(57)【要約】  本発明の課題は、前頭側頭葉変性症の新規な治療剤を提供することである。  本発明は、Ｇａｓ６及び／若しくはＴｙｒｏ３の遺伝子発現又はタンパク質機能を抑制する有効成分を含む、前頭側頭葉変性症治療剤を提供する。前記有効成分は核酸を含んでいてもよい。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｇａｓ６及び／若しくはＴｙｒｏ３の遺伝子発現又はタンパク質機能を抑制する有効成分を含む、前頭側頭葉変性症治療剤。
【請求項２】
前記有効成分が核酸を含む、請求項１に記載の前頭側頭葉変性症治療剤。
【請求項３】
プログラニュリン遺伝子をノックインにより改変された、前頭側頭葉変性症の病態モデルマウスに候補化合物を投与し、タウタンパク質のＳｅｒ２０３のリン酸化を指標として、候補化合物をスクリーニングする工程を含む、前頭側頭葉変性症治療剤のスクリーニング方法。
【請求項４】
請求項１又は２に記載の前頭側頭葉変性症治療剤を患者に投与する工程を含む、前頭側頭葉変性症の治療方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、前頭側頭葉変性症治療剤、前頭側頭葉変性症治療剤のスクリーニング方法、及び前頭側頭葉変性症の治療方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
前頭側頭葉変性症、アルツハイマー病、及びレヴィー小体型認知症は、３大認知症として知られる。しかし、これらの３大認知症に対する根本的な治療法は確立されておらず、特に、前頭側頭葉変性症は治療法の開発が遅れている傾向にある。【０００３】
３大認知症には、それぞれ、遺伝の影響が強い家族性認知症、及び、遺伝的要素が目立たない孤発性認知症がある。家族性前頭側頭葉変性症においては、タウ（Ｔａｕ）とプログラニュリン（ＰＧＲＮ）の遺伝子変異の頻度が比較的高いことが報告されている（例えば、非特許文献１）。また、前頭側頭葉変性症の発症機構では、ＭＡＰＫシグナル伝達経路のリン酸化が重要な役割を果たすことが報告されている（特許文献１）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】国際公開第２０１５／０９９０９４号
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｒｅｐｏｒｔｓ  ｖｏｌｕｍｅ  ７，  Ａｒｔｉｃｌｅ  ｎｕｍｂｅｒ：  １５１３  （２０１７）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかし、前頭側頭葉変性症の治療において、臨床症状を改善できる標的分子の特定に対してさらなるニーズがある。【０００７】
本発明は、以上の事情に鑑みてなされたものであり、前頭側頭葉変性症の新規な治療剤を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、前頭側頭葉変性症において、タウタンパク質における特定の部位に異常リン酸化が生じる結果、該異常リン酸化タウタンパク質がシナプスを障害することを見出した。さらに、該異常リン酸化の上流を解明した結果、前頭側頭葉変性症を対象とする標的分子としてＧａｓ６、及びＴｙｒｏ３を見出した。本発明者らは、これらの知見に基づき、本発明を完成するに至った。より具体的には、本発明は以下のようなものを提供する。【０００９】
（１）  Ｇａｓ６及び／若しくはＴｙｒｏ３の遺伝子発現又はタンパク質機能を抑制する有効成分を含む、前頭側頭葉変性症治療剤。【００１０】
（２）  前記有効成分が核酸を含む、（１）に記載の前頭側頭葉変性症治療剤。【００１１】
（３）  プログラニュリン遺伝子をノックインにより改変された、前頭側頭葉変性症の病態モデルマウスに候補化合物を投与し、タウタンパク質のＳｅｒ２０３のリン酸化を指標として、候補化合物をスクリーニングする工程を含む、前頭側頭葉変性症治療剤のスクリーニング方法。【００１２】
（４）  （１）又は（２）に記載の前頭側頭葉変性症治療剤を患者に投与する工程を含む、前頭側頭葉変性症の治療方法。
【発明の効果】
【００１３】
本発明によれば、前頭側頭葉変性症の新規な治療剤を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】ＦＴＬＤ−ＴＤＰの発症機構の概要図である。
【図２】タウ遺伝子をノックダウンした場合のスパインの形態分析の結果を示す図である。
【図３】ＢＲＡＦ遺伝子をノックダウンした場合のスパインの形態分析の結果を示す図である。
【図４】ＰＫＣα遺伝子をノックダウンした場合のスパインの形態分析の結果を示す図である。
【図５】Ｔｙｒｏ３遺伝子をノックダウンした場合のスパインの形態分析の結果を示す図である。
【図６】Ｇａｓ６遺伝子をノックダウンした場合のスパインの形態分析の結果を示す図である。
【図７】ＢＲＡＦ阻害剤を投与した場合のスパインの形態分析の結果を示す図である。
【図８】ＰＫＣ阻害剤を投与した場合のスパインの形態分析の結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
以下、本発明の実施形態について説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。
【００１６】
＜前頭側頭葉変性症治療剤＞
本発明の前頭側頭葉変性症治療剤（以下、「本発明の治療剤」ともいう。）は、Ｇａｓ６（ｇｒｏｗｔｈ−ａｒｒｅｓｔ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｇｅｎｅ  ６）及び／若しくはＴｙｒｏ３（受容体型チロシンキナーゼの１つ）の遺伝子発現又はタンパク質機能を抑制する有効成分を含む。
【００１７】
本発明において、「前頭側頭葉変性症（ＦＴＬＤ）」とは、前頭葉・側頭葉において、早期には萎縮を呈し、晩期には脳全体の萎縮に至る、非アルツハイマー病型の神経変性疾患を意味する。前頭側頭葉変性症には、臨床的特徴上分類される３種の疾患、前頭側頭型認知症（ＦＴＤ）、進行性非流暢性失語（ＰＮＦＡ）及び意味性認知症（ＳＤ）が含まれる。また、前頭側頭葉変性症には、細胞内に異常タンパク質として蓄積されるタンパク質の種類に応じて病理学上分類される４種の疾患、ＦＴＬＤ−Ｔａｕ、ＦＴＬＤ−ＴＤＰ、ＦＴＬＤ−ＵＰＳ及びＦＴＬＤ−ＦＵＳが含まれる。
【００１８】
「ＦＴＬＤ−Ｔａｕ」は、細胞内に優位に蓄積されるＴａｕタンパク質中の微小管結合領域のリピート数に応じ、「３Ｒ  Ｔａｕ」型、「４Ｒ  Ｔａｕ」型及び「３／４Ｒ  Ｔａｕ」型に分類される。また、「３Ｒ  Ｔａｕ」型には、Ｐｉｃｋ球を伴うＦＴＬＤ（ピック病）、ＭＡＰＴ（微小管関連蛋白Ｔａｕ）遺伝子変異を伴うＦＴＬＤ（ＦＴＬＤ−１７）等が含まれ、「４Ｒ  Ｔａｕ」型には、大脳皮質基底核変性症、進行性核上性麻痺、認知症を伴う多系統タウオパチー、嗜銀顆粒性認知症（嗜銀顆粒病）、ＭＡＰＴ遺伝子変異を伴うＦＴＬＤ（ＦＴＬＤ−１７）等が含まれ、「３／４Ｒ  Ｔａｕ」型には、神経原線維変化型認知症、ＭＡＰＴ遺伝子変異を伴うＦＴＬＤ（ＦＴＬＤ−１７）等が含まれる。
【００１９】
Ｔａｕが陰性であり、ユビキチン陽性封入体を有するＦＴＬＤ群は、「ＦＴＬＤ−Ｕ」と称され、上記ＦＴＬＤ−ＴＤＰ、ＦＴＬＤ−ＵＰＳ及びＦＴＬＤ−ＦＵＳが含まれる。
【００２０】
「ＦＴＬＤ−ＴＤＰ」は、ＦＴＬＤ−Ｕのうち、ＴＤＰ−４３が陽性の疾患を意味し、該疾患には、ＰＧＲＮ（ｐｒｏｇｒａｎｕｌｉｎ（プログラニュリン）遺伝子）変異を伴うＦＴＬＤ、孤発性のＦＴＬＤ−ＴＤＰ／ＦＴＬＤ−Ｕ、ＴＡＲＤＢＰ（ＴＤＰ−４３遺伝子）変異を伴うＦＴＬＤ、ＶＣＰ（ｖａｌｏｓｉｎ含有蛋白遺伝子）変異を伴うＦＴＬＤ、９番染色体に連鎖するＦＴＬＤ等が含まれる。
【００２１】
「ＦＴＬＤ−ＵＰＳ」は、ＴＤＰ−４３が陰性であるＦＴＬＤ−Ｕの１種であり、該疾患には、ＣＨＭＰ２Ｂ（荷電多発空胞体蛋白２Ｂ遺伝子）変異を伴うＦＴＬＤ等が含まれる。
【００２２】
「ＦＴＬＤ−ＦＵＳ」は、ＦＴＬＤ−Ｕのうち、ＴＤＰ−４３が陰性であり、ＦＵＳ（ｆｕｓｅｄ  ｉｎ  ｓａｒｃｏｍａ）が陽性の疾患を意味し、該疾患には、神経細胞性中間径フィラメント封入体病、非典型的ＦＴＬＤ−Ｕ、好塩基性封入体病、ＦＵＳ変異を伴うＦＴＬＤ等が含まれる。
【００２３】
「前頭側頭葉変性症の発症」とは、臨床診断において判断される、記憶障害、高次脳機能障害（失語、失行、失認、構成失行）、人格の変化といった症状の発現、及び、画像診断によって判断される脳の萎縮の出現を意味する。「前頭側頭葉変性症の罹患」とは、前記症状は発現していないものの、前頭側頭葉変性症特有の病理変化（例えば、前記異常タンパク質の細胞内の蓄積）が生じている状態も含む意味である。
【００２４】
本発明の治療薬の治療対象は、前頭側頭葉変性症を発症した患者、及び、前頭側頭葉変性症に罹患した患者のいずれも含む。
【００２５】
本発明において「治療」とは、例えば、前頭側頭葉変性症の症状の進行の遅延、並びに、症状の緩和、軽減、改善及び治癒等を意味する。
【００２６】
本発明は、前頭側頭葉変性症のうち、ＦＴＬＤ−ＴＤＰの治療に対して特に有効である。
【００２７】
本発明者は、前頭側頭葉変性症のうち、ＴＤＰ４３（ＴＡＲ  ＤＮＡ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｏｆ  ４３  ｋＤａ）の凝集タンパク質が認められるＦＴＬＤ−ＴＤＰの病理解明を行った。その結果特定された機構の概要を図１に示す。
【００２８】
ＴＤＰ４３の凝集タンパク質は、プログラニュリン、ＶＣＰ（ｖａｌｏｓｉｎ−ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ）、ＴＤＰ４３、Ｃ９ｏｒｆ７２（Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ  ９  ｏｐｅｎ  ｒｅａｄｉｎｇ  ｆｒａｍｅ  ７２）等の遺伝子変異によってもたらされ得ることが知られる。これを踏まえ、本発明者らは、頭側頭葉変性症の病態モデルマウスである「ＰＧＲＮ−ＫＩマウス」を作製した（作製方法等の詳細は、実施例、又は、国際公開第２０１５／０９９０９４号を参照。）。このマウスは、プログラニュリンをノックインしたものである。
【００２９】
「プログラニュリン（ＰＧＲＮ）」とは、８８ｋＤのタンパク質であり、抗炎症作用、神経栄養作用があると考えられている。「ノックイン」とは、生物の染色体の特定の遺伝子座にタンパク質をコードする相補的ＤＮＡ配列を挿入する遺伝子工学的手法を意味する。この手法を用いて作製されたマウスであるノックインマウスは、トランスジェニックマウスのように、目的遺伝子の数（コピー数）が増えたり、人為的な遺伝値調節領域（エンハンサー、プロモーター）による過剰量の遺伝子発現が起きたりしないため、より自然なマウスモデルであると考えられている。
【００３０】
本発明者らは、ＰＧＲＮ−ＫＩマウスの大脳皮質組織を用いて、経時的に網羅的リン酸化プロテオーム解析を行った。その結果、予想外にも、ＴＤＰ４３タンパク質の脳内凝集が生じる前に、タウタンパク質の２０３番目アミノ酸（Ｓｅｒ２０３）のリン酸化の異常増加が神経細胞のシナプスにおいて検出された。また、シナプスの数の減少も認められた。
【００３１】
Ｓｅｒ２０３がリン酸化したマウスタウタンパク質（ｐＳｅｒ２０３マウスタウタンパク質）は、ヒトにおいてはタウタンパク質の２１４番目アミノ酸（Ｓｅｒ２１４）がリン酸化したヒトタウタンパク質（ｐＳｅｒ２１４ヒトタウタンパク質）に対応する。本発明者らの検討の結果、ヒト前頭側頭葉変性症患者の脳神経細胞のシナプスにおいてもｐＳｅｒ２１４ヒトタウタンパク質が認められた。このような、異常リン酸化タウタンパク質のシナプスへの局在は、アルツハイマー病モデルでも報告されていることから、前頭側頭葉変性症とアルツハイマー病とが共通する病理によって発症することが示唆された。
【００３２】
マウスやヒト以外であっても、マウスタウタンパク質のＳｅｒ２０３に対応する部位がリン酸化したタウタンパク質のシナプスへの局在が前頭側頭葉変性症をもたらす可能性は極めて高い。なお、マウス以外の各種動物において、マウスタウタンパク質のＳｅｒ２０３に対応する部位は、各種動物のタウタンパク配列に基づき、容易に特定できる。
【００３３】
以上の知見に基づき、ＰＧＲＮ−ＫＩマウスに対して、タウタンパク質のアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ノックダウンベクターを用いてタウタンパク質の発現を抑制したところ、減少していたシナプスの数が正常化し、認知障害の症状が改善した。したがって、プログラニュリンの発現減少が、タウタンパク質の特定の部位のリン酸化を介して、前頭側頭葉変性症をもたらし得ることがわかった。
【００３４】
さらに、本発明者らは、プログラニュリン遺伝子変異と、タウタンパク質のＳｅｒ２０３異常リン酸化との関係を検討した。その結果、まず、プログラニュリンは、受容体型チロシンキナーゼであるＴｙｒｏ３と、分泌タンパク質であるＧａｓ６との結合を阻害することが見出された。他方、プログラニュリンの発現が減少すると、Ｇａｓ６がＴｙｒｏ３に結合し、Ｔｙｒｏ３を活性化する。その結果、Ｔｙｒｏ３の下流シグナル、すなわち、所定のキナーゼ（ＰＫＣ、ＭＡＰＫ、ＢＲＡＦ等）が活性化され、最終的に、タウタンパク質のＳｅｒ２０３の異常リン酸化をもたらすことが見出された。
【００３５】
そこで、ＰＧＲＮ−ＫＩマウスに対して、所定のキナーゼ（ＰＫＣの１つであるＰＫＣα、ＭＡＰＫ、又はＢＲＡＦ）に対する阻害薬又はＡＡＶノックダウンベクターを用いて、これらのキナーゼの活性化を抑制したところ、減少していたシナプスの数が正常化し、認知障害の症状が改善した。
【００３６】
以上の結果を踏まえ、前頭側頭葉変性症（特にＦＴＬＤ−ＴＤ）は、主に以下の順で進行する機構によって発症し得ることが見出された。
（１）プログラニュリンの発現減少
（２）Ｇａｓ６とＴｙｒｏ３との結合、及びそれによるＴｙｒｏ３の活性化
（３）Ｔｙｒｏ３の下流シグナルの活性化（具体的には、所定のキナーゼ（ＰＫＣ、ＭＡＰＫ、ＢＲＡＦ等）の活性化）
（４）タウタンパク質の特定の部位（マウスの場合はＳｅｒ２０３）のリン酸化
（５）ＴＤＰ４３タンパク質やタウタンパク質の脳内凝集
（６）シナプスの変性及び前頭側頭葉変性症の発症
【００３７】
したがって、上記の機構に作用し、結果的にタウタンパク質の特定の部位（マウスの場合はＳｅｒ２０３）のリン酸化を抑制できる有効成分によれば、前頭側頭葉変性症の治療剤となり得るという新規な知見が見出された。
【００３８】
（有効成分）
本発明の治療剤は、Ｇａｓ６及び／若しくはＴｙｒｏ３の遺伝子発現又はタンパク質機能を抑制する有効成分（以下、「本発明における有効成分」ともいう。）を含む。換言すれば、本発明における有効成分は、Ｇａｓ６とＴｙｒｏ３との結合の抑制効果、及び、Ｇａｓ６とＴｙｒｏ３との結合によって生じるＴｙｒｏ３の活性化の抑制効果を有する。これにより、本発明の治療剤によれば、Ｇａｓ６とＴｙｒｏ３との結合、及びそれによるＴｙｒｏ３の活性化の下流のシグナルが抑制されるため、例えば、タウタンパク質の特定の部位（マウスの場合はＳｅｒ２０３）のリン酸化の抑制効果や、シナプスの変性及び前頭側頭葉変性症の発症の治療効果が奏される。
【００３９】
本発明において、「遺伝子発現を抑制する」とは、遺伝子が発現しないこと、又は、本発明における有効成分を投与しない場合と比較して遺伝子の発現が少ないことを意味する。
【００４０】
本発明において、「タンパク質機能を抑制する」とは、タンパク質が機能しないこと、又は、本発明における有効成分を投与しない場合と比較してタンパク質の機能発現が少ないことを意味する。
【００４１】
本発明における有効成分の態様は特に限定されないが、例えば、核酸を含むものが好ましく、核酸からなるものが好ましい。本発明における有効成分が核酸を含む場合、通常、核酸は、Ｇａｓ６及び／若しくはＴｙｒｏ３の遺伝子を発現抑制できるもの、又は、ノックダウンすることができるものとして調製される。本発明における有効成分は１種単独であってもよく、２種以上の組み合わせであってもよい。
【００４２】
核酸は、ｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｄｓＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、アンチセンス核酸等であってもよい。本発明における有効成分は、Ｇａｓ６及び／若しくはＴｙｒｏ３の遺伝子のｓｈＲＮＡであることが好ましい。
【００４３】
本発明における有効成分の態様は、抗体（ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、抗体の機能的断片等）や低分子化合物であってもよい。
【００４４】
本発明の治療剤中の、本発明における有効成分の量は、得ようとする効果や、患者の体重及び症状等に応じて適宜調整できる。
【００４５】
本発明の治療剤には、本発明における有効成分の作用を阻害しない範囲で、上記本発明における有効成分以外の有効成分を含んでいてもよい。ただし、本発明の効果を奏しやすいという観点から、本発明の治療剤には、有効成分として、本発明における有効成分のみを含んでいることが好ましい。
【００４６】
（その他の成分）
本発明の治療剤には、本発明における有効成分や、任意で含まれるその他の有効成分の作用を阻害しない範囲で、薬理学上許容されるその他の成分を配合できる。このようなその他の成分としては、例えば、担体、賦形剤、崩壊剤、緩衝剤、乳化剤、懸濁剤、安定剤、保存剤、防腐剤、生理食塩が挙げられる。賦形剤としては乳糖、デンプン、ソルビトール、Ｄ−マンニトール、白糖等を用いることができる。崩壊剤としてはデンプン、カルボキシメチルセルロース、炭酸カルシウム等を用いることができる。緩衝剤としてはリン酸塩、クエン酸塩、酢酸塩等を用いることができる。乳化剤としてはアラビアゴム、アルギン酸ナトリウム、トラガント等を用いることができる。懸濁剤としてはモノステアリン酸グリセリン、モノステアリン酸アルミニウム、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシメチルセルロース、ラウリル硫酸ナトリウム等を用いることができる。安定剤としてはプロピレングリコール、ジエチリン亜硫酸塩、アスコルビン酸等を用いることができる。保存剤としてはフェノール、塩化ベンザルコニウム、ベンジルアルコール、クロロブタノール、メチルパラベン等を用いることができる。防腐剤としてはアジ化ナトリウム、塩化ベンザルコニウム、パラオキシ安息香酸、クロロブタノール等を用いることができる。これらの成分は、得ようとする効果等に応じて、種類や量を適宜調整できる。
【００４７】
（剤形）
本発明の治療剤の剤形は、医薬品として使用可能なものであれば特に限定されない。例えば、経口剤（錠剤等）、非経口剤（注射剤等）等が挙げられる。これらの剤形は医薬分野における通常の方法に基づき製造できる。
【００４８】
本発明の治療剤の剤形が非経口剤である場合、剤形の種類に応じて、静脈内投与、動脈内投与、腹腔内投与、皮下投与、皮内投与、気道内投与、直腸投与及び筋肉内投与、輸液による投与、標的部位（脳等）への直接投与等を行うことができる。治療効果が高く、また投与する薬剤の量が抑えられるという観点から、標的部位に直接投与することが好ましい。標的部位への投与は、例えば、カニューレ（カテーテル）、切開術、ドラッグデリバリーシステム、注射等を用いて行うことができ、より具体的には、定位脳手術方法によってカニューレ等を挿入し、当該カニューレを通じて薬剤を脳内に投与する方法、開頭し、薬剤を入れた徐放系ドラッグデリバリーシステム（例えば、ＡＬＺＥＴ社製の浸透圧ポンプ）を脳内に埋め込む方法、薬剤を電気穿孔法により脳内の細胞に導入する方法が挙げられる。また、本発明の薬剤を脳内に直接投与しない場合には、前記化合物に脳関門透過物質を結合させて投与する方法を利用してもよい。なお、脳関門透過物質としては、例えば、狂犬病ウイルス由来の２９アミノ酸からなる糖タンパク質（Ｎａｔｕｒｅ、２００７年７月５日、４４８巻、３９〜４３頁  参照）が挙げられるが、これに制限されない。
【００４９】
本発明の治療剤の投与回数は、本発明における有効成分の投与量や、投与経路等に応じて適宜調整できる。
【００５０】
＜前頭側頭葉変性症治療剤のスクリーニング方法＞
本発明の前頭側頭葉変性症治療剤のスクリーニング方法（以下、「本発明のスクリーニング方法」ともいう。）は、プログラニュリン遺伝子をノックインにより改変された、前頭側頭葉変性症の病態モデルマウスに候補化合物を投与し、タウタンパク質のＳｅｒ２０３のリン酸化を指標として、候補化合物をスクリーニングする工程を含む。
【００５１】
プログラニュリン遺伝子をノックインにより改変された、前頭側頭葉変性症の病態モデルマウスにおいては、プログラニュリンの発現が減少している。そのため、この病態モデルマウスでは上記で説明した機構が進行し、シナプスの変性や前頭側頭葉変性症の発症が認められる。このような病態モデルマウスに対して候補化合物を投与し、該候補化合物を投与しない病態モデルマウスと比較してＳｅｒ２０３のリン酸化の抑制が認められるならば、該候補化合物は、前頭側頭葉変性症治療剤として機能することが期待できる。本発明において、「候補化合物を投与しない病態モデルマウスと比較してＳｅｒ２０３のリン酸化が抑制される」とは、候補化合物を投与しない病態モデルマウスと比較してＳｅｒ２０３のリン酸化の量が少ないこと、又は、Ｓｅｒ２０３のリン酸化が認められないことを意味する。
【００５２】
プログラニュリン遺伝子のノックインの方法は特に限定されないが、実施例に示した方法や、国際公開第２０１５／０９９０９４号に記載された方法を採用できる。マウスの種類や性別は特に限定されないが、扱いや入手のしやすさから、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ  雄マウスが好ましい。
【００５３】
候補化合物としては特に制限はなく、例えば、遺伝子ライブラリーの発現産物、合成低分子化合物ライブラリー、ペプチドライブラリー、抗体、細菌放出物質、細胞（微生物、植物細胞、動物細胞）の抽出液及び培養上清、精製又は部分精製ポリペプチド、海洋生物、植物又は動物由来の抽出物、土壌、ランダムファージペプチドディスプレイライブラリーが挙げられる。
【００５４】
Ｓｅｒ２０３のリン酸化の有無や量は、病態モデルマウスの組織（例えば、大脳組織）について、抗リン酸化Ｓｅｒ２０３抗体を用いた検出（ウエスタンブロッティング等）を行うことで特定できる。具体的な方法としては、例えば、Ｆｕｊｉｔａら（Ｎａｔ  Ｃｏｍｍｕｎ．  ２０１８  Ｊａｎ  ３０；９（１）：４３３．  ｄｏｉ：  １０．１０３８／ｓ４１４６７−０１８−０２８２１−ｚ）に記載された方法であってもよい。
【００５５】
本発明のスクリーニング方法において、候補化合物が前頭側頭葉変性症治療剤として機能することの判断基準は、候補化合物を投与しない病態モデルマウスと比較してＳｅｒ２０３のリン酸化が抑制されていることのみであってもよい。判断基準としては、これに加え、さらに、候補化合物を投与しない病態モデルマウスと比較して、シナプスの変性抑制、及び／又は、前頭側頭葉変性症の症状抑制が認められることを加えてもよい。シナプスの変性の有無や程度は、実施例に示した方法でスパインの形態分析を行うことで判断できる。前頭側頭葉変性症の症状の有無や程度は、実施例に示した方法で行動実験を行うことで判断できる。
【００５６】
＜前頭側頭葉変性症の治療方法＞
本発明の前頭側頭葉変性症の治療方法（以下、「本発明の治療方法」ともいう。）は、本発明の治療剤を患者に投与する工程を含む。
【００５７】
本発明の治療剤の投与量、投与回数、投与間隔、投与経路等は、得ようとする効果や、患者の体重及び症状等に応じて適宜調整できる。
【００５８】
本発明の治療剤の投与対象は、前頭側頭葉変性症の症状を生じている任意の対象である。投与対象の種類は特に限定されず、ヒト、及びヒト以外の哺乳動物（マウス、ラット、イヌ、ネコ、ブタ、ウシ等）が挙げられる。
【実施例】
【００５９】
以下に、実施例により本発明をさらに詳しく説明するが、本発明はこれらの実施例に何ら限定されるものではない。【００６０】
＜前頭側頭葉変性症の病態モデルの作製＞
以下の方法で、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ  雄マウスを用いてプログラニュリンのノックインを行い、前頭側頭葉変性症の病態モデルマウスを作製した。得られたマウスはＲ５０４Ｘ変異を有していた。以下、プログラニュリンノックインマウスを「ＰＧＲＮ−ＫＩマウス」ともいう。【００６１】
Ｎｅｏカセット（ユニテック・ジャパン社製）をＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスに導入することで、ヘテロ接合型ＰＧＲＮ  Ｒ５０４Ｘ変異を構築した。なお、Ｆ１マウスに存在するＮｅｏカセットは、ＣＡＣ−Ｃｒｅマウスと交配させることで除去した。【００６２】
標的化ベクターは以下の２つのコンストラクトから作製した。コンストラクト２から得たＢａｍＨＩ（Ｂｌｕｎｔ）−ＸｈｏＩ  フラグメントを、コンストラクト１のＸｈｏＩ（Ｂｌｕｎｔ）と、ＳａｌＩサイトとの間にサブクローニングした。得られたプラスミドを標的化ベクターとして用いた。
（コンストラクト１）
ＢＡＣクローン（ＩＤ：ＲＰ２３−３１１Ｐ１又はＲＰ２３−１３７Ｊ１７）から増幅させた６．５ｋｂｐ  ＮｏｔＩ−ＸｈｏＩ  フラグメント（Ｒ５０４Ｘ変異を含む）のＰＣＲ産物を、ベクターｐＢＳ−ＤＴＡ（ユニテック・ジャパン社製）にサブクローニングした。
（コンストラクト２）
３．０ｋｂｐ  ＣｌａＩ−ＸｈｏＩフラグメントのＰＣＲ産物を、Ｎｅｏカセットを含むベクターｐＢＳ−ＬＮＬ（−）にサブクローニングした。【００６３】
標的化ベクターをＳｗａＩで線状にした後、得られたフラグメントを、電気穿孔法でＣ５７ＢＬ／６ＪマウスのＥＳクローンに導入した。
ＥＳクローンのジェノタイピングを、以下のプライマーを用いてＰＣＲによって行った。
５’−ＣＧＴＧＣＡＡＴＣＣＡＴＣＴＴＧＴＴＣＡＡＴ−３’  （フォワード）
５’−ＣＡＴＧＡＣＣＴＡＡＣＴＣＡＡＴＧＣＡＴＡＣＣＡＣ−３’  （リバース）【００６４】
ポジティブクローンを、サザンブロッティング解析に供した。【００６５】
サザンブロッティングのための５’及び３’プローブを以下のように作製した。
５’−プローブ
５’−ＣＴＧＴＧＴＣＴＣＡＣＴＡＧＡＡＧＣＡＴＡＡＧＣＡ−３’  （フォワード）
５’−ＡＣＴＡＧＡＴＴＧＧＧＡＡＡＧＡＣＡＧＴＧＡＡＴＣ−３’  （リバース）
３’−プローブ
５’−ＡＡＴＴＣＣＡＡＴＣＣＴＧＴＧＴＧＧＴＣＡＴＡＧ−３’  （フォワード）
５’−ＣＣＡＣＴＴＴＣＴＴＴＣＴＣＣＣＴＴＡＣＣＣＴＡ−３’  （リバース）【００６６】
ネオマイシンプローブを、以下のプライマーを用いて作製した。
５’−ＧＡＡＣＡＡＧＡＴＧＧＡＴＴＧＣＡＣＧＣＡＧＧＴＴＣＴＣＣＧ−３’  （フォワード）
５’−ＧＴＡＧＣＣＡＡＣＧＣＴＡＴＧＴＣＣＴＧＡＴＡＧ−３’  （リバース）【００６７】
導入したプログラニュリン変異の存在は、テールスニップから調製したゲノムＤＮＡを用いたＰＣＲによって確認した。増幅は、以下のプライマーを用いて、「ＫＯＤ−ＦＸ  ｎｅｏ」（東洋紡社製）によって行った。
５’−ＧＡＴＣＴＴＴＣＴＡＴＧＴＡＣＡＧＣＣＡＣＧＴＴＴ−３’  （フォワード）
５’−ＣＴＡＡＴＧＧＴＧＴＴＣＡＡＣＧＴＣＡＡＧＴＡＧＴ−３’  （リバース）
ＰＣＲ条件は以下のとおりである。
９８℃１０秒（変性）、５７℃３０秒（アニーリング）、及び６８℃４５秒（伸長）を３５サイクル行った。【００６８】
ノックインを行っていないマウスのゲノムからの増幅物は３０２ｂｐフラグメントのみを含んでいたのに対し、ノックインを行ったマウスのゲノムからの増幅物は、３０２ｂｐフラグメント及び３９２ｂｐフラグメントを含んでいた。【００６９】
得られたＰＧＲＮ−ＫＩマウスについて以下の観点から評価を行い、このマウスが前頭側頭葉変性症の病態を生じていることを確認した。【００７０】
（ＴＤＰ４３の凝集タンパク質の局在の検討）
前頭側頭葉変性症のうち「ＦＴＬＤ−ＴＤＰ」と分類されるものは、前頭葉や側頭葉の神経細胞の細胞質にＴＤＰ４３の凝集タンパク質が局在することが知られる。正常な神経細胞においては、ＴＤＰ４３は核内に局在する。そこで、ＰＧＲＮ−ＫＩマウスの前頭葉の神経細胞におけるＴＤＰ４３の凝集タンパク質の局在を、抗ＴＤＰ４３抗体及び抗リン酸化ＴＤＰ４３抗体を用いて検討した結果、神経細胞の核内ではなく細胞質において局在していることを確認した。【００７１】
（ＰＧＲＮ−ＫＩマウスの行動実験）
以下の２種類の行動実験（恐怖条件付け実験及びモリスウォーターメイズ試験）を行った結果、１２週齢以降のＰＧＲＮ−ＫＩマウスにおいて認知反応の低下が認められた。このような反応低下は前頭側頭葉変性症において同様に認められる症状である。なお、行動試験は、いずれもＩｔｏ  Ｈ．ら（Ｍｏｌ  Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ．  ２０１５  Ａｐｒ；  ２０（４）：  ４５９−４７１）に示された方法に準じて実施した。【００７２】
［行動実験；恐怖条件付け実験］
ＰＧＲＮ−ＫＩマウス及び対照マウス（ノックインを行っていないＣ５７ＢＬ／６Ｊマウス）を用いて恐怖条件付け実験を実施した。具体的には、音刺激（６５ｄＢホワイトノイズ、３０秒）と共に足に電気刺激（０．４ｍＡ、２秒）をマウスに与えた。そして、その２４時間後に、同チャンバーにて電気刺激を与えることなく音刺激を与えた際の、当該マウスのフリージング反応の頻度を測定した。その結果、ＰＧＲＮ−ＫＩマウスは対照マウスと比較して、フリージング行動の時間が有意に短かった。このことは、ＰＧＲＮ−ＫＩマウスの認知反応が、対照マウスと比較して低下したことを意味する。【００７３】
［行動実験；モリスウォーターメイズ試験］
ＰＧＲＮ−ＫＩマウス及び対照マウス（ノックインを行っていないＣ５７ＢＬ／６Ｊマウス）を用いてモリスウォーターメイズ試験を実施した。具体的には、５日間、マウスに６０秒の試行を１日当たり４回受けさせ、プラットフォームに達するまでの時間を測定した。その結果、ＰＧＲＮ−ＫＩマウスは対照マウスと比較して、目的領域での滞在時間が有意に短かった。このことは、ＰＧＲＮ−ＫＩマウスの認知反応が、対照マウスと比較して低下したことを意味する。【００７４】
＜前頭側頭葉変性症の病態モデルを用いた網羅的リン酸化プロテオーム解析＞
ＰＧＲＮ−ＫＩマウスの大脳組織を用いて、経時的に網羅的リン酸化プロテオーム解析を行った結果、前頭側頭葉変性症が、主に以下の順で進行する機構によって発症し得ることが見出された。該機構の概要図を図１に示す。
（１）プログラニュリンの発現減少
（２）Ｇａｓ６とＴｙｒｏ３との結合、及びそれによるＴｙｒｏ３の活性化
（３）Ｔｙｒｏ３の下流シグナルの活性化（具体的には、所定のキナーゼ（ＰＫＣ、ＭＡＰＫ、ＢＲＡＦ等）の活性化）
（４）タウタンパク質の特定の部位（マウスの場合はＳｅｒ２０３）のリン酸化
（５）ＴＤＰ４３タンパク質やタウタンパク質の脳内凝集
（６）シナプスの変性及び前頭側頭葉変性症の発症【００７５】
＜各種遺伝子のノックダウンによる治療効果の検討＞
上記＜前頭側頭葉変性症の病態モデルを用いた網羅的リン酸化プロテオーム解析＞で得られた知見によれば、上記の機構のいずれかを阻害し、結果的にタウタンパク質の特定の部位（マウスの場合はＳｅｒ２０３）のリン酸化を抑制できれば、前頭側頭葉変性症を治療できることが期待できる。
そこで、ＰＧＲＮ−ＫＩマウス及び対照マウス（ノックインを行っていないＣ５７ＢＬ／６Ｊマウス）において、前頭側頭葉変性症の発症に関与し得る各種遺伝子（タウ、ＢＲＡＦ（ｂ−ｒａｆとも表される。）、ＰＫＣα、Ｔｙｒｏ３、Ｇａｓ６）を、ｓｈＲＮＡを用いてノックダウンし、上記＜前頭側頭葉変性症の病態モデルの作製＞同様に行動実験を行い、さらにスパイン（シナプス後部）の形態分析を行った。【００７６】
各種遺伝子のノックダウンは以下の方法で行った。
ｓｃｒａｍｂｌｅｄ  ｓｈＲＮＡ（ｓｃ−１０８０８０、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）、Ｔａｕ−ｓｈＲＮＡ（ｓｃ−４３０４０２−Ｖ、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）、Ｂ−Ｒａｆ  ｓｈＲＮＡ（ｓｃ−６３２９４−Ｖ、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）、又はＴｙｒｏ３−ｓｉＲＮＡ（ｉＶ０３７８４８、ＡＢＭ社製）を含むレンチウイルス粒子（２×１０５ｔｉｔｅｒ  ｕｎｉｔｓ／１００μｌ中）を、ＡＣＳＦバッファー（ＮａＣｌ  １２５ｍＭ；ＫＣｌ  ２．５ｍＭ；ＮａＨ２ＰＯ４  １．２５ｍＭ；ＭｇＣｌ２  １ｍＭ；ＣａＣｌ２  １ｍＭ；ＮａＨＣＯ３  ２６ｍＭ；グルコース  ２５ｍＭ）で１：４となるように希釈した。
また、ｓｃｒａｍｂｌｅｄ  ｓｈＲＮＡ（ＴＧ５０１６５３、ＯｒｉＧｅｎｅ社製）、ＰＫＣα−ｓｈＲＮＡ  （ＴＧ５０１６５３、ＯｒｉＧｅｎｅ社製）、又はＧａｓ６−ｓｈＲＮＡ  （ｓｃ−３５４５１−ＳＨ、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）を含むプラスミドベクター（１０μｇ）を、１００μｌのｉｎ  ｖｉｖｏ−ｊｅｔＰＥＩ  （２０１−１０Ｇ、Ｐｏｌｙｐｌｕｓ−ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ社製）に溶解させた。
８〜１２週齢にかけて、ＰＧＲＮ−ＫＩマウス及び対照マウス（ノックインを行っていないＣ５７ＢＬ／６Ｊマウス）のくも膜下腔に、各ｓｈＲＮＡを、浸透圧ポンプ（０．１５μｌ／ｈ）で投与した。【００７７】
（行動実験）
恐怖条件付け実験及びモリスウォーターメイズ試験のいずれの結果においても、各種遺伝子（タウ、ＢＲＡＦ、ＰＫＣα、Ｔｙｒｏ３、Ｇａｓ６）をノックダウンされたＰＧＲＮ−ＫＩマウスは、ノックダウンされていないＰＧＲＮ−ＫＩマウスと比較して、認知反応が有意に向上した。【００７８】
（スパインの形態分析）
各遺伝子をノックダウンされたマウス（１２週齢時）の樹状突起の画像を、２光子励起顕微鏡を用いて取得した。さらに、スパインの数を「ＩＭＡＲＩＳ  ｓｏｆｔｗａｒｅ」（ＩＭＡＲＩＳ７．２．２、Ｂｉｔｐｌａｎｅ社製）を用いて計測した。タウのノックダウンの結果を図２に、ＢＲＡＦのノックダウンの結果を図３に、ＰＫＣαのノックダウンの結果を図４に、Ｔｙｒｏ３のノックダウンの結果を図５に、Ｇａｓ６のノックダウンの結果を図６に示す。【００７９】
図２〜６のとおり、各種遺伝子（タウ、ＢＲＡＦ、ＰＫＣα、Ｔｙｒｏ３、Ｇａｓ６）をノックダウンされたＰＧＲＮ−ＫＩマウスは、ノックダウンされていないＰＧＲＮ−ＫＩマウスと比較して、スパインの数が顕著に多く、対照マウスと同程度だった。他方、対照マウスにおいては、ノックダウンの有無にかかわらず、スパインの数に変化は認められなかった。このことは、各種遺伝子（タウ、ＢＲＡＦ、ＰＫＣα、Ｔｙｒｏ３、Ｇａｓ６）のノックダウンが、ＰＧＲＮ−ＫＩマウスのシナプスの変性を正常化させたことを意味する。【００８０】
＜参考；各種阻害剤を用いた前頭側頭葉変性症の治療効果の検討＞
上記＜前頭側頭葉変性症の病態モデルを用いた網羅的リン酸化プロテオーム解析＞で得られた知見によれば、上記の機構のいずれかを阻害し、結果的にタウタンパク質の特定の部位（マウスの場合はＳｅｒ２０３）のリン酸化を抑制できれば、前頭側頭葉変性症を治療できることが期待できる。
そこで、ベムラフェニブ（ＢＲＡＦ阻害剤）又はＧｏ６９７６（ＰＫＣ阻害剤）をＰＧＲＮ−ＫＩマウスに投与し、上記＜各種遺伝子のノックダウンによる治療効果の検討＞と同様に行動実験及びスパインの形態分析を行った。【００８１】
（ベムラフェニブ投与群）
６〜１２週齢にかけて、ＰＧＲＮ−ＫＩマウス及び対照マウス（ノックインを行っていないＣ５７ＢＬ／６Ｊマウス）にベムラフェニブ（３２ｍｇ／体重ｋｇ／ｄａｙ）を経口投与した。ベムラフェニブの代わりにモックを投与した群を対照群とした。【００８２】
（Ｇｏ６９７６投与群）
１０〜１２週齢にかけて、ＰＧＲＮ−ＫＩマウス及び対照マウス（ノックインを行っていないＣ５７ＢＬ／６Ｊマウス）のくも膜下腔に４．４μＭ  Ｇｏ６９７６（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ社製）を浸透圧ポンプ（０．１５μｌ／ｈ、＃２００６、ＤＵＲＥＣＴ社製）で投与した。Ｇｏ６９７６の代わりにＰＢＳを投与した群を対照群とした。【００８３】
（行動実験）
恐怖条件付け実験及びモリスウォーターメイズ試験のいずれの結果においても、ベムラフェニブ又はＧｏ６９７６を投与されたＰＧＲＮ−ＫＩマウスは、投与されていないＰＧＲＮ−ＫＩマウスと比較して、認知反応が有意に向上した。他方、対照マウスにおいては、ベムラフェニブ又はＧｏ６９７６の有無にかかわらず、認知反応に変化は認められなかった。【００８４】
（スパインの形態分析）
各投与群のマウス（１２週齢時）の樹状突起の画像を、２光子励起顕微鏡を用いて取得した。さらに、スパインの数を「ＩＭＡＲＩＳ  ｓｏｆｔｗａｒｅ」（ＩＭＡＲＩＳ７．２．２、Ｂｉｔｐｌａｎｅ社製）を用いて計測した。ベムラフェニブ投与群の結果を図７に、Ｇｏ６９７６投与群の結果を図８に示す。【００８５】
図７及び８のとおり、ベムラフェニブ又はＧｏ６９７６を投与されたＰＧＲＮ−ＫＩマウスは、投与されていないＰＧＲＮ−ＫＩマウスと比較して、スパインの数が顕著に多く、対照マウスと同程度だった。他方、対照マウスにおいては、ベムラフェニブ又はＧｏ６９７６の有無にかかわらず、スパインの数に変化は認められなかった。このことは、ベムラフェニブ又はＧｏ６９７６の投与が、ＰＧＲＮ−ＫＩマウスのシナプスの変性を正常化させたことを意味する。
【図１】
2019146805.tif 000003
【図２】
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【図３】
2019146805.tif 000005
【図４】
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【図５】
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【図６】
2019146805.tif 000008
【図７】
2019146805.tif 000009
【図８】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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