【手続補正書】
【提出日】平成21年2月10日(2009.2.10)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象への抗凝固剤の投与の際に第二の成分が第一の成分を活性化血小板へ向かわせる、凝固を阻害する能力を有する第一の成分および活性化血小板をターゲッティングする能力を有する第二の成分を含む抗凝固剤。
【請求項２】
第二の成分が、活性化血小板の表面上のマーカーに結合する能力を有する、請求項１に記載の抗凝固剤。
【請求項３】
マーカーが活性化血小板の表面上のみで発現されているかまたは主に活性化血小板の表面上で発現されている、請求項２に記載の抗凝固剤。
【請求項４】
マーカーがリガンド誘導性結合部位（ＬＩＢＳ）である、請求項２または請求項３に記載の抗凝固剤。
【請求項５】
マーカーがＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａである、請求項２から４のいずれか一つに記載の抗凝固剤。
【請求項６】
マーカーがＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａの活性化形である、請求項２から５のいずれか一つに記載の抗凝固剤。
【請求項７】
約６００００から８００００個のマーカー分子が各血小板の表面上に見出される、請求項２から６のいずれか一つに記載の抗凝固剤。
【請求項８】
第二の成分が、ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ受容体の活性化に際して形成された新しいエピトープと結合する能力がある、請求項１から７のいずれか一つに記載の抗凝固剤。
【請求項９】
対象に投与される際に出血時間を顕著に増大させないか、または対象において出血合併症を結果として生じる、請求項１から８のいずれか一つに記載の抗凝固剤。
【請求項１０】
出血時間がマウスにおける外科的尾切断によって測定される、請求項９に記載の抗凝固剤。
【請求項１１】
対象に投与される際に対象において閉塞時間を延長する、請求項１から１０のいずれか一つに記載の抗凝固剤。
【請求項１２】
閉塞時間がマウス血栓症モデルを用いて測定される、請求項１１に記載の抗凝固剤。
【請求項１３】
対象に投与される際に閉塞時間が陰性対照の投与と比較して少なくとも約２倍になる、請求項１１または請求項１２に記載の抗凝固剤。
【請求項１４】
閉塞時間の延長が、エノキサパリンについての閉塞時間と同様かまたはそれを上回る、請求項１１から１３のいずれか一つに記載の抗凝固剤。
【請求項１５】
第一の成分が活性化血小板の部位へ効果的に局在化する能力を有するように第一の成分が低分子量である、請求項１から１１のいずれか一つに記載の抗凝固剤。
【請求項１６】
第一の成分が約７，０００ダルトン以下の分子量を有する、請求項１５に記載の抗凝固剤。
【請求項１７】
第一の成分がペプチド抗凝固剤である、請求項１から１６のいずれか一つに記載の抗凝固剤。
【請求項１８】
ペプチド抗凝固剤が約６０アミノ酸残基以下から成る、請求項１７に記載の抗凝固剤。
【請求項１９】
ペプチド抗凝固剤がダニ由来である、請求項１７または請求項１８に記載の抗凝固剤。
【請求項２０】
ダニがオルニソドロス・モウバタ（Ｏｒｎｉｔｈｏｄｏｒｏｓ ｍｏｕｂａｔａ）である、請求項１９に記載の抗凝固剤。
【請求項２１】
第一の成分が酵素第Ｘａ因子に作用する、請求項１から２０のいずれか一つに記載の抗凝固剤。
【請求項２２】
第一の成分が補助因子の非存在下で直接に第Ｘａ因子を阻害する、請求項２１に記載の抗凝固剤。
【請求項２３】
第一および第二の成分が物理的に連結して単一分子の形である、請求項１から２２のいずれか一つに記載の抗凝固剤。
【請求項２４】
単一分子がタンパク質分子である、請求項２３に記載の抗凝固剤。
【請求項２５】
第一および第二の成分が一本鎖抗体分子の骨格中にある、請求項１から２４のいずれか一つに記載の抗凝固剤。
【請求項２６】
一本鎖抗体が本質的に配列番号（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ，）１に示す核酸配列、またはその誘導体または同等物である、請求項２５に記載の抗凝固剤。
【請求項２７】
請求項１から２６のいずれか一つに記載の抗凝固剤、および医薬として許容されるその塩を含む医薬組成物。
【請求項２８】
凝固障害の予防または治療のための、請求項２７に記載の医薬組成物。
【請求項２９】
凝固障害が、冠動脈疾患、心筋梗塞を含む急性冠動脈症候群、脳卒中、頸動脈または大動脈のアテローム性動脈硬化、深部静脈血栓症、肺塞栓症、および臓器のアテローム性動脈硬化または血栓症から成る群から選択される、請求項２８に記載の医薬組成物。
【請求項３０】
（ａ）活性化血小板をターゲッティングする能力がある結合成分および（ｂ）標識を含む、血管異常を検出するためのプローブ。
【請求項３１】
結合成分が活性化血小板の表面上のマーカーへ結合する能力を有する、請求項３０に記載のプローブ。
【請求項３２】
マーカーが活性化血小板の表面上だけに、または主に活性化血小板の表面上に発現される、請求項３１に記載のプローブ。
【請求項３３】
約６００００から８００００個のマーカー分子が各血小板の表面上に見出される、請求項３０から３２のいずれか一つに記載のプローブ。
【請求項３４】
結合成分が血小板上のリガンド誘導性結合部位（ＬＩＢＳ）を指向する、請求項３０から３３のいずれか一つに記載のプローブ。
【請求項３５】
マーカーがＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａである、請求項３１または請求項３２に記載のプローブ。
【請求項３６】
マーカーがＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａの活性化形である、請求項３３から３５のいずれか一つに記載のプローブ。
【請求項３７】
結合成分が、ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ受容体の活性化に際して形成される新しいエピトープと結合する能力を有する、請求項３０から３６のいずれか一つに記載のプローブ。
【請求項３８】
結合成分および標識が一本鎖抗体分子の骨格内にある、請求項３０から３７のいずれか一つに記載のプローブ。
【請求項３９】
標識が常磁性、放射性、またはＸ線造影法で検出可能である、請求項３０から３８のいずれか一つに記載のプローブ。
【請求項４０】
標識がテクネチウム−９９ｍ、ルビジウム−８２、タリウム２０１、Ｆ−１８、ガリウム−６７、またはインジウム−１１１を含む、請求項３９に記載のプローブ。
【請求項４１】
標識が超常磁性酸化鉄またはガドリニウムを含む、請求項３０から４０のいずれか一つに記載のプローブ。
【請求項４２】
標識がミクロンサイズの常磁性酸化鉄を含む、請求項３０から４１のいずれか一つに記載のプローブ。
【請求項４３】
プローブが血管異常の表面を越えて透過および／または血管の表面に接着する能力を有する、請求項３０から４２のいずれか一つに記載のプローブ。
【請求項４４】
対象の血管における 活性化 血小板の検出を含む、対象において血管異常を造影する方法。
【請求項４５】
対象の血管を、請求項３０から４３のいずれか一つに記載のプローブに曝露する段階を含む、請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
異常が破裂アテローム硬化性プラークまたは破裂する傾向にあるアテローム硬化性プラーク、血栓、塞栓、および活性化血小板の蓄積から成る群から選択される、請求項４４または請求項４５に記載の方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６１】
好ましくは、一本鎖抗体はｓｃＦｖ融合タンパク質として発現される。ＴＡＰは機能的な損失無しに融合されうることを示す以前の結果に基づき（ＴＨ）、この非常に強力な直接的な第Ｘａ因子阻害剤が、そのクローニングされた一本鎖抗体と結合させるために選択された。ＴＡＰは公表された配列情報（Ｇｅｎｂａｎｋデータベース登録番号Ｍ６０４８０として）にしたがって最初に合成され、およびｐＨＯＧ２１発現ベクターへ、軽鎖の可変領域のＣ末端に直接クローニングされた（図１参照）。ｐＨＯＧ２１は、封入体によって精製を円滑にするｐｅｌＢリーダー配列、およびＮｉ2+精製および検出のためのＨｉｓ（６）タグを含む（図１）。精製ｓｃＦｖanti-LIBS−ＴＡＰの収量は細菌培養１Ｌから約０．４〜０．８ｍｇであった。発現および精製後、一本鎖抗体構造のサイズがウェスタンブロット分析によって評価された（図３）。ｓｃＦｖanti-LIBS単独の分子量は~３２ｋＤａであり、未変化の融合タンパク質ｓｃＦｖanti-LIBS−ＴＡＰの分子量は~３９ｋＤａであり、および非標的ｍｕｔ−ｓｃＦｖ−ＴＡＰの分子量は~４２ｋＤａであった（図３）。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００９４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００９４】
一本鎖抗体クローニングのために、ハイブリドーマのｃＤＮＡが、ｍＲＮＡ精製カラム（オリゴｄＴ）およびＭ−ＭｕＬＶ（共にアマシャム・ファルマシア社（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ），ドイツ、フライブルク（Ｆｒｅｉｂｕｒｇ））を用いて調製された。抗体可変領域の増幅は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によってＰｆｕ（登録商標）ポリメラーゼ（ストラトジーン社（Ｓｔｒａｔｅｇｅｎｅ），米国カリフォルニア州ラホーヤ（Ｌａ Ｊｏｌｌａ））を用いて達成された。重鎖（ＶH）および軽鎖（ＶL）の可変領域の保存領域（ウェルショフ（Ｗｅｌｓｃｈｏｆ）他．Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ １９９５； １７９： ２０３）に由来する配列に基づいた下記のプライマーが用いられた： ＶH センス： ５’− ＣＣＧ ＧＣＣ ＡＴＧ ＧＣＧ ＣＡＧ ＧＴＧ ＣＡＧ ＣＴＧ ＣＡＧ ＣＡＧ −３’（配列番号２），ＶH アンチセンス： ５’− ＣＣ ＡＧＧ ＧＧＣ ＣＡＧ ＴＧＧ ＡＴＡ ＧＡＣ ＡＡＧ ＣＴＴ ＧＧＧ ＴＧＴ ＣＧＴ ＴＴＴ −３’（配列番号３），ＶL センス： ５’− ＡＡ ＴＴＴ ＴＣＡ ＧＡＡ ＧＣＡ ＣＧＣ ＧＴＡ ＧＡＴ ＡＴＣ G／TＴＧ A／CＴG／C ＡＣＣ ＣＡＡ T／AＣＴ ＣＣ（配列番号４），ＶL アンチセンス： ５’− ＧＡＡ ＧＡＴ ＧＧＡ ＴＣＣ ＡＧＣ ＧＧＣ ＣＧＣ ＡＧＣ ＡＴＣ ＡＧＣ −３’（配列番号５）。ＰＣＲ構造はｐＨＯＧ２１ベクター系（キプリヤノフ（Ｋｉｐｒｉｙａｎｏｖ）他．Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ．１９９７； ２００： ６９，シュワルツ（Ｓｃｈｗａｒｚ）他．ＦＡＳＥＢ Ｊ ２００４： １８： １７０４）へ、ＶHについて制限部位 Ｎｃｏ Ｉ および Ｈｉｎｄ ＩＩＩを、およびＶLについて制限部位 Ｍｌｕ Ｉ および Ｎｏｔ Ｉを用いてクローニングされた。結果として生じた一本鎖抗体をｓｃＦｖanti-LIBSと称した。ＴＡＰは以前にクローニングされており（ハーゲマイヤー（Ｈａｇｅｍｅｙｅｒ）他．Ｔｈｒｏｍｂ Ｈａｅｍｏｓｔ．２００４； ９２： ４７）、およびｓｃＦｖanti-LIBSを既に含むｐＨＯＧ２１へ、制限部位 Ｎｏｔ Ｉ および Ｘｂａ Ｉを用いて導入し、それによってｓｃＦｖanti-LIBS−ＴＡＰ（図１、配列番号１）を作製した。ｓｃＦｖ部分の結合機能を持たない対照として、一本鎖抗体を含む非標的ｍｕｔ−ｓｃＦｖ−ＴＡＰが作製され、その一本鎖抗体は元はＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａへ結合したが、しかしその重鎖ＣＤＲ３（相補性決定領域）が変異され（ＲＮＤからＡＮＤへ）およびそれによってその結合性質が失われた。すべての構造は配列決定された。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１２３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１２３】
【図１】図１はＳｃＦｖ−抗ＬＩＢＳ−ＴＡＰを示す（配列番号１）。細菌ペクチン酸リアーゼ（ｐｅｌＢ）の細菌シグナルペプチド配列は４０位から１０５位までのヌクレオチドを含み、重鎖の可変領域は１０６位から４８３位までのヌクレオチドを含み、リンカー（ＹＯＬエピトープ）は４８４位から５１０位までのヌクレオチドを含み；軽鎖の可変領域は５１１位から８６１位までのヌクレオチドを含み；ＴＡＰ領域は８６２位から１０４１位までのヌクレオチドを含み、およびＨｉｓ６−タグは１０６９位で開始しおよび１０８６位で終了する。
【図２】図２はｐＨＯＧ２１−ｓｃＦｖ抗ＬＩＢＳ−ＴＡＰのマップを示す。ＲＡＭＰ：アンピシリン耐性遺伝子；ＣｏｌＥ１ＯＲＩ：大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の複製開始点；ｆ１ＩＧ、線維状遺伝子間領域；ｐｅｌＢ：ペクチン酸リアーゼｐｅｌＢのリーダーペプチド配列；ＶＨ／ＶＬ：重鎖／軽鎖；ＴＡＰ：ダニ抗凝固ペプチド；Ｈｉｓ６：ヒスチジン６個の反復。
【図３】図３は、ＩｇＧ抗ＬＩＢＳ、ｓｃＦｖ抗ＬＩＢＳ、およびｓｃＦｖ抗ＬＩＢＳ−ＴＡＰの、非活性化でなく活性化ヒト血小板に対する特異的結合のフローサイトメトリーヒストグラムを示す。ＡＤＰ活性化血小板の結合は白ヒストグラムで示される；非活性化血小板への結合は網掛けヒストグラムで示される。ＩｇＧ抗体の結合はＤＴＡＦ複合体化ヤギ抗マウス抗体によって検出され、ｓｃＦｖｓの結合はアレクサフロー（Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ）４８８複合体化抗Ｈｉｓタグ抗体によって検出される。
【図４】図４は、Ｎｉ２＋−生成ｓｃＦｖ抗ＬＩＢＳ、ｓｃＦｖ抗ＬＩＢＳ−ＴＡＰ、および非標的ｍｕｔ−ｓｃＦｖ−ＴＡＰのウェスタンブロット分析を示す。ＭＷ：分子量マーカー（６ｘＨｉｓタンパク質ラダー）、１：ｓｃＦｖ抗ＬＩＢＳ、２：ｓｃＦｖ抗ＬＩＢＳ−ＴＡＰ、３：非標的ｓｃＦｖ−ＴＡＰ。
【図５】図５は、第Ｘａ因子活性の、ｒＴＡＰ、ｓｃＦｖ抗ＬＩＢＳ−ＴＡＰ、および非標的ｍｕｔ−ｓｃＦｖ−ＴＡＰによるが、ｓｃＦｖ抗ＬＩＢＳによらない阻害を示す。発色基質（スペクトロザイムＦＸａ＃２２２）の第Ｘａ因子（５００ｐＭ）による切断が、４０５ｎｍにて測定された。棒グラフは光学密度（ＯＤ）を、代表的な実験の三連測定の平均値および標準偏差として示す。
【図６】図６は、ＩｇＧ抗ＬＩＢＳ、ｓｃＦｖ抗ＬＩＢＳ、およびｓｃＦｖ抗ＬＩＢＳ−ＴＡＰの、非活性化でなく活性化マウス血小板への特異的結合のフローサイトメトリーヒストグラムを示す。トロンビン活性化血小板の結合は白ヒストグラムで示される；非活性化血小板への結合は網掛けヒストグラムで示される。ＩｇＧ抗体の結合はＤＴＡＦ複合体化ヤギ抗マウス抗体によって検出され、ｓｃＦｖｓの結合はアレクサフロー（Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ）４８８複合体化抗Ｈｉｓタグ抗体によって検出される。
【図７】図７は、塩化第二鉄誘導性血栓症を有するマウスモデルでの頸動脈における、高用量および低用量でのｓｃＦｖ抗ＬＩＢＳ−ＴＡＰの抗血栓作用を示す。血栓発生は頸動脈でのナノドップラーフロープローブを用いたフロー測定によって測定された、閉塞時間測定によって評価された。生理食塩水（０．９％ＮａＣｌ）および一本鎖抗体ｓｃＦｖ抗ＬＩＢＳが陰性対照として用いられる。臨床に使用される薬剤としてエノキサパリンが陽性対照として用いられる。ｒＴＡＰ、ｓｃＦｖ抗ＬＩＢＳ−ＴＡＰ、および非標的ｍｕｔ−ｓｃＦｖ−ＴＡＰが高い等モル用量で用いられ、およびｓｃＦｖ抗ＬＩＢＳ−ＴＡＰおよび非標的ｓｃＦｖ−ＴＡＰが低い等モル用量で用いられた。各群４個体のマウスの平均値および標準偏差（ＳＤ）が示される。
【図８】図８は、凝固標的化抗凝固ｓｃＦｖ抗ＬＩＢＳ−ＴＡＰが、コントラストｔｏエノキサパリン、ｒＴＡＰ、および非標的ｍｕｔ−ｓｃＦｖ−ＴＡＰとは対照的に出血時間延長を引き起こさないことを示す。マウスにおける出血時間は、尾切断によって測定した。生理食塩水（０．９％ＮａＣｌ）および一本鎖抗体ｓｃＦｖ抗ＬＩＢＳが陰性対照として用いられた。ｒＴＡＰおよび非標的ｍｕｔ−ｓｃＦｖ−ＴＡＰは、ｓｃＦｖ抗ＬＩＢＳ−ＴＡＰとは対照的に出血時間の相当な延長を示した。各群４個体のマウスの平均値および標準偏差（ＳＤ）が示される。
【図９】図９は、血栓接着検定の概要を示す。フィブリノーゲン上に固定化された血小板が、抗ＬＩＢＳビーズコントラスト剤を用いて活性化ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ受容体を介してターゲッティングされた。血小板の同時染色が、コントラスト剤の血小板だけとの選択的結合を実証するため、Ｐ−セレクチン抗体およびフルオレセイン−アビジンを用いて実施された。
【図１０】図１０左図：接着検定の共焦点顕微鏡像。Ｐ−セレクチンおよびフルオレセインアビジン染色血小板は緑色の集塊として現れ、抗ＬＩＢＳビーズコントラスト剤の赤色の蛍光ビーズで囲まれている。右図：共焦点顕微鏡像６０枚からのＺスタックの３Ｄ再構成。
【図１１】図１１は、縦軸に垂直に再構成されたヒト血栓のＭＲＩの３Ｄ ＦＬＡＳＨ像を示す。異なる濃度の抗ＬＩＢＳビーズコントラスト剤に曝露された血栓は、ＳＰＩＯビーズによって生じたＴ２＊（血栓周囲の黒い輪）のネガティブコントラストを示す。ビーズ上の無関係の抗体に曝露された血栓は、このネガティブコントラストを示さない。
【図１２】図１２は、マウス 抗ヒト Ｐ−セレクチン および ノヴァレッド（茶色）を用いた血小板の免疫組織化学を示す。抗ＬＩＢＳ ビーズ コントラスト剤は黄色に見え、および血栓表面上の血小板凝集の範囲だけに存在する。
【図１３】図１３は、アビジン−フルオレセインについてＣＤ６２Ｐ抗体を用いて染色された、フィブリノーゲンで固定されたヒト血小板の免疫蛍光を示す。（Ａ）赤色自己蛍光ＬＩＢＳ−ＭＰＩＯコントラスト剤とインキュベートされた血小板は、緑色のアビジン−フルオレセイン誘導シグナルで表される血小板との特異的結合を示し、一方、対照ＭＰＩＯコントラスト剤との血小板のインキュベートは結合を示さない（Ｂ）。（Ｃ）はＬＩＢＳ−ＭＰＩＯとインキュベートされおよびＰ−セレクチンについて染色された血小板からのＺスタックの３Ｄ再構成を表し、活性化ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ受容体に対するＬＩＢＳのターゲッティングの原理を示す。
【図１４】図１４は、３Ｄグラジエントエコーシーケンス（ＴＥ＝４ｍｓ／ＴＲ＝９０ｍｓ、視野１３×１３×１９．５ｍｍ、マトリクスサイズ２５６×２５６×３８４）、等方性分解能２５μｍ3の１１．７Ｔ ｅｘ ｖｉｖｏ ＭＲＩを示す。（Ａ）はＬＩＢＳ−ＭＰＩＯ灌流マウスにおける傷害大腿動脈を示す。黒色の内因性血管壁シグナルが、ＬＩＢＳ−ＭＰＩＯマウスおよび対照ＭＰＩＯマウスで観察でき（Ｂ）、しかし大腿動脈の管腔側に接してシグナル空白がＬＩＢＳ−ＭＰＩＯマウスにおけるＭＰＩＯ結合の指標として観察されうる（Ａ、矢印）。ＭＰＩＯに誘導されるＭＲＩシグナル空白の定量は、ＬＩＢＳ−ＭＰＩＯおよび対照ＭＰＩＯ灌流マウスの間の有意差を明らかにする（ｐ＜０．０５）。
【図１５】図１５は、代表的な傷害大腿動脈断片の組織学を示す。（Ａ）はＬＩＢＳ−ＭＰＩＯを用いた灌流後の傷害壁への複数のビーズ結合を示し（矢印）、一方、対照ＭＰＩＯ灌流後には結合は観察できない（Ｂ）。（Ａ）および（Ｂ）の組織は鉄染色されたが、ビーズのポリスチレンコーティングは鉄コアの典型的な青色染色を可能にする。しかし、鉄コアの青色の内因性シグナルは、顕微鏡の焦点に依存して観察できた。（Ｃ）ＬＩＢＳ−ＭＰＩＯコントラスト剤の血小板への結合は、ＣＤ６１についての免疫組織化学およびノヴァレッド染色を用いて確認された。（ａ）は壁に接着した血小板を表し、および（ｂ）ＭＰＩＯは血小板へ直接結合した。（Ｄ）ＬＩＢＳ−ＭＰＩＯおよび対照ＭＰＩＯ灌流マウスにおいて代表的な組織切片ごとに結合したＭＰＩＯの定量、ＬＩＢＳを標的とするコントラスト剤の高度に特異的な結合を示す（ｐ＜０．０１）。
【図１６】図１６は、ＭＲＩでの傷害肢についてのＭＰＩＯシグナルおよび組織学での切片についての結合したＭＰＩＯの間の相関分析を示し、有意な相関を示す（Ｒ2＝０．７２）
【図１７】図１７は、イメージプロ・プラス（ＩｍａｇｅＰｒｏ Ｐｌｕｓ）用３Ｄコンストラクター・プラグインを用いるＬＩＢＳ−ＭＰＩＯ動物の大腿動脈の三次元再構成を示す。（Ａ）は緑色の管として現れる大腿動脈管腔を示す。（Ｂ）は赤色のＭＰＩＯシグナル単独を示し、および（Ｃ）では解剖学的像についての融合した情報が示される。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2009500299000001.app