(57)【要約】  本発明は、TMEM5、VSTM2L、C2CD4D、VSTM2A、LY6G6C及びADRA2Cよりなる群から選択される少なくとも１の分子の発現を抑制する又は活性を阻害する物質を有効成分として含有する、進行性多発性硬化症、胃腸炎、心筋障害及び突然死よりなる群から選択される少なくとも１の疾患又は症状を予防及び／又は治療するための医薬に関する。また、本発明は、前記分子の発現又は活性を指標とした、進行性多発性硬化症、胃腸炎、心筋障害及び突然死よりなる群から選択される少なくとも１の疾患又は症状を予防及び／又は治療し得る物質をスクリーニングする方法に関する。
2020045683.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
Transmembrane Protein 5（TMEM5）、V-Set And Transmembrane Domain Containing 2 Like（VSTM2L）、C2 Calcium Dependent Domain Containing 4D（C2CD4D）及びV-Set And Transmembrane Domain Containing 2A（VSTM2A）よりなる群から選択される少なくとも１の分子の発現を抑制する又は活性を阻害する物質であって、核酸、抗体及び抗体誘導体よりなる群から選択される少なくとも１つである前記物質を有効成分として含有する、進行性多発性硬化症、胃腸炎、心筋障害及び突然死よりなる群から選択される少なくとも１の疾患又は症状を予防及び／又は治療するための医薬。
【請求項２】
lymphocyte antigen 6 family member G6C（LY6G6C）及びα2Cアドレナリン受容体（ADRA2C）よりなる群から選択される少なくとも１の分子の発現を抑制する核酸を有効成分として含有する、進行性多発性硬化症、胃腸炎、心筋障害及び突然死よりなる群から選択される少なくとも１の疾患又は症状を予防及び／又は治療するための医薬。
【請求項３】
疾患又は症状が、ストレス負荷に起因する疾患又は症状である、請求項１又は２に記載の医薬。
【請求項４】
(i) TMEM5、VSTM2L、C2CD4D、VSTM2A、LY6G6C及びADRA2Cよりなる群から選択される少なくとも１の分子を発現する細胞又は動物における、被験物質の存在下及び非存在下での前記分子の発現量又は活性を測定する工程、並びに
(ii) 被験物質存在下での前記分子の発現量又は活性が被験物質非存在下での前記分子の発現量又は活性と比べて少ない又は弱い場合に、被験物質は前記分子の発現を抑制する又は活性を阻害する能力を有すると判定する工程
を含む、進行性多発性硬化症、胃腸炎、心筋障害及び突然死よりなる群から選択される少なくとも１の疾患又は症状を予防及び／又は治療し得る物質をスクリーニングする方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、進行性多発性硬化症、胃腸炎、心筋障害又は突然死といったストレス負荷が関与する疾患又は症状を予防及び／又は治療するための医薬、並びにスクリーニング方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
騒音、寒冷、薬物、細菌感染、さらには人間関係や業務上の責任等の様々な外的な因子は一般にストレスと呼ばれ、非特異的な変調を人体に引き起こすことが、経験的にも知られている。例えば、ストレスは心身の恒常性維持機能を損なわせ、喘息、円形脱毛症、頻尿、耳鳴り、めまい等の比較的軽度の疾患又は症状をもたらし得る。【０００３】
またストレスは、さらにうつ病、パニック障害、不安障害等の神経症、消化管の潰瘍、過敏性腸症候群、虚血性心疾患等の重度な疾患又は症状を、ときに生命を直接的に脅かす症状、例えば突然死を誘発することもあり得る。突然死は、発症から24時間以内に死亡する自然死であり、心疾患に起因する心臓突然死がその代表例である。【０００４】
ストレスに起因する各種疾患に対する有効な予防法又は治療法を探るべく、ストレスと各種疾患又は症状との関連性に関する医学的研究が進められている。例えば、ストレスは、脳腸相関を介して胃腸疾患を引き起こすことが知られている。モデル動物を利用した研究によって、神経構成要素間の相互作用、例えば、自律神経系、中枢神経系や、視床下部−脳下垂体−副腎系及び副腎皮質刺激ホルモン放出因子系等のストレス系、並びに腸管バリア、管腔の微生物叢及び腸管免疫応答等の腸管因子に、脳腸相関が関与することが報告されている（非特許文献１）。【０００５】
また、ストレスと各種疾患又は症状との関連性に関する分子生物学的な研究により、ストレスに対する生体反応に、コルチコトロピン放出ホルモン（CRH）を代表とするストレスホルモン、ノルアドレナリン、セロトニン、ドーパミン等の神経伝達物質、その他様々な神経ペプチド等が関与していることも解明されつつある。【０００６】
本発明者らは、多発性硬化症の動物モデル（実験的自己免疫性脳脊髄炎、EAEモデル）を使用して、痛み刺激から多発性硬化症の症状発症に至るまでの過程を研究した結果、痛みによる感覚神経の活性化、交感神経の活性化、第５腰髄腹側血管への免疫細胞の浸潤、及び当該浸潤による炎症回路の活性化というステップ（ゲートウェイ反射）を経て多発性硬化症の症状が発症することを見出した（非特許文献２）。この研究成果は、痛みを起点とする神経ネットワークの抑制、例えば鎮痛薬の投与が、痛みの除去に留まらず多発性硬化症の再発を防ぐ新たな手段になるという可能性を提唱するものである。【０００７】
さらに本発明者らは、慢性的なストレスを受けた後のマウスに中枢神経組織由来抗原反応性のCD4陽性T細胞を移入することで脳内の特定の血管に微小な炎症が誘導されるという新たなゲートウェイ反射を見出し、このゲートウェイ反射が多発性硬化症、胃腸炎、心筋障害又は突然死といった様々な疾患又は症状を誘導する可能性を報告した（非特許文献３）。このゲートウェイ反射の遮断は、上記の様々な疾患又は症状の予防及び治療のための新たなアプローチとして注目されている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Caso, J.R. et al., Current molecular medicine, 2008, Vol.8, pp.299-312
【非特許文献２】Arima, Y. et al., eLife, 2015, 4: e08733
【非特許文献３】Arima, Y. et al., eLife, 2017, 6: e25517
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、ストレス負荷、特に慢性的なストレス負荷が関与する疾患又は症状を予防及び／又は治療するための新たな医薬を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、ストレス負荷により生じる脳内の特定血管の炎症が上記疾患又は症状を誘導する現象について研究を進め、当該血管においてTransmembrane Protein 5（TMEM5）、V-Set And Transmembrane Domain Containing 2 Like（VSTM2L）、C2 Calcium Dependent Domain Containing 4D（C2CD4D）、V-Set And Transmembrane Domain Containing 2A（VSTM2A）、lymphocyte antigen 6 family member G6C（LY6G6C）及びAdrenoceptor Alpha 2C（α2Cアドレナリン受容体、ADRA2C）の発現が亢進することを見出し、以下の発明を完成させた。【００１１】
（１）TMEM5、VSTM2L、C2CD4D及びVSTM2Aよりなる群から選択される少なくとも１の分子の発現を抑制する又は活性を阻害する物質であって、核酸、抗体及び抗体誘導体よりなる群から選択される少なくとも１つである前記物質を有効成分として含有する、進行性多発性硬化症、胃腸炎、心筋障害及び突然死よりなる群から選択される少なくとも１の疾患又は症状を予防及び／又は治療するための医薬。
（２）LY6G6C及びADRA2Cよりなる群から選択される少なくとも１の分子の発現を抑制する核酸を有効成分として含有する、進行性多発性硬化症、胃腸炎、心筋障害及び突然死よりなる群から選択される少なくとも１の疾患又は症状を予防及び／又は治療するための医薬。
（３）疾患又は症状が、ストレス負荷に起因する疾患又は症状である、（１）又は（２）に記載の医薬。
（４）(i) TMEM5、VSTM2L、C2CD4D、VSTM2A、LY6G6C及びADRA2Cよりなる群から選択される少なくとも１の分子を発現する細胞又は動物における、被験物質の存在下及び非存在下での前記分子の発現量又は活性を測定する工程；並びに(ii) 被験物質存在下での前記分子の発現量又は活性が被験物質非存在下での前記分子の発現量又は活性と比べて少ない又は弱い場合に、被験物質は前記分子の発現を抑制する又は活性を阻害する能力を有すると判定する工程を含む、進行性多発性硬化症、胃腸炎、心筋障害及び突然死よりなる群から選択される少なくとも１の疾患又は症状を予防及び／又は治療し得る物質をスクリーニングする方法。
【発明の効果】
【００１２】
本発明の医薬によると、進行性多発性硬化症、胃腸炎、心筋障害及び突然死よりなる群から選択される少なくとも１の疾患又は症状を予防及び／又は治療することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】睡眠障害を誘導したマウス（SD）の特定血管におけるTMEM5、VSTM2L、C2CD4D及びVSTM2Aの遺伝子発現量を示すグラフである。
【図２】睡眠障害を誘導したマウス（SD）の特定血管におけるLY6G6C及びADRA2Cの遺伝子発現量を示すグラフである。
【図３】睡眠障害を誘導した後、EAE病原性CD4陽性T細胞を移入したマウスに抗TMEM5抗体、抗VSTM2L抗体、抗C2CD4D抗体又は抗VSTM2A抗体をマイクロインジェクションした際の病態を示すグラフである。図３Ａは抗TMEM5抗体又は抗VSTM2L抗体を投与したマウスのEAE臨床スコアの経時変化を、図３Ｂは抗C2CD4D抗体又は抗VSTM2A抗体を投与したマウスのEAE臨床スコアの経時変化を示す。
【図４】睡眠障害を誘導した後、EAE病原性CD4陽性T細胞を移入したマウスに抗LY6G6C抗体又は抗ADRA2C抗体をマイクロインジェクションした際の病態を示すグラフである。図４Ａは抗LY6G6C抗体を投与したマウスのEAE臨床スコアの経時変化を、図４Ｂは抗ADRA2C抗体を投与したマウスのEAE臨床スコアの経時変化を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
疾患又は症状の予防及び／又は治療のための医薬
本発明の第一の態様は、TMEM5、VSTM2L、C2CD4D、VSTM2A、LY6G6C及びADRA2Cよりなる群から選択される少なくとも１の分子の発現を抑制する又は活性を阻害する物質を有効成分として含有する、進行性多発性硬化症、胃腸炎、心筋障害及び突然死よりなる群から選択される少なくとも１の疾患又は症状を予防及び／又は治療するための医薬に関する。
【００１５】
好ましい実施形態において、本発明は、TMEM5、VSTM2L、C2CD4D及びVSTM2Aよりなる群から選択される少なくとも１の分子の発現を抑制する又は活性を阻害する物質を有効成分として含有する、進行性多発性硬化症、胃腸炎、心筋障害及び突然死よりなる群から選択される少なくとも１の疾患又は症状を予防及び／又は治療するための医薬を提供する。
【００１６】
また、別の好ましい実施形態において、本発明は、LY6G6C及びADRA2Cよりなる群から選択される少なくとも１の分子の発現を抑制する核酸を有効成分として含有する、進行性多発性硬化症、胃腸炎、心筋障害及び突然死よりなる群から選択される少なくとも１の疾患又は症状を予防及び／又は治療するための医薬を提供する。
【００１７】
本発明者らは、ストレス負荷により生じる脳内の特定血管の炎症が上記疾患又は症状を誘導する現象について研究を進め、以下の作用機序を見出した。ストレスを受けてストレス状態に陥った生体は、その視床下部室傍核（PVN）において交感神経が活性化され、第三脳室、視床及び歯状回の境界領域に存在する血管からノルアドレナリンが分泌される。次いで、前記血管においてCCL5等の産生が亢進し、CD11b陽性MHCクラスII高発現細胞及びCD4陽性T細胞が集積し、炎症性サイトカインの産生や増強が亢進することで、炎症が誘発される。この血管の炎症はATPを介して背内側核（DMH）の神経を活性化し、これがさらに迷走神経背側核（DMX）及び孤束核（NTS）の迷走神経の活性化を介して、進行性多発性硬化症、胃腸炎、心筋障害及び突然死といった各種病態を誘発する（PCT/JP2018/007901及びArima, Y. et al., eLife, 2017, 6: e25517を参照されたい；これらの文献は参照によりその全体が本明細書中に組み入れられる）。
【００１８】
後述の実施例に示すように、本発明者らはさらに、ストレス負荷により第三脳室、視床及び歯状回の境界領域に存在する特定血管においてTMEM5、VSTM2L、C2CD4D、VSTM2A、LY6G6C及びADRA2Cの発現が亢進すること、これらに対する抗体を前記血管に投与することで疾患モデル動物の病態の発生又は進行が抑制されることを見出した。理論に拘束されるものではないが、これらの抗体は、前記血管への直接投与により作用を発揮することから、ストレス負荷から特定血管の炎症誘発を介して病態発生に至る一連の反応の中でも特定血管において起こる反応を阻害しているものと推測される。
【００１９】
以上の機序に基づくと、TMEM5、VSTM2L、C2CD4D、VSTM2A、LY6G6C又はADRA2Cの機能阻害は、疾患モデル動物が呈する様々な疾患又は症状に対して予防的及び／又は治療的に働くと考えられ、したがって、このような機能阻害をもたらす物質及び方法は、ストレス負荷が関与する疾患、特にストレス負荷に起因する進行性多発性硬化症、胃腸炎、心筋障害及び突然死の予防及び／又は治療に有効であるものと期待される。
【００２０】
また、上記の作用機序によって誘発される様々な疾患又は症状は相互に関係しており、一の疾患又は症状の予防及び／又は治療は、他の疾患又は症状の予防及び／又は治療に寄与することも明らかにされた（PCT/JP2018/007901及びArima, Y. et al., eLife, 2017, 6: e25517）。したがって、脳内血管に炎症を有する対象において進行性多発性硬化症、胃腸炎、心筋障害及び突然死よりなる群から選択される少なくとも１の疾患又は症状を予防及び／又は治療する物質又は方法は、前記群に含まれる他の疾患又は症状の予防及び／又は治療にも有効であることが期待される。
【００２１】
医薬の有効成分
本発明の医薬は、TMEM5、VSTM2L、C2CD4D、VSTM2A、LY6G6C及びADRA2Cよりなる群から選択される少なくとも１の分子の発現を抑制する又は活性を阻害する物質を有効成分として含有する。ここで「有効成分として含有する」とは、有効量のかかる物質又はこれを含む組み合わせを含有することを意味する。有効量は、前記物質の種類、用法、対象の年齢、性別、体重、疾患又は症状の種類又はその重症度その他の条件等に応じて当業者により適宜決定される。
【００２２】
TMEM5（Transmembrane Protein 5；別名Ribitol Xylosyltransferase 1）は、グリコシルトランスフェラーゼと推測されるII型膜貫通タンパク質である。ヒトTMEM5の遺伝子の塩基配列はGenBankにXM_005268562.3, XM_017018686.1, XM_017018687.1, XM_005268563.3として、アミノ酸配列はGenBankにXP_005268619.1, XP_016874175.1, XP_016874176.1, XP_005268620.1として登録されている。
【００２３】
VSTM2L（V-Set And Transmembrane Domain Containing 2 Like；別名C20orf102）は、神経保護ペプチドであるヒューマニンの作用を調節する分泌性アンタゴニストとして知られている。ヒトVSTM2Lの遺伝子の塩基配列はGenBankにNM_080607.2として、アミノ酸配列はGenBankにNP_542174.1として登録されている。
【００２４】
C2CD4D（C2 Calcium Dependent Domain Containing 4D）は、機能未知のタンパク質である。ヒトC2CD4Dの遺伝子の塩基配列はGenBankにNM_001136003.1として、アミノ酸配列はGenBankにNP_001129475.1として登録されている。
【００２５】
VSTM2A（V-Set And Transmembrane Domain Containing 2A）は、前駆脂肪細胞において分泌されるタンパク質であり、その分化の初期段階において機能することが知られている。ヒトVSTM2Aの遺伝子の塩基配列はGenBankにNM_001301009.1, NM_001317843.1, NM_182546.3として、アミノ酸配列はGenBankにNP_001287938.1, NP_001304772.1, NP_872352.2として登録されている。
【００２６】
LY6G6C（lymphocyte antigen 6 family member G6C）は、第6染色体の主要組織適合性複合体（MHC）クラスIII領域に位置する白血球抗原-6（LY6）ファミリーのメンバーである。ヒトLY6G6Cの遺伝子の塩基配列はGenBankにNM_025261.2として、アミノ酸配列はGenBankにNP_079537.1として登録されている。
【００２７】
ADRA2C（α2Cアドレナリン受容体、Adrenoceptor Alpha 2C）は、Gタンパク質共役受容体スーパーファミリーのメンバーであるアルファ-2-アドレナリン受容体サブタイプの1つである。ヒトADRA2Cの遺伝子の塩基配列はGenBankにNM_000683.3として、アミノ酸配列はGenBankにNP_000674.2として登録されている。
【００２８】
TMEM5、VSTM2L、C2CD4D、VSTM2A、LY6G6C及びADRA2Cよりなる群から選択される少なくとも１の分子（「ターゲット分子」とも呼ぶ）の発現を抑制する物質としては、これらの分子をコードする遺伝子からのmRNA転写を抑制することができる物質、当該mRNAを分解することができる物質及び当該mRNAからのタンパク質翻訳を抑制することのできる物質を挙げることができる。これらの物質の典型例は、これらの分子をコードする遺伝子及びタンパク質に翻訳されるmRNAの塩基配列を基にして、当業者が設計、作製することができるアンチセンスRNA又はsiRNA等の阻害性核酸である。市販されている阻害性核酸の例としては、TMEM5についてSMARTpool: Accell TMEM5 siRNA (E-020635-00) を、VSTM2LについてSMARTpool: Accell VSTM2L siRNA (E-015237-00) を、C2CD4DについてSMARTpool: Accell C2CD4D siRNA (SMARTpool: Accell C2CD4D siRNA) を、VSTM2AについてSMARTpool: Accell VSTM2A siRNA (E-018827-01) を、LY6G6CについてSMARTpool: Accell LY6G6C siRNA (E-014622-00） を、ADRA2CについてSMARTpool: Accell ADRA2C siRNA (E-005424-00)（いずれもDharmacon社）を挙げることができる。上記製品はそれぞれのターゲットに対するsiRNAを4種類含むものであるが、本発明においては4種類のsiRNAのうちの1種を、又は複数種を組み合わせて用いることができる。
【００２９】
また、siRNAの塩基配列を含むshRNA、適当な発現プロモーターの支配下に置かれることで上記アンチセンスRNA又はsiRNA等を転写誘導することのできるDNA、及び上記アンチセンスRNA又はsiRNA等の塩基配列の一部が修飾されてヌクレアーゼによる分解に対する安定性が高められたRNAも、上記アンチセンスRNA又はsiRNAと機能的に等価な核酸として、本発明にいう発現を抑制する物質に包含される。ヌクレアーゼによる分解に対する安定性を向上させるための修飾としては、2'O-メチル化、2'-F化、4'-チオ化等を挙げることができる。
【００３０】
さらに、上記RNAのリボヌクレオチドの一部が、対応するデオキシリボヌクレオチド又はヌクレオチド類似体に置き換えられたキメラRNAもまた、本発明にいう発現を抑制する物質に包含される。ヌクレオチド類似体としては、例えば、5位修飾ウリジン又はシチジン、例えば5-（2-アミノ）プロピルウリジン、5-ブロモウリジン等；8位修飾アデノシン又はグアノシン、例えば8-ブロモグアノシン等；デアザヌクレオチド、例えば7-デアザ-アデノシン等；O-又はN-アルキル化ヌクレオチド、例えばN6-メチルアデノシン等を挙げることができる。
【００３１】
上記阻害性核酸において修飾される又は置換される塩基の種類又は個数は、ターゲット分子の発現を抑制する能力を失わない限り、特に制限は無い。
【００３２】
上記阻害性核酸は、遺伝子組み換え技術又は化学合成技術を利用して人工的に合成することができる。遺伝子組み換え方法、核酸の化学合成方法、また非天然型の塩基の合成手法又はこれを含む核酸の合成手法としては、当業者に周知である手法を採用することができる。またいわゆるDNAシンセサイザー等の機器を用いることで、核酸を合成してもよい。
【００３３】
TMEM5、VSTM2L、C2CD4D、VSTM2A、LY6G6C及びADRA2Cよりなる群から選択される少なくとも１の分子の活性を阻害する物質としては、これらの分子に結合してその活性を阻害する低分子化合物、又はこれらの分子に特異的に結合する中和抗体若しくは抗体誘導体を挙げることができる。上記抗体は、モノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体若しくはヒト抗体であり得て、また抗体誘導体は、上記抗体に由来するFab、Fab’、F(ab’)2、scFv若しくはF(ab’)2等の抗体断片、ダイアボディ（diabody）、dsFv、CDRを含むペプチド等であり得る。
【００３４】
抗体は、好ましくは遺伝子組換え手法で作製されたターゲット分子を抗原として、ウサギ、マウス、ラット等の適当な実験動物を免疫することを含む一般的な抗体作製方法によって調製することができる。あるいは、市販されている抗体、例えばウサギ抗TMEM5抗体（Novus (NB110-40445), Anti-TMEM5, rabbit Poly）、マウス抗VSTM2L抗体（Santa Cruz Biotechnology (SC-376538) Anti VSTM2L(A-4), monoclonal IgG1）、ウサギ抗C2CD4D抗体（Bioss (bs-15144R), Anti-C2CD4D Polyclonal Antibody）、ウサギ抗VSTM2A抗体（Thermo Fisher (PA5-48140), VSTM2A Polyclonal Antibody）、ラット抗Ly6G6C抗体（clone;NIMP-R14, monoclonal IgG2b（NOVUS BIOLOGICALS））、ラット抗Ly6C6G抗体（LS-C663018, polyclonal, LifeSpan BioSciences)、ウサギ抗alpha 2c Adrenergic Receptor抗体（polyclonal, GeneTex）等を使用してもよく、又はこれらの抗体のCDR配列と同じアミノ酸配列をCDR配列として含む抗体を使用してもよい。
【００３５】
本発明の医薬は、上記核酸、抗体又は抗体誘導体以外の、ターゲット分子の発現を抑制する又は活性を阻害することのできる物質を含んでもよい。そのような物質は、ターゲット分子又はこれを発現する適当な細胞又は動物を用いた発現抑制能又は活性阻害能のスクリーニングを通じて探索することができる。
【００３６】
スクリーニング方法
本発明の別の態様は、(i) TMEM5、VSTM2L、C2CD4D、VSTM2A、LY6G6C及びADRA2Cよりなる群から選択される少なくとも１の分子を発現する細胞又は動物における、被験物質の存在下及び非存在下での前記分子の発現量又は活性を測定する工程；(ii)被験物質存在下での前記分子の発現量又は活性が被験物質非存在下での前記分子の発現量又は活性と比べて少ない又は弱い場合に、被験物質は前記分子の発現を抑制する又は活性を阻害する能力を有すると、すなわち被験物質はストレス負荷、特に慢性ストレス負荷に起因する疾患又は症状、典型的には進行性多発性硬化症、胃腸炎、心筋障害及び突然死よりなる群から選択される少なくとも１の疾患又は症状を予防及び／又は治療し得ると判定する工程を含む、前記分子の発現を抑制又は活性を阻害することができる物質、すなわちストレス負荷、特に慢性ストレス負荷に起因する疾患又は症状、典型的には進行性多発性硬化症、胃腸炎、心筋障害及び突然死よりなる群から選択される少なくとも１の疾患又は症状を予防及び／又は治療し得る物質をスクリーニングする方法に関する。
【００３７】
工程(i) において用いられる、TMEM5、VSTM2L、C2CD4D、VSTM2A、LY6G6C及びADRA2Cよりなる群から選択される少なくとも１の分子を発現する細胞又は動物は、天然に存在するものであっても、前記分子を発現するように組換えられたものであってもよい。これらの１つの例は、前記分子をコードする遺伝子を組み込んで前記分子を強制発現させた細胞である。また、別の例は、PCT/JP2018/007901及びArima, Y. et al., eLife, 2017, 6: e25517に記載される、ストレス状態にある非ヒト動物の体内に中枢神経組織由来抗原反応性のCD4陽性T細胞を存在させることにより作製される、第三脳室と視床と歯状回との境界領域の血管に炎症を有する疾患モデル非ヒト動物である。
【００３８】
工程(i) におけるTMEM5、VSTM2L、C2CD4D、VSTM2A、LY6G6C及びADRA2Cよりなる群から選択される少なくとも１の分子の発現量又は活性の測定は、被験物質を含む培養液や緩衝液等の生理的に許容される液体中に置いた後の前記分子を発現する細胞を用いて行うことができる。また、前記分子の発現量又は活性の測定は、被験物質を投与した後の前記分子を発現する動物から第三脳室と視床と歯状回との境界領域の血管周辺の組織を回収し、これを用いて行うこともできる。
【００３９】
TMEM5、VSTM2L、C2CD4D、VSTM2A、LY6G6C及びADRA2Cよりなる群から選択される少なくとも１の分子の発現量は、前記分子のタンパク質発現量又は前記分子をコードするmRNAの発現量であり、これらはアミノ酸配列又は塩基配列が公知であるタンパク質又は遺伝子の発現を確認することが可能な、当業者に公知の各種方法を採用して測定することができる。
【００４０】
前記分子のタンパク質発現量の測定は、これらに特異的な抗体を用いて、直接競合法、間接競合法、サンドイッチ法等のELISA法、RIA法、インサイツハイブリダイゼーション、イムノブロット解析、ウエスタンブロット解析、及び組織アレイ解析等の周知の方法によって行うことができる。
【００４１】
前記分子をコードするmRNA発現量の測定は、mRNAの塩基配列を基に設計される適当な塩基配列からなるプライマー核酸を用いたPCR法、mRNAの塩基配列又はこれに相補的なDNA若しくはRNA（cDNA若しくはcRNA）にストリンジェントな条件下でハイブリダイズし得る塩基配列からなるプローブ核酸を用いたハイブリダイゼーション法、mRNAの塩基配列にハイブリダイズし得る塩基配列からなるプローブ核酸が固定化されたチップを用いたマイクロアレイ法、RNAシーケンシング法その他の、mRNAの発現を検出することができる公知の方法により行うことができる。
【００４２】
TMEM5、VSTM2L、C2CD4D、VSTM2A、LY6G6C及びADRA2Cよりなる群から選択される少なくとも１の分子の活性は、個々の分子が有する生理機能に応じた系を用いて測定することができる。活性は、例えば前記分子が酵素であれば酵素反応により生じる基質の量的又は質的な変化を指標として、また前記分子が受容体又はリガンドであれば当該リガンド−受容体の相互作用により生じるシグナル伝達の下流に存在するタンパク質の量的又は質的な変化を指標として、測定することができる。
【００４３】
医薬製剤
本発明の医薬は、上記の有効成分に加えて、有効成分以外の薬物又は緩衝剤、抗酸化剤、保存剤、タンパク質、親水性ポリマー、アミノ酸、キレート化剤、非イオン性界面活性剤、賦形剤、安定化剤、担体等の薬学的に許容される成分と医薬組成物を形成し又は製剤化して、使用することができる。かかる医薬組成物もまた本発明にいう医薬に包含される。薬学的に許容される成分は当業者において周知であり、当業者が通常の実施能力の範囲内で、例えば第十七改正日本薬局方その他の規格書に記載された成分から製剤の形態に応じて適宜選択して使用することができる。
【００４４】
本発明の医薬の剤形は任意であり、標的部位や疾患又は症状の種類等に応じて適宜選択することができる。剤形は、一般に非経口製剤であることが好ましく、例えば注射剤、経皮剤、経腸剤、点滴剤等であることができる。また本発明の医薬の投与経路は、特に制限されないが、非経口製剤である場合は、例えば血管内投与（好ましくは静脈内投与）、腹腔内投与、腸管内投与、皮下投与、標的部位への局所投与等を挙げることができる。好ましい実施形態の一つにおいて、本発明の医薬は、静脈内投与又は局所投与により生体に投与される。
【００４５】
本発明の医薬の投与量は、用法、対象の年齢、性別、体重、疾患又は症状の種類又はその重症度その他の条件等に応じて当業者により適宜選択される。また、本発明の医薬は、進行性多発性硬化症、胃腸炎、心筋障害又は突然死の予防及び／又は治療に有益なその他の医薬と組み合わせて使用してもよい。
【００４６】
医薬の使用
本発明の医薬は、ストレス負荷、特に慢性ストレス負荷に起因する疾患又は症状の予防及び／又は治療に有用であり、典型的には進行性多発性硬化症、胃腸炎、心筋障害及び突然死よりなる群から選択される少なくとも１の疾患又は症状の予防及び／又は治療に用いることができる。これらの疾患又は症状は、ストレス状態を経験した又はストレス状態にある対象が罹患若しくは発症する又はそのおそれのある疾患又は症状と表すこともできる。
【００４７】
医学用語としての「ストレス」は、体外から加えられた有害因子（ストレス作因、ストレッサー）とそれによって生じた防御反応の両方を指す語であるが（南山堂医学大辞典第１９版）、本明細書においては前者の有害因子をストレスと、有害因子に曝露されることをストレスを受ける又はストレス負荷を受けると呼び、また後者の防御反応をストレス反応と呼ぶ。有害因子としてのストレスとしては、物理的ストレス（寒冷、騒音、放射線等）、化学的ストレス（酸素、薬物等）、生物的ストレス（炎症、感染等）、心理的ストレス（怒り、不安等）が挙げられるが、一般にヒトにおいては心理的ストレスが健康に悪影響を及ぼすものとして問題視されている。
【００４８】
いわゆるストレス学説によると、ストレス反応は、生体がストレスから自身を防御するために起こす適応症候群と呼ばれる一連の反応であり、ストレスを受けてからストレスに対する適応反応を起こすまでの警告反応期、適応反応によりストレスに対する抵抗力を発揮する抵抗期、及び長期にわたるストレス負荷により抵抗力を失っていく疲憊期の３期に分けられる。本明細書においては、かかるストレス反応のいずれかの期にある状態を、ストレス状態にあるという。
【００４９】
対象におけるストレス状態は、ストレス反応の有無を検出することにより、例えばストレスに応答して分泌が亢進することが知られているコルチゾール、アルドステロン、アンドロゲン等の副腎皮質ホルモンの血中濃度を測定することにより確認することができる。また、本発明者らは、ストレスが第三脳室と視床と歯状回との境界領域に存在する血管周辺組織におけるCCL5の発現を増加させ、また室傍核（PVN)における交感神経の活性化を引き起こすことを明らかにしている（PCT/JP2018/007901及びArima, Y. et al., eLife, 2017, 6: e25517）。したがって、前記血管周辺組織におけるCCL5の発現量の増加、PVNにおける交感神経活性化に伴うcfosやCREBのリン酸化の亢進もまた、ストレス状態にあることを確認するための指標として利用することができる。
【００５０】
上述の通り、ストレス負荷、特に慢性ストレス負荷は、対象のストレス反応を長期にわたって持続させ、その結果として対象の脳内血管、特に第三脳室と視床と歯状回との境界領域の血管に炎症を誘発し、ひいては進行性多発性硬化症、胃腸炎、心筋障害及び突然死といった疾患又は症状を誘発すると考えられる。例えばPCT/JP2018/007901及びArima, Y. et al., eLife, 2017, 6: e25517に記載され、後述の実施例において作製される疾患モデルマウスは、EAE病態の持続的な増悪を呈し、これは多発性硬化症の再発寛解型以外のサブグループ、すなわち再発寛解型の後期である二次進行型、一次進行型及び再発進行型において見られる進行性の多発性硬化症の病態を反映している。また、上記マウスは、EAEの病態を何ら呈していない状態から数日以内に死に至るという突然死、胃及び小腸上部における出血や炎症といった胃腸炎、並びに心筋細胞の細胞死又は心不全といった心筋障害の病態を呈する。
【００５１】
本発明の医薬は、これらの疾患又は症状、例えば進行性多発性硬化症；胃炎、消化性潰瘍、クローン病や潰瘍性大腸炎などの炎症性腸疾患等の胃腸炎；突然死；狭心症、心筋梗塞、不整脈、心筋症、心不全等の心筋障害の予防及び／又は治療に用いることができる。ここで予防及び／又は治療とは、疾患又は症状の治癒、一時的寛解、予防等を目的とする医学的に許容される全てのタイプの予防的及び／又は治療的介入を包含する。すなわち、疾患又は症状の予防及び／又は治療は、疾患又は症状の進行の遅延又は停止、病変の退縮又は消失、発症の予防又は再発の防止等を含む、種々の目的の医学的に許容される介入を包含する。
【００５２】
本発明の医薬が投与される対象となる動物は、これらの疾患又は症状への罹患又は発症が問題となっている動物であり、典型的にはマウス、ラット、ハムスター、モルモットを含むげっ歯類、ヒト、チンパンジー、アカゲザルを含む霊長類、ブタ、ウシ、ヤギ、ウマ、ヒツジを含む家畜、イヌ、ネコを含む愛玩動物を挙げることができる。好ましい対象は、ヒトである。
【００５３】
本発明の別の態様は、その必要がある対象に有効量のTMEM5、VSTM2L、C2CD4D、VSTM2A、LY6G6C及びADRA2Cよりなる群から選択される少なくとも１の分子の発現を抑制する又は活性を阻害する物質を投与することを含む、進行性多発性硬化症、胃腸炎、心筋障害及び突然死よりなる群から選択される少なくとも１の疾患又は症状を予防及び／又は治療する方法も包含する。
【００５４】
以下の実施例によって本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【実施例】
【００５５】
疾患モデルマウスの作製
（i）ストレス負荷
PAWWストレスの負荷及びこれによる睡眠障害の誘導は、既法の通りに実施した（Miyazaki,K. et al., PloS one, 2013, 8, e55452）。6〜8週齢のC57BL/6マウス（日本SLC）を、回転輪を備えたプラスチックケージ内で個別に順化飼育した。その後、ケージ内の木製床敷を深さ1.5cmの水に置き換え、回転輪上で継続的に運動させるPAWWストレスを2日間マウスに負荷することで睡眠障害を誘導した。【００５６】
（ii）EAE病原性CD4陽性T細胞の調製
EAE病原性CD4陽性T細胞の調製及び移入は、既報の通りに実施した（Arima,Y. et al., Cell, 2012, 148, 447-457; Arima,Y. et al., eLife, 2015, 4, e08733; Ogura,H. et al., Immunity, 2008, 29, 628-636）。簡潔には、C57BL/6マウスの尾基部にMOG（35-55）ペプチド（Sigma-Aldrich）を完全フロイントアジュバント（Sigma-Aldrich）と共に皮下注射し、さらに百日咳毒素（Sigma-Aldrich）をMOGペプチド投与後0、2及び7日目に静脈内注射した。MOGペプチド投与から9日後、マウス脾臓からリンパ球を回収し、抗CD4マイクロビーズ（Miltenyi Biotec）を用いてソートすることでCD4陽性T細胞に富む細胞集団を得た。この細胞集団（4×106個）を、MOGペプチドをパルスした放射線照射脾臓細胞（1×107個）と共に、rIL-23（10ng/ml;R&D Systems）の存在下で2日間、共培養した。培養液から細胞を回収し、抗CD4マイクロビーズを用いてCD4陽性T細胞を濃縮することでEAE病原性CD4陽性T細胞を調製した。【００５７】
（iii）EAE病原性CD4陽性T細胞の移入
上記（i）のストレス負荷を開始してから2日後、上記（ii）で調製したEAE病原性CD4陽性T細胞（1.5×107個）を静脈内注射によりマウスに移入することで疾患モデルマウスを作製した。【００５８】
実施例１  ストレス負荷により脳内特定血管における発現が変動する遺伝子の解析
睡眠障害誘導を行って2日後のC57BL/6マウスから、約100個の脳の凍結切片（15μm厚）を調製し、PAXgene（QIAGEN）で15分間固定し、次いで100% EtOHで10分間固定した。切片中の第三脳室領域血管周辺の組織をレーザーマイクロダイセクションデバイスDM6000B（Leica Microsystems）により回収し、全RNAをRNeasyマイクロキット（QIAGEN）により抽出し、かずさDNA研究所に委託してRNAシークエンスを行い、全遺伝子を対象とした発現解析を実施した。【００５９】
解析の結果、ストレス負荷によりTMEM5、VSTM2L、C2CD4D、VSTM2A、LY6G6C及びADRA2Cの遺伝子発現量が上昇することが確認され（図１、２）、これらの因子が脳内特定血管における炎症及び疾患モデルマウスの病態に関与する可能性が示された。【００６０】
実施例２  抗体による疾患モデルマウスの病態改善
C57BL/6マウスに睡眠障害誘導後、EAE病原性CD4陽性T細胞を移入した。5日後に当該マウスの頭部を麻酔下で定位装置に固定し、頭蓋骨上の毛をそり、皮膚を70%エタノールで拭いた。30ゲージの針を特定血管（座標AP -1.06mm; ML 1mm; DV 2.25mm）に向けて下げ入れ、液量0.5μlのウサギ抗TMEM5抗体（Novus (NB110-40445), Anti-TMEM5, rabbit Poly 1.0 mg/ml）、マウス抗VSTM2L抗体（Santa Cruz Biotechnology (SC-376538) Anti VSTM2L(A-4) 0.2 mg/ml）、ウサギ抗C2CD4D抗体（Bioss (bs-15144R), Anti-C2CD4D Polyclonal Antibody 1.0 mg/ml）、ウサギ抗VSTM2A抗体（Thermo Fisher (PA5-48140), VSTM2A Polyclonal Antibody）、ラット抗Ly6G6C抗体（clone;NIMP-R14（NOVUS BIOLOGICALS）、0.1mg/ml）、ウサギ抗alpha 2c Adrenergic Receptor抗体（GeneTex、1mg/ml）、又はそれぞれのコントロール抗体（ラットIgG（Sigma）若しくはウサギIgG（Sigma））を90秒かけて、マイクロインジェクションにより投与した後、EAEの病態を臨床スコアにより評価した。臨床スコアは既報の通りに測定した（Arima,Y. et al., Cell, 2012, 148, 447-457; Arima,Y. et al., eLife, 2015, 4, e08733; Ogura,H. et al., Immunity, 2008, 29, 628-636）。臨床スコアは数字が大きくなるほど脳脊髄炎の症状が深刻であることを表し、０は異常症状が観察されない正常状態に、５は死亡に相当する。【００６１】
各抗体を投与したマウスのEAE臨床スコアの経時変化を図３及び４に示す。コントロール抗体を投与した対照群では臨床スコアの急激な上昇が認められたのに対し、抗TMEM5抗体、抗VSTM2L抗体、抗C2CD4D抗体、抗VSTM2A抗体、抗Ly6G6C抗体又は抗alpha 2c Adrenergic Receptor抗体を投与した群のいずれにおいても臨床スコアの上昇はほとんど認められず、病態の進行が有意に抑制された。このことから、TMEM5、VSTM2L、C2CD4D、VSTM2A、LY6G6C又はADRA2Cの抑制、遮断又は阻害は、疾患モデルマウスの病態の予防及び／又は治療に寄与することが確認された。
【図１】
2020045683.tif 000003
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【手続補正書】
【提出日】令和2年4月2日(2020.4.2)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  ５（ＴＭＥＭ５）、Ｖ−Ｓｅｔ  Ａｎｄ  Ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ  Ｄｏｍａｉｎ  Ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ２  Ｌｉｋｅ（ＶＳＴＭ２Ｌ）、Ｃ２  Ｃａｌｃｉｕｍ  Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  Ｄｏｍａｉｎ  Ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ４Ｄ（Ｃ２ＣＤ４Ｄ）及びＶ−Ｓｅｔ  Ａｎｄ  Ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ  Ｄｏｍａｉｎ  Ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ２Ａ（ＶＳＴＭ２Ａ）よりなる群から選択される少なくとも１の分子の発現を抑制する又は活性を阻害する物質であって、核酸、抗体及び抗体誘導体よりなる群から選択される少なくとも１つである前記物質を有効成分として含有する、進行性多発性硬化症、胃腸炎、心筋障害及び突然死よりなる群から選択される少なくとも１の疾患又は症状を予防及び／又は治療するための医薬。
【請求項２】
ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ  ａｎｔｉｇｅｎ  ６  ｆａｍｉｌｙ  ｍｅｍｂｅｒ  Ｇ６Ｃ（ＬＹ６Ｇ６Ｃ）の発現を抑制する核酸を有効成分として含有する、進行性多発性硬化症、胃腸炎、心筋障害及び突然死よりなる群から選択される少なくとも１の疾患又は症状を予防及び／又は治療するための医薬。
【請求項３】
疾患又は症状が、ストレス負荷に起因する疾患又は症状である、請求項１又は２に記載の医薬。
【請求項４】
（ｉ）ＴＭＥＭ５、ＶＳＴＭ２Ｌ、Ｃ２ＣＤ４Ｄ、ＶＳＴＭ２Ａ及びＬＹ６Ｇ６Ｃよりなる群から選択される少なくとも１の分子を発現する細胞又は動物における、被験物質の存在下及び非存在下での前記分子の発現量又は活性を測定する工程、並びに
（ｉｉ）被験物質存在下での前記分子の発現量又は活性が被験物質非存在下での前記分子の発現量又は活性と比べて少ない又は弱い場合に、被験物質は前記分子の発現を抑制する又は活性を阻害する能力を有すると判定する工程
を含む、進行性多発性硬化症、胃腸炎、心筋障害及び突然死よりなる群から選択される少なくとも１の疾患又は症状を予防及び／又は治療し得る物質をスクリーニングする方法。
【請求項５】
α２Ｃアドレナリン受容体（ＡＤＲＡ２Ｃ）の発現を抑制する核酸を有効成分として含有する、進行性多発性硬化症、胃腸炎及び突然死よりなる群から選択される少なくとも１の疾患又は症状を予防及び／又は治療するための医薬。
【請求項６】
疾患又は症状が、ストレス負荷に起因する疾患又は症状である、請求項５に記載の医薬。
【請求項７】
（ｉ）ＡＤＲＡ２Ｃを発現する細胞又は動物における、被験物質の存在下及び非存在下での前記分子の発現量又は活性を測定する工程、並びに
（ｉｉ）被験物質存在下での前記分子の発現量又は活性が被験物質非存在下での前記分子の発現量又は活性と比べて少ない又は弱い場合に、被験物質は前記分子の発現を抑制する又は活性を阻害する能力を有すると判定する工程
を含む、進行性多発性硬化症、胃腸炎及び突然死よりなる群から選択される少なくとも１の疾患又は症状を予防及び／又は治療し得る物質をスクリーニングする方法。
【手続補正書】
【提出日】令和3年3月25日(2021.3.25)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
V-Set And Transmembrane Domain Containing 2A（VSTM2A）及びV-Set And Transmembrane Domain Containing 2 Like（VSTM2L）よりなる群から選択される少なくとも１の分子の発現を抑制する又は活性を阻害する物質であって、核酸、抗体及び抗体誘導体よりなる群から選択される少なくとも１つである前記物質を有効成分として含有する、進行性多発性硬化症、胃腸炎、心筋障害及び突然死よりなる群から選択される少なくとも１の疾患又は症状を予防及び／又は治療するための医薬。
【請求項２】
Transmembrane Protein 5（TMEM5）及びC2 Calcium Dependent Domain Containing 4D（C2CD4D）よりなる群から選択される少なくとも１の分子の発現を抑制する又は活性を阻害する物質であって、核酸、抗体及び抗体誘導体よりなる群から選択される少なくとも１つである前記物質を有効成分として含有する、進行性多発性硬化症、胃腸炎、心筋障害及び突然死よりなる群から選択される少なくとも１の疾患又は症状を予防及び／又は治療するための医薬。
【請求項３】
lymphocyte antigen 6 family member G6C（LY6G6C）の発現を抑制する核酸を有効成分として含有する、進行性多発性硬化症、胃腸炎、心筋障害及び突然死よりなる群から選択される少なくとも１の疾患又は症状を予防及び／又は治療するための医薬。
【請求項４】
α2Cアドレナリン受容体（ADRA2C）の発現を抑制する核酸を有効成分として含有する、進行性多発性硬化症、胃腸炎及び突然死よりなる群から選択される少なくとも１の疾患又は症状を予防及び／又は治療するための医薬。
【請求項５】
疾患又は症状が、ストレス負荷に起因する疾患又は症状である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の医薬。
【請求項６】
(i) VSTM2A及びVSTM2Lよりなる群から選択される少なくとも１の分子を発現する細胞又は動物における、被験物質の存在下及び非存在下での前記分子の発現量又は活性を測定する工程、並びに
(ii) 被験物質存在下での前記分子の発現量又は活性が被験物質非存在下での前記分子の発現量又は活性と比べて少ない又は弱い場合に、被験物質は進行性多発性硬化症、胃腸炎、心筋障害及び突然死よりなる群から選択される少なくとも１の疾患又は症状を予防及び／又は治療し得ると判定する工程
を含む、進行性多発性硬化症、胃腸炎、心筋障害及び突然死よりなる群から選択される少なくとも１の疾患又は症状を予防及び／又は治療し得る物質をスクリーニングする方法。
【請求項７】
(i) TMEM5、C2CD4D及びLY6G6Cよりなる群から選択される少なくとも１の分子を発現する細胞又は動物における、被験物質の存在下及び非存在下での前記分子の発現量又は活性を測定する工程、並びに
(ii) 被験物質存在下での前記分子の発現量又は活性が被験物質非存在下での前記分子の発現量又は活性と比べて少ない又は弱い場合に、被験物質は進行性多発性硬化症、胃腸炎、心筋障害及び突然死よりなる群から選択される少なくとも１の疾患又は症状を予防及び／又は治療し得ると判定する工程
を含む、進行性多発性硬化症、胃腸炎、心筋障害及び突然死よりなる群から選択される少なくとも１の疾患又は症状を予防及び／又は治療し得る物質をスクリーニングする方法。
【請求項８】
(i) ADRA2Cを発現する細胞又は動物における、被験物質の存在下及び非存在下での前記分子の発現量又は活性を測定する工程、並びに
(ii) 被験物質存在下での前記分子の発現量又は活性が被験物質非存在下での前記分子の発現量又は活性と比べて少ない又は弱い場合に、被験物質は進行性多発性硬化症、胃腸炎及び突然死よりなる群から選択される少なくとも１の疾患又は症状を予防及び／又は治療し得ると判定する工程
を含む、進行性多発性硬化症、胃腸炎及び突然死よりなる群から選択される少なくとも１の疾患又は症状を予防及び／又は治療し得る物質をスクリーニングする方法。
【国際調査報告】
2020045683.tif 000007
2020045683.tif 000008
2020045683.tif 000009
2020045683.tif 000010
2020045683.tif 000011
2020045683.tif 000012
2020045683.tif 000013
2020045683.tif 000014
2020045683.tif 000015
2020045683.tif 000016
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