(57)【要約】  本発明は、配列番号４４で表されるヌクレオチド配列からなる、タウmRNA前駆体のエクソン10内の領域中の、連続する少なくとも10個のヌクレオチドからなる配列と相補的なヌクレオチド配列を含むアンチセンスオリゴヌクレオチドであって、少なくとも１個の2'−O, 4'−C−エチレン架橋核酸を含む、タウエクソン10スキッピング亢進性のアンチセンスオリゴヌクレオチドを提供する。また、本発明は、配列番号４５で表されるヌクレオチド配列からなる、タウmRNA前駆体のイントロン10内の領域中の、連続する少なくとも10個のヌクレオチドからなる配列と相補的なヌクレオチド配列を含むアンチセンスオリゴヌクレオチドであって、少なくとも１個の2'−O, 4'−C−エチレン架橋核酸を含む、タウエクソン10スキッピング抑制性のアンチセンスオリゴヌクレオチドを提供する。
2020009151.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号４４で表されるヌクレオチド配列からなる、タウmRNA前駆体のエクソン10内の領域中の、連続する少なくとも10個のヌクレオチドからなる配列と相補的なヌクレオチド配列を含むアンチセンスオリゴヌクレオチドであって、少なくとも１個の2'−O, 4'−C−エチレン架橋核酸を含む、タウエクソン10スキッピング亢進性のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項２】
ヌクレオチド長が10〜30ヌクレオチドである、請求項１に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項３】
配列番号４４で表されるヌクレオチド配列中ヌクレオチド番号４〜３８の領域中の、連続する少なくとも15個のヌクレオチドからなる配列と相補的なヌクレオチド配列を含む、請求項１又は２に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項４】
配列番号２〜２１、２７〜３１及び３４〜３７のいずれかで表されるヌクレオチド配列（但し、チミンはウラシルであってもよい）を含む、請求項１又は２に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項５】
配列番号３〜２０、２９、３０、３６及び３７のいずれかで表されるヌクレオチド配列（但し、チミンはウラシルであってもよい）を含む、請求項３に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項６】
ピリミジンヌクレオチドが2'−O, 4'−C−エチレン架橋核酸である、請求項１〜５のいずれか一項に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項７】
少なくとも１個のリン酸ジエステル結合がホスホロチオエート化されている、請求項１〜６のいずれか一項に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれか一項に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む、タウエクソン10スキッピング促進剤。
【請求項９】
請求項１〜７のいずれか一項に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む、4R-タウの蓄積を伴うタウオパチーの治療又は予防剤。
【請求項１０】
タウオパチーが前頭側頭型認知症、前頭側頭葉変性症、大脳皮質基底核変性症、進行性核上性麻痺、アルツハイマー病、神経原線維変化型老年期認知症、慢性外傷性脳症又は嗜銀顆粒性認知症である、請求項９に記載の剤。
【請求項１１】
配列番号４５で表されるヌクレオチド配列からなる、タウmRNA前駆体のイントロン10内の領域中の、連続する少なくとも10個のヌクレオチドからなる配列と相補的なヌクレオチド配列を含むアンチセンスオリゴヌクレオチドであって、少なくとも１個の2'−O, 4'−C−エチレン架橋核酸を含む、タウエクソン10スキッピング抑制性のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項１２】
ヌクレオチド長が10〜30ヌクレオチドである、請求項１１に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項１３】
配列番号４５で表されるヌクレオチド配列中ヌクレオチド番号７〜２７の領域中の、連続する少なくとも15個のヌクレオチドからなる配列と相補的なヌクレオチド配列を含む、請求項１１又は１２に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項１４】
配列番号２２〜２４、３２、３３、３８及び３９のいずれかで表されるヌクレオチド配列（但し、チミンはウラシルであってもよい）を含む、請求項１１又は１２に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項１５】
配列番号２２又は２３で表されるヌクレオチド配列（但し、チミンはウラシルであってもよい）を含む、請求項１４に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項１６】
ピリミジンヌクレオチドが2'−O, 4'−C−エチレン架橋核酸である、請求項１１〜１５のいずれか一項に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項１７】
少なくとも１個のリン酸ジエステル結合がホスホロチオエート化されている、請求項１１〜１６のいずれか一項に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項１８】
請求項１１〜１７のいずれか一項に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む、タウエクソン10スキッピング抑制剤。
【請求項１９】
請求項１１〜１７のいずれか一項に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む、3R-タウの蓄積を伴うタウオパチーの治療又は予防剤。
【請求項２０】
タウオパチーがピック病である、請求項１９に記載の剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Microtubule-associated protein tau（以下、「タウ」又は「MAPT」と略記する場合がある）のmRNA前駆体のエクソン10のスプライシングを制御するアンチセンスオリゴヌクレオチド（以下、「ASO」と略記する場合がある）及びその用途に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、医療および科学技術の進歩により、特に先進国における平均寿命は大きく延長された。しかし、それに伴い、過去には問題にならなかった脳の老化によって発生する様々な機能低下、疾患、病態が大きな社会問題となってきている。それらの中でも、認知症は患者本人の生活の質を大きく低下させ、また、介護する家族への負担も非常に大きい。
認知症による症状は、記憶障害、視覚障害、言語障害、問題行動、睡眠障害、うつ症状等、多岐にわたる。このような認知症をきたす脳の変性疾患としては、アルツハイマー病、前頭側頭型認知症（frontotemporal dementia, FTD)、レビー小体型認知症、脳血管性認知症、進行性核上性麻痺（progressive supranuclear palsy, PSP)、大脳皮質基底核変性症（corticobasal degeneration, CBD）等が知られており、ほとんどは家族歴が明らかではない孤発性の症例である。【０００３】
FTDによる認知症は、特に欧米では、アルツハイマー病に次いで多い進行性認知症である。FTDの主な特徴は、前頭葉と側頭葉が変性部位であることであり、その組織病理的所見は、前頭葉変性型、ピック病型、運動ニューロン病型の３つである。症状としては、人格障害および社会的行動の異常といった高次脳機能障害に起因する行動異常が見られる。しかし、FTDの病態は非常に複雑であり、これまで診断法、治療法に関する研究が十分に進められてこなかったため、根本的な治療法は未だ確立されていない。【０００４】
FTDは病理学的にアルツハイマー病、PSP、CBDと同様の特徴を有する。即ち、疾患部位に神経原線維変化というリン酸化タウの蓄積を、神経細胞の細胞質、神経突起などに認めるものであり、これらの疾患をタウオパチーと総称する。タウは微小管に結合するタンパク質であるが、選択的スプライシングにより6つのアイソフォームが存在することがわかっており、C末端側に存在する微小管結合領域の繰り返しの数により、3-repeat タウ（3R-タウ）と4-repeat タウ（4R-タウ）とに大別される。病理学的に疾患によってこれらのアイソフォームの比率が異なることが知られており、アルツハイマー病では多くが1:1であるのに対して、FTD、PSP、CBDでは4R-タウが優位であることがわかっている。【０００５】
一方で、FTDは筋萎縮性側索硬化症（ALS）と類似した疾患スペクトラムを有することが知られている。本発明者らは、これらの疾患に共通の遺伝学的・病理学的因子であるFUSについて、機能喪失の面から研究を進めてきた。その結果、FUSとその核内結合因子であるSFPQが、ともに4R-タウ/3R-タウアイソフォーム比率を増加させることが、病態の中核であることを見出し、この比率を正常化することで病態が劇的に改善することを明らかにした。この病態は、FTD、PSP、CBD剖検脳で広く確認された（非特許文献１）。従って、タウ全体発現量を保ちつつ両アイソフォームの比率を正常化するアプローチが、タウオパチーを治療する上で重要である。【０００６】
人工核酸であるASOは、核内でRNAとワトソン-クリック塩基対を形成し、従来の低分子化合物では得られない、特異的なRNAの発現調節を可能とする。化学修飾によりRNA結合性、ヌクレアーゼ抵抗性、薬物動態、薬理効果が増強されている。ASOは神経細胞に効率的に取込まれ、長い中枢神経内半減期を有する。また免疫反応の誘導が少なく、生体忍容性が高く改良されており、個体臓器に様々な時期、病期に投与可能であり、ヒトでの長期薬理作用が示されている。ASO作用機序の一つに、スプライシングシス配列をマスク、あるいは高次構造の形成を阻害することにより、トランス因子のmRNA前駆体への結合を阻害することなどを通じて、標的遺伝子のスプライシングを制御しRNAスプライスアイソフォームの発現レベルを調節することが知られている。【０００７】
米国Ionis社は、タウの選択的スプライシングを制御する能力（以下、「タウスプライシング制御能」ともいう）を有する2'-O-methoxyethyl（MOE）修飾ASOを開発している（特許文献１、非特許文献２）。また、MOE修飾ASOを用いてのスプライシング調節を介した疾患モデル細胞、動物作製法に関する報告がある（特許文献２、非特許文献３、４）。しかし、従来のタウ標的MOE修飾ASOは、タウスプライシング制御力や生体内安定性の面で効果が不十分であり、治療効果を奏するためには高用量投与を必要とすると考えられるが、ASOケミストリー由来の有害事象を惹起するおそれがある。また、FTDなどタウオパチーに対するASOを用いた病態治療の前臨床試験の報告は、これまでなされていない。
そのため、より強力かつ安定性の高いタウmRNA前駆体に対するASOの開発が望まれている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】国際公開第2016/019063号公報
【特許文献２】米国特許出願第2014/0298496号公開明細書
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Ishigaki, S. et al., Cell Rep. 2017 Jan 31;18(5):1118-1131.
【非特許文献２】Schoch, K.M. et al., Neuron. 2016 Jun 1;90(5):941-7.
【非特許文献３】Sahashi, K. et al., Genes Dev. 2012 Aug 15;26(16):1874-84.
【非特許文献４】Sahashi, K. et al., EMBO Mol Med. 2013 Oct;5(10):1586-601.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
従って、本発明の目的は、従来公知のMOE修飾ASOよりもタウスプライシング制御力及び／又は生体内安定性に優れたタウmRNA前駆体に対するASOを提供することであり、当該ASOを用いて4R-タウ/3R-タウアイソフォーム比率を調節することにより、FTDをはじめとするタウオパチーを治療及び／又は予防する新規手段を提供することである。
また、本発明の別の目的は、上記タウmRNA前駆体に対するASOを用いて、新規なタウオパチーの細胞及び動物モデルを提供し、該モデルを用いたタウオパチー治療薬の探索手段を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは、上記の目的を達成すべく鋭意検討を重ねた結果、タウmRNA前駆体のエクソン10内の特定の領域に対して相補的なASOを設計し（図１参照）、その構成ヌクレオチドの一部を2'-O,4'-C-エチレン架橋核酸（Ethylene-bridged nucleic acid, ENA(登録商標)）としたものを培養細胞に導入したところ、これらのENA修飾ASOは、各々同一のヌクレオチド配列を有するMOE修飾ASOよりも、顕著に優れたタウエクソン10スキッピング効果を有することを見出した（図２参照）。該ENA修飾ASOを、マウスに側脳室内ボーラス投与したところ、中枢神経内でのタウエクソン10スキッピング効果が少なくとも12週間にわたり持続するとともに、良好な生体忍容性を示すことが確認された（図８参照）。さらに、タウ遺伝子をヒトMAPTに置換したヒトタウ化マウスにFUSをノックダウンした孤発性FTDモデルマウスの中枢神経においても、該ENA修飾ASOは優れたタウエクソン10スキッピング効果を示し、タウの発現を調節し、該マウスの認知症様の情動異常行動を抑制することを見出した（図１１、１３参照）。
一方で、タウmRNA前駆体のエクソン10近傍のイントロン10内の特定の領域に対して相補的なASOを設計し、その構成ヌクレオチドの一部を同様にENA修飾したものを培養細胞に導入したところ、4R-タウ/3R-タウアイソフォーム比率の上昇を認め、これらのENA修飾ASOはタウエクソン10インクルージョン効果を有することが明らかとなった（図３参照）。
本発明者らは、これらの知見に基づいて、タウmRNA前駆体のエクソン10内又はこれに隣接するイントロン10内の特定の領域を標的配列とするENA修飾ASOは、高いタウスプライシング制御力と生体内安定性とを併せ持つことから、4R-タウ又は3R-タウの異常蓄積を伴うタウオパチーの治療及び／又は予防薬となり得、また、該タウオパチーの新規な細胞及び／又は動物モデルの作製、並びに該モデルを用いたタウオパチーの治療及び／又は予防薬候補のスクリーニングに利用し得るものと結論し、本発明を完成するに至った。【００１２】
すなわち、本発明は以下のものを提供する。
［１］配列番号４４で表されるヌクレオチド配列からなる、タウmRNA前駆体のエクソン10内の領域中の、連続する少なくとも10個のヌクレオチドからなる配列と相補的なヌクレオチド配列を含むアンチセンスオリゴヌクレオチドであって、少なくとも１個の2'−O, 4'−C−エチレン架橋核酸を含む、タウエクソン10スキッピング亢進性のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
［２］ヌクレオチド長が10〜30ヌクレオチドである、［１］に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
［３］配列番号４４で表されるヌクレオチド配列中ヌクレオチド番号４〜３８の領域中の、連続する少なくとも15個のヌクレオチドからなる配列と相補的なヌクレオチド配列を含む、［１］又は［２］に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
［４］配列番号２〜２１、２７〜３１及び３４〜３７のいずれかで表されるヌクレオチド配列（但し、チミンはウラシルであってもよい）を含む、［１］又は［２］に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
［５］配列番号３〜２０、２９、３０、３６及び３７のいずれかで表されるヌクレオチド配列（但し、チミンはウラシルであってもよい）を含む、［３］に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
［６］ピリミジンヌクレオチドが2'−O, 4'−C−エチレン架橋核酸である、［１］〜［５］のいずれかに記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
［７］少なくとも１個のリン酸ジエステル結合がホスホロチオエート化されている、［１］〜［６］のいずれかに記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
［８］［１］〜［７］のいずれかに記載のアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む、タウエクソン10スキッピング促進剤。
［９］［１］〜［７］のいずれかに記載のアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む、4R-タウの蓄積を伴うタウオパチーの治療又は予防剤。
［１０］タウオパチーが前頭側頭型認知症、前頭側頭葉変性症、大脳皮質基底核変性症、進行性核上性麻痺、アルツハイマー病、神経原線維変化型老年期認知症、慢性外傷性脳症又は嗜銀顆粒性認知症である、［９］に記載の剤。
［１１］［１］〜［７］のいずれかに記載のアンチセンスオリゴヌクレオチドを哺乳動物細胞又は哺乳動物に取り込ませることを含む、3R-タウの蓄積を伴うタウオパチーの細胞又は動物モデルの作製方法。
［１２］［１］〜［７］のいずれかに記載のアンチセンスオリゴヌクレオチドを用いて作製される、3R-タウの蓄積を伴うタウオパチーの細胞又は動物モデル。
［１３］3R-タウの蓄積を伴うタウオパチーの治療又は予防薬のスクリーニング方法であって、
（１）［１２］に記載のモデルに被検物質を曝露させる工程、
（２）該モデルにおける該タウオパチーの１以上の表現型を検定する工程、
（３）被検物質を曝露していない該モデルとの間で該表現型を比較する工程、及び
（４）該表現型を改善した被検物質を該タウオパチーの治療又は予防薬の候補として選択する工程を含む、方法。
［１４］配列番号４５で表されるヌクレオチド配列からなる、タウmRNA前駆体のイントロン10内の領域中の、連続する少なくとも10個のヌクレオチドからなる配列と相補的なヌクレオチド配列を含むアンチセンスオリゴヌクレオチドであって、少なくとも１個の2'−O,4'−C−エチレン架橋核酸を含む、タウエクソン10スキッピング抑制性のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
［１５］ヌクレオチド長が10〜30ヌクレオチドである、［１４］に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
［１６］配列番号４５で表されるヌクレオチド配列中ヌクレオチド番号７〜２７の領域中の、連続する少なくとも15個のヌクレオチドからなる配列と相補的なヌクレオチド配列を含む、［１４］又は［１５］に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
［１７］配列番号２２〜２４、３２、３３、３８及び３９のいずれかで表されるヌクレオチド配列（但し、チミンはウラシルであってもよい）を含む、［１４］又は［１５］に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
［１８］配列番号２２又は２３で表されるヌクレオチド配列（但し、チミンはウラシルであってもよい）を含む、［１６］に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
［１９］ピリミジンヌクレオチドが2'−O, 4'−C−エチレン架橋核酸である、［１４］〜［１８］のいずれかに記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
［２０］少なくとも１個のリン酸ジエステル結合がホスホロチオエート化されている、［１４］〜［１９］のいずれかに記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
［２１］［１４］〜［２０］のいずれかに記載のアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む、タウエクソン10スキッピング抑制剤。
［２２］［１４］〜［２０］のいずれかに記載のアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む、3R-タウの蓄積を伴うタウオパチーの治療又は予防剤。
［２３］タウオパチーがピック病である、［２２］に記載の剤。
［２４］［１４］〜［２０］のいずれかに記載のアンチセンスオリゴヌクレオチドを哺乳動物細胞又は哺乳動物に取り込ませることを含む、4R-タウの蓄積を伴うタウオパチーの細胞又は動物モデルの作製方法。
［２５］［１４］〜［２０］のいずれかに記載のアンチセンスオリゴヌクレオチドを用いて作製される、4R-タウの蓄積を伴うタウオパチーの細胞又は動物モデル。
［２６］4R-タウの蓄積を伴うタウオパチーの治療又は予防薬のスクリーニング方法であって、
（１）［２５］に記載のモデルに被検物質を曝露させる工程、
（２）該モデルにおける該タウオパチーの１以上の表現型を検定する工程、
（３）被検物質を曝露していない該モデルとの間で該表現型を比較する工程、及び
（４）該表現型を改善した被検物質を該タウオパチーの治療又は予防薬の候補として選択する工程を含む、方法。
【発明の効果】
【００１３】
本発明のENA修飾ASOによれば、強力かつ安定にタウエクソン10の選択的スプライシングを制御することができ、投与量、投与回数、さらには製造コストを低減し、かつ侵襲性、有害事象の発現を抑制しつつ、4R-タウ/3R-タウアイソフォーム比率を正常化して、あるいは毒性の高い4-タウの蓄積を抑制して、孤発性FTDを含めたタウオパチーの治療及び予防が可能となる。また、本発明のENA修飾ASOを用いての、タウオパチーの細胞及び動物モデルの作製が可能であり、これら疾患の病態の解明や治療薬のスクリーニングに有用である。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】39種のENA修飾ASO（NK-01〜39）のタウ遺伝子上の標的領域を示す図である。タウ遺伝子の四角で囲った部分がエクソン10である。
【図２】4種のENA修飾ASO（NK-05、12、16、18）の、MOE修飾ASOに対する、HEK293細胞内因性タウエクソン10のスキッピング効力の優位性を示す図である。図中、Nはトランスフェクション処理なし、Mはモックトランスフェクション、NK-41はコントロールASOをそれぞれ示す。
【図３】17種のENA修飾ASO（NK-01、02、05、12、16、18、20〜26、40〜43）のHEK293細胞内因性タウエクソン10のスキッピング又はインクルージョン効果を示す図である。Nはトランスフェクション処理なし、Mはモックトランスフェクションをそれぞれ示す。
【図４】18種のENA修飾ASO（NK-03〜20）のHEK293細胞内因性タウエクソン10のスキッピング効果を示す図である。Nはトランスフェクション処理なし、Mはモックトランスフェクション、NK-41はコントロールASOをそれぞれ示す。
【図５】11種のENA修飾ASO（NK-02、05、18、27〜30、34〜37）のHEK293細胞内因性タウエクソン10のスキッピング効果を示す図である。Nはトランスフェクション処理なし、Mはモックトランスフェクション、NK-41はコントロールASOをそれぞれ示す。
【図６】2種のENA修飾ASO（NK-02、05）の野生型新生仔マウスへの側脳室内ボーラス投与による中枢神経内マウスタウエクソン10のスキッピング効果を示す図である。NSは生理食塩水投与、NK-41はコントロールASOをそれぞれ示す。
【図７−１】2種のENA修飾ASO（NK-02、05）の野生型成体マウスへの側脳室内ボーラス投与による用量依存的な中枢神経内マウスタウエクソン10のスキッピング効果を示す図である。NSは生理食塩水投与、NK-41はコントロールASOをそれぞれ示す。
【図７−２】ENA修飾ASO（NK-18）の成体タウモデルマウスへの側脳室内ボーラス投与による用量依存的な中枢神経内タウエクソン10のスキッピング効果を示す図である。NSは生理食塩水投与、NK-41はコントロールASOをそれぞれ示す。
【図８】2種のENA修飾ASO（NK-02、05）の野生型成体マウスへの側脳室内ボーラス投与による中枢神経内マウスタウエクソン10のスキッピング効果の持続を示す図である。NSは生理食塩水投与、NK-41はコントロールASOをそれぞれ示す。
【図９】3種のENA修飾ASO（NK-02、05、18）の新生仔タウモデルマウスへの側脳室内ボーラス投与による中枢神経内ヒトタウトランスジーンエクソン10のスキッピング効果を示す図である。NSは生理食塩水投与、NK-41はコントロールASOをそれぞれ示す。
【図１０】3種のENA修飾ASO（NK-02、05、18）の成体タウモデルマウスへの側脳室内ボーラス投与による中枢神経内ヒトタウトランスジーンエクソン10のスキッピング効果を示す図である。NSは生理食塩水投与、NK-41はコントロールASOをそれぞれ示す。
【図１１−１】ENA修飾ASOの成体孤発性FTDモデルマウス（ヒト化タウ及びFUS KDマウス）への側脳室内ボーラス投与による中枢神経内マウスタウエクソン10のスキッピング効果を示す図である。左図はNK-05による4R/3R-タウmRNA比率の低下（shFUS+NK-05、n=3）、右図はNK-05、18（n=2）による4R/3R-タウタンパク質比率の低下ないしその傾向を示す（shFUS+NK-05、18、n=2）。NSは生理食塩水投与、shContはコントロールAAV-shRNAを導入したマウス、NK-41はコントロールASOを示す。
【図１１−２】ENA修飾ASO（NK-18）の成体孤発性FTDモデルマウス（FUS KDマウス）への側脳室内ボーラス投与による中枢神経内マウスタウエクソン10のスキッピング効果を示す図である。上図はNK-18による4R/3R-タウmRNA比率の低下（shFUS+NK-18、n=3）、下図はNK-18（n=3）による4R/3R-タウタンパク質比率の低下を示す（shFUS+NK-18、n=3）。shContはコントロールAAV-shRNAを導入したマウス、NK-41はコントロールASOを示す。
【図１２−１】FITC標識したENA修飾ASO（塩基配列はNK-18と同じ）の成体マウスへの側脳室内ボーラス投与による中枢神経内での組織分布を確認した図である。脳全体に広くENA修飾ASOが分布することを示す。DAPIは核染色でここでは脳全体の形状を示す。
【図１２−２】抗ENA修飾ASO抗体を用いた、マウス側脳室内へのボーラス投与（NK-18 50μg投与）によるASOの脳内および神経細胞内分布の検出結果を示す。
【図１３−１】ENA修飾ASOの成体孤発性FTDモデルマウス（ヒト化タウ及びFUS KDマウス）への側脳室内ボーラス投与による情動異常行動の改善を示す図である。情動異常行動はElevated plus maze testにより解析し、shFUSによってOpen armへの滞在時間が増加するが（shFUS+NK-41、n=3）、NK-18投与により滞在時間が短縮される（shFUS+NK-18、n=4）。NK-41はコントロールASOを示す。
【図１３−２】ENA修飾ASOの成体孤発性FTDモデルマウス（FUS KDマウス）への側脳室内ボーラス投与による治療効果を示す。Elevated plus maze testにより、Open/closed armへの進入滞在時間が改善された。NK-41はコントロールASOを示す。shCont+NK-41:n=28、shFUS+NK-41：n=27、shFUS+NK-18：n=26
【図１４】ヒトiPS細胞由来の分化運動ニューロン(FUS KD下)における、ENA修飾ASO（NK-18）の内因性タウエクソン10のスキッピング効果を示す。shContはコントロールAAV-shRNA、NK-41はコントロールASOを示す。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
１．タウスプライシング制御能を有するアンチセンスオリゴヌクレオチド
本発明はタウスプライシング制御能を有する、タウmRNA前駆体に対するアンチセンスオリゴヌクレオチド（ASO）（以下、「本発明のASO」ともいう）を提供する。本発明のASOには、タウエクソン10スキッピングを亢進させる作用を有するものと、逆にタウエクソン10スキッピングを抑制する作用を有するものとがある。以下、それぞれの作用を有するASOについて説明する。
【００１６】
１−１．タウエクソン10スキッピング亢進性ASO
本発明は、タウの選択的スプライシングにおいてエクソン10のスキッピングを亢進させる、タウmRNA前駆体に対するアンチセンスオリゴヌクレオチド（以下、「本発明の亢進性ASO」ともいう）を提供する。ここで「エクソン10のスキッピングを亢進させる」とは、対象において、ASOを導入しない場合と比較して、ASOを導入した場合に4R-タウ/3R-タウアイソフォーム比率を低下させることをいう。
【００１７】
本発明の亢進性ASOが標的とするタウmRNA前駆体の領域は、配列番号４４で表されるヌクレオチド配列（gcaacgtccagtccaagtgtggctcaaaggataatatcaa）からなる、エクソン10内の領域である。図１にヒトタウ遺伝子のエクソン10及びその近傍（イントロン9の一部及びイントロン10の一部）（配列番号４６；NCBIデータベースに登録されるヒト第17番染色体のゲノム配列（NC_000017.11）の46010279〜46010512位の配列に相当する）のヌクレオチド配列を示す。該配列中四角で囲まれた領域がエクソン10（配列番号４６で表されるヌクレオチド配列中ヌクレオチド番号３２〜１２４の領域）である。本発明の亢進性ASOが標的とする領域は、配列番号４６で表されるヌクレオチド配列中ヌクレオチド番号６３〜１０２で示される領域である。
本発明の亢進性ASOは、上記標的領域中の連続する少なくとも10個（例：10、15、16、17、18、19、20個又はそれ以上）のヌクレオチドを標的配列とする。
【００１８】
好ましい実施態様において、本発明の亢進性ASOは、配列番号４４で表されるヌクレオチド配列中ヌクレオチド番号４〜３８の領域（acgtccagtccaagtgtggctcaaaggataatatc；配列番号４７）中の、連続する少なくとも15個（例：15、16、17、18、19、20個又はそれ以上）のヌクレオチドからなる配列を標的配列とする。
【００１９】
１−２．タウエクソン10スキッピング抑制性アンチセンスオリゴヌクレオチド（ASO）
本発明はまた、タウの選択的スプライシングにおいてエクソン10のスキッピングを抑制する、タウmRNA前駆体に対するアンチセンスオリゴヌクレオチド（以下、「本発明の抑制性ASO」ともいう）を提供する。ここで「エクソン10のスキッピングを抑制する」とは、対象において、ASOを導入しない場合と比較して、ASOを導入した場合に4R-タウ/3R-タウアイソフォーム比率を増大させることをいう。
【００２０】
本発明の抑制性ASOが標的とするタウmRNA前駆体の領域は、配列番号４５で表されるヌクレオチド配列（tgagtaccttcacacgtcccatgcgccgtgc）からなる、エクソン10近傍のイントロン10内の領域である。図１に記載のヌクレオチド配列（配列番号４６）でいえば、ヌクレオチド番号１２６〜１５６の領域である。
本発明の抑制性ASOは、上記標的領域中の連続する少なくとも10個（例：10、15、16、17、18、19、20個又はそれ以上）のヌクレオチドを標的配列とする。
【００２１】
好ましい実施態様において、本発明の抑制性ASOは、配列番号４４で表されるヌクレオチド配列中ヌクレオチド番号７〜２７の領域（ccttcacacgtcccatgcgcc；配列番号４８）中の、連続する少なくとも15個（例：15、16、17、18、19、20個）のヌクレオチドからなる配列を標的配列とする。
【００２２】
１−３．本発明のASOの構造的特徴
以下、本発明の亢進性ASO及び本発明の抑制性ASOに共通する構造的特徴について説明する。本発明の亢進性ASOと本発明の抑制性ASOとを包括して「本発明のASO」という。
【００２３】
本発明のASOは、上記した各標的領域中の、連続する少なくとも10個（例：10、15、16、17、18、19、20個又はそれ以上）、好ましくは15個以上からなるヌクレオチド配列（標的配列）と相補的なヌクレオチド配列を含む。
本発明において「相補的なヌクレオチド配列」とは、標的配列に対して完全相補的な（即ち、ミスマッチなくハイブリダイズする）ヌクレオチド配列のみならず、哺乳動物細胞の生理的条件下で標的配列とハブリダイズし得る限り、1ないし数個（例：2、3、4又は5個）のミスマッチを含むヌクレオチド配列をも含む意味で用いられる。例えば、タウmRNA前駆体中の標的配列に対して完全相補的な配列と、80%以上（例：85%以上、90%以上、95%以上、96%以上、97%以上、98%以上、99%以上）、最も好ましくは100%の同一性を有する配列が挙げられる。また、個々の塩基における相補性は、対象となる塩基とワトソン・クリック型塩基対を形成することに限定されるものではなく、フーグスティーン型塩基対やゆらぎ塩基対（Wobble base pair）を形成することも含む。
【００２４】
本発明のASOの長さは特に限定されないが、通常10〜50ヌクレオチド長であり、好ましくは10〜30ヌクレオチド長であり、より好ましくは15〜30ヌクレオチド長であり、さらに好ましくは18〜22ヌクレオチド長である。
【００２５】
本発明のASOの構成単位としては、例えば、リボヌクレオチド及びデオキシリボヌクレオチドが挙げられる。これらのヌクレオチドは、修飾されていても（修飾されたヌクレオチド残基を「修飾ヌクレオチド残基」と称する場合がある）、非修飾であってもよい（非修飾のヌクレオチド残基を「非修飾ヌクレオチド残基」と称する場合がある）。
【００２６】
前記ヌクレオチド残基は、構成要素として、糖、塩基及びリン酸を含む。リボヌクレオチドは、糖としてリボース残基を有し、塩基として、アデニン（A）、グアニン（G）、シトシン（C）及びウラシル（U）（チミン（T）に置き換えることもできる）を有し、デオキシリボヌクレオチド残基は、糖としてデオキシリボース残基を有し、塩基として、アデニン（dA）、グアニン（dG）、シトシン（dC）及びチミン（dT）（ウラシル（dU）に置き換えることもできる）を有する。以下では、アデニン、グアニン、シトシン、ウラシル、チミンを有するヌクレオチドをそれぞれ、アデニンヌクレオチド、グアニンヌクレオチド、シトシンヌクレオチド、ウラシルヌクレオチド、チミンヌクレオチドと称する場合がある。
【００２７】
前記非修飾ヌクレオチド残基は、前記各構成要素が、例えば、天然に存在するものと同一又は実質的に同一であり、好ましくは、人体において天然に存在するものと同一又は実質的に同一である。
【００２８】
前記修飾ヌクレオチド残基は、例えば、前記非修飾ヌクレオチド残基の構成要素のいずれが修飾されてもよい。本発明において、「修飾」には、例えば、前記構成要素の置換、付加及び／又は欠失、前記構成要素における原子及び／又は官能基の置換、付加及び／又は欠失が挙げられる。前記修飾ヌクレオチド残基としては、例えば、天然に存在するヌクレオチド残基、人工的に修飾したヌクレオチド残基等が挙げられる。前記天然由来の修飾ヌクレオチド残基としては、例えば、リンバックら（Limbach et al．、1994、Summary:the modified nucleosides of RNA、Nucleic Acids Res．22:2183〜2196）を参照できる。また、前記修飾ヌクレオチド残基としては、例えば、前記ヌクレオチドの代替物の残基が挙げられる。
【００２９】
前記ヌクレオチド残基の修飾は、例えば、糖−リン酸骨格（該骨格には、塩基も含まれる）（以下、糖リン酸骨格）の修飾が挙げられる。
【００３０】
前記糖リン酸骨格において、糖がリボースの場合、例えば、リボース残基を修飾できる。前記リボース残基は、例えば、2’位炭素を修飾でき、具体的には、例えば、2’位炭素に結合する水酸基をメチル基で修飾、あるいは該水酸基を水素又はフルオロ等のハロゲンに置換できる。また、前記2’位炭素の水酸基を水素に置換することで、リボース残基をデオキシリボースに置換できる。前記リボース残基は、例えば、立体異性体に置換でき、例えば、アラビノース残基に置換してもよい。以下では、前記のように糖の2’位炭素に結合する水酸基をメトキシ基で修飾した核酸を2'−O−メチル修飾核酸と称することがある。また、本発明において、「核酸」にはヌクレオチドなどの核酸モノマーが包含される。
【００３１】
前記糖リン酸骨格は、例えば、非リボース残基（非デオキシリボース残基も包含されるものとする）及び／又は非リン酸を有する非リボースリン酸骨格に置換してもよく、このような置換も糖リン酸骨格の修飾に包含される。前記非リボースリン酸骨格は、例えば、前記糖リン酸骨格の非荷電体が挙げられる。前記非リボースリン酸骨格に置換された、前記ヌクレオチドの代替物は、例えば、モルホリノ、シクロブチル、ピロリジン等が挙げられる。前記代替物は、この他に、例えば、人工核酸が挙げられる。具体例として、例えば、PNA（ペプチド核酸）、架橋構造型人工核酸（BNA：Bridged Nucleic Acid）などが挙げられる。BNAとしては、例えば、ロックト人工核酸（LNA：Locked Nucleic Acid）、2’−O，4’−C−エチレン架橋核酸（ENA：2’−O，4’−C−Ethylenebridged Nucleic Acid）などが挙げられる。以下に、本発明に用いることができるLNA及びENAを含むBNAの具体的な構造（ヌクレオシド部分）を示す（国際公開第2016/006697号公報より引用）。
【００３２】
【化１】
2020009151.tif 000003
【００３３】
式中、Rは、水素原子、分岐または環を形成していてもよい炭素数1から7のアルキル基、分岐または環を形成していてもよい炭素数2から7のアルケニル基、ヘテロ原子を含んでいてもよい炭素数3から12のアリール基、ヘテロ原子を含んでいてもよい炭素数3から12のアリール部分を有するアラルキル基、または核酸合成のアミノ基の保護基を表す。好ましくは、Rは、水素原子、メチル基、エチル基、n-プロピル基、イソプロピル基、フェニル基、またはベンジル基であり、より好ましくは、Rは、水素原子またはメチル基である。また、式中、Baseは塩基を表す。
【００３４】
これらのうち、A型（RNAタイプ）構造を効率よく安定化する以外の余剰の修飾が無いという観点から、好ましくは、以下のヌクレオシド構造を有するENAである。
【００３５】
【化２】
2020009151.tif 000004
【００３６】
式中、Baseは塩基を表す。
【００３７】
これらの人工核酸は、例えば、特開2002-241393、特開2000-297097等を参照して合成することができる。
【００３８】
本発明のASOは、少なくとも１個の2'−O, 4'−C−エチレン架橋核酸（ENA）を修飾ヌクレオチド残基として含むことを特徴とする。ENA修飾は、その架橋構造により標的RNAへの結合力と生体内での代謝安定性を増すことができる。好ましくは、本発明のASOは、ENA残基を2個以上（例：2、3、4、5、6、7、8、9又は10個以上）含む。好ましい一実施態様においては、本発明のASOに含まれるすべてのピリミジン（シトシン、チミン又はウラシル）ヌクレオチドがENAである。
【００３９】
一実施態様において、本発明のASOに含まれるプリン（アデニン又はグアニン）ヌクレオチドを2'−O−メチル修飾核酸とすることができる。従って、好ましい一実施態様においては、本発明のASOは、ピリミジンヌクレオチドがENAであり、プリンヌクレオチドが2'−O−メチル修飾核酸であるASOであり得る。このようなASOにおいて、ENAと2’-O-メチル修飾核酸との比は、ASOのヌクレオチド配列に応じて変動するが、通常1：4〜4：1であり、2：3〜3：2であることが好ましい。
【００４０】
前記糖リン酸骨格において、例えば、リン酸基を修飾できる。前記糖リン酸骨格において、糖残基に最も隣接するリン酸基は、αリン酸基と呼ばれる。前記αリン酸基は、負に荷電し、その電荷は、糖残基に非結合の2つの酸素原子にわたって、均一に分布している。前記αリン酸基における4つの酸素原子のうち、ヌクレオチド残基間のホスホジエステル結合において、糖残基と非結合である2つの酸素原子は、以下、「非結合（non-linking）酸素」ともいう。他方、前記ヌクレオチド残基間のホスホジエステル結合において、糖残基と結合している2つの酸素原子は、以下、「結合（linking）酸素」という。前記αリン酸基は、例えば、非荷電となる修飾、又は、前記非結合酸素における電荷分布が非対称型となる修飾を行うことが好ましい。
【００４１】
前記リン酸基は、例えば、前記非結合酸素を置換してもよい。前記酸素は、例えば、S（硫黄）、Se（セレン）、B（ホウ素）、C（炭素）、H（水素）、N（窒素）及びOR（Rは、アルキル基又はアリール基）のいずれかの原子で置換でき、好ましくは、Sで置換される。前記非結合酸素は、いずれか一方又は両方が置換されていてもよく、好ましくは、いずれか一方又は両方がSで置換される。より具体的には、前記修飾リン酸基として、例えば、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホロセレネート、ボラノホスフェート、ボラノホスフェートエステル、ホスホネート水素、ホスホロアミデート、アルキル又はアリールホスホネート、及びホスホトリエステル等が挙げられ、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエートが好ましい。
【００４２】
また、前記リン酸基はリン非含有のリンカーに置換してもよい。当該リンカーとしては、例えば、シロキサン、カーボネート、カルボキシメチル、カルバメート、アミド、チオエーテル、エチレンオキサイドリンカー、スルホネート、スルホンアミド、チオホルムアセタール、ホルムアセタール、オキシム、メチレンイミノ、メチレンメチルイミノ、メチレンヒドラゾ、メチレンジメチルヒドラゾ、及びメチレンオキシメチルイミノなどが挙げられ、好ましくは、メチレンカルボニルアミノ基及びメチレンメチルイミノ基が挙げられる。あるいは、前記リン酸基は他のリン酸非含有のリンカーに置換してもよい。このようなリンカーとしては、例えば、“Med. Chem. Commun., 2014, 5, 1454-1471”に記載されたもの等が挙げられる。
【００４３】
好ましい実施態様において、本発明のASOに含まれるリン酸基の1/2以上、より好ましくは2/3以上が、上記のうちの１以上のリン酸基修飾を受けており、特に好ましくは、すべてのリン酸基が修飾を受けている。例えば、18merのASOであれば、9個以上、好ましくは12個以上、より好ましくはすべてのリン酸基が、例えばホスホロチオエート化、ホスホロジチオエート化等されている。リン酸ジエステル結合部の非結合酸素の硫黄原子による置換は、ASOの組織内分布において重要である。
【００４４】
本発明のASOは、例えば、3’末端及び5’末端の少なくとも一方のヌクレオチド残基が修飾されてもよい。前記修飾は、例えば、3’末端及び5’末端のいずれか一方でもよいし、両方でもよい。前記修飾は、例えば、前述のとおりであり、好ましくは、末端のリン酸基に行うことが好ましい。前記リン酸基は、例えば、全体を修飾してもよいし、前記リン酸基における1つ以上の原子を修飾してもよい。前者の場合、例えば、リン酸基全体の置換でもよいし、欠失でもよい。
【００４５】
前記末端のヌクレオチド残基の修飾は、例えば、他の分子の付加が挙げられる。前記他の分子としては、例えば、後述する標識物質や、保護基等の機能性分子が挙げられる。前記保護基としては、例えば、S（硫黄）、Si（ケイ素）、B（ホウ素）、エステル含有基等が挙げられる。前記標識物質等の機能性分子は、例えば、本発明のASOの検出等に利用できる。
【００４６】
前記他の分子は、例えば、前記ヌクレオチド残基のリン酸基に付加してもよいし、スペーサーを介して、前記リン酸基又は前記糖残基に付加してもよい。前記スペーサーの末端原子は、例えば、前記リン酸基の前記結合酸素、又は、糖残基のO、N、SもしくはCに、付加又は置換できる。前記糖残基の結合部位は、例えば、3’位のCもしくは5’位のC、又はこれらに結合する原子が好ましい。前記スペーサーは、例えば、前記PNA等のヌクレオチド代替物の末端原子に、付加又は置換することもできる。
【００４７】
前記スペーサーは、特に制限されず、例えば、-(CH2)n-、-(CH2)nN-、-(CH2)nO-、-(CH2)nS-、O(CH2CH2O)nCH2CH2OH、無塩基糖、アミド、カルボキシ、アミン、オキシアミン、オキシイミン、チオエーテル、ジスルフィド、チオ尿素、スルホンアミド、及びモルホリノ等、ならびに、ビオチン試薬及びフルオレセイン試薬等を含んでもよい。前記式において、nは、正の整数であり、n＝3又は6が好ましい。
【００４８】
前記末端に付加する分子は、これらの他に、例えば、色素、インターカレート剤（例えば、アクリジン）、架橋剤（例えば、ソラレン、マイトマイシンC）、ポルフィリン（TPPC4、テキサフィリン、サッフィリン）、多環式芳香族炭化水素（例えば、フェナジン、ジヒドロフェナジン）、人工エンドヌクレアーゼ（例えば、EDTA）、親油性担体（例えば、コレステロール、コール酸、アダマンタン酢酸、1-ピレン酪酸、ジヒドロテストステロン、1，3-ビス-O（ヘキサデシル）グリセロール、ゲラニルオキシヘキシル基、ヘキサデシルグリセロール、ボルネオール、メントール、1，3-プロパンジオール、ヘプタデシル基、パルミチン酸、ミリスチン酸、O3-（オレオイル）リトコール酸、O3-(オレオイル）コール酸、ジメトキシトリチル、又はフェノキサジン）及びペプチド複合体（例えば、アンテナペディアペプチド、Tatペプチド）、アルキル化剤、リン酸、アミノ、メルカプト、PEG（例えば、PEG-40K）、MPEG、［MPEG］2、ポリアミノ、アルキル、置換アルキル、放射線標識マーカー、酵素、ハプテン（例えば、ビオチン）、輸送／吸収促進剤（例えば、アスピリン、ビタミンE、葉酸）、合成リボヌクレアーゼ（例えば、イミダゾール、ビスイミダゾール、ヒスタミン、イミダゾールクラスター、アクリジン−イミダゾール複合体、テトラアザマクロ環のEu3+複合体）等が挙げられる。
【００４９】
本発明のASOは、前記5’末端が、例えば、リン酸基又はリン酸基アナログで修飾されてもよい。前記リン酸基は、例えば、5’一リン酸（(HO)2(O)P-O-5’）、5’二リン酸（(HO)2(O)P-O-P(HO)(O)-O-5’）、5’三リン酸（(HO)2(O)P-O-(HO)(O)P-O-P(HO)(O)-O-5’）、5’−グアノシンキャップ（7-メチル化又は非メチル化、7m-G-O-5’-(HO)(O)P-O-(HO)(O)P-O-P(HO)(O)-O-5’）、5’−アデノシンキャップ（Appp）、任意の修飾又は非修飾ヌクレオチドキャップ構造（N-O-5’-(HO)(O)P-O-(HO)(O)P-O-P(HO)(O)-O-5’）、5’一チオリン酸（ホスホロチオエート：(HO)2(S)P-O-5’）、5’一ジチオリン酸（ホスホロジチオエート：(HO)(HS)(S)P-O-5’）、5’-ホスホロチオール酸（(HO)2(O)P-S-5’）、硫黄置換の一リン酸、二リン酸及び三リン酸（例えば、5’-α-チオ三リン酸、5’-γ-チオ三リン酸等）、5’-ホスホルアミデート（(HO)2(O)P-NH-5’、(HO)(NH2)(O)P-O-5’）、5’−アルキルホスホン酸（例えば、RP(OH)(O)-O-5’、(OH)2(O)P-5’-CH2、Rはアルキル（例えば、メチル、エチル、イソプロピル、プロピル等））、5’-アルキルエーテルホスホン酸（例えば、RP(OH)(O)-O-5’、Rはアルキルエーテル（例えば、メトキシメチル、エトキシメチル等））等が挙げられる。
【００５０】
前記ヌクレオチド残基において、前記塩基は、特に制限されず、例えば、天然の塩基でもよいし、非天然の塩基でもよい。前記塩基は、例えば、天然由来でもよいし、合成品でもよい。前記塩基として、例えば、一般的な塩基、その修飾アナログ、ユニバーサル塩基などが使用できる。
【００５１】
前記塩基としては、例えば、アデニン及びグアニン等のプリン塩基、シトシン、ウラシル及びチミン等のピリミジン塩基が挙げられる。前記塩基としては、この他に、イノシン、チミン、キサンチン、ヒポキサンチン、ヌバラリン（nubularine）、イソグアニシン（isoguanisine）、ツベルシジン（tubercidine）等が挙げられる。前記塩基は、例えば、2-アミノアデニン、6-メチル化プリン等のアルキル誘導体；2-プロピル化プリン等のアルキル誘導体；5-ハロウラシル及び5-ハロシトシン；5-プロピニルウラシル及び5-プロピニルシトシン；6-アゾウラシル、6-アゾシトシン及び6-アゾチミン；5-ウラシル（プソイドウラシル）、4-チオウラシル、5-ハロウラシル、5-（2-アミノプロピル）ウラシル、5-アミノアリルウラシル；8-ハロ化、アミノ化、チオール化、チオアルキル化、ヒドロキシル化及び他の8-置換プリン；5-トリフルオロメチル化及び他の5-置換ピリミジン；7-メチルグアニン；5-置換ピリミジン；6-アザピリミジン；N-2、N-6、及びO-6置換プリン（2-アミノプロピルアデニンを含む）；5-プロピニルウラシル及び5-プロピニルシトシン；ジヒドロウラシル；3-デアザ−5-アザシトシン；2-アミノプリン；5-アルキルウラシル；7-アルキルグアニン；5-アルキルシトシン；7-デアザアデニン；N6，N6-ジメチルアデニン；2，6-ジアミノプリン；5-アミノ−アリル−ウラシル；N3-メチルウラシル；置換1，2，4-トリアゾール；2-ピリジノン；5-ニトロインドール；3-ニトロピロール；5-メトキシウラシル；ウラシル−5-オキシ酢酸；5-メトキシカルボニルメチルウラシル；5-メチル-2-チオウラシル；5-メトキシカルボニルメチル-2-チオウラシル；5-メチルアミノメチル-2-チオウラシル；3-（3-アミノ-3-カルボキシプロピル）ウラシル；3-メチルシトシン；5-メチルシトシン；N4-アセチルシトシン；2-チオシトシン；N6-メチルアデニン；N6-イソペンチルアデニン；2-メチルチオ-N6-イソペンテニルアデニン；N-メチルグアニン；O-アルキル化塩基等が挙げられる。また、プリン及びピリミジンは、例えば、米国特許第3,687,808号、「Concise Encyclopedia Of Polymer Science And Engineering」、858〜859頁、クロシュビッツ ジェー アイ（Kroschwitz J.I.）編、John Wiley & Sons、1990、及びイングリッシュら（Englischら）、Angewandte Chemie、International Edition、1991、30巻、p.613に開示されるものが含まれる。ユニバーサル塩基は、アデニン、グアニン、シトシン、ウラシル及びチミンなどと塩基対を形成し得るヌクレオチド塩基類似体を意味する。前記ユニバーサル塩基としては、例えば、Ｃ−フェニル、Ｃ−ナフチル及び他の芳香族の誘導体、イノシン、アゾールカルボザミド（carbozamide）、ニトロアゾール誘導体（３−ニトロピロール、４−ニトロインドール、５−ニトロインドール、及び６−ニトロインドール等）（Loakes，2001，Nucleic Acids Res．29：2437）や、国際公開第2007/026485号公報に記載の塩基などが挙げられるが、これらに限定されない。
【００５２】
前記修飾ヌクレオチド残基は、これらの他に、例えば、塩基を欠失する残基、すなわち、無塩基の糖リン酸骨格を含んでもよい。また、前記修飾ヌクレオチド残基は、例えば、国際公開第2004/080406号に記載された残基が使用できる。
【００５３】
本発明のASOは、例えば、標識物質で標識化されてもよい。前記標識物質は特に制限されず、例えば、蛍光物質、色素、同位体等が挙げられる。前記蛍光物質としては、例えば、ピレン、TAMRA、フルオレセイン、Cy3色素、Cy5色素等の蛍光団が挙げられる。前記色素としては、例えば、Alexa488等のAlexa色素等が挙げられる。前記同位体としては、例えば、安定同位体及び放射性同位体が挙げられ、好ましくは安定同位体である。前記安定同位体は、例えば、被ばくの危険性が少なく、専用の施設も不要であることから取り扱い性に優れ、また、コストも低減できる。また、前記安定同位体は、例えば、標識した化合物の物性変化がなく、トレーサーとしての性質にも優れる。前記安定同位体は、特に制限されず、例えば、2H、13C、15N、17O、18O、33S、34S及び36Sが挙げられる。
【００５４】
本発明の亢進性ASOの具体例として、例えば標的配列の長さが18merである場合、例えば、以下のヌクレオチド配列（下線部は、配列番号４４で表されるエクソン10内の標的領域に相補的な領域を示す）を、標的配列に対する相補鎖配列として含むASOが挙げられる。
ggacgtgtttgatattat（配列番号２１）
gacgtgtttgatattatc（配列番号４９）
acgtgtttgatattatcc（配列番号５０）
cgtgtttgatattatcct（配列番号５１）
gtgtttgatattatcctt（配列番号５２）
tgtttgatattatccttt（配列番号５３）
gtttgatattatcctttg（配列番号５４）
tttgatattatcctttga（配列番号５５）
ttgatattatcctttgag（配列番号５６）
tgatattatcctttgagc（配列番号５７）
gatattatcctttgagcc（配列番号２０）
atattatcctttgagcca（配列番号１９）
tattatcctttgagccac（配列番号１８）
attatcctttgagccaca（配列番号１７）
ttatcctttgagccacac（配列番号１６）
tatcctttgagccacact（配列番号１５）
atcctttgagccacactt（配列番号１４）
tcctttgagccacacttg（配列番号１３）
cctttgagccacacttgg（配列番号１２）
ctttgagccacacttgga（配列番号１１）
tttgagccacacttggac（配列番号１０）
ttgagccacacttggact（配列番号９）
tgagccacacttggactg（配列番号８）
gagccacacttggactgg（配列番号７）
agccacacttggactgga（配列番号６）
gccacacttggactggac（配列番号５）
ccacacttggactggacg（配列番号４）
cacacttggactggacgt（配列番号３）
acacttggactggacgtt（配列番号５８）
cacttggactggacgttg（配列番号５９）
acttggactggacgttgc（配列番号６０）
cttggactggacgttgct（配列番号６１）
ttggactggacgttgcta（配列番号６２）
tggactggacgttgctaa（配列番号６３）
ggactggacgttgctaag（配列番号６４）
gactggacgttgctaaga（配列番号６５）
actggacgttgctaagat（配列番号６６）
ctggacgttgctaagatc（配列番号６７）
tggacgttgctaagatcc（配列番号２）
（上記ヌクレオチド配列において、チミンはウラシルであってもよい。）
【００５５】
好ましい実施態様において、本発明の亢進性ASOの具体例として、配列番号３〜２０のいずれかで表されるヌクレオチド配列、より好ましくは配列番号５〜１８のいずれかで表されるヌクレオチド配列を、標的配列に対する相補鎖配列として含むASOが挙げられる。
【００５６】
また、標的配列の長さが19merである場合、例えば、配列番号２７〜３１のいずれかで表されるヌクレオチド配列、好ましくは配列番号２９又は３０で表されるヌクレオチド配列を、標的配列に対する相補鎖配列として含むASOが挙げられる。
tggacgttgctaagatcca（配列番号２７）
ctggacgttgctaagatcc（配列番号２８）
gccacacttggactggacg（配列番号２９）
agccacacttggactggac（配列番号３０）
tattatcctttgagccaca（配列番号３１）
（上記ヌクレオチド配列において、チミンはウラシルであってもよい。）
【００５７】
また、標的配列の長さが17merである場合、例えば、配列番号３４〜３７のいずれかで表されるヌクレオチド配列、好ましくは配列番号３６又は３７で表されるヌクレオチド配列を、標的配列に対する相補鎖配列として含むASOが挙げられる。
ggacgttgctaagatcc（配列番号３４）
tggacgttgctaagatc（配列番号３５）
ccacacttggactggac（配列番号３６）
gccacacttggactgga（配列番号３７）
（上記ヌクレオチド配列において、チミンはウラシルであってもよい。）
【００５８】
本発明の抑制性ASOの具体例として、例えば標的配列の長さが18merである場合、例えば、以下のヌクレオチド配列を、標的配列に対する相補鎖配列として含むASOが挙げられる。
gcacggcgcatgggacgt（配列番号２４）
cacggcgcatgggacgtg（配列番号６８）
acggcgcatgggacgtgt（配列番号６９）
cggcgcatgggacgtgtg（配列番号７０）
ggcgcatgggacgtgtga（配列番号２３）
gcgcatgggacgtgtgaa（配列番号７１）
cgcatgggacgtgtgaag（配列番号７２）
gcatgggacgtgtgaagg（配列番号２２）
catgggacgtgtgaaggt（配列番号７３）
atgggacgtgtgaaggta（配列番号７４）
tgggacgtgtgaaggtac（配列番号７５）
gggacgtgtgaaggtact（配列番号７６）
ggacgtgtgaaggtactc（配列番号７７）
gacgtgtgaaggtactca（配列番号７８）
（上記ヌクレオチド配列において、チミンはウラシルであってもよい。）
【００５９】
好ましい実施態様において、本発明の抑制性ASOの具体例として、配列番号２２、２３、７１及び７２のいずれかで表されるヌクレオチド配列を、標的配列に対する相補鎖配列として含むASOが挙げられる。
【００６０】
また、標的配列の長さが19merである場合、例えば、配列番号３２又は３３で表されるヌクレオチド配列を、標的配列に対する相補鎖配列として含むASOが挙げられる。
ggacgtgtgaaggtactca（配列番号３２）
gggacgtgtgaaggtactc（配列番号３３）
（上記ヌクレオチド配列において、チミンはウラシルであってもよい。）
【００６１】
また、標的配列の長さが17merである場合、例えば、配列番号３８又は３９で表されるヌクレオチド配列を、標的配列に対する相補鎖配列として含むASOが挙げられる。
gacgtgtgaaggtactc（配列番号３８）
ggacgtgtgaaggtact（配列番号３９）
（上記ヌクレオチド配列において、チミンはウラシルであってもよい。）
【００６２】
本発明のASOは、自体公知の化学合成法により製造することができる。例えば、ホスホロアミダイト法及びH-ホスホネート法等が挙げられる。当該化学合成法は、例えば、市販の自動核酸合成機を用いて実施することができ、アミダイトを使用する場合、例えば、市販のアミダイトとして、RNA Phosphoramidites（2’-O-TBDMSi、商品名、三千里製薬）、ACEアミダイト及びTOMアミダイト、CEEアミダイト、CEMアミダイト、TEMアミダイト等を用いることができる。
【００６３】
２.本発明のASOの用途
２−１．タウスプライシング制御剤
本発明の亢進性ASOは、エクソン10のスキッピングを亢進させ、4R-タウ/3R-タウアイソフォーム比率を低下させることができる。一方、本発明の抑制性ASOは、エクソン10のスキッピングを抑制し、4R-タウ/3R-タウアイソフォーム比率を増大させることができる。従って、本発明はまた、本発明の亢進性ASOを含有してなるタウエクソン10スキッピング促進剤、並びに、本発明の抑制性ASOを含有してなるタウエクソン10スキッピング抑制剤（包括的に、「本発明のASOを含有してなるタウスプライシング制御剤」、「本発明のタウスプライシング制御剤」ともいう）を提供する。
【００６４】
本発明のタウスプライシング制御剤は、例えば、タウ遺伝子を発現する対象に、本発明のASOを単独で、あるいは薬理学的に許容される担体とともに接触させることにより、該対象内に導入することができる。当該接触工程は、対象が動物個体の場合、本発明のタウスプライシング制御剤を該動物に投与することにより行うことができる。また、対象が動物由来の細胞、組織又は器官の培養である場合には、該培養物の培地に本発明のタウスプライシング制御剤を添加することにより実施することができる。
【００６５】
本発明のASOの標的細胞内への導入を促進するために、本発明のタウスプライシング制御剤は、核酸導入用試薬をさらに含んでいてもよい。該核酸導入用試薬として、アテロコラーゲン；リポソーム；ナノパーティクル；リポフェクチン、リプフェクタミン（lipofectamine）、DOGS（トランスフェクタム）、DOPE、DOTAP、DDAB、DHDEAB、HDEAB、ポリブレン、あるいはポリ（エチレンイミン）(PEI)等の陽イオン性脂質等を用いることができる。
【００６６】
２−２．本発明のASOを含有してなる医薬
本発明のASOは、エクソン10のスキッピングを亢進又は抑制し、4R-タウ/3R-タウアイソフォーム比率を制御することができるので、4R/3R-タウ発現のバランス異常を伴うタウオパチーの治療及び／又は予防に用いることができる。即ち、本発明の亢進性ASOを有効成分とする医薬は、4R-タウの蓄積を伴うタウオパチーの治療及び／又は予防に用いることができる。4R-タウの蓄積を伴うタウオパチーとしては、例えば、前頭側頭型認知症（FTD）、前頭側頭葉変性症（FTLD）、大脳皮質基底核変性症（CBD）、進行性核上性麻痺（PSP）、アルツハイマー病（AD）、神経原線維変化型老年期認知症（SD-NFT）、慢性外傷性脳症、嗜銀顆粒性認知症等が挙げられる。一方、本発明の抑制性ASOを有効成分とする医薬は、3R-タウの蓄積を伴うタウオパチーの治療及び／又は予防に用いることができる。3R-タウの蓄積を伴うタウオパチーとしては、例えば、ピック病等が挙げられる。
【００６７】
本発明のASOは単独で用いてよいし、あるいは医薬上許容される担体とともに、医薬組成物として製剤化してもよい。
医薬上許容される担体としては、例えば、ショ糖、デンプン等の賦形剤、セルロース、メチルセルロース等の結合剤、デンプン、カルボキシメチルセルロース等の崩壊剤、ステアリン酸マグネシウム、エアロジル等の滑剤、クエン酸、メントール等の芳香剤、安息香酸ナトリウム、亜硫酸水素ナトリウム等の保存剤、クエン酸、クエン酸ナトリウム等の安定剤、メチルセルロース、ポリビニルピロリド等の懸濁剤、界面活性剤等の分散剤、水、生理食塩水等の希釈剤、ベースワックス等が挙げられるが、それらに限定されるものではない。
【００６８】
本発明のASOの標的細胞内への導入を促進するために、本発明の医薬は核酸導入用試薬をさらに含んでいてもよい。該核酸導入用試薬としては、上述したものと同様のものを用いることができる。
【００６９】
また、本発明の医薬は、本発明のASOがリポソームに封入されてなる医薬組成物であってもよい。リポソームは、１以上の脂質二重層により包囲された内相を有する微細閉鎖小胞であり、通常は水溶性物質を内相に、脂溶性物質を脂質二重層内に保持することができる。本明細書において「封入」という場合には、本発明のASOはリポソーム内相に保持されてもよいし、脂質二重層内に保持されてもよい。本発明に用いられるリポソームは単層膜であっても多層膜であってもよく、また、粒子径は、例えば10〜1000nm、好ましくは50〜300nmの範囲で適宜選択できる。標的組織への送達性を考慮すると、粒子径は、例えば200nm以下、好ましくは100nm以下であり得る。
【００７０】
オリゴヌクレオチドのような水溶性化合物のリポソームへの封入法としては、リピドフィルム法（ボルテックス法）、逆相蒸発法、界面活性剤除去法、凍結融解法、リモートローディング法等が挙げられるが、これらに限定されず、任意の公知の方法を適宜選択することができる。
【００７１】
本発明の医薬は、経口的に又は非経口的に、哺乳動物（例：ヒト、ラット、マウス、モルモット、ウサギ、ヒツジ、ウマ、ブタ、ウシ、サル）に対して投与することが可能であるが、非経口的に投与するのが望ましい。
【００７２】
非経口的な投与（例えば、皮下注射、筋肉注射、局所注入（例：脳室内投与）、腹腔内投与など）に好適な製剤としては、水性及び非水性の等張な無菌の注射液剤があり、これには抗酸化剤、緩衝液、制菌剤、等張化剤等が含まれていてもよい。また、水性及び非水性の無菌の懸濁液剤が挙げられ、これには懸濁剤、可溶化剤、増粘剤、安定化剤、防腐剤等が含まれていてもよい。当該製剤は、アンプルやバイアルのように単位投与量あるいは複数回投与量ずつ容器に封入することができる。また、有効成分及び医薬上許容される担体を凍結乾燥し、使用直前に適当な無菌のビヒクルに溶解又は懸濁すればよい状態で保存することもできる。
【００７３】
医薬組成物中の本発明のASOの含有量は、例えば、医薬組成物全体の約0.1ないし100重量%である。
【００７４】
本発明の医薬の投与経路は、4R又は3Rタウの蓄積がみられる標的組織、即ち、中枢神経組織の細胞内に、治療又は予防上有効量の本発明のASOが送達・導入される限り特に制限はないが、脳室内投与が好ましい。
【００７５】
本発明の医薬の投与量は、投与の目的、投与方法、対象疾患の種類、重篤度、投与対象の状況（性別、年齢、体重など）によって異なるが、例えば、成人に全身投与する場合、通常、本発明のASOの一回投与量として2 nmol/kg以上50 nmol/kg以下、局所投与する場合、1 pmol/kg以上10 nmol/kg以下が望ましい。かかる量を、例えば1〜6か月、好ましくは2〜4か月、より好ましくは約3か月の間隔で投与することができる。
本発明のASOは、従来公知のASOと比較して、顕著にタウスプライシング制御力及び生体内安定性に優れているので、少ない投与量・投与回数で治療及び／又は予防効果を奏することができ、患者のQOL改善、医療費の削減、有害事象の発現抑制が可能となる。
【００７６】
本発明の医薬は、他のタウオパチーの治療薬、例えば、タウ過剰リン酸化阻害剤（例、GSK3β阻害剤（例、リチウム、チデグルシブ）等）、タウ凝集阻害剤（例、メチレンブルー等）などと併用することができる。これらの併用薬剤は、本発明の医薬とともに製剤化して単一の製剤として投与することもできるし、あるいは、本発明の医薬とは別個に製剤化して、本発明の医薬と同一もしくは別ルートで、同時もしくは時間差をおいて投与することもできる。また、これらの併用薬剤の投与量は、該薬剤を単独投与する場合に通常用いられる量であってよく、あるいは通常用いられる量より減量することもできる。
【００７７】
有効量の本発明のASO又は本発明の医薬を哺乳動物(治療または予防の対象とする動物)に投与する治療及び／または予防方法も、本発明に含まれる。有効量、投与量、哺乳動物の具体例やその他の事項については、上記２−２．で記載した通りである。
【００７８】
２−３．疾患モデルの作製及びその利用
【００７９】
本発明のASOは、エクソン10のスキッピングを亢進又は抑制し、4R-タウ/3R-タウアイソフォーム比率を制御することができるので、当該ASOを培養細胞や実験動物に取り込ませることにより、4R/3R-タウ発現のバランス異常を伴うタウオパチーの細胞又は動物モデルを作製することができる。即ち、本発明の亢進性ASOを取り込ませることにより、3R-タウの蓄積を伴うタウオパチーのモデルを作製することができる。3R-タウの蓄積を伴うタウオパチーとしては、例えば、ピック病等が挙げられる。一方、本発明の抑制性ASOを取り込ませることにより、4R-タウの蓄積を伴うタウオパチーのモデルを作製することができる。4R-タウの蓄積を伴うタウオパチーとしては、例えば、FTD、CBD、PSP、嗜銀顆粒性認知症等が挙げられる。
【００８０】
本発明のASOを取り込ませる細胞又は動物は特に制限はなく、ヒト以外の哺乳動物、好ましくは、マウス、ラット、ハムスター、モルモット、ウサギ、サル等の実験動物、あるいはそれらの動物から誘導された細胞、組織又は器官が挙げられ、初代培養であっても継代培養であってもよいが、好ましくは株化された培養細胞、より好ましくはヒト培養細胞である。また、多能性幹細胞などの幹細胞から自体公知の方法により分化誘導することで得られる細胞であってもよい。かかる幹細胞としては、例えば、胚性幹細胞（embryonic stem cell：ES細胞）、人工多能性幹細胞（induced pluripotent stem cell：iPS細胞）、多能性生殖幹細胞、胚性生殖幹細胞（EG細胞）、神経幹細胞、間葉系幹細胞などが挙げられる。
【００８１】
本発明のASOを取り込ませる細胞又は動物は、正常な動物もしくはそれ由来の細胞等であってもよいし、タウの過剰発現や4R/3R-タウ発現のバランス異常を伴うタウオパチーを有する動物もしくはそれ由来の細胞等であってもよい。タウの過剰発現や4R/3R-タウ発現のバランス異常を伴うタウオパチーを有する動物としては、例えば、タウ遺伝子を導入されたアルツハイマー病モデルマウスや、FUSがノックダウンされた孤発性FTDモデルマウス等が挙げられるが、それらに限定されない。あるいは、タウ遺伝子を導入された培養細胞やFUSがノックダウンされた培養細胞を用いてもよい。
【００８２】
本発明のASOを細胞等に取り込ませる方法としては、該細胞等の培地に本発明のASOを添加する方法（トランスフェクションなど）が挙げられる。また、本発明のASOの動物個体への取り込みは、該動物に本発明のASOを投与することにより行うことができる。投与方法は、対象疾患において4R又は3R-タウの蓄積がみられる組織、即ち、中枢神経組織の細胞内に、病態を発現させるのに有効な量の本発明のASOが送達・導入される限り特に制限はないが、脳室内投与が好ましい。
【００８３】
本発明のASOを取り込んだ動物又は細胞等が、目的の疾患モデルであることの確認は、該動物の中枢神経又は該細胞等における4R/3R-タウ発現のバランスを測定することや、該動物の行動異常、病理の発現の有無・程度など、該疾患の１以上の表現型を調べることにより行うことができる。
【００８４】
以上のようにして得られたタウオパチーの細胞又は動物モデルは、例えば、該タウオパチーの治療及び／又は予防薬のスクリーニングに用いることができる。即ち、本発明は、3R-タウ又は4R-タウの蓄積を伴うタウオパチーの治療又は予防薬のスクリーニング方法であって、
（１）上記のモデルに被検物質を曝露させる工程、
（２）該モデルにおける該タウオパチーの１以上の表現型を検定する工程、
（３）被検物質を曝露していない該モデルとの間で該表現型を比較する工程、及び
（４）該表現型を改善した被検物質を該タウオパチーの治療又は予防薬の候補として選択する工程を含む、方法を提供する。
【００８５】
工程（１）における該モデルへの被検物質の曝露は、モデルの形態に応じて、本発明のASOの取り込みの場合と同様にして行うことができる。
工程（２）においては、上記のモデルの樹立の確認に用いたのと同様に、タウオパチーの１以上の表現型、例えば、4R/3R-タウ発現のバランスや、動物における行動異常の発現の有無・程度などを検定する。
工程（３）で対照として用いる被検物質を曝露していないモデルとしては、同様の方法により作製した別個のモデルを使用してもよいし、被検物質の曝露前の同一モデルを使用してもよい。
工程（３）における比較の結果、タウオパチーの表現型を有意に改善した被検物質を、該タウオパチーの治療及び／又は予防薬の候補物質として選択することができる。
【００８６】
以下、実施例等により、本発明を詳しく説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【実施例】
【００８７】
実施例１  タウmRNA前駆体に対するASOの作製
文献的考察および予測ツールを組み合わせ、タウエクソン10又はその近傍（イントロン9又はイントロン10）内部の配列と塩基対形成する39種の配列（NK-01〜39）及びコントロールとして非特異的配列（NK-40〜43）からなるASOを設計した。図１に、NK-01〜39のASOの標的領域を示す。各ASOのヌクレオチド配列は以下の通りである。
NK-01：agccagaaaaaaggatga（配列番号１）
NK-02：tggacgttgctaagatcc（配列番号２）
NK-03：cacacttggactggacgt（配列番号３）
NK-04：ccacacttggactggacg（配列番号４）
NK-05：gccacacttggactggac（配列番号５）
NK-06：agccacacttggactgga（配列番号６）
NK-07：gagccacacttggactgg（配列番号７）
NK-08：tgagccacacttggactg（配列番号８）
NK-09：ttgagccacacttggact（配列番号９）
NK-10：tttgagccacacttggac（配列番号１０）
NK-11：ctttgagccacacttgga（配列番号１１）
NK-12：cctttgagccacacttgg（配列番号１２）
NK-13：tcctttgagccacacttg（配列番号１３）
NK-14：atcctttgagccacactt（配列番号１４）
NK-15：tatcctttgagccacact（配列番号１５）
NK-16：ttatcctttgagccacac（配列番号１６）
NK-17：attatcctttgagccaca（配列番号１７）
NK-18：tattatcctttgagccac（配列番号１８）
NK-19：atattatcctttgagcca（配列番号１９）
NK-20：gatattatcctttgagcc（配列番号２０）
NK-21：ggacgtgtttgatattat（配列番号２１）
NK-22：gcatgggacgtgtgaagg（配列番号２２）
NK-23：ggcgcatgggacgtgtga（配列番号２３）
NK-24：gcacggcgcatgggacgt（配列番号２４）
NK-25：tttattctatgcagtgtc（配列番号２５）
NK-26：gcccaagaaggatttatt（配列番号２６）
NK-27：tggacgttgctaagatcca（配列番号２７）
NK-28：ctggacgttgctaagatcc（配列番号２８）
NK-29：gccacacttggactggacg（配列番号２９）
NK-30：agccacacttggactggac（配列番号３０）
NK-31：tattatcctttgagccaca（配列番号３１）
NK-32：ggacgtgtgaaggtactca（配列番号３２）
NK-33：gggacgtgtgaaggtactc（配列番号３３）
NK-34：ggacgttgctaagatcc（配列番号３４）
NK-35：tggacgttgctaagatc（配列番号３５）
NK-36：ccacacttggactggac（配列番号３６）
NK-37：gccacacttggactgga（配列番号３７）
NK-38：gacgtgtgaaggtactc（配列番号３８）
NK-39：ggacgtgtgaaggtact（配列番号３９）
NK-40：catctaagcaacaattga（配列番号４０）
NK-41：ctcttgacgcacatctgg（配列番号４１）
NK-42：ttccctgaaggttcctcc（配列番号４２）
NK-43：tcagtaaacttgacacca（配列番号４３）
常法に従って、上記各ヌクレオチド配列を有するASOを合成した。シトシン及びチミンにはENAを用い、リン酸基はすべてホスホロチオエート化した。比較例として、NK-05、12、16、18及び41について、すべてのヌクレオチド残基をMOE修飾したASOも合成した。【００８８】
実施例２  ENA修飾ASOとMOE修飾ASOとのタウスプライシング制御力の比較
配列番号５、１２、１６及び１８の各ヌクレオチド配列を有する4種類のENA修飾ASOと、同一配列を有する4種類のMOE修飾ASOとの間で、タウスプライシング制御力を比較した。
ヒト培養細胞（HEK293細胞）にLipofectamine 2000（#11668027, Thermo）を用いて50 nMの各ASOをトランスフェクションした。トランスフェクションの48時間後に培養した細胞をTRIzol（#15596018, Thermo）を用いて溶解させた後、RNeasy Mini Kit（#74104, Qiagen）を利用してRNAを抽出した。抽出したmRNAをImProm-II Reverse Transcriptase（#M314A, Promega）を利用してcDNAに逆転写し、これを鋳型として放射線同位元素を用いた半定量RT-PCRを行った。RT-PCRは、フォーワードプライマーとしてCCATGCCAGACCTGAAGAAT（配列番号７９）、リバースプライマーとしてTGCTCAGGTCAACTGGTTTG（配列番号８０）を用い、AmpliTaq DNA Polymerase（#N8080152, Thermo）、P-32 Deoxycytidine 5'-triphosphate（#NEG013H, PerkinElmer）を使用して行った。結果を図２に示す。
いずれの配列においても、ENA修飾ASOのタウエクソン10スキッピング効果は、同じ配列を有するMOE修飾ASOに比べて顕著に高かった（約3〜約9倍）。【００８９】
実施例３  亢進性ASO及び抑制性ASO及びそれらの標的領域の同定
実施例１で作製したタウmRNA前駆体に対するASOのうち13種（NK-01、02、05、12、16、18、20〜26）及び4種のコントロールASO（NK-40〜43）を、実施例２と同様の方法で、各々ヒト培養細胞（HEK293細胞）に導入し、内因性タウエクソン10のスキッピングに及ぼす効果を、RT-PCRにて測定し、タウスプライシング制御能を有するASOのスクリーニングを行った。結果を図３に示す。
エクソン10内の特定の領域中に標的配列を有する6種類のASO（NK-02、05、12、16、18、20）が、高いタウエクソン10スキッピング促進効果を示した。一方、イントロン10内の特定の領域中に標的配列を有する3種類のASO（NK-22、23、24）が、高いタウエクソン10スキッピング抑制（エクソン10インクルージョン）効果を示した。【００９０】
実施例４  亢進性ASOの詳細な検討
実施例３で同定した、高効率の6種のASOのタウmRNA前駆体標的領域に相補的な計18種の18 mer ASO（NK-03〜20）を、実施例２と同様の方法で、各々ヒト培養細胞（HEK293細胞）に導入し、内因性タウエクソン10のスキッピングに及ぼす効果を、RT-PCRにて測定し、タウスプライシング制御能を有するASOのスクリーニングを行った。結果を図４に示す。
5種類のASO（NK-05、13〜16）が、特に高いタウエクソン10スキッピング促進効果を示した。【００９１】
実施例５  亢進性ASOの至適長の検討
実施例３で同定した、高効率の2種の18 mer ASO（NK-02、05）のそれぞれに対し、一方の末端ヌクレオチドを除いた17 mer ASO（NK-34〜37）と、一方の末端に１ヌクレオチドを付加した19 mer ASO（NK-27〜30）を含む、計11種のASO（NK-02、05、18、27〜30、34〜37）を、実施例２と同様の方法で、各々ヒト培養細胞（HEK293細胞）に導入し、内因性タウエクソン10のスキッピングに及ぼす効果を、RT-PCRにて測定し、タウスプライシング制御能を有するASOのスクリーニングを行った。結果を図５に示す。
NK-05 ASOが、高いタウエクソン10スキッピング促進効果を示し、18 mer長の最適性が示唆された。【００９２】
実施例６−１  野生型マウスに対する亢進性ASOの効果
（１）野生型新生仔マウス（系統：C57BL/6J、性別：オスまたはメス（各n=3匹））に、NK-02、05 ASOを各10μg、側脳室内ボーラス投与し、投与1週後に中枢神経から、実施例２と同様の方法でRNAを抽出し、RT-PCRにて4R-タウ及び3R-タウのmRNAを測定し、それらの比率を算出した。結果を図６に示す。
NK-02、05 ASOは、新生仔マウスの中枢神経において、マウスタウエクソン10のスキッピングを顕著に促進した。
（２）野生型成体マウス（系統：C57BL/6J、性別：オス、約12週齢（各n=1匹））に、種々の濃度（5、10、25、50、100μg）のNK-02、05 ASOを、側脳室内ボーラス投与し、投与1週後に大脳皮質及び海馬から、実施例２と同様の方法でRNAを抽出し、RT-PCRにて4R-タウ及び3R-タウのmRNAを測定し、それらの比率を算出した。結果を図７−１に示す。
NK-05 ASOは、大脳皮質、海馬のいずれにおいても、用量依存的にマウスタウエクソン10のスキッピングを促進した。NK-02 ASOも、海馬において用量依存的にマウスタウエクソン10のスキッピングを促進したが、その効果はNK-05 ASOの方が高かった。
（３）次に、野生型成体マウス（系統：C57BL/6J、性別：オス、約12週齢（各n=1匹））に、NK-02、05 ASOを100μg、側脳室内ボーラス投与し、投与2、4、6、8、10、12週間後に大脳皮質及び海馬から、実施例２と同様の方法でRNAを抽出し、RT-PCRにて4R-タウ及び3R-タウのmRNAを測定し、それらの比率を算出した。結果を図８に示す。
NK-02、05 ASOの効果は、少なくとも12週間という長期にわたって持続した。この間良好な生体忍容性も認められた。【００９３】
実施例６−２  タウオパチーモデルマウスに対する亢進性ASOの用量依存的な効果
（１）ヒトタウトランスジーンを保有するヒト化タウマウス（hT-PAC-N）（入手先：Jackson Laboratory、性別：オス、12週齢（各n=5匹））に、種々の濃度（5、10、25、50、100μg）のNK-18 ASOを、側脳室内ボーラス投与し、投与6週後に大脳皮質から、実施例２と同様の方法でRNAを抽出し、RT-PCRにて4R-タウ及び3R-タウのmRNAを測定し、それらの比率を算出した。結果を図７−２（上図）に示す。
NK-18 ASOは、大脳皮質において、用量依存的にマウスタウエクソン10のスキッピングを促進した。
（２）ヒトタウトランスジーンを保有するヒト化タウマウス（hT-PAC-N）（入手先：（１）と同じ、性別：オス、12週齢（各n=3匹））に、種々の濃度（25、50、100μg）のNK-18 ASOを、側脳室内ボーラス投与し、投与6週後に海馬から、RIPAバッファーを用いてタンパク質を抽出し、各20μg タンパク質、抗RD3抗体（#05-803, Millipore）、抗RD4抗体（#05-804, Millipore）を用いてウエスタンブロットを行い、4R-タウ及び3R-タウタンパク質を測定し、それらの比率を算出した。結果を図７−２（下図）に示す。
NK-18は該モデルマウスの中枢神経において、4R/3R-タウタンパク質比率の低下を示した。【００９４】
実施例７  タウオパチーモデルマウスに対する亢進性ASOの効果
（１）ヒトタウトランスジーンを保有するヒト化タウマウス（hT-PAC-N）（入手先：Jackson Laboratory（#17326）の新生仔、性別：オスまたはメス（各4〜6匹））に、NK-02、05、18 ASOを10μg、側脳室内ボーラス投与し、投与1週間後に中枢神経から、実施例２と同様の方法でRNAを抽出し、RT-PCRにて4R-タウ及び3R-タウのmRNAを測定し、それらの比率を算出した。結果を図９（新生仔）に示す。
NK-05 ASOは、新生仔モデルマウスの中枢神経において、マウスタウエクソン10のスキッピングを顕著に促進した。NK-02、18 ASOも有意差はないものの、タウエクソン10のスキッピングを促進する傾向を示した。
（２）ヒトタウトランスジーンを保有するヒト化タウマウス（hT-PAC-N）（入手先：（１）と同じ、性別：オス、12週齢（各n=1匹））に、NK-02、05、18 ASOを100μg、側脳室内ボーラス投与し、投与6週後に大脳皮質及び海馬（成体）から、実施例２と同様の方法でRNAを抽出し、RT-PCRにて4R-タウ及び3R-タウのmRNAを測定し、それらの比率を算出した。結果を図１０（成体）に示す。
成体モデルマウスでは、NK-02、NK-05及びNK-18 ASOのいずれもが、大脳皮質及び海馬の両方において、マウスタウエクソン10のスキッピングを顕著に促進した。中でも、NK-05 ASOが最も強力にタウエクソン10スキッピングを促進した。
（３）AAV-shRNAを導入してFUSをノックダウンした孤発性FTDモデルマウス（入手先：（１）のhT-PAC-NにAAV-shFUSをinjectionして作成（Cell Reports（2017）18: 1118-1131）、性別：オス、6週齢）に、NK-05、18 ASOを100μg、側脳室内ボーラス投与し、投与6週後に中枢神経から、実施例２と同様の方法でRNAを抽出し、RT-PCRにて4R-タウ及び3R-タウのmRNAを測定し、それらの比率を算出した。結果を図１１−１に示す。
NK-05（n=3）は該モデルマウスの中枢神経において、4R/3R-タウmRNA比率を顕著に低下した（図１１−１左）。
同様に、海馬より、RIPAバッファーを用いてタンパク質を抽出し、各20μg タンパク質、抗RD3抗体（#05-803, Millipore）、抗RD4抗体（#05-804, Millipore）を用いてウエスタンブロットを行い、4R-タウ及び3R-タウタンパク質を測定し、それらの比率を算出した。NK-05、18（n=2）は該モデルマウスの中枢神経において、4R/3R-タウタンパク質比率の低下ないしその傾向を示した（図１１−１右）。
（４）コントロールAAV-shRNA（shCont）を導入したマウス又はAAV-shRNAを導入してFUSをノックダウンした孤発性FTDモデルマウス（入手先：（３）と同じ、性別：オス、6週齢（各n=3匹））に、NK-18 ASOを50μg、側脳室内ボーラス投与し、投与6週後に海馬から、実施例２と同様の方法でRNAを抽出し、RT-PCRにて4R-タウ及び3R-タウのmRNAを測定し、それらの比率を算出した。結果を図１１−２（上図）に示す。
NK-18は該モデルマウスの中枢神経において、4R/3R-タウmRNA比率を顕著に低下した。
同様に、海馬より、RIPAバッファーを用いてタンパク質を抽出し、各20μg タンパク質、抗RD3抗体（#05-803, Millipore）、抗RD4抗体（#05-804, Millipore）を用いてウエスタンブロットを行い、4R-タウ及び3R-タウタンパク質を測定し、それらの比率を算出した。結果を図１１−２（下図）に示す。
NK-18は該モデルマウスの中枢神経において、4R/3R-タウタンパク質比率の低下を示した。【００９５】
実施例８  ASOの脳内分布・神経細胞内取込み
（１）蛍光（FITC）抱合したNK-18 ASO 100μgを野生型成体マウスに側脳室内ボーラス投与し、投与1週間後に脳の各部位における該ASOの分布を調べた。結果を図１２−１に示す。
ASOの広範囲な脳内分布、及び神経細胞内への高い取込みが確認できた。DAPIは核染色でここでは脳全体の形状を示す。
（２）NK-18 ASO 50μgを側脳室内ボーラス投与し、抗ENA修飾ASO抗体（受注抗体, (株)メイベル）により、投与1ヶ月後に脳内及び神経細胞内における該ASOの分布を調べた。結果を図１２−２に示す。
ASOの広範囲な脳内分布、及び神経細胞内への高い取込みが確認できた。【００９６】
実施例９  ASOの孤発性FTDモデルマウスのASO治療効果
本実施例では、成体孤発性FTDモデルマウス（ヒト化タウ及びFUS KDマウス）への100μg NK-18の側脳室内ボーラス投与による情動異常行動の改善を示す。
（１）hT-PAC-Nマウスの両側海馬へのコントロールAAV-shRNA（shCont）あるいはAAV-shFUSの投与4週後に、ASOを側脳室内ボーラス投与した。情動異常行動はElevated plus maze testにより解析した。結果を図１３−１に示す。
shFUSによってOpen armへの滞在時間が増加するが（shFUS+NK-41、n=3）、NK-18投与により滞在時間が短縮された（shFUS+NK-18、n=4）。
（２）（１）と同様の実験を、多数例で行った（（１）の測定匹数と追加実験の測定匹数の合計値として、shCont+NK-41:各n=28匹、shFUS+NK-41：各n=27匹、shFUS+NK-18、各n=26匹）。結果を図１３−２に示す。
上記と同様に、shFUSによってOpen armへの滞在時間が増加するが（shFUS+NK-41）、NK-18投与により滞在時間が短縮された（shFUS+NK-18）。反対に、shFUSによってClosed armへの滞在時間が短縮されたが（shFUS+NK-41）、NK-18投与により滞在時間が増加した（shFUS+NK-18）。【００９７】
実施例１０  FUSをノックダウンした運動ニューロンを用いた亢進性ASOの効果
既報告（Mol Brain. 2015; 8: 79.）記載の方法に従い、ヒトiPS細胞を運動ニューロンに分化誘導し、AAV-shFUS 及び20nM又は40nMの各ASOの同時投与4週間後にRNAを抽出し、qRT-PCRにて4R-タウ及び3R-タウのmRNAを測定した（n=3）。結果を図１４に示す。AAV-shFUSにより4R-タウmRNA発現は増加し、NK-18により（20nM及び40nM）ではそのmRNA発現量は著明に減少した。shContはコントロールAAV-shRNA、NK-41はコントロールASOを示す。
【産業上の利用可能性】
【００９８】
本発明のASOは、高いタウスプライシング制御力と長期生体内安定性とを併せ持ち、マウス脳室内投与により忍容性も確認されているので、少ない投与量と投与回数で、タウオパチーに対して優れた治療効果を発揮することが期待される。従って、本発明のASOは、これまで有効な治療法のなかったタウオパチーに対して、新規な治療手段を提供するだけでなく、投与の負担が少なく、低侵襲性であり、有害事象の発現を抑制することができ、患者のQOL改善にも有用である。さらに、製造コスト（医療費）の削減にもつながる。
また、本発明のASOを用いれば、4R/3R-タウ発現比率を高度に制御することができるので、培養細胞や動物のタウオパチーモデル作製にも応用可能であり、タウオパチーの病態解明、治療及び／又は予防薬のスクリーニングに非常に有用である。【００９９】
本出願は、日本で出願された特願２０１８−１２７８７２(出願日：２０１８年７月４日)を基礎としており、その内容は本明細書に全て包含されるものである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７−１】
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【図７−２】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１−１】
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【図１１−２】
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【図１２−１】
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【図１２−２】
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【図１３−１】
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【図１３−２】
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【図１４】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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