(57)【要約】  本発明は、従来技術と比較して高い腫瘍増殖抑制作用を有する、HGSのC領域のペプチド及びこれを含む抗腫瘍剤を提供することを目的とする。  本発明は、HGSのC領域のアミノ酸配列のうち少なくとも連続する１０アミノ酸残基を含むペプチドを含有する、抗腫瘍剤を提供する。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
HGF-regulated tyrosine kinase substrate（HGS）のC領域のアミノ酸配列のうち少なくとも連続する１０アミノ酸残基を含むペプチド（但し、配列番号１３〜３４のアミノ酸配列からなるペプチドを除く）を含有する、抗腫瘍剤。
【請求項２】
前記ペプチドが以下の(a)、(b)又は(c)である、請求項１に記載の抗腫瘍剤。
(a) 配列番号６７のアミノ酸配列からなるペプチド
(b) 配列番号６７のアミノ酸配列からなるペプチドにおいて１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ腫瘍増殖抑制作用又は転移抑制作用を有するペプチド
(c) 配列番号６７のアミノ酸配列からなるペプチドと８０％以上の配列同一性を有し、かつ腫瘍増殖抑制作用又は転移抑制作用を有するペプチド
【請求項３】
前記ペプチドが以下の(d)、(e)又は(f)である、請求項１に記載の抗腫瘍剤。
(d) 配列番号５０のアミノ酸配列からなるペプチド
(e) 配列番号５０のアミノ酸配列からなるペプチドにおいて１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ腫瘍増殖抑制作用又は転移抑制作用を有するペプチド
(f) 配列番号５０のアミノ酸配列からなるペプチドと８０％以上の配列同一性を有し、かつ腫瘍増殖抑制作用又は転移抑制作用を有するペプチド
【請求項４】
前記ペプチドが以下の(g)、(h)又は(i)である、請求項１に記載の抗腫瘍剤。
(g) 配列番号５９のアミノ酸配列からなるペプチド
(h) 配列番号５９のアミノ酸配列からなるペプチドにおいて１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ腫瘍増殖抑制作用又は転移抑制作用を有するペプチド
(i) 配列番号５９のアミノ酸配列からなるペプチドと８０％以上の配列同一性を有し、かつ腫瘍増殖抑制作用又は転移抑制作用を有するペプチド
【請求項５】
前記ペプチドが、以下の(j)〜(p)のいずれかのアミノ酸配列（配列中Xは任意のアミノ酸を表す）からなり、かつ腫瘍増殖抑制作用又は転移抑制作用を有するペプチドである、請求項２に記載の抗腫瘍剤。
(j) E-X-R-L-Y-Y-E-G-L-Q-D-K（配列番号７３）
(k) E-R-X-L-Y-Y-E-G-L-Q-D-K（配列番号７４）
(l) E-R-R-X-Y-Y-E-G-L-Q-D-K（配列番号７５）
(m) E-R-R-L-X-Y-E-G-L-Q-D-K（配列番号７６）
(n) E-R-R-L-Y-Y-E-X-L-Q-D-K（配列番号７９）
(o) E-R-R-L-Y-Y-E-G-X-Q-D-K（配列番号８０）
(p) E-R-R-L-Y-Y-E-G-L-X-D-K（配列番号８１）
【請求項６】
腫瘍増殖抑制剤である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の抗腫瘍剤。
【請求項７】
転移抑制剤である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の抗腫瘍剤。
【請求項８】
治療有効量のペプチドを対象に投与することを含む、前記対象における癌又は腫瘍を治療する方法であって、前記ペプチドが、HGF-regulated tyrosine kinase substrate（HGS）のC領域のアミノ酸配列のうち少なくとも連続する１０アミノ酸残基を含むペプチド（但し、配列番号１３〜３４のアミノ酸配列からなるペプチドを除く）である、前記方法。
【請求項９】
有効量のペプチドを対象に投与することを含む、前記対象における癌又は腫瘍の増殖又は転移を抑制する方法であって、前記ペプチドが、HGF-regulated tyrosine kinase substrate（HGS）のC領域のアミノ酸配列のうち少なくとも連続する１０アミノ酸残基を含むペプチド（但し、配列番号１３〜３４のアミノ酸配列からなるペプチドを除く）である、前記方法。
【請求項１０】
癌又は腫瘍の治療において使用するための、HGF-regulated tyrosine kinase substrate（HGS）のC領域のアミノ酸配列のうち少なくとも連続する１０アミノ酸残基を含むペプチド（但し、配列番号１３〜３４のアミノ酸配列からなるペプチドを除く）。
【請求項１１】
癌又は腫瘍の増殖又は転移の抑制において使用するための、HGF-regulated tyrosine kinase substrate（HGS）のC領域のアミノ酸配列のうち少なくとも連続する１０アミノ酸残基を含むペプチド（但し、配列番号１３〜３４のアミノ酸配列からなるペプチドを除く）。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、HGF-regulated tyrosine kinase substrate（HGS）を標的とした抗腫瘍剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
Hepatocyte growth factor-regulated tyrosine kinase substrate (HGS)は、signal-transducing adaptor molecule (STAM)と複合体を形成し、エンドソーム内腔小胞形成(多小胞体形成)を担うEndosomal Sorting Complexes Required for Transport（ESCRT）の構成分子である。HGSは、Hrsとも呼ばれる。
HGSは、癌細胞において発現量が増加していることが知られており、HGSの高発現により、癌細胞転移、血管新生及び癌細胞の増殖が亢進することが知られている。一方、HGSのコイルド-コイル領域(以下「C領域」又は「HGS/C」ともいう)及びその部分ペプチドを癌細胞で高発現させた場合、血管新生及び癌細胞の増殖を抑制することが知られている（特許文献１：国際公開第2011/162419号公報）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】国際公開第2011/162419号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
上記の通り、HGSのC領域の部分ペプチドは腫瘍増殖を抑制するが、抗腫瘍剤として用いるためにさらに高い腫瘍増殖抑制作用を有するペプチドが求められる。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者は、上記課題を解決するために鋭意研究を行った結果、従来のHGS/Cの部分ペプチドと比較して、腫瘍増殖抑制作用がより高いペプチドを製造することに成功し、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は以下の通りである。【０００６】
（１）HGF-regulated tyrosine kinase substrate（HGS）のC領域のアミノ酸配列のうち少なくとも連続する１０アミノ酸残基を含むペプチド（但し、配列番号１３〜３４のいずれかのアミノ酸配列からなるペプチドを除く）を含有する、抗腫瘍剤。
（２）前記ペプチドが以下の(a)、(b)又は(c)である、上記（１）に記載の抗腫瘍剤。
(a) 配列番号６７のアミノ酸配列からなるペプチド
(b) 配列番号６７のアミノ酸配列からなるペプチドにおいて１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ腫瘍増殖抑制作用又は転移抑制作用を有するペプチド
(c) 配列番号６７のアミノ酸配列からなるペプチドと８０％以上の配列同一性を有し、かつ腫瘍増殖抑制作用又は転移抑制作用を有するペプチド
（３）前記ペプチドが以下の(d)、(e)又は(f)である、上記（１）に記載の抗腫瘍剤。
(d) 配列番号５０のアミノ酸配列からなるペプチド
(e) 配列番号５０のアミノ酸配列からなるペプチドにおいて１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ腫瘍増殖抑制作用又は転移抑制作用を有するペプチド
(f) 配列番号５０のアミノ酸配列からなるペプチドと８０％以上の配列同一性を有し、かつ腫瘍増殖抑制作用又は転移抑制作用を有するペプチド
（４）前記ペプチドが以下の(g)、(h)又は(i)である、上記（１）に記載の抗腫瘍剤。
(g) 配列番号５９のアミノ酸配列からなるペプチド
(h) 配列番号５９のアミノ酸配列からなるペプチドにおいて１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ腫瘍増殖抑制作用又は転移抑制作用を有するペプチド
(i) 配列番号５９のアミノ酸配列からなるペプチドと８０％以上の配列同一性を有し、かつ腫瘍増殖抑制作用又は転移抑制作用を有するペプチド
（５）前記ペプチドが、以下の(j)〜(p)のいずれかのアミノ酸配列（配列中Xは任意のアミノ酸を表す）からなり、かつ腫瘍増殖抑制作用又は転移抑制作用を有するペプチドである、上記（２）に記載の抗腫瘍剤。
(j) E-X-R-L-Y-Y-E-G-L-Q-D-K（配列番号７３）
(k) E-R-X-L-Y-Y-E-G-L-Q-D-K（配列番号７４）
(l) E-R-R-X-Y-Y-E-G-L-Q-D-K（配列番号７５）
(m) E-R-R-L-X-Y-E-G-L-Q-D-K（配列番号７６）
(n) E-R-R-L-Y-Y-E-X-L-Q-D-K（配列番号７９）
(o) E-R-R-L-Y-Y-E-G-X-Q-D-K（配列番号８０）
(p) E-R-R-L-Y-Y-E-G-L-X-D-K（配列番号８１）
（６）腫瘍増殖抑制剤である、上記（１）〜（５）のいずれかに記載の抗腫瘍剤。
（７）転移抑制剤である、上記（１）〜（５）のいずれかに記載の抗腫瘍剤。
（８）治療有効量のペプチドを対象に投与することを含む、前記対象における癌又は腫瘍を治療する方法であって、前記ペプチドが、HGF-regulated tyrosine kinase substrate（HGS）のC領域のアミノ酸配列のうち少なくとも連続する１０アミノ酸残基を含むペプチド（但し、配列番号１３〜３４のアミノ酸配列からなるペプチドを除く）である、前記方法。
（９）有効量のペプチドを対象に投与することを含む、前記対象における癌又は腫瘍の増殖又は転移を抑制する方法であって、前記ペプチドが、HGF-regulated tyrosine kinase substrate（HGS）のC領域のアミノ酸配列のうち少なくとも連続する１０アミノ酸残基を含むペプチド（但し、配列番号１３〜３４のアミノ酸配列からなるペプチドを除く）である、前記方法。
（１０）癌又は腫瘍の治療において使用するための、HGF-regulated tyrosine kinase substrate（HGS）のC領域のアミノ酸配列のうち少なくとも連続する１０アミノ酸残基を含むペプチド（但し、配列番号１３〜３４のアミノ酸配列からなるペプチドを除く）。
（１１）癌又は腫瘍の増殖又は転移の抑制において使用するための、HGF-regulated tyrosine kinase substrate（HGS）のC領域のアミノ酸配列のうち少なくとも連続する１０アミノ酸残基を含むペプチド（但し、配列番号１３〜３４のアミノ酸配列からなるペプチドを除く）。
【発明の効果】
【０００７】
本発明により、従来のHGS/Cの部分ペプチドと比較してより高い腫瘍増殖抑制作用を有するペプチド及びこれを含む抗腫瘍剤を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】HGSの構造を示す模式図である。
【図２Ａ】B16細胞における足場非依存的／依存的増殖抑制試験の結果を示す図である。
【図２Ｂ】COLO205細胞における足場非依存的／依存的増殖抑制試験の結果を示す図である。
【図３Ａ】本発明のオリゴペプチド（OP12-462）を用いたin vivo Xenograft試験の結果を示す図である。
【図３Ｂ】本発明のオリゴペプチド（OP10-507）を用いたin vivo Xenograft試験の結果を示す図である。
【図３Ｃ】本発明のオリゴペプチド（OP10-527）を用いたin vivo Xenograft試験の結果を示す図である。
【図４】本発明のオリゴペプチド（OP12-462）を用いた実験的肺転移阻害試験の結果を示す図である。
【図５】本発明のオリゴペプチド（OP12-462）の変異体を用いた足場非依存的増殖抑制試験の結果を示す図である。
【図６Ａ】従来技術のオリゴペプチド（OP10-10）を用いたin vivo Xenograft試験の結果を示す図である。
【図６Ｂ】従来技術のオリゴペプチド（OP10-7）を用いたin vivo Xenograft試験の結果を示す図である。
【図６Ｃ】従来技術のオリゴペプチド（OP10-11）を用いたin vivo Xenograft試験の結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
以下、本発明を詳細に説明する。以下の実施の形態は、本発明を説明するための例示であり、本発明をこの実施の形態のみに限定する趣旨ではない。本発明は、その要旨を逸脱しない限り、様々な形態で実施をすることができる。また、本明細書は、本願優先権主張の基礎となる2018年8月29日に出願された日本国特許出願（特願2018-160501号）の明細書及び図面に記載の内容を包含する。
【００１０】
１．概要
本発明は、HGF-regulated tyrosine kinase substrate（HGS）を標的とした抗腫瘍剤に関するものである。
従来、HGSのC領域の部分ペプチドは腫瘍増殖を抑制することが知られていたが（国際公開第2011/162419号公報）、現在、抗腫瘍剤として用いるためにさらに高い腫瘍増殖抑制作用を有するペプチドが必要とされている。
そこで、本発明者は、鋭意研究を行った結果、従来のHGS/Cの部分ペプチドと比較してより高い腫瘍増殖抑制作用を有するペプチドを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１１】
２．HGS
（１）HGSの機能
HGSは、signal-transducing adaptor molecule (STAM)と複合体を形成し、エンドソーム内腔小胞形成(多小胞体形成)を担うEndosomal Sorting Complexes Required for Transport（ESCRT）の構成分子である。多小胞体形成によりWnt-β-catenin情報伝達が誘導され、このシグナルにより、腫瘍増殖や上皮細胞−間葉系細胞変異(Epithelial-Mesenchymal Transition(EMT))などが生じる。EMTは、胎児形態形成初期における必須の過程であり、がん細胞転移における浸潤及び血管内移行にも大きく関与している過程である。
【００１２】
（２）HGS
本発明において、HGSが由来する動物種は、限定されるものではなく、ラット由来、ヒト由来、マウス由来のいずれであってもよい。ラットHGSは、マウス又はヒトHGSのホモログである。ラットHGSとマウスHGS、ラットHGSとヒトHGS、マウスHGSとヒトHGSのアミノ酸配列相同性（同一性）は以下の通りである。
(a) ラットHGSとマウスHGSのアミノ酸配列相同性は97％
(b) ラットHGSとヒトHGSのアミノ酸配列相同性は93％
(c) マウスHGSとヒトHGSのアミノ酸配列相同性は93％
従って、本発明において、HGSには、ラット由来HGS、ヒト由来HGS、マウス由来HGSが含まれる。
【００１３】
ラット由来、ヒト由来、マウス由来のHGSのアミノ酸配列を、それぞれ配列番号２、４、６で表す。また、ラット由来、ヒト由来、マウス由来のHGSをコードするポリヌクレオチドの塩基配列を、それぞれ配列番号１、３、５で表す。上記塩基配列及びアミノ酸配列は、GenBankに登録されている。各種HGS(Hrs)の塩基配列及びアミノ酸配列のGenBankアクセッション番号を以下に示す。
ラットHGS（配列番号１、２）：AB002811
ヒトHGS（配列番号３、４）：U43895
マウスHGS（配列番号５、６）：D50050
また、本発明において、ラットHGSのアミノ酸配列としては、配列番号９６のアミノ酸配列を使用することができる。
【００１４】
（３）HGSをコードするポリヌクレオチド
上記の通り、ラットHGSはマウス又はヒトHGSのホモログである。従って、本発明のHGSをコードするポリヌクレオチドには、HGSをコードするポリヌクレオチド、例えば、ヒト及びマウスのHGSをコードするポリヌクレオチド（配列番号３及び５）、さらに、配列番号４及び６のアミノ酸配列からなるヒト及びマウスHGSのペプチドをコードするポリヌクレオチドが含まれる。また、ラットHGSをコードするポリヌクレオチドも含まれる。
ここで、「ポリヌクレオチド」とは、複数のデオキシリボ核酸 (DNA) またはリボ核酸 (RNA)等の塩基または塩基対からなる重合体を指し、DNA、cDNA、ゲノムDNA、化学合成DNA及びRNAを含む。また、天然以外の人工塩基を必要に応じて含むポリヌクレオチドも包含する。
【００１５】
３．HGSのC領域
（１）HGSのC領域
HGSタンパク質は、図１に示すように、アミノ末端側から順にzinc-finger配列(FYVE)を持つ領域(Z)、高プロリン領域(P)、コイルド−コイル領域(C)及び高プロリン２／高グルタミン領域(Q)の４つの領域（ドメイン）から構成されているタンパク質である。
HGSの C-Q領域を少なくとも含むペプチドはEMT誘導能を有しており、Q領域を含まずかつC領域を含むペプチド（例えば、ZPC、PC、C）は、EMT誘導阻害活性を有している。また、トランスウェルチャンバーを用いたin vitro細胞遊走実験において、全長のHGS(ZPCQ)を発現する細胞は遊走性が上昇するが、一方、Q領域を欠損し、かつC領域を含むHGS変異体（ZPC、PC、C）では顕著にその遊走性が低下し、特にC領域を発現する細胞は遊走性の低下が顕著である（特開2005-247735号公報）。さらに、HGSのC領域のペプチドは、癌細胞の転移を抑制する。
従って、HGSのC領域のペプチドは、癌転移抑制作用を有する。また、HGSのC領域のペプチドは、腫瘍増殖抑制作用を有する。
【００１６】
（２）HGSのC領域を含むペプチド
本発明において、HGS/Cのペプチド及びその変異体は、当業者であれば下記の表１及び後述する変異体の作製方法に基づいて、容易に作製することができる。配列番号２、配列番号４及び配列番号６で表されるアミノ酸配列におけるZ、P、C及びQ領域の位置を以下の表１に示す。
【表１】
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【００１７】
本発明において、HGSのC領域のペプチドとしては、配列番号８（ラットHGS/C）、配列番号１０（ヒトHGS/C）又は配列番号１２（マウスHGS/C）で表されるアミノ酸配列からなるペプチドが挙げられる。
【００１８】
（３）HGSのC領域を含むペプチドをコードするポリヌクレオチド
上記（２）に記載のペプチドをコードするポリヌクレオチドとしては、HGS/Cをコードするポリヌクレオチドが挙げられる。これらのポリヌクレオチド及びその変異体は、当業者であれば下記の表２及び公知のハイブリダイゼーション方法に基づいて容易に作製することができる。配列番号１（ラットHGS）、配列番号３（ヒトHGS）及び配列番号５（マウスHGS）の塩基配列におけるZ、P、C及びQ領域の位置を以下の表２に示す。
【表２】
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【００１９】
本発明において、HGS/Cをコードするポリヌクレオチドは、配列番号７、９又は１１で表される塩基配列のほか、前記HGSのC領域ペプチドをコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドであれば特に限定されない。例えば、配列番号８、１０又は１２で表されるアミノ酸配列からなるペプチドをコードするポリヌクレオチドのほか、配列番号８、１０又は１２で表されるアミノ酸配列において1若しくは複数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換または付加されたアミノ酸配列からなる変異ペプチドであって、腫瘍増殖抑制作用又は転移抑制作用を有するペプチドをコードするポリヌクレオチドも本発明において使用することができる。
【００２０】
本発明のHGS/Cをコードするポリヌクレオチドは、配列番号７、９又は１１で表される塩基配列からなるポリヌクレオチド、または該塩基配列に相補的な配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、腫瘍増殖抑制作用又は転移抑制作用を有するペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む。このようなポリヌクレオチドは、配列番号７、９又は１１で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドに基づいて公知の方法により取得することができる。
【００２１】
４．HGSのC領域の構成オリゴペプチド（HGS/C構成オリゴペプチド）
HGSのC領域のペプチドは、その一部のペプチドも、癌細胞の転移抑制作用及び腫瘍増殖抑制作用を有する。例えば、後述する実施例に記載のとおり、HGSのC領域の構成オリゴペプチドは、癌細胞の転移抑制作用及び腫瘍増殖抑制作用を有する。
HGSのC領域のペプチドは約30KDタンパク質であり、大量生産が容易でなかったが、HGSのC領域の構成オリゴペプチドは1.5Kd以下のペプチドであり、製造は容易である。
【００２２】
従って、本発明に使用されるペプチドには、HGSのC領域の一部を含むペプチドが含まれる。ここで、「一部」のアミノ酸配列の長さは、少なくとも連続する１０アミノ酸残基を含む長さであれば特に限定されない。すなわち、本発明において、HGSのC領域の一部を含むペプチドには、「HGSのC領域のアミノ酸配列のうち少なくとも連続する１０アミノ酸残基を含むペプチド」が含まれる。また、本発明における「ペプチド」には、アミノ酸残基の数が２〜２０であるオリゴペプチド、アミノ酸残基の数が２０以上であるポリペプチドも含まれる。
ただし、下記のアミノ酸配列からなるペプチドは、本発明に使用されるペプチドには含まれない（本発明に使用されるペプチドから除かれる）。
OP20-1：MKSNHMRGRSITNDSAVLSL（配列番号１３）
OP20-2：ITNDSAVLSLFQSINTMHPQ（配列番号１４）
OP20-3：FQSINTMHPQLLELLNQLDE（配列番号１５）
OP20-4：LLELLNQLDERRLYYEGLQD（配列番号１６）
OP20-5：RRLYYEGLQDKLAQIRDARG（配列番号１７）
OP20-6：KLAQIRDARGALSALREEHR（配列番号１８）
OP20-7：ALSALREEHREKLRRAAEEA（配列番号１９）
OP20-8：EKLRRAAEEAERQRQIQLAQ（配列番号２０）
OP20-9：ERQRQIQLAQKLEIMRQKKQ（配列番号２１）
OP20-10：KLEIMRQKKQEYLEVQRQLA（配列番号２２）
OP20-11：EYLEVQRQLAIQRLQEQEKE（配列番号２３）
OP20-12：IQRLQEQEKERQMRLEQQKQ（配列番号２４）
OP20-13：RQMRLEQQKQTVQMRAQMPA（配列番号２５）
OP10-1：MGRGSGTFER（配列番号２６）
OP10-3：FQSINTMHPQ（配列番号２７）
OP10-6：KLAQIRDARG（配列番号２８）
OP10-7：ALSALREEHR（配列番号２９）
OP10-8：EKLRRAAEEA（配列番号３０）
OP10-9：ERQRQIQLAQ（配列番号３１）
OP10-10：KLEIMRQKKQ（配列番号３２）
OP10-11：EYLEVQRQLA（配列番号３３）
OP10-12：IQRLQEQEKE（配列番号３４）
【００２３】
本発明において、「HGSのC領域のアミノ酸配列のうち少なくとも連続する１０アミノ酸残基を含むペプチド」としては、例えば、配列番号８、１０又は１２のアミノ酸配列のうち少なくとも連続する１０アミノ酸残基以上、１１アミノ酸残基以上、１２アミノ酸残基以上、１４アミノ酸残基以上を含むペプチドが挙げられる。より具体的には、配列番号８、１０又は１２のアミノ酸配列のうち連続する１０〜３０アミノ酸残基、好ましくは１０〜２０アミノ酸残基、より好ましくは１０〜１４アミノ酸残基、さらに好ましくは１０〜１２アミノ酸残基を含むペプチドが挙げられる。
【００２４】
また、「HGSのC領域のアミノ酸配列のうち少なくとも連続する１０アミノ酸残基」のアミノ酸配列が選択されるアミノ酸配列の範囲としては、配列番号８、１０又は１２のアミノ酸配列（配列番号２、４又は６のアミノ酸配列の第３９１番目〜第５６２、５６３又は５６１番目のアミノ酸配列）の範囲内であれば限定されるものではないが、例えば、配列番号４のアミノ酸配列において、以下のアミノ酸配列：
第４０７番目（Ｑ（グルタミン））〜第５６０番目（Ｍ（メチオニン））のアミノ酸配列、
第４０７番目（Ｑ）〜第５５１番目（Ｋ（リジン））のアミノ酸配列、
第４０７番目（Ｑ）〜第４７９番目（Ｄ（アスパラギン酸））のアミノ酸配列、
第４２０番目（Ｖ（バリン））〜第５６０番目（Ｍ）のアミノ酸配列、
第４２０番目（Ｖ）〜第５５１番目（Ｋ）のアミノ酸配列、
第４２０番目（Ｖ）〜第４７９番目（Ｄ）のアミノ酸配列、
第４４３番目（Ｆ（フェニルアラニン））〜第５６０番目（Ｍ）のアミノ酸配列、
第４４３番目（Ｆ）〜第５５１番目（Ｋ）のアミノ酸配列、
第４４３番目（Ｆ）〜第４７９番目（Ｄ）のアミノ酸配列、
第４５２番目（Ｑ（グルタミン））〜第５６０番目（Ｍ）のアミノ酸配列、
第４５２番目（Ｑ）〜第５５１番目（Ｋ）のアミノ酸配列、
第４５２番目（Ｑ）〜第４７９番目（Ｄ）のアミノ酸配列、
第４７９番目（Ｄ）〜第５６０番目（Ｍ）のアミノ酸配列、
第４７９番目（Ｍ）〜第５５１番目（Ｋ）のアミノ酸配列
の範囲が挙げられる。
【００２５】
「HGSのC領域のアミノ酸配列のうち少なくとも連続する１０アミノ酸残基」のアミノ酸配列が選択されるアミノ酸配列の範囲は、配列番号４のアミノ酸配列において、好ましくは第４０７番目（Ｑ）〜第５６０番目（Ｍ）のアミノ酸配列であり、より好ましくは、第４０７番目（Ｑ）〜第５５１番目（Ｋ）、第４２０番目（Ｖ）〜第５６０番目（Ｍ）、第４４３番目（Ｆ）〜第５６０番目（Ｍ）、又は第４５２番目（Ｑ）〜第５６０番目（Ｍ）、のアミノ酸配列であり、さらに好ましくは第４２０番目（Ｖ）〜第５５１番目（Ｋ）のアミノ酸配列又は第４４３番目（Ｆ）〜第５５１番目（Ｋ）のアミノ酸配列であり、さらにより好ましくは第４５２番目（Ｑ）〜第５５１番目（Ｋ）のアミノ酸配列である。
【００２６】
別の態様において、「HGSのC領域のアミノ酸配列のうち少なくとも連続する１０アミノ酸残基」のアミノ酸配列が選択されるアミノ酸配列の範囲としては、配列番号４のアミノ酸配列において、好ましくは第４０７番目（Ｑ）〜第４７９番目（Ｄ）のアミノ酸配列であり、より好ましくは、第４２０番目（Ｖ）〜第４７９番目（Ｄ）のアミノ酸配列であり、さらに好ましくは第４４３番目（Ｆ）〜第４７９番目（Ｄ）のアミノ酸配列であり、さらにより好ましくは第４５２番目（Ｑ）〜第４７９番目（Ｄ）のアミノ酸配列である。
【００２７】
また別の態様において、「HGSのC領域のアミノ酸配列のうち少なくとも連続する１０アミノ酸残基」のアミノ酸配列が選択されるアミノ酸配列の範囲としては、配列番号４のアミノ酸配列において、好ましくは第４７９番目（Ｄ）〜第５６０番目（Ｍ）のアミノ酸配列であり、より好ましくは、第４７９番目（Ｄ）〜第５５１番目（Ｋ）のアミノ酸配列である。
【００２８】
同様に、配列番号２及び６のアミノ酸配列においても、配列番号４のアミノ酸配列における上記アミノ酸配列の範囲に相当する範囲のアミノ酸配列を、「HGSのC領域のアミノ酸配列のうち少なくとも連続する１０アミノ酸残基」のアミノ酸配列として選択することができる。
さらに、「HGSのC領域のアミノ酸配列のうち少なくとも連続する１０アミノ酸残基」のアミノ酸配列としては、限定されるものではなく、例えば下記表に示すアミノ酸配列のいずれかを含むものが挙げられるが、好ましくは、OP10-463（配列番号３８）、OP10-507（配列番号５０）、OP10-527（配列番号５９）及びOP12-462（配列番号６７）のいずれかのアミノ酸配列を含むものである。
【００２９】
【表３】
2020045479.tif 000005
【表４】
2020045479.tif 000006
【００３０】
また、前記「HGSのC領域のアミノ酸配列のうち少なくとも連続する１０アミノ酸残基を含むペプチド」には、配列番号８、１０又は１２のアミノ酸配列のうち少なくとも連続する１０アミノ酸残基を含むアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加され、又はそれらの組合せにより変異されたアミノ酸配列からなり、かつ腫瘍増殖抑制作用又は転移抑制作用を有するペプチドが含まれる。ここで、「数個」とは、１〜１０個（例えば、１〜５個、好ましくは１〜３個、より好ましくは１〜２個、さらに好ましくは１個）を意味するが、前記ペプチドに含まれるアミノ酸残基の総数が２０個前後のときは、１〜５個を意味し、前記ペプチドに含まれるアミノ酸残基の総数が１０個前後のときは、１〜３個を意味する。
【００３１】
「HGSのC領域のアミノ酸配列のうち少なくとも連続する１０アミノ酸残基を含むペプチド」には、「HGSのC領域のアミノ酸配列のうち少なくとも連続する１０アミノ酸残基」からなるペプチド又はその変異体に細胞膜透過性ペプチドを付加（結合）したものが含まれる。
また、「HGSのC領域のアミノ酸配列のうち少なくとも連続する１０アミノ酸残基を含むペプチド」には、「HGSのC領域のアミノ酸配列のうち少なくとも連続する１０アミノ酸残基」のアミノ酸配列からなるペプチドを環状化したものが含まれる。
【００３２】
本発明において使用されるHGS/C構成オリゴペプチドには、配列番号３８、５０、５９又は６７のアミノ酸配列からなるオリゴペプチドのほか、配列番号３８、５０、５９又は６７のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加され、又はそれらの組合せにより変異されたアミノ酸配列からなり、かつ腫瘍増殖抑制作用又は転移抑制作用を有するペプチドが含まれる。
上記配列番号３８、５０、５９又は６７のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が、欠失、置換、若しくは付加され、又はそれらの組合せにより変異されたアミノ酸配列としては、例えば、
(i) 配列番号３８、５０、５９又は６７のアミノ酸配列中の１〜１０個（例えば、１〜５個、好ましくは１〜３個、より好ましくは１〜２個、さらに好ましくは１個）のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列、
(ii) 配列番号３８、５０、５９又は６７のアミノ酸配列中の１〜１０個（例えば、１〜５個、好ましくは１〜３個、より好ましくは１〜２個、さらに好ましくは１個）のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されたアミノ酸配列、
(iii) 配列番号３８、５０、５９又は６７のアミノ酸配列に１〜１０個（例えば、１〜５個、好ましくは１〜３個、より好ましくは１〜２個、さらに好ましくは１個）のアミノ酸が付加したアミノ酸配列、
(iv) 上記(i)〜(iii) の組合せにより変異されたアミノ酸配列
などが挙げられる。
【００３３】
本発明において、「腫瘍増殖抑制作用」とは、癌細胞の増殖を抑制する作用を意味する。また、「転移抑制作用」とは、癌細胞の遊走を抑制する作用を意味する。
また、「腫瘍増殖抑制作用又は転移抑制作用を有する」とは、配列番号３８、５０、５９又は６７のアミノ酸配列を有するペプチドの腫瘍増殖抑制作用又は転移抑制作用を100としたときと比較して、10%以上、20％以上、30%以上、40%以上、50%以上、60%以上、70%以上、80%以上、好ましくは90%以上の活性を有することを意味する。
【００３４】
腫瘍増殖抑制作用は、任意の癌細胞に変異ペプチドを発現させ、公知の手法を用いて腫瘍の増殖量を測定することにより、測定することができる。また、転移抑制作用は、後述する実施例に記載した実験的肺転移阻害試験などで確認することができる。
【００３５】
上記の変異を有するペプチドを調製するためにポリヌクレオチドに変異を導入するには、Kunkel法やGapped duplex法等の部位特異的突然変異誘発法を利用した変異導入用キット、例えばQuikChangeTMSite-Directed Mutagenesis Kit（ストラタジーン社製）、GeneTailorTM Site-Directed Mutagenesis System（インビトロジェン社製）、TaKaRa Site-Directed Mutagenesis System（Mutan-K、Mutan-Super Express Km等：タカラバイオ社製）等を用いて行うことができる。また、「Molecular Cloning, A Laboratory Manual 2nd ed.」（Cold Spring Harbor Press（1989））、「Current Protocols in Molecular Biology」（John Wiley & Sons（1987-1997））、Kunkel（1985）Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 488-92、Kramer and Fritz（1987）Method. Enzymol. 154: 350-67、Kunkel（1988）Method. Enzymol. 85: 2763-6等に記載された部位特異的変異誘発法等の方法を用いることができる。
【００３６】
また、本発明において使用されるHGS/C構成オリゴペプチドには、配列番号３８、５０、５９又は６７のアミノ酸配列のほか、配列番号３８、５０、５９又は６７のアミノ酸配列と約８０％以上、約８１％以上、約８２％以上、好ましくは約９０％以上、約９１％以上、約９２％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ腫瘍増殖抑制作用又は転移抑制作用を有するもの（配列番号３８、５０、５９又は６７のアミノ酸配列と実質的に同等のアミノ酸配列）も含まれる。相同性（同一性）は、インターネットを利用したホモロジー検索サイト、例えば日本DNAデータバンク（DDBJ）において、FASTA、BLAST、PSI-BLAST等の相同性検索を利用できる。また、National Center for Biotechnology Information (NCBI) において、BLASTを用いた検索を行うこともできる。
【００３７】
さらに、HGS/C構成オリゴペプチドとしては、下記のいずれかのアミノ酸配列（配列中Xは任意のアミノ酸を表す）からなり、かつ腫瘍増殖抑制作用又は転移抑制作用を有するペプチドが挙げられる。
X-R-R-L-Y-Y-E-G-L-Q-D-K（配列番号７２）
E-X-R-L-Y-Y-E-G-L-Q-D-K（配列番号７３）
E-R-X-L-Y-Y-E-G-L-Q-D-K（配列番号７４）
E-R-R-X-Y-Y-E-G-L-Q-D-K（配列番号７５）
E-R-R-L-X-Y-E-G-L-Q-D-K（配列番号７６）
E-R-R-L-Y-X-E-G-L-Q-D-K（配列番号７７）
E-R-R-L-Y-Y-X-G-L-Q-D-K（配列番号７８）
E-R-R-L-Y-Y-E-X-L-Q-D-K（配列番号７９）
E-R-R-L-Y-Y-E-G-X-Q-D-K（配列番号８０）
E-R-R-L-Y-Y-E-G-L-X-D-K（配列番号８１）
E-R-R-L-Y-Y-E-G-L-Q-X-K（配列番号８２）
E-R-R-L-Y-Y-E-G-L-Q-D-X（配列番号８３）
【００３８】
好ましくは、HGS/C構成オリゴペプチドは、下記のいずれかのアミノ酸配列（配列中Xは任意のアミノ酸を表す）からなり、かつ腫瘍増殖抑制作用又は転移抑制作用を有するペプチドである。
E-X-R-L-Y-Y-E-G-L-Q-D-K（配列番号７３）
E-R-X-L-Y-Y-E-G-L-Q-D-K（配列番号７４）
E-R-R-X-Y-Y-E-G-L-Q-D-K（配列番号７５）
E-R-R-L-X-Y-E-G-L-Q-D-K（配列番号７６）
E-R-R-L-Y-Y-E-X-L-Q-D-K（配列番号７９）
E-R-R-L-Y-Y-E-G-X-Q-D-K（配列番号８０）
E-R-R-L-Y-Y-E-G-L-X-D-K（配列番号８１）
【００３９】
５. ペプチドの作製
HGSのC領域の一部を含むペプチド（以下「本発明のペプチド」という）は、公知の手法を用いて作製することができるが、具体的には以下の通りである。
（１）発現ベクターの作製
本発明のペプチドを発現するベクターは、発現させる宿主細胞に保持されるものであれば特に限定されず、例えば、プラスミド DNA、バクテリオファージ等が挙げられる。
プラスミド DNAとしては、例えばpME18S、pcDNA3、pBR322、pUC18、pUC19、pUC118、pUC119、pBluescript等が挙げられるが、大腸菌由来、枯草菌由来、酵母由来等の他のプラスミドでもよい。ファージDNAとしてはλファージ（Charon4A、Charon21A、EMBL3、EMBL4、λgt10、λgt11、）等が挙げられる。
【００４０】
本発明のペプチドをコードするポリヌクレオチドをベクターに組み込む手法は、適当な制限酵素で切断した後にリガーゼを作用させて連結する手法などが採用される（上記Molecular cloning, CSHL Press等を参照）。
本発明のペプチドをコードするポリヌクレオチドは、例えばC領域にそれぞれのポリヌクレオチドを増幅させるプライマーを設計し、PCR法等を用いて当該領域を増幅した後、制限酵素やリガーゼを用いて所望の部分のみをベクターに連結させることができる。また、標的部分を増幅させるプライマーを設計しPCR法で増幅し、ベクターに連結させることもできる。
【００４１】
（２）形質転換
本発明において使用される宿主は、目的のペプチドをコードする遺伝子が導入された後に目的のペプチドを発現するものであればよい。例えば、哺乳動物細胞、ビフィズス菌、乳酸菌、大腸菌等の細菌類、昆虫細胞、酵母、カビ等を挙げることができるがこれらに限定されない。
【００４２】
宿主への組換えDNAの導入は、公知の方法により行うことができる。上記のベクターを宿主に導入する方法として、例えば、リン酸カルシウム法、DEAE-デキストラン法、電気穿孔法、カチオン性脂質法等を挙げることができる。
また、DNAが導入されたことの確認は、選択マーカー遺伝子（例えばアンピシリン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子、テトラサイクリン耐性遺伝子、クロラムフェニコール耐性遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子、ゼオシン耐性遺伝子、ブラストシジン耐性遺伝子等）を用いて行われる。
【００４３】
（３）ペプチドの産生
本発明のペプチドは、当該ペプチドをコードするポリヌクレオチド又はその変異体を含む上記形質転換体を培養し、その培養物からペプチドを採取することにより得ることができる。
【００４４】
「培養物」とは、培養上清、培養細胞、培養菌体、又は細胞若しくは菌体の破砕物のいずれをも意味するものである。本発明の形質転換体の培養は、宿主の培養に用いられる通常の方法に従って行われる。
プロモーターとして誘導型転写プロモーターを用いた発現ベクターを導入した組換え体を培養する場合は、必要に応じて誘導剤を培地に添加してもよい。誘導剤にIPTGを用いる場合のIPTGの添加量は、0.1〜1.0 mMであり、培養開始後2〜12時間後に添加し、添加後さらに1〜12時間追加培養する。
【００４５】
培養後、本発明のペプチドが菌体内又は細胞内に蓄積される場合には、ホモジナイザー処理などを施して菌体又は細胞を破砕することにより、目的のペプチドを採取する。本発明のペプチドが菌体外又は細胞外に産生される場合には、培養液をそのまま使用するか、遠心分離等により菌体又は細胞を除去する。その後、硫安沈殿操作等により前記培養液中からペプチドを採取し、必要に応じてさらに各種クロマトグラフィー等を用いて単離精製する。
【００４６】
また、本発明においては、生細胞を全く使用することなく無細胞タンパク質合成系を採用して、本発明のペプチドを産生することが可能である。
無細胞タンパク質合成系とは、細胞抽出液を用いて試験管などの人工容器内でタンパク質を合成する系であり、例えばmRNAの情報を読み取って、リボソーム上でタンパク質を合成するというものである。なお、本発明において使用される無細胞タンパク質合成系には、DNAを鋳型としてRNAを合成する無細胞転写系も含まれる。
上記細胞抽出液は、真核細胞由来又は原核細胞由来の抽出液、例えば、小麦胚芽、ウサギ網状赤血球、マウスL-細胞、HeLa細胞、CHO細胞、出芽酵母、大腸菌などの抽出液を使用することができる。なお、これらの細胞抽出液は濃縮されたものであっても濃縮されないものであってもよい。
【００４７】
本発明において、無細胞タンパク質合成は、市販のキットを用いて行うこともできる。そのようなキットとしては、例えば試薬キットPROTEIOSTM（東洋紡）、TNTTMSystem（プロメガ）、合成装置のPG-MateTM（東洋紡）、RTS（ロシュ・ダイアグノスティクス）などが挙げられる。
無細胞タンパク質合成によって得られる本発明のペプチドは、前述のように適宜クロマトグラフィーを選択して、精製することができる。また、本発明のペプチドが単離精製されたことの確認は、SDS-PAGE等により行うことが可能である。
【００４８】
また、本発明のペプチドは、全長のHGS等から臭化シアンやペプチダーゼ等で切断することによって得ることもできる。ペプチダーゼは、当該ペプチドを切断することができれば限定されないが、トリプシン、キモトリプシン、リジルエンドペプチダーゼ等を挙げることができる。
【００４９】
（４）ペプチド合成
本発明のペプチドは化学合成により得ることができる。ペプチド合成は、既知の方法により、Model 433Aペプチドシンセサイザ(Applied Biosystems)、PSSM-8（島津製作所）等の合成装置で行うことができる。また、本発明のペプチドは、GL Biochem （Shanghai） Ltd、林化成株式会社などのペプチド合成受託会社にペプチド合成を依頼し、購入することによって得ることもできる。細胞膜透過性ペプチドを付加したペプチドについても同様である。
【００５０】
６．抗腫瘍剤
本発明のペプチド又は当該ペプチドを発現するベクターは、腫瘍増殖抑制作用及び／又は転移抑制作用を有する。従って、これらを含む組成物は、抗腫瘍剤として使用することができる。また、本発明のペプチド又は当該ペプチドを発現するベクターは、抗腫瘍剤又は癌若しくは腫瘍を治療するための医薬の製造において使用することができる。すなわち、本発明は、本発明のペプチド又は当該ペプチドを発現するベクターを含む抗腫瘍剤、並びに、本発明のペプチド又は当該ペプチドを発現するベクターの、抗腫瘍剤又は癌若しくは腫瘍を治療するための医薬の製造における使用方法を提供する。
【００５１】
本発明の抗腫瘍剤は、足場非依存的増殖のみ阻害し、足場依存的増殖を阻害しないため、正常細胞の増殖を阻害しないと推測される。そのため、本発明の抗腫瘍剤では、正常細胞の増殖阻害に伴う副作用の発生は抑制されるかほぼ発生しないと推測される。
すなわち、本発明の抗腫瘍剤は、腫瘍に対しては増殖及び転移を顕著に抑制しつつ、副作用の発生も抑制するため、癌の治療に極めて有用である。
【００５２】
本発明における「癌」又は「腫瘍」としては、例えば、固形癌としては、脳腫瘍、食道癌、舌癌、肺癌、乳癌、膵癌、胃癌、小腸や十二指腸の癌、大腸癌（結腸癌、直腸癌）、膀胱癌、腎癌、肝癌、前立腺癌、子宮癌、子宮頸癌、卵巣癌、甲状腺癌、胆嚢癌、咽頭癌、肉腫（例えば、骨肉腫、軟骨肉腫、カポジ肉腫、筋肉腫、血管肉腫、線維肉腫など）、メラノーマなどが挙げられ、血液腫瘍としては、白血病（例えば、慢性骨髄性白血病（CML）、急性骨髄性白血病（AML）、慢性リンパ球性白血病（CLL）及び急性リンパ性白血病（ALL））、リンパ腫、多発性骨髄腫（MM）などが挙げられるが、これらに限定されない。
【００５３】
また、本発明における「転移」とは、癌細胞が血液やリンパ系を介して、あるいは手術の際に、原発巣から離れた他の部位に運ばれて、そこに新しい増殖巣をつくることを意味する。あるいは、「転移」は「癌細胞が伝播し、非連続部位で新たな増殖巣を形成する（すなわち転移を形成する）能力」を指す（Hill,R.P, “Metastasis”, The Basic Science of Oncology，Tannockら編、178-195(McGraw-Hill, New York, 1992)。
【００５４】
本発明の抗腫瘍剤は、本発明のペプチド、当該ペプチドを発現するベクターのほか、薬学的に許容できる担体を含むことができる。「薬学的に許容できる担体」とは、抗腫瘍剤としての使用に適する任意の担体（リポソーム、脂質小胞体、ミセル等）、希釈剤、賦形剤、湿潤剤、緩衝剤、懸濁剤、潤滑剤、アジュバント、乳化剤、崩壊剤、吸収剤、保存料、界面活性剤、着色料、着香料、又は甘味料を指す。
【００５５】
本発明の抗腫瘍剤は、注射剤、凍結乾燥品、錠剤、硬カプセル剤、軟カプセル剤、顆粒剤、散剤、丸剤、シロップ剤、坐剤、バップ剤、軟膏剤、クリーム剤、点眼剤等の剤型をとることができる。
【００５６】
本発明の抗腫瘍剤は、当業者に既知である任意の手段によって局所的又は全身に投与される。投与量は、投与対象の年齢、体重、健康状態、性別、症状、投与経路、投与回数、剤型などの要因に応じて変化し、具体的な投与手順は当業者により設定することができる。例えば、成人には、本発明の抗腫瘍剤を錠剤として投与する場合に0.1μg〜10 g、好ましくは1μg〜1 g、より好ましくは10μg〜100 mgを一日に１〜５回投与することができる。
【００５７】
本発明の抗腫瘍剤は、哺乳動物を対象として投与することができる。哺乳動物としては、例えば、マウス、ラット、ハムスター、モルモット、ウサギ、ネコ、イヌ、ヤギ、ブタ、ヒツジ、ウシ、ウマ、サル、ヒトなどが挙げられる。
【００５８】
さらに、本発明の抗腫瘍剤を遺伝子治療剤として使用する場合は、本発明の抗腫瘍剤を注射により直接投与する方法のほか、核酸が組込まれたベクターを投与する方法が挙げられる。上記ベクターとしては、アデノウイルスベクター、アデノ関連ウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター等が挙げられ、これらのウイルスベクターを用いることにより効率よく投与することができる。
【００５９】
また、本発明の抗腫瘍剤をリポソームなどのリン脂質小胞体に導入し、その小胞体を投与することも可能である。ペプチドを保持させた小胞体をリポフェクション法により所定の細胞に導入する。そして、得られる細胞を例えば静脈内、動脈内等に全身投与する。脳等に局所投与することもできる。例えば、成人に上記の抗腫瘍剤を投与する場合は、一日あたり0.1μg/kg〜1000 mg/kg、好ましくは一日あたり1μg/kg〜100 mg/kgを投与することができる。
【００６０】
さらに、本発明のペプチドを発現するベクターをビフィズス菌、乳酸菌、酵母、糸状菌等の宿主に形質転換し、当該形質転換体を抗腫瘍剤として用いることができる。ビフィズス菌としてはBifidobacterium longum、Bifidobacterium bifidum、Bifidobacterium breve等が挙げられる。乳酸菌としては、ラクトバチラス属（Lactobacillus）、ストレプトコッカス属（Streptoccoccus）、ロイコノストック属（Leuconostoc）、ペディオコッカス属（Pediococcus）等が挙げられる。これらの形質転換体は、そのまま使用できるほか、上記の剤形に適宜製剤化し、本発明の抗腫瘍剤として用いることができる。
【００６１】
７．腫瘍増殖抑制剤及び転移抑制剤
本発明のペプチド及び当該ペプチドを発現するベクターは、腫瘍増殖抑制作用及び転移抑制作用を有する。従って、これらを含む組成物は、腫瘍増殖抑制剤及び転移抑制剤として使用することができる。
本発明の腫瘍増殖抑制剤及び転移抑制剤は、試薬として、あるいは哺乳動物の治療に用いることができ、その投与形態、添加物、投与経路、投与対象、投与量などは、当業者であれば上記「６．抗腫瘍剤」の記載に準じて適宜選択することができる。
【００６２】
８．癌又は腫瘍の治療方法、及び該方法における使用
本発明のペプチド及び当該ペプチドを発現するベクターは、腫瘍増殖抑制作用及び転移抑制作用を有する。従って、これらのペプチド及びベクターは、癌又は腫瘍の治療方法において使用することができる。すなわち、本発明は、治療有効量の本発明のペプチド及び当該ペプチドを発現するベクターを、癌又は腫瘍の治療を必要とする対象に投与することを含む、前記対象における癌又は腫瘍を治療する方法を提供する。また、本発明は、癌又は腫瘍の治療における、本発明のペプチド及び当該ペプチドを発現するベクターの使用を提供する。
本発明の方法において、本発明のペプチド及び当該ペプチドを発現するベクターの投与形態、添加物、投与経路、投与対象、投与量などは、当業者であれば上記「６．抗腫瘍剤」の記載に準じて適宜選択することができる。
【００６３】
９．癌又は腫瘍の増殖又は転移を抑制する方法、及び該方法における使用
本発明のペプチド及び当該ペプチドを発現するベクターは、腫瘍増殖抑制作用及び転移抑制作用を有する。従って、これらのペプチド及びベクターは、癌又は腫瘍の増殖又は転移を抑制する方法において使用することができる。すなわち、本発明は、有効量の本発明のペプチド及び当該ペプチドを発現するベクターを、癌又は腫瘍の増殖又は転移の抑制を必要とする対象に投与することを含む、前記対象における癌又は腫瘍の増殖又は転移を抑制する方法を提供する。また、本発明は、癌又は腫瘍の治療において使用するための、本発明のペプチド及び当該ペプチドを発現するベクターを提供する。
本発明の方法において、本発明のペプチド及び当該ペプチドを発現するベクターの投与形態、添加物、投与経路、投与対象、投与量などは、当業者であれば上記「６．抗腫瘍剤」の記載に準じて適宜選択することができる。
【００６４】
以下、実施例により本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【実施例１】
【００６５】
HGS/C構成オリゴペプチドライブラリーの調製及びスクリーニング
１．HGS/C構成オリゴペプチドライブラリーの調製
HGSのC領域のアミノ酸配列のうち連続した10アミノ酸残基を含むオリゴペプチドのライブラリーを合成した。当該ライブラリーに含まれるオリゴペプチドのアミノ酸配列の設計は発明者が行い、オリゴペプチドの合成はGL Biochem （Shanghai） Ltd.に依頼した。
このライブラリーに含まれるオリゴペプチドは、10アミノ酸残基長を有し、HGSのC領域のアミノ酸配列のN末端から順に1アミノ酸ずつC末端方向にずれた配列、すなわち互いに9アミノ酸残基オーバーラップする配列を有し、HGS/Cのアミノ酸配列を網羅する。例えば、このライブラリーに含まれる、HGS全長のN末端から460〜470位、503-511位及び523-532位のアミノ酸残基をN末端に有するオリゴペプチドは下記表に示すとおりである。
【表５】
2020045479.tif 000007
２．表層プラズモン共鳴 (SPR) 分析に基づくスクリーニング
上記で合成したHGS/C構成オリゴペプチドのライブラリーから、表層プラズモン共鳴 (SPR) 分析法を用いて、HGS、STAMのそれぞれと強い相互作用を有するオリゴペプチドをスクリーニングした。
具体的には、Glutathione S-transferase （GST）標識HGS (Human) Recombinant Protein (Abnova)、GST標識STAM（Human）Recombinant Protein (Abnova)、またはGST（Abnova)をProteOnTM GLH センサーチップに固相化した。
HGS/C構成オリゴペプチドとこれら固相化蛋白質との相互作用をProteOnTMXPR36分子間相互作用アレイシステム（Bio-Rad）を用いて測定した。GST値をブランク値として、HGS/C構成オリゴペプチドとGST標識HGS及びGST標識STAMのそれぞれとの解離速度定数（Kd）を測定した。そして、解離速度定数を指標としてHGSとSTAMの両タンパク質に対して強い相互作用を持つオリゴペプチドを探索した。
その結果、HGSとSTAMの両タンパク質に対して強い相互作用を持つオリゴペプチドとして、OP10-463、OP10-507及びOP10-527を選出した。
また、HGS及びSTAMとの相互作用をより強化したオリゴペプチドとして、OP10-463に前後1アミノ酸残基（すなわちグルタミン酸（E）とリジン（K））を付加したオリゴペプチド、すなわちOP12-462を合成した。同様に、アミノ酸残基を付加した12アミノ酸残基長のオリゴペプチドとしては、例えば下記の表に記載したものが挙げられる。
【表６】
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選出したオリゴヌクレオチド及びこれにアミノ酸を付加したオリゴヌクレオチドの代表例として、OP12-462、OP10-507及びOP10-527を、以下の試験に用いた。
【実施例２】
【００６６】
１．本発明のHGS/C構成オリゴペプチドの活性評価
（１）in vitro足場非依存的／依存的増殖抑制試験
癌細胞は足場非依存的に増殖し、正常細胞は足場依存的に増殖する。したがって、試験対象となるオリゴペプチドが、足場非依存的増殖のみ阻害し、足場依存的増殖を阻害しなければ、当該オリゴペプチドは、癌細胞の増殖のみを阻害し、正常細胞の増殖を阻害しないことを意味する。
本実施例では、超低接着表面プレート（Ultra-Low Attachment Surface (ULAS) Plate）として、Ultra-Low Attachment Surface Coning Costar 96 Well Cell Culture Plate 3474（コーニング）を用い、通常のプレート（Normal plate）として、Tissue Culture Treated Coning Costar 96 Well Cell Culture Plate 3595（コーニング）を用いた。
また、細胞としては、マウスメラノーマB16細胞及びヒト大腸癌由来COLO205細胞を用い、細胞増殖の評価にはCell Counting Kit-8（同仁化学研究所）を用いた。【００６７】
ULAS-plate及びNormal plateの各ウエルにB16細胞又はCOLO205細胞(2E+3個/0.2ml Opti-MEM medium,5%FBS/ウエル)を播種した。検体オリゴペプチド（OP12-462、OP10-507及びOP10-527）（0、0.16、0.4、8 nmol）をそれぞれ添加し、37°Cで培養した。
7日間後に0.1ml のCell Counting Kit-8溶液(5倍PBS希釈液)を加え、直ちにA450nm吸光度を測定し、T0のブランク値とした。
37°Cで2時間インキュベートした後に再度A450nm吸光度を測定し、T2とした。T2−T0=変化量を足場非依存的増殖活性値又は足場依存的増殖活性値とした。検体オリゴペプチド添加時の細胞増殖活性は、未添加時の細胞増殖活性との相対比として数値化した。【００６８】
その結果を図２Ａ及び図２Ｂに示す。これらの図から明らかなように、OP12-462、OP10-507及びOP10-527は、マウスメラノーマB16細胞（図２Ａ）及びヒト大腸癌由来COLO205細胞（図２Ｂ）の足場非依存的増殖活性を濃度依存的に強く阻害した。一方、これらのオリゴペプチドは、両細胞の足場依存的増殖活性を全く又はほとんど阻害しなかった。すなわち、OP12-462、OP10-507及びOP10-527は、癌又は腫瘍細胞の増殖を顕著に抑制する一方で、正常細胞の増殖は抑制しないことが示された。
この結果から、本発明のペプチドを含む抗腫瘍剤は、癌又は腫瘍細胞の増殖を顕著に抑制しつつ、正常細胞の増殖抑制に伴う副作用を顕著に抑制することができることが示された。【００６９】
（２）in vivo Xenograft試験
COLO205細胞 (1E+6個/0.2ml PBS)をBALB/c Slc-nu/nuヌードマウス（メス）背部皮下に接種した（n=5 または6）。10日後を日数0とし、日数0から日数9の10日間1日1回尾静脈より、PBS、または検体オリゴペプチド（OP12-462、OP10-507及びOP10-527）(5mg/体重Kg)を0.2ml PBS溶液として投与した。形成された腫瘍サイズを日数0から毎日1回測定した。腫瘍体積は腫瘍の短径と長径を測定し、概算した（腫瘍体積＝（短径ｘ短径ｘ長径ｘπ）/6）。
その結果、OP12-462、OP10-507及びOP10-527は、いずれもCOLO205細胞の腫瘍増殖を統計的有意に抑制した（図３Ａ〜Ｃ）。さらに、これらのオリゴペプチドはいずれも、後述する比較例で用いた従来技術のオリゴペプチド（比較例、図７Ａ〜Ｃ）と比較して顕著に腫瘍増殖を抑制した。
これらの結果から、本発明のオリゴペプチドは、従来のHGS/C構成オリゴペプチドと比較して顕著に高い腫瘍増殖抑制作用を有するペプチドであることが示された。また、上記のとおり、本発明のオリゴペプチドは正常細胞の増殖を抑制しないため、これらのオリゴペプチドを含む抗腫瘍剤は、顕著な腫瘍増殖抑制作用を発揮しながら副作用の発生を抑制することができる抗腫瘍剤として、極めて有用であることが示された。【００７０】
（３）実験的肺転移阻害試験
マウスメラノーマB16細胞の実験的肺転移能に対するOP12-462の転移抑制作用を検討した。
まず、マウスメラノーマB16細胞(1E+5個)及び検体オリゴペプチド（OP12-462）（40nmol）のPBS溶液（0.2ml PBS）を37°Cで2時間インキュベートした。インキュベート後、この溶液をC57BL/6マウス（メス）に尾静脈より投与した。B16細胞の尾静脈投与28日後にマウス肺のB16細胞転移腫瘍コロニー数を計測した。オリゴペプチド未処理のB16細胞の腫瘍コロニー数との相対比でOP12-462オリゴペプチドの転移抑制能を数値化した。【００７１】
その結果、OP12-462は、マウスメラノーマB16細胞の実験的肺転移能を顕著に抑制した（図４）。図４中、「vehicle」はオリゴペプチド未処理の試料を表す。
この結果から、本発明のオリゴペプチドは顕著な転移抑制作用を有することが示された。そして、本発明のオリゴペプチドを含む抗腫瘍剤は、転移抑制剤として有用であることも示された。【００７２】
２．HGS/C構成オリゴペプチドのアラニン置換体の調製及びその活性評価
（１）HGS/C構成オリゴペプチドのアラニン置換体の合成
OP12-462オリゴペプチドの1アミノ酸残基をアラニンに置換したOP12-462置換体を合成した。
NH2末端からN残基目をアラニン置換したオリゴペプチドをOP12-462-ANとし、OP12-462-A1からOP12-462-A12まで合成した。合成したオリゴペプチドを下記の表に示す。
【表７】
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【００７３】
（２）in vitro足場非依存的増殖抑制試験
上記「１．（１）」と同様に、OP12-462オリゴペプチド及びOP12-462アラニン置換体についてin vitro足場非依存的増殖抑制試験を行った。
その結果、いずれのOP12-462アラニン置換体も、オリゴペプチド未処理の試料（vehicle）と比較して、in vitro足場非依存的増殖を顕著に阻害した（図５）。【００７４】
この結果から、OP12-462のアミノ酸配列において１個のアミノ酸が変異したアミノ酸配列からなるオリゴペプチドは、腫瘍増殖抑制作用を有することが示された。また同様に、OP12-462と９０％以上の配列同一性を有するオリゴペプチドも、腫瘍増殖抑制作用を有することが示された。
さらに、OP12-462アラニン置換体であるOP12-462-A3は、OP12-462と同等又はそれ以上にin vitro足場非依存的増殖を阻害したことから、OP12-462のアミノ酸配列の３位のアミノ酸は任意のアミノ酸でよいことが示された。すなわち、アミノ酸配列E-R-X-L-Y-Y-E-G-L-Q-D-K（Xは任意のアミノ酸を表す）からなるオリゴペプチド（配列番号７４）も腫瘍増殖抑制作用を有することが示された。【００７５】
（３）実験的肺転移阻害試験
上記「１．（３）」と同様に、OP12-462オリゴペプチド及びOP12-462アラニン置換体について実験的肺転移阻害試験を行った。
その結果、OP12-462はマウスメラノーマB16細胞の実験的肺転移能を顕著に抑制した。また、OP12-462アラニン置換体であるOP12-462-A3、OP12-462-A4及びOP12-462-A9も、オリゴペプチド未処理の試料（vehicle）と比較して、実験的肺転移能を顕著に抑制した。
この結果から、OP12-462のアミノ酸配列の３位、４位又は９位のアミノ酸が任意のアミノ酸に置換されたペプチドであっても、転移抑制能を維持することができることが示された。すなわち、アミノ酸配列E-R-X-L-Y-Y-E-G-L-Q-D-K、E-R-R-X-Y-Y-E-G-L-Q-D-K又はE-R-R-L-Y-Y-E-G-X-Q-D-K（Xは任意のアミノ酸を表す）からなるオリゴペプチド（配列番号７４、７５、８０）は転移抑制作用を有することが示された。【００７６】
［比較例］
従来技術のHGS/C構成オリゴペプチドの活性評価
in vivo Xenograft試験
上記「［実施例２］１．（２）」と同様の方法で、従来技術のHGS/C構成オリゴペプチドの代表例であるOP10-7、OP10-10及びOP10-11について、腫瘍増殖抑制能の評価を行った。
その結果、腫瘍増殖抑制作用は認められたものの（図６Ａ〜Ｃ）、その作用は、本発明のOP10-463、OP10-507及びOP10-527よりも顕著に低いものであった。
すなわち、本発明のHGS/C構成オリゴペプチド（OP10-463、OP10-507及びOP10-527）は、従来のHGS/C構成オリゴペプチドと比較して顕著に高い腫瘍増殖抑制作用を有するペプチドであることが示された。
【産業上の利用可能性】
【００７７】
本発明により、従来のHGS/Cの部分ペプチドと比較してより高い腫瘍増殖抑制作用を有するペプチド及びこれを含む抗腫瘍剤を提供することができる。
【配列表フリーテキスト】
【００７８】
配列番号１３〜９５：合成ペプチド
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図４】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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