(57)【要約】  本発明は、野生型ステビア種と比べチラミン含量が低いチラミン低含有ステビア植物体を提供する。本発明はまた、そのようなチラミン低含有ステビア植物体を作出する方法、そのような植物体から得られる抽出物やステビオール配糖体精製品も提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
乾燥葉の単位質量当たりのチラミン含量が０．０９２％未満である、低チラミン含有ステビア植物体。
【請求項２】
乾燥葉の単位質量当たりのレバウジオシドＤ含量が１％以上である、請求項１に記載の植物体。
【請求項３】
配列番号１５０の２０１位に相当する位置の塩基がＣであるアレルについてホモ接合性である、請求項１又は２に記載の植物体。
【請求項４】
配列番号１の２０１位に相当する位置の塩基がＡであるアレルについてホモ接合性である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の植物体。
【請求項５】
以下の遺伝的特徴の少なくとも１つをさらに有する、請求項１〜４のいずれか一項に記載の植物体。
（１）配列番号２の４０位に相当する位置の塩基がＴであるアレルについてホモ接合性である。
（２）配列番号３の４４位に相当する位置の塩基がＴであるアレルについてホモ接合性である。
（３）配列番号４の４１位に相当する位置の塩基がＣであるアレルについてホモ接合性である。
（４）配列番号５の５５〜７２位に相当する部分が欠失しているアレルについてホモ接合性である。
【請求項６】
配列番号６の４９位に相当する位置の塩基がＡであるアレルについてヘテロ接合性である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の植物体。
【請求項７】
非遺伝子組換植物体である、請求項１〜６のいずれか一項に記載の植物体。
【請求項８】
突然変異誘発処理を行ったステビア植物体及びその子孫植物体を含む、請求項１〜７のいずれか一項に記載の植物体。
【請求項９】
請求項１〜８のいずれか一項に記載の植物体の種子、組織、組織培養物又は細胞。
【請求項１０】
胚、分裂組織細胞、花粉、葉、根、根端、花弁、プロトプラスト、葉の切片及びカルスから選択される、請求項９に記載の組織、組織培養物又は細胞。
【請求項１１】
請求項１〜８のいずれか一項に記載の植物体と第２のステビア植物体とを交雑させる工程を含む、乾燥葉の単位質量当たりのチラミン含量が０．０９２％未満である低チラミン含有ステビア植物体を作出する方法。
【請求項１２】
第２の植物体が請求項１〜８のいずれか一項に記載の植物体である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
チラミン含量の低い、請求項１〜８のいずれか一項に記載の植物体、請求項９又は１０に記載の種子、組織、組織培養物又は細胞の抽出物。
【請求項１４】
請求項１〜８のいずれか一項に記載の植物体、請求項９又は１０に記載の種子、組織、組織培養物又は細胞から抽出物を得る工程を含む、低チラミン含有ステビア抽出物の製造方法。
【請求項１５】
請求項１３に記載のステビア抽出物からステビオール配糖体を精製する工程を含む、低チラミン含有ステビオール配糖体精製品の製造方法。
【請求項１６】
ステビオール配糖体が、レバウジオシドＡ、レバウジオシドＢ、レバウジオシドＣ、レバウジオシドＤ、レバウジオシドＥ、レバウジオシドＦ、レバウジオシドＭ、レバウジオシドＮ、レバウジオシドＯ、ステビオシド、ステビオールビオシド、ルブソシド、ズルコシドＡ又はこれらの組合せを含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
請求項１５又は１６に記載の方法により製造された、低チラミン含有ステビオール配糖体精製品。
【請求項１８】
請求項１３に記載の組織、組織培養物又は細胞の抽出物、あるいは、請求項１７に記載の精製品を含む、低チラミン含有飲食品、甘味組成物、香料又は医薬品。
【請求項１９】
請求項１３に記載の組織、組織培養物又は細胞の抽出物、あるいは、請求項１７に記載の精製品を提供する工程、及び
前記抽出物又は精製品を、飲食品、甘味組成物、香料又は医薬品の原料に添加する工程
を含む、飲食品、甘味組成物、香料又は医薬品の製造方法。
【請求項２０】
被験ステビア植物体のゲノムから、配列番号１５０の２０１位に相当する位置の塩基がＣであるアレルについてホモ接合性であるという遺伝的特徴の存在及び／又は不在を検出する工程を含む、低チラミン含有ステビア植物体をスクリーニングする方法。
【請求項２１】
被験ステビア植物体のゲノムから、配列番号１の２０１位に相当する位置の塩基がＡであるアレルについてホモ接合性であるという遺伝的特徴の存在及び／又は不在を検出する工程をさらに含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
被験ステビア植物体のゲノムから以下の（１）〜（４）の遺伝的特徴の存在及び／又は不在を検出する工程をさらに含む、請求項２０又は２１に記載の方法。
（１）配列番号２の４０位に相当する位置の塩基がＴであるアレルについてホモ接合性である。
（２）配列番号３の４４位に相当する位置の塩基がＴであるアレルについてホモ接合性である。
（３）配列番号４の４１位に相当する位置の塩基がＣであるアレルについてホモ接合性である。
（４）配列番号５の５５〜７２位に相当する部分が欠失しているアレルについてホモ接合性である。
【請求項２３】
被験ステビア植物体のゲノムから、配列番号６の４９位に相当する位置の塩基がＡであるアレルについてヘテロ接合性であるという遺伝的特徴の存在及び／又は不在を検出する工程をさらに含む、請求項２０〜２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
遺伝的特徴を検出する工程が、ＣＡＰＳ法、ｄＣＡＰＳ法又はＴａｑＭａｎ  ＰＣＲ法を用いて行われる、請求項２０〜２３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
被験ステビア植物組織のチラミンの含有量を測定する工程をさらに含む、請求項２０〜２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
配列番号１５０の２０１位に相当する位置の塩基がＣであるアレルについてホモ接合性であるという遺伝的特徴の存在及び／又は不在を検出するための試薬を含む、低チラミン含有ステビア植物体のスクリーニングキット。
【請求項２７】
配列番号１の２０１位に相当する位置の塩基がＡであるアレルについてホモ接合性であるという遺伝的特徴の存在及び／又は不在を検出するための試薬をさらに含む、請求項２６に記載のキット。
【請求項２８】
以下の（１）〜（４）の遺伝的特徴の存在及び／又は不在を検出するための試薬をさらに含む、請求項２６又は２７に記載のキット。（１）配列番号２の４０位に相当する位置の塩基がＴであるアレルについてホモ接合性である。
（２）配列番号３の４４位に相当する位置の塩基がＴであるアレルについてホモ接合性である。
（３）配列番号４の４１位に相当する位置の塩基がＣであるアレルについてホモ接合性である。
（４）配列番号５の５５〜７２位に相当する部分が欠失しているアレルについてホモ接合性である。
【請求項２９】
配列番号６の４９位に相当する位置の塩基がＡであるアレルについてヘテロ接合性であるという遺伝的特徴の存在及び／又は不在を検出するための試薬をさらに含む、請求項２６〜２８のいずれか一項に記載のキット。
【請求項３０】
試薬が、ＣＡＰＳ法、ｄＣＡＰＳ法又はＴａｑＭａｎ  ＰＣＲ法に使用するプライマー及び／又はプローブを含む、請求項２６〜２９のいずれか一項に記載のキット。
【請求項３１】
配列番号１５０の２０１位に相当する位置にＴからＣへの変異を導入する工程を含む、低チラミン含有ステビア植物体を作出する方法。
【請求項３２】
変異の導入が、突然変異誘発処理によって行われる、請求項３１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、チラミンの含有量が低いステビア植物に関する。
【背景技術】
【０００２】
チラミンは乳製品や魚製品などの食品で検出されることの多い生体アミンである。チラミンは血管収縮作用を有し、食事性片頭痛、拍出量の増大、悪心、嘔吐、呼吸器障害、血糖値の上昇などを引き起こすことがある（非特許文献１）。チラミンはモノアミンオキシダーゼにより代謝され、不活性化するが、モノアミンオキシダーゼ阻害薬を投与されている対象ではチラミンの代謝が抑制され、上記のような症状が生じやすくなる。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００３】
【非特許文献１】Gardini et al., Front Microbiol. 2016;7:1218
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
近年の健康志向の高まりを受け、安全性の高い食品へのニーズが高まっている。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明は、チラミン含量の少ないステビア植物体並びに当該植物体の作出方法及びスクリーニング方法を提供する。【０００６】
一態様において、本発明は以下を提供する。
［１］
乾燥葉の単位質量当たりのチラミン含量が０．０９２％未満である、低チラミン含有ステビア植物体。
［２］
乾燥葉の単位質量当たりのレバウジオシドＤ含量が１％以上である、［１］に記載の植物体。
［３］
配列番号１５０の２０１位に相当する位置の塩基がＣであるアレルについてホモ接合性である、［１］又は［２］に記載の植物体。
［４］
配列番号１の２０１位に相当する位置の塩基がＡであるアレルについてホモ接合性である、［１］〜［３］のいずれか一項に記載の植物体。
［５］
以下の遺伝的特徴の少なくとも１つをさらに有する、［１］〜［４］のいずれか一項に記載の植物体。
（１）配列番号２の４０位に相当する位置の塩基がＴであるアレルについてホモ接合性である。
（２）配列番号３の４４位に相当する位置の塩基がＴであるアレルについてホモ接合性である。
（３）配列番号４の４１位に相当する位置の塩基がＣであるアレルについてホモ接合性である。
（４）配列番号５の５５〜７２位に相当する部分が欠失しているアレルについてホモ接合性である。【０００７】
［６］
配列番号６の４９位に相当する位置の塩基がＡであるアレルについてヘテロ接合性である、［１］〜［５］のいずれか一項に記載の植物体。
［７］
非遺伝子組換植物体である、［１］〜［６］のいずれか一項に記載の植物体。
［８］
突然変異誘発処理を行ったステビア植物体及びその子孫植物体を含む、［１］〜［７］のいずれか一項に記載の植物体。
［９］
［１］〜［８］のいずれか一項に記載の植物体の種子、組織、組織培養物又は細胞。
［１０］
胚、分裂組織細胞、花粉、葉、根、根端、花弁、プロトプラスト、葉の切片及びカルスから選択される、［９］に記載の組織、組織培養物又は細胞。【０００８】
［１１］
［１］〜［８］のいずれか一項に記載の植物体と第２のステビア植物体とを交雑させる工程を含む、乾燥葉の単位質量当たりのチラミン含量が０．０９２％未満である低チラミン含有ステビア植物体を作出する方法。
［１２］
第２の植物体が［１］〜［８］のいずれか一項に記載の植物体である、［１１］に記載の方法。
［１３］
チラミン含量の低い、［１］〜［８］のいずれか一項に記載の植物体、［９］又は［１０］に記載の種子、組織、組織培養物又は細胞の抽出物。
［１４］
［１］〜［８］のいずれか一項に記載の植物体、［９］又は［１０］に記載の種子、組織、組織培養物又は細胞から抽出物を得る工程を含む、低チラミン含有ステビア抽出物の製造方法。
［１５］
［１３］に記載のステビア抽出物からステビオール配糖体を精製する工程を含む、低チラミン含有ステビオール配糖体精製品の製造方法。【０００９】
［１６］
ステビオール配糖体が、レバウジオシドＡ、レバウジオシドＢ、レバウジオシドＣ、レバウジオシドＤ、レバウジオシドＥ、レバウジオシドＦ、レバウジオシドＭ、レバウジオシドＮ、レバウジオシドＯ、ステビオシド、ステビオールビオシド、ルブソシド、ズルコシドＡ又はこれらの組合せを含む、［１５］に記載の方法。
［１７］
［１５］又は［１６］に記載の方法により製造された、低チラミン含有ステビオール配糖体精製品。
［１８］
［１３］に記載の組織、組織培養物又は細胞の抽出物、あるいは、［１７］に記載の精製品を含む、低チラミン含有飲食品、甘味組成物、香料又は医薬品。
［１９］
［１３］に記載の組織、組織培養物又は細胞の抽出物、あるいは、［１７］に記載の精製品を提供する工程、及び
前記抽出物又は精製品を、飲食品、甘味組成物、香料又は医薬品の原料に添加する工程
を含む、飲食品、甘味組成物、香料又は医薬品の製造方法。
［２０］
被験ステビア植物体のゲノムから、配列番号１５０の２０１位に相当する位置の塩基がＣであるアレルについてホモ接合性であるという遺伝的特徴の存在及び／又は不在を検出する工程を含む、低チラミン含有ステビア植物体をスクリーニングする方法。【００１０】
［２１］
被験ステビア植物体のゲノムから、配列番号１の２０１位に相当する位置の塩基がＡであるアレルについてホモ接合性であるという遺伝的特徴の存在及び／又は不在を検出する工程をさらに含む、［２０］に記載の方法。
［２２］
被験ステビア植物体のゲノムから以下の（１）〜（４）の遺伝的特徴の存在及び／又は不在を検出する工程をさらに含む、［２０］又は［２１］に記載の方法。
（１）配列番号２の４０位に相当する位置の塩基がＴであるアレルについてホモ接合性である。
（２）配列番号３の４４位に相当する位置の塩基がＴであるアレルについてホモ接合性である。
（３）配列番号４の４１位に相当する位置の塩基がＣであるアレルについてホモ接合性である。
（４）配列番号５の５５］〜［７２位に相当する部分が欠失しているアレルについてホモ接合性である。
［２３］
被験ステビア植物体のゲノムから、配列番号６の４９位に相当する位置の塩基がＡであるアレルについてヘテロ接合性であるという遺伝的特徴の存在及び／又は不在を検出する工程をさらに含む、［２０］〜［２２］のいずれか一項に記載の方法。
［２４］
遺伝的特徴を検出する工程が、ＣＡＰＳ法、ｄＣＡＰＳ法又はＴａｑＭａｎ  ＰＣＲ法を用いて行われる、［２０］〜［２３］のいずれか一項に記載の方法。
［２５］
被験ステビア植物組織のチラミンの含有量を測定する工程をさらに含む、［２０］〜［２４］のいずれか一項に記載の方法。【００１１】
［２６］
配列番号１５０の２０１位に相当する位置の塩基がＣであるアレルについてホモ接合性であるという遺伝的特徴の存在及び／又は不在を検出するための試薬を含む、低チラミン含有ステビア植物体のスクリーニングキット。
［２７］
配列番号１の２０１位に相当する位置の塩基がＡであるアレルについてホモ接合性であるという遺伝的特徴の存在及び／又は不在を検出するための試薬をさらに含む、［２６］に記載のキット。
［２８］
以下の（１）〜（４）の遺伝的特徴の存在及び／又は不在を検出するための試薬をさらに含む、［２６］又は［２７］に記載のキット。
（１）配列番号２の４０位に相当する位置の塩基がＴであるアレルについてホモ接合性である。
（２）配列番号３の４４位に相当する位置の塩基がＴであるアレルについてホモ接合性である。
（３）配列番号４の４１位に相当する位置の塩基がＣであるアレルについてホモ接合性である。
（４）配列番号５の５５〜７２位に相当する部分が欠失しているアレルについてホモ接合性である。
［２９］
配列番号６の４９位に相当する位置の塩基がＡであるアレルについてヘテロ接合性であるという遺伝的特徴の存在及び／又は不在を検出するための試薬をさらに含む、［２６］〜［２８］のいずれか一項に記載のキット。
［３０］
試薬が、ＣＡＰＳ法、ｄＣＡＰＳ法又はＴａｑＭａｎ  ＰＣＲ法に使用するプライマー及び／又はプローブを含む、［２６］〜［２９］のいずれか一項に記載のキット。
［３１］
配列番号１５０の２０１位に相当する位置にＴからＣへの変異を導入する工程を含む、低チラミン含有ステビア植物体を作出する方法。
［３２］
変異の導入が、突然変異誘発処理によって行われる、［３１］に記載の方法。
【発明の効果】
【００１２】
本発明によって、チラミン含量の少ないステビア植物体の取得、そのような植物体を作出するための手段、そのような植物体より得られる葉、この葉より得られた抽出物を含む食物や飲料などの提供が可能になる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】チラミン含量とＲｅｂＤ含量との相関分析の結果を示した図である。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
以下、本発明を詳細に説明する。以下の実施の形態は、本発明を説明するための例示であり、本発明をそのような実施の形態のみに限定する趣旨ではない。本発明は、その要旨を逸脱しない限り、様々な形態で実施をすることができる。
なお、本明細書において引用した全ての文献、及び公開公報、特許公報その他の特許文献は、参照として本明細書に組み込むものとする。また、本明細書は、２０１８年１２月２８日に出願された本願優先権主張の基礎となる日本国特許出願（特願２０１８−２４８６５７号）の明細書及び図面に記載の内容を包含する。
【００１５】
１．チラミン低含有ステビア植物体
本発明は、乾燥葉の単位質量当たりのチラミン含量が０．０９２％未満であるチラミン低含有ステビア植物体（以下、「本発明の植物体」又は「本発明のステビア植物体」と総称する場合がある）を提供する。
ステビアは南米パラグアイを原産地とする菊科多年生植物で、学名をステビア・レバウディアナ・ベルトニー（Ｓｔｅｖｉａ  Ｒｅｂａｕｄｉａｎａ  Ｂｅｒｔｏｎｉ）という。
【００１６】
「乾燥葉の単位質量当たりのチラミン含量が０．０９２％未満である」とは、例えば、所定の質量の乾燥葉（例えば、５０ｍｇ）に、０．０９２質量％未満の割合のチラミン（例えば、０．０４６ｍｇ未満）が含まれることを意味する。本発明の植物体におけるチラミン含量は、限定されずに、例えば、乾燥葉の単位質量当たり０．０９０％以下、０．０８０％以下、０．０７０％以下、０．０６０％以下、０．０５８％以下、０．０５７％以下、０．０５６％以下、０．０５５％以下、０．０５４％以下、０．０５３％以下、０．０５２％以下、０．０５１％以下、０．０５０％以下、０．０４９％以下、０．０４８％以下、０．０４７％以下、０．０４６％以下、０．０４５％以下、０．０４４％以下、０．０４３％以下、０．０４２％以下、０．０４１％以下、０．０４０％以下、０．０３９％以下、０．０３８％以下、０．０３７％以下、０．０３６％以下、０．０３５％以下、０．０３４％以下、０．０３３％以下、０．０３２％以下、０．０３１％以下、０．０３０％以下、０．０２９％以下、０．０２８％以下、０．０２７％以下、０．０２６％以下、０．０２５％以下、０．０２４％以下、０．０２３％以下、０．０２２％以下、０．０２１％以下、０．０２０％以下、０．０１９％以下、０．０１８％以下、０．０１７％以下、０．０１６％以下、０．０１５％以下、０．０１４％以下、０．０１３％以下、０．０１２％以下、０．０１１％以下、０．０１０％以下であってよい。本発明の植物体におけるチラミン含量は低いほど好ましく、０．０５８％以下がより好ましく、０．０３０％以下が特に好ましい。
ここで乾燥葉とは、本発明のステビア植物体の新鮮葉を乾燥させることにより含水量を３〜４重量％にまで減らしたものをいう。
【００１７】
本発明の植物体は、乾燥葉の単位質量当たり１％以上のＲｅｂＤを含んでもよい。この態様における乾燥葉の単位質量当たりのＲｅｂＤの割合は、限定されずに、例えば、１％以上、１．５％以上、２％以上、２．５％以上、３％以上、３．３％以上、３．４％以上、３．５％以上、３．６％以上、３．７％以上、３．８％以上、３．９％以上、４．０％以上、４．１％以上、４．２％以上、４．３％以上、４．４％以上、４．５％以上、４．６％以上、４．７％以上、４．８％以上、４．９％以上、５．０％以上、５．１％以上、５．２％以上、５．３％以上、５．４％以上、５．５％以上、５．６％以上、５．７％以上、５．８％以上、５．９％以上、６．０％以上等であってよく、３．３％以上が好ましく、３．６％以上がより好ましい。乾燥葉の単位質量当たりのＲｅｂＤの割合の上限は特に限定されないが、例えば、２０％、１５％、１０％などであってよい。
【００１８】
一態様において、本発明のステビア植物体は、配列番号１５０の２０１位に相当する位置の塩基がＣであるアレルについてホモ接合性であるという遺伝的特徴（以下、「本発明の遺伝的特徴Ｘ」と称する場合がある）を有する。
一態様において、本発明のステビア植物体は、配列番号１の２０１位に相当する位置の塩基がＡであるアレルについてホモ接合性であるという遺伝的特徴（以下、「本発明の遺伝的特徴Ａ」と称する場合がある）を有する。
別の態様において、本発明のステビア植物体は、以下の（Ｂ−１）〜（Ｂ−４）の少なくとも１つの遺伝的特徴（以下、「本発明の遺伝的特徴Ｂ」と称する場合がある）を有する。
（Ｂ−１）配列番号２の４０位に相当する位置の塩基がＴであるアレルについてホモ接合性である（以下、「本発明の遺伝的特徴Ｂ−１」と称する場合がある）。
（Ｂ−２）配列番号３の４４位に相当する位置の塩基がＴであるアレルについてホモ接合性である（以下、「本発明の遺伝的特徴Ｂ−２」と称する場合がある）。
（Ｂ−３）配列番号４の４１位に相当する位置の塩基がＣであるアレルについてホモ接合性である（以下、「本発明の遺伝的特徴Ｂ−３」と称する場合がある）。
（Ｂ−４）配列番号５の５５〜７２位に相当する部分が欠失しているアレルについてホモ接合性である（以下、「本発明の遺伝的特徴Ｂ−４」と称する場合がある）。
別の態様において、本発明のステビア植物体は、配列番号６の４９位に相当する位置の塩基がＡであるアレルについてヘテロ接合性であるという遺伝的特徴（以下、「本発明の遺伝的特徴Ｃ」と称する場合がある）を有する。
【００１９】
好ましい態様において、本発明のステビア植物体は、本発明の遺伝的特徴Ｘと遺伝的特徴Ａとを有する。別の好ましい態様において、本発明のステビア植物体は、本発明の遺伝的特徴Ｘと遺伝的特徴Ｂ（すなわち、本発明の遺伝的特徴Ｂ−１〜Ｂ−４の少なくとも１つ）とを有する。別の好ましい態様において、本発明のステビア植物体は、本発明の遺伝的特徴Ｘと遺伝的特徴Ｃとを有する。別の好ましい態様において、本発明のステビア植物体は、本発明の遺伝的特徴Ｘと遺伝的特徴Ａと遺伝的特徴Ｂ（すなわち、本発明の遺伝的特徴Ｂ−１〜Ｂ−４の少なくとも１つ）とを有する。別の好ましい態様において、本発明のステビア植物体は、本発明の遺伝的特徴Ｘと遺伝的特徴Ａと遺伝的特徴Ｃとを有する。別の好ましい態様において、本発明のステビア植物体は、本発明の遺伝的特徴Ｘと遺伝的特徴Ｂと遺伝的特徴Ｃとを有する。より好ましい態様において、本発明のステビア植物体は、本発明の遺伝的特徴Ｘ、Ａ、Ｂ及びＣをすべて有する。
【００２０】
「〜に相当する位置（又は部分）」とは、ゲノム中に基準配列（例えば、配列番号１〜６、１５０など）と同一の配列が存在する場合は、ゲノム中に存在するその配列中の位置又は部分（例えば、２０１位、４０位、４４位、４１位、５５〜７２位、４９位など）を意味し、ゲノム中に基準配列と同一の配列が存在しない場合は、ゲノム中の基準配列に相当する配列中の、基準配列中の位置又は部分に相当する位置又は部分を意味する。ゲノム中に基準配列と同一又はそれに相当する配列が存在するかどうかは、例えば、基準配列をＰＣＲで増幅し得るプライマーで、対象となるステビア植物のゲノムＤＮＡを増幅し、増幅産物のシーケンシングを行い、得られた配列と基準配列とのアラインメント解析を行うことで決定することができる。基準配列に相当する配列の非限定例としては、例えば、基準配列に対し６０％以上、７０％以上、７５％以上、８０％以上、８１％以上、８２％以上、８３％以上、８４％以上、８５％以上、８６％以上、８７％以上、８８％以上、８９％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９８．１％以上、９８．４％以上、９８．７％以上、９９％以上、９９．２％以上、９９．５％以上又は９９．８％以上の配列同一性を有する塩基配列が挙げられる。ゲノム中の基準配列に相当する配列中の、基準配列中の位置又は部分に相当する位置又は部分は、基準配列中の位置又は部分の前後の塩基配列等を考慮して決定することができる。例えば、基準配列とゲノム中の基準配列に相当する配列とのアライメント解析により、ゲノム中の基準配列に相当する配列中の、基準配列中の位置又は部分に相当する位置又は部分を決定することができる。
【００２１】
例えば、本発明の遺伝的特徴Ａの「配列番号１の２０１位に相当する位置」を例にとると、ステビア植物体のゲノムが配列番号１と同一の塩基配列からなる部分を有している場合、「配列番号１の２０１位に相当する位置」はゲノム中の配列番号１と同一の塩基配列からなる部分の５’側から２０１位である。一方、ステビア植物体のゲノムが配列番号１と同一ではないがこれに相当する塩基配列からなる部分を有している場合、ゲノムは配列番号１と同一の塩基配列からなる部分を有しないため、「配列番号１の２０１位に相当する位置」は、必ずしも配列番号１に相当する部分の５’側から２０１位に該当するわけではないが、配列番号１の２０１位の前後の塩基配列等を考慮し、かかるステビア植物のゲノムにおける「配列番号１の２０１位に相当する位置」を特定することができる。例えば、ステビア植物のゲノムにおける配列番号１に相当する部分の塩基配列と、配列番号１の塩基配列とのアライメント解析により、ステビア植物のゲノムにおける「配列番号１の２０１位に相当する位置」を特定することができる。
【００２２】
「配列番号１に相当する塩基配列からなる部分」は、例えば、配列番号１の塩基配列に対し、６０％以上、７０％以上、７５％以上、８０％以上、８１％以上、８２％以上、８３％以上、８４％以上、８５％以上、８６％以上、８７％以上、８８％以上、８９％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９８．１％以上、９８．４％以上、９８．７％以上、９９％以上、９９．２％以上、９９．５％以上又は９９．８％以上の配列同一性を有する塩基配列からなる部分を意味する。
【００２３】
一部の態様において、「配列番号１に相当する塩基配列からなる部分」には、配列番号１の５’末端から１５〜２５塩基長の部分の相補配列にハイブリダイズするフォワードプライマーと、配列番号１の３’末端側から１５〜２５塩基長の部分にハイブリダイズするリバースプライマーとを用いたＰＣＲにより増幅され得るステビア植物体のゲノムの部分が含まれる。
ここでは簡潔のため本発明の遺伝的特徴Ａを例に説明したが、本発明の遺伝的特徴Ｘ、Ｂ（遺伝的特徴Ｂ−１〜Ｂ−４を含む）及びＣについても同様である。
【００２４】
特定の態様において、「配列番号１５０に相当する塩基配列からなる部分」には、例えば、配列番号１５１の塩基配列を含むフォワードプライマーと、配列番号１５２の塩基配列を含むリバースプライマーとを用いたＰＣＲにより増幅され得るステビア植物のゲノムの部分が含まれる。
特定の態様において、「配列番号１に相当する塩基配列からなる部分」には、例えば、配列番号７の塩基配列を含むフォワードプライマーと、配列番号８の塩基配列を含むリバースプライマーとを用いたＰＣＲにより増幅され得るステビア植物のゲノムの部分が含まれる。
特定の態様において、「配列番号２に相当する塩基配列からなる部分」には、例えば、配列番号９の塩基配列を含むフォワードプライマーと、配列番号１０の塩基配列を含むリバースプライマーとを用いたＰＣＲにより増幅され得るステビア植物のゲノムの部分が含まれる。
特定の態様において、「配列番号３に相当する塩基配列からなる部分」には、例えば、配列番号１１の塩基配列を含むフォワードプライマーと、配列番号１２の塩基配列を含むリバースプライマーとを用いたＰＣＲにより増幅され得るステビア植物のゲノムの部分が含まれる。
特定の態様において、「配列番号４に相当する塩基配列からなる部分」には、例えば、配列番号１３の塩基配列を含むフォワードプライマーと、配列番号１４の塩基配列を含むリバースプライマーとを用いたＰＣＲにより増幅され得るステビア植物のゲノムの部分が含まれる。
特定の態様において、「配列番号５に相当する塩基配列からなる部分」には、例えば、配列番号１５の塩基配列を含むフォワードプライマーと、配列番号１６の塩基配列を含むリバースプライマーとを用いたＰＣＲにより増幅され得るステビア植物のゲノムの部分が含まれる。
特定の態様において、「配列番号６に相当する塩基配列からなる部分」には、例えば、配列番号１７の塩基配列を含むフォワードプライマーと、配列番号１８の塩基配列を含むリバースプライマーとを用いたＰＣＲにより増幅され得るステビア植物のゲノムの部分が含まれる。
【００２５】
特定の態様において、「配列番号１５０の２０１位に相当する位置の塩基がＣであるアレル」は、配列番号１５３、１５４又は１５５の塩基配列を含む。
特定の態様において、「配列番号１の２０１位に相当する位置の塩基がＡであるアレル」は、配列番号１９、２０又は２１の塩基配列を含む。
特定の態様において、「配列番号２の４０位に相当する位置の塩基がＴであるアレル」は、配列番号２２、２３又は２４の塩基配列を含む。
特定の態様において、「配列番号３の４４位に相当する位置の塩基がＴであるアレル」は、配列番号２５、２６又は２７の塩基配列を含む。
特定の態様において、「配列番号４の４１位に相当する位置の塩基がＣであるアレル」は、配列番号２８、２９又は３０の塩基配列を含む。
特定の態様において、「配列番号５の５５〜７２位に相当する部分が欠失しているアレル」は、配列番号３１、３２又は３３の塩基配列を含む。
特定の態様において、「配列番号６の４９位に相当する位置の塩基がＡであるアレル」は、配列番号３４、３５又は３６の塩基配列を含む。
【００２６】
ここで、（Ｘ）配列番号１５０の２０１位に相当する位置、（Ａ）配列番号１の２０１位に相当する位置、（Ｂ−１）配列番号２の４０位に相当する位置、（Ｂ−２）配列番号３の４４位に相当する位置、（Ｂ−３）配列番号４の４１位に相当する位置、（Ｂ−４）配列番号５の５５〜７２位に相当する部分、及び（Ｃ）配列番号６の４９位に相当する位置からなる群から選択される位置を、「本発明の多型部位」又は「本発明の変異部位」と総称することがある。
また、（Ｘ）配列番号１５０の２０１位に相当する位置におけるＴからＣへの変異、（Ａ）配列番号１の２０１位に相当する位置におけるＣからＡへの変異、（Ｂ−１）配列番号２の４０位に相当する位置におけるＡからＴへの変異、（Ｂ−２）配列番号３の４４位に相当する位置におけるＣからＴへの変異、（Ｂ−３）配列番号４の４１位に相当する位置におけるＧからＣへの変異、（Ｂ−４）配列番号５の５５〜７２位に相当する部分の欠失、及び（Ｃ）配列番号６の４９位に相当する位置におけるＣからＡへの変異からなる群から選択される変異を、「本発明の多型」又は「本発明の変異」と総称することがある。
【００２７】
上記の遺伝的特徴は、ＰＣＲ法、TaqMan PCR法、シーケンス法、マイクロアレイ法、インベーダー法、TILLING法、ＲＡＤ（random amplified polymorphic DNA）法、制限酵素断片長多型（ＲＦＬＰ）法、ＰＣＲ−ＳＳＣＰ法、ＡＦＬＰ（amplified fragment length polymorphism）法、ＳＳＬＰ（simple sequence length polymorphism）法、ＣＡＰＳ（cleaved amplified polymorphic sequence）法、ｄＣＡＰＳ（derived cleaved amplified polymorphic sequence）法、アレル特異的オリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）法、ＡＲＭＳ法、変性剤濃度勾配ゲル電気泳動（ＤＧＧＥ）法、ＣＣＭ（chemical cleavage of mismatch）法、ＤＯＬ法、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＭＳ法、ＴＤＩ法、パドロックプローブ法、分子ビーコン法、ＤＡＳＨ（dynamic allele specific hybridization）法、ＵＣＡＮ法、ＥＣＡ法、ＰＩＮＰＯＩＮＴ法、ＰＲＯＢＥ（primer oligo base extension）法、ＶＳＥＴ（very short extension）法、Survivor assay、Sniper assay、Luminex assay、ＧＯＯＤ法、ＬＣｘ法、ＳＮａＰｓｈｏｔ法、Mass ARRAY法、パイロシークエンス法、ＳＮＰ−ＩＴ法、融解曲線分析法等により検出することが可能であるが、検出方法はこれらに限定されるものではない。
【００２８】
特定の態様において、本発明の遺伝的特徴は、以下のプライマーセット及び制限酵素の組合せで検出することが可能である。
候補植物体が遺伝的特徴Ｘを有する場合、例えば、候補植物体のゲノムＤＮＡに対し、配列番号１５６に示す塩基配列を有するフォワードプライマー及び配列番号１５７に示す塩基配列を有するリバースプライマーを用いてＰＣＲ増幅を行い、得られたＰＣＲ産物（約２３８ｂｐ長、例えば、配列番号１５８又は１５９）に対し制限酵素Ｈｐｙ１８８Ｉによる処理を行うと、約５１ｂｐ長（例えば、配列番号１６０）、約１０７ｂｐ長（例えば、配列番号１６１）及び約８０ｂｐ長のバンド（例えば、配列番号１６２）が生じる。一方、約５１ｂｐ長（例えば、配列番号１６０）及び約１８７ｂｐ長（例えば、配列番号１６３）の制限酵素処理産物を生じる場合、その候補植物体は遺伝的特徴Ｘを有しない。
【００２９】
候補植物体が遺伝的特徴Ａを有する場合、例えば、候補植物体のゲノムＤＮＡに対し、配列番号３７に示す塩基配列を有するフォワードプライマー及び配列番号３８に示す塩基配列を有するリバースプライマーを用いてＰＣＲ増幅を行い、得られたＰＣＲ産物（約１９６ｂｐ長、例えば、配列番号３９又は４０）に対し制限酵素Ｈｐｙ１８８Ｉによる処理を行うと、約９６ｂｐ長のバンド（例えば、配列番号４１）と約１００ｂｐ長のバンド（例えば、配列番号４２）が生じる。一方、約４３ｂｐ（例えば、配列番号４３）及び約５７ｂｐ（例えば、配列番号４４）の制限酵素処理産物を生じる場合、その候補植物体は遺伝的特徴Ａを有しない。
【００３０】
候補植物体が遺伝的特徴Ｂ−１を有する場合、例えば、候補植物体のゲノムＤＮＡに対し、配列番号４５に示す塩基配列を有するフォワードプライマー及び配列番号４６に示す塩基配列を有するリバースプライマーを用いてＰＣＲ増幅を行い、得られたＰＣＲ産物（約２９７ｂｐ長、例えば、配列番号４７又は４８）に対しＫｐｎＩ制限酵素処理を行っても約２９７ｂｐ長のバンド（例えば、配列番号４７）しか得られない。一方、約２５８ｂｐの制限酵素処理産物（例えば、配列番号４９）を生じる場合、その候補植物体は遺伝的特徴Ｂ−１を有しない。
【００３１】
候補植物体が遺伝的特徴Ｂ−２を有する場合、例えば、候補植物体のゲノムＤＮＡに対し、配列番号５０に示す塩基配列を有するフォワードプライマー及び配列番号５１に示す塩基配列を有するリバースプライマーを用いてＰＣＲ増幅を行い、得られたＰＣＲ産物（約３８３ｂｐ長、例えば、配列番号５２又は５３）にＸｂａＩ制限酵素処理を行っても約３８３ｂｐ長のバンド（例えば、配列番号５２）しか得られない。一方、上記ＰＣＲ産物に対しＸｂａＩ制限酵素処理を行った場合に約３４４ｂｐ長の制限酵素処理産物（例えば、配列番号５４）を生じた場合、その候補植物体は遺伝的特徴Ｂ−２を有しない。
【００３２】
候補植物体が遺伝的特徴Ｂ−３を有する場合、例えば、候補植物体のゲノムＤＮＡに対し、配列番号５５に示す塩基配列を有するフォワードプライマー及び配列番号５６に示す塩基配列を有するリバースプライマーを用いてＰＣＲ増幅を行い、得られたＰＣＲ産物（約３９０ｂｐ長、例えば、配列番号５７又は５８）に対しＡｆｌＩＩ制限酵素処理を行っても約３９０ｂｐ長のバンド（例えば、配列番号５７）しか得られない。一方、約３４７ｂｐ長の制限酵素処理産物（例えば、配列番号５９）を生じる場合、その候補植物体は遺伝的特徴Ｂ−３を有しない。
【００３３】
候補植物体が遺伝的特徴Ｂ−４を有する場合、候補植物体のゲノムＤＮＡに対し、配列番号６０に示す塩基配列を有するフォワードプライマー及び配列番号６１に示す塩基配列を有するリバースプライマーを用いてＰＣＲ増幅を行うと約１４０ｂｐのＰＣＲ産物（例えば、配列番号６２）のみを生じる。一方、１４０ｂｐ長（例えば、配列番号６２）及び１５８ｂｐ長（例えば、配列番号６３）のＰＣＲ産物を生じる場合、その候補植物体は遺伝的特徴Ｂ−４を有しない。
【００３４】
候補植物体が遺伝的特徴Ｃを有する場合、例えば、候補植物体のゲノムＤＮＡに対し、配列番号６４に示す塩基配列を有するフォワードプライマー及び配列番号６５に示す塩基配列を有するリバースプライマーを用いてＰＣＲ増幅を行い、得られたＰＣＲ産物（約３６７ｂｐ長、例えば、配列番号６６又は６７）に対し制限酵素ＳｐｅＩで処理を行うと約３６７ｂｐ長（例えば、配列番号６６）及び約３２１ｂｐ長（例えば、配列番号６８）のバンドが得られる。一方、約３６７ｂｐ長の制限酵素処理産物（例えば、配列番号６７）のみを生じる場合、その候補植物体は遺伝的特徴Ｃを有しない。
上記ｂｐ長に関し、「約」とは、±５ｂｐを意味する。制限酵素処理は、使用する各制限酵素の販売元が推奨する条件に従って行うことができる。
【００３５】
チラミンは、既知の任意の手法又は実施例１に記載の手法で抽出、定量することができる。チラミン含量測定法の非限定例としては、例えば、以下の手法が挙げられる。
（１）ステビア植物体の新鮮葉をトリクロロ酢酸水溶液（例えば、２０％トリクロロ酢酸水溶液）でホモジナイズし、所定時間放置する。
（２）上清にオクタンスルホン酸ナトリウム（例えば、０．１ｍｏｌ／Ｌ）を添加、混和し、固相抽出デバイス（例えば、Sep-Pak(R) Vac 6cc 1g C18 Cartridges、Watersを使用）に供する。
（３）固相抽出デバイスを洗浄後、メタノール水溶液（例えば、８０％メタノール水溶液）でアミン類を溶出する。
（４）溶出液を必要に応じて濃縮し（例えば１０倍濃縮）、内部標準溶液（例えば、１，８−ジアミノオクタンを２０μｇ／ｍＬの濃度で０．５ｍｏｌ／Ｌ塩酸に溶解したもの）、無水炭酸ナトリウム、ダンシルクロライド・アセトン溶液を加えてよく混和し、遮光して４５℃の水浴中で所定時間（例えば１時間）加温する。
（５）プロリン溶液（例えば、１０％プロリン溶液）を加え、振とうし所定時間（例えば１０分間）放置する。
（６）トルエンを加えて所定時間（例えば１分間）振とうし、上層のトルエン層を採取する。必要に応じて残液に対し同様の操作を行う。
（７）トルエン層を減圧濃縮・乾固し（例えば４０℃以下で）、残留物にアセトニトリルを加えてよく混和する。
（８）得られた溶液をＨＰＬＣで分析する。
【００３６】
ＲｅｂＤは、本発明の植物体の新鮮葉又は乾燥葉に適切な溶媒（水等の水性溶媒又はアルコール、エーテル及びアセトン等の有機溶媒）を反応させることにより抽出液の状態で抽出することができる。抽出条件等はOhta et al.,J. Appl. Glycosci., Vol. 57, No. 3 (2010)又はWO2010/038911に記載の方法や、後述の実施例に記載の方法を参照することができる。
さらに、このようにして得られた抽出液に対し、酢酸エチルその他の有機溶媒：水の勾配、高速液体クロマトグラフィー（High Performance Liquid Chromatography:HPLC）、ガスクロマトグラフィー、飛行時間型質量分析（Time-of-Flight mass spectrometry:TOF-MS）、超高性能液体クロマトグラフィー（Ultra (High) Performance Liquid chromatography:UPLC）等の公知の方法を用いることによりＲｅｂＤを精製することができる。
【００３７】
ＲｅｂＤの含量は、Ohta et al.,J. Appl. Glycosci., Vol. 57, No. 3 (2010)又はWO2010/038911に記載の方法や、後述の実施例に記載の方法で測定することができる。具体的には本発明のステビア植物体から新鮮葉をサンプリングし、ＬＣ／ＭＳ−ＭＳを行うことにより測定することができる。
【００３８】
本発明の植物体には植物体全体のみならず、植物器官（例えば葉、花弁、茎、根、種子など）、植物組織（例えば表皮、師部、柔組織、木部、維管束、柵状組織、海綿状組織など）あるいは種々の形態の植物細胞（例えば、懸濁培養細胞）、プロトプラスト、葉の切片、カルスなどが含まれ得る。また、葉は先に述べた乾燥葉であってもよい。
【００３９】
また、本発明の植物体には、組織培養物又は植物培養細胞も含まれ得る。このような組織培養物又は植物培養細胞を培養することにより、植物体を再生することができるからである。本発明の植物体の組織培養物又は植物培養細胞の例としては、胚、分裂組織細胞、花粉、葉、根、根端、花弁、プロトプラスト、葉の切片及びカルス等が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００４０】
２．本発明の植物体の作出方法
本発明は、別の実施態様において、本発明のステビア植物体と第２のステビア植物体とを交雑させる工程を含む、乾燥葉の単位質量当たりのチラミン含量が０．０９２％未満であるチラミン低含有ステビア植物体を作出する方法（以下、「本発明の作出方法」と称する場合がある）を提供する。
当該方法により作出される「乾燥葉の単位質量当たりのチラミン含量が０．０９２％未満であるチラミン低含有ステビア植物体」は、本発明の植物体と同じ表現型と遺伝的性質を有する。
本発明の作出方法によって得られる植物体におけるチラミン及びＲｅｂＤ含量の範囲は、本発明の植物体について上記したとおりである。
【００４１】
一態様において、本発明の作出方法によって得られる植物体は、本発明の遺伝的特徴Ｘを有する。一態様において、本発明の作出方法によって得られる植物体は、本発明の遺伝的特徴Ａを有する。別の態様において、本発明の作出方法によって得られる植物体は、本発明の遺伝的特徴Ｂ（すなわち、本発明の遺伝的特徴Ｂ−１〜Ｂ−４の少なくとも１つ）を有する。別の態様において、本発明の作出方法によって得られる植物体は、本発明の遺伝的特徴Ｃを有する。好ましい態様において、本発明の作出方法によって得られる植物体は、本発明の遺伝的特徴Ｘと遺伝的特徴Ａとを有する。別の好ましい態様において、本発明の作出方法によって得られる植物体は、本発明の遺伝的特徴Ｘと遺伝的特徴Ｂ（すなわち、本発明の遺伝的特徴Ｂ−１〜Ｂ−４の少なくとも１つ）とを有する。別の好ましい態様において、本発明の作出方法によって得られる植物体は、本発明の遺伝的特徴Ｘと遺伝的特徴Ｃとを有する。別の好ましい態様において、本発明の作出方法によって得られる植物体は、本発明の遺伝的特徴Ｘと遺伝的特徴Ａと遺伝的特徴Ｂ（すなわち、本発明の遺伝的特徴Ｂ−１〜Ｂ−４の少なくとも１つ）とを有する。別の好ましい態様において、本発明の作出方法によって得られる植物体は、本発明の遺伝的特徴Ｘと遺伝的特徴Ａと遺伝的特徴Ｃとを有する。別の好ましい態様において、本発明の作出方法によって得られる植物体は、本発明の遺伝的特徴Ｘと遺伝的特徴Ｂと遺伝的特徴Ｃとを有する。より好ましい態様において、本発明の作出方法によって得られる植物体は、本発明の遺伝的特徴Ｘ、Ａ、Ｂ及びＣをすべて有する。
【００４２】
本発明の作出方法において、「交雑させる」とは、本発明の植物体（第一代（Ｓ１））と、第２の植物体（Ｓ１）とを交配させることにより、その子植物体（本発明の作出方法により作出される植物体（第二代（Ｓ２））を得ることを意味する。交雑方法としては、戻し交雑が好ましい。「戻し交雑」とは、本発明の植物体と第２の植物体との間に生まれた子植物体（Ｓ２）を、さらに本発明の植物体（つまり、本発明の遺伝的特徴を有する植物体）（Ｓ１）と交雑させて、本発明の遺伝子的特徴を有する植物体を作出する手法である。本発明の作出方法に用いられる第２の植物体（Ｓ１）が、本発明の植物体と同じ表現型と遺伝的性質を有する場合には、実質的に戻し交雑となる。本発明の遺伝子多型はメンデルの法則に従って遺伝し、これに伴って当該遺伝子多型と相関する表現型、つまりチラミン低含有という表現型も、メンデルの法則に従って遺伝する。
【００４３】
あるいは、本発明の植物体は自殖により作出することもできる。自殖は、本発明の植物体のおしべの花粉を本発明の植物体のめしべに自家受粉させることにより行うことができる。
【００４４】
本発明の作出方法により作出される植物体は、表現型及び遺伝的性質が本発明の植物体と同じであるため、本発明の作出方法により作出される植物体をさらに第３のステビア植物体とを交雑させることにより、本発明の植物体と同等の表現型を有するステビア植物体を作出することも可能である。
【００４５】
別の態様として、本発明の植物体は、先に述べた組織培養物又は植物培養細胞を培養することにより植物体を再生することで作出することも可能である。培養条件については、野生型ステビア植物の組織培養物又は植物培養細胞を培養する条件と同じであり、公知である（Protocols for In Vitro cultures and secondary metabolite analysis of aromatic and medicinal plants, Method in molecular biology, vo. 1391, pp113-123）。
【００４６】
さらに別の態様として、本発明の植物体は、ステビア植物体のゲノムに、本発明の変異を導入することで作出することも可能である。変異の導入は、遺伝子組換え的手法により行っても、非遺伝子組換え的手法により行ってもよい。「非遺伝子組換え的手法」の例としては、外来遺伝子の導入を行わずに宿主細胞（又は宿主植物体）の遺伝子に変異を誘発する方法が挙げられる。そのような方法としては植物細胞の変異誘発剤を作用させる方法が挙げられる。そのような変異誘発剤としては、エチルメタンスルホン酸（ＥＭＳ）及びアジ化ナトリウム等が挙げられる。例えば、エチルメタンスルホン酸（ＥＭＳ）は、０．１％、０．２％、０．３％、０．４％、０．５％、０．６％、０．７％、０．８％、０．９％、１．０％などの濃度で植物細胞を処理することができる。処理時間は１〜４８時間、２〜３６時間、３〜３０時間、４〜２８時間、５〜２６時間、６〜２４時間である。処理の手順自体は公知であるが、吸水過程を経た吸水種子を上記濃度で変異誘発剤を含む処理液に、上記処理時間浸漬することで行うことができる。
【００４７】
あるいは、非遺伝子組換え的手法の例としてＸ線、γ線、紫外線などの放射線や光線を植物細胞に照射する方法もできる。この場合、適当な紫外線の照射量（紫外線ランプ強さ、距離、時間）を用いて照射した細胞を、選択培地などで培養させた後、目的の形質を有する細胞、カルス、植物体を選択できる。その際の照射強度は０．０１〜１００Ｇｒ、０．０３〜７５Ｇｒ、０．０５〜５０Ｇｒ、０．０７〜２５Ｇｒ、０．０９〜２０Ｇｒ、０．１〜１５Ｇｒ、０．１〜１０Ｇｒ、０．５〜１０Ｇｒ、１〜１０Ｇｒであり、照射距離は１ｃｍ〜２００ｍ、５ｃｍ〜１００ｍ、７ｃｍ〜７５ｍ、９ｃｍ〜５０ｍ、１０ｃｍ〜３０ｍ、１０ｃｍ〜２０ｍ、１０ｃｍ〜１０ｍであり、照射時間は１分〜２年、２分〜１年、３分〜０．５年、４分〜１か月、５分〜２週間、１０分〜１週間である。照射の強度、距離及び時間は、放射線の線種や照射対象となる状態（細胞、カルス、植物体）により異なるが、当業者であれば適宜調整することができる。
【００４８】
また、細胞融合、葯培養（半数体育成）、遠縁交雑（半数体育成）などの手法も公知である。
一般に、植物細胞は、培養の間に変異を伴うことがあるため、より安定した形質維持のために植物個体に戻すことが好ましい。
本発明の植物体を宿主として事後的に遺伝子組み換え（例えばゲノム編集等により）を行って得られた植物体（例えば、本発明の植物体を宿主として遺伝子組み換えを行って、さらに別の形質を付加した植物体）も、本発明の範囲から除外されるものではない。
【００４９】
３．本発明の植物体のスクリーニング方法
本発明の植物体及び本発明の植物体と同じ表現型と遺伝的性質を有する植物体は、当該植物体の組織から本発明の遺伝的特徴を検出することによりスクリーニングすることができる。ここで、「スクリーニング」とは、本発明の植物体とそれ以外の植物体とを識別し、本発明の植物体を選択することを意味する。
したがって、本発明は、別の側面において、被験植物のゲノムから本発明の遺伝的特徴Ｘ、Ａ、Ｂ及びＣの少なくとも１つの存在及び／又は不在を検出する工程を含む、チラミン低含有ステビア植物体をスクリーニングする方法（以下、「本発明のスクリーニング方法」と称する場合がある）を提供する。
【００５０】
一態様において、検出対象となる遺伝的特徴は本発明の遺伝的特徴Ｘである。別の態様において、検出対象となる遺伝的特徴は本発明の遺伝的特徴Ａである。別の態様において、検出対象となる遺伝的特徴は本発明の遺伝的特徴Ｂ（すなわち、本発明の遺伝的特徴Ｂ−１〜Ｂ−４の少なくとも１つ）である。別の態様において、検出対象となる遺伝的特徴は本発明の遺伝的特徴Ｃである。好ましい態様において、検出対象となる遺伝的特徴は、本発明の遺伝的特徴Ｘと遺伝的特徴Ａである。別の好ましい態様において、検出対象となる遺伝的特徴は、本発明の遺伝的特徴Ｘと遺伝的特徴Ｂ（すなわち、本発明の遺伝的特徴Ｂ−１〜Ｂ−４の少なくとも１つ）である。別の好ましい態様において、検出対象となる遺伝的特徴は、本発明の遺伝的特徴Ｘと遺伝的特徴Ｃである。別の好ましい態様において、検出対象となる遺伝的特徴は、本発明の遺伝的特徴Ｘと遺伝的特徴Ａと遺伝的特徴Ｂ（すなわち、本発明の遺伝的特徴Ｂ−１〜Ｂ−４の少なくとも１つ）である。別の好ましい態様において、検出対象となる遺伝的特徴は、本発明の遺伝的特徴Ｘと遺伝的特徴Ａと遺伝的特徴Ｃである。別の好ましい態様において、検出対象となる遺伝的特徴は、本発明の遺伝的特徴Ｘと遺伝的特徴Ｂと遺伝的特徴Ｃである。より好ましい態様において、検出対象となる遺伝的特徴は、本発明の遺伝的特徴Ｘ、Ａ、Ｂ及びＣのすべてである。
本発明のスクリーニング方法は、上記の少なくとも１つの遺伝的特徴の存在が検出された植物体を被験植物の中から選択する工程をさらに含んでもよい。
【００５１】
本発明の遺伝的特徴の存在は、
（Ｘ）配列番号１５０の２０１位に相当する位置の塩基がＣであるアレル（例えば、配列番号１６４の塩基配列を含むアレル）、
（Ａ）配列番号１の２０１位に相当する位置の塩基がＡであるアレル（例えば、配列番号６９の塩基配列を含むアレル）、
（Ｂ−１）配列番号２の４０位に相当する位置の塩基がＴであるアレル（例えば、配列番号７０の塩基配列を含むアレル）、
（Ｂ−２）配列番号３の４４位に相当する位置の塩基がＴであるアレル（例えば、配列番号７１の塩基配列を含むアレル）、
（Ｂ−３）配列番号４の４１位に相当する位置の塩基がＣであるアレル（例えば、配列番号７２の塩基配列を含むアレル）、
（Ｂ−４）配列番号５の５５〜７２位に相当する部分が欠失しているアレル（例えば、配列番号７３の塩基配列を含むアレル）、及び
（Ｃ）配列番号６の４９位に相当する位置の塩基がＡであるアレル（例えば、配列番号７４の塩基配列を含むアレル）
からなる群から選択されるアレルの存在の検出、及び／又は、
（ｘ）配列番号１５０の２０１位に相当する位置の塩基がＴであるアレル（例えば、配列番号１５０の塩基配列を含むアレル）、
（ａ）配列番号１の２０１位に相当する位置の塩基がＣであるアレル（例えば、配列番号１の塩基配列を含むアレル）、
（ｂ−１）配列番号２の４４位に相当する位置の塩基がＡであるアレル（例えば、配列番号２の塩基配列を含むアレル）、
（ｂ−２）配列番号３の４０位に相当する位置の塩基がＣであるアレル（例えば、配列番号３の塩基配列を含むアレル）、
（ｂ−３）配列番号４の４１位に相当する位置の塩基がＧであるアレル（例えば、配列番号４の塩基配列を含むアレル）、
（ｂ−４）配列番号５の５５〜７２位に相当する部分が欠失していないアレル（例えば、配列番号５の塩基配列を含むアレル）、及び
（ｃ）配列番号６の４９位に相当する位置の塩基がＣであるアレル（例えば、配列番号６の塩基配列を含むアレル）
からなる群から選択されるアレルの不在の検出
により決定することができる。
【００５２】
本発明の遺伝的特徴の不在は、
（Ｘ）配列番号１５０の２０１位に相当する位置の塩基がＣであるアレル（例えば、配列番号１６４の塩基配列を含むアレル）、
（Ａ）配列番号１の２０１位に相当する位置の塩基がＡであるアレル（例えば、配列番号６９の塩基配列を含むアレル）、
（Ｂ−１）配列番号２の４０位に相当する位置の塩基がＴであるアレル（例えば、配列番号７０の塩基配列を含むアレル）、
（Ｂ−２）配列番号３の４４位に相当する位置の塩基がＴであるアレル（例えば、配列番号７１の塩基配列を含むアレル）、
（Ｂ−３）配列番号４の４１位に相当する位置の塩基がＣであるアレル（例えば、配列番号７２の塩基配列を含むアレル）、
（Ｂ−４）配列番号５の５５〜７２位に相当する部分が欠失しているアレル（例えば、配列番号７３の塩基配列を含むアレル）、及び
（Ｃ）配列番号６の４９位に相当する位置の塩基がＡであるアレル（例えば、配列番号７４の塩基配列を含むアレル）
からなる群から選択されるアレルの不在の検出、及び／又は、
（ｘ）配列番号１５０の２０１位に相当する位置の塩基がＴであるアレル（例えば、配列番号１５０の塩基配列を含むアレル）、
（ａ）配列番号１の２０１位に相当する位置の塩基がＣであるアレル（例えば、配列番号１の塩基配列を含むアレル）、
（ｂ−１）配列番号２の４４位に相当する位置の塩基がＡであるアレル（例えば、配列番号２の塩基配列を含むアレル）、
（ｂ−２）配列番号３の４０位に相当する位置の塩基がＣであるアレル（例えば、配列番号３の塩基配列を含むアレル）、
（ｂ−３）配列番号４の４１位に相当する位置の塩基がＧであるアレル（例えば、配列番号４の塩基配列を含むアレル）、
（ｂ−４）配列番号５の５５〜７２位に相当する部分が欠失していないアレル（例えば、配列番号５の塩基配列を含むアレル）、及び
（ｃ）配列番号６の４９位に相当する位置の塩基がＣであるアレル（例えば、配列番号６の塩基配列を含むアレル）
からなる群から選択されるアレルの存在の検出
により決定することができる。
【００５３】
本発明の遺伝的特徴の検出方法の具体例としては、ＰＣＲ法、TaqMan PCR法、シーケンス法、マイクロアレイ法、インベーダー法、TILLING法、ＲＡＤ法、ＲＦＬＰ法、ＰＣＲ−ＳＳＣＰ法、ＡＦＬＰ法、ＳＳＬＰ法、ＣＡＰＳ法、ｄＣＡＰＳ法、ＡＳＯ法、ＡＲＭＳ法、ＤＧＧＥ法、ＣＣＭ法、ＤＯＬ法、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＭＳ法、ＴＤＩ法、パドロックプローブ法、分子ビーコン法、ＤＡＳＨ法、ＵＣＡＮ法、ＥＣＡ法、ＰＩＮＰＯＩＮＴ法、ＰＲＯＢＥ法、ＶＳＥＴ法、Survivor assay、Sniper assay、Luminex assay、ＧＯＯＤ法、ＬＣｘ法、ＳＮａＰｓｈｏｔ法、Mass ARRAY法、パイロシークエンス法、ＳＮＰ−ＩＴ法、融解曲線分析法等が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００５４】
ＰＣＲ法の場合、３’末端部分が本発明の多型部位に相補的な配列を有するようなプライマーを作製することが好ましい。このように設計されたプライマーを用いると、鋳型となるサンプルが多型を有する場合には、プライマーが完全に鋳型にハイブリダイズするため、ポリメラーゼ伸長反応が進むが、鋳型が本発明の変異を有しない場合には、プライマーの３’末端のヌクレオチドが鋳型とミスマッチを生じるので、伸長反応は起こらない。したがって、このようなプライマーを用いてＰＣＲ増幅を行い、増幅産物をアガロースゲル電気泳動などによって分析し、所定のサイズの増幅産物が確認できれば、サンプルである鋳型が変異を有していることになり、増幅産物が存在しない場合には、鋳型が変異を有していないものと判断できる。
あるいは、本発明の多型とプライマー配列とは重複させず、かつ本発明の遺伝子変異をＰＣＲ増幅させることが可能なようにプライマー配列を設計し、増幅されたヌクレオチド断片の塩基配列をシーケンスすることにより、本発明の遺伝的特徴を検出することができる。
ＰＣＲ及びアガロースゲル電気泳動については、以下を参照：Sambrook, Fritsch and Maniatis, ”Molecular Cloning: A Laboratory Manual” 2nd Edition (1989), Cold Spring Harbor Laboratory Press。
【００５５】
TaqMan PCR法とは、蛍光標識したアレル特異的オリゴとTaq DNAポリメラーゼによるPCR反応とを利用した方法である（Livak, K.J. Genet. Anal. 14, 143 (1999); Morris T. et al., J. Clin.Microbiol. 34, 2933 (1996)）。
シークエンス法とは、変異を含む領域をPCRにて増幅させ、Dye Terminatorなどを用いてＤＮＡ配列をシークエンスすることで、変異の有無を解析する方法である（Sambrook, Fritsch and Maniatis, ”Molecular Cloning: A Laboratory Manual” 2nd Edition (1989), Cold Spring Harbor Laboratory Press）。
ＤＮＡマイクロアレイは、ヌクレオチドプローブの一端が支持体上にアレイ状に固定されたものであり、ＤＮＡチップ、Geneチップ、マイクロチップ、ビーズアレイ等を包含する。本発明の多型と相補的な配列を含むプローブを用いることで、網羅的に本発明の多型の有無を検出することができる。ＤＮＡチップなどのＤＮＡマイクロアレイアッセイとしてはGeneChipアッセイが挙げられる（Affymetrix社；米国特許第6,045,996号、同第5,925,525号、及び同第5,858,659号参照）。GeneChip技術は、チップに貼り付けたオリゴヌクレオチドプローブの小型化高密度マイクロアレイを利用するものである。
【００５６】
インベーダー法とは、ＳＮＰ等の多型のそれぞれのアレルに特異的な２種類のレポータープローブ及び１種類のインベーダープローブの鋳型ＤＮＡへのハイブリダイゼーションと、ＤＮＡの構造を認識して切断するという特殊なエンドヌクレアーゼ活性を有するCleavase酵素によるＤＮＡの切断を組み合わせた方法である（Livak, K. J. Biomol. Eng. 14, 143-149 (1999); Morris T. et al., J. Clin.Microbiol. 34, 2933 (1996); Lyamichev, V. et al., Science, 260, 778-783 (1993)等）。
TILLING（Targeting Induced Local Lesions IN Genomes）法とは、変異導入した突然変異体集団のゲノム中の変異ミスマッチをＰＣＲ増幅とＣＥＬ  Ｉヌクレアーゼ処理によってスクリーニングする方法である。
【００５７】
一態様において、本発明の遺伝的特徴Ｘは、限定されずに、配列番号１５３〜１５５のいずれかに記載の配列を含む領域を増幅することができるプライマーセットと、配列番号１５３〜１５５のポリヌクレオチドは切断するが、配列番号１６５〜１６７のポリヌクレオチドは切断しない制限酵素（例えば、Ｈｐｙ１８８Ｉ）又は配列番号１５３〜１５５のポリヌクレオチドは切断しないが、配列番号１６５〜１６７のポリヌクレオチドは切断する制限酵素とを用いたＣＡＰＳ法により検出することができる。プライマーセットの非限定例としては、以下のものが挙げられる。
フォワードプライマー：ＧＴＣＡＡＣＡＴＣＡＴＣＣＡＧＴＴＴＧＡＡＧＣＡＣ（配列番号１５６）
リバースプライマー：ＧＡＡＣＴＧＣＣＴＴＣＡＴＡＴＣＡＴＧＧＡＴＣＣＡ（配列番号１５７）
【００５８】
一態様において、本発明の遺伝的特徴Ａは、限定されずに、配列番号１９〜２１のいずれかに記載の配列を含む領域を増幅することができるプライマーセットと、配列番号１９〜２１のポリヌクレオチドは切断するが、配列番号７５〜７７のポリヌクレオチドは切断しない制限酵素又は配列番号１９〜２１のポリヌクレオチドは切断しないが、配列番号７５〜７７のポリヌクレオチドは切断する制限酵素（例えば、Ｈｐｙ１８８Ｉ）とを用いたＣＡＰＳ法により検出することができる。プライマーセットの非限定例としては、以下のものが挙げられる。
フォワードプライマー：ＡＴＧＧＴＴＴＧＧＧＡＡＴＡＧＣＴＣＴＧＴＴＧＴＴ（配列番号３７）
リバースプライマー：ＡＧＡＡＣＴＴＴＧＴＴＣＴＴＧＡＡＣＣＴＣＴＴＧ（配列番号３８）
【００５９】
一態様において、本発明の遺伝的特徴Ｂは、限定されずに、以下のプライマーセットと制限酵素とを用いたｄＣＡＰＳ法等により検出することができる。
（Ｂ−１）配列番号４５に示す塩基配列を含むフォワードプライマー及び配列番号４６に示す塩基配列を含むリバースプライマーを含む、プライマーセット、
（Ｂ−２）配列番号５０に示す塩基配列を含むフォワードプライマー及び配列番号５１に示す塩基配列を含むリバースプライマーを含む、プライマーセット、
（Ｂ−３）配列番号５５に示す塩基配列を含むフォワードプライマー及び配列番号５６に示す塩基配列を含むリバースプライマーを含む、プライマーセット、又は
（Ｂ−４）配列番号６０に示す塩基配列を含むフォワードプライマー及び配列番号６１に示す塩基配列を含むリバースプライマーを含む、プライマーセット。
【００６０】
但し、プライマーセットは配列番号４５、４６、５０、５１、５５、５６、６０又は６１の配列を有するものに限定されるものではなく、例えばフォワードプライマーとしては配列番号４５、５０、５５又は６０の３‘側末端から１５塩基上流までの配列（下記表参照）を３’末端に有するものであればよくリバースプライマーとしては配列番号４６、５１、５６又は６１の３‘側末端から１５塩基上流までの配列（下記表参照）を３’末端に有するものであればよい。このようなプライマーは、１５〜５０塩基長、２０〜４５塩基長の長さにあってもよい。
【表１】
2020138365.tif 000002
【００６１】
プライマーセットは配列番号４５、４６、５０、５１、５５、５６、６０又は６１の配列を有するものに限定されるものではなく、例えばフォワードプライマーとしては配列番号４５、５０、５５、又は６０における任意の連続する１５塩基以上の配列を有する又は含むものであればよく、リバースプライマーとしては配列番号４６、５１、５６又は６１における任意の連続する１５塩基以上の配列を有する又は含むものであればよい。
（Ｂ−１’’）配列番号４５における任意の連続する１５塩基以上の配列を有する又は含むフォワードプライマー及び配列番号４６における任意の連続する１５塩基以上の配列を有する又は含むリバースプライマーを含む、プライマーセット、
（Ｂ−２’’）配列番号５０における任意の連続する１５塩基以上の配列を有する又は含むフォワードプライマー及び配列番号５１における任意の連続する１５塩基以上の配列を有する又は含むリバースプライマーを含む、プライマーセット、
（Ｂ−３’’）配列番号５５における任意の連続する１５塩基以上の配列を有する又は含むフォワードプライマー及び配列番号５６における任意の連続する１５塩基以上の配列を有する又は含むリバースプライマーを含む、プライマーセット、あるいは（Ｂ−４’’）配列番号６０における任意の連続する１５塩基以上の配列を有する又は含むフォワードプライマー及び配列番号６１における任意の連続する１５塩基以上の配列を有する又は含むリバースプライマーを含む、プライマーセット。
このようなプライマーは、前記任意の連続する１５塩基以上の配列が３‘側末端に存在すれば、１５〜５０塩基長、２０〜４５塩基長、３０〜６５塩基長の長さにあってもよい。
【００６２】
上記プライマーと組み合わせる制限酵素としては、以下のものが挙げられる。
【表２】
2020138365.tif 000003
【００６３】
一態様において、本発明の遺伝的特徴Ｃは、以下のプライマーセットと制限酵素とを用いたｄＣＡＰＳ法により検出することができる。
・プライマーセット：
３’末端に位置する配列番号８６〜１０９から選択される配列と、任意選択で前記配列の５’末端に付加される配列番号６の２８位から５’側に続く任意の連続する配列（例えば、任意の長さの連続する配列）とを含むフォワードプライマーと、配列番号６の５０位より３’側に位置する任意の連続する２０塩基以上の配列に相補的な配列（例えば、配列番号６５、１１０）を含むリバースプライマーとを含む、プライマーセット。プライマーの配列は、上記の条件を満たす範囲で最適化することができる。プライマー設計の最適化については、例えば、Sambrook and Russell, ”Molecular Cloning: A Laboratory Manual” 3rd Edition (2001), Cold Spring Harbor Laboratory Press等を参照のこと。また、上記各プライマーは、１５〜５０塩基長、１８〜４８塩基長、２０〜４５塩基長、３０〜６５塩基長等であってよい。
【００６４】
・制限酵素：
配列番号８６〜１０９の各々に対応する制限酵素を以下に示す。なお、下記配列において、「Ｒ」はＡ又はＧを、「Ｙ」はＣ又はＴを表す。
【表３】
2020138365.tif 000004
【００６５】
特定の態様において、本発明の遺伝的特徴Cは、以下のプライマーセットと制限酵素とを用いたｄＣＡＰＳ法により検出することができる。
【表４】
2020138365.tif 000005
【００６６】
本発明のスクリーニング方法は、本発明の遺伝的特徴が検出された被験ステビア植物の組織（例えば葉）のチラミンの含有量を測定する工程をさらに含んでもよい。チラミン含有量の測定は、本発明の植物体の項に記載したとおりである。また、この態様において、本発明の遺伝的特徴が検出された被験ステビア植物体のうち、チラミンの含有量が低い個体を選択して、これを他のステビア植物体と交配し、得られた子植物体について、本発明のスクリーニング方法を適用してもよい。したがって、本発明のスクリーニング方法は、以下の１以上の工程を含み得る。
（ｉ）被験ステビア植物のゲノムから、本発明の遺伝的特徴を検出する工程、
（ｉｉ）本発明の遺伝的特徴が検出された被験ステビア植物組織のチラミンの含有量を測定する工程、
（ｉｉｉ）本発明の遺伝的特徴が検出された被験ステビア植物体のうち、チラミンの含有量が低い個体を選択する工程、
（ｉｖ）選択したチラミンの含有量が低い個体を他のステビア植物体と交配する工程、
（ｖ）交配により得られた子植物体のゲノムから、本発明の遺伝的特徴を検出する工程、
（ｖｉ）本発明の遺伝的特徴が検出された子植物組織のチラミンの含有量を測定する工程、
（ｖｉｉ）本発明の遺伝的特徴が検出された子植物体のうち、チラミンの含有量が低い個体を選択する工程。
【００６７】
選択するチラミンの含有量が低い個体は、例えば、本発明の遺伝的特徴が検出された被験ステビア植物体のうち、チラミンの含有量の低さに関し上位５０％まで、上位４０％まで、上位３０％まで、上位２０％まで、上位１０％まで、上位５％まで、上位４％まで、上位３％まで、上位２％まで又は上位１％までの個体などであってよい。また、交配する他のステビア植物体は、本発明の遺伝的特徴を含んでいても含んでいなくてもよい。上記態様において、工程（ｉｖ）〜（ｖｉｉ）は、複数回繰り返すことができる。このようにして、チラミンの含有量がより低いステビア植物体をスクリーニングすることができる。
【００６８】
本発明のスクリーニング方法において、被験ステビア植物体は、天然植物体であっても、非遺伝子組換植物体であってもよい。非遺伝子組換植物体については、本発明の植物体の項に記載したとおりである。
本発明のスクリーニング方法において、被験ステビア植物体は、突然変異誘発処理を行ったステビア植物及びその子孫植物を含んでもよい。突然変異誘発処理については、本発明の植物体の項に記載したとおりであり、変異誘発剤による処理や、放射線又は光線の照射による処理等を含む。
【００６９】
また、本発明は、上記に記載されたプライマーセット、例えば、上記配列番号１５６のフォワードプライマーと配列番号１５７のリバースプライマーとを含むプライマーセット、上記配列番号３７のフォワードプライマーと配列番号３８のリバースプライマーとを含むプライマーセット、上記（Ｂ−１）〜（Ｂ−４）、（Ｂ−１’）〜（Ｂ−４’）及び（Ｂ−１’’）〜（Ｂ−４’’）からなる群より選択されるいずれか一つ以上のプライマーセット、及び／又は、上記表２〜３に記載のプライマーセットを提供する。本発明は、さらに、配列番号１５０、１６４、１〜６、６９〜７４からなる群から選択される塩基配列を有する領域をＰＣＲにより増幅し得るプライマーセット、例えば、配列番号１５１の塩基配列を含むフォワードプライマーと、配列番号１５２の塩基配列を含むリバースプライマーとのプライマーセット、配列番号７の塩基配列を含むフォワードプライマーと、配列番号８の塩基配列を含むリバースプライマーとのプライマーセット、配列番号９の塩基配列を含むフォワードプライマーと、配列番号１０の塩基配列を含むリバースプライマーとのプライマーセット、配列番号１１の塩基配列を含むフォワードプライマーと、配列番号１２の塩基配列を含むリバースプライマーとのプライマーセット、配列番号１３の塩基配列を含むフォワードプライマーと、配列番号１４の塩基配列を含むリバースプライマーとのプライマーセット、配列番号１５の塩基配列を含むフォワードプライマーと、配列番号１６の塩基配列を含むリバースプライマーとのプライマーセット、配列番号１７の塩基配列を含むフォワードプライマーと、配列番号１８の塩基配列を含むリバースプライマーとのプライマーセットを提供する。
【００７０】
さらに、本発明は、本発明の遺伝的特徴の存在及び／又は不在を検出し得るプローブ（以下、「本発明のプローブ」と称する場合がある）を提供する。本発明のプローブは、本発明の遺伝的特徴の存在及び／又は不在の各種検出方法に適した構造を有し得る。例えば、本発明のプローブは、本発明の変異部位を含むゲノムの部分に相補性を有する塩基配列を含み得る。かかるプローブの非限定例としては、配列番号１５３〜１５５、１６５〜１６７、１９〜３６、７５〜７７、１３５〜１４９から選択される塩基配列を含むものが挙げられる。これらの配列のうち、配列番号１５３〜１５５、１９〜３６は本発明の変異を含むアレルに特異的であり、配列番号１６５〜１６７、７５〜７７、１３５〜１４９は、本発明の変異を含まないアレルに特異的である。本発明の遺伝的特徴の存在は、本発明の変異を含むアレルの検出及び／又は本発明の変異を含まないアレルの非検出により検出することができ、本発明の遺伝的特徴の不在は、本発明の変異を含むアレルの非検出及び／又は本発明の変異を含まないアレルの検出により検出することができる。本発明のプローブは、好ましくは標識を有する。かかる標識の非限定例としては、蛍光標識、発光標識、放射性標識、色素、酵素、クエンチャー、検出可能な標識との結合部分等が挙げられる。特定の態様において、本発明のプローブは、配列番号１５３〜１５５、１６５〜１６７、１９〜３６、７５〜７７、１３５〜１４９から選択される塩基配列と、標識とを有する。
【００７１】
本発明はさらに、配列番号１５３〜１５５、１６５〜１６７のいずれかに記載の配列を含む領域を増幅することができるプライマーセット、例えば、配列番号１５１の塩基配列を含むフォワードプライマーと配列番号１５２の塩基配列を含むリバースプライマーとの組合せを含むプライマーセット、及び、配列番号１５３〜１５５のポリヌクレオチドは切断するが、配列番号１６５〜１６７のポリヌクレオチドは切断しない制限酵素（例えば、Ｈｐｙ１８８Ｉ）又は配列番号１５３〜１５５のポリヌクレオチドは切断しないが、配列番号１６５〜１６７のポリヌクレオチドは切断する制限酵素とを含むキット、例えばスクリーニング用キットを提供する。
【００７２】
本発明はさらに、配列番号１９〜２１のいずれかに記載の配列を含む領域を増幅することができるプライマーセット、例えば、配列番号７の塩基配列を含むフォワードプライマーと配列番号８の塩基配列を含むリバースプライマーとの組合せを含むプライマーセット、及び、配列番号１９〜２１のポリヌクレオチドは切断するが、配列番号７５〜７７のポリヌクレオチドは切断しない制限酵素又は配列番号１９〜２１のポリヌクレオチドは切断しないが、配列番号７５〜７７のポリヌクレオチドは切断する制限酵素（例えば、Ｈｐｙ１８８Ｉ）とを含むキット、例えばスクリーニング用キットを提供する。
【００７３】
本発明はさらに、上記（Ｂ−１）〜（Ｂ−４）、（Ｂ−１’）〜（Ｂ−４’）及び（Ｂ−１’’）〜（Ｂ−４’’）からなる群より選択されるいずれか一つ以上のプライマーセットと、場合により制限酵素とを含むキット、例えばスクリーニング用キットを提供する。
当該キットにおいて、（Ｂ−１）、（Ｂ−１’）及び（Ｂ−１’’）からなる群より選択される選択されるいずれか一つ以上のプライマーセットを用いる場合、前記キットに含まれる制限酵素はＫｐｎＩである。
当該キットにおいて、（Ｂ−２）、（Ｂ−２’）及び（Ｂ−２’’）からなる群より選択される選択されるいずれか一つ以上のプライマーセットを用いる場合、前記キットに含まれる制限酵素はＸｂａＩである。
当該キットにおいて、（Ｂ−３）、（Ｂ−３’）及び（Ｂ−３’’）からなる群より選択される選択されるいずれか一つ以上のプライマーセットを用いる場合、前記キットに含まれる制限酵素はＡｆｌＩＩである。
【００７４】
本発明はさらに、前記表２〜３に記載のフォワードプライマーとリバースプライマーとの組合せを含むプライマーセット、及び、これに対応する制限酵素とを含むキット、例えばスクリーニング用キットを提供する。
【００７５】
当該キットの別の態様において、
前記プライマーセットが配列番号４５における任意の連続する１５塩基以上の配列を有する又は含むフォワードプライマーを含む場合は、前記制限酵素はＫｐｎＩを含み、
前記プライマーセットが配列番号５０における任意の連続する１５塩基以上の配列を有する又は含むフォワードプライマーを含む場合は、前記制限酵素はＸｂａＩを含み、
前記プライマーセットが配列番号５５における任意の連続する１５塩基以上の配列を有する又は含むフォワードプライマーを含む場合は、前記制限酵素はＡｆｌＩＩを含む。
【００７６】
本発明はまた、配列番号１５３〜１５５、１６５〜１６７、１〜６、６９〜７４からなる群から選択される塩基配列を有する領域をＰＣＲにより増幅し得るプライマーセットと、本発明のプローブとを含む、スクリーニング用キットを提供する。
【００７７】
これらのプライマーセット、プローブ及びキットは、本発明の遺伝的特徴を検出するために用いること、本発明のスクリーニング方法に用いることなどが可能である。また、これらのプライマーセット及びキットには、本発明の遺伝的特徴の検出や、本発明のスクリーニング方法に関する説明を含む指示、例えば、使用説明書や、使用方法に関する情報を記録した媒体、例えば、フレキシブルディスク、ＣＤ、ＤＶＤ、ブルーレイディスク、メモリーカード、ＵＳＢメモリーなどが含まれていてもよい。
【００７８】
４．植物体由来抽出物の製造方法及び当該抽出物を用いた製品
本発明のさらなる態様において、本発明の植物体、又は当該植物体の種子若しくは葉（例えば、乾燥葉又は新鮮葉）から抽出物を得る工程を含む、チラミン低含有抽出物の製造方法（以下、「本発明の抽出物の製造方法」と称する場合がある）が提供される。さらに、本発明の抽出物の製造方法により得られた抽出物からステビオール配糖体を精製する工程を含む、ステビオール配糖体精製品の製造方法（以下、「本発明のステビオール配糖体精製品の製造方法」と称する場合がある）が提供される。
具体的には、本発明のチラミン低含有ステビア植物体、本発明のスクリーニング方法により選別されたチラミン低含有ステビア植物体又は本発明の方法により製造されたチラミン低含有ステビア植物体からステビオール配糖体を含む抽出物を得る工程、及び、得られた抽出物からステビオール配糖体を精製する工程を含む、ステビオール配糖体精製品の製造方法が提供される。
【００７９】
ステビオール配糖体を含む抽出物は、本発明の植物体の新鮮葉又は乾燥葉に適切な溶媒（水等の水性溶媒又はアルコール、エーテル及びアセトン等の有機溶媒）を反応させることにより得ることができる。抽出条件等はOhta et al.,J. Appl. Glycosci., Vol. 57, No. 3 (2010)又はWO2010/038911に記載の方法や、後述の実施例に記載の方法を参照することができる。
また、ステビオール配糖体を含む抽出物を酢酸エチルその他の有機溶媒：水の勾配、高速液体クロマトグラフィー（High Performance Liquid Chromatography:HPLC）、ガスクロマトグラフィー、飛行時間型質量分析（Time-of-Flight mass spectrometry:TOF-MS）、超高性能液体クロマトグラフィー（Ultra (High) Performance Liquid chromatography:UPLC）等の公知の方法を用いることにより個々のステビオール配糖体を精製することができる。
【００８０】
ステビオール配糖体としては、ＲｅｂＡ、ＲｅｂＢ、ＲｅｂＣ、ＲｅｂＤ、ＲｅｂＥ、ＲｅｂＦ、ＲｅｂＩ、ＲｅｂＪ、ＲｅｂＫ、ＲｅｂＭ、ＲｅｂＮＲｅｂＯ、ＲｅｂＱ、ＲｅｂＲ、ズルコシドＡ、ルブソシド、ステビオール、ステビオールモノシド、ステビオールビオシド、ステビオシド等が挙げられる。一態様において、ステビオール配糖体は、ＲｅｂＡ、ＲｅｂＢ、ＲｅｂＣ、ＲｅｂＤ、ＲｅｂＥ、ＲｅｂＦ、ＲｅｂＭ、ＲｅｂＮ、ＲｅｂＯ、ステビオシド、ステビオールビオシド、ルブソシド、ズルコシドＡ又はこれらの組合せを含む。
【００８１】
本発明の抽出物の製造方法により得られた抽出物（以下、「本発明の抽出物」という）は、野生型ステビア種と比べチラミンをより低い含量で含む。
本発明の抽出物は、野生型ステビア種から得られた抽出物と比べチラミンを９５％以下、９０％以下、８５％以下、８０％以下、７５％以下、７０％以下、６５％以下、６０％以下、５５％以下、５０％以下、４５％以下、４０％以下、３５％以下、３０％以下、２５％以下、２０％以下、１５％以下、１０％以下、５％以下、４％以下、３％以下、２％以下、１％以下、０．５％以下、０．３％以下、０．１％以下、０．０５％以下、０．０３％以下、０．００１％以下などの含量で含んでいてもよい。ここで、本発明の抽出物と、野生型ステビア種から得られた抽出物は、同じ方法で得られたものであってよい。
【００８２】
このようにして得られた本発明の抽出物及び／又は本発明のステビオール配糖体精製品の製造方法により得られるステビオール配糖体精製品と他の成分とを混合することにより、チラミン含量の低い、ステビオール配糖体を含む新規な医薬品、香料又は飲食品を製造することができる。そこで、本発明は、別の実施態様として、本発明の抽出物及び／又は本発明のステビオール配糖体精製品の製造方法により得られるステビオール配糖体精製品と他の成分とを混合する工程を含む、医薬品、香料又は飲食品の製造方法を提供する。さらに、本発明は、前記製造方法により得られた、チラミン含量の低い、ステビオール配糖体を含む新規な医薬品、香料又は飲食品を提供する。ここで飲食品とは、飲料及び食品を意味する。したがって、ある実施態様では、本発明は新規な医薬品、香料、飲料又は食品を提供し、また、当該医薬品、香料、飲料又は食品の製造方法を提供する。チラミン含量の低い本発明の医薬品、香料、飲料又は食品はモノアミンオキシダーゼ阻害薬の投与を受けている対象に特に有用である。
【００８３】
５．本発明の植物体に係る塩基配列
本発明は、別の側面において、本発明のステビア植物体に係る塩基配列を提供する。本発明の遺伝的特徴Ｘを有するステビア植物体に係る塩基配列の特定の態様は、配列番号１６４〜１６７から選択される塩基配列を含む、又はそれからなる。本発明の遺伝的特徴Ｘと遺伝的特徴Ａとを有するステビア植物体に係る塩基配列の特定の態様は、配列番号１６４〜１６７から選択される塩基配列と、配列番号１９〜２１及び６９から選択される塩基配列とを含む。本発明の遺伝的特徴Ｘと遺伝的特徴Ｂ（すなわち、本発明の遺伝的特徴Ｂ−１〜Ｂ−４の少なくとも１つ）とを有するステビア植物体に係る塩基配列の特定の態様は、配列番号１６４〜１６７から選択される塩基配列と、配列番号２２〜３３及び７０〜７３から選択される塩基配列とを含む。本発明の遺伝的特徴Ｘと遺伝的特徴Ｃとを有するステビア植物体に係る塩基配列の特定の態様は、配列番号１６４〜１６７から選択される塩基配列と、配列番号３４〜３６及び７４から選択される塩基配列を含む。本発明の遺伝的特徴Ｘと遺伝的特徴Ａと遺伝的特徴Ｂとを有するステビア植物体に係る塩基配列の特定の態様は、配列番号１６４〜１６７から選択される塩基配列と、配列番号１９〜２１及び６９から選択される塩基配列と、配列番号２２〜３３及び７０〜７３から選択される塩基配列とを含む。本発明の遺伝的特徴Ｘと遺伝的特徴Ａと遺伝的特徴Ｃとを有するステビア植物体に係る塩基配列の特定の態様は、配列番号１６４〜１６７から選択される塩基配列と、配列番号１９〜２１及び６９から選択される塩基配列と、配列番号３４〜３６及び７４から選択される塩基配列とを含む。本発明の遺伝的特徴Ｘと遺伝的特徴Ｂと遺伝的特徴Ｃとを有するステビア植物体に係る塩基配列の特定の態様は、配列番号１６４〜１６７から選択される塩基配列と、配列番号２２〜３３及び７０〜７３から選択される塩基配列と、配列番号３４〜３６及び７４から選択される塩基配列とを含む。本発明の遺伝的特徴ＸおよびＡ〜Ｃをすべて有するステビア植物体に係る塩基配列の特定の態様は、配列番号１６４〜１６７から選択される塩基配列と、配列番号１９〜２１及び６９から選択される塩基配列と、配列番号２２〜３３及び７０〜７３から選択される塩基配列と、配列番号３４〜３６及び７４から選択される塩基配列とを含む。
【実施例】
【００８４】
以下に本発明に関する実験例、実施例等を記載するが、本発明はこれらの具体的な態様に限定されるものではない。【００８５】
［実施例１］チラミン及びＲｅｂＤ含量の測定
（１）チラミン含量の測定
各個体よりサンプリングした新鮮葉５ｇをホモジナイザーカップに採り、これに２０％トリクロロ酢酸１０ｍＬ及び水５０ｍＬを加えて１５０００ｒｐｍで１０分間ホモジナイズした。これを水で２００ｍＬに定容し、混和して３０分間放置後、必要に応じて遠心・濾過し試験溶液とした。試験溶液５ｍＬを分取し、０．１ｍｏｌ/Ｌオクタンスルホン酸ナトリウム５ｍＬを加えてよく混和後、C18、1000mgミニカラム（Sep-Pak(R) Vac 6cc 1g C18 Cartridges、Waters）に負荷した。次いで水２０ｍＬでミニカラムを洗浄した後、メタノール：水（８：２）１０ｍＬでアミン類を溶出し、溶出液を全量採取し４０℃以下で減圧濃縮し、約１ｍＬの濃縮液とした。この濃縮液に内部標準溶液（１，８−ジアミノオクタンを２０μｇ／ｍＬの濃度で０．５ｍｏｌ／Ｌ塩酸に溶解したもの）０．５ｍＬ、無水炭酸ナトリウム０．２ｇ、１％ダンシルクロライド・アセトン溶液２ｍＬを加えてよく混和し、遮光して４５℃の水浴中で１時間加温した。加温後、１０％プロリン溶液０．５ｍＬを加え、振とうし１０分間放置した。その後トルエン５ｍＬを加えて１分間激しく振とうし、上層のトルエン層を採取した。再度トルエンを加えこの操作を２回行い、トルエン層を合わせて４０℃以下で減圧濃縮・乾固した。残留物にアセトニトリル１ｍＬを加えてよく混和したものをＨＰＬＣ分析用試料とした。【００８６】
ＨＰＬＣ分析は以下の条件で行った。
【表５】
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【００８７】
（２）ＲｅｂＤ含量の測定
（１）と同じ個体より適量の新鮮葉をサンプリングし、０．２５ｇの新鮮葉をフリーズドライにより乾燥し、破砕物乾物０．０５ｇを純水中に投入した。超音波処理２０分にて抽出し、遠心・濾過した後に０．３３ｍＬの抽出液を得た。この抽出液をLCMS-8050（島津）にてＬＣ／ＭＳ／ＭＳ分析を行い、ＲｅｂＤの濃度を定量した。【００８８】
（３）分析結果
分析結果を下表に示す。
【表６】
2020138365.tif 000007
【００８９】
個体名の最初の数字（ハイフンの左側）は、その個体が由来する親（系統）の番号を示し、ハイフンの右側の数字は、その個体が属する系統内での個体番号を示す。例えば、個体名１−１と個体名２−１は、それぞれ別々の親に由来する個体であることを示す。また、個体名２−１と個体名２−２は、同じ親に由来する（すなわち、同じ系統に属する）別々の個体であることを示す。なお、各個体とも、エチルメタンスルホン酸（ＥＭＳ）での変異誘発処理により遺伝子が改変された個体の子孫である。
上記分析で得られたチラミン含量とＲｅｂＤ含量との相関性の有無を調べたところ、両者の間には、相関係数−０．６１５の負の相関が認められた。図１は、チラミン含量とＲｅｂＤ含量との相関分析の結果を示す。また、ＷｅｌｃｈのＴ検定で有意差の有無を判定すると、チラミン含量０．０３７％未満の個体のＲｅｂＤ含量と、それ以外の個体のＲｅｂＤ含量との間のｐ値は０．０００３、チラミン含量０．０５８％未満の個体のＲｅｂＤ含量と、それ以外の個体のＲｅｂＤ含量との間のｐ値は０．０４５４、チラミン含量０．０９２％未満の個体のＲｅｂＤ含量と、それ以外の個体のＲｅｂＤ含量との間のｐ値は０．０２３９と、それぞれ有意に異なっていた。【００９０】
［実施例２］低チラミン含有ステビア植物体に特有の遺伝的特徴の検出
実施例１で試験した個体２−１〜２−３はいずれも、高ＴＳＧ含有型の遺伝的特徴を有する雄株（Ｐ１）と、高ＲｅｂＭ含有型の遺伝的特徴を有する雌株（Ｐ２）とを交配させて得られたものである。
高ＲｅｂＭ含有型の遺伝的特徴は、以下の少なくとも１つの特徴を有する。
Ｂ−１：配列番号２の４０位に相当する位置の塩基がＴであるアレルについてホモ接合性。
Ｂ−２：配列番号３の４４位に相当する位置の塩基がＴであるアレルについてホモ接合性。
Ｂ−３：配列番号４の４１位に相当する位置の塩基がＣであるアレルについてホモ接合性。
Ｂ−４：配列番号５の５５〜７２位に相当する部分が欠失しているアレルについてホモ接合性。
これらの遺伝的特徴が高ＲｅｂＭ含有特性に係ることは、本出願人による未公開の先願（２０１８年１０月１２日に出願したＰＣＴ／ＪＰ２０１８／０３８０６４）に示されている。
高ＴＳＧ含有型の遺伝的特徴は、以下の特徴を有する。
Ｃ：配列番号６の４９位に相当する位置の塩基がＡであるアレルについてヘテロ接合性。
上記の遺伝的特徴が高ＴＳＧ含有特性に係ることは、本出願人による未公開の先願（２０１８年７月３１日に出願した特願２０１８−１４４５１２）に示されている。【００９１】
個体２−１〜２−３の遺伝的特徴を特定するために、これらの個体の新鮮葉からゲノムＤＮＡを抽出し、遺伝的特徴Ｂ−１及びＣの保有状況を調査した。
遺伝的特徴Ｂ−１の検出には、以下のプライマーを用いてＰＣＲを行い、ＰＣＲ産物に制限酵素（ＫｐｎＩ）を添加し、３７℃で酵素反応を行い、制限酵素による処理を行った。制限酵素処理後、マイクロチップ型電気泳動装置ＬａｂＣｈｉｐ  ＧＸ  Ｔｏｕｃｈ  ＨＴ（PerkinElmer）により電気泳動を行い、電気泳動後のバンドパターンによってマーカーの識別を行った。
プライマーの配列は以下のとおり。
Ｆｗプライマー：５’−ＴＡＡＴＣＡＴＣＣＡＡＡＣＣＣＴＡＡＴＣＴＣＧＣＣＡＡＡＣＡＡＣＣＧＧＧＴＡＣ−３’（配列番号４５）
Ｒｖプライマー：５’−ＧＡＧＧＡＡＧＡＣＡＴＴＧＧＣＡＡＣＴＣ−３’（配列番号４６）
得られたＰＣＲ産物（約２９７ｂｐ長）に対しＫｐｎＩ制限酵素処理を行い、約２６０ｂｐの制限酵素処理産物（例えば、配列番号４９）を生じなかったものを遺伝的特徴Ｂ−１陽性とした。【００９２】
遺伝的特徴Ｃの検出には、以下のプライマーを用いてＰＣＲを行い、ＰＣＲ産物に制限酵素（ＳｐｅＩ）を添加し、３７℃で酵素反応を行った。制限酵素処理後、マイクロチップ型電気泳動装置ＬａｂＣｈｉｐ  ＧＸ  Ｔｏｕｃｈ  ＨＴにより電気泳動を行い、電気泳動後のバンドパターンによってマーカーの識別を行った。
フォワードプライマー：５’−ＴＴＡＴＴＴＡＡＴＧＡＴＣＣＡＡＴＧＧＡＧＧＧＧＧＴＧＡＴＴＣＡＧＧＴＡＡＴＡＡＡＡＧＧＣＡＣＴ−３’（配列番号６４）
リバースプライマー：５’−ＴＧＡＧＧＧＴＴＣＴＣＡＡＴＴＧＡＴＴＴＣＣＧＡＴＴＧＧ−３’（配列番号６５）
得られた約３６７ｂｐＰＣＲ産物（例えば、配列番号６６又は６７）に対しＳｐｅＩ制限酵素処理を行い、約３２１ｂｐの制限酵素処理産物（例えば、配列番号６８）を生じたものを遺伝的特徴Ｃ陽性とした。
さらに、低チラミン含有個体を識別するためのマーカーを検出するため、個体２−１〜２−３の新鮮葉からゲノムＤＮＡを抽出し、ＮＧＳ（HiSeq2500、Illumina）によるシーケンシングを行った。【００９３】
結果を下表６に示す。表中、「〇」は、対応する変異が検出されたことを示し、「×」は検出されなかったことを示す。下記結果が示すとおり、遺伝的特徴Ｂ−１を保有する個体は、そうでない個体に比べチラミン含量が低い傾向がみられた。また、以下の遺伝的特徴がチラミン含量の低い個体２−１のみで検出された。
Ａ：配列番号１の２０１位に相当する位置の塩基がＡであるアレルについてホモ接合性。
Ｘ：配列番号１５０の２０１位に相当する位置の塩基がＣであるアレルについてホモ接合性。
【表７】
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【産業上の利用可能性】
【００９４】
本発明によってチラミン含量の低いステビア抽出物やステビオール配糖体精製品が提供可能になるので、安全性の高い医薬品、香料又は飲食品などを提供することができる。
【図１】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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