(57)【要約】  以下のいずれか一つを含む配列からなり、且つ、標的特異的ガイドＲＮＡと複合体を形成することができることを特徴とするタンパク質：配列番号１で表されるアミノ酸配列；配列番号１で表されるアミノ酸配列の１００位以外の部位において、１〜数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換若しくは付加されているか、又は配列番号１と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列；配列番号２で表されるアミノ酸配列；配列番号２で表されるアミノ酸配列の１０２２位以外の部位において、１〜数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換若しくは付加されているか、又は配列番号２と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列。【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（ａ）〜（ｆ）のいずれか一つのアミノ酸配列を含む配列からなり、且つ、標的特異的ガイドＲＮＡと複合体を形成することができることを特徴とするタンパク質。
（ａ）配列番号１で表されるアミノ酸配列、
（ｂ）配列番号１で表されるアミノ酸配列のアミノ酸番号１００位以外の部位において、１〜数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換若しくは付加されたアミノ酸配列、
（ｃ）配列番号１で表されるアミノ酸配列のアミノ酸番号１００位以外の部位において、８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列、
（ｄ）配列番号２で表されるアミノ酸配列、
（ｅ）配列番号２で表されるアミノ酸配列のアミノ酸番号１０２２位以外の部位において、１〜数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換若しくは付加されたアミノ酸配列、
（ｆ）配列番号２で表されるアミノ酸配列のアミノ酸番号１０２２位以外の部位において、８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列
【請求項２】
配列番号１で表されるアミノ酸配列のアミノ酸番号１００位がＡｓｎである、又は配列番号２で表されるアミノ酸配列のアミノ酸番号１０２２位がＡｓｎであることを特徴とする、請求項１に記載のタンパク質。
【請求項３】
以下の（ｇ）〜（ｉ）のいずれか一つのアミノ酸配列を含む配列からなり、且つ、標的特異的ガイドＲＮＡと複合体を形成することができることを特徴とするタンパク質。
（ｇ）配列番号１３で表されるアミノ酸配列、
（ｈ）配列番号１３で表されるアミノ酸配列のアミノ酸番号１０２５位以外の部位において、１〜数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換若しくは付加されたアミノ酸配列、
（ｉ）配列番号１３で表されるアミノ酸配列のアミノ酸番号１０２５位以外の部位において、８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列
【請求項４】
配列番号１３で表されるアミノ酸配列のアミノ酸番号１０２５位がＡｌａであることを特徴とする、請求項３に記載のタンパク質。
【請求項５】
以下の（ｊ）〜（ｌ）のいずれか一つのアミノ酸配列を含む配列からなり、且つ、標的特異的ガイドＲＮＡと複合体を形成することができることを特徴とするタンパク質。
（ｊ）配列番号５で表されるアミノ酸配列において、以下の（１）及び／又は（２）の置換を少なくとも一つ含むアミノ酸配列
（１）アミノ酸番号５２位のＧｌｕの、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、又はＨｉｓへの置換、５５位のＳｅｒの、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、又はＨｉｓへの置換、８４３位のＳｅｒの、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、又はＴｙｒへの置換、９９７位のＬｙｓの、Ａｒｇ又はＨｉｓへの置換、１０４０位のＬｙｓの、Ａｒｇ又はＨｉｓへの置換、９５９位のＬｙｓのＡｌａへの置換、９９２位のＬｙｓのＡｌａへの置換、及び９０４位のＧｌｕの、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、又はＨｉｓへの置換から選択される少なくとも一つの置換、
（２）アミノ酸番号７２位のＨｉｓの、Ｌｙｓ若しくはＡｒｇへの置換、９３位のＧｌｎの、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、又はＨｉｓへの置換、９５位のＧｌｕの、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、又はＨｉｓへの置換、１７５位のＨｉｓの、Ｌｙｓ、又はＡｒｇへの置換、８１１位のＴｈｒの、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、又はＨｉｓへの置換、１０７５位のＳｅｒの、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、又はＨｉｓへの置換、及び１０７６位のＡｓｐの、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、又はＨｉｓへの置換から選択される少なくとも一つの置換、
（ｋ）（ｊ）のアミノ酸配列の、前記（１）及び（２）に規定するアミノ酸番号以外の部位において、１〜数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換若しくは付加されたアミノ酸配列、
（ｌ）（ｊ）のアミノ酸配列の、前記（１）及び（２）に規定するアミノ酸番号以外の部位において、８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列
【請求項６】
配列番号５で表されるアミノ酸配列において、アミノ酸番号５５位のＳｅｒのＬｙｓへの置換、及び／又はアミノ酸番号９０４位のＧｌｕのＡｒｇへの置換を含む、請求項５に記載のタンパク質。
【請求項７】
以下の（ｍ）〜（ｏ）のいずれか一つのアミノ酸配列を含む配列からなり、且つ、標的特異的ガイドＲＮＡと複合体を形成することができることを特徴とするタンパク質。
（ｍ）配列番号５で表されるアミノ酸配列において、以下の置換を少なくとも一つ含むアミノ酸配列
・アミノ酸番号１０２２位のＡｓｐの、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、又はＨｉｓへの置換、
・アミノ酸番号１０２５位のＴｈｒのＡｌａへの置換、
・アミノ酸番号５２位のＧｌｕの、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、又はＨｉｓへの置換、５５位のＳｅｒの、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、又はＨｉｓへの置換、８４３位のＳｅｒの、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、又はＴｙｒへの置換、９９７位のＬｙｓの、Ａｒｇ又はＨｉｓへの置換、１０４０位のＬｙｓの、Ａｒｇ又はＨｉｓへの置換、９５９位のＬｙｓのＡｌａへの置換、９９２位のＬｙｓのＡｌａへの置換、及び９０４位のＧｌｕの、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、又はＨｉｓへの置換から選択される少なくとも一つの置換、
・アミノ酸番号７２位のＨｉｓの、Ｌｙｓ若しくはＡｒｇへの置換、９３位のＧｌｎの、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、又はＨｉｓへの置換、９５位のＧｌｕの、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、又はＨｉｓへの置換、１７５位のＨｉｓの、Ｌｙｓ、又はＡｒｇへの置換、８１１位のＴｈｒの、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、又はＨｉｓへの置換、１０７５位のＳｅｒの、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、又はＨｉｓへの置換、及び１０７６位のＡｓｐの、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、又はＨｉｓへの置換から選択される少なくとも一つの置換、
（ｎ）（ｍ）のアミノ酸配列の、（ｍ）に規定するアミノ酸番号以外の部位において、１〜数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換若しくは付加されたアミノ酸配列、
（ｏ）（ｍ）のアミノ酸配列の、（ｍ）に規定するアミノ酸番号以外の部位において、８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列
【請求項８】
配列番号５で表されるアミノ酸配列において、以下の置換の組合せのいずれか一つを含む、請求項７に記載のタンパク質。
・アミノ酸番号５５位のＳｅｒのＬｙｓへの置換、アミノ酸番号９０４位のＧｌｕのＡｒｇへの置換、及びアミノ酸番号１０２２位のＡｓｐのＡｓｎへの置換、
・アミノ酸番号５５位のＳｅｒのＬｙｓへの置換、アミノ酸番号９０４位のＧｌｕのＡｒｇへの置換、アミノ酸番号１０２５位のＴｈｒのＡｌａへの置換、
・アミノ酸番号５５位のＳｅｒのＬｙｓへの置換、アミノ酸番号９０４位のＧｌｕのＡｒｇへの置換、アミノ酸番号１０２２位のＡｓｐのＡｓｎへの置換、及びアミノ酸番号１０２５位のＴｈｒのＡｌａへの置換
【請求項９】
（ｄ）〜（ｏ）のいずれかにおいて、前記アミノ酸配列が、以下の（３）の置換を含むことを特徴とする、請求項１〜８のいずれか一項に記載のタンパク質。
（３）アミノ酸番号８位のＡｓｐのＡｌａへの置換、５０３位のＧｌｕのＡｌａへの置換、５８４位のＨｉｓのＡｌａへの置換、５９８位のＡｓｎのＡｌａへの置換、６０７位のＡｓｎのＡｌａへの置換、及び７２５位のＡｓｐのＡｌａへの置換から選択される少なくとも一つの置換
【請求項１０】
請求項１〜９のいずれか一項に記載のタンパク質をコードする遺伝子。
【請求項１１】
以下の（ｐ）〜（ｓ）のいずれか一つの塩基配列を含む配列からなり、且つ、標的特異的ガイドＲＮＡと複合体を形成することができるタンパク質をコードすることを特徴とする遺伝子。
（ｐ）配列番号３又は４で表される塩基配列、
（ｑ）配列番号３又は４で表される塩基配列において、１〜数個の塩基が欠失、挿入、置換又は付加されている塩基配列、
（ｒ）配列番号３又は４で表される塩基配列と同一性が８０％以上である塩基配列、
（ｓ）配列番号３又は４で表される塩基配列からなるＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる塩基配列
【請求項１２】
以下の（ｔ）〜（ｗ）のいずれか一つの塩基配列を含む配列からなり、且つ、標的特異的ガイドＲＮＡと複合体を形成することができるタンパク質をコードすることを特徴とする遺伝子。
（ｔ）配列番号１４で表される塩基配列、
（ｕ）配列番号１４で表される塩基配列において、１〜数個の塩基が欠失、挿入、置換又は付加されている塩基配列、
（ｖ）配列番号１４で表される塩基配列と同一性が８０％以上である塩基配列、
（ｗ）配列番号１４で表される塩基配列からなるＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる塩基配列
【請求項１３】
請求項１〜９のいずれか一項に記載のタンパク質又は請求項１０〜１２のいずれか一項に記載の遺伝子と、
標的二本鎖ポリヌクレオチド中のＰＡＭ配列の１塩基上流から２０塩基以上２４塩基以下上流までの塩基配列に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドを含むガイドＲＮＡとを含む組成物。
【請求項１４】
標的二本鎖ポリヌクレオチドを部位特異的に切断するための方法であって、
標的二本鎖ポリヌクレオチドと、請求項１〜８のいずれか一項に記載のタンパク質と、ガイドＲＮＡとを接触させる工程を含み、
前記タンパク質が、前記標的二本鎖ポリヌクレオチド中のＰＡＭ配列の上流に位置する切断部位で該標的二本鎖ポリヌクレオチドを切断して、平滑末端を作出することを特徴とする、方法。
【請求項１５】
標的二本鎖ポリヌクレオチドを部位特異的に修飾するための方法であって、
標的二本鎖ポリヌクレオチドと、請求項１〜８のいずれか一項に記載のタンパク質と、ガイドＲＮＡとを接触させる工程を含み、
前記タンパク質が、前記標的二本鎖ポリヌクレオチド中のＰＡＭ配列の上流に位置する切断部位で該標的二本鎖ポリヌクレオチドを切断して、平滑末端を作出し、
前記ガイドＲＮＡと前記標的二本鎖ポリヌクレオチドの相補的結合によって決定される領域において、前記標的二本鎖ポリヌクレオチドが修飾されることを特徴とする、方法。
【請求項１６】
標的二本鎖ポリヌクレオチドを部位特異的に修飾するための方法であって、
標的二本鎖ポリヌクレオチドと、請求項９に記載のタンパク質と、ガイドＲＮＡとを接触させる工程を含み、
前記タンパク質が、前記ガイドＲＮＡを介して前記標的二本鎖ポリヌクレオチドに特異的に結合し、ここで、前記タンパク質が、前記標的二本鎖ポリヌクレオチドを切断しないか又は一方の鎖のみを切断し、
前記ガイドＲＮＡと前記標的二本鎖ポリヌクレオチドの相補的結合によって決定される領域において、前記標的二本鎖ポリヌクレオチドが修飾されることを特徴とする、方法。
【請求項１７】
遺伝子の発現を調節するための方法であって、
前記遺伝子に関連する標的二本鎖ポリヌクレオチドと、請求項９に記載のタンパク質と、ガイドＲＮＡと、エフェクター分子とを接触させる工程を含み、
前記タンパク質が、前記ガイドＲＮＡを介して前記標的二本鎖ポリヌクレオチドに特異的に結合し、それにより前記エフェクター分子が前記標的二本鎖ポリヌクレオチドに特異的に作用することによって前記遺伝子の発現を調節することを特徴とする、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、好ましくは単純なＰＡＭ認識を有する、エンジニアリングされたＢｌＣａｓ９ヌクレアーゼ、該ヌクレアーゼをコードする遺伝子、及びそれらの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
クラスター化した規則的な配置の短い回文反復配列（Ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ  Ｒｅｇｕｌａｒｌｙ  Ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ  Ｓｈｏｒｔ  Ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ  Ｒｅｐｅａｔｓ：ＣＲＩＳＰＲ）は、Ｃａｓ（ＣＲＩＳＰＲ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ）遺伝子と共に、細菌及び古細菌において侵入外来核酸に対する獲得耐性を提供する適応免疫系を構成することが知られている。ＣＲＩＳＰＲは、ファージ又はプラスミドＤＮＡに起因することが多く、大きさの類似するスペーサーと呼ばれる独特の可変ＤＮＡ配列が間に入った、２４〜４８ｂｐの短い保存された反復配列からなる。また、リピート及びスペーサー配列の近傍には、Ｃａｓタンパク質ファミリーをコードする遺伝子群が存在する。【０００３】
ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムにおいて、外来性のＤＮＡは、Ｃａｓタンパク質ファミリーによって３０ｂｐ程度の断片に切断され、ＣＲＩＳＰＲに挿入される。Ｃａｓタンパク質ファミリーの一つであるＣａｓ１及びＣａｓ２タンパク質は、外来性ＤＮＡのｐｒｏｔｏ−ｓｐａｃｅｒ  ａｄｊａｃｅｎｔ  ｍｏｔｉｆ（ＰＡＭ）と呼ばれる塩基配列を認識して、その上流を切り取って、宿主のＣＲＩＳＰＲ配列に挿入し、これが細菌の免疫記憶となる。免疫記憶を含むＣＲＩＳＰＲ配列が転写されて生成したＲＮＡ（ｐｒｅ−ｃｒＲＮＡと呼ぶ。）は、一部相補的なＲＮＡ（ｔｒａｎｓ−ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ  ｃｒＲＮＡ：ｔｒａｃｒＲＮＡ）と対合し、Ｃａｓタンパク質ファミリーの一つであるＣａｓ９タンパク質に取り込まれる。Ｃａｓ９に取り込まれたｐｒｅ−ｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡはＲＮＡａｓｅＩＩＩにより切断され、外来配列（ガイド配列）を含む小さなＲＮＡ断片（ＣＲＩＳＰＲ−ＲＮＡｓ：ｃｒＲＮＡｓ）となり、Ｃａｓ９−ｃｒＲＮＡ−ｔｒａｃｒＲＮＡ複合体が形成される。Ｃａｓ９−ｃｒＲＮＡ−ｔｒａｃｒＲＮＡ複合体はｃｒＲＮＡと相補的な外来侵入性ＤＮＡに結合し、ＤＮＡを切断する酵素（ヌクレアーゼ）であるＣａｓ９タンパク質が、外来侵入性ＤＮＡを切断することよって、外から侵入したＤＮＡの機能を抑制及び排除する。【０００４】
Ｃａｓ９タンパク質は外来侵入性ＤＮＡ中のＰＡＭ配列を認識して、その上流で二本鎖ＤＮＡを平滑末端になるように切断する。ＰＡＭ配列の長さや塩基配列は細菌種によってさまざまであり、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）では「ＮＧＧ」の３塩基を認識する。Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）は２つのＣａｓ９を持っており、それぞれ「ＮＧＧＮＧ」又は「ＮＮＡＧＡＡ」の５〜６塩基をＰＡＭ配列として認識する。(Ｎは任意の塩基を表す)。ＰＡＭ配列の上流の何ｂｐのところを切断するかも細菌種によって異なるが、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓを含め大部分のＣａｓ９オルソログはＰＡＭ配列の３塩基上流を切断する。【０００５】
近年、細菌でのＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムを、ゲノム編集に応用する技術が盛んに開発されている。ｃｒＲＮＡとｔｒａｃｒＲＮＡを融合させて、ｔｒａｃｒＲＮＡ−ｃｒＲＮＡキメラ（以下、ガイドＲＮＡ（ｇｕｉｄｅ  ＲＮＡ：ｇＲＮＡ）と呼ぶ。）として発現させ、活用している。これによりヌクレアーゼ（ＲＮＡ−ｇｕｉｄｅｄ  ｎｕｃｌｅａｓｅ：ＲＧＮ）を呼び込み、目的の部位でゲノムＤＮＡを切断する。【０００６】
ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムには、ｔｙｐｅＩ、ＩＩ、ＩＩＩがあるが、ゲノム編集で用いるのはもっぱらｔｙｐｅＩＩ  ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムであり、ｔｙｐｅＩＩではＲＧＮとしてＣａｓ９タンパク質が用いられている。Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ由来のＣａｓ９タンパク質はＮＧＧという３つの塩基をＰＡＭ配列として認識するため、グアニンが２つ並んだ配列がありさえすればその上流を切断できる。【０００７】
ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムを用いた方法は、目的のＤＮＡ配列と相同な短いｇＲＮＡを合成するだけでよく、単一のタンパク質であるＣａｓ９タンパク質を用いてゲノム編集ができる。そのため、従来用いられていたジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）やトランス活性化因子様作動体（ＴＡＬＥＮ）のようにＤＮＡ配列ごとに異なる大きなタンパク質を合成する必要がなく、簡便かつ迅速にゲノム編集を行うことができる。【０００８】
特許文献１には、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ由来のＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムを活用したゲノム編集技術が開示されている。【０００９】
特許文献２には、Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ由来のＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムを活用したゲノム編集技術が開示されている。さらに、特許文献２には、Ｃａｓ９タンパク質のＤ３１Ａ又はＮ８９１Ａ変異体が、一方のＤＮＡ鎖のみにニック（ｎｉｃｋ）を入れるＤＮＡ切断酵素であるニッカーゼとして機能することが開示されており、ＤＮＡ切断後の修復メカニズムで挿入欠失などの変異を起こしやすい非相同末端結合の発生率は少ないままで、野生型Ｃａｓ９タンパク質と同程度の相同組み換え効率を有することが示されている。【００１０】
非特許文献１には、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ由来のＣａｓ９を使用したＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムであって、２つのＣａｓ９タンパク質のＤ１０Ａ変異体と、該Ｄ１０Ａ変異体と複合体を形成する１対の標的特異的ガイドＲＮＡを利用するダブルニッカーゼシステムが開示されている。各Ｃａｓ９タンパク質のＤ１０Ａ変異体及び標的特異的ガイドＲＮＡの複合体は、ガイドＲＮＡと相補するＤＮＡ鎖に１つだけニックを作る。一対のガイドＲＮＡは約２０塩基程度ずれており、標的ＤＮＡの反対鎖に位置する標的配列のみを認識する。各Ｃａｓ９タンパク質のＤ１０Ａ変異体及び標的特異的ガイドＲＮＡの複合体によって作られた２つのニックはＤＳＢ（ＤＮＡ二本鎖切断）を模倣する状態になり、一対のガイドＲＮＡを利用することで高レベルの効率を維持しつつ、Ｃａｓ９タンパク質媒介型遺伝子編集の特異性を改善できることが示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１１】
【特許文献１】国際公開第２０１４／０９３６６１号
【特許文献２】特表２０１５−５１０７７８号公報
【非特許文献】
【００１２】
【非特許文献１】Ｒａｎ，  Ｆ．Ａ．，  ｅｔ  ａｌ．  ２０１３．  Ｄｏｕｂｌｅ  ｎｉｃｋｉｎｇ  ｂｙ  ＲＮＡ―ｇｕｉｄｅｄ  ＣＲＩＳＰＲ  Ｃａｓ９  ｆｏｒ  ｅｎｈａｎｃｅｄ  ｇｅｎｏｍｅ  ｅｄｉｔｉｎｇ  ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ．  Ｃｅｌｌ  １５４：  １３８０−１３８９．
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
特許文献１に開示されているＳ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ由来のＣａｓ９タンパク質は、認識可能なＰＡＭ配列が「ＮＧＧ」の３塩基であり、特許文献２に開示されているＳ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ由来のＣａｓ９タンパク質では、認識可能なＰＡＭ配列が「ＮＧＧＮＧ」又は「ＮＮＡＧＡＡ」の５〜６塩基であり、ともに認識可能なＰＡＭ配列に制限があるため、編集可能な標的配列が制限される。【００１４】
また、非特許文献１に開示されているダブルニッカーゼシステムでは、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ由来のＣａｓ９タンパク質を使用しており、認識可能なＰＡＭ配列が標的配列内のセンス鎖及びアンチセンス鎖に１か所ずつ計２か所必要となるため、さらに編集可能な標的配列が制限される。【００１５】
本発明は、上記事情に鑑みてなされたものであって、標的二本鎖ポリヌクレオチドへの結合力を保ちながら、ＰＡＭ配列の認識が広範化されたＣａｓ９タンパク質を提供することを目的とする。また、本発明は、ガイドＲＮＡ及び／又はＤＮＡの認識が向上されたＣａｓ９タンパク質を提供することを目的とする。さらに、本発明は、前記Ｃａｓ９タンパク質を利用した、標的配列に特異的なゲノム編集技術及び遺伝子発現調節の簡便且つ迅速な方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
すなわち、本発明は、以下の態様を含む。
［１］以下の（ａ）〜（ｆ）のいずれか一つのアミノ酸配列を含む配列からなり、且つ、標的特異的ガイドＲＮＡと複合体を形成することができることを特徴とするタンパク質。
（ａ）配列番号１で表されるアミノ酸配列、
（ｂ）配列番号１で表されるアミノ酸配列のアミノ酸番号１００位以外の部位において、１〜数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換若しくは付加されたアミノ酸配列、
（ｃ）配列番号１で表されるアミノ酸配列のアミノ酸番号１００位以外の部位において、８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列、
（ｄ）配列番号２で表されるアミノ酸配列、
（ｅ）配列番号２で表されるアミノ酸配列のアミノ酸番号１０２２位以外の部位において、１〜数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換若しくは付加されたアミノ酸配列、
（ｆ）配列番号２で表されるアミノ酸配列のアミノ酸番号１０２２位以外の部位において、８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列【００１７】
［２］配列番号１で表されるアミノ酸配列のアミノ酸番号１００位がＡｓｎである、又は配列番号２で表されるアミノ酸配列のアミノ酸番号１０２２位がＡｓｎであることを特徴とする、［１］に記載のタンパク質。【００１８】
［３］以下の（ｇ）〜（ｉ）のいずれか一つのアミノ酸配列を含む配列からなり、且つ、標的特異的ガイドＲＮＡと複合体を形成することができることを特徴とするタンパク質。
（ｇ）配列番号１３で表されるアミノ酸配列、
（ｈ）配列番号１３で表されるアミノ酸配列のアミノ酸番号１０２５位以外の部位において、１〜数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換若しくは付加されたアミノ酸配列、
（ｉ）配列番号１３で表されるアミノ酸配列のアミノ酸番号１０２５位以外の部位において、８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列【００１９】
［４］配列番号１３で表されるアミノ酸配列のアミノ酸番号１０２５位がＡｌａであることを特徴とする、［３］に記載のタンパク質。【００２０】
［５］以下の（ｊ）〜（ｌ）のいずれか一つのアミノ酸配列を含む配列からなり、且つ、標的特異的ガイドＲＮＡと複合体を形成することができることを特徴とするタンパク質。
（ｊ）配列番号５で表されるアミノ酸配列において、以下の（１）及び／又は（２）の置換を少なくとも一つ含むアミノ酸配列
（１）アミノ酸番号５２位のＧｌｕの、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、又はＨｉｓへの置換、５５位のＳｅｒの、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、又はＨｉｓへの置換、８４３位のＳｅｒの、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、又はＴｙｒへの置換、９９７位のＬｙｓの、Ａｒｇ又はＨｉｓへの置換、１０４０位のＬｙｓの、Ａｒｇ又はＨｉｓへの置換、９５９位のＬｙｓのＡｌａへの置換、９９２位のＬｙｓのＡｌａへの置換、及び９０４位のＧｌｕの、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、又はＨｉｓへの置換から選択される少なくとも一つの置換、
（２）アミノ酸番号７２位のＨｉｓの、Ｌｙｓ若しくはＡｒｇへの置換、９３位のＧｌｎの、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、又はＨｉｓへの置換、９５位のＧｌｕの、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、又はＨｉｓへの置換、１７５位のＨｉｓの、Ｌｙｓ、又はＡｒｇへの置換、８１１位のＴｈｒの、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、又はＨｉｓへの置換、１０７５位のＳｅｒの、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、又はＨｉｓへの置換、及び１０７６位のＡｓｐの、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、又はＨｉｓへの置換から選択される少なくとも一つの置換、
（ｋ）（ｊ）のアミノ酸配列の、前記（１）及び（２）に規定するアミノ酸番号以外の部位において、１〜数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換若しくは付加されたアミノ酸配列、
（ｌ）（ｊ）のアミノ酸配列の、前記（１）及び（２）に規定するアミノ酸番号以外の部位において、８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列【００２１】
［６］配列番号５で表されるアミノ酸配列において、アミノ酸番号５５位のＳｅｒのＬｙｓへの置換、及び／又はアミノ酸番号９０４位のＧｌｕのＡｒｇへの置換を含む、［５］に記載のタンパク質。【００２２】
［７］以下の（ｍ）〜（ｏ）のいずれか一つのアミノ酸配列を含む配列からなり、且つ、標的特異的ガイドＲＮＡと複合体を形成することができることを特徴とするタンパク質。
（ｍ）配列番号５で表されるアミノ酸配列において、以下の置換を少なくとも一つ含むアミノ酸配列
・アミノ酸番号１０２２位のＡｓｐの、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、又はＨｉｓへの置換、
・アミノ酸番号１０２５位のＴｈｒのＡｌａへの置換、
・アミノ酸番号５２位のＧｌｕの、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、又はＨｉｓへの置換、５５位のＳｅｒの、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、又はＨｉｓへの置換、８４３位のＳｅｒの、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、又はＴｙｒへの置換、９９７位のＬｙｓの、Ａｒｇ又はＨｉｓへの置換、１０４０位のＬｙｓの、Ａｒｇ又はＨｉｓへの置換、９５９位のＬｙｓのＡｌａへの置換、９９２位のＬｙｓのＡｌａへの置換、及び９０４位のＧｌｕの、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、又はＨｉｓへの置換から選択される少なくとも一つの置換、
・アミノ酸番号７２位のＨｉｓの、Ｌｙｓ若しくはＡｒｇへの置換、９３位のＧｌｎの、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、又はＨｉｓへの置換、９５位のＧｌｕの、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、又はＨｉｓへの置換、１７５位のＨｉｓの、Ｌｙｓ、又はＡｒｇへの置換、８１１位のＴｈｒの、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、又はＨｉｓへの置換、１０７５位のＳｅｒの、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、又はＨｉｓへの置換、及び１０７６位のＡｓｐの、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、又はＨｉｓへの置換から選択される少なくとも一つの置換、
（ｎ）（ｍ）のアミノ酸配列の、（ｍ）に規定するアミノ酸番号以外の部位において、１〜数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換若しくは付加されたアミノ酸配列、
（ｏ）（ｍ）のアミノ酸配列の、（ｍ）に規定するアミノ酸番号以外の部位において、８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列【００２３】
［８］配列番号５で表されるアミノ酸配列において、以下の置換の組合せのいずれか一つを含む、［７］に記載のタンパク質。
・アミノ酸番号５５位のＳｅｒのＬｙｓへの置換、アミノ酸番号９０４位のＧｌｕのＡｒｇへの置換、及びアミノ酸番号１０２２位のＡｓｐのＡｓｎへの置換、
・アミノ酸番号５５位のＳｅｒのＬｙｓへの置換、アミノ酸番号９０４位のＧｌｕのＡｒｇへの置換、アミノ酸番号１０２５位のＴｈｒのＡｌａへの置換、
・アミノ酸番号５５位のＳｅｒのＬｙｓへの置換、アミノ酸番号９０４位のＧｌｕのＡｒｇへの置換、アミノ酸番号１０２２位のＡｓｐのＡｓｎへの置換、及びアミノ酸番号１０２５位のＴｈｒのＡｌａへの置換【００２４】
［９］（ｄ）〜（ｏ）のいずれかにおいて、前記アミノ酸配列が、以下の（３）の置換を含むことを特徴とする、［１］〜［８］のいずれか一つに記載のタンパク質。
（３）アミノ酸番号８位のＡｓｐのＡｌａへの置換、５０３位のＧｌｕのＡｌａへの置換、５８４位のＨｉｓのＡｌａへの置換、５９８位のＡｓｎのＡｌａへの置換、６０７位のＡｓｎのＡｌａへの置換、及び７２５位のＡｓｐのＡｌａへの置換から選択される少なくとも一つの置換【００２５】
［１０］［１］〜［９］のいずれか一つに記載のタンパク質をコードする遺伝子。【００２６】
［１１］以下の（ｐ）〜（ｓ）のいずれか一つの塩基配列を含む配列からなり、且つ、標的特異的ガイドＲＮＡと複合体を形成することができるタンパク質をコードすることを特徴とする遺伝子。
（ｐ）配列番号３又は４で表される塩基配列、
（ｑ）配列番号３又は４で表される塩基配列において、１〜数個の塩基が欠失、挿入、置換又は付加されている塩基配列、
（ｒ）配列番号３又は４で表される塩基配列と同一性が８０％以上である塩基配列、
（ｓ）配列番号３又は４で表される塩基配列からなるＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる塩基配列【００２７】
［１２］以下の（ｔ）〜（ｗ）のいずれか一つの塩基配列を含む配列からなり、且つ、標的特異的ガイドＲＮＡと複合体を形成することができるタンパク質をコードすることを特徴とする遺伝子。
（ｔ）配列番号１４で表される塩基配列、
（ｕ）配列番号１４で表される塩基配列において、１〜数個の塩基が欠失、挿入、置換又は付加されている塩基配列、
（ｖ）配列番号１４で表される塩基配列と同一性が８０％以上である塩基配列、
（ｗ）配列番号１４で表される塩基配列からなるＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる塩基配列【００２８】
［１３］［１］〜［９］のいずれか一つに記載のタンパク質又は［１０］〜［１２］のいずれか一つに記載の遺伝子と、
標的二本鎖ポリヌクレオチド中のＰＡＭ配列の１塩基上流から２０塩基以上２４塩基以下上流までの塩基配列に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドを含むガイドＲＮＡとを含む組成物。【００２９】
［１４］標的二本鎖ポリヌクレオチドを部位特異的に切断するための方法であって、
標的二本鎖ポリヌクレオチドと、［１］〜［８］のいずれか一つに記載のタンパク質と、ガイドＲＮＡとを接触させる工程を含み、
前記タンパク質が、前記標的二本鎖ポリヌクレオチド中のＰＡＭ配列の上流に位置する切断部位で該標的二本鎖ポリヌクレオチドを切断して、平滑末端を作出することを特徴とする、方法。【００３０】
［１５］標的二本鎖ポリヌクレオチドを部位特異的に修飾するための方法であって、
標的二本鎖ポリヌクレオチドと、［１］〜［８］のいずれか一つに記載のタンパク質と、ガイドＲＮＡとを接触させる工程を含み、
前記タンパク質が、前記標的二本鎖ポリヌクレオチド中のＰＡＭ配列の３塩基上流に位置する切断部位で該標的二本鎖ポリヌクレオチドを切断して、平滑末端を作出し、
前記ガイドＲＮＡと前記標的二本鎖ポリヌクレオチドの相補的結合によって決定される領域において、前記標的二本鎖ポリヌクレオチドが修飾されることを特徴とする、方法。【００３１】
［１６］標的二本鎖ポリヌクレオチドを部位特異的に修飾するための方法であって、
標的二本鎖ポリヌクレオチドと、［９］に記載のタンパク質と、ガイドＲＮＡとを接触させる工程を含み、
前記タンパク質が、前記ガイドＲＮＡを介して前記標的二本鎖ポリヌクレオチドに特異的に結合し、ここで、前記タンパク質が、前記標的二本鎖ポリヌクレオチドを切断しないか又は一方の鎖のみを切断し、
前記ガイドＲＮＡと前記標的二本鎖ポリヌクレオチドの相補的結合によって決定される領域において、前記標的二本鎖ポリヌクレオチドが修飾されることを特徴とする、方法。【００３２】
［１７］遺伝子の発現を調節するための方法であって、
前記遺伝子に関連する標的二本鎖ポリヌクレオチドと、［９］に記載のタンパク質と、ガイドＲＮＡと、エフェクター分子とを接触させる工程を含み、
前記タンパク質が、前記ガイドＲＮＡを介して前記標的二本鎖ポリヌクレオチドに特異的に結合し、それにより前記エフェクター分子が前記標的二本鎖ポリヌクレオチドに特異的に作用することによって前記遺伝子の発現を調節することを特徴とする、方法。
【発明の効果】
【００３３】
本発明によれば、標的二本鎖ポリヌクレオチドへの結合力を保ちながら、ＰＡＭ配列の認識が広範化されたＣａｓ９タンパク質を得ることができる。また、本発明により、ガイドＲＮＡ及び／又は標的二本鎖ポリヌクレオチドの認識が向上されたＣａｓ９タンパク質を提供することができる。さらに、本発明により、従来技術では標的とすることが不可能又は困難であった配列を含む、広範な配列から選択された標的配列において、標的配列特異的なゲノム編集及び遺伝子発現調節の簡便且つ迅速な方法を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００３４】
【図１】（Ａ）ＢｌＣａｓ９タンパク質が認識することができるＰＡＭ配列を示した図である。（Ｂ）ＢｌＣａｓ９タンパク質と複合体と形成することができるガイドＲＮＡの配列及び二次構造の一例を示した図である。
【図２】ＢｌＣａｓ９タンパク質、ガイドＲＮＡ、及び標的二本鎖ポリヌクレオチドの三者複合体の結晶構造解析の結果を示した図である。図中、「ＢＨ」はブリッジヘリックス、「ＰＩ」はＰＩドメイン（ＰＡＭ配列認識部位）を示す。
【図３】野生型ＢｌＣａｓ９タンパク質のＰＡＭ配列認識部位においてＰＡＭ配列の５番目の塩基を認識する機構を示した図である。
【図４】天然のＰＡＭ配列を含む標的ＤＮＡを用いて、野生型ＢｌＣａｓ９とＤ１０２２Ｎ変異型ＢｌＣａｓ９のＤＮＡ切断活性を比較したグラフである。野生型（ＷＴ）の切断活性を１として表した。
【図５】野生型ＢｌＣａｓ９及びＤ１０２２Ｎ変異型ＢｌＣａｓ９について、認識するＰＡＭ配列の５番目の塩基の違いによる切断活性の違いを比較した電気泳動写真である。
【図６】野生型ＢｌＣａｓ９及びＤ１０２２Ｎ／Ｋ１０４０Ｅ変異型ＢｌＣａｓ９について、認識するＰＡＭ配列の５番目の塩基の違いによる切断活性の違いを比較した電気泳動写真である。
【図７】異なる長さのガイドＲＮＡを用いてＣａｓ９の切断活性を確認したグラフである。
【図８】ＤＮＡ認識を向上させる各種変異を導入したＣａｓ９タンパク質によるＤＮＡ切断活性を示したグラフである。
【図９】ＤＮＡ認識を向上させる単変異体について、ＤＮＡ切断活性の経時変化を示した図である。
【図１０】ＤＮＡ認識を向上させる二重変異体について、ＤＮＡ切断活性の経時変化を示した図である。
【図１１】Ｅ５２Ｒ／Ｓ８４３Ｎ変異を導入したＣａｓ９タンパク質による、各種ＰＡＭ配列を有する標的ＤＮＡの切断活性を示すグラフである。
【図１２】Ｋ９５９Ａ、Ｋ９９２Ａ、Ｋ９５９Ａ／Ｋ９９２Ａ、及びＴ１０２５Ａ変異型ＢｌＣａｓ９について、反応開始後（Ａ）５分、（Ｂ）１５分、（Ｃ）３０分のそれぞれの時点での、各種ＰＡＭ配列を有する標的ＤＮＡの切断活性を示す電気泳動写真である。
【図１３】図１２のＴ１０２５Ａ変異型ＢｌＣａｓ９の結果を定量化したグラフである。
【図１４】ガイドＲＮＡ認識を向上させる各種変異を導入したＣａｓ９タンパク質によるＤＮＡ切断活性を示したグラフである。
【図１５】ガイドＲＮＡ認識を向上させる各種変異を導入したＣａｓ９タンパク質によるＤＮＡ切断活性を示したグラフである。
【図１６Ａ】野生型ＢｌＣａｓ９タンパク質について、ＰＡＭ配列の５番目の塩基の違いによるＤＮＡ切断活性の違いを示したグラフである。
【図１６Ｂ】Ｄ１０２２Ｎ変異型ＢｌＣａｓ９タンパク質について、ＰＡＭ配列の５番目の塩基の違いによるＤＮＡ切断活性の違いを示したグラフである。
【図１６Ｃ】Ｓ５５Ｋ／Ｅ９０４Ｒ／Ｄ１０２２Ｎ（ＫＲＮ変異）変異型ＢｌＣａｓ９タンパク質について、ＰＡＭ配列の５番目の塩基の違いによるＤＮＡ切断活性の違いを示したグラフである。
【図１６Ｄ】Ｓ５５Ｋ／Ｅ９０４Ｒ／Ｄ１０２２Ｎ／Ｔ１０２５Ａ（ＫＲＮＡ変異）変異型ＢｌＣａｓ９タンパク質について、ＰＡＭ配列の５番目の塩基の違いによるＤＮＡ切断活性の違いを示したグラフである。
【図１７Ａ】野生型ＢｌＣａｓ９タンパク質について、ＰＡＭ配列の７番目及び８番目の塩基の違いによるＤＮＡ切断活性の違いを示したグラフである。
【図１７Ｂ】Ｔ１０２５Ａ変異型ＢｌＣａｓ９タンパク質について、ＰＡＭ配列の７番目及び８番目の塩基の違いによるＤＮＡ切断活性の違いを示したグラフである。
【図１７Ｃ】Ｓ５５Ｋ／Ｅ９０４Ｒ／Ｔ１０２５Ａ（ＫＲＡ変異）変異型ＢｌＣａｓ９タンパク質について、ＰＡＭ配列の７番目及び８番目の塩基の違いによるＤＮＡ切断活性の違いを示したグラフである。
【図１７Ｄ】Ｓ５５Ｋ／Ｅ９０４Ｒ／Ｄ１０２２Ｎ／Ｔ１０２５Ａ（ＫＲＮＡ変異）変異型ＢｌＣａｓ９タンパク質について、ＰＡＭ配列の７番目及び８番目の塩基の違いによるＤＮＡ切断活性の違いを示したグラフである。
【図１８】野生型ＢｌＣａｓ９タンパク質及びＤ１０２２Ｎ変異型ＢｌＣａｓ９タンパク質の哺乳動物細胞におけるゲノム編集活性（１塩基置換、挿入又は欠失）を示したグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００３５】
以下、必要に応じて図面を参照しながら、本発明の実施形態について詳細に説明する。なお、図面中、同一又は相当部分には同一符号を付し、重複する説明は省略する。
【００３６】
＜ＰＡＭ配列における５番目の塩基の認識が改変されたＣａｓ９タンパク質＞
一実施形態において、本発明は、以下の（ａ）〜（ｆ）のいずれか一つのアミノ酸配列を含む配列からなり、且つ、標的特異的ガイドＲＮＡと複合体を形成することができることを特徴とするタンパク質を提供する。
（ａ）配列番号１で表されるアミノ酸配列、
（ｂ）配列番号１で表されるアミノ酸配列のアミノ酸番号１００位以外の部位において、１〜数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換若しくは付加されたアミノ酸配列、
（ｃ）配列番号１で表されるアミノ酸配列のアミノ酸番号１００位以外の部位において、８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列、
（ｄ）配列番号２で表されるアミノ酸配列、
（ｅ）配列番号２で表されるアミノ酸配列のアミノ酸番号１０２２位以外の部位において、１〜数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換若しくは付加されたアミノ酸配列、
（ｆ）配列番号２で表されるアミノ酸配列のアミノ酸番号１０２２位以外の部位において、８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列
【００３７】
本実施形態によれば、標的二本鎖ポリヌクレオチドへの結合力を保ちながら、ＰＡＭ配列における５番目の塩基の認識が改変されたＣａｓ９タンパク質を得ることができる。
【００３８】
本明細書において、「ポリペプチド」、「ペプチド」、及び「タンパク質」とは、アミノ酸残基のポリマーを意味し、互換的に使用される。また、１つ若しくは複数のアミノ酸が、天然に存在する対応アミノ酸の化学的類似体、又は修飾誘導体である、アミノ酸ポリマーを意味する。本明細書においては、ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ  Ｊｏｉｎｔ  Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎ  ｏｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ（ＪＣＢＮ）に従い定義されるようなアミノ酸の一文字表記及び三文字表記を使用する。
【００３９】
本明細書において、アミノ酸配列における置換変異を表す場合、元のアミノ酸の一文字表記、続いて１〜４桁の数字による位置番号、次に置換されたアミノ酸の一文字表記により表現することがある。例えば、アミノ酸番号１０２２位においてアスパラギン酸（Ｄ）がアスパラギン（Ｎ）に置換される変異が生じている場合、「Ｄ１０２２Ｎ」と表され、これは、「アミノ酸番号１０２２位のＡｓｐのＡｓｎへの置換」と同義である。
【００４０】
本発明者らは、ＰＡＭ配列の認識が広範化されたＣａｓ９タンパク質を得るために、Ｃａｓ９のオルソログを調べ、Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌａｔｅｒｏｓｐｏｒｕｓ（Ｂ．ｌａｔｅｒｏｓｐｏｒｕｓ）由来のＣａｓ９タンパク質（ＢｌＣａｓ９タンパク質）に着目した。
【００４１】
本明細書において、「オルソログ」とは、共通の祖先遺伝子から種分岐に伴って派生した遺伝子間の対応関係、又はそのような対応関係にある遺伝子群を意味する。
【００４２】
野生型ＢｌＣａｓ９タンパク質は、１０９２個のアミノ酸残基からなるｔｙｐｅＩＩ  Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼである。野生型ＢｌＣａｓ９タンパク質の全長アミノ酸配列を、配列番号５に示す。
【００４３】
図１（Ａ）は、ＢｌＣａｓ９タンパク質が認識することができるＰＡＭ配列を示した図である。ＢｌＣａｓ９タンパク質は「５’−ＮＮＮＮＣＮＤＤ−３’」という８つの塩基をＰＡＭ配列として認識する。図１（Ｂ）は、ＢｌＣａｓ９タンパク質と複合体と形成することができるガイドＲＮＡの配列及び二次構造の一例を示した図である（Ｋａｒｖｅｌｉｓ  ｅｔ  ａｌ．  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，２０１５）。
【００４４】
なお、本明細書において、塩基配列を表す場合、「Ａ」はアデニン、「Ｇ」はグアニン、「Ｃ」はシトシン、「Ｔ」はチミンをそれぞれ意味し、「Ｄ」は、アデニン、グアニン、及びチミンからなる群から選択された任意の１塩基を意味し、「Ｎ」は、アデニン、シトシン、チミン、及びグアニンからなる群から選択された任意の１塩基を意味する。
【００４５】
続いて、本発明者らは、ＢｌＣａｓ９タンパク質、ガイドＲＮＡ及び標的二本鎖ポリヌクレオチドの三者複合体について、結晶構造解析を行い、ＰＡＭ配列認識部位の構造を得た。図２は、ＢｌＣａｓ９タンパク質、ガイドＲＮＡ及び標的二本鎖ポリヌクレオチドの三者複合体の結晶構造解析の結果を示した図である。ＰＡＭ配列として「５’−ＮＮＮＮＣＮＤＤ−３’」を含み、ガイドＲＮＡと非相補的な塩基配列を含む鎖を有する標的二本鎖ポリヌクレオチドを用いた。図３は、野生型ＢｌＣａｓ９タンパク質のＰＡＭ配列認識部位においてＰＡＭ配列の５番目の塩基を認識する機構を示した図である。ＰＡＭ配列認識部位において、ＢｌＣａｓ９タンパク質中の１０２２番目のアスパラギン酸（Ａｓｐ１０２２）及び１０４０番目のリシン（Ｌｙｓ１０４０）が、ＰＡＭ配列中の５番目のシトシン（Ｃ）及び該シトシン（Ｃ）と塩基対を形成しているグリシン（Ｇ）と、それぞれ水素結合を形成していることが明らかとなった。
【００４６】
そこで、上述した野生型ＢｌＣａｓ９タンパク質中のＰＡＭ配列認識部位の改変を試み、標的二本鎖ポリヌクレオチドへの結合力を保ちながら、ＰＡＭ配列の認識が広範化されたＣａｓ９タンパク質を発明するに至った。
【００４７】
ＰＡＭ配列における５番目の塩基の認識が改変された本実施形態のＢｌＣａｓ９タンパク質は、具体的には、以下の（ａ）又は（ｄ）のアミノ酸配列を含む配列からなることを特徴とするタンパク質である。
（ａ）配列番号１で表されるアミノ酸配列
（ｄ）配列番号２で表されるアミノ酸配列
【００４８】
配列番号１は、ＢｌＣａｓ９タンパク質中のＰＡＭ配列認識部位であるＰＩドメイン（ＰＩ：ＰＡＭ−ｉｎｔｅｒａｃｔｉｎｇ）の配列（９２３番目のＳｅｒから１０９２番目のＡｒｇまでの１７０残基）であって、ＰＡＭ配列の５番目の塩基の認識を改変する点変異、具体的には、アミノ酸番号１００位のＡｓｐ（Ｄ）の、Ａｓｎ（Ｎ）、Ｇｌｎ（Ｑ）、又はＨｉｓ（Ｈ）への置換を少なくとも含む配列である。また、配列番号１は、前記置換に加えて、任意選択で１１８位のＬｙｓ（Ｋ）の、Ｇｌｕ（Ｅ）又はＡｓｐ（Ｄ）への置換も含む。
【００４９】
配列番号２は、ＢｌＣａｓ９タンパク質の全長アミノ酸配列であって、ＰＡＭ配列の５番目の塩基の認識を改変する点変異、具体的には、アミノ酸番号１０２２位のＡｓｐ（Ｄ）の、Ａｓｎ（Ｎ）、Ｇｌｎ（Ｑ）、又はＨｉｓ（Ｈ）への置換を少なくとも含む配列である。また、配列番号２は、前記置換に加えて、任意選択で１０４０位のＬｙｓ（Ｋ）の、Ｇｌｕ（Ｅ）又はＡｓｐ（Ｄ）への置換も含む。
【００５０】
理論に拘束されるものではないが、野生型ＢｌＣａｓ９のアミノ酸番号１０２２位（配列番号１の１００位に相当）のＡｓｐ（Ｄ）を、ヌクレオチドと水素結合を形成することができる側鎖を有するアミノ酸に改変することで、二本鎖ポリヌクレオチド内のＰＡＭ配列における５番目の塩基と直接水素結合するため、結合力を強めることができ、それにより認識できる塩基の種類を改変することができると考えられる。「ヌクレオチドと水素結合を形成することができる側鎖を有するアミノ酸」としては、例えば、Ａｓｎ（Ｎ）、Ｇｌｎ（Ｑ）、及びＨｉｓ（Ｈ）が挙げられ、この中で、Ａｓｎ（Ｎ）が好ましい。また、上記１０２２位における変異に加えて、ＰＡＭ配列中の５番目のＣと塩基対を形成しているＧを認識する１０４０位（配列番号１の１１８位に相当）のＬｙｓ（Ｋ）をＧｌｕ（Ｅ）又はＡｓｐ（Ｄ）、好ましくはＧｌｕ（Ｅ）に置換することによって、認識されるＰＡＭ配列の５番目の塩基が「Ｇ」特異的になる。
【００５１】
したがって、野生型ＢｌＣａｓ９タンパク質が、ＰＡＭ配列における５番目の塩基が「Ｃ」である配列を認識するのに対して、１０２２位における上記置換を有する本実施形態のＢｌＣａｓ９タンパク質は、ＰＡＭ配列における５番目の塩基が「Ｄ」である配列（「５’−ＮＮＮＮＤＮＤＤ−３’」）を認識する。また、１０２２位及び１０４０位における上記置換の組合せを有する本実施形態のＢｌＣａｓ９タンパク質は、ＰＡＭ配列における５番目の塩基が「Ｇ」である配列（「５’−ＮＮＮＮＧＮＤＤ−３’」）を認識する。
【００５２】
また、本実施形態のＢｌＣａｓ９タンパク質は、前記（ａ）又は（ｄ）の置換を含むアミノ酸配列を含む配列からなるタンパク質と機能的に同等なタンパク質として、以下の（ｂ）若しくは（ｃ）、又は（ｅ）若しくは（ｆ）のアミノ酸配列を含む配列からなるタンパク質を包含する。
（ｂ）配列番号１で表されるアミノ酸配列のアミノ酸番号１００位以外の部位において、１〜数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換若しくは付加されたアミノ酸配列、
（ｃ）配列番号１で表されるアミノ酸配列のアミノ酸番号１００位以外の部位において、８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列、
（ｅ）配列番号２で表されるアミノ酸配列のアミノ酸番号１０２２位以外の部位において、１〜数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換若しくは付加されたアミノ酸配列、
（ｆ）配列番号２で表されるアミノ酸配列のアミノ酸番号１０２２位以外の部位において、８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列
【００５３】
本明細書において、「機能的に同等なタンパク質」とは、野生型Ｃａｓ９タンパク質に備わっている機能のうち、Ｃａｓ９タンパク質が用いられる用途において必要とされる機能を維持している、改変されたＣａｓ９タンパク質を意味し、「必要とされる機能」は、用途によって異なり得る。一実施形態において、改変されたＢｌＣａｓ９タンパク質は、ＲＮＡ誘導性ＤＮＡエンドヌクレアーゼ活性を維持している。別の実施形態において、改変されたＢｌＣａｓ９タンパク質は、少なくとも標的特異的ガイドＲＮＡと複合体を形成する機能を維持している。
【００５４】
本明細書において、アミノ酸配列又は塩基配列の「欠失、挿入、置換又は付加」は、野生型のアミノ酸配列又は塩基配列と比較しての欠失、挿入、置換又は付加を指す。本実施形態のＢｌＣａｓ９タンパク質のアミノ酸配列は、配列番号１で表されるアミノ酸配列のアミノ酸番号１００位以外の位置又は配列番号２で表されるアミノ酸配列のアミノ酸番号１０２２位以外の位置において、例えば、１〜２５０個、１〜２００個、１〜１５０個、１〜１００個、好ましくは、１〜５０個、１〜４０個、１〜３０個、より好ましくは１〜１５個、さらにより好ましくは１〜１０個、特に好ましくは１〜５個のアミノ酸の欠失、挿入、置換、又は付加を含む。一実施形態において、改変されたＢｌＣａｓ９タンパク質のアミノ酸配列は、アミノ酸番号１０２２位以外の位置において、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、又は１０個のアミノ酸の欠失、挿入、置換、又は付加を含む。
【００５５】
より具体的には、本実施形態のＢｌＣａｓ９タンパク質のアミノ酸配列は、上記の置換に加えて、以下に説明する（１）〜（３）の置換を少なくとも一つ含んでいてもよい。一実施形態において、好ましくは、本実施形態のＢｌＣａｓ９タンパク質のアミノ酸配列は、（１）及び／又は（２）の置換を少なくとも一つ含む。別の実施形態において、改変されたＢｌＣａｓ９タンパク質のアミノ酸配列は、（１）〜（３）の置換を全て含む。本実施形態の変異を含み、さらに（１）〜（３）の置換を少なくとも一つ含む本発明の全長ＢｌＣａｓ９タンパク質のアミノ酸配列の一例を、配列番号６に示す。
【００５６】
本実施形態のＢｌＣａｓ９タンパク質のＰＡＭ配列認識アミノ酸配列が、配列番号１のアミノ酸番号１００位以外の位置において１個又は複数個のアミノ酸の欠失、挿入、置換、又は付加を含む場合、前記アミノ酸配列は、配列番号１の１００位以外の部位において、配列番号１のアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有する。また、本実施形態のＢｌＣａｓ９タンパク質のアミノ酸配列が、配列番号２のアミノ酸番号１０２２位以外の位置において１個又は複数個のアミノ酸の欠失、挿入、置換、又は付加を含む場合、前記アミノ酸配列は、配列番号２の１０２２位以外の部位において、配列番号２のアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有する。本明細書において、「同一性」とは、当技術分野で公知であるように、２以上のアミノ酸配列間又は２以上のポリヌクレオチド配列間の配列を比較することによって決定される関係を意味し、公知のコンピュータープログラムを用いて決定することができる。一実施形態において、本発明の改変されたＢｌＣａｓ９タンパク質のアミノ酸配列は、配列番号１の１００位以外の部位において、配列番号１のアミノ酸配列と、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、更により好ましくは９５％以上、例えば９６％以上、９７％以上、又は９８％以上、最も好ましくは９９％以上の同一性を有する。別の実施形態において、本発明の改変されたＢｌＣａｓ９タンパク質のアミノ酸配列は、配列番号２の１０２２位以外の部位において、配列番号２のアミノ酸配列と、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、更により好ましくは９５％以上、例えば９６％以上、９７％以上、又は９８％以上、最も好ましくは９９％以上の同一性を有する。
【００５７】
一実施形態において、本発明のＢｌＣａｓ９タンパク質は、（ａ）〜（ｆ）のいずれか一つのアミノ酸配列に加えて他のアミノ酸配列を含む配列からなるタンパク質であってもよい。別の実施形態において、本発明のＢｌＣａｓ９タンパク質は、（ｄ）〜（ｆ）のいずれか一つのアミノ酸配列のみからなるタンパク質である。
【００５８】
＜ＤＮＡ配列の認識活性が向上されたＣａｓ９タンパク質／ＰＡＭ配列における７番目及び/又は８番目の塩基の認識が改変されたＣａｓ９タンパク質＞
一実施形態において、本発明は、以下の（ｇ）〜（ｉ）のいずれか一つのアミノ酸配列を含む配列からなり、且つ、標的特異的ガイドＲＮＡと複合体を形成することができることを特徴とするタンパク質を提供する。
（ｇ）配列番号１３で表されるアミノ酸配列、
（ｈ）配列番号１３で表されるアミノ酸配列のアミノ酸番号１０２５位以外の部位において、１〜数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換若しくは付加されたアミノ酸配列、
（ｉ）配列番号１３で表されるアミノ酸配列のアミノ酸番号１０２５位以外の部位において、８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列
【００５９】
ＰＡＭ配列の７番目及び８番目の塩基の認識が改変された本実施形態のＢｌＣａｓ９タンパク質は、具体的には、以下の（ｇ）のアミノ酸配列を含む配列からなることを特徴とするタンパク質である。
（ｇ）配列番号１３で表されるアミノ酸配列
【００６０】
配列番号１３は、ＰＡＭ配列の７番目及び８番目の塩基の認識が野生型ＢｌＣａｓ９と比較して緩和されたＢｌＣａｓ９タンパク質の全長アミノ酸配列であって、具体的には、アミノ酸番号１０２５位のＴｈｒ（Ｔ）のＡｌａ（Ａ）への置換を少なくとも含む配列である。
【００６１】
また、本実施形態のＢｌＣａｓ９タンパク質は、前記（ｇ）の置換を含むアミノ酸配列を含む配列からなるタンパク質と機能的に同等なタンパク質として、以下の（ｈ）又は（ｉ）のアミノ酸配列を含む配列からなるタンパク質を包含する。
（ｈ）配列番号１３で表されるアミノ酸配列のアミノ酸番号１０２５位以外の部位において、１〜数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換若しくは付加されたアミノ酸配列、
（ｉ）配列番号１３で表されるアミノ酸配列のアミノ酸番号１０２５位以外の部位において、８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列
【００６２】
本実施形態のＢｌＣａｓ９タンパク質のアミノ酸配列は、配列番号１３で表されるアミノ酸配列のアミノ酸番号１０２５位以外の位置において、例えば、１〜２５０個、１〜２００個、１〜１５０個、１〜１００個、好ましくは、１〜５０個、１〜４０個、１〜３０個、より好ましくは１〜１５個、さらにより好ましくは１〜１０個、特に好ましくは１〜５個のアミノ酸の欠失、挿入、置換、又は付加を含む。一実施形態において、改変されたＢｌＣａｓ９タンパク質のアミノ酸配列は、アミノ酸番号１０２５位以外の位置において、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、又は１０個のアミノ酸の欠失、挿入、置換、又は付加を含む。
【００６３】
本実施形態のＢｌＣａｓ９タンパク質のＰＡＭ配列認識アミノ酸配列が、配列番号１３のアミノ酸番号１０２５位以外の位置において１個又は複数個のアミノ酸の欠失、挿入、置換、又は付加を含む場合、前記アミノ酸配列は、配列番号１３の１０２５位以外の部位において、配列番号１３のアミノ酸配列と８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、更により好ましくは９５％以上、例えば９６％以上、９７％以上、又は９８％以上、最も好ましくは９９％以上の同一性を有する。
【００６４】
一実施形態において、本発明のＢｌＣａｓ９タンパク質は、（ｇ）〜（ｉ）のいずれか一つのアミノ酸配列に加えて他のアミノ酸配列を含む配列からなるタンパク質であってもよい。別の実施形態において、本発明のＢｌＣａｓ９タンパク質は、（ｇ）〜（ｉ）のいずれか一つのアミノ酸配列のみからなるタンパク質である。
【００６５】
また、一実施形態において、本発明は、ＢｌＣａｓ９タンパク質の全長アミノ酸配列において、以下の（１）の置換を少なくとも一つ含むことを特徴とする、タンパク質を提供する。
（１）アミノ酸番号５２位のＧｌｕの、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、又はＨｉｓへの置換、５５位のＳｅｒの、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、又はＨｉｓへの置換、８４３位のＳｅｒの、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、又はＴｙｒへの置換、９９７位のＬｙｓの、Ａｒｇ又はＨｉｓへの置換、１０４０位のＬｙｓの、Ａｒｇ又はＨｉｓへの置換、９５９位のＬｙｓのＡｌａへの置換、９９２位のＬｙｓのＡｌａへの置換、及び９０４位のＧｌｕの、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、又はＨｉｓへの置換
【００６６】
ＢｌＣａｓ９タンパク質の全長アミノ酸配列において、１０２５位が置換された上記実施形態、及び（１）の置換を少なくとも一つ含む上記実施形態（以下、単に「本実施形態」とする）によれば、野生型ＢｌＣａｓ９と比較してＤＮＡ配列の認識活性が向上されたＣａｓ９タンパク質を得ることができる。
【００６７】
また、本実施形態のＢｌＣａｓ９タンパク質は、ＤＮＡ配列の認識活性が向上された結果、ＰＡＭ配列における７番目及び８番目の塩基の嗜好性が緩和されている。具体的には、本実施形態のＢｌＣａｓ９タンパク質は、少なくとも７番目又は８番目のいずれかの塩基が「Ｎ」であり、好ましくは、７番目及び８番目の塩基がともに「Ｎ」であるＰＡＭ配列を認識する。
【００６８】
Ｃａｓ９タンパク質のＤＮＡ配列の認識活性には様々な要因が関与している。例えば、Ｃａｓ９タンパク質には、ＢＨ（ブリッジヘリックス）と呼ばれるアルギニン残基に富むαヘリックスが存在しているが、このＢＨ中の複数のアルギニン残基が、ガイドＲＮＡの「シード領域」と呼ばれるＰＡＭ配列の近傍１０〜１２塩基対のリン酸骨格を認識しており、Ｃａｓ９の機能に重要な役割を果たしていることが知られている。したがって、理論に拘束されるものではないが、ＢＨドメイン中に存在するＢｌＣａｓ９の５２位、５５位等におけるアミノ酸残基を、核酸と結合しやすいＬｙｓ（Ｋ）、Ａｒｇ（Ｒ）、Ｈｉｓ（Ｈ）等の塩基性アミノ酸に置換することにより、Ｃａｓ９タンパク質のＤＮＡ配列認識活性を向上させることができると考えられる。また、上述のとおり、ＰＩドメインはＰＡＭ配列の認識に関わる部位であるため、このＰＩドメイン内やその近傍に位置する８４３位、９９７位、１０４０位等のアミノ酸を、核酸と結合しやすいＬｙｓ（Ｋ）、Ａｒｇ（Ｒ）、Ｈｉｓ（Ｈ）等の塩基性アミノ酸、又は任意の核酸中のリン酸基と水素結合し得る、Ａｓｎ（Ｎ）、Ｇｌｕ（Ｅ）、Ｔｙｒ（Ｙ）等のアミノ酸に改変することで、ＤＮＡのリン酸骨格との結合を強めることができると考えられる。
【００６９】
また、理論に拘束されるものではないが、野生型ＢｌＣａｓ９のアミノ酸番号９０４位のＧｌｕ（Ｅ）を、二本鎖ＤＮＡの標的鎖（ｔａｒｇｅｔ  ｓｔｒａｎｄ）のリン酸骨格と相互作用することができるアミノ酸に改変することで、核酸の認識活性を向上させることができると考えられる。「ＤＮＡのリン酸骨格と相互作用することができるアミノ酸」としては、例えば、Ａｒｇ（Ｒ）、Ｌｙｓ（Ｋ）、及びＨｉｓ（Ｈ）が挙げられ、この中で、Ａｒｇ（Ｒ）が好ましい。
【００７０】
本実施形態のＢｌＣａｓ９タンパク質は、好ましくは以下の置換又は置換の組合せを含む。
・Ｅ５２Ｒ
・Ｅ５２Ｋ
・Ｓ５５Ｋ
・Ｓ８４４Ｎ
・Ｋ９９７Ｒ
・Ｅ５２Ｒ及びＳ８４３Ｎ
・Ｅ５２Ｒ及びＫ９９７Ｒ
・Ｅ５２Ｒ及びＫ１０４０Ｒ
・Ｅ５２Ｋ及びＳ８４４Ｎ
・Ｅ５２Ｋ及びＫ９９７Ｒ
・Ｅ５２Ｋ及びＫ１０４０Ｒ
・Ｓ５５Ｋ及びＫ９９７Ｒ
・Ｓ５５Ｋ及びＫ１０４０Ｒ
・Ｓ５５Ｋ、Ｅ５２Ｒ、及びＫ９９７Ｒ
・Ｓ５５Ｋ、Ｅ５２Ｋ、及びＫ９９７Ｒ
・Ｅ５２Ｒ、Ｓ８４３Ｎ、及びＫ９９７Ｒ
・Ｅ５２Ｋ、Ｓ８４３Ｎ、及びＫ９９７Ｒ
【００７１】
上記の中でも、三重変異、特にＥ５２Ｒ、Ｓ８４３Ｎ、及びＫ９９７Ｒの置換の組合せが好ましい。
【００７２】
上記の変異を有する本実施形態のＢｌＣａｓ９タンパク質は、ＰＡＭ配列の８番目の塩基の認識の嗜好性が「Ｄ」（Ａ、Ｇ、又はＴ）から「Ｎ」（Ａ、Ｃ、Ｇ、又はＴ）に緩和される。
【００７３】
上記の変異に代えて、またはこれに加えて、本実施形態のＢｌＣａｓ９タンパク質は、好ましくは以下の置換又は置換の組合せを含む。
・Ｋ９５９Ａ
・Ｋ９９２Ａ
・Ｋ９５９Ａ／Ｋ９９２Ａ
・Ｔ１０２５Ａ
【００７４】
上記の中でも、特にＴ１０２５Ａの置換が好ましい。
【００７５】
上記の変異を有する本実施形態のＢｌＣａｓ９タンパク質は、ＰＡＭ配列の７番目及び８番目の塩基の認識の嗜好性が「ＤＤ」（Ａ、Ｇ、又はＴ）から「ＮＮ」（Ａ、Ｃ、Ｇ、又はＴ）に緩和される。
【００７６】
上記の変異に代えて、またはこれに加えて、本実施形態のＢｌＣａｓ９タンパク質は、好ましくは以下の置換又は置換の組合せを含む。
・Ｅ９０４Ｒ
・Ｓ５５Ｋ／Ｅ９０４Ｒ
【００７７】
したがって、１０２５位の置換及び／又は（１）の置換を少なくとも一つ含む本実施形態のＢｌＣａｓ９タンパク質は、「５’−ＮＮＮＮＣＮＮＤ−３’」、「５’−ＮＮＮＮＣＮＤＮ−３’」、又は「５’−ＮＮＮＮＣＮＮＮ−３’」というＰＡＭ配列を認識することができる。また、１０２５位の置換及び／又は（１）の置換の少なくとも一つを上記配列番号１又は２で表されるアミノ酸配列に導入することにより、改変されたＣａｓ９タンパク質は、「５’−ＮＮＮＮＤＮＮＤ−３’」、「５’−ＮＮＮＮＤＮＤＮ−３’」、若しくは「５’−ＮＮＮＮＤＮＮＮ−３’」、又は「５’−ＮＮＮＮＧＮＮＤ−３’」、「５’−ＮＮＮＮＧＮＤＮ−３’」、若しくは「５’−ＮＮＮＮＧＮＮＮ−３’」というＰＡＭ配列を認識することができる。ＰＡＭ配列の認識が広範化されたこれらのＣａｓ９タンパク質を単独で又は組み合せて用いることにより、理論的には全ての配列について、ＰＡＭ配列の制限を受けることなく、自由にガイドＲＮＡを設計することが可能となる。
【００７８】
＜ガイドＲＮＡの認識活性が向上されたＣａｓ９タンパク質＞
一実施形態において、本発明は、ＢｌＣａｓ９タンパク質の全長アミノ酸配列において、以下の（２）の置換を少なくとも一つ含むことを特徴とする、タンパク質を提供する。
（２）アミノ酸番号７２位のＨｉｓの、Ｌｙｓ若しくはＡｒｇへの置換、９３位のＧｌｎの、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、又はＨｉｓへの置換、９５位のＧｌｕの、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、又はＨｉｓへの置換、１７５位のＨｉｓの、Ｌｙｓ、又はＡｒｇへの置換、８１１位のＴｈｒの、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、又はＨｉｓへの置換、１０７５位のＳｅｒの、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、又はＨｉｓへの置換、及び１０７６位のＡｓｐの、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、又はＨｉｓへの置換
【００７９】
本実施形態によれば、野生型Ｃａｓ９と比較してガイドＲＮＡの認識活性が向上されたＣａｓ９タンパク質を得ることができる。
【００８０】
理論に拘束されるものではないが、全長ＢｌＣａｓ９の９３位、９５位、１７５位、８１１位、１０７５位、及び／又は１０７６位のアミノ酸を、核酸と結合しやすい塩基性アミノ酸に置換することで、Ｃａｓ９タンパク質が標的ＤＮＡの二重らせん構造をほどく活性が向上すると考えられる。塩基性アミノ酸としては、例えば、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓが挙げられる。特に以下から選択される少なくとも一つの置換が好ましい：Ｈ７２Ｋ、Ｑ９３Ｋ、Ｅ９５Ｋ、Ｈ１７５Ｋ、Ｔ８１１Ｋ、Ｓ１０７５Ｋ、及びＤ１０７６Ｋ。
【００８１】
一実施形態において、本発明は、以下の（ｊ）〜（ｌ）のいずれか一つのアミノ酸配列を含む配列からなり、且つ、標的特異的ガイドＲＮＡと複合体を形成することができることを特徴とするタンパク質を提供する。
（ｊ）配列番号５で表されるアミノ酸配列において、以下の（１）及び／又は（２）の置換を少なくとも一つ含むアミノ酸配列
（１）アミノ酸番号５２位のＧｌｕの、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、又はＨｉｓへの置換、５５位のＳｅｒの、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、又はＨｉｓへの置換、８４３位のＳｅｒの、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、又はＴｙｒへの置換、９９７位のＬｙｓの、Ａｒｇ又はＨｉｓへの置換、１０４０位のＬｙｓの、Ａｒｇ又はＨｉｓへの置換、９５９位のＬｙｓのＡｌａへの置換、９９２位のＬｙｓのＡｌａへの置換、及び９０４位のＧｌｕの、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、又はＨｉｓへの置換から選択される少なくとも一つの置換、
（２）アミノ酸番号７２位のＨｉｓの、Ｌｙｓ若しくはＡｒｇへの置換、９３位のＧｌｎの、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、又はＨｉｓへの置換、９５位のＧｌｕの、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、又はＨｉｓへの置換、１７５位のＨｉｓの、Ｌｙｓ、又はＡｒｇへの置換、８１１位のＴｈｒの、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、又はＨｉｓへの置換、１０７５位のＳｅｒの、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、又はＨｉｓへの置換、及び１０７６位のＡｓｐの、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、又はＨｉｓへの置換から選択される少なくとも一つの置換、
（ｋ）（ｊ）のアミノ酸配列の、前記（１）及び（２）に規定するアミノ酸番号以外の部位において、１〜数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換若しくは付加されたアミノ酸配列、
（ｌ）（ｊ）のアミノ酸配列の、前記（１）及び（２）に規定するアミノ酸番号以外の部位において、８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列
【００８２】
さらに、本発明のＢｌＣａｓ９タンパク質は、上述の全ての変異の任意の組合せを含むことができる。
【００８３】
したがって、一実施形態において、本発明は、以下の（ｍ）〜（ｏ）のいずれか一つのアミノ酸配列を含む配列からなり、且つ、標的特異的ガイドＲＮＡと複合体を形成することができることを特徴とするタンパク質を提供する。
（ｍ）配列番号５で表されるアミノ酸配列において、以下の置換を少なくとも一つ含むアミノ酸配列
・アミノ酸番号１０２２位のＡｓｐの、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、又はＨｉｓへの置換、
・アミノ酸番号１０２５位のＴｈｒのＡｌａへの置換、
・アミノ酸番号５２位のＧｌｕの、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、又はＨｉｓへの置換、５５位のＳｅｒの、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、又はＨｉｓへの置換、８４３位のＳｅｒの、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、又はＴｙｒへの置換、９９７位のＬｙｓの、Ａｒｇ又はＨｉｓへの置換、１０４０位のＬｙｓの、Ａｒｇ又はＨｉｓへの置換、９５９位のＬｙｓのＡｌａへの置換、９９２位のＬｙｓのＡｌａへの置換、及び９０４位のＧｌｕの、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、又はＨｉｓへの置換から選択される少なくとも一つの置換、
・アミノ酸番号７２位のＨｉｓの、Ｌｙｓ若しくはＡｒｇへの置換、９３位のＧｌｎの、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、又はＨｉｓへの置換、９５位のＧｌｕの、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、又はＨｉｓへの置換、１７５位のＨｉｓの、Ｌｙｓ、又はＡｒｇへの置換、８１１位のＴｈｒの、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、又はＨｉｓへの置換、１０７５位のＳｅｒの、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、又はＨｉｓへの置換、及び１０７６位のＡｓｐの、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、又はＨｉｓへの置換から選択される少なくとも一つの置換、
（ｎ）（ｍ）のアミノ酸配列の、（ｍ）に規定するアミノ酸番号以外の部位において、１〜数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換若しくは付加されたアミノ酸配列、
（ｏ）（ｍ）のアミノ酸配列の、（ｍ）に規定するアミノ酸番号以外の部位において、８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列
【００８４】
本実施形態のＢｌＣａｓ９タンパク質の具体例としては、例えば以下の置換の組合せを含むタンパク質が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００８５】
ＢｌＣａｓ９タンパク質の全長アミノ酸配列における１０２２位のＡｓｐ（Ｄ）の、Ａｓｎ（Ｎ）、Ｇｌｎ（Ｑ）、又はＨｉｓ（Ｈ）への置換、好ましくはＡｓｎ（Ｎ）への置換と、５５位のＳｅｒ（Ｓ）のＬｙｓ（Ｋ）への置換と、９０４位のＧｌｕ（Ｅ）の、Ａｒｇ（Ｒ）、Ｌｙｓ（Ｋ）、又はＨｉｓ（Ｈ）への置換、好ましくはＡｒｇ（Ｒ）への置換。この置換の組合せにより、１０２２位における置換を単独で有する変異型ＢｌＣａｓ９と比較して、ＰＡＭ配列の認識活性がさらに向上した変異型ＢｌＣａｓ９を得ることができる。
【００８６】
ＢｌＣａｓ９タンパク質の全長アミノ酸配列における１０２５位のＴｈｒ（Ｔ）のＡｌａ（Ａ）への置換と、５５位のＳｅｒ（Ｓ）のＬｙｓ（Ｋ）への置換と、９０４位のＧｌｕ（Ｅ）の、Ａｒｇ（Ｒ）、Ｌｙｓ（Ｋ）、又はＨｉｓ（Ｈ）への置換、好ましくはＡｒｇ（Ｒ）への置換。この置換の組合せにより、１０２５位における置換を単独で有する変異型ＢｌＣａｓ９と比較して、ＰＡＭ配列の認識活性がさらに向上した変異型ＢｌＣａｓ９を得ることができる。
【００８７】
ＢｌＣａｓ９タンパク質の全長アミノ酸配列における１０２２位のＡｓｐ（Ｄ）の、Ａｓｎ（Ｎ）、Ｇｌｎ（Ｑ）、又はＨｉｓ（Ｈ）への置換、好ましくはＡｓｎ（Ｎ）への置換と、１０２５位のＴｈｒ（Ｔ）のＡｌａ（Ａ）への置換と、５５位のＳｅｒ（Ｓ）のＬｙｓ（Ｋ）への置換と、９０４位のＧｌｕ（Ｅ）の、Ａｒｇ（Ｒ）、Ｌｙｓ（Ｋ）、又はＨｉｓ（Ｈ）への置換、好ましくはＡｒｇ（Ｒ）への置換とを組み合わせることにより、核酸の認識活性が高く、ＰＡＭ配列の認識の嗜好性が緩和された変異型ＢｌＣａｓ９を得ることができる。
【００８８】
本実施形態のＢｌＣａｓ９タンパク質は、好ましくは以下の置換の組合せを含む。また、これらの置換の組合せを含む変異型ＢｌＣａｓ９のアミノ酸配列を配列番号１５に示す。
・Ｓ５５Ｋ／Ｅ９０４Ｒ／Ｄ１０２２Ｎ：この変異の組合せを含むＣａｓ９タンパク質は、「５’−ＮＮＮＮＤＮＤＤ−３’」というＰＡＭ配列を認識することができる。
・Ｓ５５Ｋ／Ｅ９０４Ｒ／Ｔ１０２５Ａ：この変異の組合せを含むＣａｓ９タンパク質は、「５’−ＮＮＮＮＣＮＮＮ−３’」というＰＡＭ配列を認識することができる。
・Ｓ５５Ｋ／Ｅ９０４Ｒ／Ｄ１０２２Ｎ／Ｔ１０２５Ａ：この変異の組合せを含むＣａｓ９タンパク質は、「５’−ＮＮＮＮＮＮＤＤ−３’」というＰＡＭ配列を認識することができる。
【００８９】
＜Ｃａｓ９タンパク質のＤＮＡ切断活性＞
一実施形態において、本発明の改変されたＢｌＣａｓ９タンパク質は、エンドヌクレアーゼ活性を維持している。本明細書において、「エンドヌクレアーゼ」とは、ヌクレオチド鎖の内部、すなわち末端でない部分を切断する酵素を意味する。したがって、前記実施形態において、本発明の改変されたＢｌＣａｓ９タンパク質は、標的二本鎖ポリヌクレオチドを切断することができる。
【００９０】
別の実施形態において、本発明の改変されたＢｌＣａｓ９タンパク質は、標的二本鎖ポリヌクレオチドの一方又は両方の鎖を切断する能力を欠如している改変体であってもよい。すなわち、前記実施形態において、本発明の改変されたＢｌＣａｓ９タンパク質は、標的二本鎖ポリヌクレオチドを切断しないか、又は二本のうち片方の鎖のみを切断する。
【００９１】
例えば、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ由来のＣａｓ９（ＳｐＣａｓ９）において、ＲｕｖＣ  Ｉ触媒ドメイン中のアミノ酸番号１０位のＡｓｐからＡｌａへの置換（Ｄ１０Ａ）により、Ｃａｓ９が、両方の鎖を切断するヌクレアーゼから一本鎖を切断するニッカーゼに変換されることが知られている。Ｃａｓ９をニッカーゼにする変異の他の例には、ＳｐＣａｓ９のＥ７６２Ａ、Ｈ８４０Ａ、Ｎ８５４Ａ、Ｎ８６３Ａ、及びＤ９８６Ａが含まれるが、これらに限定されない。本実施形態の改変されたＢｌＣａｓ９タンパク質は、ＢｌＣａｓ９における対応する位置において、上記の変異を一つ又は複数含んでいてもよい。
【００９２】
したがって、一実施態様において、改変されたＢｌＣａｓ９タンパク質が、標的二本鎖ポリヌクレオチドの一方又は両方の鎖を切断する能力を欠如している場合、該タンパク質のアミノ酸配列は、以下の変異：
（３）アミノ酸番号８位のＡｓｐのＡｌａへの置換、５０３位のＧｌｕのＡｌａへの置換、５８４位のＨｉｓのＡｌａへの置換、５９８位のＡｓｎのＡｌａへの置換、６０７位のＡｓｎのＡｌａへの置換、及び７２５位のＡｓｐのＡｌａへの置換から選択される少なくとも一つの置換
を含んでいてもよい。
【００９３】
一実施形態において、改変されたＢｌＣａｓ９タンパク質は、ＤＮＡ切断活性を実質的に欠く。本明細書において、改変されたＣａｓ９のＤＮＡの切断活性が「ＤＮＡ切断活性を実質的に欠く」とは、その改変体のＤＮＡ切断活性が、非改変形態に対して約２５％、１０％、５％、１％、０．１％、又は０．０１％未満であることを指す。
【００９４】
用途を制限するものではないが、標的二本鎖ポリヌクレオチドの一方又は両方の鎖を切断する能力を欠如しているＣａｓ９タンパク質は、例えば後述するような、個々の塩基を一塩基単位で高精度に改変するゲノム編集（一塩基編集）や、遺伝子の発現を調節する方法等での使用において、特に有利である。
【００９５】
本発明の改変されたＢｌＣａｓ９タンパク質は、例えば次のような方法により作製することができる。まず、改変されたＢｌＣａｓ９タンパク質をコードする核酸を含むベクターを用いて、宿主を形質転換する。続いて、形質転換された当該宿主を培養して前記Ｃａｓタンパク質を発現させる。培地の組成、培養の温度及び時間、誘導物質の添加等の条件は、形質転換体が生育し、目的のタンパク質が効率よく産生されるよう、公知の方法に従って当業者が決定できる。また、例えば、選択マーカーとして抗生物質抵抗性遺伝子を発現ベクターに組み込んだ場合、培地に抗生物質を加えることにより、形質転換体を選択することができる。続いて、宿主が発現した前記Ｃａｓ９タンパク質を適宜の方法により精製することにより、改変されたＣａｓ９タンパク質が得られる。宿主としては、特に限定されず、動物細胞、植物細胞、昆虫細胞、又は、大腸菌、枯草菌、酵母等の微生物が挙げられる。
【００９６】
＜タンパク質をコードする遺伝子＞
一実施形態において、本発明は、上記［１］〜［９］のいずれか一つに記載のタンパク質をコードする遺伝子を提供する。
【００９７】
また、一実施形態において、本発明は、以下の（ｐ）〜（ｓ）のいずれか一つの塩基配列を含む配列からなり、且つ、標的特異的ガイドＲＮＡと複合体を形成することができるタンパク質をコードすることを特徴とする遺伝子を提供する。
（ｐ）配列番号３又は４で表される塩基配列、
（ｑ）配列番号３又は４で表される塩基配列において、１〜数個の塩基が欠失、挿入、置換又は付加されている塩基配列、
（ｒ）配列番号３又は４で表される塩基配列と同一性が８０％以上である塩基配列、
（ｓ）配列番号３又は４で表される塩基配列からなるＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる塩基配列
【００９８】
配列番号３は、配列番号１のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子の塩基配列である。また、配列番号４は、配列番号２のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子の塩基配列である。
【００９９】
また、別の一実施形態において、本発明は、以下の（ｔ）〜（ｗ）のいずれか一つの塩基配列を含む配列からなり、且つ、標的特異的ガイドＲＮＡと複合体を形成することができるタンパク質をコードすることを特徴とする遺伝子を提供する。
（ｔ）配列番号１４で表される塩基配列、
（ｕ）配列番号１４で表される塩基配列において、１〜数個の塩基が欠失、挿入、置換又は付加されている塩基配列、
（ｖ）配列番号１４で表される塩基配列と同一性が８０％以上である塩基配列、
（ｗ）配列番号１４で表される塩基配列からなるＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる塩基配列
【０１００】
配列番号１４は、配列番号１３のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子の塩基配列である。
【０１０１】
本実施形態の塩基配列は、配列番号３、４、又は１４で表される塩基配列において、例えば、１〜７００個、１〜５００個、１〜３００個、１〜１００個、好ましくは、１〜５０個、１〜４０個、１〜３０個、より好ましくは１〜１５個、さらにより好ましくは１〜１０個、特に好ましくは１〜５個の塩基の欠失、挿入、置換、又は付加を含む。一実施形態において、塩基配列は、配列番号３、４、又は１４で表される塩基配列において、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、又は１０個の塩基の欠失、挿入、置換、又は付加を含む。
【０１０２】
本実施形態の塩基配列は、配列番号３、４、又は１４で表される塩基配列と、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、更により好ましくは９５％以上、例えば９６％以上、９７％以上、又は９８％以上、最も好ましくは９９％以上の同一性を有する。塩基配列の同一性は、上述のアミノ酸配列の同一性を決定する方法と同様に、当該技術分野において公知の手法により決定することができる。
【０１０３】
本明細書において、「ストリンジェントな条件下」とは、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ−Ａ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＭＡＮＵＡＬ  ＴＨＩＲＤ  ＥＤＩＴＩＯＮ（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ）に記載の方法が挙げられる。例えば、５×ＳＳＣ（２０×ＳＳＣの組成：３Ｍ  塩化ナトリウム、０．３Ｍ  クエン酸溶液、ｐＨ７．０）、０．１重量％  Ｎ−ラウロイルサルコシン、０．０２重量％のＳＤＳ、２重量％の核酸ハイブルダイゼーション用ブロッキング試薬、及び５０％フォルムアミドから成るハイブリダイゼーションバッファー中で、５５〜７０℃で数時間から一晩インキュベーションを行うことによりハイブリダイズさせる条件を挙げることができる。なお、インキュベーション後の洗浄の際に用いる洗浄バッファーとしては、好ましくは０．１重量％ＳＤＳ含有１×ＳＳＣ溶液、より好ましくは０．１重量％ＳＤＳ含有０．１×ＳＳＣ溶液である。
【０１０４】
一実施形態において、本発明の遺伝子は、（ｐ）〜（ｗ）のいずれか一つの塩基配列に加えて他の塩基配列を含む配列からなる遺伝子であってもよい。別の実施形態において、本発明の遺伝子は、（ｐ）〜（ｗ）のいずれか一つの塩基配列のみからなる遺伝子である。
【０１０５】
本実施形態の遺伝子を発現ベクターに挿入し、これを用いて宿主を形質転換することにより、標的二本鎖ポリヌクレオチドへの結合力を保ちながら、ＰＡＭ配列の認識が広範化されたＣａｓ９タンパク質を得ることができる。
【０１０６】
本実施形態において、Ｃａｓ９をコードする塩基配列は、真核生物細胞等の特定の細胞における発現のためにコドン最適化されていてもよい。真核生物細胞としては、特定の生物、例えば、ヒト、マウス、ラット、ウサギ、イヌ、ブタ、又は非ヒト霊長類等が挙げられ、これらに限定されない。一般に、コドン最適化とは、ネイティブのアミノ酸配列を維持しつつ、ネイティブの配列の少なくとも１つのコドンを、導入される動物種の遺伝子においてより頻繁に又は最も頻繁に使用されるコドンで置き換えることによって、導入される動物種における増強された発現のために核酸配列を改変するプロセスを指す。種々の種が、特定のアミノ酸の特定のコドンについて特定のバイアスを示す。コドンバイアス（生物間のコドン使用頻度における差異）は、ｍＲＮＡの翻訳効率と相関する場合が多く、これは、翻訳されているコドンの特性及び特定のｔＲＮＡの利用可能性にとりわけ依存すると考えられている。細胞中の選択されたｔＲＮＡの優勢は、一般に、ペプチド合成において最も頻繁に使用されるコドンの反映である。従って、遺伝子は、コドン最適化に基づいて、所与の生物における最適な遺伝子発現のために個別化され得る。コドン使用頻度表は、例えば、www.kazusa.or.jp/codon/（２０１８年３月２０日に訪問）に掲載されている「Ｃｏｄｏｎ  Ｕｓａｇｅ  Ｄａｔａｂａｓｅ」において容易に入手可能であり、これらの表を用いて、コドンを最適化することができる（例えば、Ｎａｋａｍｕｒａ，Ｙ．ら「Ｃｏｄｏｎ  ｕｓａｇｅ  ｔａｂｕｌａｔｅｄ  ｆｒｏｍ  ｔｈｅ  ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ＤＮＡ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｄａｔａｂａｓｅｓ：ｓｔａｔｕｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｙｅａｒ  ２０００」Ｎｕｃｌ．  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ２８：２９２  （２０００）、参照）。特定の動物種における発現のために特定の配列をコドン最適化するためのコンピューターアルゴリズムについても、例えば、Ｇｅｎｅ  Ｆｏｒｇｅ（Ａｐｔａｇｅｎ社；Ｊａｃｏｂｕｓ、ＰＡ）等において入手可能である。本実施形態において、Ｃａｓ９をコードする配列中の１つ又は複数のコドンは、特定のアミノ酸について最も頻繁に使用されるコドンに対応する。
【０１０７】
＜改変されたＣａｓ９タンパク質またはその遺伝子とガイドＲＮＡとを含む組成物＞
一実施形態において、本発明は、上述の改変されたＢｌＣａｓ９タンパク質又は該タンパク質をコードする遺伝子と、
標的二本鎖ポリヌクレオチド中のＰＡＭ配列の１塩基上流から２０塩基以上２４塩基以下上流までの塩基配列に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドを含むガイドＲＮＡとを含む組成物を提供する。
【０１０８】
本実施形態の組成物を使用することにより、広範な配列から選択された標的配列において、標的配列特異的なゲノム編集及び遺伝子発現調節を簡便且つ迅速に行うことができる。
【０１０９】
本明細書中において、「標的配列」の「配列」とは、任意の長さのヌクレオチド配列を意味しており、デオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチドであり、線状、環状、又は分岐状であり、一本鎖又は二本鎖である。
【０１１０】
また、本明細書中において、「ＰＡＭ配列」とは、標的二本鎖ポリヌクレオチド中に存在し、Ｃａｓ９タンパク質により認識可能な配列を意味する。ＰＡＭ配列の長さや塩基配列は細菌種によって異なる。本実施形態の改変されたＢｌＣａｓ９タンパク質により認識可能な配列は、「５’−ＮＮＮＮＣＮＮＤ−３’」、「５’−ＮＮＮＮＣＮＤＮ−３’」、「５’−ＮＮＮＮＣＮＮＮ−３’」、「５’−ＮＮＮＮＤＮＤＤ−３’」、「５’−ＮＮＮＮＤＮＮＤ−３’」、「５’−ＮＮＮＮＤＮＤＮ−３’」、「５’−ＮＮＮＮＤＮＮＮ−３’」、「５’−ＮＮＮＮＧＮＤＤ−３’」、「５’−ＮＮＮＮＧＮＤＮ−３’」、「５’−ＮＮＮＮＧＮＮＮ−３’」、「５’−ＮＮＮＮＮＮＤＤ−３’」、「５’−ＮＮＮＮＮＮＮＤ−３’」、「５’−ＮＮＮＮＮＮＤＮ−３’」、又は「５’−ＮＮＮＮＮＮＮＮ−３’」として表すことができる。
【０１１１】
本明細書中において、「ポリヌクレオチド」とは、線状又は環状配座であり、一本鎖又は二本鎖形態のいずれかである、デオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチドポリマーを意味し、ポリマーの長さに関して制限するものとして解釈されるものではない。また、ポリヌクレオチドには、天然ヌクレオチドの公知の類似体、並びに塩基部分、糖部分及びリン酸部分のうち少なくとも一つの部分において修飾されるヌクレオチド（例えば、ホスホロチエート骨格）も包含される。一般に、特定ヌクレオチドの類似体は、元のヌクレオチドと同一の塩基対合特異性を有し、例えば、Ａの類似体は、Ｔと塩基対合する。
【０１１２】
本明細書中において、「ガイドＲＮＡ」とは、ｔｒａｃｒＲＮＡ−ｃｒＲＮＡのヘアピン構造を模倣したものであり、標的二本鎖ポリヌクレオチド中のＰＡＭ配列の１塩基上流から、好ましくは２０塩基以上２４塩基以下、より好ましくは２１塩基以上２３塩基以下まで、さらに好ましくは２１塩基又は２２塩基、最も好ましくは２２塩基の標的塩基配列に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドを５’末端領域に含むものである。さらに、標的二本鎖ポリヌクレオチドと非相補的な塩基配列からなり、一点を軸として対称に相補的な配列になるように並び、ヘアピン構造をとり得る塩基配列からなるポリヌクレオチドを１つ以上含んでいてもよい。
【０１１３】
前記タンパク質及び前記ガイドＲＮＡは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ及びｉｎ  ｖｉｖｏにおいて、温和な条件で混合することで、タンパク質−ＲＮＡ複合体を形成することができる。温和な条件とは、温度及びｐＨが、タンパク質が分解又は変性しない程度の温度及びｐＨである条件を示しており、温度は４℃以上４０℃以下が好ましく、ｐＨは４以上１０以下が好ましい。
【０１１４】
本実施形態において、組成物は、ガイドＲＮＡをコードする発現ベクターを含んでもよい。また、組成物が、改変されたＢｌＣａｓ９をコードする遺伝子を含む場合、遺伝子は、線状（直鎖状）の遺伝子断片として提供されてもよいし、ベクターに組み込まれた状態で提供されてもよい。改変されたＢｌＣａｓ９をコードする遺伝子がベクターに組み込まれて提供される場合、Ｃａｓ９をコードする遺伝子と、ガイドＲＮＡをコードする遺伝子は、同一のベクターとして提供されてもよいし、複数の別個のベクターとして提供されてもよい。ベクターとしては、特に限定されず、プラスミドベクター、ウイルスベクター等、従来公知のものを用いることができる。ウイルスベクターの例は、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴（ＡＡＶ）ウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター、シンドビスウイルスベクター等であるが、これらに限定されない。
【０１１５】
本実施形態の組成物は、医薬用であることが好ましく、薬学的に許容される担体を含むことがより好ましい。本実施形態の医薬用組成物は、例えば、錠剤、被覆錠剤、丸剤、散剤、顆粒剤、カプセル剤、液剤、懸濁剤、乳剤等の形態で経口的に、あるいは、注射剤、坐剤、皮膚外用剤等の形態で非経口的に投与することができる。
【０１１６】
薬学的に許容される担体としては、通常医薬組成物の製剤に用いられるものを特に制限なく用いることができる。より具体的には、例えば、ゼラチン、コーンスターチ、トラガントガム、アラビアゴム等の結合剤；デンプン、結晶性セルロース等の賦形剤；アルギン酸等の膨化剤；水、エタノール、グリセリン等の注射剤用溶剤；ゴム系粘着剤、シリコーン系粘着剤等の粘着剤等が挙げられる。薬学的に許容される担体は、１種を単独で又は２種以上を混合して用いることができる。
【０１１７】
本実施形態の組成物は、更に添加剤を含んでいてもよい。添加剤としては、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム等の潤滑剤；ショ糖、乳糖、サッカリン、マルチトール等の甘味剤；ペパーミント、アカモノ油等の香味剤；ベンジルアルコール、フェノール等の安定剤；リン酸塩、酢酸ナトリウム等の緩衝剤；安息香酸ベンジル、ベンジルアルコール等の溶解補助剤；酸化防止剤；防腐剤等が挙げられる。添加剤は、１種を単独で又は２種以上を混合して用いることができる。
【０１１８】
本実施形態の組成物は、一種又は複数の疾患又は症状を治療及び／又は予防するために用いられる。好ましくは、前記疾患又は症状は、遺伝子疾患又は遺伝子の異常に起因する症状である。
【０１１９】
＜標的二本鎖ポリヌクレオチドを部位特異的に切断するための方法＞
一実施形態において、本発明は、標的二本鎖ポリヌクレオチドを部位特異的に切断するための方法であって、
標的二本鎖ポリヌクレオチドと、本発明のＣａｓタンパク質と、ガイドＲＮＡとを接触させる工程を含み、
前記タンパク質が、前記標的二本鎖ポリヌクレオチド中のＰＡＭ配列の上流に位置する切断部位で該標的二本鎖ポリヌクレオチドを切断して、平滑末端を作出することを特徴とする、方法を提供する。
【０１２０】
本実施形態の方法によれば、広範な配列から選択された標的配列において、部位特異的な標的二本鎖ポリヌクレオチドの切断を簡便且つ迅速に行うことができる。
【０１２１】
標的二本鎖ポリヌクレオチドを部位特異的に切断するための本実施形態の方法について、以下に詳細に説明する。
【０１２２】
まず、本実施形態のＢｌＣａｓ９タンパク質とガイドＲＮＡとを接触させる。接触させる工程は、例えば、前記Ｃａｓ９タンパク質とガイドＲＮＡとを温和な条件で混合し、インキュベートすることによって行ってもよい。温和な条件とは、上述のとおりである。インキュベートする時間は、０．５時間以上１時間以下が好ましい。前記Ｃａｓ９タンパク質及び前記ガイドＲＮＡによる複合体は、安定しており、室温で数時間静置しても安定性を保つことができる。
【０１２３】
本実施形態において用いるＣａｓ９タンパク質及びガイドＲＮＡについては、上述のとおりである。
【０１２４】
本実施形態において、標的二本鎖ポリヌクレオチドは、５’→３’の方向で記載される、ＮＮＮＮＣＮＮＤ、ＮＮＮＮＣＮＤＮ、ＮＮＮＮＣＮＮＮ、ＮＮＮＮＤＮＤＤ、ＮＮＮＮＤＮＮＤ、ＮＮＮＮＤＮＤＮ、ＮＮＮＮＤＮＮＮ、ＮＮＮＮＧＮＤＤ、ＮＮＮＮＧＮＮＤ、ＮＮＮＮＧＮＤＮ、ＮＮＮＮＧＮＮＮ、ＮＮＮＮＮＮＤＤ、ＮＮＮＮＮＮＮＤ、ＮＮＮＮＮＮＤＮ、及びＮＮＮＮＮＮＮＮからなる群から選択されるＰＡＭ配列を含む配列が好ましく、ここで、Ｎは、アデニン、シトシン、チミン、及びグアニンからなる群から選択された任意の１塩基であり、Ｄは、アデニン、チミン、及びグアニンからなる群から選択された任意の１塩基である。
【０１２５】
次に、前記標的二本鎖ポリヌクレオチド上において、前記タンパク質及び前記ガイドＲＮＡは複合体を形成する。前記タンパク質は、「５’−ＮＮＮＮＣＮＮＤ−３’」、「５’−ＮＮＮＮＣＮＤＮ−３’」、「５’−ＮＮＮＮＣＮＮＮ−３’」、「５’−ＮＮＮＮＤＮＤＤ−３’」、「５’−ＮＮＮＮＤＮＮＤ−３’」、「５’−ＮＮＮＮＤＮＤＮ−３’」、「５’−ＮＮＮＮＤＮＮＮ−３’」、「５’−ＮＮＮＮＧＮＤＤ−３’」、「５’−ＮＮＮＮＧＮＮＤ−３’」、「５’−ＮＮＮＮＧＮＤＮ−３’」、「５’−ＮＮＮＮＧＮＮＮ−３’」、「５’−ＮＮＮＮＮＮＤＤ−３’」、「５’−ＮＮＮＮＮＮＮＤ−３’」、「５’−ＮＮＮＮＮＮＤＮ−３’」、及び「５’−ＮＮＮＮＮＮＮＮ−３’」からなる群から選択されるＰＡＭ配列を認識し、ＰＡＭ配列の上流に位置する切断部位で、前記標的二本鎖ポリヌクレオチドを切断して、平滑末端を作出する。
【０１２６】
より詳細には、前記Ｃａｓ９タンパク質がＰＡＭ配列を認識し、ＰＡＭ配列を起点として、前記標的二本鎖ポリヌクレオチドの二重らせん構造が引き剥され、前記ガイドＲＮＡ中の前記標的二本鎖ポリヌクレオチドに相補的な塩基配列とアニーリングすることで、前記標的二本鎖ポリヌクレオチドの二重らせん構造が部分的にほぐれる。このとき、前記Ｃａｓ９タンパク質は、ＰＡＭ配列の上流に位置する切断部位で、前記標的二本鎖ポリヌクレオチドのリン酸ジエステル結合を切断し、平滑末端を作出する。
【０１２７】
本実施形態において、切断部位は、例えば、標的二本鎖ポリヌクレオチド中のＰＡＭ配列の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０塩基上流である。好ましくは、切断部位は、標的二本鎖ポリヌクレオチド中のＰＡＭ配列の３塩基上流である。
【０１２８】
本実施形態の方法は、ｉｎ  ｖｉｖｏ又はｉｎ  ｖｉｔｒｏの任意の環境で行うことができる。一実施形態において、本実施形態の方法は、生体外、すなわちｅｘ  ｖｉｖｏ又はｉｎ  ｖｉｔｒｏで行われる。
【０１２９】
＜標的二本鎖ヌクレオチドを部位特異的に修飾するための方法＞
一実施形態において、本発明は、標的二本鎖ポリヌクレオチドを部位特異的に修飾するための方法であって、
標的二本鎖ポリヌクレオチドと、本発明のＣａｓタンパク質と、ガイドＲＮＡとを接触させる工程を含み、
前記タンパク質が、前記標的二本鎖ポリヌクレオチド中のＰＡＭ配列の上流に位置する切断部位で該標的二本鎖ポリヌクレオチドを切断して、平滑末端を作出し、
前記ガイドＲＮＡと前記標的二本鎖ポリヌクレオチドの相補的結合によって決定される領域において、前記標的二本鎖ポリヌクレオチドが修飾されることを特徴とする、方法を提供する。
【０１３０】
本実施形態によれば、広範な配列から選択された標的配列において、部位特異的な標的二本鎖ポリヌクレオチドの修飾を簡便且つ迅速に行うことができる。
【０１３１】
標的二本鎖ヌクレオチドを部位特異的に修飾するための本実施形態の方法について、以下に詳細に説明する。
【０１３２】
標的二本鎖ポリヌクレオチドと、Ｃａｓタンパク質と、ガイドＲＮＡとを接触させる工程は、上記＜標的二本鎖ポリヌクレオチドを部位特異的に切断するための方法＞と同様に行うことができる。
【０１３３】
本実施形態において用いる標的二本鎖ポリヌクレオチド、Ｃａｓ９タンパク質、及びガイドＲＮＡについては、上述のとおりである。
【０１３４】
標的二本鎖ポリヌクレオチドを部位特異的に修飾するための方法について、以下に詳細を説明する。標的二本鎖ポリヌクレオチドを部位特異的に切断するまでの工程は上述のとおりである。続いて、前記ガイドＲＮＡと前記二本鎖ポリヌクレオチドの相補的結合によって決定される領域において、目的に応じた修飾が施された標的二本鎖ポリヌクレオチドを得ることができる。
【０１３５】
本明細書中において、「修飾」とは、標的二本鎖ポリヌクレオチドの塩基配列が変化することを意味する。例えば、標的二本鎖ポリヌクレオチドの切断、切断後の外因性配列の挿入（物理的挿入又は相同指向修復を介する複製による挿入）による標的二本鎖ポリヌクレオチドの塩基配列の変化、切断後の非相同末端連結（ＮＨＥＪ：切断により生じたＤＮＡ末端同士が再び結合すること）による標的二本鎖ポリヌクレオチドの塩基配列の変化等が挙げられる。本実施形態における標的二本鎖ポリヌクレオチドの修飾により、標的二本鎖ポリヌクレオチドへの変異の導入、又は、標的二本鎖ポリヌクレオチドの機能を破壊することができる。
【０１３６】
本実施形態の方法は、ｉｎ  ｖｉｖｏ又はｉｎ  ｖｉｔｒｏの任意の環境で行うことができる。一実施形態において、本実施形態の方法は、生体外、すなわちｅｘ  ｖｉｖｏ又はｉｎ  ｖｉｔｒｏで行われる。
【０１３７】
＜標的二本鎖ヌクレオチドを部位特異的かつ正確に修飾するための方法＞
一実施形態において、本発明は、標的二本鎖ポリヌクレオチドを部位特異的に修飾するための方法であって、
標的二本鎖ポリヌクレオチドと、本発明のＣａｓタンパク質と、ガイドＲＮＡとを接触させる工程を含み、
前記タンパク質が、前記ガイドＲＮＡを介して前記標的二本鎖ポリヌクレオチドに特異的に結合し、ここで、前記タンパク質が、前記標的二本鎖ポリヌクレオチドを切断しないか又は一方の鎖のみを切断し、
前記ガイドＲＮＡと前記標的二本鎖ポリヌクレオチドの相補的結合によって決定される領域において、前記標的二本鎖ポリヌクレオチドが修飾されることを特徴とする、方法を提供する。
【０１３８】
本実施形態によれば、部位特異的かつ一塩基単位の正確な標的二本鎖ポリヌクレオチドの修飾を簡便且つ迅速に行うことができる。特に、標的配列が広範化した本発明のＢｌＣａｓ９タンパク質を使用することにより、自由にガイドＲＮＡを設計することができるため、編集する塩基を自由に選択することができる。そのため、本発明の改変されたＢｌＣａｓ９タンパク質は、本実施形態の方法における使用に関して特に有利である。
【０１３９】
改変されたＢｌＣａｓ９タンパク質を用いて遺伝子の発現を調節するための本実施形態の方法について、以下に詳細に説明する。
【０１４０】
標的二本鎖ポリヌクレオチドと、Ｃａｓタンパク質と、ガイドＲＮＡと、エフェクター分子とを接触させる工程は、上記＜標的二本鎖ポリヌクレオチドを部位特異的に切断するための方法＞と同様に行うことができる。
【０１４１】
本実施形態において用いる標的二本鎖ポリヌクレオチド及びガイドＲＮＡについては、上述のとおりである。本実施形態において用いるＣａｓ９タンパク質は、上記＜Ｃａｓ９タンパク質のＤＮＡ切断活性＞に記載している、標的二本鎖ポリヌクレオチドの一方又は両方の鎖を切断する能力を欠如している改変体である。
【０１４２】
標的二本鎖ポリヌクレオチドを部位特異的にかつ正確に修飾するための方法について、以下に詳細を説明する。各構成成分を上述のとおり接触させると、Ｃａｓ９タンパク質とガイドＲＮＡとが複合体を形成し、標的二本鎖ポリヌクレオチドに結合する。ここで、Ｃａｓ９タンパク質は、前記標的二本鎖ポリヌクレオチドを切断しないか又は一方の鎖のみを切断して、すなわち、二本鎖切断を起こすことなく、標的ポリヌクレオチド内の塩基配列を修飾する。「修飾」とは、上で定義したとおりである。本実施形態において、修飾は、好ましくは一塩基単位で行われ、例えば、Ｃ−Ｇ塩基対をＴ−Ａ塩基対へ変えること、又はその逆を行うことを意味する。
【０１４３】
本実施形態において、上記の一塩基単位の特異的かつ正確な修飾（一塩基編集）は、好ましくは、デアミナーゼ（脱アミノ化酵素）を用いて行われる。デアミナーゼとしては、例えば、シチジンデアミナーゼやアデノシンデアミナーゼを使用することができる。デアミナーゼは、Ｃａｓ９タンパク質に作動可能に連結されていてもよい。本明細書において、「作動可能に連結されている」とは、連結されている各構成要素が、その通常の機能を果たすことができるように連結されていることを意味する。
【０１４４】
本実施形態の方法は、ｉｎ  ｖｉｖｏ又はｉｎ  ｖｉｔｒｏの任意の環境で行うことができる。一実施形態において、本実施形態の方法は、生体外、すなわちｅｘ  ｖｉｖｏ又はｉｎ  ｖｉｔｒｏで行われる。
【０１４５】
＜遺伝子の発現を調節するための方法＞
一実施形態において、本発明は、遺伝子の発現を調節するための方法であって、
前記遺伝子に関連する標的二本鎖ポリヌクレオチドと、本発明のＣａｓタンパク質と、ガイドＲＮＡと、エフェクター分子とを接触させる工程を含み、
前記Ｃａｓタンパク質が、前記ガイドＲＮＡを介して前記標的二本鎖ポリヌクレオチドに特異的に結合し、それにより前記エフェクター分子が前記標的二本鎖ポリヌクレオチドに特異的に作用することによって前記遺伝子の発現を調節することを特徴とする、方法を提供する。
【０１４６】
本実施形態によれば、広範な配列から選択された標的配列において、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系による標的二本鎖ポリヌクレオチド認識を利用した遺伝子発現の調節を簡便且つ迅速に行うことができる。特に、標的配列が広範化した本発明のＢｌＣａｓ９タンパク質を使用することにより、自由にガイドＲＮＡを設計することができるため、遺伝子発現の調節を最も効果的に行うことができる領域（ホットスポット）にエフェクター分子を正確に送達することができる。そのため、本発明の改変されたＢｌＣａｓ９タンパク質は、本実施形態の方法における使用に関して特に有利である。
【０１４７】
本明細書において、「発現」とは、ポリヌクレオチドがｍＲＮＡへと転写されるプロセス、及び／又は転写されたｍＲＮＡが、ペプチド、ポリペプチド、若しくはタンパク質へと翻訳されるプロセスを意味する。ポリヌクレオチドがゲノムＤＮＡ由来のポリヌクレオチドである場合、発現は、真核生物細胞におけるｍＲＮＡのスプライシングを含み得る。
【０１４８】
本明細書において、「遺伝子の発現」とは、遺伝子中に含有される情報の、遺伝子産物への変換を意味する。遺伝子産物は、遺伝子の直接的転写産物（例えば、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、リボザイム、ｓｈＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、構造ＲＮＡまたは任意の他の型のＲＮＡ）またはｍＲＮＡの翻訳によって産生されたタンパク質であり得る。遺伝子産物には、キャッピング、ポリアデニル化、メチル化および編集などのプロセスによって改変されたＲＮＡ、ならびに例えば、メチル化、アセチル化、リン酸化、ユビキチン化、ＡＤＰ−リボシル化、ミリスチル化およびグリコシル化によって改変されたタンパク質もまた含まれる。
【０１４９】
本明細書において、遺伝子の発現の「調節」とは、遺伝子の活性における変化を意味する。発現の調節は、例えば遺伝子の活性化及び抑制、より具体的には転写の活性化又は抑制であるが、これらに限定されない。
【０１５０】
ＢｌＣａｓ９タンパク質を用いて遺伝子の発現を調節するための本実施形態の方法について、以下に詳細に説明する。
【０１５１】
標的二本鎖ポリヌクレオチドと、Ｃａｓタンパク質と、ガイドＲＮＡと、エフェクター分子とを接触させる工程は、上記＜標的二本鎖ポリヌクレオチドを部位特異的に切断するための方法＞と同様に行うことができる。
【０１５２】
本実施形態において用いる標的二本鎖ポリヌクレオチド及びガイドＲＮＡについては、上述のとおりである。本実施形態において用いるＣａｓ９タンパク質は、上記＜Ｃａｓ９タンパク質のＤＮＡ切断活性＞に記載している、標的二本鎖ポリヌクレオチドの一方又は両方、好ましくは両方の鎖を切断する能力を欠如している改変体である。
【０１５３】
本明細書において、「エフェクター分子」とは、細胞において局在化した効果を発揮することが可能な、タンパク質又はタンパク質ドメイン等の分子を意味する。エフェクター分子は、例えば生物学的活性を調節するために、タンパク質またはＤＮＡに選択的に結合するものを含む、種々の異なる形態を取り得る。エフェクター分子の作用には、ヌクレアーゼ活性、酵素活性の増大又は低減、遺伝子発現の増大又は低減、細胞シグナル伝達に影響を与えること等が含まれるが、これらに限定されない。本発明において用いることができるエフェクター分子の具体的な例には、例えば、ＶＰ６４又はＮＦ−κＢ  ｐ６５等の転写活性因子又はドメイン、ＫＲＡＰ、ＥＲＦリプレッサードメイン（ＥＲＤ）、ｍＳｉｎ３Ａ相互作用ドメイン（ＳＩＤ）等の転写抑制因子又はドメイン、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ、ＤＮＡ脱メチル化酵素、ヒストンアセチルトランスフェラーゼ、ヒストン脱アセチル化酵素等のクロマチンリモデリング因子が含まれるが、これらに限定されない。
【０１５４】
本実施形態において、エフェクター分子は、Ｃａｓタンパク質とガイドＲＮＡとの複合体が標的二本鎖ポリヌクレオチドに特異的に結合することによって、前記標的二本鎖ポリヌクレオチドへと導かれる。好ましくは、エフェクター分子は、場合によりリンカーを介して、Ｃａｓ９タンパク質に作動可能に連結されている。
【０１５５】
本実施形態において、エフェクター分子は、標的二本鎖ポリヌクレオチドに特異的に作用することによって、前記標的二本鎖ポリヌクレオチドに関連する遺伝子の発現を調節する。標的とする二本鎖ポリヌクレオチドには、発現を調節しようとする遺伝子自身の塩基配列のポリヌクレオチドを選択してもよいし、あるいは、例えば、発現を調節しようとする遺伝子の発現を直接又は間接に、正又は負に制御している上流の遺伝子の塩基配列のポリヌクレオチドを選択することもできる。
【０１５６】
本実施形態の方法は、ｉｎ  ｖｉｖｏ又はｉｎ  ｖｉｔｒｏの任意の環境で行うことができる。一実施形態において、本実施形態の方法は、生体外、すなわちｅｘ  ｖｉｖｏ又はｉｎ  ｖｉｔｒｏで行われる。
【０１５７】
＜ゲノム編集及び遺伝子治療方法＞
一実施形態において、本発明は、上述のタンパク質又は組成物を用いて、ゲノム編集を実行するための方法を提供する。以前に知られている標的化された遺伝子組換えの方法と対照的に、本発明は、効率的かつ安価に行うことができ、また任意の細胞又は生物に適応可能である。細胞又は生物の二本鎖核酸の任意のセグメントは、本発明の方法により改変され得る。この方法は、全ての細胞に内在性である相同組換えプロセス及び非相同組換えプロセスの両方を利用する。
【０１５８】
一実施形態において、本発明は、改変されたＢｌＣａｓ９タンパク質又は該タンパク質をコードする遺伝子と、ガイドＲＮＡとを含む組成物を対象に投与することを含む、遺伝子治療方法を提供する。本実施形態においては、上述の実施形態のタンパク質、遺伝子、及び／又は組成物を用いることができる。
【０１５９】
本実施形態における医薬組成物の投与方法は特に限定されず、患者の症状、体重、年齢、性別等に応じて適宜決定すればよい。例えば、錠剤、被覆錠剤、丸剤、散剤、顆粒剤、カプセル剤、液剤、懸濁剤、乳剤等は経口投与される。また、注射剤は、単独で、又はブドウ糖、アミノ酸等の通常の補液と混合して静脈内投与され、更に必要に応じて、動脈内、筋肉内、皮内、皮下又は腹腔内投与される。
【０１６０】
本実施形態における医薬組成物の投与量は、患者の症状、体重、年齢、性別等によって異なり、一概には決定できないが、経口投与の場合には、例えば１日あたり１μｇ〜１０ｇ、例えば１日あたり０．０１〜２０００ｍｇの有効成分を投与すればよい。また、注射剤の場合には、例えば１日あたり０．１μｇ〜１ｇ、例えば１日あたり０．００１〜２００ｍｇの有効成分を投与すればよい。
【０１６１】
本明細書において、「ゲノム編集」とは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムやＴｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ａｃｔｉｖａｔｏｒ−Ｌｉｋｅ  Ｅｆｆｅｃｔｏｒ  Ｎｕｃｌｅａｓｅｓ（ＴＡＬＥＮ）等の技術により標的化された遺伝子組換え又は標的化された変異を実行することにより、特異的な遺伝子破壊やレポーター遺伝子のノックイン等を行う新しい遺伝子改変技術である。本実施形態において、変異は、標的ゲノムＤＮＡ又は標的ゲノムＤＮＡの発現調節領域における一部又は全部の欠失、置換、任意の配列の挿入等により生じる。
【０１６２】
また、一実施形態において、本発明は、標的化されたＤＮＡ挿入又は標的化されたＤＮＡ欠失を行う方法を提供する。この方法は、ドナーＤＮＡを含む核酸構築物を用いて、細胞を形質転換する工程を包含する。標的遺伝子切断後のＤＮＡ挿入及びＤＮＡ欠失に関するスキームについては、公知の方法に従って当業者が決定できる。
【０１６３】
また、一実施形態において、本発明は、体細胞及び生殖細胞の両方で利用され、特定の遺伝子座で遺伝子操作を提供する。
【０１６４】
また、一実施形態において、本発明は、体細胞において遺伝子を破壊するための方法を提供する。ここで、遺伝子は、細胞又は生物に対して有害な産物を過剰発現し、細胞又は生物に対して有害な産物を発現する。このような遺伝子は、疾患において生じる１つ以上の細胞型において過剰発現され得る。本発明の方法による、前記過剰発現した遺伝子の破壊は、前記過剰発現した遺伝子に起因する疾患を被る個体に、より良い健康をもたらし得る。すなわち、細胞のほんの小さな割合の遺伝子の破壊が働き、発現レベルを減少し、治療効果を生じ得る。
【０１６５】
また、一実施形態において、本発明は、生殖細胞において遺伝子を破壊するための方法を提供する。特定の遺伝子が破壊された細胞は、特定の遺伝子の機能を有さない生物を作製するために選択され得る。前記遺伝子が破壊された細胞において、遺伝子は完全にノックアウトされ得る。この特定の細胞における機能の欠損は、治療効果を有し得る。
【０１６６】
また、一実施形態において、本発明は、遺伝子産物をコードするドナーＤＮＡの挿入をさらに提供する。この遺伝子産物は、構成的に発現された場合、治療効果を有する。例えば、膵細胞の個体群において、活性プロモーター及びインシュリン遺伝子をコードするドナーＤＮＡの挿入を引き起こすために、前記ドナーＤＮＡを、糖尿病を被る個体に挿入する方法が挙げられる。次いで、外因性ＤＮＡを含む膵細胞の前記個体群は、インシュリンを生成し、糖尿病患者を治療することができる。さらに、前記ドナーＤＮＡは作物に挿入され、薬剤的関連遺伝子産物の生成を引き起こし得る。タンパク質産物の遺伝子（例えば、インシュリン、リパーゼ又はヘモグロビン）は、制御エレメント（構成的活性プロモーター、又は誘導性プロモーター）と一緒に植物に挿入され、植物中で大量の医薬品を生成し得る。
【０１６７】
次いで、このようなタンパク質産物は、植物から単離され得る。トランスジェニック植物又はトランスジェニック動物は、核酸移入技術（ＭｃＣｒｅａｔｈ，Ｋ．Ｊ．ら（２０００）Ｎａｔｕｒｅ  ４０５：１０６６−１０６９；Ｐｏｌｅｊａｅｖａ，Ｉ．Ａ．ら，（２０００）Ｎａｔｕｒｅ  ４０７：８６−９０）を用いる方法で作製され得る。組織型特異的ベクター又は細胞型特異的ベクターは、選択した細胞内でのみ遺伝子発現を提供するために利用され得る。
【０１６８】
あるいは、上記の方法は、生殖細胞内で利用され、計画された様式で挿入が生じ、後の全ての細胞分裂が、設計された遺伝的変更を有する細胞を生成する細胞を選択し得る。
【０１６９】
本発明の方法は、原核生物及び真核生物を含むすべての生物に対してか、又は培養細胞、培養組織又は培養核（インタクトな生物を再生するために使用され得る細胞、組織又は核を含む）においてか、又は配偶子（例えば、それらの発達の様々な段階の卵又は精子）において、適用され得る。本発明の方法は、任意の生物（昆虫、真菌、げっ歯類、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ニワトリ、及び他の農業上重要な動物、ならびに他の哺乳動物（イヌ、ネコ及びヒトが挙げられるが、これらに限定されない）が挙げられるが、これらに限定されない）に由来する細胞に適用され得る。
【０１７０】
さらに、本発明の組成物及び方法は、植物において使用され得る。組成物及び方法が、任意の様々な植物種（例えば、単子葉植物又は双子葉植物等）において使用され得る。
【０１７１】
以上、この発明の実施形態について図面を参照して詳述してきたが、具体的な構成はこの実施形態に限られるものではなく、この発明の要旨を逸脱しない範囲の構成等も含まれる。
【実施例】
【０１７２】
以下に実施例を挙げて本発明を更に詳述するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。【０１７３】
［実施例１］ＰＡＭ配列の５番目の塩基の認識の広範化
１．野生型及び変異型ＢｌＣａｓ９の調製
（１）コンストラクトの設計
野生型ＢｌＣａｓ９、及び、ＰＡＭ配列における５番目の塩基の認識をＣからＤ（Ａ、Ｇ、Ｔ）に変更するＤ１０２２Ｎ変異を有する改変ＢｌＣａｓ９をそれぞれコードするＢｌｃａｓ９遺伝子（野生型Ｂｌｃａｓ９の塩基配列：配列番号７、Ｄ１０２２Ｎ変異型Ｂｌｃａｓ９の塩基配列：配列番号８）をそれぞれ、ｐＥ−ＳＵＭＯ  ｖｅｃｔｏｒ（ＬｉｆｅＳｅｎｓｏｒｓ）に組み込んだ。さらに、ＳＵＭＯタグとＢｌｃａｓ９遺伝子の間にＴＥＶ認識配列を付加した。完成したコンストラクトから発現するＣａｓ９のＮ末端には６残基のヒスチジンが連続し（Ｈｉｓタグ）、続いてＳＵＭＯタグ、ＴＥＶプロテアーゼ認識サイトが付加される設計になっている。【０１７４】
（２）大腸菌での発現
作製したベクターを大腸菌Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ｒｏｓｅｔｔａ２  （ＤＥ３）株へ形質転換した。その後、２０μｇ／ｍｌカナマイシン及び２０μｇ／ｍｌクロラムフェニコールを含むＬＢ培地培養した。ＯＤ＝０．８になるまで培養した時点で、発現誘導剤としてイソプロピル−β−チオガラクトピラノシド（Ｉｓｏｐｒｏｐｙｌ  β−Ｄ−１−ｔｈｉｏｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ；ＩＰＴＧ）（終濃度１ｍＭ）を添加し、２０℃で１８時間培養した。培養後、大腸菌を遠心分離（５，０００  ｇ、１０分間）により回収した。【０１７５】
（３）野生型及び変異型ＢｌＣａｓ９の精製
（２）で回収した菌体を緩衝液Ａで懸濁し、超音波破砕した。遠心（４０，０００ｇ、３０分間）により上清を回収し、緩衝液Ａで平衡化したＮｉ−ＮＴＡ  Ｓｕｐｅｒｆｌｏｗ樹脂（ＱＩＡＧＥＮ）と混合し、１時間穏やかに転倒混和した。素通り画分を回収した後、５カラム容量の緩衝液Ａ、さらに５カラム容量の高塩濃度緩衝液Ｂで洗浄を行った。【０１７６】
再度３カラム容量の緩衝液Ａで洗浄した後、５カラム容量の高イミダゾール濃度緩衝液Ｃで目的タンパク質を溶出した。溶出したタンパク質を、緩衝液Ｄ（０Ｍ  ＮａＣｌ）８５％、緩衝液Ｅ（２Ｍ  ＮａＣｌ）１５％で平衡化したＨｉＴｒａｐ  ＳＰ  ＨＰ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）にチャージした。２カラム容量分の緩衝液Ｄ（０Ｍ  ＮａＣｌ）８５％及び緩衝液Ｅ（２Ｍ  ＮａＣｌ）１５％の混合溶液で洗浄を行った後、緩衝液Ｅを１５％から１００％へ（ＮａＣｌ濃度は３００ｍＭから２Ｍへ）直線勾配をかけて目的タンパク質を溶出した。溶出したサンプルにＴＥＶプロテアーゼを添加し、緩衝液Ｆを用いて２０℃で一晩透析し、タグの除去を行った。透析後、Ｈｉｓタグ及びＴＥＶプロテアーゼを目的タンパク質と分離するために、再び緩衝液Ｆで平衡化したＮｉ−ＮＴＡ  Ｓｕｐｅｒｆｌｏｗ樹脂と混合し、素通り画分を回収した。引き続いて、３カラム容量の緩衝液Ｃにてカラム洗浄を行い、洗浄液を回収した。【０１７７】
溶出したサンプルを緩衝液Ｇで平衡化したＨｉｌｏａｄ  １６／６００  Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に通し、１カラム容量分の緩衝液Ｇで目的タンパク質を溶出した。【０１７８】
緩衝液Ａ〜Ｇの組成について、表１に示す。表１中、「２−ＭＥ」は、２−メルカプトエタノール（２−ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏｌ）を意味し、「ＤＴＴ」は、ジチオトレイトール（ｄｉｔｈｉｏｔｈｒｅｉｔｏｌ）を意味する。【０１７９】
【表１】
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【０１８０】
２．ガイドＲＮＡの調製
目的のガイドＲＮＡ配列（配列番号９）が挿入された鋳型ＤＮＡ作製を行った。ガイドＲＮＡ配列の上流にＴ７プロモーター配列を付加したプライマーを用意し、ＰＣＲを用いてプライマー同士をアニールさせて伸長反応を起こしてｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写反応の鋳型ＤＮＡを作製した。この鋳型ＤＮＡを用いて、３７℃、４時間、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼによるｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写反応を行った。転写産物を含む反応液に１／１０量の３Ｍ
酢酸ナトリウム及び２．５倍量の１００％エタノールを添加し、４℃にて遠心（８，０００ｇ、３分）し、転写産物を沈殿させた。上清を廃棄して７０％エタノールを添加し、４℃にて遠心（８，０００ｇ、３分）し再び上清を廃棄した。沈殿を風乾後、ＴＢＥ緩衝液に再懸濁し、７Ｍ  Ｕｒｅａ変性１０％ＰＡＧＥにより精製した。目的ＲＮＡの分子量に位置するバンドを切り出し、Ｅｌｕｔｒａｐ電気溶出システム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）によりＲＮＡを抽出した。その後、抽出したＲＮＡをＰＤ−１０カラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に通し、緩衝液を緩衝液Ｈ（１０  ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ）に交換した。【０１８１】
３．プラスミドＤＮＡ切断活性測定試験
ＤＮＡ切断活性測定試験に用いるために、標的ＤＮＡ配列及びＰＡＭ配列が挿入されたベクターの作製を行った。標的ＤＮＡ配列にＰＡＭ配列１〜４をそれぞれ付加し、線状化したｐＵＣ１１９ベクターに組み込んだ。標的ＤＮＡの配列及びＰＡＭ配列１〜４を表２に示す。【０１８２】
【表２】
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【０１８３】
作製したベクターを用いて、大腸菌Ｍａｃｈ１株（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を形質転換し、２０μｇ／ｍＬアンピシリンを含むＬＢ培地で３７℃にて培養した。【０１８４】
培養後、菌体を遠心（８，０００ｇ、１分）により回収し、ＱＩＡｐｒｅｐ  Ｓｐｉｎ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いてプラスミドＤＮＡを精製した。【０１８５】
精製した４種類のＰＡＭ配列が付加した標的プラスミドＤＮＡを用いて切断実験を行った。プラスミドＤＮＡは、制限酵素ＥｃｏＲＩにより１本に線状化した。この線状化ＤＮＡ中の標的ＤＮＡ配列をＢｌＣａｓ９が切断すると、約１，０００ｂｐと約２，０００ｂｐの切断産物が生じる。３７℃にて５分間又は１０分間反応させた。反応溶液の組成は表３に示す。【０１８６】
【表３】
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【０１８７】
反応後のサンプルについて、ＭｕｌｔｉＮＡキャピラリー泳動装置（ＳＨＩＭＡＤＺＵ）を用いて電気泳動を行い、切断産物のバンドを確認した。切断活性は、切断されたＤＮＡ断片（約２，０００ｂｐ）の濃度と未切断の線状化ＤＮＡ（約３，０００ｂｐ）の濃度の合計に対する、切断ＤＮＡ断片の濃度の割合（％）として表される。【０１８８】
まず、野生型ＢｌＣａｓ９が認識する（５番目がＣである）天然のＰＡＭ配列１を含む標的ＤＮＡを用いて、野生型ＢｌＣａｓ９と変異型ＢｌＣａｓ９のＤＮＡ切断活性を比較した。結果を図４に示す。【０１８９】
図４からわかるとおり、Ｄ１０２２Ｎ変異型ＢｌＣａｓ９では、ガイドＲＮＡの切断活性が完全に失われた。このことから、Ｄ１０２２は５番目のＣの認識に重要であることが示された。【０１９０】
その他のＰＡＭ配列を含むＤＮＡ切断活性を確認した電気泳動写真を図５に示す。【０１９１】
図５が示すとおり、野生型ＢｌＣａｓ９は、５番目がＣであるＰＡＭ配列１を含む標的ＤＮＡを切断したが、その他のＰＡＭ配列を含む標的ＤＮＡはインキュベーション１０分後も切断されなかった。対照的に、Ｄ１０２２Ｎ変異型ＢｌＣａｓ９は、ＰＡＭ配列１を含む標的ＤＮＡを切断しなかったが、それ以外の全てのＰＡＭ配列を含む標的ＤＮＡを、５分間のインキュベーションという短時間で切断した。【０１９２】
以上から、Ｄ１０２２Ｎ変異型ＢｌＣａｓ９では、認識するＰＡＭ配列がＣからＤ（Ａ、Ｇ、Ｔ）に改変されたことが示された。また、Ｄ１０２２Ｎ変異型ＢｌＣａｓ９を用いて、簡便かつ迅速に、標的配列に対する標的二本鎖ポリヌクレオチドの特異的切断を導入することができることが示された。【０１９３】
［実施例２］ＰＡＭ配列の５番目の塩基の認識の改変
１．変異型ＢｌＣａｓ９の調製
実施例１と同様の方法により、ＰＡＭ配列における５番目の塩基の認識をＣからＧに改変するＤ１０２２Ｎ／Ｋ１０４０Ｅ変異を有する改変ＢｌＣａｓ９を調製した。【０１９４】
２．プラスミドＤＮＡ切断活性測定試験
ガイドＲＮＡ、ＰＡＭ配列、及び標的ＤＮＡは、実施例１と同一のものを用いた。反応溶液は、Ｃａｓ９タンパク質の濃度を０．０５ｐｍｏｌ（５０ｎＭ）にした以外は実施例１と同じ配合（表３）のものを用い、反応時間を１０分間又は２０分間とした。結果を図６に示す。【０１９５】
図６が示すとおり、Ｄ１０２２Ｎ／Ｋ１０４０Ｅ変異型ＢｌＣａｓ９は、５番目がＧであるＰＡＭ配列４を含む標的ＤＮＡのみを特異的に切断し、一方でその他のＰＡＭ配列を含む標的ＤＮＡは、反応２０分後にも切断されなかった。【０１９６】
以上から、Ｄ１０２２Ｎ／Ｋ１０４０Ｅ変異型ＢｌＣａｓ９では、認識するＰＡＭ配列がＣからＧに改変されたことが示された。また、Ｄ１０２２Ｎ／Ｋ１０４０Ｅ変異型ＢｌＣａｓ９を用いて、簡便かつ迅速に、標的配列に対する標的二本鎖ポリヌクレオチドの特異的切断を導入することができることが示された。【０１９７】
５番目のＤ（Ａ、Ｇ、Ｔ）を認識するＤ１０２２Ｎ変異型ＢｌＣａｓ９と、５番目のＧを認識するＤ１０２２Ｎ／Ｋ１０４０Ｅ変異型ＢｌＣａｓ９とを組み合わせて用いることにより、実質的にＰＡＭ配列の５番目の塩基に関する制限が解消された。【０１９８】
［実施例３］ガイドＲＮＡの長さと切断活性の関係
１．ガイドＲＮＡの調製
標的塩基配列に相補的な部分の長さが異なる以外は同一の配列及び構造を有する３種類のガイドＲＮＡを調製した。具体的には、標的ＤＮＡ配列中のＰＡＭ配列の１塩基上流から２０塩基まで（ガイドＲＮＡ（２０ｂｐ）：配列番号９）、１塩基上流から２２塩基まで（ガイドＲＮＡ（２２ｂｐ）：配列番号１１）、及び１塩基上流から２４塩基まで（ガイドＲＮＡ（２４ｂｐ）：配列番号１２）の塩基配列に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドを５’末端領域に含むものである。【０１９９】
２．プラスミドＤＮＡ切断活性測定試験
野生型ＢｌＣａｓ９、ＰＡＭ配列１、及び標的ＤＮＡは、実施例１と同一のものを用いた。反応溶液は実施例１と同じ配合（表３）のものを用い、反応時間は２分間又は５分間とした。結果を図７に示す。【０２００】
図７に示すとおり、２分間及び５分間のいずれの反応時間においても、ガイドＲＮＡの長さが２２ｂｐ、２０ｂｐ、２４ｂｐの順で、良好な切断活性が得られた。このことから、ＢｌＣａｓ９と共に用いるガイドＲＮＡの長さは、２０ｐｂ〜２４ｂｐの間の長さ、好ましくは２２ｂｐとすることが効果的であることが示された。【０２０１】
［実施例４］ＤＮＡ認識を向上させる変異
１．変異型ＢｌＣａｓ９の調製
実施例１と同様の方法により、以下の変異を有する各種改変ＢｌＣａｓ９をそれぞれ調製した。
・Ｅ５２Ｒ
・Ｅ５２Ｋ
・Ｓ５５Ｋ
・Ｓ８４４Ｎ
・Ｋ９９７Ｒ
・Ｅ５２Ｒ及びＳ８４３Ｎ
・Ｅ５２Ｒ及びＫ９９７Ｒ
・Ｅ５２Ｒ及びＫ１０４０Ｒ
・Ｅ５２Ｋ及びＳ８４４Ｎ
・Ｅ５２Ｋ及びＫ９９７Ｒ
・Ｅ５２Ｋ及びＫ１０４０Ｒ
・Ｓ５５Ｋ及びＫ９９７Ｒ
・Ｓ５５Ｋ及びＫ１０４０Ｒ
・Ｓ５５Ｋ、Ｅ５２Ｒ、及びＫ９９７Ｒ
・Ｓ５５Ｋ、Ｅ５２Ｋ、及びＫ９９７Ｒ
・Ｅ５２Ｒ、Ｓ８４３Ｎ、及びＫ９９７Ｒ
・Ｅ５２Ｋ、Ｓ８４３Ｎ、及びＫ９９７Ｒ【０２０２】
２．プラスミドＤＮＡ切断活性測定試験
ガイドＲＮＡ、ＰＡＭ配列１、及び標的ＤＮＡは、実施例１と同一のものを用いた。反応溶液は実施例１と同じ配合（表３）のものを用い、反応時間は３０秒間、１分間、又は２分間とした。２分後の全改変ＢｌＣａｓ９の結果を図８に示す。また、特に単変異体（変異を１箇所にのみ有する）について図９に、二重変異体（変異を２箇所に有する）について図１０に、３０秒後及び１分後における結果も併せて示す。【０２０３】
図８からわかるとおり、本実施例で試験した全ての変異型ＢｌＣａｓ９について、野生型と比較して切断活性が向上していることが観察された。また、図９及び図１０からわかるとおり、一部の変異型ＢｌＣａｓ９では、３０秒後、１分後といった時点において既に野生型と比較して十分な活性が観察されたものもあり、これらの変異型ＢｌＣａｓ９を用いて、野生型ＢｌＣａｓ９よりも簡便かつ迅速に、標的配列に対する標的二本鎖ポリヌクレオチドの特異的切断を導入できる可能性が示された。【０２０４】
［実施例５］ＰＡＭ配列の８番目の認識の嗜好性緩和
実施例４で使用したＥ５２Ｒ／Ｓ８４３Ｎ変異型ＢｌＣａｓ９について、ＰＡＭ配列の８番目の塩基の嗜好性をさらに試験した。【０２０５】
１．プラスミドＤＮＡ切断活性測定試験
標的ＤＮＡ及びガイドＲＮＡは、実施例１と同一のものを用いた。実施例１と同様に、標的ＤＮＡ配列及びＰＡＭ配列が挿入されたベクターの作製を行った。使用したＰＡＭ配列を以下に示す。【０２０６】
【表４】
2019194320.tif 000005
【０２０７】
反応溶液は実施例１と同じ配合（表３）のものを用い、反応時間は２分間、５分間、又は３０分間とした。結果を図１１に示す。【０２０８】
図１１からわかるとおり、Ｅ５２Ｒ／Ｓ８４３Ｎ変異型ＢｌＣａｓ９は、試験した全てのＰＡＭ配列について、遅くとも３０分後には４０％以上の切断活性を示した。この結果から、野生型ＢｌＣａｓ９では、認識できるＰＡＭ配列の８番目の塩基が「Ｄ」であるのに対し、Ｅ５２Ｒ／Ｓ８４３Ｎ変異型ＢｌＣａｓ９は、ＰＡＭ配列の８番目の塩基が「Ｎ」、すなわちＡ、Ｔ、Ｃ、Ｇのいずれであっても標的ＤＮＡを認識できることが理解される。【０２０９】
［実施例６］ＰＡＭ配列の７番目及び８番目の塩基の認識の嗜好性緩和
１．変異型ＢｌＣａｓ９の調製
実施例１と同様の方法により、実施例４で使用したＥ５２Ｒ／Ｓ８４３Ｎ／Ｋ９９７Ｒ変異に加えて、ＰＡＭ配列における７番目及び８番目の塩基の認識の嗜好性を緩和する以下の変異を有する各種改変ＢｌＣａｓ９をそれぞれ調製した。
・Ｋ９５９Ａ
・Ｋ９９２Ａ
・Ｋ９５９Ａ及びＫ９９２Ａ
・Ｔ１０２５Ａ【０２１０】
２．プラスミドＤＮＡ切断活性測定試験
標的ＤＮＡ及びガイドＲＮＡは、実施例１と同一のものを用いた。実施例１と同様に、標的ＤＮＡ配列及びＰＡＭ配列が挿入されたベクターの作製を行った。使用したＰＡＭ配列を以下に示す。【０２１１】
【表５】
2019194320.tif 000006
【０２１２】
反応溶液は実施例１と同じ配合（表３）のものを用い、反応時間は５分間、１５分間、又は３０分間とした。結果を図１２に示す。また、Ｔ１０２５Ａ変異について定量化したものを図１３に示す。【０２１３】
図１２に示されるとおり、本実施例で試験した全ての変異型ＢｌＣａｓ９について、遅くとも反応開始３０分後には、７番目及び８番目の塩基が「ＡＡ」、「ＣＡ」、又は「ＡＣ」であるＰＡＭ配列を有する標的ＤＮＡの少なくとも一部が切断されたことを示す２本のバンドが観察された。中でもＴ１０２５Ａ変異型ＢｌＣａｓ９は特に切断活性が高く、図１３からわかるとおり、５分間の反応時間では９０％以上、１５分間の反応時間ではほぼ１００％の切断活性を示した。【０２１４】
野生型ＢｌＣａｓ９では、認識できるＰＡＭ配列の７番目及び８番目の塩基の塩基が「ＤＤ」であるのに対し、本実施例で試験した変異型ＢｌＣａｓ９は、野生型ＢｌＣａｓ９が認識する「ＡＡ」に加えて、野生型ＢｌＣａｓ９が認識することができない「ＣＡ」及び「ＡＣ」というＰＡＭ配列も認識することができた。したがって、本実施例で試験した全ての変異体、特にＴ１０２５Ａ変異型ＢｌＣａｓ９は、ＰＡＭ配列の７番目及び８番目の塩基の認識の嗜好性が緩和されていることが理解される。【０２１５】
［実施例７］ガイドＲＮＡ認識を向上させる変異
１．変異型ＢｌＣａｓ９の調製
実施例１と同様の方法により、以下の変異を有する各種改変ＢｌＣａｓ９をそれぞれ調製した：Ｈ７２Ｋ、Ｑ９３Ｋ、Ｅ９５Ｋ、Ｈ１７５Ｋ、Ｔ８１１Ｋ、Ｓ１０７５Ｋ、及びＤ１０７６Ｋ。【０２１６】
２．プラスミドＤＮＡ切断活性測定試験
ガイドＲＮＡ、ＰＡＭ配列１、及び標的ＤＮＡは、実施例１と同一のものを用いた。Ｈ７２Ｋ、Ｑ９３Ｋ、Ｅ９５Ｋ、及びＴ８１１Ｋについては、Ｃａｓ９の濃度を０．０５ｐｍｏｌ（５０ｎＭ）とし、それ以外は実施例１と同じ配合（表３）のものを用い、反応時間を１分間、２分間、又は１０分間とした。Ｈ１７５Ｋ、Ｓ１０７５Ｋ、及びＤ１０７６Ｋについては、Ｃａｓ９の濃度を０．０２ｐｍｏｌ（２０ｎＭ）とした以外は実施例１と同じ配合（表３）のものを用い、反応時間は２分間、５分間、又は１５分間とした。結果を図１４及び図１５に示す。【０２１７】
図１４及び図１５からわかるとおり、ガイドＲＮＡ認識を向上させる変異を導入することにより、複数の変異型ＢｌＣａｓ９において、野生型ＢｌＣａｓ９よりも優れたＤＮＡ切断活性が観察された。【０２１８】
［実施例８］ＰＡＭ配列の５番目、７番目、及び／又は８番目の塩基の認識の広範化
１．変異型ＢｌＣａｓ９の調製
実施例１と同様の方法により、以下の変異の組合せを有する各種改変ＢｌＣａｓ９をそれぞれ調製した。
・Ｓ５５Ｋ／Ｅ９０４Ｒ／Ｄ１０２２Ｎ（ＫＲＮ変異）
・Ｓ５５Ｋ／Ｅ９０４Ｒ／Ｔ１０２５Ａ（ＫＲＡ変異）
・Ｓ５５Ｋ／Ｅ９０４Ｒ／Ｄ１０２２Ｎ／Ｔ１０２５Ａ（ＫＲＮＡ変異）【０２１９】
２．ＰＡＭ配列の５番目の塩基の認識に関するプラスミドＤＮＡ切断活性測定試験
野生型ＢｌＣａｓ９と、実施例１で作製したＤ１０２２Ｎ変異型ＢｌＣａｓ９、並びに上記ＫＲＮ変異及びＫＲＮＡ変異の各変異型ＢｌＣａｓ９とを用いて、プラスミドＤＮＡ切断活性試験を行い、ＰＡＭ配列の５番目の塩基の認識を評価した。【０２２０】
ガイドＲＮＡ、ＰＡＭ配列１〜４、及び標的ＤＮＡは、実施例１と同一のものを用いた。反応溶液は実施例１と同じ配合（表３）のものを用い、反応時間は０．５分間（３０秒間）、又は２分間とした。結果を図１６Ａ〜Ｄに示す。バーは標準誤差（ＳＥ）を表す。【０２２１】
野生型ＢｌＣａｓ９は、５番目の塩基がＣであるＰＡＭ配列を含む標的ＤＮＡを特異的に切断した（図１６Ａ）が、一方で、Ｄ１０２２Ｎ変異を導入した変異型ＢｌＣａｓ９は、５番目の塩基がＡ、Ｔ、又はＧであるＰＡＭ配列を含む標的ＤＮＡを特異的に切断し（図１６Ｂ）、この変異によりＰＡＭ配列の５番目の塩基の認識が「Ｃ」から「Ｄ」（Ａ、Ｔ、又はＧ）に改変されたことが示された。また、Ｄ１０２２Ｎ変異に加えてＳ５５Ｋ／Ｅ９０４Ｒの各変異を導入した変異型ＢｌＣａｓ９（ＫＲＮ変異）では、Ｄ１０２２Ｎ変異のみを導入した変異型ＢｌＣａｓ９と比較して、ＰＡＭ配列の認識活性が全体的に向上した（図１６Ｃ）。さらに、ＫＲＮＡ変異を導入した変異型ＢｌＣａｓ９では、ＰＡＭ配列の５番目の塩基の種類に関わらず、全ての標的ＤＮＡを高い活性で切断することができ（図１６Ｄ）、この変異の組合せにより５番目のＰＡＭ配列の認識が「Ｃ」から「Ｎ」（Ｃ、Ａ、Ｔ、及びＧ）に改変されたことが示された。【０２２２】
３．ＰＡＭ配列の７番目及び８番目の塩基の認識に関するプラスミドＤＮＡ切断活性測定試験
野生型ＢｌＣａｓ９と、実施例３で作製したＴ１０２５Ａ変異型ＢｌＣａｓ９、並びに上記ＫＲＡ変異及びＫＲＮＡ変異の各変異型ＢｌＣａｓ９とを用いて、プラスミドＤＮＡ切断活性試験を行い、ＰＡＭ配列の７番目及び８番目の塩基の認識を評価した。【０２２３】
標的ＤＮＡ及びガイドＲＮＡは、実施例１と同一のものを用いた。実施例１と同様に、標的ＤＮＡ配列及びＰＡＭ配列が挿入されたベクターの作製を行った。使用したＰＡＭ配列を以下に示す。【０２２４】
【表６】
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【０２２５】
反応溶液は実施例１と同じ配合（表３）のものを用い、反応時間は０．５分間（３０秒間）、又は２分間とした。結果を図１７Ａ〜Ｄに示す。バーは標準誤差（ＳＥ）を表す。【０２２６】
野生型ＢｌＣａｓ９は、７番目又は８番目の塩基が「Ｃ」であるＰＡＭ配列を含む標的ＤＮＡをほとんど切断することができなかった（図１７Ａ）。一方、Ｔ１０２５Ａ変異を導入した変異型ＢｌＣａｓ９、及びＫＲＮＡ変異を導入した変異型ＢｌＣａｓ９では、ＰＡＭ配列の認識活性向上し（図１７Ｂ、Ｄ）、Ｔ１０２５Ａ変異がＰＡＭ配列の７番目及び８番目の塩基の認識を緩和することが示された。さらに、ＫＲＡ変異を導入した変異型ＢｌＣａｓ９では、全ての組合せの７番目及び８番目のＰＡＭ塩基を含む標的ＤＮＡを切断することができ（図１７Ｃ）、この変異の組合せにより、ＰＡＭ配列の７番目及び８番目の塩基の嗜好性が「Ｄ」（Ａ、Ｔ、及びＧ）から「Ｎ」（Ａ、Ｔ、Ｃ、及びＧ）に広範化されたことが示された。【０２２７】
［実施例９］哺乳動物細胞における変異型ＢｌＣａｓ９を用いたゲノム編集
実施例１〜８では、変異型ＢｌＣａｓ９のＤＮＡ切断活性を、プラスミドＤＮＡを用いたｉｎ  ｖｉｔｒｏ試験で確認した。本実施例では、変異型ＢｌＣａｓ９が実際に哺乳動物細胞において（すなわちｉｎ  ｖｉｖｏで）染色体ゲノムを編集することができることを確認した。【０２２８】
１．哺乳動物細胞へのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系の導入
本実施例においては、ヒトコドン最適化（ｈｕｍａｎ  ｃｏｄｏｎ  ｏｐｔｉｍｉｚｅ）したＢｌＣａｓ９を使用した。Ｃａｓ９タンパク質のヒトコドン最適化は、当業者に周知の手法を用いて行うことができる。例えば、コドン最適化配列の例として国際公開第２０１４／０９３６２２号パンフレット（ＰＣＴ／ＵＳ２０１３／０７４６６７号明細書）のＳａＣａｓ９ヒトコドン最適化配列を参照されたい。【０２２９】
まず、ヒトコドン最適化した野生型ＢｌＣａｓ９又はＤ１０２２Ｎ変異型ＢｌＣａｓ９をコードする遺伝子と、ガイドＲＮＡをコードする遺伝子とをベクターに組み込み、ＢｌＣａｓ９タンパク質とガイドＲＮＡとを哺乳動物細胞内で発現させるためのプラスミドを作製した。ガイドＲＮＡは、実施例１と同一のものを用いた。次に、哺乳類細胞に、作製したプラスミドをトランスフェクションした。トランスフェクションの７２時間後に、細胞からゲノムＤＮＡを抽出し、次世代シーケンサーを用いて、ゲノムに導入された一塩基置換及びｉｎｄｅｌ（挿入又は欠失）を検出した。また、対照として、ＳｐＣａｓ９を用い、同様の実験を行った。結果を図１８に示す。【０２３０】
図１８に示されるように、野生型ＢｌＣａｓ９は、哺乳動物細胞において、ＰＡＭ配列ＴＴＧＧＣＡＡを含む標的配列に対して、１塩基置換、及び挿入又は欠失の両方のタイプのゲノム編集を行うことができた。また、Ｄ１０２２Ｎ変異型ＢｌＣａｓ９は、前記ＰＡＭ配列の５番目の塩基が「Ｇ」であるＰＡＭ配列を特異的に認識し、野生型ＢｌＣａｓ９同様に、１塩基置換、及び挿入又は欠失の両方のタイプのゲノム編集を行うことができた。本実施例の結果から、本発明のＢｌＣａｓ９タンパク質が哺乳動物細胞においても機能すること、及び、哺乳動物細胞においても、ＢｌＣａｓ９タンパク質への変異の導入によるＰＡＭ配列の認識の改変が維持されていることが示された。
【産業上の利用可能性】
【０２３１】
本発明によれば、標的二本鎖ポリヌクレオチドへの結合力を保ちながら、ＰＡＭ配列の認識が広範化されたＣａｓ９タンパク質を提供することができる。また、本発明によれば、ガイドＲＮＡ及び／又はＤＮＡ認識が向上されたＣａｓ９タンパク質を提供することができ、さらに、前記Ｃａｓ９タンパク質を利用した、標的配列に特異的なゲノム編集技術及び遺伝子発現調節の簡便且つ迅速な方法を提供することができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６Ａ】
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【図１６Ｂ】
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【図１６Ｃ】
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【図１６Ｄ】
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【図１７Ａ】
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【図１７Ｂ】
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【図１７Ｃ】
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【図１７Ｄ】
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【図１８】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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