(57)【要約】  微小３次元環境下で細胞を培養する場合において、細胞外微小環境をより厳密に模擬することを可能にする、細胞培養チップを実現する。  細胞培養チップは、実質的に非多孔質体の材料からなる壁部と、壁部に覆われ、長手方向に延伸する細管状空間からなる培養チャンバとを備え、培養チャンバを前記長手方向に直交する平面で切断したときの形状の内接円が、直径２００μｍ以上５００μｍ以下の範囲である。
2020095852.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
実質的に非多孔質体の材料からなる壁部と、
前記壁部に覆われ、長手方向に延伸する細管状空間からなる培養チャンバとを備え、
前記培養チャンバを前記長手方向に直交する平面で切断したときの形状の内接円が、直径２００μｍ以上５００μｍ以下の範囲であることを特徴とする、細胞培養チップ。
【請求項２】
前記壁部は、吸水率が０．５％以下であることを特徴とする、請求項１に記載の細胞培養チップ。
【請求項３】
前記壁部は、２５℃における酸素透過係数が１０−9ｃｍ3（ＳＴＰ）ｃｍ／（ｃｍ2・ｓｅｃ・ｃｍＨｇ）以下であることを特徴とする、請求項１又は２に記載の細胞培養チップ。
【請求項４】
前記壁部は、光透過性を有する材料からなることを特徴とする、請求項１〜３のいずれか１項に記載の細胞培養チップ。
【請求項５】
前記壁部は、ポリメチルメタクリレート、ポリカーボネート、シクロオレフィンコポリマー、ポリスチレン、及びシクロオレフィンポリマーからなる群より選ばれた１種又は２種以上の樹脂材料からなることを特徴とする、請求項４に記載の細胞培養チップ。
【請求項６】
前記壁部は、２５℃における酸素透過係数が１０-12〜１０-10ｃｍ3（ＳＴＰ）ｃｍ／（ｃｍ2・ｓｅｃ・ｃｍＨｇ）の範囲内であり、シクロオレフィンポリマーからなる樹脂材料からなることを特徴とする、請求項５に記載の細胞培養チップ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞培養チップに関する。
【背景技術】
【０００２】
細胞は、生体・組織内において、（i）成長因子、ビタミン、ガス分子などの可溶性因子、（ii）細胞外マトリックスタンパク、硬さ、圧力などの不可溶性因子、（iii）細胞間相互作用、などで構成される「細胞外微小環境」中に存在する。細胞は、これらの因子が複雑且つ厳密に制御されながら、その機能が制御される。つまり、再生医療、細胞移植治療、薬剤開発などに有望視されているヒト多能性幹細胞（ヒトＥＳ／ｉＰＳ細胞）などの目的細胞の機能を自在に制御するためには、この細胞外微小環境を自在に制御することが必須となる。【０００３】
従来、ヒトＥＳ／ｉＰＳ細胞を含む細胞の培養や実験は、培養ディッシュやプレートを用いた２次元環境下で行われていた（非特許文献１、非特許文献２参照）。しかし、本来、細胞は３次元環境下に置かれており、２次元環境下では本来の機能を発現することができないと考えられる。ヒトＥＳ／ｉＰＳ細胞を用いた組織工学においても、３次元環境を整えることは非常に重要である。【０００４】
また、細胞外微小環境の大きさも非常に重要な因子となる。細胞は、生体内において、マイクロメートル（μｍ）スケールの微小環境下で制御される。しかし、従来の培養方法では、このように微小空間内において因子を制御することが困難であった。更に、これらの因子を網羅的に解析することは、ほぼ不可能であった。このような事情により、従来方法では困難であった、３次元での細胞培養環境を作製する手法が望まれていた。【０００５】
上記の課題を受け、本発明者の一人は、既に、細胞を３次元環境下で培養するのに適したマイクロ流体デバイス及びこれを用いた培養方法を提案している（下記特許文献１参照）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】国際公開第２０１５／１２９６７３号
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】K. Kamei et al.  Lab Chip, 9(4), 555-563 (2009)
【非特許文献２】K. Kamei et al.  Lab Chip, 10(9), 1113-1119 (2010)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、微小３次元環境下で細胞を培養する場合において、細胞外微小環境をより厳密に模擬することを可能にする、細胞培養チップを実現することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明に係る細胞培養チップは、
実質的に非多孔質体の材料からなる壁部と、
前記壁部に覆われ、長手方向に延伸する細管状空間からなる培養チャンバとを備え、
前記培養チャンバを前記長手方向に直交する平面で切断したときの形状の内接円が、直径２００μｍ以上５００μｍ以下の範囲であることを特徴とする。【００１０】
前記細胞培養チップは、長手方向に直交する平面で切断したときの形状の内接円が、直径２００μｍ以上５００μｍ以下の範囲である、極めて細い管状の空間からなる培養チャンバを備える。このため、かかる培養チャンバ内で培養された細胞から放出された生理活性物質は、培養チャンバの周囲を覆う壁部に衝突すると、再び細胞側へと戻される。【００１１】
前記培養チャンバは、いわゆるマイクロ流路を構成する。マイクロ流路を有する培養チップとしては、ＰＤＭＳ（ポリジメチルシロキサン）からなる樹脂で形成されるのが従来、一般的とされていた。その理由は、前記材料が、光透過性や酸素透過性に優れ、成形が容易であるためである。【００１２】
しかし、ＰＤＭＳからなる樹脂は、材料分子間に微小間隙を有するため培養試験液に添加される薬剤を吸収してしまい、正確な薬剤試験濃度の制御が困難である。また、ＰＤＭＳで形成されたマイクロ流路を培養チャンバとした場合、当該培養チャンバ内で培養された細胞から放出された生理活性物質についても、マイクロ流路の壁部内に吸収・吸着されてしまう。この結果、培養細胞を自己に再帰させる作用を十分に機能させることができない。【００１３】
これに対し、前記細胞培養チップによれば、壁部が実質的に非多孔質体の材料で構成されているため、薬剤や生理活性物質が壁部内に吸収されにくい。この結果、薬剤試験濃度の制御が容易化されると共に、細胞自身から放出された生理活性物質を自身に再帰させ、自己作用を生じさせることが可能となる。これにより、生体に近い細胞応答を評価することができる。【００１４】
なお、周囲を壁部で覆われたマイクロ流路によって培養チャンバを構成することで、培養液の液面を下げた場合であっても、培養液が乾燥して培地の濃度が変化するということが起こりにくい。このため、再現性の高い細胞培養が可能となる。【００１５】
前記内接円の直径を５００μｍ以下としたことで、培養チャンバ内で培養している細胞から放出された生理活性物質を、細胞外への拡散を抑制しながら当該細胞に再帰させることが可能となる。また、前記内接円の直径を２００μｍ以上としたことで、細管状空間からなる培養チャンバ内に細胞を容易に配置することが可能となる。例えば、ヒトｉＰＳ細胞の場合、長径が約１０〜２０μｍ程度であるため、このような小型の細胞を培養する際にも、チャンバ内に配置することができる。【００１６】
前記壁部は、好ましくは、吸水率（測定法ＡＳＴＭ  Ｄ５７０、浸漬時間２４ｈｒ）が０．５％以下であり、より好ましくは前記方法による吸水率が０．００１％以上、０．１％以下であり、更に好ましくは０．００１％以上、０．０１％以下である。吸水率が当該範囲であることにより、細胞自身から放出された生理活性物質（例えば、内分泌作用を示すサイトカイン、ホルモン、脂質、細胞外基質、マイクロＲＮＡ、エクソソーム、栄養素、又は薬剤など）を、壁部内での吸収を抑制しながら、細胞側に再帰させることが可能となる。【００１７】
前記壁部は、高いガスバリア性（低い酸素透過性）を有するのが好ましい。より好ましくは、前記壁部は、２５℃における酸素透過係数が１０−9ｃｍ3（ＳＴＰ）ｃｍ／（ｃｍ2・ｓｅｃ・ｃｍＨｇ）以下であり、更に好ましくは前記酸素透過係数が１０−12ｃｍ3（ＳＴＰ）ｃｍ／（ｃｍ2・ｓｅｃ・ｃｍＨｇ）以上、１０−10ｃｍ3（ＳＴＰ）ｃｍ／（ｃｍ2・ｓｅｃ・ｃｍＨｇ）以下である。なお、本明細書において、単位中の「ｃｍ3（ＳＴＰ）」という表記は、標準状態に換算した気体の体積を示す。壁部の酸素透過係数が、当該範囲であることにより、細胞に供給される酸素又は二酸化炭素の濃度を、材料からの自然拡散による非制御下の供給を受けることなく、溶液のみからの供給により高精度に制御することができる。また、上記において、酸素透過係数は、ＪＩＳ Ｋ ７１２６（プラスチック-フィルム及びシート-ガス透過度試験法）に準拠した方法によって行われるものとして構わない。【００１８】
前記壁部は、光透過性を有する材料からなるものとしても構わない。これにより、細胞培養チップの外側から培養チャンバ内で培養されている細胞を視認することができる。【００１９】
前記壁部は、ポリメチルメタクリレート、ポリカーボネート、シクロオレフィンコポリマー、ポリスチレン、及びシクロオレフィンポリマーからなる群より選ばれた１種又は２種以上の樹脂材料からなるものとしても構わない。これにより、射出成形によって製造することができると共に、光透過性に優れ、且つ、非多孔質体の壁部を有する細胞培養チップを実現することができる。【００２０】
なお、前記壁部は、耐水性が高い材料であるのがより好ましい。上述した各樹脂材料は、いずれも耐水性が高いため培養液に含まれる水分で分解されにくい。これにより、細胞を培養している過程において、壁部の表面状態が劣化しにくく、細胞から放出された生理活性物質を吸収しにくい性質が維持される。
【発明の効果】
【００２１】
本発明によれば、細胞外微小環境がより厳密に模擬された３次元環境を構築できる細胞培養チップが実現される。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】細胞培養チップの一実施形態の構造を示す斜視図である。
【図２】図１に示す細胞培養チップを平面αで切断したときの模式的な断面図である。
【図３】図１に示す細胞培養チップ内で細胞を培養している様子を模式的に示す断面図である。
【図４】図１に示す細胞培養チップにおいて、培養チャンバを含む領域を、長手方向に直交する平面で切断したときの模式的な平面図である。
【図５】図３に示す断面図に、寸法の符号を付記した図面である。
【図６】細胞培養チップの培養チャンバ近傍の模式的な拡大断面図である。
【図７】高さの高い培養チャンバ内で細胞を培養した場合の生理活性物質の動きを模式的に示す図面である。
【図８】多孔質体からなる壁部で覆われた培養チャンバ内で細胞を培養した場合の生理活性物質の動きを模式的に示す図面である。
【図９Ａ】構成材料を異ならせて製造された細胞培養チップ内で細胞を培養したときの細胞の死細胞数をグラフ化したものである。
【図９Ｂ】構成材料を異ならせて製造された細胞培養チップ内で細胞を培養したときの写真、及び染色後の写真である。
【図１０】ＰＤＭＳ、ＣＯＰ、ＰＭＭＡ、ＰＳ、及びＰＣからなる各種樹脂のナイルレッドの吸収性を評価した結果をグラフ化したものである。
【図１１】ＰＤＭＳ、ＣＯＰ、ＰＭＭＡ、ＰＳ、及びＰＣからなる各種樹脂のドキソルビシンの吸収性を評価した結果をグラフ化したものである。
【図１２】培養チャンバの高さを変化させて細胞を培養したときの写真である。
【図１３】培養チャンバの高さを変化させて細胞を培養したときの、染色後の死細胞数を比較するための写真である。
【図１４】図１３の結果をグラフ化したものである。
【図１５】培養空間の大きさ、及び／又は培養チャンバの構成材料を変えた細胞培養チップ内で細胞を培養したときの酵素活性を比較した結果を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
本発明に係る細胞培養チップにつき、図面を参照して説明する。なお、以下の各図面はあくまで模式的に図示されたものである。すなわち、図面上の寸法比と実際の寸法比とは必ずしも一致しておらず、また、各図面間においても寸法比は必ずしも一致していない。
【００２４】
［構造］
図１は、細胞培養チップの一実施形態の構造を示す模式的に示す斜視図である。図２は、図１内の平面αで細胞培養チップ１を切断したときの模式的な断面図である。
【００２５】
本実施形態において、細胞培養チップ１は、底部３と本体５とを備える。本体５には、離間した位置に２つの貫通孔が形成されており、これらの貫通孔の一方の面が底部３と接触することで、ウェル２１及びウェル２２が形成されている。また本体５は、底部３側の面に、一対の細管状の凹部を有しており、この凹部と底部３との間の領域によって培養チャンバ１１が形成されている。培養チャンバ１１は、一方の端部がウェル２１に連結され、他方の端部がウェル２２に連結されている。
【００２６】
すなわち、培養チャンバ１１は、本体５の一部と底部３の一部からなる壁部によって周囲が覆われ、ウェル２１からウェル２２に向かう方向ｄ１を長手方向とする細管状空間で構成される（図３参照）。例えば、図３において、ウェル２１から細胞４１を含む培養液４２が注入されることで、培養チャンバ１１内において細胞４１が培養される。
【００２７】
本体５及び底部３は、実施的に非多孔質体の材料で構成される。ここで、「実質的に非多孔質体」であるとは、媒体の見かけ状の表面積が、実際の表面積に近似している状態を指す。より詳細には、本体５及び底部３のうち、少なくとも培養チャンバ１１の壁部を構成する領域のＢＥＴ比表面積が１０ｍ2／ｇ以下である。
【００２８】
上記のような非多孔質体を形成する材料の例としては、ガラスやシリコンなどの無機材料、又はポリメチルメタクリレート（ＰＭＭＡ）、ポリカーボネート（ＰＣ）、シクロオレフィンコポリマー（ＣＯＣ）、シクロオレフィンポリマー（ＣＯＰ）、ポリスチレン（ＰＳ）などの樹脂材料が挙げられる。なお、これらの樹脂材料が２種以上組み合わせられていても構わない。
【００２９】
本体５及び底部３は、好ましくは光透過性を有する材料で構成される。例えば、本体５及び底部３が上記の樹脂材料で構成された場合、細胞４１を細胞培養チップ１の外側から視認することができる。
【００３０】
培養チャンバ１１は、長手方向ｄ１、すなわちウェル２１からウェル２２に向かう方向に直交する平面で切断したときの形状の内接円ｃ１１の直径Ｄ１１が、２００μｍ以上５００μｍ以下の範囲であるような形状を示す（図４参照）。
【００３１】
寸法の一例は以下の通りである（図５参照）。底部３の高さ（厚み）ｗ３は約１ｍｍであり、好ましくは１００μｍ以上、２ｍｍ以下である。ウェル２１の高さｈ２１、及びウェル２２の高さｈ２２は、いずれも約３ｍｍである。培養チャンバ１１の高さ（流路高さ）ｈ１１は、約３００μｍである。ウェル２１及びウェル２２の、底部３の面に平行な方向に係る面（開口面）の大きさは、直径２ｍｍである。培養チャンバ１１の長手方向に係る長さｔ１１は、約５．５ｍｍである。なお、上述したように、培養チャンバ１１の高さｈ１１は、内接円ｃ１１の直径Ｄ１１に対応するため、２００μｍ以上５００μｍ以下である。
【００３２】
図６は、培養チャンバ１１の近傍を模式的に示す拡大図である。本発明の細胞培養チップ１は、培養チャンバ１１の高さｈ１１が、２００μｍ以上５００μｍ以下と極めて細く構成されている。このため、培養チャンバ１１内で培養されている細胞４１から生理活性物質４５が放出された場合、細胞４１から離れた場所まで拡散することなく、培養チャンバ１１の壁部、すなわち本体５の内壁面に衝突する。そして、この壁部は、上述したように、非多孔質体で構成されているため、生理活性物質４５をほとんど吸収することなく、細胞４１側へと戻すことができる。この結果、細胞４１に対する生理活性物質４５の自己作用の影響を正しく評価することができる。
【００３３】
これに対し、例えば図７に示すように、高さの高い培養チャンバ６１内で細胞４１を培養した場合には、細胞４１から放出された生理活性物質４５が、培養チャンバ６１の壁面に衝突するまでに大きく拡散してしまい、細胞４１側に再帰させることのできる量が減少してしまう。また、図８に示すように、高さが十分短い場合であっても、多孔質体で壁部が構成された培養チャンバ６２内で細胞４１が培養される場合には、細胞４１から放出された生理活性物質４５が、培養チャンバ６２の壁部で吸収されてしまい、やはり細胞４１側に再帰させることのできる量が減少してしまう。図７又は図８に示される構成によれば、生理活性物質４５を十分に細胞４１自身に作用させることができないため、生体に近い環境を正しく模擬することができない。
【００３４】
［実施例］
以下、実施例を参照して説明する。
【００３５】
＜検証１Ａ＞
図９Ａは、底部３及び本体５の構成材料を異ならせて同一寸法の細胞培養チップ１を製造し、培養チャンバ１１内で細胞４１を培養した場合の、培養日数ごとの死細胞数をグラフ化したものである。図９Ａにおいて、横軸は培養日数を示し、縦軸は死細胞数を示す。なお、いずれの例においても、培養チャンバ１１の寸法を、４００μｍ×８００μｍ×９ｍｍとした。細胞４１の死細胞数は、細胞を含む培養液とトリパンブルー染色液とを１：１で混和した後、血球計算盤を用いて染色された死細胞数を計測した。
【００３６】
実施例１は、底部３及び本体５の双方をシクロオレフィンポリマー（ＣＯＰ）で形成した場合に対応する。比較例１は、底部３及び本体５の双方をポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）で形成した場合に対応する。
【００３７】
ＣＯＰは、酸素透過係数が１０-12〜１０-10ｃｍ3（ＳＴＰ）ｃｍ／（ｃｍ2・ｓｅｃ・ｃｍＨｇ）程度であり、吸水率が０．０１％程度である。なお、ＪＩＳ Ｋ ７１２６−１（差圧法）に準拠した方法で得られた、室温３７℃におけるＣＯＰの酸素透過係数の実測値は、５．５×１０-11ｃｍ3ｃｍ／（ｃｍ2・ｓｅｃ・ｃｍＨｇ）であった。
【００３８】
また、ＰＤＭＳは、酸素透過係数が１０-8〜１０-7ｃｍ3（ＳＴＰ）ｃｍ／（ｃｍ2・ｓｅｃ・ｃｍＨｇ）程度であり、吸水率が１％程度である。なお、ＪＩＳ Ｋ ７１２６−１（差圧法）に準拠した方法で得られた、室温３７℃におけるＰＤＭＳの酸素透過係数の実測値は、６．４×１０-8ｃｍ3ｃｍ／（ｃｍ2・ｓｅｃ・ｃｍＨｇ）であった。
【００３９】
なお、細胞４１としては、ヒトｉＰＳ細胞が用いられた。
【００４０】
図９Ａによれば、比較例１の場合、実施例１と比較して死細胞数が高いことが確認される。このことから、培養チャンバ１１を取り囲む壁部の材料によって、細胞４１の活性状態への影響が左右されることが分かる。
【００４１】
図９Ａの結果より、周囲の壁部をＣＯＰで形成した培養チャンバ１１を含む実施例１の方が、細胞４１から放出された生理活性物質４５を細胞４１に再作用できていることが分かる。一方、前記壁部をＰＤＭＳで形成した培養チャンバを含む比較例１によれば、細胞４１から放出された生理活性物質４５を十分に細胞４１に戻すことができず、生体環境が構築できていないことが示唆される。
【００４２】
＜検証１Ｂ＞
検証１Ａと同様に、底部３及び本体５の構成材料を異ならせて同一寸法の細胞培養チップ１を製造し（実施例１、比較例１）、培養チャンバ１１内で細胞４１を培養した。図９Ｂは、このときの培養状態を示す写真である。なお、図９Ｂに示す写真は、５日間培養されたときの状態を示している。なお、図９Ｂには、死細胞を目立たせる目的で、培養チャンバ１１内を染色した後の写真も併せて表示されている。
【００４３】
なお、検証１Ｂにおいても、実施例１、及び比較例１における各培養チャンバ１１の寸法は、４００μｍ×８００μｍ×９ｍｍとした。染色に際しては、細胞を含む培養液とトリパンブルー染色液とを１：３で混和した後に培養チャンバ１１にこの混合液を導入することで、細胞４１を染色した。染色後の写真では、黒く表示されている箇所が多いほど、死細胞数が多いことを示している。
【００４４】
図９Ｂの写真によれば、比較例１の方が、実施例１よりも黒く表示されている箇所が多く、死細胞数が多いことが分かる。すなわち、この検証１Ｂによれば、検証１Ａと同様の結果が確認される。
【００４５】
＜検証２＞
ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）、シクロオレフィンポリマー（ＣＯＰ）、ポリメチルメタクリレート（ＰＭＭＡ）、ポリスチレン（ＰＳ）、及びポリカーボネート（ＰＣ）からなる各種樹脂を、蛍光色素溶液（ナイルレッド）、及び抗がん剤液（ドキソルビシン）に対してそれぞれ浸漬し、各溶液の吸着量を蛍光強度によって観察した。この結果を、図１０及び図１１に示す。なお、両図では、比較のために、白板ガラスを各溶液に対して浸漬した場合も示している。
【００４６】
より具体的には、所定の計測容器内に２．５μｇ／ｍＬの濃度のナイルレッド水溶液及び、２０μＭの濃度のドキソルビシン水溶液を収容し、それぞれ３７℃の温度に設定した状態で、各材料からなるサンプル（寸法は７５ｍｍ×２５ｍｍ×１ｍｍ）を溶液に応じた適切な時間だけ浸漬させた。具体的な浸漬時間は、ナイルレッド水溶液を１０分間とし、ドキソルビシン水溶液を２４時間とした。次に、純水によって前記サンプルを複数回洗浄した後、窒素パージによって乾燥させた。その後、各サンプルに対して、波長４８０ｎｍの励起光を照射して、５５０ｎｍ〜７００ｎｍの波長範囲内の蛍光の強度を測定した。蛍光の強度が高いことは、乾燥後のサンプルに薬剤が含まれる量が多いことを意味する。
【００４７】
図１０及び図１１によれば、ＰＤＭＳは、他の樹脂材料と比べて、薬剤の吸着性が高いことが確認される。このことは、ＰＤＭＳが多孔質性を示し、材料を吸収する傾向が高いことを示す。
【００４８】
つまり、検証１及び検証２の結果を総合すると、ＰＤＭＳで培養チャンバ１１の周囲を覆う壁部を形成した場合、細胞４１から放出された生理活性物質４５が壁部内に吸収された結果、細胞４１に対して再作用させることのできる生理活性物質４５の量が低下したことが分かる。これに対し、ＣＯＰ、ＰＭＭＡ、ＰＳ、及びＰＣからなる樹脂によって、培養チャンバ１１の周囲を覆う壁部を構成することで、細胞４１から放出された生理活性物質４５の吸収量が抑制され、細胞４１自身に再作用できることが分かる。
【００４９】
なお、ポリスチレン（ＰＳ）は、酸素透過係数が１０-10〜１０-9ｃｍ3（ＳＴＰ）ｃｍ／（ｃｍ2・ｓｅｃ・ｃｍＨｇ）程度であり、吸水率が０．０１％程度である。なお、ＪＩＳ Ｋ ７１２６−１（差圧法）に準拠した方法で得られた、室温３７℃におけるＰＳの酸素透過係数の実測値は、１．６×１０-10ｃｍ3ｃｍ／（ｃｍ2・ｓｅｃ・ｃｍＨｇ）であった。
【００５０】
以下の表１は、上記のシクロオレフィンポリマー（ＣＯＰ）、ポリスチレン（ＰＳ）のに加えて、ポリカーボネート（ＰＣ）、シクロオレフィンコポリマー（ＣＯＣ）の酸素透過係数の値を示すものである。
【００５１】
【表１】
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【００５２】
ＰＳの実測値、及び表１に示す値によれば、ＣＯＰ以外の材料である、ＰＣ、ＣＯＣ、ＰＳであっても、ＰＤＭＳよりは低い酸素透過係数を示すことが確認される。
【００５３】
＜検証３＞
培養チャンバ１１の高さｈ１１を１００μｍ、２００μｍ、３００μｍ、４００μｍ、５００μｍ、６００μｍ、８００μｍと異ならせて、培養チャンバ１１内に細胞４１を培養した場合の培養状態を比較した。このときの写真を図１２に示す。
【００５４】
細胞４１としては、ヒトｉＰＳ細胞が用いられ、また培養液４２としては、ヒトＥＳ／ｉＰＳ細胞維持培地 （ＴｅＳＲ−Ｅ８）が用いられた。各写真は、細胞４１を３７℃の下で５日間培養した後に撮影されたものである。
【００５５】
また、死細胞数を比較するため、図９の計測時に使用された方法と同様に、図１２の各各培養液をトリパンブルー染色液を用いて染色した。この染色後の写真を図１３に示す。図１３の写真では、黒く表示されている箇所が多いほど、死細胞数が多いことを示している。
【００５６】
また、図１４は、図１３に示す死細胞数と流路高さｈ１１との関係をグラフ化したものである。図１４において、横軸は流路高さｈ１１を示し、縦軸は死細胞密度を示す。死細胞密度は、計測された死細胞数を培養チャンバ１１の面積で除した値に対応する。
【００５７】
図１２によれば、培養チャンバ１１の高さｈ１１が１００μｍの場合、２００μｍ以上の場合と比較して、細胞が十分に増殖されていないことが分かる。これは、培養チャンバ１１の高さｈ１１があまりに小さすぎた結果、増殖された細胞同士が極めて密接した状態で存在することになり、十分に増殖できなかったものと推察される。
【００５８】
また、図１３及び図１４によれば、培養チャンバ１１の高さｈ１１が６００μｍ以上である場合には、死細胞数が顕著に増加していることが分かる。これは、培養チャンバ１１の高さｈ１１が大き過ぎた結果、各細胞４１から放出された生理活性物質が、当該細胞４１に十分に再帰されずに拡散したことで、十分な生体環境が構築できていないことが示唆される。
【００５９】
以上、図１２〜図１４の結果に基づけば、培養チャンバ１１の高さｈ１１は、２００μｍ以上、５００μｍ以下とするのが好ましいことが確認される。
【００６０】
＜検証４＞
培養チャンバの形状や材質が細胞の酵素活性に与える影響について検証を行った。より具体的には、肝臓細胞ＨｅｐａＲＧ（登録商標）（BIOPREDIC International社製）を各培養チャンバ（比較例２，比較例３，実施例２）内で、分化誘導培地にて２週間培養した後、Ｐ４５０-Ｇｌｏ（登録商標） ＣＹＰ３Ａ４ Ａｓｓａｙ ｗｉｔｈ Ｌｕｃｉｆｅｒｉｎ-ＩＰＡ, Ｌｏｔ: ００００３３３０８２（Promega Corporation社製）を使用して、酵素ＣＹＰ３Ａ４の活性を発光法により評価した。
【００６１】
比較例２は、従来から培養試験に使用されているポリスチレン（ＰＳ）製の９６ウェルマルチウェルプレート（ヌンク社製）である。
比較例３は、底部３及び本体５の双方をＰＤＭＳで形成し、高さｈ１１を２５０μｍとした、培養チャンバに対応する（図５参照）。
実施例２は、底部３及び本体５の双方をＣＯＰで形成し、高さｈ１１を２５０μｍとした、培養チャンバ１１に対応する（図５参照）。
【００６２】
図１５は、この検証４における結果を示すグラフである。図１５において、縦軸の「Ｌｕｍ／Ｃｅｌｌ」は、細胞数あたりの発光量であり、細胞あたりの酵素活性の程度に対応する。すなわち、細胞数あたりの発光量が大きいということは、酵素ＣＹＰ３Ａ４の活性が高いことを示している。
【００６３】
上述したように、ＰＤＭＳと比べると、ＰＳとＣＯＰは酸素透過係数が共に低い。そして、図１５によれば、比較例２よりも実施例２の方が、酵素活性が高いことが分かる。この理由としては、比較例２の培養チャンバが、実施例２の培養チャンバと比較して充分大きいことが挙げられる。
【００６４】
すなわち、比較例２の場合、細胞数に対して、培養される空間及び培地量が大きすぎたことで、肝細胞から放出された生理活性物質が培養液中に拡散した結果、細胞周辺の生理活性物質の濃度が低下し、効能が十分得られなかったものと考えられる。一方、実施例２の場合、培養チャンバ１１の高さｈ１１がミクロンオーダー（２５０μｍ）と小さいため、肝細胞から放出された生理活性物質が細胞周辺にとどまり、細胞機能を向上させることが可能な濃度を維持することができたものと考えられる。
【００６５】
また、図１５によれば、比較例３と実施例２を比較すると、培養チャンバ１１の高さｈ１１が同等であるにもかかわらず、実施例２の方が酵素活性が高いことが分かる。この理由としては、検証１Ａ及び検証１Ｂにおける検証結果と同様、比較例３の培養チャンバ（ＰＤＭＳ）の酸素透過係数が、実施例２の培養チャンバ（ＣＯＰ）の酸素透過係数よりも大幅に高いことが要因として挙げられる。
【００６６】
すなわち、比較例３の場合、培養チャンバの壁部を構成する材料の物質透過性が高く、材料分子間に生理活性物質が吸収されてしまった結果、細胞周辺の生理活性物質の濃度が低下し、肝細胞に対して生理活性物質を再帰させる作用が充分に得られなかったためと考えられる。これに対し、実施例２では、培養チャンバの壁部を構成する材料の物質透過性が低く、肝細胞から放出された生理活性物質を細胞周辺に留められたことで、細胞機能を向上させることが可能な濃度を維持することができたためと考えられる。
【００６７】
以上、検証４から、物質を透過しにくい材料で構成された微小空間内で細胞培養することで、細胞から放出された有効成分を細胞に回帰させることにより、細胞機能を向上させることが可能となることが確認された。
【００６８】
［別実施形態］
以下、別実施形態について説明する。
【００６９】
〈１〉上記実施形態では、本体５及び底部３の構成材料の例として、シクロオレフィンポリマー（ＣＯＰ）、ポリメチルメタクリレート（ＰＭＭＡ）、ポリスチレン（ＰＳ）、及びポリカーボネート（ＰＣ）を例示した。しかし、培養チャンバ１１の周囲を覆う壁部が、非多孔質体であれば、これらの材料には限定されない。ただし、光透過性に優れる上、射出成形による製造が可能となるという観点から、上記材料で構成されるのが好ましく、吸水率が低いという観点から、特にシクロオレフィンポリマー（ＣＯＰ）が好ましい。
【００７０】
なお、本体５と底部３とは別の材料で構成されていても構わない。
【００７１】
〈２〉培養チャンバ１１は同一の平面上に複数個配置されていても構わない。一例として、本体５と底部３との間の位置において、複数箇所に独立して凹部が設けられており、各凹部によって、ウェル２１と、ウェル２２と、これらのウェル（２１，２２）に連結された培養チャンバ１１とが形成されているものとしても構わない。かかる構成により、異なる条件下で複数の細胞４１を培養することができ、効率的な実験が可能となる。
【００７２】
〈３〉細胞培養チップ１は、培養チャンバ１１に対して細胞４１を含む培養液４２を注入することができればよく、この限りにおいてウェル（２１，２２）を必ずしも備えなくても構わない。
【００７３】
〈４〉上記実施形態では、培養チャンバ１１と、各ウェル（２１，２２）とが、底部３の上面を共通の底面である場合について説明した。しかし、この態様は一例である。ただし、細胞培養チップ１の製造工程を容易化すると共に、細胞培養チップ１のサイズを極めて小型化することができるという点において、培養チャンバ１１及び各ウェル（２１，２２）の底面が共通化されるのが好ましい。
【符号の説明】
【００７４】
１      ：    細胞培養チップ
３      ：    底部
５      ：    本体
１１      ：    培養チャンバ
２１      ：    ウェル
２２      ：    ウェル
４１      ：    細胞
４２      ：    培養液
４５      ：    生理活性物質
６１      ：    培養チャンバ
６２      ：    培養チャンバ
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【国際調査報告】
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