(57)【要約】  本発明は、ベンジルイソキノリンアルカロイド（ＢＩＡ）、中でもテトラヒドロパパベロリン、３−ヒドロキシコクラウリン、３−ヒドロキシ−Ｎ−メチルコクラウリン及び／又はレチクリンを効率的かつ容易に生産することができる組換え宿主細胞を提供すること、そしてその宿主細胞を用いて効率的かつ容易にこれらを製造する方法を提供することを目的とする。  本発明は、芳香族アルデヒドシンターゼ（ＡＡＳ）、芳香族アミノ酸脱炭酸酵素（ＡＡＡＤ）の、野生型又は変異体を発現させた、ベンジルイソキノリンアルカロイド（ＢＩＡ）、中でも特にテトラヒドロパパベロリン（ＴＨＰ）、３−ヒドロキシコクラウリン、３−ヒドロキシ−Ｎ−メチルコクラウリン及び／又はレチクリン産生用の組換え宿主細胞である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
異種の芳香族アルデヒドシンターゼ（ＡＡＳ）、芳香族アミノ酸脱炭酸酵素（ＡＡＡＤ）の、野生型又は変異体を発現させた、ベンジルイソキノリンアルカロイド（ＢＩＡ）産生用の組換え宿主細胞。
【請求項２】
ベンジルイソキノリンアルカロイド（ＢＩＡ）が、テトラヒドロパパベロリン（ＴＨＰ）、ノルコクラウリン、３−ヒドロキシコクラウリン、３−ヒドロキシ−Ｎ−メチルコクラウリン及び／又はレチクリンである、請求項１に記載の組換え宿主細胞。
【請求項３】
上記異種における種が、昆虫、植物又は微生物である、請求項１又は２に記載の組換え宿主細胞。
【請求項４】
上記異種における種が、ボンビックス・モリ、カンポノタス・フロリダヌス、アピス・メリフェラ、アエデス・アエギプチ、及びドロソフィラ・メラノガスターからなる群より選択される昆虫、パパヴェル・ソムニフェルム又はシュードモナス・プチダである、請求項３に記載の組換え宿主細胞。
【請求項５】
宿主細胞が大腸菌である、請求項１から４のいずれかに記載の組換え宿主細胞。
【請求項６】
芳香族アルデヒドシンターゼ（ＡＡＳ）が、３，４−ジヒドロキシフェニルアセトアルデヒドシンターゼ（ＤＨＰＡＡＳ）、４−ヒドロキシフェニルアセトアルデヒドシンターゼ（４−ＨＰＡＡＳ）である、請求項１から５のいずれかに記載の組換え宿主細胞。
【請求項７】
芳香族アルデヒドシンターゼ（ＡＡＳ）が昆虫由来であり、かつ芳香族アルデヒドシンターゼ（ＡＡＳ）の変異体における変異が、Ａｓｎ１９２Ｈｉｓ、Ｐｈｅ７９Ｔｙｒ及びＴｙｒ８０Ｐｈｅからなる群より選択される少なくとも１つである、請求項６に記載の組換え宿主細胞。
【請求項８】
芳香族アミノ酸脱炭酸酵素（ＡＡＡＤ）が、植物由来のチロシンデカルボキシラーゼ（ＴｙＤＣ）であり、かつチロシンデカルボキシラーゼ（ＴｙＤＣ）の変異体における変異が、Ｌｅｕ２０５Ａｓｎ、Ｐｈｅ９９Ｔｙｒ及びＴｙｒ９８Ｐｈｅからなる群より選択される少なくとも１つ、或いはＨｉｓ２０３Ａｓｎ、Ｐｈｅ１０１Ｔｙｒ及びＴｙｒ１００Ｐｈｅからなる群より選択される少なくとも１つである、請求項６に記載の組換え宿主細胞。
【請求項９】
芳香族アミノ酸脱炭酸酵素（ＡＡＡＤ）が、微生物由来のドーパデカルボキシラーゼ（ＤＤＣ）であり、かつドーパデカルボキシラーゼ（ＤＤＣ）の変異体における変異が、Ｔｙｒ７９Ｐｈｅ、Ｐｈｅ８０Ｔｙｒ及びＨｉｓ１８１Ａｓｎからなる群より選択される少なくとも１つである、請求項６に記載の組換え宿主細胞。
【請求項１０】
さらに、ノルコクラウリンシンターゼ（ＮＣＳ）を発現させた、請求項１から９のいずれかに記載の組換え宿主細胞。
【請求項１１】
さらに、ノルコクラウリン６−Ｏ−メチルトランスフェラーゼ（６’ＯＭＴ）、３’−ヒドロキシ−Ｎ−メチル−（Ｓ）−コクラウリン−４’−Ｏ−メチルトランスフェラーゼ（４’ＯＭＴ）、コクラウリン−Ｎ−メチルトランスフェラーゼ（ＣＮＭＴ）、及びＮ−メチルコクラウリン３−ヒドロキシラーゼから成る群より選択される少なくとも１種の酵素を発現させた、請求項１から１０のいずれかに記載の組換え宿主細胞。
【請求項１２】
請求項１から１１のいずれかに記載の組換え宿主細胞を、Ｌ−ドーパ又はチロシン含有培地中で培養する工程を含む、ベンジルイソキノリンアルカロイド（ＢＩＡ）の製造方法。
【請求項１３】
無細胞系において、Ｌ−ドーパ又はチロシンに、芳香族アルデヒドシンターゼ（ＡＡＳ）、芳香族アミノ酸脱炭酸酵素（ＡＡＡＤ）の野生型又は変異体を作用させる工程を含む、ベンジルイソキノリンアルカロイド（ＢＩＡ）の製造方法。
【請求項１４】
芳香族アルデヒドシンターゼ（ＡＡＳ）、芳香族アミノ酸脱炭酸酵素（ＡＡＡＤ）の野生型又は変異体が、請求項１から１１のいずれかに記載の組換え宿主細胞から得られる酵素であることを特徴とする、請求項１３に記載の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ベンジルイソキノリンアルカロイド（ＢＩＡ）産生用の組換え宿主細胞及びベンジルイソキノリンアルカロイド（ＢＩＡ）の新規製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ベンジルイソキノリンアルカロイド（ＢＩＡ）誘導体は、モルヒネ、コデイン等の鎮痛薬、ベルベリン等の抗菌剤といった有用医薬品を含む多様な化合物群である。これらのベンジルイソキノリンアルカロイド誘導体の多くは、各種の植物においてチロシンからテトラヒドロパパベロリン（ＴＨＰ）、ノルコクラウリン、レチクリン等のベンジルイソキノリンアルカロイド（ＢＩＡ）を介して合成される。すなわち、テトラヒドロパパベロリン（ＴＨＰ）、ノルコクラウリン、レチクリンは多くのベンジルキノリンアルカロイド誘導体の生合成経路における重要な中間体でもある。このようなテトラヒドロパパベロリン（ＴＨＰ）、ノルコクラウリン、レチクリンがそのまま疾患の治療に使用されることはないが、工業的に医薬品原料として利用され、オキシコドン、オキシモルフォン、ナルブフィン、ナロキソン、ナルトレキソン、ブプレノルフィン、エトルフィン等が製造される。【０００３】
これまでベンジルイソキノリンアルカロイド（ＢＩＡ）及びその誘導体は、その生産のほとんどを植物からの抽出に依存していた。また、いくつかのベンジルイソキノリンアルカロイド（ＢＩＡ）は、全合成によって化学合成されてきた（非特許文献１参照）。しかし、生産の安定性、効率性の観点から他の製造方法の開発が求められていた。例えば、微生物を用いたバイオプロダクションは、その他の植物代謝産物を含まないため、必要とするベンジルイソキノリンアルカロイド（ＢＩＡ）を効率的に生産させることができ、注目されている（非特許文献２〜４参照）。しかし、その収量は１リットル当たり１０ｍｇ未満であり、バイオプロダクションによる方法は産業上の要求を満たすためには、さらなる最適化が求められる。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Ｇａｔｅｓ  Ｍ．ｅｔ  ａｌ，Ｔｈｅ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  ｍｏｒｐｈｉｎｅ，Ｊ  Ａｍ  Ｃｈｅｍ  Ｓｏｃ  ７４，１１０９−１１１０（１９５２）
【非特許文献２】Ｇａｌａｎｉｅ，Ｓ．，Ｔｈｏｄｅｙ，Ｋ．，Ｔｒｅｎｃｈａｒｄ，Ｉ．Ｊ．，Ｆｉｌｓｉｎｇｅｒ  Ｉｎｔｅｒｒａｎｔｅ，Ｍ．＆Ｓｍｏｌｋｅ，Ｃ．Ｄ．Ｃｏｍｐｌｅｔｅ  ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓｓ  ｏｆ  ｏｐｉｏｉｄｓ  ｉｎ  ｙｅａｓｔ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３４９，１０９５−１１００（２０１５）
【非特許文献３】Ｎａｋａｇａｗａ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．（Ｒ，Ｓ）−Ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏｐａｐａｖｅｒｏｌｉｎｅ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｂｙ  ｓｔｅｐｗｉｓｅ  ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ  ｕｓｉｎｇ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ．Ｓｃｉ．Ｒｅｐ．４，６６９５（２０１４）
【非特許文献４】Ｎａｋａｇａｗａ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．Ｔｏｔａｌ  ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  ｏｐｉａｔｅｓ  ｂｙ  ｓｔｅｐｗｉｓｅ  ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ  ｕｓｉｎｇ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ．Ｎａｔ．Ｃｏｍｍｕｎ．７，１０３９０（２０１６）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
このような状況の中、本発明は、ベンジルイソキノリンアルカロイド（ＢＩＡ）を効率的に生産させることができる微生物、またそれを用いたベンジルイソキノリンアルカロイド（ＢＩＡ）の製造方法を提供することを目的とする。具体的には、多くのベンジルイソキノリンアルカロイド（ＢＩＡ）誘導体の生合成経路の中間体であるテトラヒドロパパベロリン（ＴＨＰ）、ノルコクラウリン、レチクリン等のベンジルイソキノリンアルカロイド（ＢＩＡ）を、効率的かつ容易に生産することができる組換え宿主細胞を提供すること、そしてその宿主細胞を用いて効率的かつ容易にテトラヒドロパパベロリン（ＴＨＰ）、ノルコクラウリン、レチクリン等のベンジルイソキノリンアルカロイド（ＢＩＡ）を製造する方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、上記課題を解決するために、微生物を用いたテトラヒドロパパベロリン（ＴＨＰ）、ノルコクラウリン、レチクリン等のベンジルイソキノリンアルカロイド（ＢＩＡ）の製造方法において、合成生物学に基づくアプローチを適用して新規な生合成経路を設計し、二官能性酵素である芳香族アルデヒドシンターゼ（ＡＡＳ）を同定することに成功した。また、チロシンデカルボキシラーゼ（ＴｙＤＣ）、ドーパデカルボキシラーゼ（ＤＤＣ）等の芳香族アミノ酸脱炭酸酵素（ＡＡＡＤ）の特定の残基に変異を導入することで、これらの酵素が４−ＨＰＡＡＳ、ＤＨＰＡＡＳ様の活性も示すようになることを見出した。即ち、本発明の要旨は、以下に示すとおりである。【０００７】
［１］異種の芳香族アルデヒドシンターゼ（ＡＡＳ）、芳香族アミノ酸脱炭酸酵素（ＡＡＡＤ）の野生型又は変異体を発現させた、ベンジルイソキノリンアルカロイド（ＢＩＡ）産生用の組換え宿主細胞。
［２］ベンジルイソキノリンアルカロイド（ＢＩＡ）が、テトラヒドロパパベロリン（ＴＨＰ）、ノルコクラウリン、３−ヒドロキシコクラウリン、３−ヒドロキシ−Ｎ−メチルコクラウリン及び／又はレチクリンである、［１］に記載の組換え宿主細胞。
［３］上記異種における種が、昆虫、植物又は微生物である、［１］又は［２］に記載の組換え宿主細胞。
［４］上記異種における種が、ボンビックス・モリ、カンポノタス・フロリダヌス、アピス・メリフェラ、アエデス・アエギプチ、及びドロソフィラ・メラノガスターからなる群より選択される昆虫、パパヴェル・ソムニフェルム又はシュードモナス・プチダである、［３］に記載の組換え宿主細胞。
［５］宿主細胞が大腸菌である、［１］から［４］のいずれかに記載の組換え宿主細胞。
［６］芳香族アルデヒドシンターゼ（ＡＡＳ）が、３，４−ジヒドロキシフェニルアセトアルデヒドシンターゼ（ＤＨＰＡＡＳ）、４−ヒドロキシフェニルアセトアルデヒドシンターゼ（４−ＨＰＡＡＳ）である、［１］から［５］のいずれかに記載の組換え宿主細胞。
［７］芳香族アルデヒドシンターゼ（ＡＡＳ）が昆虫由来であり、かつ芳香族アルデヒドシンターゼ（ＡＡＳ）の変異体における変異が、Ａｓｎ１９２Ｈｉｓ、Ｐｈｅ７９Ｔｙｒ及びＴｙｒ８０Ｐｈｅからなる群より選択される少なくとも１つである、［６］に記載の組換え宿主細胞。
［８］芳香族アミノ酸脱炭酸酵素（ＡＡＡＤ）が、植物由来のチロシンデカルボキシラーゼ（ＴｙＤＣ）であり、かつチロシンデカルボキシラーゼ（ＴｙＤＣ）の変異体における変異が、Ｌｅｕ２０５Ａｓｎ、Ｐｈｅ９９Ｔｙｒ及びＴｙｒ９８Ｐｈｅからなる群より選択される少なくとも１つである、或いはＨｉｓ２０３Ａｓｎ、Ｐｈｅ１０１Ｔｙｒ及びＴｙｒ１００Ｐｈｅからなる群より選択される少なくとも１つである、［６］に記載の組換え宿主細胞。
［９］芳香族アミノ酸脱炭酸酵素（ＡＡＡＤ）が、微生物由来のドーパデカルボキシラーゼ（ＤＤＣ）であり、かつドーパデカルボキシラーゼ（ＤＤＣ）の変異体における変異が、Ｔｙｒ７９Ｐｈｅ、Ｐｈｅ８０Ｔｙｒ及びＨｉｓ１８１Ａｓｎからなる群より選択される少なくとも１つである、［６］に記載の組換え宿主細胞。
［１０］さらに、ノルコクラウリンシンターゼ（ＮＣＳ）を発現させた、［１］から［９］のいずれかに記載の組換え宿主細胞。
［１１］さらに、ノルコクラウリン６−Ｏ−メチルトランスフェラーゼ（６’ＯＭＴ）、３’−ヒドロキシ−Ｎ−メチル−（Ｓ）−コクラウリン−４’−Ｏ−メチルトランスフェラーゼ（４’ＯＭＴ）、コクラウリン−Ｎ−メチルトランスフェラーゼ（ＣＮＭＴ）、及びＮ−メチルコクラウリン３−ヒドロキシラーゼから成る群より選択される少なくとも１種の酵素を発現させた、［１］から［１０］のいずれかに記載の組換え宿主細胞。
［１２］［１］から［１１］のいずれかに記載の組換え宿主細胞を、Ｌ−ドーパ又はチロシン含有培地中で培養する工程を含む、ベンジルイソキノリンアルカロイド（ＢＩＡ）の製造方法。
［１３］無細胞系において、Ｌ−ドーパ又はチロシンに、芳香族アルデヒドシンターゼ（ＡＡＳ）、芳香族アミノ酸脱炭酸酵素（ＡＡＡＤ）の野生型又は変異体を作用させる工程を含む、ベンジルイソキノリンアルカロイド（ＢＩＡ）の製造方法。
［１４］芳香族アルデヒドシンターゼ（ＡＡＳ）、芳香族アミノ酸脱炭酸酵素（ＡＡＡＤ）の野生型又は変異体が、［１］から［１１］のいずれかに記載の組換え宿主細胞から得られる酵素であることを特徴とする、［１３］に記載の製造方法。
【発明の効果】
【０００８】
本発明によると、二官能性酵素である芳香族アルデヒドシンターゼ（ＡＡＳ）等を発現させた組換え宿主細胞を用いることで、テトラヒドロパパベロリン（ＴＨＰ）、ノルコクラウリン、３−ヒドロキシコクラウリン、３−ヒドロキシ−Ｎ−メチルコクラウリン、レチクリン等のベンジルイソキノリンアルカロイド（ＢＩＡ）を効率的かつ容易に生産することができる。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】図１は、Ｍ−Ｐａｔｈ検索で見出されたレチクリン産生のためのＴＨＰ合成経路を示す図である。
【図２】図２は、対称的ＤＤＣ−ＤＨＰＡＡＳ経路とＭＡＯ介在非対称的経路におけるＴＨＰの予測収量を示す図である。
【図３】図３はＡＡＡＤとＤＨＰＡＡＳの構造分析を示す図である。左はＰＬＰと複合体を形成したＤ．ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ由来のＤＤＣ、中央はＰＬＰ−４−ＨＰＡＡと複合体を形成したＰ．ｓｏｍｎｉｆｅｒｕｍ  ＴｙＤＣ１、右はＰＬＰ−ＤＯＰＡと複合体を形成したＢ．ｍｏｒｉ由来ＤＨＰＡＡＳの構造を示す。
【図４】図４は、昆虫のＤＨＰＡＡの配列を系統発生学的に分類した結果である。
【図５】図５は、Ｂ．ｍｏｒｉの野生型及び変異体ＤＨＰＡＡＳの機能の比較に関する図である。
【図６】図６は、Ｂ．ｍｏｒｉの野生型及び変異体ＤＨＰＡＡＳによるＬ−ＤＯＰＡからのＨ２Ｏ２産生を速度論的に解析したものである。
【図７】図７は、Ｂ．ｍｏｒｉの野生型及び変異体ＤＨＰＡＡＳによるドーパミン、ＤＨＰＡＡ及びＴＨＰのインビトロにおける産生を示す図である。
【図８】図８は、変異体ＤＨＰＡＡＳによるＬ−ＤＯＰＡからのＴＨＰ産生のメカニズムを説明する図である。
【図９】図９−１は、ＤＨＰＡＡＳによるドーパミン、ＤＨＰＡＡＳ及びＴＨＰのインビボにおける産生を示す図である。図９−２は産生された（Ｒ，Ｓ）−ＴＨＰのキラルＬＣ−ＭＳ分析の結果を示す図である。
【図１０】図１０は、ＴＨＰ及びレチクリンのインビボにおける産生を示す図である。
【図１１】図１１は、ＴＨＰ、レチクリン及び２種類の中間体のインビボにおける産生を示す図である。
【図１２】図１２は、ＴＨＰ、ドーパミンのインビボにおける産生を示す図である。
【図１３】図１３は、ノルコクラウリンのインビボにおける産生を示す図である。
【図１４】図１４は、ノルコクラウリンのインビボにおける産生を示す図である。
【図１５】図１５は、４−ＨＰＡＡ、Ｌ−ＤＯＰＡ、ＴＨＰ、ノルコクラウリン、レチクリンのインビボにおける産生スキームを示す図である。
【図１６】図１６は、図１５のスキームにおける４−ＨＰＡＡ、Ｌ−ＤＯＰＡ、ＴＨＰ、ノルコクラウリン、レチクリンのインビボにおける産生量を示す図である。
【図１７】図１７は、ＴＨＰ、３ＨＮＭＣ、レチクリンのインビボにおける産生スキームを示す図である。
【図１８】図１８は、図１７のスキームにおけるＴＨＰ、３ＨＮＭＣ、レチクリンのインビボにおける産生量を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
以下、本発明のベンジルイソキノリンアルカロイド（ＢＩＡ）産生用の組換え宿主細胞、及びベンジルイソキノリンアルカロイド（ＢＩＡ）の新規製造方法について詳細に説明する。なお、本明細書において、ＤＮＡやベクターの調製等の分子生物学的手法は、特に明記しない限り、当業者に公知の一般的実験書に記載の方法又はそれに準じた方法により行うことができる。また、本明細書中で使用される用語は、特に言及しない限り、当該技術分野で通常用いられる意味で解釈される。なお、本発明においてベンジルイソキノリンアルカロイド（ＢＩＡ）とは、ベンジルイソキノリン構造を有する化合物をいう。例えば、各種の植物におけるテトラヒドロパパベロリン（ＴＨＰ）、ノルコクラウリン、３−ヒドロキシコクラウリン、３−ヒドロキシ−Ｎ−メチルコクラウリン、レチクリン等が挙げられるが、これらに限定されない。
【００１１】
＜組換え宿主細胞＞
本発明の組換え宿主細胞は、芳香族アルデヒドシンターゼ（ＡＡＳ）、芳香族アミノ酸脱炭酸酵素（ＡＡＡＤ）の野生型又は変異体を発現させた、ベンジルイソキノリンアルカロイド（ＢＩＡ）、特にテトラヒドロパパベロリン（ＴＨＰ）、ノルコクラウリン、３−ヒドロキシコクラウリン、３−ヒドロキシ−Ｎ−メチルコクラウリン及び／又はレチクリン産生のために用いられる組換え宿主細胞である。以下に本発明の組換え宿主細胞について詳細に説明する。
【００１２】
本発明の組換え宿主細胞が発現する芳香族アルデヒドシンターゼ（ＡＡＳ）とは、芳香族アミノ酸の脱カルボキシル化及びアミノ基酸化を触媒する二官能性酵素をいう。具体的には、Ｌ−ＤＯＰＡ又はチロシンから、ドーパミン、及びＤＨＰＡＡ又は４−ＨＰＡＡへの変換を触媒する機能を有する酵素である。上記で得られたドーパミン、及びＤＨＰＡＡ又は４−ＨＰＡＡは互いに結合してＴＨＰ又はノルコクラウリンが生成される。系統発生分析によると、ＡＡＳは芳香族アミノ酸脱炭酸酵素（ＡＡＡＤ、ＥＣ  ４．１．１．２８）から分岐した酵素であると考えられており、両者は構造的類似性を有し、補因子としてピリドキサール５’−リン酸（ＰＬＰ）に依存する点で共通している。
【００１３】
本発明におけるＡＡＳとしては上記機能を有していれば特に限定されないが、例えば、フェニルアセトアルデヒドシンターゼ（ＰＡＡＳ、ＫＥＧＧ  ＥＣ  ４．１．１．１０９）、４−ヒドロキシフェニルアセトアルデヒドシンターゼ（４−ＨＰＡＡＳ、ＫＥＧＧ  ＥＣ  ４．１．１．１０８）等の、植物において研究され、ＫＥＧＧによって分類されている植物由来ＡＡＳ、昆虫由来の３，４−ジヒドロキシフェニルアセトアルデヒドシンターゼ（ＤＨＰＡＡＳ、ＫＥＧＧ  ＥＣ  ４．１．１．１０７）酵素や、これら以外にも例えばＩＡＡＳ（ｉｎｄｏｌｅ−３−ａｃｅｔａｌｄｅｈｙｄｅ  ｓｙｎｔｈａｓｅ；インドール−３−アセトアルデヒドシンターゼ）等が挙げられる。なお、種は限定されず動物、植物、バクテリアを含む多くの種が含まれる。３，４−ジヒドロキシフェニルアセトアルデヒドシンターゼは、Ｌ−ＤＯＰＡの酸化的脱カルボキシル化を触媒しＤＨＰＡＡを産生する。また、Ｌ−ＤＯＰＡのアミノ基酸化を触媒しドーパミンを産生する。ＡＡＳとしては、Ｌ−ＤＯＰＡからのＴＨＰ変換の効率の観点から、上記のうち昆虫由来のＤＨＰＡＡＳが好ましい。昆虫由来のＤＨＰＡＡＳは、Ｌ−ＤＯＰＡに対する結合特異性が高いため、ＤＨＰＡＡ産生、ドーパミン（ＤＡ）産生の効率が高くなると考えられる。また、ＡＡＳとして、チロシンからのノルコクラウリン変換の効率の観点からは、植物由来の４−ＨＰＡＡＳも好ましい。
【００１４】
上記昆虫としては、ボンビックス・モリ、カンポノタス・フロリダヌス、アピス・メリフェラ、アエデス・アエギプチ、ドロソフィラ・メラノガスター等が挙げられ、これらのうち、本発明の効果の観点からボンビックス・モリが好ましい。
【００１５】
上記植物としては、パパヴェル・ソムニフェルム、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｌｙｒａｔａ、Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｒａｐａ、Ｃａｍｅｌｉｎａ  ｓａｔｉｖａ、Ｃｏｒｃｈｏｒｕｓ  ｏｌｉｔｏｒｉｕｓ、Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｏｌｅｒａｃｅａ、Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｃｒｅｔｉｃａ、Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｎａｐｕｓ、Ｃａｐｓｅｌｌａ  ｒｕｂｅｌｌａ、Ｅｕｔｒｅｍａ  ｓａｌｓｕｇｉｎｅｕｍ、Ｐａｒａｓｐｏｎｉａ  ａｎｄｅｒｓｏｎｉｉ、Ｐｅｔｒｏｓｅｌｉｎｕｍ  ｃｒｉｓｐｕｍ  Ａ、Ｐｒｕｎｕｓ  ａｖｉｕｍ、Ｐｒｕｎｕｓ  ｙｅｄｏｅｎｓｉｓ、Ｐｒｕｎｕｓ  ｄｕｌｃｉｓ、Ｐｒｕｎｕｓ  ｍｕｍｅ、Ｐｒｕｎｕｓ  ｐｅｒｓｉｃａ、Ｐｒｕｎｕｓ  ｙｅｄｏｅｎｓ、  Ｒａｐｈａｎｕｓ  ｓａｔｉｖｕｓ、Ｔａｒｅｎａｙａ  ｈａｓｓｌｅｒｉａｎａ、Ｔｒｅｍａ  ｏｒｉｅｎｔａｌｅ、Ｚｉｚｉｐｈｕｓ  ｊｕｊｕｂａ、Ｍａｌｕｓ  ｄｏｍｅｓｔｉｃａ、Ｅｒｉｏｂｏｔｒｙａ  ｊａｐｏｎｉｃａ、Ｃｏｒｃｈｏｒｕｓ  ｃａｐｓｕｌａｒｉｓ、Ｍｏｒｕｓ  ｎｏｔａｂｉｌｉｓ、Ｐｙｒｕｓ  ｘ  ｂｒｅｔｓｃｈｎｅｉｄｅｒｉ、Ｐｏｐｕｌｕｓ  ａｌｂａ、Ｊｕｇｌａｎｓ  ｒｅｇｉａ、Ｃｉｔｒｕｓ  ｕｎｓｈｉｕ、Ｃｉｔｒｕｓ  ｓｉｎｅｎｓｉｓ、Ｑｕｅｒｃｕｓ  ｓｕｂｅｒ、Ｃｅｐｈａｌｏｔｕｓ  ｆｏｌｌｉｃｕｌａｒｉｓ、Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ  ｇｒａｎｄｉｓ、Ｆｒａｇａｒｉａ  ｖｅｓｃａ  、Ｐｏｐｕｌｕｓ  ｔｒｉｃｈｏｃａｒｐａ、Ｄｕｒｉｏ  ｚｉｂｅｔｈｉｎｕｓ、Ｍａｎｉｈｏｔ  ｅｓｃｕｌｅｎｔａ、Ｄｕｒｉｏ  ｚｉｂｅｔｈｉｎｕｓ、Ｐｏｐｕｌｕｓ  ｔｒｉｃｈｏｃａｒｐａ、Ｊｕｇｌａｎｓ  ｒｅｇｉａ、Ｍａｎｉｈｏｔ  ｅｓｃｕｌｅｎｔａ、Ｈｅｖｅａ  ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ、Ｃｉｔｒｕｓ  ｓｉｎｅｎｓｉｓ、Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ  ｇｒａｎｄｉｓ、Ｄｕｒｉｏ  ｚｉｂｅｔｈｉｎｕｓ、Ｍａｎｉｈｏｔ  ｅｓｃｕｌｅｎｔａ、Ｈｅｖｅａ  ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ、Ｃｉｔｒｕｓ  ｃｌｅｍｅｎｔｉｎａ、Ｍｏｒｕｓ  ｎｏｔａｂｉｌｉｓ、Ｃａｒｉｃａ  ｐａｐａｙａ、Ｒｏｓａ  ｃｈｉｎｅｎｓｉｓ、Ｖｉｔｉｓ  ｖｉｎｉｆｅｒａ、Ｐｏｐｕｌｕｓ  ｅｕｐｈｒａｔｉｃａ、Ｒｏｓａ  ｃｈｉｎｅｎｓｉｓ、Ｖｉｔｉｓ  ｖｉｎｉｆｅｒａ、Ａｃｔｉｎｉｄｉａ  ｃｈｉｎｅｎｓｉｓ、Ｐｏｐｕｌｕｓ  ｅｕｐｈｒａｔｉｃａ、Ｉｐｏｍｏｅａ  ｎｉｌ、Ｐｅｔｕｎｉａ  ｈｙｂｒｉｄａ等が挙げられ、これらのうち、本発明の効果の観点からパパヴェル・ソムニフェルムが好ましい。
【００１６】
上記微生物としては、シュードモナス・プチダ（Ｐ．ｐｕｔｉｄａ）、メタノカルドコックス・ヤンナスキイ（Ｍｅｔｈａｎｏｃａｌｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ）等が挙げられ、これらのうち、本発明の効果の観点からシュードモナス・プチダ（Ｐ．ｐｕｔｉｄａ）が好ましい。
【００１７】
本発明におけるＡＡＳとしては、活性中心近傍のアミノ酸残基が、ＤＤＣ（ＤＯＰＡ  Ｄｅｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅ）に見られるアミノ酸残基に置換されている変異体であることが好ましい。
【００１８】
具体的には、例えば昆虫由来のＤＨＰＡＡＳにおいて、Ｐｈｅ７９Ｔｙｒ、Ｔｙｒ８０Ｐｈｅ、Ａｓｎ１９２Ｈｉｓの変異が好ましく、これらの変異のいずれか１つを有するものであってもよいし、いずれか２つを有するものであってもよいし、３つ全ての変異を有するものであってもよい。これらのうち、Ｌ−ＤＯＰＡからのＴＨＰ変換の効率の観点からは、上記３つ全ての変異を有するＰｈｅ７９Ｔｙｒ−Ｔｙｒ８０Ｐｈｅ−Ａｓｎ１９２Ｈｉｓ  ＤＨＰＡＡＳ、Ｐｈｅ７９Ｔｙｒ−Ｔｙｒ８０Ｐｈｅの２つの変異を有するＰｈｅ７９Ｔｙｒ−Ｔｙｒ８０Ｐｈｅ  ＤＨＰＡＡＳ  、Ａｓｎ１９２Ｈｉｓの変異のみを有するＡｓｎ１９２Ｈｉｓ  ＤＨＰＡＡＳが好ましく、Ｐｈｅ７９Ｔｙｒ−Ｔｙｒ８０Ｐｈｅ−Ａｓｎ１９２Ｈｉｓ  ＤＨＰＡＡＳ、Ａｓｎ１９２Ｈｉｓ  ＤＨＰＡＡＳがより好ましい。
【００１９】
本発明の組換え宿主細胞が発現する、芳香族アミノ酸脱炭酸酵素（ＡＡＡＤ）は、芳香族アミノ酸の脱カルボキシル化を触媒する酵素をいう。具体的には、Ｌ−ＤＯＰＡ又はチロシンから、ドーパミン又は４−ＨＰＡＡへの変換を触媒する機能を有する酵素である。具体的には、チロシンデカルボキシラーゼ（ＴｙＤＣ）、ドーパデカルボキシラーゼ（ＤＤＣ）、フェニルアラニンデカルボキシラーゼ（ＰＤＣ）、トリプトファンデカルボキシラーゼ（ＴＤＣ）等が挙げられる。
【００２０】
本発明の組換え宿主細胞が発現する、芳香族アミノ酸脱炭酸酵素（ＡＡＡＤ）の種としては、上述のＡＡＳについて記載した種と同様の種を好適に挙げることができる。
【００２１】
本発明の組み換え宿主細胞が発現する芳香族アミノ酸脱炭酸酵素（ＡＡＡＤ）が、植物由来のＴｙＤＣ１の場合、Ｐｈｅ９９Ｔｙｒ、Ｔｙｒ９８Ｐｈｅ、Ｌｅｕ２０５Ａｓｎの変異が好ましく、これらの変異のいずれか１つを有するものであってもよいし、いずれか２つを有するものであってもよいし、３つ全ての変異を有するものであってもよい。これらのうち、チロシンからのノルコクラウリン変換の効率の観点からは、上記３つ全ての変異を有するＰｈｅ９９Ｔｙｒ−Ｔｙｒ９８Ｐｈｅ−Ｌｅｕ２０５Ａｓｎ  ＴｙＤＣ１が好ましい。一方、ＴｙＤＣ３の場合、Ｐｈｅ１０１Ｔｙｒ、Ｔｙｒ１００Ｐｈｅ、Ｈｉｓ２０３Ａｓｎの変異が好ましく、これらの変異のいずれか１つを有するものであってもよいし、いずれか２つを有するものであってもよいし、３つ全ての変異を有するものであってもよい。これらのうち、チロシンからのノルコクラウリン変換の効率の観点から、上記３つ全ての変異を有するＰｈｅ１０１Ｔｙｒ−Ｔｙｒ１００Ｐｈｅ−Ｈｉｓ２０３Ａｓｎ  ＴｙＤＣ３が好ましい。
【００２２】
なお、昆虫であるボンビックス・モリ（Ｂｏｍｂｙｘ  ｍｏｒｉ）のＤＨＰＡＡＳの７９、８０及び１９２番目の活性部位残基は、芳香族アミノ酸脱炭酸酵素（ＡＡＡＤ）、芳香族アルデヒド合成酵素（ＡＡＳ）、ＤＨＰＡＡＳ及びその他の関連タンパク質全体で構造的に保存されている。ただし、残基の番号付けは、タンパク質のサイズの違いにより、種によって異なる。例えば、ボンビックス・モリ（Ｂｏｍｂｙｘ  ｍｏｒｉ）のＤＨＰＡＡＳのＰｈｅ７９は、シュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ）のＤＤＣのＴｙｒ７９、パパヴェル・ソムニフェルム（Ｐａｐａｖｅｒ  ｓｏｍｎｉｆｅｒｕｍ）のＴｙＤＣ１のＴｙｒ９８、パパヴェル・ソムニフェルム（Ｐａｐａｖｅｒ  ｓｏｍｎｉｆｅｒｕｍ）のＴｙＤＣ３のＴｙｒ１００に対応する。ボンビックス・モリ（Ｂｏｍｂｙｘ  ｍｏｒｉ）のＤＨＰＡＡＳのＴｙｒ８０は、シュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ）のＤＤＣのＰｈｅ８０、パパヴェル・ソムニフェルム（Ｐａｐａｖｅｒ  ｓｏｍｎｉｆｅｒｕｍ）のＴｙＤＣ１のＰｈｅ９９、パパヴェル・ソムニフェルム（Ｐａｐａｖｅｒ  ｓｏｍｎｉｆｅｒｕｍ）のＴｙＤＣ３のＰｈｅ１０１に対応する。ボンビックス・モリ（Ｂｏｍｂｙｘ  ｍｏｒｉ）のＤＨＰＡＡＳのＡｓｎ１９２は、シュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ）のＤＤＣのＨｉｓ１８１、パパヴェル・ソムニフェルム（Ｐａｐａｖｅｒ  ｓｏｍｎｉｆｅｒｕｍ）のＴｙＤＣ１のＬｅｕ２０５、パパヴェル・ソムニフェルム（Ｐａｐａｖｅｒ  ｓｏｍｎｉｆｅｒｕｍ）のＴｙＤＣ３のＨｉｓ２０３に対応する。なお、例えば、パパヴェル・ソムニフェルムのＴｙＤＣには、他にＴｙＤＣ２、４〜９があるが、ＴｙＤＣ１のＬｅｕ２０５に対応するのは、ＴｙＤＣ５、ＴｙＤＣ６、ＴｙＤＣ８、ＴｙＤＣ９ではＨｉｓ２０５であり、ＴｙＤＣ２、ＴｙＤＣ７ではＨｉｓ２０３である。
【００２３】
本明細書においては、ボンビックス・モリ（Ｂｏｍｂｙｘ  ｍｏｒｉ）の３，４−ジヒドロキシフェニルアセトアルデヒドシンターゼ（ＤＨＰＡＡＳ）のアミノ酸残基の番号付けにしばしば言及するが、本発明は、上記の構造的に保存された残基に対応するすべてのアミノ酸位置に適用される。この構造的に保存された残基を特定するためには構造図を参照することができる。また、対応する位置のアミノ酸の番号違いの例については配列アラインメント図を参照することができる（図３及び４）。
【００２４】
本発明の組換え宿主細胞は、上述したＡＡＳ（野生型及び各種変異体）をコードする遺伝子を有している。このような遺伝子としては、昆虫由来のＤＨＰＡＡＳの場合、例えば配列番号１（ＤＨＰＡＡＳ野生型）、配列番号２（Ａｓｎ１９２Ｈｉｓ  ＤＨＰＡＡＳ変異体）、配列番号３（Ｐｈｅ７９Ｔｙｒ−Ｔｙｒ８０Ｐｈｅ  ＤＨＰＡＡＳ変異体）、配列番号４（Ｐｈｅ７９Ｔｙｒ−Ｔｙｒ８０Ｐｈｅ−Ａｓｎ１９２Ｈｉｓ  ＤＨＰＡＡＳ変異体）で示すヌクレオチド配列を有する遺伝子が挙げられる。また、対応するタンパクのアミノ酸配列は、それぞれ配列番号５（ＤＨＰＡＡＳ野生型）、配列番号６（Ａｓｎ１９２Ｈｉｓ  ＤＨＰＡＡＳ変異体）、配列番号７（Ｐｈｅ７９Ｔｙｒ−Ｔｙｒ８０Ｐｈｅ  ＤＨＰＡＡＳ変異体）、配列番号８（Ｐｈｅ７９Ｔｙｒ−Ｔｙｒ８０Ｐｈｅ−Ａｓｎ１９２Ｈｉｓ  ＤＨＰＡＡＳ変異体）で示される。なお、本発明の組換え宿主細胞における上記野生型及び変異体ＤＨＰＡＡＳのタンパク産生の効率を向上させるために、ＳＵＭＯタグ発現システムを使用することができる。その際のそれぞれのアミノ酸配列としては、配列番号９（ＤＨＰＡＡＳ野生型）、配列番号１０（Ａｓｎ１９２Ｈｉｓ  ＤＨＰＡＡＳ変異体）、配列番号１１（Ｐｈｅ７９Ｔｙｒ−Ｔｙｒ８０Ｐｈｅ  ＤＨＰＡＡＳ変異体）、配列番号１２（Ｐｈｅ７９Ｔｙｒ−Ｔｙｒ８０Ｐｈｅ−Ａｓｎ１９２Ｈｉｓ  ＤＨＰＡＡＳ変異体）で示すものを採用することができる。
【００２５】
即ち、本発明の組換え宿主細胞が有するＡＡＳ遺伝子は、ＤＨＰＡＡＳである場合、好ましくは以下（ａ）、（ｂ）又は（ｃ）のＤＮＡである。
（ａ）配列番号１〜４のいずれかのヌクレオチド配列からなるＤＮＡ。
（ｂ）（ａ）のヌクレオチド配列からなるＤＮＡと相補的なヌクレオチド配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつＤＨＰＡＡＳの酵素活性（二官能性）を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
（ｃ）配列番号１〜４のいずれかのヌクレオチドに対して、７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、特に好ましくは９８％以上の相同性を有するヌクレオチド配列からなり、野生型の配列に対して上記変異が導入されており、かつＤＨＰＡＡＳの酵素活性（二官能性）を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
【００２６】
また、本発明の組換え宿主細胞は、上述した芳香族アミノ酸脱炭酸酵素（ＡＡＡＤ）をコードする遺伝子を有している。このような遺伝子としては、芳香族アミノ酸脱炭酸酵素（ＡＡＡＤ）が植物由来ＴｙＤＣ１の場合、野生型としては、配列番号１５のアミノ酸配列を有し、それに対応する配列番号１６のヌクレオチド配列を有するものが挙げられる。上述の変異は、配列番号１７及び配列番号１８のプライマーを用いることで、Ｐｈｅ９９Ｔｙｒ、Ｔｙｒ９８Ｐｈｅの変異を、また、配列番号１９及び配列番号２０のプライマーを用いることで、Ｌｅｕ２０５Ａｓｎの変異が導入されたヌクレオチドを合成することができる。また、本発明の組換え宿主細胞が有している遺伝子としては、芳香族アミノ酸脱炭酸酵素（ＡＡＡＤ）が植物由来のＴｙＤＣ３の場合、野生型としては、配列番号２１のアミノ酸配列を有し、それに対応する配列番号２２のヌクレオチド配列を有するものが挙げられる。上述の変異は、配列番号２３及び配列番号２４のプライマーを用いることで、Ｐｈｅ１０１Ｔｙｒ、Ｔｙｒ１００Ｐｈｅの変異を、また、配列番号２５及び配列番号２６のプライマーを用いることで、Ｈｉｓ２０３Ａｓｎの変異を導入したヌクレオチドを合成することができる。
【００２７】
本発明の組換え宿主細胞は、上述したＡＡＳ（野生型及び各種変異体）、又はＡＡＡＤ（野生型及び各種変異体）をコードする遺伝子に加えて、さらにＴＨＰやノルコクラウリンからレチクリンを合成するために必要な酵素をコードする遺伝子を有することが好ましい。
【００２８】
このような酵素としては、例えば、ノルコクラウリンシンターゼ（ＮＣＳ）が挙げられる。ノルコクラウリンシンターゼ（ＮＣＳ）は、ドーパミンとＤＨＰＡＡ、或いはドーパミンと４−ＨＰＡＡからノルコクラウリン、ＴＨＰを合成する酵素である。本発明の組み換え宿主細胞は、ノルコクラウリンシンターゼ（ＮＣＳ）をコードする遺伝子を含むことが好ましい。
【００２９】
さらに、このような酵素としては、ノルコクラウリン６−Ｏ−メチルトランスフェラーゼ（６’ＯＭＴ）、３’−ヒドロキシ−Ｎ−メチル−（Ｓ）−コクラウリン−４’−Ｏ−メチルトランスフェラーゼ（４’ＯＭＴ）、コクラウリン−Ｎ−メチルトランスフェラーゼ（ＣＮＭＴ）、Ｎ−メチルコクラウリン３−ヒドロキシラーゼ（ＮＭＣＨ）等が挙げられる。本発明の組換え宿主細胞は、ノルコクラウリン６−Ｏ−メチルトランスフェラーゼ（６’ＯＭＴ）、３’−ヒドロキシ−Ｎ−メチル−（Ｓ）−コクラウリン−４’−Ｏ−メチルトランスフェラーゼ（４’ＯＭＴ）及びコクラウリン−Ｎ−メチルトランスフェラーゼ（ＣＮＭＴ）をコードする遺伝子を全て有することがより好ましい。
【００３０】
ストリンジェントな条件とは、特異的なハイブリダイゼーションのみが起こり、非特異的なハイブリダイゼーションが起きないような条件をいう。このような条件は、通常、６Ｍ尿素、０．４％ＳＤＳ、０．５ｘＳＳＣ程度である。ハイブリダイゼーションにより得られるＤＮＡは上記（ａ）のヌクレオチド配列からなるＤＮＡと６０％以上の高い相同性を有することが好ましく、さらに８０％以上の相同性を有することが好ましい。
【００３１】
相同性とは、２つのポリペプチドあるいはポリヌクレオチド間の配列の類似の程度を意味し、比較対象のアミノ酸配列又は塩基配列の領域にわたって最適な状態（配列の一致が最大となる状態）にアラインメントされた２つの配列を比較することにより決定される。相同性の数値（％）は両方の（アミノ酸又は塩基）配列に存在する同一のアミノ酸又は塩基を決定して、適合部位の数を決定し、次いでこの適合部位の数を比較対象の配列領域内のアミノ酸又は塩基の総数で割り、得られた数値に１００をかけることにより算出される。最適なアラインメント及び相同性を得るためのアルゴリズムとしては、当業者が通常利用可能な種々のアルゴリズム（例えばＢＬＡＳＴアルゴリズム、ＦＡＳＴＡアルゴリズムなど）が挙げられる。アミノ酸配列の相同性は、例えばＢＬＡＳＴＰ、ＦＡＳＴＡなどの配列解析ソフトウェアを用いて決定される。塩基配列の相同性は、ＢＬＡＳＴＮ、ＦＡＳＴＡなどのソフトウェアを用いて決定される。
【００３２】
上記遺伝子は、当業者に周知のＰＣＲ又はハイブリダイゼーション技術、あるいはＤＮＡ合成機などを用いた人工的合成方法によって取得することが可能である。遺伝子配列の決定は、当業者に周知の方法により配列決定機を用いて行うことができる。
【００３３】
本発明に用いる宿主細胞は、当業者にとって周知の宿主細胞のいずれでもよく、原核細胞、真核細胞、例えば細菌細胞、菌類細胞、酵母細胞、哺乳動物細胞、昆虫細胞又は植物細胞が含まれる。例示的細菌細胞には、エスケリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、スタフィロコッカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）、又はバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）の任意の種が含まれ、上記には、例えば大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、ラクトコッカス・ラクチス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ）、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、バチルス・セレウス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｅｒｅｕｓ）、ネズミチフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）、シュードモナス・フルオレセンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）等が含まれる。
【００３４】
本発明に用いる宿主細胞としては、種々のストレスに耐性があり、遺伝子組換えも容易であることから、大腸菌細胞が好ましい。
【００３５】
本発明において「ポリヌクレオチド」という用語は、単一の核酸及び複数の核酸の両方を意味し、ｍＲＮＡ等の核酸分子、プラスミドＲＮＡ、全長のｃＤＮＡ及びその断片等を含む。ポリヌクレオチドは、任意のポリリボヌクレオチド又はポリデオキシリボヌクレオチドから構成され、修飾、非修飾のどちらでもよい。一本鎖でも二本鎖でもよく、両者の混合でもよい。
【００３６】
本発明において「異種の芳香族アルデヒドシンターゼ（ＡＡＳ）の野生型又は変異体を発現させた、ベンジルイソキノリンアルカロイド（ＢＩＡ）産生用の組換え宿主細胞。」という場合の「異種」とは、本発明の組換え宿主細胞とは異なる種由来のタンパク質、それをコードするポリヌクレオチドを発現させた細胞のことをいう。例えば、本発明の組換え宿主細胞が大腸菌細胞である場合、異種タンパク、異種ポリヌクレオチドとしては、昆虫、植物等のタンパク、ポリヌクレオチドが挙げられる。本発明の組換え宿主細胞において異種タンパクをコードするポリヌクレオチドを導入する目的は、元来その宿主細胞が有していない酵素等のタンパク質をコードするポリヌクレオチドを異種から導入し、目的の代謝経路、すなわちＬ−ＤＯＰＡからＴＨＰ及び／又はレチクリンを産生する代謝経路を機能させることである。
【００３７】
（ポリヌクレオチドの導入方法）
宿主細胞に異種の芳香族アルデヒドシンターゼ（ＡＡＳ）の野生型又は変異体を発現させるためには、宿主細胞に異種の芳香族アルデヒドシンターゼ（ＡＡＳ）の野生型又は変異体をコードするポリヌクレオチドを発現させる必要があり、例えば、当該ポリヌクレオチドを含む発現ベクターで細胞を形質転換させればよい。ＴＨＰからレチクリンを合成するために必要な酵素をコードするポリヌクレオチドを発現させる場合も同様である。発現ベクターは、本発明の遺伝子を発現可能な状態で含むものであれば特に限定されず、それぞれの宿主に適したベクターを用いることができる。
【００３８】
本発明の発現ベクターは、上記異種ポリヌクレオチドの上流に転写プロモーター、場合によっては下流にターミネーターを挿入して発現カセットを構築し、このカセットを発現ベクターに挿入することにより作製することができる。あるいは、発現ベクターに転写プロモーター及び／又はターミネーターがすでに存在する場合には、発現カセットを構築することなく、ベクター中のプロモーター及び／又はターミネーターを利用して、その間に当該異種ポリヌクレオチドを挿入すればよい。
【００３９】
ベクターに上記異種ポリヌクレオチドを挿入するには、制限酵素を用いる方法、トポイソメラーゼを用いる方法等を利用することができる。また、挿入の際に必要であれば、適当なリンカーを付加してもよい。また、アミノ酸への翻訳にとって重要な塩基配列として、ＳＤ配列やＫｏｚａｋ配列などのリボソーム結合配列が知られており、これらの配列を遺伝子の上流に挿入することもできる。挿入にともない、遺伝子がコードするアミノ酸配列の一部を置換してもよい。
【００４０】
本発明において使用されるベクターは、本発明の遺伝子を保持するものであれば特に限定されず、それぞれの宿主に適したベクターを用いることができる。ベクターとしては、例えば、プラスミドＤＮＡ、バクテリオファージＤＮＡ、レトロトランスポゾンＤＮＡ、人工染色体ＤＮＡなどが挙げられる。
【００４１】
宿主への発現ベクターの導入方法は、宿主に適した方法であれば特に限定されるものではない。利用可能な方法としては、例えば、エレクトロポレーション法、カルシウムイオンを用いる方法、スフェロプラスト法、酢酸リチウム法、リン酸カルシウム法、リポフェクション法等が挙げられる。組換え宿主細胞における当該ポリヌクレオチドの発現は、当業者に公知の方法に従って定量化することができる。例えば、当該ポリヌクレオチドがコードするポリペプチドの、細胞タンパク質全体のパーセントによって表すことができる。また、形質転換した細胞の細胞抽出液を用い、当該ポリヌクレオチドがコードするポリペプチドを検出できる抗体を使用したウエスタンブロッティング、あるいは当該ポリヌクレオチドを特異的に検出するプライマーを使用したリアルタイムＰＣＲなどにより確認することができる。
【００４２】
＜本発明のベンジルイソキノリンアルカロイド（ＢＩＡ）の製造方法＞
本発明は、上述の本発明の組換え宿主細胞を用いたテトラヒドロパパベロリン（ＴＨＰ）、ノルコクラウリン、３−ヒドロキシコクラウリン、３−ヒドロキシ−Ｎ−メチルコクラウリン、及び／又はレチクリンの製造方法も提供する。本発明の製造方法としては、大きく分けて２つの方法がある。
【００４３】
１つは、上述した本発明の組換え宿主細胞を、Ｌ−ドーパ及び／又はチロシン含有培地中で培養する工程を含む方法である。培地中のＬ−ドーパ及び／又はチロシンを取り込んだ本発明の組換え宿主細胞が、細胞内に発現させたＡＡＳ等を用いて、効率的にＴＨＰ、ノルコクラウリン、３−ヒドロキシコクラウリン、３−ヒドロキシ−Ｎ−メチルコクラウリン、及び／又はレチクリンを生成することができる。生成されたＴＨＰ、ノルコクラウリン、３−ヒドロキシコクラウリン、３−ヒドロキシ−Ｎ−メチルコクラウリン、及び／又はレチクリンは培地中に分泌される。
【００４４】
もう１つは、無細胞系において、Ｌ−ドーパ及び／又はチロシンに、芳香族アルデヒドシンターゼ（ＡＡＳ）、芳香族アミノ酸脱炭酸酵素（ＡＡＡＤ）の野生型又は変異体を作用させる工程を含む方法である。この方法においては、例えば、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで、Ｌ−ドーパ及び／又はチロシンと、芳香族アルデヒドシンターゼ（ＡＡＳ）、芳香族アミノ酸脱炭酸酵素（ＡＡＡＤ）の野生型又は変異体が直接作用してドーパミン、及びＤＨＰＡＡ又は４−ＨＰＡＡ等のフェニルアルデヒドが生成され、ドーパミンとＤＨＰＡＡ又は４−ＨＰＡＡが互いに結合することでＴＨＰ、又はノルコクラウリンが生成される。さらに、ＴＨＰ、ノルコクラウリンからレチクリンへの合成に必要な酵素を反応させることでレチクリンが生成される。このとき、芳香族アルデヒドシンターゼ（ＡＡＳ）、芳香族アミノ酸脱炭酸酵素（ＡＡＡＤ）の野生型又は変異体としては、上述の本発明の組換え宿主細胞から得られる酵素を用いることが好ましい。
【実施例】
【００４５】
以下の実施例にて本発明を具体的に説明するが、本発明は実施例によって限定されるものではない。なお、実施例を説明するための一部の図面においては、一部のアミノ酸表記を１文字表記とした。【００４６】
１．レチクリン生合成のためのＤＨＰＡＡＳを介した対称的ＴＨＰ産生経路の選択
Ｍ−ｐａｔｈ酵素検索は、Ａｒａｋｉらの方法（Ａｒａｋｉ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｍ−ｐａｔｈ：  ａ  ｃｏｍｐａｓｓ  ｆｏｒ  ｎａｖｉｇａｔｉｎｇ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ｍｅｔａｂｏｌｉｃ  ｐａｔｈｗａｙｓ．  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ３１，  ９０５−９１１  （２０１５）．）に従いウェブベースのバージョンを用いた。Ｍ−ｐａｔｈスコアは、Ｔａｎｉｍｏｔｏ係数として計算した。Ｍ−ｐａｔｈデータベースとしては、ＫＥＧＧからの最新の基質、製品、及び酵素情報に更新されている２０１６バージョンを使用した。チロシン（ＰｕｂＣｈｅｍ  ＣＩＤ：６０５７）を４−ＨＰＡＡ（ＣＩＤ：４４０１１３）に、Ｌ−ＤＯＰＡ（ＣＩＤ：６０４７）をＤＨＰＡＡ（ＣＩＤ：１１９２１９）に、チロシンを２’−ノルベルバムニン（ＣＩＤ：４４１０６３）に、ヒスチジン（ＣＩＤ：６２７４）をイミダゾール−４−アセトアルデヒド（ＣＩＤ：１５０８４１）に、４−アミノフェニルアラニン（ＣＩＤ：１５１００１）を４−アミノフェニルアセトアルデヒド（ＣＩＤ：２０４４０８５３）に媒介する酵素を探索するために、キュレーションモードを用いた。また、チロシンからホモバニリン酸（ＣＩＤ：１７３８）への変換には、Ｍ−ｐａｔｈをオリジナルモードで用いた。【００４７】
Ｍ−ｐａｔｈ酵素検索は、既知の酵素ネットワークを探索するのとは異なり、基質及び生成物の類似性に基づいて未知の酵素反応を予測することができる点で有利である。Ｌ−ＤＯＰＡからのＢＩＡ生産の最適化を探索するために、Ａｒａｋｉらの方法に従ってＭ−ｐａｔｈ酵素検索アルゴリズムをテストした。ＢＲＥＮＤＡ（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｂｒｅｎｄａ−ｅｎｚｙｍｅｓ．ｏｒｇ／）とＫｙｏｔｏ  Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ  Ｇｅｎｅｓ  ａｎｄ  Ｇｅｎｏｍｅｓ（ＫＥＧＧ、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｋｅｇｇ．ｊｐ）からの最新の酵素のデータベースを組み合わせたデータベースでＭ−ｐａｔｈを使用すると、Ｌ−チロシン（Ｔｙｒ）からの４−ヒドロキシフェニルアセトアルデヒド（４−ＨＰＡＡ又は４−ＨＰＡ）の生産、３，４−ジヒドロキシフェニルアラニン（Ｌ−ＤＯＰＡ）からの３，４−ジヒドロキシフェニルアセトアルデヒド（ＤＨＰＡＡ、ＤＨＰＡ又はＤＯＰＡＬ）の生産のための推定されるショートカットとして、昆虫由来の３，４−ジヒドロキシフェニルアセトアルデヒドシンターゼ（ＤＨＰＡＡＳ）と植物由来の芳香族アルデヒドシンターゼ（ＡＡＳ；ＰＡＡＳ、４−ＨＰＡＡＳ）が同定された（図１Ａ）。また上記ＤＨＰＡＡＳ又は芳香族アルデヒドシンターゼ（ＡＡＳ；ＰＡＡＳ、４−ＨＰＡＡＳ）と、３，４−ジヒドロキシフェニルアラニンデカルボキシラーゼ（ＤＤＣ）を組み合わせると、従来報告されたＭＡＯ媒介経路とは異なる新規で対称的なＴＨＰ及びノルコクラウリン生成経路が見出された（図１Ｂ）。【００４８】
上記芳香族アルデヒドシンターゼ（ＡＡＳ；ＰＡＡＳ、４−ＨＰＡＡＳ）とＤＨＰＡＡＳは、芳香族アミノ酸の脱カルボキシル化及びアミノ基酸化を触媒する、二官能性酵素である。フェニルアセトアルデヒドシンターゼ（ＰＡＡＳ、ＫＥＧＧ  ＥＣ  ４．１．１．１０９）及び４−ヒドロキシフェニルアセトアルデヒドシンターゼ（４−ＨＰＡＡＳ、ＫＥＧＧ  ＥＣ  ４．１．１．１０８）を含む、植物において発見されたこれらの酵素は総称してＡＡＳと呼ばれている。近年になって昆虫から発見された酵素ＤＨＰＡＡＳ（ＥＣ  ４．１．１．１０７）は、Ｌ−ＤＯＰＡの酸化的脱カルボキシル化を触媒するので、ＡＡＳ関連タンパク質と考えられる。なお、「ＡＡＳ」は広義には、芳香族アルデヒドシンターゼであり、昆虫由来の３，４−ジヒドロキシフェニルアセトアルデヒドシンターゼ（ＤＨＰＡＡＳ）と植物由来の芳香族アルデヒドシンターゼ（ＡＡＳ；ＰＡＡＳ、４−ＨＰＡＡＳ）のいずれをも含む概念であるが、狭義には、酵素発見の経緯から植物由来の芳香族アルデヒドシンターゼを指す。系統発生分析は、上述の植物由来のＡＡＳと昆虫由来のＤＨＰＡＡＳが芳香族アミノ酸脱炭酸酵素（ＡＡＡＤ、ＥＣ  ４．１．１．２８）から分岐したことを示す。したがって、上記ＡＡＳ、ＤＨＰＡＡＳ及びＡＡＡＤは構造的類似性を有し、補因子としてピリドキサール５’−リン酸（ＰＬＰ）に依存する。上記ＡＡＳとＤＨＰＡＡＳは、ＫＥＧＧによってＥＣ  ４．１．１．−として割り当てられているが、二官能性の作用のために分類するのが容易でなく、これら比較的新しく特徴づけされた酵素についてはまだ不明な点が残っている。【００４９】
上記ＡＡＳやＤＨＰＡＡＳに媒介される対称的ＢＩＡ産生経路は、ＭＡＯ媒介非対称的経路（図１）よりも利点を有する。そのような利点としては、可溶性のＤＨＰＡＡＳのＬ−ＤＯＰＡに対する特異性がＭＡＯより高いことが含まれる。数学的モデルと数値シミュレーションを使用して、非対称的（ＤＤＣ−ＭＡＯ）および対称的（ＤＤＣ−ＤＨＰＡＡＳ）経路によるＴＨＰの生成を比較した。非対称経路では、ＭＡＯは様々なアミンを認識するので、ＭＡＯ反応速度ＶＭＡＯ８に他の基質からの競合阻害を導入した。対称経路では、ＤＤＣ（ＶＤＤＣ）とＤＨＰＡＡＳ（ＶＤＨＰＡＡＳ）の反応速度に、フィードバックがないものと、フィードバック阻害を計算に入れる２つのモデルを構築した。モデル内の可能なパラメータ値の範囲は、Ｐｌａｃｚｅｋ，  Ｓ．ｅｔ  ａｌ．  ＢＲＥＮＤＡ  ｉｎ  ２０１７：  ｎｅｗ  ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅｓ  ａｎｄ  ｎｅｗ  ｔｏｏｌｓ  ｉｎ  ＢＲＥＮＤＡ．  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ４５，  Ｄ３８０〜Ｄ３８８  （２０１７）を参照した。各経路の性能を予測するために、関連する範囲内でパラメータ値をランダムに生成し、モンテカルロシミュレーションを実施した。反復回数は１０，０００回、シミュレーション時間は０〜５０時間とした。Ｌ−ＤＯＰＡは、ランダムに生成されたパラメータに基づく定数項として供給した。１００ｍＭ  Ｌ−ＤＯＰＡの最大量に達したとき、系への基質の供給を停止した。手作りのプログラムは、数値シミュレーションのソルバとしてｓｃｉｐｙ．ｉｎｔｅｇｒａｔｅ．ｏｄｅｉｎｔを使用してＰｙｔｈｏｎ  ３．０で実行した。【００５０】
後のインビトロおよびインビボ試験の結果から、反応性の高いＤＨＰＡＡが、細胞内または増殖培地中に存在する競合する求核試薬との反応によって分解され枯渇することが示唆された。動的モデルにこのＤＨＰＡＡの消失を含めると、わずかに低いＴＨＰ収量が得られ（図２）、実験的収量とよく良く適合した。しかしながら、増殖培地の緩衝液組成、ｐＨ、温度、潜在的阻害剤および代謝フラックスを含む多くの多様な変数もまた、ＴＨＰ収率の改善のための学習データとして考慮されるべきである。生成物によるフィードバック阻害とＤＨＰＡＡの消失を共に計算に入れると、対称的ＤＤＣ−ＤＨＰＡＡＳ経路はＭＡＯ介在非対照的経路よりもはるかに高いＴＨＰ予測収量を示した（図２）。これらのモデルは、ＤＨＰＡＡＳの媒介する経路が、過去に報告されたＭＡＯ媒介ＴＨＰ産生量（最高１ｍＭ）より、高いレベルのＴＨＰを産生する可能性があることを示唆している。さらに、フィードバック抑制モデルからは、ドーパミンとＤＨＰＡＡのバランスが、最適なＴＨＰ生成にとって重要であることが分かる。したがって、ＤＨＰＡＡＳによるＤＨＰＡＡ産生とドーパミンの産生のバランス調節をさらに検討した。【００５１】
２．構造に基づく新規ＤＨＡＡＳ変異体の同定とエンジニアリング
ＢＩＡ生産に最適な配列を選択するために、推定上の植物由来ＡＡＳと昆虫由来ＤＨＰＡＡＳの構造を比較した。ＰＬＰ補因子に共有結合した芳香族アミノ酸基質と複合体を形成した推定上のＡＡＳやＤＨＰＡＡＳのダイメリック  ホモロジー  モデルをＣｈｉｍｅｒａ内で作動するＭＯＤＥＬＬＥＲで作成し、ＭＯＥで構造を改良した（図３）。【００５２】
Ｍ−Ｐａｔｈは、４−ＨＰＡＡＳを植物ＢＩＡ合成の重要な中間体である４−ＨＰＡＡを生成する酵素として同定した。そこで、Ｐ．ｓｏｍｎｉｆｅｒｕｍ（ケシ）は天然の４−ＨＰＡＡ生合成にＡＡＳ活性を利用していると仮定し、Ｐ．ｓｏｍｎｉｆｅｒｕｍの配列から潜在的なＡＡＳ酵素を検索した。興味深いことに、カルビドパ（ＰＤＢ  ＩＤ：１ＪＳ３）と複合体を形成しているＳｕｓ  Ｓｃｒｏｆａ  ＤＤＣの構造に基づいてモデリングしたＰ．ｓｏｍｎｉｆｅｒｕｍ（ケシ）  チロシンデカルボキシラーゼ（ＴｙＤＣ１）は、ＡＡＡＤ活性部位Ｈｉｓ１９２に対応する位置に新規イソロイシン残基を含んでおり（図３、中央パネル）、この位置は重要な触媒残基として注目される。しかしながら、新規なＴｙＤＣ１  Ｌｅｕ２０５を除けば、すべてのＰ．ｓｏｍｎｉｆｅｒｕｍ  ＴｙＤＣ１配列は、標準的なＡＡＡＤ配列に良く似ている。これに対して、推定上の昆虫ＤＨＰＡＡＳ配列を比較すると、より明確な活性部位の差異が見られる（図３）。そこで、最適なＢＩＡ生産システムを選択するために、昆虫ＤＨＰＡＡＳに焦点を移した。【００５３】
昆虫ＤＨＰＡＡＳの進化及びすべての必須触媒残基の解明を含むその酸化的脱カルボキシル化メカニズムについては、依然として多くの疑問が残っている。これらの疑問を明確にし、ＤＨＰＡＡＳの機構に基づく洞察を得るために、構造解析と組み合わせて系統分類を行った。【００５４】
Ｂ．ｍｏｒｉ（ボンビックス・モリ）のＤＨＰＡＡＳ及びＰ．ｓｏｍｎｉｆｅｒｕｍ（ケシ）のＴｙＤＣ１の二量体相同性モデルをＭＯＤＥＬＬＥＲ及びＣｈｉｍｅｒａで作製した。Ｄ．ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒのＤＤＣ（ＰＤＢ  ＩＤ：３Ｋ４０）及びヒスチジンデカルボキシラーゼ（４Ｅ１Ｏ）の結晶構造をＢ．ｍｏｒｉのＤＨＰＡＡＳモデリングの鋳型として使用した。カルビドパ（ＰＤＢ  ＩＤ：１ＪＳ３）と複合体を形成したＳｕｓ  ＳｃｒｏｆａのＤＤＣの構造をＴｙＤＣ１の鋳型として用いた。ＰＬＰの芳香族アミノ酸基質への共有結合及び構造の精密化は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｏｐｅｒａｔｉｎｇ  Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ（ＭＯＥ）にて行った。完成した構造をＰｙＭＯＬで分析した。【００５５】
昆虫のＡＡＡＤ及びＡＡＳ配列は、昆虫配列ＮＰ＿４７６５９２．１、ＮＰ＿７２４１６２．１、ＸＰ＿３１９８３８．３、ＥＤＳ３９１５８．１、ＥＡＴ３７２４６．１及びＥＡＴ３７２４７．１から検索することにより、タンパク質ＢＬＡＳＴ非重複データベースから収集した。重複した配列及び７００アミノ酸長を超える配列を除去し、得られた配列を整列させ、スプリットバリュー０．１２を用いて系統樹を作成した。ＭＯＥで配列同一性表を作成することによって、クラスターを同定した。７３８個の昆虫ＡＡＡＤ関連配列の系統発生解析により、推定上のＤＨＰＡＡＳ配列２４７個とＤＨＰＡＡＳグループ５個が同定された（図４）。【００５６】
中央系統発生群（図４）を構成する性状が不明な鱗翅目ＤＨＰＡＡＳは、ＤＨＰＡＡＳ機構に対する新たな知見を得るために選択した。昆虫ＤＨＰＡＡＳの構造を分析すると、Ｇｌｙ３５３〜Ａｒｇ３２４によって形成された新規ループは、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ  ３，４−ジヒドロキシフェニルアラニンデカルボキシラーゼ（ＤＤＣ、ＰＤＢ  ＩＤ：３Ｋ４０）の構造を鋳型として用いても、容易にモデル化できなかった。クロスダイマー活性部位形成及び基質結合に関与するこの３２０〜３５０ループは、ヒスチジンメチルエステル（ＰＤＢ  ＩＤ：４Ｅ１Ｏ）との複合体中のヒトヒスチジンデカルボキシラーゼの鋳型を使用することでより良好にモデル化された。【００５７】
ＤＤＣ及びＤＨＰＡＡＳ活性部位の比較からは、１９２位（Ｂ．ｍｏｒｉ及びＤ．ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ  ＤＨＰＡＡＳの番号付け）が、脱炭酸酵素又はアルデヒドシンターゼの触媒活性を決定する際の重要な残基であることが明らかとなった（図３及び４）。この１９２残基は、ＡＡＳ機構で酸化されたＰＬＰ−芳香族アミノ酸複合体の外部アルジミンと水素結合することができる。Ａｓｎ１９２を含有するＡｅｄｅｓ  ａｅｇｙｐｔｉ及びＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ  ＤＨＰＡＡＳの特性は以前に報告されているが、今回の研究においても、構造的及び機能的解析を介してＡｓｎ１９２は重要な触媒部位として別個に同定・確認された。【００５８】
ＤＤＣとＤＨＰＡＡＳの構造を注意深く比較することにより、ＤＨＰＡＡＳのＰｈｅ７９及びＴｙｒ８０が、ＤＨＰＡＡＳ活性をＤＤＣ活性と区別するのにさらなる役割を果たすことが示された（図３及び４）。Ｔｙｒ７９−Ｐｈｅ８０は昆虫ＤＤＣにおいて保存されているが、この７９−８０モチーフは昆虫ＤＨＰＡＡＳにおいては一般的にＰｈｅ７９−Ｔｙｒ８０として逆転し、これらの残基もまたＰＬＰ−基質複合体の外部アルジミンを取り囲んでいる（図３）。したがって、我々はこれらの残基がＤＨＰＡＡＳの触媒機構に関与しており、ＤＨＰＡＡＳの分類に有用であると仮定した。同定された５つのＤＨＰＡＡＳ群の中で、Ｐｈｅ７９−Ｔｙｒ８０はＡｐｉｓ（ミツバチ）及び蚊で保存されている。ショウジョウバエのＤＨＰＡＡＳ配列では、アイソフォームＸ１と呼ばれるものではＰｈｅ７９−Ｔｙｒ８０が保存されており、アイソフォームＸ２（ＮＰ４７６５９２．１２６を含む）と呼ばれるものでは、Ｔｙｒ７９−Ｔｙｒ８０が保存されている。鱗翅目及び蟻類のＤＨＰＡＡＳ群では、Ｐｈｅ７９−Ｔｙｒ８０、Ｔｙｒ７９−Ｔｙｒ８０及びＴｙｒ７９−Ｐｈｅ８０が混じっている（図４）。【００５９】
以下の実験では、Ｂ．ｍｏｒｉ配列ＸＭ＿００４９３０９５９．２を、ＤＨＰＡＡＳに特異的な３つの残基Ｐｈｅ７９、Ｔｙｒ８０及びＡｓｎ１９２のすべてを含み、Ｌ−ＤＯＰＡに対する基質特異性の増加が報告されているＧｌｙ３５３をも含む、典型的なＤＨＰＡＡＳ配列として選択した。さらに、Ｐｈｅ７９Ｔｙｒ、Ｔｙｒ８０Ｐｈｅ及びＡｓｎ１９２Ｈｉｓ  ＤＨＰＡＡＳ触媒部位のアミノ酸変異体は、ドーパミン及びＤＨＰＡＡの産生調節機構を探索するために設計した（図５Ａ）。【００６０】
３．組換えＢ．ｍｏｒｉ  ＤＨＰＡＡＳの調製
完全長の野生型Ｂ．ｍｏｒｉ  ＤＨＰＡＡＳのｃＤＮＡ配列（ＸＭ＿００４９３０９５９．２；配列番号１）をＧｅｎｅＡｒｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）により合成し、ＢｓａＩ制限酵素サイトを介してカナマイシン耐性（ＬｉｆｅＳｅｎｓｏｒｓ  Ｉｎｃ．）を有するｐＥ−ＳＵＭＯベクターにクローニングした。アミノ酸変異体のｃＤＮＡ（配列番号２〜４）は、オーバーラップＰＣＲを用いて生成した。ＤＨＰＡＡＳ発現ベクターを、５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを添加したＬＢ培地中に維持したＢＬ２１（ＤＥ３）、又は５０μｇ／ｍＬのカナマイシン及び３４μｇ／ｍＬのクロラムフェニコールを添加したＬＢ培地中で維持したＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳに導入して形質転換した。組換えＤＨＰＡＡＳの発現は、ＬＢ培地中で好気的に増殖させた大腸菌に０．２〜０．４５ｍＭのＩＰＴＧを添加することによって誘導した。誘導後、培養温度を１４〜１６℃に下げた。一晩インキュベーションした後、細胞を遠心分離によってペレット化し、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）に再懸濁し、氷上で冷却しながら超音波処理により溶解した。溶解物を遠心分離し清澄化した溶解物を、ＨｉＴｒａｐ  ＴＡＬＯＮ及びＨｉｓＴｒａｐ  ＨＰカラム（ＧＥ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）にアプライし、これをＰＢＳ及び１０〜２０ｍＭイミダゾールで洗浄した。４５０〜１，０００ｍＭイミダゾールで組換えＤＨＰＡＡＳを溶出した。その後、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ａｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ−１５遠心フィルターを使用して、バッファーを、ＰＬＰを補充したＰＢＳに交換した。【００６１】
４．ＤＨＰＡＡＳ基質及び反応産物の分析
Ｌ−ＤＯＰＡとＤＨＰＡＡＳとの反応の推移は、薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）で基質と生成物を非定量的に分析した。ＴＬＣは、シリカゲル６０Ｆ２５４（Ｍｅｒｃｋ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）でコーティングしたアルミニウムプレート上で行った。１−ブタノール：酢酸：Ｈ２Ｏ＝７：２：１の比の混合物を移動相として使用した。ＤＨＰＡＡＳ反応の成分をＵＶ下で分析し、続いて加熱してニンヒドリン染色を行った。【００６２】
ＤＨＰＡＡＳ反応の基質及び生成物は、Ｓｈｉｍａｄｚｕ  ＬＣＭＳ−８０５０  ＥＳＩトリプル四重極でえられたマススペクトルで同定した。定量分析は、Ｎｅｘｅｒａ  Ｘ２  ＵＨＰＬＣシステムと共に、多重反応モニタリング（ＭＲＭ）モードで操作されたＳｈｉｍａｄｚｕ  ＬＣＭＳ−８０５０を用いて行った。Ｌ−ＤＯＰＡ（ＴＣＩ）、ドーパミン（ＴＣＩ）、ＤＨＰＡＡ（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）及びＴＨＰ（Ｓｉｇｍａ）には、それぞれ１９８．１０＞１５２．１０（＋）、１５４．１０＞９１．０５（＋）、１５１．３０＞１２３．１５（−）及び２８８．０５＞１６４．１５（＋）のクオリファイアＭＲＭトランジションを用いた。ドーパミン、ＤＨＰＡＡ及びＴＨＰについては、１５４．１０＞１３７．０５（＋）、１５１．３０＞１２２．１０（−）及び２８８．０５＞１２３．１５（＋）のクオリファイアＭＲＭトランジションをそれぞれ使用した。レチクリンには、３３０．１０＞１７７．２０（＋）のクオリファイアＭＲＭトランジションを用いた。４０℃に加熱したＤｉｓｃｏｖｅｒｙ  ＨＳ  Ｆ５−３カラム（３μｍ、２．１ｍｍ×１５０ｍｍ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を用い、０．１％ギ酸水溶液及び０．１％ギ酸アセトニトリルの濃度勾配を移動相として使用し、０．２５ｍＬ／分で分離を行った。同じＬＣ−ＭＳシステムを用い、加熱したＡｓｔｅｃ  ＣＹＣＬＯＢＯＮＤ  Ｉ  ２０００カラム（５μｍ、２．１ｍｍ×１５０ｍｍ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）で、９０％アセトニトリル−５０ｍＭ  ＮＨ４ＯＡｃ（ｐＨ４．５）の移動相勾配で、溶出速度０．３ｍＬ／分で溶出し、（Ｒ，Ｓ）−ＴＨＰのキラル分析を行った。【００６３】
５．アミノ酸置換によるＢ．ｍｏｒｉ  ＤＨＰＡＡＳの機能変換
陰イオンｍ／ｚ  １５１．１０の検出及び主要なドーパミンイオンの欠如に示されるように、組換えＢ．ｍｏｒｉ  ＸＭ＿００４９３０９５９．２野生型タンパク質は、Ｌ−ＤＯＰＡとの主要産物としてＤＨＰＡＡを産生した（図５）。このＢ．ｍｏｒｉＤＨＰＡＡＳの同定は、ＤＨＰＡＡＳ系統群に関する上記の分析が正確であることを示唆している。構造解析の結果から、Ｐｈｅ７９Ｔｙｒ−Ｔｙｒ８０Ｐｈｅ−Ａｓｎ１９２Ｈｉｓ三重変異体はＤＤＣ様活性を有するが、Ａｓｎ１９２Ｈｉｓ及びＰｈｅ７９Ｔｙｒ−Ｔｙ８０Ｐｈｅ変異体はＤＨＰＡＡＳ及びＤＤＣ活性の両方を有するという仮説が導かれる。この仮説を検証し、ＤＨＰＡＡＳの作用について包括的な知見を得るために、Ｂ．ｍｏｒｉ  ＤＨＰＡＡＳの野生型、Ａｓｎ１９２Ｈｉｓ変異体、Ｐｈｅ７９Ｔｙｒ−Ｔｙ８０Ｐｈｅ変異体並びにＰｈｅ７９Ｔｙｒ−Ｔｙｒ８０Ｐｈｅ−Ａｓｎ１９２Ｈｉｓ  ＤＨＰＡＡＳ変異体の酵素活性を評価した（図５、図６）。【００６４】
ＴＬＣ後のニンヒドリン染色から、Ｐｈｅ７９Ｔｙｒ−Ｔｙｒ８０Ｐｈｅ−Ａｓｎ１９２Ｈｉｓ  ＤＨＰＡＡＳ変異体の主要産物はドーパミンであることが確認され、上記の仮説が支持された（図５Ｂ）。より長時間のインキュベーションで得た生成物を分析すると、Ｌ−ＤＯＰＡとＰｈｅ７９Ｔｙｒ−Ｔｙｒ８０Ｐｈｅ−Ａｓｎ１９２Ｈｉｓ  ＤＨＰＡＡＳ反応産物の主要な陽イオンとしてＴＨＰが検出された（図５Ｄ）。【００６５】
ついで、ＤＨＰＡＡＳの活性をＨ２Ｏ２の産生で評価した。Ｈ２Ｏ２は、過酸化水素蛍光定量アッセイキット（Ｓｉｇｍａ）を用い９６穴プレートで定量した。０．６−０．８μｇのＤＨＰＡＡＳをＰＢＳ（２０μＬ）に溶解し、様々な濃度のＬ−ＤＯＰＡ（１０μＬ）と混合し、続いて３０μＬのペルオキシダーゼ酵素混合物（Ｓｉｇｍａ）を添加した。ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ  Ｐａｒａｄｉｇｍマイクロプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）を用いて蛍光を検出した。その結果、Ａｓｎ１９２がＤＨＰＡＡＳの活性維持に最も重要であり、Ｐｈｅ７９とＴｙｒ８０もＤＨＰＡＡＳの活性に影響することがわかった（図６）。【００６６】
６．インビトロにおけるＤＨＰＡＡＳによるＴＨＰの産生
ＴＨＰがＰｈｅ７９Ｔｙｒ−Ｔｙｒ８０Ｐｈｅ−Ａｓｎ１９２Ｈｉｓ  ＤＨＰＡＡＳによって直接産生され得ることを確認したので、野生型ならびに設計した３種のＢ．  ｍｏｒｉ  ＤＨＰＡＡＳ変異体を用い、インビトロにおけるＴＨＰ産生を評価した（図７）。【００６７】
具体的な試験方法は、次の通りである。ＰＢＳに溶解したＤＨＰＡＡＳ（２〜３μｇ）をＬ−ＤＯＰＡ水溶液と混合して最終容量４０μＬとした。そこに最終濃度１．８７５ｍＭのＬ−ＤＯＰＡ、及び２．５ｍＭのアスコルビン酸ナトリウムを加えた。室温（２３〜２４℃）で反応を開始し、８時間後に温度を４℃とした。様々なタイミングで反応液２μＬを採取し、アスコルビン酸とカンファースルホン酸を含むＭｅＯＨ９８μＬで希釈した。この希釈反応液は、直ちに−３０℃に保存し、ＬＣ−ＭＳ分析まで保存した。【００６８】
ドーパミン、ＤＨＰＡＡ及びＴＨＰの産生は、ＭＲＭモードで操作されるＬＣ−ＭＳを用いてモニターした。酸化されたＴＨＰイオンｍ／ｚ  ２８４．１０及びｍ／ｚ  ３０６．１５の検出で示されるように、ＴＨＰの収率は酸化に対して極めて敏感であった。ＴＨＰ−キノン（［ＴＨＰ−３Ｈ］＋＝２８４．０９１７）は主要イオンｍ／ｚ  ２８４．１０に対応する。同定されたカチオンｍ／ｚ  ３０６．１５は、ＴＨＰのＮ−オキシドに対応し得る（［ＴＨＰ＋ＯＨ］＋＝３０６．１３３６）。【００６９】
インビトロにおけるＴＨＰの収率は、Ｈ２Ｏ２による生成物の酸化的分解を抑制するためにアスコルビン酸を添加すると有意に改善された。２．５ｍＭのアスコルビン酸ナトリウムを添加すると、Ｐｈｅ７９Ｔｙｒ−Ｔｙｒ８０Ｐｈｅ−Ａｓｎ１９２Ｈｉｓ  ＤＨＰＡＡＳ変異体によるＬ−ＤＯＰＡからＴＨＰへの変換率は、２３．９％（２１９μＭ）に増加した。これは、最も高いインビボでのドーパミンのＴＨＰへの変換率１５．９％（Ｎａｋａｇａｗａ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．Ｓｃｉ．Ｒｅｐ．４，６６９５（２０１４）））を上回った。アスコルビン酸が、ＤＨＰＡＡＳによるＤＨＰＡＡ産生を阻害しなかったことは、ＤＨＰＡＡはＨ２Ｏ２酸化によるドーパミンの二次生成物ではなく、Ｌ−ＤＯＰＡの直接的な酵素反応の生成物であることを示している。【００７０】
予測されたように、ＤＨＰＡＡ産生量は、野生型酵素とＰｈｅ７９Ｔｙｒ−Ｔｙｒ８０Ｐｈｅ変異体を用いた場合が最も高く、Ａｓｎ１９２Ｈｉｓ変異体とＰｈｅ７９Ｔｙｒ−Ｔｙｒ８０Ｐｈｅ−Ａｓｎ１９２Ｈｉｓ変異体では最も低かった（図７、図８）。ドーパミン産生は予想通り逆の傾向が観察され、Ｐｈｅ７９Ｔｙｒ−Ｔｙｒ８０Ｐｈｅ−Ａｓｎ１９２Ｈｉｓ変異体で最も高く、野生型ＤＨＰＡＡＳで最も低かったが、Ａｓｎ１９２Ｈｉｓ変異体によるドーパミン産生はＰｈｅ７９Ｔｙｒ−Ｔｙｒ８０Ｐｈｅ変異体よりも高かった。これらインビトロ試験の結果は、ＤＨＰＡＡＳの機能変換におけるＰｈｅ７９、Ｔｙｒ８０及びＡｓｎ１９２の効果に関して、立体構造から導いた上記の仮説を支持するものである（図８）。【００７１】
７．インビボにおけるＤＨＰＡＡＳによるＴＨＰの産生
発現ベクターであるｐＴｒｃＨｉｓ２Ｂへのクローニングのために、ＮｃｏＩ及びＸｈｏＩ制限酵素部位を含むプライマーを用いてＤＨＰＡＡＳ配列をＰＣＲ増幅した。得られたタグなし発現ベクターをＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳに導入し形質転換した。バイオプロダクションのために、１５．６ｍＭアスコルビン酸ナトリウム、１００μｇ／ｍＬアンピシリン及び３４μｇ／ｍＬクロラムフェニコールを含むＭ９培地３．５ｍＬを用い、２００ｒｐｍで振とうしながら３７℃で大腸菌を増殖させた。ＯＤ６００が０．２〜０．４に達したとき、ＩＰＴＧを終濃度０．９７ｍＭで添加してＤＨＰＡＡＳの発現を誘導し、培養温度を２５℃に下げた。誘導から１時間１３分後に、各培養液に３．４ｍｇのＬ−ＤＯＰＡ（０．９７ｍｇ／ｍＬ）を添加し、続いてＰＬＰを４．８６μＭの終濃度で添加した。Ｌ−ＤＯＰＡを添加して１２．９時間後に、培養温度を１６℃に下げた。４つの時点で培養サンプル（３００〜５００μＬ）を採取し、３，０００Ｄａの分子量カットオフを有するＭｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ａｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ  ０．５ｍＬ遠心フィルターを通して濾過した。基質添加２２．７時間後に、約４〜５ｍｇのアスコルビン酸を各培養に添加し、培養物を４℃に移した。基質添加４９．８時間後に、培養物を４，５００ｇで遠心分離し、最終測定のために上清を回収した。培養上清をＭｅＯＨで希釈し、Ｌ−ＤＯＰＡ、ドーパミン、ＤＨＰＡＡ及びＴＨＰを定量した。【００７２】
ＬＢ培地で増殖させた大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）を用いた初期の試みでは、ＴＨＰの産生量は一般的に極めて低かったが、Ｐｈｅ７９Ｔｙｒ−Ｔｙｒ８０Ｐｈｅ変異体がわずかに高く、続いて野生型ＤＨＰＡＡＳの順であった。しかし培地をＭ９ミニマム培地に変更すると、ＴＨＰ産生量はかなり増加した（図９）。【００７３】
インビボにおけるドーパミンとＤＨＰＡＡのバイオプロダクションは、ＤＨＰＡＡＳの構造をもとにした仮説と完全に一致しており、Ｐｈｅ７９、Ｔｙｒ８０及びＡｓｎ１９２の置換によって生じる。インビトロでの結果とは対照的に、Ｐｈｅ７９Ｔｙｒ−Ｔｙｒ８０Ｐｈｅ変異体のＴＨＰ産生量は０．９０２μＭで、インビボでは最も強いＴＨＰ生産を示した。野生型ＤＨＰＡＡＳが次に高い産生量を示し、続いでＰｈｅ７９Ｔｙｒ−Ｔｙｒ８０Ｐｈｅ−Ａｓｎ１９２Ｈｉｓ  ＤＨＰＡＡＳ、Ａｓｎ１９２Ｈｉｓ変異体の順であった。キラルＬＣ−ＭＳ分析（図９−２）によって示されるように、インビボでは、ＤＨＰＡＡＳによって（Ｒ，Ｓ）−ＴＨＰのジアステレオマー混合物が生成された。【００７４】
８．インビボにおけるレチクリンの産生
ＤＨＰＡＡＳの発現と同時に、ＴＨＰからレチクリンへの変換を行う３種類の酵素を大腸菌に発現させ、インビボにおけるレチクリンへの産生を確認した。具体的には、Ｃ．ｊａｐｏｎｉｃａ由来のノルコクラウリン６−Ｏ−メチルトランスフェラーゼ（６’ＯＭＴ）、３’−ヒドロキシ−Ｎ−メチル−（Ｓ）−コクラウリン−４’−Ｏ−メチルトランスフェラーゼ（４’ＯＭＴ）、並びにコクラウリン−Ｎ−メチルトランスフェラーゼ（ＣＮＭＴ）遺伝子を発現するｐＡＣＹＣ１８４ベクター（配列番号１３）と、実施例７で得られたＤＨＰＡＡＳ発現ベクターｐＴｒｃＨｉｓ２Ｂ（配列番号１４）を用いて、ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳを共形質転換し、得られたレチクリン産生大腸菌を、アンピシリンおよびクロラムフェニコールで選択した。レチクリン産生は、２％グルコースを補充したＭ９最小培地で試験した。ＯＤ６００が０．２−０．３に達するまで大腸菌を増殖させ、そこに０．５ｍＭのＩＰＴＧ、４５０μＭのＬ−ＤＯＰＡおよび４．５４ｍＭのアスコルビン酸ナトリウムを添加した。さらに基質添加１７．２時間後、４４４μＭのアスコルビン酸塩を追加した。大腸菌を２５℃、２００ｒｐｍで振とうしながら培養し、レチクリンを産生させた。ドーパミン、ＤＨＰＡＡ、ＴＨＰおよびレチクリンの定量のために、カンファースルホン酸およびアスコルビン酸を含むＭｅＯＨで培養液を希釈した。Ｐｈｅ７９Ｔｙｒ−Ｔｙｒ８０ＰｈｅおよびＰｈｅ７９Ｔｙｒ−Ｔｙｒ８０Ｐｈｅ−Ａｓｎ１９２Ｈｉｓ媒介性レチクリン産生については重複測定を行い、野生型およびＡｓｎ１９２Ｈｉｓ媒介性レチクリン産生については４回測定を行った。結果を図１０に示す。【００７５】
９．インビボにおけるＴＨＰ、レチクリン及び中間体の産生
野生型のＤＨＰＡＡＳを導入した発現ベクターｐＴｒｃＨｉｓ２Ｂ、Ｐｈｅ７９Ｔｙｒ−Ｔｙｒ８０Ｐｈｅ−Ａｓｎ１９２Ｈｉｓ変異ＤＨＰＡＡを導入した発現ベクターｐＥ−ＳＵＭＯ、Ｃ．ｊａｐｏｎｉｃａ由来のノルコクラウリン６−Ｏ−メチルトランスフェラーゼ（６’ＯＭＴ）、３’−ヒドロキシ−Ｎ−メチル−（Ｓ）−コクラウリン−４’−Ｏ−メチルトランスフェラーゼ（４’ＯＭＴ）、並びにコクラウリン−Ｎ−メチルトランスフェラーゼ（ＣＮＭＴ）遺伝子を導入したｐＡＣＹＣ１８４ベクターを用いて、ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳを共形質転換した。ＴＨＰ生産の最初のステップでは、この３つのプラスミドシステムを、１．５％グルコース、１００μｇ／ｍＬアンピシリン、及び５０μｇ／ｍＬカナマイシンを添加したグリセロール不含のＴＢ中、３７°Ｃで培養した。ＯＤ６００が０．３８に達した後、ＩＰＴＧを終濃度０．５ｍＭとなるように添加した。誘導の１．５時間後、温度は２５℃にまで低下させた。誘導から５．５時間後、細胞を４０００  ｘ  ｇの遠心分離によって回収し、−８０°Ｃで一晩保存し、約４３ｍＬの培養物からのペレットを、低カルシウム、０．２％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、１．５％グルコース、１０μＭＰＬＰ、１０ｍＭアスコルビン酸ナトリウム、１ｍＭ  Ｌ−ＤＯＰＡを含むＭ９に再懸濁し、最終容量を６．５ｍＬとした。混合後、培養物を２４〜２５℃で１．５時間維持し、５０００  ｘ  ｇで遠心分離して、上清中のドーパミンとＤＨＰＡＡを濃縮した。基質添加の２５時間後、５０００  ｘ  ｇで再び遠心分離し、ＴＨＰ含有上清を次のＢＩＡ生産工程に使用した。【００７６】
ＢＩＡ生産の第２段階では、Ｃ．ｊａｐｏｎｉｃａの４−ＯＭＴとＰ．ｓｏｍｎｉｆｅｒｕｍの６−ＯＭＴ及びＣＮＭＴを含むｐＥＴ２３ａをＢＬ２１（ＤＥ３）に導入した。この細胞を、１．５％グルコース、１００μｇ／ｍＬアンピシリン、グリセロールなしのＴＢ中、最初は３７°Ｃで培養した。ＯＤ６００が０．７８に達した後、ＩＰＴＧを最終濃度０．５ｍＭとなるように添加した。誘導の１．５時間後、温度を２５℃まで低下させた。誘導の５．５時間後、細胞を４０００  ｘ  ｇの遠心分離によって回収し、−８０°Ｃで２晩保存し、４６ｍＬの培養物からのペレットを最初のステップの上清に再懸濁した。その後、２５℃で振とうしながらＢＩＡ生産量（３ＨＣ、３ＨＮＭＣ、及びレチクリン）を測定した。【００７７】
培地の希釈サンプルをＬＣ−ＭＳとＭＲＭを使用して分析した。結果を図１１に示す。なお、ＴＨＰはＬ−ＤＯＰＡ添加の２３時間後に定量され、３ＨＣ、３ＨＮＭＣ、及びレチクリンは２番目のバイオプロデューサー（最初のステップの上清）の添加の１８．５時間後に定量した。ここで、図中のエラーバーは平均の標準誤差を示す（ｎ＝３の独立した測定を行った）。【００７８】
図１１に示すとおり、上記２段階の細胞生産系により、ＴＨＰ、レチクリン及び２種類の中間体が産生されることが確認できた。【００７９】
１０．インビボにおけるＴＨＰの産生（ＤＨＰＡＡＳの３変異体及びＴｆＮＣＳの導入）
Ｐｈｅ７９Ｔｙｒ−Ｔｙｒ８０Ｐｈｅ−Ａｓｎ１９２Ｈｉｓ変異ＤＨＰＡＡＳ発現ベクターｐＴｒｃＨｉｓ２Ｂ−ｔＤＨＰＡＡＳ、ＮＣＳ発現ベクターｐＣＤＦＤｕｅｔ−１−ＴｆＮＣＳを用いて、ＢＬ２１（ＤＥ３）を共形質転換した。アンピシリン、スペクチノマイシン、１ｍＭアスコルビン酸を添加したＬＢ培地中、３７°Ｃで培養した。ＯＤ６００が０．４〜０．６に達した後、ＩＰＴＧを終濃度０．５ｍＭとなるように添加し、３時間後、細胞を４０００  ｘ  ｇの遠心分離によって回収し、ペレットを、１３５μＭ  ＰＬＰ、５．１ｍＭアスコルビン酸ナトリウム、１．９７ｍＭ  Ｌ−ＤＯＰＡ、１．９４ｍＭ  α―メチルドーパを含むＬＢ培地に再懸濁した。混合後、培養物を２５℃で１６．５時間維持し、５０００  ｘ  ｇで遠心分離して、上清中のドーパミンとＤＨＰＡＡ、ＴＨＰを、ＬＣ−ＭＳとＭＲＭを使用して定量した。結果を図１２に示す。【００８０】
図１２に示すとおり、ＴｆＮＣＳの導入により、内在性のＮＣＳのみの場合より、多くのＴＨＰが回収された。【００８１】
１１．インビボにおける、チロシンからのノルコクラウリン産生（Ｐ．ｓｏｍｎｉｆｅｒｕｍのＴｙＤＣ及びＮＣＳの導入）
（１）ＴｙＤＣ１及びＴｆＮＣＳを導入した試験
Ｐ．ｓｏｍｎｉｆｅｒｕｍのＴｙＤＣ１の野生型又は変異体（ＴｙＤＣ１−Ｙ９８Ｆ−Ｆ９９Ｙ−Ｌ２０５Ｎ）、並びにＴｆＮＣＳ（コドン最適化した塩基配列は配列番号２７に示す通りであり、対応するアミノ酸配列は配列番号２８に示す通りである）を導入したベクター、各種ｐＣＤＦＤｕｅｔ−１−ＴｆＮＣＳ−ＰｓＴｙＤＣ１を作成した。なお、上述の変異は、配列番号１７及び１８のプライマーを用いることで、Ｔｙｒ９８Ｐｈｅ、Ｐｈｅ９９Ｔｙｒの変異を、配列番号１９及び配列番号２０のプライマーを用いることで、Ｌｅｕ２０５Ａｓｎの変異が導入されたヌクレオチドを合成した。このベクターを用いてＢＬ２１（ＤＥ３）を形質転換した。スペクチノマイシンを添加したＬＢ中、３７°Ｃで、２００ｒｐｍで振とう培養した。ＯＤ６００が０．３を超えた後、ＩＰＴＧを終濃度０．５ｍＭとなるように添加し、２８°Ｃで、１８０ｒｐｍで振とう培養した。１時間後、それぞれ終濃度が以下のとおりとなるように、２ｍＭアスコルビン酸ナトリウム、０．５ｍＭ  ドーパミン（ＤＡ）、１ｍＭ  チロシンを培養液に添加した。混合後、５１時間振とう培養し、上清中のノルコクラウリンをＬＣ−ＭＳとＭＲＭを使用して定量した。結果を図１３に示す。【００８２】
（２）ＴｙＤＣ３及びＴｆＮＣＳを導入した試験
Ｐ．ｓｏｍｎｉｆｅｒｕｍのＴｙＤＣ３の野生型又は変異体（ＴｙＤＣ３−Ｙ１００Ｆ−Ｆ１０１Ｙ−Ｈ２０３Ｎ）、並びにＴｆＮＣＳ（コドン最適化した塩基配列は配列番号２７に示す通りであり、対応するアミノ酸配列は配列番号２８に示す通りである）を導入したベクター、各種ｐＣＤＦＤｕｅｔ−１−ＴｆＮＣＳ−ＰｓＴｙＤＣ３を作成した。なお、上述の変異は、配列番号２３及び２４のプライマーを用いることで、Ｐｈｅ１０１Ｔｙｒ、Ｔｙｒ１００Ｐｈｅの変異を、また、配列番号２５及び配列番号２６のプライマーを用いることで、Ｈｉｓ２０３Ａｓｎの変異を導入したヌクレオチドを合成した。このベクターを用いてＢＬ２１（ＤＥ３）を形質転換した。スペクチノマイシンを添加したＬＢ中、３７°Ｃで、２００ｒｐｍで振とう培養した。ＯＤ６００が０．３を超えた後、ＩＰＴＧを終濃度０．５ｍＭとなるように添加し、２８°Ｃで、１８０ｒｐｍで振とう培養した。１時間後、それぞれ終濃度が以下のとおりとなるように、２ｍＭアスコルビン酸ナトリウム、０．５ｍＭ  ドーパミン（ＤＡ）、１ｍＭ  チロシンを培養液に添加した。混合後、５１時間振とう培養し、上清中のノルコクラウリンをＬＣ−ＭＳとＭＲＭを使用して定量した。結果を図１３に示す。【００８３】
（３）ＴｙＤＣ１及びＰＳＯＮＣＳ３を導入した試験
Ｐ．ｓｏｍｎｉｆｅｒｕｍのＴｙＤＣ１の野生型又は変異体（ＴｙＤＣ１−Ｙ９８Ｆ−Ｆ９９Ｙ−Ｌ２０５Ｎ）、並びにＰＳＯＮＣＳ３（コドン最適化した塩基配列は配列番号２９で示す通りであり、対応するアミノ酸配列は配列番号３０に示す通りである）を導入したベクター、各種ｐＣＤＦＤｕｅｔ−１−ＰＳＯＮＣＳ３−ＰｓＴｙＤＣ１を作成した。なお、上述の変異は、配列番号１７及び１８のプライマーを用いることで、Ｐｈｅ９９Ｔｙｒ、Ｔｙｒ９８Ｐｈｅの変異を、また、配列番号１９及び配列番号２０のプライマーを用いることで、Ｌｅｕ２０５Ａｓｎの変異が導入されたヌクレオチドを合成した。このベクターを用いてＢＬ２１（ＤＥ３）を形質転換した。スペクチノマイシンを添加したＬＢ中、３７°Ｃで、２００ｒｐｍで振とう培養した。ＯＤ６００が０．３を超えた後、ＩＰＴＧを終濃度０．５ｍＭとなるように添加し、２８°Ｃで、１８０ｒｐｍで振とう培養した。１時間後、それぞれ終濃度が以下のとおりとなるように、２ｍＭアスコルビン酸ナトリウム、０．５ｍＭ  ドーパミン（ＤＡ）、１ｍＭ  チロシンを培養液に添加した。混合後、５１時間振とう培養し、上清中のノルコクラウリンをＬＣ−ＭＳとＭＲＭを使用して定量した。結果を図１４に示す。【００８４】
（４）ＴｙＤＣ３及びＰＳＯＮＣＳ３を導入した試験
Ｐ．ｓｏｍｎｉｆｅｒｕｍのＴｙＤＣ３の野生型又は変異体（ＴｙＤＣ３−Ｙ１００Ｆ−Ｆ１０１Ｙ−Ｈ２０３Ｎ）、並びにＰＳＯＮＣＳ３（コドン最適化した塩基配列は配列番号２９で示す通りであり、対応するアミノ酸配列は配列番号３０に示す通りである）を導入したベクター、各種ｐＣＤＦＤｕｅｔ−１−ＰＳＯＮＣＳ３−ＰｓＴｙＤＣ３を作成した。なお、上述の変異は、配列番号１７及び１８のプライマーを用いることで、Ｐｈｅ１０１Ｔｙｒ、Ｔｙｒ１００Ｐｈｅの変異を、また、配列番号１９及び配列番号２０のプライマーを用いることで、Ｈｉｓ２０３Ａｓｎの変異を導入したヌクレオチドを合成した。このベクターを用いてＢＬ２１（ＤＥ３）を形質転換した。スペクチノマイシンを添加したＬＢ中、３７°Ｃで、２００ｒｐｍで振とう培養した。ＯＤ６００が０．３を超えた後、ＩＰＴＧを終濃度０．５ｍＭとなるように添加し、２８°Ｃで、１８０ｒｐｍで振とう培養した。１時間後、それぞれ終濃度が以下のとおりとなるように、２ｍＭアスコルビン酸ナトリウム、０．５ｍＭ  ドーパミン（ＤＡ）、１ｍＭ  チロシンを培養液に添加した。混合後、５１時間振とう培養し、上清中のノルコクラウリンをＬＣ−ＭＳとＭＲＭを使用して定量した。結果を図１４に示す。【００８５】
図１３及び図１４に示すとおり、細胞内にＰ．ｓｏｍｎｉｆｅｒｕｍのＴｙＤＣ１、又はＴｙＤＣ３、及びＮＣＳ（Ｔｈａｌｉｃｔｒｕｍ  ｆｌａｖｕｍのＴｆＮＣＳ、又はＰ．ｓｏｍｎｉｆｅｒｕｍのＰＳＯＮＣＳ３）を導入することで、チロシンから４−ＨＰＡＡ及びノルコクラウリンを産生させることに成功した。さらに、ＴｙＤＣ１、又はＴｙＤＣ３に上記の変異を導入することで、ノルコクラウリンの産生量を顕著に増加させることができた。各ＴｙＤＣ１における９８番目、９９番目、２０５番目のアミノ酸は、共通の構造を有するＤＨＰＡＡＳにおいては７９番目、８０番目、１９２番目のアミノ酸に対応している。本試験において、ＴｙＤＣ１の９８番目のアミノ酸をＴｙｒからＰｈｅに、９９番目のアミノ酸をＰｈｅからＴｙｒに、２０５番目のアミノ酸をＨｉｓからＡｓｎにする変異は、ＴｙＤＣ１のカルボキシラーゼ活性において寄与するこれらの残基を、ＡＡＳ活性を有するように改変したものと考えることができる。ＴｙＤＣ３についても同様のことが言える。【００８６】
１２．インビボにおける、チロシンからのレチクリン産生（Ｐ．ｓｏｍｎｉｆｅｒｕｍのＴｙＤＣ及びＮＣＳの導入）
上記１１（１）の記載と同様に、Ｐ．ｓｏｍｎｉｆｅｒｕｍのＴｙＤＣ１の野生型又は変異体（ＴｙＤＣ１−Ｙ９８Ｆ−Ｆ９９Ｙ−Ｌ２０５Ｎ）、並びにＴｆＮＣＳを導入したベクター、各種ｐＣＤＦＤｕｅｔ−１−ＴｆＮＣＳ−ＰｓＴｙＤＣ１を作成した。さらに、上記９に記載の、Ｃ．ｊａｐｏｎｉｃａ由来のノルコクラウリン６−Ｏ−メチルトランスフェラーゼ（６’ＯＭＴ）、３’−ヒドロキシ−Ｎ−メチル−（Ｓ）−コクラウリン−４’−Ｏ−メチルトランスフェラーゼ（４’ＯＭＴ）、コクラウリン−Ｎ−メチルトランスフェラーゼ（ＣＮＭＴ）、Ｎ−メチルコクラウリン３−ヒドロキシラーゼ（ＮＭＣＨ）遺伝子を発現するｐＡＣＹＣ１８４ベクターを用いた。これらのベクターを用いてＢＬ２１（ＤＥ３）を形質転換した。スペクチノマイシン、クロラムフェコール、５ｍＭアスコルビン酸を添加したＭ９培地中、３７°Ｃ、１８０ｒｐｍで振とう培養した。ＯＤ６００が０．２〜０．３に到達したところで、ＩＰＴＧを終濃度０．８ｍＭとなるように添加し、２５℃、３０分１８０ｒｐｍで振とう培養し、それぞれ終濃度が以下のとおりとなるように、２．５ｍＭ  ドーパミン（ＤＡ）、５ｍＭ  チロシンを培養液に添加し、混合後、培養物を１８０ｒｐｍで９３時間振とう培養した。上清中のＬ−ＤＯＰＡ、４ＨＰＡＡ、ノルコクラウリン、ＴＨＰ、レチクリンをＬＣ−ＭＳとＭＲＭを使用して定量した。インビボでの反応スキームを図１５に、上清中のＬ−ＤＯＰＡ、４ＨＰＡＡ、ノルコクラウリン、ＴＨＰ、レチクリンの産生量を図１６に示す。【００８７】
図１６に示すとおり、細胞内にＰ．ｓｏｍｎｉｆｅｒｕｍのＴｙＤＣ１、ＮＣＳ、さらに６’ＯＭＴ、４’ＯＭＴ、ＣＮＭＴ、ＮＭＣＨを導入することで、チロシンから、最終的にレチクリンを産生させることに成功した。【００８８】
１３．インビボにおける、Ｌ−ドーパからのＴＨＰ及びレチクリン産生（改変したＰ．ｐｕｔｉｄａのＤＤＣの導入）
Ｐ．ｐｕｔｉｄａのＤＤＣの変異体（ＤＤＣ−Ｙ７９Ｆ−Ｆ８０Ｙ−Ｈ１８１Ｎ）、Ｃ．ｊａｐｏｎｉｃａ由来のノルコクラウリン６−Ｏ−メチルトランスフェラーゼ（６’ＯＭＴ）、３’−ヒドロキシ−Ｎ−メチル−（Ｓ）−コクラウリン−４’−Ｏ−メチルトランスフェラーゼ（４’ＯＭＴ）、及びコクラウリン−Ｎ−メチルトランスフェラーゼ（ＣＮＭＴ）を導入したｐＡＣＹＣ１８４で、ＢＬ２１（ＤＥ３）を形質転換した。スペクチノマイシン及びクロラムフェニコールを添加したＬＢ培地中、２８°Ｃ、１８０ｒｐｍで振とう培養した。ＯＤ６００が０．３を超えたところで、ＩＰＴＧを終濃度０．７４ｍＭ〜１．４８ｍＭとなるように添加した。２０℃、１８０ｒｐｍで３０分培養し、終濃度約１．９ｍＭのＬ−ＤＯＰＡ及び終濃度約４．７ｍＭのアスコルビン酸ナトリウムを培養液に添加し、混合後４０時間培養した。上清中のＴＨＰ及びレチクリンをＬＣ−ＭＳとＭＲＭを使用して定量した。インビボでの反応スキームを図１７に、及び上清中のＴＨＰ、３ＨＮＭＣ及びレチクリンの産生量を図１８に示す。【００８９】
図１７及び１８に示すとおり、Ｐ．ｐｕｔｉｄａのＤＤＣの変異体（ＤＤＣ−Ｙ７９Ｆ−Ｆ８０Ｙ−Ｈ１８１Ｎ）により、Ｌ−ＤｏｐａからＴＨＰ、３ＨＮＭＣ及びレチクリンを産生させることができた。このことは、ＤＤＣの変異体（ＤＤＣ−Ｙ７９Ｆ−Ｆ８０Ｙ−Ｈ１８１Ｎ）が、Ｌ−Ｄｏｐａから、ドーパミンとＤＨＰＡＡの両方を誘導することができたことを示す結果である。すなわち、上述の試験にて、ＤＨＰＡＡにおいて導入した変異（Ｐｈｅ７９Ｔｙｒ−Ｔｙｒ８０Ｐｈｅ−Ａｓｎ１９２Ｈｉｓ）と逆向きの変異をＰ．ｐｕｔｉｄａのＤＤＣに導入することにより（Ｔｙｒ７９Ｐｈｅ−Ｐｈｅ８０Ｔｙｒ−Ｈｉｓ１８１Ａｓｎ）、ＤＤＣにＤＨＰＡＡＳ活性を生じさせることに成功したこととなる。
【産業上の利用可能性】
【００９０】
本発明によると、二官能性酵素である芳香族アルデヒドシンターゼ（ＡＡＳ）、芳香族アミノ酸脱炭酸酵素（ＡＡＡＤ）の、野生型又は変異体を発現させた組換え宿主細胞を用いることで、ベンジルイソキノリンアルカロイド（ＢＩＡ）を効率的かつ容易に生産することができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５−１】
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【図５−２】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９−１】
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【図９−２】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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