(57)【要約】  塩味増強剤の有効成分のスクリーニング方法であって、下記の工程を含むスクリーニング方法：（ｉ）被験物質が、TMC4遺伝子又はTMC4タンパク質の機能発現を亢進できる化合物であるか否かを判定する工程、および（ｉｉ）前記工程（ｉ）においてTMC4遺伝子又はTMC4タンパク質の機能発現を亢進できる化合物であると判定された被験物質を、塩味増強剤の有効成分として選択する工程。【特許請求の範囲】
【請求項１】
塩味増強剤の有効成分のスクリーニング方法であって、下記の工程を含むスクリーニング方法：
（ｉ）被験物質が、TMC4遺伝子又はTMC4タンパク質の機能発現を亢進できる化合物であるか否かを判定する工程、および
（ｉｉ）前記工程（ｉ）においてTMC4遺伝子又はTMC4タンパク質の機能発現を亢進できる化合物であると判定された被験物質を、塩味増強剤の有効成分として選択する工程。
【請求項２】
TMC4遺伝子又はTMC4タンパク質の機能発現を亢進できる化合物を含む、塩味増強剤。
【請求項３】
前記化合物が食品由来の成分である請求項２に記載の塩味増強剤。
【請求項４】
TMC4遺伝子がノックアウトされた非ヒト動物である、高塩濃度に対する嗜好性を有するモデル動物。
【請求項５】
マウスである、請求項４に記載のモデル動物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、主に塩味増強剤のスクリーニング方法、塩味増強剤及び高塩濃度に対する嗜好性を有するモデル動物に関する。
【背景技術】
【０００２】
味覚は、五感の１つに上げられる感覚であり、口腔内上皮に分布する味蕾で感覚を受容する。その刺激は、鼓索神経、舌咽神経を介して脳の味覚野に投射し認知される。【０００３】
主要な味覚として5基本味（甘味、旨味、苦味、酸味、塩味）が知られている。甘味、旨味、苦味については味細胞のII型細胞にあるGタンパク質共役受容体（G protein-coupled receptor、GPCR）がその受容体であることが知られている。酸味については、ジフテリア毒素を用いた実験から酸味受容体はIII型細胞にあるということが分かっているが、その主たる受容体は未だ解明されていない。【０００４】
塩味は、食塩（塩化ナトリウム（NaCl）が主要成分）の味であり、NaClが口腔内で溶解、電離したNa+イオンとCl-イオンを舌で感知することによって生じる感覚である。【０００５】
塩味受容分子を担う分子として、カチオンでは、アミロライド感受性（AS）の上皮性Na+ チャネルであるepithelial sodium channel（ENaC）αβγが、舌の前方部にある茸状乳頭のI型細胞にヘテロ三量体で発現し、低濃度の塩（嗜好性）を受容すると報告されている（非特許文献１）。【０００６】
また、高濃度の塩（忌避性）の受容分子として、Transient receptor potential cation channel subfamily V member 1（TRPV1）のスプライシングバリアントであるTRPV1tが候補に挙げられている（非特許文献２）。【０００７】
また、アニオンのCl-を受容する分子についての報告はこれまでない。【０００８】
ENaC αβγが茸状乳頭のI型細胞のみで発現していることから、塩味受容は、味細胞のI型細胞で受容するとこれまで考えられてきた。しかし近年、II型細胞とIII型細胞との共役で塩味を受容しているとする説もあり、どの細胞が塩味を受容するかについて議論の決着はついていない（非特許文献３）。【０００９】
NaClは、生物にとって重要な栄養成分であり、水分バランスの恒常性やpH、浸透圧、神経コンダクタンスの調節など人体において様々な働きを担っている。しかしNa+の過剰摂取は胃がんや高血圧のリスクと深くリンクしているとされ、食事から摂取する塩分を減じることが望まれている。この方法として単純に食事中のNaClを減少する方法では、薄味となり、満足感を得ることができない。そこで、塩味受容体を探索し、その受容体を活性化させ、塩濃度はそのままであるが塩味を強く感じさせる塩味増強剤の開発が望まれている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Chandrashekar et al., Nature. 2010 Mar 11; 464(7286): 297-301.
【非特許文献２】Lyall et al., J Physiol. 2004 Jul 1; 558(Pt 1): 147-159.
【非特許文献３】Oka et al., Nature. 2013 Feb 28;494(7438):472-475.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明は、塩味増強剤のスクリーニング方法、塩味増強剤及び高塩濃度に対する嗜好性を有するモデル動物の提供を課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意検討を行ったところ、機能未知であったTMC4タンパク質が塩味受容に関与することを見出した。本発明は、これらの知見に基づいて、更に改良を重ねることにより完成したものである。【００１３】
即ち、本発明は、下記に掲げる態様の発明を提供する。【００１４】
項１、塩味増強剤の有効成分のスクリーニング方法であって、下記の工程を含むスクリーニング方法：
（ｉ）被験物質が、TMC4遺伝子又はTMC4タンパク質の機能発現を亢進できる化合物であるか否かを判定する工程、および
（ｉｉ）前記工程（ｉ）においてTMC4遺伝子又はTMC4タンパク質の機能発現を亢進できる化合物であると判定された被験物質を、塩味増強剤の有効成分として選択する工程。【００１５】
項２、TMC4遺伝子又はTMC4タンパク質の機能発現を亢進できる化合物を含む、塩味増強剤。【００１６】
項３、前記化合物が食品由来の成分である項２に記載の塩味増強剤。【００１７】
項４、TMC4遺伝子がノックアウトされた非ヒト動物である、高塩濃度に対する嗜好性を有するモデル動物。
項５、マウスである、項４に記載のモデル動物。
【発明の効果】
【００１８】
本発明により、新規な塩味増強剤のスクリーニング方法及び塩味増強剤が提供される。【００１９】
本発明により提供される塩味増強剤により、塩濃度を抑制しつつ塩味を強く感じさせ、飲食時に十分な満足感を得ることが可能となる。また、本発明のスクリーニング方法及びモデル動物は、研究開発のツールとして有用であり、食品産業及び健康科学のさらなる発展に貢献することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】In situ hybridizationの染色像を示す。CvP：有郭乳頭（Circumvallate papillae）、FoP：葉状乳頭（Foliate papillae）、FuP：茸状乳頭（Fungiform papillae）。スケールバー：50μｍ。
【図２】Whole cell patch clamp assayの結果を示す。
【図３】Brief access testの結果を示す。
【図４】塩味増強剤であるアルギニン塩酸塩（Arg-HCl）を用いた塩味増強効果測定の結果の例を示す。
【図５】塩味に影響を与えないスクロース及びマルトースを用いた塩味増強効果測定の結果の例を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
TMC4遺伝子、TMC4タンパク質
TMC（transmembrane channel like）4遺伝子は、公知の遺伝子であり、TMC4タンパク質は公知のタンパク質である。TMC4タンパク質は、TMCタンパク質の１種である。TMC タンパク質は、8回膜貫通領域を有し、細胞内にN末端及びC末端が存在する膜タンパク質である。TMCタンパク質は、TM5とTM6間にTMCモチーフという共通領域を有する。哺乳類において、TMCタンパク質は配列上、アノクタミンファミリーに属する。
【００２２】
例えば、ヒト（Homo sapiens）及びマウス（Mus musculus）のTMC4遺伝子のcDNAの塩基配列及びTMC4タンパク質のアミノ酸配列は、米国生物工学情報センター（NCBI; National Center for Biotechnology Information）が提供するGenBankに、下記のアクセッション番号で登録されている（複数のリビジョン（revision）が登録されている場合、最新のリビジョンを指すと理解される。）：
ヒトTMC4遺伝子：NM_001145303（NM_001145303.2）、NM_144686（NM_144686.3）、BC025323（BC025323.1）
ヒトTMC4タンパク質：NP_001138775（NP_001138775.2）、NP_653287（NP_653287.2）
マウスTMC4遺伝子：.NM_181820（NM_181820.2）
マウスTMC4タンパク質：NP_861541（NP_861541.2）。
【００２３】
塩味増強剤
本発明の塩味増強剤は、TMC4遺伝子又はTMC4タンパク質の機能発現を亢進できる化合物を含む。
【００２４】
本発明にいう塩味増強剤とは、それ自身で塩味を呈することはないが、同時に存在している塩化ナトリウム（NaCl、食塩）の塩味を増強する効果を有する物質をいう。
【００２５】
TMC4遺伝子又はTMC4タンパク質の機能発現を亢進できる化合物は、TMC4遺伝子又はTMC4タンパク質の機能発現を亢進できる範囲内において、あらゆる化合物を用いることができる。TMC4遺伝子又はTMC4タンパク質の機能発現を亢進できる化合物として、TMC4タンパク質に対する特異的な活性化剤およびTMC4遺伝子の発現を亢進できる核酸などが例示されるが、これに限定されるものではない。
【００２６】
ここで、「TMC4遺伝子又はTMC4タンパク質の機能発現を亢進」とは、TMC4遺伝子又はTMC4タンパク質の機能発現を亢進するあらゆる態様を指し、例えばTMC4タンパク質の機能を活性化すること、TMC4タンパク質の発現を亢進すること（TMC4遺伝子の転写の亢進、TMC4タンパク質の翻訳の亢進など）などが例示されるが、これに限定されるものではない。TMC4タンパク質の機能を活性化する態様としては、Cl-イオンのチャネルであると考えられるTMC4タンパク質を介したCl-イオンの細胞内への流入促進が挙げられる。
【００２７】
TMC4タンパク質のアゴニストは、本発明の好ましい態様の１つである。
【００２８】
また、「TMC4遺伝子の発現を亢進できる」とは、TMC4遺伝子の転写促進、TMC4タンパク質ヘの翻訳促進などのTMC4タンパク質の発現量が亢進する態様（すなわち、TMC4タンパク質の発現量が増大する態様）が例示されるが、これに限定されるものではない。
【００２９】
TMC4遺伝子又はTMC4タンパク質の機能発現を亢進できる化合物は、例えば後述のスクリーニング方法により取得することができる。
【００３０】
上記TMC4タンパク質の機能発現を亢進できる化合物は、１種単独でまたは２種以上を組み合わせて用いることができる。
【００３１】
本発明の塩味増強剤は、例えば食品（食品組成物）等として提供されることができる。また、食品由来成分、例えば、食品の代謝物又は化学的若しくは物理的分解物（糖、アミノ酸、ペプチド、脂質等又はこれらの複合体等）として提供されることも可能である。
【００３２】
本発明の塩味増強剤が食品組成物として提供される場合、有効成分であるTMC4遺伝子又はTMC4タンパク質の機能発現を亢進できる化合物を飲食品に添加した形態に調製することができる。飲食品の形態は特に限定されるものではないが、醤油、味噌、ソース、ケチャップ等の調味料、動植物タンパク加水分解物（ＨＡＰ，ＨＶＰ）、酵母エキス、アミノ酸、ペプチド等を主成分とする調味料、ダシのもとや麺つゆ、タレ、ルー、ドレッシング等の食品の味付けに用いる調味食品、麺類やパン、スナック菓子等の穀類加工品、ハムソーセージ、魚肉練製品等の蓄肉魚肉加工品、スープ、漬物、惣菜類等が挙げられる。また、飲食品には、熱湯や水を加えることで調理可能な即席食品（例えば、粉末および液体即席めん用スープ、即席のコンソメスープ、ポタージュスープ、中華スープ、味噌汁、吸い物、汁物タイプの即席麺など）が含まれる。
【００３３】
さらに、当該食品組成物の生体内における代謝の過程で生じる物質（糖、アミノ酸、ペプチド、脂質等）として提供されることも可能である。
【００３４】
本発明の塩味増強剤における有効成分であるTMC4遺伝子又はTMC4タンパク質の機能発現を亢進できる化合物の含有量は、一般に、０．０１〜１００重量％の範囲である。
【００３５】
本発明の塩味増強剤は、塩化ナトリウム１００重量部に対して１〜１５重量部の存在比又は含有比で使用することができる。
【００３６】
本発明は、以下の態様をも含む：
TMC4遺伝子又はTMC4タンパク質の機能発現を亢進できる化合物の、塩味増強剤としての使用。
塩味増強剤としての使用するための、TMC4遺伝子又はTMC4タンパク質の機能発現を亢進できる化合物。
塩味増強剤を製造するための、TMC4遺伝子又はTMC4タンパク質の機能発現を亢進できる化合物の使用。
【００３７】
スクリーニング方法
本発明のスクリーニング方法は、下記の工程を含む、：
（ｉ）被験物質が、TMC4遺伝子又はTMC4タンパク質の機能発現を亢進できる化合物であるか否かを判定する工程、および
（ｉｉ）前記工程（ｉ）においてTMC4遺伝子又はTMC4タンパク質の機能発現を亢進できる化合物であると判定された被験物質を、塩味増強剤の有効成分として選択する工程。
【００３８】
上記工程（ｉ）により、スクリーニング対象の被験物質が、TMC4遺伝子又はTMC4タンパク質の機能発現を亢進できる化合物であるか否かが判定される。
【００３９】
上記被験物質は、塩味増強剤の有効成分の候補化合物となり得る化合物であれば、特に限定されるものではない。上記被験物質は、天然化合物（例えば、生体由来物質）または合成化合物のいずれであってもよい。好ましくは、上記被験物質は、食品由来の化合物である。上記被験物質の具体例として、低分子化合物、抗体などのタンパク質、核酸（例えば、siRNA、shRNA、dsRNA、miRNA等）、糖鎖もしくは複合糖質なども挙げられる。
【００４０】
上記TMC4遺伝子又はTMC4タンパク質の機能発現を亢進できる化合物であるか否かを判定するための手段は、判定の対象とする被験物質、および、亢進が判定されるTMC4遺伝子又はTMC4タンパク質の機能発現などに応じて、目的が達成される範囲内において、当業者が公知のおよび将来開発されるあらゆる手段の中から、適宜選択することができる。
【００４１】
例えば、これらのTMC4遺伝子を細胞内に導入してTMC4タンパク質を発現する培養細胞（例えば、HEK293Tなど）、両生類卵母細胞（例えば、アフリカツメガエル卵母細胞など）等、又は、TMC4タンパク質を組み込んだ人工脂質膜に被験物質を作用させ、応答を観測する手法が挙げられる。
【００４２】
応答を観測する手法の具体例としては、パッチクランプ法（例えばセルアタッチ法、インサイドアウト法、ホールセル法など）、全細胞電流の測定、放射標識イオン流束アッセイ、並びに膜電位感受性色素及びイオン感受性色素を用いた蛍光アッセイが挙げられる。これらの手法を具体的に実施する方法は、当業者に周知である。
【００４３】
パッチクランプ法及び全細胞電流の測定においては、TMC4タンパク質を発現する細胞に流入するイオン変化を、電流または電圧の変化として検出することができる。
【００４４】
放射標識イオン流束アッセイにおいては、放射性同位体イオンを用いて、TMC4タンパク質を発現する細胞に流入するイオンの変化を検出することができる。膜電位感受性色素及びイオン感受性色素を用いた蛍光アッセイにおいては、TMC4を発現する細胞内に流入するイオンを蛍光強度の変化として検出することができる。蛍光強度の変化は、例えばプレートリーダーを用いて測定することがきる。
【００４５】
これらの方法において、TMC4タンパク質を介したCl-イオンの細胞内への流入を促進する化合物を、TMC4タンパク質の機能発現を亢進できる化合物として選択することができる。
【００４６】
また、TMC4タンパク質のアミノ酸配列に基づく構造モデルを用いた構造活性相関シミュレーションにより、TMC4タンパク質の機能発現を亢進できる化合物であるか否かの判定を行うこともできる。例えば、TMC4タンパク質の立体構造モデルを構築し、孔領域を活性化するリガンドを立体構造モデルとのドッキングシミュレーションからスクリーニングすることができる。
【００４７】
例えば、TMC4タンパク質の分子活性に影響を与える立体構造領域部位と、ドッキングしたときの合致度が高い化合物を、TMC4タンパク質の機能発現を亢進できる化合物として選択することができる。具体的には、（１）TMC4タンパク質と類似の性質を有し、その立体構造が明らかにされているタンパク質とTMC４タンパク質とのアライメントに基づいて、分子活性に影響を与える立体構造領域部位を推定し、その構造に合致するリガンドを立体構造領域部位とのドッキングシミュレーションを行いスクリーニングする方法；
（２）前記のTMC4タンパク質と類似の性質を有しその立体構造が明らかにされているタンパク質を活性化する化合物（リガンド）が知られている場合、当該リガンドの立体構造に基づいてドッキングシミュレーションを行い、当該リガンドにおけるTMC4タンパク質の構造領域に作用する領域を類推し、ドッキング部位の立体構造に基づいてよりTMC4タンパク質を活性化させるリガンド構造をスクリーニングする方法が挙げられる。
【００４８】
当該工程において、アルギニンまたはその塩（例えば、アルギニン塩酸塩）などの公知の塩味増強剤を対照として使用し、対照よりもTMC4遺伝子又はTMC4タンパク質の機能発現の亢進の程度が大きい被験物質を選別することもできる。
【００４９】
次いで、上記工程（ｉｉ）により、塩味増強剤の有効成分が選択される。
【００５０】
モデル動物
本発明において高塩濃度に対する嗜好性を有するモデル動物として使用される非ヒト動物は、TMC4遺伝子がノックアウトされた非ヒト動物である。
【００５１】
上記非ヒト動物は、非ヒトであって実験動物として使用できるものであれば、如何なる種の動物でもよいが、好ましくは齧歯目動物、更に好ましくはマウスである。
【００５２】
本明細書において、「TMC4遺伝子がノックアウトされた」とは、上記に記載したTMC4遺伝子の塩基配列の改変等により、TMC4遺伝子の発現産物が全く発現しないか、または発現しても正常なTMC4遺伝子産物が有する機能を示すことができず、TMC4遺伝子の機能が欠損している状態を指す。
【００５３】
本発明で使用される非ヒト動物は、TMC4遺伝子がノックアウトされたものである限り、TMC4遺伝子の機能を欠損させる具体的態様については、特に制限されないが、例えば、TMC4遺伝子の少なくとも一部が改変されている、或いはTMC4遺伝子のプロモーターが不活性化されている等の態様が含まれる。
【００５４】
本明細書において、「TMC4遺伝子の少なくとも一部が改変」とはTMC4遺伝子の塩基配列の少なくとも一部に、欠失、置換又は付加を生じさせる改変を加えることをいう。TMC4遺伝子をノックアウトさせるためには、TMC4遺伝子に対して欠失、置換及び付加の内、１又は２以上の変異を組み合わせてもよい。
【００５５】
また、本明細書においてTMC4遺伝子の塩基配列の少なくとも一部を「欠失」させるとは、TMC4遺伝子の一部または全部を欠失させることにより、TMC4遺伝子の発現産物がTMC4タンパク質として機能が発現しないように改変することをいう。本明細書においてTMC4遺伝子の塩基配列の少なくとも一部を「置換」するとは、TMC4遺伝子の一部又は全部をTMC4遺伝子とは関係のない別個の配列に置換することにより、TMC4遺伝子の発現産物がTMC4タンパク質として機能が発現しないように改変することをいう。さらに、本明細書においてTMC4遺伝子の塩基配列の少なくとも一部に「付加」するとは、TMC4遺伝子中にTMC4遺伝子以外の配列を付加することにより、TMC4遺伝子の発現産物がTMC4タンパク質として機能が発現しないように改変することをいう。
【００５６】
本発明で使用されるTMC4遺伝子がノックアウトされた非ヒト動物は、TMC4遺伝子における対立遺伝子（アリル）のいずれか一方がノックアウトされているヘテロ接合体のノックアウト動物であってもよく、また対立遺伝子の双方の機能がノックアウトされているホモ接合体のノックアウト動物であってもよい。
【００５７】
本発明で使用される非ヒト動物は、雌又は雄のいずれであってもよい。
【００５８】
TMC4遺伝子がノックアウトされた非ヒト動物は、公知の手法により作製することができる。このような手法として、TALEN法、CRISPR/Cas9法などのゲノム編集技術、並びに、相同組み換え法による遺伝子破壊技術が挙げられるが、これに限定されない。
【００５９】
TMC4遺伝子がノックアウトされた非ヒト動物は、後述の実施例で実証するように高塩濃度に対する嗜好性を示すため、このような嗜好性のモデル動物として使用することができる。
【００６０】
本発明は、以下の態様をも含む：
TMC4遺伝子がノックアウトされた非ヒト動物の、高塩濃度に対する嗜好性を有するモデル動物としての使用。
高塩濃度に対する嗜好性を有するモデル動物としての使用するための、TMC4遺伝子がノックアウトされた非ヒト動物。
【実施例】
【００６１】
以下、実施例により本発明をより詳細に説明する。これらの実施例は、本発明を限定するものではない。【００６２】
［実施例１］TMC4の発現パターン
口腔内の味蕾を持つ組織（有郭乳頭、葉状乳頭、茸状乳頭）でのTMC4の局在確認をIn situ hybridizationを用いて行った。【００６３】
＜方法＞
In situ hybridization
野生型C57BL/6J（B6）マウス（日本クレアから購入）7週齢以上のオスを用いた。マウスは頸椎脱臼により安楽死させた後、舌から乳頭周辺上皮を摘出し、クリオモルド1号（サクラファインテック）の中にO.C.T.コンパウンド（サクラファインテック）で包埋し、液体窒素を用いて凍結した。凍結ブロックは、7μmに薄切りし、MASコートスライドグラス（松浪硝子）に張り付けた。【００６４】
ジゴキシゲニン標識アンチセンスRNAを、DIG RNA labeling mix（Roche Diagnostics）を用いてT3 RNA Polymerase（Stratagene）でin vitro転写反応を行い合成した。その後、Alkaline Sizing Buffer（42 mM NaHCO3、63 mM Na2CO3）で65℃55分間処理し、加水分解反応によりアンチセンスRNAを150塩基程度に断片化しRNAプローブとした。【００６５】
作成した有郭、茸状、葉状乳頭凍結切片に冷風を15分当てて切片を乾燥させた後、4%PFA / PBS溶液中で15分間固定し、0.1% DEPC / PBS溶液で2回洗浄した。プローブを浸透しやすくするために、Proteinase K（1μg/ml、Invitrogen）を含むTBS溶液で5分間処理し、さらに0.1%DEPC / PBS溶液で洗浄した。そして、1.17%トリエタノールアミンと0.25％無水酢酸を含むDEPC水に切片を浸し、アセチル化を行った。DEPC水で洗浄後、切片の周りが乾く程度に乾燥させ、プレハイブリダイゼーション溶液（50%ホルムアミド、5×SSC、Fish Sperm DNA（40 μg/ml））に浸し、58℃、湿箱中で2時間プレハイブリダイゼーションを行った。その後、ハイブリダイゼーション溶液（50%ホルムアミド、5×SSC、5×Denhardt's液、Yeast RNA（0.25 mg/ml）、1 mM DTT、Fish Sperm DNA（0.5 mg/ml））に85℃で3分間処理した。これを切片上に滴下し、パラフィルムを被せて58℃で1晩ハイブリダイゼーションを行った。ハイブリダイゼーション後、58℃の5×SSCで5分間×2回、0.2×SSCで30分間×2回、洗浄した。TBS溶液で5分間洗浄し、ブロッキング溶液（0.1% Blocking Reagent（Roche Diagnostic）/ TBS）に室温で1時間程度浸してブロッキングを行った後、アルカリホスファターゼ標識抗ジゴキシゲニン抗体（0.1 μl/ml、Roche Diagnostic）を加えたブロッキング溶液中で室温1時間、抗原抗体反応を行った。TBS溶液で15分間×3回洗浄し、アルカリホスファターゼバッファー（100 mM Tris-HCl（pH9.5）、100 mM NaCl、50 mM MgCl2）に5分間浸した。【００６６】
その後発色基質としてNBT（Nitro-blue Tetrazolium）/ BCIP（5-Bromo-4-chloro-3-indolyl phosphatase p-toluidine salt）溶液（Roche Diagnostics）を滴下して、室温で1晩発色反応を行った。アルカリフォスターゼバッファーで5分間洗浄して発色を止めた後、超純水に5分間浸した。これを乾燥させ、Fluoromount（Sigma）を用いてカバーガラスをかけ封入し、プレパラートを作製した。顕微鏡BX51（Olympus）で観察、冷却CCDカメラDP73（Olympus）で画像を取得した。【００６７】
＜結果＞
結果を図１に示す。TMC4は有郭乳頭（Circumvallatepapillae、CvP）、葉状乳頭（Foliatepapillae、FoP）の味蕾特異的に強く局在していることが明らかとなった。【００６８】
［実施例２］TMC4の電気生理学的性質
TMC4の電気生理学的性質を調べるために、TMC4を発現するHEK293T細胞を用いてWhole cell patch clamp assay（全細胞記録）を行った。【００６９】
＜方法＞
プラスミド及び発現タンパク質
マウスTMC4（mTMC4）をHEK293T細胞に発現させるために、CMVプロモーターを持つプラスミドベクター pIRES2 -AcGFP1（Clontech社）を用いた。pIRES2-AcGFP1 の制限酵素EcoR1サイトとNot1サイト間にmTMC4（accession NM_181820.2の配列をマウスの有郭乳頭上皮由来のcDNAからクローニング）を挿入した発現コンストラクトを、1 μg/35mm dishの割合で遺伝子導入を行った。遺伝子導入試薬にはLipofectamine（商標）LTX Reagent with PLUS＆ Reagent（商標）（Thermo Fisher社）を用いた。また蛍光指示を目的としてpEGFP-N1（Clontech社）を0.1 μg/35mm を同時に遺伝子導入した。【００７０】
遺伝子導入した細胞を18mm丸ガラス（松浪硝子）に播種し、再度インキュベーター内（37℃、CO2濃度5体積%）で培養した。全ての実験は、HEK293T細胞に遺伝子導入後24-36時間の間に行った。【００７１】
パッチクランプ法（Patch-clamp recording）
HEK293T細胞を用いたwhole cell patch-clamp recordingにおいて、増幅器としてAxopatch 200B（Molecular Devices）を用いて、Digidata 1550（Axon Instruments、Union City、CA、USA）からデジタルデータを取得した。取得したデータは、ソフトウェアpCLAMP 10.2（Axon Instruments）を使用し解析を行った。【００７２】
GD-1.5芯入りガラス管（NARISHIGE）をマイクロピペットプラ―P-97/IVF（SUTTER社）を使って加工し、ガラス電極を作成した。電極抵抗は3-5MΩになるように調整した。【００７３】
測定は、mTMC4発現細胞の膜電位を-60mVに固定し、細胞外液を順に灌流しながら行った。各細胞外液に対して10mV間隔で-100mVから+100mVのstep-pulse（400 ms）を与えてI-Vカーブを作成し、異なる細胞外液によるmTMC4の電圧電流特性を測定した。また細胞外液を瞬間的に置換する場合は、-60mVに電圧固定した細胞に5秒毎に±100mVのランプ波を300ms与えながらマイクロフィルCMF28GxxL（WPI）を用いたパフュージョンによる液の置換を行った。全ての測定は、25℃で行った。【００７４】
パッチクランプ法において用いた細胞内液（Pipette solution）の組成を表１に、及び細胞外液（Bath solutions）の組成を表２にそれぞれ示す。なお、表２には、実施例４で用いた細胞外液の組成も記載した。【００７５】
細胞内液（Pipette solution）は、NMDG（N-Methyl-D-glucamine）を用いてpH7.4に調整した。細胞内液のそれぞれについて、浸透圧は約270mosmol / kgに調整した。【００７６】
細胞外液（Bath solutions）は、NMDG-OHを用いてpH7.4に調整した。細胞外液のすべてについて、浸透圧を約290mosmol / kgに調整した。【００７７】
【表１】
2019131936.tif 000002
【００７８】
【表２】
2019131936.tif 000003
【００７９】
＜結果＞
結果を図２に示す。【００８０】
細胞外液のNaCl（134 mM）を段階的にNa-Gluconate（グルコン酸ナトリウム）に置換し、100 mM Cl-（NaCl 100mM,Na-Gluconate 34 mM）、50mMCl-（NaCl 50mM Na-Gluconate 84 mM）、134 mM Na-Gluconate（0 mM Cl-）と外液を変化させた。すると、外向きCl-電流の大きさがCl-濃度の低下に伴って減少した。Cl-を完全にGluconateに置換した場合も外向き電流は消失しなかった。しかしCl-チャネル阻害剤であるNPPB 100μMを134mM NaClバッファーに加えると、電流が完全に消失した。このことからTMC4は、gluconateのような大きい分子も通過するポアサイズをもった外向き整流性Cl-チャネルである可能性が示された。【００８１】
［実施例３］TMC4遺伝子のノックアウトマウス
TMC4の塩味受容行動への影響を観察するために、TMC4遺伝子のノックアウトマウス(KO)を作成しリック解析実験（Brief access test）行った。【００８２】
＜方法＞
TMC4 KOマウス
動物実験は、承認を受け、動物実験実施マニュアルを順守し行った。【００８３】
TMC4 KOマウスは、C57BL / 6Jマウスを遺伝的背景としTALEN法により作製した（株式会社特殊免疫研究所）。TMC4 KOマウスのファウンダーマウスを戻し交配した後、マウス尾から抽出したDNAを用いてTMC4ゲノム配列のシークエンス解析し、フレームシフトの有無を調べた。TMC4 KOマウスの内、ヘテロ接合性マウス(+/-)を交配することによって生成した同腹仔WT(+/+)、KO(-/-)共に雄、7週齢以上を使用した。マウスに通常の食餌（Lab MR Breeder、日本農産工業）を与え、22±1℃の一定温度下、12時間の明暗サイクル下で飼育した（午前8時に点灯）。【００８４】
リック解析実験（Brief access test）
リック解析実験は、実験動物に味溶液を短時間提示し、飲み口を舐める回数（リック数）をカウントする方法であり、摂食後効果（post-ingestive effects）を除いた味の認知のみ（脳を介す）を測定することができる試験である。【００８５】
TMC4 KOマウス(-/-、7週齢以上、n=7) 及びそれらの野生型の同腹仔（+/+、7週齢以上、n=9）を用いた。甘味、旨味、苦味、酸味、塩味の5味質について水と比較したテストを行った。甘味、旨味（閾値以上になると好んで摂取する味）の試験については自由摂食下で4時間絶水させた後に試験をおこなった。苦味、酸味、塩味（閾値以上になると忌避する味）の試験日については、自由摂食下で23時間絶水させた後に試験をおこなった。嗜好性を想定した塩味については、利尿剤であるフロセミドをマウスの体重あたり50mg/kg皮下注射し、6時間絶食及び絶水をさせた。【００８６】
飲水制限による健康状態への影響を可能な限り排除するため、各個体が開始時の体重の80％以上を維持していることを確認し測定した。【００８７】
リック回数の測定は、デジタルカメラ（VSK0780; Panasonic）を用いてリック行動を記録し、取得した映像から各味溶液を提示して、マウスが飲み口を舐め始めてから5秒間のリック数をカウントした。絶水時の超純水の5秒間のリック数（最高速度でのリック数と仮定）に対する味物質溶液のリック回数の比率をリック比（Lick ratio）と定義した：  （リック比）/（絶水時の超純水のリック回数の平均）。【００８８】
WTとKOの応答をtwo- way ANOVAによる群間比較で検定した。【００８９】
＜結果＞
試験のために馴化トレーニングされたマウス（WT n=9、KO n=7、いずれも雄 20週齢以上）を用いた。一般に濃度依存的に嗜好される味質（甘味、旨味）は4時間の絶食、絶水後、濃度が上がるにつれて忌避される味質（苦味、酸味、塩味）は23時間絶水、自由摂食を行った後、5秒間のリック数を測定した。23時間絶水後の水を舐めた回数を1とし、その比率を算出した。【００９０】
味溶液として、甘味としてはスクロース（和光純薬）溶液、旨味としてはグルタミン酸ナトリウム（MSG）（和光純薬）に0.5mM イノシン酸（IMP）（和光純薬）を混合した溶液、苦味としては塩酸キニーネ（和光純薬）溶液、酸味としてはクエン酸（和光純薬）溶液、塩味としてはNaCl（関東化学）溶液をそれぞれ試験に用いた。【００９１】
結果を図３に示す。味溶液に塩味としてNaClを用いた場合、WTとKOの群間比較（two-way ANOVA)で有意差（5%水準）があり、WTに比べKOマウスはNaClに対する応答（感受性）が低下した。一方で、その他の味質や嗜好性を想定した塩味では、WTとKOの群間で有意な差は観察されなかった。【００９２】
［実施例４］TMC4の電気生理学的性質に対する公知の塩味増強剤の影響
TMC4に対する公知の塩味増強剤の影響を観察するために、humanTMC4（hTMC4）を発現するHEK293T細胞を用いてWhole cell patch clamp assay（全細胞記録）を行った。【００９３】
＜方法＞
１）ヒトTMC4（hTMC4）を発現するHEK293T細胞を用いること、及び
２）ビークル（vehicle）溶液として134 mM NaCl溶液を用い、vehicle溶液に塩味増強剤としてアルギニン塩酸塩（Arg-HCl）100 μMを添加した細胞外液、スクロースまたはマルトース100 μM をそれぞれvehicle溶液に添加した細胞外液（塩味を増強しない対照）を用いること以外は、実施例２と同様にしてWhole cell patch clamp assayを行った。TMC4を介して流入するCl-電流を比較した。【００９４】
hTMC4は、accession  BC025323のクローンをDharmacon社から購入し、プラスミドpIRES2-AcGFP1の制限酵素EcoR1サイトとNot1サイト間に挿入し、mTMC4と同様に発現コンストラクトを作製した。【００９５】
＜結果＞
結果を図４及び５に示す。【００９６】
vehicle溶液に塩味増強剤であるアルギニン塩酸塩100μMを加えた場合、同一細胞に流れるCl-電流が増大した。一方、塩味増強効果がないスクロースまたはマルトースをそれぞれ100μM加えた場合、同一細胞に流れるCl-電流は変化しなかった。これらのことからTMC4を発現する細胞に流れるCl-電流は、塩味増強剤であるアルギニン塩酸塩によって活性化されることが示された。【００９７】
従って、TMC4を発現するHEK293T細胞を用いたwhole cell patch clamp assayにおいて、Cl-電流を増大させる物質を探索することで、塩味増強剤の候補を探索することができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【手続補正書】
【提出日】令和1年8月22日(2019.8.22)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
塩味増強剤の有効成分のスクリーニング方法であって、下記の工程を含むスクリーニング方法：
（ｉ）被験物質が、ＴＭＣ４遺伝子又はＴＭＣ４タンパク質の機能発現を亢進できる化合物であるか否かを判定する工程、および
（ｉｉ）前記工程（ｉ）においてＴＭＣ４遺伝子又はＴＭＣ４タンパク質の機能発現を亢進できる化合物であると判定された被験物質を、塩味増強剤の有効成分として選択する工程。
【請求項２】
ＴＭＣ４遺伝子又はＴＭＣ４タンパク質の機能発現を亢進できる化合物を含む、塩味増強剤。
【請求項３】
前記化合物が食品由来の成分である請求項２に記載の塩味増強剤。
【請求項４】
ＴＭＣ４遺伝子がノックアウトされた非ヒト動物を、高塩濃度に対する嗜好性を有するモデル動物としての使用する方法。
【請求項５】
非ヒト動物がマウスである、請求項４に記載の方法。
【国際調査報告】
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