(57)【要約】  本発明の課題は、移植細胞による高い治療効果を発揮できる細胞移植キット、上記細胞移植キットにおいて使用する袋状構造物の製造方法、および上記細胞移植キットを含む糖尿病治療剤を提供することである。本発明によれば、平均孔径０．２ｍｍ以下の空孔を有する膜からなる第一の袋状構造物と、上記第一の袋状構造物の空孔の平均孔径よりも大きい平均長径を有する複数個の第二の袋状構造物とを含む、細胞移植キットであって、上記複数個の第二の袋状構造物のうちの少なくとも一部が、細胞を内包している、細胞移植キットが提供される。本発明によれば、上記細胞移植キットにおいて使用する袋状構造物の製造方法が提供される。本発明によれば、上記細胞移植キットを含む糖尿病治療剤が提供される。
2020138028.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
平均孔径０．２ｍｍ以下の空孔を有する膜からなる第一の袋状構造物と、前記第一の袋状構造物の空孔の平均孔径よりも大きい平均長径を有する複数個の第二の袋状構造物とを含む、細胞移植キットであって、前記複数個の第二の袋状構造物のうちの少なくとも一部が、細胞を内包している、細胞移植キット。
【請求項２】
第一の袋状構造物の材料が、ナイロン、ポリスルホン、ポリテトラフルオロエチレン、ポリウレタン、ポリエステル、塩化ビニル、ポリカーボネート、アクリル、ステンレス、チタン、シリコン、または２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリンを含む、請求項１に記載の細胞移植キット。
【請求項３】
第一の袋状構造物の材料が、ナイロンまたはポリスルホンを含む、請求項１または２に記載の細胞移植キット。
【請求項４】
第二の袋状構造物の材料が、多糖ヒドロゲル、ポリペプチド、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、乳酸・グリコール酸コポリマー、ヒアルロン酸、グリコサミノグリカン、プロテオグリカン、コンドロイチン、セルロース、アガロース、カルボキシメチルセルロース、キチン、キトサン、アルギン酸、アルギン酸ナトリウム、アルギン酸カルシウム、アルギン酸カリウム、アルギン酸バリウム、アルギネート、ポリリジンの層状マトリックス、ポリオルニチンの層状マトリックス、光重合ポリマー、ポリアクリレート、ヒドロキシエチルメタクリレート、メチルメタクリレート、シリコン、ポリエーテルスルホンメンブレン、アクリロニトリル−コ−塩化ビニル またはこれらの組み合わせを含む、請求項１から３の何れか一項に記載の細胞移植キット。
【請求項５】
第二の袋状構造物の材料が、アルギン酸ナトリウムを含む、請求項１から４の何れか一項に記載の細胞移植キット。
【請求項６】
前記複数個の第二の袋状構造物のうちの少なくとも一部は、細胞を内包していない、請求項１から５の何れか一項に記載の細胞移植キット。
【請求項７】
第二の袋状構造物のうち細胞を内包していないものの割合が５０％以下である、請求項１から６の何れか一項に記載の細胞移植キット。
【請求項８】
細胞が、細胞集合体である、請求項１から７の何れか一項に記載の細胞移植キット。
【請求項９】
細胞集合体が膵島である、請求項８に記載の細胞移植キット。
【請求項１０】
細胞集合体を内包している第二の袋状構造物について、１個の第二の袋状構造物に内包される細胞集合体の平均個数が１．０個以上５．０個以下である、請求項８または９に記載の細胞移植キット。
【請求項１１】
第一の袋状構造物の空孔の平均孔径が５０μｍ以下である、請求項１から１０の何れか一項に記載の細胞移植キット。
【請求項１２】
第一の袋状構造物の空孔の平均孔径が１μｍ以下である、請求項１から１１の何れか一項に記載の細胞移植キット。
【請求項１３】
第一の袋状構造物の内部に間葉系幹細胞を含む、請求項１から１２の何れか一項に記載の細胞移植キット。
【請求項１４】
生体親和性を有する高分子ブロックと細胞とを含む細胞構造体であって、複数個の前記細胞間の隙間に複数個の前記高分子ブロックが配置されている細胞構造体をさらに含む、請求項１から１３の何れか一項に記載の細胞移植キット。
【請求項１５】
前記細胞構造体を第一の袋状構造物と第二の袋状構造物との間に含む、請求項１４に記載の細胞移植キット。
【請求項１６】
前記細胞構造体に含まれる細胞が間葉系幹細胞である、請求項１４または１５に記載の細胞移植キット。
【請求項１７】
板状の細胞非接着性材料をさらに含む、請求項１から１６の何れか一項に記載の細胞移植キット。
【請求項１８】
第一の袋状構造物を生体内に導入し、生体内に導入された第一の袋状構造物の周囲にレシピエント由来の被膜を形成させ、その後、第一の袋状構造物の中に、複数個の第二の袋状構造物を入れる、請求項１から１７の何れか一項に記載の細胞移植キット。
【請求項１９】
細胞非接着性材料を包含した第一の袋状構造物を、腹膜の腹腔側に縫い合わせることにより、第一の袋状構造物を生体内に導入する、請求項１８に記載の細胞移植キット。
【請求項２０】
請求項１から１９の何れか一項に記載の細胞移植キットを含む、糖尿病治療剤。
【請求項２１】
糖尿病の治療における使用のための請求項１から１９の何れか一項に記載の細胞移植キット。
【請求項２２】
膵島を０．５〜４質量％の高分子溶液に懸濁することを含む、膵島を内包した袋状構造物の製造方法であって、膵島１個に対する高分子溶液の容量が０．０１〜２．０μＬである、製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞の移植による特定疾患の治療において有用である細胞移植キットに関する。本発明はさらに、上記細胞移植キットにおいて使用する袋状構造物の製造方法および上記細胞移植キットを含む糖尿病治療剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
膵島移植の方法としては、経門脈肝臓内移植が現在の主流である。しかし、経門脈肝臓内移植により移植された膵島の多くは、免疫反応によって短時間で死滅してしまうので、十分な移植効果を得るためには複数回の移植が必要となる。また、血管内に移植することから、塞栓や出血といった問題が避けられず、摘出も容易ではないことが問題となっている。上記の問題を解決するために他の移植部位の探索が行われている。しかしながら門脈移植以外の移植部位、特に皮下では、血流が少なく、膵島の生着率が他部位と比べて低いという課題があった。そこで血流豊富な移植部位を膵島の移植前に作製することで膵島の生着率を高めることが試みられている。【０００３】
非特許文献１には、血管床を作製することにより、移植した細胞の生着性を向上させることが記載されている。特許文献１には、宿主の体内に細胞を植え込むためのデバイスであって、近位端部および遠位端部を有する少なくとも１つのチャンバーを含む多孔質足場と、少なくとも１つのチャンバー内、および／または、多孔質足場の少なくとも一部内に配置されるように構成された少なくとも１つの取り外し可能なプラグとを含み、多孔質足場は、ポリプロピレンメッシュを含むデバイスが記載されている。特許文献２には、組織中埋め込まれる新生血管床形成用用具であって、埋め込まれた際に新生血管床形成用用具の周囲に毛細血管で覆われた空隙を作成することが可能な用具が記載されている。特許文献２に記載の用具は、毛細血管の豊富な組織を作成するために用いる用具である。【０００４】
膵島移植のもう一つの課題はドナー不足である。その対策として異種膵島を用いた膵島移植の研究が盛んに行われている。しかしながら、異種膵島移植の実現には膵島を異種免疫拒絶反応から保護する必要がある。膵島移植に限らず、細胞移植における免疫拒絶の対策として、ヒドロゲルなどを用いた免疫隔離膜の研究が進められている。非特許文献２には、アルギン酸カプセルにより細胞を免疫隔離することが記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特開２０１８−４３０１３号公報
【特許文献２】特開２０００−１７８１８０号公報
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｕｅｍａｔｓｕ  ＳＳ（２０１８）Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ．１０２（３）：３８７-３９５
【非特許文献２】Ｓｔｅｐｈａｎ，Ｓ  ｅｔ  ａｌ．（２００５）Ｄｉａｂｅｔｅｓ．５４（３）：６８７−６９３．
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、移植細胞による高い治療効果を発揮できる細胞移植キット、並びに上記細胞移植キットにおいて使用する袋状構造物の製造方法および上記細胞移植キットを含む糖尿病治療剤を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者は上記課題を解決するために鋭意検討した結果、血管および免疫細胞が入ってきづらい微小な孔を持つ袋状構造物を生体に予め移植しておくことにより細胞の移植部位を事前に作製し、次いで、上記移植部位にマイクロカプセル化した細胞を移植することにより、異種細胞を生着させ、治療効果を発揮できることを見出した。本発明は上記知見に基づいて完成したものである。【０００９】
即ち、本発明によれば、以下の発明が提供される。
＜１＞  平均孔径０．２ｍｍ以下の空孔を有する膜からなる第一の袋状構造物と、上記第一の袋状構造物の空孔の平均孔径よりも大きい平均長径を有する複数個の第二の袋状構造物とを含む、細胞移植キットであって、上記複数個の第二の袋状構造物のうちの少なくとも一部が、細胞を内包している、細胞移植キット。
＜２＞  第一の袋状構造物の材料が、ナイロン、ポリスルホン、ポリテトラフルオロエチレン、ポリウレタン、ポリエステル、塩化ビニル、ポリカーボネート、アクリル、ステンレス、チタン、シリコン、または２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリンを含む、＜１＞に記載の細胞移植キット。
＜３＞  第一の袋状構造物の材料が、ナイロンまたはポリスルホンを含む、＜１＞または＜２＞に記載の細胞移植キット。【００１０】
＜４＞  第二の袋状構造物の材料が、多糖ヒドロゲル、ポリペプチド、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、乳酸・グリコール酸コポリマー、ヒアルロン酸、グリコサミノグリカン、プロテオグリカン、コンドロイチン、セルロース、アガロース、カルボキシメチルセルロース、キチン、キトサン、アルギン酸、アルギン酸ナトリウム、アルギン酸カルシウム、アルギン酸カリウム、アルギン酸バリウム、アルギネート、ポリリジンの層状マトリックス、ポリオルニチンの層状マトリックス、光重合ポリマー、ポリアクリレート、ヒドロキシエチルメタクリレート、メチルメタクリレート、シリコン、ポリエーテルスルホンメンブレン 、アクリロニトリル−コ−塩化ビニル またはこれらの組み合わせを含む、＜１＞から＜３＞の何れか一に記載の細胞移植キット。
＜５＞  第二の袋状構造物の材料が、アルギン酸ナトリウムを含む、＜１＞から＜４＞の何れか一に記載の細胞移植キット。
＜６＞  上記複数個の第二の袋状構造物のうちの少なくとも一部は、細胞を内包していない、＜１＞から＜５＞の何れか一に記載の細胞移植キット。
＜７＞  第二の袋状構造物のうち細胞を内包していないものの割合が５０％以下である、＜１＞から＜６＞の何れか一に記載の細胞移植キット。【００１１】
＜８＞  細胞が、細胞集合体である、＜１＞から＜７＞の何れか一に記載の細胞移植キット。
＜９＞  細胞集合体が膵島である、＜８＞に記載の細胞移植キット。
＜１０＞  細胞集合体を内包している第二の袋状構造物について、１個の第二の袋状構造物に内包される細胞集合体の平均個数が１．０個以上５．０個以下である、＜８＞または＜９＞に記載の細胞移植キット。
＜１１＞  第一の袋状構造物の空孔の平均孔径が５０μｍ以下である、＜１＞から＜１０＞の何れか一に記載の細胞移植キット。
＜１２＞  第一の袋状構造物の空孔の平均孔径が１μｍ以下である、＜１＞から＜１１＞の何れか一に記載の細胞移植キット。【００１２】
＜１３＞  第一の袋状構造物の内部に間葉系幹細胞を含む、＜１＞から＜１２＞の何れか一に記載の細胞移植キット。
＜１４＞  生体親和性を有する高分子ブロックと細胞とを含む細胞構造体であって、複数個の前記細胞間の隙間に複数個の前記高分子ブロックが配置されている細胞構造体をさらに含む、＜１＞から＜１３＞の何れか一に記載の細胞移植キット。
＜１５＞  前記細胞構造体を第一の袋状構造物と第二の袋状構造物との間に含む、＜１４＞に記載の細胞移植キット。
＜１６＞  前記細胞構造体に含まれる細胞が間葉系幹細胞である、＜１４＞または＜１５＞に記載の細胞移植キット。
＜１７＞  板状の細胞非接着性材料をさらに含む、＜１＞から＜１６＞の何れか一に記載の細胞移植キット。【００１３】
＜１８＞  第一の袋状構造物を生体内に導入し、生体内に導入された第一の袋状構造物の周囲にレシピエント由来の被膜を形成させ、その後、第一の袋状構造物の中に、複数個の第二の袋状構造物を入れる、＜１＞から＜１７＞の何れか一に記載の細胞移植キット。
＜１９＞  細胞非接着性材料を包含した第一の袋状構造物を、腹膜の腹腔側に縫い合わせることにより、第一の袋状構造物を生体内に導入する、＜１８＞に記載の細胞移植キット。
＜２０＞  ＜１＞から＜１９＞の何れか一に記載の細胞移植キットを含む、糖尿病治療剤。
＜２１＞  糖尿病の治療における使用のための＜１＞から＜１９＞の何れか一に記載の細胞移植キット。
＜２２＞  膵島を０．５〜４質量％の高分子溶液に懸濁することを含む、膵島を内包した袋状構造物の製造方法であって、膵島１個に対する高分子溶液の容量が０．０１〜２．０μＬである、製造方法。 
【発明の効果】
【００１４】
本発明の細胞移植キットによれば、移植細胞による高い治療効果を発揮することができる。本発明の袋状構造物の製造方法によれば、上記した本発明の細胞移植キットにおいて使用するのに適した袋状構造物を製造することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】図１は、本発明の細胞移植キットの一例を用いて膵島を移植する場合の操作を示す模式図である。
【図２】図２は、第一の袋状構造物を移植した４週間後の様子を示す。
【図３】図３は、膵島を移植する際の様子を示す。
【図４】図４は、ナイロン製の第一の袋状構造物を用いた異種膵島移植における血糖値推移を示す。
【図５】図５は、ナイロン製の第一の袋状構造物を用いた異種膵島移植における体重推移を示す。
【図６】図６は細胞構造体（＋）群および細胞構造体（−）群の移植4週後の組織切片の免疫染色像を示す。
【図７】図７は細胞構造体（＋）群および細胞構造体（−）群の移植4週後の組織切片のＨＥ染色像を示す。
【図８】図８は細胞構造体（＋）群および細胞構造体（−）群の移植4週後のマイクロカプセル周囲の組織切片のＨＥ染色像を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
以下、本発明を実施するための形態を、詳細に説明する。本明細書において「〜」は、その前後に記載される数値をそれぞれ最小値および最大値として含む範囲を示すものとする。
【００１７】
本発明の細胞移植キットは、平均孔径０．２ｍｍ以下の空孔を有する膜からなる第一の袋状構造物と、上記第一の袋状構造物の空孔の平均孔径よりも大きい平均長径を有する複数個の第二の袋状構造物とを含み、複数個の第二の袋状構造物のうちの少なくとも一部が、細胞を内包している。本発明の構成によれば、細胞の生着性が高く、かつ移植された細胞を免疫拒絶から保護することができる。また、袋状構造物を使用するため、異常時の摘出、並びに細胞の追加または入れ替えが容易であり、より長期の治療効果が得られる。本発明によれば、異種ドナー細胞を用いた門脈投与以外の移植部位での細胞移植治療を実現することができる。
【００１８】
＜第一の袋状構造物＞
第一の袋状構造物は、平均孔径０．２ｍｍ以下の空孔を有する膜からなる。
第一の袋状構造物の空孔の平均孔径は、第二の袋状構造物の平均長径よりも小さければよく、好ましくは第二の袋状構造物の短径よりも小さく、より好ましくは第二の袋状構造物の短径の５０％以下である。
【００１９】
第一の袋状構造物は、平均孔径０．２ｍｍ以下の空孔を有し、好ましくは平均孔径５０μｍ以下の空孔を有し、より好ましくは平均孔径２０μｍ以下の空孔を有し、さらに好ましくは平均孔径１μｍ以下の空孔を有し、特に好ましくは平均孔径０．０５μｍ以下の空孔を有する。
空孔の平均孔径が０．２ｍｍ以下であることにより、第一の袋状構造物内に結合組織、血管および免疫細胞の侵入が助長されないようになる。
【００２０】
第一の袋状構造物の平均孔径の測定方法としては、孔を連続して５０個以上選択し、それぞれの孔径を測定し、平均値を算出して平均孔径とすることができる。また、ＡＳＴＭ  Ｆ３１６−８０により測定することができる。
【００２１】
第一の袋状構造物の開孔率は、特に限定されないが、２５％〜８５％が好ましく、４０％から７５％がより好ましい。
開孔率とは、袋状構造物の全表面における孔部の占める面積の割合を示す。
開孔率は、光学顕微鏡、あるいは走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）を用いて膜の厚み方向から垂直に撮影した膜の表面あるいは断面図の画像における開口部と膜材料の面積比を算出することで測定可能である。
【００２２】
第一の袋状構造物の孔径は、より均一であることが好ましい。しかしながら、第一の袋状構造物が厚み方向への孔径分布を有する場合、膜の厚み方向の孔径の比較は、膜断面の走査型電子顕微鏡（Ｓｃａｎｎｉｎｇ  Ｅｌｅｃｔｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ：ＳＥＭ）撮影写真を膜の厚み方向に分割して行なうものとする。分割数は膜の厚みから適宜選択できる。分割数は少なくとも５以上とし、分割幅の大きさは、膜における厚み方向の幅の大きさを意味し、写真での幅の大きさを意味するものではない。膜の厚み方向の孔径の比較において、孔径は、各区分の平均孔径として比較される。各区分の平均孔径は、例えば、膜断面図の各区分の５０個の孔の平均値であればよい。
【００２３】
第一の袋状構造物は、免疫隔離のために用いられる。免疫隔離は免疫拒絶反応の防止方法である。一般的には、免疫隔離は移植の際のレシピエントの免疫拒絶反応を防止する方法の一つである。ここで、免疫拒絶反応は、移植される細胞に対するレシピエントの拒絶反応である。免疫隔離により、レシピエントの免疫拒絶反応から細胞が隔離される。免疫拒絶反応としては、細胞性免疫応答によるものおよび液性免疫応答によるものが挙げられる。
【００２４】
第一の袋状構造物は酸素、水、グルコース等の栄養分は透過させ、免疫拒絶反応に関与する免疫細胞等の透過を阻止する選択透過性の膜であることが好ましい。免疫細胞としては、マクロファージ、樹状細胞、好中球、好酸球、好塩基球、ナチュラルキラー細胞、各種Ｔ細胞、Ｂ細胞、その他リンパ球が挙げられる。
第一の袋状構造物は、用途に応じ、免疫グロブリン（ＩｇＭまたはＩｇＧ等）および補体のような高分子量タンパク質の透過を阻止することが好ましく、インスリンなどの比較的低分子量の生理活性物質を透過させることが好ましい。
【００２５】
第一の袋状構造物の選択透過性は用途に応じて調整すればよい。第一の袋状構造物は、例えば、分子量５００ｋＤａ以上、１００ｋＤａ以上、８０ｋＤａ以上、または５０ｋＤａ以上などの物質を遮断する選択透過性の膜であればよい。例えば、第一の袋状構造物は、抗体の中で最も小さいＩｇＧ（分子量約１６０ｋＤａ）の透過を阻止できることが好ましい。また、第一の袋状構造物は、球体としてのサイズとして直径５００ｎｍ以上、１００ｎｍ以上、５０ｎｍ以上、または１０ｎｍ以上などの物質を遮断する選択透過性の膜であればよい。
【００２６】
第一の袋状構造物は生体適合性が高い材料がよく、炎症反応をより惹起しない材料が好ましい。第一の袋状構造物の材料としては、ナイロン、ポリスルホン、ポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）、ポリウレタン、ポリエステル、塩化ビニル、ポリカーボネート、アクリル、ステンレス、チタン、シリコン、または２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン（ＭＰＣ）が好ましく、ナイロンまたはポリスルホンがより好ましい。
第一の袋状構造物の内部には、サイトカインを含ませていてもよく、抗炎症作用を有する物質を含ませてもよい。
第一の袋状構造物の内部には、細胞を含ませてもよく、細胞構造体を含ませてもよい。
【００２７】
第一の袋状構造物を構成する膜の厚みは、特に限定されないが、１０μｍ〜５００μｍであることが好ましい。第一の袋状構造物を構成する膜の厚みの下限は、２０μｍ以上でもよく、３０μｍ以上でもよい。第一の袋状構造物を構成する膜の厚みの上限は、４００μｍ以下でもよく、３００μｍ以下でもよく、２５０μｍ以下でもよく、２００μｍ以下でもよく、１００μｍ以下でもよい。
第一の袋状構造物の表面には、細胞外マトリックス、コラーゲン、ラミニンまたはビトロネクチンなどの細胞接着性物質をコーティングしてもよい。第一の袋状構造物の表面には、細胞非接着コート剤をコーティングしてもよい。
【００２８】
第一の袋状構造物の形状は、長方形であってもよく、楕円状であってもよい。
【００２９】
第一の袋状構造物は、多孔質膜から構成されていてもよい。
多孔質膜は複数の孔を有する膜をいう。孔は例えば膜断面の走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）撮影画像または透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）撮影画像で確認することができる。
【００３０】
好ましくは、多孔質膜は、孔径が最小となる層状の緻密部位を内部に有し、この緻密部位から多孔質膜の少なくとも一方の表面に向かって厚み方向で孔径が連続的に増加している。孔径は、後述する区分の平均孔径で判断するものとする。
【００３１】
多孔質膜が孔径分布を有することにより、第一の袋状構造物は、寿命を向上させることができる。実質的に異なる孔径の膜を用いて多段階の濾過を行なったような効果が得られ、膜の劣化を防止することができるからである。
【００３２】
孔径は電子顕微鏡によって得られた膜断面の写真から測定すればよい。多孔質膜はミクロトーム等により切断し、断面が観察できる薄膜の切片として、多孔質膜断面の写真を得ることができる。
【００３３】
膜の厚み方向の孔径の比較は、膜断面のＳＥＭ撮影写真を膜の厚み方向に分割して行なうものとする。分割数は膜の厚みから適宜選択できる。分割数は少なくとも５以上とし、例えば２００μｍ厚の膜では後述する表面Ｘから２０分割して行う。なお、分割幅の大きさは、膜における厚み方向の幅の大きさを意味し、写真での幅の大きさを意味するものではない。膜の厚み方向の孔径の比較において、孔径は、各区分の平均孔径として比較される。各区分の平均孔径は、例えば、膜断面図の各区分の５０個の孔の平均値であればよい。この場合の膜断面図は例えば８０μｍ幅（表面と平行な方向において８０μｍの距離）で得てもよい。このとき、孔が大きく、５０個測定できない区分については、その区分でとれる数だけ測定したものであればよい。また、このとき、孔が大きくその区分に収まるものでない場合は、ほかの区分にわたってその孔の大きさを計測する。
【００３４】
孔径が最小となる層状の緻密部位は、上記膜断面の区分のうちで平均孔径が最小となる区分に相当する多孔質膜の層状の部位をいう。緻密部位は１つの区分に相当する部位からなっていても、２つ、３つなどの、平均孔径が最小となる区分の１．１倍以内の平均孔径を有する複数の区分に相当する部位からなっていてもよい。緻密部位の厚みは、０.５μｍ〜５０μｍであればよく、０.５μｍ〜３０μｍであることが好ましい。
【００３５】
本明細書において、緻密部位の平均孔径を多孔質膜の最小孔径とする。多孔質膜の最小孔径は、０．０２μｍ〜１．５μｍであることが好ましく、０．０２μｍ〜１．３μｍであることがより好ましい。このような多孔質膜の最小孔径で少なくとも通常の細胞の透過を阻止することができるからである。ここで、緻密部位の平均孔径はＡＳＴＭ  Ｆ３１６−８０により測定したものとする。
【００３６】
多孔質膜は、緻密部位を内部に有する。内部とは膜の表面に接していないことを意味し、「緻密部位を内部に有する」とは、緻密部位が、膜のいずれかの表面にもっとも近い区分ではないことを意味する。免疫隔離膜においては、緻密部位を内部に有する構造の多孔質膜を用いることにより、同じ緻密部位を表面に接して有する多孔質膜を用いた場合よりも、透過させることが意図された物質の透過性が低下しにくい。いかなる理論にも拘泥するものではないが、緻密部位が内部にあることによりタンパク質の吸着が起こりにくくなっているためと考えられる。
【００３７】
緻密部位は、多孔質膜の厚みの中央部位よりもいずれか一方の表面側に偏っていることが好ましい。具体的には、緻密部位が多孔質膜のいずれか一方の表面から多孔質膜の厚みの５分の２以内の距離にあることが好ましく、３分の１以内の距離にあることがより好ましく、４分の１以内の距離にあることがさらに好ましい。この距離は上述の膜断面写真において判断すればよい。本明細書において、緻密部位がより近い側の多孔質膜の表面を「表面Ｘ」という。
【００３８】
多孔質膜においては緻密部位から少なくともいずれか一方の表面に向かって厚み方向で孔径が連続的に増加している。多孔質膜において、緻密部位から表面Ｘに向かって厚み方向で孔径が連続的に増加していてもよく、緻密部位から表面Ｘと反対側の表面に向かって厚み方向で孔径が連続的に増加していてもよく、緻密部位から多孔質膜のいずれの表面に向かうときも厚み方向で孔径が連続的に増加していてもよい。これらのうち、少なくとも緻密部位から表面Ｘと反対側の表面に向かって厚み方向で孔径が連続的に増加していることが好ましく、緻密部位から多孔質膜のいずれの表面に向かうときも厚み方向で孔径が連続的に増加していることがより好ましい。「厚み方向で孔径が連続的に増加」とは、厚み方向に隣り合う区分の間の平均孔径の差異が、最大平均孔径（最大孔径）と最小平均孔径（最小孔径）の差異の５０％以下、好ましくは４０％以下、より好ましくは３０％以下となるように増加していることをいう。「連続的に増加」は、本質的には、減少がなく一律に増加することを意味するものであるが、減少している部位が偶発的に生じていてもよい。例えば、区分を表面から２つずつ組み合わせたときに、組み合わせの平均値が、一律に増加（表面から緻密部位に向かう場合は一律に減少）している場合は、「緻密部位から膜の表面に向かって厚み方向で孔径が連続的に増加している」と判断できる。
厚み方向で孔径が連続的に増加する多孔質膜の構造は、例えば後述する製造方法により実現することができる。
【００３９】
第一の袋状構造物においては、多孔質膜の表面Ｘが内部側にあることが好ましい。すなわち、多孔質膜の緻密部位が、第一の袋状構造物の内部により近くなるように、多孔質膜が配置されていることが好ましい。表面Ｘを第一の袋状構造物の内部側にすることにより、生理活性物質の透過性をより高くすることができる。
【００４０】
多孔質膜は、一般的にはポリマーを含む。多孔質膜は本質的にポリマーから構成されていることが好ましい。
多孔質膜を形成するポリマーは生体適合性であることが好ましい。ここで、「生体適合性」とは、無毒性、非アレルギー誘発性を含む意味であるが、ポリマーが生体内において被包化される性質を含むものではない。
ポリマーは数平均分子量（Ｍｎ）が１，０００〜１０，０００，０００であるものが好ましく、５，０００〜１，０００，０００であるものがより好ましい。
【００４１】
ポリマーの例としては、熱可塑性または熱硬化性のポリマーが挙げられる。ポリマーの具体的な例としては、ポリスルホン、セルロースアシレート、ニトロセルロース、スルホン化ポリスルホン、ポリエーテルスルホン、ポリアクリロニトリル、スチレン−アクリロニトリルコポリマー、スチレン−ブタジエンコポリマー、エチレン−酢酸ビニルコポリマーのケン化物、ポリビニルアルコール、ポリカーボネート、オルガノシロキサン−ポリカーボネートコポリマー、ポリエステルカーボネート、オルガノポリシロキサン、ポリフェニレンオキシド、ポリアミド、ポリイミド、ポリアミドイミド、ポリベンズイミダゾール、エチレンビニルアルコール共重合体、ポリテトラフルオロエチレン（PTFE）等を挙げることができる。これらは、溶解性、光学的物性、電気的物性、強度、弾性等の観点から、ホモポリマーであってもよいし、コポリマーやポリマーブレンド、ポリマーアロイとしてもよい。
これらのうち、ポリスルホン、セルロースアシレートが好ましく、ポリスルホンがより好ましい。
【００４２】
多孔質膜はポリマー以外の他の成分を添加剤として含んでいてもよい。
上記添加剤としては、食塩、塩化リチウム、硝酸ナトリウム、硝酸カリウム、硫酸ナトリウム、塩化亜鉛等の無機酸の金属塩、酢酸ナトリウム、ギ酸ナトリウム等の有機酸の金属塩、ポリエチレングリコール、ポリビニルピロリドン等の高分子、ポリスチレンスルホン酸ナトリウム、ポリビニルベンジルトリメチルアンモニウムクロライド等の高分子電解質、ジオクチルスルホコハク酸ナトリウム、アルキルメチルタウリン酸ナトリウム等のイオン系界面活性剤等を挙げることができる。添加剤は多孔質構造のための膨潤剤として作用していてもよい。
【００４３】
多孔質膜は単一の層として1つの組成物から形成された膜であることが好ましく、複数層の積層構造ではないことが好ましい。
【００４４】
多孔質膜の製造方法は、上述の構造の多孔質膜が形成できる限り、特に限定されず、通常のポリマー膜形成方法をいずれも用いることができる。ポリマー膜形成方法としては延伸法および流延法などが挙げられる。
例えば、流延法においては、製膜原液に用いる溶媒の種類および量や流延後の乾燥方法を調節することにより上述の構造を有する多孔質膜を作製することができる。
【００４５】
流延法による多孔質膜の製造は、例えば以下（１）〜（４）をこの順で含む方法で行なうことができる。
（１）ポリマー、必要に応じて添加剤、および必要に応じて溶媒を含む製膜原液を溶解状態で支持体上に流延する。
（２）流延された液膜の表面に調温湿風を当てる。
（３）調温湿風を当てた後に得られる膜を凝固液に浸漬する。
（４）必要に応じて支持体を剥離する。
【００４６】
調温湿風の温度は、４℃〜６０℃、好ましくは１０℃〜４０℃であればよい。調温湿風の相対湿度は、３０％〜７０％、好ましくは４０％〜５０％であればよい。調温湿風の絶対湿度は、１．２〜６０５ｇ／ｋｇ空気であることが好ましく、２．４〜３００ｇ／ｋｇ空気であることがより好ましい。調温湿風は、０.１ｍ／秒〜１０ｍ／秒の風速で０.１秒間〜３０秒間、好ましくは１秒間〜１０秒間、当てていればよい。
緻密部位の平均孔径および位置は、調温湿風中に含まれる水分濃度、調温湿風を当てる時間によって制御することができる。なお、緻密部位の平均孔径は、製膜原液中の含有水分量によっても制御することができる。
【００４７】
上記のように液膜の表面に調温湿風を当てることによって、溶媒の蒸発の制御を行い、液膜の表面から内部に向かってコアセルベーションを起こすことができる。この状態でポリマーの溶解性が低いがポリマーの溶媒に相溶性を有する溶媒を収容する凝固液に浸漬することによって、上記のコアセルベーション相を微細孔として固定させ微細孔以外の細孔も形成することができる。
【００４８】
上記の凝固液に浸漬する過程において凝固液の温度は−１０℃〜８０℃であればよい。この間で温度を変化させることによって、緻密部位より支持体面側におけるコアセルベーション相の形成から凝固に至るまでの時間を調節し、支持体面側の表面に至るまでの孔径の大きさを制御することが可能である。凝固液の温度を高くすると、コアセルベーション相の形成が早くなり凝固に至るまでの時間が長くなるため、支持体面側へ向かう孔径は大きくなりやすい。一方、凝固液の温度を低くすると、コアセルベーション相の形成が遅くなり凝固に至るまでの時間が短くなるため、支持体面側へ向かう孔径は大きくなりにくい。
【００４９】
支持体としては、プラスチックフィルムまたはガラス板を用いればよい。プラスチックフィルムの材料の例としては、ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）などのポリエステル、ポリカーボネート、アクリル樹脂、エポキシ樹脂、ポリウレタン、ポリアミド、ポリオレフィン、セルロース誘導体、シリコーンなどが挙げられる。支持体としてはガラス板またはＰＥＴが好ましく、ＰＥＴがより好ましい。
【００５０】
製膜原液は溶媒を含んでいてもよい。溶媒は使用するポリマーに応じて、使用するポリマーの溶解性が高い溶媒（以下、「良溶媒」ということがある）を用いればよい。良溶媒は、凝固液に浸漬した場合速やかに凝固液と置換されるものが好ましい。溶媒の例としては、ポリマーがポリスルホン等の場合、Ｎ−メチル−２−ピロリドン、ジオキサン、テトラヒドロフラン、ジメチルホルムアミド、ジメチルアセトアミドあるいはこれらの混合溶媒が挙げられ、ポリマーがポリアクリロニトリル等の場合、ジオキサン、Ｎ−メチル−２−ピロリドン、ジメチルホルムアミド、ジメチルアセトアミド、ジメチルスルホキシドあるいはこれらの混合溶媒が挙げられ、ポリマーがポリアミド等の場合にはジメチルホルムアミド、ジメチルアセトアミドあるいはこれらの混合溶媒が挙げられ、ポリマーがセルロースアセテート等の場合はアセトン、ジオキサン、テトラヒドロフラン、Ｎ−メチル−２−ピロリドンあるいはこれらの混合溶媒が挙げられる。
【００５１】
製膜原液は良溶媒のほか、ポリマーの溶解性が低いがポリマーの溶媒に相溶性を有する溶媒（以下、「非溶媒」ということがある）を用いることが好ましい。非溶媒としては、水、セルソルブ類、メタノール、エタノール、プロパノール、アセトン、テトラヒドロフラン、ポリエチレングリコール、グリセリン等が挙げられる。これらのうち、水を用いることが好ましい。
【００５２】
製膜原液としてのポリマー濃度は、５質量％以上３５質量％以下、好ましくは１０質量％以上３０質量％以下であればよい。３５質量％以下であることにより、得られる多孔質膜に十分な透過性（例えば水の透過性）を与えることができ、５質量％以上とすることにより選択的に物質を透過させる多孔質膜の形成を担保することができる。添加剤の添加量は添加によって製膜原液の均一性が失われることが無い限り特に制限は無いが、通常溶媒に対して０．５質量％以上１０質量％以下である。製膜原液が非溶媒と良溶媒とを含む場合、非溶媒の良溶媒に対する割合は、混合液が均一状態を保てる範囲であれば特に制限はないが、１．０質量％〜５０質量％が好ましく、２．０質量％〜３０質量％がより好ましく、３．０質量％〜１０質量％がさらに好ましい。
【００５３】
凝固液としては、用いられるポリマーの溶解度が低い溶媒を用いることが好ましい。このような溶媒の例としては、水、メタノール、エタノール、ブタノールなどのアルコール類；エチレングリコール、ジエチレングリコールなどのグリコール類；エーテル、ｎ−ヘキサン、ｎ−ヘプタン等の脂肪族炭化水素類；グリセリン等のグリセロール類などが挙げられる。好ましい凝固液の例としては、水、アルコール類またはこれらの２種以上の混合物が挙げられる。これらのうち、水を用いることが好ましい。
【００５４】
凝固液への浸漬の後、使用した凝固液とは異なる溶媒で洗浄を行なうことも好ましい。洗浄は、溶媒に浸漬することにより行なうことができる。洗浄溶媒としてはジエチレングリコールが好ましい。洗浄溶媒としてジエチレングリコールを用い、膜を浸漬するジエチレングリコールの温度および浸漬時間のいずれか一方または双方を調節することにより、多孔質膜中のＮ元素の分布を調節できる。特に、多孔質膜の製膜原液にポリビニルピロリドンを用いる場合において、ポリビニルピロリドンの膜への残量を制御することができる。ジエチレングリコールでの洗浄の後さらに、水で洗浄してもよい。
【００５５】
多孔質膜の製膜原液としては、ポリスルホンおよびポリビニルピロリドンをＮ−メチル−２−ピロリドンに溶解して水を加えてなる製膜原液が好ましい。
多孔質膜の製造方法については、特開平４−３４９９２７号公報、特公平４−６８９６６号公報、特開平０４−３５１６４５号公報、特開２０１０−２３５８０８号公報等を参照することができる。
【００５６】
＜第二の袋状構造物＞
第二の袋状構造物は、第一の袋状構造物の空孔の平均孔径よりも大きい平均長径を有している。複数個の第二の袋状構造物のうちの少なくとも一部は、細胞を内包している。
平均長径は、作製した第２の袋状構造物を50個以上含んだ培養皿をBZ-Xオールインワン傾向顕微鏡（KEYENCE）あるいはCell3imager（島津製作所）で撮影し、ImageJで撮影した画像から測定可能である。
【００５７】
第二の袋状構造物の材料としては、好ましくは、多糖ヒドロゲル、ポリペプチド、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、乳酸・グリコール酸コポリマー、ヒアルロン酸、グリコサミノグリカン、プロテオグリカン、コンドロイチン、セルロース、アガロース、カルボキシメチルセルロース、キチン、キトサン、アルギン酸、アルギン酸ナトリウム、アルギン酸カルシウム、アルギン酸カリウム、アルギン酸バリウム、アルギネート、ポリリジンの層状マトリックス、ポリオルニチンの層状マトリックス、光重合ポリマー、ポリアクリレート、ヒドロキシエチルメタクリレート、メチルメタクリレート、シリコン（シリコンカプセル、シリコンナノカプセル）、ポリエーテルスルホンメンブレン、アクリロニトリル−コ−塩化ビニルまたはこれらの組み合わせである。上記の中でも、生体適合性を有するものが好ましく、アルギン酸ナトリウムが最も好ましい。
【００５８】
第二の袋状構造物を構成する膜は、好ましくは分子量５００ｋＤａ以上、より好ましくは分子量１００ｋＤａ以上、さらに好ましくは分子量８０ｋＤａ以上、特に好ましくは分子量５０ｋＤａ以上の物質を遮断できる選択透過性の膜である。なお、後記の実施例で使用したアルギン酸ナトリウムマイクロカプセルの膜は、５００ｋＤＡ以上の物質を２４時間以上遮断することができ、１５０ｋＤａ以上の物質を２時間以上遮断することができる。
【００５９】
本発明においては、複数個の第二の袋状構造物の全てが細胞を内包してもよいし、複数個の第二の袋状構造物の少なくとも一部が、細胞を内包していなくてもよい。
第二の袋状構造物のうち細胞を内包していないものの割合は５０％以下であることが好ましく、４０％以下であることがより好ましく、３０％以下であることがさらに好ましい。
【００６０】
第二の袋状構造物に内包される細胞は特に限定されるものではないが、有用物質を産生する細胞が好ましい。有用物質としては、ホルモン（インスリン等）、サイトカイン（インターフェロン、インターロイキン、腫瘍壊死因子、コロニー刺激因子、成長因子等）、酵素（ライソゾーム病関連酵素など）、神経伝達物質（ドーパミン等）、抗体、抗原、その他の生理活性物質（タンパク質、ペプチド等）を挙げることができるが、これらに限定されない。有用物質を産生する細胞としては、膵臓細胞（β細胞など）、皮膚細胞、軟骨細胞、肝細胞、腎細胞等の非形質転換細胞でもよいし、有用物質をコードする遺伝子や有用物質の生合成に関与する遺伝子を導入した形質転換細胞でもよい。また、細胞は、生体由来の細胞でもよいし、胚性幹細胞または人工多能性幹細胞から誘導した細胞でもよい。
上記の中でも、細胞としては、インスリン分泌細胞が好ましい。
【００６１】
細胞は、細胞集合体でもよい。細胞集合体とは、複数個の細胞が集合した細胞塊である。
細胞集合体の一例としては、膵島を使用することができる。
第二の袋状構造物が細胞集合体を内包している場合、１個の第二の袋状構造物に内包される細胞集合体の平均個数は１．０個以上５．０個以下であることが好ましく、１．０個以上４．０個以下であることがより好ましく、１．０個以上３．０個以下であることがさらに好ましく、１．０個以上２．０個以下であることが特に好ましい。平均は細胞集合体が内包されていない第二の袋状構造物の数は含まずに計算をする。
【００６２】
第二の袋状構造物には、インスリン分泌細胞以外に、間葉系幹細胞が内包されていてもよい。間葉系幹細胞は、好ましくは細胞集合体として内包されていてもよいし、より好ましくは間葉系幹細胞を含む細胞構造体として内包されていてもよい。間葉系幹細胞を含む細胞構造体については、本明細書において後記する。
第一の袋状構造物と第二の袋状構造物との間（即ち、第一の袋状構造物の中であって、かつ第二の袋状構造物の外の空間）には間葉系幹細胞が内包されていてもよい。間葉系幹細胞は、細胞集合体として内包されていてもよいし、あるいは間葉系幹細胞を含む細胞構造体として内包されていてもよい。間葉系幹細胞を含む細胞構造体については、本明細書において後記する。
【００６３】
細胞を内包した第二の袋状構造物は、細胞を高分子溶液に懸濁することによって製造することができる。細胞として膵島を使用する場合には、膵島を高分子溶液に懸濁することによって、膵島を内包した袋状構造物を製造することができる。本発明によれば、膵島を０．５〜４質量％の高分子溶液に懸濁することを含む、膵島を内包した袋状構造物の製造方法であって、膵島１個に対する高分子溶液の容量が０．０２〜２．０μＬである、製造方法が提供される。膵島を懸濁する際の高分子溶液の濃度は、０．５〜４質量％であればよく、１．０〜３質量％が好ましく、１．５〜２．５質量％がより好ましい。膵島１個に対する高分子溶液の容量は０．０１〜２．０μＬであり、０．０５〜０．５μＬが好ましく、０．０７〜０．２μＬがより好ましい。
【００６４】
＜細胞構造体＞
本発明の細胞移植キットには、生体親和性を有する高分子ブロックと細胞とを含む細胞構造体であって、複数個の上記細胞間の隙間に複数個の上記高分子ブロックが配置されている細胞構造体をさらに含めることができる。
【００６５】
生体親和性を有する高分子ブロックと細胞とを用いて、複数個の細胞の隙間に複数個の高分子ブロックをモザイク状に３次元的に配置させることによって、生体親和性高分子ブロックと細胞とがモザイク状に３次元配置されることにより、構造体中で細胞が均一に存在する細胞３次元構造体が形成される。
【００６６】
細胞構造体は、複数個の細胞の隙間に複数個の高分子ブロックが配置されているが、ここで、「細胞の隙間」とは、構成される細胞により、閉じられた空間である必要はなく、細胞により挟まれていればよい。なお、すべての細胞に隙間がある必要はなく、細胞同士が接触している箇所があってもよい。高分子ブロックを介した細胞の隙間の距離、即ち、ある細胞とその細胞から最短距離に存在する細胞を選択した際の隙間距離は特に制限されるものではないが、高分子ブロックの大きさであることが好ましく、好適な距離も高分子ブロックの好適な大きさの範囲である。
【００６７】
また、高分子ブロックは、細胞により挟まれた構成となるが、すべての高分子ブロック間に細胞がある必要はなく、高分子ブロック同士が接触している箇所があってもよい。細胞を介した高分子ブロック間の距離、即ち、高分子ブロックとその高分子ブロックから最短距離に存在する高分子ブロックを選択した際の距離は特に制限されるものではないが、使用される細胞が１〜数個集まった際の細胞の塊の大きさであることが好ましく、例えば、１０μｍ以上１０００μｍ以下であり、好ましくは１０μｍ以上１００μｍ以下であり、より好ましくは１０μｍ以上５０μｍ以下である。
【００６８】
生体親和性高分子ブロックを構成する高分子は、生体に親和性を有するものであれば、生体内で分解されるか否かは特に限定されないが、生分解性材料で構成されることが好ましい。生分解性材料としては、具体的にはポリペプチド、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ＰＬＧＡ（ポリ乳酸−co−グリコール酸）、ヒアルロン酸、グリコサミノグリカン、プロテオグリカン、コンドロイチン、セルロース、アガロース、カルボキシメチルセルロース、キチン、および、キトサンの群から選択される少なくとも１つの材料である。上記の中でも、ポリペプチドが特に好ましい。ポリペプチドの種類は生体親和性を有するものであれば特に限定されないが、例えば、ゼラチン、コラーゲン、エラスチン、フィブロネクチン、プロネクチン、ラミニン、テネイシン、フィブリン、フィブロイン、エンタクチン、トロンボスポンジン、レトロネクチンが好ましく、最も好ましくはゼラチン、コラーゲン、アテロコラーゲンである。本発明で用いるためのゼラチンとしては、天然ゼラチン、又はリコンビナントゼラチンが好ましい。さらに好ましくは、リコンビナントゼラチンである。
【００６９】
細胞構造体の詳細および好ましい態様については、ＷＯ２０１１／１０８５１７号公報、特開２０１４−１２１１４号公報、ＷＯ２０１４／１３３０８１号公報、特開２０１５−１３４１９３号公報およびＷＯ２０１５／１９０４３０号公報に記載されており、上記文献の内容は全て引用により本明細書に取り込むものとする。
【００７０】
細胞構造体における細胞の種類は特に限定されないが、好ましくは体性幹細胞である。
体性幹細胞としては、例えば、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）、造血幹細胞、羊膜細胞、臍帯血細胞、骨髄由来細胞（例えば、骨髄由来間ＭＳＣ等）、心筋幹細胞、脂肪由来幹細胞、または神経幹細胞を使用することができる。上記の中でも、間葉系幹細胞が好ましく、脂肪由来間葉系幹細胞または骨髄由来間葉系幹細胞がより好ましく、脂肪由来間葉系幹細胞がさらに好ましい。なお、間葉系幹細胞とは間葉系組織に存在する体性幹細胞をいい、間葉系組織に属する細胞への分化能を有する。間葉系組織とは、骨、軟骨、脂肪、血液、骨髄、骨格筋、真皮、靭帯、腱、心臓等の組織をいう。
【００７１】
＜板状の細胞非接着性材料＞
本発明の細胞移植キットは、板状の細胞非接着性材料をさらに含んでいてもよい。板状の細胞非接着性材料は、生体内において第一の袋状構造物の周囲に被膜を形成させる工程において、第一の袋状構造物の内部に空間を維持するための材料として使用するためのものである。細胞非接着性材料としては、シリコンが好ましい。
細胞非接着性材料の形状としては、板状であればよく、具体的には直方体または円柱などが挙げられるが、特に限定されない。直方体の大きさとしては、縦０．５ｃｍ〜３ｃｍ、横０．５ｃｍ〜３ｃｍ、および厚さ０．５ｍｍ〜５ｍｍ程度にすることができるが、特に限定されない。
【００７２】
＜使用方法＞
本発明の細胞移植キットの一例を用いて膵島を移植する場合の操作を示す模式図を図１に示す。
細胞移植キットの使用方法としては、第一の袋状構造物を生体内に導入し、生体内に導入された第一の袋状構造物の周囲にレシピエント由来の被膜を形成させ、その後、第一の袋状構造物の中に、複数個の第二の袋状構造物を入れることができる。
本発明の一例においては、細胞非接着性材料を包含した第一の袋状構造物を、腹膜の腹腔側に縫い合わせることにより、第一の袋状構造物を生体内に導入してもよい。
【００７３】
第一の袋状構造物の周囲にレシピエント由来の被膜を形成させる工程において、第一の袋状構造物内に、サイトカイン、間葉系幹細胞、細胞外マトリックスおよびコラーゲンのうちの少なくとも一種を入れてもよい。
第一の袋状構造物に周囲にレシピエント由来の被膜を形成させる工程において、第一の袋状構造物は移植部位に静置すればよいが、筋肉または皮膚への縫合により固定することがより好ましい。
第一の袋状構造物を移植する部位としては、レシピエントの腹腔、皮下または腹膜を挙げることができるが、特には限定されない。
【００７４】
レシピエントとは、移植を受ける生体を意味する。レシピエントは哺乳動物であることが好ましく、ヒトであることがより好ましい。
本発明において、膵島および細胞のドナーとしては同種でもよく、異種でもよい。好ましくは、膵島は異種由来であり、細胞は同種由来である。特に、細胞として間葉系幹細胞を使用する場合には、同種由来の間葉系幹細胞が好ましい。
本発明の細胞移植キットの移植回数は、１回だけ移植してもよいし、必要に応じ２回以上の移植を行うこともできる。
【００７５】
本発明の細胞移植キットは、細胞移植を必要とする疾患の治療のために使用することができる。細胞移植を必要とする疾患の治療としては、例えば、膵臓細胞（β細胞）またはインスリン産生細胞を用いた糖尿病治療、ライソゾーム病関連酵素を分泌する細胞を用いたライソゾーム病治療、およびドーパミン産生細胞を使ったパーキンソン病治療などが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００７６】
＜各種の用途＞
本発明によれば、平均孔径０．２ｍｍ以下の空孔を有する膜からなる第一の袋状構造物を、生体内に導入し、生体内に導入された第一の袋状構造物の周囲にレシピエント由来の被膜を形成させ、その後、第一の袋状構造物の中に、上記第一の袋状構造物の空孔の平均孔径よりも大きい平均長径を有する複数個の第二の袋状構造物であって、上記複数個の第二の袋状構造物のうちの少なくとも一部が、細胞を内包している、複数個の第二の袋状構造物を入れる工程を含む、細胞移植方法が提供される。
【００７７】
本発明によれば、細胞移植を必要とする疾患の治療において使用するための、平均孔径０．２ｍｍ以下の空孔を有する膜からなる第一の袋状構造物と、上記第一の袋状構造物の空孔の平均孔径よりも大きい平均長径を有する複数個の第二の袋状構造物であって、上記複数個の第二の袋状構造物のうちの少なくとも一部が、細胞を内包している、複数個の第二の袋状構造物との組み合わせが提供される。
【００７８】
本発明によれば、細胞移植治療キットの製造のための、細胞移植を必要とする疾患の治療において使用するための、平均孔径０．２ｍｍ以下の空孔を有する膜からなる第一の袋状構造物と、上記第一の袋状構造物の空孔の平均孔径よりも大きい平均長径を有する複数個の第二の袋状構造物であって、上記複数個の第二の袋状構造物のうちの少なくとも一部が、細胞を内包している、複数個の第二の袋状構造物との組み合わせの使用が提供される。
以下の実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明は実施例によって限定されるものではない。
【実施例】
【００７９】
＜実施例１＞ナイロン製の第一の袋状構造物を用いた異種膵島移植の性能評価
（１）第一の袋状構造物の作製
直径２ｃｍの円状に切り出した平均孔径４０μｍのナイロンメッシュ（ＣＯＲＮＩＮＧ，  Ｆａｌｃｏｎ（登録商標）４０μｍセルストレーナー）を２枚重ね、富士インパルス社製茶袋シーラー（Ｔ−２３０Ｋ）を用いて内部に空間ができるように３辺を加熱しシールした。その後、縦１ｃｍ、横１ｃｍおよび厚さ１ｍｍのシリコンを、シールされていない残りの１辺から挿入した後に、シリコンを挿入した辺を、上記シーラーで封止し、第一の袋状構造物を作製した。【００８０】
（２）第一の袋状構造物の周囲への被膜形成
上記（１）で作製した第一の袋状構造物を６週齢のＢａｌｂ／ｃマウスの腹腔内に移植した。移植時は、第一の袋状構造物の端部２か所を腹壁に縫い付けて位置を固定し、第一の袋状構造物周囲へのレシピエント由来の被膜を形成させた。【００８１】
（３）糖尿病マウスの作製
上記（２）において第一の袋状構造物を移植してから３週間後に、ストレプトゾトシン（Ｗａｋｏ社製）をマウス１匹あたり２５０ｍｇ／ｋｇの量で腹腔内に投与した。ストレプトゾトシンの投与１週間後に血糖値が３００ｍｇ／ｄＬの個体を糖尿病発症マウスとして、細胞移植のレシピエントとした。【００８２】
（４）ラット膵島分離
Ｗｉｓｔａｒラットを用意し、１ｍｇ／ｍＬ  Ｃｏｌｌａｇｅｎａｓｅ  ｔｙｐｅ  Ｖ（Ｓｉｇｍａ社製）を膵管から注入し、膵臓を膨化し摘出した。摘出した膵臓を３７℃で消化後、Ｌｙｍｐｈｏｐｒｅｐ（コスモバイオ社製）１０ｍLとＨＢＳＳ（Ｗａｋｏ）１０ｍＬを用いて９００ｇ、２０分間の密度勾配遠心により膵島を純化した。【００８３】
（５）アルギン酸ナトリウムマイクロカプセル化膵島の作製
Ｗｉｓｔａｒラットから単離した膵島を１．８％濃度のアルギン酸ナトリウム溶液（ＢＵＣＨＩ社製）で膵島１個に対して０．０６〜０．１μＬの比に収まるよう溶液に懸濁した。懸濁液全体を、シリンジ２本間で移動することを繰り返すことにより均一に膵島を分散した。ＢＵＣＨＩ社製Ｅｎｃａｐｓｕｌａｔｏｒ  Ｂ−３９５  Ｐｒｏを用いてスターラーを攪拌している１００ｍＭ塩化カルシウム中に滴下しアルギン酸ナトリウムマイクロカプセル化膵島を得た。アルギン酸カプセルは０．０５質量％ｐｏｌｙ−Ｌ−Ｌｙｓｙｎで２分間コートした。【００８４】
（６）アルギン酸ナトリウムカプセル化膵島の評価
作製したカプセルの１０％を抽出し、Ｃｅｌｌ３ｉＭａｇｅｒ（島津製作所）で画像を撮影しＩｍａｇｅＪで画像解析を行った。空のカプセルの割合は、画面内の全カプセル量と空のカプセルをカウントして算出した。カプセルの平均膵島数は画面内の全膵島数と、膵島が入ったカプセル数をカウントして算出した。作製したカプセル中、膵島が含まれない空のカプセルは２６．４％だった。１カプセルあたりの平均膵島数は１．７０個だった。【００８５】
（７）細胞構造体の作製
マウス脂肪由来間葉系幹細胞（ｍＡＤＳＣ）を１０％ＦＢＳ（ウシ胎児血清）含有のＤ−ＭＥＭ培地（ダルベッコ改変イーグル培地）に懸濁し、そこに生体親和性高分子ブロック（５３−１０６μｍ）（特開２０１５−１３４１９３号公報の実施例２に記載のもの）を加えて、最終的にｍＡＤＳＣ（１．２×１０６ｃｅｌｌｓ）と生体親和性高分子ブロック（０．２５ｍｇ）が４ｍＬの培地に懸濁された状態で、細胞非接着性の３５ｍｍディッシュであるＥＺＳＰＨＥＲＥ（登録商標）ディッシュＴｙｐｅ９０３（スフェロイドウェル口径８００μｍ、スフェロイドウェル深さ３００μｍ、スフェロイドウェル数〜約１，２００ウェル。底面が窪み部を有する培養面であり、培養面の周縁に立設される側外壁部を有する。ＡＧＣテクノグラス製）に播種した。上記ディッシュをＣＯ2インキュベーターで３７℃で４８時間静置することで、約１，２００個の均一な細胞構造体を取得した。【００８６】
（８）アルギン酸ナトリウムマイクロカプセル化膵島の移植
上記（３）で作製した糖尿病マウスに第一の袋状構造物を移植してから４週間経過した時点で（図２）、糖尿病マウスを開腹し、被膜に覆われた第一の袋状構造物の１辺を鋏で切り、内部のシリコンを摘出した。シリコンを摘出した後にできた空間に、上記の（５）で得たアルギン酸ナトリウムマイクロカプセル化膵島を移植後、第一の袋状構造物を封止することにより、細胞移植を完了とした（図３）。細胞移植の完了後、マウスの血糖値および体重を経日で観察した。血糖値および体重の推移を図４および図５に示す。【００８７】
（９）アルギン酸ナトリウムマイクロカプセル化膵島と細胞構造体の移植
上記（３）で作製した糖尿病マウスに第一の袋状構造物を移植してから４週間経過した時点で（図２）、糖尿病マウスを開腹し、被膜に覆われた第一の袋状構造物の１辺を鋏で切り、内部のシリコンを摘出した。シリコンを摘出した後にできた空間に、上記の（５）で得たアルギン酸ナトリウムマイクロカプセル化膵島と上記（７）で得た細胞構造体を混合して移植後、第一の袋状構造物を封止することにより、細胞移植を完了とした。細胞移植の完了後、マウスの血糖値および体重を経日で観察した。血糖値および体重の推移を図４および図５に示す。【００８８】
＜比較例１＞
比較例１として、アルギン酸ナトリウムマイクロカプセル化を施さないこと以外は、実施例１の（８）と同様の操作を施して実験を実施した。
その結果、血糖値平均が移植７日時点で２８０．８ｍｇ/ｄL（ＳＤ：１８２．７）、１４日で３１０．６ｍｇ／ｄＬ（ＳＤ：１４４．７）、２１日で４２１ｍｇ／ｄＬ（ＳＤ：１４５．１）、２８日後では３６６ｍｇ／ｄＬ（ＳＤ：１５２．５）であり７日時点で血糖値制御ができないことが分かった。体重は移植日の体重を１００％とした場合、２８日時点で１０１．４％（ＳＤ：１．９）であった。【００８９】
一方、（８）にて実施した、第一の袋状構造物およびアルギン酸ナトリウムマイクロカプセル化膵島を移植した個体では、血糖値平均が移植７日時点で１３０ｍｇ/ｄL（ＳＤ：８０．６）、１４日で２８６ｍｇ／ｄＬ（ＳＤ：１２１．８）、２１日で３１４．８ｍｇ／ｄＬ（ＳＤ：１３８．１）、２８日後では３７１ｍｇ／ｄＬ（ＳＤ：１３２．２）であり、７日以上の血糖値制御が確認されたことから第一の袋状構造物とアルギン酸ナトリウムマイクロカプセル化の構成が治療効果発揮に有用であることが示された。体重は移植日の体重を１００％とした場合、２８日時点で１０６．６％（ＳＤ：２．９）であり、比較例１よりも増加することが分かった。更に（９）にて実施した、細胞構造体を移植したものでは、血糖値平均が移植７日時点で１０６．２ｍｇ/ｄL（ＳＤ：３３．０）、１４日で１８６．２ｍｇ／ｄＬ（ＳＤ：１０３．４）、２１日で２２６．４ｍｇ／ｄＬ（ＳＤ：１０５．７）、２８日後では２４５．８ｍｇ／ｄＬ（ＳＤ：８６．８）であった。移植２８日後においても、血糖値平均が２５０ｍｇ／ｄＬを下回っていることからより強い血糖値正常化作用を持つことが分かった。体重は移植日の体重を１００％とした場合、２８日時点で１１５．８％（ＳＤ：２．９２）であり、比較例１よりも、また実施例中の（８）よりも高い糖代謝機能を有していることが分かった。【００９０】
＜比較例２＞
比較例２として、第一の袋状構造物を用いないこと以外は、実施例１の（８）と同様の操作を施して実験を実施した。
その結果、第一の袋状構造物を用いない移植（比較例２）では血糖値平均が移植７日時点で１０３．６ｍｇ/ｄL（ＳＤ：１２．９）、１４日で４３２ｍｇ／ｄＬ（ＳＤ：４８．１）、２１日で４７０．２ｍｇ／ｄＬ（ＳＤ：３２．９）、２８日後では４８９ｍｇ／ｄＬ（ＳＤ：６４．８）であった。体重は移植日の体重を１００％とした場合、２８日時点で１０３．９％（ＳＤ：８．２）であった。
また、測定２回連続で血糖値２５０ｍｇ／ｍＬ以下の状態を完治と判断し、その完治した割合を完治率と定義し、比較例１、比較例２、実施例中の（８）及び（９）について、完治率を計測し、表１に示した。完治率という視点で見た際には、細胞構造体を含む構成が顕著に高い完治率を示すことが分かった。【００９１】
【表１】
2020138028.tif 000003
【００９２】
（組織標本の観察）
膵島を移植後４週間経過した個体を麻酔下で開腹し、ナイロンメッシュデバイスを被包した組織と縫合した筋肉ごと摘出した。摘出した検体は１０％ホルマリン中性緩衝液（Ｗａｋｏ）で固定した後、パラフィンで包埋し組織標本の切片を作製した。作製した切片にヘマトキシリン・エオジン（ＨＥ）染色と抗インスリン抗体（ａｂｃａｍ）よる免疫染色を行い、組織標本を観察した結果、インスリン陽性領域は、細胞構造体(-)群では僅かに確認された。一方で細胞構造体（＋）群では、多数散見された（図６）。膵島の生存は、細胞構造体(-)群では中心部あるいは全体が壊死した膵島が観察された。一方で細胞構造体（＋）群では中心まで核が染まっている生存した膵島が多数観察された（図７）。炎症反応は、細胞構造体(-)群ではカプセルの周囲に炎症系の免疫細胞が多数存在していたが、細胞構造体(+)群ではカプセル周囲に炎症系細胞はほとんど見られなかった（図８）。【００９３】
組織標本観察結果を表２に示す。インスリン陽性領域数は標本検体あたりの検出されたインスリン陽性領域の数が０：×、  １〜４：△、  ５〜：〇とした。膵島生存は標本検体あたりの核が染色された膵島数が０：×、  １〜４：△、  ５〜：〇とした。カプセル周囲の炎症は検体の組織標本に占める炎症細胞の領域の面積が０〜２０％未満：〇、  ２０〜５０％未満：△、  ５０〜１００％：×とした。【００９４】
【表２】
2020138028.tif 000004
【図１】
2020138028.tif 000005
【図２】
2020138028.tif 000006
【図３】
2020138028.tif 000007
【図４】
2020138028.tif 000008
【図５】
2020138028.tif 000009
【図６】
2020138028.tif 000010
【図７】
2020138028.tif 000011
【図８】
2020138028.tif 000012
【手続補正書】
【提出日】令和2年4月9日(2020.4.9)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
平均孔径０．２ｍｍ以下の空孔を有する膜からなる第一の袋状構造物と、前記第一の袋状構造物の空孔の平均孔径よりも大きい平均長径を有する複数個の第二の袋状構造物とを含む、細胞移植キットであって、前記複数個の第二の袋状構造物のうちの少なくとも一部が、細胞を内包している、細胞移植キット。
【請求項２】
第一の袋状構造物の材料が、ナイロン、ポリスルホン、ポリテトラフルオロエチレン、ポリウレタン、ポリエステル、塩化ビニル、ポリカーボネート、アクリル、ステンレス、チタン、シリコン、または２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリンを含む、請求項１に記載の細胞移植キット。
【請求項３】
第一の袋状構造物の材料が、ナイロンまたはポリスルホンを含む、請求項１または２に記載の細胞移植キット。
【請求項４】
第二の袋状構造物の材料が、多糖ヒドロゲル、ポリペプチド、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、乳酸・グリコール酸コポリマー、ヒアルロン酸、グリコサミノグリカン、プロテオグリカン、コンドロイチン、セルロース、アガロース、カルボキシメチルセルロース、キチン、キトサン、アルギン酸、アルギン酸ナトリウム、アルギン酸カルシウム、アルギン酸カリウム、アルギン酸バリウム、アルギネート、ポリリジンの層状マトリックス、ポリオルニチンの層状マトリックス、光重合ポリマー、ポリアクリレート、ヒドロキシエチルメタクリレート、メチルメタクリレート、シリコン、ポリエーテルスルホンメンブレン、アクリロニトリル−コ−塩化ビニル  またはこれらの組み合わせを含む、請求項１から３の何れか一項に記載の細胞移植キット。
【請求項５】
第二の袋状構造物の材料が、アルギン酸ナトリウムを含む、請求項１から４の何れか一項に記載の細胞移植キット。
【請求項６】
前記複数個の第二の袋状構造物のうちの少なくとも一部は、細胞を内包していない、請求項１から５の何れか一項に記載の細胞移植キット。
【請求項７】
第二の袋状構造物のうち細胞を内包していないものの割合が５０％以下である、請求項１から６の何れか一項に記載の細胞移植キット。
【請求項８】
細胞が、細胞集合体である、請求項１から７の何れか一項に記載の細胞移植キット。
【請求項９】
細胞集合体が膵島である、請求項８に記載の細胞移植キット。
【請求項１０】
細胞集合体を内包している第二の袋状構造物について、１個の第二の袋状構造物に内包される細胞集合体の平均個数が１．０個以上５．０個以下である、請求項８または９に記載の細胞移植キット。
【請求項１１】
第一の袋状構造物の空孔の平均孔径が５０μｍ以下である、請求項１から１０の何れか一項に記載の細胞移植キット。
【請求項１２】
第一の袋状構造物の空孔の平均孔径が１μｍ以下である、請求項１から１１の何れか一項に記載の細胞移植キット。
【請求項１３】
第一の袋状構造物の内部に間葉系幹細胞を含む、請求項１から１２の何れか一項に記載の細胞移植キット。
【請求項１４】
生体親和性を有する高分子ブロックと細胞とを含む細胞構造体であって、複数個の前記細胞間の隙間に複数個の前記高分子ブロックが配置されている細胞構造体をさらに含む、請求項１から１３の何れか一項に記載の細胞移植キット。
【請求項１５】
前記細胞構造体を第一の袋状構造物と第二の袋状構造物との間に含む、請求項１４に記載の細胞移植キット。
【請求項１６】
前記細胞構造体に含まれる細胞が間葉系幹細胞である、請求項１４または１５に記載の細胞移植キット。
【請求項１７】
板状の細胞非接着性材料をさらに含む、請求項１から１６の何れか一項に記載の細胞移植キット。
【請求項１８】
第一の袋状構造物を生体内に導入し、生体内に導入された第一の袋状構造物の周囲にレシピエント由来の被膜を形成させ、その後、第一の袋状構造物の中に、複数個の第二の袋状構造物を入れる、請求項１から１７の何れか一項に記載の細胞移植キット。
【請求項１９】
細胞非接着性材料を包含した第一の袋状構造物を、腹膜の腹腔側に縫い合わせることにより、第一の袋状構造物を生体内に導入する、請求項１８に記載の細胞移植キット。
【請求項２０】
請求項１から１９の何れか一項に記載の細胞移植キットを含む、糖尿病治療剤。
【請求項２１】
糖尿病の治療における使用のための請求項１から１９の何れか一項に記載の細胞移植キット。
【請求項２２】
膵島を１．０〜３質量％の高分子溶液に懸濁することを含む、膵島を内包した袋状構造物の製造方法であって、膵島１個に対する高分子溶液の容量が０．０５〜０．５μＬである、製造方法。
【国際調査報告】
2020138028.tif 000013
2020138028.tif 000014
2020138028.tif 000015
2020138028.tif 000016
2020138028.tif 000017
2020138028.tif 000018