(57)【要約】  細胞外マトリックス構成タンパク質を含有するゲルの表面上にて、ＦＧＦタンパク質の存在下、胚様体を培養する工程を含む、心臓オルガノイド及び／又は肺オルガオルガノイドの製造方法。
2019066059.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞外マトリックス構成タンパク質を含有するゲルの表面上にて、ＦＧＦタンパク質の存在下で胚様体を培養する工程を含む、心臓オルガノイド及び／又は肺オルガノイドの製造方法。
【請求項２】
ＦＧＦタンパク質の存在下で培養する前記工程の後に、更に、ＦＧＦタンパク質、ＢＭＰ及びＬＩＦの存在下で培養する工程を含む、請求項１に記載の製造方法。
【請求項３】
胚様体を培養する前記工程が、前記ゲルの表面上にて、ＦＧＦタンパク質及びＲｈｏ結合キナーゼ阻害剤の存在下で胚様体を培養する工程である、請求項１に記載の製造方法。
【請求項４】
前記細胞外マトリックス構成タンパク質が、ラミニン及びエンタクチンからなる群から選択される少なくとも１つを含むタンパク質である、請求項１〜３のうちのいずれか一項に記載の製造方法。
【請求項５】
前記細胞外マトリックス構成タンパク質が、コラーゲン、プロテオグリカンを含まないタンパク質である、請求項１〜４のうちのいずれか一項に記載の製造方法。
【請求項６】
前記胚様体が、ＬＩＦの非存在下、多能性幹細胞を浮遊培養してなる細胞塊である、請求項１〜５のうちのいずれか一項に記載の製造方法。
【請求項７】
細胞外マトリックス構成タンパク質を含有する溶液又はゲルと、ＦＧＦタンパク質と、胚様体を培養するための培地とを含む、心臓オルガノイド及び／又は肺オルガノイドを製造するためのキット。
【請求項８】
ＢＭＰ、ＧＳＫ−３阻害剤、ＬＩＦ及びＲｈｏ結合キナーゼ阻害剤から成る群より選択される少なくとも一つを更に含む、請求項７に記載のキット。
【請求項９】
前記細胞外マトリックス構成タンパク質が、ラミニン及びエンタクチンからなる群から選択される少なくとも１つを含むタンパク質である、請求項７又は８に記載のキット。
【請求項１０】
前記細胞外マトリックス構成タンパク質が、コラーゲン及びプロテオグリカンを含まないタンパク質である、請求項７〜９のうちのいずれか一項に記載のキット。
【請求項１１】
多能性幹細胞を浮遊培養により胚様体にするための、ＬＩＦを含有しない培地を、更に含む、請求項７〜１０のうちのいずれか一項に記載のキット。
【請求項１２】
細胞外マトリックス構成タンパク質を含有するゲルの表面上にて、ＦＧＦタンパク質の存在下、胚様体を培養してなる、心臓オルガノイド、肺オルガノイド、又はこれらオルガノイドの断片若しくは細胞。
【請求項１３】
生体への移植に用いるための、請求項１２に記載の心臓オルガノイド、肺オルガノイド、又はこれらオルガノイドの断片若しくは細胞。
【請求項１４】
ＦＧＦタンパク質の存在下で培養した後に、更に、ＦＧＦタンパク質、ＢＭＰ及びＬＩＦの存在下で培養してなる、請求項１２又は１３に記載の心臓オルガノイド、肺オルガノイド、又はこれらオルガノイドの断片若しくは細胞。
【請求項１５】
前記ゲルの表面上にて、ＦＧＦタンパク質及びＲｈｏ結合キナーゼ阻害剤の存在下で胚様体を培養してなる、請求項１２又は１３に記載の心臓オルガノイド、肺オルガノイド、又はこれらオルガノイドの断片若しくは細胞。
【請求項１６】
前記細胞外マトリックス構成タンパク質が、ラミニン及びエンタクチンからなる群から選択される少なくとも１つを含むタンパク質である、請求項１２〜１５のうちのいずれか一項に記載の心臓オルガノイド、肺オルガノイド、又はこれらオルガノイドの断片若しくは細胞。
【請求項１７】
前記細胞外マトリックス構成タンパク質が、コラーゲン及びプロテオグリカンを含まない、請求項１２〜１６のうちのいずれか一項に記載の心臓オルガノイド、肺オルガノイド、又はこれらオルガノイドの断片若しくは細胞。
【請求項１８】
前記胚様体が、ＬＩＦの非存在下、多能性幹細胞を浮遊培養してなる細胞塊である、請求項１２〜１７のうちのいずれか一項に記載の心臓オルガノイド、肺オルガノイド、又はこれらオルガノイドの断片若しくは細胞。
【請求項１９】
前記多能性幹細胞が、心臓疾患又は肺疾患の罹患者に由来する多能性幹細胞である、請求項１８に記載の、心臓オルガノイド、肺オルガノイド、又はこれらオルガノイドの断片若しくは細胞。
【請求項２０】
化合物の心臓に対する毒性を評価するための方法であって、
請求項１２〜１９のうちのいずれか一項に記載の心臓オルガノイドと、被験化合物とを接触させ、該心臓オルガノイドの状態を検出する工程と、
前記工程にて検出される状態において、悪化が認められれば、前記被験化合物は心臓に対して毒性を有する化合物であると判定する工程とを、
含む方法。
【請求項２１】
化合物の心臓疾患の治療活性を評価するための方法であって、
心臓疾患を呈する請求項１２〜１９のうちのいずれか一項に記載の心臓オルガノイドと、被験化合物とを接触させ、該心臓オルガノイドの状態を検出する工程と、
前記工程にて検出される状態において、前記心臓疾患に対する治療効果が認められれば前記被験化合物は前記心臓疾患に対する治療活性を有する化合物であると判定する工程とを、
含む方法。
【請求項２２】
化合物の肺に対する毒性を評価するための方法であって、
請求項１２〜１９のうちのいずれか一項に記載の肺オルガノイドと、被験化合物とを接触させ、該肺オルガノイドの状態を検出する工程と、
前記工程にて検出される状態において、悪化が認められれば、前記被験化合物は肺に対して毒性を有する化合物であると判定する工程とを、
含む方法。
【請求項２３】
化合物の肺疾患の治療活性を評価するための方法であって、
肺疾患を呈する請求項１２〜１９のうちのいずれか一項に記載の肺オルガノイドと、被験化合物とを接触させ、該肺オルガノイドの状態を検出する工程と、
前記工程にて検出される状態において、前記肺疾患に対する治療効果が認められれば前記被験化合物は前記肺疾患に対する治療活性を有する化合物であると判定する工程とを、
含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、臓器オルガノイド及びその製造方法に関する。本発明は特に、心臓オルガノイド及び／又は肺オルガノイドの製造方法、及び当該方法によって製造された心臓オルガノイド、肺オルガノイド、又はこれらオルガノイドの断片若しくは細胞に関する。また、本発明は、前記製造方法に用いられるキットに関する。さらに、本発明は、前記心臓オルガノイド又は前記肺オルガノイドを用いた、化合物の当該臓器に対する毒性を評価する方法、及び化合物の前記臓器に関する疾患に対する治療活性を評価する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
心臓は、血液の循環を律動的な収縮によって担い、動物が生存する上で極めて重要な臓器である。当該臓器は、内皮細胞、心筋細胞及び平滑筋細胞といった様々な種類の細胞によって構成され、また律動的な収縮を可能とするため、これら機能及び形態が異なる細胞群は、その発生過程において、繊細かつ精巧に心臓に配置されることとなる。【０００３】
心臓の発生においては、先ず１次心臓領域及び２次心臓領域を含む心原基が形成される。次いで、左右両側の細胞が融合することによって、管状形態をとる心筒が形成される。そして、この心筒がルーピングすることにより屈曲心筒が形成され、さらに心房腔及び心室腔が生じる。また、これらの過程において、各機能を担う細胞に分化、連携することによって、複雑な三次元構造を有しつつも、協調性を有する機能的な臓器として、心臓は完成することになる。【０００４】
このような心臓への分化誘導を試験管内にて再現すべく、様々な方法が開発されており、多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞、ＥＳ細胞）を試験管内にて心臓系の細胞に分化誘導する方法、単層培養条件下にて、胚様体（ＥＢ）由来心筋前駆細胞を介し、様々な種類の心臓細胞を作製する方法、体細胞から細胞系譜特異的ダイレクトリプログラミングによって心筋前駆細胞を誘導する方法等が報告されている（特許文献１、非特許文献１〜９）。【０００５】
このように、多種多様な心臓への分化誘導方法によって、多能性幹細胞から特定の種類の心臓細胞は作製できるようになったにも関わらず、上述の心臓の構造上の複雑さ故か、異なる細胞群が繊細かつ精巧に配置された機能的な三次元心臓の作製は、いまだもって達成されていない。【０００６】
また、心臓に限らず、このような機能的な三次元構造を有する臓器（所謂オルガノイド等）は、再生医療、創薬研究、安全性試験等の様々な用途において有用である。例えば、再生医療では、多能性幹細胞等から分化誘導された臓器そのものを移植することによって、その失われた機能を回復することが可能となる。また、創薬研究においては、患者由来の疾患特異的な多能性幹細胞等から分化誘導された臓器を解析、スクリーニングに供することによって、当該疾患に対する新薬の開発に大きく貢献する。また、安全性試験は、通常動物、細胞を対象として行なわれる。生体の薬物応答は様々な細胞の相互作用によって生じるため、細胞単体で評価を行なうより臓器を対象とすることにより、薬物の安全性を高い精度にて解析し得る可能性がある。【０００７】
そのため、多能性幹細胞又は成体幹細胞の三次元培養方法は、昨今精力的に進められており、生体内における臓器形成を模倣した、脳、胃、腸組織といった内胚葉及び外胚葉組織へのインビトロ分化誘導は可能となっている（非特許文献１０及び１１）。【０００８】
しかしながら、上述のとおり、三次元構造を備えた機能的な心臓等の分化誘導法は、未だ開発されていなかった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】国際公開２０１６／０４３１６８号
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Ｋａｔｔｍａｎ，Ｓ．Ｊ．ら、Ｄｅｖ  Ｃｅｌｌ  １１，７２３−７３２，ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｄｅｖｃｅｌ．２００６．１０．００２（２００６）．
【非特許文献２】Ｋａｔｔｍａｎ，Ｓ．Ｊ．ら、Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  ８，２２８−２４０，ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｓｔｅｍ．２０１０．１２．００８（２０１１）．
【非特許文献３】Ｍｏｒｅｔｔｉ，Ａ．ら、Ｃｅｌｌ  １２７，１１５１−１１６５，ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｃｅｌｌ．２００６．１０．０２９（２００６）．
【非特許文献４】Ｍａｕｒｉｔｚ，Ｃ．ら、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  １１８，５０７−５１７，ｄｏｉ：１０．１１６１／ＣＩＲＣＵＬＡＴＩＯＮＡＨＡ．１０８．７７８７９５（２００８）．
【非特許文献５】Ｋｏｕｓｋｏｆｆ，Ｖ．ら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １０２，１３１７０−１３１７５，ｄｏｉ：１０．１０７３／ｐｎａｓ．０５０１６７２１０２（２００５）．
【非特許文献６】Ｆｅｈｌｉｎｇ，Ｈ．Ｊ．ら、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １３０，４２１７−４２２７，ｄｏｉ：１０．１２４２／ｄｅｖ．００５８９（２００３）．
【非特許文献７】Ｎａｒａｚａｋｉ，Ｇ．ら、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  １１８，４９８−５０６，ｄｏｉ：１０．１１６１／ＣＩＲＣＵＬＡＴＩＯＮＡＨＡ．１０８．７６９５６２（２００８）．
【非特許文献８】Ｙａｍａｓｈｉｔａ，Ｊ．Ｋ．ら、ＦＡＳＥＢ  Ｊ  １９，１５３４−１５３６，ｄｏｉ：１０．１０９６／ｆｊ．０４−３５４０ｆｊｅ（２００５）．
【非特許文献９】Ｚｈａｎｇ  Ｊ．ら、Ｃｉｒｃ  Ｒｅｓ．１１１（９），１１２５−３６．ｄｏｉ：  １０．１１６１／ＣＩＲＣＲＥＳＡＨＡ．１１２．２７３１４４（２０１２）．
【非特許文献１０】Ｈｕｃｈ，Ｍ．＆Ｋｏｏ，Ｂ．Ｋ．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １４２，３１１３−３１２５，ｄｏｉ：１０．１２４２／ｄｅｖ．１１８５７０（２０１５）．
【非特許文献１１】Ｎｏｇｕｃｈｉ，Ｔ．Ｋ．ら、Ｎａｔ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ１７，９８４−９９３，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｃｂ３２００（２０１５）．
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明は、前記従来技術の有する課題に鑑みてなされたものであり、三次元構造を備えた機能的な心臓オルガノイド等の臓器オルガノイド、及びそれらの製造方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明者らは、前記目的を達成すべく鋭意研究を重ねた結果、マウスＥＳ細胞由来の胚様体を、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）の存在下、細胞外マトリックスを構成する、ラミニン及びエンタクチン、又は、ラミニンからなる複合体の表面上にて培養することによって、三次元構造を備えた心臓オルガノイドが形成されることを明らかにした。【００１３】
また、得られた心臓オルガノイドにおいて、血管内皮細胞のマーカーである血小板／内皮細胞接着分子−１（ＰＥＣＡＭ）／ＣＤ３１、平滑筋のマーカーであるα平滑筋アクチン（αＳＭＡ）及び平滑筋ミオシン重鎖（ＳＭ−ＭＨＣ）、並びに心筋のマーカーであるＮｋｘ２−５及び心筋トロポニンIといった様々な種類の細胞マーカーが、各領域特異的に発現していることも明らかにした。さらに、心臓オルガノイドにおいて、成熟心室のマーカーであるＭｌｃ２ｖの発現も、部域性をもって認められた。【００１４】
また、心臓が機能していることの基準となる心筋収縮を示す、自己拍動同様のカルシウム流入が、得られた心臓オルガノイドにおいて生じていることを、カルシウム動態解析によって明らかにした。【００１５】
さらに、上記方法によって、ヒトｉＰＳ細胞からも、胚様体形成を介して、心臓オルガノイドを製造できることを明らかにした。さらにまた、当該方法によれば、心臓オルガノイドのみならず、肺オルガノイドも製造できることを見出し、本発明を完成するに至った。【００１６】
すなわち、本発明は、心臓オルガノイド及び／又は肺オルガノイドの製造方法、及び該方法によって製造された心臓オルガノイド、肺オルガノイド、又はこれらオルガノイドの断片若しくは細胞に関する。また、本発明は、前記製造方法に用いられるキットに関する。さらに、本発明は、前記心臓オルガノイド又は前記肺オルガノイドを用いた、化合物の当該臓器に対する毒性を評価するための方法、及び化合物の前記臓器に関する疾患に対する治療活性を評価するための方法に関し、より具体的には以下を提供する。
＜１＞  細胞外マトリックス構成タンパク質を含有するゲルの表面上にて、ＦＧＦタンパク質の存在下で胚様体を培養する工程を含む、心臓オルガノイド及び／又は肺オルガノイドの製造方法。
＜２＞  ＦＧＦタンパク質の存在下で培養する前記工程の後に、更に、ＦＧＦタンパク質、ＢＭＰ及びＬＩＦの存在下で培養する工程を含む、＜１＞に記載の製造方法。
＜３＞  ＦＧＦタンパク質の存在下で培養する前記工程の後に、更に、ＦＧＦタンパク質、ＢＭＰ、ＬＩＦ及びＧＳＫ−３阻害剤の存在下で培養する工程を含む、＜１＞に記載の製造方法。
＜４＞  胚様体を培養する前記工程が、前記ゲルの表面上にて、ＦＧＦタンパク質及びＲｈｏ結合キナーゼ阻害剤の存在下で胚様体を培養する工程である、＜１＞に記載の製造方法。
＜５＞  前記細胞外マトリックス構成タンパク質が、ラミニン及びエンタクチンからなる群から選択される少なくとも１つを含むタンパク質である、＜１＞〜＜４＞のうちのいずれか一項に記載の製造方法。
＜６＞  前記細胞外マトリックス構成タンパク質が、コラーゲン、プロテオグリカンを含まないタンパク質である、＜１＞〜＜５＞のうちのいずれか一項に記載の製造方法。
＜７＞  前記胚様体が、ＬＩＦの非存在下、多能性幹細胞を浮遊培養してなる細胞塊である、＜１＞〜＜６＞のうちのいずれか一項に記載の製造方法。
＜８＞  細胞外マトリックス構成タンパク質を含有する溶液又はゲルと、ＦＧＦタンパク質と、胚様体を培養するための培地とを含む、心臓オルガノイド及び／又は肺オルガノイドを製造するためのキット。
＜９＞  ＢＭＰ、ＧＳＫ−３阻害剤、ＬＩＦ及びＲｈｏ結合キナーゼ阻害剤から成る群より選択される少なくとも一つを更に含む、＜８＞に記載のキット。
＜１０＞  前記細胞外マトリックス構成タンパク質が、ラミニン及びエンタクチンからなる群から選択される少なくとも１つを含むタンパク質である、＜８＞又は＜９＞に記載のキット。
＜１１＞  前記細胞外マトリックス構成タンパク質が、コラーゲン及びプロテオグリカンを含まないタンパク質である、＜８＞〜＜１０＞のうちのいずれか一項に記載のキット。
＜１２＞  多能性幹細胞を浮遊培養により胚様体にするための、ＬＩＦを含有しない培地を、更に含む、＜８＞〜＜１１＞のうちのいずれか一項に記載のキット。
＜１３＞  細胞外マトリックス構成タンパク質を含有するゲルの表面上にて、ＦＧＦタンパク質の存在下、胚様体を培養してなる、心臓オルガノイド、肺オルガノイド、又はこれらオルガノイドの断片若しくは細胞。
＜１４＞  生体への移植に用いるための、＜１３＞に記載の心臓オルガノイド、肺オルガノイド、又はこれらオルガノイドの断片若しくは細胞。
＜１５＞  ＦＧＦタンパク質の存在下で培養した後に、更に、ＦＧＦタンパク質、ＢＭＰ及びＬＩＦの存在下で培養してなる、＜１３＞又は＜１４＞に記載の心臓オルガノイド、肺オルガノイド、又はこれらオルガノイドの断片若しくは細胞。
＜１６＞  ＦＧＦタンパク質の存在下で培養した後に、更に、ＦＧＦタンパク質、ＢＭＰ、ＬＩＦ及びＧＳＫ−３阻害剤の存在下で培養してなる、＜１３＞又は＜１４＞に記載の心臓オルガノイド、肺オルガノイド、又はこれらオルガノイドの断片若しくは細胞。
＜１７＞  前記ゲルの表面上にて、ＦＧＦタンパク質及びＲｈｏ結合キナーゼ阻害剤の存在下で胚様体を培養してなる、＜１３＞又は＜１４＞に記載の心臓オルガノイド、肺オルガノイド、又はこれらオルガノイドの断片若しくは細胞。
＜１８＞  前記細胞外マトリックス構成タンパク質が、ラミニン及びエンタクチンからなる群から選択される少なくとも１つを含むタンパク質である、＜１３＞〜＜１７＞のうちのいずれか一項に記載の心臓オルガノイド、肺オルガノイド、又はこれらオルガノイドの断片若しくは細胞。
＜１９＞  前記細胞外マトリックス構成タンパク質が、コラーゲン及びプロテオグリカンを含まない、＜１３＞〜＜１８＞のうちのいずれか一項に記載の心臓オルガノイド、肺オルガノイド、又はこれらオルガノイドの断片若しくは細胞。
＜２０＞  前記胚様体が、ＬＩＦの非存在下、多能性幹細胞を浮遊培養してなる細胞塊である、＜１３＞〜＜１８＞のうちのいずれか一項に記載の心臓オルガノイド、肺オルガノイド、又はこれらオルガノイドの断片若しくは細胞。
＜２１＞  前記多能性幹細胞が、心臓疾患又は肺疾患の罹患者に由来する多能性幹細胞である、＜２０＞に記載の、心臓オルガノイド、肺オルガノイド、又はこれらオルガノイドの断片若しくは細胞。
＜２２＞  化合物の心臓に対する毒性を評価するための方法であって、
＜１３＞〜＜２１＞のうちのいずれか一項に記載の心臓オルガノイドと、被験化合物とを接触させ、該心臓オルガノイドの状態を検出する工程と、
前記工程にて検出される状態において、悪化が認められれば、前記被験化合物は心臓に対して毒性を有する化合物であると判定する工程とを、
含む方法。
＜２３＞  化合物の心臓疾患の治療活性を評価するための方法であって、
心臓疾患を呈する＜１３＞〜＜２１＞のうちのいずれか一項に記載の心臓オルガノイドと、被験化合物とを接触させ、該心臓オルガノイドの状態を検出する工程と、
前記工程にて検出される状態において、前記心臓疾患に対する治療効果が認められれば前記被験化合物は前記心臓疾患に対する治療活性を有する化合物であると判定する工程とを、
含む方法。
＜２４＞  化合物の肺に対する毒性を評価するための方法であって、
＜１３＞〜＜２１＞のうちのいずれか一項に記載の肺オルガノイドと、被験化合物とを接触させ、該肺オルガノイドの状態を検出する工程と、
前記工程にて検出される状態において、悪化が認められれば、前記被験化合物は肺に対して毒性を有する化合物であると判定する工程とを、
含む方法。
＜２５＞  化合物の肺疾患の治療活性を評価するための方法であって、
肺疾患を呈する＜１３＞〜＜２１＞のうちのいずれか一項に記載の肺オルガノイドと、被験化合物とを接触させ、該肺オルガノイドの状態を検出する工程と、
前記工程にて検出される状態において、前記肺疾患に対する治療効果が認められれば前記被験化合物は前記肺疾患に対する治療活性を有する化合物であると判定する工程とを、
含む方法。
【発明の効果】
【００１７】
本発明によれば、三次元構造を備えた機能的な心臓オルガノイド及び肺オルガノイドを提供することが可能となる。特に、これら臓器を構成する様々な種類の細胞（心臓においては、内皮細胞、心筋細胞及び平滑筋細胞等、肺においては、肺胞上皮細胞等）の各々に適合させた複雑な分化誘導方法を要することなく、心臓オルガノイド及び肺オルガノイドを製造することができる。【００１８】
さらに、本発明の心臓オルガノイドにおいて、各種細胞の部域性は生体内におけるそれらを忠実に再現しており、さらに心筋収縮等の機能も発揮するものである。また、本発明の肺オルガノイドも、その機能を発揮する上で重要な構造である肺胞を備えるものである。このため、本発明の臓器オルガノイドを用いれば、対応する臓器に対する化合物の毒性及び当該臓器に関する疾患に対する化合物の治療活性を評価することもできる。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】マウス胚発生における心臓の形成過程（上段）及び本発明のマウスＥＳ細胞から心臓オルガノイドの製造工程（下段）を示す、概略図である。
【図２】本発明の方法によって作製された、マウスＥＳ細胞由来の心臓オルガノイド（胚様体をＦＧＦ４存在下、ゲル化ラミニン（ＬＮ）／エンタクチン（ＥＴ）複合体上にて１０〜１１日培養して発生させた心臓オルガノイド）の代表例を示す、顕微鏡写真である。図中、スケールバーは１００μｍを表す。
【図３】本発明の方法によって作製された、マウスＥＳ細胞由来の心臓オルガノイド（培養１１日目）の代表例を示す、顕微鏡写真である。
【図４】本発明のマウスＥＳ細胞由来心臓オルガノイドの形成過程（胚様体を、ＦＧＦ４存在下、ゲル化ＬＮ／ＥＴ）複合体上にて培養してから０〜１５日目）と、マウス胚発生における心臓の形成過程（胎生９．５〜１３．５日目）とを示す、顕微鏡写真である。図中、スケールバー（赤色）は１ｍｍを、スケールバー（黄色）は１００μｍを表す。
【図５】自発的な拍動を示す心臓オルガノイドの割合を示すグラフである（ｎ＝８４、６つの独立した実験の結果を示す）。
【図６】胚様体からの形態変化が認められた心臓オルガノイドの割合を示すグラフである（ｎ＝８４、６つの独立した実験の結果を示す）。
【図７】形態的特徴を伴う心臓オルガノイドの発生頻度を示すグラフである（ｎ＝８４、６つの独立した実験の結果を示す）。図中、各培養期間（培養３日目、培養５〜６日目、培養９日目、培養１０〜１５日目）において、左から順にＳｂ（芽を伴う球状となった心臓オルガノイド前駆体）、ＣＣＬ（心原基様構造が認められた心臓オルガノイド）、ＨＴ（心筒様構造を形成した心臓オルガノイド）、ＬＨＴ（屈曲心筒様構造を形成した心臓オルガノイド）、ＬＨＴ  ｏｒ  ＣＦ（屈曲心筒様構造を形成又は心腔形成が認められた心臓オルガノイド）、ＣＦ（心腔形成が認められた心臓オルガノイド）の割合を示す。
【図８】マウス胎児の心臓（胎生９．５〜１３．５日）、胚様体（ＥＢ）及びＨＯ（心臓オルガノイド）の平均サイズを示すグラフである。なお、サイズは各長径の平均値を示す。
【図９】マウスＥＳ細胞５００個を用いた本発明の心臓オルガノイドの製造工程において、自発的な拍動を示す心臓オルガノイドの割合を示すグラフである。
【図１０】マウスＥＳ細胞５００個を用いた本発明の心臓オルガノイドの製造工程において、形態的特徴を伴う心臓オルガノイドの発生頻度を示すグラフである。図中の表記は、図７と同様である。
【図１１】マウスＥＳ細胞５００個を用いた本発明の心臓オルガノイドの製造工程における、胚様体（ＥＢ）及びＨＯ（心臓オルガノイド）の平均サイズを示すグラフである。なお、サイズは各長径の平均値を示す。
【図１２】マウス胎児の心臓（胎生９．５日目及び１０．５日目）において、ＰＥＣＡＭ及びＴｂｘ５の発現を、蛍光免疫染色によって検出した結果を示す、顕微鏡写真である。図中、Ｔｂｘ５の発現は緑色にて示され、ＰＥＣＡＭの発現は赤色にて示される。また、ＤＡＰＩによる対比染色の結果は青色にて示される。
【図１３】マウス胎児の心臓（胎生１１．５日目及び１２．５日目）において、ＰＥＣＡＭ及びＴｂｘ５の発現を、蛍光免疫染色によって検出した結果を示す、顕微鏡写真である。図中、Ｔｂｘ５の発現は緑色にて示され、ＰＥＣＡＭの発現は赤色にて示される。また、ＤＡＰＩによる対比染色の結果は青色にて示される。
【図１４】本発明のマウスＥＳ細胞由来心臓オルガノイドにおいて、ＰＥＣＡＭ及びＴｂｘ５の発現を、蛍光免疫染色によって検出した結果を示す、顕微鏡写真である。図中、Ｔｂｘ５の発現は緑色にて示され、ＰＥＣＡＭの発現は赤色にて示される。また、ＤＡＰＩによる対比染色の結果は青色にて示される。また、スケールバーは１００μｍを表す。
【図１５】本発明のマウスＥＳ細胞由来心臓オルガノイドにおいて、ＭＨＣ及びＴｂｘ５の発現を、蛍光免疫染色によって検出した結果を示す、顕微鏡写真である。図中、Ｔｂｘ５の発現は緑色にて示され、ＭＨＣの発現はピンク色にて示される。また、ＤＡＰＩによる対比染色の結果は青色にて示される。スケールバーは１００μｍを表す。また、図中、「ｆｉｒｓｔ  ｈｅａｒｔ  ｆｉｅｌｄ」及び「ｓｅｃｏｎｄ  ｈｅａｒｔ  ｆｉｅｌｄ」は、各々１次心臓領域及び２次心臓領域であることを示し、「ＲＡ」、「ＲＶ」、「ＬＡ」及び「ＬＶ」は、各々右心房、右心室、左心房及び左心室であることを示す。
【図１６】本発明のマウスＥＳ細胞由来心臓オルガノイド及びマウス胎児の心臓（胎生１１．５日目）において、ＭＨＣ及びＴｂｘ５の発現を、蛍光免疫染色によって検出した結果を示す、顕微鏡写真である。図中、上段左側の写真は、心臓オルガノイドを明視野にて顕微鏡観察した結果を示し、上段右側の写真は、心臓オルガノイドを蛍光顕微鏡にて観察した結果を示し、下段の写真は、マウス胎児の心臓を蛍光顕微鏡にて観察した結果を示す。また、これら蛍光顕微鏡写真において、Ｔｂｘ５の発現は緑色にて示され、ＭＨＣの発現はピンク色にて示される。また、ＤＡＰＩによる対比染色の結果は青色にて示される。
【図１７】本発明のマウスＥＳ細胞由来心臓オルガノイドにおいて、Ｍｌｃ２ａ及びＭｌｃ２ｖの発現を、蛍光免疫染色によって検出した結果を示す、顕微鏡写真である。図中、Ｍｌｃ２ａの発現はピンク色にて示され、Ｍｌｃ２ｖの発現は緑色にて示される。また、ＤＡＰＩによる対比染色の結果は青色にて示される。スケールバーは１００μｍを表す。
【図１８】マウス胎児の心臓（胎生９．５日目及び１０．５日目）において、Ｍｌｃ２ａ及びＭｌｃ２ｖの発現を、蛍光免疫染色によって検出した結果を示す、顕微鏡写真である。図中、Ｍｌｃ２ａの発現はピンク色にて示され、Ｍｌｃ２ｖの発現は緑色にて示される。また、ＤＡＰＩによる対比染色の結果は青色にて示される。
【図１９】マウス胎児の心臓（胎生１１．５日目及び１２．５日目）において、Ｍｌｃ２ａ及びＭｌｃ２ｖの発現を、蛍光免疫染色によって検出した結果を示す、顕微鏡写真である。図中、Ｍｌｃ２ａの発現はピンク色にて示され、Ｍｌｃ２ｖの発現は緑色にて示される。また、ＤＡＰＩによる対比染色の結果は青色にて示される。
【図２０】本発明のマウスＥＳ細胞由来心臓オルガノイドにおいて、心筋トロポニンI、ＰＥＣＡＭ及びＭＨＣの発現を、蛍光免疫染色によって検出した結果を示す、顕微鏡写真である。図中、心筋トロポニンIの発現は緑色にて示され、ＰＥＣＡＭの発現は赤色にて示され、ＭＨＣの発現はピンク色にて示される。また、ＤＡＰＩによる対比染色の結果は青色にて示される。
【図２１】マウス胎児の心臓（胎生１０．５日目）において、心筋トロポニンI、ＰＥＣＡＭ及びＭＨＣの発現を、蛍光免疫染色によって検出した結果を示す、顕微鏡写真である。図中、心筋トロポニンIの発現は緑色にて示され、ＰＥＣＡＭの発現は赤色にて示され、ＭＨＣの発現はピンク色にて示される。また、ＤＡＰＩによる対比染色の結果は青色にて示される。
【図２２】マウス胎児の心臓（胎生１１．５日目）において、心筋トロポニンI、ＰＥＣＡＭ及びＭＨＣの発現を、蛍光免疫染色によって検出した結果を示す、顕微鏡写真である。図中、心筋トロポニンIの発現は緑色にて示され、ＰＥＣＡＭの発現は赤色にて示され、ＭＨＣの発現はピンク色にて示される。また、ＤＡＰＩによる対比染色の結果は青色にて示される。図中、「ＲＶ」は、右心室であることを示す。
【図２３】マウス胎児の心臓（胎生１２．５日目）において、心筋トロポニンI、ＰＥＣＡＭ及びＭＨＣの発現を、蛍光免疫染色によって検出した結果を示す、顕微鏡写真である。図中、心筋トロポニンIの発現は緑色にて示され、ＰＥＣＡＭの発現は赤色にて示され、ＭＨＣの発現はピンク色にて示される。また、ＤＡＰＩによる対比染色の結果は青色にて示される。図中、「ＲＶ」及び「ＬＶ」は、各々右心室及び左心室であることを示す。
【図２４】本発明のマウスＥＳ細胞由来心臓オルガノイドにおいて、αＳＭＡ及びＮｋｘ２−５の発現を、蛍光免疫染色によって検出した結果を示す、顕微鏡写真である。図中、αＳＭＡの発現は赤色にて示され、Ｎｋｘ２−５の発現は緑色にて示される。また、ＤＡＰＩによる対比染色の結果は青色にて示される。
【図２５】マウス胎児の心臓（胎生９．５、１０．５、１１．５、１２．５日目）において、αＳＭＡ及びＮｋｘ２−５の発現を、蛍光免疫染色によって検出した結果を示す、顕微鏡写真である。図中、αＳＭＡの発現は赤色にて示され、Ｎｋｘ２−５の発現は緑色にて示される。また、ＤＡＰＩによる対比染色の結果は青色にて示される。
【図２６】本発明のマウスＥＳ細胞由来心臓オルガノイド及び胚様体において、Ｏｃｔ４及びネスチンの発現を、蛍光免疫染色によって検出した結果を示す、顕微鏡写真である。図中、Ｏｃｔ４の発現は赤色にて示され、ネスチンの発現は緑色にて示される。また、ＤＡＰＩによる対比染色の結果は青色にて示される。
【図２７】マウス胎児の心臓（胎生９．５、１０．５、１１．５、１２．５日目）において、Ｏｃｔ４及びネスチンの発現を、蛍光免疫染色によって検出した結果を示す、顕微鏡写真である。図中、Ｏｃｔ４の発現は赤色にて示され、ネスチンの発現は緑色にて示される。また、ＤＡＰＩによる対比染色の結果は青色にて示される。
【図２８】本発明のマウスＥＳ細胞由来心臓オルガノイド及びマウス胎児の心臓について、透過型電子顕微鏡を用いて微細構造を解析した結果を示す写真である。図中、「ＨＯ  ｄａｙ１１」及びその下の写真は、心臓オルガノイド（培養１１日目）の解析結果を共に示し、「Ｅ１０．５  ｈｅａｒｔ」及び「Ｅ１１．５  ｈｅａｒｔ」は、マウス胎児心臓（胎生１０．５日目）及びマウス胎児心臓（胎生１１．５日目）の解析結果を各々示す。また、これら胎児心臓の写真において、各左下隅のインセット（ｉｎｓｅｔ）の青い写真は、各心臓の電子顕微鏡用切片をｔｏｌｕｉｄｉｎｅ  ｂｌｕｅ染色し、全体を撮影した結果を示す写真である。各電子顕微鏡写真において、「Ｚ」は、Ｚ線を含むサルコメア構造を示し、「ＩＤ」は、心筋細胞特異的構造である介在板を示し、「Ｇｌｙ」は、グリコーゲンを示し、「ＲＥＲ」は粗面小胞体を示し、「Ｍ」はミトコンドリアを示し、「Ｄ」はデスモソームを示し、「ＬＤ」は、脂肪滴を示す。
【図２９】胚様体、本発明のマウスＥＳ細胞由来心臓オルガノイド、及びマウス胎児心臓（胎生１１．５日目）における心筋細胞を、心筋トロポニンＴ抗体染色後にフローサイトメトリーによって解析した結果を示す図である。図中、左側のパネルは、それぞれ胚様体（ＥＢ）及び培養１２日目の心臓オルガノイド（ＨＯ＿ｄａｙ１２）の代表的なドットプロットを示す。右側のパネルは、胚様体（ＥＢ）、３０ｎｇ／ｍＬのＦＧＦ４存在下にて培養８日目の心臓オルガノイド（ＨＯ＿ｄａｙ８）、３０ｎｇ／ｍＬのＦＧＦ４存在下にて培養１２日目の心臓オルガノイド（ＨＯ＿ｄａｙ１２）、６０ｎｇ／ｍＬのＦＧＦ４存在下にて培養１２日目の心臓オルガノイド（ＨＯ＿ｄａｙ１２Ｆ６０）及び胎生１１．５日目マウス胎児心臓（Ｅ１１．５Ｈ）における、ｃＴｎＴ陽性細胞の割合を示すドットボックスプロットである。図中のＰ値は、Ｔ−ＴＥＳＴによって求めた値である。
【図３０】ＲＮＡ−ｓｅｑ  ｄａｔａを用いた主成分分析（ＰＣＡ）の解析結果を示す図である。図中、青色、黄緑色、緑色、黄色及び赤色の点は、胚様体、培養９日目の本発明のマウスＥＳ細胞由来心臓オルガノイド、培養１３日目の本発明のマウスＥＳ細胞由来心臓オルガノイド、胎生９．５日目の心臓及び胎生１１．５日目の心臓を解析した結果を各々示す。
【図３１】胚様体（ＥＢ）、培養９日目の本発明のマウスＥＳ細胞由来心臓オルガノイド（ｄａｙ９  ＨＯ）、培養１３日目の本発明のマウスＥＳ細胞由来心臓オルガノイド（ｄａｙ１３  ＨＯ）、胎生９．５日目の心臓（Ｅ９．５  Ｈ）及び胎生１１．５日目の心臓（Ｅ１１．５  Ｈ）における遺伝子発現を解析した結果を示す、ヒートマップ及び階層的クラスタリングである。
【図３２】本発明のマウスＥＳ細胞由来心臓オルガノイド（Ｈｅａｒｔ  Ｏｒｇａｎｏｉｄ）と胚様体（ＥＢ）の間に発現に差のある遺伝子を示すＭＡプロットである。図中、調節されたＰ値＜０．０１を有する遺伝子が色で示されている。具体的には、ｌｏｇ２ＦｏｌｄＣｈａｎｇｅ＞５の遺伝子は赤色（３９６遺伝子）で表示され、ｌｏｇ２ＦｏｌｄＣｈａｎｇｅ＜−５の遺伝子は青色（５５個の遺伝子）で表示される。
【図３３】本発明のマウスＥＳ細胞由来心臓オルガノイドにおいて高発現する３９遺伝子（調節されたＰ値＜０．０１、ｌｏｇ２ＦｏｌｄＣｈａｎｇｅ＞５）について、ＧＯ（ｇｅｎｅ  ｏｎｔｏｌｏｇｙ）解析した結果を示す図である。
【図３４】本発明のマウスＥＳ細胞由来心臓オルガノイドで低発現する５５遺伝子（調節されたＰ値＜０．０１、ｌｏｇ２ＦｏｌｄＣｈａｎｇｅ＜−５）について、ＧＯ（ｇｅｎｅ  ｏｎｔｏｌｏｇｙ）解析した結果を示す図である。
【図３５】本発明のマウスＥＳ細胞由来心臓オルガノイド（図中「ＨＯ」）、並びに胎生９．５日目及び１０．５日目のマウス心臓（図中「Ｅ９．５  ｈｅａｒｔ」及び「Ｅ１０．５  ｈｅａｒｔ」）において、心筋トロポニンＴ（図中、その発現は緑色にて表される）とＰｕｒｋｉｎｊｅ  ｆｉｂｅｒで発現するＴＲＰＭ４（図中、その発現は赤色にて表される）の発現を、蛍光免疫染色によって検出した結果を示す、顕微鏡写真である。
【図３６】本発明のマウスＥＳ細胞由来心臓オルガノイド（図中、左側の２写真）及び生後１日目のマウス心臓（図中、右側の写真）における、ｉＫ１（図中、その発現は赤色にて表される）の発現を、蛍光免疫染色によって検出した結果を示す、顕微鏡写真である。なお、図中、右側の写真（Ｐ１  ｈｅａｒｔ）中の左下隅の写真は、生後１日目のマウス心臓組織切片全体を示す顕微鏡写真である
【図３７】本発明のマウスＥＳ細胞由来心臓オルガノイド（図中「ＨＯ」）及び胎生１２．５日目のマウス心臓における、ＲｙＲ（図中、その発現は緑色にて表される）の発現を、蛍光免疫染色によって検出した結果を示す、顕微鏡写真である。なお、図中、右上の写真中の右下隅の写真は、心臓オルガノイド組織切片全体を示す顕微鏡写真である
【図３８】光学マッピングシステムの概要を示す光路図と写真（Ｉｈａｒａら（Ｊ  Ｖｉｓ  Ｅｘｐ．２０１８；（１３２）：５６４７８））である。なお、後述の実施例において、光路図に示すｃａｍｅｒａ  １のみを使用した。また、写真において、中央に見える緑色の円が計測点（直径約３ｍｍ、記録範囲はこの中の２×２ｍｍ）であり、緑色コードの先はフィールドパルス用刺激電極である。
【図３９】本発明のマウスＥＳ細胞由来心臓オルガノイドを、光学マッピングにより電気生理学的に解析した結果を示す図である。
【図４０】本発明のマウスＥＳ細胞由来心臓オルガノイドにおける、Ｃａシグナルの経時的変化を示す図である。図中、上部はイソプロテレノール非存在下における心臓オルガノイドについての解析結果（Ｃｏｎｔｒｏｌ）を示し、下部は１μＭ  イソプロテレノール存在下における心臓オルガノイドについての解析結果を示す。
【図４１】本発明のマウスＥＳ細胞由来心臓オルガノイドを、光学マッピングにより電気生理学的に解析した結果を示す図である。図中、上部はＩＫｒ  ｂｌｏｃｋｅｒであるＥ４０３１添加前の心臓オルガノイドについての解析結果（Ｃｏｎｔｒｏｌ）を示し、下部は１μＭ  Ｅ４０３１添加後の心臓オルガノイドについての解析結果を示す。
【図４２】ラミニン４１１（ＬＮ４１１）、ラミニン２２１（ＬＮ２２１）又はラミニン２２１と４１１を同量混ぜた混合物（ＬＮ４１１：ＬＮ２２１）の表面上にて培養した、本発明のマウスＥＳ細胞由来心臓オルガノイドにおいて、心腔形成が認められたものの割合を示す、グラフである。
【図４３】ラミニン４１１（ＬＮ４１１）、ラミニン２２１（ＬＮ２２１）又はラミニン２２１と４１１を同量混ぜた混合物（ＬＮ２２１-ＬＮ４１１）の表面上にて培養した、本発明のマウスＥＳ細胞由来心臓オルガノイドにおける、心房タイプ心筋で発現するＭｌｃ２ａ（図中、その発現は緑色にて表される）と心室タイプ心筋で発現するＭｌｃ２ｖ（図中、その発現は赤色にて表される）の発現を、蛍光免疫染色によって検出した結果を示す、顕微鏡写真である。なお、図中、右中央の写真（Ｅ１２．５）は、マウス心臓（胎生１２．５日目）を前記蛍光免疫染色によって解析した結果を示す。また、各写真の右下の表記〈ＡＹ１１等）は、各心臓オルガノイドに任意に付したサンプル番号を示す。
【図４４】ラミニン４１１（ＬＮ４１１）、ラミニン２２１（ＬＮ２２１）又はラミニン２２１と４１１を同量混ぜた混合物（ＬＮ２２１−ＬＮ４１１）の表面上にて培養した、本発明のマウスＥＳ細胞由来心臓オルガノイドにおける、心筋トロポニンＴ（図中、その発現は緑色にて表される）とＰｕｒｋｉｎｊｅ  ｆｉｂｅｒで発現するＴＲＰＭ４（図中、その発現は赤色にて表される）の発現を、蛍光免疫染色によって検出した結果を示す、顕微鏡写真である。なお、図中、右中央の写真（Ｅ１０．５）は、マウス心臓（胎生１０．５日目）を前記蛍光免疫染色によって解析した結果を示す。
【図４５】図４３及び４４における心臓オルガノイド「ＡＺ８」の顕微鏡写真（図４５中、左側の２写真）と、図４３及び４４における心臓オルガノイド「ＡＹ１１」の顕微鏡写真（図４５中、右側の２写真）とを、示す図である。
【図４６】本発明において、胚様体を、ＦＧＦ４存在下、ラミニン１１１‐エンタクチン（ＬＮ／ＥＴ複合体）の表面上にて１０日間培養した後、ラミニン４１１又はラミニン４１１とラミニン１１１との混合物上で２１日目迄培養し、得られた心臓オルガノイドを観察した結果を示す、顕微鏡写真である。図中の２写真は、独立して得られた心臓オルガノイド２サンプルを各々観察した結果を示す。
【図４７】本発明のヒトｉＰＳ細胞から心臓オルガノイドの製造工程の概要（上段）、及び当該各工程において観察されるオルガノイド等の顕微鏡写真（下段）を示す、図である。
【図４８】マウス胎児（胎児期（胎生）１０．５〜１２．５日）の肺及び心臓の各発生段階を観察した結果を示す、顕微鏡写真である。
【図４９】条件I〜IV下にて、ヒトｉＰＳ細胞から誘導され得られた臓器オルガノイドの種類及びそれらの割合を示す、グラフである。図中に示す各条件「I、II,III、IV」については、表１を参照のほど。また「ｈｅａｒｔ  ｏｎｌｙ」は、回収時（培養１３日目以降）、心臓オルガノイドのみが認められたことを示し、「ｃｏｍｂｉｎｅｄ  ｈｅａｒｔ  ａｎｄ  ｌｕｎｇ」は、回収時、心臓の部分と肺の部分が繋がっている状態のオルガノイドが認められたことを示す（図５０の右側の２写真を参照のほど）。「Ｓｅｐａｒａｔｅｄ  ｈｅａｒｔ  ａｎｄ  ｌｕｎｇ」は、培養の途中迄は心臓と肺が結合した状態だったが、回収時迄に、心臓の部分と肺の部分が分離されている状態のものが認められたことを示す（図５０の左側の２写真を参照のほど）。「ｌｕｎｇ  ｌｉｋｅ」は、回収時に、肺オルガノイドのみなのか、形態的に心臓と肺が結合しているものなのかはっきりしない状態であったことを示す。「Ｓｅｐａｒａｔｅｄ  ｓｏｆｔ  ｔｉｓｓｕｅ」は、回収時、細胞間の結合力が弱く崩れ易い柔らかい状態であったことを示す。
【図５０】ヒトｉＰＳ細胞から誘導され得られた臓器オルガノイドを観察した結果を示す、顕微鏡写真である。図中、左側の２写真「Ｓｅｐａｒａｔｅｄ  ｈｅａｒｔ  ａｎｄ  ｌｕｎｇ」は、分離して得られた心臓オルガノイドと肺オルガノイドとを示す。なお、上部の写真は、分離したオルガノイドの内、肺オルガノイドのみを観察した結果を示す。右側の２写真「ｃｏｍｂｉｎｅｄ  ｈｅａｒｔ  ａｎｄ  ｌｕｎｇ」は、心臓の部分と肺の部分が繋がっている状態のオルガノイドを示す。
【図５１】本発明のヒトｉＰＳ細胞由来心臓オルガノイドにおいて、Ｔｂｘ５及びＮｋｘ２−５の発現を、蛍光免疫染色によって検出した結果を示す、顕微鏡写真である。図中、Ｔｂｘ５の発現は赤色にて示され（図中、一番左側の写真）、Ｎｋｘ２−５の発現は緑色にて示され（図中、左から２番目の写真）、ＤＡＰＩによる対比染色の結果は青色にて示され（図中、右から２番目の写真）、それらの重ね合わせが、図中、一番右側の写真として表される。
【図５２】本発明のヒトｉＰＳ細胞由来心臓オルガノイドにおいて、Ｍｌｃ−２ｖ及びＭｌｃ−２ａの発現を、蛍光免疫染色によって検出した結果を示す、顕微鏡写真である。図中、Ｍｌｃ−２ｖの発現は緑色にて示され、Ｍｌｃ−２ａの発現はピンク色にて示され、ＤＡＰＩによる対比染色の結果は青色にて示される。
【図５３】本発明のヒトｉＰＳ細胞由来心臓オルガノイドにおいて、ＰＥＣＡＭ及び心臓トロポニン Iの発現を、蛍光免疫染色によって検出した結果を示す、顕微鏡写真である。図中、ＰＥＣＡＭの発現は赤色にて示され（図中、一番左側の写真）、心臓トロポニン Iの発現は緑色にて示され（図中、左から２番目の写真）、ＤＡＰＩによる対比染色の結果は青色にて示され（図中、右から２番目の写真）、それらの重ね合わせが、図中、一番右側の写真として表される。
【図５４】本発明のヒトｉＰＳ細胞由来肺オルガノイド、並びにマウス肺（胎生１０．５日目及び胎生１１．５日目）において、気管上皮マーカーＥＣＡＤ（図中、その発現は赤色で表される）とＣｙｔｏｋｅｒａｔｉｎ  ８（ＣＫ８）（図中、その発現は緑色で表される）の発現を、蛍光免疫染色によって検出した結果を示す、蛍光顕微鏡写真である。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
＜心臓オルガノイド及び／又は肺オルガノイドを製造するための方法＞
本発明の心臓オルガノイド及び／又は肺オルガノイド（以下「心臓オルガノイド等」とも総称する）を製造するための方法は、細胞外マトリックス構成タンパク質を含有するゲルの表面上にて、ＦＧＦタンパク質の存在下、胚様体を培養することを特徴とする。
【００２１】
本発明において「臓器オルガノイド」とは、試験管内で製造された臓器様構造体を意味する。より具体的に、「心臓オルガノイド」とは、試験管内（インビトロ）で製造された、心室及び心房を少なくとも１つずつ有し、律動的な収縮を行なうことのできる心臓様構造体を意味する。「肺オルガノイド」とは、試験管内で製造された、肺胞構造を有する肺様構造体を意味する。
【００２２】
本発明において、その表面上にて、後述の胚様体を培養するゲルとしては、細胞外マトリックス構成タンパク質を含むものであればよく、例えば、細胞外マトリックス構成タンパク質が緩衝液に溶解してなるゲルが挙げられる。緩衝液中の細胞外マトリックス構成タンパク質の濃度としては、ゲルを形成できれば特に制限はない。しかしながら、ゲルの粘着性及び弾力性は、胚様体から心臓オルガノイド等への分化過程において生じる、細胞移動、適切なパターニング及び自己組織化の妨げとなり得る。そのため、当該妨げを抑制するという観点から、緩衝液中の細胞外マトリックス構成タンパク質の濃度は、０．５〜２０ｍｇ／ｍＬが好ましく、１〜１０ｍｇ／ｍＬがより好ましく、２〜６ｍｇ／ｍＬがさらに好ましく、３〜４ｍｇ／ｍＬが特に好ましい。また、緩衝液としては特に制限はなく、通常、ｐＨ６〜８の緩衝液（好ましくは、ｐＨ７〜７．５の緩衝液）が用いられる。さらに、ｐＨにて調整される緩衝液としては、例えば、リン酸緩衝液、トリス緩衝液、ＨＥＰＥＳ緩衝液が挙げられる。
【００２３】
本発明のゲルに含有されるタンパク質としては、細胞外マトリックスを構成するタンパク質であればよく、その由来については特に制限されるものではない。ヒトの細胞由来であってもよく、非ヒト動物（例えば、マウス及びラット等のげっ歯類、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、サル、イヌ、並びにネコ等の哺乳類、ニワトリ等の鳥類）の細胞由来であってもよいが、細胞外マトリックス構成タンパク質を多量に合成し得るという観点から、マウスのエンジェルブレス−ホーム−スワーン（ＥＨＳ）腫瘍からの分泌産物が好適に用いられる。また、本発明の心臓オルガノイド等をヒトの再生医療に応用する観点からは、ゼノフリー細胞外マトリックス構成タンパク質の利用が好ましい。
【００２４】
「細胞外マトリックス構成タンパク質」としては、例えば、ラミニン、エンタクチン（ナイドジェン１）、フィブロネクチン、コラーゲン、プロテオグリカン、ビトロネクチン、エラスチン、フィブリリン、テネイシンが挙げられる。本発明のゲルには、このようなタンパク質が少なくとも１種含まれていればよいが、複数種含まれていてもよい。さらに、複数種含まれる場合、これら異なる細胞外マトリックス構成タンパク質は、ヘテロ複合体の形態にてゲルに含まれるものであってもよい。また、本発明のゲルは、コラーゲン及びプロテオグリカンを含まない態様もとり得る。さらに、これら細胞外マトリックス構成タンパク質の中では、心臓オルガノイド等への分化誘導の効率がより高まり易いという観点から、ラミニン及び／又はエンタクチンを含むタンパク質であることが好ましく、ラミニン及びエンタクチンからなる複合体がより好ましい。また、かかる場合、ラミニン及びエンタクチンの前記ゲルにおける含有比としては特に制限はないが、モル比率にて、ラミニン：エンタクチンは、好ましくは３０〜７０：７０〜３０であり、より好ましくは４０〜６０：６０〜４０であり、特に好ましくは５０：５０である。
【００２５】
ラミニンは、３つのサブユニット鎖（α鎖、β鎖、γ鎖）が会合したヘテロ三量体分子であり、さらに、α鎖はα１〜５、β鎖はβ１〜３、γ鎖はγ１〜３のサブユニットに分類される。本発明の「ラミニン」としては、前記サブユニットから構成されるヘテロ三量体分子又はその部分断片であれば特に制限はなく、例えば、ラミニン１１１（α１鎖、β１鎖及びγ１鎖）、ラミニン２１１（α２鎖、β１鎖及びγ１鎖）、ラミニン１２１（α１鎖、β２鎖及びγ１鎖）、ラミニン２２１（α２鎖、β２鎖及びγ１鎖）、ラミニン３３２（α３鎖、β３鎖及びγ２鎖）、ラミニン３１１（α３鎖、β１鎖及びγ１鎖）、ラミニン３２１（α３鎖、β２鎖及びγ１鎖）、ラミニン４１１（α４鎖、β１鎖及びγ１鎖）、ラミニン４２１（α４鎖、β２鎖及びγ１鎖）、ラミニン５１１（α５鎖、β１鎖及びγ１鎖）、ラミニン５２１（α５鎖、β２鎖及びγ１鎖）、ラミニン２１３（α２鎖、β１鎖及びγ３鎖）、ラミニン４２３（α４鎖、β２鎖及びγ３鎖）、ラミニン５２３（α５鎖、β２鎖及びγ３鎖）、ラミニン３３３（α３鎖、β３鎖及びγ３鎖）、及びそれらの部分断片が挙げられる。また、本発明にかかるラミニンは、これらヘテロ三量体分子の混合物（例えば、ラミニン４１１とラミニン２２１との混合物）であってもよい。また、心臓オルガノイド等への分化誘導の効率がより高まり易いという観点から、本発明のゲルには、ラミニン１１１、ラミニン４１１、又はそれらの部分断片が含まれていることが好ましく、心臓オルガノイド形成において、正常な部域性を獲得した自己組織化がより生じ易いという観点から、ラミニン４１１、又はその部分断片が含まれていることがより好ましく、ラミニン４１１のＥ８断片（ラミニン４１１におけるインテグリンα６β１タンパク質との結合部位）であることがさらに好ましい。
【００２６】
本発明において、胚様体は、上述のゲルの表面上にて培養される。すなわち、当該ゲル中に完全に包埋（封入）又は分散されることなく、本発明においては、その一部を前記ゲルの表面と接触させながら胚様体を培養することになる。当該培養は、通常、本発明のゲルによって被覆された培養器の表面に、胚様体を載せて培養することによって達成される。本発明のゲルによって被覆された培養器としては、胚様体の培養が可能な細胞培養用培養器であれば、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、スライド、マルチプレート、マイクロウェルプレート、シャーレ、フラスコ、ディッシュが挙げられる。また、培養器の表面における本発明のゲルの濃度としては、用いるゲルの種類によって適宜調整すればよく、特に制限はないが、好ましくは０．１〜１００μｇ／ｃｍ２である。
【００２７】
心臓オルガノイド等の製造において、前述のゲル表面上における胚様体の培養は、ＦＧＦタンパク質の存在下で行なわれる。本発明における「ＦＧＦタンパク質」としては、ＦＧＦＲ１（ＩＩＩｃ）及びＦＧＦＲ２（ＩＩＩｃ）に結合し得るＦＧＦタンパク質であればよく、例えば、線維芽細胞増殖因子４（ＦＧＦ４）又は線維芽細胞増殖因子２（ＦＧＦ２、ｂＦＧＦ）が挙げられ、ＦＧＦ４（２０６アミノ酸）の方がｂＦＧＦ（１６４アミノ酸）より大きいため、ＦＧＦＲの２量体形成を誘導し易く、ひいてはその下流のシグナル伝達がより活性化し易くなるという観点から、好ましくはＦＧＦ４である。
【００２８】
また、ＦＧＦタンパク質の由来については特に制限されるものではなく、ヒト由来であってもよく、非ヒト動物由来であってもよい。さらに、胚様体を心臓オルガノイド等に分化誘導することができる限り、その部分断片であってもよい。ＦＧＦタンパク質の存在下での培養は、通常ＦＧＦタンパク質を培地に添加することによって達成される。ＦＧＦタンパク質の培地への添加濃度としては、胚様体を心臓オルガノイド等に分化誘導することができる濃度であればよく、下限としては、１ｎｇ／ｍＬ以上が好ましく、３ｎｇ／ｍＬ以上がより好ましく、１０ｎｇ／ｍＬ以上（例えば、２０ｎｇ／ｍＬ以上、３０ｎｇ／ｍＬ以上、４０ｎｇ／ｍＬ以上、５０ｎｇ／ｍＬ以上、６０ｎｇ／ｍＬ以上）がさらに好ましい。また、上限としては、３００ｎｇ／ｍＬ以下が好ましく、１００ｎｇ／ｍＬ以下がより好ましく、８０ｎｇ／ｍＬ以下（例えば、７０ｎｇ／ｍＬ以下、６０ｎｇ／ｍＬ以下、５０ｎｇ／ｍＬ以下、４０ｎｇ／ｍＬ以下）がさらに好ましい。かかるＦＧＦタンパク質の培地への添加濃度範囲の好適な例としては、１〜１００ｎｇ／ｍＬが挙げられ、１０〜８０ｎｇ／ｍＬがより好ましく、２０〜７０ｎｇ／ｍＬがさらに好ましい。また、心臓オルガノイド及び肺オルガノイドを同時に誘導し易いという観点において、ＦＧＦタンパク質の培地への添加濃度は、１０〜５０ｎｇ／ｍＬが好ましく、２０〜４０ｎｇ／ｍＬがより好ましい。
【００２９】
また、本発明において、胚様体を心臓オルガノイド等に分化誘導するための培養方法としては、上述のとおり、ＦＧＦタンパク質の存在下、細胞外マトリックス構成タンパク質を含有するゲルの表面上での培養であればよく、他の培養条件は、当業者であれば公知の胚様体の培養方法を適宜選択して利用することができる。
【００３０】
例えば、胚様体を心臓オルガノイド等に分化誘導するための培養に用いられる培地（以下、「心臓オルガノイド等への分化誘導用培地」とも称する）としては、公知の胚様体を培養するための基礎培地を基に調製することができる。公知の基礎培地としては、ＤＭＥＭ培地、ハムＦ１２培地、ＫＳＯＭ培地、イーグルＭＥＭ培地、グラスゴーＭＥＭ培地、αＭＥＭ培地、ハム培地、ＲＰＭＩ  １６４０培地、フィッシャーズ培地、ＢＭＥ培地、ＢＧＪｂ培地、ＣＭＲＬ  １０６６培地、ＭＥＭ  Ｚｉｎｃオプション改善培地、ＩＭＤＭ培地、メヂィウム１９９培地、及びこれら任意の混合培地が挙げられる。
【００３１】
心臓オルガノイド等への分化誘導用培地は、血清含有培地であってもよく、また無血清培地でもよい。無血清培地とは、無調製又は未精製の血清を含まない培地を意味し、精製された血液由来成分や動物組織由来成分（例えば、増殖因子）を含有する培地が挙げられる。また、心臓オルガノイド等への分化誘導用培地は、血清代替物を含んでいてもよい。血清代替物としては、例えば、ノックアウト血清代替物（ＫＳＲ、インビトロジェン社製）、化学的脂質濃縮物（Ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ−ｄｅｆｉｎｅｄ  Ｌｉｐｉｄ  ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅｄ、Ｇｉｂｃｏ社製）、グルタマックス（Ｇｉｂｃｏ社製）等の市販品が挙げられる。
【００３２】
また、心臓オルガノイド等への分化誘導用培地は、上述のＦＧＦタンパク質の他、アミノ酸（Ｌ−グルタミン、非必須アミノ酸等）、ホルモン（プロゲステロン、β−エストラジオール等）、増殖因子（インスリン、トランスフェリン、セレナイト、ＩＴＳ等）、還元剤（β−メルカプトエタノール等）、抗生物質（ペニシリン、ストレプトマイシン等）、有機酸（ピルビン酸、ピルビン酸ナトリウム、乳酸等）、脂肪酸又は脂質、糖類、ビタミン、サイトカイン、抗酸化剤、緩衝剤、無機塩類、等を含有できる。
【００３３】
また、心臓オルガノイド等への分化誘導用培地には、分化段階に応じ、増殖因子（ＢＩＯ（６’ブロモインジルビン  ３’オキシム、Ｗｎｔアクチベーター）等のＧＳＫ−３阻害剤、Ｗｎｔ１、Ｗｎｔ３、Ｗｎｔ３ａ、Ｗｎｔ４、Ｗｎｔ７ａ、ＢＭＰ４、ＢＭＰ２、ＢＭＰ６、ＢＭＰ７等）、ＲＯＣＫ（Ｒｈｏ結合キナーゼ）阻害剤（Ｙ−２７６３２）及び白血病抑制因子（ＬＩＦ）からなる群から選択される少なくとも１の物質を、更に添加してもよい。また、心臓オルガノイド及び肺オルガノイドを同時に誘導し易いという観点からは、Ｒｈｏ結合キナーゼ阻害剤（Ｙ−２７６３２）を更に添加することが好ましい。
【００３４】
例えば、ヒトｉＰＳ細胞由来の胚様体を用いた心臓オルガノイドの作製の際には、３〜３００ｎｇ／ｍＬ、好ましくは３０ｎｇ／ｍＬ以上のＦＧＦタンパク質（例えばＦＧＦ４）、及び１〜１００μＭ、好ましくは５〜１５μＭ（例えば、１０μＭ）のＹ２７６３２（Ｒｈｏ結合キナーゼ阻害剤）を心臓オルガノイド等への分化誘導用培地に含めることができる。
【００３５】
また、例えば、ヒトｉＰＳ細胞由来の胚様体を用いた心臓オルガノイド及び肺オルガノイドの作製の際には、１〜１００ｎｇ／ｍＬ、好ましくは２０〜４０ｎｇ／ｍＬのＦＧＦタンパク質（例えばＦＧＦ４）、又は、３〜３００ｎｇ／ｍＬ、好ましくは、４０〜８０ｎｇ／ｍＬのＦＧＦタンパク質（例えばＦＧＦ４）及び１〜１００μＭ、好ましくは５〜１５μＭ（例えば、１０μＭ）のＹ２７６３２（Ｒｈｏ結合キナーゼ阻害剤）を心臓オルガノイド等への分化誘導用培地に含めることができる。
【００３６】
また、例えば、マウス細胞由来の胚様体を用いた心臓オルガノイドの作製の際には、３〜３００ｎｇ／ｍＬ、好ましくは２０〜７０ｎｇ／ｍＬ（例えば、３０ｎｇ／ｍＬ）のＦＧＦタンパク質（例えばＦＧＦ４又はｂＦＧＦ）、５〜５００ｎｇ／ｍＬ、好ましくは１０〜１００ｎｇ／ｍＬ（例えば、５０ｎｇ／ｍＬ）のＢＭＰタンパク質（例えばＢＭＰ４）及び１００〜１００００ｕ／ｍＬ、好ましくは５００〜５０００ｕ／ｍＬ（例えば、１０００ｕ／ｍＬ）のＬＩＦを心臓オルガノイド等への分化誘導用培地に含めることができる。さらに、当該培地に、０．２５〜２５μＭ、好ましくは１〜５μＭ（例えば、２．５μＭ）のＧＳＫ−３阻害剤（例えば、ＢＩＯ（Ｗｎｔアクチベーター））を含めてもよい。
【００３７】
また、胚様体を心臓オルガノイド等に分化誘導するための培養期間についても特に制限はなく、当業者であれば用いる胚様体の由来等に応じて適宜調整することができるが、心腔形成に至った心臓オルガノイド及び肺胞を有する肺オルガノイドをより得易いという観点から、好ましくは５〜３０日間であり、より好ましくは７〜２０日間、さらに好ましくは９〜１５日間である。
【００３８】
なお、後述の実施例において示すとおり、成熟した心臓オルガノイドの作製及び長期培養がよりし易くなるという観点から、胚様体を８〜１２日間ラミニン１１１及びエンタクチンを含有するゲル上にて培養し、それ以降はラミニン４１１を含有するゲル上にて培養することが好ましい。
【００３９】
さらに、胚様体を心臓オルガノイド等に分化誘導するためのその他の条件は、公知の胚様体の培養条件に準じ、当業者であれば適宜選択、調整することができるが、例えば、培養温度は、特に限定されるものではないが、通常約３０〜４０℃、好ましくは約３７℃である。ＣＯ２の濃度は、通常約１〜１０％、好ましくは約２〜５％である。酸素濃度は通常、１〜１０％である。
【００４０】
本発明において、上述の培養に供される「胚様体」としては、多能性幹細胞を浮遊培養させた場合又は単層培養において過剰増殖した場合に得られる、分化細胞及び未分化細胞からなる凝集塊を意味する。
【００４１】
本発明において、胚様体を形成するために用いられる「多能性幹細胞」としては、分化多能性自己複製能を備えている細胞であればよく、例えば、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）、エピブラスト幹細胞（ＥｐｉＳ細胞）、胚性腫瘍細胞（ＥＣ細胞）、胚性生殖細胞（ＥＧ細胞）、多能性生殖細胞（ｍＧＳ細胞）、ＭＵＳＥ細胞（Ｋｕｒｏｄａ  Ｙ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．、２０１０年、１０７巻、１９号、８６３９〜８６４３ページ  参照）等の生体から採取され得る細胞が挙げられる。さらに、「多能性幹細胞」には、人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞等）のように、生体から採取された体細胞から人工的に分化多能性等を持たせるよう誘導された細胞も含まれる。
【００４２】
また、これら細胞の由来としては特に制限はなく、ヒト及び非ヒト動物が挙げられる。さらに、当該細胞の由来を心臓疾患の罹患者とすることにより、本発明によれば、心臓疾患モデルとして有用な心臓オルガノイドを得ることができる。心臓疾患としては、遺伝性の心臓疾患が挙げられ、例えば、先天性ＱＴ延長症候群（ＬＱＴＳ）、Ｂｒｕｇａｄａ症候群、家族性徐脈症候群（洞機能不全症候群、房室ブロック）、カテコラミン誘発性多形性心室頻拍（ＣＰＶＴ）、ＱＴ短縮症候群（ＳＱＴＳ）、肥大型心筋症、拡張型心筋症が挙げられる。
【００４３】
また、本発明によれば、非遺伝性の心臓疾患モデルとして有用な心臓オルガノイドも得ることができる。非遺伝性心臓疾患としては、例えば、冠動脈疾患（心筋梗塞）、先天性心疾患（心室中隔欠損症、心房中隔欠損症、ファロー四徴症）、高血圧が挙げられる。これら非遺伝性心臓疾患は、心臓オルガノイドの培養系（培地）において、その添加成分（心筋梗塞誘発剤、阻害剤、ホルモン、栄養素等の化合物）を適宜調製（添加又は除外）することによって、または前記培養系の物理的条件（温度、塩濃度等）を変化させることによって、当業者であれば再現し得る。
【００４４】
また、当該細胞の由来を肺疾患の罹患者とすることにより、本発明によれば、肺疾患モデルとして有用な肺オルガノイドを得ることができる。肺疾患としては、例えば、遺伝性間質性肺疾患である、家族性間質性肺炎、先天性肺胞淡白症及び小児期発症の間質性肺炎が挙げられる。また、非遺伝性の肺疾患としては、特発性間質性肺炎（指定難病８５）が挙げられる。間質性肺炎は本来薄い肺胞壁の壁が厚く硬くなり（繊維化）、ガス交換がうまくできない特徴を持つ。したがって、本発明における肺オルガノイドに肺線維症を誘発する薬剤等を添加することによって、間質性肺炎の試験管内再現が可能になると考えられる。
【００４５】
また、本発明の「多能性幹細胞」としては、後述の実施例において用いられているαＭＨＣ−ＧＦＰ  ＥＳ細胞のように、遺伝的に改変されている細胞（遺伝子改変細胞）であってもよい。遺伝子改変細胞としては、前記αＭＨＣ−ＧＦＰ  ＥＳ細胞におけるＧＦＰのように、発現させたいタンパク質をコードする遺伝子が外来的に導入されている細胞であってもよく、ゲノム編集、ノックアウト法、ＲＮＡ法、アンチセンス法等により、特定の遺伝子の機能が抑制されている細胞であってもよく、またランダムに遺伝子の機能が抑制又は活性化されている細胞であってもよい。遺伝子の機能がランダムに抑制又は活性化されている細胞としては、例えば、ＥＭＵ、ＥＭＳ、ＮＭＵ及びＮＴＧ等の化学変異剤によって処理された細胞、ジンクフィンガーヌクレアーゼやＴＡＬＥＮ等のＤＮＡ切断酵素が導入された細胞、速中性子線、ガンマー線又はイオンビームが照射された細胞、トランスポゾンがゲノムＤＮＡにランダムに挿入された細胞が挙げられる。さらに、遺伝子の改変は、上記細胞が樹立された後に施されたものであってもよく、樹立される前、例えば、前記未受精卵や前記精子を採取する個体段階において施されたものであってもよい。また、遺伝子の改変をもって、前記疾患の原因となる遺伝子変異が導入されたものであってもよい。
【００４６】
本発明において胚様体を形成するために供される多能性幹細胞の数としては、胚様体を形成し得る限り、特に制限はなく、当業者であれば多能性幹細胞の種類及び由来等に応じて適宜調整し得、通常５０〜５００００個であるが、後期形態形成過程（屈曲心筒及び心腔形成）に至り、また律動的な収縮能を有する心臓オルガノイドがより得られ易いという観点から、胚様体１個を形成するにあたり、好ましくは、１００〜１００００個であり、より好ましくは、５００〜７０００個であり、より好ましくは、１０００〜５０００個である。
【００４７】
多能性幹細胞の培養方法としては、胚様体を形成し得れば特に制限はなく、接着培養であってもよく、また非接着培養（例えば、凝集浮遊培養、担体上での浮遊培養等の浮遊培養）であってもよく、当業者であれば適宜公知の胚様体培養方法を選択することができるが、胚様体を球状に形成させるという観点から、浮遊培養が好ましい。
【００４８】
また、かかる培養において用いられる培地としては、公知の多能性幹細胞を培養するための基礎培地を基に調製することができる。公知の基礎培地としては、ＤＭＥＭ培地、ＫＳＯＭ培地、イーグルＭＥＭ培地、グラスゴーＭＥＭ培地、αＭＥＭ培地、ハム培地、ＲＰＭＩ  １６４０培地、フィッシャーズ培地、ＢＭＥ培地、ＢＧＪｂ培地、ＣＭＲＬ  １０６６培地、ＭＥＭ  Ｚｉｎｃオプション改善培地、ＩＭＤＭ培地、メヂィウム１９９培地、並びにこれら任意の混合培地が挙げられる。また、市販のＥＳ細胞又はｉＰＳ細胞培養用の培地も好適に用いられる。
【００４９】
胚様体を形成するための培地は、血清含有培地であってもよく、また無血清培地でもよく、血清代替物を含んでいてもよい。また、アミノ酸（Ｌ−グルタミン、非必須アミノ酸等）、還元剤（β−メルカプトエタノール等）、抗生物質（ペニシリン、ストレプトマイシン等）、ホルモン、増殖因子、有機酸、脂肪酸又は脂質、糖類、ヌクレオシド、ビタミン、サイトカイン、抗酸化剤、緩衝剤、無機塩類等、を含有できる。
【００５０】
なお、多能性幹細胞の維持培養を行う上では、上述の培地に通常ＬＩＦが添加されるが、胚様体を形成するための培養は、多能性の維持ではなく、分化誘導が必要であるという観点から、本発明においてはＬＩＦを添加しないことが望ましい。
【００５１】
胚様体を形成するための培養に用いられる培養器には、多能性幹細胞等を培養するために用いられる公知のものを適宜利用することができるが、浮遊細胞を行なう上で、細胞非接着性（低吸着性）の培養器が好ましい。当該培養器としては、親水性化合物又は水溶性樹脂によって被覆されたマルチプレート、マイクロウェルプレート、シャーレ、フラスコ、ディッシュが挙げられる。
【００５２】
また、胚様体を形成するための培養期間についても特に制限はなく、当業者であれば用いる多能性幹細胞の種類及び由来等に応じて適宜調整することができるが、通常１〜１４日間であり、好ましくは２〜７日間、より好ましくは３〜５日間である。
【００５３】
さらに、胚様体を形成するためのその他の条件は、公知の培養条件に準じ、当業者であれば適宜選択、調整することができるが、例えば、培養温度は、特に限定されるものではないが、通常約３０〜４０℃、好ましくは約３７℃である。ＣＯ２の濃度は、通常約１〜１０％、好ましくは約２〜５％である。酸素濃度は通常、５〜２１％である。
【００５４】
＜心臓オルガノイド等を製造するためのキット＞
また、本発明は、上述の心臓オルガノイド等の製造に用いられるキットを提供する。本発明のキットは、少なくとも、上述の細胞外マトリックス構成タンパク質を含有するゲルと、胚様体を培養するための上述の培地（心臓オルガノイド等への分化誘導用培地）と、当該培地に添加するＦＧＦタンパク質とを含むものである。また、本発明のキットは、前記ゲルの代わりに又はそれと併せて、ゲル化する前の、細胞外マトリックス構成タンパク質を含有する溶液を含むものであってもよい。
【００５５】
また、本発明のキットは、更に前記培地に添加するＬＩＦ及びＢＭＰ等を含むものであってもよく、さらにまた上述の胚様体を含むものであってもよい。さらに、本発明のキットは、多能性幹細胞から胚様体を経て、心臓オルガノイド等の製造を可能にすべく、上述の多能性幹細胞から胚様体を形成させるための培地、該多能性幹細胞を含むものであってもよい。
【００５６】
また、本発明のキットは、これら心臓オルガノイド等を製造するための材料の他、製造された構造体が心臓オルガノイド等であることを確認するための試薬を含めることもできる。当該試薬としては、臓器を構成する細胞特異的マーカーを認識する抗体、該抗体を認識する標識された二次抗体が挙げられる。また、心臓オルガノイドである場合には、後述の実施例に示すとおり、緑色蛍光の細胞内カルシウム指示薬が挙げられる。さらに、本発明のキットには、当該キットの使用説明書を含めることができる。
【００５７】
＜心臓オルガノイド等＞
後述の実施例において示すとおり、上述の方法によって製造される心臓オルガノイド及び肺オルガオルガノイドは、生体内におけるそれらの機能を担う構造を再現している。特に、心臓オルガノイドは、各種細胞の部域性は生体内におけるそれらを忠実に再現しており、さらに心筋収縮等の機能も発揮するものである。そして、かかる臓器オルガノイドを用いることにより、後述のとおり、対応する臓器に関する疾患を治療、改善又は予防するための化合物又は該臓器に対して毒性を有する化合物のスクリーニング、更には前記臓器に関する疾患等の再生医療を行なうことができる。
【００５８】
然るに、本発明は、細胞外マトリックス構成タンパク質を含有するゲルの表面上にて、少なくともＦＧＦタンパク質の存在下、胚様体を培養してなる、心臓オルガノイド、肺オルガノイド、若しくはこれらオルガノイドの断片又は細胞も提供する。また、一部の態様において、当該オルガノイド、その断片又は細胞は、生体への移植に用いるためのものであり得る。
【００５９】
本発明において「臓器オルガノイドの断片」は、臓器オルガノイドの一部であればよく、心臓オルガノイドにおいては、例えば、心室、心房が挙げられ、肺オルガノイドにおいては、例えば、肺胞が挙げられる。また「臓器オルガノイドの細胞」は、臓器オルガノイドを構成する細胞であればよく、心臓オルガノイドにおいては、例えば、血管内皮細胞、心筋細胞、平滑筋細胞等が挙げられれ、肺オルガノイドにおいては、例えば、肺胞上皮細胞が挙げられる。
【００６０】
なお、本発明の心臓オルガノイドは、通常の心臓とは異なり、血液の流入口及び排出口が閉鎖されている構造体である。また、本発明の心臓オルガノイドのサイズとしては、特に制限はなく、上記本発明の製造方法に供される胚様体のサイズ、該胚様体の形成に供される多能性幹細胞の数等に応じ、適宜調整し得る。したがって、本発明においては、例えば、４００〜１２００μｍ（６００〜１０００μｍ、７００〜９００μｍ等）のサイズの心臓オルガノイドを、提供することもできる。なお、本発明において、心臓オルガノイドのサイズとは、最長径を意味する。
【００６１】
また、本発明の肺オルガノイドは、肺胞、又は、複数の肺胞が繋がった肺胞管に類似した構造を示すものである。本発明においては、例えば、１ｍｍ以上（１〜１．６ｍｍ等）のサイズの肺オルガノイドを提供することができる。なお、肺オルガノイドのサイズについては、前述の心臓オルガノイド同様に、特に制限はなく、適宜調整し得る。
【００６２】
さらに、後述の実施例に示すとおり、本発明によれば、心臓オルガノイドと肺オルガノイドは繋がった状態にて得ることもできる。然るに、本発明は、心臓オルガノイドと肺オルガノイドとの結合体をも提供する。
【００６３】
＜心臓オルガノイド等を用いた評価方法＞
後述の実施例において示すとおり、本発明の心臓オルガノイドは、生体内における心臓の構造及び機能を忠実に再現している。また、本発明の肺オルガノイドは、その機能を発揮する上で重要な構造である肺胞を備える。そのため、これら臓器オルガノイドは、化合物の対応する臓器に対する毒性活性を評価する上で有用である。特に、心臓に関し、薬物によるＱＴ延長は突然死にも関係しているので有用であると思われる。また、肺オルガノイドに関しては、新たに開発された薬剤（特に、抗がん剤）が、薬剤性肺炎又は肺線維症の副作用を持つのかについての評価（肺毒性の評価）にも、有効である。
【００６４】
然るに、本発明は、化合物の心臓に対する毒性を評価するための方法であって、本発明の心臓オルガノイドと、被験化合物とを接触させ、該心臓オルガノイドの状態を検出する工程と、前記工程にて検出される状態において、悪化が認められれば、前記被験化合物は心臓に対して毒性を有する化合物であると判定する工程とを、含む方法を、提供する。
【００６５】
さらに、本発明は、化合物の肺に対する毒性を評価するための方法であって、本発明の肺オルガノイドと、被験化合物とを接触させ、該肺オルガノイドの状態を検出する工程と、前記工程にて検出される状態において、悪化が認められれば、前記被験化合物は肺に対して毒性を有する化合物であると判定する工程とを、含む方法を、提供する。
【００６６】
また、上述のとおり、本発明の心臓オルガノイド等の由来を対応する臓器に関する疾患の罹患者とすることにより、さらには、心臓オルガノイド等の培養系の含有成分及び／又は物理的条件を調整することによって、当該臓器オルガノイドを前記疾患のモデルとして用いることができる。
【００６７】
然るに、本発明は、化合物の心臓疾患の治療活性を評価するための方法であって、心臓疾患を呈する本発明の心臓オルガノイドと、被験化合物とを接触させ、該心臓オルガノイドの状態を検出する工程と、前記工程にて検出される状態において、前記心臓疾患に対する治療効果が認められれば、前記被験化合物は前記心臓疾患に対する治療活性を有する化合物であると判定する工程とを、含む方法を、提供する。
【００６８】
さらに、本発明は、化合物の肺疾患の治療活性を評価するための方法であって、肺疾患を呈する本発明の肺オルガノイドと、被験化合物とを接触させ、該肺オルガノイドの状態を検出する工程と、前記工程にて検出される状態において、前記肺疾患に対する治療効果が認められれば、前記被験化合物は前記肺疾患に対する治療活性を有する化合物であると判定する工程とを、含む方法を、提供する。
【００６９】
本発明の評価方法において用いられる「心臓オルガノイド」及び「肺オルガノイド」は、上述のとおりであるが、これら臓器オルガノイドの全体を当該評価方法に供してもよく、またこれら臓器オルガノイドの一部（断片）又は当該オルガノイドから単離した細胞を供してもよい。
【００７０】
本発明の心臓オルガノイド等に接触させる「被験化合物」としては、特に制限はないが、合成低分子化合物ライブラリー、遺伝子ライブラリーの発現産物、ペプチドライブラリー、抗体、細菌放出物質、細胞（微生物、植物細胞、動物細胞）の抽出液及び培養上清、精製又は部分精製ポリペプチド、海洋生物、植物又は動物由来の抽出物、土壌、ランダムファージペプチドディスプレイライブラリーを用いることにより、対応する臓器に対する毒性を有する化合物又は当該臓器に関する疾患に対する治療活性を有する化合物のスクリーニングを行なうことができる。
【００７１】
また、心臓オルガノイド等との「接触」は、通常、心臓オルガノイド等を培養（維持）するための培地に、被験化合物を添加することによって行なうことができる。また、当該培地としては、上述の心臓オルガノイド等への分化誘導用培地が好適に用いられる。
【００７２】
本発明の評価方法において検出される心臓オルガノイド等の「状態」としては特に制限はなく、例えば、心臓等の形態（外観及び内部の形態）、並びに機能（心臓であれば、収縮力、収縮のリズム、拍動等数。肺であれば、ガス交換）が挙げられる。毒性の評価においては、心臓等の形態又は機能の異常（悪化）が認められれば、被験化合物を心臓等に対して毒性を有する化合物であると判定できる。また、治療活性の評価においては、心臓等の形態又は機能の改善（治療効果）が認められれば、被験化合物を心臓等の疾患に対して治療活性を有する化合物であると判定できる。
【実施例】
【００７３】
以下、実施例に基づいて本発明をより具体的に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。【００７４】
（細胞培養）
トリプシン処理した野生型マウス由来のＥＳ細胞（由来の異なる３細胞株）及びαＭＨＣ−ＧＦＰ  ＥＳ細胞を、０．２％ゼラチンコートウェルに播種し、３７℃にて４５分間インキュベーションした。次いで、浮遊したＥＳ細胞を回収し、１０００ｒｐｍの遠心処理に５分間供した。【００７５】
胚様体を形成するため、１０００〜５０００個のＥＳ細胞を、９６ウェルＵ底プレート（スミロン  プライムサーフェス（登録商標）９６ウェルＵ）の１ウェルに播種し、ＬＩＦ非含有ＦＢＳ−ＥＳ培地にて、３７℃で４日間培養した。また、心臓オルガノイドを発生させる上で必要となるＥＳ細胞の最小数を調べるため、５００個のＥＳ細胞を用い、胚様体の形成を行なった。【００７６】
心臓オルガノイドを形成させるため、胚様体を、心臓オルガノイド分化誘導用培地２００μＬと共に、８５．７μｇ／ｃｍ２  ＬＮ／ＥＴゲル（ＢＤ社製、カタログ番号：３５４２５９）にてコートしたチャンバースライド（Ｆａｌｃｏｎ社製、カタログ番号：３５４１８）上に移した。【００７７】
なお、心臓オルガノイド分化誘導用培地は、３０ｎｇ／ｍＬ又は６０ｎｇ／ｍＬ  ＦＧＦ４、５０μｇ／ｍＬ  ペニシリン／ストレプトマイシン、２０％  ＫＳＲ、１ｍＭ  ピルビン酸ナトリウム、１００μＭ  β−メルカプトエタノール、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン、６０ｎｇ／ｍＬ  プロゲステロン、３０ｎｇ／ｍＬ  β−エストラジオール、５μｇ／ｍＬ  インスリン、２０μｇ／ｍＬ  トランスフェリン及び３０ｎＭ  セレナイトを含有するＤＭＥＭ／Ｆ１２（Ｇｉｂｃｏ社製、カタログ番号：１１３２００３３）である。なお、ＦＧＦ４の培地への添加濃度は、特に断りがない限り、３０ｎｇ／ｍＬとした。【００７８】
そして、胚様体を３７℃及び５％ＣＯ２にて１０〜１５日間培養した（培地交換は、３、５、７、９、１１、１３、１４及び１５日目に行った）。また、９日目からは、前記心臓オルガノイド分化誘導用培地に、５０ｎｇ／ｍｌ  ＢＭＰ４、２．５μＭ  ＢＩＯ（６’ブロモインジルビン  ３’オキシム）及び１，０００ｕｎｉｔｓ／ｍＬ  ＬＩＦを添加し、培養した。さらに、当該培養後、蛍光免疫染色及びカルシウムイオン測定等の更なる解析のため、心臓オルガノイドを回収した。【００７９】
（蛍光免疫染色）
心臓オルガノイドは、培養１０〜１５日後に回収し、プラスチック組織モルド（クリオディッシュ、株式会社硝英製作所製）中に、ティシュー・テック（登録商標）ＯＣＴコンパウンド包埋し、凍結した。凍結切片は、−１６℃のクリオスタットにて厚さが５〜７μｍになるよう調製し、ＭＡＳコートガラススライド（松浪硝子工業株式会社製）又はポリＬリジンコートスライド（シグマアルドリッチ社製）に移した。心臓オルガノイドへの分化誘導に供しなかった胚様体も回収し、上記同様の方法にて、ＯＣＴに凍結包埋し、切片に調製した。【００８０】
また、マウス胎児の心臓の切片を調製して観察すべく、妊娠雌マウス（Ｃ５７ＢＬ／６、性交後９．５〜１３．５日）を屠殺し、各ステージの胎児を切開し、心臓を回収した。ＯＣＴにおける凍結前に、胎児の心臓を、スクロース−ＰＢＳ溶液（４％、１０％、１５％及び２０％）に浸した。ＯＣＴ中にて凍結させた胎児の心臓は、クリオスタットにて厚さ７μｍの切片に調製した。【００８１】
凍結切片は、室温にて、４％パラホルムアルデヒド−ＰＢＳに１５分間浸し、固定した。固定化切片は、５分間ＰＢＳに浸して３回洗浄した。次いで、室温にて、ブロッキングバッファー（５％正常ヤギ血清及び０．３％  Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００、又は５％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）及び０．３％  Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００）に１時間浸した。切片は、１％ＢＳＡ及び０．３％  Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００含有ＰＢＳにて希釈した一次抗体と共に、４℃にて一晩インキュベーションした。ＰＢＳにて洗浄した後、切片は二次抗体と共に室温にて１〜２時間インキュベーションした。【００８２】
スライドは、ＤＡＰＩ（希釈率  １：１０００、同仁化学研究所製）にて対比染色し、ベクタシールドハードセット褪色防止キット（ベクターラボラトリーズ社製）にマウントした。【００８３】
蛍光免疫染色の一次抗体として、以下の抗体を用いた。
Ｔｂｘ５（アブカム社製、ａｂ１３７８３３）、心筋トロポニン I（アブカム社製、ａｂ４７００３）、Ｎｋｘ２−５（アブカム社製、ａｂ９１１９６）、ネスチン（アブカム社製、ａｂ１０５３８９）、Ｏｃｔ３／４（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社製），ＰＥＣＡＭ（ＢＤ社製）、Ｍｌｃ２ａ（Ｓｙｎａｐｔｉｃ  Ｓｙｓｔｅｍ社製、＃３１１  ０１１）、Ｍｌｃ２ｖ（Ｓｙｎａｐｔｉｃ  Ｓｙｓｔｅｍ社製、＃３１０  ００３）、ＳＭ−ＭＨＣ（アブカム社製、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社製）及びαＳＭＡ（ａｂ５６９４）。【００８４】
また、前記各一次抗体に合わせて適切な二次抗体（全てＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）を用いた。【００８５】
（Ｃａ２＋測定）
心臓オルガノイドは、ＰＢＳにて２回洗浄し、１．８ｍＭ  Ｃａ２＋含有タイロード溶液にて新たに希釈した、４μＭ  緑色蛍光の細胞内カルシウム指示薬  Ｆｌｕｏ８  ＡＭ（アセトキシメチル）又はＦｌｕｏ８  ＡＭ／Ｆ１２７に、３７℃、１５〜３０分間浸した。その後、ＰＢＳにて２回洗浄した。そして、心臓オルガノイドを、２００μＬ  タイロード溶液にて処理し、マウントした後、蛍光顕微鏡（Ｋｅｙｅｎｃｅ社製）にて観察した。【００８６】
なお、全ての動物実験は、東京医科歯科大学の動物実験委員会の承認を受けたものであり、また当該委員会のガイドラインに従って行なった。【００８７】
（実施例１）
＜心臓オルガノイドの形成＞
図１の上段において示すとおり、胚発生において、心臓の形成は、血管内皮細胞、心筋細胞及び平滑筋細胞といった多種多様な細胞への分化を伴う特色のある形態変化を示す。先ず、胎生７．５日目において、１次心臓領域及び２次心臓領域を含む心原基の形成は、ブラキウリの発現によって誘導される、心臓中胚葉遺伝子（Ｍｅｓｐ１、Ｆｌｋ１、Ｐｄｇｆｒａ）の発現によって特徴づけられる。次いで、胎生８日目には、線状の拍動する心筒を形成するに至る。さらに、この内層に血管内皮細胞を、外層に心筋細胞を有する管状形態をとる心筒は、胎生９．５日目に、拍動力又は流出路（ＯＦＴ）によって、ルーピングする。そして、４つの心腔（右心房、左心房、右心室及び左心室）が、胎生１０．５日迄に形成され、胎生１４．５日迄に成熟されることになる。【００８８】
このような生体内における心臓の発生過程を模倣することを試みるべく、図１の下段において示すとおり、先ず、マウスＥＳ細胞を、白血病阻害因子（ＬＩＦ）の非存在下、低結合性Ｕ底９６ウェルプレートにて培養し、完全な胚様体（ＥＢ）を得た（１０００〜５０００個／胚様体）。そして、得られた胚様体を、結合組織における細胞外マトリクス（ＥＣＭ）の成分を含む、ゲル化ＬＮ／ＥＴ複合体の表面上にて、外因性ＦＧＦシグナル（ＦＧＦ４）の存在下、培養した。【００８９】
なお、Ｌｉ，Ｘ．らが以前に報告したマイクロアレイデータを再解析した結果（ＧＥＯ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＧＤＳ５００３、Ｌｉ，Ｘ．ら、Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ４６，４８２−４９５，ｄｏｉ：１０．１１５２／ｐｈｙｓｉｏｌｇｅｎｏｍｉｃｓ．０００１５．２０１４（２０１４）．）、図には示さないが、Ｌａｍａ１、Ｌａｍｂ１、Ｌａｍｃ１及びＮｉｄ１（エンタクチン）が、胎児の心臓において優位に発現していたことが明らかになった。そのため、エンジェルブレス−ホーム−スワーン腫瘍に由来するラミニンα１β１γ１（ラミニン−１１１）を含むＬＮ／ＥＴ複合体は、心臓発生に適したＥＣＭ環境を提供し得るものであると仮定した。【００９０】
胚様体を、ＦＧＦ４の存在下にて８日間ずっと培養し、９日目からは、ＢＩＯ（ＧＳＫ−３阻害剤、Ｗｎｔアクチベーター）、ＢＭＰ４及びＬＩＦを添加して、１０日間以上培養した結果、図２に示すとおり、胎児の心臓によく似た、複数の心腔を有し、拍動する心臓オルガノイドを製造することに成功した。また、図３に示すとおり、このようにして作製されたマウスＥＳ細胞由来の心臓オルガノイドは、単なる収縮作用を示す球体構造ではなく、形態的に２心房２心室構造を有していることも確認された。【００９１】
なお、図には示さないが、ＦＧＦ４の代わりにｂＦＧＦの存在下にて培養することによって、前記同様の拍動する心臓オルガノイドを製造することにも成功した。【００９２】
また、図４に示すとおり、心原基様（ＣＣＬ）構造、心筒、及び心腔形成と共に生じる屈曲心筒は、胎児心臓の発生過程と同じく、順序よく形成された。唯一の例外は、いくらかの極性を示す芽を伴う球（Ｓｂ）の出現である。これは、生体内における心原基又は心筒の前駆構造と、インビトロ胚様体培養による人工的な構造との、違いによることかもしれない。また、胚発生において胎生８日目までには、心筋を有して拍動する線状の心筒を形成すべく、心臓前駆細胞は１次心臓領域から正中線に移動する。この過程は、図５に示すとおり、主に心原基様構造を含む心臓オルガノイドにおいて、自然に生じた拍動が検出されたこと（培養３日目においては、５２．４％、培養６日目においては７２．６％）と一致する。【００９３】
また、形態形成に関しては、図６に示すとおり、球状となった胚様体において、最初の形態変化は培養３日目において認められた（８９．３％）。これには、孵化した胚様体の伸長に由来する心原基様構造が主に含まれており、Ｆｇｆシグナルによる肢芽形成における伸長及びパターニングに類似していた（Ｐｏｗｅｒｓ，Ｃ．Ｊ．ら、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ−Ｒｅｌａｔｅｄ  Ｃａｎｃｅｒ  ７，１６５−１９７（２０００）  参照）。そして、培養６日目迄には、大抵の胚様体において、この変化は完了していた（９６．４％）。【００９４】
また、図７に示すとおり、培養３日目において、心臓オルガノイドの大部分は、心原基様の構造体であった。これらオルガノイドは、心筒、屈曲心筒、心腔の形成に移行し、最終的に培養１０〜１５日目迄には、心腔形成に至った。この過程も、生体内における心臓の形態形成のそれに似ている。【００９５】
したがって、この培養系における心臓オルガノイドの形成は、興味深いことに、胎児の心臓発生における形態変化を要約したものと言える。かかる形態変化の再現が可能となった理由については定かではないが、本培養系においては、細胞外マトリックスは、心臓オルガノイドの形成過程における、細胞移動を阻害することなく、また適切なパターニング及び自己組織化を妨げるような機械的妨害が低減されることによって、効率よく形態形成を誘導できたと想定される。【００９６】
また、図８に示すとおり、培養して得られた心臓オルガノイド（ｎ＝８４、全ての心臓オルガノイドｎ＝６５、屈曲心筒又は心腔が形成された心臓オルガノイド及び心腔が形成された心臓オルガノイド）と、胎生９．５〜１３．５日の胎児の心臓とを比較した結果、胎生９．５日目の胎児の心臓よりも心臓オルガノイドの方が大きかった。この結果から、実質的な細胞増殖が形態形成に関連していることが示唆される。【００９７】
また、最初の細胞数が、心臓オルガノイドの形成効率に制限をかける要因であるかどうかを決定するため、少ない細胞数（５００個）に由来する胚様体も培養し、心臓オルガノイドへの分化誘導を試みた（ｎ＝１１）。【００９８】
その結果、図９〜１１に示すとおり、得られた心臓オルガノイドの大きさ及び拍動能は有意に低減し、後期形態形成過程（屈曲心筒及び心腔の形成段階）にある心臓オルガノイドの数も減少した。このことから、心筋細胞の数が減少したことに伴い、形態形成において不備が生じ、拍動が低減したことが考えられる。【００９９】
（実施例２）
＜心臓オルガノイドにおける心臓細胞特異的マーカーの検出＞
次に、心臓オルガノイドにおいて、胎児の心臓形成において必要である、心臓特異的転写因子及び心臓構造遺伝子が、これらオルガノイドにおいて適切に発現しているかどうかを決定するため、形態学的に分析した（ｎ＝２５）。【０１００】
なお、Ｔ−ボックスタンパク質（Ｔｂｘ５）は、初期の心臓発生において、特に心筋の分化において、必要不可欠である。また、Ｔｂｘ５の欠失により、心筋の形態形成は不完全なものとなることが知られている。さらに、Ｔｂｘ５は、心臓マーカー遺伝子を活性化させるため、ジンクフィンガー転写因子及びＧＡＴＡファミリーと協調して機能する。【０１０１】
図１２及び１３に示すとおり、生体において、Ｔｂｘ５は、胎生９．５日目の心臓における発現と比較して、胎生１０．５日目のそれは増加し、胎生１２．５日目まで増え続ける。一方、図１４に示すとおり、Ｔｂｘ５発現の増加は、例えば、培養１０〜１５日目の心臓オルガノイドにおいても認められた。【０１０２】
さらに、興味深いことに、図１５及び１６に示すとおり、心臓オルガノイドにおけるＴｂｘ５発現の特異的パターンは、心腔形成後の生体内の胎児心臓のそれに類似していた。例えば、Ｔｂｘ５の発現は、１次心臓領域に由来する左心房、右心房及び左心室において陽性であり、２次心臓領域に由来する右心室においては陰性であった。【０１０３】
また、図１４に示すとおり、大抵の心臓オルガノイドにおいて、血小板内皮細胞接着分子−１（ＰＥＣＡＭ）の分断された発現が検出された。すなわち、初期の心筒における内膜及び複数の心腔における導管性内皮細胞において、代表的なＥＣマーカーの発現が認められた。【０１０４】
さらに、図１５及び１６に示すとおり、ＳＭ−ＭＨＣの発現も検出した結果、当該マーカーの発現から、試験管内にて培養された心臓オルガノイドが、生体内の心臓と類似した三次元構造において必須となる心臓構造細胞を保有していることが示された。【０１０５】
次に、心臓オルガノイドにおける心筋細胞が成熟しているかどうか、また心筋細胞のサブタイプが、部域性（例えば、心房腔及び心室腔）を獲得しているかどうかを決定するため、心臓オルガノイドにおける、サルコメアタンパク質  ミオシン軽鎖２心房（Ｍｌｃ−２ａ）及びミオシン軽鎖２心室（Ｍｌｃ−２ｖ）の発現について調べた。【０１０６】
その結果、図１７に示すとおり、Ｍｌｃ−２ｖは心臓オルガノイドの大半において優位に発現しており、ほんのわずかの心臓オルガノイドにおいては、Ｍｌｃ−２ａの弱い発現が認められた。【０１０７】
この結果から、本培養系は、胎生１０．５日目以後の生体内における発生同様に、成熟した心筋細胞を領域特異性をもって誘導する上で効率の良い系であることが明らかになった。【０１０８】
また、図１８及び１９に示すとおり、胎生９．５日目の心臓（屈曲心筒）において、Ｍｌｃ−２ａの発現はその全体において認められたが、心腔形成後の胎生１０．５日目においては、心房にてその発現が認められた。一方、Ｍｌｃ−２ｖの発現は、胎生１０．５日目においては、心房にて認められ、胎生１２．５日目においては、左心室においてとても強いＭｌｃ−２ｖの発現が認められた。【０１０９】
さらに、構造上、多様な心臓細胞（例えば、心筋細胞、内皮細胞及び平滑筋細胞）が心臓オルガノイドにおいて共発現しているかどうか確認するため、心筋トロポニン I（横紋筋において発現するＣＭマーカー）、ＰＥＣＡＭ（ＥＣマーカー）及びＳＭ−ＭＨＣ（ＳＭマーカー）の発現を調べた。【０１１０】
その結果、図２０〜２３に示すとおり、胎生１１．５及び１２．５日目の心臓同様に、大抵のオルガノイドにおいて、これらマーカーの分断された発現が認められた。【０１１１】
以上の結果から、心臓オルガノイドは、胎児の心臓の構造上の特性を模倣できていることが示された。【０１１２】
また、いくつかの心臓オルガノイドにおいて検出された心筋トロポニン Iの糸状の発現パターンは、胎生１２．５日目の心室において検出され、筋肉収縮といったオルガノイドの機能を示唆する、成熟した長い横紋筋におけるサルコメアの発現パターンと類似していた（図２０〜２３参照）。【０１１３】
さらに、平滑筋のマーカーであるα平滑筋アクチン（αＳＭＡ）及びＮｋｘ２−５（心臓系譜を示すホメオドメイン転写因子）を含む、他の心臓マーカー遺伝子を分析した結果、心臓オルガノイドにおけるαＳＭＡのステージ特異的発現の強度及び局在は、生体内におけるそれらと同様であった（例えば、胎生１２．５日目の心臓においては、弱い発現が認められた）。【０１１４】
また、図２４及び２５に示すとおり、心臓オルガノイドにおけるＮｋｘ２−５の広範囲な発現は、胎生１０．５日目、１１．５日目及び１２．５日目において認められる発現に似ていた。【０１１５】
さらに、心臓オルガノイドにおいて、未分化幹細胞が残っているかどうか評価するため、多能性幹細胞のマーカーであるＯｃｔ３／４を対象とする、免疫染色アッセイを行った。【０１１６】
図２６及び２７に示すとおり、培養前の胚様体におけるＯｃｔ３／４の発現と比較した結果、心臓オルガノイドにおいてはＯｃｔ３／４の発現が認められなかった。このことによって、インビトロ培養において、細胞分化が首尾よく進行したことが明らかになった。【０１１７】
また、胎児の心臓及び脳の組織において、神経幹細胞のマーカーとして発現するネスチンの発現は、いくつかの心臓オルガノイド及び胎生１２．５日目の心臓において検出された。この結果から、神経堤細胞（ＮＣＣ）由来のネスチン陽性細胞が、心臓の神経支配及び心臓自律神経系を介した伝導に貢献していることが示唆される。【０１１８】
最後に、心臓オルガノイドが心房を形成できるかどうかを決定すべく、心房のみにおいて限られた態様を示すＧＦＰ−αＭＨＣ（αＭＨＣ−ＧＦＰ  ＥＳＣｓ、Ｎｅｍｅｒ，Ｍ．ら、Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ  Ｐａｔｈｏｌ  １７，４８−５４，ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｃａｒｐａｔｈ．２００７．０６．００５（２００８）参照）を発現するＥＳ細胞を用いて、心臓オルガノイドを作製した。【０１１９】
図には示さないが、予期したとおり、野生型ＥＳ細胞同様に、複数の心腔を備えた心臓オルガノイドを上記分化誘導プロトコールにて作製することができた。また、これら心臓オルガノイドにおいて、心房形成能を有していることを示すαＭＨＣ−ＧＦＰ領域限定的な発現が認められた。【０１２０】
（実施例３）
＜心臓オルガノイドにおける機能的な収縮の検出＞
自発性の拍動が心臓オルガノイドにおいて検出された時、カルシウム振動といった特定の心臓機能が得られているかどうかについて評価した。すなわち、細胞内カルシウム指示薬を用い、Ｃａ２＋レベルを測定することによって、解離が生じていない完全な３Ｄ心臓オルガノイドを分析した（ｎ＝１０）。【０１２１】
その結果、図には示さないが、これらオルガノイドにおいて、カルシウム振動を介した機能的な心筋の収縮を示す、自由なＣａ２＋の濃度の一過的な上昇が確認された。【０１２２】
（実施例４）
＜透過型電子顕微鏡による、心臓オルガノイドの解析＞
透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）解析のために、胎生１０．５日目、１１．５日目のマウス心臓と、心臓オルガノイドから、９０ｎｍ超薄切片を各々調製した。次いで、酢酸ウラニル及びクエン酸鉛にて二重染色し、観察及び撮影を行った。得られた結果を図２８に示す。【０１２３】
図２８に示すとおり、透過型電子顕微鏡を用いた微細構造解析から、本発明の心臓オルガノイドは、Ｚ  ｂａｎｄを含むｓａｒｃｏｍｅｒｅ構造、心筋細胞の特徴的な構造であるｉｎｔｅｒｃａｌａｔｅｄ  ｄｉｓｃ（ＩＤ）を含むことが示された（図２８の左側２写真  参照）。また、これらの微細構造は胎生心臓の微細構造（図２８の右側２写真  参照）と類似していることが確認された。【０１２４】
（実施例５）
＜フローサイトメトリー解析による心筋細胞の定量化＞
フローサイトメトリー解析のため、胚様体、並びに培養後８日目及び１２日目の心臓オルガノイドを、各々コラゲナーゼ（１ｍｇ／ｍｌ）にて３７℃１５分間処理し、次いで、ＴｒｐＬＥ（Ｇｉｂｃｏ社製）にて３７℃１０〜１５分間処理した。そして、当該胚様体及び心臓オルガノイド、並びに生体の心臓を、１細胞ずつに分離するよう、各々ピペッティング処理に供した。このようにして調製した細胞を４％ＰＦＡ／ＰＢＳにて、４℃１０分間処理し、固定化した。次いで、これら細胞を、４％ＦＢＳ／ＰＢＳ／０．５％サポニンにて希釈した抗体（Ａｌｅｘａ６４７結合抗ｃＴｎＴ抗体）にて、４℃３０分間処理し、染色した。そして、ＦＡＣＳ  Ａｒｉａ  II〈ＢＤ社製）を用いた解析に供した。その結果、図２９に示すとおり、ｃＴｎＴ（心筋トロポニン）陽性の心筋細胞における有意な増加が、心臓オルガノイドにおいて認められた。【０１２５】
（実施例６）
＜ＲＮＡ−ｓｅｑデータを用いた主成分分析（ＰＣＡ）＞
胚様体、並びに培養後９日目及び１３日目の心臓オルガノイドを回収し、液体窒素にて新鮮なまま凍結保存した。また、各発達段階にて解剖し、得られた胎児の心臓も回収し、前記胚様体等と同様に凍結した。そして、これら各凍結サンプルから、ＡｌｌＰｒｅｐ  ＤＮＡ／ＲＮＡマイクロキット（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用い、そのプロトコールに沿ってトータルＲＮＡを抽出した。次いで、ＲＮＡ−ｓｅｑ解析のためのライブラリーを、ＫＡＰＡ  スタンダードｍＲＮＡ−Ｓｅｑ  キット（ＫＡＰＡ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を用いて調製した。得られたライブラリーは、ＨｉＳｅｑ  １５００（ｓｉｎｇｌｅ  ｅｎｄ  ５０ｂｐ  ｒｅａｄｓ  ｗｉｔｈ  ＨｉＳｅｑ  ＳＲ  Ｒａｐｉｄ  Ｃｌｕｓｔｅｒ  Ｋｉｔ  ｖ２  ａｎｄ  ＨｉＳｅｑ  Ｒａｐｉｄ  ＳＢＳ  Ｋｉｔ  ｖ２，Ｉｌｌｕｍｉｎａ社製）によるシークエンシングに供した。得られたシークエンスデータに関し、Ｂｏｗｔｉｅ２を用い、マウスレファレンスゲノムシークエンス（ＧＲＣｍ３８／ｍｍ１０）に対するマッピングを行なった。そして、Ｂｉｏｃｏｎｄｕｃｔｏｒ  ｐａｃｋａｇｅ  ＤＥＧｓｅｑを用い、各遺伝子におけるｒｅａｄ数及びＲＰＫＭ値を求めた。【０１２６】
その結果、図３０に示すとおり、当該ＲＮＡ−ｓｅｑデータを用いた主成分分析において、ＰＣ１のヘモグロビン関係遺伝子（Ｈｂｂ−ｙ、Ｈｂａ−ｘ及びＨｂｂ−ｂｈを含む１０個）を除外すると、ＰＣ１に関しても心臓オルガノイドと生体心臓との類似性が高まることが確認された。また図３１に示すとおり、ヒートマップ及び階層的クラスタリング分析の結果、胎生９．５日目の心臓及び胎生１１．５日目心臓と胚様体との間に発現の差がある遺伝子において、これら心臓と心臓オルガノイドにおいては、発現パターンの類似性が認められた。これらの結果から、心臓オルガノイドは血液成分を含んでないだけで、全体的に生体心臓に近い遺伝子発現を示すことが確認された。【０１２７】
さらに、図３２に示すとおり、前記ＲＮＡ−ｓｅｑデータに基づき、心臓オルガノイドと胚様体の間に発現に差のある遺伝子をＭＡプロットに展開した。その結果、心臓オルガノイドにおいて高く発現する３９遺伝子（調節されたＰ値＜０．０１、ｌｏｇ２ＦｏｌｄＣｈａｎｇｅ＞５）が抽出され、また心臓オルガノイドで発現が低い５５遺伝子（調節されたＰ値＜０．０１、ｌｏｇ２ＦｏｌｄＣｈａｎｇｅ＜−５）が抽出された。そして、それら遺伝子に関し、ＧＯ（ｇｅｎｅ  ｏｎｔｏｌｏｇｙ）解析を行なった結果、前記３９の高発現遺伝子においては、上位３０のＧＯ用語のうち２６が心臓関連であった（図３３  参照）。一方、前記５５の低発現遺伝子において、上位３０ＧＯの用語に心臓関連は含まれていなかった（（図３４  参照）。このように、心臓オルガノイドにて高発現する遺伝子群において、心臓関連遺伝子が多数含まれていることが確認された。【０１２８】
（実施例７）
＜心臓オルガノイドにおける伝導系についての確認＞
心臓オルガノイドにおいて、心筋トロポニンＴとＰｕｒｋｉｎｊｅ  ｆｉｂｅｒで発現するＴＲＰＭ４の発現を、蛍光免疫染色によって検出した。なお、蛍光免疫染色は、一次抗体として、ｃＴｎＴ（ａｂ８２９５）及びＴＲＰＭ４（ＡＢＮ４１８）を用いた以外は、上記（蛍光免疫染色）と同様の方法にて行なった。【０１２９】
その結果、図３５に示すとおり、心臓オルガノイドにおいて、Ｐｕｒｋｉｎｊｅ細胞（ＴＲＰＭ４陽性）の存在が認められた。当該細胞は、心室収縮を担う刺激伝導系細胞であることから、心臓オルガノイドにおいても、生体心臓同様に、伝導系（ｃｏｎｄｕｃｔｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ）が形成されていることが確認された。【０１３０】
（実施例８）
＜心臓オルガノイドにおける成熟細胞についての確認＞
心臓オルガノイドにおいて、カリウムチャネル  ｉＫ１の発現を、蛍光免疫染色によって検出した。なお、カリウムチャネル  ｉＫ１は、活動電位の立ち上がり速度や伝導速度を早くするために必要であり、成熟な心筋細胞のみで検出される。また、蛍光免疫染色は、一次抗体として、ＫＣＮＮ４（ｉＫ１，ＧＴＸ５４７８６）を用いた以外は、上記（蛍光免疫染色）と同様の方法にて行なった。【０１３１】
その結果、図３６に示すとおり、心臓オルガノイドにおいてｉＫ１の発現が認められたことから、心臓オルガノイドの心筋細胞には、当該カリウムチャネルを含む成熟な細胞であることが確認された。【０１３２】
（実施例９）
＜心臓オルガノイドにおけるＴ管についての確認＞
心毒性検査に用いられる心筋細胞の新しい評価基準（ＦＤＡ）として、Ｔ管（Ｔｒａｎｓｖｅｒｓｅ  ｔｕｂｕｌｅ）が重要視されている。しかしながら、ヒトｉＰＳ由来心筋細胞においては観察されておらず、それが問題となっている（Ｙａｎｇ，Ｘ．ら、Ｃｉｒｃ  Ｒｅｓ  １１４（３）５１１−２３（２０１４）  参照）。【０１３３】
なお、心筋細胞は、興奮刺激を受けると、当該細胞のＴ管に存在するジヒドロピリジン受容体（ＤＨＰＲ、電位依存性のＬ型Ｃａ２＋チャネル）が活性化される。活性化された当該受容体は、細胞内へ少量のＣａ２＋を流入させる。そして、それに反応して、心筋小胞体（ＳＲ）にあるリアノジン受容体（ＲＹＲ、Ｃａ２＋遊離チャネル）が筋小胞体内のＣａ２＋を大量に遊離し、筋収縮が引き起こされることとなる（Ｓｔｅｖｅｎ，Ｏ．Ｍら、Ｃｅｌｌ，１０１，３６５〜３７６（２０００）  参照）。【０１３４】
そこで、このような心筋の興奮・収縮に関与するＳＲ／Ｔ管Ｊｕｎｃｔｉｏｎが、本発明の心臓オルガノイドにおいて存在していることを証明すべく、当該構造体において重要なＲＹＲの発現を、蛍光免疫染色によって検出することを試みた。蛍光免疫染色は、一次抗体として、ＲＹＲ（ａｂ２８６８）を用いた以外は、上記（蛍光免疫染色）と同様の方法にて行なった。その結果、図３７に示すとおり、心臓オルガノイドにおいて、ＳＲ／Ｔ管Ｊｕｎｃｔｉｏｎが存在していることが認められた。【０１３５】
（実施例１０）
＜心臓オルガノイドの電気生理学的評価＞
心臓オルガノイドを電気生理学的に評価すべく、光学マッピング（Ｏｐｔｉｃａｌ  ｍａｐｐｉｎｇ）を、以下に示す方法にて行なった。なお、電気生理的評価法として他に、多点平面電極（ＭＥＡ）を用いた細胞外電位記録法があるが、この方法では不整脈の予測が出来ない。それに対し、光学マッピングを用いると、自発興奮及び膜電位だけではなく、波形の間隔が不規則的に変化することを示すことができるため、不整脈の予測も可能である。【０１３６】
光学マッピングは、高速ＣＭＯＳカメラシステム  （ＭｉＣＡＭ  Ｕｌｔｉｍａ，  Ｂｒａｉｎｖｉｓｉｏｎ，  Ｔｏｋｙｏ，  Ｊａｐａｎ）を用い、Ｉｈａｒａら（Ｊ  Ｖｉｓ  Ｅｘｐ．２０１８；（１３２）：５６４７８）に記載の方法に沿って行なった（図３８  参照）。【０１３７】
心臓オルガノイドは、１５μＭ  ｄｉ−４−ＡＮＥＰＰＳ（電位感受性色素、Ｗａｋｏ，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）を用いた染色処理に１５分供した。ＰＢＳにて洗浄した後、３０μＭ  ブレビスタチン（興奮・収縮脱共役剤、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）にて１５分間インキュベートし、ｍｏｔｉｏｎ  ａｒｔｉｆａｃｔを抑制した。そして、洗浄した後、タイロード溶液（１３５ｍＭ  ＮａＣｌ，５．４ｍＭ  ＫＣｌ，１．８ｍＭ  ＣａＣｌ２，０．５３ｍＭ  ＭｇＣｌ２，０．３３ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４，５．５ｍＭ  Ｄ−グルコース及び５．０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４０、ＮａＯＨ及び１００％Ｏ２通気にて調整））にて充たしたガラスボトムディッシュに、心臓オルガノイドを移し、光学マッピングに供した。光学マッピング過程において、温度は３７℃に維持した。また、全光学マッピングは、５ｘ対物レンズを用い、空間分解能  ２０μｍ×２０μｍ／ピクセルにて記録し、データのサンプリングは、２．０ｍｓｅｃ及び５．０ｍｓｅｃの間に行なった。そして、得られたデータは、ＢＶ解析ソフトウェア（Ｂｒａｉｎｖｉｓｉｏｎ）を用い解析した。【０１３８】
その結果、図３９に示すとおり、光学マッピングによる電気生理学的解析によって、心臓オルガノイドにおける自発興奮と膜電位を観測することができた。この結果から、心臓オルガノイドは、電気生理的性質も極めて生体の心臓に近いことが確認された。【０１３９】
（実施例１１）
＜心臓オルガノイドの薬剤応答性の評価＞
上記にて示したとおり、本発明の心臓オルガノイドは、成熟度が高い。そのため、薬剤安全性評価のための心毒性検査等に有効な材料になり得る。そこで、その有効性を確認すべく、心臓機能異常を引き起こす薬剤を用い、心臓オルガノイドにおける薬剤の応答性を評価した。【０１４０】
具体的には先ず、アドレナリンβ受容体作動薬であるイソプロテレノール（Ｉｓｏｐｒｏｔｅｒｅｎｏｌ）  １μＭ存在下と非存在下（コントロール）とで、上記（Ｃａ２＋測定）に記載の方法にてＣａ２＋測定を行い、１５秒間の記録（ｍｏｖｉｅ）を取って、画像解析を行い、時間（Ｘ軸）による蛍光シグナルの強度（Ｙ軸）の変化を検出した。【０１４１】
その結果、図４０に示すとおり、Ｉｓｏｐｒｏｔｅｒｅｎｏｌの添加によってＣａシグナル周期が短くなること（頻脈様）を、心臓オルガノイドにおいて測定できることが確認された。すなわち、本発明の心臓オルガノイドを用いることによって、カルシウムトランジェントによる筋収縮の制御が行なわれる薬剤応答性の評価が、可能となることが確認された。【０１４２】
次に、ＩＫｒブロッカーであるＥ４０３１に添加によって、本発明の心臓オルガノイドにおいて、ＱＴ延長や活動電位に変化が生じるか否かを、光学マッピングにて検討した。なお、１μＭのＥ４０３１を心臓オルガノイドに添加すること以外は、実施例１０に記載の方法に沿って行なった。【０１４３】
その結果、図４１に示すとおり、ＩＫｒブロッカーによって心臓オルガノイドに不整脈様なものが誘導されること（波形の間隔が不規則的に変化すること）が確認された。すなわち、本発明の心臓オルガノイド及び光学マッピングを用いることにより、不整脈予測が可能となった。【０１４４】
（実施例１２）
＜心臓オルガノイド形成における、細胞外マトリックス構成タンパク質についての検討＞
上記（細胞培養）に記載の方法と同様にして、マウスＥＳ細胞を、白血病阻害因子（ＬＩＦ）の非存在下、低結合性Ｕ底９６ウェルプレートにて培養し、完全な胚様体を得た。そして、得られた胚様体を、結合組織における細胞外マトリックス（ＥＣＭ）の成分を含む、ラミニン４１１（（Ｎｉｐｐｉ社、ｉＭａｔｒｉｘ−４１１；ヒトラミニン４１１タンパク質のインテグリン結合部位（Ｅ８切片）の精製品）、ラミニン２２１（Ｎｉｐｐｉ社、ｉＭａｔｒｉｘ−２２１；ヒトラミニン２２１タンパク質のインテグリン結合部位（Ｅ８切片）の精製品）、又はラミニン２２１及び４１１を同量混ぜた混合物の表面上にて、外因性Ｆｇｆシグナル（ＦＧＦ４）の存在下、培養した。ラミニンのコーティングは、それぞれ１０．７μｇ／ｃｍ２にて行なった。胚様体の培養期間と培地交換も、上記（細胞培養）の記載に沿って行ない、当該培養後、蛍光免疫染色等の更なる解析のため、心臓オルガノイドを回収した。【０１４５】
前記のとおり、各種ラミニン上にて胚様体を１３日間培養した結果、図４２に示すとおり、いずれの条件においても、８０％以上のサンプルにおいて心腔形成（ｃｈａｍｂｅｒ  ｆｏｒｍａｔｉｏｎ）が認められた。しかしながら、ラミニン４１１条件下にて得られた心臓オルガノイドの方が、ラミニン２２１条件下のそれよりも、形態学的特性が生体の心臓により近かった。【０１４６】
次に、前記にて得られた心臓オルガノイドを、上記（蛍光免疫染色）に記載の方法にて解析した。その結果、図４３に示すとおり、ラミニン２２１の表面上で培養したオルガノイドは、Ｍｌｃ２ａとＭｌｃ２ｖの発現がラミニン４１１の表面上で培養した心臓オルガノイドに比べて低かった。また、ラミニン２２１と４１１の混合物上で培養したオルガノイドにおいて、心房タイプ心筋細胞が分離されず散乱している状態が目立った。一方、ラミニン４１１の表面上で培養した心臓オルガノイドは、心室タイプ心筋細胞（Ｍｌｃ２ｖ陽性細胞）と心房タイプ心筋細胞（Ｍｌｃ２ａ陽性細胞）の空間的分離（ｓｐａｔｉａｌ  ｓｅｇｒｅｇａｔｉｏｎ）が認められた。【０１４７】
次に、前記にて得られた心臓オルガノイドにおける、心筋トロポニンＴと、Ｐｕｒｋｉｎｊｅ  ｆｉｂｅｒで発現するＴＲＰＭ４との発現を、蛍光免疫染色によって検出した。なお、当該検出は、一次抗体として、ｃＴｎＴ（ａｂ８２９５）及びＴＲＰＭ４（ＡＢＮ４１８）を用いたこと以外は、上記（蛍光免疫染色）に記載の方法にて行なった。【０１４８】
その結果、図４４に示すとおり、ラミニン２２１の表面上で培養したオルガノイドは、心筋トロポニンＴ及びＴＲＰＭ４の発現が低かった。一方、ラミニン４１１の表面上で培養した心臓オルガノイドにおいて、マウス心臓（胎生１０．５日）と同等な心筋トロポニンＴ及びＴＲＰＭ４の発現が認められた。さらに、通常の心筋細胞とＰｕｒｋｉｎｊｅ細胞との適切な位置関係も認められたことから、伝導系が形成されていることが示唆される。【０１４９】
以上の結果から、ラミニン４１１は、心臓発生において正常な部域性を獲得した自己組織化に寄与することが考えられる。【０１５０】
次に、前記心筋トロポニンＴ及びＴＲＰＭ４の発現に加え、心房タイプ心筋で発現するＭｌｃ２ａと心室タイプ心筋で発現するＭｌｃ２ｖの発現を、蛍光免疫染色にて検出した。その結果、図４５に示すとおり、Ｍｌｃ２ａ及びＭｌｃ２ｖの発現において、ラミニン１１１を含むＬＮ／ＥＴ複合体上にて培養した心臓オルガノイドよりも、ラミニン４１１表面上にて培養した心臓オルガノイドの方が、高度な空間的分離（ｓｐａｔｉａｌ  ｓｅｇｒｅｇａｔｉｏｎ）を示すものが、サンプルによっては認められた。【０１５１】
また、上記＜心臓オルガノイド形成＞においても言及しているように、マウス胎児の心臓における継時的マイクロアレイデータについて再度解析した結果、図には示さないが、発生初期において、ラミニンα１が１番高い発現を示し、ラミニンα４が中隔形成時の胎生１４．５日目（胎児心臓の成熟期）に一番高い発現を示すことが明らかになった。【０１５２】
そこで、成熟した心臓オルガノイドの作製及び長期培養をよりし易くするために、細胞外マトリクスを培養途中で変えることを試みた。具体的には、先ず、上記（細胞培養）に記載の方法と同様にして、マウスＥＳ細胞を、白血病阻害因子（ＬＩＦ）の非存在下、低結合性Ｕ底９６ウェルプレートにて培養し、完全な胚様体を得た。そして、得られた胚様体を、結合組織における細胞外マトリクス（ＥＣＭ）の成分を含むラミニン１１１‐エンタクチン（ＬＮ／ＥＴ複合体）の表面上にて、外因性Ｆｇｆシグナル（ＦＧＦ４）の存在下、１０日間培養した。その後、心臓オルガノイドをラミニン４１１（０．５μｇ／ｃｍ２）、又はラミニン４１１とラミニン１１１との混合物でコーティングされたチャンバースライド上に移して培養を続け、２１日目まで培養し。それらの形態を、顕微鏡にて観察した。なお、培養９日目から、ＢＭＰ４（１０ｎｇ／ｍＬ）、ＦＧＦ４（３０ｎｇ／ｍＬ）及びＬＩＦ（１０００Ｕｎｉｔ／ｍＬ）を添加すること以外、胚様体の培地交換については、上記（細胞培養）に記載のとおり行なった。【０１５３】
その結果、図４６に示すとおり、これら心臓オルガノイドを少なくとも２１日間培養できることが確認できた。また、これら心臓オルガノイドにおいて、拍動と共に形態的変化が認められた。【０１５４】
（実施例１３）
＜ヒトｉＰＳ細胞を用いた、心臓オルガノイド及び肺オルガノイドの形成＞
上述のマウスＥＳ細胞の代わりに、ヒトｉＰＳ細胞を用いても、心臓オルガノイドを形成できることを、以下に示す方法にて確認した。【０１５５】
ヒトｉＰＳ細胞（２５３Ｇ１（Ｒｉｋｅｎ  ＢＲＣ  ＃ＨＰＳ０００２）を、上記同様に、図４７に示すとおり、ＬＩＦの非存在下、低結合性Ｕ底９６ウェルプレートにて培養して胚様体を得た。そして、得られた胚様体を、ゲル化ＬＮ／ＥＴ複合体の表面上にて、下記表に示す条件下、すなわち、ＦＧＦ４の存在下（条件I．II及びIV）、又はＦＧＦ４及びＹ２７６３２（ＲＯＣＫ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）の存在下（条件III）培養した。培養１１日目に新しい培養器具に移して培養を続けた。【０１５６】
【表１】
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【０１５７】
その結果、１３〜２０日間の培養において、上述のマウス心臓オルガノイド様形態を示すものを得ることができた。さらに、胎児期肺様の形態を示すオルガノイドも製造することもできた。【０１５８】
このように、心臓オルガノイドと肺オルガノイドが同時に製造できた理由について定かではないが、本発明者らは以下のように推察する。【０１５９】
例えば、マウス胎児の発生において、肺発生は、胎生（胎児期）９．５〜１０日目に気管（Ｔｒａｃｈｅａ）形成から始まり、胎生１２．５日目に終わることが知られている。肺発生に重要な点は、分枝形態形成（Ｂｒａｎｃｈｉｎｇ  ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｓｉｓ）と上皮組織化（Ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ）である。肺発生中に行われる構造的変化は、近位部（Ｐｒｏｘｉｍａｌ）と末端（Ｔｅｒｍｉｎａｌ）とで異なる遺伝子の発現によって制御される。図４８の１段目に示したように、胎生１０．５日目の心臓は、２心房２心室の区画形成が完了しているが、肺は気管に繋がった小さい組織のまま心臓に密接し、その発生は、心臓の発生に比べると始発タイミングが遅れている。また、図４８の２及び３段目に示すように、胎生１１．５、１２．５日目は肺のサイズが急激に大きくなるので、この時期は肺組織の分化と共に細胞の分裂も旺盛となる。特に、Ｆｇｆ１０とＳｈｈ（Ｓｏｎｉｃ  ｈｅｄｇｅｈｏｇ）によって初期肺のＢｒａｎｃｈｉｎｇ（分枝）が促進される。そのため、上記のとおり、インビトロにて、ＦＧＦシグナルは、心臓の発生のみならず、肺の発生を同時に誘導したものと考えられる。【０１６０】
また、図４９及び図５０に示すとおり、上記条件I〜IVの中で心臓オルガノイド及び肺オルガノイド（ｃｏｍｂｉｎｅｄ  ｈｅａｒｔ  ａｎｄ  ｌｕｎｇ，ｓｅｐａｒａｔｅｄ  ｈｅａｒｔ  ａｎｄ  ｌｕｎｇ）の作製効率が高かった条件は、条件II（６２．５％）と条件III（６０．７％）であった。このことから、ＦＧＦの濃度を制限することにより、またＲＯＣＫ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒの働きによって、心臓−肺オルガノイドの同時作製ができることが明らかとなった。【０１６１】
次に、前記にて得られたヒトｉＰＳ細胞由来の心臓オルガノイドにおいて、胎児の心臓形成において必要である、心臓特異的転写因子及び心臓構造遺伝子が、適切に発現しているかどうかを決定するため、上述のマウス心臓オルガノイド同様に、形態学的に分析した。得られた結果を図５１〜５３に示す。【０１６２】
図５１に示すとおり、ヒトｉＰＳ細胞由来の心臓オルガノイドにおいて、心臓因子であるＴｂｘ５及びＮｋｘ２−５の発現が認められた。また、図５２に示すとおり、成熟心室マーカーであるＭｌｃ−２ｖの発現も認められた。さらに、心筋トロポニン Iの発現は、調べた全てのヒトｉＰＳ細胞由来の心臓オルガノイドにおいて認められ、ＰＥＣＡＭの発現は、一部の心臓オルガノイドにおいて認められた（図５３参照）。【０１６３】
また、上記にて得られたヒトｉＰＳ細胞由来の肺オルガノイドにおいて、肺を構成する上皮細胞で発現する遺伝子が適切に発現しているかどうかを決定するため、前述の心臓オルガノイド同様に、組織学的に分析した。なお、当該分析は、一次抗体として、ＥＣＡＤ（ａｂ１１５１２）及びＣＫ８（ａｂ５３２８０）を用いた以外は、上記（蛍光免疫染色）に記載の方法と同様にして行なった。得られた結果を図５４に示す。【０１６４】
肺の重要な構造である肺胞（ａｌｖｅｏｌｉ）は、上皮細胞であるＩ型肺胞上皮細胞（Ｔｙｐｅ  Ｉ  ａｌｖｅｏｌｉ  ｃｅｌｌ）とＩＩ型肺胞上皮細胞（Ｔｙｐｅ  ＩＩ  ａｌｖｅｏｌｉ  ｃｅｌｌ）で構成された肺胞壁（ａｌｖｅｏｌｉ  ｗａｌｌ）で囲まれていることが知られている。【０１６５】
一方、図５４に示すとおり、本発明の肺オルガノイドにおいて、上皮マーカーであるＥ  ｃａｄｈｅｒｉｎ  （ＥＣＡＤ；II型肺胞上皮細胞マーカーであるＳＦＴＰＣと共局在し、肺胞で発現する）及びII型肺胞上皮細胞マーカーの一つであるＣｙｔｏｋｅｒａｔｉｎ  ８（ＣＫ８）の発現が認められた。II型肺胞上皮細胞は、自己複製と共にＩ型肺胞上皮細胞に分化することもできる。そのため、本発明の肺オルガノイドの肺胞中にはＩ型肺胞上皮細胞が潜在的存在する可能性が示唆された。また、マウス胎児の肺において、肺胞はＥＣＡＤとＣＫ８が発現する上皮細胞によって肺胞壁の組織化が行われている。それの同様に、肺オルガノイドにおいても肺胞様の部分の上皮組織化が認められた。すなわち、本発明の肺オルガノイドにおいて、形態的に類似性を示す、肺胞構造が認められた。【０１６６】
以上のとおり、本発明の方法によれば、多能性幹細胞の種類（ＥＳ細胞、ｉＰＳ細胞等）を問わず、またその由来（マウス、ヒト等）を問わず、心臓オルガノイドを製造できることが確認された。また、本発明の方法によれば、肺胞構造を持つ肺オルガノイドを製造できることも明らかになった。
【産業上の利用可能性】
【０１６７】
以上説明したように、細胞接着性タンパク質を含有するゲルの表面上にて、胚様体を培養することにより、高い自己形成能をもって、特有の空間及び時間的挙動を示す、生体内における心臓の発生過程を模倣できることが明らかになった。すなわち、本発明によって、少なくとも心筋細胞、内皮細胞及び平滑筋細胞を含む心臓オルガノイドの作製が可能となった。【０１６８】
また、このようにして得られた心臓オルガノイドは、短い培養期間にて、心臓における転写因子及び構造タンパク質の発現、様々な種類の心臓細胞の領域特異的な発現、機能的なカルシウム振動、電気生理学的性質といった、生体内のカウンターパートと同様の構造及び機能的な特性を発揮した。【０１６９】
さらに、本発明によれば、肺オルガノイドを製造することも可能となる。そして、このようにして得られる肺オルガノイドは、肺の機能を担う重要な構造である肺胞を有している。【０１７０】
したがって、本発明の心臓オルガノイド及び肺オルガノイドは、生体内におけるその構造及び機能を再現しているため、再生医療、医薬品開発、安全性試験等において有用である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２】
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【図４３】
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【図４４】
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【図４５】
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【図４６】
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【図４７】
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【図４８】
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【図４９】
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【図５０】
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【図５１】
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【図５２】
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【図５３】
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【図５４】
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【国際調査報告】
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