(57)【要約】【課題】クロマチン構造を制御することによって遺伝子発現を制御（ON/OFFスイッチング）し、及び該制御による遺伝子組換え作物における、導入された数十の遺伝子(多重遺伝子)セットを安定的に発現させること。【解決手段】植物組換え遺伝子発現制御プラットフォームＤＮＡ配列であって、（１）ヒト染色体のセントロメアを形成するアルフォイドＤＮＡに於ける階層的反復構造を有し、且つ、その一部が遺伝子発現制御（誘導）因子の結合部位により置換されている塩基配列を有することを特徴とする、人工アルフォイドＤＮＡ配列；及び（２）多重遺伝子（複数の遺伝子）発現用カセット配列、を含み、前記カセット配列の上流側（5’側）及び下流側（3’側）に前記人工アルフォイドＤＮＡ配列が連結されている、ことを特徴とする、前記植物遺伝子発現制御プラットフォームＤＮＡ配列、該配列を用いる植物体に於ける組換え遺伝子の発現を制御する方法等。
2020031985.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
植物組換え遺伝子発現制御プラットフォームＤＮＡ配列であって、
（１）ヒト染色体のセントロメアを形成するアルフォイドＤＮＡに於ける階層的反復構造を有し、且つ、その一部が遺伝子発現制御（誘導）因子の結合部位により置換されている塩基配列を有することを特徴とする、人工アルフォイドＤＮＡ配列；及び
（２）多重遺伝子（複数の遺伝子）発現用カセット配列、
を含み、前記カセット配列の上流側（5’側）及び下流側（3’側）に前記人工アルフォイドＤＮＡ配列が連結されている、
ことを特徴とする、前記植物遺伝子発現制御プラットフォームＤＮＡ配列。
【請求項２】
アルフォイドＤＮＡがヒト２１番染色体のα２１−１配列である、請求項1記載のプラットフォームＤＮＡ配列。
【請求項３】
人工アルフォイドＤＮＡ配列が１７１ｂｐの反復単位の１１量体から成る高次反復単位の4〜16回の繰り返し構造であって、7.5〜30ｋｂの長さを有する、請求項1又は２記載のプラットフォームＤＮＡ配列。
【請求項４】
CENP-B box配列を含まない反復単位の少なくとも一部に遺伝子発現制御因子の結合部位を含む塩基配列を有することを特徴とする、請求項1ないし請求項３のいずれか一項に記載のプラットフォームＤＮＡ配列。
【請求項５】
人工アルフォイドＤＮＡ配列を構成する反復単位の１１量体から成る高次反復単位が以下のＤＮＡ配列：
（１）配列番号１（tｅｔＯを含む）又は配列番号２（ＬａｃＯを含む）の塩基配列から成るＤＮＡ配列；
（２）上記（１）の塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡ配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ配列であって、且つ、遺伝子発現制御（誘導）因子の結合部位を含む塩基配列から成り、上記（１）のＤＮＡ配列と実質的に同じ植物組換え遺伝子発現制御機能を有するＤＮＡ配列；又は
（３）上記（１）の塩基配列の全体と８０％以上の配列同一性を示し、且つ、遺伝子発現制御（誘導）因子の結合部位を含む塩基配列からなるＤＮＡ配列であって、上記（１）のＤＮＡ配列と実質的に同じ植物組換え遺伝子発現制御機能を有するＤＮＡ配列、
である、請求項1ないし請求項４のいずれか一項に記載のプラットフォームＤＮＡ配列。
【請求項６】
遺伝子発現制御因子の結合部位がtｅｔＯまたはＬａｃＯである、請求項1ないし請求項５のいずれか一項に記載のプラットフォームＤＮＡ配列。
【請求項７】
カセット配列に組換え酵素部位が含まれている、請求項1ないし請求項６のいずれか一項に記載のプラットフォームＤＮＡ配列。
【請求項８】
カセット配列にマーカー遺伝子又はレポーター遺伝子が含まれている、請求項1ないし請求項７のいずれか一項に記載のプラットフォームＤＮＡ配列。
【請求項９】
カセット配列に数個〜１０数個、又は、５〜１００ｋｂの長さに亘る多重遺伝子が導入されて成る、請求項1ないし請求項８のいずれか一項に記載のプラットフォームＤＮＡ配列。
【請求項１０】
請求項1ないし請求項９記載のプラットフォームＤＮＡ配列を含む、植物組換え遺伝子発現制御プラットフォームベクター。
【請求項１１】
請求項1に記載の遺伝子発現制御因子の発現用ＤＮＡ配列。
【請求項１２】
請求項１１記載の発現用ＤＮＡ配列を含む遺伝子発現制御因子ベクター。
【請求項１３】
発現用ＤＮＡ配列の上流側（5’側）及び下流側（3’側）に、請求項1記載の人工アルフォイドＤＮＡ配列が連結されている、請求項１２記載の遺伝子発現制御因子ベクター。
【請求項１４】
請求項1ないし請求項９のいずれか一項に記載のプラットフォームＤＮＡ配列及び請求項１１記載の発現用ＤＮＡ配列を含む植物遺伝子組換え融合ベクター。
【請求項１５】
請求項９記載の植物組換え遺伝子発現制御プラットフォームベクター、及び、請求１２または１３記載の遺伝子発現制御因子ベクター、から成る、植物遺伝子組換えベクターセット。
【請求項１６】
請求項１ないし請求項９のいずれか一項に記載の植物組換え遺伝子発現制御プラットフォームＤＮＡ配列、及び、請求項１１記載の遺伝子発現制御因子の発現用ＤＮＡ配列が染色体に導入されている遺伝子組換え植物体。
【請求項１７】
請求項１５記載の植物体の製造方法であって、請求項１４記載の融合ベクター又は請求項１５記載の植物遺伝子組換えベクターセットを植物体に導入することを含む、前記方法。
【請求項１８】
アグロバクテリウム法を用いる、請求項１７記載の製造方法。
【請求項１９】
請求項1に記載の人工アルフォイドＤＮＡ配列に含まれる結合部位への遺伝子発現制御因子の結合を阻害又は促進させることによって該遺伝子発現制御因子の作用を制御し、その結果、人工アルフォイドＤＮＡ配列及び多重遺伝子（複数の遺伝子）発現用カセット配列上のクロマチン構造をヘテロクロマチン及びオープンクロマチン間で変換させることを含む、請求項１５記載の植物体に於ける組換え遺伝子の発現を制御する方法。
【請求項２０】
テトラサイクリン（IPTGなど）を作用させることによって、人工アルフォイドＤＮＡ配列に含まれる結合部位への遺伝子発現制御因子の結合を阻害又は促進させる、請求項１９記載の制御方法。
【請求項２１】
クロマチン構造の変換が遺伝子発現制御因子の作用であるヒストンのアセチル化、メチル化、及び脱アセチル化によって誘導される、請求項１９または２０に記載の制御方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、植物組換え遺伝子発現制御（遺伝子発現ＯＮ／ＯＦＦスイッチング）プラットフォームＤＮＡ配列、該プラットフォームＤＮＡ配列等を含む植物遺伝子組換えベクターセット、該プラットフォームＤＮＡ配列等が染色体に導入されている遺伝子組換え植物体（本明細書中で、「植物体」は植物細胞、組織、及びカルスなど該植物体の一部またはそれから発生した部分も含む）、及び、該植物体に於ける組換え遺伝子の発現を制御する方法等に関する。
【背景技術】
【０００２】
遺伝子組換え作物を実用化する際の深刻な問題として、導入遺伝子の高発現が成長阻害をもたらす現象や世代が進むにつれて導入した遺伝子発現が不安定化する現象が頻繁にみられることがよく知られている（Stam, M, Mol, J. N. M. and Kooter J. M., Annals of Botany (1997) 79, 3-12, The Silence of Genes in Transgenic Plants (Review)）（図１）。遺伝子組換え植物の商品化に際しては、多数の遺伝子組換え系統を作製し、それらを長期間にわたって検査し、安定な系統を選抜する必要があるために、時間がかかり、かつ、膨大な開発コストがかかることが主に問題となっている。組換え遺伝子発現の不安定化は、遺伝子導入部位でのクロマチン構造のエピジェネティックな修飾変化に起因すると推定されているが（Stam et al., 1997）、未だに不安定化を防ぐ方法は確立されていない。【０００３】
本発明者は、このヘテロクロマチン化現象を制御する方法として、ヘテロクロマチン化した合成反復ＤＮＡの異所的染色体挿入部にヒストンアセチル化酵素とヒストンシャペロンを直接結合させることにより遺伝子の安定発現が可能なオープンクロマチン化を誘導させることにヒト及びマウス細胞で成功している（非特許文献１〜４）(図２)。この合成反復DNAを用いた異所的部位のヘテロクロマチンを制御する方法は、本発明者が、細胞へ導入した反復ＤＮＡからヒト人工染色体を作製する研究を通じて開発してきたものである（非特許文献５及び６）。【０００４】
一方、植物においては、これまでに、テトラサイクリンリプレッサーと転写活性化因子の融合蛋白質を、植物遺伝子のTATA-box上流に導入したテトラサイクリンオペレーター配列に結合させてその遺伝子の発現を誘導した例（非特許文献７）がある。【０００５】
しかしながら、上記のように、ヒト及びマウス等の哺乳動物細胞に於いては遺伝子の安定発現が可能なオープンクロマチン化を誘導させることに成功はしているものの、植物に於いては、このようなヒストン修飾を介したクロマチン構造の変化によって遺伝子の発現を制御する例はこれまで報告されていない。【０００６】
更に、動物細胞と植物細胞では、クロマチン構造の変化や遺伝子発現制御に関する構造・機能が多くの点で異なることが知られている。例えば、DNAメチル化修飾もこれらに密接に関わるが、植物細胞では、動物細胞で見られるCG配列のメチル化の他に、CHG、CHH（HはA, T, Cのいずれかの塩基）配列上にもメチル化が導入され、より複雑な制御機構を持つ。また、ヒストンH3リジン9トリメチル化（H3K9me3）は動物ではヘテロクロマチンを構成するが、植物では転写される遺伝子領域にも多く検出されている（非特許文献８及び非特許文献９）。【０００７】
従って、哺乳動物細胞に見られた、ヒストン修飾を介したクロマチン構造の変化によって遺伝子の発現を制御するようなメカニズムが、植物体(細胞)に於いても同様に機能（存在）するか否かについては全く予測することは出来ない。【０００８】
また、従来の遺伝子組換え作物においては、単独あるいは数種類の遺伝子を個別に組換えることに重点が置かれており、上記のように、こうして導入された個々の外来遺伝子の転写を各種の転写調節エレメント及び発現調節因子等によって個別(単独)に制御する方法は知られている。しかしながら、合成生物学の世界的な急展開を考えれば、代謝経路の全体を遺伝子導入するなど、数十の遺伝子セットを遺伝子導入し、これら多数の遺伝子を同時にまとめて安定的に発現させる新たな技術の需要が高まっている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Nakano M, Cardinale S, Noskov VN, Gassmann R, Vagnarelli P, Kandels-Lewis S, Larionov V, Earnshaw WC, Masumoto H.,Inactivation of a human kinetochore by specific targeting of chromatin modifiers., Dev Cell. 2008 Apr;14(4):507-22.
【非特許文献２】Ohzeki J, Bergmann JH, Kouprina N, Noskov VN, Nakano M, Kimura H, Earnshaw WC, Larionov V, Masumoto H., Breaking the HAC Barrier: histone H3K9 acetyl/methyl balance regulates CENP-A assembly., EMBO J. 2012 May 16;31(10):2391-402.
【非特許文献３】Shono, N., Ohzeki. J, Otake, K., Martins, N. M. C., Nagase, T., Kimura, H., Larionov, V., Earnshaw, W. C. and Masumoto, H., Journal of Cell Science (2015) 128, 4572-4587, CENP-C and CENP-I are key connecting factors for kinetochore and CENP-A assembly.
【非特許文献４】Ohzeki J, Shono N, Otake K, Martins NM, Kugou K, Kimura H, Nagase T, Larionov V, Earnshaw WC, Masumoto H., KAT7/HBO1/MYST2 Regulates CENP-A Chromatin Assembly by Antagonizing Suv39h1-Mediated Centromere Inactivation., Dev Cell. 2016 Jun 6;37(5):413-27.
【非特許文献５】Ikeno, M., Grimes, B., Okazaki, T., Nakano, M., Saitoh, K., Hoshino, H., McGill, N.I., Cooke, H. and Masumoto, H., Nature Biotechnology (1998) 16, 431-439, Construction of YAC-based mammalian artificial chromosomes.
【非特許文献６】Okada, T., Ohzeki. J, Nakano, M., Yoda, M., Brinkley, W.R., Larionov, V. and Masumoto, H., Cell (2007) 131, 1287-1300, CENP-B Controls Centromere Formation Depending on the Chromatin Context.
【非特許文献７】Weinmann, P., Gossen M., Hillen, W., Bujard, H. and Gatz, C., Plant Journal (1994) 5(4), 559-569. A chimeric transactivator allows tetracycline-responsive gene expression in whole plant
【非特許文献８】Jacob, Y., Feng, S., LeBlanc, C. A., Bernatavichute, Y. V., Stroud, H., Cokus, S., Johnson, L. M., Pellegrini. M., Jacobsen, S. E. and Michaels S. D., Nature Structural & Molecular Biology (2009) 16 (7) 763-769. ATXR5 and ATXR6 are H3K27 monomethyltransferases required for chromatin structure and gene silencing
【非特許文献９】Roudier F, Ahmed I, Berard C, Sarazin A, Mary-Huard T, Cortijo S, Bouyer D, Caillieux E, Duvernois-Berthet E, Al-Shikhley L, Giraut L, Despres B, Drevensek S, Barneche F, Derozier S, Brunaud V, Aubourg S, Schnittger A, Bowler C, Martin-Magniette ML, Robin S, Caboche M, Colot V. EMBO J. (2011) 30(10) 1928-1938. Integrative epigenomic mapping defines four main chromatin states in Arabidopsis.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
そこで、本発明では、クロマチン構造を制御することによって遺伝子発現を制御（ON/OFFスイッチング）し、及び該制御による遺伝子組換え作物における、導入された数十の遺伝子(多重遺伝子)セットを安定的に発現させることを主な目的とする（図３）。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者は、特定の染色体領域の遺伝子発現をオン/オフさせるために、セントロメアやヘテロクロマチン誘導機能を有する合成反復ＤＮＡとヒストン修飾酵素＋ヒストンシャペロンによるオープンクロマチン化誘導を組み合わせた遺伝子発現ON/OFFスイッチングプラットフォームを構築した。更に、該プラットフォームをベースに部位特異的組換えサイトを導入し、数十個の遺伝子を導入するのに適した動植物ゲノムDNA断片（〜100kbp）を選抜し、その中に、発現ON/OFFスイッチと自在に外来遺伝子を挿入できる組換え部位を含み、かつ、植物へのアグロバクテリウムを介した導入ができるコンストラクトを開発した。【００１２】
一具体例として、ヘテロクロマチン化とクロマチンオープン化誘導に必要な因子として、ヒト由来のセントロメア配列に基づき設計した合成反復（繰り返し）ＤＮＡにヒストン修飾酵素融合tetRタンパク質を結合させることができるＤＮＡ配列（tetO）を連結し、レポーター遺伝子と共にタバコ培養細胞BY-2並びにシロイヌナズナ及びベンサミアタバコ植物個体へ遺伝子導入した。その後、ヒストン修飾酵素融合tetR（又は、rtetR）タンパク質を発現させ、共焦点レーザー蛍光顕微鏡により異所的部位でのクロマチンの構造変換とレポーター遺伝子の発現を検出し、上記の遺伝子発現ON/OFFスイッチングプラットフォームによって、遺伝子発現の制御が可能であることを検証した（図４）。【００１３】
本発明は、以上のような予想外の新たな知見に基づき完成したものである。
即ち、本発明は以下の態様を有する。
[態様１]植物組換え遺伝子発現制御プラットフォームＤＮＡ配列であって、
（１）ヒト染色体のセントロメアを形成するアルフォイドＤＮＡに於ける階層的反復構造を有し、且つ、その一部が遺伝子発現制御（誘導）因子の結合部位により置換されている塩基配列を有することを特徴とする、人工アルフォイドＤＮＡ配列；及び
（２）多重遺伝子（複数の遺伝子）発現用カセット配列、
を含み、前記カセット配列の上流側（5’側）及び下流側（3’側）に前記人工アルフォイドＤＮＡ配列が連結されている、
ことを特徴とする、前記植物遺伝子発現制御プラットフォームＤＮＡ配列。
[態様２]アルフォイドＤＮＡがヒト２１番染色体のα２１−１配列である、態様1記載のプラットフォームＤＮＡ配列。
[態様３]人工アルフォイドＤＮＡ配列が１７１ｂｐの反復単位の１１量体から成る高次反復単位の4〜16回の繰り返し構造であって、7.5〜30ｋｂの長さを有する、態様1又は２記載のプラットフォームＤＮＡ配列。
[態様４]CENP-B box配列を含まない反復単位の少なくとも一部に遺伝子発現制御因子の結合部位を含む塩基配列を有することを特徴とする、態様1ないし態様３のいずれか一項に記載のプラットフォームＤＮＡ配列。
[態様５]人工アルフォイドＤＮＡ配列を構成する反復単位の１１量体から成る高次反復単位が以下のＤＮＡ配列：
（１）配列番号１（tｅｔＯを含む）又は配列番号２（ＬａｃＯを含む）の塩基配列から成るＤＮＡ配列；
（２）上記（１）の塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡ配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ配列であって、且つ、遺伝子発現制御（誘導）因子の結合部位を含む塩基配列から成り、上記（１）のＤＮＡ配列と実質的に同じ植物組換え遺伝子発現制御機能を有するＤＮＡ配列；又は
（３）上記（１）の塩基配列の全体と８０％以上の配列同一性を示し、且つ、遺伝子発現制御（誘導）因子の結合部位を含む塩基配列からなるＤＮＡ配列であって、上記（１）のＤＮＡ配列と実質的に同じ植物組換え遺伝子発現制御機能を有するＤＮＡ配列、
である、態様1ないし態様４のいずれか一項に記載のプラットフォームＤＮＡ配列。
[態様６]遺伝子発現制御因子の結合部位がtｅｔＯまたはＬａｃＯである、態様1ないし態様５のいずれか一項に記載のプラットフォームＤＮＡ配列。
[態様７]カセット配列に組換え酵素部位が含まれている、態様1ないし態様６のいずれか一項に記載のプラットフォームＤＮＡ配列。
[態様８]カセット配列にマーカー遺伝子又はレポーター遺伝子が含まれている、態様1ないし態様７のいずれか一項に記載のプラットフォームＤＮＡ配列。
[態様９]カセット配列に数個〜１０数個、又は、５〜１００ｋｂの長さに亘る多重遺伝子が導入されて成る、態様1ないし態様８のいずれか一項に記載のプラットフォームＤＮＡ配列。
[態様１０]態様1ないし態様９記載のプラットフォームＤＮＡ配列を含む、植物組換え遺伝子発現制御プラットフォームベクター。
[態様１１]態様1に記載の遺伝子発現制御因子の発現用ＤＮＡ配列。
[態様１２]態様１１記載の発現用ＤＮＡ配列を含む遺伝子発現制御因子ベクター。
[態様１３]発現用ＤＮＡ配列の上流側（5’側）及び下流側（3’側）に、態様1記載の人工アルフォイドＤＮＡ配列が連結されている、態様１２記載の遺伝子発現制御因子ベクター。
[態様１４]態様1ないし態様９のいずれか一項に記載のプラットフォームＤＮＡ配列及び態様１１記載の発現用ＤＮＡ配列を含む植物遺伝子組換え融合ベクター。
[態様１５]態様９記載の植物組換え遺伝子発現制御プラットフォームベクター、及び、請求１２または１３記載の遺伝子発現制御因子ベクター、から成る、植物遺伝子組換えベクターセット。
[態様１６]態様１ないし態様９のいずれか一項に記載の植物組換え遺伝子発現制御プラットフォームＤＮＡ配列、及び、態様１１記載の遺伝子発現制御因子の発現用ＤＮＡ配列が染色体に導入されている遺伝子組換え植物体。
[態様１７]態様１５記載の植物体の製造方法であって、態様１４記載の融合ベクター又は態様１５記載の植物遺伝子組換えベクターセットを植物体に導入することを含む、前記方法。
[態様１８]アグロバクテリウム法を用いる、態様１７記載の製造方法。
[態様１９]態様1に記載の人工アルフォイドＤＮＡ配列に含まれる結合部位への遺伝子発現制御因子の結合を阻害又は促進させることによって該遺伝子発現制御因子の作用を制御し、その結果、人工アルフォイドＤＮＡ配列及び多重遺伝子（複数の遺伝子）発現用カセット配列上のクロマチン構造をヘテロクロマチン及びオープンクロマチン間で変換させることを含む、態様１５記載の植物体に於ける組換え遺伝子の発現を制御する方法。
[態様２０]テトラサイクリン（IPTGなど）を作用させることによって、人工アルフォイドＤＮＡ配列に含まれる結合部位への遺伝子発現制御因子の結合を阻害又は促進させる、態様１９記載の制御方法。
[態様２１]クロマチン構造の変換が遺伝子発現制御因子の作用であるヒストンのアセチル化、メチル化、及び脱アセチル化によって誘導される、態様１９または２０に記載の制御方法。
【発明の効果】
【００１４】
本発明の植物組換え遺伝子発現制御プラットフォームＤＮＡ配列は、それが挿入されたゲノム部位のクロマチン構造に依らず、人工アルフォイドＤＮＡ配列中の結合部位（tetO等）への遺伝子発現制御（誘導）因子の結合を促進又は抑制することによって該遺伝子発現制御（誘導）因子の作用（活性）を制御し、その結果、人工アルフォイドＤＮＡ配列及び多重遺伝子（複数の遺伝子）発現用カセット配列上のクロマチン構造が変化して（オープンクロマチン及びヘテロクロマチンとの間の変換）、人工アルフォイドＤＮＡ配列に挟まれた遺伝子領域である多重遺伝子発現用カセット配列に含まれる複数の遺伝子の発現制御（遺伝子発現ＯＮ／ＯＦＦスイッチング）を実質的に同時（協調的）に行うことが出来る。【００１５】
更に、本発明に於いては、導入遺伝子を含む植物組換え遺伝子発現制御プラットフォームＤＮＡ配列に於けるクロマチン構造を人為的（積極的）に操作することによって、導入された組換え遺伝子の発現を制御するために、クロマチン構造のエピジェネティックな修飾変化に起因する組換え遺伝子発現の不安定化を数世代に亘って抑止することが可能となる。
尚、本発明の遺伝子発現ON/OFFスイッチングプラットフォームを用いた遺伝子導入では１細胞当たりのコピー数の低下効果が確認された。その結果、本発明の技術を用いて1コピー株を高確率で取得ことができる為、その産業上の有用性が高い。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】遺伝子組換え作物を実用化する際の深刻な問題を示す。
【図２】クロマチン構造変換による遺伝子の発現制御を示す。
【図３】植物での遺伝子組換え体技術の課題を示す。
【図４】本発明の遺伝子発現ON/OFFスイッチングプラットフォームの一例を示す。
【図５】発現ON/OFFスイッチングプラットフォームの構造(TACベクター#1)を示す。
【図６】発現ON/OFFスイッチングプラットフォームの原理（I）を示す。
【図７】発現ON/OFFスイッチングプラットフォームの原理（I）: 発現抑制（OFF）を示す。
【図８】発現ON/OFFスイッチングプラットフォームの原理（I）：発現誘導（ON）を示す。
【図９】発現ON/OFFスイッチングプラットフォームの原理（II）:自己活性化型を示す。
【図１０】発現ON/OFFスイッチングプラットフォームの原理（II）:自己活性化型を示す。
【図１１】tetO、LacOアルフォイドDNAの構造と伸長合成を示す。
【図１２】tetO、LacOアルフォイドDNAの構造と伸長合成を示す電気泳動の写真である。
【図１３】アグロバクテリウムバイナリーベクター pRIBACの作製を示す。
【図１４】アグロバクテリウムバイナリーベクター pRIBAC tetPF前駆プラスミドの作製を示す。
【図１５】アグロバクテリウムバイナリーベクター pRIBAC tetPF前駆プラスミドの作製を示す。
【図１６】アグロバクテリウムバイナリーベクター pRIBAC tetPFの作製を示す。
【図１７】アグロバクテリウムバイナリーベクター pRIBAC tetPFの作製を示す電気泳動の写真である。
【図１８】アグロバクテリウムバイナリーベクター pRIBAC tetPFの作製を示す電気泳動の写真である。
【図１９】アグロバクテリウムバイナリーベクター pRIBAC LacPFの作製を示す。
【図２０】アグロバクテリウムバイナリーベクター pRIBAC LacPFの作製を示す電気泳動の写真である。
【図２１】アグロバクテリウムバイナリーベクター pRIBAC LacPFの作製を示す電気泳動の写真である。
【図２２】アグロバクテリウムバイナリーベクター pRIBAC LacSG前駆プラスミドの作製（自己活性化型）を示す。
【図２３】アグロバクテリウムバイナリーベクター pRIBAC LacSG前駆プラスミドの作製（自己活性化型）を示す。
【図２４】アグロバクテリウムバイナリーベクター pRIBAC LacSG前駆プラスミドの作製（自己活性化型）を示す。
【図２５】アグロバクテリウムバイナリーベクター pRIBAC LacSGプラスミドの作製（自己活性化型）を示す。
【図２６】アグロバクテリウムバイナリーベクター pRIBAC LacSGプラスミドの作製（自己活性化型）を示す電気泳動の写真である。
【図２７】発現ON/OFFスイッチングプラットフォーム導入タバコBY-2株における遺伝子発現を示す写真EYFP蛍光）である。
【図２８】発現ON/OFFスイッチングプラットフォーム導入株における遺伝子発現を示す写真（EYFP蛍光観察／高倍率）である。
【図２９】発現ON/OFFスイッチングプラットフォーム導入BY-2株における遺伝子発現（GUS染色）を示す写真である。
【図３０】発現ON/OFFスイッチングプラットフォーム導入BY-2株についてのqPCRによる導入DNAコピー数解析を示す。
【図３１】発現ON/OFFスイッチングプラットフォームのChIPによるクロマチン構造の解析を示す。
【図３２】発現ON/OFFスイッチングプラットフォームへのOFF側因子結合による発現抑制（EYFP蛍光観察）を示す写真である。
【図３３】伝子発現ON/OFFスイッチングプラットフォーム導入シロイヌナズナにおけるEYFP蛍光観察の写真である。各株、上段が葉側から観察、下段が根側から観察したものである。
【図３４】アグロバクテリウムバイナリーベクター pRIBAC LacSG-tetPF(融合ベクター)の構築を示す。
【図３５】LacSG-tetPF挿入植物系統における発現制御の原理を示す。
【図３６】アグロバクテリウムバイナリーベクター pRIBAC LacSG-tetPFの小型化を示す。
【図３７】ゲノム組換えステーションの開発（各種CRE/Loxカセットによる遺伝子組換）を示す。
【図３８】各種部位特異的組換配列を示す。
【図３９】発現ON/OFFスイッチングプラットフォーム導入BY-2株についてのqPCRによる導入DNAコピー数解析を示す。
【図４０】ON/OFFスイッチングプラットフォーム導入BY-2株とシロイヌナズナ株について、導入DNAコピー数の頻度分布を示す。
【図４１】実施例１−（９）に記載のON/OFF制御因子の効果の検証の実験（図３２）の追加としての発現ON/OFFスイッチングプラットフォームの発現制御の例を示す。
【図４２】ON/OFFスイッチングプラットフォーム導入シロイヌナズナ株について、次世代、次次世代にON/OFFスイッチングプラットフォームが伝わることを示す。
【図４３】遺伝子発現ON/OFFスイッチングプラットフォーム導入ベンサミアタバコにおけるEYFP蛍光観察を示す。
【図４４】連結小型化pRIBAC LacSG-tetPFをBY-2細胞へ導入した結果（遺伝子OFF制御コロニー）を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
[植物組換え遺伝子発現制御プラットフォームＤＮＡ配列]
本発明の植物遺伝子発現制御プラットフォームＤＮＡ配列は、（１）人工アルフォイドＤＮＡ配列、及び（２）外来遺伝子である多重遺伝子（複数の遺伝子）発現用カセット配列を含み、該発現用カセット配列の上流側（5’側）及び下流側（3’側）に前記人工アルフォイドＤＮＡ配列が連結されている、ことを特徴とする。尚、該プラットフォームＤＮＡ配列には、合成の際に各構成要素（遺伝子等）を連結するために必要となる各種のリンカー配列等が適宜含まれていても良い。
【００１８】
（１）人工アルフォイドＤＮＡ配列  
本発明における（１）「人工アルフォイドＤＮＡ配列」は、ヒト染色体に見られる「アルフォイドＤＮＡ配列」の塩基配列情報に基づき人工的に合成されたものである。
染色体分配の機構に乱れが生じると細胞死、異常増殖、疾病などの原因になるため、その過程はきわめて正確に制御される必要がある。この染色体分配に必須な役割をはたす領域がセントロメアである。セントロメアのクロマチンに含まれるCENP-Aを含むヌクレオソームはセントロメアに特異的なタンパク質の集合に必須であり、細胞分裂のM期においてはセントロメアのクロマチンにキネトコア（動原体）構造が形成される。キネトコアはセントロメアと紡錘体微小管との相互作用をチェックするとともに、染色体の動きを制御する。現在では、100をこえるタンパク質がこのキネトコア構造に集合すると考えられている。ヒトの染色体においては、アルフォイドＤＮＡとよばれる170〜171 bp程度の反復単位が複数組み合わさった高次反復単位を基本とする0.5 Mbから数Mbにも及ぶ階層的反復構造から成る巨大な領域にセントロメアが形成される。「CENP-B box配列」と呼ばれるＤＮＡ配列は、セントロメアに結合しキネトコア形成に関与するCENP-Bタンパク質が結合するＤＮＡ上の部位であるが、多くの場合に、CENP-B box配列を含む上記反復単位とCENP-B box配列を含まない反復配列が交互に繰り返されている。
【００１９】
かかるヒト染色体のアルフォイドＤＮＡ配列の一例として、ヒト２１番染色体のα２１-I配列を挙げることが出来る。ヒト２１番染色体のセントロメア領域には、α21 - I及びα21 - IIと呼ばれる以下の２つの領域が存在する：
α21 - I : 約1.3 Mbp の領域であり、基本単位（171bp）が11回繰り返して高次反復単位を形成し，さらにこの高次反復単位が約700回繰り返す規則正しい階層的反復構造を形成している。因みに、該基本単位の各塩基配列は少しずつ異なっている（約80〜90％の相同性）。
α21 - II : 1.9 Mbp 以上の領域で、基本繰り返し単位の相同性は変化に富み、α21 - I のような階層構造は形成していない。
【００２０】
本発明の人工アルフォイドＤＮＡ配列は、ヒト染色体のセントロメアを形成するアルフォイドＤＮＡに於ける繰り返しＤＮＡ構造（階層的反復構造）を有し、且つ、その一部が遺伝子発現制御（誘導）因子の結合部位により置換されている塩基配列を有することを特徴とする。人工アルフォイドＤＮＡ配列は任意の位置に任意の数の上記結合部位を含むことが出来る。例えば、実施例に示されるように、該アルフォイドＤＮＡを構成する反復単位であって、CENP-B box配列を含まない該反復単位の少なくとも一部又は全てに遺伝子発現制御（誘導）因子の結合部位を含むことができる。或いは、CENP-B box配列を含む反復単位内に遺伝子発現制御（誘導）因子の結合部位を含んでいても良い。
【００２１】
尚、上記発現用カセット配列の上流側（5’側）及び下流側（3’側）に連結されている夫々の人工アルフォイドＤＮＡ配列は同一の塩基配列を有している必要はない。
【００２２】
また、本発明の人工アルフォイドＤＮＡ配列の好適例として、例えば、171bpの反復単位の11量体から成る高次反復単位の、数回〜16回、好ましくは、4〜16回の繰り返し構造であって、30ｋｂ程度迄、好ましくは、7.5〜30ｋｂの長さを有する、ＤＮＡ配列を挙げることが出来る。
【００２３】
より具体的には、人工アルフォイドＤＮＡ配列を構成する反復単位の１１量体から成る高次反復単位が以下のＤＮＡ配列：
（１）配列番号１（ｔｅｔＯを含む）又は配列番号２（ＬａｃＯを含む）の塩基配列から成るＤＮＡ配列；
（２）上記（１）の塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡ配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡ配列であって、且つ、遺伝子発現制御(誘導)因子の結合部位を含む塩基配列から成り、上記（１）のＤＮＡ配列と実質的に同じ植物組換え遺伝子発現制御機能を有するＤＮＡ配列；又は
（３）上記（１）の塩基配列の全体と８０％以上、好ましくは９０％以上、更に好ましくは９５％以上、最も好ましくは９９％以上の配列同一性を示し、且つ、遺伝子発現制御(誘導)因子の結合部位を含む塩基配列からなるＤＮＡ配列であって、上記（１）のＤＮＡ配列と実質的に同じ植物組換え遺伝子発現制御機能を有するＤＮＡ配列、を挙げることが出来る。
【００２４】
配列番号１：tetO 11mer (1886bp)は、ヒト２１番染色体セントロメアのtype I alphoid (CENP-B boxを持ちセントロメアとして機能的な配列)が構成する11merのユニット（higher ordered repeat）の配列から、テトラサイクリンオペレーター配列（tetO）を含むように改変したもの。配列番号1に含まれる「NheI site：制限酵素認識配列（GCTAGC）」、「SpeI site：制限酵素認識配列（ACTAGT）」及び「tetO」及び「CENP-B box」の各塩基配列の位置は以下の通りである。
1-6 NheI site；153-171 tetO；324-342 tetO；493-509 CENP-B box；665-683 tetO；835-851 CENP-B box；1006-1024 tetO；1178-1194 CENP-B box；1350-1368 tetO；1520-1536 CENP-B box；1692-1710 tetO；1862-1878 CENP-B box；及び1881-1886 SpeI site
【００２５】
配列番号２：LacO 11mer (1886bp)は、ヒト２１番染色体セントロメアのtype I alphoid (CENP-B boxを持ちセントロメアとして機能的な配列)が構成する11merのユニット（higher ordered repeat）の配列から、ラクトースオペレーター配列（LacO）を含むように改変したもの。配列番号２に含まれる「NheI site：制限酵素認識配列（GCTAGC）」、「SpeI site：制限酵素認識配列（ACTAGT）」及び「lacO」及び「CENP-B box」の各塩基配列の位置は以下の通りである。
1-6 NheI site；147-170 lacO；318-341 lacO；493-509 CENP-B box；659-682 lacO；835-851 CENP-B box；1000-1023 lacO；1178-1194 CENP-B box；1344-1367 lacO；1520-1536 CENP-B box；1686-1709 lacO；1862-1878 CENP-B box；及び1881-1886 SpeI site
【００２６】
ハイブリダイゼーションは、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー（Ｃｕｒｒｅｎｔ  ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｂｉｏｌｏｇｙ（ｅｄｉｔｅｄ  ｂｙ  Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ  Ｍ．  Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９８７）、又は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｎｇ  ｔｈｉｒｄ．ｅｄ．（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂ．Ｐｒｅｓｓ，２００１）に記載の方法等、当業界で公知の方法あるいはそれに準じる方法に従って行うことができる。また、市販のライブラリーを使用する場合、添付の使用説明書に記載の方法に従って行うことができる。
【００２７】
本明細書において、ハイブリダイズに際しての「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズ」の具体的な条件とは、例えば、５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ（１５０ｍＭ  塩
化ナトリウム、１５ｍＭ  クエン酸三ナトリウム、１０ｍＭ  リン酸ナトリウム、１ｍＭ
エチレンジアミン四酢酸、ｐＨ７．２）、５×デンハート（Ｄｅｎｈａｒｄｔ’s）溶
液、０．１％  ＳＤＳ、１０％  デキストラン硫酸及び１００μｇ／ｍＬの変性サケ精子
ＤＮＡで４２℃インキュベーションした後、フィルターを０．２×ＳＳＣ中４２℃で洗浄
することを例示することができる。
【００２８】
従って、配列番号：１又は配列番号：２で表される塩基配列を含むＤＮＡとハイブリダイズできるＤＮＡとしては、例えば、該ＤＮＡの全塩基配列との同一性の程度が、全体の平均で、約８０％以上、好ましくは９０％以上、更に好ましくは９５％以上、最も好ましくは９９％以上である塩基配列を含有するＤＮＡ等を挙げることができる。
【００２９】
２つの塩基配列における配列同一性を決定するために、配列は比較に最適な状態に前処理される。例えば、一方の配列にギャップを入れることにより、他方の配列とのアラインメントの最適化を行う。その後、各部位における塩基が比較される。第一の配列におけるある部位に、第二の配列の相当する部位と同じ塩基が存在する場合、それらの配列は、その部位において同一である。２つの配列における配列同一性は、配列間での同一である部位数の全部位数に対する百分率で示される。
【００３０】
上記の原理に従い、２つの塩基配列における配列同一性は、例えば、Ｋａｒｌｉｎ及びＡｌｔｓｃｈｕｌのアルゴリズム（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８７：２２６４−２２６８、１９９０及びＰｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：５８７３−５８７７、１９９３）により決定される。このようなアルゴリズムを用いたＢＬＡＳＴプログラムやＦＡＳＴＡプログラムは、主に与えられた配列に対し、高い配列同一性を示す配列をデータベース中から検索するために用いられる。これらは、例えば米国Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎのインターネット上のウェブサイトにおいて利用可能である。
【００３１】
上記の人工アルフォイドＤＮＡ配列を合成する際には、その階層的反復構造を構成する反復単位であってＣＥＮＰ−Ｂ  Ｂｏｘ配列を含まない反復単位の少なくとも一部に遺伝子発現制御因子の結合部位を挿入する。当該部位への遺伝子発現制御因子の結合を阻害又は促進させることによって、クロマチン構造をヘテロクロマチン及びオープンクロマチン間で変換させる。
【００３２】
ここで、「遺伝子発現制御(誘導)因子の結合部位」としては、例えば、tetO及びLacO等のオペレーター等の当業者に公知の転写調節エレメントを含む任意のＤＮＡ配列を挙げることが出来る。該転写調節エレメントには、例えば、tetR及びrtetR等のレプレッサー並びにLacインデューサー（LacI）等のトランス転写因子（蛋白質）等を含む配列特異的ＤＮＡ結合蛋白質が特異的に結合する。かかる結合は、エストラジオール誘導系、テトラサイクリン誘導系, IPTG（イソプロピル-β-ガラクトピラノシド）誘導系及びデキサメタゾン系等の化学的誘導系に於いて、適当な化合物によって阻害ないし促進することが出来る。
【００３３】
一方、本発明の「遺伝子発現制御(誘導)因子」としては、例えば、当業者に公知のヒト又は植物由来の各種ヒストン修飾酵素(表１に挙げたような、メチル化酵素、脱アセチル化酵素、アセチル化酵素)等のクロマチン構造の変換を誘導する活性を有する蛋白質を挙げることが出来る。このような遺伝子発現制御因子は該トランス転写因子等の配列特異的ＤＮＡ結合蛋白質との融合蛋白質として発現される。該融合蛋白質が該トランス転写因子等を介して対応する結合部位に特異的に結合することによって、遺伝子発現制御因子を該結合部位に結合（テザリング）させることが出来る。
【００３４】
【表１】
2020031985.tif 000003
【００３５】
即ち、夫々、適当な条件下で、適当量のエストラジオール、テトラサイクリン、IPTG 又はデキサメタゾン等の化合物を添加した培地上で得られた遺伝子組換え植物体を生育させること等により、該化合物を該植物体に作用させることによって、人工アルフォイドＤＮＡ配列に含まれる結合部位への遺伝子発現制御因子の結合を阻害又は促進させて該遺伝子発現制御因子の作用（例えば、ヒストンのアセチル化、脱アセチル化及びメチル化等の酵素活性、並びに、各種の転写活性化）を制御し、その結果、クロマチン構造の変化（ヘテロクロマチン及びオープンクロマチン間でのクロマチン構造の変換）が誘導され、ヘテロクロマチン化による遺伝子発現の抑制、または、オープンクロマチン化による遺伝子発現の促進等の、組換え植物体における導入遺伝子（組換え遺伝子）の発現を制御することが出来る。
【００３６】
（２）多重遺伝子（複数の遺伝子）発現用カセット配列
本発明の（２）「多重遺伝子（複数の遺伝子）発現用カセット配列」は、遺伝子組換え植物体に導入させ、得られた遺伝子組換え植物体内で発現させる対象（組換え遺伝子）である多重遺伝子（複数の遺伝子）を挿入するためのＤＮＡ配列である。該カセット配列に挿入可能な遺伝子の個数及び種類等に特に制限はないが、通常、数個〜１０数個、または、５〜１００ｋｂの長さに亘る多重遺伝子を導入することが出来る。
【００３７】
このような多重遺伝子は当業者に公知の任意の方法で該カセット配列に挿入することができる。その為には、該カセット配列には予め、当業者に公知の任意の組換え酵素部位が含まれていることが好ましい。このような組換え酵素部位の好適例として、例えば、特許第5336592号及び第5336676号に記載されているような、Cre/loxP系部位特異的組換えシステムの一種である（VCre/VloxPとSCre/SloxP）を挙げることが出来る。
【００３８】
多重遺伝子の例として、或る化合物の植物体内における生合成経路の全遺伝子をまとめて導入することにより、それら遺伝子の発現を協調的に増大させることが可能となり、その結果、該化合物の生合成の効率を高めることが可能となる。或いは、該カセット配列に染色体への該カセット配列の導入等を確認するために、蛍光蛋白質遺伝子及び薬剤選択遺伝子等の当業者に公知の任意のマーカー遺伝子又はレポーター遺伝子を含むことが出来る。尚、多重遺伝子を該カセット配列に挿入する際には、各遺伝子の上流又は下流に、プロモーター（好ましくは構成的プロモーター）、ターミネーター、及びその他の当業者に公知の各種の転写調節エレメント（制御配列）も併せて挿入することが好ましい。
【００３９】
尚、多重遺伝子（複数の遺伝子）を含むＤＮＡ配列を得るには、当業者に公知の任意の方法、例えば、固相DNA連続連結（PRESSO）法（Takita, E. et al., DNA Research (2013) 20(6), 583-592 doi:10.1093/dnares/dst032, Precise sequential DNA ligation on a solid substrate: solid-based rapid sequential ligation of multiple DNA molecules）を挙げることが出来る。
【００４０】
［遺伝子発現制御因子の発現用ＤＮＡ配列］
更に、本発明は、以下の実施例に記載されているように、上記の遺伝子発現制御因子をコードする遺伝子（スイッチング誘導遺伝子）を含む、遺伝子発現制御因子の発現用ＤＮＡ配列にも係る。該発現用ＤＮＡ配列には、好ましくは複数の種類の遺伝子発現制御因子をコードすることによって、プラットフォームＤＮＡ配列に於けるヘテロクロマチン及びオープンクロマチン間のクロマチン構造の変換をより効率的に行うことができる。
【００４１】
尚、各発現制御因子をコードする遺伝子を上記の発現用ＤＮＡ配列に挿入する際には、各遺伝子の上流にプロモーター（好ましくは構成的プロモーター）及びその他の当業者に公知の各種の転写調節エレメントも併せて挿入することが好ましい。更に、各構成要素（遺伝子等）を連結するために必要となる各種のリンカー配列等が適宜含まれていても良い。
【００４２】
[植物組換え遺伝子発現制御プラットフォームＤＮＡ配列を含む植物組換え遺伝子発現制御プラットフォームベクター、遺伝子発現制御因子の発現用ＤＮＡ配列を含む遺伝子発現制御因子ベクター、及び、これらベクターから成るベクターセット]
本発明は、植物組換え遺伝子発現制御プラットフォームＤＮＡ配列を含む植物組換え遺伝子発現制御プラットフォームベクター、遺伝子発現制御因子の発現用ＤＮＡ配列を含む遺伝子発現制御因子ベクター、及び、これらベクターから成るベクターセットにも係る。
【００４３】
以下の実施例に於いても詳細に記載されているように、例えば、各種ヒストン修飾酵素とトランス転写因子との融合蛋白質として発現される遺伝子発現制御因子は、様々な理由から、その発現が失われてしまう可能性がある。そこで、遺伝子発現制御因子ベクターの好適例として、遺伝子発現制御因子ベクターに導入した遺伝子発現制御因子の遺伝子発現がOFFにならないように遺伝子発現制御因子の発現用ＤＮＡ配列からの遺伝子発現制御因子の発現を自己活性化できるシステム（自己活性型）を挙げることが出来る。
【００４４】
該自己活性型システムの遺伝子発現制御因子ベクターに於いては、該遺伝子発現制御因子の発現用ＤＮＡ配列の上流側（5’側）及び下流側（3’側）に、本発明の植物組換え遺伝子発現制御プラットフォームＤＮＡ配列に含まれる人工アルフォイドＤＮＡ配列が連結されている。
【００４５】
即ち、該人工アルフォイドＤＮＡ配列に含まれる遺伝子発現制御因子の結合部位として、例えば、転写調節エレメントであるLacO配列を挿入し、一方で、遺伝子発現制御因子の発現用ＤＮＡ配列には、遺伝子発現制御(ＯＮ)因子（例えば、ヒストンのアセチル化酵素等）とトランス転写因子（蛋白質）であるLacインデューサー（LacI）との融合蛋白質であるLacI-fusion (ON)をコードする遺伝子を挿入する。そして、該LacOアルフォイドDNAで囲まれたカセット配列自身からLacI-fusion (ON)を発現させることで、LacI-fusion (ON)に加えて、同じカセット配列中に含まれるtetR-fusion (OFF)やrtetR-fusion (ON)等の遺伝子発現制御因子を恒常的に発現させることが可能となる。
【００４６】
更に、上記のベクターに含まれる以下の各要素、即ち、植物組換え遺伝子発現制御プラットフォームＤＮＡ配列及び遺伝子発現制御因子の発現用ＤＮＡ配列、更に、好ましくは、自己活性型の遺伝子発現制御因子ベクターに必要な人工アルフォイドＤＮＡ配列を一つのベクターに全て含むことも可能である。その結果、このような構成を有する「植物遺伝子組換え融合ベクター」は、植物組換え遺伝子発現制御プラットフォームベクターと遺伝子発現制御因子ベクターの両方の機能を併せ持つベクターとして作用する。
【００４７】
このような誘導ベクターを使用することによって、遺伝子(ベクター)の導入操作が一回で済み、更に、植物組換え遺伝子発現制御プラットフォームＤＮＡ配列上の組換え遺伝子が植物の生育にとって有害である場合であっても、遺伝子発現制御因子の発現用ＤＮＡ配列にある薬剤選択遺伝子を使用することによって、アグロバクテリウム感染当初から、該プラットフォームＤＮＡ配列上の遺伝子発現を抑制状態にできる等の利点がある。
【００４８】
本発明のベクターの種類・由来等に制限はなく、以下に挙げるベクターの増殖及び植物体への導入方法等に応じて、適宜選択することが出来る。例えば、プラスミドベクターが好ましい。更に、適宜、複製起点、各種の制限酵素部位、RB及びLB配列等の当業者に公知の任意のその他のベクター構成要素を含むことが出来る。
【００４９】
以上の記載及び当該技術分野における技術常識に基づき、本発明の植物遺伝子発現制御プラットフォームＤＮＡ配列、遺伝子発現制御因子の発現用ＤＮＡ配列、及び、それらを含む各ベクターは、当業者であれば、容易に設計・調製することが出来る。
【００５０】
［遺伝子組換え植物体及びその製造方法］
上記ベクターの植物体（植物細胞、及び、種及び葉に代表される組織など植物体の一部も含む）への導入及び形質転換法としては、植物体の種類等に応じて、アグロバクテリウム法、パーティクル・ガン法、ウィスカー法等の当業者に公知の任意の方法を挙げることが出来る。該植物体の種類に特に制限はなく、例えば、シロイヌナズナ等のアブラナ科植物、タバコ等のナス科植物、及び、その他の実用的価値が高い、イネ等のイネ科植物等を挙げることが出来る。
【００５１】
アグロバクテリウム法はAgrobacterium tumefaciens（正式名称 Rhizobium radiobacter）やAgrobacterium rhizogenes（正式名称 Rhizobium rhizogenes）などのアグロバクテリウムに含まれるTiプラスミドを利用する方法であり、特に、その経済性及び簡便さの点で他の方法に比べて優れている。目的遺伝子（T-DNA）は植物の核ゲノムに１〜２コピー程度の低コピー数で導入されることが多い。アグロバクテリウム法には中間ベクター法とバイナリーベクター法(binary vector)がある。現在はバイナリーベクター法が主流であり、該方法に使用するベクターはアグロバクテリウムバイナリーベクターと呼ばれる。
【００５２】
バイナリーベクター法では、本来のT-DNAを欠損したが、vir領域という、T-DNAを植物ゲノムに導入するために必要な遺伝子群を保持したままのvir helper Ti plasmidとそれを保持するA. tumefaciensの菌株が開発された。A. tumefaciensの染色体上にも植物への遺伝子導入に必要とされる遺伝子群(chv genes: chromosomal virulence genes)が存在するために、更にTi plasmidの宿主としてもA. tumefaciensはアグロバクテリウム法において必要とされる。T-DNAの両末端にはRB(right border:右境界配列)とLB(left border:左境界配列)という短い配列が存在している。RBとLBに挟まれた配列が植物に導入され、その間の配列には特異性がない。そこで、植物に導入したい遺伝子や形質転換植物を選択するための選択マーカー遺伝子をRBとLBに挟みこめば、任意の人工のT-DNAを構築できる。vir領域とT-DNAとの作用関係はトランスであり、両者が同一のプラスミド上に存在している必要が無い。そこで、操作しやすい小型のシャトル・ベクターに人工のT-DNAを付与したT-DNAプラスミド（バイナリー・ベクター）を大腸菌等の内で増幅させ、その後、vir helper Ti plasmidを保持するA. tumefaciensの菌株へ導入し、こうして得られたA. tumefaciensを植物に感染させる。
【００５３】
本発明方法に於いて該ベクターによって形質転換された植物体は、該ベクターに含まれる選択マーカー遺伝子の種類に応じた方法で適宜選択することが出来る。例えば、ハイグロマイシン耐性遺伝子を含む場合には、ハイグロマイシンを含む培地を用いて、適当な条件下で植物を栽培することによって形質転換植物体を容易に選択することが出来る。
【００５４】
以上の形質転換法によって、本発明の植物組換え遺伝子発現制御プラットフォームＤＮＡ配列、及び、本発明の遺伝子発現制御因子の発現用ＤＮＡ配列が染色体に導入されている遺伝子組換え植物体を製造することができる。従って、本発明は、かかる製造方法にも係るものである。尚、上記プラットフォームＤＮＡ配列及びカセット配列の植物染色体への導入場所に特に制約はなく、例えば、夫々別の染色体に導入されていても良い。
【００５５】
［遺伝子組換え植物体における組換え遺伝子の発現を制御する方法］
本発明の植物組換え遺伝子発現制御プラットフォームＤＮＡ配列内の人工アルフォイドＤＮＡ配列に含まれる結合部位への遺伝子発現制御因子の結合を阻害又は促進させることによって、該遺伝子発現制御因子の作用、例えば、ヒストンのアセチル化及びメチル化によって、人工アルフォイドＤＮＡ配列、更には、多重遺伝子（複数の遺伝子）発現用カセット配列上に於いてヘテロクロマチン及びオープンクロマチン間のクロマチン構造の変換を誘導し、その結果、人工アルフォイドＤＮＡ配列に挟まれた、組換え遺伝子である多重遺伝子（複数の遺伝子）の発現を制御することができる。既に記載したように、人工アルフォイドＤＮＡ配列に含まれる結合部位への遺伝子発現制御因子の結合の阻害又は促進は、使用する化学的誘導系に応じた適当な化合物を当業者に公知の任意の方法・手段によって植物体に作用させる（例えば、該化合物を含む培地で植物体を生育させる等）ことによって行うことが出来る。
【００５６】
尚、これまでに記載した、植物組換え遺伝子発現制御プラットフォームＤＮＡ配列、遺伝子発現制御因子の発現用ＤＮＡ配列、及びこれら各配列を含む各ベクターは、本明細書及び当該技術分野における技術常識に基づき、実施例に記載されているような当業者に公知の遺伝子工学手法・手段を用いて、適宜、合成することが出来る。
【００５７】
以下、実施例に則して本発明を詳述する。尚、該実施例は本発明の一態様にすぎず、本発明の技術的範囲はこれら実施例の記載によって制限されるものではなく、本明細書全体の記載、本明細書に引用された参考文献等の記載内容、及び、当該技術分野における技術常識等によって判断される。
【００５８】
尚、本明細書に特に記載がない場合には、実施例等に於ける各種条件・手段・手法等は当該技術分野における技術常識に従って当業者が適宜設定し実施することが出来る。
【実施例】
【００５９】
１．植物組換え遺伝子発現制御プラットフォームＤＮＡ配列（発現ON/OFFスイッチングプラットフォーム）の作製
１−（１）遺伝子発現ON/OFFスイッチングプラットフォームの構造  
遺伝子発現ON/OFFスイッチングプラットフォーム（TACベクター#1、TACベクター参照： Liu, Y. G., Shirano, Y., Fukaki, H., Yanai, Y., Tasaka, M., Tabata, S. and Shibata, D., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1999) 96, 6535-6540, Complementation of plant mutants with large genomic DNA fragments by a transformation-competent artificial chromosome vector accelerates positional cloning.及びShibata, D. and Liu, Y. G., Trands in Plant Science (2000) 5, 354-357, Agrobacterium-mediated plant transformation with large DNA fragments.）は、3つの遺伝子発現マーカー（NPTII、EYFP、GUS）が順方向に並んだマーカー遺伝子カセット（Marker genes cassette）を、171bpの反復単位が繰り返した30kbの合成アルフォイドDNA（tetOアルフォイドDNA）で両側から挟んだ構造である（図５）。このスイッチングプラットフォームは、tetOアルフォイドDNA上のクロマチン構造をtetR融合蛋白質を用いて操作することによって、隣接する領域のクロマチン構造を変化させ、それを介して、tetOアルフォイドDNAに挟まれた中央部のマーカー遺伝子カセット上の遺伝子発現をON/OFF制御することを目的とした構築した。【００６０】
マーカー遺伝子カセット配列上には、薬剤選択マーカーであるNPTII遺伝子、顕微鏡を用いた蛍光観察に適したEYFPタンパク質をコードする遺伝子、植物における組織染色に適したGUSタンパク質をコードする遺伝子の3つが配置されている。これらの遺伝子の上流にはプロモーター、下流にはターミネーターが配置された、遺伝子発現カセットとなっている（図５）。【００６１】
１−（２）発現ON/OFFスイッチングシステムの原理
発現ON/OFFスイッチングプラットフォームは、アグロバクテリウムバイナリーベクター（TACベクター#1）によるT-DNAの植物ゲノムへの挿入により実現する（図６）。発現ON/OFFスイッチングプラットフォームは、ゲノム挿入部位のクロマチン構造に依らず、tetOアルフォイドDNA上のクロマチン構造を操作することで、中央領域に埋め込んだ遺伝子領域の発現ON/OFF制御を行うことを目的としている。このtetOアルフォイドDNA上のクロマチン構造の制御には、tetOアルフォイドDNA中に約340bpに一回の頻度で埋め込んだtetO配列を利用する。このtetO配列にはtetRと融合させた任意の蛋白質（遺伝子発現制御因子）を結合（テザリング）させることができる（図６）。また、tetRのtetOへの結合はテトラサイクリンとその誘導体の添加により失われる（図７及び８）。【００６２】
一方、tetRの変異体であるリバーステトラサイクリンリプレッサー（rtetR）は、テトラサイクリンとその誘導体の添加によりtetOに強く結合するようになる（図７及び８）。このtetR、rtetRの持つ正反対の性質は、遺伝子発現のON/OFF制御にも有用である。具体的には、tetRに遺伝子発現を抑制する因子（ヒストン修飾酵素等を含む）を融合させた蛋白質（tetR-fusion(OFF)）、rtetRに遺伝子発現を促進する因子（転写活性化に関わる因子等）を融合させた蛋白質（rtetR-fusion(ON)）を発現させることで、テトラサイクリンとその誘導体を無添加の状態では遺伝子発現がOFF、添加時にはONという制御を行うことができる（図7及び８）。このようなtetR、rtetR融合因子を発現する遺伝子カセットは、発現ON/OFFスイッチングプラットフォーム構築（TACベクター#1）とは別のアグロバクテリウムバイナリーベクター（TACベクター#2）で細胞へ導入し、発現ON/OFFスイッチングプラットフォーム上の遺伝子発現とは独立して、制御因子を発現させる（図６，７及び８）。【００６３】
更に、既に記載した理由から、遺伝子発現制御因子の発現が失われてしまう可能性がある。もし、該制御因子の発現がOFFになってしまうと、本来の目的であるプラットフォーム上の遺伝子発現制御ができなくなる。そこで、遺伝子発現制御因子の発現用ＤＮＡ配列（制御因子カセット）からの遺伝子発現がOFFにならないように制御因子カセットからの遺伝子発現を自己活性化できるシステムを構築した（図９及び１０）。ここでLacO配列はLacI蛋白質の結合配列であり、LacOアルフォイドDNAには、LacIに融合したヒストンアセチル化酵素等の遺伝子発現をONに制御する因子（LacI-fusion (ON)）を結合させることができる。そして、LacOアルフォイドDNAで囲まれた遺伝子カセット自身からLacI-fusion (ON)を発現させることで、LacI-fusion (ON)を含め、同じカセット中に含まれるtetR-fusion (OFF)やrtetR-fusion (ON)も恒常的に発現させることが可能となる。【００６４】
１−（３）tetOアルフォイドDNA、LacOアルフォイドDNAとその反復伸長  
ヒトセントロメア配列であるアルフォイドDNAは、高頻度の反復配列である。ヒト21番染色体アルフォイドDNAは、α21-I 11merと呼ばれる繰り返し単位から構成されている。この11mer配列は少しずつ配列の異なる、アルフォイドモノマーと呼ばれる171bpの配列が11回連なった構造を取っている。これらのアルフォイドモノマーのうち5つには、ヒトセントロメアタンパク質の一つであるCENP-Bの結合配列、CENP-B box配列が含まれている（図１１上段）。【００６５】
tetO 11merは、α21-I 11mer中のCENP-B boxを含まないモノマーに、テトラサイクリンリプレッサー（tetR）の結合配列であるテトラサイクリンオペレーター配列（tetO）を埋め込んだ配列で、DNA人工合成により作製した（図１１上段、配列番号１）。【００６６】
LacO 11merは、tetOアルフォイド中のtetOの位置に、Lacリプレッサー（LacI）の結合配列である、Lacオペレーター配列（LacO）を代わりに埋め込んだもの。この配列もDNA人工合成により作製した（図１１上段、配列番号２）。【００６７】
これらのアルフォイド11mer配列の末端にNheI、SpeI、NotIサイトを付加し、クローニングベクターpBS KMneo（配列番号３）にクローニングした。このうちNheIとSpeIサイトは、DNAを切断した際に生じる突出末端の形状が同じであるため、DNAライゲースを用いた連結が可能であるが、NheIとSpeIで切断した末端がヘテロに連結した部位は、NheIでもSpeIでも認識されなくなり、切断を受けない。この性質を利用して、NheI-SpeI間のインサートを二倍ずつ反復伸長させる方法が確立されている（Ohzeki J, Nakano M, Okada T, Masumoto H., CENP-B box is required for de novo centromere chromatin assembly on human alphoid DNA. J Cell Biol. 2002 Dec 9;159(5):765-75及びOkamoto Y, Nakano M, Ohzeki J, Larionov V, Masumoto H., A minimal CENP-A core is required for nucleation and maintenance of a functional human centromere. EMBO J. 2007 Mar 7;26(5):1279-91）。
例えば、図１１下段のNheI-NotI断片とSpeI-NotI断片を連結すると、インサートの繰り返し回数は二倍になるが、制限酵素サイトの位置関係は変化しないため、同様の制限酵素処理とライゲーション反応を繰り返すことで、インサートを二倍ずつ反復させることが出来る。この方法を応用し、tetO-11mer、LacO-11merそれぞれのアルフォイド11mer配列を16回反復させたBACベクターを作製した（図１２）。【００６８】
１−（４）アグロバクテリウムバイナリーベクターpRIBACの作製
一般に、大腸菌プラスミド上にクローニングした反復配列は、組換え反応によりデリーションし易いことが知られている。従って、ヒトアルフォイドDNAのような反復配列を、デリーションを防いで安定に保持させるためには、１細胞あたりのプラスミドのコピー数を、可能な限り低く維持することが重要である。【００６９】
そこで、アルフォイドDNAを含んだプラスミドを、大腸菌内及びアグロバクテリウム内で安定に保持させるため、大腸菌1細胞あたり1コピーで維持されるBACベクターの配列と、アグロバクテリウム内での複製起点（Ri ori配列）を組み合わせ、どちらの細胞でも複製・維持されるバイナリーベクターを作製した（図１３）。【００７０】
このBACベクター配列はpBAC108Lベクター（GenBank: U51114.1）から、Ri ori配列はpRI-201-AN-GUSベクター（TAKARA）からPCRで増幅して取得した。また、大腸菌／アグロバクテリウム細胞内で用いる選択マーカーとしてNPTIII遺伝子発現カセットの配列を、pRI-201-AN-GUSベクターからPCRで増幅して取得した。これらの配列を組み合わせて、バイナリーベクターpRIBAC（配列番号４）を作製した。【００７１】
１−（５）遺伝子発現ON/OFFスイッチングプラットフォームベクターの構築
本発明の遺伝子発現ON/OFFスイッチングプラットフォームDNA配列を構築するために、まずpRIBACに30kbの長さを持つtetO 11mer反復配列（tetOアルフォイドDNA）を挿入したプラスミド、pRIBAC TW11.16を大腸菌株DH10Bを用いて作製した（図１４）。ここで挿入したtetOアルフォイドDNA断片は、NheI-NotIサイトを末端に持ち、tetOアルフォイドDNAとNotIサイトとの間にSpeIサイトを含んでいる。このため、このtetOアルフォイドDNAをpRIBACのSpeI-NotIサイトに挿入してできたpRIBAC TW11.16には、図１１と同様の制限酵素処理、ライゲーションを用いて、繰り返しSpeI-NotIサイト間にインサートを挿入することが可能になる。【００７２】
次に、pRIBAC TW11.16にマーカー遺伝子カセット配列（多重遺伝子発現用カセット配列）を連結した（図１５）。マーカー遺伝子カセット配列はNPTII、EYFP、GUSの遺伝子発現カセットが順方向に並んだ構築となっている（図５）。各遺伝子発現カセットのうち、NPTIIとGUS遺伝子カセットはpRI-201-AN-GUSベクター（TAKARA）を、EYFP遺伝子はpJETY3ベクター（非特許文献２）を鋳型として、PCR法により作成した。また、3つの遺伝子カセットは、それぞれ共通の対合末端を持つNheIとSpeIサイトを利用したライゲーションにより連結し、3つの遺伝子が連なったマーカー遺伝子カセット配列とした（図５）。このコア配列はNheI-SpeI（NotI）で切り出せるようになっており、NheI-NotIで切り出したコア配列をpRIBAC TW11.16のSpeI-NotIサイトに挿入することで、tetOアルフォイドDNAとゲノム組換えステーションのコア配列（多重遺伝子（複数の遺伝子）発現用カセット配列）が連結したベクター、pRIBAC TW11.16 MGCを作製した（図１５）。【００７３】
最後に、pRIBAC TW11.16 MGCのSpeI-NotIサイト間に、pRIBAC TW11.16からNheIとNotIで切り出したtetOアルフォイドDNA断片を挿入し、本発明の植物組換え遺伝子発現制御プラットフォームＤＮＡ配列を含むベクターである、遺伝子発現ON/OFFスイッチングプラットフォーム作製用のプラスミド（pRIBAC tetPF）を完成させた（図１６）。このpRIBAC tetPFの作成過程で用いたプラスミドDNA（pRIBAC、pRIBAC TW11.16、pRIBAC TW11.16 MGC、pRIBAC tetPF）は、すべて大腸菌株DH10Bを用いて作製し、ラージコンストラクションキット（QIAGEN）を用いて精製した。次に、これらの大腸菌由来のプラスミドをSpeIで切断し、パルスフィールドゲル電気泳動（PFGE）でサイズを確認した（図１７）。また、このほかに、アルフォイドDNA配列を持たないマーカー遺伝子カセットのみの構築（pRIBAC MGC Alone：配列番号５）も大腸菌株DH10Bを用いて作成し、同様にSpeIで切断してPFGEでサイズを確認した（図１７）。なお、pRIBAC MGC Aloneは、pRIBACのSpeI-NotIサイト間に、NheIとNotIで切り出したマーカー遺伝子カセット配列を挿入して作製した。これらのプラスミドの泳動パターンには異常は見られず、tetOアルフォイドDNAの反復配列の顕著なデリーションも観察されなかった。【００７４】
遺伝子発現ON/OFFスイッチングプラットフォームＤＮＡ配列（構築）を植物細胞に導入するためには、pRIBAC tetPFプラスミドを大腸菌からアグロバクテリウムの細胞に導入し、T-DNAとして植物ゲノムに組み込ませる必要がある。このため、アグロバクテリウム細胞株LBA4404（TAKARA）のエレクトロコンピテントセルを用いてプラスミドの導入を行った（導入条件：25μFm、200Ω、2.4kV、0.1mmキュベット、20μlコンピテントセル）。その後、pRIBAC tetPFプラスミドを導入したアグロバクテリウム細胞を、カナマイシン（30μg/ml）を含んだLBプレートに撒き、コロニーを形成させた。【００７５】
大腸菌内では、pRIBAC tetPFなどのBACプラスミドは細胞あたり1コピーで維持され、組換わりにくい。実際に精製したプラスミドをPFGEで解析してもベクター構築に異常は検出されなかった（図１８）。一方、アグロバクテリウム細胞内でのRi oriを持つプラスミド上での反復配列の安定性はよくわかっていない。そこで、実際にpRIBAC tetPFプラスミドを導入したアグロバクテリウムのシングルコロニーを複数ピックアップして培養し、ここからDNAを回収してPFGE解析をした。【００７６】
アグロバクテリウムの持つプラスミドDNAは、大腸菌の場合と同様にアルカリ-SDS法で回収し、制限酵素NheIとXhoIで処理したのち、PFGEで解析した（図１８）。解析した半数以上の株で、導入したBACプラスミドと同じ泳動度のバンドが確認され、アグロバクテリウム細胞内においても、Ri oriを持つプラスミド上に組み込んだ反復配列は安定に維持されることが確認できた。【００７７】
上記で構築したpRIBAC tetPFと同様の方法を用いて、tetOアルフォイドDNAに代えてLacOアルフォイドDNAを用いて、本発明の植物組換え遺伝子発現制御プラットフォームＤＮＡ配列を含むベクターであるpRIBAC LacPFプラスミドも作製した（図１９）。pRIBAC LacPFの作製過程で用いたプラスミドDNA（pRIBAC、pRIBAC LW11.16、pRIBAC LW11.16 MGC、pRIBAC LacPF）は、すべて大腸菌株DH10Bを用いて作製し、ラージコンストラクションキット（QIAGEN）を用いて精製した後、SpeIで切断してパルスフィールドゲル電気泳動（PFGE）でサイズを確認した（図２０）。また、アグロバクテリウム細胞に導入したpRIBAC LacPFプラスミドが、半数以上のアグロバクテリウム株において安定に維持されていることも確認された（図２１）。【００７８】
１−（６）自己活性化型制御因子発現プラットフォームベクターの作製
既に記載したような「自己活性化型制御因子発現プラットフォーム」用ベクター(図９及び１０)を構築するために、まずpRIBACに30kbの長さを持つLacO 11mer反復配列（LacOアルフォイドDNA）を挿入したプラスミドpRIBAC LW11.16を大腸菌株DH10Bを用いて作製した（図２２）。ここで挿入したLacOアルフォイドDNA断片は、NheI-NotIサイトを末端に持ち、LacOアルフォイドDNAとNotIサイトとの間にSpeIサイトを含んでいる。このため、このLacOアルフォイドDNAをpRIBACのSpeI-NotIサイトに挿入してできたpRIBAC LW11.16には、繰り返しSpeI-NotIサイト間にインサートを挿入することが可能になる（図１１下段）。【００７９】
次に、pRIBAC LW11.16にON/OFF制御因子発現カセットを連結した（図２３、表１）。発現カセットは、薬剤選択マーカーであるハイグロマイシン（Hyg）耐性遺伝子に加え、LacI融合のヒトのアセチル化酵素KAT7の酵素ドメイン(LacI-KAT7HD)、rtetR融合のKAT7の酵素ドメイン（rtetR-KAT7HD）、tetR融合のヒトメチル化酵素SUV39H1の酵素ドメイン（tetR-SUV39H1MTD）をそれぞれコードする遺伝子発現カセットが順方向に連結されている（図２４、表１）。このアセチル化酵素KAT7は、H3、H4などのヒストンをアセチル化することで遺伝子発現が活性化(促進)する（ONになる）方向にクロマチン構造を制御する因子であり、メチル化酵素SUV39H1は、ヒストンH3の9番目のリジン残基をトリメチル化することで遺伝子発現を抑制する（OFFにする）方向にクロマチン構造を制御する因子である（非特許文献２、非特許文献４）。これらの遺伝子配列は公知であって、かずさDNA研究所のHaloタグ融合ライブラリーから入手し、PCR法を用いて必要な酵素活性を持つドメインのみをクローニングに用いた。各遺伝子カセットは、共通の対合末端を持つNheIとSpeIサイトを利用したライゲーションにより連結し、4つの遺伝子が連なったON/OFF制御因子発現カセットを作成した（図２３）。このカセット配列はNheI-SpeI（NotI）で切り出せるようになっており、NheI-NotIで切り出したカセット配列をpRIBAC LW11.16のSpeI-NotIサイトに挿入することで、LacOアルフォイドDNAとON/OFF制御因子発現カセットが連結したベクター、pRIBAC LW11.16 SGを作成した。【００８０】
最後に、pRIBAC LW11.16 SGのSpeI-NotIサイト間に、pRIBAC LW11.16からNheIとNotIで切り出したLacOアルフォイドDNA断片を挿入し、本発明の遺伝子発現制御因子の発現用ＤＮＡ配列を含む遺伝子発現制御因子ベクター（自己活性型）である、「自己活性化型制御因子発現プラットフォーム」作成用のプラスミド（pRIBAC LacSG）を完成させた（図２５）。このほかに、LacOアルフォイドDNA配列を持たない制御因子発現構築（pRIBAC SG Alone：配列６）も比較対象として作成し、これらをラージコンストラクションキット（QIAGEN）を用いて精製した。【００８１】
上記の大腸菌を用いて作成・精製したpRIBAC LacSGプラスミドを、アグロバクテリウム細胞株LBA4404（TAKARA）のエレクトロコンピテントセルへ導入した。その後、カナマイシン（30μg/ml）を含んだLBプレートに撒き、シングルコロニーを形成させた。シングルコロニーを複数ピックアップして培養したアグロバクテリウムから、アルカリ-SDS法でプラスミドDNAを回収し、PFGE解析をした（図２６）。解析した半数以上の株で、導入したBACプラスミドと同じ泳動度のバンドが確認され、LacOアルフォイドDNAの反復配列も安定に維持されることが確認できた。【００８２】
１−（７）遺伝子発現ON/OFFスイッチングプラットフォーム導入タバコ培養細胞BY-2の取得
［タバコ培養細胞BY-2の培養］
理化学研究所バイオリソース研究センター実験植物開発室から提供を受けたNicotiana tabacumタバコ培養細胞BY-2（RPC00001）を使用した。培養は、細胞配布元の理化学研究所のプロトコールに従い以下の様に行った。培地はmodified Linsmaier and Skoog (mLS)培地（Murashige and Skoog Plant Salt Mixture (和光純薬), 1 μg/ml Thiamine hydrochloride, 0.1 mg/ml myo-Inositol, 0.2 mg/ml KH2PO4, 30 mg/ml Sucrose, 0.2 μg/ml 2,4-Dichlorophenoxyacetic acid, pH 5.8）を使用した。暗所28℃ 130 rpmで振盪培養した。植え継ぎ後７日目に1 mlの培養液を95 mlのmLS培地に植え継いだ。【００８３】
［タバコ培養細胞BY-2への遺伝子発現ON/OFFスイッチングプラットフォームの導入］
tetOアルフォイドDNAまたはLacOアルフォイドDNAを含む遺伝子発現ON/OFFスイッチングプラットフォーム（tetPFまたはLacPF）のBY-2染色体への挿入を、以下に示すアグロバクテリウムを利用した方法で行った。pRIBAC tetPFプラスミドまたはpRIBAC LacPFを有するアグロバクテリウムLBA4404のコロニーを10 mlの抗生物質入りLB培地（50μg/mlリファンピシン、25 μg/mlストレプトマイシン、25 μg/mlカナマイシン）に植菌し、26℃、120 rpmで一晩振盪培養した。1 mlのLB培地で3回洗浄した後、OD600が1.0になるようにLB培地に懸濁した。mLS培地中で対数増殖期のBY-2細胞（植え継ぎ後3日後の細胞）5 mlを10 cmシャーレに広げ、100 μlのアグロバクテリウム懸濁液を加え、24 μMアセトシリンゴン存在下で2日間26℃で共培養を行った。細胞を回収し、10 mlのmLS培地（0.5 mg/mlセフォタックス入り）で４回洗浄した。0.5 mg/mlセフォタックスと選択薬剤（100 μg/mlカナマイシン）を含む寒天培地で、28℃で培養することでセレクションを行った。【００８４】
［EYFP観察］
EYFP蛍光観察には、共焦点レーザスキャン顕微鏡LSM800（カールツァイス社）とPlan-NEOFLUAR 5倍レンズまたはPlan-NEOFLUAR 20倍レンズを用いた。【００８５】
［GUS染色］
BY-2細胞をGUS染色液（1 mM X-Gluc (5-bromo-4-chloro-3-indolyl-beta-D-glucuronide cyclohexylammonium salt), 50 mM Phosphate buffer pH7.2, 0.5 mM K3[Fe(CN)6], 0.5 mM K4[Fe(CN)6], 0.1% Triton X-100）に懸濁し、37℃で数時間インキュベートした。【００８６】
［ゲノムDNAの精製］
細胞約45 mgを凍結破砕用2 mlチューブ（安井器械）に回収し、液体窒素で凍結した。メタルコーンを加え、マルチビーズショッカーを用いて、2800 rpmで15秒間細胞の破砕を行った。260 μlのCell Lysis buffer（Promega）、100 μlのTail Lysis buffer（Promega）、20 μlのProteinase K solution（Promega）、20 μlのRNase A solution（Promega）を加え懸濁した後、室温14000 rpmで2分間遠心した。上清をMaxwell RSC Plant DNA kit（Promega）のカセットにアプライし、自動核酸精製装置Maxwell 16（Promega）にセットし、植物DNA調製プロトコールを実行した。Qubit dsDNA HS assay kit（Thermo Fisher Scientific）を使用してDNAの定量を行った。【００８７】
［qPCR］
精製したゲノムDNAをCFX96 real-time PCR system (Bio-Rad)、 SYBR Premix Ex TaqII (Takara Bio)、アルフォイドDNA増幅プライマーセットを用いて解析した（表２）。スタンダードサンプルとして精製したtetPFまたはLacPF DNAを用いた。ノーマライズにはゲノムDNA定量値を用いた。【００８８】
こうして作製した、植物組換え遺伝子発現制御プラットフォームＤＮＡ配列を含むベクターである遺伝子発現ON/OFFスイッチングプラットフォームを、アグロバクテリウムを利用してタバコ培養細胞BY-2に導入した。その結果、tetPFについては20個、LacPFについては8個の耐性カルスが形成された。さらに、0.5 mg/mlセフォタックスと選択薬剤（100 μg/mlカナマイシン）を含む寒天培地を用いて28℃で植え継ぎを繰り返した。最終的にtetPFについては16個、LacPFについては3個のカルス（株）について安定に培養維持することが出来た。【００８９】
遺伝子発現ON/OFFスイッチングプラットフォームには、NPTII（カナマイシン耐性）、EYFP（EYFP蛍光）、GUS（β-グルクロニダーゼ）遺伝子の３種類のマーカー遺伝子が連結されている。さらにその両側にtetO配列またはLacO配列を含むアルフォイドDNA（30 kb）が連結されている。取得したtetPF 16株とLacPF 3株について、遺伝子発現ON/OFFスイッチングプラットフォームの挿入を確認するために、EYFP蛍光観察、GUS染色を行った。その結果、LacPF株L5を除いてEYFP遺伝子とGUS遺伝子の発現を確認出来た（図２７，２８及び２９）。【００９０】
さらに、遺伝子発現ON/OFFスイッチングプラットフォームの挿入コピー数を確認するために、ゲノムDNAを精製してqPCRを行った。その結果、遺伝子発現ON/OFFスイッチングプラットフォームを１コピーで含む株も4株取得できていることが確認できた（図３０）。唯一EYPF蛍光とGUS活性を示さなかったLacPF L5株については、コピー数も0.5以下と推定されたことから、アルフォイドDNA左側半分からNPTII（カナマイシン耐性を示す）までのT-DNAしかゲノム挿入されていないと考えられる(図２７，２８及び２９)。全ての株でEYPF蛍光強度、GUS活性、NPTII耐性は、アルフォイドDNAコピー数計測結果とコンシステントであり、コピー数計測結果の信頼性の高さを示している。【００９１】
１−（８）  BY-2 ON/OFFスイッチングプラットフォーム候補株のクロマチン免疫沈降（ChIP）によるクロマチン構造の解析
［BY-2細胞からの粗核画分調製とクロマチンのクロスリンク］
ムラシゲスクーグ培地（３％スクロース）で培養したBY-2（tetOプラットフォーム候補株T4）細胞を細胞容積と等しい量の氷冷した50mMリン酸カリウムバッファー（pH5.8）で２回洗い、等細胞容積の同バッファーで懸濁した。３mlの懸濁液と1mlの氷冷した75％(w/v)グリセロールを混和し、専用メタルコーンをいれて予め氷冷した50mlマルチビーズショッカー（安井機械）専用チュープに移し、1,000rpmで1分の粉砕を5回繰り返した（各粉砕の合間に氷冷）。細胞粉砕液を４本のエッペンドルフチューブに分け、４℃で400x g（スイングローター）の遠心を２分行った。核を含む沈殿を氷冷した1mlのPBSで懸濁し、同様の遠心で２回洗った。沈殿（約0.3ml  x4チューブ）を３倍量の２％ホルムアルデヒドを含むPBSで懸濁し、室温で20分の反応でクロマチンをクロスリンクした。60μlの2.5Mグリシンを含むPBSを混和し、クロスリンク反応を止めた。４℃で400x g（スイングローター）の遠心を２分行い、沈殿を氷冷した1mlのPBSで同様の遠心により２回洗った。さらに沈殿を氷冷した1mlのTE（pH8.0）で同様の遠心により洗って上清を取り除いた後-80℃に保存した。【００９２】
［クロマチン免疫沈降］
-80℃保存した粗核画分の沈殿（約0.2ml、約0.4gの細胞に由来）を0.5mlのソニケーションバッファー（20mMトリス塩酸pH8.0、1mM EDTA、0.025％SDS、0.5mM DTT、1.5μMアプロチニン、20μMロイペプチン、40μM MG132）に懸濁し、ピコラプター（ダイアジェノード）の適当な条件で（例えば30秒ON/30秒OFFのサイクルを15サイクル）核破壊とクロマチンの切断を行った。４℃で20,000x g（スイングローター）の遠心を10分行い、上清をクロマチン画分として回収した。クロマチン画分の容積が２〜５倍量の範囲でそのバッファー組成が0.3M NaCl、20mMトリス塩酸pH8.0、0.5mM EDTA、5％グリセロール、0.05％SDS、1％TritonX-100、0.5mM DTT、1.5μMアプロチニン、20μMロイペプチン、20μM MG132になるように整え、予め抗体を結合させたProtein G磁気ビーズ（Dynabeads, サーモフィッシャー）を混合した。インプットDNAとして免疫沈降反応に使った1/10のクロマチン画分を４℃に保持した。0.5mlの免疫沈降反応あたり1μgのモノクローナル抗体と5μlのProtein G磁気ビーズを用いた。ローテーターで緩やかに攪拌しながら一晩４℃の反応をさせた後、ビーズを磁気で集め、0.3mlの洗浄バッファー（0.55M NaCl、20mMトリス塩酸pH8.0、1mM EDTA、5％グリセロール、0.1％SDS、1％TritonX-100）で３回洗った。以後の処理はインプットDNAに対しても同様に行った。磁気ビーズを80μlの溶出バッファー（0.15M NaCl、50mMトリス塩酸pH8.0、10mM EDTA、0.5％SDS、0.1mg/ml RNase A）で懸濁して37℃１時間以上の処理をした後、20μlの0.2mg/ml Proteinase Kを加え、50℃で1時間以上蛋白質を消化した。その後65℃で一晩加熱してクロスリンクを外した。磁気でビーズを除いた溶液0.1mlから、DNAをMinElute PCR Purification Kit（キアゲン）を用いて精製し、50μlのTEで溶出した。溶出したDNAの2.5μlをSYBR Green蛍光色素を用いたリアルタイムPCRの鋳型に用いた。【００９３】
BY-2 tetプラットフォーム候補株を２ヶ月間、挿入遺伝子の発現の選択圧であるカナマイシンを含まないムラシゲスクーグ培地で培養し、挿入領域である合成反復DNA (tetO alphoid)、カナマイシン耐性遺伝子 (NPTII)、蛍光マーカー遺伝子 (EYFP)、酵素マーカー遺伝子 (GUS)、およびゲノム上の発現遺伝子としてのテロメラーゼ遺伝子 (TERT)、ヘテロクロマチン化されている領域として３種のトランスポゾン (MITE, I-94, g31i) のヒストン修飾をクロマチン免疫沈降（ChIP）で評価した（図３１、表２）。プラットフォーム領域はいずれもオープンクロマチン型修飾であるヒストンH3の36番目のリジンのトリメチル化（H3K36me3）とヒストンH3の4番目のリジンのトリメチル化（H3K4me3）のレベルは、共に必須遺伝子TERTよりも高いレベルである。一方、抑制型クロマチンであるトランスポゾン領域は、H3K36me3やH3K4me3修飾はほぼ検出できないのに対して、クローズドクロマチン型修飾であるヒストンH3の27番目のリジンのトリメチル化（H3K27me3）とヒストンH3の9番目のリジンのジメチル化（H3K9me2）のレベルは非常に高いレベルで検出されている。逆にプラットフォーム領域は、抑制型のH3K27me3やH3K9me2修飾は殆ど検出されていない。これらの解析結果から、何も誘導しない条件では、選択圧なしの長期間にわたって、プラットフォームはオープンなクロマチン構造を維持できることが判明した。【００９４】
［免疫沈降に用いた抗体］
normal mouse IgG (SantaCruz SC2025)
anti-H3K9me2 (モノクローナル抗体研究所MABI0307)
anti-H3K27me3 (モノクローナル抗体研究所1E7)
anti-H3K36me3 (モノクローナル抗体研究所 MA333B)
anti-H3K4me3 (モノクローナル抗体研究所 MA304B)
【００９５】
【表２】
2020031985.tif 000004
【００９６】
１−（９）遺伝子発現ON/OFFスイッチングプラットフォームへのON/OFF制御因子の効果
[遺伝子発現ON/OFFスイッチングプラットフォーム１コピー株へのON/OFF制御因子発現用DNA配列の導入]
本発明の遺伝子発現制御因子の発現用ＤＮＡ配列である、ON/OFF制御因子発現カセットを有するアグロバクテリウムLBA4404のコロニーを10 mlの抗生物質入りLB培地（50 μg/mlリファンピシン、25 μg/mlストレプトマイシン、25 μg/mlカナマイシン）に植菌し、26℃、120 rpmで一晩振盪培養した。1 mlのLB培地で3回洗浄した後、OD600が1.0になるようにLB培地に懸濁した。mLS培地中で対数増殖期のBY-2細胞（植え継ぎ後3日後の細胞）5 mlを10 cmシャーレに広げ、100 μlのアグロバクテリウム懸濁液を加え、24 μMアセトシリンゴン存在下で3日間26℃で共培養を行った。細胞を回収し、10 mlのmLS培地（0.5 mg/mlセフォタックス入り）で４回洗浄した。0.5 mg/mlセフォタックスと選択薬剤（50 μg/mlハイグロマイシン）を含む寒天培地で、28℃で培養することでセレクションを行った。【００９７】
［EYFP観察］
EYFP蛍光観察には、EYFP観察用ペンライトHandy Green Pro Plus for YFP (リライオン社)を用いた。
【００９８】
【表３】
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【００９９】
ON/OFF制御因子（遺伝子発現制御因子）の効果の検証を行った。OFF側の因子としてtetR-SUV39H1MTDとtetR-tTSを、ON側の因子としてrtetR-KAT7HDを用いた。これらの遺伝子の発現カセットを、それぞれ単独にハイグロマイシン耐性遺伝子を含んだ適当なアグロバクテリウムベクター上にクローニングした。そして、EYFP遺伝子とGUS遺伝子の発現を示し、１コピーで遺伝子発現ON/OFFスイッチングプラットフォームを含む株としてtetPF T4とT5を選別し、該アグロバクテリウムベクターに含まれるOFF側抑制因子（tetR-SUV39H1MTDまたは、tetR-tTS）とON側制御因子（rtetR-KAT7HD）の発現カセットを個別に上記のアグロバクテリウム法によって導入した。
その結果、tetPF T4株、T5株共に、各制御因子について200程度の耐性カルスが生じた。選択培地にはテトラサイクリン系の薬剤は含まれておらず、ON/OFFプラットフォームにはtetR-SUV39H1MTDまたはtetR-tTSが結合し、OFF側の効果が現れていることが期待できる（表１）。その可能性を検証するために、各因子について10個のカルスをランダムに選択し、遺伝子発現ON/OFFプラットフォームのセレクションなし、かつ制御因子のセレクションありの状態（カナマイシンなし、ハイグロマイシンありの寒天培地）で約1ヶ月継代を行い、EYFP蛍光の観察を行った。その結果、tetR-SUV39H1MTDとtetR-tTSについては株によるレスポンスの違いはあるものの、EYFPの蛍光が大幅に低下したカルスが複数個観察された（図３２）。これは期待通りにプラットフォームがONからOFFへ変換されたことを示している。これらOFF側抑制因子はアルフォイド配列のみに結合できるが、プラットフォーム内部遺伝子領域のEYFP発現が抑制されたカルスが複数得られたことは、遺伝子発現ON/OFFプラットフォーム全域が期待通りOFF側のクロマチン構造へスイッチされた可能性を強く示唆している。一方、ON側制御因子rtetR-KAT7HDを導入したカルスはEYFP発現を検出できるがレベルに変動が観察された。制御因子を導入していないカルスについてはその様な傾向は観察されなかった。【０１００】
１−（１０）遺伝子発現ON/OFFスイッチングプラットフォーム導入シロイヌナズナの取得
［シロイヌナズナへの遺伝子発現ON/OFFスイッチングプラットフォームの導入］
tetOアルフォイドDNAを含む遺伝子発現ON/OFFスイッチングプラットフォーム（tetPF）のシロイヌナズナ染色体への挿入を、以下に示すアグロバクテリウムを利用した方法で行った。pRIBAC tetPFプラスミドを有するアグロバクテリウムGV3101のコロニーを20 mlの抗生物質入りLB培地（50 μg/mlリファンピシン、25 μg/mlゲンタマイシン、25 μg/mlカナマイシン）に植菌し、25℃、120 rpmで一晩培養した。5 mlのアグロバクテリウム培養液を150 mlの抗生物質入りLB培地（50 μg/mlリファンピシン、25μg/mlゲンタマイシン、25 μg/mlカナマイシン）に加え、25℃、120 rpmでさらに一晩培養した。150 mlのアグロバクテリウム培養液を遠心し、上澄みを除いた後、アグロバクテリウムを30 mlのインフィルトレーションバッファー（1/2濃度のMurashige and Skoog Plant Salt Mixture (和光純薬）, 5% Sucrose, Gamborg’s Vitamin Solution (Sigma), 0.01 μg/ml 6-Benzylaminopurine, 0.02% Silwet L77）に懸濁した。種を蒔いて16時間明期、8時間暗期の周期で、22℃で2ヶ月程度栽培したシロイヌナズナを懸濁液に30秒間浸した。シロイヌナズナをラップで包み横に寝かせ、一晩暗所に静置した。ラップを外し、16時間明期、8時間暗期の周期で、22℃で育成し、採種した。0.5 mg/mlセフォタックスと選択薬剤（30 μg/mlカナマイシン）を含む寒天培地（Murashige and Skoog Plant Salt Mixture (和光純薬), 3% Sucrose, 2.3 mM MES, pH 5.7, Gamborg’s Vitamin Solution (Sigma), 0.8% Agar）に播種し、セレクションを行った。【０１０１】
［EYFP観察］
EYFP蛍光観察には、EYFP観察用モジュール付きの実体顕微鏡（ライカ社）を用いて行った。遺伝子発現ON/OFFスイッチングプラットフォームを、アグロバクテリウムを利用してシロイヌナズナに導入した。約40000粒の種についてセレクションを行い、9粒についてカナマイシン耐性系統を取得できた。さらに、遺伝子発現ON/OFFスイッチングプラットフォームの挿入を確認するために、マーカー遺伝子EYFPの発現をEYFP蛍光の観察により行った。その結果、その全てでEYFPの蛍光を確認できた（図３３）。6系統については、主に根でEYFP蛍光が観察された。1系統については、植物体全体で強いEYFP蛍光が観察された。この株では、発現しやすい領域にプラットフォームが挿入されたか、複数コピー挿入された可能性がある。2系統については根などでEYFP蛍光が観察されたが、異常な形態を示した。発生や生育に悪影響を及ぼす領域にプラットフォームが挿入されたと考えられる。これらの結果から、少なくとも遺伝子発現ON/OFFスイッチングプラットフォームがシロイヌナズナのゲノムに挿入された系統は多数取得可能であり、タバコBY-2細胞同様プラットフォームのEYFP遺伝子からの発現も維持されていることが判明した。【０１０２】
１−（１１）融合バイナリーベクターpRIBAC LacSG-tetPFの構築による改良
発現ON/OFFスイッチングプラットフォームに含まれる、多重遺伝子（複数の遺伝子）発現用カセット配列（ゲノム組換えステーション）上の遺伝子発現を制御するためには、（pRIBAC tetPFベクターをアグロバクテリウム経由で感染させて得た）発現ON/OFFスイッチングプラットフォーム（植物組換え遺伝子発現制御プラットフォーム）挿入系統に、もう一度pRIBAC LacSGなどのベクター（遺伝子発現制御因子ベクター）をアグロバクテリウム経由で感染させて、制御因子を別の挿入部位から発現させる必要がある。このため、発現ON/OFFスイッチングには２段階の遺伝子導入が必要となる（図４及び６）。【０１０３】
また、ゲノム組換えステーション上の遺伝子が植物の生育にとって有害である場合、ゲノム組換えステーション上の遺伝子発現を抑制しながら形質転換した植物を得る必要があるが、この場合、ゲノム組換えステーションにある薬剤選択マーカーも発現が抑制され、選択に使えないという問題が生じる。【０１０４】
これらの問題点を克服するために、pRIBAC LacSGの自己活性化型プラットフォーム（図２５）と、pRIBAC tetPFの発現ON/OFFスイッチングプラットフォーム（ゲノム組換えステーション：図１６）を一つのベクター上で連結した構築、pRIBAC LacSG-tetPFを作製した（図３４）。連結方法はLacSGのSpeI-NotIサイトに、NheI-NotIで切り出したtetPF断片を挿入した。【０１０５】
このベクターの利点は、1回のアグロバクテリウム感染で、発現誘導制御可能なON/OFFスイッチングプラットフォーム（ゲノム組換えステーション）挿入系統が得られる点がまず挙げられる。また、LacSG側から発現する抑制因子（tetR-fusion (OFF)）を、tetOアルフォイドDNA側に結合させることで、アグロバクテリウム感染当初から、ゲノム組換えステーション上の遺伝子発現を抑制状態にできる点も挙げられる（図３５, tetracycline derivative -）。【０１０６】
さらに、LacSGは自己活性化型プラットフォームであるため、隣接するtetPF側のクロマチン構造が遺伝子発現に抑制的になっていても、LacOアルフォイドDNAの領域に遺伝子発現の活性化因子（LacI-fusion (ON)）を結合させることで、LacSG側はtetPF側から独立して薬剤耐性遺伝子や制御因子を発現できることが期待される。これにより、例えばLacSG側にあるHyg耐性遺伝子を用いた選択で、tetPF側はOFFのまま形質転換株を取得できると期待される（図３５: tetracycline derivative -）。【０１０７】
ゲノム組換えステーション上の遺伝子は、必要なタイミングでテトラサイクリンの誘導体を添加することにより、tetR-fusion (OFF)からrtetR-fusion (ON)の結合に切り替えて、遺伝子を発現誘導することもできる（図３５, tetracycline derivative +）。【０１０８】
尚、この融合ベクターpRIBAC LacSG-tetPFのサイズはT-DNAインサートだけで140kb近くのサイズを持ち、BACを用いた大腸菌内のクローニングに困難が増すことが予想される。また、これだけのサイズのT-DNAを、アグロバクテリウムを経由して植物に感染させた場合には、感染効率の低下も予想される。このため、pRIBAC LacSG-tetPF中のtetO、LacOアルフォイドDNAの長さを1/2、1/4に小型化することが好ましい（図３６）。【０１０９】
２．植物組換え遺伝子発現制御プラットフォームＤＮＡ配列に於ける多重遺伝子（複数の遺伝子）発現用カセット配列への遺伝子の挿入
２−（１）発現ON/OFFスイッチングプラットフォーム上へのゲノム組換えステーションの組み込み
発現ON/OFFスイッチングプラットフォーム上のマーカー遺伝子の脇に、LoxPなどの部位特異的な組換え酵素サイト（もしくはその変異型サイト）を適切に配置することで、発現ON/OFFスイッチングプラットフォームの多重遺伝子（複数の遺伝子）発現用カセット配列に含まれるマーカー遺伝子カセットのそれぞれを、他の任意の遺伝子や配列とカセット交換反応により、別々に入れ替えることのできるシステムを構築した。このシステムの概要は図３７のようになっている。【０１１０】
上記発現用カセット配列上の3つのマーカー遺伝子カセット（NPTII、EYFP、GUS）のうち、薬剤選択マーカーであるNPTII遺伝子カセットにおいては、NOSプロモーターとNPTII遺伝子の間にLox71 2272サイトを、そして、NOSターミネーターの下流にLox71サイトをLox71 2272サイトと逆向きに挿入した。Cre蛋白質はLoxP配列を基にした2つのサイト間での組換えを行う酵素であるが、Lox71 2272サイトとLox71サイトは、Lox配列中のコア領域の部分の配列が異なっているため、これら2つのサイト間では組換えは起こらない（図３８；Lee G, Saito I., Role of nucleotide sequences of loxP spacer region in Cre-mediated recombination. Gene. 1998 Aug 17;216(1):55-65.）。一方、同じコア配列を持つLox66 2272はLox71 2272サイトと、Lox66はLox71サイトと、それぞれ組換えが可能である。そして、Lox66 2272とLox71 2272サイトは、それぞれ右アーム、左アーム部分の配列に変異を持つため、これらの間の組換えにより両アームに変異を持ったLox 2272サイトがゲノム組換えステーション上に生じることになるが、この場合、両アームに変異を持つサイトは、他のLoxサイトとの組換え効率が著しく低下することが知られている。また、同様のことがLox71サイトとLox66サイトの間にも成り立つ。このため、Lox66 2272サイトとLox66サイトに挟まれたカセットが、ゲノム組換えステーションのLox71 2272サイトとLox71サイト間にCreによって組み込まれると、その組換わったカセットは、Cre蛋白質による組換え頻度が著しく低下し、ゲノム上に安定的に組み込まれることが期待される（図３７及び３８）。【０１１１】
EYFP遺伝子カセットのプロモーターの上流にはVLox43L 2272サイト、ターミネーターの下流にはVLox43Lサイトを、それぞれ逆向きに挿入してある。一般のVLoxサイトは、ビブリオ菌由来のCRE様組換え酵素であるVCRE酵素によって組換わるが、ゲノム組換えステーション上のVLox43L 2272サイトとVLox43Lサイトの間では、コア領域の部分の配列が異なるため、組換えが起こらない（Suzuki E, Nakayama M., VCre/VloxP and SCre/SloxP: new site-specific recombination systems for genome engineering. , Nucleic Acids Res. 2011 Apr;39(8):e49.）。ここに外部からVLox43R 2272サイトとVLox43Rサイトに挟まれた任意の配列を導入し、VCREを用いて組換えを行うことでこれをゲノム組換えステーション上に挿入することができる。また、Lox66とLox71サイトと同様に、VLox43L配列は左アーム部分に、VLox43R配列は右アーム部分の配列に変異を持っているため、一度ゲノム組換えステーション上に組換えで挿入された配列は、VCRE蛋白質による組換え頻度が著しく低下し、ゲノム上に安定的に組み込まれることが期待される（図３７及び３８）。【０１１２】
GUS遺伝子カセットのプロモーターの上流にはSLoxV1L 2272サイト、ターミネーターの下流にはSLoxV1Lサイトを、それぞれ逆向きに挿入してある。一般のSLoxサイトは、シュワネラ菌由来のCRE様組換え酵素であるSCRE酵素によって組換わるが、ゲノム組換えステーション上のSLoxV1L 2272サイトとSLoxV1Lサイトの間では、コア領域の部分の配列が異なるため、組換えが起こらない（Suzuki and Nakayama, 2011）。ここに外部からSLoxV1R 2272サイトとSLoxV1Rサイトに挟まれた任意の配列を導入し、VCREを用いて組換えを行うことでこれを挿入することができる。また、Lox66とLox71サイトと同様に、SLoxV1L配列は左アーム部分に、SLoxV1R配列は右アーム部分の配列に変異を持っているため、一度ゲノム組換えステーション上に組換えで挿入された配列はVCRE蛋白質による組換え頻度が著しく低下し、ゲノム上に安定的に組み込まれることが期待される（図３７及び３８）。【０１１３】
なお、これらのCRE、VCRE、SCRE組換え酵素は、それぞれが対応するLox、VLox、SLoxサイトに特異的に働き、他のサイトとは交差反応しない。例えば、VCREはVLox配列間の組換えを行うが、Lox、SLoxサイトにおける組換えは行わない。【０１１４】
これらの各種Lox配列の挿入には、オリゴDNA合成で作成したPCRプライマーを用いた。これらのPCRプライマーは、それぞれの対応する挿入部位とアニールする配列のほかに、各種Lox配列（Lox71 2272、Lox71、VLox43L 2272、VLox43L、SLoxV1L 2272、SLoxV1L）も付加されている。これらを用いることにより、発現ON/OFFスイッチングプラットフォーム上にある遺伝子カセットの各構成要素と、各種Lox配列を組み合わせた構築を作製した。それぞれの遺伝子カセット、もしくはtetOアルフォイドDNA配列は、すべてNheI、SpeI、NotIサイトを持ち、図１１の方法を用いて、任意の配列を何度でも順方向に連結してゆくことができる。この連結方法により、図３７の構築を、大腸菌株DH10Bを用いて作製した（図１１，１２，１４−１８参照）。作成したプラスミドがアグロバクテリウム細胞内で安定に維持されることも確認されている（図１８）。【０１１５】
追加実施例：1−（7）遺伝子発現ON/OFFスイッチングプラットフォーム導入タバコ培養細胞BY-2の取得
実施例１−（７）に記載の方法を用いて、さらにタバコ培養細胞BY-2への遺伝子発現ON/OFFスイッチングプラットフォームの導入を実施し、tetPFについて安定に培養維持することができる214株を新たに取得した。遺伝子発現ON/OFFスイッチングプラットフォームを１コピーで含む株を選択するために、ゲノムDNAを精製してqPCRを行った。コピー数を詳細に調べるために、遺伝子発現ON/OFFスイッチングプラットフォームに含まれる全てのマーカー遺伝子３種類（NPTII、EYFP、GUS）とアルフォイドDNAに対するPCRプライマーを使用した（表２）。その結果、74株の１コピー候補株を取得できた（図３９には１コピーの１５例と２コピーの２例を示す）。【０１１６】
遺伝子発現ON/OFFスイッチングプラットフォームによる遺伝子導入コピー数への効果
こうしてタバコ培養細胞BY-2への遺伝子発現ON/OFFスイッチングプラットフォームtetPF導入により得られた214株のコピー数を解析した結果、遺伝子発現ON/OFFスイッチングプラットフォームを用いることで、低コピーで目的遺伝子を導入できる確率を上げる効果があった。高確率で1コピー株を取得できる技術は産業上の有用性が高い。そこで、遺伝子発現ON/OFFスイッチングプラットフォームtetPFと、アルフォイドDNAを持たないマーカー遺伝子カセットのみの構築MGC（図４０）を同様にタバコ培養細胞BY-2にアグロバクテリウムを用いて導入し、qPCRで導入DNAのコピー数を比較解析した。タバコ培養細胞BY-2では、アルフォイドDNAプラットフォームを持つ場合において１コピーで導入される割合が高い傾向を示した。実施例１−（１０）に記載の方法を用いてシロイヌナズナでも同様の実験を行った結果、アルフォイドDNAプラットフォームを持つ場合において１コピーで導入される割合が高い傾向を示し、Mann-Whitney testでは、シロイヌナズナで特に高い有意差を示した。これらの結果から、遺伝子発現ON/OFFスイッチングプラットフォームを用いた遺伝子導入ではコピー数低下効果が確認された。【０１１７】
追加実施例：1−(９)遺伝子発現ON/OFFスイッチングプラットフォームへのON/OFF制御因子の効果
実施例１−（９）に記載した、１コピーで遺伝子発現ON/OFFスイッチングプラットフォームを含むtetPF T4株を長期（約1年半）継代培養し、エピジェネティックに導入プラットフォーム上の遺伝子（EYFP）の発現が抑制された細胞（約 50%）を含んだ長期培養株tetPF BT4 を得た。ON/OFFスイッチング効果を試すためにこの長期培養tetPF BT4株を用いてON/OFF制御因子の効果の検証実験を行った（図４１）。【０１１８】
OFF側の因子としてtetR-HDAC1を、ON側の因子としてtetR-ASH1Lを、コントロールとして制御因子を融合しないtetRだけのものを用いた。これらの遺伝子の発現カセットを、それぞれ単独にハイグロマイシン耐性遺伝子を含んだ適当なアグロバクテリウムベクター上にクローニングした。実施例１−（９）に記載の方法を用いて、これらをアグロバクテリウム法によって長期培養tetPF BT4株に形質導入した。形質導入された細胞をハイグロマイシン添加固形培地上でコロニー形成させ、EYFP蛍光が検出されるコロニーと検出されないコロニーを計数した（図４１）。図４１の棒グラフは、全体のコロニー中でEYFP蛍光が観察されたコロニーの割合を表す。その結果、OFF側抑制因子(tetR-HDAC1)を導入した場合はEYFP蛍光の検出されるコロニーの割合が減少し、ON側制御因子(tetR-ASH1L)を導入した場合はEYFP蛍光の検出されるコロニーの割合が増加した。以上の結果は、エピジェネティックに発現抑制されたON/OFFプラットフォーム上遺伝子がON側制御因子のプラットフォームへの結合により発現回復し、OFF側抑制因子の結合により発現抑制されたことを示し、プラットフォーム全域のON/OFFスイッチングが可能であることを示している。【０１１９】
追加実施例：１−（１０）遺伝子発現ON/OFFスイッチングプラットフォーム導入シロイヌナズナの取得
遺伝子発現ON/OFFスイッチングプラットフォーム１コピー導入候補株について、次世代、次次世代の種の取得を行い、カナマイシン耐性、およびEYFP蛍光の形質を確認した（図４２）。この結果は、世代が進んでも遺伝子発現ON/OFFスイッチングプラットフォームを安定に維持できることを示している。【０１２０】
遺伝子発現ON/OFFスイッチングプラットフォーム導入ベンサミアタバコの取得
アブラナ科のシロイヌナズナに加えて、ナス科のタバコでも遺伝子発現ON/OFFスイッチングプラットフォーム導入株の取得を行った。アグロバクテリウムを用いてtetOアルフォイドを含む遺伝子発現ON/OFFスイッチングプラットフォーム（tetPF）をベンサミアタバコ染色体へ挿入した。pRIBAC tetPFプラスミドを有するアグロバクテリウムGV3101またはLBA4404のコロニーを抗生物質入りLB培地に植菌し、OD600が0.5から1.0になるまで一晩振盪培養を行った。Gamborg’s B5 vitaminsを含むMurashige and Skoog (MS)培地（MSB5培地）で育てたベンサミアタバコの葉をディスク状に切り出し、アグロバクテリウム液に10分間浸した。ディスク状の葉を共培養培地上に重ねた濾紙に載せ、３日間共培養を行った。選択薬剤を含むMSB5培地に移し、カルス形成とシュート形成の誘導を行った。シュートをMSB5培地に移し、根を形成させた。分化した植物体（T1世代）を土に移し、生育させ、次の世代（T2世代）を取得した。T1世代について、マーカー遺伝子であるEYFPの蛍光を観察することで、遺伝子発現ON/OFFスイッチングプラットフォームが挿入されていることを確認した（図４３）。これまでに40株以上のT1世代を取得し、20株以上のT2世代を取得できている。T2世代においても、EYFPの蛍光を確認できていることから、世代を超えて遺伝子発現ON/OFFスイッチングプラットフォームが維持されることを示している。【０１２１】
追加実施例：１−（１１）連結型バイナリーベクターpRIBAC LacSG-tetPFの構築による改良
図３５に示されるような、連結型バイナリーベクターの LacSG 側にあるHyg耐性遺伝子を用いた選択で、tetPF側はOFFのまま形質転換株を取得できるかについて検証した。具体的には、連結型バイナリーベクター pRIBAC LacSG-tetPFをBY-2へ導入し、まず、LacSG側に搭載したHyg耐性遺伝子をマーカーとした選択を行なった。次に、得られた形質転換体のうちtetPF側に搭載したEYFP遺伝子の発現が抑制されている株を、ゲノムPCRとEYFPの蛍光観察によって選抜した。その結果、期待した形質転換株、すなわち、LacSG側のHyg耐性遺伝子は発現しているが、tetPF側のEYFP遺伝子が抑制された株を複数得ることができた（図４４）。
【産業上の利用可能性】
【０１２２】
本発明は、数少ない遺伝子組換え系統の作製のみで、かつ、短期間に商品化が行える点で優位性が高く、今後の植物バイオテクノロジー分野で幅広くこの技術が利用されると期待できる。また、この基盤技術は、遺伝子組換えが容易な植物種はもとより、遺伝子組換えが容易でないことから従来では商品化までのハードルが高かった植物種でも、少ない組換え体系統の作製で商品化まで持っていくことが可能となる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２】
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【図４３】
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【図４４】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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2020031985.tif 000051
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