(57)【要約】  ペプチドと、前記ペプチドをコードする核酸と、を含むペプチド−核酸複合体の製造方法。ペプチドをコードする第１コード配列と、トランスペプチダーゼをコードする第２コード配列と、前記トランスペプチダーゼ認識モチーフをコードする第３コード配列と、を含む、トランスペプチダーゼＮ末端基質モチーフが付加された核酸を準備する工程と、前記トランスペプチダーゼＮ末端基質モチーフ付加核酸から、無細胞タンパク質合成系を用いて、前記ペプチドのドメインと、前記トランスペプチダーゼのドメインと、前記トランスペプチダーゼ認識モチーフとを含むキメラタンパク質を合成する工程と、前記トランスペプチダーゼドメインにより、前記ペプチド−核酸複合体を形成させる工程と、を含む。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ペプチドと、前記ペプチドをコードする核酸と、を含むペプチド−核酸複合体の製造方法であって、
（Ａ１）トランスペプチダーゼＮ末端基質モチーフが付加された核酸であって、
前記ペプチドをコードする第１のコード配列と、前記トランスペプチダーゼをコードする第２のコード配列と、前記トランスペプチダーゼの認識モチーフをコードする第３のコード配列と、を含む、核酸を準備する工程と、
（Ｂ１）前記トランスペプチダーゼＮ末端基質モチーフが付加された前記核酸から、無細胞タンパク質合成系を用いて、前記ペプチドのドメインと、前記トランスペプチダーゼのドメインと、前記トランスペプチダーゼ認識モチーフとを含むキメラタンパク質を合成する工程と、
（Ｃ１）前記トランスペプチダーゼドメインによるペプチド転移反応により、前記ペプチド−核酸複合体を形成させる工程と、
を含む、ペプチド−核酸複合体の製造方法。
【請求項２】
前記核酸において、５’側から３’側に向かって、前記第１のコード配列、前記第３のコード配列、及び前記第２のコード配列が、この順で、配置されている、請求項１に記載のペプチド−核酸複合体の製造方法。
【請求項３】
前記核酸において、５’側から３’側に向かって、前記第２のコード配列、前記第１のコード配列、及び前記第３のコード配列が、この順で、配置されている、請求項１に記載のペプチド−核酸複合体の製造方法。
【請求項４】
前記核酸において、５’側から３’側に向かって、前記第１のコード配列、前記第２のコード配列、及び前記第３のコード配列が、この順で、配置されている、請求項１に記載のペプチド−核酸複合体の製造方法。
【請求項５】
前記トランスペプチダーゼＮ末端基質モチーフが付加された核酸が、固相担体に固定化されている、請求項１〜４のいずれか一項に記載のペプチド−核酸複合体の製造方法。
【請求項６】
ペプチドと、前記ペプチドをコードする核酸と、を含むペプチド−核酸複合体の製造方法であって、
（Ａ２）トランスペプチダーゼ認識モチーフが付加された核酸であって、
前記ペプチドをコードする第１のコード配列と、前記トランスペプチダーゼをコードする第２のコード配列と、前記トランスペプチダーゼのＮ末端基質モチーフをコードする第３のコード配列と、を含む、核酸を準備する工程と、
（Ｂ２）前記トランスペプチダーゼ認識モチーフが付加された前記核酸から、無細胞タンパク質合成系を用いて、前記ペプチドのドメインと、前記トランスペプチダーゼのドメインと、前記トランスペプチダーゼＮ末端基質モチーフとを含むキメラタンパク質を合成する工程と、
（Ｃ２）前記トランスペプチダーゼドメインによるペプチド転移反応により、前記ペプチド−核酸複合体を形成させる工程と、
を含む、ペプチド−核酸複合体の製造方法。
【請求項７】
前記核酸において、５’側から３’側に向かって、前記第３のコード配列、前記第１のコード配列、及び前記第２のコード配列が、この順で、配置されている、請求項６に記載のペプチド−核酸複合体の製造方法。
【請求項８】
前記核酸において、５’側から３’側に向かって、前記第３のコード配列、前記第２のコード配列、及び前記第１のコード配列が、この順で、配置されている、請求項６に記載のペプチド−核酸複合体の製造方法。
【請求項９】
前記核酸が、さらに、前記第３のコード配列の５’末端に隣接する、プロテアーゼ認識モチーフをコードする第４のコード配列を含み、
前記プロテアーゼは、前記プロテアーゼ認識モチーフと前記トランスペプチダーゼＮ末端基質モチーフとの間の結合を切断する活性を有しており、
前記工程（Ｂ２）の後、且つ前記工程（Ｃ２）の前に、さらに、
（Ｄ２）前記プロテアーゼを用いて、前記プロテアーゼ認識モチーフと前記トランスペプチダーゼＮ末端基質モチーフとの間の結合を切断する工程、
を含む、請求項６〜８のいずれか一項に記載のペプチド−核酸複合体の製造方法。
【請求項１０】
前記トランスペプチダーゼ認識モチーフが付加された核酸が、固相担体に固定化されている、請求項６〜９のいずれか一項に記載のペプチド−核酸複合体の製造方法。
【請求項１１】
（ａ）ペプチドと、
（ｂ）前記ペプチドのコード配列を含む核酸と、
（ｃ）トランスペプチダーゼによるペプチド転移反応により、前記トランスペプチダーゼの認識モチーフとＮ末端基質モチーフとが、結合して生じる配列と、を含み、
前記（ｃ）の配列が、前記（ａ）のペプチドと前記（ｂ）の核酸との間に位置する、
前記ペプチド−核酸複合体。
【請求項１２】
前記（ｂ）の核酸が、前記（ａ）のペプチドをコードする第１のコード配列と、前記トランスペプチダーゼをコードする第２のコード配列と、前記トランスペプチダーゼ認識モチーフ又は前記トランスペプチダーゼＮ末端基質モチーフをコードする第３のコード配列と、を含む、請求項１１に記載の核酸−ペプチド複合体。
【請求項１３】
前記第３のコード配列が、前記トランスペプチダーゼ認識モチーフをコードする配列であり、
前記（ｂ）の核酸において、５’側から３’側に向かって、前記第１のコード配列、前記第３のコード配列、及び前記第２のコード配列が、この順で、配置されている、請求項１２に記載の核酸−ペプチド複合体。
【請求項１４】
前記第３のコード配列が、前記トランスペプチダーゼ認識モチーフをコードする配列であり、
前記（ｂ）の核酸において、５’側から３’側に向かって、前記第２のコード配列、前記第１のコード配列、及び前記第３のコード配列が、この順で、配置されている、請求項１２に記載の核酸−ペプチド複合体。
【請求項１５】
前記第３のコード配列が、前記トランスペプチダーゼ認識モチーフをコードする配列であり、
前記（ｂ）の核酸において、５’側から３’側に向かって、前記第１のコード配列、前記第２のコード配列、及び前記第３のコード配列が、この順で、配置されている、請求項１２に記載の核酸−ペプチド複合体。
【請求項１６】
前記第３のコード配列が、前記トランスペプチダーゼＮ末端基質モチーフをコードする配列であり、
前記（ｂ）の核酸において、５’側から３’側に向かって、前記第３のコード配列、前記第１のコード配列、及び前記第２のコード配列が、この順で、配置されている、請求項１２に記載の核酸−ペプチド複合体。
【請求項１７】
前記第３のコード配列が、前記トランスペプチダーゼＮ末端基質モチーフをコードする配列であり、
前記（ｂ）の核酸において、５’側から３’側に向かって、前記第３のコード配列、前記第２のコード配列、及び前記第１のコード配列が、この順で、配置されている、請求項１２に記載の核酸−ペプチド複合体。
【請求項１８】
前記（ｂ）の核酸が、前記第３のコード配列の５’末端に隣接する、プロテアーゼ認識モチーフをコードする第４のコード配列をさらに含み、
前記プロテアーゼは、前記プロテアーゼ認識モチーフと前記トランスペプチダーゼＮ末端基質モチーフとの間の結合を切断する活性を有している、
請求項１６又は１７に記載の核酸−ペプチド複合体。
【請求項１９】
請求項１１〜１８のいずれか一項に記載のペプチド−核酸複合体が固定化された固相担体。
【請求項２０】
請求項１９に記載の固相担体を含む反応槽を備えた、ペプチドアレイ。
【請求項２１】
前記反応槽１個当たり、１種類の前記ペプチド−核酸複合体を含む、請求項２０に記載のペプチドアレイ。
【請求項２２】
トランスペプチダーゼＮ末端基質モチーフが付加された核酸であって、
ペプチドをコードする第１のコード配列と、
前記トランスペプチダーゼをコードする第２のコード配列と、
前記トランスペプチダーゼの認識モチーフをコードする第３のコード配列と、を含む、核酸。
【請求項２３】
５’側から３’側に向かって、前記第１のコード配列、前記第３のコード配列、及び前記第２のコード配列が、この順で、配置されている、請求項２２に記載の核酸。
【請求項２４】
５’側から３’側に向かって、前記第２のコード配列、前記第１のコード配列、及び前記第３のコード配列が、この順で、配置されている、請求項２２に記載の核酸。
【請求項２５】
前記核酸において、５’側から３’側に向かって、前記第１のコード配列、前記第２のコード配列、及び前記第３のコード配列が、この順で、配置されている、請求項２２に記載の核酸。
【請求項２６】
トランスペプチダーゼ認識モチーフが付加された核酸であって、
ペプチドをコードする第１のコード配列と、
前記トランスペプチダーゼをコードする第２のコード配列と、
前記トランスペプチダーゼのＮ末端基質モチーフをコードする第３のコード配列と、を含む、核酸。
【請求項２７】
５’側から３’側に向かって、前記第３のコード配列、前記第１のコード配列、及び前記第２のコード配列が、この順で、配置されている、請求項２６に記載の核酸。
【請求項２８】
５’側から３’側に向かって、前記第３のコード配列、前記第２のコード配列、及び前記第１のコード配列が、この順で、配置されている、請求項２６に記載の核酸。
【請求項２９】
前記核酸は、さらに、前記第３のコード配列の５’末端に隣接する、プロテアーゼ認識モチーフをコードする第４のコード配列を含み、
前記プロテアーゼは、前記プロテアーゼ認識モチーフと前記トランスペプチダーゼＮ末端基質モチーフとの間の結合を切断する活性を有する、
請求項２６〜２８のいずれか一項に記載の核酸。
【請求項３０】
請求項２２〜２９のいずれか一項に記載の核酸が固定化された固相担体。
【請求項３１】
下記（ａ）〜（ｄ）を含む、ペプチド−核酸複合体の作製キット。
（ａ）任意のペプチドをコードする第１のコード配列若しくは前記第１のコード配列を含む核酸断片を挿入可能なクローニングサイトと、トランスペプチダーゼをコードする第２のコード配列と、前記トランスペプチダーゼの認識モチーフをコードする第３のコード配列と、を含む核酸
（ｂ）前記（ａ）の核酸における、前記第１のコード配列若しくは前記クローニングサイト、前記第２のコード配列、及び前記第３のコード配列を含む領域を増幅可能なプライマーセットであって、フォワードプライマー及びリバースプライマーのいずれか一方に、前記トランスペプチダーゼのＮ末端基質モチーフが付加されている、プライマーセット
（ｃ）核酸増幅試薬
（ｄ）無細胞タンパク質合成反応液
【請求項３２】
前記（ａ）の核酸において、５’側から３’側に向かって、前記第１のコード配列若しくは前記クローニングサイト、前記第３のコード配列、及び前記第２のコード配列が、この順で、配置されている、請求項３１に記載のペプチド−核酸複合体の作製キット。
【請求項３３】
前記（ａ）の核酸において、５’側から３’側に向かって、前記第２のコード配列、前記第１のコード配列若しくは前記クローニングサイト、及び前記第３のコード配列が、この順で、配置されている、請求項３１に記載のペプチド−核酸複合体の作製キット。
【請求項３４】
前記（ａ）の核酸において、５’側から３’側に向かって、前記第１のコード配列若しくは前記クローニングサイト、前記第２のコード配列、及び前記第３のコード配列が、この順で、配置されている、請求項３１に記載のペプチド−核酸複合体の作製キット。
【請求項３５】
下記（ａ）〜（ｄ）を含む、ペプチド−核酸複合体の作製キット。
（ａ）任意のペプチドをコードする第１のコード配列若しくは前記第１のコード配列を含む核酸断片を挿入可能なクローニングサイトと、前記トランスペプチダーゼをコードする第２のコード配列と、前記トランスペプチダーゼのＮ末端基質モチーフをコードする第３のコード配列と、を含む核酸
（ｂ）前記（ａ）の核酸における、前記第１のコード配列若しくは前記クローニングサイト、前記第２のコード配列、及び前記第３のコード配列を含む領域を増幅可能なプライマーセットであって、フォワードプライマー及びリバースプライマーのいずれか一方に、前記トランスペプチダーゼ認識モチーフが付加されている、プライマーセット
（ｃ）核酸増幅試薬
（ｄ）無細胞タンパク質合成反応液
【請求項３６】
前記（ａ）の核酸において、５’側から３’側に向かって、前記第３のコード配列、前記第１のコード配列若しくは前記クローニングサイト、及び前記第２のコード配列が、この順で、配置されている、請求項３５に記載のペプチド−核酸複合体の作製キット。
【請求項３７】
前記（ａ）の核酸において、５’側から３’側に向かって、前記第３のコード配列、前記第２のコード配列、及び前記第１のコード配列若しくは前記クローニングサイトが、この順で、配置されている、請求項３５に記載のペプチド−核酸複合体の作製キット。
【請求項３８】
前記（ａ）の核酸は、さらに、前記第３のコード配列の５’末端に隣接する、プロテアーゼ認識モチーフをコードする第４のコード配列を含み、
前記プロテアーゼは、前記プロテアーゼ認識モチーフと前記トランスペプチダーゼＮ末端基質モチーフとの間の結合を切断する活性を有する、
請求項３５〜３７のいずれか一項に記載のペプチド−核酸複合体の作製キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ペプチド−核酸複合体に関する。さらに、ペプチド−核酸複合体を固定化した固定化担体、及び前記固定化担体を含む反応槽を備えたペプチドアレイに関する。また、ペプチド-核酸複合体の製造方法、前記製造方法に使用可能な核酸、及びキットに関する。
本願は、２０１８年１１月７日に、日本に出願された特願２０１８−２０９８７４号に基づき優先権を主張し、その内容をここに援用する。
【背景技術】
【０００２】
新規機能性ペプチドは、医薬品、洗剤、食品加工、研究開発用試薬、臨床分析、さらにはバイオエネルギー、バイオセンサーなど様々なバイオ応用分野への貢献が期待されている。【０００３】
新規機能性ペプチドの取得に際しては、ペプチドの構造情報から人知によりデザインするペプチド工学的手法が主流であった。しかし、より有用なペプチドを取得するためには従来手法よりも効率的にスクリーニングする必要があり、ペプチドのランダムな分子構造改変と淘汰を繰り返す進化分子工学的手法が期待されている。【０００４】
進化分子工学的手法の一つであるｃＤＮＡディスプレイ法は、遺伝子型−表現型の対応付けの方法であり、核酸リンカーが、ペプチド（表現型）と、これをコードするｍＲＮＡと、逆転写したｃＤＮＡ（遺伝子型）と、を結ぶものである。ｍＲＮＡ／ｃＤＮＡ−ペプチド連結体構造は、非常に安定であるため、該核酸リンカーを用いることにより、様々な環境下でスクリーニングを実施することが可能となった。【０００５】
ペプチドとこれをコードするポリヌクレオチドとを連結する方法としては、ピューロマイシンリンカーを用いる方法が知られている（特許文献１参照）。ピューロマイシンは、アミノアシル−ｔＲＮＡの３’末端と類似する構造を有するペプチド合成阻害剤であり、所定の条件下ではリボソーム上で伸長中のペプチドのＣ末端に特異的に共有結合する。【０００６】
ピューロマイシンリンカーを用いてｍＲＮＡ／ｃＤＮＡ−リンカー−ペプチド複合体のライブラリーを構築し、有用タンパク質をスクリーニングする方法は、以下の一連の工程を有する。
先ず、ピューロマイシンを有するリンカーとｍＲＮＡとを連結させ、無細胞翻訳系を用いてｍＲＮＡからペプチドを合成し、合成されたペプチドとこれをコードするｍＲＮＡとがピューロマイシンを介して結合している複合体（ｍＲＮＡ−リンカー−ペプチド複合体）が生じる（非特許文献１参照）。
次いで、このｍＲＮＡ−リンカー−ペプチド複合体のライブラリーを製造した後、製造したｍＲＮＡ−リンカー−ペプチド複合体を逆転写酵素により逆転写し、ｃＤＮＡを合成することにより、ｍＲＮＡ／ｃＤＮＡ−リンカー−ペプチド複合体のライブラリーを製造する。
次いで、このｍＲＮＡ／ｃＤＮＡ−リンカー−ペプチド複合体のライブラリーを用いて、所望の機能をもつペプチドを選択し、選択したｍＲＮＡ／ｃＤＮＡ−リンカー−ペプチド複合体中のｃＤＮＡの塩基配列を解析することによりペプチドを同定する（非特許文献２参照）。【０００７】
上記ｍＲＮＡ／ｃＤＮＡ−リンカー−ペプチド複合体のライブラリーを基板上に固定したペプチドアレイは、網羅的解析により、短期間で機能性タンパク質又は機能性ペプチドを取得するためのツールとして重要である。【０００８】
また、ｃＤＮＡ−ペプチド複合体を作製する方法としては、ベンジルグアニン修飾ＤＮＡからＳＮＡＰタグ融合ペプチドを無細胞合成することで、ベンジルグアニンとＳＮＡＰタグとの共有結合を介して、ｃＤＮＡとペプチドとを結合させる方法も知られている（非特許文献３，４）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】特許第４３１８７２１号公報
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Nemoto N et al., In vitro virus: bonding of mRNA bearing puromycin at the 3'-terminal end to the C-terminal end of its encoded protein on the ribosome in vitro. FEBS Lett. 1997 Sep 8;414(2):405-8.
【非特許文献２】Yamaguchi J et al., cDNA display: a novel screening method for functional disulfide-rich peptides by solid-phase synthesis and stabilization of mRNA-protein fusions. Nucleic Acids Res. 2009 Sep;37(16):e108.
【非特許文献３】Diamante L et al., In vitro affinity screening of protein and peptide binders by megavalent bead surface display. Protein Eng Des Sel. 2013Oct;26(10):713-24.
【非特許文献４】Mankowska SA et al., A Shorter Route to Antibody Binders via Quantitative in vitro Bead-Display Screening and Consensus Analysis. Sci Rep. 2016 Nov 7;6:36391.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
しかしながら、ピューロマイシンリンカーを用いる方法では、ピューロマイシンリンカーの調製が煩雑であるという問題がある。
また、ベンジルグアニン修飾ＤＮＡを用いる方法では、２０ｋＤａのＳＮＡＰタグを介してタンパク質にＤＮＡを連結するため、提示されたタンパク質の立体構造や機能が損なわれる恐れがある。
本発明は、上記事情に鑑みてなされたものであり、ペプチド−核酸複合体を製造する新規な製造方法、当該製造方法により製造されるペプチド−核酸複合体、並びに当該製造方法に使用可能な核酸、及びキットを提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明は、以下の態様を含む。
［１］ペプチドと、前記ペプチドをコードする核酸と、を含むペプチド−核酸複合体の製造方法であって、（Ａ１）トランスペプチダーゼＮ末端基質モチーフが付加された核酸であって、前記ペプチドをコードする第１のコード配列と、前記トランスペプチダーゼをコードする第２のコード配列と、前記トランスペプチダーゼの認識モチーフをコードする第３のコード配列と、を含む、核酸を準備する工程と、（Ｂ１）前記トランスペプチダーゼＮ末端基質モチーフが付加された前記核酸から、無細胞タンパク質合成系を用いて、前記ペプチドのドメインと、前記トランスペプチダーゼのドメインと、前記トランスペプチダーゼ認識モチーフとを含むキメラタンパク質を合成する工程と、（Ｃ１）前記トランスペプチダーゼドメインによるペプチド転移反応により、前記ペプチド−核酸複合体を形成させる工程と、を含む、ペプチド−核酸複合体の製造方法。
［２］前記核酸において、５’側から３’側に向かって、前記第１のコード配列、前記第３のコード配列、及び前記第２のコード配列が、この順で、配置されている、［１］に記載のペプチド−核酸複合体の製造方法。
［３］前記核酸において、５’側から３’側に向かって、前記第２のコード配列、前記第１のコード配列、及び前記第３のコード配列が、この順で、配置されている、［１］に記載のペプチド−核酸複合体の製造方法。
［４］前記核酸において、５’側から３’側に向かって、前記第１のコード配列、前記第２のコード配列、及び前記第３のコード配列が、この順で、配置されている、［１］に記載のペプチド−核酸複合体の製造方法。
［５］前記トランスペプチダーゼＮ末端基質モチーフが付加された核酸が、固相担体に固定化されている、［１］〜［４］のいずれか一つに記載のペプチド−核酸複合体の製造方法。
［６］ペプチドと、前記ペプチドをコードする核酸と、を含むペプチド−核酸複合体の製造方法であって、（Ａ２）トランスペプチダーゼ認識モチーフが付加された核酸であって、前記ペプチドをコードする第１のコード配列と、前記トランスペプチダーゼをコードする第２のコード配列と、前記トランスペプチダーゼのＮ末端基質モチーフをコードする第３のコード配列と、を含む、核酸を準備する工程と、（Ｂ２）前記トランスペプチダーゼ認識モチーフが付加された前記核酸から、無細胞タンパク質合成系を用いて、前記ペプチドのドメインと、前記トランスペプチダーゼのドメインと、前記トランスペプチダーゼＮ末端基質モチーフとを含むキメラタンパク質を合成する工程と、（Ｃ２）前記トランスペプチダーゼドメインによるペプチド転移反応により、前記ペプチド−核酸複合体を形成させる工程と、を含む、ペプチド−核酸複合体の製造方法。
［７］前記核酸において、５’側から３’側に向かって、前記第３のコード配列、前記第１のコード配列、及び前記第２のコード配列が、この順で、配置されている、［６］に記載のペプチド−核酸複合体の製造方法。
［８］前記核酸において、５’側から３’側に向かって、前記第３のコード配列、前記第２のコード配列、及び前記第１のコード配列が、この順で、配置されている、［６］に記載のペプチド−核酸複合体の製造方法。
［９］前記核酸が、さらに、前記第３のコード配列の５’末端に隣接する、プロテアーゼ認識モチーフをコードする第４のコード配列を含み、前記プロテアーゼは、前記プロテアーゼ認識モチーフと前記トランスペプチダーゼＮ末端基質モチーフとの間の結合を切断する活性を有しており、前記工程（Ｂ２）の後、且つ前記工程（Ｃ２）の前に、さらに、（Ｄ２）前記プロテアーゼを用いて、前記プロテアーゼ認識モチーフと前記トランスペプチダーゼＮ末端基質モチーフとの間の結合を切断する工程、を含む、［６］〜［８］のいずれか一つに記載のペプチド−核酸複合体の製造方法。
［１０］前記トランスペプチダーゼ認識モチーフが付加された核酸が、固相担体に固定化されている、［６］〜［９］のいずれか一つに記載のペプチド−核酸複合体の製造方法。
［１１］（ａ）ペプチドと、（ｂ）前記ペプチドのコード配列を含む核酸と、（ｃ）トランスペプチダーゼによるペプチド転移反応により、前記トランスペプチダーゼの認識モチーフとＮ末端基質モチーフとが、結合して生じる配列と、を含み、前記（ｃ）の配列が、前記（ａ）のペプチドと前記（ｂ）の核酸との間に位置する、前記ペプチド−核酸複合体。
［１２］前記（ｂ）の核酸が、前記（ａ）のペプチドをコードする第１のコード配列と、前記トランスペプチダーゼをコードする第２のコード配列と、前記トランスペプチダーゼ認識モチーフ又は前記トランスペプチダーゼＮ末端基質モチーフをコードする第３のコード配列と、を含む、［１１］に記載の核酸−ペプチド複合体。
［１３］前記第３のコード配列が、前記トランスペプチダーゼ認識モチーフをコードする配列であり、前記（ｂ）の核酸において、５’側から３’側に向かって、前記第１のコード配列、前記第３のコード配列、及び前記第２のコード配列が、この順で、配置されている、［１２］に記載の核酸−ペプチド複合体。
［１４］前記第３のコード配列が、前記トランスペプチダーゼ認識モチーフをコードする配列であり、前記（ｂ）の核酸において、５’側から３’側に向かって、前記第２のコード配列、前記第１のコード配列、及び前記第３のコード配列が、この順で、配置されている、［１２］に記載の核酸−ペプチド複合体。
［１５］前記第３のコード配列が、前記トランスペプチダーゼ認識モチーフをコードする配列であり、前記（ｂ）の核酸において、５’側から３’側に向かって、前記第１のコード配列、前記第２のコード配列、及び前記第３のコード配列が、この順で、配置されている、［１２］に記載の核酸−ペプチド複合体。
［１６］前記第３のコード配列が、前記トランスペプチダーゼＮ末端基質モチーフをコードする配列であり、前記（ｂ）の核酸において、５’側から３’側に向かって、前記第３のコード配列、前記第１のコード配列、及び前記第２のコード配列が、この順で、配置されている、［１２］に記載の核酸−ペプチド複合体。
［１７］前記第３のコード配列が、前記トランスペプチダーゼＮ末端基質モチーフをコードする配列であり、前記（ｂ）の核酸において、５’側から３’側に向かって、前記第３のコード配列、前記第２のコード配列、及び前記第１のコード配列が、この順で、配置されている、［１２］に記載の核酸−ペプチド複合体。
［１８］前記（ｂ）の核酸が、前記第３のコード配列の５’末端に隣接する、プロテアーゼ認識モチーフをコードする第４のコード配列をさらに含み、前記プロテアーゼは、前記プロテアーゼ認識モチーフと前記トランスペプチダーゼＮ末端基質モチーフとの間の結合を切断する活性を有している、［１６］又は［１７］に記載の核酸−ペプチド複合体。
［１９］［１１］〜［１８］のいずれか一つに記載のペプチド−核酸複合体が固定化された固相担体。
［２０］［１９］に記載の固相担体を含む反応槽を備えた、ペプチドアレイ。
［２１］前記反応槽１個当たり、１種類の前記ペプチド−核酸複合体を含む、［２０］に記載のペプチドアレイ。
［２２］トランスペプチダーゼＮ末端基質モチーフが付加された核酸であって、ペプチドをコードする第１のコード配列と、前記トランスペプチダーゼをコードする第２のコード配列と、前記トランスペプチダーゼの認識モチーフをコードする第３のコード配列と、を含む、核酸。
［２３］５’側から３’側に向かって、前記第１のコード配列、前記第３のコード配列、及び前記第２のコード配列が、この順で、配置されている、［２２］に記載の核酸。
［２４］５’側から３’側に向かって、前記第２のコード配列、前記第１のコード配列、及び前記第３のコード配列が、この順で、配置されている、［２２］に記載の核酸。
［２５］前記核酸において、５’側から３’側に向かって、前記第１のコード配列、前記第２のコード配列、及び前記第３のコード配列が、この順で、配置されている、［２２］に記載の核酸。
［２６］トランスペプチダーゼ認識モチーフが付加された核酸であって、ペプチドをコードする第１のコード配列と、前記トランスペプチダーゼをコードする第２のコード配列と、前記トランスペプチダーゼのＮ末端基質モチーフをコードする第３のコード配列と、を含む、核酸。
［２７］５’側から３’側に向かって、前記第３のコード配列、前記第１のコード配列、及び前記第２のコード配列が、この順で、配置されている、［２６］に記載の核酸。
［２８］５’側から３’側に向かって、前記第３のコード配列、前記第２のコード配列、及び前記第１のコード配列が、この順で、配置されている、［２６］に記載の核酸。
［２９］前記核酸は、さらに、前記第３のコード配列の５’末端に隣接する、プロテアーゼ認識モチーフをコードする第４のコード配列を含み、前記プロテアーゼは、前記プロテアーゼ認識モチーフと前記トランスペプチダーゼＮ末端基質モチーフとの間の結合を切断する活性を有する、［２６］〜［２８］のいずれか一つに記載の核酸。
［３０］［２２］〜［２９］のいずれか一つに記載の核酸が固定化された固相担体。
［３１］下記（ａ）〜（ｄ）を含む、ペプチド−核酸複合体の作製キット。
（ａ）任意のペプチドをコードする第１のコード配列若しくは前記第１のコード配列を含む核酸断片を挿入可能なクローニングサイトと、トランスペプチダーゼをコードする第２のコード配列と、前記トランスペプチダーゼの認識モチーフをコードする第３のコード配列と、を含む核酸
（ｂ）前記（ａ）の核酸における、前記第１のコード配列若しくは前記クローニングサイト、前記第２のコード配列、及び前記第３のコード配列を含む領域を増幅可能なプライマーセットであって、フォワードプライマー及びリバースプライマーのいずれか一方に、前記トランスペプチダーゼのＮ末端基質モチーフが付加されている、プライマーセット
（ｃ）核酸増幅試薬
（ｄ）無細胞タンパク質合成反応液
［３２］前記（ａ）の核酸において、５’側から３’側に向かって、前記第１のコード配列若しくは前記クローニングサイト、前記第３のコード配列、及び前記第２のコード配列が、この順で、配置されている、［３１］に記載のペプチド−核酸複合体の作製キット。
［３３］前記（ａ）の核酸において、５’側から３’側に向かって、前記第２のコード配列、前記第１のコード配列若しくは前記クローニングサイト、及び前記第３のコード配列が、この順で、配置されている、［３１］に記載のペプチド−核酸複合体の作製キット。
［３４］前記（ａ）の核酸において、５’側から３’側に向かって、前記第１のコード配列若しくは前記クローニングサイト、前記第２のコード配列、及び前記第３のコード配列が、この順で、配置されている、［３１］に記載のペプチド−核酸複合体の作製キット。
［３５］下記（ａ）〜（ｄ）を含む、ペプチド−核酸複合体の作製キット。
（ａ）任意のペプチドをコードする第１のコード配列若しくは前記第１のコード配列を含む核酸断片を挿入可能なクローニングサイトと、前記トランスペプチダーゼをコードする第２のコード配列と、前記トランスペプチダーゼのＮ末端基質モチーフをコードする第３のコード配列と、を含む核酸
（ｂ）前記（ａ）の核酸における、前記第１のコード配列若しくは前記クローニングサイト、前記第２のコード配列、及び前記第３のコード配列を含む領域を増幅可能なプライマーセットであって、フォワードプライマー及びリバースプライマーのいずれか一方に、前記トランスペプチダーゼ認識モチーフが付加されている、プライマーセット
（ｃ）核酸増幅試薬
（ｄ）無細胞タンパク質合成反応液
［３６］前記（ａ）の核酸において、５’側から３’側に向かって、前記第３のコード配列、前記第１のコード配列若しくは前記クローニングサイト、及び前記第２のコード配列が、この順で、配置されている、［３５］に記載のペプチド−核酸複合体の作製キット。
［３７］前記（ａ）の核酸において、５’側から３’側に向かって、前記第３のコード配列、前記第２のコード配列、及び前記第１のコード配列若しくは前記クローニングサイトが、この順で、配置されている、［３５］に記載のペプチド−核酸複合体の作製キット。
［３８］前記（ａ）の核酸は、さらに、前記第３のコード配列の５’末端に隣接する、プロテアーゼ認識モチーフをコードする第４のコード配列を含み、前記プロテアーゼは、前記プロテアーゼ認識モチーフと前記トランスペプチダーゼＮ末端基質モチーフとの間の結合を切断する活性を有する、［３５］〜［３７］のいずれか一つに記載のペプチド−核酸複合体の作製キット。
【発明の効果】
【００１３】
本発明によれば、ペプチド−核酸複合体を製造する新規な製造方法、当該製造方法により製造されるペプチド−核酸複合体、並びに当該製造方法に使用可能な核酸、及びキットが提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１Ａ】本発明の第１実施形態にかかるペプチド−核酸複合体の製造方法における工程（Ａ１）の一例を説明する図である。トランスペプチダーゼＮ末端基質モチーフが付加された核酸の一例を示す。
【図１Ｂ】本発明の第１実施形態にかかるペプチド−核酸複合体の製造方法における工程（Ｂ１）の一例を説明する図である。
【図１Ｃ】本発明の第１実施形態にかかるペプチド−核酸複合体の製造方法における工程（Ｃ１）の一例を説明する図である。
【図２Ａ】本発明の第２実施形態にかかるペプチド−核酸複合体の製造方法における工程（Ａ１）の一例を説明する図である。トランスペプチダーゼＮ末端基質モチーフが付加された核酸の一例を示す。
【図２Ｂ】本発明の第２実施形態にかかるペプチド−核酸複合体の製造方法における工程（Ｂ１）の一例を説明する図である。
【図２Ｃ】本発明の第２実施形態にかかるペプチド−核酸複合体の製造方法における工程（Ｃ１）の一例を説明する図である。
【図３Ａ】本発明の第３実施形態にかかるペプチド−核酸複合体の製造方法における工程（Ａ１）の一例を説明する図である。トランスペプチダーゼＮ末端基質モチーフが付加された核酸の一例を示す。
【図３Ｂ】本発明の第３実施形態にかかるペプチド−核酸複合体の製造方法における工程（Ｂ１）の一例を説明する図である。
【図３Ｃ】本発明の第３実施形態にかかるペプチド−核酸複合体の製造方法における工程（Ｃ１）の一例を説明する図である。
【図４Ａ】本発明の第４実施形態にかかるペプチド−核酸複合体の製造方法における工程（Ａ２）の一例を説明する図である。トランスペプチダーゼ認識モチーフが付加された核酸の一例を示す。
【図４Ｂ】本発明の第４実施形態にかかるペプチド−核酸複合体の製造方法における工程（Ｂ２）の一例を説明する図である。
【図４Ｃ】本発明の第４実施形態にかかるペプチド−核酸複合体の製造方法における工程（Ｃ２）の一例を説明する図である。
【図５Ａ】本発明の第５実施形態にかかるペプチド−核酸複合体の製造方法における工程（Ａ２）の一例を説明する図である。トランスペプチダーゼ認識モチーフが付加された核酸の一例を示す。
【図５Ｂ】本発明の第５実施形態にかかるペプチド−核酸複合体の製造方法における工程（Ｂ２）の一例を説明する図である。
【図５Ｃ】本発明の第５実施形態にかかるペプチド−核酸複合体の製造方法における工程（Ｃ２）の一例を説明する図である。
【図６Ａ】本発明の第４実施形態にかかるペプチド−核酸複合体の製造方法における工程（Ｄ２）の一例を説明する図である。
【図６Ｂ】本発明の第５実施形態にかかるペプチド−核酸複合体の製造方法における工程（Ｄ２）の一例を説明する図である。
【図７】合成例１で合成したペンタグリシンが付加されたＤＮＡプライマーのポリアクリルアミド電気泳動の写真である。
【図８】合成例２でＰＣＲに用いた鋳型ＤＮＡの構造を示す。
【図９】実験例２で無細胞タンパク質翻訳を行った、ペンタグリシン付加ＤＮＡ固定化磁気ビーズのポリリン酸キナーゼ活性の測定結果を示す。
【図１０】実験例６で、ペンタグリシン付加ＤＮＡ固定化磁気ビーズの抗体染色を行った結果を示す。
【図１１】実験例６で、ペンタグリシン付加ＤＮＡ固定化磁気ビーズの抗体染色を行った結果を示す、蛍光顕微鏡写真である。
【図１２Ａ】実施例で作製したペプチドアレイの蛍光顕微鏡写真を示す。
【図１２Ｂ】実施例で作製したペプチドアレイの各ウェルの蛍光強度の推移を示す。
【図１３】実験例９で、ペンタグリシン付加ＤＮＡ固定化磁気ビーズによるプロテインキナーゼＡ（ＰＫＡ）活性の阻害効果を測定した結果を示す。
【図１４Ａ】実験例１４で、ペンタグリシン付加ＤＮＡ固定化磁気ビーズに、蛍光標識細胞外小胞を反応させて、蛍光顕微鏡観察した結果を示す。
【図１４Ｂ】実験例１４で、ペンタグリシン付加ＤＮＡ固定化磁気ビーズに、蛍光標識細胞外小胞を反応させて、蛍光強度を検出した結果を示す。
【図１５】エマルションＰＣＲ及びエマルション無細胞タンパク質翻訳後に、実験例１８で、ポリリン酸キナーゼ活性を測定した結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
［定義］
本明細書において、「ポリヌクレオチド」及び「核酸」という用語は、相互に互換的に使用され、ヌクレオチドがホスホジエステル結合によって結合したヌクレオチドポリマーを意味する。「ポリヌクレオチド」及び「核酸」は、ＤＮＡであってもよく、ＲＮＡであってもよく、ＤＮＡとＲＮＡとの組み合わせから構成されてもよい。また、「ポリヌクレオチド」及び「核酸」は、天然ヌクレオチドのポリマーであってもよく、天然ヌクレオチドと非天然ヌクレオチド（天然ヌクレオチドの類似体、塩基部分、糖部分及びリン酸部分のうち少なくとも一つの部分が修飾されているヌクレオチド（例えば、ホスホロチエート骨格）等）とのポリマーであってもよく、非天然ヌクレオチドのポリマーであってもよい。
本明細書において、「ポリヌクレオチド」又は「核酸」の塩基配列は、特に明示しない限り、一般的に認められている１文字コードで記載される。本明細書において、「ポリヌクレオチド」又は「核酸」の塩基配列は、特に明示しない限り、５’側から３’側に向かって記載される。
本明細書において、「ポリヌクレオチド」又は「核酸」を構成するヌクレオチド残基は、単に、アデニン、チミン、シトシン、グアニン、又はウラシル等と記載されるか、あるいはそれらの１文字コードで記載される場合がある。
【００１６】
本明細書において、「遺伝子」という用語は、特定のタンパク質をコードする少なくとも１つのオープンリーディングフレームを含むポリヌクレオチドを意味する。遺伝子は、エクソン及びイントロンの両方を含み得る。
【００１７】
本明細書において、「ポリペプチド」、「ペプチド」及び「タンパク質」という用語は、相互に互換的に使用され、アミド結合によって結合したアミノ酸のポリマーを意味する。「ポリペプチド」、「ペプチド」又は「タンパク質」は、天然アミノ酸のポリマーであってもよく、天然アミノ酸と非天然アミノ酸（天然アミノ酸の化学的類似体、修飾誘導体等）とのポリマーであってもよく、非天然アミノ酸のポリマーであってもよい。
本明細書において、「ポリペプチド」、「ペプチド」又は「タンパク質」のアミノ酸配列は、特に明示しない限り、一般的に認められている１文字コード又は３文字コードで記載される。本明細書において、「ポリペプチド」、「ペプチド」又は「タンパク質」のアミノ酸配列は、特に明示しない限り、Ｎ末端側からＣ末端側に向かって記載される。
【００１８】
本明細書において、アミノ酸配列における置換変異を表す場合、元のアミノ酸の一文字表記、続いて１〜４桁の数字による位置番号、次に置換されたアミノ酸の一文字表記により表現することがある。例えば、アミノ酸番号９４位においてプロリン（Ｐ）がセリン（Ｓ）に置換される変異が生じている場合、「Ｐ９４Ｓ」と表され、これは、「アミノ酸番号９４位のＰｒｏのＳｅｒへの置換」と同義である。
【００１９】
本明細書において、「トランスペプチダーゼ」という用語は、ペプチド結合の切断を触媒し、直接又は複数の反応中間体を経て、新規のペプチド結合を形成することができる酵素を意味する。トランスペプチダーゼは、特定のアミノ酸配列を有するトランスペプチダーゼ認識モチーフを認識し、トランスペプチダーゼ認識モチーフ内のペプチド結合を切断し、前記切断後のトランスペプチダーゼ認識モチーフのＣ末端と、特定のアミノ酸配列を有するトランスペプチダーゼＮ末端基質モチーフのＮ末端との間で新たなペプチド結合を形成する触媒活性を有する。トランスペプチダーゼの好ましい例としては、ソルターゼ又はブテラーゼが挙げられる。
【００２０】
本明細書において、「ソルターゼ」という用語は、トランスペプチダーゼ活性を有する原核生物の一群の酵素群及びその改変体を意味する。ソルターゼは、特定のアミノ酸配列を有するソルターゼ認識モチーフを認識し、ソルターゼ認識モチーフ内のペプチド結合を切断し、前記切断後のソルターゼ認識モチーフのＣ末端と、特定のアミノ酸配列を有するソルターゼＮ末端基質モチーフのＮ末端との間で新たなペプチド結合を形成する触媒活性を有する。
「ソルターゼ」として同定される酵素は、様々なグラム陽性菌から単離されている。天然には、これらの酵素は、細胞壁ソーティング反応を触媒する。細胞壁ソーティング反応では、ソルターゼ認識モチーフを有する表面タンパク質が切断され、タンパク質のＣ末端が、ペプチドグリカンのペンタグリシン架橋に共有結合される。ソルターゼを有するグラム陽性菌としては、アクチノマイセス（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ）属、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属、ビフィドバクテリウム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、セルロモナス（Ｃｅｌｌｕｌｏｍｏｎａｓ）属、クロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）属、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、ミクロコッカス（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ）属、マイコバクテリウム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、ノカルディア（Ｎｏｃａｒｄｉａ）属、スタフィロコッカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）属、ストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）属、及びストレプトミセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属等に属する細菌が挙げられる。ソルターゼは、グラム陽性菌ゲノム由来の６１のソルターゼの配列アラインメント及び系統樹解析に基づいて、Ａ、Ｂ、Ｃ、及びＤと称する４クラスに分類されている（Dramsi S,Trieu-Cuot P,Bierne H,Sorting sortases:a nomenclature proposal for the various sortases of Gram-positive bacteria.Res Microbiol.156(3):289-97,2005）。これらのクラスは、ソルターゼが、Ｃｏｍｆｏｒｔ及びＣｌｕｂｂ（Comfort D,Clubb RT.A comparative genome analysis identifies distinct sorting pathways in gram-positive bacteria.Infect Immun. 72(5):2710-22,2004）によっても分類された以下のサブファミリー：クラスＡ（サブファミリー１）、クラスＢ（サブファミリー２）、クラスＣ（サブファミリー３）、クラスＤ（サブファミリー４及び５）に対応する。前述した参照文献は、多数のソルターゼ及び認識モチーフを開示している。
【００２１】
本明細書において、「ブテラーゼ」という用語は、トランスペプチダーゼ活性を有する、クリトリア・テルナテア（Ｃｌｉｔｏｒｉａ  ｔｅｒｎａｔｅａ）から単離された酵素（Nguyen GK et al., Nat Protoc. 2016 Oct;11(10):1977-1988、特表２０１７−５１５４６８号公報）、及びそのホモログ（オーソログ及びパラログを含む）、並びにそれらの改変体を意味する。
【００２２】
本明細書において、「トランスペプチダーゼ認識モチーフ」という用語は、トランスペプチダーゼにより認識される特定のアミノ酸配列を有する領域を意味する。トランスペプチダーゼ認識モチーフは、トランスペプチダーゼにより認識されてモチーフ内のペプチド結合が切断される。トランスペプチダーゼ認識モチーフは、トランスペプチダーゼの種類により異なったものであり得る。本明細書において、ソルターゼのトランスペプチダーゼ認識モチーフは、ソルターゼ認識モチーフとも記載する。本明細書において、ブテラーゼのトランスペプチダーゼ認識モチーフは、ブテラーゼ認識モチーフとも記載する。
【００２３】
本明細書において、「トランスペプチダーゼＮ末端基質モチーフ」という用語は、ペプチドのＮ末端に位置し、トランスペプチダーゼによるペプチド転移反応に供される特定のアミノ酸配列を有するＮ末端領域を意味する。トランスペプチダーゼＮ末端基質モチーフを有するペプチドは、トランスペプチダーゼの触媒作用により、トランスペプチダーゼによる切断後のトランスペプチダーゼ認識モチーフのＣ末端に結合される。
【００２４】
本明細書において、「５’末端に隣接する」又は「３’末端に隣接する」という用語は、ある塩基配列の５’末端又は３’末端に、他のヌクレオチド残基を介することなく、対象の塩基配列が連結されていることを意味する。すなわち、「配列Ａの５’末端に配列Ｂが隣接する」場合、配列Ａの５’末端と配列Ｂの３’末端とが、他の配列を介することなく、直接連結されている。同様に、本明細書において、「Ｎ末端に隣接する」又は「Ｃ末端に隣接する」という用語は、あるアミノ酸配列のＮ末端又はＣ末端に、他のアミノ酸残基を介することなく、対象のアミノ酸配列が連結されていることを意味する。
【００２５】
本明細書において、「５’側に位置する」又は「３’側に位置する」という用語は、ある塩基配列の５’側又は３’側に、他のヌクレオチド残基を介して又は他のヌクレオチド残基を介することなく、対象の塩基配列が配置されていることを意味する。すなわち、「配列Ａの５’側に配列Ｂが位置する」場合、５’側から３’側に向かって、配列Ｂ、配列Ａの順に配置されており、配列Ａと配列Ｂとの間に、他のヌクレオチド残基が介在していてもよく、介在していなくてもよい。配列Ａと配列Ｂとの間に、他のヌクレオチド残基がする場合、当該介在するヌクレオチド残基の数及び種類は限定されず、例えば、スペーサーコード配列、タンパク質コード配列、他のＯＲＦ等が介在していてもよい。同様に、本明細書において、「Ｎ末端側に位置する」又は「Ｃ末端側に位置する」という用語は、あるアミノ酸配列のＮ末端側又はＣ末端側に、他のアミノ酸残基を介して又は他のアミノ酸残基を介することなく、対象のアミノ酸配列が配置されていることを意味する。
【００２６】
本明細書において、ポリヌクレオチド又は核酸に関して用いる「機能的に連結」という用語は、第一の塩基配列が第二の塩基配列に十分に近くに配置され、第一の塩基配列が第二の塩基配列又は第二の塩基配列の制御下の領域に影響を及ぼしうることを意味する。例えば、ポリヌクレオチド又は核酸がプロモーターに機能的に連結するとは、当該ポリヌクレオチド又は核酸が、当該プロモーターの制御下で発現するように連結されていることを意味する。
【００２７】
本明細書において、ポリペプチド又は核酸に関して用いる「タンパク質を発現し得る」という用語は、ポリヌクレオチド又は核酸に、無細胞タンパク質合成系を適用した場合に、該ポリヌクレオチド又は核酸から該タンパク質が合成され得る状態にあることを意味する。
【００２８】
本明細書において、「サイレント変異」という用語は、コードするタンパク質のアミノ酸配列が変化しない遺伝子変異を指す。
【００２９】
本明細書において、アミノ酸配列どうしの配列同一性（又は相同性）は、２つのアミノ酸配列を、対応するアミノ酸が最も多く一致するように、挿入及び欠失に当たる部分にギャップを入れながら並置し、得られたアラインメント中のギャップを除くアミノ酸配列全体に対する一致したアミノ酸の割合として求められる。アミノ酸配列どうしの配列同一性は、当該技術分野で公知の各種相同性検索ソフトウェアを用いて求めることができる。例えば、アミノ酸配列の配列同一性の値は、公知の相同性検索ソフトウェアＢＬＡＳＴＰにより得られたアライメントを元にした計算によって得ることができる。
【００３０】
本明細書において、「キメラタンパク質」という用語は、由来が異なる２種以上のペプチドを含むタンパク質を意味する。
【００３１】
本明細書において、「プライマーセット」という用語は、核酸増幅反応において、目的の核酸を増幅するために用いられる１組のプライマーを意味する。核酸増幅反応がＰＣＲにより行われる場合、プライマーセットには、フォワードプライマー及びリバースプライマーが含まれる。「フォワードプライマー」とは、鋳型核酸のアンチセンス鎖にアニーリングするプライマーを意味し、「リバースプライマー」とは、鋳型核酸のセンス鎖にアニーリングするプライマーを意味する。
【００３２】
以下、場合により図面を参照しつつ、本発明の実施形態について詳細に説明する。図面中、同一又は相当部分には同一又は対応する符号を付し、重複する説明は省略する。各図における寸法比は、説明のため誇張している部分があり、必ずしも実際の寸法比とは一致しない。
【００３３】
＜ペプチド−核酸複合体の製造方法＞
≪第１の態様≫
一実施形態において、本発明は、ペプチドと、前記ペプチドをコードする核酸と、を含むペプチド−核酸複合体の製造方法を提供する。前記製造方法は、（Ａ１）トランスペプチダーゼＮ末端基質モチーフが付加された核酸であって、前記ペプチドをコードする第１のコード配列と、トランスペプチダーゼをコードする第２のコード配列と、前記トランスペプチダーゼの認識モチーフをコードする第３のコード配列と、を含む、核酸を準備する工程と、（Ｂ１）前記トランスペプチダーゼＮ末端基質モチーフが付加された前記核酸から、無細胞タンパク質合成系を用いて、前記ペプチドのドメインと、前記トランスペプチダーゼのドメインと、前記トランスペプチダーゼ認識モチーフとを含むキメラタンパク質を合成する工程と、（Ｃ１）前記キメラタンパク質の前記トランスペプチダーゼドメインによるペプチド転移反応により、前記ペプチド−核酸複合体を形成させる工程と、を含む。
【００３４】
〔第１実施形態〕
図１Ａ〜図１Ｃに基づき、本態様にかかる製造方法の第１実施形態の概略を説明する。
まず、トランスペプチダーゼＮ末端基質モチーフ２１が付加された核酸１００（以下、「ＮＳ付加核酸１００」という場合がある。）を準備する（図１Ａ；工程（Ａ１））。ＮＳ付加核酸１００は、任意のペプチドをコードする第１のコード配列と、トランスペプチダーゼをコードする第２のコード配列と、前記トランスペプチダーゼの認識モチーフをコードする第３のコード配列と、を含む。ＮＳ付加核酸１００では、５’側から３’側に向かって、第１のコード配列、第３のコード配列、及び第２のコード配列が、この順で、配置されている。また、ＮＳ付加核酸１００において、これらのコード配列は、前記第１のコード配列から翻訳される前記ペプチドのドメインと、第２のコード配列から翻訳されるトランスペプチダーゼのドメインと、第３のコード配列から翻訳される前記トランスペプチダーゼ認識モチーフと、を含むキメラタンパク質を発現し得るように配置されている。
次に、ＮＳ付加核酸１００から、無細胞タンパク質合成系を用いて、キメラタンパク質１０１を合成する（図１Ｂ；工程（Ｂ１））。キメラタンパク質１０１は、ペプチド１０のドメイン、トランスペプチダーゼ認識モチーフ２２、及びトランスペプチダーゼ２０のドメインを含んでいる。キメラタンパク質１０１において、トランスペプチダーゼ認識モチーフ２２は、ペプチド１０のドメインのＣ末端側に位置している。キメラタンパク質１０１では、Ｎ末端側からＣ末端側に向かって、ペプチド１０、トランスペプチダーゼ認識モチーフ２２、及びトランスペプチダーゼ２０が、この順で配置されている。
次に、キメラタンパク質１０１のトランスペプチダーゼ２０のドメインによるペプチド転移反応により、前記ペプチド−核酸複合体１０２を形成させる（図１Ｃ；工程（Ｃ１））。このようにして、ペプチド−核酸複合体を製造することができる。
以下、本実施形態の製造方法の各工程について説明する。
【００３５】
［工程（Ａ１）］
工程（Ａ１）は、トランスペプチダーゼＮ末端基質モチーフが付加された核酸であって、前記ペプチドをコードする第１のコード配列と、トランスペプチダーゼをコードする第２のコード配列と、前記トランスペプチダーゼの認識モチーフをコードする第３のコード配列と、を含む、核酸を準備する工程である。
【００３６】
（トランスペプチダーゼ）
トランスペプチダーゼは、特に限定されないが、ソルターゼが好ましい。ソルターゼは、ソルターゼ認識モチーフを認識して切断し、前記切断後のソルターゼ認識モチーフのＣ末端に、ソルターゼＮ末端基質モチーフのＮ末端を結合し得るものであれば、特に制限なく使用することができる。公知のソルターゼとしては、ソルターゼＡ、ソルターゼＢ、ソルターゼＣ、及びソルターゼＤが知られている。本実施形態の製造方法では、これらのいずれのソルターゼも用いることができる。これらのソルターゼの塩基配列及びアミノ酸配列は、ＧｅｎＢａｎｋ等の公知のデータベースから入手可能である。
ソルターゼのＮ末端基質モチーフとしては、例えば、１個以上のグリシン（（Ｇ）ｎ）又はアラニン（（Ａ）ｎ）（ｎは１以上の整数）が挙げられる。中でも、ソルターゼのＮ末端基質モチーフは、１個以上のグリシンが好ましい。Ｎ末端基質モチーフにおけるグリシン残基の数は、１〜１０が好ましく、１〜８がより好ましく、１〜６又は１〜５がさらに好ましい。
【００３７】
ソルターゼＡは、例えば、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）又は化膿レンサ球菌（Ｓ．ｐｙｒｏｇｅｎｅｓ）由来のものであってもよい。例えば、黄色ブドウ球菌のソルターゼＡの配列は、ＮＣＢＩ ＲｅｆＳｅｑ Ａｃｃ．Ｎｏ．ＮＰ＿１８７３３２．１；ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃ．Ｎｏ．ＡＡＤ４８４３７から入手可能である。
ソルターゼＡの認識モチーフとしては、例えば、ＸＡＰＸＢＸＣ又はＸＡＰＸＢＸＣＧのアミノ酸配列を含むものであり得る。前記において、ＸＡは、ロイシン、イソロイシン、バリン若しくはメチオニンであり；ＸＢは、任意のアミノ酸であり；ＸＣは、トレオニン、セリン若しくはアラニンであり；Ｐは、プロリンであり；Ｇは、グリシンである。好ましい態様において、ＸＡは、ロイシンであり；ＸＣは、トレオニンであり；ＸＢは、アスパラギン酸塩、グルタミン酸塩、アラニン、グルタミン、リシン又はメチオニンであり得る。例えば、ソルターゼＡの認識モチーフの具体例としては、ＬＰＸＴＧ（配列番号１）（ＬＰＡＴＧ（配列番号２）、ＬＰＮＴＧ（配列番号３）など）、ＬＰＸＡＧ（配列番号４）（ＬＰＮＡＧ（配列番号５）など）、ＬＰＸＴＡ（配列番号６）（ＬＰＮＴＡ（配列番号７）など）、ＬＧＸＴＧ（配列番号８）（ＬＧＡＴＧ（配列番号９）など）、ＩＰＸＴＧ（配列番号１０）（ＩＰＮＴＧ（配列番号１１）、ＩＰＥＴＧ（配列番号１２）など）（Ｘは任意のアミノ酸を表す。）等が挙げられる。これらの中でも、ソルターゼＡの認識モチーフとしては、ＬＰＸＴＧ（配列番号１）が好ましい。
【００３８】
ソルターゼＡは、野生型のタンパク質に制限されず、トランスペプチダーゼ活性を有する限り、改変体であってもよい。例えば、黄色ブドウ球菌のソルターゼＡの改変体は、１２０位にＨｉｓ、１８４位にＣｙｓ、及び１９７位にＡｒｇを含み、認識モチーフは、ＴＬＸＴＣ（配列番号１３）であってもよい。ソルターゼＡの改変体は、野生型ソルターゼＡ又はその触媒ドメインのアミノ酸配列に対して、８０％以上（例えば、８５％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、又は９９％以上）の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つトランスペプチダーゼ活性を有するものであってもよい。あるいは、ソルターゼＡの改変体は、野生型ソルターゼＡのアミノ酸配列において、１個又は複数個（例えば、２〜１５個：２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、若しくは１５個）のアミノ酸が欠失、置換、付加、又は挿入されたアミノ酸配列からなり、且つトランスペプチダーゼ活性を有するものであってもよい。
例えば、黄色ブドウ球菌の野生型ソルターゼＡと比較して、ＬＰＥＴＧ（配列番号１４）モチーフへの結合活性が最大１４０倍増大した黄色ブドウ球菌のソルターゼＡの改変体が見出されており（Chen, I., et al., PNAS 108(28):11399-11404,2011）、そのようなソルターゼＡを用いてもよい。例えば、ソルターゼＡの改変体は、黄色ブドウ球菌の野生型ソルターゼＡに対して、Ｐ９４Ｓ若しくはＰ９４Ｒ、Ｅ１０６Ｇ、Ｆ１２２Ｙ、Ｋ１５４Ｒ、Ｄ１６０Ｎ、Ｄ１６５Ａ、Ｇ１７４Ｓ、Ｋ１９０Ｅ、及びＫ１９６Ｔからなる群より選択される少なくとも１個の変異を有するものであってもよい。中でも、Ｐ９４Ｓ若しくはＰ９４Ｒ、Ｄ１６０Ｎ、Ｄ１６５Ａ、Ｇ１７４Ｓ、及びＫ１９６Ｔからなる群より選択される少なくとも１個の変異を有するものが好ましく、前記の全ての変異を有するものがより好ましい。
【００３９】
また、ソルターゼＡは、認識モチーフが改変されたものであってもよい。例えば、Ｐｉｏｔｕｋｈら（J Am Chem Soc. 2011 Nov 9; 133(44): 17536-9）には、認識モチーフがＸＰＸＴＧ（配列番号１５）であるソルターゼＡの改変体が記載されている。Ｄｏｒｒら（Proc Natl Acad Sci U S A. 2014 Sep 16; 111(37): 13343-8.）には、認識モチーフがＬＡＸＴＧ（配列番号１６）又はＬＰＸＳＧ（配列番号１７）であるソルターゼＡの改変体が記載されている。本実施形態の製造方法で用いるトランスペプチダーゼは、これらのソルターゼＡの改変体であってもよい。
【００４０】
ソルターゼＢは、例えば、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）、炭疽菌（Ｂ．ａｎｔｈｒａｃｉｓ）、又はリステリア・モノサイトゲネス（Ｌ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）由来のものであってもよい。
ソルターゼＢの認識モチーフは、ＮＰＸＡＴＸＢのアミノ酸配列を含むものであり得る。前記において、ＸＡは、グルタミン又はリシンであり；ＸＢは、アスパラギン又はグリシンであり；Ｎは、アスパラギンであり；Ｐは、プロリンであり；Ｔは、トレオニンである。ソルターゼＢの認識モチーフの具体例としては、例えば、ＮＰＱＴＮ（配列番号１８）、ＮＰＫＴＧ（配列番号１９）、ＮＳＫＴＡ（配列番号２０）、ＮＰＱＴＧ（配列番号２１）、ＮＡＫＴＮ（配列番号２２）、及びＮＰＱＳＳ（配列番号２３）等が挙げられる。
【００４１】
ソルターゼＣは、認識モチーフとしてＬＰＸＴＧ（配列番号１)を使用し得る。ソルターゼＣは、共通配列ＮＡ−［Ｅ／Ａ／Ｓ／Ｈ］−ＴＧ（配列番号２４）を有するモチーフを認識すると推定される（Comfort D and Clubb RT. Infect Immun.,72(5):2710-22,2004）。
【００４２】
ソルターゼＤは、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、トロフェリマ・ウィッペリ（Ｔｒｏｐｈｅｒｙｍａ ｗｈｉｐｐｌｅｉ）、サーモビフィダ・フスカ（Ｔｈｅｒｍｏｂｉｆｉｄａｆｕｓｃａ）、及びビフィドバクテリウム・ロングム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｏｎｇｈｕｍ）等に由来するものであってもよい。ソルターゼＤの認識モチーフとしては、ＬＰＸＴＡ（配列番号６）又はＬＡＸＴＧ（配列番号１６）が挙げられる。
【００４３】
ＱＶＰＴＧＶ（配列番号２５）の認識モチーフを有するソルターゼについては、Ｂａｒｎｅｔｔ及びＳｃｏｔｔ（Barnett, TC and Scott, JR, Journal of Bacteriology, Vol. 184, No.8, p.2181-2191, 2002）に記載されている。
【００４４】
ソルターゼは、グラム陰性菌、例えば、コルウェリア・サイクレリスラエ（Ｃｏｌｗｅｌｌｉａ  ｐｓｙｃｈｒｅｒｙｔｈｒａｅａ）、ミクロブルビファー・デグラダンス（Ｍｉｃｒｏｂｕｌｂｉｆｅｒ  ｄｅｇｒａｄａｎｓ）、ブラディリゾビウム・ジャポニカム（Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｊａｐｏｎｉｃｕｍ）、シェワネラ・オネイデンシス（Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ  ｏｎｅｉｄｅｎｓｉｓ）、及びシュワネラ・プトレファシエンス（Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ  ｐｕｔｒｅｆａｃｉｅｎｓ）等のソルターゼであってもよい。これらは、ＬＰ［Ｑ／Ｋ］Ｔ［Ａ／Ｓ］Ｔの認識モチーフを有し得る。
また、ソルターゼは、古細菌（Ａｒｃｈｅａ）（例えば、メタン生成菌（Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｈｅｒｍｏａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃｕｍ））由来のものであってもよい。
【００４５】
トランスペプチダーゼは、ブテラーゼであってもよい。ブテラーゼは、ブテラーゼ認識モチーフを認識して切断し、前記切断後のブテラーゼ認識モチーフのＣ末端に、ブテラーゼＮ末端基質モチーフのＮ末端を結合し得るものであれば、特に制限なく使用することができる。公知のブテラーゼとしては、ブテラーゼ１（Nguyen GK et al., Nat Protoc. 2016 Oct;11(10):1977-1988、特表２０１７−５１５４６８号公報）が知られている。ブテラーゼ１の配列は、ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃ．Ｎｏ．ＫＦ９１８３４５から入手可能である。
ブテラーゼのＮ末端基質モチーフとしては、例えば、ＸＥＸＦが挙げられる。前記において、ＸＥは、任意のアミノ酸であり；ＸＦは、ロイシン、イソロイシン、バリン若しくはシステインである。ブテラーゼの認識モチーフは、例えば、ＸＤＨＶのアミノ酸配列を含むものであり得る。前記において、ＸＤは、アスパラギン若しくはアスパラギン酸であり；Ｈは、ヒスチジンであり；Ｖは、バリンである。
ブテラーゼは、野生型のタンパク質に制限されず、トランスペプチダーゼ活性を有する限り、改変体であってもよい。ブテラーゼの改変体は、野生型ブテラーゼ又はその触媒ドメインのアミノ酸配列に対して、８０％以上（例えば、８５％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、又は９９％以上）の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つトランスペプチダーゼ活性を有するものであってもよい。あるいは、ブテラーゼの改変体は、野生型ブテラーゼのアミノ酸配列において、１個又は複数個（例えば、２〜１５個：２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、若しくは１５個）のアミノ酸が欠失、置換、付加、又は挿入されたアミノ酸配列からなり、且つトランスペプチダーゼ活性を有するものであってもよい。
【００４６】
これらの中でも、トランスペプチダーゼは、ソルターゼ又はブテラーゼが好ましく、ソルターゼＡ（野生型及び改変型を包含する）又はブテラーゼ１（野生型及び改変型を包含する）がより好ましく、ソルターゼＡがさらに好ましい。
【００４７】
（トランスペプチダーゼＮ末端基質モチーフが付加された核酸：ＮＳ付加核酸）
ＮＳ付加核酸は、５’末端及び３’末端のいずれか一方に、トランスペプチダーゼＮ末端基質モチーフが付加された核酸である。図１Ａに示すＮＳ付加核酸１００では、核酸３０ａの５’末端に、トランスペプチダーゼＮ末端基質モチーフ２１が付加されている。図１Ａにおいて、トランスペプチダーゼＮ末端基質モチーフ２１は、（Ｘ１）ｎ（ｎは１以上）のアミノ酸配列を有するペプチドとして例示されている。トランスペプチダーゼがソルターゼである場合、前記Ｘ１は、グリシン又はアラニンであることが好ましく、グリシンであることがより好ましい。トランスペプチダーゼがブテラーゼ１である場合、トランスペプチダーゼＮ末端基質モチーフ２１は、ＸＥＸＦ（ＸＥは、任意のアミノ酸であり、ＸＦは、ロイシン、イソロイシン、バリン若しくはシステインである）で表されてもよい。
【００４８】
ＮＳ付加核酸１００は、任意のペプチドをコードする第１のコード配列と、トランスペプチダーゼをコードする第２のコード配列と、トランスペプチダーゼ認識モチーフをコードする第３のコード配列と、を含む。
【００４９】
第１のコード配列がコードするペプチドは、特に限定されず、任意のペプチドであってよい。ペプチドとしては、例えば、生理活性ペプチド及び機能性ペプチド等が挙げられるが、これらに限定されない。生理活性ペプチド及び機能性ペプチドとしては、例えば、酵素、酵素阻害分子、酵素活性化分子、ホルモン、レセプター、サイトカイン、抗体、抗原、アプタマー、蛍光タンパク質、アジュバント、毒素、リガンド、接着性ペプチド、キレート形成性ペプチド、膜透過性ペプチド、ドミナントネガティブペプチド、及び抗菌性ペプチド等が挙げられるが、これらに限定されない。第１のコード配列は、目的のペプチド１０をコードするものであればよく、野生型遺伝子であってもよく、改変型遺伝子であってもよく、サイレント変異を有するものであってもよい。
第１のコード配列は、ＤＮＡライブラリー等の複数種類のＤＮＡの混合物由来のものであってもよい。第１のコード配列は、例えば、変異ＤＮＡライブラリー由来のものであり得る。変異ＤＮＡライブラリーとしては、Ｅｒｒｏｒ−ｐｒｏｎｅ  ＰＣＲ（エラープローンＰＣＲ）を利用したライブラリー、Ｇｅｎｅ  ａｓｓｅｍｂｌｙ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓを利用したライブラリー、Ｒａｎｄｏｍ  ｉｎｓｅｒｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｄｅｌｅｔｉｏｎ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓを利用したライブラリー、ＤＮＡ  ｓｈｕｆｆｌｉｎｇを利用したライブラリー、Ｆａｍｉｌｙ  ｓｈｕｆｆｌｉｎｇを利用したライブラリー、Ｓｔａｇｇｅｒｅｄ  Ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ  Ｐｒｏｃｅｓｓ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎを利用したライブラリー、ＩＴＣＨＹ  Ｈｙｂｒｉｄ ｐｒｏｔｅｉｎ  ｌｉｂｒａｒｉｅｓ、ＳＣＲＡＴＣＨＹ  Ｈｙｂｒｉｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｌｉｂｒａｒｉｅｓ、Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｈｏｍｏｌｏｇｙ−ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎを利用したライブラリー、ホスホロアミダイト法による混合塩基合成を利用したライブラリー等が挙げられる。
【００５０】
第２のコード配列は、トランスペプチダーゼ２０をコードする配列であればよく、野生型遺伝子であってもよく、改変型遺伝子であってもよく、サイレント変異を有するものであってもよい。
第３のコード配列は、トランスペプチダーゼ認識モチーフ２２をコードする配列であればよく、野生型遺伝子であってもよく、改変型遺伝子であってもよく、サイレント変異を有するものであってもよい。
【００５１】
ＮＳ付加核酸１００では、５’側から３’側に向かって、第１のコード配列、第３のコード配列、及び第２のコード配列が、この順で、配置されている（図１（Ａ）参照）。また、これらの配列は、ＮＳ付加核酸１００において、第１のコード配列から翻訳されるペプチド１０のドメインと、第２のコード配列から翻訳されるトランスペプチダーゼ２０のドメインと、第３のコード配列から翻訳されるトランスペプチダーゼ認識モチーフ２２と、を含むキメラタンパク質１０１であって、トランスペプチダーゼ認識モチーフ２２が、ペプチド１０のドメインのＣ末端側に位置するキメラタンパク質を発現し得るように配置されている（図１Ｂ参照）。すなわち、第１のコード配列と、第３のコード配列と、第２のコード配列とは、１つのＯＲＦ内で、任意の塩基配列を介して、又は介さないで、５’側から３’側に向かって前記の順でインフレームに連結されている。
【００５２】
ＮＳ付加核酸１００は、第１のコード配列、第２のコード配列及び第３のコード配列に加えて、他の塩基配列を有していてもよい。他の塩基配列としては、例えば、第１のコード配列、第２のコード配列及び第３のコード配列を含むＯＲＦの転写及び／又は翻訳を制御する制御配列が挙げられる。そのような制御配列としては、プロモーター、ターミネーター、転写促進配列、翻訳促進配列、シャイン・ダルガノ配列等が挙げられる。制御配列は、後述する工程（Ｂ１）で用いる無細胞タンパク質合成系に応じて、前記ＯＲＦの転写及び／又は翻訳を制御可能なものを適宜選択することができる。
プロモーターとしては、例えば、Ｔ７プロモーター、ＳＰ６プロモーター、Ｔ３プロモーター等が挙げられる。前記ＯＲＦは、プロモーターの制御下で発現されるように、プロモーターに機能的に連結されていることが好ましい。
【００５３】
ＮＳ付加核酸１００は、第１のコード配列と第３のコード配列との間、及び第３のコード配列と第２のコード配列との間のいずれか又は両方に、任意のスペーサーをコードする配列を有していてもよい。例えば、第２のコード配列と第３のコード配列との間に、任意のスペーサーをコードする配列を有していてもよい。スペーサーを有することにより、ＮＳ付加核酸１００から発現されたキメラタンパク質１０１において、トランスペプチダーゼ２０がトランスペプチダーゼ認識モチーフ２２に結合しやすくなる。
【００５４】
核酸３０ａに、トランスペプチダーゼＮ末端基質モチーフ２１を付加する方法は、特に限定されず、公知の方法を用いることができる。例えば、トランスペプチダーゼＮ末端基質モチーフ２１が付加されたプライマーを用いて、ＰＣＲ法等で、核酸３０ａを増幅することにより、トランスペプチダーゼＮ末端基質モチーフ２１が付加された核酸３０ａ（ＮＳ付加核酸１００）を得ることができる。
トランスペプチダーゼＮ末端基質モチーフ２１は、フォワードプライマー及びリバースプライマーのいずれか一方に付加すればよい。例えば、フォワードプライマーの５’末端にトランスペプチダーゼＮ末端基質モチーフ２１を付加してもよく、リバースプライマーの５’末端にトランスペプチダーゼＮ末端基質モチーフ２１を付加してもよい。
【００５５】
プライマーに、トランスペプチダーゼＮ末端基質モチーフ２１を付加する方法は、特に限定されず、公知の方法を用いることができる。例えば、クリックケミストリ―で用いられる各種方法を用いることができる。そのような方法としては、例えば、Ｈｕｉｓｇｅｎ反応による方法（核酸−アジド及びペプチド−アルキンの組合せを用いてもよく、核酸−アルキン及びペプチド−アジドの組合せを用いてもよい）；銅フリーのシクロオクチン、ＤＢＣＯ、又はＢＡＲＡＣ等を用いる方法；等が挙げられる。
また、クリックケミストリ―に限定されず、アミノ基、カルボキシル基、チオール基等を介して、活性化剤及び架橋化剤等により、トランスペプチダーゼＮ末端基質モチーフ２１と核酸３０ａとを結合してもよい。さらに、臭素又ヨウ素を用いた求核置換反応、アルデヒド／ケトンとヒドラジドとの反応、プロペルギルエステルとアミノ基との反応、光架橋反応等を用いてもよい。
【００５６】
また、トランスペプチダーゼＮ末端基質モチーフ２１の核酸３０ａへの付加は、核酸３０ａの末端官能基に、トランスペプチダーゼＮ末端基質モチーフ２１を結合する方法で行ってもよい。例えば、ＰＣＲ法等により、核酸３０ａを増幅した後、核酸３０ａの末端にトランスペプチダーゼＮ末端基質モチーフ２１を付加してもよい。トランスペプチダーゼＮ末端基質モチーフ２１を付加する方法は、上記と同様の方法を用いることができる。
【００５７】
本工程で準備されるＮＳ付加核酸１００は、固相担体に固定化されていてもよい。固相担体としては、特に限定されず、例えば、ビーズ（磁気ビーズ、金ナノ粒子、アガロースビーズ、プラスチックビーズ等）、マイクロウェルプレート等が挙げられる。中でも、回収や任意位置への配置が容易であることから、固相担体としては磁気ビーズが好ましい。
核酸を固相担体に固定化する方法は、特に限定されず、公知の方法を用いることができる。例えば、アビジン−ビオチン結合を利用する方法；核酸をアミノ基、ホルミル基、ＳＨ基、などの官能基で修飾し、固相担体をアミノ基、ホルミル基、エポキシ基などを有するシランカップリング剤で表面処理したものを利用する方法；金-チオール結合を利用する方法等を用いることができる。中でも、アビジン−ビオチン結合を利用する方法が好適に用いられる。
核酸３０ａをＰＣＲ法により増幅する場合、増幅後の核酸３０ａが固相担体に固定化されるように、一方のプライマーが固相担体に固定化されたプライマーセットを用いてもよい。例えば、フォワードプライマーの５’末端にトランスペプチダーゼＮ末端基質モチーフ２１が付加されている場合、リバースプライマーの５’末端を固相担体に固定化することができる。あるいは、リバースプライマーの５’末端にトランスペプチダーゼＮ末端基質モチーフ２１が付加されている場合、フォワードプライマーの５’末端を固相担体に固定化することができる。プライマーを固相担体に固定化する方法としては、上記で挙げた方法と同様の方法を用いることができる。
【００５８】
（エマルションＰＣＲ）
ＰＣＲは、エマルションＰＣＲであってもよい。例えば、一方のプライマーがビーズに固定化されたプライマーセットを用いて、ＰＣＲ法により核酸３０ａを増幅する場合、エマルションＰＣＲを行うことができる。エマルションＰＣＲは、１分子の鋳型核酸又はプライマーを固定化した１個のビーズをエマルション内に区画化し、エマルション内で、プライマーを用いてＰＣＲを行う手法である。一方のプライマーがビーズに固定化されている場合、１個のビーズごとに１個のエマルション内に区画化し、エマルション内でＰＣＲを行うことにより、ビーズ表面に１種類の核酸を増幅及び固定することができる。また、プライマーがビーズに固定化されていない場合、１分子の鋳型核酸を、１個のエマルション内に区画化し、エマルション内でＰＣＲを行ってもよい。これにより、エマルション内で同一種類の核酸を増幅することができる。
【００５９】
エマルションＰＣＲで用いるエマルションの種類は特に限定されないが、調製が容易であること及び以降の操作が簡易になること等の理由から油中水（Ｗ／Ｏ）型エマルションを用いることが好ましい。エマルションは、常法により調製すればよく、例えば、核酸３０ａ、ビーズに固定化されたプライマーセット、ＤＮＡポリメラーゼ等の核酸増幅に必要な試薬を含む水性成分に、油性成分、乳化剤を混合し、撹拌することによりＷ／Ｏ型エマルションを得ることができる。これにより、１分子の核酸３０ａ及び１個のビーズを、１個のエマルション粒子内に区画化することができる。エマルションの調製には、例えば、攪拌処理（磁気攪拌子、プロペラ式などの使用）、ホモジナイズ（ホモジナイザー、乳鉢などの使用）、超音波処理（ソニケーターなどの使用）などを利用できる。
【００６０】
エマルション粒子の大きさは特に限定されず、１分子の核酸３０ａ及び１個のビーズを内包できる大きさであればよい。エマルション粒子の平均粒径は、例えば、１μｍ〜１００μｍが好ましく、５μｍ〜５０μｍがより好ましく、１０μｍ〜３０μｍが特に好ましい。プライマーがビーズに固定されていない場合、エマルション粒子の平均粒径は、１分子の鋳型核酸を内包できる大きさであればよく、例えば１ｎｍ以上、例えば１０ｎｍ以上、又は例えば５０ｎｍ以上であることができる。平均粒径の上限は、上記と同様に、例えば１００μｍ以下、例えば５０μｍ以下、又は例えば３０μｍ以下であることができる。
エマルション粒子の数は前記水性成分の体積からエマルション１個の体積を割ることにより算出される。よって、エマルション１個あたり平均１分子以下の鋳型核酸が含まれるようにＷ／Ｏ型エマルションを調製するためには、全体におけるエマルションの数以下の分子数の核酸３０ａを用意すればよい。
【００６１】
エマルションの調製に用いられる乳化剤としては、例えば、ゴールドシュミット社製ＡＢＩＬ（登録商標）ＷＥ０９、ＡＢＩＬ（登録商標）ＷＳ０８、ＡＢＩＬ（登録商標）ＥＭ９０等が挙げられる。エマルションの調製に用いられる油性成分としては、通常、ミネラルオイル（鉱物油）が用いられる。
【００６２】
エマルションＰＣＲ後は、エマルションを破壊し、ＮＳ付加核酸１００が固定化されたビーズを回収してもよい。回収後は、適切な洗浄バッファー等を用いて、ビーズを洗浄してもよい。ＮＳ付加核酸１００がビーズに固定化されていない場合も、同様に、エマルションを破壊し、ＮＳ付加核酸１００を回収してもよい。
【００６３】
本実施形態の製造方法では、１個のビーズにつき、１種類のＮＳ付加核酸１００を提示させられることから、ビーズに固定化したプライマーを用いたエマルションＰＣＲにより、ＮＳ付加核酸１００を準備することが好ましい。
ただし、１個のビーズにつき、１種類のＮＳ付加核酸１００を提示させる方法は、エマルションＰＣＲに限定されない。例えば、１分子の核酸３０ａ及び１個のビーズを、１個の反応槽内に区画化し、ＰＣＲ反応を行う方法を用いてもよい。
【００６４】
［工程（Ｂ１）］
工程（Ｂ１）は、トランスペプチダーゼＮ末端基質モチーフが付加された核酸から、無細胞タンパク質合成系を用いて、前記ペプチドのドメインと、前記トランスペプチダーゼのドメインと、前記トランスペプチダーゼ認識モチーフとを含むキメラタンパク質を合成する工程である。
【００６５】
（キメラタンパク質）
キメラタンパク質１０１は、核酸３０ａから転写・翻訳されるタンパク質である。キメラタンパク質１０１は、ペプチド１０のドメインと、トランスペプチダーゼ２０のドメインと、トランスペプチダーゼ認識モチーフ２２と、を含んでいる。キメラタンパク質１０１において、Ｎ末端側からＣ末端側に向かって、ペプチド１０のドメイン、トランスペプチダーゼ認識モチーフ２２、及びトランスペプチダーゼ２０のドメインは、この順で配置されている。
図１Ｂにおいて、トランスペプチダーゼ認識モチーフ２２は、ＺＸ１（Ｚはトランスペプチダーゼ認識モチーフにおけるＣ末端アミノ酸残基を除く配列を示し、Ｘ１はトランスペプチダーゼ認識モチーフにおけるＣ末端アミノ酸残基を示す。）のアミノ酸配列を有するペプチドとして例示されている。トランスペプチダーゼがソルターゼである場合、前記Ｘ１は、グリシン又はアラニンであることが好ましく、グリシンであることがより好ましい。Ｚとしては、上記のソルダーゼ認識モチーフとして例示した配列からＣ末端アミノ酸残基を除いた配列が挙げられ、具体的には、ＬＰＸＴ（配列番号３１）（ＬＰＡＴ（配列番号３２）、ＬＰＮＴ（配列番号３３）など）、ＬＰＸＡ（配列番号３４）（ＬＰＮＡ（配列番号３５）など）、ＬＰＸＴ（配列番号３６）（ＬＰＮＴ（配列番号３７）など）、ＬＧＸＴ（配列番号３８）（ＬＧＡＴ（配列番号３９）など）、ＩＰＸＴ（配列番号４０）（ＩＰＮＴ（配列番号４１）、ＩＰＥＴ（配列番号４２）など）（Ｘは任意のアミノ酸を表す。）等が例示される。トランスペプチダーゼがブテラーゼである場合、トランスペプチダーゼ認識モチーフ２２は、ＸＤＨＶ（ＸＤは、アスパラギン又はアスパラギン酸であり；Ｈは、ヒスチジン；Ｖは、バリンである。）で表されてもよい。
【００６６】
（無細胞タンパク質合成系）
キメラタンパク質１０１は、無細胞タンパク質合成系を用いて、ＮＳ付加核酸１００から合成される。
無細胞タンパク質合成系とは、生細胞を用いるのではく、生細胞由来の（或いは遺伝子工学的手法で得られた）リボソームや転写・翻訳因子などを用いて、鋳型である核酸（ＤＮＡやｍＲＮＡ）からそれがコードするｍＲＮＡやタンパク質をｉｎ  ｖｉｔｒｏで合成可能な系である。無細胞タンパク質合成系では、一般的に、細胞破砕液を必要に応じて精製して得られる細胞抽出液が使用される。前記細胞抽出液には、一般的に、タンパク質合成に必要なリボソーム、開始因子などの各種因子、ｔＲＮＡ、ＲＮＡポリメラーゼ、アミノアシルｔＲＮＡ合成酵素などの各種酵素が含まれる。タンパク質の合成を行う際には、前記細胞抽出液に、各種アミノ酸；ＡＴＰ、ＧＴＰなどのエネルギー源；クレアチンリン酸などのタンパク質合成に必要なその他の物質を添加する。また、別途用意したリボソーム、各種因子、及び／又は各種酵素などを必要に応じて補充してもよい。
広く利用されている無細胞タンパク質合成系としては、例えば、大腸菌Ｓ３０抽出液の系（原核細胞の系）、コムギ胚芽抽出液の系（真核細胞の系）、及びウサギ網状赤血球可溶化物の系（真核細胞の系）等が挙げられる。これらの無細胞タンパク質合成系に必要な試薬は、キットとしても市販されており、容易に利用することが可能である。
【００６７】
無細胞タンパク質合成系は、タンパク質合成に必要な各分子（因子）を再構成した転写／翻訳系であってもよい（例えば、Shimizu, Y. et al.: Nature Biotech., 19, 751-755, 2001）。再構成した無細胞タンパク質合成系では、細菌のタンパク質合成系を構成する３種類の開始因子、３種類の伸長因子、終結に関与する４種類の因子、各アミノ酸をｔＲＮＡに結合させる２０種類のアミノアシルｔＲＮＡ合成酵素、及びメチオニルｔＲＮＡホルミル転移酵素からなる３１種類の因子の遺伝子を大腸菌ゲノムから増幅し、これらを用いてタンパク質合成系をｉｎ  ｖｉｔｒｏで再構成している。
【００６８】
無細胞タンパク質合成系を用いた、ＮＳ付加核酸１００からのキメラタンパク質１０１の合成は、エマルション中で行ってもよい。ＮＳ付加核酸１００がビーズに固定化されている場合、１個のビーズを、１個のエマルション粒子内に区画化することができる。前記工程（Ａ１）において、１個のビーズにつき、１種類のＮＳ付加核酸１００が提示されている場合、１個のエマルション粒子内に、１種類のＮＳ付加核酸１００と、前記ＮＳ付加核酸１００から合成されたキメラタンパク質１０１とを共存させることができる。
ＮＳ付加核酸１００がビーズに固定化されていない場合も、１分子のＮＳ付加核酸１００を、１個のエマルション粒子内に区画化し、前記エマルション内で無細胞タンパク質合成系によるキメラタンパク質１０１の合成を行ってもよい。この場合も、１個のエマルション粒子内に、１種類のＮＳ付加核酸１００と、前記ＮＳ付加核酸１００から合成されたキメラタンパク質１０１とを共存させることができる。
エマルションの作製方法、及びエマルション粒子の大きさ等は、上記「［工程（Ａ１）］」で例示したものと同様とすることができる。
【００６９】
本実施形態の製造方法では、１区画に、１種類のＮＳ付加核酸１００及び前記核酸から合成されたキメラタンパク質１０１を共存させられることから、エマルション内で、無細胞タンパク質合成を行うことが好ましい。
ただし、１区画に、１種類のＮＳ付加核酸１００及び前記核酸から合成されたキメラタンパク質１０１を共存させる方法は、エマルション内での無細胞タンパク質合成に限定されない。例えば、１種類のＮＳ付加核酸１００を提示する１個のビーズを、１個の反応槽内に区画化し、無細胞タンパク質合成を行う方法を用いてもよい。
【００７０】
［工程（Ｃ１）］
工程（Ｃ１）は、工程（Ｂ１）で合成されたキメラタンパク質のトランスペプチダーゼドメインのペプチド転移反応により、ペプチド−核酸複合体を形成させる工程である。
【００７１】
前記工程（Ｂ１）において、ＮＳ付加核酸１００から合成されたキメラタンパク質１０１は、トランスペプチダーゼ２０のドメインとトランスペプチダーゼ認識モチーフ２２とを含んでいる。そのため、キメラタンパク質１０１内のトランスペプチダーゼ認識モチーフ２２は、トランスペプチダーゼ２０のドメインにより認識され、モチーフ内の所定箇所で切断され、配列２２’と配列２２”とに分割されるとともに、配列２２’のＣ末端が、トランスペプチダーゼ２０のドメイン内のシステイン残基とチオエステル結合で連結される。これにより、ペプチド１０のドメイン及び配列２２’を含むタンパク質Ａと、トランスペプチダーゼ２０及び配列２２”を含むペプチド転移反応生成物１０３とが、チオエステル結合で連結した状態となる。
次いで、ペプチド転移反応により、前記タンパク質Ａにおける配列２２’のＣ末端には、ＮＳ付加核酸１００のトランスペプチダーゼＮ末端基質モチーフ２１のＮ末端が結合される。これにより、ペプチド１０と前記ペプチドをコードする核酸３０ａとを含む、ペプチド−核酸複合体１０２が形成される。同時に、ペプチド転移反応生成物１０３が形成される。
【００７２】
図１Ｃの例では、トランスペプチダーゼ認識モチーフ２２は、図１Ｂと同様にＺＸ１からなる配列として表されている。トランスペプチダーゼＮ末端基質モチーフ２１は、（Ｘ１）ｎで表されている。
キメラタンパク質１０１中のトランスペプチダーゼ２０のドメインのトランスペプチダーゼ活性により、まず、ＺとＸ１との間のペプチド結合が切断される。これにより、トランスペプチダーゼ認識モチーフ２２が、配列２２’と配列２２”とに分割される。配列２２’は、Ｚからなる配列であり、配列２２”は、Ｘ１からなる配列である。次いで、配列２２’のＣ末端のアミノ酸残基と、ＮＳ付加核酸１００のトランスペプチダーゼＮ末端基質モチーフ２１のＮ末端アミノ酸Ｘ１との間で新たなペプチド結合が形成される。これにより、ペプチド−核酸複合体１０２及びペプチド転移反応生成物１０３が生成される。
【００７３】
トランスペプチダーゼがブテラーゼである場合、トランスペプチダーゼ認識モチーフ２２は、ＸＤＨＶ（ＸＤは、アスパラギン又はアスパラギン酸であり；Ｈは、ヒスチジンであり；Ｖは、バリンである。）で表されてもよい。トランスペプチダーゼがブテラーゼ１である場合、トランスペプチダーゼＮ末端基質モチーフ２１は、ＸＥＸＦ（ＸＥは、任意のアミノ酸であり；ＸＦは、ロイシン、イソロイシン、バリン若しくはシステインである。）で表されてもよい。
この場合、キメラタンパク質１０１中のトランスペプチダーゼ２０のドメインのトランスペプチダーゼ活性により、まず、ＸＤとＨとの間のペプチド結合が切断される。これにより、トランスペプチダーゼ認識モチーフ２２は、ＸＤ（上記配列２２’に対応）とＨＶ（上記配列２２”に対応）とに分割される。次いで、トランスペプチダーゼ認識モチーフ２２の切断Ｃ末端のアミノ酸残基（ＸＤ）と、ＮＳ付加核酸１００のトランスペプチダーゼＮ末端基質モチーフ２１のＮ末端アミノ酸配列ＸＥＸＦとの間で新たなペプチド結合が形成される。これにより、ペプチド−核酸複合体１０２及びペプチド転移反応生成物１０３が生成される。
【００７４】
本工程により得られるペプチド−核酸複合体１０２は、（ａ）ペプチド１０と、（ｂ）トランスペプチダーゼによるペプチド転移反応により、トランスペプチダーゼ認識モチーフ２２とトランスペプチダーゼＮ末端基質モチーフ２１とが、結合して生じる配列と、（ｃ）ペプチド１０をコードする核酸３０ａと、を含んでいる。また、前記（ｂ）の配列は、ペプチド１０と核酸３０ａとの間に位置している。
本明細書において、「トランスペプチダーゼ認識モチーフとトランスペプチダーゼＮ末端基質モチーフとが、結合して生じる配列」（以下、「ＴＰＲ−ＮＳ配列」という場合がある）とは、トランスペプチダーゼにより、トランスペプチダーゼ認識モチーフが切断して生じた配列のＣ末端に、トランスペプチダーゼＮ末端基質モチーフのＮ末端が結合することにより生じる配列を意味する。図１Ｃの例では、ＴＰＲ−ＮＳ配列は、Ｚ（Ｘ１）ｎで表される配列である。トランスペプチダーゼがソルターゼである場合、通常、ＴＰＲ−ＮＳ配列は、トランスペプチダーゼ認識モチーフと同じ配列を含んでいる。したがって、ＴＰＲ−ＮＳ配列としては、上記ソルターゼ認識モチーフとして挙げた配列と同様のものが挙げられる。
トランスペプチダーゼがブテラーゼである場合、ＴＰＲ−ＮＳ配列としては、ＸＤＸＥＸＦ（ＸＤは、アスパラギン又はアスパラギン酸であり；ＸＥは、任意のアミノ酸であり；ＸＦは、ロイシン、イソロイシン、バリン又はシステインである。）で表される配列が挙げられる。
【００７５】
キメラタンパク質１０１では、トランスペプチダーゼ２０のドメインが、トランスペプチダーゼ認識モチーフ２２のＣ末端側に位置しているため、ペプチド転移反応により、トランスペプチダーゼ２０のドメインが除去される。そのため、ペプチド−核酸複合体１０２は、ペプチド１０が、ＴＰＲ−ＮＳ配列を介して、核酸３０ｂに結合した構造を有している（図１Ｃ参照）。
【００７６】
工程（Ｃ１）は、トランスペプチダーゼがトランスペプチダーゼ活性を発現し得る条件下で行えばよく、通常、前記工程（Ｂ１）と同時に行うことができる。
【００７７】
［他の工程］
本実施形態の製造方法は、上記工程（Ａ１）〜（Ｃ１）に加えて、他の工程を含んでいてもよい。他の工程は、特に限定されず、例えば、核酸、キメラタンパク質又はペプチド−核酸複合体の回収工程、洗浄工程、精製工程等が例示される。
【００７８】
本実施形態の製造方法によれば、リンカーの調製等の煩雑な作業を要することなく、ペプチド−核酸複合体を製造することができる。また、本実施形態の製造方法により得られたペプチド−核酸複合体では、ペプチドと核酸との間にＴＰＲ−ＮＳ配列が存在する。ＴＰＲ−ＮＳ配列は、通常、５〜１０アミノ酸程度の短い配列であるため、ペプチド−核酸複合体において、ペプチドの立体構造や機能が損なわれる可能性は低い。したがって、ペプチド−核酸複合体は、ペプチドアレイにより所望の機能を有するペプチドをスクリーニングするために好適に用いることができ、且つスクリーニングされたペプチドをコードする核酸を簡易に同定することができる。
【００７９】
〔第２実施形態〕
図２Ａ〜図２Ｃに基づき、本態様にかかる製造方法の第２実施形態の概略を説明する。
本実施形態では、トランスペプチダーゼＮ末端基質モチーフ２１が付加された核酸として、５’側から３’側に向かって、トランスペプチダーゼをコードする第２のコード配列と、ペプチドをコードする第１のコード配列と、トランスペプチダーゼ認識モチーフをコードする第３のコード配列と、がこの順で配置された核酸３０ｂに、トランスペプチダーゼＮ末端基質モチーフ２１が付加されたもの（以下、「ＮＳ付加核酸２００」という場合がある。）を用いる（図２Ａ参照）。
ＮＳ付加核酸２００は、第２のコード配列と第１のコード配列との間、及び第１のコード配列と第３のコード配列との間のいずれか又は両方に、任意のスペーサーをコードする配列を有していてもよい。例えば、第２のコード配列と第１のコード配列との間に、任意のスペーサーをコードする配列を有していてもよい。スペーサーを有することにより、ＮＳ付加核酸２００から発現されたキメラタンパク質２０１において、トランスペプチダーゼ２０がトランスペプチダーゼ認識モチーフ２２に結合しやすくなる。
【００８０】
本実施形態の製造方法は、前記第１実施形態におけるＮＳ付加核酸１００に代えて、ＮＳ付加核酸２００を用いること以外は、前記第１実施形態と同様に行うことができる。
【００８１】
無細胞タンパク質合成系を用いて、ＮＳ付加核酸２００から合成されたキメラタンパク質２０１は、Ｎ末端側からＣ末端側に向かって、トランスペプチダーゼ２０のドメイン、ペプチド１０のドメイン、及びトランスペプチダーゼ認識モチーフ２２が、この順で配置された構成を有している（図２Ｂ参照）。
キメラタンパク質２０１中のトランスペプチダーゼ２０によるペプチド転移反応により、ＮＳ付加核酸２００及びキメラタンパク質２０１から、ペプチド−核酸複合体２０２及びペプチド転移反応生成物２０３が生成される。
【００８２】
キメラタンパク質２０１では、トランスペプチダーゼ２０のドメインが、トランスペプチダーゼ認識モチーフ２２のＮ末端側に位置しているため、ペプチド転移反応により、トランスペプチダーゼ２０のドメインが除去されることがない。そのため、ペプチド−核酸複合体２０２は、トランスペプチダーゼ２０及びペプチド１０を含むキメラタンパク質が、ＴＰＲ−ＮＳ配列を介して、核酸３０ｂに結合した構造を有している（図２Ｃ参照）。
【００８３】
〔第３実施形態〕
図３Ａ〜図３Ｃに基づき、本態様にかかる製造方法の第３実施形態の概略を説明する。
本実施形態では、トランスペプチダーゼＮ末端基質モチーフ２１が付加された核酸として、５’側から３’側に向かって、ペプチドをコードする第１のコード配列と、トランスペプチダーゼをコードする第２のコード配列と、トランスペプチダーゼ認識モチーフをコードする第３のコード配列と、がこの順で配置された核酸３０ｃに、トランスペプチダーゼＮ末端基質モチーフ２１が付加されたもの（以下、「ＮＳ付加核酸３００」という場合がある。）を用いる（図３Ａ参照）。
ＮＳ付加核酸３００は、第１のコード配列と第２のコード配列との間、及び第２のコード配列と第３のコード配列との間のいずれか又は両方に、任意のスペーサーをコードする配列を有していてもよい。例えば、第２のコード配列と第３のコード配列との間に、任意のスペーサーをコードする配列を有していてもよい。スペーサーを有することにより、ＮＳ付加核酸３００から発現されたキメラタンパク質３０１において、トランスペプチダーゼ２０がトランスペプチダーゼ認識モチーフ２２に結合しやすくなる。
【００８４】
本実施形態の製造方法は、前記第１実施形態におけるＮＳ付加核酸１００に代えて、ＮＳ付加核酸３００を用いること以外は、前記第１実施形態と同様に行うことができる。
【００８５】
無細胞タンパク質合成系を用いて、ＮＳ付加核酸３００から合成されたキメラタンパク質３０１は、Ｎ末端側からＣ末端側に向かって、ペプチド１０のドメイン、トランスペプチダーゼ２０のドメイン、及びトランスペプチダーゼ認識モチーフ２２が、この順で配置された構成を有している（図３Ｂ参照）。
キメラタンパク質３０１中のトランスペプチダーゼ２０によるペプチド転移反応により、ＮＳ付加核酸３００及びキメラタンパク質３０１から、ペプチド−核酸複合体３０２及びペプチド転移反応生成物３０３が生成される。
【００８６】
キメラタンパク質３０１では、トランスペプチダーゼ２０のドメインが、トランスペプチダーゼ認識モチーフ２２のＮ末端側に位置しているため、ペプチド転移反応により、トランスペプチダーゼ２０のドメインが除去されることがない。そのため、ペプチド−核酸複合体３０２は、ペプチド１０及びトランスペプチダーゼ２０を含むキメラタンパク質が、ＴＰＲ−ＮＳ配列を介して、核酸３０ｃに結合した構造を有している（図３Ｃ参照）。
【００８７】
本態様にかかる上記第１〜第３の実施形態における核酸３０ａ，３０ｂ，３０ｃは、第１のコード配列が、第３のコード配列の５’側に位置している点で共通する。また、核酸３０ａ，３０ｂ，３０ｃから発現されるキメラタンパク質１０１，２０１，３０１は、ペプチド１０のドメインが、トランスペプチダーゼ認識モチーフ２２のＮ末端側に位置している点で共通する。
【００８８】
トランスペプチダーゼとして、Ｃ末端に位置するトランスペプチダーゼ認識モチーフに対して適合性が高いトランスペプチダーゼ（例えば、ブテラーゼ１）を用いる場合、第２の実施形態又は第３の実施形態が好ましい。
【００８９】
≪第２の態様≫
一実施形態において、本発明は、ペプチドと、前記ペプチドをコードする核酸と、を含むペプチド−核酸複合体の製造方法を提供する。前記製造方法は、（Ａ２）トランスペプチダーゼ認識モチーフが付加された核酸であって、前記ペプチドをコードする第１のコード配列と、トランスペプチダーゼをコードする第２のコード配列と、前記トランスペプチダーゼのＮ末端基質モチーフをコードする第３のコード配列と、を含む、核酸を準備する工程と、（Ｂ２）前記トランスペプチダーゼ認識モチーフが付加された前記核酸から、無細胞タンパク質合成系を用いて、前記ペプチドのドメインと、前記トランスペプチダーゼのドメインと、前記トランスペプチダーゼＮ末端基質モチーフとを含むキメラタンパク質を合成する工程と、（Ｃ２）前記キメラタンパク質の前記トランスペプチダーゼドメインによるペプチド転移反応により、前記ペプチド−核酸複合体を形成させる工程と、を含む。
【００９０】
〔第４実施形態〕
図４Ａ〜図４Ｃに基づき、本態様にかかる製造方法の第４実施形態の概略を説明する。
まず、トランスペプチダーゼ認識モチーフ２２が付加された核酸４００（以下、「ＴＰＲ付加核酸４００」という場合がある。）を準備する（図４Ａ；工程（Ａ２））。ＴＰＲ付加核酸４００は、任意のペプチドをコードする第１のコード配列と、トランスペプチダーゼをコードする第２のコード配列と、前記トランスペプチダーゼのＮ末端基質モチーフをコードする第３のコード配列と、を含む。ＴＰＲ付加核酸４００では、５’側から３’側に向かって、第３のコード配列、第１のコード配列、及び第２のコード配列が、この順で、配置されている。また、ＴＰＲ付加核酸４００において、これらのコード配列は、第１のコード配列から翻訳される前記ペプチドのドメインと、第２のコード配列から翻訳されるトランスペプチダーゼのドメインと、第３のコード配列から翻訳される前記トランスペプチダーゼＮ末端基質モチーフと、を含むキメラタンパク質を発現し得るように配置されている。
次に、ＮＳ付加核酸４００から、無細胞タンパク質合成系を用いて、キメラタンパク質４０１を合成する（図４Ｂ；工程（Ｂ２））。キメラタンパク質４０１は、トランスペプチダーゼＮ末端基質モチーフ２１、ペプチド１０のドメイン、及びトランスペプチダーゼ２０のドメインを含んでいる。キメラタンパク質４０１において、トランスペプチダーゼＮ末端基質モチーフ２１は、ペプチド１０のドメインのＮ末端側に位置している。キメラタンパク質４０１では、Ｎ末端側からＣ末端側に向かって、トランスペプチダーゼＮ末端基質モチーフ２１、ペプチド１０、及びトランスペプチダーゼ２０が、この順で配置されている。
次に、キメラタンパク質４０１のトランスペプチダーゼ２０のドメインによるペプチド転移反応により、前記ペプチド−核酸複合体４０２を形成させる（図４Ｃ；工程（Ｃ２））。このようにして、ペプチド−核酸複合体を製造することができる。
以下、本実施形態の製造方法の各工程について説明する。
【００９１】
［工程（Ａ２）］
工程（Ａ２）は、トランスペプチダーゼ認識モチーフが付加された核酸であって、前記ペプチドをコードする第１のコード配列と、トランスペプチダーゼをコードする第２のコード配列と、前記トランスペプチダーゼのＮ末端基質モチーフをコードする第３のコード配列と、を含む、核酸を準備する工程である。
【００９２】
工程（Ａ２）は、ＮＳ付加核酸１００に代えてＴＰＲ付加核酸４００を用いること以外は、前記第１の態様の第１実施形態の工程（Ａ１）と同様に行うことができる。
【００９３】
ＴＰＲ付加核酸は、５’末端及び３’末端のいずれか一方に、トランスペプチダーゼ認識モチーフが付加された核酸である。図４Ａに示すＴＰＲ付加核酸４００では、核酸３０ｄの５’末端に、トランスペプチダーゼ認識モチーフ２２が付加されている。図４Ａにおいて、トランスペプチダーゼ認識モチーフ２２は、ＺＸ１のアミノ酸配列を有するペプチドとして例示されている。ＺＸ１の説明は、前記第１の態様の第１実施形態において説明したとおりである。また、本実施形態において、ＺとＸ１との間の結合は、エステル結合であってもよい（Williamson DJ et al., Nat Protoc. 2014 Feb;9(2):253-62.）。したがって、ＴＰＲ付加核酸４００において、トランスペプチダーゼ認識モチーフ２２は、ＺとＸ１との間がエステル結合で連結されたものを包含する。後述の実施形態５におけるＴＰＲ付加核酸５００についても同様である。
トランスペプチダーゼがブテラーゼである場合、トランスペプチダーゼ認識モチーフ２２は、ＸＤＨＶ（ＸＤは、アスパラギン又はアスパラギン酸であり；Ｈは、ヒスチジンであり；Ｖは、バリンである。）で表されてもよい。
【００９４】
第１のコード配列及び第２のコード配列は、前記第１の態様の第１実施形態で説明したものと同様である。
第３のコード配列は、トランスペプチダーゼＮ末端基質モチーフ２１をコードする配列であればよく、野生型遺伝子であってもよく、改変型遺伝子であってもよく、サイレント変異を有するものであってもよい。
【００９５】
ＴＰＲ付加核酸４００では、５’側から３’側に向かって、第３のコード配列、第１のコード配列、及び第２のコード配列が、この順で、配置されている（図４Ａ参照）。また、これらの配列は、ＴＰＲ付加核酸４００において、第１のコード配列から翻訳されるペプチド１０のドメインと、第２のコード配列から翻訳されるトランスペプチダーゼ２０のドメインと、第３のコード配列から翻訳されるトランスペプチダーゼＮ末端基質モチーフ２１と、を含むキメラタンパク質４０１であって、トランスペプチダーゼＮ末端基質モチーフ２１が、ペプチド１０のドメインのＮ末端側に位置するキメラタンパク質を発現し得るように配置されている（図４Ｂ参照）。すなわち、第３のコード配列と、第１のコード配列と、第２のコード配列とは、１つのＯＲＦ内で、任意の塩基配列を介して、又は介さないで、５’側から３’側に向かって前記の順でインフレームに連結されている。
【００９６】
ＴＰＲ付加核酸４００は、第１のコード配列、第２のコード配列及び第３のコード配列に加えて、他の塩基配列を有していてもよい。他の塩基配列としては、例えば、第１のコード配列、第２のコード配列及び第３のコード配列を含むＯＲＦの転写及び／又は翻訳を制御する制御配列が挙げられる。制御配列としては、前記第１の態様の第１実施形態の工程（Ａ１）で挙げたものと同様のものが挙げられる。
【００９７】
ＴＰＲ付加核酸４００は、第１のコード配列と第３のコード配列との間、及び第３のコード配列と第２のコード配列との間のいずれか又は両方に、任意のスペーサーをコードする配列を有していてもよい。例えば、第１のコード配列と第２のコード配列との間に、任意のスペーサーをコードする配列を有していてもよい。スペーサーを有することにより、ＴＰＲ付加核酸４００から発現されたキメラタンパク質４０１において、トランスペプチダーゼ２０がトランスペプチダーゼ認識モチーフ２２に結合しやすくなる。
【００９８】
ＴＰＲ付加核酸４００は、第３のコード配列の５’末端に隣接して、プロテアーゼ認識モチーフ４１をコードする第４のコード配列を含む、ＴＰＲ付加核酸４００’であってもよい（図６Ａ参照）。プロテアーゼ認識モチーフ４１には、プロテアーゼ認識モチーフ４１とトランスペプチダーゼＮ末端基質モチーフ２１との間の結合を切断する活性を有するプロテアーゼの認識モチーフを用いる。例えば、トランスペプチダーゼＮ末端基質モチーフ２１が（Ｇ）ｎ（ｎは１以上の整数）で表される配列である場合、プロテアーゼ認識モチーフ４１としては、ＴＥＶプロテアーゼの認識モチーフ（ＥＮＬＹＦＱＧ（配列番号２７））、Ｆａｃｔｏｒ  Ｘａプロテアーゼの認識モチーフ（Ｉ（Ｅ／Ｄ）ＧＲ（配列番号２８））等を用いることができる。
ＴＰＲ付加核酸４００が、第３のコード配列の５’末端に隣接して、第４のコード配列を有するＴＰＲ付加核酸４００’であることにより、ＴＰＲ付加核酸４００’から発現されるキメラタンパク質４０１’は、トランスペプチダーゼＮ末端基質モチーフ２１のＮ末端に隣接して、プロテアーゼ認識モチーフ４１が配置される（図６Ａ参照）。そのため、キメラタンパク質４０１’においては、トランスペプチダーゼＮ末端基質モチーフ２１のＮ末端側に、開始コドンから翻訳されるメチオニン（Ｍ）等のアミノ酸残基を有する場合であっても、プロテアーゼ４０で処理を行うことにより、トランスペプチダーゼＮ末端基質モチーフ２１をキメラタンパク質のＮ末端に露出させることができる（図６Ａ参照）。
【００９９】
核酸３０ｄに、トランスペプチダーゼ認識モチーフ２２を付加する方法は、特に限定されず、第１の態様の第１実施例の工程（Ａ１）において、核酸３０ａにトランスペプチダーゼＮ末端基質モチーフ２１を付加する方法として例示した方法と同様の方法を用いることができる。
【０１００】
本工程で準備されるＴＰＲ付加核酸４００は、固相担体に固定化されていてもよく、固定化されていなくてもよいが、固相担体に固定化されていることが好ましい。固相担体としては、特に限定されず、第１の態様の第１実施形態の工程（Ａ１）で例示したものと同様のものが挙げられる。核酸を固相担体に固定化する方法についても、第１の態様の第１実施例の工程（Ａ１）で例示したものと同様のものが挙げられる。
【０１０１】
本実施形態の製造方法でも、第１の態様の第１実施形態の工程（Ａ１）と同様に、１個のビーズにつき、１種類のＴＰＲ付加核酸４００を提示させられることから、少なくとも一方のプライマーがビーズに固定化されたプライマーセットを用いたエマルションＰＣＲにより、ＴＰＲ付加核酸４００を準備することが好ましい。
ただし、１個のビーズにつき、１種類のＴＰＲ付加核酸４００を提示させる方法は、エマルションＰＣＲに限定されない。例えば、１分子の核酸３０ｄ及び１個のビーズを、１個の反応槽内に区画化し、ＰＣＲ反応を行う方法を用いてもよい。
プライマーがビーズに固定化されていない場合も、１分子の鋳型ＤＮＡを、１個のエマルション粒子内に区画化し、エマルションＰＣＲを行ってもよい。
【０１０２】
［工程（Ｂ２）］
工程（Ｂ２）は、トランスペプチダーゼ認識モチーフが付加された核酸から、無細胞タンパク質合成系を用いて、前記ペプチドのドメインと、前記トランスペプチダーゼのドメインと、前記トランスペプチダーゼＮ末端基質モチーフとを含むキメラタンパク質を合成する工程である。
【０１０３】
工程（Ｂ２）は、ＮＳ付加核酸１００に代えて、ＴＰＲ付加核酸４００を用いること以外は、第１の態様の第１実施形態の工程（Ｂ１）と同様に行うことができる。
【０１０４】
本実施形態において、キメラタンパク質４０１は、核酸３０ｄから転写及び翻訳されるタンパク質である。キメラタンパク質４０１は、トランスペプチダーゼＮ末端基質モチーフ２１と、ペプチド１０のドメインと、トランスペプチダーゼ２０のドメインと、を含んでいる。キメラタンパク質４０１では、Ｎ末端側からＣ末端側に向かって、トランスペプチダーゼＮ末端基質モチーフ２１、ペプチド１０のドメイン、及びトランスペプチダーゼ２０のドメインが、この順で配置されている（図４Ｂ参照）。
【０１０５】
無細胞合成系において、任意のアミノ酸を結合させた開始ｔＲＮＡを用いることで、Ｎ末端に任意のアミノ酸を有するタンパク質を合成することができる。例えば、グリシンを結合させた開始ｔＲＮＡを用いることで、Ｎ末端がグリシンのタンパク質を合成することができる（例えば、Goto Y and Suga H, J Am Chem Soc. 2009 Apr 15;131(14):5040-1;国際公開第２００７／０５８３７６号）。
【０１０６】
［工程（Ｃ２）］
工程（Ｃ２）は、工程（Ｂ２）で合成されたキメラタンパク質のトランスペプチダーゼドメインによるペプチド転移反応により、ペプチド−核酸複合体を形成させる工程である。
【０１０７】
工程（Ｃ２）は、ＮＳ付加核酸１００に代えてＴＰＲ付加核酸４００を用い、キメラタンパク質１０１に代えてキメラタンパク質４０１を用いること以外は、第１の態様の第１実施形態の工程（Ｃ１）と同様に行うことができる。
【０１０８】
前記工程（Ｂ２）において、ＴＰＲ付加核酸４００から合成されたキメラタンパク質４０１は、トランスペプチダーゼ２０のドメインとトランスペプチダーゼＮ末端基質モチーフ２１とを含んでいる。一方、ＴＰＲ付加核酸４００は、トランスペプチダーゼ認識モチーフ２２を含んでいる。そのため、ＴＰＲ付加核酸４００内のトランスペプチダーゼ認識モチーフ２２は、トランスペプチダーゼ２０のドメインにより認識され、モチーフ内の所定箇所で切断される。これにより、トランスペプチダーゼ認識モチーフ２２が、配列２２’と配列２２”とに分割されるとともに、配列２２’のＣ末端が、トランスペプチダーゼ２０のドメイン内のシステイン残基とチオエステル結合で連結される。これにより、配列２２’を含む核酸Ａ及びキメラタンパク質４０１がチオエステル結合で連結した状態となる。また、配列２２”を含むペプチド転移反応生成物４０３が生成される。
次いで、前記核酸Ａにおける配列２２’のＣ末端には、キメラタンパク質４０１のトランスペプチダーゼＮ末端基質モチーフ２１のＮ末端が結合される。これにより、ペプチド１０と、前記ペプチドをコードする核酸３０ｄとを含む、ペプチド−核酸複合体４０２が形成される。
【０１０９】
トランスペプチダーゼがブテラーゼである場合、トランスペプチダーゼ認識モチーフ２２は、ＸＤＨＶ（ＸＤは、アスパラギン又はアスパラギン酸であり；Ｈは、ヒスチジンであり；Ｖは、バリンである。）で表されてもよい。トランスペプチダーゼがブテラーゼ１である場合、トランスペプチダーゼＮ末端基質モチーフ２１は、ＸＥＸＦ（ＸＥは、任意のアミノ酸であり、ＸＦは、ロイシン、イソロイシン、バリン若しくはシステインである。）で表されてもよい。
この場合、キメラタンパク質１０１中のトランスペプチダーゼ２０のドメインのトランスペプチダーゼ活性により、まず、ＴＰＲ付加核酸４００中のトランスペプチダーゼ認識モチーフ２２におけるＸＤとＨとの間のペプチド結合が切断される。これにより、トランスペプチダーゼ認識モチーフ２２は、ＸＤ（上記配列２２’に対応）とＨＶ（上記配列２２”に対応）とに分割される。次いで、トランスペプチダーゼ認識モチーフ２２の切断Ｃ末端のアミノ酸残基（ＸＤ）と、キメラタンパク質４０１のトランスペプチダーゼＮ末端基質モチーフ２１のＮ末端アミノ酸配列ＸＥＸＦとの間で新たなペプチド結合が形成される。これにより、ペプチド−核酸複合体１０２及びペプチド転移反応生成物１０３が生成される。
【０１１０】
本工程により得られるペプチド−核酸複合体４０２は、トランスペプチダーゼ２０及びペプチド１０を含むキメラタンパク質が、ＴＰＲ−ＮＳ配列を介して、核酸３０ｄに結合した構造を有している（図４Ｃ参照）。
【０１１１】
［他の工程］
本実施形態の製造方法は、上記工程（Ａ２）〜（Ｃ２）に加えて、他の工程を含んでいてもよい。他の工程は、特に限定されず、例えば、核酸、キメラタンパク質又はペプチド−核酸複合体の回収工程、洗浄工程、精製工程等が例示される。核酸３０ｄが、プロテアーゼ認識モチーフをコードする第４のコード配列を含む場合には、下記工程（Ｄ２）を含むことが好ましい。
【０１１２】
（工程（Ｄ２））
工程（Ｄ２）は、前記プロテアーゼを用いて、前記プロテアーゼ認識モチーフと前記トランスペプチダーゼＮ末端基質モチーフとの間の結合を切断する工程である。工程（Ｄ２）は、前記工程（Ｂ２）の後、且つ前記工程（Ｃ２）の前に行われる。
【０１１３】
核酸３０ｄが、第３のコード配列の５’末端に隣接して、プロテアーゼ認識モチーフをコードする第４のコード配列を含む場合、当該核酸３０ｄから発現されるキメラタンパク質４０１’は、第３のコード配列から翻訳されるトランスペプチダーゼＮ末端基質モチーフ２１のＮ末端側に隣接して、第４のコード配列から翻訳されるプロテアーゼ認識モチーフ４１を含む（図６Ａ参照）。そのため、プロテアーゼ認識モチーフ４１のＣ末端アミノ酸残基とトランスペプチダーゼＮ末端基質モチーフ２１のＮ末端アミノ酸残基との間のペプチド結合を切断する活性を有するプロテアーゼ４０を用いて、キメラタンパク質４０１’を処理することにより、前記ペプチド結合を切断することができる。
したがって、キメラタンパク質４０１’においては、トランスペプチダーゼＮ末端基質モチーフ２１のＮ末端側に、開始コドンから翻訳されるメチオニン（Ｍ）等のアミノ酸残基を有する場合であっても、プロテアーゼ４０で処理を行うことにより、トランスペプチダーゼＮ末端基質モチーフ２１がＮ末端に露出したキメラタンパク質４０１を得ることができる（図６Ａ参照）。
【０１１４】
プロテアーゼ４０は、工程（Ｄ２）において、外部から添加してもよく、プロテアーゼ４０をコードするコード配列を核酸３０ｄに含ませ、前記工程（Ｂ２）において、キメラタンパク質４０１’とは別個のタンパク質として発現させてもよい。
【０１１５】
本実施形態の製造方法によれば、リンカーの調製等の煩雑な作業を要することなく、ペプチド−核酸複合体を製造することができる。本実施形態の製造方法により得られるペプチド−核酸複合体は、ペプチドアレイにより所望の機能を有するペプチドをスクリーニングするために好適に用いることができ、且つスクリーニングされたペプチドをコードする核酸を簡易に同定することができる。
【０１１６】
〔第５実施形態〕
図５Ａ〜図５Ｃに基づき、本態様にかかる製造方法の第５実施形態の概略を説明する。
本実施形態では、トランスペプチダーゼ認識モチーフ２２が付加された核酸として、５’側から３’側に向かって、トランスペプチダーゼＮ末端基質モチーフ２１をコードする第３のコード配列と、トランスペプチダーゼをコードする第２のコード配列と、ペプチドをコードする第１のコード配列と、がこの順で配置された核酸３０ｅに、トランスペプチダーゼ認識モチーフ２２が付加されたもの（以下、「ＴＰＲ付加核酸５００」という場合がある。）を用いる（図５Ａ参照）。
ＴＰＲ付加核酸５００は、第３のコード配列と第２のコード配列との間、及び第２のコード配列と第１のコード配列との間のいずれか又は両方に、任意のスペーサーをコードする配列を有していてもよい。例えば、第３のコード配列と第２のコード配列との間に、任意のスペーサーをコードする配列を有していてもよい。スペーサーを有することにより、ＴＰＲ付加核酸５００から発現されたキメラタンパク質５０１において、トランスペプチダーゼ２０がトランスペプチダーゼ認識モチーフ２２に結合しやすくなる。
【０１１７】
本実施形態の製造方法は、前記第４実施形態におけるＴＰＲ付加核酸４００に代えて、ＴＰＲ付加核酸５００を用いること以外は、前記第４実施形態と同様に行うことができる。
【０１１８】
無細胞タンパク質合成系を用いて、ＴＰＲ付加核酸５００から合成されたキメラタンパク質５０１は、Ｎ末端側からＣ末端側に向かって、トランスペプチダーゼＮ末端基質モチーフ２１、トランスペプチダーゼ２０のドメイン、及びペプチド１０のドメインが、この順で配置された構成を有している（図５Ｂ参照）。
キメラタンパク質５０１中のトランスペプチダーゼ２０によるペプチド転移反応により、ＴＰＲ付加核酸５００及びキメラタンパク質５０１から、ペプチド−核酸複合体５０２及びペプチド転移反応生成物５０３が生成される。
【０１１９】
ペプチド−核酸複合体５０２は、ペプチド１０及びトランスペプチダーゼ２０を含むキメラタンパク質が、ＴＰＲ−ＮＳ配列を介して、核酸３０ｅに結合した構造を有している（図５Ｃ参照）。
【０１２０】
本実施形態の製造方法は、前記第４実施形態と同様に、工程（Ｂ２）の後、且つ工程（Ｃ２）の前に、さらに、工程（Ｄ２）を含んでいてもよい。すなわち、核酸３０ｅは、第３のコード配列の５’末端に隣接して、プロテアーゼ認識モチーフ４１をコードする第４のコード配列を含んでいてもよい（図６Ｂ参照）。この場合、ＴＰＲ付加核酸５００’から発現されるキメラタンパク質５０１’は、トランスペプチダーゼＮ末端基質モチーフ２１のＮ末端に隣接して、プロテアーゼ認識モチーフ４１が配置される（図６Ｂ参照）。そのため、キメラタンパク質５０１’においては、トランスペプチダーゼＮ末端基質モチーフ２１のＮ末端側に、開始コドンから翻訳されるメチオニン（Ｍ）等のアミノ酸残基を有する場合であっても、プロテアーゼ４０で処理を行うことにより、トランスペプチダーゼＮ末端基質モチーフ２１がＮ末端に露出したキメラタンパク質５０１を得ることができる（図６Ｂ参照）。
【０１２１】
第２の態様にかかる上記第４〜第５の実施形態における核酸３０ｄ，３０ｅは、第３のコード配列が、第１のコード配列及び第２のコード配列の５’側に位置している点で共通する。また、核酸３０ｄ，３０ｅから発現されるキメラタンパク質４０１，５０１は、トランスペプチダーゼＮ末端基質モチーフ２１が、ペプチド１０及びトランスペプチダーゼ２０のＮ末端側に位置している点で共通する。
【０１２２】
＜ペプチド−核酸複合体＞
一実施形態において、本発明は、（ａ）ペプチドと、（ｂ）前記ペプチドのコード配列を含む核酸と、（ｃ）トランスペプチダーゼによるペプチド転移反応により、前記トランスペプチダーゼの認識モチーフとＮ末端基質モチーフとが、結合して生じる配列と、を含み、前記（ｃ）の配列が、前記（ａ）のペプチドと前記（ｂ）の核酸との間に位置する、前記ペプチド−核酸複合体を提供する。前記ペプチド−核酸複合体は、トランスペプチダーゼを前記（ａ）のペプチドのＮ末端側若しくはＣ末端側に又は前記（ｃ）の配列と前記（ａ）のペプチドの間に含むことができる。
さらに詳細に説明する。
【０１２３】
［（ａ）ペプチド］
ペプチドは、特に限定されず、任意のペプチドであってよい。ペプチドは、（ｂ）の核酸によってコードされるペプチドである。ペプチドとしては、上記「＜ペプチド−核酸複合体の製造方法＞」の第１の態様の第１実施形態において例示したものと同様のものが例示される。（ａ）のペプチドは、キメラタンパク質に含まれるペプチドのドメインであってもよい。当該キメラタンパク質は、前記ペプチド以外のドメインを含み得る。前記キメラタンパク質は、例えば、トランスペプチダーゼのドメインを含んでいてもよい。前記キメラタンパク質としては、Ｎ末端側からＣ末端側に向かって、ペプチドのドメイン、及びトランスペプチダーゼのドメインが、この順で、配置された構成を有するキメラタンパク質；並びにＮ末端側からＣ末端側に向かって、トランスペプチダーゼのドメイン、及びペプチドのドメインが、この順で、配置された構成を有するキメラタンパク質等が挙げられる。前記トランスペプチダーゼとしては、ソルターゼ又はブテラーゼが好ましく、ソルターゼＡ又はブテラーゼ１がより好ましく、ソルターゼＡがさらに好ましい。
【０１２４】
［（ｂ）核酸］
核酸は、前記（ａ）のペプチドをコードする核酸である。核酸は、前記（ａ）のペプチドをコードするものであればよく、野生型遺伝子であってもよく、改変型遺伝子であってもよく、サイレント変異を有するものであってもよい。また、上記「ペプチド−核酸複合体の製造方法＞」で例示したようなＤＮＡライブラリー等の複数種類のＤＮＡの混合物由来のものであってもよい。
【０１２５】
核酸は、前記ペプチドコード配列に加えて他の配列を含んでいてもよい。他の配列としては、例えば、トランスペプチダーゼをコードする配列、トランスペプチダーゼＮ末端基質モチーフをコードする配列、及びトランスペプチダーゼ認識モチーフをコードする配列が挙げられる。核酸の例としては、５’側から３’側に向かって、任意のペプチドをコードする第１のコード配列、トランスペプチダーゼの認識モチーフをコードする第３のコード配列、トランスペプチダーゼをコードする第２のコード配列が、この順で、配置された構成を有する核酸（１）；５’側から３’側に向かって、前記第２のコード配列、前記第１のコード配列、及び前記第３のコード配列が、この順で、配置された構成を有する核酸（２）；並びに５’側から３’側に向かって、前記第１のコード配列、前記第２のコード配列、及び前記第３のコード配列が、この順で、配置された構成を有する核酸（３）が挙げられる。
また、核酸の例としては、５’側から３’側に向かって、トランスペプチダーゼのＮ末端基質モチーフをコードする第３のコード配列、任意のペプチドをコードする第１のコード配列、及びトランスペプチダーゼをコードする第２のコード配列が、この順で、配置された構成を有する核酸（４）；並びに５’側から３’側に向かって、前記第３のコード配列、前記第２のコード配列、及び前記第１のコード配列が、この順で、配置された構成を有する核酸（５）が挙げられる。これらの場合、核酸は、トランスペプチダーゼのＮ末端基質モチーフをコードする第３のコード配列の５’末端に隣接する、プロテアーゼ認識モチーフをコードする第４のコード配列をさらに含んでいてもよい。
核酸がトランスペプチダーゼとしてソルターゼをコードする場合、前記に例示した核酸（１）〜（５）のいずれであってもよいが、核酸（１）であることが好ましい。核酸がトランスペプチダーゼとしてブテラーゼをコードする場合、前記に例示した核酸の中でも、核酸（２）〜（５）であることが好ましい。
【０１２６】
核酸は、さらに、他の配列を含んでいてもよい。他の配列としては、上記＜ペプチド−核酸複合体の製造方法＞」で挙げたものと同様のものが挙げられる。例えば、前記各コード配列間に任意のスペーサーをコードする配列を含んでいてもよい。また、前記コード配列の発現を制御するプロモーター配列等の制御配列等を含んでいてもよい。
【０１２７】
核酸の具体例としては、上記「＜ペプチド−核酸複合体の製造方法＞」で例示した核酸３０ａ，３０ｂ，３０ｃ，３０ｄ，３０ｅが挙げられる（図１〜５参照）。
【０１２８】
［（ｃ）ＴＰＲ−ＮＳ配列］
（ｃ）の配列は、トランスペプチダーゼの認識モチーフとＮ末端基質モチーフとが、結合して生じる配列（ＴＰＲ−ＮＳ配列）であり、上記「＜ペプチド−核酸複合体の製造方法＞」において説明したものと同様である。トランスペプチダーゼとしては、ソルターゼ又はブテラーゼが好ましく、ソルターゼＡ又はブテラーゼ１がより好ましく、ソルターゼＡがさらに好ましい。ＴＰＲ−ＮＳ配列は、トランスペプチダーゼの種類により適宜選択することができる。例えば、トランスペプチダーゼがソルターゼである場合、ＴＰＲ−ＮＳ配列の好ましい具体例としては、ＬＰＸＴ（Ｇ）ｎ（ｎは１以上の整数である。）が挙げられる。前記ｎとしては、１〜１０が好ましく、１〜８がより好ましく、１〜６又は１〜５がさらに好ましい。あるいは、上記ソルターゼ認識モチーフとして挙げた配列と同様のものが挙げられる。
トランスペプチダーゼがブテラーゼである場合、ＴＰＲ−ＮＳ配列としては、ＸＤＸＥＸＦ（ＸＤは、アスパラギン又はアスパラギン酸であり；ＸＥは、任意のアミノ酸であり；ＸＦは、ロイシン、イソロイシン、バリン又はシステインである。）で表される配列が挙げられる。
【０１２９】
本実施形態のペプチド−核酸複合体は、（ａ）のペプチドと、（ｂ）の核酸との間に、（ｃ）の配列が位置していることを特徴とする。本実施形態のペプチド−核酸複合体は、上記「＜ペプチド−核酸複合体の製造方法＞」で説明した方法により製造することができる。本実施形態のペプチド−核酸複合体の具体例としては、上記「＜ペプチド−核酸複合体の製造方法＞」で例示したペプチド−核酸複合体１０２，２０２，３０２，４０２，５０２が挙げられる（図１〜５参照）。
【０１３０】
本実施形態のペプチド−核酸複合体は、ペプチドと当該ペプチドをコードする核酸とが複合体を形成しているため、所望の機能を有するペプチドを同定した後、当該ペプチドをコードする核酸を容易に取得することができる。
【０１３１】
＜ペプチド−核酸複合体が固定化された固相担体＞
一実施形態において、本発明は、前記実施形態のペプチド−核酸複合体が固定化された固相担体を提供する。
固相担体としては、特に限定されないが、上記「＜ペプチド−核酸複合体の製造方法＞」で挙げたものと同様のものが挙げられる。中でも、固相担体としては、ビーズが好ましく、磁気ビーズがより好ましい。固相担体がビーズである場合、１個のビーズには、１種類のペプチド−核酸複合体が固定化されていることが好ましい。
【０１３２】
ペプチド−核酸複合体を固相担体に固定化する方法は、特に限定されず、公知の方法を用いることができる。ペプチド−核酸複合体は、核酸の５’末端又は３’末端が、固相担体に固定化されていることが好ましい。固定化方法としては、例えば、上記「＜ペプチド−核酸複合体の製造方法＞」で挙げたものと同様のものが挙げられる。中でも、アビジン−ビオチン結合を利用する方法が好適に用いられる。
【０１３３】
（使用例）
本実施形態の固相担体は、後述のように反応槽に配置して用いてもよく、それ自体をペプチドアレイとして用いてもよい。以下に、本実施形態のペプチド−核酸複合体を用いて、所望のペプチドをコードする核酸を同定する具体例を記載するが、これに限定されない。
【０１３４】
・特定物質に対して結合性親和性の高いペプチドのスクリーニング例
ペプチド−核酸複合体に、標識物質を結合させた特定物質を接触させる。例えば、ペプチド−核酸複合体を含む溶液に、標識物質を結合させた特定物質を添加して撹拌する。標識物質としては、公知の物質を特に制限なく用いることができ、例えば、フルオレセイン、ローダミン、テキサスレッド、オレゴングリーン等の蛍光色素；ホースラディッシュペルオキシダーゼ、マイクロペルオキシダーゼ、アルカリ性ホスファターゼ、β−Ｄ−ガラクトシダーゼ等の酵素；ルミノール、アクリジン色素等の化学又は生物発光化合物；３２Ｐ、１３１Ｉ、１２５Ｉ等の放射性同位体などを用いることができる。
【０１３５】
次いで、ペプチドと特定物質との結合を標識物質に基づいて検出し、結合親和性の高いペプチドを含むペプチド−核酸複合体を回収する。固相担体がビーズである場合、標識物質の検出及びペプチド−核酸複合体の回収には、フローサイトメトリーを好適に利用することができる。
【０１３６】
・特定の酵素活性を有するペプチドのスクリーニング例
固相担体としてのビーズに固定化したペプチド−核酸複合体と、酵素基質と、を含有するエマルションを調製する。エマルションは、例えば、内水相の水中油中水（Ｗ／Ｏ／Ｗ）型エマルジョンとすることができる。１個のエマルション粒子に、平均１個以下のビーズが内包されるように、エマルション粒子の大きさを調整する。次いで、エマルション内で酵素反応を行い、酵素反応を認めるエマルションを特定し、当該エマルションに内包されるペプチド−核酸複合体を回収する。酵素反応により蛍光が生ずる反応系とすれば、酵素反応の検出及びペプチド−核酸複合体の回収には、フローサイトメトリーを好適に利用することができる。
【０１３７】
＜ペプチドアレイ＞
一実施形態において、本発明は、前記実施形態の固相担体を含む反応槽を備えた、ペプチドアレイを提供する。
【０１３８】
本実施形態において、固相担体は、例えば、ビーズであってもよく、ペプチド−核酸複合体が固定化されたビーズが反応槽に配置されてもよい。あるいは、固相担体は、反応槽の壁面であってもよい。反応槽１個当たりには、１種類のペプチド−核酸複合体が配置されるようにすることが好ましい。例えば、固相担体がビーズである場合、１種類のペプチド−核酸複合体を固定化した１個のビーズを、１個の反応槽に配置することが好ましい。
【０１３９】
ビーズを配置する反応槽は、例えば、ビーズ配置用反応槽を設けたマイクロウェルプレート等のビーズ配置用基板であってもよい。ビーズが磁気ビーズである場合、ビーズ配置用基板は、磁気ビーズ配置用基板であることが好ましく、前記磁気ビーズ配置用基板に用いられる基板材料下に、磁性体板が配設されていることがより好ましい。かかる構造の磁気ビーズ配置用基板を用いることにより、反応槽内に磁気ビーズを容易にかつ高い精度で配置することができる。具体的には、該ビーズ配置用基板の下部に磁石を配置し、該基板上にＤＮＡを固定した磁気ビーズを分散させた分散液を滴下する。磁気ビーズ及び磁性体薄膜による磁力の作用により、反応槽内へ磁気ビーズが誘引されることにより配置されやすくなる。さらに磁石を適宜基板に対し平行方向に動かすことで磁気ビーズが分散し、反応槽内への充填率が向上する。磁石によりビーズ配置用基板に印加する磁場の強さは、所望の効果を得る上で、好ましくは１００〜１００００ガウスである。
また、磁石を取り除いた後も磁性体板の磁化は残るため、磁気ビーズは安定した配置を保持し続けることが可能となる。
かかる磁性体の材料としては、ニッケル、ニッケル合金、鉄および鉄合金などの金属を好適に用いることができる。
【０１４０】
反応槽１個当たり、ビーズ１個を配置する観点から、反応槽の直径はビーズの直径とほぼ同じであることが好ましい。しかしながら、ビーズの微小反応槽への充填率は該微小反応槽の直径に依存するため、反応槽の直径がビーズの直径よりも若干広い方が充填率が高い。さらに、反応槽の直径はビーズの直径の１〜２倍であることが好ましい。また、反応槽１個当たり、ビーズ１個を配置する観点から、反応槽の深さは、ビーズの直径の１〜２倍であることが好ましい。反応槽は、親水化されていることが好ましい。例えば、該反応槽を酸素プラズマ照射などにより親水化処理することにより、ビーズを分散させた液を反応槽内部に充填することが容易になり、充填率が向上する。
【０１４１】
本実施形態のペプチドアレイは、所望の機能を有するペプチドを同定し、当該ペプチドをコードする核酸を単離するために好適に用いることができる。所望の機能を有するペプチドの同定は、反応槽中で、所望の反応を行い、所望の反応結果を示す反応槽を特定することにより行うことができる。反応槽を特定した後は、当該反応槽から、ペプチド−核酸複合体を回収することにより、所望の機能を有するペプチドをコードする核酸を取得することができる。
【０１４２】
＜核酸＞
≪第１の態様≫
一実施形態において、本発明は、トランスペプチダーゼＮ末端基質モチーフが付加された核酸であって、ペプチドをコードする第１のコード配列と、前記トランスペプチダーゼをコードする第２のコード配列と、前記トランスペプチダーゼの認識モチーフをコードする第３のコード配列と、を含む、核酸を提供する。
【０１４３】
本実施形態の核酸は、トランスペプチダーゼＮ末端基質モチーフが付加された核酸であって、ペプチドをコードする第１のコード配列と、前記トランスペプチダーゼをコードする第２のコード配列と、前記トランスペプチダーゼの認識モチーフをコードする第３のコード配列と、を含む。これらのコード配列については、上記「＜ペプチド−核酸複合体の製造方法＞」で説明したものと同様である。
【０１４４】
本実施形態の核酸は、さらに、他の配列を含んでいてもよい。他の配列としては、上記＜ペプチド−核酸複合体の製造方法＞」で挙げたものと同様のものが挙げられる。例えば、前記各コード配列間に任意のスペーサーをコードする配列を含んでいてもよい。また、前記コード配列の発現を制御するプロモーター配列等の制御配列等を含んでいてもよい。
【０１４５】
本実施形態の核酸は、第１のコード配列から翻訳されるペプチドのドメインと、第３のコード配列から翻訳されるトランスペプチダーゼ認識モチーフと、を含むキメラタンパク質であって、トランスペプチダーゼ認識モチーフが、ペプチドドメインのＣ末端側に位置するキメラタンパク質を発現し得る。すなわち、第１のコード配列と、第３のコード配列は、同じＯＲＦ内に配置されており、第３のコード配列は、第１のコード配列の３’側に配置されている。
第２のコード配列は、前記第１のコード配列及び第３のコード配列と同一のＯＲＦ内に配置されていてもよく、配置されていなくてもよいが、同一のＯＲＦ内に配置されていることが好ましい。すなわち、本実施形態の核酸は、第１のコード配列から翻訳されるペプチドのドメインと、第２のコード配列から翻訳されるトランスペプチダーゼのドメインと、第３のコード配列から翻訳されるトランスペプチダーゼ認識モチーフと、を含むキメラタンパク質を発現し得ることが好ましい。
第２のコード配列が、前記第１のコード配列及び第３のコード配列と同一のＯＲＦ内に配置されていない場合、各ＯＲＦは、それぞれ転写・翻訳を制御する制御配列を有していることが好ましい。
【０１４６】
本実施形態の核酸としては、トランスペプチダーゼＮ末端基質モチーフが付加された核酸であって、
５’側から３’側に向かって、第１のコード配列、第３のコード配列、及び第２のコード配列が、この順で、配置された構成を有する核酸（１）；
５’側から３’側に向かって、第２のコード配列、第１のコード配列、及び第３のコード配列が、この順で、配置された構成を有する核酸（２）；並びに
５’側から３’側に向かって、第１のコード配列、第２のコード配列、及び第３のコード配列が、この順で、配置された構成を有する核酸（３）、
が挙げられる。
核酸がトランスペプチダーゼとしてソルターゼをコードする場合、前記に例示した核酸（１）〜（３）のいずれであってもよいが、核酸（１）であることが好ましい。核酸がトランスペプチダーゼとしてブテラーゼをコードする場合、前記に例示した核酸の中でも、核酸（２）又は核酸（３）であることが好ましい。
【０１４７】
本実施形態の核酸の好適な具体例としては、上記「＜ペプチド−核酸複合体の製造方法＞」で例示した、ＮＳ付加核酸１００、ＮＳ付加核酸２００、及びＮＳ付加核酸３００が挙げられる。
【０１４８】
≪第２の態様≫
一実施形態において、本発明は、トランスペプチダーゼ認識モチーフが付加された核酸であって、ペプチドをコードする第１のコード配列と、前記トランスペプチダーゼをコードする第２のコード配列と、前記トランスペプチダーゼのＮ末端基質モチーフをコードする第３のコード配列と、を含む、核酸を提供する。
【０１４９】
本実施形態の核酸は、トランスペプチダーゼ認識モチーフが付加された核酸であって、ペプチドをコードする第１のコード配列と、前記トランスペプチダーゼをコードする第２のコード配列と、前記トランスペプチダーゼのＮ末端基質モチーフをコードする第３のコード配列と、を含む。これらのコード配列については、上記「＜ペプチド−核酸複合体の製造方法＞」で説明したものと同様である。
【０１５０】
本実施形態の核酸は、さらに、他の配列を含んでいてもよい。他の配列としては、上記＜ペプチド−核酸複合体の製造方法＞」で挙げたものと同様のものが挙げられる。例えば、前記各コード配列間に任意のスペーサーをコードする配列を含んでいてもよい。また、前記コード配列の発現を制御するプロモーター配列等の制御配列等を含んでいてもよい。
【０１５１】
本実施形態の核酸は、第１のコード配列から翻訳されるペプチドのドメインと、第３のコード配列から翻訳されるトランスペプチダーゼＮ末端基質モチーフと、を含むキメラタンパク質であって、トランスペプチダーゼＮ末端基質モチーフが、ペプチドドメインのＮ末端側に位置するキメラタンパク質を発現し得る。すなわち、第１のコード配列と、第３のコード配列は、同じＯＲＦ内に配置されており、第３のコード配列は、第１のコード配列の５’側に配置されている。
第２のコード配列は、前記第１のコード配列及び第３のコード配列と同一のＯＲＦ内に配置されていてもよく、配置されていなくてもよいが、同一のＯＲＦ内に配置されていることが好ましい。すなわち、本実施形態の核酸は、第１のコード配列から翻訳されるペプチドのドメインと、第２のコード配列から翻訳されるトランスペプチダーゼのドメインと、第３のコード配列から翻訳されるトランスペプチダーゼＮ末端基質モチーフと、を含むキメラタンパク質を発現し得ることが好ましい。当該キメラタンパク質において、トランスペプチダーゼのドメインは、トランスペプチダーゼＮ末端基質モチーフのＣ末端側に位置していることが好ましい。
第２のコード配列が、前記第１のコード配列及び第３のコード配列と同一のＯＲＦ内に配置されていない場合、各ＯＲＦは、それぞれ転写・翻訳を制御する制御配列を有していることが好ましい。
【０１５２】
本実施形態の核酸としては、トランスペプチダーゼ認識モチーフが付加された核酸であって、
５’側から３’側に向かって、第３のコード配列、第１のコード配列、及び第２のコード配列が、この順で、配置された構成を有する核酸（４）；並びに
５’側から３’側に向かって、第３のコード配列、第２のコード配列、及び第１のコード配列が、この順で、配置された構成を有する核酸（５）、
が挙げられる。
核酸がトランスペプチダーゼとしてソルターゼ又はブテラーゼをコードする場合、前記に例示した核酸（４）及び核酸（５）のいずれであってもよい。
【０１５３】
本実施形態の核酸は、さらに、第３のコード配列の５’末端に隣接して、プロテアーゼ認識モチーフをコードする第４のコード配列を含んでいてもよい。この場合、前記のキメラタンパク質において、第４のコード配列から翻訳されるプロテアーゼ認識モチーフは、トランスペプチダーゼＮ末端基質モチーフのＮ末端側に隣接する。プロテアーゼ認識モチーフは、当該プロテアーゼ認識モチーフとトランスペプチダーゼＮ末端基質モチーフとの間の結合を切断する活性を有するプロテアーゼの認識モチーフを用いることができる。
【０１５４】
本実施形態の核酸の好適な具体例としては、上記「＜ペプチド−核酸複合体の製造方法＞」で例示した、ＴＰＲ付加核酸４００、ＴＰＲ付加核酸４００’、ＴＰＲ付加核酸５００、及びＴＰＲ付加核酸５００’が挙げられる。
【０１５５】
上記実施形態のトランスペプチダーゼＮ末端基質モチーフが付加された核酸、又はトランスペプチダーゼ認識モチーフが付加された核酸は、固相担体に固定化されたものであってもよい。したがって、一実施形態において、本発明は、上記実施形態の核酸が固定化された固相担体もまた提供する。
【０１５６】
本実施形態の核酸は、又は前記核酸が固定化された固相担体は、ペプチド−核酸複合体の製造に、好適に用いることができる。
【０１５７】
＜キット＞
≪第１の態様≫
一実施形態において、本発明は、下記（ａ）〜（ｄ）を含む、ペプチド−核酸複合体の作製キットを提供する。
（ａ）任意のペプチドをコードする第１のコード配列若しくは前記第１のコード配列を含む核酸断片を挿入可能なクローニングサイトと、トランスペプチダーゼをコードする第２のコード配列と、前記トランスペプチダーゼの認識モチーフをコードする第３のコード配列と、を含む核酸
（ｂ）前記（ａ）の核酸における、前記第１のコード配列若しくは前記クローニングサイト、前記第２のコード配列、及び前記第３のコード配列を含む前記核酸の領域を増幅可能なプライマーセットであって、フォワードプライマー及びリバースプライマーのいずれか一方に、前記トランスペプチダーゼのＮ末端基質モチーフが付加されている、プライマーセット
（ｃ）核酸増幅試薬
（ｄ）無細胞タンパク質合成反応液
【０１５８】
（（ａ）核酸）
（ａ）の核酸は、任意のペプチドをコードする第１のコード配列若しくは前記第１のコード配列を含む核酸断片を挿入可能なクローニングサイトと、トランスペプチダーゼをコードする第２のコード配列と、前記トランスペプチダーゼの認識モチーフをコードする第３のコード配列と、を含む核酸である。これらのコード配列については、上記「＜ペプチド−核酸複合体の製造方法＞」で説明したものと同様である。
【０１５９】
第１のコード配列を含む核酸断片を挿入可能なクローニングサイトは、特に限定されず、任意の制限酵素サイトであってよい。前記クローニングサイトは、当該クローニングサイトに第１のコード配列を含む核酸断片が挿入された場合に、第１のコード配列から翻訳されるペプチドのドメインと、第３のコード配列から翻訳される前記トランスペプチダーゼ認識モチーフと、を含むキメラタンパク質であって、トランスペプチダーゼ認識モチーフが、ペプチドドメインのＣ末端側に位置するキメラタンパク質を発現し得る位置に配置される。すなわち、クローニングサイトは、第３のコード配列と同じＯＲＦ内であって、第３のコード配列の５’側に配置される。
【０１６０】
（ａ）の核酸は、さらに、他の配列を含んでいてもよい。他の配列としては、上記＜ペプチド−核酸複合体の製造方法＞」で挙げたものと同様のものが挙げられる。例えば、前記各コード配列間に任意のスペーサーをコードする配列を含んでいてもよい。また、前記コード配列の発現を制御するプロモーター配列等の制御配列等を含んでいてもよい。
【０１６１】
（ａ）の核酸の例としては、５’側から３’側に向かって、第１のコード配列若しくはクローニングサイト、第３のコード配列、及び第２のコード配列が、この順で、配置された構成を有する核酸；５’側から３’側に向かって、第２のコード配列、第１のコード配列、及び第３のコード配列が、この順で、配置された構成を有する核酸；並びに５’側から３’側に向かって、第１のコード配列若しくはクローニングサイト、第２のコード配列、及び第３のコード配列が、この順で、配置された構成を有する核酸、が挙げられる。
【０１６２】
（ａ）の核酸の好ましい具体例としては、上記「＜ペプチド−核酸複合体の製造方法＞」で例示した、核酸３０ａ，３０ｂ，３０ｃ、並びに核酸３０ａ，３０ｂ，３０ｃのいずれかにおいて、第１のコード配列をクローニングサイトで置き換えたもの等が挙げられる。
【０１６３】
（ａ）の核酸は、プラスミドであってもよい。例えば、大腸菌由来のプラスミド（ｐＢＩ系、ｐＰＺＰ系、ｐＳＭＡ系、ｐＵＣ系、ｐＢＲ系、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ系プラスミド等）、枯草菌由来のプラスミド（ｐＵＢ１１０、ｐＴＰ５等）、酵母由来のプラスミド（Ｙｅｐ１３、Ｙｅｐ２４、ＹＣｐ５０等）等を好適に使用できる。
【０１６４】
（（ｂ）プライマーセット）
（ｂ）のプライマーセットは、（ａ）の核酸における、第１のコード配列若しくはクローニングサイト、第２のコード配列、及び第３のコード配列を含む領域（以下、「コード配列領域」という場合がある。）を増幅可能なプライマーセットである。当該プライマーのフォワードプライマー及びリバースプライマーのいずれか一方には、トランスペプチダーゼのＮ末端基質モチーフが付加されている。
【０１６５】
（ｂ）のプライマーセットは、（ａ）の核酸におけるコード配列領域と合わせて、これらのコード配列の転写及び／又は翻訳を制御する制御配列を含む領域を増幅できることが好ましい。当該領域を増幅可能なプライマーセットは、公知の方法に基づいて、設計することができる。プライマーへのトランスペプチダーゼＮ末端基質モチーフの付加は、上記「＜ペプチド−核酸複合体の製造方法＞」で挙げた方法と同様の方法で行うことができる。
【０１６６】
本実施形態のキットにおいて、（ｂ）のプライマーセットは、フォワードプライマー及びリバースプライマーのいずれか一方が、固相担体に固定化されていてもよい。この場合、（ｂ）のプライマーセットは、下記（ｉ）〜（ｉｖ）のいずれかであり得る。
（ｉ）５’末端にトランスペプチダーゼＮ末端基質モチーフが付加されたフォワードプライマーと、５’末端が固相担体に固定化されたリバースプライマーとのセット
（ｉｉ）５’末端にトランスペプチダーゼＮ末端基質モチーフが付加されたフォワードプライマーと、５’末端に固相担体に結合性を有する物質が付加されたリバースプライマーとのセット
（ｉｉｉ）５’末端が固相担体に固定化されたフォワードプライマーと、５’末端にトランスペプチダーゼＮ末端基質モチーフが付加されたリバースプライマーとのセット
（ｉｖ）５’末端が固相担体に結合性を有する物質が付加されたフォワードプライマーと、５’末端にトランスペプチダーゼＮ末端基質モチーフが付加されたリバースプライマーとのセット
【０１６７】
前記（ｉ）及び（ｉｉｉ）において、プライマーを固相担体に固定化する方法としては、上記「＜ペプチド−核酸複合体の製造方法＞」で挙げた方法と同様の方法を挙げるができる。前記（ｉｉ）及び（ｉｖ）において、固相担体に結合性を有する物質は、特に限定されず、固相担体の種類に応じて適宜選択可能である。例えば、アビジン−ビオチン結合を利用する場合、固相担体をストレプトアビジン修飾し、プライマーにビオチンを結合してもよい。また、プライマーをアミノ基、ホルミル基、ＳＨ基、などの官能基で修飾し、固相担体をアミノ基、ホルミル基、エポキシ基などを有するシランカップリング剤で表面処理してもよい。
【０１６８】
（（ｃ）核酸増幅試薬）
（ｃ）の核酸増幅試薬は、ＰＣＲ等の核酸増幅反応に用いられる試薬であり、好ましくはＰＣＲに用いられる試薬である。具体的には、ｄＮＴＰ及びＤＮＡポリメラーゼが挙げられる。ＤＮＡポリメラーゼとしては、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｔｈ  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｖｅｎｔ  ＤＮＡポリメラーゼ等の熱安定性ＤＮＡポリメラーゼを用いることが好ましく、試験開始前の伸長を防ぐためにホットスタート機能を持つＤＮＡポリメラーゼや、プルーフリーディング（校正）機能を持つＤＮＡポリメラーゼを使用することがより好ましい。これらの試薬は市販されており、容易に入手可能である。
【０１６９】
（（ｄ）無細胞タンパク質合成反応液）
（ｄ）の無細胞タンパク質合成反応液は、無細胞タンパク質合成系に用いられる反応液である。具体例としては、タンパク質合成に必要な成分を含む細胞抽出液等が挙げられる。タンパク質合成に必要な成分としては、例えば、リボソーム；開始因子などの各種因子；ｔＲＮＡ；ＲＮＡポリメラーゼ、アミノアシルｔＲＮＡ合成酵素などの各種酵素等が挙げられる。例えば、大腸菌Ｓ３０抽出液の系（原核細胞の系）、コムギ胚芽抽出液の系（真核細胞の系）、及びウサギ網状赤血球可溶化物の系（真核細胞の系）等が好適に挙げられる。これらの無細胞タンパク質合成系に必要な試薬は、キットとしても市販されており、容易に入手可能である。
【０１７０】
≪第２の態様≫
一実施形態において、本発明は、下記（ａ）〜（ｄ）を含む、ペプチド−核酸複合体の作製キットを提供する。
（ａ）任意のペプチドをコードする第１のコード配列若しくは前記第１のコード配列を含む核酸断片を挿入可能なクローニングサイトと、前記トランスペプチダーゼをコードする第２のコード配列と、前記トランスペプチダーゼのＮ末端基質モチーフをコードする第３のコード配列と、を含む核酸
（ｂ）前記（ａ）の核酸における、前記第１のコード配列若しくは前記クローニングサイト、前記第２のコード配列、及び前記第３のコード配列を含む領域を増幅可能なプライマーセットであって、フォワードプライマー及びリバースプライマーのいずれか一方に、前記トランスペプチダーゼ認識モチーフが付加されている、プライマーセット
（ｃ）核酸増幅試薬
（ｄ）無細胞タンパク質合成反応液
【０１７１】
（（ａ）核酸）
（ａ）の核酸は、任意のペプチドをコードする第１のコード配列若しくは前記第１のコード配列を含む核酸断片を挿入可能なクローニングサイトと、トランスペプチダーゼをコードする第２のコード配列と、前記トランスペプチダーゼのＮ末端基質モチーフをコードする第３のコード配列と、を含む核酸である。これらのコード配列については、上記「＜ペプチド−核酸複合体の製造方法＞」で説明したものと同様である。
【０１７２】
第１のコード配列を含む核酸断片を挿入可能なクローニングサイトは、特に限定されず、任意の制限酵素サイトであってよい。前記クローニングサイトは、当該クローニングサイトに第１のコード配列を含む核酸断片が挿入された場合に、第１のコード配列から翻訳されるペプチドのドメインと、第３のコード配列から翻訳される前記トランスペプチダーゼＮ末端基質モチーフと、を含むキメラタンパク質であって、トランスペプチダーゼＮ末端基質モチーフが、ペプチドドメインのＮ末端側に位置するキメラタンパク質を発現し得る位置に配置される。すなわち、クローニングサイトは、第３のコード配列と同じＯＲＦ内であって、第３のコード配列の３’側に配置される。
【０１７３】
（ａ）の核酸は、さらに、他の配列を含んでいてもよい。他の配列としては、上記＜ペプチド−核酸複合体の製造方法＞」で挙げたものと同様のものが挙げられる。例えば、前記各コード配列間に任意のスペーサーをコードする配列を含んでいてもよい。また、前記コード配列の発現を制御するプロモーター配列等の制御配列等を含んでいてもよい。
【０１７４】
（ａ）の核酸の例としては、５’側から３’側に向かって、第３のコード配列、第１のコード配列若しくはクローニングサイト、及び第２のコード配列が、この順で、配置された構成を有する核酸；５’側から３’側に向かって、第３のコード配列、第２のコード配列、及び第１のコード配列が、この順で、配置された構成を有する核酸、が挙げられる。
【０１７５】
（ａ）の核酸の好ましい具体例としては、上記「＜ペプチド−核酸複合体の製造方法＞」で例示した、核酸３０ｄ，３０ｅ、並びに核酸３０ｄ，３０ｅのいずれかにおいて、第１のコード配列をクローニングサイトで置き換えたもの等が挙げられる。
【０１７６】
（ａ）の核酸は、さらに、前記第３のコード配列の５’末端に隣接して、プロテアーゼ認識モチーフをコードする第４のコード配列を含んでいてもよい。プロテアーゼ認識モチーフは、上記「＜ペプチド−核酸複合体の製造方法＞」で説明したものと同様である。
【０１７７】
本実施形態の核酸は、第１の態様における（ａ）の核酸と同様に、プラスミドであってもよい。プラスミドとしては、第１の態様において挙げたものと同様のものが挙げられる。
【０１７８】
（（ｂ）プライマーセット）
（ｂ）のプライマーセットは、（ａ）の核酸における、第１のコード配列若しくはクローニングサイト、第２のコード配列、及び第３のコード配列を含む領域（コード配列領域）を増幅可能なプライマーセットである。当該プライマーのフォワードプライマー及びリバースプライマーのいずれか一方には、トランスペプチダーゼの認識モチーフが付加されている。
【０１７９】
（ｂ）のプライマーセットは、（ａ）におけるコード配列領域と合わせて、これらのコード配列の転写・翻訳を制御する制御配列を含む領域を増幅できることが好ましい。当該領域を増幅可能なプライマーセットは、公知の方法に基づいて、設計することができる。プライマーへのトランスペプチダーゼ認識モチーフの付加は、上記「＜ペプチド−核酸複合体の製造方法＞」で挙げた方法と同様の方法で行うことができる。
【０１８０】
本実施形態のキットにおいて、（ｂ）のプライマーセットは、フォワードプライマー及びリバースプライマーのいずれか一方が、固相担体に固定化されていてもよい。この場合、（ｂ）のプライマーセットは、下記（ｉ）〜（ｉｖ）のいずれかであり得る。
（ｉ）５’末端にトランスペプチダーゼ認識モチーフが付加されたフォワードプライマーと、５’末端が固相担体に固定化されたリバースプライマーとのセット
（ｉｉ）５’末端にトランスペプチダーゼ認識モチーフが付加されたフォワードプライマーと、５’末端に固相担体に結合性を有する物質が付加されたリバースプライマーとのセット
（ｉｉｉ）５’末端が固相担体に固定化されたフォワードプライマーと、５’末端にトランスペプチダーゼ認識モチーフが付加されたリバースプライマーとのセット、
（ｉｖ）５’末端に固相担体に結合性を有する物質が付加されたフォワードプライマーと、５’末端にトランスペプチダーゼ認識モチーフが付加されたリバースプライマーとのセット
【０１８１】
前記（ｉ）〜（ｉｖ）において、プライマーを固相担体に固定化する方法、及び固相担体に結合性を有する物質としては、前記第１の態様において挙げたものと同様のものが挙げられる。
【０１８２】
（（ｃ）核酸増幅試薬、（ｄ）無細胞タンパク質合成反応液）
（ｃ）の核酸増幅試薬、及び（ｄ）の無細胞タンパク質合成反応液は、前記第１の態様におけるものと同様である。
【０１８３】
本実施形態のキットは、ペプチド−核酸複合体の製造に、好適に用いることができる。
【実施例】
【０１８４】
本発明を実施例に基づいて説明する。ただし、本発明の実施態様は、これら実施例の記載に限定されるものではない。【０１８５】
１．ポリリン酸キナーゼを含む核酸−ペプチド複合体
［合成例１］ペンタグリシンが付加されたＤＮＡプライマーの合成
下記組成の反応液を調製し、室温で１０分間反応後、Ｍｉｃｒｏ  Ｂｉｏ−ＳｐｉｎＴＭ  ６（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いてゲルろ過精製した。精製物のポリアクリルアミドゲル電気泳動を行い、ペンタグリシンが付加されたＤＮＡ（ペンタグリシン標識ＤＮＡ）のバンドを確認した（図７）。【０１８６】
＜反応液の組成＞
２μＭ  アジド修飾ＤＮＡ
２００μＭ  アルキン修飾ペンタグリシン
１００μＭ  アスコルビン酸ナトリウム
２０μＭ  硫酸銅（ＩＩ）
５０％  Ｔｅｒｔ−ブチルアルコール【０１８７】
アジド修飾ＤＮＡ：５’−［アジド］−CGCCAATCCGGATATAGTTC−３’（配列番号２９）
アルキン修飾ペンタグリシン：(N)-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly(propargyl)-(C)（配列番号４３）【０１８８】
［合成例２］ペンタグリシン付加されたＤＮＡの合成
下記組成のＰＣＲ反応液１及び２を調製し、３０サイクル（９８℃，１０秒；５５℃，５秒／７２℃，２分）でＰＣＲを行った。ＰＣＲ産物をＱＩＡｑｕｉｃｋ（登録商標）  ＰＣＲ  ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｃｏｌｕｍｎ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いて精製した。ＰＣＲ反応液１を用いたＰＣＲにより、ペンタグリシンが付加されたＤＮＡ（以下、「ぺンタグリシン付加ＤＮＡ」という）が得られた。ＰＣＲ反応液２を用いたＰＣＲにより、ペンタグリシンが付加されていないＤＮＡ（以下、「ペンタグリシン非付加ＤＮＡという）が得られた。
下記ＰＣＲ反応液で用いた鋳型ＤＮＡ（配列番号４４）の構成を図８に示す。図８に示すように、鋳型ＤＮＡは、ポリリン酸キナーゼ遺伝子とソルターゼＡ遺伝子とソルターゼＡ認識モチーフ（ＬＰＥＴＧ（配列番号１４））コード配列とを含むＯＲＦを有している。鋳型ＤＮＡにおいて、ソルターゼＡ認識モチーフ（ＬＰＥＴＧ（配列番号１４））コード配列は、ポリリン酸キナーゼ遺伝子の３’側に位置している。鋳型ＤＮＡに含まれるソルターゼ遺伝子Ａの塩基配列を配列番号３０に示す。【０１８９】
＜ＰＣＲ反応液１の組成＞
２０ｐｇ／μＬ  鋳型ＤＮＡ
０．３μＭ  ペンタグリシン付加ＤＮＡプライマー
０．３μＭ  ビオチン標識ＤＮＡプライマー
０．２μＭ  ｅａｃｈ  ｄＮＴＰ  Ｍｉｘ
０．０２５Ｕ／μＬ  ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ（登録商標）  ＨＳ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（タカラバイオ）
１ｘＰｒｉｍｅＳＴＡＲ（登録商標）  ｂｕｆｆｅｒ（タカラバイオ）【０１９０】
＜ＰＣＲ反応液２の組成＞
２０ｐｇ／μＬ  鋳型ＤＮＡ
０．３μＭ  ペンタグリシン非付加ＤＮＡプライマー
０．３μＭ  ビオチン標識ＤＮＡプライマー
０．２μＭ  ｅａｃｈ  ｄＮＴＰ  Ｍｉｘ
０．０２５Ｕ／μＬ  ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ（登録商標）  ＨＳ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（タカラバイオ）
１ｘＰｒｉｍｅＳＴＡＲ（登録商標）  ｂｕｆｆｅｒ（タカラバイオ）【０１９１】
［実験例１］ペンタグリシン付加ＤＮＡ固定化磁気ビーズの作製
ストレプトアビジン修飾磁気ビーズ（ＭＳ３００／ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ，ＪＳＲ）１５μＬの上清を除去し、３０μＬの結合バッファー（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，１ｍＭ  ＥＤＴＡ，１Ｍ  ＮａＣｌ，０．０５％（ｗ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０，ｐＨ７．４）で洗浄した。１ｐｍｏｌのペンタグリシン付加ＤＮＡ又はペンタグリシン非付加ＤＮＡを溶解した３０μＬの結合バッファーに、磁気ビーズを懸濁し、室温で３０分間撹拌した。次いで、磁気ビーズを１００μＬの結合バッファーで３回洗浄した後、磁気ビーズを３０μＬの結合バッファーに懸濁した。【０１９２】
［実験例２］ペンタグリシン付加ＤＮＡの無細胞タンパク質翻訳
ペンタグリシン付加ＤＮＡ又はペンタグリシン非付加ＤＮＡを固定化した磁気ビーズ  １０μＬの上清を除去し、無細胞タンパク質翻訳反応液（ＰＵＲＥｆｒｅｘ（登録商標）  １．０，ジーンフロンティア）１０μＬに懸濁した。３７℃で３時間撹拌した後、磁気ビーズを１００μＬの結合バッファーで３回洗浄した。次いで、磁気ビーズを１００μＬの５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）で３回洗浄した後、１０μＬの５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）に懸濁した。【０１９３】
［実験例３］ポリリン酸キナーゼ活性測定
無細胞タンパク質翻訳の処理を行った磁気ビーズ  １０μＬ、酵素反応溶液（１ｍＭ  ヘキサメタリン酸，０．１ｍＭ  ＡＤＰ，５ｍＭ  ＭｇＳＯ４，５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．５）２５μＬ、及びＡＴＰ蛍光検出試薬（ＡＴＰ  Ｃｏｌｏｒｉｍｅｔｒｉｃ／Ｆｌｕｏｒｏｍｅｔｒｉｃ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ，ＢｉｏＶｉｓｉｏｎ，Ｉｎｃ．）２５μＬを混合し、ポリリン酸キナーゼの触媒反応の結果生じるＡＴＰに由来する蛍光シグナルを、蛍光プレートリーダーを用いて経時的に測定した。【０１９４】
結果を図９に示す。ペンタグリシン付加ＤＮＡを固定化した磁気ビーズでは、ポリリン酸キナーゼ活性が確認された。この結果は、ペンタグリシン付加ＤＮＡを固定化した磁気ビーズでは、ペンタグリシン付加ＤＮＡから無細胞翻訳されたポリリン酸キナーゼが、ビーズに固定化されていること示している。一方、ペンタグリシン非付加ＤＮＡを固定化した磁気ビーズでは、ビーズへの非特異的吸着によるものと思われる僅かなポリリン酸キナーゼ活性しか確認されなかった。
以上の結果より、ソルターゼＡＮ末端基質モチーフが付加されたＤＮＡ（任意遺伝子、ソルターゼＡ遺伝子、及びソルターゼＡ認識モチーフを含む）を無細胞タンパク質翻訳することにより、任意遺伝子ＤＮＡに当該任意遺伝子から翻訳されたタンパク質を連結できることが実証された。【０１９５】
２．ＣＰ０５又はプロテインキナーゼインヒビター（ＰＫＩ）を含む核酸−ペプチド複合体
［合成例３］ペンタグリシン付加されたＤＮＡの合成（ＣＰ０５遺伝子）
鋳型ＤＮＡとして、ＣＰ０５ペプチド遺伝子（配列番号４５、４６）の５’末端にＦａｃｔｏｒ  Ｘａプロテアーゼ認識モチーフ（配列番号２８）コード配列を連結したＤＮＡ（Ｘａモチーフ−ＣＰ０５）を含むものを用いた。当該鋳型ＤＮＡ（配列番号４７）は、図８に示す鋳型ＤＮＡにおいて、ポリリン酸キナーゼ遺伝子に代えて、Ｘａモチーフ−ＣＰ０５を有する。ＣＰ０５ペプチドの
前記鋳型ＤＮＡを用いたこと以外は、前記合成例１及び合成例２と同様に、ペンタグリシン付加されたＤＮＡを合成した。【０１９６】
［合成例４］ペンタグリシン付加されたＤＮＡの合成（ＰＫＩ遺伝子）
鋳型ＤＮＡとして、ＰＫＩ遺伝子（配列番号４８、４９）の５’末端にＦａｃｔｏｒ  Ｘａプロテアーゼ認識モチーフ（配列番号２８）コード配列を連結したＤＮＡ（Ｘａモチーフ−ＰＫＩ）を含むものを用いた。当該鋳型ＤＮＡ（配列番号５０）は、図８に示す鋳型ＤＮＡにおいて、ポリリン酸キナーゼ遺伝子に代えて、Ｘａモチーフ−ＰＫＩを有する。
前記鋳型ＤＮＡを用いたこと以外は、前記合成例１及び合成例２と同様に、ペンタグリシン付加されたＤＮＡを合成した。【０１９７】
［実験例４］ペンタグリシン付加ＤＮＡ固定化磁気ビーズの作製
前記合成例３又は合成例４で合成したペンタグリシン付加されたＤＮＡを用いたこと以外は、前記実験例２と同様に、ペンタグリシン付加ＤＮＡ固定化磁気ビーズ、及びペンタグリシン非付加ＤＮＡ固定化磁気ビーズを作製した。【０１９８】
［実験例５］ペンタグリシン付加ＤＮＡの無細胞タンパク質翻訳
ペンタグリシン付加ＤＮＡ又はペンタグリシン非付加ＤＮＡを固定化した磁気ビーズ  １５μＬの上清を除去し、無細胞タンパク質翻訳反応液（ＰＵＲＥｆｒｅｘ（登録商標）  １．０，ジーンフロンティア）１５μＬに懸濁した。３７℃で３時間撹拌した後、磁気ビーズを１００μＬのＰＢＳ−Ｔで５回洗浄した。次いで、磁気ビーズを１００μＬのＰＢＳ−Ｔに懸濁した。【０１９９】
［実験例６］抗体染色
磁気ビーズ懸濁液２５μＬの分散媒を除去し、磁気ビーズを下記（ａ）〜（ｃ）のいずれかの溶液に懸濁した。
（ａ）ＰＢＳ−Ｔで希釈したＦＩＴＣ標識抗ｃＭｙｃ抗体溶液（ａｂｃａｍ＃ａｂ１１７５９９）  １５μＬ。
（ｂ）ＰＢＳ−Ｔで希釈したＦＩＴＣ標識抗ＩｓｏｔｙｐｅＣｏｎｔｒｏｌ抗体溶液（ａｂｃａｍ＃ａｂ９１３５６）  １５μＬ。
（ｃ）ＰＢＳ−Ｔのみ  １５μＬ。【０２００】
磁気ビーズを懸濁後、遮光下、室温で、１時間撹拌した。次いで、磁気ビーズを１００μＬのＰＢＳ−Ｔで３回洗浄した。次いで、磁気ビーズを１００μＬのＰＢＳで１回洗浄した。次いで、磁気ビーズを１５μＬのＰＢＳに懸濁し、蛍光顕微鏡（Ｎｉｋｏｎ  Ｅｃｌｉｐｓｅ  Ｔｉ−Ｅ，浜松ホトニクスＥＭ−ＣＣＤカメラ，Ｂ−２Ａフィルター，キセノンランプ）で観察した。蛍光顕微鏡の撮像画像から、磁気ビーズの蛍光強度をＩｍａｇｅＪで解析した。【０２０１】
結果を図１０及び図１１に示す。図１０に示すように、ペンタグリシン付加ＤＮＡ固定化ビーズでは、ＦＩＴＣ標識抗ｃＭｙｃ抗体を反応させた場合、蛍光強度が増強した。一方、ペンタグリシン非付加ＤＮＡ固定化ビーズでも、ＦＩＴＣ標識抗ｃＭｙｃ抗体を反応させた場合に、蛍光強度が若干増強したが、増強の程度は、ペンタグリシン付加ＤＮＡ固定化ビーズと比較して小さかった。図１１は、各磁気ビーズの蛍光顕微鏡写真を示す。
図１０及び図１１の結果より、ペンタグリシン付加ＤＮＡ固定化ビーズでは、ビーズに固定されたｃＭｙｃタグコード配列を含むＤＮＡに、ｃＭｙｃタグを含むタンパク質が連結していると推測された。そのため、ＦＩＴＣ標識抗ｃＭｙｃ抗体を反応させることにより、蛍光強度が大きく増強したと考えられた。【０２０２】
３．ペプチドアレイの作製
前記実験例２で作製した核酸−ペプチド複合体固定化磁気ビーズを用いて、ペプチドアレイの作製を行った。実験例２で無細胞タンパク質翻訳処理した後の磁気ビーズ５μＬを、酵素反応溶液（３．３ｍＭ  ヘキサメタリン酸，０．３３ｍＭ  ＡＤＰ，１６．７ｍＭ  ＭｇＳＯ４）９μＬ、及びＡＴＰ蛍光検出試薬（ＡＴＰ  Ｃｏｌｏｒｉｍｅｔｒｉｃ／Ｆｌｕｏｒｏｍｅｔｒｉｃ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ，ＢｉｏＶｉｓｉｏｎ，Ｉｎｃ．）１５μＬと混合した。
直径４μｍ、深さ４μｍの穴が１ｃｍ角に１００万個形成された石英ガラス製チップに、前記で調製した磁気ビーズ懸濁液を滴下し、各ウェルを磁気ビーズ及びビーズ分散媒で満たした。チップ表面を、シリコーンオイル（信越化学，ＫＦ９６−１００ｃｓ）で被覆して各ウェルを密閉した。その後、蛍光顕微鏡（Ｎｉｋｏｎ  Ｅｃｌｉｐｓｅ  Ｔｉ−Ｅ，浜松ホトニクスＥＭ−ＣＣＤカメラ，Ｃｙ３フィルター，キセノンランプ）でタイムラプス撮影を行い、各ウェルの蛍光輝度上昇を観察した。各ウェルの蛍光輝度変化の解析は、ＩｍａｇｅＪで行った。【０２０３】
結果を図１２Ａ及び図１２Ｂに示す。蛍光輝度の上昇は、核酸−ペプチド複合体固定化磁気ビーズが充填されたウェルでのみ観察された。この結果により、本方法で作製した核酸−ペプチド複合体固定化磁気ビーズを用いて、ペプチドアレイが作製できることが確認された。【０２０４】
４．ＰＫＩを含む核酸−ペプチド複合体のプロテインキナーゼＡ（ＰＫＡ）阻害活性
［実験例７］ペンタグリシン付加ＤＮＡ固定化磁気ビーズの作製
前記合成例４で合成したペンタグリシン付加ＤＮＡ（ＰＫＩ遺伝子含有）を用いたこと以外は、前記実験例２と同様に、ペンタグリシン付加ＤＮＡ固定化磁気ビーズを作製した。陰性対照磁気ビーズとして、前記合成例３で合成したペンタグリシン付加ＤＮＡ（ＣＤ０５遺伝子含有）を用いて、前記実験例２と同様に、ペンタグリシン付加ＤＮＡ固定化磁気ビーズを作製した。【０２０５】
［実験例８］ペンタグリシン付加ＤＮＡの無細胞タンパク質翻訳
１５μＬのペンタグリシン付加ＤＮＡ（ＰＫＩ遺伝子含有）固定化磁気ビーズ若しくは１５μＬのペンタグリシン付加ＤＮＡ（ＣＤ０５遺伝子含有）固定化磁気ビーズの上清を除去し、無細胞タンパク質翻訳反応液（ＰＵＲＥｆｒｅｘ（登録商標）  １．０，ジーンフロンティア）１５μＬに懸濁した。３７℃で３時間撹拌した後、磁気ビーズを１００μＬの結合バッファーで５回洗浄した。次いで、磁気ビーズを１００μＬの１×ＰＫＡバッファー（４０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５），２０ｍＭ  ＭｇＣｌ２，０．１ｍｇ／ｍＬ  ＢＳＡ）で５回洗浄した。次いで、磁気ビーズを３μＬの１×ＰＫＡバッファーに懸濁した。【０２０６】
［実験例９］ＰＫＡ阻害活性測定
無細胞タンパク質翻訳処理した後の磁気ビーズ３μＬ、キナーゼ反応液７μＬ、及び２×ＲＴ検出液（Ｆｌｕｏｒｏｓｐａｒｋ（登録商標），富士フィルム和光）１５μＬを混合した。次いで、プロテインキナーゼＡの触媒反応の結果生じるＡＤＰに由来する蛍光シグナルを、蛍光プレートリーダーを用いて測定した。【０２０７】
キナーゼ反応液の組成を以下に示す。
＜キナーゼ反応液＞
０．０６ｍＵ／μＬ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  ｋｉｎａｓｅ  Ａ（ＳｉｇｎａｌＣｈｅｍ，  ＃ｐ５１−１０Ｇ）
５μＭ  ＡＴＰ
１００μＭ  Ｋｅｍｐｔｉｄｅ  （Ｐｒｏｍｅｇａ，  Ｖ５６０１）
３．６×ＰＫＡ  ｂｕｆｆｅｒ【０２０８】
蛍光シグナルの測定条件を以下に示す。
３０℃、６０分
励起光：５４０ＢＰ２０ｎｍ
蛍光：５９０ＢＰ２０ｎｍ【０２０９】
結果を図１３に示す。ＰＫＩを含む核酸−ペプチド複合体固定化ビーズでは、蛍光強度が低いまま維持された。ＰＫＩを含む核酸−ペプチド複合体固定化ビーズでは、陽性対照として、ＰＫＡ反応液に、１０μＭのＰＫＩを添加した場合とほぼ同じ蛍光強度に維持された。
一方、陰性対照磁気ビーズでは、反応時間の経過とともに、蛍光強度が上昇した。陰性対照磁気ビーズの蛍光強度は、ＰＫＩを添加しないＰＫＡ反応液とほぼ同等の上昇を示した。
これらの結果から、ＰＫＩを含む核酸−ペプチド複合体固定化ビーズでは、ＰＫＩ核酸−ＰＫＩペプチドの複合体が形成されていることが確認された。【０２１０】
５．ＣＰ０５を含む核酸−ペプチド複合体のエクソソーム結合活性
［実験例１０］ペンタグリシン付加ＤＮＡ固定化磁気ビーズの作製
前記合成例３で合成したペンタグリシン付加ＤＮＡ（ＣＰ０５遺伝子含有）を用いたこと以外は、前記実験例２と同様に、ペンタグリシン付加ＤＮＡ固定化磁気ビーズ及びペンタグリシン非付加ＤＮＡ固定化磁気ビーズを作製した。【０２１１】
［実験例１１］ペンタグリシン付加ＤＮＡの無細胞タンパク質翻訳
１５μＬのペンタグリシン付加ＤＮＡ固定化磁気ビーズの上清を除去し、無細胞タンパク質翻訳反応液（ＰＵＲＥｆｒｅｘ（登録商標）  １．０，ジーンフロンティア）１５μＬに懸濁した。３７℃で３時間撹拌した後、磁気ビーズを１００μＬの結合バッファーで５回洗浄した。次いで、磁気ビーズを１００μＬのＦａｃｔｏｒ  Ｘａバッファー（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５），１００ｍＭ  ＮａＣｌ）で１回洗浄した。次いで、磁気ビーズをＦａｃｔｏｒ  Ｘａバッファーに懸濁した。【０２１２】
［実験例１２］Ｆａｃｔｏｒ  Ｘａプロテアーゼ処理
磁気ビーズ懸濁液３０μＬに、Ｆａｃｔｏｒ  Ｘａプロテアーゼ（Ｐｒｏｍｅｇａ）１μＬを添加し、２５℃で１７時間攪拌した。
実験例１１の無細胞タンパク質翻訳処理により、ペンタグリシン付加ＤＮＡから、ｃＭｙｃタグ−Ｆａｃｔｏｒ  Ｘａプロテアーゼ認識モチーフ−ＣＰ０５−ＬＰＥＴＧ−ソルターゼＡのキメラタンパク質が翻訳される。次いで、ソルターゼＡによるペプチド転移反応により、ペンタグリシン付加ＤＮＡに、ｃＭｙｃタグ−Ｆａｃｔｏｒ  Ｘａプロテアーゼ認識モチーフ−ＣＰ０５−ＬＰＥＴＧが連結されて、ペプチド−核酸複合体が形成される。このペプチド−核酸複合体に、Ｆａｃｔｏｒ  Ｘａプロテアーゼを作用させると、Ｆａｃｔｏｒ  Ｘａプロテアーゼ認識モチーフで切断される。その結果、ペプチド−核酸複合体からｃＭｙｃタグが切り離される。【０２１３】
［実験例１３］蛍光標識細胞外小胞（Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｖｅｓｉｃｌｅｓ：ＥＶ）の調製
ヒト血漿１５０μＬを遠心（１５００×ｇ，１０分，２５℃）し、上清を回収した。回収した上清を心（３０００×ｇ，１０分，２５℃）し、上清を回収した。回収した上清をさらに遠心（３０００×ｇ，１０分，２５℃）し、上清を回収した。次いで、回収した上清をＥｘｏｓｏｍｅ  ｓｐｉｎ  Ｃｏｌｕｍｎ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｃｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で精製した。次いで、精製サンプルを限外濾過カラム（ＭＷＣＯ  １００Ｋ）で１００μＬに濃縮した。これに、ＰＫＨ６７（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を添加（終濃度２μＭ）し、遮光下、室温で、１０分間反応させた。反応後、反応液をＥｘｏｓｏｍｅ  Ｓｐｉｎ  Ｃｏｌｕｍｎ  （Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｃｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で精製した。精製したサンプルを蛍光標識ＥＶとして用いた。【０２１４】
［実験例１４］蛍光標識ＥＶサンプルとの反応及び蛍光顕微鏡観察
実験例１２でＦａｃｔｏｒ  Ｘａプロテアーゼ処理した磁気ビーズを１００μＬのＰＢＳ−Ｔで５回洗浄した。次いで、磁気ビーズを１５μＬのＰＢＳ−Ｔに懸濁した。磁気ビーズ懸濁液から７．５μＬの分散媒を除去し、実験例１３で調製した蛍光標識ＥＶサンプル５０μＬに、懸濁した。次いで、遮光下、室温で、１時間攪拌した。次いで、磁気ビーズを１００μＬのＰＢＳで４回洗浄した。次いで、磁気ビーズを１５μＬのＰＢＳに懸濁した。【０２１５】
上記で調製した磁気ビーズ懸濁液を、蛍光顕微鏡（Ｎｉｋｏｎ  Ｅｃｌｉｐｓｅ  Ｔｉ−Ｅ，浜松ホトニクスＥＭ−ＣＣＤカメラ，Ｂ−２Ａフィルター，キセノンランプ）で観察した。撮像画像から、磁気ビーズの蛍光強度をＩｍａｇｅＪで解析した。【０２１６】
結果を図１４Ａ及び図１４Ｂに示す。ＣＰ０５は、ＥＶの表面抗原であるＣＤ６３に対する結合性を有する。そのため、ＣＰ０５を提示するペプチド−核酸複合体が形成されている場合には、ＣＰ０５に蛍光標識ＥＶが結合し、蛍光が観察されるはずである。
図１４Ａ及び図１４Ｂに示すように、ペンタグリシン付加ＤＮＡ固定化磁気ビーズでは、ＤＮＡ非固定化磁気ビーズ及びペンタグリシン非付加ＤＮＡ固定化磁気ビーズと比較して、高い蛍光強度を示した。この結果は、ペンタグリシン付加ＤＮＡ固定化磁気ビーズでは、ＣＰ０５を提示するペプチドー核酸複合体が形成されていることを示す。【０２１７】
６．エマルションＰＣＲによるペプチド−核酸複合体の作製
［実験例１５］プライマー固定化ビーズの調製
ストレプトアビジン修飾磁気ビーズ（ＭＳ３００／ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ，ＪＳＲ）２４０μＬの上清を除去し、１２００μＬの結合バッファー（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，１ｍＭ  ＥＤＴＡ，１Ｍ  ＮａＣｌ，０．０５％（ｗ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０，ｐＨ７．４）で洗浄した。４８ｐｍｏｌのビオチン標識ＤＮＡプライマーを溶解した、４８０μＬの結合バッファーに、磁気ビーズを懸濁し、室温で１時間撹拌した。次いで、磁気ビーズを１２００μＬの結合バッファーで１回洗浄した。次いで、磁気ビーズを２４０μＬの１×ｂｕｆｆｅｒ  ｆｏｒ  ＫＯＤ  Ｐｌｕｓ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（東洋紡）で２回洗浄した。次いで、磁気ビーズを２４０μＬの１×ｂｕｆｆｅｒ  ｆｏｒ  ＫＯＤ  Ｐｌｕｓ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（東洋紡）に懸濁した。【０２１８】
［実験例１６］エマルションＰＣＲ
下記組成のＰＣＲ反応液３とオイル混合液１とを混合し、攪拌してエマルションを形成した。これを５０μＬずつ分注してＰＣＲを行った。ＰＣＲ条件は、９５℃，５分、（９４℃，３０秒；５５℃，１分；６８℃，６分）で３０サイクルとし、ＰＣＲ反応後は、１０℃で維持した。鋳型ＤＮＡは、前記合成例２と同じものを用いた。【０２１９】
＜ＰＣＲ反応液３の組成＞
プライマー結合磁気ビーズ  ２．４ｅ８粒子
鋳型ＤＮＡ  １．２ｅ８分子
ペンタグリシン付加ＤＮＡプライマー  １８０  ｐｍｏｌ
ＤＮＡプライマー  １８０  ｐｍｏｌ
２ｍＭ  ｄＮＴＰ  Ｍｉｘ  ３０μＬ
２５ｍＭ  ＭｇＳＯ４  １８μＬ
１０×ＫＯＤ  ｐｌｕｓ  ｂｕｆｆｅｒ（東洋紡）  ３０μＬ
１Ｕ／μＬ  ＫＯＤ  ｐｌｕｓ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（東洋紡）  １２μＬ
Ｎｕｃｌｅａｓｅ  Ｆｒｅｅ  Ｗａｔｅｒ，  ｕｐ  ｔｏ  ３００μＬ
合計  ３００μＬ【０２２０】
＜オイル混合液１＞
ＴＥＧＯＳＯＦＴ  ＤＥＣ（Ｅｖｏｎｉｋ）  ５４０μＬ
ミネラルオイル（ナカライテスク）  ２０４μＬ
ＡＢＩＬ  ＷＥ０９（Ｅｖｏｎｉｋ）  ７５６μＬ
合計  １５００μＬ【０２２１】
ＰＣＲ後、破砕バッファー（８０％  イソプロパノール，０．６Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ５．２），１％  Ｔｗｅｅｎ２０）７．６ｍＬを加えて混合した。磁石を用いて磁気ビーズを集め、上清を除去した。次いで、磁気ビーズを、ＴＫバッファー（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５），５０ｍＭ  ＫＣｌ，０．０１％  Ｔｗｅｅｎ２０）４ｍＬで５回洗浄した。磁気ビーズ上のＰＣＲ産物をＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｉで染色し、二本鎖ＤＮＡ結合磁気ビーズをＦＡＣＳ（ＢＤ，ＦＡＣＳＡｒｅａ使用）で分取した。【０２２２】
［実験例１７］エマルション無細胞タンパク質翻訳
下記組成の無細胞タンパク質翻訳液及びオイル混合液２を混合し、攪拌してエマルションを形成した。３７℃で、３時間反応した。陰性対照実験として、ＤＮＡ未固定の磁気ビーズを用いて、同様の処理を行った。【０２２３】
＜無細胞タンパク質翻訳液＞
エマルションＰＣＲを行った磁気ビーズ５ｅ６粒子をＰＵＲＥｆｒｅｘ１．０反応溶液６３μＬに懸濁したものを無細胞タンパク質翻訳液として用いた。【０２２４】
＜オイル混合液２＞
ＴＥＧＯＳＯＦＴ  ＤＥＣ（Ｅｖｏｎｉｋ）  １１３μＬ
ミネラルオイル（ナカライテスク）  ４３μＬ
ＡＢＩＬ  ＷＥ０９（Ｅｖｏｎｉｋ）  １５９μＬ
合計  ３１５μＬ【０２２５】
無細胞タンパク質翻訳反応後、破砕バッファー７５０μＬを加えて混合した。磁石を用いて磁気ビーズを集め、上清を除去した。磁気ビーズを、破砕バッファー１．９ｍＬで３回洗浄した。次いで、磁気ビーズを、洗浄バッファー２５０μＬで５回洗浄した。次いで、磁気ビーズを、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）２５０μＬで１回洗浄した。次いで、磁気ビーズを、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）６μＬに懸濁した。【０２２６】
［実験例１８］ポリリン酸キナーゼ活性測定
無細胞タンパク質翻訳の処理を行った磁気ビーズ６μＬ、酵素反応溶液（３．３ｍＭヘキサメタリン酸，０．３３ｍＭ  ＡＤＰ，１６．７ｍＭ  ＭｇＳＯ４）９μＬ、及びＡＴＰ蛍光検出試薬（ＡＴＰ  Ｃｏｌｏｒｉｍｅｔｒｉｃ／Ｆｌｕｏｒｏｍｅｔｒｉｃ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ，ＢｉｏＶｉｓｉｏｎ，Ｉｎｃ．）１５μＬを混合し、ポリリン酸キナーゼの触媒反応の結果生じるＡＴＰに由来する蛍光シグナルを、蛍光プレートリーダーを用いて経時的に測定した。【０２２７】
結果を図１５に示す。ペンタグリシン付加ＤＮＡを固定化した磁気ビーズでは、ポリリン酸キナーゼ活性が確認された。この結果は、ペンタグリシン付加ＤＮＡを固定化した磁気ビーズでは、ペンタグリシン付加ＤＮＡから無細胞翻訳されたポリリン酸キナーゼが、ビーズに固定化されていること示している。一方、ペンタグリシン非付加ＤＮＡを固定化した磁気ビーズでは、ビーズへの非特異的吸着によるものと思われる僅かなポリリン酸キナーゼ活性しか確認されなかった。
以上の結果より、エマルションＰＣＲ及びエマルション無細胞タンパク質翻訳を用いた場合も、上記実験例１及び実験例２と同様に、任意遺伝子ＤＮＡに当該任意遺伝子から翻訳されたタンパク質を連結できることが実証された。
【符号の説明】
【０２２８】
１０    ペプチド
２０    トランスペプチダーゼ
２１    トランスペプチダーゼＮ末端基質モチーフ
２２    トランスペプチダーゼ認識モチーフ
２２’    トランスペプチダーゼ認識モチーフの切断により生じる配列
２２’    トランスペプチダーゼ認識モチーフの切断により生じる配列
３０ａ，３０ｂ，３０ｃ，３０ｄ，３０ｅ    核酸
４０    プロテアーゼ
１００，２００，３００    トランスペプチダーゼＮ末端基質モチーフが付加された核酸（ＮＳ付加核酸）
１０１，２０１，３０１，４０１，４０１’，５０１，５０１’    キメラタンパク質
１０２，２０２，３０２，４０２，５０２    ペプチド−核酸複合体
１０３，２０３，３０３，４０３，５０３    ペプチド転移反応生成物
４００，４００’，５００，５００’    トランスペプチダーゼ認識モチーフが付加された核酸（ＴＰＲ付加核酸）
【図１Ａ】
2020095985.tif 000002
【図１Ｂ】
2020095985.tif 000003
【図１Ｃ】
2020095985.tif 000004
【図２Ａ】
2020095985.tif 000005
【図２Ｂ】
2020095985.tif 000006
【図２Ｃ】
2020095985.tif 000007
【図３Ａ】
2020095985.tif 000008
【図３Ｂ】
2020095985.tif 000009
【図３Ｃ】
2020095985.tif 000010
【図４Ａ】
2020095985.tif 000011
【図４Ｂ】
2020095985.tif 000012
【図４Ｃ】
2020095985.tif 000013
【図５Ａ】
2020095985.tif 000014
【図５Ｂ】
2020095985.tif 000015
【図５Ｃ】
2020095985.tif 000016
【図６Ａ】
2020095985.tif 000017
【図６Ｂ】
2020095985.tif 000018
【図７】
2020095985.tif 000019
【図８】
2020095985.tif 000020
【図９】
2020095985.tif 000021
【図１０】
2020095985.tif 000022
【図１１】
2020095985.tif 000023
【図１２Ａ】
2020095985.tif 000024
【図１２Ｂ】
2020095985.tif 000025
【図１３】
2020095985.tif 000026
【図１４Ａ】
2020095985.tif 000027
【図１４Ｂ】
2020095985.tif 000028
【図１５】
2020095985.tif 000029
【配列表】
2020095985000001.app
【国際調査報告】
2020095985.tif 000030
2020095985.tif 000031
2020095985.tif 000032
2020095985.tif 000033
2020095985.tif 000034
2020095985.tif 000035
2020095985.tif 000036