(57)【要約】  本発明は、同時に複数の表面抗原を定量することで、エクソソームなどの細胞外小胞を同定し、任意の表面抗原を検出・定量する方法を提供する。具体的には、本発明は、核酸を標識するための第１の金属標識試薬、および細胞外小胞表面抗原を標識するための第２の金属標識試薬を用いてサンプル中の細胞外小胞を標識するステップと、前記第１および第２の金属標識試薬を質量分析で同定するステップとを含む、細胞外小胞の検出方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
核酸を標識するための第１の金属標識試薬、および細胞外小胞表面抗原を標識するための第２の金属標識試薬を用いてサンプル中の細胞外小胞を標識するステップと、
前記第１および第２の金属標識試薬を質量分析で同定するステップと
を含む、細胞外小胞の検出方法。
【請求項２】
前記第１の金属標識試薬がDNA標識のためのインターカレーターである、請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記サンプル中の細胞外小胞を標識するステップでは、２種以上の前記第２の金属標識試薬を用いて２種以上の表面抗原を別個に標識し、同定する、請求項１または２記載の方法。
【請求項４】
２種以上の異なる細胞外小胞表面抗原を別個に標識するための２種以上の金属標識試薬を用いてサンプル中の細胞外小胞を標識するステップと、
前記２種以上の金属標識試薬を質量分析で同定するステップと
を含む、細胞外小胞の検出方法。
【請求項５】
細胞外小胞表面抗原を標識するための金属標識試薬が細胞外小胞表面抗原に対する抗体を金属標識したものである、請求項１〜４のいずれか１項記載の方法。
【請求項６】
前記細胞外小胞がエクソソームである、請求項１〜５のいずれか１項記載の方法。
【請求項７】
前記細胞外小胞表面抗原がCD9、CD63、およびCD81から選択される１種もしくは２種、またはCD9、CD63、およびCD81の３種の抗原を含む、請求項６記載の方法。
【請求項８】
前記サンプルが被験者由来の全血、血清、血漿、尿、唾液若しくは髄液、または細胞培養上清である、請求項１〜７のいずれか１項記載の方法。
【請求項９】
前記質量分析が誘導結合プラズマ質量分析（Inductively coupled plasma mass spectrometry、ICP-MS）である、請求項１〜８のいずれか１項記載の方法。
【請求項１０】
前記サンプル中の細胞外小胞を標識するステップでは、更に別の抗原を検出するための第３の金属標識試薬を用い、
前記金属標識試薬を質量分析で同定するステップでは、前記第３の金属標識試薬も質量分析で同定する、請求項１〜９のいずれか１項記載の方法。
【請求項１１】
前記更に別の抗原が、疾患特異的に発現が増大または低下するタンパク質、糖鎖、または脂質から選択される、請求項１０記載の方法。
【請求項１２】
請求項１０または１１記載の方法により細胞外小胞を検出するステップと、
検出された前記細胞外小胞の量に基づいて、被験者における疾患の有無もしくは重症度の判定を行うステップと
を含む、被験者における疾患の有無若しくは重症度の判定方法。
【請求項１３】
前記核酸を標識するための第１の金属標識試薬、および前記細胞外小胞表面抗原を標識するための第２の金属標識試薬を含む、請求項１〜３および５〜１２のいずれか１項記載の方法に使用するためのキット。
【請求項１４】
前記細胞外小胞表面抗原を標識するための２種以上の金属標識試薬を含む、請求項４〜１２のいずれか１項記載の方法に使用するためのキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、質量分析を用いた細胞外小胞の検出方法に関する。より詳細には、本発明は、細胞外小胞を質量分析により直接的に検出する方法、並びに細胞外小胞の表面抗原を定量する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
細胞外小胞とは、細胞から放出される小胞を総称して指すものであり、その由来や特徴によってエクソソーム、微小小胞体、アポトーシス小体等に分類されている。アポトーシス小体がアポトーシスを起こした細胞から放出されるのに対して、エクソソームおよび微小小胞体は、由来および大きさが異なっているが、いずれも健康な細胞からも放出されることが報告されている。【０００３】
近年、細胞外小胞は、炎症や免疫等において機能していることや疾患に関与する場合があることが知られるようになっている。また、細胞外小胞は、血液、尿、唾液等の体液中に含まれているため、細胞外小胞を非侵襲的バイオマーカーとした疾患の有無等の診断、細胞外小胞を標的とした治療薬の開発、更には細胞外小胞の細胞への取り込みを利用したドラッグデリバリーシステム（DDS）等、細胞外小胞の臨床応用の可能性が高まってきている。【０００４】
細胞外小胞は、細胞と同様にリン脂質二重層からなる膜を有し、内部にはタンパク質（酵素、細胞骨格タンパク質、シグナル分子等）や核酸（DNA、RNA等）を含有している。膜表面には、その由来によって異なる表面抗原が存在しており、例えばエクソソームの場合にはCD9、CD63、CD81といった表面抗原の存在が知られている。従って、細胞の解析の場合と同様に、これらの表面抗原を検出することで、エクソソームの解析を行うことが可能である。【０００５】
従来、細胞の表面抗原を解析する分析手法としてフローサイトメーターがあり、複数の表面抗原を異なる試薬で標識することで、同時に解析することも可能である（特許文献１）。しかしながら、細胞と比較して細胞外小胞は小さく、特にエクソソームは非常に小さい（30〜200 nm）ことから、エクソソーム等の細胞外小胞の表面抗原をフローサイトメーターで直接検出・定量解析することは困難であった。【０００６】
エクソソームをフローサイトメーターで解析する場合、エクソソームマーカーに対する抗体を一次抗体として固相化したビーズで捕捉し、捕捉したエクソソームを検出試薬(二次抗体)で検出する手法が用いられてきた（特許文献２）。この原理を利用した商品として、MACSPlex Exosome Kit（Miltenyi Biotec 社）、PS CaptureTM Exosome Flow Cytometry Kit（FUJIFILM社）、ExoStep（immunostep社）などが市販されている。【０００７】
一方、プラズマ（ICP）をイオン源として使用し、発生したイオンを質量分析部で検出する誘導結合プラズマ質量分析（Inductively coupled plasma mass spectrometry、ICP-MS）が知られている（特許文献３）。この分析方法は、複数の元素を同時に定性および定量的に測定可能であり、同位体比の測定も可能な高感度分析方法である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】EP 2 356 456 B1
【特許文献２】EP 3 093 664 A1
【特許文献３】WO2016/109603 A1
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
従来の手法でエクソソームを検出するためには、少なくとも抗体等の抗原結合分子を固相化したビーズを用いてエクソソームを捕捉し、蛍光標識した二次抗体(検出抗体)で間接的に検出する必要があった。他方で、捕捉した細胞外小胞が例えばエクソソームであることを示すためには、複数のエクソソーム表面抗原(CD9、CD63、CD81など)の有無を確認する必要があるが、従来の手法では複数の表面抗原を同時に定量することはできなかった。  従って、同時に複数の表面抗原を定量することで、エクソソームなどの細胞外小胞を同定し、任意の表面抗原を検出・定量する技術が求められている。【００１０】
最近では、マルチカラーフローサイトメトリー技術を用いて複数の抗体染色を用いることが可能となったが、光学的に区別する技術のため、波長の重なりにより、4色以上のマルチカラー解析では、蛍光補正の組み合わせが複雑になり、不正確になるという欠点があった。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
上記の課題を解決するために種々検討した結果、本発明者等は、サンプル中に含まれる細胞外小胞の１種以上の表面抗原と、細胞外小胞中に含まれる核酸とを別個に金属標識した後、サンプルを質量分析を使用して分析し、細胞外小胞の表面抗原と、細胞外小胞中の核酸との存在を同時に検出することで、複雑性の高いサンプル中から細胞外小胞を検出する方法を完成させるに到った。また、２種以上の異なる細胞外小胞表面抗原を別個に金属標識することで、同様の検出が可能なことも見出した。【００１２】
すなわち、本発明は以下を提供するものである。
１．核酸を標識するための第１の金属標識試薬、および細胞外小胞表面抗原を標識するための第２の金属標識試薬を用いてサンプル中の細胞外小胞を標識するステップと、
前記第１および第２の金属標識試薬を質量分析で同定するステップと
を含む、細胞外小胞の検出方法。
２．前記第１の金属標識試薬がDNA標識のためのインターカレーターである、上記１記載の方法。
３．前記サンプル中の細胞外小胞を標識するステップでは、２種以上の前記第２の金属標識試薬を用いて２種以上の表面抗原を別個に標識し、同定する、上記１または２記載の方法。
４．２種以上の異なる細胞外小胞表面抗原を別個に標識するための２種以上の金属標識試薬を用いてサンプル中の細胞外小胞を標識するステップと、
前記２種以上の金属標識試薬を質量分析で同定するステップと
を含む、細胞外小胞の検出方法。
５．細胞外小胞表面抗原を標識するための金属標識試薬が細胞外小胞表面抗原に対する抗体を金属標識したものである、上記１〜４のいずれか記載の方法。
６．前記細胞外小胞がエクソソームである、上記１〜５のいずれか記載の方法。
７．前記細胞外小胞表面抗原がCD9、CD63、およびCD81から選択される１種もしくは２種、またはCD9、CD63、およびCD81の３種の抗原を含む、上記６記載の方法。
８．前記サンプルが被験者由来の全血、血清、血漿、尿、唾液若しくは髄液、または細胞培養上清である、上記１〜７のいずれか記載の方法。
９．前記質量分析が誘導結合プラズマ質量分析（Inductively coupled plasma mass spectrometry、ICP-MS）である、上記１〜８のいずれか記載の方法。
１０．前記サンプル中の細胞外小胞を標識するステップでは、更に別の抗原を検出するための第３の金属標識試薬を用い、
前記金属標識試薬を質量分析で同定するステップでは、前記第３の金属標識試薬も質量分析で同定する、上記１〜９のいずれか記載の方法。
１１．前記更に別の抗原が、疾患特異的に発現が増大または低下するタンパク質、糖鎖、または脂質から選択される、上記１０記載の方法。
１２．上記１０または１１記載の方法により細胞外小胞を検出するステップと、
検出された前記細胞外小胞の量に基づいて、被験者における疾患の有無もしくは重症度の判定を行うステップと
を含む、被験者における疾患の有無若しくは重症度の判定方法。【００１３】
１３．前記核酸を標識するための第１の金属標識試薬、および前記細胞外小胞表面抗原を標識するための第２の金属標識試薬を含む、上記１〜３および５〜１２のいずれか記載の方法に使用するためのキット。
１４．前記細胞外小胞表面抗原を標識するための２種以上の金属標識試薬を含む、上記４〜１２のいずれか記載の方法に使用するためのキット。
【発明の効果】
【００１４】
本法では、細胞外小胞表面抗原を金属標識試薬で標識し、ICP-MS等の質量分析で測定することにより、抗体ビーズ等による細胞外小胞の捕捉をすることなく、細胞外小胞を直接的に検出できるようになった。また、核酸標識試薬と組み合わせることによって、検出された金属イオン量(タンパクなどの抗原発現量)が、サンプル中に遊離した抗原に結合したもの由来か細胞外小胞膜上に結合したもの由来かを区別することができる。これにより、細胞外小胞表面抗原の検出感度、および定量性が大幅に向上することが期待される。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】乳がん細胞株MCF7の培養上清より調製したエクソソーム画分において、191Ir（イリジウム）標識インターカレーターでDNAを標識しないサンプル(a)および標識したサンプル(b)における191Irの検出結果を示すグラフである。横軸は191Ir(イリジウム)の金属イオン強度、縦軸は金属イオンが横軸の強度で検出されたイベント数（近似的に粒子数）を示す。
【図２】(a)乳がん細胞株MCF7の培養上清より調製したエクソソーム画分において、191Ir-インターカレーターによる標識を指標として確認してDNA+画分が15.32％であったことを示すグラフである。横軸は191Irのイオン強度、縦軸は粒子数を表す。(b)(a)のDNA+画分中のCD9およびCD63の検出結果から、CD9+/CD63+画分が82.31％であったことを示すグラフである。横軸は171Yb（イッテルビウム）のイオン強度（CD9の発現量）、縦軸は150Nd（ネオジム）のイオン強度（CD63の発現量）をそれぞれ示す。(c)DNA+/CD9+/CD63+画分中のCD81の検出結果から、CD81+画分が97.58％（高発現：39.96％、低発現：57.62％）であったことを示すグラフである。横軸は145Ndのイオン強度（CD81の発現量）、縦軸は粒子数を示す。
【図３】血清より調製したエクソソーム画分のうち、191Ir（イリジウム）陽性画分（DNA陽性画分）を抗体のアイソタイプ・コントロールで染色した結果を示すグラフである。それぞれ、(a) 171Yb（イッテルビウム）の強度分布からCD9陽性画分、(b) 145Nd（ネオジム）の強度分布からCD81陽性画分、（c）150Nd（ネオジム）の強度分布からCD63陽性画分を同定した。
【図４】血清より調製したエクソソーム画分のうち、DNA+画分のCD9、CD63およびCD81の発現分布を確認したグラフである。それぞれ、(a) CD9とCD63が共発現している画分（DNA+/CD9+/CD63+画分）、(b) さらにCD81が発現している画分（DNA+/CD9+/CD63+/CD81+画分）を同定した。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
本出願は、2019年5月17日出願の特願2019-093686号の優先権を主張するものであり、その全内容を参照により本明細書に援用する。
本発明は、核酸を標識するための第１の金属標識試薬、および細胞外小胞表面抗原を標識するための第２の金属標識試薬を用いてサンプル中の細胞外小胞を標識し、第１および第２の金属標識試薬を質量分析で同定することを含む、細胞外小胞の検出方法を提供する。
【００１７】
本発明において、細胞外小胞としては、特に限定するものではないが、エクソソーム、微小小胞体、およびアポトーシス小体が挙げられる。これらの細胞外小胞を含むサンプルからの細胞外小胞画分の単離および精製は、一般的には超遠心分離等を用いて行われている。例えば、エクソソーム画分は、エクソソームを含むサンプルを4℃、210,000×Gで43分間の超遠心分離を2回行うことで、沈殿物として取得することができる。しかしながら、本発明の方法によれば、こうした画分の調製を行うことなく細胞外小胞の存在および存在量を迅速に検出することも可能であり、超遠心法により得られたエクソソーム画分からさらにエクソソームを検出・単離することも可能である。
【００１８】
第１の金属標識試薬が標識する核酸は、DNAまたはRNAである。例えばDNAを標識する場合、標識試薬として、インターカレーターを用いることができる。また、RNAを標識する場合、標識試薬として、例えばFastTag試薬（ジスルフィド基を含むユニバーサルリンカー）を用いることができる。この場合、該試薬のジスルフィドのチオール基に金属イオンが結合したものを用いれば良い。
【００１９】
好ましくは、第１の金属標識試薬は、DNA標識のためのインターカレーターである。
本明細書において、「インターカレーター」とは、DNAに結合して二重らせんのDNA塩基対間に平行挿入（インターカレート）する化合物を指す。インターカレーターとしては、一部の抗癌剤を含む、平面芳香環を有する多くの化合物が知られており、蛍光を発することができるインターカレーターを利用したリアルタイムPCR（qPCR）も一般的に行われている。
【００２０】
本発明では、金属標識されたインターカレーターを用いることを特徴とする。当業者であれば、本願明細書の記載および当分野における技術常識に基づいて、本発明に使用可能なインターカレーターおよびその金属標識方法について容易に理解し、本発明に使用することができる。あるいは、予め金属標識されたインターカレーターが、例えばFluidigm社から市販されており、これを入手して本発明に使用することができる。
【００２１】
第２の金属標識試薬としては、細胞外小胞表面抗原に対する抗体を金属標識したものを用いることができる。
【００２２】
例えば検出対象の細胞外小胞がエクソソームの場合、表面抗原としてCD9、CD11a、CD11b、CD11c、CD13、CD31、CD37、CD53、CD63、CD81、CD82、Tsg101、Alix、Gag、Integrins alpha4beta1、ICAM-1、LAMP1/2、Mac-1、PGRL、MHC-I、MHC-II、HLA-G、AP-1、SNAP、Arp2/3、Annexins、Rab5、Rab7、Rap 1B、およびRabGD1 が挙げられ、これらの抗原に対する抗体を好適に使用することができる。
【００２３】
検出対象の細胞外小胞が微小小胞体の場合、表面抗原としてインテグリン、セレクチン、CD40等が挙げられ、これらの抗原に対する抗体を好適に使用することができる。
【００２４】
検出対象の細胞外小胞がアポトーシス小体の場合、表面抗原としてアネキシンV、ホスファチジルセリンが挙げられ、これらの抗原に対する抗体を好適に使用することができる。
【００２５】
標識に用いる金属としては、金属であればどの原子種でも良く、特に限定するものではない。例えばリチウム（Li）、ナトリウム（Na）、マグネシウム（Mg）、アルミニウム（Al）、カリウム（K）、カルシウム（Ca）、スカンジウム（Sc）、チタン（Ti）、バナジウム（V）、クロム（Cr）、マンガン（Mn）、鉄（Fe）、コバルト（Co）、ニッケル（Ni）、銅（Cu）、亜鉛（Zn）、ガリウム（Ga）、ゲルマニウム（Ge）、ルビジウム（Rb）、ストロンチウム（Sr）、イットリウム（Y）、ジルコニウム（Zr）、ニオブ（Nb）、モリブデン（Mo）、Tc、ルテニウム（Ru）、ロジウム（Rh）、パラジウム（Pd）、銀（Ag）、カドミウム（Cd）、インジウム（In）、スズ（Sn）、アンチモン（Sb）、セシウム（Cs）、バリウム（Ba）、ハフニウム（Hf）、タンタル（Ta）、タングステン（W）、レニウム（Re）、オスミウム（Os）、イリジウム（Ir）、白金（Pt）、金（Au）、タリウム（Tl）、鉛（Pb）、ビスマス（Bi）、ランタン（La）、セリウム（Ce）、プラセオジム（Pr）、ネオジム（Nd）、サマリウム（Sm）、ユーロピウム（Eu）、ガドリニウム（Gd）、テルビウム（Tb）、ジスプロジウム（Dy）、ホルミウム（Ho）、エルビウム（Er）、ツリウム（Tm）、イッテルビウム（Yb）、ルテチウム（Lu）、トリウム（Th）、ウラン（U）等から適宜選択することができる。
【００２６】
本発明において、好ましくは、標識に使用する金属は、天然のサンプル中に存在する可能性がほとんどないこと等の理由から、Ir、Yb、Nd等から選択することが好ましい。
【００２７】
本発明の方法は、第２の金属標識試薬は１種であっても良い。あるいは、２種以上の第２の金属標識試薬を用いて２種以上の表面抗原を別個に標識し、同定することもできる。
【００２８】
例えば、検出対象の細胞外小胞がエクソソームである場合、細胞外小胞表面抗原がCD9、CD63、およびCD81から選択される１種もしくは２種、またはCD9、CD63、およびCD81の３種の抗原とすることが一般的であり、好適である。
【００２９】
本発明はまた、別の実施形態として、２種以上の異なる細胞外小胞表面抗原を別個に標識するための２種以上の金属標識試薬を用いてサンプル中の細胞外小胞を標識するステップと、
前記２種以上の金属標識試薬を質量分析で同定するステップと
を含む、細胞外小胞の検出方法を提供する。
この実施形態では、上記の核酸を標識するための第１の金属標識試薬を用いることなく、目的の細胞外小胞を検出および定量することができる。
【００３０】
当業者であれば、本願明細書の記載および当分野における技術常識に基づいて、本発明に使用可能な細胞外小胞表面抗原の金属標識について容易に理解し、実施することができる。あるいは、予め金属標識された細胞外小胞表面抗原に対する抗体が、例えばFluidigm社から市販されており、これを入手して本発明に使用することができる。
【００３１】
本発明の方法は、サンプルとして、被験者由来の体液(全血、血清、血漿、尿、唾液若しくは髄液)、または検出対象が培養細胞の場合には細胞培養上清を用いることができる。
【００３２】
本発明の方法は、誘導結合プラズマ質量分析（Inductively coupled plasma mass spectrometry、ICP-MS）、MALDI(Matrix-assisted laser desorption/ionizationマトリックス支援レーザー脱離イオン化法)-MS、ESI(Electrospray Ionization、エレクトロスプレーイオン化法)-MSを用いて好適に実施することができる。
【００３３】
このうち、ICP-MSを用いることが本発明の方法において特に好適である。ICP-MSはシグナルの半値幅が狭く、シグナルの分解能が高いため、区別も容易で定量性も良い。
【００３４】
具体的に使用可能な装置としては、特に限定するものではないが、CyTOFTM（Fluidigm社）、MALDI-7090、MALDI-8020、AXIMA Performance、AXIMA Confidence、LC-MS8050、LC-MS8060（株式会社島津製作所）を挙げることができる。
質量分析における具体的な条件は、金属イオンとして検出する金属標識の数および種類等に応じて適宜選択することができる。
【００３５】
本発明の方法は、更に別の抗原を検出するための金属標識試薬を用い、細胞外小胞画分を同定した上で、細胞外小胞表面の任意の生体分子の発現を同時に定量することができる。
【００３６】
この場合、使用可能な更に別の抗原としては、エクソソーム膜表面に局在するものであれば特に限定するものではないが、例えば疾患特異的に発現が増大または低下するタンパク質、糖鎖、または脂質から選択されるものを使用することができる。
【００３７】
例えば、乳がん患者において、ヒト上皮増殖因子受容体２型（HER2）タンパク質の過剰発現が知られており（Chemotherapy Research and Practice, Vol. 2012, Article ID 743193、doi:10.1155/2012/743193）、乳がん細胞に由来するエクソソームにはHER2が発現していることも報告されている。
【００３８】
従って、本発明の方法において同定される被験者由来のエクソソーム画分において、HER2に対する抗体を金属標識したものを同時に検出することで、被験者由来のエクソソームにおけるHER2の定量を行うことができる。
この態様において、本発明の方法は、被験者における疾患の有無もしくは重症度の診断の補助として使用することができる。具体的には、被験者における疾患の有無若しくは重症度の判定方法は、上記した方法により細胞外小胞を検出するステップと、検出された前記細胞外小胞の量に基づいて、被験者における疾患の有無もしくは重症度の判定を行うステップとを含む。
【００３９】
あるいはまた、疾患との関連が未知の細胞表面マーカーについて、細胞外小胞におけるその発現を本発明の方法によって検出し、該マーカーの機能の解析に役立てることもできる。
【００４０】
さらには、従来、細胞外小胞の取得のためには超遠心法等を用いることが必要であったが、本発明の方法を用いれば、超遠心法等による精製を行わなくとも、血液中に存在する細胞外小胞を直接検出し、任意の表面抗原を定量することが可能になると予想される。
【００４１】
本発明は更に、核酸を標識するための第１の金属標識試薬、および細胞外小胞表面抗原を標識するための第２の金属標識試薬を含む、上記の本発明の方法に使用するためのキットを提供する。また、本発明は、細胞外小胞表面抗原を標識するための２種以上の金属標識試薬を含む、上記の本発明の方法に使用するためのキットを提供する。
【００４２】
本発明の方法の具体的な態様としては、例えば以下のものが挙げられる。
金属標識されたインターカレーター、および金属標識されたエクソソーム表面抗原抗体(CD9, CD63, CD81)を用いてエクソソームを含むサンプルを標識し、標識したサンプルをICP-MSを用いた細胞計測質量分析（Cytometer Mass）により測定する。まず、インターカレーターに標識されたDNAを含む細胞外小胞画分(DNA+画分)を同定する。さらには、DNA+画分の中で、CD9、CD63、CD81の発現量を同時定量することで、エクソソーム画分(CD9+/CD63+/CD81+画分)を同定することができる。つまり、DNA+/ CD9+/CD63+/CD81+画分を同定することで、エクソソーム画分を検出・同定することができる。
【実施例】
【００４３】
以下に本発明を実施例によって更に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。【００４４】
［実施例１］細胞培養上清からのエクソソームの検出
本実施例では、サンプルとして細胞培養上清を使用し、エクソソームを検出・同定した。具体的には、以下のステップにより、サンプル中のエクソソームの同定を実施した。
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【００４５】
乳がん細胞株MCF7の培養上清を4℃、210,000×Gで43分間の超遠心分離を2回行い、沈殿物をエクソソーム画分として調製した。調製したエクソソーム画分をPBS溶液中に再懸濁し、サンプル溶液中の5.0×1010個のエクソソーム粒子をDNA標識および抗体染色に用いた。エクソソーム粒子の計数は、ナノパーティクルトラッキングアッセイ（Nanosight社）を用いて行った。【００４６】
他方で、同量の粒子を含むサンプル溶液を別に準備し、DNA標識、および抗体染色を全くしないサンプル（陰性対照１）とDNA標識のみをしたサンプル（陰性対照２）の調製も合わせて行った。DNA標識、および抗体染色はメーカー（Fluidigm社）のプロトコルに従った。
エクソソームの抗体染色、およびDNA標識に用いた試薬は以下のとおりである。
インターカレーター(191Ir-インターカレーター、Fluidigm社)、
抗CD9抗体 (171Yb 標識抗-CD9 mAb, Fluidigm社)、
抗CD63抗体 (150Nd 標識抗-CD63 mAb, Fluidigm社)、
抗CD81抗体(145Nd 標識抗-CD81 mAb, Fluidigm社)【００４７】
抗体染色、およびDNA標識後、ICP-MS (CyTOFTM, Fluidigm社)による分析を行った。ICP-MSにより、191Irイオンを定量することで各粒子中のDNAを定量した。また、171Ybイオン、150Ndイオン、145Ndイオン量を定量することで、CD9、CD63、CD81の発現量をそれぞれ定量した。
先ず、陰性対照２（図１(b)）と陰性対照１（図１(a)）の191Irイオン量の分布比較から、DNA陽性画分(DNA+画分)を同定した。【００４８】
次に、DNA+画分（図２(a)）中の細胞外小胞におけるCD9とCD63の発現分布を確認した。この発現分布より、CD9とCD63が共発現している画分(DNA+/CD9+/CD63+画分)を同定した（図２(b)）。【００４９】
更に、DNA+/CD9+/CD63+画分中のCD81の発現分布を確認し、CD81が発現している画分(DNA+/CD9+/CD63+/CD81+画分)を同定した（図２(c)）。【００５０】
このDNA+/CD9+/CD63+/CD81+画分は、DNAを含有し、エクソソームマーカーであるCD9、CD63、CD81を全て発現している画分であることから、この画分がエクソソームであることが確認できた。【００５１】
［実施例２］血清からのエクソソームの検出
本実施例では、サンプルとして血清を使用し、エクソソームを検出・同定した。具体的には、実施例１に記載のステップに従い、ヒト由来の血清より超遠心法でエクソソーム画分を調製した。調製したエクソソーム画分をPBS溶液で再懸濁し、サンプル溶液のうち1.0×1010個のエクソソーム粒子をDNA標識および抗体染色に用いた。【００５２】
他方で、同量の粒子を含むサンプル溶液を別に準備し、DNA標識のみ行ったサンプル（陰性対照１）、および抗体のアイソタイプ・コントロールのみで染色したサンプル（陰性対照２）の調製を合わせて行った。DNA標識および抗体染色は、メーカー（Fluidigm社）のプロトコルに従った。【００５３】
エクソソームの抗体染色、およびDNA標識に用いた試薬は以下のとおりである。
インターカレーター(191Ir-インターカレーター、Fluidigm社)、
抗CD9抗体 (171Yb 標識抗-CD9 mAb, Fluidigm社)、
抗CD63抗体 (150Nd 標識抗-CD63 mAb, Fluidigm社)、
抗CD81抗体(145Nd 標識抗-CD81 mAb, Fluidigm社)【００５４】
抗体染色、およびDNA標識後、ICP-MS（CyTOFTM, Fluidigm社）による分析を行った。ICP-MSにより、191Irイオンを定量することで各粒子中のDNAを定量した。また、171Ybイオン、150Ndイオン、145Ndイオン量を定量することで、CD9、CD63、CD81の発現量をそれぞれ定量した。【００５５】
まず、陰性対照１の191Ir強度分布からIr陽性、つまり、DNA陽性画分（DNA+画分）を同定した。また、陰性対照２の171Yb、150Nd、および145強度分布からCD9、CD63、およびCD81の陽性画分を同定した（図３）。【００５６】
血清サンプル中のDNA+画分の細胞外小胞におけるCD9とCD63の発現分布を確認した（図４の(a)）。この発現分布より、CD9とCD63が共発現している画分（DNA+/CD9+/CD63+画分）を同定した（図４の(a)中の右上の枠内)。次に、DNA+/CD9+/CD63+画分中のCD81の発現分布を確認し、CD81が発現している画分（DNA+/CD9+/CD63+/CD81+画分）を同定した（図４の(b)）。このDNA+/CD9+/CD63+/CD81+画分は、DNAを含有し、エクソソームマーカーであるCD9、CD63およびCD81を全て発現している画分であることから、この画分がエクソソームであることが確認できた。【００５７】
以上から、本実施例の分析手法は生体試料であるヒト血清に対しても適用でき、エキソソームを同定可能であることを確認した。
【産業上の利用可能性】
【００５８】
本発明の方法は、エクソソーム等の細胞外小胞における表面抗原の発現状態を検出することで、被験者における疾患の有無や程度を診断するために利用することができる。また、本発明の方法は、特定の表面抗原の発現を検出して該抗原の機能を調べることにも利用することができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【国際調査報告】
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