(57)【要約】  本発明は、HuNoVの複数の型の感染を抑制する抗体を作製するための抗原、その使用およびHuNoVの複数の型の感染を抑制する抗体の提供を解決課題とする。具体的には、本発明は、複数の異なる遺伝子型のヒトノロウイルス（HuNoV）の腸管上皮細胞への感染を阻害する抗体を作製する方法であって、GII.17 HuNoVのVP1タンパク質の全長またはその一部を抗原として免疫することを含む、抗体の作製方法、ならびに、複数の異なる遺伝子型のHuNoVの腸管上皮細胞への感染を阻害する抗体である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
複数の異なる遺伝子型のヒトノロウイルス（HuNoV）の腸管上皮細胞への感染を阻害する抗体を作製する方法であって、GII.17 HuNoVのVP1タンパク質の全長またはその一部を抗原として免疫することを含む、抗体の作製方法。
【請求項２】
前記GII.17 HuNoVのVP1タンパク質の全長が配列番号３で表されるアミノ酸配列からなることを特徴とする請求項１に記載の抗体の作製方法。
【請求項３】
前記複数の異なる遺伝子型が、GII.4およびGII.17であることを特徴とする、請求項１または２に記載の抗体の作製方法。
【請求項４】
GII.17 HuNoVのVP1タンパク質に結合する抗体であって、複数の異なる遺伝子型のHuNoVの腸管上皮細胞への感染を阻害する抗体またはその機能的断片。
【請求項５】
前記GII.17 HuNoVのVP1タンパク質の全長が配列番号３で表されるアミノ酸配列からなることを特徴とする請求項４に記載の抗体またはその機能的断片。
【請求項６】
前記複数の異なる遺伝子型が、GII.4およびGII.17であることを特徴とする、請求項４または５に記載の抗体またはその機能的断片。
【請求項７】
請求項４ないし６のいずれかに記載の抗体またはその機能的断片を含有する、医薬組成物。
【請求項８】
GII.17 HuNoVのVP1タンパク質の全長またはその一部を抗原として含み、複数の異なる遺伝子型のHuNoVの感染を抑制するためのワクチン。
【請求項９】
前記GII.17 HuNoVのVP1タンパク質の全長が配列番号３で表されるアミノ酸配列からなることを特徴とする請求項８に記載のワクチン。
【請求項１０】
前記複数の異なる遺伝子型が、GII.4およびGII.17であることを特徴とする、請求項８または９に記載のワクチン。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒトノロウイルス様粒子およびその使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒトノロウイルス（human norovirus：HuNoV）は、十二指腸から小腸上部の細胞に侵入し、非細菌性急性胃腸炎を引き起こす病原性ウイルスで、エンベロープを持たないカリシウイルス科に属する。
HuNoVのゲノムは、約7.7kbの一本鎖プラスセンスRNAである。VPgと呼ばれるウイルスタンパク質がゲノムの5’末端に共有結合しており、3'末端はポリアデニル化されている。ゲノムには、ORF1、VP1およびVP2の3つのタンパク質のコード領域が存在しており、各々、非構造タンパク質、構造タンパク質１および構造タンパク質２をコードしている。構造学的解析から、HuNoVは（180分子による）90個のVP1ダイマーによって切頂二十面体の構造を構築していることが明らかとなっている。各VP1モノマーは、shellドメイン（Sドメイン）とprotrudingドメイン（Pドメイン）の２つのドメインに分けられ、このうちPドメインは、さらにP1およびP2のサブドメインに分けられる。P2は、感染の際のレセプターおよび宿主感染性因子として機能する血液型抗原を認識する。P2サブドメインにおける突然変異によって、血液型抗原との結合に変化が生じる（非特許文献１）。【０００３】
HuNoVは、ゲノム配列に基づいて3つの遺伝子群（GI、GIIおよびGIV）に分類され、少なくとも25種の遺伝子型が存在するとされている。高い多様性を示すノロウイルスであるが、ここ数年では、GII、特に遺伝子型4（GII.4）などの少数の系統のみが感染流行の原因となっている（非特許文献１）。
HuNoV感染症は、米国では毎年約2,000万人が感染、約7万人が入院しており、日本には明確なデータはないが1〜2万人程度の入院患者と700万人以上の感染者が毎年発生していると推測される。HuNoV感染症の大半は軽快するが、小児と老人では死亡例も見られる等、重症化するとともに、幼稚園、老人ホーム等の施設でアウトブレイク化するケースが多く、通院患者・入院患者数は相当規模に達し、社会保険システムに対する負担は大きい。【０００４】
これまでに、GII.4 ウイルス様粒子（virus like particle：VLP）を含むいくつかのHuNoVワクチン候補が開発され、前臨床試験および臨床試験に進んでいる。VLPは感染能力のある生きたウイルスとほぼ同じ外殻構造と抗原性を有するため、良好なワクチン抗原候補と考えられている（非特許文献２）。GII.4はHuNoVの流行における主たる遺伝子型であるが、最近、他の遺伝子型、特に、GII.2、GII.3、GII.6およびGII.17がより影響力を増している（非特許文献３〜６）。従って、いくつかの遺伝子型のウイルス感染を阻害する交差反応性抗体などのウイルス治療薬の開発が求められている。
しかしながら、現在のところ、複数の遺伝子型のウイルス感染を阻害するような抗体やそれを誘導しうる単独のワクチン抗原は存在しない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Glassら, N Engl J Med 361:1776-1785 2009
【非特許文献２】Cortes-Penfieldら, Clin Ther 39:1537-1549 2017
【非特許文献３】Aoら, J Infect Dis 218:133-143 2018
【非特許文献４】Boonchanら, Infect Genet Evol 60: 133-139 2018
【非特許文献５】Kumthipら, J Med Virol 90: 617-624 2018
【非特許文献６】Matsushimaら, Euro Surveill 2015; 20 issue 26 2015
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
上記事情に鑑み、本発明は、HuNoVの複数の型の感染を抑制する抗体を作製するための抗原、その使用およびHuNoVの複数の型の感染を抑制する抗体の提供を解決課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、GII.4 VLP、GII.3 VLP、およびGII.17 VLPに対する抗体を作製し、iPS細胞（iPSC）から誘導した腸管上皮細胞の系を用いて、HuNoVのいくつかの遺伝子型についてその感染（HuNoVの腸管上皮細胞への侵入および／または腸管上皮細胞内での複製）を阻害するかどうかを検討した。
その結果、GII.4のVP1タンパク質が自己凝集してできたVLPを抗原として作製した抗体は、GII.4の複製は抑制することができたが、それ以外の遺伝子型のHuNoVの複製は抑制しなかった。また、GII.3のVP1タンパク質が自己凝集してできたVLPを抗原として作製した抗体は、GII.3の複製は抑制することができたが、それ以外の遺伝子型のHuNoVの複製は抑制しなかった。
これらに対し、GII.17のVP1タンパク質が自己凝集してできたVLPを抗原として作製した抗体は、GII.17の複製を抑制するだけではなく、GII.4の複製も効果的に抑制することが分かった。
以上の知見に基づき、本発明は、複数の異なる遺伝子型（特に、GII.4 HuNoVおよびGII.17 HuNoV）のHuNoV感染を阻害する抗体を作製する目的に適した抗原および当該抗体を用いて作製される抗体等を提供するものである。【０００８】
より具体的には、本発明は以下の（１）〜（１０）である。
（１）複数の異なる遺伝子型のヒトノロウイルス（HuNoV）の腸管上皮細胞への感染を阻害する抗体を作製する方法であって、GII.17 HuNoVのVP1タンパク質の全長またはその一部を抗原として免疫することを含む、抗体の作製方法。
（２）前記GII.17 HuNoVのVP1タンパク質の全長が配列番号３で表されるアミノ酸配列からなることを特徴とする上記（１）に記載の抗体の作製方法。
（３）前記複数の異なる遺伝子型が、GII.4およびGII.17であることを特徴とする、上記（１）または（２）に記載の抗体の作製方法。
（４）GII.17 HuNoVのVP1タンパク質に結合する抗体であって、複数の異なる遺伝子型のHuNoVの腸管上皮細胞への感染を阻害する抗体またはその機能的断片。
（５）前記GII.17 HuNoVのVP1タンパク質の全長が配列番号３で表されるアミノ酸配列からなることを特徴とする上記（４）に記載の抗体またはその機能的断片。
（６）前記複数の異なる遺伝子型が、GII.4およびGII.17であることを特徴とする、上記（４）または（５）に記載の抗体またはその機能的断片。
（７）上記（４）ないし（６）のいずれかに記載の抗体またはその機能的断片を含有する、医薬組成物。
（８）GII.17 HuNoVのVP1タンパク質の全長またはその一部を抗原として含み、複数の異なる遺伝子型のHuNoVの感染を抑制するためのワクチン。
（９）前記GII.17 HuNoVのVP1タンパク質の全長が配列番号３で表されるアミノ酸配列からなることを特徴とする上記（８）に記載のワクチン。
（１０）前記複数の異なる遺伝子型が、GII.4およびGII.17であることを特徴とする、上記（８）または（９）に記載のワクチン。
【発明の効果】
【０００９】
本発明は、複数の異なる遺伝子型（例えば、GII.4およびGII.17）のHuNoVの複製を抑制する抗体を作製するための抗原を提供するものである。【００１０】
本発明は、上記抗原に対する抗体も提供する。当該抗体は、複数の異なる遺伝子型（例えば、GII.4およびGII.17）のHuNoVの感染を抑制することが可能で、HuNoV感染症の効果的な治療を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】抗GII.4 VLPポリクローナル抗体のHuNoV複製に対する影響。Aは抗GII.4 VLPポリクローナル抗体で前処理した後に培養したGII.4 HuNoV（17-231株）のゲノムコピー数を、Bは抗GII.4 VLPポリクローナル抗体で前処理し後に培養したGII.3、GII.17およびGII.6 HuNoVのゲノムコピー数を測定した結果である。感染後3時間（白抜き）および72時間（黒）の時点で測定した。コントロールIgGとして、免疫していないウサギ由来のIgGを用いた。各値は、3回の独立した実験の代表値で、平均値±標準偏差（SD）で示す。
【図２】抗GII.3 VLPポリクローナル抗体のHuNoV複製に対する影響。Aは抗GII.3 VLPポリクローナル抗体で前処理した後に培養したGII.3 HuNoVのゲノムコピー数を、Bは抗GII.3 VLPポリクローナル抗体で前処理し後に培養したGII.4（17B93株）、GII.17およびGII.6 HuNoVのゲノムコピー数を測定した結果である。感染後3時間（白抜き）および72時間（黒）の時点で測定した。コントロールIgGとして、免疫していないウサギ由来のIgGを用いた。各値は、3回の独立した実験の代表値で、平均値±標準偏差（SD）で示す。
【図３】抗GII.17 VLPポリクローナル抗体のHuNoV複製に対する影響。Aは抗GII.17 VLPポリクローナル抗体で前処理した後に培養したGII.17 HuNoVのゲノムコピー数を、Bは抗GII.17 VLPポリクローナル抗体で前処理し後に培養したGII.4（17-231株および17B93株）、GII.3およびGII.6 HuNoVのゲノムコピー数を測定した結果である。感染後3時間（白抜き）および72時間（黒）の時点で測定した。コントロールIgGとして、免疫していないウサギ由来のIgGを用いた。各値は、3回の独立した実験の代表値で、平均値±SDで示す。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本発明の第１の実施形態は、複数の異なる遺伝子型のHuNoVの腸管上皮細胞への感染を阻害する抗体を作製する方法であって、GII.17 HuNoVのVP1タンパク質の全長またはその一部を抗原として免疫することを含む、抗体作製方法である。
第１の実施形態にかかる抗体作製方法（以下「本発明の抗体作製方法」とも記載する）は、異なる遺伝子型のHuNoVに対して、交差反応性を示し、かつ、それらの感染を阻害（または抑制）する抗体の作製方法であり、抗原として、GII.17 HuNoVのVP1タンパク質の全長またはその一部を使用することを特徴とする。本発明の抗体作製方法で作製される抗体が、感染を阻害するHuNoVの遺伝子型は、好ましくは、GIIジェノグループに属する、GII.4およびGII.17である。
本発明の全ての実施形態において、抗原であるGII.17 HuNoVのVP1タンパク質は、その全長であっても、抗原性のある一部の領域であってもよく、全長のアミノ酸配列は、例えば、配列番号３で示されるタンパク質である。抗原性のある領域は、GII.17 HuNoVのVP1タンパク質の一部分を作製し、それを免疫原として用いた抗体の中和能力（HuNoVの複製を抑制する能力）を確認することで、容易に選択することができる。
【００１３】
また、本発明の全ての実施形態において、「GII.17 HuNoVのVP1タンパク質」とは、その全長が配列番号３で表されるアミノ酸配列を含むタンパク質の他、配列番号３で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含むタンパク質である。
ここで、「実質的に同一のアミノ酸配列を含むタンパク質」とは、配列番号３で表わされるアミノ酸配列と約60%以上、好ましくは約70%以上、より好ましくは約80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、最も好ましくは約99%のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ、当該タンパク質に対する抗体が、複数の異なる遺伝子型のHuNoV（例えば、GII.4およびGII.17）の腸管上皮細胞への感染を阻害する能力を有する、タンパク質である。
【００１４】
あるいは、配列番号３で表わされるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含むタンパク質とは、配列番号３で表わされるアミノ酸配列中の1または数個（好ましくは、1〜30個程度、より好ましくは1〜10個程度、さらに好ましくは1〜5個）のアミノ酸が欠失、置換、挿入若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、当該タンパク質に対する抗体が、複数の異なる遺伝子型のHuNoVの腸管上皮細胞への感染を阻害する能力を有する、タンパク質である。
【００１５】
GII.17 HuNoVのVP1タンパク質は、このタンパク質をコードする核酸（例えば、配列番号４など）をcDNAライブラリーなどから取得し、適当な発現用ベクターに組込み、該発現ベクターによって適当な宿主細胞を形質転換または形質移入し、これを適当な培地中で培養し、VP1タンパク質を発現させ、精製することで調製することができる。
【００１６】
VP1タンパク質発現用の宿主細胞としては、例えば、細菌細胞（例えば、Escherichia coli B strain, E. coli Kl2 strain, Corynebacterium ammoniagenes, C. glutamicum, Serratia liquefaciens, Streptomyces lividans, Pseudomonas putidaなど）; カビ（ 例えば Penicillium camembertii, Acremonium chrysogenumなど）、動物細胞、植物細胞、バキュロウイルス／昆虫細胞または酵母細胞（例えばSaccharomyces cerevisiae およびPichia pastorisなど）を使用し、これらの細胞内で発現させることができる。
【００１７】
VP1タンパク質を発現させるための発現用ベクターは、各種宿主細胞に適したベクターを用いることができる。発現用ベクターとしては、例えば、pBR322、pBR325、pUC118、pETなど（大腸菌宿主）、pEGF-C、pEGF-Nなど（動物細胞宿主）、pVL1392、pVL1393など（昆虫細胞宿主、バキュロウイルスベクター）、pG-1、Yep13またはpPICZなど（酵母細胞宿主）を使用することができる。これらの発現ベクターは、各々のベクターに適した、複製開始点、選択マーカーおよびプロモーターを有しており、必要に応じて、エンハンサー、転写集結配列（ターミネーター）、リボソーム結合部位およびポリアデニル化シグナル等を有していてもよい。さらに、発現ベクターには、発現したポリペプチドの精製を容易にするため、FLAGタグ、Hisタグ、HAタグおよびGSTタグなどを融合させて発現させるための塩基配列が挿入されていてもよい。
発現用ベクターの作製は、当業者に公知の手法により実施することができ、適宜、市販のキットなどを使用して行うこともできる。
【００１８】
発現させたVP1タンパク質を培養菌体または培養細胞から抽出する際には、培養後、公知の方法で菌体または培養細胞を集め、これを適当な緩衝液に懸濁し、超音波、リゾチームおよび／または凍結融解などによって菌体または細胞を破壊したのち、遠心分離や濾過により、可溶性抽出液を取得する。特に、培養細胞を宿主として用いる場合は、培養上清中に発現させたVP1タンパク質を、上清を回収する事により取得する方が望ましい。得られた抽出液または培養上清から、公知の分離・精製法を適切に組み合わせて目的のタンパク質を取得することができる。公知の分離、精製法としては、塩析や溶媒沈澱法などの溶解度を利用する方法、透析法、限外ろ過法、ゲルろ過法、SDS-PAGE等の主として分子量の差を利用する方法、イオン交換クロマトグラフィーなどの電荷の差を利用する方法、アフィニティークロマトグラフィーなどの特異的親和性を利用する方法（例えば、GSTタグと共にポリペプチドを発現させた場合にはグルタチオンを担体に結合させた樹脂を、Hisタグと共にポリペプチドを発現させた場合にはNi-NTA樹脂やCoベースの樹脂を、HAタグと共にポリペプチドを発現させた場合には抗HA抗体樹脂を、FLAGタグと共にポリペプチドを発現させた場合には、抗FLAG抗体結合樹脂などを使用する方法）、逆相高速液体クロマトグラフィーなどの疎水性の差を利用する方法または等電点電気泳動法などの等電点の差を利用する方法などが用いられる。
【００１９】
第１の実施形態で作製される抗体は、特に限定されず、例えば、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体またはナノ抗体などであってもよい。
第１の実施形態で作製される抗体がポリクローナル抗体の場合、例えば、免疫動物（限定はしないが、例えば、ウサギ、ヤギ、ヒツジ、ニワトリ、モルモット、マウス、ラットまたはブタなど）に対して、抗原およびアジュバントの混合物をインジェクトすることにより調製することができる。通常は、抗原および／またはアジュバントを免疫動物の皮下または腹腔内へ複数回インジェクトする。アジュバントとして、限定はしないが、例えば、完全フロイントおよびモノホスホリル脂質A合成−トレハロースジコリノミコレート（MPL-TMD）が含まれる。抗原の免疫後、VP1に対する抗体を含む血清を免疫動物から調製し、常法により（例えば、rProteinA-Sepharoseなどを用いる方法など）目的の抗体を精製することができる。
【００２０】
第１の実施形態で作製される抗体がモノクローナル抗体の場合、以下のようにして作製することができる。
なお、本明細書において、「モノクローナル」とは、実質的に均一な抗体の集団から得られた抗体の特性を示唆するものであって、抗体が特定の方法（例えば、ハイブリドーマ法など）により作製されることを意味するものではない。
モノクローナル抗体の作製方法としては、例えば、ハイブリドーマ法（Kohler and Milstein, Nature 256 495 1975）、または、組換え法（米国特許第4,816,567号）などを挙げることができる。また、本発明にかかるモノクローナル抗体は、ファージ抗体ライブラリーから単離してもよい（Clackson et al., Nature 352 624-628 1991；Marks et al., J.Mol.Biol. 222 581-597 1991）。より具体的に説明すると、ハイブリドーマ法を用いて調製する場合、その調製方法には、例えば、以下に示す４つの工程が含まれる：（i）GII.17 HuNoVのVP1タンパク質またはその一部を免疫動物に免疫する、（ii）モノクローナル抗体分泌性（または潜在的に分泌性）のリンパ球を回収する、（iii）リンパ球を不死化細胞に融合させる、（iv）所望のモノクローナル抗体を分泌する細胞を選択する。免疫動物としては、例えば、マウス、ラット、モルモット、ハムスターなどが選択可能である。免疫後、宿主動物から得られたリンパ球はハイブリドーマ細胞を樹立するために、ポリエチレングリコールなどの融合剤を用いて不死化細胞株と融合する。融合細胞としては、例えば、ラットもしくはマウスのミエローマ細胞株が使用される。細胞融合を行った後、融合しなかったリンパ球および不死化細胞株の成長または生存を阻害する1または複数の基質を含む適切な培地中で細胞を生育させる。通常の技術では、酵素のヒポキサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（HGPRTまたはHPRT）を欠く親細胞を使用する。この場合、ヒポキサンチン、アミノプテリンおよびチミジンがHGPRT欠損細胞の成長を阻害し、ハイブリドーマの成長を許容する培地（HAT培地）に添加される。このようにして得られたハイブリドーマから、所望の抗体を産生するハイブリドーマを選択し、選択したハイブリドーマが生育する培地から、常法に従い、目的のモノクローナル抗体を取得することができる。
このようにして調製したハイブリドーマをインビトロ培養し、あるいは、マウス、ラット、モルモット、ハムスターなどの腹水中でインビボ培養し、目的の抗体を培養上清、あるいは、腹水から調製することができる。
【００２１】
ナノ抗体とは、抗体重鎖の可変領域（variable domain of the heavy chain of heavy chain antibody；VHH）からなるポリペプチドのことである。通常ヒトなどの抗体は重鎖と軽鎖から構成されているが、ラマ、アルパカおよびラクダなどのラクダ科の動物では、重鎖のみからなる1本鎖抗体（重鎖抗体）を産生する。重鎖抗体は、通常の重鎖および軽鎖からなる抗体と同様に、標的抗原を認識し、抗原に結合することができる。重鎖抗体の可変領域は、抗原への結合親和性を有する最小単位であり、この可変領域断片は「ナノ抗体」と呼ばれている。ナノ抗体は、高耐熱性、消化耐性、常温安定性があり、遺伝子工学的手法により容易に大量に調製することが可能である。
ナノ抗体は、例えば、以下のようにして作製することができる。ラクダ科の動物に抗原を免疫し、採取した血清から目的の抗体の有無を検出し、所望の抗体価が検出された免疫動物の末梢血リンパ球由来のRNAからcDNAを作製する。得られたcDNAからVHHをコードするDNA断片を増幅して、これを、ファージミドに挿入して、VHHファージミドライブラリを調製する。作製したVHHファージミドライブラリから数回のスクリーニングを経て、所望のナノ抗体を作製することができる。
【００２２】
本発明の第２の実施形態は、GII.17 HuNoVのVP1タンパク質に結合する抗体であって、複数の異なる遺伝子型のHuNoVの腸管上皮細胞への感染を阻害する抗体（以下「本発明の抗体」とも記載する）またはその機能的断片である。
前述のとおり、本発明の抗体は、特に限定されず、例えば、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体またはナノ抗体であってもよい。さらに、本発明の抗体は、遺伝子組換え抗体であってもよい。遺伝子組換え抗体としては、特に限定はされないが、例えば、キメラ抗体（例えば、ヒト型化抗体およびヒト抗体）等が挙げられる。ここで、キメラ抗体とは、異なる動物種由来の可変領域と定常領域を連結した抗体、例えば、マウス由来抗体の可変領域をヒト由来の定常領域に連結した抗体であり、キメラを作製する場合、そのように連結した抗体が得られるよう、当業者に周知の遺伝子組換え技術によって容易に構築できる。
また、本発明の抗体が、感染を阻害するHuNoVの遺伝子型は、好ましくは、GII.4およびGII.17である。
【００２３】
本発明の抗体の機能的断片とは、本発明の抗体の一部分の領域であって、HuNoVのVPLに結合し、その腸管上皮細胞への感染または増殖を阻害する抗体断片を意味し、例えば、Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv（variable fragment of antibody）、一本鎖抗体（重鎖、軽鎖、重鎖可変領域、軽鎖可変領域およびナノ抗体等）、scFv（single chain Fv）、diabody（scFv二量体）、dsFv（disulfide-stabilized Fv）、ならびに、本発明の抗体のCDRを少なくとも一部に含むペプチド等が挙げられる。
【００２４】
Fabは、抗体分子をタンパク質分解酵素パパインで処理して得られる断片のうち、重鎖のＮ末端側約半分と軽鎖全体とがジスルフィド結合で結合した、抗原結合活性を有する抗体断片である。Fabの作製は、抗体分子をパパインで処理して断片を取得する他、例えば、FabをコードするDNAを挿入した適当な発現ベクターを構築し、これを適当な宿主細胞（例えば、CHO細胞などの哺乳類細胞、酵母細胞、昆虫細胞など）に導入後、細胞内でFabを発現させることで実施することができる。
【００２５】
F(ab’)2は、抗体分子をタンパク質分解酵素ペプシンで処理して得られる断片のうち、Fabがヒンジ領域のジスルフィド結合を介して結合されたものよりやや大きい、抗原結合活性を有する抗体断片である。F(ab’)2は、抗体分子ペプシンで処理して断片を取得する他、Fabをチオエーテル結合あるいはジスルフィド結合させて作製することも可能で、さらに、Fabと同様に遺伝子工学的手法によっても作製することができる。
【００２６】
Fab’は、上記F(ab’)2のヒンジ領域のジスルフィド結合を切断した、抗原結合活性を有する抗体断片である。Fab’も、Fab等と同様に遺伝子工学的な手法により作製することができる。
【００２７】
scFvは、１本の重鎖可変領域（VH）と１本の軽鎖可変領域（VL）とを適当なペプチドリンカーを用いて連結した、VH-リンカー-VLないしはVL-リンカー-VHポリペプチドであって、抗原結合活性を有する抗体断片である。scFvは、抗体の重鎖可変領域および軽鎖可変領域をコードするcDNAを取得し、遺伝子工学的手法により作製することができる。
【００２８】
diabodyは、scFvが二量体化した抗体断片で、2価の抗原結合活性を有する抗体断片である。2価の抗原結合活性は、同一抗原結合活性であっても、または、一方が異なる抗原結合活性であってもよい。diabodyは、抗体の重鎖可変領域および軽鎖可変領域をコードするcDNAを取得し、重鎖可変領域と軽鎖可変領域をペプチドリンカーで結合したscFvを発現するcDNAを構築して、遺伝子工学的手法により作製することができる。
【００２９】
dsFvは、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域中のそれぞれ１アミノ酸残基をシステイン残基に置換したポリペプチドを、該システイン残基間のジスルフィド結合を介して結合させたものをいう。システイン残基に置換するアミノ酸残基は、抗体の立体構造予測に基づいて選択することができる。dsFvは、抗体の重鎖可変領域および軽鎖可変領域をコードするcDNAを取得し、dsFvをコードするDNAを構築して遺伝子工学的手法により作製することができる。
【００３０】
CDRを含むペプチドは、重鎖または軽鎖のCDR（CDR1〜3）の少なくとも１領域以上を含むように構成される。複数のCDRを含むペプチドは、直接または適当なペプチドリンカーを介して結合させることができる。CDRを含むペプチドは、抗体の重鎖または軽鎖のCDRをコードするDNAを構築し、発現ベクターに挿入する。ベクターの種類としては特に限定はなく、その後に導入される宿主細胞の種類等によって適宜選択すればよい。これらを抗体として発現させるために適当な宿主細胞（例えば、CHO細胞などの哺乳類細胞、酵母細胞、昆虫細胞など）に導入し製造することができる。また、CDRを含むペプチドは、Fmoc法（フルオレニルメチルオキシカルボニル法）およびtBoc法（t-ブチルオキシカルボニル法）等の化学合成法によって製造することもできる。
【００３１】
本発明の第３の実施形態は、本発明の抗体またはその機能的断片を含む医薬（以下「本発明の医薬」とも記載する）である。本発明の医薬は、HuNoVによる感染症の予防薬および／または治療薬としての薬効を有する。本発明の医薬は、有効成分である本発明の抗体またはその機能的断片自体を投与する形態でもよいが、一般的には、有効成分である本発明の抗体またはその機能的断片の他、1または2以上の製剤用添加物を含む医薬組成物（以下「本発明の医薬組成物」とも記載する）の形態で投与することが望ましい。また、本発明の実施形態にかかる医薬組成物中には、公知の他の薬剤を併せて配合してもよい。
【００３２】
本発明の実施形態にかかる医薬または医薬組成物は、特に限定されず、剤型としては、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、シロップ剤、懸濁剤、座剤、軟膏、クリーム剤、ゲル剤、貼付剤、吸入剤または注射剤等が挙げられる。これらの製剤は常法に従って調製される。なお、液体製剤にあっては、用時、水または他の適当な溶媒に溶解または懸濁するものであってもよい。また、錠剤、顆粒剤は周知の方法でコーティングしてもよい。注射剤の場合には、本発明の抗体またはその機能的断片を水に溶解させて調製されるが、必要に応じて生理食塩水あるいはブドウ糖溶液に溶解させてもよく、また、緩衝剤や保存剤を添加してもよい。
【００３３】
経口投与用または非経口投与用の製剤は、任意の製剤形態で提供される。製剤形態としては、例えば、顆粒剤、細粒剤、散剤、硬カプセル剤、軟カプセル剤、シロップ剤、乳剤、懸濁剤もしくは液剤等の形態の経口投与用剤、静脈内投与用、筋肉内投与用もしくは皮下投与用などの注射剤、点滴剤、経皮吸収剤、経粘膜吸収剤、点鼻剤、吸入剤または坐剤などの形態として調製することができる。注射剤や点滴剤などは、凍結乾燥形態などの粉末状の剤形として調製し、用時に生理食塩水などの適宜の水性媒体に溶解して用いることもできる。
【００３４】
本発明の実施形態にかかる医薬または医薬組成物の製造に用いられる製剤用添加物の種類、有効成分に対する製剤用添加物の割合、あるいは、医薬または医薬組成物の製造方法は、その形態に応じて当業者が適宜選択することが可能である。製剤用添加物としては無機または有機物質、あるいは、固体または液体の物質を用いることができ、一般的には、有効成分重量に対して、例えば、0.1重量％〜99.9重量％、1重量％〜95.0重量％、または1重量％〜90.0重量％の間で配合することができる。具体的には、製剤用添加物の例として乳糖、ブドウ糖、マンニット、デキストリン、シクロデキストリン、デンプン、蔗糖、メタケイ酸アルミン酸マグネシウム、合成ケイ酸アルミニウム、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ヒドロキシプロピルデンプン、カルボキシメチルセルロースカルシウム、イオン交換樹脂、メチルセルロース、ゼラチン、アラビアゴム、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール、軽質無水ケイ酸、ステアリン酸マグネシウム、タルク、トラガント、ベントナイト、ビーガム、酸化チタン、ソルビタン脂肪酸エステル、ラウリル硫酸ナトリウム、グリセリン、脂肪酸グリセリンエステル、精製ラノリン、グリセロゼラチン、ポリソルベート、マクロゴール、植物油、ロウ、流動パラフィン、白色ワセリン、フルオロカーボン、非イオン性界面活性剤、プロピレングルコールまたは水等が挙げられる。
【００３５】
経口投与用の固形製剤を製造するには、有効成分と賦形剤成分、例えば、乳糖、澱粉、結晶セルロース、乳酸カルシウムまたは無水ケイ酸などと混合して散剤とするか、さらに必要に応じて白糖、ヒドロキシプロピルセルロースまたはポリビニルピロリドンなどの結合剤、カルボキシメチルセルロースまたはカルボキシメチルセルロースカルシウムなどの崩壊剤などを加えて湿式または乾式造粒して顆粒剤とする。錠剤を製造するには、これらの散剤及び顆粒剤をそのまま、あるいは、ステアリン酸マグネシウムまたはタルクなどの滑沢剤を加えて打錠すればよい。これらの顆粒または錠剤は、ヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレート、メタクリル酸−メタクリル酸メチルポリマーなどの腸溶剤基剤で被覆して腸溶剤製剤、あるいはエチルセルロース、カルナウバロウまたは硬化油などで被覆して持続性製剤とすることもできる。また、カプセル剤を製造するには、散剤または顆粒剤を硬カプセルに充填するか、有効成分をそのまま、あるいは、グリセリン、ポリエチレングリコール、ゴマ油またはオリーブ油などに溶解した後にゼラチンで被覆し軟カプセルとすることができる。
【００３６】
注射剤を製造するには、有効成分を必要に応じて、塩酸、水酸化ナトリウム、乳糖、乳酸、ナトリウム、リン酸一水素ナトリウムまたはリン酸二水素ナトリウムなどのｐＨ調整剤、塩化ナトリウムまたはブドウ糖などの等張化剤と共に注射用蒸留水に溶解し、無菌濾過してアンプルに充填するか、さらに、マンニトール、デキストリン、シクロデキストリンまたはゼラチンなどを加えて真空凍結乾燥し、用事溶解型の注射剤としてもよい。また、有効成分にレチシン、ポリソルベート80またはポリオキシエチレン硬化ヒマシ油などを加えて水中で乳化させ、注射剤用乳剤とすることもできる。
【００３７】
直腸投与剤を製造するには、有効成分をカカオ脂、脂肪酸のトリ、ジおよびモノグリセリドまたはポリエチレングリコールなどの座剤用基材と共に加湿して溶解し、型に流し込んで冷却するか、有効成分をポリエチレングリコールまたは大豆油などに溶解した後、ゼラチン膜で被覆すればよい。
【００３８】
本発明の実施形態にかかる医薬または医薬組成物の投与量および投与回数は特に限定されず、治療対象疾患の悪化・進展の防止および／または治療の目的、疾患の種類、患者の体重や年齢などの条件に応じて、医師または薬剤師の判断により適宜選択することが可能である。
一般的には、経口投与における成人1日あたりの投与量は0.01〜1,000 mg（有効成分重量）程度であり、1日1回または数回に分けて、あるいは数日ごとに投与することができる。注射剤として用いる場合には、成人に対して1日量0.001〜100ｍｇ（有効成分重量）を連続投与または間欠投与することが望ましい。
【００３９】
本発明の実施形態にかかる医薬または医薬組成物は、植込錠およびマイクロカプセルに封入された送達システムなどの徐放性製剤として、体内から即時に除去されることを防ぎ得る担体を用いて調製することができる。そのような担体として、エチレンビニル酢酸塩、ポリ酸無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステルおよびポリ乳酸などの、生物分解性および生物適合性ポリマーを用いることができる。このような材料は、当業者によって容易に調製することができる。また、リポソームの懸濁液も薬学上許容される担体として使用することができる。リポソームは、限定はしないが、ホスファチジルコリン、コレステロールおよびPEG誘導ホスファチジルエタノール（PEG-PE）を含む脂質組成物として、使用に適するサイズになるように、適当なポアサイズのフィルターを通して調製され、逆相蒸発法によって精製することができる。
【００４０】
本発明の実施形態にかかる医薬または医薬組成物は、投与方法等の説明書と共にキットの形態で提供してもよい。キット中に含まれる医薬または医薬組成物は、有効成分の活性を長期間有効に持続し、剤等が容器内側に吸着することなく、また、構成成分を変質させることのない材質で製造された容器により供給される。例えば、封着されたガラスアンプルは、窒素ガスのような中性で不反応性を示すガスの存在下で封入されたバッファーなどを含んでもよい。
また、キットには使用説明書が添付されてもよい。本キットの使用説明は、紙などに印刷されたものであっても、CD-ROMまたはDVD-ROMなどの電磁的に読み取り可能な媒体に保存され、供給されてもよい。
【００４１】
本発明の第４の実施形態は、GII.17 HuNoVのVP1タンパク質の全長またはその一部を抗原として含み、複数の異なる遺伝子型のHuNoVの感染を抑制するためのワクチン（以下「本発明のワクチン」とも記載する）である。
本発明のワクチンは、１または複数種類のアジュバント、例えば、完全フロイントもしくは不完全フロイントアジュバント、コレラトキシン、易熱性大腸菌毒素、水酸化アルミニウム、カリウムミョウバン、サポニンもしくはその誘導体、ムラミルジペプチド、鉱物油または植物油、ノバソームまたは非イオン性ブロック共重合体、DEAEデキストラン等を含むことができる。また、医薬上許容される担体を含んでいてもよい。医薬上許容される担体は、ワクチン接種される動物の健康に悪影響を及ぼさない化合物であることが必要である。医薬上許容される担体は、例えば、無菌水またはバッファーである。
本発明のワクチンは、通常の能動免疫法で投与することができ、注射により投与しても、経口、または経鼻などの経粘膜方法で投与してもよい。また、本発明のワクチン製剤は、HuNoV感染の予防または治療に対して、有効な量（HuNoVによる攻撃に対し、動物において免疫を誘導するに足りる量）で、剤形に適合した方法による単回または複数回投与することができる。ワクチンは、皮内、皮下、筋肉内、腹腔内、静脈内、経口的に、または、粘膜（鼻腔内または舌下など）に投与することができる。また、本発明のワクチン製剤は、他の抗原成分と混合して用いることもできる。
ワクチン製剤の投与量、投与回数は投与対象により変わり得るが、抗原を数10μg 含むワクチンを１週間から数週間に一度の頻度で、数回投与することによりに防御免疫を誘導し得る。
【００４２】
本発明の第５の実施形態は、本発明の医薬もしくは医薬組成物または本発明のワクチンを患者に投与することを含む、複数の異なる遺伝子型のHuNoV（例えば、GII.4およびGII.17）による感染症の予防および／または治療方法である。
ここで「治療」とは、すでにHuNoVに感染した患者において、その病態の進行および悪化を阻止または緩和することを意味し、これによってHuNoV感染症の進行および悪化を阻止または緩和することを目的とする処置のことである。
また、「予防」とは、HuNoVに感染するおそれがある患者について、その感染を予め阻止することを意味し、これによってHuNoV感染症の発症を予め阻止することを目的とする処置のことである。
【００４３】
本明細書において引用されたすべての文献の開示内容は、参照により、その全体が本明細書の一部として取り込まれる。また、本明細書が英文に翻訳された場合であって、単数形の「a」、「an」、および「the」の単語が含まれる場合、文脈から明らかにそうでないことが示されていない限り、単数のみならず複数のものを含むものとする。
以下に実施例を示してさらに本発明の説明を行うが、実施例は、あくまでも本発明の実施形態の例示にすぎず、本発明の範囲を限定するものではない。
【実施例】
【００４４】
材料と方法
１．VLPおよびVLPに対するポリクローナル抗体の調製
地方独立行政法人大阪健康安全基盤研究所から分与されたHuNoVを含む糞便からウイルスを粗精製し、そこからウイルスゲノムを調製した。調製したゲノム上のGII.4、GII.3およびGII.17のVP1 ORFの外側にプライマーを設定して各ORF領域をPCRで増幅し、その増幅産物のヌクレオチド配列を決定した。各VP1のORFは、pFastBac Dual Expression Vector（Invitrogen）にクローニングした。GII.4 VP1のアミノ酸配列およびこれをコードする核酸配列を各々配列番号１および配列番号２に、GII.17 VP1のアミノ酸配列およびこれをコードする核酸配列を各々配列番号３および配列番号４に、GII.3 VP1のアミノ酸配列およびこれをコードする核酸配列を各々配列番号５および配列番号６に示す。
各コンストラクトは、その配列が正しいことを確認した後、Bac-to-Bac expression system（Invitrogen）の組換バキュロウイルスの作製に使用した。High Five細胞（Invitrogen）に対して各組換バキュロウイルスをMOI（multiplicity of infection）、7 pfu（plaque-forming units）/細胞で感染させた。感染から6日後、培養上清を回収し、20,000gで1時間遠心した。得られた上清を100,000gで2時間超遠心し、沈殿したVLPをPBSに懸濁した。濃縮したVLPは、10%-60%スクロース密度勾配に重層し、100,000gで1時間超遠心を行い、精製した。スクロース密度勾配を通したVLPを2 LのPBSに対して3回透析し、サンプル中のスクロースを除去した。VLPはAmiconUltra 30-kDa centrifugal filter （Millipore）で濃縮した。
抗HuNoVポリクローナル抗体を調製するために、100-200 μgのVLP（GII.4、GII.3またはGII.17）を完全フロイントアジュバントと混合して2匹のウサギに免疫した。3週間後、各ウサギに対して不完全フロイントアジュバントと混合した100-200 μgのVLPでブースター注射を行った。さらに2週間後、血清を調製するためのウサギから採血した。血清のIgG画分をrProtein A-Sepharrose Fast flow（GE Healthcare）で精製し、その後2 LのPBSに対して3回透析した。【００４５】
２．オルガノイドまたは単層化細胞としての腸管上皮細胞の培養
腸管上皮細胞の誘導には、国立大学法人東京大学医科学研究所・ステムセルバンクから入手したヒトiPS細胞株、TkDN4-M株（Oct3/4、Sox2、Klf4を導入；Takayamaら, J. Exp. Med., 207:2817-2830 2010）を使用した。細胞は、TCプロテクター（DSファーマバイオメディカル社）に懸濁し、-80℃で保存していたものを融解し、復元培養して用いた。
ヒトiPS細胞からの腸管上皮細胞の誘導は、Takahashiら, Stem Cell Reports 10:314-328 2018に記載の方法に従って行った。【００４６】
Matrigel（Corning）で培養したオルガノイドはPBSで洗浄し、ROCK inhibitor Y-27632（10 μM、Wako）を添加したTrypLE Express（Gibco）中、37℃で5分間インキュベートした。Matrigelとオルガノイドを分離するために、細胞懸濁液をマイクロピペットでピペッティングして細胞塊を破壊し、その後、ナイロンメッシュに通した。得られた細胞懸濁液に、5倍量の10%仔ウシ血清/基本培地［Advanced DMEM/F12（Gibco）に10 mM HEPES（pH 7.3, Gibco）、2 mM Glutamax（Gibco）および100 units/mL Penicillin plus 100 μg/mL streptmycin（Gibco）を添加したもの］を加えた後、440gで5分間遠心を行い、細胞を回収した。回収した腸管上皮細胞は、氷上にて、10 μM Y-27632を加えた20 %のオルガノイド培養用培地［基本培地に次のものを添加した培地。25% WRN（mouse Wnt3a、human R-spondin1、human Noggin）CM（conditioned medium）（Takahashiら, Stem Cell Reports 10:314-328 2018）、1× B-27 (Gibco)、50 ng/mL mouse EGF（Peprotech）、50 ng/mL human HGF（R&D systems）、10 μM SB202190（Sigma）および500 nM A83-01（TGF-β receptor inhibitor, Tocris）］を含むMatrigelに懸濁した。得られた細胞懸濁液は、24-wellプレートに分注し、5 % CO2インキュベーターにて、37℃、10分間インキュベートした。次に、500 μLのオルガノイド培養用培地（＋10 μM Y-27632）を各ウェルに添加した。平均の継代比は、1:16または3×104/ウェルであった。培地は、2〜3日毎に新しいオルガノイド培地に交換した。継代は、5〜7日毎に行った。【００４７】
HuNoVを感染させる場合は、2.5 % Matrigelコート96-wellプレートまたはTranswells（Corning3470）に、ウェルから剥がしてオルガノイド培養用培地（＋10 μM Y-27632）100 μLで懸濁した腸管上皮細胞を2×104/wellの細胞密度で播種した。なお、Transwellsでの培養においては、600 μLのオルガノイド培養用培地を下のウェルに加えた。37℃の5% CO2インキュベーターで2日間培養した後、培地を分化用培地［基本培地に次のものを添加した培地。12.5% RN CM（Takahashiら, Stem Cell Reports 10:314-328 2018）、1× B-27、50 ng/mL mouse EGFおよび500 nM A83-01］に交換した。さらに、2日間培養した後、培地を0.03%のブタ胆汁（Sigma）添加または非添加の分化用培地に交換した。その後、2日間培養した細胞をHuNoVの感染に使用した。【００４８】
３．HuNoVの調製と腸管上皮細胞への感染
HuNoVに感染した患者の糞便を10%(w/v)になるようにPBSに懸濁した。懸濁液は12,000gで30分間遠心し、得られた上清を0.45μmのフィルターおよび0.22μmのフィルターに通した。フィルターを通したサンプルを分注して-80℃で保存した。感染実験を行う直前に、ウイルス溶液を基本培地で1 mLあたり2×107ゲノムコピーになるまで希釈した。調製した腸管上皮細胞にその100 μL（2×106ゲノムコピー）を感染させ、5%CO2インキュベーター中で3時間インキュベートした。添加したウイルス溶液を除去した後、150 μLの基本培地で、細胞を2回洗浄した。0.03%胆汁を含むまたは含まない分化用培地を100 μL細胞に添加し、2回程度ピペッティングした後、対照サンプルとして回収した。さらに、0.03%胆汁を含むまたは含まない分化培地の100μLを各ウェルに添加し、その後、5%CO2中で72時間培養した。
阻害実験については、細胞に感染させる前に、希釈したウイルス溶液を100 ngの抗VLP（GII.4、GII.3、またはGII.17）抗体または非免疫ウサギIgG（コントロールIgG）と混合して、37℃で90分間インキュベートした。【００４９】
４．ウイルスゲノムコピーの定量
PureLink Viral RNA/DNA Mini Kit（Invitrogen）を使用して、希釈したウイルス溶液、感染後3時間および72時間に回収したサンプルからRNAを調製した。RT-qPCRはqPCR（GI/GII）Typing Kit（TakaRa）およびLightCycler 480 System（Roche）を用いて実施した。【００５０】
結果
１．GII.4 VLPを抗原にして作製した抗体
抗原として用いたVLPと比較して、ウイルス株（17-231）のVP1には、P1ドメインに１アミノ酸変異（D235E）が存在していたが、GII.4 HuNoVを抗GII.4 VLP抗体と共にインキュベートすると、腸管上皮細胞内でのその複製が完全に阻害された（図１Ａ）。
次に、この抗GII.4 VLPポリクローナル抗体が、GIIの他の遺伝子型のウイルスの複製を阻害するかどうか検討した。その結果、ここで作製した抗GII.4 VLPポリクローナル抗体は、GII.3、GII.6およびGII.17型HuNoVの複製を阻害できなかった（図１Ｂ）。この結果は、GII.4 VLPを抗原としても、他の遺伝子型の HuNoVの複製を阻害する中和抗体を誘導することができないことを示唆している。【００５１】
GII.3 HuNoVを抗GII.3 VLP抗体と共にインキュベートすると、腸管上皮細胞内でのその複製が完全に阻害された（図２Ａ）。
次に、この抗GII.3 VLPポリクローナル抗体が、GIIの他の遺伝子型のウイルスの複製を阻害するかどうか検討した。その結果、ここで作製した抗GII.3 VLPポリクローナル抗体は、GII.4、GII.17およびGII.6型HuNoVの複製を阻害できなかった（図２Ｂ）。この結果は、GII.3 VLPを抗原としても、他の遺伝子型の HuNoVの複製を阻害する中和抗体を誘導することができないことを示唆している。【００５２】
２．GII.17 VLPを抗原にして作製した抗体
GII.17 HuNoVを抗GII.17 VLP抗体で前処理すると、腸管上皮細胞内でのGII.17 HuNoVの複製が阻害された（図３Ａ）。
次に、抗GII.17 VLP抗体のGII.17以外の遺伝子型のHuNoVの複製に対する影響を検討したところ、抗GII.17 VLP抗体はGII.4 HuNoVの複製も阻害した（図３Ｂ）。【００５３】
以上の結果から、GII.17 VLPは、GIIに分類される他の遺伝子型のHuNoVの感染を阻害する可能性が高く、多価ワクチン抗原としての能力を備えていることが示唆された。
【産業上の利用可能性】
【００５４】
本発明は、複数の異なる遺伝子型のHuNoV感染を阻害する抗体を作製する目的に適した抗原および当該抗体を提供するものである。従って、本発明は、医療分野における利用が期待される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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