(57)【要約】  被験者の血液中のｃｆＤＮＡの１５０塩基以下であって、標的組織又は細胞のＤＮＡに特徴的又は特異的な非メチル化シトシンが３個以上存在する標的部分を、２段階以上のＡＲＭＳ−ＰＣＲ法で増幅することにより、標的組織特異的な細胞傷害を検出することができる。ＡＲＭＳ−ＰＣＲ法による増幅工程に先立ち、ｃｆＤＮＡの非メチル化シトシンをシトシン以外の塩基に変換する工程を含むことができ、次いで、ｃｆＤＮＡの標的部分を含む領域を、メチル化の有無にかかわらずＰＣＲにより増幅する工程を含むことができる。ＡＲＭＳ−ＰＣＲ法で標的部分が増幅されたことを確認することにより、標的組織又は細胞が傷害を受けていると判定することができ、増幅産物中の標的領域を有するＤＮＡの量を定量することにより、標的組織又は細胞の傷害の程度を判定することができる。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験者の血液中のｃｆＤＮＡの、１５０塩基以下であって、標的組織又は細胞のＤＮＡに特徴的又は特異的な非メチル化シトシンが３個以上存在する標的部分を、２段階以上のＡＲＭＳ−ＰＣＲ法で増幅する工程を含む、標的組織特異的な細胞傷害検査方法。
【請求項２】
ＡＲＭＳ−ＰＣＲ法による増幅工程に先立ち、ｃｆＤＮＡの非メチル化シトシンをシトシン以外の塩基に変換する工程を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ＡＲＭＳ−ＰＣＲ法による増幅工程に先立ち、ｃｆＤＮＡの標的部分を含む領域をＰＣＲにより増幅する工程を含む、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
ＡＲＭＳ−ＰＣＲ法で標的部分が増幅されたことを確認することにより、標的組織又は細胞が傷害を受けていると判定する工程を含む、請求項１〜３の何れかに記載の方法。
【請求項５】
ＡＲＭＳ−ＰＣＲ法の増幅産物中の標的部分を有するＤＮＡを定量することにより、標的組織又は細胞の傷害の程度を判定する工程を含む、請求項１〜３の何れかに記載の方法。
【請求項６】
標的組織又は細胞が膵β細胞であり、インスリン遺伝子のエクソン２の＋３０７〜＋４２５を含む領域であって、＋３３１位、＋３６７位、＋３７４位、＋４０１位、＋４０４位に非メチル化シトシンを含む領域を、ＡＲＭＳ-ＰＣＲ法で増幅する、請求項１〜５の何れかに記載の方法。
【請求項７】
下記塩基配列を３’末端に含む４０塩基以下のプライマーを用いて２段階のＡＲＭＳ−ＰＣＲ法を行う、請求項６に記載の方法。
第１段階のフォワードプライマー：５’−ttgtgaattaatatttgtttg−３’(配列番号１３)、又は配列番号１３において、配列番号１３において、３’末端から３塩基目がtに代えてc又はaである塩基配列
第１段階のリバースプライマー  ：５’−tacaaatcctctacctccgaa−３’(配列番号１４)、又は配列番号１４において、３’末端から３塩基目がgに代えてa又はtである塩基配列
第２段階のフォワードプライマー：５’−aagttttttatttagtgtctg−３’(配列番号１５)、又は配列番号１５において、３’末端から３塩基目がcに代えてa又はtである塩基配列
第２段階のリバースプライマー  ：５’−aatatataaaaaaaacctgat−３’(配列番号１６)
【請求項８】
第１段階、及び２段階のＡＲＭＳ−ＰＣＲ法のプライマーが、下記塩基配列からなるものである、請求項７に記載の方法。
第１段階のフォワードプライマー：５’−tagtttttgtgaattaatatttgtttg−３’（配列番号１）
第１段階のリバースプライマー  ：５’−cctacaaatcctctacctccgaa−３’（配列番号２）
第２段階のフォワードプライマー：５’−tttggtggaagttttttatttagtgtctg−３’（配列番号３）
第２段階のリバースプライマー  ：５’−aatcttaaatatataaaaaaaacctgat−３’（配列番号４）
【請求項９】
２段階のＡＲＭＳ−ＰＣＲ法による増幅工程に先立ち、インスリン遺伝子のエクソン２の＋３０１〜＋４２９を含む領域をＰＣＲ法で増幅する、請求項６〜８の何れかに記載の方法。
【請求項１０】
標的組織又は細胞が血管内皮細胞であり、ＲＯＢＯ４遺伝子の上流の−２２４〜−８０を含む領域であって、−１８５位、−１４４位、−１１８位、−１０３位に非メチル化シトシンを含む領域をＡＲＭＳ-ＰＣＲ法で増幅する、請求項１〜５の何れかに記載の方法。
【請求項１１】
下記塩基配列を３’末端に含む４０塩基以下のプライマーを用いて２段階のＡＲＭＳ−ＰＣＲ法を行う、請求項１０に記載の方法。
第１段階のフォワードプライマー：５’−agaggattaaggttttgagtg−３’(配列番号１７)、又は配列番号１７において、３’末端から３塩基目がgに代えてc又はaである塩基配列
第１段階のリバースプライマー  ：５’−accatttaactataaccccaa−３’(配列番号１８)、又は配列番号１８において、３’末端から２塩基目がaに代えてtである塩基配列
第２段階のフォワードプライマー：５’−atattttgtaagaaatttgtg−３’(配列番号１９)、又は配列番号１９において、３’末端から３塩基目がgに代えてcである塩基配列
第２段階のリバースプライマー  ：５’−acccaaaccctaacttcaaga−３’(配列番号２０)、又は配列番号２０において、３’末端から２塩基目がgに代えてaである塩基配列
【請求項１２】
第１段階、及び２段階のＡＲＭＳ−ＰＣＲ法のプライマーが下記塩基配列からなるものである、請求項１１に記載の方法。
第１段階のフォワードプライマー：５’−agatttaaatagaggattaaggttttgagtg−３’（配列番号５）
第１段階のリバースプライマー  ：５’−tcaaccatttaactataaccccaa−３’（配列番号６）
第２段階のフォワードプライマー：５’−gttagtgtaaggatattttgtaagaaatttgtg−３’（配列番号７）
第２段階のリバースプライマー  ：５’−acccaaaccctaacttcaaga−３’（配列番号８）
【請求項１３】
２段階のＡＲＭＳ−ＰＣＲ法による増幅工程に先立ち、ＲＯＢＯ４遺伝子の上流の−２２７〜−２９を含む領域をＰＣＲ法で増幅する、請求項１０〜１２の何れかに記載の方法。
【請求項１４】
標的組織又は細胞が脂肪細胞であり、ＰＰＡＲγ遺伝子の＋２１〜＋１４４を含む領域であって、＋５０位、＋１１０位、＋１２３位に非メチル化シトシンを含む領域をＡＲＭＳ-ＰＣＲ法で増幅する、請求項１〜５の何れかに記載の方法。
【請求項１５】
下記塩基配列を３’末端に含む４０塩基以下のプライマーを用いて２段階のＡＲＭＳ−ＰＣＲ法を行う、請求項１４に記載の方法。
第１段階のフォワードプライマー：５’−ttttttattgatttag−３’（配列番号２１）
第１段階のリバースプライマー  ：５’−ccttacataaatacccccaga−３’(配列番号２２)
第２段階のフォワードプライマー：５’−tttttattgatttagaaaatg−３’(配列番号２３)
第２段階のリバースプライマー  ：５’−cccccacatccccaataagca−３’(配列番号２４)、又は配列番号２４において、３’末端から２塩基目がgに代えてtである塩基配列
【請求項１６】
第１段階、及び２段階のＡＲＭＳ−ＰＣＲ法のプライマーが下記塩基配列からなるものである、請求項１５に記載の方法。
第１段階のフォワードプライマー：５’−tttgggagatttttttattgatttag−３’（配列番号９）
第１段階のリバースプライマー  ：５’−acccttacataaatacccccaga−３’（配列番号１０）
第２段階のフォワードプライマー：５’−ttgggagatttttttattgatttagaaaatg−３（配列番号１１）
第２段階のリバースプライマー  ：５’−acccccacatccccaataagca−３’（配列番号１２）
【請求項１７】
２段階のＡＲＭＳ−ＰＣＲ法による増幅工程に先立ち、ＰＰＡＲγ遺伝子の＋２０〜＋１５２を含む領域をＰＣＲ法で増幅する、請求項１４〜１６の何れかに記載の方法。
【請求項１８】
２段階のＡＲＭＳ−ＰＣＲ法に用いられるプライマーのセットであり、各プライマーが下記塩基配列を３’末端に含む４０塩基以下のプライマーである、プライマーセット。
第１段階のフォワードプライマー：５’−ttgtgaattaatatttgtttg−３’(配列番号１３)、又は配列番号１３において、配列番号１３において、３’末端から３塩基目がtに代えてc又はaである塩基配列
第１段階のリバースプライマー  ：５’−tacaaatcctctacctccgaa−３’(配列番号１４)、又は配列番号１４において、３’末端から３塩基目がgに代えてa又はtである塩基配列
第２段階のフォワードプライマー：５’−aagttttttatttagtgtctg−３’(配列番号１５)、又は配列番号１５において、３’末端から３塩基目がcに代えてa又はtである塩基配列
第２段階のリバースプライマー  ：５’−aatatataaaaaaaacctgat−３’(配列番号１６)
【請求項１９】
２段階のＡＲＭＳ−ＰＣＲ法に用いられる下記塩基配列からなるプライマーのセット。
第１段階のフォワードプライマー：５’−tagtttttgtgaattaatatttgtttg−３’（配列番号１）
第１段階のリバースプライマー  ：５’−cctacaaatcctctacctccgaa−３’（配列番号２）
第２段階のフォワードプライマー：５’−tttggtggaagttttttatttagtgtctg−３’（配列番号３）
第２段階のリバースプライマー  ：５’−aatcttaaatatataaaaaaaacctgat−３’（配列番号４）
【請求項２０】
２段階のＡＲＭＳ−ＰＣＲ法に用いられるプライマーのセットであり、各プライマーが下記塩基配列を３’末端に含む４０塩基以下のプライマーである、プライマーセット。
第１段階のフォワードプライマー：５’−agaggattaaggttttgagtg−３’(配列番号１７)、又は配列番号１７において、３’末端から３塩基目がgに代えてc又はaである塩基配列
第１段階のリバースプライマー  ：５’−accatttaactataaccccaa−３’(配列番号１８)、又は配列番号１８において、３’末端から２塩基目がaに代えてtである塩基配列
第２段階のフォワードプライマー：５’−atattttgtaagaaatttgtg−３’(配列番号１９)、又は配列番号１９において、３’末端から３塩基目がgに代えてcである塩基配列
第２段階のリバースプライマー  ：５’−acccaaaccctaacttcaaga−３’(配列番号２０)、又は配列番号２０において、３’末端から２塩基目がgに代えてaである塩基配列
【請求項２１】
２段階のＡＲＭＳ−ＰＣＲ法に用いられる下記塩基配列からなるプライマーのセット。
第１段階のフォワードプライマー：５’−agatttaaatagaggattaaggttttgagtg−３’（配列番号５）
第１段階のリバースプライマー  ：５’−tcaaccatttaactataaccccaa−３’（配列番号６）
第２段階のフォワードプライマー：５’−gttagtgtaaggatattttgtaagaaatttgtg−３’（配列番号７）
第２段階のリバースプライマー  ：５’−acccaaaccctaacttcaaga−３’（配列番号８）
【請求項２２】
２段階のＡＲＭＳ−ＰＣＲ法に用いられるプライマーのセットであり、各プライマーが下記塩基配列を３’末端に含む４０塩基以下のプライマーである、プライマーセット。
第１段階のフォワードプライマー：５’−ttttttattgatttag−３’（配列番号２１）
第１段階のリバースプライマー  ：５’−ccttacataaatacccccaga−３’(配列番号２２)
第２段階のフォワードプライマー：５’−tttttattgatttagaaaatg−３’(配列番号２３)
第２段階のリバースプライマー  ：５’−cccccacatccccaataagca−３’(配列番号２４)、又は配列番号２４において、３’末端から２塩基目がgに代えてtである塩基配列
【請求項２３】
２段階のＡＲＭＳ−ＰＣＲ法に用いられる下記塩基配列からなるプライマーのセット。
第１段階のフォワードプライマー：５’−tttgggagatttttttattgatttag−３’（配列番号９）
第１段階のリバースプライマー  ：５’−acccttacataaatacccccaga−３’（配列番号１０）
第２段階のフォワードプライマー：５’−ttgggagatttttttattgatttagaaaatg−３（配列番号１１）
第２段階のリバースプライマー  ：５’−acccccacatccccaataagca−３’（配列番号１２）
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、血中の標的組織由来のＤＮＡを特異的に検出して、その組織の細胞の傷害の程度や進行状況を評価する検査方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
各種細胞の傷害の程度や経時変化をより簡便にかつ低侵襲的に測定する方法として、血中遊離ＤＮＡ（Ｃｅｌｌ−ｆｒｅｅ  ＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ））を検出する方法が知られている。ｃｆＤＮＡは、細胞の壊死、アポトーシスなどの傷害により血中に漏出する。例えば、癌組織から血中に出た循環癌細胞から遊離される循環腫瘍ＤＮＡを検出することで癌の診断を行う方法や、移植後の組織由来のｃｆＤＮＡを検出することで移植組織の傷害を検出する方法が提案されている。【０００３】
ＤＮＡは、シトシンのピリミジン環の５位炭素又はアデニンのプリン環の６位窒素が一部メチル化されており、ＤＮＡメチル化は細胞分裂を経ても受け継がれる。生体の体細胞では、ＤＮＡのメチル化は、通常ＣｐＧ（シトシン−ホスホジエステル結合−グアニン）のＣの位置で生じる。ＤＮＡメチル化パターンは細胞特異的であるため、特定のメチル化パターンを有する標的細胞特異的なｃｆＤＮＡを検出すれば、標的組織の傷害を発見することができる。また、疾患に特徴的な細胞傷害を検出することで、その疾患か否かを診断することができる。【０００４】
従来の分析方法では、メチル化されたＤＮＡの存在確認を行うことが中心であった（特許文献１〜３）。そして、ＤＮＡのメチル化された部位やメチル化のパターンを解析することにより、癌の診断や治療マーカーとして使用できると報告されている（特許文献４〜５）。
しかし、これらの方法は、所望の位置のメチル化と非メチル化のデータの識別が困難であり、その識別操作に時間がかかり、使用する機器が高額であるため、汎用し難い。【０００５】
次世代シーケンサを用いれば、ｃｆＤＮＡに含まれる多数の遺伝子又は領域のメチル化パターンを網羅的に特定することはできる。しかし、次世代シーケンサは、リード数は大きいが必要な鋳型核酸量が多いため、患者の採血負担が大きい。また、膨大なデータを扱うものであるため、解析に時間がかかる。さらに、年々低価格化しているがなお高価である。従って、少量の検体を用いて、短時間に、かつ安価に、血中の標的組織由来のｃｆＤＮＡを検出し、定量できる方法が求められている。【０００６】
糖尿病患者の数は近年、非常に増加しており、２０１６年に国内では１，０００万人を超えたと報告されている。糖尿病は、膵臓のβ細胞から分泌されるインスリン作用が相対的に減少する病気である。糖尿病は、１型糖尿病と２型糖尿病に大別され、１型糖尿病は膵β細胞が自らを免疫系が攻撃する自己免疫機序により死滅するため、インスリンが産生されなくなる疾患である。２型糖尿病は、インスリンの効果が減弱したり、分泌のタイミングが遅れ、患者に膵β細胞傷害が進行する疾患である。２型糖尿病は、肥満、運動不足、ストレスなど環境因子の増悪を契機に発症し、疾患感受性遺伝子変異の集積した人に起こりやすい。肥満に伴い脂肪細胞が肥大化し、炎症を惹起し、壊死などの細胞障害をきたすことが知られている。これらの脂肪細胞の傷害がインスリン作用を傷害し、糖尿病の大きな原因であるインスリン作用障害をきたす。
さらに糖尿病では、血中のインスリン量の減少や、インスリン作用の減弱のため、血糖値が上昇し、その結果、血管障害を来し、糖尿病で特有な細小血管合併症である糖尿病網膜症、糖尿病神経障害、糖尿病腎症をきたし、大血管合併症では脳梗塞、末梢動脈疾患、虚血性心疾患などの動脈硬化症をはじめ多様な合併症が進行する。【０００７】
特に、１型糖尿病は、主に自己免疫応答によって、膵β細胞特異的に細胞死が誘導され、７０〜８０％以上の膵β細胞が傷害を受けた結果、口渇、多尿などの症状、および高血糖を呈して診断される。そこで、１型糖尿病の早期診断、早期治療を行い、β細胞機能を少しでも保護することが求められている。その早期発見のために、膵島関連自己抗体であるＧＡＤ抗体やＩＡ−２抗体等の検出が行われている。しかし、これらの抗体はその抗体価による重症度分類はできず、膵β細胞傷害の程度を反映するものでないことが難点であった。このため、膵β細胞の死滅の状況を的確に定量的に検出する方法の開発が切に望まれている。
また、1型糖尿病の根治医療として膵臓移植あるいは膵島移植が行われているが、移植された膵臓や膵島は拒絶反応を起こしやすく、また自己免疫応答の再燃が生じる危険もある。膵臓移植では血清アミラーゼの上昇や血糖値の上昇など間接的指標によりグラフト傷害を診断していることから、免疫抑制療法の調節が最適化できていないため、グラフト喪失に至る場合がある。また膵島移植では拒絶反応の指標が全くない。このことからも、直接的な膵β細胞傷害の臨床的指標が望まれている。【０００８】
１型糖尿病の早期からの免疫寛容療法の導入とその効果検証、及び重症患者への膵臓又は膵島移植後の拒絶反応など臓器障害の検出や的確な治療介入のためには、より直接的に膵β細胞の死滅の状況を検出する必要がある。そこで、本発明者は、血液中を循環するゲノムＤＮＡの中に含まれる膵β細胞由来のｃｆＤＮＡの検出を検討してきた。β細胞が死滅すれば、β細胞由来のＤＮＡが体内に放出され、血液に流入して、血液中を循環することになるからである。
現在、膵β細胞由来のｃｆＤＮＡを効率的に検出するために、ＤＮＡのメチル化の有無に着目した研究が進められている（非特許文献１、２）。膵β細胞がインスリンを選択的に分泌していることから、インスリンの産生に係るＤＮＡ領域は、他の体細胞と異なりＣｐＧが非メチル化状態であることが報告されている。特に、図１に示されるように、インスリン遺伝子のエクソン２領域のメチル化の割合は、膵β細胞特異的にきわめて低いと報告されている（非特許文献３）。【０００９】
上記インスリンのプロモーター領域のメチル化の有無を指標にして、膵β細胞のｃｆＤＮＡの確認が種々検討されている。ＤＮＡのメチル化の識別には、色々な解析手法が使用されるが、例えばＤＮＡのバイスルファイト処理を行い、第１のＮｅｓｔｅｄ ＰＣＲを行い、次にＤＮＡ塩基配列特異的なＰＣＲを行って、増幅したＤＮＡを電気泳動し検出することなどが行われている（特許文献６）。使用されるＰＣＲの方法にも工夫がなされ、特定のプローブを用いるＤｒｏｐｌｅｔ  Ｄｉｇｉｔａｌ法（非特許文献４、５）が報告されている。更に、次世代シークエンサーによるＭｉSｅｑ法（非特許文献６）なども行われている。
しかし、非特許文献１〜２、４〜５の方法はＣｐＧ配列のメチル化状態を検討する部位が少ないため特異性が低く、メチル化又は非メチル化の擬陽性を排除することが困難であり、臨床検査方法として実用し難い。また、非特許文献６の方法の検査費用は高額であり、臨床検査で汎用することは困難である。それ故、臨床検査に使用するために、より簡便で安価かつ特異性の高い方法が強く求められている。【００１０】
また、糖尿病の重篤な合併症を引き起こす血管障害の早期検出方法として、血管内皮機能検査や頸動脈エコー検査などの間接的な方法が行われているが、血管内皮障害を直接的に検出するバイオマーカーを用いた方法は存在しない。従って、血管内皮障害を直接的に検出できる方法が求められている。また、脂肪細胞の肥大化によるインスリン作用減弱の主因である炎症を反映する脂肪細胞傷害を直接的に検出する方法も求められている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１１】
【特許文献１】特開２０１０−１５８２４０号公報
【特許文献２】特開２０１０−６８７７５号公報
【特許文献３】特開２００６−４２６４１号公報
【特許文献４】特開２００５−５３６２２９号公報
【特許文献５】特開２００９−２３２７６１号公報
【特許文献６】再表２０１１−１３２７９８号公報
【非特許文献】
【００１２】
【非特許文献１】Herold KC.et al.,J.Clin.Invest.,2015,125(3):1163-1173
【非特許文献２】John A.Olsen et al.,PLOS ONE,2016,Apr 25:11(4)e0152662
【非特許文献３】Proc Natl Acad Sci U S A. 2017 Dec 19;114(51):13525-13530.
【非特許文献４】Husseiny MI et.al.,PLOS ONE,2014 Apr 10:9(4)e94591
【非特許文献５】Sahar U-B. et al., Endocrinology 2014,155(9):3694-3698
【非特許文献６】Marisa M.F. et al.,2015 Diabetes Jul;db150430
【非特許文献７】Lehmann-wherman et al.,E1826-E1834, PNAS,March 14,2016
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
本発明の課題は、標的細胞由来のｃｆＤＮＡを検出する、簡便で安価かつ特異性の高い臨床検査方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
そこで、本発明者は、ＰＣＲの手法を用い、標的細胞由来のｃｆＤＮＡを高精度で検出する方法を検討した。その結果、ｃｆＤＮＡの１５０塩基以下であって非メチル化シトシンが３個以上存在する標的部分を２段階以上のＡＲＭＳ（Amplification refractory mutation system）-ＰＣＲ法で増幅すれば、ｃｆＤＮＡの標的部分を、非メチル化シトシンに代えてメチル化シトシンを有する同じ塩基配列のＤＮＡや、他の塩基配列を有するＤＮＡと区別して特異的に増幅させ得ることを見出した。ｃｆＤＮＡの標的部分として、特定の組織又は細胞で他の体細胞に比べて、非メチル化率が高い部分を選択することにより、特定の組織又は細胞由来のｃｆＤＮＡを検出し、定量することができる。【００１５】
また、本発明者は、膵β細胞由来のｃｆＤＮＡを特異的に検出するためには、インスリン遺伝子のエクソン２領域の＋３０１〜＋４２９、特に＋３０７〜＋４２５を含む１５０塩基以下の非メチル化ＤＮＡ部分をＡＲＭＳ−ＰＣＲ法で増幅して確認することがより適切であることを見出した。膵β細胞由来のｃｆＤＮＡはこの領域に５つの非メチル化シトシンを有し、このメチル化パターンは膵β細胞に特徴的なものである。従来の１〜２か所のＣｐＧ配列を認識するＰＣＲ法による識別法では擬陽性を生じる可能性が高かったが、この方法によれば、陽性検体を識別する精度が向上する。【００１６】
ＡＲＭＳ法のプライマーとして、更に種々検討の結果、多くのプライマーの組合せの中から、第１段階のプライマーとして表１のプライマーセットを用い、第２段階のプライマーとして表２のプライマーセットを用いることが、上記標的部分が５個の非メチル化シトシンを有するｃｆＤＮＡを、非メチル化シトシンの１又は複数がメチル化シトシンに置き換わった同じ塩基配列のｃｆＤＮＡや、他の塩基配列のｃｆＤＮＡと区別して、精度よく検出及び定量するために好適であることを見出した。
【表１】
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【表２】
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【００１７】
本発明者は、表１と表２のプライマーセットを用いた２段階ＡＲＭＳ−ＰＣＲ法を使用して、１型糖尿病患者と健常人の血中のｃｆＤＮＡの検査を実施したところ、図１０に示されるように、１型糖尿病患者では特別に高い陽性反応を示すが大多数では陰性であり、健常人では弱陽性を示す場合も認めた。【００１８】
また、本発明者は、血管内皮細胞由来のｃｆＤＮＡを特異的に検出するためには、１回膜貫通型レセプターであるＲｏｕｎｄａｂｏｕｔ４の遺伝子（ＲＯＢＯ４遺伝子）の上流の−２２７〜−２９、中でも−２２４〜−８０を含む１５０塩基以下の部分を２段階以上のＡＲＭＳ−ＰＣＲ法で増幅して確認することがより適切であることを見出した。血管内皮細胞由来のｃｆＤＮＡはこの領域の−１８５、−１４４、−１１８、−１０３の位置に４つの非メチル化シトシンを有し、このメチル化パターンは血管内皮細胞に特徴的なものである。【００１９】
ＡＲＭＳ法のプライマーとして、更に種々検討の結果、多くのプライマーの組合せの中から、第１段階のプライマーとして表３のプライマーセットを用い、第２段階のプライマーとして表４のプライマーセットを用いることが、上記標的部分が４個の非メチル化シトシンを有するｃｆＤＮＡを、非メチル化シトシンの１又は複数がメチル化シトシンに置き換わった同じ塩基配列のｃｆＤＮＡや、他の塩基配列のｃｆＤＮＡと区別して、精度よく検出及び定量するために好適であることを見出した。
【表３】
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【表４】
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【００２０】
本発明者は、表３と表４のプライマーセットを用いた２段階ＡＲＭＳ−ＰＣＲ法を使用して、１型糖尿病患者の血中のｃｆＤＮＡの検査を実施したところ、図１４に示されるように、上記標的部分の増幅産物量は平均頸動脈内膜中膜複合体肥厚度（平均ＩＭＴ）と正の相間関係があり、このＡＲＭＳ-ＰＣＲにより血管内皮細胞の傷害が引き起こす動脈硬化を早期発見できることが分かった。【００２１】
また、本発明者は、脂肪細胞由来のｃｆＤＮＡを特異的に検出するためには、ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体（ＰＰＡＲγ）遺伝子の＋２０〜＋１５２、中でも＋２１〜＋１４４を含む１５０塩基以下の部分を２段階以上のＡＲＭＳ-ＰＣＲ法で増幅して確認することがより適切であることを見出した。脂肪細胞由来のｃｆＤＮＡはこの領域の＋５０、＋１００、＋１２３の位置に３つの非メチル化シトシンを有し、このメチル化パターンは脂肪細胞に特徴的なものである。ＰＰＡＲγの発現は、脂肪細胞への分化前は低く、成熟脂肪細胞及び褐色脂肪細胞では高い。【００２２】
ＡＲＭＳ法のプライマーとして、更に種々検討の結果、多くのプライマーの組合せの中から、第１段階のプライマーとして表５のプライマーセットを用い、第２段階のプライマーとして表６のプライマーセットを用いることが、上記標的部分が３個の非メチル化シトシンを有するｃｆＤＮＡを、非メチル化シトシンの１又は複数がメチル化シトシンに置き換わった同じ塩基配列のｃｆＤＮＡや、他の塩基配列のｃｆＤＮＡと区別して、精度よく検出及び定量するために好適であることを見出した。なお、ＡＲＭＳ-ＰＣＲの増幅対象領域には非メチル化シトシンが３つしか存在しないため、表５の第１段階の好適なフォワードプライマーは、後掲の表９の前処理ＰＣＲの好適なフォワードプライマーと同じであり、ＡＲＭＳプライマーの特徴を備えない。
【表５】
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【表６】
2019207921.tif 000008
【００２３】
本発明者らは、表５と表６のプライマーセットを用いた２段階ＡＲＭＳ−ＰＣＲ法を使用して、１型糖尿病患者の血中のｃｆＤＮＡの検査を実施したところ、図１８に示されるように、上記標的部分の増幅産物量は動脈硬化の指標であるＬＤＬ−コレステロール／ＨＤＬ−コレステロール比と正の相間関係があり、このＡＲＭＳ-ＰＣＲにより動脈硬化を早期発見できる可能性が示唆された。【００２４】
本発明者らは、上記の知見に基づいて、本発明を完成した。本発明の要旨は以下の通りである。
〔１〕  被験者の血液中のｃｆＤＮＡの、１５０塩基以下であって、標的組織又は細胞のＤＮＡに特徴的又は特異的な非メチル化シトシンが３個以上存在する標的部分を、２段階以上のＡＲＭＳ−ＰＣＲ法で増幅する工程を含む、標的組織特異的な細胞傷害検査方法。
〔２〕  ＡＲＭＳ−ＰＣＲ法による増幅工程に先立ち、ｃｆＤＮＡの非メチル化シトシンをシトシン以外の塩基に変換する工程を含む、〔１〕に記載の方法。
〔３〕  ＡＲＭＳ−ＰＣＲ法による増幅工程に先立ち、ｃｆＤＮＡの標的部分を含む領域をＰＣＲにより増幅する工程を含む、〔１〕又は〔２〕に記載の方法。
〔４〕  ＡＲＭＳ−ＰＣＲ法で標的部分が増幅されたことを確認することにより、標的組織又は細胞が傷害を受けていると判定する工程を含む、〔１〕〜〔３〕の何れかに記載の方法。
〔５〕  ＡＲＭＳ−ＰＣＲ法の増幅産物中の標的部分を有するＤＮＡを定量することにより、標的組織又は細胞の傷害の程度を判定する工程を含む、〔１〕〜〔３〕の何れかに記載の方法。
〔６〕  標的組織又は細胞が膵β細胞であり、インスリン遺伝子のエクソン２の＋３０７〜＋４２５を含む領域であって、＋３３１位、＋３６７位、＋３７４位、＋４０１位、＋４０４位に非メチル化シトシンを含む領域を、ＡＲＭＳ-ＰＣＲ法で増幅する、〔１〕〜〔５〕の何れかに記載の方法。
〔７〕  下記塩基配列を３’末端に含む４０塩基以下のプライマーを用いて２段階のＡＲＭＳ−ＰＣＲ法を行う、〔６〕に記載の方法。
第１段階のフォワードプライマー：５’−ttgtgaattaatatttgtttg−３’(配列番号１３)、又は配列番号１３において、配列番号１３において、３’末端から３塩基目がtに代えてc又はaである塩基配列
第１段階のリバースプライマー  ：５’−tacaaatcctctacctccgaa−３’(配列番号１４)、又は配列番号１４において、３’末端から３塩基目がgに代えてa又はtである塩基配列
第２段階のフォワードプライマー：５’−aagttttttatttagtgtctg−３’(配列番号１５)、又は配列番号１５において、３’末端から３塩基目がcに代えてa又はtである塩基配列
第２段階のリバースプライマー  ：５’−aatatataaaaaaaacctgat−３’(配列番号１６)
〔８〕  第１段階、及び２段階のＡＲＭＳ−ＰＣＲ法のプライマーが、下記塩基配列からなるものである、〔７〕に記載の方法。
第１段階のフォワードプライマー：５’−tagtttttgtgaattaatatttgtttg−３’（配列番号１）
第１段階のリバースプライマー  ：５’−cctacaaatcctctacctccgaa−３’（配列番号２）
第２段階のフォワードプライマー：５’−tttggtggaagttttttatttagtgtctg−３’（配列番号３）
第２段階のリバースプライマー  ：５’−aatcttaaatatataaaaaaaacctgat−３’（配列番号４）
〔９〕  ２段階のＡＲＭＳ−ＰＣＲ法による増幅工程に先立ち、インスリン遺伝子のエクソン２の＋３０１〜＋４２９を含む領域をＰＣＲ法で増幅する、〔６〕〜〔８〕の何れかに記載の方法。
〔１０〕  標的組織又は細胞が血管内皮細胞であり、ＲＯＢＯ４遺伝子の上流の−２２４〜−８０を含む領域であって、−１８５位、−１４４位、−１１８位、−１０３位に非メチル化シトシンを含む領域をＡＲＭＳ-ＰＣＲ法で増幅する、〔１〕〜〔５〕の何れかに記載の方法。
〔１１〕  下記塩基配列を３’末端に含む４０塩基以下のプライマーを用いて２段階のＡＲＭＳ−ＰＣＲ法を行う、〔１０〕に記載の方法。
第１段階のフォワードプライマー：５’−agaggattaaggttttgagtg−３’(配列番号１７)、又は配列番号１７において、３’末端から３塩基目がgに代えてc又はaである塩基配列
第１段階のリバースプライマー  ：５’−accatttaactataaccccaa−３’(配列番号１８)、又は配列番号１８において、３’末端から２塩基目がaに代えてtである塩基配列
第２段階のフォワードプライマー：５’−atattttgtaagaaatttgtg−３’(配列番号１９)、又は配列番号１９において、３’末端から３塩基目がgに代えてcである塩基配列
第２段階のリバースプライマー  ：５’−acccaaaccctaacttcaaga−３’(配列番号２０)、又は配列番号２０において、３’末端から２塩基目がgに代えてaである塩基配列
〔１２〕  第１段階、及び２段階のＡＲＭＳ−ＰＣＲ法のプライマーが下記塩基配列からなるものである、〔１１〕に記載の方法。
第１段階のフォワードプライマー：５’−agatttaaatagaggattaaggttttgagtg−３’（配列番号５）
第１段階のリバースプライマー  ：５’−tcaaccatttaactataaccccaa−３’（配列番号６）
第２段階のフォワードプライマー：５’−gttagtgtaaggatattttgtaagaaatttgtg−３’（配列番号７）
第２段階のリバースプライマー  ：５’−acccaaaccctaacttcaaga−３’（配列番号８）
〔１３〕  ２段階のＡＲＭＳ−ＰＣＲ法による増幅工程に先立ち、ＲＯＢＯ４遺伝子の上流の−２２７〜−２９を含む領域をＰＣＲ法で増幅する、〔１０〕〜〔１２〕の何れかに記載の方法。
〔１４〕  標的組織又は細胞が脂肪細胞であり、ＰＰＡＲγ遺伝子の＋２１〜＋１４４を含む領域であって、＋５０位、＋１１０位、＋１２３位に非メチル化シトシンを含む領域をＡＲＭＳ-ＰＣＲ法で増幅する、〔１〕〜〔５〕の何れかに記載の方法。
〔１５〕  下記塩基配列を３’末端に含む４０塩基以下のプライマーを用いて２段階のＡＲＭＳ−ＰＣＲ法を行う、〔１４〕に記載の方法。
第１段階のフォワードプライマー：５’−ttttttattgatttag−３’（配列番号２１）
第１段階のリバースプライマー  ：５’−ccttacataaatacccccaga−３’(配列番号２２)
第２段階のフォワードプライマー：５’−tttttattgatttagaaaatg−３’(配列番号２３)
第２段階のリバースプライマー  ：５’−cccccacatccccaataagca−３’(配列番号２４)、又は配列番号２４において、３’末端から２塩基目がgに代えてtである塩基配列
〔１６〕  第１段階、及び２段階のＡＲＭＳ−ＰＣＲ法のプライマーが下記塩基配列からなるものである、〔１５〕に記載の方法。
第１段階のフォワードプライマー：５’−tttgggagatttttttattgatttag−３’（配列番号９）
第１段階のリバースプライマー  ：５’−acccttacataaatacccccaga−３’（配列番号１０）
第２段階のフォワードプライマー：５’−ttgggagatttttttattgatttagaaaatg−３（配列番号１１）
第２段階のリバースプライマー  ：５’−acccccacatccccaataagca−３’（配列番号１２）
〔１７〕  ２段階のＡＲＭＳ−ＰＣＲ法による増幅工程に先立ち、ＰＰＡＲγ遺伝子の＋２０〜＋１５２を含む領域をＰＣＲ法で増幅する、〔１４〕〜〔１６〕の何れかに記載の方法。
〔１８〕  ２段階以上のＡＲＭＳ−ＰＣＲ法が２段階のＡＲＭＳ−ＰＣＲ法である、〔１〕〜〔１７〕の何れかに記載の方法。
〔１９〕  最後のＡＲＭＳ法のサイクル数は、標的領域を含むＤＮＡ（非メチル化シトシンを有する陽性サンプル）のＣｑ値と、対応するメチル化シトシンを有する陰性サンプルの増幅が始まるサイクル数との間とする、〔１〕〜〔１８〕の何れかに記載の方法。
〔２０〕  ２段階以上のＡＲＭＳ−ＰＣＲ法が２段階のＡＲＭＳ−ＰＣＲ法であり、第１段階のＡＲＭＳ−ＰＣＲ法のサイクル数を１２〜１８（中でも１４〜１６、特に１５）とし、第２段階のＡＲＭＳ−ＰＣＲ法のサイクル数を３０〜５０（中でも３５〜４０）とする、〔１９〕に記載の方法。
〔２１〕  ２段階のＡＲＭＳ−ＰＣＲ法に用いられるプライマーのセットであり、各プライマーが下記塩基配列を３’末端に含む４０塩基以下のプライマーである、プライマーセット。
第１段階のフォワードプライマー：５’−ttgtgaattaatatttgtttg−３’(配列番号１３)、又は配列番号１３において、配列番号１３において、３’末端から３塩基目がtに代えてc又はaである塩基配列
第１段階のリバースプライマー  ：５’−tacaaatcctctacctccgaa−３’(配列番号１４)、又は配列番号１４において、３’末端から３塩基目がgに代えてa又はtである塩基配列
第２段階のフォワードプライマー：５’−aagttttttatttagtgtctg−３’(配列番号１５)、又は配列番号１５において、３’末端から３塩基目がcに代えてa又はtである塩基配列
第２段階のリバースプライマー  ：５’−aatatataaaaaaaacctgat−３’(配列番号１６)
〔２２〕  ２段階のＡＲＭＳ−ＰＣＲ法に用いられる下記塩基配列からなるプライマーのセット。
第１段階のフォワードプライマー：５’−tagtttttgtgaattaatatttgtttg−３’（配列番号１）
第１段階のリバースプライマー  ：５’−cctacaaatcctctacctccgaa−３’（配列番号２）
第２段階のフォワードプライマー：５’−tttggtggaagttttttatttagtgtctg−３’（配列番号３）
第２段階のリバースプライマー  ：５’−aatcttaaatatataaaaaaaacctgat−３’（配列番号４）
〔２３〕  ２段階のＡＲＭＳ−ＰＣＲ法に用いられるプライマーのセットであり、各プライマーが下記塩基配列を３’末端に含む４０塩基以下のプライマーである、プライマーセット。
第１段階のフォワードプライマー：５’−agaggattaaggttttgagtg−３’(配列番号１７)、又は配列番号１７において、３’末端から３塩基目がgに代えてc又はaである塩基配列
第１段階のリバースプライマー  ：５’−accatttaactataaccccaa−３’(配列番号１８)、又は配列番号１８において、３’末端から２塩基目がaに代えてtである塩基配列
第２段階のフォワードプライマー：５’−atattttgtaagaaatttgtg−３’(配列番号１９)、又は配列番号１９において、３’末端から３塩基目がgに代えてcである塩基配列
第２段階のリバースプライマー  ：５’−acccaaaccctaacttcaaga−３’(配列番号２０)、又は配列番号２０において、３’末端から２塩基目がgに代えてaである塩基配列
〔２４〕  ２段階のＡＲＭＳ−ＰＣＲ法に用いられる下記塩基配列からなるプライマーのセット。
第１段階のフォワードプライマー：５’−agatttaaatagaggattaaggttttgagtg−３’（配列番号５）
第１段階のリバースプライマー  ：５’−tcaaccatttaactataaccccaa−３’（配列番号６）
第２段階のフォワードプライマー：５’−gttagtgtaaggatattttgtaagaaatttgtg−３’（配列番号７）
第２段階のリバースプライマー  ：５’−acccaaaccctaacttcaaga−３’（配列番号８）
〔２５〕  ２段階のＡＲＭＳ−ＰＣＲ法に用いられるプライマーのセットであり、各プライマーが下記塩基配列を３’末端に含む４０塩基以下のプライマーである、プライマーセット。
第１段階のフォワードプライマー：５’−ttttttattgatttag−３’（配列番号２１）
第１段階のリバースプライマー  ：５’−ccttacataaatacccccaga−３’(配列番号２２)
第２段階のフォワードプライマー：５’−tttttattgatttagaaaatg−３’(配列番号２３)
第２段階のリバースプライマー  ：５’−cccccacatccccaataagca−３’(配列番号２４)、又は配列番号２４において、３’末端から２塩基目がgに代えてtである塩基配列
〔２６〕  ２段階のＡＲＭＳ−ＰＣＲ法に用いられる下記塩基配列からなるプライマーのセット。
第１段階のフォワードプライマー：５’−tttgggagatttttttattgatttag−３’（配列番号９）
第１段階のリバースプライマー  ：５’−acccttacataaatacccccaga−３’（配列番号１０）
第２段階のフォワードプライマー：５’−ttgggagatttttttattgatttagaaaatg−３（配列番号１１）
第２段階のリバースプライマー  ：５’−acccccacatccccaataagca−３’（配列番号１２）
【発明の効果】
【００２５】
本発明方法によれば、ｃｆＤＮＡの１５０塩基以下であって非メチル化シトシンが３個以上存在する標的部分を２段階以上のＡＲＭＳ−ＰＣＲ法で増幅することにより、この標的部分を、非メチル化シトシンの１又は複数がメチル化シトシンに置き換わった同じ塩基配列のｃｆＤＮＡや、他の塩基配列を有するｃｆＤＮＡと区別して特異的に増幅させることができる。この方法は、メチル化パターンの擬陽性が少ない。
ｃｆＤＮＡの標的部分として、特定の細胞で他の体細胞に比べて、非メチル化率が特徴的に高い部分を選択することにより、特定の細胞由来のｃｆＤＮＡを特異的に検出し、定量することができる。特定の細胞由来のｃｆＤＮＡ検出できることは、その細胞又はその細胞が存在する組織が損傷を受けて細胞に由来するＤＮＡがｃｆＤＮＡとして血液中に流出していることを表している。従って、本発明の検出方法によれば、標的細胞の損傷の様子をモニターすることができる。それにより、その組織細胞が傷害を受けている疾患を早期診断し、進行度や重症度を把握することができる。また、移植した臓器又は組織由来のｃｆＤＮＡを検出すれば、移植片の傷害の有無や程度を把握することができる。
ｃｆＤＮＡの特定領域のメチル化パターンの同定は、次世代シークエンサによっても行えるが、次世代シーケンサは多数の領域を網羅的に増幅するため、必要な鋳型核酸量が多いことから採血負担が大きく、解析に時間がかかり、臨床検査に汎用するには高価である。これに対して、本発明方法では、ｃｆＤＮＡ中の標的部分だけを増幅するため、増幅力が高く、例えば、血清０．１ｍＬから精製したｃｆＤＮＡでも適切な時間内に増幅させることができる。また、１回のＰＣＲは通常１．０〜１.５時間という短時間で行え、複数のＰＣＲを並行できるため、検査効率が良い。さらに、ＰＣＲをマイクロアレイ化すれば、非常に多数の検体を同時に検査することができるようになる。また、ＰＣＲは既存の機器を用いて安価に行える。
また、本発明方法は、低侵襲的な方法である。【００２６】
ｃｆＤＮＡの、インスリン遺伝子のエクソン２領域の＋３０１〜＋４２９、中でも＋３０７〜＋４２５を含む１５０塩基以下の領域に５つの非メチル化シトシンを有する部分を増幅する場合は、膵β細胞インスリン遺伝子に由来するｃｆＤＮＡを特異的に検出し、定量することができる。従って、膵β細胞の損傷の様子をモニターすることができる。また、膵β細胞の大半が破壊されて高血糖を示す前段階から１型糖尿病を早期発見することができる。【００２７】
ｃｆＤＮＡの、ＲＯＢＯ４遺伝子の上流の−２２７〜−２９、中でも−２２４〜−８０を含む１５０塩基以下の領域に４つの非メチル化シトシンを有する部分を増幅する場合は、血管内皮細胞由来のｃｆＤＮＡを特異的に検出及び定量することができる。これにより、血管内皮細胞傷害が引き起こす様々な合併症を直接的に検出し、モニターし、その重症度を把握することができる。従来は、血管内皮機能検査や頸動脈エコーにより臨床症状を検査することで、血管内皮傷害を間接的に検出していたため、手間がかかり、検査間、施設間のバラツキが生じていたが、本発明方法は簡便で、かつ検査間、施設間のバラツキが少ない。【００２８】
ｃｆＤＮＡの、ＰＰＡＲγ遺伝子の＋２０〜＋１５２、中でも＋２１〜＋１４４を含む１５０塩基以下の領域に３つの非メチル化シトシンを有する部分を増幅する場合は、脂肪細胞由来のｃｆＤＮＡを特異的に検出及び定量することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２９】
【図１】インスリン遺伝子のエクソン２領域のＣｐＧ配列は、他の体細胞（血液、乳腺、結腸、腎臓、肝臓、肺、脾臓、胃）と比べて、膵β細胞でＣｐＧのメチル化の割合が低いことを表した図である。ＰＬｏＳ  ＯＮＥ  ９（４）ｅ９４５９１（２０１４）の図３を改変して使用した。
【図２】インスリン遺伝子のエクソン２領域を遺伝子増幅するためのＰＣＲ用プライマーの位置を表した図である。
【図３】インスリン遺伝子のエクソン２領域を増幅するＡＲＭＳ法で使用するプライマーにおいて、ミスマッチ部分の適切な種類を選択するために作製された各３種のプライマーを表した図である。
【図４】上記図３で作製されたプライマーの効率を検証した図である。最初のＡＲＭＳ-ＰＣＲでは、Ｆ２とＲ２の組合せ、Ｆ３とＲ１の組合せ、Ｒ３とＲ２の組合せが良好であることが示された。
【図５】図４と同様に、図３で作製されたプライマーの効率を検証した図である。第２のＡＲＭＳ-ＰＣＲでは、Ｆ１とＲ１の組合せが良好であることが示された。
【図６】１型糖尿病患者（Ｔ１Ｄ）と健常人（Ｎｏｒｍａｌ）の各ｃｆＤＮＡ、ＥＣプラスミド、ＥＴプラスミドを用いて、プライマーとして、Ｆ３とＲ１、Ｆ３とＲ２、Ｆ２とＲ２の組合せで遺伝子増幅した場合の増幅効率を検証した図である。Ｆ３Ｒ１の組み合わせがＴ１Ｄの検出能が最も高いことが示された。
【図７】図６のＥＴプラスミドに代えて、血液ｇｅｎｏｍｅＤＮＡを用いて、プライマーの増幅効率を検証した図である。ネガティブコントロールである血液ｇｅｎｏｍｅＤＮＡよりもＦ３Ｒ１を用いたＰＣＲではＣｑ値が低くより陽性であるデータを示した。
【図８】最初のＰＣＲのプライマーとして、Ｆ２Ｒ２、Ｆ３Ｒ２、Ｆ３Ｒ１の３種の組合せの中で、Ｆ３Ｒ１の組合せが、血中膵β細胞のｃｆＤＮＡを的確に遺伝子増幅できることを検証した図である。
【図９】最初のＰＣＲのプライマーとして、Ｆ２Ｒ１とＦ３Ｒ１の組合せを用いた場合の遺伝子増幅効率を比較した図である。Ｆ３Ｒ１の組み合わせの方がＦ２Ｒ１の組み合わせよりも陽性サンプルであるＴ１ＤとＮｏｒｍａｌのＰＣＲのＣｑ値の差がより大きく検出できていることが示された。
【図１０】本発明のプライマーのセットとして、最初にＦ３Ｒ１、次にＦ１Ｒ１を使用することにより、１型糖尿病患者のｃｆＤＮＡと健常人のｃｆＤＮＡから膵β細胞に由来するインスリン遺伝子を検出でき、患者と健常人の区別ができることを検証した図である。健常人のサンプルでは２１検体中１検体で強陽性であったが、小児１型糖尿病患者のサンプルでは１０検体中９検体で強陽性であった。また、成人１型糖尿病患者のサンプルでは５０検体中４検体で強陽性であった。
【図１１】ＲＯＢＯ４遺伝子上流領域を遺伝子増幅するためのＰＣＲ用プライマーの位置を表した図である。
【図１２】ＲＯＢＯ４遺伝子上流の標的領域をＡＲＭＳ法で増幅した場合、非メチル化シトシンを含むプラスミドとメチル化シトシンを含むプラスミドの増幅効率が大きく異なることを示す図である。
【図１３】別のプライマーセットを用いても、図１２と同様の結果が得られることを示す図である。
【図１４】ＲＯＢＯ４遺伝子上流の標的領域をＡＲＭＳ法で増幅した場合の増幅ＤＮＡ量と、平均ＩＭＴとが相関していることを示す図である。
【図１５】ＰＰＡＲγ遺伝子を遺伝子増幅するためのＰＣＲ用プライマーの位置を表した図である。
【図１６】ＰＰＡＲγ遺伝子の標的領域をＡＲＭＳ法で増幅した場合、非メチル化シトシンを含むプラスミドとメチル化シトシンを含むプラスミドの増幅効率が大きく異なることを示す図である。
【図１７】別のプライマーセットを用いても、図１６と同様の結果が得られることを示す図である。
【図１８】ＰＰＡＲγ遺伝子の標的領域をＡＲＭＳ法で増幅した場合の増幅ＤＮＡ量と、ＬＤＬ−コレステロール／ＨＤＬ−コレステロール比とが相関していることを示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００３０】
本発明の組織特異的な細胞傷害検査方法は、被験者の血液中のｃｆＤＮＡの１５０塩基以下であって非メチル化シトシンが３個以上存在する標的部分を２段階以上のＡＲＭＳ−ＰＣＲ法で増幅する工程を含む方法である。
【００３１】
血液は、全血、血漿、血清の何れでも良い。検査精度が良い点で血漿、血清が好ましい。血清は、一般に臨床検査対象試料となっており、採血量を増やさずに本発明の検査方法を行える点で、より好ましい。血液からのｃｆＤＮＡの調製又は精製は、市販キットを用いて行える。
血液は、哺乳動物のものが好ましく、中でもヒトの血液が好ましい。
【００３２】
ｃｆＤＮＡ中の標的部分としては、傷害検出対象組織又は細胞で特徴的又は特異的にＣｐＧのＣが非メチルしている部分を選択すればよい。即ち、標的組織又は細胞のＤＮＡに特徴的又は特異的な非メチル化シトシンが３個以上存在する１５０塩基以下の部分を選択すればよい。後述するように、標的部分に存在する非メチル化シトシンの中には、ＡＲＭＳ法でメチル化シトシンと区別しないものも存在し得るが、その非メチル化シトシンは、標的組織又は細胞以外の組織又は細胞のＤＮＡにも存在していてよい。
【００３３】
ＤＮＡのメチル化情報は、次世代シーケンシングやパイロシーケンシングにより蓄積された情報や、文献記載の情報などを利用すればよく、また、実験により個々に見出してもよい。例えば、標的組織又は細胞でタンパクが高発現している遺伝子を検索し、その中から、その遺伝子やその上流領域のメチル化パターンが組織又は細胞により大きく異なるものを選択し、その中から、非メチル化シトシンを１５０塩基内に３個以上含む領域であってその非メチル化が標的組織又は細胞に特徴的である領域を選択することができる。非メチル化シトシンを１５０塩基内に３個以上含む領域を使用することにより、２段階以上のＡＲＭＳ−ＰＣＲで非メチル化シトシンを含むＤＮＡを選択的に増幅させることができる。
ＡＲＭＳ-ＰＣＲは、２段階以上行えばよく、原則、回数が多いほど非メチル化シトシンを含むＤＮＡの選択精度が高くなるが、回数が多過ぎると標的細胞に特異的な非メチル化シトシンでない非メチル化シトシンまで検出する確率が高くなる。従って、例えば５段階以下、４段階以下、又は３段階以下とすることができ、２段階が好ましい。
【００３４】
また、ＡＲＭＳ法で、陰性検体の増幅を抑えて陽性検体を優先的に増幅させるために、例えば、２段階のＡＲＭＳ法を行う場合は、第１段階のＡＲＭＳ法のサイクル数は、標的領域を含むＤＮＡが第２段階のＡＲＭＳ法の検出感度内に収まるように増幅される最低限のサイクル数とし、また、第２段階のＡＲＭＳ法のサイクル数は、標的領域を含むＤＮＡが十分増幅するように設定すればよい。第２段階のＡＲＭＳ法のサイクル数は、標的領域を含むＤＮＡ（非メチル化シトシンを有する陽性サンプル）のＣｑ値と、対応するメチル化シトシンを有する陰性サンプルの増幅が始まるサイクル数との間とすることができる。例えば、第１段階のＡＲＭＳ法のサイクル数は１２〜１８（中でも１４〜１６、特に１５）とし、第２段階のＡＲＭＳ−ＰＣＲ法のサイクル数を３０〜５０（中でも３５〜４０）とすることができる。
３段階以上のＡＲＭＳ法を行う場合も同様であり、最後より前段階のＡＲＭＳ法のサイクル数は、標的領域を含むＤＮＡが最終段階のＡＲＭＳ法の検出感度内に収まるように増幅される最低限のサイクル数とすればよい。最終段階のＡＲＭＳ法のサイクル数は、標的領域を含むＤＮＡ（非メチル化シトシンを有する陽性サンプル）のＣｑ値と、対応するメチル化シトシンを有する陰性サンプルの増幅が始まるサイクル数との間とすることができる。
【００３５】
傷害検出対象組織又は細胞は、限定されず、疾患に関係するあらゆる組織又は細胞を対象にすることができる。本発明の具体的態様では、膵β細胞、血管内皮細胞、脂肪細胞といった糖尿病に関連した細胞を対象としているが、その他にも、脳神経細胞、心筋細胞、肝細胞、腎細胞、移植した臓器の細胞など、広く対象にすることができる。
【００３６】
ＡＲＭＳ-ＰＣＲを行う前に、ｃｆＤＮＡの非メチル化シトシンを、シトシン以外、例えばウラシルに変換すればよい。非メチル化シトシンのウラシルへの変換は、例えばバイスルファイト処理により行える。それにより、標的細胞由来のＤＮＡの非メチル化シトシンは、チミンに変換されて増幅されるので、シトシンのままであるメチル化シトシンを有するｃｆＤＮＡと区別できる。
【００３７】
検体に含まれるＤＮＡコピー数は、通常、大変少量であるため、ＡＲＭＳ-ＰＣＲに先立ち、ｃｆＤＮＡの標的部分を含む領域をＰＣＲにより増幅することが好ましい。この前処理ＰＣＲは、メチル化シトシンをシトシン以外の塩基に置換した後に行えばよい。この前処理ＰＣＲは、ＣｐＧ配列のメチル化状態のいかんにかかわらず、即ち、メチル化シトシンと非メチル化シトシンを区別せずに、標的部分を含む領域を増幅する。前処理ＰＣＲにより増幅する部分の長さはｃｆＤＮＡの長さの範囲内であればよく、例えば１６０ｂｐ以下であり得る。
【００３８】
ＡＲＭＳ−ＰＣＲ法では、フォワードプライマーは、３’末端をミスマッチのない塩基として設定し、３’末端から２塩基目にメチル化シトシン又は非メチル化シトシン由来のチミンが来るように設定することができる。この場合、プライマーがミスマッチを起こして、ＰＣＲが起こらなくなるように、更に５’側にもう１塩基のミスマッチを作る。また、リバースププライマーは、３’末端をミスマッチのない塩基として設定し、３’末端から２塩基目又は３塩基目にメチル化シトシン又は非メチル化シトシン由来のチミンが来るように設定することができる。この場合、プライマーがミスマッチを起こして、ＰＣＲが起こらなくなるように、３’末端から３塩基目又は２塩基目に、もう１塩基のミスマッチを作る。これにより、塩基１個のミスマッチである場合には、ＰＣＲで増幅が起こるが、塩基２個のミスマッチがあれば、ＰＣＲで増幅が起こらない。このような遺伝子増幅システムがＡＲＭＳ−ＰＣＲ法というものである。
【００３９】
各段階のＡＲＭＳ-ＰＣＲでは、フォワードプライマー及びリバースプライマーは、標的部分の何れかの非メチル化シトシンをメチル化シトシンと区別できるように設計すればよい。区別される非メチル化シトシンは各段階のＡＲＭＳ-ＰＣＲで重複していてもよい。また、何れの段階のＡＲＭＳ-ＰＣＲでも区別されない非メチル化シトシンが存在していてもよいが、非メチル化シトシンの検出精度を良くするため、標的部分に３個又は４個の非メチル化シトシンが存在する場合は、全ての非メチル化シトシンをメチル化シトシンと区別できるようにフォワードプライマーとリバースプライマーを設計することが好ましい。また、非メチル化シトシンの検出精度を良くするため、標的部分に存在する非メチル化シトシンのうち最も５’側及び最も３’側の非メチル化シトシンはメチル化シトシンと区別できるようにフォワードプライマーとリバースプライマーを設計することが好ましい。
本発明において、標的部分に存在する非メチル化シトシンの数が多いほど、非メチル化シトシンを有する目的のｃｆＤＮＡの標的領域を特異的に増幅する精度が向上する。非メチル化シトシンが多すぎるとプライマー設計の傷害になり得るため、標的部分に存在する非メチル化シトシンの数は、１０個以下、８個以下、又は６個以下であり得る。標的部分に存在する非メチル化シトシンのうち、標的細胞に特異的でないものがあれば、その非メチル化シトシンはメチル化シトシンと区別するようにプライマーを設計しなくてよい。
【００４０】
非メチル化シトシンが４個存在する標的部分を２段階のＡＲＭＳ-ＰＣＲで増幅する場合、例えば、第１ＡＲＭＳ-ＰＣＲでは、最も外側の２つの非メチル化シトシンを区別できるようにフォワードプライマーとリバースプライマーを設計し、第２ＡＲＭＳ-ＰＣＲでは、その内側の２つの非メチル化シトシンを区別できるようにフォワードプライマーとリバースプライマーを設計すればよい。
また、非メチル化シトシンが５個以上存在する標的部分を２段階のＡＲＭＳ-ＰＣＲで増幅する場合は、例えば、第１ＡＲＭＳ-ＰＣＲでは、最も外側の２つの非メチル化シトシンを区別できるようにフォワードプライマーとリバースプライマーを設計し、第２ＡＲＭＳ-ＰＣＲでは、その内側の２つの非メチル化シトシンを区別できるようにフォワードプライマーとリバースプライマーを設計すればよい。
また、非メチル化シトシンが３個存在する標的部分を２段階のＡＲＭＳ-ＰＣＲで増幅する場合は、例えば、第１ＡＲＭＳ-ＰＣＲでは、最も外側の２つの非メチル化シトシンを区別できるようにフォワードプライマーとリバースプライマーを設計し、第２ＡＲＭＳ-ＰＣＲでは、第１ＡＲＭＳ-ＰＣＲで区別した非メチル化シトシンを再度区別できるようにフォワードプライマー又はリバースプライマーを設計することができる。また、第１又は第２のＡＲＭＳ−ＰＣＲの何れか一方のフォワードプライマー又はリバースプライマーを、ＡＲＭＳ法の特徴を備えないプライマー、即ち、非メチル化シトシンとメチル化シトシンを区別しないプライマーとすることもできる。このように、本発明では、フォワードプライマー又はリバースプライマーの一方がＡＲＭＳ法の特徴を備えないプライマーであるＰＣＲもＡＲＭＳ-ＰＣＲに含まれる。
【００４１】
本発明方法は、ＡＲＭＳ−ＰＣＲ法で標的部分が増幅されたことを確認することにより、標的組織又は細胞が傷害を受けていると判定する工程を含むことができる。２段階以上のＡＲＭＳ法により、標的組織又は細胞のｃｆＤＮＡの標的部分が増幅されるが、標的以外の組織又は細胞のｃｆＤＮＡの対応する部分も増幅される場合がある。しかし、標的組織又は細胞のｃｆＤＮＡの標的部分が顕著に効率よく増幅されるため、増幅曲線から標的組織又は細胞のｃｆＤＮＡの標的部分が増幅したことを把握できる。さらに、増幅産物のシーケンス解析を行うことで、標的組織又は細胞のｃｆＤＮＡの３つ以上の非メチル化シトシンを含む標的部分が増幅されたことを確認できる。
また、本発明は、ＡＲＭＳ−ＰＣＲ法の増幅産物中の標的部分を有するＤＮＡを定量することにより、標的組織又は細胞の傷害の程度を判定する工程を含むことができる。
【００４２】
膵β細胞由来のｃｆＤＮＡを特異的に検出するためには、インスリン遺伝子のエクソン２の＋３０１〜＋４２９、中でも＋３０７〜＋４２５を含む（特に、＋３０１〜＋４２９、中でも＋３０７〜＋４２５からなる領域）領域をＡＲＭＳ-ＰＣＲで増幅することが好ましい。このための上記表１と表２に記載されたプライマーは、３’末端から３番目の塩基の設定が重要であり、プライマーの長さは大きな影響を与えない。従って、プライマーの長さは、アニーリングを起こすために必要な長さがあればよく、２１塩基以上あればよい。また、プライマーの長さの上限は４０塩基程度とすればよい。
例えば、第１段階のプライマーセットでは、フォワードプライマーは少なくとも５’−ttgtgaattaatatttgtttg−３’(配列番号１３)の塩基配列、リバースプライマーは少なくとも５’−tacaaatcctctacctccgaa−３’(配列番号１４)の塩基配列を有していればよい。また、配列番号１３において、３’末端から３塩基目がtに代えてc又はaである塩基配列を有するフォワードプライマーも使用できる。また、配列番号１４において、３’末端から３塩基目がgに代えてa又はtである塩基配列を有するリバースプライマーも使用できる。また、第２段階のプライマーセットでは、フォワードプライマーは少なくとも５’−aagttttttatttagtgtctg−３’(配列番号１５)の塩基配列、リバースプライマーは少なくとも５’−aatatataaaaaaaacctgat−３’(配列番号１６)の塩基配列を有していればよい。また、配列番号１５において、３’末端から３塩基目がcに代えてa又はtである塩基配列を有するフォワードプライマーも使用できる。各プライマーは、３’末端にこれらの塩基配列を含む４０塩基以下のプライマーであればよい。
その他にも、膵β細胞由来のｃｆＤＮＡのインスリン遺伝子のエクソン２の＋３０１〜＋４２９、中でも＋３０７〜＋４２５を含む領域（特に、＋３０１〜＋４２９、中でも＋３０７〜＋４２５からなる領域）を特異的に増幅できるプライマーは存在し得る。
【００４３】
血管内皮細胞由来のｃｆＤＮＡを特異的に検出するためには、ＲＯＢＯ４遺伝子の上流の−２２７〜−２９、中でも−２２４〜−８０を含む領域（特に、−２２７〜−２９、中でも−２２４〜−８０からなる領域）をＡＲＭＳ-ＰＣＲで増幅することが好ましい。このための上記表３と表４に記載されたプライマーは、フォワードプライマーは３’末端から３番目の塩基の設定が重要であり、リバースプライマーは３’末端から２番目の塩基の設定が重要である。例えば、第１段階のプライマーセットでは、フォワードプライマーは少なくとも５’−agaggattaaggttttgagtg−３’(配列番号１７)の塩基配列、リバースプライマーは少なくとも５’−accatttaactataaccccaa−３’(配列番号１８)の塩基配列を有していればよい。また、配列番号１７において、３’末端から３塩基目がgに代えてc又はaである塩基配列を有するフォワードプライマーも使用できる。また、配列番号１８において、３’末端から２塩基目がaに代えてtである塩基配列を有するリバースプライマーも使用できる。また、第２段階のプライマーセットでは、フォワードプライマーは少なくとも５’−atattttgtaagaaatttgtg−３’(配列番号１９)の塩基配列、リバースプライマーは少なくとも５’−acccaaaccctaacttcaaga−３’(配列番号２０)の塩基配列を有していればよい。また、配列番号１９において、３’末端から３塩基目がgに代えてcである塩基配列を有するフォワードプライマーも使用できる。また、配列番号２０において、３’末端から２塩基目がgに代えてaである塩基配列を有するリバースプライマーも使用できる。各プライマーは、３’末端にこれらの配列を含む４０塩基以下のプライマーであればよい。
その他にも、血管内皮細胞由来のｃｆＤＮＡのＲＯＢＯ４遺伝子の上流の−２２７〜−２９、中でも−２２４〜−８０を含む領域（特に、−２２７〜−２９、中でも−２２４〜−８０からなる領域）を特異的に増幅できるプライマーは存在し得る。
【００４４】
脂肪細胞由来のｃｆＤＮＡを特異的に検出するためには、ＰＰＡＲγ遺伝子の＋２０〜＋１５２、中でも＋２１〜＋１４４を含む領域（特に、＋２０〜＋１５２、中でも＋２１〜＋１４４からなる領域）をＡＲＭＳ-ＰＣＲで増幅することが好ましい。このための上記表５と表６に記載されたプライマーは、フォワードプライマーは３’末端から３番目の塩基の設定が重要であり、リバースプライマーは３’末端から２番目又は３番目の塩基の設定が重要である。例えば、第１段階のプライマーセットでは、フォワードプライマーは、ＡＲＭＳの特徴を備えないため、少なくとも１６塩基の、５’−ttttttattgatttag−３’（配列番号２１）の塩基配列を有していればよい。リバースプライマーは少なくとも５’−ccttacataaatacccccaga−３’(配列番号２２)の塩基配列を有していればよい。また、第２段階のプライマーセットでは、フォワードプライマーは少なくとも５’−tttttattgatttagaaaatg−３’(配列番号２３)の塩基配列、リバースプライマーは少なくとも５’−cccccacatccccaataagca−３’(配列番号２４)の塩基配列を有していればよい。また、配列番号２４において、３’末端から３塩基目がgに代えてtである塩基配列を有するリバースプライマーも使用できる。各プライマーは、３’末端にこれらの配列を含む４０塩基以下のプライマーであればよい。
その他にも、脂肪細胞由来のｃｆＤＮＡのＰＰＡＲγ遺伝子の＋２０〜＋１５２、中でも＋２１〜＋１４４を含む領域（特に、＋２０〜＋１５２、中でも＋２１〜＋１４４からなる領域）を特異的に増幅できるプライマーは存在し得る。
【実施例】
【００４５】
次に実施例を挙げて本発明を更に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
（Ｉ）ｃｆＤＮＡ中の膵β細胞特異的なインスリン遺伝子の検出及び定量
（実施例１）ｃｆＤＮＡの分離精製
血中にエクソソーム等の形で微小量循環する膵β細胞のインスリン遺伝子を検出するため、まず、被験者の血液から、膵β細胞のインスリン遺伝子のエクソン２部分の遺伝子を増幅して採取した。
（１）方法
ａ）ｃｆＤＮＡの採取とバイスルファイト処理：
被験者から採血し、血清分離のために３０分以上室温で保存した。血清を４℃  １３５０Ｇで１２分遠心し、上清を新たな１５ｍＬチューブに移した。さらに血清を４℃ ３０００Ｇで１２分遠心して上清（約３ｍＬ）を１ｍＬずつ分注した。血清１ｍＬより、ＢＩＯＯ  ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ  ＣＯＲＲＰＯＲＡＴＩＯＮ社のＮｅｘｔＰｒｅｐ―Ｍａｇ  ｃｆＤＮＡ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｋｉｔを用いてｃｆＤＮＡを精製、キットに含まれる溶出液の１２μＬで溶出した。溶出液１０μＬを用いてｉｎｎｕＣＯＮＶＥＲＴ  Ｂｉｓｕｌｆｉｔｅ  Ｂａｓｉｃ  Ｋｉｔ（Ａｎａｌｙｔｉｋ  Ｊｅｎａ社）を用いてバイスルファイト処理を行い、キットに含まれる溶出液の５０μＬで溶出した。
ｂ）膵β細胞のインスリン遺伝子のエクソン２部分の増幅：
上記溶出液を用いて、ｃｆＤＮＡのインスリン遺伝子のエクソン２部分をＣｐＧのメチル化の有無にかかわらず、遺伝子増幅した。ＰＣＲの機材はＢＩＯ−ＲＡＤ社のＴ１００ＴＭＴｈｅｒｍａｌ  Ｃｙｃｌｅｒを使用した。
ＱＩＡＧＥＮ推奨プロトコール  (ｃａｔ．Ｎｏｓ．２０３６４３)に基づき、上記バイスルファイト処理液（１本鎖ＤＮＡ）５μＬ、ＰＣＲマスターミックス（Ｑｉａｇｅｎ社ＨｏｔＳｔａｒ  Ｔａｑ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ）１０μＬ、表７のプライマーミックス（５μＭｅａ．）１μＬ、Ｃａｒａ  Ｉ Ｌｏａｄ  ２μＬ、無菌蒸留水２μＬを使用し、９５℃で５分間処理した後、９４℃で３０秒、５０℃で３０秒、７２℃で３０秒の反応処理を１５サイクル行った。その後、７２℃で１０分間の反応を行った。【００４６】
【表７】
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【００４７】
（２）結果
増幅されたエクソン２部分のＤＮＡの中に膵β細胞のインスリン遺伝子由来のＤＮＡが含まれると、図２に示されるように、＋３３１位、＋３６７位、＋３７４位、＋４０１位、＋４０４位の５カ所の非メチル化シトシン（Ｃ）がチミン（Ｔ）に変化した二本鎖ＤＮＡが存在することになる。【００４８】
（実施例２）ＡＲＭＳ法による選択的な膵β細胞のインスリン遺伝子のエクソン２部分の増幅のためのプライマー検討
（１）プライマーの作成
実施例１で得られたエクソン２部分の増幅二本鎖ＤＮＡを用いて、＋３３１位、＋４０４位のＣｐＧの脱メチル化の有無を確認することを行った。脱メチル化されていれば、遺伝子増幅が可能であり、膵β細胞のインスリン遺伝子由来のＤＮＡが選択的に遺伝子増幅されることになる。
第１、第２のＡＲＭＳ-ＰＣＲのプライマーとして、図３に示すプライマーを作製した。第１、第２のＡＲＭＳ−ＰＣＲで増幅されるインスリン遺伝子のエクソン２領域の部分は、図３に示す通りである。まず、フォワードプライマー及びリバースプライマーとして、３’末端から３つ目の塩基をミスマッチさせた各３種類のプライマーを作製した。そして、各プライマーの特異度（ミスマッチに関するプライマーの特異性）と組合せを検討した。なお、逆側のプライマーは膵β細胞でも非膵β細胞でも増幅するプライマーの中から検出精度の高いものを選択した。【００４９】
（２）方法
ＰＣＲのプライマーの最適化を目指して、以下のモデル反応を行った。使用するインスリン遺伝子のＤＮＡは次のものである。
ａ）膵β細胞由来ＤＮＡをバイスルファイト処理したときのインスリン遺伝子のＣｐＧ配列がＴＧに変化したものを含むＥＴ（Exon2_AllT）プラスミド（非メチル化ＣｐＧを模したもの）
ｂ）非膵β細胞由来ＤＮＡをバイスルファイト処理したときのインスリン遺伝子のＣｐＧ配列が同じＣＧであるものを含むＥＣ（Exon2_AllC）プラスミド（メチル化ＣｐＧを模したもの）
これらプラスミドのＰＣＲを行うことで、プライマーのミスマッチの特異度が、どれだけＥＴで増幅されやすく、ＥＣで増幅されにくいかで、プライマーの性能を評価できると考えた。
十分量のプラスミドを用いるため前処理ＰＣＲは行わなかった。第１段階のＡＲＭＳ法のプライマーの検討のためのＰＣＲは、Ｒｏｃｈｅ  Ｌｉｇｈｔｃｙｃｌｅｒ  ９６推奨プロトコールに基づき行った。第１段階のＡＲＭＳ法としては、ＥＴプラスミドとＥＣプラスミドの１×１０４−７/μＬを１μＬ、ＰＣＲマスターミックス（ＦａｓｔＳｔａｒｔ  Ｔａｑ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ）１０μＬ、表１のプライマーミックス（９μＭｅａ．）１μＬ、無菌蒸留水８μＬを使用し、９５℃で１０分間処理した後、９５℃で１０秒、５６℃で１０秒、７２℃で１０秒の反応処理を４０サイクル行った。また、第２段階のＡＲＭＳ法のプライマーの検討のためのＰＣＲは、別途、ＥＴプラスミドとＥＣプラスミドを鋳型にして、表１のプライマーミックスに代えて表２のプライマーミックスを用いた他は、上記の第１段階の方法と同様にした。【００５０】
（３）結果
増幅曲線を図４に示す。図４に示されるように、第１段階のＡＲＭＳ法で使用するプライマーの中では、フォワードプライマーはＦ２又はＦ３、リバースプライマーはＲ１又はＲ２を用いた場合に、ＥＴとＥＣとの間のＣｑ（Ｃｔ；Ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ  Ｃｙｃｌｅ）の差が大きく、良好な分離が得られた。また、図５に示されるように、第２段階のＡＲＭＳ法で使用するプライマーの中では、フォワードプライマーはＦ１が最もＣｑの分離が良好であり、リバースプライマーはＲ１のみがＰＣＲで増幅することが示された。従って、第２段階のＡＲＭＳ法で使用するプライマーはＦ１とＲ１の組み合わせとなった。【００５１】
（実施例３）第１段階のＡＲＭＳ法で用いるプライマーの検討
実施例２で良好な結果が得られた、第１段階のＡＲＭＳ法で使用されるプライマーの中で、どの組み合わせが実際の患者および健常者の血清から取り出した陽性および陰性のｃｆＤＮＡで差が出るかについて検討した。
（１）方法
次の試料を用いて、プライマーの組合せ（Ｆ３Ｒ１、Ｆ３Ｒ２、Ｆ２Ｒ２、Ｆ２Ｒ１、Ｆ１Ｒ２）の効果を確認した。
ａ）１型糖尿病患者（Ｔ１Ｄ）血清から実施例１に準じて得られたｃｆＤＮＡ溶液
ｂ）健常人血清から実施例１に準じて得られたｃｆＤＮＡ溶液
ｃ）実施例２で用いたＥＴプラスミドとＥＣプラスミドの溶液
ｄ）血液のゲノムＤＮＡ（Ｂｌｏｏｄ  Ｇｅｎｏｍｅ  ＤＮＡ）の溶液
なお、ＰａｎｃｒｅａｓゲノムＤＮＡ（１型糖尿病患者（Ｔ１Ｄ）血清のｃｆＤＮＡ溶液）は、Ｂｉｏ  Ｃｈａｉｎ社のヒト成人の正常組織（膵臓）由来のゲノムＤＮＡを用い、ＢｌｏｏｄゲノムＤＮＡはＰｒｏｍｅｇａ社  のヒト  ゲノムＤＮＡを用いた。各５μｇを上記の方法でバイスルファイト処理を行い、キットに含まれる溶出液の２５μＬでの溶出を２回行った（合計５０μＬ）。Ｐｒｏｍｅｇａ社のＱｕａｎｔｕｓＴＭＦｌｕｏｒｏｍｅｔｅｒで一本鎖ＤＮＡ量の濃度測定を行い、溶出したバイサルファイト後の一本鎖ゲノムＤＮＡの濃度を測り、１ｎｇ／μＬに調整し、１μＬ（1ｎｇ）を用いた。
第１段階のＡＲＭＳ法を行った後、第２段階のＡＲＭＳ法をＦ１Ｒ１のプライマーの組み合わせで行った。【００５２】
（２）結果
第１段階のＡＲＭＳ−ＰＣＲの増幅曲線を図６、７に示す。図６では、ＥＴをポジティブコントロールとして用い、図７では血液中のゲノムＤＮＡをネガティブコントロールとして用いた。図６、図７に示されるように、膵β細胞由来のインスリン遺伝子の増幅効率は、Ｆ３Ｒ１、Ｆ３Ｒ２、Ｆ２Ｒ２の順に高かった。また、図７から、Ｆ３Ｒ１を用いた場合、１型糖尿病患者由来のｃｆＤＮＡの方が、多種類のｃｆＤＮＡを含む血液中のゲノムＤＮＡよりも増幅効率が高いことから、１型糖尿病患者由来のｃｆＤＮＡを検出していることが確認された。
また図示しないが、Ｆ１Ｒ２、Ｆ２Ｒ１の各プライマーの組合せについても、遺伝子増幅効率が高かった。
図８に、増幅産物の電気泳動結果を示す。図８に示されるように、Ｆ２Ｒ２、Ｆ３Ｒ２の各プライマーの組合せでは陽性検体であるＴ１Ｄの検体で陽性を示さなかった。
第１段階のＡＲＭＳ−ＰＣＲにおいて、Ｆ２Ｒ１、Ｆ３Ｒ１の各プライマーの組み合わせを用いた場合の、増幅曲線を図９の上段に示し、融解曲線を図９の下段に示す。図９に示されるように、Ｆ２Ｒ１、Ｆ３Ｒ１共に、１型糖尿病患者サンプルで陽性であったが、健常人でも陽性となった。また図示しないが、電気泳動ではＦ２Ｒ１、Ｆ３Ｒ１共に検出されたＰＣＲ産物長が陽性であったが、融解温度曲線の結果から、フォワードプライマーとリバースプライマーに挟まれた領域内の＋３６７、＋３７４、＋４０１の位置の塩基が異なる複数のＤＮＡが増幅されていることが確認された。
なお、陽性（１型糖尿病患者）サンプルと陰性（健常人）サンプルのＣｑ値の差は、Ｆ３Ｒ１がＦ２Ｒ１よりも大きいことから、ＰＣＲの特異度はＦ３Ｒ１の方が優れていると考えられた。【００５３】
（実施例４）第１段階でＦ３Ｒ１を使用し、第２段階でＦ１Ｒ１のプライマーの組合せを使用する、患者および健常者のｃｆＤＮＡのインスリン遺伝子評価
（１）患者および健常者のｃｆＤＮＡサンプル
ａ）健常人のｃｆＤＮＡ溶液
健常人２１名の血清から実施例１に準じてｃｆＤＮＡ溶液を作製した。
ｂ）成人１型糖尿病患者血清のｃｆＤＮＡ溶液
成人１型糖尿病患者５０名の血清から実施例１に準じてｃｆＤＮＡ溶液を作製した。
患者背景は男性/女性：14/40例、平均年齢：46.9±15.2才、罹病期間：11.9±9.9年、HbA1c: 8.1±1.8％、血清Cペプチド0.52±1.33ng/mL、GAD抗体：2643±13910U/mL
ｃ）小児１型糖尿病患者のｃｆＤＮＡ溶液
徳島大学病院に通院中の小児１型糖尿病患者１０名の血清から実施例１に準じてｃｆＤＮＡ溶液を作製した。患者背景は男児/女児：7/3例、平均年齢：12.5±6.0才、罹病期間：5.0±3.6年、HbA1c: 7.8±1.0％、血清Cペプチド1.45±0.32ng/mL、GAD抗体：226±426U/mL
（２）方法
上記の各ｃｆＤＮＡを使用し、実施例２に準じて、ＡＲＭＳ−ＰＣＲを行った。
まず、上記ｃｆＤＮＡ溶液（精製処理済み）１μＬと、ＰＣＲマスターミックス（ＦａｓｔＳｔａｒｔ  Ｔａｑ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ）１０μＬ、表１のプライマーミックス（９μＭｅａ．）１μＬ、無菌蒸留水８μＬを使用し、９５℃で１０分間処理した後、９５℃で１０秒、５６℃で１０秒、７２℃で１０秒の反応処理を１５回サイクル行った。
第１段階のＡＲＭＳ・ＰＣＲ増幅処理液（精製処理済み）１μＬ、ＰＣＲマスターミックス（ＦａｓｔＳｔａｒｔ  Ｔａｑ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ）１０μＬ、表２のプライマーミックス（９μＭｅａ．）１μＬ、無菌蒸留水８μＬを使用し、９５℃で１０分間処理した後、９５℃で１０秒、５６℃で１０秒、７２℃で１０秒の反応処理を４０回サイクル行った。【００５４】
（３）結果
図１０に示されるように、１型糖尿病患者の血清では、健常人の血清と比較すると、膵β細胞由来のインスリン遺伝子に基づくｃｆＤＮＡが血中に認められた。
最終的なＰＣＲを４０サイクル増幅していることから、ＰＣＲの元の溶液に１コピー陽性サンプルが存在すると理論上２８サイクルで陽性になる。従って、ＰＣＲ溶解波形解析で、被検者のｃｆＤＮＡのメチル化パターンが、膵β細胞のインスリン遺伝子と同じメチル化パターンを有するＥＴプラスミドと同じパターンを呈しているものを陽性とした。
成人１型糖尿病患者のサンプルでは、５０検体中４検体で強陽性、１７例で弱陽性であった。別途行ったシークエンス解析でこれら２１例の陽性のサンプル中１９例で陽性となった。これらシークエンス解析の結果から２回目のＰＣＲでは３５サイクル以下で陽性となることが示された。小児１型糖尿病患者のサンプルでは１０検体中９検体で強陽性、１例で弱陽性となった。一方、健常人のサンプルでは２１検体中１検体で強陽性、６検体で弱陽性となった。
以上の結果から、小児１型糖尿病検体で強陽性が多かった結果は、平均罹病期間の短く、血中Ｃペプチド（インスリンは、プロインスリンからＣペプチドが除去されて生成するため、Ｃペプチド量は残存インスリン量を表す）濃度の保たれている小児１型糖尿病の病態を反映しており、成人１型糖尿病検体で陽性例が少なかった結果は、平均罹病期間の長く、血中Ｃペプチド濃度の低下した成人１型糖尿病の病態と反映していると考えられた。健常人でも陽性になるのは健常な膵β細胞のリニューアルに伴うもの、あるいは１型糖尿病前段階であることも否定できないが、循環血中に膵β細胞に由来するインスリン遺伝子を検出できるということは、高血糖に先行して膵β細胞が破壊されることを示すと考えられた。従って、本発明の検出方法により、全体の約７０〜８０％以上の膵β細胞の破壊による高血糖となる前の段階から膵β細胞傷害を検出できることが示された。
以上のように、本発明のＡＲＭＳ法により、患者および健常者のｃｆＤＮＡから膵β細胞に由来するインスリン遺伝子を的確に検出し、膵β細胞の傷害の程度を的確に評価できることが明らかとなった。【００５５】
（ＩＩ）ｃｆＤＮＡ中の血管内皮細胞特異的なＲＯＢＯ４遺伝子の上流領域の検出及び定量【００５６】
（実施例５）ＡＲＭＳ法による選択的な血管内皮細胞のＲＯＢＯ４遺伝子の上流領域の増幅
（１）プライマーの作製
第１、第２のＡＲＭＳ−ＰＣＲのプライマーとして、それぞれ表３（Ｆ１，Ｒ３）、表４（Ｆ１、Ｒ１）に示すものを作製した。第１、第２のＡＲＭＳ−ＰＣＲで増幅されるＲＯＢＯ４遺伝子の上流領域の部分は、図１１に示す通りである。【００５７】
（２）ＲＯＢＯ４遺伝子の上流領域の増幅
上記のプラマーセットを用いた２段階のＡＲＭＳ-ＰＣＲにより、内皮細胞由来のＲＯＢＯ４遺伝子の上流部分が特異的に増幅されることを、以下の方法で確認した。使用するＲＯＢＯ４遺伝子の上流部分のＤＮＡは次のものである。。
ａ）血管内皮細胞由来ＤＮＡをバイスルファイト処理したときのＲＯＢＯ４遺伝子の上流領域のＣｐＧ配列がＴＧに変化したものを含むAllTプラスミド（非メチル化ＣｐＧを模したもの）
ｂ）血管内皮細胞由来ＤＮＡをバイスルファイト処理したときのＲＯＢＯ４遺伝子の上流領域のＣｐＧ配列が同じＣＧであるものを含むAllCプラスミド（メチル化ＣｐＧを模したもの）
AllTプラスミド及びAllCプラスミドは、それぞれ、ＲＯＢＯ４遺伝子の上流の-２２７〜-２９の部分を含み、但し、AllTプラスミドは、−１８５位、−１４４位、−１１８位、−１０３位の４カ所の非メチル化シトシンをチミンに置き換えており、AllCプラスミドは、これら４カ所がシトシンのままである。十分量のプラスミドを用いるため前処理ＰＣＲは行わなかった。
ＰＣＲは、Ｒｏｃｈｅ  Ｌｉｇｈｔｃｙｃｌｅｒ  ９６推奨プロトコールに基づき行った。第１段階のＡＲＭＳ法用のプライマーを用いたＰＣＲは、AllTプラスミドとAllCプラスミドの各１×１０４−７/μＬを１μＬ、ＰＣＲマスターミックス（ＦａｓｔＳｔａｒｔ  Ｔａｑ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ）１０μＬ、表３のプライマーミックス（５μＭｅａ．）１μＬ、無菌蒸留水８μＬを使用し、９５℃で１０分間処理した後、９５℃で１０秒、５５℃で１０秒、７２℃で１０秒の反応処理を４０サイクル行った。また、第２段階のＡＲＭＳ法用のプライマーを用いたＰＣＲは、別途、AllTプラスミドとAllCプラスミドを鋳型にして、表３のプライマーミックスに代えて表４のプライマーミックスを用いた他は、上記の第１段階のＡＲＭＳ法用プライマーを用いた方法と同様にした。【００５８】
増幅曲線を図１２に示す。上記プライマーセットを用いた第１、第２のＡＲＭＳ−ＰＣＲを行った結果、AllTプラスミドの増幅効率はAllCプラスミドの増幅効率より顕著に高く、Ｃｑ値の良好な分離が認められた。上記プライマーセットを用いた２段階のＡＲＭＳ法によりｃｆＤＮＡ中の血管内皮細胞由来のＲＯＢＯ４遺伝子の上流部分を選択的に増幅できることが分かる。【００５９】
また、表３、表４に示すプライマーに代えて、下記プライマーを用いて、同様の条件で第１、第２のＡＲＭＳ−ＰＣＲ法を行った増幅曲線を図１３に示す。これらのプライマーを用いた場合も、AllTプラスミドの増幅効率はAllCプラスミドの増幅効率より顕著に高く、Ｃｑ値の良好な分離が認められた。
第１段階のＡＲＭＳ
フォワードプライマー：agatttaaatagaggattaaggttttgactg（Ｆ２）(配列番号２７)
リバースプライマー  ：tcaaccatttaactataaccccaa（Ｒ３）(配列番号２８)
フォワードプライマー：agatttaaatagaggattaaggttttgaatg（Ｆ３）(配列番号２９)
リバースプライマー  ：tcaaccatttaactataaccccta（Ｒ２）(配列番号３０)
第２段階のＡＲＭＳ
フォワードプライマー：gttagtgtaaggatattttgtaagaaatttctg（Ｆ２）(配列番号３１)
リバースプライマー  ：acccaaaccctaacttcaaaa（Ｒ３）(配列番号３２)【００６０】
（実施例６）１型糖尿病患者の血管内皮細胞傷害検査
１型糖尿病患者４５名（男性１５名、女性３０名）の血清から実施例１の方法でｃｆＤＮＡ溶液を調製し、バイスルファイト処理を行った。得られた溶出液を用いてｃｆＤＮＡのＲＯＢＯ４遺伝子の上流の-２２７〜-２９の部分をＣｐＧのメチル化の有無にかかわらず、遺伝子増幅した。方法は、表７のプライマーに代えて表８のプライマーを用いた他は、実施例１と同じである。
増幅された-２２７〜-２９の部分のＤＮＡに血管内皮細胞のＲＯＢＯ４遺伝子の上流領域由来のＤＮＡが含まれると、図１１に示されるように、−１８５位、−１４４位、−１１８位、−１０３位の４カ所の非メチル化シトシンがチミンに変化したＤＮＡが存在することになる。【００６１】
【表８】
2019207921.tif 000010
次いで、実施例５と同条件の連続した２段階のＡＲＭＳ法で、表３、表４に示すプライマーを用いて、ＲＯＢＯ４遺伝子の上流の-２２４〜-８０の部分のＣｐＧが非メチル化されているものを増幅した。
各患者の増幅されたｃｆＤＮＡコピー数に対して平均頸動脈内膜中膜複合体肥厚度（平均ＩＭＴ）をプロットしたグラフを図１４に示す。増幅したｃｆＤＮＡコピー数と平均ＩＭＴとの間には相関が認められた（ｒ＝０．３７、ｐ＝０．０１２）。糖尿病患者は合併症として血管内皮細胞が傷害を受けている場合が多く、血管内皮細胞が傷害を受けると平均ＩＭＴが高くなることから、上記プライマーセットを用いた２段階のＡＲＭＳ法により、血管内皮細胞由来のｃｆＤＮＡを特異的に定量でき、従って、血管内皮細胞傷害の程度を検査できることが分かる。【００６２】
（ＩＩＩ）ｃｆＤＮＡ中の脂肪細胞特異的なＰＰＡＲγ遺伝子の検出及び定量【００６３】
（実施例７）ＡＲＭＳ法による選択的な脂肪細胞のＰＰＡＲγ遺伝子の増幅
（１）プライマーの作製
第１、第２のＡＲＭＳ−ＰＣＲのプライマーとして、それぞれ表５、表６（Ｆ３、Ｒ１）に示すものを作製した。第１、第２のＡＲＭＳ−ＰＣＲで増幅されるＰＰＡＲγ遺伝子の部分は、図１５に示す通りである。
（２）ＰＰＡＲγ遺伝子の増幅
上記のプラマーセットを用いた２段階のＡＲＭＳ-ＰＣＲにより、脂肪細胞由来のＰＰＡＲγ遺伝子が特異的に増幅されることを、以下の方法で確認した。使用するＰＰＡＲγ遺伝子のＤＮＡは次のものである。。
ａ）脂肪細胞由来ＤＮＡをバイスルファイト処理したときのＰＰＡＲγ遺伝子のＣｐＧ配列がＴＧに変化したものを含むAllTプラスミド（非メチル化ＣｐＧを模したもの）
ｂ）脂肪細胞由来ＤＮＡをバイスルファイト処理したときのＰＰＡＲγ遺伝子のＣｐＧ配列が同じＣＧであるものを含むAllCプラスミド（メチル化ＣｐＧを模したもの）
AllTプラスミド及びAllCプラスミドは、それぞれ、ＰＰＡＲγ遺伝子の上流の＋２０〜＋１５２の部分を含み、但し、AllTプラスミドは、＋５０位、＋１１０位、＋１２３位の３カ所の非メチル化シトシンをチミンに置き換えており、AllCプラスミドは、これら３カ所がシトシンのままである。十分量のプラスミドを用いるため前処理ＰＣＲは行わなかった。
第１段階のＡＲＭＳ法用のプライマーを用いたＰＣＲは、AllTプラスミドとAllCプラスミドを各１×１０４-７/μＬ、ＰＣＲマスターミックス（KOD -Multi & Epi-）１０μＬ、表５のプライマーミックス（５μＭｅａ．）１μＬ、無菌蒸留水８μＬを使用し、９４℃で２分間処理した後、９８℃で１０秒、５３℃で１０秒、６８℃で３０秒の反応処理を５０回サイクル行った。また、第２段階のＡＲＭＳ法用のプライマーを用いたＰＣＲは、別途、AllTプラスミドとAllCプラスミドを鋳型にして、表５のプライマーミックスに代えて表６のプライマーミックスを用いた他は、第１段階のＡＲＭＳ法用プライマーを用いた方法と同じにした。【００６４】
増幅曲線を図１６に示す。上記プライマーセットを用いた第１、第２のＡＲＭＳ−ＰＣＲを行った結果、AllTプラスミドの増幅効率はAllCプラスミドの増幅効率より顕著に高く、Ｃｑ値の良好な分離が認められた。上記プライマーセットを用いた２段階のＡＲＭＳ法によりｃｆＤＮＡ中の脂肪細胞由来のＰＰＡＲγ遺伝子を選択的に増幅できることが分かる。【００６５】
また、表６に示すプライマーに代えて、下記プライマーを用いて、同様の条件で第２のＡＲＭＳ−ＰＣＲ法を行った増幅曲線を図１７に示す。これらのプライマーを用いた場合も、AllTプラスミドの増幅効率はAllCプラスミドの増幅効率より顕著に高く、Ｃｑ値の良好な分離が認められた。
第２段階のＡＲＭＳ
フォワードプライマー：ttgggagatttttttattgatttagaaaatg（Ｆ３）(配列番号１１)
リバースプライマー  ：acccccacatccccaataatca（Ｒ２）(配列番号３５)【００６６】
（実施例８）１型糖尿病患者の脂肪細胞傷害検査
１型糖尿病患者３３名の血清から実施例１の方法でｃｆＤＮＡ溶液を調製し、バイスルファイト処理した。このｃｆＤＮＡを鋳型として、実施例１と同様にしてＰＰＡＲγ遺伝子の＋２０〜＋１５２の部分をＣｐＧのメチル化の有無にかかわらず増幅した。方法は、表７のプライマーに代えて表９のプライマーを用いた他は、実施例１と同じである。増幅された＋２０〜＋１５２の領域に脂肪細胞のｃｆＤＮＡのＰＰＡＲγ遺伝子のＤＮＡが含まれると、＋５０位、＋１１０位、＋１２３位の３カ所の非メチル化シトシンがチミンに変化したＤＮＡが存在することになる。【００６７】
【表９】
2019207921.tif 000011
【００６８】
次いで、実施例７と同条件の連続した２段階のＡＲＭＳ法で、ＰＰＡＲγ遺伝子の＋２１〜＋１４４の部分のＣｐＧが非メチル化されているものを増幅した。
各患者の増幅されたｃｆＤＮＡコピー数に対してＬＤＬ-コレステロール／ＨＤＬ-コレステロール比をプロットしたグラフを図１８に示す。増幅したｃｆＤＮＡコピー数が多いほどＬＤＬ-コレステロール／ＨＤＬ-コレステロール比は高い傾向があり、両者には相関が認められた（Ｒ２＝０．３２５９）。このように増幅したＰＰＡＲγのコピー数と動脈硬化の指標であるＬＤＬ-コレステロール／ＨＤＬ-コレステロール比が正相関することから、新たな動脈硬化のマーカーとなりうることが示された。
【産業上の利用可能性】
【００６９】
本発明の標的細胞由来のｃｆＤＮＡの検出方法により、低侵襲的に、少ない血液サンプル量で、短時間に、かつ低コストで標的細胞の傷害を判定することができる。本発明方法は、各種の標的細胞のＤＮＡについて蓄積されたメチル化パターンの情報を利用するため、様々な組織の細胞に応用でき、非常に有用なものである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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