(57)【要約】本発明は、間葉系幹細胞による処置の効果を増幅するための組成物および方法に関する。  本発明の組成物は、生体外増幅培養された単核球画分を含む。本発明の方法は、生体外増幅培養された単核球画分を含む組成物を、間葉系幹細胞、または間葉系細胞を含む組成物とともに使用する、ことを含む。【特許請求の範囲】
【請求項１】
生体外増幅培養された単核球画分を含む組成物であって、間葉系幹細胞による処置の効果を増幅するための組成物。
【請求項２】
間葉系幹細胞、または間葉系細胞を含む組成物とともに使用される、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
単核球画分が、骨髄、末梢血または臍帯血由来の単核球画分である、請求項１または２に記載の組成物。
【請求項４】
生体増幅培養された単核球画分が、血管内皮前駆細胞または抗炎症・免疫寛容誘導細胞が富化した細胞群である、請求項１−３のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項５】
間葉系幹細胞が、脂肪由来間葉系幹細胞、骨髄由来間葉系幹細胞、末梢血由来間葉系幹細胞、または臍帯血由来間葉系幹細胞である、請求項１−４のいずれか１項に記の組成物。
【請求項６】
間葉系幹細胞による処置が、生体外増幅培養された単核球画分による血管新生、抗炎症作用および抗繊維化などによってその効果が促進される処置である、請求項１−５のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項７】
間葉系幹細胞による処置が、組織移植、組織再生、虚血性疾患の治療、神経変性疾患の治療、心臓疾患の治療、悪性腫瘍の治療、炎症性疾患の治療、および免疫疾患の治療、からなる群から選択される、請求項１−６のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項８】
間葉系幹細胞による処置が、脂肪移植、骨髄移植、骨格筋創傷の治療、皮膚創傷の治療、前立腺癌術後の組織再生、変形性関節症の治療、腰椎椎間板変形の治療、末梢神経損傷の治療、下肢虚血の治療、虚血性潰瘍の治療、虚血性心疾患の治療、脳梗塞の治療、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）の治療、パーキンソン病の治療、アルツハイマー病の治療、進行性核上性麻痺の治療、ハンチントン病の治療、多系統萎縮症の治療、脊髄小脳変性症の治療、脊髄損傷の治療、心不全の治療、心内膜炎の治療、心臓弁膜症の治療、心膜炎の治療、先天性心疾患の治療、心筋炎の治療、心筋梗塞の治療、クローン病の治療、肝硬変の治療、肝炎の治療、潰瘍性大腸炎の治療、炎症性腸疾患の治療、膠原病の治療、移植片対宿主病（ｇｒａｆｔ  ｖｅｒｓｕｓ  ｈｏｓｔ  ｄｉｓｅａｓｅ；  ＧＶＨＤ）の治療および多発性硬化症の治療からなる群から選択される、請求項１−７のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項９】
間葉系幹細胞による処置が移植であって、
（ｉ）移植組織の生存率が上昇する：
（ｉｉ）移植片の生着率が上昇する；
（ｉｉｉ）移植組織片の線維化を抑制する
（ｉｖ）移植組織における血流が改善する；または
（ｖ）移植による炎症が減少する
の少なくとも１つの効果が得られる、請求項８に記載の組成物。
【請求項１０】
間葉系幹細胞による処置が虚血の治療であって、
（ｖｉ）血流が改善する：
（ｖｉｉ）機能が改善する；または
（ｖｉｉｉ）組織障害が改善する
の少なくとも１つの効果が得られる、請求項８に記載の組成物。
【請求項１１】
間葉系幹細胞による処置の効果を増幅するための方法であって、生体外増幅培養された単核球画分を含む組成物を、間葉系幹細胞、または間葉系細胞を含む組成物とともに使用する、ことを含む、前記方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、間葉系幹細胞による処置の効果を増幅するための組成物およびその利用に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、多くの疾患において間葉系幹細胞を用いた治療が研究されている。間葉系幹細胞は、中胚葉性組織（間葉）に由来する体性幹細胞であり、間葉系細胞に属する細胞への分化能を有する。採取する組織毎に、脂肪由来間葉系幹細胞、骨髄由来間葉系幹細胞などと呼称される。間葉系幹細胞は、例えば、骨や血管、心筋等の様々な体細胞に分化できる多分化能を有している事が知られており，またサイトカインを分泌して免疫抑制作用、抗炎症作用、血管新生作用などを有する。また、免疫寛容能が高いことから、自家移植だけでなく他家移植も可能である。これらの特性により、間葉系幹細胞は再生医療において大きな潜在的可能性を有する多能性幹細胞であり，現在までに様々な疾患に対する臨床研究が数多く行われ、幅広い疾患への処置に使用されることが期待されている。しかしながら、現在では間葉系幹細胞単独の処置では、満足のいく効果が得られていないのが現実である。【０００３】
例えば、脂肪移植は、体積を増大させ、そして輪郭を回復させる目的で、乳がん術後の乳房再建などの軟部組織再構築の分野で行われる。この技術は、自己充填材として、豊富に利用可能な脂肪組織を用いるため、自然な感触を成し得、かつ低い感染率の安価な処置であるため、脂肪組織は外因性の材料よりも優れたものとなっている。しかしながら、脂肪吸引による採取プロセス中、脂肪細胞は、元来の血液供給から遮断される。その結果、移植片は、注入後、一時的に虚血となり、これが部分的壊死および移植片体積減少を引き起こす（非特許文献１）。脂肪移植およびその長期臨床適用に関心が高まっている（非特許文献２）にもかかわらず、この虚血による体積喪失に対する満足のいく解決法は未だ開発されていない。満足がいく結果を達成するために、しばしば二次的な処置が必要であり、脂肪移植増進のための細胞療法として、脂肪由来間葉系幹細胞（ＡＳＣ）が研究されている（非特許文献２０）。脂肪細胞移植の際にＡＳＣを補充する療法（ＡＳＣ補充脂肪移植片）は、有望であるが、一貫した臨床的結果を得るためには、まだ開発を続ける必要がある（非特許文献２１−２２）。ＡＳＣにより、血管新生促進性サイトカインの放出（非特許文献２３）およびｉｎ  ｖｉｔｒｏ血管内皮分化（非特許文献２４）が観察されている。しかしながら、その一方で、ＡＳＣを用いたｉｎ  ｖｉｖｏ実験は、血管形成に対する効果が主にパラクリン性であり（非特許文献２５）、または、ＡＳＣが脂肪移植を増進させる、異なる、非血管原性の機構があることを示唆している（非特許文献２６）。しかしながら、問題点として、ＡＳＣ単独では血管新生が脂肪組織を生着させるのに十分とは言えず、また線維化による問題も生じる。これらを改善することができれば、乳房再建目的等の脂肪移植においてＡＳＣ補充はさらに高い臨床効果が期待できる。【０００４】
また、「虚血性疾患」は、血量の減少によって組織内の血流がさがり細胞の変性、萎縮、線維化などの組織障害が生じることによって起こる疾患である。特に、足に血液を供給する動脈が狭窄または閉塞する「閉塞性動脈硬化症」が重症化すると、重症の下肢虚血となり、疼痛などの症状および難治性の潰瘍が生じ、最悪の場合、下肢切断が必要になる場合もある。虚血性疾患の治療のために、間葉系幹細胞による治療も検討されているが、十分な効果を得るに至っていない。間葉系幹細胞の治療はサイトカイン放出による間接的血管新生による効果が期待されるが、直接的な血管再生による効果は期待できない。そのため、間葉系幹細胞の治療では十分な組織内の血管再生は認められていない。さらに、間葉系幹細胞移植後の組織では線維化が認められるため、線維化による組織損傷が残存する可能性が考えられ、これを改善することができれば、下肢虚血に対して満足のいく臨床効果が期待できる。【０００５】
本発明者らは、国際公開ＷＯ２０１４／０５６１１５４に示されるように、骨髄、臍帯血または末梢血由来の単核球画分から無血清培養下で血管内皮前駆細胞または抗炎症・免疫寛容誘導細胞が富化した細胞群を増幅させる方法を、虚血性疾患、難治性潰瘍または糖尿病関連疾患の治療剤として使用する目的で発明した。しかし、今回本発明では、予期せぬことに、間葉系幹細胞の効果を増幅させる効果があることを明らかにした。さらに驚くべきことにこの効果は１つの疾患に限定するものではなく、間葉系幹細胞が効果を示す複数の疾患について同様の結果が認められたので、それぞれの治療効果が合わさったものではなく、当該生体外増幅培養された単核球画分が間葉系幹細胞の特性を増幅し、その問題点を改善するものであることが明らかになった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】国際公開ＷＯ２００６／０９０８８２
【特許文献２】国際公開ＷＯ２０１４／０５６１１５４
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ｐｌａｓｔ  Ｒｅｃｏｎｓｔｒ  Ｓｕｒｇ．２０１３  Ｆｅｂ；１３１（２）：１８５−１９１
【非特許文献２】Ｌａｎｇｅｎｂｅｃｋｓ  Ａｒｃｈ  Ｋｌｉｎ  Ｃｈｉｒ  Ｖｅｒ  Ｄｔｓｃｈ  Ｚ  Ｃｈｉｒ．１８９３；２２：６６−６９
【非特許文献３】Ｏｔｏｌａｒｙｎｇｏｌ  Ｈｅａｄ  Ｎｅｃｋ  Ｓｕｒｇ．１９９０  Ａｐｒ；１０２（４）：３１４−３２１
【非特許文献４】Ａｎｎ  Ｐｌａｓｔ  Ｓｕｒｇ．２００５  Ｊｕｌ；５５（１）：６３−６８
【非特許文献５】Ｅｘｐ  Ｂｉｏｌ  Ｍｅｄ（Ｍａｙｗｏｏｄ）．２００５  Ｎｏｖ；２３０（１０）：７４２−７４８
【非特許文献６】Ｄｅｒｍａｔｏｌ  Ｓｕｒｇ．２００６  Ｄｅｃ；３２（１２）：１４３７−１４４３
【非特許文献７】Ｐｌａｓｔ  Ｒｅｃｏｎｓｔｒ  Ｓｕｒｇ  Ｇｌｏｂ  Ｏｐｅｎ．２０１３  Ｏｃｔ  ７；１（６）：ｅ４０
【非特許文献８】Ａｒｃｈ  Ｐｌａｓｔ  Ｓｕｒｇ．２０１５  Ｍａｒ；４２（２）：１５０−１５８
【非特許文献９】Ｐｌａｓｔ  Ｒｅｃｏｎｓｔｒ  Ｓｕｒｇ．２０１２  Ｍａｙ；１２９（５）：１０８１−１０９２
【非特許文献１０】Ｐｌａｓｔ  Ｒｅｃｏｎｓｔｒ  Ｓｕｒｇ．２０１５  Ｊｕｎ；１３５（６）：１６０７−１６１７
【非特許文献１１】Ｓｃｉｅｎｃｅ．１９９７  Ｆｅｂ  １４；２７５（５３０２）：９６４−９６７
【非特許文献１２】Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ．２００１  Ｆｅｂ  ６；１０３（５）：６３４−６３７
【非特許文献１３】Ｎａｔ  Ｍｅｄ．２００１  Ａｐｒ；７（４）：４３０−４３６
【非特許文献１４】Ｃｉｒｃ  Ｒｅｓ．２００１  Ｊｕｌ  ６；８９（１）：Ｅ１−７
【非特許文献１５】Ｊ  Ａｍ  Ｃｏｌｌ  Ｃａｒｄｉｏｌ．２００３  Ｄｅｃ  １７；４２（１２）：２０７３−２０８０
【非特許文献１６】ＦＡＳＥＢ  Ｊ．２００５  Ｊｕｎ；１９（８）：９９２−９９４
【非特許文献１７】Ｐｌａｓｔ  Ｒｅｃｏｎｓｔｒ  Ｓｕｒｇ．２００８  Ｊｕｎ；１２１（６）：１９２９−１９４２
【非特許文献１８】Ｄｉａｂｅｔｅｓ．２０１０  Ａｕｇ；５９（８）；１９７４−１９８３
【非特許文献１９】Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  Ｔｒａｎｓｌ  Ｍｅｄ．２０１２  Ｆｅｂ；１（２）：１６０−１７１
【非特許文献２０】Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  Ｃｅｌｌ．２００２  Ｄｅｃ；１３（１２）：４２７９−４２９５
【非特許文献２１】Ｊ  Ｐｌａｓｔ  Ｒｅｃｏｎｓｔｒ  Ａｅｓｔｈｅｔ  Ｓｕｒｇ．２０１３  Ｎｏｖ；６６（１１）：１４９４−１５０３
【非特許文献２２】Ａｅｓｔｈｅｔ  Ｓｕｒｇ  Ｊ．２０１７  Ｊｕｌ  １；３７（ｓｕｐｐｌ＿３）：Ｓ４６−５８
【非特許文献２３】Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ．２００９  Ｊａｎ；２７（１）：２６６−２７４
【非特許文献２４】Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ．２００４  Ｆｅｂ  １０；１０９（５）：６５６−６６３
【非特許文献２５】ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ．２０１２；７（９）：ｅ４５６２１
【非特許文献２６】Ｌａｎｃｅｔ．２０１３  Ｓｅｐ  ２８；３８２（９８９８）：１１１３−１１２０
【非特許文献２７】Ｄｉａｂｅｔｅｓ．２０１３  Ｓｅｐ；６２（９）：３２０７−３２１７
【非特許文献２８】Ｃｉｒｃ  Ｒｅｓ．２０１１  Ｊｕｎ  ２４；１０９（１）：２０−３７
【非特許文献２９】Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ  Ｔｈｅｒ．２０１３  Ｆｅｂ  ２８；４（１）：２０
【非特許文献３０】Ｊ  Ａｍ  Ｈｅａｒｔ  Ａｓｓｏｃ．２０１４  Ｊｕｎ  ２５；３（３）：ｅ０００７４３
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
現在、間葉系幹細胞はその特性から、幅広い疾患への処置に使用されることが期待されているものの、単独での処置では未だ期待される効果が得られていない状況であり、その効果を安全かつ有効に増幅できる技術は、その必要性にもかかわらず存在していなかった。【０００９】
間葉系幹細胞の処置に生体外増幅培養された単核球画分を補充すると、血管形成を刺激するとともに、抗炎症作用や抗免疫作用発現することによって、その効果を安全かつ有効に増幅することが以下の２つもモデルで見いだされた。【００１０】
脂肪移植において、間葉系幹細胞と生体外増幅培養された単核球画分との組み合わせは、間葉系幹細胞単独での処置に比べて、血管新生を増幅することにより組織内の毛細血管密度でより強い効果を有することが見出された。また、生体外増幅培養された単核球画分と組み合わせることにより、移植した脂肪の線維が抑制しただけではなく炎症反応も抑制された。これらの効果によって、間葉系幹細胞単独の処置での問題点を解決することができ、より高い臨床効果が期待できる。【００１１】
また、下肢虚血においては、間葉系幹細胞と生体外増幅培養された単核球画分との組み合わせにより間葉系幹細胞単独での処置に比べて、血管新生を増幅することにより、下肢血流量の増加、下肢壊疽の発生の減少、組織内の毛細血管密度増加により強い下肢血流改善効果を有することが見出された。さらに増幅した組織内の血管は、間葉系幹細胞のサイトカイン効果による血管新生のみならず、生体外増幅培養された単核球画分による直接的血管再生が観察される。直接的血管新生により増幅した組織内血管は組織内での長期生存が認められ、長期的な血流改善効果が期待できる。また、生体外増幅培養された単核球画分は、その抗炎症作用や抗線維化作用により、間葉系幹細胞の虚血に伴う潰瘍の改善効果を増幅することも期待される。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
したがって、本発明は、それ単独で虚血性疾患、難治性潰瘍、糖尿病関連疾患の治療目的で使用されている生体外増幅培養された血管内皮前駆細胞または抗炎症・免疫寛容誘導細胞が富化した細胞群である単核球画分を全く異なる用途である、間葉系幹細胞の治療効果の増幅という目的で使用するものである。【００１３】
本発明は、非限定的に、以下の態様を含む。【００１４】
［態様１］
生体外増幅培養された単核球画分を含む組成物であって、間葉系幹細胞による処置の効果を増幅するための組成物。【００１５】
［態様２］
間葉系幹細胞、または間葉系細胞を含む組成物とともに使用される、態様１に記載の組成物。【００１６】
［態様３］
単核球画分が、骨髄、末梢血または臍帯血由来の単核球画分である、態様１または２に記載の組成物。【００１７】
［態様４］
生体増幅培養された単核球画分が、血管内皮前駆細胞または抗炎症・免疫寛容誘導細胞が富化した細胞群である、態様１−３のいずれか１項に記載の組成物。【００１８】
［態様５］
間葉系幹細胞が、脂肪由来間葉系幹細胞、骨髄由来間葉系幹細胞、末梢血由来間葉系幹細胞、または臍帯血由来間葉系幹細胞である、態様１−４のいずれか１項に記の組成物。【００１９】
［態様６］
間葉系幹細胞による処置が、生体外増幅培養された単核球画分による血管新生、抗炎症作用および抗繊維化などによってその効果が促進される処置である、態様１−５のいずれか１項に記載の組成物。【００２０】
［態様７］
間葉系幹細胞による処置が、組織移植、組織再生、虚血性疾患の治療、神経変性疾患の治療、心臓疾患の治療、悪性腫瘍の治療、炎症性疾患の治療、および免疫疾患の治療、からなる群から選択される、態様１−６のいずれか１項に記載の組成物。【００２１】
［態様８］
間葉系幹細胞による処置が、脂肪移植、骨髄移植、骨格筋創傷の治療、皮膚創傷の治療、前立腺癌術後の組織再生、変形性関節症の治療、腰椎椎間板変形の治療、末梢神経損傷の治療、下肢虚血の治療、虚血性潰瘍の治療、虚血性心疾患の治療、脳梗塞の治療、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）の治療、パーキンソン病の治療、アルツハイマー病の治療、進行性核上性麻痺の治療、ハンチントン病の治療、多系統萎縮症の治療、脊髄小脳変性症の治療、脊髄損傷の治療、心不全の治療、心内膜炎の治療、心臓弁膜症の治療、心膜炎の治療、先天性心疾患の治療、心筋炎の治療、心筋梗塞の治療、クローン病の治療、肝硬変の治療、肝炎の治療、潰瘍性大腸炎の治療、炎症性腸疾患の治療、膠原病の治療、移植片対宿主病（ｇｒａｆｔ  ｖｅｒｓｕｓ  ｈｏｓｔ  ｄｉｓｅａｓｅ；  ＧＶＨＤ）の治療および多発性硬化症の治療からなる群から選択される、態様１−７のいずれか１項に記載の組成物。【００２２】
［態様９］
間葉系幹細胞による処置が移植であって、
（ｉ）移植組織の生存率が上昇する：
（ｉｉ）移植片の生着率が上昇する；
（ｉｉｉ）移植組織片の線維化を抑制する
（ｉｖ）移植組織における血流が改善する；または
（ｖ）移植による炎症が減少する
の少なくとも１つの効果が得られる、態様８に記載の組成物。【００２３】
［態様１０］
間葉系幹細胞による処置が虚血の治療であって、
（ｖｉ）血流が改善する：
（ｖｉｉ）機能が改善する；または
（ｖｉｉｉ）組織障害が改善する
の少なくとも１つの効果が得られる、態様８に記載の組成物。【００２４】
［態様１１］
間葉系幹細胞による処置の効果を増幅するための方法であって、生体外増幅培養された単核球画分を含む組成物を、間葉系幹細胞、または間葉系細胞を含む組成物とともに使用する、ことを含む、前記方法。
【発明の効果】
【００２５】
本発明の生体外増幅培養された単核球画分を含む組成物は、間葉系幹細胞による多種多様な処置の効果を増幅するために有効である。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
［図１］図１は、本明細書の実施例における脂肪移植の態様の模式図である。
健康なレシピエントマウスをランダムに３つの群に分けた。各レシピエントマウスに２つの背部移植片を与え、そして各移植片は、０．２５ｇの脂肪組織からなった。
ＱＱＫＳＬ＋ＡＳＣ群における脂肪移植片には、４ｘ１０５  ＡＳＣと混合した２ｘ１０４  ＱＱ培養ＫＳＬ細胞を２５μｌＰＢＳ中に懸濁して移植し、ＡＳＣ群における脂肪移植片には、４ｘ１０５  ＡＳＣを２５μｌＰＢＳ中に懸濁して移植した。対照群における脂肪移植片には、細胞を含まない２５μｌ  ＰＢＳを投与した。
各群、マウス１８匹に移植を行った。具体的には、無菌１ｍｌシリンジおよび平滑端１６ゲージ針で、筋肉より表層に、腰椎側部皮下ボーラスとして、マウスあたり２つの移植片を注入する。切開創傷を、５／０ナイロン縫合糸で閉鎖する。１０週の追跡調査中、移植した脂肪および細胞は、重層する皮膚に顕著な炎症は認められなかった。
略語：ＧＦＰ、緑色蛍光タンパク質；ＫＳＬ細胞、ｃ−Ｋｉｔ＋Ｓｃａ−１＋Ｌｉｎ−細胞；ＱＱ、生体外増幅培養；ＡＳＣ、脂肪由来間葉系幹細胞。
［図２］図２は、脂肪移植片生存率（％）を示した図である。外植移植片重量を元来の移植片重量によって割り、重量持続性を生じることによって、脂肪移植片生存を計算する（Ｎ＝５週後の群あたり１０移植片；平均±ＳＥＭ）。＊、ｐ＜０．０５。略語：ＱＱＫＳＬ、ＱＱ培養ｃ−Ｋｉｔ＋Ｓｃａ−１＋Ｌｉｎ−細胞；ＡＳＣ、脂肪由来間葉系幹細胞。ＱＱＫＳＬ＋ＡＳＣを移植した脂肪移植片は、５週後、対照群に比較して、有意により高い移植片生存を示す。
［図３］図３は、脂肪移植から５週後およびの脂肪組織の完全性（％）を示した図である。ＱＱＫＳＬ＋ＡＳＣを移植した脂肪移植片は、５週後、対照群およびＡＳＣ群に比較して、有意に脂肪組織の完全率が高かった。＊、ｐ＜０．０５、略語：ＱＱＫＳＬ、ＱＱ培養ｃ−Ｋｉｔ＋Ｓｃａ−１＋Ｌｉｎ−細胞；ＡＳＣ、脂肪由来間葉系幹細胞。
［図４］図４は、脂肪移植から５週後の線維化の発症率を示す図である。ＱＱＫＳＬ＋ＡＳＣを移植した脂肪移植片では、移植後の最初の５週間、ＡＳＣだけを移植した脂肪移植片に比べて線維化が抑えられた。各移植片における線維症組織の割合をアザン染色によって定量化した（Ｎ＝５週後の群あたり４移植片）。略語：ＱＱＫＳＬ、ＱＱ培養ｃ−Ｋｉｔ＋Ｓｃａ−１＋Ｌｉｎ−細胞；ＡＳＣ、脂肪由来間葉系幹細胞。
［図５］図５は、脂肪移植から５週後後の局所炎症の発生（炎症発生単位／ｍｍ２）を示す図である。ＱＱＫＳＬ＋ＡＳＣおよびＡＳＣを移植した脂肪移植片では対照群と比較して有意に炎症を抑制した。さらにＱＱＫＳＬ＋ＡＳＣを移植した脂肪移植片では、ＡＳＣだけを移植した脂肪移植片よりも有意に炎症を抑制した。ＣＤ６８抗原に関して陽性である局所炎症単位を移植５週後にカウントし、そして提示した（Ｎ＝５週後の群あたり４移植片；平均±ＳＥＭ）。＊、ｐ＜０．０５；＊＊、ｐ＜０．０１；＊＊＊、ｐ＜０．００１。略語：ＱＱＫＳＬ、ＱＱ培養ｃ−Ｋｉｔ＋Ｓｃａ−１＋Ｌｉｎ−細胞；ＡＳＣ、脂肪由来間葉系幹細胞。
［図６］図６は、脂肪移植から５週後の血管密度（血管／ｍｍ２）を示す図である。ＱＱＫＳＬ＋ＡＳＣを移植した脂肪移植片ではＡＳＣだけを移植した脂肪移植片および対照群に比べて有意に血管密度が高い。＊＊＊、ｐ＜０．００１。略語：ＱＱＫＳＬ、ＱＱ培養ｃ−Ｋｉｔ＋Ｓｃａ−１＋Ｌｉｎ−細胞；ＡＳＣ、脂肪由来間葉系幹細胞。
［図７］図７は、細胞移植１０日目における虚血下肢における、血流画像、並びに健康な対側肢と比較した血流値を示す。
［図８］図８は、細胞移植後１４日目の肉眼画像を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２７】
本発明を実施するための形態は、以下の形態を含む
【００２８】
１．間葉系幹細胞による処置の効果を増幅するための組成物
本発明は、間葉系幹細胞による処置の効果を増幅するための組成物を提供する。組成物は、生体外増幅培養された単核球画分を含む。
【００２９】
「単核球画分」とは、成体から得られた末梢血、骨髄または臍帯血等に含まれる円形核を持つ細胞の総称で、リンパ球、単球、マクロファージ、血管内皮前駆細胞、造血幹細胞等が含まれる。単核球はさらにＣＤ３４および／またはＣＤ１３３陽性細胞を含んでいる。動物から骨髄、臍帯血または末梢血を採取し、それを例えば密度勾配遠心法に付して該分画を抽出することにより得られる。
【００３０】
一態様において、単核球画分は、骨髄、末梢血または臍帯血由来の単核球画分である、
【００３１】
一態様において、生体増幅培養された単核球画分は、血管内皮前駆細胞または抗炎症・免疫寛容誘導細胞が富化した細胞群である。この細胞群は血管内皮前駆細胞、抗炎症性マクロファージ、Ｔリンパ球サブセット、および制御性Ｔ細胞を含む。
【００３２】
「血管内皮前駆細胞（ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ  ｃｅｌｌ：ＥＰＣ）は、単核球画分のうち、特に、ＣＤ３４陽性および・またはＣＤ１３３陽性細胞である。また、分化型ＥＰＣコロニー形成細胞を含む。血管内皮前駆細胞は、血管に分化できる細胞として知られており，損傷した血管を修復または補充することができると考えられている。
【００３３】
「抗炎症・免疫寛容誘導細胞」とは、抗炎症性に転化したＭ２マクロファージや、Ｔリンパ球サブセット、制御性Ｔ細胞を含む。
【００３４】
「抗炎症性マクロファージ」とは、Ｍ２マクロファージである。
【００３５】
「生体外増幅（Ｑｕａｌｉｔｙ  ａｎｄ  Ｑｕａｎｔｉｔｙ）（ＱＱ）」とは、生体から採取された幹細胞を、生体外で、幹細胞増殖因子、インターロイキン等の因子を含有する無血清培地中で、一定期間培養し、修飾および増幅させることである。「修飾および増幅させる」とは、幹細胞の数を増やす、および／または機能を増加させる、ことを意味する。例えば、特許文献２は、骨髄、臍帯血または末梢血由来の単核球を、幹細胞因子、インターロイキン６、ＦＭＳ様チロシンキナーゼ３リガンド、トロンボポエチンおよび血管内皮細胞増殖因子を含有する無血清培地中で培養して得られる、細胞群を記載している。生体増幅培養された単核球画分は、好ましくは、血管内皮前駆細胞とともに、抗炎症・免疫寛容誘導細胞が富化されている、という特徴を有する。一態様において、抗炎症性のＭ２マクロファージ、Ｔリンパ球サブセットや制御性Ｔ細胞も含んでいる。生体増幅培養された単核球画分は、好ましくは、血管発生、抗線維化および／または、抗炎症性作用を有する。
【００３６】
核球画分を生体外増幅培養するための方法は特に限定されず、公知の任意の方法を使用することが可能である。例えば、非特許文献１９、２７には血管内皮前駆細胞を生体外増幅培養するための具体的な方法が開示されている。例えば、ＶＥＧＦ、ＳＣＦ、Ｆｌｔ−３リガンド、ＴＰＯ、ＩＬ−６および１％抗生物質を補充した培地を用いることができる。本明細書の実施例では、５０ｎｇ／ｍｌ  ＶＥＧＦ、１００ｎｇ／ｍｌ  ＳＣＦ、１００ｎｇ／ｍｌ  Ｆｌｔ−３リガンド、２０ｎｇ／ｍｌ  ＴＰＯ、２０ｎｇ／ｍｌ  ＩＬ−６および１％抗生物質を補充したＳｔｅｍＳｐａｎ培地で１週間培養した。
【００３７】
あるいは、国際公開ＷＯ２００６／０９０８８２に記載の方法を用いることもできる。当該方法は、幹細胞増殖因子、インターロイキン６、ＦＭＳ様チロシンキナーゼ３およびトロンボポエチンからなる群より選ばれる１または２以上の因子を含有する無血清培地で血液血管内皮前駆細胞をインキュベートすることを含む。
【００３８】
「間葉系幹細胞（ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ）」は、中胚葉性組織（間葉）に由来する体性幹細胞であり、間葉系細胞に属する細胞への分化能を有する。採取する組織毎に、脂肪由来間葉系幹細胞（ａｄｉｐｏｓｅ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ：ＡＳＣ）、骨髄由来間葉系幹細胞などと呼称される。間葉系幹細胞は間質細胞に含まれる。例えば、骨髄間質細胞が分化誘導されることにより、間葉系に属する細胞（骨細胞、心筋細胞、軟骨細胞、腱細胞、脂肪細胞など）になる。
【００３９】
一態様において、間葉系幹細胞は、脂肪由来間葉系幹細胞、骨髄由来間葉系幹細胞、末梢血由来間葉系幹細胞、または臍帯血由来間葉系幹細胞である。
【００４０】
組成物は、生体外増幅培養された単核球画分の作用により、間葉系幹細胞による処置の効果を増幅する。
【００４１】
「間葉系幹細胞による処置」は、間葉系幹細胞による処置によって効果がある疾患、状態であれば特に限定されない。例えば、間葉系細胞は、骨や血管、心筋の再構築などの再生医療への適用など幅広い処置に使用されうる。
【００４２】
一態様において、間葉系幹細胞による処置は、生体外増幅培養された単核球画分による血管新生、抗炎症作用および抗繊維化などによってその効果が促進される処置である。
【００４３】
一態様において、間葉系幹細胞による処置は、組織移植、組織再生、虚血性疾患の治療、神経変性疾患の治療、心臓疾患の治療、悪性腫瘍の治療、炎症性疾患の治療および免疫疾患の治療、からなる群から選択される。一態様において、間葉系幹細胞による処置は、組織再生、虚血性疾患の治療、神経変性疾患の治療、心臓疾患の治療、悪性腫瘍の治療、炎症性疾患の治療および免疫疾患の治療、からなる群から選択される。一態様において、間葉系幹細胞による処置は、虚血性疾患の治療、神経変性疾患の治療、心臓疾患の治療、悪性腫瘍の治療、炎症性疾患の治療および免疫疾患の治療、からなる群から選択される。一態様において、間葉系幹細胞による処置は、虚血性疾患の治療である。
【００４４】
「組織移植、組織再生」における組織の種類は移植・再生が可能な生体組織であれば特に限定されない。例えば、脂肪、骨髄、心臓、腎臓等が含まれる。乳がん術後の乳房再建などの脂肪移植、骨髄移植（白血病、リンパ腫、骨髄腫などの治療）等を目的として行われる。
【００４５】
組織再生には、例えば、骨格筋創傷、皮膚創傷、前立腺癌術後の組織再生、変形性関節症、腰椎椎間板変形、末梢神経損傷等に対する治療も含まれる。
【００４６】
「虚血性疾患」は、血量の減少によって組織内の血流がさがり細胞の変性、萎縮、線維化などの組織障害が生じることによって起こる疾患である。。虚血はその原因により、閉塞性虚血、圧迫性虚血、痙攣性虚血、代償性虚血に大別される。虚血が持続すると細胞の変性、萎縮、線維化が生じる。「虚血性疾患」には、下肢虚血、虚血性潰瘍、虚血性心疾患、脳梗塞等が含まれる。「脳梗塞」（または脳軟化症）は、脳を栄養する動脈の閉塞、または狭窄のため、脳虚血を来たし、脳組織が酸素、または栄養の不足のため壊死、または壊死に近い状態になる事をいう、脳血栓および脳塞栓に分類される。「下肢虚血」は、足に血液を供給する動脈が狭窄または閉塞する疾患でり、この閉塞性動脈硬化症が重症化すると、重症の下肢虚血となり、疼痛などの症状および難治性の潰瘍が生じ、最悪の場合、下肢切断が必要になる場合もある。
【００４７】
「神経変性疾患」は、中枢神経の中の特定の神経細胞群が徐々に死んでいく病気で、脳神経疾患の一種である。筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、パーキンソン病、アルツハイマー病、進行性核上性麻痺、ハンチントン病、多系統萎縮症、脊髄小脳変性症、脊髄損傷等を含む。「脊髄損傷」は、主に脊柱に強い外力が加えられることにより脊椎を損傷し、脊髄に損傷を生じる病態である。脊髄損傷は、現段階で根本的治療が困難と言われているが、幹細胞を用いた再生医療の適用が検討されている。
【００４８】
「心臓疾患」は、心臓の疾患の総称で、心不全、心内膜炎、心臓弁膜症、心膜炎、先天性心疾患、その他の疾患（心筋炎、心筋梗塞等）が含まれる。
【００４９】
「炎症性疾患」は、なんらかの原因により組織損傷などの異常が生じることで症状を起こす疾患の総称である。炎症性疾患には、クローン病、肝硬変、肝炎、潰瘍性大腸炎、炎症性腸疾患等が含まれる。
【００５０】
「免疫疾患」（「自己免疫疾患」ともいう）は、異物を認識し排除するための役割を持つ免疫系が、自分自身の正常な細胞や組織に対してまで過剰に反応し攻撃を加えてしまうことで症状を起こす、免疫寛容の破綻による疾患の総称である。自己免疫疾患は、全身にわたり影響が及ぶ全身性自己免疫疾患と、特定の臓器だけが影響を受ける臓器特異的疾患の２種類に分けることができる。例えば、関節リウマチや全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）に代表される膠原病は、全身性自己免疫疾患である。また、免疫疾患には、移植片対宿主病（ｇｒａｆｔ  ｖｅｒｓｕｓ  ｈｏｓｔ  ｄｉｓｅａｓｅ；  ＧＶＨＤ）、多発性硬化症、なども含まれる。
【００５１】
一態様において、間葉系幹細胞による処置は、脂肪移植、骨髄移植、骨格筋創傷の治療、皮膚創傷の治療、前立腺癌術後の組織再生、変形性関節症の治療、腰椎椎間板変形の治療、末梢神経損傷の治療、下肢虚血の治療、虚血性潰瘍の治療、虚血性心疾患の治療、脳梗塞の治療、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）の治療、パーキンソン病の治療、アルツハイマー病の治療、進行性核上性麻痺の治療、ハンチントン病の治療、多系統萎縮症の治療、脊髄小脳変性症の治療、脊髄損傷の治療、心不全の治療、心内膜炎の治療、心臓弁膜症の治療、心膜炎の治療、先天性心疾患の治療、心筋炎の治療、心筋梗塞の治療、クローン病の治療、肝硬変の治療、肝炎の治療、潰瘍性大腸炎の治療、炎症性腸疾患の治療、膠原病の治療、移植片対宿主病（ｇｒａｆｔ  ｖｅｒｓｕｓ  ｈｏｓｔ  ｄｉｓｅａｓｅ；  ＧＶＨＤ）の治療または多発性硬化症の治療である。
【００５２】
一態様において、間葉系幹細胞による処置は、骨格筋創傷の治療、皮膚創傷の治療、前立腺癌術後の組織再生、変形性関節症の治療、腰椎椎間板変形の治療、末梢神経損傷の治療、下肢虚血の治療、虚血性潰瘍の治療、虚血性心疾患の治療、脳梗塞の治療、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）の治療、パーキンソン病の治療、アルツハイマー病の治療、進行性核上性麻痺の治療、ハンチントン病の治療、多系統萎縮症の治療、脊髄小脳変性症の治療、脊髄損傷の治療、心不全の治療、心内膜炎の治療、心臓弁膜症の治療、心膜炎の治療、先天性心疾患の治療、心筋炎の治療、心筋梗塞の治療、クローン病の治療、肝硬変の治療、肝炎の治療、潰瘍性大腸炎の治療、炎症性腸疾患の治療、膠原病の治療、移植片対宿主病（ｇｒａｆｔ  ｖｅｒｓｕｓ  ｈｏｓｔ  ｄｉｓｅａｓｅ；  ＧＶＨＤ）の治療または多発性硬化症の治療である。
【００５３】
一態様において、間葉系幹細胞による処置は、下肢虚血の治療、虚血性潰瘍の治療、虚血性心疾患の治療、脳梗塞の治療、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）の治療、パーキンソン病の治療、アルツハイマー病の治療、進行性核上性麻痺の治療、ハンチントン病の治療、多系統萎縮症の治療、脊髄小脳変性症の治療、脊髄損傷の治療、心不全の治療、心内膜炎の治療、心臓弁膜症の治療、心膜炎の治療、先天性心疾患の治療、心筋炎の治療、心筋梗塞の治療、クローン病の治療、肝硬変の治療、肝炎の治療、潰瘍性大腸炎の治療、炎症性腸疾患の治療、膠原病の治療、移植片対宿主病（ｇｒａｆｔ  ｖｅｒｓｕｓ  ｈｏｓｔ  ｄｉｓｅａｓｅ；  ＧＶＨＤ）の治療または多発性硬化症の治療である。
【００５４】
または、組成物は、間葉系葉系幹細胞による処置の効果を増幅するためのものである。組成物は、間葉系幹細胞、または間葉系細胞を含む組成物とともに使用される。
【００５５】
「使用される」とは、ヒト等の対象に処置に応じて適切な態様で適用されることを意味する。一態様において、組成物は好ましくは、間葉系葉系幹細胞による処置を行う生体の部位に注入（例えば、静脈内投与、動脈内投与、筋肉内投与、皮下投与、脳室内投与、組織への塗布）する。
【００５６】
「間葉系葉系幹細胞による処置とともに」とは、間葉系葉系幹細胞による処置と同時であっても、あるいは、間葉系葉系幹細胞による処置の効果を増幅する効果を奏するように、間葉系葉系幹細胞による処置の直前または直後に生体に適用してもよい。間葉系葉系幹細胞による処置の効果に影響を与える範囲での使用であれば、「間葉系葉系幹細胞による処置とともに使用される」に含まれる。
【００５７】
「間葉系細胞を含む組成物」は、間葉系細胞を含む組成物であれば、生体から得られたものであっても、人工的に調製したものであってもよい。間葉系細胞による処置の効果を奏するように、有効量の間葉系細胞が含まれていればよい。一態様において、間葉系細胞を含む組成物は、間質血管細胞分画（ＳＶＦ）（「間質血管細胞群」ともいう）である。間質血管細胞分画は、脂肪組織のコラゲナーゼ処理により得られる細胞群である。間質血管細胞分画は、一般に不均一な細胞群で、血液由来細胞の他に、脂肪組織由来の細胞群が含まれる、脂肪組織由来の細胞の中には、脂肪間質細胞が含まれ、これは、脂肪由来間葉系幹細胞（ＡＳＣ）を含む。
【００５８】
組成物は、間葉系細胞による処置を必要とする任意の対象が含まれる。非限定的に、ヒト、非ヒト霊長類、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、イヌ、ネコ、げっ歯類（マウス、ラット等）などの哺乳動物を含む。好ましくは、対象はヒトである。
【００５９】
本発明の組成物は、処置部位、疾患・状態の重篤度、対象の状態（年齢、体重、身長、既往症、体調等）によって、医療従事者（医師、獣医師）が適切な用法、用量で対象に適用（使用）されうる。例えば、ヒトに投与される場合、一態様において、組成物に含まれる生体外増幅培養された単核球画分の総細胞数は、１ｘ１０５〜５ｘ１０１１の範囲である。組成物は１回〜複数回投与されうる。
【００６０】
２．組成物による効果
本発明の組成物は、間葉系幹細胞による処置の効果を増幅する。効果を増幅するとは、間葉系幹細胞単独で対象に適用し場合と比較して、組成物を間葉系幹細胞とともに適用した場合に、間葉系幹細胞による処置の効果が増加することを意味する。
【００６１】
一態様において、間葉系幹細胞による処置が、例えば、移植の場合、
（ｉ）移植組織の生存率が上昇する：
（ｉｉ）移植片の生着率が上昇する；
（ｉｉｉ）移植組織片の線維化を抑制する
（ｉｖ）移植組織における血流が改善する；または
（ｖ）移植による炎症が減少する
【００６２】
好ましくは、上記効果の２つ、３つ、４つまたは５つ（全て）が得られる。
【００６３】
一態様において、間葉系幹細胞による処置が脂肪移植であって、
（ｉ）移植脂肪組織の生存率が上昇する：
（ｉｉ）移植脂肪片の生着率が上昇する；
（ｉｉｉ）移植脂肪組織片の線維化を抑制する
（ｉｖ）移植脂肪組織における血流が改善する；または
（ｖ）移植による炎症が減少する
の少なくとも１つの効果が得られる。
【００６４】
好ましくは、上記効果の２つ、３つ、４つまたは５つ（全て）が得られる。
【００６５】
一態様において、間葉系幹細胞単独で対象に適用し場合と比較して、組成物を間葉系幹細胞とともに適用した場合に、間葉系幹細胞による処置の効果、例えば、上記（ｉ）−（ｖ）の少なくとも１つの効果が、１．１倍以上、１．２倍以上、１．３倍以上、１．５倍以上、１．８倍以上、２倍以上増加する。
【００６６】
一態様において、間葉系幹細胞による処置が虚血の治療であって、
（ｖｉ）血流が改善する：
（ｖｉｉ）機能が改善する；または
（ｖｉｉｉ）組織障害が改善する
の少なくとも１つの効果が得られる、請求項８に記載の組成物。
【００６７】
好ましくは、上記効果の２つ、３つ（全て）が得られる。
【００６８】
一態様において、間葉系幹細胞による処置が下肢虚血の治療であって、
（ｖｉ）下肢の血流が改善する：
（ｖｉｉ）機能が改善する；または
（ｖｉｉｉ）虚血性潰瘍などの組織障害が改善する
の少なくとも１つの効果が得られる、請求項８に記載の組成物。
【００６９】
好ましくは、上記効果の２つ、３つ（全て）が得られる。
【００７０】
３．間葉系幹細胞による処置の効果を増幅するための方法
本発明は、間葉系幹細胞による処置の効果を増幅するための方法も提供する。本発明の方法は、生体外増幅培養された単核球画分を含む組成物を、間葉系幹細胞、または間葉系細胞を含む組成物とともに使用する、ことを含む。
【００７１】
「生体外増幅培養された」、「単核球画分を含む組成物」「間葉系幹細胞、または間葉系細胞を含む組成物」の定義は、「１．間葉系幹細胞による処置の効果を増幅するための組成物」に記載した通りである。
【実施例】
【００７２】
以下、実施例に基づいて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。当業者は本明細書の記載に基づいて容易に本発明に修飾・変更を加えることができ、それらは本発明の技術的範囲に含まれる。【００７３】
実施例１  脂肪移植
本実施例では、脂肪移植における脂肪由来間葉系幹細胞の効果に対する生体外増幅培養されたＥＰＣを含む組成物の増幅効果を確認する。【００７４】
材料および方法
本明細書の実施例では、特に明記しない限り、以下の材料および方法を用いた。【００７５】
（１）動物
８〜１０週齢の野生型（ＷＴ）Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスおよび緑色蛍光タンパク質発現（ＧＦＰ＋）Ｃ５７ＢＬ／６−Ｔｇ（ＣＡＧ−ＥＧＦＰ）マウスをＣＬＥＡ  Ｊａｐａｎより購入した。すべての実験は、順天堂大学医学部実験動物委員会によって認可され、そして施設の実験動物実験指針に従って行われた。【００７６】
（２）脂肪組織の採取および脂肪由来間葉系幹細胞（ＡＳＣ）の調製
ＷＴ脂肪ドナーマウス（野生型（ＷＴ）Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス）を頸椎脱臼によって屠殺した。腹部切開を行って、鼠径部リンパ節を除去した後、鼠径部脂肪組織を収集した。
ＡＳＣ単離のための脂肪組織を同じ方式でＧＦＰ＋マウス（緑色蛍光タンパク質発現（ＧＦＰ＋）Ｃ５７ＢＬ／６−Ｔｇ（ＣＡＧ−ＥＧＦＰ）マウス）から切除し、そして０．１２％  Ｉ型コラゲナーゼ中で消化した。１０％ＦＢＳおよび１％抗生物質（ペニシリン−ストレプトマイシン溶液（×１００））（１０，０００ユニット／ｍＬ  ペニシリンＧおよび１０，０００μｇ／ｍＬ  ストレプトマイシン硫酸塩を含む０．８５％生理食塩水溶液）を添加したＤＭＥＭからなる間質培地によって、コラゲナーゼ活性を阻害した。漉し（ｓｔｒａｉｎｉｎｇ）、そして遠心分離した後、細胞を間質血管分画（ＳＶＦ）として収集し、そして間質培地中で培養した。第三継代接着細胞を収集し、そして形態によって、そして細胞上の表面マーカー発現をフローサイトメトリー（ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）上で測定することによって、ＡＳＣを特徴付けた。フローサイトメトリーによって、ＣＤ７３＋ＣＤ９０．２＋ＣＤ１０５＋ＣＤ１１ｂ−ＣＤ３１−ＣＤ３４−ＣＤ４５−集団が得られたことが示された。【００７７】
（３）ＫＳＬおよびＱＱＫＳＬ細胞の調製
ｃ−Ｋｉｔ＋Ｓｃａ−１＋Ｌｉｎ−細胞（ＫＳＬ細胞）を、我々の以前の報告（非特許文献２７）にしたがって、ＥＰＣとして調製した。【００７８】
簡潔には、骨髄内容物をＧＦＰ＋マウス（緑色蛍光タンパク質発現（ＧＦＰ＋）Ｃ５７ＢＬ／６−Ｔｇ（ＣＡＧ−ＥＧＦＰ）マウス）から得て、そして系譜陰性（Ｌｉｎ−）細胞を、系譜陽性ビオチンコンジュゲート化抗体カクテルおよび抗ビオチンマイクロビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）用いて系譜陽性細胞をＭＡＣＳシステム（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）上で除くことで調製した。【００７９】
【表１】
2019146131.tif 000002
【００８０】
系譜陰性（Ｌｉｎ−）細胞を蛍光標識抗Ｌｙ−６Ａ／Ｅ（Ｓｃａ−１）および抗ＣＤ１１７（ｃ−Ｋｉｔ）抗体とインキュベーションした。蛍光活性化細胞ソーティングのための抗体は以下のものを用いた。【００８１】
【表２】
2019146131.tif 000003
【００８２】
そしてＦＡＣＳＡｒｉａ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）上で、二重陽性細胞をＫＳＬ細胞としてソーティングした。【００８３】
ＱＱ培養のため、先に報告するように、ＫＳＬ細胞を、５０ｎｇ／ｍｌ  ＶＥＧＦ、１００ｎｇ／ｍｌ  ＳＣＦ、１００ｎｇ／ｍｌ  Ｆｌｔ−３リガンド、２０ｎｇ／ｍｌ  ＴＰＯ、２０ｎｇ／ｍｌ  ＩＬ−６および１％抗生物質（ペニシリン−ストレプトマイシン溶液（×１００））を補充したＳｔｅｍＳｐａｎ培地で１週間培養した（非特許文献１９、２７）。ＫＳＬ細胞およびＱＱＫＳＬ細胞を、コロニー形成アッセイによって、血管形成能に関して評価した。【００８４】
（４）コロニー形成アッセイ
ＫＳＬ細胞およびＱＱＫＳＬ細胞を、ＥＰＣコロニー形成アッセイ（ＥＰＣ−ＣＦＡ）によって血管原性潜在能力についてアッセイした。３５ｍｍディッシュ上の１５％  ＦＢＳ、５０ｎｇ／ｍｌ  ＶＥＧＦ、５０ｎｇ／ｍｌ  ｂＦＧＦ、１００ｎｇ／ｍｌ  ＳＣＦ、５０ｎｇ／ｍｌ  ＩＧＦ、５０ｎｇ／ｍｌ  ＥＧＦ、２０ｎｇ／ｍｌ  ＩＬ−３（全てＰｅｐｒｏＴｅｃｈ，Ｒｏｃｋｙ  Ｈｉｌｌ，Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ，ＵＳＡより）、２ＩＵ／ｍｌ  ヘパリン、および１％抗生物質（ペニシリン−ストレプトマイシン溶液（×１００））を補足したＭｅｔｈｏＣｕｌｔ（商標）ＳＦ  Ｍ３２３６固体培養培地（Ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ，Ｂｒｉｔｉｓｈ  Ｃｏｌｕｍｂｉａ，Ｃａｎａｄａ）に、５００細胞を播種した。飽和湿度、５％ＣＯ２に調整した大気中、３７℃での７日間の培養後、未分化型（Ｐｒｉｍｉｔｉｖｅ）ＥＰＣコロニー形成単位と分化型（Ｄｅｆｉｎｉｔｉｖｅ）ＥＰＣコロニー形成単位（ｐＥＰＣ−ＣＦＵおよびｄＥＰＣ−ＣＦＵ）とが識別できる（非特許文献２９）。コロニーを観察し、倒立顕微鏡上で計測した。【００８５】
（５）脂肪移植および試料収集
「（２）脂肪組織の採取および脂肪由来間葉系幹細胞（ＡＳＣ）の調製」、「（３）ＫＳＬおよびＱＱＫＳＬ細胞の調製」に記載の通り、脂肪移植片、ＡＳＣおよびＱＱＫＳＬを調製し、野生型（ＷＴ）Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスに注入した（図１）。
Ｃｏｎｔｒｏｌ（対照）：脂肪移植片＋ＰＢＳ
ＱＱＫＳＬ＋ＡＳＣ：：脂肪移植片＋ＱＱＫＳＬ＋ＡＳＣ
ＡＳＣ：脂肪移植片＋ＡＳＣ【００８６】
５週後、レシピエントマウス（Ｎ＝１０）を麻酔下で心臓灌流固定により屠殺した。移植試料を内因性組織と区別し、そして収集した。外植移植片重量を注入組織重量で割ることによって、脂肪移植片生存を概算した。【００８７】
（６）組織学
ＰＦＡ固定パラフィン包埋切片（４μｍ）をヘマトキシリンおよびエオジン（ＨＥ）で染色して、脂肪組織完全性を調べた。具体的には、肪組織の完全性を、１移植片あたりの２ＨＥ−染色完全横断面上で評価した。Ｋｅｙｅｎｃｅ  ＢＺ−９０００  Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ（Ｋｅｙｅｎｃｅ  Ｊａｐａｎ  Ｃｏ，Ｌｔｄ，Ｏｓａｋａ，Ｊａｐａｎ）で高解像度の画像を撮った。無傷の含脂肪細胞は、染色試薬の結果空になっている、単一の非断片化中心脂肪含有物によって特色付けられる、比較的大きな細胞として同定される。それらは細胞の縁にそって平らになった核によって、特徴的な印環状の外観を示す。よく構築された細胞組織からなる領域がＫｅｙｅｎｃｅ  ＢＺ−ＩＩ  Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ｋｅｙｅｎｃｅ  Ｊａｐａｎ  Ｃｏ，Ｌｔｄ，Ｏｓａｋａ，Ｊａｐａｎ）上に描かれた。描かれた領域の総表面積を計算し、それを組織の全表面積で割った割合（百分率）を算出して、脂肪組織完全性とした。【００８８】
さらに、マロリーの三色結合組織染色のハイデンハインのアザン修飾法で染色して、線維症を評価した。具体的には、アザン染色は、オレンジＧ、アゾカルミンＧＸおよびアニリンブルーからなり、これにより、青色に染色されたコラーゲン繊維の認識が可能になる。Ｋｅｙｅｎｃｅ  ＢＺ−ＩＩ  Ａｎａｌｙｚｅｒにより、１移植片あたり２つの完全な組織横断図中のコラーゲン繊維からなる領域を計測し、これを１横断図あたりの全組織表面積で割り、繊維症の割合（百分率）を算出した。【００８９】
（７）免疫組織化学
切片を、クエン酸緩衝液（ｐＨ６．０）中９５℃で抗原回復に供し、０．３％  Ｈ２Ｏ２で内因性ペルオキシダーゼをブロッキングし、そして５％正常ヤギ血清でブロッキングした。標本を、ＣＤ６８（Ａｂｃａｍ  ａｂ１２５２１２、１：３００）およびＣＤ３１（Ａｂｃａｍ  ａｂ２８３６４、１：５０）に対する一次抗体とインキュベーションした。ビオチン化ポリクローナルＩｇＧを二次抗体として用いて、ＨＲＰ標識ストレプトアビジンと反応させ、そして３，３’−ジアミノベンジジン（ＤＡＢ）での視覚化した。二重免疫組織化学を抗ＧＦＰ（Ｆｒｏｎｔｉｅｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  Ａｆ２０２０、１：２００）および抗ＣＤ３１抗体（Ａｂｃａｍ  ａｂ５６２９９、１：５０）で行った。ＤＡＢはＧＦＰの発色基質として働き、そしてＣＤ３１はＶｅｃｔｏｒ  Ｂｌｕｅ  ＡＰ基質キット（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  ＳＫ−５３００）で検出された。ＱＱＫＳＬ＋ＡＳＣ群における移植片は、どちらの細胞集団もＧＦＰを発現し、そして我々のモデルにおいては区別不能であるため、二重ＧＦＰ−ＣＤ３１免疫組織化学から排除した。【００９０】
Ｋｅｙｅｎｃｅ  ＢＺ−９０００  Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ（Ｋｅｙｅｎｃｅ  Ｊａｐａｎ  Ｃｏ，Ｌｔｄ，Ｏｓａｋａ，Ｊａｐａｎ）で高解像度の画像を撮り、ＢＺ−ＩＩ  Ａｎａｌｙｚｅｒで加工した。断面図を、一次抗体を欠くその陰性対照と比較した。【００９１】
２個以上のＣＤ６８陽性マクロファージによって囲まれた生存または死んでいる含脂肪細胞の各々を、局所延長の単位として計測した。消滅しかけている含脂肪細胞に富むマクロファージの集積物の組織学的特徴である、王冠状の構造に組織化された塊状のマクロファージも、１つの単位として計測した。１移植片あたり６ｍｍ２の観察した全組織表面に相当する、１移植片あたり４０倍の倍率で６０のランダムな画像を分析した。結果は、組織の１ｍｍ２あたりの局所炎症の平均単位数として示した。血管密度は、組織の表面の血管をマニュアルで定量することによって評価した。血管は、抗ＣＤ３１抗体によって標識され内皮細胞によって囲まれた内腔構造として認識された。各観察された移植片において、４０倍の倍率で、２５０−５００の部分が分析された。これは、移植の完全な横断図をカバーずる。結果は、組織の１ｍｍ２あたりの血管の平均数として示した。【００９２】
（８）定量的ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＰＣＲ）
非培養ＫＳＬ細胞、ＱＱ培養ＫＳＬ細胞およびＡＳＣからＲＮＡを精製し、そしてｃＤＮＡを合成して、ＴＧＦ−β、ＳＭＡＤ３およびＣｏｌ１Ａ１発現をｑＰＣＲで比較ＣＴ実験を行い分析した。移植片からＲＮＡを抽出し、その後、ｃＤＮＡ合成およびｑＰＣＲを行った。比較ＣＴ実験を行って、アディポネクチン、ＦＡＢＰ４、ＰＤＧＦ、ＢＡＸおよびＢＣＬ−２の遺伝子発現を決定した。【００９３】
具体的には、ＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ（登録商標），Ｖａｌｅｎｃｉａ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，ＵＳＡ）で製造業者の指示書に従って、スピン技術を用いて、非培養ＫＳＬ細胞、ＱＱ培養ＫＳＬ細胞および３継代のＡＳＣからＲＮＡを精製した。ＮａｎｏＤｒｏｐ  ＮＤ−１０００  ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，Ｄｅｌａｗａｒｅ，ＵＳＡ）を用いて全ＲＮＡ量を測定した。シグルプレックス（ｓｉｎｇｌｅｐｌｅｘ）２段階工程によって、定量ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＰＣＲ）を行った。第一に、Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｔ１００  Ｔｈｅｒｍａｌ  Ｃｙｃｌｅｒ中で、Ｓｅｎｓｉｓｃｒｉｐｔ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ（登録商標））を用いて、精製ＲＮＡからｃＤＮＡを合成し、第二に、ＳｔｅｐＯｎｅＰｌｕｓ  ｄｅｖｉｃｅ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，ＵＳＡ）中でｃＤＮＡを増幅し、そして、ＰｏｗｅｒＵｐ  ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，ＵＳＡ）の使用によって、遺伝子発現を検出した。集積した二本鎖ＤＮＡに結合して、検出可能な蛍光を生じるＳＹＢＲグリーンＩ色素を用いた。最初の２分間（９５℃）の変性後、試料を変性（１秒、９５℃）およびアニーリング−伸長（３０秒、６０℃）の４０サイクルに付した。比較ＣＴ実験（△△ＣＴ法）を行い、非培養ＫＳＬ細胞、ＱＱ培養ＫＳＬ細胞およびＡＳＣにおける、トランスフォーミング増殖因子（ＴＧＦ−β）、スマッド（ＳＭＡＤ）３（Ｃｏｎｔｒａｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｓｍａ  ａｎｄ  Ｍａｄ（Ｍｏｔｈｅｒｓ  ａｇａｉｎｓｔ  ｄｅｃａｐｅｎｔａｐｌｅｇｉｃ）ｈｏｍｏｌｏｇ  ３）およびコラーゲン１型α１（Ｃｏｌ１Ａ１）の発現レベルを調べた、【００９４】
プライマー配列は、以下の表に記載の通りである。【００９５】
【表３】
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【００９６】
異なる組織および細胞中において定常的な発現をする内在性コントロールとしての、ハウスキーピング遺伝子、グルセロールアルデヒド−３’−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）のリボソームＲＮＡに対して、データを標準化した。ＲＮＡ抽出および定量ＰＣＲのための移植片は、ＲＮａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ＴＲＩｚｏｌ（登録商標）（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，ＵＳＡ）中、−３０℃で保存ざれた。移植片のホモジェナイゼーションおよび遠心工程の後、クロロホルムを加えて、核酸の精製およびタンパク質の除去を行い、プロパノール、エタノールの順に添加して、核酸を沈殿させた。ＮａｎｏＤｒｏｐ  ＮＤ−１０００  ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒを用いて総ＲＮＡ量を計測した。次いで、これを用いて、Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｔ１００  Ｔｈｅｒｍａｌ  Ｃｙｃｌｅｒ中、Ｈｉｇｈ  Ｃａｐａｃｉｔｙ  ＲＮＡ−ｔｏ−ｃＤＮＡ  Ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｖｉｌｎｉｕｓ，Ｌｉｔｈｕａｎｉａ）でｃＤＮＡ合成を行った。研究した５つのグループにおける、アディポネクチン、脂肪酸結合タンパク質（ＦＡＢＰ）４、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、ＢＣＬ−２関連Ｘタンパク質（ＢＡＸ）およびＢ細胞リンパ腫２（ＢＣＬ−２）の発現レベルを上述したＳｔｅｐＯｎｅＰｌｕｓおよびＰｏｗｅｒＵＰ  ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘを用いて測定した。異なる試料における全ての遺伝子の発現を各々３回繰り返し測定し、ほぼ同じ結果を得た。実験したグループにおける標準化した標的の量を、対照グループにおける標準化した標的の量と比較した。結果を、対照グループと比較した変化の倍数で示す。【００９７】
（９）統計【００９８】
実験データを平均±ＳＥＭで示す。等分散に関してデータを分析し、その後、２テールｔ検定で対比較した。ｐ＜０．０５である場合、相違を統計的に有意と見なした。【００９９】
ＫＳＬ細胞増殖に対するＱＱ培養の効果
ＥＰＣ療法前に十分な細胞を得るために拡大が非常に重要である。本実施例では、ＫＳＬ細胞増殖に対するＱＱ培養の定量的な効果を測定した。【０１００】
ＫＳＬ細胞数は、１週後、６．２±３．１ｘ１０２の係数で増加した。コロニー形成アッセイを行って、血管原性潜在能力を研究した。非培養ＫＳＬ細胞と比較して、ＱＱＫＳＬ細胞は、より多くのｄＥＰＣ−ＣＦＵを提示し（９．９±１．３対３．０±０．６／プレート；ｐ＜０．０１）た。この結果は、ＱＱＫＳＬが、血管内皮系譜分化、細胞接着および管状構造形成の高い潜在能力を持つ紡錘状ＥＰＣを含有し、そして非常に血管原性の高い集団であることを示す（非特許文献１７、２７−２９）。【０１０１】
本実施例により、ＱＱ培養は、ＫＳＬ細胞の増殖および血管原性潜在能力を刺激することが示された。【０１０２】
脂肪移植片生存への効果
組織喪失は、脂肪移植における主な問題点である。本実施例では、脂肪移植片の重量持続を計算することによって、具体的には、（５週間維持された）外植移植片重量を注入組織重量で割ることによって、脂肪移植片生存率を算出し、ＱＱＫＳＬ＋ＡＳＣ、またはＡＳＣの注入による、脂肪移植片生存への効果を調べた。【０１０３】
脂肪移植の５週後、対照（４０．３±４．８％）に比較して、ＱＱＫＳＬ＋ＡＳＣ群において（５７．８±４．０％；ｐ＜０．０５）、有意に改善された（図２）。ＡＳＣ単独（５１．１±４．８％）は、脂肪移植片重量を有意に増加させず、ＱＱ培養ＫＳＬ細胞が、より高い残渣重量の原因であると示唆された。【０１０４】
本実施例は、ＱＱＫＳＬ＋ＡＳＣ細胞が、脂肪移植片生存を改善することを示す。【０１０５】
脂肪移植片完全性への効果
本実施例では、ＱＱＫＳＬ＋ＡＳＣ細胞の脂肪移植片完全性への効果を調べた。【０１０６】
脂肪移植片の臨床的転帰は、重量持続だけでなく、組織品質によっても決定される。本実施例では、脂肪移植片の品質（完全性）に与えるＱＱＫＳＬ＋ＡＳＣ、またはＡＳＣの移植の効果を調べた。脂肪移植片の完全性は、「（５）組織学」に記載した方法により評価した。【０１０７】
移植から５週間後の組織学的完全性要件を満たす脂肪組織の割合を図３に示す。５週後、組織学的完全性要件を満たす脂肪組織の割合は、対照（１６．９±３．０％）に比較してＱＱＫＳＬ＋ＡＳＣ群（２２．５±２．４％；ｐ＜０．０５）においてのみ有意に増加した。一方、ＡＳＣ群（１６．７±１．７％）においては不変であった。【０１０８】
本実施例は、ＱＱＫＳＬ＋ＡＳＣは脂肪移植片の脂肪組織完全性を改善することを示す。【０１０９】
生存脂肪細胞に特徴的なマーカーの発現
上記「脂肪移植片完全性への効果」に記載したように、脂肪組織の完全性は脂肪移植の際に注入するＱＱＫＳＬ＋ＡＳＣ、ＡＳＣの有無によって相違する。本実施例では、脂肪移植片の生存移植片の脂肪細胞中における、アディポネクチンおよびＦＡＢＰ４の遺伝子発現を調べた。アディポネクチンおよびＦＡＢＰ４のいずれも生存脂肪細胞の特徴的なマーカーである。各遺伝子の発現は、「（７）定量的ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＰＣＲ）」に記載の方法で行った。【０１１０】
脂肪移植の５週後、脂肪細胞特異的アディポネクチンは、ＱＱＫＳＬ＋ＡＳＣ群（対照と比較して２．３倍；ｐ＜０．０５）においてより高い発現を示した。【０１１１】
腫瘍原性に対する影響
一般論として、移植細胞は、腫瘍原性を有する可能性がある。本実施例では、脂肪移植片の移植細胞の腫瘍原性に対して、ＱＱＫＳＬ＋ＡＳＣ、またはＡＳＣの注入が与える影響について調べた。具体的には、細胞のアポトーシス誘導を決定する、ＢＡＸ／ＢＣＬ−２比を計算した。ＢＣＬ−２過剰発現またはＢＡＸの発現減少は、細胞集積を導き、そして悪性プロセスにおいて見出されることが報告されている。２つの実験群におけるＢＡＸ／ＢＣＬ−２比は、対照群と有意には異ならなかった。即ち、ＱＱＫＳＬ＋ＡＳＣＡＳＣの注入の有無によって、腫瘍原性に変化する（高まる）ことはなかった。【０１１２】
線維化に対する効果
低酸素は、脂肪組織における線維化を誘導する。本実施例では、脂肪移植片における線維化に対し、ＱＱＫＳＬ＋ＡＳＣ、またはＡＳＣの注入が与える効果、具体的には、移植組織の線維性形質転換を防止可能であるかどうかを調べた。【０１１３】
結果を図４に示す。脂肪移植の５週後、線維化の割合は、対照（２１．９±２．５％；ｐ＜０．０１）に比較して、ＡＳＣ群（２８．２±３．２％；ｐ＜０．０１）およびＱＱＫＳＬ＋ＡＳＣ群（２６．２±２．５％；ｐ＜０．０１）であった。【０１１４】
本実施例は、脂肪移植片におけるＡＳＣ移植の線維化に対し、ＱＱＫＳＬ＋ＡＳＣが移植組織の線維性形質転換を抑制する効果を奏することを示す。【０１１５】
炎症に対する効果
本実施例では、ＣＤ６８免疫組織化学を行って、ＱＱＫＳＬ＋ＡＳＣ、またはＡＳＣの注入した場合の、脂肪移植片の炎症状態を調べた。【０１１６】
結果を図５に示す。脂肪移植の５週後、ＱＱＫＳＬ＋ＡＳＣ群（２２．４±１．８／ｍｍ２）において検出された局所炎症単位は最小であった。ＡＳＣ群（２８．０±１．８／ｍｍ２）そして対照（４２．８±４．３／ｍｍ２）であった。これらのデータは、ＱＱＫＳＬ＋ＡＳＣの組み合わせが、移植片に対して最強の抗炎症効果を有することを示す。【０１１７】
血管形成への効果
本実施例では、ＱＱＫＳＬ＋ＡＳＣ、またはＡＳＣの注入した場合の、脂肪移植片における血管形成への効果を調べた。ＣＤ３１免疫組織化学を用いて、移植片の移植後再血管新生が成功するかどうかを調べた。【０１１８】
結果を図６に示す。これらのデータは、ＡＳＣを含むＱＱＫＳＬ細胞が強い血管形成（血管原性）効果を有することを示す。【０１１９】
実施例２  下肢虚血
本実施例では、下肢虚血における骨髄由来間葉系幹細胞の改善効果に対する生体外増幅培養された単核球画分を含む組成物の増幅効果を確認する。【０１２０】
（１）ヒトＭＮＣおよびＭＮＣ−ＱＱ細胞の調製
健常人より通常の採血法にて得られた末梢血より密度勾配遠心法を用いてＥＰＣを含む単核球（ＭＮＣ）を調製した。【０１２１】
ＱＱ培養のため、ＭＮＣを５０ｎｇ／ｍｌ  ＶＥＧＦ、１００ｎｇ／ｍｌ  ＳＣＦ、１００ｎｇ／ｍｌ  Ｆｌｔ−３リガンド、２０ｎｇ／ｍｌ  ＴＰＯ、２０ｎｇ／ｍｌ  ＩＬ−６および１％抗生物質（ペニシリン−ストレプトマイシン溶液（×１００））を補充したＳｔｅｍｌｉｎｅ  ＩＩ培地で１週間培養した（非特許文献３０）。ＭＮＣおよびＭＮＣ−ＱＱ細胞は、コロニー形成アッセイによって血管形成能に関して評価した【０１２２】
（２）ＭＳＣの培養
ヒト間葉系幹細胞（ＭＳＣ）は、ＬＯＮＺＡ（バーゼル、スイス）から購入し、ＬＯＮＺＡが提供する培養法に従い、Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｍｅｄｉｕｍ  ＢｕｌｌｅｔＫｉｔ（商標）培地を用いて培養に供し、継代数が５代目までのものを使用した。【０１２３】
（３）下肢虚血モデルマウス
下肢虚血モデルマウス作製に用いた８週齢のＢＡＬＢ／ｃＡＪｃｌ−ｎｕ／ｎｕマウス（ヌードマウス）は日本クレア株式会社（東京、日本）より購入した。すべての実験は、順天堂大学医学部実験動物委員会によって承認され、そして施設の実験動物実験指針に従い実施された。【０１２４】
ヌードマウス左鼠径部より大腿動静脈を結紮および焼灼し、虚血下肢を作成し、虚血作成直後にＭＮＣＱＱ細胞、ＭＳＣ細胞を虚血部位に筋肉内投与した。その後、レーザードップラーによる血流測定を経時的に行い、血流の改善程度を試験エンドポイントとし、虚血部位（下腿部）の組織を採材する。【０１２５】
具体的な試験実施要領を表４に示す。【０１２６】
【表４】
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【０１２７】
ＭＮＣ−ＱＱ細胞の下肢虚血改善への効果
下肢虚血後、すぐのレーザードップラーによる血流検査では、虚血肢の血流が健康な対側肢を１００％として比較すると１５％まで低下しており各群間の差はなかった。移植後１０日目において３群を比較したところ、生食群において虚血肢の血流は、健康な対側肢と比較して２６％であり、大きな改善が見られないのに対し、ＭＳＣ群では４７％と一定の改善が認められ、さらにＭＳＣ＋ＭＮＣ−ＱＱ群では８３％と他の群と比べて有意な改善が認められた（図７）。【０１２８】
また、細胞移植後１４日目の肉眼的所見において、生食群では足先の壊死が確認され、ＭＳＣ群では生食群に比べ改善していたが指先の壊死が確認された。一方、ＭＳＣ＋ＭＮＣ−ＱＱ群では壊死は確認されず肉眼的にも有効で明らかな相乗効果が示された。（図８）。【０１２９】
本実施例により、ＭＮＣ−ＱＱ細胞はＭＳＣによる血流改善に相乗的効果をもたらし虚血を改善することが示された。
［配列表］
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【国際調査報告】
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