(57)【要約】パーキンソン病を予防又は治療する手段が提供される。例えば、ダブラフェニブ又はその塩を含む、パーキンソン病予防又は治療剤が提供される。
2019124478.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ダブラフェニブ又はその塩を含む、パーキンソン病予防又は治療剤。
【請求項２】
ダブラフェニブメシル酸塩を含む、パーキンソン病予防又は治療剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、パーキンソン病予防又は治療剤等に関する。
【背景技術】
【０００２】
パーキンソン病は、手の震え・動作や歩行の困難などの運動障害を引き起こす錐体外路症状を呈する進行性の神経変性疾患である。【０００３】
パーキンソン病は、筋肉運動を制御する黒質緻密部において、ドパミンを産生するニューロンが死滅するか又は正常に機能しない。ただ、神経細胞損傷の原因は知られていない。 通常、６０歳前後の個体がパーキンソン病に侵されるが、より早期に発症する場合もある。 無動はパーキンソン病の主症状であるが、通常、運動機能が徐々に低下し、運動量の減少、運動遂行の減速及び自動運動能力の損失を伴う。【０００４】
パーキンソン病の患者は、筋緊張の特徴的な増加を示し、最終的に静止時振戦を発症する。症状が増幅されるに従い、パーキンソン病患者は、歩行、会話又は単純作業の実施が困難となる。【０００５】
また、パーキンソン病患者は、うつ病性障害、睡眠障害、さらに認知障害及び自律神経障害を呈する場合もある。 【０００６】
通常、パーキンソン病の症状は、黒質のドパミン作動性ニューロンの５０％が破壊されて初めて発現すると認識されている。これら５０％の破壊ニューロンに加えて、１５％〜２０％がサイレント、すなわち、形態学的に無傷であるが、もはやドパミンを産生しないか、又はほとんどドパミンを産生しないと考えられている。【０００７】
現在使用されている薬剤は、主として各種形態のＬ−ドパ及びドパミン作動性アンタゴニストである。これらの薬剤は、パーキンソン病の症状を緩和することはできるが、疾患の進行を停止することはできず、まして損傷を受けたニューロンの機能を再生することはできない。
また、これらの薬剤は、種々の末梢性副作用、特に低血圧及び悪心を生じる。より深刻なことは治療の５年〜１０年後、生理的なドパミンの定常放出とは対照的に、１日数回の摂取でこれらの分子の投与を繰り返すと、通常非常に耐え難い運動症状の変動（motor fluctuations）が誘発されるという事実がある。したがって、これらの分子は単に対症的に作用するものであり、変性過程を減速させないことに留意しなければならない。【０００８】
ＭＰＴＰ（１−メチル−４−フェニル−１，２，３，６−テトラヒドロピリジン：１−ｍｅｔｈｙｌ−４−ｐｈｅｎｙｌ−１，２，３，６−ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏｐｙｒｉｄｉｎｅ）が投与されたヒト、サル、マウス、その他の動物はパーキンソン病患者で見られるドパミンニューロンの脱落を引き起こすことが知られており、パーキンソン病モデル動物作製に汎用されている。ＭＰＴＰはモノアミン酸化酵素の基質となり、ＭＰＰ＋（１−メチル−４−フェニルピリジニウムイオン）へと体内で代謝され、ＭＰＰ＋はドーパミン取り込み機構によってドーパミンニューロンに取り込まれ、神経毒性（例えば、ドーパミンの減少やニューロンの変性）を示す。【０００９】
よって、ＭＰＴＰ又はＭＰＰ＋の投与にも関わらず、ドパミンニューロンの脱落を引き起こさないようにすることができる手段を見いだせれば、パーキンソン病を予防及び治療する可能性が開けると考えられる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】国際公開第２０１５／０９９０９４号
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】Ｋｏｅｎ  Ｂｏｓｓｅｒｓ，  ｅｔ．  ａｌ．，  Ｂｒａｉｎ  Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ，  ２００９
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
本発明は、パーキンソン病を予防又は治療する手段を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明者らは、ダブラフェニブを投与すると、ＭＰＴＰ又はＭＰＰ＋の投与にも関わらず、神経毒性を抑制可能であることを見出し、さらに改良を重ねて本発明を完成させるに至った。【００１４】
本発明は例えば以下の項に記載の主題を包含する。
項１．
ダブラフェニブ又はその塩を含む、パーキンソン病予防又は治療剤。
項２．
ダブラフェニブメシル酸塩を含む、パーキンソン病予防又は治療剤。
項１ａ．
ＢＲＡＦ活性化剤（好ましくは、ダブラフェニブ、ベムラフェニブ、エンコラフェニブ、あるいはこれらの塩）を含む、神経変性抑制剤。
項２ａ．
ＢＲＡＦ活性化剤が、ダブラフェニブ又はその塩（特に好ましくはダブラフェニブメシル酸塩）を含む、項１ａに記載の神経変性抑制剤。
項３ａ．
神経変性抑制剤が、パーキンソン病予防又は治療剤である、項１ａ又は２ａに記載の神経変性抑制剤。
項１ｂ．
ＥＲＫ活性化剤（好ましくは、ダブラフェニブ、ベムラフェニブ、エンコラフェニブ、あるいはこれらの塩）を含む、神経変性抑制剤。
項２ｂ．
ＥＲＫ活性化剤が、ダブラフェニブ又はその塩（特に好ましくはダブラフェニブメシル酸塩）を含む、項１ｂに記載の神経変性抑制剤。
項３ｂ．
神経変性抑制剤が、パーキンソン病予防又は治療剤である、項１ｂ又は２ｂに記載の神経変性抑制剤。
【発明の効果】
【００１５】
本発明により、神経変性に起因する疾病（特にパーキンソン病）を予防又は治療することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】ＢＲＡＦ活性化剤（具体的にはダブラフェニブ）による、ＭＰＰ＋神経毒性抑制効果を、ＬＤＨアッセイ及びＭＴＳアッセイにより検討した結果を示す。
【図２】ＢＲＡＦ活性化剤（具体的にはダブラフェニブ）による、ＭＰＰ＋神経毒性抑制効果を検討するため、活性化カスパーゼ−９又はカスパーゼ−３の発現をウエスタンブロッティングにより解析した結果を示す。
【図３ａ】ＢＲＡＦ活性化剤（具体的にはダブラフェニブ）を脳室投与することにより、ＭＰＴＰ投与によるパーキンソン病モデルマウスの作成が阻害されるかを検討する実験の投与スケジュールを示す。
【図３ｂ】図３ａのスケジュールでダブラフェニブメシル酸塩及びＭＰＴＰが投与されたマウスの脳切片において、中脳黒質緻密部のＴＨ（ｔｙｒｏｓｉｎｅ  ｈｙｄｒｏｘｙｌａｓｅ）及び粗面小胞体（Ｎｉｓｓｌ  ｂｏｄｙ）の両方が陽性のニューロンの数をカウントした結果をグラフにして示す。左側に脳切片観察画像、右側にドパミンニューロンカウント数を示す。
【図４】ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞、ＲＩＴ２遺伝子がノックアウトされたＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞、及びＲＩＴ２遺伝子がノックアウトされたＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞にＲＩＴ２遺伝子発現ベクターを組み込んだ細胞、について、リン酸化ＥＲＫの発現程度を抗リン酸化ＥＲＫ特異的抗体を用いたウエスタンブロッティングにより解析した結果を示す。
【図５】ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞、ＲＩＴ２遺伝子がノックアウトされたＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞、及びＲＩＴ２遺伝子がノックアウトされたＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞にダブラフェニブを添加した細胞、について、リン酸化ＥＲＫの発現程度を抗リン酸化ＥＲＫ特異的抗体を用いたウエスタンブロッティングにより解析した結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
以下、本発明の各実施形態について、さらに詳細に説明する。
ｓｅｒｉｎｅ／ｔｈｒｅｏｎｉｎｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｋｉｎａｓｅであるＲＡＦには、ヒトでＡ−ＲＡＦ、Ｂ−ＲＡＦ、及びＣ−ＲＡＦの３種類のｐａｒａｌｏｇが存在する。低分子ＧＴＰ結合タンパクであるＲＡＳが活性化によりＲＡＦを活性化する。ＲＡＦの作用により、第二のｐｒｏｔｅｉｎ  ｋｉｎａｓｅ  ＭＥＫ，  次いで第三のｐｒｏｔｅｉｎ  ｋｉｎａｓｅ  ＥＲＫ（Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｓｉｇｎａｌ−ｒｅｇｕｌａｔｅｄ  Ｋｉｎａｓｅ）が順次活性化される。
【００１８】
本発明に包含される神経変性抑制剤は、Ｂ−ＲＡＦ（ｖ−ｒａｆ  ｍｕｒｉｎｅ  ｓａｒｃｏｍａ  ｖｉｒａｌ  ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ｈｏｍｏｌｏｇ  Ｂ１）（以下「ＢＲＡＦ」）の働きを活性化するＢＲＡＦ活性化剤を含む。
【００１９】
ＢＲＡＦ活性化剤としては、公知のものを用いることができる。例えば、例えばダブラフェニブ、ベムラフェニブ、エンコラフェニブ、あるいはこれらの塩等が挙げられる。塩としては、特に制限されず、薬学的に許容されるものを適宜選択して好ましく用いることができる。塩としては、例えば、フッ化水素酸塩、塩酸塩、臭化水素酸塩、ヨウ化水素酸塩などのハロゲン化水素酸塩；塩酸塩、硝酸塩、過塩素酸塩、硫酸塩、リン酸塩などの無機酸塩；メシル酸塩（メタンスルホン酸塩）、トリフルオロメタンスルホン酸塩、エタンスルホン酸塩などの低級アルカンスルホン酸塩；ベンゼンスルホン酸塩、ｐ−トルエンスルホン酸塩などのアリールスルホン酸塩；酢酸塩、りんご酸塩、フマル酸塩、コハク酸塩、クエン酸塩、アスコルビン酸塩、酒石酸塩、シュウ酸塩、マレイン酸塩などの有機酸塩；ナトリウム塩、カリウム塩、リチウム塩などのアルカリ金属塩；カルシウム塩、マグネシウム塩などのアルカリ土類金属塩；アルミニウム塩、鉄塩などの金属塩；アンモニウム塩などの無機塩；ｔ−オクチルアミン塩、ジベンジルアミン塩、モルホリン塩、グルコサミン塩、フェニルグリシンアルキルエステル塩、エチレンジアミン塩、Ｎ−メチルグルカミン塩、グアニジン塩、ジエチルアミン塩、トリエチルアミン塩、ジシクロヘキシルアミン塩、  Ｎ，Ｎ’−ジベンジルエチレンジアミン塩、クロロプロカイン塩、プロカイン塩、ジエタノールアミン塩、Ｎ−ベンジルフェネチルアミン塩、ピペラジン塩、テトラメチルアンモニウム塩、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン塩などの有機塩などのアミン塩；グリシン塩、リジン塩、アルギニン塩、オルニチン塩、グルタミン酸塩、アスパラギン酸塩などのアミノ酸塩などが挙げられる。
【００２０】
【化１】
2019124478.tif 000003
【００２１】
【化２】
2019124478.tif 000004
【００２２】
【化３】
2019124478.tif 000005
【００２３】
特に制限はされないが、ＢＲＡＦ活性化剤として用いられるより好ましい前記塩としては、例えば、ダブラフェニブメシル酸塩が挙げられる。
【００２４】
ところで、これらの薬剤は、ＡＴＰ拮抗的ＲＡＦ阻害効果によりＢＲＡＦ阻害剤として用いられている。ただし、これらの薬剤がＢＲＡＦ阻害剤として働くのは、ＢＲＡＦが恒常的に発現する変異（特にＢＲＡＦ  Ｖ６００Ｅ  変異）を有する変異型ＢＲＡＦに対してであり、正常型（野生型）のＢＲＡＦに対して用いた場合には、ＲＡＳ  ＧＴＰａｓｅ依存的にＲＡＦタンパク質が二量体化し，ＢＲＡＦ阻害剤の結合したサブユニットが反対側のサブユニットを活性化することにより、ＢＲＡＦが活性化される。つまり、正常型ＢＲＡＦに対しては、これらの薬剤はＢＲＡＦ活性化剤として働く。
【００２５】
ＢＲＡＦ活性化剤は、１種単独で又は２種以上を組み合わせて用いてもよい。例えば、ダブラフェニブ、ベムラフェニブ、エンコラフェニブ、及びこれらの塩からなる群より選択される少なくとも１種の化合物を含む。
【００２６】
ＢＲＡＦが活性化されるとは、すなわちＢＲＡＦがリン酸化されることであり、活性化は例えばリン酸化ＢＲＡＦ特異的抗体を用いた解析（例えばウエスタンブロッティング解析）により確認することができる。
【００２７】
本発明に包含される神経変性抑制剤は、ＥＲＫ（Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｓｉｇｎａｌ−ｒｅｇｕｌａｔｅｄ  Ｋｉｎａｓｅ）の働きを活性化するＥＲＫ活性化剤を含む。ＥＲＫはＥＲＫ１，ＥＲＫ２、ＥＲＫ１／２であり得る。
【００２８】
ＥＲＫ活性化剤としては、公知のものを用いることができる。例えばダブラフェニブ、ベムラフェニブ、エンコラフェニブ、あるいはこれらの塩等が挙げられる。塩としては、特に制限されず、薬学的に許容されるものを適宜選択して好ましく用いることができる。塩としては、例えば、上述したものが挙げられる。
【００２９】
特に制限はされないが、ＥＲＫ活性化剤として用いられるより好ましい前記塩としては、例えば、ダブラフェニブメシル酸塩が挙げられる。
【００３０】
ところで、上記の通り、これらの薬剤は、正常型ＢＲＡＦに対してはＢＲＡＦ活性化剤として働く。少し前述した通り、ＭＡＰキナーゼカスケードでは、ＢＲＡＦが活性化されることにより、最終的にはＥＲＫ１／２が活性化される。よって、一般的に、ＢＲＡＦ活性化剤としてはたらく物質をＥＲＫ活性化剤として用いることができる。
【００３１】
ＥＲＫ活性化剤は、１種単独で又は２種以上を組み合わせて用いてもよい。例えば、ダブラフェニブ、ベムラフェニブ、エンコラフェニブ、及びこれらの塩からなる群より選択される少なくとも１種の化合物を含む。
【００３２】
ＥＲＫが活性化されるとは、すなわちＥＲＫがリン酸化されることであり、活性化は例えばリン酸化ＥＲＫ特異的抗体を用いた解析（例えばウエスタンブロッティング解析）により確認することができる。
【００３３】
本発明に包含される神経変性抑制剤は、有効成分であるＢＲＡＦ阻害剤又はＥＲＫ活性化剤を、水、生理食塩水、または緩衝液等の薬理学的に許容される溶媒を用いて希釈、溶解、または分散等し、対象に投与するための医薬形態とすることができる。当該神経変性抑制剤は、任意の剤形で製剤化されていてよい。剤形としては、例えば、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、細粒剤、散剤、徐放性製剤、液剤、懸濁剤、エマルジョン剤、シロップ剤、エリキシル剤等の経口剤、注射剤、坐剤等の非経口剤が挙げられる。製剤化にあたっては、例えば、賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、緩衝剤、安定化剤、矯味剤、矯臭剤、着色剤、香料、希釈剤、界面活性剤等の薬理学的に許容される添加剤を使用することができる。
【００３４】
神経変性抑制剤における有効成分（ＢＲＡＦ阻害剤又はＥＲＫ活性化剤）の濃度は、神経変性を抑制（特に好ましくは、パーキンソン病を予防又は治療）できる範囲であれば特に制限されず、有効成分の種類、剤型、投与態様等の諸条件に応じて適宜設定することができる。例えば、９０、８０、７０、６０、５０、４０、３０、２０、１０、又は５％（ｗ／ｗ）以下であってよい。また例えば、０．０１、０．１、又は１％（ｗ／ｗ）以上であってよい。なお、有効成分が化合物塩である場合には、化合物換算して濃度は算出する。
【００３５】
本発明の神経変性抑制剤を対象に投与することにより、神経変性の抑制を行うことができる。よって、本発明の神経変性抑制剤は、神経変性に起因する疾病（神経変性疾患）の予防及び／又は治療用の医薬として使用することができる。また、本発明は、本発明の神経変性抑制剤を神経変性疾患の治療または予防が必要なヒト等の哺乳動物を含む対象に投与することを含む、神経変性疾患を抑制（予防及び／又は治療）する方法をも包含する。神経変性疾患としては、例えばパーキンソン病や筋萎縮性側索硬化症等が挙げられ、特にパーキンソン病が好ましく挙げられる。
【００３６】
本発明の神経変性抑制剤の投与量は、有効成分の含有量、用法、年齢、性別、症状の程度等の諸条件に応じて適宜設定することができる。例えば、１０〜１０００ｍｇ／日程度とすることができる。また、１日１回又は複数回（例えば２又は３回）に分けて投与することができる。各回の投与時の投与量は、有効成分の投与量に換算して一定でもよく、差があってもよい。投与形態は、例えば、経口投与又は静脈投与が好ましい。
【００３７】
なお、本明細書において「含む」とは、「本質的にからなる」と、「からなる」をも包含する（The term "comprising" includes "consisting essentially of” and "consisting of."）。
【実施例】
【００３８】
以下、本発明をより具体的に説明するが、本発明は下記の例に限定されるものではない。なお、検討に用いた各試薬の入手先は次の通りである。また、マウスは、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスをチャールズリバー社から購入して用いた。【００３９】
・ダブラフェニルブ：Ｃａｙｍａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ  （Ａｎｎ  Ａｒｂｏｒ，  ＭＩ，  ＵＳＡ）  及び  Ｓｅｌｌｅｃｋ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ  （Ｈｏｕｓｔｏｎ，  ＴＸ，  ＵＳＡ）
・ＭＰＰ＋：Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  （Ｓｔ．  Ｌｏｕｉｓ，  ＭＯ，  ＵＳＡ）．  
・抗活性化ｃａｓｐａｓｅ−３抗体（＃９６６５，  １：１，０００）、，  抗活性化ｃａｓｐａｓｅ−９抗体（＃７２３７，  １：１，０００），  抗ＥＲＫ  １／２抗体（＃４６９５，  １：１，０００），  抗ｐｈｏｓｐｈｏ−ＥＲＫ  １／２抗体（＃４３７０，  １：２，０００），  以上Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  （Ｂｅｖｅｒｌｙ，  ＭＡ，  ＵＳＡ）．  
・抗β−ａｃｔｉｎ抗体  （Ａ１９７８，  １：２，０００）  （Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）
・抗ｔｙｒｏｓｉｎｅ  ｈｙｄｒｏｘｙｌａｓｅ  （ＴＨ）抗体（６５７０１２，  １：５，０００）  Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ  （Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，  ＣＡ，  ＵＳＡ）．【００４０】
神経毒性抑制効果の検討（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）
９６ウェルプレートにヒト神経芽腫細胞であるＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞を播種し、ＢＲＡＦ活性化剤（具体的にはダブラフェニブ）を添加して（終濃度０、０．２、１、又は５μＭ）、２４時間培養後、ＭＰＰ＋（１−メチル−４−フェニルピリジニウムイオン）を終濃度３ｍＭで添加した。さらに２４時間培養した後、ＬＤＨアッセイ又はＭＴＳアッセイにより、細胞生存率（Ｃｅｌｌ  Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ）又は細胞障害を測定した。【００４１】
なお、１ウェルに播種する細胞数は２×１０４とし、ＦＢＳフリーのＤＭＥＭ培地を用いて、３７℃、５％ＣＯ２濃度で培養を行った。【００４２】
ＬＤＨアッセイは、Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｋｉｔ  （Ｒｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，  ＩＮ，  ＵＳＡ）を用いて行った。当該アッセイは、障害を受けた細胞から放出される乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）を測定することにより細胞傷害を測定する。より具体的には、放出されたＬＤＨが乳酸をピルビン酸に酸化することで、ＮＡＤ＋をＮＡＤＨ＋／Ｈ＋に還元する。次に触媒（Ｄｉａｐｈｏｒａｓｅ）がＨ／Ｈ＋をＮＡＤＨ＋／Ｈ＋から黄色のテトラゾリウム塩に転移し、４９０ｎｍの吸収をもつホルマザンに還元する。したがって、４９０ｎｍの吸光度量を測定することでＬＤＨ活性を検討できる。【００４３】
ＭＴＳアッセイは、Ｃｅｌｌ  Ｔｉｔｅｒ  ９６  Ａｑｕｅｏｕｓ  Ｏｎｅ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ  ｃｅｌｌ  ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  ａｓｓａｙ  （Ｐｒｏｍｅｇａ，  Ｍａｄｉｓｏｎ，  ＷＩ，  ＵＳＡ）を用いて行った。当該アッセイは、３−（４，５−ｄｉｍｅｔｈｙｌｔｈｉａｚｏｌ−２−ｙｌ）−５−（３−ｃａｒｂｏｘｙｍｅｔｈｏｘｙｐｈｅｎｙｌ）−２−（４−ｓｕｌｆｏｐｈｅｎｙｌ）−２Ｈ−ｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ，ｉｎｎｅｒ  ｓａｌｔ（ＭＴＳ）が、生細胞によって還元され、培地に可溶な有色のホルマザン産物に変換されることを特徴としており、４９０ｎｍの当該ホルマザン定量値が、培地中の生細胞数を反映している。【００４４】
これらの結果を、コントロール（ダブラフェニブメシル酸塩及びＭＰＰ＋の添加無し）を０％（ＬＤＨアッセイ）又は１００％（ＭＴＳアッセイ）としたときの相対値をグラフにして図１に示す。ＬＤＨアッセイ結果を図１左側に、ＭＴＳアッセイ結果を図１ｂ右側に、それぞれ示す。なお、図中の＊＊はＰ＜０．０１を示す。【００４５】
また、上記と同様の条件で培養したＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞について、活性化カスパーゼ−９又はカスパーゼ−３の発現を、抗活性化カスパーゼ−９抗体及び抗活性化カスパーゼ−３抗体を用いたウエスタンブロッティングにより解析した。活性化カスパーゼ−９及びカスパーゼ−３は、いずれもアポトーシス関連酵素であり、その発現増加はアポトーシスが起こっている細胞が増加していることを反映している。結果を図２に示す。図２上側にウエスタンブロッティング解析結果を示し、当該解析で検出されたカスパーゼ−９又はカスパーゼ−３のバンドの濃さをβ−アクチンの検出バンドの濃さとの比で表しグラフにして図２下側に示す。図中の＊＊はＰ＜０．０１を示す。【００４６】
これらの結果から、ダブラフェニブはＭＰＰ＋による細胞毒性を抑制することがわかった。そして、ＭＰＰ＋がパーキンソン病患者に見られるドパミンニューロン障害を引き起こすことから、ダブラフェニブは特にパーキンソン病の予防及び治療に有効であることが強く示唆された。【００４７】
神経毒性抑制効果の検討（ｉｎ  ｖｉｖｏ）
ＢＲＡＦ活性化剤（具体的にはダブラフェニブ）又はｖｅｈｉｃｌｅをマウスの脳室へ投与し、その２日後から５日間にわたって毎日ＭＰＴＰ（１−メチル−４−フェニル−１，２，３，６−テトラヒドロピリジン：１−ｍｅｔｈｙｌ−４−ｐｈｅｎｙｌ−１，２，３，６−ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏｐｙｒｉｄｉｎｅ）を３０ｍｇ／ｋｇ投与した。なお、脳室への投与に際し、マウスにはペントバルビタールナトリウムで麻酔を施し、投与には１０μＬハミルトンシリンジを用いた。ダブラフェニブは１５０μｇ／ｋｇ投与した。また、ｖｅｈｉｃｌｅとして、５％ジメチルスルホキシド及びポリエチレングリコール３００を用いた。【００４８】
その後、２１日間飼育した後、マウスをＰＢＳ（リン酸緩衝液）と４％パラホルムアルデヒドで灌流固定し、脳を取り出し、４％パラホルムアルデヒドに４℃で４８時間浸漬し、０．０１％アジ化ナトリウム入り３０％スクロース／ＰＢＳにさらに４８時間浸漬し、クライオスタットを用いて厚さ２０μｍの脳切片を作成した。中脳黒室緻密部を抗ｔｙｒｏｓｉｎｅ  ｈｙｄｒｏｘｙｌａｓｅ（ＴＨ）抗体を用いて免疫染色し、発色基質にジアミノベンジン（ＤＡＢ）を用いた。その後クレシルバイオレットを用いて、ニッスル小体を青紫色に染色した。中脳黒質緻密部に存在する、ＴＨ（ｔｙｒｏｓｉｎｅ  ｈｙｄｒｏｘｙｌａｓｅ）及びニッスル小体（Ｎｉｓｓｌ  ｂｏｄｙ）の両方が陽性のニューロンをドパミンニューロンとし、その数をカウントした。【００４９】
結果を図３に示す。図３左側に脳切片（免疫染色済み：茶色部分がドパミンニューロン）の観察画像を、図３右側に前記ニューロン数を、それぞれ示す。なお、図中の＊＊はＰ＜０．０１を示す。当該結果から、ダブラフェニブはＭＰＴＰ投与による細胞死を抑制しており、よってパーキンソン病モデルの作成を阻害する効果があることがわかった。これにより、ダブラフェニブはパーキンソン病の予防及び治療に有効であることが分かった。【００５０】
ＥＲＫ活性化の検討
ＲＩＴ２（Ｒａｓ  ｌｉｋｅ  ｗｉｔｈｏｕｔ  ＣＡＡＸ  ２）遺伝子は、ＧＴＰ結合タンパク質Ｒｉｔ２をコードする遺伝子であり、当該タンパク質の発現がパーキンソン病患者脳の黒室緻密部において低下しているとの報告がある（Ｋｏｅｎ  Ｂｏｓｓｅｒｓ，  ｅｔ．  ａｌ．，  Ｂｒａｉｎ  Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ，  ２００９）。ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞におけるＲＩＴ２遺伝子をゲノム編集技術（ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９）によりノックアウトし、ＥＲＫの活性化の程度、すなわちリン酸化ＥＲＫの発現程度を検討した。【００５１】
ＲＩＴ２遺伝子ノックアウトは、Ｃａｓ９  Ｓｍａｒｔ  Ｎｕｃｌｅａｓｅ  Ａｌｌ−ｉｎ−Ｏｎｅ  ｖｅｃｔｏｒ  （Ｓｙｓｔｅｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，  Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ，  ＣＡ，  ＵＳＡ）を用いて行った。ＲＩＴ２遺伝子をノックアウトするためのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ターゲット配列（ＧＡＴＴＡＴＣＡＴＧＡＣＣＣＴＡＣＴＡＴ）をガイド配列に連結させて組み込んだＡｌｌ−ｉｎ−Ｏｎｅ  ｖｅｃｔｏｒをｚｅｏｃｉｎ耐性遺伝子を有するｐｃＤＮＡ３．１／ｍｙｃ−Ｈｉｓ  Ａ  （Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，  Ｃａｒｌｓｂａｄ，  ＣＡ，  ＵＳＡ）とともに（２０：１  ｒａｔｉｏ）、ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞にＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いてトランスフェクションした。Ｚｅｏｃｉｎ耐性スクリーニングにより、ＲＩＴ２ノックアウト細胞を選抜し、ＲＩＴ２遺伝子配列をシークエンスしてノックアウトされていることを確認した（エクソン２のｃ．１５８＿１５９ｄｅｌＴＡ）。【００５２】
ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞、ＲＩＴ２遺伝子がノックアウトされたＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞、及びＲＩＴ２遺伝子がノックアウトされたＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞にＲＩＴ２遺伝子発現ベクターを組み込んだ細胞、について、リン酸化ＥＲＫの発現程度を抗リン酸化ＥＲＫ特異的抗体を用いたウエスタンブロッティングにより解析した。結果を図４に示す。図４上側にウエスタンブロッティング像を示し、図４下側にウエスタンブロッティング解析により検出されたリン酸化ＥＲＫのバンドの濃さとコントロールである総ＥＲＫのバンドの濃さとの比を示す。図中の＊はＰ＜０．０５を、＊＊はＰ＜０．０１を、それぞれ示す。【００５３】
当該結果から、ＲＩＴ２遺伝子のノックアウトにより、ＥＲＫの活性化が抑制されること、及びＲＩＴ２を発現させることによりＥＲＫは活性化されること、が分かった。【００５４】
次に、ＲＩＴ２遺伝子がノックアウトされたＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞にＲＩＴ２遺伝子発現ベクターを組み込んだ細胞のかわりに、ＲＩＴ２遺伝子がノックアウトされたＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞にダブラフェニブを適用（終濃度５μＭ）した細胞を用いて、上記と同様の検討を行った。結果を図５に示す。図５上側にウエスタンブロッティング像を示し、図５下側にウエスタンブロッティング解析により検出されたリン酸化ＥＲＫのバンドの濃さとコントロールである総ＥＲＫのバンドの濃さとの比を示す。図中の＊はＰ＜０．０５を、＊＊はＰ＜０．０１を、それぞれ示す。【００５５】
以上の結果から、ダブラフェニブは神経細胞においてＥＲＫ活性化剤として作用することが確認された。
【図１】
2019124478.tif 000006
【図２】
2019124478.tif 000007
【図３ａ】
2019124478.tif 000008
【図３ｂ】
2019124478.tif 000009
【図４】
2019124478.tif 000010
【図５】
2019124478.tif 000011
【配列表】
2019124478000001.app
【国際調査報告】
2019124478.tif 000012
2019124478.tif 000013
2019124478.tif 000014
2019124478.tif 000015