(57)【要約】  本発明の目的は、経皮投与によって優れた免疫誘導が可能なワクチン製剤を提供することである。  抗原が溶解した水相、グリセリン脂肪酸エステル及び／又はポリグリセリン脂肪酸エステル、並びに油相を含み、当該水相が当該油相に分散しているワクチン製剤は、経皮投与すると、注射投与を凌ぐ、優れた免疫誘導が可能になる。
2020111248.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗原が溶解した水相、グリセリン脂肪酸エステル及び／又はポリグリセリン脂肪酸エステル、並びに油相を含み、前記水相が前記油相に分散している、経皮投与用ワクチン製剤。
【請求項２】
前記抗原の由来が、がん細胞、病原性ウイルス、病原性細菌、病原性生物、又は花粉である、請求項１に記載の経皮投与用ワクチン製剤。
【請求項３】
前記抗原が抗原ペプチドである、請求項１又は２に記載の経皮投与用ワクチン製剤。
【請求項４】
前記グリセリン脂肪酸エステルが、モノオレイン酸グリセリルである、請求項１〜３のいずれかに記載の経皮投与用ワクチン製剤。
【請求項５】
前記グリセリン脂肪酸エステル及び／又はポリグリセリン脂肪酸エステルの含有量が０．１〜３０重量％である、請求項１〜４のいずれかに記載の経皮投与用ワクチン製剤。
【請求項６】
抗原が溶解した水相、グリセリン脂肪酸エステル及び／又はポリグリセリン脂肪酸エステル、並びに油相を含み、前記水相が前記油相に分散している組成物の、経皮投与用ワクチン製剤の製造のための使用。
【請求項７】
抗原が溶解した水相、グリセリン脂肪酸エステル及び／又はポリグリセリン脂肪酸エステル、並びに油相を含み、前記水相が前記油相に分散している組成物の免疫誘導に有効な量を、免疫誘導が求められている動物に対して経皮投与する工程を含む、免疫誘導方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、経皮投与によって優れた免疫誘導が可能なワクチン製剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
がんの治療法として、外科手術、放射線療法、及び化学療法の三大療法が確立されているが、近年、副作用が少なく有効な手法としてがん免疫療法が注目を浴びている。がん免疫療法の中でも、がん細胞に対する抗体産生や細胞性免疫を誘導するがんワクチン療法は、副作用が少なく、更に前記三大療法と併用することも可能であり、近年、注目を浴びている。【０００３】
また、従来、感染症の予防には、人為的な疑似感染により、特定の病原体に対する抗体産生や細胞性免疫を誘導するワクチン免疫法が広く利用されている。【０００４】
このようにがんの治療や感染症の予防には、ワクチンの投与によって獲得免疫を誘導する手法が有効であり、従来、ワクチン製剤が精力的に研究されている。但し、従来開発されているワクチン製剤の大半は注射製剤であり、このような注射製剤では、投与に医療従事者を必要としたり、注射による痛みを伴ったりする欠点がある。【０００５】
一方、皮膚には外部からの異物の侵入に抵抗するための強力な免疫機能が備わっており、表皮に存在するランゲルハンス細胞には、他の樹状細胞と比較して強力に細胞障害性Ｔ細胞応答を誘導できることが報告されている（非特許文献１及び２参照）。そのため、ワクチン製剤を経皮投与して抗原を皮膚表面から浸透させランゲルハンス細胞へと送達することができれば、効果的な免疫応答の誘導が期待できる。また、ワクチン製剤の経皮投与は、患者自身で行うことができ、しかも非侵襲性であるため、投与が簡便で患者への負担が少ないという利点がある。このように、経皮投与用のワクチン製剤は、注射製剤の欠点を払拭し、優れたワクチン効果と利便性を両立させることが期待できる。【０００６】
しかしながら、表皮の最外層に位置する角層は、強力な生体バリアとして外部からの異物の侵入を防いでおり、油溶性物質又は分子量５００Ｄａ以下の低分子量の物質しか浸透することができない（非特許文献３参照）。一般にワクチンとして用いるタンパク質抗原やペプチド抗原は親水性且つ高分子量であるため、皮膚に塗布しただけでは角層の下に存在するランゲルハンス細胞まで送達することは困難である。実際、抗原を含有させた親水性ゲルパッチでは、注射剤に比べて抗原の利用率が圧倒的に低くなることが報告されている（非特許文献４参照）。また、従来、マイクロニードルを用いた経皮ワクチン製剤によって、経皮投与による免疫誘導能を向上させる試みもなされているが、このようなワクチン製剤は、製造工程が煩雑になり、製造コストの増大を招くという欠点がある。このような従来技術を背景として、マイクロニードルを利用せずとも、優れた免疫誘導が可能な経皮投与用ワクチンの開発が切望されている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】E. Klechevsky et al., Immunity, 29(3), 497-510, (2008).
【非特許文献２】J. Banchereau et al., BLOOD, 119, 5742-5749, (2012).
【非特許文献３】J. D. Bos et al., Exp. Dermatol, 9, 165-169, (2000).
【非特許文献４】N. Okada, YAKUGAKU ZASSHI, 133(12), 1363-1372, (2013).
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明の目的は、経皮投与によって優れた免疫誘導が可能なワクチン製剤を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者等は、前記課題を解決すべく鋭意検討を行ったところ、抗原が溶解した水相、グリセリン脂肪酸エステル及び／又はポリグリセリン脂肪酸エステル、並びに油相を含み、当該水相が当該油相に分散しているワクチン製剤は、経皮投与すると、注射投与を凌ぐ、優れた免疫誘導が可能になることを見出した。本発明は、かかる知見に基づいて、更に検討を重ねることにより完成したものである。【００１０】
即ち、本発明は、下記に掲げる態様の発明を提供する。
項１．  抗原が溶解した水相、グリセリン脂肪酸エステル及び／又はポリグリセリン脂肪酸エステル、並びに油相を含み、前記水相が前記油相に分散している、経皮投与用ワクチン製剤。
項２．  前記抗原の由来が、がん細胞、病原性ウイルス、病原性細菌、病原性生物、又は花粉である、項１に記載の経皮投与用ワクチン製剤。
項３．  前記抗原が抗原ペプチド又は抗原タンパク質である、項１又は２に記載の経皮投与用ワクチン製剤。
項４．  前記グリセリン脂肪酸エステルが、モノオレイン酸グリセリルである、項１〜３のいずれかに記載の経皮投与用ワクチン製剤。
項５．  前記グリセリン脂肪酸エステル及び／又はポリグリセリン脂肪酸エステルの含有量が０．１〜３０重量％である、項１〜４のいずれかに記載の経皮投与用ワクチン製剤。
項６．  抗原が溶解した水相、グリセリン脂肪酸エステル及び／又はポリグリセリン脂肪酸エステル、並びに油相を含み、前記水相が前記油相に分散している組成物の、経皮投与用ワクチン製剤の製造のための使用。
項７．  抗原が溶解した水相、グリセリン脂肪酸エステル及び／又はポリグリセリン脂肪酸エステル、並びに油相を含み、前記水相が前記油相に分散している組成物の免疫誘導に有効な量を、免疫誘導が求められている動物に対して経皮投与する工程を含む、免疫誘導方法。
【発明の効果】
【００１１】
本発明のワクチン製剤によれば、経皮投与によって、注射投与を凌ぐ優れた免疫誘導が可能になるので、がん免疫療法、感染症予防、花粉症等のアレルギーに対するアレルゲン免疫療法等において、優れた治療又は予防効果を奏することができる。また、本発明のワクチン製剤は、経皮投与によって免疫を有効に誘導できるので、非侵襲的、安全、且つ簡便な方法で使用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】試験例１における免疫誘導実験のスケジュールを模式的に示した図である。
【図２】試験例１における免疫誘導実験において、腫瘍体積を経時的に測定した結果を示す図である。
【図３】試験例１における免疫誘導実験において、実施例１経皮投与群及び参考例１注射投与群について、移植１４日後取り出した腫瘍をＡＰＣ標識抗ＣＤ８抗体とＤＡＰＩで染色し、蛍光顕微鏡で観察した結果を示す図である。
【図４】試験例２における免疫誘導実験のスケジュールを模式的に示した図である。
【図５】試験例２における免疫誘導実験において、実施例２経皮投与群、参考例２注射投与群、及びコントロール群について、Ｃｒｉｊ１特異的ＩｇＥ抗体、及びＩｇＧ１抗体の血清中濃度、並びに脾臓細胞培養液中のサイトカイン（ＩＬ−４及びＩＬ−５）濃度を測定した結果を示す図である。
【図６】試験例３における免疫誘導実験のスケジュールを模式的に示した図である。
【図７】試験例３における免疫誘導実験において、実施例３経皮投与群及び比較例３経皮投与群について、抗インフルエンザＡ（Ｈ３Ｎ２）抗体の血清中濃度を測定した結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本発明のワクチン製剤は、経皮投与されるワクチン製剤であって、抗原が溶解した水相、グリセリン脂肪酸エステル及び／又はポリグリセリン脂肪酸エステル、並びに油相を含み、前記水相が前記油相に分散していることを特徴とする。以下、本発明のワクチン製剤について詳述する。
【００１４】
［水相］
本発明のワクチン製剤において、水相は、抗原が溶解した溶解液で構成される。本発明のワクチン製剤において、グリセリン脂肪酸エステル及び／又はポリグリセリン脂肪酸エステルの親水性部分が水相に会合した状態になって、当該水相が油相に分散したＷＯ乳化形態になっている。本発明のワクチン製剤では、水相の周りをグリセリン脂肪酸エステル及び／又はポリグリセリン脂肪酸エステルで被覆された逆ミセルを形成して乳化した状態、或は水相の周りをグリセリン脂肪酸エステル及び／又はポリグリセリン脂肪酸エステルが完全に被覆せずとも水相が乳化粒子になった乳化状態になっていると推測される。以下、水相に含まれる各成分について説明する。
【００１５】
・抗原
本発明で使用される抗原は、ワクチンの免疫原として、生体内で免疫応答を誘導し得るものであり、且つ水溶性であることを限度として特に制限されないが、抗原タンパク質及び抗原ペプチドが挙げられる。本発明において、抗原タンパク質とは、病原体やアレルギー源において特異的に発現又は存在しており、免疫応答を誘導するタンパク質のことをいう。また、抗原ペプチドとは、抗原タンパク質に由来するペプチド（例えば、抗原タンパク質を低分子化したもの）のことをいう。本発明において、抗原タンパク質及び抗原ペプチドには、抗原提示細胞の細胞表面のＭＨＣ分子（ＨＬＡ分子）との複合体を直接形成することにより抗原特異的Ｔ細胞を誘導可能なものであってもよく、また、細胞内に取り込まれ、その後細胞内分解されて生じたペプチド断片がＭＨＣ分子と結合して複合体を形成し、当該複合体が細胞表面に提示されることにより抗原特異的Ｔ細胞を誘導可能なものであってもよい。
【００１６】
経皮吸収の効率を高めてより一層優れた経皮免疫を誘導させるという観点から、抗原の好適な一例として、抗原ペプチドが挙げられる。抗原ペプチドのアミノ酸残基数については、特に制限されないが、例えば、２〜５０個、好ましくは７〜３１個、より好ましくは８〜２０個程度が挙げられる。
【００１７】
抗原の由来については、特に制限されないが、例えば、がん細胞、病原性ウイルス、病原性細菌、病原性生物、花粉等が挙げられる。抗原の由来として、具体的には、メラノーマ、膵癌、肺癌、骨肉腫、大腸癌、結腸癌、胃癌、直腸癌、肝癌、乳癌、膀胱癌、前立腺癌、子宮頚癌、頭頚部癌、胆管癌、胆嚢癌、口腔癌、脳腫瘍等の固形癌、白血病、悪性リンパ腫等の血液がん等のがん細胞；インフルエンザウイルス、トリインフルエンザウイルス、パラインフルエンザウイルス、アデノウイルス、ＳＡＲＳウイルス、ＡＩＤＳウイルス、サイトメガロウイルス、肝炎ウイルス、日本脳炎ウイルス、麻疹ウイルス、風疹ウイルス、水痘・帯状疱疹ウイルス、ポリオウイルス、パピローマウイルス、ヘルペスウイルス、ムンプスウイルス、ロタウイルス、コレラウイルス、狂犬病ウイルス、ＨＩＶ等の病原性ウイルス；ジフテリア、破傷風、結核菌、肺炎球菌、髄膜炎菌、ブドウ球菌、緑膿菌、百日咳菌、炭疽菌、サルモネラ等の細菌等の病原性細菌；マラリア原虫、ダニ等の病原性生物；スギ花粉、ヒノキ花粉、シラカバ花粉等の花粉等が挙げられる。これらの抗原の由来の中でも、好ましくはがん細胞、インフルエンザウイルス、及び花粉が挙げられる。
【００１８】
本発明のワクチン製剤において、水相（溶解液）中の抗原の含有量としては、例えば、０．００１〜６０重量％、好ましくは０．００１〜５０重量％、より好ましく０．００１〜４０重量％、更に好ましくは０．１〜２５重量％、特に好ましくは０．１〜５重量％が挙げられる。
【００１９】
本発明のワクチン製剤における抗原の含有量は、抗原の種類、患者の状態、投与量等に応じて適宜設定すればよいが、例えば０．０００１〜５重量％、好ましくは０．０００１〜３．５重量％、より好ましく０．０００１〜２．５重量％、特に好ましくは０．０１〜２重量％が挙げられる。
【００２０】
・水相基剤
水相には、抗原を溶解させるための水相基剤が含まれる。水相基剤の種類については、抗原を溶解可能であることを限度として特に制限されないが、例えば、水、１価低級アルコール、及びこれらの混合液が挙げられる。
【００２１】
水相基剤として使用される水は、精製水、超純水等の水の他、緩衝液、生理食塩水等の状態であってもよい。
【００２２】
また、水相基剤として使用される１価低級アルコールとしては、例えば、炭素数２〜５の１価アルコールが挙げられる。１価低級アルコールとして、より具体的には、
エタノール、ｎ−プロパノール、イソプロパノール、ｎ−ブタノール、ｓｅｃ−ブタノール、ｔｅｒｔ−ブタノール、ｎ−アミルアルコール、ｓｅｃ−アミルアルコール、イソアミルアルコール、ｔｅｒｔ−アミルアルコール、ネオペンチルアルコール等が挙げられる。これらの１価低級アルコールは、１種単独で含まれていてもよく、２種以上が組み合わされて含まれていてもよい。
【００２３】
水相基剤の好適な一態様としては、水と１価低級アルコールの混合液、より好ましくは水とイソプロパノールとの混合液が挙げられる。また、水相基剤の他の好適な一態様としては、１価の低級アルコールを含まない水又は水溶液（緩衝液、生理食塩水等）が挙げられる。
【００２４】
水相基剤として、水と１価低級アルコールの混合液を使用する場合、これらの混合比については、特に制限されないが、例えば、水１重量部当たり、１価低級アルコールが１〜５０重量部、好ましくは１〜４５重量部、より好ましくは１〜４０重量部、特に好ましくは１〜２０重量部となる比率が挙げられる。
【００２５】
水相中の水相基剤の含有量については、例えば、４０〜９９．９９９重量％が挙げられる。より一層優れた経皮免疫を誘導させるという観点から、水相中の水相基剤の含有量の下限として、好ましくは５０重量％以上、より好ましくは６０重量％以上、更に好ましくは９５重量％以上が挙げられる。より一層優れた経皮免疫を誘導させるという観点から、水相中の水相基剤の含有量の上限として、好ましくは９９．９重量％以下、より好ましくは９９重量％以下が挙げられる。水相中の水相基剤の含有量として、より具体的には、好ましくは５０〜９９．９９９重量％、より好ましくは６０〜９９．９９９重量％、更に好ましくは７５〜９９．９重量％、特に好ましくは９５〜９９．９重量％が挙げられる。
【００２６】
また、本発明のワクチン製剤における水相基剤の含有量としては、例えば０．１〜５０重量％が挙げられる。より一層優れた経皮免疫を誘導させるという観点から、発明のワクチン製剤における水相基剤の含有量として、好ましくは０．１〜４０重量％、より好ましく０．１〜３０重量％、更に好ましくは０．５〜３０重量％、特に好ましくは５〜２０重量％が挙げられる。
【００２７】
［グリセリン脂肪酸エステル及び／又はポリグリセリン脂肪酸エステル］
本発明のワクチン製剤では、グリセリン脂肪酸エステル及び／又はポリグリセリン脂肪酸エステルは、一部又は全部が水相と会合して、水相を油相に分散させて乳化させる役割を果たすと共に、経皮投与によって優れた免疫誘導を可能にする役割を果たす。
【００２８】
グリセリン脂肪酸エステルとは、脂肪酸とグリセリンとのモノエステル、ジエステル、又はトリエステルである。グリセリン脂肪酸エステルを構成する脂肪酸の炭素数としては、例えば、６〜２４、好ましくは８〜２２、更に好ましくは１２〜１８が挙げられる。グリセリン脂肪酸エステルとして、具体的には、モノミリスチン酸グリセリル、モノステアリン酸グリセリル、モノイソステアリン酸グリセリル、モノオレイン酸グリセリル、ジオレイン酸グリセリル、トリオレイン酸グリセリル、ジステアリン酸グリセリル等が挙げられる。これらのグリセリン脂肪酸エステルの中でも、好ましくは、脂肪酸とグリセリンとのモノエステル、より好ましくはモノオレイン酸グリセリルが挙げられる。
【００２９】
ポリグリセリン脂肪酸エステルとは、脂肪酸とポリグリセリンとのエステルである。ポリグリセリン脂肪酸エステルにおいて、エステル結合の数（ポリグリセリン１分子当たり、結合している脂肪酸の数）としては、例えば１〜１０、好ましくは１〜６、更に好ましくは１〜３が挙げられる。ポリグリセリン脂肪酸エステルを構成する脂肪酸の炭素数としては、例えば、６〜２４、好ましくは８〜２２、更に好ましくは１２〜１８が挙げられる。また、ポリグリセリン脂肪酸エステルを構成するポリグリセリンの重合度は、例えば、２〜３０、好ましくは２〜１０が挙げられる。具体的には、ポリグリセリン脂肪酸エステルとして、ステアリン酸ポリグリセリル−２（モノステアリン酸ジグリセリル）、オレイン酸ポリグリセリル−２（モノオレイン酸ジグリセリル）、オレイン酸ポリグリセリル−４（モノオレイン酸テトラグリセリル）、オレイン酸ポリグリセリル−１０（モノオレイン酸デカグリセリル）、トリオレイン酸ポリグリセリル−５（トリオレイン酸ペンタグリセリル）、トリオレイン酸ポリグリセリル−１０（トリオレイン酸デカグリセリル）、パルミチン酸ポリグリセリル−１０（モノパルミチン酸デカグリセリル）、イソステアリン酸ポリグリセリル−２、トリイソステアリン酸ポリグリセリル−２、ステアリン酸ポリグリセリル−４、トリステアリン酸ポリグリセリル−６、ペンタステアリン酸ポリグリセリル−１０、ペンタヒドロキシステアリン酸ポリグリセリル−１０、ペンタイソステアリン酸ポリグリセリル−１０、ペンタオレイン酸ポリグリセリル−１０、ポリリシノレイン酸ポリグリセリル−６、ポリリシノレイン酸ポリグリセリル−１０等が挙げられる。これらのポリグリセリン脂肪酸エステルの中でも、好ましくは、トリオレイン酸ポリグリセリル、イソステアリン酸ポリグリセリル−２が挙げられる。
【００３０】
本発明において、グリセリン脂肪酸エステル及びポリグリセリン脂肪酸エステルの中から１種の成分を単独で使用してもよく、また２種以上を組み合わせて使用してもよい。
【００３１】
グリセリン脂肪酸エステル及びポリグリセリン脂肪酸エステルの中でも、より一層優れた経皮免疫を誘導させるという観点から、好ましくはグリセリン脂肪酸エステル、より好ましくは脂肪酸とグリセリンとのモノエステル、更に好ましくはモノオレイン酸グリセリルが挙げられる。
【００３２】
本発明のワクチン製剤において水相（溶解液）とグリセリン脂肪酸エステル及び／又はポリグリセリン脂肪酸エステルとの比率としては、例えば、水相１重量部当たり、グリセリン脂肪酸エステル及び／又はポリグリセリン脂肪酸エステルが総量で０．５〜２００重量部、好ましくは０．５〜７５重量部、より好ましくは０．５〜５０重量部、更に好ましくは０．５〜４０重量部、特に好ましくは０．５〜３重量部が挙げられる。
【００３３】
また、本発明のワクチン製剤におけるグリセリン脂肪酸エステル及び／又はポリグリセリン脂肪酸エステルの含有量としては、例えば０．１〜３０重量％、好ましくは０．２５〜２７．５重量％、より好ましく０．５〜２５重量％が挙げられる。
【００３４】
［油相］
本発明のワクチン製剤において、油相は、前記水相の分散媒としての役割を果たし、液状油、固形油、高級アルコール等の油相基剤で形成される。
【００３５】
液状油とは、２５℃において液状の形態を保つ油である。本発明で使用される液状油としては、化粧料や外用医薬品等に通常用いられるものであればよく、例えば、アボガド油、ツバキ油、マカデミアナツツ油、オリーブ油、アルモンド油、ダイズ油、ホホバ油、綿実油、ナタネ油、ゴマ油、シソ油、ケイヒ油、コーン油、ラッカセイ油、サンフラワー油、カカオ油、ハッカ油、ベルガモット油、ウイキョウ油等の植物油；オレイン酸、イソステアリン酸等の脂肪酸；エチルヘキサン酸セチル、パルミチン酸エチルヘキシル、ミリスチン酸オクチルドデシル、ジエチルヘキサン酸ネオペンチルグリコール、トリ２−エチルへキサン酸グリセリル、オレイン酸オクチルドデシル、ミリスチン酸イソプロピル、トリイソステアリン酸グリセリル、ジパラメトキシケイヒ酸−モノエチルへキサン酸グリセリル等のエステル油；ジメチルポリシロキサン、メチルハイドロジエンポリシロキサン、メチルフェニルポリシロキサン、オクタメチルシクロテトラシロキサン等のシリコン油；流動パラフィン、スクワレン、スクワラン等の液状炭化水素油等が挙げられる。これらの液状油は、１種単独で使用してもよく、また２種以上を組み合わせて使用してもよい。これらの液状油の中でも、好ましくはエステル油、より好ましくはミリスチン酸イソプロピルが挙げられる。
【００３６】
固形油とは、２５℃において固形の形態を保つ油である。本発明で使用される固形油としては、通常化粧料や外用医薬品等に用いられるものであればよく、例えば、キャンデリラロウ、コメヌカロウ、ミツロウ、綿ロウ、カルナウバロウ、ラノリン、セラックロウ、オゾケライト、セレシン、ポリエチレンワックス、マイクロクリスタリンワックス、パラフィン、ワセリン、ラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、ベヘニン酸、１２−ヒドロキシステアリン酸、ウンデシレン酸、ミリスチン酸ミリスチル、ミリスチン酸セチル、ステアリン酸ステアリル、ステアリン酸セチル、パルミチン酸セチル、ステアリン酸コレステリル、オレイン酸コレステリル、パルミチン酸デキストリン、ステアリン酸イヌリン、水素添加ホホバ油、セレシンワックス、固形パラフィンワックス、ポリエチレンワックス、シリコーンワックス等の固形油が挙げられる。これらの固形油は、１種単独で使用してもよく、また２種以上を組み合わせて使用してもよい。
【００３７】
高級アルコールとは、１分子中の炭素原子数が６個以上の１価アルコールである。本発明で使用される高級アルコールにおける１分子中の炭素原子数について、６以上であればよいが、好ましくは６〜３４、更に好ましくは１４〜２２が挙げられる。
【００３８】
本発明で使用される高級アルコールとしては、通常化粧料や外用医薬品等に用いられるものであればよく、例えば、ラウリルアルコール、セチルアルコール、ステアリルアルコール、ベヘニルアルコール、ミリスチルアルコール、セトステアリルアルコール、セタノール、オレイルアルコール等の直鎖状高級アルコール；ノステアリルグリセリンエーテル（バチルアルコール）、等の分枝鎖状高級アルコールが挙げられる。これらの高級アルコールは、１種単独で使用してもよく、また２種以上を組み合わせて使用してもよい。
【００３９】
これらの油相基剤の中でも、好ましくは液状油が挙げられる。
【００４０】
本発明のワクチン製剤において、水相と油相の比率としては、例えば、水相１重量部当たり、油相が１〜１０００重量部、好ましくは１．５〜１０００重量部、より好ましくは２〜１０００重量部、更に好ましくは２．５〜２００重量部、特に好ましくは２．５〜１０重量部が挙げられる。
【００４１】
本発明のワクチン製剤における油相の含有量については、特に制限されず、使用する油相基剤の種類等に応じて適宜設定すればよいが、例えば、４０〜９９．８重量％、好ましくは５０〜９９．７重量％、より好ましくは５５〜９９．４重量％が挙げられる。
【００４２】
［その他の成分］
本発明のワクチン製剤には、経皮免疫の誘導をより一層向上させるために、アジュバントが含まれていてもよい。アジュバントとしては、例えば、ＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチド、フロイント、水酸化アルミニウム（Ａｌｕｍ）、ミョウバン等が挙げられる。
【００４３】
また、本発明のワクチン製剤は、必要に応じて、前述した成分以外に、製剤化等に必要とされる他の基剤や添加剤が含まれていてもよい。このような添加剤については、薬学的又は香粧学的に許容されることを限度として特に制限されないが、例えば、防腐剤（メチルパラベン、プロピルパラベン、安息香酸、安息香酸ナトリウム、ソルビン酸等）、着香剤（シトラール、１，８−シオネール、シトロネラール、ファルネソール等）、着色剤（タール色素（褐色２０１号、青色２０１号、黄色４号、黄色４０３号等）、カカオ色素、クロロフィル、酸化アルミニウム等）、粘稠剤（カルボキシビニルポリマー、ヒプロメロース、ポリビニルピロリドン、アルギン酸ナトリウム、エチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、キサンタンガム、カラギーナン等）、ｐＨ調整剤（リン酸、塩酸、クエン酸、クエン酸ナトリウム、コハク酸、酒石酸、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、トリエタノールアミン、トリイソプロパノールアミン等）、湿潤剤（ｄｌ−ピロリドンカルボン酸ナトリウム液、Ｄ−ソルビトール液、マクロゴール等）、安定化剤（ジブチルヒドロキシトルエン、ブチルヒドロキシアニソール、エデト酸ナトリウム、メタリン酸ナトリウム、Ｌ−アルギニン、Ｌ−アスパラギン酸、ＤＬ−アラニン、グリシン、エリソルビン酸ナトリウム、没食子酸プロピル、亜硫酸ナトリウム、二酸化硫黄、クロロゲン酸、カテキン、ローズマリー抽出物等）、多価アルコール（グリセリン、プロピレングリコール、ジプロピレングリコール、ブチレングリコール、ポリエチレングリコール等）、酸化防止剤、紫外線吸収剤、キレート剤、粘着剤、緩衝剤、溶解補助剤、保存剤等の添加剤が挙げられる。
【００４４】
本発明のワクチン製剤にアジュバントや添加剤を含有させる場合、水溶性成分は水溶性画分に配合し、親油性成分は油相に配合すればよく、その含有量については、使用する成分の種類に応じて適宜設定すればよい。
【００４５】
［製剤形態］
本発明のワクチン製剤は、水相が油相に分散した状態の油中水型（Ｗ／Ｏ型）の乳化形態である。また、本発明のワクチン製剤は、更に常法に従って水相に分散することによって、Ｗ／Ｏ／Ｗ型製剤としてもよい。
【００４６】
本発明のワクチン製剤の剤型についは、経皮適用可能であることを限度として特に制限されないが、例えば、クリーム剤、軟膏剤、ゲル剤、パップ剤、ローション剤、リニメント剤、エアゾール剤等が挙げられる。これらの中でも、好ましくは、クリーム剤、軟膏剤、乳液剤、ローション剤が挙げられる。
【００４７】
［製造方法］
本発明のワクチン製剤は、公知の乳化製剤の製剤化手法に従って製造することができる。例えば、本発明のワクチン製剤の製造方法としては、含有させる成分を水溶性成分と油性成分に分けて、水溶性成分を含む溶解液（水相成分）と、油性成分とグリセリン脂肪酸エステル及び／又はポリグリセリン脂肪酸エステルとを含む混合液（油相成分とグリセリン脂肪酸エステル及び／又はポリグリセリン脂肪酸エステル）を調製し、これらを公知の手法に従って乳化させる方法が挙げられる。具体的には、抗原が水相基剤に溶解した溶解液と、グリセリン脂肪酸エステル及び／又はポリグリセリン脂肪酸エステルと油相基剤を含む混合液とを調製し、当該溶解液と混合液とを混合して乳化させることにより、本発明のワクチン製剤を製造することができる。
【００４８】
［用量・用法］
本発明のワクチン製剤は、経皮投与され、免疫を誘導するために使用される。従来の一般的な経皮投与用ワクチン製剤は、抗原の利用率が低く、免疫を十分に誘導できないという欠点があったが、本発明のワクチン製剤は経皮投与によって、注射投与を凌ぐ免疫誘導効果を奏することが可能になっている。
【００４９】
本発明のワクチン製剤は、含有する抗原の種類に応じて、がん免疫療法、感染症予防、花粉症等のアレルギーに対するアレルゲン免疫療法等に使用されるが、がん免疫療法に好適に使用できる。
【００５０】
本発明のワクチン製剤の投与対象については、前記免疫誘導が求められる動物である限り、特に制限されず、例えば、ヒト、サル、マウス、ラット、イヌ、ウサギ、ネコ、ウシ、ウマ、ヤギ等の哺乳動物；ニワトリ、ダチョウ等の鳥類が挙げられる。
【００５１】
本発明のワクチン製剤の投与量については、使用する抗原の種類、投与対象の症状、年齢、体重等に応じて適宜設定されるが、投与対象動物がヒトである場合、通常、１日１回〜数回、好ましくは１日１回、３〜１２ｍｇ／ｋｇに相当する量の抗原を経皮投与すればよい（初回免疫）。また、本発明のワクチン製剤は、初回免疫から通常１〜２週間後に初回免疫と同様条件で再投与してもよい（追加免疫）。
【００５２】
本発明のワクチン製剤が投与される皮膚部位については、特に制限されないが、例えば、ヒトの場合であれば、上腕部、胸部、背部等が挙げられ、非ヒト動物の場合であれば背部、耳介部等が挙げられる。
【実施例】
【００５３】
以下、実施例を挙げて本発明を説明する。但し、本発明は、以下の実施例に限定されて解釈されるものではない。【００５４】
試験例1
１．製剤の調製
表１に示す組成の各製剤を以下の手法で調製した。
【表１】
2020111248.tif 000003
【００５５】
［実施例１及び比較例１］
水相基剤（精製水及びイソプロパノール）に、所定量のメラノーマ抗原ペプチド（Ｋ-ＴＲＰ−２、アミノ酸配列：ＫＫＫＧＳＶＹＤＦＦＶＷＬ、チロシナーゼ関連タンパク質２の１８０〜１８８位のアミノ酸からなるペチチドのＮ末端側に１個のグリシン残基と３個のリジン残基を付加したペプチド）を溶解させた溶解液を調製した。別途、所定量の界面活性剤（モノオレイン酸グリセリル又はポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート（Ｔｗｅｅｎ８０））を液状油（ミリスチン酸イソプロピル）に添加し、７０℃で１０分間加熱し、完全に溶解させた。これに、前記溶解液の所定量を撹拌しながら、少しずつ滴下した。これを常温になるまで撹拌することにより、メラノーマ抗原ペプチドを含む油中水型乳化形態（逆ミセルによって水相が油相に分散して乳化している形態）のワクチン製剤を得た。【００５６】
［比較例２及び参考例１］
リン酸緩衝剤（ＰＢＳ）に所定量の所定量のメラノーマ抗原ペプチド（Ｋ-ＴＲＰ−２）を添加して溶解させることにより、水溶液状のワクチン製剤を得た。【００５７】
２．免疫誘導実験
６週齢のマウス（Ｃ５７ＢＬ／６Ｎ、雌）を表２に示す４つの試験群に分けて（１群当たり、６匹）、表２に示す条件で初日（Ｄａｙ−１４）に初回免疫、１週間後（Ｄａｙ −７）に追加免疫を行った。なお、初回免疫及び追加免疫のそれぞれにおいて、投与された各成分量は表１に示す通りである。
【表２】
2020111248.tif 000004
【００５８】
追加免疫から７日後の各マウスに、ＨＢＳＳ（−）培地に１．０×１０6ｃｅｌｌｓ／ｍｌとなるように懸濁したマウスメラノーマ細胞（Ｂ１６Ｆ１０）の細胞懸濁液１００μｌを皮下注射により移植した（Ｄａｙ ０）。マウスメラノーマ細胞の移植５日後から２日おきに腫瘍の長径と短径を測定し、下記式に基づいて、腫瘍体積を算出した。
【数１】
2020111248.tif 000005
【００５９】
また、実施例１経皮投与群及び参考例１注射投与群については、マウスメラノーマ細胞の移植１４日後に、皮下から腫瘍を取り出して、腫瘍を２０μｍ厚に裁断し、スライドガラスに載せて、アロフィコシアニン（ＡＰＣ）標識抗ＣＤ８抗体とＤＡＰＩ（４’，６−ｄｉａｍｉｄｉｎｏ−２−ｐｈｅｎｙｌｉｎｄｏｌｅ）にて染色した（Ｄａｙ １４）。【００６０】
図１に実験スケジュール、図２に腫瘍体積を経時的に測定した結果、及び図３に移植１４日後取り出した腫瘍をＡＰＣ標識抗ＣＤ８抗体とＤＡＰＩで染色した結果を示す。図２から分かるように、比較例１皮下投与群及び比較例２皮下投与群では、参考例１注射投与群に比べて、腫瘍体積が大きく、がん免疫の誘導が不十分になっていた。これに対して、実施例１経皮投与群では、参考例１注射投与群よりも腫瘍体積が小さく、がん免疫を効果的に誘導できていた。更に、図３から分かるように、参考例１注射投与群では、腫瘍中にＡＰＣの蛍光が認められず、細胞障害性Ｔ細胞は腫瘍中に遊走していなかったが、実施例１経皮投与群では、腫瘍中にＡＰＣの蛍光が観察され、腫瘍中に細胞障害性Ｔ細胞が遊走していることが確認された。【００６１】
また、実施例１の経皮投与用のワクチン製剤において、モノオレイン酸グリセリルに代えて、トリオレイン酸ポリグリセリル−１０、又はイソステアリン酸ポリグリセリル−２を使用した経皮投与用のワクチン製剤を調製し、前記と同様の免疫誘導実験を行ったところ、トリオレイン酸ポリグリセリル−１０又はイソステアリン酸ポリグリセリル−２を使用した経皮投与用のワクチン製剤でも、優れたがん免疫の誘導が確認された。更に、実施例１の経皮投与用のワクチン製剤において、水相基剤をリン酸緩衝液とイソプロパノールの混合液からリン酸緩衝液単独に代えて経皮投与用のワクチン製剤を調製し、前記と同様の免疫誘導実験を行ったところ、優れたがん免疫の誘導が確認された。【００６２】
以上の結果から、抗原が水に溶解した溶解液とグリセリン脂肪酸エステル及び／又はポリグリセリン脂肪酸エステルとを含む水溶性画分を、油相に分散させたワクチン製剤は、経皮投与によって免疫を効果的に誘導できることが確認された。【００６３】
試験例２
１．製剤の調製
表３に示す組成の各製剤を以下の手法で調製した。
【表３】
2020111248.tif 000006
【００６４】
［実施例２］
水相基剤（精製水及びイソプロパノール）に、所定量の花粉抗原ペプチド（ｐｅｐＡ、アミノ酸配列：ＳＭＫＶＴＶＡＦＮＱＦＧＰ）を溶解させた溶解液を調製した。別途、所定量の界面活性剤（モノオレイン酸グリセリル）を液状油（ミリスチン酸イソプロピル）に添加し、７０℃で１０分間加熱し、完全に溶解させた。これに、前記溶解液の所定量を撹拌しながら、少しずつ滴下した。これを常温になるまで撹拌することにより、花粉抗原ペプチドを含む油中水型乳化形態（逆ミセルによって水相が油相に分散して乳化している形態）のワクチン製剤を得た。【００６５】
［比較例３］
リン酸緩衝剤（ＰＢＳ）に所定量の所定量の花粉抗原ペプチド（ｐｅｐＡ）を添加して溶解させることにより、水溶液状のワクチン製剤を得た。【００６６】
２．免疫誘導実験
６週齢のマウス（Ｂ１０．Ｓ、雌）４０匹を水と餌を自由摂取できる環境で１週間飼育して馴化させた後に、花粉抗原抽出物１０μｇ及びＩｎｊｅｃｔ？  Ａｌｕｍ  Ａｄｊｕｖａｎｔ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）４ｍｇを含むリン酸緩衝液（ＰＢＳ）２００μｌを両足の付け根に１週間に１回の頻度で合計３回皮下投与し、花粉症モデルマウスを作製した。３回目の皮下投与から６日後にヒスタミン（２０ｎｇ／ｈｅａｄ）を経鼻投与し、その翌日から、花粉暴露を１日回の頻度で５日間行った。花粉暴露は、スギ花粉抽出物（商品名「スギ花粉抽出物−Ｃｊ」、株式会社エル・エス・エル製）を０．１ｍｇ／ｍＬとなるようにＰＢＳ溶液に溶解させた花粉溶液を両鼻腔に１０μＬずつ経鼻曝露することにより行った。花粉暴露終了から１週間後に、マウスの尾から採血し、ＥＬＩＳＡにより血中のＩｇＥ抗体価を測定した。ＩｇＥ抗体価が高い順で５番目〜３４番目の花粉症モデルマウスから、１２匹を選定し、各群のＩｇＥ抗体価の平均値が同じになるように、表４に示す２群（１群当たり、６匹）に分け、通常の環境で８日間飼育した後に、表４に示す条件で初回免疫及び追加免疫を行った。
【表４】
2020111248.tif 000007
【００６７】
２回目の追加免疫終了（合計３回の免疫終了）から６日後にヒスタミン（２０ｎｇ／ｈｅａｄ）を経鼻投与し、その翌日から、花粉暴露を１日回の頻度で５日間行った。花粉暴露は、スギ花粉抽出物（商品名「スギ花粉抽出物−Ｃｊ」、株式会社エル・エス・エル製）を０．１ｍｇ／ｍＬとなるようにＰＢＳ溶液に溶解させた花粉溶液を両鼻腔に１０μＬずつ経鼻曝露することにより行った。花粉暴露終了から１週間後に、マウスの尾から採血し、更に脾臓を摘出した。【００６８】
得られた血液から血清を調製し、ＥＬＩＳＡによりＣｒｉｊ１特異的ＩｇＥ抗体、及びＩｇＧ１抗体の血清中濃度を測定した。【００６９】
また、得られた脾臓は、すりつぶして溶血処理を行った後に、７０μｍのセルストレーナーで不純物を除去することにより細胞を回収した。得られた細胞を１０％非働化済みＦＢＳ（牛胎児血清）、５０μＭの２−メルカプトエタノール、及び１％ 抗生物質／抗真菌剤混合溶液を含むＰＲＭＩ１６４０培地にて３７℃で３日間培養した後に、培養液（脾臓細胞培養液）を回収した。得られた培養液中のサイトカイン（ＩＬ−４、及びＩＬ−５）濃度をＥＬＩＳＡにより測定した。【００７０】
図４に実験スケジュール、並びに図５にＣｒｉｊ１特異的ＩｇＥ抗体、及びＩｇＧ１抗体の血清中濃度、並びに脾臓細胞培養液中のサイトカイン（ＩＬ−４、及びＩＬ−５）濃度の測定結果を示す。この結果、実施例２経皮投与群では、比較例３経皮投与群に比べて、血清中の抗体濃度が低下しており、更にアレルギー反応に関与するサイトカインの産生量を抑制できることが確認された。【００７１】
試験例３
１．製剤の調製
表５に示す組成の各製剤を以下の手法で調製した。
【表５】
2020111248.tif 000008
【００７２】
［実施例３］
水相基剤（精製水及びイソプロパノール）に、所定量のインフルエンザウイルス抗原タンパク質（Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  Ａ  Ｈ３Ｎ２（Ａ／Ａｉｃｈｉ／１９６８）Ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ／ＨＡ  Ｐｒｏｔｅｉｎ（Ｈｉｓ  ｔａｇ）、Ｓｉｎｏ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ）を溶解させた溶解液を調製した。別途、所定量の界面活性剤（モノオレイン酸グリセリル）を液状油（ミリスチン酸イソプロピル）に添加し、７０℃で１０分間加熱し、完全に溶解させた。これに、前記溶解液の所定量を撹拌しながら、少しずつ滴下した。これを常温になるまで撹拌することにより、花粉抗原ペプチドを含む油中水型乳化形態（逆ミセルによって水相が油相に分散して乳化している形態）のワクチン製剤を得た。【００７３】
［コントロール］
インフルエンザウイルス抗原タンパク質を含まないこと以外は、前記実施例３と同様の方法で、油中水型乳化形態（逆ミセルによって水相が油相に分散して乳化している形態）のワクチン製剤を得た。【００７４】
２．免疫誘導実験
６週齢のマウス（ＢＡＬＢ／ｃ、雌）を水と餌を自由摂取できる環境で１週間飼育して馴化させた後に、表６に示す２つの試験群に分けて（１群当たり、６匹）、表６に示す条件で初回免疫及び追加免疫を行った。
【表６】
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【００７５】
２回目の追加免疫後、通常の環境で３週間飼育した。初回免疫行った日から１週間に１回の頻度で、マウスの尾から採血した。得られた血液から血清を調製し、ＥＬＩＳＡにより抗インフルエンザＡ（Ｈ３Ｎ２）抗体の血清中濃度を測定した。【００７６】
図６に実験スケジュール、並びに図７に抗インフルエンザＡ（Ｈ３Ｎ２）抗体の血清中濃度の測定結果を示す。この結果、実施例３経皮投与群では、hyou
初回免疫から３週間後には、抗インフルエンザＡ（Ｈ３Ｎ２）抗体の産生が認められ、経時的に当該抗体濃度が上昇することが確認された。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【国際調査報告】
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