(57)【要約】  本発明は、１）ＤＮＡウイルスまたは単細胞生物の保有する標的核酸を用意する工程と、２）標的核酸を鋳型としたＰＣＲによる増幅範囲が１５００−２８００ｂｐの長さとなるプライマーを用意する工程と、３）標的核酸とプライマーを用いて定量ＰＣＲを行う工程と、４）定量ＰＣＲの結果をＤＮＡウイルスまたは単細胞生物の活性能に変換する工程とを有することを特徴とする、ＤＮＡウイルスまたは単細胞生物の活性測定方法を提供するものである。  また本発明は、活性エネルギー線照射装置の殺菌力測定方法を提供するものである。
2019124306.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
１）ＤＮＡウイルスまたは単細胞生物の保有する標的核酸を用意する工程と、
２）標的核酸を鋳型としたＰＣＲによる増幅産物が１５００−２８００ｂｐの長さとなるプライマーを用意する工程と、
３）標的核酸とプライマーを用いて定量ＰＣＲを行う工程と、
４）定量ＰＣＲの結果をＤＮＡウイルスまたは単細胞生物の活性能に変換する工程とを有することを特徴とする、
ＤＮＡウイルスまたは単細胞生物の活性測定方法。
【請求項２】
さらに、標的核酸をエンドヌクレアーゼ処理する工程を有する、請求項１に記載のＤＮＡウイルスまたは単細胞生物の活性測定方法。
【請求項３】
１）活性エネルギー線照射装置を用いて、ＤＮＡに活性エネルギー線照射処理し、処理ＤＮＡを得る工程と、
２）得られた処理ＤＮＡに対し、ＰＣＲによる増幅範囲が１５００−２８００ｂｐの長さとなるプライマーを用意する工程と、
３）処理ＤＮＡとプライマーを用いて定量ＰＣＲを行う工程と、
４）定量ＰＣＲの結果を活性エネルギー線による殺菌力に変換する工程とを有することを特徴とする、
活性エネルギー線照射装置の殺菌力測定方法。
【請求項４】
さらに、活性エネルギー線照射処理後に得られた処理ＤＮＡをエンドヌクレアーゼ処理する工程を有する、請求項３に記載の活性エネルギー線照射装置の殺菌力測定方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＤＮＡウイルスまたは単細胞生物の活性測定方法、及び、活性エネルギー線照射装置の殺菌力測定方法に関する。
本願は、２０１７年１２月２１日に、日本に出願された特願２０１７−２４５０２３号に基づき優先権を主張し、その内容をここに援用する。
【背景技術】
【０００２】
病原性を有するウイルスや細菌等の単細胞生物の殺菌・消毒は、衛生環境の維持に置いて大変重要である。特に飲料水や環境水の殺菌・消毒は、人々の健康に直結する為、厳密に行われる必要がある。従来は、塩素剤等の薬剤投与が多く用いられているが、薬剤の残留が生態系への影響やアレルギー等の原因となるという課題があった。そこで、近年紫外線や放射線といった活性エネルギー線照射を行い核酸に損傷を与える殺菌・消毒処理が多く利用されるようになってきた。特に、耐塩素性を有するクリプトスポリジウムなどの原虫対策に、活性エネルギー線照射処理が期待されている。【０００３】
しかし、ウイルスや単細胞生物の殺菌に用いる活性エネルギー線照射装置については、各種課題が存在する。例えば、活性エネルギー線照射装置の照射線量については、装置や光源の設定や照射量測定装置等である程度の検証は可能である。しかし、実際の殺菌力については、照射時間や照射装置内での滞留時間、照射場所等でバラつきがあるため、実際の装置が保有する殺菌力の検証は、培養法により、生菌や病原性の確認を行う必要があり、判定までに時間がかかってしまうという大きな課題が存在していた。【０００４】
また、殺菌対象であるウイルスや単細胞生物についても、殺菌・消毒処理がきちんと行われたかどうかの検証には、多くの課題があった。たとえば処理前後で顕微鏡観察したとしても、形態変化が無い場合があるため、ウイルスや単細胞生物が病原性を保持しているのかどうか判別できなかった。また、菌量やウイルス量を測定するのに定量ＰＣＲを用いる場合があるが、従来の一般的な定量ＰＣＲでは核酸の損傷の有無に関係なく増幅反応が進む場合があるため、核酸の損傷有無に伴う不活化の効果を判定しにくかった。よって、殺菌・消毒処理の正確な検証、つまり、ウイルスや単細胞生物の保有する活性能の測定を行うには、やはり培養法により生菌や病原性の確認を行う必要があり、判定までに時間がかかってしまうという大きな課題があった。【０００５】
核酸の損傷率を知るために、非特許文献１では、ＰＣＲを利用して核酸の損傷率をＰＣＲの増幅産物が４０−７０ｂｐと３０００−４０００ｂｐとなる２つのリアルタイムＰＣＲの結果から、標的核酸の損傷率を求める方法が開示されている。しかし、ＰＣＲを２回行う手間がある上、増幅産物が３０００ｂｐを越える場合、ＰＣＲ増幅エラーが起こりやすくなるという課題があった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｏｌｉｖｅｒ  Ｒｏｔｈｆｕｓｓ、”Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ”，  ２０１４，  Ｖｏｌ．４２，  Ｎｏ．６，  ｅ４１
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の課題は、簡便かつスピーディーにＤＮＡウイルスまたは単細胞生物の活性を測定する方法を提供することにある。
また、本発明の課題は、簡便かつスピーディーに活性エネルギー線照射装置の殺菌力を測定する方法を提供するものである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは鋭意検討の結果、定量ＰＣＲの増幅範囲を１５００−２８００ｂｐとすることで、定量ＰＣＲの結果をウイルスまたは単細胞生物の活性測定方法として使用できることを見出した。【０００９】
すなわち本発明は、１）ＤＮＡウイルスまたは単細胞生物の保有する標的核酸を用意する工程と、２）標的核酸を鋳型としＰＣＲによる増幅範囲が１５００−２８００ｂｐの長さとなるプライマーを用意する工程と、３）標的核酸とプライマーを用いて定量ＰＣＲを行う工程と、４）定量ＰＣＲの結果をＤＮＡウイルスまたは単細胞生物の活性能に変換する工程とを有することを特徴とする、ＤＮＡウイルスまたは単細胞生物の活性測定方法を提供するものである。【００１０】
また本発明は、さらに、標的核酸をエンドヌクレアーゼ処理する工程を有するウイルスまたは単細胞生物の活性測定方法を提供するものである。【００１１】
また本発明者らは鋭意検討の結果、定量ＰＣＲの増幅範囲を１５００−２８００ｂｐとすることで、定量ＰＣＲの結果を活性エネルギー線照射装置の殺菌力測定方法として使用できることを見出した。【００１２】
すなわち本発明は、１）活性エネルギー線照射装置を用いて、ＤＮＡに活性エネルギー線照射処理し、処理ＤＮＡを得る工程と、２）得られた処理ＤＮＡに対し、ＰＣＲによる増幅範囲が１５００−２８００ｂｐの長さとなるプライマーを用意する工程と、３）処理ＤＮＡとプライマーを用いて定量ＰＣＲを行う工程と、４）定量ＰＣＲの結果を活性エネルギー線による殺菌力に変換する工程とを有することを特徴とする、活性エネルギー線照射装置の殺菌力測定方法を提供するものである。
【発明の効果】
【００１３】
本発明の活性測定方法を用いることで、ＤＮＡウイルスまたは単細胞生物の活性が簡便に測定可能となる。
また、本発明の活性エネルギー線照射装置の殺菌力測定方法を用いることで、活性エネルギー線照射装置の実質的な殺菌力を簡便に測定することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】参考例１−５において、ＰＣＲによって求められた検量線を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
＜ＤＮＡウイルスまたは単細胞生物の活性測定方法＞
本発明は、１）ＤＮＡウイルスまたは単細胞生物の保有する標的核酸を用意する工程と、２）標的核酸を鋳型としたＰＣＲによる増幅産物が１５００−２８００ｂｐの長さとなるプライマーを用意する工程と、３）標的核酸とプライマーを用いて定量ＰＣＲを行う工程と、４）定量ＰＣＲの結果をＤＮＡウイルスまたは単細胞生物の活性能に変換する工程とを有することを特徴とする、ＤＮＡウイルスまたは単細胞生物の活性測定方法を提供するものである。
本方法により、定量ＰＣＲでＤＮＡウイルスまたは単細胞生物の活性を測定することが出来る。ここでいう活性とは、ＤＮＡウイルスまたは単細胞生物の増殖能力のことをいう。
【００１６】
１）ＤＮＡウイルスまたは単細胞生物の保有する標的核酸を用意する工程
＜ＤＮＡウイルスまたは単細胞生物＞
本発明の活性測定方法では、ＤＮＡウイルスまたは単細胞生物の保有する標的核酸を定量ＰＣＲにて増幅させる。このとき、標的核酸はＤＮＡ（デオキシリボ核酸）である。
【００１７】
ＤＮＡウイルスとしては、核酸としてＤＮＡを有するウイルスであれば良い。
病原性があるものも無いものも活性測定可能であるが、公衆衛生上の観点から病原性を有するウイルスの活性測定が培養せずとも可能であることは有用である。
ＤＮＡウイルスとしては、たとえばラムダファージ、ヘルペスウイルス、ヒトパピローマウイルス、ＪＣウイルス、サイトメガロウイルス、アデノウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、水痘・帯状疱疹ウイルス、パルボウイルス、ＥＢウイルス、Ｍ１３ファージ、Ｔ２ファージ、Ｔ４ファージ、Ｔ５ファージ、Ｔ６ファージ、Ｔ７ファージ等が挙げられる。
【００１８】
単細胞生物としては、原核単細胞生物でも真核単細胞生物でも構わない。１細胞で１活性を有するものであると、活性測定がより正確となる。
単細胞生物としては、細菌、原虫、藻類、繊毛虫、鞭毛虫、胞子、等が挙げられる。好ましくは細菌、原虫である。
病原性があるものも無いものも活性測定可能であるが、公衆衛生上の観点から病原性を有する単細胞生物の活性測定が、培養せずとも可能であることは有用である。
【００１９】
細菌としては、例えば、大腸菌、レジオネラ菌、赤痢菌、コレラ菌、カンピロバクター、エルシニア菌、チフス菌、ジフテリア菌、連鎖球菌、炭疽菌、破傷風菌、ブルセラ属菌、緑膿菌、サルモネラ菌、ペスト菌、結核菌、腸炎ビブリオ、リステリア菌、ブドウ球菌、ボツリヌス菌、セレウス菌、ウェルシュ菌、ペスト菌、マイコプラズマ等が挙げられる。
【００２０】
原虫としては例えば、クリプトスポリジウム、ジアルジア、アメーバ、マラリア、トキソプラズマ、サイクロスポラ、ミクロスポリディア、イソスポラ、ネグレリア、バウムチア、リーシュマニア、トリパノソーマ、トリコモナス、バベシア、ランブル鞭毛虫、バランチジウム、ゾウリムシ等が挙げられる。
【００２１】
＜標的核酸＞
ＤＮＡウイルスまたは単細胞生物が保有する標的核酸を、定量ＰＣＲするために用意する。具体的には、ウイルス殻や細胞壁といった外殻の一部または全部を破壊すればよい。標的核酸は抽出して単離しても良いし、外殻から開放された状態のまま使用しても構わない。
外殻の破壊方法は公知慣用の方法を用いればよい。浸透圧法、酵素処理法、界面活性剤処理法、凍結融解法、超音波処理、磨砕処理等の方法を用いることが出来る。市販のＤＮＡ抽出キットを用いても構わない。
標的核酸は、ゲノムＤＮＡであっても、プラスミドＤＮＡであっても、細胞小器官ＤＮＡであってもよい。１細胞１コピーである場合、活性測定がより正確である為、ゲノムＤＮＡであることが好ましい。
【００２２】
＜エンドヌクレアーゼ処理＞
本発明は、１５００−２８００ｂｐという長い増幅範囲のＰＣＲを行うことで、ＤＮＡのエラーの有無を測定するものである。このとき、鋳型となる標的核酸はそのまま用いても良いが、エンドヌクレアーゼ処理をすることで、ＤＮＡが負ったエラーを明確化し、定量ＰＣＲの結果をより正確に測定できる為、併用することが好ましい。
エンドヌクレアーゼとしては、例えば、Ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ  ＩＩＩ、Ｔｍａ  Ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ  ＩＩＩ、Ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ  ＶＩＩＩ、Ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ  ＩＶ、Ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ  Ｖ、Ｔ４ＰＤＧ、Ｓ１  Ｎｕｃｌｅａｓｅを用いることが出来る。
【００２３】
２）標的核酸を鋳型としたＰＣＲによる増幅産物が１５００−２８００ｂｐの長さとなるプライマーを用意する工程
定量ＰＣＲを行う為のプライマーは、標的核酸を鋳型とするように設計する。このとき、ＰＣＲによる増幅産物が１５００−２８００ｂｐとなるように調整することが本発明の特徴である。増幅産物が１５００ｂｐ未満であると、ＤＮＡエラーがあり活性を有さないＤＮＡであっても、ＰＣＲで増幅してしまう可能性がある。２８００ｂｐより大きい場合、ＰＣＲ自体のエラーが多くなり増幅産物がうまく得られない場合がある。
増幅産物としては、好ましくは１５００−２５００ｂｐであり、特に好ましくは１７００−２２００ｂｐである。
定量ＰＣＲ用のプライマーは、フォワードとリバースのセットで設計する。このとき、標的核酸中で増幅エラーが起きないよう、配列特異性のあるプライマーとするのが好ましい。
【００２４】
３）標的核酸とプライマーを用いて定量ＰＣＲを行う工程
得られた標的核酸とプライマーとを用いて定量ＰＣＲを行う。定量ＰＣＲとしては、公知慣用の方法を用いればよく、アガロースゲル電気泳動法、インターカレーター法、蛍光プローブ法等が挙げられる。正確性から、標的範囲にアニールするプローブを併用する蛍光プローブ法が好ましい。インターカレーター法や蛍光プローブ法であれば、リアルタイム定量ＰＣＲを行うことが出来るので、スピーディーな測定が可能であることから好ましい。
【００２５】
得られた増幅産物量は、標準品からの検量線で求めることが出来る。標準品は、配列が相同するＤＮＡ断片であっても良いし、異なる配列であっても構わない。増幅産物とほぼ同じ長さの標準品について、濃度を振ったサンプルの蛍光濃度を測定することで、検量線を描くことができる。
【００２６】
ＰＣＲの条件としては、公知慣用の方法を用いればよい。例えばＤＮＡウイルスの標的核酸を増幅する場合の一例として、Ｈｏｌｄｉｎｇ  Ｓｔａｇｅは９５℃  ｘ  ３ｍｉｎ、Ｃｙｃｌｉｎｇ  Ｓｔａｇｅは９５℃  ｘ  ３ｓｅｃ、６５−６６℃  ｘ  ９０ｓｅｃを４０サイクルという条件が挙げられる。
【００２７】
４）定量ＰＣＲの結果をＤＮＡウイルスまたは単細胞生物の活性能に変換する工程
本方法に依ると、定量ＰＣＲの結果はＤＮＡウイルスまたは単細胞生物の活性能として扱うことが出来る。
具体的には、定量ＰＣＲの結果を以下の式で活性能とすることが出来る。
サンプル１ｍｌ当たりの活性能（Ｕ／ｍｌ）＝（サンプル中のＤＮＡコピー数）／（サンプルｍｌ数）
サンプル中のＤＮＡコピー数は、増幅範囲とほぼ同等のｂｐ数を有する標準品を鋳型として定量ＰＣＲを行い、検量線を作製し参照することで求めることが出来る。
【００２８】
本発明の活性測定方法は、定量ＰＣＲの結果をそのままＤＮＡウイルスまたは単細胞生物の活性能に変換することが出来る。これは、１５００−２８００ｂｐという特定の長さを有する増幅範囲のＰＣＲを行うことで、損傷のないＤＮＡを正確に測定できるからである。
【００２９】
本方法での活性測定が正確であることは、定量ＰＣＲから得られるＤＮＡコピー数と、培養法等のバイオアッセイで得られる生菌数とが相関することで証明が出来る。
例えば、紫外線（ＵＶ）照射前後での活性低下を、定量ＰＣＲと培養法で比較すればよい。
【００３０】
＜活性エネルギー線照射装置の殺菌力測定方法＞
本発明は、１）活性エネルギー線照射装置を用いて、ＤＮＡに活性エネルギー線照射処理し、処理ＤＮＡを得る工程と、２）得られた処理ＤＮＡに対し、ＰＣＲによる増幅範囲が１５００−２８００ｂｐの長さとなるプライマーを用意する工程と、３）処理ＤＮＡとプライマーを用いて定量ＰＣＲを行う工程と、４）定量ＰＣＲの結果を活性エネルギー線による殺菌力に変換する工程とを有することを特徴とする、活性エネルギー線照射装置の殺菌力測定方法も提供するものである。
本方法により、活性エネルギー線照射装置の殺菌力を測定することが出来る。ここでいう殺菌力とは、活性エネルギー線照射によりＤＮＡに損傷を与える能力のことを言う。
【００３１】
１）活性エネルギー線照射装置を用いて、ＤＮＡに活性エネルギー線照射処理し、処理ＤＮＡを得る工程
本工程では、殺菌力を測定したい活性エネルギー線照射装置を用いて、ＤＮＡに活性エネルギー線を照射し、処理ＤＮＡを得る。
活性エネルギー線としては、ＤＮＡに損傷を与えるエネルギー線であれば良く、放射線（エックス線、ガンマ線、電子線等）、紫外線、赤外線等が挙げられる。産業上良く使用されているのは紫外線である。
【００３２】
本測定方法では、ＤＮＡを用意し活性エネルギー線を照射した処理ＤＮＡを得る。
ＤＮＡとしては特に限定は無く、生物やウイルスから抽出して得られるＤＮＡを用いてもよいし、ＰＣＲ増幅産物を用いてもよいし、合成ＤＮＡを用いてもよい。環境への影響から、好ましくは、病原性のないＤＮＡ断片である。
処理前ＤＮＡのｂｐ数としては、その後のＰＣＲの増幅範囲以上であれば良いが、電気泳動を行う場合には、鋳型と増幅産物のコンタミネーションが起きないよう、ＤＮＡ増幅範囲よりも１．５倍程度以上鎖長が長いほうが好ましい。
【００３３】
ＤＮＡに対し活性エネルギー線照射処理を行うのにあたって、特に方法に限定は無い。開放シャーレ等を用いるオープン環境で活性エネルギー線を照射するか、活性エネルギー線を透過できる材質の容器やライン中にＤＮＡを入れ、活性エネルギー線を照射すればよい。例えばシャーレ、マイクロチューブ、試験管、バッグ等の容器に入っているＤＮＡに活性エネルギー線を照射しても良いし、管にＤＮＡ液を通液したラインに対し活性エネルギー線を照射しても構わない。
活性エネルギー線を照射する場合、線量と照射時間については適宜調整すればよい。
【００３４】
２）得られた処理ＤＮＡに対し、ＰＣＲによる増幅範囲が１５００−２８００ｂｐの長さとなるプライマーを用意する工程
３）処理ＤＮＡとプライマーを用いて定量ＰＣＲを行う工程
本２）３）の工程については、ＤＮＡウイルスまたは単細胞生物の活性測定方法の２）３）工程と同様に行うことができる。
【００３５】
４）定量ＰＣＲの結果を活性エネルギー線による殺菌力に変換する工程
本工程では、定量ＰＣＲで得られた結果を元に、活性エネルギー線による殺菌力を計算する。
定量ＰＣＲの結果から、照射により傷がついていないＤＮＡ数を導き出すことができる。殺菌力を示したい場合、活性エネルギー線照射前後でコピー数の比を表すことで、殺菌力とすることができる。
殺菌力（％）＝［１−（活性エネルギー線照射後のＤＮＡコピー数  ／  活性エネルギー線照射前のＤＮＡコピー数）］＊１００
【００３６】
本発明の殺菌力測定方法は、定量ＰＣＲの結果をそのまま活性エネルギー線照射装置の殺菌能に変換することが出来る。これは、１５００−２８００ｂｐという特定の長さを有する増幅範囲のＰＣＲを行うことで、損傷のないＤＮＡ、すなわち殺菌できなかったＤＮＡを正確に測定できるからである。
【００３７】
本方法での活性測定が正確であることは、処理前ＤＮＡとして生菌を用いた上で本法を行い、定量ＰＣＲから得られるＤＮＡコピー数と、培養法等のバイオアッセイで得られる生菌数とが相関することで証明が出来る。
例えば、紫外線（ＵＶ）照射前後での活性低下を、定量ＰＣＲと培養法で比較すればよい。
【００３８】
＜定量ＰＣＲ＞
前記活性測定方法およびまたは殺菌力測定方法において、このように正確な結果を得る為には、定量ＰＣＲの増幅範囲が１５００−２８００ｂｐである必要がある。ＰＣＲの増幅範囲が１５００ｂｐより小さい場合、本方法での残活性能がバイオアッセイの結果よりも高くなるため使用できず、２８００ｂｐより大きい場合は、本方法での残活性能がバイオアッセイの結果よりも低くなるため使用できないからである。
増幅産物としては、好ましくは１５００−２５００ｂｐであり、特に好ましくは１７００−２２００ｂｐである。
【００３９】
このように、本発明の測定方法は、定量ＰＣＲを用いることで簡単かつスピーディーにＤＮＡウイルスまたは単細胞生物の活性を測定することが出来る。本方法を利用することで、水や土壌、食品や生体由来物質等から、目的のＤＮＡウイルスまたは単細胞生物量を簡便に測定することが出来るため、産業上非常に有用である。
また、本発明の殺菌力測定方法は、定量ＰＣＲを用いることで簡単かつスピーディに活性エネルギー線照射装置の殺菌力を測定することができる。
特に、顕微鏡等を用いた形態観察では活性が判別できない、活性エネルギー線照射後の残活性量を測定することに適している。
【実施例】
【００４０】
以下、本発明を実施例にて詳細に説明するが、本発明は実施例に限定されるものではない。【００４１】
＜定量ＰＣＲ条件＞
定量ＰＣＲについては以下の条件にて行った。【００４２】
・ＰＣＲ装置  Ｓｔｅｐ  Ｏｎｅ  Ｐｌｕｓ  Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ（ライフテクノロジーズジャパン製）
・ＰＣＲキット  ＴａｑＭａｎ  Ｆａｓｔ  Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（ライフテクノロジーズジャパン製）【００４３】
・ＰＣＲ条件
Ｈｏｌｄｉｎｇ  Ｓｔａｇｅ  ９５℃  ｘ  ３ｍｉｎ
Ｃｙｃｌｉｎｇ  Ｓｔａｇｅ（４０サイクル）  
（１００ｂｐ）  ９５℃ｘ３ｓｅｃ、６０℃ｘ２０ｓｅｃ
（２０００ｂｐ）  ９５℃ｘ３ｓｅｃ、６５℃ｘ９０ｓｅｃ
（＞２０００ｂｐ）  ９５℃ｘ３ｓｅｃ、６５℃ｘ１２０ｓｅｃ【００４４】
＜紫外線照射条件＞
・紫外線光源  ：  ＬＥＤ（３０−５０ｍＷ；  ＵＶＭＡＸ２６０−ＦＷ−５０，  Ｓｅｎｓｏｒ  Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｃ．）
・ウイルスサンプル  ：  １ｘ１０１０ｃｏｐｉｅｓ／ｍＬ（ＴＥ緩衝液、ｐＨ８．０）【００４５】
＜ＤＮＡ抽出及び酵素処理＞
・ＤＮＡ抽出キット  ：  ＱＩＡＧＥＮ  ＭｉｎＥｌｕｔｅ  Ｖｉｒｕｓ  Ｓｐｉｎキット（株式会社キアゲン製）
・酵素  ：  エンドヌクレアーゼ  Ｔ４ＰＤＧ（ＮＥＷ  ＥＮＧＬＡＮＤ  ＢｉｏＬａｂｓ  Ｉｎｃ．  Ｎｏ．Ｍ０３０８Ｓ）
・酵素処理条件  ：  Ｔ４ＰＤＧの力価が４０Ｕ／１ｇ  ＤＮＡとなるように、１０×Ｔ４ＰＤＧ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｂｕｆｆｅｒ、ＢＳＡ（最終濃度０．１ｍｇ／ｍＬ）、Ｎｕｃｌｅａｓｅ  ｆｒｅｅ  ｗａｔｅｒで調製した。酵素反応は３７℃で２時間行った。【００４６】
＜培養法（プラークアッセイ）＞
プラークアッセイ（スポットアッセイ）は次のようにして行った。約９ｍＬのソフトアガーを大腸菌培養液３００μＬと混合し、平板上に注ぎ、乾燥させた。次に試料であるファージ懸濁液各１μＬを平板上にスポットし、３７℃で一晩インキュベートしてスポットを観察した。ファージに感染性があれば、スポットの周りにプラークが観察される。【００４７】
＜ＤＮＡウイルスの活性測定方法＞
（参考例１〜５）  定量ＰＣＲ用の検量線作成及びＰＣＲ正確性の確認
鋳型としてラムダファージを用いて、定量ＰＣＲの検量線を作成した。
用いたプライマーは以下のとおりである。【００４８】
・ウイルス  ：  ラムダファージ（Ｇｅｌｍａｎ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，  Ｎｏ．４４９９）【００４９】
・ＰＣＲプライマー
増幅範囲：１００ｂｐ
Ｆｏｒｗａｒｄ  Ｐｒｉｍｅｒ    ＴＡＡＣＡＣＧＣＴＣＡＣＣＡＴＧＡＡＧＣ（配列番号１）
Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｐｒｉｍｅｒ    ＧＣＣＡＣＡＴＣＣＡＣＣＧＡＣＴＴＴＴ（配列番号２）
蛍光Ｐｒｏｂｅ  ＦＡＭ−ＡＣＴＡＡＴＧＧＧＣＧＴＧＧＣＴ−ＭＧＢ（配列番号３）【００５０】
増幅範囲：２０００ｂｐ
Ｆｏｒｗａｒｄ  Ｐｒｉｍｅｒ    ＴＡＡＣＡＣＧＣＴＣＡＣＣＡＴＧＡＡＧＣ（配列番号４）
Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｐｒｉｍｅｒ    ＧＣＣＡＣＡＴＣＣＡＣＣＧＡＣＴＴＴＴ（配列番号５）
蛍光Ｐｒｏｂｅ  ＦＡＭ−ＣＣＧＴＣＴＡＣＧＧＡＡＡＧＣ−ＭＧＢ（配列番号６）【００５１】
増幅範囲：２５００ｂｐ
Ｆｏｒｗａｒｄ  Ｐｒｉｍｅｒ    ＴＡＡＣＡＣＧＣＴＣＡＣＣＡＴＧＡＡＧＣ（配列番号７）
Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｐｒｉｍｅｒ    ＣＡＴＡＣＡＴＣＧＣＣＴＴＣＡＣＡＡＴＧＧ（配列番号８）
蛍光Ｐｒｏｂｅ  ＦＡＭ−ＡＴＣＴＧＡＣＣＧＡＡＧＣＧＣＡ−ＭＧＢ（配列番号９）【００５２】
増幅範囲：３０００ｂｐ
Ｆｏｒｗａｒｄ  Ｐｒｉｍｅｒ    ＴＡＡＣＡＣＧＣＴＣＡＣＣＡＴＧＡＡＧＣ（配列番号１０）
Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｐｒｉｍｅｒ    ＧＡＧＣＣＴＡＴＣＣＡＧＴＣＧＣＡＧＴＴＣ（配列番号１１）
蛍光Ｐｒｏｂｅ  ＦＡＭ−ＡＣＡＧＧＡＡＧＡＡＣＴＴＧＣＣＧ−ＭＧＢ（配列番号１２）【００５３】
増幅範囲：３５００ｂｐ
Ｆｏｒｗａｒｄ  Ｐｒｉｍｅｒ    ＴＡＡＣＡＣＧＣＴＣＡＣＣＡＴＧＡＡＧＣ（配列番号１３）
Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｐｒｉｍｅｒ    ＧＡＴＧＣＣＧＴＴＣＡＴＧＡＣＣＴＧＡＴ（配列番号１４）
蛍光Ｐｒｏｂｅ  ＦＡＭ−ＡＡＴＡＴＧＣＣＧＧＴＴＡＴＣＡＣＧ−ＭＧＢ（配列番号１５）【００５４】
各プライマー、プローブで得られたＤＮＡ濃度とＴｈｒｅｓｈｏｌｄ  Ｃｙｃｌｅ（ＣＴ）との関係、すなわち検量線を図１に示す。ＣＴ＝３０の場合のＤＮＡ数を検量線から求めると、表１の通りとなった。増幅範囲が１００ｂｐのときを１とすると、２５００ｂｐでは３．３であるのに対し、３０００ｂｐでは１３．３、３５００ｂｐでは１１．３と１０倍以上の値となった。これは、増幅範囲が２５００ｂｐ以下では検出するためのＤＮＡ量が３倍以内であるのに対し、増幅範囲が３０００ｂｐを超えると、検出するためのＤＮＡが１００ｂｐの１０倍以上必要であることを示している。【００５５】
【表１】
2019124306.tif 000003
【００５６】
活性能測定および培養法との比較
（参考例６・実施例１〜４・比較例１及び２）  ラムダファージ
ＤＮＡ源として、ラムダファージ（Ｇｅｌｍａｎ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，  Ｎｏ．４４９９）を使用して、紫外線を照射し（４０ｍＪ／ｃｍ２）、紫外線照射ファージを得た。
得られた紫外線照射ファージから処理ＤＮＡ抽出し、当該処理ＤＮＡを鋳型として用いて、定量ＰＣＲをインターカレート法にて行い、活性測定を行った。また、処理ＤＮＡに対し、さらに前述の方法にて、エンドヌクレアーゼによる酵素処理を行ったサンプルを調製した。
また、培養法（プラークアッセイ）での活性測定を行い、本発明の活性測定方法と比較した。【００５７】
・ウイルス  ：  ラムダファージ（Ｇｅｌｍａｎ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，  Ｎｏ．４４９９）
・紫外線照射量  ：  ４０ｍＪ／ｃｍ２【００５８】
用いたプライマーは以下のとおりである。
増幅範囲：１００ｂｐ
Ｆｏｒｗａｒｄ  Ｐｒｉｍｅｒ    ＴＡＡＣＡＣＧＣＴＣＡＣＣＡＴＧＡＡＧＣ（配列番号１６）
Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｐｒｉｍｅｒ    ＧＣＣＡＣＡＴＣＣＡＣＣＧＡＣＴＴＴＴ（配列番号１７）【００５９】
増幅範囲：１６００ｂｐ
Ｆｏｒｗａｒｄ  Ｐｒｉｍｅｒ    ＴＡＡＣＡＣＧＣＴＣＡＣＣＡＴＧＡＡＧＣ（配列番号１８）
Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｐｒｉｍｅｒ    ＣＧＴＡＡＡＣＴＣＣＡＣＣＣＴＴＣＧＴＣ（配列番号１９）【００６０】
増幅範囲：２０００ｂｐ
Ｆｏｒｗａｒｄ  Ｐｒｉｍｅｒ    ＴＡＡＣＡＣＧＣＴＣＡＣＣＡＴＧＡＡＧＣ（配列番号２０）
Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｐｒｉｍｅｒ    ＡＧＣＴＴＧＧＧＣＧＡＴＧＡＣＴＧＡＧ（配列番号２１）【００６１】
増幅範囲：２５００ｂｐ
Ｆｏｒｗａｒｄ  Ｐｒｉｍｅｒ    ＴＡＡＣＡＣＧＣＴＣＡＣＣＡＴＧＡＡＧＣ（配列番号２２）
Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｐｒｉｍｅｒ    ＣＡＴＡＣＡＴＣＧＣＣＴＴＣＡＣＡＡＴＧＧ（配列番号２３）【００６２】
プラークアッセイ（スポットアッセイ）は次のようにして行った。約９ｍＬのソフトアガーを大腸菌培養液３００μＬと混合し、平板上に注ぎ、乾燥させた。次に試料であるファージ懸濁液の希釈系列を調製し、各１μＬを平板上にスポットし、３７℃で一晩インキュベートしてスポットを観察した。ファージに感染性があれば、スポットの周りにプラークが観察される。【００６３】
ラムダファージにおける定量ＰＣＲ及びプラークアッセイの結果を以下表２−１に示す。
紫外線（ＵＶ）照射後の残活性能については、以下の式で求めた。
ｑＰＣＲによる残活性能［％］  ＝  ＵＶ照射後のＤＮＡコピー数  ／  ＵＶ照射前のＤＮＡコピー数＊１００
プラーク法による残活性能［％］  ＝  ＵＶ照射後のＤＮＡプラーク数  ／  ＵＶ照射前のＤＮＡプラーク数＊１００
【００６４】
【表２】
2019124306.tif 000004
【００６５】
増幅範囲が１００ｂｐの場合は、酵素処理してもプラークアッセイ／ｑＰＣＲ比は変化しないが、増幅範囲を長くした１６００ｂｐではｑＰＣＲのみよりも酵素処理を組合せた方がプラークアッセイ／ｑＰＣＲ比は１に近くなることがわかった。【００６６】
（参考例７および８・実施例５および６）  Ｔ５およびＭ１３
参考例６および実施例４において、ラムダファージに代えて、Ｔ５ファージ（Ｇｅｌｍａｎ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，  Ｎｏ．１６３５３）およびＭ１３ファージ（Ｔａｋａｒａ  ３１１８）でも同様の試験を行い、結果を表２−２に示す。なお、紫外線照射量は１０ｍＪ／ｃｍ２とした。定量ＰＣＲでの増幅範囲は２０００ｂｐのみとした。使用したプライマーを以下に示す。【００６７】
Ｔ５ファージ用プライマー
増幅範囲：２０００ｂｐ
Ｆｏｒｗａｒｄ  Ｐｒｉｍｅｒ    ＴＡＡＣＴＧＣＣＣＡＡＡＡＴＧＣＴＴＣＣ（配列番号２４）
Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｐｒｉｍｅｒ    ＡＡＴＴＣＴＧＧＡＧＣＡＡＴＣＣＡＴＣＧ（配列番号２５）【００６８】
Ｍ１３ファージ用プライマー
増幅範囲：２０００ｂｐ
Ｆｏｒｗａｒｄ  Ｐｒｉｍｅｒ    ＧＣＧＴＴＧＧＣＣＧＡＴＴＣＡＴＴＡＡ（配列番号２６）
Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｐｒｉｍｅｒ    ＴＣＡＣＴＧＣＣＣＧＣＴＴＴＣＣＡ（配列番号２７）【００６９】
【表３】
2019124306.tif 000005
【００７０】
（参考例９−１２）  遺伝子損傷と測定の正確性の確認
・ｐＢＲ３２２  ＤＮＡの酵素処理（分解）
ｐＢＲ３２２  ＤＮＡ（ＮＥＷ  ＥＮＧＬＡＮＤ  ＢｉｏＬａｂｓ）を５μｇ、制限酵素Ｈｉｎｆ  I（タカラバイオ製）５０  ｕｎｉｔｓ、制限酵素に添付されている１０  ｘ  Ｈ  Ｂｕｆｆｅｒを１０μＬ測りとり、水で全量が１００μＬとなるよう調製し、３７℃で３時間インキュベートした。【００７１】
・酵素処理後のｐＢＲ３２２  ＤＮＡの精製
インキュベート後、ＴＥ緩衝液（ｐＨ  ８．０）で反応液中のＤＮＡ量を２  ｘ  １０９  ｃｏｐｉｅｓ／μＬに調整し、Ａｇｅｎｃｏｕｒｔ  ＡＭＰｕｒｅ  ＸＰ（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ）と磁気プレートを用い、Ａｇｅｎｃｏｕｒｔ  ＡＭＰｕｒｅ  ＸＰに添付の取扱い説明書記載の方法に準じて、ＤＮＡの精製を行った。【００７２】
（定量ＰＣＲによる測定）
制限酵素で処理したｐＢＲ３２２  ＤＮＡと、制限酵素で処理していないｐＢＲ３２２  ＤＮＡを任意の割合で混合して、定量ＰＣＲを行った。
この時、増幅範囲には、制限酵素Ｈｉｎｆ  I の認識部位が含まれていることから、制限酵素で処理したｐＢＲ３２２のＤＮＡを鋳型とする場合には、理論上定量ＰＣＲでは検出されない。よって、定量ＰＣＲが正確に行われるのであれば、制限酵素で処理したＤＮＡと処理しないＤＮＡをある一定の濃度で混合した場合、定量ＰＣＲの結果は、理論上の混合比と同等となるはずである。
ただし、定量ＰＣＲの増幅部位が長すぎる、あるいは短すぎる場合には、定量ＰＣＲの検出精度が悪くなることから、理論値とのずれが生じてしまう。【００７３】
酵素処理ＤＮＡと未処理ＤＮＡの混合割合と定量ＰＣＲによる測定値、および理論値を表３に示す。【００７４】
増幅範囲：２５００ｂｐ
Ｆｏｒｗａｒｄ  Ｐｒｉｍｅｒ    ＧＣＴＡＣＴＴＧＧＡＧＣＣＡＣＴＡＴＣＧＡＣＴＡ（配列番号２８）
Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｐｒｉｍｅｒ    ＣＴＣＴＧＣＴＡＡＴＣＣＴＧＴＴＡＣＣＡＧＴＧＧ（配列番号２９）
蛍光Ｐｒｏｂｅ    ＦＡＭ−ＴＣＣＴＧＴＣＧＴＴＧＡＧＧＡＣＣ−ＭＧＢ（配列番号３０）【００７５】
【表４】
2019124306.tif 000006
【００７６】
表３から明らかなとおり、本発明の測定方法を用いると、定量ＰＣＲの結果は、制限酵素で処理したＤＮＡと処理しないＤＮＡの理論上の混合比と同等となり、定量ＰＣＲの結果が正確であることが確かめられた。
【産業上の利用可能性】
【００７７】
本発明の活性測定方法や殺菌力測定方法は、ウイルスや単細胞生物の培養を待たずとも、ＤＮＡウイルスまたは単細胞生物の活性や活性エネルギー線照射装置の殺菌力を測定することが可能である。
【図１】
2019124306.tif 000007
【配列表】
2019124306000001.app
【国際調査報告】
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