(57)【要約】  新規なコレステロール合成促進剤を提供する。  有効成分として、アセンヤク抽出物、２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン基を有するコポリマー、酢酸レチノール、及びシカクマメ抽出物からなる群から選択される少なくとも１種類の成分を用いる。
2019107440.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
アセンヤク抽出物、２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン基を有するコポリマー、酢酸レチノール、及びシカクマメ抽出物からなる群から選択される少なくとも１種類の成分を含むコレステロール合成促進剤。
【請求項２】
請求項１に記載のコレステロール合成促進剤を含む、表皮細胞の分化を促進するための組成物。
【請求項３】
表皮細胞の分化を促進する薬剤をスクリーニングする方法であって、候補薬剤を培養細胞に作用させた場合に、該細胞のＤＨＣＲ７遺伝子の発現を亢進させる薬剤を表皮細胞の分化を促進する薬剤として選定することを特徴とする方法。
【請求項４】
前記培養細胞がヒト表皮角化細胞である、請求項３に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規なコレステロール合成促進剤、該コレステロール合成促進剤を含む表皮細胞の分化を促進するための組成物、及び表皮細胞の分化を促進する薬剤をスクリーニングする方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
老化は全身の臓器で進行しているが、その中でも目で見ることができる皮膚、とりわけ特に意識が集中しやすい顔面については、老化とともに発生するシワ及び小ジワが、世の多くの中高年齢者、とりわけ女性を悩ませている。最近では女性だけでなく男性でも、若く見られたいという願望が強くなってきており、とりわけ老化に伴い現れる皮膚のシワを緩和することが望まれている。【０００３】
このような要望に対し、従来、ボツリヌス毒素やヒアルロン酸などの注入が行われてきたが、このような施術においては、異物を注入する点から敬遠され、また、効果の持続性の点からも不満がもたれていた。これらの施術に代わり、近年では、自己血液中の血小板画分を濃縮し、それを自己の患部に注入する「多血小板血漿（Platelet Rich Plasma: PRP）療法」と称される施術が美容医療界に広まっている。ＰＲＰ療法は、1985年頃から研究や臨床応用が開始された技術であり、当初は主に歯科用のインプラント治療における骨再生誘導療法などに用いられていたが、その後、美容医療に応用されるようになり、主にシワやたるみの解消のために施されている。ＰＲＰ療法は、自己の血液を戻すことから異物注入という点から敬遠されることはなく、また、効果の点でも長期にわたって持続することが明らかになっている。ＰＲＰ中には血小板由来の各種因子が含有されており、これらが血清のフィブリンと協調的に作用し、真皮中の線維芽細胞を活性化し、コラーゲン産生等を促進して、みずみずしいハリのある肌に寄与するものと考えられている。現在では、ＰＲＰは、皮膚科領域にとどまらず、肝臓癌により肝臓の多くを摘出した患者における肝臓の再生治療や心筋梗塞治療にも応用できることが示唆されている（非特許文献１、非特許文献２、非特許文献３）。また、白血球を多く含むＰＲＰ（Ｗ−ＰＲＰ）は、従来のＰＲＰ技術と比較してより有効性が高いことが報告されており（非特許文献１、非特許文献２）、皮膚老化の改善に有用であることが示されている（非特許文献４、非特許文献５、非特許文献６）。【０００４】
しかしながら、Ｗ−ＰＲＰの治療効果には個人差が大きく、また、Ｗ−ＰＲＰの治療メカニズムについては依然として十分に知られていない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Classification of platelet concentrates: from pure platelet-rich plasma（P-PRP） to leucocyte- and platelet-rich fibrin（L-PRF）. Dohan Ehrenfest DM, Rasmusson L, Albrektsson T.Trends Biotechnol. 2009 Mar;27（3）:158-67. Epub 2009 Jan 31. Review.PMID:19187989
【非特許文献２】除皺を目的とした自己白血球含有多血小板血漿（autologous W-PRP）注入療法の基礎から臨床 川添 剛、金 学嬉 日本臨床皮膚外科学会誌 17,1-26 ,2008
【非特許文献３】陥凹の治療：多血小板注入について  川添ら、MB Derma, 168: 29-35, 2010
【非特許文献４】白血球含有多血小板血漿（Ｗ−ＰＲＰ）の皮膚老化改善効果に関する研究  相馬ら、第28回美容皮膚科学会、2010年8月
【非特許文献５】白血球含有多血小板血漿（Ｗ−ＰＲＰ）の皮膚老化改善メカニズムに関する研究  相馬ら、第29回美容皮膚科学会、2011年9月
【非特許文献６】白血球含有多血小板血漿（Ｗ−ＰＲＰ）の皮膚老化改善メカニズムに関する研究  辻ら、第31回美容皮膚科学会、2013年8月
【非特許文献７】Free Radic Biol Med. 2006 Jul 15; 41（2）: 339-46
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明の課題は、新規なコレステロール合成促進剤、該コレステロール合成促進剤を含む表皮細胞の分化を促進するための組成物、及び表皮細胞の分化を促進する薬剤をスクリーニングする方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、マイクロアレイを利用し、Ｗ−ＰＲＰの施術前と施術後における皮膚中の遺伝子発現プロファイルを調べた結果、Ｗ−ＰＲＰ施術によって、ＤＨＣＲ７遺伝子の発現が有意に増加されるという知見を見出した。かかる知見に基づき、本発明者らは、鋭意検討したところ、この度、驚くべきことに、皮膚細胞中のＤＨＣＲ７遺伝子の発現が表皮細胞の分化に密接に関与していること、さらには、アセンヤク抽出物、２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン基を有するコポリマー、酢酸レチノール、及びシカクマメ抽出物が、ＤＨＣＲ７遺伝子の発現を促進することを見出し、本発明を完成するに至った。【０００８】
したがって、本願は以下の発明を包含する：
［１］アセンヤク抽出物、２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン基を有するコポリマー、酢酸レチノール、及びシカクマメ抽出物からなる群から選択される少なくとも１種類の成分を含むコレステロール合成促進剤。
［２］１に記載のコレステロール合成促進剤を含む、表皮細胞の分化を促進するための組成物。
［３］表皮細胞の分化を促進する薬剤をスクリーニングする方法であって、候補薬剤を培養細胞に作用させた場合に、該細胞のＤＨＣＲ７遺伝子の発現を亢進させる薬剤を表皮細胞の分化を促進する薬剤として選定することを特徴とする方法。
［４］前記培養細胞がヒト表皮角化細胞である、３に記載の方法。
［５］表皮細胞の分化を促進するための組成物の調製における、アセンヤク抽出物、２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン基を有するコポリマー、酢酸レチノール、及びシカクマメ抽出物からなる群から選択される少なくとも１種類の成分の使用。
［６］ＤＨＣＲ７遺伝子の発現を亢進させる薬剤を含む、表皮細胞の分化を促進するための組成物。
［７］表皮細胞の分化を促進するための美容的又は治療的な方法であって、ＤＨＣＲ７遺伝子の発現を亢進させる薬剤を対象に適用することを含む方法。
［８］表皮細胞の分化を促進するための組成物の調製における、ＤＨＣＲ７遺伝子の発現を亢進させる薬剤の使用。
【発明の効果】
【０００９】
本発明により、表皮細胞の分化を促進させ、これにより、表皮細胞の分化の抑制に起因する状態又は疾患を予防、改善又は治療することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】図１は、Ｗ−ＰＲＰの施術前、施術２週間後、及び施術３か月後におけるＤＨＣＲ７遺伝子の発現変化を示すグラフである。
【図２】図２は、ＤＨＣＲ７阻害剤（ＡＹ−９９４４）による、ヒト表皮角化細胞の分化に伴う形態変化を示す写真である。
【図３】図３は、培養４日目のヒト表皮角化細胞における、ＤＨＣＲ７阻害剤（ＡＹ−９９４４）による表皮細胞分子マーカー（ケラチン１０）の発現変化を示すグラフである。
【図４】図４Ａは、分化開始後１日目及び４日目のヒト表皮角化細胞における、ＤＨＣＲ７阻害剤（ＡＹ−９９４４）によるコレステロールの濃度変化を示すグラフである。図４Ｂは、分化開始後１日目のヒト表皮角化細胞における、ＤＨＣＲ７阻害剤（ＡＹ−９９４４）による細胞呼吸活性を示すグラフである。
【図５】図５は、ヒト表皮角化細胞における、各濃度のアセンヤク抽出物、ＭＰＣコポリマー、酢酸レチノール、及びシカクマメ抽出物によるＤＨＣＲ７の遺伝子発現を示すグラフである。
【図６】図６は、ヒト表皮角化細胞における、アセンヤク抽出物による表皮分化マーカー（インボルクリン）の遺伝子発現を示すグラフである。
【００１１】
ＤＨＣＲ７遺伝子は、主に細胞内の小胞体膜に存在し、７−デヒドロコレステロールをコレステロールに変換する酵素として知られる７−デヒドロコレステロールレダクターゼ（ＥＣ１．３．１．２１）をコードする遺伝子である。ＤＨＣＲ７遺伝子は、スミス−レムリーオプティズ症候群（ＳＯＬＳ）の原因遺伝子として知られている。ＳＯＬＳに罹患した患者は、精神遅延、顔面異型、つま先の合趾、全前脳症（重篤な場合）などの症状を有するほか、ＵＶＡに対する光感受性が亢進されることも報告されており、これは、血中の７−デヒドロコレステロールが増加からＵＶＡ吸収性の代謝産物が増加し、活性酸素が産生されることに起因するものと考えられている（非特許文献７）。【００１２】
本発明の１つの態様においては、アセンヤク抽出物、２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン基を有するコポリマー、酢酸レチノール、及びシカクマメ抽出物からなる群から選択される少なくとも１種類の成分を含むコレステロール合成促進剤が提供される。【００１３】
アセンヤク抽出物は、東南アジア等に分布しているアカネ科に属する植物であるアセンヤク（学名：Uncarina gambir）に由来する抽出物であり、抽出原料として使用する部位としては、例えば、花（蕾）部、葉部、枝部、樹皮部、根部等が挙げられるが、好ましくは葉部である。アセンヤク抽出物は常法より得ることができ、例えば、抽出原料として使用する部位を必要により乾燥した後、抽出溶媒に一定期間浸漬するか、あるいは加熱還流している抽出溶媒と接触させ、次いで濾過し、濃縮して得ることができる。抽出溶媒としては、通常抽出に用いられる溶媒であれば任意に用いることができ、例えば、水、メタノール、エタノール、プロピレングリコール、１，３−ブチレングリコール、グリセリン等のアルコール類、クロロホルム、ジクロルエタン、四塩化炭素、アセトン、酢酸エチル等の有機溶媒を、それぞれ単独であるいは適宜組み合わせて用いることができる。上記溶媒で抽出して得た抽出液をそのまま、あるいは濃縮したエキスを用いるか、あるいはこれらエキスを吸着法、例えばイオン交換樹脂を用いて不純物を除去したものや、ポーラスポリマー（例えばアンバーライトＸＡＤ−２）のカラムにて吸着させた後、メタノールまたはエタノールで溶出し、濃縮したものも使用することができる。また分配法、例えば水／酢酸エチルで抽出した抽出物等も用いることができる。こうして得られる抽出物は、そのまま、あるいはエタノール等でさらに希釈し、または固化後、乾燥物をそのまま、もしくは乾燥物を例えばエタノールに再溶解して、本発明で用いることができる。【００１４】
２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン基を有するコポリマーは、２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリンと疎水性モノマーとの共重合体であり、６０万〜７０万の重量平均分子量を有する。例えば、２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリンとメタクリル酸ブチルのコポリマー（ＭＰＣコポリマー）は、優れた保湿性を有することから、ハンドクリームやコンタクトレンズ保存液、シャンプー・リンスなどに使用されている。【００１５】
酢酸レチノールは、ビタミンＡの酢酸エステルであり、保湿クリームなどの化粧品成分として使用されている。【００１６】
シカクマメ抽出物は、東南アジアを原産とし、日本の沖縄県や小笠原諸島などでも栽培されているシカクマメ（学名：Psophocarpus tetragonolobus）に由来する抽出物であり、抽出原料として使用する部位としては、例えば、種子、莢、葉、花、根、全草等が挙げられるが、好ましくは種子又は莢である。シカクマメ抽出物もまた、上述した常法により得ることができる。【００１７】
本発明のさらなる態様として、上記コレステロール合成促進剤を含む、表皮細胞の分化を促進するための組成物が提供される。このような組成物は、化粧料組成物又は医薬組成物として用いることができ、局所的なコレステロール合成の低下による表皮細胞の分化異常に起因する状態又は疾患、例えば、しわ、たるみなどの表皮内のコレステロール低下に伴う皮膚の加齢変化を予防、改善又は治療するために有効である。【００１８】
本発明の組成物は、その使用目的に合わせて用量、用法、剤型を適宜決定することが可能である。例えば、本発明の組成物の投与形態は特に制限されるものではなく、経口、非経口、外用等であってよいが、好ましくは皮膚外用組成物である。剤型としては、例えば軟膏、クリーム、乳液、ローション、パック、浴用剤等の外用剤、注射剤、点滴剤、若しくは坐剤等の非経口投与剤、又は錠剤、粉剤、カプセル剤、顆粒剤、エキス剤、シロップ剤等の経口投与剤を挙げることができる。【００１９】
本発明の組成物の活性成分の配合量は、用途に応じて適宜決定できるが、組成物全量中、アセンヤク抽出物は、典型的には０．０００１％〜１０％、好適には０．００１％〜１％、最適には０．０５％〜０．５％で配合される。２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン基を有するコポリマーは、典型的には０．０００１％〜１０％、好適には０．００１％〜１％、最適には０．０５％〜０．５％で配合される。酢酸レチノールは、典型的には０．０００００１％〜１％、好適には０．００００１％〜０．０１％、最適には０．００００５％〜０．００５％で配合される。シカクマメ抽出物は、典型的には０．０００１％〜１０％、好適には０．００１％〜１％、最適には０．０５％〜０．５％で配合される。【００２０】
また、本発明の組成物には、上記活性成分以外に、例えば、化粧品や医薬品に通常用いられる美白剤、保湿剤、油性成分、紫外線吸収剤、界面活性剤、増粘剤、アルコール類、粉末成分、色剤、水性成分、水、各種皮膚栄養剤等を必要に応じて適宜配合することができる。【００２１】
さらに、本発明の組成物を皮膚外用剤として使用する場合、皮膚外用剤に慣用の助剤、例えばエデト酸二ナトリウム、エデト酸三ナトリウム、クエン酸ナトリウム、ポリリン酸ナトリウム、メタリン酸ナトリウム、グルコン酸等の金属封鎖剤、カフェイン、タンニン、ベラパミル、トラネキサム酸及びその誘導体、グラブリジン、カリンの果実の熱水抽出物、各種生薬、酢酸トコフェロール、グリチルリチン酸及びその誘導体またはその塩等の薬剤、ビタミンＣ、アスコルビン酸リン酸マグネシウム、アスコルビン酸グルコシド、アルブチン、コウジ酸等の美白剤、グルコース、フルクトース、マンノース、ショ糖、トレハロース等の糖類なども適宜配合することができる。【００２２】
本発明の別の態様において、ＤＨＣＲ７遺伝子の発現の亢進を指標として用いた、表皮細胞の分化を促進する薬剤のスクリーニング方法が提供される。ＤＨＣＲ７遺伝子の発現の亢進は、例えば培養細胞中のＤＨＣＲ７の量を直接測定することにより決定することができる。培養細胞は、典型的には皮膚細胞、特には表皮細胞であり、角化細胞、顆粒細胞、有棘細胞等が含まれ、ヒト由来であっても、その他の動物、例えばラット、マウス、ウサギなどであってもよい。ＤＨＣＲ７の量を直接測定する場合、好ましくはＤＨＣＲ７に特異的な抗体を利用し、当業界において周知の方法、例えば蛍光物質、色素、酵素などを利用する免疫染色法、ウエスタンブロット法、免疫測定方法、例えばＥＬＩＳＡ法、ＲＩＡ法など、様々な方法により実施できる。あるいは、培養細胞からＲＮＡを抽出し、ＤＨＣＲ７をコードするｍＲＮＡの量を測定することにより決定することもできる。ｍＲＮＡの抽出、その量の測定も当業界において周知であり、例えばＲＮＡの定量は定量ポリメラーゼ連鎖反応法（ＰＣＲ）、例えばリアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）により行われる。ＲＴ−ＰＣＲに適切なプライマーの選定は当業者に周知な方法により実施することができる。【００２３】
ＤＨＣＲ７遺伝子のＲＴ−ＰＣＲ分析には、例えば、以下のプライマーを使用することができる。
フォワードプライマー：5'-AGGGGAAGGTGGGCGCAGGAC-3'（配列番号１）
リバースプライマー：  5'-TTGGGCCCTCCAGCCTCTTGC-3'（配列番号２）【００２４】
上述の測定において、例えば培養細胞中のＤＨＣＲ７遺伝子の発現がコントロール値と比べ有意差を持って更新し、好ましくは３０％以上、より好ましくは５０％以上、さらに好ましくは７０％以上、最も好ましくは１００％以上亢進したら、「表皮細胞の分化を促進する薬剤」と判断する、としてよい。コントロール値としては、限定されるものではないが、例えば統計学的に有意な数の健常人の対応の部位における培養細胞のＤＨＣＲ７遺伝子の発現量の平均値であってよい。【００２５】
上記スクリーニング方法によって、表皮細胞の分化を促進する新規な薬剤を容易に得ることが可能となる。【００２６】
以下の実施例により、本発明を更に具体的に説明する。なお、本発明はこれに限定されるものではない。
【実施例】
【００２７】
１．Ｗ−ＰＲＰ施術により発現が亢進される遺伝子のマイクロアレイ解析
二人の被験者の上腕前側部にＷ−ＰＲＰ施術を施し、施術前、施術２週間後、施術３か月後に５ｍｍパンチにより皮膚組織の採取を行った。それぞれの試料を液体窒素中でクライオプレスにより破砕し、Isogen(ニッポンジーン社)で細胞内のＲＮＡを抽出し、マニュアル(Agilent 社)に従い、ラベル化プローブを合成し、約４万個の遺伝子がスポットされた、ＤＮＡマイクロアレイ(one-color, whole mouse 44K、Agilent社)上で、ハイブリダイゼーションを行った。得られたシグナルはスキャナーAgilent dual-laser Microarray scanner G2565AA を用いて検出し、解析ソフトFeature Extraction Software 9.1 (Agilent 社)を用いて数値化し遺伝子発現指標値とした。
図１に示されるとおり、Ｗ−ＰＲＰ施術により、ＤＨＣＲ７の発現が亢進することが判明した。【００２８】
２．ＤＨＣＲ７阻害剤による表皮角化細胞分化への効果
ヒト表皮角化細胞をＣｎＴ−０７培地（CELLnTEC社）で継代培養し、継代４代目の細胞を同培地に懸濁して、コラーゲンコート６穴マルチプレート（旭硝子）に２×１０5 細胞／ウェルになるように播種し、５％ＣＯ2存在下、３７℃で細胞が集密に達するまで３〜５日間の培養を行った。ＣｎＴ−０２培地（CELLnTEC社）に交換し、分化誘導を開始した。同時に、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）中に溶解したＤＨＣＲ７阻害剤（ＡＹ−９９４４）（Sigma-Aldrich社）を最終濃度１０μＭとなるように添加し、４日間培養した。細胞の状態観察は位相差顕微鏡下で行った。コントロールとしては、ＤＭＳＯを同量（最終濃度０．１％）添加したサンプルを用いた。
図２の写真に示されるとおり、ＤＨＣＲ７の阻害により、表皮細胞の分化にともなう形態の変化が阻害された。【００２９】
３．ＤＨＣＲ７阻害剤による表皮角化細胞分化マーカーの発現変化
培養後の細胞からＲＮＡ抽出試薬MagNA Pure LC mRNA HSキット（Roche社）と自動核酸抽出装置 MagNA Pure LC 1.0 インスツルメント（Roche社）を用いて、提供されたプロトコールに従ってｍＲＮＡの抽出・精製を行った。上述のＤＨＣＲ７阻害剤（ＡＹ−９９４４）及びコントロールについて、逆転写酵素 Superscript II（Invitrogen社）によりＲＮＡからランダムヘキサマー・プライマーを用いて、Invitrogen社のプロトコールにしたがいｃＤＮＡを合成した。合成したｃＤＮＡを鋳型に、後述の配列番号１及び２のプライマーペア、反応試薬 QuantiFast SYBR Green RT-PCR キット（Qiagen社）及び反応装置 LightCycler（Roche社）を用いて、分化マーカーであるケラチン１０遺伝子の定量リアルタイムＰＣＲを行った。組成条件は Qiagen社のプロトコールに従った。また、ＰＣＲの条件は、初期変性９５℃で１０分、変性９５℃で１０秒、アニール６０℃で１０秒、伸長７２℃で１２秒とした。なお、Ｇ３ＰＤＨは内部標準として用い、これを用いてコントロール群のｍＲＮＡ量を補正した。
ケラチン１０：
フォワードプライマー：5'-CCATCGATGACCTTAAAAATCAG-3'（配列番号１）
リバースプライマー：5'-GCAGAGCTACCTCATTCTCATACTT-3'（配列番号２）
Ｇ３ＰＤＨ：
フォワードプライマー：5'-GCACCGTCAAGGCTGAGAAC-3'（配列番号３）
リバースプライマー：  5'-ATGGTGGTGAAGACGCCAGT-3'（配列番号４）
図３のグラフに示されるとおり、ＡＹ−９９４４により、表皮細胞の分化マーカーであるケラチン１０が顕著に減少した。【００３０】
４．細胞コレステロール量の測定
上記で調製した分化開始後１日目及び４日目の細胞を２００μｌのクロロフォルム：イソプロパノール：ＮＰ−４０（７：１１：０．１）で抽出した後、溶媒を蒸散させ、コレステロール／コレステロールエステル定量キット（BioVision社）に含まれるコレステロールアッセイバッファー中に懸濁して測定試料とした。キット付属の９６ウェルプレートに試料を添加し、各ウェルに５０μｌの反応ミックスを加え、３７℃で１時間インキュベートした後、プレートリーダーを用い波長５７０ｎｍの吸光度を測定した。キット付属の標準品を用いて検量線を作成し、サンプル中のコレステロール濃度を定量した。
図４Ａに示されるとおり、ＡＹ−９９４４により表皮細胞に含有されるコレステロール量は減少した。【００３１】
５．細胞呼吸活性の測定
上記で調製した分化開始後１日目の細胞培養液をalamarBlue(R)Cell Viability Reagent（invitrogen社）を１０％含有するＣｎＴ−０２培地（CELLnTEC社）に交換し、５％ＣＯ2存在下、３７℃で３時間インキュベーションした後、蛍光プレートリーダーを用い励起波長／蛍光波長：５４０／５９０ｎｍで計測した。
図４Ｂに示されるとおり、ＡＹ−９９４４によって細胞増殖に変化は見られなかった。
図４Ａ及び図４Ｂに示される結果から、実験２におけるケラチン１０の減少は細胞死によるものではないこと、及び、ＤＨＣＲ７の阻害により細胞のコレステロール含有量が確かに減少していることが確認された。【００３２】
６．コレステロール産生酵素（ＤＨＣＲ７）産生促進
ヒト表皮角化細胞をＣｎＴ−０７培地（CELLnTEC社）で継代培養し、継代３代目の細胞を同培地に懸濁して、コラーゲンコート１２穴マルチプレート（旭硝子）に５０，０００個の割合で播種し、５％ＣＯ2存在下、３７℃で細胞が集密に達するまで３〜５日間の培養を行った。３０品目の候補薬剤を各評価対象サンプルとして、各サンプルを上記濃度となるように添加、又は各評価対象サンプルが溶解している溶媒であるＤＭＳＯを同量添加したＣｎＴ−０７培地に交換した後、更に１日間培養を行った。培養後の細胞からＲＮＡ抽出試薬MagNA Pure LC mRNA HSキット（Roche社）と自動核酸抽出装置 MagNA Pure LC 1.0 インスツルメント（Roche社）を用いて、提供されたプロトコールに従ってｍＲＮＡの抽出・精製を行った。各サンプルについて、逆転写酵素 Superscript II（Invitrogen社）によりＲＮＡからランダムヘキサマー・プライマーを用いて、Invitrogen社のプロトコールにしたがいｃＤＮＡを合成した。合成したｃＤＮＡを鋳型に、後述の配列番号１及び２のプライマーペア、反応試薬 QuantiFast SYBR Green RT-PCR キット（Qiagen社）及び反応装置 LightCycler（Roche社）を用いて、ＤＨＣＲ７遺伝子の定量リアルタイムＰＣＲを行った。組成条件はQiagen社のプロトコールに従った。また、ＰＣＲの条件は、初期変性９５℃で１０分、変性９５℃で１０秒、アニール６０℃で１０秒、伸長７２℃で１２秒とした。なお、Ｇ３ＰＤＨは内部標準として用い、これを用いてコントロール群のｍＲＮＡ量を補正した。
ＤＨＣＲ７：
フォワードプライマー：5'-AGGGGAAGGTGGGCGCAGGAC-3'（配列番号１）
リバースプライマー：  5'-TTGGGCCCTCCAGCCTCTTGC-3'（配列番号２）
Ｇ３ＰＤＨ：
フォワードプライマー：5'-GCACCGTCAAGGCTGAGAAC-3'（配列番号３）
リバースプライマー：  5'-ATGGTGGTGAAGACGCCAGT-3'（配列番号４）
その結果、アセンヤク抽出物（丸善製薬（株））、ＭＰＣコポリマー（日本油脂（株））、酢酸レチノール（BASF社）及びシカクマメ抽出物（一丸ファルコス（株））の４種類の薬剤がＤＨＣＲ７産生促進効果を有することが判明した（図５）。【００３３】
７．アセンヤク抽出物による表皮分化マーカー産生促進
ヒト表皮角化細胞をＣｎＴ−０７培地（CELLnTEC社）で継代培養し、継代３代目の細胞を同培地に懸濁して、コラーゲンコート１２穴マルチプレート（旭硝子）に５０，０００個の割合で播種し、５％ＣＯ2存在下、３７℃で細胞が集密に達するまで３〜５日間の培養を行った。アセンヤク抽出物（丸善製薬）を０．２％となるように添加、又はコントロールとしてＤＭＳＯを同量添加したＣｎＴ−０７培地に交換した後、更に１日間培養を行った。培養後の細胞からＲＮＡ抽出試薬MagNA Pure LC mRNA HSキット（Roche社）と自動核酸抽出装置 MagNA Pure LC 1.0 インスツルメント（Roche社）を用いて、提供されたプロトコールに従ってｍＲＮＡの抽出・精製を行った。各サンプルについて、逆転写酵素 Superscript II（Invitrogen社）によりＲＮＡからランダムヘキサマー・プライマーを用いて、Invitrogen社のプロトコールにしたがいｃＤＮＡを合成した。合成したｃＤＮＡを鋳型に、後述の配列番号１及び２のプライマーペア、反応試薬 QuantiFast SYBR Green RT-PCR キット（Qiagen社）及び反応装置 LightCycler（Roche社）を用いて、分化マーカーであるインボルクリン（involucrin）遺伝Ｗ−ＰＲＰ施術により発現が亢進される遺伝子のマイクロアレイ解析子の定量リアルタイムＰＣＲを行った。組成条件は Qiagen社のプロトコールに従った。また、ＰＣＲの条件は、初期変性９５℃で１０分、変性９５℃で１０秒、アニール６０℃で１０秒、伸長７２℃で１２秒とした。なお、Ｇ３ＰＤＨは内部標準として用い、これを用いてコントロール群のｍＲＮＡ量を補正した。
インボルクリン：
フォワードプライマー：5'-CTGCCTCAGCCTTACTGTGA-3'（配列番号５）
リバースプライマー：  5'-TGGGTATTGACTGGAGGAGG-3'（配列番号６）
Ｇ３ＰＤＨ：
フォワードプライマー：5'-GCACCGTCAAGGCTGAGAAC-3'（配列番号３）
リバースプライマー：  5'-ATGGTGGTGAAGACGCCAGT-3'（配列番号４）
図６に示されるとおり、アンヤク抽出物によって、インボルクリンの産生が促進されることが確認された。
【図１】
2019107440.tif 000003
【図２】
2019107440.tif 000004
【図３】
2019107440.tif 000005
【図４】
2019107440.tif 000006
【図５】
2019107440.tif 000007
【図６】
2019107440.tif 000008
【配列表】
2019107440000001.app
【国際調査報告】
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