(57)【要約】  ワクチンの副反応の可能性を検査する方法の提供。  ワクチンの副反応の可能性を検査する方法であって、以下の工程：   (a) 生体試料から採取された細胞外小胞内に含まれるマイクロRNA及びsnRNAの発現量、又は異なる２つのマイクロRNA又はsnRNAの発現量の比を測定する工程、及び   (b) 前記測定された発現量又は比から、自己免疫疾患の発症リスクを予測する工程、   を含み、   前記マイクロRNA及びsnRNAが、miR-16、miR-21、miR-451a及びU6から選ばれる少なくとも１つである、前記方法。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ワクチンの副反応の可能性を検査する方法であって、以下の工程：
(a) 生体試料から採取された細胞外小胞内に含まれるマイクロRNA又はsnRNAの発現量、又は当該細胞外小胞内に含まれる異なる２つのマイクロRNA又はsnRNAの発現量の比を測定する工程、及び
(b) 前記測定された発現量又は比から、前記副反応の発症リスクを予測する工程、
を含み、
前記マイクロRNA及びsnRNAが、miR-16、miR-21、miR-451a及びU6からなる群から選ばれる少なくとも１つである、前記方法。
【請求項２】
ワクチンが、インフルエンザワクチン、子宮頸がんワクチン、肝炎ワクチン、日本脳炎ワクチン、狂犬病ワクチン及びウイルスの抗原を用いた不活化ワクチンからなる群から選ばれる少なくとも１つである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ワクチンの副反応が自己免疫疾患である、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
自己免疫疾患が、急性散在性脳脊髄炎又はギラン・バレー症候群である、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
生体試料が血液、尿、汗又は唾液である請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
マイクロRNA及びsnRNAの発現量の比が、U6/miR-21及びmiR-16/miR-451aである、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
U6/miR-21の値が高いときは、ワクチンの副反応のリスクが高いと判定し、及び/又はU6/miR-21の値が低いときは、ワクチンの副反応のリスクが少ないと判定する、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
miR-16/miR-451aの値が低いときは、ワクチンの副反応のリスクが高いと判定し、及び/又はmiR-16/miR-451aが高いときは、ワクチンの副反応のリスクが少ないと判定する、請求項６に記載の方法。
【請求項９】
miR-16、miR-21、miR-451a及びU6から選ばれる少なくとも１つのマイクロRNA又はsnRNAを含む、ワクチンの副反応マーカー。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、末梢血中の細胞外小胞を用いたワクチンの副反応リスクの検査方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
自己免疫疾患は、外来からの異物を認識する免疫系が、自己の成分を異物として認識し攻撃することによって生じる。中枢神経系に対する自己免疫疾患として急性散在性脳脊髄炎や多発性硬化症などがあり、末梢神経に対する自己免疫疾患としてギラン・バレー症候群などがある。その他の組織での自己免疫疾患として、Ｉ型糖尿病や関節リウマチなどが知られている。【０００３】
急性散在性脳脊髄炎やギラン・バレー症候群などの神経系に対する自己免疫疾患は、ウイルスの感染やワクチン接種後にも生じる。例えば、ジカウイルス感染とギラン・バレー症候群の発症に因果関係があることが報告されており、インフルエンザワクチンや子宮頸がんワクチンの副作用として、急性散在性脳脊髄炎やギラン・バレー症候群が生じることが報告されている。【０００４】
感染やワクチン接種後の自己免疫疾患では、体内で産生されるIL-1β、IL-6、TNF-αなどの炎症性サイトカインが、血液脳関門を破壊し、免疫担当細胞である樹状細胞やＴ細胞等が、中枢神経系内に侵入することが主な原因である。この中枢神経系に対する自己免疫疾患の動物モデルとして、実験的自己免疫性脳脊髄炎（Experimental Autoimmune Encephalomyelitis: EAE)が知られている（非特許文献１、非特許文献２）。マウスのEAEの実験系は自己免疫疾患全般のモデル実験系として研究に広く用いられている。【０００５】
細胞外小胞は、様々な細胞から放出される小胞であり、機能的なmicroRNAを細胞から細胞へと伝達する。生体内では、様々な細胞から放出される細胞外小胞が、血液などの体液中に豊富に存在する。細胞から細胞へと伝達されたmicroRNAは、細胞質内へと取り込まれると標的遺伝子の機能を阻害することで、サイトカイン産生や、その他のタンパク質の発現量を変化させ、様々な細胞の機能を制御する。そのため、細胞外小胞が、樹状細胞やＴ細胞などの免疫担当細胞の機能を制御することが報告されている。【０００６】
急性散在性脳脊髄炎やギラン・バレー症候群などの自己免疫疾患の発症リスクを予測できれば、インフルエンザワクチンや子宮頸がんワクチンなどのワクチン接種を控えることができる。また、ウイルス感染に対して早期に治療するなどし、自己免疫疾患の発症を予防することが可能である。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Yin JX et al PLoS One 2010 5: e12400
【非特許文献２】Stimmer L et al Vet. Pathol. 2018 55: 27-41
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
上記の事情から、自己免疫疾患発症リスクを検査し得る方法の開発が望まれていた。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者は、上記課題を解決するために鋭意検討を行った結果、EAE動物モデルにより、血液中の細胞外小胞内の２つのRNAの発現量の比を用いることで、自己免疫疾患発症リスクを予測し得ることを見出し、本発明を完成するに至った。【００１０】
すなわち、本発明は以下の通りである。
（１）ワクチンの副反応の可能性を検査する方法であって、以下の工程：
(a) 生体試料から採取された細胞外小胞内に含まれるマイクロRNA又はsnRNAの発現量、又は当該細胞外小胞内に含まれる異なる２つのマイクロRNA又はsnRNAの発現量の比を測定する工程、及び
(b) 前記測定された発現量又は比から、前記副反応の発症リスクを予測する工程、
を含み、
前記マイクロRNA及びsnRNAが、miR-16、miR-21、miR-451a及びU6からなる群から選ばれる少なくとも１つである、前記方法。
（２）ワクチンが、インフルエンザワクチン、子宮頸がんワクチン、肝炎ワクチン、日本脳炎ワクチン、狂犬病ワクチン及びウイルスの抗原を用いた不活化ワクチンからなる群から選ばれる少なくとも１つである、（１）に記載の方法。
（３）ワクチンの副反応が自己免疫疾患である、（１）又は（２）に記載の方法。
（４）自己免疫疾患が、急性散在性脳脊髄炎又はギラン・バレー症候群である、（１）〜（３）のいずれか１項に記載の方法。
（５）生体試料が血液、尿、汗又は唾液である（１）〜（４）のいずれか１項に記載の方法。
（６）マイクロRNA及びsnRNAの発現量の比が、U6/miR-21及びmiR-16/miR-451aである、（１）〜（５）のいずれか１項に記載の方法。
（７）U6/miR-21の値が高いときは、ワクチンの副反応のリスクが高いと判定し、及び/又はU6/miR-21の値が低いときは、ワクチンの副反応のリスクが少ないと判定する、（６）に記載の方法。
（８）miR-16/miR-451aの値が低いときは、ワクチンの副反応のリスクが高いと判定し、及び/又はmiR-16/miR-451aが高いときは、ワクチンの副反応のリスクが少ないと判定する、（６）に記載の方法。
（９）miR-16、miR-21、miR-451a及びU6から選ばれる少なくとも１つのマイクロRNA又はsnRNAを含む、ワクチンの副反応マーカー。
【発明の効果】
【００１１】
本発明により、ワクチンの副反応リスク、特に自己免疫疾患発症リスクを検査することが可能となった。本発明によれば、ワクチン接種の有無にかかわらず、自己免疫疾患発症リスクを予測することができる。このため、インフルエンザワクチンや、今後新たに開発されるワクチン等の副作用リスクの予測にも使用できる。
本発明の検査法は、ワクチン接種に不安を頂いている人に対しても使用可能であり、副反応発症リスクを知ることができる。そして、リスクがある場合には、ワクチンを接種せず、リスクが低い場合には安心してワクチンを接種することができる。その結果、接種率の向上と、接種による疾患の予防につながる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】細胞外小胞によるTLR4依存的炎症性サイトカイン産生の制御を示す図である。  ヒト血清から精製した細胞外小胞（EVS: Extracellular vesicles）をマクロファージ細胞株(THP-1細胞）に加え、２４時間以上培養した後に、THP-1細胞をTLR4のリガンドであるリポ多糖（LPS: Lipopolysaccharide）で刺激し、刺激後の各時間（0, 2, 4, 6時間後）の、IL-6とTNF-αのmRNAの発現量を定量PCR法により測定した。
【図２】EAEスコアと実験開始前日の血液中細胞外小胞内U6/miR-21値との関連を示す図である。  実験開始前日に、マウスの静脈から採血し調整した血清から細胞外小胞を精製した。精製した細胞外小胞内からRNAを抽出し、miR-21とU6 RNAの発現量を測定し、miR-21とU6の発現量の比（U6/miR-21）を算出した。U6/miR-21の値が上位５０％の群（U6/miR-21 high group）と下位５０％の群（U6/miR-21 low group）について、それぞれEAEの実験開始後３０日目まで各マウスのEAEスコアを観察した。両群でEAEスコアについて比較すると、U6/miR-21値が高い群は、低い群と比較してEAEスコアが高い傾向が観察され、その差は統計的に有意であった。
【図３】積算EAEスコアと実験開始前日の血液中細胞外小胞内RNAの発現量の比較を示す図である。  マウスのEAEの実験開始前日に静脈より採血し、血清を調整後に細胞外小胞を精製した。精製した細胞外小胞からRNAを抽出し、miR-21量とU6 RNA量を、定量PCR法を用いて測定し、その発現量の比の値を求めた。EAEの実験開始後30日目までのEAEスコアを合算し積算EAEスコアを算出した。各マウスの積算スコアを横軸に、U6/miR-451aの値を縦軸にとりグラフ化した。子宮頸がんワクチンを接種しなかった場合（Ａ）と子宮頸がんワクチンを接種した場合（Ｂ）の何れにおいても、U6/miR-21の値は積算EAEスコアと統計的に有意に相関した。
【図４】EAEスコアと実験開始前日の血液中細胞外小胞内miR-16/miR-451a値との関連を示す図である。  実験開始前日に、マウスの静脈から採血し調製した血清から細胞外小胞を精製した。精製した細胞外小胞内からRNAを抽出し、miR-16とmiR-451aの発現量を測定し、miR-16とmiR-451aの発現量の比（miR-16/miR-451a）を算出した。miR-16/miR-451aの値が上位30％の群（miR-16/miR-451a top 30 %）と下位30％の群（miR-16/miR-451a bottom 30%）について、それぞれEAEの実験開始後３０日目まで各マウスのEAEスコアを観察した。両群でEAEスコアについて比較すると、miR-16/miR-451a値が低い群（bottom 30%）は、高い群（top 30%）と比較してEAEスコアが高い傾向が観察され、EAEスコアの差が統計的に有意である時期が存在した。
【図５】EAEスコアと実験開始前日の血液中細胞外小胞内U6/miR-22値との関連を示す図である。  実験開始前日に、マウスの静脈から採血し調整した血清から細胞外小胞を精製した。精製した細胞外小胞内からRNAを抽出し、U6とmiR-22 RNAの発現量を測定し、miR-22とU6の発現量の比（U6/miR-22）を算出した。U6/miR-22の値が上位50％の群（U6/miR-22 high）と下位50％の群（U6/miR-22 low）について、それぞれEAEの実験開始後３０日目まで各マウスのEAEスコアを観察した。両群でEAEスコアについて比較すると、両群では統計的に有意な差は観察されなかった。
【図６】EAEスコアと実験開始前日の血液中細胞外小胞内U6/miR-23b値との関連を示す図である。  実験開始前日に、マウスの静脈から採血し調整した血清から細胞外小胞を精製した。精製した細胞外小胞内からRNAを抽出し、U6とmiR-23b RNAの発現量を測定し、miR-23bとU6の発現量の比（U6/miR-23b）を算出した。U6/miR-23bの値が上位50％の群（U6/miR-23b high）と下位50％の群（U6/miR-23b low）について、それぞれEAEの実験開始後３０日目まで各マウスのEAEスコアを観察した。両群でEAEスコアについて比較すると、両群では統計的に有意な差は観察されなかった。
【図７】自己免疫疾患症状発症リスクを示す図である。  実験開始前日に、マウスの静脈から採血し調整した血清から細胞外小胞を精製した。精製した細胞外小胞内からRNAを抽出し、miR-16, miR-21, miR-451a, U6 RNA量を測定した。EAEの実験開始後３０日目まで観察し、尾の完全下垂と後肢の完全麻痺の症状が２日異常続いたマウスの数を計測した。低リスクグループ（U6/miR-21値が集団全体の４分の１、あるいは、miR-16/miR-451a値が上位３分の１）、中リスクグループ（U6/miR-21値が上位４分の１、あるいは、miR-16/miR-451aが下位３分の１、の何れか一方のみに含まれる）、高リスクグループ（U6/miR-21値が上位４分の１、且つ、miR-16/miR-451aが下位３分の１)に分類すると、低リスクグループでは、尾の完全下垂と後肢の完全麻痺の症状が２日異常続いたマウスの数が0%であったのに対し、中リスクグループでは31%、高リスクグループでは50%であった。（パーセントは少数点第一位を四捨五入）。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本発明は、ワクチンの副反応の可能性を検査する方法であって、以下の工程：
(a) 生体試料から採取された細胞外小胞内に含まれるマイクロRNA及びsnRNA(small nuclear RNA)の発現量、又は当該細胞外小胞内に含まれる異なる２つのマイクロRNA及びsnRNAの発現量の比を測定する工程、及び
(b) 前記測定された発現量又は比から、前記副反応の発症リスクを予測する工程、
を含む。そして、本発明においてマイクロRNA及びsnRNAとして、miR-16、miR-21、miR-451a及びU6からなる群から選ばれる少なくとも１つを使用することを特徴とする。
【００１４】
本発明では、生体試料中（例えば血中）のエクソソームと呼ばれる小胞内のマイクロRNA及びsnRNAの量を測定することで、あるいは、これらのマイクロRNA及びsnRNAのうち異なる2つのマイクロRNA及びsnRNAの量比を測定することで、仮に全粒子ワクチンを接種した場合の過剰な免疫応答の有無をあらかじめ予見できる。そのため、本発明により、副反応の有無をあらかじめ予見する前診断が可能になる。前診断を実施することで、ワクチン接種量を減らす、あるいは、接種を止める等の措置をとることが可能になり、全粒子ワクチン接種後の副反応を未然に防ぐことが可能になる。
【００１５】
使用する被検サンプルに関し、血液の細胞外小胞は体内で循環するため、汗、唾液、尿などの他の体液でも細胞外小胞は検出される。マイクロRNA及びsnRNAは細胞外小胞内に含まれており細胞外には出てこないことから、血液中の細胞外小胞がランダムに他の体液へと移行すると考えられる。このため、血液の細胞外小胞内のマイクロRNA及びsnRNAの発現比は、他の体液から採取した細胞外小胞のマイクロRNA及びsnRNAの発現比と同じになる。
そこで本発明においては、血液以外の体液（汗、唾液、尿など）から細胞外小胞を単離しても、そのマイクロRNA及びsnRNAの発現比を調べることで、過剰な免疫応答による副反応を予測することができる。
従って、本発明の方法に使用される生体試料としては、血液、尿、汗、唾液などが挙げられる。
【００１６】
生体試料として血液を用いる場合は、血液中の細胞外小胞内のマイクロRNA及びsnRNAの発現量を測定するために、ヒトの血液から血清を調製する。血清より精製する細胞外小胞とは、エクソソーム（エキソソーム）と呼ばれる小胞に加えて、微少小胞（microvesicle）など、細胞から放出される小胞である。これらをポリエチレングリコール等のポリマーを用いた方法や、超遠心を用いた方法などを用いて血清から精製する。精製した細胞外小胞からRNAを抽出し、定量PCR法やマイクロアレイ法、あるいはRNA-Seq法などによりマイクロRNA及びsnRNAの発現量を測定する。
【００１７】
血清中に存在する細胞外小胞内のマイクロRNA及びsnRNAは、その血清で培養した細胞に取り込まれることが知られていることから、細胞外小胞内のマイクロRNA及びsnRNAの発現量の比が、細胞内のマイクロRNA及びsnRNAの発現量の比と比例する。具体的には、ヒト血清から細胞外小胞を単離し、細胞外小胞内のマイクロRNAや及びsnRNAの発現量の比の値は、ワクチンの副反応のリスクと、統計的に有意に相関する。従って、本発明においてマイクロRNA及びsnRNAは、ワクチン接種後に起こる副反応のマーカーとして利用することができる。
【００１８】
本発明において測定対象となるマイクロRNA及びsnRNAは、miR-16、miR-21、miR-451a及びU6から選ばれる。本発明では、これらのマイクロRNA及びsnRNAの中から任意に２つを選択し、一方のマイクロRNA及びsnRNAの発現量をaとし、他方のマイクロRNA及びsnRNAの発現量をｂとして、発現量の比「ａ／b」を算出する。
上記ａ／b の比において、「ａ」（分子）に相当するマイクロRNA及びsnRNA及び「ｂ」（分母）に相当するマイクロRNA又及びsnRNAは任意である。
【００１９】
例えば、発現比は、U6/miR-21、miR-16/miR-451aなどが挙げられ、これらの比を単独で又は適宜組み合わせて使用することができる。
【００２０】
本発明においては、ワクチン接種の有無にかかわらず急性散在性脳脊髄炎の発症を予測する検査方法を開発するために、マウスの実験的自己免疫性脳脊髄炎（Experimental Autoimmune Encephalomyelitis: EAE）の実験系を用いた。このEAEの実験系は、ヒトの急性散在性脳脊髄炎や多発性硬化症の動物モデルとして広く知られている。
マウスの尾静脈から予め採血し、その血清内の細胞外小胞内microRNA量を測定した。そのマウスに対し、EAEの実験系を使い、脳脊髄炎を発症させ、その発症の度合いと相関するmicroRNAを探索したところ、miR-21の発現量とU6 RNAの発現量の比をとることで、統計的に有意に発症リスクを予測することができた。これは、子宮頸がんワクチンのガーダシルを接種した場合でも、接種しなかった場合でも予測できる。
その結果、この血清の細胞外小胞内のmicroRNA量又は量比をバイオマーカーとして使用することで、急性散在性脳脊髄炎や多発性硬化症を予測できる検査方法を開発することができる。
【００２１】
本発明者は、予め血液から血清を調製し、そこから細胞外小胞を精製して特定のRNA量を測定することで、自己免疫疾患の発症や重症化を予測する方法を開発した。急性散在性脳脊髄炎やギラン・バレー症候群はワクチン接種後の副反応として生じることが知られている。本発明の方法（前記発現量又は比）を用いることにより、ワクチン接種前に副反応のリスク、例えば神経系に対する自己免疫疾患（急性散在性脳脊髄炎、又はギラン・バレー症候群等）の発症リスクを予測することができ、ワクチンを接種するかどうかを判断する根拠又は補助資料とすることができる。
【００２２】
本発明の方法は、インフルエンザワクチン、子宮頸がんワクチン、日本脳炎ワクチンなどに適用することができ、その他、B型肝炎ウイルスやデングウイルスなどの他のウイルスに対するワクチン、例えば肝炎ワクチン（B型肝炎ワクチン、C型肝炎ワクチン等）、デング熱ワクチン、狂犬病ワクチン、ポリオワクチン等の不活化ワクチンに対しても適用することができる。
【００２３】
子宮頸がんワクチンは、副作用への懸念から接種率が大きく減少しており、ワクチン接種後の副作用のリスクを予め予測することで、リスクが小さいと判断された場合には、安心してワクチン接種できることから、ワクチン接種率の向上につながると期待される。また、リスクがあると判断された場合には、ワクチン接種を取りやめる、あるいは延期することで、副作用発症頻度を下げることができる。
予測する方法として、末梢血から調整した血清が例えば50μLあれば、細胞内小胞内のmiR-21, miR-16, miR-451a, U6 RNAの量を測定することが可能であり、少量の血液で、自己免疫疾患発症リスクを予測できる利点がある。
【００２４】
本発明は、ワクチン接種の有無にかかわらず、自己免疫疾患発症リスクを予測できたことから、インフルエンザワクチンなどや、今後新たに開発されるワクチンの副作用リスクの予測にも使用できる。
神経系に対する自己免疫疾患の原因として、ワクチン接種以外にも、ウイルスなどの感染が原因になることが知られている。そのことから、ウイルスに感染した患者で、自己免疫疾患発症リスクが非常に高いと予測された場合には、感染が収まったあとに、速やかに免疫抑制剤を用いた治療などを実施することで、自己免疫疾患の発症を回避できる。
【００２５】
神経系以外の自己免疫疾患として、関節リウマチなどが知られている。関節リウマチは４０歳代の女性の発症頻度が高い自己免疫疾患である。そのため、この世代の女性に対して、本発明を利用して自己免疫疾患発症リスクを予測することで、関節リウマチの発症リスクを把握し、早期に適切に診断と治療を実施できる利点がある。
【００２６】
さらに、予測できる副反応として、ワクチン接種後の局所での発赤や腫脹は、免疫応答として知られている炎症応答であり、本発明においてはこれらの副反応を予測することが可能である。重篤な副反応として知られるギラン・バレー症候群なども自己免疫応答が原因であると考えられており、このような自己免疫応答も接種後の過剰な免疫応答が引き金になると推測されている。従って、本発明の方法は、マイクロRNA及びsnRNAの発現比を求めることで、免疫応答が原因と考えられる上記重篤な副反応の発症の予測にも使用できる。
【００２７】
本発明においては、血液などの生体試料から細胞外小胞を採取し、その中のマイクロRNA及びsnRNAの発現の比をマイクロアレイなどの方法により網羅的に調べることで、ワクチンに対する免疫応答の強さを非常に精度良く予測できることが明らかとなった。microRNAの発現の比は、マイクロアレイ法の他、RNA-Seq法や定量PCR法などの方法を用いても同様の結果が得られる。
【００２８】
本発明においては、U6/miR-21の値が高いときは、ワクチンの副反応のリスクが高いと判定し、及び/又はU6/miR-21の値が低いときは、ワクチンの副反応のリスクが少ないと判定する。また、miR-16/miR-451aの値が低いときは、ワクチンの副反応のリスクが高いと判定し、及び/又はmiR-16/miR-451aが高いときは、ワクチンの副反応のリスクが少ないと判定する。
比の値が「高い」とは、ヒトの母集団全体の平均値に対して相対的に値が高い状態であることを意味し、比の値が「低い」とは、ヒトの母集団全体の平均値に対して相対的に値が低い状態であることを意味する。
具体的には、マイクロRNA及びsnRNAの発現比と副反応との間の相関係数（グラフの傾き）を構成するデータのうち、乖離しているデータの元となった被検者は、副反応の可能性（リスク）があるものと予測できる。例えば、図３のパネルAでは、U6/miR-21の値が0.03以上がリスクが高い状態であると予測でき、パネルBではU6/miR-21の値が0.06以上がリスクが高い状態であると予測できる。
【００２９】
ところで、本発明の方法では、複数の被検者由来の試料を用いてmicroRNAの発現比と副反応との相関関係を解析している。従って、被検者一個人の副反応の可能性を検査する場合は、例えば、対照となる複数（集団）のサンプル由来のmicroRNAを用いて、検査対象となる被検者由来のmicroRNAの発現比と副反応との相関関係を解析することができる。また、複数の被検者全員が副反応の可能性を検査する対象者（すなわち集団検診の態様）であると考えれば、これらの被検者のデータを用いて相関関係を解析し、その中から副反応のリスクのある被検者とそうでない被検者とを区別することが可能である。
【００３０】
このように、集団における相関関係の解析は、例えば図７に示すことができる。
集団全体のうち、U6/miR-21の値が下位4分の1を占めるか、あるいはmiR-16/miR-451aの値が上位3分の1を占める集団内に含まれる被検者は、リスクが低い（ほぼ0％）と判定できる。
同様に、U6/miR-21の値が上位4分の1を占めるか、あるいはmiR-16/miR-451aの値が下位3分の1を占める集団内に含まれる被検者は、リスクが中程度（約20％）であると判定できる。
さらに、U6/miR-21の値が上位4分の1を占め、かつ、miR-16/miR-451aの値が下位3分の1を占める集団内に含まれる被検者は、リスクが高い（約50％）と判定できる。
【００３１】
さらに、予め規定された数の対照被験者（１次母集団）においてマイクロRNA及びsnRNAの発現比を解析し、得られた解析データ（グラフ、測定値等）を基本データとして、この基本データと、検査の対象となる単数又は複数の被検者由来のマイクロRNA及びsnRNAの発現比とを比較し、ワクチンを接種した場合副反応の可能性を検査することもできる。
上記解析された被験者由来のデータを前記１次母集団のデータに組み込んで、副反応のリスクレベルを再度データ処理し、対象となる被検者の例数を増やすことにより２次母集団とする。この２次母集団のデータを、次に続く被検者の解析に利用することができる。
【００３２】
実施例
以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明する。但し、本発明の範囲はこれらの実施例により限定されるものではない。
【実施例１】
【００３３】
1. 血液からの細胞外小胞の抽出と、そのRNA量の測定
静脈から採取した血液から細胞外小胞を調整する。血清より精製する細胞外小胞はエクソソーム（エキソソーム）や微小小胞（microvesicle）など、細胞から放出される小胞である。ポリエチレングリコールなどのポリマーを用いた方法や、超遠心を用いた方法などを用いて、末梢血から調整した血清を用いて、細胞外小胞を精製する。精製した細胞外小胞からRNAを抽出し、定量PCR法やマイクロアレイ法、あるいは、RNA-Seq法などを用いて発現量を測定する。血清は、ヒトの指先や、マウスの尾静脈、あるいは、その他の静脈から採取した血液から調整したものを用いることができる。
Toll様受容体４（Toll-like receptor 4: TLR4）分子のリガンドであるリポ多糖（LPS)で、マクロファージを刺激した際に産生される炎症性サイトカイン(IL-6とTNF-α)の発現量は、細胞外小胞により増加していた（図１）。これは、細胞外小胞が、TLR4依存的なサイトカイン産生という免疫応答に影響を与えることを示唆する。子宮頸がんワクチンのサーバリックスにはTLR4分子のリガンドであるモノホスホリルリピッドが含まれる。【００３４】
２．実験的自己免疫性脳脊髄炎（EAE）におけるワクチンの影響
ヒトの急性散在性脳脊髄炎や多発性硬化症の動物モデルとして知られる実験的自己免疫性脳脊髄炎（EAE）のマウス動物モデルを用いて実験を実施した。
８週齢のマウスを用いて、これに、200μgのMOG35-55ペプチドを、フロイント完全アジュバントを用いて乳化し、マウスの皮下に注射する。注射した日を実験開始０日目とする。また、500 ngの百日咳毒素を実験開始０日目と２日目に筋肉注射する。子宮頸がんワクチンを注射する場合には、MSD社から購入した子宮頸がんワクチン（ガーダシル）100μlを、実験開始０日目に筋肉注射した。その時のコントロール群として100μlのPBSを、筋肉注射したマウスを用いた。自己免疫疾患の症状の程度（EAEスコア）の判定は、表１に従った。EAE積算値は、実験開始後０日目から３０日目までの、それぞれの日のEAEスコアの合計値として算出した。【００３５】
【表１】
2020045509.tif 000002
【００３６】
３．EAEにおける血液中の細胞外小胞の影響
マウスEAE動物モデルを用いて血液中の細胞外小胞内RNAの影響を評価した。実験開始前日に、マウスの静脈より血液を採取し調整した血清50μlから細胞外小胞を精製し、細胞外小胞内のRNAを抽出し、miR-16, miR-21, miR-451a, U6 RNA量を測定した。それぞれのRNAの塩基配列、又は、GenbankのAccession Numberは、表２の通りである。なお、U6 RNAの塩基配列は、DNA配列として表示してある。【００３７】
【表２】
2020045509.tif 000003
【００３８】
EAEの実験開始後３０日目まで各マウスについてEAEスコアを観察した。細胞外小胞内のmiR-21とU6のRNAの発現量の比（U6/miR-21）について、高い群と低い群とで分けると、U6/miR-21が高い群は、低い群と比較し、統計的に有意に自己免疫症状の重症度を示すEAEスコアが高くなった（図２）。また、個々のマウスのU6/miR-21の値は、EAE積算値と統計的に有意に相関した（図３Ａ）。これは、子宮頸がんワクチンを注射した群でも、注射しなかった群でもU6/miR-21の値が、EAE積算値と統計的に有意に相関した（図３A, B）。これらは、EAEにおける自己免疫疾患の重症度が、ワクチン注射の有無にかかわらず、血液中の細胞外小胞内のU6/miR-21の値に強く依存することを示す。【００３９】
実験開始前日に精製した細胞外小胞のmiR-16とmiR-451aの発現量の比(miR-16/miR-451a）について比較したところ、miR-16/miR-451aの値が低い群は、高い群と比較して、EAEスコアが統計的に有意に高いことが示された（図４）。
一方で、U6とmiR-23bのRNAの発現量の比（U6/miR-23b）やU6とmiR-22のRNAの発現量の比(U6/miR-22）は、その値が高い群と低い群とでは、そのEAEスコアについて統計的に有意な差は観察されなかった（図５、図６）。これは、細胞外小胞内の特定のRNAの発現量の比が、EAEスコアと相関することを示す。【００４０】
４．細胞外小胞内のRNAの発現量の比を用いた自己免疫疾患重症度の予測方法
実験開始前日に決定した上記のU6/miR-21とmiR-16/miR-451aの値を用いて、EAEスコアを予測できるかどうかについて検討した。
集団全体の中で、U6/miR-21の値が高い上位４分の１の集団では、尾の完全下垂と後肢の完全麻痺の症状が２日以上現れたマウスが25%いたのに対し、U6/miR-21の値が低い下位４分の１の集団では、尾の完全下垂と後肢の完全麻痺の症状が２日以上続くマウスはいなかった（0%)（表3）。【００４１】
また、miR-16/miR-451aの値が低い上位３分の１の集団では、尾の完全下垂と後肢の完全麻痺の症状が２日以上現れたマウスが、30%いたが、miR-16/miR-451aの値が高い下位３分の１の集団では、尾の完全下垂と後肢の完全麻痺の症状が２日以上現れたマウスはいなかった（表3）。
【表３】
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【００４２】
実験開始前日に決定したU6/miR-21よmiR-16/miR-451aの両方の値を用いて高リスクグループ、中リスクグループ、低リスクグループを図７の定義に従い分けた。高リスクグループは全体の１３％を占め、尾の完全下垂と後肢の完全麻痺の症状が２日以上続くマウスは50%であった。中リスクグループは全体の２７％を占め、上記の症状が現れるマウスが31%であった。低リスクグループは全体の５０％存在した、このグループでは上記の症状が現れるマウスは0%であった（図７）。これらの結果は、予め測定した血液中の細胞外小胞内の、miR-16, miR-21, miR-451a, U6 RNAの発現量を用いることで、自己免疫疾患の重症度や発症を予測することができることを示す。
【配列表フリーテキスト】
【００４３】
配列番号４：U6 small nuclear RNA（存在位置：1..107）
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】令和2年6月29日(2020.6.29)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ワクチンの副反応の可能性を検査する方法であって、以下の工程：
（ａ）生体試料から採取された細胞外小胞内に含まれる異なる２つのマイクロＲＮＡ及び／又はｓｎＲＮＡの発現量の比を測定する工程、及び
（ｂ）前記測定された比から、前記副反応の発症リスクを予測する工程、
を含み、
前記マイクロＲＮＡ及び／又はｓｎＲＮＡの発現量の比が、Ｕ６／ｍｉＲ−２１及び／又はｍｉＲ−１６／ｍｉＲ−４５１ａである、前記方法。
【請求項２】
ワクチンが、インフルエンザワクチン、子宮頸がんワクチン、肝炎ワクチン、日本脳炎ワクチン、狂犬病ワクチン及びウイルスの抗原を用いた不活化ワクチンからなる群から選ばれる少なくとも１つである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ワクチンの副反応が自己免疫疾患である、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
自己免疫疾患が、急性散在性脳脊髄炎又はギラン・バレー症候群である、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
生体試料が血液、尿、汗又は唾液である請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
（削除）
【請求項７】
Ｕ６／ｍｉＲ−２１の値が高いときは、ワクチンの副反応のリスクが高いと判定し、及び／又はＵ６／ｍｉＲ−２１の値が低いときは、ワクチンの副反応のリスクが少ないと判定する、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
ｍｉＲ−１６／ｍｉＲ−４５１ａの値が低いときは、ワクチンの副反応のリスクが高いと判定し、及び／又はｍｉＲ−１６／ｍｉＲ−４５１ａが高いときは、ワクチンの副反応のリスクが少ないと判定する、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
Ｕ６／ｍｉＲ−２１又はｍｉＲ−１６／ｍｉＲ−４５１ａである、マイクロＲＮＡ及び／又はｓｎＲＮＡの発現量の比を含む、ワクチンの副反応マーカー。
【国際調査報告】
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