(57)【要約】  培養容器内の培養液中に浮遊している同一の細胞に対して、異なる視点から見た互いに視差がある２つの像を結像させるステレオ光学系（２５）と、ステレオ光学系（２５）によって結像された２つの像をそれぞれ撮影する撮像素子（２７）と、撮像素子（２７）によって取得された２つの像の各画像に含まれる細胞の位置を特定し、所定の領域内に存在する細胞の数に基づいて、培養液内の細胞密度を算出する画像解析部とを備える観察装置である。
2019235563.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
培養容器内の培養液中に浮遊する細胞を撮像するステレオ撮像光学系と、
該ステレオ撮像光学系によって取得された複数の画像に基づいて、前記細胞の細胞密度を算出する画像解析部と、
を備える観察装置。
【請求項２】
前記ステレオ撮像光学系が、前記培養液中に浮遊している同一の細胞に対して、異なる視点から見た互いに視差がある２つの像を結像させるステレオ光学系と、
該ステレオ光学系によって結像された２つの前記像をそれぞれ撮影する撮像素子とを備え、
前記画像解析部が、前記撮像素子によって取得された２つの前記像の各画像に含まれている前記細胞の位置を特定し、所定の領域内に存在する前記細胞の数に基づいて、前記細胞密度を算出する請求項１に記載の観察装置。
【請求項３】
前記ステレオ光学系が、前記細胞からの光を集光する対物光学系と、該対物光学系により集光された光を分割する絞り開口部と、該絞り開口部により分割された光を偏向するプリズムとを備える請求項２に記載の観察装置。
【請求項４】
前記ステレオ光学系が、前記細胞からの光を集光する対物光学系と、該対物光学系により集光された光を分割する絞り開口部と、該絞り開口部により分割された光をそれぞれ別個に結像させる結像光学系とを備える請求項２に記載の観察装置。
【請求項５】
前記ステレオ光学系が、前記細胞からの光を集光することによって２つの前記像に分割するプリズムを備える請求項２に記載の観察装置。
【請求項６】
前記ステレオ光学系の前記視点の配列方向に対して交差する方向に角度を付けて前記細胞に照明光を照射する偏射照明部を備える請求項２から請求項５のいずれかに記載の観察装置。
【請求項７】
光学的に透明な材質からなる平行平板状の観察窓を側面に有する前記培養容器を備え、
前記ステレオ光学系が、前記培養容器の外側に配置され、前記細胞から前記観察窓を透過して前記培養容器外に出射された光を結像させる請求項２から請求項５のいずれかに記載の観察装置。
【請求項８】
前記細胞からの光を偏向することによって前記培養容器外に出射するプリズムを側面に有する前記培養容器を備え、
前記ステレオ光学系が、前記培養容器の外側に配置され、前記プリズムによって前記培養容器外に出射された光を結像させる請求項２から請求項５のいずれかに記載の観察装置。
【請求項９】
前記培養容器内を該培養容器の深さ方向に延びる中空の攪拌軸と、該攪拌軸回りに回転する攪拌翼とを備え、該攪拌翼が前記攪拌軸回りに回転することによって前記培養液を攪拌する攪拌機構とを備え、
前記攪拌軸が、光学的に透明な材質からなる平行平板状の観察窓を有し、
前記ステレオ光学系が、前記攪拌軸内に収納され、前記観察窓を透過して前記攪拌軸内に入射する前記細胞からの光を結像させる請求項２から請求項５のいずれかに記載の観察装置。
【請求項１０】
前記攪拌軸の径方向外方から前記観察窓に向けて照明光を発する光源を備え、
前記ステレオ光学系が、前記攪拌軸回りに回転しない請求項９に記載の観察装置。
【請求項１１】
前記攪拌軸の径方向外方から前記観察窓に向けて照明光を発する光源を備え、
前記ステレオ光学系が、前記攪拌軸とともに該攪拌軸回りに回転する請求項９に記載の観察装置。
【請求項１２】
前記攪拌軸の径方向外方における周方向の全域から前記観察窓に向けて照明光を発する光源を備え、
前記ステレオ光学系が、前記攪拌軸とともに該攪拌軸回りに回転する請求項９に記載の観察装置。
【請求項１３】
前記培養容器内を該培養容器の深さ方向に延びる攪拌軸と、該攪拌軸回りに回転する攪拌翼とを備え、該攪拌翼が前記攪拌軸回りに回転することによって前記培養液を攪拌する攪拌機構と、
前記攪拌軸に該攪拌軸と共に回転可能に設けられ、前記攪拌軸の径方向外方に向けて照明光を発する複数の光源とを備え、
これら複数の光源が、前記攪拌軸の周方向に配列されている請求項７に記載の観察装置。
【請求項１４】
前記培養容器内を該培養容器の深さ方向に延びる中空の攪拌軸と、該攪拌軸回りに回転する攪拌翼とを備え、該攪拌翼が前記攪拌軸回りに回転することによって前記培養液を攪拌する攪拌機構と、
前記攪拌軸内に収納され、該攪拌軸と共に回転しながら前記攪拌軸の周方向の全周から径方向外方に向けて照明光を発する光源とを備え、
前記攪拌軸が、前記光源の周囲を囲む光学的に透明な材質からなる環状の透過窓を有する請求項７に記載の観察装置。
【請求項１５】
前記培養容器内を該培養容器の深さ方向に延びる中空の攪拌軸と、該攪拌軸回りに回転する攪拌翼とを備え、該攪拌翼が前記攪拌軸回りに回転することによって前記培養液を攪拌する攪拌機構と、
該攪拌機構の前記攪拌軸内に収納され、前記観察窓に向けて照明光を発する光源とを備え、
前記攪拌軸が、前記光源の周囲を囲む光学的に透明な材質からなる環状の透過窓を有し、
前記光源が、前記攪拌軸回りに回転しない請求項７に記載の観察装置。
【請求項１６】
前記培養容器内を該培養容器の深さ方向に延びる攪拌軸と、該攪拌軸回りに回転する攪拌翼とを備え、該攪拌翼が前記攪拌軸回りに回転することによって前記培養液を攪拌する攪拌機構と、
前記培養容器の外側に、前記攪拌軸を挟んで該攪拌軸の径方向に前記観察窓と対向して配置され、前記観察窓に向けて照明光を発する光源とを備え、
前記培養容器が、前記光源から発せられた前記照明光を透過させる平行平板状の照明窓を前記側面に有し、
前記攪拌軸の前記照明光の光路上に配置される領域が光学的に透明な材質によって形成されている請求項７に記載の観察装置。
【請求項１７】
前記培養容器内を該培養容器の深さ方向に延びる攪拌軸と、該攪拌軸回りに回転する攪拌翼とを備え、該攪拌翼が前記攪拌軸回りに回転することによって前記培養容器内の前記培養液を攪拌する攪拌機構と、
前記培養容器の外側に配置され、前記攪拌軸に向けて照明光を発する光源とを備え、
前記培養容器が、前記光源から発せられた前記照明光を透過させる平行平板状の照明窓を前記側面に有し、
前記攪拌軸の前記照明光の光路上に配置される領域が、前記照明光を前記観察窓に向けて反射する材質によって形成されている請求項７に記載の観察装置。
【請求項１８】
前記培養容器内を該培養容器の深さ方向に延びる攪拌軸と、該攪拌軸回りに回転する攪拌翼とを備え、該攪拌翼が前記攪拌軸回りに回転することによって前記培養液を攪拌する攪拌機構と、
前記培養容器の外側において、前記攪拌機構を挟み、かつ、前記攪拌軸の径方向に位置をずらして前記観察窓に対向して配置され、前記観察窓に向けて照明光を発する光源とを備え、
前記培養容器が、前記光源から発せられた前記照明光を透過させる平行平板状の照明窓を前記側面に有し、
前記光源から発せられた前記照明光が、前記攪拌翼に対して前記攪拌軸の長手方向にずれた位置を通過して前記観察窓に入射される請求項７に記載の観察装置。
【請求項１９】
前記培養容器内を該培養容器の深さ方向に延びる攪拌軸と、該攪拌軸回りに回転する攪拌翼とを備え、該攪拌翼が前記攪拌軸回りに回転することによって前記培養液を攪拌する攪拌機構と、
前記培養容器の外側において、前記攪拌機構を挟み、かつ、前記攪拌軸の径方向に位置をずらして前記観察窓に対向して配置され、前記観察窓に向けて照明光を発する光源とを備え、
前記培養容器が、前記光源から発せられた前記照明光を透過させる平行平板状の照明窓を有し、
前記攪拌翼が、少なくとも一部が光学的に透明な材質によって形成され、
前記光源から発せられた前記照明光が、前記攪拌翼の前記光学的に透明な材質によって形成された領域を透過して、前記観察窓に入射される請求項７に記載の観察装置。
【請求項２０】
前記培養容器内を該培養容器の深さ方向に延びる攪拌軸と、該攪拌軸回りに回転する攪拌翼とを備え、該攪拌翼が前記攪拌軸回りに回転することによって前記培養容器内の前記培養液を攪拌する攪拌機構と、
前記培養容器の外側に配置され、前記攪拌翼に向けて照明光を発する光源とを備え、
前記培養容器が、前記光源から発せられた前記照明光を透過させる平行平板状の照明窓を前記側面に有し、
前記攪拌翼の前記照明光の光路上に配置される領域が、前記照明光を前記観察窓に向けて反射する材質によって形成されている請求項７に記載の観察装置。
【請求項２１】
光学的に透明な材質からなる平行平板状の観察窓を底面に有する前記培養容器と、
該培養容器の上面に配置され、前記観察窓に向けて照明光を発する光源とを備え、
前記ステレオ光学系が、前記培養容器の外側に配置され、前記細胞から前記観察窓を透過して前記培養容器外に出射された光を結像させる請求項２から請求項５のいずれかに記載の観察装置。
【請求項２２】
前記光源が、前記観察窓に向けて、前記ステレオ光学系の前記視点の配列方向に対して交差する方向に角度を付けて前記照明光を照射する請求項１０から請求項２１のいずれかに記載の観察装置。
【請求項２３】
前記培養容器がバイオリアクタであって、
前記ステレオ撮像光学系が、前記バイオリアクタ中で浮遊する前記細胞を撮像する請求項１から請求項２２のいずれかに記載の観察装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、観察装置に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
近年、ｉＰＳ細胞（人工多能性幹細胞）をはじめとする再生医療分野において、細胞培養のスケールアップが望まれている。細胞の大量生産に向けて、従来のウェルプレートやディッシュと呼ばれる容器を用いた接着培養から、バイオリアクタと呼ばれる浮遊培養容器を用いた浮遊培養に変わりつつある。浮遊培養容器を用いた浮遊培養は、浮遊培養容器内において液体を攪拌することによって細胞を液体中に浮遊させた状態で培養する。【０００３】
浮遊培養容器を用いた細胞の観察方法としては、例えば、特許文献１に記載された方法が知られている。特許文献１に記載の方法は、浮遊培養容器の外側に配置された照明装置および撮像装置により、浮遊培養容器内の液体中に浮遊している細胞の画像を取得する。そして、画像解析と予め入力されたパラメータとを用いた演算処理により、細胞の粒径分布と総細胞数とを算出する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２０１７−１４０００６号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかしながら、浮遊培養容器は用途に応じて多種多様な形状、大きさ、攪拌羽根および材質等があるため、全ての浮遊培養容器に対して、浮遊培養容器の外側から常に同じ向きで同じ方向から、同じ範囲を照明することによって細胞を観察するということができない。そのため、使用する浮遊培養容器によっては、安定した撮影条件で画像を得ることが難しく、画像解析の精度が大きく低下してしまう虞がある。特に、細胞数や細胞密度の解析に至っては、照明範囲等の撮影条件の変化により、細胞密度等の精度が大きく低下してしまうという問題がある。【０００６】
本発明は、上述した事情に鑑みてなされたものであって、浮遊培養中の培養液内の細胞密度を精度よく測定することができる観察装置を提供することを目的としている。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
上記目的を達成するために、本発明は以下の手段を提供する。
本発明の一態様は、培養容器内の培養液中に浮遊する細胞を撮像するステレオ撮像光学系と、該ステレオ撮像光学系によって取得された複数の画像に基づいて、前記細胞の細胞密度を算出する画像解析部とを備える観察装置である。【０００８】
本態様によれば、ステレオ撮像光学系により、ステレオ撮像光学系からの距離に応じて同一の細胞の位置がずれた複数の画像が取得される。したがって、これらの画像に基づいて、各細胞の３次元的な位置が分かるので、画像解析部により、培養液内の細胞密度を精度よく算出することができる。【０００９】
上記態様に係る観察装置は、前記ステレオ撮像光学系が、前記培養液中に浮遊している同一の細胞に対して、異なる視点から見た互いに視差がある２つの像を結像させるステレオ光学系と、該ステレオ光学系によって結像された２つの前記像をそれぞれ撮影する撮像素子とを備え、前記画像解析部が、前記撮像素子によって取得された２つの前記像の各画像に含まれている前記細胞の位置を特定し、所定の領域内に存在する前記細胞の数に基づいて、前記細胞密度を算出することとしてもよい。【００１０】
ステレオ光学系により、培養液中の同一の細胞に対して、異なる視点から見た互いに視差がある２つの像を結像させることによって、撮像素子により取得されるこれら２つの像の画像間で、ステレオ光学系からの距離に応じて同一の細胞の位置がずれる。すなわち、ステレオ光学系からの距離が近い細胞ほど画像間のずれ量が小さく、遠い細胞ほど画像間のずれ量が大きくなる。【００１１】
したがって、各細胞の３次元的な位置が分かるので、画像解析部により、所定の領域内に含まれる細胞と含まれない細胞とを正確に区別して、培養液内の細胞密度を算出することができる。よって、使用する培養容器の形状および大きさ等に関わらず、浮遊培養中の培養液内の細胞密度を精度よく測定することができる。【００１２】
上記態様に係る観察装置は、前記ステレオ光学系が、前記細胞からの光を集光する対物光学系と、該対物光学系により集光された光を分割する絞り開口部と、該絞り開口部により分割された光を偏向するプリズムとを備えることとしてもよい。【００１３】
上記態様に係る観察装置は、前記ステレオ光学系が、前記細胞からの光を集光する対物光学系と、該対物光学系により集光された光を分割する絞り開口部と、該絞り開口部により分割された光をそれぞれ別個に結像させる結像光学系とを備えることとしてもよい。【００１４】
上記態様に係る観察装置は、前記ステレオ光学系が、前記細胞からの光を集光することによって２つの前記像に分割するプリズムを備えることとしてもよい。【００１５】
上記態様に係る観察装置は、前記ステレオ光学系の前記視点の配列方向に対して交差する方向に角度を付けて前記細胞に照明光を照射する偏射照明部を備えることとしてもよい。
この構成によって、培養液中と細胞内との屈折率が異なるため、培養液と細胞との境界で光が曲げられる。この場合において、瞳の外側を通る方向に光が曲がった部分は像面で暗くなり、瞳の内側を通る方向に光が曲がった部分は像面で明るくなる。したがって、細胞のコントラストを向上した画像を取得することができる。【００１６】
上記態様に係る観察装置は、光学的に透明な材質からなる平行平板状の観察窓を側面に有する前記培養容器を備え、前記ステレオ光学系が、前記培養容器の外側に配置され、前記細胞から前記観察窓を透過して前記培養容器外に出射された光を結像させることとしてもよい。【００１７】
この構成によって、培養容器の培養液や細胞の流れがステレオ光学系によって邪魔されずに済む。この場合において、細胞からの光を平行平板状の観察窓を透過させてステレオ光学系に入射させることにより、収差の発生を抑制することができる。【００１８】
上記態様に係る観察装置は、前記細胞からの光を偏向することによって前記培養容器外に出射するプリズムを側面に有する前記培養容器を備え、前記ステレオ光学系が、前記培養容器の外側に配置され、前記プリズムによって前記培養容器外に出射された光を結像させることとしてもよい。【００１９】
この構成によって、培養容器の培養液や細胞の流れがステレオ光学系によって邪魔されずに済む。この場合において、細胞からの光をプリズムによって偏向することにより、ステレオ光学系の光軸に交差する方向から発せられる細胞の光をステレオ光学系に入射させることができる。【００２０】
上記態様に係る観察装置は、前記培養容器内を該培養容器の深さ方向に延びる中空の攪拌軸と、該攪拌軸回りに回転する攪拌翼とを備え、該攪拌翼が前記攪拌軸回りに回転することによって前記培養液を攪拌する攪拌機構とを備え、前記攪拌軸が、光学的に透明な材質からなる平行平板状の観察窓を有し、前記ステレオ光学系が、前記攪拌軸内に収納され、前記観察窓を透過して前記攪拌軸内に入射する前記細胞からの光を結像させることとしてもよい。
この構成によって、攪拌機構の攪拌軸内のスペースを利用して、培養容器内にステレオ光学系を配置することができる。【００２１】
上記態様に係る観察装置は、前記攪拌軸の径方向外方から前記観察窓に向けて照明光を発する光源を備え、前記ステレオ光学系が、前記攪拌軸回りに回転しないこととしてもよい。
この構成によって、攪拌軸の回転中において、観察窓がステレオ光学系の入射位置に重なったときに撮影される。この場合において、ステレオ光学系が回転しないので、構成をシンプルにすることができる。また、攪拌軸内にステレオ光学系を収納することによって、ステレオ光学系が培養液および細胞の流れの邪魔にならずに済む。【００２２】
上記態様に係る観察装置は、前記攪拌軸の径方向外方から前記観察窓に向けて照明光を発する光源を備え、前記ステレオ光学系が、前記攪拌軸とともに該攪拌軸回りに回転することとしてもよい。
この構成によって、攪拌軸の回転中において、観察窓およびステレオ光学系の入射位置が光源と対向したときに撮影される。この場合において、ステレオ光学系が攪拌軸と共に回転することによって、培養液および細胞の流れに撮影領域を追従させることができる。【００２３】
上記態様に係る観察装置は、前記攪拌軸の径方向外方における周方向の全域から前記観察窓に向けて照明光を発する光源を備え、前記ステレオ光学系が、前記攪拌軸とともに該攪拌軸回りに回転することとしてもよい。
この構成によって、光源から照明光を発生させるタイミングと観察窓およびステレオ光学系の入射位置を光源に対向させるタイミングとを合わせる必要がなく、常時撮影することができる。【００２４】
上記態様に係る観察装置は、前記培養容器内を該培養容器の深さ方向に延びる攪拌軸と、該攪拌軸回りに回転する攪拌翼とを備え、該攪拌翼が前記攪拌軸回りに回転することによって前記培養液を攪拌する攪拌機構と、前記攪拌軸に該攪拌軸と共に回転可能に設けられ、前記攪拌軸の径方向外方に向けて照明光を発する複数の光源とを備え、これら複数の光源が、前記攪拌軸の周方向に配列されていることとしてもよい。【００２５】
この構成によって、攪拌軸の回転中において、いずれかの光源が観察窓と対向したときに撮影される。この場合において、ステレオ光学系を攪拌軸内に収納しない分だけ、攪拌軸を細径化することができる。【００２６】
上記態様に係る観察装置は、前記培養容器内を該培養容器の深さ方向に延びる中空の攪拌軸と、該攪拌軸回りに回転する攪拌翼とを備え、該攪拌翼が前記攪拌軸回りに回転することによって前記培養液を攪拌する攪拌機構と、前記攪拌軸内に収納され、該攪拌軸と共に回転しながら前記攪拌軸の周方向の全周から径方向外方に向けて照明光を発する光源とを備え、前記攪拌軸が、前記光源の周囲を囲む光学的に透明な材質からなる環状の透過窓を有することとしてもよい。【００２７】
この構成によって、光源から発せられて攪拌軸の透過窓を透過した照明光が、培養液中の細胞に照射される。そして、細胞を透過した照明光の透過光が、培養容器の観察窓を透過してステレオ光学系に入射される。この場合において、光源が攪拌軸と共に攪拌軸回りに回転しながら、攪拌軸の周方向の全周から径方向外方に向けて照明光を発することによって、１つの光源で常時撮影することができる。【００２８】
上記態様に係る観察装置は、前記培養容器内を該培養容器の深さ方向に延びる中空の攪拌軸と、該攪拌軸回りに回転する攪拌翼とを備え、該攪拌翼が前記攪拌軸回りに回転することによって前記培養液を攪拌する攪拌機構と、該攪拌機構の前記攪拌軸内に収納され、前記観察窓に向けて照明光を発する光源とを備え、前記攪拌軸が、前記光源の周囲を囲む光学的に透明な材質からなる環状の透過窓を有し、前記光源が、前記攪拌軸回りに回転しないこととしてもよい。【００２９】
この構成によって、光源から発せられた照明光が、攪拌軸の透過窓を透過して培養容器内の培養液を経由した後、培養容器の観察窓を透過してステレオ光学系に入射される。この場合において、光源を回転させないので、光源に接続する回路が複雑にならなくて済む。【００３０】
上記態様に係る観察装置は、前記培養容器内を該培養容器の深さ方向に延びる攪拌軸と、該攪拌軸回りに回転する攪拌翼とを備え、該攪拌翼が前記攪拌軸回りに回転することによって前記培養液を攪拌する攪拌機構と、前記培養容器の外側に、前記攪拌軸を挟んで該攪拌軸の径方向に前記観察窓と対向して配置され、前記観察窓に向けて照明光を発する光源とを備え、前記培養容器が、前記光源から発せられた前記照明光を透過させる平行平板状の照明窓を前記側面に有し、前記攪拌軸の前記照明光の光路上に配置される領域が光学的に透明な材質によって形成されていることとしてもよい。【００３１】
この構成によって、光源から発せられて照明窓を透過した照明光が、培養容器内において攪拌軸の光学的に透明な領域を透過した後、光源に対して攪拌軸の径方向に対向して配置された観察窓を透過してステレオ光学系に入射される。この場合において、光源およびステレオ光学系を培養容器の外側に配置することによって、これら光源およびステレオ光学系が培養液および細胞の流れの邪魔にならずに済む。【００３２】
上記態様に係る観察装置は、前記培養容器内を該培養容器の深さ方向に延びる攪拌軸と、該攪拌軸回りに回転する攪拌翼とを備え、該攪拌翼が前記攪拌軸回りに回転することによって前記培養容器内の前記培養液を攪拌する攪拌機構と、前記培養容器の外側に配置され、前記攪拌軸に向けて照明光を発する光源とを備え、前記培養容器が、前記光源から発せられた前記照明光を透過させる平行平板状の照明窓を前記側面に有し、前記攪拌軸の前記照明光の光路上に配置される領域が、前記照明光を前記観察窓に向けて反射する材質によって形成されていることとしてもよい。【００３３】
この構成によって、光源から発せられて照明窓を透過した照明光が、培養容器内において攪拌軸の反射する領域によって反された後、観察窓を透過してステレオ光学系に入射される。この場合において、光源およびステレオ光学系を培養容器の外側に配置することによって、これら光源およびステレオ光学系が培養液および細胞の流れの邪魔にならずに済む。また、培養容器の外側において光源とステレオ光学系を近接した位置に配置することができ、省スペース化を図ることができる。【００３４】
上記態様に係る観察装置は、前記培養容器内を該培養容器の深さ方向に延びる攪拌軸と、該攪拌軸回りに回転する攪拌翼とを備え、該攪拌翼が前記攪拌軸回りに回転することによって前記培養液を攪拌する攪拌機構と、前記培養容器の外側において、前記攪拌機構を挟み、かつ、前記攪拌軸の径方向に位置をずらして前記観察窓に対向して配置され、前記観察窓に向けて照明光を発する光源とを備え、前記培養容器が、前記光源から発せられた前記照明光を透過させる平行平板状の照明窓を前記側面に有し、前記光源から発せられた前記照明光が、前記攪拌翼に対して前記攪拌軸の長手方向にずれた位置を通過して前記観察窓に入射されることとしてもよい。【００３５】
この構成によって、光源から発せられて照明窓を透過した照明光が、攪拌軸および攪拌翼によって遮られることなく培養容器内を通過した後、観察窓を透過してステレオ光学系に入射される。したがって、観察窓および照明窓以外は、従来の培養容器と同様にシンプルな構成にすることができる。【００３６】
上記態様に係る観察装置は、前記培養容器内を該培養容器の深さ方向に延びる攪拌軸と、該攪拌軸回りに回転する攪拌翼とを備え、該攪拌翼が前記攪拌軸回りに回転することによって前記培養液を攪拌する攪拌機構と、前記培養容器の外側において、前記攪拌機構を挟み、かつ、前記攪拌軸の径方向に位置をずらして前記観察窓に対向して配置され、前記観察窓に向けて照明光を発する光源とを備え、前記培養容器が、前記光源から発せられた前記照明光を透過させる平行平板状の照明窓を有し、前記攪拌翼が、少なくとも一部が光学的に透明な材質によって形成され、前記光源から発せられた前記照明光が、前記攪拌翼の前記光学的に透明な材質によって形成された領域を透過して、前記観察窓に入射されることとしてもよい。【００３７】
この構成によって、光源から発せられて照明窓を透過した照明光が、攪拌翼の光学的に透明な領域を透過した後、観察窓を透過してステレオ光学系に入射される。したがって、培養容器内において、攪拌翼が配置されている深さに相当する領域の細胞密度も測定することができる。【００３８】
上記態様に係る観察装置は、前記培養容器内を該培養容器の深さ方向に延びる攪拌軸と、該攪拌軸回りに回転する攪拌翼とを備え、該攪拌翼が前記攪拌軸回りに回転することによって前記培養容器内の前記培養液を攪拌する攪拌機構と、前記培養容器の外側に配置され、前記攪拌翼に向けて照明光を発する光源とを備え、前記培養容器が、前記光源から発せられた前記照明光を透過させる平行平板状の照明窓を前記側面に有し、前記攪拌翼の前記照明光の光路上に配置される領域が、前記照明光を前記観察窓に向けて反射する材質によって形成されていることとしてもよい。【００３９】
この構成によって、光源から発せられて照明窓を透過した照明光が、攪拌翼によって反された後、観察窓を透過してステレオ光学系に入射される。この場合において、光源およびステレオ光学系を培養容器の外側に配置することによって、これら光源およびステレオ光学系が培養液および細胞の流れの邪魔にならずに済む。また、培養容器の外側において光源とステレオ光学系を近接した位置に配置することができ、省スペース化を図ることができる。【００４０】
上記態様に係る観察装置は、光学的に透明な材質からなる平行平板状の観察窓を底面に有する前記培養容器と、該培養容器の上面に配置され、前記観察窓に向けて照明光を発する光源とを備え、前記ステレオ光学系が、前記培養容器の外側に配置され、前記細胞から前記観察窓を透過して前記培養容器外に出射された光を結像させることとしてもよい。
この構成によって、培養容器の培養液や細胞の流れがステレオ光学系によって邪魔されずに済む。また、培養容器の形状をシンプルにすることができる。【００４１】
上記態様に係る観察装置は、前記光源が、前記観察窓に向けて、前記ステレオ光学系の前記視点の配列方向に対して交差する方向に角度を付けて前記照明光を照射することとしてもよい。
この構成によって、培養液中と細胞内との屈折率が異なるため、培養液と細胞との境界で光が曲げられる。この場合において、瞳の外側を通る方向に光が曲がった部分は像面で暗くなり、瞳の内側を通る方向に光が曲がった部分は像面で明るくなるので、細胞のコントラストを向上した画像を取得することができる。【００４２】
上記態様に係る観察装置は、前記培養容器がバイオリアクタであって、前記ステレオ撮像光学系が、前記バイオリアクタ中で浮遊する前記細胞を撮像することとしてもよい。
【発明の効果】
【００４３】
本発明によれば、浮遊培養中の培養液内の細胞密度（細胞濃度（例えば、cells／mm3またはcells／L））を精度よく測定することができるという効果を奏する。
【図面の簡単な説明】
【００４４】
【図１】本発明の第１実施形態に係る観察装置の縦断面図である。
【図２】図１の先端ユニットおよび先端ユニットを装着する前のカメラユニットの縦断面図である。
【図３】図２のカメラユニットを先端側から長手方向に沿って見た正面図である。
【図４】図２のカメラユニットのＸ−Ｚ断面を示す図である。
【図５】図２のカメラユニットのＹ−Ｚ断面を示す図である。
【図６】図２のカメラユニットのＹ−Ｚ断面を示す図である。
【図７】図６のカメラユニットの先端付近を示す縦断面図である。
【図８】図６の偏向プリズムの拡大図である。
【図９】偏射照明によるコントラストの付与について説明する図である。
【図１０】上側画像と下側画像とこれら上側画像および下側画像を重ね合わせた状態を示す図である。
【図１１】像面に投影される細胞のＹ座標と細胞のＺ位置との関係を示す図である。
【図１２】像面での細胞の位置ずれ量と細胞のＺ位置との関係を示す図である。
【図１３】細胞の位置ずれ量がフォーカス位置に比例する様子を説明する図である。
【図１４】フォーカス位置による画像の変化の一例を示す図である。
【図１５】本発明の第２実施形態に係るカメラユニットのＹ−Ｚ断面を示す図である。
【図１６】図１５のカメラユニットの先端付近を示す縦断面図である。
【図１７】本発明の第３実施形態に係るカメラユニットのＹ−Ｚ断面を示す図である。
【図１８】図１７のカメラユニットの先端付近を示す縦断面図である。
【図１９】本発明の第４実施形態に係る観察装置の横断面と縦断面を示す図である。
【図２０】本発明の第４実施形態の変形例に係る観察装置の横断面と縦断面を示す図である。
【図２１】本発明の第５実施形態に係る観察装置の横断面と縦断面を示す図である。
【図２２】本発明の第５実施形態の第１変形例に係る観察装置の横断面と縦断面を示す図である。
【図２３】本発明の第５実施形態の第１変形例に係る別の観察装置の横断面と縦断面を示す図である。
【図２４】本発明の第５実施形態の第２変形例に係る観察装置の横断面と縦断面を示す図である。
【図２５】本発明の第５実施形態の第３変形例に係る観察装置の横断面と縦断面を示す図である。
【図２６】本発明の第５実施形態の第２変形例に係る別の観察装置の横断面と縦断面を示す図である。
【図２７】本発明の第５実施形態の第２変形例に係るさらに別の観察装置の横断面と縦断面を示す図である
【図２８】本発明の第５実施形態の第３変形例に係る別の観察装置の横断面と縦断面を示す図である。
【図２９】本発明の第５実施形態の第４変形例に係る別の観察装置の横断面と縦断面を示す図である。
【図３０】本発明の第５実施形態の第５変形例に係る別の観察装置の横断面と縦断面を示す図である。
【図３１】本発明の第６実施形態に係るバッグ培養装置の縦断面図である。
【図３２】図３１のバッグ培養装置の別の縦断面図である。
【図３３】本発明の第６実施形態の変形例に係るバッグ培養装置の縦断面図である。
【図３４】図３３のバッグ培養装置の別の縦断面図である。
【図３５】本発明の第６実施形態の他の変形例に係るバッグ培養装置の縦断面図である。
【発明を実施するための形態】
【００４５】
〔第１実施形態〕
本発明の第１実施形態に係る観察装置１について図面を参照して以下に説明する。
本実施形態に係る観察装置１は、図１および図２に示されるように、培養容器９内の培養液（培地）Ｗ中に浮遊している細胞Ｓ（図１０等参照。）を観察するカメラユニット３と、カメラユニット３の先端に着脱可能に装着される先端ユニット５と、培養液Ｗ内の細胞密度を算出する画像解析部７とを備えている。
【００４６】
培養容器９は、上面が閉塞された有底円筒状のバイオリアクタであり、内部に培養液Ｗとともに細胞Ｓを収容する。この培養容器９は、培養液Ｗの温度を調整する筒状の温度調整ジャケット１１によって、周囲が覆われている。この培養容器９には、各種のホース１３およびプローブ１５を挿入するための複数のポート９ａと、攪拌機構１７を挿入するための挿入口９ｂとが上面に設けられている。
【００４７】
図１に示す例では、培養容器９の上面に６つのポート９ａが設けられている。これらのポート９ａには、培養液Ｗを輸送する培地輸送ホース１３Ａと、培養液Ｗに空気を送る送気ホース１３Ｂと、培養液ＷのｐＨを測定するｐＨプローブ１５Ａと、培養液Ｗの温度を測定する温度測定プローブ１５Ｂと、培養液ＷのＣＯ２圧力を測定するＣＯ２圧力プローブ１５Ｃとが挿入されている。カメラユニット３は、先端ユニット５を装着した状態で、培養容器９の残りの１つのポート９ａに挿入することができる。
【００４８】
攪拌機構１７は、培養容器９の挿入口９ｂを経由して培養容器９内に挿入される攪拌軸１７ａと、攪拌軸１７ａに設けられた複数の攪拌翼１７ｂとを備えている。複数の攪拌翼１７ｂは、攪拌軸１７ａの長手方向の３ヶ所において、それぞれ周方向に間隔をあけて複数枚ずつ配置されている。
【００４９】
この攪拌機構１７は、図示しないモータ等の駆動部により、攪拌軸１７ａおよび攪拌翼１７ｂを長手軸回りに回転させることによって、培養液Ｗを攪拌することができる。そして、攪拌機構１７により培養液Ｗを攪拌することによって、培養容器９の内面に細胞Ｓが張り付くのを防ぎ、培養液Ｗ中に細胞Ｓを浮遊させながら培養することができる。
【００５０】
カメラユニット３は、図３、図４および図５に示すように、光源２１と、光源２１から発せられた照明光を導光するライトガイドファイバ２３と、同一の細胞Ｓに対して、異なる視点から見た互いに視差がある２つの像を結像させるステレオ光学系（ステレオ撮像光学系）２５と、ステレオ光学系２５によって結像された２つの像をそれぞれ撮影する撮像素子（ステレオ撮像光学系）２７と、これら光源２１、ステレオ光学系２５および撮像素子２７を収容する細長い略四角筒状の筐体２９とを備えている。図３において、符号Ｋは発光領域を示している。
【００５１】
光源２１は、筐体２９の基端側に配置されている。
ライトガイドファイバ２３は、光源２１からの照明光を筐体２９の先端に導光する。
ステレオ光学系２５は、先端側から順に、細胞Ｓからの光を集光する対物光学系３１と、対物光学系３１により集光された光を分割する絞り開口部３３と、絞り開口部３３により分割された光をそれぞれ偏向する偏向プリズム３５と、偏向プリズム３５により偏向された光をそれぞれ結像させる結像光学系３７とを備えている。
【００５２】
このステレオ光学系２５は、例えば、倍率が４倍で、ＮＡが０．０８９を有している。また、ステレオ光学系２５は、実視野が、Ｘ方向に１．０６ｍｍで、Ｙ方向に０．６ｍｍを有している。Ｙ方向はステレオになっていている。以下、ステレオ光学系２５の視点の配列方向をステレオ方向という。また、ステレオ光学系２５の光軸に沿う方向をＺ方向とし、ステレオ光学系２５の光軸に直交し、かつ、ステレオ方向に直交する方向をＸ方向とする。
【００５３】
対物光学系３１は、図６および図７に示すように、両凹レンズと両凸レンズとを接合したレンズ成分３１ａと、凸凹レンズ３１ｂとから構成されている。この対物光学系３１は、例えば、直径が５．５ｍｍを有している。また、対物光学系３１は、例えば、作動距離（ＷＤ）が４ｍｍを有している。図６および図７において、符号Ｆはベストフォーカス面の位置を示し、符号３９はカバーガラスを示している。図７には主に主光線が表示されている。
【００５４】
絞り開口部３３は、図７に示すように、瞳位置に配置されている。この絞り開口部３３には、例えば、直径１．４ｍｍの孔３３ａがステレオ方向に間隔をあけて２個設けられている。
【００５５】
偏向プリズム３５は、例えば、図８に示すように、撮像素子２７側の面が、Ｙ方向の絶対値が大きくなるにつれて厚さが増す方向に傾斜した平面を有するプリズム３５Ａとプリズム３５Ｂを張り合わせたものである。この撮像素子２７側の面の傾きは、例えば、光軸に対して＋Ｙ方向では２.９°の角度を有し、−Ｙ方向では−２．９°の角度を有している。また、プリズム３５Ａとプリズム３５Ｂとの間には、光が透過しない遮光塗料３５ａが塗布されている。遮光塗料３５ａに代えて、プリズム３５Ａとプリズム３５Ｂとの間に遮光部材を設けることとしてもよい。
【００５６】
結像光学系３７は、図５および図６の示すように、両凹レンズ３７ａと、凸凹レンズと両凸レンズとを接合したレンズ成分３７ｂとから構成されている。この結像光学系３７は、直径が１１ｍｍを有している。偏向プリズム３５と結像光学系３７との間、および、結像光学系３７と撮像素子２７との間には、図６に示すように、＋Ｙ方向を通る光と−Ｙ方向を通る光とが混ざり合うのを防ぐ遮光部材３６がそれぞれ設けられている。
【００５７】
撮像素子２７は、筐体２９の最も基端側に配置されている。この撮像素子２７は、Ｘ方向に４．２８ｍｍで、Ｙ方向に５．９ｍｍの撮像領域を有している。撮像素子２７により取得された細胞の画像情報は、画像解析部７に送られる。
【００５８】
先端ユニット５は、図２に示すように、カメラユニット３が挿入される略四角筒状の保護カバー４１と、ステレオ方向に対して交差する方向に角度を付けて細胞Ｓに照明光を照射するミラー（偏射照明部）４３とを備えている。この先端ユニット５は、保護カバー４１が滅菌処理されており、１回の使用毎に使い捨てるディスポーザブルな部品として交換することができる。
【００５９】
保護カバー４１は、先端よりも基端側において、幅方向に対向する両側面に開口する開口窓４１ａを有している。これら開口窓４１ａは、保護カバー４１にカメラユニット３が挿入された状態において、ミラー４３と対物光学系３１との間に配置される。また、開口窓４１ａは、細胞Ｓおよび培養液Ｗが保護カバー４１の内部を幅方向に通過可能な大きさを有している。これら開口窓４１ａは、例えば、保護カバー４１を長手方向の先端側と基端側とに分けて、これら先端側と基端側とを保護カバー４１の周方向の２ヶ所で連結することによって形成される開口部であってもよい。
【００６０】
ミラー４３は、保護カバー４１の先端において、基端側を向いて配置されている。また、ミラー４３は、反射面が対物光学系３１の光軸に対して６．５°の傾きを有している。このミラー４３は、例えば、ライトガイドファイバ２３によって導光されてきた照明光をカメラユニット３の対物光学系３１に向けてステレオ方向に対して直交する方向に角度を付けて反射することにより、培養液Ｗ中の細胞Ｓを偏射照明する。
【００６１】
培養液Ｗ中と細胞Ｓ内は互いに屈折率が異なるため、培養液Ｗと細胞Ｓとの境界で光が曲げられる。例えば、図９に示すように、瞳Ｅの外側を通る方向に光が曲がった部分は像面Ｉで暗くなり、瞳Ｅの内側を通る方向に光が曲がった部分は像面Ｉで明るくなる。したがって、ミラー４３によって細胞Ｓを偏射照明することにより、細胞Ｓのコントラストを向上した画像を取得することができる。図９において、Ｒ１，Ｒ２はレンズを示している。
【００６２】
画像解析部７は、撮像素子２７によって取得された２つの像の各画像に含まれている細胞Ｓの位置を特定する。そして、画像解析部７は、所定の領域内に存在する細胞Ｓの数に基づいて、培養液Ｗ内の細胞密度を算出する。所定の領域は、例えば、フォーカスが合う範囲であり、予め設定しておく。本実施形態においては、例えば、所定の領域のＺ方向は、ベストフォーカス位置からの距離がＺ±０．２ｍｍの範囲が好ましい。
【００６３】
次に、本実施形態に係る観察装置１の作用について説明する。
上記構成の観察装置１により、培養容器９において培養液Ｗ中に浮遊させながら培養している細胞Ｓを観察するには、まず、図１に示すように、カメラユニット３に先端ユニット５を装着した状態で、培養容器９のポート９ａを経由させて、培養液Ｗ内にカメラユニット３および先端ユニット５を挿入する。
【００６４】
次いで、カメラユニット３の光源２１から照明光を発生させて、ライトガイドファイバ２３により照明光を導光し、ライトガイドファイバ２３の先端から先端ユニット５のミラー４３に向けて照明光を出射させる。これにより、ミラー４３によって反射された照明光が、培養液Ｗ中に浮遊しながら開口窓４１ａを通過して先端ユニット５内に侵入している細胞Ｓに対して照射される。そして、細胞Ｓを透過した照明光の透過光がカメラユニット３のステレオ光学系２５に入射する。
【００６５】
ステレオ光学系２５においては、細胞Ｓを透過した照明光の透過光が対物光学系３１により集光された後、絞り開口部３３により分割されて、偏向プリズム３５によりそれぞれ偏向される。これにより、培養液Ｗ中に浮遊している複数の細胞Ｓに対して、個々の細胞Ｓごとにそれぞれ異なる視点から見た互いに視差がある２つの像が結像される。そして、結像された２つの像が撮像素子２７により撮影される。
【００６６】
撮像素子２７によって取得された２つの像の各画像情報は、それぞれ画像解析部７に送られる。そして、画像解析部７により、入力された画像情報に基づいて、図１０に示すように、複数の細胞Ｓに対して、個々の細胞Ｓごとにそれぞれ異なる視点から見た互いに視差がある２次元的な２つの画像、すなわち、図１０に示す上側画像および下側画像が生成される。
【００６７】
次いで、画像解析部７により、生成した複数の細胞Ｓの２つの画像に含まれる各細胞Ｓの位置が特定される。そして、画像解析部７により、所定の領域内に存在する細胞Ｓの数に基づいて、培養液Ｗ中の細胞密度が算出される。
【００６８】
この場合において、ステレオ光学系２５により、培養液Ｗ中の複数の細胞Ｓに対して、個々の細胞Ｓごとに異なる視点から見た互いに視差がある２つの像を結像させることによって、撮像素子２７により取得されるこれら２つの像の画像間で、ステレオ光学系２５からの距離に応じて同一の細胞ＳのＹ方向の位置が互いに反対方向にずれる。
【００６９】
ベストフォーカス面Ｆにある同一細胞Ｓを撮影して得られる撮像面での２つの細胞像のＹ座標の差をΔＹ０とし、任意のＺ位置にある細胞Ｓを撮影して得られる撮像面での２つの細胞像のＹ座標の差をΔＹとして、ずれ量δ＝ΔＹ−ΔＹ０と定義する。そうすると、例えば、図１０、図１１および図１２に示すように、ステレオ光学系２５からの距離が近い細胞Ｓほど画像間のずれ量が小さくなり、すなわち負の値になり、遠い細胞Ｓほど画像間のずれ量が大きくなる。つまり、図１３に示すように、細胞Ｓの位置ずれ量は、フォーカス位置に比例する。図１３は、各細胞Ｓの大きさがそれぞれ２０μｍで、細胞Ｓの屈折率が１．３６で、培養液Ｗの屈折率が１．３３２で、表示画像の大きさが０．４８ｍｍ×０．４８ｍｍ（物体側換算０．１２ｍｍ×０．１２ｍｍ。）の場合を示したものである。図１４も同様である。
【００７０】
したがって、各細胞Ｓの位置ずれ量に基づいて各細胞Ｓの３次元的な位置が分かるので、画像解析部７により、所定の領域内に含まれる細胞Ｓと含まれない細胞Ｓとを正確に区別して、培養液Ｗ内の細胞密度を算出することができる。これにより、本実施形態に係る観察装置１によれば、使用する培養容器９の形状および大きさ等に関わらず、培養液Ｗ内の細胞密度を精度よく測定することができる。
【００７１】
図１４に示すように、ベストフォーカス位置からの距離がＺ±０．２ｍｍを超えると、画像が大幅にボケるため、測定に影響が殆どなくなる。細胞密度以外にも、フォーカスが合った位置では、細胞Ｓや細胞塊の大きさや形状も測定することができる。これにより、細胞Ｓの状態を把握することができる。図１４において、Ｚの単位はｍｍである。
【００７２】
本実施形態に係るステレオ光学系２５によって測定できる領域の体積は、Ｘ方向の実視野とＹ方向の実視野とＺ方向のピントが合う範囲との積より、１．０６ｍｍ×０．６ｍｍ×０．４ｍｍ＝０．２５４４ｍｍ３となる。また、ステレオ光学系２５によって測定できる領域内の細胞Ｓの数は、例えば、最小で１０１個／ｍｍ３×０．２５４４ｍｍ３＝２．５４４個であり、最大で１０３個／ｍｍ３×０．２５４４ｍｍ３＝２５４．４個である。
【００７３】
本実施形態では細胞Ｓを培養する培養容器としてバイオリアクタである培養容器９を例示したが、培養容器はバイオリアクタ以外にも細胞培養用パックでもよい。細胞培養用パックを用いる場合には、本観察装置１のカメラユニット３および先端ユニット５を細胞培養用パックの内部に挿入して使用する。第２実施形態および第３実施形態も同様である。
【００７４】
〔第２実施形態〕
次に、本発明の第２実施形態に係る観察装置について、図面を参照して以下に説明する。
本実施形態に係る観察装置１は、図１５および図１６に示すように、ステレオ光学系２５の構成が第１実施形態と異なる。
本実施形態の説明において、上述した第１実施形態に係る観察装置１と構成を共通とする箇所には同一符号を付して説明を省略する。
【００７５】
本実施形態のステレオ光学系２５は、偏向プリズム３５を備えず、細胞Ｓからの光を集光する対物光学系３１と、対物光学系３１により集光された光を分割する絞り開口部３３と、絞り開口部３３により分割された光をそれぞれ別個に結像させる結像光学系４５とを備えている。
【００７６】
結像光学系４５は、凹凸レンズ４５ａと、両凹レンズと両凸レンズとを接合したレンズ成分４５ｂと、凸凹レンズ４５ｃとにより構成されている。これら凹凸レンズ４５ａ、レンズ成分４５ｂおよび凸凹レンズ４５ｃは、左右のレンズ対により構成されている。各レンズ対の間には、それぞれ遮光部材３６が挟まれている。凹凸レンズ４５ａ、レンズ成分４５ｂおよび凸凹レンズ４５ｃの各レンズ対は、それぞれ光軸が左右に間隔をあけて配置されており、絞り開口部３３によって分割された光をそれぞれ透過させることができる。
【００７７】
上記構成のステレオ光学系２５を備える本実施形態に係る観察装置１においても、第１実施形態と同様の効果を奏する。
【００７８】
〔第３実施形態〕
次に、本発明の第３実施形態に係る観察装置について、図面を参照して以下に説明する。
本実施形態に係る観察装置１は、図１７および図１８に示すように、ステレオ光学系２５の構成が第１実施形態と異なる。
本実施形態の説明において、上述した第１実施形態に係る観察装置１と構成を共通とする箇所には同一符号を付して説明を省略する。
【００７９】
本実施形態のステレオ光学系２５は、細胞Ｓからの光を２つの像に分割する先端プリズム（プリズム）４７Ａを備えている。また、このステレオ光学系２５は、絞り開口部３３に代えて、２つに分割されていない単一の開口を有する絞り開口部４８を備えている。このステレオ光学系２５は、例えば、倍率が４倍で、ＮＡが０．０８７を有している。また、ステレオ光学系２５は、実視野が、Ｘ方向に１．０７ｍｍで、Ｙ方向に０．５ｍｍを有している。
【００８０】
図１７および図１８において、符号４９ａは凸凹レンズと両凸レンズとを接合したレンズ成分を示し、符号４９ｂは両凸レンズを示し、符号４９ｃは凹凸レンズを示し、符号４９ｄは凹凸レンズと凹凸レンズとを接合したレンズ成分を示し、符号４７Ｂは基端プリズムを示している。
【００８１】
先端プリズム４７Ａおよび基端プリズム４７Ｂは、図１８の紙面の奥行き方向に一定の厚さを有している。また、先端プリズム４７Ａは、入射面が−２°の傾き角を有し、出射面が７°の傾き角を有し、光軸に対して＋Ｙ側と−Ｙ側とで線対称になっている。これにより、絞り開口部４８への主光線入射角を＋Ｙ側と−Ｙ側とで互いに反対方向の傾きを持ち、ステレオ光学系を実現している。
【００８２】
基端プリズム４７Ｂは、入射面および出射面が相互に平行に形成され、入射面が７°の傾き角を有し、出射面が７°の傾き角を有している。また、基端プリズム４７Ｂは、光軸に対して＋Ｙ側と−Ｙ側とで線対称になっている基端プリズム４７Ｂ１と基端プリズムＢ２とにより構成されている。
【００８３】
この基端プリズム４７Ｂは、＋Ｙ側の像と−Ｙ側の像とを近接させることによって、１つの撮像素子（図示略）によりステレオ像を同時に撮影させるものである。基端プリズム４７Ｂがないと、＋Ｙ側の像位置と−Ｙ側の像位置とがＹ方向に離れ過ぎることによって、中間付近、すなわち光軸付近において密度の解析に不要な無駄な領域が生じてしまうため、撮像素子の撮像領域がより広いものを使用しなければならなくなる。
接合したレンズ成分４９ｄから撮像素子（図示略）の間には、＋Ｙ側の光線と−Ｙ側の光線とが混ざり合うのを防ぐ遮光部材３６が設けられている。
【００８４】
上記構成のステレオ光学系２５を備える本実施形態に係る観察装置１においても、第１実施形態と同様の効果を奏する。
【００８５】
〔第４実施形態〕
次に、本発明の第４実施形態に係る観察装置について、図面を参照して以下に説明する。
本実施形態に係る観察装置５１は、例えば、図１９に示すように、光源２１がカメラユニット３の外部に配置されている点で第１〜第３実施形態と異なる。
本実施形態の説明において、上述した第１〜第３実施形態に係る観察装置１と構成を共通とする箇所には同一符号を付して説明を省略する。本実施形態では、上述した第１実施形態のステレオ光学系２５を例示して説明する。
【００８６】
本実施形態に係る観察装置５１は、図１９に示すように、攪拌軸１７ａが、中空の円筒部材によって形成されている。カメラユニット３は、光源２１およびライトガイドファイバ２３を備えず、先端ユニット５に装着されていない状態で、攪拌軸１７ａ内に収納されている。
【００８７】
また、攪拌軸１７ａが、光学的に透明な材質からなる平行平板状の観察窓５３を有している。観察窓５３は、例えば、攪拌軸１７ａの先端側から１つ目の攪拌翼１７ｂと２つ目の攪拌翼１７ｂとの間に配置されている。
【００８８】
ステレオ光学系２５は、攪拌軸１７ａの長手方向に沿って配置されており、観察窓５３を透過して攪拌軸１７ａ内に入射する細胞Ｓからの光を結像させる。また、ステレオ光学系２５は、攪拌軸１７ａ回りに回転しない。
【００８９】
観察窓５３とステレオ光学系２５との間には、観察窓５３から攪拌軸１７ａ内に入射した光を攪拌軸１７ａの長手方向に偏向する直角プリズム５５が配置されている。直角プリズム５５により、観察窓５３から攪拌軸１７ａ内に入射した光がステレオ光学系２５に入射される。
【００９０】
光源２１は、培養容器９の外側に配置されており、培養容器９の外側から観察窓５３に向けて照明光を発する。また、光源２１は、観察窓５３と高さをずらして配置されている。また、光源２１の横方向（ステレオ方向＝視差が発生する方向）発光領域は、ステレオ光学系２５の視野内の主光線が到達する幅より広く取ってある。これにより、細胞Ｓを偏射照明することができ、細胞Ｓのコントラストを向上した画像を取得することができる。
【００９１】
培養容器９は、光源２１から発せられた照明光を透過させる平行平板状の照明窓９ｃを側面に有している。これにより、光源２１から発せられた照明光が、照明窓９ｃを透過して培養液Ｗ中の細胞Ｓに照射される。そして、細胞Ｓを透過した照明光の透過光が、観察窓５３を透過した後、直角プリズム５５により偏向されてステレオ光学系２５に入射される。
【００９２】
本実施形態に係る観察装置５１によれば、攪拌軸１７ａの回転中において、観察窓５３がステレオ光学系２５の入射位置に重なったときに細胞Ｓの像が撮影される。この場合において、ステレオ光学系２５が回転しないので、構成をシンプルにすることができる。また、攪拌軸１７ａ内にステレオ光学系２５を収納することによって、ステレオ光学系２５が培養液Ｗおよび細胞Ｓの流れの邪魔にならずに済む。本実施形態においては、直角プリズム５５に代えて、４５°ミラーを採用することとしてもよい。
【００９３】
本実施形態においては、ステレオ光学系２５が、攪拌軸１７ａとともに攪拌軸１７ａ回りに回転することとしてもよい。
この構成によって、攪拌軸１７ａの回転中において、観察窓５３およびステレオ光学系２５の入射位置が光源２１と対向したときに、細胞Ｓの像が撮影される。この場合において、ステレオ光学系２５が攪拌軸１７ａと共に回転することによって、培養液Ｗおよび細胞Ｓの流れに撮影領域を追従させることができる。
【００９４】
また、本実施形態においては、例えば、図２０に示すように、光源２１が、培養容器９の外側における周方向の全域から観察窓５３に向けて照明光を発生させることとしてもよい。また、ステレオ光学系２５が、攪拌軸１７ａとともに攪拌軸１７ａ回りに回転することとしてもよい。この場合、培養容器９の周方向の全域に亘って照明窓９ｃが形成されていることとすればよい。
【００９５】
この構成によって、光源２１から照明光を発生させるタイミングと観察窓５３およびステレオ光学系２５の入射位置を光源２１に対向させるタイミングとを合わせる必要がなく、常時撮影することができる。
【００９６】
〔第５実施形態〕
次に、本発明の第５実施形態に係る観察装置について、図面を参照して以下に説明する。
本実施形態に係る観察装置６１は、例えば、図２１に示すように、培養容器９の外側にカメラユニット３が配置されている点で第４実施形態と異なる。
本実施形態の説明において、上述した第４実施形態に係る観察装置５１と構成を共通とする箇所には同一符号を付して説明を省略する。
【００９７】
本実施形態に係る観察装置６１は、図２１に示すように、培養容器９が、光学的に透明な材質からなる平行平板状の観察窓６３を側面に有している。
ステレオ光学系２５は、培養容器９の外側に配置され、観察窓６３を透過した細胞Ｓからの光を結像させる。
【００９８】
攪拌軸１７ａには複数の光源２１が取り付けられ、各光源２１から攪拌軸１７ａの径方向外方に向けて照明光が発せられる。各光源２１は、観察窓６３と高さとずらして配置されている。また、各光源２１は、攪拌軸１７ａと共に攪拌軸１７ａ回りに回転される。これにより、各光源２１から発せられた照明光が培養液Ｗ中の細胞Ｓに照射される。そして、細胞Ｓを透過した照明光の透過光が、観察窓６３を透過してステレオ光学系２５に入射される。
【００９９】
本実施形態に係る観察装置６１によれば、攪拌軸１７ａの回転中において、いずれかの光源２１が観察窓６３と対向したときに、細胞Ｓの像が撮影される。この場合において、ステレオ光学系２５を攪拌軸１７ａ内に収納しない分だけ、攪拌軸１７ａを細径化し、培養容器９を小型化することができる。
【０１００】
また、ステレオ光学系２５を培養容器９の外側に配置することにより、培養容器９の培養液Ｗや細胞Ｓの流れがステレオ光学系２５によって邪魔されずに済む。また、照明光が照射された培養液Ｗ中の細胞Ｓからの光が平行平板状の観察窓６３を透過してステレオ光学系２５に入射することにより、収差の発生を抑制することができる。また、光源２１として、ＬＥＤなどの小型のものを使用することができる。また、光源２１を観察窓５３と高さをずらして配置することにより、細胞Ｓを偏射照明することができる。
【０１０１】
本実施形態は以下の構成に変形することができる。
第１変形例としては、例えば、図２２に示すように、攪拌軸１７ａを中空にして、攪拌軸１７ａ内に光源２１を収納することとしてもよい。また、光源２１が攪拌軸１７ａと共に攪拌軸１７ａ回りに回転しながら、攪拌軸１７ａの周方向の全周から攪拌軸１７ａの径方向外方に向けて照明光を発することとしてもよい。
【０１０２】
この場合、攪拌軸１７ａが、光源２１の周囲を囲む光学的に透明な材質からなる環状の透過窓６５を有することとすればよい。透過窓６５は、透過した照明光に様々な角度成分を持たせる比較拡散機能を有することとしてもよい。
【０１０３】
本変形例によれば、光源２１から発せられて攪拌軸１７ａの透過窓６５を透過した照明光が、培養液Ｗ中の細胞Ｓに照射される。そして、細胞Ｓを透過した照明光の透過光が、観察窓６３を透過してステレオ光学系２５に入射される。この場合において、光源２１が攪拌軸１７ａと共に回転しながら、攪拌軸１７ａの周方向の全周から径方向外方に向けて照明光を発することによって、１つの光源２１で常時撮影することができる。
【０１０４】
本変形例においては、光源２１が攪拌軸１７ａと共に回転することとしたが、これに代えて、例えば、図２３に示すように、光源２１が、攪拌軸１７ａ回りに回転せず、観察窓６３に向けて照明光を発することとしてもよい。
【０１０５】
この構成によって、光源２１から発せられて攪拌軸１７ａの透過窓６５を透過した照明光が、培養液Ｗ中の細胞Ｓに照射される。そして、細胞Ｓを透過した照明光の透過光が、観察窓６３を透過してステレオ光学系２５に入射される。この場合において、光源２１を回転させないので、光源２１に接続する回路が複雑にならなくて済む。
【０１０６】
第２変形例としては、例えば、図２４に示すように、光源２１が、培養容器９の外側に配置され、観察窓６３に向けて照明光を発することとしてもよい。また、光源２１と観察窓６３とが攪拌軸１７ａを挟んで、攪拌軸１７ａの径方向に対向して配置されることとしてもよい。
【０１０７】
また、培養容器９が、光源２１から発せられた照明光を透過させる平行平板状の照明窓９ｃを有することとしてもよい。さらに、攪拌軸１７ａの照明光の光路上に配置される領域を光学的に透明な材質からなる光透過部材１７ｃによって形成することとしてもよい。
【０１０８】
この構成によって、光源２１から発せられて照明窓９ｃを透過した照明光が、攪拌軸１７ａの光透過部材１７ｃを透過する。そして、培養液Ｗ中の細胞Ｓに照明光が照射され、細胞Ｓを透過した照明光の透過光が、観察窓６３を透過してステレオ光学系２５に入射される。この場合において、光源２１およびステレオ光学系２５を培養容器９の外側に配置することによって、これら光源２１およびステレオ光学系２５が培養液Ｗおよび細胞Ｓの流れの邪魔にならずに済む。
【０１０９】
第３変形例としては、例えば、図２５に示すように、光源２１が、培養容器９の外側に配置され、攪拌軸１７ａに向けて照明光を発することとしてもよい。また、培養容器９が、光源２１から発せられた照明光を透過させる平行平板状の照明窓９ｃを側面に有することとしてもよい。さらに、攪拌軸１７ａの照明光の光路上に配置される領域が、照明光を観察窓６３に向けて反射する材質からなる反射部材１７ｄによって形成されていることとしてもよい。
【０１１０】
本変形例によれば、光源２１から発せられて照明窓９ｃを透過した照明光が、攪拌軸１７ａの反射部材１７ｄによって反射される。そして、培養液Ｗ中の細胞Ｓに照明光が照射され、細胞Ｓを透過した照明光の透過光が、観察窓６３を透過してステレオ光学系２５に入射される。
【０１１１】
この場合において、光源２１およびステレオ光学系２５を培養容器９の外側に配置することによって、これら光源２１およびステレオ光学系２５が培養液Ｗおよび細胞Ｓの流れの邪魔にならずに済む。また、培養容器９の外側において光源２１とステレオ光学系２５を近接した位置に配置することができ、省スペース化を図ることができる。
【０１１２】
上記第２変形例においては、例えば、図２６に示すように、光源２１および照明窓９ｃと観察窓６３とが、攪拌軸１７ａの径方向に位置をずらして互いに対向して配置されていることとしてもよい。また、光源２１から発せられた照明光が、攪拌翼１７ｂに対して攪拌軸１７ａの長手方向にずれた位置を通過して、観察窓６３に入射されることとしてもよい。
【０１１３】
この構成によって、光源２１から発せられて照明窓９ｃを透過した照明光が、攪拌軸１７ａおよび攪拌翼１７ｂによって遮られることなく培養液Ｗ中の細胞Ｓに照射される。そして、細胞Ｓを透過した照明光の透過光が、観察窓６３を透過してステレオ光学系２５に入射される。したがって、観察窓６３および照明窓９ｃ以外は、従来の培養容器と同様にシンプルな構成にすることができる。
【０１１４】
図２６に示す例では、光源２１から発せられた照明光が、攪拌翼１７ｂに対して攪拌軸１７ａの長手方向にずれた位置を通過することとした。これに代えて、例えば、図２７に示すように、攪拌翼１７ｂの少なくとも一部が光学的に透明な材質によって形成され、光源２１から発せられた照明光が、攪拌翼１７ｂの光学的に透明な材質によって形成された領域を透過することとしてもよい。
【０１１５】
この構成によって、光源２１から発せられて照明窓９ｃを透過した照明光が、攪拌翼１７ｂの光学的に透明な材質によって形成された領域を透過する。そして、培養液Ｗ中の細胞Ｓに照明光が照射され、細胞Ｓを透過した照明光の透過光が、観察窓６３を透過してステレオ光学系２５に入射される。したがって、培養容器９内において、攪拌翼１７ｂが配置されている深さに相当する領域の細胞密度も測定することができる。
【０１１６】
上記第３変形例においては、例えば、図２８に示すように、光源２１が、攪拌翼１７ｂに向けて照明光を発することとしてもよい。また、攪拌翼１７ｂの照明光の光路上に配置される領域が、照明光を観察窓６３に向けて反射する材質によって形成されていることとしてもよい。
【０１１７】
この構成によって、光源２１から発せられて照明窓９ｃを透過した照明光が、攪拌翼１７ｂによって反射される。そして、培養液Ｗ中の細胞Ｓに照明光が照射され、細胞Ｓを透過した照明光の透過光が、観察窓６３を透過してステレオ光学系２５に入射される。
【０１１８】
この場合において、光源２１およびステレオ光学系２５を培養容器９の外側に配置することによって、これら光源２１およびステレオ光学系２５が培養液Ｗおよび細胞Ｓの流れの邪魔にならずに済む。また、培養容器９の外側において光源２１とステレオ光学系２５を近接した位置に配置することができ、省スペース化を図ることができる。
【０１１９】
第４変形例としては、図２９に示すように、光源２１が培養容器９の外側に配置され、培養容器９内に向けて照明光を発することとしてもよい。また、培養容器９が、光源２１から発せられた照明光を培養容器９内において内周面に沿う方向に偏向する第１プリズム５７と、第１プリズム５７により偏向された後に培養液Ｗ中の細胞Ｓに照射された照明光の透過光を培養容器９の外側に向けて偏向する第２プリズム５９とをそれぞれ側面に有することとしてもよい。そして、ステレオ光学系２５が、培養容器９の外側に配置され、第２プリズム５９によって培養容器９の外側に出射された光を結像させることとしてもよい。
【０１２０】
本変形例によれば、培養容器９の培養液Ｗや細胞Ｓの流れがステレオ光学系２５によって邪魔されずに済む。この場合において、細胞Ｓからの光を第２プリズム５９によって偏向することにより、ステレオ光学系２５の光軸に交差する方向から発せられる細胞Ｓの光をステレオ光学系２５に入射させることができる。また、照明光が培養容器９内を横断せず、第１プリズム５７と第２プリズム５９との距離を短くすることができる。これにより、照明光の光路中の培養液Ｗの体積が小さく、細胞Ｓの数も少ないので、照明光の散乱の影響を抑制して、コントラストが高い像を得ることができる。
【０１２１】
第５変形例としては、例えば、図３０に示すように、培養容器９が、観察窓６３を底面に有することとしてもよい。また、光源２１が、培養容器９の上面に配置され、観察窓６３に向けて照明光を発することとしてもよい。また、ステレオ光学系２５が、培養容器９の底面の下方に配置され、観察窓６３を透過して培養容器９外に出射された細胞Ｓからの光を結像させることとしてもよい。
【０１２２】
この場合、ステレオ光学系２５を培養容器９の底面に沿って配置することとしてもよい。また、観察窓６３とステレオ光学系２５との間に、観察窓６３を透過した光を培養容器９の底面に沿う方向に偏向することによって、ステレオ光学系２５に入射させる直角プリズム５５を配置することとしてもよい。
【０１２３】
この構成によって、培養容器９の培養液Ｗや細胞Ｓの流れがステレオ光学系２５によって邪魔されずに済む。また、培養容器９の形状をシンプルにすることができる。
【０１２４】
上述した第４実施形態および第５実施形態では、ステレオ光学系２５の観察窓６３の高さ位置と光源２１の高さ位置とが異なるように配置することを例示した。ステレオ光学系２５の光軸に対して斜めに照明光が入射することによって偏斜照明画像の取得が可能であるため、ステレオ光学系２５の光軸に対して光源２１をずらして配置してもよい。例えば、光源２１から発せられる照明光の光軸に対してステレオ光学系２５を傾けて配置してもよい。
【０１２５】
〔第６実施形態〕
次に、本発明の第６実施形態に係るバッグ培養装置（観察装置）について、図面を参照して以下に説明する。
本実施形態に係るバッグ培養装置７１は、例えば、図３１および図３２に示すように、袋状の培養バッグ（培養容器）７３内に培養液Ｗとともに収容された状態で培養されている細胞Ｓを観察するものである点で第１〜第５実施形態と異なる。
本実施形態の説明において、上述した第１〜第５実施形態に係る観察装置１，５１，６１と構成を共通とする箇所には同一符号を付して説明を省略する。
【０１２６】
バッグ培養装置７１は、カメラユニット３を収容する箱状の筐体部７５と、筐体部７５に搭載され、培養バッグ７３を載置する載置部７７と、筐体部７５に対して載置部７７を揺動させる揺動機構７９とを備えている。
【０１２７】
カメラユニット３は、光源２１およびライトガイドファイバ２３を備えず、先端ユニット５に装着されていない状態で、筐体部７５内に収容されている。また、カメラユニット３は、ステレオ光学系２５の前方に配置される光学的に透明な材質からなる平行平板状の観察窓８１を備えている。カメラユニット３は、筐体部７５の上面から観察窓８１を突出させ、観察窓８１を透過して筐体２９内に入射する光をステレオ光学系２５によって結像させる。
【０１２８】
載置部７７は、筐体部７５の上面に設置されている。載置部７７は、ステレオ光学系２５の観察窓８１を貫通させる孔部７７ａを有している。孔部７７ａは、載置部７７が観察窓８１に干渉するのを回避可能な十分な大きさを有している。
【０１２９】
筐体部７５は、光源２１を支持する光源支持部８３を備えている。光源支持部８３は、載置部７７に載置される培養バッグ７３に対して上方に間隔をあけた位置に光源２１を配置し、光源２１を観察窓８１に向けて保持する。光源２１は、光源支持部８３により、ステレオ光学系２５の光軸上から光軸に交差する方向にずれた位置に配置されている。光源２１は、観察窓８１に向けて斜め上方から照明光を照射する。これにより、培養バッグ７３内の細胞Ｓを偏斜照明で照明し、細胞Ｓのコントラストを向上した画像を取得することができる。
【０１３０】
揺動機構７９は、筐体部７５上面と載置部７７下面との間に配置されている。揺動機構７９は、光源２１およびステレオ光学系２５に対して、載置部７７をステレオ光学系２５の光軸に交差する方向に揺動させる。揺動機構７９によって培養バッグ７３を揺動させることにより、培養バッグ７３内の細胞Ｓを攪拌することができる。
【０１３１】
本実施形態によれば、培養液Ｗおよび細胞Ｓが収容された培養バッグ７３が載置部７７上に載置され、揺動機構７９によって載置部７７が揺動されることにより、培養バッグ７３内で培養液Ｗが攪拌されながら細胞Ｓが培養される。
【０１３２】
この状態で、光源２１から発せられた照明光が培養バッグ７３内の細胞Ｓに照射される。細胞Ｓを透過した照明光の透過光は、観察窓８１を透過してステレオ光学系２５に入射し、撮像素子２７によって撮影される。本実施形態に係るバッグ培養装置７１においても、ステレオ光学系２５からの距離に応じて同一の細胞Ｓの位置がずれた複数の画像が取得されるので、画像解析部７により、培養液Ｗ内の細胞密度を精度よく算出することができる。したがって、使用する培養バッグ７３の形状および大きさ等に関わらず、培養液Ｗ内の細胞密度を精度よく測定することができる。
【０１３３】
本実施形態は、以下の構成に変形することができる。
本実施形態においては、光源２１およびステレオ光学系２５に対して載置部７７上の培養バッグ７３が揺動することとした。これに代えて、例えば、図３３および図３４に示すように、揺動機構７９により、載置部７７上の培養バッグ７３とともに光源２１およびステレオ光学系２５が揺動することとしてもよい。
【０１３４】
この場合、光源２１およびステレオ光学系２５の先端をそれぞれ載置部７７上の培養バッグ７３に密着させることとしてもよい。光源２１およびステレオ光学系２５の観察窓８１を培養バッグ７３に密着させることによって、細胞密度の計測時の状態をより安定させることができる。例えば、ステレオ光学系２５の観察窓８１を培養バッグ７３に密着させるために、載置部７７上の培養バッグ７３に対してステレオ光学系２５をカメラユニット３ごと近接および離間させるステレオ光学系位置調整機構８５を設けることとしてもよい。また、光源２１を培養バッグ７３に密着させるために、光源支持部８３が、載置部７７上の培養バッグ７３に対して光源２１を近接および離間させる光源位置調整機構８７を備えることとしてもよい。
【０１３５】
本実施形態においては、培養バッグ７３の下方にステレオ光学系２５が配置され、培養バッグ７３の上方に光源２１が配置されることとした。これに代えて、例えば、図３５に示すように、培養バッグ７３の上方にステレオ光学系２５が配置され、培養バッグ７３の下方に光源２１が配置されることとしてもよい。図３５において、符号８９は、カメラユニット３を支持するカメラユニット支持部を示している。
【０１３６】
この場合、載置部７７上に光源２１を配置し、載置部７７に載置される培養バッグ７３に対して光源２１が下方から照明光を照射することとしてもよい。また、載置部７７の上方にカメラユニット３を配置し、光源２１から照明光が照射されることによって培養バッグ７３の細胞Ｓを上方に向かって透過した透過光をステレオ光学系２５に入射させることとしてもよい。
【０１３７】
また、光源２１およびステレオ光学系２５が固定された状態で、揺動機構７９によって培養バッグ７３上の載置部７７が揺動させられることとしてもよい。あるいは、揺動機構７９によって、載置部７７上の培養バッグ７３とともに光源２１およびステレオ光学系２５が揺動することとしてもよい。この場合は、ステレオ光学系２５の観察窓８１を載置部７７上の培養バッグ７３に密着させるステレオ光学系位置調整機構８５を採用することとしてもよい。
【０１３８】
以上、本発明の実施形態について図面を参照して詳述してきたが、具体的な構成はこの実施形態に限られるものではなく、本発明の要旨を逸脱しない範囲の設計変更等も含まれる。例えば、本発明を上記各実施形態および変形例に適用したものに限定されることなく、これらの実施形態および変形例を適宜組み合わせた実施形態に適用してもよく、特に限定されるものではない。
【符号の説明】
【０１３９】
１，５１，６１，７１  観察装置
７                    画像解析部
９                    培養容器
９ｃ                  照明窓
２５                  ステレオ光学系（ステレオ撮像光学系）
２７                  撮像素子（ステレオ撮像光学系）
１７                  攪拌機構
１７ａ                攪拌軸
１７ｂ                攪拌翼
２１                  光源
３１                  対物光学系
３３                  絞り開口部
３５                  偏向プリズム（プリズム）
３７                  結像光学系
４３                  ミラー（偏射照明部）
６３                  観察窓
６５                  透過窓
７３                  培養バッグ（培養容器）
Ｓ                    細胞
【図１】
2019235563.tif 000003
【図２】
2019235563.tif 000004
【図３】
2019235563.tif 000005
【図４】
2019235563.tif 000006
【図５】
2019235563.tif 000007
【図６】
2019235563.tif 000008
【図７】
2019235563.tif 000009
【図８】
2019235563.tif 000010
【図９】
2019235563.tif 000011
【図１０】
2019235563.tif 000012
【図１１】
2019235563.tif 000013
【図１２】
2019235563.tif 000014
【図１３】
2019235563.tif 000015
【図１４】
2019235563.tif 000016
【図１５】
2019235563.tif 000017
【図１６】
2019235563.tif 000018
【図１７】
2019235563.tif 000019
【図１８】
2019235563.tif 000020
【図１９】
2019235563.tif 000021
【図２０】
2019235563.tif 000022
【図２１】
2019235563.tif 000023
【図２２】
2019235563.tif 000024
【図２３】
2019235563.tif 000025
【図２４】
2019235563.tif 000026
【図２５】
2019235563.tif 000027
【図２６】
2019235563.tif 000028
【図２７】
2019235563.tif 000029
【図２８】
2019235563.tif 000030
【図２９】
2019235563.tif 000031
【図３０】
2019235563.tif 000032
【図３１】
2019235563.tif 000033
【図３２】
2019235563.tif 000034
【図３３】
2019235563.tif 000035
【図３４】
2019235563.tif 000036
【図３５】
2019235563.tif 000037
【手続補正書】
【提出日】令和2年12月7日(2020.12.7)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
培養容器内の培養液中に浮遊する細胞を撮像するステレオ撮像光学系と、
該ステレオ撮像光学系によって取得された複数の画像に基づいて、前記細胞の細胞密度を算出する画像解析部と、
を備え、
前記画像解析部が、前記複数の画像に含まれている前記細胞の３次元位置を特定し、所定の３次元領域内に存在する前記細胞の数に基づいて前記細胞密度を算出する観察装置。
【請求項２】
前記ステレオ撮像光学系が、前記培養液中に浮遊している同一の細胞に対して、異なる視点から見た互いに視差がある２つの像を結像させるステレオ光学系と、
該ステレオ光学系によって結像された２つの前記像をそれぞれ撮影する撮像素子とを備える請求項１に記載の観察装置。
【請求項３】
前記ステレオ光学系が、前記細胞からの光を集光する対物光学系と、該対物光学系により集光された光を分割する絞り開口部と、該絞り開口部により分割された光を偏向するプリズムとを備える請求項２に記載の観察装置。
【請求項４】
前記ステレオ光学系が、前記細胞からの光を集光する対物光学系と、該対物光学系により集光された光を分割する絞り開口部と、該絞り開口部により分割された光をそれぞれ別個に結像させる結像光学系とを備える請求項２に記載の観察装置。
【請求項５】
前記ステレオ光学系が、前記細胞からの光を集光することによって２つの前記像に分割するプリズムを備える請求項２に記載の観察装置。
【請求項６】
前記ステレオ光学系の前記視点の配列方向に対して交差する方向に角度を付けて前記細胞に照明光を照射する偏斜照明部を備える請求項２から請求項５のいずれかに記載の観察装置。
【請求項７】
光学的に透明な材質からなる平行平板状の観察窓を側面に有する前記培養容器を備え、
前記ステレオ光学系が、前記培養容器の外側に配置され、前記細胞から前記観察窓を透過して前記培養容器外に出射された光を結像させる請求項２から請求項５のいずれかに記載の観察装置。
【請求項８】
前記細胞からの光を偏向することによって前記培養容器外に出射するプリズムを側面に有する前記培養容器を備え、
前記ステレオ光学系が、前記培養容器の外側に配置され、前記プリズムによって前記培養容器外に出射された光を結像させる請求項２から請求項５のいずれかに記載の観察装置。
【請求項９】
前記培養容器内を該培養容器の深さ方向に延びる中空の攪拌軸と、該攪拌軸回りに回転する攪拌翼とを備え、該攪拌翼が前記攪拌軸回りに回転することによって前記培養液を攪拌する攪拌機構とを備え、
前記攪拌軸が、光学的に透明な材質からなる平行平板状の観察窓を有し、
前記ステレオ光学系が、前記攪拌軸内に収納され、前記観察窓を透過して前記攪拌軸内に入射する前記細胞からの光を結像させる請求項２から請求項５のいずれかに記載の観察装置。
【請求項１０】
前記攪拌軸の径方向外方から前記観察窓に向けて照明光を発する光源を備え、
前記ステレオ光学系が、前記攪拌軸回りに回転しない請求項９に記載の観察装置。
【請求項１１】
前記攪拌軸の径方向外方から前記観察窓に向けて照明光を発する光源を備え、
前記ステレオ光学系が、前記攪拌軸とともに該攪拌軸回りに回転する請求項９に記載の観察装置。
【請求項１２】
前記攪拌軸の径方向外方における周方向の全域から前記観察窓に向けて照明光を発する光源を備え、
前記ステレオ光学系が、前記攪拌軸とともに該攪拌軸回りに回転する請求項９に記載の観察装置。
【請求項１３】
前記培養容器内を該培養容器の深さ方向に延びる攪拌軸と、該攪拌軸回りに回転する攪拌翼とを備え、該攪拌翼が前記攪拌軸回りに回転することによって前記培養液を攪拌する攪拌機構と、
前記攪拌軸に該攪拌軸と共に回転可能に設けられ、前記攪拌軸の径方向外方に向けて照明光を発する複数の光源とを備え、
これら複数の光源が、前記攪拌軸の周方向に配列されている請求項７に記載の観察装置。
【請求項１４】
前記培養容器内を該培養容器の深さ方向に延びる中空の攪拌軸と、該攪拌軸回りに回転する攪拌翼とを備え、該攪拌翼が前記攪拌軸回りに回転することによって前記培養液を攪拌する攪拌機構と、
前記攪拌軸内に収納され、該攪拌軸と共に回転しながら前記攪拌軸の周方向の全周から径方向外方に向けて照明光を発する光源とを備え、
前記攪拌軸が、前記光源の周囲を囲む光学的に透明な材質からなる環状の透過窓を有する請求項７に記載の観察装置。
【請求項１５】
前記培養容器内を該培養容器の深さ方向に延びる中空の攪拌軸と、該攪拌軸回りに回転する攪拌翼とを備え、該攪拌翼が前記攪拌軸回りに回転することによって前記培養液を攪拌する攪拌機構と、
該攪拌機構の前記攪拌軸内に収納され、前記観察窓に向けて照明光を発する光源とを備え、
前記攪拌軸が、前記光源の周囲を囲む光学的に透明な材質からなる環状の透過窓を有し、
前記光源が、前記攪拌軸回りに回転しない請求項７に記載の観察装置。
【請求項１６】
前記培養容器内を該培養容器の深さ方向に延びる攪拌軸と、該攪拌軸回りに回転する攪拌翼とを備え、該攪拌翼が前記攪拌軸回りに回転することによって前記培養液を攪拌する攪拌機構と、
前記培養容器の外側に、前記攪拌軸を挟んで該攪拌軸の径方向に前記観察窓と対向して配置され、前記観察窓に向けて照明光を発する光源とを備え、
前記培養容器が、前記光源から発せられた前記照明光を透過させる平行平板状の照明窓を前記側面に有し、
前記攪拌軸の前記照明光の光路上に配置される領域が光学的に透明な材質によって形成されている請求項７に記載の観察装置。
【請求項１７】
前記培養容器内を該培養容器の深さ方向に延びる攪拌軸と、該攪拌軸回りに回転する攪拌翼とを備え、該攪拌翼が前記攪拌軸回りに回転することによって前記培養容器内の前記培養液を攪拌する攪拌機構と、
前記培養容器の外側に配置され、前記攪拌軸に向けて照明光を発する光源とを備え、
前記培養容器が、前記光源から発せられた前記照明光を透過させる平行平板状の照明窓を前記側面に有し、
前記攪拌軸の前記照明光の光路上に配置される領域が、前記照明光を前記観察窓に向けて反射する材質によって形成されている請求項７に記載の観察装置。
【請求項１８】
前記培養容器内を該培養容器の深さ方向に延びる攪拌軸と、該攪拌軸回りに回転する攪拌翼とを備え、該攪拌翼が前記攪拌軸回りに回転することによって前記培養液を攪拌する攪拌機構と、
前記培養容器の外側において、前記攪拌機構を挟み、かつ、前記攪拌軸の径方向に位置をずらして前記観察窓に対向して配置され、前記観察窓に向けて照明光を発する光源とを備え、
前記培養容器が、前記光源から発せられた前記照明光を透過させる平行平板状の照明窓を前記側面に有し、
前記光源から発せられた前記照明光が、前記攪拌翼に対して前記攪拌軸の長手方向にずれた位置を通過して前記観察窓に入射される請求項７に記載の観察装置。
【請求項１９】
前記培養容器内を該培養容器の深さ方向に延びる攪拌軸と、該攪拌軸回りに回転する攪拌翼とを備え、該攪拌翼が前記攪拌軸回りに回転することによって前記培養液を攪拌する攪拌機構と、
前記培養容器の外側において、前記攪拌機構を挟み、かつ、前記攪拌軸の径方向に位置をずらして前記観察窓に対向して配置され、前記観察窓に向けて照明光を発する光源とを備え、
前記培養容器が、前記光源から発せられた前記照明光を透過させる平行平板状の照明窓を有し、
前記攪拌翼が、少なくとも一部が光学的に透明な材質によって形成され、
前記光源から発せられた前記照明光が、前記攪拌翼の前記光学的に透明な材質によって形成された領域を透過して、前記観察窓に入射される請求項７に記載の観察装置。
【請求項２０】
前記培養容器内を該培養容器の深さ方向に延びる攪拌軸と、該攪拌軸回りに回転する攪拌翼とを備え、該攪拌翼が前記攪拌軸回りに回転することによって前記培養容器内の前記培養液を攪拌する攪拌機構と、
前記培養容器の外側に配置され、前記攪拌翼に向けて照明光を発する光源とを備え、
前記培養容器が、前記光源から発せられた前記照明光を透過させる平行平板状の照明窓を前記側面に有し、
前記攪拌翼の前記照明光の光路上に配置される領域が、前記照明光を前記観察窓に向けて反射する材質によって形成されている請求項７に記載の観察装置。
【請求項２１】
光学的に透明な材質からなる平行平板状の観察窓を底面に有する前記培養容器と、
該培養容器の上面に配置され、前記観察窓に向けて照明光を発する光源とを備え、
前記ステレオ光学系が、前記培養容器の外側に配置され、前記細胞から前記観察窓を透過して前記培養容器外に出射された光を結像させる請求項２から請求項５のいずれかに記載の観察装置。
【請求項２２】
前記光源が、前記観察窓に向けて、前記ステレオ光学系の前記視点の配列方向に対して交差する方向に角度を付けて前記照明光を照射する請求項１０から請求項２１のいずれかに記載の観察装置。
【請求項２３】
前記培養容器がバイオリアクタであって、
前記ステレオ撮像光学系が、前記バイオリアクタ中で浮遊する前記細胞を撮像する請求項１から請求項２２のいずれかに記載の観察装置。
【請求項２４】
前記培養容器が培養バッグであって、
前記ステレオ撮像光学系が、前記培養バッグ中で浮遊する前記細胞を撮像する請求項１から請求項２２のいずれかに記載の観察装置。
【請求項２５】
培養容器内の培養液中に浮遊する細胞を撮像し、
取得された複数の画像に基づき、前記複数の画像に含まれている前記細胞の３次元位置を特定し、
所定の３次元領域内に存在する前記細胞の数を算出する細胞観察方法。
【請求項２６】
前記細胞の数と、前記所定の３次元領域の体積とを用いて細胞密度を算出する請求項２５に記載の細胞観察方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１５】
上記態様に係る観察装置は、前記ステレオ光学系の前記視点の配列方向に対して交差する方向に角度を付けて前記細胞に照明光を照射する偏斜照明部を備えることとしてもよい。
この構成によって、培養液中と細胞内との屈折率が異なるため、培養液と細胞との境界で光が曲げられる。この場合において、瞳の外側を通る方向に光が曲がった部分は像面で暗くなり、瞳の内側を通る方向に光が曲がった部分は像面で明るくなる。したがって、細胞のコントラストを向上した画像を取得することができる。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４４】
【図１】本発明の第１実施形態に係る観察装置の縦断面図である。
【図２】図１の先端ユニットおよび先端ユニットを装着する前のカメラユニットの縦断面図である。
【図３】図２のカメラユニットを先端側から長手方向に沿って見た正面図である。
【図４】図２のカメラユニットのＸ−Ｚ断面を示す図である。
【図５】図２のカメラユニットのＹ−Ｚ断面を示す図である。
【図６】図２のカメラユニットのＹ−Ｚ断面を示す図である。
【図７】図６のカメラユニットの先端付近を示す縦断面図である。
【図８】図６の偏向プリズムの拡大図である。
【図９】偏斜照明によるコントラストの付与について説明する図である。
【図１０】上側画像と下側画像とこれら上側画像および下側画像を重ね合わせた状態を示す図である。
【図１１】像面に投影される細胞のＹ座標と細胞のＺ位置との関係を示す図である。
【図１２】像面での細胞の位置ずれ量と細胞のＺ位置との関係を示す図である。
【図１３】細胞の位置ずれ量がフォーカス位置に比例する様子を説明する図である。
【図１４】フォーカス位置による画像の変化の一例を示す図である。
【図１５】本発明の第２実施形態に係るカメラユニットのＹ−Ｚ断面を示す図である。
【図１６】図１５のカメラユニットの先端付近を示す縦断面図である。
【図１７】本発明の第３実施形態に係るカメラユニットのＹ−Ｚ断面を示す図である。
【図１８】図１７のカメラユニットの先端付近を示す縦断面図である。
【図１９】本発明の第４実施形態に係る観察装置の横断面と縦断面を示す図である。
【図２０】本発明の第４実施形態の変形例に係る観察装置の横断面と縦断面を示す図である。
【図２１】本発明の第５実施形態に係る観察装置の横断面と縦断面を示す図である。
【図２２】本発明の第５実施形態の第１変形例に係る観察装置の横断面と縦断面を示す図である。
【図２３】本発明の第５実施形態の第１変形例に係る別の観察装置の横断面と縦断面を示す図である。
【図２４】本発明の第５実施形態の第２変形例に係る観察装置の横断面と縦断面を示す図である。
【図２５】本発明の第５実施形態の第３変形例に係る観察装置の横断面と縦断面を示す図である。
【図２６】本発明の第５実施形態の第２変形例に係る別の観察装置の横断面と縦断面を示す図である。
【図２７】本発明の第５実施形態の第２変形例に係るさらに別の観察装置の横断面と縦断面を示す図である
【図２８】本発明の第５実施形態の第３変形例に係る別の観察装置の横断面と縦断面を示す図である。
【図２９】本発明の第５実施形態の第４変形例に係る別の観察装置の横断面と縦断面を示す図である。
【図３０】本発明の第５実施形態の第５変形例に係る別の観察装置の横断面と縦断面を示す図である。
【図３１】本発明の第６実施形態に係るバッグ培養装置の縦断面図である。
【図３２】図３１のバッグ培養装置の別の縦断面図である。
【図３３】本発明の第６実施形態の変形例に係るバッグ培養装置の縦断面図である。
【図３４】図３３のバッグ培養装置の別の縦断面図である。
【図３５】本発明の第６実施形態の他の変形例に係るバッグ培養装置の縦断面図である。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５８】
先端ユニット５は、図２に示すように、カメラユニット３が挿入される略四角筒状の保護カバー４１と、ステレオ方向に対して交差する方向に角度を付けて細胞Ｓに照明光を照射するミラー（偏斜照明部）４３とを備えている。この先端ユニット５は、保護カバー４１が滅菌処理されており、１回の使用毎に使い捨てるディスポーザブルな部品として交換することができる。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６０】
ミラー４３は、保護カバー４１の先端において、基端側を向いて配置されている。また、ミラー４３は、反射面が対物光学系３１の光軸に対して６．５°の傾きを有している。このミラー４３は、例えば、ライトガイドファイバ２３によって導光されてきた照明光をカメラユニット３の対物光学系３１に向けてステレオ方向に対して直交する方向に角度を付けて反射することにより、培養液Ｗ中の細胞Ｓを偏斜照明する。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６１】
培養液Ｗ中と細胞Ｓ内は互いに屈折率が異なるため、培養液Ｗと細胞Ｓとの境界で光が曲げられる。例えば、図９に示すように、瞳Ｅの外側を通る方向に光が曲がった部分は像面Ｉで暗くなり、瞳Ｅの内側を通る方向に光が曲がった部分は像面Ｉで明るくなる。したがって、ミラー４３によって細胞Ｓを偏斜照明することにより、細胞Ｓのコントラストを向上した画像を取得することができる。図９において、Ｒ１，Ｒ２はレンズを示している。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００７３】
本実施形態では細胞Ｓを培養する培養容器としてバイオリアクタである培養容器９を例示したが、培養容器はバイオリアクタ以外にも細胞培養用バッグでもよい。細胞培養用バッグを用いる場合には、本観察装置１のカメラユニット３および先端ユニット５を細胞培養用バッグの内部に挿入して使用する。第２実施形態および第３実施形態も同様である。
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００９０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００９０】
光源２１は、培養容器９の外側に配置されており、培養容器９の外側から観察窓５３に向けて照明光を発する。また、光源２１は、観察窓５３と高さをずらして配置されている。また、光源２１の横方向（ステレオ方向＝視差が発生する方向）発光領域は、ステレオ光学系２５の視野内の主光線が到達する幅より広く取ってある。これにより、細胞Ｓを偏斜照明することができ、細胞Ｓのコントラストを向上した画像を取得することができる。
【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１００
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１００】
また、ステレオ光学系２５を培養容器９の外側に配置することにより、培養容器９の培養液Ｗや細胞Ｓの流れがステレオ光学系２５によって邪魔されずに済む。また、照明光が照射された培養液Ｗ中の細胞Ｓからの光が平行平板状の観察窓６３を透過してステレオ光学系２５に入射することにより、収差の発生を抑制することができる。また、光源２１として、ＬＥＤなどの小型のものを使用することができる。また、光源２１を観察窓５３と高さをずらして配置することにより、細胞Ｓを偏斜照明することができる。
【手続補正１０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１３９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１３９】
１，５１，６１，７１  観察装置
７                    画像解析部
９                    培養容器
９ｃ                  照明窓
２５                  ステレオ光学系（ステレオ撮像光学系）
２７                  撮像素子（ステレオ撮像光学系）
１７                  攪拌機構
１７ａ                攪拌軸
１７ｂ                攪拌翼
２１                  光源
３１                  対物光学系
３３                  絞り開口部
３５                  偏向プリズム（プリズム）
３７                  結像光学系
４３                  ミラー（偏斜照明部）
６３                  観察窓
６５                  透過窓
７３                  培養バッグ（培養容器）
Ｓ                    細胞
【国際調査報告】
2019235563.tif 000038
2019235563.tif 000039
2019235563.tif 000040
2019235563.tif 000041