(57)【要約】  樹立されたハイブリドーマが産生するモノクローナル抗体は、ＩＬ−１８に対して特異性が高いだけではなく、ＩＬ−１８の機能解析を行ううえで重要であるウェスタンブロッティング、免疫沈降、免疫染色を行うことができる。特に、ウェスタンブロッティングを高感度で行うことができるので、活性型のＩＬ−１８を検出することができる。また、ＩＬ−１８の機能を阻害することから、治療にも使用することができる。【選択図】図２
2019194217.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトＩＬ−１８のＲＸＬＦＥＤ（配列番号５）をエピトープとして認識する抗ＩＬ−１８モノクローナル抗体。
【請求項２】
重鎖可変ドメインが、ＧＹＡＦＴＫＹＹ（配列番号２３）、又はＧＹＴＦＴＤＹＹ（配列番号３６）のアミノ酸配列からなるＣＤＲ１Ｈ領域、
ＩＮＰＮＮＧＧＴ（配列番号２４）、又はＩＮＰＫＮＧＧＳ（配列番号３７）のアミノ酸配列からなるＣＤＲ２Ｈ領域、
ＡＫＬＧＬＤＦＤＣ（配列番号２５）のアミノ酸配列からなるＣＤＲ３Ｈ領域を含み、
軽鎖可変ドメインが、ＬＬＹＳＮＧＫＴＹ（配列番号２６）のアミノ酸配列からなるＣＤＲ１Ｌ領域、
ＬＶＳ（配列番号２７）のアミノ酸配列からなるＣＤＲ２Ｌ領域、
ＶＱＧＴＨＦＰＹＴ（配列番号２８）のアミノ酸配列からなるＣＤＲ３Ｌ領域を含むことを特徴とする請求項１記載の抗ＩＬ−１８モノクローナル抗体。
【請求項３】
Ｈ鎖可変領域のアミノ酸配列が配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６のいずれか１つであり、
Ｌ鎖可変領域のアミノ酸配列が配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２のいずれか１つであることを特徴とする請求項１、又は２記載の抗ＩＬ−１８モノクローナル抗体
【請求項４】
請求項２記載のＣＤＲ配列、又は請求項３記載の可変領域をコードする遺伝子をオープンリーディングフレーム領域として有する遺伝子。
【請求項５】
請求項１〜３いずれか１項記載の抗ＩＬ−１８モノクローナル抗体の機能的断片。
【請求項６】
請求項１〜３いずれか１項記載のモノクローナル抗体、又は請求項５記載のモノクローナル抗体の機能的断片を含む、
ＩＬ−１８を検出、及び／又は定量するためのキット。
【請求項７】
請求項２のＣＤＲ、又は請求項３の可変領域と
ヒト定常領域を備えている抗ＩＬ−１８ヒト化抗体。
【請求項８】
請求項１〜３いずれか１項記載のモノクローナル抗体、又は請求項５記載のモノクローナル抗体の機能的断片を有効成分として含む、
ＩＬ−１８関連疾患の治療に用いる医薬組成物。
【請求項９】
請求項１〜３いずれか１項記載のモノクローナル抗体、請求項５記載のモノクローナル抗体の機能的断片、又は請求項６記載のキットを使用して、
活性型ＩＬ−１８を検出及び／又は定量することを特徴とするＩＬ−１８関連疾患の検査方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
炎症性サイトカインであるインターロイキン１８（ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−１８、以下ＩＬ−１８と記載する。）タンパク質に対する抗体、及びその応用に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＩＬ−１８は、ＩＬ−１βファミリーのサイトカインであり、主としてマクロファージで発現しているが、樹状細胞、上皮細胞、ケラチノサイトなど様々な細胞で発現している。また、ＩＬ−１８受容体はＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞、ＣＤ４  Ｔ細胞の他、Ｂ細胞、好中球、マクロファージ、血管内皮細胞、平滑筋細胞など様々な細胞で発現している。ＩＬ−１８発現細胞、受容体発現細胞の多様性は、ＩＬ−１８の機能の多様性を示しており、種々の免疫系に関与していることが知られている。【０００３】
ＩＬ−１８は、発見当初寄生虫や細菌感染などの病原体に対する防御機構において重要な役割を果たすことが示されてきたが、それだけではなく、アレルギー疾患や自己免疫疾患においても重要な役割を果たすことが示されている（非特許文献１、２）。【０００４】
ＩＬ−１８は、ＴＮＦなどのサイトカインとは異なり、ｍＲＮＡレベルでの産生調節を受けず、活性のない前駆体（ｐｒｏ−ＩＬ−１８）として細胞内に豊富に存在する。ｐｒｏ−ＩＬ−１８は、カスペース１（ｃａｓｐａｓｅ−１）、又はカスペース４によって前駆体が切断されることで、活性型となり細胞外に放出される。したがって、ｍＲＮＡ発現量や、細胞内の前駆体タンパク質の測定を行っても、ＩＬ−１８の活性を測定することにはならず、ＩＬ−１８の機能解析を行うためには、カスペースによって切断された活性型ＩＬ−１８を解析することが必須である。【０００５】
ＩＬ−１８が種々の疾患において重要な役割を果たすことから、ＩＬ−１８に結合する中和抗体については多数報告されている（特許文献１〜１０）。しかし、いずれの文献もＩＬ−１８が関与する種々の疾患を治療することを目的として開発された中和抗体であることから、中和活性としての機能が開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】国際公開第２００１／０５８９５６号
【特許文献２】国際公開第２００５／０４７３０７号
【特許文献３】国際公開第２００７／１３７９８４号
【特許文献４】国際公開第２０１０／０２０５９３号
【特許文献５】国際公開第００／５６７７１号
【特許文献６】国際公開第２０１２／０８５０１５号
【特許文献７】国際公開第２０１４／０３７８９９号
【特許文献８】特開２０００−２３６８８４号公報
【特許文献９】国際公開第２００４／０９７０１９号
【特許文献１０】国際公開第２０１４／０８０８６６号
【特許文献１１】国際公開第２０１２／１２４６８３号
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Arend, W.P. et al., Immunol. Rev., 2008, Vol.223, p.20-38.
【非特許文献２】Sanders, N.L. & Mishra, A., Cytokine Growth Factor Rev., 2016, Vol.32,pp.31-39.
【非特許文献３】Kawashima, M. et al., Arthritis Rheum. 2001, Vol.44, No.3, pp.550-560.
【非特許文献４】Yoshida H, et.Al., Genes & Dev., 2015, Vol.29, pp.1649-1660.
【非特許文献５】Tsutsumi, N. et al., Nature Commun., 2014, DOI:10.1038/ncomms6340.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
しかしながら、上記特許文献で開示されている抗体はいずれも中和抗体であり、ウェスタンブロッティング、免疫沈降、免疫染色など、ＩＬ−１８の機能解析を行うのに必要な性質を備えているものではない。特に、ウェスタンブロッティングは、カスペース１、又はカスペース４により切断され活性を有するＩＬ−１８と前駆体を区別し得ることから、ＩＬ−１８の機能を理解するうえで重要な実験となる。いずれの文献に開示されている抗体もウェスタンブロッティングを行い得るものであることの記載はなく、さらに、現在研究用に市販されている抗体もＥＬＩＳＡに適した抗体であり、高感度でウェスタンブロッティングが行えるものはない。また、市販のポリクローナル抗体を使用してウェスタンブロッティングを行い、活性型ＩＬ−１８を検出したとの報告があるものの（非特許文献３）、検出感度が低いことや、ポリクローナル抗体であることから、安定して同じ性質の抗体を得ることができず、すでにこの抗体は販売が中止されている。ＩＬ−１８は、臨床検体では非常に低濃度で存在していることから、感度良く検出を行うことが要求されるのにも関わらず、高感度でウェスタンブロッティングを行うことができる抗体は存在していない。【０００９】
本発明は、ＩＬ−１８に対して特異性が高く、ＩＬ−１８の機能解析を行ううえで重要であるウェスタンブロッティング、免疫沈降、免疫染色を行うことができる抗体を提供することを課題とする。さらに、研究用の試薬としてだけではなく、ＩＬ−１８の機能を阻害し、治療にも使用できる抗体を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明は以下のモノクローナル抗体、モノクローナル抗体の機能的断片、及びこれら抗体を含むキット、また、これら抗体、又は機能的断片をコードする遺伝子、及びヒト化抗体、医薬組成物、検査方法、治療方法に関する。【００１１】
（１）ヒトＩＬ−１８のＲＸＬＦＥＤ（配列番号５）をエピトープとして認識する抗ＩＬ−１８モノクローナル抗体。
（２）重鎖可変ドメインが、ＧＹＡＦＴＫＹＹ（配列番号２３）、又はＧＹＴＦＴＤＹＹ（配列番号３６）のアミノ酸配列からなるＣＤＲ１Ｈ領域、ＩＮＰＮＮＧＧＴ（配列番号２４）、又はＩＮＰＫＮＧＧＳ（配列番号３７）のアミノ酸配列からなるＣＤＲ２Ｈ領域、ＡＫＬＧＬＤＦＤＣ（配列番号２５）のアミノ酸配列からなるＣＤＲ３Ｈ領域を含み、軽鎖可変ドメインが、ＬＬＹＳＮＧＫＴＹ（配列番号２６）のアミノ酸配列からなるＣＤＲ１Ｌ領域、ＬＶＳ（配列番号２７）のアミノ酸配列からなるＣＤＲ２Ｌ領域、ＶＱＧＴＨＦＰＹＴ（配列番号２８）のアミノ酸配列からなるＣＤＲ３Ｌ領域を含むことを特徴とする（１）記載の抗ＩＬ−１８モノクローナル抗体。
（３）Ｈ鎖可変領域のアミノ酸配列が配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６のいずれか１つであり、Ｌ鎖可変領域のアミノ酸配列が配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２のいずれか１つであることを特徴とする（１）、又は（２）記載の抗ＩＬ−１８モノクローナル抗体。
（４）（２）記載のＣＤＲ配列、又は（３）記載の可変領域をコードする遺伝子をオープンリーディングフレーム領域として有する遺伝子。
（５）（１）〜（３）いずれか１つ記載の抗ＩＬ−１８モノクローナル抗体の機能的断片。
（６）（１）〜（３）いずれか１つ記載のモノクローナル抗体、又は（５）記載のモノクローナル抗体の機能的断片を含む、ＩＬ−１８を検出、及び／又は定量するためのキット。
（７）（２）のＣＤＲ、又は（３）の可変領域とヒト定常領域を備えている抗ＩＬ−１８ヒト化抗体。
（８）（１）〜（３）いずれか１つ記載のモノクローナル抗体、又は（５）記載のモノクローナル抗体の機能的断片を有効成分として含む、ＩＬ−１８関連疾患の治療に用いる医薬組成物。
（９）（１）〜（３）いずれか１つ記載のモノクローナル抗体、（５）記載のモノクローナル抗体の機能的断片、又は（６）記載のキットを使用して、活性型ＩＬ−１８を検出及び／又は定量することを特徴とするＩＬ−１８関連疾患の検査方法。
（１０）請求項８記載の医薬組成物を用い、ＩＬ−１８関連疾患を治療する方法。
【発明の効果】
【００１２】
本明細書に記載している抗体は、現在使用されている抗体よりも高感度にＩＬ−１８の検出を行うことができる。特に、ウェスタンブロッティングを行うことのできる高感度のモノクローナル抗体であることから、活性型のＩＬ−１８と前駆体であるｐｒｏ−ＩＬ−１８とを区別して検出することが可能である。また、ＩＬ−１８の機能阻害活性も備えていることから、治療用に使用することも可能である。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】モノクローナル抗体１１−４．１の特異性を示す図。
【図２】モノクローナル抗体１１−４．１の感度を示す図。
【図３】モノクローナル抗体１１−４．１による成人スティル病（ＡＯＳＤ）患者血清中の活性型ＩＬ−１８の検出を示す図。
【図４】モノクローナル抗体１１−４．１による血球貪食症候群患者血清中の活性型ＩＬ−１８の検出を示す図。
【図５】モノクローナル抗体１１−４．１による免疫沈降の実験結果を示す図。
【図６】モノクローナル抗体１１−４．１によるＩＬ−１８の機能阻害活性の実験結果を示す図。
【図７】モノクローナル抗体１１−４．１による免疫染色の実験結果を示す図。図７Ａは、ＨｅＬａ細胞にＧ１９６タグを付与した活性型ＩＬ−１８を発現させ免疫染色を行った図。図７Ｂは、ＨｅＬａ細胞中の内在性ＩＬ−１８をウェスタンブロッティング、及び免疫染色で検出した図。
【図８】図８Ａ、Ｂともにモノクローナル抗体１１−４．１の認識部位をウェスタンブロッティングにより解析した結果を示す図。
【図９】モノクローナル抗体１１−４．１、４−１８．１．４、及び９−４．２．１の詳細な認識部位をウェスタンブロッティングにより解析した結果を示す図。図９Ａは１１−４．１の解析結果を、図９Ｂは４−１８．１．４、及び９−４．２．１の解析結果を示す。
【図１０】モノクローナル抗体１１−４．１の表面プラズモン共鳴解析のセンサーグラム。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本発明の抗体は、以下に示すＩＬ−１８のエピトープに特異的に結合するモノクローナル抗体、又は誘導体をいう。また、元の抗体と実質的に同じ抗原特異性を示す当該抗体の機能的断片をも含むものとする。抗体の機能的断片には、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、単鎖抗体（ｓｃＦｖ）、ジスルフィド安定化Ｖ領域断片（ｄｓＦｖ）、もしくはＣＤＲを含むペプチドなどの抗体の機能的断片が含まれる。
【００１５】
また、本発明で特定したＩＬ−１８のエピトープに特異的に結合するモノクローナル抗体を遺伝子組換え技術を利用してヒト型キメラ抗体、ヒト化ＣＤＲ移植抗体などとしたヒト化抗体、遺伝子改変マウスを用いたヒト抗体もまた本発明の抗体に含まれる。ヒト化抗体、ヒト抗体は、ヒトに投与した場合、ヒト以外の動物の抗体に比べ副作用が少なく、その治療効果が長時間持続する。
【００１６】
「エピトープ」とは、抗体によって認識される抗原（本発明の場合にはＩＬ−１８）の一部をいい、本明細書において開示される抗体可変領域を含むドメインが結合する抗原上の部位を意味する。例えば、ＩＬ−１８のようなポリペプチドを抗原とする場合には、抗体は直線的なアミノ酸配列を認識する場合も、３次元的な立体構造を認識する場合もあるから、エプトープは、アミノ酸配列や抗原の構造によって定義することができる。
【００１７】
本明細書において「ＩＬ−１８関連疾患」とは、活性型ＩＬ−１８が過剰に細胞外に放出されることにより惹起される疾患、あるいはＩＬ−１８によって増悪する可能性のある疾患をいう。ＩＬ−１８関連疾患は、ＩＬ−１８の過剰発現で発症、増悪している疾患であるから、ＩＬ−１８の機能を阻害することができる有効成分を含有する薬剤によって治療、もしくは予防することができる。例えば、成人スティル病（ＡＯＳＤ）、若年性スティル病、膵がん、肺がん、大腸がんなどの悪性腫瘍、クリオピリン関連周期熱症候群、全身性エリトマトーデス（ＳＬＥ）、多発性硬化症、若年性突発性関節炎（ＪＩＡ）、気管支喘息、気管支拡張症、慢性閉塞性肺疾患（ＣＤＰＤ）、輸血関連肺傷害、気管支肺異形成症（ＢＰＤ）、急性呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）、間質性肺疾患（ＩＬＤ）、突発性肺線維症、嚢胞性線維症、関節リウマチ、代謝性骨疾患、肝臓及び腸管での重篤な臓器傷害、心不全、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、眼球乾燥症（ＤＥＤ）、角膜炎、角膜血管新生、病的眼球内血管新生、虹彩炎、緑内障、黄斑変性症、シェーグレン症候群、自己免疫性ブドウ膜炎、ベーチェット病、結膜炎、アレルギー性結膜炎、眼瞼皮膚炎、アレルギー性鼻炎、２型糖尿病、非アルコール性脂肪肝疾患（ＮＡＦＬＤ）、脂肪性肝炎、虚血再灌流傷害、家族性地中海熱、ＴＮＦ受容体関連周期性症候群、高ＩｇＤ症候群、痛風、シュニッツラー症候群、顕微鏡的多発血管炎、肉芽腫性多発血管炎、好酸球肉芽腫性多発血管炎からなるＡＮＣＡ関連血管炎、橋本病、クローン病、潰瘍性大腸胃炎、免疫グロブリン−４（ＩｇＧ４）関連疾患、肺動脈高血圧症、アトピー性皮膚炎などでＩＬ−１８の関与が報告されていることから、これらＩＬ−１８関連疾患ではＩＬ−１８の機能を阻害する薬剤によって治療効果が得られることが期待される。
【００１８】
本明細書において「キット」とは、以下の実施例で示すウェスタンブロッティング、免疫沈降、免疫染色、ＩＬ−１８の機能阻害活性試験に限らず、本明細書で開示する抗体を用いてＩＬ−１８を検出、定量、あるいは、その機能を評価する目的のために、必要な試薬、器具などを構成要素とするパッケージングされた組み合わせをいう。
【００１９】
本発明で検査とは、サンプル中に活性型ＩＬ−１８が存在するか否かを判断することを目的とする活性型ＩＬ−１８の検出をいう。特に、患者サンプルを用いて活性型ＩＬ−１８がサンプル中に存在するかを検出することをいう。患者サンプルとしては、血漿、血清、血液、髄液、尿などのサンプルを用いることができる。
【００２０】
また、医薬組成物は、投与経路に適合するように製剤化される。投与経路は、例えば、静脈内投与、皮下投与、硝子体内投与のような非経口投与だけではなく、軟膏、点眼剤などの外用薬等、疾患に適した剤形に製剤することができる。医薬組成物には、剤形に適した担体、賦形剤、溶媒、希釈剤など一般に当該分野で用いることのできる化合物を含むことができる。
【実施例】
【００２１】
以下の実施例において、本発明を詳細に説明するが、本発明の範囲はこれに限定されるものではない。
［実施例１］抗体の作製
ヒト炎症性サイトカインＩＬ−１８タンパク質（ｕｎｉｐｒｏｔ：Ｑ１４１１６）の３７〜１９３位のポリペプチド（活性型ＩＬ−１８、配列番号１）をコードする遺伝子領域をｐＥＴ２８ＨｉｓＴＥＶ（非特許文献４）にクローニングし、大腸菌で発現させ精製した。精製したタンパク質を常法に従いマウスに免疫し、抗原に使用した精製タンパク質を用いてＥＬＩＳＡ法により選別し、ハイブリドーマを樹立した。【００２２】
以下に詳述するが、同一のエピトープを認識する３種のモノクローナル抗体１１−４．１モノクローナル抗体（以下、１１−４．１抗体という。他の抗体も同様に記載する。）、４−１８．１．４抗体、９−４．２．１抗体を産生するハイブリドーマ１１−４．１、４−１８．１．４、９−４．２．１を選択し解析を行った。これらモノクローナル抗体のうち、主として１１−４．１抗体についてウェスタンブロッティング、免疫染色などの応用について説明するが、以下で示すように、他の２種のモノクローナル抗体もエピトープが同一であり、ウェスタンブロッティング等、同様の手法の解析に用いることができる。【００２３】
［実施例２］ハイブリドーマ１１−４．１が産生するモノクローナル抗体１１−４．１の特異性の評価
Ｇ１９６タグ（アスパラギン酸−ロイシン−バリン−プロリン−アルギニン、ＤＬＶＰＲ、以下、アミノ酸配列は一文字表記で表す。配列番号２）を融合したヒト炎症性サイトカインＩＬ−１βファミリータンパク質をヒト胎児腎由来細胞株ＨＥＫ−２９３細胞で発現させた。発現させたタンパク質を、ウェスタンブロッティングを用いて１１−４．１抗体を評価した（図１）。１１−４．１抗体は、ＩＬ−１８タンパク質のみを認識し、ＩＬ−１βファミリーであるＩＬ−１α、β、Ｒａ（Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ａｎｔａｇｏｎｉｓｔ）、ＩＬ−３３、ＩＬ−３６α、β１、β２、γ、Ｒａ、ＩＬ−３７、ＩＬ−３８のアイソフォームであるＩＬ−３８−１、ＩＬ−３８−２とは反応しなかった。ＩＬ−１βファミリーの他のタンパク質には結合性を示さなかったことから、非常に特異性の高い抗体であるといえる。なお、Ｇ１９６タグは、Ｇ１９６モノクローナル抗体によって検出されるタグ配列である（特許文献１１）。下段に示すＧ１９６モノクローナル抗体によるウェスタンブロッティングは、各タンパク質が発現していることを示すためのものである。【００２４】
［実施例３］１１−４．１抗体の親和性の評価
汎用されている市販の２種類の抗ＩＬ−１８抗体（Ｄ０４３−３：ｃｌｏｎｅ  ２５−２Ｇ、Ｍ１５６−３：ｃｌｏｎｅ  ４３Ａ１１、いずれも株式会社医学生物学研究所製）との性能比較を行った。大腸菌で発現精製させた１００、３３、１０、３．３ｎｇ／ｍＬの活性型ＩＬ−１８タンパク質（アミノ酸３７位〜１９３位、図中ｃＩＬ−１８  ｐｒｏｔｅｉｎと記載。）をＷｅｓ（プロテイン  シンプル社）を用いてキャピラリーウエスタンイムノアッセイ法により検出した。１次抗体として、各精製抗体を０．４ｍｇ／ｍＬに調整後、表示の希釈で使用した。すなわち、１：１２５倍希釈は、３．２μｇ／ｍＬ、１：２５倍希釈は１６μｇ／ｍＬ濃度で各一次抗体を使用している。露光時間、２次抗体など他の条件はすべて同一にして行った（図２）。【００２５】
１１−４．１抗体は、１：２５倍希釈で３．３ｎｇ／ｍＬの濃度のタンパク質を検出可能であった。これに対し、同希釈倍率では、Ｄ０４３−３抗体は１００ｎｇ／ｍＬ濃度のタンパク質を検出可能で、Ｍ１５６−３抗体はいずれの濃度でも検出できなかった。１１−４．１抗体は、検出が確認されたＤ０４３−３と比較しても約６０倍以上感度がよいことが判明した。【００２６】
［実施例４］臨床検体を用いた評価
（１）１１−４．１抗体の臨床検体を用いた評価
上述のように、ＩＬ−１８は、ＴＮＦなどのサイトカインとは異なり、ｍＲＮＡレベルでの産生調節を受けず、活性のない前駆体として細胞内に豊富に存在する。そのため、ｍＲＮＡ発現量や細胞内の前駆体タンパク質の測定は、ＩＬ−１８の活性を反映しておらず、ＩＬ−１８の機能解析を行うためには、活性型ＩＬ−１８、すなわち切断されたＩＬ−１８タンパク質を検出することが必須である。上記実施例３で示したように、１１−４．１抗体は市販の抗ＩＬ−１８抗体に比べて非常に感度が高いことから臨床検体中の活性型ＩＬ−１８を検出することができるか検討した。なお、以下の研究に関しては、島根大学医学部医の倫理委員会の承認を受けて行っている。【００２７】
ＩＬ−１８タンパク質が高値を示すことが報告されている成人発症スティル病（ＡＯＳＤ）患者血清中のＩＬ−１８タンパク質を、Ｗｅｓを用いたキャピラリーウエスタンイムノアッセイ法により検出した。１次抗体として、１１−４．１抗体を０．４ｍｇ／ｍＬに調整後、１：１２５倍希釈（３．２μｇ／ｍＬ）で使用した。【００２８】
図３に示すように、１１−４．１抗体は、ＡＯＳＤ患者血清中の活性型ＩＬ−１８を検出できる。今までモノクローナル抗体を用いたウェスタンブロッティングにより患者血清中の活性型ＩＬ−１８を検出した報告はなく、１１−４．１抗体が非常に感度が高く有用な抗体であることが示された。また、検体番号の下に示すバーは、同一患者からの検体であることを示しているが、血清中に含まれる微量の活性型ＩＬ−１８を検出できるだけではなく、試料５３、５４（図３上）、１３７、１３８（図３下）のように同一患者における治療前後での活性型ＩＬ−１８の変化や、試料６４、６５（図３上）のように発作時、非発作時、試料５７、１３６（図３下）のように、発作時、治療後で活性型ＩＬ−１８の変化を検出することができることから、治療の効果、病状の変化を客観的に検査することができる。すなわち、１１−４．１抗体は、ＩＬ−１８関連疾患の診断薬として使用できる。なお、試料５２についてはＡＯＳＤ症例であるという以外の患者情報が得られていない。【００２９】
（２）１１−４．１抗体の臨床検体を用いた評価
モノクローナル抗体１１−４．１を用い、血中のＩＬ−１８タンパク質が高値を示すことが報告されている血球貪食症候群患者血清についても解析を行った。【００３０】
血球貪食症候群患者血清中のＩＬ−１８タンパク質を、上記と同様にＷｅｓを用いたキャピラリーウエスタンイムノアッセイ法により検出した。１次抗体として、１１−４．１を０．４ｍｇ／ｍＬに調整後、１：１２５倍希釈で使用した。内部標準タンパク質として、活性型カスペース４１０５−３７７で切断した活性型ＩＬ−１８タンパク質を４０、２０、１０、５及び２．５ｎｇ／ｍＬの濃度で使用した。結果を図４に示す。６名中、２人の患者（＃２、＃５）において、活性型ＩＬ−１８、すなわち、カスペースで切断された活性型ＩＬ−１８と同じ位置にタンパク質が検出された。【００３１】
ＥＬＩＳＡは感度を増強してＩＬ−１８を検出することができるが、活性型ＩＬ−１８を特異的に認識できる抗体がないため、活性型ＩＬ−１８のみをＥＬＩＳＡによって直接検出することはできない。キャピラリーウエスタンイムノアッセイ法により、分子量を確認することによって、ＡＯＳＤや血球貪食症候群患者血清中で活性型ＩＬ−１８を検出できることは臨床上非常に意味のあることである。【００３２】
［実施例５］１１−４．１抗体による免疫沈降法
活性型である３７位から１９３位のＩＬ−１８ポリペプチドにＧ１９６タグを融合させて発現させるベクター、ＩＬ−１８３７−１９３-Ｇ１９６／ｐｃＤＮＡ３ベクターをＨＥＫ−２９３細胞に導入し、ＩＬ−１８３７−１９３-Ｇ１９６タンパク質を発現させた。１１−４．１抗体の免疫沈降法における有用性について、既存のＧ１９６タグ抗体と比較し評価した（図５）。１１−４．１抗体、Ｇ１９６抗体、ネガティブコントロール抗体としてＦｌａｇタグ抗体（Ｍ２、シグマ−アルドリッチ社）を使用し、免疫沈降を行い、免疫沈降産物はＧ１９６ウサギポリクローナル抗体でウェスタンブロッティングにより検出した。【００３３】
１１−４．１抗体は、ＨＥＫ−２９３細胞内で発現させたＩＬ−１８３７−１９３-Ｇ１９６タンパク質を、既存のＧ１９６抗体と同等に免疫沈降した。すなわち、１１−４．１抗体はＩＬ−１８タンパク質を特異的に認識し効率よく免疫沈降できるモノクローナル抗体であることが明らかとなった。【００３４】
［実施例６］１１−４．１抗体によるＩＬ−１８機能阻害活性
大腸菌で発現精製した活性型ＩＬ−１８タンパク質を急性骨髄性白血病細胞株ＫＧ−１（ＪＣＲＢ００６５）に添加するとＩＦＮ−γが産生されることが知られている。１１−４．１抗体がＩＬ−１８機能を阻害する抗体であれば、ＩＬ−１８によるＩＦＮ−γ産生を阻害する。ＩＬ−１８タンパク質の２〜１９３位のポリペプチド（ｐｒｏ−ＩＬ−１８、配列番号３）をコードする遺伝子領域をｐＥＴ２８ＨｉｓＴＥＶにクローニングし、大腸菌で発現させ精製した。また、ヒトカスペース４タンパク質の１０５位〜３７７位のポリペプチド（活性型カスペース４、配列番号４）をコードする遺伝子領域をｐＥＴ２８ＨｉｓＴＥＶにクローニングし、大腸菌で発現させ精製した。この両者のタンパク質を混合し、活性型ＩＬ−１８タンパク質（配列番号１）を精製した。３×１０４個／９６ｗｅｌｌのＫＧ−１細胞に２ｎｇ／ｗｅｌｌで上記の方法で精製した活性型ＩＬ−１８と０〜２．０μｇ濃度で抗体を添加し、３６時間後に培養上清中のＩＦＮ−γをＩＦＮ−γ検出ＥＬＩＳＡ法キット（ダイアクローン社）を用いて測定した。【００３５】
図６に示すように、１１−４．１抗体を活性型ＩＬ−１８タンパク質と同時に培養液に添加することによって、濃度依存的にＩＬ−１８の機能を阻害する。すなわち、１１−４．１抗体はＩＬ−１８の機能を阻害する中和抗体として作用する。また、ＩＣ５０は１４．２ｎＭであり、非常に低濃度でＩＬ−１８の機能を阻害する活性を備えている。したがって、本発明の抗体をＩＬ−１８関連疾患の治療薬として用いることができる。【００３６】
［実施例７］１１−４．１抗体による免疫染色
ＩＬ−１８３７−１９３-Ｇ１９６／ｐｃＤＮＡ３ベクターをＨｅＬａ細胞に導入し、ＩＬ−１８３７−１９３-Ｇ１９６タンパク質を発現させた。ホルマリン固定後、常法に従い１１−４．１抗体を一次抗体として、二次抗体としてＡｌｅｘａ４８８標識抗マウス抗体（Ａ−１１０２９、サーモフィッシャーサイエンティフィック社）を用いて免疫染色を行った。図７（Ａ）に示すように、１１−４．１抗体は、ＨｅＬａ細胞内で一過性に発現させたＩＬ−１８３７−１９３-Ｇ１９６タンパク質を細胞質に強く認識した。なお、コントロールとしては、二次抗体のみを反応させたものを示している。【００３７】
次に、ＨｅＬａ細胞で内在性のＩＬ−１８タンパク質が発現しているかどうかを検討した（図７Ｂ）。ＨｅＬａ細胞における内在性ＩＬ−１８タンパク質をウェスタンブロッティングで解析すると、カスペースによって切断されていない全長ＩＬ−１８が主要の分子種として検出される（図７（Ｂ）左）。上記と同様に１１−４．１抗体を一次抗体、二次抗体としてＡｌｅｘａ４８８標識抗マウス抗体により免疫染色を行うと、ＨｅＬａ細胞の核を含めた細胞全体において顆粒状にＩＬ−１８タンパク質が検出される。すなわち、１１−４．１抗体はＨｅＬａ細胞で発現している内在性のＩＬ−１８タンパク質をウェスタンブロッティングや免疫染色で検出できることを示している。なお、図７（Ｂ）の免疫染色像は、撮像後、グレースケールに変換したものをさらに白黒反転させている。【００３８】
図７に示したように、本発明の抗体は、ウェスタンブロッティングと免疫染色とを同じ抗体を用いて、解析することによって、細胞内に存在するのが全長ＩＬ−１８であること、さらにその局在を明らかにすることができる。従来の抗体は、高感度でウェスタンブロッティングができなかったことから、細胞内での局在を明らかにしたとしても、全長、活性型という分子種を区別することができなかった。これに対し、本発明の抗体は、種々の方法に適用することができるため、多面的な解析を行うことが可能である。【００３９】
［実施例８］エピトープ解析
活性型ＩＬ−１８をＮ末から１５アミノ酸ずつＧＳＴ融合タンパク質として発現するようなプラスミドをｐＧＥＸ−４Ｔ−２（ＧＥヘルスケア・ジャパン社）で構築した。各プラスミドを大腸菌で発現させ、１１−４．１抗体を用いたウェスタンブロッティングによって、１１−４．１抗体が認識する配列の解析を行った。二次抗体はペルオキシダーゼ標識抗マウス抗体（７１０−１３３２、ロックランド社）を用い、ＩｍａｇｅＱｕａｎｔＬＡＳ  ４０００（ＧＥヘルスケア社）により検出した。図８（Ａ）に示すように、１１−４．１抗体は、５８位から７２位のアミノ酸に対して強い反応性を示した。【００４０】
さらに、１１−４．１抗体が、５８位から７２位の配列のどの領域を認識しているか、領域を狭めてＧＳＴ融合タンパク質を作製してウェスタンブロッティングにより解析を行った（図８（Ｂ））。ＩＬ−１８の５８位から７２位のアミノ酸をＧＳＴと融合させたタンパク質の他、６２位から７２位（レーン１）、６２位から７０位（レーン２）、６４位から７２位（レーン３）のアミノ酸配列をＧＳＴ融合タンパク質として発現するようなプラスミドを、ｐＧＥＸ−４Ｔ−２で構築した。１１−４．１抗体は、６２位から７０位のアミノ酸配列を含むＧＳＴ融合タンパク質を認識するが、６４位から７２位のアミノ酸配列は認識しなかった（図８（Ｂ）右）。【００４１】
そこで、６２位から７０位のアミノ酸配列中の１１−４．１抗体が認識するアミノ酸の詳細を検討した。大腸菌でＧＳＴ融合タンパク質として発現させた６２位から７０位ＩＬ−１８タンパク質の６２位のアスパラギンから７０位のスレオニン（ＮＲＰＬＦＥＤＭＴ）の領域のアミノ酸をアラニンに変異させて１１−４．１抗体とが認識するか解析を行った。１１−４．１抗体を用いて、ウェスタンブロッティングを行い、ＩｍａｇｅＱｕａｎｔＬＡＳ  ４０００により定量した。【００４２】
１１−４．１抗体は、図９（Ａ）に示すように、６３位のアルギニンをアラニンに変えた変異体（以下、Ｒ６３Ａ変異体という。以下、変異体は、本来のアミノ酸の種類、アミノ酸の位置、変異後のアミノ酸の種類によって同様に表記する。）、あるいは６８位のアスパラギン酸をアラニンに変えた変異体（Ｄ６８Ａ）をほとんど認識できなかった。また、Ｌ６５Ａ変異体、Ｆ６６Ａ変異体、及びＥ６７Ａ変異体は、野生型（レーン左端）の半分程度の認識しか示さなかった。また、１１−４．１抗体は、Ｎ６２Ａ変異体、Ｐ６４Ａ変異体、Ｍ６９Ａ変異体、Ｔ７０Ａ変異体は野生型ペプチドと同様の認識を示した。【００４３】
上記結果や、すでに報告されているヒトＩＬ−１８の結晶構造（非特許文献５）から、１１−４．１抗体は、立体構造上表面に露出している６３位のアルギニン（Ｒ）及び６８位のアスパラギン酸（Ｄ）を中心に６５位から６７位までのロイシン−フェニルアラニン-グルタミン酸（ＬＦＥ）を認識しているものと考えられる。【００４４】
実施例１で取得した他の２種のモノクローナル抗体、４−１８．１．４抗体、９−４．２．１抗体についても認識部位の解析を行った（図９（Ｂ））。４−１８．１．４抗体、９−４．２．１抗体は、１１−４．１抗体と同様に、Ｒ６３Ａ変異体、Ｄ６８Ａ変異体をほとんど認識できず、Ｌ６５Ａ変異体、Ｆ６６Ａ変異体、Ｅ６７Ａ変異体を野生型の半分程度の認識しかできなかった。また、Ｍ６９Ａ変異体及びＴ７０Ａ変異体は野生型同様に認識した。したがって、１１−４．１抗体、４−１８．１．４抗体、及び９−４．２．１抗体の３種類の抗体のエピトープは同一であると考えられる。すなわち、これら３種のモノクローナル抗体はＲＸＬＦＥＤ（配列番号５）をエピトープとして認識する抗体である。【００４５】
また、樹立したハイブリドーマは、ＩｓｏＳｔｒｉｐ（商標）マウスモノクローナル抗体アイソタイピングキット（シグマ・アルドリッチ社製）を用いてアイソタイプを確認した。１１−４．１抗体、４−１８．１．４抗体、及び９−４．２．１抗体のアイソタイプはいずれもＩｇＧ２ｂ、κであった。【００４６】
４−１８．１．４抗体、及び９−４．２．１抗体は、１１−４．１抗体とエピトープが同一であり、１１−４．１抗体と同様に、ウェスタンブロッティング、免疫沈降、免疫染色、ＥＬＩＳＡなど種々の手法で使用することができる。また、１１−４．１抗体のように、ＩＬ−１８の機能阻害活性を有し、ＩＬ−１８が過剰発現することによって惹起される疾患の治療など臨床面でも応用することが可能である。【００４７】
［実施例９］エピトープペプチドとの親和性解析
エピトープが明らかになり、また、得られたモノクローナル抗体の親和性が非常に高いと考えられることから、表面プラズモン共鳴解析によって、親和性の測定を行った。ＩＬ−１８タンパク質のエピトープを含む６０位から７２位の配列にスペーサーとしてリンカー配列ＧＳＧＳおよびクロスリンク用ＣｙｓをＣ末端に付加したペプチド（ＱＧＮＲＰＬＦＥＤＭＴＤＳＧＳＧＳＣ、配列番号６）をリガンドチオールカップリング法によりセンサーチップＣＭ５（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、ＢＲ１０００１２）に固定化し解析した。【００４８】
精製抗体１１−４．１を０．０８ｎＭ〜５０ｎＭの範囲で５濃度、５倍希釈系列でＢｉａｃｏｒｅ  Ｘ１００（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いてｓｉｎｇｌｅ−ｃｙｃｌｅで測定した（図１０）。解析はｂｉｖａｌｅｎｔ  ａｎａｌｙｓｉｓで行った。実測値と適合解析データがほぼ一致しており、ＫＤ：１．２５ｘ１０−１１Ｍ、Ｋａ：３．３ｘ１０６Ｍ−１Ｓ−１、Ｋｄ：４．１ｘ１０−５ｓ−１であった。実験的に非常に親和性が高いことが確かめられた。【００４９】
［実施例１０］抗体遺伝子の解析
次に、上記３種のモノクローナル抗体の遺伝子解析を行った。ハイブリドーマ１１−４．１、４−１８．１．４、９−４．２．１より夫々ＲＮＡを抽出後、ｏｌｉｇｏ−ｄＴプライマーを用いて逆転写しｃＤＮＡを作成した。合成したｃＤＮＡを、Ｈ鎖及びＬ鎖のプライマーセットを用いて、ダイレクトシークエンス法により超可変領域の抗体遺伝子の配列、及びアミノ酸配列を決定した。【００５０】
用いたＨ鎖及びＬ鎖のプライマーの配列は以下のとおりである。
Ｈ鎖プライマー
ＶＨ１−１Ｓ：5′-ggggatcc  ag gts mar ctg cag sag tcw gg-3′(配列番号７)
s=g+c、m=a+c、r=a+g、w=a+t
ＩｇＧ２−１ＡＳ：5’-gggaattc ctt gac cag gca tcc tag agt ca-3’(配列番号８)
Ｌ鎖プライマー
ＶＫ−１Ｓ：5′-ggggatcc gay att gtg mts acm car wct mca -3′（配列番号９）
y=c+t、m=a+c、s=g+c、r=a+g、w=a+t
ＣＫ−２ＡＳ：5’-gggaattc gaa gat gga tac  agt tgg  tgc-3’（配列番号１０）【００５１】
Ｈ鎖の遺伝子解析によって、１１−４．１抗体の塩基配列（配列番号１１）、アミノ酸配列（配列番号１２）、４−１８．１．４抗体の塩基配列（配列番号１３）、アミノ酸配列（配列番号１４）、９−４．２．１抗体の塩基配列（配列番号１５）、アミノ酸配列（配列番号１６）を決定した。また、Ｌ鎖の遺伝子解析によって、１１−４．１抗体の塩基配列（配列番号１７）、アミノ酸配列（配列番号１８）、４−１８．１．４抗体の塩基配列（配列番号１９）、アミノ酸配列（配列番号２０）、９−４．２．１抗体の塩基配列（配列番号２１）、アミノ酸配列（配列番号２２）を決定した。【００５２】
これら抗体の各相補性決定領域（ＣＤＲ）のアミノ酸配列、遺伝子配列について以下にまとめる。【００５３】
［表１］１１−４．１抗体のＣＤＲのアミノ酸配列
2019194217.tif 000003
【００５４】
［表２］１１−４．１抗体のＣＤＲの塩基配列
2019194217.tif 000004
【００５５】
［表３］４−１８．１．４抗体のＣＤＲのアミノ酸配列
2019194217.tif 000005
【００５６】
［表４］４−１８．１．４抗体のＣＤＲの塩基配列
2019194217.tif 000006
【００５７】
［表５］９−４．２．１抗体のＣＤＲのアミノ酸配列
2019194217.tif 000007
【００５８】
［表６］９−４．２．１抗体のＣＤＲの塩基配列
2019194217.tif 000008
【００５９】
遺伝子解析の結果、ハイブリドーマ１１−４．１と４−１８．１．４のＣＤＲ部分のアミノ酸配列は完全に一致していた。また、１１−４．１と４−１８．１．４の重鎖および軽鎖の可変領域の各１箇所アミノ酸配列が異なるのみで他の領域は比較した限りおいて一致していた。ハイブリドーマ１１−４．１と９−４．２．１では重鎖のＣＤＲ１及びＣＤＲ２のアミノ酸配列が一部異なっていたが、それ以外のＣＤＲはすべて一致していた。【００６０】
したがって、これらＣＤＲを有する抗体であれば、いずれも同じエピトープに結合し、同様の性質を示すものと結論づけた。以上、示してきたように、本明細書で開示した抗体は、ウェスタンブロッティング、免疫沈降、免疫染色など、種々の実験に用いることができるだけではなく、ＩＬ−１８の機能を阻害することができることから非常に有用な抗体である。
【図１】
2019194217.tif 000009
【図２】
2019194217.tif 000010
【図３】
2019194217.tif 000011
【図４】
2019194217.tif 000012
【図５】
2019194217.tif 000013
【図６】
2019194217.tif 000014
【図７】
2019194217.tif 000015
【図８】
2019194217.tif 000016
【図９】
2019194217.tif 000017
【図１０】
2019194217.tif 000018
【配列表】
2019194217000001.app
【国際調査報告】
2019194217.tif 000019
2019194217.tif 000020
2019194217.tif 000021
2019194217.tif 000022
2019194217.tif 000023
2019194217.tif 000024
2019194217.tif 000025
2019194217.tif 000026