(57)【要約】  本発明は細胞小器官の動態に影響を与える薬剤について、実験動物を用いて細胞小器官の蛍光撮影を行うことで、当該薬剤を評価する方法に関し、蛍光タンパク質融合細胞小器官結合タンパク質を発現する細胞を移植した病変部を有する実験動物に、細胞小器官の動態に影響を与える薬剤を投与し、さらに実験動物の病変部から採取した組織切片から検体を作製する検体作製工程、検体の蛍光画像の取得を行う蛍光撮影工程、および蛍光画像から蛍光輝点に基づく情報を取得する情報取得工程を含む薬剤評価方法である。
2019221062.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
病変部を有する実験動物を用いた薬剤評価方法であって、
前記病変部が、
蛍光タンパク質と、
細胞小器官に結合するタンパク質である細胞小器官結合タンパク質とが融合したタンパク質である、蛍光タンパク質融合細胞小器官結合タンパク質を発現する細胞を移植した部分であって、
前記実験動物に細胞小器官の動態に影響を与える薬剤を投与する工程を有し、
さらに以下の工程（ａ）〜（ｃ）を含む薬剤評価方法。
（ａ）前記実験動物の病変部から採取した組織切片から検体を作製する、検体作製工程。
（ｂ）前記検体の蛍光画像の取得を行う、蛍光撮影工程。
（ｃ）前記撮影工程において取得した画像から、蛍光輝点に基づく情報を取得する、情報取得工程。
【請求項２】
前記蛍光輝点に基づく情報が、前記蛍光タンパク質の輝点数、前記蛍光タンパク質の輝点の移動距離、移動速度、および移動の直線性、ならびに前記蛍光タンパク質の輝点の分布、および密度から選ばれる１以上の指標を含む、請求項１に記載の薬剤評価方法。
【請求項３】
前記細胞小器官の動態に影響を与える薬剤が蛍光標識化薬剤である、請求項１または２に記載の薬剤評価方法。
【請求項４】
前記蛍光輝点に基づく情報が、蛍光標識化薬剤の輝点数を含む、請求項３に記載の薬剤評価方法。
【請求項５】
前記工程（ａ）の後であって前記工程（ｂ）の前に、さらに以下の工程（α）を含む、請求項１または２に記載の薬剤評価方法。
（α）前記検体に対して、蛍光物質を用いて蛍光染色を行う、蛍光染色工程
【請求項６】
前記蛍光輝点に基づく情報が、前記蛍光物質の輝点数を含む、請求項５に記載の薬剤評価方法。
【請求項７】
前記蛍光タンパク質融合細胞小器官結合タンパク質が、蛍光タンパク質融合微小管結合タンパク質である、請求項１〜６のいずれか一項に記載の薬剤評価方法。
【請求項８】
前記蛍光染色が、前記細胞小器官の動態に影響を与える薬剤に対する蛍光染色である、請求項５〜７のいずれか一項に記載の薬剤評価方法。
【請求項９】
前記細胞小器官の動態に影響を与える薬剤が微小管の動態に影響を与える薬剤である、請求項１〜８のいずれか一項に記載の薬剤評価方法。
【請求項１０】
前記細胞小器官の動態に影響を与える薬剤が微小管の重合に影響を与える薬剤である、請求項１〜９のいずれか一項に記載の薬剤評価方法。
【請求項１１】
前記細胞小器官の動態に影響を与える薬剤が微小管重合阻害剤である、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の薬剤評価方法。
【請求項１２】
前記病変部が腫瘍部である、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の薬剤評価方法。
【請求項１３】
前記実験動物がマウスである、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の薬剤評価方法。
【請求項１４】
前記蛍光タンパク質の蛍光波長と前記蛍光物質の蛍光波長とがそれぞれ異なっている、請求項５〜１３のいずれか一項に記載の薬剤評価方法。
【請求項１５】
前記蛍光物質が蛍光体集積ナノ粒子である、請求項５〜１４のいずれか一項に記載の薬剤評価方法。
【請求項１６】
前記蛍光タンパク質がＧＦＰである、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の薬剤評価方法。
【請求項１７】
蛍光撮影装置と、情報処理装置とを備える薬剤の評価システムであって、
前記蛍光撮影装置が蛍光画像の撮影を行う装置であって、
前記情報処理装置が、
前記蛍光撮影装置により取得された蛍光画像を受け取り、
受け取った蛍光画像から蛍光輝点に基づく情報を取得し、
前記蛍光輝点に基づく情報を解析する装置である、
請求項１〜１６のいずれか一項に記載の薬剤評価方法を行うための、薬剤の評価システム。
【請求項１８】
前記蛍光輝点に基づく情報を表示する表示装置をさらに備える、請求項１７に記載の薬剤の評価システム。
【請求項１９】
前記情報処理装置が、前記蛍光輝点に基づく情報を蓄積する情報蓄積部を含む、請求項１７または１８に記載の薬剤の評価システム。
【請求項２０】
請求項１〜１６のいずれか一項に記載の薬剤評価方法をコンピュータにより実行させるためのプログラム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、薬剤評価方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
がんは、心筋梗塞や脳梗塞に代表される血管系疾患とともに成人の死亡原因を二分する疾患である。例えば、日本における乳がん罹患率は、欧米諸国に比べて低いものの、近年では年々増加する傾向にあり、１９９８年には胃がんの罹患率を抜いて女性のがん罹患率の第１位となった。最近の報告である２００５年の厚生労働省統計によれば、乳がんの年間患者数は５万人を超えている。世界でも同様に乳がん患者数数は年々増加しており、２００８年のＷＨＯの報告によれば、乳がんはがんの中でも罹患率が第１位であり、その年間罹患者数は１３８万人を超え、女性のがん全体の約２３％を占めている。【０００３】
細胞小器官は細胞内で様々な機能を果たす構造物であり、そのうちの１つである微小管は、真核生物の細胞内に存在する線維状の細胞骨格である。微小管は、α−チューブリンとβ−チューブリンと呼ばれる２種のタンパク質からなり、各１分子ずつが結合したヘテロ２量体がその基本単位である。微小管はこのヘテロ２量体の付加（重合）により伸長し、解離により短縮する。微小管の伸長と短縮は、微小管のダイナミクスとも呼ばれ、他の様々な細胞内小器官や細胞膜タンパク質の輸送等に重要な機能を持つと同時に、細胞分裂（有糸分裂）や細胞極性の制御に関与することが知られている。微小管の動態に影響する物質は、微小管の構造や制御に障害を与えることにより細胞増殖、細胞運動を抑制することができることから、抗がん剤として広く使用されている。そのような薬剤としては例えば、微小管の重合を抑制する作用を有するコルヒチンやビンカアルカロイド系の抗がん剤（ビンクリスチンなど）、微小管の脱重合を阻害する作用を有するタキサン系の抗がん剤（ドセタキセル、パクリタキセル）等が知られている。【０００４】
抗がん剤の開発においては、培養細胞を用いてスクリーニングした候補薬剤を実験動物に直接投与することで、候補薬剤の薬効を評価する方法が広く用いられている。例えば、腫瘍細胞を移植したマウスである担がんモデルマウスに候補薬剤を投与して、所定の時間が経過した後に、腫瘍の大きさを測定することで候補薬剤の薬効を評価するという方法がある。特許文献１では細胞実験で微小管阻害作用が示された薬物を乳がん細胞を移植したモデルマウスに投与し、薬物投与前後における腫瘍体積の変化を測定している。【０００５】
また、特許文献２には遺伝子操作により作製された蛍光タンパクに融合した微小管結合タンパク質であるＣＬＩＰ−１７０を発現する細胞を用いて、微小管伸長抑制剤であるポリペプチドの作用をイメージングする手法が記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特表２０１２−５００１８０号公報
【特許文献２】特開２０１１−０１６７３０号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
しかしながら、特許文献１に開示された方法では、マウスの腫瘍体積の変化を測定することにより薬剤の評価を行っており、当該薬剤の微小管阻害作用を直接評価してはいない。したがって当該文献の方法では、マウスの体内においても当該薬剤が細胞実験において示したものと同じメカニズムによって、つまり微小管阻害作用によってマウスの腫瘍体積を抑制しているかどうかは明らかではない。【０００８】
また、特許文献２に記載の手法ではポリペプチドによる微小管伸長の抑制作用を直接評価してはいるが、当該評価はマウスではなく培養細胞を用いて行うものであり、より生理的な環境下であるマウスの生体内で同様の評価が行えるかどうかは明らかではない。【０００９】
本発明は、細胞小器官の動態に影響を与える薬剤および実験動物を用いて、当該薬剤を評価する方法に関する。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、実験動物の病変部から採取した組織切片から検体を作製し、蛍光撮影を行い、細胞小器官の動態を観察することで、細胞小器官の動態に影響を与える薬剤の効果を評価できることを見出した。【００１１】
すなわち、本発明は次のような解析方法を提供する。
［１］
病変部を有する実験動物を用いた薬剤評価方法であって、
前記病変部が、
蛍光タンパク質と、
細胞小器官に結合するタンパク質である細胞小器官結合タンパク質とが融合したタンパク質である、蛍光タンパク質融合細胞小器官結合タンパク質を発現する細胞を移植した部分であって、
前記実験動物に細胞小器官の動態に影響を与える薬剤を投与する工程を有し、
さらに以下の工程（ａ）〜（ｃ）を含む薬剤評価方法。【００１２】
（ａ）前記実験動物の病変部から採取した組織切片から検体を作製する、検体作製工程。
（ｂ）前記検体の蛍光画像の取得を行う、蛍光撮影工程。
（ｃ）前記撮影工程において取得した画像から、蛍光輝点に基づく情報を取得する、情報取得工程。
［２］
前記蛍光輝点に基づく情報が、前記蛍光タンパク質の輝点数、前記蛍光タンパク質の輝点の移動距離、および移動速度、移動の直線性、ならびに前記蛍光タンパク質の輝点の分布、および密度から選ばれる１以上を含む、［１］に記載の薬剤評価方法。
［３］
前記細胞小器官の動態に影響を与える薬剤が蛍光標識化薬剤である、［１］または［２］に記載の薬剤評価方法。
［４］
前記蛍光輝点に基づく情報が、蛍光標識化薬剤の輝点数を含む、［３］に記載の薬剤評価方法。【００１３】
［５］
前記工程（ａ）の後であって前記工程（ｂ）の前に、さらに以下の工程（α）を含む、［１］または［２］に記載の薬剤評価方法。
（α）前記検体に対して、蛍光物質を用いて蛍光染色を行う、蛍光染色工程
［６］
前記蛍光輝点に基づく情報が、前記蛍光物質の輝点数を含む、［５］に記載の薬剤評価方法。
［７］
前記蛍光タンパク質融合細胞小器官結合タンパク質が、蛍光タンパク質融合微小管結合タンパク質である、［１］〜［６］のいずれか一項に記載の薬剤評価方法。
［８］
前記蛍光染色が、前記細胞小器官の動態に影響を与える薬剤に対する蛍光染色である、［５］〜［７］のいずれか一項に記載の薬剤評価方法。【００１４】
［９］
前記細胞小器官の動態に影響を与える薬剤が微小管の動態に影響を与える薬剤である、［１］〜［８］のいずれか一項に記載の薬剤評価方法。
［１０］
前記細胞小器官の動態に影響を与える薬剤が微小管の重合に影響を与える薬剤である、［１］〜［９］のいずれか一項に記載の薬剤評価方法。
［１１］
前記細胞小器官の動態に影響を与える薬剤が微小管重合阻害剤である、［１］〜［１０］のいずれか一項に記載の薬剤評価方法。
［１２］
前記病変部が腫瘍部である、［１］〜［１１］のいずれか一項に記載の薬剤評価方法。【００１５】
［１３］
前記実験動物がマウスである、［１］〜［１２］のいずれか一項に記載の薬剤評価方法。
［１４］
前記蛍光タンパク質の蛍光波長と前記蛍光物質の蛍光波長とがそれぞれ異なっている、［５］〜［１３］のいずれか一項に記載の薬剤評価方法。
［１５］
前記蛍光物質が蛍光体集積ナノ粒子である、［５］〜［１４］のいずれか一項に記載の薬剤評価方法。
［１６］
前記蛍光タンパク質がＧＦＰである、［１］〜［１５］のいずれか一項に記載の薬剤評価方法。【００１６】
［１７］
蛍光撮影装置と、情報処理装置とを備える薬剤の評価システムであって、
前記蛍光撮影装置が蛍光画像の撮影を行う装置であって、
前記情報処理装置が、
前記蛍光撮影装置により取得された蛍光画像を受け取り、
受け取った蛍光画像から蛍光輝点に基づく情報を取得し、
前記蛍光輝点に基づく情報を解析する装置である、
［１］〜［１６］のいずれか一項に記載の薬剤評価方法を行うための、薬剤の評価システム。
［１８］
前記蛍光輝点に基づく情報を表示する表示装置をさらに備える、［１７］に記載の薬剤の評価システム。
［１９］
前記情報処理装置が、前記蛍光輝点に基づく情報を蓄積する情報蓄積部を含む、［１７］または［１８］に記載の薬剤の評価システム。
［２０］
［１］〜［１６］のいずれか一項に記載の薬剤評価方法をコンピュータにより実行させるためのプログラム。
【発明の効果】
【００１７】
本発明の評価方法によれば、実験動物の病変部から採取した組織切片から作製した検体について蛍光撮影を行い、細胞小器官の動態を観察することで、実験動物の病変部の細胞における当該薬剤の影響の評価を行うことが可能になる。また、本発明において作製する検体は、細胞が生きたままの状態であるため、細胞小器官の移動距離等、より詳細な情報を取得することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】図１は本発明の薬剤評価方法におけるフローチャートである。
【図２】図２は本発明の一実施形態であるシステムの模式図である。
【図３】図３は本発明の一実施形態であるシステムを用いて、薬剤評価方法を行った場合におけるフローチャートである。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
本発明は、蛍光タンパク質融合細胞小器官結合タンパク質を発現する細胞を移植した実験動物を用いて蛍光撮影を行うことで、細胞小器官の動態に影響を与える薬剤の効果を評価する方法を含む。
【００２０】
＜薬剤評価方法＞
本発明の評価方法は、蛍光タンパク質と細胞小器官に結合するタンパク質（細胞小器官結合タンパク質）とが融合したタンパク質である、蛍光タンパク質融合細胞小器官結合タンパク質を発現する細胞を、移植した病変部を有する実験動物に細胞小器官の動態に影響を与える薬剤を投与する工程および、工程（ａ）検体作製工程、工程（ｂ）蛍光撮影工程、および工程（ｃ）情報取得工程を含み、前記情報取得工程で取得された情報に基づいて薬剤の評価を行う方法である。
【００２１】
（実験動物）
本発明における実験動物は、病変部を有する実験動物であって、前記病変部は後述する蛍光タンパク質融合細胞小器官結合タンパク質を発現する細胞を移植した部位である。前記病変部は特に限定されないが、腫瘍部であることが好ましく、この場合実験動物は担がん動物となる。蛍光タンパク質融合細胞小器官結合タンパク質を発現する細胞を移植する方法は特に限定されないが、例えば該細胞を懸濁した溶液を皮下注射することで移植することができる。
【００２２】
前記実験動物は、目的に応じて選択することが好ましく、例えば、マウス、ラット、ウサギ、モルモット、スナネズミ、ハムスター、フェレット、イヌ、ミニブタ、サル、ウシ、ウマ、ヒツジなど、ある程度の遺伝学的な制御がなされており、均質な遺伝的要件を備えている動物が挙げられる。実験系が確立しており、また飼育が容易であるという観点から、マウスが好適に用いられる。また、本発明においては蛍光タンパク質融合細胞小器官結合タンパク質を発現する細胞を移植するという理由から、免疫不全マウスであることが好ましい。
（蛍光タンパク質融合細胞小器官結合タンパク質）
本発明の蛍光タンパク質融合細胞小器官結合タンパク質は、蛍光タンパク質と細胞小器官に結合するタンパク質とが融合したタンパク質である。
【００２３】
蛍光タンパク質融合細胞小器官結合タンパク質の構成は選択される蛍光タンパク質および細胞小器官結合タンパク質にしたがって最適なものを選択すればよく、例えば、蛍光タンパク質としてＧＦＰを、細胞小器官結合タンパク質としてＥＢ１を選択する場合には、局在や機能における影響の側面から、ＥＢ１のＣ末端側にＧＦＰが融合した構造をとることが好ましい。
【００２４】
（細胞小器官結合タンパク質）
前記細胞小器官結合タンパク質は、細胞小器官と結合する性質を持つタンパク質であれば特に限定されない。例えば細胞小器官として微小管を選択する場合、細胞小器官結合タンパク質は微小管の伸長端を認識して結合するタンパク質が好ましく、具体的には例えば、ＥＢ３(end binding protein 3)、ＣＬＩＰ１７０（cytoplasmic linker protein 170）、ＡＰＣ（adenomatous polyposis coli）、ＳＴＩＭ１（stromal interaction molecule 1）、ＥＢ１(end binding protein 1)が挙げられ、特にＥＢ１が好ましい。
【００２５】
（蛍光タンパク質）
前記蛍光タンパク質は、他のタンパク質と融合させて発現させることができる蛍光タンパク質であれば特に限定されず、例えばＧＦＰ、ＲＦＰ、ＹＦＰ等が挙げられ、特にＧＦＰであることが好ましい。本明細書における蛍光タンパク質は、所定の波長の電磁波（Ｘ線、紫外線または可視光線）が照射されるとそのエネルギーを吸収することで電子が励起し、その励起状態から基底状態に戻る際に余剰のエネルギーを、「蛍光」として放出（発光）するタンパク質である。また、「蛍光」は広義的な意味を持ち、励起のための電磁波の照射を止めても発光が持続する発光寿命が比較的長い燐光と、発光寿命が比較的短いいわゆる狭義の蛍光とを包含する。
【００２６】
（細胞）
前記蛍光タンパク質融合細胞小器官結合タンパク質を発現させる細胞は、特に限定されないが、病変組織由来の培養細胞であることが好ましく、腫瘍組織由来の培養細胞であることがより好ましい。また、細胞に発現させる蛍光タンパク質融合細胞小器官結合タンパク質は１種類でもよいし、複数の種類でもよい。複数の種類の蛍光タンパク質融合細胞小器官結合タンパク質を細胞に発現させる場合にはそれぞれの蛍光タンパク質融合細胞小器官結合タンパク質を構成する蛍光タンパク質は互いに異なった蛍光波長の蛍光を発する蛍光タンパク質を選択することが好ましい。この場合、蛍光タンパク質融合細胞小器官結合タンパク質を構成する細胞小器官結合タンパク質が結合する細胞小器官は、それぞれ同じものでもよいし、異なっていてもよい。
【００２７】
前記蛍光タンパク質融合細胞小器官結合タンパク質を細胞に発現させる方法は、蛍光タンパク質融合細胞小器官結合タンパク質をコードする遺伝子を細胞に導入することにより行われる。遺伝子導入の方法は公知の手法を用いることができ、例えば所望の遺伝子を有するウイルスベクターにより作製したウイルス粒子により遺伝子導入を行ってもよいし、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（登録商標）等のトランスフェクション用試薬を用いて化学的に遺伝子導入を行ってもよいし、エレクトロポレーション等の物理的な方法で行ってもよい。
【００２８】
＜薬剤を投与する工程＞
本発明の薬剤を投与する工程は、前記実験動物に、細胞小器官の動態に影響を与える薬剤を投与する工程である。薬剤の投与形態、投与経路、投与期間や投与回数などは、特に制限はなく、薬剤を投与する工程は、一回でもよく、複数回でもよい。
【００２９】
前記細胞小器官の動態に影響を与える薬剤は特に限定されないが、微小管の動態に影響を与える薬剤であることが好ましく、微小管の重合に影響を与える薬剤であることがより好ましく、特に微小管重合阻害薬であることがさらにより好ましく、具体的には例えばパクリタキセル（商品名パクリタキセル、日本化薬株式会社）、トラスツズマブ−エムタンシン（商品名カドサイラ、中外製薬株式会社）、ブレンツキシマブ ベドチン（商品名アドセトリス、武田薬品株式会社）、エリブリン（商品名ハラヴェン、エーザイ株式会社）等が挙げられる。
【００３０】
薬剤の量は特に限定されず、薬剤の種類や実験動物の体重や年齢、病変部の大きさ（体積）などによって、適切な量を投与すればよい。
【００３１】
本発明の一実施形態においては、前記薬剤が蛍光物質で標識された蛍光標識化薬剤であることが好ましい。前記蛍光物質は、有機蛍光色素、量子ドット、後述する蛍光体集積ナノ粒子等、後述する蛍光染色において用いられる蛍光物質と同様の一群から好適なものを選択することができるが、前記蛍光タンパク質融合細胞小器官結合タンパク質を構成する蛍光タンパク質が発する蛍光とは異なる波長の蛍光を発する蛍光物質を選択することが好ましい。
【００３２】
前記薬剤を蛍光物質で標識する方法は特に限定されないが、例えば薬剤および蛍光物質の有するアミノ基や水酸基等の官能基を介して両者を共有結合する方法等が挙げられ、例えば市販されている蛍光標識試薬（キット）を利用して薬剤を蛍光標識することができる。
【００３３】
＜検体作製工程＞
本発明における検体作製工程においては、前記実験動物の病変部から採取した組織切片から検体を作製する。
【００３４】
薬剤投与後に実験動物を堵殺し、腫瘍部を摘出する。摘出した腫瘍組織を加熱したゲルに浸漬し、冷却して固化させた腫瘍組織をメスで薄切したものを検体とする。
【００３５】
前記ゲルは溶融温度が室温より高く、室温程度でゲル化するものであれば特に限定されず、例えばPrimeGel（登録商標） Agarose等のアガロースゲルや低融点アクリルアミド等を用いることができる。前記溶融温度は６０℃〜１００℃であることが好ましく、６５℃〜９５℃であることがさらに好ましく、６５℃〜９０℃であることがよりさらに好ましい。前記固化温度は１０℃〜５０℃であることが好ましく、２０℃〜４０℃であることがさらに好ましい。
【００３６】
ゲルの濃度はゲルの種類、気温等の環境条件等によって適宜変更することができ、例えばアガロースゲルを使用する場合には１％〜２％であることが好ましい。
【００３７】
＜蛍光撮影工程＞
本発明における蛍光撮影工程では、蛍光タンパク質融合細胞小器官結合タンパク質を構成している蛍光タンパク質に対応した励起光を検体に照射することで蛍光タンパク質から発せられる蛍光を、蛍光画像として取得する工程である。これらの励起光の照射は、例えば、蛍光顕微鏡が備えるレーザー光源と、必要に応じて所定の波長を選択的に透過させる励起光用光学フィルターを用いて行うことができる。複数の種類の蛍光タンパク質融合細胞小器官結合タンパク質を発現させた細胞を移植した病変部から採取した組織切片から検体を作製した場合は、それぞれの蛍光タンパク質に対応した励起光を、順次標本サンプルに照射することで、それぞれの蛍光タンパク質から発せられる蛍光を蛍光画像として取得することもできる。
【００３８】
また、前記薬剤を投与する工程において蛍光標識した薬剤を用いる場合には、薬剤を標識した蛍光物質に対応した励起光と、蛍光タンパク質融合細胞小器官結合タンパク質を構成している蛍光タンパク質に対応した励起光とを、順次標本サンプルに照射することで蛍光タンパク質および蛍光物質から発せられる蛍光を、それぞれ蛍光画像として取得することもできる。
【００３９】
また、後述する蛍光染色工程を行う場合には、蛍光タンパク質に対応した励起光と、蛍光染色に用いる蛍光物質に対応した励起光とを、順次標本サンプルに照射することで蛍光タンパク質および蛍光物質から発せられる蛍光を、それぞれ蛍光画像として取得することもできる。
【００４０】
上述した蛍光タンパク質の蛍光画像および蛍光物質の蛍光画像の取得順序は特に限定されず、本明細書においては最も先に行われるものを第１の蛍光撮影工程、次に行われるものを第２の蛍光撮影工程、Ｎ回目に行われるものを第Ｎの蛍光撮影工程と呼ぶこともある。
【００４１】
蛍光画像は、例えば、蛍光顕微鏡が備えるデジタルカメラによって撮影することによって取得することができる。蛍光画像は静止画であってもよいし、動画であってもよい。またタイムラプス撮影を行い、継時的に複数の蛍光画像を取得することもできる。タイムラプス撮影した画像は公知のソフトを用いて動画に変換してもよい。
【００４２】
＜可視光撮影工程＞
本発明の薬剤評価方法においては、前記蛍光撮影工程の前または後に可視光下で撮影を行って画像を取得する、可視光撮影工程を行ってもよい。
【００４３】
＜情報取得工程＞
本発明の情報取得工程においては、前記蛍光撮影工程において取得した画像について、蛍光輝点に基づく情報を取得する。
【００４４】
前記蛍光輝点に基づく情報は、前記蛍光タンパク質融合細胞小器官タンパク質を構成する蛍光タンパク質が発光する蛍光に由来していることが好ましい。また、後述する蛍光染色工程を行う場合においては、さらに、蛍光染色に用いる蛍光物質が発光する蛍光に由来している情報、例えば蛍光物質の輝点数やその局在などが含まれていてもよい。
【００４５】
蛍光輝点に基づく情報を取得する際には、任意の方法で画像処理を行ってもよい。例えば、第１の蛍光撮影工程〜第Ｎの蛍光撮影工程において取得した画像を重ねあわせる画像処理を行うと、撮影された細胞の細胞小器官や薬剤等の相互的な位置関係を観察することができる。さらに「Ｉｍａｒｉｓ」（カールツァイス社製）や「ＩｍａｇｅＪ」（オープンソース）のような画像処理ソフトウェアを利用して画像処理を行うことで、蛍光画像から、所定の波長（色）の輝点を抽出してその輝度の総和を算出したり、所定の輝度以上である輝点数を計測したり、また輝点の移動距離を測定する等の処理を半自動的に、迅速に行うことで、所望の蛍光輝点に基づく情報を取得することができる。
【００４６】
前記蛍光輝点に基づく情報は、特に限定されないが、蛍光タンパク質の輝点数、蛍光タンパク質の輝点の移動距離、移動速度、移動の直線性、ならびに蛍光タンパク質の輝点の分布および密度から選ばれる１以上の指標を含むことが好ましく、２以上の指標を含むことがより好ましい。なお、移動の直線性は「輝点の始点と終点の直線距離」÷「輝点の移動距離」で数値化して求めることができ、値が１に近いほど直線性が高い。また、前述した薬剤を投与する工程において実験動物に投与される細胞小器官の動態に影響を与える薬剤が蛍光標識化薬剤である時には、薬剤を標識している蛍光物質に由来する輝点数をさらに含むことが好ましい。また、後述する蛍光染色を行う場合は蛍光物質の輝点数をさらに含むことが好ましい。
【００４７】
本発明の薬剤評価方法においては、情報取得工程において取得した情報に基づいて薬剤の評価を行うことができる。例えば、任意の情報について設定した一定の閾値によって、検体を分類することで行うことができ、輝点数の変化率について、５０％以上を効果が高い（Ｒａｎｋ  Ａ）と判定し、３０％以上５０％未満を効果は中程度（Ｒａｎｋ  Ｂ）と判定し、それ以外の場合は効果が低い（Ｒａｎｋ  Ｃ）と判定することができる。また蛍光輝点に基づく情報を含む複数の情報を参酌することで、複合的に判断することでより正確な薬剤評価が可能になる。
【００４８】
また、情報取得工程において取得した情報が薬剤評価に不足していた場合は、任意で再度蛍光撮影工程を行ってもよい。この場合においては蛍光強度や視野等を変更することで、より適切な画像を撮影することができる。
【００４９】
＜蛍光染色工程＞
本発明の一実施形態においては、前記検体作製工程の後、蛍光観察する前の検体に対して、蛍光物質を用いた蛍光染色を行ってもよい。前記蛍光染色の対象は、特に限定されないが、本発明の評価対象である実験動物に投与された細胞小器官の動態に影響を与える薬剤であることが好ましい。蛍光染色の方法は、特に限定されないが、蛍光物質で標識した抗体を用いて行う蛍光免疫染色であることが好ましい。例えば実験動物に投与された細胞小器官の動態に影響を与える薬剤に対して蛍光染色を行う場合は、前記蛍光物質で標識した抗体は、［抗薬剤抗体］〜［蛍光物質］の構成をとり、ここで、"〜"が示す結合の態様としては特に限定されず、例えば、共有結合、イオン結合、水素結合、配位結合、物理吸着または化学吸着等が挙げられ、必要に応じてリンカー分子を介していてもよい。
【００５０】
［抗薬剤抗体］〜［蛍光物質］は、あらかじめ所望の抗体に所望の蛍光物質が結合されている［抗薬剤抗体］〜［蛍光物質］自体が市販されていれば、それを利用してもよいし、また、所望の抗体（タンパク質）に所望の蛍光物質を結合させることのできる公知の手法に基づいて、 例えば市販されている蛍光標識試薬（キット）を利用して作製することができる。
【００５１】
（蛍光物質）
前記蛍光染色に用いられる蛍光物質は、特に限定されないが、前記蛍光タンパク質の蛍光波長と異なっている蛍光波長の蛍光物質であることが好ましく、輝度や定量性の観点から蛍光体集積粒子を用いることが好ましい。
【００５２】
前記蛍光体集積粒子は、有機物または無機物でできた粒子を母体とし、複数の蛍光体（例えば蛍光色素や半導体ナノ粒子）がその中に内包されているおよび／またはその表面に吸着している構造を有する、ナノサイズの粒子である。蛍光体集積ナノ粒子を構成する蛍光色素としては、例えば、ローダミン系色素、Ｃｙ系色素、AlexaFluro（登録商標）系色素、ＢＯＤＩＰＹ系色素、スクアリリウム系色素、シアニン系色素、芳香環系色素、オキサジン系色素、カルボピロニン系色素、ピロメセン系色素などが挙げられ、蛍光体集積ナノ粒子を構成する半導体ナノ粒子の素材としては、例えば、ＩＩ−ＶＩ族半導体、ＩＩＩ−Ｖ族半導体、またはＩＶ族半導体などが挙げられる。
【００５３】
蛍光体集積粒子は、公知の方法（例えば特開２０１３−５７９３７号公報参照）に従って作製することができる。
【００５４】
（検体作製方法）
本発明の一実施形態である検体作製方法は、前記薬剤評価方法を行うための検体を作製するための方法であり、実験動物の病変部から採取した組織切片から、細胞が生きたままの状態で蛍光撮影可能な検体を作製する方法である。具体的には、溶融したゲルで実験動物の病変部から採取した組織切片を被覆し、ゲルで被覆された組織切片を室温より低い固化温度で固化したものを薄切することで検体を作製する方法である。前記ゲルは溶融温度が室温より高く固化温度が室温より低いものであれば特に限定されず、例えばPrimeGel（登録商標） Agarose等のアガロースゲルや低融点アクリルアミド等を用いることができる。前記溶融温度は６０℃〜１００℃であることが好ましく、６５℃〜９５℃であることがさらに好ましく、６５℃〜９０℃であることがよりさらに好ましい。前記固化温度は１０℃〜５０℃であることが好ましく、２０℃〜４０℃であることがさらに好ましい。
【００５５】
（評価システム）
本発明の一実施形態である薬剤の評価システムは、前記薬剤評価方法を行うためのシステムであり、蛍光観察装置と、情報処理装置とを備える薬剤の評価システムである。前記蛍光観察装置は、蛍光画像の撮影を行う装置であり、前記情報処理装置は、前記蛍光観察装置により取得された撮影情報を受け取り、受け取った撮影情報から蛍光輝点に基づく情報を取得し、蛍光輝点に基づく情報を解析する装置である。本発明の評価システムは、好ましくはさらにシステムを制御する入力装置と、前記情報処理装置により取得された情報を出力する表示装置を備える。
【００５６】
＜蛍光撮影装置＞
前記蛍光撮影装置は、蛍光画像の撮影を行うことができる装置であれば特に限定されるものではないが、撮影装置を備えた蛍光顕微鏡であることが好ましく、さらに撮影装置を備えた共焦点顕微鏡であることがより好ましい。前記撮影装置は蛍光画像を撮影しうるものであれば特に限定されないが、多色タイムラプス画像や動画が撮影可能なものであることが好ましい。蛍光撮影装置によって取得された蛍光画像は情報処理装置へ伝達される。
【００５７】
（情報処理装置）
取得された蛍光画像はデジタル画像として変換されていることが好ましく、また公知の手段によって加工または画像処理がされていてもよい。
【００５８】
前記情報処理装置には、蛍光輝点に基づく情報を蓄積する、情報蓄積部が含まれることが好ましい。例えば、測定時点において、入力装置等から検体のＩＤ情報と薬剤のＩＤ情報を入力して、複数の時点において撮影を行い、情報処理装置にデータを蓄積することで、ある検体について継時的に蛍光輝点に基づく情報を参照することができ、測定値の変化量やその割合、変動等を観察することができる。
【００５９】
＜表示装置＞
前記評価システムは、蛍光輝点に基づく情報を表示する表示装置を有していることが好ましい。表示装置は、例えば、ＣＲＴ（Cathode Ray Tube）やＬＣＤ（Liquid Crystal Display）等のモニターを備えて構成されており、入力装置の表示制御に従って、蛍光撮影装置によって撮影された画像や情報処理装置で取得された情報を表示する。表示される情報は、さらに任意の方法で整理された情報であってもよい。例えば、薬剤ＩＤ（薬剤名、ＬＯＴ番号等）、検体情報（マウスのＩＤ、マウスに移植された細胞情報等）、撮影履歴、各情報の変化量、測定日時、撮影画像、および各検体における薬剤判定結果等が併せて表示されることが好ましい（図２：表示装置参照）。
【００６０】
（評価プログラム）
本発明の一実施形態であるプログラムは、前記薬剤評価方法をコンピュータにより実行させるためのプログラムである。例えば、前記評価システムにおいて、蛍光撮影装置に情報処理装置に撮影情報を提示させる処理、ならびに情報処理装置に受け取った撮影情報から蛍光輝点に基づく情報を含む所定の情報を算出させる処理、複数の時点において算出した情報からその継時的な変化を算出させる処理、およびその変化に基づいて実験動物に投与した薬剤の評価を提示させる処理を、実行させるためのプログラムである。
【００６１】
前記プログラムは情報処理装置に記憶されていてもよいし、それ以外のコンピュータ可読記録媒体、例えば、磁気テープ（デジタルデータストレージ（ＤＳＳ）など）、磁気ディスク（ハードディスクドライブ（ＨＤＤ）、フレキシブルディスク（ＦＤ）など）、光ディスク（コンパクトディスク（ＣＤ）、デジタルバーサタイルディスク（ＤＶＤ）、ブルーレイディスク（ＢＤ）など）、光磁気ディスク（ＭＯ）、フラッシュメモリ（ＳＳＤ（Solid State Drive）、メモリーカード、ＵＳＢメモリなどに記録されていてもよいし、また独立して提供されるものであってもよい。前記プログラムを情報処理装置や可読媒体に記憶させる場合、当該情報処理装置等はプログラムの実行に必要なデータを併せて記憶していることが好ましい。例えば、患者ＩＤおよび検体情報、薬剤ＩＤ等の薬剤情報等が挙げられる。
【００６２】
薬剤の評価に対しては、例えば任意の情報について設定した一定の閾値によって、検体を分類することで行うことができる。例えば、輝点数の変化率について、５０％以上を効果が高い（Ｒａｎｋ  Ａ）と判定し、３０％以上５０％未満を効果は中程度（Ｒａｎｋ  Ｂ）と判定し、それ以外の場合は効果が低い（Ｒａｎｋ  Ｃ）と判定する。また複数の情報に対して閾値を設定し、複合的に判断することでより正確な薬剤評価が可能になる。
【実施例】
【００６３】
以下、実施例に基づいて本発明の好適な態様をさらに具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されない。【００６４】
［作製例１］
＜ＧＦＰ融合微小管結合タンパク質を発現する、担がんマウスの作製＞
ＥＢ１−ＥＧＦＰ遺伝子を安定的に細胞に発現させるために、ＥＢ１−ＥＧＦＰ  ｃＤＮＡを挿入したレトロウイルスベクターの構築を行った。【００６５】
逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction）によりヒトＥＢ１のｃＤＮＡを増幅し、増幅産物をｐＥＧＦＰクローニングベクター（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）に挿入してＥＢ１−ＥＧＦＰ  ｃＤＮＡをさらに増幅させた。ＥＢ１−ＥＧＦＰ  ｃＤＮＡを切り出し、ｐＬＮＣＸ２レトロウイルスベクター（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製）に挿入することでＥＢ１−ＥＧＦＰ  ｃＤＮＡを挿入したレトロウイルスベクターを構築した。【００６６】
構築したレトロウイルスベクターをXfect Transfection Reagent（タカラバイオ株式会社）を用いてパッケージング細胞（ＧＰ２−２９３細胞）にトランスフェクトし、４８時間培養後、培養上清を濾過することで組み換えウイルス粒子を回収した。当該組換えウイルス粒子を用いて、ヒト乳がん細胞株ＫＰＬ−４にＥＢ１−ＥＧＦＰ遺伝子をトランスフェクションした。トランスフェクションを行った細胞は１０％ＦＢＳ（Ｇｉｂｃｏ社製）および４００μｇ／ｍｌ  Ｇ４１８を含むＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ社製）によって３７℃、５％ＣＯ2の環境下で継代を繰り替えすことで単一クローン化した（以下単一クローン化した細胞をＥＢ１−ＥＧＦＰ−ＫＰＬ細胞と称する）。【００６７】
５〜７週齢の雌の免疫不全マウス（ＢＡＬＢ−ｃ  ｎｕ／ｎｕ:チャールスリバー社）において、１．５％ケタミンと１．０％キシラジンの混合液による全身麻酔下のもと、２×１０7個のＥＢ１−ＥＧＦＰ−ＫＰＬ細胞を当該マウス右腰の皮下に移植することで担がんマウスの作製を行った。移植から４〜５週間後、腫瘍径が５〜１０ｍｍになった個体を実験に用いた。【００６８】
［作製例２］
<テキサスレッド集積メラミン樹脂粒子の作製>
テキサスレッド色素「Ｓｕｌｆｏｒｈｏｄａｍｉｎｅ  １０１」（シグマアルドリッチ社）２．５ｍｇを純水２２．５ｍＬに溶解した後、ホットスターラーにより溶液の温度を７０℃に維持しながら２０分間撹拌した。撹拌後の溶液に、メラミン樹脂「ニカラックＭＸ−０３５」（日本カーバイド工業株式会社）１．５ｇを加え、さらに同一条件で５分間加熱撹拌した。撹拌後の溶液にギ酸１００μＬを加え、溶液の温度を６０℃に維持しながら２０分間攪拌した後、その溶液を放置して室温まで冷却した。冷却した後の溶液を複数の遠心用チューブに分注して、１２，０００ｒｐｍで２０分間遠心分離して、溶液に混合物として含まれるテキサスレッド集積メラミン樹脂粒子を沈殿させた。上澄みを除去し、沈殿した粒子をエタノールおよび水で洗浄した。得られたテキサスレッド集積メラミン樹脂粒子の１０００個についてＳＥＭ観察を行い、平均粒子径を測定したところ、平均粒子径は８０ｎｍであった。このようにして作製されたテキサスレッド集積メラミン樹脂粒子の表面に、次の手段で抗体を結合させた。【００６９】
［作製例３］
<抗ＩｇＧ抗体結合テキサスレッド集積メラミン樹脂粒子の作製>
作製例２で得られたテキサスレッド集積メラミン樹脂粒子０．１ｍｇをＥｔＯＨ１．５ｍＬ中に分散し、アミンプロピルトリメトキシシランＬＳ−３１５０（信越化学工業社製）２μＬを加えて８時間反応させて表面アミノ化処理を行った。【００７０】
次いで、ＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）を２ｍＭ含有したＰＢＳ（リン酸緩衝液生理的食塩水）を用いて上記表面アミノ化処理を行った粒子を３ｎＭに調整し、この溶液に最終濃度１０ｍＭとなるようＳＭ（ＰＥＧ）12（サーモサイエンティフィック社製、ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ−［（Ｎ−ｍａｌｅｉｍｉｄｏｐｒｏｐｉｏｎａｍｉｄｏ）−ｄｏｄｅｃａｅｔｈｙｌｅｎｅｇｌｙｃｏｌ］ｅｓｔｅｒ）を混合し、１時間反応させた。この混合液を１０，０００Ｇで２０分遠心分離を行い、上澄みを除去した後、ＥＤＴＡを２ｍＭ含有したＰＢＳを加え、沈降物を分散させ、再度遠心分離を行った。同様の手順による洗浄を３回行い、マレイミド基で修飾されたテキサスレッド集積メラミン粒子を得た。【００７１】
Ｎ−ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ  Ｓ−ａｃｅｔｙｌｔｈｉｏａｃｅｔａｔｅ（ＳＡＴＡ）を用いて抗ヒトＩｇＧ抗体（ロバポリクローナル抗体；Jackson ImmunoResearch社）にチオール基付加処理を行ったのち、ゲルろ過カラムによるろ過を行い、テキサスレッド集積メラミン粒子に結合可能な抗ＩｇＧ抗体溶液を得た。【００７２】
前記マレイミド基で修飾されたテキサスレッド集積メラミン粒子と前記チオール基付加処理を行った抗ＩｇＧ抗体とを、ＥＤＴＡを２ｍＭ含有したＰＢＳ中で混合し、室温で１時間反応させた後、１０ｍＭメルカプトエタノールを添加し、反応を停止させた。得られた溶液を遠心フィルターで濃縮後、精製用ゲルろ過カラムを用いて未反応の抗体等を除去し、抗ＩｇＧ抗体結合テキサスレッド集積メラミン粒子を取得した。【００７３】
［作製例４］
＜Ｃｙ５標識トラスツズマブ−エムタンシンの作製＞
Biotin Labeling Kit - NH2（株式会社同仁化学研究所製）の、NH2-Reactive Biotinのかわりに、Cy5 NHS Ester Mono-reactive  （ＧＥヘルスケア社製）を用いて、Ｃｙ５標識トラスツズマブ−エムタンシンの作製を行った。【００７４】
トラスツズマブ−エムタンシン  １００μｇ（１ｍｇ／ｍＬ）（商品名：カドサイラ；中外製薬株式会社）を、３０％グリセロールを含む１００ｍＭ  ＨＥＰＥＳ緩衝液により希釈して、限外濾過フィルターナノセップ３０Ｋ（Pall Corporation）を用いて精製した。【００７５】
精製したトラスツズマブ−エムタンシン  １００μｇ（１ｍｇ／ｍＬ）と、ジメチルスルホキシド(Thermo Fisher社製)で８．５ｍＭになるよう溶解したCy5 NHS Ester Mono-reactiveとを３７℃環境で１５分間反応させることで、トラスツズマブ−エムタンシンのリシン残基のアミノ基に、Ｃｙ５を結合させた。以下、キット記載の手順に従い、Ｃｙ５標識トラスツズマブ−エムタンシンを精製した。精製されたＣｙ５標識トラスツズマブ−エムタンシンは、NanoDrop（登録商標）（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）により２８０ｎｍとＣｙ５の６４０ｎｍの吸光度からモル吸光係数に基づいて濃度と標識率（色素と抗体の比）の測定を行った。Ｃｙ５モル数／抗体モル数の平均値が３．０±０．３に収まったＣｙ５標識トラスツズマブ−エムタンシンのみを以下の実験に使用した。【００７６】
［実施例１］
作製例１で作製した担がんマウスについて、ＧＦＰ融合ＥＢ１発現細胞を移植してから４〜５週間後、１．５％ケタミン＋１％キシラジン混合麻酔により麻酔を行い、生理食塩水によって１．３５ｍｇ／ｍＬ濃度に希釈された抗がん剤トラスツズマブ−エムタンシン（商品名：カドサイラ；中外製薬株式会社）を尾静脈から２００μＬ尾静脈から投与した。コントロールとして同様に作製した担がんマウスに、同量の生理食塩水(大塚生食注；大塚製薬株式会社)を投与した。【００７７】
＜検体作製＞
トラスツズマブ−エムタンシン投与から２４時間後にマウスを頸椎脱臼により堵殺し、皮下から腫瘍部を採取した。採取した腫瘍部を培養液（FluoroBrite DMEM Media；サーモフィッシャーサイエンティフィック社）で洗浄して、３７℃で１時間静置した後、生理食塩水で１．５％（ｗ／ｖ）に希釈された低温融解アガロースゲル（PrimeGel（商標） Agarose LMT 1-20；タカラバイオ社）に浸漬し、包埋した。ゲルに包埋された腫瘍をリニアスライサーＰＲＯ7(堂阪イーエム株式会社製)で８３〜８５Ｈｚの振動で厚さ２００μｍになるように薄切し、FluoroBrite（登録商標） DMEM Mediaで洗浄し、３７℃環境で1時間静置した。その後腫瘍切片をFluoroBrite DMEM Mediaを適量入れた３５ｍｍ  ガラスボトムディッシュＮｏ１．５に載せ、その上に丸型カバーガラスを置くことで腫瘍切片をディッシュ上に固定した。なお、本発明においては、上記処理を行った腫瘍切片において細胞の大部分が生存を維持しており、以下蛍光観察においても生きた細胞が解析の対象となる。【００７８】
＜蛍光観察＞
顕微鏡ステージにインキュベーター(株式会社東海ヒット)を取り付けた共焦点レーザー顕微鏡システムＡ１Ｒ(株式会社ニコンインステック)を用いて、３７℃、５％ＣＯ2の環境下でＥＢ１−ＥＧＦＰのex vivo imagingによる蛍光観察を行った。【００７９】
蛍光の検出は、出力を０．５％に設定した４８８ｎｍ  Ｌａｓｅｒを励起光源として、ＨＶが７５（ａ．ｕ．）、解像度５１２×５１２、ピクセルサイズ０．１０４μｍ／ｐｉｘｅｌ（Ｚｏｏｍ  ４）、Ｌｉｎｅ  Ａｖｅｒａｇｅ  １６に設定したレゾナント スキャナーを用いて行った。さらに１．０７秒／１フレームのスキャン速度で２０秒間連続撮影することでＴｉｍｅ  Ｌａｐｓｅ撮影を行った。【００８０】
細胞１２個について取得した画像について画像処理ソフトウェア「Ｉｍａｒｉｓ」で解析を行った。それぞれの細胞について撮影時間（２０秒間）に観察された輝点数は、実施例１において１細胞あたり２０００個、比較例において１細胞あたり２７１０個であった。そのうち実施例において１細胞あたり２１０個、比較例においては１細胞あたり４００個を追跡輝点数として抽出した。さらにそれぞれの輝点について直線移動距離（撮影の始点および終点における輝点の直線距離）、輝点の移動速度、輝点移動の直線性を測定し、平均値を算出した。さらに、１細胞に含まれる全輝点の直線移動距離の総和を算出した。それぞれの結果を表１に示す。【００８１】
【表１】
2019221062.tif 000003
ＧＦＰ融合ＥＢ１を発現するＫＰＬ−４細胞を用いて作製した担がんマウスにトラスツズマブ−エムタンシンを投与した実施例１においては、生理食塩水を投与した比較例１と比べて、蛍光輝点の輝点数、直線移動距離、および移動速度が大きく減少していることが判った。ここから、トラスツズマブ−エムタンシンによる微小管重合阻害作用により微小管の数が減少し、また微小管の運動も阻害されていることがわかる。【００８２】
［実施例２］
作製例１で作製した担がんマウスについて、トラスツズマブ−エムタンシンのかわりに作製例４のＣｙ５標識トラスツズマブ−エムタンシンを投与した以外は、実施例１と同じ手順で検体の作製およびＥＢ１−ＥＧＦＰおよびＣｙ５のex vivo imagingによる蛍光観察を行った。【００８３】
蛍光の検出はＥＧＦＰについては実施例１と同じ条件で、Ｃｙ５については出力を４．０％に設定した６４０  ｎｍ  Ｌａｓｅｒを励起光源としてＨＶが８０（ａ．ｕ．）、解像度５１２  ｘ  ５１２、ピクセルサイズ０．１０４μｍ／ｐｉｘｅｌ  （Ｚｏｏｍ  ４）、Ｌｉｎｅ  Ａｖｅｒａｇｅ  １６に設定したレゾナントスキャナーを用いて行った。【００８４】
細胞１２個について取得した画像について、ＥＧＦＰについては実施例１と同様に画像処理ソフトウェア「Ｉｍａｒｉｓ」で解析を行った。【００８５】
それぞれの細胞について撮影時間（２０秒間）に観察された緑色輝点数（ＧＦＰに対応する）は、実施例２において１細胞あたり３０００個、比較例において１細胞あたり５８００個であった。さらに、それぞれの細胞における赤色輝点（Ｃｙ５に対応する）を抽出し、それらの蛍光強度を測定した。なお、Ｃｙ５については、オープンソフトウェアＦＩＪＩ／ＩｍａｇｅＪを用いて解析を行い、関心領域（Region of Interest：ＲＯＩ）として設定した領域において自家蛍光の画像の平均信号値を差分して単位面積あたりに規格化することによってそれぞれの細胞のＣｙ５蛍光強度を計測した。【００８６】
実施例２において緑色輝点が観察された細胞をＣｙ５蛍光強度に基づいて２群に分け、それぞれの群および比較例について直線移動距離（撮影の始点および終点における輝点の直線距離）、輝点の移動速度、輝点移動の直線性を測定し、平均値を算出した。さらに、１細胞に含まれる全輝点の直線移動距離の総和を算出した。【００８７】
それぞれの結果を表２に示す。【００８８】
【表２】
2019221062.tif 000004
実施例１と同様に、緑色蛍光輝点の移動距離および移動速度が大きく減少していることから、微小管重合阻害作用が働いていることがわかる。さらにトラスツズマブ−エムタンシンを標識したＣｙ５の蛍光から、細胞に到達した薬剤に関する情報も同時に得られる。Ｃｙ５の蛍光強度の強い細胞、すなわち薬剤到達量が多い細胞は、Ｃｙ５の蛍光強度の弱い細胞すなわち薬剤到達量の少ない細胞に比べ緑色蛍光輝点の移動距離および移動速度が小さく、微小管重合阻害作用が大きいことがわかる。【００８９】
このように微小管と薬剤を同時に染色することで、薬剤が細胞に到達した量と微小管のダイナミズムとの関係を理解することができ、より正確に薬剤の評価を行うことができると考えられる。【００９０】
［実施例３］
作製例１で作製した担がんマウスについて、実施例１と同じ手順で薬剤（トラスツズマブ−エムタンシン）の投与を行い、さらに実施例１と同様の手法で検体を作製した。作製例３で作製した抗ＩｇＧ抗体結合テキサスレッド集積メラミン樹脂粒子を０．１ｎＭになるように培養液（FluoroBrite DMEM Media；サーモフィッシャーサイエンティフィック社）で調製した蛍光染色液に、作製した検体を浸漬して、室温３時間振とうすることで蛍光染色を行った。蛍光染色後、余分な蛍光染色液を除去するために、リン酸緩衝生理食塩水を２０ｍＬいれたチューブにいれ、室温で１５分おいた後、培養液１ｍＬに浸漬した。【００９１】
上記蛍光染色を行った検体に対して実施例１と同様にＥＢ１−ＥＧＦＰおよびテキサスレッド集積メラミン樹脂粒子のex vivo imagingによる蛍光観察を行った。【００９２】
蛍光の検出はＥＧＦＰについては実施例１と同じ条件で、テキサスレッド集積メラミン樹脂粒子については出力を０．５％に設定した５６１  ｎｍ  Ｌａｓｅｒを励起光源としてＨＶが８０（ａ．ｕ．）、解像度５１２  ｘ  ５１２、ピクセルサイズ０．１０４μｍ／ｐｉｘｅｌ  （Ｚｏｏｍ  ４）、Ｌｉｎｅ  Ａｖｅｒａｇｅ  １６に設定したレゾナント スキャナーを用いて行った。【００９３】
細胞１２個について取得した画像について実施例１と同様に画像処理ソフトウェア「Ｉｍａｒｉｓ」で解析を行った。それぞれの細胞について撮影時間（２０秒間）に観察された緑色輝点数（ＧＦＰに対応する）は、実施例１において１細胞あたり４２００個、比較例において１細胞あたり６８００個であった。そのうち実施例において１細胞あたり２８０個、比較例においては１細胞あたり４３０個を追跡輝点数として抽出した。さらにそれぞれの緑色輝点について直線移動距離（撮影の始点および終点における輝点の直線距離）、輝点の移動速度、輝点移動の直線性を測定し、平均値を算出した。さらに、１細胞に含まれる全輝点の直線移動距離の総和を算出した。また、上記に加えて、それぞれの細胞における赤色輝点（テキサスレッドに対応する）の輝点数を測定し、１細胞あたりの平均値を算出した。それぞれの結果を表３に示す。【００９４】
【表３】
2019221062.tif 000005
実施例１と同様に、比較例に比べて緑色蛍光輝点の移動距離および輝点数が大きく減少していることから、微小管重合阻害作用が働いていることがわかる。さらにトラスツズマブエムタンシンの蛍光染色に用いたテキサスレッドを示す赤色輝点数から、細胞に到達したトラスツズマブエムタンシンの量に関する情報も同時に得られる。このように微小管と薬剤を同時に染色することで、薬剤が細胞に到達した量と微小管のダイナミズムとの関係を理解することができ、より正確に薬剤の評価を行うことができると考えられる。
【符号の説明】
【００９５】
１・・・蛍光観察装置
５・・・情報処理装置
１０・・・表示装置
１５・・・入力装置
３０・・・制御部
３３・・・反射画像生成部
３６・・・蛍光画像生成部
５０・・・光源
５１・・・ミラー
５２・・・ハーフミラー
５５・・・フィルター
６０・・・レンズ
７０・・・試料
８０・・・ステージ
【図１】
2019221062.tif 000006
【図２】
2019221062.tif 000007
【図３】
2019221062.tif 000008
【国際調査報告】
2019221062.tif 000009
2019221062.tif 000010
2019221062.tif 000011
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