(57)【要約】  新たなＩ型コラーゲン又はエラスチンの産生促進剤の提供。  マイコスポリン様アミノ酸又はその塩を有効成分とするＩ型コラーゲン又はエラスチンの産生促進剤。
2020170388.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
マイコスポリン様アミノ酸又はその塩を有効成分とするＩ型コラーゲン又はエラスチンの産生促進剤。
【請求項２】
マイコスポリン様アミノ酸又はその塩が、藻類由来である請求項１記載のＩ型コラーゲン又はエラスチンの産生促進剤。
【請求項３】
マイコスポリン様アミノ酸又はその塩を有効成分とするＩ型コラーゲン遺伝子又はエラスチン遺伝子の発現促進剤。
【請求項４】
マイコスポリン様アミノ酸又はその塩が、藻類由来である請求項３記載のＩ型コラーゲン遺伝子又はエラスチン遺伝子の発現促進剤。
【請求項５】
マイコスポリン様アミノ酸又はその塩の、Ｉ型コラーゲン又はエラスチンの産生促進剤製造のための使用。
【請求項６】
マイコスポリン様アミノ酸又はその塩が、藻類由来である請求項５記載の使用。
【請求項７】
マイコスポリン様アミノ酸又はその塩の、Ｉ型コラーゲン遺伝子又はエラスチン遺伝子の発現促進剤製造のための使用。
【請求項８】
マイコスポリン様アミノ酸又はその塩が、藻類由来である請求項７記載の使用。
【請求項９】
Ｉ型コラーゲン又はエラスチンを産生促進するための、マイコスポリン様アミノ酸又はその塩。
【請求項１０】
マイコスポリン様アミノ酸又はその塩が、藻類由来である請求項９記載の化合物。
【請求項１１】
Ｉ型コラーゲン遺伝子又はエラスチン遺伝子を発現促進するための、マイコスポリン様アミノ酸又はその塩。
【請求項１２】
マイコスポリン様アミノ酸又はその塩が、藻類由来である請求項１１記載の化合物。
【請求項１３】
マイコスポリン様アミノ酸又はその塩の有効量を投与することを特徴とするＩ型コラーゲン又はエラスチンの産生促進方法。
【請求項１４】
マイコスポリン様アミノ酸又はその塩が、藻類由来である請求項１３記載の方法。
【請求項１５】
マイコスポリン様アミノ酸又はその塩の有効量を投与することを特徴とする、Ｉ型コラーゲン遺伝子又はエラスチン遺伝子の発現促進方法。
【請求項１６】
マイコスポリン様アミノ酸又はその塩が、藻類由来である請求項１５記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
Ｉ型コラーゲンは、線維性コラーゲンであり、骨及び皮膚に多く含まれており、骨や皮膚の弾力性に関与している。一方、エラスチンは、コラーゲンの線維を支える役割を持つ線維である。ヒトの皮膚真皮のエラスチン含量は、約２〜５％を占めると言われている。エラスチンは年齢とともに減少し、シワの原因となる。シワなどの症状を予防、改善するため、Ｉ型コラーゲンやエラスチンを塗布、経口摂取が行われている。【０００２】
しかしながら、食品や化粧品中に配合されたＩ型コラーゲンやエラスチンが効率的に吸収され、作用部位に到達するか否かはよくわかっていない。【０００３】
マイコスポリン様アミノ酸は、藻類やホタテ等に含まれるアミノ酸の一種であり、紫外線吸収作用（非特許文献１）や線維芽細胞増殖促進作用（特許文献１）を有することが知られている。また、マイコスポリン様アミノ酸は、ヒアルロン酸産生促進作用があることもすでに知られている（特許文献２）
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２００７−１６００４号
【特許文献２】特許第６２７２８１４号
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】J. Phycol. 34, 418-430(1998)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
前記のごとくＩ型コラーゲンやエラスチンは、吸収され、作用部位に効率的に到達するか否かはよくわかっていないことから、天然成分で吸収されやすい成分を用いてＩ型コラーゲンやエラスチンを産生させるためのＩ型コラーゲン又はエラスチンの産生促進剤が望まれている。
従って、本発明の課題は、新たなＩ型コラーゲン又はヒアルロン酸の産生促進剤を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
そこで本発明者は、新たなＩ型コラーゲン及びエラスチンの産生促進剤を探索すべく、種々の天然由来成分の機能を検討してきたところ、マイコスポリン様アミノ酸又はその塩が強力なＩ型コラーゲン及びエラスチンの産生促進作用を有し、その作用が繊維芽細胞増殖促進作用からは考えられない程度に強力であることを見出し、本発明を完成した。【０００８】
すなわち、本発明は、次の〔１〕〜〔１６〕を提供するものである。【０００９】
〔１〕マイコスポリン様アミノ酸又はその塩を有効成分とするＩ型コラーゲン又はエラスチンの産生促進剤。
〔２〕マイコスポリン様アミノ酸又はその塩が、藻類由来である〔１〕記載のＩ型コラーゲン又はエラスチンの産生促進剤。
〔３〕マイコスポリン様アミノ酸又はその塩を有効成分とするＩ型コラーゲン遺伝子又はエラスチン遺伝子の発現促進剤。
〔４〕マイコスポリン様アミノ酸又はその塩が、藻類由来である〔３〕記載のＩ型コラーゲン遺伝子又はエラスチン遺伝子の発現促進剤。
〔５〕マイコスポリン様アミノ酸又はその塩の、Ｉ型コラーゲン又はエラスチンの産生促進剤製造のための使用。
〔６〕マイコスポリン様アミノ酸又はその塩が、藻類由来である〔５〕記載の使用。
〔７〕マイコスポリン様アミノ酸又はその塩の、Ｉ型コラーゲン遺伝子又はエラスチン遺伝子の発現促進剤製造のための使用。
〔８〕マイコスポリン様アミノ酸又はその塩が、藻類由来である〔７〕記載の使用。
〔９〕Ｉ型コラーゲン又はエラスチンを産生促進するための、マイコスポリン様アミノ酸又はその塩。
〔10〕マイコスポリン様アミノ酸又はその塩が、藻類由来である〔９〕記載の化合物。
〔11〕Ｉ型コラーゲン遺伝子又はエラスチン遺伝子を発現促進するための、マイコスポリン様アミノ酸又はその塩。
〔12〕マイコスポリン様アミノ酸又はその塩が、藻類由来である〔11〕記載の化合物。
〔13〕マイコスポリン様アミノ酸又はその塩の有効量を投与することを特徴とするＩ型コラーゲン又はエラスチンの産生促進方法。
〔14〕マイコスポリン様アミノ酸又はその塩が、藻類由来である〔13〕記載の方法。
〔15〕マイコスポリン様アミノ酸又はその塩の有効量を投与することを特徴とする、Ｉ型コラーゲン遺伝子又はエラスチン遺伝子の発現促進方法。
〔16〕マイコスポリン様アミノ酸又はその塩が、藻類由来である〔15〕記載の方法。
【発明の効果】
【００１０】
本発明のＩ型コラーゲン又はエラスチンの産生促進剤は、低分子で吸収性が良好であるから、経皮的や経口的に投与された後、生体内でＩ型コラーゲン又はエラスチンを産生する。従って、関節、皮膚等においてＩ型コラーゲン又はエラスチンの産生を促進し、関節痛、関節の動きの改善、皮膚の弾力改善等の目的で、医薬品、化粧品、機能性食品等として有用である。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】マイコスポリン様アミノ酸（ＭＡＡｓ）のエラスチン遺伝子の発現促進効果を示す図である。
【図２】マイコスポリン様アミノ酸のＩ型コラーゲン遺伝子発現促進効果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本発明のＩ型コラーゲン又はエラスチンの産生促進剤、又はこれらの遺伝子発現促進剤の有効成分は、マイコスポリン様アミノ酸又はその塩である。
マイコスポリン様アミノ酸は、海藻、微細藻等の藻類、海産物、カビ類等が生産することが知られているシクロヘキサノン構造を有するアミノ酸である。元来、紫外線吸収物質として発見されたものである。前記のように、マイコスポリン様アミノ酸が紫外線吸収作用、繊維芽細胞増殖促進作用を有することは知られているが、Ｉ型コラーゲンやエラスチンの産生促進作用を有することは知られていない。
【００１３】
マイコスポリン様アミノ酸としては、例えば次の化合物が知られている。
【００１４】
【化１】
2020170388.tif 000003
【００１５】
【化２】
2020170388.tif 000004
【００１６】
【化３】
2020170388.tif 000005
【００１７】
本発明に用いられるマイコスポリン様アミノ酸又はその塩としては、貝類等の海産物、カビ類等から抽出することもできるが、藻類由来のものが好ましく、藍藻類、紅藻類、褐藻類又は緑藻類由来のものがより好ましく、藻類由来のマイコスポリン様アミノ酸には、前記化合物が含まれている。
【００１８】
藻類や貝類からマイコスポリン様アミノ酸を抽出するには、藻類の乾燥物又は凍結乾燥物から水、エタノール、アセトン、メタノール、イソプロパノール、アセトニトリル等の極性溶媒又はこれらの混合溶媒を用いて抽出することができる。抽出溶媒としては水−エタノール混液が好ましく、水：エタノール＝１：９〜９：１の混液がより好ましい。得られた抽出物は、さらに活性炭吸着カラム、樹脂カラム等を利用してマイコスポリン様アミノ酸を吸着させ、水−エタノール混液で溶出することにより濃縮するのが好ましい。さらに高速液体クロマトグラフィーにより精製することもできる。
【００１９】
また、マイコスポリン様アミノ酸を含有する藻類抽出エキスは、既に市販されており、これを用いることもできる。
【００２０】
マイコスポリン様アミノ酸の塩としては、塩酸塩等の酸付加塩、ナトリウム塩、カリウム塩等のアルカリ金属塩が挙げられる。
【００２１】
マイコスポリン様アミノ酸又はその塩は、後記実施例に示すように、強力なＩ型コラーゲン及びエラスチンの産生促進作用を有する。かかる優れたＩ型コラーゲン及びエラスチンの産生促進作用は、マイコスポリン様アミノ酸の繊維芽細胞増殖促進作用からは予測できない程強力である。
また、マイコスポリン様アミノ酸又はその塩は、Ｉ型コラーゲン遺伝子又はエラスチン遺伝子の発現を強く促進する作用を有する。従ってマイコスポリン様アミノ酸のＩ型コラーゲン又はエラスチンの産生促進作用はこれらの遺伝子発現促進作用に基づくものと考えられる。
【００２２】
本発明のＩ型コラーゲン又はエラスチンの産生促進剤は、生体内の種々の部位でＩ型コラーゲン又はエラスチンの産生を促進する作用を有する。従って、本発明のＩ型コラーゲン又はエラスチンの産生促進剤は、関節痛、関節の動きの改善剤、皮膚の弾力改善剤等の目的で、医薬品、医薬部外品、化粧品、特定保健用食品、機能性表示食品、機能性食品、美容食品、疾病者用食品等として有用である。
【００２３】
本発明のＩ型コラーゲン又はエラスチンの産生促進剤の投与形態としては、経口投与、注射による投与、経皮投与等が挙げられる。医薬品、医薬部外品、機能性表示食品等として用いる場合には、錠剤、顆粒剤、細粒剤、カプセル剤、トローチ剤等の経口投与製剤；クリーム剤、軟膏剤、乳液、化粧水等の皮膚外用剤が好ましい。また、特定保健用食品、機能性表示食品の場合には、飲料、ヨーグルト等の通常の食品と同様の形態であってもよい。
【００２４】
上記製剤中へのマイコスポリン様アミノ酸又はその塩の配合量は、特に限定されないが、０．００１〜５０質量％が好ましく、０．００１〜３０質量％がより好ましい。
【００２５】
上記経口投与用製剤中には、マイコスポリン様アミノ酸又はその塩以外に、賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、着色剤、矯味剤、矯臭剤等を配合できる。また皮膚外用剤の場合には、マイコスポリン様アミノ酸又はその塩以外に、各種油剤、色素、防腐剤、界面活性剤、増粘剤等を配合できる。さらに、他のヒアルロン酸産生促進剤を配合することもできる。
【実施例】
【００２６】
次に実施例を挙げて本発明をさらに詳細に説明する。【００２７】
試験例１（表皮細胞毒性試験）
１）ヒト正常皮膚由来表皮細胞の培養条件
ヒト正常皮膚由来表皮細胞は、ＨｕＭｅｄｉａ−ＫＧ２（表皮細胞専用培地）を用い、ＣＯ2インキュベーター（５％ＣＯ2、３７℃）内で培養した。培地交換は一日おきに行った。
２）細胞毒性試験
正常ヒト表皮細胞を２×１０4個／１００μＬ／ｗｅｌｌの濃度で９６ウェルプレートに播種し、翌日、各濃度サンプル（１０％を最高濃度とした１０倍希釈系列、８段階濃度）を含む培地（１００μＬ／ｗｅｌｌ）に交換し、２４時間培養した。培養終了時に位相差顕微鏡で細胞形態を観察し、培地を除いてＰＢＳで一度洗浄した後、生細胞数測定試薬ＳＦを１０％の濃度で添加した培地１００μＬを加えて、３７℃、５％ＣＯ2で９０分インキュベートし、その間、３０分おきにマイクロプレートリーダーを用いてサンプルの吸光度を測定した（測定波長：４５０ｎｍ、対照波長：５９５ｎｍ）。細胞の増殖性(viability)は、６０分後〜０分後のＯ．Ｄ．値として算出した。その後、サンプル無添加試験区を１００％としたときの相対値として、Cell Viabilityを示した。各試験濃度はｎ＝３で実施した。【００２８】
３）結果
サンプルとして、０．００００１ｍｇ／ｍＬ〜１０ｍｇ／ｍＬのマイコスポリン様アミノ酸（藻類から、特開２００７−１６００４号公報と同様にして７０％エタノール水溶液及び活性炭カラムで抽出分画したマイコスポリン様アミノ酸乾燥物）を添加して培養しても何ら細胞毒性を示さなかった。
試験例２（線維芽細胞増殖試験）
１）培養条件
正常ヒト線維芽細胞は、１０％ＦＢＳ添加Ｄ−ＭＥＭ培地を用い、ＣＯ2インキュベーター（５％ＣＯ2、３７℃）内で培養した。１０％ＦＢＳ添加Ｄ−ＭＥＭ培地は、Ｄ−ＭＥＭ培地４４５ｍＬにＦＢＳ５０ｍＬとPenicillin-streptomycin solution ５ｍＬを加えて調製した。
２）細胞賦活試験（ＷＳＴ−８アッセイ）
増殖培地で５×１０4個／ｍＬに調製した線維芽細胞を１ウェル（９６ウェルプレート）あたり１００μＬ播種した（５×１０3個／１００μＬ／１ウェル）。これは、翌日におよそ５０％コンフルエント、つまり対数増殖期となる細胞数であり、被験物質が細胞増殖活性に与える影響を解析するのに適した細胞数である。播種後約２４時間培養し、各濃度のサンプルを含む増殖培地１００μＬに交換して、さらに２４時間培養した。培養終了時に培地を除き、生細胞数測定試薬ＳＦを１０％の濃度で添加した培地１００μＬを加え、３７℃、５％ＣＯ2でインキュベートした（測定波長：４５０ｎｍ、対照波長：５９５ｎｍ）。添加後、３０分、９０分後にマイクロプレートリーダーにて吸光度測定し（測定：４５０ｎｍ）、９０分、３０分の値から１時間あたりの吸光度変化量を算出した。各試験濃度はｎ＝５で実施した。
３）結果
マイコスポリン様アミノ酸１ｍｇ／ｍＬ添加群での生細胞数相対値は１０９±２．２２％で、無添加群での１００±１．４３％と比して、約１０％高く、無添加群に比して有意（ｐ＜０．０５）に増加していた。【００２９】
【表１】
2020170388.tif 000006
【００３０】
試験例３（遺伝子発現試験）
使用培地をＤ−ＭＥＭ（シグマ社）＋１０％ＦＢＳ（ＢＷＴ社）とし、ヒト正常線維芽細胞（ＨＤＦｎ、ギブコ社）を９．０×１０4／ウェル（１２穴プレート）で播き、定着後、Ｓｔａｒｖａｔｉｏｎ培地（Ｄ−ＭＥＭ（シグマ社））に２４時間置き換えた。その後、マイコスポリン様アミノ酸をＤ―ＭＥＭに０、１０、２５、３０、４０及び５０μｇ／ｍＬとなる様に調製した培地と交換し、３時間後に細胞を回収し、ＲＮＡ抽出キット（ReliaPrepTM RNA Miniprep Systems／カタログ番号Ｚ６０１２、プロメガ社）を用いてＲＮＡを抽出後、ｃＤＮＡを合成し（東洋紡、製品番号ＦＳＱ−３０１Ｓ）、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ（SYBR Fast qPCR Mix、カタログ番号ＲＲ４３０Ｂ、タカラバイオ社）にてＩ型コラーゲン遺伝子及びエラスチン遺伝子の発現解析を行った。
用いたプライマーは以下の通り。遺伝子発現を標準化するために、Ribosomal Protein Lateral Stalk Subunit P0(RPLPO)遺伝子の発現量で補正を行った。【００３１】
【表２】
2020170388.tif 000007
【００３２】
この結果、図１及び図２に示すように、エラスチン遺伝子及びＩ型コラーゲン遺伝子では、共にマイコスポリン様アミノ酸濃度が３０μｇ／ｍＬで有意に遺伝子発現が増強された。
【図１】
2020170388.tif 000008
【図２】
2020170388.tif 000009
【配列表】
2020170388000001.app
【国際調査報告】
2020170388.tif 000010
2020170388.tif 000011
2020170388.tif 000012
2020170388.tif 000013