(57)【要約】  本発明は、生産性が向上した１３−ヒドロキシ−９（Ｚ）−オクタデセン酸の製造方法を提供する。具体的には、本発明は、下記（Ａ）〜（Ｃ）からなる群より選ばれるタンパク質を産生する形質転換微生物の存在下において、リノール酸から１３−ヒドロキシ−９（Ｚ）−オクタデセン酸を生成することを含む、１３−ヒドロキシ−９（Ｚ）−オクタデセン酸の製造方法を提供する：（Ａ）配列番号４、５、８〜１０、１３、および１４からなる群から選ばれるアミノ酸配列を含むタンパク質；（Ｂ）配列番号４、５、８〜１０、１３、および１４からなる群から選ばれるアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、もしくは付加を含むアミノ酸配列を含み、かつ、リノレート１３−ヒドラターゼ活性を有するタンパク質；ならびに（Ｃ）配列番号４、５、８〜１０、１３、および１４からなる群から選ばれるアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ、リノレート１３−ヒドラターゼ活性を有するタンパク質。【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記（Ａ）〜（Ｃ）からなる群より選ばれるタンパク質を産生する形質転換微生物の存在下において、リノール酸から１３−ヒドロキシ−９（Ｚ）−オクタデセン酸を生成することを含む、１３−ヒドロキシ−９（Ｚ）−オクタデセン酸の製造方法：
（Ａ）配列番号４、５、８〜１０、１３、および１４からなる群から選ばれるアミノ酸配列を含むタンパク質；
（Ｂ）配列番号４、５、８〜１０、１３、および１４からなる群から選ばれるアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、もしくは付加を含むアミノ酸配列を含み、かつ、リノレート１３−ヒドラターゼ活性を有するタンパク質；ならびに
（Ｃ）配列番号４、５、８〜１０、１３、および１４からなる群から選ばれるアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ、リノレート１３−ヒドラターゼ活性を有するタンパク質。
【請求項２】
前記タンパク質が、下記：
（Ａ’）配列番号８、９、１３、および１４からなる群から選ばれるアミノ酸配列を含むタンパク質；
（Ｂ’）配列番号８、９、１３、および１４からなる群から選ばれるアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、もしくは付加を含むアミノ酸配列を含み、かつ、リノレート１３−ヒドラターゼ活性を有するタンパク質；または
（Ｃ’）配列番号８、９、１３、および１４からなる群から選ばれるアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ、リノレート１３−ヒドラターゼ活性を有するタンパク質
である、請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記同一性が９５％以上である、請求項１または２記載の方法。
【請求項４】
前記タンパク質が、ラクトバチルス・ガリナラム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ）、ラクトバチルス・クリスパタス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｒｉｓｐａｔｕｓ）、ラクトバチルス・ハムステリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｈａｍｓｔｅｒｉ）、ラクトバチルス・ガセリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｇａｓｓｅｒｉ）、Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ  ｃｌａｕｓｓｅｎｉｉ）、ストレプトコッカス・ミュータンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｍｕｔａｎｓ）、およびストレプトコッカス・エクイナス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｑｕｉｎｕｓ）からなる群から選ばれる微生物由来リノレート１３−ヒドラターゼである、請求項１記載の方法。
【請求項５】
前記タンパク質が、ラクトバチルス・ハムステリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｈａｍｓｔｅｒｉ）、ラクトバチルス・ガセリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｇａｓｓｅｒｉ）、ストレプトコッカス・ミュータンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｍｕｔａｎｓ）、およびストレプトコッカス・エクイナス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｑｕｉｎｕｓ）からなる群から選ばれる微生物由来リノレート１３−ヒドラターゼである、請求項４記載の方法。
【請求項６】
前記形質転換微生物が、前記タンパク質をコードするポリヌクレオチドおよびそれに作動可能に連結されたプロモーターを含む発現単位を含む微生物である、請求項１〜５のいずれか一項記載の方法。
【請求項７】
前記形質転換微生物が、エシェリヒア属細菌である、請求項１〜６のいずれか一項記載の方法。
【請求項８】
前記形質転換微生物が、エシェリヒア・コリである、請求項７記載の方法。
【請求項９】
δ−デカラクトンの製造方法であって、
（ｉ）下記（Ａ）〜（Ｃ）からなる群より選ばれるタンパク質を産生する形質転換微生物の存在下において、リノール酸から１３−ヒドロキシ−９（Ｚ）−オクタデセン酸を生成すること：
（Ａ）配列番号４、５、８〜１０、１３、および１４からなる群から選ばれるアミノ酸配列を含むタンパク質；
（Ｂ）配列番号４、５、８〜１０、１３、および１４からなる群から選ばれるアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、もしくは付加を含むアミノ酸配列を含み、かつ、リノレート１３−ヒドラターゼ活性を有するタンパク質；ならびに
（Ｃ）配列番号４、５、８〜１０、１３、および１４からなる群から選ばれるアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ、リノレート１３−ヒドラターゼ活性を有するタンパク質；
および
（ｉｉ）１３−ヒドロキシ−９（Ｚ）−オクタデセン酸からδ−デカラクトンを生成すること
を含む方法。
【請求項１０】
（ｉｉ）が、β酸化活性を有する微生物の存在下において行われる、請求項９記載の方法。
【請求項１１】
前記β酸化活性を有する微生物が、アルデヒドオキシダーゼの活性が野生型に比べて低下した微生物である、請求項１０記載の方法。
【請求項１２】
前記β酸化活性を有する微生物が、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｙｔｉｃａ）である、請求項１１記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、１３−ヒドロキシ−９（Ｚ）−オクタデセン酸の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
δ−デカラクトンは、香料として有用である。δ−デカラクトンは、１３−ヒドロキシ−９（Ｚ）−オクタデセン酸（１３−ＨＯＤ）から生成することができる（特許文献１、非特許文献２、５）。したがって、１３−ＨＯＤは、δ−デカラクトンの製造における中間体として有用である。【０００３】
特許文献１には、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ由来リノレート１３−ヒドラターゼ（１３−ＬＡＨ）を用いたリノール酸から１３−ＨＯＤを製造する方法、およびＷａｌｔｏｍｙｃｅｓ  ｌｉｐｏｆｅｒを用いた１３−ＨＯＤからδ−デカラクトンを製造する方法が記載されている。非特許文献１には、１３−ＬＡＨを導入したＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉを用いて１３−ＨＯＤを製造する方法が記載されている。非特許文献２には、リノール酸から１３−ＨＯＤを経由してδ−デカラクトンを製造する方法が記載されている。非特許文献３には、ＬＡＨの進化系統が記載され、１３−ＬＡＨがＬ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓで見出されていることが記載されている。非特許文献４には、１３−ＬＡＨをＬ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓから発見したこと、およびリノール酸から１３−ＨＯＤへの変換反応に対する１３−ＬＡＨの触媒機能を同定したことが記載されている。非特許文献５には、デカラクトンの生産の概略が記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】韓国特許出願公開ＫＲ１０２０１５００９８４９７Ａ
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Ｊ  Ｐａｒｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，２０８，１−１０（２０１５）
【非特許文献２】Ｈ  Ｏｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｄｖ．Ｓｙｎｔｈ．Ｃａｔａｌ．，３５７，４０８−４１６（２０１５）
【非特許文献３】ＹＹ  Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，７，ｅ１５６１（２０１６）
【非特許文献４】Ｋ  Ｋｉｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｅｎｇ．１１２，２２０６−２２１３（２０１５）
【非特許文献５】Ａｌｉｎａ  Ｓｗｉｚｄｏｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｓｃｉ．，１３，１６５１４−１６５４３（２０１２）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、生産性が向上した１３−ＨＯＤおよびδ−デカラクトンの製造方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、鋭意研究した結果、Ｌ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ由来１３−ＬＡＨよりも優れた酵素活性を有する１３−ＬＡＨを見出し、本願発明を完成するに至った。【０００８】
すなわち、本発明は、以下のとおりである。
〔１〕下記（Ａ）〜（Ｃ）からなる群より選ばれるタンパク質を産生する形質転換微生物の存在下において、リノール酸から１３−ヒドロキシ−９（Ｚ）−オクタデセン酸を生成することを含む、１３−ヒドロキシ−９（Ｚ）−オクタデセン酸の製造方法：
（Ａ）配列番号４、５、８〜１０、１３、および１４からなる群から選ばれるアミノ酸配列を含むタンパク質；
（Ｂ）配列番号４、５、８〜１０、１３、および１４からなる群から選ばれるアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、もしくは付加を含むアミノ酸配列を含み、かつ、リノレート１３−ヒドラターゼ活性を有するタンパク質；ならびに
（Ｃ）配列番号４、５、８〜１０、１３、および１４からなる群から選ばれるアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ、リノレート１３−ヒドラターゼ活性を有するタンパク質。
〔２〕前記タンパク質が、下記：
（Ａ’）配列番号８、９、１３、および１４からなる群から選ばれるアミノ酸配列を含むタンパク質；
（Ｂ’）配列番号８、９、１３、および１４からなる群から選ばれるアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、もしくは付加を含むアミノ酸配列を含み、かつ、リノレート１３−ヒドラターゼ活性を有するタンパク質；または
（Ｃ’）配列番号８、９、１３、および１４からなる群から選ばれるアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ、リノレート１３−ヒドラターゼ活性を有するタンパク質
である、〔１〕の方法。
〔３〕前記同一性が９５％以上である、〔１〕または〔２〕の方法。
〔４〕前記タンパク質が、ラクトバチルス・ガリナラム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ）、ラクトバチルス・クリスパタス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｒｉｓｐａｔｕｓ）、ラクトバチルス・ハムステリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｈａｍｓｔｅｒｉ）、ラクトバチルス・ガセリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｇａｓｓｅｒｉ）、Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ  ｃｌａｕｓｓｅｎｉｉ）、ストレプトコッカス・ミュータンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｍｕｔａｎｓ）、およびストレプトコッカス・エクイナス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｑｕｉｎｕｓ）からなる群から選ばれる微生物由来リノレート１３−ヒドラターゼである、〔１〕の方法。
〔５〕前記タンパク質が、ラクトバチルス・ハムステリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｈａｍｓｔｅｒｉ）、ラクトバチルス・ガセリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｇａｓｓｅｒｉ）、ストレプトコッカス・ミュータンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｍｕｔａｎｓ）、およびストレプトコッカス・エクイナス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｑｕｉｎｕｓ）からなる群から選ばれる微生物由来リノレート１３−ヒドラターゼである、〔４〕の方法。
〔６〕前記形質転換微生物が、前記タンパク質をコードするポリヌクレオチドおよびそれに作動可能に連結されたプロモーターを含む発現単位を含む微生物である、〔１〕〜〔５〕のいずれかの方法。
〔７〕前記形質転換微生物が、エシェリヒア属細菌である、〔１〕〜〔６〕のいずれかの方法。
〔８〕前記形質転換微生物が、エシェリヒア・コリである、〔７〕の方法。
〔９〕δ−デカラクトンの製造方法であって、
（ｉ）下記（Ａ）〜（Ｃ）からなる群より選ばれるタンパク質を産生する形質転換微生物の存在下において、リノール酸から１３−ヒドロキシ−９（Ｚ）−オクタデセン酸を生成すること：
（Ａ）配列番号４、５、８〜１０、１３、および１４からなる群から選ばれるアミノ酸配列を含むタンパク質；
（Ｂ）配列番号４、５、８〜１０、１３、および１４からなる群から選ばれるアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、もしくは付加を含むアミノ酸配列を含み、かつ、リノレート１３−ヒドラターゼ活性を有するタンパク質；ならびに
（Ｃ）配列番号４、５、８〜１０、１３、および１４からなる群から選ばれるアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ、リノレート１３−ヒドラターゼ活性を有するタンパク質；
および
（ｉｉ）１３−ヒドロキシ−９（Ｚ）−オクタデセン酸からδ−デカラクトンを生成すること
を含む方法。
〔１０〕（ｉｉ）が、β酸化活性を有する微生物の存在下において行われる、〔９〕の方法。
〔１１〕前記β酸化活性を有する微生物が、アルデヒドオキシダーゼの活性が野生型に比べて低下した微生物である、〔１０〕の方法。
〔１２〕前記β酸化活性を有する微生物が、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｙｔｉｃａ）である、〔１１〕の方法。
【発明の効果】
【０００９】
本発明の方法によれば、生物学的方法により１３−ヒドロキシ−９（Ｚ）−オクタデセン酸を効率的に製造することができる。さらに、本発明の方法によれば、生物学的方法によりδ−デカラクトンを効率的に製造することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】図１は、ＢＬＲ（ＤＥ３）／ｐＥＴ−２２ｂ（＋）ＫｍＲ株の反応液から得られたＭＳ（質量分析）クロマトグラム示す図である。
【図２】図２は、ＢＬＲ（ＤＥ３）／ｐＥＴ−２２ｂ（＋）ＫｍＲ−Ｌａｃｉ＿１３−ＬＡＨ株の反応液から得られたＭＳクロマトグラム示す図である。
【図３】図３は、ＢＬＲ（ＤＥ３）／ｐＥＴ−２２ｂ（＋）ＫｍＲ−Ｌａｍｙ＿１３−ＬＡＨ株の反応液から得られたＭＳクロマトグラム示す図である。
【図４】図４は、ＢＬＲ（ＤＥ３）／ｐＥＴ−２２ｂ（＋）ＫｍＲ−Ｌｈｅｌ＿１３−ＬＡＨ株の反応液から得られたＭＳクロマトグラム示す図である。
【図５】図５は、ＢＬＲ（ＤＥ３）／ｐＥＴ−２２ｂ（＋）ＫｍＲ−Ｌｇａｌ＿１３−ＬＡＨ株の反応液から得られたＭＳクロマトグラム示す図である。
【図６】図６は、ＢＬＲ（ＤＥ３）／ｐＥＴ−２２ｂ（＋）ＫｍＲ−Ｌｃｒｉ＿１３−ＬＡＨ株の反応液から得られたＭＳクロマトグラム示す図である。
【図７】図７は、ＢＬＲ（ＤＥ３）／ｐＥＴ−２２ｂ（＋）ＫｍＲ−Ｌｋｅｆ＿１３−ＬＡＨ株の反応液から得られたＭＳクロマトグラム示す図である。
【図８】図８は、ＢＬＲ（ＤＥ３）／ｐＥＴ−２２ｂ（＋）ＫｍＲ−Ｌｉｎｔ＿１３−ＬＡＨ株の反応液から得られたＭＳクロマトグラム示す図である。
【図９】図９は、ＢＬＲ（ＤＥ３）／ｐＥＴ−２２ｂ（＋）ＫｍＲ−Ｌｈａｍ＿１３−ＬＡＨ株の反応液から得られたＭＳクロマトグラム示す図である。
【図１０】図１０は、ＢＬＲ（ＤＥ３）／ｐＥＴ−２２ｂ（＋）ＫｍＲ−Ｌｇａｓ＿１３−ＬＡＨ株の反応液から得られたＭＳクロマトグラム示す図である。
【図１１】図１１は、ＢＬＲ（ＤＥ３）／ｐＥＴ−２２ｂ（＋）ＫｍＲ−Ｐｃｌａ＿１３−ＬＡＨ株の反応液から得られたＭＳクロマトグラム示す図である。
【図１２】図１２は、ＢＬＲ（ＤＥ３）／ｐＥＴ−２２ｂ（＋）ＫｍＲ−Ｌｒｕｍ＿１３−ＬＡＨ株の反応液から得られたＭＳクロマトグラム示す図である。
【図１３】図１３は、ＢＬＲ（ＤＥ３）／ｐＥＴ−２２ｂ（＋）ＫｍＲ−Ｓｉｎｆ＿１３−ＬＡＨ株の反応液から得られたＭＳクロマトグラム示す図である。
【図１４】図１４は、ＢＬＲ（ＤＥ３）／ｐＥＴ−２２ｂ（＋）ＫｍＲ−Ｓｍｕｔ＿１３−ＬＡＨ株の反応液から得られたＭＳクロマトグラム示す図である。
【図１５】図１５は、ＢＬＲ（ＤＥ３）／ｐＥＴ−２２ｂ（＋）ＫｍＲ−Ｓｅｑｕ＿１３−ＬＡＨ株の反応液から得られたＭＳクロマトグラム示す図である。
【図１６】図１６は、ＢＬＲ（ＤＥ３）／ｐＥＴ−２２ｂ（＋）ＫｍＲ−Ｌａｃｉ＿１３−ＬＡＨ株の反応液から得られたＰ２ピークのＭＳスペクトル示す図である。
【図１７】図１７は、ＢＬＲ（ＤＥ３）／ｐＥＴ−２２ｂ（＋）ＫｍＲ−Ｌａｍｙ＿１３−ＬＡＨ株の反応液から得られたＰ２ピークのＭＳスペクトル示す図である。
【図１８】図１８は、ＢＬＲ（ＤＥ３）／ｐＥＴ−２２ｂ（＋）ＫｍＲ−Ｌｈｅｌ＿１３−ＬＡＨ株の反応液から得られたＰ２ピークのＭＳスペクトル示す図である。
【図１９】図１９は、ＢＬＲ（ＤＥ３）／ｐＥＴ−２２ｂ（＋）ＫｍＲ−Ｌｇａｌ＿１３−ＬＡＨ株の反応液から得られたＰ２ピークのＭＳスペクトル示す図である。
【図２０】図２０は、ＢＬＲ（ＤＥ３）／ｐＥＴ−２２ｂ（＋）ＫｍＲ−Ｌｃｒｉ＿１３−ＬＡＨ株の反応液から得られたＰ２ピークのＭＳスペクトル示す図である。
【図２１】図２１は、ＢＬＲ（ＤＥ３）／ｐＥＴ−２２ｂ（＋）ＫｍＲ−Ｌｋｅｆ＿１３−ＬＡＨ株の反応液から得られたＰ２ピークのＭＳスペクトル示す図である。
【図２２】図２２は、ＢＬＲ（ＤＥ３）／ｐＥＴ−２２ｂ（＋）ＫｍＲ−Ｌｉｎｔ＿１３−ＬＡＨ株の反応液から得られたＰ２ピークのＭＳスペクトル示す図である。
【図２３】図２３は、ＢＬＲ（ＤＥ３）／ｐＥＴ−２２ｂ（＋）ＫｍＲ−Ｌｈａｍ＿１３−ＬＡＨ株の反応液から得られたＰ２ピークのＭＳスペクトル示す図である。
【図２４】図２４は、ＢＬＲ（ＤＥ３）／ｐＥＴ−２２ｂ（＋）ＫｍＲ−Ｌｇａｓ＿１３−ＬＡＨ株の反応液から得られたＰ２ピークのＭＳスペクトル示す図である。
【図２５】図２５は、ＢＬＲ（ＤＥ３）／ｐＥＴ−２２ｂ（＋）ＫｍＲ−Ｐｃｌａ＿１３−ＬＡＨ株の反応液から得られたＰ２ピークのＭＳスペクトル示す図である。
【図２６】図２６は、ＢＬＲ（ＤＥ３）／ｐＥＴ−２２ｂ（＋）ＫｍＲ−Ｌｒｕｍ＿１３−ＬＡＨ株の反応液から得られたＰ２ピークのＭＳスペクトル示す図である。
【図２７】図２７は、ＢＬＲ（ＤＥ３）／ｐＥＴ−２２ｂ（＋）ＫｍＲ−Ｓｉｎｆ＿１３−ＬＡＨ株の反応液から得られたＰ２ピークのＭＳスペクトル示す図である。
【図２８】図２８は、ＢＬＲ（ＤＥ３）／ｐＥＴ−２２ｂ（＋）ＫｍＲ−Ｓｍｕｔ＿１３−ＬＡＨ株の反応液から得られたＰ２ピークのＭＳスペクトル示す図である。
【図２９】図２９は、ＢＬＲ（ＤＥ３）／ｐＥＴ−２２ｂ（＋）ＫｍＲ−Ｓｅｑｕ＿１３−ＬＡＨ株の反応液から得られたＰ２ピークのＭＳスペクトル示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
本発明は、１３−ヒドロキシ−９（Ｚ）−オクタデセン酸の製造方法を提供する。本発明の方法は、下記（Ａ）〜（Ｃ）からなる群より選ばれるタンパク質を産生する形質転換微生物の存在下において、リノール酸から１３−ヒドロキシ−９（Ｚ）−オクタデセン酸を生成することを含む：
（Ａ）配列番号４、５、８〜１０、１３、および１４（好ましくは、配列番号８、９、１３、および１４）からなる群から選ばれるアミノ酸配列を含むタンパク質；
（Ｂ）配列番号４、５、８〜１０、１３、および１４（好ましくは、配列番号８、９、１３、および１４）からなる群から選ばれるアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、もしくは付加を含むアミノ酸配列を含み、かつ、リノレート１３−ヒドラターゼ活性を有するタンパク質；ならびに
（Ｃ）配列番号４、５、８〜１０、１３、および１４（好ましくは、配列番号８、９、１３、および１４）からなる群から選ばれるアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ、リノレート１３−ヒドラターゼ活性を有するタンパク質。
【００１２】
タンパク質（Ｂ）では、アミノ酸残基の置換、欠失、挿入および付加からなる群より選ばれる１、２、３または４種の変異により、１個または数個のアミノ酸残基を改変することができる。アミノ酸残基の変異は、アミノ酸配列中の１つの領域に導入されてもよいが、複数の異なる領域に導入されてもよい。用語「１または数個」は、タンパク質の活性を大きく損なわない個数を示す。用語「１または数個」が示す数は、例えば１〜６０個、好ましくは１〜５０個、より好ましくは１〜４０個、さらにより好ましくは１〜３０個、なおさらにより好ましくは１〜２０個、特に好ましくは１〜１０個または１〜５個（例、１個、２個、３個、４個、または５個）である。
【００１３】
タンパク質（Ｃ）における同一性％は、９０％以上である。好ましくは、同一性は、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上または９９％以上であってもよい。ポリペプチド（タンパク質）の同一性％の算出は、アルゴリズムｂｌａｓｔｐにより行うことができる。より具体的には、ポリペプチドの同一性の算定％は、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）において提供されているアルゴリズムｂｌａｓｔｐにおいて、デフォルト設定のＳｃｏｒｉｎｇ  Ｐａｒａｍｅｔｅｒｓ（Ｍａｔｒｉｘ：ＢＬＯＳＵＭ６２；Ｇａｐ  Ｃｏｓｔｓ：Ｅｘｉｓｔｅｎｃｅ＝１１  Ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ＝１；Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎａｌ  Ａｄｊｕｓｔｍｅｎｔｓ：Ｃｏｎｄｉｔｉｏｎａｌ  ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎａｌ  ｓｃｏｒｅ  ｍａｔｒｉｘ  ａｄｊｕｓｔｍｅｎｔ）を用いて行うことができる。ポリヌクレオチド（遺伝子）の同一性％の算出は、アルゴリズムｂｌａｓｔｎにより行うことができる。より具体的には、ポリヌクレオチドの同一性％の算定は、ＮＣＢＩにおいて提供されているアルゴリズムｂｌａｓｔｎにおいて、デフォルト設定のＳｃｏｒｉｎｇ  Ｐａｒａｍｅｔｅｒｓ（Ｍａｔｃｈ／Ｍｉｓｍａｔｃｈ  Ｓｃｏｒｅｓ＝１，−２；Ｇａｐ  Ｃｏｓｔｓ＝Ｌｉｎｅａｒ）を用いて行うことができる。
【００１４】
「リノレート１３−ヒドラターゼ活性」とは、リノール酸を１３−ヒドロキシ−９（Ｚ）−オクタデセン酸（１３−ＨＯＤ）に変換する活性をいう。タンパク質（Ｂ）および（Ｃ）はそれぞれ、特定の測定条件で活性を測定した場合、配列番号４、５、８〜１０、１３、および１４からなる群から選ばれる対応するアミノ酸配列を含むタンパク質（好ましくは、対応するアミノ酸配列からなるタンパク質）の活性を基準として、例えば６０％以上、好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以上、さらにより好ましくは８５％以上、特に好ましくは９０％以上、９４％以上、９６％以上、９８％以上、または同等（すなわち、１００％）以上の活性を有していてもよい。このような特定の測定条件としては、次の条件を採用することができる：
目的のタンパク質を発現する形質転換微生物（例、目的のタンパク質をコードする塩基配列を含むＤＮＡがｐＥＴ−２２ｂ（＋）に組み込まれたベクターで形質転換されたエシェリヒア・コリ〔Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ〕ＢＬＲ（ＤＥ３）株）を、前培養（例、３ｍＬ  ＳＯＣ培地で３７℃、１６〜２４時間）および本培養（例、０．５ｍＬの前培養液を５０ｍＬ  ＳＯＣ培地で３７℃、２時間）により培養し；
培養物に、イソプロピル−β−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を添加して培養（例、１６℃、２２〜２４時間）し；
遠心分離により所定量（例、４ｍＬ）の得られた培養液から菌体を回収し、および菌体を洗浄（例、０．８Ｍ  ＮａＣｌで２回）し；
菌体を、所定量（例、１ｍＬ）のリノール酸含有変換反応液（例、Ｃｉｔｒａｔｅ／ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ６．０）１００ｍＬ、Ｔｗｅｅｎ２０終濃度０．２５ｗｔ％、リノール酸  終濃度５０ｇ／Ｌ）に懸濁し；
変換反応液を、所定の条件（３７℃、１２０ｒｐｍの振盪、５時間）で反応させ；
所定量（例、０．２ｍＬ）の変換反応液を有機溶媒（例、酢酸エチル０．６ｍＬ）で抽出し；
所定量（例、３０μＬ）の有機溶媒層に誘導体化試薬（例、ＢＳＡ＋ＴＭＣＳ  ５：１）６０μＬを加えて、室温にて２時間静置して脂肪酸類をシリル化させ、ＧＣ−ＭＳ分析によりシリル化リノール酸およびシリル化１３−ＨＯＤのピークを測定してリノレート１３−ヒドラターゼ活性を評価する。
【００１５】
タンパク質（Ｂ）および（Ｃ）は、目的特性を保持し得る限り、触媒ドメイン中の部位、および触媒ドメイン以外の部位に、変異が導入されていてもよい。目的特性を保持し得る、変異が導入されてもよいアミノ酸残基の位置は、当業者に明らかである。具体的には、当業者は、１）同種の特性を有する複数のタンパク質のアミノ酸配列を比較し、２）相対的に保存されている領域、および相対的に保存されていない領域を明らかにし、次いで、３）相対的に保存されている領域および相対的に保存されていない領域から、それぞれ、機能に重要な役割を果たし得る領域および機能に重要な役割を果たし得ない領域を予測できるので、構造・機能の相関性を認識できる。したがって、当業者は、本発明で用いられるタンパク質のアミノ酸配列において変異が導入されてもよいアミノ酸残基の位置を特定できる。
【００１６】
アミノ酸残基が置換により変異される場合、アミノ酸残基の置換は、保存的置換であってもよい。本明細書中で用いられる場合、用語「保存的置換」とは、所定のアミノ酸残基を、類似の側鎖を有するアミノ酸残基で置換することをいう。類似の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当該分野で周知である。例えば、このようなファミリーとしては、塩基性側鎖を有するアミノ酸（例、リジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖を有するアミノ酸（例、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電性極性側鎖を有するアミノ酸（例、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖を有するアミノ酸（例、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、β位分岐側鎖を有するアミノ酸（例、スレオニン、バリン、イソロイシン）、芳香族側鎖を有するアミノ酸（例、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）、ヒドロキシル基（例、アルコール性、フェノール性）含有側鎖を有するアミノ酸（例、セリン、スレオニン、チロシン）、および硫黄含有側鎖を有するアミノ酸（例、システイン、メチオニン）が挙げられる。好ましくは、アミノ酸の保存的置換は、アスパラギン酸とグルタミン酸との間での置換、アルギニンとリジンとヒスチジンとの間での置換、トリプトファンとフェニルアラニンとの間での置換、フェニルアラニンとバリンとの間での置換、ロイシンとイソロイシンとアラニンとの間での置換、およびグリシンとアラニンとの間での置換であってもよい。
【００１７】
本発明の方法で用いられる形質転換微生物は、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ由来リノレート１３−ヒドラターゼ（配列番号１のアミノ酸配列を含むタンパク質）を産生する形質転換微生物に比し向上したリノレート１３−ヒドラターゼ活性を有することが好ましい。具体的には、本発明の方法で用いられる形質転換微生物は、配列番号１のアミノ酸配列を含むタンパク質を産生する形質転換微生物に対して１．０倍を超えるリノレート１３−ヒドラターゼ活性を有することが好ましく、例えば１．０１倍以上、好ましくは１．１倍以上、より好ましくは１．２倍以上、さらにより好ましくは１．３倍以上、なおさらにより好ましくは１．４倍以上、最も好ましくは２倍以上のリノレート１３−ヒドラターゼ活性を有してもよい。
【００１８】
本発明の方法で用いられる形質転換微生物が産生するタンパク質はまた、異種部分とペプチド結合を介して連結された融合タンパク質であってもよい。このような異種部分としては、例えば、目的タンパク質の精製を容易にするペプチド成分（例、ヒスチジンタグ、Ｓｔｒｅｐ−ｔａｇ  ＩＩ等のタグ部分；グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ、マルトース結合タンパク質、およびこれらの変異型等の目的タンパク質の精製に利用されるタンパク質）、目的タンパク質の可溶性を向上させるペプチド成分（例、Ｎｕｓ−ｔａｇ）、シャペロンとして働くペプチド成分（例、トリガーファクター）、他の機能を有するペプチド成分（例、全長タンパク質またはその一部）、ならびにリンカーが挙げられる。
【００１９】
本発明の方法で用いられる形質転換微生物が産生するタンパク質は、ラクトバチルス・ガリナラム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ）、ラクトバチルス・クリスパタス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｒｉｓｐａｔｕｓ）、ラクトバチルス・ハムステリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｈａｍｓｔｅｒｉ）、ラクトバチルス・ガセリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｇａｓｓｅｒｉ）、Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ  ｃｌａｕｓｓｅｎｉｉ）、ストレプトコッカス・ミュータンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｍｕｔａｎｓ）、およびストレプトコッカス・エクイナス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｑｕｉｎｕｓ）からなる群から選ばれる微生物由来リノレート１３−ヒドラターゼが好ましく、ラクトバチルス・ハムステリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｈａｍｓｔｅｒｉ）、ラクトバチルス・ガセリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｇａｓｓｅｒｉ）、ストレプトコッカス・ミュータンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｍｕｔａｎｓ）、およびストレプトコッカス・エクイナス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｑｕｉｎｕｓ）からなる群から選ばれる微生物由来リノレート１３−ヒドラターゼがより好ましい。
【００２０】
本発明で用いられる形質転換微生物は、例えば、本発明で用いられる上記タンパク質をコードするポリヌクレオチドおよびそれに作動可能に連結されたプロモーターを含む発現単位を含む微生物であってもよい。本発明では、用語「形質転換」は、宿主細胞に対するポリヌクレオチドの導入のみならず、宿主細胞におけるゲノムの改変もまた意図される。
【００２１】
本発明で用いられる上記タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、好ましくは、以下（ａ）〜（ｄ）からなる群より選ばれるポリヌクレオチドであってもよい：
（ａ）配列番号１８、１９、２２〜２４、２７、および２８（好ましくは、配列番号２２、２３、２７、および２８）からなる群から選ばれる塩基配列を含むポリヌクレオチド；
（ｂ）配列番号１８、１９、２２〜２４、２７、および２８（好ましくは、配列番号２２、２３、２７、および２８）からなる群から選ばれる塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェント条件下でハイブリダイズし、かつ、リノレート１３−ヒドラターゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｃ）配列番号１８、１９、２２〜２４、２７、および２８（好ましくは、配列番号２２、２３、２７、および２８）からなる群から選ばれる塩基配列と９０％以上の同一性を有する塩基配列を含み、かつ、リノレート１３−ヒドラターゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；ならびに
（ｄ）（ａ）〜（ｃ）からなる群より選ばれるポリヌクレオチドの縮重変異体。
【００２２】
上記ポリヌクレオチドは、ＤＮＡであってもＲＮＡであってもよいが、ＤＮＡであることが好ましい。配列番号１８、１９、２２〜２４、２７、および２８の塩基配列は、配列番号３０のアミノ酸配列をコードする。配列番号３１の塩基配列はそれぞれ、配列番号４、５、８〜１０、１３、および１４のアミノ酸配列をコードする。
【００２３】
上記ポリヌクレオチド（ｂ）において、用語「ストリンジェント条件」とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。例えば、ストリンジェント条件としては、６×ＳＳＣ（塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム）中、約４５℃でのハイブリダイゼーション、続いて、０．２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中、５０〜６５℃での１または２回以上の洗浄が挙げられる。
【００２４】
上記ポリヌクレオチド（ｃ）における同一性％は、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上または９９％以上であってもよい。
【００２５】
上記ポリヌクレオチド（ｄ）において、用語「縮重変異体」とは、変異前のポリヌクレオチド中の所定のアミノ酸残基をコードする少なくとも１つのコドンが、同一アミノ酸残基をコードする別のコドンに変更されたポリヌクレオチド変異体をいう。このような縮重変異体はサイレント変異に基づく変異体であることから、縮重変異体によりコードされるタンパク質は、変異前のポリヌクレオチドによりコードされるタンパク質と同一である。
【００２６】
好ましくは、縮重変異体は、それが導入されるべき宿主細胞のコドン使用頻度に適合するようにコドンが変更されたポリヌクレオチド変異体である。ある遺伝子を異種宿主細胞（例、微生物）で発現させる場合、コドン使用頻度の相違により、対応するｔＲＮＡ分子種が十分に供給されず、翻訳効率の低下および／または不正確な翻訳（例、翻訳の停止）が生じることがある。例えば、エシェリヒア・コリでは、表１に示される低頻度コドンが知られている。
【００２７】
【表１】
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【００２８】
したがって、本発明では、後述するような宿主細胞のコドン使用頻度に適合する縮重変異体を利用することができる。例えば、縮重変異体は、アルギニン残基、グリシン残基、イソロイシン残基、ロイシン残基、およびプロリン残基からなる群より選ばれる１種以上のアミノ酸残基をコードするコドンが変更されたものであってもよい。より具体的には、縮重変異体は、低頻度コドン（例、ＡＧＧ、ＡＧＡ、ＣＧＧ、ＣＧＡ、ＧＧＡ、ＡＵＡ、ＣＵＡ、およびＣＣＣ）からなる群より選ばれる１種以上のコドンが変更されたものであってもよい。好ましくは、縮重変異体は、以下からなる群より選ばれる１種以上（例、１種、２種、３種、４種、または５種）のコドンの変更を含んでいてもよい：
ｉ）Ａｒｇをコードする４種のコドン（ＡＧＧ、ＡＧＡ、ＣＧＧ、およびＣＧＡ）からなる群より選ばれる少なくとも１種のコドンの、Ａｒｇをコードする別のコドン（ＣＧＵ、またはＣＧＣ）への変更；
ｉｉ）Ｇｌｙをコードする１種のコドン（ＧＧＡ）の、別のコドン（ＧＧＧ、ＧＧＵ、またはＧＧＣ）への変更；
ｉｉｉ）Ｉｌｅをコードする１種のコドン（ＡＵＡ）の、別のコドン（ＡＵＵ、またはＡＵＣ）への変更；
ｉｖ）Ｌｅｕをコードする１種のコドン（ＣＵＡ）の、別のコドン（ＵＵＧ、ＵＵＡ、ＣＵＧ、ＣＵＵ、またはＣＵＣ）への変更；ならびに
ｖ）Ｐｒｏをコードする１種のコドン（ＣＣＣ）の、別のコドン（ＣＣＧ、ＣＣＡ、またはＣＣＵ）への変更。
縮重変異体がＲＮＡの場合、上記のとおりヌクレオチド残基「Ｕ」が利用されるべきであるが、縮重変異体がＤＮＡの場合、ヌクレオチド残基「Ｕ」の代わりに「Ｔ」が利用されるべきである。宿主細胞のコドン使用頻度に適合させるためのヌクレオチド残基の変異数は、変異前後で同一のタンパク質をコードする限り特に限定されないが、例えば、１〜４００個、１〜３００個、１〜２００個、または１〜１００個である。
【００２９】
低頻度コドンの同定は、当該分野で既知の技術を利用することにより、任意の宿主細胞の種類およびゲノム配列情報に基づいて容易に行うことができる。したがって、縮重変異体は、低頻度コドンの非低頻度コドン（例、高頻度コドン）への変更を含むものであってもよい。また、低頻度コドンのみならず、生産菌株のゲノムＧＣ含量への適合性などの要素を考慮して変異体を設計する方法が知られているので（Ａｌａｎ  Ｖｉｌｌａｌｏｂｏｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｇｅｎｅ  Ｄｅｓｉｇｎｅｒ：  ａ  ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ｂｉｏｌｏｇｙ  ｔｏｏｌ  ｆｏｒ  ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｎｇ  ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ  ＤＮＡ  ｓｅｇｍｅｎｔｓ，  ＢＭＣ  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ．  ２００６  Ｊｕｎ  ６；７：２８５．）、このような方法を利用してもよい。このように、上述の変異体は、それが導入され得る任意の宿主細胞（例、後述するような微生物）の種類に応じて適宜作製できる。
【００３０】
本発明において、用語「発現単位」とは、タンパク質として発現されるべき所定のポリヌクレオチドおよびそれに作動可能に連結されたプロモーターを含む、当該ポリヌクレオチドの転写、ひいては当該ポリヌクレオチドによりコードされるタンパク質の産生を可能にする最小単位をいう。発現単位は、ターミネーター、リボゾーム結合部位、および薬剤耐性遺伝子等のエレメントをさらに含んでいてもよい。発現単位は、ＤＮＡであってもＲＮＡであってもよいが、ＤＮＡであることが好ましい。発現単位はまた、宿主細胞に対して同種（ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ）（すなわち、固有（ｉｎｈｅｒｅｎｔ））であっても、異種（ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ）（すなわち、非固有）であってもよい。発現単位はまた、タンパク質として発現されるべき１つのポリヌクレオチド、およびそれに作動可能に連結されたプロモーターを含む発現単位（すなわち、モノシストロニックｍＲＮＡの発現を可能にする発現単位）、またはタンパク質として発現されるべき複数のポリヌクレオチド（例えば２以上、好ましくは３以上、より好ましくは４以上、さらにより好ましくは５以上、特に好ましくは１０以上のポリヌクレオチド）、およびそれに作動可能に連結されたプロモーターを含む発現単位（すなわち、ポリシストロニックｍＲＮＡの発現を可能にする発現単位）であってもよい。発現単位は、微生物（宿主細胞）においてゲノム領域（例、上記タンパク質をコードするポリヌクレオチドが固有に存在する天然ローカスである天然ゲノム領域、もしくは当該天然ローカスではない非天然ゲノム領域）、または非ゲノム領域（例、細胞質内）に含まれることができる。発現単位は、１または２以上（例、１、２、３、４、または５）の異なる位置においてゲノム領域中に含まれていてもよい。非ゲノム領域に含まれる発現単位の具体的な形態としては、例えば、プラスミド、ウイルスベクター、ファージ、および人工染色体が挙げられる。
【００３１】
発現単位を構成するプロモーターは、その下流に連結されたポリヌクレオチドによりコードされるタンパク質を宿主細胞で発現させることができるものであれば特に限定されない。例えば、プロモーターは、宿主細胞に対して同種であっても異種であってもよいが、好ましくは異種である。例えば、組換えタンパク質の産生に汎用される構成または誘導プロモーターを用いることができる。このようなプロモーターとしては、例えば、ＰｈｏＡプロモーター、ＰｈｏＣプロモーター、Ｔ７プロモーター、Ｔ５プロモーター、Ｔ３プロモーター、ｌａｃプロモーター、ｔｒｐプロモーター、ｔｒｃプロモーター、ｔａｃプロモーター、ＰＲプロモーター、ＰＬプロモーター、ＳＰ６プロモーター、アラビノース誘導プロモーター、コールドショックプロモーター、テトラサイクリン誘導性プロモーターが挙げられる。好ましくは、宿主細胞で強力な転写活性を有するプロモーターを用いることができる。宿主細胞で強力な転写活性を有するプロモーターとしては、例えば、宿主細胞で高発現している遺伝子のプロモーター、およびウイルス由来のプロモーターが挙げられる。
【００３２】
本発明において、形質転換微生物として使用される宿主細胞としては、例えば、腸内細菌科（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）に属する細菌等の細菌、および真菌が挙げられる。細菌はまた、グラム陽性菌であってもグラム陰性菌であってもよい。グラム陽性細菌としては、例えば、バシラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属細菌、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属細菌が挙げられる。バシラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属細菌としては、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）が好ましい。コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属細菌としては、コリネバクテリウム・グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）が好ましい。グラム陰性細菌としては、例えば、エシェリヒア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属細菌、パントエア（Ｐａｎｔｏｅａ）属細菌が挙げられる。エシェリヒア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属細菌としては、エシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）が好ましい。パントエア（Ｐａｎｔｏｅａ）属細菌としては、パントエア・アナナティス（Ｐａｎｔｏｅａ  ａｎａｎａｔｉｓ）が好ましい。真菌としては、サッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、シゾサッカロミセス（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、ヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）属、ワルトマイセス（Ｗａｌｔｏｍｙｃｅｓ）属（リポマイセス〔Ｌｉｐｏｍｙｃｅｓ〕属とも呼ぶ）の微生物が好ましい。サッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属の微生物としては、サッカロミセス・セレビシエー（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）が好ましい。シゾサッカロミセス（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属の微生物としては、シゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ）が好ましい。ヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）属の微生物としては、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｙｔｉｃａ）が好ましい。ワルトマイセス属（リポマイセス〔Ｌｉｐｏｍｙｃｅｓ〕属）の微生物としては、ワルトマイセス・リポファー（Ｗａｌｔｏｍｙｃｅｓ  ｌｉｐｏｆｅｒ）（リポマイセス・リポファー〔Ｌｉｐｏｍｙｃｅｓ  ｌｉｐｏｆｅｒ〕とも呼ぶ）が好ましい。
【００３３】
本発明で用いられる形質転換微生物は、当該分野において公知の任意の方法により作製することができる。例えば、上述したような形質転換微生物は、発現ベクターを用いる方法（例、コンピテント細胞法、エレクトロポレーション法）、またはゲノム改変技術により作製することができる。発現ベクターが宿主細胞のゲノムＤＮＡと相同組換えを生じる組込み型（ｉｎｔｅｇｒａｔｉｖｅ）ベクターである場合、発現単位は、形質転換により、宿主細胞のゲノムＤＮＡに組み込まれることができる。一方、発現ベクターが宿主細胞のゲノムＤＮＡと相同組換えを生じない非組込み型ベクターである場合、発現単位は、形質転換により、宿主細胞のゲノムＤＮＡに組み込まれず、宿主細胞内において、発現ベクターの状態のまま、ゲノムＤＮＡから独立して存在できる。あるいは、ゲノム編集技術（例、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステム、Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ａｃｔｉｖａｔｏｒ−Ｌｉｋｅ  Ｅｆｆｅｃｔｏｒ  Ｎｕｃｌｅａｓｅｓ（ＴＡＬＥＮ））によれば、発現単位を宿主細胞のゲノムＤＮＡに組み込むこと、および宿主細胞が固有に備える発現単位を改変することが可能である。
【００３４】
発現ベクターは、発現単位として上述した最小単位に加えて、宿主細胞で機能するターミネーター、リボゾーム結合部位、および薬剤耐性遺伝子等のエレメントをさらに含んでいてもよい。薬剤耐性遺伝子としては、例えば、テトラサイクリン、アンピシリン、カナマイシン、ハイグロマイシン、ホスフィノスリシン等の薬剤に対する耐性遺伝子が挙げられる。
【００３５】
発現ベクターはまた、宿主細胞のゲノムＤＮＡとの相同組換えのために、宿主細胞のゲノムとの相同組換えを可能にする領域をさらに含んでいてもよい。例えば、発現ベクターは、それに含まれる発現単位が一対の相同領域（例、宿主細胞のゲノム中の特定配列に対して相同なホモロジーアーム、ｌｏｘＰ、ＦＲＴ）間に位置するように設計されてもよい。発現単位が導入されるべき宿主細胞のゲノム領域（相同領域の標的）としては、特に限定されないが、宿主細胞において発現量が多い遺伝子のローカスであってもよい。
【００３６】
発現ベクターは、プラスミド、ウイルスベクター、ファージ、または人工染色体であってもよい。発現ベクターはまた、組込み型（ｉｎｔｅｇｒａｔｉｖｅ）ベクターであっても非組込み型ベクターであってもよい。組込み型ベクターは、その全体が宿主細胞のゲノムに組み込まれるタイプのベクターであってもよい。あるいは、組込み型ベクターは、その一部（例、発現単位）のみが宿主細胞のゲノムに組み込まれるタイプのベクターであってもよい。発現ベクターはさらに、ＤＮＡベクター、またはＲＮＡベクター（例、レトロウイルス）であってもよい。発現ベクターはまた、汎用されている発現ベクターであってもよい。このような発現ベクターとしては、例えば、ｐＵＣ（例、ｐＵＣ１９、ｐＵＣ１８）、ｐＳＴＶ、ｐＢＲ（例、ｐＢＲ３２２）、ｐＨＳＧ（例、ｐＨＳＧ２９９、ｐＨＳＧ２９８、ｐＨＳＧ３９９、ｐＨＳＧ３９８）、ＲＳＦ（例、ＲＳＦ１０１０）、ｐＡＣＹＣ（例、ｐＡＣＹＣ１７７、ｐＡＣＹＣ１８４）、ｐＭＷ（例、ｐＭＷ１１９、ｐＭＷ１１８、ｐＭＷ２１９、ｐＭＷ２１８）、ｐＱＥ（例、ｐＱＥ３０）、およびその誘導体が挙げられる。
【００３７】
本発明の方法において用いられる基質であるリノール酸は、上記１３−ＬＡＨを含む反応系（すなわち、上記１３−ＬＡＨを産生する形質転換微生物の存在下、例、上記１３−ＬＡＨを産生する形質転換微生物を含む培養液）に添加することができる。あるいは、本発明の方法では、反応系において生成したリノール酸を基質として利用することもできる。
【００３８】
本発明の方法が上記形質転換微生物を培養することにより行われる場合、培養培地としては、上述したものを用いることができる。培養培地は、炭素源を含むことが好ましい。炭素源としては、例えば、単糖類、二糖類、オリゴ糖類、多糖類等の炭水化物；ショ糖を加水分解した転化糖；グリセロール；メタノール、ホルムアルデヒド、ギ酸塩、一酸化炭素、二酸化炭素等の炭素数が１の化合物（以下、Ｃ１化合物という。）；コーン油、パーム油、大豆油等のオイル；アセテート；動物油脂；動物オイル；飽和脂肪酸、不飽和脂肪酸等の脂肪酸；脂質；リン脂質；グリセロ脂質；モノグリセライド、ジグリセライド、トリグリセライド等のグリセリン脂肪酸エステル；微生物性タンパク質、植物性タンパク質等のポリペプチド；加水分解されたバイオマス炭素源等の再生可能な炭素源；酵母エキス；又はこれらを組み合わせたものが挙げられる。窒素源としては、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム等の無機アンモニウム塩、大豆加水分解物などの有機窒素、アンモニアガス、アンモニア水等を用いることができる。有機微量栄養源としては、ビタミンＢ１、Ｌ−ホモセリンなどの要求物質または酵母エキス等を適量含有させることが望ましい。これらの他に、必要に応じて、リン酸カリウム、硫酸マグネシウム、鉄イオン、マンガンイオン等が少量添加される。なお、本発明で用いる培地は、炭素源、窒素源、無機イオン及び必要に応じてその他の有機微量成分を含む培地であれば、天然培地、合成培地のいずれでもよい。
【００３９】
形質転換微生物の培養条件としては、特に限定されず、標準的な細胞培養条件を用いることができる。培養温度としては、４〜４０℃が好ましく、１０〜３７℃がより好ましい。ｐＨとしては、約４〜９であることが好ましい。また、宿主細胞の性質に応じて好気性、無酸素性、又は嫌気性条件下で培養を行うことが好ましい。
【００４０】
培養方法としては、任意の適切な方法を用いることができる。このような培養方法としては、例えば、バッチ培養法、流加培養法、連続培養法が挙げられる。形質転換体微生物により産生される特定のタンパク質の発現がｌａｃプロモーター等の誘導的プロモーターの制御下にある場合、培養培地中に、例えばＩＰＴＧ（イソプロピル−β−チオガラクトピラノシド）等の誘導剤を添加して、タンパク質の発現を誘導してもよい。
【００４１】
１３−ＨＯＤの製造の確認は、適宜行うことができる。例えば、このような確認は、反応系から１３−ＨＯＤを有機溶媒で抽出し、抽出液をガスクロマトグラフィーや質量分析に供することにより行うことができる。培養培地からの１３−ＨＯＤの回収および精製もまた、適宜行うことができる。例えば、１３−ＨＯＤの回収および精製は、有機溶媒による抽出・分画、および包接化合物を用いる方法（シクロデキストリン等の包接化合物等を接触させることで、１３−ＨＯＤの包接錯体を作成させ、その後当該包接錯体から１３−ＨＯＤを脱離する方法）が挙げられる。１３−ＨＯＤの回収および精製はまた、一般的な香料と同じく、精密蒸留により分離する方法により行われてもよい。１３−ＨＯＤの製造の確認、ならびに回収および精製については、例えば、国際公開第２０１６／０２９１８７号、米国出願公開第２０１２／０２４６７６７号、特開２００２−４７２３９号公報、Ｘｉｅ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｆｏｏｄ  Ｃｈｅｍ．，  ２００９；１１７：３７５−３８０を参照してもよい。
【００４２】
別の実施形態では、本発明は、δ−デカラクトンの製造方法を提供する。本発明のδ−デカラクトンの製造方法は、以下を含む：
（ｉ）Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ由来リノレート１３−ヒドラターゼ（配列番号１のアミノ酸配列を含むタンパク質）を産生する形質転換微生物に比し向上したリノレート１３−ヒドラターゼ活性を有する形質転換微生物の存在下において、リノール酸から１３−ヒドロキシ−９（Ｚ）−オクタデセン酸を生成すること；および
（ｉｉ）１３−ヒドロキシ−９（Ｚ）−オクタデセン酸からδ−デカラクトンを生成すること。
【００４３】
工程（ｉ）における形質転換微生物および１３−ヒドロキシ−９（Ｚ）−オクタデセン酸を生成するための各条件は、上述したものが挙げられる。
【００４４】
工程（ｉｉ）は、化学的または生物学的な任意の方法により行うことができる（例、韓国特許出願公開ＫＲ１０２０１５００９８４９７Ａ；Ｈ  Ｏｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｄｖ．Ｓｙｎｔｈ．Ｃａｔａｌ．，３５７，４０８−４１６（２０１５）；Ａｌｉｎａ  Ｓｗｉｚｄｏｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｓｃｉ．，１３，１６５１４−１６５４３（２０１２））。
【００４５】
特定の実施形態では、工程（ｉｉ）は、β酸化活性を有する微生物の存在下において行われてもよい。
【００４６】
β酸化活性を有する微生物としては、例えば、ヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）属、ワルトマイセス（Ｗａｌｔｏｍｙｃｅｓ）属（リポマイセス〔Ｌｉｐｏｍｙｃｅｓ〕属とも呼ぶ）、サッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、シゾサッカロミセス（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属の微生物が挙げられる。ヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）属の微生物としては、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｙｔｉｃａ）が好ましい。ワルトマイセス属（リポマイセス〔Ｌｉｐｏｍｙｃｅｓ〕属）の微生物としては、ワルトマイセス・リポファー（Ｗａｌｔｏｍｙｃｅｓ  ｌｉｐｏｆｅｒ）（リポマイセス・リポファー〔Ｌｉｐｏｍｙｃｅｓ  ｌｉｐｏｆｅｒ〕とも呼ぶ）が好ましい。サッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属の微生物としては、サッカロミセス・セレビシエー（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）が好ましい。シゾサッカロミセス（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属の微生物としては、シゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ）が好ましい。
【００４７】
δ−デカラクトンの生産能を上げるために、β酸化活性を有する微生物は、アルデヒドオキシダーゼの活性が野生型に比べて低下した微生物であってもよい。アルデヒドオキシダーゼの活性が野生型に比べて低下した微生物としては、例えば、Ａｃｙｌ−ＣｏＡ  ｏｘｉｄａｓｅをコードする遺伝子群の中から特定の一つまたは複数の遺伝子を破壊するか、または機能低下するように改変した微生物が挙げられる。微生物がＹ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａである場合、６個存在するＡｃｙｌ−ＣｏＡ  ｏｘｉｄａｓｅをコードする遺伝子の中で、短鎖脂肪酸に対して高い基質親和性を示すＡｃｙｌ−ＣｏＡ  ｏｘｉｄａｓｅ  ３（ＡＯＸ３）をコードする遺伝子が破壊され、または機能低下するように改変されることが好ましい。
【００４８】
アルデヒドオキシダーゼの活性が野生型に比べて低下した微生物は、微生物のゲノムＤＮＡとの相同組換えを利用する方法、またはゲノム改変技術により作製することができる。相同組換えを利用する方法としては、例えば、標的遺伝子（例、Ａｃｙｌ−ＣｏＡ  ｏｘｉｄａｓｅ遺伝子）の前後の相同領域を持ち、標的遺伝子相当部分がマーカー遺伝子（例、テトラサイクリン、アンピシリン、カナマイシン、ハイグロマイシン、ホスフィノスリシン等の薬剤に対する耐性遺伝子）に置き換わった遺伝子断片（例、ＤＮＡ断片）を微生物に外来から導入する方法（例、コンピテント細胞法、エレクトロポレーション法）が挙げられる。ゲノム改変技術としては、ゲノム編集技術（例、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステム、Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ａｃｔｉｖａｔｏｒ−Ｌｉｋｅ  Ｅｆｆｅｃｔｏｒ  Ｎｕｃｌｅａｓｅｓ（ＴＡＬＥＮ））が挙げられる。アルデヒドオキシダーゼ活性は、例えば、Ｓａｋａｙｕ  Ｓｈｉｍｉｚｕ  ｅｔ．  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，９１，１０８−１１３（１９７９）に記載された方法に従って測定できる。
【００４９】
工程（ｉｉ）における１３−ヒドロキシ−９（Ｚ）−オクタデセン酸は、工程（ｉ）で得られた１３−ヒドロキシ−９（Ｚ）−オクタデセン酸（例、１３−ヒドロキシ−９（Ｚ）−オクタデセン酸を含む培養液、粗精製物、または精製物）として供給される。１３−ヒドロキシ−９（Ｚ）−オクタデセン酸の供給源として工程（ｉ）で得られた培養液を用いる場合、形質転換微生物は除去されていてもされていなくてもよい。
【００５０】
工程（ｉｉ）は、あらかじめ培地中で培養したβ酸化活性を有する微生物を、工程（ｉ）で得られた１３−ヒドロキシ−９（Ｚ）−オクタデセン酸を含む培養液に植菌して培養することにより実施してもよい。培養液に植菌される微生物は、例えば、一般的な微生物培養培地（例、ＹＰＤ培地）中の培養（前培養）、その後の誘導培地（例、オレイン酸、アラキドン酸、ステアリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、イコセン酸、またはエルカ酸を含む培地）中の培養（誘導培養）、および緩衝液（例、リン酸緩衝液）での洗浄により調製してもよい。
【００５１】
β酸化活性を有する微生物の培養（前培養、誘導培養、および工程（ｉｉ）における培養）のための条件は、特に限定されず、標準的な細胞培養条件を用いることができる。培養温度としては、４〜４０℃が好ましく、１０〜３７℃がより好ましい。ｐＨとしては、約４〜９であることが好ましい。また、微生物の性質に応じて好気性、無酸素性、又は嫌気性条件下で培養を行うことが好ましい。培養方法としては、任意の適切な方法を用いることができる。このような培養方法としては、例えば、バッチ培養法、流加培養法、連続培養法が挙げられる。
【００５２】
δ−デカラクトンの生産量は、ガスクロマトグラフィー（ＧＣ）、水素炎イオン化型検出器（ＦＩＤ）、質量分析（ＭＳ）を用いて評価することができる。
【００５３】
本発明のδ−デカラクトンの製造方法は、δ−デカラクトンを回収することを含んでもよい。δ−デカラクトンを回収するための方法は、例えば、酢酸エチル、ヘキサン、へプタン、オクタン、デカン、アセトンなどを利用した溶剤抽出法などが挙げられる。
【００５４】
本発明のδ−デカラクトンの製造方法は、δ−デカラクトンを精製することをさらに含んでもよい。δ−デカラクトンを精製するための方法は、例えば、蒸留、再結晶、各種クロマトグラフィーを用いた方法が挙げられる。
【実施例】
【００５５】
次に実施例を示して本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。【００５６】
実施例１：各種微生物由来Ｌｉｎｏｌｅａｔｅ  １３−ｈｙｄｒａｔａｓｅの発現プラスミド構築
＜Ｌｉｎｏｌｅａｔｅ  １３−ｈｙｄｒａｔａｓｅをコードする遺伝子の探索＞
リノール酸のΔ１２位の二重結合を水和しＣ１３位に水酸基を導入する酵素として、Ｌｉｎｏｌｅａｔｅ  １３−ｈｙｄｒａｔａｓｅ（以下１３−ＬＡＨと略称する）が知られている（米国特許出願公開ＵＳ２００４０１９７８８２Ａ１）。同酵素はＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓより単離され、リノール酸を基質に１３−ｈｙｄｒｏｘｙ−ｃｉｓ−９−ｏｃｔａｄｅｃｅｎｏｉｃ  ａｃｉｄ（以下１３−ＨＯＤと略称する）を生成することが報告されている（韓国特許出願公開ＫＲ１０２０１５００９８４９７Ａ、Ｐａｒｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，２０１５，２０８：１−１０）。Ｌ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ由来１３−ＬＡＨ（以下Ｌａｃｉ１３−ＬＡＨと略称）のアミノ酸配列を配列番号１に示す。Ｌａｃｉ１３−ＬＡＨよりも高活性な１３−ＬＡＨを新たに単離する為に、データベースを利用した同一性検索を実施した。Ｌ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ  １３−ＬＡＨのアミノ酸配列を基にｂｌａｓｔｐ（ｈｔｔｐｓ：／／ｂｌａｓｔ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／Ｂｌａｓｔ．ｃｇｉ）を利用して相同検索を行った。その結果、同酵素と７０％以上の同一性を示した１３種類の候補タンパク質を抽出した。表２に抽出された候補タンパク質の一覧を示す。【００５７】
【表２】
2019194287.tif 000003
【００５８】
＜各種１３−ＬＡＨをコードする遺伝子の化学合成＞
コドン使用頻度をＥ．ｃｏｌｉに至適化された配列番号１５〜２８で示す塩基配列をＧｅｎＳｃｒｉｐｔ社が提供する人工遺伝子合成受託サービスを利用して、遺伝子合成を実施した。合成された各遺伝子は同社にてｐＥＴ−９ａ（Ｎｏｖａｇｅｎ（Ｍｅｒｃｋ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）製、製品番号６９４３１−３）にクローニングされ、各種１３−ＬＡＨ遺伝子が導入されたプラスミド、ｐＥＴ−９ａ−Ｌａｃｉ＿１３−ＬＡＨ、ｐＥＴ−９ａ−Ｌａｍｙ＿１３−ＬＡＨ、ｐＥＴ−９ａ−Ｌｈｅｌ＿１３−ＬＡＨ、ｐＥＴ−９ａ−Ｌｇａｌ＿１３−ＬＡＨ、ｐＥＴ−９ａ−Ｌｃｒｉ＿１３−ＬＡＨ、ｐＥＴ−９ａ−Ｌｋｅｆ＿１３−ＬＡＨ、ｐＥＴ−９ａ−Ｌｉｎｔ＿１３−ＬＡＨ、ｐＥＴ−９ａ−Ｌｈａｍ＿１３−ＬＡＨ、ｐＥＴ−９ａ−Ｌｇａｓ＿１３−ＬＡＨ、ｐＥＴ−９ａ−Ｐｃｌａ＿１３−ＬＡＨ、ｐＥＴ−９ａ−Ｌｒｕｍ＿１３−ＬＡＨ、ｐＥＴ−９ａ−Ｓｉｎｆ＿１３−ＬＡＨ、ｐＥＴ−９ａ−Ｓｍｕｔ＿１３−ＬＡＨ、ｐＥＴ−９ａ−Ｓｅｑｕ＿１３−ＬＡＨを取得した。各遺伝子の略称名は表２を参照。【００５９】
＜発現プラスミドｐＥＴ−２２ｂ（＋）ＫｍＲの構築＞
各種１３−ＬＡＨの遺伝子を発現する為のプラスミドｐＥＴ−２２ｂ（＋）ＫｍＲは、以下の手順で構築した。初めにｐＥＴ−２２ｂ（＋）（Ｎｏｖａｇｅｎ（Ｍｅｒｃｋ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）社製、製品番号６９７４４−３ＣＮ）の薬剤マーカーをアンピシリン耐性からカナマイシン耐性に変更した。λａｔｔＬ−ＫｍＲ−λａｔｔＲ（国際公開第２００８／０９０７７０号）を含むゲノムＤＮＡを鋳型としてプライマーＫｍ−ｐＥＴ−Ｆ（配列番号２９）とＫｍ−ｐＥＴ−Ｒ（配列番号３０）を用いＰＣＲ（ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ  ＧＸＬ（登録商標）ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ、９８℃・１０ｓｅｃ．、５５℃・１５ｓｅｃ．、６８℃・１２０ｓｅｃ．、３０ｃｙｃｌｅｓ）にてλａｔｔＬ−ＫｍＲ−λａｔｔＲの遺伝子断片を増幅した。得られたＰＣＲ産物をＷｉｚａｒｄ（登録商標）ＳＶ  Ｇｅｌ  ａｎｄ  ＰＣＲ  Ｃｌｅａｎ−ＵＰ  ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ製、製品番号Ａ９２８１）で精製し、カナマイシン耐性遺伝子のＤＮＡ断片を取得した。続けて、ｐＥＴ−２２ｂ（＋）を鋳型としてプライマーｐＥＴ２２−Ｋｍ−ｉｎｖＦ（配列番号３１）とｐＥＴ２２−Ｋｍ−ｉｎｖＲ（配列番号３２）を用いて、アンピシリン耐性遺伝子を除くプラスミドの全長領域をＰＣＲ（ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ  ＧＸＬ（登録商標）ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ、９８℃・１０ｓｅｃ．、５４℃・１５ｓｅｃ．、６８℃・２４０ｓｅｃ．、４０ｃｙｃｌｅｓ）にて増幅した。得られたＰＣＲ産物を、前記と同様にＷｉｚａｒｄ（登録商標）ＳＶ  Ｇｅｌ  ａｎｄ  ＰＣＲ  Ｃｌｅａｎ−ＵＰ  ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ製、製品番号Ａ９２８１）で精製し、ｐＥＴ−２２ｂ（＋）の遺伝子断片を取得した。カナマイシン耐性遺伝子とｐＥＴ−２２ｂ（＋）の遺伝子断片をＩｎ−Ｆｕｓｉｏｎ（登録商標）ＨＤ  ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ製、製品番号６３９６４８）で連結し、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９株に形質転換した。５０ｍｇ／Ｌのカナマイシンを含むＬＢ寒天培地（１０ｇ／Ｌ  ＮａＣｌ、１０ｇ／Ｌ  Ｂａｃｔｏ  ｔｒｙｐｔｏｎｅ、５ｇ／Ｌ  Ｂａｃｔｏ  ｙｅａｓｔ  ｅｘｔｒａｃｔ、Ｂａｃｔｏ  ａｇａｒ  ２０ｇ／Ｌ）に播種後、３７℃で一晩培養を行い、形質転換体を取得した。出現した形質転換体はＫｍ−ｐＥＴ−Ｆ（配列番号２９）とＫｍ−ｐＥＴ−Ｒ（配列番号３０）で示すプライマーの組み合わせでコロニーＰＣＲを行い、ｐＥＴ−２２ｂ（＋）の薬剤マーカーがアンピシリン耐性からカナマイシン耐性に変更したｐＥＴ−２２ｂ（＋）ＫｍＲを取得した。ｐＥＴ−２２ｂ（＋）ＫｍＲの構築で使用したプライマーの配列を表３に示した。【００６０】
【表３】
2019194287.tif 000004
【００６１】
＜ｐＥＴ−２２ｂ（＋）ＫｍＲを利用した各種１３−ＬＡＨ発現用プラスミドの構築＞
ｐＥＴ−２２ｂ（＋）ＫｍＲは制限酵素ＮｄｅＩとＥｃｏＲＩによって消化処理した後、アガロースゲル電気泳動を実施した。続けて、ｐＥＴ−２２ｂ（＋）ＫｍＲのＤＮＡ断片をゲルより切り出し、Ｗｉｚａｒｄ（登録商標）ＳＶ  Ｇｅｌ  ａｎｄ  ＰＣＲ  Ｃｌｅａｎ−ＵＰ  ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ製、製品番号Ａ９２８１）を用いて精製ＤＮＡ断片を取得した。各種１３−ＬＡＨの遺伝子断片は、表４に示したプライマーの組み合わせと鋳型となるプラスミドを用いて、ＰＣＲ（ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ  ＧＸＬ（登録商標）、９８℃・１０ｓｅｃ．、５５℃・１５ｓｅｃ．、６８℃・１２０ｓｅｃ．、３０ｃｙｃｌｅｓ）を行い１３−ＬＡＨの遺伝子断片を増幅した。例えば、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｍｙｌｏｖｏｒｕｓ由来１３−ＬＡＨ（Ｌａｍｙ＿１３−ＬＡＨ）の遺伝子断片は、ｐＥＴ−９ａ−Ｌａｍｙ＿１３−ＬＡＨを鋳型ＤＮＡとして１３ＬＡＨ１２３４５７８＿Ｆ（配列番号３３）と１３ＬＡＨ１３８＿Ｒ（配列番号３４）で記したプライマーの組み合わせでＰＣＲを実施した。ＰＣＲの反応に用いた鋳型ＤＮＡとプライマーの組み合わせを表４に示した。その後、得られた各ＰＣＲ産物は、Ｗｉｚａｒｄ（登録商標）ＳＶ  Ｇｅｌ  ａｎｄ  ＰＣＲ  Ｃｌｅａｎ−ＵＰ  ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ製、製品番号Ａ９２８１）で精製し、各１３−ＬＡＨ遺伝子の精製ＤＮＡ断片を取得した。上記ｐＥＴ−２２ｂ（＋）ＫｍＲのＤＮＡ断片と各１３−ＬＡＨ遺伝子の精製ＤＮＡ断片をそれぞれ、Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ（登録商標）ＨＤ  ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ製、製品番号６３９６４８）で連結し、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９株に形質転換した。その後、５０ｍｇ／Ｌのカナマイシンを含むＬＢ寒天培地に播種した後、３７℃で一晩培養を行い、形質転換体を取得した。出現した形質転換体はＴ７Ｐ−Ｆ（塩基配列：５’ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧ３’、配列番号６１）とＴ７Ｔ−Ｒ（塩基配列５’ＧＣＴＡＧＴＴＡＴＴＧＣＴＣＡＧＣＧＧ３’、配列番号６２）で示すプライマーの組み合わせでコロニーＰＣＲを行い、ｐＥＴ−２２ｂ（＋）ＫｍＲに各種１３−ＬＡＨが導入された発現プラスミドを取得した。【００６２】
【表４−１】
2019194287.tif 000005
【表４−２】
2019194287.tif 000006
【００６３】
実施例２：各種１３−ＬＡＨが発現したＥ．ｃｏｌｉを利用したリノール酸からの１３−ＨＯＤ生産試験
＜各種１３−ＬＡＨが発現したＥ．ｃｏｌｉ  ＢＬＲ（ＤＥ３）株の構築＞
ＢＬＲ（ＤＥ３）株（メルクミリポア製、製品番号６９０５３）から、定法に従ってエレクトロコンピテントセルを調製し、各種ｐＥＴ−２２ｂ（＋）ＫｍＲ−ＸＸＸＸ＿１３−ＬＡＨ（ＸＸＸＸは略称名を意味する、表４参照）をエレクトロポレーション法にて導入した。得られた形質転換体を５０ｍｇ／Ｌのカナマイシンを含むＬＢ寒天培地に播種後、３７℃で一晩培養を行い、形質転換体ＢＬＲ（ＤＥ３）／ｐＥＴ−２２ｂ（＋）ＫｍＲ−ＸＸＸＸ＿１３−ＬＡＨ株を取得した。【００６４】
＜ＢＬＲ（ＤＥ３）／ｐＥＴ−２２ｂ（＋）ＫｍＲ−ＸＸＸＸ＿１３−ＬＡＨ株を利用したリノール酸からの１３−ＨＯＤ生産試験＞
上記で得られたＢＬＲ（ＤＥ３）／ｐＥＴ−２２ｂ（＋）ＫｍＲ−ＸＸＸＸ＿１３−ＬＡＨ株を、ＳＯＣ培地３ｍＬを張り込んだ試験管に播種し、３７℃、１２０ｒｐｍの条件で１６〜２４時間、振盪培養し、前培養液Ａを得た。ＳＯＣ培地の組成と調製法を表５に示す。前培養液ＡはＳＯＣ培地５０ｍＬを張り込んだ５００ｍＬ振とうフラスコに０．５ｍＬ播種し、３７℃で２時間、１２０ｒｐｍの条件で振盪培養した。その後、培養温度を１６℃に下げ、イソプロピル−β−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を１ｍＭ添加する方法で１３−ＬＡＨタンパク質の発現を誘導した。ＩＰＴＧ添加後、培養をさらに２２〜２４時間実施し、得られた培養液４ｍＬを遠心分離することで菌体を回収した。その後、該菌体を０．８Ｍ  ＮａＣｌにて２回洗浄したものを、変換反応に用いた。得られた菌体を変換反応液１ｍＬに懸濁し、１４ｍＬ  Ｆａｌｃｏｎ  ｔｕｂｅにて３７℃、１２０ｒｐｍの条件で５時間、振盪した。変換反応液の組成と調製法を表６に示す。【００６５】
【表５】
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【００６６】
Ｓｔｏｃｋ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ  Ａは以下の手順で調製した。０．５ｇのＮａＣｌ、２０ｇのＢａｃｔｏ  Ｔｒｙｐｔｏｎｅ、５ｇのＢａｃｔｏ  Ｙｅａｓｔ  Ｅｘｔｒａｃｔ、０．１８６ｇのＫＣｌを純水に溶解し、９６０ｍＬにメスアップした後、ＮａＯＨにてｐＨを７．０に調整した。その後、１２０℃、１５ｍｉｎ．オートクレイブにて滅菌した。また、１Ｍ  ＣａＣｌ２、１Ｍ  ＭｇＳＯ４、１Ｍ  Ｇｌｕｃｏｓｅは、各濃度の溶液を調製後、０．２２μｍのフィルターで滅菌濾過した物を利用した。放冷したＳｔｏｃｋ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ  Ａ  ９６０ｍＬに１０ｍＬの１Ｍ  ＣａＣｌ２、１０ｍＬの１Ｍ  ＭｇＳＯ４、さらには２０ｍＬ  １Ｍ  Ｇｌｕｃｏｓｅを添加した。その後、カナマイシンが終濃度５０ｍｇ／Ｌになるように混合液に添加したものをＳＯＣ培地として使用した。【００６７】
【表６】
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【００６８】
Ｃｉｔｒａｔｅ／ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｂｕｆｆｅｒは１Ｍクエン酸溶液１７．９ｍＬと０．２Ｍリン酸水素二ナトリウム・１２水和物溶液３２．１ｍＬを混ぜた後、ＮａＯＨでｐＨを６．０に調整した。その後、純水で１００ｍｌにメスアップし、１２０℃、１５ｍｉｎ．オートクレイブにて滅菌した。その後、同条件で滅菌処理したＴｗｅｅｎ２０とリノール酸を、それぞれ終濃度０．２５ｗｔ％と５０ｇ／Ｌになるようになるように添加した。【００６９】
＜反応溶液からの脂肪酸類の抽出法とＧＣ−ＭＳによる成分分析＞
反応液中の脂肪酸類の抽出は以下の手順で分析した。変換後の反応液０．２ｍＬを１．５ｍＬロック付きマイクロチューブに入れ、そこに酢酸エチル０．６ｍＬを加えた後、ボルテックスにて１０秒間混合した。この酢酸エチル溶液を１５，０００ｒｐｍ、２５℃、１０分間の条件で遠心分離し、上層の酢酸エチル層を分析サンプルとして取得した。続けて、分析サンプル中の脂肪酸類をシリル化反応に供する為、分析サンプル３０μＬに誘導体化試薬（ＢＳＡ＋ＴＭＣＳ  ５：１（ＳＵＰＥＬＣＯ製、製品番号３３０１８））６０μＬを加え、室温にて２時間静置した。これをＧＣ−ＭＳ分析に用いた。ＧＣ−ＭＳ分析の条件を以下に示した。【００７０】
＜ＧＣ−ＭＳ＞
装置：Ａｇｉｌｅｎｔ  ５９７５Ｃ  ＭＳＤ  ａｎｄ  ７８９０Ａ  ＧＣ、オートサンプラー：Ｇｅｒｓｔｅｌ  ＭＰＳ  Ａｕｔｏｓａｍｐｌｅｒ
（ＧＣ）
注入量：１μＬ、注入法：スプリット２０：１、注入口温度：２３０℃、カラム：Ａｇｉｌｅｎｔ  ＤＢ−１ｍｓ，３０ｍ，０．２５ｍｍ，０．２５μｍ（部品番号１２２−０１３２）、カラム温度プログラム：９０℃で開始後２５℃／ｍｉｎで１６０℃まで昇温、その後５℃／ｍｉｎで２８０℃まで昇温（２．５分間維持）、キャリアガス圧力：９．９５４ｐｓｉ
（ＭＳ）
インターフェース温度：２８０℃、イオン源温度：２３０℃、四重極温度：１５０℃、イオン化モード：ＥＩ：（電子エネルギー：７０ｅＶ）、チューニング：Ｅｔｕｎｅ、溶媒待ち時間：４分、測定モード：スキャン（２０−５００ｍ／Ｚ）【００７１】
ＧＣ−ＭＳ解析で得られたＭＳクロマトグラムとＭＳスペクトルを図１〜２９に示す。【００７２】
Ｐ１で示したＲ．Ｔ．＝１０．９ｍｉｎ．のピークはシリル化（−ＳｉＭｅ３）されたリノール酸を意味し、Ｐ２で示したＲ．Ｔ．＝１３．６ｍｉｎ．はＭＳスペクトルの解析結果から、７３、１７３、３７１（ｍ／Ｚ）に特徴的なピークを有することが示された（図１６〜２９参照）。シリル化された１３−ＨＯＤのＭＳスペクトルの解析結果は既に公開されており（非特許文献：Ｐａｒｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０１５，２０；２０８：１−１０）、今回得られた結果と一致したことから、Ｐ２のピークはシリル化された１３−ＨＯＤであることが明らかとなった。以上の結果より、本検討で使用した各種１３−ＬＡＨ発現株の全てにおいてリノール酸から１３−ＨＯＤが変換されることを見出した。【００７３】
＜ＧＣ−ＦＩＤを利用した１３−ＨＯＤの定量解析＞
次にＧＣ−ＦＩＤを利用して、生産された１３−ＨＯＤの定量解析を実施した。サンプルは前記と同様にシリル化反応を実施した後、ＧＣ−ＦＩＤに供した。以下にＧＣ−ＦＩＤの分析条件と定量解析の結果を表７に示す。【００７４】
＜ＧＣ−ＦＩＤの分析条件＞
装置：島津ＧＣ−２０１０Ｐｌｕｓ／ＦＩＤ、カラム：Ａｇｉｌｅｎｔ  ＤＢ−１ｍｓ，３０ｍ，０．２５ｍｍ，０．２５μｍ（部品番号１２２−０１３２）、注入量：１μＬ、注入法：スプリット２０：１、注入口：２３０℃、カラム温度プログラム：９０℃で開始後２５℃／ｍｉｎで１６０℃まで昇温、その後５℃／ｍｉｎで２８０℃まで昇温（２．５分間維持）、キャリアガス：ヘリウム、線速度３５ｃｍ／ｓ、検出器：温度２５０℃、取り込み周期２５Ｈｚ、メークアップ流量（Ａｉｒ）３０ｍＬ／ｍｉｎ。標品はリノール酸のＣ１２位にヒドロキシル基が導入されたリシノール酸（東京化成工業社製、製品番号Ｒ００２７）をサンプルと同様にシリル化した物を利用した。【００７５】
【表７】
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【００７６】
以上の結果から、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｒｉｓｐａｔｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｈａｍｓｔｅｒｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｇａｓｓｅｒｉ、Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ  ｃｌａｕｓｓｅｎｉｉ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｍｕｔａｎｓ、さらにはＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｑｕｉｎｕｓ由来１３−ＬＡＨにおいて、既知のＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ由来１３−ＬＡＨよりも高い１３−ＨＯＤ生産量が観察された。【００７７】
実施例３：Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａを利用した１３−ＨＯＤからδ−デカラクトンへの変換反応
＜Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａＷ２９ΔＵＲＡ３株構築用のプラスミドｐＵＣ−ΔＰＤＨ１：：ＵＲＡ３の構築＞
次に本検討で得られた１３−ＨＯＤを利用してδ−デカラクトンへの変換を試みた。Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ  ＣＬＩＢ１２２株のゲノム配列は公開されている（ＧＣＦ＿０００００２５２５．２）。ゲノム配列情報を基にＵＲＡ３遺伝子を増幅する為のプライマーＩＦ−ｕｒａ３＿ｆ１（配列番号６３）とＩＦ−ｕｒａ３＿ｒ１（配列番号６４）を設計した。Ｙ．ｌｙｐｏｌｙｔｉｃａ  Ｗ２９（ＣＢＳ７５０４）株のゲノムＤＮＡを鋳型にプライマーＩＦ−ｕｒａ３＿ｆ１とＩＦ−ｕｒａ３＿ｒ１でＰＣＲ（Ｐｒｉｍｅ  ｓｔａｒ  ＧＸＬ（登録商標）、９８℃・１０ｓｅｃ．、５５℃・１５ｓｅｃ．、６８℃・６０ｓｅｃ．、３５ｃｙｃｌｅｓ）を行いＵＲＡ３遺伝子のＯＲＦ領域を含む遺伝子断片を得た。同様に、該菌株のゲノムＤＮＡを鋳型にプライマーＩＦ−Ｄｐｄｈ１＿ｆ１（配列番号６５）とＩＦ−Ｄｐｄｈ１＿ｒ１（配列番号６６）の組み合わせと、プライマーＩＦ−Ｄｐｄｈ１＿ｆ２（配列番号６７）とＩＦ−Ｄｐｄｈ１＿ｒ２（配列番号６８）の組み合わせでそれぞれＰＣＲ（Ｐｒｉｍｅ  ｓｔａｒ  ＧＸＬ（登録商標）、９８℃・１０ｓｅｃ．、５５℃・１５ｓｅｃ．、６８℃・６０ｓｅｃ．、３５ｃｙｃｌｅｓ）を行い、ＰＤＨ１遺伝子の上流領域（約１ｋｂ）とＰＤＨ１遺伝子の下流領域（約１ｋｂ）のそれぞれのＤＮＡ断片を得た。さらに、ｐＵＣ１８（ＴＡＫＡＲＡ製、製品番号３２１８）のプラスミドＤＮＡを鋳型にプライマーＲ−Ｍ１３−Ｍ４（配列番号６９）とＲ−Ｍ１３−ＲＶ（配列番号７０）でＰＣＲ（Ｐｒｉｍｅ  ｓｔａｒ  ＧＸＬ（登録商標）、９８℃・１０ｓｅｃ．、５５℃・１５ｓｅｃ．、６８℃・２４０ｓｅｃ．、３５ｃｙｃｌｅｓ）を行いプラスミドのＤＮＡ断片を得た。上記で得られた４つのＤＮＡ断片を混合し、Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ（登録商標）ＨＤ  ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ製、製品番号６３９６４８）で連結し、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９株に形質転換した。形質転換体を含む培養液を１００ｍｇ／Ｌカルベニシリン二ナトリウム（ナカライテスク製、製品番号０７１２９−１４）を含むＬＢ寒天培地に塗布し、得られた形質転換体に対してプライマーＭ１３＿Ｍ４（配列番号７１）とＭ１３−ＲＶ（配列番号７２）を用いてコロニーＰＣＲ（ＳａｐｐｈｉｒｅＡｍｐ  Ｆａｓｔ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ、ＴＡＫＡＲＡ製、製品番号ＲＲ３５０Ａ、９８℃・５ｓｅｃ．、５５℃・５ｓｅｃ．、６８℃・６０ｓｅｃ．、３５ｃｙｃｌｅｓ）を行うことでプラスミドへの目的遺伝子断片の挿入を確認し、得られたプラスミドをｐＵＣ−ΔＰＤＨ１：：ＵＲＡ３と命名した。ｐＵＣ−ΔＰＤＨ１：：ＵＲＡ３の構築に使用したプライマーの配列を表８に示した。【００７８】
＜Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａＷ２９ΔＵＲＡ３株の構築＞
次に、ｐＵＣ−ΔＰＤＨ１：：ＵＲＡ３のプラスミドＤＮＡを鋳型にプライマーＨＲ−Ｄｐｄｈ１＿ｆ１（配列番号７３）とＨＲ−Ｄｐｄｈ１＿ｒ１（配列番号７４）とでＰＣＲ（Ｐｒｉｍｅ  ｓｔａｒ  ＧＸＬ（登録商標）、９８℃・１０ｓｅｃ．、５５℃・１５ｓｅｃ．、６８℃・３６０ｓｅｃ．、３５ｃｙｃｌｅｓ）を行った。得られたＰＣＲ産物中の鋳型ＤＮＡを除くために、制限酵素ＤｐｎＩで消化し、Ｗｉｚａｒｄ（登録商標）ＳＶ  Ｇｅｌ  ａｎｄ  ＰＣＲ  Ｃｌｅａｎ−ＵＰ  ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ製、製品番号Ａ９２８１）で精製し、得られたＤＮＡ断片を形質転換に用いた。続けて、Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａＷ２９株のコンピテントセルを以下の手順に従って調製した。Ｗ２９株を３ｍＬのＹＰＤ培地（１０ｇ／Ｌ  Ｂａｃｔｏ  ｙｅａｓｔ  ｅｘｔｒａｃｔ、２０ｇ／Ｌ  Ｐｏｌｙｐｅｐｔｏｎｅ、２０ｇ／Ｌ  Ｇｌｕｃｏｓｅ）を用いて３０℃で一晩培養した後、培養液３０μＬを新しい３ｍＬ  ＹＰＤ培地に再度接種し、吸光度（６６０ｎｍ）が０．８付近になるまで培養を行った。得られた培養液から菌体を遠心操作にて回収し、コンピテントセルの調製後、約２μｇのｐＵＣ−ΔＰＤＨ１：：ＵＲＡ３と混合し形質転換を実施した。なお、コンピテントセルの調製および形質転換はＦｒｏｚｅｎ−ＥＺ  Ｙｅａｓｔ  Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ＩＩ  Ｋｉｔ（ＺＹＭＯ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ社、製品番号Ｔ２００１）を用いて、添付のプロトコールに従って行った。形質転換後の菌体溶液は、ＹＰＤ培地にて３０℃で一晩回復培養を行った後、菌体を回収し、ＳＣ＋５−ＦＯＡ寒天培地（２２．２ｇ／Ｌ  Ｇｌｕｃｏｓｅ、６．７ｇ／Ｌ  Ｙｅａｓｔ  ｎｉｔｒｏｇｅｎ  ｂａｓｅ、１．５ｇ／Ｌ  ５−ＦＯＡ、２０ｇ／Ｌ  Ｂａｃｔｏ  ａｇａｒ）に塗布し、５−ＦＯＡ耐性株を得た。得られた耐性株のウラシル要求性をＳＣ寒天培地およびＳＣ（−ｕｒａ）寒天培地（２２．２ｇ／Ｌ  Ｇｌｕｃｏｓｅ、６．７ｇ／Ｌ  Ｙｅａｓｔ  ｎｉｔｒｏｇｅｎ  ｂａｓｅ  ｗｉｔｈｏｕｔ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ、０．７７ｇ／Ｌ  −Ｕｒａ  ＤＯ  ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ、２０ｇ／Ｌ  Ｂａｃｔｏ  ａｇａｒ）で確認した。このウラシル要求性を示した株に対してプライマーＣＰ−Ｄｕｒａ３＿ｆ１（配列番号７５）とＣＰ−Ｄｕｒａ３＿ｒ１（配列番号７６）を用いてコロニーＰＣＲ（ＳａｐｐｈｉｒｅＡｍｐ  Ｆａｓｔ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ、ＴＡＫＡＲＡ製、製品番号ＲＲ３５０Ａ、９８℃・５ｓｅｃ．、５５℃・５ｓｅｃ．、７２℃・３０ｓｅｃ．、３５ｃｙｃｌｅｓ）でＵＲＡ３遺伝子の欠損を確認した。このようにして得られたウラシル要求性の株をＷ２９ΔＵＲＡ３株とした。Ｗ２９ΔＵＲＡ３株の構築に使用したプライマーの配列を表８に示した。【００７９】
【表８】
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【００８０】
＜ＡＯＸ３遺伝子の破壊用プラスミドｐＵＣ５７−ＡＯＸ３−ＨｙｇＲの構築＞
δ−デカラクトンの生産能を上げる目的で、Ａｃｙｌ−ＣｏＡ  ｏｘｉｄａｓｅ遺伝子の破壊を行った。Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａにはＡｃｙｌ−ＣｏＡ  ｏｘｉｄａｓｅをコードする遺伝子が６個存在する。その中でも、短鎖脂肪酸に対して高い基質親和性を示すＡｃｙｌ−ＣｏＡ  ｏｘｉｄａｓｅ  ３（以下ＡＯＸ３と略称する）を欠失することで、γ−デカラクトンの生産量が上がることが報告されている（非特許文献Ｗａｃｈｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，２０００，６６：１２３３−１２３６）。そこで、Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ  Ｗ２９ΔＵＲＡ３株から染色体上にコードされたＡＯＸ３遺伝子（ＹＡＬＩ０Ｄ２４７５０ｇ）の破壊を実施した。ＡＯＸ３の遺伝子配列を配列番号７７、アミノ酸配列を配列番号７８に示す。まず、同遺伝子を破壊する為のプラスミド、ｐＵＣ５７−ＡＯＸ３−ＨｙｇＲを以下の手順に従って構築した。ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ社が提供する人工遺伝子合成受託サービスを利用し、Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ由来ＵＲＡ３遺伝子の両端にＡＯＸ３遺伝子の前後１０００ｂｐの相同領域を持つ遺伝子断片をｐＵＣ５７にクローニングしたプラスミド、ｐＵＣ５７−ＡＯＸ３−ＵＲＡ３を化学合成した。ｐＵＣ５７−ＡＯＸ３−ＵＲＡ３の塩基配列を配列番号７９に示す。次に、同プラスミドのＵＲＡ３遺伝子をハイグロマイシン耐性遺伝子に置換した。前記と同様にＧｅｎＳｃｒｉｐｔ社が提供する人工遺伝子合成受託サービスを利用し、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ由来ＴＥＦ１プロモーター下流にＨｙｇｒｏｍｙｃｉｎ  Ｂ  ｐｈｏｓｐｈｏｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ（以下ＨｙｇＲと略称する）が連結した遺伝子断片をｐＵＣ５７にクローニングしたプラスミド、ｐＵＣ５７−ＴＥＦ−ＨｙｇＲを化学合成した。ｐＵＣ５７−ＴＥＦ−ＨｙｇＲの塩基配列を配列番号８０に示す。ｐＵＣ５７−ＡＯＸ３−ＵＲＡ３を鋳型にプライマーＡＯＸ３＿ｉｎｓｅｒｔ＿Ｆ（配列番号８１）とＡＯＸ３＿ｉｎｓｅｒｔ＿Ｒ（配列番号８２）でＰＣＲ（Ｐｒｉｍｅ  ｓｔａｒ  ＧＸＬ（登録商標）、９８℃・１０ｓｅｃ．、５５℃・５ｓｅｃ．、６８℃・３００ｓｅｃ．、３５ｃｙｃｌｅｓ）を行いプラスミドのＤＮＡ断片を得た。同様にｐＵＣ５７−ＴＥＦ−ＨｙｇＲを鋳型にプライマーＡＯＸ３＿ｂａｃｋｂｏｎｅ＿Ｆ（配列番号８３）とＡＯＸ３＿ｂａｃｋｂｏｎｅ＿Ｒ（配列番号８４）でＰＣＲ（Ｐｒｉｍｅ  ｓｔａｒ  ＧＸＬ（登録商標）、９８℃・１０ｓｅｃ．、５５℃・５ｓｅｃ．、６８℃・３００ｓｅｃ．、３５ｃｙｃｌｅｓ）を行いＴＥＦプロモーターとハイグロマイシン耐性遺伝子が連結したＤＮＡ断片を得た。上記、２つのＤＮＡ断片は、アガロースゲル電気泳動後、該当のバンドをゲルより切り出し、Ｗｉｚａｒｄ（登録商標）ＳＶ  Ｇｅｌ  ａｎｄ  ＰＣＲ  Ｃｌｅａｎ−ｕｐ  ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用い精製した。得られた２つの精製ＤＮＡ断片を混合し、Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ（登録商標）ＨＤ  ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ製、製品番号６３９６４８）で連結し、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＪＭ１０９株に形質転換した。形質転換体を含む培養液を１００ｍｇ／Ｌカルベニシリン二ナトリウム（ナカライ���スク製、製品番号０７１２９−１４）を含むＬＢ寒天培地に塗布し、得られた形質転換体に対してプライマーｐＵＣ５７＿Ｆ（配列番号８５）とｐＵＣ５７＿Ｒ（配列番号８６）を用いてコロニーＰＣＲ（ＳａｐｐｈｉｒｅＡｍｐ  Ｆａｓｔ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ、ＴＡＫＡＲＡ製、製品番号ＲＲ３５０Ａ、９８℃・５ｓｅｃ．、５５℃・５ｓｅｃ．、７２℃・３０ｓｅｃ．、３５ｃｙｃｌｅｓ）を行うことでプラスミドへの目的遺伝子断片の挿入を確認し、得られたプラスミドをｐＵＣ５７−ＡＯＸ３−ＨｙｇＲと命名した。ｐＵＣ５７−ＡＯＸ３−ＨｙｇＲの塩基配列を配列番号８７に示す。ｐＵＣ５７−ＡＯＸ３−ＨｙｇＲの構築に使用したプライマーの配列を表９に示した。【００８１】
【表９】
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【００８２】
＜Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ  Ｗ２９ΔＵＲＡ３ΔＡＯＸ３株の構築＞
次に、ｐＵＣ５７−ＡＯＸ３−ＨｙｇＲのプラスミドＤＮＡを鋳型にプライマーＡＯＸ３＿ｄｅｌ＿Ｆ（配列番号８８）とＡＯＸ３＿ｄｅｌ＿Ｒ（配列番号８９）とでＰＣＲ（Ｐｒｉｍｅ  ｓｔａｒ  ＧＸＬ（登録商標）、９８℃・１０ｓｅｃ．、５５℃・５ｓｅｃ．、７２℃・２４０ｓｅｃ．、４０ｃｙｃｌｅｓ）を行った。得られたＰＣＲ産物中の鋳型ＤＮＡを除くために、制限酵素ＤｐｎＩで消化し、Ｗｉｚａｒｄ（登録商標）ＳＶ  Ｇｅｌ  ａｎｄ  ＰＣＲ  Ｃｌｅａｎ−ＵＰ  ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ製、製品番号Ａ９２８１）で精製し、得られたＤＮＡ断片を形質転換に用いた。続けて、Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ  Ｗ２９ΔＵＲＡ３株（以下、Ｗ２９ΔＵＲＡ３株と略称）のコンピテントセルを以下の手順に従って調製した。Ｗ２９ΔＵＲＡ３株を３ｍＬのＹＰＤ培地（１０ｇ／Ｌ  Ｂａｃｔｏ  ｙｅａｓｔ  ｅｘｔｒａｃｔ、２０ｇ／Ｌ  Ｐｏｌｙｐｅｐｔｏｎｅ、２０ｇ／Ｌ  Ｇｌｕｃｏｓｅ）を用いて３０℃で一晩培養した後、培養液３０μＬを新しい３ｍＬ  ＹＰＤ培地に再度接種し、吸光度（６６０ｎｍ）が０．８付近になるまで培養を行った。得られた培養液から菌体を遠心操作にて回収し、コンピテントセルの調製後、約１μｇの精製したＤＮＡ断片と混合し形質転換を実施した。なお、コンピテントセルの調製および形質転換はＦｒｏｚｅｎ−ＥＺ  Ｙｅａｓｔ  Ｔｒａｎｓｆｏｍａｔｉｏｎ  ＩＩ  Ｋｉｔ（ＺＹＭＯ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ社、製品番号Ｔ２００１）を用いて、添付のプロトコールに従って行った。形質転換後の菌体溶液は、ＹＰＤ培地にて３０℃で一晩回復培養を行った後、菌体を回収し、３００ｍｇ／ＬハイグロマイシンＢ（ナカライテスク製、製品番号０７２９６−２４）を含むＹＰＤ寒天培地に塗布し、３０℃で２日間培養した。得られた形質転換体に対して、プライマーＡＯＸ３＿ｃｈｅｃｋ＿Ｆ（配列番号９０）とＡＯＸ３＿ｃｈｅｃｋ＿Ｒ（配列番号９１）を用いてコロニーＰＣＲ（ＫＯＤ  ＦＸ（登録商標）Ｎｅｏ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ、９８℃・１０ｓｅｃ．、５５℃・３０ｓｅｃ．、６８℃・１２０ｓｅｃ．、４０ｃｙｃｌｅｓ）を行い、ＡＯＸ３遺伝子の破壊を確認した。Ｗ２９ΔＵＲＡ３ΔＡＯＸ３株の構築に使用したプライマーの配列を表１０に示した。【００８３】
【表１０】
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【００８４】
＜Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ  Ｗ２９ΔＵＲＡ３ΔＡＯＸ３株を利用した１３−ＨＯＤからのδ−デカラクトン生産試験＞
上記で得られたＷ２９ΔＵＲＡ３ΔＡＯＸ３株を、ＹＰＤ培地１０ｍＬを張り込んだ試験管に播種し、３０℃で２０時間、振盪培養し、前培養液Ｂを得た。前培養液Ｂ  ７．５ｍＬを、誘導培地５０ｍＬを張り込んだ５００ｍＬフラスコに接種し、３０℃で２０時間、１２０ｒｐｍの条件で振盪培養した。誘導培地の組成と調製法を表１１に示す。得られた培養液を遠心分離（１０００Ｇ、５分、４℃）することで菌体を回収した。その後、菌体をリン酸緩衝液（１３７ｍＭ  ＮａＣｌ、８．１ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４、２．６８ｍＭ  ＫＣｌ、１．４７ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４）にて２回洗浄したものを、変換反応に用いた。【００８５】
【表１１】
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【００８６】
Ｓｔｏｃｋ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ  Ｂは以下の手順で調製した。０．１ｇのＹｅａｓｔ  ｅｘｔｒａｃｔ、２．１ｇのＫＨ２ＰＯ４、４．５１ｇのＫ２ＨＰＯ４、０．１ｇのＮａＣｌ、０．２ｇのＭｇＳＯ４を純水に溶解し、９２９ｍＬにメスアップした。その後、１２０℃、１５ｍｉｎ．オートクレイブにて滅菌した。また、１０ｇ／Ｌ  ＦｅＳＯ４、５０ｍｇ／Ｌ  ＺｎＣｌ２、１５６ｍｇ／Ｌ  ＣｕＳＯ４は、各濃度の溶液を調製後、０．２２μｍのフィルターで滅菌濾過した物を利用した。放冷したＳｔｏｃｋ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ  Ｂ  ９２９ｍＬに１ｍＬ  ＦｅＳＯ４、１０ｍＬ  ＺｎＣｌ２、１０ｍＬ  ＣｕＳＯ４、５０ｍＬ  Ｇｌｕｃｏｓｅを添加した。その後、オレイン酸７ｇを添加したものを誘導培地として使用した。【００８７】
リン酸緩衝液は以下の手順で調製した。８０ｇのＮａＣｌ、２ｇのＫＣｌ、２２ｇのＮａ２ＨＰＯ４・７Ｈ２Ｏ、２ｇのＫＨ２ＰＯ４を純水に溶解し、１Ｌにメスアップした後、１２０℃、１５ｍｉｎ．オートクレイブにて滅菌し、１０倍濃度ストック溶液とした。そのストック溶液を１０倍希釈してリン酸緩衝液として使用した。【００８８】
１３−ＨＯＤを含む培養液は、前記に記載した方法に準じて各種１３−ＬＡＨを発現させた菌株で培養した培養液を使用した。本培養液に対して、乾燥菌体重量あたり約４．２ｇＤＣＷ（Ｄｒｙ  Ｃｅｌｌ  Ｗｅｉｇｈｔ）／ＬとなるようにＷ２９ΔＵＲＡ３ΔＡＯＸ３株を稙菌し、３０℃、１２０ｒｐｍの条件で６時間の振盪培養を実施した。なお、ＤＣＷを計算する際は、ＯＤ６００の値に０．１９７を掛けた値を用いた。反応液中のδ−デカラクトンは以下のように分析した。変換反応後の培養液０．２ｍＬを１．５ｍＬキャップロック付きチューブに入れ、２Ｎ  ＨＣｌ溶液２０μＬと酢酸エチル０．６ｍＬを加え、ボルテックスにて１０秒間混合した。これを１５，０００ｒｐｍ、２５℃、１０分間の条件にて遠心分離した。上層の酢酸エチル層２００μＬを回収し、以下の条件でＧＣ−ＦＩＤ分析を行った。各種１３−ＬＡＨを発現させた菌株で培養した培養液から生成したδ−デカラクトン量を表１２に示す。【００８９】
＜δ−デカラクトンのＧＣ−ＦＩＤ分析条件＞
装置：ＧＣ―２０１０Ｐｌｕｓ（島津製作所）、カラム：ＤＢ−１ｍｓ、内径０．２５ｍｍ、長さ３０ｍ、膜厚０．２５μｍ（部品番号１２２−０１３２）、注入量：５μＬ、注入法：スプリット２０：１、注入口：２３０℃、カラム温度プログラム：９０℃で開始後２５℃／ｍｉｎで１６０℃まで昇温、その後５℃／ｍｉｎで１８０℃まで昇温、その後５０℃／ｍｉｎで２８０℃まで昇温（２．５分間維持）、キャリアガス：ヘリウム、カラム流量：２．０ｍＬ・ｍｉｎ、検出器：温度２５０℃、取り込み周期２５Ｈｚ、メークアップ流量（Ａｉｒ）３０ｍＬ・ｍｉｎ【００９０】
【表１２】
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【００９１】
ＧＣ−ＦＩＤの解析結果より、各種１３−ＬＡＨを発現した株から得られる培養液の全てにおいて、δ−デカラクトンの生産が確認できた。以上より、本検討で得られた１３−ＨＯＤを利用してδ−デカラクトンへの変換が可能であることが示された。
【産業上の利用可能性】
【００９２】
本発明は、δ−デカラクトンの中間体として利用可能な１３−ヒドロキシ−９（Ｚ）−オクタデセン酸の製造のために、さらにδ−デカラクトンの製造のために有用である。
【配列表フリーテキスト】
【００９３】
配列番号１は、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ由来１３−ＬＡＨのアミノ酸配列を示す。
配列番号２は、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｍｙｌｏｖｏｒｕｓ由来１３−ＬＡＨのアミノ酸配列を示す。
配列番号３は、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｈｅｌｖｅｔｉｃｕｓ由来１３−ＬＡＨのアミノ酸配列を示す。
配列番号４は、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ由来１３−ＬＡＨのアミノ酸配列を示す。
配列番号５は、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｒｉｓｐａｔｕｓ由来１３−ＬＡＨのアミノ酸配列を示す。
配列番号６は、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｋｅｆｉｒａｎｏｆａｃｉｅｎｓ由来１３−ＬＡＨのアミノ酸配列を示す。
配列番号７は、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌｉｓ由来１３−ＬＡＨのアミノ酸配列を示す。
配列番号８は、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｈａｍｓｔｅｒｉ由来１３−ＬＡＨのアミノ酸配列を示す。
配列番号９は、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｇａｓｓｅｒｉ由来１３−ＬＡＨのアミノ酸配列を示す。
配列番号１０は、Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ  ｃｌａｕｓｓｅｎｉｉ由来１３−ＬＡＨのアミノ酸配列を示す。
配列番号１１は、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｕｍｉｎｉｓ由来１３−ＬＡＨのアミノ酸配列を示す。
配列番号１２は、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｉｎｆａｎｔａｒｉｕｓ由来１３−ＬＡＨのアミノ酸配列を示す。
配列番号１３は、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｍｕｔａｎｓ由来１３−ＬＡＨのアミノ酸配列を示す。
配列番号１４は、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｑｕｉｎｕｓ由来１３−ＬＡＨのアミノ酸配列を示す。
配列番号１５は、化学合成したＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ由来１３−ＬＡＨ遺伝子（Ｌａｃｉ＿１３−ＬＡＨ）の塩基配列を示す。
配列番号１６は、化学合成したＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｍｙｌｏｖｏｒｕｓ由来１３−ＬＡＨ遺伝子（Ｌａｍｙ＿１３−ＬＡＨ）の塩基配列を示す。
配列番号１７は、化学合成したＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｈｅｌｖｅｔｉｃｕｓ由来１３−ＬＡＨ遺伝子（Ｌｈｅｌ＿１３−ＬＡＨ）の塩基配列を示す。
配列番号１８は、化学合成したＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ由来１３−ＬＡＨ遺伝子（Ｌｇａｌ＿１３−ＬＡＨ）の塩基配列を示す。
配列番号１９は、化学合成したＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｒｉｓｐａｔｕｓ由来１３−ＬＡＨ遺伝子（Ｌｃｒｉ＿１３−ＬＡＨ）の塩基配列を示す。
配列番号２０は、化学合成したＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｋｅｆｉｒａｎｏｆａｃｉｅｎｓ由来１３−ＬＡＨ遺伝子（Ｌｋｅｆ＿１３−ＬＡＨ）の塩基配列を示す。
配列番号２１は、化学合成したＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌｉｓ由来１３−ＬＡＨ遺伝子（Ｌｉｎｔ＿１３−ＬＡＨ）の塩基配列を示す。
配列番号２２は、化学合成したＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｈａｍｓｔｅｒｉ由来１３−ＬＡＨ遺伝子（Ｌｈａｍ＿１３−ＬＡＨ）の塩基配列を示す。
配列番号２３は、化学合成したＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｇａｓｓｅｒｉ由来１３−ＬＡＨ遺伝子（Ｌｇａｓ＿１３−ＬＡＨ）の塩基配列を示す。
配列番号２４は、化学合成したＰｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ  ｃｌａｕｓｓｅｎｉｉ由来１３−ＬＡＨ遺伝子（Ｐｃｌａ＿１３−ＬＡＨ）の塩基配列を示す。
配列番号２５は、化学合成したＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｕｍｉｎｉｓ由来１３−ＬＡＨ遺伝子（Ｌｒｕｍ＿１３−ＬＡＨ）の塩基配列を示す。
配列番号２６は、化学合成したＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｉｎｆａｎｔａｒｉｕｓ由来１３−ＬＡＨ遺伝子（Ｓｉｎｆ＿１３−ＬＡＨ）の塩基配列を示す。
配列番号２７は、化学合成したＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｍｕｔａｎｓ由来１３−ＬＡＨ遺伝子（Ｓｍｕｔ＿１３−ＬＡＨ）の塩基配列を示す。
配列番号２８は、化学合成したＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｑｕｉｎｕｓ由来１３−ＬＡＨ遺伝子（Ｓｅｑｕ＿１３−ＬＡＨ）の塩基配列を示す。
配列番号２９〜３２は、ｐＥＴ−２２ｂ（＋）ＫｍＲの構築に使用したプライマーの塩基配列を示す。
配列番号３３〜６２は、１３−ＬＡＨ発現用プラスミドの構築に使用したプライマーの塩基配列を示す。
配列番号６３〜７６は、Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａＷ２９ΔＵＲＡ３株の構築に使用したプライマーの塩基配列を示す。
配列番号７７は、ＡＯＸ３の塩基配列を示す。
配列番号７８は、ＡＯＸ３のアミノ酸配列を示す。
配列番号７９は、ｐＵＣ５７−ＡＯＸ３−Ｕｒａの塩基配列を示す。
配列番号８０は、ｐＵＣ５７−ＴＥＦ−ＨｙｇＲの塩基配列を示す。
配列番号８１〜８６は、ｐＵＣ５７−ＡＯＸ３−ＨｙｇＲの構築に使用したプライマーの塩基配列を示す。
配列番号８７は、ｐＵＣ５７−ＡＯＸ３−ＨｙｇＲの塩基配列を示す。
配列番号８８〜９１は、Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ  Ｗ２９ΔＵＲＡ３ΔＡＯＸ３株の構築に使用したプライマーの塩基配列を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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