(57)【要約】開示されているのは、3'-シアリルラクトースに結合し、3以下のアミノ酸置換してもよい、ARKNGGLDYAMDY (配列番号３)のアミノ酸配列からなるCDR配列を含む重鎖可変領域を含む、抗体又はその機能性断片、該抗体又はその機能性断片をコードするポリヌクレオチド、該ポリヌクレオチドを含む発現ベクター、並びに該抗体又はその機能性断片を含む疾患の検査薬及び医薬組成物である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
3'-シアリルラクトースに結合し、3以下のアミノ酸置換してもよい、ARKNGGLDYAMDY (配列番号３)のアミノ酸配列からなるCDR配列を含む重鎖可変領域を含む、抗体又はその機能性断片。
【請求項２】
3'-シアリルラクトースに結合し、
(i) 3以下のアミノ酸置換してもよい、GIDFSIYW (配列番号１)のアミノ酸配列からなるCDR配列、INSDSSTI (配列番号２)のアミノ酸配列からなるCDR配列及びARKNGGLDYAMDY (配列番号３)のアミノ酸配列からなるCDR配列を含む重鎖可変領域、並びに／又は
(ii) 1以下のアミノ酸置換してもよい、KSISKY (配列番号４)のアミノ酸配列からなるCDR配列、SGSのアミノ酸配列からなるCDR配列及びQQHNEYPWT (配列番号５)のアミノ酸配列からなるCDR配列を含む軽鎖可変領域
を含む、抗体又はその機能性断片。
【請求項３】
前記抗体が脊椎動物由来である、請求項１又は２に記載の抗体又はその機能性断片。
【請求項４】
前記抗体がマウス由来である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の抗体又はその機能性断片。
【請求項５】
前記抗体がIgG又はIgMである、請求項１〜４のいずれか一項に記載の抗体又はその機能性断片。
【請求項６】
前記機能性断片が、Fab、Fab'、F(ab')2、scFv、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ又はミニボディである、請求項１〜５のいずれか一項に記載の抗体又はその機能性断片。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか一項に記載の抗体又はその機能性断片をコードするポリヌクレオチド。
【請求項８】
請求項７に記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
【請求項９】
請求項１〜６のいずれか一項に記載の抗体又はその機能性断片を含む、疾患の検査薬。
【請求項１０】
前記疾患が癌である、請求項９に記載の検査薬。
【請求項１１】
前記癌が、膵臓癌、メラノーマ、甲状腺癌、胃癌、精巣癌及び卵巣癌からなる群から選択される少なくとも1種である、請求項１０に記載の検査薬。
【請求項１２】
診断剤で標識された、請求項１〜６のいずれか一項に記載の抗体又はその機能性断片を含む、疾患を診断するための医薬組成物。
【請求項１３】
前記診断剤が放射性物質である、請求項１２に記載の医薬組成物。
【請求項１４】
請求項１〜６のいずれか一項に記載の抗体又はその機能性断片を含む、疾患を治療するための医薬組成物。
【請求項１５】
治療剤で標識された、請求項１〜６のいずれか一項に記載の抗体又はその機能性断片を含む、疾患を治療するための医薬組成物。
【請求項１６】
前記治療剤が抗がん剤である、請求項１５に記載の医薬組成物。
【請求項１７】
前記治療剤が放射性物質である、請求項１５に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗体又はその機能性断片に関する。さらに、本発明は、該抗体又はその機能性断片をコードするポリヌクレオチド、該ポリヌクレオチドを含む発現ベクター、並びに該抗体又はその機能性断片を含む疾患の検査薬及び医薬組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
癌は日本における死亡原因の第1位で、平均寿命の延びに伴って死亡者数は年々増加している。癌による死亡者数の減少のためには早期診断が最も重要とされているが、初期に特徴的な症状が無い場合が多く、診断されたときには既に癌が進行して治療が困難となっている。また、膵臓癌等の癌では、手術によって癌組織の切除できても術後の再発率が高く、術後のモニタリングが欠かせない。したがって、血液検査など簡便な癌の検査方法は、適切な実施により確実な効果が得られることから重要な役割を担っている。【０００３】
これまで、癌抗原に対する抗体が多く作製されており、特に、モノクローナル抗体は感度及び特異度が高く、また、半永久的に使用できるため、一般的に用いられている。早期診断が最も困難な膵臓癌の場合、CA19-9モノクローナル抗体を用いる検査方法が報告されている(非特許文献１)。また、胃癌ではCEA抗体、卵巣癌ではCA125抗体等が癌の検査に用いられている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Erxi W. Shuang Z. Kruttika B. Qingyong M. :CA19-9 and pancreatic cancer. Clin Adv Hematol Oncol. 2013 11(1):53-55.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、癌の検査及び治療に利用可能な抗体又はその機能性断片を提供することを目的とする。さらに、本発明は、該抗体又はその機能性断片をコードするポリヌクレオチド、該ポリヌクレオチドを含む発現ベクター、並びに該抗体又はその機能性断片を含む疾患の検査薬及び医薬組成物を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、上記目的を達成すべく鋭意研究を重ねた結果、ヒトES細胞をマウスに免疫することにより抗体を取得し、該抗体の抗原値を指標とすることにより癌の罹患の可能性を判定できるという知見を得た。さらに、該抗体が癌細胞傷害活性を有することも見出した。【０００７】
本発明は、これら知見に基づき、更に検討を重ねて完成されたものであり、次の抗体又はその機能性断片、ポリヌクレオチド、発現ベクター、疾患の検査薬、及び医薬組成物を提供するものである。【０００８】
項１．3'-シアリルラクトースに結合し、3以下のアミノ酸置換してもよい、ARKNGGLDYAMDY (配列番号３)のアミノ酸配列からなるCDR配列を含む重鎖可変領域を含む、抗体又はその機能性断片。
項２．3'-シアリルラクトースに結合し、
(i) 3以下のアミノ酸置換してもよい、GIDFSIYW (配列番号１)のアミノ酸配列からなるCDR配列、INSDSSTI (配列番号２)のアミノ酸配列からなるCDR配列及びARKNGGLDYAMDY (配列番号３)のアミノ酸配列からなるCDR配列を含む重鎖可変領域、並びに／又は
(ii) 1以下のアミノ酸置換してもよい、KSISKY (配列番号４)のアミノ酸配列からなるCDR配列、SGSのアミノ酸配列からなるCDR配列及びQQHNEYPWT (配列番号５)のアミノ酸配列からなるCDR配列を含む軽鎖可変領域
を含む、抗体又はその機能性断片。
項３．前記抗体が脊椎動物由来である、項１又は２に記載の抗体又はその機能性断片。
項４．前記抗体がマウス由来である、項１〜３のいずれか一項に記載の抗体又はその機能性断片。
項５．前記抗体がIgG又はIgMである、項１〜４のいずれか一項に記載の抗体又はその機能性断片。
項６．前記機能性断片が、Fab、Fab'、F(ab')2、scFv、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ又はミニボディである、項１〜５のいずれか一項に記載の抗体又はその機能性断片。
項７．項１〜６のいずれか一項に記載の抗体又はその機能性断片をコードするポリヌクレオチド。
項８．項７に記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
項９．項１〜６のいずれか一項に記載の抗体又はその機能性断片を含む、疾患の検査薬。
項１０．前記疾患が癌である、請求項９に記載の検査薬。
項１１．前記癌が、膵臓癌、メラノーマ、甲状腺癌、胃癌、精巣癌及び卵巣癌からなる群から選択される少なくとも1種である、項１０に記載の検査薬。
項１２．診断剤で標識された、項１〜６のいずれか一項に記載の抗体又はその機能性断片を含む、疾患を診断するための医薬組成物。
項１３．前記診断剤が放射性物質である、項１２に記載の医薬組成物。
項１４．項１〜６のいずれか一項に記載の抗体又はその機能性断片を含む、疾患を治療するための医薬組成物。
項１５．治療剤で標識された、項１〜６のいずれか一項に記載の抗体又はその機能性断片を含む、疾患を治療するための医薬組成物。
項１６．前記治療剤が抗がん剤である、項１５に記載の医薬組成物。
項１７．前記治療剤が放射性物質である、項１５に記載の医薬組成物。【０００９】
また、本発明は、以下も提供する。
項１８．膵臓癌等の癌の罹患の可能性を検査する方法であって、(1) 被検体から採取された生体試料について項９〜１１のいずれか一項に記載の検査薬を用いて抗原の量又は濃度を測定する工程を含む、方法。
項１９．さらに、(2) 前記工程(1)で測定された前記抗原の量又は濃度の値が、予め設定されたカットオフ値以上である場合に、前記被検体が膵臓癌等の癌に罹患している可能性が高いと判定する工程を含む、項１８に記載の方法。
項２０．被検体における膵臓癌等の癌を診断する方法であって、
(1a) 被検体から採取された生体試料について項９〜１１のいずれか一項に記載の検査薬を用いて抗原の量又は濃度を測定する工程、及び
(2a) 前記工程(1a)で測定された前記抗原の量又は濃度の値が、予め設定されたカットオフ値以上である場合に、前記被検体が膵臓癌等の癌に罹患している可能性が高いと判定する工程
を含む、方法。
項２１．さらに、(3) 前記工程(2a)で膵臓癌等の癌に罹患している可能性が高いと判定された被検体に対して膵臓癌等の癌の診断方法を適用する工程を含む、項２０に記載の方法。
項２２．前記工程(3)において適用される膵臓癌等の癌の診断方法が、生検法、PET検査法、CT検査法、及び超音波検査法からなる群より選択される少なくとも1種である、項２１に記載の方法。
項２３．被検体における膵臓癌等の癌を検査及び治療する方法であって、
(1b) 被検体から採取された生体試料について項９〜１１のいずれか一項に記載の検査薬を用いて抗原の量又は濃度を測定する工程、
(2b) 前記工程(1b)で測定された前記抗原の量又は濃度の値が、予め設定されたカットオフ値以上である場合に、前記被検体が膵臓癌等の癌に罹患している可能性が高いと判定する工程、
(3b)前記工程(2b)で膵臓癌等の癌に罹患している可能性が高いと判定された被検体に対して膵臓癌等の癌の診断方法を適用する工程、及び
(4b)前記工程(2b)で膵臓癌等の癌に罹患している可能性が高いと判定された被検体、又は前記工程(3b)で膵臓癌等の癌に罹患していると診断された被検体に対して膵臓癌等の癌治療を行う工程
を含む、方法。
項２４．被検体における膵臓癌等の癌を診断する方法であって、診断剤で標識された、項１〜６のいずれか一項に記載の抗体又はその機能性断片を、該診断を必要とする被検体に投与する工程を含む、方法。
項２５．前記診断剤が放射性物質である、項２４に記載の方法。
項２６．被検体における膵臓癌等の癌を治療する方法であって、項１〜６のいずれか一項に記載の抗体又はその機能性断片を、該治療を必要とする被検体に投与する工程を含む、方法。
項２７．前記抗体又はその機能性断片が治療剤で標識されたものである、項２６に記載の方法。
項２８．前記治療剤が抗がん剤である、項２７に記載の方法。
項２９．前記治療剤が放射性物質である、項２７に記載の方法。
【発明の効果】
【００１０】
本発明によれば、癌の検査及び治療に利用可能な抗体又はその機能性断片を提供することができる。また、該抗体又はその機能性断片を含む検査薬を用いれば、膵臓癌等の癌の罹患の可能性を検査することが可能となる。さらに、該抗体又はその機能性断片を含む医薬組成物を用いれば、膵臓癌等の癌を診断及び治療することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】実施例２で行われた、3B1E2抗体(マウスIgG2a)と3'-シアリルラクトースとの結合結果を示す。縦軸は、450 nmの吸光度を示す。横軸は、抗体の濃度を示す。
【図２】実施例２で行われた、3B1E2抗体(マウスIgM)と3'-シアリルラクトースとの結合結果を示す。縦軸は、450 nmの吸光度を示す。横軸は、抗体の濃度を示す。
【図３】実施例４での、健常人及び膵臓癌患者の血清における、3B1E2抗体の抗原値を示す。縦軸が3B1E2抗体の抗原値を示す(数値は、450 nmの吸光度)。
【図４】実施例５で行われた、3B1E2抗体(マウスIgG2a)とコントロール抗体(マウスIgG2a)の癌細胞傷害活性の結果を示す。縦軸は、癌細胞傷害活性を示す。横軸は、抗体の濃度を示す。データは平均±標準偏差で示す。n=3
【発明を実施するための形態】
【００１２】
以下、本発明の実施の形態について詳細に説明する。
【００１３】
なお、本明細書において「含む(comprise)」とは、「本質的にからなる(essentially consist of)」という意味と、「のみからなる(consist of)」という意味をも包含する。
【００１４】
１．抗体又はその機能性断片
本発明の抗体又はその機能性断片が結合し得る特異的な抗原として、3'-シアリルラクトースが挙げられる。3'-シアリルラクトースの構造式の一例としては、下記式(A)［式中、Acはアセチル基を示す。］が挙げられ、分子式はC23H34NO19、分子量は628.51である。
【００１５】
2020158943.tif 000002
【００１６】
3'-シアリルラクトース糖鎖とは、Neu5Acα(2→3)Galβ(1→4)Glcで表される糖鎖、すなわち、ノイラミン酸(Neu5Ac)の2位のヒドロキシ基とガラクトース(Gal)の3位のヒドロキシ基とがαグリコシド結合によって連結され、且つ該ガラクトース(Gal)の1位のヒドロキシ基とグルコース(Glc)の4位のヒドロキシ基とがβグリコシド結合によって連結されてなる糖鎖である。
【００１７】
本発明の抗体又はその機能性断片は、3以下のアミノ酸置換してもよい、ARKNGGLDYAMDY (配列番号３)のアミノ酸配列からなるCDR配列を含む重鎖可変領域を含むことを特徴とする。
【００１８】
本発明の抗体又はその機能性断片はまた、
(i) 3以下のアミノ酸置換してもよい、GIDFSIYW (配列番号１)のアミノ酸配列からなるCDR配列、INSDSSTI (配列番号２)のアミノ酸配列からなるCDR配列及びARKNGGLDYAMDY (配列番号３)のアミノ酸配列からなるCDR配列を含む重鎖可変領域、並びに／又は
(ii) 1以下のアミノ酸置換してもよい、KSISKY (配列番号４)のアミノ酸配列からなるCDR配列、SGSのアミノ酸配列からなるCDR配列及びQQHNEYPWT (配列番号５)のアミノ酸配列からなるCDR配列を含む軽鎖可変領域
を含むことを特徴とする。
【００１９】
アミノ酸置換は、3'-シアリルラクトースに対する結合性が維持されるように行われる。上記「3以下のアミノ酸置換してもよい」及び「1以下のアミノ酸置換してもよい」とは、重鎖可変領域又は軽鎖可変領域において合計3個又は1個以下のアミノ酸を置換してもよいことを意味し、アミノ酸置換はCDRの部分で行われるのが望ましい。
【００２０】
アミノ酸置換の数は、好ましくは2以下、より好ましくは1以下であり、更に好ましくは0である。アミノ酸を置換する場合、性質の似たアミノ酸に置換すれば、元の抗体断片の活性が維持されやすいと考えられる。特定のアミノ酸配列において、アミノ酸を置換させる技術は公知である。
【００２１】
「その機能性断片」とは、その機能性断片が由来する抗体としての結合活性の一部又は全部を保持する重鎖及び／又は軽鎖ポリペプチドを含む抗体の一部を示すものとする。機能性断片としては、例えば、Fd、Fv、Fab、F(ab')、F(ab)2、F(ab')2、単鎖Fv(scFv)、ダイアボディ、トリアボディ(triabody)、テトラボディ(tetrabody)及びミニボディを挙げることができる。
【００２２】
「重鎖」とは、アミノ末端部分が約120〜130又はそれ以上のアミノ酸の可変領域を含み、カルボキシ末端部分が定常領域を含む、約50〜70kDaのポリペプチド鎖を意味する。定常領域は、重鎖定常領域のアミノ酸配列に基づいて、アルファ(α)、デルタ(δ)、イプシロン(ε)、ガンマ(γ)及びミュー(μ)と称される5種の別個の型のうちの1種であり得る。別個の型の重鎖は、サイズが異なり、α、δ及びγはおよそ450アミノ酸を含有し、μ及びεはおよそ550アミノ酸を含有する。これらの別個の型の重鎖を軽鎖と組み合わせると、IgGの4つのサブクラス(IgG1、IgG2、IgG3及びIgG4)を含め、5つの周知のクラスの抗体、それぞれIgA、IgD、IgE、IgG及びIgMが生じる。
【００２３】
「軽鎖」とは、アミノ末端部分が約100〜約110又はそれ以上のアミノ酸の可変領域を含み、カルボキシ末端部分が定常領域を含む、約25kDaのポリペプチド鎖を意味する。軽鎖のおおよその長さは211〜217アミノ酸である。定常ドメインのアミノ酸配列に基づいてカッパ(κ)又はラムダ(λ)と称される2種の別個の型が存在する。
【００２４】
「可変領域」とは、一般に軽鎖又は重鎖のアミノ末端に位置し、長さが重鎖では約120〜130残基、軽鎖では約100〜110残基であり、特定の抗原に対する結合及び特異性に関与する、抗体の軽鎖又は重鎖の一部である。可変領域は異なる抗体の間で配列が広範囲にわたって異なり、配列の変動性は可変領域に存在するCDR (complementary determining region：相補性決定領域)に集中し、可変領域内の変動性の低い部分はフレームワーク領域と称される。軽鎖及び重鎖のCDRは、抗体と抗原との相互作用に主に関与する。
【００２５】
「CDR」とは、抗体重鎖(H)可変領域β−シートフレームワークの非フレームワーク領域内の3つの超可変領域(H1、H2又はH3)のうちの1つ、又は抗体軽鎖(L)可変領域β−シートフレームワークの非フレームワーク領域内の3つの超可変領域(L1、L2又はL3)のうちの1つを意味する。CDRは、フレームワーク領域配列内に散在する超可変領域配列である。
【００２６】
「結合」とは、複合体が形成される分子間の相互作用を意味する。相互作用は、例えば、水素結合、イオン結合、疎水性相互作用、及び／又はファンデルワールス相互作用を含めた、非共有結合性の相互作用である。抗体又はその機能性断片の結合は、例えば、実施例２及び４で提示される方法である酵素結合免疫吸着アッセイ、又はその他の公知の方法を使用して検出することができる。
【００２７】
本発明の抗体としては、マウス、ラット、ウシ、ウサギ、ヤギ、ヒツジ、モルモット等の脊椎動物由来のものであることが好ましく、中でもマウス由来のものであることがより好ましい。
【００２８】
本発明の抗体のアイソタイプは特に制限されない。該アイソタイプとしては、例えば、IgG (IgG1、IgG2、IgG3、IgG4)、IgA、IgD、IgE、IgG及びIgMが挙げられる。これらの中でも、好ましくはIgG又はIgMである。
【００２９】
配列番号１〜３のCDRアミノ酸配列はそれぞれ重鎖可変領域CDR1〜3に、配列番号４、SGS、配列番号５のCDRアミノ酸配列はそれぞれ軽鎖可変領域CDR1〜3に対応することが望ましい。
【００３０】
本発明の抗体は、上記重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を両方とも含んでいることが望ましい。
【００３１】
本発明のポリヌクレオチドは、上記抗体又はその機能性断片をコードすることを特徴とする。
【００３２】
「ポリヌクレオチド」とは、デオキシリボヌクレオチド若しくはリボヌクレオチドのいずれか又はその類似体の、任意の長さのポリマーの形態のヌクレオチドを意味する。ポリヌクレオチドの配列は、4種のヌクレオチド塩基：アデニン(A)；シトシン(C)；グアニン(G)；チミン(T)；及びポリヌクレオチドがRNAの場合にはチミンの代わりにウラシル(U)で構成される。ポリヌクレオチドは、遺伝子、遺伝子断片、エクソン、イントロン、メッセンジャーRNA (mRNA)、転移RNA、リボソームRNA、リボザイム、cDNA、組換えポリヌクレオチドなどを含み得る。ポリヌクレオチドはまた、二本鎖分子と一本鎖分子の両方を意味する。
【００３３】
配列番号１〜３のCDRアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列としては、例えば、それぞれ、GGAATCGATTTTAGTATATACTGG (配列番号６)、ATTAATTCAGATAGCAGTACAATA (配列番号７)、GCAAGAAAGAATGGGGGATTGGACTATGCTATGGACTAC (配列番号８)が挙げられる。また、配列番号４、SGS、配列番号５のCDRアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列として、例えば、それぞれ、AAGAGCATTAGCAAATAT (配列番号９)、TCTGGATCC、CAACAGCATAATGAATACCCGTGGACG (配列番号１０)が挙げられる。
【００３４】
本発明のポリヌクレオチドは、化学的に合成することもでき、又は適切な供給源(例えば、抗体を発現させるために選択されたハイブリドーマ細胞等の抗体を発現する細胞から単離したcDNA)から、配列の3'及び5'末端とハイブリダイズ可能な合成プライマーを使用したPCR増幅によって、若しくは特定の核酸配列に特異的なオリゴヌクレオチドプローブを使用したクローニングによって得ることもできる。次いで、PCRによって生成した増幅核酸を、当技術分野で周知の任意の方法を使用して、複製可能なクローニングベクターにクローニングすることができる。
【００３５】
本発明の抗体又はその機能性断片をコードするポリヌクレオチドが得られたら、当技術分野で周知の方法を使用した組換えDNA技術によって、抗体又はその機能性断片を産生させるためのベクターを作製することができ、更に周知の方法を使用して、抗体又はその機能性断片のコード配列並びに適切な転写及び翻訳制御シグナルを含有する発現ベクターを構築することができる。また、定常領域はヒト、マウス、ラット等の種間で大きく異なるが、同一種の抗体間の定常領域は極めて類似しているため、それぞれの種の定常領域をコードするヌクレオチド配列を含むベクターにクローニングすることによって、ヒト、マウス、ラット等の抗体が作製できる。
【００３６】
発現ベクターは従来の方法によって宿主細胞に導入することができ、次いで、トランスフェクトされた細胞を従来の方法によって培養して本発明の抗体又はその機能性断片を産生させることができる。免疫グロブリン分子全体を発現させるためには、重鎖及び軽鎖を両方コードするベクターを宿主細胞において同時発現させればよい。
【００３７】
本発明の抗体又はその機能性断片を発現させるために、種々の宿主−発現ベクター系を利用することができる。例えば、抗体コード配列を含有する組換えバクテリオファージDNA、プラスミドDNA若しくはコスミドDNA発現ベクターを用いて形質転換した細菌(例えば、大腸菌、古草菌)、抗体コード配列を含有する組換え酵母発現ベクターを用いて形質転換した酵母(例えば、サッカロマイセス・ピキア)などの微生物、抗体コード配列を含有する組換えウイルス発現ベクター(例えば、バキュロウイルス)を感染させた昆虫細胞系、組換えウイルス発現ベクター(例えば、カリフラワーモザイクウイルス、TMV)を感染させた若しくは抗体コード配列を含有する組換えプラスミド発現ベクター(例えば、Tiプラスミド)を用いて形質転換した植物細胞系、又は哺乳動物細胞のゲノムに由来するプロモーター(例えば、メタロチオネインプロモーター)若しくは哺乳動物ウイルスに由来するプロモーター(例えば、アデノウイルス後期プロモーター)を含有する組換え発現構築物を有する哺乳動物細胞系(例えば、COS、CHO、HEK293、3T3細胞)が挙げられる。
【００３８】
本発明の抗体又はその機能性断片が組換え発現によって産生されたら、それを、免疫グロブリン分子を精製するための当技術分野で公知の方法によって、例えば、クロマトグラフィー(例えば、イオン交換クロマトグラフィー、プロテインAクロマトグラフィー、ゲルろ過カラムクロマトグラフィー)、遠心分離、塩析等によって精製することができる。さらに、本発明の抗体又はその機能性断片は、精製を容易にするために公知の異種ポリペプチド配列と融合することができる。例えば、本発明の抗体又はその機能性断片は、ポリ−ヒスチジンタグ(Hisタグ)、FLAGタグ、赤血球凝集素タグ(HAタグ)又はmycタグを組換えによって付加することによって精製することができる。
【００３９】
また、本発明の抗体の機能性断片は、公知の方法によって生成することができる。例えば、本発明の抗体のFab及びF(ab')2断片は、パパイン(Fab断片を作製するため)、ペプシン(F(ab')2断片を作製するため)などの酵素を使用した免疫グロブリン分子のタンパク質分解性の切断によって作製することができる。
【００４０】
２．疾患の検査薬
本発明の疾患の検査薬は、上記抗体又はその機能性断片を含むことを特徴とする。本発明の検査薬は、特に癌の罹患の可能性を検査する薬である。
【００４１】
本発明の疾患の検査薬は、膵臓癌等の癌の罹患の可能性を検査(又は判定)する方法であって、被検体から採取された生体試料における、本発明の抗体又はその機能性断片に結合する抗原の量又は濃度を測定する工程を含む方法(本明細書において、「本発明の検査方法」と称することもある。)に用いることができる。以下、これについて説明する。
【００４２】
検査対象である膵臓癌等の癌は、特に制限されず、あらゆる種類、ステージなどの癌を包含する。癌の種類としては、好ましくは膵臓癌、メラノーマ、甲状腺癌、胃癌、精巣癌及び卵巣癌であり、特に好ましくは膵臓癌である。膵臓癌の種類としては、例えば、膵管癌、膵内分泌腫瘍、膵管内乳頭粘液性腫瘍、粘液性嚢胞腫瘍、腺房細胞癌などが挙げられ、好ましくは膵管癌などが挙げられる。また、メラノーマの種類としては、末端黒子型、表在拡大型、結節型、悪性黒子型などが挙げられ、末端黒子型は日本人に多い一方、表在拡大型は白人に多い。検査対象である癌のステージとしては、より早期のステージから順に、ステージ0、ステージI、ステージII、ステージIII、及びステージIV (ステージIVa、ステージIVb)が挙げられる。
【００４３】
被検体は、本発明の検査方法の対象生物であり、その生物種は特に制限されない。被検体の生物種としては、例えば、ヒト、サル、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ウサギなどの種々の哺乳類動物が挙げられ、好ましくはヒトが挙げられる。
【００４４】
被検体の癌に関する状態は、特に制限されない。被検体としては、例えば、癌に罹患しているかどうか不明な検体、癌罹患歴の無い検体、癌罹患歴があり且つ癌治療を受けた検体、他の判定方法によって癌に罹患している(或いは罹患していない)と既に判定されている検体などが挙げられる。
【００４５】
生体試料は、本発明の抗体又はその機能性断片に結合する抗原を含有し得るものであれば特に制限されない。生体試料としては、例えば、全血、血清、血漿、唾液、髄液、関節液、尿、組織液、汗、涙、唾液などの体液、これらの体液由来の試料が挙げられる。体液由来の試料としては、体液から調製される試料である限り特に制限されず、例えば、体液から本発明の抗体又はその機能性断片が結合する抗原を濃縮、精製などして得られる試料などが挙げられる。体液としては、好ましくは全血、血清、血漿などが挙げられる。生体試料は、1種単独で採用してもよいし、2種以上を組み合わせて採用してもよい。
【００４６】
生体試料は、当業者に公知の方法で被検体から採取することができる。例えば、全血は、注射器などを用いた採血によって採取することができる。なお、採血は、医師、看護師などの医療従事者が行うことが望ましい。血清は、血液から血球及び特定の血液凝固因子を除去した部分であり、例えば、血液を凝固させた後の上澄みとして得ることができる。血漿は、血液から血球を除去した部分であり、例えば、血液を凝固させない条件下で遠心分離に供した際の上澄みとして得ることができる。
【００４７】
本発明の抗体又はその機能性断片に結合する抗原は、本発明の抗体又はその機能性断片に結合することができる3'-シアリルラクトース、又は3'-シアリルラクトースを含む分子であり、この限りにおいて特に制限されない。本発明の検査方法は、本発明の抗体又はその機能性断片に結合する抗原の量又は濃度を測定する工程を含み、その方法は特に制限されない。該方法としては、例えば、イムノアッセイが挙げられる。イムノアッセイは、直接法、関節法、均一法、不均一法、競合法、非競合法などを問わず、広く採用することができる。イムノアッセイとして、より具体的には、例えば、ELISA (例えば、直接法、間接法、サンドイッチ法、競合法など)、ラジオイムノアッセイ(RIA)、イムノラジオメトリックアッセイ(IRMA)、エンザイムイムノアッセイ(EIA)、サンドイッチEIA、イムノクロマト、ウェスタンブロット、免疫沈降、スロット或いはドットブロットアッセイ、免疫組織染色、蛍光イムノアッセイ、アビジン−ビオチン又はストレプトアビジン−ビオチン系を用いるイムノアッセイ、表面プラズモン共鳴(SPR)法を用いるイムノアッセイなどが挙げられる。検出方法は、1種単独で採用してもよいし、2種以上を組み合わせて採用してもよい。
【００４８】
本発明の抗体又はその機能性断片に結合する抗原の量又は濃度を測定する工程において、抗原を検出する際に用いられる標識物(例えば、標識抗体など)における標識の種類は特に制限されない。標識としては、例えば、蛍光物質、発光物質、色素、酵素、金コロイド、放射性同位体などが挙げられる。これらの中でも、ペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼなどの酵素標識は、安全性、経済性、検出感度などの観点から、好ましい。
【００４９】
本発明の抗体又はその機能性断片に結合する抗原の量又は濃度を測定、算出する方法の詳細について説明する。
【００５０】
その一態様としては、本発明の抗体又はその機能性断片と、被検体から採取された生体試料とを接触させる工程、並びに本発明の抗体又はその機能性断片に結合した抗原量を測定する工程を例示することができる。
【００５１】
被検体から採取された生体試料との接触の態様は、特に制限されず、本発明の抗体又はその機能性断片に結合する抗原の量又は濃度を測定する方法(例えば、各種イムノアッセイなど)の種類に応じて、適切な態様を選択することができる。
【００５２】
接触態様としては、例えば、本発明の抗体又はその機能性断片及び生体試料のいずれか一方のみを固相に固定した状態で接触させる態様、これらの両方とも固相に固定しない状態で接触させる態様などが挙げられる。これらの中でも、効率性などの観点から、好ましくは本発明の抗体又はその機能性断片のみを固相に固定した状態で接触させる態様が挙げられる。
【００５３】
本発明の抗体又はその機能性断片及び生体試料のいずれか一方のみを固相に固定する場合、固定後に、トリスヒドロキシメチルアミノメタン(Tris)及び／又はエーテル型非イオン界面活性剤を含む溶液で固相を洗浄することが好ましい。
【００５４】
固相としては、本発明の抗体又はその機能性断片及び生体試料を固定可能なものである限り特に制限されない。該固相としては、例えば、ポリスチレン、ガラス、ニトロセルロースなどを主成分として含むプレート、スライド、膜などが挙げられる。固相は、本発明の抗体又はその機能性断片及び生体試料をより容易に固定させるための成分、例えば、易反応性化合物(例えば、易反応性基を有する化合物、金コロイドなど)でコーティングされたものであってもよい。易反応性基を有する化合物としては、糖鎖又は糖鎖誘導体と共有結合を形成し得る基であって、例えば、(１Ｈ−イミダゾール−１−イル)カルボニル基、スクシンイミジルオキシカルボニル基、エポキシ基、アルデヒド基、アミノ基、チオール基、カルボキシル基、アジド基、シアノ基、活性エステル基(１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イルオキシカルボニル基、ペンタフルオロフェニルオキシカルボニル基、パラニトロフェニルオキシカルボニル基等)、又はハロゲン化カルボニル基(塩化カルボニル基、フッ化カルボニル基、臭化カルボニル基、ヨウ化カルボニル基)等を有する化合物が挙げられる。
【００５５】
易反応性基を有する化合物としては、例えば、エポキシシラン、ポリリジン等が挙げられる。
【００５６】
易反応性化合物でコーティングされた固相を用いる場合、ウシ血清アルブミン(BSA)等を含む緩衝液を用いて易反応性化合物をブロッキングすることが好ましく、ブロッキング時間は、60分間以上であることが好ましい。また、ブロッキング液には、トリスヒドロキシメチルアミノメタン(Tris)及び／又はエーテル型非イオン界面活性剤を含むことが好ましい。
【００５７】
本発明の抗体又はその機能性断片に結合した抗原量を測定する態様は、特に制限されず、上述した本発明の抗体又はその機能性断片に結合する抗原の量又は濃度を測定する方法(例えば、各種イムノアッセイなど)の種類に応じて、適切な態様を選択することができる。該測定は、例えば、用いられた標識物の標識に由来するシグナルを定量することによって行うことができる。より具体的な態様としては、例えば、本発明の抗体又はその機能性断片に結合した抗原に対し、標識した本発明の抗体若しくはその機能性断片、又は抗原に対する標識した抗体を接触させ、結合した標識抗体の標識に由来するシグナルを定量することによって行うことができる。
【００５８】
得られたシグナル量に基づいて、本発明の抗体又はその機能性断片に結合した抗原量を算出することができる。例えば、非競合法の場合であれば、得られたシグナル量をそのまま本発明の抗体又はその機能性断片に結合した抗原量とすることができる。また、別の例として、競合法の場合であれば、得られたシグナル量と本発明の抗体又はその機能性断片に結合した抗原量とは、反比例の関係にあるので、この関係に基づいて得られたシグナル量から本発明の抗体又はその機能性断片に結合した抗原量を算出することができる。
【００５９】
本発明の検査方法によれば、膵臓癌等の癌の罹患の検出指標である本発明の抗体又はその機能性断片に結合する抗原値を提供することができ、これにより膵臓癌等の癌の罹患の可能性の判定などを補助することができる。
【００６０】
本発明の検査方法は、一態様として、更に、測定された本発明の抗体又はその機能性断片に結合する抗原の量又は濃度の値が、予め設定されたカットオフ値以上である場合に、前記被検体が膵臓癌等の癌に罹患している可能性が高いと判定する工程を含むことが好ましい。ここで、「膵臓癌等の癌に罹患している可能性」とは、「生体試料採取時に膵臓癌等の癌に罹患している可能性」を意味する。
【００６１】
本発明の検査方法によれば、膵臓癌に罹患している可能性を判定することが可能となる。また、本発明の検査方法は、より高い感度で膵臓癌等の癌に罹患している可能性を判定できるので、本発明の検査方法により、真に膵臓癌等の癌に罹患している被検体を、より確実に「膵臓癌等の癌に罹患している」と判定できる(すなわち、「膵臓癌に罹患していない」と誤判定する可能性をより低減することができる)。
【００６２】
カットオフ値は、感度、特異度、陽性的中率、陰性的中率などの観点から当業者が適宜設定することができ、例えば、膵臓癌等の癌に罹患していない被検体から採取された生体試料における本発明の抗体又はその機能性断片に結合する抗原の量又は濃度の値の平均値、パーセンタイル値、又は最大値とすることができる。より具体的には、例えば、膵臓癌等の癌に罹患していない被検体及び膵臓癌等の癌に罹患している被検体からそれぞれ採取された生体試料における、本発明の抗体又はその機能性断片に結合する抗原の量又は濃度を測定し、該測定値を用いて、受信者操作特性(Receiver Operating Characteristic, ROC)曲線の解析などに基づいた統計解析(より具体的には、Youden indexを用いた方法が例示される。)を行うことにより、カットオフ値を設定することができる。
【００６３】
また、同一の被検体から一定期間前に採取された生体試料における本発明の抗体又はその機能性断片に結合する抗原量又は濃度の値をカットオフ値とすることもできる。「一定期間」とは、本発明の抗体又はその機能性断片に結合する抗原の量又は濃度が同一被検体内で変化し得る程度の期間であれば特に制限されない。例えば、1か月〜10年、2か月〜5年、3か月〜2年、4か月〜1年程度の期間が挙げられる。
【００６４】
本発明の検査方法の変法として、本発明の抗体又はその機能性断片に結合する抗原の量又は濃度の値が、同一の被検体から一定期間前に採取された生体試料における本発明の抗体又はその機能性断片に結合する抗原の量又は濃度の値よりも高い場合に、前記被検体が将来膵臓癌等の癌に罹患する可能性が高いと判定する工程を含む方法が挙げられる。該工程を含む検査方法により、将来における膵臓癌罹患リスクを判定する。
【００６５】
「一定期間」とは、本発明の抗体又はその機能性断片に結合する抗原の量又は濃度が同一被検体内で変化し得る程度の期間であれば特に制限されない。例えば、1か月〜10年、2か月〜5年、3か月〜2年、4か月〜1年程度の期間が挙げられる。
【００６６】
「高い」程度は、特に制限されず、本発明の抗体又はその機能性断片に結合する抗原の量又は濃度の値が、同一の被検体から一定期間前に採取された生体試料における本発明の抗体又はその機能性断片に結合する抗原の量又は濃度の値の2倍以上、4倍以上、8倍以上、20倍以上であることが例示される。
【００６７】
本発明の検査方法により、被検体が膵臓癌等の癌に罹患している可能性が高いと判定された場合、本発明の検査方法に、さらに別の診断方法を組み合わせることによって、より高い精度で膵臓癌等の癌の罹患を診断することができる。別の診断方法としては、特に制限されず、公知の診断方法を各種採用することができる。該診断方法としては、例えば生検法、PET検査法、CT検査法、超音波検査法、腫瘍マーカー検査法などが挙げられる。これらの中でも、より高い精度で膵臓癌を診断できるという観点から、好ましくは生検法、PET検査法、CT検査法、超音波検査法などが挙げられる。診断方法は、1種単独で採用してもよいし、2種以上を組み合わせて採用してもよい。
【００６８】
本発明の検査薬は、本発明の抗体又はその機能性断片を含む組成物の形態であってもよい。該組成物には、必要に応じて他の成分が含まれていてもよい。他の成分としては、例えば、基剤、担体、溶剤、分散剤、乳化剤、緩衝剤、安定剤、賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、増粘剤、保湿剤、着色料、香料、キレート剤等が挙げられる。
【００６９】
本発明の検査薬は、本発明の抗体又はその機能性断片を含むキットの形態であってもよい。該キットには、本発明の検査方法の実施に用いられ得る器具、試薬などが含まれていてもよい。
【００７０】
器具としては、例えば、試験管、マイクロタイタープレート、アガロース粒子、ラテックス粒子、精製用カラム、エポキシコーティングスライドガラス、金コロイドコーティングスライドガラスなどが挙げられる。
【００７１】
試薬としては、例えば、本発明の抗体の抗原に対する抗体若しくはその標識抗体、標準試料(陽性対照、陰性対照)などが挙げられる。
【００７２】
本発明の抗体の抗原に対する抗体としては、3'-シアリルラクトースに対する抗体、本発明の抗体が結合する分子(例えば、タンパク質)に対する抗体などを用いることができる。
【００７３】
標識抗体を作製するための標識物の種類は、特に制限されない。標識物としては、例えば、蛍光物質、発光物質、色素、酵素、金コロイド、放射性同位体などが挙げられる。これらの中でも、ペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼなどの酵素標識は、安全性、経済性、検出感度などの観点から好ましい。
【００７４】
標準試料としては、本発明の抗体の抗原が用いられる。本発明の抗体の抗原は、例えば、本発明の抗体を用いて生体試料から免疫沈降法により分離及び精製できる。また、3'-シアリルラクトースを含むポリマー(例えば、GlycoTech Corporation製の3'-シアリルラクトース-PAA)、3'-シアリルラクトースが表面に露出されているリポソーム又はタンパク質等を作製することにより、本発明の抗体の抗原を取得することができる。
【００７５】
また、本発明は、診断剤で標識された本発明の抗体又はその機能性断片を含む、疾患を診断するための医薬組成物も提供する。本発明の検査方法により、被検体が膵臓癌等の癌に罹患している可能性が高いと判定された場合、診断剤で標識された本発明の抗体又はその機能性断片を含む医薬組成物を、例えば、血管内、筋肉内、皮下又は腹腔内に投与し全身を検査することにより、より高い精度で膵臓癌等の癌の罹患を診断することができる。
【００７６】
本発明の疾患を診断するための医薬組成物は、薬学的に許容され得る担体を更に含み得る。使用することができる薬学的に許容され得る担体としては、リン酸緩衝食塩水溶液、水、油・水エマルションなどのエマルション、種々の型の湿潤剤などの当技術分野で公知の標準の医薬担体が挙げられる。また、本発明の疾患を診断するための医薬組成物において、他の成分、例えば、医薬品グレードの安定剤、緩衝剤、防腐剤、賦形剤なども使用することができ、pH、等張性、安定性などを考慮する医薬組成物の調製は公知の方法により実施することができる。
【００７７】
本発明の抗体又はその機能性断片を標識する診断剤としては、放射性物質、蛍光材料、発光材料、生物発光材料、光音響イメージング材料等が挙げられる。放射性物質としては、ジルコニウム(89Zr)、ヨウ素(131I、125I、124I、123I、及び121I)、インジウム(115In、113In、112In、及び111In）、テクネチウム(99Tc)、タリウム(201Ti)、ガリウム(68Ga、67Ga)等及び種々の陽電子放出性金属、蛍光材料としては、ウンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート等、発光材料としては、ルミノール等、生物発光材料としては、ルシフェラーゼ、ルシフェリン、エクオリン等、光音響イメージング材料としては、金ナノ粒子、単層カーボンナノチューブ、インドシアニングリーン、メチレンブルー等が挙げられる。
【００７８】
本発明の抗体又はその機能性断片を標識する方法としては、ポリエチレングリコール等のリンカーを用いて間接的に化合物を結合させる方法、及び抗体又その機能性断片のシステイン残基にジスルフィド結合を形成させることによって化合物を直接結合させる方法を挙げることができる。また、N-サクシニル-3-(2-ピリジルジチオ)プロピオネートなどの異種二官能性架橋剤を使用して抗体又その機能性断片に化合物を直接結合させることも可能である。さらには、抗体のFc領域の糖鎖を酸化して化合物を結合させることもできる。
【００７９】
本発明の疾患を診断するための医薬組成物に含まれる、診断剤で標識された抗体又はその機能性断片の投与量は、薬理学的に有効な量であれば特に限定されず、人種、性別、年齢、癌の種類等に応じて適宜決定することができ、通常0.01〜1,000 mg/kg、好適には0.1〜100 mg/kgである。本発明の診断剤で標識された抗体又はその機能性断片を被検体における結合部位に優先的に集中させるため及び結合部位に結合していない抗体又はその機能性断片をバックグラウンドレベルまで除くための時間は、使用する診断剤の種類、投与方法などに応じて適宜決定でき、例えば、投与後6〜48時間程度である。また、疾患をモニタリングする場合、例えば、投与後の時間間隔は5〜20日で、最初の診断から1〜12か月繰り返すことによって行う。
【００８０】
本発明の疾患を診断するための医薬組成物に含まれる、診断剤で標識された抗体又はその機能性断片の存在は、公知の方法を使用して被検体の全身を検査することで検出することができる。当該検出方法は、使用する診断剤の種類に依存するものであり、本発明において使用することができる方法としては、コンピュータ断層撮影法、陽電子放出断層撮影法、磁気共鳴画像法、超音波検査、光音響イメージング法などが挙げられる。
【００８１】
本発明の医薬組成物を使用して診断することができる疾患としては、上記の膵臓癌等の癌が挙げられ、本発明の医薬組成物は、特に3'-シアリルラクトースを高発現する癌を診断するために有用である。すなわち、本発明の検査方法により、被検体が膵臓癌等の癌に罹患している可能性が高いと判定された場合、本発明の医薬組成物を投与することで被検体の膵臓癌等の癌をより高い精度で診断することが可能となる。
【００８２】
３．癌の治療
本発明の検査方法により、被検体が膵臓癌等の癌に罹患している可能性が高いと判定された場合、又は別の診断方法を組み合わせて被検体が膵臓癌等の癌であると診断された場合、被験者に対して癌治療を行うことによって、被検体の癌を治療することが可能となる。また、本発明の検査方法はより高い感度で膵臓癌等の癌に罹患している可能性を判断できるので、本発明の検査方法又は別の診断方法と組み合わせによって、真に癌に罹患している被検体を、より確実に治療できる(すなわち、真に癌に罹患している被検体を治療対象から除外する可能性をより低減することができる)。
【００８３】
癌治療の方法としては、特に制限されず、公知の治療方法を各種採用することができる。治療方法としては、例えば化学療法、外科治療法、放射線治療法、免疫療法などが挙げられる。これらは公知の方法に従って実施することができる。
【００８４】
化学療法に用いられる治療薬としては、特に制限されず、各種抗がん剤を用いることができる。抗がん剤としては、例えば、アルキル化剤、代謝拮抗剤、微小管阻害剤、抗生物質抗がん剤、トポイソメラーゼ阻害剤、白金製剤、分子標的薬、ホルモン剤、生物製剤などが挙げられる。アルキル化剤としては、例えばシクロホスファミド、イホスファミド、ニトロソウレア、ダカルバジン、テモゾロミド、ニムスチン、ブスルファン、メルファラン、プロカルバジン、ラニムスチンなどが挙げられる。代謝拮抗剤としては、例えば、エノシタビン、カルモフール、カペシタビン、テガフール、テガフール・ウラシル、テガフール・ギメラシル・オテラシルカリウム、ゲムシタビン、シタラビン、シタラビンオクホスファート、ネララビン、フルオロウラシル、フルダラビン、ペメトレキセド、ペントスタチン、メトトレキサート、クラドリビン、ドキシフルリジン、ヒドロキシカルバミド、メルカプトプリンなどが挙げられる。微小管阻害剤としては、例えば、ビンクリスチンなどのアルカロイド系抗がん剤、ドセタキセル、パクリタキセルなどのタキサン系抗がん剤が挙げられる。抗生物質抗がん剤としては、例えば、マイトマイシンC、ドキソルビシン、エピルビシン、ダウノルビシン、ブレオマイシン、アクチノマイシンD、アクラルビシン、イダルビシン、ピラルビシン、ペプロマイシン、ミトキサントロン、アムルビシン、ジノスタチンスチマラマーなどが挙げられる。トポイソメラーゼ阻害剤としては、例えば、トポイソメラーゼI阻害作用を有するCPT-11、イリノテカン、ノギテカン、トポイソメラーゼII阻害作用をもつエトポシド、ソブゾキサンなどが挙げられる。白金製剤としては、例えば、シスプラチン、ネダプラチン、オキサリプラチン、カルボプラチンなどが挙げられる。ホルモン剤としては、例えば、デキサメタゾン、フィナステリド、タモキシフェン、アストロゾール、エキセメスタン、エチニルエストラジオール、クロルマジノン、ゴセレリン、ビカルタミド、フルタミド、ブレドニゾロン、リュープロレリン、レトロゾール、エストラムスチン、トレミフェン、ホスフェストロール、ミトタン、メチルテストステロン、メドロキシプロゲステロン、メピチオスタンなどが挙げられる。生物製剤としては、例えば、抗PD-1抗体、抗PD-L1抗体などの免疫チェックポイント阻害剤、インターフェロンα、β及びγ、インターロイキン2、ウベニメクス、乾燥BCGなどが挙げられる。分子標的薬としては、例えば、リツキシマブ、アレムツズマブ、トラスツズマブ、セツキシマブ、パニツムマブ、イマチニブ、ダサチニブ、ニロチニブ、ゲフィチニブ、エルロチニブ、テムシロリムス、ベバシズマブ、VEGF trap、スニチニブ、ソラフェニブ、トシツズマブ、ボルテゾミブ、ゲムツズマブ・オゾガマイシン、イブリツモマブ・オゾガマイシン、イブリツモマブチウキセタン、タミバロテン、トレチノインなどが挙げられる。ここに特定する分子標的薬以外にも、ヒト上皮性増殖因子受容体2阻害剤、上皮性増殖因子受容体阻害剤、Bcr-Ablチロシンキナーゼ阻害剤、上皮性増殖因子チロシンキナーゼ阻害剤、mTOR阻害剤、血管内皮増殖因子受容体2阻害剤(α-VEGFR-2抗体)などの血管新生を標的にした阻害剤、MAPキナーゼ阻害剤などの各種チ��シンキナーゼ阻害剤、サイトカインを標的とした阻害剤、プロテアソーム阻害剤、抗体−抗がん剤配合体などの分子標的薬なども含めることができる。これら阻害剤には抗体も含まれる。
【００８５】
代表的な膵臓癌治療薬としては、ゲムシタビン、TS-1、エルロチニブ、ゲムシタビンとエルロチニブとの併用薬、ゲムシタビンとアルブミン結合型パクリタキセルとの併用薬、4種の薬剤(オキサリプラチン、レボホリナート、イリノテカン、及びフルオロウラシル)の併用薬などが挙げられる。
【００８６】
また、本発明は、本発明の抗体又はその機能性断片を含む、疾患を治療するための医薬組成物も提供する。後述する実施例で示すように、本発明の抗体又はその機能性断片自体が癌細胞傷害活性を有しているので、本発明の抗体又はその機能性断片単独でも膵臓癌等の癌の治療に使用することができる。さらに、本発明は、上記の各種抗がん剤及び膵臓癌治療薬、リシン等の毒素化合物、放射性物質放射活性金属イオン(例えば、アルファーエミッター等の放射活性を有する化合物)等の放射性物質などの治療剤で標識された本発明の抗体又はその機能性断片を含む、疾患を治療するための医薬組成物も提供する。その標識法としては、ポリエチレングリコール等のリンカーを用いて間接的に化合物を結合させる方法、及び抗体又その機能性断片のシステイン残基にジスルフィド結合を形成させることによって化合物を直接結合させる方法を挙げることができる。また、N-サクシニル-3-(2-ピリジルジチオ)プロピオネートなどの異種二官能性架橋剤を使用して抗体又その機能性断片に化合物を直接結合させることも可能である。さらには、抗体のFc領域の糖鎖を酸化して化合物を結合させることもできる。
【００８７】
本発明の疾患を治療するための医薬組成物は、薬学的に許容され得る担体を更に含み得る。使用することができる薬学的に許容され得る担体としては、リン酸緩衝食塩水溶液、水、油・水エマルションなどのエマルション、種々の型の湿潤剤などの当技術分野で公知の標準の医薬担体が挙げられる。また、本発明の疾患を治療するための医薬組成物には、他の成分、例えば、医薬品グレードの安定剤、緩衝剤、防腐剤、賦形剤なども使用することができ、pH、等張性、安定性などを考慮する医薬組成物の調製は公知の方法により実施することができる。
【００８８】
本発明の疾患を治療するための医薬組成物に含まれる抗体又はその機能性断片、及び治療剤で標識された抗体又はその機能性断片の投与量は、薬理学的に有効な量であれば特に限定されず、人種、性別、年齢、癌の種類等に応じて適宜決定することができ、通常0.01〜1,000 mg/kg、好適には0.1〜100 mg/kgを、1〜180日間に1回、又は1日2回若しくは3回以上投与することができる。
【００８９】
本発明の医薬組成物を使用して治療することができる疾患としては、上記の膵臓癌等の癌が挙げられ、本発明の医薬組成物は、特に、3'-シアリルラクトースを高発現する癌を治療するために有用である。すなわち、本発明の検査方法により、被検体が膵臓癌等の癌に罹患している可能性が高いと判定された場合、本発明の医薬組成物を投与することで被検体の膵臓癌等の癌を治療することが可能となる。
【実施例】
【００９０】
以下に、実施例に基づいて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例等によってなんら限定されるものではない。【００９１】
実施例１．ヒトES細胞に対するマウスモノクローナル抗体の作製
(a) ハイブリドーマの調製
ヒトES細胞(クローン名：KhES-1)をマイトマイシン処理したマウス初代線維芽細胞(オリエンタル酵母工業株式会社製、カタログ番号：KBL9284400)上で、添加剤(20% KSR (KnockOut Serum Replacement、Invitrogen製、カタログ番号：10828028)、2 mM グルタミン、0.1 mM 非必須アミノ酸)を含むDMEM/F12培地(Sigma-Aldrich製、カタログ番号：D9785)中で培養して未分化能を維持した。未分化ヒトES細胞に酵素溶液(0.25% トリプシン、1 mg/ml コラゲナーゼIV、20% KSR、1 mM CaCl2)を含むPBS (リン酸緩衝生理食塩水)を加えてピペッティングにより細胞を剥がし、遠心分離(1000 rpm、3分間)を行った。沈殿物の未分化ヒトES細胞にPBSを加えて懸濁した後に、2倍量のADJUBANT COMPLETE FREUND (DIFCO製、カタログ番号：263810)を加えて超音波処理して乳化させて免疫源とした。【００９２】
8週齢雌C57BL/6JJmsSlマウスの尾根部に免疫源50μlを注射し、14日後にPBSに未分化ヒトES細胞を懸濁させた懸濁液を免疫源として追加免疫した。追加免疫3日後に腹部リンパ節よりリンパ球を採取し、リンパ球の細胞数を測定後、リンパ球1×108個とマウスミエローマSP2細胞2×107個とを混和して遠心分離(1300 rpm、10分間)した。沈殿物にPEG1500 (Roche製、カタログ番号：783641) 1 mlを加え、37℃で2分間保温して細胞融合を行った後に、DMEM培地(富士フイルム和光純薬株式会社製、カタログ番号：044-29765) 4.5 mlを添加して遠心分離した。次に、沈殿物にHAT培地(ヒポキサンチン13.61 mg/l、アミノプテリン0.176 mg/l、チミジン3.88 mg/l、牛胎児血清10%を含むHybridoma-SFM (GIBCO製、カタログ番号：12300-067)) 50 ml加えて混和した後に、1ウエル当たり100μlのハイブリドーマ懸濁液を96ウエルプレート4枚に播種して5日間培養した。【００９３】
(b) ハイブリドーマの選別
96ウエルプレートにマウス初代線維芽細胞上で未分化ヒトES細胞を培養後、PBSで10倍希釈した37%ホルムアルデヒド(富士フイルム和光純薬株式会社製、カタログ番号：06400406)を加えて室温で15分間固定した。PBSで1回洗浄後、0.5% Triton-X 100を1ウエル当たり50μl加えて室温で5分間静置し、PBSで3回洗浄後、NGS blocking液 (1% BSA、2% ヤギ血清、3.75% グリシンを含むPBS溶液)を添加して室温で30分間静置した。次に、NGS blocking液を除去し、実施例１(a)のハイブリドーマ上清を40μl加えて室温で1時間静置し、PBSで3回洗浄後、NGS blocking液で500倍希釈したヤギ抗マウスIgG(H+L)-Alexa Fluor 488 (abcam製、カタログ番号：ab150113)を加えて室温で30分間静置した。次に、PBSで3回洗浄後にPBSを1ウエル当たり50μl加えて蛍光顕微鏡にて蛍光像を観察し、マウス初代線維芽細胞ではなく、未分化ヒトES細胞のみが染色されるハイブリドーマ上清を選別した。【００９４】
選別された上清を含むウエルからハイブリドーマを回収し、ハイブリドーマ100個当たりHAT培地10 ml加え、96ウエルプレートに1ウエル当たり100μl (理論上、1ウエル当たり、ハイブリドーマ1個)加えて培養し、上記と同様にして免疫染色法によりハイブリドーマ上清を選別した。その結果、未分化ヒトES細胞に反応する抗体を産生するクローン3B1E2が得られた。【００９５】
(c) 3B1E2抗体の精製
HAT培地中でクローン3B1E2を拡大培養して殖やした。10 cmシャーレにまで殖やした後、HAT培地中の牛胎児血清を10%から5%、2%、1%、0%まで徐々に下げて培養し、15 cmシャーレに播き直して牛胎児血清を含まないHAT培地中で12日間培養した。【００９６】
得られた培養上清に314 g/lになるように硫酸アンモニウムと液量の1/10量の1M Tris-HCl (pH8.0)とを加え、室温で1時間撹拌した。遠心分離(18,000 rpm、4℃、30分間)して得られた沈殿に、20 mM NaClを含む15.7 mMリン酸緩衝液(pH6.3) 2 mlを加えて完全に溶解し、PD-10カラム(GE Healthcare製、カタログ番号：17-0851-01)に供した後に同一緩衝液2.5 mlで溶出した。次に、得られた溶出液をHiTrap SP HP強イオン交換カラム(GE Healthcare製、カタログ番号：17-1151-01)に供し、1 M NaClを含む15.7 mMリン酸緩衝液(pH6.3)で溶出して分取した。各分画をSDS-PAGEして抗体画分を取得し、BCA Protein Assay Kit (Thermo Fisher Scientific製、カタログ番号：23225)を用いてタンパク質濃度を決定した。また、Mouse Monoclonal Antibody Isotyping Test Kit (BioRad製、カタログ番号：MMT1)を用いて抗体のクラスを決定したところ、IgM、κであった。【００９７】
(d) 3B1E2抗体遺伝子の決定
クローン3B1E2からISOGENII (株式会社ニッポンジーン製、カタログ番号：311-07361)を用いて全RNAを精製し、マウスIgMの重鎖又は軽鎖定常領域のプライマー(Mu IgM VH 3'-1 Primer又はMu Igκ VL 3'-1 Primer : Merck製、カタログ番号：69831-3CN)と逆転写酵素(Thermo Fisher Scientific製、カタログ番号：18080044)を加えて55℃、30分間反応させてcDNAを調製した。得られたcDNAと、Mouse Ig-Primer Set (Merck製、カタログ番号：69831-3CN)のMu Ig VH 5'-F PrimerとMu IgM VH 3'-1 Primer、又はMu Igκ VL 5'-G PrimerとMu Igκ VL 3'-1 Primerを用いてPCRを行い、それぞれ重鎖及び軽鎖の約500bpのマウス抗体遺伝子断片を取得した。得られた遺伝子断片をpGEM-T Easyベクター(Promega製、カタログ番号：A1360)へ挿入してクローニングを行った。【００９８】
DNAシークエンサーにより3B1E2抗体の重鎖及び軽鎖のCDR塩基配列を決定し、表１に示される重鎖及び軽鎖のCDR1〜3のアミノ酸配列が同定された。また、以下に重鎖可変領域及び軽鎖可変領域全体のアミノ酸配列及び塩基配列を示す。【００９９】
【表１】
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【０１００】
重鎖可変領域(アミノ酸配列)
MDFGLIFFIVALLKGVQCEVKLLQSGGGLVQPGGSLKLSCAASGIDFSIYWMSWVRRAPGKGLEWIGEINSDSSTINYAPSLKDKFTISRDNAKNTLYLQMSKVRSEDTALYYCARKNGGLDYAMDYWGQGTSVTVSS (配列番号１１)
軽鎖可変領域(アミノ酸配列)
MVLISLLFWISGAQCDVQITQSPSYLAASPGETITINCRSSKSISKYLAWYQEKPGKTNKLLIYSGSTLQSGIPSRFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAMYYCQQHNEYPWTFGGGTKLEIK (配列番号１２)
重鎖可変領域(塩基配列配列)
ATGGATTTTGGGCTGATTTTTTTTATTGTTGCTCTTTTAAAAGGGGTCCAGTGTGAGGTGAAGCTTCTCCAGTCTGGAGGTGGCCTGGTGCAGCCTGGAGGATCCCTGAAACTCTCCTGTGCAGCCTCAGGAATCGATTTTAGTATATACTGGATGAGTTGGGTTCGGCGGGCTCCAGGGAAAGGACTAGAATGGATTGGAGAAATTAATTCAGATAGCAGTACAATAAACTATGCACCATCTCTAAAGGATAAATTCACCATCTCCAGAGACAACGCCAAAAATACGCTGTACCTGCAAATGAGCAAAGTGAGATCTGAGGACACAGCCCTTTATTACTGTGCAAGAAAGAATGGGGGATTGGACTATGCTATGGACTACTGGGGTCAAGGAACCTCAGTCACCGTCTCCTCA (配列番号１３)
軽鎖可変領域(塩基配列配列)
ATGGTTCTCATATCCTTGCTGTTCTGGATATCAGGTGCCCAGTGTGATGTCCAGATAACCCAGTCTCCATCTTATCTTGCTGCATCTCCTGGAGAAACCATTACTATTAATTGCAGGTCAAGTAAGAGCATTAGCAAATATTTAGCCTGGTATCAAGAGAAACCTGGGAAAACTAATAAGCTTCTTATCTACTCTGGATCCACTTTACAATCTGGAATTCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGATCTGGTACAGATTTCACTCTCACCATCAGTAGCCTGGAGCCTGAAGATTTTGCAATGTATTACTGTCAACAGCATAATGAATACCCGTGGACGTTCGGTGGAGGCACCAAGCTGGAAATCAAG (配列番号１４)【０１０１】
(e) 3B1E2抗体（マウスIgG2a、κ）の調製
実施例１(d)で得られた重鎖又は軽鎖可変領域の遺伝子断片をマウス抗体(IgG2a)発現用ベクターpUC19-CAG-HC (mIgG2a)又はpUC19-CAG-HC (mKappa)にそれぞれ挿入した。作製された2種のプラスミド各0.25μgを、0.4×106細胞のHEK293細胞にPEI (Merck製、カタログ番号：408727-100ML)を用いて遺伝子導入して3日間培養した。得られた培養上清を回収し、実施例１(c)と同様にして硫酸アンモニウムと1M Tris-HCl (pH8.0)とを加え、3B1E2抗体(マウスIgG2a、κ)を調製した。【０１０２】
実施例２．3B1E2抗体と3'-シアリルラクトースとの結合
MaxiSorp 96ウエルプレート(Thermo Fisher Scientific製、カタログ番号：439454)の各ウエルに10μg/mlの3'-シアリルラクトース-PAA (polyacrylamide)(GlycoTech Corporation製、カタログ番号：08-038) PBS溶液を100μl加え、室温で16時間静置した。次に、各ウエルを300μlの1% Triton-X 100を含むPBS (洗浄液)で3回洗浄後、200μlの5% BSA及び1% Triton-X 100を含むPBSを加えて室温で1時間静置した。各ウエルを300μlの洗浄液で洗浄後、3B1E2抗体(マウスIgG2a又はマウスIgM)又は各コントロール抗体(マウスIgG2a：BioLegend製、カタログ番号：401502又はマウスIgM：BioLegend製、カタログ番号：401602)を100μlずつ添加して室温で2時間静置した。【０１０３】
次に、各ウエルを300μlの洗浄液で5回洗浄後、1,000倍に希釈したペルオキシダーゼ標識ヤギ抗マウスIgG抗体(Jackson ImmunoResearch製、カタログ番号：115-035-071)又はペルオキシダーゼ標識ヤギ抗マウスIgM抗体(Jackson ImmunoResearch、カタログ番号：115-035-075)を100μlずつ添加して室温で1時間静置した後に、300μLの洗浄液で3回洗浄し、ペルオキシダーゼ基質液(SeraCare Life Sciences製、カタログ番号：5120-0053)を100μlずつ添加して室温で30分間静置した。反応後、2%硫酸を50μl添加して反応を停止させた後に、各ウエルの450 nmの吸光度をマイクロプレートリーダーで測定した。【０１０４】
その結果、図１に示すように、3B1E2抗体(マウスIgG2a)はコントロール抗体と比較して、3'-シアリルラクトースに強く結合していることが示された。また、図２に示すように、3B1E2抗体(マウスIgM)はコントロール抗体に比して、3'-シアリルラクトースに強く結合していることが示された。【０１０５】
実施例３．3B1E2抗体による癌組織の病理検査
複数種の組織について癌組織(各15標本程度)の切片が搭載されている組織アレイスライド(US Biomax製、カタログ番号：MC5003c)を脱パラフィン処理(キシレン  7分間3回、メタノール  2分間3回、水洗)した後に、3%過酸化水素を含むメタノールを加えて内因性ペルオキシダーゼを不活性化した。水洗した後に、10 mM クエン酸緩衝液(pH6.0)中で98℃、5分間保温して抗原を賦活化した。洗浄後、パップペンで標本の周りを囲んだ後に、ブロックエース(DSファーマバイオメディカル株式会社製、カタログ番号：UKB40)溶液を加えて室温で15分間ブロッキング処理した。【０１０６】
次に、50μg/ml 3B1E2抗体(マウスIgG2a)を300μl加え、室温で2時間静置し、PBSで3回洗浄した後に、ヒト組織用ヒストファインシンプルステインMAX-PO (株式会社ニチレイ製、カタログ番号：424131)を加えて室温で30分間静置した。PBSで3回洗浄後、DAB発色液(Dako製、カタログ番号：K3468)を加えて1分間反応させた後に水洗し、ヘマトキシリン溶液(サクラファインテックジャパン株式会社製、カタログ番号：8656)を加えて約30秒間核を染色した。水洗後、スライドを脱水処理(75%エタノール  3分間、95%エタノール  3分間、100%エタノール  3分間2回)、透徹処理(キシレン  3分間2回)した後に封入して顕微鏡観察した。【０１０７】
全標本に対する3B1E2抗体(マウスIgG2a)で染色された陽性標本の割合を測定した結果、表２に示すように、膵臓癌及びメラノーマでは標本の50%以上が陽性であり、また、甲状腺癌、胃癌、精巣癌、卵巣癌では10%以上が陽性だった。このことから、膵臓癌、メラノーマ、甲状腺癌、胃癌、精巣癌、卵巣癌の癌組織では3B1E2抗体の抗原が検出されることが示された。【０１０８】
【表２】
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【０１０９】
実施例４．3B1E2抗体による膵臓癌患者の血液検査
(a) 3B1E2抗体（マウスIgM）のペルオキシダーゼ標識
3B1E2抗体(マウスIgM) 10μgをAb-10 Rapid Peroxidase Labeling Kit (株式会社同仁化学研究所製、カタログ番号：LK33)を用いて、プロトコルに従ってペルオキダーゼ標識した。【０１１０】
(b) 血清検体の調製
生体試料として、健常人13名、及び膵臓癌患者55名(ステージI：15名、ステージII：15名、ステージIII：11名、ステージIV：14名)の血清を、富士フイルム和光純薬株式会社を介して米国の病院から入手した。各血清は、検体希釈溶液(1% BSA及び0.05% Triton-X 100を含むPBS)で6倍に希釈して血清検体とした。【０１１１】
(c) 健常人および膵臓癌患者の血清中の3B1E2抗体の抗原値の測定
MaxiSorp 96ウエルプレートの各ウエルに10μg/mlの3B1E2抗体(マウスIgG2a)を100μl加え、4℃、16時間静置した。次に、各ウエルを洗浄液(0.05% Triton-X 100を含む50 mM Tris-HCl (pH8.0)、140 mM NaCl) 200μlで3回洗浄し、5% BSAを含む洗浄液200μlを加えて室温で1時間静置した。各ウエルを3回洗浄し、血清検体100μl添加して室温で1時間静置後、各ウエルを5回洗浄し、検体希釈溶液で10,000倍に希釈したペルオキシダーゼ標識3B1E2抗体(マウスIgM)を100μlずつ添加して室温で1時間静置した。各ウエルを5回洗浄した後に、ペルオキシダーゼ基質液(SeraCare Life Sciences製、コード番号：5120-0053)を100μlずつ添加して室温で30分間静置した。反応後、2%硫酸を50μl添加して反応を停止させ、各ウエルの450 nmの吸光度をマイクロプレートリーダーで測定した。【０１１２】
その結果、図３に示すように、健常人に比して膵臓癌患者では、血清中の3B1E2抗体の抗原値が有意(p<0.0001)に高く、膵臓癌の罹患と3B1E2抗体の抗原値とが相関していることが示された。【０１１３】
実施例５．3B1E2抗体の癌細胞に対する傷害作用
3B1E2抗体は、ヒト膵臓癌細胞株KP-3L (JCRB生物資源バンク、細胞登録番号：JCRB0178.1)の細胞膜表面に結合する。1%牛血清アルブミン(Sigma-Aldrich製、カタログ番号：A7906)を含むRPMI-1640培地(富士フイルム和光純薬株式会社製、コード番号：186-02155)中でKP-3Lを分散し、96ウエル培養プレートに1ウエル当たり2x104個播種した。翌日、培地35μlを除去し、3B1E2抗体(マウスIgG2a)又はコントロール抗体(BioLegend製、カタログ番号：401502)を含むRPMI-1640培地を10μl添加して室温で30分間静置した。次に、ウサギ補体血清(Sigma-Aldrich製、カタログ番号：S7764)を25μl添加して37℃、5% CO2下で4時間培養した。その後、プレートを1,000rpmで5分間遠心分離して上清50μlを回収し、上清中のラクトースデヒドロゲナーゼ活性をcytotoxicity detection kit (Roche製、カタログ番号：4744926)を用いて測定した。陰性対照は抗体の代わりにRPMI-1640培地、陽性対照は抗体の代わりにRPMI-1640培地、及びウサギ補体血清の代わりにTween(商標)20を添加して同様に測定した。抗体の癌細胞傷害活性は、以下の式に基づいて算出した。
癌細胞傷害活性(%)=(抗体の485 nmの吸光度-陰性対照の485 nmの吸光度)/(陽性対照の485 nmの吸光度-陰性対照の485 nmの吸光度)×100【０１１４】
その結果、図４に示すように、3B1E2抗体では濃度依存的に癌細胞傷害活性が上昇し、その活性は全ての濃度においてコントロールに比して有意(p<0.01)に高いことが示された。
【産業上の利用可能性】
【０１１５】
本発明の抗体を用いた検査薬は、膵臓癌等の癌の罹患の可能性を判定することが可能である。本発明の抗体の抗原値を測定することにより、膵臓癌等の癌の進行及び抗癌剤の有効性をモニタリングすることも可能である。また、本発明の抗体を用いた医薬組成物は、膵臓癌等の癌を診断並びに治療することが可能である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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