(57)【要約】  本発明は、種々の疾患、特に心臓疾患の処置において好適に用いることができるシート状細胞培養物の製造方法、当該方法で製造されたシート状細胞培養物、当該シート状細胞培養物を含む組成物、移植片および医療製品、当該シート状細胞培養物を用いた疾患の処置方法などの提供を目的とする。  少なくとも１種のシート形成細胞を含む細胞集団を培養基材に播種すること、播種された細胞集団を細胞培養液中でシート化し、シート状細胞培養物を形成すること、および形成されたシート状細胞培養物を培養基材から剥離することを含み、前記シート化が、２〜１２時間のインキュベートにより行われる、シート状細胞培養物の製造方法により、上記課題が解決された。【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ｉ）少なくとも１種のシート形成細胞を含む細胞集団を培養基材に播種するステップ、
（ｉｉ）ステップ（ｉ）で播種された細胞集団を細胞培養液中でシート化し、シート状細胞培養物を形成するステップ、および
（ｉｉｉ）ステップ（ｉｉ）で形成されたシート状細胞培養物を培養基材から剥離するステップ
を含み、ステップ（ｉｉ）におけるシート化が、２〜１２時間のインキュベートにより行われる、シート状細胞培養物の製造方法。
【請求項２】
シート形成細胞が、筋芽細胞または心筋細胞である、請求項１に記載の製造方法。
【請求項３】
細胞培養液が、同種血清を含む、請求項１または２に記載の製造方法。
【請求項４】
培養基材が、血清で被覆されている、請求項１〜３のいずれか一項に記載の製造方法。
【請求項５】
培養基材が、温度応答性材料で被覆されている、請求項１〜４のいずれか一項に記載の製造方法。
【請求項６】
ステップ（ｉ）において、細胞集団が、７．５×１０５個／ｃｍ２〜３．０×１０６個／ｃｍ２の密度で播種される、請求項１〜５のいずれか一項に記載の製造方法。
【請求項７】
シート化が、２〜１２時間、２〜１１．５時間、２〜１１時間、２〜１０時間、２〜９時間、２〜８時間、２〜７時間、２〜６時間、２〜５時間または２〜４時間のインキュベートにより行われる、請求項１〜６のいずれか一項に記載の製造方法。
【請求項８】
シート化が、２〜６時間のインキュベートにより行われる、請求項７に記載の製造方法。
【請求項９】
剥離後のシート状細胞培養物が、培養基材の面積に対して３５％以上の面積を有する、請求項１〜８のいずれか一項に記載の製造方法。
【請求項１０】
シート状細胞培養物の適用により改善される疾患を処置する方法であって、請求項１〜９のいずれか一項に記載の製造方法により製造されたシート状細胞培養物を、それを必要とする対象に適用するステップを含む、前記方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本開示は、種々の疾患、特に心臓疾患の処置において好適に用いることができるシート状細胞培養物の製造方法、当該方法で製造されたシート状細胞培養物、当該シート状細胞培養物を含む組成物、移植片および医療製品、当該シート状細胞培養物を用いた疾患の処置方法などに関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、損傷した組織等の修復のために、種々の細胞を移植する試みが行われている。例えば、狭心症、心筋梗塞などの虚血性心疾患により損傷した心筋組織の修復のために、胎児心筋細胞、骨格筋芽細胞、間葉系幹細胞、心臓幹細胞、ＥＳ細胞、ｉＰＳ細胞等の利用が試みられている（非特許文献１）。【０００３】
このような試みの一環として、スキャフォールドを利用して形成した細胞構造物や、細胞をシート状に形成したシート状細胞培養物が開発されてきた（特許文献１、非特許文献２）。
シート状細胞培養物の治療への応用については、火傷などによる皮膚損傷に対する培養表皮シートの利用、角膜損傷に対する角膜上皮シート状細胞培養物の利用、食道ガン内視鏡的切除に対する口腔粘膜シート状細胞培養物の利用などの検討が進められており、その一部は臨床応用の段階に入っている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特表２００７−５２８７５５号公報
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Haraguchi et al., Stem Cells Transl Med. 2012 Feb;1(2):136-41
【非特許文献２】Sawa et al., Surg Today. 2012 Jan;42(2):181-4
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本開示は、種々の疾患、特に心臓疾患の処置において好適に用いることができるシート状細胞培養物の製造方法、当該方法で製造されたシート状細胞培養物、当該シート状細胞培養物を含む組成物、移植片および医療製品、当該シート状細胞培養物を用いた疾患の処置方法などの提供を目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
シート状細胞培養物の臨床応用が進むにつれて、より高品質で取り扱いが容易であり、簡便に製造可能なシート状細胞培養物を提供することが求められるようになってきた。本発明者らは、シート状細胞培養物の改良について研究する中で、温度応答性培養皿を用いたシート状細胞培養物の形成のためのインキュベート中に、形成されたシート状細胞培養物が自然と剥離してしまうという現象を見出した。この現象は、シート状細胞培養物の形成とともにシートを構成する細胞の細胞間接着力が増大した結果、細胞と基材との接着力を上回るために起こるとの仮説に基づいて研究を続けたところ、シート状細胞培養物の自然剥離が起こった後、遊離状態のまま適切な処理をせずに放置しておくと、シート状細胞培養物が細胞間接着力により収縮し、縮んだまま癒着してしまい、シート状細胞培養物として使用が困難になるという新たな課題に直面した。かかる課題を解決すべくさらに研究を続けたところ、細胞播種後２時間ほどのインキュベートにより十分な強度のシート状細胞培養物が形成されること、およびシート状細胞培養物が培養基材上に形成された後自然剥離前に人為的に基材からシート状細胞培養物を剥離すると、収縮が起こりにくく、癒着も防止できることを見出し、さらに研究を進め、本発明を完成させるに至った。【０００８】
すなわち、本発明に下記に掲げるものに関する：
［１］（ｉ）少なくとも１種のシート形成細胞を含む細胞集団を培養基材に播種するステップ、
（ｉｉ）ステップ（ｉ）で播種された細胞集団を細胞培養液中でシート化し、シート状細胞培養物を形成するステップ、および
（ｉｉｉ）ステップ（ｉｉ）で形成されたシート状細胞培養物を培養基材から剥離するステップ
を含み、ステップ（ｉｉ）におけるシート化が、２〜１２時間のインキュベートにより行われる、シート状細胞培養物の製造方法。
［２］シート形成細胞が、筋芽細胞または心筋細胞である、［１］の製造方法。
［３］細胞培養液が、同種血清を含む、［１］または［２］の製造方法。
［４］培養基材が、血清で被覆されている、［１］〜［３］の製造方法。
［５］培養基材が、温度応答性材料で被覆されている、［１］〜［４］の製造方法。
［６］ステップ（ｉ）において、細胞集団が、７．５×１０５個／ｃｍ２〜３．０×１０６個／ｃｍ２の密度で播種される、［１］〜［５］の製造方法。
［７］シート化が、２〜１２時間、２〜１１．５時間、２〜１１時間、２〜１０時間、２〜９時間、２〜８時間、２〜７時間、２〜６時間、２〜５時間または２〜４時間のインキュベートにより行われる、［１］〜［６］の製造方法。
［８］シート化が、２〜６時間のインキュベートにより行われる、［７］の製造方法。
［９］剥離後のシート状細胞培養物が、培養基材の面積に対して３５％以上の面積を有する、［１］〜［８］の製造方法。
［１０］シート状細胞培養物の適用により改善される疾患を処置する方法であって、［１］〜［９］の製造方法により製造されたシート状細胞培養物を、それを必要とする対象に適用するステップを含む、前記方法。
【発明の効果】
【０００９】
本発明によれば、細胞播種した後、剥離されたシート状細胞培養物を得るまでの時間が短くなるため、短時間で効率よくシート状細胞培養物を得ることができる。また、シート状細胞培養物をシート形成後に自然剥離前に人為的に剥離することにより、剥離された後しばらく液中に浸漬したままでも収縮および癒着が起こりにくく平らで縮みのないシート状細胞培養物となるため、長時間の保存が可能となる。さらに、シート状細胞培養物の基材から剥離後の収縮が抑制されているため、同じ基材を用いても従来のものより大きな面積のシート状細胞培養物が得られる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】図１は、各時間インキュベートし、剥離作業を行った後のシート状細胞培養物の様子を表した写真である。それぞれ、Ａは３０分、Ｂは１時間、Ｃは２時間、Ｄは４時間、Ｅは５．５時間、Ｆは６時間、Ｇは１１．５時間、Ｈは１２時間インキュベートした場合の写真である。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
以下、本開示を詳細に説明する。
本明細書において別様に定義されない限り、本明細書で用いる全ての技術用語および科学用語は、当業者が通常理解しているものと同じ意味を有する。本明細書中で参照する全ての特許、出願、公開された出願および他の出版物は、その全体を参照により本明細書に援用する。また本明細書において参照された出版物と本明細書の記載に矛盾が生じた場合は、本明細書の記載が優先されるものとする。
【００１２】
本開示において「シート状細胞培養物」は、細胞が互いに連結してシート状になったものをいう。細胞同士は、直接（接着分子などの細胞要素を介するものを含む）および／または介在物質を介して、互いに連結していてもよい。介在物質としては、細胞同士を少なくとも物理的（機械的）に連結し得る物質であれば特に限定されないが、例えば、細胞外マトリックスなどが挙げられる。介在物質は、好ましくは細胞由来のもの、特に、細胞培養物を構成する細胞に由来するものである。細胞は少なくとも物理的（機械的）に連結されるが、さらに機能的、例えば、化学的、電気的に連結されてもよい。シート状細胞培養物は、１の細胞層から構成されるもの（単層）であっても、２以上の細胞層から構成されるもの（積層（多層）体、例えば、２層、３層、４層、５層、６層など）であってもよい。また、シート状細胞培養物は、細胞が明確な層構造を示すことなく、細胞１個分の厚みを超える厚みを有する３次元構造を有してもよい。例えば、シート状細胞培養物の垂直断面において、細胞が水平方向に均一に整列することなく、不均一に（例えば、モザイク状に）配置された状態で存在していてもよい。
【００１３】
シート状細胞培養物は、好ましくはスキャフォールド（支持体）を含まない。スキャフォールドは、その表面上および／またはその内部に細胞を付着させ、シート状細胞培養物の物理的一体性を維持するために当該技術分野において用いられることがあり、例えば、ポリビニリデンジフルオリド（ＰＶＤＦ）製の膜等が知られているが、本開示のシート状細胞培養物は、かかるスキャフォールドがなくともその物理的一体性を維持することができる。また、本開示のシート状細胞培養物は、好ましくは、シート状細胞培養物を構成する細胞由来の物質のみからなり、それら以外の物質を含まない。
【００１４】
シート状細胞培養物を構成する細胞は、シート状細胞培養物を形成し得るものであれば特に限定されず、例えば、接着細胞（付着性細胞）を含む。接着細胞は、例えば、接着性の体細胞（例えば、心筋細胞、線維芽細胞、上皮細胞、内皮細胞、肝細胞、膵細胞、腎細胞、副腎細胞、歯根膜細胞、歯肉細胞、骨膜細胞、皮膚細胞、滑膜細胞、軟骨細胞など）および幹細胞（例えば、筋芽細胞、心臓幹細胞などの組織幹細胞、胚性幹細胞、ｉＰＳ（induced pluripotent stem）細胞などの多能性幹細胞、間葉系幹細胞等）などを含む。体細胞は、幹細胞、特にｉＰＳ細胞から分化させたもの（ｉＰＳ細胞由来接着細胞）であってもよい。シート状細胞培養物を構成する細胞の非限定例としては、例えば、筋芽細胞（例えば、骨格筋芽細胞など）、間葉系幹細胞（例えば、骨髄、脂肪組織、末梢血、皮膚、毛根、筋組織、子宮内膜、胎盤、臍帯血由来のものなど）、心筋細胞、線維芽細胞、心臓幹細胞、胚性幹細胞、ｉＰＳ細胞、滑膜細胞、軟骨細胞、上皮細胞（例えば、口腔粘膜上皮細胞、網膜色素上皮細胞、鼻粘膜上皮細胞など）、内皮細胞（例えば、血管内皮細胞など）、肝細胞（例えば、肝実質細胞など）、膵細胞（例えば、膵島細胞など）、腎細胞、副腎細胞、歯根膜細胞、歯肉細胞、骨膜細胞、皮膚細胞等が挙げられる。ｉＰＳ細胞由来接着細胞の非限定例としては、ｉＰＳ細胞由来の心筋細胞、線維芽細胞、上皮細胞、内皮細胞、肝細胞、膵細胞、腎細胞、副腎細胞、歯根膜細胞、歯肉細胞、骨膜細胞、皮膚細胞、滑膜細胞、軟骨細胞などが挙げられる。
【００１５】
本開示において「筋芽細胞」は、横紋筋細胞の前駆細胞であり、骨格筋芽細胞および心筋芽細胞を含む。
本開示において「骨格筋芽細胞」は、骨格筋に存在する筋芽細胞を意味する。骨格筋芽細胞は当該技術分野でよく知られており、骨格筋から任意の既知の方法（例えば、特開２００７−８９４４２号公報に記載の方法など）により調製することもできるし、商業的に入手することもできる（例えば、Lonza、Cat# CC-2580）。骨格筋芽細胞は、限定されずに、例えば、ＣＤ５６、α７インテグリン、ミオシン重鎖ＩＩａ、ミオシン重鎖ＩＩｂ、ミオシン重鎖ＩＩｄ（ＩＩｘ）、ＭｙｏＤ、Ｍｙｆ５、Ｍｙｆ６、ミオゲニン、デスミン、ＰＡＸ３などのマーカーにより同定することができる。特定の態様において、骨格筋芽細胞はＣＤ５６陽性である。さらに特定の態様において、骨格筋芽細胞はＣＤ５６陽性およびデスミン陽性である。骨格筋芽細胞は、骨格筋を有する任意の生物、限定されずに、例えば、ヒト、非ヒト霊長類、げっ歯類（マウス、ラット、ハムスター、モルモットなど）、ウサギ、イヌ、ネコ、ブタ、ウマ、ウシ、ヤギ、ヒツジなどの哺乳動物に由来してもよい。一態様において、骨格筋芽細胞は哺乳動物の骨格筋芽細胞である。特定の態様において、骨格筋芽細胞はヒト骨格筋芽細胞である。
【００１６】
本開示において「心筋芽細胞」は、心筋に存在する筋芽細胞を意味する。心筋芽細胞は当該技術分野でよく知られており、Ｉｓｌ１などのマーカーにより同定することができる。心筋芽細胞は、心筋を有する任意の生物、限定されずに、例えば、ヒト、非ヒト霊長類、げっ歯類（マウス、ラット、ハムスター、モルモットなど）、ウサギ、イヌ、ネコ、ブタ、ウマ、ウシ、ヤギ、ヒツジなどの哺乳動物に由来してもよい。一態様において、心筋芽細胞は哺乳動物の心筋芽細胞である。特定の態様において、心筋芽細胞はヒト心筋芽細胞である。
本開示において「心筋細胞」は、心筋細胞の特徴を有する細胞を意味し、心筋細胞の特徴としては、限定されずに、例えば、心筋細胞マーカーの発現、自律的拍動の存在などが挙げられる。心筋細胞マーカーの非限定例としては、例えば、ｃ−ＴＮＴ（cardiac troponin T）、ＣＤ１７２ａ（別名ＳＩＲＰＡまたはＳＨＰＳ−１）、ＫＤＲ（別名ＣＤ３０９、ＦＬＫ１またはＶＥＧＦＲ２）、ＰＤＧＦＲＡ、ＥＭＩＬＩＮ２、ＶＣＡＭなどが挙げられる。心筋細胞としては、ｉＰＳ細胞由来の心筋細胞が好ましく例示される。
【００１７】
シート状細胞培養物を構成する細胞は、シート状細胞培養物による治療が可能な任意の生物に由来し得る。かかる生物には、限定されずに、例えば、ヒト、非ヒト霊長類、イヌ、ネコ、ブタ、ウマ、ヤギ、ヒツジ、げっ歯目動物（例えば、マウス、ラット、ハムスター、モルモットなど）、ウサギなどが含まれる。また、シート状細胞培養物を構成する細胞の種類の数は特に限定されず、１種類のみ細胞で構成されていてもよいが、２種類以上の細胞を用いたものであってもよい。シート状細胞培養物を形成する細胞が２種類以上ある場合、最も多い細胞の含有比率（純度）は、シート状細胞培養物の形成終了時において、５０％以上、好ましくは６０％以上、より好ましくは７０％以上、さらに好ましくは７５％以上である。
【００１８】
細胞は異種由来細胞であっても同種由来細胞であってもよい。ここで「異種由来細胞」は、シート状細胞培養物が移植に用いられる場合、そのレシピエントとは異なる種の生物に由来する細胞を意味する。例えば、レシピエントがヒトである場合、サルやブタに由来する細胞などが異種由来細胞に該当する。また、「同種由来細胞」は、レシピエントと同一の種の生物に由来する細胞を意味する。例えば、レシピエントがヒトである場合、ヒト細胞が同種由来細胞に該当する。同種由来細胞は、自己由来細胞（自己細胞または自家細胞ともいう）、すなわち、レシピエントに由来する細胞と、同種非自己由来細胞（他家細胞ともいう）を含む。自己由来細胞は、移植しても拒絶反応が生じないため、本開示においては好ましい。しかしながら、異種由来細胞や同種非自己由来細胞を利用することも可能である。異種由来細胞や同種非自己由来細胞を利用する場合は、拒絶反応を抑制するため、免疫抑制処置が必要となることがある。なお、本明細書中で、自己由来細胞以外の細胞、すなわち、異種由来細胞と同種非自己由来細胞を非自己由来細胞と総称することもある。本開示の一態様において、細胞は自家細胞または他家細胞である。本開示の一態様において、細胞は自家細胞である。本開示の別の態様において、細胞は他家細胞である。
【００１９】
シート状細胞培養物は、既知の任意の方法（例えば、特許文献１、特許文献２、特開２０１０−０８１８２９、特開２０１１−１１０３６８など参照）で製造することができる。シート状細胞培養物の製造方法は、典型的には、細胞を培養基材上に播種するステップ、播種した細胞をシート化するステップ、形成されたシート状細胞培養物を培養基材から剥離するステップを含むが、これに限定されない。細胞を培養基材上に播種するステップの前に、細胞を凍結するステップおよび細胞を解凍するステップを行ってもよい。さらに、細胞を解凍するステップの後に細胞を洗浄するステップを行ってもよい。これら各ステップは、シート状細胞培養物の製造に適した既知の任意の手法で行うことができる。本開示の製造方法は、シート状細胞培養物を製造するステップを含んでもよく、その場合、シート状細胞培養物を製造するステップは、サブステップとして上記シート状細胞培養物の製造方法に係るステップの１または２以上を含んでもよい。ある一態様において、細胞を解凍するステップの後、細胞を培養基材上に播種するステップの前に細胞を増殖させるステップを含まない。
【００２０】
培養基材は、細胞がその上で細胞培養物を形成し得るものであれば特に限定されず、例えば、種々の材質の容器、容器中の固形もしくは半固形の表面などを含む。容器は、培養液などの液体を透過させない構造・材料が好ましい。かかる材料としては、限定することなく、例えば、ポリエチレン、ポリプロピレン、テフロン（登録商標）、ポリエチレンテレフタレート、ポリメチルメタクリレート、ナイロン６，６、ポリビニルアルコール、セルロース、シリコン、ポリスチレン、ガラス、ポリアクリルアミド、ポリジメチルアクリルアミド、金属（例えば、鉄、ステンレス、アルミニウム、銅、真鍮）等が挙げられる。また、容器は、少なくとも１つの平坦な面を有することが好ましい。かかる容器の例としては、限定することなく、例えば、細胞培養物の形成が可能な培養基材で構成された底面と、液体不透過性の側面とを備えた培養容器が挙げられる。かかる培養容器の特定の例としては、限定されずに、細胞培養皿、細胞培養ボトルなどが挙げられる。容器の底面は透明であっても不透明であってもよい。容器の底面が透明であると、容器の裏側から細胞の観察、計数などが可能となる。また、容器は、その内部に固形もしくは半固形の表面を有してもよい。固形の表面としては、上記のごとき種々の材料のプレートや容器などが、半固形の表面としては、ゲル、軟質のポリマーマトリックスなどが挙げられる。培養基材は、上記材料を用いて作製してもよいし、市販のものを利用してもよい。好ましい培養基材としては、限定することなく、例えば、シート状細胞培養物の形成に適した、接着性の表面を有する基材が挙げられる。具体的には、親水性の表面を有する基材、例えば、コロナ放電処理したポリスチレン、コラーゲンゲルや親水性ポリマーなどの親水性化合物を該表面にコーティングした基材、さらには、コラーゲン、フィブロネクチン、ラミニン、ビトロネクチン、プロテオグリカン、グリコサミノグリカンなどの細胞外マトリックスや、カドヘリンファミリー、セレクチンファミリー、インテグリンファミリーなどの細胞接着因子などを表面にコーティングした基材などが挙げられる。また、かかる基材は市販されている（例えば、Corning(R)?TC-Treated Culture Dish、Corningなど）。培養基材は全体または部分が透明であっても不透明であってもよい。
【００２１】
培養基材は、刺激、例えば、温度や光に応答して物性が変化する材料で表面が被覆されていてもよい。かかる材料としては、限定されずに、例えば、（メタ）アクリルアミド化合物、Ｎ−アルキル置換（メタ）アクリルアミド誘導体（例えば、Ｎ−エチルアクリルアミド、Ｎ−ｎ−プロピルアクリルアミド、Ｎ−ｎ−プロピルメタクリルアミド、Ｎ−イソプロピルアクリルアミド、Ｎ−イソプロピルメタクリルアミド、Ｎ−シクロプロピルアクリルアミド、Ｎ−シクロプロピルメタクリルアミド、Ｎ−エトキシエチルアクリルアミド、Ｎ−エトキシエチルメタクリルアミド、Ｎ−テトラヒドロフルフリルアクリルアミド、Ｎ−テトラヒドロフルフリルメタクリルアミド等）、Ｎ，Ｎ−ジアルキル置換（メタ）アクリルアミド誘導体（例えば、Ｎ，Ｎ−ジメチル（メタ）アクリルアミド、Ｎ，Ｎ−エチルメチルアクリルアミド、Ｎ，Ｎ−ジエチルアクリルアミド等）、環状基を有する（メタ）アクリルアミド誘導体（例えば、１−（１−オキソ−２−プロペニル）−ピロリジン、１−（１−オキソ−２−プロペニル）−ピペリジン、４−（１−オキソ−２−プロペニル）−モルホリン、１−（１−オキソ−２−メチル−２−プロペニル）−ピロリジン、１−（１−オキソ−２−メチル−２−プロペニル）−ピペリジン、４−（１−オキソ−２−メチル−２−プロペニル）−モルホリン等）、またはビニルエーテル誘導体（例えば、メチルビニルエーテル）のホモポリマーまたはコポリマーからなる温度応答性材料、アゾベンゼン基を有する光吸収性高分子、トリフェニルメタンロイコハイドロオキシドのビニル誘導体とアクリルアミド系単量体との共重合体、および、スピロベンゾピランを含むＮ−イソプロピルアクリルアミドゲル等の光応答性材料などの公知のものを用いることができる（例えば、特開平２−２１１８６５、特開２００３−３３１７７参照）。これらの材料に所定の刺激を与えることによりその物性、例えば、親水性や疎水性を変化させ、同材料上に付着した細胞培養物の剥離を促進することができる。温度応答性材料で被覆された培養皿は市販されており（例えば、CellSeed Inc.のUpCell(R)）、これらを本開示の製造方法に使用することができる。
【００２２】
培養基材は、種々の形状であってもよいが、平坦であることが好ましい。また、その面積は特に限定されないが、例えば、約１ｃｍ２〜約２００ｃｍ２、約２ｃｍ２〜約１００ｃｍ２、約３ｃｍ２〜約５０ｃｍ２などであってよい。例えば、培養基材として直径１０ｃｍの円形の培養皿が挙げられる。この場合、面積は５６．７ｃｍ２となる。
培養基材は血清でコート（被覆またはコーティング）されていてもよい。血清でコートされた培養基材を用いることにより、より高密度のシート状細胞培養物を形成することができる。「血清でコートされている」とは、培養基材の表面に血清成分が付着している状態を意味する。かかる状態は、限定されずに、例えば、培養基材を血清で処理することにより得ることができる。血清による処理は、血清を培養基材に接触させること、および、必要に応じて所定期間インキュベートすることを含む。
【００２３】
血清としては、異種血清および／または同種血清を用いることができる。異種血清は、シート状細胞培養物を移植に用いる場合、そのレシピエントとは異なる種の生物に由来する血清を意味する。例えば、レシピエントがヒトである場合、ウシやウマに由来する血清、例えば、ウシ胎仔血清（ＦＢＳ、ＦＣＳ）、仔ウシ血清（ＣＳ）、ウマ血清（ＨＳ）などが異種血清に該当する。また、「同種血清」は、レシピエントと同一の種の生物に由来する血清を意味する。例えば、レシピエントがヒトである場合、ヒト血清が同種血清に該当する。同種血清は、自己血清（自家血清ともいう）、すなわち、レシピエントに由来する血清、およびレシピエント以外の同種個体に由来する同種他家血清を含む。なお、本明細書中で、自己血清以外の血清、すなわち、異種血清と同種他家血清を非自己血清と総称することもある。
培養基材をコートするための血清は、市販されているか、または、所望の生物から採取した血液から定法により調製することができる。具体的には、例えば、採取した血液を室温で約２０分〜約６０分程度放置して凝固させ、これを約１０００×ｇ〜約１２００×ｇ程度で遠心分離し、上清を採取する方法などが挙げられる。
【００２４】
培養基材上でインキュベートする場合、血清は原液で用いても、希釈して用いてもよい。希釈は、任意の媒体、例えば、限定することなく、水、生理食塩水、種々の緩衝液（例えば、ＰＢＳ、ＨＢＳＳなど）、種々の液体培地（例えば、ＤＭＥＭ、ＭＥＭ、Ｆ１２、ＤＭＥＭ／Ｆ１２、ＤＭＥ、ＲＰＭＩ１６４０、ＭＣＤＢ（ＭＣＤＢ１０２、１０４、１０７、１２０、１３１、１５３、１９９など）、Ｌ１５、ＳｋＢＭ、ＲＩＴＣ８０−７など）等で行うことができる。希釈濃度は、血清成分が培養基材上に付着することができれば特に限定されず、例えば、約０．５％〜約１００％（ｖ／ｖ）、好ましくは約１％〜約６０％（ｖ／ｖ）、より好ましくは約５％〜約４０％（ｖ／ｖ）である。
【００２５】
インキュベート時間も、血清成分が培養基材上に付着することができれば特に限定されず、例えば、約１時間〜約７２時間、好ましくは約２時間〜約４８時間、より好ましくは約２時間〜約２４時間、さらに好ましくは約２時間〜約１２時間である。本開示において、かかるインキュベート時間によりインキュベートを行なった後は、さらなるインキュベートは行なわず、シート状細胞培養物を剥離するステップを行なう。インキュベート温度も、血清成分が培養基材上に付着することができれば特に限定されず、例えば、約０℃〜約６０℃、好ましくは約４℃〜約４５℃、より好ましくは室温〜約４０℃である。
【００２６】
インキュベート後に血清を廃棄してもよい。血清の廃棄手法としては、ピペットなどによる吸引や、デカンテーションなどの慣用の液体廃棄手法を用いることができる。本開示の好ましい態様においては、血清廃棄後に、培養基材を無血清洗浄液で洗浄してもよい。無血清洗浄液としては、血清を含まず、培養基材に付着した血清成分に悪影響を与えない液体媒体であれば特に限定されず、例えば、限定することなく、水、生理食塩水、種々の緩衝液（例えば、ＰＢＳ、ＨＢＳＳなど）、種々の液体培地（例えば、ＤＭＥＭ、ＭＥＭ、Ｆ１２、ＤＭＥＭ／Ｆ１２、ＤＭＥ、ＲＰＭＩ１６４０、ＭＣＤＢ（ＭＣＤＢ１０２、１０４、１０７、１２０、１３１、１５３、１９９など）、Ｌ１５、ＳｋＢＭ、ＲＩＴＣ８０−７など）等で行うことができる。洗浄手法としては、慣用の培養基材洗浄手法、例えば、限定することなく、培養基材上に無血清洗浄液を加えて所定時間（例えば、約５秒〜約６０秒間）撹拌後、廃棄する手法などを用いることができる。
【００２７】
本開示において、培養基材を、成長因子でコートしてもよい。ここで、「成長因子」は、細胞の増殖を、それがない場合に比べて促進する任意の物質を意味し、例えば、上皮細胞成長因子（ＥＧＦ）、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）などを含む。成長因子による培養基材のコート手法、廃棄手法および洗浄手法は、インキュベーション時の希釈濃度が、例えば、約０．０００１μｇ／ｍＬ〜約１μｇ／ｍＬ、好ましくは約０．０００５μｇ／ｍＬ〜約０．０５μｇ／ｍＬ、より好ましくは約０．００１μｇ／ｍＬ〜約０．０１μｇ／ｍＬである以外は、基本的に血清と同じである。
【００２８】
本開示において、培養基材を、ステロイド剤でコートしてもよい。ここで「ステロイド剤」は、ステロイド核を有する化合物のうち、生体に、副腎皮質機能不全、クッシング症候群などの悪影響を及ぼし得るものをいう。かかる化合物としては、限定されずに、例えば、コルチゾール、プレドニゾロン、トリアムシノロン、デキサメタゾン、ベタメタゾン等が含まれる。ステロイド剤による培養基材のコート手法、廃棄手法および洗浄手法は、インキュベーション時の希釈濃度が、デキサメタゾンとして、例えば、約０．１μｇ／ｍＬ〜約１００μｇ／ｍＬ、好ましくは約０．４μｇ／ｍＬ〜約４０μｇ／ｍＬ、より好ましくは約１μｇ／ｍＬ〜約１０μｇ／ｍＬである以外は、基本的に血清と同じである。
【００２９】
培養基材は、血清、成長因子およびステロイド剤のいずれか１つでコートしても、これらの任意の組合わせ、すなわち、血清と成長因子、血清とステロイド剤、血清と成長因子とステロイド剤、または、成長因子とステロイド剤の組合わせでコートしてもよい。複数の成分でコートする場合、これらの成分を混合して同時にコートしてもよいし、別々のステップでコートしてもよい。
【００３０】
培養基材は、血清等でコートした後直ちに細胞を播種してもよいし、コートした後に保存しておき、その後細胞を播種することもできる。コートした基材は、例えば約４℃以下、好ましくは約−２０℃以下、より好ましくは約−８０℃以下に保つことにより長期間保存することができる。
培養基材への細胞の播種は、既知の任意の手法および条件で行うことができる。培養基材への細胞の播種は、例えば、細胞を培養液に懸濁した細胞懸濁液を培養基材（培養容器）に注入することにより行ってもよい。細胞懸濁液の注入には、スポイトやピペットなど、細胞懸濁液の注入操作に適した器具を用いることができる。
【００３１】
＜１＞本開示の製造方法
本開示の一側面において、品質の高いシート状細胞培養物を製造する方法が提供される。
本開示の製造方法は、以下を含む：
（ｉ）シート形成細胞を含む細胞集団を培養基材に播種すること、
（ｉｉ）上記（ｉ）で播種された細胞集団を細胞培養液中でシート化し、シート状細胞培養物を形成すること、および
（ｉｉｉ）上記（ｉｉ）で形成されたシート状細胞培養物を培養基材から剥離すること。
【００３２】
（ｉ）において、培養基材上にシート形成細胞を含む細胞集団を播種する。シート形成細胞は、シート状細胞培養物を構成し得る細胞として上述した細胞であれば特に限定されない。細胞集団には、少なくとも１種のシート形成細胞が含まれるが、２種以上のシート形成細胞を含んでもよいし、シート形成細胞以外の細胞を含んでもよい。本開示の一態様において、細胞集団に含まれる少なくとも１種のシート形成細胞は筋芽細胞であり、好ましくは骨格筋芽細胞である。かかる態様において、細胞集団にはさらに線維芽細胞が含まれ得る。すなわち、筋芽細胞と線維芽細胞をシート形成細胞として含むシート状細胞培養物が挙げられる。本開示の別の一態様において、細胞集団に含まれる少なくとも１種のシート形成細胞は心筋細胞である。かかる態様において、細胞集団にはさらに血管内皮細胞が含まれ得る。すなわち、心筋細胞と血管内皮細胞をシート形成細胞として含むシート状細胞培養物が挙げられる。本開示のさらに別の一態様において、細胞集団に含まれる少なくとも１種のシート形成細胞は、間葉系幹細胞である。かかる態様において、細胞集団にはさらに血管内皮細胞が含まれ得る。
【００３３】
播種される細胞密度は、シート状細胞培養物を形成し得る密度であれば特に限定されないが、好ましい態様において、細胞集団はコンフルエントに達する密度またはそれ以上の密度で播種される。本開示において、「コンフルエントに達する密度」とは、細胞を播種した際に、播種された細胞により、培養容器の接着表面一面が隙間なく覆われることが想定される程度の密度を指す。例えば、播種した際に、細胞が互いに接触することが想定される程度の密度、接触阻害が発生する密度、または接触阻害により細胞の増殖を実質的に停止する密度である。
【００３４】
細胞集団の播種密度の非限定例は、約７．１×１０５個／ｃｍ２〜約３．０×１０６個／ｃｍ２、約７．３×１０５個／ｃｍ２〜約２．８×１０６個／ｃｍ２、約７．５×１０５個／ｃｍ２〜約２．５×１０６個／ｃｍ２、約７．５×１０５個／ｃｍ２〜約３．０×１０６個／ｃｍ２、約７．８×１０５個／ｃｍ２〜約２．３×１０６個／ｃｍ２、約８．０×１０５個／ｃｍ２〜約２．０×１０６個／ｃｍ２、約８．５×１０５個／ｃｍ２〜約１．８×１０６個／ｃｍ２、約９．０×１０５個／ｃｍ２〜約１．６×１０６個 ／ｃｍ２などの密度を含む。なお、これらの密度は、特段の記載がない限り、細胞集団に含有される全ての細胞の密度であることとする。
【００３５】
さらに別の態様において、播種は、成長因子を実質的に含まない細胞培養液において、細胞集団に含まれ得る少なくとも１種のシート形成細胞が実質的に増殖しない密度で行うことができる。かかる態様において、細胞集団に含まれ得る他の細胞は、増殖抑制を受けながらも、増殖可能な密度であり得る。
本開示の方法に用いられる培養基材は、上述のとおりである。好ましい一態様において、培養基材は血清で被覆されていてよい。別の好ましい一態様において、培養基材は温度応答性材料で被覆されていてよい。さらに好ましい一態様において、培養基材は温度応答性材料及び血清で被覆されていてよい。
【００３６】
（ｉｉ）において、播種された細胞集団は、細胞培養液中でインキュベートしてシート化され、シート状細胞培養物として形成される。
播種した細胞のシート化は、既知の任意の手法および条件で行うことができる。かかる手法の非限定例は、例えば、特許文献１、WO 2014/185517などに記載されている。細胞のシート化は、細胞同士が接着分子や、細胞外マトリックスなどの細胞間接着機構を介して互いに接着することにより達成されると考えられている。したがって、播種した細胞のシート化は、例えば、細胞を、細胞間接着を形成する条件下で培養することにより達成することができる。かかる条件は、細胞間接着を形成することができればいかなるものであってもよいが、通常は一般的な細胞培養条件と同様の条件であれば細胞間接着を形成することができる。かかる条件としては、例えば、約３７℃、５％ＣＯ２での培養が挙げられる。また、培養は通常の圧力下（大気圧下、非加圧下）で行うことができる。培養は任意の大きさおよび形状の容器で行うことができる。シート状細胞培養物の大きさや形状は、培養容器の細胞付着面の大きさ・形状を調整すること、または、培養容器の細胞付着面に、所望の大きさ・形状の型枠を設置し、その内部で細胞を培養することなどにより任意に調節することができる。本明細書において、播種した細胞をシート化するための培養を、「シート化培養」と称することもある。シート化培養により、培養基材上（培養容器内）のシート状細胞培養物の厚みは減少する。すなわち、播種後、細胞が沈降した後、その後のシート化により培養基材上で細胞層の厚みは減少するが、シート状細胞培養物は培養基材からの剥離により収縮し、再び厚みを増す。シート化による厚みの減少は、播種直後の細胞層の厚みを１００％とすると、約９０％〜約１０％程度である。培養基材からの剥離によりシート状細胞培養物はふたたび収縮し、その際のシート状細胞培養物の厚みの増加率は剥離直後の細胞層の厚みを１００％とすると、約１２０％〜３００％である。
【００３７】
シート化のためのインキュベート時間は、シートが形成され得る時間であれば特に限定されない。シートが形成され得る時間は、播種された細胞集団に含有される細胞の種類（特にシート形成細胞の種類）や細胞の状態により変化し得るが、例えばシート形成細胞として骨格筋芽細胞を含む細胞集団を播種した場合、２時間程度でシートが形成され得る。したがって一態様において、シート化のためのインキュベート時間は、２時間以上であり得る。
【００３８】
上述のとおり本発明者らは、シート状細胞培養物が形成された後、形成されたシート状細胞培養物が自然に培養基材から剥離する前に人為的に剥離することにより、剥離後遊離したシート状細胞培養物に癒着防止の処理を施すことで、製造されたシート状細胞培養物を高品質に保つことが可能であることを見出したものである。したがってシート化のためのインキュベートは、シート状細胞培養物が自然剥離されるより前に終了される。インキュベート開始から自然剥離が開始されるまでの時間は、播種された細胞集団に含有される細胞の種類（特にシート形成細胞の種類）や細胞の状態により変化し得るが、例えばシート形成細胞として骨格筋芽細胞を含む細胞集団を播種した場合、６〜１２時間程度で自然剥離が生じる場合が多い。したがって本開示の一態様において、シート化のためのインキュベート時間の上限は１２時間、１１．５時間、１１時間、１０時間、９時間、８時間、７時間、６時間、５時間または４時間であり得る。
【００３９】
したがって本開示の製造方法において、シート化のためのインキュベート時間は、２〜１２時間、２〜１１．５時間、２〜１１時間、２〜１０時間、２〜９時間、２〜８時間、２〜７時間、２〜６時間、２〜５時間または２〜４時間、好ましくは２〜４時間または２〜６時間であり得る。本開示の製造方法は、前記インキュベート時間によりインキュベートを行なった後は、さらなるインキュベートは行なわず、シート状細胞培養物を剥離するステップを行なう。      
【００４０】
培養に用いる細胞培養液（単に「培養液」もしくは「培地」と称することもある）は、細胞の生存を維持できるものであれば特に限定されないが、典型的には、アミノ酸、ビタミン類、電解質を主成分としたものが利用できる。本開示の一態様において、培養液は、細胞培養用の基礎培地をベースにしたものである。かかる基礎培地には、限定されずに、例えば、ＤＭＥＭ、ＭＥＭ、Ｆ１２、ＤＭＥＭ／Ｆ１２、ＤＭＥ、ＲＰＭＩ１６４０、ＭＣＤＢ（ＭＣＤＢ１０２、１０４、１０７、１２０、１３１、１５３、１９９など）、Ｌ１５、ＳｋＢＭ、ＲＩＴＣ８０−７などが含まれる。これらの基礎培地の多くは市販されており、その組成も公知となっている。
基礎培地は、標準的な組成のまま（例えば、市販されたままの状態で）用いてもよいし、細胞種や細胞条件に応じてその組成を適宜変更してもよい。したがって、本開示に用いる基礎培地は、公知の組成のものに限定されず、１または２以上の成分が追加、除去、増量もしくは減量されたものを含む。
【００４１】
基礎培地に含まれるアミノ酸としては、限定されずに、例えば、Ｌ−アルギニン、Ｌ−シスチン、Ｌ−グルタミン、グリシン、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−リジン、Ｌ−メチオニン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−セリン、Ｌ−トレオニン、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−チロシン、Ｌ−バリンなどが、ビタミン類としては、限定されずに、例えば、Ｄ−パントテン酸カルシウム、塩化コリン、葉酸、ｉ−イノシトール、ナイアシンアミド、リボフラビン、チアミン、ピリドキシン、ビオチン、リポ酸、ビタミンＢ１２、アデニン、チミジンなどが、そして、電解質としては、限定されずに、例えば、ＣａＣｌ２、ＫＣｌ、ＭｇＳＯ４、ＮａＣｌ、ＮａＨ２ＰＯ４、ＮａＨＣＯ３、Ｆｅ（ＮＯ３）３、ＦｅＳＯ４、ＣｕＳＯ４、ＭｎＳＯ４、Ｎａ２ＳｉＯ３、（ＮＨ４）６Ｍｏ７Ｏ２４、ＮａＶＯ３、ＮｉＣｌ２、ＺｎＳＯ４などがそれぞれ含まれる。基礎培地には、これらの成分のほか、Ｄ−グルコースなどの糖類、ピルビン酸ナトリウム、フェノールレッドなどのｐＨ指示薬、プトレシンなどを含んでもよい。
【００４２】
本開示の一態様において、基礎培地に含まれるアミノ酸の濃度は、Ｌ−アルギニン：約６３．２ｍｇ／Ｌ〜約８４ｍｇ／Ｌ、Ｌ−シスチン：約３５ｍｇ／Ｌ〜約６３ｍｇ／Ｌ、Ｌ−グルタミン：約４．４ｍｇ／Ｌ〜約５８４ｍｇ／Ｌ、グリシン：約２．３ｍｇ／Ｌ〜約３０ｍｇ／Ｌ、Ｌ−ヒスチジン：約４２ｍｇ／Ｌ、Ｌ−イソロイシン：約６６ｍｇ／Ｌ〜約１０５ｍｇ／Ｌ、Ｌ−ロイシン：約１０５ｍｇ／Ｌ〜約１３１ｍｇ／Ｌ、Ｌ−リジン：約１４６ｍｇ／Ｌ〜約１８２ｍｇ／Ｌ、Ｌ−メチオニン：約１５ｍｇ／Ｌ〜約３０ｍｇ／Ｌ、Ｌ−フェニルアラニン：約３３ｍｇ／Ｌ〜約６６ｍｇ／Ｌ、Ｌ−セリン：約３２ｍｇ／Ｌ〜約４２ｍｇ／Ｌ、Ｌ−トレオニン：約１２ｍｇ／Ｌ〜約９５ｍｇ／Ｌ、Ｌ−トリプトファン：約４．１ｍｇ／Ｌ〜約１６ｍｇ／Ｌ、Ｌ−チロシン：約１８．１ｍｇ／Ｌ〜約１０４ｍｇ／Ｌ、Ｌ−バリン：約９４ｍｇ／Ｌ〜約１１７ｍｇ／Ｌである。
また、本開示の一態様において、基礎培地に含まれるビタミン剤の濃度は、Ｄ−パントテン酸カルシウム：約４ｍｇ／Ｌ〜約１２ｍｇ／Ｌ、塩化コリン：約４ｍｇ／Ｌ〜約１４ｍｇ／Ｌ、葉酸：約０．６ｍｇ／Ｌ〜約４ｍｇ／Ｌ、ｉ−イノシトール：約７．２ｍｇ／Ｌ、ナイアシンアミド：約４ｍｇ／Ｌ〜約６．１ｍｇ／Ｌ、リボフラビン：約０．００３８ｍｇ／Ｌ〜約０．４ｍｇ／Ｌ、チアミン：約３．４ｍｇ／Ｌ〜約４ｍｇ／Ｌ、ピリドキシン：約２．１ｍｇ／Ｌ〜約４ｍｇ／Ｌである。
【００４３】
細胞培養液は、上記のほか、血清、成長因子、ステロイド剤成分、セレン成分などの１種または２種以上の添加物を含んでもよい。しかし、これらの成分が自己由来のものではない場合は、臨床においてはレシピエントに対するアナフィラキシーショック等の副作用要因となり得ることが否定できない製造工程由来不純物となり得るため、臨床への適用にあたってはかかる非自己由来成分を排除することが望ましい場合がある。したがって、本開示の好ましい態様において、細胞培養液は、これらの非自己由来の添加物の少なくとも１種の有効量を含まない。また、本開示のより好ましい態様において、細胞培養液は、これらの非自己由来の添加物の少なくとも１種を実質的に含まない。さらに、本開示の特に好ましい態様において、細胞培養液は、非自己由来の添加物を実質的に含まない。一態様において、細胞培養液は、基礎培地のみを含んでもよい。
【００４４】
本開示の一態様において、細胞培養液は血清を実質的に含まない。血清を実質的に含まない細胞培養液のことを、本明細書中で「無血清培地」と呼ぶこともある。ここで、「血清を実質的に含まない」とは、培養液における血清の含量が、シート状細胞培養物を生体に適用した場合に悪影響を及ぼさない程度（例えば、シート状細胞培養物中の血清アルブミン含量が約５０ｎｇ未満となる量）であること、好ましくは、培養液にこれらの物質を積極的に添加しないことを意味する。本開示においては、移植時の副作用を回避するために、細胞培養液は異種血清を実質的に含まないことが好ましく、非自己血清を実質的に含まないことがさらに好ましい。
【００４５】
本開示の一態様において、細胞培養液は血清を含む。血清は、同種血清であっても異種血清であってもよい。特定の態様において、細胞培養液は自己血清を含む。血清でコートされた培養基材上で細胞を培養する場合、細胞培養液に含まれる血清（細胞の培養に用いる血清）は、培養基材をコートするために用いる血清と同じであっても異なってもよい。一態様において、細胞培養液に含まれる血清は、培養基材をコートするために用いる血清と同一であり、特定の態様において、該血清は自己血清である。血清は、本開示の製造方法に用いるためのものであってもよい。例えば、血清は、細胞の培養に用いるためのものであっても、培養基材をコートするためのものであってもよい。
【００４６】
本開示の一態様において、細胞培養液は有効量の成長因子を含まない。ここで、「有効量の成長因子」とは、細胞の増殖を、成長因子がない場合に比べて、有意に促進する成長因子の量、または、便宜的に、当該技術分野において細胞の増殖を目的として通常添加する量を意味する。細胞増殖促進の有意性は、例えば、当該技術分野で知られた任意の統計学的手法、例えば、ｔ検定などにより適宜評価することができ、また、通常の添加量は当該技術分野の種々の公知文献から知ることができる。具体的には、細胞培養におけるＥＧＦの有効量は、例えば約０．００５μｇ／ｍＬ以上である。
【００４７】
したがって、「有効量の成長因子を含まない」とは、本開示における培養液における成長因子の濃度がかかる有効量未満であることを意味する。例えば、細胞培養におけるＥＧＦの培養液中の濃度は、好ましくは約０．００５μｇ／ｍＬ未満、より好ましくは約０．００１μｇ／ｍＬ未満である。本開示の好ましい態様においては、培養液における成長因子の濃度は、生体における通常の濃度未満である。かかる態様においては、例えば、細胞培養におけるＥＧＦの培養液中の濃度は、好ましくは約５．５ｎｇ／ｍＬ未満、より好ましくは約１．３ｎｇ／ｍＬ未満、さらに好ましくは、約０．５ｎｇ／ｍＬ未満である。さらに好ましい態様において、本開示における培養液は、成長因子を実質的に含まない。ここで、実質的に含まないとは、培養液中の成長因子の含量が、シート状細胞培養物を生体に適用した場合に悪影響を及ぼさない程度であること、好ましくは、培養液に成長因子を積極的に添加しないことを意味する。したがって、この態様においては、培養液は、その中の他の成分、例えば血清などに含まれる以上の濃度の成長因子を含まない。
【００４８】
本開示の一態様において、細胞培養液は、ステロイド剤成分を実質的に含まない。ここで「ステロイド剤成分」は、ステロイド核を有する化合物のうち、生体に、副腎皮質機能不全、クッシング症候群などの悪影響を及ぼし得るものをいう。かかる化合物としては、限定されずに、例えば、コルチゾール、プレドニゾロン、トリアムシノロン、デキサメタゾン、ベタメタゾン等が含まれる。したがって、「ステロイド剤成分を実質的に含まない」とは、培養液におけるこれらの化合物の含量が、シート状細胞培養物を生体に適用した場合に悪影響を及ぼさない程度であること、好ましくは、培養液にこれらの化合物を積極的に添加しないこと、すなわち、培養液が、その中の他の成分、例えば血清などに含まれる以上の濃度のステロイド剤成分を含まないことを意味する。
【００４９】
本開示の一態様において、細胞培養液は、セレン成分を実質的に含まない。ここで「セレン成分」は、セレン分子、およびセレン含有化合物、特に、生体内でセレン分子を遊離し得るセレン含有化合物、例えば、亜セレン酸などを含む。したがって、「セレン成分を実質的に含まない」とは、培養液におけるこれらの物質の含量が、シート状細胞培養物を生体に適用した場合に悪影響を及ぼさない程度であること、好ましくは、培養液にこれらの物質を積極的に添加しないこと、すなわち、培養液が、その中の他の成分、例えば血清などに含まれる以上の濃度のセレン成分を含まないことを意味する。具体的には、例えば、ヒトの場合、培養液中のセレン濃度は、ヒト血清中の正常値（例えば、１０．６μｇ／ｄＬ〜１７．４μｇ／ｄＬ）に、培地中に含まれるヒト血清の割合を乗じた値よりも低い（すなわち、ヒト血清の含量が約１０％であれば、セレン濃度は、例えば、約１．０μｇ／ｄＬ〜約１．７μｇ／ｄＬ未満である）。
【００５０】
本開示の上記好ましい態様においては、生体に適用する細胞培養物を作製する場合に従来必要であった、成長因子、ステロイド剤成分、異種血清成分などの製造工程由来不純物を、洗浄などにより除去するステップが不要となる。したがって、本開示の方法の一態様は、この製造工程由来不純物を除去するステップを含まない。
ここで、「製造工程由来不純物」とは、典型的には、製造各工程に由来する以下に列挙するものが含まれる。すなわち、細胞基材に由来するもの（例えば、宿主細胞由来タンパク質、宿主細胞由来ＤＮＡ）、細胞培養液に由来するもの（例えば、インデューサー、抗生物質、培地成分）、あるいは細胞培養以降の工程である目的物質の抽出、分離、加工、精製工程に由来するものなどである（例えば、医薬審発第５７１号参照）。
【００５１】
（ｉｉｉ）において、形成されたシート状細胞培養物が、培養基材から剥離される。
シート状細胞培養物の培養基材からの剥離は、シート状細胞培養物が少なくとも部分的に、シート構造を保ったまま、足場となっている培養基材から遊離（剥離）できれば特に限定されず、例えば、タンパク質分解酵素（例えばトリプシンなど）による酵素処理および／またはピペッティングなどの機械的処理によって行うことができる。また、細胞を、刺激、例えば、温度や光に応答して物性が変化する材料で表面を被覆した培養基材上で培養して細胞培養物を形成した場合には、所定の刺激を加えることで、非酵素的に遊離することもできる。
【００５２】
例えば、細胞を温度応答性培養皿で培養して細胞培養物を形成した場合には、温度を温度応答性材料の水に対する下限臨界溶液温度（ＬＣＳＴ）以下または上限臨界溶液温度（ＵＣＳＴ）以上とする温度処理により、シート状細胞培養物を非酵素的に遊離することができる。かかる温度処理は、限定されずに、例えば、形成されたシート状細胞培養物が付着した培養基材を、ＬＣＳＴより高い温度の培養環境（例えば、約３７℃の温度のインキュベーター内など）から、ＬＣＳＴ以下の環境（例えば、インキュベーター外の室温環境など）に移行させることなどにより達成することができる。ＬＣＳＴ以下の環境への移行は、限定されずに、例えば、形成されたシート状細胞培養物が存在するＬＣＳＴより高い温度の培養液を、ＬＣＳＴ以下の温度の媒体（例えば、緩衝液（ＰＢＳ、ＨＢＳＳ等）や、培養液などの液体等）に置換することなどにより達成することができる。したがって、上記緩衝液等の媒体は、本開示の製造方法において、シート状細胞培養物を培養基材から非酵素的に遊離するために用いることができる。
【００５３】
（ｉｉｉ）の工程により剥離されたシート状細胞培養物は、剥離前と比較して収縮し、面積が小さくなる。本開示の製造方法により製造されたシート状細胞培養物は、剥離後に収縮しにくく、より大きな面積を有するという特徴がある。本開示の一態様において、剥離後のシート状細胞培養物は、剥離前のシート状細胞培養物の面積（すなわち培養基材の面積）に対して、約２０％以上、例えば約２０％、約２５％、約３０％、約３１％、約３２％、約３３％、約３４％、約３５％、約３６％、約３７％、約３８％、約３９％、約４０％、約５０％、約６０％の面積を有し、好ましくは約３５％以上、例えば約３５％、約３６％、約３７％、約３８％、約３９％、約４０％、約５０％、約６０％の面積を有する。
【００５４】
剥離後のシート状細胞培養物の面積は、面積５６．７ｃｍ２（直径１０ｃｍ）の培養皿でシート化した場合、剥離後に１８００ｍｍ２以上、１８４７ｍｍ２以上または１９２３ｍｍ２以上であってよい。上限としては特に制限されないが、２６００ｍｍ２、２５０５ｍｍ２、２４６２ｍｍ２であってよい。具体的には、剥離後の面積は１８００ｍｍ２〜２６００ｍｍ２、１８４７ｍｍ２〜２６００ｍｍ２、１９２３ｍｍ２〜２６００ｍｍ２、１９２３ｍｍ２〜２５０５ｍｍ２のいずれかであってよい。面積８．８ｃｍ２（直径３．５ｃｍ）の培養皿でシート化した場合、または面積３．５ｃｍ２（１２ウエル）の培養皿でシート化した場合、各々面積５６．７ｃｍ２（直径１０ｃｍ）の培養皿で剥離後に得られたシート状細胞培養物の面積に比例する面積のシート状細胞培養物を得ることができる。
【００５５】
シート状細胞培養物剥離後の収縮は、シート状細胞培養物を構成する細胞の細胞間接着力の大きさに影響されるものと推測される。したがって、ある程度シート化のためのインキュベートの時間を長くした場合、例えばシート状細胞培養物の自然剥離が起こる程度の時間までインキュベートした場合、シート状細胞培養物の剥離後収縮率は最大に達するものと考えられる。したがって、剥離後収縮率が最大になった場合、すなわち剥離後のシート状細胞培養物の面積が最小になった場合の面積を基準として、シート状細胞培養物の面積を規定してもよい。本開示の一態様において、剥離後のシート状細胞培養物の最小面積（すなわち自然剥離が起こる程度の時間までインキュベートした場合の剥離後シート状細胞培養物の面積）を１とした場合の（ｉｉｉ）で得られるシート状細胞培養物の面積は、約１．０４〜約１．４、約１．１〜約１．４または約１．３〜約１．３５であってよい。
【００５６】
したがって特に好ましい一態様において、本開示の製造方法は、以下を含む：
（ｉ）筋芽細胞または心筋細胞を含む細胞集団を、約７．１×１０５個／ｃｍ２〜約３．０×１０６個／ｃｍ２、約７．３×１０５個／ｃｍ２〜約２．８×１０６個／ｃｍ２、約７．５×１０５個／ｃｍ２〜約２．５×１０６個／ｃｍ２、約７．５×１０５個／ｃｍ２〜約３．０×１０６個／ｃｍ２、約７．８×１０５個／ｃｍ２〜約２．３×１０６個／ｃｍ２、約８．０×１０５個／ｃｍ２〜約２．０×１０６個／ｃｍ２、約８．５×１０５個／ｃｍ２〜約１．８×１０６個／ｃｍ２または約９．０×１０５個／ｃｍ２〜約１．６×１０６個／ｃｍ２のいずれかの播種密度で培養基材に播種すること、、
（ｉｉ）上記（ｉ）で播種された細胞集団を細胞培養液中で２〜１２時間、２〜１１．５時間、２〜１１時間、２〜１０時間、２〜９時間、２〜８時間、２〜７時間、２〜６時間、２〜５時間または２〜４時間インキュベートしてシート化し、シート状細胞培養物を形成すること、および
（ｉｉｉ）上記（ｉｉ）で形成されたシート状細胞培養物を培養基材から剥離すること、ここで剥離されたシート状細胞培養物の面積が、自然剥離が起こる程度の時間までインキュベートした場合の剥離後シート状細胞培養物の面積を１とした場合、約１．０４〜約１．４、約１．１〜約１．４または約１．３〜約１．３５となる。
【００５７】
本開示の製造方法は、（ｉ）の前に、細胞（細胞集団）を凍結するステップと凍結細胞を解凍するステップとを含んでもよい。細胞の凍結は、既知の任意の手法により行うことができる。かかる手法としては、限定されずに、例えば、容器内の細胞を、凍結手段、例えば、フリーザー、ディープフリーザー、低温の媒体（例えば、液体窒素等）に供することなどが挙げられる。凍結手段の温度は、容器内の細胞集団の一部、好ましくは全体を凍結させ得る温度であれば特に限定されないが、典型的には約０℃以下、好ましくは約−２０℃以下、より好ましくは約−４０℃以下、さらに好ましくは約−８０℃以下である。また、凍結操作における冷却速度は、凍結解凍後の細胞の生存率や機能を大きく損なうものでなければ特に限定されないが、典型的には４℃から冷却を始めて約−８０℃に達するまで約１時間〜約５時間、好ましくは約２時間〜約４時間、特に約３時間かける程度の冷却速度である。具体的には、例えば、約０．４６℃／分の速度で冷却することができる。かかる冷却速度は、所望の温度に設定した凍結手段に、細胞を含む容器を直接、または、凍結処理容器に収容して供することにより達成することができる。凍結処理容器は、容器内の温度の下降速度を所定の速度に制御する機能を有していてもよい。かかる凍結処理容器としては、既知の任意のもの、例えば、BICELL(R)（日本フリーザー）、プログラムフリーザーなどを用いることができる。
【００５８】
凍結操作は、細胞を培養液や生理緩衝液などに浸漬させたまま行ってもよいが、細胞を凍結・解凍操作から保護するための凍結保護剤を培養液に加えたり、培養液を凍結保護剤を含む凍結保存液と置換するなどの処理を施したうえで行ってもよい。したがって、凍結ステップを含む本開示の製造方法は、培養液に凍結保護剤を添加するステップ、または、培養液を凍結保存液に置換するステップをさらに含んでもよい。培養液を凍結保存液に置換する場合、凍結時に細胞が浸漬している液に有効濃度の凍結保護剤が含まれていれば、培養液を実質的に全て除去してから凍結保存液を添加しても、培養液を一部残したまま凍結保存液を添加してもよい。ここで、「有効濃度」とは、凍結保護剤が、毒性を示すことなく、凍結保護効果、例えば、凍結保護剤を用いない場合と比べた、凍結解凍後の細胞の生存率、活力、機能などの低下抑制効果を示す濃度を意味する。かかる濃度は当業者に知られているか、ルーチンの実験などにより適宜決定することができる。
【００５９】
凍結保護剤は、細胞に対して凍結保護作用を示すものであれば特に限定されずに、例えば、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、グリセロール、エチレングリコール、プロピレングリコール、セリシン、プロパンジオール、デキストラン、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール、ヒドロキシエチルデンプン、コンドロイチン硫酸、ポリエチレングリコール、ホルムアミド、アセトアミド、アドニトール、ペルセイトール、ラフィノース、ラクトース、トレハロース、スクロース、マンニトールなどを含む。凍結保護剤は、単独で用いても、２種または３種以上を組み合わせて用いてもよい。
【００６０】
培養液への凍結保護剤の添加濃度、または、凍結保存液中の凍結保護剤の濃度は、上記で定義した有効濃度であれば特に限定されず、典型的には、例えば、培養液または凍結保存液全体に対して約２％〜約２０％（ｖ／ｖ）である。しかしながら、この濃度範囲からは外れるが、それぞれの凍結保護剤について知られているか、実験的に決定した代替的な使用濃度を採用することもでき、かかる濃度も本開示の範囲内である。
【００６１】
凍結した細胞を解凍するステップは、既知の任意の細胞解凍手法により行うことができ、典型的には、例えば、凍結した細胞を、解凍手段、例えば、凍結温度より高い温度の固形、液状もしくはガス状の媒体（例えば、水）、ウォーターバス、インキュベーター、恒温器などに供したり、または、凍結した細胞を、凍結温度より高い温度の媒体（例えば、培養液）で浸漬することにより達成されるが、これに限定されない。解凍手段または浸漬媒体の温度は、細胞を所望の時間内に解凍できる温度であれば特に限定されないが、典型的には約４℃〜約５０℃、好ましくは約３０℃〜約４０℃、より好ましくは約３６℃〜約３８℃である。また、解凍時間は、解凍後の細胞の生存率や機能を大きく損なうものでなければ特に限定されないが、典型的には約２分以内であり、特に約２０秒以内とすることで生存率の低下を大幅に抑制することができる。解凍時間は、例えば、解凍手段または浸漬媒体の温度、凍結時の培養液または凍結保存液の容量もしくは組成などを変化させて調節することができる。凍結した細胞は、任意の手法により凍結させた細胞を含み、その非限定例としては、例えば、上記の細胞を凍結するステップにより凍結された細胞などが挙げられる。一態様において、凍結した細胞は、凍結保護剤の存在下で凍結された細胞である。一態様において、凍結した細胞は、本開示の製造方法に用いるためのものである。
【００６２】
本開示の製造方法は、上述の凍結した細胞を解凍するステップの後、かつ、シート状細胞培養物を形成するステップ、好ましくは細胞を培養基材に播種するステップの前に、細胞を洗浄するステップを含んでいてもよい。細胞の洗浄は、既知の任意の手法により行うことができ、典型的には、例えば、細胞を洗浄液（例えば、血清や血清成分（血清アルブミンなど）を含むもしくは含まない、培養液（例えば、培地等）または生理緩衝液（例えば、ＰＢＳ、ＨＢＳＳ等）など）に懸濁し、遠心分離し、上清を廃棄し、沈殿した細胞を回収することにより達成されるが、これに限定されない。細胞を洗浄するステップにおいては、かかる懸濁、遠心分離、回収のサイクルを１回または複数回（例えば、２、３、４、５回など）行ってもよい。本開示の一態様において、細胞を洗浄するステップは、凍結した細胞を解凍するステップの直後に行われる。
【００６３】
本開示の製造方法は、上述の細胞を凍結するステップの前に、細胞を増殖させるステップをさらに含んでもよい。細胞を増殖させるステップは、既知の任意の手法で行ってもよく、当業者は各種細胞の増殖に適した培養条件に精通している。
【００６４】
一態様において、本開示の製造方法は、細胞に遺伝子を導入するステップを含まない。別の態様において、本開示の製造方法は、細胞に遺伝子を導入するステップを含む。導入する遺伝子は、対象とする疾患の処置に有用なものであれば特に限定されず、例えば、ＨＧＦ、ＶＥＧＦなどのサイトカインであってもよい。遺伝子の導入は、リン酸カルシウム法、リポフェクション法、超音波導入法、電気穿孔法、パーティクルガン法、アデノウイルスベクター、レトロウイルスベクターなどのウイルスベクター利用する方法、マイクロインジェクション法などの既知の任意の方法を用いて行うことができる。細胞への遺伝子の導入は、限定されずに、例えば、細胞を凍結するステップの前に行うことができる。
【００６５】
一態様において、本開示の製造方法はその全ステップがin vitroで行われる。別の態様において、本開示の製造方法は、in vivoで行われるステップ、限定されずに、例えば、対象から細胞または細胞の給源となる組織（例えば、横紋筋組織、特に骨格筋組織）を採取するステップを含む。一態様において、本開示の製造方法はその全ステップが無菌条件下で行われる。一態様において、本開示の製造方法は、最終的に得られるシート状細胞培養物が実質的に無菌となるように行われる。一態様において、本開示の製造方法は、最終的に得られるシート状細胞培養物が無菌となるように行われる。
【００６６】
本開示の別の側面は、本開示の製造方法により製造されたシート状細胞培養物に関する。本開示のシート状細胞培養物は、シート状細胞培養物の適用により改善される疾患、例えば、組織の異常に関連する種々の疾患の処置に有用である。したがって、一態様において、本開示のシート状細胞培養物は、シート状細胞培養物の適用により改善される疾患、特に、組織の異常に関連する疾患の処置に用いるためのものである。本開示のシート状細胞培養物は、従来のシート状細胞培養物に比べて高い機械的強度を有する以外は、これと同様の構成細胞固有の性質を有しているため、少なくとも従来の筋芽細胞または線維芽細胞を含むシート状細胞培養物による処置が可能な組織や疾患に適用することができる。処置の対象となる組織としては、限定されずに、例えば、心筋、食道、皮膚、膵臓、骨格筋などが挙げられる。また、処置の対象となる疾患としては、限定されずに、例えば、心疾患（例えば、心筋傷害（心筋梗塞、心外傷）、心筋症など）、食道疾患（例えば、食道手術（食道ガン除去）後の食道の炎症・狭窄の予防など）、皮膚疾患（例えば、皮膚損傷（外傷、熱傷）など）、膵臓疾患（例えば、膵液瘻など）、筋疾患（例えば、筋損傷、筋炎など）が挙げられる。本開示のシート状細胞培養物が上記疾患に有用であることは、例えば、特許文献１、非特許文献１、Tanaka et al., J Gastroenterol. 2013;48(9):1081-9.などに記載されている。本開示のシート状細胞培養物は、注射可能な大きさに断片化し、これを処置が必要な部位に注射することで、単細胞懸濁液による注射よりも高い効果を得ることもできる（Wang et al., Cardiovasc Res. 2008;77(3):515-24）。したがって、本開示のシート状細胞培養物についても、このような利用法が可能である。
【００６７】
一態様において、本開示のシート状細胞培養物は実質的に無菌である。一態様において、本開示のシート状細胞培養物は無菌である。一態様において、本開示のシート状細胞培養物は、遺伝子操作されていない。別の態様において、本開示のシート状細胞培養物は、遺伝子操作されたものである。遺伝子操作は、限定されずに、例えば、シート状細胞培養物の生存性、生着能、機能などを高める遺伝子、および／または、疾患の治療に有用な遺伝子の導入を含む。導入される遺伝子としては、限定されずに、例えば、ＨＧＦ遺伝子、ＶＥＧＦ遺伝子などのサイトカイン遺伝子が挙げられる。
【００６８】
本開示の別の側面は、本開示のシート状細胞培養物を含む、組成物（例えば、医薬組成物等）、移植片および医療製品など（以下、「組成物等」と総称することがある）に関する。
本開示の組成物等は、本開示のシート状細胞培養物に加えて、種々の追加成分、例えば、薬学的に許容し得る担体や、シート状細胞培養物の生存性、生着性および／または機能などを高める成分、対象疾患の処置に有用な他の有効成分などを含んでいてもよい。かかる追加成分としては、既知の任意のものを使用することができ、当業者はこれらの追加成分について精通している。また、本開示の組成物等は、シート状細胞培養物の生存性、生着性および／または機能などを高める成分や、対象疾患の処置に有用な他の有効成分などと併用することができる。一態様において、本開示の組成物等は、シート状細胞培養物の適用により改善される疾患（例えば、組織の異常に関連する疾患など）の処置に用いるためのものである。処置の対象となる組織や疾患は、本開示のシート状細胞培養物について上記したとおりである。
【００６９】
＜２＞本開示の処置方法
本開示の別の側面は、対象においてシート状細胞培養物の適用により改善される疾患（例えば、組織の異常に関連する疾患など）を処置する方法であって、本開示のシート状細胞培養物または組成物等の有効量を、それを必要とする対象に投与することを含む方法に関する（以下、「本開示の処置方法」と称することがある）。本開示の処置方法の対象となる組織や疾患は、本開示のシート状細胞培養物について上記したとおりである。また、本開示の処置方法においては、シート状細胞培養物の生存性、生着性および／または機能などを高める成分や、対象疾患の処置に有用な他の有効成分などを、本開示のシート状細胞培養物または組成物等と併用することができる。
【００７０】
本開示の処置方法は、本開示の製造方法に従って、シート状細胞培養物を製造するステップをさらに含んでもよい。本開示の処置方法は、シート状細胞培養物を製造するステップの前に、対象からシート状細胞培養物を製造するための細胞または細胞の給源となる組織を採取するステップをさらに含んでもよい。一態様において、細胞または細胞の給源となる組織を採取する対象は、シート状細胞培養物または組成物等の投与を受ける対象と同一の個体である。別の態様において、細胞または細胞の供給源となる組織を採取する対象は、シート状細胞培養物または組成物等の投与を受ける対象とは同種の別個体である。別の態様において、細胞または細胞の給源となる組織を採取する対象は、シート状細胞培養物または組成物等の投与を受ける対象とは異種の個体である。
【００７１】
本開示において、用語「対象」は、任意の生物個体、好ましくは動物、さらに好ましくは哺乳動物、さらに好ましくはヒトの個体を意味する。本開示において、対象は健常であっても、何らかの疾患に罹患していてもよいものとするが、シート状細胞培養物の適用により改善される疾患（例えば、組織の異常に関連する疾患など）の処置が企図される場合には、典型的には当該疾患に罹患しているか、罹患するリスクを有する対象を意味する。
【００７２】
また、用語「処置」は、疾患の治癒、一時的寛解または予防などを目的とする医学的に許容される全ての種類の予防的および／または治療的介入を包含するものとする。例えば、「処置」の用語は、シート状細胞培養物の適用により改善される疾患（例えば、組織の異常に関連する疾患など）の進行の遅延または停止、病変の退縮または消失、当該疾患発症の予防または再発の防止などを含む、種々の目的の医学的に許容される介入を包含する。
【００７３】
本開示において、有効量とは、例えば、疾患の発症や再発を抑制し、症状を軽減し、または進行を遅延もしくは停止し得る量（例えば、シート状細胞培養物のサイズや重量、枚数など）であり、好ましくは、当該疾患の発症および再発を予防し、または当該疾患を治癒する量である。また、投与による利益を超える悪影響が生じない量が好ましい。かかる量は、例えば、マウス、ラット、イヌまたはブタなどの実験動物や疾患モデル動物における試験などにより適宜決定することができ、このような試験法は当業者によく知られている。また、処置の対象となる組織病変の大きさは、有効量決定のための重要な指標となり得る。
【００７４】
投与方法としては、典型的には組織への直接的な適用が挙げられるが、シート状細胞培養物の断片を用いる場合には、注射による投与が可能な種々の経路、例えば、静脈内、筋肉内、皮下、局所、動脈内、門脈内、心室内、腹腔内等の経路から投与してもよい。
投与頻度は、典型的には１回の処置につき１回であるが、所望の効果が得られない場合には、複数回投与することも可能である。
【実施例】
【００７５】
本開示を以下の例を参照してより詳細に説明するが、これは本開示の特定の具体例を示すものであり、本開示はこれらに限定されるものではない。【００７６】
例１．シート状細胞培養物の製造
（１）細胞集団の調製
成人大腿部から無菌的に採取した骨格筋組織から得られた細胞を培養フラスコに播種し、筋芽細胞数と線維芽細胞数の比率を調整するために、２０％ＦＢＳを含有するＭＣＤＢ１３１培地中で増殖させた。増殖させた細胞をタンパク質分解酵素液で培養フラスコから剥離させ、回収後、遠心分離により濃縮した。【００７７】
（２）シート状細胞培養物の作製
２０％ヒト血清を含有するＤＭＥＭ／Ｆ１２培地をφ10cm温度応答性培養皿に添加し一晩静置した。その後、添加した培地を廃棄した。
２０％ヒト血清を含有するＤＭＥＭ／Ｆ１２培地１ｍＬあたり細胞を６．０×１０６〜６．１×１０６個懸濁して得た細胞懸濁液を１０ｍＬ、φ１０ｃｍ温度応答性培養皿（UpCell(R)、セルシード製、培養基材の面積：５６．７ｃｍ２）に播種した。播種後、細胞を、３７℃、５％ＣＯ２の条件でインキュベートし、３０分後、１時間後、２時間後、４時間後、５．５時間後、６時間後、１１．５時間後、１２時間後にそれぞれ培養基材からシート状細胞培養物を剥離するステップに供した（ｎ＝３）。【００７８】
結果を図１および下表に示す。図１は各インキュベート時間の後に剥離を行ったシート状細胞培養物の様子を示す写真である。インキュベート時間が２時間以上の場合に、シートが形成され、損傷なく剥離可能であることが確認された。剥離されたシート状細胞培養物について、大きさ（短径および長径）の平均値を計測し、面積を算出した。インキュベート時間を１２時間とした場合の面積を１として、上記各インキュベート時間により得られた剥離シート状細胞培養物の面積比を算出した。
なお、インキュベート時間を１２時間以上とした場合には、剥離したシート状細胞培養物の面積はほぼ変動しない。【００７９】
【表１】
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【００８０】
本明細書に記載された本開示の種々の特徴は様々に組み合わせることができ、そのような組合せにより得られる態様は、本明細書に具体的に記載されていない組合せも含め、すべて本開示の範囲内である。また、当業者は、本開示の精神から逸脱しない多数の様々な改変が可能であることを理解しており、かかる改変を含む均等物も本開示の範囲に含まれる。したがって、本明細書に記載された態様は例示にすぎず、これらが本開示の範囲を制限する意図をもって記載されたものではないことを理解すべきである。
【図１】
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【国際調査報告】
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