【誤訳訂正書】
【提出日】平成21年4月22日(2009.4.22)
【誤訳訂正１】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】特許請求の範囲
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】  ファルネシルプリロリン酸（ＦＰＰ）またはゲラニルゲラニルピロリン酸（ＧＧＰＰ）中間体由来のイソプレノイド生成物を生成する方法において、
（ａ）ＨＭＧ−ＣｏＡリタクターゼの作用を増大させる遺伝子修飾と、メバロネート・キナーゼ、ホスホメバロネート・キナーゼ、およびホスホメバロネート・デカルボキシロースのうちの少なくとも一つの作用を増大させる遺伝子修飾とを有し、かつスクアレン・シンターゼの作用を低下された微生物を、ＦＰＰまたはＧＧＰＰ由来のイソプレノイド生成物を生成させる発酵培地中で培養するステップと、
（ｂ）前記生成物を回収するステップとを含む方法。
【請求項２】  前記イソプレノイド化合物は、ステロール、ユビキノン、ヘム、ドリコール、及びカルチノイドである請求項１に記載の方法。
【請求項３】  前記微生物がスクアレン・シンターゼの作用を低下させるように遺伝子修飾されていることを特徴とする請求項２記載の方法。
【請求項４】  前記微生物は誘導性プロモータまたは抑制性プロモータの制御下にあるスクアレン・シンターゼ遺伝子を有する請求項３記載の方法。
【請求項５】  前記スクアレン・シンターゼ遺伝子は誘導性プロモータの制御下にあり、前記微生物は前記プロモータの誘導化合物が培地から欠乏した条件で培養される請求項４記載の方法。
【請求項６】  前記発酵培地はスクアレン・シンターゼ阻害剤を含む請求項１に記載の方法。
【請求項７】  前記微生物がｅｒｇ９突然変異体である請求項１に記載の方法。
【請求項８】  ＨＭＧ−ＣｏＡリダクターゼの作用が前記微生物におけるＨＭＧ−ＣｏＡリダクターゼまたはその触媒ドメインの過剰発現で増大される請求項１〜７のいずれかに記載の方法。
【請求項９】  メバロネート・キナーゼ、ホスホメバロネート・キナーゼ、またはホスホメバロネート・デカルボキシロースの作用が、複製プラスミドまたは細胞のゲノムにおけるメバロネート・キナーゼ、ホスホメバロネート・キナーゼ、またはホスホメバロネート・デカルボキシロースの遺伝子のコピーの存在により増大される請求項１〜８のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】  前記微生物がさらに、アセトアセチル  Ｃｏ−Ａチオロース、ＨＭ
Ｇ−ＣｏＡシンターゼ、ＨＭＧ  ＣｏＡリタクターゼ、イソペンテニル・ピロリン酸・イソメラーゼ、ファルネシル・ピロリン酸・シンターゼ、Ｄ−１−デオキシキシルロース  ５−リン酸・シンターゼ、及び１−デオキシ−Ｄ−キシルロース  ５−リン酸・リダクトイソメラーゼで構成されるグループから選択される蛋白質の作用を増強するように遺伝子修飾されている請求項８または９記載の方法。
【請求項１１】  前記微生物がファルネシル・ピロリン酸・シンターゼの作用を増大させるように遺伝子修飾されている請求項１〜１０のいずれかに記載の方法。
【請求項１２】  前記微生物がファルネシル・ピロリン酸・シンターゼを過剰発現するように遺伝子修飾されている請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】  前記微生物が真菌である請求項１〜１２のいずれかに記載の方法。
【請求項１４】  前記真菌が酵母である請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】  前記イソプレノイド生成物をα−トコフェノールまたはα−トコフェニル・エステルに化学的に転化するステップをさらに含む請求項１〜１４のいずれかに記載の方法。
【請求項１６】  前記微生物のスクアレン・シンターゼ作用が低下された、請求項１〜１５に記載の方法により定義された微生物。
【誤訳訂正２】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００１８
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００１８】
好ましくは、この細胞培養で用いられる細胞はファルネソールまたはＧＧの収率を増大させるように遺伝子的修飾されている。細胞は遺伝子加工技術（遺伝子組換え技術）、従来の微生物学的手法、あるいはそれらの技術の組み合わせで遺伝子修飾することができ、天然由来の遺伝子的変種も含むことができる。こうした技術の一部は一般的に、例えば、Sambrook et．al．，1989，Molecular Cloning： A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Labs Pressなどに開示されている。上記Ｓaｍｂｒｏｏｋらの文献はここで参照することでその全体が本明細書に組み込まれている。遺伝子修飾された微生物はそうした修飾がその微生物内部あるいは培養上清内でのファルネソールまたはＧＧの収率増大に対して望ましい影響をもたらすことができるような方法で、核酸分子が挿入、欠失、修飾されたりする（つまり、例えば、核酸の挿入、欠失、置換及び／または逆位によって突然変異される）微生物を含んでいる。
【誤訳訂正３】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００１９
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００１９】
ここで述べられている遺伝子、その遺伝子の機能、あるいはその遺伝子発現量（つまり遺伝子にコードされた蛋白質）の低下をもたらす遺伝子修飾は遺伝子の（完全または部分的）不活性化、消失、中断、遮断、あるいはダウン・レギュレーションと呼ばれる場合もある。例えば、そうした遺伝子にコードされる蛋白質の機能の低下をもたらす遺伝子の遺伝子修飾はその遺伝子の完全な消失（つまり、その遺伝子が存在せず、従ってその蛋白質も存在しない）、その蛋白質の翻訳が不完全であったりあるいは翻訳が行われなかったりするようなその遺伝子における突然変異（例えば、蛋白質が発現されない）、あるいはその蛋白質の本来の機能を減少させてしまうか無くしてしまうような遺伝子における突然変異（例えば、酵素活性が低下した、あるいは酵素活性を持たない蛋白質が発現される）などの結果であり得る。遺伝子発現または機能の増大につながる遺伝子修飾は遺伝子の増幅、過剰生産、過剰発現、活性化、増強、付加、あるいはアップ・レギュレーションと呼ば
れる。遺伝子発現を増大させるためのクローンされた遺伝子の付加はそのクローンされた遺伝子をプラスミド上での保持すること、そのクローンされた遺伝子を生産生物のゲノム内に組み込むことなどを含む。さらに、望ましいクローンされた遺伝子の発現の増大はそのクローンされた遺伝子と天然の、あるいは外来性の転写制御要素への操作による結合を含む場合もある。
【誤訳訂正４】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００２０
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００２０】
２．１．１  スクアレン・シンターゼの修飾
本発明の実施の形態はそのイソプレノイド生合成経路内の１つまたは複数の酵素の活性を調節するために遺伝子修飾された微生物、好ましくは酵母を培養することでファルネソールまたはＧＧの生物学的生産を含んでいる。１つの実施の形態で、微生物はスクアレン・シンターゼ活性を低下（あるいは消失）させることで遺伝子修飾されている（図１参照）。例えば、メバロン酸をスクアレンに転化することができない、そしてファルネソールを蓄積する酵母ｅｒｇ９突然変異体が開発されている。Karst and Lacroute, Molec. Gen. Genet., 154, 269-277 (1977);米国特許第５，５９８，３７２。本明細書で用いられる場合、ｅｒｇ９突然変異体あるいは突然変異とは一般的にはスクアレン・シンターゼ生産の停止や減少、スクアレン・シンターゼ活性の低下、あるいはスクアレン・シンターゼ活性の抑制などによる、ホスファターゼ活性によるファルネソールへの転化などファルネソールピロリン酸（ＦＰＰ）の他の化合物へ転化されなければファルネソールピロリン酸（ＦＰＰ）の蓄積をもたらすようなスクアレン・シンターゼの活性を低下させる遺伝子修飾を意味している。スクアレン・シンターゼ生産の停止あるいは減少ということはＥＲＧ９遺伝子を培地中で誘導化合物の存在を必要とするプロモータの制御下に置くことを含む場合もある。その誘導因子が培地から枯渇してしまうような状態を確立することで、ＥＲＧ９の発現（従って、スクアレン・シンターゼ合成）を中止させてしまうことができるであろう。また、いくつかのプロモータも抑制性化合物の存在によってその存在を抑制されてしまう。例えば、酵母ＣＴＲ３またはＣＴＲ１遺伝子からのプロモータは銅の転化で抑制することができる。スクアレン・シンターゼ活性の停止や減少は参照によって本明細書に組み込まれる米国特許第４，７４３，５４６に述べられているのと同様の切除技術の使用を含む場合もあろう。この方式の場合、ＥＲＧ９遺伝子はそのゲノムからのＥＲＧ9 遺伝子の特殊な、制御された切除を可能にする特殊な遺伝子配列間でクローンされる。切除は、例えば、米国特許第４，７４３，５４６に述べられているような培養温度の変化、あるいは他のいくつかの物理的または栄養的信号によって促進される場合もあるであろう。そうした遺伝子修飾にはいずれのタイプの修飾も含まれるが、特に遺伝子組換え技術によって行われる修飾と、従来の突然変異誘発による修飾が含まれる。スクアレン・シンターゼの阻害剤は公知であり（米国特許第４，８７１，７２１及び米国特許第５，４７５，０２９に引用されている文献参照）、細胞培養に付加することができる。別の実施の形態で、メバロン酸に依存しないイソプレノイド生合成経路がＦＰＰ及び／またはファルネソールを蓄積するように遺伝子修飾される。例えば、オクタプレニル・ピロリン酸・シンターゼ（ｉｓｐＢ遺伝子の生成物）の活性を低下させると、大腸菌におけるＦＰＰ蓄積をもたらすことが予想される。（(Asai, et al., Biochem. Biophys. Res. Comm. 202, 340-345(1994)).ホスファターゼの作用はさらに大腸菌でのファルネソール蓄積をもたらすであろう。
【誤訳訂正５】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００２１
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００２１】
酵母細胞系統は細胞膜流動性のためにエルゴステロールを必要としており、従って、ｅｒｇ９突然変異などのエルゴステロール経路で遮断された突然変異体はそれらの細胞が成長可能性を維持するために、外来性のエルゴステロールあるいはその培養液に付加された他のステロールを必要とする。これらの細胞は通常嫌気性条件下で育てられなければ、こうした追加的なステロールを活用することができない。従って、本発明のさらに別の実施の形態はｅｒｇ９突然変異体などの内部でのスクアレン・シンターゼの作用が減少した、そして外部から補給されたステロール類を嫌気条件下で摂取する酵母である。酵母が好気性条件下でステロールを活用できるようにする遺伝子修飾は以下の実施例の個所（実施例１参照）に示されており、この技術分野では公知である。例えば、そうした遺伝子修飾はｕｐｃ（細胞が好気性条件下でステロールを摂取するようにする摂取制御突然変異）及びｈｅｍｌ（ＨＥＭ１遺伝子はＦＰＰからのヘム生合成経路への最初のステップであるアミノレブリン酸シンターゼをコードし、ｈｅｌｍ突然変異体はそれらの培養に不飽和脂肪酸が補給された場合、エルゴステロール生合成経路における中断の後、好気性条件でエルゴステロールを摂取することができる）などである。こうした突然変異体を有している酵母系統公知の技術を用いてつくりだすことができ、また、例えば、ノースカロライナ州立大学（Raleigh 、NC）のLeo Parks博士から入手することができる。これらの突然変異体を含む半数体は他の半数体細胞との遺伝子的交配によって他の突然変異体を発生させるために用いることができる。また、ＳＵＴ１（ステロール摂取）遺伝子の過剰発現も好気性条件下でのステロール摂取を可能にするために用いることができる。ＳＵＴ１遺伝子はすでにクローンされ、配列も決定されている。Bourot and Karst, Gene, 165: 97-102 (1995).
【誤訳訂正６】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００２２
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００２２】
スクアレン・シンターゼ阻害剤は当業者には公知である。（例えば、米国特許第５，５５６，９９０参照。
２．１．２  ＨＭＧ−ＣｏＡリダクターゼの修飾
本発明のさらに別の実施の形態はＨＭＧ−ＣｏＡリダクターゼの作用を増大するように遺伝子修飾された微生物の使用である。なお、ここで取り上げられるＨＭＧ−ＣｏＡリダクターゼ及び他の酵素の作用の増強に関する言及はそれらの酵素の機能性の増大につながる問題の微生物におけるあらゆる遺伝子修飾を意味しており、それらの酵素の活性の増大、それらの酵素の抑制や劣化の減少、及びそれらの酵素の過剰発現を含んでいる。例えば、遺伝子コピー数を増大させることができ、発現のレベルを天然のプロモータより高くするプロモータの使用によって高めることでき、あるいは、１つの酵素の活性を増大するために遺伝子加工、あるいは従来の突然変異誘発によって遺伝子を変えることができる。メバロン酸依存イソプレノイド生合成経路における重要な酵素の１つは３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル−補酵素（ＨＭＧ−ＣｏＡ）の還元を触媒するＨＭＧ−ＣｏＡである。これはこの経路における一次速度限定及び最初の不可逆ステップであり、ＨＭＧ−ＣｏＡリダクターゼ活性の増大は野生型のＳ．セレビシアエにおけるスクアレン及びエルゴステロールの収量とｅｒｇ９系統におけるファルネソールの収量の向上につながる。ＨＭＧ−ＣｏＡリタクターゼの作用が増大される１つのメカニズムは酵素の抑制を低下させること、その酵素を遺伝子修飾するか、あるいはその阻害剤を取り除くためにその系を修飾することによって行われる。例えば、イソプレノイド経路のステロール及び非ステロール生成物の両方ともこの酵素をフィードバック抑制する（例えば、., Parks and Casey, Annu. Rev. Microbiol. 49:95-116 (1995 参照) 。また、あるいはさらに、ＨＭＧ−ＣｏＡリ
タクターゼをコードする遺伝子を遺伝子加工あるいは古典的な突然変異誘発手法で変えて抑制を減少させたり、防いだりすることができる。また、ＨＭＧ−ＣｏＡリタクターゼの作用は遺伝子コピー数を増大させたり、ＨＭＧ−ＣｏＡリタクターゼの発現レベルを増大させたり、あるいはその酵素の活性を増大させるために遺伝子加工かあるいは古典的な突然変異誘発でＨＭＧ−ＣｏＡリタクターゼ遺伝子を変えることで増大させることができる。米国特許第５，４６０，９４９参照。この特許の内容全体が参照によって本明細書に組み込まれる。例えば、先端が切断されたＨＭＧ−ＣｏＡリタクターゼがつくられており、この酵素では調節領域が除去されており、さらに、遺伝子コピー数を最大６まで増大させることでも活性の増大につながる。例えば、ＨＭＧ−ＣｏＡリタクターゼのレベルが増強されている２つの酵母突然変異体について述べいている, Downing et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 94, 974-79 (1980) 参照。ＨＭＧ１及びＨＭＧ２遺伝子でコードされるＨＭＧ−ＣｏＡリタクターゼの２つのイソ酵素がＳ. セレビシアエ内に存在している。これら２つのイソ酵素の活性は転写の調節、翻訳の調節、そしてＨｍｇ２ｐの場合は小胞体内の酵素の劣化などを含むいくつかのメカニズムによって調節されている
【誤訳訂正７】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００２５
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００２５】
２．１．３  ＧＧＰＰシンターゼの修飾
本発明のさらに別の実施の形態は、ＧＧＰＰシンターゼの作用を増強するために遺伝子修飾された微生物の使用である。細菌、真菌類、植物、哺乳動物、及び原始細菌など種々の供給源からこの酵素を発現する遺伝子が確認されている。
【誤訳訂正８】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００２６
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００２６】
Brinkhaus et al., Arch. Biochem. Biophys., 266, 607-612 (1988); Carattoli et al., J. Biol. Chem., 266, 5854-59 (199 1); Chen et al., J. Biol. Chem., 268, 11002-11007 (1993); Dogbo et al., Biochim. Biophys. Acta, 920, 140-148 (1987); Jiang et al., J. Biol. Chem., 270, 21793-99 (1995); Kuntz al., Plant J., 2, 25-34 (1992); Laferriere, et al., Biochim. Biophys. Acta, 1077 ,  167-72 (1991); Math et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89, 6761-64 (1992); Ohnuma et al., J. Biol. Chem., 269, 14792-97 (1994); Sagami et al., Arch. Biochem. Biophys., 297, 314-20 (1992); Sagami et al., J. Biol. Chem., 269, 20561-66 (1994); Sandmann et a l., J. Photochem. Photobiol. B: Biol., 18, 245-51 (1993); Scolnik et al., Plant Physiol.,
104, 1469-70 (1994); Tachibana et al., Biosci. Biotech. Biochem., 7, 1129-33 (1993); Tachibana et al., J. Biochem., 114, 389-92 (1993); Wiedemann et al., Arch.
Bioch e m. Biophys., 306, 152-57 (1993)参照。いくつかの生物はＦＰＰシンターゼとしても機能する二機能性酵素を保有しており、従って、ＩＰＰ及びＤＭＡＰＰのＦＰＰそしてＧＧＰＰへの全体的な転化に関与している（図１参照）。植物で発見されるものなど、いくつかの酵素はその特殊性が低く、ＩＰＰとＤＭＡＰＰをＧＧＰＰに転化する（図1 参照）。ここで用いられているＧＧＰＰシンターゼの遺伝子修飾とはその酵素のＧＧＰＰシンターゼ活性成分を強化するために二機能性ＦＰＰ／ＧＧＰＰシンターゼを加工することを含んでいる。好ましいＧＧＰＰシンターゼ遺伝子はＳ. セレビシアエからのＢＴＳ１遺伝子である。ＢＴＳ１遺伝子とその単離はJiang et al., J. Biol. Chem., 270, 21793-99 (1995)を１９９６年12月6 日に提出された共係属出願第０８／７６１，３４４に述べ
られており、これらの資料の」 開示はその全体が参照によって本明細書に組み込まれる。しかしながら、他の宿主のＧＧＰＰシンターゼを用いることもでき、二機能性ＧＧＰＰシンターゼの使用は炭素流をＦＰＰからＧＧＰＰに向かわせて、それによって細胞内での競合する反応へのロスを避けることができるので、特に好適である。
【誤訳訂正９】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００２８
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００２８】
２．１．４  ＦＰＰシンターゼ修飾
本発明のさらに別の実施の形態はＦＰＰシンターゼの作用を増強するために遺伝子修飾された微生物の利用である。種々の供給源からこの酵素をコードするための遺伝子が確認されている。Anderson et al., J. Biol. Chem., 264, 19176-19184 (1989); Attucci, et al., Arch. Biochem. Biophys., 321, 493-500 (1995); Cane et al ., J. Am. Chem. Soc., 105, 122-124 (1983); Chambon et al., Current Genetics, 18, 41-46 (1990);, Chambon et al., Lipids, 26, 633-36 (1991); Chen al., Protein Science, 3, 600-607
(1994); Davisson, et al., J. Am. Chem. Soc., 115, 1235-45 (1993); Ding et al., 
Biochem. J., 275, 61-65 (1991); Hugueney et al., FEBS Let ters, 273, 235-38 (1990); Joly et al., J. Biol. Chem., 268, 26983-89 (1993); Koyama al., J. Biochem.,
113, 355-63 (1993); Sheares, et al., Biochem., 28, 8129-35 (1989); Song et al.,
Proc. Natl. Acad .  Sci. USA, 91, 3044-48 (1994); Spear et al., J. Biol. C hem., 267, 14662-69 (1992); Spear et al., J. Biol. Chem., 269, 25212-18 (1994)参照。
Anderson et al., J. Biol. Chem., 264, 19176-19184 (1989)は酵母シャトル・ベクターでＳ. セレビシアエ遺伝子によるＦＰＰシンターゼの２−３倍の過剰発現を報告している。
【誤訳訂正１０】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００３０
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００３０】
本発明のさらに別の実施の形態では、上に述べたＦＰＰシンターゼの修飾に加えて、野生型のＦＰＰシンターゼが生産生物から除去される。このことは、例えば、基質ＩＰＰ、ＤＭＡＰＰ、及びＧＰＰに対する修飾ＦＰＰシンターゼ及び野生型酵素との間の競合をなくしてくれるであろう。ＦＰＰシンターゼをコードする野生型遺伝子の消失も高遺伝子配列相同性領域をなくすことで、起きる可能性のある不適切な遺伝子組換えを回避することでクローンされたＦＰＰシンターゼ遺伝子の安定性を向上させてくれるであろう。
【誤訳訂正１１】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００３１
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００３１】
２．１．５  ホスファターゼの修飾
本発明のさらに別の実施の形態はＦＰＰのファルネソールあるいはＧＰＰのＧＧへの転化を増強するためにホスファターゼ作用を強化するように遺伝子修飾した微生物の利用である。例えば、Ｓ. セレビシアエ及び大腸菌の両方とも多数のホスファターゼ活性を含んでいる。ＦＰＰまたはＧＧＰＰを効率的に脱リン酸化するためにいくつかのホスファターゼをテストすることによって、適切なホスファターゼを選択してファルネソールまたはＧ
Ｇ生産を増大させるために生産生物内でこの酵素をコードする遺伝子を発現することができる。ファルネソールまたはＧＧ生産を強化するために望ましいホスファターゼの作法を増強するのに加えて（あるいはその代わりに）、遺伝子的な手段を通じて、望ましくないホスファターゼ活性を除去することも可能であろう。例えば、特にＦＰＰに作用を及ぼすホスファターゼの活性を突然変異を通じて取り除き、そのＦＰＰをＧＧＰＰとそしてさらにＧＧへの転化に用いることは可能であろう。
【誤訳訂正１２】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００３２
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００３２】
２．１．６  追加的な遺伝子修飾
他のイソプレノイド経路酵素の修飾
ＨＭＧＣｏＡリタクターゼ、ＧＧＰＰシンターゼ及びホスファターゼの作用を強化するために行うことができる修飾について上に述べた。イソプレノイド経路酵素の作用の修飾はこれらの具体例に限定されるものではなく、アセトアセチルＣｏＡチオラーゼ、ＨＭＧ−ＣｏＡシンターゼ、メバロン酸キナーゼ、ホスホメバロン酸キナーゼ、ホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ、ＩＰＰイソメラーゼ、ファルネソール・ピロリン酸・シンターゼ、あるいはＤ−１−デオキシキシルロース・５−リン酸・シンターゼ・Ｄ−１−デオキシキシルロース・５−リン酸・リダクトイソメラーゼなどの他のイソプレノイド経路酵素の作用を修飾するために同様の戦略を適用することが可能である。
【誤訳訂正１３】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００３６
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００３６】
ＦＰＰやＧＧＰＰから遠ざかる方向に導く経路を遮断することは生産生物の生長と生理に否定的な影響を及ぼすであろう。こうした事情を解消するために必要な追加的な遺伝子修飾を行うことも想定される。イソプレノイド経路で遮断され、上に述べたような好気性条件の下でステロールを取り込むＳ. セレビシアエ突然変異体の単離は、一次的な遺伝子修飾の影響を克服する代償的な突然変異を獲得することができることを示している。
【誤訳訂正１４】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００３７
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００３７】
ファルネソールまたはＧＧに対する抵抗性を有する生産系統の単離  実施例の個所で、遺伝子修飾されたＳ. セレビシアエの系統による高レベルのファルネソール及びＧＧの生産について述べてある。ファルネソールあるいはＧＧ生産がさらに増大すると、これらの化合物はその生産生物に対して毒性を示すレベルに到達してしまう場合がある。実際、生成物の毒性は生物生産過程において遭遇する一般的な問題である。しかしながら、生成物の毒性を克服する古典的な方法や遺伝子組換え技術も同様に一般的である。本発明は生成物の毒性が起きることを想定している。従って、本発明の別の実施の形態はファルネソール及び/ またはＧＧに対する抵抗性が増大した突然変異体の単離である。
【誤訳訂正１５】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００３８
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００３８】
修飾された成長特性を有する生産生物の単離  Ｓ. セレビシアエにおいてイソプレノイド経路を遮断することの１つの影響は、突然変異体（本発明ではｅｒｇ９突然変異体）は培地にエルゴステロールが添加されているにも関わらず親株系統よりも生育が遅いことである。ｅｒｇ９突然変異体の生育がよりゆっくりしているのはｅｒｇ９での遮断のせいであることは、実施例１．Ｇに説明してあるが、このことは、ｅｒｇ9 突然変異を修復するとその系統の成長速度が野生タイプの親系統の成長速度とほぼ同じ程度まで回復することを示している。ｅｒｇ9 突然変異体のより遅い成長速度は外部から供給されたエルゴステロール上での成長とその細胞内で合成されたエルゴステロール上での成長との違いや、あるいは他の生理学的因子の影響である可能性もある。本発明の１つの実施の形態は修飾された成長特性を有するファルネソールまたはＧＧ生産系統の変種を単離することである。これは、例えば、継続的に培養を行い、より速く成長する変種を選択することにより達成することが可能であろう。こうした変種は自然に発生する場合もあれば、古典的な突然変異誘発あるいは分子遺伝子方式によって得ることも可能であろう。
【誤訳訂正１６】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００４０
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００４０】
この実施の形態で、発酵に用いられる微生物は本明細書で触れられているどの微生物でもよい。加えて、この微生物を遺伝子修飾して、ジメチルアリル・トランスフェラーゼの作用を増強してゲラニル・ピロリン酸及びファルネソール・ピロリン酸の生産を促進することができる。種々の供給源からこの酵素をコードする遺伝子が確認されている[Chen et
al., Protein Sci., 3, 600-607 (1994)]。さらに、微生物を遺伝子修飾して、イソプレノール・キナーゼまたはプレノール・キナーゼの作用を増強することもできる。これらの酵素はまだ発見されていないが、ホスホリレート・ファルネソール及びゲラニルゲラニオールと同様の酵素については開示されている［Betinger  et al., Biochem. Biophys., 353,191-198 (1998); Ohnuma et al., J.Biochem., 119:541-547 (1996)］。
【誤訳訂正１７】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００４１
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００４１】
２．３  発酵培地及び条件
ファルネソールまたはＧＧを生産する方法において、上に述べたような遺伝子修飾を加えた微生物がファルネソールまたはＧＧを生産するために発酵培地中で培養される。適切、あるいは有効な発酵培地は本発明による遺伝子修飾された微生物が培養された場合にファルネソールまたはGGを生産することができるいずれの培地をも含むものとする。こうした培地は通常は吸収同化可能な炭素、窒素及びリン酸供給源で構成される水溶液である。こうした培地は適切な塩類、鉱物、金属、あるいはその他の栄養素を含む場合もある。加えて、１つの生物がエルゴステロール経路で遮断されて外部からのステロールを必要としている場合は、発酵培地はそうした外来性のステロールを含んでいなければならない。適切な例示としての培地を以下の説明と実施例の個所に示す。しかしながら、適している発酵条件は種々あり、当業者が選択することができる。
【誤訳訂正１８】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００８９
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００８９】
また、ゲラニルゲラニル・リダクターゼがＧＧを基質として使うことができるためには、GGが（前の箇所で述べたような）醗酵によってつくられ、それを生物学的変換工程に対して供給原料として使うのに必要な程度まで精製される生物学的工程が提供される。この生物学的変換はゲラニルゲラニル・リダクターゼを用いてＧＧを１回のステップでフィトールに転化する。この生物学的変換は単離されたゲラニルゲラニル・リダクターゼかゲラニルゲラニル・リダクターゼ活性を含む細胞全体のいずれかを用いる。酵素または細胞はその生物学的変換を促進するために基質上で、あるいは架橋によって固定される。工業的な生物学的プロセスにおいてフィトールを生産するためにその活性を高める目的で、ゲラニルゲラニル・リダクターゼを遺伝子修飾で修飾することも予想される。
【誤訳訂正１９】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】０３０７
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【０３０７】
実施例１１
この実施例は機能性ＥＲＧ９遺伝子を含む本来のままの機能性ステロール経路を有する系統でザラゴズ酸によってスクアレン・シンターゼがブロックされた実験について述べ、スクアレン・シンターゼ阻害剤のファルネソール及びＧＧ蓄積に対する影響について観察する。
【誤訳訂正２０】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】０３１１
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【０３１１】
【表２５】
2002519049.tif 000001
別の実験で、空のベクター（Ｙｅｐ３５２）あるいはＨＭＧ  Ｃｏ  ＡリタクターゼとＧＧＰＰシンターゼ（ｐＳＷ４６−１）の両方の過剰発現を可能にするプラスミドのいずれかを含むＳＷ２３−Ｅ９を振動フラスコ内で先ず最初にＳＣＥ−ｕｒａ培養液内で４８時間それらの系統を成長させてプラスミドを選択させることによってテストした。これらの培養のサンプルをＹＰＤＥ培養液あるいは１００ｍｇ／ｍｌの濃度でザラゴズ酸を含むＹＰＤＥ培養液内に入れた。ＹＰＤＥ（＋／−ザラゴズ酸）培養を３０℃の温度で７２時間培養することで、乾燥細胞重量とＧＧについて分析した。そのデータを表２６に示す。ザラゴズ酸で処理したＳＷＥ２３−Ｅ９／ｐＳＷ４６−１の培養はザラゴズ酸の不在下で成長された同じ系統と比較してより高いレベルのＧＧを示した。これらの実験はステロール生合成経路内に突然変異を含まない系統はスクアレン・シンターゼ阻害剤を用いて経路をブロックすることでファルネソールを蓄積するように誘導することができる。ザラゴズ酸で処理した培養によって蓄積されたファルネソールまたはＧＧの量は完全に欠陥性のｅｒｇ９遺伝子を含んだ系統によって蓄積された量よりずっと少なく、このことはスクアレン・シンターゼの遺伝子的ブロックがスクアレン・シンターゼ阻害剤によって誘発されるブロックより効率的であることを示唆している。