(57)【要約】【課題】バチルス・サーキュランス以外の微生物に由来する、３糖ガラクトオリゴ糖の製造選択性が高く、かつ、高効率にガラクトオリゴ糖を製造できる新規の酵素と、ガラクトオリゴ糖を製造し得る新規の方法とを提供する。【解決手段】以下の（ａ）〜（ｆ）からなる群より選択されるアミノ酸配列を有する酵素と、Paenibacillus属に属する細菌の菌体および／または前記細菌のガラクトオリゴ糖生産酵素を乳糖に接触させることを含むガラクトオリゴ糖の製造方法。  （ａ）配列番号１に示すアミノ酸配列  （ｂ）配列番号２に示すアミノ酸配列  （ｃ）配列番号１に示すアミノ酸配列において１〜１０個のアミノ酸が置換、削除、挿入されたアミノ酸配列であって、ガラクトオリゴ糖生産活性を有する酵素のアミノ酸配列  （ｄ）配列番号２に示すアミノ酸配列において１〜１０個のアミノ酸が置換、削除、挿入されたアミノ酸配列であって、ガラクトオリゴ糖生産活性を有する酵素のアミノ酸配列  （ｅ）配列番号１に示すアミノ酸配列に対する相同性が８０％以上１００％未満のアミノ酸配列であって、ガラクトオリゴ糖生産活性を有する酵素のアミノ酸配列  （ｆ）配列番号２に示すアミノ酸配列に対する相同性が８０％以上１００％未満のアミノ酸配列であって、ガラクトオリゴ糖生産活性を有する酵素のアミノ酸配列【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の（ａ）〜（ｆ）からなる群より選択されるアミノ酸配列を有する酵素。
（ａ）配列番号１に示すアミノ酸配列
（ｂ）配列番号２に示すアミノ酸配列
（ｃ）配列番号１に示すアミノ酸配列において１〜１０個のアミノ酸が置換、削除、挿入されたアミノ酸配列であって、ガラクトオリゴ糖生産活性を有する酵素のアミノ酸配列
（ｄ）配列番号２に示すアミノ酸配列において１〜１０個のアミノ酸が置換、削除、挿入されたアミノ酸配列であって、ガラクトオリゴ糖生産活性を有する酵素のアミノ酸配列
（ｅ）配列番号１に示すアミノ酸配列に対する相同性が８０％以上１００％未満のアミノ酸配列であって、ガラクトオリゴ糖生産活性を有する酵素のアミノ酸配列
（ｆ）配列番号２に示すアミノ酸配列に対する相同性が８０％以上１００％未満のアミノ酸配列であって、ガラクトオリゴ糖生産活性を有する酵素のアミノ酸配列
【請求項２】
請求項１に記載の酵素をコードしているＤＮＡ。
【請求項３】
以下の（Ａ）〜（Ｇ）からなる群より選択される塩基配列を有するＤＮＡ。
（Ａ）配列番号５に示す塩基配列
（Ｂ）配列番号６に示す塩基配列
（Ｃ）配列番号５に示す塩基配列に対する相同性が８０％以上１００％未満である塩基配列であって、コードしている酵素がガラクトオリゴ糖生産活性を有する塩基配列
（Ｄ）配列番号６に示す塩基配列に対する相同性が８０％以上１００％未満である塩基配列であって、コードしている酵素がガラクトオリゴ糖生産活性を有する塩基配列
（Ｅ）配列番号５に示す塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列であって、コードしている酵素がガラクトオリゴ糖生産活性を有する塩基配列
（Ｆ）配列番号６に示す塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列であって、コードしている酵素がガラクトオリゴ糖生産活性を有する塩基配列
（Ｇ）前記（Ａ）〜（Ｆ）のＤＮＡのいずれかの塩基配列に対して保存的塩基置換されている塩基配列
【請求項４】
ストリンジェントな条件が、６０℃、１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳに相当する塩濃度および温度で洗浄する条件であることを特徴とする請求項３に記載のＤＮＡ。
【請求項５】
請求項３または４に記載のＤＮＡがコードしている、ガラクトオリゴ糖生産活性を有する酵素。
【請求項６】
請求項２〜４のいずれか１項に記載のＤＮＡを含む組換えベクター。
【請求項７】
請求項２〜４のいずれか１項に記載のＤＮＡまたは請求項６に記載の組換えベクターを有する形質転換体。
【請求項８】
請求項７に記載の形質転換体を培養する工程と、培養した形質転換体からガラクトオリゴ糖生産活性を有する酵素を回収する工程と、を含むガラクトオリゴ糖生産活性を有する酵素の調製方法。
【請求項９】
請求項１または５に記載の酵素を有効成分として含む、酵素含有組成物。
【請求項１０】
乳糖と、パエニバチルス・パブリ（Paenibacillus pabuli）が生産するガラクトオリゴ糖生産活性を有する酵素と、を接触させることを含むガラクトオリゴ糖の製造方法。
【請求項１１】
乳糖と、請求項１または５に記載の酵素と、を接触させることを含むガラクトオリゴ糖の製造方法。
【請求項１２】
Paenibacillus属に属する細菌の菌体および／または前記細菌のガラクトオリゴ糖生産酵素を乳糖に接触させることを含むガラクトオリゴ糖の製造方法。
【請求項１３】
Paenibacillus属に属する細菌が、
Paenibacillus themophilus、
Paenibacillus popilliae、
Paenibacillus thiaminolyticus、
Paenibacillus pabuli、
Paenibacillus alvei、
Paenibacillus alginolyticus、
Paenibacillus chibensis、
Paenibacillus chitinolyticus、
Paenibacillus chondroitinus、
Paenibacillus glucanolyticus、
Paenibacillus lautus、
Paenibacillus macerans、
Paenibacillus peoriae、
Paenibacillus polymyxa、
Paenibacillus validus、
Paenibacillus apiarius、
Paenibacillus jamilae、
Paenibacillus kribbensis、
Paenibacillus terrae、
から成る群より選択される１以上の細菌であることを特徴とする、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
Paenibacillus属に属する細菌が、
Paenibacillus themophilus、
Paenibacillus popilliae、
Paenibacillus thiaminolyticus、
Paenibacillus pabuli、
Paenibacillus alvei、
Paenibacillus polymyxa、
から成る群より選択される１以上の細菌であることを特徴とする、請求項１２に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ガラクトオリゴ糖を製造可能な酵素に関する。また本発明は、この酵素をコードしているＤＮＡおよびこの酵素を用いたガラクトオリゴ糖の製造方法に関する。また本発明は、ガラクトオリゴ糖を製造する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ガラクトオリゴ糖は、ヒト腸内細菌フローラに生息するビフィズス菌などの有用細菌の栄養源として重宝される。そのためガラクトオリゴ糖の製造方法として種々の方法が提案されている（例えば特許文献１〜６）。この中で使用されている酵素はラクターゼであり、この中で使用されている微生物はラクターゼ産生微生物である。ラクターゼ（β−ガラクトシダーゼ）は乳糖をβ−ガラクトースとグルコースに加水分解する。ここで、ラクターゼによっては乳糖分子を分解して得られたβ−ガラクトシル基を別の乳糖分子などに転移させる反応を起こし得、この反応によってガラクトオリゴ糖を生産し得る。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】特許第２６５２０４９号
【特許文献２】特許第２７３９３３５号
【特許文献３】特許第５６４３７５６号
【特許文献４】特開平５−２３６９８１号公報
【特許文献５】特表２０１１−５１７５５３号公報
【特許文献６】特表２０１３−５０１５０４号公報
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Z. Mozaffar, K. Nakanishi, R. Matsuno and T. Kamikubo, Purification and Properties of β-Galactosidases from Bacillus circulans, Agric. biol. chem., 48, 3053-3061 (1986)
【非特許文献２】Sotoya et al., Identification of genes involved in galactooligosaccharide utilization in Bifidobacterium breve strain YIT 4014T., Microbiology, 163, 1420-1428. (2017)
【非特許文献３】Van Leeuwen, S. S., 1H NMR analysis of the lactose/β-galactosidase-derived galacto-oligosaccharide components of Vivinal(R) GOS up to DP5., Carbohydrates. Res., 400, 59-73. (2014)
【非特許文献４】T. Moriya, N. Nagahata, R. Odaka, H. Nakamura, J. Yoshikawa, K. Kurashima, T. Saito, Synthesis of an allergy inducing tetrasaccharide "4P-X"., Carbohydrates. Res., 439, 44-49. (2017)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
現在、商業的に実用されているガラクトオリゴ糖製造のためのラクターゼは、主としてバチルス・サーキュランス（Bacillus circulans）由来のラクターゼである。バチルス・サーキュランス由来のラクターゼは、ガラクトオリゴ糖の製造効率が比較的高いという利点がある。しかしながら、このラクターゼは４糖以上のガラクトオリゴ糖を製造し易いというデメリットがある。４糖以上のガラクトオリゴ糖は３糖のガラクトオリゴ糖に比べ収率が低くなる。【０００６】
本願は、このような背景に基づき、バチルス・サーキュランス以外の微生物に由来し、３糖のガラクトオリゴ糖の製造選択性が高く、高効率にガラクトオリゴ糖を製造できる酵素およびそれを用いたガラクトオリゴ糖の製造方法を提供することを第一の目的とする。【０００７】
また、ガラクトオリゴ糖の製造方法には、ラクターゼ産生微生物を用いる方法とその微生物から精製したラクターゼを使用する方法とが存在する。ラクターゼ産生微生物を用いる製造方法には、精製ラクターゼを用いる場合と比較して、酵素精製の工程を省ける点、副反応生成物であるグルコースなどの単糖を微生物が資化することで除去可能である点などの利点がある。しかしその検討は依然として不十分である。
さらに、ガラクトオリゴ糖産生微生物としてバチルス属が良く知られているが、バチルス属の中には炭疽菌やセレウス菌など病原性を示す種も多く知られており、より安全なガラクトオリゴ糖産生菌が求められている。【０００８】
本願は、このような背景に基づき、ガラクトオリゴ糖の製造に適した微生物を同定し、この微生物を利用したガラクトオリゴ糖の製造方法を提供することを第二の目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは前記第一の目的について鋭意研究した結果、本発明を完成するに至った。【００１０】
すなわち、本発明１によれば、以下の（ａ）〜（ｆ）からなる群より選択されるアミノ酸配列を有する酵素が提供される。
（ａ）配列番号１に示すアミノ酸配列
（ｂ）配列番号２に示すアミノ酸配列
（ｃ）配列番号１に示すアミノ酸配列において１〜１０個のアミノ酸が置換、削除、挿入されたアミノ酸配列であって、ガラクトオリゴ糖生産活性を有する酵素のアミノ酸配列
（ｄ）配列番号２に示すアミノ酸配列において１〜１０個のアミノ酸が置換、削除、挿入されたアミノ酸配列であって、ガラクトオリゴ糖生産活性を有する酵素のアミノ酸配列
（ｅ）配列番号１に示すアミノ酸配列に対する相同性が８０％以上１００％未満のアミノ酸配列であって、ガラクトオリゴ糖生産活性を有する酵素のアミノ酸配列
（ｆ）配列番号２に示すアミノ酸配列に対する相同性が８０％以上１００％未満のアミノ酸配列であって、ガラクトオリゴ糖生産活性を有する酵素のアミノ酸配列【００１１】
また、本発明によれば、前記酵素をコードしているＤＮＡも提供される。【００１２】
本発明によれば、以下の（Ａ）〜（Ｇ）からなる群より選択される塩基配列を有するＤＮＡが提供される。
（Ａ）配列番号５に示す塩基配列
（Ｂ）配列番号６に示す塩基配列
（Ｃ）配列番号５に示す塩基配列に対する相同性が８０％以上１００％未満である塩基配列であって、コードしている酵素がガラクトオリゴ糖生産活性を有する塩基配列
（Ｄ）配列番号６に示す塩基配列に対する相同性が８０％以上１００％未満である塩基配列であって、コードしている酵素がガラクトオリゴ糖生産活性を有する塩基配列
（Ｅ）配列番号５に示す塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列であって、コードしている酵素がガラクトオリゴ糖生産活性を有する塩基配列
（Ｆ）配列番号６に示す塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列であって、コードしている酵素がガラクトオリゴ糖生産活性を有する塩基配列
（Ｇ）前記（Ａ）〜（Ｆ）のＤＮＡのいずれかの塩基配列に対して保存的塩基置換されている塩基配列【００１３】
ここで、ストリンジェントな条件とは、６０℃、１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳに相当する塩濃度および温度で洗浄する条件であってもよい。【００１４】
また、本発明によれば、前記ＤＮＡがコードしている、ガラクトオリゴ糖生産活性を有する酵素も提供される。【００１５】
さらに本発明によれば、前記ＤＮＡを含む組換えベクターが提供される。前記ＤＮＡまたはこの組換えベクターを有する形質転換体も提供される。【００１６】
さらに本発明によれば、前記形質転換体を培養する工程と、培養した形質転換体からガラクトオリゴ糖生産活性を有する酵素を回収する工程と、を含むガラクトオリゴ糖生産活性を有する酵素の調製方法が提供される。【００１７】
さらに本発明によれば、前記酵素を有効成分として含む、酵素含有組成物が提供される。【００１８】
さらに本発明によれば、乳糖と、パエニバチルス・パブリ（Paenibacillus pabuli）が生産するガラクトオリゴ糖生産活性を有する酵素と、を接触させることを含むガラクトオリゴ糖の製造方法が提供される。【００１９】
さらに本発明によれば、乳糖と、前記酵素と、を接触させることを含むガラクトオリゴ糖の製造方法が提供される。【００２０】
また、本発明者らは前記第二の目的について鋭意研究した結果、これまでガラクトオリゴ糖を生産することが知られていなかった微生物を同定し、さらにこの微生物が属する属全体においてガラクトオリゴ糖を生産することを見出し、本発明を完成するに至った。【００２１】
すなわち、本発明２は、Paenibacillus属に属する細菌の菌体および／または前記細菌のガラクトオリゴ糖生産酵素を乳糖に接触させることを含むガラクトオリゴ糖の製造方法である。【００２２】
Paenibacillus属に属する細菌は、Paenibacillus themophilus、Paenibacillus popilliae、Paenibacillus thiaminolyticus、Paenibacillus pabuli、Paenibacillus alvei、Paenibacillus alginolyticus、Paenibacillus chibensis、Paenibacillus chitinolyticus、Paenibacillus chondroitinus、Paenibacillus glucanolyticus、Paenibacillus lautus、Paenibacillus macerans、Paenibacillus peoriae、Paenibacillus polymyxa、Paenibacillus validus、Paenibacillus apiarius、Paenibacillus jamilae、Paenibacillus kribbensis、Paenibacillus terraeであってもよい。【００２３】
Paenibacillus属に属する細菌は、Paenibacillus themophilus、Paenibacillus popilliae、Paenibacillus thiaminolyticus、Paenibacillus pabuli、Paenibacillus alvei、Paenibacillus polymyxaであってもよい。
【発明の効果】
【００２４】
本発明１によれば、パエニバチルス・パブリ由来のガラクトオリゴ糖生産活性を有する酵素を用いて、３糖のガラクトオリゴ糖の製造選択性が高く、高効率にガラクトオリゴ糖を製造することが可能となった。【００２５】
本発明２により、ガラクトオリゴ糖を製造し得る微生物を利用したガラクトオリゴ糖の製造方法を提供することが可能となった。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１】（Ａ）配列番号１に示すアミノ酸配列からなる酵素のＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果である。左レーンはマーカーである。（Ｂ）配列番号２に示すアミノ酸配列からなる酵素のＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果である。左レーンはマーカーである。
【図２】比較例のラクターゼと実施例２のラクターゼによって生成するＧＯＳの比較を示したチャートである。
【図３】比較例のラクターゼと実施例２のラクターゼによって生成するＧＯＳにおける、アレルゲン性４糖の存在確認を示したチャートである。
【図４】Paenibacillus属とBacillus属の１６Ｓ ｒＤＮＡ部分塩基配列に基づく簡易分子系統樹である。
【発明を実施するための形態】
【００２７】
≪本発明１≫
以下、本発明１について詳述する。
【００２８】
本発明においてオリゴ糖とは３糖から１０糖の多糖化合物を意味する。
【００２９】
本発明においてガラクトオリゴ糖（ＧＯＳとも表記する）とは、下記一般式で表せるオリゴ糖を主として意味する。
（Ｇａｌ）ｎ−Ｇａｌ−Ｇｌｃ
ここで、Ｇａｌはガラクトース残基、Ｇｌｃはグルコース残基を表し、ｎは１〜８の整数、特に１〜３の整数である。糖間の各結合の結合様式は特に制限されないが、典型的にはβ−１，４−グリコシド結合である。糖間（特にＧａｌ−Ｇａｌ間）の結合様式はβ−１，３−グリコシド結合であってもよい。
【００３０】
ラクターゼとは、乳糖をβ−ガラクトースとグルコースに加水分解できる酵素である。この分解の際、β−ガラクトシル基を他の分子に転移させることができる。水に転移させればβ−ガラクトースを生じるが、乳糖（Ｇａｌ−Ｇｌｃ）に転移させれば３糖（上記式のｎが１）のガラクトオリゴ糖（Ｇａｌ−Ｇａｌ−Ｇｌｃ）を生じる。
【００３１】
このβ−ガラクトシル基の転移反応が３糖（上記式のｎが１）のガラクトオリゴ糖（Ｇａｌ−Ｇａｌ−Ｇｌｃ）に対して起これば、４糖（上記式のｎが２）のガラクトオリゴ糖（（Ｇａｌ）２−Ｇａｌ−Ｇｌｃ）が生じる。同様に、４糖（上記式のｎが２）のガラクトオリゴ糖に対して起これば、５糖（上記式のｎが３）のガラクトオリゴ糖が生じる。
【００３２】
３糖のガラクトオリゴ糖を製造する場合、２分子の乳糖から１分子のグルコース及び１分子の３糖のガラクトオリゴ糖が生じる。この時のガラクトオリゴ糖の理論収率は約７４質量％である。
【００３３】
４糖のガラクトオリゴ糖を製造する場合、３分子の乳糖から２分子のグルコース及び１分子の４糖のガラクトオリゴ糖が生じる。この時のガラクトオリゴ糖の理論収率は約６５質量％である。
【００３４】
したがって乳糖からガラクトオリゴ糖を製造する場合、３糖のガラクトオリゴ糖のみを製造することが収率の点で最も効率的である。ここでガラクトオリゴ糖の収率（質量％）とは、「ガラクトオリゴ糖の生成量」を「乳糖の消費量」で除した百分率を意味する。
【００３５】
本発明において酵素のラクターゼ活性は、以下の挙げる２つの方法のいずれかによって定義される。
【００３６】
乳糖溶液（乳糖濃度１０％）に測定対象の酵素を添加し、ｐＨ６．５、４０℃の条件下におけるグルコース生成量を測定して定量する。１分間に１μｍｏｌのグルコースを生成する酵素活性が１ＬＵと定義される。
【００３７】
ｏ−ニトロフェニル−β−ガラクトピラノシド（ＯＮＰＧ）溶液（ＯＮＰＧ濃度１．６５ｍＭ）に測定対象の酵素を添加し、ｐＨ６．５、４０℃の条件下におけるｏ−ニトロフェニル生成量を測定して定量する。１分間に１μｍｏｌのｏ−ニトロフェニルを生成する酵素活性が１ＯＵと定義される。
【００３８】
この２つの方法の少なくとも一方で活性が測定可能であれば、その酵素はラクターゼであると判断してよい。より具体的には、０．２ＬＵ／ｍＬ以上または０．５ＯＵ／ｍＬ以上であれば、ラクターゼと判断してよい。
【００３９】
ただし、酵素がラクターゼ活性を有しても、ガラクトオリゴ糖生産活性（ＧＯＳ生産活性とも表記する）を必ずしも有するわけではない。酵素のガラクトオリゴ糖生産活性は、以下に説明する方法によって評価される。
【００４０】
乳糖溶液（乳糖濃度６０％）に測定対象の酵素を添加し、ｐＨ６．５、５０℃の条件下において所定時間に亘って静置または振とうする。酵素がＧＯＳ生産活性を有している場合、この間に乳糖からＧＯＳを生産する。所定時間経過後、反応溶液をＨＰＬＣによって解析する。
【００４１】
ＨＰＬＣで使用するカラムはＴｒａｎｓｇｅｎｏｍｉｃ社製ＣＡＲＢＯＳｅｐ ＣＨＯ−６２０ ６．５φ×３００ｍｍ等が挙げられる。移動相は水、流速は０．４ｍＬ／ｍｉｎ、温度は８５℃、検出はＲＩの条件にて分析する。
【００４２】
単糖および２糖ならびにＧＯＳ（３糖以上、主として３〜５糖）のピーク面積の合計値に対して、ＧＯＳのＨＰＬＣピーク面積の合計値が占める割合が、基準値以上であればガラクトオリゴ糖生産活性ありと判断してよい。当該基準値は通常１％である。当然のことながら、この割合が大きいほどその酵素は高いガラクトオリゴ糖生産活性を有している。高いガラクトオリゴ糖生成活性を有する酵素を取得したい場合には高い基準値を設定してよい。よって当該基準値を１％、３％、５％、１０％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％と設定してもよい。
【００４３】
（ＢｇａＤ）
ＢｇａＤは現在、商業的に最も利用されているＧＯＳ製造用ラクターゼであり、Bacillus circulans 由来ラクターゼである。これまでの研究から、ＢｇａＤは、分子量の異なる４種類の酵素、即ち、分子量１９５ｋＤａのラクターゼ（ＢｇａＤ−Ａ、配列番号３、GenBank code:BAJ61032）、分子量１６０ｋＤａのラクターゼ（ＢｇａＤ−Ｂ）、分子量１３５ｋＤａのラクターゼ（ＢｇａＤ−Ｃ）、及び分子量８６ｋＤａのラクターゼ（ＢｇａＤ−Ｄ、配列番号４）で構成されていることが知られている（特許文献３）。この中で最小サイズのＢｇａＤ−Ｄが、最もＧＯＳ生産活性が高いことが知られており、天野エンザイム株式会社が販売するＧＯＳ製造用ラクターゼ製剤「ビオラクタ」にも多く含まれている。
【００４４】
下記する本発明のＧＯＳ製造方法において、ＧＯＳ製造用ラクターゼとしてＢｇａＤ−Ｄを用いた場合のＧＯＳ収率は、約６０〜７０％である。
【００４５】
ＧＯＳ収率（％）とはＧＯＳ生成量／ラクトース消費量の百分率である。ＧＯＳ生成量およびラクトース消費量はＨＰＬＣ解析によって求めることができる。
【００４６】
下記する本発明のＧＯＳ製造方法において、ＧＯＳ製造用ラクターゼとしてＢｇａＤ−Ｄを用いた場合の３糖ＧＯＳの製造選択性は最大で約６０％である。
【００４７】
３糖ＧＯＳの製造選択性（％）とは、ＧＯＳの全生成量に対する３糖ＧＯＳの生成量の百分率を意味する。この数値が高ければ高いほど３糖ＧＯＳを主に生成していることを意味する。ＧＯＳの全生成量および３糖ＧＯＳの生成量はＨＰＬＣ解析によって求めることができる。３糖ＧＯＳの製造選択性は６０％以上であることが好ましく、７０％以上であることがより好ましく、７５％以上であることがさらに好ましく、８０％以上であることが特に好ましい。
【００４８】
ＢｇａＤ−Ｄを使用してＧＯＳを製造した場合、４糖以上のＧＯＳも多く製造される。
【００４９】
＜ＧＯＳ生産活性を有する酵素およびそれをコードしているＤＮＡ＞
本発明の第１の態様によれば、ガラクトオリゴ糖生産活性を有する新規の酵素およびその酵素をコードしているＤＮＡが提供される。
【００５０】
本発明者らは、Bacillus circulans由来ＧＯＳ生産酵素であるＢｇａＤとは相同性の低い酵素であって、高い収率かつ高いＧＯＳ製造選択性を奏する酵素を見出した。その酵素とは配列番号１に示すアミノ酸配列からなる酵素および配列番号２に示すアミノ酸配列からなる酵素およびそれらの相同体である。
【００５１】
配列番号１に示すアミノ酸配列からなる酵素および配列番号２に示すアミノ酸配列からなる酵素は、いずれもPaenibacillus pabuliが産生する酵素である。いずれのアミノ酸配列も本発明者らが初めて特定し、報告するものである。
【００５２】
（配列番号１に示すアミノ酸配列からなる酵素）
配列番号１に示すアミノ酸配列からなる酵素の分子量は約１１４ｋＤａである（図１Ａ参照）。ＢｇａＤ−Ｄに対する相同性は約１５％である。この酵素はラクターゼとして機能する酵素であり、乳糖を原料としたＧＯＳ製造に使用可能であることが分かった。
【００５３】
下記する本発明のＧＯＳ製造方法において、ＧＯＳ製造用ラクターゼとして配列番号１に示すアミノ酸配列からなる酵素を用いた場合のＧＯＳ収率は、約４５〜約６０％である。しかし、製造されるＧＯＳのうち３糖ＧＯＳの製造選択性は約７５％以上である。さらに当該酵素は酵素の性能を示すＫｍ値がＢｇａＤ−Ｄよりも優れている。
【００５４】
（配列番号２に示すアミノ酸配列からなる酵素）
配列番号２に示すアミノ酸配列からなる酵素の分子量は約５０ｋＤａである（図１Ｂ参照）。ＢｇａＤ−Ｄに対する相同性は約８％である。この酵素はラクターゼとして機能する酵素であり、乳糖を原料としたＧＯＳ製造に使用可能であることが分かった。
【００５５】
下記する本発明のＧＯＳ製造方法において、ＧＯＳ製造用ラクターゼとして配列番号２に示すアミノ酸配列からなる酵素を用いた場合のＧＯＳ収率は、約６０〜約７０％である。また製造されるＧＯＳのうち３糖ＧＯＳの製造選択性は約８０％以上である。
【００５６】
配列番号２に示すアミノ酸配列からなる酵素は、β−１，３−グリコシド結合を形成するように、β−ガラクトシル基（β−ガラクトース残基）を糖（例えば乳糖）に高度に選択的に転移させる。すなわち、配列番号２に示すアミノ酸配列からなる酵素によって製造されるＧＯＳの多くは、β−ガラクトシル基間がβ−１，３−グリコシド結合している３糖ＧＯＳである。一般的な腸内細菌の中ではビフィズス菌のみがβ−１，３−グリコシド結合を分解することができる。そのためこのような糖を多く含むＧＯＳを摂取した場合、腸内においてビフィズス菌が優先的にこのＧＯＳを資化し、増殖することができると想定される。なお従来の多くのＧＯＳでは、ガラクトシル基は乳糖にβ−１，４−グリコシド結合またはβ−１，６−グリコシド結合を形成して結合している。
【００５７】
このように、配列番号１に示すアミノ酸配列からなる酵素および配列番号２に示すアミノ酸配列からなる酵素は、高いＧＯＳ収率を実現しながら、高い酵素化学的性質や高い３糖ＧＯＳ選択性をも両立している。Paenibacillus pabuliに由来するこれら酵素の使用によって、収率の悪化を招く４糖以上のＧＯＳの発生を従来よりも低減できる。
【００５８】
当然のことながら、配列番号１に示すアミノ酸配列からなる酵素のファミリー酵素および配列番号２に示すアミノ酸配列からなる酵素のファミリー酵素も同様の効果を奏するものと推論される。
【００５９】
なお当然のことながら、その機能を害しない限り、上記酵素は付加領域を有していてもよい。このような付加領域としては、例えば、タグドメイン等の領域が挙げられる。これらが付加される位置はＮ末端、Ｃ末端の一方または双方のいずれでもよい。
【００６０】
したがって、本発明の第１の態様として、以下の酵素（１）〜（５）が提供される。
（１）配列番号１に示すアミノ酸配列からなる酵素
（２）配列番号２に示すアミノ酸配列からなる酵素
（３）配列番号１に示すアミノ酸配列からなる酵素のファミリー酵素（または相同体）
（４）配列番号２に示すアミノ酸配列からなる酵素のファミリー酵素（または相同体）
（５）前記（１）〜（４）の酵素にペプチド等を付加した酵素であって、ガラクトオリゴ糖生産活性を有する酵素
【００６１】
ある酵素Ｅ１が別の酵素Ｅ２のファミリー（または相同体）であるとは、Ｅ１とＥ２のアミノ酸配列に基づく相同性（または同一性、類似性と表現してもよい）が８０％以上、８５％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上または９９％以上を有していることを意味する。上限値に特に制限はないが１００％未満である。すなわち、少なくとも１以上のアミノ酸残基の置換、削除、挿入が存在する。アミノ酸配列相同性はＢＬＡＳＴアルゴリズムおよびＢＬＡＳＴ２．０アルゴリズムを用いた公知のソフトウェアなどを用いて容易に算出することができる。
【００６２】
ある酵素Ｅ１が別の酵素Ｅ２のファミリー（または相同体）であるとは、特に、酵素Ｅ１のアミノ酸配列が、酵素Ｅ２のアミノ酸配列に対して１個以上１０個以下のアミノ酸の置換、削除、挿入によって達成できることを意味する。置換とは、特定部位のアミノ酸が別のアミノ酸へ置き換えられたことを意味する。削除とは、特定部位のアミノ酸を欠失していることを意味する。挿入とは、存在しなかったアミノ酸がアミノ酸配列の内部に追加されていることを意味する。
【００６３】
これに加えて、ある酵素Ｅ１と別の酵素Ｅ２とがファミリー（または相同体）であるとは、酵素Ｅ１と酵素Ｅ２とが同一の機能を発揮できることを意味する。この機能における活性比に特に制限はない。例えば、より活性の高い酵素をＥ１とし、その活性を１００％としたとき、より活性の低い酵素Ｅ２の活性は１％以上、５％以上、１０％以上、２０％以上、３０％以上、４０％以上、５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上または９０％以上である。
【００６４】
配列番号１に示すアミノ酸配列からなる酵素のファミリー酵素とは、配列番号１に示すアミノ酸配列に対して８０％以上１００％未満の相同性を有し、かつ、ガラクトオリゴ糖生産活性を有する酵素を意味する。特に、配列番号１に示すアミノ酸配列において１〜１０個のアミノ酸が置換、削除、挿入されたアミノ酸配列からなり、かつ、ガラクトオリゴ糖生産活性を有する酵素を意味する。配列番号１に示すアミノ酸配列からなる酵素のファミリー酵素は、配列番号１に示すアミノ酸配列に対する相同性の下限値が、８５％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上または９９％以上であってもよい。相同性の下限値がこれらの場合においても、上限値はいずれも１００％未満である。
【００６５】
同様に、配列番号２に示すアミノ酸配列からなる酵素のファミリー酵素とは、配列番号２に示すアミノ酸配列に対して８０％以上１００％未満の相同性を有し、かつ、ガラクトオリゴ糖生産活性を有する酵素を意味する。特に、配列番号２に示すアミノ酸配列において１〜１０個のアミノ酸が置換、削除、挿入されたアミノ酸配列からなり、かつ、ガラクトオリゴ糖生産活性を有する酵素を意味する。配列番号２に示すアミノ酸配列からなる酵素のファミリー酵素は、配列番号２に示すアミノ酸配列に対する相同性の下限値が、８５％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上または９９％以上であってもよい。相同性の下限値がこれらの場合においても、上限値はいずれも１００％未満である。
【００６６】
したがってより具体的には、本発明の第１の態様として、以下の酵素（１）〜（７）が提供される。
（１）配列番号１に示すアミノ酸配列からなる酵素
（２）配列番号２に示すアミノ酸配列からなる酵素
（３）配列番号１に示すアミノ酸配列において１〜１０個のアミノ酸が置換、削除、挿入されたアミノ酸配列からなる酵素であって、ガラクトオリゴ糖生産活性を有する酵素
（４）配列番号２に示すアミノ酸配列において１〜１０個のアミノ酸が置換、削除、挿入されたアミノ酸配列からなる酵素であって、ガラクトオリゴ糖生産活性を有する酵素
（５）配列番号１に示すアミノ酸配列に対する相同性が８０％以上１００％未満のアミノ酸配列からなる酵素であって、ガラクトオリゴ糖生産活性を有する酵素
（６）配列番号２に示すアミノ酸配列に対する相同性が８０％以上１００％未満のアミノ酸配列からなる酵素であって、ガラクトオリゴ糖生産活性を有する酵素
（７）前記（１）〜（６）の酵素にペプチド等を付加した酵素であって、ガラクトオリゴ糖生産活性を有する酵素
【００６７】
別の表現をすれば、本発明の第１の態様として、以下のアミノ酸配列（ａ）〜（ｆ）を有する、またはアミノ酸配列（ａ）〜（ｆ）からなる酵素が提供される。
（ａ）配列番号１に示すアミノ酸配列
（ｂ）配列番号２に示すアミノ酸配列
（ｃ）配列番号１に示すアミノ酸配列において１〜１０個のアミノ酸が置換、削除、挿入されたアミノ酸配列であって、ガラクトオリゴ糖生産活性を有する酵素のアミノ酸配列
（ｄ）配列番号２に示すアミノ酸配列において１〜１０個のアミノ酸が置換、削除、挿入されたアミノ酸配列であって、ガラクトオリゴ糖生産活性を有する酵素のアミノ酸配列
（ｅ）配列番号１に示すアミノ酸配列に対する相同性が８０％以上１００％未満のアミノ酸配列であって、ガラクトオリゴ糖生産活性を有する酵素のアミノ酸配列
（ｆ）配列番号２に示すアミノ酸配列に対する相同性が８０％以上１００％未満のアミノ酸配列であって、ガラクトオリゴ糖生産活性を有する酵素のアミノ酸配列
【００６８】
また本発明の第１の態様は、上記したような酵素をコードしているＤＮＡも提供する。上述した酵素をコードしていれば、いかなる塩基配列からなるＤＮＡも本発明の範囲内である。特に、以下に詳しく説明する塩基配列からなるＤＮＡが、そのようなＤＮＡの典型例である。
【００６９】
配列番号５に示す塩基配列からなるＤＮＡは配列番号１に示すアミノ酸配列からなる酵素をコードしている（３’末端の終始コドンを含む）。配列番号６に示す塩基配列からなるＤＮＡは配列番号２に示すアミノ酸配列からなる酵素をコードしている（３’末端の終始コドンを含む）。上述したように配列番号１および配列番号２に示すアミノ酸配列からなる酵素はいずれも良好なガラクトオリゴ糖生産活性を有している。よってこれら塩基配列と相同性の高い塩基配列からなるＤＮＡがコードする酵素は、高確率でガラクトオリゴ糖生産活性を有する酵素である。
【００７０】
また上記ＤＮＡに対して、保存的塩基置換されている塩基配列からなるＤＮＡも本発明に含まれる。塩基配列の保存的塩基置換とは、塩基配列における塩基の置換のうち、コードする酵素のアミノ酸配列が変化しない置換を意味する。すなわち、２以上のＤＮＡが、それぞれの塩基配列は相互に異なるが同一アミノ酸配列の酵素をコードしている関係にあることを意味する。
【００７１】
なお当然のことながら、自身またはコードしている酵素の機能を害しない限り、上記ＤＮＡは、付加領域を有していてもよい。このような付加領域としては、例えば、そのＤＮＡ自身の繰り返し構造や、終止コドンやオペレーター配列、タグペプチドに対応する領域等が挙げられる。これらが付加される位置は５’末端、３’末端の一方または双方のいずれでもよい。
【００７２】
したがって、本発明の第１の態様として、以下のＤＮＡ（１）〜（６）が提供される。
（１）配列番号５に示す塩基配列からなるＤＮＡ
（２）配列番号６に示す塩基配列からなるＤＮＡ
（３）配列番号５に示す塩基配列に高い相同性を有する塩基配列からなるＤＮＡであって、コードしている酵素がガラクトオリゴ糖生産活性を有しているＤＮＡ
（４）配列番号６に示す塩基配列に高い相同性を有する塩基配列からなるＤＮＡであって、コードしている酵素がガラクトオリゴ糖生産活性を有しているＤＮＡ
（５）前記（１）〜（４）のＤＮＡのいずれかの塩基配列に対して保存的塩基置換されている塩基配列からなるＤＮＡ
（６）前記（１）〜（５）のＤＮＡに前記（１）〜（５）のＤＮＡ、終止コドンやオペレーター配列等を付加したＤＮＡであって、コードしている酵素がガラクトオリゴ糖生産活性を有しているＤＮＡ
【００７３】
あるＤＮＡの塩基配列に高い相同性（または同一性、類似性と表現してもよい）を有する塩基配列からなるＤＮＡとは、あるＤＮＡの塩基配列に対する相同性が８０％以上、８５％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上または９９％以上である塩基配列からなるＤＮＡを意味する。上限値は特に制限はなく１００％未満である。ＤＮＡの塩基配列相同性はＢＬＡＳＴアルゴリズムおよびＢＬＡＳＴ２．０アルゴリズムを用いた公知のソフトウェアなどを用いて容易に算出することができる。
【００７４】
これとは別に／これに加えて、あるＤＮＡの塩基配列に高い相同性を有する塩基配列からなるＤＮＡとは、当該あるＤＮＡの塩基配列に相補的な塩基配列からなるＤＮＡに、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする、またはハイブリダイズできるＤＮＡを意味する。
【００７５】
ここで、『ストリンジェントな条件』とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件を意味する。ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーは、主に、温度、イオン強度、および変性剤の条件によって決定される。ストリンジェントな条件としては、例えば、６０℃、１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳに相当する塩濃度および温度で洗浄する条件が挙げられる。６０℃、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳに相当する塩濃度および温度で洗浄する条件、６８℃、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳに相当する塩濃度および温度で洗浄する条件としてもよい。
【００７６】
したがってより具体的には、本発明の第１の態様として、以下のＤＮＡ（１）〜（８）が提供される。
（１）配列番号５に示す塩基配列からなるＤＮＡ
（２）配列番号６に示す塩基配列からなるＤＮＡ
（３）配列番号５に示す塩基配列に対する相同性が８０％以上１００％未満である塩基配列からなるＤＮＡであって、コードしている酵素がガラクトオリゴ糖生産活性を有するＤＮＡ
（４）配列番号６に示す塩基配列に対する相同性が８０％以上１００％未満である塩基配列からなるＤＮＡであって、コードしている酵素がガラクトオリゴ糖生産活性を有するＤＮＡ
（５）配列番号５に示す塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列からなるＤＮＡであって、コードしている酵素がガラクトオリゴ糖生産活性を有するＤＮＡ
（６）配列番号６に示す塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列からなるＤＮＡであって、コードしている酵素がガラクトオリゴ糖生産活性を有するＤＮＡ
（７）前記（１）〜（６）のＤＮＡのいずれかの塩基配列に対して保存的塩基置換されている塩基配列からなるＤＮＡ
（８）前記（１）〜（７）のＤＮＡに前記（１）〜（７）のＤＮＡの繰り返し構造、終止コドンやオペレーター配列等を付加したＤＮＡであって、コードしている酵素がガラクトオリゴ糖生産活性を有しているＤＮＡ
【００７７】
別の表現をすれば、本発明の第１の態様として、以下の塩基配列（Ａ）〜（Ｇ）を有する、または塩基配列（Ａ）〜（Ｇ）からなるＤＮＡが提供される。
（Ａ）配列番号５に示す塩基配列
（Ｂ）配列番号６に示す塩基配列
（Ｃ）配列番号５に示す塩基配列に対する相同性が８０％以上１００％未満である塩基配列であって、コードしている酵素がガラクトオリゴ糖生産活性を有する塩基配列
（Ｄ）配列番号６に示す塩基配列に対する相同性が８０％以上１００％未満である塩基配列であって、コードしている酵素がガラクトオリゴ糖生産活性を有する塩基配列
（Ｅ）配列番号５に示す塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列であって、コードしている酵素がガラクトオリゴ糖生産活性を有する塩基配列
（Ｆ）配列番号６に示す塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列であって、コードしている酵素がガラクトオリゴ糖生産活性を有する塩基配列
（Ｇ）（Ａ）〜（Ｆ）のＤＮＡのいずれかの塩基配列に対して保存的塩基置換されている塩基配列
【００７８】
なお、前記したようなＤＮＡは、例えば、Paenibacillus属の細菌（特にPaenibacillus pabuli）からゲノムＤＮＡを回収した後、これを鋳型とするＰＣＲによって得ることができる。
【００７９】
配列番号１に示すアミノ酸配列からなる酵素やその相同体をコードしている構造遺伝子を増幅するためのプライマーのペアとしては、例えば、プライマー１およびプライマー２が挙げられる。
プライマー１：５’−GAACACAAGGTCATGAAAGCAGCAAAGGCAGAT−３’
プライマー２：５’−CATCCTGTTAAGCTTTTACAATGCCCGAATGAC−３’
【００８０】
配列番号２に示すアミノ酸配列からなる酵素やその相同体をコードしている構造遺伝子を増幅するためのプライマーのペアとしては、例えば、プライマー３およびプライマー４が挙げられる。
プライマー３：５’−GAACACAAGGTCATGACCATTTTTCAATTTCCG−３’
プライマー４：５’−CATCCTGTTAAGCTTTTAACGGATTTCCAGCCAATTG−３’
【００８１】
こうして、配列番号１に示すアミノ酸配列からなる酵素やその相同体をコードしている構造遺伝子（例えば配列番号５に示す塩基配列からなるＤＮＡ）や配列番号２に示すアミノ酸配列からなる酵素やその相同体をコードしている構造遺伝子（例えば配列番号６に示す塩基配列からなるＤＮＡ）を取得することができる。
【００８２】
＜ベクター＞
本発明の第２の態様として、第１の態様のＤＮＡを含む組換えベクターが提供される。この組換えベクターによって形質転換体の作製および酵素の大量発現が可能となる。
【００８３】
ベクターとしては特に制限はなく通常使用されるものが使用できる。例えば、プラスミド、バクテリオファージ、コスミド、ファージミドなどが挙げられる。
【００８４】
プラスミドとしては、例えば、pK4、pRK401、pRF31、pBR322、pBR325、pUC118、pUC119、pUC18、pBIC、pUB110、pTP5、YEp13、YEp24、YCp50などが挙げられる。
【００８５】
ファージとしてはλファージ（λgt10、λgt11、λZAP等）が挙げられる。さらに、レトロウイルス又はワクシニアウイルスなどの動物ウイルス、バキュロウイルスなどの昆虫ウイルスベクターを用いることもできる。
【００８６】
ベクターには、プロモーター、エンハンサーなどのシスエレメント、スプライシングシグナル、ポリＡ付加シグナル、選択マーカー、リボソーム結合配列（ＳＤ配列）、開始コドン、終止コドンなどを連結することができる。また、製造する酵素の精製を容易にするためのタグ配列を連結することもできる。タグとしては、Ｈｉｓタグ、ＧＳＴタグ、ＭＢＰタグなどの公知のタグを利用できる。またベクターはセレクションのための抗生物質耐性遺伝子などを含んでもよい。
【００８７】
ベクターにＤＮＡを挿入する手法に特に制限はなく通常使用されるものが使用できる。通常は以下の手法によって行われる。まず、精製されたＤＮＡを適切な制限酵素で切断し、ベクターＤＮＡの制限酵素部位またはマルチクローニングサイトに挿入してベクターに連結する。
【００８８】
＜形質転換体＞
本発明の第３の態様によれば、第１の態様のＤＮＡおよび／または第２の態様の組換えベクターを含む（または導入させた）形質転換体が提供される。
【００８９】
形質転換体の宿主となる生物に特に制限はなく通常使用されるものが使用できる。原核生物、古細菌、真核生物のいずれも使用可能であり、例えば、真正細菌（大腸菌等）、酵母、植物細胞、動物細胞（ＣＯＳ細胞、ＣＨＯ細胞等）、昆虫細胞が挙げられる。
【００９０】
宿主としては、特に、Bacillus属、Paenibacillus属、Brevibacillus属（例えばBrevibacillus chosinensis）、Escherichia属（例えばEscherichia coli）、Corynebacterium属、Saccharomyces属、Shizosaccharomyces属、Kluyveromyces属、Pichia属、Aspergillus属、Penicillium属、Trichoderma属の微生物が挙げられる。また、乳酸菌や酢酸菌といった食経験のある微生物が挙げられる。
【００９１】
ＤＮＡおよび／または組換えベクターをこれら宿主に導入させる手法に特に制限はない。例えばエレクトロポレーション法、スフェロプラスト法、酢酸リチウム法、リン酸カルシウム法、リポフェクション法等が挙げられる。相同組換え等を利用して宿主のゲノム中に挿入または付加してもよい。
【００９２】
なお、ＤＮＡや組換えベクターが宿主に導入されたか否かの確認手法は任意の手法が使用可能である。例えば、ＰＣＲ法、サザンハイブリダイゼーション法、ノーザンハイブリダイゼーション法等により行うことができる。
【００９３】
前記形質転換体を利用して従来周知な方法によって本発明の酵素やそれを含む組成物を調製することができる。例えば、以下に説明する方法によって調製することができる。
【００９４】
対象遺伝子を導入した前記形質転換体を液体培地で大量培養する。大量培養後、所定の誘導剤を形質転換体に投与して対象遺伝子の発現を誘導させてもよい。例えば、ベクターがＬａｃオペロンを使用している場合にはＩＰＴＧを投与して対象遺伝子の発現を誘導させることができる。
【００９５】
大量発現後、培養上清、もしくは細胞を超音波や細胞壁溶解酵素などによって破砕することで得られる破砕液を回収する。この上清や破砕液には本発明の酵素が大量に含まれている。この上清や破砕液を酵素含有液体組成物としてそのまま使用してもよいし、この液体組成物について精製処理を施して精製酵素として回収してもよい。
【００９６】
この精製処理は例えば塩析や膜分離、カラムクロマトグラフィーによって実行できる。これら操作は一種もしくは複数を組み合わせることもできる。カラムクロマトグラフィーの種類に制限はないが、これら酵素に特異的に作用する抗体などを含むカラムを使用してもよいし、予め酵素に付加させたＨｉｓタグなどのタグドメインと相互作用可能なカラムを使用してもよい。
【００９７】
このような方法によって、配列番号１に示すアミノ酸配列からなる酵素もしくはその相同体または配列番号２に示すアミノ酸配列からなる酵素もしくはその相同体を大量に調製することが可能である。これら酵素はガラクトオリゴ糖の製造に用いることができる。
【００９８】
＜ＧＯＳの製造方法＞
本発明の第４の態様によれば、上述の酵素などのPaenibacillus pabuli由来ラクターゼを用いたＧＯＳの製造方法が提供される。
【００９９】
本発明の第１の態様で詳述した酵素などのPaenibacillus pabuli由来ラクターゼはガラクトオリゴ糖生産活性を有しているため、これを用いて乳糖からＧＯＳを製造することができる。ＧＯＳ製造の手法や条件は制限されない。１例を挙げて以下に説明するが本発明はこれに制限されない。
【０１００】
本発明のＧＯＳの製造方法は、酵素と乳糖とを接触させる工程、この接触によってＧＯＳを製造する工程を含む。任意に製造されたＧＯＳを単離精製する工程を含んでもよい。
【０１０１】
本発明のＧＯＳ製造方法は、上述の酵素と乳糖とを接触させることを含む。乳糖と接触させる酵素は、その酵素を産生する微生物から精製した状態（精製酵素）であってもよい。あるいはその微生物自体と乳糖とを接触させてもよいし、微生物の破砕物や抽出物などの他の因子も混在する混合物と乳糖とを接触させてもよい。副反応を予防する点で精製酵素を乳糖に接触させることが好ましい。
【０１０２】
精製酵素とは、所定の精製処理を経ることで得られる酵素溶液または酵素固形物を意味する。主にその酵素以外の酵素を実質的に含まないか、もしくは他の酵素が低減されていることを意味する。
【０１０３】
乳糖を含有する溶液に酵素等を混合するか、または酵素等を含む溶液に乳糖を混合することでガラクトオリゴ糖を製造するための反応系（溶媒、乳糖、本発明の酵素を含む混合物）が形成される。溶媒は任意であるが、通常は水または水を主成分とする水性溶媒である。
【０１０４】
反応系の乳糖の含有率は、特に制限はなく任意に設定し得る。反応系全量基準で例えば１〜８０質量％、２〜７０質量％または４〜６０質量％としてもよい。
ある実施態様においては、さらに４〜５０質量％、４〜４０質量％、４〜３０質量％、４〜２０質量％、４〜１０質量％としてもよい。このような比較的低基質濃度の領域においては、配列番号１に示すアミノ酸配列からなる酵素やそのファミリー酵素が好ましく使用される。これらはＫｍ値に優れており、低基質濃度においても十分な活性を有するからである。
別の実施態様では、５〜６０質量％、１０〜６０質量％、２０〜６０質量％、３０〜６０質量％、４０〜６０質量％としてもよい。このような比較的高基質濃度の領域においては、配列番号２に示すアミノ酸配列からなる酵素やそのファミリー酵素が好ましく使用される。これらは良好なＧＯＳ生産活性と３糖ＧＯＳ選択活性を両立しており、短時間に大量の３糖ＧＯＳを製造することができる。
【０１０５】
反応系の本発明の酵素の含有量は、特に制限はなく任意に設定し得る。反応系において例えば０．１〜１０ＬＵ／ｍＬまたは０．１〜１０ＯＵ／ｍＬとしてもよい。
【０１０６】
ＧＯＳ生産活性は反応系によって異なる。本発明の酵素の含有量は次のように決定すればよい。
第一工程として、特定の反応系（乳糖の含有率、本発明の酵素の含有量、反応ｐＨ、反応温度、反応時間等）において、本発明の酵素の含有量に対するＧＯＳ生産量を確認する。
第二工程として、先の反応系に含まれる、本発明の酵素のラクターゼ活性（ＬＵ／ｍＬまたはＯＵ／ｍＬの少なくとも一方）を測定する。
第三工程として、第二工程で測定したラクターゼ活性を指標にして、反応系に含まれる本発明の酵素量を調整する（本発明の酵素の含有量を増加または低減する）。
第四工程として、反応系に含まれる本発明の酵素の含有量を調整した値になるよう含ませる。
なお、上記の第一工程と第二工程は逆に行っても良い。
【０１０７】
反応系のｐＨは、特に制限はなく任意に設定し得る。例えば３〜９、４〜８または５〜７としてもよい。当然のことながら、ｐＨは一定でもよいし変動してもよい。
【０１０８】
反応系の温度は、特に制限はなく任意に設定し得る。例えば２０〜７５℃、３０〜７５℃、４０〜７５℃、５０〜７０℃または６０〜７０℃としてもよい。当然のことながら、温度は一定でもよいし変動してもよい。反応系に含まれる乳糖が溶解する温度を選択することが好ましい。
【０１０９】
反応時間は、特に制限はなく任意に設定し得る。例えば、１〜１００時間、１２〜６０時間または２４〜４８時間としてもよい。
【０１１０】
これら一連の製造方法は、回分式でも連続式のいずれでもよい。回分式では、反応器に所定量の酵素と原料乳糖とを投入し、所定時間ＧＯＳを生成させた後、ＧＯＳを含む混合物を反応器から回収する。連続式では、反応器に酵素および／または原料乳糖を連続的または断続的に投入する。そしてＧＯＳを生成させつつ、ＧＯＳを含む混合物を反応器から回収する。
【０１１１】
本発明において、原料とする乳糖の状態は特に制限はない。任意の溶媒に溶解させた乳糖溶液でも良い。また凝乳した上清であるホエーならびにその濃縮物や脱脂粉乳などの乳糖を含んだ混合物を乳糖原料として使用してもよい。
【０１１２】
上述した工程の終了時点では、反応系には単糖、二糖、ＧＯＳが混在する。そのままＧＯＳ溶液として使用しても良いし、これからＧＯＳを精製しても良い。ＧＯＳを精製する手法は特に制限はなく任意のものを採用し得る。例えば、活性炭や金属イオンを配位した陽イオン交換樹脂、ゲル濾過用樹脂を使用するカラムクロマトグラフィーによってそれぞれの画分に分離することができる。
【０１１３】
カラムクロマトグラフィーにおけるカラムのサイズ、溶媒の種類、溶媒の流量などの条件も任意に調整し得るものである。
【０１１４】
≪本発明２≫
以下、本発明２について詳述する。
【０１１５】
本発明においてオリゴ糖とは３糖から１０糖の多糖化合物を意味する。
【０１１６】
本発明においてガラクトオリゴ糖（ＧＯＳとも表記する）とは、下記一般式で表せるオリゴ糖を主として意味する。
（Ｇａｌ）ｎ−Ｇａｌ−Ｇｌｃ
ここで、Ｇａｌはガラストース残基、Ｇｌｃはグルコース残基を表し、ｎは１〜８の整数、特に１〜３の整数である。糖間の各結合の結合様式は特に制限されないが、典型的にはβ−１，４−グリコシド結合である。
【０１１７】
ラクターゼとは、乳糖をβ−ガラクトースとグルコースに加水分解できる酵素である。この分解の際、β−ガラクトシル基を他の分子に転移させることができる。水に転移させればβ−ガラクトースを生じるが、乳糖（Ｇａｌ−Ｇｌｃ）に転移させれば３糖（上記式のｎが１）のガラクトオリゴ糖（Ｇａｌ−Ｇａｌ−Ｇｌｃ）を生じる。
【０１１８】
このβ−ガラクトシル基の転移反応が３糖（上記式のｎが１）のガラクトオリゴ糖（Ｇａｌ−Ｇａｌ−Ｇｌｃ）に対して起これば、４糖（上記式のｎが２）のガラクトオリゴ糖（（Ｇａｌ）２−Ｇａｌ−Ｇｌｃ）が生じる。同様に、４糖（上記式のｎが２）のガラクトオリゴ糖に対して起これば、５糖（上記式のｎが３）のガラクトオリゴ糖が生じる。
【０１１９】
本発明のガラクトオリゴ糖の製造方法は、ラクターゼ産生微生物としてPaenibacillus属の細菌を使用する。Paenibacillus属の細菌が一般的にガラクトオリゴ糖を産生するとはこれまで報告されていなかった。
【０１２０】
Paenibacillus属の細菌としては、例えば、以下の細菌が挙げられる。下記する細菌はいずれも、土壌などから単離できたり、公的機関に寄託されていたり、当業者であれば容易に入手可能である。
・Paenibacillus themophilus（例えば、寄託番号ＤＳＭ  ２４７４６）
・Paenibacillus popilliae（例えば、寄託番号ＤＳＭ  ２２７００）
・Paenibacillus thiaminolyticus（例えば、寄託番号ＮＢＲＣ  １５６５６）
・Paenibacillus pabuli（例えば、寄託番号ＮＢＲＣ  １３６３８）
・Paenibacillus alvei（例えば、寄託番号ＮＢＲＣ  ３３４３）
・Paenibacillus alginolyticus（例えば、寄託番号ＮＢＲＣ  １５３７５）
・Paenibacillus chibensis（例えば、寄託番号ＮＢＲＣ  １５９５８）
・Paenibacillus chitinolyticus（例えば、寄託番号ＮＢＲＣ  １５６６０）
・Paenibacillus chondroitinus（例えば、寄託番号ＮＢＲＣ  １５３７６）
・Paenibacillus glucanolyticus（例えば、寄託番号ＮＢＲＣ  １５３３０）
・Paenibacillus lautus（例えば、寄託番号ＮＢＲＣ  １５３８０）
・Paenibacillus macerans（例えば、寄託番号ＮＢＲＣ  １５３０７）
・Paenibacillus peoriae（例えば、寄託番号ＮＢＲＣ  １５５４１）
・Paenibacillus polymyxa（例えば、寄託番号ＮＢＲＣ  １５３０９および寄託番号ＪＣＭ  ２５０７）
・Paenibacillus validus（例えば、寄託番号ＮＢＲＣ  １５３８２）
・Paenibacillus apiarius（例えば、寄託番号ＤＳＭ  ５５８１）
・Paenibacillus jamilae（例えば、寄託番号ＤＳＭ  １３８１５）
・Paenibacillus kribbensis（例えば、寄託番号ＪＣＭ  １１４６５）
・Paenibacillus terrae（例えば、寄託番号ＪＣＭ  １１４６６）
【０１２１】
上述したPaenibacillus属の細菌は、乳糖を原料としてガラクトオリゴ糖を製造することができることが分かった。一般的に、ラクターゼ活性があってもガラクトオリゴ糖を生産するとは限らない。ガラクトオリゴ糖の生産性は、遺伝子配列から確認することができないため、ガラクトオリゴ糖の生産性を確認するには実際に試験を行って、ガラクトオリゴ糖の生産性を確認する必要がある。上述した多くのPaenibacillus属において、ガラクトオリゴ糖の生産性を確認できた。また、微生物がオリゴ糖を生産する理由は、糖をオリゴ糖に変えることによって糖を異種微生物に資化され難くすること、富栄養時にオリゴ糖を貯蔵物質として蓄え貧栄養時にこのオリゴ糖を資化すること、乳糖分解に伴う浸透圧変化を予防／低減することが考えられる。近傍種の微生物は同様の遺伝子によって同様の生存戦略を行い得るから、近傍種の微生物は同様のオリゴ糖を生産する能力があると考えられる。これらのことから、Paenibacillus属に属する微生物全般において、ガラクトオリゴ糖が生産されることが推測された。またこれらPaenibacillus属細菌の突然変異株や遺伝子組み換え技術により製造した組換え体等も用いることが可能である。
【０１２２】
Paenibacillus属の細菌は一般に生育速度が速い。また多様な微生物に対して抗菌性を有する。よってガラクトオリゴ糖の製造に際し、これら細菌を大量に培養することは酵母などと比べて容易である。
【０１２３】
他方、Bacillus属の細菌とは異なり、人体に対する病原性を示すPaenibacillus属の細菌は知られておらず、操作中の安全性も高いものと考えられる。
【０１２４】
これらPaenibacillus属の細菌およびBacillus属の細菌について解析した系統樹が図４である。図４からわかる通り、Paenibacillus属はBacillus属と明確に分岐した属である。
【０１２５】
本発明のガラクトオリゴ糖の製造方法では、これらPaenibacillus属の細菌の菌体および／または前記細菌のガラクトオリゴ糖生産酵素を乳糖に接触させてガラクトオリゴ糖を製造する。ガラクトオリゴ糖生産酵素は、精製された酵素を使用してもよい。また、この酵素を含有する混合物（酵素含有混合物）を使用してもよい。酵素含有混合物としては、菌体の破砕物や抽出物などの菌体の処理物が挙げられる。処理物は固形でも液状でもよい。細菌が該酵素を菌体外に分泌する場合には菌体を除去した培地も酵素含有混合物として使用できる。
【０１２６】
より具体的には、本発明のガラクトオリゴ糖の製造方法の典型的な実施形態では、
Paenibacillus属の細菌を培養する任意の工程（培養工程）、
Paenibacillus属の細菌の菌体および／またはそのガラクトオリゴ糖生産酵素と原料乳糖を接触させる工程（混合工程）、
原料乳糖からガラクトオリゴ糖を製造させ、ガラクトオリゴ糖混合物を得る工程（ガラクトオリゴ糖生成工程）、
前記ＧＯＳ混合物からガラクトオリゴ糖を精製する任意の工程（ガラクトオリゴ糖精製工程）、
といった工程が実行される。
【０１２７】
これら一連の製造方法は、回分式でも連続式のいずれでもよい。回分式では、反応器に所定量のPaenibacillus属の細菌と原料乳糖とを投入し、所定時間ＧＯＳを生成させた後、ＧＯＳを含む混合物を反応器から回収する。連続式では、反応器にPaenibacillus属の細菌やその酵素および／または原料乳糖を連続的または断続的に投入する。そしてＧＯＳを生成させつつ、ＧＯＳを含む混合物を反応器から回収する。
【０１２８】
本発明において、原料とする乳糖の状態は特に制限はない。任意の溶媒に溶解させた乳糖溶液でも良い。また凝乳した上清であるホエーならびにその濃縮物や脱脂粉乳などの乳糖を含んだ混合物を乳糖原料として使用してもよい。
【０１２９】
接触させる際は操作の利便性のため乳糖もしくはPaenibacillus属の細菌および／またはそのガラクトオリゴ糖生産酵素は適切な溶媒によって流体とすることが好ましい。溶媒は任意であるが、典型的には水または水を主成分とする水性溶媒である。
【０１３０】
通常、Paenibacillus属の細菌は乳糖に接触させるより前に培養を行う。Paenibacillus属の細菌の培養条件に何ら制限はなく任意である。例えば、嫌気的または好気的条件下において液体培地中で約３０℃、約３日間培養してもよい。液体培地の種類に何ら制限はなく任意のものが使用可能である。例えば、ソイビーンカゼインダイジェスト（ＳＣＤ）培地やブレインハートインヒュージョン（ＢＨＩ）培地などが挙げられる。
【０１３１】
培養により得られたPaenibacillus属の細菌は、生死を問わず、培養物あるいはその処理物も有利に用いることができる。培養物を濃縮してもよい。遠心分離により液体培地と菌体を分離し、生理食塩水、蒸留水等で洗浄して湿菌体を得ることができる。その他、培養物の処理物としては、超音波処理物、溶菌酵素処理物、界面活性剤処理物、機械的磨砕処理物等が挙げられる。これらを適切な溶媒に懸濁させて、Paenibacillus属の細菌の菌体および／または酵素を含む流体とすることができる。
【０１３２】
乳糖とPaenibacillus属の細菌とを混合することでガラクトオリゴ糖を製造するための反応系（溶媒、乳糖、Paenibacillus属の細菌の菌体および／または酵素を含む混合物）が形成される。
【０１３３】
反応系のPaenibacillus属の細菌の菌体の含有量は、特に制限はなく適宜設定し得る。例えば湿菌体で１０〜２００ｇ／Ｌ、３０〜１５０ｇ／Ｌ、５０〜１００ｇ／Ｌとしてもよい。破砕物、抽出物、培地などの酵素含有混合物を使用して酵素を含有させる場合、その含有量は、元の菌株が上記範囲になるような量に調整すればよい。
【０１３４】
反応系の乳糖の含有量は、特に制限はなく適宜設定し得る。例えば反応系全量基準で５〜６０質量％または３０〜６０質量％としてもよい。乳糖の消費に伴い、適宜乳糖を補充してもよい。
【０１３５】
反応系の乳糖の含有量に対するPaenibacillus属の細菌の含有量の比率（ｋｇ／ｋｇ）は、特に制限はなく適宜設定し得る。例えば、乳糖量に対して湿菌体で１／３０〜１／１、１／２０〜１／２、１／１０〜１／５としてもよい。破砕物、抽出物、培地などの酵素含有混合物を使用して酵素を含有させる場合、その含有量は、元の菌株が上記範囲になるような量に調整すればよい。
【０１３６】
反応系の温度は、特に制限はなく適宜設定し得る。例えば１０〜７５℃、２０〜６０℃または３０〜５０℃としてもよい。当然のことながら、温度は一定でもよいし変動してもよい。
【０１３７】
反応系のｐＨは、特に制限はなく適宜設定し得る。例えば３〜９、５〜８、６〜８、６〜７．５または６〜７としてもよい。当然のことながら、ｐＨは一定でもよいし変動してもよい。
【０１３８】
反応系の反応時間は、特に制限はなく適宜設定し得る。例えば１〜５０時間、５〜３０時間または１２〜２４時間としてもよい。
【０１３９】
ガラクトオリゴ糖の製造を効率的に行うため、反応系は無機塩類などを含有してもよい。無機塩類などの含有量は例えば反応系全量基準で０．００００１〜１０質量％、０．０００１〜１質量％である。無機塩類を含むような溶媒として、ＳＣＤ培地とＢＨＩ培地などの液体培地を使用してもよい。
【０１４０】
上述した工程の終了時点では、反応系には単糖、二糖、ＧＯＳが混在する。そのまま菌体含有ＧＯＳ溶液として使用しても良いし、菌体を除去してＧＯＳ溶液として使用しても良いし、これからＧＯＳを精製しても良い。菌体含有ＧＯＳ溶液から菌体を除去する方法は任意である。例えば遠心分離、フィルタリング、加熱などによる滅菌処理などが挙げられる。ＧＯＳを精製する手法は特に制限はなく任意のものを採用し得る。活性炭や金属イオンを配位した陽イオン交換樹脂、ゲル濾過用樹脂を使用するカラムクロマトグラフィーによってそれぞれの画分に分離することができる。
【０１４１】
カラムクロマトグラフィーにおけるカラムのサイズ、溶媒の種類、溶媒の流量などの条件も任意に調整し得るものである。
【実施例】
【０１４２】
≪本発明１≫
以下に実施例を挙げて本発明１を具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。【０１４３】
（実施例１〜２：配列番号１および配列番号２に示すアミノ酸配列からなる酵素）
Paenibacillus pabuliからゲノムＤＮＡを採取し、これを鋳型にＰＣＲによって配列番号１および配列番号２に示すアミノ酸配列からなる酵素をコードしているＤＮＡ（構造遺伝子）をそれぞれ増幅した。【０１４４】
配列番号１に示すアミノ酸配列からなる酵素をコードしている構造遺伝子（即ち、配列番号５に示す塩基配列からなるＤＮＡ）を増幅するために使用したプライマーのペアはプライマー１および２である。
プライマー１：５’−GAACACAAGGTCATGAAAGCAGCAAAGGCAGAT−３’
プライマー２：５’−CATCCTGTTAAGCTTTTACAATGCCCGAATGAC−３’【０１４５】
配列番号２に示すアミノ酸配列からなる酵素をコードしている構造遺伝子（即ち、配列番号６に示す塩基配列からなるＤＮＡ）を増幅するために使用したプライマーのペアはプライマー３および４である。
プライマー３：５’−GAACACAAGGTCATGACCATTTTTCAATTTCCG−３’
プライマー４：５’−CATCCTGTTAAGCTTTTAACGGATTTCCAGCCAATTG−３’【０１４６】
増幅したそれぞれの構造遺伝子をＢＩＣ  Ｓｙｓｔｅｍ（ＴａＫａＲａ）を用いて、相同組換えによりプラスミドpBICに挿入した。それぞれのプラスミドをBrevibacillus chosinensisに導入させ、酵素を大量発現させた。【０１４７】
各酵素の産生後、この形質転換体を超音波破砕して細胞破砕液を得た。この破砕液のＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を図１に示す。図１Ａは配列番号１に示すアミノ酸配列を有する酵素、図１Ｂは配列番号２に示すアミノ酸配列からなる酵素のＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果である。調製した細胞破砕液は、必要に応じて限外ろ過し、酵素を濃縮した。配列番号１に示すアミノ酸配列からなる酵素の濃縮破砕液を実施例１、配列番号２に示すアミノ酸配列からなる酵素の濃縮破砕液を実施例２とした。【０１４８】
実施例１のラクターゼ活性は、乳糖分解活性が０．４ＬＵ／ｍＬであり、ＯＮＰＧ分解活性が１１．７ＯＵ／ｍＬであった。
実施例２のラクターゼ活性は、乳糖分解活性が５１．７ＬＵ／ｍＬであり、ＯＮＰＧ分解活性が２４０ＯＵ／ｍＬであった。【０１４９】
（検証１：反応速度パラメーターの解析）
実施例１の酵素のＯＮＰＧを基質とした時の反応速度パラメーターを以下の方法により求めた。０．０７５〜７．５ｍＭの基質濃度で４０℃、１０分反応させた時の比活性（μｍｏｌ／ｍｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ／ｍｉｎ）を算出し、各基質濃度に対し比活性をプロットした。このとき、緩衝液には１００ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ６．５）を用いた。上記方法により測定した基質飽和曲線から、ミカエリス・メンテンの式に則り、酵素と基質の親和性を表すＫｍ（ミカエリス・メンテン定数）と酵素１ｍｇあたり、１分間に何μｍｏｌの基質を触媒するか、を示すＶｍａｘ（最大反応速度）を算出した。これとβ−ｇａｌIIの性能と比較したのが表１である。β−ｇａｌIIはBacillus circulansの培養液から低分子のラクターゼのみを精製した酵素であり、ビオラクタ（天野エンザイム株式会社製）の主要酵素である（非特許文献１）。【０１５０】
【表１】
2019194062.tif 000002
【０１５１】
表１から明らかな通り、実施例１の酵素はビオラクタに含まれる酵素と最大反応速度は同等であるが、基質ＯＮＰＧに対する親和性を表すＫｍが著しく低い。したがって、本発明の酵素を用いれば、ビオラクタよりも低基質濃度においても効率よくＧＯＳを製造することが可能であると考えられる。【０１５２】
（比較例）
比較例として、配列番号４に示すアミノ酸配列からなる酵素（Bacillus circulans由来ラクターゼＢｇａＤ−Ｄ）を使用した。本酵素を取得するため、Bacillus sp. ATCC 31382株（旧名Bacillus circulans）からゲノムＤＮＡを採取し、これを鋳型にＰＣＲによって配列番号４に示すアミノ酸配列からなる酵素をコードしている構造遺伝子を増幅した。本遺伝子のＮ末端側に開始コドン、Ｃ末端側に終止コドンを付加し、Brevibacillus chosinensisに導入させ、酵素を大量発現させた。酵素の産生後、この形質転換体を超音波破砕して細胞破砕液を得た。【０１５３】
（検証２：ＧＯＳ製造能力の解析）
実施例１、実施例２および比較例の各サンプルのＧＯＳ生成能を評価した。実施例１の酵素では、１ｍＭ硫酸マグネシウムおよび０．０６４ｍＭ  ＥＤＴＡを含む０．１Ｍリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．５）に終濃度が系全量基準で３０質量％となるよう乳糖を配合し、活性が１．５ＬＵ／ｍＬとなるように酵素を添加した。実施例２の酵素および比較例の各酵素では、０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．５）に終濃度が系全量基準で６０質量％となるよう乳糖を配合し、活性が５．０ＬＵ／ｍＬとなるように酵素を添加した。【０１５４】
反応温度を実施例１の酵素では３０℃、実施例２および比較例の酵素では５０℃として２４時間、ＧＯＳ製造反応を行わせた。所定時間経過後、２０ｗｔ％スルホサリチル酸溶液を反応液の１／２０量添加して反応を停止させた。【０１５５】
実施例１〜２および比較例の各サンプルについてＨＰＬＣを行い、製造されたＧＯＳの量を解析した。カラムはＴｒａｎｓｇｅｎｏｍｉｃ社製ＣＡＲＢＯＳｅｐ ＣＨＯ−６２０ ６．５φ×３００ｍｍを使用し、移動相は水、流速は０．４ｍＬ/ｍｉｎ、温度は８５℃、検出はＲＩの条件にて分析を行った。各サンプルのＨＰＬＣの結果を表２に示す。【０１５６】
表２中の「ＧＯＳ」とはＧＯＳ含有割合を意味する。より具体的にはＧＯＳ（５糖、４糖、３糖）、２糖（未反応ラクトースや転移２糖）、単糖（グルコース、ガラクトース）の合計ＨＰＬＣ面積に対する、ＧＯＳのＨＰＬＣ面積の百分率である。
「収率」とはＧＯＳの生成効率を意味する。より具体的にはＧＯＳ生成量／ラクトース消費量の百分率である（ＨＰＬＣからＧＯＳ生成量およびラクトース消費量が算出される）。
なお、６糖以上の糖は実施例１〜２及び比較例で確認することはできなかった。【０１５７】
【表２】
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【０１５８】
表２から明らかな通り、実施例１〜２の酵素は比較例の酵素よりも３糖ＧＯＳの選択性が高い。本発明の酵素はこの点において良好な機能を有していることが明らかとなった。
特に実施例２の酵素はＧＯＳの収率が比較例の酵素と同程度であり、高いＧＯＳ製造収率と３糖選択性を両立することができる。【０１５９】
（検証３：ＧＯＳの糖構成）
ヒト母乳中のＧＯＳは、結合様式の違いから4’-GL (Galβ1-4Galβ1-4Glc)、3’-GL (Galβ1-3Galβ1-4Glc) および6’-GL (Galβ1-6Galβ1-4Glc) の３種類の構造が存在し、市販されているＧＯＳ製造用ラクターゼの多くは、4’-GLおよび6’-GLをメインとして生成することが知られている。一方、ビフィズス菌の多くは恒常的に3’-GLを菌体内に取り込むトランスポーターを発現している (非特許文献２)。即ち、3’-GLを含むＧＯＳのメリットは、ビフィズス菌が増殖し易い。【０１６０】
これを踏まえ、比較例のBgaD-Dおよび実施例２のラクターゼによるGOSをHPAEC-PAD (Thermo Fisher Scientific; ICS-3000＋, Dionex CarboPac PA1カラム) により分析した (図２)。尚、糖組成の分析条件は下記の通りである。【０１６１】
・分析条件：ＨＰＡＥＣ−ＰＡＤ（high performance anion exchange chromatography - pulsed amperometric detection）では、装置にイオンクロマトグラフ ICS-3000 (Thermo Scientific社製) 、カラムにCarboPac PA1 (φ4 mm x 250 mm, Thermo Scientific社製) を用いた。移動相は100 mM 水酸化ナトリウム溶液 (A)、100 mM 水酸化ナトリウム含有600 mM 酢酸ナトリウム溶液 (B)、水 (C)、50 mM 酢酸ナトリウム溶液 (D) を用い、グラジエントにて糖を分離した。条件を表３に示す。反応液の糖濃度を0.5 mg/mLとなるように調製し、分析用サンプルとした。これを流速1.0 mL/min、注入量25 μL、カラム温度 20℃、検出器PADにて分析した。【０１６２】
【表３】
2019194062.tif 000004
【０１６３】
その結果、実施例２のラクターゼが生成する主要なGOSは、4’-GLが主要糖である比較例のラクターゼによって生成するGOSとは異なり、そのピーク位置から3’-GLである可能性が高いことがわかった (表４)。また、実施例２のラクターゼによって生成されるGOSのうち、3糖を分離して構造解析を行ったところ、1H-NMRスペクトルおよび13C-NMRスペクトルが3’-GLのパターンと一致した （非特許文献３）。このことから、本酵素によって生成される主要GOSは3’-GLであると考えられた。【０１６４】
【表４】
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【０１６５】
次に、アレルゲン性が高い、通称４Ｐ−Ｘと称される4糖 ([Galβ1-4 (Galβ1-4Galβ1-6) Glc] の含有確認試験を、比較例のラクターゼにより生成されたＧＯＳと実施例２の酵素により生成されたＧＯＳとに関して実施した。具体的には、これら酵素によって生成されるGOSのうち4糖をBio-Gel P2 Gel (Bio-Rad) を用いたゲルろ過クロマトグラフィーにより分離し、これをHPAEC-PADを用いて分析した。このとき、当社で合成した4P-Xを多く含む標品と比較した (非特許文献４)。その結果、実施例２の酵素により生成されたＧＯＳのみ、4P-Xの位置にピークは確認されなかった (図３)。このことから、実施例２の酵素によって生成されるGOSは4P-Xを含まないことがわかった。【０１６６】
≪本発明２≫
以下に実施例を挙げて本発明２を具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。【０１６７】
（ＧＯＳ転移能を有する微生物のスクリーニング）
任意の土壌を乳糖１％を含むＳＣＤ培地に加え、３０℃、２５０ｓｐｍで７日間振とう培養した。この培養液０．１ｍＬを同組成の培地１０ｍＬに移植し、３０℃、２５０ｓｐｍで７日間振とう培養した。次いで、培養液を同組成の寒天培地に塗布し、３０℃、５日間程度培養を行った。
また、任意の土壌を乳糖０．１％を含むＳＣＤ寒天培地に塗布し、３０℃、７日間程度、同様に培養を行った。【０１６８】
得られた各コロニーについて、４８ウェルプレートに入れた乳糖２％を含むＳＣＤ培地０．５ｍＬに一白金耳接種し、３０℃、５００ｒｐｍ（振幅２ｍｍ）で４日間振とう培養することでそれぞれの菌株の培養液を回収した。【０１６９】
各菌株の培養液について、０．２Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ６．０）を用いて溶解した乳糖溶液を、乳糖の終濃度が２５〜３０質量％となるよう加えた。その後、３０℃、５００ｒｐｍで２４時間転移反応を行った。【０１７０】
反応終了後、反応液を遠心分離し、上清液を回収した。これを純水で適宜希釈したものを分析用試料とした。ＨＰＬＣ分析法（カラムはＴｒａｎｓｇｅｎｏｍｉｃ社製ＣＡＲＢＯＳｅｐ  ＣＨＯ−６２０  ６．５φ×３００ｍｍ、移動相は水、流速は０．５ｍＬ／ｍｉｎ、温度は８５℃、検出はＲＩ）によって各試料のＧＯＳ量を測定した。試料にＧＯＳが存在することは、その試料の菌株がＧＯＳ転移能を有することを意味する。こうしてＧＯＳ転移能を有する菌株を選別した。【０１７１】
その結果得られた菌株の一部が、Paenibacillus popilliae、Paenibacillus themophilus、Paenibacillus pabuli、Paenibacillus alvei、Paenibacillus thiaminolyticus、であった。すなわちPaenibacillus属に属する細菌は乳糖からＧＯＳを製造する能力を有することが示唆された。【０１７２】
各菌株について、２４φ×２００ｍｍ試験管に入れた乳糖２％を含むＳＣＤ培地と乳糖２％を含むＢＨＩ培地、それぞれの培地１０ｍＬに一白金耳接種し、３０℃、２５０ｓｐｍで４日間振とう培養した。対照として、Bacillus属に属する細菌（寄託番号ＡＴＣＣ  ３１３８２株：旧名Bacillus circulans）を利用して同一条件にて培養した。
培養終了後、培養液０．５ｍＬを４８ウェルプレートに移した。これに０．２Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ６．０）に乳糖濃度が３０質量％となるよう乳糖を溶解させた乳糖溶液０．５ｍＬを加え、３０℃、５００ｒｐｍで２４時間転移反応を行った。
反応終了後、反応液中のＧＯＳや乳糖の含有量をＨＰＬＣによって各成分のピーク面積を解析して、各菌株のＧＯＳ製造能力を評価した。その結果を表５に示す。【０１７３】
【表５】
2019194062.tif 000006
【０１７４】
表５中の「ＧＯＳ」とはＧＯＳ含有割合を意味する。より具体的にはＧＯＳ（３糖以上、主として５糖、４糖、３糖）、ラクトース、グルコース、ガラクトースの合計ＨＰＬＣ面積に対する、ＧＯＳのＨＰＬＣ面積の百分率である。
表５中の「収率」とはＧＯＳの生成効率を意味する。より具体的にはＧＯＳ生成量／ラクトース消費量の百分率である（ＨＰＬＣからＧＯＳ生成量およびラクトース消費量が算出される）。
表５中の「相同性検索（ＢＬＡＳＴ）」の欄における相同率は、各strainの１６Ｓ  ｒＤＮＡ塩基配列をDNA Data Bank of Japanのサイトなどを利用してＢＬＡＳＴ検索を行った時に最も相同性が高かった種（該当菌株）との相同性を意味する。相同性９９．５％以上を示した場合にその種と同定した。【０１７５】
表５中の各strain及び該当菌株、同定された種の基準株、ＧＯＳ転移能を有するPaenibacillus属、代表的なBacillus属を用い、アウトグループとしてAneurinibacillus aneurinilyticus ＤＳＭ  ５５６２を指定し、これらの１６Ｓ  ｒＤＮＡ塩基配列をDNA Data Bank of Japanのサイトなどを利用してアライメントし、系統樹を作成した。系統樹の作成は、遺伝情報処理ソフトウェアであるＧＥＮＥＴＹＸ（ゼネティックス社製）を用いた。Paenibacillus属とBacillus属の１６Ｓ  ｒＤＮＡ部分塩基配列に基づく簡易分子系統樹を図４に示す。【０１７６】
表５からわかる通り、これらPaenibacillus属の細菌は高い生成割合と収率でＧＯＳを製造することができることがわかった。またこれらのPaenibacillus属の細菌は、対照であるBacillus属の細菌よりも良好な効率でＧＯＳを製造できることが分かった。【０１７７】
この知見から、Paenibacillus属の他の細菌についても同様の条件下でＧＯＳの製造能力を評価した。使用した菌株とその結果を表６に示す。【０１７８】
【表６】
2019194062.tif 000007
【０１７９】
表６中の「ＧＯＳ」の欄における数値はＧＯＳ生成割合を意味し、「＋＋」はＧＯＳ生成割合が１％以上であったこと、「＋」はＧＯＳ生成割合が１％未満であったこと、「−」は実施していないことを意味する。表６中の「収率」は表５のものと同じ意味である。【０１８０】
表６の結果から明らかな通り、Paenibacillus属の細菌はＧＯＳを製造する能力があることが分かった。またBacillus circulansは２種類の培地でＧＯＳ製造能力に大きな差異は生じなかったが、Paenibacillus属の細菌は２種類の培地でＧＯＳ製造能力に大きな差異が生じる場合があることがわかった。この結果はPaenibacillus属の細菌は、培地などの条件を変えることでＧＯＳの製造能力が大きく左右されることを示唆している。このことから、Paenibacillus属の各細菌に対して最適な条件を設定することで、従来よりも良好なＧＯＳ製造量および／またはＧＯＳ収率を得られる可能性があることが示唆された。Paenibacillus属がＧＯＳ製造に使用可能であることや、その収率が従来よりも良好なものとなり得ることは自明なことではなく、驚くべきことである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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