(57)【要約】  本発明は、キマーゼに結合するアプタマーであって、該アプタマーが、ＵＡＡＣＲ１Ｎ１Ｒ２ＧＧＧＧ（式中、Ｒ１およびＲ２が任意の一つの塩基であり、Ｎ１が３〜３０個の塩基である）で表される共通配列（ただし、ウラシルはチミンであってもよい）を含む、アプタマーを提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
キマーゼに結合するアプタマーであって、該アプタマーが、ＵＡＡＣＲ１Ｎ１Ｒ２ＧＧＧＧ（式中、Ｒ１およびＲ２が任意の一つの塩基であり、Ｎ１が３〜３０個の塩基である）で表される共通配列（ただし、ウラシルはチミンであってもよい）を含む、アプタマー。
【請求項２】
キマーゼに結合するアプタマーであって、以下の式（１）で表される潜在的二次構造（ただし、ウラシルはチミンであってもよい）を有する、アプタマー。
【化１】
2019107532.tif 000021
ここで、式（１）における
【化２】
2019107532.tif 000022
部分は、ステム／ループ部分構造を示し、Ｒ１およびＲ２は任意の一つの塩基を示す。
【請求項３】
キマーゼの活性を阻害する、請求項１または２に記載のアプタマー。
【請求項４】
Ｒ１とＲ２との組み合わせがＡ／Ｕ、Ｃ／Ｇ、Ａ／ＣまたはＧ／Ｕ（ただし、ウラシルはチミンであってもよい）である、請求項１〜３のいずれか一項に記載のアプタマー。
【請求項５】
ピリミジンヌクレオチドの少なくとも一つが修飾または改変されている、請求項１〜４のいずれか一項に記載のアプタマー。
【請求項６】
配列ＵＡＡＣＲ１におけるＵおよび／またはＣが修飾または改変されている、請求項１〜５のいずれか一項に記載のアプタマー。
【請求項７】
（１’）部分のステム／ループ部分の塩基長が３〜２１である、請求項２〜６のいずれか一項に記載のアプタマー。
【請求項８】
Ｎ１または
【化３】
2019107532.tif 000023
で表されるステム／ループ部分構造の配列が、ＵＵＧＵ、ＣＵＧＧまたはＡＡＵＵである（ただし、ウラシルはチミンであってもよい）、請求項１〜７のいずれか一項に記載のアプタマー。
【請求項９】
以下の（ａ）、（ｂ）または（ｃ）のいずれかのヌクレオチド配列を含む、請求項１または２に記載のアプタマー。
（ａ）配列番号１〜１１および１４〜３３のいずれかから選択されるヌクレオチド配列（但しウラシルはチミンであってもよい）；
（ｂ）配列番号１〜１１および１４〜３３のいずれかから選択されるヌクレオチド配列（但しウラシルはチミンであってもよい）において、１〜数個のヌクレオチドが置換、欠失、挿入あるいは付加されたヌクレオチド；または
（ｃ）配列番号１〜１１および１４〜３３のいずれかから選択されるヌクレオチド配列（但しウラシルはチミンであってもよい）と70%以上の相同性を有するヌクレオチド配列。
【請求項１０】
アプタマーに含まれる少なくとも一つのヌクレオチドが修飾または改変されている、請求項９に記載のアプタマー。
【請求項１１】
アプタマーに含まれる各ピリミジンヌクレオチドのリボース２’位のヒドロキシル基が、同一または異なって、無置換であるか、水素原子、フッ素原子およびメトキシ基からなる群より選ばれる原子または基で置換されている、請求項１または２に記載のアプタマー。
【請求項１２】
アプタマーに含まれる各プリンヌクレオチドのリボース２’位のヒドロキシル基が、同一または異なって、無置換であるか、水素原子、フッ素原子およびメトキシ基からなる群より選ばれる原子または基で置換されている、請求項１または２に記載のアプタマー。
【請求項１３】
請求項１〜１２のいずれか一項に記載のアプタマーおよび機能性物質を含む複合体。
【請求項１４】
請求項１〜１２のいずれか一項に記載のアプタマーまたは請求項１３に記載の複合体を含む医薬。
【請求項１５】
臓器または組織の線維化が関与する疾患、または循環器系疾患の治療薬である、請求項１４に記載の医薬。
【請求項１６】
線維症の治療薬である、請求項１４に記載の医薬。
【請求項１７】
請求項１〜１２のいずれか一項に記載のアプタマーまたは請求項１３に記載の複合体を用いることを特徴とする、キマーゼの検出方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、キマーゼに対するアプタマー及びその利用方法などに関するものである。
【背景技術】
【０００２】
ヒトキマーゼ（ＥＣ．３．４．２１．３９）はキモトリプシン様セリンプロテアーゼの一種で、肥満細胞の分泌顆粒中に貯蔵されている。肥満細胞が外的刺激を受けると脱顆粒を起こし、ヒトキマーゼは様々な炎症メディエーターと共に細胞外に放出される。放出されたヒトキマーゼは、基質である蛋白質やペプチドに含まれるフェニルアラニンやチロシンといった芳香族アミノ酸を特異的に認識し、そのアミノ酸に隣接するペプチド結合を切断する。ヒトキマーゼの代表的な基質として、アンジオテンシンＩ（ＡｎｇＩ）が挙げられる。ヒトキマーゼはＡｎｇＩを切断し、血管収縮因子であるアンジオテンシンＩＩ（ＡｎｇＩＩ）を産生する。
哺乳類のキマーゼは系統学的にαとβの２つのサブファミリーに分類される。ヒトを含む霊長類の発現するキマーゼは一種類のみでαファミリーに属している。一方で、げっ歯類はαとβ両方のキマーゼを発現する。マウスの場合、複数の種類のキマーゼが知られているが、基質特異性や組織における発現様式から、βファミリーに属するｍｏｕｓｅ  ｍａｓｔ  ｃｅｌｌ  ｐｒｏｔｅａｓｅ−４（ｍＭＣＰ−４）が最もヒトキマーゼに近いと考えられる。また、ハムスターでもβファミリーに属するｈａｍｓｔｅｒ  ｃｈｙｍａｓｅ−１がそれに対応する。一方で、ヒトキマーゼと同じαファミリーに属するｍＭＣＰ−５やｈａｍｓｔｅｒ  ｃｈｙｍａｓｅ−２はエラスターゼ様活性を持ち、基質特異性が異なる。
キマーゼはトランスフォーミング増殖因子β（ＴＧＦ−β）の活性化に深く関係している。ＴＧＦ−βは上皮細胞や内皮細胞周辺の細胞外マトリックス中に潜在型（ｌａｔｅｎｔ−ＴＧＦ−β）として存在し、ｌａｒｇｅ  ｌａｔｅｎｔ  ＴＧＦ−β  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ（ＬＴＢＰ）を介して細胞外マトリックスに保持されている。必要に応じて細胞外マトリックスから放出され、活性化されたＴＧＦ−βは細胞の増殖分化、組織障害後の修復や再生に関与するとされ、生体にとって極めて重要なサイトカインである。また、そのシグナルの破綻は、様々な疾患の発症及び進展に繋がることも知られている。この過程において、キマーゼはｌａｔｅｎｔ  ＴＧＦ−βの細胞外マトリックスからの遊離、及びｌａｔｅｎｔ  ＴＧＦ−βから活性型ＴＧＦ−βへの変換反応へ関与すると考えられている。
キマーゼは線維症、循環器疾患、炎症、アレルギー疾患、臓器癒着など様々な疾患と関係していることが知られている。線維症とは肺や心臓、肝臓、腎臓、皮膚などで細胞外基質の代謝異常が起こり、結合組織タンパク質が過剰に沈着する病気である。例えば肺線維症では肺にコラーゲンなどの結合組織タンパク質が過剰に沈着し、肺胞が硬く縮んでしまい呼吸困難に陥る。肺の線維化は、大量のほこりに曝露することで起こる塵肺、抗がん剤などの薬物使用によって起こる薬剤性肺炎、アレルギー性肺炎、肺結核、膠原病のような自己免疫疾患などが原因で起こることがわかっている。一方で原因不明のケースも少なくない。
線維症の分子レベルでの発症機序は未だ十分に解明されていない。一般に正常な状態においては線維芽細胞の増殖やその機能は十分に制御されているが、炎症や外傷が重篤あるいは持続的であった場合には、組織修復機構が過剰に働き、線維芽細胞の異常増殖や結合組織タンパク質の過剰生産が起こる。このような現象を引き起こす因子としてＴＧＦ−βが知られている。その関与を示唆するものとして、線維症動物モデルに抗ＴＧＦ−β中和抗体を投与すると、コラーゲン発現が減少し、線維化が有意に抑制されることが報告されている。また、特発性肺線維症患者においては、ＴＧＦ−βやキマーゼ陽性肥満細胞の増加がみられる。
一方で、キマーゼが線維症に関係していることがモデル動物を用いた実験により示されている。ハムスターのブレオマイシン誘発性肺線維症モデルでは、キマーゼ活性の亢進、コラーゲンＩＩＩ  ｍＲＮＡの発現増加、組織の線維化といった現象が、キマーゼ阻害剤により有意に減少する。マウスのブレオマイシン誘発性肺線維症モデルにおいても同様で、キマーゼ阻害剤投与により、キマーゼ活性の抑制、ヒドロキシプロリン量の減少といった効果が得られている。
以上より、キマーゼ阻害剤は線維症などのキマーゼと関係する疾患の予防薬又は治療薬として利用可能である。キマーゼ阻害剤としては低分子化合物であるＴＰＣ−８０６やＳＵＮ−１３８３４、ＳＵＮ−Ｃ８２５７、ＳＵＮ−Ｃ８０７７、ＪＮＪ−１０３１１７９５などが開発されている（特許文献１）。【０００３】
ところで、近年、ＲＮＡアプタマーの治療薬、診断薬、試薬への応用が注目されており、いくつかのＲＮＡアプタマーが臨床段階あるいは実用化段階に入っている。２００４年１２月には世界初のＲＮＡアプタマー医薬であるＭａｃｕｇｅｎが加齢黄斑変性症の治療薬として米国で承認された。ＲＮＡアプタマーとはタンパク質などの標的物質に特異的に結合するＲＮＡのことで、ＳＥＬＥＸ法（Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ  Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｌｉｇａｎｄｓ  ｂｙ  Ｅｘｐｏｎｅｎｔｉａｌ  Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ）を用いて作製することができる（特許文献２〜４）。ＳＥＬＥＸ法とは、１０１４個程度の異なるヌクレオチド配列を持つＲＮＡのプールから、標的物質に特異的に結合するＲＮＡを選別する方法である。使用されるＲＮＡは４０ヌクレオチド程度のランダム配列をプライマー配列で挟み込んだ構造をしている。このＲＮＡプールを標的物質と会合させて、フィルターなどを用いて標的物質に結合したＲＮＡのみ回収する。回収したＲＮＡはＲＴ−ＰＣＲで増幅し、これを次のラウンドの鋳型として用いる。この作業を１０回程度繰り返すことにより、標的物質と特異的に結合するＲＮＡアプタマーを取得することができる場合がある。
アプタマー医薬は抗体医薬と同様に細胞外タンパク質を標的にすることができるが、既に公表されている多くの学術論文等を参考にすると、いくつかの点で抗体医薬を上回る可能性がある。例えば、アプタマーは抗体よりも標的分子に対して高い親和性や特異性を示す場合が多々ある。また、免疫排除を受けにくく、抗体特有の抗体依存性細胞障害（ＡＤＣＣ）や補体依存性細胞障害（ＣＤＣ）などの副作用は起こりにくいとされる。デリバリーの観点では、アプタマーは抗体の１／１０程度の分子サイズであるため組織移行が起こりやすく、目的の部位まで薬物を送達させることがより容易である。アプタマーは化学合成により生産されるので、部位選択的な化学修飾が可能であり、大量生産すればコストダウンを図ることができる。その他、長期保存安定性や熱・溶媒耐性もアプタマーの優位な特徴である。一方で、一般にアプタマーの血中半減期は抗体よりも短い。しかし、この点も毒性を考慮した場合はメリットとなる場合がある。以上の点より、同じ分子を標的にした医薬品であっても、アプタマー医薬は抗体医薬に勝る可能性がある。
本発明者らは、キマーゼに結合し、キマーゼの活性を阻害するアプタマーとして、Ｘ１ＧＡＵＡＧＡＮ１Ｎ２ＵＡＡＸ２（式中、Ｘ１及びＸ２は、同一又は異なって、Ａ又はＧであり、Ｎ１及びＮ２は、同一又は異なって、Ａ、Ｇ、Ｃ、ＵまたはＴである）で表されるヌクレオチド配列を含むアプタマーを製造した（特許文献５（当該配列は、特許文献５において配列番号２１で表される））。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】米国特許公報６５００８３５号
【特許文献２】国際公開ＷＯ９１／１９８１３号パンフレット
【特許文献３】国際公開ＷＯ９４／０８０５０号パンフレット
【特許文献４】国際公開ＷＯ９５／０７３６４号パンフレット
【特許文献５】国際公開ＷＯ２０１０／１４３７１４号パンフレット
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、キマーゼに対するアプタマー及びその利用方法などを提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは上記課題を解決するため鋭意検討した結果、特許文献５に記載されたキマーゼアプタマーとは全く配列が異なり、かつ活性が著しく高いという特徴を有する、キマーゼに対する良質なアプタマーを作製することに成功し、もって本発明を完成するに至った。【０００７】
即ち、本発明は、以下の発明などを提供するものである：
［１］キマーゼに結合するアプタマーであって、該アプタマーが、ＵＡＡＣＲ１Ｎ１Ｒ２ＧＧＧＧ（式中、Ｒ１およびＲ２が任意の一つの塩基であり、Ｎ１が３〜３０個の塩基である）で表される共通配列（ただし、ウラシルはチミンであってもよい）を含む、アプタマー。
［２］キマーゼに結合するアプタマーであって、以下の式（１）で表される潜在的二次構造（ただし、ウラシルはチミンであってもよい）を有する、アプタマー。【０００８】
【化１】
2019107532.tif 000002
【０００９】
ここで、式（１）における【００１０】
【化２】
2019107532.tif 000003
【００１１】
部分は、ステム／ループ部分構造を示し、Ｒ１およびＲ２は任意の一つの塩基を示す。
［３］キマーゼの活性を阻害する、［１］または［２］のアプタマー。
［４］Ｒ１とＲ２との組み合わせがＡ／Ｕ、Ｃ／Ｇ、Ａ／ＣまたはＧ／Ｕ（ただし、ウラシルはチミンであってもよい）である、［１］〜［３］のいずれかのアプタマー。
［５］ピリミジンヌクレオチドの少なくとも一つが修飾または改変されている、［１］〜［４］のいずれかのアプタマー。
［６］配列ＵＡＡＣＲ１におけるＵおよび／またはＣが修飾または改変されている、［１］〜［５］のいずれかのアプタマー。
［７］（１’）部分のステム／ループ部分の塩基長が３〜２１である、［２］〜［６］のいずれかのアプタマー。
［８］Ｎ１または【００１２】
【化３】
2019107532.tif 000004
【００１３】
で表されるステム／ループ部分構造の配列が、ＵＵＧＵ、ＣＵＧＧまたはＡＡＵＵである（ただし、ウラシルはチミンであってもよい）、［１］〜［７］のいずれかのアプタマー。【００１４】
［９］以下の（ａ）、（ｂ）または（ｃ）のいずれかのヌクレオチド配列を含む、［１］または［２］のアプタマー。
（ａ）配列番号１〜１１および１４〜３３のいずれかから選択されるヌクレオチド配列（但しウラシルはチミンであってもよい）；
（ｂ）配列番号１〜１１および１４〜３３のいずれかから選択されるヌクレオチド配列（但しウラシルはチミンであってもよい）において、１〜数個のヌクレオチドが置換、欠失、挿入あるいは付加されたヌクレオチド；または
（ｃ）配列番号１〜１１および１４〜３３のいずれかから選択されるヌクレオチド配列（但しウラシルはチミンであってもよい）と70%以上の相同性を有するヌクレオチド配列。
［１０］アプタマーに含まれる少なくとも一つのヌクレオチドが修飾または改変されている、［９］のアプタマー。
［１１］アプタマーに含まれる各ピリミジンヌクレオチドのリボース２’位のヒドロキシル基が、同一または異なって、無置換であるか、水素原子、フッ素原子およびメトキシ基からなる群より選ばれる原子または基で置換されている、［１］または［２］のアプタマー。
［１２］アプタマーに含まれる各プリンヌクレオチドのリボース２’位のヒドロキシル基が、同一または異なって、無置換であるか、水素原子、フッ素原子およびメトキシ基からなる群より選ばれる原子または基で置換されている、［１］または［２］のアプタマー。
［１３］［１］〜［１２］のいずれかのアプタマーおよび機能性物質を含む複合体。
［１４］［１］〜［１２］のいずれかのアプタマーまたは［１３］の複合体を含む医薬。
［１５］臓器または組織の線維化が関与する疾患、または循環器系疾患の治療薬である、［１４］の医薬。
［１６］線維症の治療薬である、［１４］の医薬。
［１７］［１］〜［１２］のいずれかのアプタマーまたは［１３］の複合体を用いることを特徴とする、キマーゼの検出方法。
［１８］［１］〜［１２］のいずれかに記載のアプタマー、［１３］の複合体、または[１４]の医薬を対象に投与することを含む、臓器または組織の線維化が関与する疾患、または循環器系疾患の治療方法。
［１９］臓器または組織の線維化が関与する疾患、または循環器系疾患の治療における使用のための、［１］〜［１２］のいずれかのアプタマー、［１３］の複合体、または[１４]の医薬。
［２０］臓器または組織の線維化が関与する疾患、または循環器系疾患の治療用の医薬の製造における、［１］〜［１２］のいずれかのアプタマー、または［１３］の複合体の使用。
【発明の効果】
【００１５】
本発明のアプタマー及び複合体は、例えば線維症や循環器系疾患などのキマーゼに起因する種々の疾患に対する医薬、あるいは診断薬、試薬として有用であり得る。本発明のアプタマー及び複合体はまた、キマーゼの精製及び濃縮、並びにキマーゼの検出及び定量に有用であり得る。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】配列番号１〜６で表される配列のアプタマーの二次構造予測を示す図である。
【図２】配列番号７〜８で表される配列のアプタマーの二次構造予測を示す図である。
【図３】配列番号９〜１０で表される配列のアプタマーの二次構造予測を示す図である。
【図４】配列番号１４〜１８、２０で表される配列のアプタマーの二次構造予測を示す図である。
【図５】最適化ＳＥＬＥＸにおけるＤＮＡ鋳型のランダム配列部分を示す図である。
【図６】配列番号２６〜３１で表される配列のアプタマーの二次構造予測を示す図である。
【図７】配列番号３２〜３３で表される配列のアプタマーの二次構造予測を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
本発明は、キマーゼに対して結合活性を有するアプタマーを提供する。本発明のアプタマーは、キマーゼの活性を阻害し得る。
【００１８】
アプタマーとは、所定の標的分子に対する結合活性を有する核酸分子をいう。アプタマーは、所定の標的分子に対して結合することにより、所定の標的分子の活性を阻害し得る。本発明のアプタマーは、キマーゼに対して結合活性を有し、キマーゼの活性を阻害し得るアプタマーである。また本発明のアプタマーは、ＲＮＡ、ＤＮＡ、修飾核酸又はそれらの混合物であり得る。本発明のアプタマーはまた、直鎖状又は環状の形態であり得る。
【００１９】
キマーゼは公知のセリンプロテアーゼの一つであり、肥満細胞の分泌顆粒内に貯蔵されている。キマーゼは、例えば生理活性ペプチドの産生・分解、細胞外マトリックスのリモデリング、サイトカインとのネットワーク、免疫等の肥満細胞が関与する様々な生体反応に深く関与している。本発明のアプタマーは、任意の哺乳動物に由来するキマーゼに対する阻害活性を有し得る。このような哺乳動物としては、例えば、霊長類（例、ヒト、サル）、げっ歯類（例、マウス、ラット、モルモット、ハムスター）、並びにペット、家畜及び使役動物（例、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ヤギ、ヒツジ、ブタ）が挙げられるが、好ましくはヒトである。ヒトキマーゼのアミノ酸配列はＡｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｕｍｂｅｒ  ＡＡＢ２６８２８で表されるものであるが、１〜数残基の変異が入ったものや、そのドメイン部分、ペプチド部分であってもよい。また、ヒトキマーゼの構造はモノマーだけでなくダイマーや多量体であってもよい。
【００２０】
本発明のアプタマーは、生理的な緩衝液中でキマーゼへ結合する。緩衝液としては特に限定されるものではないが、ｐＨが約５．０〜１０．０程度のものが好ましく用いられ、このような緩衝液としては、例えば後述する溶液Ａや溶液Ｃ（実施例１及び２参照）が挙げられる。本発明のアプタマーは、以下のいずれかの試験により検出可能な程度の強度で、キマーゼへ結合するものである。
結合強度の測定にはＧＥヘルスケア社製のＢｉａｃｏｒｅ  Ｔ１００を用いる。一つの測定方法としては、まずセンサーチップにアプタマーを固定化する。固定化量は約１０００ＲＵとする。アナライト用のキマーゼ溶液は０．２μＭに調製したものを２０μＬインジェクトし、キマーゼのアプタマーへの結合を検出する。３０もしくは４０ヌクレオチドからなるランダムなヌクレオチド配列を含むＲＮＡをネガティブコントロールとし、該コントロールＲＮＡと比較してキマーゼが同等もしくは有意に強くアプタマーに結合した場合、該アプタマーはキマーゼへの結合能を有すると判定することができる。
別の測定方法としては、まずセンサーチップにキマーゼを固定化する。固定化量は約４０００ＲＵとする。アナライト用のアプタマー溶液は０．０１μｇ／μＬに調製したものを２０μＬインジェクトし、アプタマーのキマーゼへの結合を検出する。３０もしくは４０ヌクレオチドからなるランダムなヌクレオチド配列を含むＲＮＡをネガティブコントロールとし、該コントロールＲＮＡと比較してキマーゼが同等もしくは有意に強くアプタマーに結合した場合、該アプタマーはキマーゼへの結合能を有すると判定する。
【００２１】
キマーゼに対する阻害活性とは、キマーゼが保有する任意の活性に対する阻害能を意味する。例えば、キマーゼの機能の一つに、ペプチド鎖を加水分解することにより切断する酵素活性があるが、それを阻害するということである。酵素活性に対する基質として許容されるのは、生体内に存在する蛋白質や生理活性ペプチド（例えばＡｎｇＩ、ｌａｔｅｎｔ  ＴＧＦ−βなど）に限らず、それらのペプチドの一部のアミノ酸配列が含まれるペプチドに発色物質や蛍光物質が付加したペプチドも含まれる。発色物質や蛍光物質は、当業者に公知である。また、蛋白質や生理活性ペプチドの分解反応を介して起こる現象として、コラーゲンＩ／ＩＩＩの発現増加、ヒドロキシプロリン量の増加、ＩｇＥ発現増加などが挙げられるが、これらに対する抑制効果もキマーゼに対する阻害活性に含まれる。その他、キマーゼに対する好中球、単球、好酸球の遊走活性を阻害する活性も、キマーゼに対する阻害活性に含まれる。さらに、キマーゼにより誘導されるヒスタミン遊離促進、肥満細胞数の増加、血管透過性の増大、組織の線維化、炎症、血管新生、血管内膜肥厚などに対する抑制効果も、キマーゼに対する阻害活性に含まれる。
【００２２】
キマーゼの基質とは、キマーゼにより加水分解を受け切断されるペプチドや蛋白質などを意味する。生体内に存在するキマーゼの基質としては、ＡｎｇＩ、ｌａｔｅｎｔ  ＴＧＦ−β、ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ  ｆａｃｔｏｒ（ＳＣＦ）、プロコラーゲン、プロコラゲナーゼ、フィブロネクチン、プロマトリックスメタロプロテアーゼ−１（ｐｒｏ−ＭＭＰ−１）、ｐｒｏ−ＭＭＰ−９、ｔｉｓｓｕｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｏｆ  ｍａｔｒｉｘ  ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ−１（ＴＩＭＰ−１）、アポリポプロテインＡ−Ｉ（ａｐｏＡ−Ｉ）、ａｐｏＥ、ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐｉｄ  ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｐｒｏｔｅｉｎ、ＩＬ−１β前駆体、ｂｉｇ−ｅｎｄｏｔｈｅｌｉｎ−１（ｂｉｇ−ＥＴ−１）、ｂｉｇ−ＥＴ−２、ｃｏｎｎｅｃｔｉｖｅ  ｔｉｓｓｕｅ−ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ＩＩＩ、ＩＬ−１８前駆体、ｓｕｂｓｔａｎｃｅ  Ｐ、ｖａｓｏａｃｔｉｖｅ  ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  ｐｅｐｔｉｄｅ（ＶＩＰ）、ｋａｌｌｉｄｉｎ、ｂｒａｄｙｋｉｎｉｎ、Ｃ３ａなどのペプチドや蛋白質が知られている。本明細書におけるキマーゼの基質としては、これらに限らず、それらの一部のアミノ酸配列としてキマーゼが特異的に認識するＰｈｅやＴｙｒなどのアミノ酸残基を含む人工的に設計されたモデルペプチドや、このようなペプチドに発色物質や蛍光物質が付加されたペプチドも含まれる。
【００２３】
キマーゼの酵素活性をアプタマーが阻害するか否かは、以下の試験により評価することができる。例として二つの方法を以下に示す。
【００２４】
一つめに、合成基質を用いる評価方法を示す。キマーゼの基質としては、例えばキモトリプシン様プロテアーゼの標準基質である４アミノ酸ペプチド、「Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ」（配列番号４１）を含んでなる、Ｓｕｃ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−ＭＣＡ（４−メチルクマリル−７−アミド基）（ペプチド研究所社製）を用いる。
【００２５】
アッセイには、９６ウェルプレート（Ｆ１６  Ｂｌａｃｋ  Ｍａｘｉｓｏｒｐ  Ｆｌｕｏｒｏｎｕｎｃ、Ｎｕｎｃ社製）を用い、反応液量を１００μＬとし、緩衝液（溶液Ｃ；後述する実施例１参照）中で反応を行う。まず、核酸は溶液Ｃ中に調製したものを、５０μＬ用意する。そこに、溶液Ｃ中に調製した１ｍＭの基質を１０μＬ添加した後、プレートをマイクロプレートリーダーＳｐｅｃｔｒａＭａｘ１９０（モレキュラーデバイス社製）にセットし、３７℃で５分間保温する。一方で、０．０５μｇのキマーゼ（ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ、ＳＩＧＭＡ社製）を溶液Ｃ中に希釈したものを４０μＬ用意し、３７℃で５分間保温する。核酸及び基質からなる混合液に、キマーゼ溶液を加えて、酵素反応を開始させる。反応液を含むプレートを、マイクロプレートリーダーＳｐｅｃｔｒａＭａｘ１９０（モレキュラーデバイス社製）にセットし、３７℃で５分間、蛍光強度の変化を経時的に測定（励起波長  ３８０ｎｍ、検出波長  ４６０ｎｍ）する。キマーゼ活性により、基質から放出されるＡＭＣ（７−アミノ−４−メチルクマリン）の蛍光増加の線形近似を求め、その傾きの値を初速度とする。コントロールとして、３０もしくは４０ヌクレオチドのランダム配列を含む核酸プールを用いた場合（ネガティブコントロール）、及び既知のキモトリプシン様セリンプロテアーゼ阻害剤であるキモスタチンを用いた場合（ポジティブコントロール）において、同様に処理し測定を行う。核酸、阻害剤を含まない場合の反応初速度を酵素活性１００％とし、各被験物質の阻害率を算出し、酵素活性を５０％阻害するのに要する阻害剤の濃度（ＩＣ５０）を求める。ＩＣ５０が既知の阻害剤であるキモスタチンに比べて低い値を示すアプタマーを、優れた阻害活性を持つアプタマーであると判定する。
【００２６】
二つめに、天然の基質を用いる評価方法を示す。キマーゼの天然の基質としては、例えばアンジオテンシンＩを用いる。ここでは、アンジオテンシンＩの分解により遊離するペプチド断片であるＨｉｓ−Ｌｅｕを蛍光誘導化し、その蛍光強度を定量的に測定する方法を説明する。
【００２７】
アッセイにおける酵素反応の溶液量は５０μＬとし、溶液Ｃ中で反応を行う。まず、０．３〜０．７５ｎｇのキマーゼ（ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ、ＳＩＧＭＡ社製、もしくはｎａｔｉｖｅ、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ社製）を溶液Ｃ中に希釈したものを５μＬ用意する。核酸は溶液Ｃ中に調製したものを、２５μＬ用意する。キマーゼ溶液５μＬと核酸溶液２５μＬを混和し、３７℃で５分間保温する。一方で、溶液Ｃ中に調製した１２５μＭアンジオテンシンＩ（ペプチド研究所社製）を２０μＬ用意し、３７℃で５分間保温する。キマーゼ及び核酸からなる混合液に、アンジオテンシンＩ溶液を加えて、酵素反応を開始させる。３７℃で９０分間反応させた後、氷冷した３０％トリクロロ酢酸溶液を２５μＬ添加し、反応を停止させる。混合液全体を４℃、１４０００ｒｐｍで１０分間遠心し、その上清３０μＬを次の蛍光誘導化反応に用いる。
【００２８】
上記の上清３０μＬを９６ウェルプレート（ブラック、Ｃｏｓｔａｒ社製）に加え、各ウェルに対し、メタノールに溶解した２％  ｏ−フタルアルデヒド（ＳＩＧＭＡ社製）溶液１５μＬと、０．３Ｍ  ＮａＯＨ溶液１７０μＬを混和し、室温に１０分間放置する。その後、３Ｍ  ＨＣｌ溶液を２５μＬ添加し、反応を停止させる。プレートをマイクロプレートリーダーＳｐｅｃｔｒａＭａｘ１９０（モレキュラーデバイス社製）にセットし、励起波長３５５ｎｍ、蛍光波長４６０ｎｍの条件で蛍光強度を測定する。
【００２９】
なお、コントロールとして、配列番号５８を用いた場合（ネガティブコントロール）、及び既知のキモトリプシン様セリンプロテアーゼ阻害剤であるキモスタチンを用いた場合（ポジティブコントロール）で同様に処理し測定を行う。各条件において、反応時間０分における蛍光強度をブランクとする。キマーゼ酵素反応において、核酸を添加するかわりに溶液Ｃを同量添加した場合に検出される蛍光強度を１００％とし、各被験物質の阻害率を算出し、酵素活性を５０％阻害するのに要する阻害剤の濃度（ＩＣ５０）を求める。ＩＣ５０が既知の阻害剤であるキモスタチンに比べて低い値を示すアプタマーを、優れた阻害活性を持つアプタマーであると判定する。
【００３０】
後述する実施例で詳細に示されるように、本発明のアプタマーは、既に報告されているＷＯ２０１０／１４３７１４のキマーゼに対するアプタマーと比較して、およそ１０〜１００倍の高いキマーゼに対する阻害活性を有する。具体的には、ＷＯ２０１０／１４３７１４に開示されたキマーゼに対するアプタマーは、０．１μＭ以下のＩＣ５０値を示すことで優れたアプタマーであるとしているが（段落［０１０５］など参照）、本発明のアプタマーでは、実施例３（表４）に示されるように１ｎＭ以下のＩＣ５０値を示すアプタマーも数多く存在した。
したがって発明者らは、本発明の完成時点でこのような良質なキマーゼに対するアプタマーが得られるとは予想だにしていなかった。以上のことから、本発明のアプタマーは、たとえ当業者であっても公知文献からは容易に想到し得ないほどの有利な効果を奏するアプタマーであるといえる。
【００３１】
本発明のアプタマーは、キマーゼの任意の部分に結合し、その活性を阻害し得るものである限り特に限定されない。
【００３２】
本発明のアプタマーの長さは特に限定されず、通常、約２５〜約２００ヌクレオチドであり得るが、例えば約１００ヌクレオチド以下であり、好ましくは約５０ヌクレオチド以下であり、より好ましくは約４０ヌクレオチド以下であり、最も好ましくは約３５ヌクレオチド以下であり得る。総ヌクレオチド数が少なければ、化学合成及び大量生産がより容易であり、かつコスト面でのメリットも大きい。また、化学修飾も容易であり、生体内安定性も高く、毒性も低いと考えられる。一方で、本発明のアプタマーの長さは、通常、約２５ヌクレオチド以上であり、好ましくは、約２８ヌクレオチド以上であり得る。総ヌクレオチド数が少なすぎると以下で説明する共通配列を持ちえないし、潜在的２次構造が不安定となって場合によっては活性を有しない場合もある。
【００３３】
本発明のアプタマーに含まれる各ヌクレオチドはそれぞれ、同一又は異なって、リボース（例、ピリミジンヌクレオチドのリボース、プリンヌクレオチドのリボース）の２’位においてヒドロキシル基を含むヌクレオチド（即ち、未置換であるヌクレオチド）であるか、あるいはリボースの２’位において、ヒドロキシル基が、任意の原子又は基で置換されているヌクレオチドであり得る。このような任意の原子又は基としては、例えば、水素原子、フッ素原子又は−Ｏ−アルキル基（例、−Ｏ−Ｍｅ基）、−Ｏ−アシル基（例、−Ｏ−ＣＯＭｅ基）、アミノ基（例、−ＮＨ２基）で置換されているヌクレオチドが挙げられる。
【００３４】
本発明のアプタマーは、ＵＡＡＣＲ１Ｎ１Ｒ２ＧＧＧＧで表される共通配列（以下、本発明の共通配列と称することがある）を有するアプタマーである。この配列を有するアプタマーは強くキマーゼに結合することで、キマーゼの活性を阻害する。すなわちキマーゼの活性を阻害することが分かっているアプタマーは、キマーゼへの結合を確認するまでもなく、キマーゼに結合するアプタマーであることが明らかである。
【００３５】
上記共通配列中、Ｒ１およびＲ２は任意の一つの塩基を示す。Ｒ１とＲ２との組み合わせは本発明のアプタマーがキマーゼに結合する限り特に限定されず、例えば、Ｒ１とＲ２との組み合わせとしては、Ａ／Ｕ、Ｃ／Ｇ、Ａ／ＣまたはＧ／Ｕであり（但し、ウラシルはチミンであってもよい）、より好ましくはＲ１とＲ２とでワトソン−クリック塩基対を形成する組み合わせ（Ａ／ＵまたはＣ／Ｇ）である。
【００３６】
上記Ｒ１とＲ２との組み合わせは、本発明のアプタマーがキマーゼに結合する限り特に限定されず、Ｒ１とＲ２が入れ替わっていてもよい。すなわちＲ１とＲ２との組み合わせをＡ／Ｕとして示す場合、Ｒ１がＡでありＲ２がＵである場合と、Ｒ１がＵでＲ２がＡである場合とが含まれる。Ｃ／Ｇ、Ａ／ＣまたはＧ／Ｕにおいても同様である。
【００３７】
共通配列ＵＡＡＣＲ１Ｎ１Ｒ２ＧＧＧＧにおけるＮ１部分の配列は本発明のアプタマーがキマーゼに結合する限り特に限定されず、任意の配列を採りうる。当該部分の塩基長は、本発明のアプタマーがキマーゼに結合する限り特に限定されないが、通常３〜３０であり、好ましくは３〜２１であり、より好ましくは３〜１９である。
【００３８】
また本発明のアプタマーは、以下の式（１）
【００３９】
【化４】
2019107532.tif 000005
【００４０】
で表される潜在的二次構造を有するアプタマーである。この配列を有するアプタマーは強くキマーゼに結合することで、キマーゼの活性を阻害する。
【００４１】
上記式（１）中、ＵＡＡＣＲ１とＲ２ＧＧＧＧとの間でステム構造を形成する（Ａ／Ｇミスマッチを二つ含む）。すなわち共通配列におけるＵＡＡＣＲ１とＲ２ＧＧＧＧとの間でステム構造が形成される。換言すれば、共通配列におけるＮ１部分がループ構造を形成する。
【００４２】
上記式（１）中、Ｒ１およびＲ２は任意の一つの塩基を示す。Ｒ１とＲ２との組み合わせとしては、上記式（１）中のＵＡＡＣＲ１とＲ２ＧＧＧＧとの間でステム構造を形成する限りにおいて限定されない。しかしながらＲ１とＲ２との組み合わせとして好ましくは、Ａ／Ｕ、Ｃ／Ｇ、Ａ／ＣまたはＧ／Ｕであり（但し、ウラシルはチミンであってもよい）、より好ましくはＲ１とＲ２とでワトソン−クリック塩基対を形成する組み合わせ（Ａ／ＵまたはＣ／Ｇ）である。
【００４３】
上記Ｒ１とＲ２との組み合わせは、上記式（１）中のＵＡＡＣＲ１とＲ２ＧＧＧＧとの間でステム構造を形成する限りにおいてＲ１とＲ２が入れ替わっていてもよい。すなわちＲ１とＲ２との組み合わせをＡ／Ｕとして示す場合、Ｒ１がＡでありＲ２がＵである場合と、Ｒ１がＵでＲ２がＡである場合とが含まれる。Ｃ／Ｇ、Ａ／ＣまたはＧ／Ｕにおいても同様である。
【００４４】
ここで、式（１）における
【００４５】
【化５】
2019107532.tif 000006
【００４６】
部分は、ステム／ループ部分構造を示す。当該部分構造の塩基長は、本発明のアプタマーがキマーゼに結合する限り特に限定されないが、通常３〜３０であり、好ましくは３〜２１であり、より好ましくは３〜１９である。当該部分構造の塩基長が３未満であるとループ構造が形成できず、３０を超えると当該部分構造における塩基の影響が顕著となりアプタマーの活性が低下する場合がある。特に塩基長が２１以下である場合に、安定したアプタマー活性を示す。当該ステム／ループ部分構造において、ステム構造は存在してもよいし、存在せず全てループ構造であってもよい。すなわち本発明のアプタマーがキマーゼに対する結合活性を有するには、以下の式（１）
【００４７】
【化６】
2019107532.tif 000007
【００４８】
の構造が全体としてステム／ループ構造を採ることが重要であり、ＵＡＡＣＲ１とＲ２ＧＧＧＧとの間で既にステム構造が形成されているのであるから、式（１）における
【００４９】
【化７】
2019107532.tif 000008
【００５０】
部分構造において、ステム構造が存在するか否かは重要ではない。一方でステム構造が存在する場合、当該ステム構造はバルジ構造を有していても良い。
【００５１】
前述したとおり、本発明のアプタマーは式（１）
【００５２】
【化８】
2019107532.tif 000009
【００５３】
の構造が全体としてステム／ループ構造を採ることがキマーゼに対するアプタマーとしての活性発現のうえで非常に重要である。すなわち本発明において、上記式（１）の構造を有し、かつキマーゼへの結合活性（あるいはキマーゼ阻害活性）を有する限りにおいて、式（１）における
【００５４】
【化９】
2019107532.tif 000010
【００５５】
で示されるステム／ループ部分構造における配列は特に限定されない。実際に後述する実施例で示されるように、上記ステム／ループ部分構造における配列は特定のものに限定されず、様々な配列において同様にステム／ループ部分構造を有し、かつキマーゼへの結合活性を有し得る。
しかしながら、上記式（１’）における好ましい配列としては、ＵＵＧＵ、ＵＵＧＣ、ＣＵＧＧまたはＡＡＵＵであり（ただし、ウラシルはチミンであってもよい）、より好ましくは、ＵＵＧＵである。
【００５６】
さらに上記式（１）で示される構造の両側、すなわち５’末端側および３’末端側においてもその配列は特定のものに限定されず、様々な配列において同様のキマーゼへの結合活性（あるいはキマーゼ阻害活性）を有し得る。
【００５７】
本発明のアプタマーはまた、少なくとも１種（例、１、２、３又は４種）のヌクレオチドが、リボースの２’位において、ヒドロキシル基、又は上述した任意の原子又は基、例えば、水素原子、フッ素原子、ヒドロキシル基及びメトキシ基からなる群より選ばれる少なくとも２種（例、２、３又は４種）の基を含むヌクレオチドであり得る。特に共通配列と、式（１）で表される構造におけるＵおよび／またはＣは、好ましくはリボースの２’位において、水素原子、フッ素原子、及びメトキシ基からなる群より選ばれる基で修飾されうる。
【００５８】
本発明のアプタマーにおいてはまた、全てのピリミジンヌクレオチドが、リボースの２’位において、同一又は異なって、フッ素原子で置換されるヌクレオチドであるか、又は上述した任意の原子又は基、好ましくは、水素原子、ヒドロキシル基及びメトキシ基からなる群より選ばれる原子又は基で置換されているヌクレオチドであり得る。
【００５９】
本発明のアプタマーにおいてはまた、全てのプリンヌクレオチドが、リボースの２’位において、同一又は異なって、ヒドロキシル基で置換されるヌクレオチドであるか、又は上述した任意の原子又は基、好ましくは、水素原子、メトキシ基及びフッ素原子からなる群より選ばれる原子又は基で置換されるヌクレオチドであり得る。
【００６０】
本発明のアプタマーはまた、全てのヌクレオチドが、リボースの２’位において、ヒドロキシル基、又は上述した任意の原子又は基、例えば、水素原子、フッ素原子、ヒドロキシル基及びメトキシ基からなる群より選ばれる同一の基を含むヌクレオチドであり得る。
【００６１】
尚、本明細書においては、アプタマーを構成するヌクレオチドをＲＮＡと仮定して（すなわち糖基をリボースと仮定して）、ヌクレオチド中の糖基への修飾の態様を説明するが、これは、アプタマーを構成するヌクレオチドからＤＮＡが除外されることを意味するものではなく、適宜ＤＮＡへの修飾として読み替えられる。例えば、アプタマーを構成するヌクレオチドがＤＮＡである場合、リボースの２’位のヒドロキシル基のＸへの置換は、デオキシリボースの２’位の一方の水素原子のＸへの置換として読み替えられる。
【００６２】
本発明のアプタマーはまた、
（ａ）配列番号１〜１１および１４〜３３のいずれかから選択されるヌクレオチド配列（但し、ウラシルはチミンであってもよい）を含むアプタマー；
（ｂ）配列番号１〜１１および１４〜３３のいずれかから選択されるヌクレオチド配列（但し、ウラシルはチミンであってもよい）において１又は数個のヌクレオチドが置換、欠失、挿入又は付加されたヌクレオチド配列を含むアプタマー；又は
（ｃ）配列番号１〜１１および１４〜３３のいずれかから選択されるヌクレオチド配列（但し、ウラシルはチミンであってもよい）と７０％以上（好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、最も好ましくは９５％以上）の同一性を有するヌクレオチド配列を含むアプタマー；
であり得；或いは、本発明のアプタマーとしては、
（ｄ）上記（ａ）の複数の連結物、上記（ｂ）の複数の連結物、上記（ｃ）の複数の連結物、上記（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）の複数の連結物からなる群より選ばれる連結物も含まれる。
【００６３】
上記（ａ）のアプタマーだけでなく（ｂ）〜（ｄ）のアプタマーも、キマーゼに結合し且つ／又はキマーゼの活性（キマーゼの酵素活性等）を阻害し得る。
【００６４】
本発明のアプタマーはまた、
（ａ’）配列番号１７（１）〜１７（２５）および３３（１）〜３３（１８）のいずれかから選択されるヌクレオチド配列（但し、ウラシルはチミンであってもよい）を含むアプタマー；
（ｂ’）配列番号１７（１）〜１７（２５）および３３（１）〜３３（１８）のいずれかから選択されるヌクレオチド配列（但し、ウラシルはチミンであってもよい）において、１〜５個のヌクレオチドが置換、欠失、挿入又は付加されたヌクレオチド配列を含むアプタマー；又は
（ｃ’）配列番号１７（１）〜１７（２５）および３３（１）〜３３（１８）のいずれかから選択されるヌクレオチド配列（但し、ウラシルはチミンであってもよい）と７０％以上の同一性を有するヌクレオチド配列を含むアプタマー；
であり得；或いは、本発明のアプタマーとしては、
（ｄ’）上記（ａ’）の複数の連結物、上記（ｂ’）の複数の連結物、上記（ｃ’）の複数の連結物、上記（ａ’）、（ｂ’）及び（ｃ’）の複数の連結物からなる群より選ばれる連結物も含まれる。さらに、本発明のアプタマーとしては、
（ｅ）上記（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）からなる群より選ばれるアプタマーの一つ以上と（ａ’）、（ｂ’）及び（ｃ’）からなる群より選ばれるアプタマーの一つ以上とからなる連結物も含まれる。
【００６５】
上記（ａ’）〜（ｄ’）および（ｅ）のアプタマーも、キマーゼに結合し且つ／又はキマーゼの活性（キマーゼの酵素活性等）を阻害し得る。
【００６６】
上記（ｂ）および（ｂ’）において、置換、欠失、挿入又は付加されるヌクレオチド数は、アプタマーがキマーゼに結合し且つ／又はキマーゼの活性（キマーゼの酵素活性等）を阻害し得る限り特に限定されないが、例えば約３０個以下、好ましくは約２０個以下、より好ましくは約１０個以下、さらにより好ましくは５個以下、最も好ましくは４個、３個、２個又は１個であり得る。
【００６７】
上記（ｃ）および（ｃ’）において、「同一性」とは、当該技術分野において公知の数学的アルゴリズムを用いて２つのヌクレオチド配列をアラインさせた場合の、最適なアラインメント（好ましくは、該アルゴリズムは最適なアラインメントのために配列の一方もしくは両方へのギャップの導入を考慮し得るものである）における、オーバーラップする全ヌクレオチド残基に対する、同一ヌクレオチド残基の割合（％）を意味する。
【００６８】
本明細書において、ヌクレオチド配列における同一性は、例えば相同性計算アルゴリズムＮＣＢＩ  ＢＬＡＳＴ−２（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  Ｂａｓｉｃ  Ｌｏｃａｌ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｓｅａｒｃｈ  Ｔｏｏｌ）を用い、以下の条件（ギャップオープン＝５ペナルティ；ギャップエクステンション＝２ペナルティ；ｘ＿ドロップオフ＝５０；期待値＝１０；フィルタリング＝ＯＮ）にて２つのヌクレオチド配列をアラインすることにより、計算することができる。
【００６９】
上記（ｄ）、（ｄ’）および（ｅ）において連結はタンデム結合にて行われ得る。また、連結に際し、リンカーを利用してもよい。リンカーとしては、ヌクレオチド鎖（例、１〜約２０ヌクレオチド）、非ヌクレオチド鎖（例、−（ＣＨ２）ｎ−リンカー、−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−リンカー、ヘキサエチレングリコールリンカー、ＴＥＧリンカー、ペプチドを含むリンカー、−Ｓ−Ｓ−結合を含むリンカー、−ＣＯＮＨ−結合を含むリンカー、−ＯＰＯ３−結合を含むリンカー）が挙げられる。上記複数の連結物における複数とは、２以上であれば特に限定されないが、例えば２個、３個又は４個であり得る。上記（ａ）〜（ｄ）、（ａ’）〜（ｄ’）および（ｅ）における各ヌクレオチドはそれぞれ、同一又は異なって、リボース（例、ピリミジンヌクレオチドのリボース）の２’位においてヒドロキシル基を含むヌクレオチドであるか、あるいはリボースの２’位において、ヒドロキシル基が、任意の基（例、水素原子、フッ素原子又は−Ｏ−Ｍｅ基）で置換されているヌクレオチドであり得る。
【００７０】
本発明のアプタマーは、キマーゼに対する結合性、安定性、薬物送達性等を高めるため、各ヌクレオチドの糖残基（例、リボース）が修飾されたものであってもよい。糖残基において修飾される部位としては、例えば、糖残基の２’位、３’位及び／又は４’位の酸素原子を他の原子に置き換えたものなどが挙げられる。修飾の種類としては、例えば、フルオロ化、Ｏ−アルキル化（例、Ｏ−メチル化、Ｏ−エチル化）、Ｏ−アリル化、Ｓ−アルキル化（例、Ｓ−メチル化、Ｓ−エチル化）、Ｓ−アリル化、アミノ化（例、−ＮＨ２）が挙げられる。このような糖残基の改変は、自体公知の方法により行うことができる（例えば、Ｓｐｒｏａｔ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９１）Ｎｕｃｌｅ．Ａｃｉｄ．  Ｒｅｓ．１９，７３３−７３８；Ｃｏｔｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９１）  Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ．Ｒｅｓ．１９，２６２９−２６３５；Ｈｏｂｂｓ  ｅｔ  ａｌ．，（１９７３）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １２，５１３８−５１４５参照）。
【００７１】
本発明のアプタマーにおいて、本発明の共通配列または式（１）
【００７２】
【化１０】
2019107532.tif 000011
【００７３】
で表される構造においても上記修飾がなされたものであってもよいが、ＵＡＡＣＲ１Ｎ１Ｒ２ＧＧＧＧにおけるＧＧＧＧ部分の２番目のＧは、糖残基の２’位においてＯ−メチル化（Ｏ−メチル修飾）されないことが望ましい。したがって、本発明のアプタマーはＵＡＡＣＲ１Ｎ１Ｒ２ＧＧＧＧや式（１）
【００７４】
【化１１】
2019107532.tif 000012
【００７５】
の構造におけるＧＧＧＧ部分の２番目のＧがＯ−メチル化（Ｏ−メチル修飾）されないアプタマーでありうる。この場合、ＧＧＧＧ部分の２番目のＧは好ましくはフッ素原子で修飾されている（フルオロ化されている）ことが望ましい。
【００７６】
本発明のアプタマーはまた、キマーゼに対する結合活性等を高めるため、核酸塩基（例、プリン、ピリミジン）が改変（例、化学的置換）されたものであってもよい。このような改変としては、例えば、５位ピリミジン改変、６及び／又は８位プリン改変、環外アミンでの改変、４−チオウリジンでの置換、５−ブロモ又は５−ヨード−ウラシルでの置換、8-(Propyl)phenyl-rA (n-bz)-2'-tBDMS amiditeでの置換が挙げられる。
【００７７】
また、ヌクレアーゼ及び加水分解に対して耐性であるように、本発明のアプタマーに含まれるリン酸基が改変されていてもよい。例えば、Ｐ（Ｏ）Ｏ基が、Ｐ（Ｏ）Ｓ（チオエート）、Ｐ（Ｓ）Ｓ（ジチオエート）、Ｐ（Ｏ）ＮＲ２（アミデート）、Ｐ（Ｏ）ＣＨ３、Ｐ（Ｏ）ＢＨ３、Ｐ（Ｏ）Ｒ、Ｒ（Ｏ）ＯＲ’、ＣＯ又はＣＨ２（ホルムアセタール）又は３’−アミン（−ＮＨ−ＣＨ２−ＣＨ２−）で置換されていてもよい〔ここで各々のＲ又はＲ’は独立して、Ｈであるか、あるいは置換されているか、又は置換されていないアルキル（例、メチル、エチル）である〕。
【００７８】
連結基としては、−Ｏ−、−Ｎ−又は−Ｓ−が例示され、これらの連結基を通じて隣接するヌクレオチドに結合し得る。
改変はまた、キャッピングのような３’及び５’の改変を含んでもよい。
【００７９】
改変はさらに、ポリエチレングリコール、アミノ酸、ペプチド、ｉｎｖｅｒｔｅｄ  ｄＴ、核酸、ヌクレオシド、Ｍｙｒｉｓｔｏｙｌ、Ｌｉｔｈｏｃｏｌｉｃ−ｏｌｅｙｌ、Ｄｏｃｏｓａｎｙｌ、Ｌａｕｒｏｙｌ、Ｓｔｅａｒｏｙｌ、Ｐａｌｍｉｔｏｙｌ、Ｏｌｅｏｙｌ、Ｌｉｎｏｌｅｏｙｌ、その他脂質、ステロイド、コレステロール、カフェイン、ビタミン、色素、蛍光物質、抗癌剤、毒素、酵素、放射性物質、ビオチンなどを末端に付加することにより行われ得る。このような改変については、例えば、米国特許第５，６６０，９８５号、同第５，７５６，７０３号を参照して行うことができる。
【００８０】
本発明のアプタマーは、本明細書中の開示及び当該技術分野における自体公知の方法により合成することができる。合成方法の一つはＲＮＡポリメラーゼを用いる方法である。目的の配列とＲＮＡポリメラーゼのプロモーター配列を持つＤＮＡを化学合成し、これをテンプレートにして既に公知の方法により転写することで目的のＲＮＡを得ることができる。また、ＤＮＡポリメラーゼを用いることでも合成することができる。目的の配列を有したＤＮＡを化学合成し、これをテンプレートにして、既に公知の方法であるポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により増幅する。これを既に公知の方法であるポリアクリルアミド電気泳動法や酵素処理法により一本鎖とする。修飾の入ったアプタマーを合成する場合は、特定の位置に変異を導入したポリメラーゼを用いることで伸長反応の効率を上げることができる。このようにして得られたアプタマーは公知の方法により容易に精製することができる。
【００８１】
アプタマーはアミダイト法もしくはホスホアミダイト法などの化学合成法によって大量合成することができる。合成方法はよく知られている方法であり、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ（Ｖｏｌ．２）［１］Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ａｎｄ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ（Ｅｄｉｔｏｒ：Ｙｕｋｉｏ  Ｓｕｇｉｕｒａ，Ｈｉｒｏｋａｗａ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ）などに記載のとおりである。実際にはＧＥヘルスケアーバイオサイエンス社製のＯｌｉｇｏＰｉｌｏｔ１００やＯｌｉｇｏＰｒｏｃｅｓｓなどの合成機を使用する。精製はクロマトグラフィー等の自体公知の方法により行われる。
【００８２】
アプタマーはホスホアミダイト法などの化学合成時にアミノ基などの活性基を導入することで、合成後に機能性物質を付加することができる。例えば、アプタマーの末端にアミノ基を導入することで、カルボキシル基を導入したポリエチレングリコール鎖を縮合させることができる。
【００８３】
アプタマーは、リン酸基の負電荷を利用したイオン結合、リボースを利用した疎水結合及び水素結合、核酸塩基を利用した水素結合やスタッキング相互作用など多様な結合様式により標的物質と結合する。特に、構成ヌクレオチドの数だけ存在するリン酸基の負電荷を利用したイオン結合は強く、タンパク質の表面に存在するリジンやアルギニンの正電荷と結合する。このため、標的物質との直接的な結合に関わっていない核酸塩基は置換することができる。特に、ステム構造の部分は既に塩基対が作られており、また、二重らせん構造の内側を向いているので、核酸塩基は、標的物質と直接結合し難い。従って、塩基対を他の塩基対に置換してもアプタマーの活性は減少しない場合が多い。ループ構造など塩基対を作っていない構造においても、核酸塩基が標的分子との直接的な結合に関与していない場合に、塩基の置換が可能である。リボースの２’位の修飾に関しては、まれにリボースの２’位の官能基が標的分子と直接的に相互作用していることがあるが、多くの場合無関係であり、他の修飾分子に置換可能である。このようにアプタマーは、標的分子との直接的な結合に関与している官能基を置換又は削除しない限り、その活性を保持していることが多い。また、全体の立体構造が大きく変わらないことも重要である。
【００８４】
アプタマーは、ＳＥＬＥＸ法及びその改良法（例えば、Ｅｌｌｉｎｇｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９０）  Ｎａｔｕｒｅ，  ３４６，  ８１８−８２２；  Ｔｕｅｒｋ  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９０）  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  ２４９，  ５０５−５１０）を利用することで作製することができる。ＳＥＬＥＸ法ではラウンド数を増やしたり、競合物質を使用したりして、選別条件を厳しくすることで、標的物質に対してより結合力の強いアプタマーが濃縮され、選別されてくる。よって、ＳＥＬＥＸのラウンド数を調節したり、及び／又は競合状態を変化させたりすることで、結合力が異なるアプタマー、結合形態が異なるアプタマー、結合力や結合形態は同じであるが塩基配列が異なるアプタマーを得ることができる場合がある。また、ＳＥＬＥＸ法にはＰＣＲによる増幅過程が含まれるが、その過程でマンガンイオンを使用するなどして変異を入れることで、より多様性に富んだＳＥＬＥＸを行うことが可能となる。
【００８５】
ＳＥＬＥＸで得られるアプタマーは標的物質に対して親和性が高い核酸であるが、そのことは標的物質の生理活性を阻害することを意味しない。キマーゼは塩基性タンパク質であり、核酸が非特異的に結合しやすいと考えられるが、特定の部位に強く結合するアプタマー以外はその標的物質の活性に影響を及ぼさない。実際、ネガティブコントロールとして用いたランダム配列を含むＲＮＡはキマーゼに弱く結合するものの、キマーゼの酵素活性を阻害しなかった。
【００８６】
このようにして選ばれた活性のあるアプタマーに基づき、より高い活性を有するアプタマーを獲得するためのＳＥＬＥＸを行うことが出来る。具体的な方法とは、ある配列が決まっているアプタマーの一部をランダム配列にしたテンプレートや１０〜３０％程度のランダム配列をドープしたテンプレートを作製して、再度ＳＥＬＥＸを行うものである。
【００８７】
ＳＥＬＥＸで得られるアプタマーは８０ヌクレオチド程度の長さがあり、これをそのまま医薬にすることは難しい。そこで、試行錯誤を繰り返し、容易に化学合成ができる５０ヌクレオチド程度以下の長さまで短くする必要がある。ＳＥＬＥＸで得られるアプタマーはそのプライマー設計に依存して、その後の最小化作業のしやすさが変わる。うまくプライマーを設計しないと、ＳＥＬＥＸによって活性のあるアプタマーが選別できたとしても、その後の開発が不可能となる。本発明では２８ヌクレオチドでも活性を保持しているアプタマーを得ることができた。
【００８８】
アプタマーは化学合成が可能であるので改変が容易である。アプタマーはＭＦＯＬＤプログラムを用いて二次構造を予測したり、Ｘ線解析やＮＭＲ解析によって立体構造を予測したりすることで、どのヌクレオチドを置換又は欠損することが可能か、また、どこに新たなヌクレオチドを挿入可能かなどを、ある程度予測することができる。予測された新しい配列のアプタマーは容易に化学合成することができ、そのアプタマーが活性を保持しているかどうかは、既存のアッセイ系により確認することができる。
【００８９】
得られたアプタマーの標的物質との結合に重要な部分が、上記のような試行錯誤を繰り返すことにより特定できた場合、その配列の両端に新しい配列を付加しても、多くの場合活性は変化しない。新しい配列の長さは特に限定されるものではない。
【００９０】
修飾に関しても、配列と同様に当業者であれば自由に設計又は改変可能である。
【００９１】
以上のように、アプタマーは高度に設計又は改変可能である。本発明はまた、所定の配列（例、ステム部分、インターナルループ部分、バルジ部分、ヘアピンループ部分及び一本鎖部分から選ばれる部分に対応する配列：以下、必要に応じて固定配列と省略する）を含むアプタマーを高度に設計又は改変可能であるアプタマーの製造方法を提供する。
【００９２】
例えば、このようなアプタマーの製造方法は、下記：
【００９３】
【化１２】
2019107532.tif 000013
【００９４】
〔上記において、（Ｎ）ａはａ個のＮからなるヌクレオチド鎖を示し、（Ｎ）ｂは、ｂ個のＮからなるヌクレオチド鎖を示し、Ｎはそれぞれ、同一又は異なって、Ａ、Ｇ、Ｃ、Ｕ及びＴ（好ましくは、Ａ、Ｇ、Ｃ及びＵ）からなる群より選ばれるヌクレオチドである。ａ、ｂはそれぞれ、同一又は異なって、任意の数であり得るが、例えば１〜約１００個、好ましくは１〜約５０個、より好ましくは１〜約３０個、さらにより好ましくは１〜約２０個又は１〜約１０個であり得る。〕で表されるヌクレオチド配列からなる単一種の核酸分子又は複数種の核酸分子（例、ａ、ｂの数等が異なる核酸分子のライブラリ）、及びプライマー用配列（ｉ）、（ｉｉ）にそれぞれ対応するプライマー対を用いて、固定配列を含むアプタマーを製造することを含む。
【００９５】
本発明はまた、本発明のアプタマー及びそれに結合した機能性物質を含む複合体を提供する。本発明の複合体におけるアプタマーと機能性物質との間の結合は共有結合、又は非共有結合であり得る。本発明の複合体は、本発明のアプタマーと１以上（例、２又は３個）の同種又は異種の機能性物質とが結合したものであり得る。機能性物質としては、本発明のアプタマーに何らかの機能を新たに付加するもの、あるいは本発明のアプタマーが保持し得る何らかの特性を変化（例、向上）させ得るものである限り特に限定されない。機能性物質としては、例えば、タンパク質、ペプチド、アミノ酸、脂質、糖質、単糖、ポリヌクレオチド、ヌクレオチドが挙げられる。機能性物質としてはまた、例えば、親和性物質（例、ビオチン、ストレプトアビジン、標的相補配列に対して親和性を有するポリヌクレオチド、抗体、グルタチオンセファロース、ヒスチジン）、標識用物質（例、蛍光物質、発光物質、放射性同位体）、酵素（例、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ）、薬物送達媒体（例、リポソーム、ミクロスフェア、ペプチド、ポリエチレングリコール類）、薬物（例、カリケアマイシンやデュオカルマイシンなどミサイル療法に使用されているもの、シクロフォスファミド、メルファラン、イホスファミド又はトロホスファミドなどのナイトロジェンマスタード類似体、チオテパなどのエチレンイミン類、カルムスチンなどのニトロソ尿素、テモゾロミド又はダカルバジンなどのアルキル化剤、メトトレキセート又はラルチトレキセドなどの葉酸類似代謝拮抗剤、チオグアニン、クラドリビン又はフルダラビンなどのプリン類似体、フルオロウラシル、テガフール又はゲムシタビンなどのピリミジン類似体、ビンブラスチン、ビンクリスチン又はビンオレルビンなどのビンカアルカロイド及びその類似体、エトポシド、タキサン、ドセタキセル又はパクリタキセルなどのポドフィロトキシン誘導体、ドキソルビシン、エピルビシン、イダルビシン及びミトキサントロンなどのアントラサイクリン類及び類似体、ブレオマイシン及びミトマイシンなどの他の細胞毒性抗生物質、シスプラチン、カルボプラチン及びオキザリプラチンなどの白金化合物、ペントスタチン、ミルテフォシン、エストラムスチン、トポテカン、イリノテカン及びビカルタミド）、毒素（例、リシン毒素、リア毒素及びベロ毒素）が挙げられる。これらの機能性分子は最終的に取り除かれる場合がある。更に、トロンビンやマトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）、ＦａｃｔｏｒＸなどの酵素が認識して切断することができるペプチド、ヌクレアーゼや制限酵素が切断できるポリヌクレオチドであってもよい。
【００９６】
本発明のアプタマー及び複合体は、例えば、医薬又は診断薬、検査薬、試薬として使用され得る。
【００９７】
本発明のアプタマー及び複合体は、キマーゼの機能を阻害する活性を有し得る。上述のように、キマーゼは線維症や循環器系疾患と深く関わっている。従って、本発明のアプタマー及び複合体は、線維症や循環器系疾患のほかに、線維症や循環器系疾患を伴う疾患をも治療又は予防するための医薬として有用である。
【００９８】
本発明のアプタマー及び複合体は、キマーゼに特異的に結合し得る。従って、本発明のアプタマー及び複合体は、キマーゼ検出用プローブとして有用である。該プローブは、キマーゼのインビボイメージング、血中濃度測定、組織染色、ＥＬＩＳＡ等に有用である。また、該プローブは、キマーゼが関与する疾患（線維症や循環器系疾患、線維症や循環器系疾患を伴う疾患等）の診断薬、検査薬、試薬等として有用である。
【００９９】
また、そのキマーゼへの特異的結合に基づき、本発明のアプタマー及び複合体はキマーゼの分離精製用リガンドとして使用され得る。
【０１００】
また、本発明のアプタマー及び複合体は、薬物送達剤として使用され得る。
【０１０１】
線維症とは、何らかの理由で臓器または組織の線維化が進行し、当該臓器や組織の機能が低下することに起因する疾患である。よって広義の線維症としては、臓器または組織の線維化が関与する疾患であるということができる。
臓器又は組織の線維化が関与する疾患としては、肺線維症、前立腺肥大、心筋線維化、心筋線維症、筋骨格線維症、骨髄線維症、子宮筋腫、強皮症、外科手術後の癒着、手術後の瘢痕、熱傷性瘢痕、肥厚性瘢痕、ケロイド、アトピー性皮膚炎、腹膜硬化症、喘息、肝硬変、慢性膵炎、スキルス胃癌、肝線維症、腎線維症、線維性血管病、糖尿病の合併症である線維性微小血管炎による網膜症、神経症、腎症、糸球体腎炎、尿細管間質性腎炎、遺伝性腎疾患、動脈硬化末梢動脈炎などが挙げられる。他に、大腸炎、骨粗鬆症、アレルギー性結膜炎、劇症肝炎、皮膚血管炎、色素性蕁麻疹、掻痒、ヘルペス状皮膚炎、水疱性類天疱瘡、乾癬、食道炎、食道弛緩不全症、気道炎症、アテローム硬化症、静脈瘤なども挙げられる。
【０１０２】
循環器系疾患としては、血管障害、大動脈瘤、腎不全、高血圧症、動脈硬化、心筋梗塞、心肥大、心不全、経皮経管冠動脈形成術などによる血管障害後の再狭窄、糖尿病性及び非糖尿病性の腎障害、末梢循環障害などが挙げられる。他に、肺高血圧症、大動脈弁狭窄症なども挙げられる。
【０１０３】
キマーゼは酵素活性を保有し、基質となる生理活性物質を切断する。その基質としては、例えばＡｎｇＩ、ｌａｔｅｎｔ  ＴＧＦ−β、ＳＣＦ、プロコラーゲン、プロコラゲナーゼ、ｐｒｏ−ＭＭＰ−９、ＩＬ−１β前駆体などが知られており、これら生理活性ペプチドの産生・分解反応を介して、細胞外マトリックスのリモデリング、サイトカインとのネットワーク、免疫、血管収縮といった生理作用を発揮する。一方、キマーゼそのものが肥満細胞を活性化したり、ヒスタミン遊離を促進したりする作用があり、炎症と関連深い。従って、本発明のアプタマー及び複合体は、上記に挙げた基質に限定されるものではないが、キマーゼに許容される基質が媒介する生体機能に関係した疾患及びキマーゼそのものが関与する疾患の医薬又は診断薬、検査薬、試薬として使用され得る。
【０１０４】
本発明の医薬は、医薬上許容される担体が配合されたものであり得る。医薬上許容される担体としては、例えば、ショ糖、デンプン、マンニット、ソルビット、乳糖、グルコース、セルロース、タルク、リン酸カルシウム、炭酸カルシウム等の賦形剤、セルロース、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ポリプロピルピロリドン、ゼラチン、アラビアゴム、ポリエチレングリコール、ショ糖、デンプン等の結合剤、デンプン、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルスターチ、ナトリウム−グリコール−スターチ、炭酸水素ナトリウム、リン酸カルシウム、クエン酸カルシウム等の崩壊剤、ステアリン酸マグネシウム、エアロジル、タルク、ラウリル硫酸ナトリウム等の滑剤、クエン酸、メントール、グリシルリシン・アンモニウム塩、グリシン、オレンジ粉等の芳香剤、安息香酸ナトリウム、亜硫酸水素ナトリウム、メチルパラベン、プロピルパラベン等の保存剤、クエン酸、クエン酸ナトリウム、酢酸等の安定剤、メチルセルロース、ポリビニルピロリドン、ステアリン酸アルミニウム等の懸濁剤、界面活性剤等の分散剤、水、生理食塩水、オレンジジュース等の希釈剤、カカオ脂、ポリエチレングリコール、白灯油等のベースワックスなどが挙げられるが、それらに限定されるものではない。
【０１０５】
本発明の医薬の投与経路としては特に限定されるものではないが、例えば経口投与、非経口投与が挙げられる。
経口投与に好適な製剤としては、水、生理食塩水、オレンジジュースのような希釈液に有効量のリガンドを溶解させた液剤、有効量のリガンドを固体や顆粒として含んでいるカプセル剤、サッシェ剤又は錠剤、適当な分散媒中に有効量の有効成分を懸濁させた懸濁液剤、有効量の有効成分を溶解させた溶液を適当な分散媒中に分散させ乳化させた乳剤、水溶性物質の吸収を促進させるＣ１０等が挙げられる。
【０１０６】
また、本発明の医薬は必要により、味のマスキング、腸溶性あるいは持続性などの目的のため、自体公知の方法でコーティングすることができる。コーティングに用いられるコーティング剤としては、例えば、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、エチルセルロース、ヒドロキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ポリオキシエチレングリコール、ツイーン８０、プルロニックＦ６８、セルロースアセテートフタレート、ヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレート、ヒドロキシメチルセルロースアセテートサクシネート、オイドラギット（ローム社製、ドイツ，メタアクリル酸・アクリル酸共重合体）及び色素（例、ベンガラ、二酸化チタンなど）などが用いられる。当該医薬は、速放性製剤、徐放性製剤のいずれであってもよい。
【０１０７】
非経口的な投与（例えば、静脈内投与、皮下投与、筋肉内投与、局所投与、腹腔内投与、経鼻投与など）に好適な製剤としては、水性及び非水性の等張な無菌の注射液剤があり、これには抗酸化剤、緩衝液、制菌剤、等張化剤等が含まれていてもよい。また、水性及び非水性の無菌の懸濁液剤が挙げられ、これには懸濁剤、可溶化剤、増粘剤、安定化剤、防腐剤等が含まれていてもよい。当該製剤は、アンプルやバイアルのように単位投与量あるいは複数回投与量ずつ容器に封入することができる。また、有効成分及び医薬上許容される担体を凍結乾燥し、使用直前に適当な無菌の溶媒に溶解又は懸濁すればよい状態で保存することもできる。
【０１０８】
また、徐放製剤も好適な製剤として挙げることができる。徐放製剤の剤形としては、人工骨や生体分解性基材もしくは生体非分解性スポンジ、バッグなど、体内に埋め込まれた担体もしくは容器からの徐放形態が挙げられる。あるいは薬剤ポンプ、浸透圧ポンプなど、体外から継続的もしくは断続的に体内もしくは局所に送達されるデバイス等も徐放製剤に含む。生体分解性の基材としては、リポソーム、カチオニックリポソーム、Ｐｏｌｙ（ｌａｃｔｉｃ−ｃｏ−ｇｌｙｃｏｌｉｃ）ａｃｉｄ（ＰＬＧＡ）、アテロコラーゲン、ゼラチン、ヒドロキシアパタイト、多糖シゾフィランなどが挙げられる。
【０１０９】
更に注射液剤、懸濁液剤や徐放製剤以外にも、経肺投与に適した吸入剤、経皮投与に適した軟膏剤なども可能である。
【０１１０】
吸入剤の場合、凍結乾燥状態の有効成分を微細化し適当な吸入デバイスを用いて吸入投与する。吸入剤には、更に必要に応じて使用されている界面活性剤、油、調味料、シクロデキストリン又はその誘導体等を適宜配合することができる。吸入剤は常法に従って製造することができる。すなわち、本発明のアプタマー又は複合体を粉末状又は液状にして、吸入噴射剤及び／又は担体中に配合し、適当な吸入容器に充填することにより製造することができる。また上記本発明のアプタマー又は複合体が、粉末状の場合は通常の機械的粉末吸入器を、液状の場合はネブライザー等の吸入器をそれぞれ使用することもできる。ここで吸入噴射剤としては従来公知のものを広く使用でき、フロン−１１、フロン−１２、フロン−２１、フロン−２２、フロン−１１３、フロン−１１４、フロン−１２３、フロン−１４２ｃ、フロン−１３４ａ、フロン−２２７、フロン−Ｃ３１８、１，１，１，２−テトラフルオロエタン等のフロン系化合物、プロパン、イソブタン、ｎ−ブタン等の炭化水素類、ジエチルエーテル等のエーテル類、窒素ガス、炭酸ガス等の圧縮ガス等を例示できる。
【０１１１】
界面活性剤としては、例えばオレイン酸、レシチン、ジエチレングリコールジオレエート、テトラヒドロフルフリルオレエート、エチルオレエート、イソプロピルミリステート、グリセリルトリオレエート、グリセリルモノラウレート、グリセリルモノオレエート、グリセリルモノステアレート、グリセリルモノリシノエート、セチルアルコール、ステアリルアルコール、ポリエチレングリコール４００、セチルピリジニウムクロリド、ソルビタントリオレエート（商品名スパン８５）、ソルビタンモノオレエート（商品名スパン８０）、ソルビタンモノラウエート（商品名スパン２０）、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油（商品名ＨＣＯ−６０）、ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノラウレート（商品名ツイーン２０）、ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノオレエート（商品名ツイーン８０）、天然資源由来のレシチン（商品名エピクロン）、オレイルポリオキシエチレン（２）エーテル（商品名ブリジ９２）、ステアリルポリオキシエチレン（２）エーテル（商品名ブリジ７２）、ラウリルポリオキシエチレン（４）エーテル（商品名ブリジ３０）、オレイルポリオキシエチレン（２）エーテル（商品名ゲナポル０−０２０）、オキシエチレンとオキシプロピレンとのブロック共重合体（商品名シンペロニック）等が挙げられる。油としては、例えばトウモロコシ油、オリーブ油、綿実油、ヒマワリ油等が挙げられる。また、軟膏剤の場合、適当な医薬上許容される基剤（黄色ワセリン、白色ワセリン、パラフィン、プラスチベース、シリコーン、白色軟膏、ミツロウ、豚油、植物油、親水軟膏、親水ワセリン、精製ラノリン、加水ラノリン、吸水軟膏、親水プラスチベース、マクロゴール軟膏等）を用い、有効成分である本発明のアプタマーと混合し製剤化し使用する。
【０１１２】
本発明の医薬の投与量は、有効成分の種類・活性、病気の重篤度、投与対象となる動物種、投与対象の薬物受容性、体重、年齢等によって異なるが、通常、成人１日あたり有効成分量として約０．０００１〜約１００ｍｇ／ｋｇ、例えば約０．０００１〜約１０ｍｇ／ｋｇ、好ましくは約０．００５〜約１ｍｇ／ｋｇであり得る。
【０１１３】
本発明はまた、本発明のアプタマー及び複合体が固定化された固相担体を提供する。固相担体としては、例えば、基板、樹脂、プレート（例、マルチウェルプレート）、フィルター、カートリッジ、カラム、多孔質材が挙げられる。基板は、ＤＮＡチップやプロテインチップなどに使われているものなどであり得、例えば、ニッケル−ＰＴＦＥ（ポリテトラフルオロエチレン）基板やガラス基板、アパタイト基板、シリコン基板、アルミナ基板などで、これらの基板にポリマーなどのコーティングを施したものが挙げられる。樹脂としては、例えば、アガロース粒子、シリカ粒子、アクリルアミドとＮ，Ｎ’−メチレンビスアクリルアミドの共重合体、ポリスチレン架橋ジビニルベンゼン粒子、デキストランをエピクロロヒドリンで架橋した粒子、セルロースファイバー、アリルデキストランとＮ，Ｎ’−メチレンビスアクリルアミドの架橋ポリマー、単分散系合成ポリマー、単分散系親水性ポリマー、セファロース、トヨパールなどが挙げられ、また、これらの樹脂に各種官能基を結合させた樹脂も含まれる。本発明の固相担体は、例えば、キマーゼの精製、及びキマーゼの検出、定量に有用であり得る。
【０１１４】
本発明のアプタマー及び複合体は、自体公知の方法により固相担体に固定できる。例えば、親和性物質（例、上述したもの）や所定の官能基を本発明のアプタマー及び複合体に導入し、次いで当該親和性物質や所定の官能基を利用して固相担体に固定化する方法が挙げられる。本発明はまた、このような方法を提供する。所定の官能基は、カップリング反応に供することが可能な官能基であり得、例えば、アミノ基、チオール基、ヒドロキシル基、カルボキシル基が挙げられる。本発明はまた、このような官能基が導入されたアプタマーを提供する。
【０１１５】
本発明はまた、キマーゼの精製及び濃縮方法を提供する。特に本発明はキマーゼを他のファミリータンパク質から分離することが可能である。本発明の精製及び濃縮方法は、本発明の固相担体にキマーゼを吸着させ、吸着したキマーゼを溶出液により溶出させることを含み得る。本発明の固相担体へのキマーゼの吸着は自体公知の方法により行うことができる。例えば、キマーゼを含有する試料（例、細菌又は細胞の培養物又は培養上清、血液）を、本発明の固相担体又はその含有物に導入する。キマーゼの溶出は、中性溶液等の溶出液を用いて行うことができる。中性溶出液は特に限定されるものではないが、例えばｐＨ約６〜約９、好ましくは約６．５〜約８．５、より好ましくは約７〜約８であり得る。中性溶液はまた、例えば、尿素、キレート剤（例、ＥＤＴＡ）、ナトリウム塩（例、ＮａＣｌ）、カリウム塩（例、ＫＣｌ）、マグネシウム塩（例、ＭｇＣｌ２）、界面活性剤（例、Ｔｗｅｅｎ２０、Ｔｒｉｔｏｎ、ＮＰ４０）、グリセリンを含むものであり得る。本発明の精製及び濃縮方法はさらに、キマーゼの吸着後、洗浄液を用いて固相担体を洗浄することを含み得る。洗浄液としては、例えば、尿素、キレート剤（例、ＥＤＴＡ）、Ｔｒｉｓ、酸、アルカリ、Ｔｒａｎｆｅｒ  ＲＮＡ、ＤＮＡ、Ｔｗｅｅｎ  ２０などの表面活性剤、ＮａＣｌなどの塩を含むものなどが挙げられる。本発明の精製及び濃縮方法はさらに、固相担体を加熱処理することを含み得る。かかる工程により、固相担体の再生、滅菌が可能である。
【０１１６】
本発明はまた、キマーゼの検出及び定量方法を提供する。特に本発明はキマーゼを他のファミリータンパク質と区別して検出及び定量することができる。本発明の検出及び定量方法は、本発明のアプタマーを利用して（例、本発明の複合体及び固相担体の使用により）キマーゼを測定することを含み得る。キマーゼの検出及び定量方法は、抗体の代わりに本発明のアプタマーを用いること以外は、免疫学的方法と同様の方法により行われ得る。従って、抗体の代わりに本発明のアプタマーをプローブとして用いることにより、酵素免疫測定法（ＥＩＡ）（例、直接競合ＥＬＩＳＡ、間接競合ＥＬＩＳＡ、サンドイッチＥＬＩＳＡ）、放射免疫測定法（ＲＩＡ）、蛍光免疫測定法（ＦＩＡ）、ウエスタンブロット法、免疫組織化学的染色法、セルソーティング法等の方法と同様の方法により、検出及び定量を行うことができる。また、ＰＥＴ等の分子プローブとしても、使用することができる。このような方法は、例えば、生体又は生物学的サンプルにおけるキマーゼ量の測定、キマーゼが関連する疾患の診断に有用であり得る。
【０１１７】
本明細書中で挙げられた特許及び特許出願明細書を含む全ての刊行物に記載された内容は、本明細書での引用により、その全てが明示されたと同程度に本明細書に組み込まれるものである。
【０１１８】
以下に実施例を挙げ、本発明を更に詳しく説明するが、本発明は下記実施例等に何ら制約されるものではない。
【実施例】
【０１１９】
実施例１：キマーゼに特異的に結合するＲＮＡアプタマーの作製（１）
キマーゼに特異的に結合するＲＮＡアプタマーはＳＥＬＥＸ法を用いて作製した。ＳＥＬＥＸはＥｌｌｉｎｇｔｏｎらの方法（Ｅｌｌｉｎｇｔｏｎ  ａｎｄ  Ｓｚｏｓｔａｋ，Ｎａｔｕｒｅ  ３４６，８１８−８２２，１９９０）及びＴｕｅｒｋらの方法（Ｔｕｅｒｋ  ａｎｄ  Ｇｏｌｄ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４９，５０５−５１０，１９９０）を参考にして行った。標的物質としてＮＨＳ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ４  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ（ＧＥヘルスケア社製）の担体に固相化したキマーゼ（Ｈｕｍａｎ  Ｓｋｉｎ、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ社製）を用いた。担体へのキマーゼの固相化方法はＧＥヘルスケア社の仕様書に沿って行った。固相化量は、固相化前のキマーゼ溶液と固相化直後の上清をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより調べることで確認した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果、上清からはキマーゼのバンドは検出されず、使用したキマーゼのほぼ全てがカップリングされたことが確認された。約１６７ｐｍｏｌのキマーゼが約３μＬの樹脂に固相化されたことになる。【０１２０】
最初のラウンドで用いたＲＮＡ（３０Ｎ）は、化学合成によって得られたＤＮＡをＤｕｒａＳｃｒｉｂｅＴＭＴ７  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ社製）を用いて転写して得た。この方法によって得られたＲＮＡはピリミジンヌクレオチドのリボースの２’位がフルオロ化されたものである。ＤＮＡ鋳型として以下に示す３０ヌクレオチドのランダム配列の両端にプライマー配列を持った長さ７２ヌクレオチドのＤＮＡを用いた。ＤＮＡ鋳型とプライマーは化学合成によって作製した。【０１２１】
ＤＮＡ鋳型：５’−ＴＣＡＣＡＣＴＡＧＣＡＣＧＣＡＴＡＧＧＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＣＡＴＣＴＧＡＣＣＴＣＴＣＴＣＣＴＧＣＴＣＣＣ−３’（配列番号３４）
プライマーＦｗｄ：５’−ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＡＧＣＡＧＧＡＧＡＧＡＧＧＴＣＡＧＡＴＧ−３’（配列番号３５）
プライマーＲｅｖ：５’−ＴＣＡＣＡＣＴＡＧＣＡＣＧＣＡＴＡＧＧ−３’（配列番号３６）【０１２２】
ＤＮＡ鋳型（配列番号３４）中のＮの連続は任意の組み合わせの３０個のヌクレオチド（３０Ｎ：それぞれのＮは、Ａ、Ｇ、Ｃ又はＴである）であり、得られるアプタマー独特の配列領域を生じる。プライマーＦｗｄはＴ７  ＲＮＡポリメラーゼのプロモーター配列を含んでいる。最初のラウンドで用いたＲＮＡプールのバリエーションは理論上１０１４であった。【０１２３】
キマーゼが固相化された担体にＲＮＡプールを加え、３０分室温で保持した後、キマーゼに結合しないＲＮＡを取り除くために、溶液Ａで樹脂を洗浄した。ここで溶液Ａは１４５ｍＭ  塩化ナトリウム、５．４ｍＭ  塩化カリウム、１．８ｍＭ  塩化カルシウム、０．８ｍＭ  塩化マグネシウム、２０ｍＭ  トリス（ｐＨ７．６）の混合溶液である。キマーゼに結合したＲＮＡは、溶出液として溶液Ｂを加えて９５℃で１０分間熱処理を行い、その上清から回収した。ここで溶液Ｂは７Ｍ  Ｕｒｅａ、３ｍＭ  ＥＤＴＡ、１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ６．６）の混合液である。回収されたＲＮＡはＲＴ−ＰＣＲで増幅し、ＤｕｒａＳｃｒｉｂｅＴＭＴ７  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ｋｉｔで転写して次のラウンドのプールとして用いた。以上を１ラウンドとし、同様の作業を複数回繰り返し行った。ＳＥＬＥＸ終了後、ＰＣＲ産物をｐＧＥＭ−Ｔ  Ｅａｓｙベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）にクローニングし、大腸菌株ＤＨ５α（Ｔｏｙｏｂｏ社製）をトランスフォーメーションした。シングルコロニーからプラスミドを抽出後、ＤＮＡシーケンサー（３１３０ｘｌ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ａｎａｌｙｚｅｒ、ＡＢＩ社製）でクローンの塩基配列を調べた。【０１２４】
ＳＥＬＥＸを９ラウンド行った後に５６クローンの配列を調べたところ、配列に収束が見られた。それらクローンの一部の配列を配列番号１〜６に示す。これらの配列には以下で表される共通配列【０１２５】
ＵＡＡＣＲ１Ｎ１Ｒ２ＧＧＧＧ【０１２６】
が含まれていた。【０１２７】
前記共通配列は５６クローン中７クローンに含まれていた。これらの配列の二次構造をＭＦＯＬＤプログラム（Ｍ．Ｚｕｋｅｒ，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３１（１３），３４０６−３４１５，２００３）を用いて予測したところ、前記共通配列のＵＡＡＣＲ１とＲ２ＧＧＧＧとで形成された部分がよく似たステム構造となり、それに挟まれるＮ１で形成された部分がよく似たループ構造となった。配列番号１〜６で表される配列のアプタマーの二次構造予測を図１に示す。前記共通配列は以下の式（１）【０１２８】
【化１３】
2019107532.tif 000014
【０１２９】
で表されるステム／ループ構造を採ることが分かる。当該ステム／ループ構造部分を四角（□）で囲った。【０１３０】
以下にそれぞれのヌクレオチド配列を示す。特に言及がなければ、以下に挙げられる個々の配列は、５’から３’の方向で表すものとし、プリン塩基（Ａ及びＧ）は２’−ＯＨ体であり、ピリミジン塩基（Ｕ及びＣ）は２’−フルオロ修飾体である。【０１３１】
配列番号１
ＧＧＧＡＧＣＡＧＧＡＧＡＧＡＧＧＵＣＡＧＡＵＧＡＧＣＡＵＧＣＵＵＵＵＵＧＧＵＡＡＣＣＧＡＵＡＡＵＧＧＧＧＧＣＣＵＡＵＧＣＧＵＧＣＵＡＧＵＧＵＧＡ【０１３２】
配列番号２
ＧＧＧＡＧＣＡＧＧＡＧＡＧＡＧＧＵＣＡＧＡＵＧＡＵＣＧＧＡＣＡＵＡＡＣＡＵＵＧＵＵＧＧＧＧＵＧＵＣＡＡＧＧＣＣＵＡＵＧＣＧＵＧＣＵＡＧＵＧＵＧＡ【０１３３】
配列番号３
ＧＧＧＡＧＣＡＧＧＡＧＡＧＡＧＧＵＣＡＧＡＵＧＡＵＡＡＣＣＡＧＵＵＧＧＧＧＧＧＵＣＡＡＵＵＡＣＡＵＧＧＧＡＣＣＵＡＵＧＣＧＵＧＣＵＡＧＵＧＵＧＡ【０１３４】
配列番号４
ＧＧＧＡＧＣＡＧＧＡＧＡＧＡＧＧＵＣＡＧＡＵＧＵＡＡＣＵＣＵＡＵＵＧＡＧＧＧＧＣＡＵＣＡＧＣＡＣＡＧＵＡＧＣＣＵＡＵＧＣＧＵＧＣＵＡＧＵＧＵＧＡ【０１３５】
配列番号５
ＧＧＧＡＧＣＡＧＧＡＧＡＧＡＧＧＵＣＡＧＡＵＧＡＵＧＡＣＣＧＡＵＵＡＵＡＧＧＵＡＡＣＣＡＣＵＵＡＧＧＧＧＧＣＣＵＡＵＧＣＧＵＧＣＵＡＧＵＧＵＧＡ【０１３６】
配列番号６
ＧＧＧＡＧＣＡＧＧＡＧＡＧＡＧＧＵＣＡＧＡＵＧＵＣＡＵＧＡＣＵＵＡＵＡＧＧＵＡＡＣＣＧＡＵＡＡＵＧＧＧＧＧＣＣＵＡＵＧＣＧＵＧＣＵＡＧＵＧＵＧＡ【０１３７】
[共通配列]ＵＡＡＣＲ１Ｎ１Ｒ２ＧＧＧＧ【０１３８】
９ラウンドまで行った上記ＳＥＬＥＸを同様の条件で継続し、１０ラウンド目に８クローン、１１ラウンド目に４７クローン、合計５５クローンの配列を調べた。それらクローンの一部の配列を配列番号７〜８に示す。これらの配列には９ラウンド目と同様に共通配列が含まれていた。共通配列は５５クローン中３クローンに含まれていた。配列番号７〜８で表される配列のアプタマーの二次構造予測を図２に示す。ステム／ループ構造を四角（□）で囲った。それらは図１同様、全て特徴的なステム／ループ構造となった。【０１３９】
以下にそれぞれのヌクレオチド配列を示す。特に言及がなければ、以下に挙げられる個々の配列は、５’から３’の方向で表すものとし、プリン塩基（Ａ及びＧ）は２’−ＯＨ体であり、ピリミジン塩基（Ｕ及びＣ）は２’−フルオロ修飾体である。【０１４０】
配列番号７
ＧＧＧＡＧＣＡＧＧＡＧＡＧＡＧＧＵＣＡＧＡＵＧＵＵＵＧＧＵＡＧＵＡＡＣＵＧＧＡＡＵＡＧＧＧＧＣＵＡＣＡＧＧＣＣＵＡＵＧＣＧＵＧＣＵＡＧＵＧＵＧＡ【０１４１】
配列番号８
ＧＧＧＡＧＣＡＧＧＡＧＡＧＡＧＧＵＣＡＧＡＵＧＡＵＵＧＡＣＧＡＣＵＡＵＡＧＧＵＡＡＣＣＵＵＵＡＣＧＧＧＧＧＣＣＵＡＵＧＣＧＵＧＣＵＡＧＵＧＵＧＡ【０１４２】
配列番号１〜８で表される核酸がキマーゼの酵素活性を阻害するかどうかを、下記の方法により評価した。キマーゼの基質としてキモトリプシン様プロテアーゼの標準基質である４アミノ酸ペプチドＡｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅを含むＳｕｃ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−ＭＣＡ（ペプチド研究所社製）を選択した。ここでＳｕｃは保護基であるスクシニル基、ＭＣＡは４−メチルクマリル−７−アミド基であり、フェニルアラニンのＣ末端側が切断されるとＡＭＣ（７−アミノ−４−メチルクマリン）が遊離する。このＡＭＣの蛍光を検出することで、キマーゼの酵素活性を測定することができる。アッセイには、９６ウェルプレート（Ｆ１６  Ｂｌａｃｋ  Ｍａｘｉｓｏｒｐ  Ｆｌｕｏｒｏｎｕｎｃ、Ｎｕｎｃ社製）を用い、反応液量を１００μＬとし、溶液Ｃの緩衝液中で実施した。ここで溶液Ｃは１４５ｍＭ  塩化ナトリウム、５．４ｍＭ  塩化カリウム、１．８ｍＭ  塩化カルシウム、０．８ｍＭ  塩化マグネシウム、２０ｍＭ  トリス（ｐＨ７．６）、０．０５％  Ｔｗｅｅｎ２０の混合溶液である。まず、核酸は溶液Ｃ中に段階希釈したものを、５０μＬずつ用意した。そこに、溶液Ｃ中に調製した１ｍＭの基質を１０μＬ添加した後、プレートをマイクロプレートリーダーＳｐｅｃｔｒａＭａｘ１９０（モレキュラーデバイス社製）にセットし、３７℃で５分間保温した。一方で、０．０５μｇのキマーゼ（ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ、ＳＩＧＭＡ社製）を溶液Ｃ中に希釈したものを４０μＬ用意し、３７℃で５分間保温した。核酸及び基質からなる混合液に、キマーゼ溶液を加えて、酵素反応を開始させた。反応溶液中の最終キマーゼ濃度は１６．７ｎＭ、最終基質濃度は１００μＭである。反応液を含むプレートを、マイクロプレートリーダーＳｐｅｃｔｒａＭａｘ１９０（モレキュラーデバイス社製）にセットし、３７℃で５分間（もしくは３０分間）、蛍光強度の変化を経時的に測定した（励起波長  ３８０ｎｍ、検出波長  ４６０ｎｍ）。キマーゼ活性により、基質から放出されるＡＭＣの蛍光増加の線形近似を求め、その傾きの値を初速度（Ｖｍａｘ）とした。コントロールとして、３０Ｎ（３０個の連続したヌクレオチド；Ｎは、Ａ、Ｇ、Ｃ又はＴである）の核酸プールを用いた場合（ネガティブコントロール）、及び既知のキモトリプシン様セリンプロテアーゼ阻害剤であるキモスタチンを用いた場合（ポジティブコントロール）において、同様に処理し測定を行った。核酸、阻害剤を含まない場合の反応初速度（Ｖ０）を酵素活性１００％とし、各被験物質の阻害率を次式を用いて算出した。【０１４３】
阻害率（％）＝（１−Ｖｍａｘ／Ｖ０）×１００【０１４４】
酵素活性を５０％阻害するのに要する阻害剤の濃度（ＩＣ５０）を求めた。その結果を表１に示す。“＞０．５”は０．５μＭまでの濃度範囲で阻害活性が見られなかったことを示す。ＩＣ５０の値は２〜３回測定の平均値を示す。【０１４５】
【表１】
2019107532.tif 000015
【０１４６】
ネガティブコントロールである３０Ｎは阻害活性を示さなかった（ＩＣ５０＞０．５μＭ）。また、ポジティブコントロールであるキモスタチンのＩＣ５０値は０．１μＭ〜０．２μＭの値を示した。
以上の結果より、表１に記載された共通配列を含むアプタマーはキマーゼに対する阻害活性を示した。特に０．１μＭ以下のＩＣ５０値を示したアプタマーは優れた阻害効果を示したと言える。またこの結果から、これら共通配列に含まれるＲ１とＲ２との組み合わせとしてはＡ／Ｕ、Ｃ／Ｇ、Ａ／ＣまたはＧ／Ｕのどれでもよいことが示された。【０１４７】
ランダム配列が３０ヌクレオチドでプライマー配列が上記ＳＥＬＥＸで用いたものと異なる鋳型を用いて、上記と同様のＳＥＬＥＸを行った。ＳＥＬＥＸの標的物質としてＮＨＳ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ４  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ（ＧＥヘルスケア社製）の担体に固相化したキマーゼ（ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ、ＳＩＧＭＡ社製）を用いた。使用した鋳型とプライマーの配列を以下に示す。ＤＮＡ鋳型とプライマーは化学合成により作製した。【０１４８】
ＤＮＡ鋳型：５’−ＴＣＴＧＴＣＣＴＣＡＧＴＡＣＴＴＧＡＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＧＴＣＴＧＴＣＧＣＴＴＣＧＴＴＣＣＣ−３’（配列番号３７）
プライマーＦｗｄ：５’−ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＡＡＣＧＡＡＧＣＧＡＣＡＧＡＣ−３’（配列番号３８）
プライマーＲｅｖ：５’−ＴＣＴＧＴＣＣＴＣＡＧＴＡＣＴＴＧＡ−３’（配列番号３９）【０１４９】
ＤＮＡ鋳型（配列番号３７）中のＮの連続は任意の組み合わせの４０個のヌクレオチド（４０Ｎ：それぞれのＮは、Ａ、Ｇ、Ｃ又はＴである）であり、得られるアプタマー独特の配列領域を生じる。プライマーＦｗｄはＴ７  ＲＮＡポリメラーゼのプロモーター配列を含んでいる。最初のラウンドで用いたＲＮＡプールのバリエーションは理論上１０１４であった。【０１５０】
キマーゼが固相化された担体にＲＮＡプールを加え、３０分室温で保持した後、キマーゼに結合しないＲＮＡを取り除くために、溶液Ａで樹脂を洗浄した。ここで溶液Ａは１４５ｍＭ  塩化ナトリウム、５．４ｍＭ  塩化カリウム、１．８ｍＭ  塩化カルシウム、０．８ｍＭ  塩化マグネシウム、２０ｍＭ  トリス（ｐＨ７．６）の混合溶液である。キマーゼに結合したＲＮＡは、溶出液として溶液Ｂを加えて９５℃で１０分間熱処理を行い、その上清から回収した。ここで溶液Ｂは７Ｍ  Ｕｒｅａ、３ｍＭ  ＥＤＴＡ、１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ６．６）の混合液である。回収されたＲＮＡはＲＴ−ＰＣＲで増幅し、ＤｕｒａＳｃｒｉｂｅＴＭＴ７  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ｋｉｔで転写して次のラウンドのプールとして用いた。以上を１ラウンドとし、同様の作業を複数回繰り返し行った。ＳＥＬＥＸ終了後、ＰＣＲ産物をｐＧＥＭ−Ｔ  Ｅａｓｙベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）にクローニングし、大腸菌株ＤＨ５α（Ｔｏｙｏｂｏ社製）をトランスフォーメーションした。シングルコロニーからプラスミドを抽出後、ＤＮＡシーケンサー（３１３０ｘｌ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ａｎａｌｙｚｅｒ、ＡＢＩ社製）でクローンの塩基配列を調べた。【０１５１】
ＳＥＬＥＸを８ラウンド行った後に３８クローンの配列を調べたところ、配列に収束が見られた。それらクローンの一部の配列を配列番号９〜１０に示す。そのうち、配列番号１０で表される配列は２配列存在した。共通配列は３８クローン中３クローンに含まれていた。これらの配列の二次構造をＭＦＯＬＤプログラム（Ｍ．Ｚｕｋｅｒ，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３１（１３），３４０６−３４１５，２００３）を用いて予測したところ、共通配列の部分がよく似たループ構造となった。配列番号９〜１０で表される配列のアプタマーの二次構造予測を図３に示す。ステム／ループ構造を四角（□）で囲った。【０１５２】
以下にそれぞれのヌクレオチド配列を示す。特に言及がなければ、以下に挙げられる個々の配列は、５’から３’の方向で表すものとし、プリン塩基（Ａ及びＧ）は２’−ＯＨ体であり、ピリミジン塩基（Ｕ及びＣ）は２’−フルオロ修飾体である。【０１５３】
配列番号９
ＧＧＧＡＡＣＧＡＡＧＣＧＡＣＡＧＡＣＧＵＵＣＣＡＧＣＧＵＣＵＡＡＵＡＣＧＵＧＡＡＵＡＡＣＣＵＧＡＵＣＧＵＡＧＧＧＧＧＵＵＣＡＡＧＵＡＣＵＧＡＧＧＡＣＡＧＡ【０１５４】
配列番号１０
ＧＧＧＡＡＣＧＡＡＧＣＧＡＣＡＧＡＣＣＧＡＡＵＣＡＧＡＡＧＵＵＣＡＡＣＡＵＧＧＡＣＡＵＡＡＣＡＵＣＧＡＵＧＧＧＧＵＧＵＣＡＡＧＵＡＣＵＧＡＣＧＡＣＡＧＡ【０１５５】
配列番号９および１０で表される核酸がキマーゼの酵素活性を阻害するかどうかを、下記の方法により評価した。アンジオテンシンＩはキマーゼによりアンジオテンシンＩＩに変換され、その際にペプチド断片であるＨｉｓ−Ｌｅｕが遊離する。このペプチドＨｉｓ−Ｌｅｕはｏ−フタルアルデヒドにより蛍光誘導体化されるため、その蛍光強度を定量的に測定することが可能である。【０１５６】
アッセイにおける酵素反応の溶液量は５０μＬとし、溶液Ｃの緩衝液中で実施した。まず、ｎａｔｉｖｅ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ社製）を溶液Ｃ中に希釈したものを５μＬ用意した。ここでｎａｔｉｖｅとはヒト皮膚肥満細胞から精製したキマーゼである。核酸は溶液Ｃ中に０．００２７〜２μＭの濃度で段階希釈したものを、２５μＬずつ用意した。キマーゼ溶液５μＬと核酸溶液２５μＬを混和し、３７℃で５分間保温した。一方で、溶液Ｃ中に調製した１２５ｍＭアンジオテンシンＩ（ペプチド研究所社製）を２０μＬ用意し、３７℃で５分間保温した。キマーゼ及び核酸からなる混合液に、アンジオテンシンＩ溶液を加えて、酵素反応を開始させた。反応溶液中の最終キマーゼ濃度は０．５ｎＭ、最終基質濃度は５０μＭである。３７℃で９０分間反応させた後、氷冷した３０％トリクロロ酢酸溶液を２５μＬ添加し、反応を停止させた。混合液全体を４℃、１４０００ｒｐｍで１０分間遠心し、その上清３０μＬを次の蛍光誘導化反応に用いた。【０１５７】
上記の上清３０μＬを９６ウェルプレート（ブラック、Ｃｏｓｔａｒ社製）に加え、各ウェルに対し、メタノールに溶解した２％  ｏ−フタルアルデヒド（ＳＩＧＭＡ社製）溶液１５μＬと、０．３Ｍ  ＮａＯＨ溶液１７０μＬを混和し、室温に１０分間放置した。その後、３Ｍ  ＨＣｌ溶液を２５μＬ添加し、反応を停止させた。プレートをマイクロプレートリーダーＳｐｅｃｔｒａＭａｘ１９０（モレキュラーデバイス社製）にセットし、励起波長３５５ｎｍ、蛍光波長４６０ｎｍの条件で蛍光強度を測定した。【０１５８】
各条件において、反応時間０分における蛍光強度をブランクとした。キマーゼ酵素反応において、核酸を添加するかわりに溶液Ｃを同量添加した場合に検出される蛍光強度を１００％とし、各被験物質の阻害率を、次式を用いて算出した。【０１５９】
阻害率（％）＝［１−｛（被験物質の蛍光強度−被験物質のブランクの蛍光強度）／（被験物質を含まない場合の蛍光強度−被験物質を含まない場合のブランクの蛍光強度）｝］×１００【０１６０】
酵素活性を５０％阻害するのに要する阻害剤の濃度（ＩＣ５０）を求めた。その結果を表２に示す。表中、ＩＣ５０の値は２〜３回測定の平均値を示す。【０１６１】
【表２】
2019107532.tif 000016
【０１６２】
ポジティブコントロールに使用されるキモスタチンのＩＣ５０値は０．３５〜０．５μＭ値であり、表２に含まれるすべての核酸は、天然の基質であるアンジオテンシンＩを用いた場合でもキマーゼに対する強い阻害活性を有するため、アンジオテンシンが関与する各種疾患の予防および／または治療薬として期待される。【０１６３】
実施例２：アプタマーの短鎖化
配列番号２で表されるアプタマーの短鎖化を行った。配列番号２で表されるアプタマーは共通配列を含む。短鎖化した配列を配列番号１１〜２０に示す。配列番号１１〜２０で表されるアプタマーの一部についての二次構造予測を図４に示す。図４中、共通配列を四角（□）で囲った。【０１６４】
以下に配列番号１１〜２０で表されるそれぞれのヌクレオチド配列を示す。特に言及がなければ、以下に挙げられる個々の配列は、５’から３’の方向で表すものとし、プリン塩基（Ａ及びＧ）は２’−ＯＨ体であり、ピリミジン塩基（Ｕ及びＣ）は２’−フルオロ修飾体である。【０１６５】
配列番号１１
（配列番号２で表される配列を、共通配列を含む４３ヌクレオチドの長さに短鎖化した配列）
ＧＧＧＵＣＡＧＡＵＧＡＵＣＧＧＡＣＡＵＡＡＣＡＵＵＧＵＵＧＧＧＧＵＧＵＣＡＡＧＧＣＣＣ【０１６６】
配列番号１２
（配列番号２で表される配列を、共通配列を含む２２ヌクレオチドの長さに短鎖化した配列）
ＧＡＣＡＵＡＡＣＡＵＵＧＵＵＧＧＧＧＵＧＵＣ【０１６７】
配列番号１３
（配列番号２で表される配列を、共通配列を含む２７ヌクレオチドの長さに短鎖化した配列）
ＧＧＡＣＡＵＡＡＣＡＵＵＧＵＵＧＧＧＧＵＧＵＣＡＡＧＧ【０１６８】
配列番号１４
（配列番号２で表される配列を、共通配列を含む３９ヌクレオチドの長さに短鎖化した配列）
ＧＧＣＡＧＡＵＧＡＵＣＧＧＡＣＡＵＡＡＣＡＵＵＧＵＵＧＧＧＧＵＧＵＣＡＡＧＣＣ【０１６９】
配列番号１５
（配列番号２で表される配列を、共通配列を含む３５ヌクレオチドの長さに短鎖化した配列）
ＧＡＵＧＡＵＣＧＧＡＣＡＵＡＡＣＡＵＵＧＵＵＧＧＧＧＵＧＵＣＡＡＧＣＣ【０１７０】
配列番号１６
（配列番号２で表される配列を、共通配列を含む３６ヌクレオチドの長さに短鎖化した配列）
ＧＧＣＡＧＡＵＧＡＵＣＧＧＡＣＡＵＡＡＣＡＵＵＧＵＵＧＧＧＧＵＧＵＣＡＡ【０１７１】
配列番号１７
（配列番号２で表される配列を、共通配列を含む３２ヌクレオチドの長さに短鎖化した配列）
ＧＡＵＧＡＵＣＧＧＡＣＡＵＡＡＣＡＵＵＧＵＵＧＧＧＧＵＧＵＣＡＡ【０１７２】
配列番号１８
（配列番号２で表される配列を、共通配列を含む３０ヌクレオチドの長さに短鎖化した配列）
ＵＧＡＵＣＧＧＡＣＡＵＡＡＣＡＵＵＧＵＵＧＧＧＧＵＧＵＣＡＡ【０１７３】
配列番号１９
（配列番号２で表される配列を、共通配列を含む２８ヌクレオチドの長さに短鎖化した配列）
ＡＵＣＧＧＡＣＡＵＡＡＣＡＵＵＧＵＵＧＧＧＧＵＧＵＣＡＡ【０１７４】
配列番号２０
（配列番号２で表される配列を、共通配列を含む３１ヌクレオチドの長さに短鎖化した配列）
ＧＡＵＧＡＵＣＧＧＡＣＡＵＡＡＣＡＵＵＧＵＵＧＧＧＧＵＧＵＣＡ
配列番号１１〜２０の核酸は全て化学合成により作製した。配列番号１１〜２０の評価においては、実施例１で示したアンジオテンシンＩを基質として用いた場合のキマーゼに対する阻害活性評価方法と同様の方法を用いて測定した。測定の結果を表３に示す。表中、“＞１”は１μＭまでの濃度範囲で阻害活性が見られなかったことを示す。ＩＣ５０の値は２〜３回測定の平均値を示す。【０１７５】
【表３】
2019107532.tif 000017
【０１７６】
表３に記載された配列番号２の短鎖化体の多くはキマーゼに対する阻害活性を示した。特に０．０１μＭ以下のＩＣ５０値を示したアプタマーは優れた阻害効果を示したと言える。配列番号１８の結果より、共通配列を含む３０ヌクレオチドに短鎖化したものであっても活性を維持していることがわかった。これは、共通配列がキマーゼに対する結合及び阻害活性に重要であることを示している。【０１７７】
実施例３：短鎖化したアプタマーの改変
配列番号１７で表されるアプタマーのヌクレアーゼ耐性を高めるために、末端修飾した改変体、配列中のプリン塩基のリボースの２’位にＯ−メチル基あるいはＦ修飾を導入した改変体、その他に、ホスホロチオエートを導入した改変体を作製した。配列を配列番号１７（１）〜１７（２５）に示す。【０１７８】
以下にそれぞれのヌクレオチド配列を示す。特に言及がなければ、以下に挙げられる個々の配列は、５’から３’の方向で表すものとし、ヌクレオチドにおける括弧はそのリボースの２’位の修飾を示し、Ｆはフッ素原子、ＭはＯ−メチル基、ＰＨＥは８−（Ｐｒｏｐｙｌ）ｐｈｅｎｙｌ−ｒＡ（ｎ−ｂｚ）−２’−ｔＢＤＭＳ  ａｍｉｄｉｔｅを示す。また、各配列末端におけるｉｄＴはｉｎｖｅｒｔｅｄ−ｄＴによる修飾、Ｓはチオール基の修飾を示す。ＸはフェニルアラニンのＣ末端とシステインのＮ末端がペプチド結合することによるペプチド配列、ＹはフェニルアラニンのＮ末端とシステインのＣ末端がペプチド結合することによるペプチド配列を示す。配列中におけるｓはヌクレオチド同士を結合するリン酸基がホスホロチオエート化されたことを示す。ＺはＴＣ６Ｆ  ａｍｉｄｉｔｅを示す。【０１７９】
配列番号１７（１）
配列番号１７で表される配列の共通配列ＧＧＧＧにおける最初のＧと二番目のＧに２’−Ｏ−メチル修飾を導入した配列
ＧＡＵ（Ｆ）ＧＡＵ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）ＧＧＡＣ（Ｆ）ＡＵ（Ｆ）ＡＡＣ（Ｆ）ＡＵ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）ＧＵ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）ＧＧＵ（Ｆ）ＧＵ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）ＡＡ【０１８０】
配列番号１７（２）
配列番号１７で表される配列の５’末端及び３’末端にｉｄＴ修飾を導入し、共通配列以外の配列のうち１２箇所に２’−Ｏ−メチル修飾を導入し、共通配列ＧＧＧＧにおける２番目のＧ以外のＧに２’−Ｏ−メチル修飾を導入した配列
ｉｄＴ−Ｇ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｕ（Ｆ）Ｇ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｕ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｃ（Ｆ）Ａ（Ｍ）Ｕ（Ｆ）ＡＡＣ（Ｆ）ＡＵ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ｇ（Ｍ）Ｕ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ｇ（Ｍ）ＧＧ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｕ（Ｆ）Ｇ（Ｍ）Ｕ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ａ（Ｍ）Ａ（Ｍ）−ｉｄＴ【０１８１】
配列番号１７（３）
配列番号１７で表される配列の５’末端及び３’末端にｉｄＴ修飾を導入し、共通配列以外の配列のうち１２箇所に２’−Ｏ−メチル修飾を導入し、共通配列ＧＧＧＧにおける１番目のＧ以外のＧに２’−Ｏ−メチル修飾を導入した配列
ｉｄＴ−Ｇ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｕ（Ｆ）Ｇ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｕ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｃ（Ｆ）Ａ（Ｍ）Ｕ（Ｆ）ＡＡＣ（Ｆ）ＡＵ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ｇ（Ｍ）Ｕ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）ＧＧ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｕ（Ｆ）Ｇ（Ｍ）Ｕ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ａ（Ｍ）Ａ（Ｍ）−ｉｄＴ【０１８２】
配列番号１７（４）
配列番号１７で表される配列の５’末端及び３’末端にｉｄＴ修飾を導入し、共通配列以外の配列のうち１２箇所に２’−Ｏ−メチル修飾を導入し、共通配列ＧＧＧＧにおける２番目のＧ以外のＧに２’−Ｏ−メチル修飾を導入した配列
ｉｄＴ−Ｇ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｕ（Ｆ）Ｇ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｕ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｃ（Ｆ）Ａ（Ｍ）Ｕ（Ｆ）ＡＡＣ（Ｆ）ＡＴＴＧ（Ｍ）Ｕ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ｇ（Ｍ）ＧＧ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｕ（Ｆ）Ｇ（Ｍ）Ｕ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ａ（Ｍ）Ａ（Ｍ）−ｉｄＴ【０１８３】
配列番号１７（５）
配列番号１７で表される配列の５’末端及び３’末端にｉｄＴ修飾を導入し、共通配列以外の配列のうち１２箇所に２’−Ｏ−メチル修飾を導入し、共通配列ＧＧＧＧにおける２番目のＧ以外のＧに２’−Ｏ−メチル修飾を導入した配列
ｉｄＴ−Ｇ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｕ（Ｆ）Ｇ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｕ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｃ（Ｆ）Ａ（Ｍ）Ｕ（Ｆ）ＡＡＣ（Ｆ）ＡＴＴＧ（Ｍ）Ｕ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ｇ（Ｍ）ＧＧ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）ＴＧ（Ｍ）ＴＣＡ（Ｍ）Ａ（Ｍ）−ｉｄＴ【０１８４】
配列番号１７（６）
配列番号１７で表される配列の５’末端及び３’末端にｉｄＴ修飾を導入し、共通配列以外の配列のうち１３箇所に２’−Ｏ−メチル修飾を導入し、共通配列ＧＧＧＧにおける２番目のＧ以外のＧに２’−Ｏ−メチル修飾を導入した配列
ｉｄＴ−Ｇ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｕ（Ｆ）Ｇ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｕ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｃ（Ｆ）Ａ（Ｍ）Ｕ（Ｆ）ＡＡＣ（Ｆ）Ａ（Ｍ）ＴＴＧ（Ｍ）Ｕ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ｇ（Ｍ）ＧＧ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）ＴＧ（Ｍ）ＴＣＡ（Ｍ）Ａ（Ｍ）−ｉｄＴ【０１８５】
配列番号１７（７）
配列番号１７で表される配列の５’末端及び３’末端にｉｄＴ修飾を導入し、共通配列以外の配列のうち１３箇所に２’−Ｏ−メチル修飾を導入し、共通配列ＧＧＧＧにおける２番目のＧ以外のＧに２’−Ｏ−メチル修飾を導入した配列
ｉｄＴ−Ｇ（Ｍ）Ａ（Ｍ）ＴＧ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｕ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ａ（Ｍ）ＣＡ（Ｍ）Ｕ（Ｆ）ＡＡＣ（Ｆ）Ａ（Ｍ）ＴＴＧ（Ｍ）Ｕ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ｇ（Ｍ）ＧＧ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）ＴＧ（Ｍ）ＴＣＡ（Ｍ）Ａ（Ｍ）−ｉｄＴ【０１８６】
配列番号１７（８）
配列番号１７で表される配列の５’末端及び３’末端にｉｄＴ修飾を導入し、共通配列以外の配列のうち１３箇所に２’−Ｏ−メチル修飾を導入し、共通配列ＵＡＡＣにおけるＵに２’−Ｏ−メチル修飾を導入し、共通配列ＧＧＧＧにおける２番目のＧ以外のＧに２’−Ｏ−メチル修飾を導入した配列
ｉｄＴ−Ｇ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｕ（Ｆ）Ｇ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｕ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｃ（Ｆ）Ａ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）ＡＡＣ（Ｆ）Ａ（Ｍ）ＴＴＧ（Ｍ）Ｕ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ｇ（Ｍ）ＧＧ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）ＴＧ（Ｍ）ＴＣＡ（Ｍ）Ａ（Ｍ）−ｉｄＴ【０１８７】
配列番号１７（９）
配列番号１７で表される配列の５’末端及び３’末端にｉｄＴ修飾を導入し、共通配列以外の配列のうち１３箇所に２’−Ｏ−メチル修飾を導入し、共通配列ＵＡＡＣにおけるＣに２’−Ｏ−メチル修飾を導入し、共通配列ＧＧＧＧにおける２番目のＧ以外のＧに２’−Ｏ−メチル修飾を導入した配列
ｉｄＴ−Ｇ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｕ（Ｆ）Ｇ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｕ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｃ（Ｆ）Ａ（Ｍ）Ｕ（Ｆ）ＡＡＣ（Ｍ）Ａ（Ｍ）ＴＴＧ（Ｍ）Ｕ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ｇ（Ｍ）ＧＧ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）ＴＧ（Ｍ）ＴＣＡ（Ｍ）Ａ（Ｍ）−ｉｄＴ【０１８８】
配列番号１７（１０）
配列番号１７で表される配列の５’末端及び３’末端にｉｄＴ修飾を導入し、共通配列以外の配列のうち１４箇所に２’−Ｏ−メチル修飾を導入し、共通配列ＧＧＧＧにおける２番目のＧ以外のＧに２’−Ｏ−メチル修飾を導入した配列
ｉｄＴ−Ｇ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｕ（Ｆ）Ｇ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｕ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｃ（Ｆ）Ａ（Ｍ）Ｕ（Ｆ）ＡＡＣ（Ｆ）Ａ（Ｍ）ＴＴＧ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ｕ（Ｆ）Ｇ（Ｍ）ＧＧ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）ＴＧ（Ｍ）ＴＣＡ（Ｍ）Ａ（Ｍ）−ｉｄＴ【０１８９】
配列番号１７（１１）
配列番号１７で表される配列の５’末端及び３’末端にｉｄＴ修飾を導入し、共通配列以外の配列のうち１４箇所に２’−Ｏ−メチル修飾を導入し、共通配列ＧＧＧＧにおける２番目のＧ以外のＧに２’−Ｏ−メチル修飾を導入した配列
ｉｄＴ−Ｇ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｕ（Ｆ）Ｇ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｕ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｃ（Ｆ）Ａ（Ｍ）Ｕ（Ｆ）ＡＡＣ（Ｆ）Ａ（Ｍ）ＴＴＧ（Ｍ）Ｕ（Ｆ）Ｕ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）ＧＧ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）ＴＧ（Ｍ）ＴＣＡ（Ｍ）Ａ（Ｍ）−ｉｄＴ【０１９０】
配列番号１７（１２）
配列番号１７で表される配列の５’末端にフェニルアラニンのＣ末端とシステインのＮ末端がペプチド結合することによるペプチド配列の修飾をチオール基で導入し、３’末端にｉｄＴ修飾を導入し、共通配列以外の配列のうち１３箇所に２’−Ｏ−メチル修飾を導入し、共通配列ＧＧＧＧにおける２番目のＧ以外のＧに２’−Ｏ−メチル修飾を導入した配列
Ｘ−Ｓ−Ｇ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｕ（Ｆ）Ｇ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｕ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｃ（Ｆ）Ａ（Ｍ）Ｕ（Ｆ）ＡＡＣ（Ｆ）Ａ（Ｍ）ＴＴＧ（Ｍ）Ｕ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ｇ（Ｍ）ＧＧ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）ＴＧ（Ｍ）ＴＣＡ（Ｍ）Ａ（Ｍ）−ｉｄＴ【０１９１】
配列番号１７（１３）
配列番号１７で表される配列の５’末端にフェニルアラニンのＮ末端とシステインのＣ末端がペプチド結合することによるペプチド配列の修飾をチオール基で導入し、３’末端にｉｄＴ修飾を導入し、共通配列以外の配列のうち１３箇所に２’−Ｏ−メチル修飾を導入し、共通配列ＧＧＧＧにおける２番目のＧ以外のＧに２’−Ｏ−メチル修飾を導入した配列
Ｙ−Ｓ−Ｇ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｕ（Ｆ）Ｇ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｕ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｃ（Ｆ）Ａ（Ｍ）Ｕ（Ｆ）ＡＡＣ（Ｆ）Ａ（Ｍ）ＴＴＧ（Ｍ）Ｕ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ｇ（Ｍ）ＧＧ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）ＴＧ（Ｍ）ＴＣＡ（Ｍ）Ａ（Ｍ）−ｉｄＴ【０１９２】
配列番号１７（１４）
配列番号１７で表される配列の５’末端にｉｄＴ修飾を導入し、３’末端にフェニルアラニンのＮ末端とシステインのＣ末端がペプチド結合することによるペプチド配列の修飾をチオール基で導入し、共通配列以外の配列のうち１３箇所に２’−Ｏ−メチル修飾を導入し、共通配列ＧＧＧＧにおける２番目のＧ以外のＧに２’−Ｏ−メチル修飾を導入した配列
ｉｄＴ−Ｇ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｕ（Ｆ）Ｇ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｕ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｃ（Ｆ）Ａ（Ｍ）Ｕ（Ｆ）ＡＡＣ（Ｆ）Ａ（Ｍ）ＴＴＧ（Ｍ）Ｕ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ｇ（Ｍ）ＧＧ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）ＴＧ（Ｍ）ＴＣＡ（Ｍ）Ａ（Ｍ）−Ｓ−Ｙ【０１９３】
配列番号１７（１５）
配列番号１７で表される配列の５’末端及び３’末端にｉｄＴ修飾を導入し、共通配列以外の配列のうち１２箇所に２’−Ｏ−メチル修飾を導入し、１ヶ所に８−（Ｐｒｏｐｙｌ）ｐｈｅｎｙｌ−ｒＡ（ｎ−ｂｚ）−２’−ｔＢＤＭＳ  ａｍｉｄｉｔｅ修飾を導入し、共通配列ＧＧＧＧにおける２番目のＧ以外のＧに２’−Ｏ−メチル修飾を導入した配列
ｉｄＴ−Ｇ（Ｍ）Ａ（ＰＨＥ）Ｕ（Ｆ）Ｇ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｕ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｃ（Ｆ）Ａ（Ｍ）Ｕ（Ｆ）ＡＡＣ（Ｆ）Ａ（Ｍ）ＴＴＧ（Ｍ）Ｕ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ｇ（Ｍ）ＧＧ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）ＴＧ（Ｍ）ＴＣＡ（Ｍ）Ａ（Ｍ）−ｉｄＴ【０１９４】
配列番号１７（１６）
配列番号１７で表される配列の５’末端及び３’末端にｉｄＴ修飾を導入し、共通配列以外の配列のうち１２箇所に２’−Ｏ−メチル修飾を導入し、１ヶ所に８−（Ｐｒｏｐｙｌ）ｐｈｅｎｙｌ−ｒＡ（ｎ−ｂｚ）−２’−ｔＢＤＭＳ  ａｍｉｄｉｔｅ修飾を導入し、共通配列ＧＧＧＧにおける２番目のＧ以外のＧに２’−Ｏ−メチル修飾を導入した配列
ｉｄＴ−Ｇ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｕ（Ｆ）Ｇ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｕ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｃ（Ｆ）Ａ（Ｍ）Ｕ（Ｆ）ＡＡＣ（Ｆ）Ａ（Ｍ）ＴＴＧ（Ｍ）Ｕ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ｇ（Ｍ）ＧＧ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）ＴＧ（Ｍ）ＴＣＡ（ＰＨＥ）Ａ（Ｍ）−ｉｄＴ【０１９５】
配列番号１７（１７）
配列番号１７で表される配列の５’末端及び３’末端にｉｄＴ修飾を導入し、共通配列以外の配列のうち１２箇所に２’−Ｏ−メチル修飾を導入し、１ヶ所に８−（Ｐｒｏｐｙｌ）ｐｈｅｎｙｌ−ｒＡ（ｎ−ｂｚ）−２’−ｔＢＤＭＳ  ａｍｉｄｉｔｅ修飾を導入し、共通配列ＧＧＧＧにおける２番目のＧ以外のＧに２’−Ｏ−メチル修飾を導入した配列
ｉｄＴ−Ｇ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｕ（Ｆ）Ｇ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｕ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｃ（Ｆ）Ａ（Ｍ）Ｕ（Ｆ）ＡＡＣ（Ｆ）Ａ（Ｍ）ＴＴＧ（Ｍ）Ｕ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ｇ（Ｍ）ＧＧ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）ＴＧ（Ｍ）ＴＣＡ（Ｍ）Ａ（ＰＨＥ）−ｉｄＴ【０１９６】
配列番号１７（１８）
配列番号１７で表される配列の５’末端及び３’末端にｉｄＴ修飾を導入し、共通配列以外の配列のうち１３箇所に２’−Ｏ−メチル修飾を導入し、共通配列ＵＡＡＣにおけるＵのヌクレオチド同士を結合するリン酸基をホスホロチオエート化し、共通配列ＧＧＧＧにおける２番目のＧ以外のＧに２’−Ｏ−メチル修飾を導入した配列
ｉｄＴ−Ｇ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｕ（Ｆ）Ｇ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｕ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｃ（Ｆ）Ａ（Ｍ）Ｕ（Ｆ）ｓＡＡＣ（Ｆ）Ａ（Ｍ）ＴＴＧ（Ｍ）Ｕ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ｇ（Ｍ）ＧＧ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）ＴＧ（Ｍ）ＴＣＡ（Ｍ）Ａ（Ｍ）−ｉｄＴ【０１９７】
配列番号１７（１９）
配列番号１７で表される配列の５’末端及び３’末端にｉｄＴ修飾を導入し、共通配列以外の配列のうち１３箇所に２’−Ｏ−メチル修飾を導入し、共通配列ＵＡＡＣにおける１番目のＡヌクレオチド同士を結合するリン酸基をホスホロチオエート化し、共通配列ＧＧＧＧにおける２番目のＧ以外のＧに２’−Ｏ−メチル修飾を導入した配列
ｉｄＴ−Ｇ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｕ（Ｆ）Ｇ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｕ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｃ（Ｆ）Ａ（Ｍ）Ｕ（Ｆ）ＡｓＡＣ（Ｆ）Ａ（Ｍ）ＴＴＧ（Ｍ）Ｕ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ｇ（Ｍ）ＧＧ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）ＴＧ（Ｍ）ＴＣＡ（Ｍ）Ａ（Ｍ）−ｉｄＴ【０１９８】
配列番号１７（２０）
配列番号１７で表される配列の５’末端及び３’末端にｉｄＴ修飾を導入し、共通配列以外の配列のうち１３箇所に２’−Ｏ−メチル修飾を導入し、共通配列ＵＡＡＣにおける２番目のＡヌクレオチド同士を結合するリン酸基をホスホロチオエート化し、共通配列ＧＧＧＧにおける２番目のＧ以外のＧに２’−Ｏ−メチル修飾を導入した配列
ｉｄＴ−Ｇ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｕ（Ｆ）Ｇ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｕ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｃ（Ｆ）Ａ（Ｍ）Ｕ（Ｆ）ＡＡｓＣ（Ｆ）Ａ（Ｍ）ＴＴＧ（Ｍ）Ｕ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ｇ（Ｍ）ＧＧ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）ＴＧ（Ｍ）ＴＣＡ（Ｍ）Ａ（Ｍ）−ｉｄＴ【０１９９】
配列番号１７（２１）
配列番号１７で表される配列の５’末端及び３’末端にｉｄＴ修飾を導入し、共通配列以外の配列のうち１３箇所に２’−Ｏ−メチル修飾を導入し、共通配列ＵＡＡＣにおける２番目のＡのヌクレオチド同士を結合するリン酸基をホスホロチオエート化し、共通配列ＧＧＧＧにおける２番目のＧ以外のＧに２’−Ｏ−メチル修飾を導入し、２番目のＧのヌクレオチド同士を結合するリン酸基をホスホロチオエート化した配列
ｉｄＴ−Ｇ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｕ（Ｆ）Ｇ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｕ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｃ（Ｆ）Ａ（Ｍ）Ｕ（Ｆ）ＡＡＣ（Ｆ）Ａ（Ｍ）ＴＴＧ（Ｍ）Ｕ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ｇ（Ｍ）ＧｓＧ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）ＴＧ（Ｍ）ＴＣＡ（Ｍ）Ａ（Ｍ）−ｉｄＴ【０２００】
配列番号１７（２２）
配列番号１７で表される配列の５’末端及び３’末端にｉｄＴ修飾を導入し、共通配列以外の配列のうち１９箇所に２’−Ｏ−メチル修飾を導入し、１ヶ所に８−（Ｐｒｏｐｙｌ）ｐｈｅｎｙｌ−ｒＡ（ｎ−ｂｚ）−２’−ｔＢＤＭＳ  ａｍｉｄｉｔｅ修飾を導入し、共通配列ＵＡＡＣのＵ及びＣに２’−Ｏ−メチル修飾を導入し、共通配列ＧＧＧＧにおける２番目のＧ以外のＧに２’−Ｏ−メチル修飾を導入した配列
ｉｄＴ−Ａ（ＰＨＥ）Ａ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｕ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）ＡＡＣ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）ＧＧ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）ＴＧ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ａ（Ｍ）−ｉｄＴ【０２０１】
配列番号１７（２３）
配列番号１７で表される配列の５’末端及び３’末端にｉｄＴ修飾を導入し、共通配列以外の配列のうち１１箇所に２’−Ｏ−メチル修飾を導入し、１ヶ所に８−（Ｐｒｏｐｙｌ）ｐｈｅｎｙｌ−ｒＡ（ｎ−ｂｚ）−２’−ｔＢＤＭＳ  ａｍｉｄｉｔｅ修飾を導入し、共通配列ＧＧＧＧにおける２番目のＧ以外のＧに２’−Ｏ−メチル修飾を導入した配列
ｉｄＴ−Ｇ（Ｍ）Ａ（ＰＨＥ）Ｕ（Ｆ）Ｇ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｕ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｃ（Ｆ）Ａ（Ｍ）Ｕ（Ｆ）ＡＡＣ（Ｆ）ＡＵ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ｇ（Ｍ）Ｕ（Ｆ）Ｕ（Ｆ）Ｇ（Ｍ）ＧＧ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｕ（Ｆ）Ｇ（Ｍ）Ｕ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ａ（Ｍ）Ａ（Ｍ）−ｉｄＴ【０２０２】
配列番号１７（２４）
配列番号１７で表される配列の５’末端にＴＣ６Ｆ  ａｍｉｄｉｔｅ修飾を導入し、３’末端にｉｄＴ修飾を導入し、共通配列以外の配列のうち２０箇所に２’−Ｏ−メチル修飾を導入し、共通配列ＵＡＡＣのＵ及びＣに２’−Ｏ−メチル修飾を導入し、共通配列ＧＧＧＧにおける２番目のＧ以外のＧに２’−Ｏ−メチル修飾を導入した配列
ｉｄＴ−ＺＡ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｕ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）ＡＡＣ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）ＧＧ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）ＴＧ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ａ（Ｍ）−ｉｄＴ【０２０３】
配列番号１７（２５）
配列番号１７で表される配列の５’末端にＴＣ６Ｆ  ａｍｉｄｉｔｅ修飾を導入し、３’末端にｉｄＴ修飾を導入し、共通配列以外の配列のうち２０箇所に２’−Ｏ−メチル修飾を導入し、共通配列ＵＡＡＣのＵ及びＣに２’−Ｏ−メチル修飾を導入し、共通配列ＧＧＧＧにおける２番目のＧ以外のＧに２’−Ｏ−メチル修飾を導入した配列
ｉｄＴ−ＺＡ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｕ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）ＡＡＣ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）ＧＧ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）ＴＧ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ａ（Ｍ）−ｉｄＴ【０２０４】
配列番号１７（１）〜１７（２５）の核酸は全て化学合成により作製した。配列番号１７（１）〜１７（２５）の評価においては、実施例１で示したアンジオテンシンＩを基質として用いた場合のキマーゼに対する阻害活性評価方法と同様の方法を用いて測定した。測定の結果を表４に示す。表中、ＩＣ５０の値は２〜３回測定の平均値を示す。【０２０５】
【表４】
2019107532.tif 000018
【０２０６】
表４に記載された配列番号１７の改変体の多くはキマーゼに対する阻害活性を示した。特に０．００１μＭ以下のＩＣ５０値を示したアプタマーは優れた阻害効果を示したと言える。配列番号１７（１１）〜配列番号１７（１４）の結果より、末端修飾による活性の影響はないことが示された。【０２０７】
共通配列に含まれるヌクレオチドに関しては、配列番号１７（１）や配列番号１７（３）のように共通配列におけるＧＧＧＧの２番目のＧを２’−Ｏ−メチル修飾すると、アプタマーとして十分な活性を有するものの活性が低下し、この部分の修飾態様の変化は活性に影響が認められることが示された。一方で配列番号１７（２）のように共通配列におけるＧＧＧＧの２番目のＧ以外のＧを２’−Ｏ−メチル修飾しても活性の影響はないことが示された。【０２０８】
配列番号１７（１）〜配列番号１７（２５）で表されるアプタマーの結果から、上記共通配列におけるＧＧＧＧの２番目のＧ以外の修飾は安定性を向上させるため、本発明のアプタマーにおいては、活性を有する限り少なくとも一つのヌクレオチドに修飾を導入したものであってもよいことがわかった。ヌクレオチドの修飾としては、２’−Ｏ−メチル修飾以外にも、例えば２’−アミノ修飾などが挙げられる。【０２０９】
以上より、配列番号１７を化学修飾により改変することで、キマーゼに対するより強い阻害活性を有し、キマーゼ阻害剤として使用可能であることが示された。【０２１０】
実施例４：アプタマーのループ構造における塩基挿入の効果
配列番号２で表されるアプタマーのループ構造に塩基を挿入し、結合活性及び阻害活性に対する影響を調べた。配列を配列番号２１〜配列番号２５に示す。【０２１１】
配列番号２１〜２５の核酸は全て化学合成により作製した。以下に配列番号２１〜２５で示される各アプタマーのヌクレオチド配列を示す。特に言及がなければ、以下に挙げられる個々の配列は、５’から３’の方向で表すものとし、ヌクレオチドにおける括弧はそのリボースの２’位の修飾を示し（例えば、Ｕ（Ｆ）と表記する場合、ウラシルのリボースの２’位がＦで修飾されることを示す）、Ｆはフッ素原子を示す。【０２１２】
配列番号２１
配列番号２で表される配列のループ構造に１７個の核酸塩基を挿入した配列
ＧＧＣＡＧＡＵＧＡＵＣＧＧＡＣＡＵＡＡＣＡＧＧＵＵＡＧＡＵＡＧＡＧＵＵＡＡＡＡＡＣＣＵＧＧＧＧＵＧＵＣＡＡ【０２１３】
配列番号２２
配列番号２で表される配列のループ構造に１５個の核酸塩基を挿入した配列
ＧＧＣＡＧＡＵＧＡＵＣＧＧＡＣＡＵＡＡＣＡＧＵＵＡＧＡＵＡＧＡＧＵＵＡＡＡＡＡＣＵＧＧＧＧＵＧＵＣＡＡ【０２１４】
配列番号２３
配列番号２で表される配列のループ構造に１３個の核酸塩基を挿入した配列
ＧＧＣＡＧＡＵＧＡＵＣＧＧＡＣＡＵＡＡＣＡＧＵＡＧＡＵＡＧＡＧＵＵＡＡＡＡＣＵＧＧＧＧＵＧＵＣＡＡ【０２１５】
配列番号２４
配列番号２で表される配列のループ構造に１１個の核酸塩基を挿入した配列
ＧＧＣＡＧＡＵＧＡＵＣＧＧＡＣＡＵＡＡＣＡＵＡＧＡＵＡＧＡＧＵＵＡＡＡＡＵＧＧＧＧＵＧＵＣＡＡ【０２１６】
配列番号２５
配列番号２で表される配列のループ構造に９個の核酸塩基を挿入した配列
ＧＧＣＡＧＡＵＧＡＵＣＧＧＡＣＡＵＡＡＣＡＡＧＡＵＡＧＡＧＵＵＡＡＡＵＧＧＧＧＵＧＵＣＡＡ【０２１７】
配列番号２１〜２５の核酸は全て化学合成により作製した。【０２１８】
配列番号２１〜２５の評価においては、キマーゼの量を０．０５μｇから０．００５μｇに変更した以外は実施例１で示したＭＣＡを基質として用いた場合のキマーゼに対する阻害活性評価方法と同様の方法を用いて測定した。測定の結果を表５に示す。表中、ＩＣ５０の値は１回の測定値を示す。【０２１９】
【表５】
2019107532.tif 000019
【０２２０】
表５に記載された配列はキマーゼに対する阻害活性を示した。何れも０．０１μＭ以下のＩＣ５０値を示しており阻害効果を維持していると言える。配列番号２のループ構造へは、１７塩基までの挿入であれば活性を維持していることがわかった。【０２２１】
実施例５：最適化ＳＥＬＥＸによるＲＮＡアプタマーの作製
キマーゼに特異的に結合し、より高い活性を有するアプタマーを獲得する目的で、最適化ＳＥＬＥＸを実施した。最適化ＳＥＬＥＸは、以下で記載するＤＮＡ鋳型とプライマー以外は、実施例１で記載したＳＥＬＥＸと同様である。【０２２２】
ＤＮＡ鋳型は、実施例２で取得した配列番号１７を基に、一部をランダム配列とする４種類のＤＮＡ鋳型を化学合成によって作製したものを用いた。プライマーは、実施例１で使用した配列番号３５、配列番号３６を使用した。ＤＮＡ鋳型のランダム配列部分（四角で囲った部分）を図５に示す。【０２２３】
ＤＮＡ鋳型：５’−ＴＣＡＣＡＣＴＡＧＣＡＣＧＣＡＴＡＧＧＣＣＴＴＧＡＣＡＣＣＣＣＡＡＣＡＡＴＧＴＴＡＴＧＴＣＣＧＡＴＣＡＴＣＴＧＡＣＣＴＣＴＣＴＣＣＴＧＣＴＣＣＣ−３’（配列番号４０）
ＤＮＡ鋳型１：配列番号１７の四角で囲った部分に９％のランダム配列（任意の組み合わせのヌクレオチドでＡ、Ｇ、Ｃ又はＴ）をドープした鋳型
ＤＮＡ鋳型２：配列番号１７の四角で囲った部分に９％のランダム配列（任意の組み合わせのヌクレオチドでＡ、Ｇ、Ｃ又はＴ）をドープした鋳型
ＤＮＡ鋳型３：配列番号１７の四角で囲った部分に１５％のランダム配列（任意の組み合わせのヌクレオチドでＡ、Ｇ、Ｃ又はＴ）をドープした鋳型
ＤＮＡ鋳型４：配列番号１７の四角で囲った部分をランダム配列（任意の組み合わせのヌクレオチドでＡ、Ｇ、Ｃ又はＴ）とした鋳型【０２２４】
ＤＮＡ鋳型１、ＤＮＡ鋳型２を用いてＳＥＬＥＸを６ラウンド行った後に各々４８クローンの配列を調べたところ、配列に収束が見られた。同様にＤＮＡ鋳型３、ＤＮＡ鋳型４を用いてＳＥＬＥＸを３ラウンド行った後に、各々３２クローンの配列を調べたところ、配列に収束が見られた。それらクローンの一部の配列を配列番号２６〜３１に示す。配列番号２６〜３１で表される配列の二次構造予測を図６示す。式（１）で表されるステム／ループ構造を四角（□）で囲った。【０２２５】
以下にそれぞれのヌクレオチド配列を示す。特に言及がなければ、以下に挙げられる個々の配列は、５’から３’の方向で表すものとし、プリン塩基（Ａ及びＧ）は２’−ＯＨ体であり、ピリミジン塩基（Ｕ及びＣ）は２’−フルオロ修飾体である。【０２２６】
配列番号２６
ＧＧＧＡＧＣＡＧＧＡＧＡＧＡＧＧＵＣＡＧＡＵＵＵＵＣＧＧＧＣＡＵＡＡＣＡＵＵＧＵＵＧＧＧＧＵＧＵＡＡＣＧＡＣＣＵＡＵＧＣＧＵＧＣＵＡＧＵＧＵＧＡ【０２２７】
配列番号２７
ＧＧＧＡＧＣＡＧＧＡＧＡＧＡＧＧＵＣＡＧＡＵＧＡＡＣＧＧＡＣＡＵＡＡＣＡＵＵＧＵＵＧＧＧＧＵＧＵＣＡＡＧＧＣＣＵＡＵＧＣＧＵＧＣＵＡＧＵＧＵＧＡ【０２２８】
配列番号２８
ＧＧＧＡＧＣＡＧＧＡＧＡＧＡＧＧＵＣＡＧＡＵＧＡＵＣＧＧＡＣＡＵＡＡＣＵＣＵＧＧＡＧＧＧＧＵＧＵＣＡＡＧＧＣＣＵＡＵＧＣＧＵＧＣＵＡＧＵＧＵＧＡ【０２２９】
配列番号２９
ＧＧＧＡＧＣＡＧＧＡＧＡＧＡＧＧＵＣＡＧＡＵＧＡＵＣＧＧＧＣＡＵＡＡＣＡＵＵＧＵＵＧＧＧＧＵＧＵＣＡＡＧＧＣＣＵＡＵＧＣＧＵＧＣＵＡＧＵＧＵＧＡ【０２３０】
配列番号３０
ＧＧＧＡＧＣＡＧＧＡＧＡＧＡＧＧＵＣＡＧＡＵＧＡＵＣＧＧＡＣＡＵＡＡＣＵＡＡＵＵＡＧＧＧＧＵＧＵＣＡＡＧＧＣＣＵＡＵＧＣＧＵＧＣＵＡＧＵＧＵＧＡ【０２３１】
配列番号３１
ＧＧＧＡＧＣＡＧＧＡＧＡＧＡＧＧＵＣＡＧＡＵＧＡＵＣＧＧＡＣＡＵＡＡＣＡＵＵＧＣＵＧＧＧＧＵＧＵＣＡＡＧＧＣＣＵＡＵＧＣＧＵＧＣＵＡＧＵＧＵＧＡ【０２３２】
配列番号２６〜３１の核酸は全て化学合成により作製した。そしてこれらの配列で表されるアプタマーには、実施例２で示されるアプタマーと同様の活性が認められた。【０２３３】
実施例６：最適化ＳＥＬＥＸで取得したアプタマーの短鎖化
配列番号３０で表されるアプタマーの短鎖化を行った。配列番号３０で表されるアプタマーは共通配列を含む。短鎖化した配列を配列番号３２〜３３に示す。配列番号３２〜３３で表されるアプタマーの二次構造予測を図７示す。図７中、式（１）で表されるステム／ループ構造を四角（□）で囲った。【０２３４】
以下に配列番号３２〜３３で表されるそれぞれのヌクレオチド配列を示す。特に言及がなければ、以下に挙げられる個々の配列は、５’から３’の方向で表すものとし、プリン塩基（Ａ及びＧ）は２’−ＯＨ体であり、ピリミジン塩基（Ｕ及びＣ）は２’−フルオロ修飾体である。【０２３５】
配列番号３２
配列番号３０で表される配列を、共通配列を含む３２ヌクレオチドの長さに短鎖化した配列
ＧＡＵＧＡＵＣＧＧＡＣＡＵＡＡＣＵＡＡＵＵＡＧＧＧＧＵＧＵＣＡＡ【０２３６】
配列番号３３
配列番号３０で表される配列を、共通配列を含む３１ヌクレオチドの長さに短鎖化した配列
ＡＵＧＡＵＣＧＧＡＣＡＵＡＡＣＵＡＡＵＵＡＧＧＧＧＵＧＵＣＡＡ【０２３７】
配列番号３２〜３３の核酸は全て化学合成により作製した。そしてこれらの配列で表されるアプタマーには、実施例２で示されるアプタマーと同様の活性が認められた。【０２３８】
実施例７：最適化ＳＥＬＥＸ及び短鎖化で取得したアプタマーの改変
配列番号３３で表されるアプタマーのヌクレアーゼ耐性を高めるために、末端修飾した改変体、配列中のプリン塩基のリボースの２’位にＯ−メチル基あるいはＦ修飾を導入した改変体、その他に、ホスホロチオエートを導入した改変体を作製した。配列を配列番号３３（１）〜３３（１８）に示す。【０２３９】
以下にそれぞれのヌクレオチド配列を示す。特に言及がなければ、以下に挙げられる個々の配列は、５’から３’の方向で表すものとし、ヌクレオチドにおける括弧はそのリボースの２’位の修飾を示し、Ｆはフッ素原子、ＭはＯ−メチル基、ＰＨＥは８−（Ｐｒｏｐｙｌ）ｐｈｅｎｙｌ−ｒＡ（ｎ−ｂｚ）−２’−ｔＢＤＭＳ  ａｍｉｄｉｔｅを示す。また、各配列末端におけるｉｄＴはｉｎｖｅｒｔｅｄ−ｄＴによる修飾、ＰＥＧは４０ｋＤａの分岐型ポリエチレングリコールによる修飾、Ｓはチオール基の修飾を示す。【０２４０】
配列番号３３（１）
配列番号３３で表される配列の５’末端及び３’末端にｉｄＴ修飾を導入し、共通配列以外の配列のうち１５箇所に２’−Ｏ−メチル修飾を導入し、共通配列ＵＡＡＣにおけるＵ及びＣに２’−Ｏ−メチル修飾を導入し、共通配列ＧＧＧＧにおける２番目のＧ以外のＧに２’−Ｏ−メチル修飾を導入した配列
ｉｄＴ−Ａ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｕ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）ＡＡＣ（Ｍ）Ｕ（Ｆ）ＡＡＵ（Ｆ）Ｕ（Ｍ）ＡＧ（Ｍ）ＧＧ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）ＴＧ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ａ（Ｍ）−ｉｄＴ【０２４１】
配列番号３３（２）
配列番号３３で表される配列の５’末端及び３’末端にｉｄＴ修飾を導入し、共通配列以外の配列のうち１３箇所に２’−Ｏ−メチル修飾を導入し、共通配列ＵＡＡＣにおけるＵ及びＣに２’−Ｏ−メチル修飾を導入し、共通配列ＧＧＧＧにおける２番目のＧ以外のＧに２’−Ｏ−メチル修飾を導入した配列
ｉｄＴ−Ａ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｕ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｃ（Ｆ）Ａ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）ＡＡＣ（Ｍ）Ｕ（Ｆ）ＡＡＵ（Ｆ）Ｕ（Ｍ）ＡＧ（Ｍ）ＧＧ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）ＴＧ（Ｍ）ＴＣ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ａ（Ｍ）−ｉｄＴ【０２４２】
配列番号３３（３）
配列番号３３で表される配列の５’末端及び３’末端にｉｄＴ修飾を導入し、共通配列以外の配列のうち１７箇所に２’−Ｏ−メチル修飾を導入し、１箇所に８−（Ｐｒｏｐｙｌ）ｐｈｅｎｙｌ−ｒＡ（ｎ−ｂｚ）−２’−ｔＢＤＭＳ  ａｍｉｄｉｔｅ修飾を導入し、共通配列ＵＡＡＣにおけるＵ及びＣに２’−Ｏ−メチル修飾を導入し、共通配列ＧＧＧＧにおける２番目のＧ以外のＧに２’−Ｏ−メチル修飾を導入した配列
ｉｄＴ−Ａ（ＰＨＥ）Ｕ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｕ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）ＡＡＣ（Ｍ）Ｕ（Ｆ）Ａ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｕ（Ｆ）Ｕ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）ＧＧ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）ＴＧ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ａ（Ｍ）−ｉｄＴ【０２４３】
配列番号３３（４）
配列番号３３で表される配列の５’末端及び３’末端にｉｄＴ修飾を導入し、共通配列以外の配列のうち１５箇所に２’−Ｏ−メチル修飾を導入し、１箇所に８−（Ｐｒｏｐｙｌ）ｐｈｅｎｙｌ−ｒＡ（ｎ−ｂｚ）−２’−ｔＢＤＭＳ  ａｍｉｄｉｔｅ修飾を導入し、共通配列ＵＡＡＣにおけるＵ及びＣに２’−Ｏ−メチル修飾を導入し、共通配列ＧＧＧＧにおける２番目のＧ以外のＧに２’−Ｏ−メチル修飾を導入した配列
ｉｄＴ−Ａ（ＰＨＥ）Ｕ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｕ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｃ（Ｆ）Ａ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）ＡＡＣ（Ｍ）Ｕ（Ｆ）Ａ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｕ（Ｆ）Ｕ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）ＧＧ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）ＴＧ（Ｍ）ＴＣ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ａ（Ｍ）−ｉｄＴ【０２４４】
配列番号３３（５）
配列番号３３で表される配列の５’末端及び３’末端にｉｄＴ修飾を導入し、共通配列以外の配列のうち１６箇所に２’−Ｏ−メチル修飾を導入し、１箇所に８−（Ｐｒｏｐｙｌ）ｐｈｅｎｙｌ−ｒＡ（ｎ−ｂｚ）−２’−ｔＢＤＭＳ  ａｍｉｄｉｔｅ修飾を導入し、共通配列ＵＡＡＣにおけるＵ及びＣに２’−Ｏ−メチル修飾を導入し、共通配列ＧＧＧＧにおける２番目のＧ以外のＧに２’−Ｏ−メチル修飾を導入した配列
ｉｄＴ−Ａ（ＰＨＥ）Ｕ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｕ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｃ（Ｆ）Ａ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）ＡＡＣ（Ｍ）Ｕ（Ｆ）Ａ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｕ（Ｆ）Ｕ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）ＧＧ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）ＴＧ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ａ（Ｍ）−ｉｄＴ【０２４５】
配列番号３３（６）
配列番号３３で表される配列の５’末端及び３’末端にｉｄＴ修飾を導入し、共通配列以外の配列のうち１８箇所に２’−Ｏ−メチル修飾を導入し、共通配列ＵＡＡＣにおけるＵ及びＣに２’−Ｏ−メチル修飾を導入し、共通配列ＧＧＧＧにおける２番目のＧ以外のＧに２’−Ｏ−メチル修飾を導入した配列
ｉｄＴ−Ａ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｕ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｃ（Ｆ）Ａ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）ＡＡＣ（Ｍ）Ｕ（Ｆ）Ａ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）ＧＧ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）ＴＧ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ａ（Ｍ）−ｉｄＴ【０２４６】
配列番号３３（７）
配列番号３３で表される配列の５’末端及び３’末端にｉｄＴ修飾を導入し、共通配列以外の配列のうち１９箇所に２’−Ｏ−メチル修飾を導入し、共通配列ＵＡＡＣにおける２番目のＡ以外に２’−Ｏ−メチル修飾を導入し、共通配列ＧＧＧＧにおける２番目のＧ以外のＧに２’−Ｏ−メチル修飾を導入した配列
ｉｄＴ−Ａ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｕ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ａ（Ｍ）ＡＣ（Ｍ）Ｕ（Ｆ）Ａ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）ＧＧ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）ＴＧ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ａ（Ｍ）−ｉｄＴ【０２４７】
配列番号３３（８）
配列番号３３で表される配列の５’末端及び３’末端にｉｄＴ修飾を導入し、共通配列以外の配列のうち１９箇所に２’−Ｏ−メチル修飾を導入し、共通配列ＵＡＡＣにおける１番目のＡ以外に２’−Ｏ−メチル修飾を導入し、共通配列ＧＧＧＧにおける２番目のＧ以外のＧに２’−Ｏ−メチル修飾を導入した配列
ｉｄＴ−Ａ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｕ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）ＡＡ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ｕ（Ｆ）Ａ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）ＧＧ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）ＴＧ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ａ（Ｍ）−ｉｄＴ【０２４８】
配列番号３３（９）
配列番号３３で表される配列の５’末端及び３’末端にｉｄＴ修飾を導入し、共通配列以外の配列のうち１９箇所に２’−Ｏ−メチル修飾を導入し、共通配列ＵＡＡＣにおけるＵ及びＣに２’−Ｏ−メチル修飾を導入し、共通配列ＧＧＧＧに２’−Ｏ−メチル修飾を導入した配列
ｉｄＴ−Ａ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｕ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）ＡＡＣ（Ｍ）Ｕ（Ｆ）Ａ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）ｔＧ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ａ（Ｍ）−ｉｄＴ【０２４９】
配列番号３３（１０）
配列番号３３で表される配列の５’末端及び３’末端にｉｄＴ修飾を導入し、共通配列以外の配列のうち１９箇所に２’−Ｏ−メチル修飾を導入し、共通配列ＵＡＡＣにおけるＵ及びＣに２’−Ｏ−メチル修飾を導入し、共通配列ＧＧＧＧにおける２番目のＧ以外のＧに２’−Ｏ−メチル修飾を導入した配列
ｉｄＴ−Ａ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｕ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）ＡＡＣ（Ｍ）ＴＡ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）ＧＧ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）ＴＧ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ａ（Ｍ）−ｉｄＴ【０２５０】
配列番号３３（１１）
配列番号３３で表される配列の５’末端及び３’末端にｉｄＴ修飾を導入し、共通配列以外の配列のうち１８箇所に２’−Ｏ−メチル修飾を導入し、共通配列ＵＡＡＣにおけるＵ及びＣに２’−Ｏ−メチル修飾を導入し、共通配列ＧＧＧＧにおける２番目のＧ以外のＧに２’−Ｏ−メチル修飾を導入した配列
ｉｄＴ−Ａ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｕ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）ＡＡＣ（Ｍ）Ｕ（Ｆ）Ａ（Ｍ）Ａ（Ｍ）ＴＵ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）ＧＧ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）ＴＧ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ａ（Ｍ）−ｉｄＴ【０２５１】
配列番号３３（１２）
配列番号３３で表される配列の５’末端及び３’末端にｉｄＴ修飾を導入し、共通配列以外の配列のうち１８箇所に２’−Ｏ−メチル修飾を導入し、共通配列ＵＡＡＣにおけるＵ及びＣに２’−Ｏ−メチル修飾を導入し、共通配列ＧＧＧＧにおける２番目のＧ以外のＧに２’−Ｏ−メチル修飾を導入した配列
ｉｄＴ−Ａ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｕ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）ＡＡＣ（Ｍ）Ｕ（Ｆ）Ａ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）ＴＡ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）ＧＧ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）ＴＧ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ａ（Ｍ）−ｉｄＴ【０２５２】
配列番号３３（１３）
配列番号３３で表される配列の５’末端及び３’末端にｉｄＴ修飾を導入し、共通配列以外の配列のうち２０箇所に２’−Ｏ−メチル修飾を導入し、共通配列ＵＡＡＣにおけるＵ及びＣに２’−Ｏ−メチル修飾を導入し、共通配列ＧＧＧＧにおける２番目のＧ以外のＧに２’−Ｏ−メチル修飾を導入した配列
ｉｄＴ−Ａ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｕ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）ＡＡＣ（Ｍ）Ｔ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）ＧＧ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）ＴＧ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ａ（Ｍ）−ｉｄＴ【０２５３】
配列番号３３（１４）
配列番号３３で表される配列の５’末端及び３’末端にｉｄＴ修飾を導入し、共通配列以外の配列のうち１９箇所に２’−Ｏ−メチル修飾を導入し、共通配列ＵＡＡＣにおけるＵ及びＣに２’−Ｏ−メチル修飾を導入し、共通配列ＧＧＧＧにおける２番目のＧ以外のＧに２’−Ｏ−メチル修飾を導入した配列
ｉｄＴ−Ａ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｕ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）ＡＡＣ（Ｍ）Ｕ（Ｆ）Ａ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｔ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）ＧＧ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）ＴＧ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ａ（Ｍ）−ｉｄＴ【０２５４】
配列番号３３（１５）
配列番号３３で表される配列の５’末端及び３’末端にｉｄＴ修飾を導入し、共通配列以外の配列のうち１９箇所に２’−Ｏ−メチル修飾を導入し、共通配列ＵＡＡＣにおけるＵ及びＣに２’−Ｏ−メチル修飾を導入し、共通配列ＧＧＧＧにおける２番目のＧ以外のＧに２’−Ｏ−メチル修飾を導入した配列
ｉｄＴ−Ａ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｕ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）ＡＡＣ（Ｍ）Ｕ（Ｆ）Ａ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ｔ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）ＧＧ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）ＴＧ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ａ（Ｍ）−ｉｄＴ【０２５５】
配列番号３３（１６）
配列番号３３で表される配列の５’末端及び３’末端にｉｄＴ修飾を導入し、共通配列以外の配列のうち２０箇所に２’−Ｏ−メチル修飾を導入し、共通配列ＵＡＡＣにおけるＵ及びＣに２’−Ｏ−メチル修飾を導入し、共通配列ＧＧＧＧにおける２番目のＧ以外のＧに２’−Ｏ−メチル修飾を導入した配列
ｉｄＴ−Ａ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｕ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）ＡＡＣ（Ｍ）Ｕ（Ｆ）Ａ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）ＧＧ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｔ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ａ（Ｍ）−ｉｄＴ【０２５６】
配列番号３３（１７）
配列番号３３で表される配列の５’末端及び３’末端にｉｄＴ修飾を導入し、共通配列以外の配列のうち１８箇所に２’−Ｏ−メチル修飾を導入し、1箇所に８−（Ｐｒｏｐｙｌ）ｐｈｅｎｙｌ−ｒＡ（ｎ−ｂｚ）−２’−ｔＢＤＭＳ  ａｍｉｄｉｔｅ修飾を導入し、共通配列ＵＡＡＣにおけるＵ及びＣに２’−Ｏ−メチル修飾を導入し、共通配列ＧＧＧＧにおける２番目のＧ以外のＧに２’−Ｏ−メチル修飾を導入した配列
ｉｄＴ−Ａ（ＰＨＥ）Ｕ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｕ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）ＡＡＣ（Ｍ）Ｕ（Ｆ）Ａ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）ＧＧ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）ＴＧ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ａ（Ｍ）−ｉｄＴ【０２５７】
配列番号３３（１８）
配列番号３３で表される配列の５’末端に４０ｋＤａの分岐型ポリエチレングリコール修飾を導入し、３’末端にｉｄＴ修飾を導入し、共通配列以外の配列のうち１８箇所に２’−Ｏ−メチル修飾を導入し、共通配列ＵＡＡＣにおけるＵ及びＣに２’−Ｏ−メチル修飾を導入し、共通配列ＧＧＧＧにおける２番目のＧ以外のＧに２’−Ｏ−メチル修飾を導入した配列
ＰＥＧ−Ａ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｕ（Ｆ）Ｃ（Ｆ）Ｇ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）ＡＡＣ（Ｍ）Ｕ（Ｆ）Ａ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）ＴＡ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）ＧＧ（Ｍ）Ｇ（Ｍ）ＴＧ（Ｍ）Ｕ（Ｍ）Ｃ（Ｍ）Ａ（Ｍ）Ａ（Ｍ）−ｉｄＴ【０２５８】
配列番号３３（１）〜３３（１８）の核酸は全て化学合成により作製した。そしてこれらの配列で表されるアプタマーについて、実施例１で示したアンジオテンシンＩを基質として用いた場合のキマーゼに対する阻害活性評価方法と同様の方法を用いて測定した。結果を表６に示す。表中、ＩＣ５０の値は２〜３回測定の平均値を示す。【０２５９】
【表６】
2019107532.tif 000020
【０２６０】
表６に示されるように、改変体の多くはキマーゼに対する阻害活性を示した。特に０．０００１μＭ以下のＩＣ５０値を示したアプタマーは非常に優れた阻害効果を示したと言える。以上のことから、配列番号３３で表される配列に様々な修飾を施したアプタマーは安定性を向上させるため、本発明のアプタマーは、活性を有する限り少なくとも一つのヌクレオチドに修飾を導入したものであってもよいことがわかった。ヌクレオチドの修飾としては、２’−Ｏ−メチル修飾以外にも、例えば２’−アミノ修飾などが挙げられる。【０２６１】
共通配列に含まれるヌクレオチドに関しては、配列番号３３（９）のように共通配列におけるＧＧＧＧの２番目のＧを２’−Ｏ−メチル修飾すると、アプタマーとして十分な活性を有するものの、配列番号３３で表される配列を有する他のアプタマー改変体と比較して活性が低下することが分かった。一方で、例えば配列番号３３（１２）のように修飾しても活性に影響しなかった。【０２６２】
配列番号３３（１８）の結果より、ＰＥＧ結合アプタマーの活性はＰＥＧが結合していないアプタマー（配列番号３３（１２））と比較しても、一定の活性が維持されていた。ＰＥＧを結合することでｉｎ  ｖｉｖｏでの薬物体内動態が大きく改善されるので、この結果よりｉｎ  ｖｉｖｏで効果を示すことが期待できる。【０２６３】
以上の結果より、表６に含まれる、共通配列におけるＧＧＧＧの２番目のＧを２’−Ｏ−メチル修飾した核酸以外のすべての核酸は、天然の基質であるアンジオテンシンＩを用いた場合でもキマーゼに対する極めて強い阻害活性を有するため、アンジオテンシンが関与する各種疾患の予防および／または治療薬として期待される。
【産業上の利用可能性】
【０２６４】
本発明のアプタマーは、線維症などのＴＧＦ−βの活性化が関与する各種疾患の予防および／または治療用医薬、診断薬または標識剤として有用であり得る。【０２６５】
本出願は、日本で出願された特願２０１７−２３０５０３（出願日：２０１７年１１月３０日）を基礎としており、その内容は本明細書に全て包含されるものである。
【図１】
2019107532.tif 000024
【図２】
2019107532.tif 000025
【図３】
2019107532.tif 000026
【図４】
2019107532.tif 000027
【図５】
2019107532.tif 000028
【図６】
2019107532.tif 000029
【図７】
2019107532.tif 000030
【配列表】
2019107532000001.app
【国際調査報告】
2019107532.tif 000031
2019107532.tif 000032
2019107532.tif 000033
2019107532.tif 000034
2019107532.tif 000035
2019107532.tif 000036
2019107532.tif 000037
2019107532.tif 000038