で収容可能な収容部と、
前記収容部に重ねた状態で収容されたフィルターを圧搾する１または複数の圧搾部材と、
前記収容部と連通するリザーバーと
を含む、抽出容器であって、
前記リザーバーが前記収容部の外周に設けられている、
前記抽出容器。
【請求項１８】
請求項１−１６のいずれか１項に記載の方法によって得られた、加熱式喫煙物品の煙中の粒子状物質を含む抽出液。
【請求項１９】
溶媒を含まない、請求項１８に記載の抽出液。
【請求項２０】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏの毒性試験に用いるための請求項１８または１９に記載の抽出液。
【請求項２１】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏの毒性試験が、小核試験またはエームズ試験である、請求項２０に記載の抽出液。
【請求項２２】
請求項１−１６のいずれか１項に記載の方法によって得られた、加熱式喫煙物品の煙中の粒子状物質を含む抽出液を用いる、ｉｎ ｖｉｔｒｏの毒性試験方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００２】
紙巻たばこなどの可燃性喫煙物品は通常、たばこロッドを形成する紙ラッパーに囲まれた細かく切られたたばこ（普通はカットフィラーの形態）を備える。紙巻たばこは、その一方の端に点火し、細かく切られたたばこを燃焼することにより、消費者によって使用される。消費者は、燃焼された紙巻たばこの反対側の端（口側の端またはフィルター端）で引き込むことによって主流煙を受ける。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００８】
【非特許文献１】Ｈｅａｌｔｈ  Ｃａｎａｄａ−ＴｏｂａｃｃｏＲｅｐｏｒｔｉｎｇ  Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎｓ  ＳＯＲ／２０００−２７３、Ｊｕｌｙ  ２０１８
【非特許文献２】「化学試験の試験に関するＯＥＣＤガイドライン」の「細菌復帰突然変異試験」（ＯＥＣＤ／ＯＣＤＥ  ＴＧ４７１）（１９９７年７月２１日採択）
【非特許文献３】「化学試験の試験に関するＯＥＣＤガイドライン」の「ＩＮ  ＶＩＴＲＯ  哺乳類細胞小核試験」（ＯＥＣＤ／ＯＣＤＥ  ＴＧ４８７）（２０１４年９月２６日採択）
【非特許文献４】ＣＯＲＥＳＴＡ  ＲＥＣＯＭＭＥＮＤＥＤ  ＭＥＴＨＯＤ  Ｎｏ．８１  ＲＯＵＴＩＮＥ  ＡＮＡＬＹＴＩＣＡＬ  ＭＡＣＨＩＮＥ  ＦＯＲ  Ｅ−ＣＩＧＡＲＥＴＴＥ  ＡＥＲＯＳＯＬ  ＧＥＮＥＲＡＴＩＯＮ  ＡＮＤ  ＣＯＬＬＥＣＴＩＯＮ−ＤＥＦＩＮＩＴＩＯＮＳ  ＡＮＤ  ＳＴＡＮＤＡＲＤ  ＣＯＮＤＩＴＩＯＮＳ  （Ｊｕｎｅ  ２０１５）
【非特許文献５】ＩＳＯ  ３４０２
【非特許文献６】ＩＳＯ  ３３０８
【非特許文献７】ＩＳＯ４３８７
【非特許文献８】Ｈｅａｌｔｈ  Ｃａｎａｄａ  Ｏｆｆｉｃｉａｌ  Ｍｅｔｈｏｄ  Ｔ−５０１  Ｂａｃｔｅｒｉａｌ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｍｕｔａｔｉｏｎ  Ａｓｓａｙ  ｆｏｒ  Ｍａｉｎｓｔｒｅａｍ  Ｔｏｂａｃｃｏ  Ｓｍｏｋｅ
【非特許文献９】ＣＯＲＥＳＴＡ  Ｒｅｃｏｍｍｅｎｄｅｄ  Ｍｅｔｈｏｄ  Ｎｏ．  ８４  ＤＥＴＥＲＭＩＮＡＴＩＯＮ  ＯＦ  ＧＬＹＣＥＲＩＮ，  ＰＲＯＰＹＬＥＮＥ  ＧＬＹＣＯＬ，  ＷＡＴＥＲ，  ＡＮＤ  ＮＩＣＯＴＩＮＥ  ＩＮ  ＴＨＥ  ＡＥＲＯＳＯＬ  ＯＦ  Ｅ−ＣＩＧＡＲＥＴＴＥＳ  ＢＹ  ＧＡＳ  ＣＨＲＯＭＡＴＯＧＲＡＰＨＩＣ  ＡＮＡＬＹＳＩＳ
【非特許文献１０】Ｍａｔｓｕｓｈｉｍａ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９９，  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  １４（６），  ５６９−５８０
【非特許文献１１】Ｈｅａｌｔｈ  Ｃａｎａｄａ  Ｏｆｆｉｃｉａｌ  Ｍｅｔｈｏｄ  Ｔ−５０２，Ｎｅｕｔｒａｌ  Ｒｅｄ  Ｕｐｔａｋｅ  Ａｓｓａｙ  ｆｏｒ  Ｍａｉｎｓｔｒｅａｍ  Ｔｏｂａｃｃｏ  Ｓｍｏｋｅ  （Ｈｅａｌｔｈ  Ｃａｎａｄａ，  ２００４ｃ）
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１４】
限定されるわけではないが、本発明は以下の態様を含む。
［態様１］
加熱式喫煙物品の煙中の粒子状物質を抽出する方法であって、
（１）加熱式喫煙物品の煙中の粒子状物質を、粒子状物質を捕捉可能なフィルターを２枚以上に捕集し、
（２）前記２枚以上のフィルターを重ね、そして、
（３）重ねたフィルターを圧搾することによりフィルターに付着した成分を抽出する、
ことを含む、前記方法。
［態様２］
（３）の工程を、
（３−ｉ）前記重ねたフィルターを圧縮し、復帰させる、
（３−ｉｉ）前記重ねたフィルターを圧縮してフィルターに付着した成分を抽出し、抽出液を重ねたフィルターにかけて、再び圧縮する、あるいは、
（３−ｉｉｉ）（３−ｉ）と（３−ｉｉ）を組み合わせて行う
ことによって行う、態様１に記載の方法。
［態様３］
（３−ｉ）の前記重ねたフィルターの圧縮復帰を２回以上繰り返す、態様２に記載の方法。
［態様４］
（３−ｉ）および／または（３−ｉｉ）の工程の際に、フィルターと抽出液とを振とうする、態様２に記載の方法。
［態様５］
（３−ｉｉ）前記重ねたフィルターを圧縮してフィルターに付着した成分を抽出し、抽出液を重ねたフィルターにかけ戻して、再び圧縮することを、２回以上繰り返す、態様２に記載の方法。
［態様６］
工程（３）を、２つの圧搾面を有する抽出容器内にフィルターを収めて行う、態様１−５のいずれか１項に記載の方法。
［態様７］
工程（３）において、圧搾により抽出された抽出液を流動または循環させる、態様１−６のいずれか１項に記載の方法。
［態様８］
フィルターを３枚以上使用する、態様１−７のいずれか１項に記載の方法。
［態様９］
フィルターを１０枚−１５枚使用する、態様１−８のいずれか１項に記載の方法。
［態様１０］
重ねたフィルターの厚さが工程（３）を行う前の１／３以下になるまで、工程（３）を繰り返す、態様１−９のいずれか１項に記載の方法。
［態様１１］
工程（３）において溶媒を使用しない、態様１−１０のいずれか１項に記載の方法。
［態様１２］
工程（３）において、フィルター容積に対して０％（重量／容積）より多く、４００％（重量／容積）以下の量の両親媒性溶媒を加える、態様１−１０のいずれか１項に記載の方法。
［態様１３］
圧縮を１０ＭＰａ以下で行う、態様１−１２のいずれか１項に記載の方法。
［態様１４］
フィルターがガラス繊維フィルターである、態様１−１３のいずれか１項に記載の方法。
［態様１５］
フィルターが、定格風量で、粒径が０．３μｍの粒子に対して９９％以上の粒子捕集率を有するフィルターである、態様１−１４のいずれか１項に記載の方法。
［態様１６］
さらに、
（４）フィルターを遠心分離し分離液を得る；そして
（５）工程（３）で得られた抽出液に分離液を混合する
ことを含む、態様１−１５のいずれか１項に記載の方法。
［態様１７］
２枚以上のフィルターを重ねた状態で収容可能な収容部と、
前記収容部に重ねた状態で収容されたフィルターを圧搾する１または複数の圧搾部材と、
前記収容部と連通するリザーバーと
を含む、抽出容器。
［態様１８］
前記圧搾部材によりフィルターを圧搾する圧搾面の形状が、平面、錐形の斜面または凸状若しくは凹状の曲面、のいずれかである、態様１７の抽出容器。
［態様１９］
前記圧搾部材によりフィルターを圧搾する圧搾面が２面ある、態様１７または１８の抽出容器。
［態様２０］
２つの前記圧搾面が互いに回転摺動する、態様１９の抽出容器。
［態様２１］
前記リザーバーが、前記収容部の上方および下方の少なくともいずれかに配置される、態様１７−２０のいずれか１項に記載の抽出容器。
［態様２２］
前記リザーバーが前記収容部の外周に設けられている、態様１７−２０のいずれか１項に記載の抽出容器。
［態様２３］
前記リザーバーは前記圧搾面の少なくとも１つを貫通する細管を通して前記収容部と連通している、態様１７−２１のいずれか１項に記載の抽出容器。
［態様２４］
前記圧搾部材の圧搾面に溝が設けられている、態様１７−２３のいずれか１項に記載の抽出容器。
［態様２５］
前記圧搾部材を２つ有し、該２つの圧搾部材は各々の圧搾面を対向させた状態で移動可能であり、
前記２つの圧搾部材の各々対向する圧搾面の間の空間が前記収容部を画成する、態様１７−２４のいずれか１項に記載の抽出容器。
［態様２６］
前記２つの圧搾部材のうち一方が凹部を有し、該凹部の内側底面が圧搾面を形成し、
前記２つの圧搾部材のうち他方がその圧搾面を前記内側底面に向けた状態で前記凹部内を液密に摺動可能である、態様２５に記載の抽出容器。
［態様２７］
注射器型のシリンダー部材と、
前記シリンダー部材の中空空間を基端側空間と先端側空間とに仕切るように配置された、細孔を有するふるい部材と、
前記シリンダー部材の前記基端側空間を液密に摺動可能なピストン部材と、
を備え、
前記ふるい部材および前記ピストン部材は、それらの内側対向する面が圧搾面を各々形成して前記圧搾部材を構成し、
前記ピストン部材の圧搾面と前記ふるい部材の圧搾面との間の前記基端側空間の少なくとも一部が前記収容部を画成し、
前記先端側空間が前記リザーバーを画成する、
態様１７−２０のいずれか１項に記載の抽出容器。
［態様２８］
リザーバーに回収された抽出液が流動または循環される、態様１７−２７のいずれか１項に記載の抽出容器。
［態様２９］
態様１−１６のいずれか１項に記載の方法に使用するための態様１７−２８のいずれか１項に記載の抽出容器。
［態様３０］
態様１−１６のいずれか１項に記載の方法によって得られた、加熱式喫煙物品の煙中の粒子状物質を含む抽出液。
［態様３１］
溶媒を含まない、態様３０に記載の抽出液。
［態様３２］
ｉｎ  ｖｉｔｒｏの毒性試験に用いるための態様３０または３１に記載の抽出液。
［態様３３］
ｉｎ  ｖｉｔｒｏの毒性試験が、小核試験またはエームズ試験である、態様３２に記載の抽出液。
［態様３４］
態様１−１６のいずれか１項に記載の方法によって得られた、加熱式喫煙物品の煙中の粒子状物質を含む抽出液を用いる、ｉｎ ｖｉｔｒｏの毒性試験方法。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１６】
【図１】図１は、本発明の第１の実施形態に係る抽出容器の断面図である。
【図２】図２は、第１の実施形態に係る抽出容器を構成する第２の圧搾部材の圧搾面の平面図であって、（ａ）は当該圧搾面が平面である例、（ｂ）は当該圧搾面に放射状の溝が形成された例を示す。
【図３】図３は、第１の実施形態に係る抽出容器を構成する圧搾部材を駆動させる駆動手段を備えた状態での当該抽出容器の断面図である。
【図４】図４は、本発明の第２の実施形態に係る抽出容器の図であって、（ａ）は、当該抽出容器の断面図、（ｂ）は、抽出液体を循環させる循環装置を備えた抽出容器の概略図である。
【図５】図５は、本発明の第３の実施形態に係る、第１の構成例による抽出容器の断面図である。
【図６】図６は、本発明の第３の実施形態に係る、第２の構成例による抽出容器の断面図である。
【図７】図７は、本発明の第４の実施形態に係る、第１の構成例による抽出容器の断面図である。
【図８】図８は、本発明の第４の実施形態に係る、第２の構成例による抽出容器の断面図である。
【図９】図９は、本発明の第５の実施形態に係る抽出容器の断面図である。
【図１０】図１０は、本発明の各実施形態に係る抽出容器を用いてフィルターから液体を抽出する一方法を示すフローチャートである。
【図１１】図１１は、フィルターに与えた圧縮および復帰の圧力（ＭＰａ）（４回）と、フィルターの厚さ（ｍｍ）および抽出液量との関係を示す。フィルターの厚さを白丸、抽出液量を黒三角で示す。
【図１２】図１２は、Ａｍｅｓ試験の結果を示す。横軸に、試料の添加用量（μｇ総粒子物質（ＴＰＭ）  ｅｑ．／ｍＬ）、縦軸に、試料添加前の生細胞数に対する試料添加後の生細胞数（細胞復帰突然変異を起こした細胞）の割合（％）をプロットしたものである。
【図１３】図１３は、ＭＮ試験の結果を示す。横軸に、試料の添加用量（μｇ総粒子物質（ＴＰＭ）  ｅｑ．／ｍＬ）、縦軸に、小核（ＭＮ）の発生頻度（ＭＮ誘発が生じた）割合（％）をプロットしたものである。
【図１４Ａ】図１４Ａは、ＤＭＳＯ抽出試料（慣用法）のニュートラルレッド取込活性試験結果を示す。横軸に試料の添加用量、縦軸に試料無添加の細胞のニュートラルレッド取込量に対する試料に曝露した細胞のニュートラルレッド取込量の百分率をプロットした。試験試料としては、紙巻きたばこ３Ｒ４Ｆ（白抜き三角形）、加熱型喫煙物品のＭａｒｌｂｏｒｏ  ｆｏｒ  ｉＱＯＳ  ＲＥＧＵＬＡＲ（商標）（サンプルＡ）（黒丸）、加熱型喫煙物品Ｂ（サンプルＢ）（白抜き丸）、Ｍｅｖｉｕｓ（登録商標）  Ｒｅｇｕｌａｒ  ｆｏｒ  Ｐｌｏｏｍ  ＴＥＣＨ（黒三角形）を用いた。
【図１４Ｂ】図１４Ｂは、ＳＥＰ法のニュートラルレッド取込活性試験結果を示す。横軸に試料の添加用量、縦軸に試料無添加の細胞のニュートラルレッド取込量に対する試料に曝露した細胞のニュートラルレッド取込量の百分率をプロットした。試験試料としては、加熱型喫煙物品のＭａｒｌｂｏｒｏ  ｆｏｒ  ｉＱＯＳ  ＲＥＧＵＬＡＲ（商標）（サンプルＡ）（黒丸）、加熱型喫煙物品Ｂ（サンプルＢ）（白抜き丸）、Ｍｅｖｉｕｓ（登録商標）  Ｒｅｇｕｌａｒ  ｆｏｒ  Ｐｌｏｏｍ  ＴＥＣＨ（黒三角形）を用いた。
【図１４Ｃ】図１４Ｃは、ＳＥＰ法のニュートラルレッド取込活性試験結果を示す。横軸に試料の添加用量、縦軸に試料無添加の細胞のニュートラルレッド取込量に対する試料に曝露した細胞のニュートラルレッド取込量の百分率をプロットした。試験試料としては、加熱型喫煙物品のＭａｒｌｂｏｒｏ  ｆｏｒ  ｉＱＯＳ  ＲＥＧＵＬＡＲ（商標）（サンプルＡ）（黒丸）、加熱型喫煙物品Ｂ（サンプルＢ）（白抜き丸）、Ｍｅｖｉｕｓ（登録商標）  Ｒｅｇｕｌａｒ  ｆｏｒ  Ｐｌｏｏｍ  ＴＥＣＨ（黒三角形）を用いた。
【図１４Ｄ】図１４Ｄは、ＳＥＰ法のニュートラルレッド取込活性試験結果を示す。横軸に試料の添加用量、縦軸に試料無添加の細胞のニュートラルレッド取込量に対する試料に曝露した細胞のニュートラルレッド取込量の百分率をプロットした。試験試料としては、加熱型喫煙物品のＭａｒｌｂｏｒｏ  ｆｏｒ  ｉＱＯＳ  ＲＥＧＵＬＡＲ（商標）（サンプルＡ）（黒丸）、加熱型喫煙物品Ｂ（サンプルＢ）（白抜き丸）、Ｍｅｖｉｕｓ（登録商標）  Ｒｅｇｕｌａｒ  ｆｏｒ  Ｐｌｏｏｍ  ＴＥＣＨ（黒三角形）を用いた。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２２】
「加熱式喫煙物品の煙中の粒子状物質」とは、加熱式喫煙物品から発生する煙中のガス状、揮発性の物質を除く全ての物質を意味し、総粒子状物質（ＴＰＭ、ｔｏｔａｌ  ｐａｒｔｉｃｕｌａｔｅ  ｍａｔｔｅｒ）と呼称される場合もある。一態様において、加熱式喫煙物品の煙中の粒子状物質には、水蒸気、ニコチン、プロピレングリコール、グリセリン、メントール等を含む。加熱式喫煙物品の1つであるフィリップモリス・プロダクツ・ソシエテ・アノニム社の加熱式喫煙物品（商品名  Ｍａｒｌｂｏｒｏ（登録商標） ＨｅａｔＳｔｉｃｋｓ（登録商標）ＳＭＯＯＴＨ  ＆  ＰＵＲＰＬＥ、同ＰＵＲＰＬＥ  ＭＥＮＴＨＯＬ、同ＲＥＧＵＬＡＲ、同ＢＡＬＡＮＣＥＤ  ＲＥＧＵＬＡＲ、同ＭＥＮＴＨＯＬ、同ＭＩＮＴ（商標）））を専用の加熱式喫煙具（商品名ｉＱＯＳ（登録商標）、ｉＱＯＳ２．４、ｉＱＯＳ２．４ｐｌｕｓ）に適用した場合に発生する煙中の粒子状物質には、ニコチン、プロピレングリコール、グリセリン、フルクトース、グルコース、定量限界以下の微量の一酸化炭素等を含む。成分の種類に応じてガスクロマトグラフィー質量分析法（ＧＣ／ＭＳ）等により分析をすることができる。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２５】
一態様において、「粒子状物質を捕捉可能なフィルター」としてケンブリッジフィルターを使用可能である。ケンブリッジフィルターは、直径約４４または９２ｍｍ、厚さ１．５  ｍｍの平たい円形のガラス繊維のフィルターで、粒子状物質を捕捉可能なフィルターとして、当業者に周知であり汎用されている。ケンブリッジフィルターは、日本ケンブリッジフィルター株式会社、Ｂｏｒｇｗａｌｄｔ社（カタログ番号８０２０  ２８５  ２）等より入手可能である。
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３２】
一態様において、好ましくは、圧縮は０．０１ＭＰａ以上、０．1ＭＰａ以上、０．５ＭＰａ以上、２．０ＭＰａ以上で行う。一態様において、好ましくは、圧縮を０．５ＭＰａ以下、２．０ＭＰａ以下、５．０ＭＰａ以下、１０．０ＭＰａ以下で行う。圧搾液の流動性が無くならない程度の圧力が望ましい。例えば０Ｍｐａより圧搾を開始し、徐々に圧搾の圧力を高めてもよい。圧搾は例えば、０ＭＰａ−１０．０ＭＰａの範囲で行う。工程（３−ｉ）の圧縮復帰を２回以上行う場合、各回の圧力は同じであっても異なってもよい。回を重ねる毎に徐々に圧搾の圧力を高めてもよい。
【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５５】
ネジロッド２３がハウジング２０内に引き込まれる方向（図３のＡ方向）にハンドル２４を回転させるとき、Ａ方向に移動するネジロッド２３は、ベアリング部２５を介して第２の圧搾部材３ａを下方向に移動させる。このとき、第２の圧搾面５は第１の圧搾面４に接近するため、第１および第２の圧搾面４、５の間に配置されている、重ねた複数のフィルター部材７を圧縮させる。図３の駆動手段では、大きな直径のハンドル２４を用いたネジロッド２３のネジ孔２２内へのネジ込みに伴う圧力をフィルター部材７の圧縮力として利用できるため、大きい圧縮力を得ることができる。
【手続補正１０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５６】
一方、ネジロッド２３がハウジング２０から引き出される方向（図３のＢ方向）にハンドル２４を回転させるとき、Ｂ方向に移動するネジロッド２３は、ベアリング部２５を介して第２の圧搾部材３ａを上方向に移動させる。このとき、第２の圧搾面５は第１の圧搾面４から離れていくため、第１および第２の圧搾面４、５の間に配置されている、重ねた複数のフィルター部材７は、上記の圧縮状態から復帰される。
【手続補正１１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５９】
次に、第１の圧搾面４および第２の圧搾面５を接近させ、重ねたフィルター部材７を圧縮させる（ステップ１０２）。図３に示される駆動手段を用いた場合、ステップ１０２は、上記したように、ネジロッド２３がハウジング２０内に引き込まれる方向（図３のＡ方向）にハンドル２４を回転させることによって行われる。
【手続補正１２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６０】
次に、第１の圧搾面４および第２の圧搾面５を引き離して、重ねたフィルター部材７を圧縮状態から復帰させる（ステップ１０４）。図３に示される駆動手段を用いた場合、ステップ１０４は、上記したように、ネジロッド２３がハウジング２０から引き出される方向（図３のＢ方向）にハンドル２４を回転させることによって行われる。ステップ１０２の圧縮工程およびステップ１０４の復帰工程は、１つの圧縮―復帰サイクルとカウントされる。なお、圧縮および復帰の際の好ましい圧力としては、本発明の第１の形態で上述された圧力や、本発明の第３の形態で後述される圧力が用いられる。
【手続補正１３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００８３】
第２の実施形態に係る抽出容器１ｂでは、第１の空洞部４０および第２の空洞部４５、特に、中径部４２、４７および小径部４３、４８が、第１の実施形態におけるリザーバー１０としての役割も果たすことになる。第２の実施形態では、第１の実施形態における、「抽出液のかけ戻し」を循環用チューブ５０およびペリスタポンプ５３を用いて、より効率的かつ効果的に実行することが可能となる。
【手続補正１４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００８４】
第２の実施形態に係る抽出容器１ｂを用いて、図１０のフローチャートに従って、フィルター部材７から液体を抽出することができる。この場合、図１０のステップ１０８における「抽出液の回収およびフィルターへのかけ戻し」がペリスタポンプ５３による「循環用チューブ５０および収容部８を通る抽出液の循環」に相当することとなる。また、ステップ１１０の「抽出液のかけ戻し回数」は、例えば、「所定時間ペリスタポンプ５３を駆動させて抽出液を循環させた」ことを１回とカウントする場合の回数、或いは、「抽出液を収容部８から循環用チューブ５０を介して収容部８へと一巡」したことを１回とカウントしてもよい。
【手続補正１５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１００
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１００】
第５の実施形態に係る注射器型の抽出容器１ｇにおいても、ピストン部材（第２の圧搾部材）３ｇを、シリンダー部材（第１の圧搾部材）２ｇ内で摺動させることによって、収容部８ｇ内のフィルター部材７に対して、第１の実施形態の図１０で説明した圧縮―復帰サイクルを実行することができる。圧縮―復帰サイクルを受けたフィルター部材７から液体が抽出され、当該抽出液は、ふるい部材６０の細孔から先端側空間（リザーバー）１０ｇへと浸出する。このとき、抽出容器１ｇを先端部６１が下方向に向くように配置し、先端部６１の開口を閉鎖しておけば、先端側空間（リザーバー）１０ｇ内に抽出液を貯蔵することが可能となる。図１０のステップ１０８のかけ戻し工程においては、抽出容器１ｇを先端部６１が上方向に向くように逆に配置すれば、重力により先端側空間（リザーバー）１０ｇに貯蔵された抽出液は、ふるい部材６０の細孔を通過して、再び、フィルター部材７へとかけ戻される。
【手続補正１６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１３６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１３６】
全ての細菌株＋Ｓ９の組み合わせにおいて、再現可能なように、復帰変異体が用量依存的増加し、そして、試験試料の１以上の濃度において、ＴＡ９８、ＴＡ１００およびＴＡ１０２が溶媒コントロールに対し少なくとも２倍増加するか、もしくは、試験試料の１以上の濃度において、ＴＡ１５３５およびＴＡ１５３７が溶媒コントロールに対し少なくとも３倍増加する場合に、その試料は変異原性である、と評価した。
【手続補正１７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１４４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１４４】
各試料の遺伝毒性をＭａｔｓｕｓｈｉｍａ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９９，  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  １４（６），  ５６９−５８０（非特許文献１０）に記載された方法に従って評価した。コクラン−アーミテージ２項検定を用いて、ＭＮ頻度の用量依存性を調べた。フィッシャーの正確検定を用いて、併行した溶媒コントロールに対して、試験試料の１以上の濃度において、ＭＮ頻度が有意に増加するかを評価した。
【手続補正１８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１５１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１５１】
加熱型喫煙物品：
サンプルＡ＝加熱型喫煙物品の内部に挿入された熱源からエアロゾル形成基質への熱の移動によってエアロゾルが生成されるタイプ、フィリップモリス・プロダクツ・ソシエテ・アノニム社の加熱式喫煙物品（商品名  Ｍａｒｌｂｏｒｏ  ｆｏｒ  ｉＱＯＳ  ＲＥＧＵＬＡＲ（商標））を専用の加熱式喫煙具（商品名ｉＱＯＳ２．４（登録商標））、フィリップモリス・プロダクツ・ソシエテ・アノニム社製）を用いた。
サンプルＢ＝加熱型喫煙物品の外周に配置された熱源からエアロゾル形成基質への熱の移動によってエアロゾルが生成されるタイプ、を専用の加熱式喫煙具を用いた。
サンプルＣ＝加熱型喫煙物品Ｍｅｖｉｕｓ（登録商標）  Ｒｅｇｕｌａｒｆｏｒ  Ｐｌｏｏｍ  ＴＥＣＨ（日本たばこ産業株式会社製）を，同封のカートマイザーと専用の喫煙具（Ｐｌｏｏｍ（登録商標）  ＴＥＣＨ）を用いた。試料は次の調湿・調和を開始する直前まで４℃で保存した。
【手続補正１９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１６１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１６１】
各処理レベルの細胞毒性を、同時併行の溶媒コントロールとの相対吸光度として表した。試験試料間の細胞毒性活性の比較のためのＩＣ５０値を算出するために、ロジスティック係数を用いた最小二乗法に基づき、相対吸光度と濃度の間の関係について非線形回帰分析を行った。吸光度が、同時併行の溶媒コントロールの値の５０％まで減少した時点の、有効濃度の逆推定により、ＩＣ５０値を算出した。ＪＭＰ  ｖｅｒｓｉｏｎ  １０．０．２（ＳＡＳ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  Ｊａｐａｎ、東京、日本）を用いて計算を行った。
【手続補正２０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１６３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１６３】
ＤＭＳＯ抽出試料を用いた場合、紙巻きたばこ試料についてはニュートラルレッド取込活性がほぼ消失する程度まで曝露できた。一方、加熱型喫煙物品試料については、サンプルＡ加熱型喫煙物品ｉＱＯＳおよびサンプルＢ加熱型喫煙物品Ｂいずれについてもニュートラルレッド取込活性７０％程度までしか曝露できなかった（図１４Ａ）。加熱型喫煙物品Ｐｌｏｏｍ  ＴＥＣＨについては、ニュートラルレッド取込活性は変化がなかった（図１４Ａ）。いずれの加熱型喫煙物品試料においても、ＤＭＳＯ抽出試料を調整できる技術的限界はＴＰＭ１０００μｇ／ｍｌであった。
【手続補正２１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１６４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１６４】
これに対し、ＳＥＰ法による試料を用いた場合、加熱型喫煙物品試料は、サンプルＡ加熱型喫煙物品ｉＱＯＳおよびサンプルＢ加熱型喫煙物品Ｂいずれについても、ニュートラルレッド取込活性が消失する程度まで曝露できた（図１４Ｂ，同Ｃ，同Ｄ）。サンプルＣ加熱型喫煙物品Ｐｌｏｏｍ  ＴＥＣＨについては、ニュートラルレッド取込活性９０％程度まで曝露できた（図１４Ｂ，同Ｃ，同Ｄ）。ＳＥＰ法は、抽出原理的に加熱型喫煙物品が発生するエアロゾルの原液を抽出する方法であるが、Ｐｌｏｏｍ  ＴＥＣＨ試料の原液でもＴＰＭ２００００μｇ／ｍｌが上限であるからである。すなわち、ＳＥＰ法により得られた試料で、加熱型喫煙物品のエアロゾル成分を試料としたニュートラルレッド取込活性試験が完遂できることが示された。図１４で明らかなとおり、加熱型喫煙物品の内部に挿入された熱源からエアロゾル形成基質への熱の移動によってエアロゾルが生成される加熱型喫煙物品、加熱型喫煙物品の外周に配置された熱源からエアロゾル形成基質への熱の移動によってエアロゾルが生成される加熱型喫煙物品、インフューズド型加熱型喫煙物品、種々のタイプの加熱式喫煙物品の比較試験を行うことができた。
【国際調査報告】
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