【手続補正書】
【提出日】平成20年12月22日(2008.12.22)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料中の標的核酸配列における変異の検出方法であって、該標的核酸配列が、第１のＤＮＡ鎖および必要に応じてその相補鎖を含み、該方法が、
（ａ）該核酸に検出プライマーを添加する工程であって、該検出プライマーが、該変異部位を含むＤＮＡ配列で該第１のＤＮＡ鎖に結合する、工程；
（ｂ）該検出プライマーを伸長して、該第１のＤＮＡ鎖に相補的である第２のＤＮＡ鎖を形成する工程；
（ｃ）該核酸に増幅プライマーを添加する工程であって、該増幅プライマーが、該変異部位から離れた位置で該第２のＤＮＡ鎖および／または該相補鎖に結合する、工程；
（ｄ）該増幅プライマーを伸長して、該第２のＤＮＡ鎖に相補的である第３のＤＮＡ鎖、および／または該第１のＤＮＡ鎖の追加コピーを形成する工程；該変異部位から離れた位置で該第１のＤＮＡ鎖および／または該第３のＤＮＡ鎖に結合する第３のプライマーを添加する工程；および該第３のプライマーを伸長して、該相補鎖および／または該第２のＤＮＡ鎖の追加コピーを形成する工程；
（ｅ）相補塩基対合によって該ＤＮＡ鎖をアニールして、核酸二重鎖を形成する工程であって、該二重鎖の２本の鎖が該変異部位でミスマッチした残基を有するならば、該二重鎖がヘテロ二重鎖であり、そして該二重鎖の２本の鎖が該変異部位でミスマッチした残基を有しないならば、該二重鎖がホモ二重鎖である、工程；および
（ｆ）ヘテロ二重鎖および／またはホモ二重鎖の存在を検出する工程；
を含み、
該検出プライマーがリバースプライマーであるならば、該第３のプライマーがリバース増幅プライマーであり；そして
該検出プライマーがフォワードプライマーであるならば、該第３のプライマーがフォワード増幅プライマーである、
方法。
【請求項２】
前記検出プライマーがリバースプライマーであり、前記増幅プライマーがフォワードプライマーであり、そして前記第３のプライマーがリバース増幅プライマーである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記検出プライマーがフォワードプライマーであり、前記増幅プライマーがリバースプライマーであり、そして前記第３のプライマーがフォワード増幅プライマーである、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記工程ａ）からｄ）が連続的に行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記工程ａ）およびｃ）が実質的に同時に行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記工程ｂ）およびｄ）が実質的に同時に行われる、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記検出プライマーが、前記第１のＤＮＡ鎖における前記変異部位で野生型残基に相補的な核酸残基を含む野生型検出プライマーであり、そして前記へテロ二重鎖の存在が、前記試料が該変異部位に変異残基を有する標的核酸を含むことを示す、請求項１から６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
前記検出プライマーが、前記第１のＤＮＡ鎖における前記変異部位で変異残基に相補的な核酸残基を含む変異検出プライマーであり、そして前記へテロ二重鎖の存在が、前記試料が該変異部位に野生型残基を有する標的核酸を含むことを示す、請求項１から６のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
前記変異が核酸置換である、請求項１から８のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
前記変異が核酸欠失または挿入である、請求項１から８のいずれかの項に記載の方法。
【請求項１１】
核酸置換、欠失、および挿入からなる群より選択される核酸配列における多重変異の検出のための、請求項１から１０のいずれか項に記載の方法。
【請求項１２】
前記伸長工程がＰＣＲによって行われる、請求項１から１１のいずれかに記載の方法。
【請求項１３】
前記ヘテロ二重鎖および／またはホモ二重鎖の検出が、変性高速液体クロマトグラフィーによって行われる、請求項１から１２のいずれかに記載の方法。
【請求項１４】
前記検出プライマーが少なくとも１５ヌクレオチド長である、請求項１から１３のいずれかに記載の方法。
【請求項１５】
前記検出プライマーが、少なくとも２０核酸長である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記検出プライマーが、前記増幅プライマーよりも高い融解温度を有する、請求項１から１５のいずれかに記載の方法。
【請求項１７】
前記工程ａ）が高いアニーリング温度で行われ、該温度で、前記検出プライマーが前記標的核酸に結合し得るが、前記増幅プライマーが該標的核酸に結合し得ない、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記工程ｃ）が前記工程ａ）よりも低いアニーリング温度で行われ、該より低い温度で、前記増幅プライマーが前記標的核酸に結合し得る、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
変異検出プライマーを用いて工程ａ）からｅ）を繰り返す工程を含み、該変異検出プライマーが、前記第１のＤＮＡ鎖における前記変異部位で変異残基に相補的である核酸残基を含み、そして前記へテロ二重鎖の存在が、前記試料が野生型および変異標的核酸の混合物を含むことを示す、請求項７に記載の方法。
【請求項２０】
野生型検出プライマーを用いて工程ａ）からｅ）を繰り返す工程を含み、該野生型検出プライマーが、前記第１のＤＮＡ鎖における前記変異部位で野生型残基に相補的である核酸残基を含み、そして前記へテロ二重鎖の存在が、前記試料が野生型および変異標的核酸の混合物を含むことを示す、請求項８に記載の方法。
【請求項２１】
前記標的核酸が一本鎖である、請求項１から２０のいずれかに記載の方法。
【請求項２２】
前記標的核酸がＲＮＡであり、そして工程ａ）の前にｃＤＮＡに変換される、請求項１から２１のいずれかに記載の方法。
【請求項２３】
前記試料が臨床試料である、請求項１から２２のいずれかに記載の方法。
【請求項２４】
前記標的核酸が、マイコバクテリウム種由来である、請求項１から２３のいずれかに記載の方法。
【請求項２５】
前記標的核酸が、配列番号１の核酸配列を含む、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記検出プライマーが、配列番号２と少なくとも８０％同一であるＤＮＡ配列、またはその相補物に結合する、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記検出プライマーが、配列番号３の配列、またはそれと少なくとも８０％の同一性を有する配列を含む野生型検出プライマーであり、ただし、下線を付した残基は必須であり、そして任意の他のヌクレオチドで置換され得ない、請求項２５または２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記検出プライマーが、配列番号４の配列、またはそれと少なくとも８０％の同一性を有する配列を含む変異検出プライマーであり、ただし、下線を付した残基は必須であり、そして任意の他のヌクレオチドで置換され得ない、請求項２５または２６に記載の方法。
【請求項２９】
前記標的核酸が、好気性細菌に由来する、請求項１から２３のいずれかの項に記載の方法。
【請求項３０】
前記標的核酸が、通性嫌気性細菌に由来する、請求項１から２３のいずれかの項に記載の方法。
【請求項３１】
前記標的核酸が、グラム陽性細菌に由来する、請求項１から２３のいずれかの項に記載の方法。
【請求項３２】
前記標的核酸が、グラム陰性細菌に由来する、請求項１から２３のいずれかの項に記載の方法。
【請求項３３】
前記標的核酸が、腸内細菌に由来する、請求項１から２３のいずれかの項に記載の方法。
【請求項３４】
試料中の標的核酸配列における変異の検出方法であって、該標的核酸配列が、第１のＤＮＡ鎖および必要に応じてその相補鎖を含み、該方法が、
（ａ）該核酸に検出プライマーを添加する工程であって、該検出プライマーが、該変異部位を含むＤＮＡ配列で該第１のＤＮＡ鎖に結合する、工程；
（ｂ）該検出プライマーを伸長して、該第１のＤＮＡ鎖に相補的である第２のＤＮＡ鎖を形成する工程；
（ｃ）該核酸に増幅プライマーを添加する工程であって、該増幅プライマーが、該変異部位から離れた位置で該第２のＤＮＡ鎖および／または該相補鎖に結合する、工程；
（ｄ）該増幅プライマーを伸長して、該第２のＤＮＡ鎖に相補的である第３のＤＮＡ鎖、および／または該第１のＤＮＡ鎖の追加コピーを形成する工程；
（ｅ）相補塩基対合によって該ＤＮＡ鎖をアニールして、核酸二重鎖を形成する工程であって、該二重鎖の２本の鎖が該変異部位でミスマッチした残基を有するならば、該二重鎖がヘテロ二重鎖であり、そして該二重鎖の２本の鎖が該変異部位でミスマッチした残基を有しないならば、該二重鎖がホモ二重鎖である、工程；および
（ｆ）ヘテロ二重鎖および／またはホモ二重鎖の存在を検出する工程；
を含み、
該検出プライマーが、該増幅プライマーよりも高い融解温度を有する、
方法。
【請求項３５】
試料中の標的細菌またはウイルス核酸配列における変異の検出方法であって、該標的核酸配列が、第１のＤＮＡ鎖および必要に応じてその相補鎖を含み、該方法が、
（ａ）該核酸に検出プライマーを添加する工程であって、該検出プライマーが、該変異部位を含むＤＮＡ配列で該第１のＤＮＡ鎖に結合する、工程；
（ｂ）該検出プライマーを伸長して、該第１のＤＮＡ鎖に相補的である第２のＤＮＡ鎖を形成する工程；
（ｃ）該核酸に増幅プライマーを添加する工程であって、該増幅プライマーが、該変異部位から離れた位置で該第２のＤＮＡ鎖および／または該相補鎖に結合する、工程；
（ｄ）該増幅プライマーを伸長して、該第２のＤＮＡ鎖に相補的である第３のＤＮＡ鎖、および／または該第１のＤＮＡ鎖の追加コピーを形成する工程；
（ｅ）相補塩基対合によって該ＤＮＡ鎖をアニールして、核酸二重鎖を形成する工程であって、該二重鎖の２本の鎖が該変異部位でミスマッチした残基を有するならば、該二重鎖がヘテロ二重鎖であり、そして該二重鎖の２本の鎖が該変異部位でミスマッチした残基を有しないならば、該二重鎖がホモ二重鎖である、工程；および
（ｆ）ヘテロ二重鎖および／またはホモ二重鎖の存在を検出する工程；
を含む、方法。
【請求項３６】
配列番号２と少なくとも８５％同一である標的核酸配列、またはその相補物に結合する、検出プライマー。
【請求項３７】
配列番号２と少なくとも９０％同一である標的核酸配列、またはその相補物に結合する、請求項３６に記載の検出プライマー。
【請求項３８】
前記検出プライマーが、配列番号３の配列、またはそれと少なくとも８５％の同一性を有する配列を含む野生型検出プライマーであり、ただし、下線を付した残基は必須であり、そして任意の他のヌクレオチドで置換され得ない、請求項３６または３７に記載の検出プライマー。
【請求項３９】
前記検出プライマーが、配列番号３の配列と少なくとも９０％の同一性を有する配列を含む、請求項３８に記載の野生型検出プライマー。
【請求項４０】
前記検出プライマーが、配列番号４の配列、またはそれと少なくとも８５％の同一性を有する配列を含む変異検出プライマーであり、ただし、下線を付した残基は必須であり、そして任意の他のヌクレオチドで置換され得ない、請求項３６または３７に記載の検出プライマー。
【請求項４１】
前記検出プライマーが、配列番号４の配列と少なくとも９０％の同一性を有する配列を含む、請求項４０に記載の変異検出プライマー。
【請求項４２】
第１のＤＮＡ鎖および必要に応じてその相補鎖を含むM. tuberculosis標的核酸配列における変異の検出用のキットであって、該キットが、
（ａ）請求項３６から４１のいずれかの項に記載の検出プライマーであって、該第１のＤＮＡ鎖に存在する変異部位に結合する、検出プライマー；
（ｂ）該変異部位から離れた位置で、該第１のＤＮＡ鎖に相補的である第２のＤＮＡ鎖、および／または該相補鎖に結合する増幅プライマー；
（ｃ）ポリメラーゼ；
（ｄ）少なくとも１つのヌクレオチド；
を含む、キット。
【請求項４３】
前記好気性細菌が、バチラス種またはナイセリア種である、請求項２９に記載の方法。
【請求項４４】
前記通性嫌気性細菌が、サルモネラ種である、請求項３０に記載の方法。
【請求項４５】
前記グラム陽性細菌が、バチラス種である、請求項３１に記載の方法。
【請求項４６】
前記グラム陰性細菌が、サルモネラ種である、請求項３２に記載の方法。
【請求項４７】
前記腸内細菌が、サルモネラ種である、請求項３３に記載の方法。