(57)【要約】  標的物質に対する動的結合容量が大きく、且つ標的物質と夾雑物とを分離する性能に優れるクロマトグラフィー担体を提供すること。  支持体と、下記式（１）で表されるリガンドとを有する、クロマトグラフィー担体。2020045541.tif 000031〔式（１）中、  Ａは、アニオン性官能基を示し、  Ｑは、２価の芳香族炭化水素基を示し、  Ｒ1は、２価の有機基を示し、  Ｒ2は、水素原子又は炭化水素基を示し、  Ｘは、チオ基、スルフィニル基又はスルホニル基を示し、  ＊は、結合手を示す。〕
2020045541.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
支持体と、下記式（１）で表されるリガンドとを有する、クロマトグラフィー担体。
【化１】
2020045541.tif 000025
〔式（１）中、
Ａは、アニオン性官能基を示し、
Ｑは、２価の芳香族炭化水素基を示し、
Ｒ1は、２価の有機基を示し、
Ｒ2は、水素原子又は炭化水素基を示し、
Ｘは、チオ基、スルフィニル基又はスルホニル基を示し、
＊は、結合手を示す。〕
【請求項２】
Ａが、−Ｃ（＝Ｏ）ＯＨ、−Ｃ（＝Ｏ）Ｏ-Ｍ+、−Ｃ（＝Ｏ）Ｏ-、−Ｓ（＝Ｏ）2ＯＨ、−Ｓ（＝Ｏ）2Ｏ-Ｍ+、−Ｓ（＝Ｏ）2Ｏ-、−Ｐ（＝Ｏ）（ＯＨ）2、−Ｐ（＝Ｏ）（Ｏ-Ｍ+）2、−Ｐ（＝Ｏ）（Ｏ-）2、−Ｐ（＝Ｏ）（ＯＨ）（Ｏ-Ｍ+）、−Ｐ（＝Ｏ）（ＯＨ）（Ｏ-）、−Ｏ−Ｐ（＝Ｏ）（ＯＨ）2、−Ｏ−Ｐ（＝Ｏ）（Ｏ-Ｍ+）2、−Ｏ−Ｐ（＝Ｏ）（Ｏ-）2、−Ｏ−Ｐ（＝Ｏ）（ＯＨ）（Ｏ-Ｍ+）、又は−Ｏ−Ｐ（＝Ｏ）（ＯＨ）（Ｏ-）（上記Ｍ+は、それぞれ対イオンを示す）である、請求項１に記載の担体。
【請求項３】
Ｑが、下記式（２）又は（３）で表される２価の基である、請求項１又は２に記載の担体。
【化２】
2020045541.tif 000026
〔式（２）中、
Ｒ3は、ハロゲン原子、ヒドロキシ基、カルボキサミド基又は有機基を示し、
ｎは、０〜４の整数を示し、
＊は、結合手を示す。〕
【化３】
2020045541.tif 000027
〔式（３）中、
Ｒ4は、ハロゲン原子、ヒドロキシ基、カルボキサミド基又は有機基を示し、
ｍは、０〜６の整数を示し、
＊は、結合手を示す。〕
【請求項４】
Ｒ1が、炭素数１〜２０の２価の炭化水素基である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の担体。
【請求項５】
Ｘが、チオ基である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の担体。
【請求項６】
前記リガンドが、下記式（α）で表されるものである、請求項１〜５のいずれか１項に記載の担体。
【化４】
2020045541.tif 000028
〔式（α）中、
Ｒ1は、炭素数１〜１０のアルカンジイル基を示し、
＊は、結合手を示す。〕
【請求項７】
前記支持体が、合成高分子支持体である、請求項１〜６のいずれか１項に記載の担体。
【請求項８】
前記リガンドが前記支持体に結合されている、請求項１〜７のいずれか１項に記載の担体。
【請求項９】
タンパク質精製クロマトグラフィー担体である、請求項１〜８のいずれか１項に記載の担体。
【請求項１０】
抗体精製クロマトグラフィー担体である、請求項１〜８のいずれか１項に記載の担体。
【請求項１１】
疎水クロマトグラフィーとカチオン交換クロマトグラフィーとのミックスモードクロマトグラフィー担体である、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の担体。
【請求項１２】
請求項１〜１１のいずれか１項に記載の担体を製造する方法であって、スルファニル基と反応可能な官能基を分子内に有する支持体と、下記式（β）で表される化合物とを接触させる工程を含む、製造方法。
【化５】
2020045541.tif 000029
〔式（β）中、
Ａは、アニオン性官能基を示し、
Ｑは、２価の芳香族炭化水素基を示し、
Ｒ1は、２価の有機基を示し、
Ｒ2は、水素原子又は炭化水素基を示す。〕
【請求項１３】
請求項１〜１１のいずれか１項に記載の担体がカラム容器に充填されている、クロマトグラフィーカラム。
【請求項１４】
請求項１〜１１のいずれか１項に記載の担体を用いる、標的物質の精製方法。
【請求項１５】
下記式（β）で表される化合物。
【化６】
2020045541.tif 000030
〔式（β）中、
Ａは、アニオン性官能基を示し、
Ｑは、２価の芳香族炭化水素基を示し、
Ｒ1は、２価の有機基を示し、
Ｒ2は、水素原子又は炭化水素基を示す。〕
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、クロマトグラフィー担体に関する。より詳細には、クロマトグラフィー担体、当該担体の製造方法及びその製造中間体、クロマトグラフィーカラム、並びに標的物質の精製方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
抗体医薬等に代表されるバイオ医薬品の分野では、タンパク質等の標的物質の発現技術が著しく進展し、それに伴いクロマトグラフィー等による精製工程での生産性の向上が求められている。特に、治療薬・診断薬として抗体を使用する場合等には、細胞副産物や培養液成分等から抗体を高純度で分離することが必要となる。【０００３】
従来、抗体に代表される標的タンパク質を高純度化する方法としては、アフィニティー精製で夾雑物を除去し、次いでイオン交換精製により更に純度を高める方法が一般的であったが、イオン交換精製では、等電点（ｐＩ）が標的タンパク質と近い標的外のタンパク質を標的タンパク質から分離しにくいという問題があった。
そのため、等電点（ｐＩ）が標的タンパク質と近い標的外のタンパク質と親疎水性が標的タンパク質と近い標的外のタンパク質の両方を標的タンパク質から分離することを目的として、近年では、イオン交換精製の代わりに、疎水クロマトグラフィー（ＨＩＣ）とカチオン交換クロマトグラフィーとのミックスモード精製が行われるようになってきた。このミックスモード精製には、アニオン性官能基と疎水性基を含むミックスモードリガンドを有する担体が使用されている。このようなミックスモード担体として、例えば、２−（ベンゾイルアミノ）−４−メルカプト酪酸の残基（特許文献１、２）の他、Ｌ−トリプトファンの残基（特許文献３）や４−アミノ馬尿酸の残基（特許文献４）をミックスモードリガンドとして有する担体が提案されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特表２００７−５２５５０１号公報
【特許文献２】特表２００８−５０５８５１号公報
【特許文献３】特開２０１０−２１０４９７号公報
【特許文献４】特表２０１５−５０１３１０号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかしながら、標的タンパク質等の標的物質の更なる高純度化が求められる昨今においては、上記標的物質から標的外のタンパク質等の夾雑物を分離する性能を更に改善させることが要求される。また、特許文献１〜４に記載の上記担体は、標的物質に対する動的結合容量にもそもそも改善の余地があった。
本発明が解決しようとする課題は、標的物質に対する動的結合容量が大きく、且つ標的物質と夾雑物とを分離する性能に優れるクロマトグラフィー担体を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明の課題は、以下の＜１＞〜＜１５＞の手段により解決された。
＜１＞  支持体と、下記式（１）で表されるリガンド（以下、「リガンド（１）」ともいう）とを有する、クロマトグラフィー担体（以下、「本発明のクロマトグラフィー担体」ともいう）。【０００７】
【化１】
2020045541.tif 000003
【０００８】
〔式（１）中、
Ａは、アニオン性官能基を示し、
Ｑは、２価の芳香族炭化水素基を示し、
Ｒ1は、２価の有機基を示し、
Ｒ2は、水素原子又は炭化水素基を示し、
Ｘは、チオ基、スルフィニル基又はスルホニル基を示し、
＊は、結合手を示す。〕【０００９】
＜２＞  Ａが、−Ｃ（＝Ｏ）ＯＨ、−Ｃ（＝Ｏ）Ｏ-Ｍ+、−Ｃ（＝Ｏ）Ｏ-、−Ｓ（＝Ｏ）2ＯＨ、−Ｓ（＝Ｏ）2Ｏ-Ｍ+、−Ｓ（＝Ｏ）2Ｏ-、−Ｐ（＝Ｏ）（ＯＨ）2、−Ｐ（＝Ｏ）（Ｏ-Ｍ+）2、−Ｐ（＝Ｏ）（Ｏ-）2、−Ｐ（＝Ｏ）（ＯＨ）（Ｏ-Ｍ+）、−Ｐ（＝Ｏ）（ＯＨ）（Ｏ-）、−Ｏ−Ｐ（＝Ｏ）（ＯＨ）2、−Ｏ−Ｐ（＝Ｏ）（Ｏ-Ｍ+）2、−Ｏ−Ｐ（＝Ｏ）（Ｏ-）2、−Ｏ−Ｐ（＝Ｏ）（ＯＨ）（Ｏ-Ｍ+）、又は−Ｏ−Ｐ（＝Ｏ）（ＯＨ）（Ｏ-）（上記Ｍ+は、それぞれ対イオンを示す）である、＜１＞に記載の担体。【００１０】
＜３＞  Ｑが、下記式（２）又は（３）で表される２価の基である、＜１＞又は＜２＞に記載の担体。【００１１】
【化２】
2020045541.tif 000004
【００１２】
〔式（２）中、
Ｒ3は、ハロゲン原子、ヒドロキシ基、カルボキサミド基又は有機基を示し、
ｎは、０〜４の整数を示し、
＊は、結合手を示す。〕【００１３】
【化３】
2020045541.tif 000005
【００１４】
〔式（３）中、
Ｒ4は、ハロゲン原子、ヒドロキシ基、カルボキサミド基又は有機基を示し、
ｍは、０〜６の整数を示し、
＊は、結合手を示す。〕【００１５】
＜４＞  Ｒ1が、炭素数１〜２０の２価の炭化水素基である、＜１＞〜＜３＞のいずれかに記載の担体。【００１６】
＜５＞  Ｘが、チオ基である、＜１＞〜＜４＞のいずれかに記載の担体。【００１７】
＜６＞  前記リガンドが、下記式（α）で表されるものである、＜１＞〜＜５＞のいずれかに記載の担体。【００１８】
【化４】
2020045541.tif 000006
【００１９】
〔式（α）中、
Ｒ1は、炭素数１〜１０のアルカンジイル基を示し、
＊は、結合手を示す。〕【００２０】
＜７＞  前記支持体が、合成高分子支持体である、＜１＞〜＜６＞のいずれかに記載の担体。【００２１】
＜８＞  前記リガンドが前記支持体に結合されている、＜１＞〜＜７＞のいずれかに記載の担体。【００２２】
＜９＞  タンパク質精製クロマトグラフィー担体である、＜１＞〜＜８＞のいずれかに記載の担体。【００２３】
＜１０＞  抗体精製クロマトグラフィー担体である、＜１＞〜＜８＞のいずれかに記載の担体。【００２４】
＜１１＞  疎水クロマトグラフィーとカチオン交換クロマトグラフィーとのミックスモードクロマトグラフィー担体である、＜１＞〜＜１０＞のいずれかに記載の担体。【００２５】
＜１２＞  ＜１＞〜＜１１＞のいずれかに記載の担体を製造する方法であって、スルファニル基と反応可能な官能基を分子内に有する支持体と、下記式（β）で表される化合物とを接触させる工程を含む、製造方法（以下、「本発明の製造方法」ともいう）。【００２６】
【化５】
2020045541.tif 000007
【００２７】
〔式（β）中、
Ａは、アニオン性官能基を示し、
Ｑは、２価の芳香族炭化水素基を示し、
Ｒ1は、２価の有機基を示し、
Ｒ2は、水素原子又は炭化水素基を示す。〕【００２８】
＜１３＞  ＜１＞〜＜１１＞のいずれかに記載の担体がカラム容器に充填されている、クロマトグラフィーカラム（以下、「本発明のクロマトグラフィーカラム」ともいう）。【００２９】
＜１４＞  ＜１＞〜＜１１＞のいずれかに記載の担体を用いる、標的物質の精製方法（以下、「本発明の標的物質の精製方法」ともいう）。【００３０】
＜１５＞  下記式（β）で表される化合物（以下、「本発明の製造中間体」又は「化合物（β）」ともいう）。【００３１】
【化６】
2020045541.tif 000008
【００３２】
〔式（β）中、
Ａは、アニオン性官能基を示し、
Ｑは、２価の芳香族炭化水素基を示し、
Ｒ1は、２価の有機基を示し、
Ｒ2は、水素原子又は炭化水素基を示す。〕
【発明の効果】
【００３３】
本発明のクロマトグラフィー担体は、標的物質に対する動的結合容量が大きく、且つ標的物質と夾雑物とを分離する性能に優れる。
したがって、本発明のクロマトグラフィーカラム及び標的物質の精製方法によれば、標的物質と夾雑物とを簡便に且つ効率よく分離できる。
また、本発明の製造方法によれば、標的物質に対する動的結合容量が大きく、且つ標的物質と夾雑物とを分離する性能に優れるクロマトグラフィー担体を、簡便に且つ効率よく製造できる。
本発明の製造中間体は、本発明のクロマトグラフィー担体の製造中間体として有用である。
【発明を実施するための形態】
【００３４】
＜クロマトグラフィー担体（ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  ｃａｒｒｉｅｒ）＞
本発明のクロマトグラフィー担体は、支持体と、下記式（１）で表されるリガンドとを有することを特徴とするものである。
【００３５】
【化７】
2020045541.tif 000009
【００３６】
〔式（１）中、
Ａは、アニオン性官能基を示し、
Ｑは、２価の芳香族炭化水素基を示し、
Ｒ1は、２価の有機基を示し、
Ｒ2は、水素原子又は炭化水素基を示し、
Ｘは、チオ基（−Ｓ−）、スルフィニル基（−Ｓ（＝Ｏ）−）又はスルホニル基（−Ｓ（＝Ｏ）2−）を示し、
＊は、結合手を示す。〕
【００３７】
（リガンド）
本発明において「リガンド」は、タンパク質に代表される標的物質を捕捉できる部位をいい、捕捉の作用機序は化学結合に限られるものではなく、イオン交換、疎水性相互作用等によるものでもよい。本発明のクロマトグラフィー担体は、特定の化学構造を有するリガンド（１）を有することによって、標的物質に対する動的結合容量、標的物質と夾雑物とを分離する性能が改善されたものである。
【００３８】
以下、式（１）中の各記号について説明する。
式（１）中、Ａは、アニオン性官能基を示す。本発明のクロマトグラフィー担体において、Ａで示されるアニオン性官能基は、陽イオン交換基として作用する。
上記アニオン性官能基としては、具体的には、−Ｃ（＝Ｏ）ＯＨ、−Ｃ（＝Ｏ）Ｏ-Ｍ+、−Ｃ（＝Ｏ）Ｏ-、−Ｓ（＝Ｏ）2ＯＨ、−Ｓ（＝Ｏ）2Ｏ-Ｍ+、−Ｓ（＝Ｏ）2Ｏ-、−Ｐ（＝Ｏ）（ＯＨ）2、−Ｐ（＝Ｏ）（Ｏ-Ｍ+）2、−Ｐ（＝Ｏ）（Ｏ-）2、−Ｐ（＝Ｏ）（ＯＨ）（Ｏ-Ｍ+）、−Ｐ（＝Ｏ）（ＯＨ）（Ｏ-）、−Ｏ−Ｐ（＝Ｏ）（ＯＨ）2、−Ｏ−Ｐ（＝Ｏ）（Ｏ-Ｍ+）2、−Ｏ−Ｐ（＝Ｏ）（Ｏ-）2、−Ｏ−Ｐ（＝Ｏ）（ＯＨ）（Ｏ-Ｍ+）、−Ｏ−Ｐ（＝Ｏ）（ＯＨ）（Ｏ-）等が挙げられる。
上記Ｍ+は、それぞれ対イオンを示す。対イオンとしては、例えば、ナトリウムイオン、カリウムイオン等のアルカリ金属イオン；マグネシウムイオン、カルシウムイオン等のアルカリ土類金属イオン；アンモニウムイオン；有機アンモニウムイオン等が挙げられる。
【００３９】
これらアニオン性官能基の中でも、本発明の所望の効果を高めるために、−Ｃ（＝Ｏ）ＯＨ、−Ｃ（＝Ｏ）Ｏ-Ｍ+、−Ｃ（＝Ｏ）Ｏ-、−Ｓ（＝Ｏ）2ＯＨ、−Ｓ（＝Ｏ）2Ｏ-Ｍ+、−Ｓ（＝Ｏ）2Ｏ-、−Ｐ（＝Ｏ）（ＯＨ）2、−Ｐ（＝Ｏ）（Ｏ-Ｍ+）2、−Ｐ（＝Ｏ）（Ｏ-）2、−Ｐ（＝Ｏ）（ＯＨ）（Ｏ-Ｍ+）、−Ｐ（＝Ｏ）（ＯＨ）（Ｏ-）が好ましく、−Ｃ（＝Ｏ）ＯＨ、−Ｃ（＝Ｏ）Ｏ-Ｍ+、−Ｃ（＝Ｏ）Ｏ-、−Ｓ（＝Ｏ）2ＯＨ、−Ｓ（＝Ｏ）2Ｏ-Ｍ+、−Ｓ（＝Ｏ）2Ｏ-がより好ましく、−Ｃ（＝Ｏ）ＯＨ、−Ｃ（＝Ｏ）Ｏ-Ｍ+、−Ｃ（＝Ｏ）Ｏ-が特に好ましい。
【００４０】
Ｑは、２価の芳香族炭化水素基を示す。本発明のクロマトグラフィー担体において、Ｑで示される２価の芳香族炭化水素基は、疎水性相互作用を奏する疎水性基として作用する。
２価の芳香族炭化水素基の炭素数としては、６〜１８が好ましく、６〜１２がより好ましい。２価の芳香族炭化水素基としては、アリーレン基が好ましく、具体的には、フェニレン基、ナフチレン基、フェナントレニレン基等が挙げられる。この中でも、本発明の所望の効果を高めるために、フェニレン基、ナフチレン基が好ましく、フェニレン基が特に好ましい。
なお、２価の芳香族炭化水素基の結合部位は、環上のいずれの炭素上でもよい。
【００４１】
また、２価の芳香族炭化水素基は、置換基を有する２価の芳香族炭化水素基、非置換の２価の芳香族炭化水素基のいずれでもよい。なお、２価の芳香族炭化水素基が置換基を有する場合、置換基の置換位置及び個数は任意であり、置換基を２個以上有する場合、該置換基は同一でも異なっていてもよい。置換基としては、塩素原子、臭素原子、フッ素原子等のハロゲン原子；ヒドロキシ基；カルボキサミド基；有機基等が挙げられる。有機基としては、炭化水素基、炭素数２以上の炭化水素基の炭素−炭素原子間にエーテル結合、アミド結合及びエステル結合から選ばれる１種以上を有する基が挙げられる。有機基が炭化水素基である場合、その炭素数は、好ましくは１〜４であり、より好ましくは１又は２である。「炭素数２以上の炭化水素基の炭素−炭素原子間にエーテル結合、アミド結合及びエステル結合から選ばれる１種以上を有する基」における炭化水素基の炭素数は、好ましくは２〜４である。
また、上記炭化水素基としては、アルキル基が好ましい。アルキル基は直鎖状でも分岐鎖状でもよく、例えば、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基、ｎ−ブチル基、ｓｅｃ−ブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基等が挙げられる。
【００４２】
Ｑで示される２価の芳香族炭化水素基としては、本発明の所望の効果を高めるために、下記式（２）又は（３）で表される２価の基が好ましく、式（２）で表される２価の基が特に好ましい。
【００４３】
【化８】
2020045541.tif 000010
【００４４】
〔式（２）中、
Ｒ3は、ハロゲン原子、ヒドロキシ基、カルボキサミド基又は有機基を示し、
ｎは、０〜４の整数を示し、
＊は、結合手を示す。〕
【００４５】
【化９】
2020045541.tif 000011
【００４６】
〔式（３）中、
Ｒ4は、ハロゲン原子、ヒドロキシ基、カルボキサミド基又は有機基を示し、
ｍは、０〜６の整数を示し、
＊は、結合手を示す。〕
【００４７】
式（２）、（３）中、Ｒ3、Ｒ4で示されるハロゲン原子としては、塩素原子、臭素原子、フッ素原子が挙げられる。また、Ｒ3、Ｒ4で示される有機基としては、炭化水素基、炭素数２以上の炭化水素基の炭素−炭素原子間にエーテル結合、アミド結合及びエステル結合から選ばれる１種以上を有する基が挙げられる。有機基が炭化水素基である場合、その炭素数は、好ましくは１〜４であり、より好ましくは１又は２である。「炭素数２以上の炭化水素基の炭素−炭素原子間にエーテル結合、アミド結合及びエステル結合から選ばれる１種以上を有する基」における炭化水素基の炭素数は、好ましくは２〜４である。
また、上記炭化水素基としては、アルキル基が好ましい。アルキル基は直鎖状でも分岐鎖状でもよく、例えば、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基、ｎ−ブチル基、ｓｅｃ−ブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基等が挙げられる。
【００４８】
式（２）中、ｎは、０〜４の整数を示すが、本発明の所望の効果を高めるために、０〜２が好ましく、０が特に好ましい。また、式（３）中、ｍは、０〜６の整数を示すが、本発明の所望の効果を高めるために、０〜２が好ましく、０が特に好ましい。
なお、ｎが２〜４の整数の場合、ｎ個のＲ3は同一であっても異なっていてもよい。また、ｍが２〜６の整数の場合、ｍ個のＲ4は同一であっても異なっていてもよい。
【００４９】
Ｒ1は、２価の有機基を示す。Ｒ1で示される２価の有機基としては、２価の炭化水素基、炭素数２以上の２価の炭化水素基の炭素−炭素原子間にエーテル結合、アミド結合及びエステル結合から選ばれる１種以上を有する基が挙げられるが、本発明の所望の効果を高めるために、２価の炭化水素基が好ましい。
Ｒ1で示される２価の有機基が、２価の炭化水素基である場合、その炭素数は、本発明の所望の効果を高めるために、好ましくは１〜２０、より好ましくは１〜１４、更に好ましくは１〜１０、更に好ましくは１〜５、特に好ましくは１又は２である。一方、２価の有機基が、「炭素数２以上の２価の炭化水素基の炭素−炭素原子間にエーテル結合、アミド結合及びエステル結合から選ばれる１種以上を有する基」である場合、斯かる基における２価の炭化水素基の炭素数は、本発明の所望の効果を高めるために、好ましくは２〜２０、より好ましくは２〜１４、更に好ましくは２〜１０、更に好ましくは２〜５、特に好ましくは２である。
なお、Ｒ1で示される２価の炭化水素基、「炭素数２以上の２価の炭化水素基の炭素−炭素原子間にエーテル結合、アミド結合及びエステル結合から選ばれる１種以上を有する基」における２価の炭化水素基は、置換基を有していてもよい。当該置換基としては、例えば、塩素原子、臭素原子、フッ素原子等のハロゲン原子、ヒドロキシ基等が挙げられる。なお、置換基の置換位置及び個数は任意であり、置換基を２個以上有する場合、該置換基は同一でも異なっていてもよい。
【００５０】
Ｒ1で示される２価の炭化水素基、「炭素数２以上の２価の炭化水素基の炭素−炭素原子間にエーテル結合、アミド結合及びエステル結合から選ばれる１種以上を有する基」における２価の炭化水素基は、２価の飽和炭化水素基でも２価の不飽和炭化水素基でもよい。また、当該２価の炭化水素基としては、２価の脂肪族炭化水素基、２価の脂環式炭化水素基、２価の芳香族炭化水素基が挙げられるが、本発明の所望の効果を高めるために、２価の脂肪族炭化水素基、２価の脂環式炭化水素基が好ましい。なお、２価の脂肪族炭化水素基は、直鎖状でも分岐鎖状でもよい。
【００５１】
Ｒ1で示される２価の有機基が、２価の脂肪族炭化水素基である場合、その炭素数は、本発明の所望の効果を高めるために、好ましくは１〜２０、より好ましくは１〜１４、更に好ましくは１〜１０、更に好ましくは１〜５、特に好ましくは１又は２である。一方、２価の有機基が、「炭素数２以上の２価の脂肪族炭化水素基の炭素−炭素原子間にエーテル結合、アミド結合及びエステル結合から選ばれる１種以上を有する基」である場合、斯かる基における２価の脂肪族炭化水素基の炭素数は、本発明の所望の効果を高めるために、好ましくは２〜２０、より好ましくは２〜１４、更に好ましくは２〜１０、更に好ましくは２〜５、特に好ましくは２である。
上記２価の脂肪族炭化水素基としては、アルカンジイル基、アルケンジイル基が挙げられるが、本発明の所望の効果を高めるために、アルカンジイル基が好ましい。
アルカンジイル基としては、具体的には、メタン−１，１−ジイル基、エタン−１，１−ジイル基、エタン−１，２−ジイル基、プロパン−１，１−ジイル基、プロパン−１，２−ジイル基、プロパン−１，３−ジイル基、プロパン−２，２−ジイル基、ブタン−１，１−ジイル基、ブタン−１，２−ジイル基、ブタン−１，３−ジイル基、ブタン−１，４−ジイル基、ペンタン−１，４−ジイル基、ペンタン−１，５−ジイル基、ヘキサン−１，２−ジイル基、ヘキサン−１，５−ジイル基、ヘキサン−１，６−ジイル基、ヘプタン−１，７−ジイル基、オクタン−１，８−ジイル基、ノナン−１，９−ジイル基、デカン−１，２−ジイル基、デカン−１，１０−ジイル基等が挙げられる。
【００５２】
上記２価の脂環式炭化水素基の炭素数は、好ましくは３〜２０であり、より好ましくは３〜１４であり、更に好ましくは３〜１０であり、特に好ましくは３〜８である。
２価の脂環式炭化水素基としては、シクロアルカンジイル基の他、アダマンチレン基等の２価の橋かけ環炭化水素基が挙げられるが、シクロアルカンジイル基が好ましい。
シクロアルカンジイル基としては、具体的には、シクロヘキサンジイル基、メチルシクロヘキサンジイル基、シクロヘプタンジイル基等が挙げられる。
【００５３】
上記２価の芳香族炭化水素基の炭素数は、好ましくは６〜１８であり、より好ましくは６〜１２である。２価の芳香族炭化水素基としては、アリーレン基が好ましく、具体的には、フェニレン基、ナフチレン基等が挙げられる。
なお、２価の脂環式炭化水素基の結合部位、及び２価の芳香族炭化水素基の結合部位は、環上のいずれの炭素上でもよい。
【００５４】
これら２価の炭化水素基の中でも、本発明の所望の効果を高めるために、アルカンジイル基、シクロアルカンジイル基が好ましく、アルカンジイル基が特に好ましい。
【００５５】
Ｒ2は、水素原子又は炭化水素基を示す。Ｒ2で示される炭化水素基は、脂肪族炭化水素基、脂環式炭化水素基及び芳香族炭化水素基を包含する概念であり、飽和炭化水素基でも不飽和炭化水素基でもよい。炭化水素基の炭素数は、好ましくは１〜４、より好ましくは１又は２である。当該炭化水素基としては、好ましくは脂肪族炭化水素基、より好ましくはアルキル基である。アルキル基は直鎖状でも分岐鎖状でもよく、例えば、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基、ｎ−ブチル基、ｓｅｃ−ブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基等が挙げられる。
また、Ｒ2の中では、本発明の所望の効果を高めるために、水素原子が好ましい。
【００５６】
Ｘは、チオ基、スルフィニル基又はスルホニル基を示すが、チオ基が好ましい。
【００５７】
リガンド（１）としては、本発明の所望の効果を高めるために、下記式（α）で表されるものが好ましい。
【００５８】
【化１０】
2020045541.tif 000012
【００５９】
〔式（α）中、
Ｒ1は、式（１）中のＲ1と同義であり２価の有機基を示すが、好ましくは炭素数１〜１０のアルカンジイル基であり、
＊は、結合手を示す。〕
【００６０】
また、リガンド（１）が光学異性を有する場合、いずれの光学異性体であってもよく、また、１種の光学異性体を単独で用いても、複数種の光学異性体を組み合わせて用いてもよい。
【００６１】
また、リガンド（１）を有する本発明のクロマトグラフィー担体のイオン交換容量は、担体１ｍＬあたりに、好ましくは１０〜５００μｅｑであり、より好ましくは５０〜２００μｅｑである。
イオン交換容量は、例えば、本発明のクロマトグラフィー担体がカラム容器に充填されているクロマトグラフィーカラムを平衡化させた後、ＨＣｌ水溶液を通液して中和し、中和に要したＨＣｌのモル数とカラム容量から算出することができる。
より具体的には、次の方法で測定することができる。すなわち、容量４ｍＬ（５ｍｍφ×２００ｍｍ長）のカラム容器に、本発明のクロマトグラフィー担体を充填高さ約２０ｃｍで充填してクロマトグラフィーカラムを作製する。得られたカラムをＧＥヘルスケア社製ＡＫＴＡ  Ｐｒｉｍｅ  Ｐｌｕｓに接続した後、０．１Ｍ  ＮａＯＨ／２．０Ｍ  ＮａＣｌ水溶液を、線流速６００ｃｍ／ｈｒでカラム容量の５倍通液することで洗浄する。次いで、０．０１Ｍ  ＮａＯＨ水溶液を、線流速６００ｃｍ／ｈｒでカラム容量の５倍通液することで平衡化させる。次に、０．０１Ｍ  ＨＣｌ水溶液を、線流速３００ｃｍ／ｈｒで中和するまで通液する。ここで得られた中和に要したＨＣｌのモル数とカラム容量から算出する等といった方法で測定することができる。
【００６２】
（支持体）
支持体としては、合成高分子支持体、天然高分子支持体等の有機系支持体；無機系支持体；これらを組み合わせた有機−有機複合系支持体や有機−無機複合系支持体等が挙げられる。合成高分子支持体としては、例えば、ポリビニルアルコール類、ポリ（メタ）アクリレート類、ポリ（メタ）アクリルアミド類、ポリスチレン類、エチレン−無水マレイン酸共重合物等で構成されるもの挙げられる。天然高分子支持体としては、例えば、セルロース（結晶性セルロース等）、アガロース、デキストラン等の多糖類で構成されるものが挙げられる。無機系支持体としては、ガラスビーズ、シリカゲル、金属、金属酸化物等で構成されるものが挙げられる。これらの中でも、本発明の所望の効果を高めるために、合成高分子支持体が好ましい。また、支持体は、好ましくは水不溶性支持体である。
【００６３】
また、本発明のクロマトグラフィー担体としては、本発明の所望の効果を高めるために、リガンド（１）が支持体に結合されているもの（すなわち、式（１）中の＊が支持体に結合しているもの）が好ましい。具体的には、支持体が、スルファニル基と反応可能な官能基の残基を分子内に有し、この残基が、リガンド（１）と化学結合しているものが挙げられる。なお、「スルファニル基と反応可能な官能基の残基」は、スルファニル基と反応可能な官能基がスルファニル基と反応したときに残る残基を意味する。スルファニル基と反応可能な官能基の残基としては、下記で「スルファニル基と反応可能な官能基」として挙げたものがスルファニル基と反応したときに残る残基が挙げられるが、環状エーテル基が開環してなる２価の基、−Ｃ（＝Ｏ）−、−ＮＨ−Ｃ（＝Ｏ）−が好ましく、環状エーテル基が開環してなる２価の基がより好ましい。
【００６４】
ここで、「スルファニル基と反応可能な官能基」としては、環状エーテル基、カルボキシ基、−Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ−Ｃ（＝Ｏ）−、コハク酸イミドオキシカルボニル基、ホルミル基、イソシアネート基、マレイミド基、ハロアセチル基（ヨードアセチル基やブロモアセチル基など）、α，β−不飽和カルボニル基、アルケニル基及びアルキニル基からなる群より選ばれる１種以上の官能基が挙げられるが、本発明の所望の効果を高めるために、環状エーテル基が好ましい。
本明細書における「環状エーテル基」としては、環を構成する原子数が３〜７個の環状エーテル基が好ましい。環状エーテル基は、置換基としてアルキル基を有していてもよい。環状エーテル基の具体例としては、以下の式（４）〜（９）で表される環状エーテル基が挙げられるが、本発明の所望の効果を高めるために、式（４）で表される環状エーテル基が好ましい。
【００６５】
【化１１】
2020045541.tif 000013
【００６６】
〔式中、Ｒ5〜Ｒ8は、それぞれ独立して、水素原子又はアルキル基を示し、＊は、結合手を示す。〕
【００６７】
Ｒ5〜Ｒ8で示されるアルキル基の炭素数は、好ましくは１〜４であり、より好ましくは１又は２である。アルキル基は直鎖状でも分岐鎖状でもよく、例えば、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基、ｎ−ブチル基、ｓｅｃ−ブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基等が挙げられる。また、Ｒ5〜Ｒ8としては、水素原子が好ましい。なお、環状エーテル基がエポキシ基である場合、環状エーテル基が開環してなる２価の基は、開環エポキシ基（−ＣＨＯＨ−ＣＨ2−）である。
【００６８】
また、支持体は、下記式（１０）で表される基を分子内に有していてもよい。
【００６９】
【化１２】
2020045541.tif 000014
【００７０】
〔式（１０）中、
Ｒ9は、ｑ＋１価の炭化水素基を示し、
Ｙ1は、チオ基、スルフィニル基又はスルホニル基を示し、
Ｙ2は、親水性基を示し、
ｑは、０以上の整数を示し、
＊は、結合手を示す。〕
【００７１】
式（１０）中、Ｒ9は、ｑ＋１価の炭化水素基を示す。すなわち、ｑ＝０のとき、Ｒ9は１価の炭化水素基であり、ｑ＝１のとき、Ｒ9は２価の炭化水素基であり、ｑ＝２のとき、Ｒ9は３価の炭化水素基である。
Ｒ9で示される１価の炭化水素基としては、Ｒ2で示される炭化水素基と同様のものが挙げられる。Ｒ9で示される２価の炭化水素基としては、Ｒ1で示される２価の炭化水素基と同様のものが挙げられる。Ｒ9で示される３価の炭化水素基の炭素数は、好ましくは１〜１２、より好ましくは１〜６である。３価の炭化水素基としては、メタン−１，１，１−トリイル基、エタン−１，１，１−トリイル基、エタン−１，１，２−トリイル基、プロパン−１，２，３−トリイル基、プロパン−１，２，２−トリイル基等のアルカントリイル基が好ましい。
Ｙ2で示される親水性基としては、ヒドロキシ基、スルファニル基、カルボキシ基等が挙げられる。
ｑは、０以上の整数を示すが、好ましくは０〜４の整数、より好ましくは０〜２の整数である。なお、ｑが２以上の整数の場合、ｑ個のＹ2は同一であっても異なっていてもよい。
【００７２】
また、支持体が重合体を含む場合、当該重合体としては、スルファニル基と反応可能な官能基の残基を有する構造単位（Ａ）を有するものが好ましい。また、重合体に含まれる複数の構造単位（Ａ）中の上記残基の一部又は全部が、リガンド（１）と結合していることが好ましい。また、重合体に含まれる複数の構造単位（Ａ）中の上記残基の一部が、上記式（１０）で表される基と結合していてもよい。
また、上記重合体は、構造単位（Ａ）に加えて、スルファニル基と反応可能な官能基を有する構造単位（Ｂ）を有していてもよい。
構造単位（Ａ）としては、下記式（１１）で表される構造単位が好ましく、構造単位（Ｂ）としては、下記式（１２）で表される構造単位が好ましい。
【００７３】
【化１３】
2020045541.tif 000015
【００７４】
〔式（１１）中、
Ｒ10は、水素原子又はメチル基を示し、
Ｒ11は、単結合又は２価の連結基を示し、
Ｚ1は、スルファニル基と反応可能な官能基の残基を示し、
＊＊は、結合手を示す。〕
【００７５】
【化１４】
2020045541.tif 000016
【００７６】
〔式（１２）中、
Ｒ12は、水素原子又はメチル基を示し、
Ｒ13は、単結合又は２価の連結基を示し、
Ｚ2は、スルファニル基と反応可能な官能基を示す。〕
【００７７】
式（１１）中のＺ1で示されるスルファニル基と反応可能な官能基の残基、式（１２）中のＺ2で示されるスルファニル基と反応可能な官能基としては、上記と同様のものが挙げられる。
【００７８】
式（１１）中のＲ11、式（１２）中のＲ13で示される２価の連結基としては、例えば、アルカンジイル基、炭素数２以上のアルカンジイル基の炭素−炭素原子間にエーテル結合を有する基、アリーレン基、−Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−Ｒ14−＊、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ−Ｒ15−＊、−Ａｒ−Ｒ16−＊、又は−Ａｒ−ＯＲ17−＊等が挙げられる。ここで、Ａｒは、アリーレン基を示し、Ｒ11、Ｒ13における＊は、上記Ｚ1又はＺ2に結合する結合手を示す。Ｒ11、Ｒ13、Ａｒで示されるアリーレン基としては、フェニレン基、ナフチレン基、フェナントレニレン基等が挙げられる。
また、Ｒ14〜Ｒ17は、それぞれ独立して、アルカンジイル基、又は炭素数２以上のアルカンジイル基の炭素−炭素原子間にエーテル結合を有する基を示す。
【００７９】
Ｒ11、Ｒ13、Ｒ14〜Ｒ17で示されるアルカンジイル基の炭素数としては、１〜１２が好ましく、１〜６がより好ましく、１〜３が特に好ましい。当該アルカンジイル基は、直鎖状でも分岐鎖状でもよい。アルカンジイル基の具体例としては、メタン−１，１−ジイル基、エタン−１，１−ジイル基、エタン−１，２−ジイル基、プロパン−１，１−ジイル基、プロパン−１，２−ジイル基、プロパン−１，３−ジイル基、プロパン−２，２−ジイル基、ブタン−１，１−ジイル基、ブタン−１，２−ジイル基、ブタン−１，３−ジイル基、ブタン−１，４−ジイル基、ペンタン−１，１−ジイル基、ペンタン−１，２−ジイル基、ペンタン−１，３−ジイル基、ペンタン−１，４−ジイル基、ペンタン−１，５−ジイル基、ヘキサン−１，１−ジイル基、ヘキサン−１，２−ジイル基、ヘキサン−１，３−ジイル基、ヘキサン−１，４−ジイル基、ヘキサン−１，５−ジイル基、ヘキサン−１，６−ジイル基、ヘプタン−１，７−ジイル基、オクタン−１，８−ジイル基等が挙げられる。
【００８０】
Ｒ11、Ｒ13、Ｒ14〜Ｒ17で示される「炭素数２以上のアルカンジイル基の炭素−炭素原子間にエーテル結合を有する基」としては、−Ｒa（ＯＲb）tＯＲc−で表される基が好ましい（Ｒa、Ｒb及びＲcは、それぞれ独立して、炭素数１〜４のアルカンジイル基を示し、ｔは０〜３０の整数を示す。）。
Ｒa、Ｒb及びＲcで示されるアルカンジイル基は直鎖状でも分岐鎖状でもよい。具体的には、メタン−１，１−ジイル基、エタン−１，１−ジイル基、エタン−１，２−ジイル基、プロパン−１，１−ジイル基、プロパン−１，２−ジイル基、プロパン−１，３−ジイル基、プロパン−２，２−ジイル基、ブタン−１，１−ジイル基、ブタン−１，２−ジイル基、ブタン−１，３−ジイル基、ブタン−１，４−ジイル基が挙げられる。ｔとしては、０〜２０の整数が好ましく、０〜１０の整数がより好ましく、０〜５の整数が更に好ましく、０が特に好ましい。なお、ｔが２〜３０の整数の場合、ｔ個のＲbは同一であっても異なっていてもよい。炭素数２以上のアルカンジイル基の炭素−炭素原子間にエーテル結合を有する基の好適な具体例としては、Ｃ1-4アルカンジイルオキシＣ1-4アルカンジイル基が挙げられる。
なお、Ｒ11、Ｒ13、Ｒ14〜Ｒ17で示されるアルカンジイル基、炭素数２以上のアルカンジイル基の炭素−炭素原子間にエーテル結合を有する基は、置換基を有していてもよい。当該置換基としては、例えば、ヒドロキシ基等が挙げられる。
【００８１】
上記のようなＲ11、Ｒ13の中では、−Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−Ｒ14−＊が特に好ましい。
【００８２】
構造単位（Ａ）や構造単位（Ｂ）を与えるモノマーとしては、スルファニル基と反応可能な官能基及び重合性不飽和基を有するモノマーが好ましい。このようなモノマーとしては、例えば、グリシジル（メタ）アクリレート、３−オキシラニルプロピル（メタ）アクリレート、４−オキシラニルブチル（メタ）アクリレート、５−オキシラニルペンチル（メタ）アクリレート、６−オキシラニルヘキシル（メタ）アクリレート、７−オキシラニルヘプチル（メタ）アクリレート、８−オキシラニルオクチル（メタ）アクリレート、（３−メチルオキシラニル）メチル（メタ）アクリレート、４−ヒドロキシブチル（メタ）アクリレートグリシジルエーテル、グリセリンモノ（メタ）アクリレートグリシジルエーテル、３，４−エポキシシクロヘキシルメチル（メタ）アクリレート、３，４−エポキシシクロヘキシルエチル（メタ）アクリレート、３，４−エポキシシクロヘキシルプロピル（メタ）アクリレート、α−（メタ）アクリル−ω−グリシジルポリエチレングリコール、テトラヒドロフルフリル（メタ）アクリレート等の環状エーテル基を有する（メタ）アクリレート系モノマー；（ビニルベンジル）グリシジルエーテル、（イソプロペニルベンジル）グリシジルエーテル、（ビニルフェネチル）グリシジルエーテル、（ビニルフェニルブチル）グリシジルエーテル、（ビニルベンジルオキシエチル）グリシジルエーテル、（ビニルフェニル）グリシジルエーテル、（イソプロペニルフェニル）グリシジルエーテル、１，２−エポキシ−３−（４−ビニルベンジル）プロパン等の環状エーテル基を有する芳香族ビニル系モノマー；アリルグリシジルエーテル等の環状エーテル基を有するアリルエーテル系モノマー；イソシアナトエチル（メタ）アクリレート等のイソシアネート基を有する（メタ）アクリレート系モノマー；マレイン酸無水物、メチルマレイン酸無水物、グルタコン酸無水物等の不飽和ジカルボン酸無水物系モノマーの他、（メタ）アクリル酸、３，４−エポキシ−１−ブテン、３，４−エポキシ−３−メチル−１−ブテン等が挙げられる。これらモノマーは、１種を単独で又は２種以上を組み合わせて使用できる。
これらモノマーの中では、本発明の所望の効果を高めるために、環状エーテル基を有する（メタ）アクリレート系モノマーが好ましい。
【００８３】
支持体に含まれる重合体中の構造単位（Ａ）及び（Ｂ）の合計含有割合は、重合体中の全構造単位に対して、好ましくは５０〜１００質量％であり、より好ましくは７０〜９０質量％である。
【００８４】
また、支持体に含まれる重合体は、構造単位（Ａ）及び（Ｂ）の他にも構造単位を有していてもよい。このような構造単位を与えるモノマー（以下、他のモノマーとも称する）としては、スルファニル基と反応可能な官能基をもたない重合性不飽和基含有モノマーが挙げられる。他のモノマーは、非架橋性モノマー、架橋性モノマーに大別され、これらのうち一方を用いても併用してもよい。
【００８５】
上記非架橋性モノマーとしては、例えば、（メタ）アクリレート系非架橋性モノマー、（メタ）アクリルアミド系非架橋性モノマー、芳香族ビニル系非架橋性モノマー、ビニルケトン系非架橋性モノマー、（メタ）アクリロニトリル系非架橋性モノマー、Ｎ−ビニルアミド系非架橋性モノマー等が挙げられる。これらは１種を単独で又は２種以上を組み合わせて使用できる。非架橋性モノマーの中では、（メタ）アクリレート系非架橋性モノマー、芳香族ビニル系非架橋性モノマーが好ましい。
【００８６】
上記（メタ）アクリレート系非架橋性モノマーとしては、例えば、メチル（メタ）アクリレート、エチル（メタ）アクリレート、ｎ−ブチル（メタ）アクリレート、４−ｔｅｒｔ−ブチル（メタ）アクリレート、イソブチル（メタ）アクリレート、ｎ−オクチル（メタ）アクリレート、２−エチルヘキシル（メタ）アクリレート、シクロヘキシル（メタ）アクリレート、メトキシエチル（メタ）アクリレート、ヒドロキシエチル（メタ）アクリレート、ヒドロキシプロピル（メタ）アクリレート、グリセロールモノ（メタ）アクリレート、トリメチロールエタンモノ（メタ）アクリレート、トリメチロールプロパンモノ（メタ）アクリレート、ブタントリオールモノ（メタ）アクリレート、ポリエチレングリコールモノ（メタ）アクリレート、メトキシポリエチレングリコール（メタ）アクリレート、ペンタエリスリトールモノ（メタ）アクリレート、ジペンタエリスリトールモノ（メタ）アクリレート、イノシトールモノ（メタ）アクリレート等が挙げられる。これらは１種を単独で又は２種以上を組み合わせて使用できる。
【００８７】
また、上記（メタ）アクリルアミド系非架橋性モノマーとしては、例えば、（メタ）アクリルアミド、ジメチル（メタ）アクリルアミド、ヒドロキシエチル（メタ）アクリルアミド、（メタ）アクリロイルモルホリン、ダイアセトン（メタ）アクリルアミド等が挙げられる。これらは１種を単独で又は２種以上を組み合わせて使用できる。
【００８８】
また、上記芳香族ビニル系非架橋性モノマーとしては、例えば、スチレン、α−メチルスチレン、ハロゲン化スチレン、４−メチルスチレン、２，４−ジメチルスチレン、２，４，６−トリメチルスチレン、エチルビニルベンゼン、４−イソプロピルスチレン、４−ｎ−ブチルスチレン、４−イソブチルスチレン、４−ｔｅｒｔ−ブチルスチレン等のスチレン類；１−ビニルナフタレン、２−ビニルナフタレン等のビニルナフタレン類等が挙げられる。これらは１種を単独で又は２種以上を組み合わせて使用できる。
【００８９】
また、上記ビニルケトン系非架橋性モノマーとしては、例えば、エチルビニルケトン、プロピルビニルケトン、イソプロピルビニルケトン等が挙げられる。これらは１種を単独で又は２種以上を組み合わせて使用できる。
また、上記（メタ）アクリロニトリル系非架橋性モノマーとしては、例えば、アクリロニトリル、メタクリロニトリル等が挙げられる。これらは１種を単独で又は２種以上を組み合わせて使用できる。
また、上記Ｎ−ビニルアミド系非架橋性モノマーとしては、例えば、Ｎ−ビニルアセトアミド、Ｎ−ビニルプロピオンアミド等が挙げられる。これらは１種を単独で又は２種以上を組み合わせて使用できる。
【００９０】
支持体に含まれる重合体中の非架橋性モノマー由来の構造単位の含有割合は、重合体中の全構造単位に対して、好ましくは０〜５０質量％であり、より好ましくは０〜２０質量％である。
【００９１】
また、上記架橋性モノマーとしては、例えば、（メタ）アクリレート系架橋性モノマー、芳香族ビニル系架橋性モノマー、アリル系架橋性モノマー等が挙げられる。これらは１種を単独で又は２種以上を組み合わせて使用できる。また、架橋性モノマーとしては、２〜５官能の架橋性モノマーが好ましく、２又は３官能の架橋性モノマーがより好ましい。
架橋性モノマーの中では、本発明の所望の効果を高めるために、（メタ）アクリレート系架橋性モノマー、芳香族ビニル系架橋性モノマーが好ましく、芳香族ビニル系架橋性モノマーが特に好ましい。
【００９２】
上記（メタ）アクリレート系架橋性モノマーとしては、例えば、エチレングリコールジ（メタ）アクリレート、ジエチレングリコールジ（メタ）アクリレート、トリエチレングリコールジ（メタ）アクリレート、テトラエチレングリコールジ（メタ）アクリレート、ポリエチレングリコールジ（メタ）アクリレート、プロピレングリコールジ（メタ）アクリレート、ジプロピレングリコールジ（メタ）アクリレート、トリプロピレングリコールジ（メタ）アクリレート、テトラプロピレングリコールジ（メタ）アクリレート、ポリプロピレングリコールジ（メタ）アクリレート、１，４−ブタンジオールジ（メタ）アクリレート、１，６−ヘキサンジオールジ（メタ）アクリレート、グリセリンジ（メタ）アクリレート、トリメチロールエタンジ（メタ）アクリレート、トリメチロールプロパンジ（メタ）アクリレート、トリメチロールプロパントリ（メタ）アクリレート、ブタントリオールジ（メタ）アクリレート、ペンタエリスリトールジ（メタ）アクリレート、ペンタエリスリトールトリ（メタ）アクリレート、ペンタエリスリトールテトラ（メタ）アクリレート、グルコースジ（メタ）アクリレート、グルコーストリ（メタ）アクリレート、グルコーステトラ（メタ）アクリレート、ジペンタエリスリトールジ（メタ）アクリレート、ジペンタエリスリトールトリ（メタ）アクリレート、ジペンタエリスリトールテトラ（メタ）アクリレート、ジペンタエリスリトールペンタ（メタ）アクリレート、イノシトールジ（メタ）アクリレート、イノシトールトリ（メタ）アクリレート、イノシトールテトラ（メタ）アクリレート、マンニトールジ（メタ）アクリレート、マンニトールトリ（メタ）アクリレート、マンニトールテトラ（メタ）アクリレート、マンニトールペンタ（メタ）アクリレート等が挙げられる。これらは１種を単独で又は２種以上を組み合わせて使用できる。
【００９３】
また、上記芳香族ビニル系架橋性モノマーとしては、例えば、ジビニルベンゼン、トリビニルベンゼン、ジビニルトルエン、ジビニルキシレン、ジビニルエチルベンゼン、ジビニルナフタレン等が挙げられる。これらは１種を単独で又は２種以上を組み合わせて使用できる。
【００９４】
また、上記アリル系架橋性モノマーとしては、例えば、フタル酸ジアリル、イソフタル酸ジアリル、テレフタル酸ジアリル、マレイン酸ジアリル、フマル酸ジアリル、イタコン酸ジアリル、トリメリット酸ジアリル、トリメリット酸トリアリル、シアヌル酸トリアリル、イソシアヌル酸ジアリル、イソシアヌル酸トリアリル等が挙げられる。これらは１種を単独で又は２種以上を組み合わせて使用できる。
さらに、架橋性モノマーとしては、上記例示したものの他に、ジアミノプロパノール、トリスヒドロキシメチルアミノメタン、グルコサミン等のアミノアルコールと（メタ）アクリル酸との脱水縮合反応物や、ブタジエン、イソプレン等の共役ジオレフィン等を挙げることができる。
【００９５】
支持体に含まれる重合体中の架橋性モノマー由来の構造単位の含有割合は、重合体中の全構造単位に対して、好ましくは５〜５０質量％であり、より好ましくは１０〜３０質量％である。
【００９６】
また、支持体の含有量は、本発明のクロマトグラフィー担体中、好ましくは５０〜９９．９質量％であり、より好ましくは８０〜９９質量％である。
【００９７】
また、本発明のクロマトグラフィー担体は、クロマトグラフィー担体として使用できる形態であればよい。このような形態としては、例えば、粒子状、モノリス状、板状、膜状（中空糸を含む）、繊維状、カセット状、チップ状等が挙げられ、好ましくは粒子状である。また、本発明のクロマトグラフィー担体としては、多孔質粒子等の多孔質担体が好ましい。また、多孔質粒子としては、多孔質ポリマー粒子が好ましい。
【００９８】
また、本発明のクロマトグラフィー担体が粒子状の担体である場合、平均粒径（体積平均粒径）は、耐圧性能や耐破損性能を高めるために、好ましくは２０〜１５０μｍであり、より好ましくは４０〜１００μｍである。また、平均粒径の変動係数は、好ましくは４０％以下であり、より好ましくは３０％以下である。
また、本発明のクロマトグラフィー担体の比表面積は、好ましくは１〜５００ｍ2／ｇであり、より好ましくは１０〜３００ｍ2／ｇである。
また、本発明のクロマトグラフィー担体の体積平均細孔径は、好ましくは１０〜３００ｎｍである。
なお、上記平均粒径、変動係数、比表面積及び体積平均細孔径は、レーザー回析・散乱粒子径分布測定等により測定できる。
【００９９】
＜担体の製造方法＞
本発明のクロマトグラフィー担体は、常法を適宜組み合わせて製造することができるが、クロマトグラフィー担体を簡便に且つ効率よく製造するために、スルファニル基と反応可能な官能基を分子内に有する支持体（以下、原料支持体ともいう）と、下記式（β）で表される化合物とを接触させる工程を含む方法で製造するのが好ましい。なお、式（β）中の各記号は、式（１）中のものと同義である。
【０１００】
【化１５】
2020045541.tif 000017
【０１０１】
〔式（β）中、
Ａは、アニオン性官能基を示し、
Ｑは、２価の芳香族炭化水素基を示し、
Ｒ1は、２価の有機基を示し、
Ｒ2は、水素原子又は炭化水素基を示す。〕
【０１０２】
本発明の製造方法としては、例えば、（工程Ｐ１−１）原料支持体を準備するとともに、（工程Ｐ１−２）化合物（β）を準備し、（工程Ｐ２）原料支持体と化合物（β）とを接触させる方法が挙げられる。
以下、上記各工程について、具体的に説明する。
【０１０３】
（工程Ｐ１−１）
工程Ｐ１−１は、原料支持体を準備する工程である。
原料支持体は、市販品を使用しても、特表２００７−５２５５０１号公報、特表２００８−５０５８５１号公報、特開２０１０−２１０４９７号公報、特表２０１５−５０１３１０号公報、国際公開第２０１５／１１９２５５号、特開２０１６−５０８９７号公報等に記載の公知の方法を参考にして調製したものを使用してもよい。原料支持体を調製する方法としては、具体的には、スルファニル基と反応可能な官能基及び重合性不飽和基を有するモノマーを（共）重合（好ましくは懸濁重合）させる方法が挙げられる。
スルファニル基と反応可能な官能基及び重合性不飽和基を有するモノマーとしては、構造単位（Ａ）、（Ｂ）を与えるモノマーとして例示したものが挙げられる。また、スルファニル基と反応可能な官能基及び重合性不飽和基を有するモノマーとともに上記他のモノマー（非架橋性モノマー、架橋性モノマー）を共重合させてもよい。
スルファニル基と反応可能な官能基及び重合性不飽和基を有するモノマーの合計使用量としては、工程Ｐ１−１で使用するモノマー総量１００質量部に対して、５０〜１００質量部が好ましく、７０〜９０質量部がより好ましい。
架橋性モノマーの合計使用量としては、工程Ｐ１−１で使用するモノマー総量１００質量部に対して、５〜５０質量部が好ましく、１０〜３０質量部がより好ましい。
なお、非架橋性モノマーを使用する場合、その合計使用量は、スルファニル基と反応可能な官能基及び重合性不飽和基を有するモノマーや架橋性モノマー以外の残余の量である。
【０１０４】
また、工程Ｐ１−１の具体的な方法としては、例えば、モノマー及び必要に応じて多孔化剤を含む混合溶液（単量体溶液）に重合開始剤を溶解させ、水系媒体中に懸濁させて所定温度まで加熱して重合させる方法や、モノマー及び必要に応じて多孔化剤を含む混合溶液（単量体溶液）に重合開始剤を溶解させ、所定温度まで加熱した水系媒体中に添加して重合させる方法、モノマー及び必要に応じて多孔化剤を含む混合溶液（単量体溶液）を、水系媒体中に懸濁させて所定温度まで加熱して、重合開始剤を添加し重合させる方法等が挙げられる。
【０１０５】
重合開始剤としてはラジカル重合開始剤が好ましい。ラジカル重合開始剤としては、例えば、アゾ系開始剤、過酸化物系開始剤、レドックス系開始剤等が挙げられ、具体的には、アゾビスイソブチロニトリル、アゾビスイソ酪酸メチル、アゾビス−２，４−ジメチルバレロニトリル、過酸化ベンゾイル、過酸化ジ−ｔｅｒｔ−ブチル、過酸化ベンゾイル−ジメチルアニリン等が挙げられる。重合開始剤の合計使用量は、通常、モノマー総量１００質量部に対して０．０１〜１０質量部程度である。
【０１０６】
上記多孔化剤は、多孔質粒子を製造するために使用され、油滴内の重合において、モノマーと共に存在し、非重合成分として孔を形成する役割を有する。多孔化剤は、多孔質表面において容易に除去可能なものであれば特に限定されるものではなく、例えば、各種の有機溶剤や混合モノマーに可溶な線状重合物等が挙げられ、これらを併用してもよい。
【０１０７】
上記多孔化剤としては、例えば、ヘキサン、ヘプタン、オクタン、ノナン、デカン、ウンデカン等の脂肪族炭化水素類；シクロペンタン、シクロヘキサン等の脂環式炭化水素類；ベンゼン、トルエン、キシレン、ナフタレン、エチルベンゼン等の芳香族炭化水素類；四塩化炭素、１，２−ジクロロエタン、テトラクロロエタン、クロロベンゼン等のハロゲン化炭化水素類；ブタノール、ペンタノール、ヘキサノール、ヘプタノール、４−メチル−２−ペンタノール、２−エチル−１−ヘキサノール等の脂肪族アルコール類；シクロヘキサノール等の脂環式アルコール類；２−フェニルエチルアルコール、ベンジルアルコール等の芳香族アルコール類；ジエチルケトン、メチルイソブチルケトン、ジイソブチルケトン、アセトフェノン、２−オクタノン、シクロヘキサノン等のケトン類；ジブチルエーテル、ジイソブチルエーテル、アニソール、エトキシベンゼン等のエーテル類；酢酸イソペンチル、酢酸ブチル、酢酸−３−メトキシブチル、マロン酸ジエチル等のエステル類の他、非架橋性ビニルモノマーのホモポリマー等の線状重合物が挙げられる。多孔化剤は単独で又は２種以上を混合して用いることができる。
上記多孔化剤の合計使用量は、通常、モノマー総量１００質量部に対して４０〜６００質量部程度である。
【０１０８】
上記水系媒体としては、例えば水溶性高分子水溶液等が挙げられ、水溶性高分子としては、例えばヒドロキシエチルセルロース、ポリビニルアルコール、カルボキシメチルセルロース、ポリビニルピロリドン、デンプン、ゼラチン等が挙げられる。
水系媒体の合計使用量は、通常、モノマー総量１００質量部に対して２００〜７０００質量部程度である。
また、水系媒体の分散媒として水を用いる場合、例えば、炭酸ナトリウム、炭酸カルシウム、硫酸ナトリウム、燐酸カルシウム、塩化ナトリウム等の分散安定剤を使用してもよい。
【０１０９】
また、工程Ｐ１−１には、アルキル硫酸エステル塩、アルキルアリール硫酸エステル塩、アルキルリン酸エステル塩、脂肪酸塩等のアニオン性界面活性剤をはじめとする各種界面活性剤を用いてもよい。また、亜硝酸ナトリウム等の亜硝酸塩、ヨウ化カリウム等のヨウ化物塩、ｔｅｒｔ−ブチルピロカテコール、ベンゾキノン、ピクリン酸、ハイドロキノン、塩化銅、塩化第二鉄等の重合禁止剤を用いることもできる。また、ドデシルメルカプタン等の重合調製剤を用いてもよい。
【０１１０】
また、工程Ｐ１−１の重合温度は重合開始剤に応じて決定すればよいが、通常２〜１００℃程度であり、アゾビスイソブチロニトリルを重合開始剤として用いる場合は、５０〜１００℃が好ましく、６０〜９０℃がより好ましい。また、重合時間は通常５分間〜４８時間、好ましくは１０分間〜２４時間である。
【０１１１】
（工程Ｐ１−２）
工程Ｐ１−２は、化合物（β）を準備する工程である。
化合物（β）は、例えば、下記カルボン酸（ＰＲ−Ａ）と下記スルファニル化合物（ＰＲ−Ｃ）とを接触させることにより得ることができる。また、化合物（β）のうち、アニオン性官能基Ａが−Ｃ（＝Ｏ）ＯＨである下記化合物（β'）については、下記ジカルボン酸無水物（ＰＲ−Ｂ）と下記スルファニル化合物（ＰＲ−Ｃ）とを接触させることにより得ることもできる。なお、本明細書においては、カルボン酸（ＰＲ−Ａ）とスルファニル化合物（ＰＲ−Ｃ）との反応、ジカルボン酸無水物（ＰＲ−Ｂ）とスルファニル化合物（ＰＲ−Ｃ）との反応を、「化合物（β）合成反応」と総称する。
化合物（β'）を得る場合は、所望の化合物を効率よく得るために、ジカルボン酸無水物（ＰＲ−Ｂ）とスルファニル化合物（ＰＲ−Ｃ）との接触により得ることが好ましい。
【０１１２】
【化１６】
2020045541.tif 000018
【０１１３】
〔式中の各記号は前記と同義である。〕
【０１１４】
カルボン酸（ＰＲ−Ａ）としては、例えば、３−スルホプロパン酸、４−スルホブタン酸、５−スルホペンタン酸、３−ホスホノプロピオン酸、４−ホスホノ酪酸等が挙げられる。
ジカルボン酸無水物（ＰＲ−Ｂ）としては、例えば、コハク酸無水物、メチルコハク酸無水物、ジメチルコハク酸無水物、ブチルコハク酸無水物、オクチルコハク酸無水物、ジクロロコハク酸無水物、シクロプロパン−１，２−ジカルボン酸無水物、ヘキサヒドロフタル酸無水物、メチルヘキサヒドロフタル酸無水物、グルタル酸無水物、２，４−ジエチルグルタル酸無水物、セバシン酸無水物、しょうのう酸無水物、マレイン酸無水物、メチルマレイン酸無水物、グルタコン酸無水物等が挙げられる。
スルファニル化合物（ＰＲ−Ｃ）としては、例えば、２−アミノベンゼンチオール、３−アミノベンゼンチオール、４−アミノベンゼンチオール、１−アミノ−２−ナフタレンチオール等が挙げられる。
化合物（β）合成反応において、スルファニル化合物（ＰＲ−Ｃ）の使用量は、カルボン酸（ＰＲ−Ａ）又はジカルボン酸無水物（ＰＲ−Ｂ）１モルに対して、通常１．０〜３．０モル当量であり、好ましくは１．０〜１．５モル当量である。
【０１１５】
化合物（β）合成反応は、所望の化合物を効率よく得るために、溶媒存在下で行うのが好ましい。溶媒としては、テトラヒドロフラン、ジブチルエーテル、ジメトキシエタン等のエーテル系溶媒；ベンゼン、トルエン、キシレン、クメン等の芳香族炭化水素系溶媒；ペンタン、ヘキサン、ヘプタン、オクタン等の脂肪族アルカン系溶媒；シクロヘキサン、シクロヘプタン、デカリン等のシクロアルカン系溶媒；クロロホルム、塩化メチレン等のハロゲン系溶媒；アセトン、メチルエチルケトン等のケトン系溶媒；ジメチルホルムアミド等のアミド系溶媒等が挙げられる。これらのうち１種を単独で使用しても２種以上を組み合わせて使用してもよい。
溶媒の使用量は、カルボン酸（ＰＲ−Ａ）又はジカルボン酸無水物（ＰＲ−Ｂ）とスルファニル化合物（ＰＲ−Ｃ）との合計１００質量部に対して、通常１００〜５００００質量部であり、好ましくは５００〜１００００質量部である。
【０１１６】
また、化合物（β）合成反応の反応時間は特に限定されないが、通常１５分間〜９６時間程度であり、好ましくは１〜２４時間である。また、反応温度は、溶媒の沸点以下で適宜選択すればよいが、通常２０〜１００℃程度である。
【０１１７】
なお、工程Ｐ１−２で得られる化合物（β）は、新規化合物であり、本発明のクロマトグラフィー担体の製造中間体として有用である。
【０１１８】
（工程Ｐ２）
工程Ｐ２は、原料支持体と化合物（β）とを接触させる工程である。
化合物（β）の使用量は、原料支持体に含まれるスルファニル基と反応可能な官能基１モルに対して、好ましくは０．１〜２０モル当量、より好ましくは０．５〜５モル当量である。
【０１１９】
工程Ｐ２は、所望の担体を効率よく得るために、溶媒存在下で行うのが好ましい。溶媒としては、水；メタノール、エタノール、プロパノール、イソプロピルアルコール、ｎ−ブチルアルコール等のアルコール類；ジメチルスルホキシド等のスルホキシド類等が挙げられる。これらのうち１種を単独で使用しても２種以上を組み合わせて使用してもよい。
溶媒の使用量は、原料支持体１００質量部に対して、通常３００〜３０００質量部であり、好ましくは５００〜２０００質量部である。
【０１２０】
工程Ｐ２のｐＨは、所望の担体を効率よく得るために、好ましくは８〜１６、より好ましくは１０〜１４である。
また、工程Ｐ２の反応時間は特に限定されないが、通常０．５〜７２時間程度であり、好ましくは１〜４８時間である。また、反応温度は、溶媒の沸点以下で適宜選択すればよいが、通常１０〜１００℃程度である。
【０１２１】
また、式（１）中のＸがスルフィニル基又はスルホニル基である担体を製造する場合は、上記の工程Ｐ２で得られた式（１）中のＸがチオ基である担体を酸化すればよい。
上記酸化は、国際公開第２０１５／１１９２５５号、特開２０１６−５０８９７号公報等に記載の公知の方法を参考にして行えばよいが、具体的には、酸化剤を用いる方法が挙げられる。酸化剤としては、過酢酸、過安息香酸、メタクロロ過安息香酸、ｔｅｒｔ−ブチルヒドロペルオキシド等の有機酸化剤；過酸化水素、クロム酸、過マンガン酸塩等の無機酸化剤が挙げられる。なお、これら酸化剤は１種を単独でまたは２種以上を組み合わせて使用できる。
【０１２２】
また、上記のようにして得られた担体に、メタンチオール、チオグリセロール等のスルファニル化合物を接触させ、未反応の官能基を開環等させてもよい。この処理は、国際公開第２０１５／１１９２５５号パンフレット等の記載を参考にして行えばよい。
なお、上記各工程で得られる反応生成物を、蒸留、抽出、洗浄等の分離手段で精製してもよい。
【０１２３】
そして、上記のようにして製造することができる本発明のクロマトグラフィー担体は、標的物質に対する動的結合容量が大きく、且つ標的物質と夾雑物とを分離する性能に優れる。特に、後記実施例に記載のとおり、タンパク質を複数種含む混合液から各タンパク質を簡便に且つ効率よく分離することができるため、標的タンパク質と標的外のタンパク質の分離に有用である。
このような効果が奏される理由は必ずしも明らかではないが、２価の芳香族炭化水素基とアニオン性官能基を含むリガンドを有するということだけではなく、式（１）中のＱで示される２価の芳香族炭化水素基が、Ｘで示されるチオ基、スルフィニル基又はスルホニル基と隣接しており、且つＱで示される２価の芳香族炭化水素基と、Ａで示されるアニオン性官能基が、−Ｎ（−Ｒ2）−Ｃ（＝Ｏ）−Ｒ1−という特定の連結基を介して連結されているためであると、本発明者らは推察する。
したがって、本発明のクロマトグラフィー担体は、タンパク質精製に適し、抗体精製にも適する。また、本発明のクロマトグラフィー担体は、疎水クロマトグラフィーとカチオン交換クロマトグラフィーとのミックスモードクロマトグラフィーに極めて有用である。
【０１２４】
＜クロマトグラフィーカラム＞
本発明のクロマトグラフィーカラムは、本発明のクロマトグラフィー担体がカラム容器に充填されているものである。
本発明のクロマトグラフィーカラムは、タンパク質精製に適し、抗体精製にも適する。また、疎水クロマトグラフィーとカチオン交換クロマトグラフィーとのミックスモードクロマトグラフィーに極めて有用である。
【０１２５】
＜精製方法＞
本発明の標的物質の精製方法は、本発明のクロマトグラフィー担体を用いることを特徴とするものである。
本発明の標的物質の精製方法は、本発明のクロマトグラフィー担体を用いること以外は、公知の方法と同様にして行うことができる。例えば、特表２００７−５２５５０１号公報、特表２００８−５０５８５１号公報、特開２０１０−２１０４９７号公報、特表２０１５−５０１３１０号公報等に記載の公知の方法を参考にして行えばよい。具体的には、本発明のクロマトグラフィー担体と、標的物質を含む試料とを接触させる工程を含む方法が挙げられる。また、この工程によって担体に捕捉された標的物質を溶出させる溶出工程を更に含むことが好ましい。溶出工程には、リガンドと標的物質を解離させる解離液が通常使用される。
また、精製は、本発明のクロマトグラフィーカラムを用いて行ってもよい。このような方法としては、本発明のクロマトグラフィーカラムに、標的物質を含む試料を通液する工程を含む方法が挙げられ、上記と同様に溶出工程を更に含むことが好ましい。
【０１２６】
標的物質としては、例えば、タンパク質、ペプチド、アミノ酸、糖、多糖、脂質、ビタミン、ＤＮＡ、ＲＮＡ等の生体関連物質が挙げられるが、タンパク質、ペプチドが好ましく、タンパク質がより好ましい。標的となるタンパク質としては、抗原、抗体、ウイルス粒子等が挙げられるが、抗体が好ましい。抗体としては、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、二重特異性抗体、合成抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、一本鎖抗体、Ｆａｂフラグメント、Ｆａｂ'フラグメント、Ｆ（ａｂ'）２フラグメント、Ｆｖ断片、Ｆｖ'断片、Ｆａｂ発現ライブラリーにより産生されたフラグメント、抗イディオタイプ（抗−Ｉｄ）抗体、上記のいずれかのエピトープ結合フラグメントが挙げられる。また、抗体のクラスとしては、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡが挙げられる。なお、サブクラスは特に限定されない。
標的物質を含む試料としては、例えば、全血、血清、血漿、血液成分、各種血球、血餅、血小板等の血液組成成分、尿、精液、母乳、汗、間質液、間質性リンパ液、骨髄液、組織液、唾液、胃液、関節液、胸水、胆汁、腹水、羊水等の体液、菌体液、細胞培養の培地、細胞培養上清、組織細胞の破砕液等の各種液体が挙げられる。また、試料として、アフィニティー精製等の他の精製処理が１回又は複数回行われた試料を使用することも、このような他の精製処理が行われていない試料を使用することもできる。
夾雑物としては、例えば、標的外のタンパク質が挙げられる。具体的には、抗体を標的物質とする場合は、抗体以外のタンパク質である。また、ウイルス粒子を標的物質とする場合は、ＤＮＡや宿主細胞由来タンパク質である。
【０１２７】
本発明の標的物質の精製方法としては、より具体的には、以下の工程Ｓ１及びＳ２を含む方法が挙げられる。そして、工程Ｓ２で担体から溶出した標的物質を回収することができる。
（工程Ｓ１）本発明のクロマトグラフィー担体と、標的物質を含む試料とを接触させる工程
（工程Ｓ２）前記担体が有するリガンドと前記標的物質とを解離させる解離液と、工程Ｓ１で標的物質を捕捉した担体とを接触させる工程
【０１２８】
（工程Ｓ１）
工程Ｓ１は、本発明のクロマトグラフィー担体と、標的物質を含む試料とを接触させる工程である。工程Ｓ１により、本発明のクロマトグラフィー担体に標的物質が捕捉される。
工程Ｓ１は、バッファー存在下で通常行われる。工程Ｓ１に使用するバッファーのｐＨ（２５℃）は、標的物質を夾雑物から効率よく分離するために、好ましくは２〜９の範囲、より好ましくは３〜８の範囲である。また、バッファーの塩濃度は、好ましくは０〜０．５Ｍである。
【０１２９】
（工程Ｓ２）
工程Ｓ２は、本発明のクロマトグラフィー担体が有するリガンドと前記標的物質とを解離させる解離液と、工程Ｓ１で標的物質を捕捉した担体とを接触させる工程である。工程Ｓ２により、担体に捕捉された標的物質が溶出し、また、本発明のクロマトグラフィー担体と標的物質の親和性が、本発明のクロマトグラフィー担体と夾雑物の親和性と異なることを利用して、標的物質を夾雑物から分離できる。
工程Ｓ２は、バッファー存在下で通常行われる。工程Ｓ２に使用するバッファーのｐＨ（２５℃）は、標的物質を夾雑物から効率よく分離するために、好ましくは２〜９の範囲、より好ましくは３〜８の範囲である。
工程Ｓ２においては、ステップワイズ方式、グラジェント方式、又はこれら両方を組み合わせた方式で標的物質を担体から溶出させることができる。また、バッファーの塩濃度は、通常１．０〜３．０Ｍまで高くすればよい。
ステップワイズ方式とは、塩濃度が異なる複数種のバッファーを使用して段階的に塩濃度を変化させて、標的物質を担体から溶出させる方式をいう。
グラジェント方式とは、連続的に塩濃度を変化させて標的物質を担体から溶出させる方式をいう。グラジェント方式で溶出を行う場合、好ましくは０．００１〜０．２Ｍ／分、より好ましくは０．０１〜０．１Ｍ／分で濃度を高くすることが好ましい。
【実施例】
【０１３０】
以下、実施例を挙げて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。【０１３１】
［合成例１］
以下の合成経路に従い、化合物（Ｅ−Ａ１）を得た。【０１３２】
【化１７】
2020045541.tif 000019
【０１３３】
すなわち、ジムロートを取り付けた３口フラスコに、４−アミノベンゼンチオール１１．２７ｇと無水コハク酸９．０１ｇを加え、脱気窒素置換操作を行った。その後、脱水トルエン４００ｍＬと脱水ＴＨＦ４５０ｍＬを加え、５０℃で４時間撹拌した。放冷後、溶媒を留去し、化合物（Ｅ−Ａ１）２０．２２ｇを得た。【０１３４】
1H NMR (600MHz, DMSO-d6) : δ2.53(m,4H), 7.21(d, J= 8.4 Hz，2H), 7.47(d, J= 8.4 Hz，2H), 9.94(s, 1H), 12.10(brs, 1H)【０１３５】
［合成例２］
無水コハク酸９．０１ｇをグルタル酸無水物１０．２７ｇに変更した以外は、合成例１と同様の操作を行い、以下の化合物（Ｅ−Ａ２）２１．４０ｇを得た。【０１３６】
【化１８】
2020045541.tif 000020
【０１３７】
1H NMR (600MHz, DMSO-d6) : δ1.79(m,2H), 2.26(dd, J= 7.5 Hz，2H), 2.32(dd, J= 7.5 Hz，2H), 7.21(d, J= 8.6 Hz，2H), 7.48(d, J= 8.6 Hz，2H), 9.88(s, 1H), 12.05(brs, 1H)【０１３８】
［比較合成例１］
以下の合成経路に従い、化合物（Ｅ−Ｂ１）を得た。【０１３９】
【化１９】
2020045541.tif 000021
【０１４０】
（１）すなわち、フラスコに、４−アミノ馬尿酸４．７５ｇ及び１Ｍ水酸化ナトリウム水溶液２５．５ｇを加え、氷浴にて撹拌した。そこに、ブロモ酢酸クロライド４．２５ｇと５Ｍ水酸化ナトリウム水溶液６．５０ｇとを交互に滴下した。滴下終了後、溶液を氷浴から取り出し、室温にて３０分間撹拌した。その後、溶液から白濁沈殿が生じるまで２Ｍ塩酸水溶液を加え、さらに酢酸エチルを加えて分液抽出操作を行った。減圧留去後、真空乾燥を行い、中間体化合物（Ｅ−ＰＢ１）３．８０ｇを得た。
（２）続いて、別のフラスコに中間体化合物（Ｅ−ＰＢ１）３．１０ｇを加え、アセトン１５０ｍＬに溶解させた。そこに、チオ酢酸カリウム１．１３ｇを加え、４０℃にて４時間撹拌した。アセトンを減圧留去後、酢酸エチルを加えて反応物を溶解させた。そこに、５質量％クエン酸水溶液を加え、洗浄操作を行った。得られた有機相を減圧留去した後、真空乾燥することで、中間体化合物（Ｅ−ＰＢ２）を３．０１ｇ得た。
（３）続いて、新たなフラスコに、中間体化合物（Ｅ−ＰＢ２）２．８０ｇ及びメタノール２０ｇを加えて撹拌した。さらに、１Ｍ水酸化ナトリウム水溶液２０．０ｇを加え、室温で１時間撹拌した。減圧留去にてメタノールを留去後、２Ｍ塩酸水溶液を加えることで沈殿を生じさせた。その後、酢酸エチルを加え、抽出操作を行った。得られた有機相を飽和食塩水で洗浄後、硫酸マグネシウムにて水を除去した。さらに得られた有機相を減圧留去した後、真空乾燥することで、化合物（Ｅ−Ｂ１）２．３０ｇを得た。【０１４１】
［比較合成例２］
以下の合成経路に従い、化合物（Ｅ−Ｂ２）を得た。【０１４２】
【化２０】
2020045541.tif 000022
【０１４３】
（１）すなわち、脱気窒素置換を行ったフラスコに、ＤＬ−ホモシステインチオラクトン塩酸塩５．００ｇ及び脱水ＤＭＦ１５０ｍＬを加え、氷浴にて撹拌した。その後、塩化ベンゾイル５．４９ｇ及びＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン５．０５ｇを加えた後、溶液を氷浴から取り出し、室温にて２時間撹拌した。減圧蒸留にてＤＭＦを留去し、そこに酢酸エチルを加えた。飽和食塩水及び蒸留水にて洗浄操作後、有機相を減圧蒸留及び真空乾燥することで、中間体化合物（Ｅ−ＰＢ３）を６．１２ｇ得た。
（２）続いて、別のフラスコに、中間体化合物（Ｅ−ＰＢ３）５．００ｇ及びＴＨＦ１００ｍＬを加えて撹拌した。さらに、１Ｍ水酸化ナトリウム水溶液２５．０ｇを加え、室温で１時間撹拌した。減圧留去にてＴＨＦを留去後、２Ｍ塩酸水溶液を加えることで沈殿を生じさせた。その後、酢酸エチルを加え、抽出操作を行った。得られた有機相を飽和食塩水で洗浄後、硫酸マグネシウムにて水を除去した。さらに得られた有機相を減圧留去及び真空乾燥することで、化合物（Ｅ−Ｂ２）を５．３３ｇ得た。【０１４４】
［比較合成例３］
以下の合成経路に従い、化合物（Ｅ−Ｂ３）を得た。【０１４５】
【化２１】
2020045541.tif 000023
【０１４６】
（１）すなわち、フラスコに、Ｌ−トリプトファン５．００ｇ及び１Ｍ水酸化ナトリウム水溶液２５．５ｇを加え、氷浴にて撹拌した。そこに、ブロモ酢酸クロライド４．２５ｇと５Ｍ水酸化ナトリウム水溶液６．５０ｇとを交互に滴下した。滴下終了後、溶液を氷浴から取り出し、室温にて３０分間撹拌した。その後、溶液から白濁沈殿が生じるまで２Ｍ塩酸水溶液を加え、さらに酢酸エチルを加えて分液抽出操作を行った。減圧留去後、真空乾燥を行い、中間体化合物（Ｅ−ＰＢ４）３．４８ｇを得た。
（２）続いて、別のフラスコに中間体化合物（Ｅ−ＰＢ４）３．２０ｇを加え、アセトン１５０ｍＬに溶解させた。そこに、チオ酢酸カリウム１．１３ｇを加え、４０℃にて４時間撹拌した。アセトンを減圧留去後、酢酸エチルを加えて反応物を溶解させた。そこに、５質量％クエン酸水溶液を加え、洗浄操作を行った。得られた有機相を減圧留去した後、真空乾燥することで、中間体化合物（Ｅ−ＰＢ５）を３．０５ｇ得た。
（３）続いて、新たなフラスコに、中間体化合物（Ｅ−ＰＢ５）２．９０ｇ及びメタノール２０ｇを加えて撹拌した。さらに、１Ｍ水酸化ナトリウム水溶液２０．０ｇを加え、室温で１時間撹拌した。減圧留去にてメタノールを留去後、２Ｍ塩酸水溶液を加えることで沈殿を生じさせた。その後、酢酸エチルを加え、抽出操作を行った。得られた有機相を飽和食塩水で洗浄後、硫酸マグネシウムにて水を除去した。さらに得られた有機相を減圧留去した後、真空乾燥することで、化合物（Ｅ−Ｂ３）を２．３１ｇ得た。【０１４７】
［実施例１］
（１）４４８ｇの純水にポリビニルアルコール（クラレ社製  ＰＶＡ−２１７）２．６９ｇを添加し、加熱撹拌してポリビニルアルコールを溶解させ、冷却した後、ドデシル硫酸ナトリウム（和光純薬工業製）０．０４５ｇを添加し、撹拌して水溶液Ｓを調製した。
一方、ジビニルベンゼン（和光純薬工業製）３．６３ｇ、１−エチル−４−ビニルベンゼン（ＣｈｅｍＳａｍｐＣｏ社製）０．３６ｇ及びグリシジルメタクリレート（三菱ガス化学社製）１４．１５ｇからなる単量体組成物を、２−オクタノン（東洋合成社製）２９．３８ｇに溶解させ、単量体溶液を調製した。
次いで、前記水溶液Ｓを、セパラブルフラスコ内に全量投入し、温度計、撹拌翼及び冷却管を装着して、温水バスにセットし、窒素雰囲気下で撹拌を開始した。セパラブルフラスコ内に前記単量体溶液を全量投入して、温水バスにより加温し内温が８５℃に到達したところで２，２'−アゾイソブチロニトリル（和光純薬工業社製）１．３４ｇを添加し、内温を８６℃にした。【０１４８】
（２）その後、８６℃に温度を維持したまま、３時間撹拌を行った。次いで、反応液を冷却した後、斯かる反応液をろ過し、純水とエタノールで洗浄した。洗浄した粒子を純水に分散させてデカンテーションを３回行い、小粒子を除いた。次いで、粒子の濃度が１０質量％となるように粒子を純水に分散させ、多孔質粒子分散液を得た。この分散液に含まれる多孔質粒子を、「多孔質担体１」と称する。
（３）その後、多孔質粒子分散液を２０ｇ分取し、水を除去後、１Ｍ水酸化ナトリウム水溶液９．５ｇ及び化合物（Ｅ−Ａ１）０．９７６ｇを加え、５０℃で１５時間撹拌を行った。次いで、斯かる反応液をろ過し、純水で洗浄した。
（４）次いで、α−チオグリセロール（東京化成工業株式会社製）７．３０ｇ及び水酸化ナトリウム２．１６ｇを加え、７０℃で３時間撹拌を行った。次いで、斯かる反応液をろ過し、純水で洗浄した後、粒子の濃度が１０質量％となるように粒子を純水に分散させた。この分散液に含まれる多孔質粒子を、「クロマトグラフィー担体Ｖ１」と称する。【０１４９】
［実施例２］
実施例１の工程（３）の化合物（Ｅ−Ａ１）０．９７６ｇを、化合物（Ｅ−Ａ２）１．０３６ｇに変更した以外は、実施例１の工程（１）〜（４）と同様の操作を行った。得られた分散液に含まれる多孔質粒子を、「クロマトグラフィー担体Ｖ２」と称する。【０１５０】
［比較例１］
実施例１の工程（３）の化合物（Ｅ−Ａ１）０．９７６ｇを、化合物（Ｅ−Ｂ１）１．１６２ｇに変更した以外は、実施例１の工程（１）〜（４）と同様の操作を行った。得られた分散液に含まれる多孔質粒子を、「クロマトグラフィー担体Ｘ１」と称する。【０１５１】
［比較例２］
実施例１の工程（３）の化合物（Ｅ−Ａ１）０．９７６ｇを、化合物（Ｅ−Ｂ２）１．０３６ｇに変更した以外は、実施例１の工程（１）〜（４）と同様の操作を行った。得られた分散液に含まれる多孔質粒子を、「クロマトグラフィー担体Ｘ２」と称する。【０１５２】
［比較例３］
実施例１の工程（３）の化合物（Ｅ−Ａ１）０．９７６ｇを、化合物（Ｅ−Ｂ３）１．２０５ｇに変更した以外は、実施例１の工程（１）〜（４）と同様の操作を行った。得られた分散液に含まれる多孔質粒子を、「クロマトグラフィー担体Ｘ３」と称する。【０１５３】
［実施例３］
実施例１の工程（１）のジビニルベンゼン（和光純薬工業製）３．６３ｇ、１−エチル−４−ビニルベンゼン（ＣｈｅｍＳａｍｐＣｏ社製）０．３６ｇを、エチレングリコールジメタクリレート５．５６ｇに変更した以外は、実施例１の工程（１）〜（４）と同様の操作を行った。得られた分散液に含まれる多孔質粒子を、「クロマトグラフィー担体Ｖ３」と称する。なお、エチレングリコールジメタクリレートを使用することで多孔質担体１の代わりに調製された多孔質担体を、「多孔質担体２」と称する。【０１５４】
［実施例４］
実施例１の工程（１）のジビニルベンゼン（和光純薬工業製）３．６３ｇ、１−エチル−４−ビニルベンゼン（ＣｈｅｍＳａｍｐＣｏ社製）０．３６ｇを、エチレングリコールジメタクリレート５．５６ｇに変更し、更に実施例１の工程（３）の化合物（Ｅ−Ａ１）０．９７６ｇを、化合物（Ｅ−Ａ２）１．０３６ｇに変更した以外は、実施例１の工程（１）〜（４）と同様の操作を行った。得られた分散液に含まれる多孔質粒子を、「クロマトグラフィー担体Ｖ４」と称する。【０１５５】
［比較例４］
実施例１の工程（１）のジビニルベンゼン（和光純薬工業製）３．６３ｇ、１−エチル−４−ビニルベンゼン（ＣｈｅｍＳａｍｐＣｏ社製）０．３６ｇを、エチレングリコールジメタクリレート５．５６ｇに変更し、更に実施例１の工程（３）の化合物（Ｅ−Ａ１）０．９７６ｇを、化合物（Ｅ−Ｂ１）１．１６２ｇに変更した以外は、実施例１の工程（１）〜（４）と同様の操作を行った。得られた分散液に含まれる多孔質粒子を、「クロマトグラフィー担体Ｘ４」と称する。【０１５６】
［比較例５］
実施例１の工程（１）のジビニルベンゼン（和光純薬工業製）３．６３ｇ、１−エチル−４−ビニルベンゼン（ＣｈｅｍＳａｍｐＣｏ社製）０．３６ｇを、エチレングリコールジメタクリレート５．５６ｇに変更し、更に実施例１の工程（３）の化合物（Ｅ−Ａ１）０．９７６ｇを、化合物（Ｅ−Ｂ２）１．０３６ｇに変更した以外は、実施例１の工程（１）〜（４）と同様の操作を行った。得られた分散液に含まれる多孔質粒子を、「クロマトグラフィー担体Ｘ５」と称する。【０１５７】
［比較例６］
実施例１の工程（１）のジビニルベンゼン（和光純薬工業製）３．６３ｇ、１−エチル−４−ビニルベンゼン（ＣｈｅｍＳａｍｐＣｏ社製）０．３６ｇを、エチレングリコールジメタクリレート５．５６ｇに変更し、更に実施例１の工程（３）の化合物（Ｅ−Ａ１）０．９７６ｇを、化合物（Ｅ−Ｂ３）１．２０５ｇに変更した以外は、実施例１の工程（１）〜（４）と同様の操作を行った。得られた分散液に含まれる多孔質粒子を、「クロマトグラフィー担体Ｘ６」と称する。【０１５８】
［試験例１  （ＤＢＣの測定）］
ＧＥヘルスケア社製ＡＫＴＡ  Ｐｒｉｍｅ  Ｐｌｕｓを用いて、線流速３００ｃｍ／ｈｒにおけるタンパク質（ヒトＩｇＧ抗体、Ｅｑｕｉｔｅｃｈ  Ｂｉｏ社製  ＨＧＧ−１０００）に対する各実施例及び比較例の担体Ｖ１〜Ｖ４、Ｘ１〜Ｘ６のＤＢＣを測定した。カラム容器は容量４ｍＬ（５ｍｍφ×２００ｍｍ長）のものを、タンパク質は５０ｍＭ酢酸ナトリウム／１００ｍＭ塩化ナトリウム水溶液（ｐＨ４．７）にタンパク質を５ｍｇ／ｍＬ溶解したものをそれぞれ使用し、溶出先端１０％ブレークスルーのときのタンパク質捕捉量とカラム充填体積からＤＢＣを求めた。結果を表１に示す。【０１５９】
［試験例２  （タンパク質の分離）］
各実施例及び比較例の担体を使用して、３種類のタンパク質（トリプシノーゲン（ｐＩ＝１０、Ｍｗ＝２３ｋＤａ）、シトクロムＣ（ｐＩ＝１０、Ｍｗ＝１２ｋＤａ）、リゾチーム（ｐＩ＝１１、Ｍｗ＝１４ｋＤａ））を含む液体サンプルから各タンパク質を分離させることで、タンパク質分離能を評価した。具体的手順を以下に示す。
容量４ｍＬ（５ｍｍφ×２００ｍｍ長）のカラム容器に、充填高さ約５ｃｍで各担体を充填してカラムを作製した。得られたカラムをＧＥヘルスケア社製ＡＫＴＡ  Ｐｒｉｍｅ  Ｐｌｕｓに接続した。２０ｍＭリン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ７．０）を、カラム容量の４倍通液し、平衡化させた。
次いで、トリプシノーゲン、シトクロムＣ及びリゾチームを、２０ｍＭリン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ７．０）に溶解させて、タンパク質混合液（トリプシノーゲン：０．２ｍｇ／ｍＬ、シトクロムＣ：０．１ｍｇ／ｍＬ、リゾチーム：０．２ｍｇ／ｍＬ）を調製した。
次に、上記タンパク質混合液１００μＬを、線流速３００ｃｍ／ｈｒでカラムに通液した。
次いで、２０ｍＭリン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ７．０）１００％から２０ｍＭリン酸ナトリウム／１．５Ｍ塩化ナトリウムバッファー（ｐＨ７．０）１００％へのリニアグラジェント溶出を４０分間かけて行った後、２０ｍＭリン酸ナトリウム／１．５Ｍ塩化ナトリウムバッファー（ｐＨ７．０）１００％で溶出を１０分間続けた。溶出時の各タンパク質のピークの溶出体積Ｖ及びピーク幅Ｗの値を、ＧＥヘルスケア社製ＡＫＴＡ  Ｐｒｉｍｅ  Ｐｌｕｓ付属の分光光度計を用いて取得した（ＵＶ検出波長：２８０ｎｍ）。
溶出体積Ｖは、ピークの最高吸光度値の点からベースラインに垂線を引いたときにベースラインと交わる接点から求めた溶出液の体積値である。
ピーク幅Ｗは、ピーク左右の変曲点を通る２本の接線を引いたときにベースラインと交わる２つの接点の間の幅から求めた体積値である。ただし、溶出ピークが重なっている場合は、これら重なるピーク間の最低吸光度値の点からベースラインに垂線を引いたときにベースラインと交わる接点から求めた。ピーク幅Ｗの値が小さいほど、タンパク質が高濃度で回収されており、タンパク質分離能に優れるといえる。
また、溶出体積Ｖ及びピーク幅Ｗの値を用いて、以下の算出式から分離能Ｒｓ１、Ｒｓ２をそれぞれ算出した。分離能Ｒｓ１、Ｒｓ２の値が大きいほど、タンパク質分離能に優れるといえる。試験例２の結果を表１に示す。【０１６０】
Ｒｓ１  ＝  （２（Ｖ2−Ｖ1））  ／  （Ｗ2＋Ｗ1）
Ｒｓ２  ＝  （２（Ｖ3−Ｖ2））  ／  （Ｗ3＋Ｗ2）【０１６１】
Ｖ1：トリプシノーゲンの溶出体積、Ｖ2：シトクロムＣの溶出体積、Ｖ3：リゾチームの溶出体積、Ｗ1：トリプシノーゲンのピーク幅、Ｗ2：シトクロムＣのピーク幅、Ｗ3：リゾチームのピーク幅【０１６２】
【表１】
2020045541.tif 000024
【０１６３】
表１に示すとおり、化合物（Ｅ−Ａ１）、（Ｅ−Ａ２）をリガンドとして結合させた担体を用いた場合（実施例１〜２、実施例３〜４）は、４−アミノ馬尿酸の残基をリガンドとする担体を用いた場合（比較例１、４）よりも、分離能Ｒｓ２が大となった。また、ＤＢＣの測定値も大きかった。
また、化合物（Ｅ−Ａ１）、（Ｅ−Ａ２）をリガンドとして結合させた担体を用いた場合（実施例１〜２、実施例３〜４）は、２−（ベンゾイルアミノ）−４−メルカプト酪酸の残基又はＬ−トリプトファンの残基をリガンドとする担体を用いた場合（比較例２〜３、比較例５〜６）よりも、分離能Ｒｓ１が大となった。また、ＤＢＣの測定値も大きかった。
また、比較例２〜３の結果に示すとおり、２−（ベンゾイルアミノ）−４−メルカプト酪酸の残基又はＬ−トリプトファンの残基をリガンドとする担体は、支持体（ベース粒子）の種類によってはそもそもリゾチームが溶出すらせず、分離能Ｒｓ２を算出できなかった。
【国際調査報告】
2020045541.tif 000032
2020045541.tif 000033
2020045541.tif 000034
2020045541.tif 000035