(57)【要約】  神経細胞増殖促進作用及び神経突起伸展作用を有し、且つ、中枢神経組織への移行性に優れる経口投与の可能な抗神経変性疾患剤を提供することを課題とし、下記一般式４で表される化合物を有効成分として含有し、神経細胞増殖促進作用、神経突起伸展作用、活性酸素種の消去作用を有する抗神経変性疾患剤を提供することにより上記課題を解決する。【化１】2020067055.tif 000028一般式４において、Ｒ１０とＲ１１は、炭素数２乃至８の互いに同じか異なるアルキル基を表すものとし、アルキル基は直鎖状であっても分岐状であってもよい。ｎは０又は１のいずれかである整数を表し、Ｘ４−は薬学的に許容される適宜の対アニオンを表す。
2020067055.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記一般式４で表される化合物を有効成分として含有し、中枢神経系の神経細胞増殖促進作用と、神経突起伸展作用と、活性酸素種の消去作用とを有する抗神経変性疾患剤。
【化１】
2020067055.tif 000026
（一般式４において、Ｒ１０とＲ１１は、炭素数２乃至８の互いに同じか異なるアルキル基を表すものとし、アルキル基は直鎖状であっても分岐状であってもよい。ｎは０又は１のいずれかである整数を表し、Ｘ４−は薬学的に許容される適宜の対アニオンを表す。）
【請求項２】
上記抗神経変性疾患剤が経口投与剤である請求項１記載の抗神経変性疾患剤。
【請求項３】
一般式４で表される化合物のカチオン部の分子量が５００Ｄａ未満である請求項１又は２記載の抗神経変性疾患剤。
【請求項４】
神経変性疾患がアルツハイマー病、パーキンソン病、認知症、脊髄小脳変性症、脳梗塞及び運動失調症から選ばれる神経変性疾患である請求項１乃至３のいずれかに記載の抗神経変性疾患剤。
【請求項５】
一般式４で表される化合物の対アニオンが、沃素イオン、臭素イオン又は塩素イオンのいずれかである請求項１乃至４のいずれかに記載の抗神経変性疾患剤。
【請求項６】
一般式４で表される化合物が、下記化学式２乃至１１のいずれかで表される化合物である請求項１乃至５のいずれかに記載の抗神経変性疾患剤；
【化２】
2020067055.tif 000027
【請求項７】
一般式４で表される化合物であって、ｎが１である化合物の１種又は２種以上と、ｎが０である化合物の１種又は２種以上を有効成分として含み、ｎが１である化合物のモル数の総和と、ｎが０である化合物のモル数の総和の比が、１０：１乃至１：１０の範囲にある請求項１乃至６のいずれかに記載の抗神経変性疾患剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、中枢神経系の神経細胞増殖促進作用、神経突起伸展作用及び活性酸素種消去作用を有する抗神経変性疾患剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
神経変性疾患は系統的な神経細胞の変性、脱落に基づく神経回路網の破綻により引き起こされる病態であり、神経変性疾患としては、数多くの難病、例えば、アルツハイマー病、パーキンソン病、パーキンソン症候群、脳血管性認知症、前頭側頭葉型認知症、筋萎縮性側索硬化症、進行性核上性麻痺、ハンチントン病、脊髄小脳変性症などが知られている。【０００３】
神経変性疾患の原因である神経変性死のメカニズムには多くの分子群が複雑に関与し、それらの発現、機能異常が生じているものと予想される。そのため、分子病態については鋭意研究がなされるも未だ部分的な解明に留まり、神経変性の根治的な抑制方法は確立されていない。【０００４】
神経変性疾患において病因を取り除く治療に加えて重要なのが、神経回路網を再構築させることである。例えば、アミロイドβペプチドの細胞毒性がその一因と考えられているアルツハイマー病では、神経突起（軸索及び樹状突起）の萎縮とシナプスの減少が、神経機能が損なわれる発端であるが、それらの現象が生起した後でも、部分変性した神経細胞や変性を免れて生き残っている神経細胞を活性化して、神経突起を伸展させ、シナプスを回復できれば、神経機能を回復できるといわれている。【０００５】
アルツハイマー病やパーキンソン病などに代表される神経変性疾患は、神経細胞に変性を来たす重大な疾患であり、これらの疾患やそれに伴う病態や神経機能障害を改善するために、種々の化合物を有効成分とする治療剤が提案されており（特許文献１乃至４参照）、神経突起伸展剤なども提案されている（特許文献５参照）。本出願人も、２３９種類の化合物のスクリーニングに基づき、下記一般式１乃至３で表されるシアニン系色素化合物等が、優れた神経細胞活性化作用と神経突起伸展作用を有することを見出し、新たな抗神経変性疾患剤として提案している（特許文献６）。【０００６】
【化１】
2020067055.tif 000003
(一般式１において、Ｒ１乃至Ｒ３は、互いに同じか異なる脂肪族炭化水素基を表す。Ｘ１−は適宜の対アニオンを表し、ｍは力チオン部の電荷とバランスする電荷となる１又は２のいずれかである整数を表す。)【０００７】
【化２】
2020067055.tif 000004
(一般式２において、Ｒ４乃至Ｒ６は互いに同じか異なる脂肪族炭化水素基を表す。Ｘ２−は適宜の対アニオンを表し、ｍは力チオン部の電荷とバランスする電荷となる１又は２のいずれかである整数を表す。)【０００８】
【化３】
2020067055.tif 000005
(一般式３において、Ｒ７乃至Ｒ９は互いに同じか異なる脂肪族炭化水素基を表す。Ｘ３−は適宜の対アニオンを表し、ｍは力チオン部の電荷とバランスする電荷となる１又は２のいずれかである整数を表す。)【０００９】
しかしながら、上記の色素化合物は、化学構造上の共通点として、３つの複素環（もしくは複素芳香環）がペンタメチン鎖を介して連結されているため、分子量が大きく嵩高い。そのため、中枢神経組織への移行・浸透効率や水溶性、安定性等の製剤面で未だ課題が残っており、剤として想定される使用形態は非経口的な投与に限定されている。【００１０】
今なお多くの神経変性疾患に対して、効果の高い治療法が確立されていない現状に鑑み、医療・製薬業界では継続的な研究開発がおこなわれている。即ち、医療現場では、患者にとって肉体的及び精神的負担の少ない、経口投与可能な薬剤が望まれており、例え皮下や血管内などの全身投与の場合においても、より少ない用量や回数で、中枢神経系の神経細胞に作用する、より効果の高い新規抗神経変性疾患剤の開発が切望されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１１】
【特許文献１】国際公開ＷＯ９７／０３０７０３号パンフレット
【特許文献２】特開平１１−２２８４１７号公報
【特許文献３】特開２００６−１４３７０８号公報
【特許文献４】特開２００６−３２１７３７号公報
【特許文献５】特開２００２−２３４８４１号公報
【特許文献６】国際公開ＷＯ２０１０／０８７３０６号パンフレット
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
本発明は、神経細胞増殖促進作用及び神経突起伸展作用を有し、且つ、本出願人が特許文献６において提案した剤よりも中枢神経組織への移行性に優れ、経口投与の可能な抗神経変性疾患剤を提供することを課題とする。【００１３】
本発明者等は、上記課題を解決するために鋭意研究した結果、下記一般式４で表される化合物が優れた神経細胞増殖促進作用及び神経突起伸展作用、さらには活性酸素種の消去作用を有し、且つ、中枢神経組織への移行性に優れることを見出した。【００１４】
【化４】
2020067055.tif 000006
（一般式４において、Ｒ１０とＲ１１は、炭素数２乃至８の互いに同じか異なるアルキル基を表すものとし、アルキル基は直鎖状であっても分岐状であってもよい。ｎは０又は１のいずれかである整数を表し、Ｘ４−は薬学的に許容される適宜の対アニオンを表す。）【００１５】
因みに、上記化合物は、本出願人が特許文献６で開示・提案した抗神経変性疾患剤の代表的な有効成分であるところの下記化学式１で表されるシアニン系色素（以下、「ＮＫ−４」という。）（一般式１で表される化合物でもある。）とほぼ同等かそれ以上の神経細胞増殖促進作用と神経突起伸展作用を有しながら、分子量が小さく、中枢神経組織への移行性に優れるという顕著な特徴を有する化合物である。【００１６】
【化５】
2020067055.tif 000007
【００１７】
上記化学式１で表される化合物ＮＫ−４は、多数の色素化合物からなるライブラリーを各種の評価系を用いてスクリーニングした結果得られた、いわば厳選された化合物であり、神経細胞増殖促進作用及び神経突起伸展作用に関し、これを上回る、乃至は、匹敵する効果を有する化合物は他に存在しないと考えられてきた。ところが、意外なことに、一般式４で表わされる化合物は、ＮＫ−４より低分子でありながら、ＮＫ−４の主要な作用である神経細胞増殖促進作用及び神経突起伸展作用をＮＫ−４とほぼ同等もしくはそれ以上に有しており、加えて、特許文献６で開示した化合物群に見られない異質の優れた特性、即ち、脳などの中枢神経組織への移行性に優れるという特性を有するとともに、さらには、神経細胞が酸化的なストレスに曝された際に、細胞内において活性酸素種の産生を抑制するという特性を有している。一般式４で表される化合物が、このような種々の優れた特性を有しているということは本発明者らが初めて見出した知見であり、この知見に基づき、本発明者らは本発明を完成した。
【課題を解決するための手段】
【００１８】
本発明は、下記一般式４で表される化合物を有効成分として含有し、中枢神経系の神経細胞増殖促進作用及び神経突起伸展作用、並びに活性酸素種の消去作用とを有する抗神経変性疾患剤を提供することによって上記課題を解決するものである。【００１９】
【化６】
2020067055.tif 000008
（一般式４において、Ｒ１０とＲ１１は、炭素数２乃至８の互いに同じか異なるアルキル基を表すものとし、アルキル基は直鎖状であっても分岐状であってもよい。ｎは０又は１のいずれかである整数を表し、Ｘ４−は薬学的に許容される適宜の対アニオンを表す。）
【発明の効果】
【００２０】
本発明の抗神経変性疾患剤は、経口的又は非経口的に投与することにより、酸化的ストレスから神経細胞を保護すると共に、神経細胞の増殖や神経突起の伸展を促進することで、神経変性疾患の治療、緩和、予防に有利に利用できる。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
１．用語の定義
本明細書において以下の用語は以下の意味を有している。
【００２２】
＜神経突起／神経突起伸展作用＞
本発明でいう神経突起とは、神経の細胞体から伸びる軸索及び樹状突起をいう。また、神経突起伸展作用とは、神経細胞を活性化して軸索及び／又は樹状突起を伸展させる作用をいい、神経突起の萎縮や減少の抑制作用、神経細胞間のシナプス形成の促進作用やシナプスの減少を抑制する作用を含む。
【００２３】
＜神経変性＞
本発明でいう神経変性とは、神経細胞、とりわけ、中枢神経系の神経細胞の機能低下、死滅や減少（脱落）をいい、神経突起の萎縮や減少、シナプスの減少、グリア細胞の機能低下、死滅や減少、網膜細胞の死滅や変性を含む。
【００２４】
２．本発明の抗神経変性疾患剤の有効成分と態様
本発明の抗神経変性疾患剤は、下記一般式４で表される化合物を有効成分とする。
【００２５】
【化７】
2020067055.tif 000009
【００２６】
一般式４において、Ｒ１０とＲ１１は、炭素数２乃至８の互いに同じか異なるアルキル基を表すものとし、アルキル基は直鎖状であっても分岐状であってもよい。ｎは０又は１のいずれかである整数を表す。
【００２７】
一般式４において、Ｘ４−は薬学的に許容される適宜の対アニオンを表し、通常、例えば、弗素イオン、塩素イオン、臭素イオン、沃素イオン、過塩素酸イオン、過沃素酸イオン、六弗化燐酸イオン、六弗化アンチモン酸イオン、六弗化錫酸イオン、燐酸イオン、硼弗化水素イオン、四弗硼素酸イオンなどの無機酸アニオンや、チオシアン酸イオン、ベンゼンスルホン酸イオン、ナフタレンスルホン酸イオン、ナフタレンジスルホン酸イオン、ｐ−トルエンスルホン酸イオン、アルキルスルホン酸イオン、ベンゼンカルボン酸イオン、アルキルカルボン酸イオン、トリハロアルキルカルボン酸イオン、アルキル硫酸イオン、トリハロアルキル硫酸イオン、ニコチン酸イオン、アスパラギン酸イオンなどの有機酸アニオンから選択されるが、とりわけ、塩素イオン、臭素イオン、沃素イオンが有利に利用されうる。
【００２８】
一般式４で表される化合物としては、より具体的には、例えば、化学式２乃至１１で表される化合物を例示することができる。
【００２９】
【化８】
2020067055.tif 000010
【００３０】
上記、化学式２乃至６で表される化合物（以下、順に「ＮＫ−５」、「ＮＫ−３６」、「ＮＫ−３７」、「ＮＫ−４４」及び「ＮＫ−４５」という場合がある。）は、一般式４においてｎ＝１に相当するトリメチン系シアニン色素であり、化学式３乃至６で表される化合物は、化学式２で表される化合物ＮＫ−５の類縁体である。例えば、化学式３（ＮＫ−３６）及び化学式４（ＮＫ−３７）は、ＮＫ−５の対アニオンである沃素イオンが、其々、臭素イオン及び塩素イオンに置き換わった化合物であり、化学式５（ＮＫ−４４）及び化学式６（ＮＫ−４５）で表される化合物は、ＮＫ−５のＮ−アルキル鎖が、其々、エチル基からｎ−ブチル基及びイソペンチル基に置き換わった化合物である。
【００３１】
同様に、化学式７乃至１１で表される化合物（以下、順に「ＮＫ−６」、「ＮＫ−１４９６」、「ＮＫ−１４９５」、「ＮＫ−１０７４５」及び「ＮＫ−１４８６」という場合がある。）は、一般式４においてｎ＝０に相当するモノメチン系シアニン色素であり、化学式８乃至１１は化学式７で表される化合物ＮＫ−６の類縁体である。上記と同様に、化学式８及び化学式９で表される化合物は、ＮＫ−６の対アニオンである沃素イオンが、其々、臭素イオン及び塩素イオンに置き換わった化合物であり、化学式１０（ＮＫ−１０７４５）及び化学式１１（ＮＫ−１４８６）は、ＮＫ−６のＮ−アルキル鎖が、其々、エチル基からｎ−ブチル基及びイソペンチル基に置き換わった化合物である。
【００３２】
なお、本明細書中のＮＫで始まる化合物番号（以下、「ＮＫ番号」という。）に対応する化合物の構造は、例えば、『感光色素表』、感光色素研究所発行（１９６９年）や、『ケミカル  アブストラクト  インデックス  ガイド（ＣＨＥＭＩＣＡＬ  ＡＢＳＴＲＡＣＴ  Ｉｎｄｅｘ  Ｇｕｉｄｅ）（Ｎ−Ｚ）』、１５３１Ｇ乃至１５３６Ｇ頁（１９９４年）などにも記載されている。また、以降に記載する実験結果には、本明細書中の化学式番号とＮＫ番号を併せて記した。
【００３３】
また、これら化合物の合成方法は、例えば『感光色素−その不思議な作用と多彩な機能−』、産業図書株式会社発行、２４乃至３０頁（１９９７年）や、『ザ  ケミストリー  オブ  シンセティック  ダイズ（Ｔｈｅ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  Ｄｙｅｓ）』、アカデミックプレス社発行、第２巻、１１４３頁（１９５２年）及び同書第４巻、２１２頁（１９７１年）などにも記載されている。
【００３４】
一般式４で表される化合物は、神経細胞に対する増殖促進作用、神経突起伸展作用を有し、酸化刺激により細胞内に誘発される活性酸素種（以下、単に「ＲＯＳ」という場合がある。）から神経細胞を保護して細胞死や神経突起の萎縮を抑制する作用を有しているので、本発明の抗神経変性疾患剤の有効成分として望ましい。Ｒ１０及びＲ１１で表されるアルキル基の鎖長は、通常、炭素数が２乃至８の範囲が利用されるが、炭素数２乃至５が好ましく、２乃至４がより好ましい。
【００３５】
神経細胞増殖促進作用、神経突起伸展作用、及びＲＯＳ消去作用の強度の点からは、ＮＫ−５（化学式２）及びその類縁体（化学式３乃至６）がより望ましい。水溶性、脳移行性、製剤化の容易性などを考慮すると、ＮＫ−５（化学式２）及びその類縁体（化学式３乃至６）並びにＮＫ−６（化学式７）及びその類縁体（化学式８乃至１１）が特に望ましい。さらに安定性や効果の持続性に重点を置く場合には、ＮＫ−６（化学式７）及びその類縁体（化学式８乃至１１）がとりわけ有利に利用されうる。
【００３６】
上記の通り、一般式４で表される化合物群は、其々の化合物が複数の生理的及び／又は化学的作用を有し、その作用強度や化学的性質が個々に異なるため、化合物の作用スペクトラムや物性に応じて２種以上の化合物を組み合わせることで、対象疾患に合わせた、より好ましい効果を発揮させることも随意である。例えば、経口投与製剤を設計するにあたっては、其々の作用と安定性の両面を勘案し、作用強度の強い化合物と安定性の高い別の化合物を選択し、任意の濃度範囲で適宜混合することでより効果の高い剤とすることができる。例えば、一般式４においてｎ＝１の場合に相当するＮＫ−５（化学式２）に代表されるトリメチン系色素と一般式４においてｎ＝０の場合に相当するＮＫ−６（化学式７）に代表されるモノメチン系色素を混合製剤とする場合、所望の効果が得られる限りにおいて、その混合比率に特に制限は無いが、トリメチン系色素とモノメチン系色素の配合割合は、通常、モル比で１：１０乃至１０：１が好適に利用される。
【００３７】
本発明の抗神経変性疾患剤の有効成分として使用する一般式４で表される化合物は、その由来や製法に制限はない。
【００３８】
本発明の抗神経変性疾患剤は、有効成分として、一般式４で表される化合物、望ましくは、化学式２乃至１１のいずれかで表されるトリメチン系シアニン色素及び／又はモノメチン系シアニン色素を、１種又は２種以上含有してなる。
【００３９】
本発明の抗神経変性疾患剤は、必要に応じて、有効成分である一般式４で表される化合物に加えて、製剤学的に許容される食品分野、化粧品分野、医薬品分野、医薬部外品分野で使用される成分の１種又は２種以上を配合した経口もしくは非経口製剤の形態で提供される。
【００４０】
製剤学的に許容される成分としては、例えば、添加剤、賦形剤、崩壊剤、滑沢剤、結着剤、安定化剤、界面活性剤、防腐剤（抗菌剤）、香料、増粘剤、抗酸化剤、キレート剤、ビタミン類、アミノ酸類、水性媒体、糖質、甘味剤、水溶性高分子、ｐＨ調整剤、発泡剤、医薬品・医薬部外品・化粧品・食品用の添加剤、医薬用・医薬部外品用の有効成分など例示することができ、これらの成分の１種又は２種以上を適宜組み合わせて配合し、目的とする剤型に応じて、常法により製造すればよい。
【００４１】
また、本発明の抗神経変性疾患剤は、一般式４で表される化合物以外の物質を有効成分とする神経突起伸展剤との併用や、神経変性疾患やそれに起因する病態や神経機能障害の治療剤との併用も有利に実施できる。これらの薬剤は、本発明の有効成分と混合剤の形態で投与してもよいし、個々の製剤を別々に投与することもできる。
【００４２】
本発明の抗神経変性疾患剤の投与経路に特に制限はなく、患者の肉体的及び精神的負担に配慮して、好ましくは経口製剤の形態で提供されるが、より高い効果が求められる場合には、非経口用の注射用の製剤などの形態で提供されるのも随意である。有効成分である一般式４で表される化合物は、対象とする投与製剤の組成やその使用目的を勘案して、原料の段階から製品が完成するまでの工程で配合すればよい。その方法としては、例えば、混和、撹拌、混捏、造粒、溶解、融解、分散、懸濁、乳化、逆ミセル化、ホットメルト、浸透、晶出、散布、塗布、付着、噴霧、被覆（コーティング）、注入、浸漬、固化、担持などの１種又は２種以上の方法が適宜に選ばれる。
【００４３】
本発明の抗神経変性疾患剤は、上述したとおり、経口摂取用の組成物の形態で提供することが可能である。その場合の剤形に特に制限はなく、固状、粉末、顆粒、錠剤、液状、シラップ、ペースト、乳液、カプセル、フィルム等の形態で摂取してもよく、通常の飲食品に混合して摂取することも随意である。
【００４４】
注射用製剤などの非経口用の製剤の場合、対象となる疾患や症状などに応じて、通常、パイロジェンを含まない水性媒体に溶解して、皮内、皮下、筋肉内、体腔内（胸腔内、腹腔内など）、血管内又は脳内（脊髄内を含む）へ投与されるので、製剤の形態としては、乾燥製剤であってもよく、液剤であってもよい。乾燥製剤の場合は、使用時に、注射用の精製水、生理食塩水、ブドウ糖液などの水性媒体に溶解して使用すればよい。液剤の場合は、そのまま投与してもよく、輸液、灌流液、腹膜透析液などに添加して使用してもよい。また、溶媒への溶解性や水性媒体への溶解性に問題のある場合や、徐放性の製剤を調製する場合には、両親媒性溶媒、油性基材や乳化剤などを使用して、有効成分の溶媒への溶解性を高めることも随意である。また、リポソームなどに封入して投与することも随意である。
【００４５】
また、本発明の抗神経変性疾患剤は、経口剤、注射剤以外にも、ハップ剤や経肺用の吸飲噴霧剤などの形態で使用することもでき、皮下などの体内に埋め込む徐放製剤の形態で使用することもできる。また、神経変性疾患を発症したペットをはじめとするヒト以外の動物の治療や、神経変性症に伴う病態や神経機能障害の予防剤乃至治療剤として使用することも随意である。
【００４６】
このようにして製造される本発明の抗神経変性疾患剤は、長期間連用しても、重篤な副作用もなく安全な製剤である。
【００４７】
本発明の抗神経変性疾患剤は、対象とする神経変性疾患、その病態や症状に応じて、毎日乃至１日以上の間隔をおいて、一日に一回乃至複数回に分けて一日あたりの所定量を摂取又は投与すればよい。一日当たりの摂取又は投与量は、所期の作用・効果が得られる量であれば特に制限はなく、通常、経口摂取の場合、一般式４で表される化合物を合計で、０．０２ｍｇ／ｋｇ・体重／日以上が望ましく、０．２乃至５０ｍｇ／ｋｇ・体重／日がより望ましく、１乃至１０ｍｇ／ｋｇ・体重／日が特に望ましい。一方、静脈内投与（点滴を含む）、皮下乃至腹腔内投与の場合、一般式４で表される化合物を合計で、０．００２ｍｇ／ｋｇ・体重／日以上が望ましく、０．０２乃至５ｍｇ／ｋｇ・体重／日がより望ましく、０．１乃至１ｍｇ／ｋｇ・体重／日が特に望ましい。一日当たりの摂取又は投与量が指定量の下限値未満であると、所期の効果が発揮されず、上限値を超えても摂取量に見合う効果が発揮されない場合がある。なお、本発明の抗神経変性疾患剤の活性酸素種の除去作用を期待して投与する場合には、上記投与量よりも増量して投与することも随意である。また、本発明の抗神経変性疾患剤の投与期間は、対象とする疾患、病態乃至症状に応じて調整すればよく、急性疾患の場合には症状が改善乃至消失するまで投与すればよく、認知症などのような慢性疾患の場合には、症状の改善乃至消失が認められた場合でも、投与を継続することが望ましい。
【００４８】
本発明の抗神経変性疾患剤は、脳や神経細胞を傷害因子から保護して変性を抑制すると共に、神経細胞を活性化し、神経突起の伸展促進や萎縮の抑制、神経細胞の生存延長や変性を抑制することもできるので、神経変性疾患、とりわけ、中枢神経の変性に起因する疾患を治療、緩和または予防することができる。神経変性疾患とは、神経細胞の変性を伴う疾患全てを包含し、神経細胞の由来としては中枢神経（例えば、脳神経、脊髄神経など）及び／又は末梢神経（例えば、自律神経系（例えば、交感神経、副交感神経など）、運動神経系、知覚神経系）を含み、その病因によって限定されるものではない。
【００４９】
本発明の抗神経変性疾患剤の対象として好ましい該神経変性疾患は、例えば、アルツハイマー病、パーキンソン病、パーキンソン症候群、ハンチントン病、老年性認知症、脊髄小脳変性症、筋萎縮性側索硬化症、脱髄性疾患（例えば、多発性硬化症など）、脳血管障害（例えば、脳卒中、脳梗塞（例えば、脳血栓、脳塞栓など）、一過性脳虚血発作、脳出血（例えば、高血圧性脳内出血、クモ膜下出血など）など）・脳腫瘍・外傷性ショック・頭部損傷及び／又は脳脊髄外傷（例えば、脳挫傷など）に伴う神経機能障害、感染症に伴う脳脊髄疾患（例えば、髄膜炎、インフルエンザ脳炎・脳症、クロイツフェルト−ヤコブ病、エイズ脳症による認知症など）、てんかんなどの中枢神経系の神経変性に由来する疾患であり、より好ましくは、例えば、アルツハイマー病、パーキンソン病、パーキンソン症候群、筋萎縮性側索硬化症に伴う神経機能障害、脳血管障害、一過性脳虚血発作などの虚血性脳疾患である。
【００５０】
さらに、本発明の抗神経変性疾患剤は、神経細胞を活性化し、神経突起を伸展させ、シナプスの形成を促進するなどにより、神経機能障害をも治療することができる。したがって、本発明の抗神経変性疾患剤は、神経細胞保護剤、神経細胞活性化剤、神経突起伸展剤、神経突起萎縮抑制剤、プルキンエ細胞変性・脱落抑制剤、神経変性疾患に伴う病態（例えば、振戦、固縮、無動、寡動、動作緩慢、姿勢反射障害、自律神経障害、突進現象、歩行障害、うつ、記憶障害、筋萎縮、筋力低下、上・下肢機能障害、構音障害、嚥下障害、呼吸障害、しびれ及び麻痺など）の治療剤、神経機能障害治療剤などとして有利に使用することができる。なお本発明でいう神経変性疾患や神経機能障害の治療とは、神経変性に起因する病態や機能障害を治癒の方向へ導く、いわゆる治療に加え、悪化を抑制し病態の進行をとどめる進展防止、さらには疾患の発症そのものの予防も含む。
【００５１】
さらに、本発明の抗神経変性疾患剤は、ヒドロキシラジカルをはじめとする生体内で発生するフリーラジカルを効果的に低減することができる。さらには、細胞内及び／又は組織中に移行することで代謝活動により産生されるＲＯＳを随時消去することができるため、細胞内器官の酸化傷害蓄積を最小限に留め、細胞体の機能を良好に保持することができ、脳内の神経や血管などの組織はいうまでもなく、脳以外の血管や臓器における、虚血後の再灌流、炎症性疾患（免疫疾患、アレルギー、腫瘍などを含む）、感染症、薬物、放射線或いは物理的な刺激などにより発生するフリーラジカルや過酸化脂質に起因するといわれている各種疾患や病態の予防剤、治療剤として有利に利用することができる。より具体的には、例えば、上記神経変性疾患の予防・治療剤としてだけでなく、脳保護剤、脳（神経細胞、血管内皮細胞）の酸化的障害抑制剤、虚血性脳障害抑制剤、脳梗塞巣進展抑制剤、脳浮腫抑制剤、遅発性神経死抑制剤、脳機能正常化剤、酸化ストレス抑制剤、抗潰瘍剤、血糖上昇抑制剤、白内障や角膜障害などの眼性疾患の予防・治療剤、移植臓器保存剤や移植組織（皮膚を含む）・臓器の壊死防止剤、急性腎不全・薬物などによる腎障害、皮膚組織障害、肺障害、肝繊維化、化学物質、エンドトキシン、熱傷などによる皮膚組織の機能の障害、虚血などによる肝障害、脊髄損傷、動脈などの血管壁障害、心筋などの筋肉障害、尿細管間質障害などの各種臓器の障害の治療・予防剤、放射線障害予防剤・治療剤、抗腫瘍剤、腫瘍転移抑制剤、細胞障害マーカー抑制剤、心筋炎、膵臓炎、腸炎、関節、アレルギーをはじめとする各種組織や臓器の炎症性疾患やそれに伴う組織障害の予防・治療剤、視細胞障害、視神経障害、網膜疾患、聴覚細胞障害、聴覚神経障害などの感覚細胞、感覚神経或いは感覚器の障害の抑制剤、農薬や有機溶媒などによる薬物中毒の予防・治療剤、カルシウム・ナトリウム交換系阻害剤、疼痛や掻痒の予防・治療剤、プロテインキナーゼ刺激剤、ミトコンドリア脳筋症予防・治療剤、動脈閉塞・狭窄予防・治療剤、血液脳関門破綻抑制剤、薬物依存症治療剤、アポトーシス抑制剤、臓器や組織における過酸化脂質生成抑制剤、スーパーオキシド、ヒドロキシラジカル、ペルオキシラジカルなどのラジカルスカベンジャーなどとしても有利に利用することができる。
【００５２】
以下、実験により本発明をさらに詳細に説明する。なお実験結果を示す各表においては、本明細書における化学式番号とＮＫ番号との対応を併せて示した。
【００５３】
＜実験１：神経細胞に対する作用＞
神経細胞は、栄養飢餓や活性酸素による傷害に対して非常に脆弱なことが知られている。神経細胞の増殖や分化を促進する物質には神経変性疾患による神経細胞死を抑制する効果が期待でき、疾患の治療薬候補となり得ることから、神経系のモデル細胞であるＰＣ１２細胞に対して、増殖促進作用及び神経突起伸展作用を有する化合物の探索試験を特許文献６に開示された方法に準じて以下のように実施した。
【００５４】
＜実験１−１：神経細胞増殖促進作用及び神経突起伸展作用を有する色素化合物の探索１＞
本発明者等が特許文献６で開示している通り、化学式１で表されるＮＫ−４をはじめとするいくつかのシアニン色素は神経細胞増殖促進作用及び神経突起伸展作用を有しているが、より生体利用率の高い有効な薬剤を開発する目的のもと、ＮＫ−４を陽性対照として探索を行った。神経細胞のモデルとしては、ヒトの神経細胞変性の研究に好適なモデルとして汎用されている、ラット副腎褐色細胞腫由来のＰＣ１２細胞のＮＧＦ（神経増殖因子）高感受性株（以下、「ＰＣ１２−ＨＳ細胞」という。国立研究開発法人医薬基盤・健康・栄養研究所ＪＣＲＢ細胞バンク）を使用した。被験化合物としては、ＮＫ−５（化学式２）、ＮＫ−３６（化学式３）、ＮＫ−４４（化学式５）及び化学式１２乃至１８で表される１０種類のトリメチン系シアニン色素化合物と、モノメチン系シアニン色素であるＮＫ−６（化学式７）を選択した。また、特許文献６に開示されたスクリーニングにおいて、良好な神経細胞増殖促進作用及び／又は神経突起伸展作用が見込まれたエチレン架橋色素２種（化学式１９及び２０）、モノメチン系シアニン色素１５種（化学式２１乃至３５）及びトリメチン系シアニン色素７種（化学式３６乃至４２）も比較対象として再評価した。化学式１２乃至４２を以下に示す。
【００５５】
【化９】
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【００５６】
【化１０】
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【００５７】
【化１１】
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【００５８】
【化１２】
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【００５９】
【化１３】
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【００６０】
＜試験標品＞
試験に供したシアニン系色素化合物（いずれも純度９７質量％以上、株式会社林原製造）は、個々にＤＭＳＯ（ＳＩＧＭＡ社販売、商品番号「Ｄ８４１８」）に５ｍｇ／ｍｌの濃度で溶解した後、ＤＭＳＯ耐性膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社販売、商品名「Ｍｉｌｌｅｘ−ＬＧＳ  ＬＬＧ０２５ＳＳ」）で濾過し、遮光して２５℃で保存した。使用時には、１０容積％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）を添加したダルベッコＭＥＭ培地（日水製薬株式会社販売、以下、「Ｄ−ＭＥＭ培地」と略記する。）でさらに希釈して、試験に供した。なお、ＤＭＳＯに溶解した試験標品を、Ｄ−ＭＥＭ培地で、試験に使用する濃度に希釈した場合、そこに含まれる濃度のＤＭＳＯは、以下の各試験系に影響しないことを予め確認した。
【００６１】
以下、ＰＣ１２−ＨＳ細胞に対する細胞増殖促進作用とＮＧＦ存在下の神経突起伸展作用を其々評価した。
【００６２】
＜評価法Ａ：神経細胞増殖促進作用の評価法＞
ＰＣ１２−ＨＳ細胞は、凍結保存した細胞を解凍して、１０容積％ＦＢＳ加Ｄ−ＭＥＭ培地を用いて３７℃、５容積％ＣＯ２インキュベーター内で静置培養して試験に供した（以下、単に「培養」と表現する場合は、３７℃、５容積％ＣＯ２インキュベーター内で静置培養することを表すものとする。）。試験に用いる細胞は、常法により、０．２５質量％トリプシン溶液を用いて剥離し、１０容積％ＦＢＳ加Ｄ−ＭＥＭ培地（以下、「培養培地」という。）で希釈して、コラーゲンコートした９６ウェルプレート（ファルコン社販売、商品名「マイクロテストプレート・細胞培養用、平底」）に、５×１０３個／１００μｌ／ウェルになるように播種し、２４時間培養した（以下、これらの操作を「前培養」と言う。）。その後、上記試験標品を培養培地で希釈し、ウェル内の被験化合物の終濃度が５０ｎｇ／ｍｌになるように各ウェルに被験化合物の希釈溶液を１００μｌずつ添加してさらに３日間培養した。３日目に培養上清を除去し、１０容積％のＡｌａｍａｒ  ｂｌｕｅ試薬（Ｔｒｅｋ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ社販売）を含む培養培地を２００μｌ／ウェルずつ添加し、６時間培養ののち蛍光プレートリーダー（日本モレキュラーディバイス社販売、商品名「ＦｌｅｘＳｔａｔｉｏｎ  ３」）で５４４−５９０ｎｍの蛍光強度を測定した。各被験化合物の細胞増殖促進作用は細胞増殖率（％）で表し、被験化合物を含まない培養培地を１００μｌ／ウェル添加した陰性対照の蛍光強度の値を１００％とした時に、１３０％乃至１６９％の場合をＮＫ−４と同等（「○」）、１７０％以上をＮＫ−４より明確に強い作用（「◎」）と判定して表１に示した。測定は各被験化合物について３点ずつ実施し、平均値を採用した。なお、表１には、後述する評価方法Ｂによる神経突起伸展作用の評価結果も併せて示している。
【００６３】
＜評価法Ｂ：神経突起伸展作用の評価法＞
細胞増殖促進活性の評価（評価法Ａ）の場合と同様に、前培養したＰＣ１２−ＨＳ細胞に、被験化合物の終濃度が５００ｎｇ／ｍｌになるように培養培地で希釈調製した被験化合物（５０μｌ／ウェル）と、同じく培養培地で２０ｎｇ／ｍＬに調整したＮＧＦ（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ社販売、マウス由来、終濃度１０ｎｇ／ｍｌ）（５０μｌ／ウェル）とを加えて、３日間培養した。培養３日目に培養培地を除去し、１０容積％グルタールアルデヒドを１００μｌ／ウェル添加して室温下２０分間静置することで細胞を固定した。陰性対照として培養培地のみで３日間培養したＰＣ１２−ＨＳ細胞をグルタールアルデヒドで同様に固定した。固定した細胞は顕微鏡下で観察し、神経突起伸展の有無を評価した。なお神経突起伸展率（％）は、顕微鏡下で、一視野に約１００個の細胞を含む倍率で細胞を観察し、細胞体（長径）の２倍以上の長さの神経突起を有する細胞数をカウントし、同一視野内にある全細胞数で除し１００倍して求めた。測定は各被験化合物について３点ずつ実施し、神経突起伸展率の平均値が２５乃至４４％の場合を陽性対照としたＮＫ−４と同等（「○」）、４５％以上をＮＫ−４よりも明確に強い作用（「◎」）と判定し、表１に併せて示した。なおこの実験系において、被験化合物を添加せずＮＧＦを添加（終濃度１０ｎｇ／ｍｌ）したときの神経突起伸展率は５％以下であった。
【００６４】
【表１】
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【００６５】
表１に示すスクリーニング結果は、各化合物の至適濃度を考慮していないため、厳密な作用強度の比較はできないが、ＮＫ−５２８（化学式１９）とＮＫ−３６（化学式３）は、特許文献６において抗神経変性疾患剤の有効成分として最も好ましいとされるＮＫ−４と比較して、神経細胞増殖促進作用及び神経突起伸展作用の双方において、同等（「○」）と評価された。また、ＮＫ−５（化学式２）とＮＫ−６（化学式７）は、ＮＫ−４と同等の神経細胞増殖促進作用を示しつつ、ＮＫ−４よりも強い（「◎」）と評価される神経突起伸展作用を示した。逆に、ＮＫ−４と同等の神経突起伸展作用を示しつつ、ＮＫ−４よりも強い神経細胞増殖促進作用を示す（「◎」）と評価される化合物としてＮＫ−４４（化学式５）が見出された。その他の化合物は、どちらか一方、或いは、両方の評価においてＮＫ−４の作用強度に及ばなかったが、ＮＫ−４７８１（化学式１４）及びＮＫ−１０２１４（化学式１６）は、神経突起伸展作用がＮＫ−４を上回る（「◎」）と評価された。このことより、エチレン架橋型のＮＫ−５２８（化学式１９）、モノメチン型のＮＫ−６（化学式７）及びトリメチン型のＮＫ−５（化学式２）、ＮＫ−３６（化学式３）、ＮＫ−４４（化学式５）が神経細胞増殖促進作用と神経突起伸展作用の両作用においてＮＫ−４と同等かそれ以上の作用を示し、抗神経変性疾患剤の有効成分として有用である可能性が示された。なお、これら抗神経変性疾患剤の有効成分としの有用性が示された化合物は、ＮＫ−５２８（化学式１９）を除いて、いずれも一般式４で表される化合物であった。また、化学式１３乃至１７で表されるトリメチン型の化合物も、神経細胞増殖促進作用又は神経突起伸展作用のいずれかにおいては、ＮＫ−４と同等（「○」）又はそれ以上（「◎」）と評価されており、抗神経変性疾患剤の有効成分として有用であると判断される。
【００６６】
＜実験１−２：神経細胞増殖促進作用及び神経突起伸展作用を有する色素化合物の探索２＞
上記の単一重量濃度でのスクリーニング結果（実験１−１）を受けて、ＮＫ−４を含む１１種類の色素化合物を選択し、これらについてモル濃度と作用強度の関連を確認した。試験方法は実験１−１に準じたが、被験化合物の濃度は、評価法Ａ（神経細胞増殖促進作用）は、４０ｎＭ、２００ｎＭ、１，０００ｎＭの３用量、評価法Ｂ（神経突起伸展作用）は、２００ｎＭ、１，０００ｎＭの２用量とした。測定は評価法Ａ、Ｂ共に各被験化合物の各濃度について３点ずつ実施した。評価法Ａの結果は、細胞増殖率（％）として表し、被験化合物を添加しない陰性対照の値を１００％とした時の相対百分率（％）を示した。評価法Ｂは、１視野（約１００個の細胞を含む）の全細胞中で、細胞体（長径）の２倍以上の長さの神経突起を有する細胞数を相対百分率で表し神経突起伸展率（％）とした。なお本実験系において、被験化合物を添加せずＮＧＦのみを添加（終濃度１０ｎｇ／ｍｌ）したときの神経突起伸展率は５％以下であった。
【００６７】
【表２】
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【００６８】
＜神経細胞増殖促進作用＞
表２に示す通り、ＮＫ−５（化学式２）は、低濃度（４０ｎＭ）及び中濃度（２００ｎＭ）においてＮＫ−４（化学式１）と同等の神経細胞増殖促進作用を示した。一方、ＮＫ−６（化学式７）及びＮＫ−３６（化学式３）は、高濃度（１，０００ｎＭ）領域においてやや強い神経細胞増殖促進活性を発揮した。このことより、神経細胞増殖促進作用はＮＫ−４（化学式１）に比べてやや弱いものの、ＮＫ−６（化学式７）及びＮＫ−３６（化学式３）も、ＮＫ−５（化学式２）と同様に神経系の細胞株に対する増殖促進作用があることが確認された。神経細胞増殖促進作用に関し、最も強い活性を示したのはＮＫ−４４（化学式５）で、４０ｎＭの添加濃度で陰性対照の約１．９倍もの細胞増殖が認められた。ＮＫ−４４（化学式５）に関しては、ＮＫ−５（化学式２）と同じく、高濃度領域で若干の増殖抑制が認められたことから、至適濃度がＮＫ−４よりも低い、即ち、活性がＮＫ−４よりも高いことを物語っている。その他、神経細胞増殖促進作用に関し、ＮＫ−４と同等程度の活性を有する化合物としてＮＫ−１０３５８（化学式１７）が、ＮＫ−６やＮＫ−３６よりも若干弱い活性を有する化合物として、ＮＫ−１００８９（化学式１５）、ＮＫ−１０２１４（化学式１６）及びＮＫ−３１３４（化学式１３）が、また殆ど増殖促進作用を示さない化合物として、ＮＫ−１８８３（化学式１２）とＮＫ−４７８１（化学式１４）が確認された。なお、表に示すすべての化合物は、ＰＣ−１２ＨＳ細胞に対して、試験を実施した濃度範囲において顕著な細胞傷害性を示すことはなかった。
【００６９】
＜神経突起伸展作用＞
表２に示す通り、ＮＫ−４（化学式１）よりも神経突起伸展作用が強いものとしてＮＫ−５（化学式２）、ＮＫ−６（化学式７）、ＮＫ−４７８１（化学式１４）及びＮＫ−１０２１４（化学式１６）の４化合物が、ＮＫ−４とほぼ同等の神経突起伸展率を示した化合物として、ＮＫ−３６（化学式３）、ＮＫ−４４（化学式５）及びＮＫ−３１３４（化学式１３）が示された。ＮＫ−４７８１（化学式１４）は、高濃度（１，０００ｎＭ）において非常に強い神経突起伸展作用を示したが、神経細胞増殖促進作用はほぼ陰性対照と同じ程度であった。
【００７０】
ＮＫ−４(化学式１)は強力な神経細胞増殖促進作用と神経突起伸展作用を併せ持つ化合物として２３９種類の化合物ライブラリーの中から厳選された化合物であるが、意外にも、今回新たに探索した低分子生の色素化合物群の中からＮＫ−４に匹敵する、もしくはＮＫ−４の活性を顕著に上回る作用をもつ化合物の存在が明らかとなった。神経細胞増殖促進作用及び神経突起伸展作用の両作用を併せ持つ化合物としては、キノリン骨格を有するトリメチン系色素であるＮＫ−５（化学式２）、ＮＫ−４４（化学式５）、ＮＫ−３６（化学式３）及びモノメチン系色素であるＮＫ−６（化学式７）が有望であり、とりわけＮＫ−５（化学式２）及びＮＫ−４４（化学式５）が、ＮＫ−４を上回る作用の期待できる剤として有利に利用されうることが示され、化学構造的な観点からは、２つのキノリン骨格の４位同士がメチン鎖で連結された基本構造にその可能性が高いと推察された。
【００７１】
＜実験１−３：細胞内ＲＯＳの産生に対する作用＞
前記実験１−１及び実験１−２より、ＮＫ−５（化学式２）及びＮＫ−５類縁体（化学式３及び化学式５）、並びに、ＮＫ−６（化学式７）が強い神経細胞増殖促進作用及び神経突起伸展作用を有することが示されたことより、これら化合物は、神経細胞に対する酸化傷害に対しても有効に作用するかを以下の実験で検証した。即ち、ＰＣ１２−ＨＳ細胞に過酸化水素で酸化刺激を加え、その際に発生する細胞内のＲＯＳを蛍光試薬を用いて定量化し、外的な酸化ストレスを負荷した際に細胞内で発生するＲＯＳの産生抑制作用を評価した。
【００７２】
実験１−１及び実験１−２と同様に前培養したＰＣ１２−ＨＳ細胞に、培養培地で希釈調製した被験化合物を終濃度が１２５、２５０、５００及び１，０００ｎＭになるように添加して２４時間培養した。その後、培養上清を除去し、Ｈａｎｋ´ｓ緩衝液（６０μＭ
ＣａＣｌ２、４００μＭ ＭｇＳＯ４、５００μＭ ＭｇＣｌ２）で細胞を洗浄した後、同緩衝液で５μＭに調製したＲＯＳ検出試薬ＣＭ−Ｈ２ＤＣＦＤＡ（富士フィルム和光純薬工業株式会社販売）を各ウェルに１００μｌずつ添加した。３７℃で３０分間培養して細胞にＣＭ−Ｈ２ＤＣＦＤＡを取り込ませ、ＣＭ−Ｈ２ＤＣＦＤＡを含んだ液を除去した後、Ｈａｎｋ´ｓ緩衝液で細胞を洗浄し、５０μＭ過酸化水素（富士フィルム和光純薬工業株式会社販売）を含むＨａｎｋ´ｓ緩衝液を１００μｌ／ウェル添加してＰＣ１２−ＨＳ細胞を３７℃で２時間刺激した。過酸化水素を含んだ液を除去し、Ｈａｎｋ´ｓ緩衝液２００μｌ／ウェルを添加して蛍光プレートリーダーで細胞内ＲＯＳ産生の指標となる４９２−５２７ｎｍの蛍光強度を測定した。また、蛍光強度測定後に、各ウェルにグルタールアルデヒド２０μｌを添加して細胞を固定し、常法に従い、メチレンブルーの色素取込量を６５０ｎｍの吸光度として測定し、生細胞数の指標とした。細胞当りのＲＯＳ産生量は、各ウェルの蛍光強度（４９２−５２７ｎｍ）を６５０ｎｍの吸光度で除した値を指標とした。陰性対照として被験化合物を含まず過酸化水素のみを添加した細胞から算出した細胞当りのＲＯＳ産生量を１００％とし、被験化合物を添加した際の相対値を求め、各ウェルの細胞当りのＲＯＳ産生率（％）として表３に示した。測定は各被験化合物の各濃度について３点ずつ実施し、平均値を記載した。
【００７３】
【表３】
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【００７４】
表３に示す通り、１２５乃至１，０００ｎＭの濃度範囲においてＮＫ−４（化学式１）は細胞内ＲＯＳ産生に対して何ら抑制的な作用を示さなかった。一方で、ＮＫ−５（化学式２）、ＮＫ−６（化学式７）、ＮＫ−３６（化学式３）、ＮＫ−４４（化学式５）は、過酸化水素刺激で誘導される細胞内ＲＯＳの産生を濃度依存的に抑制した。特にＮＫ−５、ＮＫ−３６については、その作用は強力で、ＮＫ−４４やＮＫ−６に比べても顕著であった。
【００７５】
ＮＫ−４（化学式１）がラジカル消去能を有することは既に公知であるが、上記の通り、同化合物は細胞内ＲＯＳの産生に影響しなかった。その詳細な理由は不明であるが、ＮＫ−５（化学式２）やＮＫ−６（化学式７）などと異なり、活性発現に必要な量が細胞内へ移行できなかったことが一因として考えられる。これは、ＮＫ−４を含む一般式１乃至３で表されるシアニン色素の薬剤利用上の課題を示唆しており、これら化合物は、複素環もしくは複素芳香環の３核構造を有するため、必然的に分子量が大きく、嵩高くなり、細胞や組織への透過性において不利になると考えられる。逆に、実験１−３で強い活性を示した化合物群は、ＮＫ−４と比べ化学構造的に低分子であり、その実験結果はこれら化合物の細胞透過性が良好であることを物語っている。
【００７６】
実験１−１及び実験１−２で示されたように、ＮＫ−５及びその類縁体（ＮＫ−３６、ＮＫ−４４）、並びにＮＫ−６は、ＮＫ−４と同様に細胞傷害性を示さず、ナノモルレベルの濃度範囲において強い神経細胞増殖促進作用と神経突起伸展作用を有していた。一方、実験１−３において、ＮＫ−５及びその類縁体（ＮＫ−３６、ＮＫ−４４）、並びにＮＫ−６は、ＮＫ−４の具有しない作用、即ち、細胞内ＲＯＳの産生抑制作用を併せ持つことが明らかとなり、ＮＫ−５（化学式２）及びその類縁体（ＮＫ−３６（化学式３）、ＮＫ−４４（化学式５））並びにＮＫ−６（化学式７）は、これまでにない新規な特性を持つ抗神経変性疾患剤になりうることが示された。
【００７７】
＜実験２：色素化合物の脳移行性＞
上記実験１において、ＮＫ−５（化学式２）及びその類縁体（ＮＫ−３６（化学式３）、ＮＫ−４４（化学式５））並びにＮＫ−６（化学式７）は、強い神経細胞増殖促進作用と神経突起伸展作用を持ち、尚且つ細胞透過性が良好であると推察された。このことを検証するため、これら色素化合物の血液脳関門透過性に関連する物性指標を実験的並びに理論計算からの予測に基づいて検討した。
【００７８】
＜実験２−１：色素化合物のＬｏｇＰ測定＞
化合物の脳移行性を表す薬理学的な指標としては、脳組織への浸透性を表すＬｏｇＢＢや血液脳関門（以下、「ＢＢＢ」という。）の透過速度を表すＬｏｇＰＳが知られる。これらのパラメーターを化学計算でシミュレーションする際には、幾つかの実測パラメーターをインプットすることにより機械学習が必要とされるが、例えば、『セラピューティック  デリバリー（Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ）』、６巻（第７号）９６１乃至９７１頁（２０１５年）に記載されているように、最も大きく影響する実測パラメーターは、ＬｏｇＰと呼ばれるオクタノール／水分配率であり、ＬｏｇＰが大きいほど脂溶性に優れ、ある一定の範囲で脳組織への浸透性が高まるといわれる。そこで、ＮＫ−５及びＮＫ−６のＬｏｇＰ値を実測し、ＮＫ−４のそれと比較した。
【００７９】
オクタノール/水分配係数（以下、「ＬｏｇＰ」という。）の測定は、『分析化学（ＢＵＮＳＥＫＩ  ＫＡＧＡＫＵ）』、５３巻（９号）９５３頁−９５８頁（２００４年）及び『日本工業規格』、Ｚ７２６０−１０７（２０００年）、「分配係数(１−オクタノール/水)の測定-フラスコ振とう法」に準じて実施した。即ち、適量の被験化合物を１−オクタノール（分配係数測定用、関東化学株式会社販売）に添加し、各試料の飽和１−オクタノール溶液を調製した。この溶液１ｍｌをとり、超純水１ｍｌと混合し、２５℃にて振盪器を用いて１分間に２０回転の速度で５分間振盪した。混合液を、遠心分離機を用いて、２５℃、１５，０００ｒｐｍで１５分間遠心分離し、１−オクタノール層と水層が完全に分離していることを確認した後、互いの層からの混入を防止しながら、両層を５００μｌずつ回収した。回収した溶液中の被検物質濃度は、以下に示すＨＰＬＣ法にて定量し、１−オクタノール層中の被検物質濃度(［Ｃ］ｏ)と水層中の被検物質濃度（［Ｃ］ｗ）から、次式により分配係数を算出し、表４に示した。
【００８０】
【数１】
2020067055.tif 000019
【００８１】
＜検量線用標準溶液の調製＞
各被験化合物２０ｍｇを精密に量り、５０ｍｌの移動相に溶かして４００μｇ／ｍＬの溶液を調製した。この溶液をさらに移動相で希釈して５，０００、２，５００、１，０００、５００、２５０、１００、５０ｎｇ／ｍＬの標準溶液を作製した。
＜試料溶液の調製＞
回収した試料溶液（各５００μｌ）に５倍容量の移動相を加えてよく混合した後、０．４５μｍの有機溶媒耐性フィルターで濾過したものを試料溶液とし、各試料１０μｌをＨＰＬＣに注入して分析した。
【００８２】
＜ＨＰＬＣ分析条件（ＮＫ−４）＞
ＨＰＬＣシステム：ＨＰＬＣプロミネンスＬＣ−２０ＡＤ（島津製作所）
検出器：紫外分光光度検出器ＳＰＤ−Ｍ２０Ａ（島津製作所）
カラム（ＮＫ−４）：ＸＢｒｉｄｇｅＣ８  ５μｍ（Ｗａｔｅｒｓ製)
カラム径×カラム長：４．６×２５０ｍｍ
カラム温度：４０℃
移動相：６０容積部  水、４０容積部  メタノール、０．１容積部  酢酸
流速：０．７ｍＬ／ｍｉｎ
検出波長：７７６ｎｍ
定量範囲：５０−５，０００ｎｇ／Ｌ
【００８３】
＜ＨＰＬＣ分析条件（ＮＫ−５／ＮＫ−６）＞
ＮＫ−４と異なる条件のみ以下に記載した。
カラム：ＣＯＳＭＯＳＩＬ  ５Ｃ８−ＡＲ−３００（ナカライテスク社製）
移動相：７０容積部  アセトニトリル、３０容積部  水、０．１容積部
トリエチルアミン、０．１容積部  酢酸
検出波長：７００ｎｍ（ＮＫ−５）、５８８ｎｍ（ＮＫ−６）
【００８４】
【表４】
2020067055.tif 000020
【００８５】
表４に示される通り、１−オクタノール層へ分配された化合物濃度はＮＫ−５＞ＮＫ−６＞ＮＫ−４の順であり、分配係数ＬｏｇＰも同順であった。このことより、化合物間の相対的な脂溶性、ひいては組織や細胞への浸透性もこの順序であることが推察されることから、実験１−３で示されたＮＫ−５及びその類縁体（ＮＫ−３６、ＮＫ−４４）、並びにＮＫ−６が細胞内への移行性に優れることが化学計算に基づくシミュレーションによっても裏付けられたこととなる。とりわけＮＫ−５については、ＮＫ−４の３０倍以上のＰ値を示していることから、これまでは困難であった経口投与が可能なレベルに到達すると考えられた。本実験の結果は、ＮＫ−５（化学式２）とＮＫ−６（化学式７）が、組織浸透性について、ＮＫ−４（化学式１）に対して顕著な優位性を持つことを物語っている。
【００８６】
＜実験２−２：計算化学による色素化合物の脳浸透性予測＞
上記の通り、化合物の脳移行性を表す薬理学的な指標としては、脳組織への浸透性を表すＬｏｇＢＢやＢＢＢ透過速度を表すＬｏｇＰＳが知られる。これらのパラメーターは、実験動物などの、所謂、「生体」を用いて実験的に取得されるが、その実験手技は難易度が高く、非常に高価、且つ、低スループットである。近年では、計算化学の手法を用いて、これらのパラメーターをコンピューター予測することが可能となり、例えば、『ドラッグ  メタボリズム  アンド  ディスポジション（Ｄｒｕｇ  Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ  ａｎｄ  Ｄｉｓｐｏｓｉｔｉｏｎ）』、３２巻（第１号）１３２乃至１３９頁（２００４年）、『ジャーナル  オブ  ファーマシューティカル  サイエンス（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ）』、９８巻（第１号）１２２乃至１３４頁（２００９年）や『セラピューティック  デリバリー（Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ）』、６巻（第７号）９６１乃至９７１頁（２０１５年）などに記載されるシミュレーションでは、その予測精度も着実に向上している。そこで色素化合物の相対的な脳移行性と脳浸透性をより詳細に推測するために、化学式１、２、５乃至７、１０及び１１で表される７化合物を選択して計算化学的な手法によりＬｏｇＰ（以下、ＬｏｇＰ実測値と区別するために「ｃＬｏｇＰ」という。）とＬｏｇＢＢを算出した。なおこれら７化合物は、全て、対アニオンとして沃素を持つ化合物である。
【００８７】
ｃＬｏｇＰは、実測ＬｏｇＰと同様に、値が大きいほど脂溶性に優れ、脳組織への浸透性が高まることを示す。より具体的な数値範囲としては、例えば、『ファルマシア』、４８巻（第８号）７６１乃至７６６頁（２０１２年）などに記載される通り、中枢神経系薬の創薬における経験則として、ｃＬｏｇＰが１乃至３の範囲にあることが好ましく、２付近であるとき脳浸透性が最適であるといわれる。一方、ＬｏｇＢＢは、原理的には下式で表される分配係数であって、値が大きいほど、血管から脳組織への浸透性が高いことを表す。コンピューター・シミュレーションには、『ＡＤＭＥＷＯＲＫＳ（登録商標）ソフトウエア』（株式会社富士通九州システムズ社販売）を使用した。算定された各色素化合物のｃＬｏｇＰ及びＬｏｇＢＢを表５に示す。なお各物性値のシミュレーションにあたっては、対象化合物のカチオン化窒素と沃素イオンが共有結合していると仮定して構造補正を行った後に計算を実施した。
【００８８】
【数２】
2020067055.tif 000021
【００８９】
【表５】
2020067055.tif 000022
【００９０】
表５に示す通り、ＮＫ−４（化学式１）、ＮＫ−５（化学式２）、ＮＫ−６（化学式７）の３化合物を相対比較した場合、ｃＬｏｇＰ値は、ＮＫ−５＞ＮＫ−６＞ＮＫ−４の順で、表４に示すＬｏｇＰ実測値と同様の傾向を示した。これら３化合物以外では、キノリン環に付加したＮ-アルキル基として、ｎ−ブチル基もしくはイソペンチル基を有する化合物（化学式５、６、１０及び１１）が、高いｃＬｏｇＰ値を示した。上記の通り中枢神経系薬として好ましいｃＬｏｇＰ値は１乃至３といわれるが、ＮＫ−４を除く被験化合物のｃＬｏｇＰ値は概ねその範囲にあることが示された。
【００９１】
同じく表５に示す通り、ＬｏｇＢＢ値に関しては、化合物間の数値差がｃＬｏｇＰほど大きくなかったが、被験化合物の中では、ＮＫ−４（化学式１）が最も脳への浸透性が低いことが推察された。ＬｏｇＢＢにおいて高値を示したのはｃＬｏｇＰの場合と同様に、側鎖アルキル基としてｎ−ブチル基もしくはイソペンチル基を有する化合物（化学式５、６、１０及び１１）であり、キノリン系２核モノメチン及びトリメチンシアニン色素において、キノリンの１位窒素原子に結合する側鎖アルキル基の炭素鎖長が、脳移行性に関連することが示された。計算化学的な代替評価手法は、創薬分野において既に汎用ツールとして利用されているため、その信頼性は高く、上記計算結果は、これら化合物に中枢系薬剤として優れた性能があることを物語っている。
【００９２】
＜実験３：色素化合物のフリーラジカルに対する作用＞
心筋梗塞や脳梗塞に代表される虚血性疾患において、虚血後の血液再灌流時の組織傷害にはＲＯＳの関与が大きい。とりわけ脳組織は、脂質含有量が多いことから、ヒドロキシラジカルやペルオキシラジカルによる酸化傷害に対して感受性が高いことが知られており、これらフリーラジカルによる直接的、及び／又は間接的な神経細胞変性によって脳機能に障害が及ぶ。そこで、本発明の抗神経変性疾患剤の有効成分である色素化合物が、効果的にフリーラジカルを消去する作用を有するか、４種類のモデルラジカルを選択し、それらの消去活性を吸光度法および電子スピン共鳴法（以下、「ＥＳＲ」と略記する。）により測定した。
【００９３】
＜試験標品＞
試験には、実験１で使用した被験化合物の中からＮＫ−４（化学式１）、ＮＫ−５（化学式２）及びＮＫ−６（化学式７）を選択し作用強度を比較した。なお実験３−２乃至実験３−４においては、抗酸化能を有するＬ−アスコルビン酸を陽性対照として用いた。
【００９４】
＜実験３−１：ＤＰＰＨラジカル消去能の測定＞
２，２−ジフェニル−１−ピクリルヒドラジル（以下、「ＤＰＰＨ」という。）は不対電子を持つラジカルで、他の物質の酸化能を持つこと、また、安定で扱いやすいことから、人工のラジカル様物質として抗酸化物質の抗酸化能測定に汎用されている。ＤＰＰＨは抗酸化能を有する物質と反応すると、自身の酸化能を失い、深紫色から無色に変化する性質を持つ。そこで、ＤＰＰＨの呈する深紫色の消失を吸光度法で測定することにより、色素化合物のＤＰＰＨ消去能を検討した。
【００９５】
＜試験標品＞
被験化合物としてＮＫ−４（化学式１）、ＮＫ−５（化学式２）及びＮＫ−６（化学式７）を用い、実験１−１に記載したと同じ方法で被験標品を調製した。た。なお実験３−１（ＤＰＰＨラジカル消去能の測定）のみ、色素化合物の構造と活性の相関を確認するために化学式４３で表されるＮＫＸ−４０７６を合成し、被験化合物として追加した。
【００９６】
【化１４】
2020067055.tif 000023
【００９７】
ＤＰＰＨ（東京化成工業株式会社販売）をエタノールに溶解して１６７μＭのＤＰＰＨエタノール溶液を調製し、９６穴マイクロプレートに各ウェル９０μｌずつ添加した。ここに、エタノールで段階希釈した被験化合物を各ウェル６０μｌずつ添加して室温で２時間反応させた後に４９０ｎｍの吸光度を測定した。被験化合物を添加していないウェルの吸光度を１００％のラジカル強度として、各濃度の被験化合物を含むウェルのラジカル強度をその相対百分率（％）で示し、その値からＤＰＰＨラジカルの５０％阻害濃度（以下、「ＩＣ５０」と表記する。）を算定した。測定は各被験化合物の各濃度について３点ずつ実施し、平均値で表６に示した。なお、表６には、後述するスーパーオキシド消去能、ヒドロキシラジカル消去能及びペルオキシラジカル消去能の評価結果も併せて示している。
【００９８】
表６に示すように、ＮＫ−４（化学式１）、ＮＫ−５（化学式２）及びＮＫ−６（化学式７）はいずれもＤＰＰＨラジカル消去能を有しており、その強度はＮＫ−５＞ＮＫ−６＞ＮＫ−４の順であった。なお表６には示していないが、化学式４３で表されるＮＫＸ−４０７６のＩＣ５０値は１０，０００μＭ以上と算定され、キノリン骨格を有する同化合物は、実質的にＤＰＰＨラジカル消去能を有さないことが示された。このことより、これら化合物のＤＰＰＨラジカル消去活性に寄与する構造単位は、複素芳香環自体ではなく、複素芳香環と繋がったメチン構造であると推察された。一方、ＩＣ５０値に基づく相対活性は、ＮＫ−５がＮＫ−４の約４倍、ＮＫ−６はＮＫ−４の約２倍であり、ＤＰＰＨラジカルの消去能は分子内にメチン鎖の存在を必須の要件とするものの、キノリン環を繋ぐメチン鎖の長さとは相関せず、分岐を有さない直鎖メチン構造が有利に働くと推察された。
【００９９】
＜実験３−２：スーパーオキシド消去能の測定＞
スーパーオキシドは酸素分子の分子軌道の２つのπ*軌道（反結合性のπ軌道）に３つの電子が入った状態のＲＯＳであり、ラジカルとしての反応性とアニオンの性質を持つ。酸素分子の一電子還元で生成するが、生体内ではミトコンドリア呼吸鎖電子伝達系、キサンチン酸化酵素、ＮＡＤＨ酸化酵素などによって生成され、スーパーオキシドジスムターゼ（以下、「ＳＯＤ」という。）により消去される。本実験では、ヒポキサンチンとキサンチンオキシダーゼを反応させて生成するスーパーオキシドをスピントラップ剤である５，５−ジメチル−４−フェニル−１−ピロリンＮ−オキシド（以下、「４ＰＤＭＰＯ」という。）で捕捉し、被験化合物によるＳＯＤ様活性をＥＳＲにて測定した。
【０１００】
具体的には、ガラス試験管に１ｍＭに調製したヒポキサンチン（富士フィルム和光純薬工業株式会社販売）の水溶液を５０μｌ、ＤＭＳＯを３０μｌ、４．５Ｍの４ＰＤＭＰＯ（富士フィルム和光純薬工業株式会社販売）を５０μｌ添加・撹拌し、さらに被験化合物を５０μｌ添加した後、０．４ユニット／ｍＬのキサンチンオキシダーゼ溶液（Ｒｏｃｈｅ販売）を５０μｌを添加してボルテックスで１０秒間混合した。キサンチンオキシダーゼの添加から４０秒後に反応混合液のＥＳＲスペクトルを測定し、色素化合物を添加しない場合を１００％のラジカル強度として、被験化合物のラジカル消去能をその相対パーセントで示した。測定は各被験化合物の各濃度について３点ずつ実施し、それらの平均値を用いてＩＣ５０を算出して表６に併せて示した。なお、陽性対照には抗酸化物質として知られるアスコルビン酸（富士フィルム和光純薬工業株式会社販売）を用いた。また、この時のＥＳＲ測定条件は後述する。
【０１０１】
表６に示す通り、被験化合物はいずれもスーパーオキシドラジカルの消去能を有しており、ＮＫ−６は、強力なラジカル消去剤として知られるアスコルビン酸と同等の能力を有していた。被験化合物のＩＣ５０値を比較した場合、ＮＫ−５及びＮＫ−６は、ＮＫ−４に比べて２倍以上のスーパーオキシドラジカル消去能を示し、これら３化合物の消去活性の相対強度はＤＰＰＨラジカルに対する消去能の場合とほぼ同様であった。
【０１０２】
＜実験３−３：ヒドロキシラジカル消去能の測定＞
ヒドロキシラジカルはフリーラジカルの一種で、生体内では極めて反応性が高い、即ち組織傷害性が高いことが知られている。ヒドロキシラジカルは、生体内では過酸化水素への紫外線の照射や、過酸化水素と二価の鉄化合物との反応（フェントン反応）によって生成され、ベータカロチン、ビタミンＥ、尿酸、リノール酸、システイン、フラボノイド、グルタチオン等の抗酸化物質により消去される。本実験では、フェントン反応によりジエチレントリアミン−Ｎ，Ｎ，Ｎ´，Ｎ´´，Ｎ´´−五酢酸（ＤＴＰＡ）から生じるヒドロキシラジカルを４ＰＤＭＰＯでトラップし、ＥＳＲにて測定した。
【０１０３】
具体的には、ＤＭＳＯに溶解した色素化合物を、各々精製水で希釈し被験化合物溶液とした。ガラス試験管に１ｍＭ過酸化水素水５０μｌと３５６ｍＭの４ＰＤＭＰＯ  ５０μｌを加え、続いて被験化合物溶液５０μｌを添加した。そこに１ｍＭ  ＦｅＳＯ４と１ｍＭ  ＤＴＰＡ（富士フィルム和光純薬工業株式会社販売）を含む水溶液５０μｌを加え、ボルテックスミキサーで１０秒間混合した後、正確に４０秒間反応させた反応液をＥＳＲ測定に使用した。色素化合物を添加しない場合を１００％のラジカル強度として、被験化合物のラジカル消去能をその相対パーセントで示した。測定は各被験化合物の各濃度について３点ずつ実施し、それらの平均値を用いてＩＣ５０を算出して表６に併せて示した。なお陽性コントロールには実験３−２の場合と同様にＬ−アスコルビン酸を用いた。また、この時のＥＳＲ測定条件は後述する。
【０１０４】
表６に示すように、被験化合物はいずれもヒドロキシラジカルの消去能を有し、ＩＣ５０値をヒドロキシラジカル消去能の強度指標とした場合、ＮＫ−５（化学式２）が最も強い消去活性を有しており、続いてＮＫ−４（化学式１）、ＮＫ−６（化学式７）の順であった。対照として用いたアスコルビン酸は強力な天然抗酸化物質として知られるが、ＮＫ−４及びＮＫ−５は、Ｌ−アスコルビン酸よりも顕著に高い活性を有することが示された。またＮＫ−６についても、アスコルビン酸には劣るものの、ヒドロキシラジカル消去能を有していた。
【０１０５】
＜実験３−４：ペルオキシラジカル消去能の測定＞
フリーラジカルの一種であるペルオキシラジカルは、不飽和脂肪酸とヒドロキシラジカルの反応によって生じる生体内脂質過酸化物の一種である。脳などの脂質含有率が高い臓器は、ペルオキシラジカルに対する感受性が強いことが知られており、当該ラジカルを効果的に消去する作用は、酸化ストレスが病態形成に関与する神経変性疾患において非常に重要である。２，２´−アゾビス（２−アミノジプロパン）二塩酸塩（以下、「ＡＡＰＨ」という。）の加熱により生じるペルオキシラジカルは、生体由来ラジカルのモデルとされるため、本実験では、被験化合物がペルオキシラジカルを消去する能力をＥＳＲにより測定した。
【０１０６】
具体的には、ＤＭＳＯに溶解した色素化合物を、各々０．１Ｍ  リン酸緩衝液で希釈して被験化合物溶液とした。０．１Ｍ  リン酸緩衝液（ｐＨ７．４）５０μｌに、７２０  ｍＭ  ＤＭＰＯ  ５０μｌ、被験化合物溶液５０μｌ、１００ｍＭ  ＡＡＰＨ（富士フィルム和光純薬工業株式会社販売）５０μｌを加え、ボルテックスミキサーで１０秒間混合した後、３７℃の恒温槽中で２分５０秒間反応させた反応液を、反応終了３０秒後にＥＳＲ測定に使用した。色素化合物を添加しない場合を１００％のラジカル強度として、被験化合物のラジカル消去能をその相対パーセントで示した。測定は各被験化合物の各濃度について３点ずつ実施し、それらの平均値を用いてＩＣ５０を算出して表６に示した。なお陽性コントロールには実験３−２及び実験３−３と同様にＬ−アスコルビン酸を用いた。また、この時のＥＳＲ測定条件は後述する。
【０１０７】
【表６】
2020067055.tif 000024
【０１０８】
表６に示す通り、ＮＫ−４（化学式１）、ＮＫ−５（化学式２）及びＮＫ−６（化学式７）はいずれもペルオキシラジカルの消去能を有していたが、ＩＣ５０値をラジカル消去能の指標とした場合、ＮＫ−５が最も強い消去活性を有しており、続いてＮＫ−４、ＮＫ−６の順であり、この傾向はヒドロキシラジカルの消去能と相関していた。
【０１０９】
＜ＥＳＲ測定法＞
上記ＥＳＲ測定の詳細条件について本項に記す。各種ラジカル測定用の反応液をＥＳＲ用扁平石英セルにとり、ＥＳＲ装置（日本電子株式会社販売、商品名「Ｆｒｅｅｒａｄｉｃａｌ  Ｍｏｎｉｔｏｒ  ＪＥＳ−ＦＲ３０」）にてＥＳＲスペクトルを測定した。各ラジカル由来のＥＳＲスペクトルを測定する際には、被験化合物溶液に代えて、スーパーオキシド及びヒドロキシラジカル測定の場合には精製水を、ペルオキシラジカル測定の場合には０．１Ｍ  リン酸緩衝液を反応液に混合して、被験化合物を測定した場合と同様に反応させた。この時の其々のラジカルに対応するＥＳＲスペクトルのピーク高を１００として、溶液を加えて反応させたときの相対強度を求め、ラジカル残存率（％）として表した。この時のＥＳＲ測定パラメーターは以下のように設定した。
＜測定条件＞
Ｐｏｗｅｒ：４ｍＷ
Ｍａｇｎｅｔｉｃ  ｆｉｅｌｄ：３３５．５ｍＴ
Ｓｗｅｅｐ  ｔｉｍｅ：２ｍｉｎ
Ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ  ｗｉｄｔｈ：０．０７９ｍＴ
Ａｍｐｌｉｔｕｄｅ：７９（ヒドロキシラジカルの測定の場合）
１２５（ペルオキシラジカルの測定の場合）
２５０（スーパーオキシドの測定の場合）
Ｔｉｍｅ  ｃｏｎｓｔａｎｔ：０．１ｓｅｃ
Ａｃｃｕｍ：１
【０１１０】
上記実験３から分かる通り、ＮＫ−５（化学式２）は、ヒドロキシラジカルやペルオキシラジカルをＮＫ−４（化学式１）よりも強力に消去するため、生体に投与することで、虚血性疾患において血液再灌流時に発生するヒドロキシラジカル及び／又はペルオキシラジカルによる酸化ストレスを顕著に抑制することが期待できる。また実験１−１及び実験１−２の結果より、ＮＫ−５（化学式２）及びＮＫ−６（化学式７）は、ＮＫ−４（化学式１）と同等、もしくはＮＫ−４を上回る神経細胞増殖促進作用及び神経突起伸展作用を併せ持つため、神経細胞死を抑制する作用が期待できる。さらに実験１−３において、ＮＫ−５（化学式２）とその類縁体、並びにＮＫ−６（化学式７）が、酸化ストレスで惹起された神経細胞内のＲＯＳ産生を効果的に抑制したことは、これらの化合物が、抗神経変性疾患剤としてだけではなく、脳保護剤、ラジカルスカベンジャー、酸化ストレス抑制剤、過酸化脂質生成抑制剤、脳の酸化的障害抑制剤などとして有効であることを物語っている。尚且つ、実験３で示されたＮＫ−５（化学式２）のラジカル消去作用は顕著であり、実験に供した４種のラジカルの全てにおいて、ＮＫ−４（化学式１）よりも強力な消去能を示した。一方、ＮＫ−６（化学式７）は、ＤＰＰＨラジカルやスーパーオキシドに対して強い作用を有することが示された。このことは、ＮＫ−５とＮＫ−６のラジカル消去に関する特異性が異なることを物語っており、これら２種化合物を同時配合することで、より多種類のラジカルを含むＲＯＳを効果的に消去する剤が設計可能であることを示唆している。
【０１１１】
＜実験４：化合物の溶解性＞
従来技術（特許文献６）で開示されているキノリン骨格３核ペンタメチン色素であるＮＫ−４（化学式１；分子量７８９．５４）は、一般的な中枢神経系薬剤と比べて分子量が大きく溶解性が低いと考えられる。そこで、ＮＫ−４と同じく神経細胞増殖促進作用、神経突起伸展作用及びラジカル消去作用を併せ持つＮＫ−５（化学式２；分子量４８０．３８）及びＮＫ−６（化学式７；分子量４５４．３４）について、水及びエタノールに対する溶解性を評価した。
【０１１２】
＜化合物の定量法（吸光度法）＞
各被験化合物をＤＭＳＯに５ｍｇ／ｍＬの濃度で溶解した試験標品を７０容積％アセトニトリルで希釈して、４００ｎｍから９００ｎｍの波長領域の吸収スペクトルを吸光光度計（製品名『フレックスステーション３』、モレキュラーディバイスジャパン社製）でスキャンした。各被験化合物の最大吸収波長を求め、同波長における吸光度と濃度の相関式を算定して検量線を作成したうえで、以下の定量試験を実施した。なお各化合物の７０容積％アセトニトリル溶液における最大吸収波長は、ＮＫ−４が７７０ｎｍ、ＮＫ−５が７０４ｎｍ、ＮＫ−６が５８８ｎｍであり、各化合物共に、最大吸収波長における濃度依存性が確認されている。
【０１１３】
各色素化合物の溶解性は日本薬局方に記載の方法を参考にして、次の通り測定した。即ち、各被験化合物を減圧乾燥器（商品名『バキューム・ドライ・オーブンＤＰ４１』、ヤマト科学社製）を用いて１２０℃で２時間減圧乾燥したものを各２０ｍｇ秤量し、１００ｍｌの蒸留水を添加して、室温・遮光下でスターラー撹拌を行った。３０分後に、各被験液から１ｍｌを３点サンプリングし、１８，４００×ｇで５分間遠心分離後、上清０．３ｍｌを採取し、アセトニトリル０．７ｍｌを添加して合計１．０ｍｌとした後に上述した各色素に対応する最大吸収波長にて吸光度を測定し、検量線から濃度を算定した。
【０１１４】
【表７】
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【０１１５】
表７に示す通り、各色素化合物の蒸留水に対する溶解性は、ＮＫ−６（化学式７）が最も高く、次いでＮＫ−５（化学式２）であり、両化合物の水溶性はＮＫ−４（化学式１）よりも顕著に高いことが判明した。エタノールに対する溶解性では、ＮＫ−５とＮＫ−６の順が逆転したが、いずれもＮＫ−４よりも顕著に高い溶解性を持つことが示された。このことは、ＮＫ−５及びＮＫ−６は、ＮＫ−４よりも、顕著に溶解性が高く、そのため、バイオアベイラビリティや薬剤利用性の点においても極めて有利に利用されうることを物語っている。
【０１１６】
上記実験１乃至４の一連の結果より、一般式４で表される化合物であるＮＫ−５及びＮＫ−６、並びにそれらのアルキル側鎖が異なる類縁体（化学式２乃至１１）は、従来から抗神経変性疾患剤の有効成分として提案されている色素化合物ＮＫ−４（化学式１）と比較して、その作用効果や製剤適性、さらには脳移行性に関して、顕著な優位性を有することは明らかである。
【０１１７】
以下、本発明の抗神経変性疾患剤について、実施例により説明するが、本発明はこれら実施例に何ら限定されるものではない。
【実施例１】
【０１１８】
＜経口用剤＞
ＮＫ−５（化学式２で表される化合物）及びＮＫ−６（化学式７で表される化合物）（いずれも株式会社林原製造）を等モル量配合し、乳鉢を用いて微粉化した混合粉末５．０質量部に対し、炭酸水素ナトリウム３．７５質量部及び含水結晶α，α−トレハロース（株式会社林原販売、商品名『トレハロース１００ＰＨ』）１．５質量部、ステアリン酸マグネシウム０．２５質量部を均質に混合し、常法により０．５ｇずつ打錠し錠剤を調製した。本品は、効果が高く持続性に優れる経口投与用の抗神経変性疾患剤として利用できる。また、本品は、神経変性抑制剤、神経細胞保護剤、神経突起促進剤や、神経変性に伴う病態や神経機能障害の治療剤としても利用できる。また、本品は脳保護剤、脳の酸化的障害抑制剤、虚血性脳障害抑制剤、脳梗塞巣進展抑制剤、脳浮腫抑制剤、遅発性神経死抑制剤、脳機能正常化剤、酸化ストレス抑制剤、抗潰瘍剤、血糖上昇抑制剤、眼性疾患の予防・治療剤、移植臓器保存剤、移植組織・臓器の壊死防止剤、組織・臓器の障害の予防・治療剤、放射線障害予防・治療剤、抗腫瘍剤、腫瘍転移抑制剤、細胞障害マーカー抑制剤、炎症性疾患やそれに伴う組織障害の予防・治療剤、感覚細胞、感覚神経或いは感覚器の障害の抑制剤、薬物中毒の予防・治療剤、カルシウム・ナトリウム交換系阻害剤、疼痛や掻痒の予防・治療剤、プロテインキナーゼ刺激剤、ミトコンドリア脳筋症予防・治療剤、動脈閉塞・狭窄予防・治療剤、血液脳関門破綻抑制剤、薬物依存症治療剤、アポトーシス抑制剤、過酸化脂質生成抑制剤、ラジカルスカベンジャー、アミロイドβペプチド凝集阻害剤、アミロイドβペプチド傷害抑制剤として利用してもよい。さらに、本発明の抗神経変性疾患剤は、神経変性疾患を発症したペットをはじめとするヒト以外の動物の治療剤や、その予防剤として使用することもできる。
【実施例２】
【０１１９】
＜経口用剤＞
予め乳鉢を用い微粉化した、化学式２乃至６で表されるＮＫ−５もしくはその類縁体（ＮＫ−３６，ＮＫ−３７，ＮＫ−４４及びＮＫ−４５）、化学式７乃至１１で表されるＮＫ−６もしくはその類縁体（ＮＫ−１９４６、ＮＫ−１９４５，ＮＫ−１０７４５及びＮＫ−１４８６）（いずれも株式会社林原製造）のいずれか１種５．０質量部に対し、炭酸水素ナトリウム３．７５質量部及びアスコルビン酸２−グルコシド（株式会社林原販売、商品名『Ｌ−アスコルビン酸２−グルコシド試薬』）１．５質量部、ステアリン酸マグネシウム０．２５質量部を均質に混合し、常法により０．５ｇずつ打錠し錠剤を調製した。本品は、実施例１と同じく経口投与用の抗神経変性疾患剤として、該実施例の適用範囲において利用できる。また本品は安定型ビタミンＣであるところのＬ−アスコルビン酸２−グルコシドの作用により保存安定性に優れ、長期間摂取しても、副作用がなく、未病者でも安心して利用できる。
【実施例３】
【０１２０】
＜注射用液剤＞
注射用精製水３７０ｇに注射用精製マルトース（株式会社林原製造）６０ｇを溶解した溶液と、注射用精製水１７０ｇに、レシチン２ｇと有効成分として、化学式２乃至６で表されるＮＫ−５もしくはその類縁体（ＮＫ−３６，ＮＫ−３７，ＮＫ−４４及びＮＫ−４５）及び、化学式７乃至１１で表されるＮＫ−６もしくはその類縁体（ＮＫ−１９４６、ＮＫ−１９４５，ＮＫ−１０７４５及びＮＫ−１４８６）（いずれも株式会社林原製造）の其々各１種を、１２０ｍｇずつ溶解した溶液とを混合し、濾過滅菌後、溶存する酸素の濃度が約０．１ｐｐｍになるまで無菌の窒素ガスをバブリングして、褐色アンプルに１ｍｌずつ分注し、窒素気流下でアンプルを封止した。本品は、いずれもパイロジェンフリーであり、注射用の抗神経変性疾患剤として利用できる。また、本品は、神経変性抑制剤、神経細胞保護剤、神経突起促進剤や、神経変性に伴う病態や神経機能障害の治療剤としても利用できる。また、本品は脳保護剤、脳の酸化的障害抑制剤、虚血性脳障害抑制剤、脳梗塞巣進展抑制剤、脳浮腫抑制剤、遅発性神経死抑制剤、脳機能正常化剤、酸化ストレス抑制剤、抗潰瘍剤、血糖上昇抑制剤、眼性疾患の予防・治療剤、移植臓器保存剤、移植組織・臓器の壊死防止剤、組織・臓器の障害の予防・治療剤、放射線障害予防・治療剤、抗腫瘍剤、腫瘍転移抑制剤、細胞障害マーカー抑制剤、炎症性疾患やそれに伴う組織障害の予防・治療剤、感覚細胞、感覚神経或いは感覚器の障害の抑制剤、薬物中毒の予防・治療剤、カルシウム・ナトリウム交換系阻害剤、疼痛や掻痒の予防・治療剤、プロテインキナーゼ刺激剤、ミトコンドリア脳筋症予防・治療剤、動脈閉塞・狭窄予防・治療剤、血液脳関門破綻抑制剤、薬物依存症治療剤、アポトーシス抑制剤、過酸化脂質生成抑制剤、ラジカルスカベンジャー、アミロイドβペプチド凝集阻害剤、アミロイドβペプチド傷害抑制剤、コリンエステラーゼ活性阻害剤、セリン／スレオニンキナーゼ（Ａｋｔ）活性化剤、ホスファチヂルイノシトール（３，４，５）３リン酸キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）−セリン／スレオニンキナーゼ（Ａｋｔ）カスケード活性化剤、サイクリックＡＭＰ濃度上昇促進剤、或いは、ＳＡＰＫ／ＪＮＫリン酸化抑制剤として利用してもよい。さらに、本発明の抗神経変性疾患剤は、神経変性疾患を発症したペットをはじめとするヒト以外の動物の治療剤や、その予防剤として使用することもできる。
【実施例４】
【０１２１】
＜注射用液剤＞
注射用精製水３７０ｇにパイロジェンフリーの含水結晶α，α−トレハロース（株式会社林原販売、商品名『トレハロースＳＧ』）５０ｇ、アスコルビン酸０．５ｇ、炭酸水素ナトリウム１．２５ｇを溶解しｐＨを７．２に調整した溶液と、注射用精製水１７７ｇに、ツイーン８０（日本油脂株式会社販売、商品名『ポリソルベイト８０』）３ｇと、有効成分である化学式７乃至１１で表されるＮＫ−６もしくはその類縁体（ＮＫ−１９４６、ＮＫ−１９４５，ＮＫ−１０７４５及びＮＫ−１４８６）（いずれも株式会社林原製造）のいずれか１種を、各々１２０ｍｇ溶解した溶液を混合し、濾過滅菌後、溶存する酸素の濃度が約０．１ｐｐｍになるまで無菌の窒素ガスをバブリングし、褐色アンプルに１ｍｌずつ分注し、窒素気流下でアンプルを封止した。本品は、いずれもパイロジェンフリーであり、実施例４と同じく注射用の抗神経変性疾患剤として、該実施例の適用範囲において利用できる。
【実施例５】
【０１２２】
＜用時溶解型粉末剤＞
注射用精製水３７０ｇに注射用精製マルトース（株式会社林原製造）３０ｇ、アスコルビン酸０．５ｇ、炭酸水素ナトリウム１ｇを溶解しｐＨを７．０に調整した溶液と、注射用精製水１００ｇに、有効成分である化学式２乃至６で表されるＮＫ−５もしくはその類縁体（ＮＫ−３６，ＮＫ−３７，ＮＫ−４４及びＮＫ−４５）、化学式７乃至１１で表されるＮＫ−６もしくはその類縁体（ＮＫ−１９４６、ＮＫ−１９４５，ＮＫ−１０７４５及びＮＫ−１４８６）（いずれも株式会社林原製造）のいずれか１種を２００ｍｇ溶解した溶液とを、各々混合して濾過滅菌後、褐色アンプルに１０ｍｌずつ分注し、常法により凍結乾燥後、窒素気流下でアンプルを封止した。本品は、いずれもパイロジェンフリーであり、用時に、アンプルに注射用精製水乃至生理食塩水２乃至１０ｍｌを加えて溶解し、点滴静注、皮下投与、腹腔内投与などの方法で用いることができる。本品は、水溶液状態で安定性に劣る色素化合物に適した剤形であるが、実施例４と同じく注射用の抗神経変性疾患剤として、該実施例の適用範囲において利用できる。
【産業上の利用可能性】
【０１２３】
本発明の抗神経変性疾患剤は、神経細胞の神経変性に起因する疾患の予防、治療及び／又は進展抑制、さらには、神経変性を引き起こす因子からの神経細胞保護に有用である。また、神経変性疾患に伴う種々の病態や神経機能障害の改善にも有用である。更に本発明の抗神経変性疾患剤は、溶解性が高く、脳移行性も改善されているため、経口投与が可能であり、より少量の投与で、従来の剤と同等、もしくはそれ以上の効果が期待でき、水系製剤への配合に関しても自由度が増すことから顕著な進歩性を有するものである。本発明は、斯くも顕著な作用効果を奏する発明であり、斯界に多大の貢献をする、誠に意義のある発明である。
【国際調査報告】
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