(57)【要約】  安価な、腫瘍免疫治療薬を提供する。  テトラサイクリン系化合物及びその薬学的に許容される塩よりなる群から選択される少なくとも一種により、腫瘍免疫を賦活化することができる。
2019177011.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記一般式（Ｉ）で示されるテトラサイクリン系化合物及びその薬学的に許容される塩よりなる群から選択される少なくとも一種を含む、腫瘍免疫賦活化剤：
【化１】
2019177011.tif 000012
［式中、
Ｒ１は、下記一般式（ＩＩ）で示される基（Ｒ８は水素原子又は炭素数１〜３の低級アルキル基）、又は炭素数１〜３の低級アルキル基である：
【化２】
2019177011.tif 000013
。
Ｒ２は、下記一般式（ＩＩＩ）で示される基（Ｒ９は炭素数１〜３の低級アルキル基又は水素原子）である：
【化３】
2019177011.tif 000014
。
Ｒ３は、水素原子、水酸基、又は炭素数１〜３の低級アルキル基である。
Ｒ４及びＲ５は、共に又は独立して水素原子、水酸基又は炭素数１〜３の低級アルキル基であるか、Ｒ４及びＲ５は、１つになってメチレン基である。
Ｒ６は、水素原子、ハロゲン又は下記一般式（ＩＶ）で表される基（Ｒ１０は水素原子、又は炭素数１〜３の低級アルキル基）である：
【化４】
2019177011.tif 000015
。
Ｒ７は、水素原子、炭素数１〜３の低級アルキル基、−ＮＨ−ＣＯ−ＣＨ２−ＮＨ−Ｃ（ＣＨ３）３又は−ＣＨ２−ＮＨ−ＣＨ２−Ｃ（ＣＨ３）３である。］。
【請求項２】
前記炭素数１〜３の低級アルキル基がメチル基である、請求項１に記載の腫瘍免疫賦活化剤。
【請求項３】
前記一般式（Ｉ）で示される化合物が、デメチルクロルテトラサイクリン、メクロサイクリン、テトラサイクリン、クロルテトラサイクリン、ドキシサイクリン、ミノサイクリン、及びオキシテトラサイクリンよりなる群から選択される少なくとも一種である、請求項１に記載の腫瘍免疫賦活化剤。
【請求項４】
腫瘍免疫薬と併用するための、請求項１〜３のいずれか一項に記載の腫瘍免疫賦活化剤。
【請求項５】
前記腫瘍免疫薬が、免疫チェックポイント阻害薬、ＣＡＲ−Ｔ細胞薬、二重特異性分子薬、及びがんワクチンから選択される少なくとも一種である、請求項４に記載の腫瘍免疫賦活化剤。
【請求項６】
請求項１〜３のいずれか一項に記載の腫瘍免疫賦活化剤と、腫瘍免疫薬とを含む、腫瘍治療用組成物。
【請求項７】
前記腫瘍免疫薬が、免疫チェックポイント阻害薬、ＣＡＲ−Ｔ細胞薬、二重特異性分子薬、及びがんワクチンから選択される少なくとも一種である、請求項６に記載の腫瘍治療用組成物。 
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本明細書には、腫瘍免疫賦活化剤が開示される。
【背景技術】
【０００２】
現在、がん免疫療法として、抗ＰＤ−１抗体をはじめとする免疫チェックポイント阻害療法が実地臨床で用いられ、効果を発揮し、その有用性が示唆されている。
また、非特許文献１及び２には化学修飾型テトラサイクリンを腫瘍細胞に投与することで、腫瘍細胞の増殖が抑制され、細胞傷害が起こることが示されている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００３】
【非特許文献１】Anticancer Drugs 2013 Sep;24(8)799-809
【非特許文献２】Curr Med Chem 2001 Feb;8(3)271-279
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
しかし、免疫チェックポイント阻害剤で奏功するのは一部の患者群のみであり、奏功する患者を予測するバイオマーカーも開発途上である。さらに、免疫チェックポイント阻害剤は薬価が非常に高額であるという問題を抱えている。他のがん免疫療法として開発が進められているキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）遺伝子改変Ｔ細胞療法も非常に高額な治療法であり、その価格が実用化への障壁となっている。このような現状から安価でより多数のがん患者に有効な免疫療法の開発は、喫緊の課題である。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
このような状況から、本発明者らは、特許権の存続期間が満了した既存薬の中から、腫瘍免疫の賦活化に、テトラサイクリン系化合物が有効であることを見出した。【０００６】
本明細書に開示される発明は、当該知見に基づいて完成されたものであり、以下の態様を含む。
項１．下記一般式（Ｉ）で示されるテトラサイクリン系化合物及びその薬学的に許容される塩よりなる群から選択される少なくとも一種を含む、腫瘍免疫賦活化剤：
【化１】
2019177011.tif 000003
［式中、
Ｒ１は、下記一般式（ＩＩ）で示される基（Ｒ８は水素原子又は炭素数１〜３の低級アルキル基）、又は炭素数１〜３の低級アルキル基である：
【化２】
2019177011.tif 000004
。
Ｒ２は、下記一般式（ＩＩＩ）で示される基（Ｒ９は炭素数１〜３の低級アルキル基又は水素原子）である：
【化３】
2019177011.tif 000005
。
Ｒ３は、水素原子、水酸基、又は炭素数１〜３の低級アルキル基である。
Ｒ４及びＲ５は、共に又は独立して水素原子、水酸基又は炭素数１〜３の低級アルキル基であるか、Ｒ４及びＲ５は、１つになってメチレン基である。
Ｒ６は、水素原子、ハロゲン又は下記一般式（ＩＶ）で表される基（Ｒ１０は水素原子、又は炭素数１〜３の低級アルキル基）である：
【化４】
2019177011.tif 000006
。
Ｒ７は、水素原子、炭素数１〜３の低級アルキル基、−ＮＨ−ＣＯ−ＣＨ２−ＮＨ−Ｃ（ＣＨ３）３又は−ＣＨ２−ＮＨ−ＣＨ２−Ｃ（ＣＨ３）３である。］。
項２．前記炭素数１〜３の低級アルキル基がメチル基である、項１に記載の腫瘍免疫賦活化剤。
項３．前記一般式（Ｉ）で示される化合物が、デメチルクロルテトラサイクリン、メクロサイクリン、テトラサイクリン、クロルテトラサイクリン、ドキシサイクリン、ミノサイクリン、及びオキシテトラサイクリンよりなる群から選択される少なくとも一種である、項１に記載の腫瘍免疫賦活化剤。
項４．抗腫瘍薬と併用するための、項１〜３のいずれか一項に記載の腫瘍免疫賦活化剤。
項５．前記抗腫瘍薬が、腫瘍免疫薬、である、項４に記載の腫瘍免疫賦活化剤。
項６．前記腫瘍免疫薬が、免疫チェックポイント阻害薬、ＣＡＲ−Ｔ細胞薬、二重特異性分子薬、がんワクチンから選択される少なくとも一種である、項５に記載の腫瘍免疫賦活化剤。項７．項１〜３のいずれか一項に記載の腫瘍免疫賦活化剤と、腫瘍免疫薬とを含む、腫瘍治療用組成物。
項８．前記腫瘍免疫薬が、免疫チェックポイント阻害薬、ＣＡＲ−Ｔ細胞薬、二重特異性分子薬、がんワクチンから選択される少なくとも一種である、請求項７に記載の腫瘍治療用組成物。
【発明の効果】
【０００７】
テトラサイクリン系化合物により、腫瘍免疫を賦活化することができる。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】図１は、in vitroにおいてT細胞の抗腫瘍活性を評価するシステムの概要を示す。
【図２】図２は、被験薬のin vitroにおけるT細胞の抗腫瘍活性に対する効果を示す。 “BiTE”は、BiTEの単独添加を、 “BiTE＋DMC”は、BiTEとデメチルクロルテトラサイクリン（DMC）とを併用添加を示す。
【図３】図３は、被験薬のin vitroにおけるCD8＋T細胞の腫瘍細胞傷害活性に対する効果を示す。“BiTE”は、BiTEの単独添加を、 “BiTE＋DMC”は、BiTEとDMCとを併用添加を示す。
【図４】図４は、被験薬のin vitroにおけるグランザイムB発現CD8＋T細胞の存在比率に対する効果を示す。“BiTE”は、BiTEの単独添加を、 “BiTE＋DMC”は、BiTEとDMCとを併用添加を示す。
【図５】図５は、被験薬のin vitroにおけるCD8＋T細胞の増殖能に対する効果を示す。“BiTE”は、BiTEの単独添加を、 “BiTE＋DMC”は、BiTEとDMCとを併用添加を示す。
【図６】図６は、被験薬のin vitroにおけるCMV（サイトメガロウイルス）特異的細胞傷害性T細胞の誘導に対する効果を示す。Aは、CMV処理後７日目及び14日目のFACS解析のスキャッタグラムを示す。P7分画にCMV Tetramer+ 細胞が分画される。Bは、CMV処理後14日目のCMV Tetramer+ 細胞の存在比率を示す。
【図７】図７Aは、被験薬のin vitroにおける肺癌組織内T細胞の細胞傷害活性に対する効果を示す。図７Bは、被験薬のin vitroにおけるIFNγ産生CD8+T細胞の存在比率に対する効果を示す。図７Cは、FACS解析のスキャッタグラムを示す。P8分画にIFNγ産生CD8+T細胞が分画される。
【図８】図８Aは、被験薬の投与プロトコールを示す。図８Bは、腫瘍体積の変化を示す。図８Bにおいて、破線はVehicle群を、実線は被験薬投与群を示す。
【図９】デメチルクロルテトラサイクリンと抗PD-L1抗体の併用効果を示す。pは有意差を示す。
【図１０】デメチルクロルテトラサイクリンの免疫チェックポイント阻害剤の抗腫瘍作用の増強効果が、CD8+T細胞に依存していることを示す図である。pは有意差を示す。
【図１１】マウス末梢血中のがん抗原特異的CD8陽性T細胞の存在比率に対するデメチルクロルテトラサイクリンの効果を示す。pは有意差を示す。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
１．腫瘍免疫賦活化剤
本明細書において、腫瘍免疫賦活化剤は、テトラサイクリン系化合物又はその薬学的に許容される塩を有効成分として含む。
【００１０】
腫瘍の種類は、特に制限されない。良性腫瘍であっても悪性腫瘍であってもよい。好ましくは悪性腫瘍である。また、腫瘍には、上皮性腫瘍及び非上皮性腫瘍が含まれるが、好ましくは上皮性腫瘍である。本発明において、腫瘍として最も好ましくは、上皮性悪性腫瘍である。
【００１１】
悪性腫瘍としては、例えば、気管、気管支又は肺等から発生する呼吸器系悪性腫瘍；頭頸部癌；食道、胃、十二指腸、空腸、回腸、盲腸、虫垂、上行結腸、横行結腸、Ｓ状結腸、直腸又は肛門部等から発生する消化管系悪性腫瘍；肝臓癌；膵臓癌；膀胱、尿管又は腎臓から発生する泌尿器系悪性腫瘍；卵巣、卵管及び子宮等のから発生する女性生殖器系悪性腫瘍；乳癌：前立腺癌；皮膚癌；視床下部、下垂体、甲状腺、副甲状腺、副腎等の内分泌系悪性腫瘍；中枢神経系悪性腫瘍；骨軟部組織から発生する悪性腫瘍等の固形腫瘍、及び骨髄異形成症候群、急性リンパ性白血病、急性骨髄性白血病、慢性リンパ性白血病、慢性骨髄性白血病、急性骨髄単球性白血病、慢性骨髄単球性白血病、急性単球性白血病、慢性単球性白血病、急性全骨髄性白血病、急性巨核球性白血病、赤白血病、好酸球性白血病、慢性好酸球性白血病、慢性好中球性白血病、成人Ｔ細胞白血病、ヘアリー細胞白血病、形質細胞性白血病、多発性骨髄腫、悪性リンパ腫等の造血系悪性腫瘍；リンパ系悪性腫瘍等の造血器腫瘍が挙げられる。より好ましくは、肺癌（扁平上皮癌、小細胞癌、大細胞癌、腺癌）等の呼吸器系上皮性悪性腫瘍、悪性胸膜中皮腫；頭頸部癌；食道癌、胃癌、大腸癌（Ｓ状結腸癌、直腸癌等）等の消化管系上皮性悪性腫瘍；肝臓癌；膵臓癌；腎細胞癌；膀胱癌；悪性黒色腫；古典的ホジキンリンパ腫；卵巣癌；乳癌：前立腺癌；を挙げることができる。最も好ましくは、肺癌である。
【００１２】
腫瘍免疫は、Ｔ細胞の腫瘍細胞に対する傷害活性に基づく生体の対腫瘍反応であると考えられている。したがって、腫瘍免疫を賦活化するとは、Ｔ細胞の腫瘍細胞に対する細胞傷害活性を高めることであるともいえる。
【００１３】
本発明で使用するテトラサイクリン化合物は、非特許文献１及び２に記載されているような直接腫瘍細胞に対して増殖抑制作用や細胞傷害作用を示すことを意図するものではない。後述する実施例に示すように、Ｔ細胞の腫瘍細胞傷害活性を増強する作用を有するものである。
【００１４】
テトラサイクリン系化合物は、例えば下記一般式（Ｉ）で表される化合物を例示することができる。
【００１５】
【化５】
2019177011.tif 000007
［式中、
Ｒ１は、下記一般式（ＩＩ）で示される基（Ｒ８は水素原子又は炭素数１〜３の低級アルキル基）、又は炭素数１〜３の低級アルキル基である：
【化６】
2019177011.tif 000008
。
Ｒ２は、下記一般式（ＩＩＩ）で示される基（Ｒ９は炭素数１〜３の低級アルキル基又は水素原子）である：
【化７】
2019177011.tif 000009
。
Ｒ３は、水素原子、水酸基、又は炭素数１〜３の低級アルキル基である。
Ｒ４及びＲ５は、共に又は独立して水素原子、水酸基又は炭素数１〜３の低級アルキル基であるか、Ｒ４及びＲ５は、１つになってメチレン基である。
Ｒ６は、水素原子、ハロゲン又は下記一般式（ＩＶ）で表される基（Ｒ１０は水素原子、又は炭素数１〜３の低級アルキル基）である：
【化８】
2019177011.tif 000010
。
Ｒ７は、水素原子、炭素数１〜３の低級アルキル基、−ＮＨ−ＣＯ−ＣＨ２−ＮＨ−Ｃ（ＣＨ３）３又は−ＣＨ２−ＮＨ−ＣＨ２−Ｃ（ＣＨ３）３である。］。
【００１６】
炭素数１〜３の低級アルキル基としては、メチル基、エチル基、プロピル基、及びイソプロピル基を例示することができる。好ましくはメチル基、又はエチル基であり、より好ましくはメチル基である。
ハロゲンは、特に制限されない。例えば、塩素原子、フッ素原子、臭素原子、及びヨウ素原子等を挙げることができる。好ましくは、塩素原子である。
テトラサイクリン系化合物として、好ましくは下記表１に記載されたテトラサイクリン化合物よりなる群から選択される少なくとも一種である。
【００１７】
【表１】
2019177011.tif 000011
【００１８】
テトラサイクリン系化合物として、より好ましくはデメチルクロルテトラサイクリン、メクロサイクリン、テトラサイクリン、クロルテトラサイクリン、ドキシサイクリン、ミノサイクリン、及びオキシテトラサイクリンよりなる群から選択される少なくとも一種である。
【００１９】
本明細書に開示されるテトラサイクリン系化合物及びその塩は、公知である。したがって、テトラサイクリン系化合物及びその塩の製造方法も、公知である。
【００２０】
テトラサイクリン系化合物の塩は、薬学的に許容される塩である限り制限されない。例えば、塩は、アミン又は他の塩基性基を含むテトラサイクリン系化合物の酸塩は、テトラサイクリン系化合物を好適な有機又は無機酸と反応させ陰イオン塩を生じさせることにより製造することができる。陰イオン塩の例として、酢酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、安息香酸塩、重炭酸塩、重酒石酸塩、臭化物、エデト酸カルシウム、カンシル酸塩、炭酸塩、塩化物、クエン酸塩、二塩酸塩、エデト酸塩、エジシル酸塩、エストル酸塩（ｅｓｔｏｌａｔｅ）、エシル酸塩（ｅｓｙｌａｔｅ）、フマル酸塩、グルセプト酸塩、グルコン酸塩、グルタミン酸塩、グリコリルアルサニル酸塩（ｇｌｙｃｏｌｌｙｌａｒｓａｎｉｌａｔｅ）、ヘキシルレゾルシン酸塩、臭化水素酸塩、塩酸塩、ヒドロキシナフトエ酸塩、ヨウ化物、イセチオン酸塩、乳酸塩、ラクトビオン酸塩、リンゴ酸塩、マレイン酸塩、マンデル酸塩、メシル酸塩、硫酸メチル、ムチン酸塩（ｍｕｃａｔｅ）、ナプシル酸塩（ｎａｐｓｙｌａｔｅ）、硝酸塩、パモ酸塩、パントテン酸塩、リン酸塩／二リン酸塩、ポリガラクツロン酸塩、サリチル酸塩、ステアリン酸塩、塩基性酢酸塩、コハク酸塩、硫酸塩、タンニン酸塩、酒石酸塩、テオクル酸塩、トシル酸塩、及びトリエチオジド（ｔｒｉｅｔｈｉｏｄｉｄｅ）塩等が含まれる。塩として好ましくは、塩酸塩又は二塩酸塩である。
【００２１】
テトラサイクリン系化合物は、好適な塩基と反応させることによって陽イオン塩を生じさせることができる。陽イオン塩は、薬学的に許容できる陽イオンを与える塩基で作製されてもよく、アルカリ金属塩（特に、ナトリウムおよびカリウム）、アルカリ土類金属塩（特に、カルシウムおよびマグネシウム）、アルミニウム塩及びアンモニウム塩、並びにトリメチルアミン、トリエチルアミン、モルホリン、ピリジン、ピペリジン、ピコリン、ジシクロヘキシルアミン、Ｎ，Ｎ’−ジベンジルエチレンジアミン、２−ヒドロキシエチルアミン、ビス−（２−ヒドロキシエチル）アミン、トリ−（２−ヒドロキシエチル）アミン、プロカイン、ジベンジルピペリジン、デヒドロアビエチルアミン、Ｎ，Ｎ’−ビスデヒドロアビエチルアミン、グルカミン、Ｎ−メチルグルカミン、コリジン、キニーネ、キノリン、並びにリジン及びアルギニンなどの塩基性アミノ酸などの塩を含む。
【００２２】
腫瘍免疫賦活化剤は、テトラサイクリン系化合物又はその薬学的に許容される塩を含む。腫瘍免疫賦活化剤は、テトラサイクリン系化合物又はその薬学的に許容される塩と適当な担体又は添加剤とを組み合わせて調製してもよい。当該腫瘍免疫賦活化剤の調製に用いられる担体や添加剤としては、腫瘍免疫賦活化剤の剤形に応じて通常の薬剤に汎用される各種のもの、例えば賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、着色剤、矯味剤、矯臭剤、界面活性剤等を例示できる。
【００２３】
上記腫瘍免疫賦活化剤が経口投与されるものである場合の剤形は、特に制限されないが、錠剤、散剤、顆粒剤、カプセル剤（硬質カプセル剤及び軟質カプセル剤を含む）、液剤、丸剤、懸濁剤、及び乳剤等を例示できる。また上記腫瘍免疫賦活化剤が、非経口投与されるものである場合には、注射剤、点滴剤、坐剤、点鼻剤、及び経肺投与剤等を例示できる。
【００２４】
上記腫瘍免疫賦活化剤が、錠剤、散剤、顆粒剤、丸剤、カプセル剤等の経口用固形組成物である場合の調製に際しては、担体として例えば乳糖、白糖、塩化ナトリウム、ブドウ糖、尿素、デンプン、炭酸カルシウム、カオリン、結晶セルロース、ケイ酸、メチルセルロース、グリセリン、アルギン酸ナトリウム、アラビアゴム等の賦形剤；単シロップ、プドウ糖液、デンプン液、ゼラチン溶液、ポリビニルアルコール、ポリビニルエーテル、ポリビニルピロリドン、カルボキシメチルセルロース、セラック、メチルセルロース、エチルセルロース、水、エタノール、リン酸カリウム等の結合剤；乾燥デンプン、アルギン酸ナトリウム、カンテン末、ラミナラン末、炭酸水素ナトリウム、炭酸カルシウム、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル類、ラウリル硫酸ナトリウム、ステアリン酸モノグリセリド、デンプン、乳糖等の崩壊剤；白糖、ステアリン酸、カカオバター、水素添加油等の崩壊抑制剤；ラウリル硫酸ナトリウム等の吸収促進剤；グリセリン、デンプン等の保湿剤；デンプン、乳糖、カオリン、ベントナイト、コロイド状ケイ酸等の吸着剤；精製タルク、ステアリン酸塩、ホウ酸末、ポリエチレングリコール等の滑沢剤等を使用できる。更に錠剤は必要に応じ通常の剤皮を施した錠剤、例えば糖衣錠、ゼラチン被包錠、腸溶被錠、フイルムコーティング錠、二重錠、多層錠等とすることができる。
【００２５】
上記腫瘍免疫賦活化剤が、丸剤の経口用固形組成物である場合の調製に際しては、担体として、例えばブドウ糖、乳糖、デンプン、カカオ脂、硬化植物油、カオリン、タルク等の賦形剤；アラビアゴム末、トラガント末、ゼラチン等の結合剤；ラミナラン、カンテン等の崩壊剤等を使用できる。
【００２６】
上記腫瘍免疫賦活化剤が、カプセル剤の経口用固形組成物である場合の調製に際しては、カプセル剤は有効成分を上記で例示した各種の担体と混合し、硬質カプセル、又は軟質カプセル等に充填して調製される。
上記製剤が液剤の場合には、水性又は油性の懸濁液、溶液、シロップ、エリキシル剤であってもよく、通常の添加剤を用いて常法に従い、調製される。
【００２７】
上記腫瘍免疫賦活化剤が注射剤の場合の調製に際しては、担体として例えば水、エチルアルコール、マクロゴール、プロピレングリコール、エトキシ化イソステアリルアルコール、ポリオキシ化イソステアリルアルコール、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル類等の希釈剤；クエン酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、リン酸ナトリウム等のｐＨ調整剤；リン酸二カリウム、リン酸三ナトリウム、リン酸水素ナトリウム、クエン酸ナトリウム等の緩衝剤；ピロ亜硫酸ナトリウム、ＥＤＴＡ、チオグリコール酸、チオ乳酸等の安定化剤；凍結乾燥した際の成形剤として例えばマンニトール、イノシトール、マルトース、シュクロース、ラクトース等の糖類を使用できる。なお、この場合等張性の溶液を調整するに十分な量のブドウ糖或いはグリセリンを剤中に含有せしめてもよく、また通常の溶解補助剤、無痛化剤、局所麻酔剤等を添加しても良い。これらの担体を添加して、常法により皮下、筋肉内、静脈内用注射剤を製造することができる。
【００２８】
上記製剤が点滴剤の場合には、投与化合物を生理食塩水、リンゲル液等を基本とした等張電解質輸液製剤に溶解して調製することができる。
【００２９】
本発明における腫瘍免疫賦活化剤は、経口用組成物及び非経口用組成物のいずれであってもよいが、好ましくは経口用組成物である。
【００３０】
腫瘍免疫賦活化剤に含まれる、テトラサイクリン系化合物又はその薬学的に許容される塩は一種であっても複数種であってもよい。すなわち、腫瘍免疫賦活化剤は、テトラサイクリン系化合物及びその薬学的に許容される塩よりなる群から選択される少なくとも一種を含んでいればよい。
【００３１】
テトラサイクリン系化合物又はその薬学的に許容される塩の投与量は公知である。したがって、腫瘍免疫賦活化剤の投与量も、公知のテトラサイクリン系化合物の投与量から換算して決定することができる。例えば、テトラサイクリン系化合物又はその薬学的に許容される塩の投与量は、経口投与の場合、１日あたり０．１ｍｇ〜１，０００ｍｇ／ｋｇ（成人）、又は１日あたり０．０２ｍｇ〜１００ｍｇ／ｋｇ（小児）程度である。注射又は静脈点滴の場合、１日あたり０．１ｍｇ〜５００ｍｇ／ｋｇ（成人）、又は１日あたり０．０２ｍｇ〜５０ｍｇ／ｋｇ（小児）程度である。投与量は、年齢、症状、腫瘍の大きさ、他の薬剤の投与状況等に応じて適宜調整できる。テトラサイクリン系化合物及びその薬学的に許容される塩の二種以上を組み合わせて投与する場合には、テトラサイクリン系化合物又はその薬学的に許容される塩の合計量が上記投与量となることが好ましい。
【００３２】
テトラサイクリン系化合物又はその薬学的に許容される塩は、他の薬剤と併用してもよい。併用されうる他の薬剤は、特に制限されないが、好ましくは抗腫瘍薬である。
【００３３】
抗腫瘍薬として、例えば一般に抗がん剤と使用されるものを挙げることができ、アルキル化薬、代謝拮抗薬、抗腫瘍性抗生物質、微小血管阻害薬、ホルモン又はホルモン類似薬、白金製剤、トポイソメラーゼ阻害薬、サイトカイン、抗体薬、腫瘍免疫薬（放射免疫療法薬、非特異的免疫活薬、免疫チェックポイント阻害薬、ＣＡＲ−Ｔ細胞薬、ＢｉＴＥ薬、がんワクチン等）、分子標的薬、及びその他の抗腫瘍薬の中から、対象とする腫瘍に応じて適宜選択することができる。
【００３４】
ここで制限はされないものの、アルキル化薬としては、例えば、シクロホスファミド、イホスファミド、ブスルファン、メルファラン、ベンダムスチン塩酸塩、ニムスチン塩酸塩、ラニムスチン、ダガルバジン、プロカルバジン塩酸塩テモゾロミド等；代謝拮抗薬としては、メトトレキサート、ペメトレキセドナトリウム、フルオロウラシル、ドキシフルリジン、カペシタビン、テガフール、シタラビン、シタラビンオクホスファート水和物、エノシタビン、ゲムシタビン塩酸塩、メルカプトプリン水和物、フルダラビンリン酸エステル、ネララビン、ペントスタチン、クラドリビン、レボホリナートカルシウム、ホリナートカルシウム、ヒドロキシカルバミド、Ｌ−アスパラギナーゼ、アザシチジン等；抗腫瘍性抗生物質としては、ドキソルビシン塩酸塩、ダウノルビシン塩酸塩、ピラルビシン、エピルビシン塩酸塩、イダルビシン塩酸塩、アクラルビシン塩酸塩、アムルビシン塩酸塩、ミトキサントロン塩酸塩、マイトマイシンＣ、アクチノマイシンＤ、ブレオマイシン、ペプロマイシン硫酸塩、ジノスタチンスチラマー等；微小血管阻害薬としては、ビンクリスチン硫酸塩、ビンブラスチン硫酸塩、ビンデシン硫酸塩、ビノレルビン酒石酸塩、パクリタキセル、ドセタキセル水和物、エリブリンメシル酸塩等；ホルモン又はホルモン類似薬（ホルモン剤）としては、アナストロゾール、エキセメスタン、レトロゾール、タモキシフェンクエン酸塩、トレミフェンクエン酸塩、フルベストラント、フルタミド、ビカルタミド、メドロキシプロゲステロン酢酸エステル、エストラムスチンリン酸エステルナトリウム水和物、ゴセレリン酢酸塩、リュープロレリン酢酸塩等；白金製剤としては、シスプラチン、ミリプラチン水和物、カルボプラチン、ネダプラチン、オキサリプラチン等；トポイソメラーゼ阻害薬としては、イリノテカン塩酸塩水和物、及びノギテカン塩酸塩等のトポイソメラーゼＩ阻害薬、並びにエトポシド、及びソブゾキサン等のトポイソメラーゼＩＩ阻害薬；サイトカインとしては、インターフェロンガンマ−１ａ、テセロイキン、セルモロイキン等；抗体薬としては、トラスツズマブ、リツキシマブ、ゲムツズマブオゾガマイシン、ベバシズマブ、セツキシマブ、パニツムマブ、アレムツズマブ等；放射免疫療法薬としては、イブリツモマブ、チウキセタン配合剤等；分子標的薬としては、ゲフィチニブ、イマチニブメシル酸塩、ボルテゾミブ、エルロチニブ塩酸塩、ソラフェニブトシル酸塩、スニチニブリンゴ酸塩、サリドマイド、ニロチニブ塩酸塩水和物、ダサチニブ水和物、ラパチニブトシル酸塩水和物、エベロリムス、レナリドミド水和物、デキサメタゾン、テムシロリムス、ボリノスタット、トレチノイン、及びタミバロテン等；非特異的免疫活薬としては、ＯＫ−４３２、乾燥ＢＣＧ、かわらたけ多糖体製剤、レンチナン、ウベニメクス等；免疫チェックポイント阻害薬としては、アテゾリズマブ、ニボルマブ、ペンブロリズマブ、イピリムマブ、デュルバルマブ、アベルマブ、トレメリムマブ等；ＣＡＲ−Ｔ細胞薬としては、Ｔｉｓａｇｅｎｌｅｃｌｅｕｃｅｌ等；二重特異性分子薬としては、ブリナツモマブ等のＢｉＴＥ（商標）薬；がんワクチンとしては、シプリューセ−Ｔ等；その他、アセグラトン、ポルフィマーナトリウム、タラポルフィンナトリウム、エタノール、三酸化ヒ素等を例示することができる。ここで、二重特異性分子とは、一分子内に、腫瘍細胞に存在する少なくとも一種の表面抗原と結合する抗原結合領域と、Ｔ細胞に存在する表面抗原の少なくとも一種と結合する抗原結合領域とを有する分子を意図する。表面抗原の少なくとも一種と結合する抗原結合領域は、１つの抗原に対して、１つであっても２以上であってもよい。例えば、表面抗原の少なくとも一種と結合する抗原結合領域は、同種のＦａｂ領域の組み合わせ、同種の可変領域の組み合わせ、同種のｓｃ−Ｆｖの組み合わせ、１種の抗体に由来する重鎖Ｆａｂ領域と軽鎖Ｆａｂ領域の組み合わせ１種の抗体に由来する重鎖可変領域と軽鎖可変領域の組み合わせ、１種の抗体に由来する重鎖ｓｃ−Ｆｖの組み合わせであってもよい。Ｔ細胞の表面抗原は、Ｔ細胞の表面に存在し、二重特異性分子又は三重特異性分子に含まれる少なくとも一つの抗原結合領域が結合できる限り制限されない。Ｔ細胞の表面抗原として、好ましくは細胞障害性Ｔ細胞の表面抗原を挙げることができる。例えば、Ｔ細胞の表面抗原は、ＣＤ３、ＣＤ８、ＴＣＲ、ＣＴＬＡ−４、ＰＤ１、Ｔｉｍ３、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ４０、ＣＤ１３４（ＯＸ４０）、ＣＤ１３７（４−１ＢＢ）、ＣＤ２７８（ＩＣＯＳ）を挙げることができる。好ましくはＣＤ３である。腫瘍細胞の表面抗原は、腫瘍細胞の表面に存在し、二重特異性分子に含まれる少なくとも一つの抗原結合領域が結合できる限り制限されない。腫瘍細胞の表面抗原としては、ＥｐｈＡ１（ｅｐｈｒｉｎ  ｔｙｐｅ−Ａ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  １）、ＥｐｈＡ２、ＦｏｌＲ１（ｆｏｌａｔｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  １）、ＥｐＣＡＭ（Ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌ  ａｄｈｅｓｉｏｎ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ）、ＣＤ１９、Ｈｅｒ１  （ｖ−ｅｒｂ−ｂ２  ｅｒｙｔｈｒｏｂｌａｓｔｉｃ  ｌｅｕｋｅｍｉａ  ｖｉｒａｌ  ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ｈｏｍｏｌｏｇ  １：  ＥｒｂＢ１）、Ｈｅｒ２、ＣＤ２０、ＥＧＦＲ（Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ）、ＣＣＲ４（Ｃ−Ｃ  ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｔｙｐｅ  ４）、ＣＥＡ（Ｃａｒｃｉｎｏｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ａｎｔｉｇｅｎ）、ＧＤ２、ＧＤ３，ＣＤ２２、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ７０、ＣＤ１２３、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＭＵＣ１（Ｍｕｃｉｎ１）、ＰＳＣＡ（Ｐｒｏｓｔａｔｅ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ  ａｎｔｉｇｅｎ）、ＰＳＭＡ（Ｐｒｏｓｔａｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ａｎｔｉｇｅｎ）、ＨＬＡ−Ａ１＋ＮＹ−ＥＳＯ１（ＨＬＡ−Ａ１  ｒｅｓｔｒｉｃｔｅｄ  ＮＹ−ＥＳＯ１）、ＨＬＡ−Ａ２＋ＮＹ−ＥＳＯ１（ＨＬＡ−Ａ２  ｒｅｓｔｒｉｃｔｅｄ  ＮＹ−ＥＳＯ１）、ＨＬＡ−Ａ３＋ＮＹ−ＥＳＯ１（ＨＬＡ−Ａ３  ｒｅｓｔｒｉｃｔｅｄ  ＮＹ−ＥＳＯ１）等を挙げることができる。二重特異性分子には、ＢｉＴＥ（商標）、二重特異性抗体等が含まれる。ＢｉＴＥ（商標）としては、ＣＤ１９とＣＤ３を標的とする二重特異性分子、ＥｐｈＡ２とＣＤ３を標的とする二重特異性分子を挙げることができる。また二重特異性抗体としては、ＥｐＣＡＭとＣＤ３を標的とする抗体を挙げる��とができる。
【００３５】
テトラサイクリン系化合物の作用効果の点から、抗腫瘍薬として好ましくは腫瘍免疫療法薬を挙げることができ、より好ましくは免疫チェックポイント阻害薬、ＣＡＲ−Ｔ細胞薬、二重特異性分子薬、及びがんワクチンから選択される少なくとも一種を挙げることができる。腫瘍免疫薬のうち最も好ましくは、免疫チェックポイント阻害薬（アテゾリズマブ、ニボルマブ、ペンブロリズマブ、イピリムマブ、デュルバルマブ、アベルマブ、トレメリムマブ等）である。
【００３６】
抗腫瘍薬の投与は、公知の方法にしたがって行うことができる。また、抗腫瘍薬の投与量を決定するにあたり、後述する実施例１．末梢血単核細胞を用いた腫瘍細胞傷害活性の測定方法にしたがって、各患者について末梢血単核細胞のＴ細胞の腫瘍細胞傷害活性の強さを評価して、この強さに応じて投与量を決定してもよい。
【００３７】
本発明のテトラサイクリン系化合物又はその薬学的に許容される塩と抗腫瘍薬との併用（組み合わせ）の態様は、本発明の効果を奏する使用の態様であればよく、特に制限されない。例えば、抗腫瘍薬の投与と同時にテトラサイクリン系化合物又はその薬学的に許容される塩を並行して投与してもよいし、また抗腫瘍薬の投与に先立って、又は抗腫瘍薬の投与後にテトラサイクリン系化合物又はその薬学的に許容される塩を投与してもよい。この場合、テトラサイクリン系化合物又はその薬学的に許容される塩と抗腫瘍薬の投与を交互に行ってもよい。さらに、抗腫瘍薬投与後、腫瘍の組織の縮小度合い等に併せて、抗腫瘍薬投与の途中から、テトラサイクリン系化合物又はその薬学的に許容される塩を併用投与してもよいし、また逆に、テトラサイクリン系化合物又はその薬学的に許容される塩を投与後、その途中から抗腫瘍薬を併用投与してもよい。
【００３８】
また、本発明のテトラサイクリン系化合物又はその薬学的に許容される塩は、抗腫瘍薬と併用する態様であれば、単回投与、連続投与、また間歇的投与のいずれであってもよい。例えば、抗腫瘍薬の投与に先立って本発明のテトラサイクリン系化合物又はその薬学的に許容される塩を投与する場合を例にすれば、抗腫瘍薬の投与開始の７日前から、又は３日前から、１日１回連日、１４日間から２１日間程度、投与する方法を例示することができる。また、テトラサイクリン系化合物又は薬学的に許容される塩を抗腫瘍薬の投与クール中連日投与してもよい。
【００３９】
本発明のテトラサイクリン系化合物又は薬学的に許容される塩は、その投与経路（投与方法）に応じて、種々の形態（剤型）の医薬組成物として調製され、抗腫瘍薬と組み合わせて、対象とする腫瘍患者に投与される。
【００４０】
腫瘍免疫賦活剤の投与対象患者は、腫瘍免疫療法が適用されうる者である限り制限されない。例えば、患者としては、上記に記載のいずれかの腫瘍を有し、かつ未治療である患者、又は既に何らかの腫瘍治療を受けた患者、腫瘍の治療中の患者、腫瘍が再発又は転移している患者を挙げることができる。前記、腫瘍の治療には、好ましくは、外科的腫瘍切除、化学療法、放射療法等を含む。
【００４１】
２．腫瘍治療用組成物
腫瘍治療用組成物は、上記１．に記載の腫瘍免疫賦活剤と、抗腫瘍薬を含む。好ましくは抗腫瘍薬は、腫瘍免疫薬であり、より好ましくは腫瘍免疫薬は、免疫チェックポイント阻害薬、ＣＡＲ−Ｔ細胞薬、二重特異性分子薬、がんワクチンから選択される少なくとも一種である。投与量は、上記１．に記載の説明をここに援用する。
【００４２】
腫瘍免疫賦活剤と、抗腫瘍薬とを含む腫瘍治療用組成物には下記態様が含まれる：
（ｉ）腫瘍免疫賦活剤と抗腫瘍薬とが同一製剤中に混合された態様で含まれている状態（配合剤）である場合、
（ｉｉ）腫瘍免疫賦活剤単体若しくは腫瘍免疫賦活剤を含有する製剤と、抗腫瘍薬単体若しくは抗腫瘍薬を含有する製剤とが、おのおの別個の製剤として包装されており、両者が組み合わせ物（キット）として販売される場合、
（ｉｉｉ）腫瘍免疫賦活剤単体若しくは腫瘍免疫賦活剤を含有する製剤と、抗腫瘍薬単体若しくは抗腫瘍薬を含有する製剤とがおのおの個別の製剤であり、これらが組み合わせて一つの包装物として販売される場合、又は
（ｉｖ）腫瘍免疫賦活剤単体若しくは腫瘍免疫賦活剤を含有する製剤と、抗腫瘍薬単体若しくは抗腫瘍薬を含有する製剤とが、おのおの別個の製剤として包装されており、また両者は別個の流通経路で市場に存在し、使用時に組み合わせて使用される場合。
【００４３】
３．腫瘍の治療方法
本開示は、上述した腫瘍免疫賦活化剤、及び腫瘍治療用組成物を使用した腫瘍の治療方法を含む。腫瘍免疫賦活化剤、及び腫瘍治療用組成物の投与方法及び投与対象は、上記１．に記載の説明をここに援用する。
【実施例】
【００４４】
以下に実施例を示して本発明を具体的に説明するが、本発明は実施例に限定し解釈されるものではない。【００４５】
Ｉ．各実験プロトコール
１．末梢血単核細胞を用いた腫瘍細胞傷害活性の測定と各被験薬の評価
図１に示すように、in vitroにおいて、末梢血単核細胞群（Peripheral Blood Mononuclear Cells：PBMC）と、腫瘍細胞とを、BiTE（登録商標）等のエンゲージャーを介して接触させて培養した後に、PBMCによって腫瘍細胞がどのくらい傷害されたか（腫瘍細胞傷害活性）を測定することにより、PBMC中のT細胞の抗腫瘍活性を評価した。【００４６】
（１）U251細胞株を、10%FBSを添加したRPMI1640培地（10％FBS加RPMI1640培地）で培養した後、トリプシンで剥がし、1×105個/mLとなるように10%FBS加RPMI1640培地に懸濁し細胞懸濁液を調製した。前記細胞懸濁液を100μL/ウェルとなるように96ウェルプレートに播種し、５％炭酸ガスが存在する湿式インキュベータ内で、37℃で18時間インキュベーションした。【００４７】
（２）健常人から末梢血（ヘパリン採血）を採取し、LymphoprepTM （Alere Technologies AS）を使って、添付のプロトコールにしたがって、PBMCを回収した。具体的には、チューブに入れたLymphoprepTMに採取した末梢血をゆっくりと重層し、50分間400 gで遠心した後、リンパ球層を回収した。回収した溶液に10%FBS加RPMI1640培地を加えて遠心した後、上清を除去した。細胞のペレットを10%FBS加RPMI1640培地で懸濁して1×106/mLに調整した。前記PBMCの回収は、後述する（３）の工程の直前に行った。【００４８】
（３）１分子内にEphA2に対する抗原結合部位とCD3に対する抗原結合部位を有するEphA2-CD3 BiTE（登録商標）を10%FBS加RPMI1640培地で400 ng/mLとなるように調製した（「BiTE溶液」という）。また、各被験薬は、前記BiTE溶液で10μMとなるように調整した。（１）でインキュベーションが終わった96ウェルプレートに、1ウェルあたり、PBMC細胞懸濁液50μLと、各被験薬を含むBiTE溶液50μLとを添加した。BiTE終濃度は100ng/mL、各被験薬の終濃度は2.5μMとなるようにした。コントロールとして、（１）でインキュベーションが終わった96ウェルプレート内にPBMC細胞懸濁液50μLと、被験薬を含まないBiTE溶液50μLとを添加するウェルと、（１）でインキュベーションが終わった96ウェルプレート内にPBMC細胞懸濁液50μLと、10%FBS加RPMI1640培地50μLとを添加するウェルを準備した。1ウェルあたりの10%FBS加RPMI培地の量は、最終的に総量が200μLとなるようにした。PBMCとEphA2-CD3 BiTE（登録商標）とを添加した後、又はPBMCとEphA2-CD3 BiTE（登録商標）と被験薬とを添加した後の96ウェルプレートを、37℃で48時間インキュベーションした。【００４９】
（４）インキュベーション終了後、各ウェルの培地をPBMCとともに回収した。さらに各ウェルに10%FBS加RPMI培地を200μL加えウェル内を洗浄し、洗浄に使用した培地を回収した。この操作を3回繰り返しウェル内を３回洗浄した。この時、最初に回収した培地と洗浄の際に回収した培地はウェルごとに１つのチューブにまとめた。洗浄後培地とPBMCが除去された各ウェルに、100μLの10%FBS加RPMI培地と20μLのCellTiter 96（登録商標） AQueous One Solution Reagent （MTS reagent：プロメガ）を添加した。その後、96ウェルマイクロプレートを５％炭酸ガスが存在する湿式インキュベータ内で、30分〜１時間程度、37℃でインキュベーションした。【００５０】
（５）（４）でインキュベーションが終了した96ウェルマイクロプレートについて、マイクロプレートリーダを使って各ウェルの492 nmにおける吸光度を測定した。続いて、下式にしたがって、腫瘍細胞傷害活性を算出した。【００５１】
U251細胞株とPBMCのみを含むウェルの吸光度=A
U251細胞株とPBMCとEphA2-CD3 BiTE（登録商標）とを含むウェル、又はU251細胞株とPBMCとEphA2-CD3 BiTE（登録商標）と被験薬とを含むウェルの吸光度=B    腫瘍細胞傷害活性 （%）=[（A−B）/A]×100  【００５２】
２． Granzyme B染色
上記１．（４）において回収した培地を400 gで5分間遠心し、上清を除去しPBMCのペレットを残した。2%FBSおよび10mM HEPES加HBSS培地（以下、「HBSS+2%FBS+10mM HEPES」培地とする）でそれぞれの抗体（CD3、CD4、CD8、CD45RA）を100倍希釈し、これらの抗体希釈液を上清が除去されたペレットへ30μL/tubeずつ加えて4℃で30分間インキュベーションした。HBSS+2%FBS+10mM HEPES培地を200μL/tubeずつ加えて400 gで5分間遠心した後、上清を除去しペレットを残した。Fix bufferを100μL/tubeずつ加えて残ったPBMCを懸濁した後、4℃で30分間インキュベーションした。【００５３】
インキュベーションが終わったチューブを400 gで5分間遠心して上清を除去し、PBMCのペレットを残した。Wash bufferを200μL/tubeずつ加えてペレットを懸濁した後、400 gで5分間遠心して上清を除去し、PBMCのペレットを残した。Wash bufferで抗Granzyme B抗体を100倍希釈し、この抗体希釈液30μL/tubeで残ったPBMCを懸濁して4℃で30分間インキュベーションした。Wash bufferを200μL/tubeずつ加えて、400 gで5分間遠心し上清を除去し、PBMCのペレットを残した。HBSS+2%FBS+10mM HEPES培地で残ったPBMCを懸濁し、懸濁液をFACS解析に供した。【００５４】
３．CytoTellアッセイ
上記１．（１）の方法にしたがって、健常人末梢血からPBMCを回収した。回収したPBMCのペレットに、HBSS+2%FBS+10mM HEPES培地にCytoTell redを混合した溶液を加えて、37℃で30分間インキュベーションした。インキュベーション終了後、400 gで5分間遠心し、上清を除去しPBMCのペレットを残した。10%FBS加RPMI培地を加えて残ったPBMCを懸濁し、1×106/mLのPBMC細胞懸濁液を調整した。【００５５】
上記１．（３）と同様にU251細胞株とPBMCとBiTE、又はU251細胞株とPBMCとBiTEと被験薬とを接触させ、37℃で96時間培養した。【００５６】
培養終了後、培養上清を回収し、さらに10%FBS加RPMI1640培地で3回洗浄した、その培地も回収した。この時、最初に回収した培地と洗浄の際に回収した培地はウェルごとに１つのチューブにまとめた。【００５７】
回収した培地を400 gで5分間遠心し上清を除去し、PBMCのペレットを残した。HBSS+2%FBS+10mM HEPES培地でそれぞれの抗体（CD3、CD4、CD8、CD45RA）を100倍希釈し、これらの抗体液をペレットに30μL/tubeで添加し残ったPBMCを懸濁し、4℃で30分間インキュベーションした。【００５８】
インキュベーションが終わったチューブに、HBSS+2%FBS+10mM HEPES培地を200μL/tubeずつ加えて400 gで5分間遠心した後、上清を除去し、PBMCのペレットを残した。HBSS+2%FBS+10mM HEPES培地で残ったPBMCを懸濁し、懸濁液をFACS解析に供した。【００５９】
４．CMV特異的CTL誘導（Mixed CMV peptide/Lymphocytes culture）
HLAタイプが24:02の健常人のPBMCに10%FBS加RPMI培地で10μg/mLに調整したCMV peptideを加えて96 well plateで3日間培養した。10μg/mL CMV peptide + 20U/mL IL-2±2.5μM デメチルクロルテトラサイクリン（DMC）を含む10%FBS加RPMI培地に培地を交換し、さらに4日間培養した（７日間培養）。PBMCを含む各wellの培地を24 well plateに移してscale upした後、10μg/mL peptide+20U/mL IL-2±2.5μM DMCを含む10%FBS加RPMI培地でさらに3日間培養した。10μg/mL peptide+20U/mL IL-2±2.5μM DMCを含む10%FBS加RPMI培地に培地を交換し、さらに4日間培養した（14日間培養）。【００６０】
培養終了後、400 gで5分間遠心して上清を除去してPBMCのペレットを残し、HBSS+2%FBS+10mM HEPES培地でそれぞれの抗体（CD3、CD4、CD8）を100倍希釈 及びCMV Tetramerを10倍希釈）してPBMCのペレットペレットに30μL/tubeで加えPBMCを懸濁し、4℃で30分間インキュベーションした。HBSS+2%FBS+10mM HEPES培地を200μL/tubeずつ加えて400 gで5分間遠心し、上清を除去しPBMCのペレットを残した。【００６１】
HBSS+2%FBS+10mM HEPES培地で残ったPBMCを懸濁し、懸濁液をFACS解析に供した。【００６２】
５．肺癌組織内T細胞の採取
肺癌組織内のT細胞の腫瘍細胞傷害活性は、以下の方法にしたがって肺癌組織から細胞を回収した。腫瘍細胞傷害活性は、その細胞群の活性として測定した。【００６３】
癌組織を6 cm Dishに移して細断した後、組織攪拌溶液（HBSS + 2% FBS + 10mM HEPESにTumor Dissociation Kit （Miltenyi Biotec）を添加）に入れてgentleMACSTM Dissociator （Miltenyi Biotec）で攪拌後、37℃で維持したインキュベータ内で30分回転させながらインキュベーションした。その後、細胞を含む攪拌液を70 μmメッシュを通して、組織残渣を取り除き、濾液を600xg、10分遠心して沈殿物を回収した。細胞を含む沈殿物にBD Pharm lyse （BD Biosciences）を添加して2分間静置した。静置後の細胞を含む溶解液にHBSS Bufferを加えて600xg、10分遠心し、再度沈殿物を回収した。再回収された沈殿物に30% パーコール液を加えて12000xg、30秒遠心し、再度沈殿物を回収した。再回収された沈殿物をHBSS Bufferで洗浄し、12000xg、30秒遠心して組織内の細胞を回収した。回収された細胞の腫瘍細胞傷害活性は、上記Ｉ．１．（１）〜（５）と同様の方法で測定した。BiTEとしてCD3に結合するものを使用していることから、この肺癌組織内から回収された細胞の腫瘍細胞傷害活性は、肺癌組織内Ｔ細胞の腫瘍細胞傷害活性であると考えられる。【００６４】
６．IFNγ産生アッセイ
上記５．において上記１．（４）に準じて回収した全ての培地内の細胞について、IFNγ産生能を、IFN-γSecretion Assayキット（Miltenyi Biotec）を用いて測定した。【００６５】
上記１．（４）において回収した培地を400 gで5分間遠心し、上清を除去した。残ったPBMCのペレットに、10%ヒト血清加AIM培地で100倍希釈したIFNγ Catch Reagentを100μL/tubeずつ添加し、PBMCを懸濁した後4℃で10分間インキュベーションした。【００６６】
インキュベーションが終わったチューブに、37℃に温めた10%ヒト血清加AIM培地を1mL/tubeずつ分注し、チューブを攪拌しながら37℃下で45分間インキュベーションした。インキュベーション終了後、再度氷上で冷却した後、400×g、5分遠心して上清を除去しPBMCのペレットを残した。【００６７】
HBSS+2%FBS+10mM HEPES培地で残ったPBMCを懸濁し、各サンプルを２つに分けた（片方はisotype染色用）後、再度400 gで5分間遠心して上清を除去しペレットを残した。【００６８】
HBSS+2%FBS+10mM HEPES培地でそれぞれの抗体（CD3、CD4、CD8、CD45RA）を100倍希釈及び抗i-IFNγ抗体を10倍希釈し、これらの抗体希釈液を残ったPBMCへ30μL/tubeずつ加えてPBMCを懸濁し、4℃で30分間インキュベーションした。【００６９】
インキュベーションが終わったチューブにHBSS+2%FBS+10mM HEPES培地を200μL/tubeずつ加えて400gで5分間遠心した後、上清を除去し、再度HBSS+2%FBS+10mM HEPES培地で残ったPBMCを懸濁し、懸濁液をFACS解析に供した。【００７０】
７．in vivoにおける腫瘍細胞増殖抑制作用の検証
接種の5日前にCT26WT細胞を解凍し、DMEM+10%FBS+1% penicillin/streptomycin培地で培養した。腫瘍細胞接種2日前にCT26WT細胞をトリプシン処理し継代した。【００７１】
BALB/cマウスの右背側の毛をトリミングした後、CT26WT細胞を2×105cells/匹ずつ皮内接種した。腫瘍細胞接種後6日目にマウスの体重及び腫瘍径を測定し、それらが均一になるように被検薬投与群とVehicle群（各n=9）とに群分けした。被検薬投与群には、被験薬を生理食塩水で溶解し3.0 mg/mLに調整し、200μL/匹ずつ30mg/kg/dayとなるように腹腔内へ投与した。Vehicle群は生理食塩水のみを200μL/匹ずつ腹腔内へ投与した。被験薬又は生理食塩水の投与は10日間連日行った（図８A）。 腫瘍細胞投与後10日、13日、16日に腫瘍径を測定した。【００７２】
II．実施例１：テトラサイクリン系化合物のT細胞抗腫瘍活性の賦活化作用の検証
上記Ｉ．１．で述べた方法にしたがって、被験薬として、デメチルクロルテトラサイクリン（DMC）、メクロサイクリン（MC）、テトラサイクリン（TC）、及びクロルテトラサイクリン（CTC）、ミノサイクリン（MINO）を用い、T細胞抗腫瘍活性の賦活化作用を検証した。ｎはそれぞれ３（独立した健常人）として、BiTE単独添加群とBiTEと被験薬併用群の差をｔ検定により算出した。その結果を図２に示す。【００７３】
BiTEと被験薬併用群では、DMC、MC、TC、CTC及びMINO全てにおいて、BiTEを単独で添加した場合と比較してT細胞の抗腫瘍活性が増強していた（DMC、MC及びCTC：p<0.01、TC及びMINO：p<0.05）。このことから、テトラサイクリン系化合物には、T細胞抗腫瘍活性を賦活化する作用があることが明らかとなった。【００７４】
III．実施例２：テトラサイクリン系化合物によるCD8＋T細胞の腫瘍細胞傷害活性の増強作用の検証
上記Ｉ．１．で述べた方法にしたがって、被験薬として、デメクロサイクリン（DMC：終濃度2.5μM）を用い、３名の健常人から採取したそれぞれのPBMC中のCD8陽性T細胞（CD8+T細胞）の腫瘍細胞傷害活性に対するテトラサイクリン系化合物の効果を検証した。CD8+T細胞はCD8+T cell Isolation Kit (Miltenyi Biotec) でネガティブセレクションした。図3に示すように、BiTEを単独で添加したCD8＋T細胞と比較してBiTEと被験薬とを併用添加したCD8＋T細胞では、腫瘍細胞傷害活性が高くなっていた（p=0.05）。このことからテトラサイクリン系化合物には、CD8＋T細胞の腫瘍細胞傷害活性を増強する作用があることが示唆された。【００７５】
IV．実施例３：テトラサイクリン系化合物によるグランザイムB発現CD8＋T細胞の存在比率の増加の検証
上記Ｉ．２．で述べた方法にしたがって、被験薬として、デメチルクロルテトラサイクリン（DMC：終濃度2.5μM）を用い、４名の健常人から採取したそれぞれのPBMC中のグランザイムB発現CD8＋T細胞の存在比率に対するテトラサイクリン系化合物の効果を検証した。図４に示すように、BiTEを単独で添加したPBMCと比較してBiTEと被験薬との両方を添加したPBMCでは、グランザイムB発現CD8＋T細胞の存在比率が高くなっていた（p=0.01）。このことからテトラサイクリン系化合物は、グランザイムB発現CD8＋T細胞を増やすことが示唆された。【００７６】
V．実施例４： テトラサイクリン系化合物によるCD8＋T細胞の増殖能亢進の検証
上記Ｉ．３．で述べた方法にしたがって、被験薬として、デメチルクロルテトラサイクリン（DMC：終濃度2.5μM）を用い、５名の健常人から採取したそれぞれのPBMC中のCD8＋T細胞の増殖能に対するに対するテトラサイクリン系化合物の効果を検証した。図５に示すように、BiTEを単独で添加したPBMCと比較してBiTEと被験薬とを併用添加したPBMCでは、CD8＋T細胞の増殖能が高くなっていた（p=0.007）。このことからテトラサイクリン系化合物は、腫瘍細胞傷害活性を示すCD8＋T細胞の増殖能を高めることが示唆された。【００７７】
VI．実施例５：テトラサイクリン系化合物によるCMV特異的細胞傷害性T細胞の誘導亢進効果の検証
上記Ｉ．４．で述べた方法にしたがって、PBMCをCMV抗原で刺激してCMV特異的細胞傷害性T細胞を誘導する際の、テトラサイクリン系化合物の効果を検証した。被験薬として、デメチルクロルテトラサイクリン（DMC：終濃度2.5μM）を用いた。PMBCは、１名の健常人から採取した。CMV特異的細胞傷害性T細胞はFACS解析で同定した。図６Aに示すように、CMV特異的細胞傷害性T細胞を誘導抗原で刺激後７日目ではまだCMV特異的細胞傷害性T細胞（図６A中の区画P7に分画される）の誘導は認められないが、14日目では、CMV特異的細胞傷害性T細胞の誘導が認められた。DMCを添加しなかった群（DMC−）とDMCを添加した群（DMC＋）を比較すると、DMC＋では、DMC−と比較して有意にCMV特異的細胞傷害性T細胞（CMV Tetramer+ CD8+T cells）の存在比率が高くなった（図６B；p<0.05）。このことからテトラサイクリン系化合物は、抗原特異的T細胞の増殖能を高めることが示唆された。【００７８】
VII．実施例６：テトラサイクリン系化合物による肺癌組織内T細胞の腫瘍細胞傷害活性の増強効果の検証
上記Ｉ．５．で述べた方法にしたがって、肺癌患者の腫瘍組織内のT細胞を採取し、その細胞を用いて、腫瘍細胞傷害活性を測定し、テトラサイクリン系化合物の効果を検証した。また、上記Ｉ．５．で述べた方法にしたがって、肺癌患者の腫瘍組織内のT細胞を採取し、上記Ｉ．６．で述べた方法にしたがって、IFNγ産生CD8+T細胞の存在比率を測定し、テトラサイクリン系化合物の効果を検証した。【００７９】
被験薬として、デメチルクロルテトラサイクリン（DMC）を用い、ｎは、細胞傷害活性測定は５（独立した患者）、IFNγ産生CD8+T細胞の存在比率測定は３（独立した患者）とした。【００８０】
BiTEと被験薬併用群では、BiTEを単独で添加した場合と比較してT細胞の抗腫瘍活性が増強していた（図７A）。【００８１】
BiTEと被験薬併用群では、BiTEを単独で添加した場合と比較してIFNγ産生CD8+T細胞の存在比率が高くなった（図７B、C）。このことからテトラサイクリン系化合物は、IFNγ産生CD8+T細胞を増やすことが示唆された。【００８２】
VIII．実施例７：in vivoにおけるテトラサイクリン系化合物の効果
上記７．で述べた方法にしたがって、テトラサイクリン系化合物のin vivoにおける腫瘍増殖の抑制効果を検証した。Vehicle群と比較して、被検薬投与群では、腫瘍径の増加が抑制される傾向にあった（図８B）。【００８３】
以上の結果から、テトラサイクリン系化合物には、T細胞の抗腫瘍作用を賦活化する効果があることが示された。【００８４】
VIII．実施例８：in vivoにおけるテトラサイクリン系化合物と抗PD-L1抗体の併用効果の検証
in vivoにおいてテトラサイクリン系化合物が免疫チェックポイント阻害薬の抗腫瘍効果を増強できることを検証した。【００８５】
１．方法
接種する6日前にCT26WT細胞を解凍し、10%FBS及び1% penicillin/streptomycin を添加したDMEM培地で培養した。腫瘍に投与2日前にCT26WT細胞をトリプシン処理して継代した。
Balb/c 6週齢 マウスの右背側の毛をトリミングした後、3×105 cells/50μL/匹ずつトリミングした箇所の皮内に接種した（Day 0）。Day 6にマウスの体重及び腫瘍径を測定し、それらが均一になるように9匹ずつ5群に分けた。抗PD-L1抗体として、BioXCell社のInVivoMAb anti-mouse PD-L1を使用した。【００８６】
各群の内訳は、以下の通りである。
コントロールIgGと水を投与する群（コントロールIgG＋H2O群）
抗PD-L1抗体と水を投与する群（aPD-L1＋H2O群）
抗PD-L1抗体とDMC(300 mg/kg)を投与する群（aPD-L1＋DMC(300 mg/kg)群）
抗PD-L1抗体とDMC(100 mg/kg)を投与する群（aPD-L1＋DMC(100 mg/kg)群）
抗PD-L1抗体とDMC(30 mg/kg)を投与する群（aPD-L1＋DMC(30 mg/kg)群）【００８７】
はじめにDay 7よりDMCの投与を開始した。DMCは生理食塩水で溶解した後、200μl/匹ずつ経口ゾンデを用いて経口投与した。DMC非投与群は蒸留水を200μL/匹ずつ経口投与した。DMCの投与は、Day 7〜Day 12まで1日1回連日行った。【００８８】
次にDay 10に、抗PD-L1抗体、又はコントロールIgGを200μg/200μL/匹で腹腔内へ投与した。
Day 10、Day 13に腫瘍径を測定した。腫瘍体積は、（短径2×長径）/2の式により算出した。【００８９】
２．結果
図９に測定結果を示す。コントロールIgG＋H2O群では、DMC投与開始時に40 mm3程度であった腫瘍体積が160 mm3程度まで増加した。これに対してaPD-L1＋H2O群の腫瘍体積は90 mm3程度にとどまった。さらに、DMCをあらかじめ投与した群では、いずれもaPD-L1＋H2O群よりも腫瘍体積の増加の抑制が認められた。特にaPD-L1＋DMC(30 mg/kg)群では、より腫瘍体積の増加の抑制効果が認められた。
このことから、テトラサイクリン系化合物の投与は、免疫チェックポイント阻害薬の抗腫瘍効果を増強させることが示された。【００９０】
IX．実施例９：in vivoにおけるテトラサイクリン系化合物による抗PD-L1抗体の抗腫瘍作用の増強効果がCD8+T細胞に依存していることの検証
in vivoにおいてテトラサイクリン系化合物が示した免疫チェックポイント阻害薬の抗腫瘍作用の増強効果が、CD8+T細胞の抗腫瘍作用に依存しているか否かを検証するため、CD8+T細胞の存在下及び非存在下でテトラサイクリン系化合物が免疫チェックポイント阻害薬の抗腫瘍作用に及ぼす影響を検討した。【００９１】
１．方法
実施例８と同様にCT26WT細胞を培養し、Balb/c 6週齢 マウスの皮下に接種した（Day 0）。Day 6にマウスの体重及び腫瘍径を測定し、それらが均一になるように９匹ずつ6群に分けた。
コントロールIgGと水を投与する群（IgG＋H2O群）
抗PD-L1抗体と水を投与する群（aPD-L1＋H2O群）
抗PD-L1抗体と水と抗CD8抗体を投与する群（aPD-L1＋H2O＋CD 8depletion群）
抗PD-L1抗体とDMC(30 mg/kg)と抗CD8抗体を投与する群（aPD-L1＋DMC＋CD8 depletion群）
コントロールIgGとDMC(30 mg/kg)を投与する群（IgG＋DMC群）
抗PD-L1抗体とDMC(30 mg/kg)を投与する群（aPD-L1＋DMC群）【００９２】
DMC又は水及び抗PD-L1抗体の投与に先立って、Day 6で、CD8 depletion群には抗CD8抗体（InVivoMAb anti-mouse CD8α、BioXCell社）400μg/200μL/匹を腹腔内投与した。それ以外の群にはコントロールIgG 400μg/200μL/匹を投与した。【００９３】
次に、Day 7よりDMCの投与を開始した。DMCは生理食塩水で溶解した後，200μL/匹ずつ経口ゾンデを用いて経口投与した。DMC非投与群は蒸留水を200μL/匹ずつ経口投与した。DMCの投与は、Day 7〜Day 12まで1日1回連日行った。【００９４】
次にDay 10に、抗PD-L1抗体、又はコントロールIgGを200μg/200μL/匹で腹腔内へ投与した。
Day 10、Day 13に腫瘍径を測定した。腫瘍体積は、実施例８と同様に算出した。【００９５】
２．結果
図１０に結果を示す。IgG＋H2O群ではDay 13における腫瘍体積は150 mm3程度であった。これに対して、Day 13におけるaPD-L1＋H2O群の腫瘍体積は120 mm3程度であった。また、IgG＋DMC群では腫瘍体積の増加がaPD-L1＋H2O群よりも抑制され、Day 13における腫瘍体積は100 mm3程度であった。さらに、aPD-L1＋DMC群ではDay 13における腫瘍体積は80 mm3程度であった。これに対して、抗CD8抗体を投与すると腫瘍体積の増加速度がIgG＋H2O群よりも加速し、aPD-L1＋H2O＋CD 8 depletion群及びaPD-L1＋DMC＋CD8 depletion群では、Day 10でIgG＋H2O群よりも腫瘍体積が増加していた。さらに腫瘍体積は、Day 13において、aPD-L1＋H2O＋CD 8 depletion群及びaPD-L1＋DMC＋CD8 depletion群とも300 mm3前後となり、抗PD-L1抗体又は抗PD-L1抗体及びデメチルクロルテトラサイクリンが存在していても、腫瘍体積の増加が加速していた。Day 13において、aPD-L1＋DMC群ではaPD-L1＋H2O群に比べ有意に腫瘍体積の減少が認められたのに対し、aPD-L1＋DMC＋CD 8depletion群及びaPD-L1＋H2O＋CD8 depletion群の腫瘍体積に有意な差は認められなかった。【００９６】
このことから、テトラサイクリン系化合物の免疫チェックポイント阻害薬の抗腫瘍作用の増強効果はCD8+T細胞に依存していることが示された。
X．実施例１０：in vivoにおけるテトラサイクリン系化合物によるがん抗原特異的CD8＋T細胞に対する効果の検証
免疫チェックポイント阻害薬に対するテトラサイクリン系化合物の抗腫瘍作用増強効果により、in vivoにおいてがん抗原特異的CD8＋T細胞が増加するか否かを検証した。【００９７】
１．方法
実施例９のIgG＋H2O群、aPD-L1＋H2O群、aPD-L1＋DMC群のマウスの眼底からDay 13に血液を採取した。採取した血液が入っているチューブにPharmlyseを1 ml加えて赤血球を溶血させ、遠心後、上清を除去した。沈渣を含むチューブに２％FBSと10mM HEPESを添加したHBSS培地（以下、「HBSS+２％FBS+10mM HEPES」という）を加えて沈渣を懸濁してから、再度遠心し上清を除去した。沈渣を含むチューブにgp70 Tetramer[T-Select H-2Ld MuLV gp70 Tetramer-SPSYVYHQF-PE、MBL社]を加え4℃で30分間反応させた。コントロールとして沈渣を含むチューブにβ-galactosidase Tetramer [T-Select H-2Ld β-galactosidase Tetramer-TPHPARIGL-PE、MBL社]を加え4℃で30分間反応させた。反応終了後のチューブにHBSS+２％FBS+10mM HEPESを加え混合した。再度チューブを遠心し、上清を除去した。チューブ内に抗CD8抗体を添加し、染色後、細胞を洗浄してFACS測定に供し、gp70 TetramerとCD8が陽性の細胞を計数した。【００９８】
２．結果
計数結果を図１１に示す。IgG＋H2O群と比較して、aPD-L1＋DMC群では、がん抗原特異的CD8+細胞の存在比率が増加していた。このことから、テトラサイクリン系化合物は、免疫チェックポイント阻害薬の抗腫瘍作用を増強させる際に、がん抗原特異的CD8＋T細胞を増加させることが明らかとなった。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【国際調査報告】
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