(57)【要約】  本発明は、多能性幹細胞に、インテグリンβ1-β-カテニンシグナル伝達経路を活性化する処理を施すこと（但し、多能性幹細胞を、ラミニン421もしくはその断片及び／又はラミニン121もしくはその断片に接触させることを除く）を含む、中内胚葉系への分化抵抗性が解除された多能性幹細胞の作製方法等を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
多能性幹細胞に、インテグリンβ1-β-カテニンシグナル伝達経路を活性化する処理を施すこと（但し、多能性幹細胞を、ラミニン421もしくはその断片及び／又はラミニン121もしくはその断片に接触させることを除く）を含む、中内胚葉系への分化抵抗性が解除された多能性幹細胞の作製方法。
【請求項２】
前記多能性幹細胞は、さらに中胚葉系への分化抵抗性が解除されている、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記多能性幹細胞は、さらに血液細胞への分化抵抗性が解除されている、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記活性化処理が、ラミニン511 E8断片換算で0.005〜0.25μg/cm2に相当するラミニン511もしくはその断片に、多能性幹細胞を接触させることである、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記活性化処理が、ラミニン511 E8断片換算で0.03〜0.07μg/cm2に相当するラミニン511もしくはその断片に、多能性幹細胞を接触させることである、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
多能性幹細胞の90%以上がOct3/4陽性かつSox2陽性である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記活性化処理が、多能性幹細胞をGSK3β阻害剤に2〜5日間接触させることである、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
多能性幹細胞がヒト由来である、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
（１）請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法により中内胚葉系への分化抵抗性が解除された多能性幹細胞を作製する工程、及び
（２）工程（１）で得られた細胞を、中胚葉系又は内胚葉系の細胞に分化誘導する工程
を含む、中胚葉系又は内胚葉系の細胞の作製方法。
【請求項１０】
前記中胚葉系の細胞が、血液細胞、血管内皮細胞、骨格筋細胞、軟骨細胞、腎細胞、心筋細胞又は脂肪細胞である、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記中胚葉系の細胞が血液細胞である、請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
前記内胚葉系の細胞が、膵β細胞、肝細胞、腸管細胞、肺細胞又は甲状腺細胞である、請求項９に記載の方法。
【請求項１３】
ラミニン511 E8断片換算で0.005〜0.25μg/cm2に相当するラミニン511もしくはその断片でコーティングされた培養容器を含む、多能性幹細胞の中内胚葉系への分化抵抗性を解除するための培養キット。
【請求項１４】
前記培養容器が、ラミニン511 E8断片換算で0.03〜0.07μg/cm2に相当するラミニン511もしくはその断片でコーティングされている、請求項１３に記載のキット。
【請求項１５】
多能性幹細胞におけるインテグリンβ1の発現量を測定することを含む、該多能性幹細胞の中内胚葉系への分化抵抗性の評価方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、中内胚葉系への分化抵抗性が解除された多能性幹細胞の作製方法に関する。より詳細には、本発明は、多能性幹細胞を、インテグリンβ1及びβカテニンを介するシグナル伝達経路を活性化する処理に付すことを含む、中内胚葉系への分化抵抗性が解除された多能性幹細胞の作製方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来より、人工多能性幹細胞（iPS細胞）から血液細胞への分化のし易さ（易分化性）は、iPS細胞株ごとに異なることが知られていたが、その理由は不明であった。iPS細胞から血液細胞への易分化性の違いの要因が、細胞株自身の特性にあるのか、あるいは細胞外の環境にあるのかを検証することが求められていた。【０００３】
本発明者らは以前、フィーダーフリー培養で細胞外マトリクスとして用いられる種々のラミニン上で多能性幹細胞を培養したところ、ラミニン511上で維持した多能性幹細胞は中内胚葉系への分化抵抗性を示すのに対し、ラミニン421やラミニン121上で維持した多能性幹細胞では、この分化抵抗性が解除され、中内胚葉系、特に血液細胞に分化しやすい傾向を示すことを見出した。また、上記特定のラミニン上で維持され、中内胚葉系への分化抵抗性が解除された多能性幹細胞では、Wnt/β-カテニンシグナル伝達経路の下流遺伝子群の発現が上昇していることも見出した（特許文献１）。この発見は、Wnt/β-カテニンシグナルの活性化が、ES細胞やエピブラストからの中胚葉、血液分化に重要であるという以前の報告（例えば、非特許文献１〜３）と一致する。【０００４】
しかし、特定のラミニンのみが、なぜ多能性幹細胞の中内胚葉系への分化抵抗性を解除し得るのかについては、依然として不明のままであった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】国際公開第2018/038242号公報
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Liu, P. et al., Nat. Genet., 22: 361-365 (1999)
【非特許文献２】Huelsken, J. et al., J. Cell. Biol., 148: 567-578 (2000)
【非特許文献３】Woll, P.S. et al., Blood, 111(1): 122-123 (2008)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
従って、本発明の目的は、特定のラミニンが多能性幹細胞の中内胚葉系への分化抵抗性を解除するメカニズムを解明し、多能性幹細胞から中内胚葉系、特に血液細胞への、より効率的な分化誘導方法を提供することである。また、本発明の別の目的は、当該メカニズムを利用して、多能性幹細胞クローンの中内胚葉系への易分化性を評価する手段を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、多能性幹細胞の中内胚葉系への分化抵抗性を解除するには、Wnt/β-カテニンシグナル伝達経路を活性化することが重要であると考えた。そこでまず、β-カテニンをリン酸化してユビキチンプロテアソーム系による恒常的分解を促すGSK3βの阻害剤の存在下に、多能性幹細胞を推奨濃度のラミニン511上で維持培養した後、造血前駆細胞へと分化誘導すると、分化能が改善され、造血前駆細胞数が増加することを見出した。【０００９】
次に、本発明者らは、ラミニンのレセプターとして知られる細胞表面タンパク質であるインテグリンβ1（ITGB1）に着目し、造血前駆細胞への分化誘導能の高い（本明細書において「造血性」ともいう。）ラミニン421やラミニン121上で維持した多能性幹細胞と、造血前駆細胞への分化誘導能の低い（本明細書において「非造血性」ともいう。）ラミニン511上で維持した多能性幹細胞とで、ITGB1の発現量を比較したところ、前者の方がITGB1を高発現していることを見出した。がん細胞において、ITGB1はILK/pGSK3βを介してβ-カテニンの蓄積量を変化させ、Wnt/β-カテニンシグナル伝達経路を調節していることが報告されていたので、本発明者らは、ラミニン421及びラミニン121上で維持した多能性幹細胞と、ラミニン511上で維持した多能性幹細胞とで、ILK/pGSK3β/β-カテニン量を比較した。その結果、前者の方がILK/pGSK3β/β-カテニン量が多く、結果的にWnt/β-カテニンシグナル伝達経路が活性化されていることが明らかとなった。【００１０】
造血性のラミニン421とラミニン121は、β及びγサブユニットとして、ともにβ2及びγ1を含むが、同じくβ2及びγ1を含むラミニン321上で維持した多能性幹細胞からは、造血前駆細胞が誘導されなかったことから、βγサブユニットの組み合わせ以外の機序が考えられた。また、本発明者らは、多能性幹細胞の維持培養研究の過程で、造血性のラミニン421やラミニン121は、非造血性のラミニン511に比べて、細胞-基質間接着が弱い傾向があることを見出していた。そこで、ラミニン421やラミニン121と、ラミニン511との間における造血前駆細胞への分化誘導能の違いが、ラミニンの種類によるものなのか、それともITGB1とラミニンとの間の接着強度によるものなのかを調べるため、非造血性のラミニン511を段階希釈して、ITGB1との接着強度を低下させたところ、分化抵抗性を示す多能性幹細胞では、細胞-基質間接着が弱くなるに従ってITGB1の発現が上昇することが明らかとなった。さらに、段階希釈したラミニン511上で維持した当該多能性幹細胞を造血前駆細胞へ分化誘導したところ、推奨濃度で維持した多能性幹細胞に比べて分化能が改善され、造血前駆細胞数が増加することを見出した。
一方で、多能性幹細胞クローンによっては、推奨濃度のラミニン511で維持しても分化抵抗性を示さないものも存在することが分かった。このような分化抵抗性を示さない多能性幹細胞では、いずれの希釈系列のラミニン511上でも十分なITGB1の発現があることが明らかとなった。即ち、細胞表面分子であるITGB1の発現量を指標として、多能性幹細胞の中内胚葉系、特に血液細胞への易分化性を評価することができ、分化抵抗性を示すと判定された多能性幹細胞に対しては、ラミニン511濃度を低下させて用いることで、分化抵抗性を解除し得ることが示された。【００１１】
本発明者らはまた、前述のGSK3β阻害剤を用いてWnt/β-カテニンシグナル伝達経路を活性化した場合は、造血前駆細胞への分化誘導を開始する前に、多能性を維持する細胞数が減少してしまうのに対し、ITGB1との接着強度が弱いラミニン421やラミニン121を用いたり、ラミニン511を希釈し接着強度を弱くして用いた場合には、多能性を維持する細胞数を減らすことなく分化能が改善されることを見出した。即ち、ラミニン511を推奨濃度より低い濃度で用いることで、多能性幹細胞の維持培養に要するコストを削減しつつ、多能性の維持と分化抵抗性の解除とを両立させることに成功した。【００１２】
本発明者らは、これらの知見に基づいてさらに研究を重ねた結果、本発明を完成するに至った。【００１３】
即ち、本発明は以下のものを提供する。
［１］多能性幹細胞に、インテグリンβ1-β-カテニンシグナル伝達経路を活性化する処理を施すことを含む、中内胚葉系への分化抵抗性が解除された多能性幹細胞の作製方法。
［２］前記多能性幹細胞は、さらに中胚葉系への分化抵抗性が解除されている、［１］に記載の方法。
［３］前記多能性幹細胞は、さらに血液細胞への分化抵抗性が解除されている、［２］に記載の方法。
［４］前記活性化処理が、ラミニン511 E8断片換算で0.005〜0.25μg/cm2に相当するラミニン511もしくはその断片に、多能性幹細胞を接触させることである、［１］〜［３］のいずれかに記載の方法。
［５］前記活性化処理が、ラミニン511 E8断片換算で0.03〜0.07μg/cm2に相当するラミニン511もしくはその断片に、多能性幹細胞を接触させることである、［１］〜［３］のいずれかに記載の方法。
［６］多能性幹細胞の90%以上がOct3/4陽性かつSox2陽性である、［１］〜［５］のいずれかに記載の方法。
［７］前記活性化処理が、多能性幹細胞をGSK3β阻害剤に2〜5日間接触させることである、［１］〜［３］のいずれかに記載の方法。
［８］多能性幹細胞がヒト由来である、［１］〜［７］のいずれかに記載の方法。
［９］（１）［１］〜［８］のいずれかに記載の方法により中内胚葉系への分化抵抗性が解除された多能性幹細胞を作製する工程、及び（２）工程（１）で得られた細胞を、中胚葉系又は内胚葉系の細胞に分化誘導する工程を含む、中胚葉系又は内胚葉系の細胞の作製方法。
［１０］前記中胚葉系の細胞が、血液細胞、血管内皮細胞、骨格筋細胞、軟骨細胞、腎細胞、心筋細胞又は脂肪細胞である、［９］に記載の方法。
［１１］前記中胚葉系の細胞が血液細胞である、［９］に記載の方法。
［１２］前記内胚葉系の細胞が、膵β細胞、肝細胞、腸管細胞、肺細胞又は甲状腺細胞である、［９］に記載の方法。
［１３］ラミニン511 E8断片換算で0.005〜0.25μg/cm2に相当するラミニン511もしくはその断片でコーティングされた培養容器を含む、多能性幹細胞の中内胚葉系への分化抵抗性を解除するための培養キット。
［１４］前記培養容器が、ラミニン511 E8断片換算で0.03〜0.07μg/cm2に相当するラミニン511もしくはその断片でコーティングされている、［１３］に記載のキット。
［１５］多能性幹細胞におけるインテグリンβ1の発現量を測定することを含む、該多能性幹細胞の中内胚葉系への分化抵抗性の評価方法。
【発明の効果】
【００１４】
本発明によれば、インテグリンβ1（ITGB1）-β-カテニンシグナル伝達経路を活性化することで、多能性幹細胞の中内胚葉系への分化抵抗性を解除することができるので、中内胚葉系の細胞への分化誘導に適した多能性幹細胞を提供することができる。特に、ラミニン511又はその断片を推奨濃度より低濃度に希釈して用いることで、多能性幹細胞の中内胚葉系への分化抵抗性を解除することができるので、維持培養のコスト削減と効率的な分化誘導とを同時に達成することができる。また、本発明によれば、多能性幹細胞の多能性を十分に維持したまま中内胚葉系への分化抵抗性を解除することができるので、中内胚葉系の細胞への分化誘導をより効率的に行うことができる。また、本発明によれば、ITGB1の発現量を指標として、多能性幹細胞の中内胚葉系への分化抵抗性を簡便に評価することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】ラミニン511 E8断片（LM511）上で維持培養した多能性幹細胞（PSCs）は造血細胞への分化抵抗性を示すことを示す図である。
【図２】Wntシグナル作動薬（GSK3β阻害剤）処理が、LM511上で培養維持したPSCsの造血前駆細胞への分化抵抗性を解除することを示す図である。
【図３】造血性のラミニン上で培養維持したPSCsは、インテグリンβ1（ITGB1）を高発現することを示す図である。
【図４】造血性のラミニンは、ITGB1-β-カテニンシグナリングを活性化することを示す図である。
【図５】PSCs（AK5）の維持培養に用いたLM511濃度と該PSCsにおけるITGB1発現との関係を示す図である。
【図６】希釈したLM511上で維持培養したPSCs（AK5）は、ITGB1を高発現し、効率よく造血前駆細胞に分化誘導されることを示す図である。
【図７】GSK3β阻害剤による調節はPSCsの多能性維持を妨げるのに対し、希釈したLM511や、LM421/LM121上でPSCsを維持培養すると、多能性維持と分化抵抗性の解除とを両立できることを示す図である。
【図８】造血性のラミニン421やラミニン121は、非造血性のラミニン511に比べて、細胞-基質間接着が弱いことを示す図である。
【図９】LM511の希釈系列上で維持培養した3種のPSCsの、（Ａ）造血前駆細胞（HPCs）への分化能、（Ｂ）ITGB1の相対発現量及び（Ｃ）HPCs数とITGB1発現量との相関関係を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
（Ｉ）分化抵抗性が解除された多能性幹細胞の作製方法
本発明は、多能性幹細胞の中内胚葉系への分化抵抗性を解除する方法、即ち、分化抵抗性が解除された多能性幹細胞の作製方法（以下、「本発明の製法（Ｉ）」という）を提供する。従って、本発明の製法（Ｉ）に供される多能性幹細胞は、分化抵抗性を有するものであることが好ましい。
ここで「分化抵抗性」とは、多能性幹細胞を所望の細胞に分化誘導した際に、当該所望の細胞に分化しにくい性質を意味する。本発明における「中内胚葉系への分化抵抗性」は、例えば、推奨濃度（ラミニン511 E8断片換算で0.5μg/cm2）のラミニン511もしくはその断片上で維持培養したヒトiPS細胞株AK5 (Nakagawa et al., Scientific Reports, 4: 3954, 2014)を、中内胚葉系の細胞へと分化誘導した場合の、当該所望の細胞への分化のしにくさ、あるいはそれと同等もしくはそれ以上の分化しにくさとして表すことができる。多能性幹細胞が分化抵抗性を有するか否かは、後述の「本発明の評価方法」により判定することができる。
また、「分化抵抗性が解除される」とは、解除処理前に比べて、所望の細胞への分化効率が有意に増加することを意味する。好ましくは、解除処理前に比べて2倍以上、より好ましくは4倍以上、さらに好ましくは8倍以上、所望の細胞への分化効率が増加することをいう。
【００１７】
「中内胚葉系」とは、中胚葉系の細胞及び内胚葉系の細胞、並びに両者の共通の前駆体である中内胚葉細胞を包含する意味で用いられる。従って、「中内胚葉系への分化抵抗性を解除する」とは、少なくとも、多能性幹細胞から中内胚葉細胞への分化効率を解除処理前より増加させることを意味する。好ましくは、本発明の製法（Ｉ）によれば、少なくとも、さらに中胚葉系細胞への分化抵抗性、より好ましくは、少なくとも、さらに血液細胞への分化抵抗性が解除された多能性幹細胞が提供される。
【００１８】
本発明で用いられる多能性幹細胞は、未分化状態を保持したまま増殖できる「自己再生能」と三胚葉系列すべてに分化できる「分化多能性」とを有する未分化細胞であれば特に制限されず、例えば、胚性幹（ES）細胞、iPS細胞の他、始原生殖細胞に由来する胚性生殖（EG）細胞、精巣組織からのGS細胞の樹立培養過程で単離されるmutipotent germline stem（mGS）細胞、骨髄から単離されるmultipotent adult progenitor cell（MAPC）、MUSE細胞等が挙げられる。ES細胞は体細胞から核初期化されて生じたES細胞であってもよい。好ましくはES細胞またはiPS細胞である。多能性幹細胞は哺乳動物に由来するものであってもよく、好ましくはヒト由来の多能性幹細胞である。
【００１９】
ES細胞は、哺乳動物の受精卵の胚盤胞から内部細胞塊を取出し、内部細胞塊を線維芽細胞のフィーダー上で培養することによって樹立することができる。また、継代培養による細胞の維持は、白血病抑制因子(leukemia inhibitory factor (LIF))、塩基性線維芽細胞成長因子(basic fibroblast growth factor (bFGF))などの物質を添加した培養液を用いて行うことができる。ヒトおよびサルのES細胞の樹立と維持の方法については、例えばUSP5,843,780; Thomson JA, et al. (1995), Proc Natl. Acad. Sci. U S A. 92:7844-7848；Thomson JA, et al. (1998), Science. 282:1145-1147；H. Suemori et al. (2006), Biochem. Biophys. Res. Commun., 345:926-932； M. Ueno et al. (2006), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 103:9554-9559； H. Suemori et al. (2001), Dev. Dyn., 222:273-279;H. Kawasaki et al. (2002), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 99:1580-1585；Klimanskaya I, et al. (2006), Nature. 444:481-485などに記載されている。
また、ヒトES細胞株は、例えばWA01(H1)およびWA09(H9)は、WiCell Reserch Instituteから、KhES-1、KhES-2、KhES-3およびKthES11は、京都大学ウイルス・再生医科学研究所(京都、日本)から入手可能である。
【００２０】
iPS細胞は、特定の初期化因子を、DNA又はタンパク質の形態で体細胞に導入することによって作製することができる、ES細胞とほぼ同等の特性、例えば分化多能性と自己複製による増殖能、を有する体細胞由来の人工の幹細胞である（K. Takahashi and S. Yamanaka (2006) Cell, 126:663-676; K. Takahashi et al. (2007), Cell, 131:861-872; J. Yu et al. (2007), Science, 318:1917-1920; Nakagawa, M.ら, Nat. Biotechnol. 26:101-106 (2008)；国際公開WO 2007/069666）。ここで「体細胞」とは、卵子、卵母細胞、ES細胞などの生殖系列細胞または分化全能性細胞を除くあらゆる動物細胞（好ましくは、ヒトを含む哺乳動物細胞）を意味し、胎児(仔)の体細胞、新生児(仔)の体細胞、および成熟した健全なもしくは疾患性の体細胞のいずれも包含されるし、また、初代培養細胞、継代細胞、および株化細胞のいずれも包含される。具体的には、体細胞は、例えば（1）神経幹細胞、造血幹細胞、間葉系幹細胞、歯髄幹細胞等の組織幹細胞（体性幹細胞）、（2）組織前駆細胞、（3）リンパ球、上皮細胞、内皮細胞、筋肉細胞、線維芽細胞（皮膚細胞等）、毛細胞、肝細胞、胃粘膜細胞、腸細胞、脾細胞、膵細胞(膵外分泌細胞等)、脳細胞、肺細胞、腎細胞および脂肪細胞等の分化した細胞などが例示される。
【００２１】
得られるiPS細胞がヒトの再生医療用途に使用される場合には、拒絶反応が起こらないという観点から、患者本人またはHLAの型が同一もしくは実質的に同一である他人から体細胞を採取することが特に好ましい。ここでHLAの型が「実質的に同一」とは、免疫抑制剤などの使用により、該体細胞由来のiPS細胞から分化誘導することにより得られた細胞を患者に移植した場合に移植細胞が生着可能な程度にHLAの型が一致していることをいう。例えば、主たるHLA(例えば、HLA-A、HLA-BおよびHLA-DRの3遺伝子座、あるいはHLA-Cを加えた4遺伝子座）が同一である場合などが挙げられる。
【００２２】
初期化因子は、ES細胞に特異的に発現している遺伝子、その遺伝子産物もしくはnon-cording RNAまたはES細胞の未分化維持に重要な役割を果たす遺伝子、その遺伝子産物もしくはnon-coding RNA、あるいは低分子化合物によって構成されてもよい。初期化因子に含まれる遺伝子として、例えば、Oct3/4、Sox2、Sox1、Sox3、Sox15、Sox17、Klf4、Klf2、c-Myc、N-Myc、L-Myc、Nanog、Lin28、Fbx15、ERas、ECAT15-2、Tcl1、beta-catenin、Lin28b、Sall1、Sall4、Esrrb、Nr5a2、Tbx3またはGlis1等が例示され、これらの初期化因子は、単独で用いても良く、組み合わせて用いても良い。
【００２３】
多能性幹細胞は、作製直後から本発明の製法（Ｉ）により中内胚葉系への分化抵抗性が解除された状態で維持培養することもできるが、本発明の製法（Ｉ）に供する前に、自体公知の方法により維持培養することができる。維持培養用の基本培地としては、例えば、Neurobasal培地、Neural Progenitor Basal培地、NS-A培地、BME培地、BGJb培地、CMRL 1066培地、最小必須培地（MEM）、Eagle MEM培地、αMEM培地、ダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）、Glasgow MEM培地、Improved MEM Zinc Option培地、IMDM培地、Medium 199培地、DMEM／F12培地、ハム培地、RPMI 1640培地、Fischer’s培地、及びこれらの混合培地などが挙げられるが、これらに限定されない。あるいは、市販の多能性幹細胞用の培地（例、StemFit、AK02N、Essential 8等）を用いてもよい。
【００２４】
培地は、血清含有培地又は無血清培地であり得る。好ましくは、無血清培地が使用され得る。無血清培地（SFM）とは、未処理又は未精製の血清をいずれも含まない培地を意味し、従って、精製された血液由来成分又は動物組織由来成分（増殖因子など）を含有する培地が挙げられ得る。血清（例えば、ウシ胎児血清（FBS）、ヒト血清など）の濃度は、0〜20％、好ましくは0〜5％、より好ましくは0〜2％、最も好ましくは0％（すなわち、無血清）であり得る。SFMは任意の血清代替物を含んでよく、又は含まなくてもよい。血清代替物としては、例えば、アルブミン（例えば、脂質リッチアルブミン、組換えアルブミン等のアルブミン代替物、植物デンプン、デキストラン及びタンパク質加水分解物等）、トランスフェリン（又は他の鉄輸送体）、脂肪酸、インスリン、コラーゲン前駆体、微量元素、2−メルカプトエタノール、3’−チオグリセロールあるいはこれらの均等物などを適宜含有する物質が挙げられ得る。かかる血清代替物は、例えば、WO 98／30679に記載の方法により調製できる。また、より簡便にするため、市販のものを利用できる。かかる市販の物質としては、Knockout（商標）Serum Replacement（KSR）、Chemically−defined Lipid concentrated、及びGlutamax（Invitorogen）が挙げられる。
【００２５】
培地は、自体公知のその他の添加物を含んでもよい。例えば、成長因子（例えば、インスリンなど）、ポリアミン類（例えば、プトレシンなど）、ミネラル（例えば、セレン酸ナトリウムなど）、糖類（例えば、グルコースなど）、有機酸（例えば、ピルビン酸、乳酸など）、アミノ酸（例えば、非必須アミノ酸（NEAA）、L−グルタミンなど）、還元剤（例えば、2−メルカプトエタノールなど）、ビタミン類（例えば、アスコルビン酸、d−ビオチンなど）、ステロイド（例えば、［ベータ］−エストラジオール、プロゲステロンなど）、抗生物質（例えば、ストレプトマイシン、ペニシリン、ゲンタマイシンなど）、緩衝剤（例えば、HEPESなど）、栄養添加物（例えば、B27 supplement、N2 supplement、StemPro−Nutrient Supplementなど）を挙げることができる。各添加物は自体公知の濃度範囲で含まれることが好ましい。
【００２６】
多能性幹細胞は、フィーダー細胞の存在下又は非存在下にて培養されてよいが、ESC、iPSCなどの多能性幹細胞の培養に使用することができるフィーダー細胞の多くは、自体、多能性幹細胞の中内胚葉系への分化抵抗性を解除し得るので、本発明の製法（Ｉ）に供する必要がない場合が多い。また、ヒトへの臨床応用を考慮すれば、多能性幹細胞はフィーダー細胞の非存在下で培養されることが望ましい。従って、本発明の好ましい実施態様において、多能性幹細胞は無フィーダー条件下で培養される。
【００２７】
多能性幹細胞を維持培養するために使用される培養器は、特に限定されないが、フラスコ、組織培養用フラスコ、ディッシュ、ペトリデッシュ、組織培養用ディッシュ、マルチディッシュ、マイクロプレート、マイクロウェルプレート、マルチプレート、マルチウェルプレート、マイクロスライド、チャンバースライド、シャーレ、チューブ、トレイ、培養バック、及びローラーボトルが挙げられ得る。培養器は細胞接着性であり得る。細胞接着性の培養器は、培養器表面の細胞への接着性を向上させる目的で、細胞外マトリックス（ECM）などの任意の細胞接着用基質でコートされたものであり得る。細胞接着用基質は、多能性幹細胞又はフィーダー細胞（用いられる場合）の接着を目的とする任意の物質であり得る。細胞接着用基質としては、ラミニン、コラーゲン、ゼラチン、ポリ−L−リジン、ポリ-D-リジン、ポリ-L-オルニチン、及びフィブロネクチン並びにそれらの混合物、例えばマトリゲル、並びに溶解細胞膜調製物（lysed cell membrane preparations）が挙げられる（Klimanskaya I et al 2005. Lancet 365：p1636-1641）。これらの細胞接着用基質は、それらの種類に応じて、通常多能性幹細胞の培養に使用される濃度で培養器にコーティングされる。
【００２８】
この培養において、多能性幹細胞を上記培養器上に播き、例えば、約104〜105細胞／cm2の細胞密度とし、1〜10％ CO2／99〜90％大気の雰囲気下、インキュベーター中で約30〜40℃、好ましくは約37℃で培養することができる。
【００２９】
多能性幹細胞を培養する工程において、培養期間の途中で培地交換を行うことができる。培地交換に用いられる培地は、培地交換前の培地と同じ成分を有する培地であっても、異なる成分を有する培地であってもよい。好ましくは、同じ成分を有する培地が用いられる。培地交換の時期は、特に限定されないが、新鮮な培地での培養を開始してから、例えば、1日毎、2日毎、3日毎、4日毎、5日毎に行われる。
【００３０】
本発明の製法（Ｉ）は、多能性幹細胞に、インテグリンβ1-β-カテニンシグナル伝達経路を活性化する処理を施すことを特徴とする。当該処理により、多能性幹細胞の中内胚葉系への分化抵抗性を解除することができる。
【００３１】
本明細書において「インテグリンβ1-β-カテニンシグナル伝達経路」とは、結合リガンドからの刺激を受けてインテグリンβ1（ITGB1）が、インテグリン結合キナーゼ（ILK）を活性化し、活性化ILKがグリコーゲン合成酵素キナーゼ3β（GSK3β）の9番目のSerをリン酸化してこれを不活性化し、それによってβ-カテニンのリン酸化が抑制されて細胞内にβ-カテニンが蓄積し、結果的にWnt/β-カテニンシグナル伝達経路が活性化され、その下流遺伝子の発現が誘導される経路を意味する。
【００３２】
ITGB1-β-カテニンシグナル伝達経路を活性化する処理としては、例えば、多能性幹細胞におけるITGB1の発現を上昇させる、及び／又はITGB1を活性化状態に変化させる処理等が挙げられる。そのような処理としては、好ましくは、多能性幹細胞に十分なITGB1の発現を付与し得る濃度のITGB1の結合リガンドを、当該多能性幹細胞に接触させることが挙げられるが、これに限定されない。ITGB1の結合リガンドとしては、ある特定の濃度範囲において、ITGB1-β-カテニンシグナル伝達経路を活性化するのに十分なITGB1の発現量を付与し得るものであれば、特に制限されないが、例えば、分化抵抗性を有する多能性幹細胞にラミニン511もしくはその断片を用いる場合、ラミニン511 E8断片換算で0.005〜0.25μg/cm2（推奨濃度0.5μg/cm2の1/100〜1/2）、好ましくは、0.025〜0.125μg/cm2（推奨濃度の1/20〜1/4）、より好ましくは、0.03〜0.07μg/cm2（推奨濃度の約1/16〜1/7）に相当する濃度で、多能性幹細胞と接触させることにより、多能性幹細胞の中内胚葉系への分化抵抗性を解除することができる。一方、本明細書における「分化抵抗性」を有しない多能性幹細胞の場合には、推奨濃度のラミニン511を好ましく用いることができる。
ラミニン511の断片は、インタクトなラミニン511と同等のITGB1への接着強度を有する限り特に制限はないが、少なくともE8断片の領域を含む断片であることが望ましい。
【００３３】
他のラミニン（例えばラミニン411、ラミニン311、ラミニン111及びそれらの断片）やラミニン以外のITGB1の結合リガンド（例えば、コラーゲン、フィブロネクチン、E-カドヘリン、ADAM等）については、対象の多能性幹細胞におけるITGB1の発現量を指標として、ITGB1-β-カテニンシグナル伝達経路を活性化するのに十分なITGB1の発現量を付与する濃度を適宜選択することができる。
【００３４】
ITGB1の結合リガンドと多能性幹細胞との接触は、多能性幹細胞を維持培養するために使用される前記培養器の表面に、該結合リガンドを細胞接着用基質としてコーティングし、該培養器上に多能性幹細胞を播種して、前記と同様に維持培養することにより行うことができる。例えば、ITGB1の結合リガンドとしてラミニン511もしくはその断片を使用して、分化抵抗性を有する多能性幹細胞に適用する場合、ラミニン511 E8断片換算で0.005〜0.25μg/cm2（推奨濃度0.5μg/cm2の1/100〜1/2）、好ましくは、0.025〜0.125μg/cm2（推奨濃度の1/20〜1/4）、より好ましくは、0.03〜0.07μg/cm2（推奨濃度の約1/16〜1/7）に相当する濃度となるように、ラミニン511もしくはその断片の溶液を培養器に添加し、一定時間静置することにより、培養器表面上にラミニン511もしくはその断片をコーティングすることができる。
【００３５】
ITGB1の結合リガンドと多能性幹細胞との接触時間は、ITGB1-β-カテニンシグナル伝達経路を活性化するのに十分であれば特に制限はないが、例えば2日以上、好ましくは3日以上である。ITGB1の結合リガンドとの接触によりITGB1-β-カテニンシグナル伝達経路を活性化する場合、接触の間、即ち、該リガンドを細胞接着用基質としてコーティングした培養器内での培養期間を通じて、多能性幹細胞集団において多能性を保持する細胞数は十分に維持されるので（Oct3/4及びSox2の両陽性の細胞が全体の90%、好ましくは95%以上）、接触時間に特に上限はない。
【００３６】
本発明の別の実施態様においては、ITGB1-β-カテニンシグナル伝達経路を活性化する処理として、例えば、ITGB1の発現促進剤（例、ヒバマタ、ローズマリー、キウイ、フクリョウ、ゴボウ、ニンジン又はコウソウの抽出液（特開平11-246428）等）、ITGB1の発現を抑制する物質（例、ZFYVE21、miR-29C、miR-124等）の発現・機能を阻害する物質（例、抗体、アンチセンス核酸、siRNA又はshRNA等）、ITGB1をコードする核酸などを、多能性幹細胞に接触させることが挙げられる。これらの処理は、上記の物質を多能性幹細胞の培地に添加することにより行うことができる。該物質が核酸の場合、該核酸の細胞内への導入を促進するための核酸導入試薬をさらに添加することが好ましい。
【００３７】
本発明の別の実施態様においては、ITGB1-β-カテニンシグナル伝達経路を活性化する処理として、多能性幹細胞におけるILKの発現を上昇させる、及び／又はILKを活性化状態に変化させる処理が挙げられる。そのような処理としては、例えば、ILKをコードする核酸、ILKの恒常的活性化体（例、ILKのN末端にミリストイル化シグナル配列を付加するか、C末端にCaaXモチーフを付加することにより、膜局在性の恒常的活性化体とすることができる）をコードする核酸を多能性幹細胞に導入することが挙げられる。
【００３８】
本発明のさらに別の実施態様においては、ITGB1-β-カテニンシグナル伝達経路を活性化する処理として、多能性幹細胞におけるGSK3β活性、特にβ-カテニンをリン酸化する活性を阻害することが挙げられる。GSK3βは、β-カテニンをリン酸化してユビキチンプロテアソーム系による恒常的分解を促すので、GSK3βを阻害することにより、細胞内β-カテニンが蓄積し、結果としてWnt/β-カテニンシグナル伝達経路が活性化される。
【００３９】
GSK3β活性を阻害する方法としては、例えば、多能性幹細胞を低分子GSK3β阻害剤に接触させる方法や、β-カテニンの標的リン酸化部位をミミックしたペプチドを多能性幹細胞に接触させる方法等が挙げられるが、低分子GSK3β阻害剤を用いる方法が好ましい。
【００４０】
本発明において、GSK-3β阻害剤は、GSK-3βタンパク質のキナーゼ活性（例、βカテニンに対するリン酸化能）を阻害する物質として定義され、既に多数のものが知られているが、例えば、GSK-3β阻害剤として最初に見出された塩化リチウム (LiCl)、インジルビン誘導体であるBIO（別名、GSK-3β阻害剤IX；6-ブロモインジルビン3'-オキシム）、マレイミド誘導体であるSB216763（3-(2,4-ジクロロフェニル)-4-(1-メチル-1H-インドール-3-イル)-1H-ピロール-2,5-ジオン）、フェニルαブロモメチルケトン化合物であるGSK-3β阻害剤VII（4-ジブロモアセトフェノン）、細胞膜透過型のリン酸化ペプチドであるL803-mts（別名、GSK-3βペプチド阻害剤；Myr-N-GKEAPPAPPQSpP-NH2）及び高い選択性を有するCHIR99021 (6-[2-[4-(2,4-Dichlorophenyl)-5-(4-methyl-1H-imidazol-2-yl)pyrimidin-2-ylamino]ethylamino]pyridine-3-carbonitrile) が挙げられる。これらの化合物は、例えばCalbiochem社やBiomol社等から市販されている。GSK-3β阻害剤は、好ましくは、CHIR99021であり得る。
【００４１】
多能性幹細胞とGSK3β阻害剤との接触は、GSK3β阻害剤を添加した培地中で多能性幹細胞を培養することにより行うことができる。培地に添加されるGSK3β阻害剤の濃度は薬剤の種類によって異なるが、例えば、CHIR99021の場合、例えば、1μM、2μM、3μM、4μM、5μM、6μM、7μM、8μM、9μM、10μM、15μM、20μM、25μM、30μM、35μM、40μM 、45μM、50μM等であるがこれらに限定されない。好ましくは、5μM以上（例えば、5μM〜50μM、好ましくは5μM〜10μM）である。
【００４２】
多能性幹細胞とGSK3β阻害剤との接触は、2〜5日間、好ましくは3〜4日間行うことができる。
【００４３】
（ＩＩ）多能性幹細胞の中内胚葉系への分化抵抗性を解除するための培養キット
本発明はまた、ITGB1-β-カテニンシグナル伝達経路を活性化する前記いずれかの物質を含有してなる、多能性幹細胞の中内胚葉系への分化抵抗性を解除するための試薬を提供する。好ましい一実施態様において、ITGB1-β-カテニンシグナル伝達経路を活性化する物質は、多能性幹細胞に十分なITGB1の発現量を付与し得る濃度のITGB1の結合リガンドである。当該結合リガンドは、好ましくは、それがコーティングされた培養器の形態で提供される。従って、本発明はまた、当該培養器を構成として含む、多能性幹細胞の中内胚葉系への分化抵抗性を解除するための培養キット（以下、「本発明のキット」ともいう）を提供する。
【００４４】
本発明のキットに含まれる結合リガンドがコーティングされた培養器として、例えば、結合リガンドがラミニン511もしくはその断片の場合、ラミニン511 E8断片換算で0.005〜0.25μg/cm2（推奨濃度0.5μg/cm2の1/100〜1/2）、好ましくは、0.025〜0.125μg/cm2（推奨濃度の1/20〜1/4）、より好ましくは、0.03〜0.07μg/cm2（推奨濃度の約1/16〜1/7）に相当するラミニン511もしくはその断片でコーティングされた培養器が挙げられる。培養器としては、多能性幹細胞の維持培養のための培養器として上記したものを、同様に用いることができる。
【００４５】
本発明のキットは、培地や培地添加物、継代や分化誘導培養へ細胞を移すための細胞の培養器からの剥離・細胞間接着の解離のための試薬などをさらに含むことができる。
【００４６】
（ＩＩＩ）中胚葉系又は内胚葉系の細胞への分化誘導法
本発明はまた、上記本発明の製法（Ｉ）で作製した中内胚葉系への分化抵抗性が解除された多能性幹細胞を、中胚葉系又は内胚葉系の細胞に分化誘導する工程を含む、中胚葉系又は内胚葉系の細胞の作製方法（以下、「本発明の製法（ＩＩ）」ともいう）を提供する。本発明の製法（Ｉ）で作製された多能性幹細胞は、中内胚葉系への分化抵抗性が解除されているので、効率よく中胚葉系又は内胚葉系の細胞へ分化誘導することができる。
【００４７】
本発明の製法（ＩＩ）により作製され得る中胚葉系の細胞は、多能性幹細胞からの分化誘導系が確立している限り、中胚葉系に属するいかなる細胞であってもよいが、例えば、血液細胞、血管内皮細胞、骨格筋細胞、軟骨細胞、腎細胞、心筋細胞、脂肪細胞などが挙げられる。ここで「血液細胞」とは、造血幹細胞から分化する血液中に含まれる任意の細胞を意味し、赤血球、血小板、好中球、好酸球、好塩基球、マクロファージ、NK細胞、樹状細胞、T細胞、B細胞、並びにそれらの前駆細胞等が包含される。
【００４８】
本発明の製法（ＩＩ）により作製され得る内胚葉系の細胞は、多能性幹細胞からの分化誘導系が確立している限り、内胚葉系に属するいかなる細胞であってもよいが、例えば、膵β細胞、肝細胞、腸管細胞、肺細胞、甲状腺細胞等の細胞又はそれらの前駆細胞などが挙げられる。
【００４９】
中胚葉系及び内胚葉系は、中内胚葉細胞を共通の前駆体とする。従って、中胚葉系又は内胚葉系の細胞への分化誘導工程の初期において、中内胚葉細胞への分化が誘導される。中内胚葉細胞への分化は、例えば、T、Foxa2、Gsc、Mixl1等の中内胚葉マーカーの発現を調べることにより確認することができる。
【００５０】
多能性幹細胞から上記のいずれかの中胚葉系細胞又は内胚葉系細胞への分化誘導法は、それぞれ当該技術分野において周知であり、例えば、中辻及び末盛編、「実験医学別冊  ES・iPS細胞実験スタンダード」（羊土社発行、2014年）に種々の中胚葉系細胞又は内胚葉細胞への分化誘導法が記載されており、当業者であれば、これらの成書を参照することにより、多能性幹細胞を各種中胚葉系細胞又は内胚葉系細胞へと分化誘導することができる。
【００５１】
本発明の製法（Ｉ）により得られる多能性幹細胞は、特に血液細胞への分化効率に優れている。従って、好ましい一実施態様においては、本発明の製法（ＩＩ）において作製される中胚葉系細胞は、血液細胞である。多能性幹細胞から造血前駆細胞への分化誘導法としては、例えば、マウス間質細胞であるC3H10TRとの共培養法であるPSC-Sac法が挙げられる (Takayama and Eto Methods Mol Biol. 2012;788:205-17, Takayama et al. J Exp Med. 2010 207(13): 2817-2830)。本法は必要なサイトカインが血管内皮増殖因子（VEGF）のみとシンプルであり、維持培養していた多能性幹細胞を基質から剥離してマイトマイシンC（MMC）処理したC3H 10T1/2細胞上へ播種すると、4日目には多能性幹細胞のフィーダー細胞への接着が認められ、14日目まで培養を続けると、多能性幹細胞からSac様の構造物が形成される。造血前駆細胞はこのSac用構造物の中に得られる。
【００５２】
上記のようにして得られる造血前駆細胞は、自体公知の方法により各種血液細胞にさらに分化させることができる。例えば、巨核球前駆細胞、さらに血小板への分化誘導法については、WO 2018/038242に詳述されている。
【００５３】
（ＩＶ）多能性幹細胞の中内胚葉系への分化抵抗性の評価方法
上述のように、多能性幹細胞において、ITGB1-β-カテニンシグナル伝達経路を活性化することにより、中内胚葉系への分化抵抗性を解除することができる。即ち、分化抵抗性が解除された多能性幹細胞では、ITGB1の発現が亢進している。従って、多能性幹細胞におけるITGB1の発現を指標として、該多能性幹細胞の中内胚葉系への分化抵抗性の程度を評価することができる。即ち、本発明はまた、多能性幹細胞におけるITGB1の発現量を測定することを含む、該多能性幹細胞の中内胚葉系への分化抵抗性の評価方法（以下、「本発明の評価方法」ともいう。）を提供する。
【００５４】
本発明の評価方法に供される多能性幹細胞は、中内胚葉系への分化抵抗性が不明なものである。ITGB1の発現量の測定は、例えば、被検多能性幹細胞を蛍光標識した抗ITGB1抗体に接触させ、ITGB1発現細胞を可視化した後、フローサイトメトリーや蛍光顕微鏡を用いた画像解析により行うことができる。得られたITGB1発現量を、対照発現量（例えば、分化抵抗性が解除されていることが既知の相当数の多能性幹細胞クローンにおけるITGB1発現量から設定したカットオフ値）と比較し、対照発現量以上である場合に、被検多能性幹細胞は中内胚葉系への分化抵抗性が解除されていると判定することができる。
【００５５】
別の実施態様において、多能性幹細胞として、ITGB1遺伝子のプロモーターの制御下にレポーター遺伝子（例、蛍光タンパク質遺伝子）を発現する細胞から誘導された多能性幹細胞を用い、該多能性幹細胞を、ITGB1-β-カテニンシグナル伝達経路を活性化するのに十分なITGB1の発現量を付与し得る濃度が未知の細胞接着用基質でコーティングした培養器内で維持培養し、上記の評価方法を実施することにより、ITGB1-β-カテニンシグナル伝達経路を活性化するのに十分なITGB1の発現量を付与し得る、該細胞接着用基質の濃度を決定することができる。従って、本発明はまた、そのようにして決定された濃度で、該細胞接着用基質を多能性幹細胞に接触させることを含む、中内胚葉細胞への分化抵抗性が解除された多能性幹細胞の作製方法を提供する。
【００５６】
以下に、実施例によって本発明を更に説明するが、本発明は以下の実施例になんら限定されるものではない。
【実施例】
【００５７】
（材料及び方法）
１．多能性幹細胞株
分化実験、イメージング、ウェスタンブロッティング、フローサイトメトリー、細胞内染色、細胞接着アッセイに用いたヒトiPS細胞株AK5 (Nakagawa et al., Scientific Reports, 4: 3954, 2014)は、京都大学iPS細胞研究所内で分与されたものである。また、実施例８で使用したヒトiPS細胞株692D2（Okita et al., Stem Cells, 31: 458-466 (2013)）は、京都大学iPS細胞研究所  沖田圭介博士より分与されたものであり、ヒトES細胞株KthES11Sは、京都大学ウイルス・再生医科学研究所  末盛博文博士より分与されたものである。【００５８】
２．多能性幹細胞（PSCs）の維持培養
２−１．マウス胎児線維芽細胞（MEF）フィーダー上での維持培養
マイトマイシンCにて処理を行ったMEFを播種した6cm dish上にて、既報に従ってPSCsの培養を行った (Takayama et al., Blood, 111(11): 5298-5306, 2008)。培地として、MEM non-essential amino acids, 0.1 mM 2-mercaptoethanol, 20% KnockOut（商標）Serum Replacement (Gibco/ Thermo Fisher, Waltham, MA, USA), 5 ng/mL basic fibroblast growth factor (bFGF; Wako, Osaka, Japan) を添加したDulbecco modified Eagle medium/Nutrient Mixture F-12 Ham (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) を使用した。【００５９】
２−２．ラミニン上での維持培養
既報に従って、各種ラミニンE8断片上にてフィーダーフリー条件下でPSCsを培養した(Nakagawa et al., Scientific Reports, 4: 3954, 2014)。使用した組換えラミニンE8断片のうち、LM511 E8はiMatrix-511/iMatrix-511 silk (Nippi, Ibaraki, Japan) を、その他のラミニンE8（LM421/121）断片は 関口清俊博士 (大阪大学 蛋白質研究所) にご提供いただいた。それぞれのラミニン断片を、dish底面積に対して 0.5 μg/cm2となるように添加した。尚、ラミニンの希釈実験では、Laminin 511E8 0.5 μg/cm2条件を[x1]として、[x1/2]、[x1/4]、[x1/8]、[x1/16]の条件で、上記と同様にコーティングを行った。
具体的には、組換えラミニンE8断片をPBS(-)に懸濁し、dish上へ添加、37℃にて1時間以上静置した。AK02N培地(Ajinomoto) を少量添加し馴化させ、ラミニン-PBS溶液を吸引除去した後、Y-27632を添加したAK02N培地へ置換した。これらのdishへPSCsを播種した。翌日以降も、細胞の様子を伺いながら適宜Y-27632を添加したAK02N培地で培地交換し、培養を継続した。【００６０】
３．細胞分化実験
PSCsから血球分化を行う方法としては、マウス間質細胞であるC3H10TRとの共培養法であるPSC-Sac法を用いた (Takayama and Eto Methods Mol Biol. 2012;788:205-17, Takaayama et al. J Exp Med. 2010 207(13): 2817-2830)。PSCsは同数を2 wellに分けて培養しておき、1つのwellに対してPBSで洗浄後、TrypLE（商標） Select (Thermo Fisher Scientific、Waltham、MA) で曝露した後、37℃で4分間静置し、細胞間接着が剥がれたことを確認の上でCell scraperでdishより細胞を剥離し、Trypan Blueと血球計算板で細胞数を計数した。
他方のwellをDispase I (Wako, Osaka, Japan) で曝露し、37℃で2分間静置した後、細胞をCell scraperで剥離し、培地で穏やかに懸濁した。マイトマイシンCにて処理後、ゼラチンコートを施した10cm dish上に播種し、37℃、5% CO2環境にて一晩静置したC3H10TR（Riken Bio-Resource Center, Tsukuba, Ibaraki, Japan）フィーダー細胞上に、PSCsを0.7-1x10^5の細胞数となるように播種し、分化誘導を開始した。Day0-7までは5% O2環境にて培養を行った。分化誘導開始時より造血細胞分化培地［IMDM media (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) with 15% fetal bovine serum (FBS), insulin/ transferrin/selenite solution (Gibco/Thermo Fisher, Waltham, MA, USA), Ascorbic acid, 1-thioglycerol (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA -Aldrich), 20ng/ml recombinant human VEGF (VEGF-A165; Wako, Osaka, Japan)］にて3-4日に一度培地交換を行い、14日目にdish上の細胞を回収し、Trypan Blueと血球計算板で細胞数を計数した。
CHIR99021 (ADOOQ Bioscience, Irvine, CA, USA) 添加実験は，ラミニン511 E8断片（LM511）上で培養維持されている分化予定のPSCsに対して、分化誘導開始4日前、3日前、2日前又は1日前から分化誘導開始時までの間、それぞれにCHIR99021 6nMを添加した。CHIR99021を添加していない群には、同日にDMSOを同量添加した。【００６１】
４．フローサイトメトリー（FCM）
細胞は、Trypan Blueと血球計算板を用いて細胞数を計数した。各サンプルは3％ FBSを含むPBS (Staining Medium) に懸濁し、各種抗体を添加して氷上暗所で30分間静置した後、FACS Verse (BD bioscience) にて測定を行った。hPSCsの測定については，TRA-1-60陽性細胞を計測した。抗体として、Brilliant Violet 421（商標） anti-human CD34 antibody(561), Pacific Blue（商標） Anti-human CD326 antibody (BioLegend, San Diego, CA, USA), APC conjugated CD43 monoclonal antibody(eBio84-3C1)(eBioscience/Thermo Fisher, Waltham, MA, USA), PE mouse anti-human CD29 antibody (BD, Bedford, MA, USA), Propidium Iodide (Sigma), Alexa Fluor（登録商標） 647 Mouse anti-Human TRA-1-60 Antigen (BD, Bedford, MA, USA)を用いた。【００６２】
５．イメージング
蛍光顕微鏡写真は、高速多光子共焦点レーザー顕微鏡システム (Nikon A1R system) によって得た。簡潔にいうと、各種ラミニン断片でコーティングを施したμ-Dish 35 mm (ibidi, GmbH, Martinsried, Germany) へiPS細胞を播種し、4日間培養した。コロニー形成が見られたところで、4% PFAで15分間固定し、洗浄した後、3% FBS含有PBSにて希釈したBB515 Mouse Anti-human CD29 (BD bioscience, Bedford, MA, USA)を添加し、30分間静置した。十分に洗浄した後、観察を行った。画像はNIS-Elements software (Nikon) にて解析した。【００６３】
６．ウェスタンブロッティング
ウェスタンブロッティングは以前に記載されているように行った (Eto et al., 2007; Nishikii et al., 2008, Nakamura et al., 2014)。 簡潔にいうと、Protease inhibitor cocktail（Roche、Basel、Switzerland）とphosphatase inhibitor cocktail (Nacalai tesque, Kyoto, Japan) を添加したTNE緩衝液（10mM Tris-HCl, pH 7.8, 150mM NaCl, 1％ NP-40及び1mM EDTA）で、同数の細胞を処理した細胞溶解物の試料15μlを、4-15％Mini-PROTEAN（登録商標） TGX Precast Gels（Bio-Rad Laboratories、Hercules、CA）上で電気泳動し、分離した。次いで、polyvinylidene difluoride membranes (GE Healthcare Life Sciences,Buckinghamshire,UK）に転写した。ILK1 (4G9), phospho-GSK3β(Ser9)(D85E12), β-catenin (D10A8)(CST, Chicago, USA), β-actin (AC-74)(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) にて一次抗体反応を行ない、anti-mouse IgG-HRP (GE Healthcare, Little Chalfont, UK) 及びAnti-rabbit IgG, HRP-linked Antibody (CST, Chicago, USA) を2次抗体として用いてSuperSignal（商標） West Pico Chemiluminescent Substrate（Thermo Fisher Scientific、Waltham、MA）にて可視化した。【００６４】
７．細胞内染色（ICS）及びフローサイトメトリー（FCM）解析
多能性マーカーであるSOX2とOCT3/4の検出のために、フローサイトメトリーによる細胞内染色を実施した。簡潔にいうと、Zombie（商標） Aqua Fixable Viability Kit (BioLegend, San Diego, CA, USA) にて死細胞染色を実施し、洗浄した後、PerFix-ncキットReagent1にて室温で15分静置し、細胞を固定した。続いて、氷冷した100% メタノールで5分間固定、0.5% サポニンを用いて室温で10分間インキュベートし透過処理を行った。PBS（3% FBS含有）にて洗浄懸濁した後、V450 Mouse anti-Sox2及びAlexa Fluor（登録商標） 488 conjugated Mouse anti-OCT3/4 (BD biosciences, Bedford, MA, USA) を添加し、氷上で30分間インキュベーションした。余剰抗体を洗浄ののち、FACSVerse（商標） (BD Biosciences) にて解析を行った。【００６５】
８．細胞接着アッセイ
Stem Cell Reports, Vol. 11. Issue 1, 142-156, 2018を参照し、一部改変して行った。48 well plateに対して、各種ラミニンを0.5 μg/cm2となるようにコーティングし、37℃で1時間以上静置した後、Y-27632を添加したAK02N培地 (Ajinomoto, Japan) へ置換した。継代培養していたヒトiPS細胞に対して、PBSで洗浄後、TrypLE（商標） Select (Thermo Fisher Scientific、Waltham、MA) に37℃で10分間曝露した。ピペッティングにてSingle cellとし、各Wellへ0.5x10^5ずつ播種し、37℃、5% CO2で1時間静置した。浮遊細胞をDMEM/F12 (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) にて2回洗浄、除去した。4% PFA (Wako, Osaka, Japan) を添加し、15分間静置して固定し、100%エタノールを添加して5分間静置した。メタノールに0.4% Crystal Violetを添加したもので置換し、室温で5分間静置した。脱塩水にて3回洗浄し、上清を除去した。1% SDS 250 μlにて洗浄し、上清をNanoDrop 2000c (Thermo Fisher Scientific、Waltham、MA) にて、595 nm波長を用い、光学密度を測定した．【００６６】
（結果）
参考例１  ラミニン511 E8断片（LM511）上で維持培養したPSCsは造血細胞への分化抵抗性を示す
MEF上で維持培養したPSCsを基質から剥離し、MMC処理したC3H10TR細胞上へ播種すると、4日目にはPSCsはフィーダー細胞への接着が認められ、さらに14日目まで培養を続けると、PSCsからSac様の構造物が形成された。造血前駆細胞はこのSac様構造物の中に得られた。一方、LM511で培養維持したPSCsを同様にC3H10TR細胞へ播種しても、該フィーダー細胞へはほとんど接着せず、14日目になってもSac様構造物はほとんど見られなかった。14日目に細胞を回収し、CD34+CD43+の造血前駆細胞を計数した結果、前記の観察を反映して、LM511で培養維持した多能性幹細胞からは、ほとんど造血前駆細胞が得られなかった（図１）。【００６７】
実施例１  Wntシグナル作動薬はLM511上で培養維持したPSCsの造血細胞分化抵抗性を解除する
本発明者らは以前、ラミニン511上で維持した多能性幹細胞は中内胚葉系への分化抵抗性を示すのに対し、ラミニン421やラミニン121上で維持した多能性幹細胞では、この分化抵抗性が解除され、中内胚葉系、特に血液細胞に分化しやすい傾向を示すこと、分化抵抗性が解除された多能性幹細胞では、Wnt/β-カテニンシグナル伝達経路の下流遺伝子群の発現が上昇していることを報告している（WO 2018/0378242）。そこで、造血前駆細胞を作ることができなかったLM511で培養維持した細胞に対して、 Wnt/β-カテニンシグナル伝達経路を刺激することによって、造血細胞への分化抵抗性が解除されるかを調べた。該シグナル伝達経路の中間メディエータであるGSK3βを、CHIR99021を用いて阻害することで、細胞内にβ-カテニンの蓄積を促した。GSK3β阻害剤で処理した細胞を用いて、PSC-sac法で分化誘導を行ったところ、LM511上で培養維持したPSCsによる造血細胞への分化誘導が改善され、造血前駆細胞数を増やすことができた（図２）。
これらの結果より、ラミニンによる細胞の足場は、PSCs内部における造血系分化への経路を、Wnt/β-カテニンシグナル伝達経路を介して調節していると考えられた。【００６８】
実施例２  造血細胞分化誘導能を有するラミニン上で培養維持したPSCsはインテグリンβ1を高発現する
LM511/LM421/LM121のそれぞれで培養維持されたPSCsにおけるインテグリンβ1（ITGB1）の発現レベルを調べた。ITGB1は、ラミニンのレセプターとして知られる細胞表面タンパク質で、PSCsにおいては細胞の生存と維持に重要であることが報告されている。FCMおよび蛍光顕微鏡を用いた観察において、造血の特徴を持つLM421とLM121で培養維持したPSCsは、非造血の特徴を持つLM511と比較してITGB1の発現が高かった（図３）。【００６９】
実施例３  造血細胞分化誘導能を有するラミニンはITGB1-β-カテニンシグナリングを活性化する
いくつかのがんに関する報告では、ITGB1がILK/pGSK3βを介してβ-カテニンの蓄積量を変化させ、Wnt/β-カテニンシグナル伝達経路を調節していると考えられている。そこで、ラミニンとPSCsの関係においても同様の経路が働いているかを確認するため、ウェスタンブロッティング解析を行った。その結果、MEFで維持したものはILK/pGSK3β/β-カテニンの量が最も多かった。また、LM421とLM121で培養維持したものは、LM511で培養維持したものよりもILK/pGSK3β/β-カテニンの量が多かった（図４）。これらの結果は、細胞表面のITGB1の量が増えることでITGB1以下のシグナルが強くなり、β-カテニンの細胞内蓄積量が増えて、結果的にWnt/β-カテニンシグナル伝達経路が賦活化されたことを示唆している。【００７０】
実施例４  LM511濃度とITGB1発現の関係
本発明者らは、PSCsの維持培養研究の過程で、LM421/LM121は、LM511に比べて細胞-基質間接着が弱い傾向があることに気づいていた。そこで、上記の結果がラミニンの種類によるものなのか、それともITGB1とラミニンの間の「接着の強さ」に依存したものなのかを確かめた。本実施例では、非造血性のラミニンであるLM511を段階希釈してコーティングしたプレートへPSCsを播種し、培養維持した。これは、LM511を希釈することで、ラミニンとしてのサブユニットを5-1-1のまま変えずに、接着の強さ（=インテグリン-ラミニン結合数）を調節したものである。その結果、FCMおよび蛍光顕微鏡による解析では、弱い細胞-基質間接着の条件ほどITGB1の発現が高く、ITGB1の発現量がラミニンサブユニットの種類ではなく、細胞-基質接着の量、つまり接着の強さに依存したものであることが示された（図５）。【００７１】
実施例５  希釈したLM511上で培養維持したPSCsは効率よく造血前駆細胞に誘導される
次に、段階希釈したLM511上で培養維持したPSCsをPSC-sac法で培養したところ、LM511の推奨濃度 (x1) で培養維持したPSCsから分化した造血前駆細胞数よりも、希釈したLM511で培養維持したPSCsから分化した造血前駆細胞数の方が多く、LM511（x1）で培養維持することで起きた血液細胞への分化抵抗性を解除することができた（図６）。また、ITGB1の発現量が高いPSCsの方が，血液細胞へ分化させた時の造血能が高かった（図６）。
以上の結果をまとめると、細胞外基質と細胞の弱い接着は，ITGB1の発現を誘導し，十分な量のITGB1が発現すると下流のシグナルが変化し、β-カテニンが蓄積してWnt/β-カテニンシグナル伝達経路が賦活化され、造血前駆細胞の分化が促進されると考えられる。【００７２】
実施例６  GSK3β阻害剤による調節はPSCsの多能性維持を妨げる
実施例１において、CHIR99021を添加することで、LM511で培養維持したPSCsの血液細胞への分化抵抗性を解除できたが、C3H10TRフィーダー細胞上へ播種して分化を開始する直前には、該PSCsではOCT3/4・SOX2両陽性の多能性が維持されている細胞数は減少していた。これに対し、LM511を段階希釈する方法を用いた場合や、LM421/121などのその他のラミニンを用いて維持した場合は、OCT3/4・SOX2両陽性の多能性が維持されている細胞の割合が高く、「多能性の維持」と「分化抵抗性の解除」を両立することができた（図７）。【００７３】
実施例７  各種ラミニンの細胞−基質間接着強度
造血性のLM421及びLM121と、非造血性のLM511とで、細胞-基質間接着強度を比較した。その結果、造血性のLM421やLM121は、非造血性のLM511に比べて、細胞-基質間接着が弱いことが確認された（図８）。【００７４】
実施例８  分化抵抗性を解除し得るラミニン511濃度は多能性幹細胞クローンごとに異なる
ヒトiPS細胞株AK5（hPSC1）、ヒトiPS細胞株692D2（hPSC2）及びヒトES細胞株KthES11（hPSC3）について、実施例４及び５と同様にして、LM511濃度とITGB1発現の関係、並びにLM511濃度と造血前駆細胞への分化能の関係について調べた。その結果、hPSC1では、推奨濃度 (x1) のLM511で維持培養するよりも、希釈したLM511で維持培養する方が、ITGB1の発現量が高く、造血前駆細胞への分化効率が増すのに対し、hPSC2では、推奨濃度（x1）のLM511上で維持培養した場合でも十分なITGB1発現量を示し、造血前駆細胞への分化抵抗性は認められなかった。また、LM511を段階希釈してもITGB1発現量に大きな変化はなく、造血前駆細胞への分化効率は、推奨濃度か2倍濃度でむしろ高いことがわかった（図９Ａ及びＢ）。hPSC3はLM511の推奨濃度でほとんど造血前駆細胞へ分化せず、高い分化抵抗性を示したが、LM511を段階希釈して用いることにより、ある程度の造血前駆細胞への分化能が得られた（図９Ａ及びＢ）。PSCsのITGB1相対発現量と造血前駆細胞への分化効率との間には、正の相関が認められた（図９Ｃ）。
以上の結果から、ITGB1の発現量を指標として多能性幹細胞クローンの中内胚葉系への易分化性を評価することができ、推奨濃度のLM511で分化抵抗性を有すると判定された多能性幹細胞に対しては、LM511を推奨濃度よりも低濃度に希釈して用いることで、当該分化抵抗性を解除することができることが示された。
【産業上の利用可能性】
【００７５】
本発明によれば、ラミニン511又はその断片を推奨濃度より低濃度に希釈して用いることで、多能性幹細胞の中内胚葉系への分化抵抗性を解除することができるので、維持培養のコスト削減と効率的な分化誘導とを同時に達成することができ、中内胚葉系の細胞の製造において、きわめて有用である。【００７６】
本出願は、2018年10月31日付で日本国に出願された特願2018-205912を基礎としており、ここで言及することにより、その内容はすべて本明細書に包含されるものである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【国際調査報告】
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