(57)【要約】【課題】微生物を利用し、石油関連物質に汚染された環境を除染する技術では、従来何れの微生物も耐圧性が低く、地中深く高圧で注入することが必要な工事では、困難との問題があった。また、多くの場合、微生物の生存は環境の温度などに影響され、使用に当たり、保存や環境の条件（温度、圧力、pHなど）に細心の注意が必要との問題がある。【解決手段】高い温度や高い圧力にも耐性を有する一方で、優れた石油関連物質を分解する能力をもった微生物を取得し、それにより、温度、pH、圧力など、環境の負荷に強い生物体を使用して、有用性が高く、優れた石油関連物質分解能を利用した、バイオレメデイエーション技術、特にはバイオオーグメンテーション技術を提供。【選択図】  図６
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
バシルス(Bacillus)属の微生物を用いることを特徴とする石油関連物質の分解法。
【請求項２】
微生物と微生物の増殖を促進する成分を併用することを特徴とする請求項１記載の石油関連物質の分解法。
【請求項３】
バイオマス物質を併用することを特徴とする請求項１記載の石油関連物質の分解法。
【請求項４】
バシルス(Bacillus)属細菌の胞子を用いることを特徴とする請求項１記載の石油関連物質の分解法。
【請求項５】
バシルス(Bacillus)属細菌が、Bacillus siamensis、Bacillus amyloliquefaciens、及びBacillus velezensisからなる群から選択されたものと遺伝子の相同性の高いBacillus属細菌であることを特徴とする請求項１記載の石油関連物質の分解法。
【請求項６】
土壌中の高分子（炭素数30以上）の石油関連物質を分解することを特徴とする請求項１記載の石油関連物質の分解法。
【請求項７】
Bacillus sp. af-1株(受託番号:NITE P-02735)の菌体又は胞子とBacillus sp. af-5株(受託番号: NITE P-02736)の菌体又は胞子を併用することを特徴とする請求項１記載の石油関連物質の分解法。
【請求項８】
バシルス(Bacillus)属細菌を用いて水中の炭化水素を分解除去することを特徴とする方法。
【請求項９】
バシルス(Bacillus)属の微生物を用いることを特徴とする炭化水素類の生化学的分解法。
【請求項１０】
Bacillus siamensis、Bacillus amyloliquefaciens、及びBacillus velezensisからなる群から選択されたものと遺伝子の相同性の高いバシルス(Bacillus)属細菌で、石油関連物質の分解活性を有することを特徴とするバシルス(Bacillus)属細菌又はその胞子。
【請求項１１】
Bacillus sp. af-1株(受託番号:NITE P-02735)及びその子孫、Bacillus sp. af-5株(受託番号: NITE P-02736)及びその子孫、及びそれらの胞子（芽胞）からなる群から選択されたことを特徴とする微生物。
【請求項１２】
Bacillus sp. af-1株(受託番号:NITE P-02735)の菌体又は胞子とBacillus sp. af-5株(受託番号: NITE P-02736)の菌体又は胞子を有効成分として含有することを特徴とする環境汚染物質除去剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、微生物を用いて石油関連物質により汚染された土あるいは（及び）水の除染に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、土地の再開発事業や土壌汚染対策の法制化が世界各国で進められ、有害物質に汚染された土地や地下水の安全で安価な浄化手段の開発が求められている。土（以下、土壌とも称する）や環境水質の浄化対策は、国内外で1900年代から盛んに研究され、実用に供されている方法も少なくないが、その多くは、洗浄、熱処理、吸引除去などの物理的処理法や薬品による分解除去や不溶化などの化学的処理法よるものが多い。【０００３】
一方、石油成分を分解する微生物の研究の発展を背景にして、汚染現場に棲息している微生物を活用して修復する技術（バイオステイミュレーション）が開発されて実用化が進んでいる。しかし、バイオステイミュレ一ションでは、除染が棲息する微生物の生物的機能により限定的であるという欠点がある。現在では、汚染物質を完全に分解する微生物を導入して、効率よく除染する手法として、汚染物質を分解する微生物を汚染土中に導入して高濃度に保つ方法であるバイオオーグメンテーションの開発に期待が集まっている〔非特許文献１〕。我が国の経済産業省および環境省は、微生物を土中・地下水汚染サイトに導入して浄化を行う場合のガイドラインとして2005年3月に「微生物によるバイオレメデイエーション利用指針」を告知している〔非特許文献２〕。当該指針は、使用微生物の安全性と除染技術方法を公的に認証する制度であるが、未だ広くは普及していない。【０００４】
有用な微生物を自然環境下で選択的に活性化させる必要があるバイオオーグメンテーションでは、微生物を含む水溶液を加圧によって投入しなければならない場合が多い。
現在までに、石油汚染のバイオレメデイエーションに利用出来る実用的な微生物としては、Pseudomonas属、Acinetobactor属、Rhodococcus属、Acinetobacter属などの細菌、Candida属、Rhodotorula属などの酵母が石油分解菌として分離されている〔非特許文献３〕。それらの石油分解能を持つ微生物を汚染された環境に投入して汚染物質を分解して除染する目的で、現在までに使用されている微生物は、高分子（炭素数30以上）の炭化水素の分解活性が低く、さらに細胞が高圧では死滅するので、深い地中に投入するには技術的に解決すべき課題があった。【０００５】
一般に、微生物菌体は加圧すると死滅するので、微生物を加圧によって投入しなければならない土中などの深部環境でのバイオレメデイエーションは極めて困難で、新規な技術の開発は極めて意義あることである。また、一方では、バシルス(Bacillus)属芽胞につき、圧力による活性化と殺菌についての報告もある〔非特許文献４〕。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】高畑  陽：バイオオーグメンテーションの実用化の可能性と課題、環境バイオテクノロジー学会誌、13巻、19−23、2013年。
【非特許文献２】微生物によるバイオレメデイエーション利用指針：2005年3月、経済産業省・環境省。
【非特許文献３】どんな微生物が石油を分解するか？：独立行政法人製品評価技術基盤機構（バイオテクノロジーセンターホームページhttps://www.nite.go.jp/nbrc/industry/bioreme2009/knowledge/bacteria/bacteria-1.htmlより）。
【非特許文献４】西  賢司、加藤  良、富田  守：Bacillus属芽胞の圧力による活性化と殺菌、醸造協会誌、50巻（2号）104110，1995年。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
現在までに、石油関連物質に汚染された環境を除染する方法として汚染物質の分解能を持つ微生物を利用する方法が開発されているが、何れの微生物も耐圧性が低く、地中深く高圧で注入する必要な工事では、効率の良い工事が困難であった。また、多くの場合には、微生物の生存は環境の温度などに影響される場合が多く、使用に当たっては保存や環境の条件（温度、圧力、pHなど）に細心の注意が必要であった。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本願発明者は、この技術上の難点を解決する手段の開発に鋭意検討を加え、本願発明を完成させた。
上記の従来のバイオオーグメンテーション法の難点を解決し、保存や使用時の環境条件の制限を解消できる方法として、温度、pH、圧力など、環境の負荷に強い生物体として細菌の胞子（芽胞）〔非特許文献４：西  賢司、加藤  良、富田  守：Bacillus属芽胞の圧力による活性化と殺菌、醸造協会誌、50巻（2号）104110，1995年〕を使用する工法について鋭意研究を行い、本願に係る発明を完成させた。【０００９】
因みに、従来の工法で用いられて来た微生物は、温度100℃、あるいは圧力5MPa程度で完全に死滅するが、本願に係る発明で開発した菌株は100℃でも死滅することなく、圧力200 MPaでも死滅しない菌株である。
すなわち、芽胞を形成し、温度70℃でも生存できる菌株で、好気的条件下で、石油関連物質（炭化水素）を分解する細菌を選抜した。検索した複数の細菌を同時に作用させることのよって高分子の炭化水素化合物（炭素数35以上の炭化水素）をも分解する機能を発揮させることに成功し、本願に係る基礎技術発明を完成した。【００１０】
本発明は、次なる態様を提供している。
〔１〕バシルス(Bacillus)属の微生物を用いることを特徴とする石油関連物質の分解法。
〔２〕微生物と微生物の増殖を促進する成分を併用することを特徴とする上記〔１〕記載の石油関連物質の分解法。
〔３〕バイオマス物質を併用することを特徴とする請求項１記載の石油関連物質の分解法。
〔４〕バシルス(Bacillus)属細菌の胞子を用いることを特徴とする上記〔１〕記載の石油関連物質の分解法。
〔５〕バシルス(Bacillus)属細菌が、Bacillus siamensis、Bacillus amyloliquefaciens、及びBacillus velezensisからなる群から選択されたものと遺伝子の相同性の高いバシルス(Bacillus)属細菌であることを特徴とする上記〔１〕記載の石油関連物質の分解法。
〔６〕土壌中の高分子（炭素数30以上）の石油関連物質を分解することを特徴とする上記〔１〕記載の石油関連物質の分解法。
〔７〕Bacillus sp. af-1株(受託番号:NITE P-02735)の菌体又は胞子とBacillus sp. af-5株(受託番号: NITE P-02736)の菌体又は胞子を併用することを特徴とする上記〔１〕記載の石油関連物質の分解法。
〔８〕バシルス(Bacillus)属細菌を用いて水中の炭化水素を分解除去することを特徴とする方法。
〔９〕バシルス(Bacillus)属の微生物を用いることを特徴とする炭化水素類の生化学的分解法。
〔１０〕Bacillus siamensis、Bacillus amyloliquefaciens、及びBacillus velezensisからなる群から選択されたものと遺伝子の相同性の高いバシルス(Bacillus)属細菌で、石油関連物質の分解活性を有することを特徴とするバシルス(Bacillus)属細菌又はその胞子。
〔１１〕Bacillus sp. af-1株(受託番号:NITE P-02735)及びその子孫、Bacillus sp. af-5株(受託番号: NITE P-02736)及びその子孫、及びそれらの胞子（芽胞）からなる群から選択されたことを特徴とする微生物。
〔１２〕Bacillus sp. af-1株(受託番号:NITE P-02735)の菌体又は胞子とBacillus sp. af-5株(受託番号: NITE P-02736)の菌体又は胞子を有効成分として含有することを特徴とする環境汚染物質除去剤。
【発明の効果】
【００１１】
本発明で、高い温度や高い圧力にも耐性を有する一方で、優れた石油関連物質を分解する能力をもった微生物が提供される。本発明で、環境汚染物質除去剤における、保存や使用時の環境条件の制限といった問題の解消が可能となり、温度、pH、圧力など、環境の負荷に強い生物体を使用して、有用性が高く、優れた石油関連物質分解能を利用した、バイオレメデイエーション技術、特にはバイオオーグメンテーション技術を提供できる。例えば、本発明で開発した菌株は100℃でも死滅することなく、圧力200 MPaでも死滅しない菌株であり、それは芽胞を形成し、高温でも生存できる菌株で、好気的条件下で、石油関連物質（例えば、炭化水素など）を分解するという特徴を有し、更に、複数の菌を同時に作用させることのよって、高分子の炭化水素化合物（炭素数35以上の炭化水素など）をも分解するという、優れた能力機能を発揮させることができる。
本発明のその他の目的、特徴、優秀性及びその有する観点は、以下の記載より当業者にとっては明白であろう。しかしながら、以下の記載及び具体的な実施例等の記載を含めた本件明細書の記載は本発明の好ましい態様を示すものであり、説明のためにのみ示されているものであることを理解されたい。本明細書に開示した本発明の意図及び範囲内で、種々の変化及び／又は改変（あるいは修飾）をなすことは、以下の記載及び本明細書のその他の部分からの知識により、当業者には容易に明らかであろう。本明細書で引用されている全ての特許文献及び参考文献は、説明の目的で引用されているもので、それらは本明細書の一部としてその内容はここに含めて解釈されるべきものである。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】sf-1菌及びsf-5菌の培養液中における潤滑油の分解の様子を示す図面代用写真を示す。培地：ペプトン0.5%、酵母抽出物0.5%、潤滑油5%、pH7.0水酸化ナトリウムで調整。培養条件：28℃、振とう培養100rpm、36時間。対照は、植菌をせずに、他の条件を同様にしたもの。
【図２】実施例１で発見、単離したsf-1株についての株式会社テクノスルガ・ラボよりの報告書。
【図３】実施例１で発見、単離したsf-5株についての株式会社テクノスルガ・ラボよりの報告書。
【図４】sf-1株とsf-5株の併用処理での、ディーゼル油を含む土試料のGC-FID分析のチャートを示す。
【図５】sf-1株とsf-5株の併用処理での、潤滑油を含む土試料のGC-FID分析のチャートを示す。
【図６】本発明の微生物資材により反応処理せしめた土試料中の炭化水素のGC-FID分析のチャートの変化を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
現在までに、石油関連物質に汚染された環境を除染する方法として汚染物質の分解能を持つ微生物を利用する方法は開発されているが、何れの微生物も耐圧性が低く、地中深く高圧で注入する必要な工事では、効率の良い注入は困難であった。また、多くの場合には、微生物の生存は環境の温度などに影響される場合が多く、使用に当たっては保存や環境の条件（温度、圧力、pHなど）に細心の注意が必要であった。
【００１４】
こうした課題を、本発明では、以下のようにして解決方法を模索した。
上記の従来のバイオオーグメンテーション法の難点を解決する目的で、保存や使用時の環境条件の制限を解消できる方法として、温度、pH、圧力など、環境の負荷に強い生物体として細菌の胞子（芽胞）〔西  賢司、加藤  良、富田  守：Bacillus属芽胞の圧力による活性化と殺菌、醸造協会誌、50巻（2号）104110，1995年〕を使用する工法について鋭意研究を行い、本願に係る発明を完成させた。
因みに、従来の工法で用いられて来た微生物は、温度100℃、あるいは圧力5MPa程度で完全に死滅するが、本願に係る発明で開発した菌材は100℃でも死滅することなく、圧力200MPaでも死滅しない。
本発明では使用する微生物として、芽胞を形成し、温度70℃でも生存できる菌株で、好気的条件下で、石油関連物質（炭化水素）を分解する細菌を選抜した。検索した複数の細
菌を同時に作用させることによって高分子の炭化水素化合物（炭素数35以上の炭化水素）を分解する機能を発揮させることに成功し、本願に係る技術発明を完成した。
【００１５】
本発明の微生物は、バシルス（Bacillus）属に属し、好気的条件下で石油関連物質、例えば、炭化水素を分解する能力を有するものである。本発明の微生物は、潤滑油の分解活性は微弱であるが、界面活性機能を持つ物質を生産し、別の微生物の潤滑油の分解を促進するもの、更に、その潤滑油の分解活性が、別の界面活性機能を持つ物質を生産する微生物により、増強されるものであってよい。本発明の微生物には、石油製品、例えば、潤滑油を分解する活性を指標に培養選別されるものが挙げられ、このような微生物としては、本発明者により単離されたsf-1株、sf-5株などを例示することができる。
これらの菌株のリボソームDNA（16S rDNA-500）の塩基配列、すなわち、配列表の配列番号1 (SEQ ID NO: 1)や配列表の配列番号2 (SEQ ID NO: 2)に対する相同性の分析から、Bacillus siamensis PD-A10T株、Bacillus amyloliquefaciens NBRC 15535T株、及びBacillus velezensis CR-50T株からなる群から選択されたものと高い遺伝子の相同性（例えば、99.6％の相同性）を示すが、その相同性よりも高い遺伝子相同性を有するものを、本発明のバシルス（Bacillus）属菌に含めてよい。
【００１６】
本発明の微生物には、sf-1株、sf-5株のほか、これらの菌株と一定の類似性を示す微生物も含まれる。一定の類似性を示す微生物とは、例えば、リボソームDNA（16S rDNA-500）の塩基配列が、上記２菌株と類似している微生物をいう。具体的には、リボソームDNA（16S rDNA-500）の塩基配列が配列番号1又は配列番号2に記載の塩基配列と99.7％以上、好ましくは99.8％以上、特に好ましくは99.9％以上相同である微生物が、上記菌株と一定の類似性を示す微生物に含まれる。
このような上記菌株と一定の類似性を示す微生物は、石油関連物質、例えば、揮発油の分解活性を指標にする、実施例１に記載された手法を利用したり、土壌試料から、配列番号１〜2に記載の塩基配列を指標として単離してくることができる。
【００１７】
本発明の微生物を培養して増殖させるには、通常の培養法が挙げられる。培養は、好適には、好気的条件で行うことができる。培養には、当該微生物が同化したり、資化することが可能な炭素源や窒素源などを含有する培地を使用する。炭素源としては、該微生物が同化したり、資化することができるものであればどのようなものでもよいが、例えば、グルコース、シュクロース、フラクトース、糖蜜、でんぷん、可溶性でんぷん、デンプン加水分解物、デキストリンなどの糖類あるいは炭水化物、パラフィン類などが挙げられ、さらに、酢酸、クエン酸、酪酸、フマール酸、安息香酸などの有機酸類、メタノール、エタノール、ブタノール、グリセリンなどのアルコール類、オレイン酸、ステアリン酸などの脂肪酸およびそのエステル類、大豆油、菜種油、ラード油などの油脂類などが挙げられ、それらは単独又は混合して用いることができる。
【００１８】
窒素源としては、資化することができるものであればどのようなものでもよいが、例えば、アンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、硝酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、リン酸アンモニウムなどのアンモニウム塩類、硝酸ナトリウム、硝酸カリウムなどの硝酸塩類、尿素、ペプトン、カザミノ酸、コーンステイープリカー、コーングルテンミール、カゼイン加水分解物、ふすま、酵母エキス、乾燥酵母、各種発酵菌体およびその消化物、大豆粉、大豆粕および大豆粕加水分解物、綿実粉、肉エキス、その他の有機または無機の窒素含有物などが挙げられ、それらは単独又は混合して用いることができる。培地には、無機塩類、ミネラル、ビタミン、微量金属塩などの栄養素を任意に適宜加えることもできる。
【００１９】
無機塩として培地に添加する物質としては、リン酸塩、マグネシウム塩、カルシウム塩、鉄塩、その他必要に応じて微量金属塩が挙げられる。さらに、本発明の微生物の増殖を促進するための栄養源として、ビタミンなどを適量添加しても良い。その他、当該分野で一般的に使用されるものを適宜選択して用いることができる。有機物、無機塩、窒素源、その他栄養源を含む培地等に本発明の微生物を接種し、例えば静置培養法、振とう培養法、深部通気攪拌培養法等の好気的条件下で培養を行う。
上記培養における温度条件は、使用する微生物の生育温度の範囲、好ましくは最適生育温度の範囲に設定する。例えば20〜30℃、好ましくは25℃に設定することができる。なお、培地のpHは、6.5〜7.5の範囲に設定すればよい。
培養時間は、栄養源の量や種類により異なるが、十分な増殖を達成できるように選ぶことが可能である。例えば、培養時間は、数分間とか、数時間とか、数日であっても良い。
【００２０】
本発明の微生物は、石油関連物質に汚染された環境の浄化に利用することができる。すなわち、本発明は、微生物を有効成分として含有する環境汚染物質除去剤を提供する。ここでいう「環境」には、土壌、海洋、湖沼、河川、地下水のほか、排水なども含まれる。さらに、廃棄物、例えば、産業廃棄物、家庭廃棄物、工場廃棄物、工場排水なども包含される意味であってよい。環境の浄化は、上記条件で培養した微生物の培養液、当該微生物の胞子（芽胞）含有液、あるいは、微生物またはその胞子を凍結乾燥処理した乾燥粉末を汚染環境に散布すること、あるいは注入することにより行われる。この際、複数の微生物を併用したり、微生物と増殖を補助する成分や無機塩類を混合・造粒し、粉末状及び顆粒状等に製剤化したものを汚染環境に散布しても良い。処理に用いる微生物の量は、土壌及び海水の汚染状況等に応じ、任意に定めることができる。さらに、汚染された排水の浄化は、同じく上記培養液あるいは乾燥菌体を汚染排水と混合し、好気条件で培養することで行う。
【００２１】
本発明で対象としている「石油関連物質」とは、液状の化石燃料を含めてよく、例えば、原油、原油を精製分離することで製造される、石油製品、例えば、ガソリン、灯油、軽油、重油、潤滑油、エンジンオイル、ディーゼル油、パラフィン、タール、アスファルトなど、更には、それらの成分である、直鎖状アルカン、分枝状アルカン、シクロアルカン、アルキルシクロアルカンなどの飽和炭化水素、不飽和脂肪族炭化水素、ベンゼン、トルエン、ナフタレン、フェナントレン、アントラセンなどの芳香族炭化水素、それら炭化水素誘導体、硫黄化合物、窒素化合物、酸素化合物なども包含されて良い。該石油関連物質には、石油製品由来の有機合成技術で生み出され、環境に悪影響を与えているものも、それに含まれてよい。
【００２２】
本発明では、高い温度や高い圧力などに対して耐性を示す当該微生物を複数種組み合わせて使用することで、より優れた石油関連物質の分解性能を得る技術にも関する。例えば、Bacillus sp. af-1株(受託番号:NITE P-02735)の菌体又は胞子とBacillus sp. af-5株(受託番号: NITE P-02736)の菌体又は胞子を有効成分として併用して使用することにより、従来分解が困難と看做されていた高分子の炭化水素、例えば、C30程度の高分子の炭化水素をも良好に分解せしめることが出来る。さらに、本発明は、該微生物に対して、同化したり、資化することが可能なバイオマス物質、更には、成長促進活性を示すバイオマス物質を併用して使用する技術も提供する。当該バイオマス物質を併用することにより、より優れた石油関連物質の分解性能を得ることも可能であり、効率よく環境の除染を図ることが可能となる。該バイオマス物質としては、様々な生物起源のものが挙げられる。例えば、上記培養において利用される栄養源なども含まれてよいし、様々な形態のバイオマス物質も利用可能である。そして、該バイオマス物質としては、当該分野や、その他の分野で、生物利用が可能であることの知られているものの中から選択して利用でき、例えば、廃棄物系バイオマス、未利用バイオマス、資源作物由来バイオマスが挙げられる。廃棄物系バイオマスとしては、例えば、廃棄された紙、パルプ廃液、家畜排泄物、食品廃棄物、建設発生木材、製材工場残材、おが屑、樹木の枝葉、草、下水汚泥、下水有機物などが挙げられる。未利用バイオマスとしては、例えば、稲わら、麦わら、籾殻、農作物の未利用部分、海草、プランクトンなどが挙げられる。資源作物由来バイオマスとしては、例えば、サトウキビ、トウモロコシなどが挙げられる。さらに、本発明では、界面活性剤など油性成分を乳化せしめる活性を有する物質を併用したり、そうした成分を産生する微生物を併用することも有利である。因みに、Bacillus sp. af-1菌は、界面活性機能を持つ物質を生産する。
【００２３】
以下に実施例を掲げ、本発明を具体的に説明するが、この実施例は単に本発明の説明のため、その具体的な態様の参考のために提供されているものである。これらの例示は本発明の特定の具体的な態様を説明するためのものであるが、本願で開示する発明の範囲を限定したり、あるいは制限することを表すものではない。本発明では、本明細書の思想に基づく様々な実施形態が可能であることは理解されるべきである。
全ての実施例は、他に詳細に記載するもの以外は、標準的な技術を用いて実施したもの、又は実施することのできるものであり、これは当業者にとり周知で慣用的なものである。
【００２４】
後述の実施例１に記載のsf-1株は、2018年6月7日から千葉県木更津市かずさ鎌足２丁目５番地８（郵便番号 292-0818)の独立行政法人製品評価技術基盤機構(NITE)特許微生物寄託センター(NPMD)に寄託されて保管されている（識別の表示 Bacillus sp. af-1、受託番号 NITE P-02735、受領日: 2018年6月7日)。また、後述の実施例１に記載のsf-5株は、2018年6月7日から千葉県木更津市かずさ鎌足２丁目５番地８（郵便番号 292-0818)の独立行政法人製品評価技術基盤機構(NITE)特許微生物寄託センター(NPMD)に寄託されて保管されている（識別の表示 Bacillus sp. af-5、受託番号 NITE P-02736、受領日: 2018年6月7日)。
【実施例１】
【００２５】
〔石油関連物質の分解能を持つ菌株の取得と石油関連物質の分解活能の定性〕
石油関連物質の分解能を持つ菌株を、下記の手法で検索を行った。
すなわち、口径1.3 cmのガラス製試験管に滅菌した液体（0.5%のペプトンと0.1%の酵母エキスを含む水溶液）5mLと0.5mL〜1.0mLの潤滑油を入れ攪拌する。
これをスクリーニング培地として、分離源のサンプルを少量添加して、27℃で振盪培養した。
この培養液では、静置すると石油関連物質は液上面に層を形成して培養液層と分離するが、この石油層が培養により減少したサンプルの培養液層を上記スクリーニング培地に繰り返して移植し、微生物を集積培養した。
このスクリーニング培養の一例を図１の写真に示すが、この手法で潤滑油の分解活性を有すると看做した菌株を集めた。因みに、本発明に係る研究では、本実施例で示した様に、石油分解菌を包含した球状の液泡を形成する（図１の写真参照）ことを発見し、これを指標として、容易に石油分解菌の検出を可能にした。
この手法で、大阪府堺市内の土壌を試料として、石油（潤滑油）を分解する活性を有する微生物の検索を行い、市内の汚泥中から目的に適う細菌（sf-1株と称する）と（sf-5株と称する）の２株を単離した。sf-1株は、潤滑油の分解活性は微弱であるが、界面活性機能を持つ物質を生産し、sf-5株の潤滑油の分解を促進した。
【実施例２】
【００２６】
本発明は、sf-1株及び／又はsf-5株の両菌株を使用する石油汚染の除染法に関するものであるが、以下に示す実施例では、特に断らない限り、下記に示す石油関連物質の〔分解活性の測定法〕を用いた。
本発明に関する石油関連物質に汚染された土壌の除染活性の測定（以下、活性の測定）は、下記の手法に沿って行った。
使用した土壌品は、大阪府内の山林を整地して造成した農場用地で採取した。石油汚染土の試料は、前記の農場用地の表面からの深度約１メートルで採取した土を用い、これにディーゼル油及び／又は潤滑油を吸着させて調製した。ディーゼル油および潤滑油は何れも日本国内で市販されている商品を用いた。
これに、sf-1株およびsf-5株の胞子の混合物（M-U）およびM-U中の胞子の発芽・増殖を誘発し、促進する素材（A-U）を添加し、充分攪拌して、活性測定用サンプルとした。
活性の測定は、次の手順で行った。すなわち、上記の活性測定用サンプルを27℃で反応させ、サンプル中の石油関連物質は、下記の〔石油関連物質の抽出法〕に示す手法で抽出して抽出物の重量の変化を測定する重量法およぴ、表１に示す条件での、ガスクロマトグラフィー法（GC-FID）によって分析した。【００２７】
【表１】
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【００２８】
〔分解活性の測定法〕
本発明に関する石油関連物質に汚染された土（及び／又は汚染土標品と呼ぶ）の除染活性の測定（以下、活性の測定）は、下記の手法に沿って行った。
土標品にディーゼル油あるいは潤滑油を所定の重量比で添加し、ブレンダーを用いて充分に攪拌して石油汚染土サンプルとした。これに、M-U及びA-Uを添加し、ブレンダーで充分攪拌して活性測定用サンプルとした。
活性の測定は、次の手順で行った。すなわち、上記の活性測定用サンプルを27℃で反応させ、サンプル中の石油関連物質は、下記の〔石油関連物質の抽出法〕の手法で抽出して重量の変化を測定する重量法および、表１に示す条件での、ガスクロマトグラフィー法（GC-FID）によっても分析した。【００２９】
〔石油関連物質の抽出法〕
土標品からの石油関連物質の抽出の標準的な手順は次の通りである。すなわち、(1)5 gの土サンプルを50 mL容のファルコンチューブに入れ、(2)これに15 gのNa2SO4と15 mLのn-ヘキサンを添加し、攪拌して、石油関連物質を抽出し、(3)抽出液を濾過で集めた。この操作を３回繰り返し、抽出液とした。(4)この抽出液を減圧濃縮してn-ヘキサンを除去して、石油関連物質を集め秤量して、石油関連物質の含量を測定した。この手法で、M-U及びA-Uの石油関連物質の分解活性を測定した。
また、表１に示した条件によるガスクロマトグラフィーによる常法の分析法によつても石油関連物質の含量を測定した。
【実施例３】
【００３０】
〔菌株sf-1と菌株sf-5の同定〕
実施例１で発見、単離したsf-1株及びsf-5株は、何れも好気性の細菌で、胞子を形成するグラム陽性の桿菌であった。これらの性質は、分類学上バシルス(Bacillus)属に分類される細菌であることを示している。
また、リボソームDNA（16S rDNA-500）の相同性の分析から（図２及び３）、この２菌株は、共にBacillus siamensisに近縁（相同率卒99.6％）なBacillus sp.と同定された。【００３１】
菌株sf-1と菌株sf-5から抽出された16S rDNA-500の塩基配列（株式会社テクノスルガ・ラボの報告書より）を、次に示す。
sf-1株のDNAの塩基配列〔配列表の配列番号1 (SEQ ID NO: 1)〕【００３２】
【化１】
2020009097.tif 000004
【００３３】
sf-5株のDNAの塩基配列〔配列表の配列番号2 (SEQ ID NO: 2)〕【００３４】
【化２】
2020009097.tif 000005
【００３５】
また、BLAST検索により最も高い相同性を示した種（基準株）は、Bacillus siamensis PD-A10T株、Bacillus amyloliquefaciens NBRC 15535T株、Bacillus velezensis CR-50T株であり、総合的な考察の結果、Bacillus siamensisに近縁なBacillus sp.と同定された（株式会社テクノスルガ・ラボよりの報告書：図２及び３）。因みに、Bacillus siamensisは、プーケム（タイ国原産の沢がにの塩漬け）から多く分離される菌種で、バイオセーフティーレベル１（図２及び３：日本細菌学会バイオセーフティー指針より）と評価される安全性の高い菌株である。
これらの事実から、sf-1株とsf-5株は、大量の微生物菌体を使用する石油汚染の除染（バイオオーグメンテーション）に用いるには、極めて適切な微生物であると評価される。  なお、マウスを用いる動物試験で、経口急性毒性および遅延型過敏反応の何れも陰性で有ることを確認している。
【実施例４】
【００３６】
〔sf-1株とsf-5株の併用によるディーゼル油と潤滑油の分解〕
本発明で用いた土の標品は、何れも日本国内で山林を整地した農業用地で採取した。微生物資材としては、（1g中にsf-1株とsf-5株の胞子を各々107ヶを含む粉末：以下、M-Uと称する）を用いた。
さらに、微生物資材の発芽・増殖活性を持つ素材としてA-Uを開発した。A-Uの成分は、胞子の発芽および当該菌株の増殖活性を有する物質であれば、単品であれ混合物であれ、その組成を問わない。例えば、糖質、タンパク質、酵母の抽出物、核酸、リン酸、カリウム、カルシウム、マグネシウム塩などの混合物を使用したが、単品でも混合物の何れでも用いることが出来る。本発明のA-Uの一例を示せば、グルコース 2％、ペプトン 0.5％および酵母エキス 0.3％を含む混合物である。
以下、表２に示す組成の土の標品100 gを500 mL容のプラスチック製の容器に入れ綿栓をして、27℃で反応させ、ディーゼル油と潤滑油の分析を行い、M-Uの効果を評価した。【００３７】
【表２】
2020009097.tif 000006
【００３８】
その結果、表３〜６中の1−1と1−2あるいは、1−3と1−4の結果を比較すると、何れも前者に比べて後者のディーゼル油あるいは潤滑油の分解速度が大きいことが明確である。【００３９】
【表３】
2020009097.tif 000007
【００４０】
【表４】
2020009097.tif 000008
【００４１】
【表５】
2020009097.tif 000009
【００４２】
【表６】
2020009097.tif 000010
【００４３】
このことから、微生物（M-U）の投入量がディーゼル油や潤滑油の除去量と相関性があることが実証され、本発明技術で分離された菌株がディーゼル油汚染の除去に有効であることが実証された。
【実施例５】
【００４４】
実施例４で示した表２に示す条件の1−2，1−4について、ディーゼル油や潤滑油の分解の状態をGC-FID法（ガスクロマトグラフィー法）で検討した。その結果を、図４、図５で比較して示した。これらの結果から、本発明の方法では、従来は困難が多いとされる潤滑油の微生物分解が一定の速度で進行し、分解反応は投入するM-Uの量と相関があり、潤滑油の除染に活用出来る方法であると考えられた。
また、GC-FID法による分析結果から、この方法で、C30（炭素数30、クロマトグラム中の最大ピークの部分）程度の高分子の炭化水素が分解できることが明らかになった。現在までの知見によると、C30程度の高分子の炭化水素の微生物分解は容易では無いので、本発明の技術は極めて貴重な技術と言える。
【実施例６】
【００４５】
土の量を増量した条件で潤滑油の除染テストを行った。すなわち、3 kgの土サンプルに潤滑油10,000 ppmになる様に添加して、回転ドラム式のミキサーを用いて充分に攪拌した。更に、これにM-U 60 g、A-U 90 gおよび水 750 mLを添加して充分攪拌し、除染用試料とした。この試料を木箱（14m×13cm×16cm）に入れ、試料の上面を水で湿した綿布で覆った。この木箱を、下段に水を入れたバットを入れた恒温器の上段に置き、25℃で反応させた。
反応中、1週間の間隔で試料表面から5 cmの深度の土を採取して、石油関連物質の濃度を測定した。測定結果を表７及び図６に示すが、22週間の反応で土中に潤滑油が検出不能になる状態になった。これらの結果、本発明の石油関連物質に汚染された土の除染への有効性が実証された。【００４６】
【表７】
2020009097.tif 000011
【産業上の利用可能性】
【００４７】
本発明では、高い温度や高い圧力に対しての耐性が優れており、高分子（炭素数30以上）の炭化水素などに対しても優れた分解活性を示す微生物が見出されており、深い地中に投入することの可能な石油関連物質除染技術であり、石油汚染のバイオレメデイエーションに利用出来る実用的な技術となる。本発明により、耐圧性が優れている微生物を利用して、、地中深く高圧で注入する必要のあるような工事で、効率の良い工事が可能となり、石油関連物質に汚染された環境を有利に除染することが可能である。本発明は、有害物質に汚染された土地や地下水の安全で安価な浄化手段の開発に資することができる。
本発明は、前述の説明及び実施例に特に記載した以外も、実行できることは明らかである。上述の教示に鑑みて、本発明の多くの改変及び変形が可能であり、従ってそれらも本件添付の請求の範囲の範囲内のものである。
【受託番号】
【００４８】
バシルス属(Bacillus sp.)菌af-1株: NITE P-02735
バシルス属(Bacillus sp.)菌af-5株: NITE P-02736
【配列表フリーテキスト】
【００４９】
SEQ ID NO: 1, 16S-rDNA
SEQ ID NO: 2, 16S-rDNA
【図１】
2020009097.tif 000012
【図２】
2020009097.tif 000013
【図３】
2020009097.tif 000014
【図４−１】
2020009097.tif 000015
【図４−２】
2020009097.tif 000016
【図５−１】
2020009097.tif 000017
【図５−２】
2020009097.tif 000018
【図６−１】
2020009097.tif 000019
【図６−２】
2020009097.tif 000020
【配列表】
2020009097000001.app
【国際調査報告】
2020009097.tif 000021
2020009097.tif 000022
2020009097.tif 000023
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