(57)【要約】  下式で示される薬物と、抗体とが、リンカーを介して結合した抗体−薬物コンジュゲートの、薬物部位を認識する蛋白質、及び該蛋白質を用いて、上記の抗体−薬物コンジュゲートを投与された哺乳動物における、該抗体−薬物コンジュゲートの血漿中濃度を定量する方法及び組織分布を確認する方法。2020022475.tif 000062
2020022475.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
式
【化１】
2020022475.tif 000051
で示される薬物と、抗体とが、リンカーを介して結合した抗体−薬物コンジュゲートの、薬物部位を認識する蛋白質。
【請求項２】
抗体−薬物コンジュゲートにおける薬物リンカーが、
式
【化２】
2020022475.tif 000052
（式中、Ａは抗体との結合位置を示し、該薬物リンカーは抗体とチオエーテル結合によって結合している）
で示される、請求項１に記載の蛋白質。
【請求項３】
抗体−薬物コンジュゲートにおける薬物リンカーが、
式
【化３】
2020022475.tif 000053
（式中、Ａは抗体との結合位置を示し、該薬物リンカーは抗体とチオエーテル結合によって結合している）
で示される、請求項１に記載の蛋白質。
【請求項４】
抗体−薬物コンジュゲートにおける薬物リンカーが、
式
【化４】
2020022475.tif 000054
（式中、Ａは抗体との結合位置を示し、該薬物リンカーは抗体とチオエーテル結合によって結合している）
で示される、請求項１に記載の蛋白質。
【請求項５】
抗体−薬物コンジュゲートが、式
【化５】
2020022475.tif 000055
（式中、薬物リンカーは抗体とチオエーテル結合によって結合しており、ｎは１抗体あたりの薬物リンカーの平均結合数を示す）
で示される、請求項１に記載の蛋白質。
【請求項６】
抗体−薬物コンジュゲートが、式
【化６】
2020022475.tif 000056
（式中、薬物リンカーは抗体とチオエーテル結合によって結合しており、ｎは１抗体あたりの薬物リンカーの平均結合数を示す）
で示される、請求項１に記載の蛋白質。
【請求項７】
抗体−薬物コンジュゲートが、式
【化７】
2020022475.tif 000057
（式中、薬物リンカーは抗体とチオエーテル結合によって結合しており、ｎは１抗体あたりの薬物リンカーの平均結合数を示す）
で示される、請求項１に記載の蛋白質。
【請求項８】
抗体−薬物コンジュゲートにおける１抗体あたりの薬物リンカーの平均結合数が２から８の範囲である、請求項１〜７のいずれか１項に記載の蛋白質。
【請求項９】
抗体−薬物コンジュゲートにおける抗体が、抗ＨＥＲ２抗体、抗ＨＥＲ３抗体、抗ＴＲＯＰ２抗体、抗Ｂ７−Ｈ３抗体、抗ＧＰＲ２０抗体、又は抗ＣＤＨ６抗体である、請求項１〜８のいずれか１項に記載の蛋白質。
【請求項１０】
抗体−薬物コンジュゲートにおける１抗体あたりの薬物リンカーの平均結合数の違いによって該抗体−薬物コンジュゲートに対する認識性が実質的に異ならない、請求項１〜９のいずれか１項に記載の蛋白質。
【請求項１１】
式
【化８】
2020022475.tif 000058
で示される薬物を認識する蛋白質。
【請求項１２】
式
【化９】
2020022475.tif 000059
で示される薬物を認識する蛋白質。
【請求項１３】
式
【化１０】
2020022475.tif 000060
で示される薬物を認識する蛋白質。
【請求項１４】
式
【化１１】
2020022475.tif 000061
で示される薬物を認識する蛋白質。
【請求項１５】
抗体であることを特徴とする、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の蛋白質。
【請求項１６】
ａ）配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ１、配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ２、及び配列番号３に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ３を含む重鎖、並びに、配列番号４に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ１、配列番号５に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ２、及び配列番号６に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ３を含む軽鎖を含んでなる抗体、
ｂ）配列番号７に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ１、配列番号８に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ２、及び配列番号３に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ３を含む重鎖、並びに、配列番号４に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ１、配列番号５に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ２、及び配列番号６に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ３を含む軽鎖を含んでなる抗体、
ｃ）配列番号９に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ１、配列番号１０に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ２、及び配列番号３に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ３を含む重鎖、並びに、配列番号４に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ１、配列番号５に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ２、及び配列番号６に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ３を含む軽鎖を含んでなる抗体、又は、
ｄ）配列番号１１に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ１、配列番号１２に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ２、及び配列番号１３に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ３を含む重鎖、並びに、配列番号１４に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ１、ＷＡＳで示されるトリペプチドからなるＣＤＲＬ２、及び配列番号６に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ３を含む軽鎖を含んでなる抗体であることを特徴とする、請求項１５に記載の蛋白質。
【請求項１７】
配列番号１５においてアミノ酸番号２０乃至１４１に記載のアミノ酸配列からなる重鎖可変領域を含む重鎖、及び配列番号１６においてアミノ酸番号２１乃至１２７に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む軽鎖を含んでなる抗体であることを特徴とする、請求項１６に記載の蛋白質。
【請求項１８】
マウス抗体であることを特徴とする、請求項１７に記載の蛋白質。
【請求項１９】
配列番号１５においてアミノ酸番号２０乃至４７７に記載のアミノ酸配列からなる重鎖及び配列番号１６においてアミノ酸番号２１乃至２３４に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖を含んでなる抗体であることを特徴とする、請求項１７に記載の蛋白質。
【請求項２０】
キメラ抗体であることを特徴とする、請求項１７に記載の蛋白質。
【請求項２１】
ウサギキメラ化抗体であることを特徴とする、請求項１７に記載の蛋白質。
【請求項２２】
配列番号１９においてアミノ酸番号２０乃至４６４に記載のアミノ酸配列からなる重鎖及び配列番号２０においてアミノ酸番号２１乃至２３３に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖を含んでなる抗体であることを特徴とする、請求項１７に記載の蛋白質。
【請求項２３】
請求項１９又は２２に記載の抗体の重鎖カルボキシル末端のリシン残基が欠失している抗体であることを特徴とする、請求項１５に記載の蛋白質。
【請求項２４】
請求項１９又は２２に記載の抗体のアミノ酸配列と少なくとも９５％の同一性を持つアミノ酸配列からなる抗体であることを特徴とする、請求項１５に記載の蛋白質。
【請求項２５】
請求項１９又は２２に記載の抗体のアミノ酸配列と少なくとも９９％の同一性を持つアミノ酸配列からなる抗体であることを特徴とする、請求項１５に記載の蛋白質。
【請求項２６】
薬物への認識性について、請求項１９又は２２に記載の抗体と競合する抗体であることを特徴とする、請求項１５に記載の蛋白質。
【請求項２７】
請求項１５〜２６のいずれか１項に記載の抗体の抗原結合断片であることを特徴とする、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の蛋白質。
【請求項２８】
抗体の抗原結合断片が、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’又はＦｖである、請求項２７に記載の蛋白質。
【請求項２９】
請求項１〜２８のいずれか１項に記載の蛋白質を用いて、抗体−薬物コンジュゲートを投与された哺乳動物における、該抗体−薬物コンジュゲートの血漿中濃度を定量する方法。
【請求項３０】
（１）抗体−薬物コンジュゲートの標的抗原が固相化されたプレートに血漿中の抗体−薬物コンジュゲートを接触させ複合体を形成させるステップ、（２）マーカーで標識化された、請求項１〜２８のいずれか１項に記載の蛋白質を該複合体と接触させ、さらなる複合体を形成させるステップ、次いで（３）該マーカーを検出するステップ、を含むことを特徴とする、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
（１）請求項１〜２８のいずれか１項に記載の蛋白質が固相化されたプレートに血漿中の抗体−薬物コンジュゲートを接触させ複合体を形成させるステップ、（２）該抗体−薬物コンジュゲートの抗体部位を認識することができ、マーカーで標識化された第二の蛋白質を該複合体と接触させ、さらなる複合体を形成させるステップ、次いで（３）該マーカーを検出するステップ、を含むことを特徴とする、請求項２９に記載の方法。
【請求項３２】
請求項１〜２８のいずれか１項に記載の蛋白質を用いて、抗体−薬物コンジュゲートを投与された哺乳動物における、該抗体−薬物コンジュゲートから遊離した薬物の血漿中濃度を定量する方法。
【請求項３３】
（１）請求項１〜２８のいずれか１項に記載の蛋白質が固相化されたプレートに、マーカーで標識化された競合薬物の存在下で、血漿中の抗体−薬物コンジュゲートから遊離した薬物を接触させ複合体を形成させるステップ、（２）該マーカーを検出するステップ、を含むことを特徴とする、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
請求項１〜２８のいずれか１項に記載の蛋白質を用いて、抗体−薬物コンジュゲートを投与された哺乳動物における、該抗体−薬物コンジュゲート及び／又は該抗体−薬物コンジュゲートから遊離した薬物の組織分布を確認する方法。
【請求項３５】
（１）組織中の抗体−薬物コンジュゲート及び／又は該抗体−薬物コンジュゲートから遊離した薬物を請求項１〜２８のいずれか１項に記載の蛋白質と接触させ複合体を形成させるステップ、（２）請求項１〜２８のいずれか１項に記載の蛋白質を認識することができ、マーカーで標識化された第二の蛋白質を該複合体と接触させ、さらなる複合体を形成させるステップ、次いで（３）該マーカーを検出するステップ、を含むことを特徴とする、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
（１）組織中の抗体−薬物コンジュゲート及び／又は該抗体−薬物コンジュゲートから遊離した薬物を、マーカーで標識化された請求項１〜２８のいずれか１項に記載の蛋白質と接触させ複合体を形成させるステップ、次いで（２）該マーカーを検出するステップ、を含むことを特徴とする、請求項３４に記載の方法。
【請求項３７】
マーカーが蛍光物質であり、該マーカーの検出が該マーカーの発する蛍光を感知することにより行われる、請求項３０、３１、３３、３５又は３６に記載の方法。
【請求項３８】
マーカーが酵素であり、該マーカーの検出が該酵素と基質との反応により生じる発光又は発色を感知することにより行われる、請求項３０、３１、３３、３５又は３６に記載の方法。
【請求項３９】
マーカーが発光物質であり、該マーカーの検出が電気化学反応に基づく該マーカーの発光を感知することにより行われる、請求項３０、３１、３３、３５又は３６に記載の方法。
【請求項４０】
請求項１〜２８のいずれか１項に記載の蛋白質をコードするポリヌクレオチド。
【請求項４１】
請求項４０に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
【請求項４２】
請求項４０に記載のポリヌクレオチドを含む形質転換宿主細胞。
【請求項４３】
請求項４１に記載のベクターを含む形質転換宿主細胞。
【請求項４４】
請求項４２又は４３に記載の宿主細胞を培養する工程、次いで、前記培養工程で得られた培養産物から蛋白質を精製する工程、を含む、請求項１〜２８のいずれか１項に記載の蛋白質の製造方法。
【請求項４５】
請求項１〜２８のいずれか１項に記載の蛋白質を含む組成物。
【請求項４６】
請求項１〜２８のいずれか１項に記載の蛋白質、又は請求項４５に記載の組成物を含むキット。
【請求項４７】
抗体−薬物コンジュゲートを投与された哺乳動物における、抗体−薬物コンジュゲート及び／又は該抗体−薬物コンジュゲートから遊離した薬物の血漿中濃度を定量するための、請求項４６に記載のキット。
【請求項４８】
抗体−薬物コンジュゲートを投与された哺乳動物における、抗体−薬物コンジュゲート及び／又は該抗体−薬物コンジュゲートから遊離した薬物の組織分布を確認するための、請求項４６に記載のキット。
【請求項４９】
配列番号１５においてアミノ酸番号２０乃至１４１に記載のアミノ酸配列からなる重鎖可変領域を含む重鎖、及び配列番号１６においてアミノ酸番号２１乃至１２７に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む軽鎖を含んでなる抗体。
【請求項５０】
配列番号１５においてアミノ酸番号２０乃至４７７に記載のアミノ酸配列からなる重鎖及び配列番号１６においてアミノ酸番号２１乃至２３４に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖を含んでなる、請求項４９に記載の抗体。
【請求項５１】
配列番号１９においてアミノ酸番号２０乃至４６４に記載のアミノ酸配列からなる重鎖及び配列番号２０においてアミノ酸番号２１乃至２３３に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖を含んでなる、請求項４９に記載の抗体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、エキサテカンの誘導体を構成要素とする抗体−薬物コンジュゲートの薬物部位を認識する蛋白質、及び該蛋白質を用いて、上記の抗体−薬物コンジュゲートを投与された哺乳動物における、該抗体−薬物コンジュゲートの血漿中濃度を定量する方法及び組織分布を確認する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
がん細胞表面に発現する抗原に結合し、かつ細胞に内在化できる抗体に、細胞毒性を有する薬物を結合させた抗体−薬物コンジュゲート（Ａｎｔｉｂｏｄｙ−Ｄｒｕｇ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ；  ＡＤＣ）は、がん細胞に選択的に薬物を送達できることによって、がん細胞内に薬物を蓄積させ、がん細胞を死滅させることが期待できる（非特許文献１〜５）。【０００３】
低分子化合物や抗体と同様に、抗体−薬物コンジュゲートの医薬品開発においても薬物動態試験（ＰＫ試験）の実施は不可欠である。動物におけるＰＫ試験結果と薬理試験結果及び安全性試験結果との相関関係を把握した上で、ヒトにおけるＰＫ試験を行うことにより、臨床試験デザインの策定やヒトでの有効性及び安全性の考察に有用な情報を取得できるためである。【０００４】
抗体−薬物コンジュゲートのＰＫ試験は、投薬後の抗体−薬物コンジュゲートの血漿中濃度を定量することを基本に行われる。抗体−薬物コンジュゲートの血漿中濃度を定量するための方法としてＥＬＩＳＡ法を挙げることができる。例えば、（１）抗原が固相化されたプレートに抗体−薬物コンジュゲートを接触させ複合体を形成させるステップ、（２）該抗体−薬物コンジュゲートを認識することができ、マーカーで標識化された蛋白質を該複合体と接触させ、さらなる複合体を形成させるステップ、次いで（３）酵素反応等による発色・発光等により該マーカーを検出するステップ、を経ることにより、抗体−薬物コンジュゲートの血漿中濃度を定量することができる。【０００５】
しかし、抗体−薬物コンジュゲートの抗体部位を認識する蛋白質を用いた場合、薬物を保持した状態の抗体−薬物コンジュゲートのみならず、薬物が遊離した状態の抗体−薬物コンジュゲート（すなわち、実質的に抗体部位のみとなったもの）も含めた血漿中濃度が算出され、正確な定量を行うことができない。【０００６】
抗体−薬物コンジュゲートの薬物部位を認識する蛋白質を用いたＥＬＩＳＡ法により、抗体−薬物コンジュゲートの血漿中濃度を定量する方法が知られている（非特許文献６〜１１）。【０００７】
抗体−薬物コンジュゲートの一つとして、抗体とトポイソメラーゼＩ阻害剤であるエキサテカンの誘導体を構成要素とする抗体−薬物コンジュゲートが知られている（特許文献１〜７、非特許文献１２〜１５）。これらの抗体−薬物コンジュゲートは、優れた抗腫瘍効果と安全性を有することから、現在、臨床試験が進行中である。【０００８】
上記のエキサテカンの誘導体を構成要素とする抗体−薬物コンジュゲートについて、薬物を保持した状態での血漿中濃度を定量する方法は知られていなかった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】国際公開第2014/057687号
【特許文献２】国際公開第2014/061277号
【特許文献３】国際公開第2015/098099号
【特許文献４】国際公開第2015/115091号
【特許文献５】国際公開第2015/146132号
【特許文献６】国際公開第2015/155976号
【特許文献７】国際公開第2015/155998号
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Ducry, L., et al., Bioconjugate Chem. (2010) 21, 5-13.
【非特許文献２】Alley, S. C., et al., Current Opinion in Chemical Biology (2010) 14, 529-537.
【非特許文献３】Damle N. K. Expert Opin. Biol. Ther. (2004) 4, 1445-1452.
【非特許文献４】Senter P. D., et al., Nature Biotechnology (2012) 30, 631-637.
【非特許文献５】Howard A. et al., J Clin Oncol 29: 398-405.
【非特許文献６】Xie H. et al., J Pharmacol Exp Ther. (2004) 308(3), 1073-1082.
【非特許文献７】Sanderson RJ. et al., Clinical Cancer Research (2005) Vol.11, 843-852.
【非特許文献８】Stephan JP. et al., Bioconjugate Chem. 2008, 19, 1673-1683.
【非特許文献９】Stephan JP. et al., Bioanalysis (2011) 3(6), 677-700.
【非特許文献１０】Kaur S. et al., Bioanalysis (2013) 5(2), 201-226.
【非特許文献１１】Dere R. et al., Bioanalysis (2013) 5(9), 1025-1040.
【非特許文献１２】Ogitani Y. et al., Clinical Cancer Research (2016) 22(20), 5097-5108.
【非特許文献１３】Ogitani Y. et al., Cancer Science (2016) 107, 1039-1046.
【非特許文献１４】Doi T, et al., Lancet Oncol 2017; 18: 1512-22.
【非特許文献１５】Takegawa N, et al., Int. J. Cancer: 141, 1682-1689 (2017).
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明は、エキサテカンの誘導体を構成要素とする抗体−薬物コンジュゲートの薬物部位を認識する蛋白質、及び該蛋白質を用いて、上記の抗体−薬物コンジュゲートを投与された哺乳動物における、該抗体−薬物コンジュゲートの血漿中濃度を定量する方法及び組織分布を確認する方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討したところ、特定の免疫スクリーニングにより取得された蛋白質が、エキサテカンの誘導体を構成要素とする抗体−薬物コンジュゲートの薬物部位を特異的に認識することを見出した。また、該蛋白質を用いた、上記の抗体−薬物コンジュゲートを投与された哺乳動物における、該抗体−薬物コンジュゲートの血漿中濃度を定量する方法及び組織分布を確認する方法を確立した。【００１３】
すなわち、本発明は、以下の［１］〜［５１］を提供する。
［１］
式【００１４】
【化１】
2020022475.tif 000003
【００１５】
で示される薬物と、抗体とが、リンカーを介して結合した抗体−薬物コンジュゲートの、薬物部位を認識する蛋白質。
［２］
抗体−薬物コンジュゲートにおける薬物リンカーが、
式【００１６】
【化２】
2020022475.tif 000004
【００１７】
（式中、Ａは抗体との結合位置を示し、該薬物リンカーは抗体とチオエーテル結合によって結合している）
で示される、［１］に記載の蛋白質。
［３］
抗体−薬物コンジュゲートにおける薬物リンカーが、
式【００１８】
【化３】
2020022475.tif 000005
【００１９】
（式中、Ａは抗体との結合位置を示し、該薬物リンカーは抗体とチオエーテル結合によって結合している）
で示される、［１］に記載の蛋白質。
［４］
抗体−薬物コンジュゲートにおける薬物リンカーが、
式【００２０】
【化４】
2020022475.tif 000006
【００２１】
（式中、Ａは抗体との結合位置を示し、該薬物リンカーは抗体とチオエーテル結合によって結合している）
で示される、［１］に記載の蛋白質。
［５］
抗体−薬物コンジュゲートが、式【００２２】
【化５】
2020022475.tif 000007
【００２３】
（式中、薬物リンカーは抗体とチオエーテル結合によって結合しており、ｎは１抗体あたりの薬物リンカーの平均結合数を示す）
で示される、［１］に記載の蛋白質。
［６］
抗体−薬物コンジュゲートが、式【００２４】
【化６】
2020022475.tif 000008
【００２５】
（式中、薬物リンカーは抗体とチオエーテル結合によって結合しており、ｎは１抗体あたりの薬物リンカーの平均結合数を示す）
で示される、［１］に記載の蛋白質。
［７］
抗体−薬物コンジュゲートが、式【００２６】
【化７】
2020022475.tif 000009
【００２７】
（式中、薬物リンカーは抗体とチオエーテル結合によって結合しており、ｎは１抗体あたりの薬物リンカーの平均結合数を示す）
で示される、［１］に記載の蛋白質。
［８］
抗体−薬物コンジュゲートにおける１抗体あたりの薬物リンカーの平均結合数が２から８の範囲である、［１］〜［７］のいずれか１項に記載の蛋白質。
［９］
抗体−薬物コンジュゲートにおける抗体が、抗ＨＥＲ２抗体、抗ＨＥＲ３抗体、抗ＴＲＯＰ２抗体、抗Ｂ７−Ｈ３抗体、抗ＧＰＲ２０抗体、又は抗ＣＤＨ６抗体である、［１］〜［８］のいずれか１項に記載の蛋白質。
［１０］
抗体−薬物コンジュゲートにおける１抗体あたりの薬物リンカーの平均結合数の違いによって該抗体−薬物コンジュゲートに対する認識性が実質的に異ならない、［１］〜［９］のいずれか１項に記載の蛋白質。
［１１］
式【００２８】
【化８】
2020022475.tif 000010
【００２９】
で示される薬物を認識する蛋白質。
［１２］
式【００３０】
【化９】
2020022475.tif 000011
【００３１】
で示される薬物を認識する蛋白質。
［１３］
式【００３２】
【化１０】
2020022475.tif 000012
【００３３】
で示される薬物を認識する蛋白質。
［１４］
式【００３４】
【化１１】
2020022475.tif 000013
【００３５】
で示される薬物を認識する蛋白質。
［１５］
抗体であることを特徴とする、［１］〜［１４］のいずれか１項に記載の蛋白質。
［１６］
ａ）配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ１、配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ２、及び配列番号３に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ３を含む重鎖、並びに、配列番号４に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ１、配列番号５に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ２、及び配列番号６に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ３を含む軽鎖からなる抗体、
ｂ）配列番号７に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ１、配列番号８に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ２、及び配列番号３に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ３を含む重鎖、並びに、配列番号４に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ１、配列番号５に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ２、及び配列番号６に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ３を含む軽鎖からなる抗体、
ｃ）配列番号９に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ１、配列番号１０に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ２、及び配列番号３に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ３を含む重鎖、並びに、配列番号４に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ１、配列番号５に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ２、及び配列番号６に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ３を含む軽鎖からなる抗体、又は、
ｄ）配列番号１１に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ１、配列番号１２に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ２、及び配列番号１３に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ３を含む重鎖、並びに、配列番号１４に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ１、ＷＡＳで示されるトリペプチドからなるＣＤＲＬ２、及び配列番号６に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ３を含む軽鎖からなる抗体であることを特徴とする、［１５］に記載の蛋白質。
［１７］
配列番号１５においてアミノ酸番号２０乃至１４１に記載のアミノ酸配列からなる重鎖可変領域を含む重鎖、及び配列番号１６においてアミノ酸番号２１乃至１２７に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む軽鎖からなる抗体であることを特徴とする、［１６］に記載の蛋白質。
［１８］
マウス抗体であることを特徴とする、［１７］に記載の蛋白質。
［１９］
配列番号１５においてアミノ酸番号２０乃至４７７に記載のアミノ酸配列からなる重鎖及び配列番号１６においてアミノ酸番号２１乃至２３４に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖からなる抗体であることを特徴とする、［１７］に記載の蛋白質。
［２０］
キメラ抗体であることを特徴とする、［１７］に記載の蛋白質。
［２１］
ウサギキメラ化抗体であることを特徴とする、［１７］に記載の蛋白質。【００３６】
［２２］
配列番号１９においてアミノ酸番号２０乃至４６４に記載のアミノ酸配列からなる重鎖及び配列番号２０においてアミノ酸番号２１乃至２３３に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖からなる抗体であることを特徴とする、［１７］に記載の蛋白質。
［２３］
［１９］又は［２２］に記載の抗体の重鎖カルボキシル末端のリシン残基が欠失している抗体であることを特徴とする、［１５］に記載の蛋白質。
［２４］
［１９］又は［２２］に記載の抗体のアミノ酸配列と少なくとも９５％の同一性を持つアミノ酸配列からなる抗体であることを特徴とする、［１５］に記載の蛋白質。
［２５］
［１９］又は［２２］に記載の抗体のアミノ酸配列と少なくとも９９％の同一性を持つアミノ酸配列からなる抗体であることを特徴とする、［１５］に記載の蛋白質。
［２６］
薬物への認識性について、［１９］又は［２２］に記載の抗体と競合する抗体であることを特徴とする、［１５］に記載の蛋白質。
［２７］
［１５］〜［２６］のいずれか１項に記載の抗体の抗原結合断片であることを特徴とする、［１］〜［１４］のいずれか１項に記載の蛋白質。
［２８］
抗体の抗原結合断片が、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’又はＦｖである、［２７］に記載の蛋白質。
［２９］
［１］〜［２８］のいずれか１項に記載の蛋白質を用いて、抗体−薬物コンジュゲートを投与された哺乳動物における、該抗体−薬物コンジュゲートの血漿中濃度を定量する方法。
［３０］
（１）抗体−薬物コンジュゲートの標的抗原が固相化されたプレートに血漿中の抗体−薬物コンジュゲートを接触させ複合体を形成させるステップ、（２）マーカーで標識化された、［１］〜［２８］のいずれか１項に記載の蛋白質を接触させ、さらなる複合体を形成させるステップ、次いで（３）該マーカーを検出するステップ、を含むことを特徴とする、［２９］に記載の方法。
［３１］
（１）［１］〜［２８］のいずれか１項に記載の蛋白質が固相化されたプレートに血漿中の抗体−薬物コンジュゲートを接触させ複合体を形成させるステップ、（２）該抗体−薬物コンジュゲートの抗体部位を認識することができ、マーカーで標識化された第二の蛋白質を接触させ、さらなる複合体を形成させるステップ、次いで（３）該マーカーを検出するステップ、を含むことを特徴とする、［２９］に記載の方法。
［３２］
［１］〜［２８］のいずれか１項に記載の蛋白質を用いて、抗体−薬物コンジュゲートを投与された哺乳動物における、該抗体−薬物コンジュゲートから遊離した薬物の血漿中濃度を定量する方法。
［３３］
（１）［１］〜［２８］のいずれか１項に記載の蛋白質が固相化されたプレートに、マーカーで標識化された競合薬物の存在下で、血漿中の抗体−薬物コンジュゲートから遊離した薬物を接触させ複合体を形成させるステップ、（２）該マーカーを検出するステップ、を含むことを特徴とする、［３２］に記載の方法。
［３４］
［１］〜［２８］のいずれか１項に記載の蛋白質を用いて、抗体−薬物コンジュゲートを投与された哺乳動物における、該抗体−薬物コンジュゲート及び／又は該抗体−薬物コンジュゲートから遊離した薬物の組織分布を確認する方法。
［３５］
（１）組織中の抗体−薬物コンジュゲート及び／又は該抗体−薬物コンジュゲートから遊離した薬物を［１］〜［２８］のいずれか１項に記載の蛋白質と接触させ複合体を形成させるステップ、（２）［１］〜［２８］のいずれか１項に記載の蛋白質を認識することができ、マーカーで標識化された第二の蛋白質を接触させ、さらなる複合体を形成させるステップ、次いで（３）該マーカーを検出するステップ、を含むことを特徴とする、［３４］に記載の方法。【００３７】
［３６］
（１）組織中の抗体−薬物コンジュゲート及び／又は該抗体−薬物コンジュゲートから遊離した薬物を、マーカーで標識化された［１］〜［２８］のいずれか１項に記載の蛋白質と接触させ複合体を形成させるステップ、次いで（２）該マーカーを検出するステップ、を含むことを特徴とする、［３４］に記載の方法。
［３７］
マーカーが発色試薬であり、該マーカーの検出が該マーカーの発色を感知することにより行われる、［３０］、［３１］、［３３］、［３５］又は［３６］に記載の方法。
［３８］
マーカーが酵素であり、該マーカーの検出が該酵素と基質との反応により生じた発光又は発色を感知することにより行われる、［３０］、［３１］、［３３］、［３５］又は［３６］に記載の方法。
［３９］
マーカーが発光物質であり、該マーカーの検出が電気化学反応に基づく該マーカーの発光を感知することにより行われる、［３０］、［３１］、［３３］、［３５］又は［３６］に記載の方法。
［４０］
［１］〜［２８］のいずれか１項に記載の蛋白質をコードするポリヌクレオチド。
［４１］
［４０］に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
［４２］
［４０］に記載のポリヌクレオチドを含む形質転換宿主細胞。
［４３］
［４１］に記載のベクターを含む形質転換宿主細胞。
［４４］
［４２］又は［４３］に記載の宿主細胞を培養する工程、次いで、前記培養工程で得られた培養産物から蛋白質を精製する工程、を含む、［１］〜［２８］のいずれか１項に記載の蛋白質の製造方法。
［４５］
［１］〜［２８］のいずれか１項に記載の蛋白質を含む組成物。
［４６］
［１］〜［２８］のいずれか１項に記載の蛋白質、又は［４５］に記載の組成物を含むキット。
［４７］
抗体−薬物コンジュゲートを投与された哺乳動物における、抗体−薬物コンジュゲート及び／又は該抗体−薬物コンジュゲートから遊離した薬物の血漿中濃度を定量するための、［４６］に記載のキット。
［４８］
抗体−薬物コンジュゲートを投与された哺乳動物における、抗体−薬物コンジュゲート及び／又は該抗体−薬物コンジュゲートから遊離した薬物の組織分布を確認するための、［４６］に記載のキット。
［４９］
配列番号１５においてアミノ酸番号２０乃至１４１に記載のアミノ酸配列からなる重鎖可変領域を含む重鎖、及び配列番号１６においてアミノ酸番号２１乃至１２７に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む軽鎖を含んでなる抗体。
［５０］
配列番号１５においてアミノ酸番号２０乃至４７７に記載のアミノ酸配列からなる重鎖及び配列番号１６においてアミノ酸番号２１乃至２３４に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖を含んでなる、［４９］に記載の抗体。
［５１］
配列番号１９においてアミノ酸番号２０乃至４６４に記載のアミノ酸配列からなる重鎖及び配列番号２０においてアミノ酸番号２１乃至２３３に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖を含んでなる、［４９］に記載の抗体。
【発明の効果】
【００３８】
本発明により、エキサテカンの誘導体を構成要素とする抗体−薬物コンジュゲートの薬物部位を認識する蛋白質、及び該蛋白質を用いた、上記の抗体−薬物コンジュゲートを投与された哺乳動物における、該抗体−薬物コンジュゲートの血漿中濃度を定量する方法及び組織分布を確認する方法が提供された。
【図面の簡単な説明】
【００３９】
【図１】マウス抗体１Ａ３重鎖のアミノ酸配列（配列番号１５）を示す。
【図２】マウス抗体１Ａ３軽鎖のアミノ酸配列（配列番号１６）を示す。
【図３】マウス抗体１Ａ３重鎖可変領域のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列（配列番号１７）を示す。
【図４】マウス抗体１Ａ３軽鎖可変領域のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列（配列番号１８）を示す。
【図５】ウサギキメラ化抗体１Ａ３重鎖のアミノ酸配列（配列番号１９）を示す。
【図６】ウサギキメラ化抗体１Ａ３軽鎖のアミノ酸配列（配列番号２０）を示す。
【図７】抗ＨＥＲ２抗体重鎖のアミノ酸配列（配列番号２１）を示す。
【図８】抗ＨＥＲ２抗体軽鎖のアミノ酸配列（配列番号２２）を示す。
【図９】抗ＨＥＲ３抗体重鎖のアミノ酸配列（配列番号２３）を示す。
【図１０】抗ＨＥＲ３抗体軽鎖のアミノ酸配列（配列番号２４）を示す。
【図１１】抗ＴＲＯＰ２抗体重鎖のアミノ酸配列（配列番号２５）を示す。
【図１２】抗ＴＲＯＰ２抗体軽鎖のアミノ酸配列（配列番号２６）を示す。
【図１３】抗Ｂ７−Ｈ３抗体重鎖のアミノ酸配列（配列番号２７）を示す。
【図１４】抗Ｂ７−Ｈ３抗体軽鎖のアミノ酸配列（配列番号２８）を示す。
【図１５】マウス抗体１Ａ３をキャプチャー試薬とした場合における、ＨＥＲ２−ＡＤＣ（Ｉ）（ＤＡＲ８）及びＨＥＲ２−ＡＤＣ（Ｉ）（ＤＡＲ４）の検量線を示す。
【図１６】マウス抗体８Ｂ２をキャプチャー試薬とした場合における、ＨＥＲ２−ＡＤＣ（Ｉ）（ＤＡＲ８）及びＨＥＲ２−ＡＤＣ（Ｉ）（ＤＡＲ４）の検量線を示す。
【図１７】マウス抗体１１Ｂ１をキャプチャー試薬とした場合における、ＨＥＲ２−ＡＤＣ（Ｉ）（ＤＡＲ８）及びＨＥＲ２−ＡＤＣ（Ｉ）（ＤＡＲ４）の検量線を示す。
【図１８】マウス抗体１Ａ３を検出試薬とした場合における、ＨＥＲ２−ＡＤＣ（Ｉ）（ＤＡＲ８）及びＨＥＲ２−ＡＤＣ（Ｉ）（ＤＡＲ４）の検量線を示す。
【図１９】マウス抗体８Ｂ２を検出試薬とした場合における、ＨＥＲ２−ＡＤＣ（Ｉ）（ＤＡＲ８）及びＨＥＲ２−ＡＤＣ（Ｉ）（ＤＡＲ４）の検量線を示す。
【図２０】マウス抗体１１Ｂ１を検出試薬とした場合における、ＨＥＲ２−ＡＤＣ（Ｉ）（ＤＡＲ８）及びＨＥＲ２−ＡＤＣ（Ｉ）（ＤＡＲ４）の検量線を示す。
【図２１】マウス抗体１Ａ３を検出試薬とした場合における、Ｂ７−Ｈ３−ＡＤＣ（Ｉ）（ＤＡＲ８）及びＢ７−Ｈ３−ＡＤＣ（Ｉ）（ＤＡＲ４）の検量線を示す。
【００４０】
【図２２】マウス抗体８Ｂ２を検出試薬とした場合における、Ｂ７−Ｈ３−ＡＤＣ（Ｉ）（ＤＡＲ８）及びＢ７−Ｈ３−ＡＤＣ（Ｉ）（ＤＡＲ４）の検量線を示す。
【図２３】マウス抗体１１Ｂ１を検出試薬とした場合における、Ｂ７−Ｈ３−ＡＤＣ（Ｉ）（ＤＡＲ８）及びＢ７−Ｈ３−ＡＤＣ（Ｉ）（ＤＡＲ４）の検量線を示す。
【図２４】ＨＥＲ２−ＡＤＣ（Ｉ）のマウス血漿中濃度測定のための検量線を示す。
【図２５】ＨＥＲ３−ＡＤＣ（Ｉ）のサル血漿中濃度測定のための検量線を示す。
【図２６】ＴＲＯＰ２−ＡＤＣ（Ｉ）のサル血漿中濃度測定のための検量線を示す。
【図２７】Ｂ７−Ｈ３−ＡＤＣ（Ｉ）のサル血漿中濃度測定のための検量線を示す。
【図２８】ヒト軽鎖シグナル配列及びヒトκ鎖定常領域のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列（配列番号２９）を示す。
【図２９】ウサギキメラ化抗体１Ａ３重鎖のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列（配列番号３０）を示す。
【図３０】ウサギキメラ化抗体１Ａ３軽鎖のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列（配列番号３１）を示す。
【図３１】抗ＧＰＲ２０抗体重鎖のアミノ酸配列（配列番号３２）を示す。
【図３２】抗ＧＰＲ２０抗体軽鎖のアミノ酸配列（配列番号３３）を示す。
【図３３】抗ＣＤＨ６抗体重鎖のアミノ酸配列（配列番号３４）を示す。
【図３４】抗ＣＤＨ６抗体軽鎖のアミノ酸配列（配列番号３５）を示す。
【図３５】ウサギキメラ化抗体１Ａ３を用いた免疫染色像を示す。ヒト頭頸部がん細胞株ＦａＤｕを皮下移植したヌードマウスにＴＲＯＰ２−ＡＤＣ（Ｉ）又はＡｎｔｉ−ＴＲＯＰ２  Ａｂを投与した場合の染色像を比較している。
【図３６】ウサギキメラ化抗体１Ａ３を用いた免疫染色像を示す。ＧＰＲ２０過剰発現ヒト消化管間質腫瘍細胞株ＧＩＳＴ−Ｔ１／ＧＰＲ２０を皮下移植したヌードマウスにＧＰＲ２０−ＡＤＣ（Ｉ）を投与した場合、又は未投与の場合の染色像を比較している。
【図３７】マウス抗体１Ａ３を用いた免疫染色像を示す。淡明細胞型腎細胞癌患者より採取された腫瘍組織を皮下移植したヌードマウスにＣＤＨ６−ＡＤＣ（Ｉ）を投与した場合、又は未投与の場合の染色像を比較している。
【図３８】マウス抗体１Ａ３を用いた免疫染色像を示す。淡明細胞型腎細胞癌患者より採取された腫瘍組織を皮下移植したヌードマウスにＣＤＨ６−ＡＤＣ（Ｉ）を投与し、マウス抗体１Ａ３を化合物（２）又はＳＮ−３８とあらかじめ混合した後、免疫染色に用いた場合、又は、そうでない場合の染色像を比較している。
【図３９】ＧＰＲ２０−ＡＤＣ（Ｉ）のマウス血漿中濃度測定のための検量線を示す。
【図４０】ＨＥＲ２−ＡＤＣ（Ｉ）のヒト血清中濃度測定のための検量線を示す。
【図４１】マウス抗体１Ａ３のＨＥＲ２−ＡＤＣ（Ｉ）への認識に対する競合阻害用化合物の阻害率を示す。
【発明を実施するための形態】
【００４１】
以下、本発明を実施するための好適な形態について説明する。なお、以下に説明する実施形態は、本発明の代表的な実施形態の一例を示したものであり、これによって本発明の範囲が狭く解釈されることはない。
【００４２】
１．定義
本発明において、「蛋白質」とは、「ペプチド」又は「ポリペプチド」と同義である。
【００４３】
本発明の蛋白質は、好適には、抗体又は抗体の抗原結合断片であるが、抗体と同様に抗原を認識する機能を有する蛋白質であれば、抗体及び抗体の抗原結合断片以外の蛋白質（抗体オルタナティブ）であっても良い。抗体オルタナティブとしては、例えば、Ｆｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎ、ＰｒｏｔｅｉｎＡ、Ｌｉｐｏｃａｌｉｎ、ＴｒｘＡ、Ａ−ｄｏｍａｉｎ、Ａｎｋｙｒｉｎ  ｒｅｐｅａｔ、ＡＰＰＩ、Ｒａｓ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ＡＦ−６等のスキャフォールド蛋白を挙げることができる（Kasper Binz H. et al., Current Opinion in Biotechnology 2005, 16:459-469、Kasper Binz H. et al., Nature Biotechnology 23(10) 2005, 1257-1268、Skerra A., Current Opinion in Biotechnology 2007, 18:295-304、Nygren P., FEBS Journal 275 (2008) 2668-2676、Gronwall C. et al., Journal of Biotechnology 140 (2009) 254-269）。
【００４４】
本発明において、「抗体」とは、特定の抗原を認識する機能を有する糖蛋白質を示す。抗体の具体例としては、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、ウサギ化抗体、ヒト化抗体、及びヒト抗体等を挙げることができる。
【００４５】
本発明において、「抗原」を「免疫原」の意味に用いることがある。
【００４６】
本発明において、「抗体の抗原結合断片」とは、抗原を認識する機能を保持した抗体の部分断片を意味し、「抗体の機能性断片」と同義である。抗体の抗原結合断片としては、例えば、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ’、一本鎖免疫グロブリン等を挙げることができるが、それらに限定されるものではない。かかる抗体の機能性断片は、抗体の全長分子をパパイン、ペプシン等の酵素で処理することによって得られたものに加え、組換え遺伝子を用いて適当な宿主細胞において産生された組換え蛋白質であってもよい。
【００４７】
本発明の蛋白質が抗原を「認識する」とは、本発明の蛋白質が分子間力（静電相互作用、ファンデルワールス力、水素結合等）により抗原と結合することを意味する。本発明の蛋白質が抗原を「認識する」ことは、例えば、種々の免疫化学的手法により生じるシグナルを検出することにより確認することができる。
【００４８】
本発明の蛋白質の抗原に対する「認識性」が異なる、とは、本発明の蛋白質の抗原に対する結合の強さや性質が実質的に異なることを意味する。本発明の蛋白質の抗原に対する「認識性」が異なるか否かは、例えば、種々の免疫化学的手法により生じるシグナルの強さを比較することや、抗原の濃度とシグナルの強さの相関関係を表した検量線を比較することにより確認することがきできる。
【００４９】
本発明の蛋白質が認識する「部位」とは、本発明の蛋白質が認識する対象の中の特定の部分構造を意味する。本発明の蛋白質が認識する対象を「抗原」と呼び、本発明の蛋白質が認識する特定の部位を「エピトープ」と呼ぶこともある。
【００５０】
抗体の重鎖及び軽鎖にはそれぞれ３箇所の相補性決定領域（ＣＤＲ：Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ  ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ  ｒｅｇｉｏｎ）があることが知られている。相補性決定領域は、超可変領域（ｈｙｐｅｒｖａｒｉａｂｌｅ  ｄｏｍａｉｎ）とも呼ばれ、抗体の重鎖及び軽鎖の可変領域内にあって、一次構造の変異性が特に高い部位であり、重鎖及び軽鎖のポリペプチド鎖の一次構造上において、通常、それぞれ３ヶ所に分離している。本発明においては、抗体の相補性決定領域について、重鎖の相補性決定領域を重鎖アミノ酸配列のアミノ末端側からＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、ＣＤＲＨ３と表記し、軽鎖の相補性決定領域を軽鎖アミノ酸配列のアミノ末端側からＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、ＣＤＲＬ３と表記する。これらの部位は立体構造の上で相互に近接し、抗原に対する特異性を決定している。
【００５１】
本発明において、「遺伝子」とは、蛋白質のアミノ酸をコードするヌクレオチド配列が含まれるヌクレオチドまたはその相補鎖を意味し、例えば、蛋白質のアミノ酸をコードするヌクレオチド配列が含まれるヌクレオチドまたはその相補鎖であるポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ＤＮＡ、ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ、ｃＲＮＡ等は「遺伝子」の意味に含まれる。かかる遺伝子は一本鎖、二本鎖または三本鎖以上のヌクレオチドであり、ＤＮＡ鎖とＲＮＡ鎖の会合体、一本のヌクレオチド鎖上にリボヌクレオチド（ＲＮＡ）とデオキシリボヌクレオチド（ＤＮＡ）が混在するもの及びそのようなヌクレオチド鎖を含む二本鎖または三本鎖以上のヌクレオチドも「遺伝子」の意味に含まれる。
【００５２】
本発明において、「ヌクレオチド」と「核酸」は同義であり、例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、プローブ、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、プライマー等も「ヌクレオチド」の意味に含まれる。かかるヌクレオチドは一本鎖、二本鎖または三本以上の鎖からなるヌクレオチドであり、ＤＮＡ鎖とＲＮＡ鎖の会合体、一本のヌクレオチド鎖上にリボヌクレオチド（ＲＮＡ）とデオキシリボヌクレオチド（ＤＮＡ）が混在するもの及びそのようなヌクレオチド鎖を含む二本鎖または三本以上の鎖の会合体も「ヌクレオチド」の意味に含まれる。
【００５３】
本発明において、「細胞」には、動物個体に由来する各種細胞、継代培養細胞、初代培養細胞、細胞株、組換え細胞及び微生物等も含まれる。
【００５４】
２．抗体−薬物コンジュゲート
本発明において「抗体−薬物コンジュゲート」とは、抗体と薬物とが、リンカーを介して結合した結合体を意味する。
【００５５】
本発明において「薬物リンカー」とは、抗体−薬物コンジュゲートのうち、リンカー及び薬物からなる部分構造を意味する。
【００５６】
本発明の蛋白質は、式
【００５７】
【化１２】
2020022475.tif 000014
【００５８】
で示される薬物（以下、「化合物（１）」と呼ぶ）と、抗体とが、リンカーを介して結合した抗体−薬物コンジュゲート（以下、「本発明に係る抗体−薬物コンジュゲート」と呼ぶ）の、薬物部位を認識することを特徴とする。
【００５９】
化合物（１）は、エキサテカン（ＩＵＰＡＣ名：（１Ｓ，９Ｓ）−１−アミノ−９−エチル−５−フルオロ−１，２，３，９，１２，１５−ヘキサヒドロ−９−ヒドロキシ−４−メチル−１０Ｈ，１３Ｈ−ベンゾ［ｄｅ］ピラノ［３’，４’：６，７］インドリジノ［１，２−ｂ］キノリン−１０，１３−ジオン、（化学名：（１Ｓ，９Ｓ）−１−アミノ−９−エチル−５−フルオロ−２，３−ジヒドロ−９−ヒドロキシ−４−メチル−１Ｈ，１２Ｈ−ベンゾ［ｄｅ］ピラノ［３’，４’：６，７］インドリジノ［１，２−ｂ］キノリン−１０，１３（９Ｈ，１５Ｈ）−ジオンとして表すこともできる））と呼ばれる抗腫瘍薬であり、トポイソメラーゼＩ阻害活性を有することが知られている。
【００６０】
なお、本発明の蛋白質は、化合物（１）そのものを認識することもできる。
【００６１】
本発明に係る抗体−薬物コンジュゲートにおける抗体は、特に制限はないが、例えば、抗ＨＥＲ２抗体、抗ＨＥＲ３抗体、抗ＴＲＯＰ２抗体、抗Ｂ７−Ｈ３抗体、抗ＣＤ３抗体、抗ＣＤ３０抗体、抗ＣＤ３３抗体、抗ＣＤ３７抗体、抗ＣＤ５６抗体、抗ＣＤ９８抗体、抗ＤＲ５抗体、抗ＥＧＦＲ抗体、抗ＥＰＨＡ２抗体、抗ＦＧＦＲ２抗体、抗ＦＧＦＲ４抗体、抗ＦＯＬＲ１抗体、抗ＶＥＧＦ抗体、抗ＣＤ２０抗体、抗ＣＤ２２抗体、抗ＣＤ７０抗体、抗ＰＳＭＡ抗体、抗ＣＥＡ抗体、抗Ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎ抗体、抗Ａ３３抗体、抗ＣａｎＡｇ抗体、抗Ｃｒｉｐｔｏ抗体、抗Ｇ２５０抗体、抗ＭＵＣ１抗体、抗ＧＰＮＭＢ抗体、抗Ｉｎｔｅｇｒｉｎ抗体、抗Ｔｅｎａｓｃｉｎ−Ｃ抗体、抗ＳＬＣ４４Ａ４抗体、抗ＧＰＲ２０抗体、及び抗ＣＤＨ６抗体を挙げることができ、好適には、抗ＨＥＲ２抗体、抗ＨＥＲ３抗体、抗ＴＲＯＰ２抗体、抗Ｂ７−Ｈ３抗体、抗ＧＰＲ２０抗体、及び抗ＣＤＨ６抗体を挙げることができる。
【００６２】
本発明において、「抗ＨＥＲ２抗体」とは、ＨＥＲ２（Ｈｕｍａｎ  Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  Ｔｙｐｅ  ２；  ＥｒｂＢ−２）に特異的に結合し、好ましくは、ＨＥＲ２と結合することによってＨＥＲ２発現細胞に内在化する活性を有する抗体を示す。
【００６３】
抗ＨＥＲ２抗体としては、例えば、トラスツズマブ（Ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ）（米国特許第５８２１３３７号）、ペルツズマブ（Ｐｅｒｔｕｚｕｍａｂ）（国際公開第０１／００２４５号）を挙げることができ、好適にはトラスツズマブを挙げることができる。
【００６４】
本発明において、「抗ＨＥＲ３抗体」とは、ＨＥＲ３（Ｈｕｍａｎ  Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  Ｔｙｐｅ  ３；  ＥｒｂＢ−３）に特異的に結合し、好ましくは、ＨＥＲ３と結合することによってＨＥＲ３発現細胞に内在化する活性を有する抗体を示す。
【００６５】
抗ＨＥＲ３抗体としては、例えば、パトリツマブ（Ｐａｔｒｉｔｕｍａｂ；  Ｕ３−１２８７）、Ｕ１−５９（国際公開第２００７／０７７０２８号）、ＭＭ−１２１（Ｓｅｒｉｂａｎｔｕｍａｂ）、国際公開２００８／１００６２４号記載の抗ＥＲＢＢ３抗体、ＲＧ−７１１６（Ｌｕｍｒｅｔｕｚｕｍａｂ）、及びＬＪＭ−７１６（Ｅｌｇｅｍｔｕｍａｂ）を挙げることができ、好適には、パトリツマブ、及びＵ１−５９を挙げることができる。
【００６６】
本発明において、「抗ＴＲＯＰ２抗体」とは、ＴＲＯＰ２（ＴＡＣＳＴＤ２：Ｔｕｍｏｒ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｃａｌｃｉｕｍ  ｓｉｇｎａｌ  ｔｒａｎｓｄｕｃｅｒ  ２；  ＥＧＰ−１）に特異的に結合し、好ましくは、ＴＲＯＰ２と結合することによってＴＲＯＰ２発現細胞に内在化する活性を有する抗体を示す。
【００６７】
抗ＴＲＯＰ２抗体としては、例えば、ｈＴＩＮＡ１−Ｈ１Ｌ１（国際公開第２０１５／０９８０９９号）を挙げることができる。
【００６８】
本発明において、「抗Ｂ７−Ｈ３抗体」とは、Ｂ７−Ｈ３（Ｂ  ｃｅｌｌ  ａｎｔｉｇｅｎ  ＃７  ｈｏｍｏｌｏｇ  ３；  ＰＤ−Ｌ３；  ＣＤ２７６）に特異的に結合し、好ましくは、Ｂ７−Ｈ３と結合することによってＢ７−Ｈ３発現細胞に内在化する活性を有する抗体を示す。
【００６９】
抗Ｂ７−Ｈ３抗体としては、例えば、Ｍ３０−Ｈ１−Ｌ４（国際公開第２０１４／０５７６８７号）を挙げることができる。
【００７０】
本発明において、「抗ＧＰＲ２０抗体」とは、ＧＰＲ２０（Ｇ  Ｐｒｏｔｅｉｎ−ｃｏｕｐｌｅｄ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ２０）に特異的に結合し、好ましくは、ＧＰＲ２０と結合することによってＧＰＲ２０発現細胞に内在化する活性を有する抗体を示す。
【００７１】
抗ＧＰＲ２０抗体としては、例えば、ｈ０４６−Ｈ４ｅ／Ｌ７（国際公開第２０１８／１３５５０１号）を挙げることができる。
【００７２】
本発明において、「抗ＣＤＨ６抗体」とは、ＣＤＨ６（Ｃａｄｈｅｒｉｎ−６）に特異的に結合し、好ましくは、ＣＤＨ６と結合することによってＣＤＨ６発現細胞に内在化する活性を有する抗体を示す。
【００７３】
抗ＣＤＨ６抗体としては、例えば、Ｈ０１Ｌ０２（国際公開第２０１８／２１２１３６号）を挙げることができる。
【００７４】
本発明の蛋白質は、好適には、
式
【００７５】
【化１３】
2020022475.tif 000015
【００７６】
（式中、Ａは抗体との結合位置を示し、該薬物リンカーは抗体とチオエーテル結合によって結合している）
で示される薬物リンカーを有する抗体−薬物コンジュゲート（以下、「抗体−薬物コンジュゲート（Ｉ）」と呼ぶ）、
式
【００７７】
【化１４】
2020022475.tif 000016
【００７８】
（式中、Ａは抗体との結合位置を示し、該薬物リンカーは抗体とチオエーテル結合によって結合している）
で示される薬物リンカーを有する抗体−薬物コンジュゲート（以下、「抗体−薬物コンジュゲート（ＩＩ）」と呼ぶ）、又は、
式
【００７９】
【化１５】
2020022475.tif 000017
【００８０】
（式中、Ａは抗体との結合位置を示し、該薬物リンカーは抗体とチオエーテル結合によって結合している）
で示される薬物リンカーを有する抗体−薬物コンジュゲート（以下、「抗体−薬物コンジュゲート（ＩＩＩ）」と呼ぶ）の、薬物部位を特異的に認識することを特徴とする。
【００８１】
抗体−薬物コンジュゲート（Ｉ）〜（ＩＩＩ）の薬物リンカーは、抗体の鎖間のジスルフィド結合部位（２箇所の重鎖−重鎖間、及び２箇所の重鎖−軽鎖間）において生じたチオール基（言い換えれば、システイン残基の硫黄原子）に結合している。
【００８２】
本発明の蛋白質は、より好適には、抗体−薬物コンジュゲート（Ｉ）の薬物部位を特異的に認識することを特徴とする。
【００８３】
抗体−薬物コンジュゲート（Ｉ）は、次式で示すこともできる。
【００８４】
【化１６】
2020022475.tif 000018
【００８５】
ここで、薬物リンカーは抗体とチオエーテル結合によって結合している。また、ｎはいわゆる平均薬物結合数（ＤＡＲ；  Ｄｒｕｇ−ｔｏ−Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｒａｔｉｏ）と同義であり、１抗体あたりの薬物リンカーの平均結合数を示す。
【００８６】
なお、本発明に係る抗体−薬物コンジュゲートの抗体一分子あたりの平均薬物結合数の算出は、例えば、２８０ｎｍ及び３７０ｎｍの二波長における抗体−薬物コンジュゲートとそのコンジュゲーション前駆体のＵＶ吸光度を測定することにより算出する方法（ＵＶ法）や、抗体−薬物コンジュゲートを還元剤で処理し得られた各フラグメントをＨＰＬＣ測定により定量し算出する方法（ＨＰＬＣ法）により行うことができる。
【００８７】
抗体−薬物コンジュゲート（Ｉ）は、がん細胞内に移行した後にリンカー部分が切断され、
式
【００８８】
【化１７】
2020022475.tif 000019
【００８９】
で表される化合物（以下、「化合物（２）」と呼ぶ）を遊離する。
【００９０】
化合物（２）は、本発明で使用される抗体−薬物コンジュゲートのリンカー部分が切断されることにより生じると考えられる、
式
【００９１】
【化１８】
2020022475.tif 000020
【００９２】
で表される化合物（以下、「化合物（３）」と呼ぶ）のアミナール構造が分解することにより生じると考えられる。
【００９３】
化合物（２）は、抗体−薬物コンジュゲート（Ｉ）の抗腫瘍活性の本体であると考えられ、トポイソメラーゼＩ阻害作用を有することが確認されている（Ogitani Y. et al., Clinical Cancer Research, 2016, Oct 15;22(20):5097-5108, Epub 2016 Mar 29）。
【００９４】
なお、本発明の蛋白質は、抗体−薬物コンジュゲート（Ｉ）から遊離した化合物（２）そのものを認識することもできる。
【００９５】
抗体−薬物コンジュゲート（ＩＩ）は、次式で示すこともできる。
【００９６】
【化１９】
2020022475.tif 000021
【００９７】
ここで、薬物リンカーは抗体とチオエーテル結合によって結合している。また、ｎはＤＡＲと同義であり、１抗体あたりの薬物リンカーの平均結合数を示す。
【００９８】
抗体−薬物コンジュゲート（ＩＩ）は、がん細胞内に移行した後にリンカー部分が切断され、
式
【００９９】
【化２０】
2020022475.tif 000022
【０１００】
で表される化合物（以下、「化合物（４）」と呼ぶ）を遊離する。
【０１０１】
なお、本発明の蛋白質は、抗体−薬物コンジュゲート（ＩＩ）から遊離した化合物（４）そのものを認識することもできる。
【０１０２】
抗体−薬物コンジュゲート（ＩＩＩ）は、次式で示すこともできる。
【０１０３】
【化２１】
2020022475.tif 000023
【０１０４】
ここで、薬物リンカーは抗体とチオエーテル結合によって結合している。また、ｎはＤＡＲと同義であり、１抗体あたりの薬物リンカーの平均結合数を示す。
【０１０５】
抗体−薬物コンジュゲート（ＩＩＩ）は、がん細胞内に移行した後にリンカー部分が切断され、
式
【０１０６】
【化２２】
2020022475.tif 000024
【０１０７】
で表される化合物（以下、「化合物（５）」と呼ぶ）を遊離する。
【０１０８】
なお、本発明の蛋白質は、抗体−薬物コンジュゲート（ＩＩＩ）から遊離した化合物（５）そのものを認識することもできる。
【０１０９】
本発明において、「抗ＨＥＲ２抗体−薬物コンジュゲート」とは、本発明に係る抗体−薬物コンジュゲートにおける抗体が抗ＨＥＲ２抗体である抗体−薬物コンジュゲートを示す。
【０１１０】
抗ＨＥＲ２抗体は、好適には、配列番号２１においてアミノ酸番号１乃至４４９に記載のアミノ酸配列からなる重鎖及び配列番号２２においてアミノ酸番号１乃至２１４に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖を含んでなる抗体、又は、配列番号２１に記載のアミノ酸配列からなる重鎖及び配列番号２２に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖を含んでなる抗体である。
【０１１１】
抗ＨＥＲ２抗体−薬物コンジュゲートの１抗体あたりの薬物リンカーの平均結合数は、好適には２から８であり、より好適には３から８であり、更により好適には７から８であり、更により好適には７．５から８であり、更により好適には約８である。
【０１１２】
抗ＨＥＲ２抗体−薬物コンジュゲートは、国際公開第２０１５／１１５０９１号等の記載を参考に製造することができる。
【０１１３】
本発明において、「抗ＨＥＲ３抗体−薬物コンジュゲート」とは、本発明に係る抗体−薬物コンジュゲートにおける抗体が抗ＨＥＲ３抗体である抗体−薬物コンジュゲートを示す。
【０１１４】
抗ＨＥＲ３抗体は、好適には、配列番号２３においてアミノ酸番号２６乃至３５に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ１、配列番号２３においてアミノ酸番号５０乃至６５に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ２、及び配列番号２３においてアミノ酸番号９８乃至１０６に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ３を含む重鎖、並びに、配列番号２４においてアミノ酸番号２４乃至３９に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ１、配列番号２４においてアミノ酸番号５６乃至６２に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ２、及び配列番号２４においてアミノ酸番号９５乃至１０３に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ３を含む軽鎖、を含む抗体であり、
より好適には、配列番号２３においてアミノ酸番号１乃至１１７に記載のアミノ酸配列からなる重鎖可変領域を含む重鎖、及び配列番号２４においてアミノ酸番号１乃至１１３に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む軽鎖、を含む抗体であり、
更により好適には、配列番号２３に記載のアミノ酸配列からなる重鎖及び配列番号２４に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖を含んでなる抗体、又は、該抗体の重鎖カルボキシル末端のリシン残基が欠失している抗体である。
【０１１５】
抗ＨＥＲ３抗体−薬物コンジュゲートの１抗体あたりの薬物リンカーの平均結合数は、好適には２から８であり、より好適には３から８であり、更により好適には７から８であり、更により好適には７．５から８であり、更により好適には約８である。
【０１１６】
抗ＨＥＲ３抗体−薬物コンジュゲートは、国際公開第２０１５／１５５９９８号等の記載を参考に製造することができる。
【０１１７】
本発明において、「抗ＴＲＯＰ２抗体−薬物コンジュゲート」とは、本発明に係る抗体−薬物コンジュゲートにおける抗体が抗ＴＲＯＰ２抗体である抗体−薬物コンジュゲートを示す。
【０１１８】
抗ＴＲＯＰ２抗体は、好適には、配列番号２５においてアミノ酸番号５０乃至５４に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ１、配列番号２５においてアミノ酸番号６９乃至８５に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ２、及び配列番号２５においてアミノ酸番号１１８乃至１２９に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ３を含む重鎖、並びに、配列番号２６においてアミノ酸番号４４乃至５４に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ１、配列番号２６においてアミノ酸番号７０乃至７６に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ２、及び配列番号２６においてアミノ酸番号１０９乃至１１７に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ３を含む軽鎖、を含む抗体であり、
より好適には、配列番号２５においてアミノ酸番号２０乃至１４０に記載のアミノ酸配列からなる重鎖可変領域を含む重鎖、及び配列番号２６においてアミノ酸番号２１乃至１２９に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む軽鎖、を含む抗体であり、
更により好適には、配列番号２５においてアミノ酸番号２０乃至４７０に記載のアミノ酸配列からなる重鎖及び配列番号２６においてアミノ酸番号２１乃至２３４に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖を含んでなる抗体、又は、該抗体の重鎖カルボキシル末端のリシン残基が欠失している抗体である。
【０１１９】
抗ＴＲＯＰ２抗体−薬物コンジュゲートの１抗体あたりの薬物リンカーの平均結合数は、好適には２から８であり、より好適には３から５であり、更により好適には３．５から４．５であり、更により好適には約４である。
【０１２０】
抗ＴＲＯＰ２抗体−薬物コンジュゲートは、国際公開第２０１５／０９８０９９号等の記載を参考に製造することができる。
【０１２１】
本発明において、「抗Ｂ７−Ｈ３抗体−薬物コンジュゲート」とは、本発明に係る抗体−薬物コンジュゲートにおける抗体が抗Ｂ７−Ｈ３抗体である抗体−薬物コンジュゲートを示す。
【０１２２】
抗Ｂ７−Ｈ３抗体は、好適には、配列番号２７においてアミノ酸番号５０乃至５４に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ１、配列番号２７においてアミノ酸番号６９乃至８５に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ２、及び配列番号２７においてアミノ酸番号１１８乃至１３０に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ３を含む重鎖、並びに、配列番号２８においてアミノ酸番号４４乃至５３に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ１、配列番号２８においてアミノ酸番号６９乃至７５に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ２、及び配列番号２８においてアミノ酸番号１０８乃至１１６に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ３を含む軽鎖、を含む抗体であり、
より好適には、配列番号２７においてアミノ酸番号２０乃至１４１に記載のアミノ酸配列からなる重鎖可変領域を含む重鎖、及び配列番号２８においてアミノ酸番号２１乃至１２８に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む軽鎖、を含む抗体であり、
更により好適には、配列番号２７においてアミノ酸番号２０乃至４７１に記載のアミノ酸配列からなる重鎖及び配列番号２８においてアミノ酸番号２１乃至２３３に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖を含んでなる抗体、又は、該抗体の重鎖カルボキシル末端のリシン残基が欠失している抗体である。
【０１２３】
抗Ｂ７−Ｈ３抗体−薬物コンジュゲートの１抗体あたりの薬物リンカーの平均結合数は、好適には２から８であり、より好適には３から５であり、更により好適には３．５から４．５であり、更により好適には約４である。
【０１２４】
抗Ｂ７−Ｈ３抗体−薬物コンジュゲートは、国際公開第２０１４／０５７６８７号等の記載を参考に製造することができる。
【０１２５】
本発明において、「抗ＧＰＲ２０抗体−薬物コンジュゲート」とは、本発明に係る抗体−薬物コンジュゲートにおける抗体が抗ＧＰＲ２０抗体である抗体−薬物コンジュゲートを示す。
【０１２６】
抗ＧＰＲ２０抗体は、好適には、配列番号３２においてアミノ酸番号４５乃至５４に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ１、配列番号３２においてアミノ酸番号６９乃至７８に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ２、及び配列番号３２においてアミノ酸番号１１８乃至１３１に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ３を含む重鎖、並びに、配列番号３３においてアミノ酸番号４４乃至５４に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ１、配列番号３３においてアミノ酸番号７０乃至７６に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ２、及び配列番号３３においてアミノ酸番号１０９乃至１１７に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ３を含む軽鎖、を含む抗体であり、
より好適には、配列番号３２においてアミノ酸番号２０乃至１４２に記載のアミノ酸配列からなる重鎖可変領域を含む重鎖、及び配列番号３３においてアミノ酸番号２１乃至１２９に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む軽鎖、を含む抗体であり、
更により好適には、配列番号３２においてアミノ酸番号２０乃至４７２に記載のアミノ酸配列からなる重鎖及び配列番号３３においてアミノ酸番号２１乃至２３４に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖を含んでなる抗体、又は、該抗体の重鎖カルボキシル末端のリシン残基が欠失している抗体である。
【０１２７】
抗ＧＰＲ２０抗体−薬物コンジュゲートの１抗体あたりの薬物リンカーの平均結合数は、好適には２から８であり、より好適には３から８であり、更により好適には７から８であり、更により好適には７．５から８であり、更により好適には約８である。
【０１２８】
抗ＧＰＲ２０抗体−薬物コンジュゲートは、国際公開第２０１８／１３５５０１号等の記載を参考に製造することができる。
【０１２９】
本発明において、「抗ＣＤＨ６抗体−薬物コンジュゲート」とは、本発明に係る抗体−薬物コンジュゲートにおける抗体が抗ＣＤＨ６抗体である抗体−薬物コンジュゲートを示す。
【０１３０】
抗ＣＤＨ６抗体は、好適には、配列番号３４においてアミノ酸番号４５乃至５４に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ１、配列番号３４においてアミノ酸番号６９乃至７８に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ２、及び配列番号３４においてアミノ酸番号１１８乃至１３０に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ３を含む重鎖、並びに、配列番号３５においてアミノ酸番号４４乃至５４に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ１、配列番号３５においてアミノ酸番号７０乃至７６に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ２、及び配列番号３５においてアミノ酸番号１０９乃至１１６に記載のアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ３を含む軽鎖、を含む抗体であり、
より好適には、配列番号３４においてアミノ酸番号２０乃至１４１に記載のアミノ酸配列からなる重鎖可変領域を含む重鎖、及び配列番号３５においてアミノ酸番号２１乃至１２８に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む軽鎖、を含む抗体であり、
更により好適には、配列番号３４においてアミノ酸番号２０乃至４７１に記載のアミノ酸配列からなる重鎖及び配列番号３５においてアミノ酸番号２１乃至２３３に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖を含んでなる抗体、又は、該抗体の重鎖カルボキシル末端のリシン残基が欠失している抗体である。
【０１３１】
抗ＣＤＨ６抗体−薬物コンジュゲートの１抗体あたりの薬物リンカーの平均結合数は、好適には２から８であり、より好適には３から８であり、更により好適には７から８であり、更により好適には７．５から８であり、更により好適には約８である。
【０１３２】
抗ＣＤＨ６抗体−薬物コンジュゲートは、国際公開第２０１８／２１２１３６号等の記載を参考に製造することができる。
【０１３３】
３．本発明の蛋白質の製造
本発明の蛋白質は、好適には抗体（以下、「本発明の抗体」と呼ぶ）として取得することができる。本発明の抗体は、化合物（１）又はその誘導体とキャリア蛋白とがリンカーを介して結合した抗原蛋白質を動物に免疫し、生体内に産生される抗体を採取、精製することによって得ることができる。
【０１３４】
上記の抗原蛋白質は、例えば、
式
【０１３５】
【化２３】
2020022475.tif 000025
【０１３６】
で表される化合物（以下、「化合物（６）と呼ぶ」）に、キャリア蛋白を付加したものを用いることができる。
【０１３７】
キャリア蛋白としては、低分子化合物やペプチドのような小さな抗原であっても免疫応答を誘発できるような蛋白質であれば特に限定はされないが、例えば、ウシサイログロブリン、及びウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、及びＫｅｙｈｏｌｅ  ｌｉｍｐｅｔ  ｈｅｍｏｃｙａｎｉｎ（ＫＬＨ）を用いることができる。
【０１３８】
得られた抗血清は、陽性対照及び陰性対照を用いたＥＬＩＳＡ法により、所望の性質を有するものを選別することができる。
【０１３９】
陽性対照としては、例えば、化合物（１）、化合物（２）、化合物（６）を挙げることができ、これらの陽性対照による高いｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ効果が認められる抗血清を選別することができる。
【０１４０】
なお、化合物（１）が有するラクトン環は、酸性水性溶媒中（例えばｐＨ３程度）では閉環体に平衡が偏り、塩基性水性溶媒中（例えばｐＨ１０程度）では開環体に平衡が偏ることが知られているが、ラクトン環の開閉に関係なく化合物（１）の基本骨格そのものを認識する抗体を選別する観点から、ラクトン環が還元された化合物、例えば、
式
【０１４１】
【化２４】
2020022475.tif 000026
【０１４２】
で表される化合物（以下、「化合物（７）と呼ぶ」）も陽性対照として用いることができ、この陽性対照による高いｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ効果が認められる抗血清を選別することができる。ただし、化合物（１）と化合物（７）を同程度に認識する抗体を選別する観点から、化合物（１）よりも化合物（７）への認識性が特に高い抗体は除外することが好ましい。
【０１４３】
さらに、本発明に係る抗体−薬物コンジュゲート（好適には、抗体−薬物コンジュゲート（Ｉ）、（ＩＩ）、及び（ＩＩＩ））も陽性対照として用いることができ、これらの陽性対照による高いｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ効果が認められる抗血清を選別することができる。
【０１４４】
一方、化合物（１）の基本骨格から離れた部分を認識する抗体を除外する観点から、例えば、リンカー付近の部分構造である、シクロヘキサン環からなる化合物である、
式
【０１４５】
【化２５】
2020022475.tif 000027
【０１４６】
で表される化合物（以下、「化合物（８）と呼ぶ」）を陰性対照として用いることができる。この陰性対照による高いｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ効果が認められる抗血清を除外することができる。
【０１４７】
以上のようにして選別した抗血清をクローニングすることにより、本発明の抗体を産生する細胞を取得することができる。
【０１４８】
次に、公知の方法（例えば、Kohler and Milstein, Nature (1975)256,p.495-497、Kennet,R.ed., Monoclonal Antibodies, p.365-367, Plenum Press,N.Y.(1980)）に従って、本発明の抗体を産生する細胞とミエローマ細胞とを融合させることによりハイブリドーマを樹立し、モノクローナル抗体を得ることができる。このような方法の具体的な例は、国際公開第ＷＯ０９／４８０７２号パンフレット（２００９年４月１６日公開）及び第ＷＯ１０／１１７０１１号（２０１０年１０月１４日公開）パンフレットに記載されている。
【０１４９】
得られた抗体は、均一にまで精製することができる。抗体の分離、精製は通常の蛋白質で使用されている分離、精製方法を使用すればよい。例えばカラムクロマトグラフィー、フィルター濾過、限外濾過、塩析、透析、調製用ポリアクリルアミドゲル電気泳動、等電点電気泳動等を適宜選択、組み合わせれば、抗体を分離、精製することができる（Strategies for Protein Purification and Characterization:A Laboratory Course Manual, Daniel R. Marshak et al. eds., Cold Spring Harbor Laboratory Press(1996)、Antibodies: A Laboratory Manual. Ed Harlow and David Lane, Cold Spring Harbor Laboratory(1988)）が、これらに限定されるものではない。
【０１５０】
クロマトグラフィーとしては、アフィニティークロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、吸着クロマトグラフィー等を挙げることができる。これらのクロマトグラフィーは、ＨＰＬＣやＦＰＬＣ等の液体クロマトグラフィーを用いて行うことができる。アフィニティークロマトグラフィーに用いるカラムとしては、プロテインＡカラム、プロテインＧカラムを挙げることができる。例えばプロテインＡカラムとして、Ｈｙｐｅｒ  Ｄ，ＰＯＲＯＳ，Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆ．Ｆ．（ファルマシア）等を挙げることができる。また、抗原を固定化した担体を用いて、抗原への結合性を利用して抗体を精製することも可能である。
【０１５１】
さらに、本発明の抗体は、好適には、本発明に係る抗体−薬物コンジュゲートにおける１抗体あたりの薬物リンカーの平均結合数（ＤＡＲ）の違いによって該抗体−薬物コンジュゲートに対する認識性が実質的に異ならないことを特徴とする。このような性質を有する抗体であることは、例えば、高ＤＡＲ（ＤＡＲ８）の抗体−薬物コンジュゲートに対する検量線と、低ＤＡＲ（ＤＡＲ４）の抗体−薬物コンジュゲートに対する検量線を比較し、実質的に差異がないことにより確認することができる。
【０１５２】
このようにして取得された本発明の抗体の実例としては、マウス抗体１Ａ３を挙げることができる。マウス抗体１Ａ３の重鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号１５においてアミノ酸番号２０乃至１４１に記載のアミノ酸配列で示され、これをコードするヌクレオチド配列は配列番号１７においてヌクレオチド番号５８乃至４２３に記載のヌクレオチド配列で示される。マウス抗体１Ａ３の軽鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号１６においてアミノ酸番号２１乃至１２７に記載のアミノ酸配列で示され、これをコードするヌクレオチド配列は配列番号１８においてヌクレオチド番号６１乃至３８１に記載のヌクレオチド配列で示される。
【０１５３】
本発明の抗体は、マウス抗体１Ａ３に由来する６種全てのＣＤＲ配列を保持し、且つ、本発明に係る抗体−薬物コンジュゲートの薬物部位を特異的に認識する抗体であればよい。ＣＤＲ配列の決定には、数種の方法が知られており、例えば、Ａｂｍの定義、Ｃｈｏｔｈｉａの定義、Ｋａｂａｔの定義、及びＩｍｇｔ（登録商標）（Ｔｈｅ  ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ＩｍＭｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓ  ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ（登録商標））の定義を挙げることができる。本発明の抗体のＣＤＲ配列はいずれの方法によって定義されたものでもよい。
【０１５４】
Ａｂｍの定義によれば、本発明の抗体の重鎖可変領域は、配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ１（ＧＦＴＦＳＤＹＧＭＶ）、配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ２（ＹＩＳＳＧＳＳＡＩＹ）、及び配列番号３に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ３（ＰＰＲＹＤＶＹＳＡＷＦＡＹ）を保有しており、本発明の抗体の軽鎖可変領域は、配列番号４に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ１（ＫＡＳＱＤＶＧＳＡＶＶ）、配列番号５に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ２（ＷＡＳＴＲＨＴ）、及び配列番号６に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ３（ＱＱＹＳＳＹＰＶＴ）を保有している。
【０１５５】
Ｃｈｏｔｈｉａの定義によれば、本発明の抗体の重鎖可変領域は、配列番号７に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ１（ＧＦＴＦＳＤＹ）、配列番号８に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ２（ＳＳＧＳＳＡ）、及び配列番号３に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ３（ＰＰＲＹＤＶＹＳＡＷＦＡＹ）を保有しており、本発明の抗体の軽鎖可変領域は、配列番号４に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ１（ＫＡＳＱＤＶＧＳＡＶＶ）、配列番号５に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ２（ＷＡＳＴＲＨＴ）、及び配列番号６に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ３（ＱＱＹＳＳＹＰＶＴ）を保有している。
【０１５６】
Ｋａｂａｔの定義によれば、本発明の抗体の重鎖可変領域は、配列番号９に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ１（ＤＹＧＭＶ）、配列番号１０に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ２（ＹＩＳＳＧＳＳＡＩＹＹＡＤＴＶＫＧ）、及び配列番号３に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ３（ＰＰＲＹＤＶＹＳＡＷＦＡＹ）を保有しており、本発明の抗体の軽鎖可変領域は、配列番号４に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ１（ＫＡＳＱＤＶＧＳＡＶＶ）、配列番号５に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ２（ＷＡＳＴＲＨＴ）、及び配列番号６に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ３（ＱＱＹＳＳＹＰＶＴ）を保有している。
【０１５７】
Ｉｍｇｔ（登録商標）の定義によれば、本発明の抗体の重鎖可変領域は、配列番号１１に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ１（ＧＦＴＦＳＤＹＧ）、配列番号１２に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ２（ＩＳＳＧＳＳＡＩ）、及び配列番号１３に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ３（ＡＲＰＰＲＹＤＶＹＳＡＷＦＡＹ）を保有しており、本発明の抗体の軽鎖可変領域は、配列番号１４に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ１（ＱＤＶＧＳＡ）、ＷＡＳ（トリプトファン−アラニン−セリン）で示されるトリペプチドからなるＣＤＲＬ２、及び配列番号６に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ３（ＱＱＹＳＳＹＰＶＴ）を保有している。
【０１５８】
本発明の抗体には、上記のモノクローナル抗体に加え、異種抗原性を低下させること等を目的として人為的に改変した遺伝子組換え型抗体、例えば、キメラ（Ｃｈｉｍｅｒｉｃ）抗体、ヒト化（Ｈｕｍａｎｉｚｅｄ）抗体、又はウサギ化（Ｒａｂｂｉｔ  ｔｙｐｅ）抗体、マウス化抗体等も含まれる。これらの抗体は、既知の方法を用いて製造することができる。
【０１５９】
キメラ抗体としては、抗体の可変領域と定常領域が互いに異種である抗体、例えばマウス又はラット由来抗体の可変領域をヒト由来の定常領域に接合したキメラ抗体を挙げることができる（Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,81,6851-6855,(1984)参照）。また、他の例としてはマウス又はラット由来の抗体の可変領域をウサギ由来の定常領域に接合したキメラ抗体（ウサギキメラ化抗体）を挙げることができる。
【０１６０】
ウサギキメラ化抗体の更に具体的な例としてはマウス抗体１Ａ３由来の重鎖可変領域とウサギ抗体重鎖の定常領域を含むことからなる重鎖、並びに、マウス抗体１Ａ３抗体由来の軽鎖可変領域とウサギ抗体軽鎖の定常領域を含むことからなる軽鎖を含むことからなる抗体（ウサギキメラ化抗体１Ａ３）を挙げることができる。ウサギキメラ化抗体１Ａ３の重鎖は配列番号１９においてアミノ酸番号２０乃至４６４に記載のアミノ酸配列からなり、ウサギキメラ化抗体１Ａ３の軽鎖は配列番号２０においてアミノ酸番号２１乃至２３３に記載のアミノ酸配列からなる。
【０１６１】
がん研究の非臨床動物モデルとしてマウスが使用されることが多いが、マウス抗体を用いた場合、内因性のマウスＩｇＧとの競合を避けるために使用方法が限定的となってしまう。そこで、ウサギキメラ化抗体を用いることにより、マウス由来サンプル、ヒト由来サンプルの両者を同一プラットフォームで比較評価が可能となり、トランスレーショナル研究に有用となりえる。
【０１６２】
ヒト化抗体としては、相補性決定領域（ＣＤＲ；ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ  ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ  ｒｅｇｉｏｎ）のみをヒト由来の抗体に組み込んだ抗体（Nature(1986)321,p.522-525参照）、ＣＤＲの配列に加え一部のフレームワークのアミノ酸残基もヒト抗体に移植した抗体（国際公開第ＷＯ９０／０７８６１号パンフレット）を挙げることができる。ウサギ化抗体としては、相補性決定領域（ＣＤＲ；ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ  ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ  ｒｅｇｉｏｎ）のみをウサギ由来の抗体に組み込んだ抗体、ＣＤＲの配列に加え一部のフレームワークのアミノ酸残基もウサギ抗体に移植した抗体を挙げることができる。
【０１６３】
なお、哺乳類培養細胞で生産される抗体の重鎖のカルボキシル末端のリシン残基が欠失することが知られており（Journal of Chromatography A,705:129-134(1995)）、また、同じく重鎖カルボキシル末端のグリシン、リシンの２アミノ酸残基が欠失し、新たにカルボキシル末端に位置するプロリン残基がアミド化されることが知られている（Analytical Biochemistry,360:75-83(2007)）。しかし、これらの重鎖配列の欠失及び修飾は、抗体の抗原結合能及びエフェクター機能（補体の活性化や抗体依存性細胞傷害作用など）には影響を及ぼさない。従って、本発明には当該修飾を受けた抗体も含まれ、重鎖カルボキシル末端において１又は２つのアミノ酸が欠失した欠失体、及びアミド化された当該欠失体（例えば、カルボキシル末端部位のプロリン残基がアミド化された重鎖）等を挙げることができる。但し、抗原結合能及びエフェクター機能が保たれている限り、本発明に係る抗体の重鎖のカルボキシル末端の欠失体は上記の種類に限定されない。本発明に係る抗体を構成する２本の重鎖は、完全長及び上記の欠失体からなる群から選択される重鎖のいずれか一種であっても良いし、いずれか二種を組み合わせたものであっても良い。各欠失体の量比は本発明に係る抗体を産生する哺乳類培養細胞の種類及び培養条件に影響を受け得るが、本発明に係る抗体の主成分としては２本の重鎖の双方でカルボキシル末端の１つのアミノ酸残基が欠失している場合を挙げることができる。
【０１６４】
本発明の抗体は、本発明の抗体の性質が維持されていれば、マウス抗体１Ａ３又はウサギキメラ化抗体１Ａ３のアミノ酸配列と少なくとも９５％の同一性（好適には、少なくとも９９％の同一性）を持つアミノ酸配列からなる抗体であってもよい。
【０１６５】
二種類のアミノ酸配列間の同一性は、Ｂｌａｓｔ（Nucl. Acids Res., 25, p.3389-3402(1997)）のデフォルトパラメーターを使用することによって決定することができる。Ｂｌａｓｔは、インターネットでwww. ncbi. nlm. nih. gov/blastにアクセスすることによっても使用することができる。
【０１６６】
また、本発明の抗体は、本発明に係る抗体−薬物コンジュゲートにおける薬物部位への認識性について、マウス抗体１Ａ３又はウサギキメラ化抗体１Ａ３と競合する抗体であってもよい。
【０１６７】
以上の方法によって得られた抗体は、本発明に係る抗体−薬物コンジュゲートにおける薬物部位への認識性について評価し、好適な抗体を選抜することができる。抗体の性質を比較する際の別の指標の一例としては、抗体の安定性を挙げることができる。示差走査カロリメトリー（ＤＳＣ）は、蛋白の相対的構造安定性の良い指標となる熱変性中点（Ｔｍ）を素早く、また正確に測定することができる方法である。ＤＳＣを用いてＴｍ値を測定し、その値を比較することによって、熱安定性の違いを比較することができる。抗体の保存安定性は、抗体の熱安定性とある程度の相関を示すことが知られており（Lori Burton, et. al., Pharmaceutical Development and Technology (2007) 12, p.265-273）、熱安定性を指標に、好適な抗体を選抜することができる。抗体を選抜するための他の指標としては、適切な宿主細胞における収量が高いこと、及び水溶液中での凝集性が低いことを挙げることができる。例えば収量の最も高い抗体が最も高い熱安定性を示すとは限らないので、以上に述べた指標に基づいて総合的に判断して、最も適した抗体を選抜する必要がある。
【０１６８】
また、抗体の重鎖及び軽鎖の全長配列を適切なリンカーを用いて連結し、一本鎖イムノグロブリン（ｓｉｎｇｌｅ  ｃｈａｉｎ  ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ）を取得する方法も知られている（Lee, H-S, et al., Molecular  Immunology (1999) 36, p.61-71、Shirrmann, T. et al., mAbs (2010), 2, (1) p.1-4）。このような一本鎖イムノグロブリンは二量体化することによって、本来は四量体である抗体と類似した構造と活性を保持することが可能である。また、本発明の抗体は、単一の重鎖可変領域を有し、軽鎖配列を有さない抗体であっても良い。このような抗体は、単一ドメイン抗体（ｓｉｎｇｌｅ  ｄｏｍａｉｎ  ａｎｔｉｂｏｄｙ：ｓｄＡｂ）又はナノボディ（ｎａｎｏｂｏｄｙ）と呼ばれており、実際にラクダ又はラマで観察され、抗原結合能が保持されていることが報告されている（Muyldemans S. et al., Protein Eng. (1994) 7(9), 1129-35、Hamers-Casterman C. et al., Nature (1993) 363 (6428) 446-8）。上記の抗体は、本発明における抗体の抗原結合性断片の一種と解釈することも可能である。
【０１６９】
抗体遺伝子を一旦単離した後、適当な宿主に導入して抗体を作製する場合には、適当な宿主と発現ベクターの組み合わせを使用することができる。抗体遺伝子の具体例としては、本明細書に記載された抗体の重鎖配列をコードする遺伝子、及び軽鎖配列をコードする遺伝子を組み合わせたものを挙げることができる。宿主細胞を形質転換する際には、重鎖配列遺伝子と軽鎖配列遺伝子は、同一の発現ベクターに挿入されていることが可能であり、又別々の発現ベクターに挿入されていることも可能である。真核細胞を宿主として使用する場合、動物細胞、植物細胞、真核微生物を用いることができる。動物細胞としては、（１）哺乳類細胞、例えば、サルの細胞であるＣＯＳ細胞（Gluzman, Y. Cell (1981) 23, p.175-182、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１６５０）、マウス線維芽細胞ＮＩＨ３Ｔ３（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．ＣＲＬ−１６５８）やチャイニーズ・ハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ細胞、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−６１）のジヒドロ葉酸還元酵素欠損株（Urlaub, G. and Chasin, L. A. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. (1980) 77, p.4126-4220）を挙げることができる。また、原核細胞を使用する場合は、例えば、大腸菌、枯草菌を挙げることができる。これらの細胞に目的とする抗体遺伝子を形質転換により導入し、形質転換された細胞をｉｎ  ｖｉｔｒｏで培養することにより抗体が得られる。以上の培養法においては抗体の配列によって収量が異なる場合があり、同等な結合活性を持つ抗体の中から収量を指標に医薬としての生産が容易なものを選別することが可能である。
【０１７０】
本発明の抗体のアイソタイプとしての制限はなく、例えばＩｇＧ（ＩｇＧ１，ＩｇＧ２，ＩｇＧ３，ＩｇＧ４）、ＩｇＭ、ＩｇＡ（ＩｇＡ１，ＩｇＡ２）、ＩｇＤあるいはＩｇＥ等を挙げることができるが、好ましくはＩｇＧ又はＩｇＭ、さらに好ましくはＩｇＧ１又はＩｇＧ２を挙げることができる。
【０１７１】
また本発明の抗体は、抗体の抗原結合部を有する抗体の抗原結合性断片又はその修飾物であってもよい。抗体をパパイン、ペプシン等の蛋白質分解酵素で処理するか、あるいは抗体遺伝子を遺伝子工学的手法によって改変し適当な培養細胞において発現させることによって、該抗体の断片を得ることができる。このような抗体断片のうちで、抗体全長分子の持つ機能の全て又は一部を保持している断片を抗体の抗原結合性断片と呼ぶことができる。
【０１７２】
例えば、抗体の断片としては、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、又は重鎖及び軽鎖のＦｖを適当なリンカーで連結させたシングルチェインＦｖ（ｓｃＦｖ）、ｄｉａｂｏｄｙ（ｄｉａｂｏｄｉｅｓ）、線状抗体、及び抗体断片より形成された多特異性抗体などを挙げることができる。また、Ｆ（ａｂ’）２を還元条件下で処理した抗体の可変領域の一価の断片であるＦａｂ’も抗体の断片に含まれる。
【０１７３】
さらに、本発明の抗体は少なくとも２種類の異なる抗原に対して特異性を有する多特異性抗体であってもよい。通常このような分子は２種類の抗原に結合するものであるが（即ち、二重特異性抗体（ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ  ａｎｔｉｂｏｄｙ））、本発明における「多特異性抗体」は、それ以上（例えば、３種類）の抗原に対して特異性を有する抗体を包含するものである。
【０１７４】
本発明の多特異性抗体は、全長からなる抗体、又はそのような抗体の断片（例えば、Ｆ（ａｂ’）２二重特異性抗体）でもよい。二重特異性抗体は２種類の抗体の重鎖と軽鎖（ＨＬ対）を結合させて作製することもできるし、異なるモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを融合させて、二重特異性抗体産生融合細胞を作製することによっても、作製することができる（Millstein et al., Nature (1983) 305, p.537-539）。
【０１７５】
本発明の抗体は一本鎖抗体（ｓｃＦｖとも記載する）でもよい。一本鎖抗体は、抗体の重鎖可変領域と軽鎖可変領域とをポリペプチドのリンカーで連結することにより得られる（Pluckthun, The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, 113（Rosenberg及びMoore編、Springer Verlag, New York, p.269-315(1994)、Nature Biotechnology (2005), 23, p.1126-1136)。また、２つのｓｃＦｖをポリペプチドリンカーで結合させて作製されるＢｉｓｃＦｖ断片を二重特異性抗体として使用することもできる。
【０１７６】
一本鎖抗体を作製する方法は当技術分野において周知である（例えば、米国特許第４，９４６，７７８号、米国特許第５，２６０，２０３号、米国特許第５，０９１，５１３号、米国特許第５，４５５，０３０号等を参照）。このｓｃＦｖにおいて、重鎖可変領域と軽鎖可変領域は、コンジュゲートを作らないようなリンカー、好ましくはポリペプチドリンカーを介して連結される（Huston, J. S. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.(1988), 85, p.5879-5883）。ｓｃＦｖにおける重鎖可変領域及び軽鎖可変領域は、同一の抗体に由来してもよく、別々の抗体に由来してもよい。可変領域を連結するポリペプチドリンカーとしては、例えば１２〜１９残基からなる任意の一本鎖ペプチドが用いられる。
【０１７７】
ｓｃＦｖをコードするＤＮＡは、前記抗体の重鎖又は重鎖可変領域をコードするＤＮＡ、及び軽鎖又は軽鎖可変領域をコードするＤＮＡのうち、それらの配列のうちの全部又は所望のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ部分を鋳型とし、その両端を規定するプライマー対を用いてＰＣＲ法により増幅し、次いで、さらにポリペプチドリンカー部分をコードするＤＮＡ、及びその両端が各々重鎖、軽鎖と連結されるように規定するプライマー対を組み合わせて増幅することにより得られる。
【０１７８】
また、一旦ｓｃＦｖをコードするＤＮＡが作製されると、それらを含有する発現ベクター、及び該発現ベクターにより形質転換された宿主を常法に従って得ることができ、また、その宿主を用いることにより、常法に従ってｓｃＦｖを得ることができる。これらの抗体断片は、前記と同様にして遺伝子を取得し発現させ、宿主により産生させることができる。
【０１７９】
本発明の抗体は、多量化して抗原に対する親和性を高めたものであってもよい。多量化する抗体としては、１種類の抗体であっても、同一の抗原の複数のエピトープを認識する複数の抗体であってもよい。抗体を多量化する方法としては、ＩｇＧ  ＣＨ３ドメインと２つのｓｃＦｖとの結合、ストレプトアビジンとの結合、へリックスーターン−へリックスモチーフの導入等を挙げることができる。
【０１８０】
本発明の抗体は、アミノ酸配列が異なる複数種類の抗体の混合物である、ポリクローナル抗体であってもよい。ポリクローナル抗体の一例としては、ＣＤＲが異なる複数種類の抗体の混合物を挙げることができる。そのようなポリクローナル抗体としては、異なる抗体を産生する細胞の混合物を培養し、該培養物から精製された抗体を用いることが出来る（ＷＯ２００４／０６１１０４号参照）。
【０１８１】
抗体の修飾物として、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）等の各種分子と結合した抗体を使用することもできる。
【０１８２】
本発明の抗体は、更にこれらの抗体と他の薬剤がコンジュゲートを形成しているもの（Ｉｍｍｕｎｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ）でもよい。このような抗体の例としては、該抗体が放射性物質や薬理作用を有する化合物と結合している物を挙げることができる（Nature Biotechnology (2005) 23, p.1137-1146）。
【０１８３】
４．本発明の蛋白質の使用
本発明の蛋白質は、ＥＬＩＳＡ（Ｅｎｚｙｍｅ−Ｌｉｎｋｅｄ  ＩｍｍｕｎｏＳｏｒｂｅｎｔ  Ａｓｓａｙ）法、ＥＣＬ（Ｅｌｅｃｔｒｏｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ）法、ＲＩＡ（Ｒａｄｉｏ  Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ）法、ＥＬＩＳＰＯＴ（Ｅｎｚｙｍｅ−Ｌｉｎｋｅｄ  ＩｍｍｕｎｏＳｐｏｔ）法、ドットブロット法、オクタロニー法、ＣＩＥ（Ｃｏｕｎｔｅｒｉｍｍｕｎｏｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ）法、ＣＬＩＡ（Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ  ｉｍｍｕｎｏ  ａｓｓａｙ）、及びＦＣＭ（Ｆｌｏｗ  Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ）などの検出方法、並びに免疫組織化学（ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ：ＩＨＣ）法に利用することができ、好適には、ＥＬＩＳＡ法、ＥＣＬ法、並びにＩＨＣ法に利用することができる。
【０１８４】
ＥＬＩＳＡ法及びＥＣＬ法としては、例えば、本発明の抗体−薬物コンジュゲートを投与された哺乳動物（本発明における「哺乳動物」としては、例えば、ヒト、マウス、ラット、サル、ウサギ等を挙げることができるが、哺乳動物である限りこれらに限定されない）における、該抗体−薬物コンジュゲートの血漿中濃度を定量する方法に利用することができる。
【０１８５】
具体的には、（１）抗体−薬物コンジュゲートの標的抗原が固相化されたプレートに血漿中の抗体−薬物コンジュゲートを接触させ複合体を形成させるステップ、（２）マーカーで標識化された、本発明の蛋白質を接触させ、さらなる複合体を形成させるステップ、次いで（３）該マーカーを検出するステップ、を含む。
【０１８６】
また、（１）本発明の蛋白質が固相化されたプレートに血漿中の抗体−薬物コンジュゲートを接触させ複合体を形成させるステップ、（２）該抗体−薬物コンジュゲートの抗体部位を認識することができ、マーカーで標識化された第二の蛋白質を接触させ、さらなる複合体を形成させるステップ、次いで（３）該マーカーを検出するステップ、を含むこともできる。
【０１８７】
また、ＥＬＩＳＡ法及びＥＣＬ法は、本発明の抗体−薬物コンジュゲートを投与された哺乳動物における、該抗体−薬物コンジュゲートから遊離した薬物（例えば、化合物（１）、化合物（２）、化合物（４）、及び化合物（５））の血漿中濃度を定量する方法に利用することもできる。
【０１８８】
具体的には、（１）本発明の蛋白質が固相化されたプレートに、マーカーで標識化された競合薬物の存在下で、血漿中の抗体−薬物コンジュゲートから遊離した薬物を接触させ複合体を形成させるステップ、（２）該マーカーを検出するステップ、を含む。
【０１８９】
ＩＨＣ法としては、例えば、本発明の抗体−薬物コンジュゲートを投与された哺乳動物における、該抗体−薬物コンジュゲート及び／又は該抗体−薬物コンジュゲートから遊離した薬物の組織分布を定量する方法に利用することができる。
【０１９０】
具体的には、（１）組織中の抗体−薬物コンジュゲート及び／又は該抗体−薬物コンジュゲートから遊離した薬物を本発明の蛋白質と接触させ複合体を形成させるステップ、（２）本発明の蛋白質を認識することができ、マーカーで標識化された第二の蛋白質を接触させ、さらなる複合体を形成させるステップ、次いで（３）該マーカーを検出するステップ、を含む。
【０１９１】
また、（１）組織中の抗体−薬物コンジュゲート及び／又は該抗体−薬物コンジュゲートから遊離した薬物を、マーカーで標識化された本発明の蛋白質と接触させ複合体を形成させるステップ、次いで（２）該マーカーを検出するステップ、を含むこともできる。
【０１９２】
なお、本発明において「マーカー」とは、検出可能なシグナルを生成する、又は他の基質に対し検出可能な信号を生成するように誘導する、任意の物質を意味する。かかるマーカーとしては、例えば、蛍光物質、酵素、酵素断片、酵素基質、酵素阻害剤、補酵素、触媒、染料、発光物質、増感剤、及び放射性物質を挙げることができる。
【０１９３】
本発明において、「マーカーで標識化された」とは、マーカーが直接又は任意の部分構造（例えばリンカー）を介して結合していることを意味する。ビオチンとアビジン（又はストレプトアビジン）の相互作用による結合もこれに含まれる。
【０１９４】
本発明の蛋白質をマーカーで標識化するためには、例えば、マーカーを構成要素とする試薬（活性エステル基を有するもの）を、本発明の蛋白質のリシン残基と反応させアミド結合を形成させれば良いが、これに限定されない。
【０１９５】
マーカーが蛍光物質である場合は、該マーカーの検出は該マーカーの蛍光を感知することにより行われる。
【０１９６】
このような蛍光物質としては、例えば、ＤｙＬｉｇｈｔ（登録商標）３５０、ＤｙＬｉｇｈｔ（登録商標）４０５、ＤｙＬｉｇｈｔ（登録商標）４８８、ＤｙＬｉｇｈｔ（登録商標）５５０、ＤｙＬｉｇｈｔ（登録商標）５９４、ＤｙＬｉｇｈｔ（登録商標）６３３、ＤｙＬｉｇｈｔ（登録商標）６５０、ＤｙＬｉｇｈｔ（登録商標）６８０、ＤｙＬｉｇｈｔ（登録商標）７４７、ＤｙＬｉｇｈｔ（登録商標）７５５、ＤｙＬｉｇｈｔ（登録商標）８００、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）３５０、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４０５、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５３２、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５４６、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５５５、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５６８、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５９４、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６８０、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）７５０、ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）ＦＬ、Ｃｏｕｍａｒｉｎ、Ｃｙ（登録商標）３、Ｃｙ（登録商標）５、Ｃｙ（登録商標）、Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ（ＦＩＴＣ）、Ｏｒｅｇｏｎ  Ｇｒｅｅｎ（登録商標）、Ｐａｃｉｆｉｃ  Ｂｌｕｅ、Ｐａｃｉｆｉｃ  Ｇｒｅｅｎ、Ｐａｃｉｆｉｃ  Ｏｒａｎｇｅ、Ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｒｈｏｄａｍｉｎｅ（ＴＲＩＴＣ）、Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄ（登録商標）を挙げることができる。
【０１９７】
また、Ｑｄｏｔ（登録商標）５２５、Ｑｄｏｔ（登録商標）５６５、Ｑｄｏｔ（登録商標）６０５、Ｑｄｏｔ（登録商標）６５５、Ｑｄｏｔ（登録商標）７０５、及びＱｄｏｔ（登録商標）８００のようなナノクリスタルや、Ａｌｌｏｐｈｙｃｏｃｙａｎｉｎ（ＡＰＣ）、Ｒ−Ｐｈｙｃｏｅｒｙｔｈｒｉｎ（Ｒ−ＰＥ）、Ｃｙａｎ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｐｒｏｔｅｉｎ（ＣＦＰ）、Ｇｒｅｅｎ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｐｒｏｔｅｉｎ（ＧＦＰ）、及びＲｅｄ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｐｒｏｔｅｉｎ（ＲＦＰ）のような蛍光蛋白質も、蛍光物質として使用することができる。
【０１９８】
マーカーが酵素である場合は、該マーカーの検出が該酵素と基質との反応により生じた発光又は発色を感知することにより行われる。
【０１９９】
このような酵素としては、例えば、ペルオキシダーゼ（例えば、ホースラディッシュペルオキシダーゼ；ＨＲＰ等）を挙げることができ、この場合、酵素の基質としては、例えば、ＴＭＢ（３，３’，５，５’−ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｂｅｎｚｉｄｉｎｅ）、ＤＡＢ（３，３’−Ｄｉａｍｉｎｏｂｅｎｚｉｄｉｎｅ  ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ）、ＯＰＤ（ｏ−Ｐｈｅｎｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅ）、及びＡＢＴＳ（３−Ｅｔｈｙｌｂｅｎｚｏｔｈｉａｚｏｌｉｎｅ−６−ｓｕｌｆｏｎｉｃ  ａｃｉｄ）を挙げることができる。
【０２００】
また、他の酵素としては、アルカリフォスファターゼを挙げることができ、この場合、酵素の基質としては、例えば、ＢＣＩＰ（５−ｂｒｏｍｏ−４−ｃｈｌｏｒｏ−３−ｉｎｄｏｌｙｌ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）、及びＰＮＰＰ（ρ−ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）を挙げることができる。
【０２０１】
また、他の酵素としては、ルシフェラーゼを挙げることができ、この場合、酵素の基質としては、例えば、Ｌｕｃｉｆｅｒｉｎ、及びＣｏｅｌｅｎｔｅｒａｚｉｎｅ類を挙げることができる。
【０２０２】
さらに、その他の酵素としては、β−ガラクトシダーゼを挙げることができ、この場合、酵素の基質としては、例えば、ｏ−ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌ−β−Ｄ−ｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ（ＯＮＰＧ）を挙げることができる。
【０２０３】
マーカーが発光物質である場合は、該マーカーの検出は電気化学反応に基づく該マーカーの発光を感知することにより行われる。
【０２０４】
このような発光物質としては、例えば、ルテニウム錯体を挙げることができ、好適には、ルテニウム−ピリジン錯体を挙げることができ、より好適には、ルテニウム（ＩＩ）トリス（ビピリジル）錯体を挙げることができる。
【０２０５】
上記の電気化学反応は、例えば、トリプロピルアミン（ＴＰＡ）の共存下で行うことができる。具体的には、電極反応によりＴＰＡカチオンラジカルと３価のルテニウム錯体を生じさせた後、ＴＰＡカチオンラジカルは直ちに水素イオンを失い、強い還元作用を持つＴＰＡラジカルとなり、これが３価のルテニウム錯体と反応することにより発光が生じる。
【０２０６】
マーカーが放射性物質である場合は、該マーカーの検出は、該マーカーが発する放射線を感知することにより行われる。
【０２０７】
このような放射性物質としては、例えば、トリチウム（３Ｈ）、炭素−１４（１４Ｃ）、窒素−１５（１５Ｎ）、硫黄−３５（３５Ｓ）、イットリウム−９０（９０Ｙ）、テクネチウム−９９（９９Ｔｃ）、インジウム−１１１（１１１Ｉｎ）、ヨウ素−１２５（１２５Ｉ）、及びヨウ素−１３１（１３１Ｉ）等を挙げることができる。
【０２０８】
本発明の蛋白質は、ｐＨ緩衝剤、浸透圧調節剤、塩類、安定化剤、防腐剤、顕色剤、増感剤、凝集防止剤等を含有せしめることにより、組成物（以下、「本発明の組成物」という。）として使用することができる。
【０２０９】
本発明の蛋白質（又は本発明の組成物）は、アッセイを行うのに使用される材料及び試薬と組み合わせたキット（以下、「本発明のキット」という。）として使用することができる。試薬は、それらの安定性に応じて、同一又は別個の容器中に液体又は凍結乾燥された状態で提供され得る。本発明のキット中に提供される試薬の量及び割合は、特定の用途に最適な結果を提供するように選択され得る。本発明のキットには、本発明の蛋白質（又は本発明の組成物）以外に、例えば、マーカーで標識するための試薬、酵素の基質、ブロッキング試薬、ポリマー試薬、抗原賦活液、キャリブレーター、希釈用緩衝液、洗浄用緩衝液、固相化用緩衝液、固相化抗体、検出用抗体、及びマイクロタイターウェル等が含まれ得る。また、本発明のキットを使用するための指示書等が含まれていても良い。本キットを用いて、抗体−薬物コンジュゲート及び／又は該抗体−薬物コンジュゲートから遊離した薬物の組織分布の確認や、血漿中濃度の定量等が可能となる。
【実施例】
【０２１０】
以下、本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではなく、これらはいかなる意味においても限定的に解釈されない。なお、下記実施例において遺伝子操作に関する各操作は特に明示がない限り、「モレキュラークローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ）」（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．及びＭａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．著，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓより１９８９年に発刊）に記載の方法により行うか、又は、市販の試薬やキットを用いる場合には市販品の指示書に従って使用した。また、本明細書において、特に記載のない試薬、溶媒及び出発材料は、市販の供給源から容易に入手可能である。【０２１１】
［実施例１］化合物の合成
ｉ）  ８−［（２，５−ジオキソピロリジン−１−イル）オキシ］−N−（４−｛［（１Ｓ，９Ｓ）−９−エチル−５−フルオロ−９−ヒドロキシ−４−メチル−１０，１３−ジオキソ−２，３，９，１０，１３，１５−ヘキサヒドロ−１Ｈ，１２Ｈ−ベンゾ［ｄｅ］ピラノ［３’，４’：６，７］インドリジノ［１，２−ｂ］キノリン−１−イル］アミノ｝−４−オキソブチル）−８−オキソオクタンアミド（化合物（６））の合成【０２１２】
【化２６】
2020022475.tif 000028
【０２１３】
４−アミノ−Ｎ−［（１Ｓ，９Ｓ）−９−エチル−５−フルオロ−９−ヒドロキシ−４−メチル−１０，１３−ジオキソ−２，３，９，１０，１３，１５−ヘキサヒドロ−１Ｈ，１２Ｈ−ベンゾ［ｄｅ］ピラノ［３’，４’：６，７］インドリジノ［１，２−ｂ］キノリン−１−イル］ブタンアミド（０．０３２ｇ、０．０５０ｍｍｏＬ）（国際公開第２０１４／０５７６８７号に記載の実施例１工程２にて得られる化合物）のＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（０．５ｍＬ）溶液に、トリエチルアミン（７μＬ，０．０５０ｍｍｏＬ）、スベリン酸ジ（Ｎ−スクシンイミジル）（２０．４ｍｇ，０．０５５ｍｍｏＬ）を加え、室温で２０分間撹拌した。溶媒を減圧留去し、得られた残留物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー［クロロホルム〜クロロホルム：メタノール＝９：１（ｖ／ｖ）］にて精製し、標記化合物（１６．０ｍｇ，４１％）を淡黄色固体として得た。
１Ｈ−ＮＭＲ  （４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）  δ：０．８７（３Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．６Ｈｚ），１．１８−１．３７（４Ｈ，ｍ），１．４０−１．５０（２Ｈ，ｍ），１．５４−１．６４（２Ｈ，ｍ），１．６５−１．７４（２Ｈ，ｍ），１．７８−１．９３（２Ｈ，ｍ），２．０２（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．６Ｈｚ），２．０９−２．２０（４Ｈ，ｍ），２．４０（３Ｈ，ｓ），２．６０−２．６８（２Ｈ，ｍ），２．８０（４Ｈ，ｓ），３．００−３．０８（２Ｈ，ｍ），３．１３−３．２１（２Ｈ，ｍ），５．１９（２Ｈ，ｄｄ，Ｊ  ＝３２．０，１８．０Ｈｚ），５．３７−５．４７（２Ｈ，ｍ），５．５３−５．６０（１Ｈ，ｍ），６．５２（１Ｈ，ｓ），７．３０（１Ｈ，ｓ），７．７４−７．８２（２Ｈ，ｍ），８．４４（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．５Ｈｚ）．
ＭＳ（ＡＰＣＩ）ｍ／ｚ：７７４（Ｍ＋Ｈ）＋【０２１４】
ｉｉ）  ４−アミノ−Ｎ−［（１Ｓ，９Ｓ）−９−エチル−５−フルオロ−９，１０−ジヒドロキシ−４−メチル−１３−オキソ−２，３，９，１０，１３，１５−ヘキサヒドロ−１Ｈ，１２Ｈ−ベンゾ［ｄｅ］ピラノ［３’，４’：６，７］インドリジノ［１，２−ｂ］キノリン−１−イル］ブタンアミド  トリフルオロ酢酸塩（化合物（７））の合成【０２１５】
【化２７】
2020022475.tif 000029
【０２１６】
工程１： 
ｔｅｒｔ−ブチル（４−｛［（１Ｓ，９Ｓ）−９−エチル−５−フルオロ−９−ヒドロキシ−４−メチル−１０，１３−ジオキソ−２，３，９，１０，１３，１５−ヘキサヒドロ−１Ｈ，１２Ｈ−ベンゾ［ｄｅ］ピラノ［３’，４’：６，７］インドリジノ［１，２−ｂ］キノリン−１−イル］アミノ｝−４−オキソブチル）カーバメート（０．０９２ｇ、０．１４８ｍｍｏＬ）（国際公開第２０１４／０５７６８７号に記載の実施例１工程１にて得られる化合物）をメタノール（１．６ｍＬ）に溶解し、氷冷した。水素化ホウ素ナトリウム（０．０２８ｇ、０．７４０ｍｍｏＬ）を加え氷冷下にて２０分間攪拌した。メタノール(１０ｍＬ）及びクロロホルム(５０ｍＬ）で希釈し、１０％クエン酸水溶液を加え、クロロホルムで抽出した。得られた有機層を１０％クエン酸水溶液、続いて飽和食塩水で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥し、ろ過した。溶媒を減圧留去し、得られた残留物をシリカゲルカラムクロマトグラフィ−［クロロホルム：メタノール＝１００：０〜９５：５（ｖ／ｖ）］にて精製し、薄黄色固体のｔｅｒｔ−ブチル（４−｛［（１Ｓ，９Ｓ）−９−エチル−５−フルオロ−９−ヒドロキシ−４−メチル−１３−オキソ−２，３，９，１０，１３，１５−ヘキサヒドロ−１Ｈ，１２Ｈ−ベンゾ［ｄｅ］ピラノ［３’，４’：６，７］インドリジノ［１，２−ｂ］キノリン−１−イル］アミノ｝−４−オキソブチル）カーバメート（０．０７８ｇ、８５％）を得た。
１Ｈ−ＮＭＲ  （４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）  δ：０．８９（３Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．４Ｈｚ），１．３１（９Ｈ，ｓ），１．６２−１．７３（４Ｈ，ｍ），２．０８−２．１８（４Ｈ，ｍ），  ２．３９（３Ｈ，ｓ），２．９１（２Ｈ，ｑ，Ｊ＝６．５Ｈｚ），３．１２−３．２０（２Ｈ，ｍ），４．４９（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１７．２Ｈｚ），４．６１（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１７．２Ｈｚ），４．９７（１Ｈ，ｓ），４．９９（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝４．７Ｈｚ），５．１０（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝１８．８Ｈｚ），５．２１（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝１８．８Ｈｚ），５．５４−５．５８（１Ｈ，ｍ），６．７４−６．８２（２Ｈ，ｍ），７．３３（１Ｈ，ｓ），７．７８（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１１．０Ｈｚ），８．４０（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．６Ｈｚ）．
工程２：
上記工程１で得た化合物（０．０７８ｇ、０．１２５ｍｍｏＬ）をジクロロメタン（２ｍＬ）を加え、氷冷し、トリフルオロ酢酸（２ｍＬ）を加え、４０分間攪拌した。溶媒を減圧留去し、得られた残留物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー［クロロホルム〜クロロホルム：メタノール：水＝７：３：１（ｖ／ｖ／ｖ）の分配有機層］にて精製した。得られた固体をメタノールに溶解し、エーテルを加えて生成した沈殿を濾取、真空乾燥し、黄色固体の標記化合物（０．０４５ｇ、５６％）を得た。
１Ｈ−ＮＭＲ  （４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）  δ：０．８９（３Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．４Ｈｚ），１．７１（２Ｈ，ｑ，Ｊ＝７．４Ｈｚ），１．８０−１．８８（２Ｈ，ｍ），２．０９−２．１９（２Ｈ，ｍ），２．２７（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．０Ｈｚ），２．４０（３Ｈ，ｓ），２．８４（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．６Ｈｚ），３．１３−３．２０（２Ｈ，ｍ），４．５０（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１７．２Ｈｚ），４．６２（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１７．２Ｈｚ），４．９７−５．０２（２Ｈ，ｍ），５．０９（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１８．８Ｈｚ），５．２１（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１８．８Ｈｚ），５．５５−５．５９（１Ｈ，ｍ），６．７９（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝４．７Ｈｚ），７．３４（１Ｈ，ｓ），７．６４−７．７５（３Ｈ，ｍ），７．７９（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１１．３Ｈｚ），８．５３（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．６Ｈｚ）．
ＭＳ（ＡＰＣＩ）ｍ／ｚ：５２３（Ｍ＋Ｈ）＋【０２１７】
ｉｉｉ）  ４−アミノ−Ｎ-シクロヘキシル−ブタンアミド塩酸塩（化合物（８））の合成【０２１８】
【化２８】
2020022475.tif 000030
【０２１９】
工程１： 
４−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ）ブタン酸（０．４９２ｇ、２．４２ｍｍｏＬ）をジクロロメタン（１５ｍＬ）及びＮ, Ｎ-ジメチルホルムアミド（２ｍＬ）に溶解し、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（０．２７９ｇ、２．４２ｍｍｏＬ）及び、ＥＤＣＩ（１−Ｅｔｈｙｌ−３−（３−ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏｐｒｏｐｙｌ）ｃａｒｂｏｄｉｉｍｉｄｅ  Ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ）（０．４６４ｇ、２．４２ｍｍｏＬ）を加え室温にて３０分間攪拌した。その反応溶液をシクロヘキシルアミン（０．２００ｇ、２．０２ｍｍｏＬ）のジクロロメタン溶液（２ｍＬ）に滴下し、室温にて２０分間攪拌した。反応液をジクロロメタンで希釈し、１０％クエン酸水溶液を加え、ジクロロメタンで抽出した。得られた有機層を飽和重曹水で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥し、ろ過した。溶媒を減圧留去し、得られた残留物をシリカゲルカラムクロマトグラフィ−［ヘキサン：酢酸エチル＝５０：５０〜２５：７５（ｖ／ｖ）］にて精製し、無色油状のｔｅｒｔ−ブチル  Ｎ-[４−（シクロヘキシルアミノ）−４−オキソ−ブチル]カーバメート（０．３０８ｇ、５４％）を得た。
１Ｈ−ＮＭＲ  （４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）  δ：１．０８−１．２３（４Ｈ，ｍ），１．２９−１．４２（２Ｈ，ｍ），１．４４（９Ｈ，ｓ），１．６６−１．７５（２Ｈ，ｍ），１．７７−１．８３（２Ｈ，ｍ），１．８６−１．９５（２Ｈ，ｍ），２．１７（２Ｈ，ｔ，  Ｊ＝７．０Ｈｚ），３．１１−３．２１（２Ｈ，ｍ），３．６９−３．８２（１Ｈ，ｍ），４．７５（１Ｈ，ｂｒｓ），５．８９（１Ｈ，ｂｒｓ）．
工程２：
上記工程１で得た化合物（０．２００ｇ、０．７０３ｍｍｏＬ）を酢酸エチル（５０ｍＬ）及びジオキサン（１０ｍＬ）に溶解した。４Ｎ塩酸ジオキサン（１０ｍＬ）を加え２時間攪拌した。生成した沈殿を濾取、真空乾燥し、無色固体の標記化合物（０．０９８ｇ、６３％）を得た。
１Ｈ−ＮＭＲ  （４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）  δ：１．０６−１．３０（５Ｈ，ｍ），１．５０−１．５８（１Ｈ，ｍ），１．６２−１．８２（６Ｈ，ｍ），２．１６（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝  ７．２Ｈｚ），２．６９−２．７９（２Ｈ，ｍ），３．４５−３．５８（１Ｈ，ｍ），４．７３（１Ｈ，ｂｒｓ），７．８９（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．８Ｈｚ），７．９６−８．１０（２Ｈ，ｍ）．
ＭＳ（ＡＰＣＩ）ｍ／ｚ：１８５（Ｍ＋Ｈ）＋【０２２０】
［実施例２］抗体−薬物コンジュゲートの製造 
ｉ）  抗Ｂ７−Ｈ３抗体−薬物コンジュゲートの製造（１）
国際公開第２０１４／０５７６８７号に記載の製造方法に従って、抗Ｂ７−Ｈ３抗体（配列番号２７においてアミノ酸番号２０乃至４７１に記載のアミノ酸配列からなる重鎖及び配列番号２８においてアミノ酸番号２１乃至２３３に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖を含んでなる抗体）を用いて、式【０２２１】
【化２９】
2020022475.tif 000031
【０２２２】
（式中、Ａは抗体との結合位置を示す）
で示される薬物リンカーと、抗Ｂ７−Ｈ３抗体とがチオエーテル結合によって結合した抗Ｂ７−Ｈ３抗体−薬物コンジュゲート（本発明において「Ｂ７−Ｈ３−ＡＤＣ（Ｉ）」と称する）を製造した。【０２２３】
ｉｉ）  抗Ｂ７−Ｈ３抗体−薬物コンジュゲートの製造（２）
国際公開第２０１４／０５７６８７号に記載の製造方法に従って、抗Ｂ７−Ｈ３抗体（配列番号２７においてアミノ酸番号２０乃至４７１に記載のアミノ酸配列からなる重鎖及び配列番号２８においてアミノ酸番号２１乃至２３３に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖を含んでなる抗体）を用いて、式【０２２４】
【化３０】
2020022475.tif 000032
【０２２５】
（式中、Ａは抗体との結合位置を示す）
で示される薬物リンカーと、抗Ｂ７−Ｈ３抗体とがチオエーテル結合によって結合した抗Ｂ７−Ｈ３抗体−薬物コンジュゲート（本発明において「Ｂ７−Ｈ３−ＡＤＣ（ＩＩ）」と称する）を製造した。【０２２６】
ｉｉｉ）  抗Ｂ７−Ｈ３抗体−薬物コンジュゲートの製造（３）
国際公開第２０１４／０５７６８７号に記載の製造方法に従って、抗Ｂ７−Ｈ３抗体（配列番号２７においてアミノ酸番号２０乃至４７１に記載のアミノ酸配列からなる重鎖及び配列番号２８においてアミノ酸番号２１乃至２３３に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖を含んでなる抗体）を用いて、式【０２２７】
【化３１】
2020022475.tif 000033
【０２２８】
（式中、Ａは抗体との結合位置を示す）
で示される薬物リンカーと、抗Ｂ７−Ｈ３抗体とがチオエーテル結合によって結合した抗Ｂ７−Ｈ３抗体−薬物コンジュゲート（本発明において「Ｂ７−Ｈ３−ＡＤＣ（ＩＩＩ）」と称する）を製造した。【０２２９】
ｉｖ）  抗ＨＥＲ２抗体−薬物コンジュゲートの製造（１）
国際公開第２０１５／１１５０９１号に記載の製造方法に従って、抗ＨＥＲ２抗体（配列番号２１においてアミノ酸番号１乃至４４９に記載のアミノ酸配列からなる重鎖及び配列番号２２においてアミノ酸番号１乃至２１４に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖を含んでなる抗体）を用いて、式【０２３０】
【化３２】
2020022475.tif 000034
【０２３１】
（式中、Ａは抗体との結合位置を示す）
で示される薬物リンカーと、抗ＨＥＲ２抗体とがチオエーテル結合によって結合した抗ＨＥＲ２抗体−薬物コンジュゲート（本発明において「ＨＥＲ２−ＡＤＣ（Ｉ）」と称する）を製造した。【０２３２】
ｖ）  抗ＨＥＲ３抗体−薬物コンジュゲートの製造（１）
国際公開第２０１５／１５５９９８号に記載の製造方法に従って、抗ＨＥＲ３抗体（配列番号２３に記載のアミノ酸配列からなる重鎖及び配列番号２４に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖を含んでなる抗体）を用いて、式【０２３３】
【化３３】
2020022475.tif 000035
【０２３４】
（式中、Ａは抗体との結合位置を示す）
で示される薬物リンカーと、抗ＨＥＲ３抗体とがチオエーテル結合によって結合した抗ＨＥＲ３抗体−薬物コンジュゲート（本発明において「ＨＥＲ３−ＡＤＣ（Ｉ）」と称する）を製造した。【０２３５】
ｖｉ）  抗ＴＲＯＰ２抗体−薬物コンジュゲートの製造（１）
国際公開第２０１５／０９８０９９号に記載の製造方法に従って、抗ＴＲＯＰ２抗体（配列番号２５においてアミノ酸番号２０乃至４７０に記載のアミノ酸配列からなる重鎖及び配列番号２６においてアミノ酸番号２１乃至２３４に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖を含んでなる抗体）を用いて、式【０２３６】
【化３４】
2020022475.tif 000036
【０２３７】
（式中、Ａは抗体との結合位置を示す）
で示される薬物リンカーと、抗ＴＲＯＰ２抗体とがチオエーテル結合によって結合した抗ＴＲＯＰ２抗体−薬物コンジュゲート（本発明において「ＴＲＯＰ２−ＡＤＣ（Ｉ）」と称する）を製造した。【０２３８】
［実施例３］  モノクローナル抗体作製
ｉ）  抗原蛋白質の調製
抗原蛋白質は化合物（６）にキャリア蛋白としてウシサイログロブリンを付加したもの（以下、「抗原蛋白質（１）」と呼ぶ）及びＢＳＡを付加したもの（以下、「抗原蛋白質（２）」と呼ぶ）を使用した。【０２３９】
ｉｉ）  免疫
免疫にはＢＡＬＢ／ｃＡｎＮＣｒｌＣｒｌｊ（ＢＡＬＢ／ｃ）マウス（４個体）及びＢ６Ｄ２Ｆ１／Ｃｒｌｊ（ＢＤＦ１）マウス（４個体）の雌（日本チャールス・リバー株式会社）を使用した。初回は抗原蛋白質（１）とＦｒｅｕｎｄ’ｓ  Ｃｏｍｐｌｅｔｅ  Ａｄｊｕｖａｎｔ（和光純薬社製）を混合したものを、２回目以降は抗原蛋白質（１）とＦｒｅｕｎｄ’ｓ  Ｉｎｃｏｍｐｌｅｔｅ  Ａｄｊｕｖａｎｔ（和光純薬社製）を混合したものを皮下及び皮内に投与した。７日毎に合計４回投与した。【０２４０】
ｉｉｉ）  抗血清の抗体価評価
免疫前及び４回投与後のＢＡＬＢ／ｃマウス（４個体）及びＢＤＦ１マウス（４個体）の血清をそれぞれ２００倍から２０４８００倍まで希釈して、陽性対照として抗原蛋白質（２）及びＢ７−Ｈ３−ＡＤＣ（ＩＩ）、陰性対照としてＢＳＡに対する抗体価を確認した。抗原蛋白質（２）、Ｂ７−Ｈ３−ＡＤＣ（ＩＩ）、及びＢＳＡをＥＬＩＳＡ用イムノプレートに固相化し、希釈した免疫前及び４回投与後のマウス血清を３７℃で３０分間反応させた。洗浄後、ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ  ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ−ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ  ａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ  ＩｇＧ（ａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ  ＩｇＧ−ＨＲＰ）を３７℃で３０分間反させた。洗浄後、ｏ−ｐｈｅｎｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅ  ｄｉｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ（ＯＰＤ）溶液を添加し、発色停止後に４９０ｎｍの吸光度を測定した。すべての個体において、陽性対照に対する抗体価が上昇していることを確認した。【０２４１】
ｉｖ）  Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ＥＬＩＳＡ
４回投与後のＢＡＬＢ／ｃマウス（４個体）及びＢＤＦ１マウス（４個体）の血清に、陽性対照として化合物（６）、化合物（７）及び化合物（１）、陰性対象として化合物（８）を添加し、抗原蛋白質（２）に対する未吸収率を算出した。５００００倍希釈したマウスの血清と１２．５、２５、５０、１００μｇ／ｍＬに調製した化合物（６）、化合物（８）、化合物（７）及び化合物（１）を混合し、４℃で一晩反応させたのち、抗原蛋白質（２）を固相化したＥＬＩＳＡ用イムノプレートにし添加し、３７℃で３０分間反応させた。洗浄後、ａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ  ＩｇＧ−ＨＲＰを３７℃で３０分間反応させた。洗浄後、ＯＰＤ溶液を添加し、発色停止後に４９０ｎｍの吸光度を測定した。以下式により未吸収率を算出した。
未吸収率  （％）  ＝（ａ／ｂ）×１００
ａ：陽性対照又は陰性対象の添加濃度１２．５μｇ／ｍＬの吸光度
ｂ：陽性対照又は陰性対象無添加の吸光度
いずれのマウス血清も陽性対照の化合物（６）及び化合物（１）に、個体によっては化合物（７）に高いｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ効果が認められた。また、陰性対象の化合物（８）にはいずれの血漿にも高いｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ効果が認められなかった。その中でも化合物（７）に高いｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ効果が認められ且つ化合物（８）に高いｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ効果が認めらなかった血清を有するＢＡＬＢ／ｃマウス及びＢＤＦ１マウスからそれぞれ１個体を選択し、リンパ節及び脾臓を採取してハイブリドーマ作製に用いた。【０２４２】
ｖ）  ハイブリドーマ作製
ｉｖ）で選択した個体のリンパ節細胞及び脾臓細胞とマウスミエローマをＰＥＧ法にて細胞融合した。出現したハイブリドーマの培養上清を用いて抗体産生ハイブリドーマのスクリーニングを行った。【０２４３】
ｖｉ）  抗原蛋白質（２）に対する特異的結合評価
抗原蛋白質（２）をＥＬＩＳＡ用イムノプレートに固相化し、２倍希釈した抗体産生ハイブリドーマ上清を３７℃で１２０分反応させた。洗浄後、ａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ  ＩｇＧ−ＨＲＰを３７℃で３０分間反応させた。洗浄後、ＯＰＤ溶液を添加し、発色停止後に４９０ｎｍの吸光度を測定した。ＯＤ値が０．２以上の数値を示す培養上清を産生するハイブリドーマ１１株を陽性として選択した。【０２４４】
ｖｉｉ）  クロスチェック
ｖｉ）で陽性として選択した１１株について、陽性対照として化合物（６）、化合物（１）、Ｂ７−Ｈ３−ＡＤＣ（ＩＩ）、Ｂ７−Ｈ３−ＡＤＣ（Ｉ）及びＢ７−Ｈ３−ＡＤＣ（ＩＩＩ）、並びに反応性確認用化合物として化合物（８）及び化合物（７）を用いて、ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ＥＬＩＳＡを実施した。２倍希釈したｖｉ）で陽性として選択した１１株の培養上清に、陽性対照及び反応性確認用化合物を最終濃度が２５μg/ｍＬになるように添加した。４℃で一晩反応させた後、抗原蛋白質（２）を固相化したＥＬＩＳＡ用イムノプレートに添加し、３７℃で３０分間反応させた。洗浄後、ａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ  ＩｇＧ−ＨＲＰを３７℃で３０分間反応させた。洗浄後、ＯＰＤ溶液を添加し、発色停止後に４９０ｎｍの吸光度を測定した。抗原蛋白質（２）に対する反応性が高く、陽性対照によるｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ効果が認められた８株を選択して一次クローニングに供した。【０２４５】
ｖｉｉｉ）  一次クローニング、一次スクリーニング
ｖｉｉ）で選択した８株を限界希釈法でクローニングした。ハイブリドーマを６０細胞／９６穴プレートになるように播種し、マウス胸腺細胞を５×１０６細胞／穴ずつ添加し、１０％ＦＢＳ含有ＴＩＬ（株式会社免疫生物研究所）を用いて培養した。ｖｉｉ）と同様なｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ＥＬＩＳＡを行い、特異性が確認された８株ｘ６サブクローンを選択した。【０２４６】
ｉｘ）  一次クロスチェック
ｖｉｉｉ）で選択した８株ｘ６サブクローンのＢ７−Ｈ３−ＡＤＣ（ＩＩ）及びＢ７−Ｈ３−ＡＤＣ（Ｉ）に対する反応性を確認した。Ｂ７−Ｈ３ Ｃ１ ｄｏｍａｉｎ ＬｏｔＢ７＿ＯｍＪ１をｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ  ｂｕｆｆｅｒで１μｇ／ｍＬに希釈し、Ｍａｘｉ−Ｓｏｒｐプレートに１００μＬずつ添加後、４℃で一晩固相化した。翌日、プレートの培地を除き、５％ＢＳＡ含有ＰＢＳを１８０μＬずつ添加し、室温で３時間静置した。０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０含有ＰＢＳで２回洗浄後、０．１μｇ／ｍＬに調製したＢ７−Ｈ３−ＡＤＣ（ＩＩ）、及びＢ７−Ｈ３−ＡＤＣ（Ｉ）を１００μＬずつ添加後、室温でおよそ１時間静置した。０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０含有ＰＢＳで２回洗浄後、９００μｇ/ｍＬから公比３で７段階に希釈したハイブリドーマ上清を５０μＬずつ添加後、室温で１時間静置した。０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０含有ＰＢＳで２回洗浄後、５０００倍希釈したＰｅｒｏｘｉｄａｓｅ ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅ Ｇｏａｔ Ａｎｔｉ−Ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ， Ｆｃγ Ｆｒａｇｍｅｎｔ Ｓｐｅｃｉｆｉｃ（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＩＥＳ，ＩＮＣ．）を１００μＬずつ添加し、室温で１時間静置した。０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０含有ＰＢＳで３回洗浄後、ＨＲＰ基質（ＯＰＤ ｔａｂｌｅｔ）を１００μＬずつ添加して発色反応を行い、１Ｍ  ＨＣｌを１００μＬずつ添加して発色反応を停止させた後、ＡＲＶＯ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社）で４５０ｎｍの吸光度を測定した。８株ｘ６サブクローンの全てにおいてＢ７−Ｈ３−ＡＤＣ（ＩＩ）及びＢ７−Ｈ３−ＡＤＣ（Ｉ）に対する反応性が確認された。その中でも反応性の高かった４株ｘ６サブクローンを一次検量線確認へ供した。【０２４７】
ｘ）  一次検量線確認
ｉｘ）で選択した４株ｘ６サブクローンのＢ７−Ｈ３−ＡＤＣ（Ｉ）（ＤＡＲ７）とＢ７−Ｈ３−ＡＤＣ（Ｉ）（ＤＡＲ５）への反応性をＥＬＩＳＡで確認した。ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅ  Ｇｏａｔ  Ａｎｔｉ−Ｍｏｕｓｅ  ＩｇＧ，Ｆｃγ  ｆｒａｇｍｅｎｔ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｃ．）をＣｏａｔｉｎｇ  Ｂｕｆｆｅｒで１μｇ／ｍＬに希釈し、Ｍａｘｉ−Ｓｏｒｐプレートに１００μＬずつ添加後、４℃で一晩固相化した。翌日、プレートの培地を除き、ＰＢＳで洗浄後に１０％ＢＳＡ含有ＰＢＳを１００μＬずつ添加し、３７℃で２．５時間静置した。プレートの培地を除き、ハイブリドーマ４株ｘ６サブクローンを２％ＢＳＡ、０．２％Ｐｏｌｙｓｏｒｂａｔｅ２０（以下、「ＰＳ２０」と呼ぶ）含有ＰＢＳで１０、２５及び１００ｎｇ／ｍＬに希釈し、プレートに１００μＬずつ添加し、３７℃で１時間静置した。０．０５％ＰＳ２０含有ＰＢＳで４回洗浄後、２％ＢＳＡ、０．２％Ｔｗｅｅｎ２０含有ＰＢＳでＢ７−Ｈ３−ＡＤＣ（Ｉ）（ＤＡＲ７）及びＢ７−Ｈ３−ＡＤＣ（Ｉ）（ＤＡＲ５）を１、２．５、１０、２５、１００、２５０ｎｇ／ｍＬに希釈し、プレートに１００μＬずつ添加し、３７℃で１時間静置した。０．０５％ＰＳ２０含有ＰＢＳで４回洗浄後、２％ＢＳＡ、０．２％ＰＳ２０含有ＰＢＳで７５００倍希釈したＧｏａｔ  Ａｎｔｉ−Ｈｕｍａｎ  ｋａｐｐａ−ＨＲＰ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，  Ｉｎｃ．）を１００μＬずつ添加し、室温で１時間静置した。０．０５％ＰＳ２０含有ＰＢＳで４回洗浄後、ＴＭＢ  ｓｏｌｕｂｌｅ  ｒｅａｇｅｎｔ（ＳｃｙＴｅｋ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を１００μＬ／ウェルで添加して発色反応を行い、ＴＭＢ  ｓｔｏｐ  ｂｕｆｆｅｒ（ＳｃｙＴｅｋ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を１００μＬ／ウェルを添加して発色反応を停止させた後、ＶｅｒｓａＭａｘ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ社製）で４５０ｎｍの吸光度（ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  ６５０ｎｍ）を測定し、以下式により相対誤差を算出し、値の小さいクローンを選択した。
相対誤差（％）  ＝｛（ＤＡＲ７の測定値）／（ＤＡＲ５の測定値）−１｝×１００
その中から、４株ｘ２サブクローンを二次クローニングへ供した。【０２４８】
ｘｉ）  二次クローニング、スクリーニング
ｘ）で選択した４株ｘ２サブクローンの二次クローニングを行い、各クローンで陽性ウェルの中から３ウェルを選抜することにより合計２４クローンを選択し、抗原蛋白質（２）に対する抗体価の確認をｖｉ）と同様に実施した。さらに陽性対照として化合物（６）、化合物（１）、Ｂ７−Ｈ３−ＡＤＣ（ＩＩ）、Ｂ７−Ｈ３−ＡＤＣ（Ｉ）及びＢ７−Ｈ３−ＡＤＣ（ＩＩＩ）、並びに反応性確認用化合物として化合物（８）及び化合物（７）を用いて、ｖｉｉ）と同様にｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ＥＬＩＳＡを実施した。【０２４９】
ｘｉｉ）  二次検量線確認
ｘｉ）で選択した２４クローンのうち、化合物（１）に比較して化合物（７）への反応性が特に高い６クローンを除いた１８クローンについて、ＨＥＲ２−ＡＤＣ（Ｉ）（ＤＡＲ８)、ＨＥＲ２−ＡＤＣ（Ｉ）（ＤＡＲ４）、及びＨＥＲ２−ＡＤＣ（Ｉ）（ＤＡＲ２）に対する反応性及び検量線をＧｙｒｏｌａｂ  ｘＰ  ｗｏｒｋｓｔａｔｉｏｎ（ＧＹＲＯＳ  ＰＲＯＴＥＩＮ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で確認した。キャプチャー試薬はＢｉｏｔｉｎ−ＳＰ−ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ  ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅ  Ｇｏａｔ  Ａｎｔｉ−Ｍｏｕｓｅ  ＩｇＧ，  Ｆｃγ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＩＥＳ、ＩＮＣ．）を用い、０．０１％ＰＳ２０含有ＰＢＳで１７２．５ｎＭに調製した。細胞培養上清はＲｅｘｘｉｐ  ＣＣＳ（ＧＹＲＯＳ  ＰＲＯＴＥＩＮ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で２００ｎｇ／ｍＬに調製した。ＨＥＲ２−ＡＤＣ（Ｉ）（ＤＡＲ８)、ＨＥＲ２−ＡＤＣ（Ｉ）（ＤＡＲ４）、及びＨＥＲ２−ＡＤＣ（Ｉ）（ＤＡＲ２）は０．０１％ＰＳ２０含有ＰＢＳでいずれも１０００ｎｇ/ｍＬから４倍公比で６段階に希釈し調製した。検出試薬はＧｏａｔ  Ａｎｔｉ  Ｈｕｍａｎ  ｋａｐｐａ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．）をＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７ラベリングキット（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｉｎｃ．）で標識したものを用い、Ｒｅｘｘｉｐ  Ｆで１０ｎＭに調製した。上記に調製した試薬、細胞培養上清及び検量線試料を９６ウェルＰＣＲプレートに入れ、Ｇｙｒｏｌａｂ  Ｂｉｏａｆｆｙ  ２００とともに  Ｇｙｒｏｌａｂ  ｘＰ  ｗｏｒｋｓｔａｔｉｏｎにセットして、４−Ｓｔｅｐ（２ｘＣ）−Ａ−Ｄ（ｗｉｚａｒｄ   ｍｅｔｈｏｄ）で測定した。検量線はＧｙｒｏｌａｂ Ｅｖａｌｕａｔｏｒ Ｓｏｆｔｗａｒｅ を用いて４−パラメータロジスティックモデル（重み付け；Ｒｅｓｐｏｎｓｅ）で回帰した。評価した１８クローンはいずれもＨＥＲ２−ＡＤＣ（Ｉ）のＤＡＲに依存せず、また、株間の反応性の違いも認められなかったため、同一株でＩｇＧ濃度が高い３クローン（１Ａ３、８Ｂ２、１１Ｂ１）を選択して、少量生産を行った。【０２５０】
ｘｉｉｉ）  ＰｒｏｔｅｉｎＡ精製抗体の調製とクロスチェック
ｘｉｉ）で選択した３クローン（１Ａ３、８Ｂ２、１１Ｂ１）について、無血清培地（ＡＳＦ１０４（Ｎ））でローラーボトル培養し、培養上清を回収後に０．４５μｍのフィルターでろ過してＰｒｏｔｅｉｎＡカラムで精製した。抗原蛋白質（２）を５０ｎｇ／ｗｅｌｌ／５０μＬ添加して固相化したＥＬＩＳＡ用イムノプレートに、ＰｒｏｔｅｉｎＡ精製した３クローンを５μｇ／ｍＬから２倍公比で１０段階希釈した溶液５０μＬを添加して３７℃で３０分間反応させた。洗浄後、ａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ  ＩｇＧ−ＨＲＰを３７℃で３０分間反応させた。洗浄後、ＯＰＤ溶液を添加し、発色停止後に４９０ｎｍの吸光度を測定した。いずれのＰｒｏｔｅｉｎＡ精製抗体も抗原蛋白質（２）と良好な反応性を示した。【０２５１】
ｘｉｖ）  ＰｒｏｔｅｉｎＡ精製抗体の検量線確認
ｘｉｉｉ）でＰｒｏｔｅｉｎＡ精製した３クローン（１Ａ３、８Ｂ２、１１Ｂ１）について、ＨＥＲ２−ＡＤＣ（Ｉ）（ＤＡＲ８）、及びＨＥＲ２−ＡＤＣ（Ｉ）（ＤＡＲ４）、並びに、Ｂ７−Ｈ３−ＡＤＣ（Ｉ）（ＤＡＲ８）、及びＢ７−Ｈ３−ＡＤＣ（Ｉ）（ＤＡＲ４）に対する反応性をＧｙｒｏｌａｂ  ｘＰ  ｗｏｒｋｓｔａｔｉｏｎを用いて確認した。【０２５２】
キャプチャー試薬は、ＰｒｏｔｅｉｎＡ精製後の３クローンをＥＺ−Ｌｉｎｋ  ＮＨＳ−ＬＣ−Ｂｉｏｔｉｎ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｉｎｃ．）でビオチン標識したものを用い、０．０１％ＰＳ２０含有ＰＢＳで７００ｎＭに調製した。ＨＥＲ２−ＡＤＣ（Ｉ）（ＤＡＲ８）とＨＥＲ２−ＡＤＣ（Ｉ）（ＤＡＲ４）はＲｅｘｘｉｐ  ＨＮで、いずれも１０００ｎｇ/ｍＬから４倍公比で６段階に希釈し調製した。検出試薬はＧｏａｔ  Ａｎｔｉ  Ｈｕｍａｎ  ｋａｐｐａ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ、Ｉｎｃ．）をＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７ラベリングキットで標識したものを用い、Ｒｅｘｘｉｐ  Ｆで１０ｎＭに調製した。調製した試薬及び抗体−薬物コンジュゲート（検量線試料）を９６ウェルＰＣＲプレートに入れ、Ｇｙｒｏｌａｂ  Ｂｉｏａｆｆｙ  ２００とともに  Ｇｙｒｏｌａｂ  ｘＰ  ｗｏｒｋｓｔａｔｉｏｎにセットして、２００−３Ｗ−００１−Ａ（ｗｉｚａｒｄ   ｍｅｔｈｏｄ）で測定した。検量線はＧｙｒｏｌａｂ Ｅｖａｌｕａｔｏｒ Ｓｏｆｔｗａｒｅ を用いて４−パラメータロジスティックモデル（重み付け；Ｒｅｓｐｏｎｓｅ）で回帰した。クローン１Ａ３の検量線を図１５に、クローン８Ｂ２の検量線を図１６に、クローン１１Ｂ１の検量線を図１７に示す。いずれのクローンについてもＨＥＲ２−ＡＤＣ（Ｉ）との間でＤＡＲに依存しない反応性を示した。【０２５３】
さらにキャプチャー試薬として、ＥＺ−Ｌｉｎｋ  ＮＨＳ−ＬＣ−Ｂｉｏｔｉｎでビオチン標識したＨｕｍａｎ  Ｈｅｒ２／ＥｒｂＢ２  Ｐｒｏｔｅｉｎ（ＡＣＲＯＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、及び同様にビオチン標識したＢ７−Ｈ３ Ｃ１ ｄｏｍａｉｎを用い、０．０１％ＰＳ２０含有ＰＢＳで７００ｎＭに調製した。ＨＥＲ２−ＡＤＣ（Ｉ）（ＤＡＲ８）及びＨＥＲ２−ＡＤＣ（Ｉ）（ＤＡＲ４）、並びにＢ７−Ｈ３−ＡＤＣ（Ｉ）（ＤＡＲ８）及びＢ７−Ｈ３−ＡＤＣ（Ｉ）（ＤＡＲ４）についてはＲｅｘｘｉｐ  ＨＮで、いずれも１０００ｎｇ/ｍｌから４倍公比で６段階に希釈し調製した。検出試薬はＰｒｏｔｅｉｎＡ精製後の３クローン（１Ａ３、８Ｂ２、１１Ｂ１）をＤｙＬｉｇｈｔ６５０（登録商標）ラベリングキット（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｉｎｃ．）で標識したものを用い、Ｒｅｘｘｉｐ  Ｆで１０ｎＭに調製した。調製した試薬及び抗体−薬物コンジュゲートの検量線試料を９６ウェルＰＣＲプレートに入れ、Ｇｙｒｏｌａｂ  Ｂｉｏａｆｆｙ  ２００とともに  Ｇｙｒｏｌａｂ  ｘＰ  ｗｏｒｋｓｔａｔｉｏｎにセットして、２００−３Ｗ−００１−Ａ（ｗｉｚａｒｄ   ｍｅｔｈｏｄ）で測定した。検量線はＧｙｒｏｌａｂ Ｅｖａｌｕａｔｏｒ Ｓｏｆｔｗａｒｅ を用いて４−パラメータロジスティックモデル（重み付け；Ｒｅｓｐｏｎｓｅ）で回帰した。ＨＥＲ２−ＡＤＣ（Ｉ）との反応性について、クローン１Ａ３の検量線を図１８に、クローン８Ｂ２の検量線を図１９に、クローン１１Ｂ１の検量線を図２０に示す。また、Ｂ７−Ｈ３−ＡＤＣ（Ｉ）との反応性について、クローン１Ａ３の検量線を図２１に、クローン８Ｂ２の検量線を図２２に、クローン１１Ｂ１の検量線を図２３に示す。いずれのクローンについてもＨＥＲ２−ＡＤＣ（Ｉ）及びＢ７−Ｈ３−ＡＤＣ（Ｉ）との間でＤＡＲに依存しない反応性を示した。【０２５４】
以上の結果から、いずれのクローンについてもＤＡＲ並びに抗体部分の違いに依存せずに抗体−薬物コンジュゲートに対する反応性を示し、かつキャプチャー試薬と検出試薬のどちらにも使用可能であることが確認された。この中から最もシグナル値の大きかったクローン１Ａ３を選択し、本発明に係る抗体−薬物コンジュゲートの検出に使用することにした。【０２５５】
ｘｖ）  マウスモノクローナル抗体のアイソタイプ決定
ｘｉｖ）で取得したクローン１Ａ３に係るマウスモノクローナル抗体（以下、「マウス抗体１Ａ３」と呼ぶ）のアイソタイプは、Ｍｏｕｓｅ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ｉｓｏｔｙｐｉｎｇ  ｔｅｓｔ  ｋｉｔ（ＡｂＤ  Ｓｅｒｏｔｅｃ社製）により決定された。その結果、アイソタイプはＩｇＧ２ｂ、κ鎖であることが確認された。【０２５６】
ｘｖｉ）  モノクローナル抗体の遺伝子クローニング及びＮ末端アミノ酸配列解析
マウス抗体１Ａ３産生ハイブリドーマより、ＴＲＩｚｏｌ  Ｒｅａｇｅｎｔ（ＬＩＦＥ  ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＩＥＳ）を用いてｔｏｔａｌ  ＲＮＡを調製した。精製したマウス抗体１Ａ３のＮ末端アミノ酸配列解析（Ｅｄｍａｎ分解法）を実施した。さらに抗体遺伝子クローニングにより、クローン１Ａ３のヌクレオチド配列を解析した。抗体遺伝子クローニングの結果、重鎖可変領域・軽鎖可変領域ともにそれぞれ１種類の配列が得られ、精製したマウス抗体１Ａ３のＮ末端アミノ酸配列解析の結果と抗体遺伝子クローニングにより得られたクローン１Ａ３のヌクレオチド配列のＮ末端アミノ酸配列は一致することが確認された。【０２５７】
マウス抗体１Ａ３重鎖のアミノ酸配列を配列番号１５に記した。配列番号１５においてアミノ酸番号１乃至１９に記載のアミノ酸配列はシグナル配列を示し、アミノ酸番号２０乃至１４１に記載のアミノ酸配列は重鎖可変領域を示し、アミノ酸番号１４２乃至４７７に記載のアミノ酸配列は重鎖定常領域のアミノ酸配列を示す。【０２５８】
マウス抗体１Ａ３軽鎖のアミノ酸配列を配列番号１６に記した。配列番号１６においてアミノ酸番号１乃至２０に記載のアミノ酸配列はシグナル配列を示し、アミノ酸番号２１乃至１２７に記載のアミノ酸配列は軽鎖可変領域を示し、アミノ酸番号１２８乃至２３４に記載のアミノ酸配列は軽鎖定常領域のアミノ酸配列を示す。【０２５９】
マウス抗体１Ａ３重鎖のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を配列番号１７に記した。配列番号１７においてヌクレオチド番号１乃至５７に記載のヌクレオチド配列はシグナル配列を示し、ヌクレオチド番号５８乃至４２３に記載のヌクレオチド配列は重鎖可変領域のアミノ酸配列をコードする。【０２６０】
マウス抗体１Ａ３軽鎖のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を配列番号１８に記した。配列番号１８においてヌクレオチド番号１乃至６０に記載のヌクレオチド配列はシグナル配列を示し、ヌクレオチド番号６１乃至４５９に記載のヌクレオチド配列は重鎖可変領域のアミノ酸配列をコードする。【０２６１】
また、ＣＤＲの解析を行った。【０２６２】
Ａｂｍの定義によれば、マウス抗体１Ａ３重鎖可変領域は、配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ１（ＧＦＴＦＳＤＹＧＭＶ）、配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ２（ＹＩＳＳＧＳＳＡＩＹ）、及び配列番号３に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ３（ＰＰＲＹＤＶＹＳＡＷＦＡＹ）を保有しており、マウス抗体１Ａ３軽鎖可変領域は、配列番号４に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ１（ＫＡＳＱＤＶＧＳＡＶＶ）、配列番号５に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ２（ＷＡＳＴＲＨＴ）、及び配列番号６に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ３（ＱＱＹＳＳＹＰＶＴ）を保有していることが判明した。【０２６３】
Ｃｈｏｔｈｉａの定義によれば、マウス抗体１Ａ３重鎖可変領域は、配列番号７に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ１（ＧＦＴＦＳＤＹ）、配列番号８に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ２（ＳＳＧＳＳＡ）、及び配列番号３に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ３（ＰＰＲＹＤＶＹＳＡＷＦＡＹ）を保有しており、マウス抗体１Ａ３軽鎖可変領域は、配列番号４に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ１（ＫＡＳＱＤＶＧＳＡＶＶ）、配列番号５に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ２（ＷＡＳＴＲＨＴ）、及び配列番号６に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ３（ＱＱＹＳＳＹＰＶＴ）を保有していることが判明した。【０２６４】
Ｋａｂａｔの定義によれば、マウス抗体１Ａ３重鎖可変領域は、配列番号９に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ１（ＤＹＧＭＶ）、配列番号１０に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ２（ＹＩＳＳＧＳＳＡＩＹＹＡＤＴＶＫＧ）、及び配列番号３に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ３（ＰＰＲＹＤＶＹＳＡＷＦＡＹ）を保有しており、マウス抗体１Ａ３軽鎖可変領域は、配列番号４に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ１（ＫＡＳＱＤＶＧＳＡＶＶ）、配列番号５に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ２（ＷＡＳＴＲＨＴ）、及び配列番号６に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ３（ＱＱＹＳＳＹＰＶＴ）を保有していることが判明した。【０２６５】
Ｉｍｇｔ（登録商標）の定義によれば、マウス抗体１Ａ３重鎖可変領域は、配列番号１１に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ１（ＧＦＴＦＳＤＹＧ）、配列番号１２に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ２（ＩＳＳＧＳＳＡＩ）、及び配列番号１３に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＨ３（ＡＲＰＰＲＹＤＶＹＳＡＷＦＡＹ）を保有しており、マウス抗体１Ａ３軽鎖可変領域は、配列番号１４に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ１（ＱＤＶＧＳＡ）、ＷＡＳ（トリプトファン−アラニン−セリン）で示されるトリペプチドからなるＣＤＲＬ２、及び配列番号６に示されるアミノ酸配列からなるＣＤＲＬ３（ＱＱＹＳＳＹＰＶＴ）を保有していることが判明した。【０２６６】
［実施例４］  非臨床試験の血漿中濃度測定
実施例２で取得したマウス抗体１Ａ３を使用して、ＨＥＲ２−ＡＤＣ（Ｉ）のマウス血漿中濃度、並びにＨＥＲ３−ＡＤＣ（Ｉ）、ＴＲＯＰ２−ＡＤＣ（Ｉ）、及びＢ７−Ｈ３−ＡＤＣ（Ｉ）のサル血漿中濃度測定法を構築した。マウス抗体１Ａ３は検出試薬としてＤｙＬｉｇｈｔ６５０（登録商標）又はＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７標識して使用することが可能で、どちらを使用しても本発明に係る抗体−薬物コンジュゲートの血漿中濃度を測定することができる。さらにＤＡＲ並びに抗体部分の違いに依存せず検量線が作成でき、本発明に係る抗体−薬物コンジュゲートの血漿中濃度測定に使用可能である。【０２６７】
ｉ）  ＨＥＲ２−ＡＤＣ（Ｉ）
ＨＥＲ２−ＡＤＣ（Ｉ）のマウス血漿中濃度測定法をＧｙｒｏｌａｂ  ｘＰ  ｗｏｒｋｓｔａｔｉｏｎで構築した。キャプチャー試薬としてＢｉｏｔｉｎｙｌａｔｅｄ  Ｍｏｕｓｅ Ａｎｔｉ−（Ａｎｔｉ−ＨＥＲ２  Ａｂ） ｉｄｉｏｔｙｐｅ Ａｂ（ここで、「（Ａｎｔｉ−ＨＥＲ２  Ａｂ）」は、配列番号２１においてアミノ酸番号１乃至４４９に記載のアミノ酸配列からなる重鎖及び配列番号２２においてアミノ酸番号１乃至２１４に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖を含んでなる抗体を示す）（１３Ｃ１）（ＩＢＬ） を用い、０．１％ＰＳ２０含有ＰＢＳで３５０ ｎＭに調製した。検量線試料はＲｅｘｘｉｐ ＨＮで１００倍希釈したマウス血漿でＨＥＲ２−ＡＤＣ（Ｉ）の濃度が０、 ０．１５０、０．２００、０．６００、１．６０、４．００、１６．０、４０．０、１００、１４０μｇ／ｍＬ  になるように調製した。検出試薬はマウス抗体１Ａ３をＤｙＬｉｇｈｔ６５０（登録商標）ラベリングキットでラベル化したものを用い、Ｒｅｘｘｉｐ  Ｆで１０ｎＭ に調製した。これら調製した試薬及び検量線試料を９６ウェルＰＣＲプレートに入れ、Ｇｙｒｏｌａｂ  Ｂｉｏａｆｆｙ  ２００とともに  Ｇｙｒｏｌａｂ  ｘＰ  ｗｏｒｋｓｔａｔｉｏｎにセットした。測定ｗｉｚａｒｄは２００−３Ｗ−００２−Ａ（ＰＭＴ１）を使用した。回帰解析はＧｙｒｏｌａｂ  Ｅｖａｌｕａｔｏｒ  ３．３．９．１７５を用いて５−パラメータロジスティックモデルで行った。検量線を図２４に示す。【０２６８】
Ｔｏｔａｌ抗体（抗ＨＥＲ２抗体及びＨＥＲ２−ＡＤＣ（Ｉ））のマウス血漿中濃度測定法をＧｙｒｏｌａｂ  ｘＰ  ｗｏｒｋｓｔａｔｉｏｎで構築した。キャプチャー試薬としてＢｉｏｔｉｎｙｌａｔｅｄ  Ｍｏｕｓｅ Ａｎｔｉ−（Ａｎｔｉ−ＨＥＲ２  Ａｂ） ｉｄｉｏｔｙｐｅ Ａｂ （１３Ｃ１）  （ＩＢＬ） を用い、０．１％ＰＳ２０含有ＰＢＳで３５０ ｎＭに調製した。検量線試料はＲｅｘｘｉｐ ＨＮで１００倍希釈したマウス血漿でＨＥＲ２−ＡＤＣ（Ｉ）の濃度が０、 ０．１５０、０．２００、０．６００、１．６０、４．００、１６．０、４０．０、１００、１４０μｇ／ｍＬ  になるように調製した。検出試薬はＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７ ａｎｔｉ−ｈｕｍａｎ ＩｇＧ， Ｆｃγ Ａｎｔｉｂｏｄｙ (Ｊａｋｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｎｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ, Ｉｎｃ.)をＲｅｘｘｉｐ  Ｆで１０ｎＭ に調製した。これら調製した試薬及び検量線試料を９６ウェルＰＣＲプレートに入れ、Ｇｙｒｏｌａｂ  Ｂｉｏａｆｆｙ  ２００とともに  Ｇｙｒｏｌａｂ  ｘＰ  ｗｏｒｋｓｔａｔｉｏｎにセットした。測定ｗｉｚａｒｄは２００−３Ｗ−００２−Ａ（ＰＭＴ１）を使用した。回帰解析はＧｙｒｏｌａｂ  Ｅｖａｌｕａｔｏｒ  ３．３．９．１７５を用いて５−パラメータロジスティックモデルで行った。【０２６９】
濃度測定結果を表１に示す。【０２７０】
【表１】
2020022475.tif 000037
【０２７１】
ｉｉ）  ＨＥＲ３−ＡＤＣ（Ｉ）
ＨＥＲ３−ＡＤＣ（Ｉ）のサル血漿中濃度測定法をＧｙｒｏｌａｂ  ｘＰ  ｗｏｒｋｓｔａｔｉｏｎで構築し、バリデーションを取得した。キャプチャー試薬としてＥＺ−Ｌｉｎｋ  Ｓｕｌｆｏ−ＮＨＳ−ＬＣ−Ｂｉｏｔｉｎ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｉｎｃ．）でビオチン標識したＨＥＲ３（Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  Ｈｕｍａｎ  ＥｒｂＢ−３／ＨＥＲ３  Ｐｒｏｔｅｉｎ、ＡＣＲＯｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用い、０．１％ＰＳ２０含有ＰＢＳで７００ ｎＭに調製した。検量線試料はサル血漿でＨＥＲ３−ＡＤＣ（Ｉ）の濃度が０、０．０７５０、０．ｌ００、０．２５０、０．７５０、２．２５、６．７５、２０．０、３８．０、４８．０μｇ/ｍＬになるように調製したものを用い、さらにＰｏｌｙｓｏｒｂａｔｅ  ２０含有ＰＢＳ及びＲｅｘｘｉｐ ＡＮ（ＧＹＲＯＳ  ＰＲＯＴＥＩＮ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で１００倍希釈した。検出試薬はマウス抗体１Ａ３をＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７ラベリングキットでラベル化したものを用い、Ｒｅｘｘｉｐ  Ｆで１０ｎＭ に調製した。これら調製した試薬及び検量線試料を９６ウェルＰＣＲプレートに入れ、Ｇｙｒｏｌａｂ  ｘＰ  ｗｏｒｋｓｔａｔｉｏｎにセットした。測定ｗｉｚａｒｄは２００−３Ｗ−００２−Ａ（ＰＭＴ５）を使用した。回帰解析はＧｙｒｏｌａｂ  Ｅｖａｌｕａｔｏｒ  ３．３．７．１７１を用いて４−パラメータロジスティックモデル（重み：Ｒｅｓｐｏｎｓｅ）で行った。検量線を図２５に示す。【０２７２】
ｉｉｉ）  ＴＲＯＰ２−ＡＤＣ（Ｉ）
ＴＲＯＰ２−ＡＤＣ（Ｉ）のサル血漿中濃度測定法をＧｙｒｏｌａｂ  ｘＰ  ｗｏｒｋｓｔａｔｉｏｎで構築し、バリデーションを取得した。キャプチャー試薬としてＥＺ−Ｌｉｎｋ  Ｓｕｌｆｏ−ＮＨＳ−ＬＣ−Ｂｉｏｔｉｎでビオチン標識したｎｅｗ  ｈＴｒｏｐ２（Ｌｏｔ番号Ｖ３５、第一三共（株））を用い、０．１％ＰＳ２０含有ＰＢＳで３５０ｎＭに調製した。検量線試料はサル血漿でＴＲＯＰ２−ＡＤＣ（Ｉ）の濃度が０、０．００７５０、０．０１００、０．０２５０、０．０７５０、０．２５０、０．７５０、２．５０、７．５０、１０．０μｇ/ｍＬになるように調製したものを用い、さらにＲｅｘｘｉｐ ＨＮ（ＧＹＲＯＳ  ＰＲＯＴＥＩＮ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で１０倍希釈した。検出試薬はマウス抗体１Ａ３をＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７ラベリングキットでラベル化したものを用い、Ｒｅｘｘｉｐ  Ｆで１０ｎＭ に調製した。これら調製した試薬及び検量線試料を９６ウェルＰＣＲプレートに入れ、Ｇｙｒｏｌａｂ  ｘＰ  ｗｏｒｋｓｔａｔｉｏｎにセットした。測定ｗｉｚａｒｄは２００−３Ｗ−００２−Ａ（ＰＭＴ１）を使用した。回帰解析はＧｙｒｏｌａｂ  Ｅｖａｌｕａｔｏｒ  ３．３．７．１７１を用いて４−パラメータロジスティックモデル（重み：Ｒｅｓｐｏｎｓｅ）で行った。検量線を図２６に示す。【０２７３】
ｉｖ）  Ｂ７−Ｈ３−ＡＤＣ（Ｉ）
Ｂ７−Ｈ３−ＡＤＣ（Ｉ）のサル血漿中濃度測定法をＧｙｒｏｌａｂ  ｘＰ  ｗｏｒｋｓｔａｔｉｏｎで構築し、バリデーションを取得した。キャプチャー試薬としてＥＺ−Ｌｉｎｋ  Ｓｕｌｆｏ−ＮＨＳ−ＬＣ−Ｂｉｏｔｉｎ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｉｎｃ．）でビオチン標識したＢ７−Ｈ３  Ｃ１  ｄｏｍａｉｎ（Ｌｏｔ番号Ｂ７＿ＯｍＪ１、第一三共（株））を用い、０．１％ＰＳ２０含有ＰＢＳで７００ｎＭに調製した。検量線試料はサル血漿でＢ７−Ｈ３−ＡＤＣ（Ｉ）の濃度が０、０．０７５０、０．ｌ００、０．２５０、０．７５０、２．２５、６．７５、２０．０、３８．０、４８．０μｇ/ｍＬになるように調製したものを用い、さらにＰｏｌｙｓｏｒｂａｔｅ  ２０含有ＰＢＳ及びＲｅｘｘｉｐ ＨＮ（ＧＹＲＯＳ  ＰＲＯＴＥＩＮ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で５０倍希釈した。検出試薬はマウス抗体１Ａ３をＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７ラベリングキットでラベル化したものを用い、Ｒｅｘｘｉｐ  Ｆで１０ｎＭ に調製した。これら調製した試薬及び検量線試料を９６ウェルＰＣＲプレートに入れ、Ｇｙｒｏｌａｂ  ｘＰ  ｗｏｒｋｓｔａｔｉｏｎにセットした。測定ｗｉｚａｒｄは２００−３Ｗ−００１−Ａ（ＰＭＴ５）を使用した。回帰解析はＧｙｒｏｌａｂ  Ｅｖａｌｕａｔｏｒ  ３．３．７．１７１を用いて４−パラメータロジスティックモデル（重み：Ｒｅｓｐｏｎｓｅ）で行った。検量線を図２７に示す。【０２７４】
［実施例５］  マウス抗体１Ａ３を用いた免疫染色
ｉ）  ヒト由来皮下移植腫瘍を用いた染色性の確認
高度免疫不全マウス（ＮＯＧマウス）にヒト由来腫瘍を皮下移植する。本発明に係る抗体−薬物コンジュゲート投与後にその腫瘍組織を採取してパラフィン包埋標本を作製し、マウス抗体１Ａ３の染色性を検討する。本発明に係る抗体−薬物コンジュゲート未投与のＮＯＧマウスより採取した腫瘍組織を陰性対照とする。脱パラフィン及び抗原賦活はＡｕｔｏｓｔａｉｎｅｒ  Ｌｉｎｋ用前処理システム（ＰＴ  Ｌｉｎｋ：ＤＡＫＯ社製）及び、抗原賦活液（Ｔａｒｇｅｔ  Ｒｅｔｒｉｅｖａｌ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ  Ｌｏｗ  ｐＨ：ＤＡＫＯ社製）を用いて実施する。その後の染色作業は自動染色装置（ダコ  Ａｕｔｏｓｔａｉｎｅｒ  Ｌｉｎｋ４８：ＤＡＫＯ社製）を用いて実施する。ＥｎＶｉｓｉｏｎ  ＦＬＥＸ  ＷＡＳＨ  ＢＵＦＦＥＲ（ＤＡＫＯ社製）で洗浄した後、Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ  Ｂｌｏｃｋ  ３％  Ｈ２Ｏ２（ＤＡＫＯ社製）を加えインキュベートし、ＥｎＶｉｓｉｏｎ  ＦＬＥＸ  ＷＡＳＨ  ＢＵＦＦＥＲで洗浄する。Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｂｌｏｃｋ  ｓｅｒｕｍ  ｆｒｅｅ（ＤＡＫＯ社製）を加え、インキュベートし、Ａｉｒ  ｂｌｏｗで液を除去する。マウス抗体１Ａ３をＲＥＡＬ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｄｉｌｕｅｎｔ（ＤＡＫＯ社製）で希釈し、反応させる。ＥｎＶｉｓｉｏｎ  ＦＬＥＸ  ＷＡＳＨ  ＢＵＦＦＥＲで洗浄後、ＥｎＶｉｓｉｏｎ＋  Ｓｙｓｔｅｍ−ＨＲＰ  Ｌａｂｅｌｌｅｄ  Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ａｎｔｉ−Ｍｏｕｓｅ  ＃Ｋ４０００（ＤＡＫＯ社製）を加え、インキュベートした後、ＥｎＶｉｓｉｏｎ  ＦＬＥＸ  ＷＡＳＨ  ＢＵＦＦＥＲで洗浄する。【０２７５】
ＤＡＫＯ  Ｌｉｑｕｉｄ  ＤＡＢ＋Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ  Ｃｈｒｏｍｏｇｅｎ  Ｓｙｓｔｅｍを加えインキュベートした後、ＥｎＶｉｓｉｏｎ  ＦＬＥＸ  ＷＡＳＨ  ＢＵＦＦＥＲで洗浄する。ＥｎＶｉｓｉｏｎ  ＦＬＥＸ  Ｈｅｍａｔｏｘｙｌｉｎを加えインキュベートした後、ＥｎＶｉｓｉｏｎ  ＦＬＥＸ  ＷＡＳＨ  ＢＵＦＦＥＲ及びイオン交換水で洗浄する。【０２７６】
本発明に係る抗体−薬物コンジュゲートを投与されたＮＯＧマウスに対してマウス抗体１Ａ３は良好な染色性を示し、マウス抗体１Ａ３の濃度の増加に伴って染色強度が増加することを確認する。また、本発明に係る抗体−薬物コンジュゲート未投与のＮＯＧマウスに対してマウス抗体１Ａ３は染色性を示さないことを確認する。なお、ＮＯＧマウスはＢ細胞を欠損しているため、マウス由来の内在性ＩｇＧによるバックグラウンド染色は認められないことが知られている（Ito M, et al. Blood 100(9):3175-3182, 2002）。【０２７７】
ｉｉ）  マウス抗体１Ａ３の特異性確認
マウス抗体１Ａ３を化合物（２）又はＳＮ−３８とあらかじめ混合した後、免疫染色に用いる。混合比は分子量に基づいて抗体１Ａ３：化合物（２）：ＳＮ−３８＝０．１：０．０４：０．０３とする。染色はｉ）と同様の方法で実施する。【０２７８】
化合物（２）との混合によってマウス抗体１Ａ３の染色性が消失することを確認する。また、ＳＮ−３８との混合によってマウス抗体１Ａ３の染色性は消失しないことを確認する。【０２７９】
［実施例６］ウサギキメラ化抗体の作製
ｉ）  マウス抗体１Ａ３のウサギキメラ化抗体のデザイン
マウス抗体１Ａ３のウサギキメラ化抗体（以下、「ウサギキメラ化抗体１Ａ３」と呼ぶ）を以下の通りデザインした。ウサギキメラ化抗体の配列は、ウサギの重鎖定常領域ＩＧＨＧ＊０２とウサギの軽鎖定常領域ＩＧＫＣ２＊０１をＩＭＧＴ（登録商標）から参照して、クローン１Ａ３のそれぞれの可変領域につなげることで設計した。【０２８０】
ウサギキメラ化抗体１Ａ３重鎖のアミノ酸配列を配列番号１９に記した。配列番号１９においてアミノ酸番号１乃至１９に記載のアミノ酸配列はシグナル配列を示し、アミノ酸番号２０乃至１４１に記載のアミノ酸配列は重鎖可変領域を示し、アミノ酸番号１４２乃至４６４に記載のアミノ酸配列は重鎖定常領域のアミノ酸配列を示す。【０２８１】
ウサギキメラ化抗体１Ａ３軽鎖のアミノ酸配列を配列番号２０に記した。配列番号２０においてアミノ酸番号１乃至２０に記載のアミノ酸配列はシグナル配列を示し、アミノ酸番号２１乃至１２７に記載のアミノ酸配列は軽鎖可変領域を示し、アミノ酸番号１２８乃至２３３に記載のアミノ酸配列は軽鎖定常領域のアミノ酸配列を示す。【０２８２】
ｉｉ）  抗体発現ベクターｐＣＭＡ−ＬＫの構築
プラスミドｐｃＤＮＡ３．３−ＴＯＰＯ／ＬａｃＺ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を制限酵素ＸｂａＩ及びＰｍｅＩで消化して得られる約５．４ｋｂのフラグメントと、ヒト軽鎖シグナル配列及びヒトκ鎖定常領域のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列（配列番号２９）を有するＤＮＡ断片をＩｎ−Ｆｕｓｉｏｎ  Ａｄｖａｎｔａｇｅ  ＰＣＲクローニングキット（ＣＬＯＮＴＥＣＨ社）を用いて結合して、ｐｃＤＮＡ３．３／ＬＫを作製した。【０２８３】
ｐｃＤＮＡ３．３／ＬＫからネオマイシン発現ユニットを除去することによりｐＣＭＡ−ＬＫを構築した。【０２８４】
ｉｉｉ）  ウサギキメラ化抗体１Ａ３重鎖発現ベクターの構築
ウサギキメラ化抗体１Ａ３重鎖のアミノ酸配列（配列番号１９）をコードするヌクレオチド配列（配列番号３０）を有するＤＮＡ断片を合成した（ＧＥＮＥＡＲＴ社）。配列番号３０においてヌクレオチド番号２６乃至８２に記載のヌクレオチド配列はシグナル配列を示し、ヌクレオチド番号８３乃至４４８に記載のヌクレオチド配列は重鎖可変領域のアミノ酸配列をコードし、ヌクレオチド番号４４９乃至１４１７に記載のヌクレオチド配列は定常領域のアミノ酸配列をコードする。【０２８５】
Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ  ＨＤ  ＰＣＲクローニングキット（ＣＬＯＮＴＥＣＨ社）を用いて、合成したＤＮＡ断片とｐＣＭＡ−ＬＫをＸｂａＩ及びＰｍｅＩで消化して軽鎖シグナル配列及びヒトκ鎖定常領域のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列（配列番号２９）を取り除いたＤＮＡ断片を結合することにより、ウサギキメラ化抗体１Ａ３重鎖発現ベクターを構築した。【０２８６】
ｉｖ）  ウサギキメラ化抗体１Ａ３軽鎖発現ベクターの構築
ウサギキメラ化抗体１Ａ３軽鎖のアミノ酸配列（配列番号２０）をコードするヌクレオチド配列（配列番号３１）を有するＤＮＡ断片を合成した（ＧＥＮＥＡＲＴ社）。配列番号３１においてヌクレオチド番号２６乃至８５に記載のヌクレオチド配列はシグナル配列を示し、ヌクレオチド番号８６乃至４０６に記載のヌクレオチド配列は軽鎖可変領域のアミノ酸配列をコードし、ヌクレオチド番号４０７乃至７２４に記載のヌクレオチド配列は定常領域のアミノ酸配列をコードする。ｉｉｉ）と同様の方法でウサギキメラ化抗体１Ａ３軽鎖発現ベクターを構築した。【０２８７】
ｖ）  ウサギキメラ化抗体１Ａ３の生産
ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ  ２９３Ｆ細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）はマニュアルに従い、継代、培養をおこなった。対数増殖期の２．４×１０９個のＦｒｅｅＳｔｙｌｅ  ２９３Ｆ細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）をＯｐｔｉｍｕｍ  Ｇｒｏｗｔｈ  ５Ｌ  Ｆｌａｓｋ（Ｔｈｏｍｓｏｎ社）に播種し、ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ２９３  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｍｅｄｉｕｍ  （Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）で希釈して１．８８×１０６細胞／ｍＬに調製した。４０ｍＬのＯｐｔｉ−Ｐｒｏ  ＳＦＭ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）に０．４８ｍｇのウサギキメラ化抗体１Ａ３重鎖発現ベクターと０．７２ｍｇのウサギキメラ化抗体１Ａ３軽鎖発現ベクターと３．６ｍｇのＰｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅｉｍｉｎｅ（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅ  ＃２４７６５）を加えて穏やかに攪拌し、さらに５分間放置した後にＦｒｅｅＳｔｙｌｅ  ２９３Ｆ細胞に添加した。３７℃、８％ＣＯ２インキュベーターで４時間、９０ｒｐｍで振とう培養後に１２００ｍＬのＥＸ−ＣＥＬＬ  ＶＰＲＯ培地（ＳＡＦＣ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）、１８ｍＬのＧｌｕｔａＭＡＸ  Ｉ（ＧＩＢＣＯ社）、及び６０ｍＬのＹｅａｓｔｏｌａｔｅ  Ｕｌｔｒａｆｉｌｔｒａｔｅ（ＧＩＢＣＯ社）を添加し、３７℃、８％ＣＯ２インキュベーターで７日間、９０ｒｐｍで振とう培養して得られた培養上清をＤｉｓｐｏｓａｂｌｅ  Ｃａｐｓｕｌｅ  Ｆｉｌｔｅｒ  （Ａｄｖａｎｔｅｃ  ＃ＣＣＳ−０４５−Ｅ１Ｈ）でろ過することにより、ウサギキメラ化抗体１Ａ３を含む培養上清を得た。【０２８８】
ｖｉ）  ウサギキメラ化抗体１Ａ３の精製
ｖ）で得られた培養上清をｒＰｒｏｔｅｉｎ  Ａアフィニティークロマトグラフィーの１段階工程で精製した。培養上清をＰＢＳで平衡化したＭａｂＳｅｌｅｃｔＳｕＲｅが充填されたカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製）にアプライしたのちに、カラム容量の２倍以上のＰＢＳでカラムを洗浄した。次に２Ｍアルギニン塩酸塩溶液（ｐＨ４．０）で溶出し、抗体の含まれる画分を集めた。その画分を透析（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、Ｓｌｉｄｅ−Ａ−Ｌｙｚｅｒ  Ｄｉａｌｙｓｉｓ  Ｃａｓｓｅｔｔｅ）によりＰＢＳへのバッファー置換を行った。Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｌ  ＵＦ  Ｆｉｌｔｅｒ  Ｄｅｖｉｃｅ  ＶＩＶＡＳＰＩＮ２０（分画分子量ＵＦ１０Ｋ，Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ社）で抗体を濃縮し、ＩｇＧ濃度を２ｍｇ／ｍＬ以上に調製した。最後にＭｉｎｉｓａｒｔ−Ｐｌｕｓ  ｆｉｌｔｅｒ（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ社）でろ過し、ウサギキメラ化抗体１Ａ３の精製サンプルを得た。【０２８９】
［実施例７］抗体−薬物コンジュゲートの製造
ｉ）  抗ＧＰＲ２０抗体−薬物コンジュゲートの製造（１）
国際公開第２０１８／１３５５０１号に記載の製造方法に従って、抗ＧＰＲ２０抗体（配列番号３２においてアミノ酸番号２０乃至４７２に記載のアミノ酸配列からなる重鎖及び配列番号３３においてアミノ酸番号２１乃至２３４に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖を含んでなる抗体）を用いて、式【０２９０】
【化３５】
2020022475.tif 000038
【０２９１】
（式中、Ａは抗体との結合位置を示す）
で示される薬物リンカーと、抗ＧＰＲ２０抗体とがチオエーテル結合によって結合した抗ＧＰＲ２０抗体−薬物コンジュゲート（本発明において「ＧＰＲ２０−ＡＤＣ（Ｉ）」と称する）を製造した。【０２９２】
ｉｉ）  抗ＣＤＨ６抗体−薬物コンジュゲートの製造（１）
国際公開第２０１８／２１２１３６号に記載の製造方法に従って、抗ＣＤＨ６抗体（配列番号３４においてアミノ酸番号２０乃至４７１に記載のアミノ酸配列からなる重鎖及び配列番号３５においてアミノ酸番号２１乃至２３３に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖を含んでなる抗体）を用いて、式【０２９３】
【化３６】
2020022475.tif 000039
【０２９４】
（式中、Ａは抗体との結合位置を示す）
で示される薬物リンカーと、抗ＣＤＨ６抗体とがチオエーテル結合によって結合した抗ＣＤＨ６抗体−薬物コンジュゲート（本発明において「ＣＤＨ６−ＡＤＣ（Ｉ）」と称する）を製造した。【０２９５】
［実施例８］ウサギキメラ化抗体１Ａ３を用いた免疫染色
ｉ）  ヒト由来皮下移植腫瘍を用いたＴＲＯＰ２−ＡＤＣ（Ｉ）投与後の染色性の確認
免疫不全マウス（ヌードマウス）にヒト頭頸部がん細胞株ＦａＤｕを皮下移植した。ＴＲＯＰ２−ＡＤＣ（Ｉ）投与後にその腫瘍組織を採取してパラフィン包埋標本を作製し、ウサギキメラ化抗体１Ａ３の染色性を検討した。また、抗ＴＲＯＰ２抗体（配列番号２５においてアミノ酸番号２０乃至４７０に記載のアミノ酸配列からなる重鎖及び配列番号２６においてアミノ酸番号２１乃至２３４に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖を含んでなる抗体、以下、「Ａｎｔｉ−ＴＲＯＰ２  Ａｂ」と称する。）を投与したヌードマウスより採取した腫瘍組織を陰性対照とした。脱パラフィンおよび抗原賦活はＡｕｔｏｓｔａｉｎｅｒ  Ｌｉｎｋ用前処理システム（ＰＴ  Ｌｉｎｋ：ＤＡＫＯ社製）を用いて、抗原賦活液（Ｔａｒｇｅｔ  Ｒｅｔｒｉｅｖａｌ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ  Ｌｏｗ  ｐＨ：ＤＡＫＯ社製）を用いて、９７℃で４０分間実施した。その後の染色作業は自動染色装置（ダコ  Ａｕｔｏｓｔａｉｎｅｒ  Ｌｉｎｋ４８：ＤＡＫＯ社製）を用いて室温で実施した。ＥｎＶｉｓｉｏｎ  ＦＬＥＸ  ＷＡＳＨ  ＢＵＦＦＥＲ（ＤＡＫＯ社製）で１回洗浄した後、ＲＥＡＬ  Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ−Ｂｌｏｃｋｉｎｇ    Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ＤＡＫＯ社製）を加え５分間インキュベートし、ＥｎＶｉｓｉｏｎ  ＦＬＥＸ  ＷＡＳＨ  ＢＵＦＦＥＲで１回洗浄した。Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｂｌｏｃｋ  ｓｅｒｕｍ  ｆｒｅｅ（ＤＡＫＯ社製）を加え、３０分間インキュベートし、Ａｉｒ  ｂｌｏｗで液を除去した。ウサギキメラ化抗体１Ａ３をＲＥＡＬ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｄｉｌｕｅｎｔ（ＤＡＫＯ社製）で０．１μｇ／ｍＬに希釈し、３０分間反応させた。ＥｎＶｉｓｉｏｎ  ＦＬＥＸ  ＷＡＳＨ  ＢＵＦＦＥＲで３回洗浄後、ＥｎＶｉｓｉｏｎ＋  Ｓｙｓｔｅｍ−ＨＲＰ  Ｌａｂｅｌｌｅｄ  Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ａｎｔｉ−Ｒａｂｂｉｔ  （ＤＡＫＯ社製）を加え、３０分インキュベートした後、ＥｎＶｉｓｉｏｎ  ＦＬＥＸ  ＷＡＳＨ  ＢＵＦＦＥＲで２回洗浄した。【０２９６】
ＤＡＫＯ  Ｌｉｑｕｉｄ  ＤＡＢ＋Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ  Ｃｈｒｏｍｏｇｅｎ  Ｓｙｓｔｅｍを加え計１０分インキュベートした後、ＥｎＶｉｓｉｏｎ  ＦＬＥＸ  ＷＡＳＨ  ＢＵＦＦＥＲで１回洗浄した。ＥｎＶｉｓｉｏｎ  ＦＬＥＸ  Ｈｅｍａｔｏｘｙｌｉｎを加え５分間インキュベートした後、ＥｎＶｉｓｉｏｎ  ＦＬＥＸ  ＷＡＳＨ  ＢＵＦＦＥＲ及びイオン交換水で計３回洗浄した。【０２９７】
図３５に典型的な染色像を示す。ＴＲＯＰ２−ＡＤＣ（Ｉ）を投与された動物の皮下腫瘍組織に対してウサギキメラ化抗体１Ａ３は良好な染色性を示す一方、Ａｎｔｉ−ＴＲＯＰ２  Ａｂを投与された動物の皮下腫瘍組織に対してウサギキメラ化抗体１Ａ３は染色性を示さなかった。【０２９８】
ｉｉ）  ヒト由来皮下移植腫瘍を用いたＧＰＲ２０−ＡＤＣ（Ｉ）投与後の染色性の確認
免疫不全マウス（ヌードマウス）にＧＰＲ２０過剰発現ヒト消化管間質腫瘍細胞株ＧＩＳＴ−Ｔ１／ＧＰＲ２０を皮下移植した。ＧＰＲ２０−ＡＤＣ（Ｉ）投与後にその腫瘍組織を採取してパラフィン包埋標本を作製し、ウサギキメラ化抗体１Ａ３の染色性を検討した。また、ＧＰＲ２０−ＡＤＣ（Ｉ）非投与マウスより採取した腫瘍組織を陰性対照とした。ｉ）と同様の方法で染色を行った。【０２９９】
図３６に典型的な染色像を示す。ＧＰＲ２０−ＡＤＣ（Ｉ）投与動物の皮下腫瘍組織に対してウサギキメラ化抗体１Ａ３は良好な染色性を示す一方、ＧＰＲ２０−ＡＤＣ（Ｉ）非投与動物の皮下腫瘍組織に対してウサギキメラ化抗体１Ａ３は染色性を示さなかった。【０３００】
［実施例９］  マウス抗体１Ａ３を用いた免疫染色
ｉ）  ヒト由来皮下移植腫瘍を用いたＣＤＨ６−ＡＤＣ（Ｉ）投与後の染色性の確認
高度免疫不全マウス（ＮＯＧマウス）に淡明細胞型腎細胞癌患者より採取された腫瘍組織を皮下移植した。ＣＤＨ６−ＡＤＣ（Ｉ）投与後にその腫瘍組織を採取してパラフィン包埋標本を作製し、マウス抗体１Ａ３の染色性を検討した。また、ＣＤＨ６−ＡＤＣ（Ｉ）未投与のＮＯＧマウスより採取した腫瘍組織を陰性対照とした。脱パラフィンおよび抗原賦活はＡｕｔｏｓｔａｉｎｅｒ  Ｌｉｎｋ用前処理システム（ＰＴ  Ｌｉｎｋ：ＤＡＫＯ社製）を用いて、抗原賦活液（Ｔａｒｇｅｔ  Ｒｅｔｒｉｅｖａｌ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ  Ｌｏｗ  ｐＨ：ＤＡＫＯ社製）、９７℃で４０分間実施した。その後の染色作業は自動染色装置（ダコ  Ａｕｔｏｓｔａｉｎｅｒ  Ｌｉｎｋ４８：ＤＡＫＯ社製）を用いて室温で実施した。ＥｎＶｉｓｉｏｎ  ＦＬＥＸ  ＷＡＳＨ  ＢＵＦＦＥＲ（ＤＡＫＯ社製）で１回洗浄した後、Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ  Ｂｌｏｃｋ  ３％  Ｈ２Ｏ２（ＤＡＫＯ社製）を加え５分間インキュベートし、ＥｎＶｉｓｉｏｎ  ＦＬＥＸ  ＷＡＳＨ  ＢＵＦＦＥＲで１回洗浄した。Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｂｌｏｃｋ  ｓｅｒｕｍ  ｆｒｅｅ（ＤＡＫＯ社製）を加え、３０分間インキュベートし、Ａｉｒ  ｂｌｏｗで液を除去した。マウス抗体１Ａ３をＲＥＡＬ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｄｉｌｕｅｎｔ（ＤＡＫＯ社製）で０．０３μｇ／ｍＬ〜０．３μｇ／ｍＬに希釈し、６０分間反応させた。ＥｎＶｉｓｉｏｎ  ＦＬＥＸ  ＷＡＳＨ  ＢＵＦＦＥＲで３回洗浄後、ＥｎＶｉｓｉｏｎ＋  Ｓｙｓｔｅｍ−ＨＲＰ  Ｌａｂｅｌｌｅｄ  Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ａｎｔｉ−Ｍｏｕｓｅ  ＃Ｋ４０００（ＤＡＫＯ社製）を加え、３０分インキュベートした後、ＥｎＶｉｓｉｏｎ  ＦＬＥＸ  ＷＡＳＨ  ＢＵＦＦＥＲで２回洗浄した。【０３０１】
ＤＡＫＯ  Ｌｉｑｕｉｄ  ＤＡＢ＋Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ  Ｃｈｒｏｍｏｇｅｎ  Ｓｙｓｔｅｍを加え計１０分インキュベートした後、ＥｎＶｉｓｉｏｎ  ＦＬＥＸ  ＷＡＳＨ  ＢＵＦＦＥＲで１回洗浄した。ＥｎＶｉｓｉｏｎ  ＦＬＥＸ  Ｈｅｍａｔｏｘｙｌｉｎを加え５分間インキュベートした後、ＥｎＶｉｓｉｏｎ  ＦＬＥＸ  ＷＡＳＨ  ＢＵＦＦＥＲ及びイオン交換水で計３回洗浄した。【０３０２】
図３７に典型的な染色像を示す。ＣＤＨ６−ＡＤＣ（Ｉ）投与動物に対してマウス抗体１Ａ３は良好な染色性を示し、マウス抗体１Ａ３の濃度の増加に伴って染色強度が増加した。一方、ＣＤＨ６−ＡＤＣ（Ｉ）非投与動物に対してマウス抗体１Ａ３は染色性を示さなかった。なお、ＮＯＧマウスはＢ細胞を欠損しているため、マウス由来の内在性ＩｇＧによるバックグラウンド染色は認められていない（Ito M, et al. Blood 100(9):3175-3182, 2002）。【０３０３】
ｉｉ）  マウス抗体１Ａ３の特異性確認
マウス抗体１Ａ３を化合物（２）又はＳＮ−３８とあらかじめ混合した後、免疫染色に用いた。【０３０４】
なお、化合物（２）は、式【０３０５】
【化３７】
2020022475.tif 000040
【０３０６】
で表される化合物である。
ＳＮ−３８は、式【０３０７】
【化３８】
2020022475.tif 000041
【０３０８】
で表される化合物である。【０３０９】
混合比は分子量に基づいてマウス抗体１Ａ３：化合物（２）：ＳＮ−３８＝０．１：０．０４：０．０３とした。染色はｉ）と同様の方法で実施した。【０３１０】
図３８に典型的な染色像を示す。化合物（２）との混合によってマウス抗体１Ａ３の染色性は消失したが、ＳＮ−３８との混合ではマウス抗体１Ａ３の染色性は消失しなかった。このことから、マウス抗体１Ａ３が組織中の化合物（２）を特異的に認識していることが示された。【０３１１】
［実施例１０］  非臨床試験の血漿中濃度測定
ＧＰＲ２０−ＡＤＣ（Ｉ）のマウス血漿中濃度測定法をＧｙｒｏｌａｂ  ｘＰ  ｗｏｒｋｓｔａｔｉｏｎ（ＧＹＲＯＳ  ＰＲＯＴＥＩＮ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で構築した。キャプチャー試薬としてマウス抗体１Ａ３をラベリングキット（ＣｈｒｏｍａＬｉｎｋ  Ｂｉｏｔｉｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｌａｂｅｌｉｎｇ  Ｋｉｔ、Ｓｏｌｕｌｉｎｋ）でビオチンラベル化したものを用い、０．１％ＰＳ２０含有ＰＢＳで７００ｎＭに調製した。検量線試料はマウス血漿でＧＰＲ２０−ＡＤＣ（Ｉ）の濃度が、０、５、１０、２０、５０、ｌ００、２００、５００、１０００、２０００、５０００、１００００ｎｇ/ｍＬになるように調製したものをＲｅｘｘｉｐ  ＡＮ（ＧＹＲＯＳ  ＰＲＯＴＥＩＮ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で１０倍希釈した。検出試薬はＭｏｕｓｅ Ａｎｔｉ−（Ａｎｔｉ−ＧＰＲ２０  Ａｂ）（ここで、「（Ａｎｔｉ−ＧＰＲ２０  Ａｂ）」は、配列番号３２においてアミノ酸番号２０乃至４７２に記載のアミノ酸配列からなる重鎖及び配列番号３３においてアミノ酸番号２１乃至２３４に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖を含んでなる抗体を示す）ｉｄｉｏｔｙｐｅ Ａｂ（７１Ｃ１）（ＩＢＬ）をＤｙＬｉｇｈｔ６５０（登録商標）ラベリングキットでラベル化したものを用い、Ｒｅｘｘｉｐ  Ｆ（ＧＹＲＯＳ  ＰＲＯＴＥＩＮ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で１０ｎＭ に調製した。これら調製した試薬及び検量線試料を９６ウェルＰＣＲプレートに入れ、Ｇｙｒｏｌａｂ  ｘＰ  ｗｏｒｋｓｔａｔｉｏｎにセットした。Ｂｉｏａｆｆｙ２００を使用し、ｗｉｚａｒｄは２００−３Ｗ−００２−Ａ（ＰＭＴ１）で測定した。回帰解析はＧｙｒｏｌａｂ  Ｅｖａｌｕａｔｏｒ  ３．３．９．１７５を用いて４−パラメータロジスティックモデル（重み：Ｒｅｓｐｏｎｓｅ）で行った。検量線を図３９に示す。【０３１２】
［実施例１１］  臨床試験の血清中濃度測定
ＥＣＬを使用したＨＥＲ２−ＡＤＣ（Ｉ）のヒト血清中濃度測定法を構築した。マウス抗体１Ａ３をＨｉｇｈ  Ｂｉｎｄ  ｐｌａｔｅ（Ｍｅｓｏ  Ｓｃａｌｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、ＬＬＣ：ＭＳＤ）にコーティング後にプレートを洗浄した。ブロッキング緩衝液（ＢＳＡ入りのＰＳ２０含有ＰＢＳ）でブロッキング後に０、２００、４００、８００、１６００、３２００、６４００、１２８００、２００００および２５６００ｎｇ/ｍＬに調製したＨＥＲ２−ＡＤＣ（Ｉ）をアッセイ希釈液で１０００倍に希釈して検量線試料とした。さらに、ＥＺ−Ｌｉｎｋ  Ｓｕｌｆｏ−ＮＨＳ−ＬＣ−ＬＣ  Ｂｉｏｔｉｎ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｉｎｃ．）でビオチン標識したＢｉｏｔｉｎｙｌａｔｅｄ  Ｍｏｕｓｅ Ａｎｔｉ−（Ａｎｔｉ−ＨＥＲ２）ｉｄｉｏｔｙｐｅ Ａｂ（１３Ｃ１）（ＩＢＬ）とスルホタグストレプトアビジン（ＭＳＤ）をプレインキュベートして検出溶液を調製した。検量線試料添加後にインキュベートおよび洗浄したプレートに検出溶液を加え、複合体を形成させた。４×Ｒｅａｄ  Ｂｕｆｆｅｒ  Ｔ（ＭＳＤ）を精製水で２倍希釈し、洗浄後のプレートに添加してＭＳＤ ＳＥＣＴＯＲ Ｉｍａｇｅｒ ６０００（コントロールソフト：ＭＳＤ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ｗｏｒｋｂｅｎｃｈ  Ｖｅｒｓｉｏｎ  ３．０．１８）で測定した。回帰解析は４−パラメータロジスティックモデル（重み：１/Ｒｅｓｐｏｎｓｅ２）で行った。検量線を図４０に示す。【０３１３】
［実施例１２］  マウス抗体１Ａ３が認識する化学構造の検証
マウス抗体１Ａ３が認識する化学構造をＧｙｒｏｌａｂ  ｘＰ  ｗｏｒｋｓｔａｔｉｏｎ（ＧＹＲＯＳ  ＰＲＯＴＥＩＮ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いてＨＥＲ２−ＡＤＣ（Ｉ）の競合阻害により検証した。競合阻害用化合物としては、化合物（１）、化合物（２）、化合物（７）、化合物（８）、化合物（９）、化合物（１０）、化合物（１１）、Ｔｏｐｏｔｅｃａｎ、及びＲｕｂｉｔｅｃａｎを選定した。【０３１４】
なお、化合物（１）は、式【０３１５】
【化３９】
2020022475.tif 000042
【０３１６】
で表される化合物である。
化合物（２）は、式【０３１７】
【化４０】
2020022475.tif 000043
【０３１８】
で表される化合物である。
化合物（７）は、式【０３１９】
【化４１】
2020022475.tif 000044
【０３２０】
で表される化合物である。
化合物（８）は、式【０３２１】
【化４２】
2020022475.tif 000045
【０３２２】
で表される化合物である。
化合物（９）は、式【０３２３】
【化４３】
2020022475.tif 000046
【０３２４】
で表される化合物である（Sugimori M. et al., J Med. Chem. 1994, 3033-3039）。
化合物（１０）は、式【０３２５】
【化４４】
2020022475.tif 000047
【０３２６】
で表される化合物である（米国特許第５８３４４７６号）。
化合物（１１）は、式【０３２７】
【化４５】
2020022475.tif 000048
【０３２８】
で表される化合物である（Atsumi R. et al., Arzneimittel-Forschung 2001, 253-257）。
Ｔｏｐｏｔｅｃａｎは、式【０３２９】
【化４６】
2020022475.tif 000049
【０３３０】
で表される化合物である。
Ｒｕｂｉｔｅｃａｎは、式【０３３１】
【化４７】
2020022475.tif 000050
【０３３２】
で表される化合物である。【０３３３】
キャプチャー試薬としてマウス抗体１Ａ３をラベリングキット（ＣｈｒｏｍａＬｉｎｋ  Ｂｉｏｔｉｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  ＬＡＢＥＬＩＮＧ  Ｋｉｔ、Ｓｏｌｕｌｉｎｋ）でビオチンラベル化したものを用い、０．１％ＰＳ２０含有ＰＢＳで７００ｎＭに調製した。競合阻害用化合物である、化合物（１）、化合物（２）、化合物（７）、化合物（８）、化合物（９）、化合物（１０）、化合物（１１）、Ｔｏｐｏｔｅｃａｎ、及びＲｕｂｉｔｅｃａｎをそれぞれＤＭＳＯに溶解後、１０％または２０％ＤＭＳＯ  ｉｎ  Ｒｅｘｘｉｐ  ＨＮ（ＧＹＲＯＳ  ＰＲＯＴＥＩＮ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で希釈し、０、１および１００ μｇ/ｍＬに調製後に７００ ｎＭのマウス抗体１Ａ３溶液を等量加えて混和し、室温・暗所で1時間以上反応させた。ＨＥＲ２−ＡＤＣ（Ｉ）はＲｅｘｘｉｐ  ＨＮで、０、０．２４４、０．９７７、３．９１、１５．６、６２．５、２５０、１０００ｎｇ/ｍＬに調製した。検出試薬はＭｏｕｓｅ  Ａｎｔｉ−（Ａｎｔｉ−ＨＥＲ２  Ａｂ）ｉｄｉｏｔｙｐｅ  Ａｂ（１３Ｃ１）（ＩＢＬ）をＤｙＬｉｇｈｔ６５０（登録商標）ラベリングキットでラベル化したものを用い、Ｒｅｘｘｉｐ  Ｆ（ＧＹＲＯＳ  ＰＲＯＴＥＩＮ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で１０ｎＭ に調製した。上記の溶液をＧｙｒｏｌａｂ  ｘＰ  ｗｏｒｋｓｔａｔｉｏｎにセットし、Ｇｙｒｏｌａｂ  Ｂｉｏａｆｆｙ  ２００を用いて２００−３Ｗ−００２−Ａ（ＰＭＴ５）で測定した。回帰解析はＧｙｒｏｌａｂ  Ｅｖａｌｕａｔｏｒ  ３．４．０．２４を用いて４−パラメータロジスティックモデル（重み：Ｒｅｓｐｏｎｓｅ）で行った。競合阻害用化合物の濃度ごとにＨＥＲ２−ＡＤＣ（Ｉ）の検量線を作製し、ＨＥＲ２−ＡＤＣ（Ｉ）濃度の２５０ｎｇ／ｍＬ時のＲｅｓｐｏｓｅを化合物非添加（濃度０ｎｇ/ｍＬ）に比較した阻害率（％）を算出した。【０３３４】
阻害率グラフを図４１に示す。化合物（１）、化合物（２）、化合物（７）、及び化合物（９）は強い競合阻害を示した。一方、化合物（８）、化合物（１０）、化合物（１１）、Ｔｏｐｏｔｅｃａｎ、及びＲｕｂｉｔｅｃａｎは競合阻害を示さなかった。この結果から、マウス抗体１Ａ３は、化合物（１）の基本骨格からなり４位のメチル基が保持された化学構造を特異的に認識することが示された。
【配列表フリーテキスト】
【０３３５】
配列番号１：ＣＤＲＨ１
配列番号２：ＣＤＲＨ２
配列番号３：ＣＤＲＨ３
配列番号４：ＣＤＲＬ１
配列番号５：ＣＤＲＬ２
配列番号６：ＣＤＲＬ３
配列番号７：ＣＤＲＨ１
配列番号８：ＣＤＲＨ２
配列番号９：ＣＤＲＨ１
配列番号１０：ＣＤＲＨ２
配列番号１１：ＣＤＲＨ１
配列番号１２：ＣＤＲＨ２
配列番号１３：ＣＤＲＨ３
配列番号１４：ＣＤＲＬ１
配列番号１５：マウス抗体１Ａ３重鎖のアミノ酸配列
配列番号１６：マウス抗体１Ａ３軽鎖のアミノ酸配列
配列番号１７：マウス抗体１Ａ３重鎖可変領域のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列
配列番号１８：マウス抗体１Ａ３軽鎖可変領域のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列
配列番号１９：ウサギキメラ化抗体１Ａ３重鎖のアミノ酸配列
配列番号２０：ウサギキメラ化抗体１Ａ３軽鎖のアミノ酸配列
配列番号２１：抗ＨＥＲ２抗体重鎖のアミノ酸配列
配列番号２２：抗ＨＥＲ２抗体軽鎖のアミノ酸配列
配列番号２３：抗ＨＥＲ３抗体重鎖のアミノ酸配列
配列番号２４：抗ＨＥＲ３抗体軽鎖のアミノ酸配列
配列番号２５：抗ＴＲＯＰ２抗体重鎖のアミノ酸配列
配列番号２６：抗ＴＲＯＰ２抗体軽鎖のアミノ酸配列
配列番号２７：抗Ｂ７−Ｈ３抗体重鎖のアミノ酸配列
配列番号２８：抗Ｂ７−Ｈ３抗体軽鎖のアミノ酸配列
配列番号２９：ヒト軽鎖シグナル配列及びヒトκ鎖定常領域のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列
配列番号３０：ウサギキメラ化抗体１Ａ３重鎖のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列
配列番号３１：ウサギキメラ化抗体１Ａ３軽鎖のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列
配列番号３２：抗ＧＰＲ２０抗体重鎖のアミノ酸配列
配列番号３３：抗ＧＰＲ２０抗体軽鎖のアミノ酸配列
配列番号３４：抗ＣＤＨ６抗体重鎖のアミノ酸配列
配列番号３５：抗ＣＤＨ６抗体軽鎖のアミノ酸配列
【図１】
2020022475.tif 000063
【図２】
2020022475.tif 000064
【図３】
2020022475.tif 000065
【図４】
2020022475.tif 000066
【図５】
2020022475.tif 000067
【図６】
2020022475.tif 000068
【図７】
2020022475.tif 000069
【図８】
2020022475.tif 000070
【図９】
2020022475.tif 000071
【図１０】
2020022475.tif 000072
【図１１】
2020022475.tif 000073
【図１２】
2020022475.tif 000074
【図１３】
2020022475.tif 000075
【図１４】
2020022475.tif 000076
【図１５】
2020022475.tif 000077
【図１６】
2020022475.tif 000078
【図１７】
2020022475.tif 000079
【図１８】
2020022475.tif 000080
【図１９】
2020022475.tif 000081
【図２０】
2020022475.tif 000082
【図２１】
2020022475.tif 000083
【図２２】
2020022475.tif 000084
【図２３】
2020022475.tif 000085
【図２４】
2020022475.tif 000086
【図２５】
2020022475.tif 000087
【図２６】
2020022475.tif 000088
【図２７】
2020022475.tif 000089
【図２８】
2020022475.tif 000090
【図２９】
2020022475.tif 000091
【図３０】
2020022475.tif 000092
【図３１】
2020022475.tif 000093
【図３２】
2020022475.tif 000094
【図３３】
2020022475.tif 000095
【図３４】
2020022475.tif 000096
【図３５】
2020022475.tif 000097
【図３６】
2020022475.tif 000098
【図３７】
2020022475.tif 000099
【図３８】
2020022475.tif 000100
【図３９】
2020022475.tif 000101
【図４０】
2020022475.tif 000102
【図４１】
2020022475.tif 000103
【配列表】
2020022475000001.app
【国際調査報告】
2020022475.tif 000104
2020022475.tif 000105
2020022475.tif 000106
2020022475.tif 000107
2020022475.tif 000108
2020022475.tif 000109