(57)【要約】【課題】  Ｏ結合型糖ペプチド・糖アミノ酸を工業的規模で簡便かつ収率よく製造する方法を提供すること。【解決手段】  ホエイプロテインから下記式１で表されるＯ結合型糖鎖を含む糖ペプチド・糖アミノ酸を製造する方法であって、次のA〜E工程を含むＯ結合型糖ペプチド・糖アミノ酸の製造方法。A  ホエイプロテインからプロテオースペプトン画分を抽出する工程、B  前記抽出物をプロテアーゼ酵素によって分解する工程、C  前記分解物を水溶性有機溶媒に添加してＯ結合型糖ペプチド・糖アミノ酸を沈殿させる工程、D  沈殿させたＯ結合型糖ペプチド・糖アミノ酸の濃縮工程E  濃縮工程で得た濃縮物を順相カラム及び/又は逆相カラムにより精製する工程。【選択図】  図１
2020090357.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ホエイプロテインから下記式１で表されるＯ結合型糖鎖を含む糖ペプチド・糖アミノ酸を製造する方法であって、次のA〜E工程を含むＯ結合型糖ペプチド・糖アミノ酸の製造方法。
A  ホエイプロテインからプロテオースペプトン画分を抽出する工程、
B  前記抽出物をプロテアーゼ酵素によって分解する工程、
C  前記分解物を水溶性有機溶媒に添加してＯ結合型糖ペプチド・糖アミノ酸を沈殿させる工程、
D  沈殿させたＯ結合型糖ペプチド・糖アミノ酸の濃縮工程
E  濃縮工程で得た濃縮物を順相カラム及び/又は逆相カラムにより精製する工程
式１：
【化１５】
2020090357.tif 000018
（式中、Xは、糖又は糖鎖。Yは、糖又は糖鎖）
【請求項２】
前記ホエイプロテインが、ホエイを粉末化したホエイパウダー、ホエイプロテインを濃縮したホエイプロテインコンセントレイト（ＷＰＣ）、ホエイプロテインアイソレイト（ＷＰＩ）である請求項１に記載の製造方法。
【請求項３】
前記プロテアーゼ酵素が、トリプシンである請求項１に記載の製造方法。
【請求項４】
前記水溶性有機溶媒が、メタノール、エタノール、アセトン、アセトニトリルから選択される少なくとも１種類を含有する請求項１に記載の製造方法。
【請求項５】
前記濃縮工程が、前記沈殿物をセファロース樹脂へ保持し、有機溶媒を含む水溶液で洗浄し、溶出させる事によって、Ｏ結合型糖ペプチド・糖アミノ酸を濃縮する工程である請求項１に記載の製造方法。
【請求項６】
前記順相カラムがアミド基で表面を修飾された化学結合型シリカを充填されたカラムである請求項１に記載の製造方法。
【請求項７】
前記逆相カラムがオクタデシルシリル基で表面を修飾された化学結合型シリカを充填されたカラムである請求項１に記載の製造方法。
【請求項８】
前記Ｏ結合型糖鎖が下記式２〜７で表されるＯ結合型糖鎖である、請求項１〜７のいずれかに記載の製造方法。
式２：
NeuAcα2-3Galβ1-3(NeuAcα2-6)GalNAcα1-Ser/Thr
式３：
Galβ1-3(Galβ1-4GlcNAcβ1-6)GalNAcα1-Ser/Thr
式４：
Galβ1-3GalNAcα1-Ser/Thr
式５：
NeuAcα2-3Galβ1-3(Galβ1-4GlcNAcβ1-6)GalNAcα1-Ser/Thr
式６：
Galβ1-3(Galβ1-4GlcNAcβ1-3Galβ1-4GlcNAcβ1-6)GalNAcα1-Ser/Thr
式７：
NeuAcα2-3Galβ1-3(Galβ1-4GlcNAcβ1-3Galβ1-4GlcNAcβ1-6)GalNAcα1-Ser/Thr
【請求項９】
前記Ｏ結合型糖ペプチドが下記式８〜１９で表されるＯ結合型糖ペプチドである、請求項１〜７のいずれかに記載の製造方法。
式８：
【化１６】
2020090357.tif 000019
式９：
【化１７】
2020090357.tif 000020
式１０：
【化１８】
2020090357.tif 000021
式１１：
【化１９】
2020090357.tif 000022
式１２：
【化２０】
2020090357.tif 000023
式１３：
【化２１】
2020090357.tif 000024
式１４：
【化２２】
2020090357.tif 000025
式１５：
【化２３】
2020090357.tif 000026
式１６：
【化２４】
2020090357.tif 000027
式１７：
【化２５】
2020090357.tif 000028
式１８：
【化２６】
2020090357.tif 000029
式１９：
【化２７】
2020090357.tif 000030
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ホエイプロテインからＯ結合型糖ペプチド・糖アミノ酸を製造する方法に関する。Ｏ結合型糖ペプチド・糖アミノ酸とは、Ｏ結合型糖ペプチドまたはＯ結合型糖アミノ酸をいう。
【背景技術】
【０００２】
近年、生体分子として、糖鎖が注目されている。生体内で、糖鎖は複合糖質として糖タンパク質、糖脂質、遊離糖鎖等で存在しており、細胞間や生体分子の認識、シグナル伝達において非常に重要な役割を果たしている。糖タンパク質の糖鎖は大きくＮ結合型糖鎖とＯ結合型糖鎖に分類される。Ｎ結合型糖鎖は、タンパク質のコンセンサス配列（ＮＸＳ／Ｔ）のアスパラギンの側鎖に結合し、その糖鎖構造はハイマンノース型、複合型、混合型のタイプが存在するが、すべてのタイプの糖鎖は同じ共通のコア構造と呼ばれる５糖ユニットが最小単位として存在している。【０００３】
一方、Ｏ結合型糖鎖は、タンパク質のセリン、スレオニンの側鎖に結合するが、Ｎ結合型糖鎖と比較すると結合部位のコンセンサス配列が存在せず、糖鎖もムチン型のコア１型、コア２型、コア３型、コア４型等の様々な種類が存在し、糖鎖構造も共通ユニットが存在しない。その為、糖ペプチド解析において、Ｏ結合型糖ペプチドは、糖鎖結合部位同定及び糖鎖構造同定の点でＮ結合型糖ペプチドよりも困難である。【０００４】
Ｎ結合型糖鎖及びＮ結合型糖ペプチド・糖アミノ酸に関しては、天然物から大量に調製する報告がある。例えば、Ｎ結合型糖鎖は鶏の卵黄から複合型糖鎖を有するシアリルオリゴ糖ペプチドを調製する手法が開発されており（非特許文献１）、また、安価な大豆粉由来の大豆アグルチニンからハイマンノース型糖鎖を取り出す手法も開発されている（非特許文献２）。さらに、牛由来フェツインから３本鎖の複合型糖鎖を取り出したり（非特許文献３）、鶏のオボアルブミンから混合型糖鎖を取り出したりする手法も開発されている（非特許文献４）。【０００５】
しかしながら、Ｏ結合型糖鎖並びに糖ペプチドは、天然物から大量に調製する手法は報告されていない。現在、Ｏ結合型糖鎖を持つ試料としてよく利用されているのは、牛顎下腺ムチン（ＢＳＭ）や豚胃ムチン（ＰＳＭ）、牛フェツイン、ウシ由来κカゼイン、ヒト初乳ＩｇＡであるが、これらは糖鎖構造が多様で不均一に存在しており、かつタンパク質上の糖鎖結合部位も複数存在している為、均一な糖ペプチド・糖アミノ酸を調製する原料として不向きである。また、上記のタンパク質は、非常に希少かつ分離精製に手間がかかる為、大量に調製する原料としては不向きである。ウシ由来κカゼイングリコマクロペプチドについては、報告例があるが、ホエイからの精製工程の収率は約０．１２％と低く、収量も１０７〜４μｇと微量である（非特許文献５）。κカゼイングリコマクロペプチドは、κカゼインがレンネット（キモシン）によって、切断された６４残基の糖ペプチドで、Ｏ結合型糖鎖が７か所に結合し、リン酸化部位が３か所ある。そして、Ｏ結合型糖鎖も不均一に存在している為に、上記で分離した物も単一な化合物ではなく、いくつかのアイソフォームの混合物である（非特許文献６）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開平９−１１０８９６号公報
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ｓｅｋｏ  Ａ， Ｋｏｋｅｔｓｕ  Ｍ，  Ｎｉｓｈｉｚｏｎｏ  Ｍ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｂｉｏｃｈｉｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ａｃｔａ，  １３３５，  ２３−３２，  １９９７
【非特許文献２】Ｌｉｓ  Ｈ，  ａｎｄ  Ｓｈａｒｏｎ  Ｎ，  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．，  ２５３，  ３４６８−３４７６，  １９７８
【非特許文献３】Ｇｉｄｄｅｎｓ  ＪＰ，  Ｌｏｍｉｎｏ  ＪＶ，  Ａｍｉｎ  ＭＮ，  ａｎｄ  Ｗａｎｇ  ＬＸ，  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．，  ２９１，  ９３５６−９３７０，  ２０１６
【非特許文献４】Ｌｉ  Ｔ，  Ｔｏｎｇ  Ｘ，  Ｙａｎｇ  Ｑ，  Ｇｉｄｄｅｎｓ  ＪＰ，  Ｗａｎｇ  ＬＸ，  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．，  ２９１，  １６５０８−１６５１８，  ２０１６
【非特許文献５】Ｎａｋａｎｏ  Ｔ，  Ｓｉｌｖａ−Ｈｅｒｎａｎｄｅｚ  ＥＲ，  Ｉｋａｗａ  Ｎ，  Ｏｚｉｍｅｋ  Ｌ，  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｐｒｏｇ．，  １８，  ４０９−４１２，  ２００２
【非特許文献６】Ｂｒｏｄｙ  ＥＰ，  Ｂｒ  Ｊ  Ｎｕｔｒ．，  ８４，  Ｓ３９−Ｓ４６，  ２０００
【非特許文献７】Ｇｉｒａｒｄｅｔ  ＪＭ，  Ｌｉｎｄｅｎ  Ｇ，  Ｊ  Ｄａｉｒｙ  Ｒｅｓ．，  ６３，  ３３３−３５０，  １９９６
【非特許文献８】Ｋｊｅｌｄｓｅｎ  Ｆ，  Ｈａｓｅｌｍａｎｎ  ＫＦ，  Ｂｕｄｎｉｋ  ＢＡ，  Ｓｏｒｅｓｅｎ  ＥＳ，  Ｚｕｂａｒｅｖ  ＲＡ，  Ａｎａｌ  Ｃｈｅｍ．，  ７５，  ２３５５−２３６１，  ２００３
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
発明が解決しようとする課題は、Ｏ結合型糖鎖を持つ糖ペプチド・糖アミノ酸を簡便かつ大量に製造する方法を提供する事にある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者は、Ｏ結合型糖ペプチド・糖アミノ酸を製造する事は、コスト面、工程の煩雑さから非常に困難であるが、ホエイプロテインを原料として、Ｏ結合型糖ペプチド・糖アミノ酸を製造する方法により、上記課題を解決できる事を見出し、本発明を完成するに到った。【００１０】
詳細には、本発明者は、原材料として安価に大量に入手可能なホエイプロテインに着目した。そして、ホエイプロテインから調製したプロテオースペプトン画分から、主な３つのタンパク質の１つであるＰＰ−３（ラクトフォリン）を分離精製することなく、ラクトフォリン由来のＯ結合型糖ペプチドを調製できる方法を見出した。ラクトフォリンは、非特許文献８からリン酸基が５か所、Ｎ結合型糖鎖が１か所、Ｏ結合型糖鎖が３か所に結合していることが分かっている（図１）。Ｏ結合型糖ペプチドを調製して解析した結果、２ヶ所のＯ結合型糖鎖は、ジシアリルコア１型の糖鎖が均一に結合していることを初めて見出した。更に、もう１ヶ所のＯ結合型糖鎖は、複数の糖鎖が結合しているが、それらのＯ結合型糖ペプチドを分離精製できること、その結果、コア１型、ジシアリルコア１型、コア２型、シアリルコア２型と、ポリラクトサミン構造を持つコア２型、ポリラクトサミン構造を持つシアリルコア２型の糖ペプチドを調製できることを見出した。以上により、上記課題を解決して本発明を完成するに至った。【００１１】
すなわち、本発明は、以下のとおりである。
＜１＞  
ホエイプロテインから下記式１で表されるＯ結合型糖鎖を含む糖ペプチド・糖アミノ酸を製造する方法であって、次のA〜E工程を含むＯ結合型糖ペプチド・糖アミノ酸の製造方法。
A  ホエイプロテインからプロテオースペプトン画分を抽出する工程、
B  前記抽出物をプロテアーゼ酵素によって分解する工程、
C  前記分解物を水溶性有機溶媒に添加してＯ結合型糖ペプチド・糖アミノ酸を沈殿させる工程、
D  沈殿させたＯ結合型糖ペプチド・糖アミノ酸の濃縮工程
E  濃縮工程で得た濃縮物を順相カラム及び/又は逆相カラムにより精製する工程
式１：
【化１】
2020090357.tif 000003
（式中、Xは、糖又は糖鎖。Yは、糖又は糖鎖）【００１２】
＜２＞  前記ホエイプロテインが、ホエイを粉末化したホエイパウダー、ホエイプロテインを濃縮したホエイプロテインコンセントレイト（ＷＰＣ）、ホエイプロテインアイソレイト（ＷＰＩ）である＜１＞に記載の製造方法。
＜３＞  前記プロテアーゼ酵素が、トリプシンである＜１＞に記載の製造方法。
＜４＞  前記水溶性有機溶媒が、メタノール、エタノール、アセトン、アセトニトリルから選択される少なくとも１種類を含有する＜１＞に記載の製造方法。
＜５＞  前記濃縮工程が、前記沈殿物をセファロース樹脂へ保持し、有機溶媒を含む水溶液で洗浄し、溶出させる事によって、Ｏ結合型糖ペプチド・糖アミノ酸を濃縮する工程である＜１＞に記載の製造方法。
＜６＞  前記順相カラムがアミド基で表面を修飾された化学結合型シリカを充填されたカラムである＜１＞に記載の製造方法。
＜７＞  前記逆相カラムがオクタデシルシリル基で表面を修飾された化学結合型シリカを充填されたカラムである＜１＞に記載の製造方法。【００１３】
＜８＞  前記Ｏ結合型糖鎖が下記式２〜７で表されるＯ結合型糖鎖である、＜１＞〜＜７＞のいずれかに記載の製造方法。
式２：
NeuAcα2-3Galβ1-3(NeuAcα2-6)GalNAcα1-Ser/Thr
式３：
Galβ1-3(Galβ1-4GlcNAcβ1-6)GalNAcα1-Ser/Thr
式４：
Galβ1-3GalNAcα1-Ser/Thr
式５：
NeuAcα2-3Galβ1-3(Galβ1-4GlcNAcβ1-6)GalNAcα1-Ser/Thr
式６：
Galβ1-3(Galβ1-4GlcNAcβ1-3Galβ1-4GlcNAcβ1-6)GalNAcα1-Ser/Thr
式７：
NeuAcα2-3Galβ1-3(Galβ1-4GlcNAcβ1-3Galβ1-4GlcNAcβ1-6)GalNAcα1-Ser/Thr【００１４】
＜９＞  前記Ｏ結合型糖ペプチドが下記式８〜１９で表されるＯ結合型糖ペプチドである、＜１＞〜＜７＞のいずれかに記載の製造方法。
式８：
【化２】
2020090357.tif 000004
式９：
【化３】
2020090357.tif 000005
式１０：
【化４】
2020090357.tif 000006
式１１：
【化５】
2020090357.tif 000007
式１２：
【化６】
2020090357.tif 000008
式１３：
【化７】
2020090357.tif 000009
式１４：
【化８】
2020090357.tif 000010
式１５：
【化９】
2020090357.tif 000011
式１６：
【化１０】
2020090357.tif 000012
式１７：
【化１１】
2020090357.tif 000013
式１８：
【化１２】
2020090357.tif 000014
式１９：
【化１３】
2020090357.tif 000015
【発明の効果】
【００１５】
本発明の方法により、Ｏ結合型糖ペプチド・糖アミノ酸を簡便に製造する事ができる。また、このＯ結合型糖ペプチド・糖アミノ酸を利用して、質量分析計を用いたＯ結合型糖ペプチド・糖アミノ酸の解析手法の開発が可能となる。さらに、このＯ結合型糖ペプチド・糖アミノ酸を利用して、新規の糖鎖化合物の創製が可能となり、このＯ結合型糖ペプチド・糖アミノ酸を標的とした新規の糖鎖認識タンパク質の探索も可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】今回、同定されたラクトフォリン中の糖ペプチド配列
【図２】ＬＣ−ＭＳ分析による同定された糖ペプチドのＬＣ−ＭＳプロファイルとＯ結合型糖ペプチドのＭＳスペクトル
【図３】ＬＣ−ＭＳ分析による同定された糖ペプチドのＮ結合型糖ペプチドのＭＳスペクトル
【図４】プロテオースペプトン由来の糖ペプチドの高効率液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）プロファイル（上段：１段目のＡｍｉｄｅカラムのプロファイル、中段：フラクション１９の２段目のＯＤＳカラムのプロファイル、下段：フラクション２４の２段目のＯＤＳカラムのプロファイル）
【図５】分離したＯ結合型糖ペプチドのＭＳスペクトル（上段：２段目のＯＤＳカラムのプロファイルのフラクション２３、下段：２段目のＯＤＳカラムのプロファイルのフラクション１５）
【図６】分離したＯ結合型糖ペプチドフラクションのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳスペクトル
【図７Ａ】分離したＶＥＳＴＶＡＴ（７ａａ）、にＮｅｕＡｃα２−３Ｇａｌβ１−３（ＮｅｕＡｃα２−６）ＧａｌＮＡｃが結合したＯ結合型糖ペプチドのＮＭＲスペクトル
【図７Ｂ】分離したＩＡＳＧＥＰＴＳＴＰＴ（１１ａａ）にＮｅｕＡｃα２−３Ｇａｌβ１−３（ＮｅｕＡｃα２−６）ＧａｌＮＡｃが結合したＯ結合型糖ペプチドのＮＭＲスペクトル
【図８】今回、同定されたκカゼイングリコマクロペプチド中の糖ペプチド配列
【発明を実施するための形態】
【００１７】
以下、本発明を実施する為の形態について詳細に説明する。なお、本発明は以下の実施形態に限定されるものではなく、その要旨の範囲内で種々変形して実施する事ができる。
【００１８】
本発明のＯ結合型糖ペプチド・糖アミノ酸を製造する方法は、次のA〜E工程を含む。
A  ホエイプロテインからプロテオースペプトン画分を抽出する工程、
B  前記抽出物をプロテアーゼ酵素によって分解する工程、
C  前記分解物を水溶性有機溶媒に添加してＯ結合型糖ペプチド・糖アミノ酸を沈殿させる工程、
D  沈殿させたＯ結合型糖ペプチド・糖アミノ酸の濃縮工程
E  濃縮工程で得た濃縮物を順相カラム及び/又は逆相カラムにより精製する工程
【００１９】
本発明のＯ結合型糖ペプチドは、下記式１で表されるセリン（Ｓｅｒ）、スレオニン（Ｔｈｒ）残基の側鎖に結合するＯ結合型糖鎖構造を持つ。
式１：
【化１４】
2020090357.tif 000016
（式中、Xは、糖又は糖鎖。Yは、糖又は糖鎖）
【００２０】
（１）Ｏ結合型糖鎖
本発明においてＯ結合型糖鎖とは、セリン（Ｓｅｒ）、スレオニン（Ｔｈｒ）残基の側鎖にＧａｌＮＡｃを介して結合している糖鎖である。このＯ結合型糖鎖は、粘液中に産生される糖タンパク質であるムチン上に豊富に存在する為、「ムチン型糖鎖」とも呼ばれる。このＯ結合型糖鎖は、表１に示すようなコア１〜コア４の一般的な４種類のコア構造と、その他にコア５〜コア８の４種類のコア構造が存在する。
【００２１】
また、ジシアリルコア１型は、シアリダーゼを反応させる事によって、コア１型に変換でき、また、ガラクトシダーゼを反応させる事によって、Ｔｎ抗原に変換できる。さらに、糖転移酵素を用いる事によって、他のコア構造へ変換でき、糖鎖伸長も可能である。その他の糖鎖に関しても、同様に糖加水分解酵素と糖転移酵素によって、他のコア構造へ変換可能である。
表１：  ムチン型糖鎖のタイプ
【表１】
2020090357.tif 000017
【００２２】
A  ホエイプロテインからプロテオースペプトン画分を抽出する工程
（２）ホエイプロテイン
ホエイプロテインとは、牛乳からチーズやカゼインを製造する際の副産物である、スイートホエイと酸ホエイ中のタンパク質を示す。ホエイ中のタンパク質は、β−ラクトグロブリン、α−ラクトアルブミン、免疫グロブリン、ウシ血清アルブミン、ラクトフェリン、ラクトパーオキシダーゼ、プロテオースペプトン等からなっている。
【００２３】
ホエイ中には、乳糖、ミネラル及びビタミンが大量に混在している為、それらを分離し、タンパク質を回収・粉末化した物がホエイプロテインコンセントレイト（ＷＰＣ）として調製されている。また、イオン交換樹脂等を用いて、脂肪や乳糖をほとんど除去した９０％以上のタンパク質含量の物をホエイプロテインアイソレイト（ＷＰＩ）として調製されている。現在、これらの原料は、飼料やサプリメントとして安価に大量に購入可能である。本発明では、ホエイプロテインとは、ホエイパウダー、ホエイプロテインコンセントレイト（ＷＰＣ）、ホエイプロテインアイソレイト（ＷＰＩ）を含むプロテオースペプトン画分を持つホエイ由来のタンパク質の総称を示す。
【００２４】
（３）プロテオースペプトン
プロテオースペプトン（ＰＰ）は、脱脂乳を９５℃で２０分間加熱し、ｐＨ４．６に調製したときに沈殿しない耐熱性のタンパク質である。ここでは、脱脂乳、脱脂粉乳以外のホエイパウダー、ホエイプロテインコンセントレイト（ＷＰＣ）、ホエイプロテインアイソレイト（ＷＰＩ）から調製したプロテオースペプトン画分も含める。この画分は、主に３つのタンパク質ＰＰ−３，５，８からなり、ＰＰ−５，８はカゼインの分解物であり、ＰＰ−３はラクトフォリンである（非特許文献７）。このラクトフォリンは、ホエイプロテインから簡便に調製できる事を特許文献１から報告されている。ラクトフォリンは、非特許文献８からリン酸基が５か所、Ｎ結合型糖鎖が１か所、Ｏ結合型糖鎖が３か所に結合している１３４アミノ酸残基からなるタンパク質である事が分かっている。
【００２５】
（３−１）抽出方法
ホエイプロテインに５０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．４）などの酸性水溶液を抽出溶媒として加え、８０℃〜１００℃で５分〜３０分加熱後、上澄み液を取り出す。
B  前記抽出物をプロテアーゼ酵素によって分解する工程
（４）プロテアーゼ酵素
プロテアーゼは、ペプチドやタンパク質のペプチド結合を加水分解する酵素である。
本発明で用いるプロテアーゼ酵素は、好ましくは、基質特異性の高い酵素として、トリプシン、リシルエンドペプチダーゼ、エンドプロテイナーゼＧｌｕＣ、サーモリシンであるが、ペプチドの断片化の用途に合わせて基質特異性の低い酵素であるキモトリプシン、ペプシンや、アクチナーゼやプロナーゼ等の複数の酵素の混合物も使用できる。
【００２６】
C  前記分解物を水溶性有機溶媒に添加してＯ結合型糖ペプチド・糖アミノ酸を沈殿させる工程、
水溶性溶媒としては、アセトン、エタノール、メタノール、アセトニトリルなどがある。
D  沈殿させたＯ結合型糖ペプチド・糖アミノ酸の濃縮工程
（５）濃縮工程
糖ペプチドは、糖鎖が多数の水酸基を持っている為、親水性を示す。この性質を利用した濃縮方法が親水性相互作用抽出である。一般的には、セファロースやアガロース、セルロースといった親水性の担体に対して有機溶媒が多い極性の低い溶液中（ブタノール：エタノール：水＝４：４：１、８０％アセトニトリル水溶液）で糖ペプチド・糖アミノ酸等の糖鎖化合物を吸着させ、担体を十分に極性の低い溶液で洗浄した後に、有機溶媒が少ない極性の高い溶液（エタノール：水＝１：１、５０％アセトニトリル水溶液）で吸着した糖ペプチド・糖アミノ酸等の糖鎖化合物を溶出させて、濃縮する手法である。
また、シアル酸等の酸性を示す糖ペプチド・糖アミノ酸の場合は、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）セファロース等のレジンを用いた陰イオン交換クロマトグラフィー法を用いて、分離・濃縮する事が出来る。
E  濃縮工程で得た濃縮物を順相カラム及び/又は逆相カラムにより精製する工程
糖ペプチドは、糖鎖部分が示す親水性とペプチド部分が示す疎水性の両方の性質を持った化合物であるため、逆相カラムを用いたＨＰＬＣは、糖鎖を持つ糖ペプチドと糖鎖を持たないペプチドの混合物を、親水性の糖ペプチドを疎水性のペプチドよりも早めに溶出する事によって、分離する事が可能である。
また、順相カラムを用いたＨＰＬＣでも、糖鎖を持つ糖ペプチドと糖鎖を持たないペプチド間の分離も可能で、こちらは糖ペプチドの方がペプチド鎖よりも後に溶出する事によって分離が可能である。特に、順相カラムを用いたＨＰＬＣは、糖鎖の僅かな親水性の違いが逆相カラムよりも効果的に影響される為、同じペプチド鎖を持ち、異なる糖鎖を持つ糖ペプチドを分離する場合に有効である。しかしながら、順相カラムのＨＰＬＣは、塩の影響を受けやすい為、カラム許容量が試料の塩含有率に反映してしまうので、大量に分離したい場合は、脱塩効果が高い逆相カラムが優れている。
よって、非常に複雑な糖ペプチド混合物を分離するには、逆相カラムと順相カラムを用いた精製工程を効果的に行う事によって、糖ペプチドとペプチド間の分離並びに糖ペプチド間の分離に可能になる。
【実施例】
【００２７】
以下に本発明の実施例を挙けるが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
＜実施例１＞  ホエイプロテインコンセントレイト（ＷＰＣ）からＯ結合型糖ペプチドを同定する方法
ホエイプロテインコンセントレイト（ＷＰＣ  ２０ｇ、ボディウィング社製）を５０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．４）２００ｍｌに溶かし、オイルバスを用いて１００度で３０分間、加熱しながら攪拌させる。反応液を遠心（１０，０００ｇ、１０分間）する事によって、上清液を分離し、取り出す。その後、上清液を透析チューブ（分画分子量：１５ｋＤａ）の純水による膜透析を行い、減圧濃縮し、凍結乾燥する事によって、プロテオースペプトン画分が３ｇ（電気泳動によるＰＰ３の換算量：約２００ｍｇ）入手する事が出来た。【００２８】
次に、このプロテオースペプトン画分（１ｇ）を５０ｍＭ炭酸水素アンモニウム水溶液（１０ｍｌ）に溶かし、ＴＰＣＫ処理トリプシン（ＰＩＥＲＣＥ社製、２ｍｇ）を加え、３７℃で２４時間、反応した。その後、Ｃ１８シリカゲル（ＷＡＫＯ社製）の簡易カラムを用いて反応液を濾過し、その濾液（約１０ｍｌ）を氷冷しているアセトン（９０ｍｌ）に加え、糖ペプチド混合物を沈殿させた。この溶液を遠心（１０，０００ｇ、１０分間）する事によって、上清液を除去し、沈殿画分（５０ｍｇ）を入手した。【００２９】
これを水に溶かした後に、Ｚｏｒｂａｘ Ｅｘｔｅｎｄ−Ｃ１８ １．０×１５０ｍｍ  カラム（Ａｇｉｌｅｎｔ社製）を繋げたＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ製ＬＣ−ＥＳＩ  ＭＳ装置（Ｕｌｔｉｍａｔｅ３０００＋ＶｅｌｏｓＰｒｏ）を用いてｐｏｓｉｔｉｖｅモードでＭＳ測定、ＭＳ／ＭＳ測定を行った。溶出条件は流速：５０μｌ／ｍｉｎで、Ａ液：２０ｍＭ ギ酸アンモニウム、Ｂ液：０．１％ギ酸水溶液、Ｃ液：アセトニトリルの３液を使用した系で、０−５ｍｉｎ：Ａ１００％，５−２０ｍｉｎ：Ｃ０−２５％，Ｂ１００−７５％，２０−３０ｍｉｎ：Ｃ８０％Ｂ２０％，３０−５０ｍｉｎ：Ａ１００％を１測定のメソッドとした。【００３０】
ラクトフォリンの配列（図１）を基にＬＣ−ＭＳプロファイルを網羅的に解析した結果、Ｏ結合型糖ペプチド断片は、ペプチド鎖ＩＬＮＫＰＥＤＥＴＨＬＥＡＱＰＴＤＡＳＡＱＦ（２２ａａ）にＮｅｕＡｃα２−３Ｇａｌβ１−３（ＮｅｕＡｃα２−６）ＧａｌＮＡｃが結合した分子量３４０１のイオンが３価として、ｍ／ｚ：１１３４．５で検出された。【００３１】
また、ペプチド鎖ＱＰＱＳＱＮＰＫ（８ａａ）にＮｅｕＡｃα２−３Ｇａｌβ１−３（ＮｅｕＡｃα２−６）ＧａｌＮＡｃが結合した分子量１８７４のイオンが２価として、ｍ／ｚ：９３７．４で検出された。【００３２】
さらに、ペプチド鎖ＬＧＳＥＥＴＴＥＨＴＰＳＤＡＳＴＴＥＧＫ（２０ａａ）にＧａｌβ１−３ＧａｌＮＡｃ，Ｇａｌβ１−３（Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−６）ＧａｌＮＡｃ，ＮｅｕＡｃα２−３Ｇａｌβ１−３（ＮｅｕＡｃα２−６）ＧａｌＮＡｃ，ＮｅｕＡｃα２−３Ｇａｌβ１−３（Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−６）ＧａｌＮＡｃが結合した分子量２４４１，２８０６，３０２３，３０９７のイオンが３価として、ｍ／ｚ：８１４．８，９３６．４，１００８．８，１０３３．５で検出された。【００３３】
また、Ｎ結合型糖ペプチドはペプチド鎖ＮＡＴ（３ａａ）にＮｅｕＡｃ１Ｈｅｘ５ＨｅｘＮＡｃ４，ＮｅｕＡｃ１Ｈｅｘ４ＨｅｘＮＡｃ５，ＮｅｕＡｃ１Ｈｅｘ３ＨｅｘＮＡｃ６，ＮｅｕＡｃ１Ｈｅｘ５ＨｅｘＮＡｃ４ｄＨｅｘ１，ＮｅｕＡｃ１Ｈｅｘ４ＨｅｘＮＡｃ５ｄＨｅｘ１，ＮｅｕＡｃ１Ｈｅｘ３ＨｅｘＮＡｃ６ｄＨｅｘ１，ＮｅｕＡｃ１Ｈｅｘ７ＨｅｘＮＡｃ６，ＮｅｕＡｃ１Ｈｅｘ７ＨｅｘＮＡｃ６ｄＨｅｘ１，ＮｅｕＡｃ１Ｈｅｘ６ＨｅｘＮＡｃ７ｄＨｅｘ１が結合した分子量２２１８，２２５９，２３００，２３６４，２４０５，２４４６，２５８３，２７２９，２７７０のイオンが２価として、ｍ／ｚ：１１１０．０，１１３０．５，１１５１．０，１１８３．０，１２０３．５，１２２４．０，１２９２．５，１３６５．６，１３８６．０で検出された（図２，３）。【００３４】
これらは、すべてＭＳ／ＭＳ測定を行い、ペプチド鎖配列及び結合部位を同定している。従って、プロテオースペプトン画分からＴＰＣＫ処理トリプシンで反応させる事によって、Ｎ結合型糖鎖が１か所、Ｏ結合型糖鎖が３か所に結合しているラクトフォリンの糖ペプチドをそれぞれ断片化する事が出来、その構造も同定できた（図１）。【００３５】
＜実施例２＞  ホエイプロテインコンセントレイト（ＷＰＣ）から調製したプロテオースペプトンからＯ結合型糖ペプチドを調製する方法
前記の糖ペプチドの沈殿画分（１ｍｇ）を水２００μｌに溶かし、ブタノール：エタノール：水＝４：２：１の溶液で十分に洗浄したセファロース４Ｂ樹脂（ｓｉｇｍａ−ａｌｄｒｉｃｈ社製、２ｍｌ）の中に加え、ブタノール（１．６ｍｌ）とエタノール（０．４ｍｌ）を加え、室温で２時間、攪拌した。この樹脂をブタノール：エタノール：水＝４：２：１の溶液で十分に洗浄した後にエタノール：水＝１：１の溶液で溶出する事によって、糖ペプチド画分を入手し、減圧濃縮を行った。【００３６】
この糖ペプチド画分を８０％アセトニトリル溶液に懸濁させ、順相カラムＩｎｅｒｔＳｕｓｔａｉｎ  Ａｍｉｄｅ  ４．６ｘ２５０ｍｍカラム（ＧＬ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）を用いたＨＰＬＣシステムにて分離した。分離条件は流速１．０ｍｌ／ｍｉｎで、Ａ液：２０ｍＭ ギ酸アンモニウム、Ｂ液：アセトニトリルの２液を使用した物で、０−５ｍｉｎ：Ｂ７５％，５−２５ｍｉｎ：Ｂ７５−６０％，２５−２７ｍｉｎ：Ｂ６０−２０％，２７−３３ｍｉｎ：Ｂ２０％，３３−４０ｍｉｎ：Ｂ７５％を使用した。各フラクションを１分間隔で分取した。【００３７】
質量分析計を用いて、それぞれのフラクションを測定した結果、フラクション１９に分子量３４０２のペプチド鎖ＩＬＮＫＰＥＤＥＴＨＬＥＡＱＰＴＤＡＳＡＱＦ＋ＮｅｕＡｃα２−３Ｇａｌβ１−３（ＮｅｕＡｃα２−６）ＧａｌＮＡｃが検出され、フラクション２４に分子量１８７４のペプチド鎖ＱＰＱＳＱＮＰＫ＋ＮｅｕＡｃα２−３Ｇａｌβ１−３（ＮｅｕＡｃα２−６）ＧａｌＮＡｃが検出された（図４の上段）。【００３８】
しかしながら、このフラクションはまだ他の化合物が混入しているので、このフラクションをそれぞれ逆相カラムＩｎｅｒｔｓｉｌＯＤＳ−３  ４．６ｘ２５０ｍｍカラム（ＧＬ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）を用いたＨＰＬＣシステムにて分離した（図４の中段、下段）。分離条件は流速１．０ｍｌ／ｍｉｎで、Ａ液：２０ｍＭ ギ酸アンモニウム、Ｂ液：アセトニトリルの２液を使用した物で、０−５ｍｉｎ：Ｂ０％，５−３０ｍｉｎ：Ｂ０−２５％，３０−３７ｍｉｎ：Ｂ１００％，３７−４５ｍｉｎ：Ｂ０％を使用した。各フラクションを１分間隔で分取した。【００３９】
質量分析計を用いて、それぞれのフラクションを測定した結果、フラクション２３に分子量３４０２のペプチド鎖ＩＬＮＫＰＥＤＥＴＨＬＥＡＱＰＴＤＡＳＡＱＦ＋ＮｅｕＡｃα２−３Ｇａｌβ１−３（ＮｅｕＡｃα２−６）ＧａｌＮＡｃが検出され、フラクション１５に分子量１８７４のペプチド鎖ＱＰＱＳＱＮＰＫ＋ＮｅｕＡｃα２−３Ｇａｌβ１−３（ＮｅｕＡｃα２−６）ＧａｌＮＡｃが検出された（図５）。その結果、糖ペプチドの混合物の中からセリン残基にジシアリルコア１型糖鎖が結合したＯ結合型糖ペプチドと、スレオニン残基にジシアリルコア１型糖鎖が結合したＯ結合型糖ペプチドが入手できた。【００４０】
＜実施例３＞  ホエイプロテインアイソレイト（ＷＰＩ）から調製したプロテオースペプトンからＯ結合型糖ペプチドを調製する方法
ホエイプロテインアイソレイト（ＷＰＩ，  ２０ｇ、ＴＯＦＣＯ社製）を５０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．４）２００ｍｌに溶かし、オイルバスを用いて１００℃で３０分間、加熱しながら攪拌させる。反応液を遠心（１０，０００ｇ、１０分間）する事によって、上清液を取り出す。その後、上清液を透析チューブ（分画分子量：１５ｋＤａ）の純水による膜透析を行い、減圧濃縮し、凍結乾燥する事によって、プロテオースペプトン画分が３．５ｇ（電気泳動によるＰＰ３の換算量：約２５０ｍｇ）入手する事が出来た。【００４１】
次に、このプロテオースペプトン画分（１．２ｇ）を５０ｍＭ炭酸水素アンモニウム水溶液（１０ｍｌ）に溶かし、ＴＰＣＫ処理トリプシン（ＰＩＥＲＣＥ社製、２ｍｇ）を加え、３７℃で２４時間、反応した。この糖ペプチド混合物は、上記で示したＷＰＣから調製した物と同じ断片化を示し、糖ペプチドの含有量もほぼ同じであるが、脂質分がほとんどない。よって、その後の処理で行っていたＣ１８シリカゲル（ＷＡＫＯ社製）の簡易カラムとアセトン沈殿が省く事が可能である。また、ＷＰＣよりも重量当たりのラクトフォリン回収量も若干多い。【００４２】
＜実施例４＞  ホエイプロテインアイソレイト（ＷＰＩ）から調製したプロテオースペプトンからジシアリルコア１型並びにコア１型、コア２型とポリラクトサミン構造を持つコア２型Ｏ結合型糖ペプチドを調製する方法
上記で調製したＴＰＣＫ処理トリプシンで消化した糖ペプチド混合物（プロテオースペプトン５００ｍｇ分）を逆相カラムＩｎｅｒｔｓｉｌＯＤＳ−３  １０ｘ２５０ｍｍカラム（ＧＬ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）を用いたＨＰＬＣシステムにて分離した。分離条件は流速４．７ｍｌ／ｍｉｎで、Ａ液：２０ｍＭ ギ酸アンモニウム、Ｂ液：アセトニトリルの２液を使用した物で、０−５ｍｉｎ：Ｂ０％，５−３０ｍｉｎ：Ｂ０−２５％，３０−３７ｍｉｎ：Ｂ１００％，３７−４５ｍｉｎ：Ｂ０％を使用した。各フラクションを１分間隔で分取した。【００４３】
フラクション１４，１５，１６，２３の部分に糖ペプチドが出てくるので、そのフラクションを回収した。フラクション２３は、再度、ＯＤＳ−３カラムを用いて分取し、純度を高めた。回収された糖ペプチドは、分子量３４０２のペプチド鎖ＩＬＮＫＰＥＤＥＴＨＬＥＡＱＰＴＤＡＳＡＱＦ＋ＮｅｕＡｃα２−３Ｇａｌβ１−３（ＮｅｕＡｃα２−６）ＧａｌＮＡｃの糖ペプチドであり、収量は約１．７ｍｇ（６６０ｎｍｏｌ）であった。【００４４】
次に、フラクション１４、フラクション１５とフラクション１６は、それぞれ別に順相カラムＩｎｅｒｔＳｕｓｔａｉｎ  Ａｍｉｄｅ  １０ｘ２５０ｍｍカラム（ＧＬ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）を用いたＨＰＬＣシステムにて分離した。分離条件は流速４．７ｍｌ／ｍｉｎで、Ａ液：２０ｍＭ ギ酸アンモニウム、Ｂ液：アセトニトリルの２液を使用した物で、０−５ｍｉｎ：Ｂ７５％，５−２５ｍｉｎ：Ｂ７５−６０％，２５−２７ｍｉｎ：Ｂ６０−２０％，２７−３３ｍｉｎ：Ｂ２０％，３３−４０ｍｉｎ：Ｂ７５％を使用した。各フラクションを１分間隔で分取した。【００４５】
フラクション２０、２１、２２，２３の部分に糖ペプチドが出てくるので、そのフラクションを回収した。より純度を高める為、回収したフラクションを再度、ＩｎｅｒｔＳｕｓｔａｉｎ  Ａｍｉｄｅ  １０ｘ２５０ｍｍカラムを用いて分取した。その結果、ポリラクトサミン構造を持つコア２型の糖鎖を持つ糖ペプチドを含む８種類の糖ペプチドが分取できた。【００４６】
これらの試料をＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳで測定した結果、図６で示されるように、分子量１８７４のペプチド鎖ＱＰＱＳＱＮＰＫ＋ＮｅｕＡｃα２−３Ｇａｌβ１−３（ＮｅｕＡｃα２−６）ＧａｌＮＡｃは、逆相フラクション１４、順相フラクション２２に回収できており、収量は約３２４μｇ（１８０ｎｍｏｌ）であった。【００４７】
また、分子量２４４４のペプチド鎖ＬＧＳＥＥＴＴＥＨＴＰＳＤＡＳＴＴＥＧＫ＋Ｇａｌβ１−３ＧａｌＮＡｃは、逆相フラクション１５、順相フラクション２０に回収できており、若干他のペプチド鎖と糖ペプチドが混入しているが、約３６０μｇ（１５０ｎｍｏｌ）が得られた。【００４８】
また、分子量３０２６のペプチド鎖ＬＧＳＥＥＴＴＥＨＴＰＳＤＡＳＴＴＥＧＫ＋ＮｅｕＡｃα２−３Ｇａｌβ１−３（ＮｅｕＡｃα２−６）ＧａｌＮＡｃは、逆相フラクション１４、順相フラクション２０に回収できており、若干他のペプチド鎖が混入しているが、約４８０μｇ（１６０ｎｍｏｌ）が得られた。【００４９】
さらに、分子量３０９９のペプチド鎖ＬＧＳＥＥＴＴＥＨＴＰＳＤＡＳＴＴＥＧＫ＋ＮｅｕＡｃα２−３Ｇａｌβ１−３（Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−６）ＧａｌＮＡｃは、逆相フラクション１５、順相フラクション２１に回収できており、若干他の糖ペプチド鎖が混入しているが、約４６５μｇ（１５０ｎｍｏｌ）が得られた。【００５０】
そして、分子量２８０８のペプチド鎖ＬＧＳＥＥＴＴＥＨＴＰＳＤＡＳＴＴＥＧＫ＋Ｇａｌβ１−３（Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−６）ＧａｌＮＡｃは、逆相フラクション１５、順相フラクション２２に回収できており、純度が高く、約２５０μｇ（９０ｎｍｏｌ）が得られた。【００５１】
さらにまた、分子量３４６２のペプチド鎖ＬＧＳＥＥＴＴＥＨＴＰＳＤＡＳＴＴＥＧＫ＋ＮｅｕＡｃα２−３Ｇａｌβ１−３（Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−６）ＧａｌＮＡｃは、逆相フラクション１６、順相フラクション２２に回収できており、若干他のペプチド鎖と糖ペプチドが混入しているが、約７０μｇ（２０ｎｍｏｌ）が得られた。【００５２】
そして、分子量３１７５のペプチド鎖ＬＧＳＥＥＴＴＥＨＴＰＳＤＡＳＴＴＥＧＫ＋Ｇａｌβ１−３（Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−３Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−６）ＧａｌＮＡｃは、逆相フラクション１６、順相フラクション２３に回収できており、若干他のペプチド鎖と糖ペプチドが混入しているが、約９５μｇ（３０ｎｍｏｌ）が得られた。【００５３】
よって、原料ホエイプロテイン３ｇから合計約３．７ｍｇのＯ結合型糖ペプチドを調製できた。重量換算の収率は約０．１２％である。いくつかの糖ペプチドフラクションは他の糖ペプチドが混在しているが、ジシアリルコア１型糖ペプチド、コア２型糖ペプチドとポリラクトサミン構造を持つコア２型糖ペプチドは、純度の高いＯ結合型糖ペプチドとして調製できた。【００５４】
＜実施例５＞ ホエイプロテインアイソレイト（ＷＰＩ）から調製したプロテオースペプトンをサーモリシン消化してＯ結合型糖ペプチドを調製する方法
ホエイプロテインアイソレイト（ＷＰＩ，  ２０ｇ、ＴＯＦＣＯ社製）を５０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．４）２００ｍｌに溶かし、オイルバスを用いて１００℃で３０分間、加熱しながら攪拌させる。反応液を遠心（１０，０００ｇ、１０分間）する事によって、上清液を取り出す。その後、上清液を透析チューブ（分画分子量：１５ｋＤａ）の純水による膜透析を行い、アセトン中に透析した溶液を加えて、８０％アセトン溶液にし、静置する事によって、タンパク質を沈殿させた。この沈殿画分を遠心処理（５，０００ｇ、１０分間）によって分離し、５０℃で減圧しながら乾燥させる事によって、プロテオースペプトン画分が３．５ｇ入手する事が出来た。【００５５】
次に、このプロテオースペプトン画分（１．２ｇ）を５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．４）＋５ｍＭ塩化カルシウム溶液（１０ｍｌ）に溶かし、サーモリシン（ＭＥＲＣＫ社製、２ｍｇ）を加え、３７℃で２４時間、反応した。
次にサーモリシンで消化した糖ペプチド混合物（プロテオースペプトン７８０ｍｇ分）を逆相カラムＩｎｅｒｔｓｉｌＯＤＳ−３  １０ｘ２５０ｍｍカラム（ＧＬ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）を用いたＨＰＬＣシステムにて分離した。分離条件は流速４．７ｍｌ／ｍｉｎで、Ａ液：２０ｍＭ ギ酸アンモニウム、Ｂ液：アセトニトリルの２液を使用した物で、０−５ｍｉｎ：Ｂ０％，５−３０ｍｉｎ：Ｂ０−２５％，３０−３７ｍｉｎ：Ｂ１００％，３７−４５ｍｉｎ：Ｂ０％を使用した。各フラクションを１分間隔で分取した。【００５６】
次に、糖ペプチドが存在するフラクションをそれぞれ別に順相カラムＩｎｅｒｔＳｕｓｔａｉｎ  Ａｍｉｄｅ  １０ｘ２５０ｍｍカラム（ＧＬ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）を用いたＨＰＬＣシステムにて分離した。分離条件は流速４．７ｍｌ／ｍｉｎで、Ａ液：２０ｍＭ ギ酸アンモニウム、Ｂ液：アセトニトリルの２液を使用した物で、０−５ｍｉｎ：Ｂ７５％，５−２５ｍｉｎ：Ｂ７５−６０％，２５−２７ｍｉｎ：Ｂ６０−２０％，２７−３３ｍｉｎ：Ｂ２０％，３３−４０ｍｉｎ：Ｂ７５％を使用した。各フラクションを１分間隔で分取した。【００５７】
さらに、糖ペプチドが存在するフラクションをそれぞれ別に逆相カラムＩｎｅｒｔｓｉｌＯＤＳ−３  １０ｘ２５０ｍｍカラム（ＧＬ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）を用いたＨＰＬＣシステムにて分離した。分離条件は流速４．７ｍｌ／ｍｉｎで、Ａ液：２０ｍＭ ギ酸アンモニウム、Ｂ液：アセトニトリルの２液を使用した物で、０−５ｍｉｎ：Ｂ０％，５−３０ｍｉｎ：Ｂ０−２５％，３０−３７ｍｉｎ：Ｂ１００％，３７−４５ｍｉｎ：Ｂ０％を使用した。各フラクションを１分間隔で分取した。【００５８】
このサーモリシンで消化した糖ペプチド混合物をＨＰＬＣで分離する事によって、ラクトフォリン由来のペプチド鎖ＬＧＳＥＥＴＴＥＨＴＰＳＤＡＳＴＴＥＧＫ（２０ａａ）にＧａｌβ１−３ＧａｌＮＡｃ，Ｇａｌβ１−３（Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−６）ＧａｌＮＡｃ，ＮｅｕＡｃα２−３Ｇａｌβ１−３（ＮｅｕＡｃα２−６）ＧａｌＮＡｃ，ＮｅｕＡｃα２−３Ｇａｌβ１−３（Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−６）ＧａｌＮＡｃが結合した糖ペプチドが効率よく回収できた。また、κカゼイングリコマクロペプチド由来（図８）のペプチド鎖ＩＡＳＧＥＰＴＳＴＰＴ（１１ａａ）、ＶＥＳＴＶＡＴ（７ａａ）、ＶＱＶＴＳＴ（６ａａ）にＮｅｕＡｃα２−３Ｇａｌβ１−３（ＮｅｕＡｃα２−６）ＧａｌＮＡｃが結合した糖ペプチドが入手できた。特に、ＩＡＳＧＥＰＴＳＴＰＴ（１１ａａ）、ＶＥＳＴＶＡＴ（７ａａ）はホエイプロテインアイソレイト２０グラムから約１５ｍｇと約５ｍｇと大量に入手できた。これらのＮＭＲスペクトル（図７）から、この糖ペプチドが高純度かつ大量に得られている事が分かった。
【産業上の利用可能性】
【００５９】
本発明は、Ｏ結合型糖ペプチド・糖アミノ酸をホエイプロテインより簡便かつ収率よく製造する方法を提供する事ができる。また、調製したＯ結合型糖ペプチド・糖アミノ酸を原料として用いる事によって、糖タンパク質を合成する事も可能である。さらに、調製したＯ結合型糖ペプチド・糖アミノ酸を基質とした新規の糖鎖認識タンパク質・酵素の探索や機能解析などに適用でき、医薬品業界等においても利用可能である。
【図１】
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【図２】
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【図２−１】
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【図２−２】
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【図２−３】
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【図２−４】
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【図３】
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【図３−１】
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【図３−２】
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【図３−３】
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【図４】
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【図５】
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【図５−１】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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