(57)【要約】  本発明は、新規キナーゼ阻害剤等の提供、及びかかる阻害剤等を応用した疾患の治療剤や創薬スクリーニング方法等の提供を目的とする。下記、式（Ｉ）で示される化合物、またはその塩は、Ｈｉｐｐｏシグナル伝達経路の主要キナーゼであるＬＡＴＳ（特にＬＡＴＳ２）を含む、複数のキナーゼを阻害することができ、また、細胞増殖の不全を伴う疾患または組織損傷の治療することができる。従って、本発明は、例えば、Ｈｉｐｐｏシグナル伝達経路が関与する細胞機能や疾病等の研究分野において有益である。さらに、かかる疾病等を治療する医療分野において有益である：2019235569.tif 000145 ｛式中、各記号は明細書中で定義される通りである。｝
2019235569.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記、式（Ｉ）で示される化合物またはその塩を含む、キナーゼ阻害剤：
【化１】
2019235569.tif 000117
｛式中、Ｘは、単結合、−ＣＨ２ＣＯＯ−、−ＣＯＮＨ−、または−ＮＨＣＯ−であり、Ｒ１は、置換基を有していてもよい炭素数１〜１０のアルキル基、置換基を有していてもよいアリール基、または−Ｙ−Ｗ−Ｚ−Ａｒであり（式中、Ｙ、およびＺは、単結合、または置換基を有していてもよい炭素数１〜６のアルキレン基であり、Ｗは、酸素原子、硫黄原子またはＮ（Ｒ４）であり、Ｒ４は、水素原子または炭素数１〜６のアルキル基であり、Ａｒは、置換基を有していてもよいアリール基である。）、Ｒ２は、置換基を有していてもよい炭素数１〜６のアルキル基であり、Ｒ３は、水酸基であり、ｎは、０、１または２である。｝。
【請求項２】
キナーゼが、ＣＧＫ２、ＬＡＴＳ２、ＭＳＫ１、ｐ７０Ｓ６Ｋ、ＰＫＡＣα、ＰＫＡＣβ、ＳＧＫ２、ＳＧＫ３からなる群から選択される、請求項１に記載の剤。
【請求項３】
キナーゼが、ＬＡＴＳ２である、請求項２に記載の剤。
【請求項４】
下記、式（Ｉ）で示される化合物またはその塩を含む、Ｈｉｐｐｏシグナル伝達経路阻害剤：
【化２】
2019235569.tif 000118
｛式中、Ｘは、単結合、−ＣＨ２ＣＯＯ−、−ＣＯＮＨ−、または−ＮＨＣＯ−であり、Ｒ１は、置換基を有していてもよい炭素数１〜１０のアルキル基、置換基を有していてもよいアリール基、または−Ｙ−Ｗ−Ｚ−Ａｒであり（式中、Ｙ、およびＺは、単結合、または置換基を有していてもよい炭素数１〜６のアルキレン基であり、Ｗは、酸素原子、硫黄原子またはＮ（Ｒ４）であり、Ｒ４は、水素原子または炭素数１〜６のアルキル基であり、Ａｒは、置換基を有していてもよいアリール基である。）、Ｒ２は、置換基を有していてもよい炭素数１〜６のアルキル基であり、Ｒ３は、水酸基であり、ｎは、０、１または２である。｝。
【請求項５】
下記、式（Ｉ）で示される化合物またはその塩を含む、細胞増殖の不全を伴う疾患または組織損傷の治療剤：
【化３】
2019235569.tif 000119
｛式中、Ｘは、単結合、−ＣＨ２ＣＯＯ−、−ＣＯＮＨ−、または−ＮＨＣＯ−であり、Ｒ１は、置換基を有していてもよい炭素数１〜１０のアルキル基、置換基を有していてもよいアリール基、または−Ｙ−Ｗ−Ｚ−Ａｒであり（式中、Ｙ、およびＺは、単結合、または置換基を有していてもよい炭素数１〜６のアルキレン基であり、Ｗは、酸素原子、硫黄原子またはＮ（Ｒ４）であり、Ｒ４は、水素原子または炭素数１〜６のアルキル基であり、Ａｒは、置換基を有していてもよいアリール基である。）、Ｒ２は、置換基を有していてもよい炭素数１〜６のアルキル基であり、Ｒ３は、水酸基であり、ｎは、０、１または２である。｝。
【請求項６】
細胞増殖の不全を伴う疾患または組織損傷が、ＹＡＰおよび／またはＴＡＺの核内移行の抑制を伴う疾患である、請求項５に記載の剤。
【請求項７】
細胞増殖の不全を伴う疾患または組織損傷が、炎症性疾患、炎症性腸疾患、神経変性疾患、免疫性神経疾患、筋ジストロフィー、ミオパチー、外傷、火傷、薬傷、皮膚潰瘍、外傷性潰瘍、下肢潰瘍、凍傷潰瘍、免疫性潰瘍、帯状疱疹後潰瘍、放射線潰瘍、褥瘡、糖尿病性皮膚潰瘍、巨大色素性母斑、瘢痕、刺青による障害、尋常性白斑、白皮症、脊髄損傷、筋肉損傷、肝不全、薬剤性肝障害、アルコール性肝障害、虚血性肝障害、ウイルス性肝障害、自己免疫性肝障害、急性肝炎、慢性肝炎、肝硬変、皮膚損傷、脳浮腫、心筋梗塞、脳出血、および脳梗塞からなる群から選択される、請求項５に記載の剤。
【請求項８】
下記、式（Ｉ）で示される化合物またはその塩を含む、移植治療用細胞または組織の増殖促進剤：
【化４】
2019235569.tif 000120
｛式中、Ｘは、単結合、−ＣＨ２ＣＯＯ−、−ＣＯＮＨ−、または−ＮＨＣＯ−であり、Ｒ１は、置換基を有していてもよい炭素数１〜１０のアルキル基、置換基を有していてもよいアリール基、または−Ｙ−Ｗ−Ｚ−Ａｒであり（式中、Ｙ、およびＺは、単結合、または置換基を有していてもよい炭素数１〜６のアルキレン基であり、Ｗは、酸素原子、硫黄原子またはＮ（Ｒ４）であり、Ｒ４は、水素原子または炭素数１〜６のアルキル基であり、Ａｒは、置換基を有していてもよいアリール基である。）、Ｒ２は、置換基を有していてもよい炭素数１〜６のアルキル基であり、Ｒ３は、水酸基であり、ｎは、０、１または２である。｝。
【請求項９】
Ｘが、−ＮＨＣＯ−である、請求項１〜８のいずれか一項に記載の剤。
【請求項１０】
Ｒ２が、炭素数１〜６のアルキル基であり、ｎが０である、請求項１〜９のいずれか一項に記載の剤。
【請求項１１】
Ｒ１が、−Ｙ−Ｗ−Ｚ−Ａｒであり、Ｙが、炭素数１〜６のアルキル基を有していてもよいメチレン基であり、Ｗが、Ｎ（Ｒ４）であり、Ｚが、単結合であり、Ａｒが、ハロゲン原子、水酸基、炭素数１〜６のアルキル基または炭素数１〜６のアルコキシ基を有していてもよいアリール基である、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の剤。
【請求項１２】
Ｒ２が、メチル基、エチル基、またはイソブチル基であり、
ｎが０であり、
Ａｒが、水酸基またはメチル基で置換されていてもよいフェニル基であり、
Ｙが、メチル基またはエチル基で置換されていてもよいメチレン基である、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の剤。
【請求項１３】
式（Ｉ）で示される化合物が、以下からなる群より選択される化合物である、請求項１〜１２のいずれか一項記載の剤。
【化５】
2019235569.tif 000121
【化６】
2019235569.tif 000122
【化７】
2019235569.tif 000123
【化８】
2019235569.tif 000124
【化９】
2019235569.tif 000125
【化１０】
2019235569.tif 000126
【化１１】
2019235569.tif 000127
【化１２】
2019235569.tif 000128
【化１３】
2019235569.tif 000129
【請求項１４】
式（Ｉ）で示される化合物が、以下からなる群より選択される化合物のＲ体の光学異性体である、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の剤。
【化１４】
2019235569.tif 000130
【化１５】
2019235569.tif 000131
【化１６】
2019235569.tif 000132
【化１７】
2019235569.tif 000133
【請求項１５】
Ｒ１が、−Ｙ−Ｗ−Ｚ−Ａｒであり、Ｙが、単結合であり、Ｗが、Ｎ（Ｒ４）であり、Ｒ４が、水素原子であり、Ｚが、炭素数１〜６のアルキル基を有していてもよいメチレン基であり、Ａｒが、ハロゲン原子、水酸基、炭素数１〜６のアルキル基または炭素数１〜６のアルコキシ基を有していてもよいアリール基である、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の剤。
【請求項１６】
Ｒ２が、メチル基、エチル基、またはイソブチル基であり、
ｎが０であり、
Ａｒが、水酸基で置換されていてもよいフェニル基であり、
Ｚが、メチル基またはエチル基で置換されていてもよいメチレン基である、請求項１〜１０および１５のいずれか一項に記載の剤。
【請求項１７】
式（Ｉ）で示される化合物が、以下からなる群より選択される化合物である、請求項１〜１０、１５および１６のいずれか一項に記載の剤。
【化１８】
2019235569.tif 000134
【化１９】
2019235569.tif 000135
【化２０】
2019235569.tif 000136
【請求項１８】
式（Ｉ）で示される化合物が、以下の化合物のＲ体の光学異性体である、請求項１〜１２、１５および１６のいずれか一項に記載の剤。
【化２１】
2019235569.tif 000137
【請求項１９】
以下の工程を含む、ＹＡＰおよび／またはＴＡＺの核内移行の亢進を伴う疾患を治療および／または予防するための物質のスクリーニング方法：
（工程１）下記、式（Ｉ）で示される化合物またはその塩を含む培地において細胞を培養する工程:
【化２２】
2019235569.tif 000138
｛式中、Ｘは、単結合、−ＣＨ２ＣＯＯ−、−ＣＯＮＨ−、または−ＮＨＣＯ−であり、Ｒ１は、置換基を有していてもよい炭素数１〜１０のアルキル基、置換基を有していてもよいアリール基、または−Ｙ−Ｗ−Ｚ−Ａｒであり（式中、Ｙ、およびＺは、単結合、または置換基を有していてもよい炭素数１〜６のアルキレン基であり、Ｗは、酸素原子、硫黄原子またはＮ（Ｒ４）であり、Ｒ４は、水素原子または炭素数１〜６のアルキル基であり、Ａｒは、置換基を有していてもよいアリール基である。）、Ｒ２は、置換基を有していてもよい炭素数１〜６のアルキル基であり、Ｒ３は、水酸基であり、ｎは、０、１または２である。｝；
（工程２）被検物質の存在下、(工程１)で得られた細胞においてＹＡＰおよび／またはＴＡＺの細胞核における存在量を測定する工程；
（工程３）（工程２）で測定されたＹＡＰおよび／またはＴＡＺの細胞核における存在量が、前記被検物質の非存在下における存在量と比較して減少している場合に、前記被検物質をＹＡＰおよび／またはＴＡＺの核内移行の亢進を伴う疾患を治療および／または予防するための物質と判断する工程。
【請求項２０】
下記、式（Ｉ）で示される化合物の光学活性体、またはその塩：
【化２３】
2019235569.tif 000139
｛式中、Ｘは、単結合、−ＣＨ２ＣＯＯ−、−ＣＯＮＨ−、または−ＮＨＣＯ−であり、Ｒ１は、置換基を有していてもよい炭素数１〜１０のアルキル基、置換基を有していてもよいアリール基、または−Ｙ−Ｗ−Ｚ−Ａｒであり（式中、Ｙ、およびＺは、単結合、または置換基を有していてもよい炭素数１〜６のアルキレン基であり、Ｗは、酸素原子、硫黄原子またはＮ（Ｒ４）であり、Ｒ４は、水素原子または炭素数１〜６のアルキル基であり、Ａｒは、置換基を有していてもよいアリール基である。）、Ｒ２は、置換基を有していてもよい炭素数１〜６のアルキル基であり、Ｒ３は、水酸基であり、ｎは、０、１または２である（ただし、Ｘが−ＮＨＣＯ−であり、Ｒ２がエチル基であり、ｎが０であるとき、Ｒ１は、−ＣＨ２−ＮＨ−Ｃ６Ｈ５ではない。）。｝。
【請求項２１】
Ｘが、−ＮＨＣＯ−である、請求項２０に記載の光学活性体、またはその塩。
【請求項２２】
Ｒ２が、炭素数１〜６のアルキル基であり、ｎが０である、請求項２０または２１に記載の光学活性体、またはその塩。
【請求項２３】
Ｒ１が、−Ｙ−Ｗ−Ｚ−Ａｒであり、Ｙが、炭素数１〜６のアルキル基を有するメチレン基であり、Ｗが、Ｎ（Ｒ４）であり、Ｚが、単結合であり、Ａｒが、ハロゲン原子、水酸基、炭素数１〜６のアルキル基または炭素数１〜６のアルコキシ基を有していてもよいアリール基である、請求項２０〜２２のいずれか一項に記載の光学活性体またはその塩。
【請求項２４】
光学活性体がＲ体である、請求項２０〜２３のいずれか一項に記載の光学活性体、またはその塩。
【請求項２５】
式（Ｉ）で示される化合物が、以下からなる群より選択される化合物である、請求項２０〜２４のいずれか一項に記載の光学活性体、またはその塩。
【化２４】
2019235569.tif 000140
【化２５】
2019235569.tif 000141
【化２６】
2019235569.tif 000142
【化２７】
2019235569.tif 000143
【請求項２６】
Ｒ１が、−Ｙ−Ｗ−Ｚ−Ａｒであり、Ｙが、単結合であり、Ｗが、Ｎ（Ｒ４）であり、Ｒ４が、水素原子であり、Ｚが、炭素数１〜６のアルキル基を有するメチレン基であり、Ａｒが、ハロゲン原子、水酸基、炭素数１〜６のアルキル基または炭素数１〜６のアルコキシ基を有していてもよいアリール基である、請求項２０〜２２のいずれか一項に記載の光学活性体、またはその塩。
【請求項２７】
光学活性体がＲ体である、請求項２０〜２２、および２６のいずれか一項に記載の光学活性体、またはその塩。
【請求項２８】
式（Ｉ）で示される化合物が、以下の化合物である、請求項２０〜２２、２６、および２７のいずれか一項に記載の光学活性体、またはその塩。
【化２８】
2019235569.tif 000144
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、キナーゼ阻害剤、Ｈｉｐｐｏシグナル伝達経路阻害剤、細胞増殖の不全を伴う疾患または組織損傷の治療剤、移植治療用細胞または組織の増殖促進剤、およびＹＡＰおよび／またはＴＡＺの核内移行の亢進を伴う疾患を治療及び／または予防するための物質のスクリーニング方法等に関する。
【背景技術】
【０００２】
キナーゼ（タンパク質リン酸化酵素、プロテインキナーゼ）は、タンパク質のセリン、スレオニン、あるいはチロシンの水酸基をリン酸化する酵素であり、細胞の増殖や分化等のシグナル伝達を担う酵素群である。キナーゼをコードする遺伝子としては、これまでに５００種以上がクローニングされている。そして、プロテインキナーゼは細胞内のいたる所に存在し、細胞の増殖や分化或いは機能発現等の調節や制御に深く関与している（非特許文献１）。【０００３】
また、多数の疾患において異常なプロテインキナーゼ活性が確認されており、プロテインキナーゼ活性を阻害することによる疾患の治療も行われている（非特許文献２）。例えば、細胞の癌化に関与する癌遺伝子の多くがプロテインキナーゼをコードしていることが知られており、プロテインキナーゼ阻害剤であるグリベック（Ｇｌｅｅｖｅｃ）は慢性骨髄性白血病治療薬として（非特許文献３）、ハーセプチン（Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ）は乳癌治療薬として販売されている（特許文献１）。【０００４】
ＬＡＴＳ１或いはＬＡＴＳ２（Ｌａｒｇｅ ｔｕｍｏｒ ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒ １或いは２）は、Ｈｉｐｐｏシグナル伝達経路を構成する主要因子のプロテインキナーゼである（特許文献２、非特許文献４、５）。本伝達経路は、細胞密度が上昇してｃｏｎｔａｃｔ  ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎがかかるとき、あるいは、活性酸素、ＤＮＡ損傷などにより細胞が傷害されるときに活性化することが知られている（非特許文献６、７、８）。本伝達経路が活性化された際には、ＬＡＴＳが転写共役因子であるＹＡＰ（Ｙｅｓ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ）あるいはＴＡＺ（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ ｃｏ−ａｃｔｉｖａｔｏｒ ｗｉｔｈ ＰＤＺ−ｂｉｎｄｉｎｇ ｍｏｔｉf）をリン酸化する。リン酸化されたＹＡＰあるいはＴＡＺは細胞核から細胞質へと移行し、タンパク質分解を受けるため、ＹＡＰあるいはＴＡＺのターゲット遺伝子の発現が抑制される。ＹＡＰによる発現調節を受ける遺伝子の例としては、ＣＣＤＮ１、ＣＴＧＦ、ＢＩＲＣ２、ＣＹＲ６１、ＡＭＯＴＬ２、ＴＧＦＢ２などが知られている（非特許文献９、１０、１１、１２）。Ｈｉｐｐｏシグナル伝達経路の活性化はこれらの遺伝子の発現抑制につながり、細胞増殖抑制、細胞死誘導を引き起こす。【０００５】
Ｈｉｐｐｏシグナル伝達経路は幹細胞の自己複製・分化を制御することが知られている（非特許文献１３）。また、Ｈｉｐｐｏシグナル伝達経路は皮膚、腸管や神経の維持に必要であり、ＹＡＰが正常に機能しないと、組織損傷時の修復が阻害される（非特許文献１４）。さらに、Ｈｉｐｐｏシグナル伝達経路の欠失は心筋梗塞後の収縮期心不全を回復させることが報告されている（非特許文献１５）。このように、Ｈｉｐｐｏシグナル伝達経路は細胞、組織、臓器の増殖、維持や回復を制御しているため、Ｈｉｐｐｏシグナル伝達経路の阻害剤或いはＹＡＰ及びＴＡＺの活性化剤は細胞増殖の不全によって引き起こされる疾患の治療薬として期待できる。このような疾患の例としては、火傷、外傷、筋委縮、虚血性の疾患、神経変性疾患（例えばアルツハイマーやパーキンソンやハンチントン病）などが挙げられる。Ｈｉｐｐｏシグナル伝達経路の阻害剤の例としては、ＭＳＴ１の阻害剤としてＸＭＵ―ＭＰ―1が報告されている（非特許文献１６）。ＸＭＵ―ＭＰ―1は、Ｈｉｐｐｏシグナル伝達経路を阻害することにより肝障害からの回復を促進することが示されている。さらに、ＬＡＴＳ１及びＬＡＴＳ２を阻害する化合物による眼球、皮膚や肝臓の修復促進効果が報告されている（特許文献３）。また、ＴＡＺの活性化剤としてＩＢＳ００８７３８が報告されており、本活性化剤による筋損傷の回復促進効果が示されている（非特許文献１７）。以上の様に、Ｈｉｐｐｏシグナル伝達経路の制御剤が各種の疾患の治療薬として期待されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】米国特許第５７０５１５１号
【特許文献２】米国特許第５９９４５０３号
【特許文献３】国際公開第２０１８／１９８０７７号
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Robert Roskoski Jr., Pharmacological Research 2016,100: 1-23
【非特許文献２】Doriano F et al, Br J Pharmacol. 2015, 172(11): 2675-2700
【非特許文献３】Druker BJ et al, Nat Med. 1996, 2(5):561-566
【非特許文献４】Justice RW et al, Genes Dev. 1995, 9(5):534-546
【非特許文献５】Hergovich A, Cell Biosci. 2013, 3(1):32
【非特許文献６】Pefani DE et al, FEBS J. 2016, 283(8):1392-1403
【非特許文献７】Meng Z et al, Genes Dev. 2016, 30(1):1-17
【非特許文献８】Zhao B et al, Curr Opin Cell Biol. 2008, 20(6):638-646
【非特許文献９】Imajo M et al, EMBO J. 2012, 31:1109-1122
【非特許文献１０】Hong W et al, Semin Cell Dev Biol. 2012, 23(7):785-793
【非特許文献１１】Gujral TS et al, Proc Natl Acad Sci U S A. 2017, 114(18):E3729-E3738
【非特許文献１２】Lee DH et al, Nat Commun. 2016, 7:11961
【非特許文献１３】Aylon Y et al, Cell Death Differ. 2014, 21(4):624-633
【非特許文献１４】Johnson R et al, Nat Rev Drug Discov. 2014, 13(1):63-79
【非特許文献１５】Leach JP et al, Nature. 2017, 550(7675):260-264
【非特許文献１６】Fan F et al, Sci Transl Med. 2016, 8(352):352ra108
【非特許文献１７】Yang Z et al, Mol Cell Biol. 2014, 34(9):1607-1621
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、新規キナーゼ阻害剤の提供を目的とする。特に、本発明はＨｉｐｐｏシグナル伝達経路を阻害する新規キナーゼ阻害剤の提供を目的とする。加えて、本発明は、かかる阻害剤を応用した疾患の治療剤や創薬スクリーニング方法等の提供をも目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、上記課題に対して鋭意検討した結果、特定の化合物がＬＡＴＳ（特にＬＡＴＳ２）を含む複数のプロテインキナーゼの活性を阻害することを見出した。また、本発明者らは、当該特定の化合物が細胞内のＹＡＰタンパク質の核内移行を促進すること、ＹＡＰまたはＴＡＺタンパク質の標的遺伝子群の発現を促進すること、及び、不斉炭素を有する特定の化合物においては、光学異性体によっては活性が大きく異なること等を見出し、かかる知見に基づいてさらに研究を進めることによって本発明を完成するに至った。すなわち、本発明は以下の通りである。【００１０】
［１］下記、式（Ｉ）で示される化合物またはその塩を含む、キナーゼ阻害剤：【００１１】
【化１】
2019235569.tif 000003
【００１２】
｛式中、Ｘは、単結合、−ＣＨ２ＣＯＯ−、−ＣＯＮＨ−、または−ＮＨＣＯ−であり、Ｒ１は、置換基を有していてもよい炭素数１〜１０のアルキル基、置換基を有していてもよいアリール基、または−Ｙ−Ｗ−Ｚ−Ａｒであり（式中、Ｙ、およびＺは、単結合、または置換基を有していてもよい炭素数１〜６のアルキレン基であり、Ｗは、酸素原子、硫黄原子またはＮ（Ｒ４）であり、Ｒ４は、水素原子または炭素数１〜６のアルキル基であり、Ａｒは、置換基を有していてもよいアリール基である。）、Ｒ２は、置換基を有していてもよい炭素数１〜６のアルキル基であり、Ｒ３は、水酸基であり、ｎは、０、１または２である。｝。
［２］キナーゼが、ＣＧＫ２、ＬＡＴＳ２、ＭＳＫ１、ｐ７０Ｓ６Ｋ、ＰＫＡＣα、ＰＫＡＣβ、ＳＧＫ２、ＳＧＫ３からなる群から選択される、［１］に記載の剤。
［３］キナーゼが、ＬＡＴＳ２である、［２］に記載の剤。
［４］下記、式（Ｉ）で示される化合物またはその塩を含む、Ｈｉｐｐｏシグナル伝達経路阻害剤：【００１３】
【化２】
2019235569.tif 000004
【００１４】
｛式中、Ｘは、単結合、−ＣＨ２ＣＯＯ−、−ＣＯＮＨ−、または−ＮＨＣＯ−であり、Ｒ１は、置換基を有していてもよい炭素数１〜１０のアルキル基、置換基を有していてもよいアリール基、または−Ｙ−Ｗ−Ｚ−Ａｒであり（式中、Ｙ、およびＺは、単結合、または置換基を有していてもよい炭素数１〜６のアルキレン基であり、Ｗは、酸素原子、硫黄原子またはＮ（Ｒ４）であり、Ｒ４は、水素原子または炭素数１〜６のアルキル基であり、Ａｒは、置換基を有していてもよいアリール基である。）、Ｒ２は、置換基を有していてもよい炭素数１〜６のアルキル基であり、Ｒ３は、水酸基であり、ｎは、０、１または２である。｝。
［５］下記、式（Ｉ）で示される化合物またはその塩を含む、細胞増殖の不全を伴う疾患または組織損傷の治療剤：【００１５】
【化３】
2019235569.tif 000005
【００１６】
｛式中、Ｘは、単結合、−ＣＨ２ＣＯＯ−、−ＣＯＮＨ−、または−ＮＨＣＯ−であり、Ｒ１は、置換基を有していてもよい炭素数１〜１０のアルキル基、置換基を有していてもよいアリール基、または−Ｙ−Ｗ−Ｚ−Ａｒであり（式中、Ｙ、およびＺは、単結合、または置換基を有していてもよい炭素数１〜６のアルキレン基であり、Ｗは、酸素原子、硫黄原子またはＮ（Ｒ４）であり、Ｒ４は、水素原子または炭素数１〜６のアルキル基であり、Ａｒは、置換基を有していてもよいアリール基である。）、Ｒ２は、置換基を有していてもよい炭素数１〜６のアルキル基であり、Ｒ３は、水酸基であり、ｎは、０、１または２である。｝。
［６］細胞増殖の不全を伴う疾患または組織損傷が、ＹＡＰおよび／またはＴＡＺの核内移行の抑制を伴う疾患である、［５］に記載の剤。
［７］細胞増殖の不全を伴う疾患または組織損傷が、炎症性疾患、炎症性腸疾患、神経変性疾患、免疫性神経疾患、筋ジストロフィー、ミオパチー、外傷、火傷、薬傷、皮膚潰瘍、外傷性潰瘍、下肢潰瘍、凍傷潰瘍、免疫性潰瘍、帯状疱疹後潰瘍、放射線潰瘍、褥瘡、糖尿病性皮膚潰瘍、巨大色素性母斑、瘢痕、刺青による障害、尋常性白斑、白皮症、脊髄損傷、筋肉損傷、肝不全、薬剤性肝障害、アルコール性肝障害、虚血性肝障害、ウイルス性肝障害、自己免疫性肝障害、急性肝炎、慢性肝炎、肝硬変、皮膚損傷、脳浮腫、心筋梗塞、脳出血、および脳梗塞からなる群から選択される、［５］に記載の剤。
［８］下記、式（Ｉ）で示される化合物またはその塩を含む、移植治療用細胞または組織の増殖促進剤：【００１７】
【化４】
2019235569.tif 000006
【００１８】
｛式中、Ｘは、単結合、−ＣＨ２ＣＯＯ−、−ＣＯＮＨ−、または−ＮＨＣＯ−であり、Ｒ１は、置換基を有していてもよい炭素数１〜１０のアルキル基、置換基を有していてもよいアリール基、または−Ｙ−Ｗ−Ｚ−Ａｒであり（式中、Ｙ、およびＺは、単結合、または置換基を有していてもよい炭素数１〜６のアルキレン基であり、Ｗは、酸素原子、硫黄原子またはＮ（Ｒ４）であり、Ｒ４は、水素原子または炭素数１〜６のアルキル基であり、Ａｒは、置換基を有していてもよいアリール基である。）、Ｒ２は、置換基を有していてもよい炭素数１〜６のアルキル基であり、Ｒ３は、水酸基であり、ｎは、０、１または２である。｝。
［９］Ｘが、−ＮＨＣＯ−である、［１］〜［８］のいずれかに記載の剤。
［１０］Ｒ２が、炭素数１〜６のアルキル基であり、ｎが０である、［１］〜［９］のいずれかに記載の剤。
［１１］Ｒ１が、−Ｙ−Ｗ−Ｚ−Ａｒであり、Ｙが、炭素数１〜６のアルキル基を有していてもよいメチレン基であり、Ｗが、Ｎ（Ｒ４）であり、Ｚが、単結合であり、Ａｒが、ハロゲン原子、水酸基、炭素数１〜６のアルキル基または炭素数１〜６のアルコキシ基を有していてもよいアリール基である、［１］〜［１０］のいずれかに記載の剤。
［１２］Ｒ２が、メチル基、エチル基、またはイソブチル基であり、
ｎが０であり、
Ａｒが、水酸基またはメチル基で置換されていてもよいフェニル基であり、
Ｙが、メチル基またはエチル基で置換されていてもよいメチレン基である、［１］〜［１１］のいずれかに記載の剤。
［１３］式（Ｉ）で示される化合物が、以下からなる群より選択される化合物である、［１］〜［１２］のいずれかに記載の剤。【００１９】
【化５】
2019235569.tif 000007
【００２０】
【化６】
2019235569.tif 000008
【００２１】
【化７】
2019235569.tif 000009
【００２２】
【化８】
2019235569.tif 000010
【００２３】
【化９】
2019235569.tif 000011
【００２４】
【化１０】
2019235569.tif 000012
【００２５】
【化１１】
2019235569.tif 000013
【００２６】
【化１２】
2019235569.tif 000014
【００２７】
【化１３】
2019235569.tif 000015
【００２８】
［１４］式（Ｉ）で示される化合物が、以下からなる群より選択される化合物のＲ体の光学異性体である、［１］〜［１２］のいずれかに記載の剤。【００２９】
【化１４】
2019235569.tif 000016
【００３０】
【化１５】
2019235569.tif 000017
【００３１】
【化１６】
2019235569.tif 000018
【００３２】
【化１７】
2019235569.tif 000019
【００３３】
［１５］Ｒ１が、−Ｙ−Ｗ−Ｚ−Ａｒであり、Ｙが、単結合であり、Ｗが、Ｎ（Ｒ４）であり、Ｒ４が、水素原子であり、Ｚが、炭素数１〜６のアルキル基を有していてもよいメチレン基であり、Ａｒが、ハロゲン原子、水酸基、炭素数１〜６のアルキル基または炭素数１〜６のアルコキシ基を有していてもよいアリール基である、［１］〜［１２］のいずれかに記載の剤。
［１６］Ｒ２が、メチル基、エチル基、またはイソブチル基であり、
ｎが０であり、
Ａｒが、水酸基で置換されていてもよいフェニル基であり、
Ｚが、メチル基またはエチル基で置換されていてもよいメチレン基である、［１］〜［１０］および［１５］のいずれかに記載の剤。
［１７］式（Ｉ）で示される化合物が、以下からなる群より選択される化合物である、［１］〜［１０］、［１５］および［１６］のいずれかに記載の剤。【００３４】
【化１８】
2019235569.tif 000020
【００３５】
【化１９】
2019235569.tif 000021
【００３６】
【化２０】
2019235569.tif 000022
【００３７】
［１８］式（Ｉ）で示される化合物が、以下の化合物のＲ体の光学異性体である、［１］〜［１２］、［１５］および［１６］のいずれかに記載の剤。【００３８】
【化２１】
2019235569.tif 000023
【００３９】
［１９］以下の工程を含む、ＹＡＰおよび／またはＴＡＺの核内移行の亢進を伴う疾患を治療および／または予防するための物質のスクリーニング方法：
（工程１）下記、式（Ｉ）で示される化合物またはその塩を含む培地において細胞を培養する工程:【００４０】
【化２２】
2019235569.tif 000024
【００４１】
｛式中、Ｘは、単結合、−ＣＨ２ＣＯＯ−、−ＣＯＮＨ−、または−ＮＨＣＯ−であり、Ｒ１は、置換基を有していてもよい炭素数１〜１０のアルキル基、置換基を有していてもよいアリール基、または−Ｙ−Ｗ−Ｚ−Ａｒであり（式中、Ｙ、およびＺは、単結合、または置換基を有していてもよい炭素数１〜６のアルキレン基であり、Ｗは、酸素原子、硫黄原子またはＮ（Ｒ４）であり、Ｒ４は、水素原子または炭素数１〜６のアルキル基であり、Ａｒは、置換基を有していてもよいアリール基である。）、Ｒ２は、置換基を有していてもよい炭素数１〜６のアルキル基であり、Ｒ３は、水酸基であり、ｎは、０、１または２である。｝；
（工程２）被検物質の存在下、(工程１)で得られた細胞においてＹＡＰおよび／またはＴＡＺの細胞核における存在量を測定する工程；
（工程３）（工程２）で測定されたＹＡＰおよび／またはＴＡＺの細胞核における存在量が、前記被検物質の非存在下における存在量と比較して減少している場合に、前記被検物質をＹＡＰおよび／またはＴＡＺの核内移行の亢進を伴う疾患を治療および／または予防するための物質と判断する工程。
［２０］下記、式（Ｉ）で示される化合物の光学活性体、またはその塩：【００４２】
【化２３】
2019235569.tif 000025
【００４３】
｛式中、Ｘは、単結合、−ＣＨ２ＣＯＯ−、−ＣＯＮＨ−、または−ＮＨＣＯ−であり、Ｒ１は、置換基を有していてもよい炭素数１〜１０のアルキル基、置換基を有していてもよいアリール基、または−Ｙ−Ｗ−Ｚ−Ａｒであり（式中、Ｙ、およびＺは、単結合、または置換基を有していてもよい炭素数１〜６のアルキレン基であり、Ｗは、酸素原子、硫黄原子またはＮ（Ｒ４）であり、Ｒ４は、水素原子または炭素数１〜６のアルキル基であり、Ａｒは、置換基を有していてもよいアリール基である。）、Ｒ２は、置換基を有していてもよい炭素数１〜６のアルキル基であり、Ｒ３は、水酸基であり、ｎは、０、１または２である（ただし、Ｘが−ＮＨＣＯ−であり、Ｒ２がエチル基であり、ｎが０であるとき、Ｒ１は、−ＣＨ２−ＮＨ−Ｃ６Ｈ５ではない。）。｝。
［２１］Ｘが、−ＮＨＣＯ−である、［２０］に記載の光学活性体、またはその塩。
［２２］Ｒ２が、炭素数１〜６のアルキル基であり、ｎが０である、［２０］または［２１］に記載の光学活性体、またはその塩。
［２３］Ｒ１が、−Ｙ−Ｗ−Ｚ−Ａｒであり、Ｙが、炭素数１〜６のアルキル基を有するメチレン基であり、Ｗが、Ｎ（Ｒ４）であり、Ｚが、単結合であり、Ａｒが、ハロゲン原子、水酸基、炭素数１〜６のアルキル基または炭素数１〜６のアルコキシ基を有していてもよいアリール基である、［２０］〜［２２］のいずれかに記載の光学活性体またはその塩。
［２４］光学活性体がＲ体である、［２０］〜［２３］のいずれかに記載の光学活性体、またはその塩。
［２５］式（Ｉ）で示される化合物が、以下からなる群より選択される化合物である、［２０］〜［２４］のいずれかに記載の光学活性体、またはその塩。【００４４】
【化２４】
2019235569.tif 000026
【００４５】
【化２５】
2019235569.tif 000027
【００４６】
【化２６】
2019235569.tif 000028
【００４７】
【化２７】
2019235569.tif 000029
【００４８】
［２６］Ｒ１が、−Ｙ−Ｗ−Ｚ−Ａｒであり、Ｙが、単結合であり、Ｗが、Ｎ（Ｒ４）であり、Ｒ４が、水素原子であり、Ｚが、炭素数１〜６のアルキル基を有するメチレン基であり、Ａｒが、ハロゲン原子、水酸基、炭素数１〜６のアルキル基または炭素数１〜６のアルコキシ基を有していてもよいアリール基である、［２０］〜［２２］のいずれかに記載の光学活性体、またはその塩。
［２７］光学活性体がＲ体である、［２０］〜［２２］、および［２６］のいずれかに記載の光学活性体、またはその塩。
［２８］式（Ｉ）で示される化合物が、以下の化合物である、［２０］〜［２２］、［２６］、および［２７］のいずれかに記載の光学活性体、またはその塩。【００４９】
【化２８】
2019235569.tif 000030
【００５０】
また、一態様において、本発明は以下の通りである。
［１’］下記式（Ｉ’）で示される化合物またはその塩を含む、キナーゼ阻害剤：【００５１】
【化２９】
2019235569.tif 000031
【００５２】
｛式中、Ｘ０は、−ＮＨＣＯ−であり、Ｒ１0は、−Ｙ−ＮＨ−Ｚ−Ａｒであり（式中、
Ｙ、およびＺは、単結合、または置換基を有していてもよい炭素数１〜６のアルキレン基であり、Ａｒは、置換基を有していてもよいアリール基である。）、Ｒ２は、置換基を有していてもよい炭素数１〜６のアルキル基であり、Ｒ３は、水酸基であり、ｎは、０、１または２の整数である。｝。
［２’］下記式（Ｉ’）で示される化合物またはその塩を含む、Ｈｉｐｐｏシグナル伝達経路阻害剤：【００５３】
【化３０】
2019235569.tif 000032
【００５４】
｛式中、Ｘ０は、−ＮＨＣＯ−であり、Ｒ１0は、−Ｙ−ＮＨ−Ｚ−Ａｒであり（式中、
Ｙ、およびＺは、単結合、または置換基を有していてもよい炭素数１〜６のアルキレン基であり、Ａｒは、置換基を有していてもよいアリール基である。）、Ｒ２は、置換基を有していてもよい炭素数１〜６のアルキル基であり、Ｒ３は、水酸基であり、ｎは、０、１または２の整数である。｝。
［３’］下記式（Ｉ’）で示される化合物またはその塩を含む、細胞増殖の不全を伴う疾患または組織損傷の治療剤：【００５５】
【化３１】
2019235569.tif 000033
【００５６】
｛式中、Ｘ０は、−ＮＨＣＯ−であり、Ｒ１0は、−Ｙ−ＮＨ−Ｚ−Ａｒであり（式中、
Ｙ、およびＺは、単結合、または置換基を有していてもよい炭素数１〜６のアルキレン基であり、Ａｒは、置換基を有していてもよいアリール基である。）、Ｒ２は、置換基を有していてもよい炭素数１〜６のアルキル基であり、Ｒ３は、水酸基であり、ｎは、０、１または２の整数である。｝。
［４’］下記式（Ｉ’）で示される化合物またはその塩を含む、移植治療用細胞または組織の増殖促進剤：【００５７】
【化３２】
2019235569.tif 000034
【００５８】
｛式中、Ｘ０は、−ＮＨＣＯ−であり、Ｒ１0は、−Ｙ−ＮＨ−Ｚ−Ａｒであり（式中、
Ｙ、およびＺは、単結合、または置換基を有していてもよい炭素数１〜６のアルキレン基であり、Ａｒは、置換基を有していてもよいアリール基である。）、Ｒ２は、置換基を有していてもよい炭素数１〜６のアルキル基であり、Ｒ３は、水酸基であり、ｎは、０、１または２の整数である。｝。
［５’］Ｒ２が、メチル基、エチル基、またはイソブチル基であり、
ｎが０であり、
Ａｒが、水酸基またはメチル基で置換されていてもよいフェニル基であり、
Ｙが、メチル基またはエチル基で置換されていてもよいメチレン基である、［１’］〜［４’］のいずれか記載の剤。
［６’］化合物(Ｉ’)が、以下からなる群より選択される化合物である、［１’］〜［５’］のいずれか記載の剤。【００５９】
【化３３】
2019235569.tif 000035
【００６０】
【化３４】
2019235569.tif 000036
【００６１】
【化３５】
2019235569.tif 000037
【００６２】
【化３６】
2019235569.tif 000038
【００６３】
【化３７】
2019235569.tif 000039
【００６４】
および、【００６５】
【化３８】
2019235569.tif 000040
【００６６】
［７’］化合物(Ｉ’)が、以下で示される化合物である、［１’］〜［５’］のいずれかに記載の剤。【００６７】
【化３９】
2019235569.tif 000041
【００６８】
および、【００６９】
【化４０】
2019235569.tif 000042
【００７０】
［８’］キナーゼが、ＣＧＫ２、ＬＡＴＳ２、ＭＳＫ１、ｐ７０Ｓ６Ｋ、ＰＫＡＣα、ＰＫＡＣβ、ＳＧＫ２、ＳＧＫ３からなる群から選択される、［１’］、［５’］〜［７’］のいずれか記載の剤。
［９’］キナーゼが、ＬＡＴＳ２である、［８’］記載の剤。
［１０’］細胞増殖の不全を伴う疾患または組織損傷が、ＹＡＰおよび／またはＴＡＺの核内移行の抑制を伴う疾患である、［３’］、［５’］〜［７’］のいずれか記載の剤。
［１１’］細胞増殖の不全を伴う疾患または組織損傷が、炎症性疾患、神経変性疾患、免疫性神経疾患、筋ジストロフィー、ミオパチー、外傷、火傷、脊髄損傷、筋肉損傷、肝不全、皮膚損傷、脳浮腫、心筋梗塞、脳出血、および脳梗塞からなる群から選択される、［３’］、［５’］〜［７’］のいずれか記載の剤。
［１２’］以下の工程を含む、ＹＡＰおよび／またはＴＡＺの核内移行の亢進を伴う疾患を治療および／または予防するための物質のスクリーニング方法：
（工程１）下記式（Ｉ’）で示される化合物またはその塩を含む培地において細胞を培養する工程:【００７１】
【化４１】
2019235569.tif 000043
【００７２】
｛式中、Ｘ０は、−ＮＨＣＯ−であり、Ｒ１0は、−Ｙ−ＮＨ−Ｚ−Ａｒであり（式中、Ｙ、およびＺは、単結合、または置換基を有していてもよい炭素数１〜６のアルキレン基であり、Ａｒは、置換基を有していてもよいアリール基である。）、Ｒ２は、置換基を有していてもよい炭素数１〜６のアルキル基であり、Ｒ３は、水酸基であり、ｎは、０、１または２の整数である。｝；
（工程２）被検物質の存在下、(工程１)で得られた細胞においてＹＡＰおよび／またはＴＡＺの細胞核における存在量を測定する工程；
（工程３）（工程２）で測定されたＹＡＰおよび／またはＴＡＺの細胞核における存在量が、前記被検物質の非存在下における存在量と比較して減少している場合に、前記被検物質をＹＡＰおよび／またはＴＡＺの核内移行の亢進を伴う疾患を治療および／または予防するための物質と判断する工程。
［１３’］［１’］、［２’］、［４’］〜［７’］のいずれか記載の剤を含む、細胞培養培地。【００７３】
なお、化合物(Ｉ’)は、式（Ｉ）で示される化合物において、Ｘが−ＮＨＣＯ−であり、かつ、Ｒ１が、−Ｙ−Ｗ−Ｚ−Ａｒ（式中、Ｙ、およびＺが、単結合、または置換基を有していてもよい炭素数１〜６のアルキレン基であり、Ｗが、ＮＨであり、Ａｒが、置換基を有していてもよいアリール基である）である場合に相当する。
【発明の効果】
【００７４】
本発明によれば、Ｈｉｐｐｏシグナル伝達経路における主要キナーゼであるＬＡＴＳを含む、複数のキナーゼの活性を阻害することができる。特にＬＡＴＳキナーゼの活性を阻害することにより、Ｈｉｐｐｏシグナル伝達経路を効率的に阻害することが可能となる。これにより、細胞内のＹＡＰタンパク質の核内移行が促進され、その結果としてＹＡＰまたはＴＡＺタンパク質の標的遺伝子群の発現を促進することが可能となる。細胞におけるＨｉｐｐｏシグナル伝達経路の阻害は細胞増殖を亢進するため、細胞増殖の不全を伴う疾患（特に、Ｈｉｐｐｏシグナル伝達経路の活性化を伴う疾患等）または組織損傷の治療が可能となる。さらに、本発明によれば、Ｈｉｐｐｏシグナル伝達経路が関与する細胞機能や疾病の研究を従来よりも迅速かつ効率的に実施することが可能となる。すなわち、これまではＨｉｐｐｏシグナル伝達経路を選択的に阻害するために分子生物学的な手法を用いてＭＳＴ１やＬＡＴＳ２の遺伝子を欠損させたり（遺伝子ノックアウト）、その発現を抑制させたり（遺伝子ノックダウン）をすることが必要であった。これらの手法は、選択的な阻害という観点では優れているが、目的の遺伝子をノックダウン或いはノックアウトした細胞を得るためには煩雑な操作と時間が必要であり、また目的の細胞毎にこれらの遺伝子操作を加える必要がある。しかしながら、本発明の特定の化合物を用いれば、細胞培養時の培地に当該化合物を添加するだけで簡便にＨｉｐｐｏシグナル伝達経路を選択的に阻害することができる。また、当該化合物を培地から除去すれば、阻害効果が無くなるため、一時的にＨｉｐｐｏシグナル伝達経路を阻害するという用途にも最適である。更に、本発明によれば、Ｈｉｐｐｏシグナル伝達経路が関与する疾病の治療薬を見出すことができる。すなわち、本発明の特定の化合物を添加した培地にて細胞を培養すれば、細胞内のＹＡＰの核内移行が促進されるため、ＹＡＰが関与する疾病の表現型がより明確に表れる。この様な状況では、ＹＡＰの機能を阻害するような化合物や因子をこれまでよりも効率よく探索することができる。
【図面の簡単な説明】
【００７５】
【図１】図１は、本発明の特定化合物を添加した培地にて培養されたＳＫＯＶ３細胞中のＹＡＰ、リン酸化ＹＡＰ及びＴＡＺの量を、ウェスタンブロッティング法を用いて観察した図である。
【図２】図２は、本発明の特定化合物を投与したマウスにおける肝臓重量の変化を観察した図である。
【図３】図３は、本発明の特定化合物を投与したマウスにおける大腸の長さの変化を観察した図である。
【図４】図４は、本発明の特定化合物を投与したマウスにおける皮膚創傷の面積の変化を観察した図である。
【発明を実施するための形態】
【００７６】
本明細書において使用する用語を以下に定義する。
【００７７】
本明細書において、ｎ−はノルマル、ｉ−はイソ、ｓｅｃ−はセカンダリー及びｔｅｒｔ−はターシャリーを各々意味する。また、本明細書において、ｏ−はオルト、ｍ−はメタ及びｐ−はパラを各々意味する。
【００７８】
「ハロゲン原子」とは、フッ素原子、塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子である。「ハロゲノ基」とは、フルオロ、クロロ、ブロモ、ヨードである。
【００７９】
「アルキル基」および「炭素数１〜６のアルキル基」とは、直鎖または分岐状のアルキル基を意味し、具体的には、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ｎ−ペンチル、イソペンチル、ｔｅｒｔ−ペンチル、ネオペンチル、２−ペンチル、３−ペンチル、ｎ−ヘキシル、２−ヘキシル等の基が挙げられる。
【００８０】
「アリール基」とは、少なくとも１つの環が芳香族であり、各環が５〜８の環原子を有する単環式、二環式、三環式および四環式炭素環式基が挙げられ、具体的には、フェニル、インデニル、ナフチル、フルオレニル等が挙げられる。特に、アリール基は、Ｃ６−１０の芳香族のフェニル、インデニル、ナフチルであり得る。
【００８１】
「アルキレン基」および「炭素数１〜６のアルキレン基」とは、直鎖の炭素鎖を意味し、具体的には、メチレン、エチレン、プロピレン、ブチレン、ペンチレン、ヘキシレン等の基が挙げられる。
【００８２】
「アルキル基」、「アリール基」及び「アルキレン基」は、置換基を有していてもよく、そのような置換基としては、例えば以下が挙げられる。尚、「アルキル基」の場合には下記（１）〜（４０）が挙げられ、「アリール基」及び「アルキレン基」の場合には下記（１）〜（４１）が挙げられる。
(1)ハロゲノ基、
(2)水酸基、
(3)シアノ基、
(4)ニトロ基、
(5)カルボキシル基、
(6)アルケニル基（Ｃ２−１０アルケニル基；例、ビニル、アリル、プロペニル、ブテニル、ペンテニル、へキセニル、ヘプテニル、ブタジエニル、ヘキサトリエニル、およびその各異性体）、
(7)アルキニル基（Ｃ２−１０アルキニル基；例、エチニル、プロピニル、ブチニル、ペンチニル、ヘキシニル、および、その各異性体）、
(8)ハロゲノアルキル基（例、モノフルオロメチル、ジフルオロメチル、トリフルオロメチル、モノフルオロエチル、ジフルオロエチル、トリフルオロエチル、クロロメチル、クロロエチル、ジクロロエチル、およびその各異性体）、
(9)環状アルキル基（環中にヘテロ原子を含んでもよい）（例、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、テトラヒドロフラニル、テトラヒドロピラニル、アジリジニル、アゼチジニル、ピロリジニル、ピペリジニル、モルホリニル）、
(10)アリール基（例、フェニル、ナフチル）、
(11)ヘテロアリール基（例、ピリジル、ピリダジニル、ピリミジニル、ピラジニル、フリル、チオフェニル、ピロリル、ピラゾリル、イミダゾリル、トリアゾリル（例、１，２，３−トリアゾリル、１，２，４−トリアゾリル）、テトラゾリル、オキサゾリル、イソオキサゾリル、チアゾリル、イソチアゾリル、オキサジアゾリル（例、１，２，３−オキサジアゾリル、１，２，４−オキサジアゾリル、１，３，４−オキサジアゾリル）、チアジアゾリル（例、１，２，３−チアジアゾリル、１，２，４−チアジアゾリル、１，３，４−チアジアゾリル）、ベンゾフリル、ベンゾチオフェニル、インドリル、イソインドリル、ベンゾオキサゾリル、ベンゾチアゾリル、ベンズイミダゾリル、インダゾリル、ベンズイソオキサゾリル、ベンズイソチアゾリル、ベンゾオキサジアゾリル、ベンゾチアジアゾリル、プリニル、キノリニル、イソキノリニル、シンノリニル、フタラジニル、キナゾリニル、キノキサリニル、プテリジニル、イミダゾオキサゾリル、イミダゾチアゾリル、イミダゾイミダゾリル）、
(12)アルコキシ基（例、メトキシ、エトキシ、ｎ−プロポキシ、イソプロポキシ、ｎ−ブトキシ、イソブトキシ、ｓｅｃ−ブトキシ、ｔｅｒｔ−ブトキシ、ｎ−ペンチルオキシ、イソペンチルオキシ、ｔｅｒｔ−ペンチルオキシ、ネオペンチルオキシ、２−ペンチルオキシ、３−ペンチルオキシ、ｎ−ヘキシルオキシ、２−ヘキシルオキシ）、
(13)アルキルチオ基（例、メチルチオ、エチルチオ、ｎ−プロピルチオ、イソプロピルチオ、ｎ−ブチルチオ、イソブチルチオ、ｓｅｃ−ブチルチオ、ｔｅｒｔ−ブチルチオ、ｎ−ペンチルチオ、イソペンチルチオ、ｔｅｒｔ−ペンチルチオ、ネオペンチルチオ、２−ペンチルチオ、３−ペンチルチオ、ｎ−ヘキシルチオ、２−ヘキシルチオ）、
(14)アリール基（上記(10)と同義）で置換された、アルコキシ基（上記(12)と同義）、
(15)アリール基（上記(10)と同義）で置換された、アルキルチオ基（上記(13)と同義）、
(16)ヘテロアリール基（上記(11)と同義）で置換された、アルコキシ基（上記(12)と同義）、
(17)ヘテロアリール基（上記(11)と同義）で置換された、アルキルチオ基（上記(13)と同義）、
(18)環状アルキル（環中にヘテロ原子を含んでもよい）オキシ基（例、シクロプロピルオキシ、シクロブチルオキシ、シクロペンチルオキシ、シクロヘキシルオキシ、テトラヒドロフラニルオキシ、テトラヒドロピラニルオキシ、アジリジニルオキシ、アゼチジニルオキシ、ピロリジニルオキシ、ピペリジニルオキシ、モルホリニルオキシ）、
(19)アリールオキシ基（例、アリール基（上記(10)と同義）が酸素原子に結合した基）、
(20)ヘテロアリールオキシ基（例、ヘテロアリール基（上記(11)と同義）が酸素原子に結合した基）、
(21)ハロゲノアルコキシ基（例、ハロゲノアルキル基（上記(8)と同義）が酸素原子に結合した基）、
(22)ハロゲノアルキルチオ基（例、ハロゲノアルキル基（上記(8)と同義）が硫黄原子に結合した基）、
(23)水酸基で置換された、アルコキシ基（上記(12)と同義）、
(24)アルコキシ基（上記(12)と同義）で置換された、アルコキシ基（上記(12)と同義）、
(25)アミノ基、
(26)アルキル基でモノまたはジ置換されたアミノ基、
ここで、「アルキル基」とは、Ｃ１−６アルキル基が挙げられ、具体的には、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ｎ−ペンチル、イソペンチル、ｔｅｒｔ−ペンチル、ネオペンチル、２−ペンチル、３−ペンチル、ｎ−ヘキシル、２−ヘキシル等が挙げられる。
(27)カルバモイル基、
(28)アルキル基（上記(26)における「アルキル基」と同義）でモノまたはジ置換されたカルバモイル基（例、メチルカルバモイル、エチルカルバモイル、ジメチルカルバモイル、ジエチルカルバモイル、エチルメチルカルバモイル）、
(29)スルファモイル基、
(30)アルキル基（上記(26)における「アルキル基」と同義）でモノまたはジ置換されたスルファモイル基（例、メチルスルファモイル、エチルスルファモイル、ジメチルスルファモイル、ジエチルスルファモイル、エチルメチルスルファモイル）、
(31)アルカノイル基（例、水素原子若しくはアルキル基（上記(26)における「アルキル基」と同義）が炭素原子に結合したカルボニル基）、
(32)アロイル基（例、アリール基（上記（10）と同義）が炭素原子に結合したカルボニル基）、
(33)アルキルスルホニルアミノ基（例、アルキル基（上記(26)における「アルキル基」と同義）で置換されたスルホニルアミノ基）、
(34)アリールスルホニルアミノ基（例、アリール基（上記（10）と同義）で置換されたスルホニルアミノ基）、
(35)へテロアリールスルホニルアミノ基（例、ヘテロアリール基（上記（11）と同義）で置換されたスルホニルアミノ基）、
(36)アシルアミノ基（例、アシル基で置換されたアミノ基）、
ここで、「アシル基」とは、Ｃ１−６アルキル基、またはＣ６−１０アリール基を有するアシル基である。ここで、「Ｃ１−６アルキル基」とは、上記「アルキル基」のうち、炭素数が１〜６のものであり、「Ｃ6−１０アリール基」とは、上記「アリール基」のうち、炭素数が６〜１０のものである。アシル基としては、具体的には、アセチル基、プロピオニル基、ブチロイル基、イソブチロイル基、バレロイル基、イソバレロイル基、ピバロイル基、ヘキサノイル基、アクリロイル基、メタクリロイル基、クロトノイル基、イソクロトノイル基、ベンゾイル基、ナフトイル基等が挙げられる、
(37)アルコキシカルボニルアミノ基（例、アルコキシ基（上記(12)と同義）で置換されたカルボニルアミノ基）、
(38)アルキルスルホニル基（例、アルキル基（上記(26)における「アルキル基」と同義）で置換されたスルホニル基）、
(39)アルキルスルフィニル基（例、アルキル基（上記(26)における「アルキル基」と同義）で置換されたスルフィニル基）、
(40)アルコキシカルボニル基（例、メトキシカルボニル基、エトキシカルボニル基）、
(41)アルキル基（Ｃ1−６アルキル基；例、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ｎ−ペンチル、イソペンチル、ｔｅｒｔ−ペンチル、ネオペンチル、２−ペンチル、３−ペンチル、ｎ−ヘキシル、２−ヘキシル等）等が挙げられる。
置換基が２以上存在する場合は、それらは同一でも異なっていてもよい。
【００８３】
式（Ｉ）に示される化合物（以下、特定化合物ともいう）は、塩の形態であってもよい。前記式（Ｉ）で表される化合物の塩としては、例えば、塩酸及び臭化水素酸等の無機酸との塩ならびに酢酸、プロピオン酸、酒石酸、フマル酸、マレイン酸、リンゴ酸、シュウ酸、コハク酸、クエン酸及び安息香酸等の有機酸との塩が挙げられる。
【００８４】
式（Ｉ）に示される化合物は、置換基の種類によってはＥの立体配置を有するＥ体及びＺの立体配置を有するＺ体の幾何異性体が存在する場合がある。本発明はこれらＥ体、Ｚ体またはＥ体およびＺ体を任意の割合で含む混合物を包含するものである。
【００８５】
また、式（Ｉ）で示される化合物は、１個又は２個以上の不斉炭素原子の存在に起因する光学活性体が存在する場合があるが、式（Ｉ）で示される化合物は全ての光学活性体又はラセミ体を包含する。
【００８６】
［式（Ｉ）に示される化合物の合成］
式（Ｉ）に示される化合物は、下記式で表されるように、ケトン化合物とＨ２Ｎ−Ｘ−Ｒ１（式中、Ｘ及びＲ１は前記の意味を表し、例えば、ヒドラジド化合物、セミカルバジド化合物等）、それぞれを１当量ずつ用い、トルエン、１,４−ジオキサン、Ｎ、Ｎ−ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド等の溶媒中、１００℃以上の温度範囲で、１時間から３日間反応を行なうのが好ましい。
［反応式１］
【００８７】
【化４２】
2019235569.tif 000044
【００８８】
反応終了後の反応混合物は、蒸留水を加えて析出させる、又は析出しない場合は、有機溶媒抽出後濃縮といった通常の後処理を行ない、目的の特定化合物を得ることができる。また、精製の必要が生じたときには、再結晶、カラムクロマトグラフ、薄層クロマトグラフ、液体クロマトグラフ分取等の任意の精製方法によって分離、精製することができる。
【００８９】
[光学活性体の取得]
上述の方法により合成される化合物のうち、光学異性体を有するものについては、光学活性体（ユートマー）が存在し得る。光学活性体の取得は、結晶化による方法、酵素反応を用いる方法、又はＨＰＬＣを用いる方法（例、光学活性担持法）等の自体公知の方法を用いて行うことができる。また、光学活性体を、不斉合成法等を用いて調製することもできる。尚、本明細書において「光学活性体」とは、少なくともＬＡＴＳ１または２のキナーゼ活性を阻害する活性において、より活性が強いと判断される光学異性体を意味する。
【００９０】
１．キナーゼ阻害剤
本発明は、以下の特定化合物またはその塩を含む、キナーゼ阻害剤（以下、「本発明のキナーゼ阻害剤」と称することがある。）を提供する。
【００９１】
本発明のキナーゼ阻害剤に含まれる化合物は、式（Ｉ）：
【００９２】
【化４３】
2019235569.tif 000045
【００９３】
｛式中、Ｘは、単結合、−ＣＨ２ＣＯＯ−、−ＣＯＮＨ−、または−ＮＨＣＯ−であり、Ｒ１は、置換基を有していてもよい炭素数１〜１０のアルキル基、置換基を有していてもよいアリール基、または−Ｙ−Ｗ−Ｚ−Ａｒであり（式中、Ｙ、およびＺは、単結合、または置換基を有していてもよい炭素数１〜６のアルキレン基であり、Ｗは、酸素原子、硫黄原子またはＮ（Ｒ４）であり、Ｒ４は、水素原子または炭素数１〜６のアルキル基であり、Ａｒは、置換基を有していてもよいアリール基である。）、Ｒ２は、置換基を有していてもよい炭素数１〜６のアルキル基であり、Ｒ３は、水酸基であり、ｎは、０、１または２である。｝で表される化合物、またはその塩である（以下、式（I）で示される化合物またはその塩を総称して、単に「本発明に用いられる特定化合物」等と称する場合がある）。
【００９４】
一態様において、式（I）中のＸが−ＮＨＣＯ−、かつ、Ｒ１が−Ｙ−Ｗ−Ｚ−Ａｒ、かつ、Ｙが、置換基を有していてもよい炭素数１〜６のアルキレン基（好ましくは、炭素数１〜６のアルキル基を有していてもよい炭素数１〜６のアルキレン基、より好ましくはメチル基もしくはエチル基で置換されていてもよいメチレン基）である場合は、Ｗは、Ｎ（Ｒ４）（より好ましくは、Ｎ（Ｒ４）であって、式中Ｒ４が、水素原子または炭素数１〜６のアルキル基であり、特に好ましくは、Ｎ（Ｒ４）であって、Ｒ４が、水素原子）であり、Ｚは、単結合であり、Ａｒは、置換基を有していてもよいアリール基（好ましくは、置換基を有していてもよいフェニル基、より好ましくは、ハロゲノ基、水酸基、メチル基もしくはエトキシ基で置換されているフェニル基またはナフチル基）であり、Ｒ２は、置換基を有していてもよい炭素数１〜６のアルキル基（より好ましくは、炭素数１〜６のアルキル基、特に好ましくは、メチル基、エチル基、またはイソプロピル基）であり、ｎ＝０である。
【００９５】
また、式（I）中のＸが−ＮＨＣＯ−、かつ、Ｒ１が、−Ｙ−Ｗ−Ｚ−Ａｒであり、かつ、Ｙが、単結合である場合は、Ｗは、Ｎ（Ｒ４）（より好ましくは、Ｎ（Ｒ４）であって、Ｒ４が水素原子または炭素数１〜６のアルキル基であり、特に好ましくは、Ｎ（Ｒ４）であって、Ｒ４が、水素原子）であるか、酸素原子であり、Ｚは、単結合または置換基を有していてもよいアルキレン基（より好ましくは、置換基を有していてもよいアルキレン基、特に好ましくは、置換基を有していてもよいメチレン基）であり、Ａｒは置換基（ハロゲン原子、水酸基、メチル基、またはメトキシ基等）を有していてもよいアリール基（より好ましくは、水酸基を有するアリール基もしくは置換基を有していないアリール基、特に好ましくは、水酸基を有するフェニル基もしくはフェニル基）であり、Ｒ２は、置換基を有していてもよい炭素数１〜６のアルキル基（より好ましくは、炭素数１〜６のアルキル基、特に好ましくは、メチル基、エチル基、またはイソプロピル基）であり、ｎ＝０である。
【００９６】
好ましい一態様において、式(I)で示される化合物は、以下に示される化合物のいずれかであり得る。
【００９７】
【化４４】
2019235569.tif 000046
【００９８】
【化４５】
2019235569.tif 000047
【００９９】
【化４６】
2019235569.tif 000048
【０１００】
【化４７】
2019235569.tif 000049
【０１０１】
【化４８】
2019235569.tif 000050
【０１０２】
【化４９】
2019235569.tif 000051
【０１０３】
【化５０】
2019235569.tif 000052
【０１０４】
【化５１】
2019235569.tif 000053
【０１０５】
【化５２】
2019235569.tif 000054
【０１０６】
【化５３】
2019235569.tif 000055
【０１０７】
【化５４】
2019235569.tif 000056
【０１０８】
【化５５】
2019235569.tif 000057
【０１０９】
好ましい一態様において、式(I)で示される化合物は、以下に示される化合物の光学異性体のうち、Ｒ体のものであり得る。
【０１１０】
【化５６】
2019235569.tif 000058
【０１１１】
【化５７】
2019235569.tif 000059
【０１１２】
【化５８】
2019235569.tif 000060
【０１１３】
【化５９】
2019235569.tif 000061
【０１１４】
【化６０】
2019235569.tif 000062
【０１１５】
本発明のキナーゼ阻害剤に配合される本発明に用いられる特定化合物の量は、所望の効果を得られ得る限り特に限定されないが、通常０．０１〜１００重量％、好ましくは０．１〜１００重量％、より好ましくは１〜１００重量％、さらに好ましくは５〜１００重量％、特に好ましくは１０〜１００重量％で有り得る。
【０１１６】
本発明のキナーゼ阻害剤は、提供時あるいは保存時に任意の形状であり得る。当該組成物は、錠剤、丸剤、カプセル剤、顆粒剤のような製剤化された固体、適切な溶媒並びに溶解剤で溶解した溶液あるいは懸濁液のような液体、又は基板や単体に結合させた状態であり得る。製剤化される際の溶媒としては、水、生理食塩水、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、メタノール、エタノール、ブタノール、プロパノール、グリセリン、プロピレングリコール、ブチレングリコール等の各種アルコールなどの水性溶媒が挙げられる。製剤化される際の添加物としては、ｐ−ヒドロキシ安息香酸エステル類等の防腐剤；乳糖、ブドウ糖、ショ糖、マンニット等の賦形剤；ステアリン酸マグネシウム、タルク等の滑沢剤；ポリビニルアルコール、ヒドロキシプロピルセルロース、ゼラチン等の結合剤；脂肪酸エステル等の界面活性剤；グリセリン等の可塑剤等が挙げられる。これらの添加物は上記のものに限定されることはなく、当業者が利用可能であれば自由に選択することができる。
【０１１７】
また、本発明のキナーゼ阻害剤は、必要に応じて滅菌処理を施してもよい。滅菌方法は特に制限はなく、例えば、放射線滅菌、エチレンオキサイドガス滅菌、オートクレーブ滅菌、フィルター滅菌等が挙げられる。フィルター滅菌（以下、ろ過滅菌という場合もある。）を行う際のフィルター部分の材質は特に制限されないが、例えば、グラスファイバー、ナイロン、ＰＥＳ（ポリエーテルスルホン）、親水性ＰＶＤＦ（ポリフッ化ビニリデン）、セルロース混合エステル、セルロースアセテート、ポリテトラフルオロエチレン等が挙げられる。フィルターの細孔の大きさは特に制限されないが、好ましくは、０．１μｍ〜１０μｍ、より好ましくは、０．１μｍ〜１μｍ、最も好ましくは、０．１μｍ〜０．５μｍである。これらの滅菌処理は、特定化合物が固形でも溶液の状態でもよい。
【０１１８】
本発明のキナーゼ阻害剤において「キナーゼを阻害する」とは、キナーゼのリン酸化機能を阻害してその活性を消失又は減弱することを意味する。本発明のキナーゼ阻害剤により阻害されるキナーゼの種類としては、ＣＧＫ２、ＬＡＴＳ２、ＭＳＫ１、ｐ７０Ｓ６Ｋ、ＰＫＡＣα、ＰＫＡＣβ、ＳＧＫ２、ＳＧＫ３が挙げられるが、これらに限定されない。尚、本明細書において「キナーゼの活性を減弱する」とは、例えば、対照となる所定のキナーゼのリン酸化活性レベルと比較して、少なくとも５％以上、少なくとも１０％以上、少なくとも１５％以上、少なくとも２０％以上、少なくとも２５％以上、少なくとも３０％以上、少なくとも３５％以上、少なくとも４０％以上、少なくとも５０％以上、少なくとも５５％以上、少なくとも６０％以上、少なくとも６５％以上、少なくとも７０％以上、少なくとも７５％以上、少なくとも８０％以上、少なくとも８５％以上、少なくとも９０％以上、少なくとも９５％以上、または、少なくとも９９％以上、キナーゼの活性が減弱することを意味する。キナーゼ活性の測定は、以下の実施例において説明されるように、ＭＳＡ法などの自体公知の方法を用いることができる。或いは、キナーゼがＨｉｐｐｏシグナル伝達経路の上流に位置するＬＡＴＳ２等の場合は、その下流エフェクターであり、リン酸化の標的となるＹＡＰおよび／またはＴＡＺの細胞内の局在を、自体公知の分子生物学的手法を用いて確認することにより間接的にキナーゼ活性の減弱の程度を評価することもできる。
【０１１９】
本発明の一態様において、キナーゼがＬＡＴＳ２である場合、「ＬＡＴＳ２を阻害する」とは、ＬＡＴＳ２のキナーゼとしての機能を阻害してその活性を消失又は減弱することを意味する。ＬＡＴＳ２は酵母からヒトまで広範な種で進化的に保存されている。従って、本発明のキナーゼ阻害剤によりその活性が阻害されるＬＡＴＳ２は、あらゆる生物におけるＬＡＴＳ２であり得、ラット、マウス、ウサギ、モルモット、リス、ハムスター、ハタネズミ、カモノハシ、イルカ、クジラ、イヌ、ネコ、ヤギ、ウシ、ウマ、ヒツジ、ブタ、ゾウ、コモンマーモセット、リスザル、アカゲザル、チンパンジー、ヒト等の哺乳動物のＬＡＴＳであり得る。本発明のキナーゼ阻害剤により阻害されるＬＡＴＳ２は、好ましくはヒトＬＡＴＳであり得る。尚、本明細書において単に「ＬＡＴＳ」と記載する場合、「ＬＡＴＳ１」および「ＬＡＴＳ２」の両方、並びにＬＡＴＳ１とＬＡＴＳ２の複合体を包含する概念とする。
【０１２０】
本発明のキナーゼ阻害剤の使用態様の例としては、分子生物学的な試験や研究目的での使用等が含まれるが、これらに限定されない。分子生物学的な試験や研究目的での使用の一態様としては、本発明のキナーゼ阻害剤をＬＡＴＳ２等の特定のキナーゼを発現する細胞に投与することで、特定のキナーゼの活性が抑制された細胞を容易に調製し得る。かくして得られた細胞は特定のキナーゼの機能解析や該特定のキナーゼの機能を調節し得る候補物質のスクリーニング等に有用であり得る。
【０１２１】
一態様において、特定のキナーゼを発現する細胞は、哺乳動物由来の細胞であり得る。かかる細胞の例としては、生体を構成する体細胞、正常細胞株、がん細胞株、前駆細胞、幹細胞、生体から分離され人為的に遺伝子改変が成された細胞、生体から分離され人為的に核が交換された細胞等の細胞が挙げられるが、これらに限定されない。なお、これらの細胞の由来も特に限定されず、ラット、マウス、ウサギ、モルモット、リス、ハムスター、ハタネズミ、カモノハシ、イルカ、クジラ、イヌ、ネコ、ヤギ、ウシ、ウマ、ヒツジ、ブタ、ゾウ、コモンマーモセット、リスザル、アカゲザル、チンパンジー、ヒト等の哺乳動物由来の細胞が挙げられる。また、かかる細胞が由来する組織または臓器も、特に限定されず、組織の例としては、皮膚、腎臓、脾臓、副腎、肝臓、肺、卵巣、膵臓、子宮、胃、結腸、小腸、大腸、膀胱、前立腺、精巣、胸腺、筋肉、結合組織、骨、軟骨、血管組織、血液、心臓、眼、脳または神経組織等の組織が挙げられ、また、臓器の例としては、肝臓、肺、腎臓、心臓、膵臓、胃、脾臓、小腸、大腸、生殖器等の臓器が挙げられる。尚、本明細書において「幹細胞」とは、自分自身を複製する能力と他の複数系統の細胞に分化する能力を兼ね備えた細胞を意味し、その例としては、以下に限定されるものではないが、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）、胚性腫瘍細胞、胚性生殖幹細胞、人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）、神経幹細胞、造血幹細胞、間葉系幹細胞、肝幹細胞、膵幹細胞、筋幹細胞、生殖幹細胞、腸幹細胞、癌幹細胞、毛包幹細胞などが挙げられる。多能性幹細胞としては、前記幹細胞のうち、ＥＳ細胞、胚性生殖幹細胞、ｉＰＳ細胞が挙げられる。前駆細胞とは、前記幹細胞から特定の体細胞や生殖細胞に分化する途中の段階にある細胞である。
【０１２２】
本発明のキナーゼ阻害剤の特定のキナーゼを発現する細胞への投与は、当該細胞を培養する培地に本発明のキナーゼ阻害剤を添加することにより達成される。本発明のキナーゼ阻害剤の添加量は、本発明の所望の効果を得られる量であれば特に限定されないが、例えば、本発明に用いられる特定化合物の培地中の濃度が、通常０．００１〜１００μＭ、好ましくは０．０１Ｍ〜５０μＭ、より好ましくは０．１〜３０μＭ、さらに好ましくは１〜２０μＭ、特に好ましくは５〜１０μＭとすることができる。
【０１２３】
また、本発明のキナーゼ阻害剤を用いるに際して、細胞を培養するための培地は特に限定されず、市販の培地を用いることもできる。好適な市販培地としては、例えば、ダルベッコ改変イーグル培地（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ’ｓ Ｍｅｄｉｕｍ；ＤＭＥＭ）、ハムＦ１２培地（Ｈａｍ’ｓ Ｎｕｔｒｉｅｎｔ ＭｉｘｔｕｒｅＦ１２）、ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地、マッコイ５Ａ培地（ＭｃＣｏｙ’s ５Ａ ｍｅｄｉｕｍ）、イーグルＭＥＭ（Ｅａｇｌｅ’s Ｍｉｎｉｍｕｍ Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｍｅｄｉｕｍ；ＥＭＥＭ）、αＭＥＭ（ａｌｐｈａ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ’s Ｍｉｎｉｍｕｍ Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｍｅｄｉｕｍ；αＭＥＭ）、ＭＥＭ（Ｍｉｎｉｍｕｍ Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｍｅｄｉｕｍ）、ＲＰＭＩ１６４０培地、イスコフ改変ダルベッコ培地（Ｉｓｃｏｖｅ’s Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’s Ｍｅｄｉｕｍ；ＩＭＤＭ）、ＭＣＤＢ１３１培地、ウィリアム培地Ｅ、ＩＰＬ４１培地、Ｆｉｓｃｈｅｒ’s培地、ＳｔｅｍＰｒｏ３４（インビトロジェン社製）、Ｘ−ＶＩＶＯ １０（ケンブレックス社製）、Ｘ−ＶＩＶＯ １５（ケンブレックス社製）、ＨＰＧＭ（ケンブレックス社製）、ＳｔｅｍＳｐａｎ Ｈ３０００（ステムセルテクノロジー社製）、ＳｔｅｍＳｐａｎＳＦＥＭ（ステムセルテクノロジー社製）、ＳｔｅｍｌｉｎｅＩＩ（シグマアルドリッチ社製）、ＱＢＳＦ−６０（クオリティバイオロジカル社製）、ＳｔｅｍＰｒｏｈＥＳＣＳＦＭ（インビトロジェン社製）、Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ８（登録商標）培地（ギブコ社製）、ｍＴｅＳＲ１或いは２培地（ステムセルテクノロジー社製）、ＴｅＳＲ−Ｅ８培地（ステムセルテクノロジー社製）、リプロＦＦ或いはリプロＦＦ２（リプロセル社製）、Ｐｒｉｍａｔｅ  ＥＳ  Ｃｅｌｌ  Ｍｅｄｉｕｍ（リプロセル社製）、ＰＳＧｒｏ ｈＥＳＣ／ｉＰＳＣ培地（システムバイオサイエンス社製）、ＮｕｔｒｉＳｔｅｍ（登録商標）培地（バイオロジカルインダストリーズ社製）、ＳｔｅｍＦｉｔ（登録商標）培地（味の素社製）、ＣＳＴＩ−７培地（細胞科学研究所社製）、ＭｅｓｅｎＰＲＯ ＲＳ培地（ギブコ社製）、ＭＦ−Ｍｅｄｉｕｍ（登録商標）間葉系幹細胞増殖培地（東洋紡株式会社製）、間葉系幹細胞用培地（プロモセル社製）、Ｓｆ−９００ＩＩ（インビトロジェン社製）、Ｏｐｔｉ−Ｐｒｏ（インビトロジェン社製）、ケラチノサイト基礎培地２（ＰｒｏｍｏＣｅｌｌ社製）、ケラチノサイト増殖培地２（ＰｒｏｍｏＣｅｌｌ社製）、正常ヒト表皮角化細胞増殖用培地（クラボウ社製）、正常ヒト表皮角化細胞基礎培地（クラボウ社製）、ヒトＥｐｉＶｉｔａ増殖培地（東洋紡株式会社製）、ＥｐｉＬｉｆｅ（登録商標）培地（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）、角膜上皮細胞基礎培地（ＡＴＣＣ（登録商標）、ＰＣＳ−７００−０３０（登録商標））等の培地が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１２４】
また、上記の培地に、ナトリウム、カリウム、カルシウム、マグネシウム、リン、塩素、各種アミノ酸、各種ビタミン、抗生物質、血清、脂肪酸、糖、細胞増殖因子、分化誘導因子、細胞接着因子、抗体、酵素、サイトカイン、ホルモン、レクチン、細胞外マトリックス、生理活性物質等の更なる物質を、試験・研究の目的に応じて、適宜添加することができる。具体的な例としては、塩基性線維芽細胞増殖因子、トランスフォーミング増殖因子−α、トランスフォーミング増殖因子−β、上皮成長因子、インスリン様成長因子、Ｗｎｔ蛋白質、アンフィレグリン、インターフェロン類、インターロイキン類、血管内皮細胞増殖因子、血小板由来成長因子、肝細胞増殖因子、アルブミン、インスリン、β−メルカプトエタノール、Ｋｎｏｃｋｏｕｔ  Ｓｅｒｕｍ  Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ（ＫＳＲ、サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）、Ｇｌｕｔａｍａｘ（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）、ヒドロコルチゾン、エピネフリン、Ｌ−グルタミン、ピルビン酸、亜セレン酸などが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１２５】
細胞培養条件（例えば、温度、二酸化炭素濃度、培養期間等）は自体公知の条件を用いればよく、あるいは、目的に応じて、適宜改変してもよい。例えば、細胞を培養する際の温度は、通常２５〜３９℃、好ましくは３３〜３９℃（例、３７℃）である。二酸化炭素濃度は、通常、培養の雰囲気中、４〜１０体積％であり、４〜６体積％が好ましい。培養期間は、通常１〜３５日間であるが、培養の目的に合わせて適宜設定すればよい。
【０１２６】
２．Ｈｉｐｐｏシグナル伝達経路阻害剤
本発明はまた、本発明に用いられる特定化合物を含む、Ｈｉｐｐｏシグナル伝達経路阻害剤（以下、「本発明のＨｉｐｐｏシグナル伝達経路阻害剤」と称することがある。）を提供する。
【０１２７】
Ｈｉｐｐｏシグナル伝達経路は、細胞増殖、細胞死、器官サイズ、自己複製、幹細胞および前駆細胞の分化、創傷治癒、組織再生に関与するシグナル伝達経路である。この経路は多種の生物において進化的に保存されており、特に哺乳動物において高度に保存されている。哺乳動物におけるＨｉｐｐｏシグナル伝達経路の主要な因子には、ＬＡＴＳ１およびＬＡＴＳ２が挙げられる。ＬＡＴＳは、足場タンパク質Ｍｏｂ１Ａ／Ｂとの会合によって活性化される。ＬＡＴＳはまた、ＳＴＥ２０ファミリープロテインキナーゼＭｓｔ１およびＭｓｔ２によるリン酸化によっても活性化される。ＬＡＴＳは、転写共役因子である下流エフェクターのＹＡＰおよびＴＡＺをリン酸化する。ＬＡＴＳによるＹＡＰおよびＴＡＺのリン酸化は、Ｈｉｐｐｏシグナル伝達経路における非常に重要な事象である。リン酸化されたＹＡＰおよびＴＡＺは、細胞核から細胞質へと移行し、ユビキチンプロテアソーム系により分解される。従って、Ｈｉｐｐｏシグナル伝達経路が活性化された状態にある場合は、ＹＡＰおよび／またはＴＡＺはＬＡＴＳによりリン酸化され、細胞質中に移行し、分解される。一方、Ｈｉｐｐｏシグナル伝達経路が不活性の状態にある場合は、ＹＡＰおよび／またはＴＡＺはリン酸化されておらず、細胞核中に局在する。
【０１２８】
上述した通り、ＹＡＰおよび／またはＴＡＺは転写共役因子であり、細胞核中に局在する場合、様々な遺伝子の発現を誘導することが知られている。ＹＡＰおよび／またはＴＡＺによって発現が誘導される遺伝子の多くは、細胞の生存や増殖を媒介することが知られている。かかる遺伝子の例としては、例えば、ＣＣＮＤ１、ＣＴＧＦ、ＢＩＲＣ２、ＣＹＲ６１、ＡＭＯＴＬ２、ＴＧＦＢ２、ＡＮＫＲＤ１等が挙げられるが、これらに限定されるものではない。尚、ＣＣＮＤ１遺伝子（ＣＹＣＬＩＮ  Ｄ１、「ＰＲＡＤ１」等とも称される。）は、ヒトにおいては１１番染色体に存在する。該遺伝子によりコードされるタンパク質（２９５アミノ酸、分子量：約３６ｋＤａ）は、細胞周期の促進に関する。ＣＴＧＦ遺伝子（ｃｏｎｎｅｃｔｉｖｅ  ｔｉｓｓｕｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ、「ＣＣＮ２」等とも称される。）は、ヒトにおいては第６番染色体に存在し、細胞増殖促進等を誘導するポリペプチド（３４９アミノ酸、分子量：約３５ｋＤａ）をコードする。ＢＩＲＣ２遺伝子（ｂａｃｕｌｏｖｉｒａｌ  ＩＡＰ  ｒｅｐｅａｔ  ｋｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ２、「ＡＰＩ１」等とも称される。）は、ヒトにおいては第１１番染色体に存在し、カスパーゼ分解活性によりアポトーシスを阻害するタンパク質（６１８アミノ酸、分子量：約７０ｋＤａ）をコードする遺伝子である。ＣＹＲ６１遺伝子（ｃｙｓｔｅｉｎｅ  ｒｉｃｈ  ａｎｇｉｏｇｅｎｉｃ  ｉｎｄｕｃｅｒ  ６１、「ＣＣＮ１」等とも称される。）は、ヒトにおいては第１番染色体に存在する。該遺伝子によりコードされるタンパク質（３８１アミノ酸、分子量：約３９ｋＤａ）は、血管形成、ＶＥＧＦの亢進、骨形成において重要な役割を担う。ＡＭＯＴＬ２遺伝子（ａｎｇｉｏｍｏｔｉｎ  ｌｉｋｅ  ２、「ＬＣＣＰ」とも称される。）は、ヒトにおいては第３番染色体（３ｑ２２．２）に存在する。該遺伝子によりコードされるタンパク質（８３７アミノ酸、分子量：約９２ｋＤａ）は、血管新生を阻害するアンジオモチンに関連し、モチンタンパク質ファミリーに属する。ＡＮＫＲＤ１遺伝子（Ａｎｋｙｒｉｎ ｒｅｐｅａｔ ｄｏｍａｉｎ−ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ １、Ｃａｒｄｉａｃ  ａｄｒｉａｍｙｃｉｎ−ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ、「ＣＡＲＰ」とも称される。）は、ヒトにおいては第１０番染色体に存在する。該遺伝子によりコードされるタンパク質（３１９アミノ酸、分子量：約３６ｋＤａ）は、心筋や骨格筋において高発現しており、転写因子として機能している。
【０１２９】
本発明のＨｉｐｐｏシグナル伝達経路阻害剤は、ＬＡＴＳ（特にＬＡＴＳ２）のキナーゼ活性を阻害し、ＬＡＴＳによるＹＡＰおよび／またはＴＡＺのリン酸化を阻害する。ＹＡＰおよび／またはＴＡＺがリン酸化されないため、ＹＡＰおよび／またはＴＡＺの核内移行が促進される。結果として、ＹＡＰおよび／またはＴＡＺにより発現が誘導される遺伝子の遺伝子発現が亢進する。従って、本発明のＨｉｐｐｏシグナル伝達経路阻害剤は、「ＹＡＰおよび／またはＴＡＺの核内移行促進剤」、もしくは、「ＹＡＰおよび／またはＴＡＺにより誘導される遺伝子の発現促進剤」とも言い換えることができる。
【０１３０】
なお、本明細書において「ＹＡＰおよび／またはＴＡＺの核内移行を促進する」とは、ＹＡＰおよび／またはＴＡＺのリン酸化と蛋白質分解を阻害することにより、細胞質よりも核でのＹＡＰおよび／またはＴＡＺの存在量を高めることを意味する。尚、ＹＡＰおよび／またはＴＡＺの存在量を高めるとは、例えば、対照となるＹＡＰおよび／またはＴＡＺの細胞核内の存在量と比較して、少なくとも１．３倍以上、少なくとも１．５倍以上、少なくとも２倍以上、少なくとも３倍以上、少なくとも４倍以上、少なくとも５倍以上、少なくとも６倍以上、少なくとも７倍以上、少なくとも８倍以上、少なくとも９倍以上、少なくとも１０倍以上、ＹＡＰおよび／またはＴＡＺの細胞核内の存在量が上昇することを意味する。尚、ＹＡＰおよび／またはＴＡＺの細胞核の存在量の測定は、後述する実施例において用いられているような、蛍光ラベルを結合させた抗ＹＡＰ（またはＴＡＺ）抗体を用いたイメージング解析等の自体公知の方法により実施することができる。また、ＹＡＰおよび／またはＴＡＺの細胞核の存在量は、ウェスタンブロッティング法等を用いてＹＡＰおよび／またはＴＡＺのリン酸化状態を観察することにより、間接的に測定することができる。
【０１３１】
また、本明細書において「ＹＡＰおよび／またはＴＡＺにより誘導される遺伝子の発現促進」とは、ＹＡＰおよび／またはＴＡＺの細胞核への移行が促進される結果、ＹＡＰおよび／またはＴＡＺにより誘導される遺伝子（例えば、ＣＣＮＤ１、ＣＴＧＦ、ＢＩＲＣ２、ＣＹＲ６１、ＡＭＯＴＬ２、ＴＧＦＢ２、ＡＮＫＲＤ１の少なくとも１つ以上）の発現量が亢進することを意味する。尚、遺伝子発現が亢進するとは、例えば、所定の対照レベルの発現量（例えば、本発明のＨｉｐｐｏシグナル伝達経路阻害剤を無添加の細胞群）と比較して、少なくとも１．３倍以上、少なくとも１．５倍以上、少なくとも２倍以上、少なくとも３倍以上、少なくとも４倍以上、少なくとも５倍以上、少なくとも６倍以上、少なくとも７倍以上、少なくとも８倍以上、少なくとも９倍以上、少なくとも１０倍以上、上記した遺伝子の少なくとも１つ以上の遺伝子の発現量が上昇することを意味する。尚、遺伝子発現の亢進の評価は、マイクロアレイ法、リアルタイムＰＣＲ法等を用いて転写レベルで評価してもよく、或いは、ウェスタンブロッティング法等を用いてタンパク質翻訳レベルで評価することもできる。
【０１３２】
本発明のＨｉｐｐｏシグナル伝達経路阻害剤における、本発明に用いられる特定化合物の量、剤形、滅菌処理等に関しては、１．本発明のキナーゼ阻害剤において説明したものと同様である。
【０１３３】
本発明のＨｉｐｐｏシグナル伝達経路阻害剤の使用態様の例としては、分子生物学的な試験や研究目的での使用等が含まれるが、これらに限定されない。分子生物学的な試験や研究目的での使用の具体例としては、例えば、本発明のＨｉｐｐｏシグナル伝達経路阻害剤を、Ｈｉｐｐｏシグナル伝達経路を有する細胞に投与することで、Ｈｉｐｐｏシグナル伝達経路が阻害された状態の細胞を容易に調製することができる。上述した通り、本発明のＨｉｐｐｏシグナル伝達経路阻害剤は、ＹＡＰおよび／またはＴＡＺの細胞核への移行を促進するため、該細胞においてはＹＡＰおよび／またはＴＡＺが関与する疾病の表現型がより明確に表れ得る。従って、かかる特性を有する細胞を用いることにより、ＹＡＰおよび／またはＴＡＺの機能を調節し得る物質の探索を効率よく行い得る。
【０１３４】
一態様において、Ｈｉｐｐｏシグナル伝達経路を有する細胞は、哺乳動物由来の細胞であり得る。かかる細胞の例としては、生体を構成する体細胞、正常細胞株、がん細胞株、前駆細胞、幹細胞、生体から分離され人為的に遺伝子改変が成された細胞、生体から分離され人為的に核が交換された細胞等の細胞が挙げられるが、これらに限定されない。なお、これらの細胞の由来も特に限定されず、ラット、マウス、ウサギ、モルモット、リス、ハムスター、ハタネズミ、カモノハシ、イルカ、クジラ、イヌ、ネコ、ヤギ、ウシ、ウマ、ヒツジ、ブタ、ゾウ、コモンマーモセット、リスザル、アカゲザル、チンパンジー、ヒト等の哺乳動物由来の細胞が挙げられる。また、かかる細胞が由来する組織または臓器も、特に限定されず、組織の例としては、皮膚、腎臓、脾臓、副腎、肝臓、肺、卵巣、膵臓、子宮、胃、結腸、小腸、大腸、膀胱、前立腺、精巣、胸腺、筋肉、結合組織、骨、軟骨、血管組織、血液、心臓、眼、脳または神経組織等の組織が挙げられ、また、臓器の例としては、肝臓、肺、腎臓、心臓、膵臓、胃、脾臓、小腸、大腸、生殖器等の臓器が挙げられる。
【０１３５】
本発明のＨｉｐｐｏシグナル伝達経路阻害剤の、Ｈｉｐｐｏシグナル伝達経路を有する細胞への投与は、当該細胞を培養する培地に本発明のＨｉｐｐｏシグナル伝達経路阻害剤を添加することにより達成される。本発明のキナーゼ阻害剤の添加量は、本発明の所望の効果を得られる量であれば特に限定されないが、例えば、本発明に用いられる特定化合物の培地中の濃度が、通常０．００１〜１００μＭ、好ましくは０．０１〜５０μＭ、より好ましくは０．１〜３０μＭ、さらに好ましくは１〜２０μＭ、特に好ましくは５〜１０μＭとすることができる。
【０１３６】
また、本発明のＨｉｐｐｏシグナル伝達経路阻害剤を用いるに際して、細胞を培養するための培地は特に限定されず、市販の培地を用いることもできる。本発明のＨｉｐｐｏシグナル伝達経路阻害剤の使用に際して用い得る市販培地は、本発明のキナーゼ阻害剤の使用に際して用い得る市販培地と同様である。また、細胞培養条件等も本発明のキナーゼ阻害剤で説明したものと同様である。
【０１３７】
３．細胞増殖の不全を伴う疾患または組織損傷の治療剤
本発明はまた、本発明に用いられる特定化合物を含む、細胞増殖の不全を伴う疾患または組織損傷の治療剤（以下、「本発明の細胞増殖の不全を伴う疾患または組織損傷の治療剤」と称することがある。）を提供する。
【０１３８】
Ｈｉｐｐｏシグナル伝達経路は、細胞増殖、細胞死、器官サイズ、自己複製、幹細胞および前駆細胞の分化、創傷治癒、組織再生に関与するシグナル伝達経路であり、特に、Ｈｉｐｐｏシグナル伝達経路を阻害することにより、細胞増殖、創傷治癒、および組織再生が亢進される。従って、一態様において、本発明のＨｉｐｐｏシグナル伝達経路阻害剤は、細胞増殖の不全を伴う疾患または損傷組織の再生にも用いることもできる。
【０１３９】
本発明の細胞増殖の不全を伴う疾患または組織損傷の治療剤における、本発明に用いられる特定化合物の量、滅菌処理等に関しては、１．本発明のキナーゼ阻害剤において説明したものと同様である。
【０１４０】
本発明の細胞増殖の不全を伴う疾患または組織損傷の治療剤は、単独で、又は他の少なくとも１種類の治療薬と組み合わせて使用されてもよい。その際、本発明の細胞増殖の不全を伴う疾患または組織損傷の治療剤は、当該治療薬と共に同時に投与されてもよく、あるいは、当該治療薬の投与に先立って、又はその後に投与されてもよい。本発明の細胞増殖の不全を伴う疾患または組織損傷の治療剤は、当該治療薬と同じか、又は異なった投与経路により投与されてもよい。当該治療薬としては、化学療法薬、支持治療薬、又はその組み合わせが挙げられる。
【０１４１】
本明細書中において「治療する」とは、疾患の程度を部分的又は完全に軽減すること、疾患に関連する臨床的症状又は指標が改善するか又は向上すること、疾患の進行を遅らせるか、抑制するか、又は予防すること、或いは疾患の発症又は進行を部分的又は完全に遅らせるか、抑制するか、又は予防すること、の1つ以上を部分的又は実質的に達成することが含まれる。
【０１４２】
本発明の細胞増殖の不全を伴う疾患または組織損傷の治療剤の適用対象となる動物は、通常哺乳動物であり、好ましくはヒトであるが、ペット（例えば、イヌ、ネコ、モルモット、ウサギ、リス等）或いは家畜（ウシ、ヒツジ、ブタ、ウマ等）であってもよい。
【０１４３】
また、本発明の細胞増殖の不全を伴う疾患または組織損傷の治療剤は、通常錠剤、カプセル剤、散剤、顆粒剤、丸剤、シロップ剤などの経口投与剤、直腸投与剤、経皮吸収剤あるいは注射剤として投与できる。本剤は１個の治療薬として、あるいはほかの治療薬との混合物として投与できる。それらは単体で投与してもよいが、一般的には医薬組成物の形態で投与する。それらの製剤は、薬理的、製剤学的に許容しうる添加物を加え、常法により製造することができる。すなわち、経口剤には通常の賦形剤、滑沢剤、結合剤、崩壊剤、湿潤剤、可塑剤、コーティング剤などの添加物を使用することができる。経口用液剤は、水性または油性懸濁液、溶液、乳濁液、シロップ、エリキシルなどの形態であってもよく、あるいは使用前に水またはほかの適当な溶媒で調製するドライシロップとして供されてもよい。前記の液剤は、懸濁化剤、香料、希釈剤あるいは乳化剤のような通常の添加剤を含むことができる。直腸内投与する場合は座剤として投与することができる。坐剤はカカオ脂、ラウリン脂、マクロゴール、グリセロゼラチン、ウィテップゾール、ステアリン酸ナトリウムまたはそれらの混合物など、適当な物質を基剤として用い、必要に応じて乳化剤、懸濁化剤、保存剤などを加えることができる。注射剤は、水性剤形あるいは用時溶解型剤形を形成するために、注射用蒸留水、生理食塩水、５％ブドウ糖溶液、プロピレングリコールなどの溶解剤ないし溶解補助剤、ｐＨ調節剤、等張化剤、安定化剤などの製剤成分が使用される。局所投与剤としては、例えば、スプレー、エアロゾル、クリーム剤、軟膏剤、ローション剤、リニメント剤、ゲル剤が挙げられ、好ましくはスプレー、クリーム剤、軟膏剤、又はゲル剤である。これらの製剤には必要により、吸収促進剤、ｐＨ調整剤、保存剤、着香料、分散剤、湿潤剤、安定剤、防腐剤、懸濁剤、界面活性剤、抗菌剤等の添加剤を配合することができる。また、本発明の治療剤は、被覆材と共に用いることができる。その例としては、ガーゼ、ポリウレタンフィルム、ハイドロコロイド、ポリウレタンフォーム、アルギン酸塩被覆材、ハイドロジェル、ハイドロファイバー、ハイドロポリマー等を挙げることができる。以下に、本発明の細胞増殖の不全を伴う疾患または組織損傷の治療剤の製剤例およびその調製方法を例示するが、これらに限定されるものではない。
【０１４４】
製剤例１
以下の成分を含有する顆粒剤を製造する。
成分
式（Ｉ）で表される化合物  １０ｍｇ
乳糖                    ７００ｍｇ
コーンスターチ          ２７４ｍｇ
ＨＰＣ−Ｌ                １６ｍｇ                      
計                    １０００ｍｇ
【０１４５】
式（Ｉ）で表される化合物と乳糖を６０メッシュのふるいに通す。コーンスターチを１２０メッシュのふるいに通す。これらをＶ型混合機にて混合する。混合末に低粘度ヒドロキシプロピルセルロース（ＨＰＣ−Ｌ）水溶液を添加し、練合、造粒（押し出し造粒 孔径０．５〜１ｍｍ）した後、乾燥する。得られた乾燥顆粒を振動ふるい（12/60メッシュ）で篩過し顆粒剤を得る。
【０１４６】
製剤例２
以下の成分を含有するカプセル充填用散剤を製造する。
成分
式（Ｉ）で表される化合物  １０ｍｇ
乳糖                      ７９ｍｇ
コーンスターチ            １０ｍｇ
ステアリン酸マグネシウム    １ｍｇ                      
計                      １００ｍｇ
【０１４７】
式（Ｉ）で表される化合物と乳糖を６０メッシュのふるいに通す。コーンスターチを１２０メッシュのふるいに通す。これらとステアリン酸マグネシウムをＶ型混合機にて混合する。１０倍散１００ｍｇを5号硬ゼラチンカプセルに充填する。
【０１４８】
製剤例３
以下の成分を含有するカプセル充填用顆粒剤を製造する。
成分
式（Ｉ）で表される化合物  １５ｍｇ
乳糖                      ９０ｍｇ
コーンスターチ            ４２ｍｇ
ＨＰＣ−Ｌ                  ３ｍｇ                      
計                      １５０ｍｇ
【０１４９】
式（Ｉ）で表される化合物と乳糖を６０メッシュのふるいに通す。コーンスターチを１２０メッシュのふるいに通す。これらをＶ型混合機にて混合する。混合末に低粘度ヒドロキシプロピルセルロース（HPC-L）水溶液を添加し、練合、造粒した後、乾燥する。得られた乾燥顆粒を振動ふるい（12/60メッシュ）で篩過し整粒し、その１５０ｍｇを４号硬ゼラチンカプセルに充填する。
【０１５０】
製剤例４
以下の成分を含有する錠剤を製造する。
成分
式（Ｉ）で表される化合物  １０ｍｇ
乳糖                      ９０ｍｇ
微結晶セルロース          ３０ｍｇ
ステアリン酸マグネシウム    ５ｍｇ
CMC-Na                    １５ｍｇ                      
計                      １５０ｍｇ
【０１５１】
式（Ｉ）で表される化合物と乳糖と微結晶セルロース、CMC-Na(カルボキシメチルセルロース ナトリウム塩)を６０メッシュのふるいに通し、混合する。混合末にステアリン酸マグネシウムを添加し、製剤用混合末を得る。本混合末を直打し１５０ｍｇの錠剤を得る。
【０１５２】
製剤例５
静脈用製剤は次のように製造する。
式（Ｉ）で表される化合物  １００ｍｇ
飽和脂肪酸グリセリド    １０００ｍＬ
上記成分の溶液は通常、1分間に１ｍＬの速度で患者に静脈内投与される。
【０１５３】
製剤例６
液剤は次のように製造する。
式（Ｉ）で表される化合物  １０ｍｇ
エタノール                  １ｍＬ
水                        ９９ｍＬ
上記成分を混合する。
【０１５４】
製剤例７
液剤は次のように製造する。
式（Ｉ）で表される化合物                １ｇ
Ｐｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ−６８            １０ｇ
プロピレングリコール                ２０ｍＬ
トリスヒドロキシメチルアミノメタン  ２．４ｇ
水                                ９７０ｍＬ
上記成分を混合する。
【０１５５】
本発明の細胞増殖の不全を伴う疾患または組織損傷の治療剤をヒトに投与する場合は、その投与量を患者の年齢、状態により決定するが通常成人の場合、経口剤あるいは直腸内投与では、本発明に用いられる特定化合物の投与量として、０．１〜１０００ｍｇ/ヒト/日程度、注射剤で０．０５ｍｇ〜５００ｍｇ/ヒト/日程度である。局所投与剤では、投与量は通常成人１回当たり０．０１ｍｇ／ｋｇ乃至１００ｍｇ／ｋｇであり、投与回数は通常１日１回から６回である。これらの数値はあくまでも例示であり、投与量は患者の症状にあわせて決定されるものである。
【０１５６】
プロドラッグとして利用できる本発明に用いられる特定化合物は、加溶媒分解によりまたは生理的条件下のインビボにおいて本発明の薬理学的に活性な化合物を生成する、化学的または代謝的に分解できる基を有する本発明の誘導体である。適当なプロドラッグを選択する方法および製造する方法は、例えばＤｅｓｉｇｎ  ｏｆ  Ｐｒｏｄｒｕｇｓ（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ １９８５）に記載されている。本発明において、水酸基を有する化合物である場合は、該化合物と適当なアシルハライドまたは適当な酸無水物とを反応させることによって得られるアシルオキシ誘導体がプロドラッグとして例示される。プロドラッグとして特に好ましいアシルオキシとしては−ＯＣＯＣ２Ｈ５、−ＯＣＯ（ｔ−Ｂｕ）、−ＯＣＯＣ１５Ｈ３１、−ＯＣＯ（ｍ−ＣＯ２Ｎａ−Ｐｈ）、−ＯＣＯＣＨ２ＣＨ２ＣＯ２Ｎａ、−ＯＣＯＣＨ（ＮＨ２）ＣＨ３、−ＯＣＯＣＨ２Ｎ（ＣＨ３）２などが挙げられる。本発明を形成する化合物がアミノ基を有する場合は、アミノ基を有する化合物と適当な酸ハロゲン化物または適当な混合酸無水物とを反応させることにより製造されるアミド誘導体がプロドラッグとして例示される。プロドラッグとして特に好ましいアミドとしては、−ＮＨＣＯ（ＣＨ２）２０ＯＣＨ３、−ＮＨＣＯＣＨ（ＮＨ２）ＣＨ３等が挙げられる。
【０１５７】
本発明の細胞増殖の不全を伴う疾患または組織損傷の治療剤が適用され得る疾患としては、Ｈｉｐｐｏシグナル伝達経路の阻害による細胞増殖促進、創傷治癒、組織再生の結果として治療され得る疾患または組織損傷であれば特に限定されない。一態様において、細胞増殖の不全を伴う疾患には、Ｈｉｐｐｏシグナル伝達経路の異常な活性化を伴う疾患が含まれる。また別の一態様において、細胞増殖の不全を伴う疾患は、ＹＡＰおよび／またはＴＡＺの核内移行の抑制を伴う疾患が含まれる。かかる細胞増殖の不全を伴う疾患または組織損傷の例としては、例えば、炎症性疾患（例えば、炎症、皮膚炎、アトピー性皮膚炎、肝炎、腎炎、糸球体腎炎、膵炎、乾癬、痛風、アジソン病（Ａｄｄｉｓｏｎ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ）、炎症性腸疾患（例えば、クローン病（Ｃｒｏｈｎ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ）、潰瘍性大腸炎、膠原線維性大腸炎、リンパ球性大腸炎、虚血性大腸炎、空置大腸炎、ベーチェット症候群、感染性大腸炎（ｉｎｆｅｃｔｉｖｅ  ｃｏｌｉｔｉｓ）、および分類不能大腸炎など）、神経変性疾患（例えば、アルツハイマー病、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、クロイツフェルト・ヤコブ病、ハンチントン病、脊髄小脳変性症（ＳＣＤ）、多系統萎縮症（ＭＳＡ）、脊髄性筋萎縮症（ＳＭＡ）、球脊髄性筋萎縮症など）、免疫性神経疾患（例えば、多発性硬化症、ギラン・バレー症候群、重症筋無力症、多発性筋炎など）、筋ジストロフィー、ミオパチー、外傷、火傷、薬傷、皮膚潰瘍、外傷性潰瘍、下肢潰瘍、凍傷潰瘍、免疫性潰瘍、帯状疱疹後潰瘍、放射線潰瘍、褥瘡、糖尿病性皮膚潰瘍、巨大色素性母斑、瘢痕、刺青による障害、尋常性白斑、白皮症、脊髄損傷、筋肉損傷、肝不全、薬剤性肝障害、アルコール性肝障害、虚血性肝障害、ウイルス性肝障害、自己免疫性肝障害、急性肝炎、慢性肝炎、肝硬変、皮膚損傷、脳浮腫、心筋梗塞、脳出血、および脳梗塞などが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１５８】
また、一態様において、本発明の細胞増殖の不全を伴う疾患または組織損傷の治療剤は、細胞、組織、臓器等を哺乳動物に移植した際の生着及び回復を促進する際に有効であり得る。移植される細胞の例としては、幹細胞（造血幹細胞、間葉系幹細胞、神経幹細胞等）、β細胞等が挙げられるが、これらに限定されない。移植される組織の例としては、血液、赤血球、血小板、リンパ球、骨髄、臍帯血、血管、角膜、網膜、眼球、皮膚等が挙げられるが、これらに限定されない。移植される臓器の例としては、膵臓、肺、腎臓、肝臓、心臓、小腸等が挙げられるが、これらに限定されない。本態様において、本発明の細胞増殖の不全を伴う疾患または損傷組織の治療剤は、「細胞、組織、および／または臓器移植の生着促進剤」とも言い換えられる。
【０１５９】
４．移植治療用細胞または組織の増殖促進剤
本発明はまた、本発明に用いられる特定化合物を含む、移植治療用細胞または組織の増殖促進剤（以下、「本発明の増殖促進剤」と称することがある。）を提供する。
【０１６０】
Ｈｉｐｐｏシグナル伝達経路が抑制または阻害されている細胞は、ＹＡＰおよび／またはＴＡＺの核内濃度が高まり、その結果、細胞増殖が促進される。加えて、Ｈｉｐｐｏシグナル伝達経路が抑制または阻害されている細胞は損傷治癒能や組織再生能に関する細胞機能も亢進している。従って、Ｈｉｐｐｏシグナル伝達経路を抑制または阻害されている細胞または該細胞を含む組織は移植治療に適し、Ｈｉｐｐｏシグナル伝達経路を抑制または阻害していない細胞または組織と比較して、対象への移植後、生着および／または回復に要する期間の短縮が期待される。
【０１６１】
本発明の増殖促進剤に配合される、本発明に用いられる特定化合物の量および滅菌処理等に関しては、１．本発明のキナーゼ阻害剤において説明したものと同様である。
【０１６２】
本発明の増殖促進剤を添加した培地において細胞を培養することにより、Ｈｉｐｐｏシグナル伝達経路が抑制または阻害されている細胞、またはこれを含む組織を生体外において調製することができる。一態様において、本発明の増殖促進剤を添加した培地において培養される細胞は、哺乳動物由来の細胞であり得る。かかる細胞の例としては、生体を構成する体細胞、正常細胞株、がん細胞株、前駆細胞、幹細胞、生体から分離され人為的に遺伝子改変が成された細胞、生体から分離され人為的に核が交換された細胞等の細胞が挙げられるが、これらに限定されない。なお、これらの細胞の由来も特に限定されず、ラット、マウス、ウサギ、モルモット、リス、ハムスター、ハタネズミ、カモノハシ、イルカ、クジラ、イヌ、ネコ、ヤギ、ウシ、ウマ、ヒツジ、ブタ、ゾウ、コモンマーモセット、リスザル、アカゲザル、チンパンジー、ヒト等の哺乳動物由来の細胞が挙げられる。また、かかる細胞が由来する組織または臓器も、特に限定されず、組織の例としては、皮膚、腎臓、脾臓、副腎、肝臓、肺、卵巣、膵臓、子宮、胃、結腸、小腸、大腸、膀胱、前立腺、精巣、胸腺、筋肉、結合組織、骨、軟骨、血管組織、血液、心臓、眼、脳または神経組織等の組織が挙げられ、また、臓器の例としては、肝臓、肺、腎臓、心臓、膵臓、胃、脾臓、小腸、大腸、生殖器等の臓器が挙げられる。一態様において、培養する細胞としては幹細胞が好ましい。例えば、生体外でＥＳ細胞やｉＰＳ細胞を本発明の増殖促進剤を添加した培地を用いて培養すれば、該細胞の増殖が促進され、大量のＥＳ細胞またはｉＰＳ細胞を効率よく調製することができる。かくして得られたＥＳ細胞またはｉＰＳ細胞を、自体公知の方法により目的の組織へと分化させることで、移植治療に好適に用いることができる。
【０１６３】
本発明の増殖促進剤の培地への添加量は、細胞におけるＨｉｐｐｏシグナル伝達経路が阻害される限り特に限定されないが、例えば、本発明に用いられる特定化合物の培地中の濃度が、通常０．００１〜１００μＭ、好ましくは０．０１Ｍ〜５０μＭ、より好ましくは０．１〜３０μＭ、さらに好ましくは１〜２０μＭ、特に好ましくは５〜１０μＭとすることができる。また、本発明の増殖促進剤の培地への添加タイミングは、細胞を培養し、増幅させている期間中であればいかなるタイミングで添加してもよいが、細胞増殖を促進する効果の観点からは、培養開始時から添加しておくことが好ましい。
【０１６４】
また、本発明の増殖促進剤を添加することができる培地は、細胞を維持または増殖できる培地である限り特に限定されず、市販の培地を用いることもできる。本発明の増殖促進剤の使用に際して用い得る市販培地は、本発明のキナーゼ阻害剤の使用に際して用い得る市販培地と同様である。
【０１６５】
本発明の増殖促進剤を添加した培地における培養条件としては、細胞を維持又は増幅し得る限り特に限定されないが、培養温度として、例えば３０〜４０℃の範囲内、好ましくは３６〜３８℃の範囲内、より好ましくは３７℃を好適に例示することができる。また、細胞をより好適に維持または増幅する観点から、培地交換や継代を適当な時期に行うことが好ましい。培地交換の頻度としては、細胞を維持または増幅し得る限り特に限定されないが、例えば１〜５日間経過毎、好ましくは３日間経過毎とすることができる。継代の頻度としては、細胞を維持または増幅し得る限り特に限定されず、細胞の集団（好ましくはオルガノイド）が大きくなってきたタイミングで適宜行うことができ、例えば、４〜１２日間経過毎、好ましくは６〜１０日間経過毎とすることができる。
【０１６６】
細胞および／または組織の培養は、細胞培養に一般的に用いられるシャーレ、フラスコ、プラスチックバック、テフロン（登録商標）バック、ディッシュ、ペトリデッシュ、組織培養用ディッシュ、マルチディッシュ、マイクロプレート、マイクロウエルプレート、マルチプレート、マルチウエルプレート、チャンバースライド、チューブ、トレイ、培養バック、ローラーボトル等の培養容器を用いて実施することができる。一態様において、培養容器として、培養容器の表面が、細胞との接着性を向上させる目的で人工的に処理（例えば、細胞外マトリクス等によるコーティング処理）されているものを用いてもよい。このような容器の例としては、マトリゲル（登録商標）、Ｇｅｌｔｒｅｘ（登録商標）、コラーゲン、ゼラチン、ポリ−Ｌ−リジン、ポリ−Ｄ−リジン、ラミニン、ｉＭａｔｒｉｘ−５１１、ｉＭａｔｒｉｘ−４１１、ｉＭａｔｒｉｘ−２２１、フィブロネクチン、ビトロネクチン、テネイシン、セレクチン、ヒアルロン酸、フィブリン等をコーティングした容器が挙げられるが、これらに限定されない。また、細胞及び／又は組織の培養器材に対する接着を阻害するためのコーティング材料を用いることもできる。このようなコーティング材料としては、ハイドロゲル、ｐｒｅｖｅｌｅｘ（登録商標）、シリコン、ポリ（２−ヒドロキシメチルメタクリレート）、ポリ（２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン）等が挙げられるが、これらに限られるわけではない。また、培養容器の表面が、細胞との接着性を低減させる目的で人工的に処理されているものも使用できる。このような培養容器の例としては、スミロンセルタイトプレート（住友ベークライト株式会社製）、ＰｒｉｍｅＳｕｒｆａｃｅ（登録商標）プレート（住友ベークライト株式会社製）、超低接着表面プレート（コーニング社製）、ヌンクロンスフェラプレート（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）等が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１６７】
細胞および／または組織の培養は、機械的な制御下のもと閉鎖環境下で細胞播種、培地交換、細胞画像取得、培養細胞回収を自動で実行し、ｐＨ、温度、酸素濃度などを制御しながら、高密度での培養が可能なバイオリアクターや自動培養装置によって行うこともできる。これら装置を用いて培養の途中に新しい培地を補給し、要求する物質を過不足なく細胞および／または組織に供給する手法には、流加培養、連続培養、灌流培養が含まれるが、これらに限定されない。
【０１６８】
５．スクリーニング方法
上述した本発明のＨｉｐｐｏシグナル伝達経路阻害剤によれば、所望の細胞のＨｉｐｐｏシグナル伝達経路を阻害することができる。Ｈｉｐｐｏシグナル伝達経路が阻害された細胞は、ＹＡＰおよび／またはＴＡＺの核内移行の亢進を伴う疾患の細胞環境を模倣している。従って、かかる細胞を用いることにより、該疾患の治療または予防に適用し得る候補物質をスクリーニングすることができる。即ち、本発明は、ＹＡＰおよび／またはＴＡＺの核内移行の亢進を伴う疾患を治療および／または予防するための物質のスクリーニング方法（以下、「本発明のスクリーニング方法」と称することがある。）を提供する。
【０１６９】
本発明のスクリーニング方法においては、まず、本発明に用いられる特定化合物（または本発明のＨｉｐｐｏシグナル伝達経路阻害剤でもよい）を添加した培地において細胞を培養する（工程１）。工程１に用い得る細胞、培地、特定化合物の培地への添加量等は、本発明のキナーゼ阻害剤において説明したものと同様である。
【０１７０】
次に、工程１において得られた細胞に対して被検物質を接触させる。被検物質の接触は被検物質を細胞培養培地に添加することにより行うことができる。被検物質を培養培地に添加後、通常１〜５日間（好ましくは２〜４日間）細胞を維持培養する。この維持培養期間中、細胞におけるＨｉｐｐｏシグナル伝達経路の阻害が維持されるよう、維持培養用の培地に本発明のＨｉｐｐｏシグナル伝達経路阻害剤を添加しておくことが好ましい。所定期間の経過後、被検物質を接触させた細胞において、ＹＡＰおよび／またはＴＡＺの細胞核における存在量を測定する（工程２）。ＹＡＰおよび／またはＴＡＺの細胞核における存在量が被検物質の非存在下における存在量と比較して減少している場合、被検物質はＹＡＰおよび／またはＴＡＺの核内移行の亢進を伴う疾患の治療および／または予防剤と判断することができる（工程３）。尚、ＹＡＰおよび／またはＴＡＺの存在量が減少するとは、例えば、対照となるＹＡＰおよび／またはＴＡＺの細胞核内の存在量と比較して、少なくとも５％以上、少なくとも１０％以上、少なくとも１５％以上、少なくとも２０％以上、少なくとも２５％以上、少なくとも３０％以上、少なくとも３５％以上、少なくとも４０％以上、少なくとも５０％以上、少なくとも５５％以上、少なくとも６０％以上、少なくとも６５％以上、少なくとも７０％以上、少なくとも７５％以上、少なくとも８０％以上、少なくとも８５％以上、少なくとも９０％以上、少なくとも９５％以上、または、少なくとも９９％以上、ＹＡＰおよび／またはＴＡＺの細胞核の存在量が減少することを意味する。尚、ＹＡＰおよび／またはＴＡＺの細胞核の存在量の測定は、後述する実施例において用いられているような、蛍光ラベルを結合させた抗ＹＡＰ（またはＴＡＺ）抗体を用いたイメージング解析等の自体公知の方法により実施することができる。
【０１７１】
本発明のスクリーニング方法において、ＹＡＰおよび／またはＴＡＺの核内移行の亢進を伴う疾患には癌が含まれ、具体的には、大腸癌、膵癌、肺癌、卵巣癌、肝癌、乳癌、腎癌、前立腺癌、胃腸癌、メラノーマ、子宮頸部癌、膀胱癌、膠芽腫、および頭頸部癌等が挙げられるがこれらに限定されない。
【０１７２】
６．キナーゼを阻害する方法
本発明は、本発明に用いられる特定化合物を細胞に接触させることを含む、特定のキナーゼ活性を阻害する方法（以下、「本発明のキナーゼを阻害する方法」と称することがある。）を提供する。本発明のキナーゼを阻害する方法は、上記した本発明のキナーゼ阻害剤を用いて好適に実施することができるため、その実施形態が本方法にも適用され得る。一態様において、本発明のキナーゼを阻害する方法は、細胞におけるＬＡＴＳ２のリン酸化活性を阻害する。
【０１７３】
７．Ｈｉｐｐｏシグナル伝達経路を阻害する方法
本発明は、本発明に用いられる特定化合物を細胞に接触させることを含む、Ｈｉｐｐｏシグナル伝達経路を阻害する方法（以下、「本発明のＨｉｐｐｏシグナル伝達経路を阻害する方法」と称することがある。）を提供する。本発明のＨｉｐｐｏシグナル伝達経路を阻害する方法は、上記した本発明のＨｉｐｐｏシグナル伝達経路阻害剤を用いて好適に実施することができるため、その実施形態が本方法にも適用され得る。
【０１７４】
８．細胞増殖の不全を伴う疾患または組織損傷を治療するための方法
本発明は、本発明に用いられる特定化合物を対象に投与することを含む、細胞増殖の不全を伴う疾患または組織損傷を治療するための方法（以下、「本発明の治療方法」と称することがある。）を提供する。本発明の治療方法は、上記した本発明の細胞増殖の不全を伴う疾患または組織損傷の治療剤を用いて好適に実施することができるため、その実施形態が本方法にも適用され得る。尚、本発明の治療方法を、特に細胞、組織、臓器等を哺乳動物に移植した際の生着及び回復の促進を目的として実施する場合、本発明の治療方法は、「細胞、組織、および／または臓器移植の生着促進方法」とも言い換えられる。
【０１７５】
９．移植治療用細胞または組織の増殖を促進するための方法
本発明は、本発明に用いられる特定化合物を細胞に投与することを含む、移植治療用細胞または組織の増殖を促進するための方法（以下、「本発明の増殖促進方法」と称することがある。）を提供する。本発明の増殖促進方法は、上記した本発明の増殖促進剤を用いて好適に実施することができるため、その実施形態が本方法にも適用され得る。尚、本発明の増殖促進方法により、移植治療用細胞または組織を効率よく調製できることから、本発明の増殖促進方法は、「移植治療用細胞または組織を製造するための方法」とも言い換えられる。
【０１７６】
１０．培地
本発明はまた、本発明のキナーゼ阻害剤、本発明のＨｉｐｐｏシグナル伝達経路阻害剤、または、本発明の移植治療用細胞または組織の増殖促進剤のいずれかを含む細胞培養培地（以下、「本発明の培地」と称することがある。）を提供する。本発明の培地は、本発明のキナーゼ阻害剤、本発明のＨｉｐｐｏシグナル伝達経路阻害剤、および、本発明の移植治療用細胞または組織の増殖促進剤に記載した通り、これらの剤を細胞培養に適した培地に添加することにより調製される培地である。本発明の培地を用いて細胞を培養することにより、本発明のキナーゼ阻害剤、本発明のＨｉｐｐｏシグナル伝達経路阻害剤、および、本発明の移植治療用細胞または組織の増殖促進剤に記載した通りの効果を得ることができる。
【０１７７】
以下に、本発明の有用性について、以下の実施例において具体的に説明するが、本発明はこれらのみに限定されるものではない。なお、ＣＯ２インキュベーターにおけるＣＯ２の濃度（％）は、雰囲気中のＣＯ２の体積％で示した。また、ＰＢＳはリン酸緩衝生理食塩水（シグマアルドリッチジャパン社製）を意味し、ＦＢＳは牛胎児血清（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ社製）を意味する。また、（ｗ／ｖ）は、１体積あたりの重量を表わす。
【実施例】
【０１７８】
以下に、本発明に用いられる特定化合物の合成方法および構造式を示す。尚、１Ｈ−ＮＭＲはプロトン核磁気共鳴スペクトラムを表し、２７０ＭＨｚまたは４００ＭＨｚにて、重ジメチルスルホキシド中で測定した。ケミカルシフト値は、重ジメチルスルホキシドの値を２．４９ｐｐｍとして記載した。また、ｓとの記載はシングレットを表し、以下同様にｂｒｓはブロードシングレットを、ｄはダブレットを、ｄｄはダブルダブレットを、ｔはトリプレットを、ｑはカルテットを、ｍはマルチプレットをそれぞれ表す。【０１７９】
［合成例１］ケトンおよびヒドラジドを原料とした本発明化合物の合成
（材料と方法）
以下に図示されるケトン４種［１−（２，４−ジヒドロキシ−３−メチルフェニル）プロパン−１−オン（以下、ｋ−１と略称する。）、１−（２，４−ジヒドロキシ−３−メチルフェニル）エタン−１−オン（以下、ｋ−２と略称する。）、１−（２，４，６−トリヒドロキシ−３−メチルフェニル）プロパン−１−オン（以下、ｋ−３と略称する。）、１−（２，４−ジヒドロキシ−３−メチルフェニル）−３−メチルブタン−１−オン（以下、ｋ−５と略称する。）］及びヒドラジド１０種［２−（フェニルアミノ）アセトヒドラジド（以下、Ｈ−１と略称する。）、２−（ｏ−トリルアミノ）アセトヒドラジド（以下、Ｈ−２と略称する。）、２−（ｍ−トリルアミノ）アセトヒドラジド（以下、Ｈ−３と略称する。）、２−（ｐ−トリルアミノ）アセトヒドラジド（以下、Ｈ−４と略称する。）、２−［（４−フルオロフェニル）アミノ］アセトヒドラジド（以下、Ｈ−５と略称する。）、２−（ナフタレン−１−イルアミノ）アセトヒドラジド（以下、Ｈ−６と略称する。）、２−（フェニルアミノ）ブタンヒドラジド（以下、Ｈ−７と略称する。）、２−［（４−エトキシフェニル）アミノ］アセトヒドラジド（以下、Ｈ−９と略称する。）、２−［（４−ヒドロキシフェニル）アミノ］アセトヒドラジド（以下、Ｄ−２と略称する。）、２−［（２−ヒドロキシフェニル）アミノ］アセトヒドラジド（以下、Ｄ−４と略称する。）］より化合物を合成した。【０１８０】
【化６１】
2019235569.tif 000063
【０１８１】
合成した３４化合物を第１表に記載する。表中、Ｍｅとの記載はメチルを表し、以下同様に、Ｅｔとの記載はエチルを、ｎ−Ｐｒはノルマルプロピルを、ｉ−Ｂｕはイソブチルを、Ｐｈはフェニルを、Ｎａｐｈはナフチルをそれぞれ表す。（Ｒ３）ｎにおける「−」との記載は無置換を表し、構造式に記載された番号は、（Ｒ３）ｎの置換位置を表す。
［第１表］【０１８２】
【化６２】
2019235569.tif 000064
【０１８３】
【表１】
2019235569.tif 000065
【０１８４】
第１表に記載した化合物の１Ｈ−ＮＭＲの測定結果を第２表に記す。【０１８５】
［第２表］【０１８６】
【表２−１】
2019235569.tif 000066
【０１８７】
【表２−２】
2019235569.tif 000067
【０１８８】
【表２−３】
2019235569.tif 000068
【０１８９】
【表２−４】
2019235569.tif 000069
【０１９０】
以下に本発明に用いられる特定化合物及び合成中間体の化合物の合成法を記載する。【０１９１】
４種のケトンのうち、ｋ−１、ｋ−２およびｋ−５については公知の方法により合成が可能である（Sum TH et al., Tetrahedron. 2015 Jul 1;71(26-27): 4557-4564.）。また、１０種のヒドラジドのうち、Ｈ−１、Ｈ−２、Ｈ−３、Ｈ−４、Ｈ−５、Ｈ−６、Ｈ−９、Ｄ−２及びＤ−４は公知の方法により合成が可能である（Samal RP et al., Chem Biol Drug Des. 2013 Jun;81(6):715-29.等）。従って、以下、ｋ−３およびＨ−７の合成法につき詳述する。【０１９２】
［ｋ−３の合成］
２，４，６−トリヒドロキシベンズアルデヒド(２．２２ｇ、１４．４ｍｍｏｌ）をＴＨＦ（４０ｍＬ）に溶解させ、氷冷下ＮａＢＨ３ＣＮ（２．７ｇ、４３ｍｍｏｌ）、酢酸（８ｍＬ）を加えて室温で２時間撹拌した。反応溶液を酢酸エチル（５０ｍＬ）で希釈し、水（５０ｍＬｘ２）、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液（５０ｍＬ）、ブライン（５０ｍＬ）で順次洗浄した。無水硫酸ナトリウムで乾燥、ろ過、減圧下濃縮して得られた残渣を中圧シリカゲルカラムクロマトグラフィー(シリカゲル５０ｇ、酢酸エチル／ヘキサン＝２０／８０〜５０／５０）で精製し、中間化合物（１．２０ｇ、８．５６ｍｍｏｌ、収率５９％）を白色固体として得た。【０１９３】
上記のようにして得られた中間化合物（１．０４ｇ，７．４２ｍｍｏｌ）を、プロピオン酸（７ｍＬ）に懸濁させ、プロピオン酸無水物（１．１５ｍＬ，８．９０ｍｍｏｌ）、ＢＦ３−Ｅｔ２Ｏ（１．１２ｍＬ、８．９０ｍｍｏｌ）を加えて１３０℃で１時間加熱還流した。放冷後、反応溶液を酢酸エチル（１００ｍＬ）で希釈し、水(１００ｍＬｘ３）、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液(１００ｍＬｘ２）、ブライン（１００ｍＬ）で順次洗浄した。無水硫酸ナトリウムで乾燥、ろ過、減圧下濃縮して得られた残渣を中圧シリカゲルカラムクロマトグラフィー（シリカゲル１００ｇ、酢酸エチル／ヘキサン＝１０／９０〜４５／５５）で精製し、得られた固体をヘキサンで洗浄してｋ−３（０．４１ｇ）を薄橙色固体として得た。ろ液を減圧下濃縮し、得られた残渣を再度中圧シリカゲルカラムクロマトグラフィー（シリカゲル３０ｇ、酢酸エチル／ヘキサン＝１０／９０〜５０／５０）で精製し、ｋ−３（０．７０ｇ）を薄橙色固体として得た。以上まとめて、ｋ−３（１．１１ｇ、５．６６ｍｍｏｌ、収率７６％）を薄橙色固体として得た。【０１９４】
［Ｈ−７の合成］
２−ブロモ酪酸メチル（８．０ｇ、４４ｍｍｏｌ）、アニリン(８．０ｍＬ、８８ｍｍｏｌ）をトルエン(１０ｍＬ）に溶解させ、５時間加熱還流した。放冷後、反応溶液を水(３０ｍＬ）、２Ｍ塩酸（２５ｍＬ）、水（３０ｍＬ）、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液（３０ｍＬ）、ブライン（３０ｍＬ）で順次洗浄して、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。ろ過、減圧下濃縮して得られた残渣を中圧シリカゲルカラムクロマトグラフィー（シリカゲル１００ｇ、酢酸エチル／ヘキサン＝１／９９〜１０／９０）で精製し、中間化合物（５．１１ｇ、２６．４ｍｍｏｌ、収率６０％）を黄色液体として得た。
上記のようにして得られた中間化合物（５．１１ｇ、２６．４ｍｍｏｌ）をメタノール(２６ｍＬ）に溶解させ、ヒドラジン・１水和物（１２．８ｍＬ、２６４ｍｍｏｌ）を加えて室温で４．５時間撹拌した。水（１５０ｍＬ）を加えて、塩化メチレン（３０ｍＬｘ５）で抽出した。有機層を飽和食塩水（１００ｍＬ）で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥、ろ過、減圧下濃縮して得られた固体をＩＰＥで洗浄し、Ｈ−７（４．６０ｇ、２３．８ｍｍｏｌ、収率９０％）を白色固体として得た。【０１９５】
［ｋ−１：Ｈ−１の合成］
ｋ−１（１００ｍｇ、０．５５５ｍｍｏｌ）、Ｈ−１（１１０ｍｇ、０．６６６ｍｍｏｌ）をＤＭＳＯ（１．１ｍＬ）に溶解させ、１００℃で１４時間撹拌した。放冷後、蒸留水（１１ｍＬ）を加え、再度１００℃で撹拌後、熱時ろ過してｋ−１：Ｈ−１（７０．１ｍｇ、０．２１４ｍｍｏｌ、収率３９％）を薄黄色固体として得た。【０１９６】
［ｋ−１：Ｈ−２の合成］
ｋ−１（５０ｍｇ、０．２８ｍｍｏｌ）、Ｈ−２（６９ｍｇ、０．３３ｍｍｏｌ）をＤＭＳＯ（０．５５ｍＬ）に溶解させ１００℃で１８時間撹拌した。放冷後、蒸留水（６ｍＬ）を加えてデカンテーションし、残った固体を塩化メチレン、酢酸エチルで順次洗浄した。得られた残渣をＤＭＳＯ（０．２ｍＬ）に溶解させ、水を加えて析出した固体をメタノールで洗浄し、ｋ−１：Ｈ−２（１９．６ｍｇ、０．０５７４ｍｍｏｌ、収率２１％）を薄橙色固体として得た。【０１９７】
［ｋ−１：Ｈ−３の合成］
ｋ−１（１００ｍｇ、０．５５５ｍｍｏｌ）、Ｈ−３（１１９ｍｇ、０．６６６ｍｍｏｌ）をＤＭＳＯ（１．１ｍＬ）に溶解させ１００℃で１４時間撹拌した。同温で蒸留水（１１ｍＬ）を加えて放冷後、析出した固体をろ取、メタノールで洗浄してｋ−１：Ｈ−３（９８．９ｍｇ、０．２９０ｍｍｏｌ、収率５２％）を白色固体として得た。【０１９８】
［ｋ−１：Ｈ−４の合成］
ｋ−１（５０ｍｇ、０．２８ｍｍｏｌ）、Ｈ−４（６５ｍｇ、０．３６ｍｍｏｌ）をＤＭＳＯ（０．５５ｍＬ）に溶解させ１００℃で１９時間撹拌した。放冷後、蒸留水（６ｍＬ）を加えて析出した固体をろ取、酢酸エチルで洗浄してｋ−１：Ｈ−４（２８．６ｍｇ、０．０８３８ｍｍｏｌ、収率３０％）を薄黄色固体として得た。【０１９９】
［ｋ−１：Ｈ−５の合成］
ｋ−１（１００ｍｇ、０．５５５ｍｍｏｌ）、Ｈ−５（１２２ｍｇ、０．６６６ｍｍｏｌ）をＤＭＳＯ（１．１ｍＬ）に溶解させ１００℃で１４時間撹拌した。同温で蒸留水（１１ｍＬ）を加えて放冷後、析出した固体をろ取、メタノールで洗浄してｋ−１：Ｈ−５（５５．６ｍｇ、０．１６１ｍｍｏｌ、収率２９％）を薄黄色固体として得た。【０２００】
［ｋ−１：Ｈ−６の合成］
ｋ−１（１００ｍｇ、０．５５５ｍｍｏｌ）、Ｈ−６（１４３ｍｇ、０．６６６ｍｍｏｌ）をＤＭＳＯ（１．１ｍＬ）に溶解させ１００℃で１４時間撹拌した。放冷後、蒸留水（１１ｍＬ）を加えて析出した固体をろ取、塩化メチレンで洗浄してｋ−１：Ｈ−６（８６．５ｍｇ、０．２２９ｍｍｏｌ、収率４１％）を茶色固体として得た。【０２０１】
［ｋ−１：Ｈ−７の合成］
ｋ−１（５０ｍｇ、０．２８ｍｍｏｌ）、Ｈ−７（５４ｍｇ、０．２８ｍｍｏｌ）をＤＭＳＯ（０．５５ｍＬ）に溶解させ１００℃で１７時間撹拌した。放冷後、蒸留水（６ｍＬ）を加えてデカンテーションし、残渣を塩化メチレン（０．５ｍＬ）に溶解させた。ヘキサン（０．５ｍＬ）を加えて析出した固体をろ取してｋ−１：Ｈ−７（５６．８ｍｇ、０．１６０ｍｍｏｌ、収率５７％）を白色固体として得た。【０２０２】
［ｋ−１：Ｈ−９の合成］
ｋ−１（１５０ｍｇ、０．８３ｍｍｏｌ）、Ｈ−９（２２６ｍｇ、１．０８ｍｍｏｌ）をＤＭＳＯ（０．５５ｍＬ）に懸濁させ１００℃で１７時間撹拌した。放冷後、蒸留水（２０ｍＬ）を加えてデカンテーションし、得られた残渣を中圧シリカゲルカラムクロマトグラフィー（シリカゲル１０ｇ、酢酸エチル／ヘキサン＝１０／９０〜６０／４０）で精製した。得られた固体を塩化メチレンで洗浄してｋ−１：Ｈ−９（４０．２ｍｇ、０．１０８ｍｍｏｌ、収率１３％）を白色固体として得た。【０２０３】
［ｋ−２：Ｈ−１の合成］
ｋ−２（８０ｍｇ、０．４８ｍｍｏｌ）、Ｈ−１（９５．４ｍｇ、０．５７８ｍｍｏｌ）をＤＭＳＯ（１．０ｍＬ）に溶解させ１００℃で１５時間撹拌した。放冷後、蒸留水（１０ｍＬ）を加えて析出した固体をろ取、塩化メチレンで洗浄してｋ−２：Ｈ−１（８０．４ｍｇ、０．２５７ｍｍｏｌ、収率５３％）を黄色固体として得た。【０２０４】
［ｋ−２：Ｈ−２の合成］
ｋ−２（８０ｍｇ，０．４８ｍｍｏｌ）、Ｈ−２（１１２ｍｇ、０．６２５ｍｍｏｌ）をＤＭＳＯ（１ｍＬ）に溶解させ１００℃で１９時間撹拌した。放冷後、蒸留水（３０ｍＬ）、酢酸エチル（３０ｍＬ）を加えて分液し、有機層を飽和食塩水（３０ｍＬ）で洗浄した。無水硫酸ナトリウムで乾燥、ろ過、減圧下濃縮して得られた残渣を中圧シリカゲルカラムクロマトグラフィー（シリカゲル１０ｇ、酢酸エチル／ヘキサン＝１０／９０〜８０／２０）で精製してｋ−２：Ｈ−２（３４ｍｇ、０．１０ｍｍｏｌ、収率２１％）を薄黄色固体として得た。【０２０５】
［ｋ−２：Ｈ−３の合成］
ｋ−２（８０ｍｇ、０．４８ｍｍｏｌ）、Ｈ−３（１０４ｍｇ、０．５７８ｍｍｏｌ）をＤＭＳＯ（１ｍＬ）に溶解させ１００℃で１５時間撹拌した。放冷後、蒸留水（１０ｍＬ）を加えてデカンテーションし、得られた残渣を塩化メチレン（３ｍＬ）に溶解させ、ヘキサン（３ｍＬ）を加えて析出した固体をろ取した。得られた固体を中圧シリカゲルカラムクロマトグラフィー(シリカゲル１０ｇ、酢酸エチル／ヘキサン＝５０／５０〜８０／２０）で精製してｋ−２：Ｈ−３（４６．９ｍｇ、０．１４３ｍｍｏｌ、収率３０％）を薄黄色固体として得た。【０２０６】
［ｋ−２：Ｈ−４の合成］
ｋ−２（８０ｍｇ、０．４８ｍｍｏｌ）、Ｈ−４（１１２ｍｇ、０．６２５ｍｍｏｌ）をＤＭＳＯ（１ｍＬ）に溶解させ１００℃で１９時間撹拌した。放冷後、蒸留水（１０ｍＬ）を加えてデカンテーションし、残渣を塩化メチレンで洗浄してｋ−２：Ｈ−４（５８．７ｍｇ、０．１７９ｍｍｏｌ、収率３７％）を薄黄色固体として得た。【０２０７】
［ｋ−２：Ｈ−５の合成］
ｋ−２（８０ｍｇ、０．４８ｍｍｏｌ）、Ｈ−５（１０６ｍｇ、０．５７８ｍｍｏｌ）をＤＭＳＯ（１ｍＬ）に溶解させ１００℃で１５時間撹拌した。放冷後、蒸留水（１０ｍＬ）を加えてデカンテーションし、得られた残渣を塩化メチレン（３ｍＬ）に溶解させ、ヘキサン（１ｍＬ）を加えて析出した固体をろ取した。得られた固体を中圧シリカゲルカラムクロマトグラフィー（シリカゲル１０ｇ、酢酸エチル／ヘキサン＝５０／５０〜８０／２０）で精製してｋ−２：Ｈ−５（３６．６ｍｇ、０．１１０ｍｍｏｌ、収率２３％）を白色固体として得た。【０２０８】
［ｋ−２：Ｈ−６の合成］
ｋ−２（１００ｍｇ、０．６０２ｍｍｏｌ）、Ｈ−６（１５５ｍｇ、０．７２２ｍｍｏｌ）をＤＭＳＯ（１ｍＬ）に溶解させ１００℃で１５時間撹拌した。放冷後、蒸留水（１０ｍＬ）を加えてデカンテーションし、得られた残渣を塩化メチレンで洗浄してｋ−２：Ｈ−６（５９．３ｍｇ、０．１６３ｍｍｏｌ、収率２７％）を薄茶色固体として得た。【０２０９】
［ｋ−２：Ｈ−７の合成］
ｋ−２（８０ｍｇ、０．４８ｍｍｏｌ）、Ｈ−７（１２１ｍｇ、０．６２６ｍｍｏｌ）をＤＭＳＯ（０．５５ｍＬ）に溶解させ１００℃で１７時間撹拌した。放冷後、蒸留水（２０ｍＬ）、酢酸エチル（２０ｍＬ）を加えて分液し、有機層を飽和食塩水（２０ｍＬ）で洗浄した。無水硫酸ナトリウムで乾燥、ろ過、減圧下濃縮して得られた残渣を中圧シリカゲルカラムクロマトグラフィー（シリカゲル１０ｇ、酢酸エチル／ヘキサン＝５／９５〜５０／５０）で精製してｋ−２：Ｈ−７（１０９ｍｇ、０．３１９ｍｍｏｌ、収率６６％）を薄黄色固体として得た。【０２１０】
［ｋ−２：Ｈ−９の合成］
ｋ−２（１００ｍｇ、０．６０ｍｍｏｌ）、Ｈ−９（１６４ｍｇ，０．７８４ｍｍｏｌ）をＤＭＳＯ（１．２ｍＬ）に懸濁させ１００℃で１８時間撹拌した。放冷後、蒸留水（１２ｍＬ）、酢酸エチル（２０ｍＬ）を加えて分液し、有機層を飽和食塩水（２０ｍＬ）で洗浄した。無水硫酸ナトリウムで乾燥、ろ過、減圧下濃縮して得られた残渣を中圧シリカゲルカラムクロマトグラフィー(シリカゲル１０ｇ、酢酸エチル／ヘキサン＝１０／９０〜６０／４０）で精製し、得られた固体を塩化メチレンで洗浄してｋ−２：Ｈ−９（６３．１ｍｇ、０．１７７ｍｍｏｌ、収率３０％）を薄黄色固体として得た。【０２１１】
［ｋ−３：Ｈ−１の合成］
ｋ−３（２００ｍｇ、１．０２ｍｍｏｌ）、Ｈ−１（２５３ｍｇ、１．５３ｍｍｏｌ）をＤＭＳＯ（２．０ｍＬ）に溶解させ１００℃で３日撹拌した。放冷後、蒸留水（１５ｍＬ）を加えてデカンテーションし、得られた残渣を中圧シリカゲルカラムクロマトグラフィー(シリカゲル３０ｇ、酢酸エチル／ヘキサン＝４０／６０〜７０／３０）で精製した。得られた固体を塩化メチレンで洗浄してｋ−３：Ｈ−１（２５．０ｍｇ，０．０７２８ｍｍｏｌ、収率７．１％）を薄茶色固体として得た。【０２１２】
［ｋ−３：Ｈ−２の合成］
ｋ−３（２００ｍｇ、１．０２ｍｍｏｌ）、Ｈ−２（２３７ｍｇ、１．３３ｍｍｏｌ）をＤＭＳＯ（２ｍＬ）に溶解させ１００℃で４日撹拌した。放冷後、蒸留水（１５ｍＬ）を加えて析出した固体をろ取し、メタノールで洗浄した。得られた固体を中圧シリカゲルカラムクロマトグラフィー(シリカゲル３０ｇ、酢酸エチル／ヘキサン＝４０／６０〜７０／３０）で精製した。得られた固体を塩化メチレンで洗浄してｋ−３：Ｈ−２（１０．３ｍｇ、０．０２８８ｍｍｏｌ、収率２．８％）を薄茶色固体として得た。【０２１３】
［ｋ−３：Ｈ−３の合成］
ｋ−３（２００ｍｇ、１．０２ｍｍｏｌ）、Ｈ−３（２１９ｍｇ、１．２２ｍｍｏｌ）をＤＭＳＯ（２ｍＬ）に溶解させ１００℃で５日撹拌した。放冷後、蒸留水（１５ｍＬ）を加えて析出した固体をろ取し、中圧シリカゲルカラムクロマトグラフィー（シリカゲル３０ｇ、酢酸エチル／ヘキサン＝４０／６０〜７０／３０）で精製した。得られた固体を塩化メチレンで洗浄してｋ−３：Ｈ−３（１７．９ｍｇ、０．０５０１ｍｍｏｌ、収率４．９％）を薄茶色固体として得た。【０２１４】
［ｋ−３：Ｈ−４の合成］
ｋ−３（２００ｍｇ、１．０２ｍｍｏｌ）、Ｈ−４（２３７ｍｇ、１．３３ｍｍｏｌ）をＤＭＳＯ（２ｍＬ）に溶解させ１００℃で４日撹拌した。放冷後、蒸留水（１５ｍＬ）を加えて析出した固体をろ取し、中圧シリカゲルカラムクロマトグラフィー(シリカゲル３０ｇ、酢酸エチル／ヘキサン＝４０／６０〜７０／３０）で精製した。得られた固体を塩化メチレンで洗浄してｋ−３：Ｈ−４（１７．９ｍｇ、０．０５０１ｍｍｏｌ、収率４．９％）を薄茶色固体として得た。【０２１５】
［ｋ−３：Ｈ−５の合成］
ｋ−３（２００ｍｇ、１．０２ｍｍｏｌ）、Ｈ−５（２２４ｍｇ、１．２２ｍｍｏｌ）をＤＭＳＯ（２ｍＬ）に溶解させ１００℃で６日撹拌した。放冷後、蒸留水（１５ｍＬ）を加えてデカンテーションし、得られた残渣を塩化メチレン（３ｍＬ）に溶解させ、ヘキサン（１ｍＬ）を加えて析出した固体をろ取し、中圧シリカゲルカラムクロマトグラフィー（シリカゲル３０ｇ、酢酸エチル／ヘキサン＝４０／６０〜７０／３０）で精製した。得られた固体を塩化メチレンで洗浄してｋ−３：Ｈ−５（１３．７ｍｇ、０．０３７９ｍｍｏｌ、収率３．７％）を薄茶色固体として得た。【０２１６】
［ｋ−３：Ｈ−６の合成］
ｋ−３（１００ｍｇ、０．５１０ｍｍｏｌ）、Ｈ−６（１２１ｍｇ、０．５６１ｍｍｏｌ）をＤＭＳＯ（２ｍＬ）に溶解させ１００℃で４日撹拌した。放冷後、蒸留水（１５ｍＬ）を加えてデカンテーションし、得られた残渣を中圧シリカゲルカラムクロマトグラフィー（シリカゲル３０ｇ、酢酸エチル／ヘキサン＝４０／６０〜７０／３０）で精製した。得られた固体を塩化メチレンで洗浄してｋ−３：Ｈ−６（１７．０ｍｇ、０．０４３２ｍｍｏｌ、収率８．５％）を橙色固体として得た。【０２１７】
［ｋ−３：Ｈ−７の合成］
ｋ−３（２００ｍｇ、１．０２ｍｍｏｌ）、Ｈ−７（２５６ｍｇ、１．３３ｍｍｏｌ）をＤＭＳＯ（２ｍＬ）に溶解させ１００℃で３日撹拌した。放冷後、蒸留水（１５ｍＬ）を加えてデカンテーションし、得られた残渣を中圧シリカゲルカラムクロマトグラフィー(シリカゲル３０ｇ、酢酸エチル／ヘキサン＝４０／６０〜７０／３０）で精製した。得られた固体を塩化メチレンで洗浄しｋ−３：Ｈ−７（２８．３ｍｇ、０．７６２ｍｍｏｌ、収率７．５％）を白色固体として得た。【０２１８】
［ｋ−３：Ｈ−９の合成］
ｋ−３（２００ｍｇ，１．０２ｍｍｏｌ）、Ｈ−９（２７７ｍｇ、１．３３ｍｍｏｌ）をＤＭＳＯ（２ｍＬ）に溶解させ１００℃で４日撹拌した。放冷後、蒸留水（１５ｍＬ）を加えて析出した固体をろ別し、中圧シリカゲルカラムクロマトグラフィー(シリカゲル３０ｇ、酢酸エチル／ヘキサン＝４０／６０〜７０／３０）で精製した。得られた固体を塩化メチレンで洗浄してｋ−３：Ｈ−９（１１．２ｍｇ、０．０２８９ｍｍｏｌ、収率２．８％）を薄茶色固体として得た。【０２１９】
［ｋ−５：Ｈ−１の合成］
ｋ−５（１００ｍｇ、０．４８ｍｍｏｌ）、Ｈ−１（９５．２ｍｇ、０．５７６ｍｍｏｌ）をＤＭＳＯ（１ｍＬ）に溶解させ１００℃で４日撹拌した。放冷後、蒸留水（１０ｍＬ）を加えて析出した固体をろ取し、塩化メチレン、メタノールで順次洗浄してｋ−５：Ｈ−１（３８．１ｍｇ、０．１０７ｍｍｏｌ、収率２２％）を黄色固体として得た。【０２２０】
［ｋ−５：Ｈ−２の合成］
ｋ−５（１００ｍｇ、０．４８ｍｍｏｌ）、Ｈ−２（１１２ｍｇ、０．６２５ｍｍｏｌ）をＤＭＳＯ（１ｍＬ）に溶解させ１００℃で３日撹拌した。蒸留水（１０ｍＬ）を加えてデカンテーションし、残渣を塩化メチレン（２ｍＬ）に溶解させ、芒硝乾燥した。ろ過、減圧下濃縮して得られた残渣に塩化メチレン（１ｍＬ）を加え、超音波に晒して析出した固体をろ取してｋ−５：Ｈ−２（１８．６ｍｇ、０．０５０３ｍｍｏｌ、収率１０％）を黄色固体として得た。【０２２１】
［ｋ−５：Ｈ−３の合成］
ｋ−５（１００ｍｇ、０．４８０ｍｍｏｌ）、Ｈ−３（１０３ｍｇ、０．５７６ｍｍｏｌ）をＤＭＳＯ（１ｍＬ）に溶解させ１００℃で４日撹拌した。放冷後、蒸留水（１０ｍＬ）を加えて析出した固体をろ取し、塩化メチレンで洗浄してｋ−５：Ｈ−３（４４．６ｍｇ、０．１２１ｍｍｏｌ、収率２５％）を黄色固体として得た。【０２２２】
［ｋ−５：Ｈ−４の合成］
ｋ−５（１００ｍｇ，０．４８０ｍｍｏｌ）、Ｈ−４（１１２ｍｇ，０．６２５ｍｍｏｌ）をＤＭＳＯ（１ｍＬ）に溶解させ１００℃で３日撹拌した。蒸留水（１０ｍＬ）を加えて析出した固体をろ取し、塩化メチレンで洗浄してｋ−５：Ｈ−４（４４．４ｍｇ、０．１２０ｍｍｏｌ、収率２５％）を黄色固体として得た。【０２２３】
［ｋ−５：Ｈ−５の合成］
ｋ−５（１００ｍｇ、０．４８０ｍｍｏｌ）、Ｈ−５（１０６ｍｇ、０．５７６ｍｍｏｌ）をＤＭＳＯ（２ｍＬ）に溶解させ１００℃で４日撹拌した。放冷後、蒸留水（１０ｍＬ）を加えて析出した固体をろ取してｋ−５：Ｈ−５（３７．４ｍｇ、０．１００ｍｍｏｌ、収率２１％）を黄色固体として得た。【０２２４】
［ｋ−５：Ｈ−６の合成］
ｋ−５（１００ｍｇ、０．４８０ｍｍｏｌ）、Ｈ−６（１２４ｍｇ、０．５７６ｍｍｏｌ）をＤＭＳＯ（１ｍＬ）に溶解させ１００℃で５日撹拌した。放冷後、蒸留水（１０ｍＬ）を加えて析出した固体をろ取し、中圧シリカゲルカラムクロマトグラフィー（シリカゲル１０ｇ、酢酸エチル／ヘキサン＝２０／８０〜５０／５０）で精製した。得られた固体をメタノールで洗浄してｋ−５：Ｈ−６（２８．１ｍｇ、０．０６９３ｍｍｏｌ、収率１４％）を薄黄色固体として得た。【０２２５】
［ｋ−５：Ｈ−７の合成］
ｋ−５（１００ｍｇ、０．４８０ｍｍｏｌ）、Ｈ−７（１２１ｍｇ、０．６２６ｍｍｏｌ）をＤＭＳＯ（１ｍＬ）に溶解させ１００℃で４日撹拌した。放冷後、蒸留水（１０ｍＬ）を加えて析出した固体をろ取し、酢酸エチル、塩化メチレン、メタノールで順次洗浄してｋ−５：Ｈ−７（４３．６ｍｇ、０．１１４ｍｍｏｌ、収率２４％）を白色固体として得た。【０２２６】
［ｋ−５：Ｈ−９の合成］
ｋ−５（１５０ｍｇ、０．７２ｍｍｏｌ）、Ｈ−９（１９６ｍｇ、０．９３７ｍｍｏｌ）をＤＭＳＯ（１．４ｍＬ）に懸濁させ１００℃で３日撹拌した。放冷後、蒸留水（１２ｍＬ）、塩化メチレン（２０ｍＬ）を加えて分液し、有機層を飽和食塩水（２０ｍＬ）で順次洗浄した。無水硫酸ナトリウムで乾燥、ろ過、減圧下濃縮して得られた残渣を中圧シリカゲルカラムクロマトグラフィー（シリカゲル１０ｇ、酢酸エチル／ヘキサン＝１０／９０〜５０／５０）で精製しｋ−５：Ｈ−９（７２．０ｍｇ、０．１８０ｍｍｏｌ、収率２５％）を薄黄色固体として得た。【０２２７】
また、化合物番号ｋ−１：Ｄ−２及びｋ−１：Ｄ−４ついても、上記の合成法に準じた方法により合成することができる。【０２２８】
［合成例２］ｋ−１：Ａ−１の合成【０２２９】
【化６３】
2019235569.tif 000070
【０２３０】
ｋ−１（１００ｍｇ、０．５５ｍｍｏｌ）、グリシンエチル塩酸塩(Ａ−１）（１００ｍｇ、０．７２ｍｍｏｌ）、酢酸ナトリウム（６４ｍｇ、０．７８ｍｍｏｌ）をＤＭＳＯ（１．１ｍＬ）に溶解させ１００℃で２時間撹拌した。放冷後、水（２０ｍＬ）、酢酸エチル（２０ｍＬ）を加えて分液し、有機層を飽和食塩水（２０ｍＬ）で洗浄した。無水硫酸ナトリウムで乾燥、ろ過、減圧下濃縮し、得られた残渣を中圧シリカゲルカラムクロマトグラフィー(シリカゲル１０ｇ、酢酸エチル／ヘキサン＝１０／９０〜５０／５０）で精製した。得られた固体をＩＰＥで洗浄してｋ−１：Ａ−１（２１．９ｍｇ、０．０８２５ｍｍｏｌ、収率１５％）を黄色固体として得た。【０２３１】
1H-NMR(270MHz);δ9.69(s, 1H), 7.32(d, J=8.1Hz, 1H), 6.30(d, J=10.8Hz, 1H), 5.76(s, 1H), 4.48(s, 2H), 4.19(q, J=8.1Hz, 2H), 2.67(q, J=8.1Hz, 2H), 1.94(s, 3H), 1.24(t, J=8.1Hz, 3H), 1.08(t, J=8.1Hz, 3H).【０２３２】
［合成例３］ｋ−１：Ａ−２の合成【０２３３】
【化６４】
2019235569.tif 000071
【０２３４】
ｋ−１（１００ｍｇ、０．５５ｍｍｏｌ）、グリシンベンジルｐ−トルエンスルホナート(Ａ−２）（２４３ｍｇ、０．７２１ｍｍｏｌ）、酢酸ナトリウム（６４ｍｇ、０．７８ｍｍｏｌ）をＤＭＳＯ（１．１ｍＬ）に溶解させ１００℃で２時間撹拌した。放冷後、水（２０ｍＬ）、酢酸エチル（２０ｍＬ）を加えて分液し、有機層を飽和食塩水（２０ｍＬ）で洗浄した。無水硫酸ナトリウムで乾燥、ろ過、減圧下濃縮し、得られた残渣を中圧シリカゲルカラムクロマトグラフィー(シリカゲル１０ｇ、酢酸エチル／ヘキサン＝５／９５〜５０／５０）で精製した。得られた固体をＩＰＥで洗浄してｋ−１：Ａ−２（２５．０ｍｇ、０．０７６４ｍｍｏｌ、収率１４％）を黄色固体として得た。【０２３５】
1H-NMR(270MHz);δ9.69(s, 1H), 7.45-7.35 (m, 6H), 7.32(d, J=10.8Hz, 1H), 6.31(d, J=10.8Hz, 1H), 5.23(s, 2H), 4.56(s, 2H), 2.70(q, J=8.1Hz, 2H), 1.94(s, 3H), 1.08(t, J=8.1Hz, 3H).【０２３６】
［合成例４］ｋ−１：Ａ−３の合成【０２３７】
【化６５】
2019235569.tif 000072
【０２３８】
ｋ−１（１００ｍｇ、０．５５ｍｍｏｌ）をＤＭＳＯ（１．１ｍＬ）に溶解させ、ｎ−オクチルアミン(Ａ−３）（１２０ｍＬ、０．７２ｍｍｏｌ）を加えて室温で２時間、１００℃で１７時間撹拌した。放冷後、水（２０ｍＬ）、酢酸エチル（２０ｍＬ）を加えて分液し、有機層を飽和食塩水（２０ｍＬ）で洗浄した。無水硫酸ナトリウムで乾燥、ろ過、減圧下濃縮し、得られた残渣を中圧シリカゲルカラムクロマトグラフィー(シリカゲル１０ｇ、酢酸エチル／ヘキサン＝０／１００〜２０／８０）で精製した。得られた固体をＩＰＥで洗浄してｋ−１：Ａ−３（６０．１ｍｇ、０．２０６ｍｍｏｌ、収率３７％）を黄色固体として得た。【０２３９】
1H-NMR(270MHz);δ9.52(s, 1H), 7.25(d, J=8.1Hz, 1H), 6.20(d, J=8.1Hz, 1H), 5.31 (t, J=8.1Hz, 2H), 2.73(q, J=8.1Hz, 2H), 1.90(s, 3H), 1.64(m, 2H), 1.30-1.05(m, 10H), 1.11(t, J=8.1Hz, 3H), 0.86(t, J=8.1Hz, 3H).【０２４０】
［合成例５］ｋ−１：Ａ−５の合成【０２４１】
【化６６】
2019235569.tif 000073
【０２４２】
ｋ−１（３００ｍｇ、１．７ｍｍｏｌ）を２Ｍアンモニア／メタノール溶液（１７ｍＬ、３３ｍｍｏｌ）に溶解させ、室温で１週間撹拌した。その間、毎日アンモニアガスを１５分バブリングした。反応溶液を減圧下濃縮し、４−（１−イミノプロピル）−２−メチルベンゼン−１，３−ジオール（ｋ−１’）とｋ−１の混合物（２９２ｍｇ、ｋ−１’:ｋ−１＝１:０．２）を黄土色固体として得た。上記のようにして得られたｋ−１’とｋ−１の混合物（２９２ｍｇ）をＴＨＦ（６．５ｍＬ）に溶解させ、氷冷下、フェニルイソシアネート（Ａ−５）（１５８ｍＬ、１．４６ｍｍｏｌ）を加えた。同温で３０分撹拌後、水（３０ｍＬ）、酢酸エチル（３０ｍＬ）を加えて分液し、有機層を飽和食塩水（３０ｍＬ）で洗浄した。無水硫酸ナトリウムで乾燥、ろ過、減圧下濃縮し、得られた残渣を中圧シリカゲルカラムクロマトグラフィー(シリカゲル１０ｇ、酢酸エチル／ヘキサン＝５／９５〜４５／５５）で精製した。得られた固体をＩＰＥで洗浄してｋ−１：Ａ−５（１６０ｍｇ、０．５３６ｍｍｏｌ、２工程収率３２％）を薄黄色固体として得た。【０２４３】
1H-NMR(270MHz);δ13.74(s, 1H), 10.22(s, 1H), 10.11(s, 1H), 7.63(d, J=8.1Hz, 2H), 7.53 (d, J=8.1Hz, 1H), 7.32 (t, J=8.1Hz, 2H), 7.06 (t, J=8.1Hz, 1H), 6.49 (d, J=8.1Hz, 1H), 2.84(q, J=8.1Hz, 2H), 2.00(s, 3H), 1.24(t, J=8.1Hz, 3H).【０２４４】
［合成例６］ｋ−１：Ｈ−１０の合成【０２４５】
【化６７】
2019235569.tif 000074
【０２４６】
ｋ−１（１００ｍｇ，０．５５ｍｍｏｌ）、４−フェニルセミカルバジド(Ｈ−１０）（１０９ｍｇ，０．７２１ｍｍｏｌ）をＤＭＳＯ（１．１ｍＬ）に溶解させ１００℃で３．５時間撹拌した。放冷後、水（２０ｍＬ）、酢酸エチル（２０ｍＬ）を加えて分液し、有機層を飽和食塩水（２０ｍＬ）で洗浄した。無水硫酸ナトリウムで乾燥、ろ過、減圧下濃縮し、得られた残渣を中圧シリカゲルカラムクロマトグラフィー(シリカゲル１０ｇ、酢酸エチル／ヘキサン＝１０／９０〜５０／５０）で精製した。得られた固体をＩＰＥで洗浄してｋ−１：Ｈ−１０（１９．１ｍｇ、０．０６１０ｍｍｏｌ、収率１１％）を白色固体として得た。【０２４７】
1H-NMR(270MHz):δ13.50(s, 1H), 9.75(s, 1H), 9.59(s, 1H), 8.82(s, 1H), 7.49(d, J=8.1Hz, 2H), 7.30(t, J=8.1Hz, 2H), 7.21(d, J=8.0Hz, 1H), 6.99(t, J=8.1Hz, 1H), 6.39(d, J=8.1Hz, 1H), 2.70(q, J=8.1Hz, 2H), 1.99(s, 3H), 1.14(t, J=8.1Hz, 3H).【０２４８】
［合成例７］ｋ−１：Ｉ−１の合成【０２４９】
【化６８】
2019235569.tif 000075
【０２５０】
ヒドラジン一水和物（０．２６ｍＬ、５．３ｍｍｏｌ）を塩化メチレン（５．３ｍＬ）に溶解させ、氷冷下ベンジルイソシアネート（１０１）（０．３２４  ｍＬ、２．６３  ｍｍｏｌ）をゆっくり加えた。室温で３時間撹拌し、析出した固体をＩＰＥで洗浄後、減圧下乾燥し、１０２（３５２ｍｇ、２．１３ｍｍｏｌ、収率８２％）を白色固体として得た。【０２５１】
上記のようにして得られた１０２（１５５ｍｇ、０．９３８ｍｍｏｌ）、ｋ−１（１３０ｍｇ、０．７２ｍｍｏｌ）をＤＭＳＯ（１．４ｍＬ）に溶解させ１００℃で３．５時間撹拌した。放冷後、蒸留水（１０ｍＬ）を加え、析出した固体をろ取、中圧シリカゲルカラムクロマトグラフィー（シリカゲル１０ｇ、酢酸エチル／ヘキサン＝１０／９０〜５５／４５）にて精製した。得られた固体を塩化メチレンで洗浄後、減圧下乾燥し、ｋ−１：Ｉ−１（５５ｍｇ、０．１７ｍｍｏｌ、収率２４％）を白色固体として得た。【０２５２】
1H-NMR(400MHz);δ9.59(s, 1H), 9.56(s, 1H), 7.40-7.25(m, 5H), 7.17(d, J=12.0Hz, 1H), 6.84(t, J=8.0Hz, NH), 6.37(d, J=12.0Hz, 1H), 4.34(d, J=8.0Hz, 2H), 2.65(q, J=8.0Hz, 2H), 1.97(s, 3H), 1.08(t, J=8.0Hz, 3H).（NHの一つのシグナルは観測されなかった。）【０２５３】
［合成例８］ｋ−１：Ｉ−３の合成【０２５４】
【化６９】
2019235569.tif 000076
【０２５５】
ヒドラジン一水和物（０．２０ｍＬ、４．２ｍｍｏｌ）を塩化メチレン（４．２ｍＬ）に溶解させ、氷冷下４−クロロベンジルイソシアネート（１０３）（０．２７８ｍＬ、２．０９ｍｍｏｌ）をゆっくり加えた。室温で１．５時間撹拌し、析出した固体をろ取後、減圧下乾燥し、１０４（３１５ｍｇ、１．５８ｍｍｏｌ、収率７５％）を白色固体として得た。【０２５６】
上記のようにして得られた１０４（１８７ｍｇ、０．９３７ｍｍｏｌ）、ｋ−１（１３０ｍｇ、０．７２ｍｍｏｌ）をＤＭＳＯ（１．４ｍＬ）に溶解させ１００℃で２２時間撹拌した。反応溶液をそのまま中圧シリカゲルカラムクロマトグラフィー（シリカゲル１０ｇ、酢酸エチル／ヘキサン＝１０／９０〜６５／３５）にて精製し、得られた精製物を酢酸エチルに溶解させ、ヘキサンを加えて析出した固体をろ取後、減圧下乾燥し、ｋ−１：Ｉ−３（１５５ｍｇ、０．４２８ｍｍｏｌ、収率５９％）を白色固体として得た。【０２５７】
1H-NMR(400MHz);δ9.63(s, 1H), 9.56(s, 1H), 7.41(d, J=8.0Hz, 2H), 7.34(d, J=8.0Hz, 2H), 7.17(d, J=8.0Hz, 1H), 6.89(t, J=8.0Hz, NH), 6.36(d, J=8.0Hz, 1H), 4.31(d, J=8.0Hz, 2H), 2.65(q, J=8.0Hz, 2H), 1.97(s, 3H), 1.08(t, J=8.0Hz, 3H).（NHの一つのシグナルは観測されなかった。）【０２５８】
［合成例９］ｋ−１：Ｉ−６の合成【０２５９】
【化７０】
2019235569.tif 000077
【０２６０】
ヒドラジン一水和物（０．２３ｍＬ、４．８ｍｍｏｌ）を塩化メチレン（８ｍＬ）に溶解させ、氷冷下４−メチルベンジルイソシアネート（１０５）（３５０ｍｇ、２．４ｍｍｏｌ）をゆっくり加えた。室温で２時間撹拌し、析出した固体をろ取後、減圧下乾燥し、１０６（２９７ｍｇ、１．６６ｍｍｏｌ、収率６９％）を白色固体として得た。【０２６１】
上記のようにして得られた１０６（１６８ｍｇ、０．９３７ｍｍｏｌ）、ｋ―１（１３０ｍｇ、０．７２ｍｍｏｌ）をＤＭＳＯ（２．８ｍＬ）に懸濁させ１００℃で２２時間撹拌した。反応溶液をそのまま中圧シリカゲルカラムクロマトグラフィー（シリカゲル１０ｇ、酢酸エチル／ヘキサン＝１０／９０〜６０／４０）にて精製し、得られた精製物を酢酸エチル（３０ｍＬ）に溶解させ、水（２０ｍＬ）、飽和食塩水（３０ｍＬ）で順次洗浄した。無水硫酸ナトリウムで乾燥、ろ過、減圧下濃縮して得られた固体を塩化メチレンで洗浄後、減圧下乾燥し、ｋ−１：Ｉ−６（１１８ｍｇ、０．３４６ｍｍｏｌ、収率４８％）を白色固体として得た。【０２６２】
1H-NMR(400MHz);δ9.56(s, 1H), 9.55(s, 1H), 7.20(d, J=8.0Hz, 2H), 7.16(d, J=8.0Hz, 2H), 7.15(d, J=8.0Hz, 1H), 6.78(t, J=8.0Hz, NH), 6.36(d, J=8.0Hz, 1H), 4.29(d, J=8.0Hz, 2H), 2.64(q, J=8.0Hz, 2H), 2.28(s, 3H), 1.97(s, 3H), 1.07(t, J=8.0Hz, 3H).（NHの一つのシグナルは観測されなかった。）【０２６３】
［合成例１０］ｋ−１：Ｉ−７の合成【０２６４】
【化７１】
2019235569.tif 000078
【０２６５】
ヒドラジン一水和物（０．２１ｍＬ、４．３ｍｍｏｌ）を塩化メチレン（４．３ｍＬ）に溶解させ、氷冷下４−メトキシベンジルイソシアネート（１０７）（３５０ｍｇ、２．１５ｍｍｏｌ）をゆっくり加えた。室温で２時間撹拌し、析出した固体をろ取後、減圧下乾燥し、１０８（３８１ｍｇ、１．９５ｍｍｏｌ、収率９３％）を白色固体として得た。【０２６６】
上記のようにして得られた１０８（１８３ｍｇ、０．９３７ｍｍｏｌ）、ｋ−１（１３０ｍｇ、０．７２ｍｍｏｌ）をＤＭＳＯ（２．８ｍＬ）に懸濁させ１００℃で５時間撹拌した。放冷後、蒸留水（１５ｍＬ）を加え、析出した固体をろ取、中圧シリカゲルカラムクロマトグラフィー（シリカゲル１０ｇ、酢酸エチル／ヘキサン＝１５／８５〜６５／３５）にて精製し、得られた固体を塩化メチレンで洗浄後、減圧下乾燥し、ｋ−１：Ｉ−７（５５．０ｍｇ、０．１５４ｍｍｏｌ、収率２１％）を白色固体として得た。【０２６７】
1H-NMR(400MHz);δ9.55(s, 2H), 7.25(d, J=8.0Hz, 2H), 7.16(d, J=8.0Hz, 1H), 6.91(d, J=8.0Hz, 2H), 6.75(t, J=8.0Hz, NH), 6.36(d, J=8.0Hz, 1H), 4.26(d, J=8.0Hz, 2H), 3.73(s, 3H), 2.63(q, J=8.0Hz, 2H), 1.97(s, 3H), 1.07(t, J=8.0Hz, 3H).（NHの一つのシグナルは観測されなかった。）【０２６８】
上記の合成法に準じた方法により合成した化合物を第３表に記載する。
［第３表］【０２６９】
【化７２】
2019235569.tif 000079
【０２７０】
【表３】
2019235569.tif 000080
【０２７１】
また、第３表に記載した化合物の１Ｈ−ＮＭＲの測定結果を第４表に記す。【０２７２】
［第４表］【０２７３】
【表４】
2019235569.tif 000081
【０２７４】
［合成例１１］ｋ−１：Ｂ−１の合成【０２７５】
【化７３】
2019235569.tif 000082
【０２７６】
２−ブロモプロピオン酸メチル（１０９）（５００ｍｇ、３．０ｍｍｏｌ）をＤＭＳＯ（６ｍＬ）に溶解させ、アニリン（０．３６ｍＬ、３．９ｍｍｏｌ）、炭酸カリウム（０．５４ｇ、３．９ｍｍｏｌ）を加えて室温で２１時間撹拌した。酢酸エチル（３０ｍＬ）、水（５０ｍＬ）を加えて分液し、有機層を飽和食塩水（３０ｍＬ）で洗浄、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。ろ過、減圧下濃縮して得られた残渣を中圧シリカゲルクロマトグラフィー（シリカゲル３０ｇ、酢酸エチル／ヘキサン＝２／９８〜１５／８５）で精製し、１１０（３４３ｍｇ、１．９１ｍｍｏｌ、収率６４％）を薄黄色液体として得た。【０２７７】
上記のようにして得られた１１０（３４０ｍｇ、１．９ｍｍｏｌ）をメタノール（３．８ｍＬ）に溶解させ、ヒドラジン一水和物（０．１８ｍＬ、３．８ｍｍｏｌ）を加えて６０℃で２４時間撹拌した。ヒドラジン一水和物（０．３６ｍＬ、７．４ｍｍｏｌ）を追加して６０℃で更に１７時間撹拌した。反応溶液を減圧下濃縮して得られた残渣を中圧シリカゲルクロマトグラフィー（アミンシリカゲル１０ｇ、酢酸エチル／塩化メチレン＝０／１００〜２０／８０）で精製し、１１１（３２１ｍｇ、１．７９ｍｍｏｌ、収率９４％）を白色固体として得た。【０２７８】
上記のようにして得られた１１１（１６８ｍｇ、０．９３７ｍｍｏｌ）、ｋ−１（１３０ｍｇ、０．７２ｍｍｏｌ）をＤＭＳＯ（１．４ｍＬ）に溶解させ１００℃で１９時間撹拌した。放冷後、蒸留水（１５ｍＬ）を加え、析出した固体をろ取、乾燥して得られた黄色固体を塩化メチレンで洗浄後、減圧下乾燥し、ｋ−１：Ｂ−１（１７３ｍｇ、０．５０７ｍｍｏｌ、収率７０％）を薄黄色固体として得た。【０２７９】
1H-NMR(400MHz):δ10.82(s, 1H), 9.71(s, 1H), 7.25(d, J=8.0Hz, 1H), 7.07(t, J=8.0Hz, 2H), 6.63(d, J=8.0Hz, 2H), 6.56(t, J=8.0Hz, 1H), 6.39(d, J=8.0Hz, 1H), 5.93(d, J=12Hz, NH), 4.28(m, 1H), 2.80(q, J=8.0Hz, 2H), 1.95(s, 3H), 1.40(d, J=8.0Hz, 3H), 1.03(t, J=8.0Hz, 3H).(NHの一つのシグナルは観測されなかった。)【０２８０】
［合成例１２］化合物ＧＡ−００２Ａ及び化合物ＧＡ−００２Ｂの合成
前述の合成例１１で合成したｋ−１：Ｂ−１（ラセミ体）を下記分取条件に従ってＷａｔｅｒｓ社製超臨界流体クロマトグラフィー（ＳＦＣ）にて光学分割を行い、以下の２つのエナンチオマーを取得した。両エナンチオマーの比旋光度は、旋光度計Ｐ−１０２０（日本分光社製）を用いて測定した。また、エナンチオマーの立体配置（Ｒ体、Ｓ体）は、Ｘ線結晶構造解析によって決定した。
化合物ＧＡ−００２Ａ（ｋ−１：Ｂ−１の左旋性エナンチオマー）；保持時間１１．９５分、分取量４７５．１ｍｇ、光学純度９９．９ｅｅ％、純度９９．０％、比旋光度[α]２２Ｄ  −１０．５（ｃ＝０．１０１９、エタノール）、立体配置Ｒ体
化合物ＧＡ−００２Ｂ（ｋ−１：Ｂ−１の右旋性エナンチオマー）；保持時間１４．８５分、分取量４７４．０ｍｇ、光学純度９９．９ｅｅ％、純度９９．１％、比旋光度[α]２２Ｄ  ＋１２．６（ｃ＝０．１０１２、エタノール）、立体配置Ｓ体
＜分取条件＞
カラム：ＣＨＩＲＡＬＰＡＫ  ＩＡ＜ダイセル社製、２０＊２５０ｍｍ、５μｍ＞、弱溶媒：ＣＯ２（７０％）、強溶媒：ＭｅＯＨ（３０％）、カラム温度：４０℃、総チャージ量：１ｇ、流速：１５ｍＬ／分
［合成例１３］ｋ−１：Ｂ−２の合成【０２８１】
【化７４】
2019235569.tif 000083
【０２８２】
２−ブロモイソ吉草酸エチル（１１２）（７００ｍｇ、３．３ｍｍｏｌ）をＤＭＳＯ（７ｍＬ）に溶解させ、アニリン（０．４０ｍＬ、４．４ｍｍｏｌ）、炭酸カリウム（０．６０ｇ、４．４ｍｍｏｌ）を加えて室温で２１時間、８０℃で６時間、１２０℃で２０時間撹拌した。酢酸エチル（３０ｍＬ）、水（５０ｍＬ）を加えて分液し、有機層を飽和食塩水（３０ｍＬ）で洗浄、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。ろ過、減圧下濃縮して得られた残渣を中圧シリカゲルクロマトグラフィー（シリカゲル３０ｇ、酢酸エチル／ヘキサン＝０／１００〜５／９５）で精製し、１１３（１１０ｍｇ、０．４９７ｍｍｏｌ、収率１５％）を黄色液体として得た。【０２８３】
上記のようにして得られた１１３（９６ｍｇ、０．４３ｍｍｏｌ）をメタノール（１ｍＬ）に溶解させ、ヒドラジン一水和物（０．０４２ｍＬ、０．８７ｍｍｏｌ）を加えて５０℃で４時間、ヒドラジン一水和物（０．２ｍＬ、４．１ｍｍｏｌ）を追加して２０時間、ヒドラジン一水和物（０．１ｍＬ、２．１ｍｍｏｌ）を追加して更に２３時間撹拌した。反応溶液を減圧下濃縮し、得られた残渣を中圧シリカゲルクロマトグラフィー（アミンシリカゲル１０ｇ、酢酸エチル／塩化メチレン＝０／１００〜５／９５）で精製し、１１４（８０．７ｍｇ、０．３８９ｍｍｏｌ、収率９０％）を白色固体として得た。【０２８４】
上記のようにして得られた１１４（７５ｍｇ、０．３６ｍｍｏｌ）、ｋ−１（５０ｍｇ、０．２８  ｍｍｏｌ）をＤＭＳＯ（０．６ｍＬ）に溶解させ１００℃で１８時間撹拌した。放冷後、反応溶液をそのまま中圧シリカゲルカラムクロマトグラフィー（シリカゲル１０ｇ、酢酸エチル／ヘキサン＝１０／９０〜７５／２５）にて精製し、得られた固体を塩化メチレン／ＩＰＥで洗浄後、減圧下乾燥し、ｋ−１：Ｂ−２（３７．６ｍｇ、０．１０２ｍｍｏｌ、収率３６％）を白色固体として得た。【０２８５】
1H-NMR(400MHz):δ10.83(s, 1H), 9.72(s, 1H), 7.26(d, J=8.0Hz, 1H), 7.05(t, J=8.0Hz, 2H), 6.71(d, J=8.0Hz, 2H), 6.53(t, J=8.0Hz, 1H), 6.39(d, J=8.0Hz, 1H), 5.78(d, J=12Hz, NH), 3.97(m, 1H), 2.82(q, J=8.0Hz, 2H), 2.03(m, 1H), 1.95(s, 3H), 1.06(t, J=8.0Hz, 3H), 0.97(d, J=8.0Hz, 6H).(NHの一つのシグナルは観測されなかった。)【０２８６】
［合成例１４］ｋ−１：Ｂ−３の合成【０２８７】
【化７５】
2019235569.tif 000084
【０２８８】
２−ブロモ−ｎ−オクタン酸（１１５）（６００ｍｇ、２．７ｍｍｏｌ）をメタノール（５．５ｍＬ）に溶解させ、濃塩酸（３滴）を加えて５０℃で１８時間撹拌した。放冷後、ジエチルエーテル（３０ｍＬ）、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液（２０ｍＬ）を加えて分液し、有機層を飽和食塩水（２０ｍＬ）で洗浄、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。ろ過、減圧下濃縮して１１６（５８８ｍｇ、２．４８ｍｍｏｌ、収率９２％）を黄色液体として得た。【０２８９】
上記のようにして得られた１１６（５８５ｍｇ、２．４７ｍｍｏｌ）をＤＭＳＯ（５ｍＬ）に溶解させ、アニリン（０．２９ｍＬ、３．２ｍｍｏｌ）、炭酸カリウム（０．４４ｇ、３．２ｍｍｏｌ）を加えて室温で２１時間、６０℃で１６時間撹拌した。酢酸エチル（３０ｍＬ）、水（５０ｍＬ）を加えて分液し、有機層を飽和食塩水（３０ｍＬ）で洗浄、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。ろ過、減圧下濃縮して得られた残渣を中圧シリカゲルクロマトグラフィー（シリカゲル３０ｇ、酢酸エチル／ヘキサン＝１／９９〜５／９５）で精製し、１１７（２７７ｍｇ、１．１１ｍｍｏｌ、収率４５％）を黄色液体として得た。【０２９０】
上記のようにして得られた１１７（２５６ｍｇ、１．０８ｍｍｏｌ）をメタノール（２．２ｍＬ）に溶解させ、ヒドラジン一水和物（０．１０ｍＬ、２．２ｍｍｏｌ）を加えて５０℃で４時間、ヒドラジン一水和物（０．５０ｍＬ、１０．３ｍｍｏｌ）を追加して２０時間、ヒドラジン一水和物（０．２５ｍＬ、５．２ｍｍｏｌ）を追加して更に２３時間撹拌した。反応溶液を減圧下濃縮し、得られた残渣を中圧シリカゲルクロマトグラフィー（アミンシリカゲル１０ｇ、酢酸エチル／塩化メチレン＝０／１００〜５／９５）で精製し、１１８（２６８ｍｇ、１．０７ｍｍｏｌ、収率９９％）を薄黄色固体として得た。【０２９１】
上記のようにして得られた１１８（１４４ｍｇ、０．５８ｍｍｏｌ）、ｋ−１（８０ｍｇ、０．４４ｍｍｏｌ）をＤＭＳＯ（０．９ｍＬ）に溶解させ１００℃で１８時間撹拌した。放冷後、反応溶液をそのまま中圧シリカゲルカラムクロマトグラフィー（シリカゲル１０ｇ、酢酸エチル／ヘキサン＝５／９５〜７５／２５）、続けて中圧シリカゲルカラムクロマトグラフィー（シリカゲル１０ｇ、酢酸エチル／塩化メチレン＝１／９９〜５／９５）、にて精製し、得られた固体を塩化メチレン／ＩＰＥで洗浄後、減圧下乾燥し、ｋ−１:Ｂ−３（８８．７ｍｇ、０．２１６ｍｍｏｌ、収率４９％）を白色固体として得た。【０２９２】
1H-NMR(400MHz):δ10.82(s, 1H), 9.72(s, 1H), 7.25(d, J=8.0Hz, 1H), 7.06(t, J=8. 0Hz, 2H), 6.65(d, J=8.0Hz, 2H), 6.54(t, J=8.0Hz, 1H), 6.39(d, J=8.0Hz, 1H), 5.87(d, J=8.0Hz, NH), 4.19(m, 1H), 2.81(q, J=8.0Hz, 2H), 1.95(s, 3H), 1.73(q, J=8.0Hz, 2H), 1.33(m, 4H), 1.27(m, 4H), 1.03(t, J=8.0Hz, 3H), 0.86(t, J=8.0Hz, 3H).(NHの一つのシグナルは観測されなかった。)【０２９３】
［合成例１５］ｋ−１：Ｂ−５の合成【０２９４】
【化７６】
2019235569.tif 000085
【０２９５】
フェニルプルビン酸（１１９）（１．０ｇ、６．１ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（５ｍＬ）に溶解させ、氷冷下ＤＢＵ（１．０ｍＬ、６．７ｍｍｏｌ）、ヨウ化メチル（０．４２ｍＬ、６．７ｍｍｏｌ）を加えて室温で３時間撹拌した。酢酸エチル（３０ｍＬ）、１Ｍ塩酸（５０ｍＬ）を加えて分液し、有機層を飽和食塩水（５０ｍＬ）で洗浄、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。ろ過、減圧下濃縮して得られた残渣を中圧シリカゲルクロマトグラフィー（シリカゲル３０ｇ、酢酸エチル／ヘキサン＝０／１００〜１３／８７）で精製し、１２０ａ（２９８ｍｇ、１．６７ｍｍｏｌ、収率２７％）を白色固体として得た。【０２９６】
上記のようにして得られた１２０ａ（２９５ｍｇ、１．６６ｍｍｏｌ）をメタノール（６．６ｍＬ）、酢酸（０．６６ｍＬ）、２ＭエチルアミンＴＨＦ溶液（０．８７ｍＬ、１．７ｍｍｏｌ）に溶解させ、氷冷下ピコリンボラン（０．３５ｇ、３．３ｍｍｏｌ）を加えて室温で２．５時間撹拌した。４Ｍ塩酸（３ｍＬ）を加えて５０℃で３０分加熱し、放冷後、酢酸エチル（２０ｍＬ）、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液（５０ｍＬ）を加えて分液した。有機層を飽和食塩水（２０ｍＬ）で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥、ろ過、減圧下濃縮して得られた残渣を中圧シリカゲルクロマトグラフィー（シリカゲル１０ｇ、酢酸エチル／ヘキサン＝２／９８〜３０／７０）で精製し、１２０ｂ（４８．９ｍｇ、０．２３６ｍｍｏｌ、収率１４％）を得た。【０２９７】
上記のようにして得られた１２０ｂ（４５ｍｇ、０．２２ｍｍｏｌ）をメタノール（０．９ｍＬ）に溶解させ、ヒドラジン一水和物（０．０２１ｍＬ、０．４３ｍｍｏｌ）を加えて５０℃で３時間、メタノール（０．９ｍＬ）、ヒドラジン一水和物（０．０２１ｍＬ、０．４３ｍｍｏｌ）を追加して１２時間、メタノール（０．９ｍＬ）、ヒドラジン一水和物（０．０２１ｍＬ、０．４３ｍｍｏｌ）を追加して更に３時間撹拌した。反応溶液を減圧下濃縮し、得られた残渣を中圧シリカゲルクロマトグラフィー（アミンシリカゲル１０ｇ、酢酸エチル／塩化メチレン＝０／１００〜２０／８０）で精製し、１２０ｃ（３２ｍｇ、０．１５ｍｍｏｌ、収率６８％）を薄黄色液体として得た。【０２９８】
上記のようにして得られた１２０ｃ（３０ｍｇ、０．１４ｍｍｏｌ）、ｋ−１（２５ｍｇ、０．１４ｍｍｏｌ）をＤＭＳＯ（０．３ｍＬ）に溶解させ１００℃で１８時間撹拌した。放冷後、反応溶液をそのまま中圧シリカゲルカラムクロマトグラフィー（シリカゲル１０ｇ、酢酸エチル／塩化メチレン＝１０／９０〜６０／４０）にて精製し、得られた固体をＩＰＥで洗浄後、減圧下乾燥し、ｋ−１：Ｂ−５（１８．４ｍｇ、０．０４９８ｍｍｏｌ、収率３６％）を白色固体として得た。【０２９９】
1H-NMR(400MHz):δ9.72(s, 1H), 7.30-7.10(m, 6H), 6.38(d, J=8.0Hz, 1H), 3.62(m, J=8.0Hz, 1H), 2.86(q, J=8.0Hz, 2H), 2.66(q, J=8.0Hz, 2H), 1.97(s, 3H), 1.04(d, J=8.0Hz, 2H), 0.98(t, J=8.0Hz, 3H), 0.92(t, J=8.0Hz, 3H).(NHの二つのシグナルとOHの一つのシグナルは観測されなかった。)【０３００】
［合成例１６］ｋ−１：Ｃ−１の合成【０３０１】
【化７７】
2019235569.tif 000086
【０３０２】
Ｂｏｃ−Ｇｌｙ−ＯＨ（１２１）（０．７０ｇ、４．０ｍｍｏｌ）を塩化メチレン（１３ｍＬ）に溶解させ、ＷＳＣ（０．８４ｇ、４．４ｍｍｏｌ）、フェニルヒドラジン（１２２）（０．４７ｍＬ、４．８ｍｍｏｌ）を加えて室温で４時間撹拌した。水（２０ｍＬ）を加えて分液し、有機層を飽和食塩水（２０ｍＬ）で洗浄した。無水硫酸ナトリウムで乾燥、ろ過、減圧下濃縮し得られた残渣を中圧シリカゲルカラムクロマトグラフィー（シリカゲル３０ｇ、酢酸エチル／ヘキサン＝１５／８５〜６５／３５）にて精製し、１２３（８５３ｍｇ、３．２２ｍｍｏｌ、収率８１％）を無色アモルファスとして得た。【０３０３】
上記のようにして得られた１２３（０．６４ｇ、２．４ｍｍｏｌ）に４Ｍ塩酸／ジオキサン（６ｍＬ）を加えて室温で３時間撹拌した。析出した固体をろ取し、中圧シリカゲルカラムクロマトグラフィー（アミンシリカゲル３０ｇ、メタノール／塩化メチレン＝０／１００〜８／９２）にて精製し、１２４（２９０ｍｇ、１．７６ｍｍｏｌ、収率７３％）を、薄黄色固体として得た。【０３０４】
上記のようにして得られた１２４（１２０ｍｇ、０．７２ｍｍｏｌ）、ｋ−１（１００ｍｇ、０．５５ｍｍｏｌ）をＤＭＳＯ（１．１ｍＬ）に溶解させ１００℃で２２時間撹拌した。放冷後、反応溶液をそのまま中圧シリカゲルカラムクロマトグラフィー（シリカゲル１０ｇ、酢酸エチル／ヘキサン＝２０／８０〜９０／１０）にて精製し、得られた固体を塩化メチレンで洗浄後、減圧下乾燥し、ｋ−１：Ｃ−１（２０．２ｍｇ、０．０６１７ｍｍｏｌ、収率１１％）を黄色固体として得た。【０３０５】
1H-NMR(400MHz):δ9.89 (s, 1H), 9.67(s, 1H), 7.83(s, 1H), 7.25(d, J=8.0Hz, 1H), 7.14(t, J=8.0Hz, 2H), 6.77(d, J=8.0Hz, 2H), 6.71(t, J=8.0Hz, 1H), 6.29(d, J=8.0Hz, 1H), 4.35(s, 2H), 2.74(q, J=8.0Hz, 2H), 1.92(s, 3H), 1.13(t, J=8.0Hz, 3H).(NHの一つのシグナルは観測されなかった。)【０３０６】
［合成例１７］ｋ−１：Ｃ−２の合成【０３０７】
【化７８】
2019235569.tif 000087
【０３０８】
Ｂｏｃ−Ｇｌｙ−ＯＨ（１２１）（０．７０ｇ、４．０ｍｍｏｌ）を塩化メチレン（１３ｍＬ）に溶解させ、ＷＳＣ（０．８４ｇ、４．４ｍｍｏｌ）、ベンジルアミン（１２５）（０．５２ｍＬ、４．８ｍｍｏｌ）を加えて室温で３時間撹拌した。水（２０ｍＬ）、塩化メチレン（２０ｍＬ）を加えて分液し、有機層を飽和食塩水（２０ｍＬ）で洗浄した。無水硫酸ナトリウムで乾燥、ろ過、減圧下濃縮して得られた残渣を中圧シリカゲルカラムクロマトグラフィー（シリカゲル３０ｇ、酢酸エチル／ヘキサン＝１０／９０〜６５／３５）にて精製し、１２６（９３７ｍｇ、３．５４ｍｍｏｌ、収率８９％）を無色液体として得た。【０３０９】
上記のようにして得られた１２６（０．９３ｇ、３．５ｍｍｏｌ）にＴＦＡ（７ｍＬ）を加えて室温で３．５時間撹拌した。反応溶液を減圧下濃縮して得られた残渣を中圧シリカゲルカラムクロマトグラフィー（アミンシリカゲル３０ｇ、酢酸エチル／塩化メチレン＝１０／９０〜９５／５）にて精製し、１２７（４５７ｍｇ、２．７８ｍｍｏｌ、収率７９％）を、薄黄色液体として得た。【０３１０】
上記のようにして得られた１２７（１２０ｍｇ、０．７２ｍｍｏｌ）、ｋ−１（１００ｍｇ、０．５５ｍｍｏｌ）をＤＭＳＯ（１．１ｍＬ）に溶解させ１００℃で２２時間撹拌した。放冷後、反応溶液をそのまま中圧シリカゲルカラムクロマトグラフィー（シリカゲル１０ｇ、酢酸エチル／ヘキサン＝１０／９０〜８０／２０）にて精製し、得られた固体をＩＰＥ、塩化メチレンで洗浄後、減圧下乾燥し、ｋ−１：Ｃ−２（２９．９ｍｇ、０．０９０８ｍｍｏｌ、収率１７％）を黄色固体として得た。【０３１１】
1H-NMR(400MHz):δ9.63 (s, 1H), 8.55(m, NH), 7.40-7.20(m, 6H), 6.25(d, J=8.0Hz, 1H), 4.32(d, J=8.0Hz, 2H), 4.29(s, 2H), 2.70(q, J=8.0Hz, 2H), 1.91(s, 3H), 1.09(t, J=8.0Hz, 3H).(OHの一つのシグナルは観測されなかった。)【０３１２】
［合成例１８］ｋ−１：Ｄ−１の合成【０３１３】
【化７９】
2019235569.tif 000088
【０３１４】
３−ベンジルオキシアニリン（１２９）（２．４４ｇ、１２．２ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（２４ｍＬ）に溶解させ、酢酸ナトリウム（１．１０ｇ、１３．５ｍｍｏｌ）、ブロモ酢酸エチル（１２８）（１．４９ｍＬ、１３．５ｍｍｏｌ）を加えて室温で４時間撹拌した。水（３００ｍＬ）、酢酸エチル（１５０ｍＬ）を加えて分液し、有機層を飽和食塩水（１００ｍＬ）で洗浄した。無水硫酸ナトリウムで乾燥、ろ過、減圧下濃縮して得られた残渣を中圧シリカゲルカラムクロマトグラフィー（シリカゲル５０ｇ、酢酸エチル／ヘキサン＝２／９８〜１０／９０）にて精製し、１３０（２．８２ｇ、９．８８ｍｍｏｌ、収率８１％）を薄黄色固体として得た。【０３１５】
上記のようにして得られた１３０（１．０ｇ、３．５ｍｍｏｌ）をメタノール（１８ｍＬ）に懸濁させ、１０％Ｐｄ／Ｃ（０．１ｇ）を加えて水素雰囲気下室温で５時間撹拌した。反応溶液をセライトろ過し、ろ液を減圧下濃縮して得られた残渣を中圧シリカゲルカラムクロマトグラフィー（シリカゲル３０ｇ、酢酸エチル／ヘキサン＝３／９７〜３５／６５）にて精製し、１３１（２９５ｍｇ、１．５１ｍｍｏｌ、収率４３％）を薄黄色液体として得た。【０３１６】
上記のようにして得られた１３１（０．２９ｇ、１．５ｍｍｏｌ）をエタノール（３．５ｍＬ）に溶解させ、ヒドラジン一水和物（０．３２ｍＬ、６．５ｍｍｏｌ）を加えて６０℃で１８時間撹拌した。反応溶液を減圧下濃縮し、得られた残渣を中圧シリカゲルクロマトグラフィー（アミンシリカゲル１０ｇ、メタノール／塩化メチレン＝１／９９〜１０／９０）で精製した。得られた固体をＩＰＥで洗浄後、減圧下乾燥し、１３２（２３９ｍｇ、１．３２ｍｍｏｌ、収率８８％）を薄黄色固体として得た。【０３１７】
上記のようにして得られた１３２（１３０ｍｇ、０．７２ｍｍｏｌ）、ｋ−１（１００ｍｇ、０．５５ｍｍｏｌ）をＤＭＳＯ（１．１ｍＬ）に溶解させ１００℃で２１時間撹拌した。放冷後、反応溶液をそのまま中圧シリカゲルカラムクロマトグラフィー（シリカゲル１０ｇ、酢酸エチル／塩化メチレン＝５／９５〜５０／５０）にて精製した。得られた固体を水、およびＩＰＥで洗浄後、減圧下乾燥し、ｋ−１：Ｄ−１（９５．９ｍｇ、０．２７９ｍｍｏｌ、収率５１％）を白色固体として得た。【０３１８】
1H-NMR(270MHz);δ 13.66(s, 1H), 10.76(s, 1H), 9.70(s, 1H), 8.98(s, 1H), 7.25(d, J=10.8Hz, 1H), 6.86(t, J=10.8Hz, 1H), 6.40(d, J=8.1Hz, 1H), 6.20-5.95(m, 3H), 5.87(t, J=5.4Hz, NH), 3.88(d, J=5.4Hz, 2H), 2.78(q, J=8.0Hz, 2H), 1.97(s, 3H), 1.05(t, J=8.1Hz, 3H).【０３１９】
［合成例１９］ｋ−１：Ｄ−３の合成【０３２０】
【化８０】
2019235569.tif 000089
【０３２１】
合成例１８の工程中で得られた１３０（１．２ｇ、４．２ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（１２ｍＬ）に溶解させ、炭酸カリウム（１．１６ｇ、８．４ｍｍｏｌ）、ヨードエタン（１．３５ｍＬ、１６．８ｍｍｏｌ）を加えて１００℃で３時間、ヨードエタン（０．７ｍＬ、８．７ｍｍｏｌ）を追加して１．５時間、室温で２０時間撹拌した。水（１００ｍＬ）、酢酸エチル（５０ｍＬ）を加えて分液し、有機層を飽和食塩水（５０ｍＬ）で洗浄した。無水硫酸ナトリウムで乾燥、ろ過、減圧下濃縮して得られた残渣を中圧シリカゲルカラムクロマトグラフィー（シリカゲル１０ｇ、酢酸エチル／ヘキサン＝２／９８〜１０／９０）にて精製し、１３３（１．２１ｇ、３．８６ｍｍｏｌ、収率９２％）を無色液体として得た。【０３２２】
上記のようにして得られた化合物１３３（１．２ｇ、３．９ｍｍｏｌ）をメタノール（１９ｍＬ）に溶解させ、１０％Ｐｄ／Ｃ（０．１ｇ）を加えて水素雰囲気下室温で１５時間撹拌した。反応溶液をセライトろ過し、ろ液を減圧下濃縮して得られた残渣を中圧シリカゲルカラムクロマトグラフィー（シリカゲル３０ｇ、酢酸エチル／ヘキサン＝５／９５〜２５／７５）にて精製し、１３４（１９４ｍｇ、０．８６９ｍｍｏｌ、収率２２％）を得た。【０３２３】
上記のようにして得られた１３４（０．２０ｇ、０．９０ｍｍｏｌ）をエタノール（２．２ｍＬ）に溶解させ、ヒドラジン一水和物（０．２２ｍＬ、４．５ｍｍｏｌ）を加えて５０℃で１８時間、ヒドラジン一水和物（０．２２ｍＬ、４．５ｍｍｏｌ）を追加して更に６０℃で２４時間撹拌した。反応溶液を減圧下濃縮し、得られた残渣を中圧シリカゲルクロマトグラフィー（アミンシリカゲル１０ｇ、メタノール／塩化メチレン＝１／９９〜６／９４）で精製した。得られた固体をＩＰＥで洗浄後、減圧下乾燥し、１３５（１５１ｍｇ、０．７２２ｍｍｏｌ、収率８０％）を薄黄色固体として得た。【０３２４】
上記のようにして得られた１３５（１５０ｍｇ、０．７２ｍｍｏｌ）、ｋ−１（１００ｍｇ、０．５５ｍｍｏｌ）をＤＭＳＯ（１．１ｍＬ）に溶解させ１００℃で２３時間撹拌した。放冷後、反応溶液をそのまま中圧シリカゲルカラムクロマトグラフィー（シリカゲル１０ｇ、酢酸エチル／ヘキサン＝１５／８５〜８０／２０）にて精製した。得られた固体をＩＰＥ／塩化メチレン（１／１）の混合溶媒で洗浄後、減圧下乾燥し、ｋ−１：Ｄ−３（１１８ｍｇ、０．３１８ｍｍｏｌ、収率５８％）を黄色固体として得た。【０３２５】
1H-NMR(270MHz);δ 13.68(s, 1H), 10.78(s, 1H), 9.69(s, 1H), 9.00(s, 1H), 7.26(d, J=8.1Hz, 1H), 6.91(t, J=8.1Hz, 1H), 6.40(d, J=8.1Hz, 1H), 6.11(d, J=8.1Hz, 1H), 6.10-6.05(m, 2H), 4.12(s, 2H), 3.42(q, J=8.1Hz, 2H), 2.79(q, J=8.1Hz, 2H), 1.96(s, 3H), 1.13(t, J=8.1Hz, 3H), 1.05(t, J=8.1Hz, 3H).【０３２６】
［合成例２０］ｋ−１：Ｅ−１の合成【０３２７】
【化８１】
2019235569.tif 000090
【０３２８】
アミノフェノール（１３７）（５００ｍｇ、４．６ｍｍｏｌ）をＴＨＦ（５ｍＬ）、水（５ｍＬ）に溶解させ、炭酸水素ナトリウム（０．７７ｇ、９．２ｍｍｏｌ）を加えて氷冷下クロロギ酸フェニル（１３６）（０．６１ｍＬ、４．８ｍｍｏｌ）をゆっくり滴下した。同温で２時間撹拌し、酢酸エチル（２０ｍＬ）、２Ｍ塩酸（２０ｍＬ）を加えて分液した。有機層を飽和食塩水（２０ｍＬ）で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥、ろ過、減圧下濃縮して得られた固体をＩＰＥで洗浄後、減圧下乾燥し、１３８（０．９４ｇ、４．１ｍｍｏｌ、収率８９％）を白色固体として得た。【０３２９】
上記のようにして得られた１３８（０．９４ｇ、４．１ｍｍｏｌ）をアセトニトリル（４ｍＬ）に溶解させ、ヒドラジン一水和物（１．０ｍＬ、２１ｍｍｏｌ）を加えて６０℃で２３時間撹拌した。反応溶液を減圧下濃縮し、得られた残渣を中圧シリカゲルクロマトグラフィー（アミンシリカゲル３０ｇ、メタノール／塩化メチレン＝０／１００〜１２／８８）で精製して１３９（６６４ｍｇ、３．９７ｍｍｏｌ、収率９７％）を薄黄色固体として得た。【０３３０】
上記のようにして得られた１３９（１２０ｍｇ、０．７２ｍｍｏｌ）、ｋ−１（１００ｍｇ、０．５５ｍｍｏｌ）をＤＭＳＯ（１．１ｍＬ）に溶解させ１００℃で１６時間撹拌した。放冷後、反応溶液をそのまま中圧シリカゲルカラムクロマトグラフィー（シリカゲル１０ｇ、酢酸エチル／ヘキサン＝１０／９０〜８０／２０）、続けて中圧シリカゲルカラムクロマトグラフィー（シリカゲル１０ｇ、メタノール／塩化メチレン＝１／９９〜５／９５）にて精製した。得られた固体をＩＰＥで洗浄してｋ−１：Ｅ−１（１９．７ｍｇ、０．０５９８ｍｍｏｌ、収率１１％）を白色固体として得た。【０３３１】
1H-NMR(400MHz);δ 9.70(s, 1H), 9.60(s, 1H), 9.38(s, 1H), 8.73(s, 1H), 7.21(d, J=8.0Hz, 1H), 7.06(t, J=8.0Hz, 1H), 7.05(s, 1H), 6.82(d, J=8.0Hz, 1H), 6.39(d, J=8.0Hz, 2H), 5.76(s, 1H), 2.69(q, J=8.0Hz, 2H), 1.99(s, 3H), 1.13(t, J=8.0Hz, 3H).【０３３２】
［合成例２１］ｋ−１：Ｆ−１の合成【０３３３】
【化８２】
2019235569.tif 000091
【０３３４】
ヒドラジン一水和物（０．５８ｍＬ、１２ｍｍｏｌ）を塩化メチレン（６ｍＬ）に溶解させ、氷冷下ヘキサメチレンジイソシアネート（１４０）（０．４８ｍＬ、３．０ｍｍｏｌ）を加えて室温で１．５時間、ヒドラジン一水和物（０．２９ｍＬ、６．０ｍｍｏｌ）を追加して２時間撹拌した。生じた固体をろ取、減圧下乾燥し、１４１（０．６０ｇ、２．６ｍｍｏｌ、収率８７％）を白色固体として得た。【０３３５】
上記のようにして得られた１４１（１００ｍｇ、０．４３ｍｍｏｌ）、ｋ−１（２３３ｍｇ、１．２９ｍｍｏｌ）をＤＭＳＯ（１．４ｍＬ）に懸濁させ１００℃で２０時間撹拌した。放冷後、塩化メチレンを加えて不溶物をろ別し、ろ液を減圧下濃縮した。得られた固体を塩化メチレンおよび水で洗浄後、減圧下乾燥し、ｋ−１：Ｆ−１（８８．６ｍｇ、０．１５９ｍｍｏｌ、収率３７％）を薄黄色固体として得た。【０３３６】
1H-NMR(400MHz);δ 9.44(s,4H), 7.15(d, J=8.0Hz, 2H), 6.40-6.30(m, 2H), 3.13(q, J=8.0Hz, 4H), 2.63 (q, J=8.0Hz, 4H),1.97(s, 6H), 1.47(m, 4H), 1.38(m, 4H),1.07(t, J=8.0Hz, 6H).【０３３７】
［合成例２２］ｋ−１：Ｇ−１の合成【０３３８】
【化８３】
2019235569.tif 000092
【０３３９】
Ｎ−メチル−アニリン（１４２）（０．５０ｇ、４．７ｍｍｏｌ）をエタノール（９ｍＬ）に溶解させ、炭酸カリウム（０．９７ｇ、７．０ｍｍｏｌ）、ブロモ酢酸エチル（１２８）（０．５７ｍＬ、５．１ｍｍｏｌ）を加えて６０℃で２１時間撹拌した。不溶物をろ別し、ろ液を減圧下濃縮して得られた残渣に酢酸エチル（３０ｍＬ）、水（３０ｍＬ）を加えて分液した。有機層を飽和食塩水（３０ｍＬ）で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥、ろ過、減圧下濃縮して得られた残渣を中圧シリカゲルカラムクロマトグラフィー（シリカゲル１０ｇ、酢酸エチル／ヘキサン＝０／１００〜５／９５）にて精製し１４３（４９６ｍｇ、２．５７ｍｍｏｌ、収率５５％）を薄黄色液体として得た。【０３４０】
上記のようにして得られた１４３（０．４９ｇ、２．６ｍｍｏｌ）をメタノール（５ｍＬ）に溶解させ、ヒドラジン一水和物（０．２５ｍＬ、５．１ｍｍｏｌ）を加えて５５℃で１５時間撹拌した。ヒドラジン一水和物（０．５０ｍＬ、１０ｍｍｏｌ）を追加して６０℃で更に１８時間撹拌した。反応溶液を減圧下濃縮し、得られた固体をＩＰＥで洗浄後、減圧下乾燥し、１４４（３８９ｍｇ、２．１７ｍｍｏｌ、収率８３％）を白色固体として得た。【０３４１】
上記のようにして得られた１４４（１３０ｍｇ、０．７２ｍｍｏｌ）、ｋ−１（１００ｍｇ、０．５５ｍｍｏｌ）をＤＭＳＯ（１．１ｍＬ）に溶解させ１００℃で１７時間撹拌した。放冷後、反応溶液をそのまま中圧シリカゲルカラムクロマトグラフィー（シリカゲル１０ｇ、酢酸エチル／ヘキサン＝１０／９０〜８０／２０）にて精製した。得られた固体をＩＰＥで洗浄後、減圧下乾燥し、ｋ−１：Ｇ−１（９２ｍｇ、０．２７ｍｍｏｌ、収率４９％）を白色固体として得た。【０３４２】
1H-NMR(270MHz);δ 13.64(s, 1H), 10.86(s, 1H), 9.67(s, 1H), 7.24(d, J=10.8Hz, 1H), 7.15(t, J=10.8Hz, 2H), 6.71(d, J=8.1Hz, 2H), 6.62(t, J=8.1Hz, 1H), 6.38(d, J=8.1Hz, 1H), 4.23(s, 2H), 3.04(s, 3H), 2.89(q, J=8.1Hz, 2H), 1.93(s, 3H), 1.05(t, J=8.1Hz, 3H).【０３４３】
［合成例２３］ｋ−１：Ｌ−１の合成【０３４４】
【化８４】
2019235569.tif 000093
【０３４５】
上記の合成例２２に準じた方法により、レゾルシノールを出発原料とし、ｋ−１：Ｌ−１（６５ｍｇ、白色固体）を合成した。【０３４６】
1H-NMR(270MHz);δ 13.63(s, 1H), 10.99(s, 1H), 9.74(s, 1H), 9.46(s, 1H), 7.28(d, J=8.1Hz, 1H), 7.07(t, J=8.1Hz, 1H), 6.45-6.35(m, 4H), 4.72(s, 2H), 2.81(q, J=8.1Hz, 2H), 1.97(s, 3H), 1.08(t, J=8.1Hz, 3H).【０３４７】
［合成例２４］ｋ−１：Ｍ−１の合成【０３４８】
【化８５】
2019235569.tif 000094
【０３４９】
上記の合成例２２に準じた方法により、３−メルカプトフェノールを出発原料とし、ｋ−１：Ｍ−１（１１９ｍｇ、白色固体）を合成した。【０３５０】
1H-NMR(270MHz);δ13.64(s, 1H), 10.96(s, 1H), 9.72(s, 1H), 9.57(s, 1H), 7.26(d, J=8.1Hz, 1H), 7.11(t, J=8.1Hz, 1H), 6.82(d, J=8.1Hz, 1H), 6.80(s, 1H), 6.62(d, J=8.1Hz, 1H), 6.40(d, J=8.1Hz, 1H), 3.88(s, 2H), 2.78(q, J=8.1Hz, 2H), 1.97(s, 3H), 1.06(t, J=8.1Hz, 3H).【０３５１】
［合成例２５］ｋ−１：Ｇ−２の合成【０３５２】
【化８６】
2019235569.tif 000095
【０３５３】
Ｎ−エチル−アニリン（１４５）（０．５０ｇ、４．１ｍｍｏｌ）をエタノール（８ｍＬ）に溶解させ、炭酸カリウム（０．８６ｇ、６．２ｍｍｏｌ）、ブロモ酢酸エチル（１２８）（０．５０ｍＬ、４．１ｍｍｏｌ）を加えて６０℃で２１時間撹拌した。不溶物をろ別し、ろ液を減圧下濃縮して得られた残渣に酢酸エチル（３０ｍＬ）、水（３０ｍＬ）を加えて分液した。有機層を飽和食塩水（３０ｍＬ）で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥、ろ過、減圧下濃縮して得られた残渣を中圧シリカゲルカラムクロマトグラフィー（シリカゲル１０ｇ、酢酸エチル／ヘキサン＝０／１００〜５／９５）にて精製し１４６（４７３ｍｇ、２．２８ｍｍｏｌ、収率５６％）を薄黄色液体として得た。【０３５４】
上記のようにして得られた１４６（０．４７ｇ、２．３ｍｍｏｌ）をメタノール（４．５ｍＬ）に溶解させ、ヒドラジン一水和物（０．２２ｍＬ、４．５ｍｍｏｌ）を加えて５５℃で１５時間撹拌した。ヒドラジン一水和物（０．４４ｍＬ、９．１ｍｍｏｌ）を追加して６０℃で更に１８時間撹拌した。反応溶液を減圧下濃縮し、得られた固体をＩＰＥで洗浄後、減圧下乾燥し、１４７（３０９ｍｇ、１．６０ｍｍｏｌ、収率７０％）を白色固体として得た。【０３５５】
上記のようにして得られた１４７（１４０ｍｇ、０．７２ｍｍｏｌ）、ｋ−１（１００ｍｇ、０．５５ｍｍｏｌ）をＤＭＳＯ（１．１ｍＬ）に溶解させ１００℃で１７時間撹拌した。放冷後、反応溶液をそのまま中圧シリカゲルカラムクロマトグラフィー（シリカゲル１０ｇ、酢酸エチル／ヘキサン＝１０／９０〜８０／２０）にて精製した。得られた固体をＩＰＥで洗浄後、減圧下乾燥し、ｋ−１：Ｇ−２（９６ｍｇ、０．２７ｍｍｏｌ、収率４９％）を白色固体として得た。【０３５６】
1H-NMR(270MHz);δ 13.66(s, 1H), 10.82(s, 1H), 9.68(s, 1H), 7.25(d, J=8.1Hz, 1H), 7.13(t, J=8.1Hz, 2H), 6.65(d, J=8.1Hz, 2H), 6.59(t, J=8.1Hz, 1H), 6.38(d, J=10.8Hz, 1H), 4.17(s, 2H),3.46(q, J=8.1Hz, 2H), 2.79(q, J=8.1Hz, 2H), 1.94(s, 3H), 1.13(t, J=8.1Hz, 3H), 1.03(t, J=8.1Hz, 3H).【０３５７】
［合成例２６］ｋ−１：Ｊ−１の合成【０３５８】
【化８７】
2019235569.tif 000096
【０３５９】
氷冷したＴＨＦ（１０ｍＬ）に水素化アルミニウム（１．０ｇ、２６ｍｍｏｌ）、３−シアノフェノール（１４８）（０．６３ｇ、５．３ｍｍｏｌ）を順次加え、室温で１．５時間、６０℃で３．５時間撹拌した。放冷後、水素化アルミニウム（１．０ｇ、２６ｍｍｏｌ）、ＴＨＦ（１０ｍＬ）を追加して６０℃で更に１６時間撹拌した。反応溶液を氷冷し、水（１．５ｍＬ）、１５％水酸化ナトリウム水溶液（１．５ｍＬ）、水（４．５ｍＬ）を順次加えて室温で３時間撹拌した。懸濁溶液をセライトろ過し、ろ液を減圧下濃縮して得られた残渣を中圧シリカゲルカラムクロマトグラフィー（アミンシリカゲル１０ｇ、メタノール／塩化メチレン＝０／１００〜８／９２）にて精製した。得られた固体をＩＰＥで洗浄後、減圧下乾燥し、１４９（４７７ｍｇ、３．８７ｍｍｏｌ、収率７３％）を白色固体として得た。【０３６０】
上記のようにして得られた１４９（２００ｍｇ、１．６ｍｍｏｌ）を塩化メチレン（２ｍＬ）、水（２ｍＬ）に溶解させ、炭酸水素ナトリウム（０．２７ｇ、３．２ｍｍｏｌ）を加えて氷冷下クロロギ酸フェニル（１３６）（０．２２ｍＬ、１．７ｍｍｏｌ）をゆっくり滴下した。室温で２０時間撹拌し、酢酸エチル（２０ｍＬ）、水（２０ｍＬ）を加えて分液した。有機層を飽和食塩水（２０ｍＬ）で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥、ろ過、減圧下濃縮して得られた残渣を中圧シリカゲルカラムクロマトグラフィー（シリカゲル１０ｇ、酢酸エチル／ヘキサン＝５／９５〜３５／６５）にて精製し１５０（３６９ｍｇ、１．５２ｍｍｏｌ、収率９５％）を無色液体として得た。【０３６１】
上記のようにして得られた１５０（３６５ｍｇ、１．５０ｍｍｏｌ）をアセトニトリル（３．８ｍＬ）に懸濁させ、ヒドラジン一水和物（０．１８ｍＬ、３．８ｍｍｏｌ）を加えて室温で２．５時間、ヒドラジン一水和物（０．１８ｍＬ、３．８ｍｍｏｌ）を追加して５５℃で更に２０時間撹拌した。反応溶液を減圧下濃縮し、得られた固体をＩＰＥ／塩化メチレン（３／１）で洗浄後、減圧下乾燥し、１５１（２３３ｍｇ、１．２９ｍｍｏｌ、収率８６％）を白色固体として得た。【０３６２】
上記のようにして得られた１５１（１３０ｍｇ、０．７２ｍｍｏｌ）、ｋ−１（１００ｍｇ、０．５５ｍｍｏｌ）をＤＭＳＯ（１．１ｍＬ）に溶解させ１００℃で１５時間撹拌した。放冷後、反応溶液をそのまま中圧シリカゲルカラムクロマトグラフィー（シリカゲル１０ｇ、酢酸エチル／塩化メチレン＝１０／９０〜５５／４５）にて精製した。得られた精製物に水を加えて析出した固体をろ取後、減圧下乾燥し、ｋ−１：Ｊ−１（１０２ｍｇ、０．２９７ｍｍｏｌ、収率５４％）を白色固体として得た。【０３６３】
1H-NMR(270MHz);δ13.45(brs, 1H), 9.57(s, 1H), 9.53(s, 1H), 9.36(s, 1H), 7.17(d, J=8.1Hz, 1H), 7.11(d, J=8.1Hz, 1H), 6.80-6.60(m, 4H), 6.37(d, J=8.1Hz, 1H), 4.25(d, J=5.4Hz, 2H), 2.65(q, J=8.1Hz, 2H), 1.97(s, 3H), 1.08(t, J=8.1Hz, 3H).【０３６４】
［合成例２７］ｋ−１：Ｊ−５の合成【０３６５】
【化８８】
2019235569.tif 000097
【０３６６】
４−ベンジル−３−チオセミカルバジド（１５５）（１３０ｍｇ、０．７２ｍｍｏｌ）、ｋ−１）（１００ｍｇ、０．５５ｍｍｏｌ）をＤＭＳＯ（１．１ｍＬ）に溶解させ１００℃で１７時間撹拌した。放冷後、反応溶液をそのまま中圧シリカゲルカラムクロマトグラフィー（シリカゲル１０ｇ、酢酸エチル／ヘキサン＝５／９５〜８０／２０）、続けて中圧シリカゲルカラムクロマトグラフィー（シリカゲル１０ｇ、酢酸エチル／ヘキサン＝１０／９０〜５０／５０）にて精製した。得られた固体をＩＰＥで洗浄後、減圧下乾燥し、ｋ−１：J−５（４９．９ｍｇ、０．１４５ｍｍｏｌ、収率２６％）を白色固体として得た。【０３６７】
1H-NMR(400MHz);δ10.61(brs, 1H), 9.69(s, 1H), 8.43(brs, 1H), 7.40-7.20(m, 6H), 6.40 (d, J=8.0Hz, 1H), 4.78(d, J=8.0Hz, 2H), 2.74(q, J=8.1Hz, 2H), 1.99(s, 3H), 1.09(t, J=8.1Hz, 3H). (NHの一つのシグナルは観測されなかった。)【０３６８】
［合成例２８］ｋ−１：Ｊ−６の合成【０３６９】
【化８９】
2019235569.tif 000098
【０３７０】
チオセミカルバジド（１５２）（０．５０ｇ、５．５ｍｍｏｌ）をメタノール（５．５ｍＬ）に懸濁させ、ヨウ化メチル（０．４１ｍＬ、６．６ｍｍｏｌ）を加えて６０℃で１．５時間、反応容器のふたを開けて７０℃で５０分撹拌した。放冷後、ベンジルアミン（０．６１ｍＬ、５．５ｍｍｏｌ）を加えて５５℃で１７時間撹拌した。反応溶液を減圧下濃縮し、得られた残渣をＩＰＥ／塩化メチレン（１／４）の混合溶媒で洗浄した。得られた粗精製物を中圧シリカゲルカラムクロマトグラフィー（アミンシリカゲル３０ｇ、メタノール／塩化メチレン＝０／１００〜１５／８５）にて精製し、得られた固体を塩化メチレンで洗浄後、減圧下乾燥し、１５６（６２６ｍｇ、３．８１ｍｍｏｌ、収率６９％）を橙色固体として得た。【０３７１】
上記のようにして得られた１５６（１２０ｍｇ、０．７２ｍｍｏｌ）、ｋ−１（１００ｍｇ、０．５５ｍｍｏｌ）をＤＭＳＯ（１．１ｍＬ）に溶解させ１００℃で２７時間撹拌した。放冷後、反応溶液をそのまま中圧シリカゲルカラムクロマトグラフィー（シリカゲル１０ｇ、酢酸エチル／塩化メチレン＝１０／９０〜８０／２０）にて精製し、得られた粗精製物に塩化メチレン、水を加えて分液した。有機層を無水硫酸マグネシウムにて乾燥、ろ過、減圧下濃縮して得られた残渣を中圧シリカゲルカラムクロマトグラフィー（シリカゲル１０ｇ、酢酸エチル／ヘキサン＝１０／９０〜６０／４０）にて精製しｋ−１：Ｊ−６（２９．９ｍｇ、０．０９１６ｍｍｏｌ、収率１７％）を黄色アモルファスとして得た。【０３７２】
1H-NMR(270MHz);δ14.51(brs, 1H), 9.39(s, 1H), 7.36-7.05 (m, 6H), 6.32(d, J=8.1Hz, 1H), 6.20 (m, NH), 5.30(brs, NH), 4.34(d, J=5.4Hz, 2H), 2.84(q, J=8.1Hz, 2H), 1.96(s, 3H), 0.96(t, J=8.1Hz, 3H).【０３７３】
［合成例２９］ｋ−１：Ｎ−１の合成
【化９０】
2019235569.tif 000099
【０３７４】
２−ヒドロキシベンジルアルコール（１．０ｇ、８．１ｍｍｏｌ）を塩化メチレン（１０ｍＬ）、水（１０ｍＬ）に懸濁させ、炭酸水素ナトリウム（２．０ｇ、２４ｍｍｏｌ）を加えて氷冷下クロロギ酸フェニル（２．０ｍＬ、１６ｍｍｏｌ）をゆっくり滴下した。徐々に室温まで昇温して５．５時間撹拌し、塩化メチレン（２０ｍＬ）、水（２０ｍＬ）を加えて分液した。有機層を飽和食塩水（３０ｍＬ）で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥、ろ過、減圧下濃縮して得られた残渣を中圧シリカゲルカラムクロマトグラフィー（シリカゲル３０ｇ、酢酸エチル／ヘキサン＝２／９８〜３５／６５）にて精製し、３−（ヒドロキシメチル）フェニル  フェニル  カーボネート（１．４５ｇ、５．９４ｍｍｏｌ、収率７３％）を白色固体として得た。【０３７５】
上記のようにして得られた３−（ヒドロキシメチル）フェニル  フェニル  カーボネートを塩化メチレン（７ｍＬ）に溶解させ、ピリジン（０．７２ｍＬ、８．９ｍｍｏｌ）、ＤＭＡＰを少量加えて氷冷下クロロギ酸フェニル（０．９０ｍＬ、７．１ｍｍｏｌ）をゆっくり滴下した。室温で２時間撹拌し、塩化メチレン（１０ｍＬ）、水（３０ｍＬ）を加えて分液した。有機層を飽和食塩水（３０ｍＬ）で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥、ろ過、減圧下濃縮して得られた残渣を中圧シリカゲルカラムクロマトグラフィー（シリカゲル３０ｇ、酢酸エチル／ヘキサン＝３／９７〜２５／７５）にて精製し、３−［（フェノキシカルボニル）オキシ］ベンジル  フェニル  カーボネート（２．２０ｇ、６．０４ｍｍｏｌ、収率１０２％）を無色液体として得た。【０３７６】
上記のようにして得られた３−［（フェノキシカルボニル）オキシ］ベンジル  フェニル  カーボネート（２．２ｇ、６．０ｍｍｏｌ）をエタノール（１０ｍＬ）に懸濁させ、ヒドラジン一水和物（２．９ｍＬ、６０ｍｍｏｌ）を加えて６０℃で２１時間撹拌した。不溶物をろ別し、ろ液を減圧下濃縮して得られた残渣を中圧シリカゲルカラムクロマトグラフィー（シリカゲル３０ｇ、メタノール／塩化メチレン＝０／１００〜１０／９０）にて精製し、得られた固体を塩化メチレンで懸濁洗浄して３−ヒドロキシベンジル  ヒドラジンカルボキシレート（８０８ｍｇ、４．４４ｍｍｏｌ、収率７４％）を白色固体として得た。【０３７７】
上記のようにして得られた３−ヒドロキシベンジル  ヒドラジンカルボキシレート（１３０ｍｇ、０．７２ｍｍｏｌ）、２’，４’−ジヒドロキシ−３’−メチルプロピオフェノン（１００）（１００ｍｇ、０．５５ｍｍｏｌ）をＤＭＳＯ（１．１ｍＬ）に懸濁させ１００℃で２２時間撹拌した。放冷後、反応溶液をそのまま中圧シリカゲルカラムクロマトグラフィー（シリカゲル１０ｇ、酢酸エチル／塩化メチレン＝２／９８〜３０／７０）にて精製し、得られた精製物に水を加えて析出した固体をろ取し、ｋ−１：Ｎ−１（８５．５ｍｇ、０．２４８ｍｍｏｌ、収率４５％）を白色固体として得た。【０３７８】
1H-NMR(270MHz);δ13.45(brs, 1H), 10.78(brs, 1H), 9.63 (s, 1H), 9.49 (s, 1H), 7.21(d, J=8.1Hz, 1H), 7.18(t, J=8.1Hz, 1H), 6.84(d, J=8.1Hz, 1H), 6.83(s, 1H), 6.73(d, J=8.1Hz, 1H), 6.38(d, J=8.1Hz, 1H), 5.14(s, 2H), 2.75(q, J=8.1Hz, 2H), 1.97(s, 3H), 1.03(t, J=8.1Hz, 3H).【０３７９】
［合成例３０］ＧＡ−００５Ａの合成【０３８０】
【化９１】
2019235569.tif 000100
【０３８１】
（式中、Ｂｎはベンジル基を示す）
Ｄ−アラニンメチル塩酸塩（１５７）（１．４０ｇ、１０．０ｍｍｏｌ）、３−ベンジルオキシフェニルボロン酸（１５８）（３．４３ｇ、１５．１ｍｍｏｌ）、酢酸銅（ＩＩ）一水和物（３．００ｇ、１５．１ｍｍｏｌ）、モレキュラーシーブ４Ａ（ＭＳ４Ａ；２０ｇ）を塩化メチレン（２００ｍＬ）に溶解させ、トリエチルアミン（４．１７ｍＬ、３０．１ｍｍｏｌ）を加えて酸素雰囲気下室温で２３時間撹拌した。反応溶液をセライトろ過し、ろ液を半分まで減圧下濃縮、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液（５０ｍＬ）を加えて分液した。有機層を飽和食塩水（２０ｍＬ）で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥、ろ過、減圧下濃縮した。得られた残渣を中圧シリカゲルカラムクロマトグラフィー（シリカゲル３０ｇ、酢酸エチル／ヘキサン＝１／９９〜１０／９０）にて精製し、１５９（５９５ｍｇ、２．０９ｍｍｏｌ、収率２１％）を黄色液体として得た。【０３８２】
【化９２】
2019235569.tif 000101
【０３８３】
（式中、Ｂｎはベンジル基を示す）
上記のようにして得られた１５９（５９５ｍｇ、２．０９ｍｍｏｌ）をメタノール（２１ｍＬ）に溶解させ、パラジウム炭素エチレンジアミン複合体（２４１ｍｇ）を加えて水素雰囲気下、室温で３．５時間撹拌した。パラジウム炭素をろ別し、ろ液を減圧下濃縮して得られた残渣を中圧シリカゲルカラムクロマトグラフィー（シリカゲル３０ｇ、酢酸エチル／ヘキサン＝１０／９０〜３０／７０）にて精製し、１６０（４１３ｍｇ、２．１２ｍｍｏｌ、ｑｕａｎｔ．）を黄色液体として得た。【０３８４】
【化９３】
2019235569.tif 000102
【０３８５】
上記のようにして得られた１６０（４１３ｍｇ、２．１２ｍｍｏｌ）をメタノール（４．２ｍＬ）に溶解させ、ヒドラジン一水和物（１．０ｍＬ、２１ｍｍｏｌ）を加えて６０℃で３．５時間撹拌した。反応溶液を減圧下濃縮、トルエン共沸して得られた残渣を中圧シリカゲルカラムクロマトグラフィー（シリカゲル１０ｇ、メタノール／塩化メチレン＝１／９９〜１０／９０）にて精製し、１６１（３９１ｍｇ、２．００ｍｍｏｌ、収率９５％）を褐色アモルファスとして得た。【０３８６】
【化９４】
2019235569.tif 000103
【０３８７】
上記のようにして得られた１６１（７２ｍｇ、０．３７ｍｍｏｌ）、２’，４’−ジヒドロキシ−３’−メチルプロピオフェノン（１００）（６０ｍｇ、０．３３ｍｍｏｌ）をＤＭＳＯ（０．６７ｍＬ）に溶解させ１００℃で３日撹拌した。放冷後、反応溶液をそのまま中圧シリカゲルカラムクロマトグラフィー（シリカゲル１０ｇ、酢酸エチル／塩化メチレン＝５／９５〜５０／５０）にて精製し、得られた精製物を蒸留水、イソプロピルアルコール（ＩＰＡ）／ヘキサン、蒸留水で順次懸濁洗浄して、ＧＡ−００５Ａ（ＺＸ−０１−Ｒ（４０．５ｍｇ、０．１１３ｍｍｏｌ、収率３４％））を薄茶色固体として得た。比旋光度は、旋光度計Ｐ−１０２０（日本分光社製）を用いて測定した。【０３８８】
1H-NMR(270MHz); ;δ13.65(s, 1H), 10.75(s, 1H), 9.70(s, 1H), 8.97(s, 1H), 7.25(d, J=8.1Hz, 1H), 6.83(t, J=8.1Hz, 1H), 6.39(d, J=8.1Hz, 1H), 6.15-5.95(m, 3H), 5.81(d, J=8.1Hz, 1H), 4.18(m, 1H), 2.78(q, J=8.1Hz, 2H), 1.95(s, 3H), 1.37(d, J=8.1Hz, 3H), 1.03(t, J=8.1Hz, 3H).
化合物ＧＡ−００５Ａ；光学純度９９．９ｅｅ％、純度９９．２％、比旋光度[α]２２Ｄ−１１．４（ｃ＝０．０２６４、エタノール）、立体配置Ｒ体【０３８９】
［合成例３１］ＧＡ−００５Ｂの合成【０３９０】
【化９５】
2019235569.tif 000104
【０３９１】
（式中、Ｂｎはベンジル基を示す）
Ｌ−アラニンメチル塩酸塩（１６２）（７００ｍｇ、５．０２ｍｍｏｌ）、３−ベンジルオキシフェニルボロン酸（１５８）（１．７２ｇ、７．５２ｍｍｏｌ）、酢酸銅（ＩＩ）一水和物（１．５０ｇ、７．５２ｍｍｏｌ）、ＭＳ４Ａ（１０ｇ）を塩化メチレン（１００ｍＬ）に溶解させ、トリエチルアミン（２．０９ｍＬ、１５．１ｍｍｏｌ）を加えて室温で１８時間撹拌した。反応溶液をセライトろ過し、ろ液を減圧下半分まで濃縮、塩化メチレン（２５ｍＬ）、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液（２５ｍＬ）を加えて分液した。有機層を飽和食塩水（１０ｍＬ）で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥、ろ過、減圧下濃縮した。得られた残渣を中圧シリカゲルカラムクロマトグラフィー（シリカゲル３０ｇ、酢酸エチル／ヘキサン＝１／９９〜１０／９０）にて精製し、１６３（２５５ｍｇ、０．８９４ｍｍｏｌ、収率１８％）を薄黄色液体として得た。【０３９２】
【化９６】
2019235569.tif 000105
【０３９３】
（式中、Ｂｎはベンジル基を示す）
上記のようにして得られた１６３(２５５ｍｇ、０．８９４ｍｍｏｌ)をメタノール(９ｍＬ)に溶解させ、５％パラジウム炭素(１９０ｍｇ)を加えて水素雰囲気下、室温で2時間撹拌した。パラジウム炭素をろ別し、ろ液を減圧下濃縮して得られた残渣を中圧シリカゲルカラムクロマトグラフィー（シリカゲル１０ｇ、酢酸エチル／ヘキサン＝１０／９０〜１００／０）にて精製し、１６４（９２．０ｍｇ、０．４７１ｍｍｏｌ、収率５３％）を薄褐色液体として得た。【０３９４】
【化９７】
2019235569.tif 000106
【０３９５】
上記のようにして得られた１６４（７５．５ｍｇ、０．３８９ｍｍｏｌ）をエタノール（０．８ｍＬ）に溶解させ、ヒドラジン一水和物（０．１９ｍＬ、３．９ｍｍｏｌ）を加えて６０℃で２時間撹拌した。反応溶液を減圧下濃縮、トルエン共沸して得られた残渣を中圧シリカゲルカラムクロマトグラフィー（シリカゲル１０ｇ、メタノール／塩化メチレン＝１／９９〜４／９６）にて精製し１６５（６２．２ｍｇ、０．３１９ｍｍｏｌ、収率８２％）を無色アモルファスとして得た。【０３９６】
【化９８】
2019235569.tif 000107
【０３９７】
上記のようにして得られた１６５（６０ｍｇ、０．３１ｍｍｏｌ）、２’，４’−ジヒドロキシ−３’−メチルプロピオフェノン（１００）（５０ｍｇ、０．２８ｍｍｏｌ）をＤＭＳＯ（０．５５ｍＬ）に溶解させ１００℃で３日撹拌した。放冷後、反応溶液をそのまま中圧シリカゲルカラムクロマトグラフィー（シリカゲル１０ｇ、酢酸エチル／塩化メチレン＝３／９７〜５０／５０）にて精製し、得られた固体をＩＰＡに溶解させ、ヘキサンを加えて析出した固体をろ取して、ＧＡ−００５Ｂ（ＺＸ−０１−Ｓ（３０．１ｍｇ、０．０８４２ｍｍｏｌ、収率３０％））を薄茶色固体として得た。
1H-NMR(270MHz);δ13.64(s, 1H), 10.73(s, 1H), 9.69(s, 1H), 8.96(s, 1H), 7.24(d, J=8.1Hz, 1H), 6.82(t, J=8.1Hz, 1H), 6.38(d, J=8.1Hz, 1H), 6.15-5.95(m, 3H), 5.80(d, J=8.1Hz, 1H), 4.18(m, 1H), 2.78(q, J=8.1Hz, 2H), 1.95(s, 3H), 1.36(d, J=8.1Hz, 3H), 1.01(t, J=8.1Hz, 3H).
化合物ＧＡ−００５Ｂ；光学純度９９．９ｅｅ％、純度９７．８％、比旋光度［α］２２Ｄ  ＋１１．３（ｃ＝０．０２３０、エタノール）、立体配置Ｓ体【０３９８】
［実施例１］キナーゼ阻害活性評価１
化合物ｋ−１：Ｂ−１について、８種類のキナーゼ（ＣＧＫ２、ＬＡＴＳ２、ＭＳＫ１、ｐ７０Ｓ６Ｋ、ＰＫＡＣα、ＰＫＡＣβ、ＳＧＫ２、ＳＧＫ３）に対する阻害活性評価（５０％阻害濃度（IC50）の算出）を行った。活性測定は、以下に記載したＯｆｆ―ｃｈｉｐ  Ｍｏｂｉｌｉｔｙ  Ｓｈｉｆｔ  Ａｓｓａｙ (ＭＳＡ法)を用いて行った。ｋ−１：Ｂ−１の試験濃度は最終濃度１０μＭから０．３ｎＭの１０段階になるように添加した。【０３９９】
データの解析方法としては全ての反応コンポーネントを含むコントロールウェルの平均シグナルを０％阻害、酵素非添加の平均シグナルを１００％阻害とし、各被検物質試験２ウェルの平均シグナルから阻害率を計算した。IC50値は被検物質濃度と阻害率によるプロットをExcel ソルバーアドインを用いて非線形最小二乗法により４パラメータのロジスティック曲線に近似させて求めた。【０４００】
ＭＳＡ法：
アッセイバッファー(20 mM HEPES, 0.01% Triton X-100, 2 mM DTT, pH7.5)にて調製した５μＬの４倍濃度ｋ−１：Ｂ−１溶液、５μLの４倍濃度基質／ＡＴＰ／金属溶液および１０μLの２倍濃度キナーゼ溶液をポリプロピレン製３８４ウェルプレートのウェル内で混合し、室温にて１もしくは５時間反応させた。続いて７０μLのTermination Buffer (QuickScout Screening Assist MSA; Carna Biosciences社)を添加して反応を停止させた。その後、反応溶液中の基質ペプチドとリン酸化ペプチドをLabChip system (Perkin Elmer社)にて分離、定量した。キナーゼ反応は基質ペプチドピーク高さ(S)とリン酸化ペプチドピーク高さ(P)から計算される生成物比（P/(P+S))にて評価した。【０４０１】
本試験の結果として、ｋ−１：Ｂ−１のIC50値を表５に示す。ｋ−１：Ｂ−１は、ＣＧＫ２、ＬＡＴＳ２、ＭＳＫ１、ｐ７０Ｓ６Ｋ、ＰＫＡＣα、ＰＫＡＣβ、ＳＧＫ２、及びＳＧＫ３キナーゼを阻害していた。【０４０２】
【表５】
2019235569.tif 000108
【０４０３】
[実施例２]キナーゼ阻害活性評価２
化合物ｋ−１：Ｈ−７、ｋ−１：Ｈ−１、ｋ−１：Ｄ−１、ｋ−１：Ｊ−１、及びｋ−１：Ｂ−１について、８種類のキナーゼ（CGK2、LATS2、MSK1、p70S6K、PKACα、PKACβ、SGK2、SGK3）に対する１００ｎＭでの阻害率の算出を行った。活性測定はＭＳＡ法を用いて行った。データの解析方法としては全ての反応コンポーネントを含むコントロールウェルの平均シグナルを0%阻害、酵素非添加の平均シグナルを１００％阻害とし、各被検物質試験２ウェルの平均シグナルから阻害率を計算した。【０４０４】
ＭＳＡ法：
アッセイバッファー(20 mM HEPES, 0.01% Triton X-100, 2 mM DTT, pH7.5)にて調製した５μＬの４倍濃度化合物溶液、５μＬの４倍濃度基質／ＡＴＰ／金属溶液および１０μＬの２倍濃度キナーゼ溶液をポリプロピレン製３８４ウェルプレートのウェル内で混合し、室温にて１もしくは５時間反応させた。続いて７０μＬのTermination Buffer (QuickScout Screening Assist MSA; Carna Biosciences社)を添加して反応を停止させた。その後、反応溶液中の基質ペプチドとリン酸化ペプチドをLabChip system (Perkin Elmer社)にて分離、定量した。キナーゼ反応は基質ペプチドピーク高さ(S)とリン酸化ペプチドピーク高さ(P)から計算される生成物比（P/(P+S))にて評価した。【０４０５】
本試験の結果、化合物ｋ−１：Ｈ−７、ｋ−１：Ｈ−１、ｋ−１：Ｄ−１、ｋ−１：Ｊ−１、及びｋ−１：Ｂ−１は１００nMにおいて８種類のキナーゼ（CGK2、LATS2、MSK1、p70S6K、PKACα、PKACβ、SGK2、及びSGK3）に対して４０％以上の活性阻害率を示した。【０４０６】
【表６】
2019235569.tif 000109
【０４０７】
[実施例３]キナーゼ阻害活性評価３
化合物ｋ−１：Ｉ−１、ｋ−１：Ｄ−１、ｋ−１：Ｊ−１、ｋ−１：Ｈ−１、ｋ−１：Ｈ−７、ｋ−１：Ｂ−１、ｋ−５：Ｈ−１、ｋ−１：Ｈ−３、ｋ−１：Ｄ−４及びｋ−１：Ｉ−１０について、ＬＡＴＳ２に対する阻害活性評価（ＩＣ５０の算出）を行った。活性測定は、以下に記載したＯｆｆ―ｃｈｉｐ  Ｍｏｂｉｌｉｔｙ  Ｓｈｉｆｔ  Ａｓｓａｙ (ＭＳＡ法)を用いて行った。各化合物の試験濃度は最終濃度１０μＭから０．３ｎＭの１０段階になるように添加した。【０４０８】
データの解析方法としては全ての反応コンポーネントを含むコントロールウェルの平均シグナルを０％阻害、酵素非添加の平均シグナルを１００％阻害とし、各被検物質試験２ウェルの平均シグナルから阻害率を計算した。ＩＣ５０値は被検物質濃度と阻害率によるプロットをExcel ソルバーアドインを用いて非線形最小二乗法により４パラメータのロジスティック曲線に近似させて求めた。【０４０９】
ＭＳＡ法：
アッセイバッファー(20 mM HEPES, 0.01% Triton X-100, 2 mM DTT, pH7.5)にて調製した５μLの４倍濃度ｋ−１：Ｉ−１、ｋ−１：Ｄ−１、ｋ−１：Ｊ−１、ｋ−１：Ｈ−１、ｋ−１：Ｈ−７、ｋ−１：Ｂ−１、ｋ−５：Ｈ−１、ｋ−１：Ｈ−３、ｋ−１：Ｄ−４及びｋ−１：Ｉ−１０溶液、５μLの４倍濃度基質／ＡＴＰ／金属溶液および１０μLの２倍濃度キナーゼ溶液をポリプロピレン製３８４ウェルプレートのウェル内で混合し、室温にて１もしくは５時間反応させた。続いて７０μLのTermination Buffer (QuickScout Screening Assist MSA; Carna Biosciences社製)を添加して反応を停止させた。その後、反応溶液中の基質ペプチドとリン酸化ペプチドをLabChip system (Perkin Elmer社製)にて分離、定量した。キナーゼ反応は基質ペプチドピーク高さ(S)とリン酸化ペプチドピーク高さ(P)から計算される生成物比（P/(P+S))にて評価した。【０４１０】
本試験の結果として、ｋ−１：Ｉ−１、ｋ−１：Ｄ−１、ｋ−１：Ｊ−１、ｋ−１：Ｈ−１、ｋ−１：Ｈ−７、ｋ−１：Ｂ−１、ｋ−５：Ｈ−１、ｋ−１：Ｈ−３、ｋ−１：Ｄ−４及びｋ−１：Ｄ−１０のＩＣ５０値を表７に示す。これらの化合物は、ＬＡＴＳ２に対するＩＣ５０が１００ｎＭ以下であり、ＬＡＴＳ２に対する阻害効果を有することが示された。【０４１１】
【表７】
2019235569.tif 000110
【０４１２】
[実施例４]ＹＡＰ蛋白質の核内移行に対する特定化合物の作用
化合物ｋ−１：Ｂ−１、ｋ−１：Ｈ−１、及びｋ−１：Ｊ−１について、ＹＡＰ蛋白質及びＴＡＺ蛋白質の核内移行に対する評価を行った。核内移行はヒト卵巣がん細胞株ＳＫＯＶ３（ＤＳファーマバイオメディカル社製）を用いて、以下に記載したＯｐｅｒｅｔｔａＣＬＳ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社製）を用いたイメージング解析によって行った。ｋ−１：Ｂ−１、ｋ−１：Ｈ−１、及びｋ−１：Ｊ−１の試験濃度は最終濃度が１０μＭになるように添加した。【０４１３】
イメージング解析：
ＤＳファーマバイオメディカル社推奨プロトコルによって培養したヒト卵巣がん細胞株ＳＫＯＶ３を、シクロオレフィン底面の９６ウェルプレート（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社製、ＣｅｌｌＣａｒｒｉｅｒ−Ｕｌｔｒａ）へ１５，０００細胞／９０μＬ／ウェルとなるように播種し、ＣＯ２インキュベーター（３７℃、５％ＣＯ２）内で１日培養した。培養後、ＤＭＳＯに溶解した１００μＭの濃度のｋ−１：Ｂ−１、ｋ−１：Ｈ−１、及びｋ−１：Ｊ−１溶液を１０μＬ添加した。更に３７℃のＣＯ２インキュベーターで４時間培養し、培地を４％パラホルムアルデヒドへ交換、室温で１０分間静置することによって、細胞を固定した。固定した細胞に対してＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（Ｒ）６４７標識ＹＡＰ抗体（ＣｅｌｌＳｉｇｎａｌｉｎｇＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）、抗マウスＴＡＺ（Ｄ−８）抗体（ＳａｎｔａＣｒｕｚ社製）、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（Ｒ）５５５標識抗マウスＩｇＧ抗体（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を用いて、ＣｅｌｌＳｉｇｎａｌｉｎｇＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製の推奨プロトコルに従って免疫染色を行い、さらに１０μｇ／ｍＬのＨｏｅｃｈｓｔ３３３４２溶液で細胞核を染色した。【０４１４】
ＯｐｅｒｅｔｔａＣＬＳの２０倍対物レンズを用いて、１ウェルあたり９視野撮像した。得られた蛍光像から解析ソフトＨａｒｍｏｎｙ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社製）を用いて、細胞核領域と細胞質領域をそれぞれ同定し、各領域内の単位面積あたりのＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（Ｒ）６４７蛍光強度と単位面積あたりのＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（Ｒ）５５５蛍光強度を抽出した。核内移行は、抽出した値から細胞質領域の蛍光強度に対する細胞核領域の蛍光強度の比を算出することによって評価した。ＹＡＰ蛋白質ならびにＴＡＺ蛋白質が細胞核へ移行するにつれて値は１より大きくなり、細胞質へ局在する場合は１未満となる。【０４１５】
本試験の結果として、化合物無添加とｋ−１：Ｂ−１、ｋ−１：Ｈ−１、及びｋ−１：Ｊ−１を添加した際の核内移行率を表８に示す。表８に示される通り、化合物ｋ−１：Ｂ−１、ｋ−１：Ｈ−１、及びｋ−１：Ｊ−１は、ＹＡＰ蛋白質及びＴＡＺ蛋白質の核内移行を促進する作用を有することが明らかになった。【０４１６】
【表８】
2019235569.tif 000111
【０４１７】
[実施例５]ＹＡＰ蛋白質の核内移行に対する特定化合物の作用
化合物ｋ−１：Ｂ−１、ｋ−１：Ｈ−１、及びｋ−１：Ｊ−１について、ＹＡＰ蛋白質及びＴＡＺ蛋白質の核内移行に対する評価を行った。核内移行はヒト骨髄由来間葉系幹細胞（ＰｒｏｍｏＣｅｌｌ社製）を用いて、実施例４に記載したＯｐｅｒｅｔｔａＣＬＳ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社製）を用いたイメージング解析によって行った。ｋ−１：Ｂ−１、ｋ−１：Ｈ−１とｋ−１：Ｊ−１の試験濃度は最終濃度が１０μＭになるように添加した。【０４１８】
サンプル調製：
ＰｒｏｍｏＣｅｌｌ社推奨プロトコルによって培養したヒト骨髄由来間葉系幹細胞を、シクロオレフィン底面の９６ウェルプレート（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社製、ＣｅｌｌＣａｒｒｉｅｒ−Ｕｌｔｒａ）へ２５，０００細胞／９０μＬ／ウェルとなるように播種し、ＣＯ２インキュベーター（３７℃、５％ＣＯ２）内で１日培養した。培養後、１００μＭの濃度のｋ−１：Ｂ−１、ｋ−１：Ｈ−１、及びｋ−１：Ｊ−１溶液を添加した。３７℃のＣＯ２インキュベーターで４時間培養し、培地を４％パラホルムアルデヒド溶液へ交換、室温で１０分間静置することによって、細胞を固定した。固定した細胞に対して、実施例４に記載した方法で免疫染色を行った。【０４１９】
本試験の結果として、化合物無添加群とｋ−１：Ｂ−１、ｋ−１：Ｈ−１、及びｋ−１：Ｊ−１を添加した際の核内移行率を表９に示す。表９に示される通り、化合物ｋ−１：Ｂ−１、ｋ−１：Ｈ−１、及びｋ−１：Ｊ−１は、ＹＡＰ蛋白質及びＴＡＺ蛋白質の核内移行を促進する作用を有することが明らかになった。【０４２０】
【表９】
2019235569.tif 000112
【０４２１】
[実施例６]遺伝子発現に対する特定化合物の作用
特許文献（ＷＯ２０１４／０１７５１３）の方法に従い、０．０１５％（ｗ／ｖ）の脱アシル化ジェランガム（ＫＥＬＣＯＧＥＬ  ＣＧ−ＬＡ、三昌株式会社製）、３０ｎｇ／ｍＬヒトＥＧＦ（ＰＥＰＲＯＴＥＣＨ社製）及び１５％（ｖ／ｖ）ＦＢＳを含有するＭｃＣｏｙ’ｓ５ａ培地（シグマアルドリッチ社製）を調製した。ＤＳファーマバイオメディカル社推奨プロトコルによって培養したヒト卵巣がん細胞株ＳＫＯＶ３を、本培地に懸濁し６ウェルプレート（コーニング社製、＃３４７１）へ１，０００，０００細胞／３．３ｍＬ／ウェルとなるように播種した。引き続き、ＤＭＳＯに溶解したｋ−１：Ｂ−１を１０μＭの最終濃度となるように細胞懸濁液に添加した。更に３７℃のＣＯ２インキュベーターで６或いは２４時間培養した後、細胞培養液に対して１１ｍＬのリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ、シグマアルドリッチジャパン社製）を添加してから遠心処理（４００Ｇ、３分間）することにより、細胞を沈降させた。上清を除去後、ＰＢＳ１０ｍＬにて細胞を懸濁し、さらなる遠心処理（４００Ｇ、５分間）により細胞のペレットを得た。引き続き、ＲＮＡｅａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社製）を使用して、得られた細胞から全ＲＮＡ（リボ核酸）を単離した。本ＲＮＡについて、ＨｕｍａｎＧｅｎｅ２．０ＳＴ Ａｒｒａｙ（アフィメトリックス社製）を用いたＤＮＡマイクロアレイを実施し、特定化合物の添加によるヒト遺伝子発現の変化を網羅的に解析した（倉敷紡績株式会社の遺伝子解析受託サービスを利用、製品番号；ＧＡ０３１２）。【０４２２】
本解析の結果として、ｋ−１：Ｂ−１添加により発現が上昇した、ＹＡＰにより発現が制御される遺伝子を表１０に示す。表１０の数値は、化合物無添加時の遺伝子発現量を１としたときのｋ−１：Ｂ−１添加時の発現量の倍率を表す。表１０に示される通り、化合物ｋ−１：Ｂ−１は、ＹＡＰ蛋白質により発現が制御される遺伝子に関して、その発現量を上昇させる効果を有することが明らかになった。【０４２３】
【表１０】
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【０４２４】
[実施例７]ＹＡＰ、リン酸化ＹＡＰ、ＴＡＺのタンパク質量に対する特定化合物の作用
２Ｄ培養条件：ＤＳファーマバイオメディカル社推奨プロトコルによって培養したヒト卵巣がん細胞株ＳＫＯＶ３を、１５％（ｖ／ｖ）ＦＢＳを含有するＭｃＣｏｙ’ｓ５ａ培地（シグマアルドリッチ社製）に懸濁し１００ｍｍディッシュ（コーニング社製、＃４３０１６７）へ１，０００，０００細胞／１０ｍＬとなるように播種し、ＣＯ２インキュベーターで２４時間培養した。その後、ＤＭＳＯに溶解したｋ−１：Ｂ−１を１，５，１０μＭの最終濃度となるように培養液に添加した。対照として、未添加のもの及びＤＭＳＯを添加したものを培養した。１時間後に、氷冷したリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ、和光純薬工業社製）で３回洗浄した後、プロテアーゼインヒビターカクテル（ロシュ社製）を含むリパバッファー（和光純薬工業社製）を２５０μＬ添加し、スクレーパーを用いて細胞を溶解させた。溶解液をチューブに移し、超音波を４℃で４５秒間照射した後、４℃で１０分間１５，０００ｒｐｍで遠心分離した。上清を分注し、タンパク質濃度はＢＣＡタンパク質アッセイキット（ＰＩＥＲＣＥ社製）を用いて測定し、続いて溶解物に対してＳＤＳ（ｓｏｄｉｕｍ  ｄｏｄｅｃｙl  ｓｕｌｆａｔｅ）ゲル電気泳動を行った。タンパク質をメンブレン（ＢｉｏＲａｄ社製）に転写し、ブロッキングバッファ中で保管した。その後、ＹＡＰ（ＣＳＴジャパン社製）、リン酸化ＹＡＰ（Ｓｅｒ１２７，ＣＳＴジャパン社製）、ＴＡＺ（ＣＳＴジャパン社製）、及びＧＡＰＤＨ（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ社製）を認識する一次抗体でプローブした。抗ウサギＨＲＰ（ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ  ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ）または抗マウスＨＲＰを連結した二次抗体（ＳｏｕｔｈｅｒｎＢｉｏｔｅｃｈ社製）でインキュベーション後、イムノスターゼータ（和光純薬工業社製）を用いて化学発光検出装置（ＢｉｏＲａｄ社製）にて検出した。【０４２５】
３Ｄ培養条件：特許文献（ＷＯ２０１４／０１７５１３）の方法に従い、０．０１５％（ｗ／ｖ）の脱アシル化ジェランガム（ＫＥＬＣＯＧＥＬ  ＣＧ−ＬＡ、三昌株式会社製）、３０ｎｇ／ｍＬヒトＥＧＦ（ＰＥＰＲＯＴＥＣＨ社製）及び１５％（ｖ／ｖ）ＦＢＳを含有するＭｃＣｏｙ’ｓ５ａ培地（シグマアルドリッチ社製）を調製した。ＤＳファーマバイオメディカル社推奨プロトコルによって培養したヒト卵巣がん細胞株ＳＫＯＶ３を、本培地に懸濁し低接着１００ｍｍディッシュ（コーニング社製、＃３２６２）へ２，０００，０００細胞／１０ｍＬとなるように播種し、ＣＯ２インキュベーターで２４時間培養した。その後、ＤＭＳＯに溶解したｋ−１：Ｂ−１を１，５，１０μＭの最終濃度となるように培養液に添加した。対照として、未添加のもの及びＤＭＳＯを添加したものを培養した。１時間後に、培養液を５０ｍＬチューブに移し、氷冷したリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ、和光純薬工業社製）を４０ｍＬ加えた。４℃で３分間１０，０００ｒｐｍで遠心分離した後、上清を除去した。再度、氷冷したＰＢＳを５０ｍＬ加え、４℃で３分間１０，０００ｒｐｍで遠心分離した後、上清を除去した。氷冷したＰＢＳを１ｍＬ加え、エッペンチューブに移した後、４℃で３分間１５，０００ｒｐｍで遠心分離した後、上清を除去した。再度、氷冷したＰＢＳを１ｍＬ加え、４℃で３分間１５，０００ｒｐｍで遠心分離した後、上清を除去した。この後、プロテアーゼインヒビターカクテル（ロシュ社製）を含むリパバッファー（和光純薬工業社製）を２５０μＬ添加し、ピペッティングにより細胞を溶解させた。その後、超音波を４℃で４５秒間照射した後、４℃で１０分間１５，０００ｒｐｍで遠心分離した。上清を分注し、タンパク質濃度はＢＣＡタンパク質アッセイキット（ＰＩＥＲＣＥ社製）を用いて測定し、続いて溶解物に対してＳＤＳゲル電気泳動を行った。タンパク質をメンブレンに転写し、ブロッキングバッファ中で保管した。その後、ＹＡＰ（ＣＳＴジャパン社製）、リン酸化ＹＡＰ（Ｓｅｒ１２７，ＣＳＴジャパン社製）、ＴＡＺ（ＣＳＴジャパン社製）、及びＧＡＰＤＨ（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ社製）を認識する一次抗体でプローブした。抗ウサギＨＲＰまたは抗マウスＨＲＰを連結した二次抗体（ＳｏｕｔｈｅｒｎＢｉｏｔｅｃｈ社製）でインキュベーション後、イムノスターゼータ（和光純薬工業社製）を用いて化学発光検出装置（ＢｉｏＲａｄ社製）にて検出した。本結果を図１に示す。【０４２６】
本解析の結果として、ｋ−１：Ｂ−１添加により２Ｄ培養並びに３Ｄ培養の両条件においてＹＡＰのリン酸化が抑制されていることが明らかとなった。また、２Ｄ培養並びに３Ｄ培養の両条件においてｋ−１：Ｂ−１添加により細胞内の総ＹＡＰタンパク量並びに総ＴＡＺタンパク量が増加していることが明らかとなった。【０４２７】
[実施例８]マウス肝部分切除モデルにおける肝重量増加に対する特定化合物の作用
マウス肝臓を一部切除した肝部分切除モデルを以下に記述するように作製し、切除直後の肝重量と切除３日後の肝重量を比較することで特定化合物の肝重量増加効果を評価した。【０４２８】
評価サンプル：
０．５ｗ/ｖ％メチルセルロース水溶液（０．５％ＭＣ、富士フイルム和光純薬社製）及びｋ−１：Ｂ−１、ｋ−１：Ｊ−１を評価した。ｋ−１：Ｂ−１及びｋ−１：Ｊ−１は０．５％ＭＣに懸濁し、最終濃度１ｍｇ/ｍＬとなるように調製した。【０４２９】
手順：
マウスはＢＡＬＢ／ｃＡｎＮＣｒｌＣｒｌｊ、５週齢、雄を日本チャールスリバー（株）より購入した。０．５％ＭＣ投与コントロール群は０．５％ＭＣ  １０ｍＬ/ｋｇを腹腔内へ単回投与し、２４時間後に肝臓を全て摘出して肝重量を測定した（ｎ＝５）。また、０．５％ＭＣ投与肝切除群は０．５％ＭＣ  １０ｍＬ/ｋｇを腹腔内へ２４時間ごとに計４回連続投与した。投与２回目の直後にイソフルラン（株式会社インターベット製）麻酔下で開腹し、肝臓の葉の根元を縫合糸を用いて結紮し、結紮した葉の先を切除することで最終的に肝臓の３０％程度を除去した。その後閉腹し、最終投与から２４時間後に肝臓を全て摘出し肝重量を測定した（ｎ＝４）。ｋ−１：Ｂ−１またはｋ−１：Ｊ−１投与−コントロール群はｋ−１：Ｂ−１またはｋ−１：Ｊ−１  １０ｍｇ/ｋｇ、１０ｍＬ/ｋｇを腹腔内へ単回投与し、２４時間後に肝臓を全て摘出して肝重量を測定した（ｎ＝５）。また、ｋ−１：Ｂ−１またはｋ−１：Ｊ−１−肝切除群はｋ−１：Ｂ−１またはｋ−１：Ｊ−１  １０ｍｇ/ｋｇ、１０ｍＬ/ｋｇを腹腔内へ２４時間ごとに計４回連続投与した。投与２回目の直後にイソフルラン麻酔下で開腹し、肝臓の葉の根元を縫合糸を用いて結紮し、結紮した葉の先を切除することで最終的に肝臓の３０％程度を除去した。その後閉腹し、最終投与から２４時間後に肝臓を全て摘出して肝重量を測定した（ｎ＝５）。【０４３０】
本試験の結果として、０．５％ＭＣ、ｋ−１：Ｂ−１またはｋ−１：Ｊ−１を投与した肝部分切除マウスの肝体重比の変化を図２に示す。図２に示される通り、ｋ−１：Ｂ−１及びｋ−１：Ｊ−１は切除後の肝重量の回復を促進する作用を有することが明らかとなった。すなわち、ｋ−１：Ｂ−１及びｋ−１：Ｊ−１は組織損傷の治療効果を有することが明らかとなった。【０４３１】
[実施例９]光学異性体のキナーゼ阻害活性評価
化合物ｋ−１：Ｂ−１（ラセミ体）、ＧＡ−００２Ａ、ＧＡ−００２Ｂ、ＧＡ−００５Ａ及びＧＡ−００５Ｂについて、ＬＡＴＳ１及びＬＡＴＳ２（カルナバイオサイエンス社製）に対する阻害活性評価（ＩＣ５０の算出）を行った。活性測定は、以下に記載したＫｉｎａｓｅ  Ａｓｓａｙ法を用いて行った。ｋ−１：Ｂ−１（ラセミ体）、ＧＡ−００２Ａ、ＧＡ−００２Ｂ、ＧＡ−００５Ａ及びＧＡ−００５Ｂの試験濃度は最終濃度１０μＭから０．３ｎＭの８段階（１０μＭ、１μＭ、１００ｎＭ、３０ｎＭ、１０ｎＭ、３ｎＭ、１ｎＭ、０．３ｎＭ）になるように添加した。【０４３２】
データの解析方法としては評価化合物以外の反応コンポーネントを含むコントロールウェルの平均シグナルを０％阻害、酵素非添加の平均シグナルを１００％阻害とし、各被検物質試験２ウェルの平均シグナルから阻害率を計算した。ＩＣ５０値の算出は、ＥＸＳＵＳ（バージョン７．１．６、ＣＡＣエクシケア社製）を用いて行った。【０４３３】
Ｋｉｎａｓｅ  Ａｓｓａｙ法：
アッセイバッファー(２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、０．０１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ-１００、２ｍＭ ＤＴＴ、５０ｕｇ/ｍＬ ＢＳＡ、ｐＨ７．５)にて調製した２μＬの２．５倍濃度本発明化合物溶液、１μＬの５倍濃度基質（ＳＧＫｔｉｄｅ：ＮＨ２−ＣＫＫＲＮＲＲＬＳＶＡ−ＣＯＯＨ、ＳｉｇｎａｌＣｈｅｍ社製）、ＡＴＰ（シグマアルドリッチ社製）、ＭｇＣｌ２（富士フイルム和光純薬社製）溶液（終濃度は１０μＭ、４００μＭ又は５ｍＭ）及び２μＬの２．５倍濃度キナーゼ溶液（ＬＡＴＳ１又はＬＡＴＳ２の終濃度５μｇ/ｍＬ）をポリプロピレン製３８４ウェルプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ  Ｂｉｏ−Ｏｎｅ社製、♯７８４９００）のウェル内で混合し、室温にて５時間反応させた。続いて５μＬの検出溶液 (Ｆｌｕｏｒｏｓｐａｒｋ（登録商標）Ｋｉｎａｓｅ/ＡＤＰ  Ｍｕｌｔｉ-Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ；富士フイルム和光純薬社製)を添加し、室温にて３０分反応させた。続いて５μLの反応停止液 (Ｆｌｕｏｒｏｓｐａｒｋ（登録商標）Ｋｉｎａｓｅ/ＡＤＰ  Ｍｕｌｔｉ-Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ；富士フイルム和光純薬社製)を添加して反応を停止させた。その後、反応溶液中のＡＤＰ濃度をＥｎＳｐｉｒｅ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ社製）にて定量し、キナーゼ反応を検出した。【０４３４】
本試験の結果として、ｋ−１：Ｂ−１（ラセミ体）、ＧＡ−００２Ａ(左旋性ｋ−１：Ｂ−１、Ｒ体)、ＧＡ−００２Ｂ（右旋性ｋ−１：Ｂ−１、Ｓ体）、ＧＡ−００５Ａ（Ｒ体）及びＧＡ−００５Ｂ（Ｓ体）のＩＣ５０値を第１１表に、阻害率を第１２表に示す。【０４３５】
[第１１表]【０４３６】
【表１１】
2019235569.tif 000114
【０４３７】
[第１２表]【０４３８】
【表１２】
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【０４３９】
第１１表及び第１２表に示される通り、ｋ−１：Ｂ−１（ラセミ体）、ＧＡ−００２Ａ及びＧＡ−００５Ａは、ＬＡＴＳ１及びＬＡＴＳ２に対する高い阻害効果を有することが示された。特に、ＧＡ−００２Ａは、ｋ−１：Ｂ−１（ラセミ体）と比較して、２倍以上ＩＣ５０が減少していた。【０４４０】
［実施例１０］ヒト表皮角化細胞を用いた細胞増殖に対する特定化合物の作用
ヒト初代表皮角化細胞は、＃ＰＣＳ−２００−０１０（ＡＴＣＣ；Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）を、ケラチノサイト用添加物キット（ＡＴＣＣ、＃ＰＣＳ−２００−０４０）を添加した表皮細胞系基礎培地（ＡＴＣＣ、＃ＰＣＳ−２００−０３０）を用いて単層培養法にて前培養した。表皮角化細胞を同培地に懸濁した後、終濃度１０μＭとなるように、ＤＭＳＯに溶解した本発明に用いられる特定化合物をそれぞれ添加し、９６ウェルＵ底細胞低接着プレート（コーニング社、＃４５２０）に１６００ｃｅｌｌｓ／９０μＬ／ウェルとなるように播種した。３７℃、５％  ＣＯ２インキュベーターにて４日間培養した。対照として、ＤＭＳＯを終濃度０．１％となるよう添加した。培養後、ＡＴＰ試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ社、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（登録商標）Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ  Ａｓｓａｙ）を用いて生細胞数を計測した。平底プレートの培養液に対してＡＴＰ試薬を６４μＬ／ウェル添加し懸濁させ、懸濁液１００μＬ／ウェルをアッセイ用白色プレート（コーニング社、＃３９１２）へ移した。１０分間室温で静置した後、プレートリーダー（パーキンエルマー社、ＥｎＳｐｉｒｅ）を用いて発光量を測定した。
測定した発光量について、対照群（ＤＭＳＯ）に対する相対値を算出したところ、下記の化合物を添加することで、発光量が４倍以上増加した。すなわち、下記の化合物の添加により細胞数が４倍以上に増加していた。このことから本発明の化合物は表皮角化細胞の増殖促進効果を有していることが示された。
細胞数が４倍以上に増加した化合物：
ｋ−１：Ｂ−１、ＧＡ−００２Ａ、ｋ−１：Ｊ−１、ｋ−１：Ｈ−１【０４４１】
［実施例１１］ヒト初代表皮角化細胞およびヒト初代角膜上皮細胞の遺伝子発現に対する特定化合物の作用
実施例１０と同様に、ヒト初代表皮角化細胞（ＡＴＣＣ、＃ＰＣＳ−２００−０１０）を、ケラチノサイト用添加物キット（ＡＴＣＣ、＃ＰＣＳ−２００−０４０）を添加した表皮細胞系基礎培地（ＡＴＣＣ、＃ＰＣＳ−２００−０３０）を用いて単層培養法にて前培養した。また、ヒト初代角膜上皮細胞（ＡＴＣＣ、＃ＰＣＳ−７００−０１０）を、角膜上皮細胞系添加物キット（ＡＴＣＣ、＃ＰＣＳ−７００−０４０）を添加した角膜上皮細胞系基礎培地（ＡＴＣＣ、＃ＰＣＳ−７００−０３０）を用いて単層培養法にて前培養した。角膜上皮細胞及び表皮角化細胞を２４ウェル平底プレート（コーニング社、＃３５２６）に１００，０００ｃｅｌｌｓ／３８０μＬ／ウェルとなるように播種し、３７℃、５％  ＣＯ２インキュベーターにて２４時間培養した。続いて、ＤＭＳＯに溶解した本発明に用いられる特定化合物を、終濃度１０μＭとなるように添加した培地に交換し、さらに２４時間培養した。培養後、細胞培養液を除去し、Ｄ−ＰＢＳ（富士フイルム和光純薬株式会社、＃０４９−２９７９３）を５００μＬ／ウェル添加し、除去した。引き続き、ＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社製）を使用して、細胞から全ＲＮＡ（リボ核酸）を単離した。本ＲＮＡについて、ＴａｑｍａｎＡｓｓａｙ（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏＳｙｓｔｅｍｓ社）を用いた遺伝子発現解析を実施し、特定化合物の添加によるＹＡＰおよびＴＡＺ蛋白質下流のヒト遺伝子発現の変化を解析した。解析した遺伝子名と使用したプローブのＡｓｓａｙＩＤを以下に示す。
遺伝子名             ＡｓｓａｙＩＤ            
ＧＡＰＤＨ           Ｈｓ０２７５８９９１＿ｇ１
ＣＹＲ６１           Ｈｓ００１５５４７９＿ｍ１
ＡＮＫＲＤ１         Ｈｓ００１７３３１７＿ｍ１
ＣＣＮＤ１           Ｈｓ００７６５５５３＿ｍ１
得られた発現量について、ＧＡＰＤＨに対する相対値を算出した。その結果、対照群（ＤＭＳＯ）と比較して、特定化合物を添加することにより相対発現量が増加した。すなわち、本発明に用いられる特定化合物は、ＹＡＰ蛋白質により発現が制御される遺伝子に関して、その発現量を上昇させる効果を有することが明らかになった。【０４４２】
ＡＮＫＲＤ相対発現量が５倍以上増加した化合物（表皮角化細胞）：
ｋ−１：Ｂ−１、ＧＡ−００２Ａ、ｋ−１：Ｊ−１、ｋ−１：Ｈ−１
ＡＮＫＲＤ相対発現量が３倍以上増加した化合物（角膜上皮細胞）：
ｋ−１：Ｂ−１、ＧＡ−００２Ａ、ｋ−１：Ｊ−１、ｋ−１：Ｈ−１
ＡＮＫＲＤ相対発現量が５倍以上増加した化合物（角膜上皮細胞）：
ｋ−１：Ｂ−１、ＧＡ−００２Ａ、ｋ−１：Ｊ−１
ＣＣＮＤ１相対発現量が１．５倍以上増加した化合物（表皮角化細胞）：
ｋ−１：Ｂ−１、ＧＡ−００２Ａ、ｋ−１：Ｊ−１、ｋ−１：Ｈ−１
ＣＣＮＤ１相対発現量が１．５倍以上増加した化合物（角膜上皮細胞）：
ｋ−１：Ｂ−１、ＧＡ−００２Ａ、ｋ−１：Ｊ−１、ｋ−１：Ｈ−１
ＣＹＲ６１相対発現量が１．５倍以上増加した化合物（表皮角化細胞）：
ｋ−１：Ｂ−１、ＧＡ−００２Ａ、ｋ−１：Ｊ−１、ｋ−１：Ｈ−１
ＣＹＲ６１相対発現量が２倍以上増加した化合物（角膜上皮細胞）：
ｋ−１：Ｂ−１、ＧＡ−００２Ａ、ｋ−１：Ｊ−１、ｋ−１：Ｈ−１【０４４３】
［実施例１２］ＹＡＰ蛋白質およびＴＡＺ蛋白質の核内移行に対する特定化合物の作用
本発明に用いられる特定化合物について、ＹＡＰ蛋白質およびＴＡＺ蛋白質の核内移行に対する評価を行った。核内移行はヒト卵巣がん細胞株ＳＫＯＶ３（ＤＳファーマバイオメディカル社）を用いて、以下に記載したＯｐｅｒｅｔｔａＣＬＳ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社）を用いたイメージング解析によって行った。本発明に用いられる特定化合物の試験濃度は最終濃度が１０μＭになるように添加した。【０４４４】
イメージング解析：
ＤＳファーマバイオメディカル社推奨プロトコルによって培養したヒト卵巣がん細胞株ＳＫＯＶ３を、シクロオレフィン底面の９６ウェルプレート（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社、ＣｅｌｌＣａｒｒｉｅｒ−Ｕｌｔｒａ）へ１５，０００細胞／９０μＬ／ウェルとなるように播種し、ＣＯ２インキュベーター（３７℃、５％ＣＯ２）内で１日培養した。培養後、ＤＭＳＯに溶解した本発明に用いられる特定化合物の溶液をそれぞれ添加した。更に３７℃のＣＯ２インキュベーターで４時間培養し、培地を４％パラホルムアルデヒドへ交換、室温で１０分間静置することによって、細胞を固定した。固定した細胞に対してＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（Ｒ）６４７標識ＹＡＰ抗体（ＣｅｌｌＳｉｇｎａｌｉｎｇＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社）、抗マウスＴＡＺ（Ｄ−８）抗体（ＳａｎｔａＣｒｕｚ社）、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（Ｒ）５５５標識抗マウスＩｇＧ抗体（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を用いて、ＣｅｌｌＳｉｇｎａｌｉｎｇＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社の推奨プロトコルに従って免疫染色を行い、さらに１０μｇ／ｍＬのＨｏｅｃｈｓｔ３３３４２溶液で細胞核を染色した。
ＯｐｅｒｅｔｔａＣＬＳの２０倍対物レンズを用いて、１ウェルあたり９視野撮像した。得られた蛍光像から解析ソフトＨａｒｍｏｎｙ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社）を用いて、細胞核領域と細胞質領域をそれぞれ同定し、各領域内のＹＡＰ蛋白質−ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（Ｒ）６４７蛍光強度ならびにＴＡＺ蛋白質−ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（Ｒ）５５５蛍光強度を抽出した。さらに抽出した値から細胞質領域の蛍光強度に対する細胞核領域の蛍光強度の比を算出した。今回、蛍光強度比が１．４以上となった場合を、ＹＡＰ蛋白質およびＴＡＺ蛋白質が核内へ移行した細胞集団と定義し、その割合を算出した。
算出した細胞集団の割合について、対照群（ＤＭＳＯ）に対する相対値を算出したところ、下記の化合物を添加することで、ＹＡＰ蛋白質については６倍以上、ＴＡＺ蛋白質については１．５倍以上、細胞集団が増加した。このことから本発明に用いられる特定化合物は、ＹＡＰ蛋白質ならびにＴＡＺ蛋白質の核内移行を促進する作用を有することが明らかになった。【０４４５】
ＹＡＰ蛋白質が核内移行した細胞集団が６倍以上に増加した化合物：
ｋ−１：Ｂ−１、ＧＡ−００２Ａ、ｋ−１：Ｊ−１、ｋ−１：Ｈ−１
ＴＡＺ蛋白質が核内移行した細胞集団が１．５倍以上に増加した化合物：
ｋ−１：Ｂ−１、ＧＡ−００２Ａ、ｋ−１：Ｊ−１、ｋ−１：Ｈ−１【０４４６】
〔実施例１３〕本発明化合物のＹＡＰリン酸化阻害作用
ヒト卵巣癌細胞株ＳＫＯＶ３（ＤＳファーマバイオメディカル社製）を１５％ＦＢＳ含有ＭｃＣｏｙ’ｓ５ａ培地（シグマアルドリッチ社製）にて前培養（単層培養）を行った。対数増殖期にある上記細胞をＰＢＳ洗浄した。接着細胞は、０．２５％（ｗ／ｖ）トリプシン−１ｍｍｏｌ／Ｌエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）溶液（富士フイルム和光純薬社製）を添加して３７℃にて３分間インキュベートして、剥離した。上記培地を添加し、遠心して同培地で再懸濁した。
特許文献（ＷＯ２０１４／０１７５１３）の方法に従い、０．０１５％（ｗ／ｖ）の脱アシル化ジェランガム（ＫＥＬＣＯＧＥＬ  ＣＧ−ＬＡ、三昌株式会社製）を含有する１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ培地（Ｐｈｅｎｏｌ−ｒｅｄ不含、富士フイルム和光純薬社製）の組成物をＦＣｅＭ−ｓｅｒｉｅｓ  Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（富士フイルム和光純薬社製）にて調製した。次いで、上記で調製した各種細胞を上記の脱アシル化ジェランガムを添加した培地組成物（３Ｄ条件）または非添加の培地（２Ｄ条件）に懸濁した後、１０００００ｃｅｌｌｓ／ウェルとなるように、５０μＬ／ウェル（コーニング社製、９６ウェル平底プレート、＃３５８５、２Ｄ条件）または２５μＬ／ウェル（コーニング社製、９６ウェル低接着平底プレート、＃３４７４）へ播種した。３７℃、５％ＣＯ２インキュベーターに静置し、播種から３時間後に終濃度の２倍または６倍濃度にて培地で希釈した本発明化合物、ＤＭＳＯ、または培地のみを５０μＬ／ウェル（２Ｄ条件）、５μＬ／ウェル（３Ｄ条件）でプレートに添加し、各化合物の終濃度を１０μＭとした。さらに１時間、３７℃、５％ＣＯ２インキュベーターで培養後、２Ｄ条件では上清をアスピレートしてｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔｅｄ  Ｌｙｓｉｓ  ｂｕｆｆｅｒ（１倍濃度、シスバイオ社製、ＹＡＰ−ｔｏｔａｌキットまたはＹＡＰ  ｐｈｏｓｐｈｏ−Ｓ１２７キット）５０μＬを添加、３Ｄ条件ではｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔｅｄ  Ｌｙｓｙｓ  ｂｕｆｆｅｒ（４倍濃度）１０μＬを培養上清に添加し、プレートシェイカーで３０分間攪拌した。その後プレートを遠心して、上清１６μＬを３８４ウェル白色プレート（コーニング社、＃４５１２）に移し、キット付属の各抗体溶液（ｐＹＡＰ  ｄ２抗体またはＴｏｔａｌ−ＹＡＰ  ｄ２抗体と、ｐＹＡＰ  Ｃｒｙｐｔａｔｅ抗体またはＴｏｔａｌ−ＹＡＰ  Ｃｒｙｐｔａｔｅ抗体）を計４μＬ／ウェル添加し、室温にて一晩静置した。ブランクコントロールとして、化合物刺激を行わない細胞にｐＹＡＰ  Ｃｒｙｐｔａｔｅ抗体またはＴｏｔａｌ−ＹＡＰ  Ｃｒｙｐｔａｔｅ抗体のみを添加して同様に処理をした（Ｎｏｎ−ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）。翌日、ＥｎＶｉｓｉｏｎ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ社製）のＨＴＲＦモードにて６６５ｎｍ及び６１５ｎｍ波長を測定した。
得られたシグナルを下記のように計算した。Ｒａｔｉｏ＝ｓｉｇｎａｌ（６６５ｎｍ）／ｓｉｇｎａｌ（６１５ｎｍ）×１００００、ΔＲ＝Ｓｉｇｎａｌ（Ｒａｔｉｏ）−Ｂａｃｋｇｒｏｕｎｄ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ、化合物非添加群（Ｎｏｎ−ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）のΔＲを１００％とした相対値を算出し、各化合物のリン酸化ＹＡＰ量または総ＹＡＰ量を評価した。【０４４７】
【表１３】
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【０４４８】
表１３に示される通り、ｋ−１：Ｂ−１、ｋ−１：Ｈ−１、ｋ−１：Ｊ−１、ＧＡ−００２Ａ、およびＧＡ−００５Ａは２Ｄ、３Ｄの両培養条件でＹＡＰリン酸化阻害作用を有することが示された。【０４４９】
［実施例１４］大腸炎モデルマウスにおける炎症抑制効果
デキストラン硫酸ナトリウム（Ｄｅｘｔｒａｎ  ｓｕｌｆａｔｅ  ｓｏｄｉｕｍ（ＤＳＳ）、富士フイルム和光純薬製）を投与した大腸炎モデルを以下に記述するように作製した。また、大腸炎の評価は形態学的パラメータとして大腸の長さが利用されており、炎症の程度に応じて大腸が短小化する。このため大腸の長さを比較することで化合物の炎症抑制効果を評価した。
評価サンプル：
化合物Ｋ−１：Ｊ−１を０．５ｗ／ｖ％メチルセルロース水溶液（０．５％ＭＣ、富士フイルム和光純薬製）に５ｍｇ／ｍＬとなるように調製し、１回あたり５０ｍｇ／ｋｇを腹腔内投与した。陰性対照は０．５％ＭＣを投与した。
手順：
マウスはＣ５７ＢＬ／６ＮＣｒｌ、６週齢、雄を日本チャールスリバー（株）より購入した。飲料水は蒸留水または２．５ｗ／ｖ％ＤＳＳ水溶液を自由飲水させた。ＤＳＳ飲水開始日を１日目とし、８日目まで飲水させた。化合物Ｋ−１：Ｊ−１は５０ｍｇ／ｋｇを１日目から２４時間おきに腹腔内投与した。８日目に解剖して大腸を摘出し、大腸の長さを測定した。各群４例で実施した。
本試験の結果としてマウスの大腸の長さを図３に示す。図３に示される通り、ＤＳＳ飲水群は蒸留水飲水群と比較して大腸が短くなったが、ＤＳＳ飲水−化合物Ｋ−１：Ｊ−１投与群はＤＳＳ飲水−０．５％ＭＣ投与群より大腸の短小化が抑制された。以上のことから化合物Ｋ−１：Ｊ−１はＤＳＳ由来の大腸炎の発症を抑制する効果を有することが明らかとなった。【０４５０】
［実施例１５］マウス皮膚全層欠損創モデルにおける創傷治癒促進効果
マウス背部の皮膚を一部除去した皮膚全層欠損創を以下に記述するように作製し、創面積の縮小率を比較することで化合物の創傷治癒促進効果を評価した。
評価サンプル：
化合物Ｋ−１：Ｊ−１を１ｍｇ／ｍＬの濃度で溶媒（１０％  Ｐｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ−６８、２％  Ｐｒｏｐｙｌｅｎｅ  Ｇｌｙｃｏｌ、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ８．５））に溶解させ、創部に滴下投与（創傷部位１か所あたり０．０４ｍＬ）した。陰性対照は溶媒のみを滴下投与した。
手順：
マウスはＢＫＳ．Ｃｇ−Ｄｏｃｋ７ｍ＋／＋Ｌｅｐｒｄｂ／Ｊ、７週齢、雄を日本チャールスリバー（株）より購入した。背部を除毛後、生検トレパン（貝印株式会社）を用いて８ｍｍの全層皮膚欠損創を作製し、被覆材（テガダームトランスペアレントドレッシング、スリーエム）で保護した。創作製日を１日目とし、１ｍｇ／ｍＬの化合物Ｋ−１：Ｊ−１を創傷部位１か所あたり０．０４ｍＬの投与量で、２４時間おきに１２日目まで滴下した。１、３、６、９、１３日目に創部の面積を測定した。１日目の創面積を１００％とし、測定した総面積を創作製日に対する１００分率（％）で算出した。各群６例で実施した。
本試験の結果として、全創皮膚欠損創作製マウスの創面積の変化を図４に示す。また、創面積比の経時変化の結果から算出した創面積比下面積（Ａｒｅａ  Ｕｎｄｅｒ  ｔｈｅ  Ｃｕｒｖｅ（ＡＵＣ）、％×日）は、陰性対照で８５４．２±１１９．２、Ｋ−１：Ｊ−１投与群で６５９．６±１６３．７となった。図４とＡＵＣの値に示される通り、化合物Ｋ−１：Ｊ−１は創傷治癒促進効果を有することが明らかとなった。
【産業上の利用可能性】
【０４５１】
本発明によれば、Ｈｉｐｐｏシグナル伝達経路の主要キナーゼであるＬＡＴＳ（特にＬＡＴＳ２）を含む、複数のキナーゼを阻害することができる。また、細胞増殖の不全を伴う疾患または組織損傷の治療することができる。従って、本発明は、例えば、Ｈｉｐｐｏシグナル伝達経路が関与する細胞機能や疾病等の研究分野において有益である。さらに、かかる疾病等を治療する医療分野において有益である。【０４５２】
本出願は、日本で出願された特願２０１８−１１０７４８（出願日：２０１８年６月８日）及び特願２０１９−０１４８９８（出願日：２０１９年１月３０日）を基礎としておりその内容は本明細書に全て包含されるものである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【国際調査報告】
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