(57)【要約】  生体分子および／または有機化合物を支持体に簡便に固定化し、生体分子および／または有機化合物の反応、流出、流入、保持から選択される少なくとも１つを伴うことを可能にするバイオセンサなどのデバイスを提供する。  実施形態に係るデバイスは、多孔性の支持体と、前記支持体に固定化された複合物と、を備え、前記複合物が、数平均繊維径が２〜１５０ｎｍであってセルロースＩ型結晶構造を有しアニオン変性された微細繊維状セルロースと、生体分子および／または有機化合物とを含有してなり、前記支持体内に前記複合物が固定化されてなる１または複数の独立した領域が形成され、前記領域に水が浸入することにより、前記生体分子および／または有機化合物の反応、流出、流入、および保持から選択される少なくとも１つを伴う、デバイスである。
2019171906.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
多孔性の支持体と、前記支持体に固定化された複合物と、を備えたデバイスであって、
前記複合物が、数平均繊維径が２〜１５０ｎｍであってセルロースＩ型結晶構造を有しアニオン変性された微細繊維状セルロースと、生体分子および／または有機化合物とを含有してなり、
前記支持体内に前記複合物が固定化されてなる１または複数の独立した領域が形成され、前記領域に水が浸入することにより、前記生体分子および／または有機化合物の反応、流出、流入、および保持から選択される少なくとも１つを伴う、
ことを特徴とするデバイス。
【請求項２】
前記複合物の含水率が２０質量％以下である、請求項１に記載のデバイス。
【請求項３】
前記複合物が生体分子を含み、前記生体分子がタンパク質である、請求項１または２に記載のデバイス。
【請求項４】
前記タンパク質が酵素である、請求項３に記載のデバイス。
【請求項５】
前記支持体がろ紙または不織布である、請求項１〜４のいずれか１項に記載のデバイス。
【請求項６】
前記領域が複数設けられ、前記複数の独立した領域が流路で連結された、請求項１〜５のいずれか１項に記載のデバイス。
【請求項７】
第１の生体分子および／または有機化合物を含む第１の領域と、前記第１の生体分子および／または有機化合物と反応し得る第２の生体分子および／または有機化合物を含む第２の領域とを備え、前記流路を通じて前記第１の生体分子および／または有機化合物を前記第２の領域に流入させて前記第２の生体分子および／または有機化合物と反応させることができるよう形成された、請求項６に記載のデバイス。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれか１項に記載のデバイスを含むバイオセンサ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、微細繊維状セルロースと生体分子および／または有機化合物とを含有してなる複合物を、多孔性の支持体に固定化してなる、デバイス、並びに、それを用いたバイオセンサに関するものである。
【背景技術】
【０００２】
バイオセンシングは、酵素と基質、抗原と抗体、糖鎖とレクチン、ビオチンとアビジン、ホルモンとレセプターなどの生体分子を含む物質間における認識機構を利用して、様々な分子等を検出、計測する技術である。例えば、ＤＮＡチップ、マイクロ流路チップ、紙製チップなどのバイオチップは、生体分子の分子間相互作用を活用した診断、検査デバイスであり、疾病、ウィルス感染の早期診断、食品や水の微生物、細菌、農薬の検査などに用いられている。たとえば、支持体に固定化された生体分子などの酵素反応や特異的結合などを検出し、計測する。【０００３】
近年、健康寿命延伸や安心、安全な食糧、飲料水などの供給に関する社会課題の解決策として、バイオチップを用いた診断や検査が提案されている。これらのバイオチップは、安価で迅速、簡易、正確に診断、検査できることが求められる。このため、検出に使用する生体分子および／または有機化合物をチップなどの支持体に簡便に固定化し、生体分子および／または有機化合物の反応、流出、流入、保持を制御し、迅速、簡易かつ正確に検出することが必要である。【０００４】
試料中の有害物質の有無を簡易に分析する技術として、非特許文献１には、プルランとアセチルコリンエステラーゼ（ＡＣｈＥ）とを組み合わせて作製したタブレットを用い、マラチオンを検査、検出する技術が報告されている。この検出には、プルランとＡＣｈＥ、または酢酸インドキシル（ＩＤＡ）とを組み合わせたタブレットを予め作製し、両タブレットと試料と水とを混合したときの混合液の色により、マラチオンの含有の有無を検出することが示されている。しかしながら、プルランは水溶性の多糖類であるため、ＡＣｈＥとＩＤＡのタブレットは耐水性が不十分であり、バイオチップなどの検査デバイスとしての使用を想定する場合、実用上、問題になる。【０００５】
特許文献１には、物質を吸着、担持、カプセル化する吸着性材料、カプセル化材料として、セルロースベースナノ材料の使用が示されている。しかしながら、特許文献１には、セルロースＩ型結晶構造を持つセルロースナノファイバーを用いることや、物質の反応や流量を制御することや、生体分子を固定化して検査、検出に使用することは記載されていない。【０００６】
特許文献２には、多孔性または非多孔性支持体に酵素を固定化したバイオセンサが示されている。しかしながら、特許文献２は酵素を支持体に共有結合により固定化する合成化学的操作を含むため、簡便な方法ではない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特表２０１７−５１７４７８号公報
【特許文献２】特表２００２−５４３３９６号公報
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Sana Jahanshahi-Anbuhi, 他９名、”PullulanEncapsulation of Labile Biomolecules to Give Stable Bioassay Tablets”, Angew.Chem. Int. Ed., 53,6155-6158 (2014)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明の実施形態は、上記の事情に鑑みてなされたものであり、生体分子および／または有機化合物を支持体に簡便に固定化し、生体分子および／または有機化合物の反応、流出、流入、保持から選択される少なくとも１つを伴うことを可能にするデバイスを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明は以下の実施形態を含む。【００１１】
第１に、多孔性の支持体と、前記支持体に固定化された複合物と、を備えたデバイスであって、前記複合物が、数平均繊維径が２〜１５０ｎｍであってセルロースＩ型結晶構造を有しアニオン変性された微細繊維状セルロースと、生体分子および／または有機化合物とを含有してなり、前記支持体内に前記複合物が固定化されてなる１または複数の独立した領域が形成され、前記領域に水が浸入することにより、前記生体分子および／または有化合物の反応、流出、流入、および保持から選択される少なくとも１つを伴う、ことを特徴とするデバイスである。【００１２】
第２に、前記複合物の含水率が２０質量％以下である、第１に記載のデバイスである。【００１３】
第３に、前記複合物が生体分子を含み、前記生体分子がタンパク質である、第１または第２に記載のデバイスである。【００１４】
第４に、前記タンパク質が酵素である、第３に記載のデバイスである。【００１５】
第５に、前記支持体がろ紙または不織布である、第１〜第４のいずれか１項に記載のデバイスである。【００１６】
第６に、前記領域が複数設けられ、前記複数の独立した領域が流路で連結された、第１〜第５のいずれか１項に記載のデバイスである。【００１７】
第７に、第１の生体分子または有機化合物を含む第１の領域と、前記第１の生体分子または有機化合物と反応し得る第２の生体分子または有機化合物を含む第２の領域とを備え、前記流路を通じて前記第１の生体分子または有機化合物を前記第２の領域に流入させて前記第２の生体分子または有機化合物と反応させることができるよう形成された、第６に記載のデバイスである。【００１８】
第８に、第１〜７のいずれか１項に記載のデバイスを含むバイオセンサである。
【発明の効果】
【００１９】
本発明の実施形態の係るデバイスであると、上記微細繊維状セルロースと生体分子および／または有機化合物を含む複合物を、多孔性の支持体に固定化させて該支持体内に独立した領域を形成したことにより、該領域に水が浸入したときに、生体分子および／または有機化合物の反応、流出、流入、保持から選択される少なくとも１つを伴うことができる。そのため、安価で、迅速、簡易に診断、検査できるバイオセンサを提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】実施例におけるろ紙に対する微細繊維状セルロースの付着状態を示すＳＥＭ写真
【図２】（Ａ）実施例におけるバイオセンサの作製過程におけるワックスプリンタの印刷パターン図、および（Ｂ）その加熱後の流路を示す図
【図３】（Ａ）実施例におけるバイオセンサの平面図、および（Ｂ）その通水時を示す説明図
【図４】実施例におけるバイオセンサのマラチオン検出結果を示すグラフ
【発明を実施するための形態】
【００２１】
以下、本発明の実施形態について詳細に説明する。
【００２２】
本実施形態に係るデバイスは、多孔性の支持体と、前記支持体に固定化された複合物とを備え、前記複合物が、数平均繊維径が２〜１５０ｎｍであってセルロースＩ型結晶構造を有しアニオン変性された微細繊維状セルロースと、生体分子および／または有機化合物とを含有するものである。
【００２３】
セルロースＩ型結晶構造を有しアニオン変性された微細繊維状セルロースは、水不溶性の微細繊維であり、多孔性の支持体の表面に付着できると同時に、微細繊維状であるがゆえ、多孔性の支持体の内部にも浸透することができる。また、微細繊維状セルロースからなる乾燥皮膜は、水不溶性の微細繊維からなる非常に緻密な皮膜を形成するため、当該皮膜で生体分子や有機化合物を包んだ状態に複合化できると同時に、微細繊維からなる非常に緻密な皮膜と組み合わさって、生体分子や有機化合物を多孔性の支持体の表面や内部に簡便に固定化することができる。
【００２４】
また、本実施形態に係るデバイスは、多孔性の支持体内に上記複合物が固定化されてなる１または複数の独立した領域を形成し、該領域に水が浸入することにより、生体分子および／または有機化合物の反応、流出、流入、および保持から選択される少なくとも１つを伴うものである。生化学反応場の観点において、アニオン変性された微細繊維状セルロースは親水性であるため、乾燥状態の複合物を含む上記領域に水が浸入し、水に膨潤することにより、微細繊維状セルロースが生体分子および／または有機化合物の反応、流出入、および保持の場を与え、生体分子および／または有機化合物の活性発現に寄与し得る。すなわち、微細繊維状セルロースは、水不溶性であるため、バイオセンサなどの検査デバイスとしての使用において、水への適度な親和性を発揮して従来技術で課題となっていた耐水性の問題を解消できる可能性がある。また、微細繊維状セルロースの水への適度な親和性により、微細繊維状セルロースが生体分子および／または有機化合物の反応、流出入、および保持の場を与え、多孔性の支持体内の独立した領域に、発光、発色、呈色、変色などの可視的な変化を与えることや、不可視的な変化であっても装置や機器などを用いて、検出ができる可能性がある。さらには、バイオセンサなどの検査デバイスにおいて、迅速、簡易に検出できる可能性がある。
【００２５】
本実施形態で用いられる微細繊維状セルロースは、ナノメートルレベルの繊維径を持つセルロース繊維（即ち、セルロースナノファイバー）であり、その数平均繊維径は、上記のように２〜１５０ｎｍであることが好ましく、例えば、３〜１５０ｎｍでもよく、３〜１００ｎｍでもよく、３〜８０ｎｍでもよい。
【００２６】
微細繊維状セルロースの数平均繊維径は、次のようにして測定することができる。すなわち、固形分率で０．０５〜０．１質量％の微細繊維状セルロースの水分散体を調製し、その水分散体を、親水化処理済みのカーボン膜被覆グリッド上にキャストして、透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）の観察用試料とする。そして、構成する繊維の大きさに応じて５０００倍、１００００倍あるいは５００００倍のいずれかの倍率で電子顕微鏡画像による観察を行う。その際に、得られた画像内に縦横任意の画像幅の軸を想定し、その軸に対し、２０本以上の繊維が交差するよう、試料及び観察条件（倍率等）を調節する。そして、この条件を満たす観察画像を得た後、この画像に対し、１枚の画像当たり縦横２本ずつの無作為な軸を引き、軸に交錯する繊維の繊維径を目視で読み取っていく。このようにして、最低３枚の重複しない表面部分の画像を、電子顕微鏡で撮影し、各々２つの軸に交錯する繊維の繊維径の値を読み取る（したがって、最低２０本×２×３＝１２０本の繊維径の情報が得られる）。このようにして得られた繊維径のデータにより、数平均繊維径を算出する。
【００２７】
微細繊維状セルロースの平均アスペクト比は、例えば、１０〜１０００でもよく、５０〜１０００でもよく、１００〜１０００でもよい。平均アスペクト比は、以下の方法で測定することができる。すなわち、微細繊維状セルロースを親水化処理済みのカーボン膜被覆グリッド上にキャストした後、２質量％ウラニルアセテートでネガティブ染色したＴＥＭ像（倍率：１００００倍）から、微細繊維状セルロースの短幅の方の数平均幅、及び、長幅の方の数平均幅を観察し、これらの値を用いて平均アスペクト比を下記式に従い算出する。
平均アスペクト比＝長幅の方の数平均幅（ｎｍ）／短幅の方の数平均幅（ｎｍ）
【００２８】
微細繊維状セルロースは、解繊処理を行うことにより得られる。解繊処理は、後述するアニオン基を導入してから実施してもよく、導入前に実施してもよい。解繊処理としては、例えば、高速回転下でのホモミキサー、高圧ホモジナイザー、超音波分散処理機、ビーター、ディスク型レファイナー、コニカル型レファイナー、ダブルディスク型レファイナー、グラインダー等を用いて、セルロース繊維の水分散液を処理することにより行うことができ、微細繊維状セルロースの水分散液を得ることができる。
【００２９】
本実施形態では、微細繊維状セルロースとして、水不溶性の観点から、セルロースＩ型結晶構造を有するものが用いられる。微細繊維状セルロースを構成するセルロースがＩ型結晶構造を有することは、例えば、広角Ｘ線回折像測定により得られる回折プロファイルにおいて、２シータ＝１４°〜１７°付近と、２シータ＝２２°〜２３°付近の２つの位置に典型的なピークをもつことから同定することができる。
【００３０】
微細繊維状セルロースとしては、セルロース分子中のグルコースユニットにアニオン基が導入されたアニオン変性微細繊維状セルロースが用いられる。アニオン基としては、例えば、カルボキシル基、リン酸基、スルホン酸基、及び硫酸基からなる群から選択される少なくとも１種が挙げられる。本明細書において、カルボキシル基は、酸型（−ＣＯＯＨ）だけでなく、塩型、即ちカルボン酸塩基（−ＣＯＯＸ、ここでＸはカルボン酸と塩を形成する陽イオン）も含む概念である。リン酸基、スルホン酸基及び硫酸基についても、同様に、酸型だけでなく、塩型も含む概念である。
【００３１】
一実施形態において、アニオン基としてはカルボキシル基が好ましい。カルボキシル基を含有する微細繊維状セルロースとしては、例えば、セルロース分子中のグルコースユニットの水酸基を酸化してなる酸化セルロースナノファイバーや、セルロース分子中のグルコースユニットの水酸基をカルボキシメチル化してなるカルボキシメチル化セルロースナノファイバーが挙げられる。
【００３２】
好ましい実施形態に係る酸化セルロースナノファイバーとしては、セルロース分子中のグルコースユニットのＣ６位の水酸基が選択的に酸化されてカルボキシル基に変性されたものが挙げられる。酸化セルロースナノファイバーは、木材パルプなどの天然セルロースをＮ−オキシル化合物の存在下、共酸化剤を用いて酸化させ、解繊（微細化）処理することにより得られる。Ｎ−オキシル化合物としては、一般に酸化触媒として用いられるニトロキシラジカルを有する化合物が用いられ、例えばピペリジンニトロキシオキシラジカルであり、特に２，２，６，６−テトラメチルピペリジノオキシラジカル（ＴＥＭＰＯ）または４−アセトアミド−ＴＥＭＰＯが好ましい。ＴＥＭＰＯで酸化された微細繊維状セルロースは、一般にＴＥＭＰＯ酸化セルロースナノファイバーと称されており、本実施形態でも使用することができる。なお、酸化セルロースナノファイバーは、カルボキシル基とともに、アルデヒド基又はケトン基を有していてもよいが、アルデヒド基及びケトン基を実質的に有していないことが好ましい。
【００３３】
微細繊維状セルロースにおけるアニオン基の量は、特に限定されず、例えば、０．０５〜３．０ｍｍｏｌ／ｇでもよく、０．５〜２．５ｍｍｏｌ／ｇでもよい。アニオン基の量は、例えば、カルボキシル基の場合、乾燥質量を精秤したセルロース試料から０．５〜１質量％スラリーを６０ｍＬ調製し、０．１Ｍの塩酸水溶液によってｐＨを約２．５とした後、０．０５Ｍの水酸化ナトリウム水溶液を滴下して、電気伝導度測定を行い、ｐＨが約１１になるまで続け、電気伝導度の変化が緩やかな弱酸の中和段階において消費された水酸化ナトリウム量（Ｖ）から、下記式に従い求めることができる。リン酸基についても、同様の電気伝導度測定により測定することができる。その他のアニオン基についても公知の方法で測定すればよい。
アニオン基量(mmol/g)＝Ｖ(mL)×〔0.05／セルロース試料質量(g)〕
【００３４】
本実施形態において生体分子としては、例えば、タンパク質、核酸、脂質、ビタミン、ホルモン、糖及び糖鎖などの各種生体分子が挙げられる。より詳細には、酵素−基質、抗原−抗体、ホルモン−レセプター、糖鎖−レクチン、ビオチン−アビジンなどの酵素反応や特異的結合などの様々な反応に関与する生体分子が挙げられる。一実施形態において、生体分子としては、酵素、抗体タンパク質、レセプタータンパク質、ホルモン、サイトカイン、レクチン、糖鎖、アビジン、ビオチン、及び、核酸からなる群から選択される少なくとも一種が挙げられる。好ましい実施形態において、生体分子としては蛋白質が用いられ、例えば、酵素、抗体タンパク質、レセプタータンパク質、サイトカイン、レクチンおよびアビジンからなる群から選択される少なくとも一種の蛋白質が挙げられ、より好ましくは酵素を用いることである。
【００３５】
一実施形態に係る生体分子である酵素としては、特に限定されず、加水分解酵素、酸化還元酵素、転移酵素、リアーゼ、イソメラーゼ、リガーゼなどが挙げられ、これらをいずか１種または２種以上組み合わせて用いてもよい。
【００３６】
一実施形態に係る加水分解酵素として、コリンエステラーゼ（例えば、アセチルコリンエステラーゼ、ブチリルコリンエステラーゼなど）、プロテアーゼ、アミラーゼなどを用いてもよい。
【００３７】
本実施形態において有機化合物としては、上記生体分子と反応し得るものが挙げられる。例えば、酵素と基質との酵素反応における基質、抗原と抗体との特異的結合における抗原などが挙げられる。このうち、例えば、酵素に対する基質としては、特に限定されず、加水分解酵素特異基質（例えば、コリンエステラーゼ特異基質、プロテアーゼ特異基質、アミラーゼ特異基質など）、酸化還元酵素特異基質、転移酵素特異基質、リアーゼ特異基質、イソメラーゼ特異基質、リガーゼ特異基質などが挙げられる。また、酵素に対する阻害剤などを有機化合物として用いてもよい。また、有機化合物としては、基質や生成物と反応し得るものを用いてもよく、例えば、発色試薬、呈色試薬、蛍光試薬、発光試薬などの検出を可能にする試薬が挙げられる。以上の有機化合物は、いずれか１種または２種以上組み合わせて用いることができる。
【００３８】
一実施形態において、生体分子としてコリンエステラーゼを用いる場合、有機化合物としては、コリンエステラーゼ特異基質であるアセチルコリン、ブチルコリン、酢酸インドキシルが挙げられ、また、コリンエステラーゼ阻害剤である有機リン系化合物やカルバメート系化合物などが挙げられる。
【００３９】
本実施形態において、微細繊維状セルロースの水への適度な親和性により、上記複合物が固定化された領域に水が浸入すると、生体分子および／または有機化合物が反応、流出、流入、および保持から選択される少なくとも１つを伴う。そのため、生化学反応場の観点において、発光、発色、呈色、変色などの可視的な変化を与える生体分子や有機化合物が好ましく用いられる。
【００４０】
支持体内に複合物を含む領域を１つ形成する場合、その領域の複合物に有機化合物を含ませてもよいが、好ましくは、その領域の複合物に生体分子を含ませることである。また、支持体内に該領域を複数形成する場合、少なくとも一つの領域の複合物に生体分子を含ませることが好ましい。
【００４１】
例えば、多孔性の支持体内の独立した領域に生体分子として酵素を含ませておき、該酵素に対する特異的基質の有無を検出、計測するために、当該特異的基質や酵素反応により生成する生成物を、発光試薬、発色試薬、呈色試薬または蛍光試薬などを用いて、変色の有無を検出してもよく、酵素反応により生成する生成物自身の変色の有無を検出してもよい。
【００４２】
また、酵素に対する阻害剤との反応を利用し、阻害剤により活性が阻害された酵素と該酵素の特異的基質との間で反応が起こらないことを利用して、変色の有無を検出することにより、阻害剤の有無を検出、計測するようにしてもよい。例えば、コリンエステラーゼとコリンエステラーゼ特異基質との加水分解反応において、コリンエステラーゼとしてアセチルコリンエステラーゼを用い、コリンエステラーゼ特異基質として酢酸インドキシルを用い、加水分解反応をさせてもよく、加水分解生成物であるインディゴを発色する生成物として検出に用いてもよく、阻害剤である有機リン系化合物やカルバメート系化合物の有無を検出、計測することができる。
【００４３】
このように反応生成物を検出に利用する場合、生体分子および／または有機化合物の反応、流出、流入、保持から選択される少なくとも１つとともに、反応生成物の保持を伴うことが好ましい。
【００４４】
本実施形態に係るデバイスにおいて、多孔性の支持体内の独立した領域は、支持体に上記複合物を固定化することによって形成され、そのため、該領域は、複合物と、該複合物が固定化された支持体の一部（即ち、支持体における複合物が固定化された部分）とよりなる。
【００４５】
ここで、独立した領域とは、支持体の全体ではなく、その一部に複合物が固定化されて形成された領域であり、複数の領域が形成された場合には、それらの領域が連続することなく互いに離れて形成されていることを意味する。独立した領域であることにより、当該領域に水が浸入し、生体分子および／または有機化合物が反応、流出、流入、保持から選択される少なくとも１つを伴った後、発光、発色、呈色、変色などによる可視的な変化を明確に検出することができる。
【００４６】
ここで、反応とは、酵素反応や特異的結合などの生体分子が関与する様々な分子間の相互作用を包括する概念であり、好ましくは生体分子同士または生体分子と有機化合物との間で生じる。また、流出とは、生体分子および／または有機化合物が上記領域から外に出ること（複合物から離脱して外に出ること）であり、徐放も含まれる。流入とは、１の領域から流出した生体分子および／または有機化合物が他の領域に入り込むことであり、複合物の内部に吸収されることや、複合物の表面に吸着されることも含まれる。保持とは、生体分子および／または有機化合物が上記領域内に保持されることであり、微細繊維状セルロースの表面に担持されることや、微細繊維状セルロース内に包含されることも含まれる。
【００４７】
多孔性の支持体は、シート状であることが好ましく、例えば、ろ紙等の紙、または不織布のような、繊維により構成された繊維シートが好適である。かかる繊維シートは、水を吸収可能な無数の空隙（孔）が繊維間に形成されているため、多孔性の支持体に該当する。上記の複合物を固定化することにより形成される上記領域は、シート状をなす支持体の厚み方向の全体で形成されていてもよい。
【００４８】
上記の複合物を固定化した領域は、微細繊維状セルロースと、生体分子および／または有機化合物と、水などとの混合物を、スポイトやピペットなどを用いて多孔性の支持体へ滴下し、混合物を乾燥させることにより形成してもよい。あるいはまた、上記混合物をインクジェット印刷やグラビア印刷などにより多孔性の支持体に印刷後、混合物を乾燥させることにより形成してもよい。あるいはまた、コーターなどを用いて上記混合物を多孔性の支持体に塗布後、混合物を乾燥させることにより形成してもよい。上記混合物が含水したゲルである場合、例えば、混合物を支持体上に置き、混合物を支持体に圧着後、あるは混合物を別の支持体と挟み込んだ後、混合物を乾燥させることにより形成してもよい。これにより、微細繊維状セルロースと生体分子および／または有機化合物との複合物が支持体に固定化された状態となり、実施形態に係るデバイスが得られる。
【００４９】
上記混合物は、微細繊維状セルロースの水分散液に、生体分子および／または有機化合物を添加し混合することにより得ることができる。微細繊維状セルロースの水分散液は、上記のように、天然セルロースにアニオン基を導入してから解繊処理を実施し、又は、天然セルロースを解繊してからアニオン基を導入することにより作製することができる。当該水分散液中における微細繊維状セルロースの濃度は、特に限定されず、例えば０．０１〜５質量％でもよく、０．０５〜３質量％でもよく、０．１〜１質量％でもよい。生体分子および／または有機化合物は、微細繊維状セルロースの水分散液に対して、そのまま添加してもよく、あるいは、予め緩衝液に溶解、あるいは混合させた生体分子および／または有機化合物の混合液を添加してもよい。
【００５０】
混合物の乾燥方法は、特に限定されず、例えば、自然乾燥、加熱乾燥、減圧乾燥、送風乾燥、マイクロ波乾燥、赤外線乾燥、凍結乾燥、ろ過脱水方式等が挙げられる。複数の方式を組み合わせて乾燥してもよい。乾燥温度は、特に限定されないが、加熱乾燥方式の場合を例示するならば、生体分子の失活を抑制するために、４０℃以下であることが好ましく、より好ましくは５〜３５℃である。また、乾燥時間は特に限定されず、加熱温度は常に一定でもよく、段階的に上昇させても良い。
【００５１】
本実施形態において、多孔性の支持体内の独立した領域の個数は、単一でもよく、複数でもよく、複数の独立した領域を流路で連結してもよい。
【００５２】
本実施形態において、上記微細繊維状セルロースは親水性であるため、乾燥状態の複合物を含む上記領域に水が浸入すると、該複合物を水に膨潤させることができる。したがって、複合物に含まれる生体分子および／または有機化合物と反応し得る物質を水と混合し、その混合液を上記複合物を含む領域に加えることにより、当該領域内で生体分子および／または有機化合物と上記物質とを反応させることができる。
【００５３】
また、多孔性の支持体内に水の流路を作成し、流路を介して複数の独立した領域を連結した場合、流路を通じて、一方の領域の複合物に含まれる生体分子および／または有機化合物を他の領域に送り、当該他の領域でその生体分子および／または有機化合物と反応させてもよい。
【００５４】
例えば、第１の生体分子および／または有機化合物を含む第１の領域と、該第１の生体分子および／または有機化合物と反応し得る第２の生体分子および／または有機化合物を含む第２の領域とを設け、第１の領域と第２の領域との間を流路で連結してもよい。この場合、第１の領域に水が浸入することにより、流路を通じて第１の生体分子および／または有機化合物を第２の領域に流入させ、第１の生体分子および／または有機化合物を第２の生体分子および／または有機化合物と反応させることができる。
【００５５】
実施形態に係るデバイスにおいて、複合物中における微細繊維状セルロースの含有量は、特に限定されず、１５〜９９質量％でもよく、２５〜９８質量％でもよい。
【００５６】
なお、複合物中における微細繊維状セルロースと生体分子および／または有機化合物との含有比は特に限定されず、例えば微細繊維状セルロース１００質量部に対して、生体分子および／または有機化合物が０．１〜５００質量部でもよく、１〜３００質量部でもよい。
【００５７】
実施形態に係るデバイスにおいて、複合物の含水率は２０質量％以下であることが好ましい。このように含水率が少なくなるまで乾燥させることにより、上記微細繊維状セルロースと、生体分子および／または有機化合物を、多孔性の支持体に固定化することができる。なお、複合物の含水率は、支持体内の独立した領域における支持体を除く複合物自体の含水率である。複合物の含水率は、１〜２０質量％でもよい。
【００５８】
該複合物には、上述した微細繊維状セルロース、生体分子および／または有機化合物の他、本発明の効果を阻害しない範囲において、例えば、無機系及び／又は有機系のフィラー類、粘土鉱物類、色素などの着色剤、塩類、ｐＨ調整剤、油剤、水溶性高分子、界面活性剤、乾燥塗膜の造膜性を改良する目的で添加される親水性の溶剤類の乾燥残留物を含んでいても良い。例えば、造膜性を改良する親水性の溶剤としてはアルコール類、セロソルブ類、カルビトール類、グリコール類、グリコールモノフェニルエーテル類、フェニルアルコール類、フェニルカルボン酸エステル類、オキシカルボン酸フェニルエステル類等を含んでいてもよい。その他、耐光剤、酸化防止剤、防腐剤、無機物等を含んでもよい。
【００５９】
実施形態に係るデバイスは、例えばバイオセンサなどの検査デバイス、ウエアラブルセンサ、ＭＥＭＳ、マイクロリアクター、微細流路などに用いることができる。バイオセンサは、生体分子の認識機構を利用して様々な分子等を検出・計測するセンシングデバイスであり、その構成要素として該デバイスを用いることができる。バイオセンサの好適な一例として、生体分子を基板（即ち、多孔性の支持体）上に多数固定したバイオチップが挙げられ、該生体分子として上記複合物を基板上に多数固定することにより、一実施形態に係るバイオチップを構成することができる。また、上記のようにインクジェット印刷が可能であることから、マイクロ流体ペーパー分析デバイス（μＰＡＤ）に利用することもできる。
【実施例】
【００６０】
以下、実施例により更に詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。【００６１】
１．試薬
・ＴＯＣＮ：セルロースＩ型結晶構造を有するＴＥＭＰＯ酸化セルロースナノファイバー、１．１質量％水分散液、第一工業製薬（株）製「レオクリスタＩ−２ＳＸ」、数平均繊維径＝４ｎｍ、平均アスペクト比＝２８０、アニオン基量＝１．９ｍｍｏｌ／ｇ
・Ｔｒｉｓ：トリスヒドロキシメチルアミノメタン、ＳＩＧＭＡ−ＡＬＤＲＩＣＨＩ製
・ＩＤＡ：酢酸インドキシル、ＳＩＧＭＡ−ＡＬＤＲＩＣＨＩ製
・ＡＣｈＥ：アセチルコリンエステラーゼ、デンキウナギ由来、200-1000 Unit/mgprotein、ＳＩＧＭＡ−ＡＬＤＲＩＣＨＩ製
・ＦＩＴＣ−ａｌｂｕｍｉｎ：アルブミン−フルオレセインイソチオシアン酸コンジュゲート（Ａｌｂｕｍｉｎ−ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ  ｉｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ  ｃｏｎｊｕｇａｔｅ、ウシ血清由来、ＳＩＧＭＡ−ＡＬＤＲＩＣＨＩ製）
・マラチオン：ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  ｓｔａｎｄａｒｄ、ＳＩＧＭＡ−ＡＬＤＲＩＣＨＩ製
・メタノール：関東化学（株）製
・１ＭＮａＯＨ：水酸化ナトリウム水溶液（１Ｍ、和光純薬工業（株）製）
・６ＭＨＣｌ：濃塩酸（６Ｍ、和光純薬工業（株）製）
これらは特に精製せずに使用した。【００６２】
２．ろ紙に対するＴＯＣＮの付着状態の観察
以下の方法によりろ紙に対するＴＯＣＮの付着状態を観察した。【００６３】
（１）０．５質量％ＴＯＣＮ水分散液の調製
ＴＯＣＮが０．５質量％となるようＭｉｌｌｉＱ水と混合し、ホモジナイザー（（株）マイクロテック・ニチオン製、超高速万能ホモジナイザーヒスコトロンＮＳ−５２）を用いて、出力４０（約５０００ｒｐｍ）で１分間ホモジナイズして、ＴＯＣＮ水分散液を作成した。【００６４】
（２）ろ紙へのＴＯＣＮの滴下の有無に対するＦＥ−ＳＥＭ観察
ろ紙でのＴＯＣＮの状態を調査するため、０．５質量％ＴＯＣＮ水分散液を１０μＬ滴下して１日乾燥させた円形ろ紙と、滴下を行っていないろ紙をそれぞれＦＥ−ＳＥＭ（（株）日立ハイテクノロジーズ製、Ｓ−４８００）で観察した。観察前に、あらかじめオスミウムコーター（メイワフォース（株）製、Ｎｅｏｃ  Ｐｒｏ）を用いて、電流値約１０ｍＡで２０秒間オスミウムコーティングを行った。ＦＥ−ＳＥＭによる観察は加速電圧１．５ｋＶで行った。【００６５】
ＦＥ−ＳＥＭ観察の結果を図１に示す。０．５質量％ＴＯＣＮ水分散液の滴下を行ったろ紙と滴下を行っていないろ紙のＦＥ−ＳＥＭ画像を比較すると、図１（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）に示す滴下を行っていないろ紙の空隙が、図１（ａ）、（ｂ）、（ｃ）に示すようにＴＯＣＮの添加により埋まっていた。さらに、ＴＯＣＮを滴下したろ紙では、未処理のろ紙で見られる蜘蛛の巣状繊維も減少しており、ＴＯＣＮがろ紙の表面だけでなく、内部にも浸透し固定化していることを示す。【００６６】
３．ＴＯＣＮの生体分子の固定化の評価
生体分子としてウシ血清由来のアルブミンに蛍光標識をしたＦＩＴＣ−ａｌｂｕｍｉｎを用いて、ＴＯＣＮによる生体分子の固定化を評価した。ろ紙上にＦＩＴＣ−ａｌｂｕｍｉｎとＴＯＣＮの混合液を滴下し、通水することにより、ろ紙上にＦＩＴＣ−ａｌｂｕｍｉｎがどの程度残存しているかを蛍光顕微鏡で観察した。詳細は以下の通りである。【００６７】
（１）ＦＩＴＣ−ａｌｂｕｍｉｎを２ｍｇ計量し、２ｍＬメスフラスコを用いてＭｉｌｌｉＱ水でメスアップし、１ｍｇ／ｍＬアルブミン水溶液を調製した。この溶液１μＬと０．５質量％ＴＯＣＮ水分散液９μＬを混合し、ＴＯＣＮ／ＦＩＴＣ−ａｌｂｕｍｉｎ混合液を調製した。なお、コントロールとしてＴＯＣＮ水分散液の代わりにＭｉｌｌｉＱ水を加えたものを同様に調製した。【００６８】
（２）ろ紙上のＦＩＴＣ−ａｌｂｕｍｉｎの蛍光顕微鏡観察
ろ紙を２×７ｃｍのストリップにカットし、下端から約２ｃｍの場所にＴＯＣＮ／ＦＩＴＣ−ａｌｂｕｍｉｎ混合液およびコントロール溶液をマイクロピペットで１μＬずつ、３箇所にスポットして１時間以上乾燥させた。このストリップの下端から約１ｃｍを脱イオン水に浸し、上端から約１ｃｍに水が達したところで取り出して乾燥させた。通水前と後のストリップを蛍光顕微鏡で観察し、スポットした箇所の大きさ（３箇所の平均直径）と蛍光強度を評価した。観察の結果、ＴＯＣＮ／ＦＩＴＣ−ａｌｂｕｍｉｎ混合液をスポットしたものは、スポットの平均直径が通水前で３．２ｍｍ、通水後で３．２ｍｍであり、コントロール溶液をスポットしたものでは、通水前で５ｍｍ、通水後で５ｍｍであった。このようにＴＯＣＮ／ＦＩＴＣ−ａｌｂｕｍｉｎ混合液をスポットしたものはコントロール溶液をスポットしたものよりも、スポットした箇所が小さく蛍光した。また、スポットの蛍光強度から、通水後の蛍光残存率（３箇所の平均）を算出した結果、コントロール溶液では６５％、ＴＯＣＮ／ＦＩＴＣ−ａｌｂｕｍｉｎ混合液では７５％であった。これらの結果は、ＴＯＣＮが生体分子を担持、包含できることを示す。【００６９】
３．バイオセンサ
多孔性の支持体としてろ紙を用い、生体分子（酵素）としてアセチルコリンエステラーゼを用い、有機化合物（基質）として酢酸インドキシルを用い、検査対象として酵素の阻害剤であるマラチオンを用いて、バイオセンサを作製し、検出評価を行った。【００７０】
（１）１００ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌバッファー（ｐＨ８．０）の調製
Ｔｒｉｓを６．０５７ｇビーカーに計り取り、ＭｉｌｌｉＱ水４００ｍＬを添加し、マグネチックスターラーを用いてＴｒｉｓを溶解させた。ここに６ＭＨＣｌを一滴ずつ滴下し、ｐＨが８．０となるよう調製した。溶液を５００ｍＬメスフラスコに移し、ＭｉｌｌｉＱ水で希釈して１００ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌバッファーを調製した。ｐＨが大きくずれた場合は、１ＭＮａＯＨおよび６ＭＨＣｌを滴下し再調製した。【００７１】
（２）マラチオンアッセイ試薬の調製
ＩＤＡ溶液は使用する当日に作製した。ＩＤＡをエッペンチューブ中で８０ｍＭとなるようにそれぞれメタノールを加え、溶解させた。ＡＣｈＥはエッペンチューブ中で２５０Ｕ／ｍＬとなるよう予め調製した１００ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌバッファー（ｐＨ８．０）を加えて溶解し、冷凍保存した。マラチオンは１６．５ｍｇを秤り取り、１ｍＬのメタノールで溶解した後、脱イオン水で５ｍＬにメスアップして１０ｍＭマラチオン溶液を調製した。これを脱イオン水でさらに希釈し、２、４および６ｍＭマラチオン溶液を調製した。【００７２】
（３）バイオセンサの作製
バイオセンサの流路の作製にはワックスプリンタを用いる方法を適用した。まず、パソコン上で設計図を作製し、ワックスプリンタでろ紙上に図２（Ａ）に示すパターンにて印刷した。次に印刷物をホットステージ上で、１２０℃、２分間加熱し、ろ紙中に疎水性インクを浸透させ、図２（Ｂ）に示す流路を形成させた。流路は疎水性インクからなる疎水部の内側に形成されており、流路には直径約７ｍｍの円形の親水部が上下２箇所に形成され、この２つの親水部が流路で連結されている。【００７３】
作製した流路の親水部にマイクロピペットでアッセイ試薬を配置した。アッセイ試薬のうち、２５０Ｕ／ｍＬのＡＣｈＥ溶液は０．５質量％ＴＯＣＮ水分散液と体積比で１：１０にて混合し、８０ｍＭのＩＤＡ溶液は０．５質量％ＴＯＣＮ水分散液と体積比で１：１にて混合した。上側の親水部に酵素のＡＣｈＥ混合液を１１μＬ、下側の親水部に基質のＩＤＡ混合液を５μＬ、それぞれ滴下し、乾燥させた。これにより、図３（Ａ）に示すバイオセンサ（マラチオン検出μＰＡＤ）を得た。【００７４】
得られたバイオセンサは、流路の上流側（図３では下側）の親水部に基質（有機化合物）であるＩＤＡをＴＯＣＮとともに含む第１の領域が形成され、流路の下流側（図３では上側）の親水部に酵素（生体分子）であるＡＣｈＥをＴＯＣＮとともに含む第２の領域が形成され、これら第１の領域と第２の領域が流路で接続されている。第１の領域における複合物は、ＴＯＣＮ１００質量部に対してＩＤＡを２８０質量部含有するものであり、第２の領域における複合物は、ＴＯＣＮ１００質量部に対してＡＣｈＥを２．３質量部含有するものであった。【００７５】
なお、コントロールとして、ＴＯＣＮを含まないバイオセンサを作成した。ＴＯＣＮを含まないバイオセンサでは、上側の親水部に２５０Ｕ／ｍＬのＡＣｈＥ溶液とＭｉｌｌｉＱ水を体積比で１：１０にて混合した混合液を１１μＬ、下側の親水部に８０ｍＭのＩＤＡ溶液とＭｉｌｌｉＱ水を体積比で１：１にて混合した混合液を５μＬ、それぞれ滴下し、乾燥させた。【００７６】
（４）複合物の含水率の測定
上記（３）で作製したバイオセンサにおいて、ろ紙にＴＯＣＮとＩＤＡが固定化された第１の領域と、ろ紙にＴＯＣＮとＡＣｈＥが固定化された第２の領域を、それぞれ切り取り、熱重量分析装置（セイコーインスツル（株）製、ＴＧＤＴＡ６３００）を用いて、試料をアルミ製オープン型サンプルパンに入れ、窒素雰囲気下、２００ｍＬ／分で３０℃から４００℃まで１０℃／分で昇温し、熱重量分析を行った。ＴＯＣＮ／ＩＤＡ／ろ紙のＴＧ（熱重量曲線）及びＤＴＧ（微分熱重量曲線）の測定結果から、ろ紙を除いたＴＯＣＮ／ＩＤＡの複合物の含水率は１２質量％であった。また、ＴＯＣＮ／ＡＣｈＥ／ろ紙のＴＧ（熱重量曲線）及びＤＴＧ（微分熱重量曲線）の測定結果から、ろ紙を除いたＴＯＣＮ／ＡＣｈＥの複合物の含水率は１３質量％であった。【００７７】
（５）マラチオンの検出
作製したバイオセンサ上のＡＣｈＥを配置した第２の領域に対し、マラチオン濃度が０，２，４，６ｍＭの各サンプルを４μＬマイクロピペットで添加した。１５分乾燥した後、図３（Ｂ）に示すように、バイオセンサの下端約１ｃｍをＭｉｌｌｉＱ水に浸して通水した。流路の上端が水に届いたところでバイオセンサを取り出した。バイオセンサを乾燥させた後、画像を２４ｂｉｔカラー、解像度８００ｄｐｉの条件でスキャナ（ＥＰＳＯＮ製ＧＴ−Ｘ９８０）を用いてパソコン上に取り込んだ。この画像から処理ソフト（Ｉｍａｇｅ  Ｊ）を用いて生成したインディゴの青色の輝度を取得し、以下の式から検出部位の青色強度を算出した。【００７８】
青色の強度＝（サンプルの青色の輝度）−（ブランクの青色の輝度）
式中のブランクの青色の輝度とは、上記（３）で作製したバイオセンサにおいて、ろ紙にＴＯＣＮとＩＤＡが固定化された第１の領域の通水前に測定した輝度を示す。【００７９】
結果は図４に示す通りであり、マラチオン濃度の上昇とともに青色強度も低下した。この結果はバイオセンサの水への浸漬により、ＩＤＡとＴＯＣＮを含む上流側の第１の領域に水が付着し、ＩＤＡが流出、徐放したことを示す。また、流出、徐放したＩＤＡが、ＡＣｈＥとＴＯＣＮを含む下流側の第２の領域に流入、吸着され、第２の領域に含まれる生体分子であるＡＣｈＥの反応を伴い、これによりインディゴが生成されたことを示す。また、マラチオンは、ＡＣｈＥに対する阻害剤であるため、第２の領域に付与するマラチオン濃度が高くほど、ＡＣｈＥの反応がより阻害され、インディゴの生成量が少なくなることを示す。【００８０】
なお、青色に変色した部分は数か月経っても青色が消失することはなかった。このことから、反応生成物であるインディゴが第２の領域内で保持されていること、より詳細には、ＴＯＣＮを含む複合物に担持され、あるいはまた複合物に内包（包含）されていることを示す。【００８１】
下記表１は、ＴＯＣＮを含む実施例のバイオセンサと、ＴＯＣＮを含まない比較例のバイオセンサについて、図３（Ｂ）に示すように、バイオセンサの下端約１ｃｍをＭｉｌｌｉＱ水に浸して通水を開始した時点から、第２の領域の上端に水が達するまでの時間（到達時間）と、第２の領域における変色の有無を示した結果である。実施例および比較例ともに、マラチオン濃度が０ｍＭのサンプルについて測定した結果である。実施例のバイオセンサでは、第２の領域が青色変色したのに対し、コントロールとして作製した比較例のバイオセンサでは、水に浸漬しても、青色変色しなかった。ＴＯＣＮを含む複合物は親水性が高く、バイオセンサの水への浸漬後、第１の領域の複合物に水が付着し、水の流出入を調整しながら、ＩＤＡを徐放、流出させている。さらに、第２の領域の複合物も同様の親水性の高さにより、水とＩＤＡが到達し、徐々にＡＣｈＥを含む複合物に水が付着して、流入、吸着が調整され、酵素反応に適した反応時間を保ちながら反応を伴ったことを示す。一方、ＴＯＣＮを含まないバイオセンサではＡＣｈＥを含む第２の領域において親水性を有さないため、水とＩＤＡの流入、吸着を調整できず、ＡＣｈＥを含む領域をＩＤＡと水が通過してしまい、反応が起こらず変色しなかったことを示す。【００８２】
【表１】
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【００８３】
以上より、多孔性の支持体と、該支持体に固定化された数平均繊維径が２〜１５０ｎｍであってセルロースＩ型結晶構造を有するアニオン変性された微細繊維状セルロースと、該微細繊維状セルロースを介して支持体に固定化された生体分子および／または有機化合物とを含有する複合体がバイオセンサに好適であることが分かった。【００８４】
以上、本発明のいくつかの実施形態を説明したが、これら実施形態は、例として提示したものであり、発明の範囲を限定することは意図していない。これら実施形態は、その他の様々な形態で実施されることが可能であり、発明の要旨を逸脱しない範囲で、種々の省略、置き換え、変更を行うことができる。これら実施形態やその省略、置き換え、変更などは、発明の範囲や要旨に含まれると同様に、特許請求の範囲に記載された発明とその均等の範囲に含まれるものである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【国際調査報告】
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2019171906.tif 000009
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