(57)【要約】  本発明は、ラクトバチルス  クリスパタス菌株であって、該菌株の１６ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子のヌクレオチド配列は配列番号１に示されるヌクレオチド配列と少なくとも９５％の同一性を有する、ラクトバチルス  クリスパタス菌株に関する。
2020166708.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ラクトバチルス  クリスパタス菌株であって、該菌株の１６ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子のヌクレオチド配列は配列番号１に示されるヌクレオチド配列と少なくとも９５％の同一性を有する、ラクトバチルス  クリスパタス菌株。
【請求項２】
前記同一性が９８％以上である、請求項１に記載の菌株。
【請求項３】
受託番号ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２８６９の下寄託されたラクトバチルス  クリスパタス  ＣＦＦ  Ｎｏ．２０３１である、請求項１または２に記載の菌株。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか一項に記載の菌株を含んでなる、組成物。
【請求項５】
医薬、飲食品、化粧品または飼料として用いるための、請求項４に記載の組成物。
【請求項６】
乳幼児または未成年のための、請求項４または５に記載の組成物。
【請求項７】
常在細菌叢に含まれる細菌構成バランスを調節するための、請求項４〜６のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項８】
前記常在細菌叢に含まれる細菌が、ラクノスピラ科細菌、アシネトバクター属細菌、ムシスピリラム属細菌、プレボテラ属細菌およびバクテロイデス属細菌から選択される少なくとも１つのものである、請求項７に記載の組成物。
【請求項９】
前記常在細菌叢が、粘膜付着細菌叢または腸内細菌叢である、請求項７または８に記載の組成物。
【請求項１０】
炎症に関連する疾患または症状を抑制するための、請求項４〜９のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１１】
消化管を保護するための、請求項４〜１０に記載のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１２】
体重減少を抑制するための、請求項４〜１１のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１３】
常在細菌叢に含まれる細菌構成バランス調節用組成物の製造における、ラクトバチルス  クリスパタス菌株の使用であって、該菌株の１６ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子のヌクレオチド配列は配列番号１に示されるヌクレオチド配列と少なくとも９５％の同一性を有する、使用。
【請求項１４】
常在細菌叢に含まれる細菌の構成バランスを調整する方法であって、それを必要とする対象にラクトバチルス  クリスパタス菌株の有効量を投与することを含んでなり、前記菌株の１６ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子のヌクレオチド配列は配列番号１に示されるヌクレオチド配列と少なくとも９５％の同一性を有する、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規乳酸菌およびそれを含有する組成物に関する。
【従来の技術】
【０００２】
従来、腸内細菌叢とは、糞便や内容物に存在する細菌のこと一般的には指していた。しかしながら、近年、宿主粘膜に付着している細菌の生理的意義、および粘膜内で形成される粘膜付着細菌叢の存在が明らかになってきている。
【０００３】
例えば、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）やクローン病の患者は、健常者とは異なる粘膜付着細菌叢を形成していることが報告されている（非特許文献１）。また、腸内細菌叢に含まれうる細菌のうち、ラクノスピラ科細菌およびアシネトバクター属細菌、バクテロイデス属細菌、プレボテラ属細菌は、腸管や全身の炎症時に腸内で増加することが知られている（非特許文献２〜８）。
【０００４】
一方で、母乳には乳児の発達に必要な様々な栄養素が含まれていることが知られている。また、近年、母乳にも乳酸菌が含まれ、新生児の腸内細菌叢形成に寄与していることが報告されている（非特許文献９）。さらに、母乳の細菌叢と子の発達の関連性についても報告されている（非特許文献１０）。
【０００５】
しかしながら、母体の体質や育児環境によっては、母乳育児を実施することは困難な場合がある。また、母乳の細菌叢には個人差があるため、母親の細菌叢が劣悪な場合は、子の粘膜付着細菌叢および腸内細菌叢もその影響を受けてしまう場合がある。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｔｈｅ  Ｊａｐａｎｅｓｅ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｏｆ  Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ、Ｎｉｓｈｉｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，  ＤＯＩ  １０．１００７／ｓ００５３５−０１７−１３８４−４，  ２０１７
【非特許文献２】Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ，  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，  Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ，  ａｎｄ  Ｍｅｔａｂｏｌｏｍｉｃｓ，  Ｐｒｅｉｄｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，  ９４０−９４８，  Ｆｉｒｓｔ  ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ  ｏｎｌｉｎｅ  Ａｐｒｉｌ  ６，  ２０１６
【非特許文献３】Ｔｈｅ  ＩＳＭＥ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ６，  Ｂｅｒｒｙ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０９１−２１０６，  （２０１２）
【非特許文献４】Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ，  Ａｌｄｙ  ｅｔ  ａｌ．，  １−１２，  ０３  Ａｕｇｕｓｔ  ２０１７
【非特許文献５】Ｇｕｔ  Ｍｉｃｒｏｂｅｓ，  Ｖｏｌｕｍｅ  ６，  Ｉｓｓｕｅ  １，  Ｔａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，  ４８−５６，  ２０１５
【非特許文献６】Ｓｅｔｏｙａｍａ  ｅｔ  ａｌ．  Ｍｉｃｒｏｂｅｓ  Ｉｎｆｅｃｔ．  ２００３  Ｆｅｂ；５（２）：１１５−２２
【非特許文献７】Ｓｃｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．  ｅＬｉｆｅ  ２０１３；２：ｅ０１２０２．ＤＯＩ：１０．７５５４／ｅＬｉｆｅ．０１２０２
【非特許文献８】Ａｒａｉ  ｅｔ  ａｌ．  Ｊａｐａｎｅｓｅ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｏｆ  Ａｌｌｅｒｇｏｌｏｇｙ，  ６７（１），  ２４−２７，  ２０１８
【非特許文献９】ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ  Ｒｅｐｏｒｔｓ，  ７，  ９９４０，  ＤＯＩ：１０．１０３８／ｓ４１５９８−０１７−０９２７８−ｙ，  Ｄｒｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，  ３０  Ａｕｇｕｓｔ  ２０１７
【非特許文献１０】Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ  ｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，  Ｖｏｌｕｍｅ  ８，  Ａｒｔｉｃｌｅ  ２１００，  Ｔｏｓｃａｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｏｃｔｏｂｅｒ  ２０１７
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の一実施態様は、常在細菌叢における細菌構成バランスを効果的に調節しうる新規乳酸菌を提供することを一つの目的としている。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、粘膜付着細菌叢または腸内細菌叢をはじめとする常在細菌叢の細菌構成バランスを効果的に調節しうる新規乳酸菌を見出した。本発明はかかる知見に基づくものである。【０００９】
本発明の一実施態様は以下の態様を包含する。
［１］ラクトバチルス  クリスパタス菌株であって、該菌株の１６ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子のヌクレオチド配列は配列番号１に示されるヌクレオチド配列と少なくとも９５％の同一性を有する、ラクトバチルス  クリスパタス菌株。
［２］前記同一性が９８％以上である、［１］に記載の菌株。
［３］受託番号ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２８６９の下寄託されたラクトバチルス  クリスパタス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｒｉｓｐａｔａｓ）  ＣＦＦ  Ｎｏ．２０３１である、［１］または［２］に記載の菌株。
［４］［１］〜［３］のいずれかに記載の菌株を含んでなる、組成物。
［５］医薬、飲食品、化粧品または飼料として用いるための、［４］に記載の組成物。
［６］乳幼児または未成年のための、［４］または［５］に記載の組成物。
［７］常在細菌叢に含まれる細菌の構成バランスを調節するための、［４］〜［６］のいずれか一項に記載の組成物。
［８］前記常在細菌叢に含まれる細菌が、ラクノスピラ科細菌、アシネトバクター属細菌、ムシスピリラム属細菌、プレボテラ属細菌およびバクテロイデス属細菌から選択される少なくとも１つのものである、［７］に記載の組成物。
［９］前記常在細菌叢が、粘膜付着細菌叢または腸内細菌叢である、［７］または［８］に記載の組成物。
［１０］炎症に関連する疾患または症状を抑制するための［４］〜［９］のいずれかに記載の組成物。
［１１］消化管の保護するための、［４］〜［１０］のいずれかに記載の組成物。
［１２］体重減少を抑制するための、［４］〜［１１］のいずれかに記載の組成物。
［１３］常在細菌叢に含まれる細菌構成バランス調節用組成物の製造における、ラクトバチルス  クリスパタス菌株の使用であって、該菌株の１６ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子のヌクレオチド配列は配列番号１に示されるヌクレオチド配列と少なくとも９５％の同一性を有する、使用。
［１４］常在細菌叢に含まれる細菌の構成バランスを調整する方法であって、それを必要とする対象にラクトバチルス  クリスパタス菌株の有効量を投与することを含んでなり、前記菌株の１６ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子のヌクレオチド配列は配列番号１に示されるヌクレオチド配列と少なくとも９５％の同一性を有する、方法。
【発明の効果】
【００１０】
本発明の一実施態様によれば、粘膜付着細菌叢または腸内細菌叢をはじめとする常在細菌叢における細菌構成バランスを効果的に調節することができる。本発明の一実施態様によれば、健常な常在細菌叢の形成を有利に促進することができる。本発明の乳酸菌株は、炎症に起因する疾病または状態を改善する上で有利に利用することができる。また、本発明の一実施態様によれば、乳酸菌株は、未成年または乳幼児等の子に摂取させて成長後の疾患を予防する上で有利に利用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１Ａ】例１において、対照群（Ｃ群）およびラクトバチルス  クリスパタス  ＣＦＦ  Ｎｏ．２０３１株投与群（Ｌ群）に関して盲腸の粘膜付着細菌叢のメタゲノム解析による主座標分析を行った結果を示すグラフ（縦軸パラメータ：Ａｘｉｓ  ２、横軸Ａｘｉｓ  １）である。
【図１Ｂ】例１において、対照群（Ｃ群）およびラクトバチルス  クリスパタス  ＣＦＦ  Ｎｏ．２０３１株投与群（Ｌ群）に関して盲腸の粘膜付着細菌叢のメタゲノム解析による主座標分析を行った結果を示すグラフ（縦軸パラメータ：Ａｘｉｓ  ２、横軸Ａｘｉｓ  ３）である。
【図２Ａ】例１において、盲腸の粘膜付着細菌叢のメタゲノム解析に基づき菌叢構造解析を行った結果を示すグラフである。
【図２Ｂ】例１において、盲腸の粘膜付着細菌叢に関して、ラクトバチルス  クリスパタス  ＣＦＦ  Ｎｏ．２０３１株投与群（Ｌ群）におけるＵｎｃｌａｓｓｉｆｉｅｄ  ｆ＿Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅの占有率と、対照群（Ｃ群）における当該占有率との比較結果を示すグラフである。
【図２Ｃ】例１において、盲腸の粘膜付着細菌叢に関して、ラクトバチルス  クリスパタス  ＣＦＦ  Ｎｏ．２０３１株投与群（Ｌ群）におけるムシスピリラム属細菌（Ｍｕｃｉｓｐｉｒｉｌｌｕｍ）の占有率と、対照群（Ｃ群）における当該占有率との比較結果を示すグラフである。
【図３Ａ】例１において、結腸の粘膜付着細菌叢のメタゲノム解析に基づき菌叢構造解析を行った結果を示すグラフである。
【図３Ｂ】例１において、結腸の粘膜付着細菌叢に関して、ラクトバチルス  クリスパタス  ＣＦＦ  Ｎｏ．２０３１株投与群（Ｌ群）におけるアシネトバクター属細菌（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ）の占有率と、対照群（Ｃ群）における当該占有率との比較結果を示すグラフである。
【図４Ａ】例１において、盲腸内容物の細菌叢のメタゲノム解析に基づき菌叢構造解析を行った結果を示すグラフである。
【図４Ｂ】例１において、盲腸内容物の細菌叢に関して、ラクトバチルス  クリスパタス  ＣＦＦ  Ｎｏ．２０３１株投与群（Ｌ群）におけるバクテロイデス属細菌（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ）の占有率と、対照群（Ｃ群）における当該占有率との比較結果を示すグラフである。
【図４Ｃ】例１において、盲腸内容物の細菌叢に関して、ラクトバチルス  クリスパタス  ＣＦＦ  Ｎｏ．２０３１株投与群（Ｌ群）におけるプレボテラ属細菌（［Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ]）の占有率と、対照群（Ｃ群）における当該占有率との比較結果を示すグラフである。
【図４Ｄ】例１において、盲腸内容物の細菌叢に関して、ラクトバチルス  クリスパタス  ＣＦＦ  Ｎｏ．２０３１株投与群（Ｌ群）におけるラクノスピラ科細菌（Ｕｎｃｌａｓｓｉｆｉｅｄ  Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ）の占有率と、対照群（Ｃ群）における当該占有率との比較結果を示すグラフである。
【図４Ｅ】例１において、結腸内容物の細菌叢のメタゲノム解析に基づき菌叢構造解析を行った結果を示すグラフである。
【図４Ｆ】例１において、結腸内容物の細菌叢に関して、ラクトバチルス  クリスパタス  ＣＦＦ  Ｎｏ．２０３１株投与群（Ｌ群）におけるバクテロイデス属細菌（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ）の占有率と、対照群（Ｃ群）における当該占有率との比較結果を示すグラフである。
【図４Ｇ】例１において、結腸内容物の細菌叢に関して、ラクトバチルス  クリスパタス  ＣＦＦ  Ｎｏ．２０３１株投与群（Ｌ群）におけるプレボテラ属細菌（Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ）の占有率と、対照群（Ｃ群）における当該占有率との比較結果を示すグラフである。
【図４Ｈ】例１において、結腸内容物の細菌叢に関して、ラクトバチルス  クリスパタス  ＣＦＦ  Ｎｏ．２０３１株投与群（Ｌ群）におけるプレボテラ属細菌（［Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ］）の占有率と、対照群（Ｃ群）における当該占有率との比較結果を示すグラフである。
【図５Ａ】例２における被験マウスの体重推移を示すグラフである。ＤＳＳ投与開始１日目（ｄ１）の体重を１００．００％とし、ＤＳＳ投与開始１１日目（ｄ１１）までの体重推移（％）を示している。
【図５Ｂ】例２における被験マウスのＤｉｓｅａｓｅ  Ａｃｔｉｖｉｔｙ  Ｉｎｄｅｘ（ＤＡＩ）の推移を示すグラフである。ＤＳＳ投与開始１日目（ｄ１）から１１日目（ｄ１１）までのＤＡＩスコアを示している。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明の一実施態様によれば、ラクトバチルス  クリスパタスに属する乳酸菌の新規菌株である、ラクトバチルス  クリスパタスＣＦＦ  Ｎｏ．２０３１菌株が提供される。
【００１３】
ラクトバチルス  クリスパタス  ＣＦＦ  Ｎｏ．２０３１菌株（以下、単に「ＣＦＦ  Ｎｏ．２０３１菌株」または「寄託菌株」ともいう。）は、ヒト母乳を分離源として分離された。同菌株の菌学的性質は、後述の実施例中に示す。同菌株は、２０１９年１月２９日に、独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センター（〒２９２−０８１８    千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８    １２２号室）に、受託番号ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２８６９の下で寄託されている。
【００１４】
本発明の乳酸菌株は、上記寄託菌株またはそれと実質的に同等の菌株であってもよい。上記寄託菌株またはそれと実質的に同等の菌株は、ラクトバチルス  クリスパタスに属する菌株であって、その１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子のヌクレオチド配列が、配列番号１で示される上記寄託菌株の１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子のヌクレオチド配列と少なくとも９５％の同一性を有するものである。また、上記同一性は、好ましくは９８％以上、より好ましくは９９％以上、さらに好ましくは９９．９％以上、さらに一層好ましくは１００％の同一性を有する。
【００１５】
本発明において、２つのヌクレオチド配列間の「同一性」同一性とは、比較される２つの配列間で、ベストアライメント（最適アライメント）の後に得られる同一のヌクレオチドのパーセントを意味し、このパーセントは単に統計学的なものであり、２つの配列間の違いはそれらの全長にわたりランダムに分布している。２つのヌクレオチド配列間の配列の比較は、通常、最適な方法でアライメントした後にこれらの配列を比較することによりなされるが、この場合、前記比較はセグメントごとに、または「比較ウィンドウ」ごとに行われてよい。比較のための配列の最適アライメントは、コンピューターソフトウエア（ＢＬＡＳＴ  Ｐ比較ソフトウエア）によって行うことができる。
【００１６】
また、上記実質的に同等の菌株は、好ましくは上記寄託菌株と機能的に同等である。上記実質的に同等の菌株が上記寄託菌株と機能的に同等か否かは、後述する実施例の例１および例２と同様の試験を行い統計的手法により有意差がない範囲であるか否かにより判定することができる。
【００１７】
上記実質的に同等の菌株は、好ましくは上記寄託菌株と同等に、常在細菌叢に含まれる細菌構成バランスの調節機能を有する。また、より好ましい実施態様によれば、上記常在細菌叢に含まれる細菌は、ラクノスピラ科細菌（Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ、Ｕｎｃｌａｓｓｉｆｉｅｄ Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅを含む）、アシネトバクター属細菌（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ）、ムシスピリラム属細菌（Ｍｕｃｉｓｐｉｒｉｌｌｕｍ）、プレボテラ属細菌（Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ、［Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ］を含む）、またはバクテロイデス属細菌（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ）である。ここで、上記菌株の分類は、ソフトウェアｐｈｙｌｏｓｅｑ（ｈｔｔｐｓ：／／ｊｏｅｙ７１１．ｇｉｔｈｕｂ．ｉｏ／ｐｈｙｌｏｓｅｑ）および当該ソフトウェアの参照するＧｒｅｅｎｇｅｎｅｓの分類に従うものとする。また、さらに好ましい実施態様によれば、上記実質的に同等の菌株は、上記寄託菌株と同等に、上記常在細菌叢におけるラクノスピラ科細菌、アシネトバクター属細菌、プレボテラ属細菌またはバクテロイデス属細菌の減少活性を有する。また、さらに別の好ましい実施態様によれば、上記実質的に同等の菌株は、上記寄託菌株と同等に、上記常在細菌叢におけるムシスピリラム属細菌の増加活性を有する。また、別の好ましい実施態様によれば、上記実質的に同等の菌株は、上記寄託菌株と同等に、それを投与した対象における腸管炎症時の下痢等に起因する体重減少の抑制活性を有する。また、別のより好ましい実施態様によれば、上記実質的に同等の菌株は、上記寄託菌株と同等に、それを投与した対象における腸炎発症時のＤＡＩスコアの抑制活性を有する。また、上記常在細菌叢は、好ましくは粘膜付着細菌叢または腸内細菌叢である。
【００１８】
本発明の乳酸菌株には、本発明の効果が損なわれない限り、寄託菌株またはそれと実質的に同等の菌株から、変異処理、遺伝子組換え、自然変異株の選択等によって育種された菌株も包含される。
【００１９】
本発明の乳酸菌株は、例えば、同菌株を培養することにより容易に増殖させることができる。培養する方法は、ＣＦＦ  Ｎｏ．２０３１菌株が増殖できる限り特に限定されず、乳酸菌の培養に通常用いられる方法を必要により適宜修正して用いることができる。例えば、培養温度は２５〜５０℃でよく、３５〜４２℃であることが好ましい。また培養は好気条件下、および嫌気条件下のいずれで行ってもよいが、嫌気条件下で行うことが好ましく、例えば、炭酸ガス等の嫌気ガスを通気しながら培養することができる。また、液体静置培養等の微好気条件下で培養してもよい。
【００２０】
本発明の乳酸菌株を培養する培地としては、特に限定されず、乳酸菌の培養に通常用いられる培地を必要により適宜修正して用いることができる。すなわち、炭素源としては、例えば、ガラクトース、グルコース、フルクトース、マンノース、セロビオース、マルトース、ラクトース、スクロース、トレハロース、デンプン、デンプン加水分解物、廃糖蜜等の糖類を資化性に応じて使用できる。窒素源としては、例えば、アンモニア、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、硝酸アンモニウムなどのアンモニウム塩類や硝酸塩類を使用できる。また、無機塩類としては、例えば、塩化ナトリウム、塩化カリウム、リン酸カリウム、硫酸マグネシウム、塩化カルシウム、硝酸カルシウム、塩化マンガン、硫酸第一鉄等を用いることができる。また、ペプトン、大豆粉、脱脂大豆粕、肉エキス、酵母エキス等の有機成分を用いてもよい。また、調製済みの培地としては、例えばＭＲＳ培地を好適に用いることができる。
【００２１】
本発明の乳酸菌株としては、培養後、得られた培養物をそのまま用いてもよく、希釈または濃縮して用いてもよく、培養物から回収した菌体を用いてもよい。また、本発明の効果を損なわない限り、培養後に加熱、および凍結乾燥等の種々の追加操作を行うことができる。
【００２２】
本発明の乳酸菌株は、生菌であることが好ましいが、死菌であってもよい。
【００２３】
本発明の乳酸菌株は、そのまま使用してもよく、所望により、天然または他の添加物と共に組成物の形態で用いてもよい。
【００２４】
本発明の乳酸菌株は、対象における常在細菌叢に含まれる細菌構成バランスの調節機剤として利用することができる。したがって、本発明の乳酸菌株を含んでなる組成物は、好ましくは対象における常在細菌叢に含まれる細菌構成バランスの調節用組成物として用いられる。また、より好ましい実施態様によれば、上記組成物は、上記常在細菌叢におけるラクノスピラ科細菌、アシネトバクター属細菌、プレボテラ属細菌、またはバクテロイデス属細菌を減少させるために用いられる。また、別のより好ましい実施態様によれば、上記組成物は、上記常在細菌叢におけるムシスピリラム属細菌を増加するために用いられる。また、さらに別の好ましい施態様によれば、上記組成物は、それを投与した対象における腸炎発症時の下痢に起因する体重減少を抑制するために用いられる。また、さらに別の好ましい実施態様によれば、上記組成物は、それを投与した対象における腸炎発症時のＤＡＩスコアを抑制活性するために用いられる。また、さらに別のより好ましい実施態様によれば、上記組成物は、それを投与した対象における粘膜の炎症を抑制し、下痢または便出血を抑制するために用いられる。
【００２５】
また、本発明の乳酸菌株は、常在細菌叢中の炎症に関与する細菌の量を減少させるために利用することができる。したがって、別の実施態様によれば、本発明の組成物は、炎症に関連する疾患または症状を抑制するために用いられる。
【００２６】
本発明における常在細菌叢は、好ましくは粘膜付着細菌叢または腸内細菌叢である。
【００２７】
本発明の組成物は、好ましくは医薬、飲食品、化粧品または飼料として使用することができる。
【００２８】
医薬は、本発明の乳酸菌株を含有する限り特に制限されない。医薬としては、本発明の乳酸菌株を薬学的に許容可能な担体と共に製剤化して使用してもよい。
【００２９】
本発明の医薬の剤形は特に制限されず、具体的には、錠剤、丸剤、散剤、液剤、懸濁剤、乳剤、顆粒剤、カプセル剤、シロップ剤、坐剤、注射剤、軟膏剤、貼付剤、点眼剤および点鼻剤等を例示できる。また、製剤化にあたっては、製剤担体として通常使用される賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、安定剤、矯味矯臭剤、希釈剤、界面活性剤または注射剤用溶剤等の添加剤を使用することができる。
【００３０】
本発明の医薬における乳酸菌の含有量は、剤形、用法、患者の年齢、性別、疾患の種類、疾患の程度、およびその他の条件等により適宜設定されるが、通常、１×１０６〜１×１０１２ｃｆｕ／ｇまたは１×１０６〜１×１０１２ｃｆｕ／ｍｌの範囲内であることが好ましく、１×１０７〜１×１０１１ｃｆｕ／ｇまたは１×１０７〜１×１０１１ｃｆｕ／ｍｌの範囲内であることがより好ましい。ＣＦＦ  Ｎｏ．２０３１菌株が死菌の場合、ｃｆｕ／ｇまたはｃｆｕ／ｍｌは、個細胞／ｇまたは個細胞／ｍｌと置き換えることができる。
【００３１】
飲食品は、本発明の乳酸菌株を含有する限り特に制限されず、飲食品としては、清涼飲料、炭酸飲料、栄養飲料、果汁飲料、および乳酸菌飲料等の飲料（これらの飲料の濃縮原液および調製用粉末を含む）；アイスクリーム、シャーベット、かき氷等の氷菓；飴、チューインガム、キャンディー、ガム、チョコレート、錠菓、スナック菓子、ビスケット、ゼリー、ジャム、クリーム、および焼き菓子等の菓子類；加工乳、乳飲料、発酵乳、ドリンクヨーグルト、およびバター等の乳製品；パン；経腸栄養食、流動食、育児用ミルク、スポーツ飲料；その他機能性食品等が例示される。また、飲食品は、サプリメントであってもよく、例えばタブレット状のサプリメントであってもよい。サプリメントである場合には、一日当りの食事量および摂取カロリーについて他の食品に影響されることなく、ＣＦＦ  Ｎｏ．２０３１菌株を摂取できる。
【００３２】
飲食品は、飲食品の原料に本発明の乳酸菌株を添加することにより製造することができ、本発明の乳酸菌株を添加すること以外は、通常の飲食品と同様にして製造することができる。本発明の乳酸菌株の添加は、飲食品の製造工程のいずれの段階で行ってもよい。また、添加した本発明の乳酸菌株による発酵工程を経て、飲食品が製造されてもよい。そのような飲食品としては、乳酸菌飲料および発酵乳等が挙げられる。
【００３３】
食品または飲料の原料としては、通常の飲料や食品に用いられている原料を使用することができる。
【００３４】
本発明の飲食品には、飲食品製造のための原料、および食品添加物等、飲食品の製造工程または製造後に飲食品に添加されるものも含まれる。例えば、本発明の乳酸菌株は、発酵乳製造用スターターとして使用することができる。また、本発明の乳酸菌株を、製造された発酵乳に後から添加することもできる。
【００３５】
飲食品における本発明の乳酸菌株の含有量は、飲食品の態様によって適宜設定されるが、通常、飲食品中に、１×１０６〜１×１０１２ｃｆｕ／ｇまたは１×１０６〜１×１０１２ｃｆｕ／ｍｌの範囲内であることが好ましく、１×１０７〜１×１０１１ｃｆｕ／ｇまたは１×１０７〜１×１０１１ｃｆｕ／ｍｌの範囲内であることがより好ましい。
【００３６】
本発明の飲食品は、常在細菌叢に含まれる細菌構成バランスの調節用、常在細菌叢におけるラクノスピラ科細菌、アシネトバクター属細菌、バクテロイデス属細菌またはプレボテラ属細菌の減少用、粘膜付着細菌叢または腸内細菌叢におけるムシスピリラム属細菌の増加用、体重減少の抑制用、ＤＡＩスコアの抑制用、下痢または便出血の抑制用、炎症に関与する菌株の減少用、炎症に関連する疾患または症状の抑制用等の用途が表示された飲食品として販売することができる。
【００３７】
また、本発明の飲食品には、「常在細菌叢に含まれる細菌の構成バランスの調節用」、「常在細菌叢におけるラクノスピラ科細菌、アシネトバクター属細菌、バクテロイデス属細菌またはプレボテラ属細菌の減少用」、「常在細菌叢におけるムシスピリラム属細菌の増加用」、「体重減少の抑制用」、「ＤＡＩスコアの抑制用」、「下痢または便出血の抑制用」、「炎症に関与する細菌の減少用」、「炎症に関連する疾患または症状の抑制用」等の表示をすることができる。また、これ以外でも、上記用途への組成物の使用によって二次的に生じる効果を表す文言であれば、使用できることはいうまでもない。かかる文言としては、例えば、「おなかの調子を整える」、「胃部または腸部不快感の改善」等が挙げられる。
【００３８】
前記「表示」とは、需要者に対して上記用途を知らしめるための全ての行為を意味し、上記用途を想起・類推させうるような表示であれば、表示の目的、表示の内容、表示する対象物および媒体等の如何に拘わらず、すべて本発明の「表示」に該当する。しかしながら、需要者が上記用途を直接的に認識できるような表現により表示することが好ましい。
【００３９】
具体的には、本発明の飲食品に係る商品または商品の包装に上記用途を記載する行為、商品または商品の包装に上記用途を記載したものを譲渡し、引渡し、譲渡若しくは引渡しのために展示し、輸入する行為、商品に関する広告、価格表若しくは取引書類に上記用途を記載して展示し、若しくは頒布し、またはこれらを内容とする情報に上記用途を記載して電磁気的（インターネット等）方法により提供する行為等が例示でき、特に包装、容器、カタログ、パンフレット、ＰＯＰ等の販売現場における宣伝材、その他の書類等への表示が好ましい。
【００４０】
また、表示としては、行政等によって許可された表示（例えば、行政が定める各種制度に基づいて認可を受け、そのような認可に基づいた態様で行う表示）であることが好ましい。例えば、健康食品、機能性食品、経腸栄養食品、特別用途食品、栄養機能食品、医薬用部外品等としての表示を例示することができ、その他厚生労働省によって認可される表示、例えば、特定保健用食品、これに類似する制度にて認可される表示を例示できる。後者の例としては、特定保健用食品としての表示、条件付き特定保健用食品としての表示、身体の構造や機能に影響を与える旨の表示、疾病リスク低減表示等を例示することができる。さらに詳細には、健康増進法施行規則（平成１５年４月３０日日本国厚生労働省令第８６号）に定められた特定保健用食品としての表示（特に保健の用途の表示）、およびこれに類する表示等を例示することができる。
【００４１】
本発明の化粧品は、上記医薬または飲食品に準じて調製して内服用美容剤として用いてもよいが、局所用または全身用の皮膚外用剤としてもよい。皮膚外用剤の好適な例としては、化粧水、乳液、クリーム、軟膏、ローション、オイル、パック等の基礎化粧料、固形石鹸、液体ソープ、ハンドウォッシュ等の洗顔料や皮膚洗浄料、マッサージ用剤、クレンジング用剤、除毛剤、脱毛剤、髭剃り処理料、アフターシェーブローション、プレショーブローション、シェービングクリーム、ファンデーション、口紅、頬紅、アイシャドウ、アイライナー、マスカラ等のメークアップ化粧料、香水類、美爪剤、美爪エナメル、美爪エナメル除去剤、パップ剤、プラスター剤、テープ剤、シート剤、貼付剤、エアゾール剤等が挙げられる。
【００４２】
本発明の化粧品におけるＣＦＦ  ＮＯ．２０３１菌株の含有量は、化粧品の態様や投与対象によって適宜設定されるが、１×１０６〜１×１０１２ｃｆｕ／ｇまたは１×１０６〜１×１０１２ｃｆｕ／ｍｌの範囲内であることが好ましく、１×１０７〜１×１０１１ｃｆｕ／ｇまたは１×１０７〜１×１０１１ｃｆｕ／ｍｌの範囲内であることがより好ましい。
【００４３】
また、化粧品には、必要に応じ以下に例示する添加成分を任意に選択・併用して製造することができる。かかる添加成分としては、特に限定されないが、油脂類（カカオ脂、カミツレ油、カロット油、キューカンバー油、牛脂脂肪酸、ククイナッツ油、サフラワー油、シア脂等）、ロウ類（ミツロウ、カルナバロウ、鯨ロウ、ラノリン、液状ラノリン、還元ラノリン、硬質ラノリン、カンデリラロウ、モンタンロウ、セラックロウ、ライスワックス等）、鉱物油（流動パラフィン、ワセリン、パラフィン、オゾケライド、セレシン、マイクロクリスタンワックス等）、脂肪酸類（ラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、ベヘン酸、オレイン酸、リノール酸、リノレン酸、ドコサヘキサエン酸、エイコサペンタエン酸、12-ヒドロキシステアリン酸、ウンデシレン酸、トール油、ラノリン脂肪酸等の天然脂肪酸、イソノナン酸、カプロン酸、2-エチルブタン酸、イソペンタン酸、2-メチルペンタン酸、2-エチルヘキサン酸、イソペンタン酸等の合成脂肪酸）、アルコール類（エタノール、イソプロパノール、ラウリルアルコール、セタノール、ステアリルアルコール、オレイルアルコール、ラノリンアルコール、コレステロール、フィトステロール、フェノキシエタノール等の天然アルコール、2-ヘキシルデカノール、イソステアリルアルコール、2-オクチルドデカノール等の合成アルコール等）、各種ビタミン類（ビタミンＡ群：レチノール、レチナール（ビタミンＡ１）、デヒドロレチナール（ビタミンＡ２）、カロチン、リコピン（プロビタミンＡ）、ビタミンＢ群：チアミン塩酸塩、チアミン硫酸塩（ビタミンＢ１）、リボフラビン（ビタミンＢ２）、ピリドキシン（ビタミンＢ６）、シアノコバラミン（ビタミンＢ１２）、葉酸類、ニコチン酸類、パントテン酸類、ビオチン類、コリン、イノシトール類、ビタミンＣ群：ビタミンＣ酸又はその誘導体、ビタミンＤ群：エルゴカルシフェロール（ビタミンＤ２）等）、高分子化合物（アラビアゴム、ベンゾインゴム、ダンマルゴム、グアヤク脂、キトサン、ヒアルロン酸又はその塩、コンドロイチン硫酸又はその塩、エチルセルロース、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、カルボキシエチルセルロース、カルボキシエチルセルロースナトリウム、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ニトロセルロース、結晶セルロース、ポリビニルアルコール、ポリビニルメチルエーテル、ポリビニルピロリドン、ポリビニルメタアクリレート、ポリアクリル酸塩、ポリエチレンオキサイドやポリプロピレンオキサイド等のポリアルキレンオキサイド又はその架橋重合物、カルボキシビニルポリマー、ポリエチレンイミン等）等が挙げられる。
【００４４】
本発明の飼料としては、ペットフード、家畜飼料、および養魚飼料等が例示される。本発明の飼料は、一般的な飼料、例えば、穀類、粕類、糠類、魚粉、骨粉、油脂類、脱脂粉乳、ホエー、鉱物質飼料、または酵母類等にＣＦＦ  ＮＯ．２０３１菌株を混合することにより製造することができる。また、例えばサイレージの様に、添加したＣＦＦ  ＮＯ．２０３１菌株による発酵工程を経て、飼料が製造されてもよい。製造された飼料は、一般的な哺乳動物、家畜類、養魚類、および愛玩動物等に経口的に投与することが可能である。
【００４５】
本発明の飼料におけるＣＦＦ  ＮＯ．２０３１菌株の含有量は、飼料の態様や投与対象によって適宜設定されるが、１×１０６〜１×１０１２ｃｆｕ／ｇまたは１×１０６〜１×１０１２ｃｆｕ／ｍｌの範囲内であることが好ましく、１×１０７〜１×１０１１ｃｆｕ／ｇまたは１×１０７〜１×１０１１ｃｆｕ／ｍｌの範囲内であることがより好ましい。
【００４６】
また、別の態様によれば、常在細菌叢に含まれる細菌の構成バランスを調整する方法であって、それを必要とする対象に本発明の乳酸菌株の有効量を投与することを含んでなる方法が提供される。本発明の別の好ましい態様によれば、上記方法は、炎症に関与する菌（例えば、常在細菌叢におけるラクノスピラ科細菌、アシネトバクター属細菌、バクテロイデス属細菌またはプレボテラ属細菌等）を減少させるための方法である。また、別のより好ましい態様によれば、上記方法は、常在細菌叢におけるムシスピリラム属細菌の増加のための方法である。また、別のさらに好ましい態様によれば、上記方法は、腸炎発症の下痢に起因する体重減少、ＤＡＩスコア、下痢または便出血から選択される少なくとも一つの症状の抑制のための方法である。
【００４７】
また、別の態様によれば、炎症に関連する疾患または症状の抑制方法であって、それを必要とする対象に本発明の乳酸菌株の有効量を投与することを含んでなる方法が提供される。ここで、「抑制」には、確立された病態を治療または改善するだけでなく、将来確立される可能性のある病態を予防することをも含む。
【００４８】
上記炎症に関連する疾患または症状としては、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、具体的には潰瘍性大腸炎（ＵＣ）やクローン病（ＣＤ）等が挙げられる。
【００４９】
また、一つの態様によれば、本発明の方法は医療行為を除く。別の態様によれば、本発明の方法は非治療的方法である。
【００５０】
本発明の乳酸菌株の有効量は、本発明の効果を妨げない限り特に限定されず、例えば、１．０×１０４ｃｆｕ／回〜１．０×１０１２ｃｆｕ／回とすることができる。一つの態様によれば、ＣＦＦ  ＮＯ．２０３１菌株の有効量は、一食当たりの摂取量とされる。
【００５１】
本発明の乳酸菌株の有効量は、１日１回または複数回に分けて投与することができ、また、数日または数週間に１回の投与としてもよい。また、対象の状態等に応じて、適宜投与時期を選択することが可能である。
【００５２】
本発明の対象は、好ましくはヒトであり、より好ましくは１５才以下の未成年であり、さらに好ましくは乳幼児である。乳幼児に本発明の乳酸菌株を適用することは、母乳の代替えとして粘膜付着細菌叢または腸内細菌叢に含まれる細菌の構成バランスを調節する上で特に有利である。
【００５３】
また、本発明の乳酸菌株は、一時期に限らず継続的に投与してよいが、乳幼児期の一時期に投与してもよい。本発明の乳酸菌株を乳幼児期に投与することは、成長後の疾患を予防する上でも特に有利である。
【００５４】
また、対象は、健常者であってもよく、胃腸管における炎症に関連した疾患または症状を有する者あるいはそれに起因して身体の不調を有する者であってもよい。
【００５５】
また、本発明における投与方法は、経口が好ましい。しかしながら、本発明の効果を妨げない限り特に限定されず、例えば、経管、経腸、経皮（塗布等）等の他の方法により本発明の乳酸菌株を対象に投与させてさせてもよい。
【００５６】
また、別の態様によれば、常在細菌叢に含まれる細菌構成バランス調整用組成物の製造における、本発明の乳酸菌株の使用が提供される。好ましい態様によれば、上記組成物は、炎症に関与する菌（例えば、常在細菌叢におけるラクノスピラ科細菌、アシネトバクター属細菌、プレボテラ属細菌またはバクテロイデス属細菌等）の減少用組成物である。また、別の好ましい態様によれば、上記組成物は、常在細菌叢におけるムシスピリラム属細菌の増加用組成物である。また、別のより好ましい態様によれば、上記組成物は、腸炎発症の下痢に起因する体重減少、ＤＡＩスコア、下痢または便出血から選択される少なくとも一つの症状の抑制のための組成物である。
【００５７】
また、別の好ましい態様によれば、炎症に関連する疾患または症状の抑制用組成物の製造における、本発明の乳酸菌株の使用が提供される。
【実施例】
【００５８】
以下、本発明の実施例を説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。【００５９】
例１：粘膜付着細菌叢および腸内細菌叢に対する乳酸菌投与の影響の確認試験
日本ＳＬＣから購入した２週齢のＣ５７ＢＬ／６Ｎマウスを７日間の施設馴化の後、３週齢で離乳させた。次に、マウスを体重が均等になるように、対照群（Ｃ群）およびラクトバチルス  クリスパタス  ＣＦＦ  Ｎｏ．２０３１株投与群（Ｌ群）の２群（ｎ＝６）に分けて飼育管理した。離乳後のマウスにはマウス・ラット・ハムスター用ラボＭＲストック（日本農産工業）を自由に摂取させかつ未滅菌の水を自由に摂取させた。飼育室は８時点灯、２０時消灯の１２時間明暗周期で、室温は２５±２℃に設定した。【００６０】
離乳日の翌日から各被験物質の経口投与を開始し、１４日間経口投与を行った。Ｃ群にはＰＢＳ（−）を、Ｌ群にはラクトバチルス  クリスパタス  ＣＦＦ  Ｎｏ．２０３１株を経口投与した。経口投与する際の液量はマウスの体重により調節し、体重１２．５ｇ未満であれば１００μｌ、１２．５以上１７．５ｇ未満であれば１５０μｌとした。【００６１】
経口投与用の器具としては１ｍｌシリンジ（ＴＥＲＵＭＯ）を使用した。なお、１ｍｌシリンジには、経口投与時に、適当な長さに切断して先端を焼いて丸く加工したチューコーフローＰＴＦＥチューブＡＷＧ−２６（中興化生工業）を装着してオートクレーブ滅菌した２３Ｇ針（ＴＥＲＵＭＯ）を装着した。【００６２】
マウスに経口投与したラクトバチルス  クリスパタス  ＣＦＦ  Ｎｏ．２０３１株含有液は、次のように調製した。−８０℃で保存されたＬ．ｃｒｉｓｐａｔａｓ  ＣＦＦ  Ｎｏ．２０３１株を１０ｍｌのＭＲＳ培地に植菌し、嫌気条件下で３７℃２４時間培養し、前培養液とした。この前培養液を冷蔵保存し、毎日の乳酸菌株含有液の調製に使用した。菌株含有液は、経口投与の前日に前培養液から２００μｌ取り出して新たな１０ｍｌのＭＲＳ培地に植え継ぎ、前培養と同条件で培養したものを使用した。培養終了後、１０，０００×ｇにて室温で３分間遠心分離し、菌体をペレットにしたのち、ＰＢＳ（−）で洗浄し、濁度（ＯＤ５９５）を基準にして、５×１０９ｃｆｕ／ｍｌになるようにＰＢＳ（−）に懸濁し、乳酸菌株含有液とした。【００６３】
経口投与終了後７日間を被験物質のウォッシュアウト期間（休止期間）とし、経口投与を行わず飼育した。【００６４】
ウォッシュアウト期間終了後（マウスが６週齢に達した後）、すべてのマウスを解剖し、盲腸粘膜と盲腸内容物、および結腸粘膜と結腸内容物をそれぞれ採取した。【００６５】
採取した各組織の粘膜および内容物からＱｕｉｃｋＧｅｎｅ  ＤＮＡ  ｔｉｓｓｕｅ  ｋｉｔ  Ｓ（ＫＵＲＡＢＯ）を用いて細菌ＤＮＡを抽出した。抽出した細菌ゲノムＤＮＡを鋳型として、１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子のＶ３−Ｖ４領域をＫＡＰＡ  ＨｉＦｉ  ＨＳ  Ｒｅａｄｙ  Ｍｉｘ（日本ジェネティクス）を用いたＰＣＲ反応により増幅した。この反応には、２ｎｄＰＣＲ用の配列がテイルとしてついているフォワードプライマー３４１Ｆ（配列番号２：５’−ＴＣＧＴＣＧＧＣＡＧＣＧＴＣＡＧＡＴＧＴＧＴＡＴＡＡＧＡＧＡＣＡＧＣＣＴＡＣＧＧＧＮＧＧＣＷＧＣＡＧ−３’）と、リバースプライマー８０５Ｒ（配列番号３：５’−ＧＴＣＴＣＧＴＧＧＧＣＴＣＧＧＡＧＡＴＧＴＧＴＡＴＡＡＧＡＧＡＣＡＧＧＡＣＴＡＣＨＶＧＧＧＴＡＴＣＴＡＡＴＣＣ−３’）を用いた。ＫＡＰＡ  ＨＩＦＩ  ＨＳ  Ｒｅａｄｙ  Ｍｉｘ  １２．５μｌ、鋳型ＤＮＡ  ２．５μｌ、プライマー各０．０５μｌ、ｆｒｅｅ  ｗａｔｅｒ  ９．９μｌの全量２５μｌを反応液としてＰＣＲを行った。９５℃  ３分間の初期変性の後、９５℃  ３０秒間、５５℃  ３０秒間、７２℃  ３０秒間の温度サイクルを２５サイクル、最後に７２℃  ５分間の伸長反応を行った。ＰＣＲ反応終了後、１％アガロースゲル（ｔｒｉｓ  ａｃｅｔａｔｅ  ＥＤＴＡ  ：ＴＡＥ）を用いて電気泳動を行い、目的の遺伝子が増幅されていることを確認した。その後、ＮｕｃｌｅｏＦａｓｔ  ９６  ＰＣＲ  Ｃｌｅａｎ  ｕｐ  ｐｌａｔｅ  （タカラバイオ）を使用してＰＣＲ産物を精製した。ＩｎｄｅｘおよびＩｌｌｕｍｉｎａ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ａｄａｐｔｅｒを負荷したプライマーを用いた２回目のＰＣＲ反応により、精製産物のタグ付けを行った。【００６６】
ＳｅｑｕａｌＰｒｅｐＴＭＮｏｒｍａｌｉｚａｔｉｏｎ  Ｐｌａｔｅ  Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、ＰＣＲにより得られた産物の精製および濃度調製を行った。次いで、ＫＡＰＡ  ＳＹＢＲ  Ｆａｓｔ  ｑＰＣＲ  Ｋｉｔ（日本ジェネティクス）を用いたｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  ＰＣＲによって精製産物の濃度の定量を行った。十分に濃度が得られたサンプルを１サンプル当たり１０μｌずつ混合し、Ａｇｅｎｃｏｕｅｔ  ＡＭＰｕｒｅ  ＸＰ（ＢＥＣＫＭＡＮ  ＣＯＵＬＴＥＲ）を用いて精製・濃縮した。【００６７】
得られたライブラリーの濃度をＫＡＰＡ  Ｌｉｂｒａｒｙ  Ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（日本ジェネティクス）の標準プロトコルに従い、算出した。その後、求めた濃度をもとにサンプルを１０  ｍＭ  Ｔｒｉｓ  Ｂｕｆｆｅｒで４ｎＭに希釈した。その後の操作は、１６Ｓ  Ｍｅｔａｇｅｎｏｍｉｃ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｌｉｂｒａｒｙ  Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  （Ｉｌｌｕｍｉｎａ）に従い、最終調製を行った。調製したサンプルをＭｉｓｅｑ  Ｒｅａｇｅｎｔ  Ｋｉｔ  Ｖ３（６００ＰＥ）の試薬カートリッジにアプライし、ＭｉＳｅｑ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）によるシーケンスを行った。得られたシーケンスデータはＱＩＩＭＥによる一次解析の後、ＳＴＡＭＰを使用して二次解析を行った。【００６８】
結果は、図１〜４に示される通りであった。
図１Ａおよび図１Ｂは、盲腸の粘膜付着細菌叢のメタゲノム解析による主座標分析の結果である。上記分析には、ｐｈｙｌｏｓｅｑ（ｈｔｔｐｓ：／／ｊｏｅｙ７１１．ｇｉｔｈｕｂ．ｉｏ／ｐｈｙｌｏｓｅｑ／参照）を用いた。したがって、図２Ａ、図３Ａ、図４Ａ〜図４Ｈに示される菌の分類は、ｐｈｙｌｏｓｅｑおよび当該ソフトウェアが参照するＧｒｅｅｎｇｅｎｅｓの分類に従う。メタゲノム解析による主座標分析の結果、ラクトバチルス  クリスパタス  ＣＦＦ  Ｎｏ．２０３１株投与群（Ｌ群）では、対照群（Ｃ群）と比較して盲腸の粘膜付着細菌叢の構成に変化が確認された（ＰＥＲＭＡＮＯＶＡ  ｐ＝０．００２）。【００６９】
盲腸の粘膜付着細菌叢のメタゲノム解析による菌叢構造解析結果は、図２Ａに示される通りであった。また、盲腸の粘膜付着細菌叢に関して、ラクトバチルス  クリスパタス  ＣＦＦ  Ｎｏ．２０３１株投与群（Ｌ群）におけるラクノスピラ科細菌（Ｕｎｃｌａｓｓｉｆｉｅｄ  Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ）の占有率は、対照群における当該占有率（ｐｒｏｐｏｒｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ（％））と比較して有意に低かった（図２Ｂ、Ｗｉｌｃｏｘｏｎ／Ｋｒｕｓｋａｌ−Ｗａｌｌｉｓの検定（順位和）、ｐ＜０．０５）。一方で、ラクトバチルス  クリスパタス  ＣＦＦ  Ｎｏ．２０３１株投与群（Ｌ群）におけるムシスピリラム属細菌の占有率は対照群における当該占有率と比較して有意に高かった（図２Ｃ、Ｗｉｌｃｏｘｏｎ／Ｋｒｕｓｋａｌ−Ｗａｌｌｉｓの検定（順位和）、ｐ＜０．０５）。【００７０】
結腸の粘膜付着細菌叢のメタゲノム解析による菌叢構造解析結果は、図３Ａに示される通りであった。結腸の粘膜付着細菌叢に関して、ラクトバチルス  クリスパタス  ＣＦＦ  Ｎｏ．２０３１株投与群（Ｌ群）におけるアシネトバクター属細菌の占有率は、対照群（Ｃ群）における当該占有率と比較して有意に低かった（図３Ｂ、Ｗｉｌｃｏｘｏｎ／Ｋｒｕｓｋａｌ−Ｗａｌｌｉｓの検定（順位和）、ｐ＜０．０５）。【００７１】
ラクノスピラ科細菌およびアシネトバクター属細菌は、腸管の炎症時に増加することが知られている（非特許文献２〜５）。したがって、これらの細菌がラクトバチルス  クリスパタス  ＣＦＦ  Ｎｏ．２０３１株の投与により減少するという結果からラクトバチルス  クリスパタス  ＣＦＦ  Ｎｏ．２０３１株は消化管の炎症を抑制しうる効果を有すると考えられる。また、Ｍｕｃｉｓｐｉｒｉｌｌｕｍは粘液を資化する細菌である。この細菌が増加したという結果から、ラクトバチルス  クリスパタス  ＣＦＦ  Ｎｏ．２０３１株の投与により、消化管粘膜は粘液で十分に満たされたと考えられる。
以上のことから、ラクトバチルス  クリスパタス  ＣＦＦ  Ｎｏ．２０３１株は消化管粘膜のバリア機能を高める効果を有すると考えられる。【００７２】
盲腸内容物の細菌叢のメタゲノム解析による菌叢構造解析結果は、図４Ａに示される通りであった。また、盲腸内容物の細菌叢に関して、図４Ｂに示される通り、ラクトバチルス  クリスパタス  ＣＦＦ  Ｎｏ．２０３１株投与群（Ｌ群）におけるバクテロイデス属（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ）の占有率は、対照群と比較して有意に低かった（ステューデントのt検定、ｐ＝０．０４８４）。また、図４Ｃに示される通り、Ｌ群におけるプレボテラ属細菌（［Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ］）の占有率は、対照群と比較して有意に低かった（ステューデントのt検定、ｐ＝０．０４３０）。また、図４Ｄに示される通り、Ｌ群におけるラクノスピラ科細菌（Ｕｎｃｌａｓｓｉｆｉｅｄ  Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ）の占有率は、対照群と比較して有意に低かった（ステューデントのt検定、ｐ＜０．０００１）。さらに、Ｌ群におけるラクトバシルス属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）の占有率は、対照群と比較して有意に高かった（ステューデントのt検定、ｐ＝０．０４０９）。【００７３】
結腸内容物の細菌叢のメタゲノム解析による菌叢構造解析結果は、図４Ｅに示される通りであった。結腸内容物の細菌叢に関して、図４Ｆに示される通り、Ｌ群におけるバクテロイデス属細菌（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ）の占有率は、対照群と比較して有意に低かった（ステューデントのt検定、ｐ＝０．０００４）。また、図４Ｇに示される通り、Ｌ群におけるプレボテラ属（Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ）の占有率は、対照群と比較して有意に低かった（Ｗｉｌｃｏｘｏｎ／Ｋｒｕｓｋａｌ−Ｗａｌｌｉｓの検定（順位和）、ｐ＝０．０１３１）。また、図４Ｈに示される通り、Ｌ群におけるプレボテラ属細菌（［Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ］）の占有率は、対照群と比較して有意に低かった（ステューデントのt検定、ｐ＝０．００７２）。【００７４】
プレボテラ属細菌およびバクテロイデス属細菌は、腸管および全身の炎症時に増加することが知られている（非特許文献６〜８）。したがって、これらの細菌がラクトバチルス  クリスパタス  ＣＦＦ  Ｎｏ．２０３１株の投与により減少するという結果からラクトバチルス  クリスパタス  ＣＦＦ  Ｎｏ．２０３１株は消化管の炎症を抑制しうる効果を有すると考えられる。以上のことから、ラクトバチルス  クリスパタス  ＣＦＦ  Ｎｏ．２０３１株は消化管粘膜の炎症を抑制する効果を有すると考えられる。【００７５】
例２：乳酸菌投与による消化管バリア機能増強試験
日本チャールズリバーから母マウスと併せて購入した２週齢のＣ５７ＢＬ／６Ｎマウス  ２腹（各腹６匹）  を当研究室の飼育室に導入し、７日間の施設馴致を行った。仔マウスを３週齢で離乳させ、体重が均等になるよう対照群（Ｃ群）、ラクトバチルス  クリスパタス  ＣＦＦ  Ｎｏ．２０３１株投与群（Ｌ群）の２群  （Ｎ＝６）に分け飼育管理した。例１と同様に離乳日の翌日からＤＣ群にはＰＢＳ（−）、ＤＬ群にはラクトバチルス  クリスパタス  ＣＦＦ  Ｎｏ．２０３１株の経口投与を開始し、１４日間経口投与を行った。経口投与終了後から７日間を投与した菌のｗａｓｈ  ｏｕｔ期間とし、経口投与を行わず飼育した。ｗａｓｈ  ｏｕｔ期間が終了しマウスが６週齢に達したところで、例２では１．５％ＤＳＳ（蒸留水にＤｅｘｔｒａｎ  Ｓｕｌｆａｔｅ  Ｓｏｄｉｕｍ  （ＤＳＳ）  ｓａｌｔ，  Ｃｏｌｉｔｉｓ  ｇｒａｄｅ  （ＭＰ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ  Ｍ．Ｗ  ３６−５０ｋＤａ）を１５  ｇ／ｌで溶解した）を水道水に替えて飲水として自由摂取させた。ＤＳＳ投与１１日目に全てのマウスを解剖に供した。【００７６】
なお、離乳後の特に記載のない期間は、マウス・ラット・ハムスター用ラボＭＲストック（日本農産工業）を自由に摂取させ、未滅菌の水道水を自由に摂取させた。飼育室は８時点灯、２０時消灯の１２時間の明暗周期で、室温は２５±２℃、湿度は４０〜７０％に設定した。【００７７】
ＤＳＳ投与開始日（ｄ２２）から最終日の前日（ｄ３１）まで毎日マウスの体重測定および便性状（硬さおよび出血）のスコアリングを行った。ただし、最終日（ｄ３２）は解剖の直前にマウスの体重測定および便性状のスコアリングを行った。体重減少率および便性状から、腸炎の重症度を表す指数であるＤＡＩを算出し、腸炎症状の評価を行った。なお、この評価方法はＭｅｎｎｉｇｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００９）（表２−１）に準拠した。【００７８】
【表１】
2020166708.tif 000003
【００７９】
また、図５Ａに示される通り、ＤＳＳ投与１１日目（ｄ１１）において、対照群（Ｃ群：８６．８７％）と比較してラクトバチルス  クリスパタス  ＣＦＦ  Ｎｏ．２０３１株投与群（Ｌ群：９２．２６％）において体重減少抑制効果が観察された（ｔ−ｔｅｓｔ、ｐ＝０．０５）。また、図５Ｂに示される通り、ＤＳＳ投与１１日目（ｄ１１）において、対照群（Ｃ群：ＤＡＩスコア９．０７）と比較してラクトバチルス  クリスパタス  ＣＦＦ  Ｎｏ．２０３１株投与群（Ｌ群：：ＤＡＩスコア７．００）においてＤＡＩスコアの悪化も抑制されていた（ｔ−ｔｅｓｔ、ｐ＝０．０７）。【００８０】
本試験で使用したマウスの投与時期と週齢をヒトに換算する場合（マウスの寿命を２年、ヒトの寿命を６０〜８０歳として換算する場合）、本試験では１歳半〜２歳半程度の子供に乳酸菌を１年〜１年半の間投与した結果、４〜５歳頃に発生しうる炎症性疾患を予防したことになる。この結果から、本発明の乳酸菌株を乳幼児期に投与することは、成長後の疾患を予防に利用しうると考えられる。
【産業上の利用可能性】
【００８１】
本発明によれば、粘膜付着細菌叢または腸内細菌叢をはじめとする常在細菌叢における細菌構成バランスを効果的に調節しうる新規乳酸菌が提供される。
【図１Ａ】
2020166708.tif 000004
【図１Ｂ】
2020166708.tif 000005
【図２Ａ】
2020166708.tif 000006
【図２Ｂ】
2020166708.tif 000007
【図２Ｃ】
2020166708.tif 000008
【図３Ａ】
2020166708.tif 000009
【図３Ｂ】
2020166708.tif 000010
【図４Ａ】
2020166708.tif 000011
【図４Ｂ】
2020166708.tif 000012
【図４Ｃ】
2020166708.tif 000013
【図４Ｄ】
2020166708.tif 000014
【図４Ｅ】
2020166708.tif 000015
【図４Ｆ】
2020166708.tif 000016
【図４Ｇ】
2020166708.tif 000017
【図４Ｈ】
2020166708.tif 000018
【図５Ａ】
2020166708.tif 000019
【図５Ｂ】
2020166708.tif 000020
【配列表】
2020166708000001.app
【国際調査報告】
2020166708.tif 000021
2020166708.tif 000022
2020166708.tif 000023
2020166708.tif 000024
2020166708.tif 000025
2020166708.tif 000026