(57)【要約】  多能性幹細胞を、ＧＳＫ３β阻害剤を含む培地で培養する工程を含む、多能性幹細胞から体節細胞を製造する方法を提供する。体節細胞をＧＳＫ３β阻害剤およびＢＭＰを含む培地にて培養する工程を含む、体節細胞から真皮節細胞を製造する方法を提供する。硬節細胞を、ＦＧＦを含む培地で培養し、次いでＢＭＰおよびＴＧＦβを含む培地で培養する工程を含む、硬節細胞から靱帯節細胞を製造する方法を提供する。体節細胞を、ＦＧＦを含む培地で培養する工程を含む、体節細胞から間葉系間質細胞を製造する方法を提供する。また、上記方法並びに既知方法を適宜組み合わせて多能性幹細胞から体節細胞を経て筋節細胞、真皮節細胞、硬節細胞および靱帯節細胞を製造する方法を提供する。
2019177118.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
多能性幹細胞を提供する工程、および
多能性幹細胞を、ＧＳＫ３β阻害剤を含む培地で培養する工程を含む、多能性幹細胞から体節細胞を製造する方法。
【請求項２】
多能性幹細胞を、ＧＳＫ３β阻害剤を含む培地で培養する工程が、
（１）多能性幹細胞をＧＳＫ３β阻害剤を含む培地で培養して未分節中胚葉細胞培養物を得る工程、および
（２）未分節中胚葉細胞培養物を、ＧＳＫ３β阻害剤を含む培地で培養して体節細胞培養物を得る工程を含む、請求項１記載の方法。
【請求項３】
（２）の工程に用いる培地が、更にＴＧＦβ阻害剤を含む、請求項２記載の方法。
【請求項４】
ＧＳＫ３β阻害剤が、ＣＨＩＲ９９０２１である、請求項１〜３いずれかに記載の方法。
【請求項５】
（２）の工程におけるＣＨＩＲ９９０２１の濃度が、０．１μＭ〜５０μＭである、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
ＴＧＦβ阻害剤が、ＳＢ４３１５４２である、請求項３〜５何れかに記載の方法。
【請求項７】
（１）の工程の培養期間が１〜７日間、（２）の工程の培養期間が１〜７日間である、請求項２〜６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
（１）の工程の培養期間が４日間、（２）の工程の培養期間が４日間である、請求項２〜７のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
多能性幹細胞が、ヒト多能性幹細胞である、請求項１〜８いずれかに記載の方法。
【請求項１０】
多能性幹細胞が、ヒトｉＰＳ細胞である、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
請求項１〜１０いずれかに記載の方法で体節細胞を得、さらに（３）体節細胞をＧＳＫ３β阻害剤およびＢＭＰを含む培地にて培養する工程を含む、多能性幹細胞から皮筋節細胞を製造する方法。
【請求項１２】
請求項１１記載の方法で皮筋節細胞を得、さらに（４）皮筋節細胞をＧＳＫ３β阻害剤を含む培地で培養する工程を含む、多能性幹細胞から筋節細胞を製造する方法。
【請求項１３】
請求項１１記載の方法で皮筋節細胞を得、さらに（５）皮筋節細胞をＧＳＫ３β阻害剤およびＢＭＰを含む培地にて培養する工程を含む、多能性幹細胞から真皮節細胞を製造する方法。
【請求項１４】
体節細胞を提供する工程、および
体節細胞をＧＳＫ３β阻害剤およびＢＭＰを含む培地にて培養する工程を含む、体節細胞から真皮節細胞を製造する方法。
【請求項１５】
得られた真皮節細胞培養物を、ＦＡＣＳにより純化する工程をさらに含む、請求項１３または１４に記載の方法。
【請求項１６】
ＧＳＫ３β阻害剤が、ＣＨＩＲ９９０２１である、請求項１３〜１５いずれかに記載の方法。
【請求項１７】
ＢＭＰがＢＭＰ４である、請求項１３〜１６いずれかに記載の方法。
【請求項１８】
請求項１〜１０いずれかに記載の方法で体節細胞を得、さらに（６）体節細胞をソニックヘッジホッグ活性化剤およびＢＭＰ阻害剤を含む培地にて培養する工程を含む、多能性幹細胞から硬節細胞を製造する方法。
【請求項１９】
請求項１８に記載の方法で硬節細胞を得、さらに
（７−１）硬節細胞を、ＦＧＦを含む培地で培養する工程、および
（７−２）工程（７−１）で得られた細胞培養物を、ＢＭＰおよびＴＧＦβを含む培地で培養する工程を含む、多能性幹細胞から靱帯節細胞を製造する方法。
【請求項２０】
体節細胞を提供する工程、
（６）体節細胞をヘッジホッグ活性化剤およびＢＭＰ阻害剤を含む培地にて培養して硬節細胞を製造する工程、
（７−１）硬節細胞を、ＦＧＦを含む培地で培養する工程、および
（７−２）工程（７−１）で得られた細胞培養物を、ＢＭＰおよびＴＧＦβを含む培地で培養する工程を含む、体節細胞から靱帯節細胞を製造する方法。
【請求項２１】
硬節細胞を提供する工程、
（７−１）硬節細胞を、ＦＧＦを含む培地で培養する工程、および
（７−２）工程（７−１）で得られた細胞培養物を、ＢＭＰおよびＴＧＦβを含む培地で培養する工程を含む、硬節細胞から靱帯節細胞を製造する方法。
【請求項２２】
靱帯節細胞培養物を、ＦＡＣＳにより純化する工程をさらに含む、請求項１９〜２１いずれかに記載の靱帯節細胞を製造する方法。
【請求項２３】
（７−１）の工程に用いる培地が更にＴＧＦβを含む、請求項１９〜２２いずれかに記載の方法。
【請求項２４】
ＦＧＦがＦＧＦ８である、請求項１９〜２３いずれかに記載の方法。
【請求項２５】
ＢＭＰがＢＭＰ７である、請求項１９〜２４いずれかに記載の方法。
【請求項２６】
ＴＧＦβがＴＧＦβ３である、請求項１９〜２５いずれかに記載の方法。
【請求項２７】
請求項１〜１０いずれかに記載の方法で体節細胞を得、さらに
（８）体節細胞を、ＦＧＦを含む培地で培養する工程を含む、多能性幹細胞から間葉系間質細胞を製造する方法。
【請求項２８】
体節細胞を提供する工程、および
体節細胞を、ＦＧＦを含む培地で培養する工程を含む、体節細胞から間葉系間質細胞を製造する方法。
【請求項２９】
ＦＧＦがＦＧＦ２である、請求項２７または２８に記載の方法。
【請求項３０】
ゼノフリー条件下で誘導された多能性幹細胞を提供する工程、
（１）多能性幹細胞をＧＳＫ３β阻害剤を含む培地で培養して未分節中胚葉細胞培養物を得る工程、
（２）未分節中胚葉細胞培養物を、ＧＳＫ３β阻害剤を含む培地で培養して体節細胞培養物を得る工程、
（６）体節細胞をソニックヘッジホッグ活性化剤およびＢＭＰ阻害剤を含む培地で培養して硬節細胞培養物を得る工程、
（７−１）硬節細胞培養物を、ＦＧＦを含む培地で培養する工程、および
（７−２）工程（７−１）で得られた細胞培養物を、ＢＭＰおよびＴＧＦβを含む培地で培養する工程を含み、各工程がゼノフリー条件下で行われる、多能性幹細胞から靱帯節細胞を製造する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願は、多能性幹細胞から体節細胞の製造方法に関する。本願はまた、多能性幹細胞から製造された体節細胞を更に分化誘導することにより、多能性幹細胞から筋節細胞、真皮節細胞、硬節細胞、靱帯節細胞および間葉系間質細胞を製造する方法に関する。本願はまた、体節細胞から真皮節細胞、靱帯節細胞および間葉系間質細胞を製造する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
内因性シグナル伝達環境の再現は、多能性幹細胞（pluripotent stem cells, ＰＳＣ）からの所望の細胞種の誘導に重要だと考えられている。発生生物学の知見に基づいて、アクチビン／Ｎｏｄａｌ／ＴＧＦβシグナル伝達が、多能性幹細胞から中内胚葉への分化を誘導し、ＢＭＰシグナル伝達が多能性幹細胞から中胚葉への分化を誘導し、これらのシグナルの妨害が神経細胞を誘導することがわかっている(非特許文献１〜４）。【０００３】
注目すべきことに、アクチビン／Ｎｏｄａｌ／ＴＧＦβシグナル伝達およびＢＭＰシグナル伝達で誘導された中胚葉は、沿軸中胚葉（神経管と側板中胚葉との間に形成される、中胚葉のサブ集団）ではなく、主に側板中胚葉（中胚葉の側部（腹部）のサブ集団）からなることが報告されている。いくつかの治験が、アクチビン／Ｎｏｄａｌ／ＴＧＦβに基づくプロトコルの改変によって沿軸中胚葉を誘導するために行われたが、誘導の比率は相対的に低い（約２０％）ままであったと報告されている(非特許文献５)。【０００４】
近年、いくつかのグループが、異なる考えに基づく沿軸中胚葉の誘導の成功を報告している(非特許文献６〜９)。これらの報告では、神経（背側）となる運命へ誘導するため、細胞をアクチビン／Ｎｏｄａｌ／ＴＧＦβを含まない処理、またはＴＧＦβ阻害剤を含む処理を行っており、さらに相対的に高濃度のＧＳＫ３阻害剤（ＷＮＴシグナル伝達活性化剤）を用いている。これらのプロトコルを用いることで、沿軸中胚葉の誘導率は、約７０〜９５％に達した(非特許文献７および９）。この神経から沿軸中胚葉への変換は、胚形成において神経と沿軸中胚葉に共通の前駆体が存在することを示唆する(非特許文献１０および１１）。これらの前駆体は神経中胚葉前駆体または軸性中胚葉と呼ばれる。この理論は、Ｗｎｔ３ａノックアウトマウスにおいて、沿軸中胚葉の消失の代わりに異所性（二次）神経管の形成が認められる事実(非特許文献１２および非特許文献１２）によっても支持される。【０００５】
沿軸中胚葉およびその先の分化の誘導は達成できたが、依然として対処すべきいくつかの問題がある。脊椎動物の発生の過程において、沿軸中胚葉はまず、未分節中胚葉（ＰＳＭ）を後方に、体節（ＳＭ）を前方に形成する。体節は最終的に、背側が皮筋節（ＤＭ）に、腹側が硬節に分化する。皮筋節は真皮の前駆体である真皮節（Ｄ）および骨格筋の前駆体である筋節（ＭＹＯ）を生じ、硬節のサブ集団は、腱および靱帯の前駆体である靱帯節を形成する(非特許文献１４)。多能性幹細胞から誘導された体節細胞が完全なものであるというためには、誘導された体節細胞が、真皮節細胞、筋節細胞、硬節細胞および靱帯節細胞への分化能を示すことが重要である。上述の報告は、筋節細胞および硬節細胞の誘導には成功しているが、真皮節細胞および靱帯節細胞における誘導プロトコルは、未だ確立されていない。さらに、側板中胚葉は間葉系間質細胞（ＭＳＣ）の主要な供給源である(非特許文献１５)が、体節細胞もまた、間葉系間質細胞の供給源になり得る。しかしながら、多能性幹細胞から、沿軸中胚葉を介して間葉系間質細胞を誘導した報告はない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Bernardo, A.S., Faial, T., Gardner, L., Niakan, K.K., Ortmann, D., Senner, C.E., Callery, E.M., Trotter, M.W., Hemberger, M., Smith, J.C., et al. (2011). BRACHYURY and CDX2 mediate BMP-induced differentiation of human and mouse pluripotent stem cells into embryonic and extraembryonic lineages. Cell Stem Cell 9, 144-155.
【非特許文献２】Chambers, S.M., Fasano, C.A., Papapetrou, E.P., Tomishima, M., Sadelain, M., and Studer, L. (2009). Highly efficient neural conversion of human ES and iPS cells by dual inhibition of SMAD signaling. Nat Biotechnol 27, 275-280.
【非特許文献３】Fasano, C.A., Chambers, S.M., Lee, G., Tomishima, M.J., and Studer, L. (2010). Efficient derivation of functional floor plate tissue from human embryonic stem cells. Cell Stem Cell 6, 336-347.
【非特許文献４】Sumi, T., Tsuneyoshi, N., Nakatsuji, N., and Suemori, H. (2008). Defining early lineage specification of human embryonic stem cells by the orchestrated balance of canonical Wnt/beta-catenin, Activin/Nodal and BMP signaling. Development 135, 2969-2979.
【非特許文献５】Sakurai, H., Sakaguchi, Y., Shoji, E., Nishino, T., Maki, I., Sakai, H., Hanaoka, K., Kakizuka, A., and Sehara-Fujisawa, A. (2012). In vitro modeling of paraxial mesodermal progenitors derived from induced pluripotent stem cells. PLoS One 7, e47078.
【非特許文献６】Chal, J., Oginuma, M., Al Tanoury, Z., Gobert, B., Sumara, O., Hick, A., Bousson, F., Zidouni, Y., Mursch, C., Moncuquet, P., et al. (2015). Differentiation of pluripotent stem cells to muscle fiber to model Duchenne muscular dystrophy. Nat Biotechnol 33, 962-969.
【非特許文献７】Loh, K.M., Chen, A., Koh, P.W., Deng, T.Z., Sinha, R., Tsai, J.M., Barkal, A.A., Shen, K.Y., Jain, R., Morganti, R.M., et al. (2016). Mapping the Pairwise Choices Leading from Pluripotency to Human Bone, Heart, and Other Mesoderm Cell Types. Cell 166, 451-467.
【非特許文献８】Umeda, K., Zhao, J., Simmons, P., Stanley, E., Elefanty, A., and Nakayama, N. (2012). Human chondrogenic paraxial mesoderm, directed specification and prospective isolation from pluripotent stem cells. Sci Rep 2, 455.
【非特許文献９】Xi, H., Fujiwara, W., Gonzalez, K., Jan, M., Liebscher, S., Van Handel, B., Schenke-Layland, K., and Pyle, A.D. (2017). In Vivo Human Somitogenesis Guides Somite Development from hPSCs. Cell Rep 18, 1573-1585.
【非特許文献１０】Gouti, M., Delile, J., Stamataki, D., Wymeersch, F.J., Huang, Y., Kleinjung, J., Wilson, V., and Briscoe, J. (2017). A Gene Regulatory Network Balances Neural and Mesoderm Specification during Vertebrate Trunk Development. Developmental cell 41, 243-261 e247.
【非特許文献１１】Takemoto, T., Uchikawa, M., Yoshida, M., Bell, D.M., Lovell-Badge, R., Papaioannou, V.E., and Kondoh, H. (2011). Tbx6-dependent Sox2 regulation determines neural or mesodermal fate in axial stem cells. Nature 470, 394-398.
【非特許文献１２】Takada, S., Stark, K.L., Shea, M.J., Vassileva, G., McMahon, J.A., and McMahon, A.P. (1994). Wnt-3a regulates somite and tailbud formation in the mouse embryo. Genes & development 8, 174-189.
【非特許文献１３】Yoshikawa, Y., Fujimori, T., McMahon, A.P., and Takada, S. (1997). Evidence that absence of Wnt-3a signaling promotes neuralization instead of paraxial mesoderm development in the mouse. Developmental biology 183, 234-242.
【非特許文献１４】Brent, A.E., Schweitzer, R., and Tabin, C.J. (2003). A somitic compartment of tendon progenitors. Cell 113, 235-248.
【非特許文献１５】Sheng, G. (2015). The developmental basis of mesenchymal stem/stromal cells (MSCs). BMC developmental biology 15, 44.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本願は多能性幹細胞から体節細胞を製造する方法を提供することを目的とする。本願の別の目的は、体節細胞から真皮節細胞を製造する方法を提供することである。本願の更に別の目的は、体節細胞から靱帯節細胞を誘導する方法を提供することである。本願の更に別の目的は、体節細胞から間葉系間質細胞を誘導する方法を提供することである。【０００８】
本願はまた、多能性幹細胞から体節細胞を分化誘導し、体節細胞をさらに筋節細胞、真皮節細胞、硬節細胞および靱帯節細胞、並びに間葉系間質細胞へそれぞれ分化誘導することにより、多能性幹細胞から筋節細胞、真皮節細胞、硬節細胞、靱帯節細胞および間葉系間質細胞を誘導する方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本願の方法の全容（但し間葉系間質細胞の製造以外）を図１に示す。多能性幹細胞から、インビトロで未分節中胚葉（ＰＳＭ）を介して体節細胞（ＳＭ）を製造した。得られた体節細胞は、生体において体節から更に分化誘導されることが知られている、真皮節（Ｄ）、筋節（ＭＹＯ）、硬節（ＳＣＬ）および靱帯節（ＳＹＮ）それぞれに段階的にインビトロで分化させることができた。各誘導プロトコルを、決定した。なお、この図は、論文(Buckingham et al., 2003)から改変した図である。【００１０】
本願は多能性幹細胞を提供する工程、および
多能性幹細胞を、ＧＳＫ３β阻害剤を含む培地で培養する工程を含む、多能性幹細胞から体節細胞を製造する方法を提供する。本態様において、多能性幹細胞をＧＳＫ３β阻害剤を含む培地で培養する工程は好ましくは、
（１）多能性幹細胞をＧＳＫ３β阻害剤を含む培地で培養して未分節中胚葉細胞培養物を得る工程、および
（２）未分節中胚葉細胞培養物を、ＧＳＫ３β阻害剤を含む培地で培養して体節細胞培養物を得る工程を含んでいる。【００１１】
本願はまた、上記方法にて体節細胞を得、さらに（３）体節細胞をＧＳＫ３β阻害剤およびＢＭＰを含む培地にて培養する工程を含む、多能性幹細胞から皮筋節細胞を製造する方法を提供する。本願はさらに、（３）で得られた皮筋節細胞をＧＳＫ３β阻害剤を含む培地にて培養する工程（４）を含む、多能性幹細胞から筋節細胞を製造する方法を提供する。筋節細胞は、既知方法によって更なる分化を誘導し、骨格筋細胞を得ることができる。かかる多能性幹細胞から体節細胞、筋節細胞を経て骨格筋細胞を製造する方法もまた、本願に含まれる。【００１２】
本願はまた、体節細胞を提供する工程、および
体節細胞をＧＳＫ３β阻害剤およびＢＭＰを含む培地にて培養する工程（５）を含む、体節細胞から真皮節細胞を製造する方法を提供する。本態様において、体節細胞は多能性幹細胞から上記方法により製造された細胞であっても、他の方法で得られたものであってもよい。すなわち本態様によって、多能性幹細胞から真皮節細胞を製造する方法が提供される。真皮節細胞は既知方法にてさらに分化誘導して真皮細胞を得ることができる。本態様で得られる真皮節細胞をさらに分化誘導する工程を含む、真皮細胞を製造する方法もまた、本願に含まれる。【００１３】
本願はまた、上記方法で体節細胞を得、得られた体節細胞をソニックヘッジホッグ活性化剤およびＢＭＰ阻害剤を含む培地にて培養する工程（６）を含む、多能性幹細胞から硬節細胞を製造する方法を提供する。硬節細胞を更に既知方法にてさらに分化誘導して、骨、軟骨などを得る方法は知られている。多能性幹細胞から硬節細胞を介して骨、軟骨などを得る方法もまた、本願に含まれる。【００１４】
本願はまた、硬節細胞を提供する工程、
（７−１）硬節細胞を、ＦＧＦを含む培地で培養する工程、および
（７−２）工程（７−１）で得られた細胞培養物を、ＢＭＰおよびＴＧＦβを含む培地で培養する工程を含む、硬節細胞から靱帯節細胞を製造する方法を提供する。本態様において、硬節細胞は、本願の方法により体節細胞から製造されたものであってよく、この場合に体節細胞は本願の方法により多能性幹細胞から製造されたものであってよい。すなわち、本態様において、体節細胞から靱帯節細胞を製造する方法、および多能性幹細胞から靱帯節細胞を製造する方法が提供される。帯節細胞は既知方法にて更に分化誘導して腱、靱帯を製造することができる。本態様により靱帯節細胞を得、得られた靱帯節細胞を更に分化誘導して腱や靱帯を製造する方法もまた本願に含まれる。【００１５】
本願はさらに、体節細胞を提供する工程、および
体節細胞をＦＧＦを含む培地で培養する工程を含む、体節細胞から間葉系間質細胞を製造する方法を提供する。本態様における体節細胞は、多能性幹細胞から本願の方法によって誘導したものであっても、他の公知の方法で提供される細胞であってもよい。すなわち、本態様によって、多能性幹細胞から体節細胞を経て間葉性間質細胞を製造する方法が提供される。
本態様において得られる間葉系間質細胞を既知方法にて更に分化を誘導して、軟骨、骨、脂肪細胞を製造することができる。間葉系間質細胞を得、間葉系間質細胞の分化を更に誘導して軟骨、骨、脂肪細胞を製造する方法もまた、本願に含まれる。
【発明の効果】
【００１６】
本願によって、遺伝子導入をすることなく多能性幹細胞から体節細胞へと効率的に分化誘導することができる。本願によって得られる体節細胞は、皮筋節細胞、筋節細胞、硬節細胞、靱帯節細胞へとさらに誘導することができる。本願によって得られる体節細胞はまた、間葉系間質細胞へ誘導することができる。【００１７】
即ち、本願の方法によって遺伝子導入することなく多能性幹細胞から体節細胞を経て筋節細胞、皮筋節細胞、硬節細胞、靱帯節細胞および間葉系間質細胞を製造することができる。また、これらの細胞から更に分化誘導して真皮細胞、骨格筋細胞、骨、軟骨、腱および靱帯を得ることができる。【００１８】
本願の方法にて製造される細胞は、細胞移植治療などに応用することができる。例えば本願の方法に製造される細胞は、筋ジストロフィー、関節軟骨欠損、骨欠損、腱断裂などの筋骨格障害を治療するための細胞医療への利用が期待される。また、遺伝性疾患者の体細胞由来のｉＰＳ細胞から本願の方法によって製造される細胞は、かかる疾患の疾患モデルとして利用することができる。本願の方法にて得られる真皮節および真皮細胞は、皮膚科学研究や化粧品開発のためのモデルとして、あるいは細胞移植による皮膚創傷治療剤や皮膚疾患研究のための疾患モデルの作成に利用することができる。【００１９】
本願はまた、本願の方法によって多能性幹細胞から誘導された細胞を用いる、細胞移植治療方法を提供する。本願の方法は、筋ジストロフィー、関節軟骨欠損、骨欠損、腱断裂などの筋骨格障害の治療のために用いることができる。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】本願の方法の全容（但し間葉系間質細胞の製造を除く）を示す概略図。
【図２Ａ】ヒトｉＰＳ細胞から未分節中胚葉（ＰＳＭ）を経て体節細胞（ＳＭ）へ分化させ、体節細胞（ＳＭ）からさらに硬節細胞（ＳＣＬ）、靱帯節細胞（ＳＹＮ）への段階的分化、体節細胞（ＳＭ）から皮筋節細胞（ＤＭ）を経て筋節細胞（ＭＹＯ）並びに真皮節細胞（Ｄ）への段階的分化誘導の概略図。
【図２Ｂ】実施例１におけるヒトｉＰＳ細胞から未分節中胚葉細胞（ＰＳＭ）誘導のプロトコルの概略図を示す。
【図２Ｃ】未分節中胚葉細胞（ＰＳＭ）から体節細胞（ＳＭ）が形成される過程におけるＤＬＬ１およびＰＡＸ３の発現パターンを示す。
【図２Ｄ】未分節中胚葉細胞誘導の最適なプロトコルを決定するため、ヒトｉＰＳ細胞を種々の分化誘導条件にて培養して得た細胞を、ＦＡＣＳにてＤＬＬ１およびＰＡＸ３−ＧＦＰでソートした結果。図中の各記号は培地に添加した各成分を示す。Ｓ：ＳＢ４３１５４２ １０μＭ、Ｃ：ＣＨＩＲ９９０２１ １０μＭ、Ｄ：ＤＭＨ１ ２μＭ、Ｆ：ＦＧＦ２ ２０ｎｇ／ｍｌ。
【図２Ｅ】ｉＰＳ細胞および、未分節中胚葉細胞誘導培地での培養４日目の細胞の、ｉＰＳ細胞および未分節中胚葉細胞のマーカーについてのＲＴ−ｑＰＣＲ分析結果を示す。各細胞をＤＬＬ１でソーティングした細胞について遺伝子発現を分析した。エラーバーは平均値±ＳＥ（ｎ＝３）である。
【図２Ｆ】ｉＰＳ細胞から未分節中胚葉細胞へ誘導する際の、最適な培養日数を調べた結果。ｉＰＳ細胞をＳＣＤＦ条件（図２Ｄ）にて１〜５日培養した培養細胞のＤＬＬ１およびＰＡＸ３の発現をＦＡＣＳにて分析した。
【図２Ｇ】異なるｉＰＳ細胞株をＳＣＤＦ条件（図２Ｄ）にて4日間培養した培養細胞のＤＬＬ１の発現をＦＡＣＳにて分析した。
【図２Ｈ】無血清およびフィーダー細胞無しの条件下で維持されているｉＰＳ細胞株である１２３１Ａ３をＳＣＤＦ条件（図２Ｄ）にて４日間培養した培養細胞のＤＬＬ１の発現をＦＡＣＳにて分析した。
【００２１】
【図３Ａ】実施例２の未分節中胚葉細胞から体節細胞誘導のプロトコルの概略図。
【図３Ｂ】種々の濃度のＣおよびＳを含む培地で４日間培養した細胞のＤＬＬ１およびＰＡＸ−３ＧＦＰの発現をＦＡＣＳにて分析した。Ｓ１０：ＳＢ４３１５４２ １０μＭ、Ｃ１、Ｃ５およびＣ１０：それぞれＣＨＩＲ９９０２１ １、５および１０μＭ、Ｄ２：ＤＭＨ１  ２μＭ、Ｆ２０：ＦＧＦ２  ２０ｎｇ／ｍｌ。
【図３Ｃ】未分節中胚葉細胞から体節細胞を誘導する工程において、誘導前後の細胞マーカーの発現をＲＴ−ｑＰＣＲにて分析した。エラーバー：平均値±ＳＥ（ｎ＝３）
【図３Ｄ】体節細胞誘導の４日目（ｉＰＳ細胞培養開始からＤａｙ８）における、体節細胞特異的細胞マーカー遺伝子の発現をＲＴ−ｑＰＣＲにて分析した。エラーバー：平均値±ＳＥ（ｎ＝３）。Ｓ１０：ＳＢ４３１５４２ １０μＭ、Ｉ１０：ＩＷＲ１ １０μＭ、Ｃ５：ＣＨＩＲ９９０２１ ５μＭ。＊ｐ＜０．０５；＊＊＊ｐ＜０．００１（ダネットの多重比較ｔ検定）。ｎ．ｓ：有意差なし。
【００２２】
【図４Ａ】実施例３の体節細胞（ＳＭ）から、皮筋節細胞（ＤＭ）を介する、筋節細胞（ＭＹＯ）および真皮節細胞（Ｄ）への指向性分化誘導プロトコルの概略図。
【図４Ｂ】体節細胞（ＳＭ）から種々の濃度のＣＨＩＲ９９０２１およびＢＭＰ４を添加した皮筋節細胞誘導培地による培養３日目の細胞における種々のマーカー遺伝子の発現を、ＲＴ−ｑＰＣＲにて分析した。添加物なしの対照（φ、φ）と比較した、ダネットの多重比較ｔ検定による、＊＊＊ｐ＜０．００１
【図４Ｃ】皮筋節細胞への分化の指標となるＥＮ１の発現を、ｉＰＳ細胞を対照として用いてＦＡＣＳによって分析した。エラーバー：平均値±ＳＥ（ｎ＝３）。
【図４Ｄ】筋節細胞への分化の進行について、筋節細胞のマーカーであるＭＹＯＤ、ＭＹＯＧ、ＰＡＸ７および皮筋節細胞のマーカーであるＡＬＸ４の遺伝子の発現量をＲＴ−ｑＰＣＲで測定した。エラーバー：平均値±ＳＥ（ｎ＝３）。
【図４Ｅ】体節細胞（ＳＭ）、皮筋節細胞（ＤＭ）、真皮節細胞（Ｄ）、筋節細胞（ＭＹＯ）および皮膚繊維芽細胞（ＤＦ）マーカー遺伝子の経時的な発現量の変化をＲＴ−ｑＰＣＲで分析した。なお、左下グラフ（ＤＭ／Ｄマーカー）の右の縦軸はＥＮ１の相対的発現量の指標である。エラーバー：平均値±ＳＥ（ｎ＝３）。
【図４Ｆ】皮筋節細胞（ＤＭ）から真皮節細胞（Ｄ）への誘導の９日目のＥＮ１とＰＤＧＦＲａの発現をＦＡＣＳで調べた。３組の実験から、平均値±ＳＥを示す。ｉＰＳ細胞を対照集団として用いた。エラーバー：平均値±ＳＥ（ｎ＝３）。
【００２３】
【図５Ａ】体節細胞（ＳＭ）から、硬節細胞（ＳＣＬ）への誘導、および硬節細胞から靱帯節細胞（ＳＹＮ）および軟骨への分化誘導におけるプロトコルの概略図。
【図５Ｂ】体節細胞（ＳＭ）から硬節細胞（ＳＣＬ）への分化誘導４日目の硬節細胞マーカー遺伝子（ＰＡＸ１、ＰＡＸ９およびＮＫＸ３．２）の発現量をＲＴ−ｑＰＣＲにて調べた。３組の実験の平均値±ＳＥを示す。
【図５Ｃ】硬節細胞（ＳＣＬ）から三次元軟骨形成誘導（３ＤＣＩ）２１日目の軟骨形成マーカーの相対発現量。硬節細胞における発現量を１とした。エラーバー：平均値±ＳＥ（ｎ＝３）
【図５Ｄ】硬節細胞（ＳＣＬ）から二次元骨形成誘導（２ＤＯＩ）１８日目の骨形成マーカーの相対発現量。硬節細胞における発現量を１とした。エラーバー：平均値±ＳＥ（ｎ＝３）
【図５Ｅ】硬節細胞（ＳＣＬ）から靱帯節細胞（ＳＹＮ）への誘導２１日間の靱帯節細胞マーカー遺伝子ＳＣＸ、ＣＯＬＩＡ１、ＭＫＸおよびＣＯＬＩＡ２の発現量の経時変化。３組の実験の平均値±ＳＥを示す。
【図５Ｆ】硬節細胞（ＳＣＬ）から靱帯節細胞（ＳＹＮ）への誘導２１日目の細胞のＳＣＸ発現をＦＡＣＳにて調べた。ｉＰＳ細胞を対照として用いた。
【００２４】
【図６Ａ】ｉＰＳ細胞から段階的に分化を誘導した各段階の細胞における各マーカー遺伝子の発現量の、ヒートマップ解析結果。
【図６Ｂ】ｉＰＳ細胞から、未分節中胚葉細胞および体節細胞を介して、４種の細胞への段階的な誘導を示す、ＰＣＡプロット。
【００２５】
【図７Ａ】体節細胞（ＳＭ）から体節細胞由来間葉系間質細胞（ＳＭＭＳＣ）誘導プロトコルの概略図。
【図７Ｂ】体節細胞を、ＦＧＦ２（４ｎｇ／ｍｌ）を添加した１０％ＦＢＳ含有培地で１２日間培養して得た細胞の、ＦＡＣＳ分析結果。ＣＤ４４＋、ＣＤ７３＋、ＣＤ１０５＋およびＣＤ４５−間葉系間質細胞が誘導された。体節細胞を、対照集団として用いた。
【図７Ｃ】体節細胞と体節細胞由来間葉系間質細胞における種々の細胞マーカーの相対発現量発現量。発現量の多い方を１とした。
【図７Ｄ】体節細胞由来硬節細胞と、体節細胞由来間葉系間質細胞における種々の細胞マーカーの相対発現量。発現量の多い方を１とした。
【図８Ａ】実施例６のプロトコルの概要を示す。ＦＯＰ−ｉＰＳ細胞およびｒｅｓＦＯＰ−ｉＰＳ細胞から体節細胞を経て間葉系間質細胞（ＳＭＭＳＣ）、硬節細胞（ＳＣＬ）を誘導し、それぞれフィブロネクチンで被覆したディッシュ上にスポットし、アクチビンＡ（３０ｎｇ／ｍｌ）を添加した軟骨誘導基本培地中の軟骨誘導条件下で５日間処理した。
【図８Ｂ】誘導された間葉系間質細胞及び硬節細胞のＡＣＶＲ１の相対発現量。エラーバー：平均値±ＳＥ（ｎ＝６）。ｒｅｓＦＯＰ−ｉＰＳ細胞由来のＭＳＣまたはＳＣＬ細胞における発現レベルをそれぞれ１とした。  図８Ｂ〜Ｈ、Ｊ〜Ｌにおいて、エラーバー：平均値±ＳＥ（ｎ＝３）。スチューデントのｔ検定による、＊ｐ＜０．０５；＊＊＜０．０１；＊＊＊＜０．００１。ｎ．ｓ、有意な差なし；ＦＯＰ、進行性骨化性線維異形成症；ｒｅｓＦＯＰ、レスキューされたＦＯＰクローン；ＣＩ、軟骨形成誘導；Ｒ６６７、Ｒ６６７ １０ｎＭ；Ｒａｐａ、ラパマイシン １０ｎＭ。
【図８Ｃ】ＦＯＰ−ｉＰＳ細胞およびｒｅｓＦＯＰ−ｉＰＳ細胞から体節細胞を経て間葉系間質細胞を得、それぞれの間葉系間質細胞をアクチビンＡを添加した軟骨誘導条件下で５日間培養誘導した細胞の軟骨形成マーカーの相対発現量。ｒｅｓＦＯＰ−ｉＰＳ由来細胞の発現量を１とした。
【図８Ｄ】図８Ｄのそれぞれの細胞のＤＮＡ量に対するＧＡＧ／ＤＮＡ分析結果。
【図８Ｅ】ＦＯＰ−ｉＰＳ細胞およびｒｅｓＦＯＰ−ｉＰＳ細胞から体節細胞を経て硬節細胞を得、それぞれの硬節細胞をアクチビンＡを添加した軟骨誘導条件下で５日間培養誘導した細胞の軟骨形成マーカーの相対発現量。ｒｅｓＦＯＰ−ｉＰＳ由来細胞の発現量を１とした。
【図８Ｆ】図８Ｅのそれぞれの細胞のＧＡＧ／ＤＮＡ分析結果。
【図８Ｇ】ＦＯＰ−ｉＰＳ細胞から体節細胞を経て間葉系間質細胞を得、それぞれの間葉系間質細胞をアクチビンＡを添加した軟骨誘導条件下、Ｒ６６７またはラパマイシンの存在／不存在下で５日間培養誘導した細胞の軟骨形成マーカーの相対発現量。
【図８Ｈ】図８Ｇの細胞のＧＡＧ／ＤＮＡ分析結果。
【図８Ｉ】ＦＯＰ−ｉＰＳ細胞から体節細胞を経て間葉系間質細胞を誘導し、ＦＡＣＳによりＰＤＧＦＲα＋／ＣＤ３１−集団およびＰＤＧＦＲα−／ＣＤ３１−集団に単離した。
【図８Ｊ】図８Ｉの各細胞集団を軟骨誘導条件下で５日培養した際のＧＡＧ／ＤＮＡ分析結果。
【図８Ｋ】図８Ｊの細胞における軟骨細胞形成マーカーの相対発現量。ＰＤＧＦＲα−／ＣＤ３１−細胞における発現量を１とした。
【図８Ｌ】図８Ｊの細胞におけるＰＡＩ１およびＭＭＰ１（共に、異常なＦＯＰ−ＡＣＶＲ１シグナル伝達の代替マーカー）の相対発現量。ＰＤＧＦＲα−／ＣＤ３１−細胞における発現量を１とした。
【図８Ｍ】実施例６の結果を説明する図。
【００２６】
【図９Ａ】ゼノフリー環境における硬節細胞（ＳＣＬ）から靱帯節細胞（ＳＹＮ）への誘導８日目までの靱帯節細胞関連マーカー遺伝子（ＳＣＸ、ＭＫＸ、ＴＮＭＤ、ＴＮＣＣ、ＣＯＬ１Ａ１、ＣＯＬ１Ａ２およびＦＭＯＤ）の発現量の経時変化。縦軸は硬節細胞での発現量を１とした。
【図９Ｂ】ゼノフリー環境における硬節細胞（ＳＣＬ）から靱帯節細胞（ＳＹＮ）への誘導８日目までの靱帯節細胞関連マーカー遺伝子（ＳＣＸ、ＴＮＭＤ、ＣＯＬ１Ａ１およびＣＯＬ１Ａ２）の発現量とヒト健常前十字靱帯（ｈＡＣＬ）試料の各マーカー遺伝子の発現量との比較。
【図９Ｃ】靱帯節細胞（ＳＹＮ）誘導２１日目の免疫染色画像。
【００２７】
【図１０Ａ】アキレス腱断裂モデルラットの作製および飼育方法の概要。
【図１０Ｂ】移植後１週間毎に取得した、移植群（Ｔｒａｎｓ）および非移植群（Ｃｔｒｌ）の右後肢のフットプリント。
【図１０Ｃ】移植群（Ｔｒａｎｓ）および非移植群（Ｃｔｒｌ）のアキレスの機能的指標（Achilles Functional Index, ＡＦＩ）。０、７、１４日目において、ｎ＝８；２１、２８日目において、ｎ＝４。＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．０１；＊＊＊ｐ＜０．００１（スチューデントのｔ検定）。ｎ．ｓ：有意差なし。
【図１０Ｄ】移植の２週間後における、移植群（Ｔｒａｎｓ）および非移植群（Ｃｔｒｌ）のトレッドミルでの歩行機能の観察。
【発明を実施するための形態】
【００２８】
本願明細書および請求の範囲において、数値について「約」という場合、示された数値の±２０％、±１５％まで、±１０％まで、または±５％の値までを包含するものとする。
【００２９】
本明細書中に記載される「細胞」の由来は、ヒト及び非ヒト動物（例えば、マウス、ラット、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、サル、イヌ、ネコ、トリなど）であり、特に限定はされないが、ヒト由来の細胞が特に好ましい。 
【００３０】
本願の方法において、細胞の培養には、動物細胞培養用基礎培地へ必要な因子を添加した培地を用いる。本願において用い得る動物細胞培養用基礎培地としては、例えば、Iscove's modified Eagle's Medium 培地、Ham's F12培地、MEM Zinc Option培地、IMEM Zinc Option培地、IMDM培地、Medium 199培地、Eagle's Minimum Essential Medium（EMEM）培地、αMEM培地、Dulbecco's modified Eagle's Medium（DMEM）培地、RPMI 1640培地、Fischer's培地、およびこれらの混合培地などが包含される。基礎培地には、血清（例えば、ウシ胎児血清（FBS））が含有されていてもよいし、または無血清でもよい。必要に応じて、例えば、アルブミン、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）トランスフェリン、アポトランスフェリン、KnockOut Serum Replacement（KSR）（ES細胞培養時の血清代替物）（Invitrogen）、N2サプリメント（Invitrogen）、B27サプリメント（Invitrogen）、脂肪酸、インスリン、コラーゲン前駆体、微量元素、2-メルカプトエタノール、3'-チオールグリセロール、モノチオグリセロールなどの１つ以上の血清代替物を含んでもよいし、脂質（例えば、chemically defined lipid concentrate）、アミノ酸、L-グルタミン、GlutaMAX（Invitrogen）、非必須アミノ酸（NEAA）、ビタミン、増殖因子、抗生物質（例えば、ペニシリンおよびストレプトマイシン）、抗酸化剤、ピルビン酸、緩衝剤、無機塩類、およびこれらの同等物などの１つ以上の物質も含有しうる。
【００３１】
１つの実施態様において、以下に説明する体節細胞から間葉系間質細胞を誘導する工程を除き、基礎培地としては好ましくは無血清培地あるいは合成培地（Chemically defined medium、以下「ＣＤＭ」）が用いられる。ＣＤＭ培地としては、Iscove's modified Eagle's Medium/ Ham's F12培地 １：１(GIBCO, Grand Island, NY, USA)に１ｘ chemically defined lipid concentrate (GIBCO)、１５ｍｇ／ｍｌアポトランスフェリン(Sigma, St. Louis, MO)、４５０ｍＭモノチオグリセロール(Sigma)、５ｍｇ／ｍｌ精製ＢＳＡ（結晶化による９９％精製；Sigma）、７ｍｇ／ｍｌインスリン(WAKO)およびペニシリン／ストレプトマイシン(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)を添加した培地が例示される。以下本願明細書においてこの組成の培地を「ＣＤＭ基礎培地」という。
【００３２】
また、培養は好ましくはフィーダー細胞を用いず、必要に応じて培養基質を用いて行えばよい。培養基質としては、例えば市販の細胞外マトリクスであるマトリゲル(BD, Bedford, MA, USA)が例示される。
【００３３】
また、他の実施態様において、以下に説明する体節細胞から間葉系間質細胞を誘導する工程を除き、ゼノフリー条件下で行うことが可能である。例えば、多能性幹細胞から未分節中胚葉細胞を誘導する工程、未分節中胚葉細胞から体節細胞を誘導する工程、体節細胞から硬節細胞を誘導する工程、および硬節細胞から靱帯節細胞を誘導する工程をゼノフリー条件下で実施できる。「ゼノフリー」とは、培養対象の細胞の生物種とは異なる生物由来の成分を含まない培地または培養条件を意味する。ゼノフリー培地としては、特に限定されないが、ＳｔｅｍＦｉｔ（登録商標） ＡＫ０２培地（味の素株式会社）、ＳｔｅｍＦｉｔ（登録商標） ＡＫ０３培地（味の素株式会社）、およびCTS（商標） KnockOut SR XenoFree Medium(Gibco)などが例示され、例えばＡＫ０３培地である。また、ゼノフリー培養においては、ゼノフリー培地と併せてゼノフリー培養基質を用いることが好ましい。ゼノフリー培養基質としては組み替えヒトラミニン５１１のインテグリン結合部位（Ｅ８）断片が例示される。かかるゼノフリー培養基質としては、ｉＭａｔｒｉｘ５１１(株式会社ニッピ)、およびCTS CELLstart Substrate(Gibco)などが例示され、例えばｉＭａｔｒｉｘ５１１である。
【００３４】
本願の方法において、細胞の培養は一般的な動物細胞培養条件下で行えば良い。培養温度は、以下に限定されないが、約30〜40℃、好ましくは約37℃である。培養は、好適にはCO2含有空気の雰囲気下で培養が行われ、CO2濃度は、好ましくは約2〜5％である。
【００３５】
各工程において目的とする細胞が得られたことは、得られた細胞の細胞表面マーカーの発現プロファイルを調べることにより確認することができる。細胞表面マーカーの発現プロファイルの確認は、公知の方法を用いて行えばよく、例えばＲＴ−ｑＰＣＲ、免疫細胞化学分析、ＦＡＣＳ（Fluorescence-activated cell sorting）などが挙げられる。
【００３６】
各工程において得られる細胞培養物は、更なる分化誘導に供する際に純化して用いてもよい。また、目的とする細胞を含む細胞培養物を、目的の細胞について純化して提供してもよい。細胞の純化は、例えば細胞表面のマーカーに基づいて行うことができる。例えば目的とする細胞が発現する、あるいは発現しない細胞表面マーカーに対する抗体を用いてＦＡＣＳにてソートする方法が例示される。
【００３７】
多能性幹細胞から体節細胞の製造
本願は多能性幹細胞を提供する工程、および
多能性幹細胞を、ＧＳＫ３β阻害剤を含む培地で培養する工程を含む、多能性幹細胞から体節細胞を製造する方法を提供する。
【００３８】
多能性幹細胞とは、生体に存在する全ての細胞に分化可能である多能性を有し、かつ、増殖能をも併せもつ幹細胞であり、それには、例えば胚性幹(ES)細胞(J.A. Thomson et al. (1998), Science 282:1145-1147; J.A. Thomson et al. (1995), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92:7844-7848;J.A. Thomson et al. (1996), Biol. Reprod., 55:254-259; J.A. Thomson and V.S. Marshall (1998), Curr. Top. Dev. Biol., 38:133-165)、核移植により得られるクローン胚由来の胚性幹(ntES)細胞（T. Wakayama et al. (2001), Science, 292:740-743; S. Wakayama et al. (2005), Biol. Reprod., 72:932-936; J. Byrne et al. (2007), Nature, 450:497-502）、精子幹細胞（「GS細胞」）(M. Kanatsu-Shinohara et al. (2003) Biol. Reprod., 69:612-616; K. Shinohara et al. (2004), Cell, 119:1001-1012)、胚性生殖細胞（「EG細胞」）(Y. Matsui et al. (1992), Cell, 70:841-847; J.L. Resnick et al. (1992), Nature, 359:550-551)、人工多能性幹(iPS)細胞（K. Takahashi and S. Yamanaka (2006) Cell, 126:663-676; K. Takahashi et al. (2007), Cell, 131:861-872; J. Yu et al. (2007), Science, 318:1917-1920; Nakagawa, M.ら,Nat. Biotechnol. 26:101-106 (2008)；WO2007/069666）、培養線維芽細胞や骨髄幹細胞由来の多能性細胞（Muse細胞）（WO2011/007900）などが含まれる。好ましくは、多能性幹細胞はヒト多能性幹細胞、例えばＥＳ細胞やｉＰＳ細胞である。
【００３９】
特にｉＰＳ細胞は治療や移植に用いるための細胞を製造する場合の材料として特に好適に用いられる。本願により得られる細胞を治療のために用いる場合、拒絶反応が起こらないという観点から、移植先の個体のＨＬＡ遺伝子型と同一もしくは実質的に同一である体細胞から得たｉＰＳ細胞を用いることが望ましい。ここで、「実質的に同一」とは、移植した細胞に対して免疫抑制剤により免疫反応が抑制できる程度にＨＬＡ遺伝子型が一致していることであり、例えば、ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−ＢおよびＨＬＡ−ＤＲの３遺伝子座あるいはＨＬＡ−Ｃを加えた４遺伝子座が一致するＨＬＡ型を有する体細胞である。もちろん、患者自身の体細胞から誘導されたｉＰＳ細胞を用いて、治療のために用いる細胞を製造してもよい。
【００４０】
多能性幹細胞は、公知の方法を用いて製造したものを用いても、市販の多能性幹細胞や、研究あるいは移植医療のためにその由来する個体の情報と共に保存された多能性幹細胞を用いてもよい。頻度の高いHLAハプロタイプをホモで有するヒトをドナーとして用いることにより、汎用性の高いiPS細胞バンクを構築するプロジェクトが日本において現在進行中であり（CYRANOSKI, Nature vol. 488, 139(2012)）、例えばかかるｉＰＳ細胞バンクから取得された多能性幹細胞を用いてもよい。ヒト体細胞からｉＰＳ細胞を製造する方法としては、例えばKoyanagi-Aoi et al., 2013; Nakagawa et al., 2014; Okita et al., 2011; Takahashi et al., 2007などの報告がある。ｉＰＳ細胞の誘導に際してフィーダー細胞を用いず、完全にゼノフリー条件下で誘導する方法もまた知られている（Nakagawa M, et al. Scientific Reports 4:3594 (2014)）。かかるゼノフリー条件下で誘導されたｉＰＳ細胞を用いてもよい。
【００４１】
また、多能性幹細胞は遺伝子疾患患者由来の細胞から誘導したものを用いてもよい。かかる遺伝子疾患由来のｉＰＳ細胞から本願の方法によって得られた体節細胞、および体節細胞から更に分化誘導された細胞は疾患モデル細胞として創薬研究および疾患メカニズムの解明に応用可能である。例えば、進行性骨化性繊維異形成症患者の体細胞からｉＰＳ細胞を誘導することが報告されている（Matsumoto et al.,2014）
【００４２】
（１）多能性幹細胞（ＰＳＣ）から未分節中胚葉細胞（ＰＳＭ）への分化誘導
未分節中胚葉細胞を多能性幹細胞から製造する方法は知られており、公知のいずれの方法を用いてもよい。例えば多能性幹細胞を比較的高濃度のＧＳＫ３β阻害剤を含む培地中で培養することによって、比較的高い誘導率で未分節中胚葉細胞へと誘導することができる(非特許文献７および９：Loh et al 2016およびXi 2017)。
【００４３】
ＧＳＫ３β阻害剤はＧＳＫ３βタンパク質のキナーゼ活性（例えば、βカテニンに対するリン酸化能）を阻害する物質として定義され、既に多数のものが知られている。ＧＳＫ３β阻害剤はまた、ＷＮＴシグナル伝達活性化剤としても知られている。例えば、インジルビン誘導体であるBIO（別名、GSK-3β阻害剤IX；6-ブロモインジルビン3'-オキシム）、マレイミド誘導体であるSB216763（3-(2,4-ジクロロフェニル)-4-(1-メチル-1H-インドール-3-イル)-1H-ピロール-2,5-ジオン）、SB415286（３-［（３-クロロ-４-ヒドロキシフェニル）アミノ］-４-（２-ニトロフェニル）-１Ｈ-ピロール-２，５-ジオン）、フェニルαブロモメチルケトン化合物であるGSK-3β阻害剤VII（4-ジブロモアセトフェノン）、細胞膜透過型のリン酸化ペプチドであるL803-mts（別名、GSK-3βペプチド阻害剤；Myr-N-GKEAPPAPPQSpP-NH2）および高い選択性を有するCHIR99021(6-[2-[4-(2,4-Dichlorophenyl)-5-(4-methyl-1H-imidazol-2-yl)pyrimidin-2-ylamino]ethylamino]pyridine-3-carbonitrile)が挙げられる。これらの化合物は、例えばCalbiochem社やBiomol社等から市販されており容易に利用することが可能である。他の入手先から入手しても、あるいは自ら作製してもよい。
【００４４】
多能性幹細胞から未分節中胚葉細胞を製造する際に使用されるＧＳＫ３β阻害剤としては、例えばＣＨＩＲ９９０２１が例示される。ＧＳＫ３β阻害剤の濃度は当業者が適宜定めればよく、比較的高濃度とする必要がある。ＧＳＫ３β阻害剤としてＣＨＩＲ９９０２１を用いる場合、その培地中の濃度を例えば、０．１μＭ〜５０μＭ、好ましくは１〜２０μＭ、より好ましくは約１０μＭとすることが例示される。
【００４５】
多能性幹細胞から未分節中胚葉細胞を製造する際に使用される培地は、好ましくは、さらにＴＧＦβ阻害剤、ＢＭＰ阻害剤およびＦＧＦのうち少なくとも１つを含み、最も好ましくは３種全てを含む。
【００４６】
本願明細書および請求の範囲において用いるＴＧＦβ阻害剤とは、ＴＧＦβ、Ａｃｔｉｖｉｎ、ＮｏｄａｌといったＴＧＦβファミリーの分子が受容体へと結合し、下流のＳＭＡＤへと続くシグナル伝達を阻害する物質であり、受容体であるＡＬＫファミリーへの結合を阻害する物質、またはＡＬＫファミリーによるＳＭＡＤのリン酸化を阻害する物質である限り特に限定されない。例えば、Ｌｅｆｔｙ−１（NCBI Accession No.として、マウス：ＮＭ＿０１００９４、ヒト：ＮＭ＿０２０９９７が例示される）、ＳＢ４３１５４２、ＳＢ２０２１９０(以上、R.K.Lindemann et al., Mol. Cancer, 2003, 2:20)、ＳＢ５０５１２４ (GlaxoSmithKline)、ＮＰＣ３０３４５、ＳＤ０９３、ＳＤ９０８、ＳＤ２０８（Ｓｃｉｏｓ）、ＬＹ２１０９７６１、ＬＹ３６４９４７、ＬＹ５８０２７６ (Lilly Research Laboratories)、Ａ−８３−０１(WO 2009146408) ＡＬＫ５阻害剤ＩＩ（２-［３-［６-メチルピリジン-２-イル］-１Ｈ-ピラゾル-４-イル］-１，５-ナフチリジン）、ＴＧＦβＲＩキナーゼ阻害剤ＶＩＩＩ（６-［２-ｔｅｒｔ-ブチル-５-［６-メチル-ピリジン-２-イル］-１Ｈ-イミダゾル-４-イル］-キノキサリン）およびこれらの誘導体などが例示される。
【００４７】
多能性幹細胞から未分節中胚葉細胞を製造する際に用いるＴＧＦβ阻害剤としては、例えばＳＢ４３１５４２が挙げられる。ＴＧＦβ阻害剤の濃度は当業者が適宜定めれば良く特に限定されない。ＴＧＦβ阻害剤としてＳＢ４３１５４２を用いる場合、その培地中の濃度を例えば、０．１μＭ〜５０μＭ、好ましくは１〜２０μＭ、より好ましくは約１０μＭとすることが例示される。
【００４８】
ＢＭＰ阻害剤としては、Ｃｈｏｒｄｉｎ、Ｎｏｇｇｉｎ、Ｆｏｌｌｉｓｔａｔｉｎなどのタンパク質性阻害剤、Ｄｏｒｓｏｍｏｒｐｈｉｎ(6-[4-(2-piperidin-1-yl-ethoxy)phenyl]-3-pyridin-4-yl-pyrazolo[1,5-a]pyrimidine)、その誘導体（ＤＭＨ１など）(P. B. Yu et al. (2007), Circulation, 116:II_60; P.B. Yu et al. (2008), Nat. Chem. Biol., 4:33-41; J. Hao et al. (2008), PLoS ONE, 3(8):e2904)およびＬＤＮ−１９３１８９（すなわち、4-(6-(4-(piperazin-1-yl)phenyl)pyrazolo[1,5-a]pyrimidin-3-yl)quinoline）が例示される。
【００４９】
多能性幹細胞から未分節中胚葉細胞を製造する際に使用されるＢＭＰ阻害剤としては、例えばＤＭＨ１が用いられる。ＢＭＰ阻害剤の濃度は当業者が適宜定めれば良く特に限定されない。ＢＭＰ阻害剤としてＤＭＨ１を用いる場合、その培地中の濃度を例えば、０．１μＭ〜２０μＭ、好ましくは１〜５μＭ、より好ましくは約２μＭとすることが例示される。
【００５０】
ＦＧＦ（繊維芽細胞増殖因子）としては、ＦＧＦ２、ＦＧＦ７、ＦＧＦ８、ＦＧＦ１０が例示される。多能性幹細胞から未分節中胚葉細胞を製造する際に使用されるＦＧＦとしては、例えばＦＧＦ２が用いられる。ＦＧＦの濃度は当業者が適宜定めれば良く特に限定されない。ＦＧＦとしてＦＧＦ２を用いる場合、その培地中の濃度を例えば、０．１ｎｇ／ｍｌ〜１００ｎｇ／ｍｌ、好ましくは１〜５０ｎｇ／ｍｌ、より好ましくは約２０ｎｇ／ｍｌとすることが例示される。
【００５１】
多能性幹細胞から未分節中胚葉細胞を製造する際の培養日数は、当業者が適宜定めれば良く特に限定されない。例えば１〜７日、好ましくは３〜５日、より好ましくは約４日とすればよい。
【００５２】
未分節中胚葉細胞は、例えばＤＬＬ１を発現する細胞として特定することができる。多能性幹細胞としてｉＰＳ細胞を用いる場合、ｉＰＳ細胞から未分節中胚葉細胞が製造されたことの確認は、ｉＰＳ細胞に特有のマーカー、例えばＮＡＮＯＧ、ＯＣＴ３／４、ＳＯＸ２が発現しないこと、および未分節中胚葉細胞のマーカーであるＢＲＡＣＨＹＵＲＹ、ＤＬＬ１、ＴＢＸ６、ＭＳＧＮ１およびＷＮＴ３Ａのいずれか１つまたはその組み合わせの発現によって確認することができる。
【００５３】
本工程で得られる未分節中胚葉細胞培養物は、純化した上でその後の工程に供しても、そのまま用いてもよい。細胞培養物中の特定種類の細胞の純化には、例えば未分節中胚葉細胞が発現する、あるいは発現しない細胞表面マーカーに対する抗体を用いたＦＡＣＳを用いることが例示される。一例として細胞表面のＤＬＬ１の発現を指標にＦＡＣＳでソートすることが挙げられる
【００５４】
（２）未分節中胚葉細胞（ＰＳＭ）から体節細胞（ＳＭ）への分化誘導
体節細胞は、複数の細胞型（真皮節（Ｄ）、筋節（ＭＹＯ）、硬節（ＳＣＬ）および靭帯節（ＳＹＮ）など）を生じるトランジェントな幹細胞であり、また、出生後に骨、軟骨および脂肪を生じる間葉系間質細胞（ＭＳＣ）の起源ともなる細胞である。
【００５５】
未分節中胚葉細胞を、ＧＳＫ３β阻害剤を含む培地中で培養して、体節細胞を誘導する。未分節中胚葉細胞から体節細胞を製造する際に使用されるＧＳＫ３β阻害剤は、上述のものと同様のものを用いることができ、例えばＣＨＩＲ９９０２１であり得る。ＧＳＫ３β阻害剤の濃度は当業者が適宜定めれば良く特に限定されない。ＧＳＫ３β阻害剤としてＣＨＩＲ９９０２１を用いる場合、その培地中の濃度を例えば、０．１μＭ〜５０μＭ、好ましくは１〜２０μＭ、より好ましくは約５μＭとすることが例示される。
【００５６】
未分節中胚葉細胞から体節細胞を製造する際に使用される培地には、さらにＴＧＦβ阻害剤を含んでもよい。ＴＧＦβ阻害剤は、上述したものと同様のものを用いることができ、例えばＳＢ４３１５４２であり得る。ＴＧＦβ阻害剤の濃度は当業者が適宜定めれば良く、限定されない。ＴＧＦβ阻害剤としてＳＢ４３１５４２を用いる場合、その培地中の濃度を例えば、０．１μＭ〜５０μＭ、好ましくは１〜２０μＭ、より好ましくは約１０μＭとすることが例示される。
【００５７】
未分節中胚葉細胞から体節細胞を製造する際の培養日数は特に限定されず、例えば１〜７日、好ましくは３〜５日、より好ましくは約４日とすればよい。
【００５８】
体節細胞が生成したことは、体節細胞マーカー、例えばＭＥＯＸ１およびＰＡＲＡＸＩＳや転写因子であるＰＡＸ３のうちの１以上の発現、未分節中胚葉細胞マーカーの１以上の発現の消失を適宜組み合わせて確認することができる。
【００５９】
体節細胞から種々の細胞への段階的分化誘導
（３）体節細胞（ＳＭ）から皮筋節細胞（ＤＭ）への分化誘導
皮筋節は、体節の背側が分化して形成され、真皮の前駆体である真皮節および骨格筋の前駆体である筋節を生じる。
【００６０】
皮筋節細胞を体節細胞から製造する方法は知られており、公知のいずれの方法を用いてもよい。皮筋節細胞は例えば、ＧＳＫ３阻害剤およびＢＭＰを含む培地で培養することによって、製造できる。
【００６１】
体節細胞から皮筋節細胞を製造するにあたり、出発物質として用いる体節細胞は上記（１）および（２）の工程を経て多能性幹細胞から製造した体節細胞であっても、他の方法で得た体節細胞であってもよい。体節細胞としてはまた、動物の生体から取得してもよい。
【００６２】
体節細胞から皮筋節細胞を製造する際に使用されるＧＳＫ３阻害剤は、上述したものと同様のものを用いることができ、例えばＣＨＩＲ９９０２１であり得る。ＧＳＫ３β阻害剤の濃度特に限定されず、当業者が適宜定めれば良い。ＧＳＫ３β阻害剤としてＣＨＩＲ９９０２１を用いる場合、その培地中の濃度を例えば、０．１μＭ〜５０μＭ、好ましくは１〜２０μＭ、より好ましくは約５μＭとすることが例示される。
【００６３】
体節細胞から皮筋節細胞を製造する際に使用されるＢＭＰは、例えばＢＭＰ２、ＢＭＰ４、ＢＭＰ７等が挙げられ、例えばＢＭＰ４である。ＢＭＰの濃度は特に限定されず、当業者が適宜定めれば良い。ＢＭＰとしてＢＭＰ４を用いる場合、その培地中の濃度を例えば、０．１ｎｇ／ｍｌ〜１００ｎｇ／ｍｌ、好ましくは１〜５０ｎｇ／ｍｌ、より好ましくは約１０ｎｇ／ｍｌとすることが例示される。
【００６４】
体節細胞から皮筋節細胞を製造する際の培養日数は特に限定されず、当業者が適宜定めればよい。例えば１〜５日、好ましくは２〜４日、より好ましくは約３日とすればよい。培養中に培地を適宜新しいものと交換してもよい。
【００６５】
皮筋節細胞のマーカーとしてはＡＬＸ４、ＥＮ１およびＮＯＧＧＩＮ等が知られている。体節細胞から皮筋節細胞が製造されたことの確認は、体節細胞と共通する転写因子であるＰＡＸ３が維持されていること、皮筋節細胞マーカーの一以上が発現すること、および体節細胞マーカーの１以上の発現の消失などを適宜組み合わせて確認することができる。
【００６６】
体節細胞から製造した皮筋節細胞培養物は、そのまま筋節細胞や真皮節細胞の製造に用いても良く、または皮筋節細胞を純化した上で真皮節細胞の製造に供してもよい。皮節筋細胞の純化は、皮節筋細胞が発現する、および／または発現しないことが知られているマーカーに対する抗体を用いたＦＡＣＳにて行うことが例示される。
【００６７】
（４）皮筋節細胞（ＤＭ）から筋節細胞（ＭＹＯ）への分化誘導
本願発明のひとつの態様として、多能性幹細胞から上記（１）（２）（３）の工程を経て、皮筋節細胞を得、さらに皮筋節細胞から筋節細胞を得る方法を提供する。筋節細胞は骨格筋細胞の前駆細胞である。筋節細胞は、例えば皮筋節細胞をＧＳＫ３β阻害剤を含む培地中で培養することによって、製造できる。
【００６８】
皮筋節細胞から筋節細胞を製造する際に使用されるＧＳＫ３阻害剤は、上述したものと同様のものを用いることができ、例えばＣＨＩＲ９９０２１であり得る。ＧＳＫ３β阻害剤の濃度は特に限定されず、当業者が適宜定めれば良い。ＧＳＫ３β阻害剤としてＣＨＩＲ９９０２１を用いる場合、その培地中の濃度を例えば、０．１μＭ〜５０μＭ、好ましくは１〜２０μＭ、より好ましくは約５μＭとすることが例示される。
【００６９】
皮筋節細胞から筋節細胞を製造する際の培養日数は特に限定されず、当業者が適宜定めれば良い。例えば２０日〜４５日、２５日〜４０日、約３０日とすればよい。培養中に培地を適宜新しいものと交換する。培地の交換は例えば約２〜３日毎に行えばよい。
【００７０】
筋節細胞マーカーとして、ＭＹＯＤ、ＭＹＯＧおよびＰＡＸ７などが知られている。筋節細胞の生成はこれらの公知のマーカーの１以上の発現および／または１以上の皮筋節細胞マーカーが発現しないことにより確認することができる。また、得られた筋節細胞培養物を節筋細胞が発現する、および／または発現しないことが知られているマーカーに対する抗体を用いたＦＡＣＳにて純化してもよい。
【００７１】
得られた筋節細胞は更に分化させて、骨格筋細胞を製造することができる。筋節細胞から骨格筋細胞への分化誘導方法は公知である。
【００７２】
（５）皮筋節細胞（ＤＭ）から真皮節細胞（Ｄ）への分化誘導
真皮節は、皮筋節から誘導され、背側真皮の前駆体となる。皮筋節細胞をＧＳＫ３β阻害剤およびＢＭＰを含む培地にて培養することによって、真皮節細胞を製造することができる。皮筋節細胞から真皮節細胞を製造するにあたり、出発物質として用いる皮筋節細胞は上記（１）〜（２）の工程を経て多能性幹細胞から製造した体節細胞から（３）の工程により製造された皮筋節細胞であっても、他の方法で得た体節細胞から製造されたものであっても、その他の方法で得られた皮筋節細胞であってもよい。皮筋節細胞としてはまた、動物の生体から取得したものであってもよい。
【００７３】
皮筋節細胞から真皮節細胞を製造する際に使用されるＧＳＫ３阻害剤は、上述したものと同様のものを用いることができ、例えばＣＨＩＲ９９０２１であり得る。ＧＳＫ３β阻害剤の濃度は特に限定されず、当業者が適宜定めれば良い。ＧＳＫ３β阻害剤としてＣＨＩＲ９９０２１を用いる場合、その培地中の濃度を例えば、０．１μＭ〜５０μＭ、好ましくは１〜２０μＭ、より好ましくは約５μＭとすることが例示される。
【００７４】
皮筋節細胞から真皮節細胞を製造する際に使用されるＢＭＰは、例えばＢＭＰ２、ＢＭＰ４、ＢＭＰ７等が挙げられ、例えばＢＭＰ４である。ＢＭＰの濃度は特に限定されず、当業者が適宜定めれば良い。ＢＭＰとしてＢＭＰ４を用いる場合、その培地中の濃度を例えば、０．１ｎｇ／ｍｌ〜１００ｎｇ／ｍｌ、好ましくは１〜５０ｎｇ／ｍｌ、より好ましくは約１０ｎｇ／ｍｌとすることが例示される。
【００７５】
皮筋節細胞から真皮節細胞を製造する際の培養日数は特に限定されず、当業者が適宜定めれば良い。一態様において例えば８日〜１５日、約９日とすればよい。
【００７６】
真皮節細胞のマーカーとしては、ＰＤＧＦＲα、ＥＮ１、ＡＬＸ４、ＭＳＸ１およびＣＯＬＩＡ２などが知られている。真皮節細胞の生成はこれらの公知のマーカーの発現および皮筋節細胞マーカーの発現の消失の１以上を適宜組み合わせて確認することができる。また、得られた真皮節細胞培養物を真皮節細胞が発現する、および／または発現しないことが知られているマーカーに対する抗体を用いたＦＡＣＳにて純化してもよい。抗ＰＤＧＦＲα抗体を用いてＦＡＣＳにて真皮節細胞を純化することが例示される。
【００７７】
得られた真皮節細胞は更に分化させて真皮細胞を製造することができる。
【００７８】
（６）体節細胞（ＳＭ）から硬節細胞（ＳＣＬ）への分化誘導
硬節は、体節の腹側が分化して形成され、腱および靱帯の前駆体である靱帯節を生じる。本願発明のひとつの態様として、多能性幹細胞から上記（１）（２）の工程を経て、体節細胞を得、さらに体節細胞から硬節細胞を製造方法を提供する。
【００７９】
硬節細胞を体節細胞から製造する方法は知られており（Zhao et l., 2014)て得られた体節細胞から公知のいずれの方法を用いて誘導してもよい。ひとつの態様において、体節細胞をソニックヘッジホッグ活性化剤（ＳＨＨ活性化剤）およびＢＭＰ阻害剤を含む培地で培養することによって、硬節細胞を製造する。
【００８０】
ソニックヘッジホッグ活性化剤としては、ヘッジホッグファミリーに属するタンパク質(例えば、Ｓｈｈ、Ｓｈｈ-Ｎ)、Ｓｈｈ受容体、Ｓｈｈ受容体アゴニスト(Purmorphamine、ＳＡＧ)が挙げられ、例えばＳＡＧを用いることができる。ＳＨＨ活性化剤の濃度は特に限定されず、当業者が適宜定めれば良い。ＳＨＨ活性化剤としてＳＡＧを用いる場合、その培地中の濃度を例えば、１ｎＭ〜１μＭ、好ましくは１０〜５００ｎＭ、より好ましくは約１００ｎＭとすることが例示される。
【００８１】
体節細胞から硬節細胞を製造する際に使用されるＢＭＰ阻害剤は、上述したものと同様のものを用いることができ、例えばＬＤＮ１９３１８９であり得る。ＢＭＰ阻害剤の濃度は特に限定されず、当業者が適宜定めれば良い。ＢＭＰ阻害剤としてＬＤＮ１９３１８９を用いる場合、その培地中の濃度を例えば、０．０１μＭ〜１０μＭ、好ましくは０．１μＭ〜１μＭ、より好ましくは約０．６μＭとすることが例示される。
【００８２】
体節細胞から硬節細胞を製造する際の培養日数は特に限定されず、当業者が適宜定めれば良い。例えば１〜５日、好ましくは２〜４日、より好ましくは約３日とすればよい。
【００８３】
硬節細胞のマーカーとしてはＰＡＸ１、ＰＡＸ９およびＮＫＸ３．２等が知られている。硬節細胞の生成はこれらの公知のマーカーの発現および体節細胞に特異的なマーカーの発現の消失の１以上を適宜組み合わせて確認することができる。また、得られた硬節細胞培養物を硬節細胞が発現する、および／または発現しないことが知られているマーカーに対する抗体を用いたＦＡＣＳにて純化してもよい。
【００８４】
（７）硬節細胞（ＳＣＬ）から靱帯節細胞（ＳＹＮ）への分化誘導
靱帯節は、硬節の内側部分から分化し、腱および靱帯を生じる。本願の一態様として、以下の工程を含む硬節細胞から靱帯節細胞を製造する方法を提供する：
（７−１）硬節細胞を、ＦＧＦを含む培地で培養する工程、および 
（７−２）工程７−１で得られた細胞を、ＢＭＰおよびＴＧＦβを含む培地で培養する工程。
【００８５】
出発物質として用いられる硬節細胞は、体節細胞等の他の細胞種から公知の方法により誘導された細胞であってもよい。硬節細胞を体節細胞から製造する場合、体節細胞は、本願の方法により多能性幹細胞から製造したものであってもよい。
【００８６】
硬節細胞から靱帯節細胞を製造する際に使用されるＦＧＦとしては、ＦＧＦ２、ＦＧＦ７、ＦＧＦ８、ＦＧＦ１０が例示され、例えばＦＧＦ８である。ＦＧＦの濃度は特に限定されず、当業者が適宜定めればよい。ＦＧＦとしてＦＧＦ８を用いる場合、その培地中の濃度を例えば、０．１ｎｇ／ｍｌ〜１００ｎｇ／ｍｌ、好ましくは１〜５０ｎｇ／ｍｌ、より好ましくは約２０ｎｇ／ｍｌとすることが例示される。
【００８７】
硬節細胞から靱帯節細胞を製造する際に使用されるＢＭＰとしては、ＢＭＰ２、ＢＭＰ４、ＢＭＰ７が例示され、例えばＢＭＰ７である。ＢＭＰの濃度は特に限定されず、当業者が適宜定めればよい。ＢＭＰとしてＢＭＰ７を用いる場合、その培地中の濃度を例えば、０．１ｎｇ／ｍｌ〜１００ｎｇ／ｍｌ、好ましくは１〜５０ｎｇ／ｍｌ、より好ましくは約１０ｎｇ／ｍｌとすることが例示される。
【００８８】
工程７−１において、培地はさらにＴＧＦβを含んでいてもよい。硬節細胞から靱帯節細胞を製造する際に使用されるＴＧＦβとしては、ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、ＴＧＦβ３が例示され、例えばＴＧＦβ３である。ＴＧＦβの濃度は特に限定されず、当業者が適宜定めればよい。ＴＧＦとしてＴＧＦβ３を用いる場合、その培地中の濃度を例えば、０．１ｎｇ／ｍｌ〜１００ｎｇ／ｍｌ、好ましくは１〜５０ｎｇ／ｍｌ、より好ましくは約１０ｎｇ／ｍｌとすることが例示される。
【００８９】
ある態様においては、硬節細胞培養物から硬節細胞を一旦取り出し、靱帯節培養用培地へ播種して培養を開始する。工程（７−１）および（７−２）それぞれの培養日数は特に限定されず、当業者が適宜定めればよい。工程（７−１）において培地にＴＧＦβを含まない場合、工程（７−１）の培養日数を例えば１〜７日、好ましくは約３日、工程（７−２）の日数を約１５〜２５日、好ましくは約１８日とすることが例示される。工程（７−１）において培地にＴＧＦβを含む場合、工程（７−１）の培養日数を例えば１〜５日、好ましくは約２日、工程（７−２）の日数を例えば約４〜８日、好ましくは約６日とすることが例示される。
【００９０】
靱帯節細胞のマーカーとしては、ＳＣＸ、ＭＫＸ、ＣＯＬ１Ａ１およびＣＯＬ１Ａ２等が知られている。靱帯節細胞の生成はこれらの公知のマーカーの発現および硬節細胞マーカーの発現の消失の１以上を適宜組み合わせて確認することができる。また、得られた靱帯節細胞培養物を靱帯節細胞が発現する、および／または発現しないことが知られているマーカーに対する抗体を用いたＦＡＣＳにて純化してもよい。
【００９１】
（８）体節細胞（ＳＭ）から体節細胞由来の間葉系間質細胞（ＳＭＭＳC）への分化誘導
間葉系間質は骨、軟骨、脂肪へと分化することが知られており、間葉系間質細胞は、骨髄、脂肪組織または血液など、身体内の複数の部位から得ることができる多能性細胞である。本願の一つの態様として、体節細胞を、ＦＧＦを含む培地で培養する工程を含む、間葉系間質細胞（体節細胞由来間葉系間質細胞）を製造する方法を提供する。体節細胞は、生体内から単離された細胞でも、他の細胞種から製造された細胞であってもよい。ある態様において体節細胞は、上記（１）（２）の工程により多能性幹細胞から誘導された体節細胞が用いられる。
【００９２】
体節細胞から間葉系間質細胞を製造する際に使用されるＦＧＦは、上述したものと同様のものを用いることができ、例えばＦＧＦ２であり得る。ＦＧＦの濃度は特に限定されず、当業者が適宜定めればよい。ＦＧＦとしてＦＧＦ２を用いる場合、その培地中の濃度を例えば、０．４ｎｇ／ｍｌ〜４０ｎｇ／ｍｌ、好ましくは１〜１０ｎｇ／ｍｌ、より好ましくは約４ｎｇ／ｍｌとすることが例示される。体節細胞から間葉系間質細胞を製造する際に使用される培地は、αＭＥＭ培地が例示される。本工程で用いる培地は、好ましくは血清を含む。血清としてはウシ胎児血清（ＦＢＳ）を使用しても、ヒト細胞の分化誘導の場合には例えばヒト血清を用いる等、他動物種の血清を用いてもよい。ＦＢＳの濃度は特に限定されず、当業者が適宜定めればよい。例えば約１０％とすればよい。
【００９３】
体節細胞から間葉系間質細胞を製造する際の培養日数は、特に限定されず、当業者が適宜定めればよい。例えば４〜３０日、好ましくは８〜１８日、より好ましくは１０〜１５日、さらに好ましくは約１２日とすればよい。
【００９４】
間葉系間質細胞のマーカーとしては、ＣＤ４４、ＣＤ７３、ＣＤ１０５およびＣＤ９０などが知られている。間葉系間質細胞の生成はこれらの公知のマーカーの発現および体節細胞マーカーの消失の１以上を適宜組み合わせて確認することができる。また、得られた間葉系間質細胞培養物を間葉系間質細胞が発現する、および／または発現しないことが知られているマーカーに対する抗体を用いたＦＡＣＳにて純化してもよい。
【００９５】
詳述したとおり、本願は多能性幹細胞から体節細胞を得る方法を提供する。本願の方法によって得られる体節細胞は、皮節細胞を経て真皮節細胞、筋節細胞へ、硬節細胞を経て靱帯節細胞へと更に段階的に分化誘導することができる。また、本願の方法によって得られる体節細胞は、更に間葉系間質細胞へと分化誘導することができる。
【００９６】
即ち、本願は下記を含む多能性幹細胞から筋節細胞へ分化誘導する方法を提供する：
上記（１）に従い多能性幹細胞（ＰＳＣ）から未分節中胚葉細胞（ＰＳＭ）を誘導する、
誘導された未分節中胚葉細胞（ＰＳＭ）から上記（２）に従い体節細胞（ＳＭ）を誘導する、
誘導された体節細胞（ＳＭ）から上記（３）に従い皮筋節細胞（ＤＭ）を誘導する、および
誘導された皮筋節細胞（ＤＭ）から上記（４）に従い筋節細胞（ＭＹＯ）を誘導する。
【００９７】
本願はまた、下記を含む多能性幹細胞から真皮節細胞へ分化誘導する方法を提供する：
上記（１）に従い多能性幹細胞（ＰＳＣ）から未分節中胚葉細胞（ＰＳＭ）を誘導する、
誘導された未分節中胚葉細胞（ＰＳＭ）から上記（２）に従い体節細胞（ＳＭ）を誘導する、
誘導された体節細胞（ＳＭ）から上記（３）に従い皮筋節細胞（ＤＭ）を誘導する、および
誘導された皮筋節細胞（ＤＭ）から上記（５）に従い真皮節細胞（Ｄ）を誘導する。
【００９８】
本願はさらに、下記を含む多能性幹細胞から硬節細胞へ分化誘導する方法を提供する：
上記（１）に従い多能性幹細胞（ＰＳＣ）から未分節中胚葉細胞（ＰＳＭ）を誘導する、
誘導された未分節中胚葉細胞（ＰＳＭ）から上記（２）に従い体節細胞（ＳＭ）を誘導する、および
誘導された体節細胞（ＳＭ）から上記（６）に従い硬節細胞（ＳＣＬ）を誘導する。
【００９９】
本願はさらにまた、下記を含む多能性幹細胞から靱帯節細胞へ分化誘導する方法を提供する：
上記（１）に従い多能性幹細胞（ＰＳＣ）から未分節中胚葉細胞（ＰＳＭ）を誘導する、
誘導された未分節中胚葉細胞（ＰＳＭ）から上記（２）に従い体節細胞（ＳＭ）を誘導する、
誘導された体節細胞（ＳＭ）から上記（６）に従い硬節細胞（ＳＣＬ）を誘導する、および
誘導された硬節細胞（ＳＣＬ）から上記（７）に従い靱帯節細胞（ＳＹＮ）を誘導する。
【０１００】
本願はさらにまた、下記を含む多能性幹細胞から体節細胞由来の間葉系間質細胞へ分化誘導する方法を提供する：
上記（１）に従い多能性幹細胞（ＰＳＣ）から未分節中胚葉細胞（ＰＳＭ）を誘導する、
誘導された未分節中胚葉細胞（ＰＳＭ）から上記（２）に従い体節細胞（ＳＭ）を誘導する、および
誘導された体節細胞（ＳＭ）から上記（８）に従い体節細胞由来の間葉系間質細胞（ＳＭＭＳＣ）を誘導する。
【０１０１】
本願はまた、本願の方法によって多能性幹細胞から誘導された細胞を用いる、細胞移植治療方法を提供する。例えば本願で得られた種々のiPS細胞由来体節派生細胞を、筋ジストロフィー、腱断裂などの筋骨格障害の治療のために用いることができる。具体的には靱帯節細胞を、後縦靱帯骨化症や進行性骨化性線維異形成症などの腱・靱帯関連疾患や腱断裂などの治療のために用いることが例示される。
【０１０２】
腱・靱帯関連疾患や腱断裂などの治療のために本願方法で得られたｉＰＳ細胞由来靱帯節細胞を用いる場合、靱帯節細胞は生体適合性基剤等に分散させた上で疾患／損傷部位に注入すればよい。生体適合性基材としては、公知のものを適宜採用でき、マトリゲルが例示される。注入する細胞数や、注入部位は治療対象とする疾患／損傷に応じて適宜定めれば良く、特に限定されない。例えば注入部位１カ所につき１０１２〜１０６個あるいは１０１１〜１０７個、もしくは１０１０〜１０８個のｉＰＳ細胞由来靱帯節細胞を注入する。必要に応じて、疾患/損傷部位の縫合など、外科的処置を併せて実施する。
【実施例】
【０１０３】
以下に実施例を示してさらに詳細に説明するが、本発明は実施例により何ら限定されるものではない。
細胞培養
ヒトｉＰＳ細胞は、Takahashi et al., 2007の方法を用いて調製、維持した。具体的にはヒトｉＰＳ細胞を、４ｎｇ／ｍｌ ＦＧＦ２(WAKO, Osaka, Japan)を添加した霊長類ＥＳ細胞培地(ReproCELL, Tokyo, Japan)中のＳＮＬフィーダー細胞上で維持した。特に断りの無い限り、実施例１〜５の全ての実験において、エクソン１のＰＡＸ３コード配列の１つの対立遺伝子のひとつとＥＧＦＰを置換した２０１Ｂ７−ＰＡＸ３−ＧＦＰ ｉＰＳ細胞を用いた。同一のノックイン設計を有する、ＰＡＸ３ＧＦＰ／＋ヘテロ接合体マウスは、生存可能で、繁殖性である。ＧＦＰ発現はマウスの内因性Ｐａｘ３の発現を意味する（Lagha, M. et al., 2010)。また、実施例１では、種々のｉＰＳ細胞系統（２０１Ｂ７、ＴＩＧ１１８−４ｆ、４１４Ｃ２、４０９Ｂ２および１２３１Ａ３）(Koyanagi-Aoi et al., 2013; Nakagawa et al., 2014; Okita et al., 2011; Takahashi et al., 2007に準じて製造された細胞)を用いて、ｉＰＳ細胞系統の相違による再現性を調べた。【０１０４】
培地
実施例において用いたＣＤＭ基礎培地の組成を以下に示す：
Iscove's modified Eagle's Medium/ Ham's F12培地 １：１(GIBCO, Grand Island, NY, USA)に１ｘ chemically defined lipid concentrate (GIBCO)、１５ｍｇ／ｍｌアポトランスフェリン(Sigma, St. Louis, MO)、４５０ｍＭモノチオグリセロール(Sigma)、５ｍｇ／ｍｌ精製ＢＳＡ（結晶化による９９％精製；Sigma）、７ｍｇ／ｍｌインスリン(WAKO)およびペニシリン／ストレプトマイシン(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)を添加【０１０５】
ＲＴ−ｑＰＣＲ分析
全ＲＮＡを、RNeasyキット(Qiagen, Valencia, CA)で精製し、DNase-oneキット(Qiagen)で処理し、ゲノムＤＮＡを除去した。逆転写を、１μｇの全ＲＮＡおよびSuperscript III逆転写酵素(Invitrogen)を用いて、製造者の説明書に従って、行った。ＲＴ−ｑＰＣＲを、Thunderbird SYBR qPCR Mix (TOYOBO, Osaka, Japan)を用いて行い、QunatStudio12K Flex PCRシステム(Applied Biosystems, Forester City, CA)、またはStepOne real-time PCRシステム(Applied Biosystems)を用いて、分析した。【０１０６】
免疫細胞化学、免疫組織化学、組織学的分析
抗体での免疫細胞化学を行う前に、プレート上の細胞を、２％パラホルムアルデヒドで、４℃で１０分間固定し、ＰＢＳで２回洗浄し、透過処理のための界面活性剤としての０．２％ＭｔＯＨ(Nacalai Tesque)または０．２％ｔｗｅｅｎ２０(sigma)／ＰＢＳと共に、４℃で、１５分間インキュベートし、ブロッキングワン(Nacalai Tesque)または１％ＢＳＡ／ＰＢＳで、４℃で１時間処理し、一次抗体で４℃で一晩処理した。次に、試料を、０．２％ｔｗｅｅｎ２０／ＰＢＳで数回洗浄し、二次抗体と共に１時間、室温でインキュベートした。ＤＡＰＩ（１：５０００；Sigma）を用いて、核を対比染色した。抗ＩＩ型コラーゲン抗体の免疫組織化学および、誘導した３ＤＣＩペレットの組織学的分析（ＨＥ染色、アルシアンブルー染色およびサフラニンＯ染色）を、Center for Anatomical, Pathological and Forensic Medical Researches, Graduate School of Medicine, Kyoto Universityで行った。試料の観察および評価を、ＢＺ−Ｘ７００(Keyence, Osaka, Japan)で行った。ＭＨＣの免疫細胞化学に関して、ＢＺ−Ｘ７００のオプティカルセクショニングシステムを用いて、写真を撮影した。【０１０７】
ＦＡＣＳ（Fluorescence-activated cell sorting）および分析
Fluorescence-activated cell sorting（ＦＡＣＳ）を、製造者のプロトコルに従って、AriaII(BD)で行った。また、細胞内フローサイトメトリー解析を、製造者のプロトコルに従って、AriaII(BD)で行った。簡潔に述べると、細胞を、抗体染色の前に、固定および透過処理した。各分化マーカーの発現比率を、ｉＰＳＣまたは誘導された体節細胞と比較することによって、計算した。【０１０８】
ＧＡＧ（グルコサミノグリカン）アッセイ
ペレット中のＧＡＧ含量を、Blyscan Glycosaminoglycan Assay Kit (Biocolor Ltd., Belfast, UK)で定量化した。ＤＮＡ含量を、PicoGreen dsDNA Quantitation Kit (Invitrogen)で定量化した。【０１０９】
マイクロアレイ分析
全ＲＮＡを、RNeasy Mini Kit (Qiagen)を用いて調製した。ｃＤＮＡを、GeneChip WT (Whole Transcript) Sense Target Labeling and Control Reagents Kitを用いて、製造者(Affymetrix, Santa Clara, CA)によって記載されるように、合成した。GeneChip Human Gene 1.0 ST expression arrayとのハイブリダイゼーション、洗浄、スキャニングを、製造者(Affymetrix)のプロトコルに従って、行った。発現値を、ＲＭＡ要約法を用いて計算し、得られたデータを、ヒートマップおよび主成分分析（ＰＣＡ）のために、GeneSpring GX 14.5 (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA)で分析した。ＰＣＡ分析を、（統計的有意性を伴って、２倍高い）発現値において行った。統計解析を、Benjamini and Hochberg False Discovery Rate (BH-FDR 50.01)多重検定補正での一元配置分散分析を用い、次いでテューキーのHSD事後検定(GeneSpring GX)を用いて行った。【０１１０】
統計
全ての実験の統計的有意性を、GraphPad Prism7 (GraphPad Software, inc., La Jolla, CA, USA)を用いて計算した。０．０５未満のＰ値を、統計的に有意と見なした。【０１１１】
実施例１〜４
図２Ａに実施例１〜４の概要を示す。
【実施例１】
【０１１２】
（１）ヒトｉＰＳ細胞から未分節中胚葉細胞（ＰＳＭ）への分化誘導
フィーダー細胞から分泌される増殖因子および培地中に含まれる増殖因子の影響を最小限にするため、ｉＰＳ細胞培養物からＳＮＬフィーダー細胞を除去し、ヒトｉＰＳ細胞を、マトリゲル(BD, Bedford, MA, USA)で被覆したディッシュ上に播種した（１．３ｘ１０６細胞／１０ｃｍディッシュ）。ｍＴｅＳＲ１培地(STEMCELL Technology, Vancouver, Canada)を含むフィーダーフリー条件下で３日間培養した。その後、ｉＰＳ細胞を、ＣＤＭ基礎培地に４種類の因子を１つずつ、および適宜組み合わせて添加した培地にて４日間培養した（図２Ｂ）。添加した因子は下記のとおりである。２以上の因子を組み合わせて用いる場合には、各記号を並べて示す：
Ｓ：１０μＭ ＳＢ４３１５４２(ＴＧＦβ阻害剤；Sigma)
Ｃ：１０μＭ ＣＨＩＲ９９０２１(ＧＳＫ３β阻害剤；WAKO)
Ｄ：２μＭ ＤＭＨ１(ＢＭＰ阻害剤；Tocris, Bristol, UK)
Ｆ：２０ｎｇ／ｍｌ ＦＧＦ２【０１１３】
培地は３日目に交換した。未分節中胚葉細胞の誘導効率を検出するため、ＤＬＬ１（未分節中胚葉細胞および体節の後方部分の表面マーカー）陽性で、ＰＡＸ３−ＧＦＰ（新たに形成され、分割した体節細胞であることを示す）陰性の細胞集団（図２Ｃ）をＦＡＣＳで検出した。ＰＡＸ３は転写因子であるため、ＰＡＸ３−ＧＦＰノックインｉＰＳ細胞（ＰＡＸ３−ＧＦＰ ｉＰＳ細胞）を用いて、ＰＡＸ３陽性細胞の検出に用いた。結果を図２Ｄに示す。【０１１４】
４種の因子（ＳＢ４３１５４２、ＣＨＩＲ９９０２１、ＤＭＨ１およびＦＧＦ２）の効果を１種類ずつ分析した。ＣＨＩＲ９９０２１（Ｃ）が、ＤＬＬ１＋／ＰＡＸ３−ＧＦＰ−細胞を効率的に誘導した（５６．３±３．１％）。かかる結果は、先の報告と合致する(Chal et al., 2015; Loh et al., 2016; Sudheer et al., 2016; Umeda et al., 2012; Xi et al., 2017)。次に、２種類の因子の組合せを評価し、ＣＨＩＲ９９０２１および、ＳＢ４３１５４２またはＤＭＨ１（ＳＣまたはＣＤ）が、ＤＬＬ１＋／ＰＡＸ３−ＧＦＰ−細胞をより効率的に誘導することを確認した（それぞれ、８０．５±１．７％および８０．６±１．２％）。しかし、ＣＨＩＲ９９０２１とＦＧＦ２の組み合わせ（ＣＦ）は逆に効率を抑えた（４２．７±１．１％）。ＤＭＨ１とＳＢ４３１５４２およびＣＨＩＲ９９０２１の組み合わせ（ＳＣＤ）は、ほとんど最大限にＤＬＬ１＋／ＰＡＸ３−ＧＦＰ−細胞を誘導した（８３．８±１．１％）が、ＤＬＬ１−／ＰＡＸ３−ＧＦＰ＋細胞も出現した。これは細胞が、この条件下で、ＰＡＸ３＋の体節細胞および／または神経細胞に分化することを示唆する。【０１１５】
次に、４種全ての分子を添加（ＳＣＤＦ）して培養したところ、この条件下において、ＰＡＸ３−ＧＦＰ＋細胞を含まないＤＬＬ１＋／ＰＡＸ３−ＧＦＰ−細胞が、ＰＡＸ３−ＧＦＰ ｉＰＳ細胞から誘導されることがわかった（８５．４±０．４％）。ＤＬＬ１＋細胞の誘導効率に関して、ＳＣＤ、ＳＣＦおよびＳＣＤＦ間に明白な差異はなかったが、ＳＣＤＦが正確な内因性シグナル伝達環境を再現することから、さらなる分析においてはＳＣＤＦ条件を用いた。【０１１６】
ＳＣＤＦ条件下での未分節中胚葉細胞の誘導は、抗ＴＢＸ６、ＢＲＡＣＨＹＵＲＹおよびＣＤＸ２抗体を用いて行った免疫組織化学によっても確認された（データ示さず）。【０１１７】
また、ＳＣＤＦ条件で４日間培養する前後の細胞の、ｉＰＳ細胞マーカー（ＮＡＮＯＧ、ＯＣＴ３／４、ＳＯＸ２）並びに未分節中胚葉細胞マーカー（ＢＲＡＣＨＹＵＲＹ、ＤＬＬ１、ＴＢＸ６、ＭＳＧＮ１およびＷＮＴ３Ａ）の相対発現量をＲＴ−ｑＰＣＲにて調べた。結果を図２Ｅに示す。ＳＣＤＦ条件下での培養期間を１〜５日としたところ、ＤＬＬ１＋／ＰＡＸ３−ＧＦＰ−細胞の誘導効率は、４日目がピークであった（図２Ｆ）。【０１１８】
プロトコルの頑強性を確認するため、他のｉＰＳ細胞クローン（２０１Ｂ７、４０９Ｂ２、４１４Ｃ２およびＴＩＧ１１８−４ｆ、並びに１２３１Ａ３）からのＤＬＬ１＋細胞の誘導効率を調べた。各ｉＰＳ細胞クローンをＳＣＤＦ条件下で４日間培養してＦＡＣＳにて分析した。結果を図２Ｇおよび２Ｆに示す。全てのｉＰＳ細胞クローンより高い効率でＤＬＬ１１＋細胞が得られた。また、フィーダー細胞フリー、無血清培地中で維持されているｉＰＳ細胞株である１２３１Ａ３からも、ＤＬＬ１１＋細胞の誘導が認められた。
【実施例２】
【０１１９】
（２）未分節中胚葉細胞（ＰＳＭ）から体節細胞（ＳＭ）への分化誘導
実施例１のＳＣＤＦ条件でｉＰＳ細胞を４日間培養し、ＦＡＣＳでソーティングした全１．０ｘ１０５個のＤＬＬ１＋ 未分節中胚葉細胞を、マトリゲルで被覆した１２ウェルプレートの１つのウェル上に播種し、体節細胞の誘導を行った（図３Ａ）。体節細胞誘導は、ＳＢ４３１５４２および／または５μＭ ＣＨＩＲ９９０２１を添加したＣＤＭ基礎培地中で、４日間行った。培地は、体節細胞誘導の３日目に交換した。ＰＡＸ３−ＧＦＰの発現を体節細胞のマーカーとして用いた。【０１２０】
添加した因子とその濃度は以下である：
Ｓ１０：ＳＢ４３１５４２ １０μＭ
Ｃ１：ＣＨＩＲ９９０２１ １μＭ
Ｃ５：ＣＨＩＲ９９０２１ ５μＭ
Ｃ１０：ＣＨＩＲ９９０２１ １０μＭ
Ｄ２：ＤＭＨ１ ２μＭ
Ｆ２０：ＦＧＦ２ ２０ｎｇ／ｍｌ
Ｉ１０：ＩＷＲ１ １０μＭ【０１２１】
結果を図３Ｂに示す。４日間の培養において、１０μＭ ＳＢ４３１５４２（Ｓ１０）および５μＭ ＣＨＩＲ９９０２１（Ｃ５）はいずれもＰＡＸ３−ＧＦＰ＋細胞を効率的に誘導した（それぞれ、５２．１±０．８％および７０．７±０．１％）。両者による処理（Ｓ１０Ｃ５）では、体節細胞の誘導が最大となった（７４．７±０．５％）。一方で、より多くの量のＣＨＩＲ９９０２１（１０μＭ）では、逆にＰＡＸ３−ＧＦＰ＋細胞を誘導できなかった（Ｃ１０において、０．３±０．０％、およびＳ１０Ｃ１０において、０．７±０．１％）。この結果より、過剰なＷＮＴシグナル伝達により体節細胞の誘導が抑制されることが示唆される。さらに、ＦＧＦおよびＢＭＰ阻害の効果についても確認し、１０μＭ ＳＢ４３１５４２および５μＭ ＣＨＩＲ９９０２１（Ｓ１０Ｃ５）が、未分節中胚葉細胞からＰＡＸ３−ＧＦＰ＋細胞を最も効率的に誘導することを確認した。
抗ＰＡＲＡＸＩＳ（ＴＣＦ１５）抗体を用いた免疫組織化学によっても図３Ｂに示したＦＡＣＳを用いて得られた結果と同じく、体節細胞（ＳＭ）であることを示すＰＡＲＡＸＩＳ発現細胞がＣ４、Ｓ１０Ｃ１、Ｓ１０Ｃ５およびＳ１０Ｃ５Ｄ２で認められ、その割合はＳ１０Ｃ５群で最も高いことが確認された。【０１２２】
Ｓ１０Ｃ５条件による誘導前後の未分節中胚葉細胞マーカー（ＴＢＸ６、ＭＳＧＮ１およびＷＮＴ３Ａ）および体節細胞マーカー（ＭＥＯＸ１、ＰＡＲＡＸＩＳおよびＰＡＸ３）の発現量をＲＴ−ｑＰＣＲで調べた。結果を図３Ｃに示す。体節細胞のマーカーはまた、体節細胞誘導の４日目（ｉＰＳ細胞から８日目）にピークとなった。同じ条件で誘導した細胞の誘導前後の抗ＴＢＸ６、ＰＡＲＡＸＩＳおよびＭＥＯＸ１抗体の発現を免疫組織化学で、およびＰＡＸ３−ＧＦＰの発現を蛍光にて調べたところ、図３Ｃと同様の結果が得られた。【０１２３】
未分節中胚葉細胞をＳ１０Ｉ１０、Ｓ１０およびＳ１０Ｃ５の条件にて４日間培養した。得られた細胞における体節マーカーであるＰＡＲＡＸＩＳおよびＭＥＯＸ１の発現量をＲＴ−ｑＰＣＲにより調べた。結果を図３Ｄに示す。ＰＡＲＡＸＩＳおよびＭＥＯＸ１発現量は、ＣＨＩＲ９９０２１を含む場合に高かった。
またＣＤＨ１１（上皮性体節細胞のマーカー）の発現を免疫組織化学によって調べたところ、ＣＨＩＲ９９０２１を含む条件（Ｓ１０Ｃ５）においてのみ、ＣＤＨ１１の発現が細胞−細胞ジャンクションに認められた。
ＦＡＣＳソーティング後のＰＡＸ３＋細胞の生存数の低かったため、得られた細胞は、ソーティングなしで、実施例３で用いた。
【実施例３】
【０１２４】
体節（ＳＭ）細胞から皮筋節細胞（ＤＭ）を介し、筋節細胞（ＭＹＯ）および真皮節細胞（Ｄ）の誘導
図４Ａに概略を示す。【０１２５】
（３）体節細胞（ＳＭ）から皮筋節細胞（ＤＭ）の誘導
体節細胞誘導に用いた培地から、皮筋節細胞誘導用培地に交換してさらに培養を続けた。ＷＮＴシグナル伝達の阻害〜活性化のため、１０μＭのＩＷＲ１(Cayman chemical, Michigan, USA)（Ｉ１０）またはＣＨＩＲ９９０２１（０、０．１、１および５μＭ）（Ｃ０，Ｃ０．１，Ｃ１およびＣ５）を用いた。ＢＭＰ活性の制御のため、ＢＭＰ４(R&D, Minneapolis, KA, USA)（０、０．１、１および１０ｎｇ／ｍｌ）（Ｂ０，Ｂ０．１，Ｂ１およびＢ１０）および１０μＭのＤＭＨ１(Tocris)（Ｄ１０）を用いた。【０１２６】
実施例２で得られた体節細胞培養物の培地をＣＤＭ基礎培地にＷＮＴシグナル伝達制御のための因子およびＢＭＰ活性制御のための因子を添加した培地と交換してさらに培養し、皮筋節細胞を誘導した。培養は３日間行い、２日目に培地を交換した。【０１２７】
３日間培養後の細胞について、皮筋節細胞マーカーであるＡＬＸ４、ＥＮ１およびＮＯＧＧＩＮの相対発現量をＲＴ−ｑＰＣＲにて調べた。結果を図４Ｂに示す。ＷＮＴシグナル活性化剤であるＧＳＫ３β阻害剤濃度およびＢＭＰ活性化剤濃度がいずれも高い場合に、これらの皮筋節細胞マーカーが最も誘導されることがわかった。同じく得られた細胞について抗ＡＬＸ４およびＥＮ１抗体を用いた免疫細胞化学、体節細胞および皮筋節細胞両方に発現するＰＡＸ３−ＧＦＰによっても皮筋節細胞が生成していることを確認した。さらに抗ＥＮ１抗体を用いたＦＡＣＳ（図４Ｃ）によっても皮筋節細胞の生成を確認した。【０１２８】
（４）皮筋節細胞（ＤＭ）から筋節細胞（ＭＹＯ）の誘導
上記（３）で得た皮筋節細胞から直接筋節細胞を誘導することを試みた。（３）で得た皮筋節細胞培養物の培地を、ＣＤＭ基礎培地にＣＨＩＲ９９０２１を５μＭ添加した培地に交換し、さらに培養した。培地は３日毎に交換し、３０日間培養した。６日毎に培養細胞を少量採取し、筋原性マーカーであるＭＹＯＤ、ＭＹＯＧおよびＰＡＸ７の経時的発現を調べた。培地交換後１８〜３０日後に筋原性マーカーの誘導が認められた。一方、皮筋節細胞マーカーであるＡＬＸ４の発現は経時的に減少した（図４Ｄ）。また、ＭＹＯＤおよびＭＹＯＧの発現を免疫細胞化学によって調べた。皮節細胞から筋節細胞への誘導効率を、ＭＹＯＤ陽性細胞およびＭＹＯＧ陽性細胞の数に基づき計算したところ、約２２％であった。【０１２９】
（５）皮筋節細胞（ＤＭ）から真皮節細胞（Ｄ）への誘導
生体において皮筋節細胞はまた真皮節細胞へ分化し、真皮節細胞は背中の真皮へと分化するが、インビトロで皮筋節細胞から真皮節細胞を経て真皮へと誘導するプロトコルは確立されていない。上記（３）の皮筋節細胞誘導培地（Ｃ５Ｂ１０）中、継代せずに１１日目（ＳＭから３日目）以降、皮筋節細胞が生じた後も培養を続けた。種々の細胞マーカーの発現をＲＴ−ｑＰＣＲによって調べた結果、ＤＭ生成から６日後にＰＡＸ３およびＰＡＲＡＸＩＳ（皮筋節細胞および体節細胞マーカー：ＳＭ／ＤＭ ｍａｒｋｅｒｓ）ならびにＰＡＸ７およびＮＣＡＤ（皮筋節細胞および筋節細胞マーカー：ＤＭ／ＭＹＯ ｍａｒｋｅｒｓ）の発現レベルが減少した（図４Ｅ上段）。そこで、皮筋節細胞から真皮節細胞の誘導を、皮筋節細胞を皮筋節細胞誘導培地（上記（３）の培地）で引き続き培養することによって行った。皮筋節細胞が生成した後、９日間引き続き培養を行い、培地を３日毎に交換した。ＰＤＧＦＲαは、真皮節細胞（Ｄ）と皮膚線維芽細胞（ＤＦ）において発現し(Orr-Urtreger et al., 1992)、ＥＮ１は、真皮節細胞（Ｄ）および皮筋節細胞（ＤＭ）において発現する(Ahmed et al., 2006)ことが知られている。ＰＤＧＦＲαおよびＥＮ１の発現を、ＲＴ−ｑＰＣＲ（図４Ｅ下段）および免疫細胞化学（データ示さず）によって調べ、これらのマーカーが、真皮節細胞誘導工程の９日目において主に発現することがわかった。ＡＬＸ４およびＭＳＸ１（皮筋節細胞と真皮節細胞のマーカー：ＤＭ／Ｄ ｍａｒｋｅｒｓ）ならびにＣＯＬ１Ａ２（真皮節細胞と皮膚繊維が細胞のマーカー：Ｄ／ＤＦｍａｒｋｅｒｓ）の発現はまた、真皮節細胞誘導工程の９日目において上昇した（図４Ｅ下段）。抗ＰＤＧＦＲαおよび抗ＥＮ１でＦＡＣＳ分析を行い、真皮節細胞培養物の６９．５±１．４％がＰＤＧＦＲα＋であり、ＰＤＧＦＲα＋細胞の９２．７±０．４％がＥＮ１＋であることを確認した（図４Ｆ）。かかる結果から、真皮節細胞（Ｄ）が誘導されたことが確認された。
【実施例４】
【０１３０】
体節細胞（ＳＭ）から硬節細胞（ＳＣＬ）を介し、軟骨細胞、骨細胞および靱帯節細胞（ＳＹＮ）への分化誘導
図５Ａに概略を示す。【０１３１】
（６）体節細胞から硬節細胞への分化誘導
体節細胞から硬節細胞への誘導を、既知方法(Zhao et al., 2014)により行った。具体的には、体節細胞誘導培地を硬節細胞誘導培地（１００ｎＭ ＳＡＧ(ＳＨＨ活性化剤；Calbiochem, La Jolla, CA, USA)および０．６μＭ ＬＤＮ１９３１８９(ＢＭＰ阻害剤；Stemgent, Cambridge, MA, USA)を含むＣＤＭ基礎培地）と交換して３日間培養した。培地は２日目に交換した。【０１３２】
ＰＡＸ１、ＰＡＸ９およびＮＫＸ３．２の発現が、体節細胞を３日間の培養した細胞（ｉＰＳ細胞から１１日目）に確認された（図５Ｂ）。抗ＰＡＸ１および抗ＰＡＸ９抗体での免疫細胞化学に基づいて計算された、体節細胞から硬節細胞誘導率は約４５％であった。【０１３３】
硬節細胞（ＳＣＬ）から３次元軟骨細胞形成誘導（３ＤＣＩ）
全１．０ｘ１０６個の誘導された硬節細胞（ＳＣＬ）を、１０ｎｇ／ｍｌ ＢＭＰ７（Ｒ＆Ｄ）および１０ｎｇ／ｍｌ ＴＧＦβ３（Ｒ＆Ｄ）を添加した、０．５ｍｌの軟骨形成基礎培地（ＤＭＥＭ：Ｆ１２(Invitrogen)に１％（ｖ／ｖ）ＩＴＳ＋Ｐｒｅｍｉｘ(BD Biosciences, San Jose, CA, USA)、０．１μＭデキサメタゾン(WAKO)、０．１７ｍＭ Ｌ−アスコルビン酸２−リン酸セスキマグネシウム水和物(Sigma)、０．３５ｍＭプロリン(Sigma)、０．１５％（ｖ／ｖ）グルコース(Sigma)、１ｍＭピルビン酸ナトリウム、２ｍＭ GlutaMax (Invitrogen)、１％（ｖ／ｖ）ＦＢＳ））に懸濁し、１５ｍｌのチューブ(Corning Inc., Corning, NY, USA)内に移行し、遠心してペレットを形成し、３７℃、５％ＣＯ２中でインキュベートした。培地を３日毎に交換した。【０１３４】
培養した硬節細胞を回収、遠心し、ペレットを形成し、軟骨形成基礎培地中で更に培養した。アルシアンブルー染色、サフラニンＯ染色、抗ＩＩ型コラーゲン抗体による免疫細胞化学（データ示さず）、および軟骨形成マーカー（図５Ｃ）のＲＴ−ｑＰＣＲによって、硬節細胞からの軟骨誘導の２１日目（ｉＰＳ細胞から３２日目）に軟骨が生成したことを確認した。【０１３５】
硬節細胞（ＳＣＬ）から２次元骨形成誘導（２ＤＯＩ）
全４．０ｘ１０５個の誘導された硬節細胞を、マトリゲルで被覆した１２ウェルプレート上に播種し、次いで、MSC go rapid骨形成培地(Biological Industries, Kibbutz Beit-Haemek, Israel)を用いて、２次元で骨細胞への分化を誘導した。骨細胞誘導の１８日目（ｉＰＳ細胞から２９日目）の細胞におけるＰＡＸ１、ＲＵＮＸ２、ＣＯＬ１Ａ１、ＯＳＸおよびＯＰＮの発現（図５Ｄ）並びに細胞のアリザリンレッド染色（データ示さず）により、硬節細胞が骨細胞へ分化したことを確認した。【０１３６】
（７）硬節細胞（ＳＣＬ）から靱帯節細胞（ＳＹＮ）の誘導
硬節の背側の部分は、靱帯節として定義されており、靱帯節は、腱および靱帯の原基である(Brent et al., 2003)。硬節細胞から靱帯節への誘導プロトコルは本願の前には知られていなかった。誘導した硬節細胞を、０．２５％トリプシン−ＥＤＴＡ(GIBCO)でディッシュから取り出し、全５．０ｘ１０４細胞を、マトリゲルで被覆した２４ウェルプレートの１つのウェル上に播種し、次いで靱帯節細胞誘導を行った。【０１３７】
硬節細胞を靱帯節細胞誘導培地Ａ（２０ｎｇ／ｍｌ ＦＧＦ８(Peprotech, Rocky Hill, NJ, USA)を添加したＣＤＭ基礎培地）中で、３日間培養した（工程７−１）。その後継代せずに、培地を、靱帯節細胞誘導培地Ｂ（１０ｎｇ／ｍｌ ＢＭＰ７(R&D)および１０ｎｇ／ｍｌ ＴＧＦβ３(R&D)を含む、ＣＤＭ基礎培地）に交換して１８日間培養した（工程７−２）。培地を３日毎に交換した。【０１３８】
靱帯節細胞への誘導の後期において、靱帯節細胞マーカーである、ＳＣＸ、ＭＫＸ、ＣＯＬ１Ａ１およびＣＯＬ１Ａ２の発現が、経時的に上昇した（図５Ｅ）。また、各因子のタンパク質の発現を、免疫細胞化学によって靱帯節細胞誘導の２１日目に確認して図５Ｅと同様の結果を確認した。ＦＡＣＳによってＳＣＸ発現細胞を確認し、靱帯節細胞への誘導率が６８．０±２．４％であることを確認した（図５Ｆ）。【０１３９】
本願実施例により多能性幹細胞から未分節中胚葉（ＰＳＭ）を経て体節細胞（ＳＭ）を誘導した。体節細胞（ＳＭ）は、さらに真皮節細胞（ＤＭ）、筋節細胞（ＭＹＯ）、硬節細胞（ＳＣＬ）および靱帯節細胞（ＳＹＮ）へと分化誘導した。
各誘導された細胞の遺伝子発現プロファイルを調べた。ヒートマップ解析図を図６Ａに、ＰＣＡプロットを図６Ｂに示す。これらの図より、各段階の細胞への優先的かつ段階的な分化が示され、この結果は各手法の理論的根拠を支持する。
【実施例５】
【０１４０】
（８）体節細胞（ＳＭ）から間葉系間質細胞（ＭＳＣ）の誘導
体節細胞は、間葉系間質細胞の前駆体となり得るが、ヒト多能性幹細胞から体節細胞を介して間葉系間質細胞を誘導したとの報告は今までなかった。体節細胞から間葉系間質細胞を誘導すべく、体節細胞誘導培地を体節細胞由来間葉系間質細胞誘導培地（１０％ウシ胎仔血清(Nichirei Inc., Tokyo, Japan)および４ｎｇ／ｍｌ ＦＧＦ２(WAKO)を含む、αＭＥＭ(Nacalai Tesque, Kyoto, Japan)）に交換してさらに培養した（図７Ａ）。０．２５％トリプシン−ＥＤＴＡ(GIBCO)を用いて容器より培養細胞を剥離し、４日毎に継代を行った。細胞は、２ｘ１０４細胞／ｃｍ３の密度となるよう、組織培養ディッシュ上に播種した。【０１４１】
体節細胞由来間葉系間質細胞誘導を１２日間行い、１２日目に各マーカーの発現量を、ＦＡＣＳで分析した。細胞の形態は線維芽細胞様に変化した。間葉系間質細胞マーカーであるＣＤ４４、ＣＤ７３およびＣＤ１０５について陽性であり（図７Ｂ）、間葉系間質細胞の生成を確認した。【０１４２】
得られた間葉系間質細胞から、上記既知方法により骨形成誘導（ＯＩ）、軟骨形成誘導（ＣＩ）、脂肪形成誘導（ＡＩ）を行い、体節細胞から誘導した間葉系間質細胞（ＳＭＭＳＣ）の分化能を確かめた。ＣＩ、ＯＩ、ＡＩおよびこれらのアッセイ（アリザリンレッド染色、アルシアンブルー染色、オイルレッドＯ染色）を、既報(Fukuta et al., 2014)に従い行ったところ、軟骨、骨および脂肪細胞の生成が確認できた。【０１４３】
体節細胞から誘導される硬節細胞からも、間葉系間質細胞からも、骨形成および軟骨形成を誘導することができる。体節細胞、硬節細胞および間葉系間質細胞を区別するため、体節細胞マーカー（ＰＡＸ３、ＰＡＲＡＸＩＳ、ＭＥＯＸ１）、間葉系間質細胞マーカー（ＣＤ４４、ＣＤ７３、ＣＤ９０およびＣＤ１０５）、また硬節細胞マーカー（ＰＡＸ１、ＰＡＸ９、ＮＫＸ３．２）の発現を、各細胞において、ＲＴ−ｑＰＣＲで分析した。誘導された間葉系間質細胞は、間葉系間質細胞マーカー（ＣＤ４４、ＣＤ７３、ＣＤ９０およびＣＤ１０５）陽性であったが、体節細胞または硬節細胞マーカーは陽性ではなかった（図７Ｃおよび図７Ｄ）。これらの結果は、上記（８）によって誘導された細胞が、間葉系間質細胞であることを示した。
【実施例６】
【０１４４】
体節細胞から誘導した間葉系間質細胞および、体節細胞から誘導した硬節細胞からの軟骨形成の相違
ｉＰＳ細胞の有望な用途の一つは、患者特異的なｉＰＳ細胞での疾患モデリングである。実施例４および５において、硬節細胞由来の軟骨細胞および体節細胞由来間葉系間質細胞由来の軟骨細胞の２つの異なる種類の軟骨細胞の誘導に成功した。このプロトコルを、遺伝的変異によって生じる、進行性骨化性線維異形成症（ＦＯＰ）患者の体細胞から作成したｉＰＳ細胞に適用した（ＦＯＰ−ｉＰＳ細胞）。ＦＯＰは、主に生後の患者の軟組織における軟骨内骨化によって特徴付けられる、難治性希少疾患であり、ＡＣＶＲ１に変異が生じて過剰に働くことに起因することが知られている。本発明者らを含む研究グループは先に、ＦＯＰ−ｉＰＳ由来の神経堤細胞から誘導した間葉系間質細胞を用い、間葉系間質細胞から軟骨形成の亢進が認められることを報告している(Hino et al., 2015; Matsumoto et al., 2015)。同様にＦＯＰ−ｉＰＳ細胞由来の体節細胞から誘導された間葉系間質細胞に由来する軟骨細胞では、軟骨形成が亢進するが、硬節細胞由来の胚性軟骨細胞では、軟骨形成の亢進は無いことが予測される。【０１４５】
試験の概要を図８Ａに示す。体節細胞をＦＯＰ−ｉＰＳ細胞(Matsumoto et al., 2013)および遺伝子を修復した（レスキューした）ＦＯＰ−ｉＰＳ細胞（ｒｅｓＦＯＰ−ｉＰＳ細胞）(Hino et al., 2015; Matsumoto et al., 2015)から、上記実施例１および２のプロトコルに従って誘導した。体節細胞由来間葉系間質細胞および硬節細胞を、実施例４および５のプロトコルにしたがって誘導した。【０１４６】
得られた間葉系間質細胞と硬質細胞を、アクチビンＡ（ＡＣＶＲ１変異体の促進剤）を添加した、または添加していない、軟骨形成培地(Hino et al., 2015）を用い、二次元軟骨形成誘導を行った。【０１４７】
２次元軟骨形成誘導（２ＤＣＩ）
全１．５ｘ１０５個の誘導された間葉系間質細胞または硬節細胞を、５μＬの軟骨形成基本培地（ＤＭＥＭ：Ｆ１２(Invitrogen)、１％（ｖ／ｖ）ＩＴＳ＋Ｐｒｅｍｉｘ(BD Biosciences, San Jose, CA, USA)、０．１μＭデキサメタゾン(WAKO)、０．１７ｍＭ Ｌ−アスコルビン酸２−りん酸セスキマグネシウム水和物(Sigma)、０．３５ｍＭプロリン(Sigma)、０．１５％（ｖ／ｖ）グルコース(Sigma)、１ｍＭピルビン酸ナトリウム、２ｍＭ GlutaMax (Invitrogen)、１％（ｖ／ｖ）ＦＢＳ）に懸濁し、次いで、フィブロネクチンで被覆した２４ウェルプレートの１つのウェルに移行した(BD Biosciences)。３７℃、５％ＣＯ２中での１時間のインキュベーション後、細胞は微小集積(micromass)を形成した。【０１４８】
その後、３０ｎｇ／ｍＬのアクチビンＡ（Ｒ＆Ｄ）を含む、または含まない１０ｎｇ／ｍｌ  ＢＭＰ７（Ｒ＆Ｄ）および１０ｎｇ／ｍｌ  ＴＧＦβ３（Ｒ＆Ｄ）を添加した１ｍＬの軟骨形成基本培地中で、微小集積を、３７℃、５％ＣＯ２中で、５日間培養した。【０１４９】
また、ＦＯＰ−ｉＰＳから誘導した体節細胞由来の間葉系間質細胞から誘導した微小集積を、３０ｎｇ／ｍＬのアクチビンＡ（Ｒ＆Ｄ）を含み、１０ｎＭ Ｒ６６７(Toronto Research Chemicals, Toronto, ON, Canada)または１０ｎＭラパマイシン(MedChem Express, Monmouth Junction, NJ, USA)を含む／含まない、１ｍＬの軟骨形成基本培地中で同様に培養した。【０１５０】
得られた細胞の分化能を、ＲＴ−ｑＰＣＲ分析、グリコサミノグリカン（ＧＡＧ）定量およびアルシアンブルー染色で分析した。簡潔に述べると、誘導された細胞を、４％パラホルムアルデヒド(WAKO)で３０分間固定し、ＰＢＳでリンスし、次いで、アルシアンブルー溶液（１％アルシアンブルー、ｐＨ１）(MUTO PURE CHEMICAL CO., LTD, Tokyo, Japan)で一晩染色した。【０１５１】
結果を図８Ｂ〜Ｄに示す。体節細胞由来間葉系間質細胞と硬節細胞それぞれに由来する軟骨細胞のＡＣＶＲ１の発現レベルは由来する細胞種およびＡＣＶＲ１の変異修復の有無に関わらず、差が無かった（図８Ｂ）。【０１５２】
アクチビンＡ刺激無しの場合、軟骨形成マーカーの発現レベルは由来する細胞種およびＡＣＶＲ１の変異修復の有無に関わらず、差が無かった（データ示さず）。【０１５３】
ＦＯＰ−ｉＰＳから誘導した体節細胞由来間葉系間質細胞をアクチビン刺激下で軟骨へと誘導した場合、軟骨形成マーカーの発現量およびグリコサミノグリカン（ＧＡＧ）産生量に関して、ｒｅｓＦＯＢ−ｉＰＳ細胞から誘導した細胞に比して軟骨形成の亢進を示した（図８ＣおよびＤ）。アルシアンブルー染色においてもＦＯＢ−ｉＰＳ細胞から誘導した体節細胞由来間葉系間質細胞において軟骨形成の亢進が認められた（データ示さず）。一方、アクチビンＡで刺激した体節細胞由来の硬節細胞から軟骨細胞を誘導した場合、ＦＯＢ−ｉＰＳ由来、ｒｅｓＦＯＢ−ｉＰＳ由来細胞の間に軟骨形成マーカーの発現、グリコサミノグリカン（ＧＡＧ）定量およびアルシアンブルー染色結果について差は無かった（図８ＥおよびＦ）。【０１５４】
ＦＯＰ−ｉＰＳから誘導した体節細胞由来間葉系間質細胞のアクチビン刺激下軟骨誘導の際に、Ｒ６６７またはラパマイシンを添加した場合、軟骨形成マーカーの発現およびグリコサミノグリカン（ＧＡＧ）産生量の亢進が有意に抑制された（図８Ｇ、Ｈ）。また、アルシアンブルー染色により軟骨形成の亢進が抑制されていることを確認した。Ｒ６６７（レチノイン酸受容体γアゴニスト）、ラパマイシン（ｍＴＯＲ阻害剤）は共に異所性骨化の強力な抑制剤であることが報告されている(Hino et al., 2017)。【０１５５】
近年、ＦＯＰ病変の起源細胞の１つとして、ＰＤＧＦＲα＋／ＣＤ３１−細胞が提案されている(Dey et al., 2016)。ＦＯＰ−ＳＭＭＳＣをＦＡＣＳによって別々にソーティングしＰＤＧＦＲα＋／ＣＤ３１−細胞およびＰＤＧＦＲα−／ＣＤ３１−細胞を得た（図８Ｉ）。それぞれの細胞から上記プロトコルにて２Ｄ軟骨形成分化を行った。単離した細胞におけるＡＣＶＲ１の発現レベルには差が無かった（データ示さず）。想定されるように、ＰＤＧＦＲα＋／ＣＤ３１−細胞は、ＰＤＧＦＲα−／ＣＤ３１−細胞と比較して、軟骨形成の亢進を示した（図８Ｊおよび６Ｋ）。興味深いことに、ＰＡＩ１およびＭＭＰ１（ＡＣＶＲ１変異体活性化の指標遺伝子）が、ＰＤＧＦＲα＋／ＣＤ３１−細胞において有意に高かった（図８Ｌ）。
これらの結果を図８Ｍにまとめた。ＦＯＰ表現型という細胞種の特異性を示し、我々のプロトコルが疾患モデリング、表現型分析および薬剤の発見に使用できることを示す。
【実施例７】
【０１５６】
硬節細胞（ＳＣＬ）から靱帯節細胞（ＳＹＮ）へのゼノフリー分化誘導
硬節細胞をゼノフリー条件下で誘導されたｉＰＳ細胞から、ゼノフリー環境下で誘導した。具体的には、ｉＰＳ細胞としてゼノフリー条件下で誘導された１２３１Ａ３を用いた。まず実施例１のＳＣＤＦ条件でｉＰＳ細胞を４日間培養し、未分節中胚葉細胞を誘導した。培地にはＳｔｅｍＦｉｔ（登録商標） ＡＫ０３（Ｃ液不含）培地（味の素株式会社、以下、ＡＫ０３（−Ｃ）培地）を用いた。次に体節細胞誘導のため、ＦＡＣＳでソーティングした全１．０ｘ１０５個のＤＬＬ１＋ 未分節中胚葉細胞を、１０μＭ ＳＢ４３１５４２および５μＭ ＣＨＩＲ９９０２１を添加したＡＫ０３（−Ｃ）培地を含むｉＭａｔｒｉｘ５１１（ニッピ株式会社）で被覆された１２ウェルプレートの各ウェルに播種し、４日間培養した。培地を体節細胞誘導の３日目に交換した。硬節細胞の誘導のため、培地を１００ｎＭ ＳＡＧおよび０．６μＭ ＬＤＮ１９３１８９を含むＡＫ０３（−Ｃ）培地に交換し、さらに３日間培養した。硬節細胞誘導の２日目に培地を交換した。【０１５７】
靱帯節細胞の誘導を開始する前日にｉＭａｔｒｉｘ５１１で被覆されたプレートを調製した。ｉＭａｔｒｉｘ５１１で被覆された２４ウェルプレートを調製するため、各ウェルに０．５ｍＬのｉＭａｔｒｉｘ５１１溶液を４℃において添加し、一晩放置した。【０１５８】
誘導した硬節細胞培養液の培地を吸引し、ＰＢＳで洗浄した。各ウェルに０．２ｍＬの細胞剥離試薬Ａｃｃｕｔａｓｅ登録商標（Innovative Cell Technologies, Inc.）を添加し、室温で３分間放置した。次に、各ウェルに０．８ｍＬのＡＫ０３（−Ｃ）培地を添加し、全ての細胞を擦り取って１５ｍＬコニカルチューブに回収した。その後、２８０×ｇで３分間遠心した。上清を慎重に吸引し、１ｍＬの靱帯節細胞誘導培地Ａ’（２０ｎｇ／ｍＬ ＦＧＦ８および１０ｎｇ／ｍＬ ＴＧＦβ３を添加したＡＫ０３（−Ｃ）培地）に再懸濁した。細胞数を自動細胞計数器を用いて計数した。【０１５９】
５．０×１０４個の細胞を、１ｍＬの靱帯節細胞誘導培地Ａ’を含むｉＭａｔｒｉｘ５１１で被覆された２４ウェルプレートの各ウェルに播種し、５％ＣＯ２中、３７℃で２日間インキュベートした（工程７−１）。靱帯節細胞誘導の２日目に、培地を靱帯節細胞誘導培地Ｂ’（１０ｎｇ／ｍＬ ＢＭＰ７および１０ｎｇ／ｍＬ ＴＧＦβ３を添加したＡＫ０３（−Ｃ）培地）に交換した。５％ＣＯ２中、３７℃で８日目まで６日間インキュベートした（工程７−２）。培地を２日毎に交換した。【０１６０】
工程７−１において、実施例４では２０ｎｇ／ｍｌ ＦＧＦ８を添加した培地（靱帯節細胞誘導培地Ａ）を使用したが、本実施例では２０ｎｇ／ｍＬ ＦＧＦ８および１０ｎｇ／ｍＬ ＴＧＦβ３を添加した培地（靱帯節細胞誘導培地Ａ’）を使用した。その結果、工程７−１の培養日数が２日に短縮され、工程７−２の培養日数が６日に短縮された。【０１６１】
靱帯節細胞誘導開始から８日目まで、７つの靱帯節細胞関連マーカー（ＳＣＸ、ＭＫＸ、ＴＮＭＤ、ＴＮＣＣ、ＣＯＬ１Ａ１、ＣＯＬ１Ａ２およびＦＭＯＤ）の発現が経時的に上昇した（図９Ａ）。また、誘導８日目における靱帯節細胞関連マーカー（ＳＣＸ、ＴＮＭＤ、ＣＯＬ１Ａ１およびＣＯＬ１Ａ２）のｍＲＮＡ発現量を調べた。比較のため、ヒト健常前十時靱帯試料（CDD-H-6800-N-R、Articular Engineering社）の各マーカーの発現量を調べた。両者の各マーカーのｍＲＮＡ発現量は同程度であった（図９Ｂ）。さらに、誘導２１日目における免疫染色の結果、各マーカー（ＳＣＸ、ＴＮＭＤ、ＣＯＬ１Ａ１およびＣＯＬ１Ａ２）のタンパク質発現が確認された（図９Ｃ）。
【実施例８】
【０１６２】
ｉＰＳ細胞由来靱帯節細胞の移植治療効果
実施例７における靱帯節細胞誘導８日目の細胞をアキレス腱断裂モデルラットに移植し、移植治療効果を４週間観察した。【０１６３】
アキレス腱断裂モデルラットの作製および飼育の概要を図１０Ａに示す。アキレス腱断裂モデルラットを作製するため、８週齢のＦ３４４／ＮＳｌｃ雄性ラットの左後肢を切開し（図１０Ａ左上）、踵骨から５ｍｍのアキレス腱部位を切断した（図１０Ａ右上）。その後、切開部を縫合し、３×１０６個のｉＰＳ細胞由来靱帯節細胞／５０μＬマトリゲル：ＤＭＥＭ／Ｆ１２＝１：１の溶液を注射した（図１０Ａ左下）。ラットの尾を吊り上げた状態で１週間飼育し（図１０Ａ右下）、その後３週間観察した。【０１６４】
移植後１週間毎に、移植群（Ｔｒａｎｓ）および非移植群（Ｃｔｒｌ）の左後肢のフットプリントを取得した（図１０Ｂ）。健常ラットは踵をあげて歩行する（図１０Ｂの手術前（Ｐｒｅ−ＯＰ）参照）。移植群は非移植群と比較して、移植の２週間後に有意な回復が観察された。【０１６５】
また、移植治療効果の検証をアキレスの機能的指標（Achilles Functional Index, ＡＦＩ；Murrell et al., 2014）に基づいて行った（図１０Ｃ）。移植群は非移植群と比較して、移植の２週間後に有意な回復が観察された。【０１６６】
さらに、移植の４週間後にトレッドミルでの歩行機能の観察を行った（図１０Ｄ）。移植群は非移植群と比較して、床から踵の高さおよび足首の角度の有意な回復が示された。【０１６７】
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【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【図２Ｅ】
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【図２Ｆ】
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【図２Ｇ】
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【図２Ｈ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図４Ｄ】
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【図４Ｅ】
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【図４Ｆ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図５Ｄ】
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【図５Ｅ】
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【図５Ｆ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図７Ｄ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図８Ｄ】
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【図８Ｅ】
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【図８Ｆ】
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【図８Ｇ】
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【図８Ｈ】
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【図８Ｉ】
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【図８Ｊ】
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【図８Ｋ】
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【図８Ｌ】
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【図８Ｍ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図９Ｃ】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１０Ｃ】
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【図１０Ｄ】
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【国際調査報告】
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