(57)【要約】  本発明は、免疫チェックポイント分子の発現が抑制された活性化T細胞の提供、当該T細胞の調製方法および当該T細胞を調製するために使用可能な物質のスクリーニング方法を提供する。具体的には、本発明は、免疫チェックポイント分子の発現が誘導されないT細胞を作製または誘導する方法であって、T細胞のグルコシルセラミド合成酵素（UGCG）またはガングリオシドの機能を低下または喪失させることを含む前記方法、当該方法で作製または誘導したT細胞を解決手段とする。【特許請求の範囲】
【請求項１】
免疫チェックポイント分子の発現が誘導されないT細胞を作製または誘導する方法であって、T細胞のグルコシルセラミド合成酵素（UGCG）またはガングリオシドの機能を低下または喪失させることを含む、前記方法。
【請求項２】
前記免疫チェックポイント分子がPD-1（Programmed Death-1）、TIM3（T-cell Immunoglobulin and Mucin domain 3）またはCTLA4（Cytotoxic T-Lymphocyte Associated antigen 4）であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記UGCGの機能を低下または喪失させる方法が、UGCG遺伝子の発現を低下または喪失させることである請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記UGCGの機能を低下または喪失させる方法が、グルコシルセラミド合成酵素阻害剤で処理することを特徴とする請求項１または２に記載の方法。
【請求項５】
UGCGの機能が低下または喪失したT細胞であって、活性化による免疫チェックポイント分子の発現増加が誘導されない前記T細胞。
【請求項６】
UGCG阻害剤を有効成分として含む、免疫チェックポイント阻害薬。
【請求項７】
T細胞を標的化する薬剤担体に担持されていることを特徴とする請求項６に記載の阻害薬。
【請求項８】
請求項５に記載のT細胞または請求項６もしくは７に記載の阻害薬を含む、がんの予防または治療のための医薬組成物。
【請求項９】
UGCG阻害剤を有効成分として含む、T細胞におけるPD-1、TIM3および／またはCTLA4の発現抑制剤。
【請求項１０】
UGCG阻害剤を有効成分として含む、T細胞の活性化維持剤。
【請求項１１】
被験物質をT細胞に接触させ、当該T細胞におけるGlc-Cerの産生量を測定することを含む、免疫チェックポイント阻害物質のスクリーニング方法。
【請求項１２】
被験物質をT細胞に接触させ、当該T細胞におけるUGCGの発現量を測定することを含む、免疫チェックポイント阻害物質のスクリーニング方法。
【請求項１３】
前記免疫チェックポイント阻害物質が、がんの予防剤または治療剤である、請求項１１または請求項１２に記載のスクリーニング方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、グルコシルセラミド合成酵素の機能が低下または喪失したT細胞の使用等に関する。
【背景技術】
【０００２】
現在、がんの治療として、手術などの外科的治療、抗がん剤を使用した薬物療法、放射線治療の他、免疫チェックポイント阻害剤などによる免疫治療などが行われている。なかでも、免疫チェックポイント阻害剤による治療は、免疫チェックポイント分子とそのリガンドとの結合を阻害することで免疫抑制シグナル伝達を抑止し、T細胞の活性化抑制を解除する治療法で近年注目を浴びている治療法の１つである。【０００３】
これまでに様々な免疫チェックポイント分子が同定されており、その代表的な分子として、CTLA-4（cytotoxic T-lymphocyte associated antigen-4）やPD-1（programmed cell death-1/CD279）などが報告されている。T細胞の活性化は、T細胞受容体（T-cell receptor：TCR）を介した抗原刺激およびT細胞上のCD28と抗原提示細胞上のB7（CD80/CD86）との結合によって誘導される。しかし、活性化したT細胞上には、B7との親和性がCD28よりも高いCTLA-4が発現しており、これとB7が結合することで、CD28を介したシグナルが遮断され、T細胞の活性化が抑制される（非特許文献１）。また、PD-1は活性化T細胞に発現しており、そのリガンドであるPD-L1およびPD-L2などが結合すると、活性化が抑制されることが知られている。PD-L1／PD-L2はがん細胞に発現しており、これらが活性化T細胞と結合することで、T細胞の活性化が抑制される（非特許文献１）。【０００４】
このように、がん細胞はT細胞の不活性化を介して、免疫系による攻撃を回避している。しかし、血中半減期が長い抗体を用いた免疫チェックポイントの阻害は、腫瘍細胞以外の自己抗原に反応するT細胞が産生される可能性があり、肺炎や膵炎などの重篤な副作用が生じることが知られている。そのため、現在は腫瘍細胞を特異的に認識するT細胞を活性化する手法に注目が集まっている。この活性化したTリンパ球による治療法として、CAT（CD3 Activated T Lymphocyte）療法およびCAR-T（chimeric antigen receptor T cell）療法などがある。この治療法は、様々な手法で自己のCD3活性化Tリンパ球を生体外で増殖させ、これを体内に戻すことで、がん細胞への攻撃性を高める方法である。Tリンパ球のみならず、活性化T細胞もがん細胞の攻撃手段としては有効であると考えられる。しかしながら、これらの手法も生体内ではPD-1などによる免疫チェックポイント機構により抑制を受けることが知られている。そのため、腫瘍細胞を特異的に認識し、かつ免疫チェックポイントへの感受性が低いT細胞の作成法が求められている。【０００５】
膜構成分子の１つであるスフィンゴ糖脂質（glycosphingolipids：GSLs）は脂質および糖鎖部分からなり、細胞膜の脂質ラフトに局在して、T細胞受容体（T-cell receptor：TCR）シグナルを介したT細胞の活性化などを含む様々な細胞プロセスにおいて重要な役割を果たしている（非特許文献２）。そのため、スフィンゴ糖脂質のT細胞の活性化における機能の解明により、前述の免疫チェックポイント阻害剤療法やCAT療法と類似または異なる、新たながん免疫療法の確立が可能であると考えられる。これまでに、グルコシルセラミド合成酵素（UDP-glucose ceramide glucosyltransferase：UGCG）阻害剤である1-フェニル-2-ヘキサデカノイルアミノ-3-モルフォリノ-1-プロパノール（PPMP）が、神経芽腫細胞株および急性リンパ性白血病由来のALL細胞株に対して、フェンレチニド（4-hydroxyphenylretinamide：4-HPR）の持つ細胞毒性を相乗的に増強することが報告されている（特許文献１）。
しかしながら、現時点において、T細胞が関与するがん免疫とスフィンゴ糖脂質との関連性については、未だ不明な点が多い。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】WO2005/049827公報
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Pardoll, Nat Rev Cancer 12:252-264 2012
【非特許文献２】Nagafukuら、Proc Natl Acad Sci U S A. 109(6):E336-42. doi: 10.1073/pnas.1114965109. 2012
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
上記事情に鑑み、本発明は、免疫チェックポイント分子の発現が抑制された活性化T細胞の提供、当該T細胞の調製方法および当該T細胞を調製するために使用可能な物質のスクリーニング方法の提供を解決課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
発明者らは、スフィンゴ脂質の前駆体であるグルコシルセラミドに着目し、セラミドからグルコシルセラミドを合成するグルコシルセラミド合成酵素（UGCG）がT細胞特異的に欠損したマウス（T細胞特異的UGCG遺伝子欠損マウス）に腫瘍を移植し、腫瘍増殖への影響および当該マウス由来のUGCG遺伝子欠損T細胞の性質について検討を行った。
その結果、腫瘍を移植したT細胞特異的UGCG遺伝子欠損マウスでは、腫瘍成長が遅延し、生存期間が延長すること、腫瘍移植後のT細胞特異的UGCG遺伝子欠損マウス由来の脾臓中においてCD3+/CD8+T細胞の割合が顕著に増加することが明らかとなった。さらに、野生型マウス脾臓由来のT細胞をエクスビボ（ex vivo）で活性化すると刺激に対する負のフィードバックにより免疫チェックポイント分子の１つであるPD-1の発現量が増加したが、T細胞特異的UGCG遺伝子欠損マウス脾臓由来のT細胞をex vivoで活性化しても、PD-1の発現量の増加は観察されなかった。
なお、UGCGは、ガングリオシド（スフィンゴ糖脂質の糖鎖部分にシアル酸を含むもの）類合成経路の最上流に位置する合成酵素であり、UGCGを欠損したT細胞はすべてのガングリオシド類を持たないT細胞となる（図１）。例えば、GM3の合成阻害剤など個々のガングリオシド類の合成を阻害することが考えられるが、UGCGは最上流に位置するため効率的にすべてのガングリオシド類の生合成を阻害することができ、ガングリオシド類の生合成を阻害することにより発現される種々の生理活性の最大化が期待される。
本発明は以上の知見に基づいて完成されたものである。【００１０】
すなわち、本発明は以下の（１）〜（１３）である。
（１）免疫チェックポイント分子の発現が誘導されないT細胞を作製または誘導する方法であって、T細胞のグルコシルセラミド合成酵素（UGCG）またはガングリオシドの機能を低下または喪失させることを含む、前記方法。
（２）前記免疫チェックポイント分子がPD-1、TIM3（T-cell Immunoglobulin and Mucin domain 3）またはCTLA4であることを特徴とする上記（１）に記載の方法。
（３）前記UGCGの機能を低下または喪失させる方法が、UGCG遺伝子の発現を低下または喪失させることである上記（１）または（２）に記載の方法。
（４）前記UGCGの機能を低下または喪失させる方法が、グルコシルセラミド合成酵素阻害剤で処理することを特徴とする上記（１）または（２）に記載の方法。
（５）UGCGの機能が低下または喪失したT細胞であって、活性化による免疫チェックポイント分子の発現増加が誘導されない前記T細胞。
（６）UGCG阻害剤を有効成分として含む、免疫チェックポイント阻害薬。
（７）T細胞を標的化する薬剤担体に担持されていることを特徴とする上記（６）に記載の阻害薬。
（８）上記（５）に記載のT細胞または上記（６）もしくは（７）に記載の阻害薬を含む、がんの予防または治療のための医薬組成物。
（９）UGCG阻害剤を有効成分として含む、T細胞におけるPD-1、TIM3および／またはCTLA4の発現抑制剤。
（１０）UGCG阻害剤を有効成分として含む、T細胞の活性化維持剤。
（１１）被験物質をT細胞に接触させ、当該T細胞におけるGlc-Cerの産生量を測定することを含む、免疫チェックポイント阻害物質のスクリーニング方法。
（１２）被験物質をT細胞に接触させ、当該T細胞におけるUGCGの発現量を測定することを含む、免疫チェックポイント阻害物質のスクリーニング方法。
（１３）前記免疫チェックポイント阻害物質が、がんの予防剤または治療剤である、上記（１１）または上記（１２）に記載のスクリーニング方法。
【発明の効果】
【００１１】
本発明により、がん免疫療法に使用し得るT細胞の提供が可能となる。また、当該T細胞を使用することで、新たながん免疫療法の開発が可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】ガングリオシドの合成経路。
【図２】T細胞特異的UGCG遺伝子欠損マウスに移植した腫瘍の体積変化。T-cell UGCG WTおよびT-cell UGCG KOは、各々、コントロールマウスおよびT細胞特異的UGCG遺伝子欠損マウスである。各々、n=８
【図３】マウスB16F10メラノーマ細胞を移植したT細胞特異的UGCG遺伝子欠損マウスの生存率。T-cell UGCG WTおよびT-cell UGCG KOは、各々、コントロールマウスおよびT細胞特異的UGCG遺伝子欠損マウスである。各々、n=8
【図４】T細胞特異的UGCG遺伝子欠損マウス（KO）およびコントロールマウス（WT）の腫瘍組織の観察。（Ａ）T細胞特異的UGCG遺伝子欠損マウス（右）およびコントロールマウス（左）の腫瘍組織のHE染色結果を示す。矢印は、T細胞特異的UGCG遺伝子欠損マウスの腫瘍組織周辺に観察されたT細胞である。（Ｂ）図３Ａの腫瘍組織（右）中に存在するT細胞数を目視にて計数した結果を示す。
【図５】T細胞特異的UGCG遺伝子欠損マウス脾臓中のT細胞におけるガングリオシドをフローサイトメーターで解析した結果。WTおよびKOは、各々、コントロールマウスおよびT細胞特異的UGCG遺伝子欠損マウスの結果を示す。
【図６】T細胞特異的UGCG遺伝子欠損マウス脾臓中のT細胞の構成を解析した結果。WTおよびKOは、各々、コントロールマウスおよびT細胞特異的UGCG遺伝子欠損マウスであることを示す。各々、n=8
【図７】T細胞特異的UGCG遺伝子欠損マウス由来の活性化T細胞の解析。（A）脾臓から調製したT細胞を活性化後、48時間および72時間において、各T細胞の増殖率を測定した結果を示す。（B）脾臓から調製したT細胞を活性化後、経時的にPD-1遺伝子の発現量を測定した結果を示す。WTおよびKOは、各々、コントロールマウスおよびT細胞特異的UGCG遺伝子欠損マウスであることを示す。各々、n=4
【図８】T細胞特異的UGCG遺伝子欠損マウス由来の活性化CD4陽性T細胞の解析。脾臓から調製したCD4陽性T細胞を活性化後、経時的にIFNγ、PD-1、TIM3およびCTLA4遺伝子の発現量を測定した結果を示す。WTおよびKOは、各々、コントロールマウスおよびT細胞特異的UGCG遺伝子欠損マウスであることを示す。各々、n=3
【図９】T細胞特異的UGCG遺伝子欠損マウス由来の活性化T細胞の増殖率の測定。脾臓から調製したT細胞を活性化後、経時的にその増殖率を測定した結果を示す。WTおよびKOは、各々、コントロールマウスおよびT細胞特異的UGCG遺伝子欠損マウスであることを示す。各々、n=3
【図１０】In vitroでのPPMP処理によるT細胞への影響の検討。単離したT細胞を0、1、5および10 μMで24時間処理し、GM3の発現量（左図）と細胞の増殖率（右図）を測定した結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本発明の第１の実施形態は、免疫チェックポイント分子の発現が誘導されないT細胞を作製または誘導する方法であって、T細胞のグルコシルセラミド合成酵素（UGCG）またはガングリオシドの機能を低下または喪失させることを含む、前記方法である。
【００１４】
発明者らは、T細胞特異的UGCG遺伝子欠損マウスの脾臓由来のT細胞すなわち、UGCG遺伝子欠損T細胞を活性化（TCR/CD3およびCD28の共刺激）しても、免疫チェックポイント分子の１つであるPD-1、TIM3およびCTLA4の発現が誘導されないことを見出している。活性化刺激を受けた後のUGCG遺伝子欠損T細胞は、PD-1などの免疫チェックポイント分子が誘導されないことから、当該T細胞の活性化状態が持続し、当該T細胞によるがん細胞への免疫応答も持続すると考えられる。実際に、T細胞特異的UGCG遺伝子欠損マウスに移植したメラノーマの腫瘍体積は、野生型マウスに移植したものと比較して体積増加の速度が遅く、また、腫瘍を移植したT細胞特異的UGCG遺伝子欠損マウスの生存期間が長くなることが確認された。  従って、第１の実施形態にかかる方法（以下「本発明のT細胞作製方法」とも記す）によって作製されたT細胞は、がん細胞に対する免疫応答を増強させるために使用することができる。
【００１５】
また、UGCGはガングリオシド合成経路の最上流に位置しており、この酵素の活性を阻害すると、合成経路の下流にある全てのガングリオシド類の生合成が阻害される。この点を考慮すると、合成経路下流で合成される１または複数のガングリオシドの機能を低下または抑制させる、すなわち、例えば、当該ガングリオシドの生合成を低下または抑制させることによっても、UGCGの機能低下または抑制を行った場合と同様の効果が生じると考えられる。
第１の実施形態において、「ガングリオシドの機能を低下または喪失させる」方法として、ガングリオシド合成経路のいずれか１または複数を阻害または抑制することが挙げられる。より具体的には、図１に示すガングリオシドの各合成過程を触媒する１または複数の酵素活性を阻害または抑制することにより、各ガングリオシド生合成が阻害または抑制され、その結果、ガングリオシドの機能低下または喪失（細胞に発現するガングリオシド自体の量が減少または消失する）を引き起こすことができる。酵素活性の阻害は、酵素活性阻害剤（阻害剤としては化合物の他、中和抗体であってもよい）を細胞に添加することによって達成されるが、適切な阻害剤がない場合でも、酵素遺伝子の発現を、例えば、RNA干渉（siRNA、shRNAなどを用いる方法）により阻害または抑制することによっても達成可能である。なお、上記酵素遺伝子の発現を阻害または抑制するRNAなどの核酸も阻害剤に含まれる。
RNA干渉法を用いる場合、例えば、LacCer→GM3 はST3GAL5遺伝子に対するRNA干渉により、GM3→GD3はST8SIA1遺伝子に対するRNA干渉により、GM3→GM2とGD3→GD2はB4GALNT1遺伝子に対するRNA干渉により、各合成過程を阻害または抑制することができる。
【００１６】
本発明の実施形態において、「免疫チェックポイント分子」とは、本来の機能として、自己に対する免疫応答を抑制し、また、過剰な免疫応答を抑制する分子のことで、免疫系細胞、例えば、T細胞、B細胞などに発現する分子のことである。本発明の実施形態においては、T細胞に発現する分子とする。当該「免疫チェックポイント分子」としては、特に限定はしないが、例えば、PD-1、CTLA-4、TIM-3およびLAG-3（Lymphocyte Activation Gene-3）などが挙げられる。
【００１７】
本発明の実施形態において、「T細胞」とは、細胞表面にT細胞受容体（T cell receptor：TCR）を発現している細胞のことである。当該T細胞として、特に限定はしないが、例えば、CD8陽性T細胞、CD4陽性T細胞、サプレッサーT細胞、制御性T細胞（Treg細胞）、エフェクターT細胞、ナイーブT細胞、メモリーT細胞、αβT細胞、γδT細胞などが挙げられる。また、当該T細胞は、CAT（CD3 Activated T Lymphocyte）やCAR-T（chimeric antigen receptor T）細胞であってもよい。さらに、本発明の実施形態における「T細胞」には、T細胞の前駆細胞をも包含する。
当該T細胞は、生体、例えば、末梢血や臍帯血などの血液、骨髄液などの体液などから、採取したものであっても、iPS細胞などの多能性幹細胞から分化誘導したものであってもよい。
【００１８】
グルコシルセラミド合成酵素（UDP-glucose ceramide glucosyltransferase：UGCG、EC 2.4.1.80）は、UDP-グルコースのグルコースをセラミドに転移する過程を触媒する酵素で、ヒトのグルコシルセラミド合成酵素のアミノ酸配列およびcDNA配列は、各々、配列番号１および２に示される。ただし、本発明の実施形態における「グルコシルセラミド合成酵素」とは、ヒト由来のUGCGに限定されず、他の哺乳動物（マウス、ラット、イヌ、ネコのほか、ウシ、ウマ、ヒツジなど家畜、サル、チンパンジーやゴリラなどの霊長類等も含まれる）由来のものであってもよく、例えば、配列番号１で表されるアミノ酸を含むタンパク質の他、配列番号１で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含むタンパク質であってもよい。
ここで、「実質的に同一のアミノ酸配列を含むタンパク質」とは、配列番号１で表わされるアミノ酸配列と約60%以上、好ましくは約70%以上、より好ましくは約80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、最も好ましくは約99%のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつ、グルコシルセラミド合成酵素活性を有するタンパク質である。
あるいは、配列番号１で表わされるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含むタンパク質とは、配列番号１で表わされるアミノ酸配列中の1または数個（好ましくは、1〜30個程度、より好ましくは1〜10個程度、さらに好ましくは1〜5個）のアミノ酸が欠失、置換、挿入若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、グルコシルセラミド合成酵素活性を有するタンパク質である。
また、ヒトのグルコシルセラミド合成酵素をコードするcDNA配列には、配列番号２で表される核酸以外にも、上記「配列番号１で表されるアミノ酸を含むタンパク質」をコードするcDNAも含まれる。
【００１９】
本発明の実施形態において、「グルコシルセラミド合成酵素（UGCG）の機能を低下または喪失させる」方法として、ex vivoにおいて、UGCG活性阻害剤をT細胞に接触させ、T細胞内に導入する方法の他、T細胞のUGCG遺伝子のノックアウトまたは当該遺伝子への突然変異を導入などにより、UGCGタンパク質発現の抑制または発現したタンパク質の酵素活性を喪失もしくは低下させる方法などを挙げることができる。
UGCG活性阻害剤としては、例えば、1-フェニル-デカノイルアミノ-3-モルフォリノ-1-プロパノール（PDMP）、1-フェニル-2-ヘキサデカノイルアミノ-3-モルフォリノ-1-プロパノール（PPMP）、ブチル-デオキシノジリマイシンおよびブチル-デオキシガラクトノジリマイシンなどの他、UGCGに対する中和抗体やUGCG遺伝子ノックアウトのためのsiRNA、miRNAなどであってもよい。
UGCG遺伝子のノックアウトは、例えば、cre/loxPシステムなどを使用した遺伝子組換法の他、前述のsiRNAやmiRNAなどの導入によるRNAi法などによって実施することができる。
【００２０】
本発明の第１の実施形態には、本発明のT細胞の作製または誘導方法によって調製される、UGCGまたはガングリオシドの機能が低下または喪失したT細胞であって、活性化による免疫チェックポイント分子（例えば、PD-1、TIM3およびCTLA4など）の発現増加が誘導されない（発現が抑制された）T細胞（以下「本発明のT細胞」とも記載する。）も含まれる。また、本発明のT細胞には、UGCGまたはガングリオシドの機能が低下または喪失したT細胞であって、TCR/CD3刺激等により活性化された当該T細胞も含まれる。
【００２１】
本発明の第２の実施形態は、グルコシルセラミド合成酵素（UGCG）阻害剤または各ガングリオシドの生合成を触媒する酵素の阻害剤を有効成分として含む、免疫チェックポイント阻害薬である。
本発明の第２の実施形態にかかる阻害薬（以下「本発明の阻害薬」とも記載する）は、有効成分であるグルコシルセラミド合成酵素阻害剤または各ガングリオシドの生合成を触媒する酵素の阻害剤が、T細胞を標的化する薬剤担体に担持されていることが望ましい。そのような薬剤担体としては、DDS（drug delivery system）において使用されるようなリポソーム、高分子ミセル、アルブミン担体などのナノ担体に、T細胞特異的に標的化する分子を結合させた薬剤担体などを使用することができる。
T細胞特異的に標的化する分子としては、例えば、T細胞マーカー（例えば、TCR、CD3、CD4、CD8およびPD-1など、T細胞特異的にその細胞表面に発現している分子）を特異的に認識する分子（抗体、ペプチド、アプタマーなど）を結合させた薬剤担体などを使用することができる。
【００２２】
前述のとおり、発明者らは、T細胞のUGCGの機能を低下または喪失させると、当該T細胞を活性化しても、PD-1、TIM3およびCTLA4などの免疫チェックポイント分子の発現が増大しない（T細胞活性化に伴う免疫チェックポイント分子の発現が抑制される）ことを見出した。すなわち、ex vivoまたはin vivoにおいて、UGCG阻害剤または各ガングリオシドの生合成を触媒する酵素の阻害剤で処理したT細胞においては、活性化に伴うPD-1、TIM3およびCTLA4などの免疫チェックポイント分子の発現が抑制され、当該T細胞の活性化が維持されると考えられる。
そこで、本発明の第３の実施形態は、UGCG阻害剤または各ガングリオシドの生合成を触媒する酵素の阻害剤を有効成分として含む、T細胞におけるPD-1の発現抑制剤またはT細胞の活性化維持剤である。
【００２３】
本発明の第４の実施形態は、本発明のT細胞または本発明の阻害薬を含む、がんの予防または治療のための医薬組成物（以下「本発明の医薬組成物」とも記載する）である。
本発明の医薬組成物は、有効成分（例えば、グルコシルセラミド合成酵素阻害剤またはDDS担体に担持されたグルコシルセラミド合成酵素阻害剤）の他、1または2以上の製剤用添加物を含む医薬組成物の形態で投与してもよい。また、当該実施形態にかかる医薬組成物中には、公知の他の薬剤を併せて配合してもよい。
【００２４】
本発明の医薬組成物は、経口または非経口用の剤型であってもよく、特に限定はしないが、例えば、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、シロップ剤、懸濁剤、座剤、軟膏、クリーム剤、ゲル剤、貼付剤、吸入剤または注射剤等が挙げられる。これらの製剤は常法に従って調製される。なお、液体製剤にあっては、用時、水または他の適当な溶媒に溶解または懸濁するものであってもよい。また、錠剤、顆粒剤は周知の方法でコーティングしてもよい。注射剤の場合には、本発明の抗体またはその機能的断片を水に溶解させて調製されるが、必要に応じて生理食塩水あるいはブドウ糖溶液に溶解させてもよく、また、緩衝剤や保存剤を添加してもよい。
【００２５】
本発明の医薬組成物の製造に用いられる製剤用添加物の種類、有効成分に対する製剤用添加物の割合、あるいは、医薬組成物の製造方法は、その形態に応じて当業者が適宜選択することが可能である。製剤用添加物としては無機または有機物質、あるいは、固体または液体の物質を用いることができ、一般的には、有効成分重量に対して、例えば、0.1重量％〜99.9重量％、1重量％〜95.0重量％、または1重量％〜90.0重量％の間で配合することができる。具体的には、製剤用添加物の例として乳糖、ブドウ糖、マンニット、デキストリン、シクロデキストリン、デンプン、蔗糖、メタケイ酸アルミン酸マグネシウム、合成ケイ酸アルミニウム、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ヒドロキシプロピルデンプン、カルボキシメチルセルロースカルシウム、イオン交換樹脂、メチルセルロース、ゼラチン、アラビアゴム、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール、軽質無水ケイ酸、ステアリン酸マグネシウム、タルク、トラガント、ベントナイト、ビーガム、酸化チタン、ソルビタン脂肪酸エステル、ラウリル硫酸ナトリウム、グリセリン、脂肪酸グリセリンエステル、精製ラノリン、グリセロゼラチン、ポリソルベート、マクロゴール、植物油、ロウ、流動パラフィン、白色ワセリン、フルオロカーボン、非イオン性界面活性剤、プロピレングルコールまたは水等が挙げられる。
【００２６】
経口投与用の固形製剤を製造するには、有効成分と賦形剤成分、例えば、乳糖、澱粉、結晶セルロース、乳酸カルシウムまたは無水ケイ酸などと混合して散剤とするか、さらに必要に応じて白糖、ヒドロキシプロピルセルロースまたはポリビニルピロリドンなどの結合剤、カルボキシメチルセルロースまたはカルボキシメチルセルロースカルシウムなどの崩壊剤などを加えて湿式または乾式造粒して顆粒剤とする。錠剤を製造するには、これらの散剤および顆粒剤をそのまま、あるいは、ステアリン酸マグネシウムまたはタルクなどの滑沢剤を加えて打錠すればよい。これらの顆粒または錠剤は、ヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレート、メタクリル酸−メタクリル酸メチルポリマーなどの腸溶剤基剤で被覆して腸溶剤製剤、あるいは、エチルセルロース、カルナウバロウまたは硬化油などで被覆して持続性製剤とすることもできる。また、カプセル剤を製造するには、散剤または顆粒剤を硬カプセルに充填するか、有効成分をそのまま、あるいは、グリセリン、ポリエチレングリコール、ゴマ油またはオリーブ油などに溶解した後ゼラチンで被覆し軟カプセルとすることができる。
【００２７】
注射剤を製造するには、有効成分を必要に応じて、塩酸、水酸化ナトリウム、乳糖、乳酸、ナトリウム、リン酸一水素ナトリウムまたはリン酸二水素ナトリウムなどのｐＨ調整剤、塩化ナトリウムまたはブドウ糖などの等張化剤と共に注射用蒸留水に溶解し、無菌濾過してアンプルに充填するか、さらに、マンニトール、デキストリン、シクロデキストリンまたはゼラチンなどを加えて真空凍結乾燥し、用事溶解型の注射剤としてもよい。また、有効成分にレチシン、ポリソルベート80またはポリオキシエチレン硬化ヒマシ油などを加えて水中で乳化させ、注射剤用乳剤とすることもできる。
【００２８】
直腸投与剤を製造するには、有効成分をカカオ脂、脂肪酸のトリ、ジおよびモノグリセリドまたはポリエチレングリコールなどの座剤用基材と共に加湿して溶解し、型に流し込んで冷却するか、有効成分をポリエチレングリコールまたは大豆油などに溶解した後、ゼラチン膜等で被覆してもよい。
【００２９】
本発明の医薬組成物の投与量および投与回数は特に限定されず、治療対象疾患の悪化・進展の防止および／または治療の目的、疾患の種類、患者の体重や年齢などの条件に応じて、医師または薬剤師の判断により適宜選択することが可能である。
一般的には、経口投与における成人1日あたりの投与量は0.01〜1,000 mg（有効成分重量）程度であり、1日1回または数回に分けて、あるいは数日ごとに投与することができる。注射剤として用いる場合には、成人に対して1日量0.001〜100ｍｇ（有効成分重量）を連続投与または間欠投与することが望ましい。
【００３０】
本発明の第５の実施形態は、被験物質をT細胞に接触させ、該T細胞におけるGlc-Cerの産生量または該T細胞におけるUGCGの発現量を測定することを含む、免疫チェックポイント阻害物質のスクリーニング方法である。
本発明の第５の実施形態にかかるスクリーニング方法（以下「本発明のスクリーニング方法」とも記載する）において、Glc-Cerの精製および定量方法については、公知の方法、例えば、薄層クロマトグラフィーやHPLCを用いた方法により、容易に実施することができる。被験物質を接触させたT細胞内のGlc-Cer産生量が、被験物質を接触させていないコントロールのT細胞内のGlc-Cerの産生量と比較して、例えば、約80%以下、好ましくは約60%以下、より好ましくは約40%以下、さらにより好ましくは約20%以下、最も好ましくは約10%以下の場合に、被験物質によってGlc-Cerの産生量が抑制されたと判断することができ、当該被験物質を免疫チェックポイント阻害物質の候補とすることができる。
【００３１】
また、本発明のスクリーニング方法において、UGCGの発現量の測定方法としては、公知の方法、例えば、RT-PCR法やリアルタイムPCR法などのPCR法、ノーザンブロッティング法の他、マイクロアレイなどによるハイスループットなアッセイ方法によっても、測定可能である。被験物質を接触させたT細胞内のUGCGの発現量が、被験物質を接触させていないコントロールのT細胞内のUGCGの発現量と比較の、例えば、約80%以下、好ましくは約60%以下、より好ましくは約40%以下、さらにより好ましくは20%以下、最も好ましくは約10%以下の場合に、被験物質によってUGCGの発現量が抑制されたと判断することができ、当該被験物質を免疫チェックポイント阻害物質の候補とすることができる。前記免疫チェックポイント阻害物質は、がんの予防剤または治療剤としての候補にもなり得るので、本発明のスクリーニング方法は、がんの予防剤または治療剤候補のスクリーニング方法でもあり得る。
【００３２】
本発明の第６の実施形態は、本発明の医薬組成物または本発明のT細胞を患者に投与することを含む、がんの予防および／または治療方法（以下「本発明の予防または治療方法」とも記載する）である。
ここで「治療」とは、すでにがんに罹患した患者において、その病態の進行および悪化を阻止または緩和することを意味し、これによってがんの進行および悪化を阻止または緩和することを目的とする処置のことである。
また、「予防」とは、治療を要するがんを発症するおそれがある者について、その発症を予め阻止することを意味し、これによってがんの発症を予め阻止することを目的とする処置のことである。さらに、がん治療後の再発を阻止するための処置も「予防」に含まれる。
また、治療および予防の対象はヒトに限定されず、ヒト以外の哺乳動物、例えば、マウス、ラット、イヌ、ネコのほか、ウシ、ウマ、ヒツジなど家畜、サル、チンパンジーやゴリラなどの霊長類等であってもよく、特に好ましくは、ヒトである。
【００３３】
上記本発明のT細胞を患者に投与する方法は、当該T細胞が、自己またはドナー（他者）由来のCATもしくはCAR-T細胞から調製した本発明のT細胞であっても、あるいは、CD3を活性化した本発明のT細胞もしくは本発明のT細胞から調製したCAR-T細胞であってもよい。
【００３４】
本発明の予防または治療方法の対象となるがんには、悪性の腫瘍および新生物などが含まれる。
悪性の腫瘍としては、例えば、肝細胞癌、胆管細胞癌、腎細胞癌、扁平上皮癌、基底細胞癌、移行細胞癌、腺癌、悪性ガストリノーマ、悪性黒色腫、線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、悪性奇形腫、血管肉腫、カポジ肉腫、骨肉腫、軟骨肉腫、リンパ管肉腫、悪性髄膜腫、非ホジキンリンパ腫、ホジキンリンパ腫、白血病および脳腫瘍等が含まれる。
新生物には、上皮細胞由来新生物（上皮癌腫）、基底細胞癌腫、腺癌腫、口唇癌、口腔癌、食道癌、小腸癌および胃癌のような胃腸癌、結腸癌、直腸癌、肝癌、膀胱癌、膵臓癌、卵巣癌、子宮頚癌、肺癌、乳癌、扁平上皮細胞癌および基底細胞癌のような皮膚癌、前立腺癌並びに腎細胞癌腫などが含まれ、また、全身の上皮、間葉または血液細胞を冒す他の既知の癌も含まれる。
【００３５】
本明細書が英語に翻訳されて、単数形の「a」、「an」および「the」の単語が含まれる場合、文脈から明らかにそうでないことが示されていない限り、単数のみならず複数のものも含むものとする。
以下に実施例を示してさらに本発明の説明を行うが、本実施例は、あくまでも本発明の実施形態の例示にすぎず、本発明の範囲を限定するものではない。
【実施例】
【００３６】
１．T細胞特異的UGCG遺伝子欠損マウスを用いた解析
T細胞特異的UGCG遺伝子欠損マウスに悪性黒色腫（メラノーマ）を移植して、腫瘍の成長およびマウスの生存期間について検討を行った。なお、本実施例で行ったマウスの実験において、マウスは、全てSPF（specific pathogen free）環境で飼育し、麻布大学動物実験委員会の承認を得てガイドラインに従って扱った。
T細胞特異的UGCG遺伝子欠損マウスは、UGCG遺伝子欠損floxマウス（Yamashitaら, Genesis 43:175-180 2005）とT細胞特異的なCreマウスとの掛け合わせにより作製した。また、同腹子のうちcre遺伝子を持たないマウスをコントロールとして使用した。
マウスメラノーマ細胞（B16F110：東北大学 医用細胞資源センター・細胞バンクから入手）1×105個を、30%マトリゲル（CORNING）を含む100 μｌのダルベコ改変イーグル（DMEM）培地に懸濁し、T細胞特異的UGCG遺伝子欠損マウスとコントロールマウスの背部皮下にインジェクションした。メラノーマ細胞の移植後、経時的に、マウスを安楽死させた後、腫瘍を摘出し、その体積を測定した。T細胞特異的UGCG遺伝子欠損マウスに移植したメラノーマ細胞の腫瘍はその成長が遅延することが分かった（図２）。【００３７】
次に、T細胞特異的UGCG遺伝子欠損マウスとコントロールマウスの生存率を比較するためのカプランマイヤー生存曲線を求め、ログランクによる検定を行った。メラノーマ細胞を移植したマウスについて、斃死した場合、腫瘍体積が1500mm3を超えた場合、明らかな呼吸の異常を認めた場合、10%異常の体重減少を認めた場合および肉眼で明確な転移を認めた場合をエンドポイントとして生存率の解析を行った。その結果、T細胞特異的UGCG遺伝子欠損マウスには、少なくとも、1週間程度の延命効果が認められた（図３）。【００３８】
各マウスの腫瘍組織をホルマリン固定したのち、パラフィン包埋を行い、HE染色を行った。T細胞特異的UGCG遺伝子欠損マウス由来の組織においては、リンパ球集積が見られた（図４Ａ右）。さらに、図４Ａに示されるT細胞数を目視で計数したところ、T細胞特異的UGCG遺伝子欠損マウスの腫瘍内T細胞は増加傾向にあった（図４Ｂ）。従って、腫瘍に対するT細胞による攻撃が活発に行われていることが示唆された。【００３９】
２．T細胞特異的UGCG遺伝子欠損マウス脾臓中のT細胞の構成
T細胞特異的UGCG遺伝子欠損マウスおよびコントロールマウスを、メラノーマ細胞移植条件または非移植条件で14日間飼育した後、脾臓を摘出した。Dynabeads Untouched Mouse T Cells kit（Thermo fisher Scientific社）を使用して、摘出した脾臓からT細胞を単離した。
まず、単離したT細胞に存在するガングリオシドの量を調べた。T細胞を抗CD3抗体（T細胞マーカー）とFITC標識コレラ毒素（ガングリオシドと結合する）で染色した後、フローサイトメーター（EC800、Sony社）で解析したところ、T細胞特異的UGCG遺伝子欠損マウスの脾臓細胞中のT細胞において、ガングリオシドが減少していること、すなわち、UGCGより下流に位置する多くのガングリオシド類の生合成が阻害されていることを確認した（図５）。
次に、抗CD3抗体、抗CD4抗体および抗CD8抗体で多重染色をした後、フローサイトメーターで解析した（図６）。その結果、メラノーマ細胞移植後、野生型マウス（WT）の脾臓中のT細胞の総数は減少しており（図６左）、特に、CD8+T細胞の減少が顕著であった（図６右）。よって腫瘍によりT細胞が疲弊化することを確認した。T細胞特異的UGCG遺伝子欠損マウス(KO)では腫瘍の移植後、CD4+細胞およびCD8+細胞が増加しており、特に、CD8+細胞の増加が顕著であった（図６中および右）。よってT細胞の疲弊化が生じにくい形質を獲得していることを確認した。【００４０】
３．T細胞特異的UGCG遺伝子欠損マウス由来のT細胞の活性化後における免疫チェックポイント分子の発現状況の解析
Dynabeads Untouched Mouse T Cells kit（Thermo fisher Scientific社）を使用して、摘出した脾臓からT細胞を単離し、IL-2（30 U/mL）およびDynabeads Mouse T-Cell activator CD3-CD28（Thermo fisher Scientific社）でT細胞を活性化した。その後、経時的にT細胞を回収し、PD-1遺伝子の発現をqPCRで解析した。活性化後のT細胞の増殖率については、T細胞特異的UGCG遺伝子欠損マウス由来の細胞において、増殖率が増大していた（図７Ａ）。さらに、注目すべきことに、T細胞活性化後、コントロールマウス由来のT細胞におけるPD-1の発現量が明らかに増大したのに対し、T細胞特異的UGCG遺伝子欠損マウス由来のT細胞においては、PD-1の発現量の増大は認められなかった（図７Ｂ）。
以上の結果から、UGCG遺伝子欠損T細胞では、その活性化後において、免疫チェックポイント分子の1つであるPD-1遺伝子の発現量がほとんど増大しないことが明らかとなった。【００４１】
４．T細胞特異的UGCG遺伝子欠損マウス由来のCD4陽性T細胞の活性化後における免疫チェックポイント分子の発現状況の解析
MojoSortTM Mouse CD4 T Cell Isolation Kit（BioLegend社）を使用して、摘出した脾臓からCD4陽性T細胞を単離し、上記２．と同様にして、CD4陽性T細胞を活性化した。その後、経時的にT細胞を回収し、IFNγ、PD-1、遺伝子の発現をqPCRで解析した。
その結果、T細胞特異的UGCG遺伝子欠損マウス由来のCD4陽性T細胞において、IFNγの発現が、野生型マウス由来のT細胞と同等以上に上昇するのに対し、免疫チェックポイント分子であるPD-1、TIM3およびCTLA4の発現は低下することが分かった（図８）。【００４２】
５．T細胞特異的UGCG遺伝子欠損マウス由来のT細胞の活性化後の増殖率の測定
上記３．と同様に、単離したT細胞を活性化し、血球計算盤を用いて経時的にT細胞数を計数した。その結果、活性化T細胞の増殖率は、野生型（WT）とUGCG遺伝子欠損（KO）で差異はなく（図９）、UGCG遺伝子の欠損は、T細胞の増殖には影響しないことが確認できた。【００４３】
６．In vitroでのPPMP処理によるT細胞中の糖脂質への影響
上記３．と同様にT細胞を単離し、UGCG阻害剤であるPPMPの各種濃度でT細胞を24時間処理した。その後、ガングリオシドGM3の発現量をフローサイトメーターで解析した。その結果、GM3の発現量はPPMPの濃度依存的に減少することが確認できた（図１０左）。また、PPMP処理によるT細胞への毒性を検討するため、T細胞の増殖率を、細胞増殖/細胞毒性アッセイキット（CK-1, Dojindo）で測定したところ、少なくとも糖脂質を減少させる濃度範囲においては、増殖率に影響はなく、細胞への毒性は低いことが示唆された（図１０右）。
【産業上の利用可能性】
【００４４】
本発明により、免疫チェックポイント分子の発現が誘導されないT細胞や、免疫チェックポイント阻害薬、UGCG阻害剤などが提供され、それらはがんの予防や治療に使用される。従って、本発明は、医学分野における利用が期待される。
【図１】
2020085414.tif 000002
【図２】
2020085414.tif 000003
【図３】
2020085414.tif 000004
【図４】
2020085414.tif 000005
【図５】
2020085414.tif 000006
【図６】
2020085414.tif 000007
【図７】
2020085414.tif 000008
【図８】
2020085414.tif 000009
【図９】
2020085414.tif 000010
【図１０】
2020085414.tif 000011
【配列表】
2020085414000001.app
【国際調査報告】
2020085414.tif 000012
2020085414.tif 000013
2020085414.tif 000014
2020085414.tif 000015