(57)【要約】  本発明は、ウリ科植物にて発生する植物ウイルス由来の植物病を防除できる、新規なキュウリモザイクウイルス弱毒株、前記ＣＭＶ弱毒株を含有するウリ科植物用のモザイク病抵抗性誘導剤、前記ＣＭＶ弱毒株を用いたウリ科植物のモザイク病防除方法およびウリ科植物に関する。具体的には、２ｂタンパク質をコードする配列番号１に示されるＲＮＡの５’側から２７９番目〜２８２番目の塩基配列から１または２個の塩基が欠失されているＲＮＡまたは前記２７９番目〜２８２番目の塩基配列中に１または２個の塩基が挿入されているＲＮＡをゲノム中に有するキュウリモザイクウイルス弱毒株に関し、このキュウリモザイクウイルス弱毒株は、２ｂタンパク質をコードするＲＮＡが配列番号２に示される塩基配列または配列番号３に示されるアミノ酸配列からなる２ｂタンパク質を有する。
2020009012.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
２ｂタンパク質をコードする配列番号１に示されるＲＮＡの５’側から２７９番目〜２８２番目の塩基配列から１または２個の塩基が欠失されているＲＮＡまたは前記２７９番目〜２８２番目の塩基配列中に１または２個の塩基が挿入されているＲＮＡをゲノム中に有するキュウリモザイクウイルス弱毒株。
【請求項２】
２ｂタンパク質をコードするＲＮＡが配列番号２に示される塩基配列を含む、請求項１に記載のキュウリモザイクウイルス弱毒株。
【請求項３】
配列番号３に示されるアミノ酸配列からなる２ｂタンパク質を有する、請求項１または２に記載のキュウリモザイクウイルス弱毒株。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれかに記載のキュウリモザイクウイルス弱毒株を有効成分として含有する、ウリ科植物用のモザイク病抵抗性誘導剤。
【請求項５】
さらにヘルパーコンポーネントプロテアーゼをコードする配列番号４に示されるＲＮＡをゲノム中に有するスイカモザイクウイルス弱毒株を含む、請求項４に記載のウリ科植物用のモザイク病抵抗性誘導剤。
【請求項６】
前記スイカモザイクウイルス弱毒株が配列番号５に示されるアミノ酸配列からなるヘルパーコンポーネントプロテアーゼを有する、請求項５に記載のウリ科植物用のモザイク病抵抗性誘導剤。
【請求項７】
請求項１〜３のいずれかに記載のキュウリモザイクウイルス弱毒株をウリ科植物に接種することを特徴とする、ウリ科植物のモザイク病防除方法。
【請求項８】
さらにヘルパーコンポーネントプロテアーゼをコードする配列番号４に示されるＲＮＡをゲノム中に有するスイカモザイクウイルス弱毒株をウリ科植物に接種する、請求項７に記載のウリ科植物のモザイク病防除方法。
【請求項９】
前記スイカモザイクウイルス弱毒株が配列番号５に示されるアミノ酸配列からなるヘルパーコンポーネントプロテアーゼを有する、請求項７または８に記載のウリ科植物のモザイク病防除方法。
【請求項１０】
請求項１〜３のいずれかに記載のキュウリモザイクウイルス弱毒株が接種された、モザイク病抵抗性を有するウリ科植物。
【請求項１１】
さらにヘルパーコンポーネントプロテアーゼをコードする配列番号４に示されるＲＮＡをゲノム中に有するスイカモザイクウイルス弱毒株が接種された、請求項１０に記載のウリ科植物。
【請求項１２】
前記スイカモザイクウイルス弱毒株が配列番号５に示されるアミノ酸配列からなるヘルパーコンポーネントプロテアーゼを有する、請求項１１に記載のウリ科植物。
【請求項１３】
モザイクウイルス弱毒株の抽出方法であって、モザイクウイルス弱毒株感染葉からのポリ（オキシエチレン）オクチルフェニルエーテルを含むノニオン系界面活性剤添加抽出バッファーを用いるモザイクウイルス弱毒株の抽出方法。
【請求項１４】
前記抽出方法が、モザイクウイルス弱毒株感染葉の磨砕物の遠沈後の上清と、沈査からの前記ノニオン系界面活性剤添加抽出バッファーを用いる抽出物との混液、または前記ノニオン系界面活性剤添加抽出バッファーを用いる磨砕物の遠沈上清である、請求項１３に記載の抽出方法。
【請求項１５】
前記モザイクウイルスがキュウリモザイクウイルスまたはスイカモザイクウイルスである請求項１３または１４に記載の抽出方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、植物ウイルスの感染を予防する新規のキュウリモザイクウイルス弱毒株に関する。また、本発明は、前記キュウリモザイクウイルス弱毒株を含有するウリ科植物用のモザイク病抵抗性誘導剤、前記キュウリモザイクウイルス弱毒株を用いたウリ科植物のモザイク病防除方法およびモザイク病抵抗性ウリ科植物に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来、野外で栽培している野菜などの作物に見られる植物病は、虫により媒介される植物ウイルスの感染が一因であることが知られている。【０００３】
例えば、ウリ科植物に見られるモザイク病では、アブラムシなどがウリ科植物から吸汁した際にキュウリモザイクウイルス（ｃｕｃｕｍｂｅｒ ｍｏｓａｉｃ ｖｉｒｕｓ:ＣＭＶ）、スイカモザイクウイルス（ｗａｔｅｒｍｅｌｏｎ ｍｏｓａｉｃ ｖｉｒｕｓ：ＷＭＶ）などの植物ウイルスに感染することにより、この植物に葉と果実が輪点、モザイクまたは奇形を形成し、植物体では萎凋などが生じることが知られている。【０００４】
キュウリモザイクウイルス（ＣＭＶ）は、世界各地で発生する非常に宿主範囲が広い植物ウイルスの１つで、１０００種以上の植物に感染する。ＣＭＶは、ブロモウイルス（Bromoviridae）科ククモウイルス（Cucumovirus）属に属する、直径約３０ｎｍの球状ウイルスである。ウイルスゲノムは３分節の１本鎖の（＋）鎖ＲＮＡで、それぞれＲＮＡ１、ＲＮＡ２またはＲＮＡ３とされている。ＲＮＡ１は１ａタンパク質を、ＲＮＡ２は２ａタンパク質とサブゲノムＲＮＡの４Ａから翻訳される２ｂタンパク質を、ＲＮＡ３は３ａタンパク質とサブゲノムＲＮＡの４から翻訳される外被タンパク質（coat protein：CP、構造タンパク質）をコードしている。ＣＭＶの２ｂタンパク質は、キュウリやタバコにおける全身感染や細胞内分布、各植物における病原性に重要な多機能因子として同定されている。【０００５】
ところで、植物は自身に不要となる２本鎖ＲＮＡを分解するＲＮＡサイレンシングを備えており、これが植物ウイルスに対する防御機構として活用されている。しかしながら、ＣＭＶが持つ２ｂタンパク質は、植物ウイルスを標的としたＲＮＡサイレンシングによる分解を回避するための抑制因子（サプレッサー）として機能しているため、ＣＭＶが感染を成立させ作物はウイルス病を発症すると考えられる。【０００６】
また、スイカモザイクウイルス（ＷＭＶ）が属するポティウイルス（Potyviridae）科ポティウイルス（Potyvirus）属のウイルスは、個々の宿主範囲は非常に狭いが、世界各地で様々な植物から分離されている。ＷＭＶは世界各地のウリ科植物の他、マメ科など２３科の植物に感染が認められている。ＷＭＶは１２〜１３×７００〜８００ｎｍのひも状で、ウイルスゲノムは１本鎖の（＋）鎖ＲＮＡ（約１０，０００塩基）ウイルスである。まず、１つのポリプロテインが翻訳され、自身が有するプロテアーゼによって１０種のタンパク質が生み出される。ポティウイルスのヘルパーコンポーネントプロテアーゼ（ＨＣ−Ｐｒｏ）はＲＮＡサイレンシングのサプレッサーとして同定されており、ＲＮＡ結合、ウイルス増殖性及び病原性などにも関与している。これらの多機能性は、ＲＮＡサイレンシングを抑制する機能と密接に関与している。【０００７】
従来、前記のような植物ウイルスに対しては、有効な抗ウイルス剤はなかったため、作物の栽培現場では、対処法として、植物ウイルスを作物に伝搬する虫を駆除するために殺虫剤などの化学農薬に依存しているが、このような方法は、化学農薬による環境汚染が懸念されていた。【０００８】
そこで、近年、植物ウイルス病防除法として、弱毒ウイルスの接種による防除技術が注目されている。これは、あるウイルス（１次ウイルス）に感染した植物は近縁のウイルス（２次ウイルス）には感染しないという干渉効果を利用した防除方法である。つまり、病原性の非常に弱い弱毒株を１次ウイルスとして接種しておくと、病原性の強い強毒株による２次感染を阻止できるという、いわばワクチンのような作用である。【０００９】
本件出願人も、以前に、弱毒ズッキーニ黄斑モザイクウイルス（ＺＹＭＶ）を用いたウイルス病防除作用を有する弱毒ズッキーニ黄斑モザイクウイルス（特許文献１）を開発している。近年でも本発明者らは植物ワクチン接種が可能な植物苗の固定化装置や植物ワクチン接種方法を開発している（特許文献２）。【００１０】
また、他の弱毒化ウイルスとしては、サテライトＲＮＡにより弱毒化されたキュウリモザイクウイルス（ＣＭＶ）が知られており、トマト、ピーマン及びリンドウなどで利用されている。サテライトＲＮＡという短いＲＮＡは、ＣＭＶに寄生してそのゲノムＲＮＡの増殖を抑える作用に関連し、これによりＣＭＶが弱毒化されていることが報告されている（非特許文献１）。【００１１】
しかしながら、ウリ科植物での実用的な弱毒ウイルス株はこれまで知られていない。
例えば、キュウリなどのウリ科露地産地では、ＣＭＶやＷＭＶの慢性的な甚発生、さらにはＣＭＶとＷＭＶとの重複感染による病徴激化が多数報告されており、その被害は甚大となっている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１２】
【特許文献１】特許第４０４５３５８号公報
【特許文献２】特許第５９３８７９８号公報
【非特許文献】
【００１３】
【非特許文献１】佐山春樹、「植物ワクチン」、化学と生物41（7）（2003）454〜459頁）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
本発明は、ウリ科植物にて発生する植物ウイルス由来の植物病を防除できる、新規なキュウリモザイクウイルス（ＣＭＶ）弱毒株を提供することを目的とする。
また、本発明は、前記ＣＭＶ弱毒株を含有するウリ科植物用のモザイク病抵抗性誘導剤、前記ＣＭＶ弱毒株を用いたウリ科植物のモザイク病防除方法およびウリ科植物を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
本発明者らは、前記課題を解決すべく鋭意検討した結果、キュウリ圃場からＣＭＶ強毒株を分離し、弱毒化を繰り返すことで、キュウリなどのウリ科植物に対する病原性が極めて低いＣＭＶ弱毒株を作出すること成功し、しかもこのＣＭＶ弱毒株をウリ科植物に接種することで、モザイク病抵抗性をウリ科植物に誘導できることを初めて見出した。
本発明は、上記の知見に基づいて本発明者らが完成させたものである。【００１６】
すなわち、本発明の要旨は、
〔１〕２ｂタンパク質をコードする配列番号１に示されるＲＮＡの５’側から２７９番目〜２８２番目の塩基配列から１または２個の塩基が欠失されているＲＮＡまたは前記２７９番目〜２８２番目の塩基配列中に１または２個の塩基が挿入されているＲＮＡをゲノム中に有するキュウリモザイクウイルス弱毒株、
〔２〕２ｂタンパク質をコードするＲＮＡが配列番号２に示される塩基配列を含む、前記〔１〕に記載のキュウリモザイクウイルス弱毒株、
〔３〕配列番号３に示されるアミノ酸配列からなる２ｂタンパク質を有する、前記〔１〕または〔２〕に記載のキュウリモザイクウイルス弱毒株、
〔４〕前記〔１〕〜〔３〕のいずれかに記載のキュウリモザイクウイルス弱毒株を有効成分として含有する、ウリ科植物用のモザイク病抵抗性誘導剤、
〔５〕さらにヘルパーコンポーネントプロテアーゼをコードする配列番号４に示されるＲＮＡをゲノム中に有するスイカモザイクウイルス弱毒株を含む、前記〔４〕に記載のウリ科植物用のモザイク病抵抗性誘導剤、
〔６〕前記スイカモザイクウイルス弱毒株が配列番号５に示されるアミノ酸配列からなるヘルパーコンポーネントプロテアーゼを有する、前記〔５〕に記載のウリ科植物用のモザイク病抵抗性誘導剤、
〔７〕前記〔１〕〜〔３〕のいずれかに記載のキュウリモザイクウイルス弱毒株をウリ科植物に接種することを特徴とする、ウリ科植物のモザイク病防除方法、
〔８〕さらにヘルパーコンポーネントプロテアーゼをコードする配列番号４に示されるＲＮＡをゲノム中に有するスイカモザイクウイルス弱毒株をウリ科植物に接種する、前記〔７〕に記載のウリ科植物のモザイク病防除方法、
〔９〕前記スイカモザイクウイルス弱毒株が配列番号５に示されるアミノ酸配列からなるヘルパーコンポーネントプロテアーゼを有する、前記〔７〕または〔８〕に記載のウリ科植物のモザイク病防除方法、
〔１０〕前記〔１〕〜〔３〕のいずれかに記載のキュウリモザイクウイルス弱毒株が接種された、モザイク病抵抗性を有するウリ科植物、
〔１１〕さらにヘルパーコンポーネントプロテアーゼをコードする配列番号４に示されるＲＮＡをゲノム中に有するスイカモザイクウイルス弱毒株が接種された、前記〔１０〕に記載のウリ科植物、
〔１２〕前記スイカモザイクウイルス弱毒株が配列番号５に示されるアミノ酸配列からなるヘルパーコンポーネントプロテアーゼを有する、前記〔１１〕に記載のウリ科植物、
〔１３〕モザイクウイルス弱毒株の抽出方法であって、モザイクウイルス弱毒株感染葉からのポリ（オキシエチレン）オクチルフェニルエーテルを含むノニオン系界面活性剤添加抽出バッファーを用いるモザイクウイルス弱毒株の抽出方法、
〔１４〕前記抽出方法が、モザイクウイルス弱毒株感染葉の磨砕物の遠沈後の上清と、沈査からの前記ノニオン系界面活性剤添加抽出バッファーを用いる抽出物との混液、または前記ノニオン系界面活性剤添加抽出バッファーを用いる磨砕物の遠沈上清である、前記〔１３〕に記載の抽出方法、
〔１５〕前記モザイクウイルスがキュウリモザイクウイルスまたはスイカモザイクウイルスである前記〔１３〕または〔１４〕に記載の抽出方法
に関する。
【発明の効果】
【００１７】
本発明のＣＭＶ弱毒株は、遺伝子の塩基配列またはアミノ酸配列において極めて新規性の高いものであり、キュウリのみならずＣＭＶあるいはＷＭＶの被害が大きいウリ科植物に接種することで、モザイク病に対する有効な防除手段となり得る。【００１８】
また、本発明と既に実用化されているＺＹＭＶワクチンなどと合わせれば、アブラムシなどの虫媒介により混発する主要ウイルスを網羅的に防除することが可能となり、作物の生産性の向上、防除コスト・作業の低減・省力化を可能とすることで、野外でウリ科植物を栽培している各産地の持続的発展に貢献し得る。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】図１は、ＣＭＶのゲノム構造を示す概略図である。
【図２】図２は、ＣＭＶ弱毒株であるＣＭ１４株の２ｂタンパク質の塩基配列と強毒株Ｈ２３との比較を示す概略図である。
【図３】図３は、ＣＭＶ弱毒株であるＣＭ１４株の２ｂタンパク質のアミノ酸配列と強毒株Ｈ２３との比較を示す概略図である。
【図４】図４は、ＣＭＶ弱毒株の２ｂタンパク質を示す概略図である。
【図５−１】図５−１〜図５−３は、ＷＭＶ弱毒株であるＷＭ１４株のＨＣ−Ｐｒｏの塩基配列と強毒株ＭＩＹＡとの比較を示す概略図である。
【図５−２】図５−２は、図５−１に続く図である。
【図５−３】図５−３は、図５−２に続く図である。
【図６】図６は、ＷＭＶ弱毒株であるＷＭ１４株のＨＣ−Ｐｒｏのアミノ酸配列と強毒株ＭＩＹＡとの比較を示す概略図である。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
１．キュウリモザイクウイルス（ＣＭＶ）弱毒株
本発明のＣＭＶ弱毒株は、２ｂタンパク質をコードする配列番号１に示されるＲＮＡの５’側から２７９番目〜２８２番目の塩基配列から１または２個の塩基が欠失されているＲＮＡまたは前記２７９番目〜２８２番目の塩基配列中に１または２個の塩基が挿入されているＲＮＡ（以下、弱毒化２ｂＲＮＡともいう）をゲノム中に有することを特徴とする。
【００２１】
配列番号１に示されるＲＮＡは、ＣＭＶ強毒株が有する２ｂタンパク質をコードする塩基配列であり、全長で３３３ｂｐのものである。
【００２２】
本発明のＣＭＶ弱毒株は、前記のような弱毒化２ｂＲＮＡを有することで、配列番号１に示されるＲＮＡの５’側から２７９番目〜２８２番目以降の塩基配列にコードされるアミノ酸配列が改変された弱毒化２ｂタンパク質を産生する。この弱毒化２ｂタンパク質は、正常な２ｂタンパク質と比べて分子量などは類似しているものの、２ｂタンパク質の特に病原性因子としての機能を損なっているために、本発明のＣＭＶ弱毒株を接種したウリ科植物ではモザイク病の病徴を示さない、もしくは、極めて軽微な病徴しか示さないという弱毒性に優れたものである。
また、本発明のＣＭＶ弱毒株が接種されたウリ科植物は、ＣＭＶ弱毒株および／または弱毒化２ｂタンパク質が植物体内に存在するため、ウリ科植物が有する干渉効果の働きにより、野外に存在しているアブラムシから媒介される他のＣＭＶ強毒株の感染に対しても、優れたモザイク病抵抗性を発揮する。
なお、本発明においてモザイク病抵抗性とは、モザイク病の原因となる植物ウイルスがウリ科植物の感染に対して抵抗する性質をいい、具体的には、ＣＭＶ強毒株から攻撃を受けても感染させない、ＣＭＶ強毒株に感染したウリ科植物がモザイク病の病徴を示さない、極めて軽微な病徴しか示さない、もしくは、モザイク病を発病しても生育を抑制させないという性質をいう。
【００２３】
本発明のＣＭＶ弱毒株が有する弱毒化２ｂＲＮＡとしては、前記配列番号１に示されるＲＮＡの塩基配列中、５’側から２７９番目〜２８２番目の４個のチミン（Ｔ）が連続する配列において、１または２個の塩基が欠失されているＲＮＡ、前記２７９番目〜２８２番目の４個のチミンが連続する配列に１または２個の塩基が挿入されているＲＮＡなどが挙げられる。
前記欠失または挿入は、２７９番目〜２８２番目以降の塩基配列から翻訳されるアミノ酸配列が、正常な２ｂタンパク質と異なるようになっていればよく、欠失または挿入される塩基の数や、挿入させる塩基の種類については、特に限定はない。
【００２４】
例えば、前記弱毒化２ｂＲＮＡとしては、配列番号２に示される塩基配列を有するものが挙げられる。
配列番号２は、塩基配列１に示される２ｂタンパク質遺伝子の５’側から２７９番目〜２８２番目の塩基において、強毒株の場合チミン（Ｔ）が４個連続するのに対し、チミン（Ｔ）が３連続になっており、１塩基のチミン（Ｔ）が欠損している塩基配列である。なお、配列番号２では、塩基配列１に示される２ｂタンパク質遺伝子の５’側から３１９番目の塩基に相当するアデニン（Ａ）がチミン（Ｔ）に変換されている。
前記弱毒化２ｂＲＮＡとしては、配列番号２の塩基配列そのものには限られず、前記配列番号２に示す塩基配列と８０％以上の相同性、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上の相同性を有する塩基配列であって、前記弱毒化２ｂＲＮＡと同程度の弱毒性およびモザイク病抵抗性を発現させるＲＮＡも本発明に含まれる。
【００２５】
本発明のＣＭＶ弱毒株は、前記弱毒化２ｂＲＮＡで翻訳することで産生される弱毒化２ｂタンパク質を有する。
弱毒化２ｂタンパク質は、正常な２ｂタンパク質と比べて、分子量などはほぼ同じであり、Ｎ末端から９３番目付近までは相同性の高いアミノ酸配列になっている一方で、９４番目以降のアミノ酸配列が相違したアミノ酸配列となっている。また、弱毒化２ｂタンパク質を構成するアミノ酸の数は、正常な２ｂタンパク質と比べて、１もしくは複数個のアミノ酸配列が欠失もしくは付加されていてもよい。
前記弱毒化２ｂタンパク質としては、例えば、配列番号３に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質が挙げられる。配列番号３に示される弱毒化２ｂタンパク質は、１０６個のアミノ酸からなる配列であり、強毒株であるＨ２３強毒株の２ｂタンパク質のアミノ酸配列（全長１１０個のアミノ酸配列）と比べて、９４番目以降のアミノ酸配列が相違している。
なお、前記配列番号３に示すアミノ酸配列と、８０％以上の相同性、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列であって、前記弱毒化２ｂタンパク質と同程度の弱毒性およびモザイク病抵抗性を奏するタンパク質も本発明に含まれる。
例えば、前記配列番号３に示すアミノ酸配列から、１もしくは複数個のアミノ酸配列が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であってもよい。
【００２６】
前記のような配列番号２に示す弱毒化ＲＮＡを有する本発明のＣＭＶ弱毒株としては、例えば、後述の実施例に記載のＣＭＶ弱毒株であるＣＭ１４株が挙げられる。
前記ＣＭ１４株は、配列番号３に示すアミノ酸配列からなる２ｂタンパク質をコードするＲＮＡをゲノムＲＮＡ中に持つウイルスであり、２ｂタンパク質遺伝子の５‘側から２７９番目〜２８２番目の塩基において、強毒株の場合チミン（Ｔ）が４個連続するのに対し（図４の「強毒株」）、チミン（Ｔ）が３連続のみと１塩基のチミン（Ｔ）が欠損しているという特徴的な塩基配列を有した弱毒株である（図４の「弱毒株」）。
前記ＣＭ１４株では、前記のようにチミン（Ｔ）１塩基が欠損することに伴って、アミノ酸翻訳への読み枠にずれが生じる。つまり、２ｂタンパク質遺伝子の５’側から２８０番目〜２８２番目の塩基以降におけるタンパク質の生合成が、本来の２ｂタンパク質とは異なる特徴を有している。
【００２７】
本発明のＣＭＶ弱毒株の作製は、天然から分離したまたは市販のＣＭＶ強毒株、ＣＭＶ弱毒株に、周知の技術である部位特異的変異誘発法により塩基配列もしくはアミノ酸配列の欠失、置換あるいは付加を導入することで実施することができる。
また、本発明のＣＭＶ弱毒株は、天然に存在するものであっても、遺伝子組み換え技術などにより人為的に弱毒化したものであってもよい。
また、本発明のＣＭＶ弱毒株は、低温処理した植物体からモザイク葉の緑色部を磨砕して分離する手法で作製してもよい。
この手法としては、Kosaka and Fukunishi （1997）Plant disease 81（7）733〜738、Kobori et al. （2005）Plant disease 89（8）879〜882）などに記載の方法が挙げられる。
【００２８】
ここで、アミノ酸が欠失または付加された場合におけるＣＭＶ弱毒株の塩基配列番号の算定は、このような欠失または付加された塩基の数も考慮し、欠失した場合には欠失分だけ番号を増やし、付加された場合には付加分だけ番号を減らして定められる。例えば、配列番号１の塩基配列番号２７９に相当する塩基について、これよりも上流に塩基が２つ付加された場合、対象とする塩基チミン（Ｔ）は実際には２８１番目の塩基であるが、付加された塩基数に相当する２を減じることにより、この２８１番目の塩基を塩基配列番号２７９であるとする。
【００２９】
２．ウリ科植物用のモザイク病抵抗性誘導剤
本発明に係るウリ科植物用のモザイク病抵抗性誘導剤（以下、本発明の誘導剤という）は、前記の本発明のＣＭＶ弱毒株を有効成分として含有するものである。
【００３０】
本発明においてウリ科植物とは、キュウリ、メロン、スイカ、ズッキーニ、トウガン、シロウリ、ヘチマ、ニガウリ、ユウガオなど食用の植物、ラカンカ、カラスウリなどの生薬として用いられる植物などが挙げられるが、特に限定はない。
【００３１】
本発明の誘導剤は、前記のとおり、ウリ科植物に接種させることで、ＣＭＶに対する抵抗性（モザイク病抵抗性）を引き起こす作用を有する。
【００３２】
本発明の誘導剤に含まれる本発明のＣＭＶ弱毒株の量としては、接種されたウリ科植物に所望のモザイク病抵抗性を引き起こすことができる量であればよく、特に限定はない。
【００３３】
また、本発明の誘導剤は、さらにヘルパーコンポーネントプロテアーゼ（ＨＣ−Ｐｒｏ）をコードする配列番号４に示されるＲＮＡをゲノム中に有するスイカモザイクウイルス（ＷＭＶ）弱毒株を含有していてもよい。
【００３４】
前記ＷＭＶ弱毒株とは、ＨＣ−Ｐｒｏをコードする配列番号４に示されるＲＮＡが、選抜元のＷＭＶ強毒株と比べて、ＨＣ−Ｐｒｏ遺伝子の５’側から４３４番目と１０４８番目の塩基配列がチミン（Ｔ）とアデニン（Ａ）に変異しているという特徴的な塩基配列（以下、弱毒化ＨＣ−Ｐｒｏ  ＲＮＡ）に変異した弱毒株である。
前記弱毒化ＨＣ−Ｐｒｏ  ＲＮＡとしては、配列番号４の塩基配列そのものには限られず、前記配列番号４に示す塩基配列と８０％以上の相同性、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上の相同性を有する塩基配列であって、前記弱毒化ＨＣ−Ｐｒｏ  ＲＮＡと同程度の弱毒性を奏するＲＮＡも本発明に含まれる。
【００３５】
また、前記ＷＭＶ弱毒株としては、配列番号５に示されるアミノ酸配列からなるＨＣ−Ｐｒｏを有していてもよい。
前記配列番号５に示されるアミノ酸配列は、前記配列番号４に示される弱毒化ＨＣ−Ｐｒｏ  ＲＮＡでコードされるアミノ酸配列であり、ＷＭＶ強毒株と比べてＨＣ−ＰｒｏのＮ末端から１４５番目と３５０番目のアミノ酸配列がロイシン（Ｌ）とスレオニン（Ｔ）に変異したアミノ酸配列である。前記配列番号５に示されるアミノ酸配列は前記部位が変異していることで、正常な化ＨＣ−Ｐｒｏと比べて、分子量などは同じであるものの、サプレッサーとしての機能を損なっていると推察されるために、前記ＷＭＶ弱毒株を接種したウリ科植物ではモザイク病の病徴を示さない、もしくは、極めて軽微な病徴しか示さないという弱毒性に優れたものであり、また、ウリ科植物が有する干渉効果の働きにより、野外に存在している様々な虫から媒介される他のＷＭＶ強毒株の感染に対しても、優れたモザイク病抵抗性を発揮する。
なお、前記配列番号５に示すアミノ酸配列と、８０％以上の相同性、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上の相同性を有するアミノ酸配列であって、前記弱毒化ＨＣ−Ｐｒｏと同程度の弱毒性およびモザイク病抵抗性を奏するタンパク質も本発明に含まれる。
例えば、前記配列番号５に示すアミノ酸配列から、１もしくは複数個のアミノ酸配列が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であってもよい。
【００３６】
前記ＷＭＶ弱毒株も、前記ＣＭＶ弱毒株と同様にして、天然から分離したまたは市販のＷＭＶ強毒株、ＷＭＶ弱毒株に、周知の技術である部位特異的変異誘発法により塩基配列もしくはアミノ酸配列の欠失、置換あるいは付加を導入することで実施することができる。
また、本発明のＷＭＶ弱毒株は、天然に存在するものであっても、遺伝子組み換え技術などにより人為的に弱毒化したものであってもよい。
また、本発明のＷＭＶ弱毒株は、低温処理した植物体からモザイク葉の緑色部を磨砕して分離する手法で作製してもよい。
この手法としては、Kosaka and Fukunishi （1997）Plant disease 81（7）ｐ733〜738、Kobori et al. （2005）Plant disease 89（8）ｐ879〜882などに記載の方法が挙げられる。
【００３７】
本発明の誘導剤に含まれる本発明のＷＭＶ弱毒株の量としては、接種されたウリ科植物に所望のモザイク病抵抗性を引き起こすことができる量であればよく、特に限定はない。
【００３８】
本発明の誘導剤は、本発明のＣＭＶ弱毒株、さらにはＷＭＶ弱毒株を水、リン酸ナトリウム緩衝液、リン酸カリウム緩衝液またはクエン酸緩衝液などに混合し、必要に応じて、界面活性剤、糖類、キレート剤あるいは還元剤なども混合することで調製することができる。
また、本発明のＣＭＶ弱毒株を接種したウリ科植物の植物体の葉部等の磨砕物から得られる汁液や、この汁液を濃縮または希釈した液体を本発明の誘導剤として用いてもよい。ＣＭＶ弱毒株を接種したウリ科植物の植物体から得られる汁液に、ＷＭＶ弱毒株を接種したウリ科植物の植物体から得られる汁液や、この汁液を濃縮または希釈した液体を混合して本発明の誘導剤としてもよい。
前記磨砕とは、細かく砕き、すり潰すことをいい、例えば、乳鉢、石臼、ホモジナイザー、スーパーブレンダーなどの公知の破砕機に植物体および水などの媒体を供して磨砕処理することで得ることができる。なお、磨砕は、前記植物体に存在するＣＭＶ弱毒株やＷＭＶ弱毒株が抽出できる程度に、植物体が砕かれたり、すり潰されていればよく、特に限定はない。
【００３９】
葉部の磨砕物から汁液を得る際には、抽出液として水、リン酸ナトリウム緩衝液、リン酸カリウム緩衝液またはクエン酸緩衝液等の各種抽出バッファー、各種界面活性剤溶液、ｎ−ブタノール、クロロホルムおよび四塩化炭素等の有機溶剤を単独であるいはこれらの混液として用いてもよい。
界面活性剤としては、カチオン系界面活性剤溶液、アニオン系界面活性剤溶液、ノニオン系界面活性剤溶液が挙げられる。
中でもポリ（オキシエチレン）オクチルフェニルエーテルを含むノニオン系界面活性剤が抽出効率の観点から好ましい。好ましくはＴｒｉｔｏｎ（登録商標） Ｘ-１００が用いられる。
【００４０】
３．ウリ科植物のモザイク病防除方法
本発明のＣＭＶ弱毒株をウリ科植物に接種することで、ウリ科植物のモザイク病を予防（防除）できる。
【００４１】
本発明において、「モザイク病防除」とは、ウリ科植物におけるモザイク病の症状の発生を防ぐ、発病の程度を緩和する、もしくは、症状の発生を遅らせることをいう。
ウリ科植物からモザイク病防除を行うことで、順調な生育を促して、ウリ科植物の収量および商品価値を高めることができる。
【００４２】
また、本発明のＣＭＶ弱毒株に加えて、前記ＷＭＶ弱毒株をウリ科植物に接種することで、ＣＭＶおよびＷＭＶという２種類の植物ウイルスに関連するモザイク病の防除を行うことができる。
【００４３】
前記接種には、ＣＭＶ弱毒株を含有する本発明の誘導剤を用いればよい。また、本発明の誘導剤は、さらに前記ＷＭＶ弱毒株を含有していてもよい。
前記接種の方法としては、例えば、特に限定されることなく、公知の手法を採用することができる。例えば、カーボランダム法による擦り付け接種やスプレーガンやエアブラシなどを用いた高圧噴霧接種が挙げられる。
また、ＷＭＶ弱毒株を用いる場合、接種はＣＭＶ弱毒株、ＷＭＶ弱毒株をそれぞれ単独で接種したり、ＣＭＶ弱毒株またはＷＭＶ弱毒株を混合したのち接種したり、ＣＭＶ弱毒株を接種した後にＷＭＶ弱毒株を接種したり、あるいはＷＭＶ弱毒株を接種した後にＣＭＶ弱毒株を接種することができる。
なお、接種の回数についは、接種するＣＭＶ弱毒株の濃度、ウリ科植物のサイズなどを考慮して決定すればよく、例えば、１回でもよいし、初回の接種後に弱毒株の感染が確認できなかった場合は２回以上でもよい。
【００４４】
４．モザイクウイルス病抵抗性を有するウリ科植物
前記のように、本発明のＣＭＶ弱毒株が接種されたウリ科植物は、ＣＭＶに対するモザイク病抵抗性を有する。
【００４５】
本発明に係るウリ科植物は、植物体中において、本発明のＣＭＶ弱毒株、配列番号４に示されるＲＮＡ、または、配列番号５に示されるアミノ酸配列を含んでいることで、非接種のウリ科植物と区別できる。
【００４６】
本発明のＣＭＶ弱毒株を接種する時期としては、特に限定はない。例えば、育苗の段階でＣＭＶ弱毒株を接種することで、モザイク病抵抗性を有するウリ科植物の苗を作製することができる。また、ＣＭＶ弱毒株を、比較的清浄な環境で生育しているウリ科植物に接種して露地などの圃場に定植したり、販売用に搬出する前に接種することで、不特定の様々な環境下でも安全な生育を図ることもできる。
また、ＣＭＶ弱毒株と同様の方法で、ＷＭＶ弱毒株をさらに接種することで、ウリ科植物のモザイク病抵抗性をさらに向上させることができる。
したがって、モザイク病抵抗性を有するウリ科植物の状態としては、苗および成長した植物体などが含まれるが、限定はない。
【実施例】
【００４７】
以下、実施例を挙げて本発明をより具体的に説明するが、本発明の範囲はこれらに限定されるものではない。【００４８】
実施例１
ＣＭＶ弱毒株ＣＭ１４株の作出
福島県内で栽培された、激しいモザイク症状を引き起こしているキュウリを選択し、ＤＡＳ-ＥＬＩＳＡ法によるＣＭＶ検定及びニコチアナ・ルスチカ（Nicotiana rustica）への接種検定を用いることで、キュウリに激しいモザイク症状を引き起こすＣＭＶの強毒株（以下、「Ｈ２３株」という）を分離した。
次いで、Ｈ２３株をタバコ属のニコチアナ・ルスチカに接種し、これを低温処理とモザイク葉（モザイク症状が目視で確認できる葉）の緑色部を分離する方法に用いた。前記の低温処理と緑色部の分離は、植物体中に存在する植物ウイルスの弱毒株を選抜する手法としては、すでに報告がなされている（Kosaka and Fukunishi （1997）Plant disease 81（7）733〜738、Kobori et al. （2005）Plant disease 89（8）879〜882）。
【００４９】
具体的には、まず、ＣＭＶ強毒株であるＨ２３株を接種したニコチアナ・ルスチカの幼苗を、直ちに１５℃で２ヵ月間人工気象器で育成した（低温処理）。
その後、前記苗のモザイク葉の緑色部を切り出して葉重量の１０〜５０倍量の０．１Ｍリン酸カリウム緩衝液、ｐＨ７．０を加えて磨砕した汁液を接種源とし、別のニコチアナ・ルスチカの幼苗に接種した。ウイルス接種後、２５℃のガラス温室で１１〜２５日間育成した。
その後、育成した各ニコチアナ・ルスチカの病徴調査を行った。症状が軽くなったと思われるニコチアナ・ルスチカからさらに緑色部を切り出して葉重量の１０〜５０倍量の０．１Ｍリン酸カリウム緩衝液、ｐＨ７．０を加えて磨砕した汁液を接種源とし、１５〜１８℃で１４日〜２か月間の低温処理または緑色部の分離を計１０回繰り返すことで、接種しても軽微なモザイク症状にとどまる弱毒株を１株分離した。【００５０】
次いで、前記弱毒株感染葉について葉重量の１０倍量の０．１Ｍリン酸カリウム緩衝液、ｐＨ７．０を加えて磨砕した汁液を接種源としてケノポディウム・キノア（Chenopodium quinoa）に接種した後、２〜３日後の接種葉上にウイルス感染によって生じた多数の局部病斑を１個ずつ切り出して、葉重量の５０倍量の０．１Ｍリン酸カリウム緩衝液、ｐＨ７．０を加えて磨砕した汁液を接種源とし、ニコチアナ・ルスチカの幼苗に接種した（単病斑分離）。この単病斑分離を４回繰り返したところ、キュウリとズッキーニに接種した場合において病徴が軽微なＣＭ１４株を得た。
さらに、キュウリまたはズッキーニの幼苗の子葉に、カーボランダム法によってＨ２３株またはＣＭ１４株のウイルス感染葉の粗汁液を擦り付け接種したところ、Ｈ２３株は激しいモザイク症状を引き起こしたのに対し、ＣＭ１４株はキュウリとズッキーニには一過的な退緑斑のみであった。その結果を表１に示す。【００５１】
【表１】
2020009012.tif 000003
【００５２】
実施例２
ＣＭＶ弱毒株の２ｂタンパク質遺伝子の解析
実施例１で得られたＣＭ１４株の２ｂタンパク質遺伝子を解析し、選抜元であるＨ２３株との相違を検討した。
ＣＭ１４株を感染させたニコチアナ・ルスチカ葉からＲＮＡ抽出を行い、ＲＴ−ＰＣＲ法で２ｂタンパク質遺伝子を合成した。
プライマーはPeR2-2367F：ＴＡＧＴＡＣＡＧＡＧＴＴＣＡＧＡＧＴＴＧＡＧＣＧ（配列番号６）、及びPeR2-2967R：ＧＴＣＣＴＴＣＣＧＡＡＧＡＡＡＣＣＴＡＧＧ（配列番号７）、酵素は「Ｏｎｅｓｔｅｐ ＲＴ−ＰＣＲ ｋｉｔ」（ＱＩＡＧＥＮ社）を使用した。
ＤＮＡの解析はユーロフィンジェノミクス社のＤＮＡシーケンスサービスを利用し、その結果を取りまとめ２ｂタンパク質遺伝子の塩基配列を決定した。
配列番号２、３に塩基配列とアミノ酸配列を、図１にＣＭＶのゲノム構成を、図２に２ｂタンパク質に関する弱毒株と強毒株の塩基配列の比較を、図３に同様にしてアミノ酸配列の比較を、図４に２ｂタンパク質の模式図をそれぞれ示す。【００５３】
実施例３
ＷＭＶ弱毒株ＷＭ１４の作出
宮崎県内で栽培された、モザイク症状を引き起こしているキュウリを選択し、ＤＡＳ-ＥＬＩＳＡ法によるＷＭＶ検定及びカボチャとキュウリへの接種検定を用いることで、キュウリにモザイク症状を引き起こすＷＭＶの強毒株（以下、「ＭＩＹＡ株」という）を分離した。
次いで、ＭＩＹＡ株をカボチャに接種して、これを既述の低温処理とモザイク葉緑色部からウイルスを分離する方法に用いた。さらに、ＷＭＶ弱毒株の選抜では、ｓｉｎｇｌｅ ｐｌａｎｔ ｉｓｏｌａｔｉｏｎ（ＳＰＩ）を組み合わせた。ＳＰＩは感染葉から葉重量に対して１００〜５００倍量の０．１Ｍリン酸カリウム緩衝液、ｐＨ７．０を加えて磨砕した汁液すなわち高希釈倍率液を作製した後、選抜植物に接種する公知の方法である。【００５４】
具体的には、まず、ＷＭＶ強毒株であるＭＩＹＡ株を接種したカボチャ幼苗を、直ちに１５℃で２ヵ月間人工気象器で育成した（低温処理）。
その後、前記苗のモザイク葉の緑色部を切り出して作製した磨砕汁液をＳＰＩの接種源とし、別のカボチャ幼苗に接種した。ウイルス接種後、２５℃のガラス温室で１４〜２1日間育成した。
その後、育成した各カボチャの病徴調査を行った。症状が軽くなったと思われるカボチャからさらに緑色部を切り出して作製した磨砕汁液をＳＰＩの接種源とし、１８〜２０℃で２〜３ヵ月間の低温処理または緑色部の分離及びＳＰＩを計７回繰り返すことで、接種しても軽微なモザイク病の症状にとどまる弱毒株を１株分離した。【００５５】
次いで、前記弱毒株感染葉について葉重量の１０倍量の０．１Ｍリン酸カリウム緩衝液、ｐＨ７．０を加えて磨砕した汁液を接種源としてケノポディウム・ムラーレ（Chenopodium murale）に接種した後、１２〜２６日後の接種葉上にウイルス感染によって生じた多数の局部病斑を１個ずつ切り出して、葉重量の５０倍量の０．１Ｍリン酸カリウム緩衝液、ｐＨ７．０を加えて磨砕した汁液を接種源とし、カボチャ幼苗に接種した。この単病斑分離を７回繰り返したところ、カボチャとズッキーニのいずれに接種した場合においても病徴が軽微なＷＭ１４株を得た。
さらに、キュウリ、ズッキーニまたはカボチャの幼苗の子葉に、カーボランダム法によってＭＩＹＡ株またはＷＭ１４株のウイルス感染葉の粗汁液を擦り付け接種したところ、ＭＩＹＡ株は激しいモザイク症状を引き起こしたのに対し、ＷＭ１４株はキュウリ、ズッキーニまたはカボチャには軽微な退緑斑あるいは極めて軽微なモザイクであった。その結果を表２に示す。【００５６】
【表２】
2020009012.tif 000004
【００５７】
実施例４
ＷＭＶ弱毒株のＨＣ−Ｐｒｏ遺伝子の解析
実施例３で得られたＷＭ１４株のＨＣ−Ｐｒｏ遺伝子を解析し、選抜元であるＭＩＹＡ株との相違を検討した。
ＷＭ１４株を感染させたカボチャ葉からＲＮＡ抽出を行い、ＲＴ−ＰＣＲ法でＨＣ−Ｐｒｏ遺伝子を合成した。
プライマーはWMV-1389F：ＴＧＴＧＣＧＡＧＧＴＡＧＡＧＡＧＡＡＴＧＧ（配列番号８）、及び、WMV-2865R：ＴＴＣＡＣＡＣＴＴＣＡＴＣＣＴＴＴＧＴＴＧ（配列番号９）、酵素は「Ｏｎｅｓｔｅｐ ＲＴ−ＰＣＲ ｋｉｔ」（ＱＩＡＧＥＮ社）を使用した。
ＤＮＡの解析はユーロフィンジェノミクス社のＤＮＡシーケンスサービスを利用し、その結果を取りまとめ、ＨＣ−Ｐｒｏ遺伝子の塩基配列を決定した。配列番号４、５に塩基配列とアミノ酸配列を、図５−１〜図５−３にＨＣ−Ｐｒｏに関する弱毒株と強毒株の塩基配列の比較を、図６に同様にしてアミノ酸配列の比較をそれぞれ示す。【００５８】
実施例５
ＣＭＶとＷＭＶの重複感染による病徴激化は、キュウリなどのウリ科作物でよく知られている。ＣＭＶ弱毒株とＷＭＶ弱毒株をキュウリ苗（品種：エクセレント節成２号）に混合接種したところ、表３に示すように各単独感染と比べて病徴が強まることはなかった。【００５９】
【表３】
2020009012.tif 000005
【００６０】
実施例１、３および５の結果から、ＣＭ１４株は、ウリ科植物に対して単独で接種した場合に弱毒性を示すことに加えて、ＷＭ１４株を併用した場合でも、優れた弱毒性を示すことから、安全性に優れた弱毒株であることがわかる。【００６１】
実施例６
ＣＭ１４株接種により生じるキュウリ苗の干渉効果
ＣＭ１４株及びＷＭ１４株を接種したウリ科植物におけるＣＭＶ強毒株やＷＭＶ強毒株に対する発病抑制の効果、つまり干渉効果を温室内のポット植えのキュウリ苗（品種：おおのぞみ）への接種試験により検証した。
あらかじめＣＭ１４株を感染させたニコチアナ・ルスチカの葉汁液またはＷＭ１４株を感染させたカボチャの葉汁液を単独または混合してカーボランダム法によって試験用キュウリ苗の子葉に擦り付け接種した。
次いで、１８日後にＣＭＶ強毒株であるＨ２３株を感染させたニコチアナ・ルスチカの葉汁液あるいはＷＭＶ強毒株であるＭＩＹＡ株を感染させたカボチャの葉汁液を、試験用キュウリ苗の第１本葉に擦り付け接種した。
その後、試験用キュウリ苗の上位葉に強毒ウイルス特有のモザイク症状が現れるか否かで、干渉効果を判定した。ＣＭＶ強毒株に対する干渉効果を表４に、ＷＭＶ強毒株に対する干渉効果を表５に示す。
その結果、表４に示すように無接種区ではＣＭＶ強毒株接種の１１日後にはすべての試験株で激しいモザイク症状が現れたため、ＣＭＶ強毒株の感染が確認された。
それに対して、ＣＭ１４株単独またはＷＭ１４株との混合接種では、接種３１日後においてもＣＭＶ強毒株の発病株数が１０株中５株あるいは２株と少なく、ＣＭＶ弱毒株であるＣＭ１４株の接種により試験用キュウリ苗に高い干渉効果が生じていること認められた。【００６２】
【表４】
2020009012.tif 000006
【００６３】
ＷＭＶの干渉効果試験では、表５に示すように、無接種区ではＷＭＶ強毒株接種の１１日後にはすべての試験株で激しいモザイク症状が現れたため、ＷＭＶ強毒株の感染が確認された。
それに対して、ＷＭ１４株単独またはＣＭ１４株との混合接種では、接種３１日後においてもＷＭＶ強毒株の発病株数が１０株中３株あるいは２株と少なく、ＷＭＶ弱毒株であるＷＭ１４株の接種により試験用キュウリに高い干渉効果が生じていることが確認された。【００６４】
【表５】
2020009012.tif 000007
【００６５】
実施例７
ＣＭ１４株接種により生じるキュウリ接ぎ木苗における干渉効果
ＣＭ１４株及びＷＭ１４株を接種したウリ科植物におけるＣＭＶ強毒株やＷＭＶ強毒株に対する干渉効果を、温室内のポット植えの接ぎ木キュウリ苗（穂木品種：パイロット２号、台木品種：ＧＴ−ＩＩ）への接種試験により検証した。
あらかじめＣＭ１４株を感染させたニコチアナ・ルスチカの葉汁液及びＷＭ１４株を感染させたカボチャの葉汁液を混合し、カーボランダム法によって試験用接ぎ木キュウリ苗の子葉に擦り付け接種した。
次いで、台木カボチャとの接ぎ木と育苗を実施し、ＣＭ１４株及びＷＭ１４株を接種した１６日後にＣＭＶ強毒株であるＨ２３株を感染させたニコチアナ・ルスチカの葉汁液及びＷＭＶ強毒株であるＭＩＹＡ株を感染させたカボチャの葉汁液の混合液を試験用接ぎ木キュウリ苗の第１本葉に擦り付け接種した。
その後、試験用接ぎ木キュウリ苗の上位葉に強毒ウイルス特有のモザイク病が現れるか否かで、干渉効果を判定した。結果を表６に示す。
その結果、表６に示すように無接種区ではＣＭＶ強毒株及びＷＭＶ強毒株接種の１２日後にはすべての試験株で激しいモザイク病の症状が現れたため、強毒株の感染が確認された。
それに対して、ＣＭ１４株及びＷＭ１４株を接種した試験用接ぎ木キュウリ苗には、モザイク病は認められなかったことから、ＣＭ１４株及びＷＭ１４株の接種により接ぎ木キュウリ苗に非常に高い干渉効果が生じていることが認められた。【００６６】
【表６】
2020009012.tif 000008
【００６７】
実施例８
ビニルハウスにおける弱毒株のモザイク病に対する防除効果
ＣＭ１４株及びＷＭ１４株のモザイク病に対する防除効果を、ビニルハウス圃場にキュウリ苗（品種：エクセレント節成２号）を定植して検証した。
あらかじめＣＭ１４株を感染させたニコチアナ・ルスチカの葉汁液及びＷＭ１４株を感染させたカボチャの葉汁液どうしを混合して、この混合液をカーボランダム法によって試験用キュウリ苗の子葉に擦り付け接種し、本葉が４枚程度になるまで温室内で育成した。
その後、試験用キュウリ苗をビニルハウス圃場に定植して栽培した。
定植２４〜３７日後までにＣＭＶ強毒株であるＨ２３株及びＷＭＶ強毒株であるＭＩＹＡ株が感染したキュウリ苗にアブラムシをのせ、その苗を伝染源として畝間に配置しモザイク病を誘発させた。
その後、強毒株によるモザイク病と萎凋症が現れるか否かで、防除効果を判定した。モザイク病が発生した株の割合を表７に、萎凋症が確認された株の割合を表８に、果実の収量調査の結果を表９に示す。なお、表９に記載の商品果実率は、
(優品果実数＋良品果実数)／全収穫果実数×１００
で計算した。
また発病果実率は、
発病果実数／全収穫果実数×１００
で計算した。【００６８】
表７、８の結果より、定植６０日後において無接種区では、モザイク病が１２株中１０株、萎凋症が１２株中３株で確認されたが、接種区では、モザイク病が１２株中５株と低く推移し、萎凋症はまったく認められなかった。【００６９】
【表７】
2020009012.tif 000009
【００７０】
【表８】
2020009012.tif 000010
【００７１】
また、表９の結果より、無接種区の商品果実率は６０．６％、発病果実率は３５．６％であるのに対し、接種区の商品果実率は９０．７％で発病果実率は８．９％であった。
したがって、ＣＭ１４株およびＷＭ１４株を接種することで、無接種区に対して、商品として使用できる果実数は１．５６倍と顕著に向上し、また、発病果実の数も顕著に低減したことがわかる。この結果から、ＣＭ１４株およびＷＭ１４株は、ウリ科植物の生産性の向上に大きく寄与し、また圃場に定植する前の苗に接種すれば、その後の生育においてもモザイク病を防除できるため、防除を圃場で行うコストや作業の省力化が可能になることがわかる。【００７２】
【表９】
2020009012.tif 000011
【００７３】
実施例９
ＣＭＶ弱毒株の抽出
ＣＭＶ弱毒株の抽出には、あらかじめＣＭ１４株を感染させたニコチアナ・ルスチカ接種葉を−８０℃で凍結保存して使用した。
凍結感染葉を葉重量の３倍量の抽出バッファー（０．１Ｍクエン酸緩衝液、０．０１Ｍエチレンジアミン４酢酸２ナトリウム（以下ＥＤＴＡ）、ｐＨ７．２、０．１％チオグリコール酸ナトリウム）を加えてホモジナイザーで磨砕（１５，０００ｒｐｍ、５分、４℃）した。その後、磨砕汁液に対してクロロホルムを等量加えてさらに磨砕、撹拌した後、遠心分離（７，０００ｒｐｍ、１５分間、４℃）して上清を得た。クロロホルムの代用として、ブタノールを磨砕汁液の５％量加えたもの、あるいは有機溶媒無添加の汁液も同様に遠心分離し上清を得た。各ＣＭ１４株含有上清のウイルス含有量は、以下のようにして測定した。【００７４】
ＣＭＶ弱毒株を感染させた植物感染葉からウイルスを抽出した際、その含有量（濃度）は５０％感染価（ＩＤ５０）を指標として表わすこととした。ウイルスを含有する試料を希釈して植物１株あたり０．３ｍLを接種し、接種した希釈試料ごとの感染率を調べ、ベーレンス・ケルバー法の計算式に各感染率（実測値）を代入して５０％感染価（ＩＤ５０）を求めた（ウイルス実験学総論（改訂二版）  ２３．ウイルス学に必要な数値の扱い方、国立予防衛生研究所学友会編、丸善株式会社発行、１９７３年６月）。
このようにして感染が起こる限界の希釈度を求めた。限界の希釈度とは接種された５０％の個体に感染が認められた希釈倍率（対数）のことで、ウイルス含有量（濃度）はこの時の希釈倍率の逆数で表し、５０％感染価（ＩＤ５０）という単位を用いた。これを試料０．３ｍLあたりのウイルス含有量とした。【００７５】
ベーレンス・ケルバー法の計算式
５０％感染価 (対数の指数)＝χＫ−（ｈ1 ＋ｈ2 ＋…＋ｈＫ−1）×d−０．５×d
χＫ：感染率１００％を示す試料の希釈度（対数指数））
ｈ1 ＋ｈ2 ＋…＋ｈＫ−1：各希釈での感染率の和
０．５：定数
d：希釈間隔の対数指数（１０倍階段希釈の場合d＝１）【００７６】
５０％感染価の計算例
ウイルス含有量を測定したい試料を１０倍段階希釈し、各感染率を表１０とした場合の計算例を以下に示す。表１０の結果をベーレンス・ケルバー法の計算式に入れると、
ＩＤ５０＝−１−(０．８＋０．２＋０)×１−０．５×１＝−(１+１+０．５)=−２．５
すなわち、この試料が５０％感染を示す希釈度は１０−２．５となり、従って、このウイルス液のウイルス含有量（濃度）は希釈度の逆数である、０．３ｍLあたり１０２．５ＩＤ５０となる。言い換えると、この試料は、１０２．５（約３１６）倍希釈した場合に５０％が感染する感染量を有していることになる。【００７７】
【表１０】
2020009012.tif 000012
【００７８】
次に、各ＣＭ１４株含有上清のウイルス含有量を測定するために、０．１Ｍリン酸カリウム緩衝液、ｐＨ７．０で１０倍階段希釈した試料を調整し、各試料の０．３ｍＬを綿棒に吸い込ませてニコチアナ・ルスチカ幼苗へカーボランダム法によって擦り付け接種した。接種は各試料に付き4株に実施した。接種後直ちに接種葉へ散水し、１０，０００〜１８，０００ルックス（１４時間照射）の人工光又は自然光下、 ２０〜３０℃で栽培した。接種１４〜２１日後に病徴を観察し、各試料の感染率を求めた。結果を表１１に示す。【００７９】
【表１１】
2020009012.tif 000013
【００８０】
表１１の結果より、ＣＭ１４株の含有量は有機溶媒無添加の試料が１０２．０ＩＤ５０／０．３ｍLと最も低く、クロロホルムまたは５％ブタノール添加の含有量は１０２．５０ＩＤ５０／０．３ｍLまたは１０２．７５ＩＤ５０／０．３ｍLと高い傾向にあった。【００８１】
実施例１０
ＣＭＶ弱毒株の遠心沈渣からの抽出
実施例９では、ＣＭ１４株の含有量は有機溶媒無添加の遠心上清が１０２．０ＩＤ５０／０．３ｍLと低い値であった。そこで、遠心沈渣からＣＭＶ弱毒株を抽出する条件を検証した。凍結感染葉に実施例９と同じ抽出バッファー（０．１Ｍクエン酸緩衝液、０．０１Ｍ ＥＤＴＡ、ｐＨ７．２、０．１％チオグリコール酸ナトリウム）を葉重量の２．５倍量加えてスーパーブレンダーで磨砕（１５分、４℃）した。その後、遠心分離（７，０００ｒｐｍ、２５分間、４℃）して上清とともに遠心沈渣を得た。この遠心沈渣へ、抽出バッファーを沈渣容量の３倍量加えて再びスーパーブレンダーにて１０分再懸濁し、遠心分離（７，０００ｒｐｍ、２５分間、４℃）して再懸濁上清を得た。この際、抽出バッファーは、Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標） Ｘ-１００無添加、最終濃度０．１２％または０．５％となるように加えた液を使用した。得られた各ＣＭ１４株含有液のウイルス含有量を実施例９と同様にして測定した。【００８２】
結果を表１２に示す。遠心沈渣におけるＣＭ１４株の含有量はＴｒｉｔｏｎ（登録商標） Ｘ-１００無添加では１０２．００ＩＤ５０／０．３ｍL、Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標） Ｘ-１００が０．１２％または０．５％において各々１０３．５０ＩＤ５０／０．３ｍLまたは１０３．２５ＩＤ５０／０．３ｍLであったことから、遠心沈渣にはＣＭ１４株が遠心上清へ浮遊せずに大量に残っていることが明らかになった。また、Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標） Ｘ-１００の添加によって遠心沈渣からＣＭ１４株を高効率で抽出できることが確認された。【００８３】
【表１２】
2020009012.tif 000014
【００８４】
実施例１１：ＣＭＶ弱毒株の高抽出条件の確立
ＣＭＶ弱毒株の抽出効率を高める条件を検証した。凍結感染葉に実施例９と同じ抽出バッファー（０．１Ｍクエン酸緩衝液、０．０１Ｍ ＥＤＴＡ、ｐＨ７．２、０．１％チオグリコール酸ナトリウム）を葉重量の２．５倍量加えてスーパーブレンダーで磨砕（１５分、４℃）した。その後、遠心分離（７，０００ｒｐｍ、２５分間、４℃）して上清（１）と沈渣を得た。上記抽出バッファーにＴｒｉｔｏｎ（登録商標） Ｘ-１００を最終濃度０．５％加え、得られた沈渣へ沈渣容量の３倍量加えて再びスーパーブレンダーにて１０分再懸濁し、遠心分離（７，０００ｒｐｍ、２５分間、４℃）して上清（再懸濁上清（２））を得た。その後、（１）と（２）液を混合した。得られた各ＣＭ１４株含有液のウイルス含有量を実施例９と同様にして測定した。【００８５】
結果を表１３に示す。ＣＭ１４株の含有量は遠心上清が１０２．０ＩＤ５０／０．３ｍLと低い値であったが、再懸濁上清は１０２．７５ＩＤ５０／０．３ｍLと高い値であった。また、遠心上清（１）と得られた沈渣の再懸濁上清（２）の混合液は１０２．５０ＩＤ５０／０．３ｍLと高い値であった。以上のことから、Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標） Ｘ-１００添加による遠心沈渣の再懸濁は、ＣＭ１４株の抽出に有効であることが明らかになった。【００８６】
【表１３】
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【００８７】
Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標） Ｘ-１００添加済の抽出バッファーを使用して、ＣＭ１４株の抽出を試みた。抽出バッファーとして、実施例１０と同じもの（０．１Ｍクエン酸緩衝液、０．０１ＭＥＤＴＡ、ｐＨ７．２、０．１％チオグリコール酸ナトリウム）へＴｒｉｔｏｎ（登録商標） Ｘ-１００が最終濃度０．１２％または０．５％となるように添加したものを感染葉の磨砕に使用した。凍結感染葉にＴｒｉｔｏｎ（登録商標） Ｘ-１００を添加した抽出バッファーを葉重量の２．５倍量加えてスーパーブレンダーで磨砕（１５分、４℃）した。その後、遠心分離（７，０００ｒｐｍ、２５分間、４℃）して上清を得た。得られた各ＣＭ１４株含有液のウイルス含有量を実施例９と同様にして測定した。【００８８】
結果を表１３に示す。ＣＭ１４株の含有量はＴｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ-１００が無添加の遠心上清１０２．０ＩＤ５０／０．３ｍLと比べてＴｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ-１００が０．１２％または０．５％添加とも１０２．７５ＩＤ５０／０．３ｍLと高い値であったことから、Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ-１００を添加した抽出バッファーで感染葉を磨砕することはＣＭ１４株の抽出に有効であることが明らかになった。【００８９】
実施例１２：ＷＭＶ弱毒株の抽出
ＷＭＶ弱毒株の抽出には、あらかじめＷＭ１４株を感染させたカボチャ品種えびす感染葉を−８０℃で凍結保存して使用した。
凍結感染葉を葉重量の２．５倍量の抽出バッファー（０．１Ｍリン酸カリウム緩衝液、０．０１ＭＥＤＴＡ、０．０１Ｍ Ｎ,Ｎ-ジエチルジチオカルバミド酸ナトリウム三水和物（ＤＩＥＣＡ）、ｐＨ７．０、０．１％メルカプトエタノール）を加えてホモジナイザーで磨砕（１５，０００ｒｐｍ、５分、４℃）した。その後、磨砕汁液に対して四塩化炭素を１５容量％加えてさらに磨砕、撹拌した後、遠心分離（７，０００ｒｐm、１５分間、４℃）して上清を得た。有機溶媒無添加の汁液も同様に遠心分離し上清を得た。【００９０】
次に、各ＷＭ１４株含有上清のウイルス含有量を、実施例９と同様にして測定した。０．１Ｍリン酸カリウム緩衝液、０．０１ＭＤＩＥＣＡ、ｐＨ７．０で１０倍階段希釈した試料を調整し、各試料の０．３ｍＬを綿棒に吸い込ませてカボチャ幼苗へカーボランダム法によって擦り付け接種した。接種は各試料に付き４株または８株に実施した。接種後直ちに接種葉へ散水し、自然光下、２０〜３０℃のガラス温室で栽培した。接種１４〜２１日後にカボチャ葉を採取し、ＤＡＳ-ＥＬＩＳＡ法によりＷＭＶの感染を確認した。【００９１】
結果を表１４に示す。四塩化炭素の添加によって遠心上清の清澄化は確認されたものの、ＷＭ１４株の含有量は四塩化炭素の添加・無添加で同量であった。【００９２】
【表１４】
2020009012.tif 000016
【００９３】
実施例１３：ＷＭＶ弱毒株の遠心沈渣からの抽出
実施例１０では、ＣＭ１４株を遠心沈渣から再抽出する際にＴｒｉｔｏｎ（登録商標） Ｘ-１００は有効であることを明らかにした。
そこで、ＷＭ１４株についても、遠心沈渣におけるウイルスの残存とその抽出を試みた。ＷＭＶ弱毒株の抽出には、あらかじめＷＭ１４株を感染させたカボチャ品種えびす感染葉を−８０℃で凍結保存して使用した．
凍結感染葉を葉重量の２．５倍量の抽出バッファー（０．３Ｍリン酸カリウム緩衝液、０．０１Ｍ ＥＤＴＡ、ｐＨ７．５、０．１％メルカプトエタノール）を加えてスーパーブレンダーで磨砕（１５分、４℃）した。その後、遠心分離（７，０００ｒｐｍ、２５分間、４℃）して上清とともに遠心沈渣を得た。この遠心沈渣へ、抽出バッファーを沈渣容量の３倍量加えて再びスーパーブレンダーにて１０分再懸濁し、遠心分離（７，０００ｒｐｍ、２５分間、４℃）して再懸濁上清を得た。この際、抽出バッファーは、Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標） Ｘ-１００無添加、最終濃度０．５容量％となるように加えた液を使用した。得られた各ＷＭ１４株含有液のウイルス含有量は実施例１２と同様にして測定した。【００９４】
結果を表１５に示す。遠心沈渣におけるＷＭ１４株の含有量はＴｒｉｔｏｎ（登録商標） Ｘ-１００無添加では１０２．２５ＩＤ５０／０．３ｍL、Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標） Ｘ-１００が０．５容量％において１０２．７５ＩＤ５０／０．３ｍLであったことから、ＷＭ１４株の遠心沈渣にはＣＭ１４株と同様に遠心上清へ浮遊せずに大量に残っていることが明らかになった。また、Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標） Ｘ-１００の添加によって遠心沈渣からＷＭ１４株を高効率で抽出できることが確認された。【００９５】
【表１５】
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【００９６】
実施例１４：ＷＭＶ弱毒株の高抽出条件の確立
ＷＭＶ弱毒株の抽出効率を高める条件を検証した。凍結感染葉に実施例１３と同じ抽出バッファー（０．３Ｍリン酸カリウム緩衝液、０．０１Ｍ ＥＤＴＡ、ｐＨ７．５、０．１％メルカプトエタノール）を葉重量の２．５倍量加えてスーパーブレンダーで磨砕（１５分、４℃）した。その後、遠心分離（７，０００ｒｐｍ、２５分間、４℃）して上清（１）と沈渣を得た。上記抽出バッファーにＴｒｉｔｏｎ（登録商標） Ｘ-１００を最終濃度０．５％加え、得られた沈渣へ沈渣容量の３倍量加えて再びスーパーブレンダーにて１０分再懸濁し、遠心分離（７，０００ｒｐｍ、２５分間、４℃）して上清（再懸濁上清（２））を得た。その後、（１）と（２）液を混合した。得られた各ＷＭ１４株含有液のウイルス含有量を実施例１２と同様にして測定した。【００９７】
結果を表１６に示す。ＷＭ１４株の含有量は遠心上清が１０２．５ＩＤ５０／０．３ｍLであったが、再懸濁上清は１０２．７５ＩＤ５０／０．３ｍLと高い値であった。また、遠心上清（１）と得られた沈渣の再懸濁上清（２）の混合液は１０２．７５ＩＤ５０／０．３ｍLであった。以上のことから、Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標） Ｘ-１００添加による遠心沈渣の再懸濁は、ＷＭ１４株の抽出に有効であることが明らかになった。【００９８】
【表１６】
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【００９９】
Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標） Ｘ-１００添加済の抽出バッファーを使用して、ＷＭ１４株の抽出を試みた。抽出バッファーとして、実施例１３と同じもの（０．３Ｍリン酸カリウム緩衝液、０．０１Ｍ ＥＤＴＡ、ｐＨ７．５、０．１％メルカプトエタノール）へＴｒｉｔｏｎ（登録商標） Ｘ-１００が最終濃度０．５容量％となるように添加したものを感染葉の磨砕に使用した。凍結感染葉にＴｒｉｔｏｎ（登録商標） Ｘ-１００添加抽出バッファーを葉重量の２．５倍量加えてスーパーブレンダーで磨砕（１５分、４℃）した。その後、遠心分離（７，０００ｒｐｍ、２５分間、４℃）して上清を得た。得られた各ＷＭ１４株含有液のウイルス含有量を実施例１２と同様にして測定した。【０１００】
結果を表１６に示す。ＷＭ１４株の含有量は、Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標） Ｘ-１００が無添加の遠心上清１０２．５０ＩＤ５０／０．３ｍLと比べてＴｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ-１００が０．５容量％添加では１０３．２５ＩＤ５０／０．３ｍLと高い値であったことから、Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標） Ｘ-１００を添加した抽出バッファーで感染葉を磨砕することはＷＭ１４株の抽出に有効であることが明らかになった。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５−１】
2020009012.tif 000023
【図５−２】
2020009012.tif 000024
【図５−３】
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【図６】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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