(57)【要約】  本発明は、互いに異なる二種の抗原を共発現する標的細胞に対してより選択的にエフェクター機能を発揮し傷害するとともに、個々の標的抗原に対する親和性を充分高く維持し得る抗体組成物を提供することを目的とする。本発明は、第１のＩｇＧ半量体と第２のＩｇＧ半量体とからなる、互いに異なる第１の抗原及び第２の抗原に対する抗体組成物に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
第１のＩｇＧ半量体と第２のＩｇＧ半量体とからなる、互いに異なる第１の抗原及び第２の抗原に対する抗体組成物であって、
第１のＩｇＧ半量体及び第２のＩｇＧ半量体は、それぞれ、１つのイムノグロブリン軽鎖（以下、Ｌ鎖と略記する）及び１つのイムノグロブリン重鎖（以下、Ｈ鎖と略記する）からなり、Ｈ鎖はＨ鎖可変領域、一部または全体の置換もしくは欠失、または修飾によりジスルフィド結合が形成されないように改変されたヒンジドメイン及びＣＨ１〜ＣＨ３ドメインを含み、ＣＨ２ドメインにおいて互いに異なる第１のＦｃγ受容体ＩＩＩＡ（以下、ＣＤ１６ａ）結合領域及び第２のＣＤ１６ａ結合領域のいずれかに改変を有し、
第１のＩｇＧ半量体は、第１の抗原に結合する抗原結合ドメインを含み、且つ第１のＣＤ１６ａ結合領域におけるＣＤ１６ａ結合活性が改変により減弱しており、
第２のＩｇＧ半量体は、第２の抗原に結合する抗原結合ドメインを含み、且つ第２のＣＤ１６ａ結合領域におけるＣＤ１６ａ結合活性が改変により減弱しており、
第１のＩｇＧ半量体と第２のＩｇＧ半量体との間において、Ｈ鎖間におけるジスルフィド結合が形成されない、
抗体組成物。
【請求項２】
第１の抗原及び第２の抗原を共発現する標的細胞にのみエフェクター機能を発揮し傷害する、請求項１に記載の抗体組成物。
【請求項３】
第１のＣＤ１６ａ結合領域及び第２のＣＤ１６ａ結合領域における改変がアミノ酸の置換、欠失もしくは付加、または修飾である請求項１または２に記載の抗体組成物。
【請求項４】
第１のＣＤ１６ａ結合領域が、ＥＵインデックスで表される２３５位、２３６位、２３７位、２３８位、２３９位、２６５位、２６６位、２６７位、２６８位、２６９位、２９４位、２９５位、２９６位、２９７位、２９８位、２９９位、３０１位、３２５位、３２７位、３３２位のアミノ酸残基から選ばれる少なくとも１を含む請求項１〜３のいずれか１項に記載の抗体組成物。
【請求項５】
第１のＣＤ１６ａ結合領域における改変が、ＥＵインデックスで表される２３５位、２３６位、２３７位、２３８位、２３９位、２６５位、２６６位、２６７位、２６８位、２６９位、２９４位、２９５位、２９６位、２９７位、２９８位、２９９位、３０１位、３２５位、３２７位、３３２位のアミノ酸残基から選ばれる少なくとも１のアミノ酸残基の置換である請求項４に記載の抗体組成物。
【請求項６】
第１のＣＤ１６ａ結合領域における改変が、ＥＵインデックスで表される２３５位、２３８位、２３９位、２６５位、２６７位、２６９位、２９６位、２９８位、２９９位、３２７位のアミノ酸残基から選ばれる少なくとも１のアミノ酸残基の置換である請求項５に記載の抗体組成物。
【請求項７】
第２のＣＤ１６ａ結合領域が、ＥＵインデックスで表される２３５位、２３６位、２３７位、３２６位、３２７位、３２８位、３２９位、３３０位のアミノ酸残基から選ばれる少なくとも１を含む請求項１〜６のいずれか１項に記載の抗体組成物。
【請求項８】
第２のＣＤ１６ａ結合領域における改変が、ＥＵインデックスで表される２３５位、２３６位、２３７位、３２６位、３２７位、３２８位、３２９位、３３０位のアミノ酸残基から選ばれる少なくとも１から選ばれる少なくとも１のアミノ酸残基の置換である請求項７に記載の抗体組成物。
【請求項９】
第２のＣＤ１６ａ結合領域が、ＥＵインデックスで表される３２６位、３２８位、３２９位、３３０位のアミノ酸残基から選ばれる少なくとも１を含む請求項８に記載の抗体組成物。
【請求項１０】
第１のＣＤ１６ａ結合領域における改変が、ＥＵインデックスで表される２３５位、２３８位、２３９位、２６５位、２６７位、２６９位、２９６位、２９８位、２９９位、３２７位のアミノ酸残基から選ばれる少なくとも１のアミノ酸残基の置換であり、第２のＣＤ１６ａ結合領域における改変が、ＥＵインデックスで表される３２６位、３２８位、３２９位、３３０位のアミノ酸残基から選ばれる少なくとも１のアミノ酸残基の置換である請求項１〜９のいずれか１項に記載の抗体組成物。
【請求項１１】
第１のＣＤ１６ａ結合領域における改変が、ＥＵインデックスで表される２３８位、２６５位、２６７位のアミノ酸残基から選ばれる少なくとも１のアミノ酸残基の置換である請求項１〜１０のいずれか１項に記載の抗体組成物。
【請求項１２】
第２のＣＤ１６ａ結合領域における改変が、ＥＵインデックスで表される３２６位、３２８位、３２９位のアミノ酸残基から選ばれる少なくとも１のアミノ酸残基の置換である請求項１〜１１のいずれか１項に記載の抗体組成物。
【請求項１３】
第１のＩｇＧ半量体及び第２のＩｇＧ半量体が、ＥＵインデックスで表される２２６位及び２２９位の少なくとも一方のアミノ酸残基が置換されたヒンジドメインを含む請求項１〜１２のいずれか１項に記載の抗体組成物。
【請求項１４】
第１のＩｇＧ半量体及び第２のＩｇＧ半量体における、Ｌ鎖、Ｈ鎖のＨ鎖可変領域及びＣＨ１ドメイン及びＣＨ２ドメインのイムノグロブリンサブクラスがＩｇＧ１である、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の抗体組成物。
【請求項１５】
第１のＩｇＧ半量体及び第２のＩｇＧ半量体における、Ｈ鎖のＣＨ３ドメインが、ＩｇＧ１サブクラスのＣＨ３ドメインよりもＣＨ３ドメイン間相互作用が弱い、請求項１４に記載の抗体組成物。
【請求項１６】
第１のＩｇＧ半量体及び第２のＩｇＧ半量体における、Ｈ鎖のＣＨ３ドメインのイムノグロブリンサブクラスがＩｇＧ４である、請求項１５に記載の抗体組成物。
【請求項１７】
第１のＩｇＧ半量体における第２のＣＤ１６ａ結合領域、及び第２のＩｇＧ半量体における第１のＣＤ１６ａ結合領域を介してＣＤ１６ａに結合する請求項１〜１６のいずれか１項に記載の抗体組成物。
【請求項１８】
第１のＩｇＧ半量体及び第２のＩｇＧ半量体における、Ｆｃ領域に結合する全Ｎ−グリコシド結合型糖鎖のうち、糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンにフコースが結合していない糖鎖の割合が２０％以上である、請求項１〜１７のいずれか１項に記載の抗体組成物。
【請求項１９】
第１のＩｇＧ半量体及び第２のＩｇＧ半量体が、ＣＨ２ドメインにおいて、さらにＣＤ１６ａ結合活性を増強させる少なくとも１のアミノ酸残基置換を含む請求項１〜１８のいずれか１項に記載の抗体組成物。
【請求項２０】
第１のＩｇＧ半量体及び第２のＩｇＧ半量体が、ＣＨ２ドメインにおいて、ＥＵインデックスで表されるＳ２９８Ａ、Ｅ３３３Ａ、Ｋ３３４Ａから選ばれる少なくとも１のアミノ酸残基置換を含む請求項１９に記載の抗体組成物。
【請求項２１】
第２のＩｇＧ半量体と併用する第１のＩｇＧ半量体であって、第１のＩｇＧ半量体及び第２のＩｇＧ半量体は、それぞれ、１つのＬ鎖及び１つのＨ鎖からなり、Ｈ鎖はＨ鎖可変領域、一部または全体の置換もしくは欠失、または修飾によりジスルフィド結合が形成されないように改変されたヒンジドメイン及びＣＨ１〜ＣＨ３ドメインを含み、ＣＨ２ドメインにおいて互いに異なる第１のＣＤ１６ａ結合領域及び第２のＣＤ１６ａ結合領域のいずれかに改変を有し、
第１のＩｇＧ半量体は、第１の抗原に結合する抗原結合ドメインを含み、且つ第１のＣＤ１６ａ結合領域におけるＣＤ１６ａ結合活性が改変により減弱しており、
第２のＩｇＧ半量体は、第１の抗原とは異なる第２の抗原に結合する抗原結合ドメインを含み、且つ第２のＣＤ１６ａ結合領域におけるＣＤ１６ａ結合活性が改変により減弱しており、
第１のＩｇＧ半量体と第２のＩｇＧ半量体との間において、Ｈ鎖間におけるジスルフィド結合が形成されない、第１のＩｇＧ半量体。
【請求項２２】
第１のＩｇＧ半量体と第２のＩｇＧ半量体とからなり、且つ互いに異なる第１の抗原及び第２の抗原に対する抗体組成物の製造に用いるための、第１のＩｇＧ半量体であって、
第１のＩｇＧ半量体及び第２のＩｇＧ半量体は、それぞれ、１つのＬ鎖及び１つのＨ鎖からなり、Ｈ鎖はＨ鎖可変領域、一部または全体の置換もしくは欠失、または修飾によりジスルフィド結合が形成されないように改変されたヒンジドメイン及びＣＨ１〜ＣＨ３ドメインを含み、ＣＨ２ドメインにおいて互いに異なる第１のＣＤ１６ａ結合領域及び第２のＣＤ１６ａ結合領域のいずれかに改変を有し、
第１のＩｇＧ半量体は、第１の抗原に結合する抗原結合ドメインを含み、且つ第１のＣＤ１６ａ結合領域におけるＣＤ１６ａ結合活性が改変により減弱しており、
第２のＩｇＧ半量体は、第２の抗原に結合する抗原結合ドメインを含み、且つ第２のＣＤ１６ａ結合領域におけるＣＤ１６ａ結合活性が改変により減弱しており、
第１のＩｇＧ半量体と第２のＩｇＧ半量体との間において、Ｈ鎖間におけるジスルフィド結合が形成されない、
第１のＩｇＧ半量体。
【請求項２３】
第１のＩｇＧ半量体と併用する第２のＩｇＧ半量体であって、第１のＩｇＧ半量体及び第２のＩｇＧ半量体は、それぞれ、１つのＬ鎖及び１つのＨ鎖からなり、Ｈ鎖はＨ鎖可変領域、一部または全体の置換もしくは欠失、または修飾によりジスルフィド結合が形成されないように改変されたヒンジドメイン及びＣＨ１〜ＣＨ３ドメインを含み、ＣＨ２ドメインにおいて互いに異なる第１のＣＤ１６ａ結合領域及び第２のＣＤ１６ａ結合領域のいずれかに改変を有し、
第１のＩｇＧ半量体は、第１の抗原に結合する抗原結合ドメインを含み、且つ第１のＣＤ１６ａ結合領域におけるＣＤ１６ａ結合活性が改変により減弱しており、
第２のＩｇＧ半量体は、第１の抗原と異なる第２の抗原に結合する抗原結合ドメインを含み、且つ第２のＣＤ１６ａ結合領域におけるＣＤ１６ａ結合活性が改変により減弱しており、
第１のＩｇＧ半量体と第２のＩｇＧ半量体との間において、Ｈ鎖間におけるジスルフィド結合が形成されない、第２のＩｇＧ半量体。
【請求項２４】
第１のＩｇＧ半量体と第２のＩｇＧ半量体とからなり、且つ互いに異なる第１の抗原及び第２の抗原に対する抗体組成物の製造に用いるための、第２のＩｇＧ半量体であって、
第１のＩｇＧ半量体及び第２のＩｇＧ半量体は、それぞれ、１つのＬ鎖及び１つのＨ鎖からなり、Ｈ鎖はＨ鎖可変領域、一部または全体の置換もしくは欠失、または修飾によりジスルフィド結合が形成されないように改変されたヒンジドメイン及びＣＨ１〜ＣＨ３ドメインを含み、ＣＨ２ドメインにおいて互いに異なる第１のＣＤ１６ａ結合領域及び第２のＣＤ１６ａ結合領域のいずれかに改変を有し、
第１のＩｇＧ半量体は、第１の抗原に結合する抗原結合ドメインを含み、且つ第１のＣＤ１６ａ結合領域におけるＣＤ１６ａ結合活性が改変により減弱しており、
第２のＩｇＧ半量体は、第２の抗原に結合する抗原結合ドメインを含み、且つ第２のＣＤ１６ａ結合領域におけるＣＤ１６ａ結合活性が改変により減弱しており、
第１のＩｇＧ半量体と第２のＩｇＧ半量体との間において、Ｈ鎖間におけるジスルフィド結合が形成されない、
第２のＩｇＧ半量体。
【請求項２５】
以下のａ）またはｂ）のＤＮＡ。
ａ）請求項２１または２２に記載の第１のＩｇＧ半量体のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ
ｂ）請求項２３または２４に記載の第２のＩｇＧ半量体のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ
【請求項２６】
請求項２５に記載のａ）及びｂ）の少なくとも一方のＤＮＡを含む組換えベクター。
【請求項２７】
請求項２６に記載の組換えベクターが導入された形質転換体。
【請求項２８】
請求項２７に記載の形質転換体を培地に培養し、培養物中に請求項２１または２２に記載の第１のＩｇＧ半量体及び請求項２３または２４に記載の第２のＩｇＧ半量体の少なくとも一方を蓄積させ、培養物から第１のＩｇＧ半量体及び第２のＩｇＧ半量体の少なくとも一方を採取する工程を含む抗体組成物の製造方法。
【請求項２９】
第１のＩｇＧ半量体及び第２のＩｇＧ半量体を含むキットであって、
第１のＩｇＧ半量体及び第２のＩｇＧ半量体は、それぞれ、１つのＬ鎖及び１つのＨ鎖からなり、Ｈ鎖はＨ鎖可変領域、一部または全体の置換もしくは欠失、または修飾によりジスルフィド結合が形成されないように改変されたヒンジドメイン及びＣＨ１〜ＣＨ３ドメインを含み、ＣＨ２ドメインにおいて互いに異なる第１のＣＤ１６ａ結合領域及び第２のＣＤ１６ａ結合領域のいずれかに改変を有し、
第１のＩｇＧ半量体は、第１の抗原に結合する抗原結合ドメインを含み、且つ第１のＣＤ１６ａ結合領域におけるＣＤ１６ａ結合活性が改変により減弱しており、
第２のＩｇＧ半量体は、第２の抗原に結合する抗原結合ドメインを含み、且つ第２のＣＤ１６ａ結合領域におけるＣＤ１６ａ結合活性が改変により減弱しており、
第１のＩｇＧ半量体と第２のＩｇＧ半量体との間において、Ｈ鎖間におけるジスルフィド結合が形成されない、
キット。
【請求項３０】
請求項１〜２０のいずれか１項に記載の抗体組成物を用いる、第１の抗原及び第２の抗原を共発現する標的細胞にのみエフェクター機能を誘導する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗体組成物及びその製造方法、ＩｇＧ半量体並びに該ＩｇＧ半量体を含むキットに関する。
【背景技術】
【０００２】
今までに承認された抗体医薬は様々な作用メカニズムを有することが知られる（非特許文献１）。その代表的なものとしては、増殖因子などのリガンドと受容体の結合を阻害する中和活性、結合した受容体を活性化するアゴニスト活性、並びに抗体依存性細胞傷害（ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ：以下ＡＤＣＣ）活性及び補体依存性細胞傷害（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ：以下ＣＤＣ）活性など、ＩｇＧクラスの抗体分子が有するエフェクター機能などがある。これらの中でも、ｒｉｔｕｘｉｍａｂ、ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂの臨床試験のバイオマーカー解析から、ＡＤＣＣ活性は抗体医薬の臨床における重要な作用メカニズムであることが示唆されている（非特許文献２、３）。【０００３】
抗体は二分子の重鎖（Ｈ鎖）及び二分子の軽鎖（Ｌ鎖）、合計４分子のポリペプチド鎖からなる約１５０ＫＤａの４量体タンパク質である。図１に示すように、抗体は、抗原結合に直接関与し抗体クローンごとにアミノ酸配列が異なる相補性決定（ＣＤＲ）領域を含む可変領域と、上述のエフェクター機能や血中半減期の制御を司るＦｃ領域（以下、Ｆｃとも略す）を含む定常領域に分けられる。ＦｃはＣＨ１〜ＣＨ３ドメイン及びヒンジドメインを含む。【０００４】
ヒト抗体は、Ｈ鎖定常領域の配列により機能の異なるＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＥの５つのクラスに分類される。さらにヒ卜ＩｇＧクラスはＩｇＧ１からＩｇＧ４までの４種のサブクラスに分かれる。【０００５】
その中でもＩｇＧ１サブクラスの抗体が最も高いＡＤＣＣ活性、ＣＤＣ活性を有することが知られ（非特許文献４）、ｒｉｔｕｘｉｍａｂ、ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂを含む、多くの抗体医薬がＩｇＧ１である。【０００６】
一方でＩｇＧ４サブクラスはエフェクター機能が低く、また固有のヒンジ領域のアミノ酸配列を有することや、二つのＣＨ３ドメイン間の相互作用が他のサブクラスと比較して弱いことによる、「Ｆａｂ  ａｒｍ  ｅｘｃｈａｎｇｅ」と呼ばれる、体内で二つのＨ鎖の可逆的な結合・乖離が起こることなどの特徴が知られる（非特許文献５、６）。【０００７】
ＡＤＣＣ活性はがん細胞表面の膜抗原に結合したＩｇＧ型の抗体のＦｃを、ナチュラルキラー細胞（以下ＮＫ細胞）などがＦｃ受容体の一種ＦｃγＲＩＩＩＡ（以下、ＣＤ１６ａとも略す）を介して認識し活性化され、その結果パーフォリンやグランザイム、Ｆａｓといった分子の発現を介して起こる細胞傷害のメカニズムである（非特許文献１）。【０００８】
Ｘ線結晶構造解析により、ＣＤ１６ａとヒトＩｇＧ１との結合様式は明らかとなっている（非特許文献７、８）。ＩｇＧ１のＦｃ上におけるＣＤ１６ａ結合領域は、Ｆｃの構造の点対称性より二箇所存在し、実際にはＦｃとＩｇＧは１：１の数比（ｓｔｏｉｃｈｉｏｍｅｔｒｙ）で結合する。そしてＦｃを構成する二つのＣＨ２ドメインにおいては、それぞれ異なる領域（以下、ＣＤ１６ａ結合領域）で接している。【０００９】
具体的には、ＣＤ１６ａは、ＩｇＧ１の一方のＣＨ２ドメイン上におけるＬ２３５、Ｇ２３６、Ｇ２３７、Ｐ２３８、Ｓ２３９、Ｄ２６５、Ｖ２６６、Ｓ２６７、Ｈ２６８、Ｅ２６９、Ｅ２９４、Ｑ２９５、Ｙ２９６、Ｎ２９７、Ｓ２９８、Ｔ２９９、Ｒ３０１、Ｎ３２５、Ａ３２７、Ｉ３３２等と相互作用する。一方で、ＣＤ１６ａは、同時にＩｇＧ１のもう一方のＣＨ２ドメイン上におけるＬ２３５、Ｇ２３６、Ｇ２３７、Ｋ３２６、Ａ３２７、Ｌ３２８、Ｐ３２９、Ａ３３０等に相互作用する（番号はＥＵナンバリングによるＣＨ２ドメイン上のアミノ酸の位置を表す）（非特許文献７、８、９、１０）。【００１０】
抗体医薬のＣＨ２ドメインを人工的に改変し、ＣＤ１６ａとの結合能を上昇させることによってＡＤＣＣ活性を増強させることが可能である。実際にＣＨ２ドメインのアミノ酸の改変によるＡＤＣＣ活性の増強例は数多く知られる（非特許文献１１）。【００１１】
また、Ｆｃに結合するＮ−結合型複合型糖鎖の糖鎖を改変することによってＡＤＣＣ活性を増強できることも知られている（非特許文献１２）。特に糖鎖改変によるＡＤＣＣ活性の増強技術は、ｍｏｇａｍｕｌｉｚｕｍａｂ（非特許文献１３）、ｏｂｉｎｕｔｕｚｕｍａｂ（非特許文献１４）といった承認済の抗体医薬に応用されている。【００１２】
バイスペシフィック抗体とは、天然の抗体とは異なり、二種類の異なる種類の抗原に結合することを可能にした人工的な改変抗体分子であり、数多くの分子形が報告されている（非特許文献１５）。【００１３】
図２Ａにバイスペシフィック抗体の構造の模式図を示す。バイスペシフィック抗体の医薬への応用として、例えば、がん細胞とＴ細胞表面のＣＤ３とに結合し（以下、ＣＤ３バイスペシフィック抗体）、両者を架橋することによるがん細胞の傷害、二種の機能分子の中和による薬効の増強が挙げられる（非特許文献１５）。【００１４】
がんや自己免疫疾患の治療において、病因細胞のがん細胞や自己反応性のリンパ球を除去するために、ＩｇＧ型抗体のエフェクター機能やＣＤ３バイスペシフィック抗体のＴ細胞リクルート機能を発揮する抗体医薬が用いられている。【００１５】
しかし、これらの病因細胞は本来正常な細胞由来であり、一般的には単一の表面マーカー分子では正確に正常細胞と区別できることはまれである。従ってエフェクター機能などを利用した病因細胞の除去は、多くの場合、同一の抗原分子を発現する正常細胞をも攻撃し副作用につながる恐れがある。【００１６】
例えば、リンパ腫や種々の自己免疫疾患の治療に用いられるｒｉｔｕｘｉｍａｂの標的抗原であるＣＤ２０は正常Ｂ細胞に、乳がん治療に用いられるｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂの標的抗原であるＨＥＲ２は心筋細胞にそれぞれ発現する。したがって、これらの抗体医薬により正常細胞が破壊されることによる副作用が懸念される。【００１７】
一方、Ｍａｚｏｒらは個々の標的抗原に対する親和性を弱めたバイスペシフィック抗体が、両陽性細胞に対して相対的に強くエフェクター活性を発揮する例を報告している（非特許文献１６）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１８】
【非特許文献１】Carter P. Nat Rev Cancer 2001; 1: 118-29
【非特許文献２】Cartron G, Dacheux L, Salles G, et al. Blood 2002; 99: 754-8
【非特許文献３】Weng WK, Levy R. J Clin Oncol 2003; 21: 3940-7
【非特許文献４】Birch, J.R., Lennox, E.S. (Eds.), Monoclonal Antibodies: Principles and Applications. Wiley-Liss, Inc., New York, 1995; p. 45.
【非特許文献５】Aalberse RC and Schuurman J, Immunology 2002; 105: 9-10
【非特許文献６】Labrijn AF, Nat Biotechnol 2009; 27: 767-71
【非特許文献７】Sondermann P, Nature 2000; 406: 267-73
【非特許文献８】Radaev S, J Biol Chem 2001; 276: 16469-77
【非特許文献９】Ferrara C, Proc Natl Acad Sci 2011; 108; 12660-74
【非特許文献１０】Mizushima T, Genes Cells 2011; 16: 1071-80
【非特許文献１１】Strohl WR, Curr Opin Biotechnol 2009; 20: 685-91
【非特許文献１２】Niwa R, J Pharm Sci 2015; 930-41
【非特許文献１３】Beck A, mAbs 2012; 4: 419-25
【非特許文献１４】Goede V, N Engl J Med 2014; 370: 1101-10
【非特許文献１５】Byrne H, Trends Biotechnol 2013; 31: 621-32
【非特許文献１６】Mazor Y, MAbs 2015; 7: 377-89
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１９】
上記した副作用の解決法の一つとしては、より選択性の高い病因細胞の除去のため、二種類の異なる抗原を認識して初めてエフェクター機能を発揮する、バイスペシフィック抗体による技術が考えられる。【００２０】
しかし、図２Ｂに示すように、通常のバイスペシフィック抗体によるエフェクター機能を用いて標的細胞を攻撃する場合、二種の抗原を共発現する標的細胞（以下、両陽性細胞とも略す）だけでなく、一種類の標的抗原のみを発現する細胞（以下、単陽性細胞とも略す）に対してもバイスペシフィック抗体が結合して攻撃する懸念がある。また、個々の標的抗原に対する親和性に関わらず、両陽性細胞に対して選択的にエフェクター機能を発揮し傷害する抗体技術は知られていない。【００２１】
したがって、本発明者らは、互いに異なる二種の抗原を共発現する標的細胞に対してより選択的にエフェクター機能を発揮し傷害する抗体組成物を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００２２】
本発明者らは、抗体分子の定常領域において、図３に示すように、通常のヒトＩｇＧ１抗体と異なる以下に示す［１］〜［３］の要素を有する抗体組成物により、上記課題を解決し得ることを着想した。
［１］互いに異なる第１の抗原（抗原分子Ｘ）及び第２の抗原（抗原分子Ｙ）に対する抗原結合部位を有する抗体の半量体（第１及び第２のＩｇＧ半量体）の混合物であること。すなわち、第１のＩｇＧ半量体と第２のＩｇＧ半量体との間において、Ｈ鎖間のジスルフィド結合による共有結合が存在しない「ＨＬ体」の混合物であること。
［２］抗原分子Ｘ、Ｙに対するそれぞれのＨＬ体が、抗原分子Ｘ、Ｙの両方を発現する標的細胞（Ｘ／Ｙ両陽性細胞）の表面に結合した後に会合して通常のＩｇＧと同様のＨ２Ｌ２体を形成し、ＣＤ１６ａ結合領域を構成し、抗体の活性を惹起すること。
［３］単一の抗原分子のみを発現する細胞に対しては抗体の活性を惹起しないよう、抗原分子Ｘ又はＹに対するＨＬ体同士が細胞表面で会合しホモ会合体を形成しても、ＣＤ１６ａ結合領域を構成しないこと。【００２３】
上記着想に基づき、本発明者らは、下記（１）及び（２）について見出し、本発明を完成させた。
（１）前記［１］については、図４に示すように、ＩｇＧ半量体のヒンジドメインにおける一部又は全体を置換もしくは欠失、または修飾することにより、ヒンジドメインにおいてＨ鎖間にジスルフィド結合が形成されないよう改変する。
（２）図５に示すように、ＣＤ１６ａはＦｃ中の二つのＣＨ２ドメイン（図５中、ＣＨ２−Ａ、ＣＨ２−Ｂ）に、それぞれ別の部位（ＣＨ２−Ａの領域１、ＣＨ２−Ｂの領域２）で接する。
したがって結合に使われていないＣＨ２−Ａの領域２、及びＣＨ２−Ｂの領域１を、それぞれアミノ酸の改変等により「破壊」して結合性を減弱させた場合、そのような改変ＣＨ２−Ａを有するＨＬ体同士のホモ会合体においてはＣＨ２−Ａの領域２のみ、あるいは改変ＣＨ２−Ｂを有するＨＬ体同士のホモ会合体においてはＣＨ２−Ｂの領域１のみが存在しないことになる。したがって、これらのホモ会合体にはＣＤ１６ａは十分な親和性を持って結合することができない。
一方、そのような改変ＣＨ２−Ａ、改変ＣＨ２−Ｂをそれぞれ構成要素として有するＨＬ体の組み合わせ（ヘテロ会合体）によれば、上記［２］及び［３］の条件を満たす抗体組成物が得られる。【００２４】
すなわち、本発明は以下に関する。
１．第１のＩｇＧ半量体と第２のＩｇＧ半量体とからなる、互いに異なる第１の抗原及び第２の抗原に対する抗体組成物であって、
第１のＩｇＧ半量体及び第２のＩｇＧ半量体は、それぞれ、１つのイムノグロブリン軽鎖（以下、Ｌ鎖と略記する）及び１つのイムノグロブリン重鎖（以下、Ｈ鎖と略記する）からなり、Ｈ鎖はＨ鎖可変領域、一部または全体の置換もしくは欠失、または修飾によりジスルフィド結合が形成されないように改変されたヒンジドメイン及びＣＨ１〜ＣＨ３ドメインを含み、ＣＨ２ドメインにおいて互いに異なる第１のＦｃγ受容体ＩＩＩＡ（以下、ＣＤ１６ａ）結合領域及び第２のＣＤ１６ａ結合領域のいずれかに改変を有し、
第１のＩｇＧ半量体は、第１の抗原に結合する抗原結合ドメインを含み、且つ第１のＣＤ１６ａ結合領域におけるＣＤ１６ａ結合活性が改変により減弱しており、
第２のＩｇＧ半量体は、第２の抗原に結合する抗原結合ドメインを含み、且つ第２のＣＤ１６ａ結合領域におけるＣＤ１６ａ結合活性が改変により減弱しており、
第１のＩｇＧ半量体と第２のＩｇＧ半量体との間において、Ｈ鎖間におけるジスルフィド結合が形成されない、
抗体組成物。
２．第１の抗原及び第２の抗原を共発現する標的細胞にのみエフェクター機能を発揮し傷害する、前記１に記載の抗体組成物。
３．第１のＣＤ１６ａ結合領域及び第２のＣＤ１６ａ結合領域における改変がアミノ酸の置換、欠失もしくは付加、または修飾である前記１または２に記載の抗体組成物。
４．第１のＣＤ１６ａ結合領域が、ＥＵインデックスで表される２３５位、２３６位、２３７位、２３８位、２３９位、２６５位、２６６位、２６７位、２６８位、２６９位、２９４位、２９５位、２９６位、２９７位、２９８位、２９９位、３０１位、３２５位、３２７位、３３２位のアミノ酸残基から選ばれる少なくとも１を含む前記１〜３のいずれか１に記載の抗体組成物。
５．第１のＣＤ１６ａ結合領域における改変が、ＥＵインデックスで表される２３５位、２３６位、２３７位、２３８位、２３９位、２６５位、２６６位、２６７位、２６８位、２６９位、２９４位、２９５位、２９６位、２９７位、２９８位、２９９位、３０１位、３２５位、３２７位、３３２位のアミノ酸残基から選ばれる少なくとも１のアミノ酸残基の置換である前記４に記載の抗体組成物。
６．第１のＣＤ１６ａ結合領域における改変が、ＥＵインデックスで表される２３５位、２３８位、２３９位、２６５位、２６７位、２６９位、２９６位、２９８位、２９９位、３２７位のアミノ酸残基から選ばれる少なくとも１のアミノ酸残基の置換である前記５に記載の抗体組成物。
７．第１のＣＤ１６ａ結合領域における改変が、ＥＵインデックスで表される２３５位のＬｅｕ、２３８位のＰｒｏ、２３９位のＳｅｒ、２６５位のＡｓｐ、２６７位のＳｅｒ、２６９位のＧｌｕ、２９６位のＴｙｒ、２９８位のＳｅｒ、２９９位のＴｈｒ、３２７位のＡｌａから選ばれる少なくとも１のアミノ酸残基の置換である前記６に記載の抗体組成物。
８．第１のＣＤ１６ａ結合領域における改変が、ＥＵインデックスで表されるＬ２３５Ｒ、Ｐ２３８Ａ、Ｓ２３９Ｒ、Ｄ２６５Ａ、Ｄ２６５Ｎ、Ｄ２６５Ｅ、Ｓ２６７Ｌ、Ｓ２６７Ｋ、Ｅ２６９Ｐ、Ｙ２９６Ｐ、Ｓ２９８Ｅ、Ｔ２９９Ａ、Ａ３２７Ｉから選ばれる少なくとも１のアミノ酸残基の置換である前記７に記載の抗体組成物。
９．第２のＣＤ１６ａ結合領域が、ＥＵインデックスで表される２３５位、２３６位、２３７位、３２６位、３２７位、３２８位、３２９位、３３０位のアミノ酸残基から選ばれる少なくとも１を含む前記１〜８のいずれか１に記載の抗体組成物。
１０．第２のＣＤ１６ａ結合領域における改変が、ＥＵインデックスで表される２３５位、２３６位、２３７位、３２６位、３２７位、３２８位、３２９位、３３０位のアミノ酸残基から選ばれる少なくとも１のアミノ酸残基の置換である前記９に記載の抗体組成物。
１１．第２のＣＤ１６ａ結合領域における改変が、ＥＵインデックスで表される３２６位、３２８位、３２９位、３３０位のアミノ酸残基から選ばれる少なくとも１から選ばれる少なくとも１のアミノ酸残基の置換である前記１０に記載の抗体組成物。
１２．第２のＣＤ１６ａ結合領域における改変が、ＥＵインデックスで表される３２６位のＬｙｓ、３２８位のＬｅｕ、３２９位のＰｒｏ、３３０のＡｌａから選ばれる少なくとも１のアミノ酸残基の置換である前記１１に記載の抗体組成物。
１３．第２のＣＤ１６ａ結合領域における改変が、ＥＵインデックスで表されるＫ３２６Ｗ、Ｋ３２６Ｇ、Ｌ３２８Ｖ、Ｌ３２８Ｒ、Ｐ３２９Ｙ、Ｐ３２９Ｋ、Ｐ３２９Ｗ、Ａ３３０Ｐから選ばれる少なくとも１のアミノ酸残基置換である前記１２に記載の抗体組成物。
１４．第１のＣＤ１６ａ結合領域における改変が、ＥＵインデックスで表される２３５位、２３８位、２３９位、２６５位、２６７位、２６９位、２９６位、２９８位、２９９位、３２７位のアミノ酸残基から選ばれる少なくとも１のアミノ酸残基の置換であり、第２のＣＤ１６ａ結合領域における改変が、ＥＵインデックスで表される３２６位、３２８位、３２９位、３３０位のアミノ酸残基から選ばれる少なくとも１のアミノ酸残基の置換である前記１〜１３のいずれか１に記載の抗体組成物。
１５．第１のＣＤ１６ａ結合領域における改変が、ＥＵインデックスで表される２３５位のＬｅｕ、２３８位のＰｒｏ、２３９位のＳｅｒ、２６５位のＡｓｐ、２６７位のＳｅｒ、２６９位のＧｌｕ、２９６位のＴｙｒ、２９８位のＳｅｒ、２９９位のＴｈｒ、３２７位のＡｌａから選ばれる少なくとも１のアミノ酸残基の置換であり、第２のＣＤ１６ａ結合領域における改変が、ＥＵインデックスで表される３２６位のＬｙｓ、３２８位のＬｅｕ、３２９位のＰｒｏ、３３０のＡｌａから選ばれる少なくとも１のアミノ酸残基の置換である前記１４に記載の抗体組成物。
１６．第１のＣＤ１６ａ結合領域における改変が、ＥＵインデックスで表されるＬ２３５Ｒ、Ｐ２３８Ａ、Ｓ２３９Ｒ、Ｄ２６５Ａ、Ｄ２６５Ｎ、Ｄ２６５Ｅ、Ｓ２６７Ｌ、Ｓ２６７Ｋ、Ｅ２６９、Ｐ、Ｙ２９６Ｐ、Ｓ２９８Ｅ、Ｔ２９９Ａ、Ａ３２７Ｉから選ばれる少なくとも１のアミノ酸残基の置換であり、第２のＣＤ１６ａ結合領域における改変が、ＥＵインデックスで表されるＫ３２６Ｗ、Ｋ３２６Ｇ、Ｌ３２８Ｖ、Ｌ３２８Ｒ、Ｐ３２９Ｙ、Ｐ３２９Ｋ、Ｐ３２９Ｗ、Ａ３３０Ｐから選ばれる少なくとも１のアミノ酸残基の置換である前記１５に記載の抗体組成物。
１７．第１のＣＤ１６ａ結合領域における改変が、ＥＵインデックスで表される２３８位、２３９位、２６５位、２６６位、２６７位、２６８位、２６９位、２９４位、２９５位、２９６位、２９７位、２９８位、２９９位、３０１位、３２５位、３３２位のアミノ酸残基から選ばれる少なくとも１のアミノ酸残基の置換である前記４に記載の抗体組成物。
１８．第１のＣＤ１６ａ結合領域における改変が、ＥＵインデックスで表される２３８位、２６５位、２６７位のアミノ酸残基から選ばれる少なくとも１のアミノ酸残基の置換である前記１〜１７のいずれか１に記載の抗体組成物。
１９．第１のＣＤ１６ａ結合領域における改変が、ＥＵインデックスで表される２３８位のＰｒｏ、２６５位のＡｓｐ、２６７位のＳｅｒから選ばれる少なくとも１のアミノ酸残基の置換である前記１８に記載の抗体組成物。
２０．第１のＣＤ１６ａ結合領域における改変が、ＥＵインデックスで表されるＰ２３８Ａ、Ｄ２６５Ａ、Ｓ２６７Ｌから選ばれる少なくとも１のアミノ酸残基置換である前記１９に記載の抗体組成物。
２１．第２のＣＤ１６ａ結合領域における改変が、ＥＵインデックスで表される３２６位、３２８位、３２９位のアミノ酸残基から選ばれる少なくとも１のアミノ酸残基の置換である前記１１〜２０のいずれか１に記載の抗体組成物。
２２．第２のＣＤ１６ａ結合領域における改変が、ＥＵインデックスで表される３２６位のＬｙｓ、３２８位のＬｅｕ、３２９位のＰｒｏから選ばれる少なくとも１のアミノ酸残基の置換である前記２１に記載の抗体組成物。
２３．第２のＣＤ１６ａ結合領域における改変が、ＥＵインデックスで表されるＫ３２６Ｗ、Ｌ３２８Ｖ、Ｐ３２９Ｙから選ばれる少なくとも１のアミノ酸残基置換である前記２２に記載の抗体組成物。
２４．第１のＩｇＧ半量体及び第２のＩｇＧ半量体が、ＥＵインデックスで表される２２６位及び２２９位の少なくとも一方のアミノ酸残基が置換されたヒンジドメインを含む前記１〜２３のいずれか１に記載の抗体組成物。
２５．第１のＩｇＧ半量体及び第２のＩｇＧ半量体における、Ｌ鎖、Ｈ鎖のＨ鎖可変領域及びＣＨ１ドメイン及びＣＨ２ドメインのイムノグロブリンサブクラスがＩｇＧ１である、前記１〜２４のいずれか１に記載の抗体組成物。
２６．第１のＩｇＧ半量体及び第２のＩｇＧ半量体における、Ｈ鎖のＣＨ３ドメインが、ＩｇＧ１サブクラスのＣＨ３ドメインよりもＣＨ３ドメイン間相互作用が弱い、前記２５に記載の抗体組成物。
２７．第１のＩｇＧ半量体及び第２のＩｇＧ半量体における、Ｈ鎖のＣＨ３ドメインのイムノグロブリンサブクラスがＩｇＧ４である、前記２６に記載の抗体組成物。
２８．第１のＩｇＧ半量体における第２のＣＤ１６ａ結合領域、及び第２のＩｇＧ半量体における第１のＣＤ１６ａ結合領域を介してＣＤ１６ａに結合する前記１〜２７のいずれか１に記載の抗体組成物。
２９．第１のＩｇＧ半量体及び第２のＩｇＧ半量体における、Ｆｃ領域に結合する全Ｎ−グリコシド結合型糖鎖のうち、糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンにフコースが結合していない糖鎖の割合が２０％以上である、前記１〜２８のいずれか１に記載の抗体組成物。
３０．第１のＩｇＧ半量体及び第２のＩｇＧ半量体が、ＣＨ２ドメインにおいて、さらにＣＤ１６ａ結合活性を増強させる少なくとも１のアミノ酸残基置換を含む前記１〜２９のいずれか１に記載の抗体組成物。
３１．第１のＩｇＧ半量体及び第２のＩｇＧ半量体が、ＣＨ２ドメインにおいて、ＥＵインデックスで表されるＳ２９８Ａ、Ｅ３３３Ａ、Ｋ３３４Ａから選ばれる少なくとも１のアミノ酸残基置換を含む前記３０に記載の抗体組成物。
３２．第２のＩｇＧ半量体と併用する第１のＩｇＧ半量体であって、第１のＩｇＧ半量体及び第２のＩｇＧ半量体は、それぞれ、１つのＬ鎖及び１つのＨ鎖からなり、Ｈ鎖はＨ鎖可変領域、一部または全体の置換もしくは欠失、または修飾によりジスルフィド結合が形成されないように改変されたヒンジドメイン及びＣＨ１〜ＣＨ３ドメインを含み、ＣＨ２ドメインにおいて互いに異なる第１のＣＤ１６ａ結合領域及び第２のＣＤ１６ａ結合領域のいずれかに改変を有し、
第１のＩｇＧ半量体は、第１の抗原に結合する抗原結合ドメインを含み、且つ第１のＣＤ１６ａ結合領域におけるＣＤ１６ａ結合活性が改変により減弱しており、
第２のＩｇＧ半量体は、第１の抗原とは異なる第２の抗原に結合する抗原結合ドメインを含み、且つ第２のＣＤ１６ａ結合領域におけるＣＤ１６ａ結合活性が改変により減弱しており、
第１のＩｇＧ半量体と第２のＩｇＧ半量体との間において、Ｈ鎖間におけるジスルフィド結合が形成されない、第１のＩｇＧ半量体。
３３．第１のＩｇＧ半量体と第２のＩｇＧ半量体とからなり、且つ互いに異なる第１の抗原及び第２の抗原に対する抗体組成物の製造に用いるための、第１のＩｇＧ半量体であって、
第１のＩｇＧ半量体及び第２のＩｇＧ半量体は、それぞれ、１つのＬ鎖及び１つのＨ鎖からなり、Ｈ鎖はＨ鎖可変領域、一部または全体の置換もしくは欠失、または修飾によりジスルフィド結合が形成されないように改変されたヒンジドメイン及びＣＨ１〜ＣＨ３ドメインを含み、ＣＨ２ドメインにおいて互いに異なる第１のＣＤ１６ａ結合領域及び第２のＣＤ１６ａ結合領域のいずれかに改変を有し、
第１のＩｇＧ半量体は、第１の抗原に結合する抗原結合ドメインを含み、且つ第１のＣＤ１６ａ結合領域におけるＣＤ１６ａ結合活性が改変により減弱しており、
第２のＩｇＧ半量体は、第２の抗原に結合する抗原結合ドメインを含み、且つ第２のＣＤ１６ａ結合領域におけるＣＤ１６ａ結合活性が改変により減弱しており、
第１のＩｇＧ半量体と第２のＩｇＧ半量体との間において、Ｈ鎖間におけるジスルフィド結合が形成されない、
第１のＩｇＧ半量体。
３４．第１のＣＤ１６ａ結合領域が、ＥＵインデックスで表される２３５位、２３６位、２３７位、２３８位、２３９位、２６５位、２６６位、２６７位、２６８位、２６９位、２９４位、２９５位、２９６位、２９７位、２９８位、２９９位、３０１位、３２５位、３２７位、３３２位のアミノ酸残基から選ばれる少なくとも１を含む前記３２又は３３に記載の第１のＩｇＧ半量体。
３５．第１のＣＤ１６ａ結合領域における改変が、ＥＵインデックスで表される２３５位、２３６位、２３７位、２３８位、２３９位、２６５位、２６６位、２６７位、２６８位、２６９位、２９４位、２９５位、２９６位、２９７位、２９８位、２９９位、３０１位、３２５位、３２７位、３３２位のアミノ酸残基から選ばれる少なくとも１のアミノ酸残基の置換である前記３４に記載の第１のＩｇＧ半量体。
３６．第１のＣＤ１６ａ結合領域における改変が、ＥＵインデックスで表される２３８位、２３９位、２６５位、２６６位、２６７位、２６８位、２６９位、２９４位、２９５位、２９６位、２９７位、２９８位、２９９位、３０１位、３２５位、３３２位のアミノ酸残基から選ばれる少なくとも１のアミノ酸残基の置換である前記３５に記載の第１のＩｇＧ半量体。
３７．第１のＣＤ１６ａ結合領域における改変が、ＥＵインデックスで表される２３５位、２３８位、２３９位、２６５位、２６７位、２６９位、２９６位、２９８位、２９９位、３２７位のアミノ酸残基から選ばれる少なくとも１のアミノ酸残基の置換である前記３６に記載の第１のＩｇＧ半量体。
３８．第１のＣＤ１６ａ結合領域における改変が、ＥＵインデックスで表される２３５位のＬｅｕ、２３８位のＰｒｏ、２３９位のＳｅｒ、２６５位のＡｓｐ、２６７位のＳｅｒ、２６９位のＧｌｕ、２９６位のＴｙｒ、２９８位のＳｅｒ、２９９位のＴｈｒ、３２７位のＡｌａから選ばれる少なくとも１のアミノ酸残基の置換である前記３７に記載の第１のＩｇＧ半量体。
３９．第１のＣＤ１６ａ結合領域における改変が、ＥＵインデックスで表されるＬ２３５Ｒ、Ｐ２３８Ａ、Ｓ２３９Ｒ、Ｄ２６５Ａ、Ｄ２６５Ｎ、Ｄ２６５Ｅ、Ｓ２６７Ｌ、Ｓ２６７Ｋ、Ｅ２６９Ｐ、Ｙ２９６Ｐ、Ｓ２９８Ｅ、Ｔ２９９Ａ、Ａ３２７Ｉから選ばれる少なくとも１のアミノ酸残基置換である前記３８に記載の第１のＩｇＧ半量体。
４０．第１のＩｇＧ半量体と併用する第２のＩｇＧ半量体であって、第１のＩｇＧ半量体及び第２のＩｇＧ半量体は、それぞれ、１つのＬ鎖及び１つのＨ鎖からなり、Ｈ鎖はＨ鎖可変領域、一部または全体の置換もしくは欠失、または修飾によりジスルフィド結合が形成されないように改変されたヒンジドメイン及びＣＨ１〜ＣＨ３ドメインを含み、ＣＨ２ドメインにおいて互いに異なる第１のＣＤ１６ａ結合領域及び第２のＣＤ１６ａ結合領域のいずれかに改変を有し、
第１のＩｇＧ半量体は、第１の抗原に結合する抗原結合ドメインを含み、且つ第１のＣＤ１６ａ結合領域におけるＣＤ１６ａ結合活性が改変により減弱しており、
第２のＩｇＧ半量体は、第１の抗原と異なる第２の抗原に結合する抗原結合ドメインを含み、且つ第２のＣＤ１６ａ結合領域におけるＣＤ１６ａ結合活性が改変により減弱しており、
第１のＩｇＧ半量体と第２のＩｇＧ半量体との間において、Ｈ鎖間におけるジスルフィド結合が形成されない、第２のＩｇＧ半量体。
４１．第１のＩｇＧ半量体と第２のＩｇＧ半量体とからなり、且つ互いに異なる第１の抗原及び第２の抗原に対する抗体組成物の製造に用いるための、第２のＩｇＧ半量体であって、
第１のＩｇＧ半量体及び第２のＩｇＧ半量体は、それぞれ、１つのＬ鎖及び１つのＨ鎖からなり、Ｈ鎖はＨ鎖可変領域、一部または全体の置換もしくは欠失、または修飾によりジスルフィド結合が形成されないように改変されたヒンジドメイン及びＣＨ１〜ＣＨ３ドメインを含み、ＣＨ２ドメインにおいて互いに異なる第１のＣＤ１６ａ結合領域及び第２のＣＤ１６ａ結合領域のいずれかに改変を有し、
第１のＩｇＧ半量体は、第１の抗原に結合する抗原結合ドメインを含み、且つ第１のＣＤ１６ａ結合領域におけるＣＤ１６ａ結合活性が改変により減弱しており、
第２のＩｇＧ半量体は、第２の抗原に結合する抗原結合ドメインを含み、且つ第２のＣＤ１６ａ結合領域におけるＣＤ１６ａ結合活性が改変により減弱しており、
第１のＩｇＧ半量体と第２のＩｇＧ半量体との間において、Ｈ鎖間におけるジスルフィド結合が形成されない、
第２のＩｇＧ半量体。
４２．第２のＣＤ１６ａ結合領域が、ＥＵインデックスで表される２３５位、２３６位、２３７位、３２６位、３２７位、３２８位、３２９位、３３０位のアミノ酸残基から選ばれる少なくとも１を含む前記４０または４１に記載の第２のＩｇＧ半量体。
４３．第２のＣＤ１６ａ結合領域における改変が、ＥＵインデックスで表される２３５位、２３６位、２３７位、３２６位、３２７位、３２８位、３２９位、３３０位のアミノ酸残基から選ばれる少なくとも１のアミノ酸残基の置換である前記４２に記載の第２のＩｇＧ半量体。
４４．第２のＣＤ１６ａ結合領域における改変が、ＥＵインデックスで表される３２６位、３２８位、３２９位、３３０位のアミノ酸残基から選ばれる少なくとも１のアミノ酸残基の置換である前記４３に記載の第２のＩｇＧ半量体。
４５．第２のＣＤ１６ａ結合領域における改変が、ＥＵインデックスで表される３２６位のＬｙｓ、３２８位のＬｅｕ、３２９位のＰｒｏ、３３０のＡｌａから選ばれる少なくとも１のアミノ酸残基の置換である前記４４に記載の第２のＩｇＧ半量体。
４６．第２のＣＤ１６ａ結合領域における改変が、ＥＵインデックスで表されるＫ３２６Ｗ、Ｋ３２６Ｇ、Ｌ３２８Ｖ、Ｌ３２８Ｒ、Ｐ３２９Ｙ、Ｐ３２９Ｋ、Ｐ３２９Ｗ、Ａ３３０Ｐから選ばれる少なくとも１のアミノ酸残基置換である前記４５に記載の第２のＩｇＧ半量体。
４７．以下のａ）またはｂ）のＤＮＡ。
ａ）前記３２〜３９のいずれか１に記載の第１のＩｇＧ半量体のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ
ｂ）前記４０〜４６のいずれか１に記載の第２のＩｇＧ半量体のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ
４８．前記４７に記載のａ）及びｂ）の少なくとも一方のＤＮＡを含む組換えベクター。
４９．前記４８に記載の組換えベクターが導入された形質転換体。
５０．前記４９に記載の形質転換体を培地に培養し、培養物中に前記３２〜３９のいずれか１に記載の第１のＩｇＧ半量体及び前記４０〜４６のいずれか１に記載の第２のＩｇＧ半量体の少なくとも一方を蓄積させ、培養物から第１のＩｇＧ半量体及び第２のＩｇＧ半量体の少なくとも一方を採取する工程を含む抗体組成物の製造方法。
５１．第１のＩｇＧ半量体及び第２のＩｇＧ半量体を含むキットであって、
第１のＩｇＧ半量体及び第２のＩｇＧ半量体は、それぞれ、１つのＬ鎖及び１つのＨ鎖からなり、Ｈ鎖はＨ鎖可変領域、一部または全体の置換もしくは欠失、または修飾によりジスルフィド結合が形成されないように改変されたヒンジドメイン及びＣＨ１〜ＣＨ３ドメインを含み、ＣＨ２ドメインにおいて互いに異なる第１のＣＤ１６ａ結合領域及び第２のＣＤ１６ａ結合領域のいずれかに改変を有し、
第１のＩｇＧ半量体は、第１の抗原に結合する抗原結合ドメインを含み、且つ第１のＣＤ１６ａ結合領域におけるＣＤ１６ａ結合活性が改変により減弱しており、
第２のＩｇＧ半量体は、第２の抗原に結合する抗原結合ドメインを含み、且つ第２のＣＤ１６ａ結合領域におけるＣＤ１６ａ結合活性が改変により減弱しており、
第１のＩｇＧ半量体と第２のＩｇＧ半量体との間において、Ｈ鎖間におけるジスルフィド結合が形成されない、
キット。
５２．前記１〜３１に記載の抗体組成物を用いる、第１の抗原及び第２の抗原を共発現する標的細胞にのみエフェクター機能を誘導する方法。
【発明の効果】
【００２５】
本発明の抗体組成物は、互いに異なる２種の抗原に対する抗原結合ドメインを有し、互いに異なるＣＤ１６ａ結合領域におけるＣＤ１６ａ結合活性が減弱している２種のＩｇＧ半量体である、第１及び第２のＩｇＧ半量体からなる。このことから、第１のＩｇＧ半量体同士、又は第２のＩｇＧ半量体同士によりホモ会合体の抗体構造を構成しても、ＣＤ１６ａと結合することはできず、抗体の有する活性を発揮し得ない。一方、第１及び第２のＩｇＧ半量体によりヘテロ会合体の抗体構造が構成されると、第１のＩｇＧ半量体における第２のＣＤ１６ａ結合領域と、第２のＩｇＧ半量体における第１のＣＤ１６ａ結合領域とを介してＣＤ１６ａに対し結合可能となる。【００２６】
また、第１及び第２のＩｇＧ半量体におけるヒンジドメインは、ジスルフィド結合が形成されないように改変されている。このことにより、第１のＩｇＧ半量体と第２のＩｇＧ半量体との間において、Ｈ鎖間におけるジスルフィド結合が形成されない。したがって、第１及び第２のＩｇＧ半量体を混合した場合には、第１及び第２のＩｇＧ半量体を会合体又は半量体の平衡状態で存在させることが可能となる。このことにより、本発明の抗体組成物は、単陽性細胞と比較して、両陽性細胞に対してより選択的にエフェクター機能を発揮し傷害し得る。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１】図１は、抗体、ＶＨＨ−Ｆｃ及びｓｃＦｖ−Ｆｃの構造を示す模式図である。
【図２Ａ】図２Ａは、一般的なバイスペシフィック抗体の構造の模式図を示す。
【図２Ｂ】図２Ｂは、一般的なバイスペシフィック抗体による結合様式の模式図を示す。
【図３】図３は、本発明の抗体組成物による結合様式の一態様の模式図を示す。
【図４】図４は、本発明の抗体組成物の構造の一態様の模式図を示す。
【図５】図５は、通常のヒトＩｇＧとＣＤ１６ａとの結合様式の模式図を示す。
【図６】図６は、本発明の抗体組成物とＣＤ１６ａとの結合様式の模式図を示す。
【図７】図７は、通常のヒトＩｇＧ１のフォーマット上におけるアミノ酸改変の候補部位を示す模式図である。
【図８】図８は、ＣＤ１６ａ結合領域を「破壊」したヒトＩｇＧ１抗ＣＣＲ６抗体のＡＤＣＣ活性を示す図である。
【図９】図９は、ＣＨ２−ＡとＣＨ２−Ｂのみにそれぞれ上記の改変を非対称に導入してＡＤＣＣ活性を評価するための一価抗体の模式図である。
【図１０】図１０は、ＣＤ１６ａ結合非対称改変一価抗体のＡＤＣＣ活性を示す図である。
【図１１】図１１は、実施例３で用いたＩｇＧ１１１４＿ＡＡ＿ＡＡＡ＿Ｄ２６５Ａ（／Ｐ３２９Ｙ）型のＩｇＧ半量体の模式図である。
【図１２】図１２は、抗ＣＤ４及びＣＤ７０半量体のＳＤＳ−ＰＡＧＥによる精製度を評価した結果である。
【図１３】図１３は、ＣＤ４単陽性細胞、ＣＤ７０単陽性細胞、ＣＤ４／ＣＤ７０両陽性細胞におけるＣＤ４及びＣＤ７０の抗原発現を測定した結果である。
【図１４】図１４は、ＣＤ４単陽性細胞、ＣＤ７０単陽性細胞、ＣＤ４／ＣＤ７０両陽性細胞に対する抗ＣＤ４及びＣＤ７０  ＩｇＧ１及び半量体のＡＤＣＣ活性を示す図である。
【図１５Ａ】図１５Ａは、ＣＤ４／ＣＤ７０両陽性細胞（ＴＬ−Ｏｍ１）、ＣＤ７０単陽性細胞（ＭＴ−１）、ＣＤ４単陽性細胞（ＣＤ４／ＥＬ４）に対する各半量体添加時のＡＤＣＣ活性を示す図である。
【図１５Ｂ】図１５Ｂは、ＣＤ４／ＣＤ７０両陽性細胞（ＴＬ−Ｏｍ１）、ＣＤ７０単陽性細胞（ＭＴ−１）、ＣＤ４単陽性細胞（ＣＤ４／ＥＬ４）に対する各半量体添加時のＡＤＣＣ活性を示す図である。
【図１５Ｃ】図１５Ｃは、ＣＤ４／ＣＤ７０両陽性細胞（ＴＬ−Ｏｍ１）、ＣＤ７０単陽性細胞（ＭＴ−１）、ＣＤ４単陽性細胞（ＣＤ４／ＥＬ４）に対する各半量体添加時のＡＤＣＣ活性を示す図である。
【図１５Ｄ】図１５Ｄは、ＣＤ４／ＣＤ７０両陽性細胞（ＴＬ−Ｏｍ１）、ＣＤ７０単陽性細胞（ＭＴ−１）、ＣＤ４単陽性細胞（ＣＤ４／ＥＬ４）に対する各半量体添加時のＡＤＣＣ活性を示す図である。
【図１５Ｅ】図１５Ｅは、ＣＤ４／ＣＤ７０両陽性細胞（ＴＬ−Ｏｍ１）、ＣＤ７０単陽性細胞（ＭＴ−１）、ＣＤ４単陽性細胞（ＣＤ４／ＥＬ４）に対する各半量体添加時のＡＤＣＣ活性を示す図である。
【図１５Ｆ】図１５Ｆは、ＣＤ４／ＣＤ７０両陽性細胞（ＴＬ−Ｏｍ１）、ＣＤ７０単陽性細胞（ＭＴ−１）、ＣＤ４単陽性細胞（ＣＤ４／ＥＬ４）に対する各半量体添加時のＡＤＣＣ活性を示す図である。
【図１５Ｇ】図１５Ｇは、ＣＤ４／ＣＤ７０両陽性細胞（ＴＬ−Ｏｍ１）、ＣＤ７０単陽性細胞（ＭＴ−１）、ＣＤ４単陽性細胞（ＣＤ４／ＥＬ４）に対する各半量体添加時のＡＤＣＣ活性を示す図である。
【図１５Ｈ】図１５Ｈは、ＣＤ４／ＣＤ７０両陽性細胞（ＴＬ−Ｏｍ１）、ＣＤ７０単陽性細胞（ＭＴ−１）、ＣＤ４単陽性細胞（ＣＤ４／ＥＬ４）に対する各半量体、抗ＣＤ４又はＣＤ７０ＩｇＧ１添加時のＡＤＣＣ活性を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２８】
１．抗体組成物の構造
本発明において抗体分子はイムノグロブリン（以下、Ｉｇと表記する）とも称され、ヒト抗体は、分子構造の違いに応じて、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４及びＩｇＭのアイソタイプに分類される。アミノ酸配列の相同性が比較的高いＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３及びＩｇＧ４を総称してＩｇＧともいう。
【００２９】
抗体分子は重鎖（ｈｅａｖｙ  ｃｈａｉｎ、以下Ｈ鎖と記す）及び軽鎖（ｌｉｇｈｔ  ｃｈａｉｎ、以下Ｌ鎖と記す）と呼ばれるポリペプチドより構成される。抗体は２つのＨ鎖及び２つのＬ鎖からなる４量体タンパク質である。
【００３０】
また、Ｈ鎖はＮ末端側よりＨ鎖可変領域（ＶＨとも表記される）、Ｈ鎖定常領域（ＣＨとも表記される）、Ｌ鎖はＮ末端側よりＬ鎖可変領域（ＶＬとも表記される）、Ｌ鎖定常領域（ＣＬとも表記される）の各領域により、それぞれ構成される。ＣＨは各サブクラスにおいて、α、δ、ε、γ及びμ鎖がそれぞれ知られている。ＣＬは、λ及びκが知られている。
【００３１】
ドメインとは、抗体分子の各ポリペプチドを構成する機能的な構造単位をいう。また、本発明におけるＦｃ領域（Ｆｃ）とは、ヒンジドメイン、ＣＨ２ドメイン及びＣＨ３ドメインから成るＨ鎖定常領域の部分配列及び部分構造を指す。
【００３２】
ＣＨはさらに、Ｎ末端側よりＣＨ１ドメイン、ヒンジドメイン、ＣＨ２ドメイン及びＣＨ３ドメインの各ドメインにより構成される。本発明におけるＣＨ１ドメイン、ヒンジドメイン、ＣＨ２ドメイン、ＣＨ３ドメイン及びＦｃは、ＥＵインデックス［Kabat et al.,Sequences of Proteins of Immunological Interest,US Dept.Health and Human Services(1991)］により、Ｎ末端からのアミノ酸残基の番号で特定することができる。
【００３３】
具体的には、ＣＨ１はＥＵインデックス１１８〜２１５位のアミノ酸配列、ヒンジはＥＵインデックス２１６〜２３０位のアミノ酸配列、ＣＨ２はＥＵインデックス２３１〜３４０位のアミノ酸配列、ＣＨ３はＥＵインデックス３４１〜４４７位のアミノ酸配列とそれぞれ特定される。
【００３４】
本発明におけるＩｇＧとしては、少なくとも抗原結合ドメイン及びＦｃを有する、ＩｇＧに機能が類似する人工的な亜種の改変分子をも含む。具体的には、ＩｇＧのアミノ酸が置換、欠失もしくは付加、または修飾された改変分子、さらにはポリペプチドやドメインの付加体等を含む。また、ＩｇＧのＶＨ、ＶＬ、あるいはＦａｂからなる抗原結合部位の一部もしくは全部を、他の抗原結合ドメインに置き換えたものも含む。具体的には、図１に示されるｓｉｎｇｌｅ−ｃｈａｉｎ  Ｆｖ（ｓｃＦｖ）−Ｆｃ、ＶＨＨ−Ｆｃなども含む（Brinkmann U et al., MABS 2017, 9: 182-212; Fernandes CFC et al., Frontiers in Immunology 2017, 8: 653）。
【００３５】
本発明において抗体としては、ハイブリドーマから取得されるモノクローナル抗体の他に、遺伝子組換え技術により作製された遺伝子組換え抗体も含まれる。遺伝子組換え抗体としては、ヒト抗体定常領域を非ヒト抗体可変領域に結合させたキメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体産生動物など用いて作製されるヒト抗体が包含される。
【００３６】
キメラ抗体は、モノクローナル抗体を生産する非ヒト動物細胞由来のハイブリドーマより、ＶＨ及びＶＬをコードするｃＤＮＡを取得し、ヒト抗体のＣＨ及びＣＬをコードするＤＮＡを有する動物細胞用発現ベクターにそれぞれ挿入してヒト型キメラ抗体発現ベクターを構築し、動物細胞へ導入することにより発現させ、製造することができる。
【００３７】
ヒト化抗体とは、非ヒト抗体可変領域のＨ鎖及びＬ鎖の相補性決定領域（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ  ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ  ｒｅｇｉｏｎ、以下、ＣＤＲと略記する）をヒト抗体可変領域のフレームワーク領域（以下、ＦＲと略記する）に挿入することで作製される抗体をいう。
【００３８】
ヒト化抗体（又は、ＣＤＲ移植抗体）は、次の方法により製造できる。非ヒト動物抗体のＶＨのＣＤＲのアミノ酸配列と任意のヒト抗体のＶＨのＦＲのアミノ酸配列からなるＶＨのアミノ酸配列をコードするｃＤＮＡと、非ヒト動物抗体のＶＬのＣＤＲのアミノ酸配列と任意のヒト抗体のＶＬのＦＲのアミノ酸配列からなるＶＬのアミノ酸配列をコードするｃＤＮＡを構築する。ヒト抗体のＣＨ及びＣＬをコードするＤＮＡを有する動物細胞用発現ベクターにこれらのｃＤＮＡをそれぞれ挿入してヒト化抗体発現ベクターを構築し、動物細胞へ導入することにより発現させることによりヒト化抗体を製造できる。
【００３９】
ヒト抗体は、元来、ヒト体内に天然に存在し得る抗体又はヒト遺伝子によってコードされるアミノ酸配列からなる抗体をいうが、最近の遺伝子工学的、細胞工学的、発生工学的な技術の進歩により作製されたヒト抗体ファージライブラリー、不死化ヒト末梢血リンパ球のクローニング又はヒト抗体産生トランスジェニック動物から得られる抗体等も含まれる。
【００４０】
ヒト抗体は、ヒトイムノグロブリン遺伝子を保持するマウス（Tomizuka K.et.al.,Proc Natl Acad Sci USA.97,722-7,2000）に所望の抗原を免疫することにより、取得することが出来る。また、ヒト由来のＢ細胞から抗体遺伝子を増幅したｐｈａｇｅ  ｄｉｓｐｌａｙライブラリーを用いることにより、所望の結合活性を有するヒト抗体を選択することで、免疫を行わずにヒト抗体を取得することができる（Winter G. et. al., Annu Rev Immunol. 12: 433-55. 1994）。
【００４１】
さらに、ＥＢウイルスを用いてヒトＢ細胞を不死化することにより、所望の結合活性を有するヒト抗体を生産する細胞を作製し、ヒト抗体を取得することができる（Rosen A. et. al., Nature 267, 52-54. 1977）。
【００４２】
ヒト体内に存在する抗体は、例えば、ヒト末梢血から単離したリンパ球を、ＥＢウイルス等を感染させることによって不死化した後、クローニングすることにより、該抗体を産生するリンパ球を培養でき、培養物中より該抗体を精製することができる。
【００４３】
ヒト抗体ファージライブラリーは、ヒトＢ細胞から調製した抗体遺伝子をファージ遺伝子に挿入することにより、Ｆａｂ又はｓｃＦｖ等の抗体断片を表面に発現させたファージのライブラリーである。該ライブラリーより、抗原を固定化した基質に対する結合活性を指標として所望の抗原結合活性を有する抗体断片を発現しているファージを回収することができる。該抗体断片は、更に遺伝子工学的手法により、２本の完全なＨ鎖及び２本の完全なＬ鎖からなるヒト抗体分子へも変換することができる。
【００４４】
ヒト抗体産生トランスジェニック動物は、ヒト抗体遺伝子が宿主動物の染色体内に組込まれた動物をいう。具体的には、マウスＥＳ細胞へヒト抗体遺伝子を導入し、該ＥＳ細胞を他のマウスの初期胚へ移植後、発生させることによりヒト抗体産生トランスジェニック動物を作製することができる。
【００４５】
ヒト抗体産生トランスジェニック動物からのヒト抗体の作製方法は、通常のヒト以外の哺乳動物で行われているハイブリドーマ作製方法によりヒト抗体産生ハイブリドーマを取得し、培養することで培養物中にヒト抗体を産生蓄積させることができる。
【００４６】
ＶＨ及びＶＬのアミノ酸配列としては、ヒト抗体のＶＨ及びＶＬのアミノ酸配列、非ヒト動物抗体のＶＨ及びＶＬのアミノ酸配列、非ヒト動物抗体のＣＤＲを、ヒト抗体のフレームワークに移植したヒト化抗体のアミノ酸配列並びにヒト抗体由来のＶＨ及びＶＬのアミノ酸配列のいずれでもよい。
【００４７】
具体的には、ハイブリドーマ又は抗体産生細胞が産生する非ヒト動物抗体、ヒト化抗体及びヒト抗体のＶＨ及びＶＬのアミノ酸配列などが挙げられる。
【００４８】
ＣＬのアミノ酸配列としては、ヒト抗体のアミノ酸配列又は非ヒト動物抗体のアミノ酸配列のいずれでもよいが、ヒト抗体のＣκ又はＣλのアミノ酸配列が好ましい。
【００４９】
ＣＨとしては、イムノグロブリンに属すればいかなるものでもよいが、好ましくはヒトＩｇＧクラスに属するサブクラス、γ１（ＩｇＧ１）、γ２（ＩｇＧ２）、γ３（ＩｇＧ３）、γ４（ＩｇＧ４）のいずれも用いることができる。
【００５０】
「抗原結合ドメイン」としては、抗体、リガンド及び受容体など既知の結合分子の結合ドメインを利用して組換えた結合タンパク質でもよく、具体的には各抗原に結合する抗体のＣＤＲを含む組換えタンパク質、ＣＤＲを含む抗体可変領域、抗体可変領域及び各抗原に結合するリガンドの結合ドメインを含む組換えタンパク質などが挙げられる。なかでも、本発明においては、抗原結合ドメインは抗体可変領域であることが好ましい。
【００５１】
本発明の抗体組成物は、第１のＩｇＧ半量体と第２のＩｇＧ半量体とからなる、互いに異なる第１の抗原及び第２の抗原に対する抗体組成物であって、以下の１）〜４）の性質を有する。
１）第１及び第２のＩｇＧ半量体は、それぞれ、１つのＬ鎖及び１つのＨ鎖からなり、Ｈ鎖はＨ鎖可変領域、一部又は全体の置換もしくは欠失、または修飾によりジスルフィド結合が形成されないように改変されたヒンジドメイン及びＣＨ１〜ＣＨ３ドメインを含み、ＣＨ２ドメインにおいて互いに異なる第１及び第２のＣＤ１６ａ結合領域のいずれかに改変を有する。
２）第１のＩｇＧ半量体は、第１の抗原に結合する抗原結合ドメインを含み、且つ第１のＣＤ１６ａ結合領域におけるＣＤ１６ａ結合活性が改変により減弱している。
３）第２のＩｇＧ半量体は、第２の抗原に結合する抗原結合ドメインを含み、且つ第２のＣＤ１６ａ結合領域におけるＣＤ１６ａ結合活性が改変により減弱している。
４）第１のＩｇＧ半量体と第２のＩｇＧ半量体との間において、Ｈ鎖間におけるジスルフィド結合が形成されない。
【００５２】
「互いに異なる第１の抗原及び第２の抗原に対する抗体組成物」とは、第１の抗原に対するＩｇＧ半量体及び第２の抗原に対するＩｇＧ半量体を含む組成物を示す。
【００５３】
本発明の抗体組成物におけるＩｇＧ半量体の取り得る態様としては、例えば半量体及び２量体が挙げられる。半量体としては、例えば、第１のＩｇＧ半量体、第２のＩｇＧ半量体が挙げられる。２量体としては、例えば、第１のＩｇＧ半量体の２量体、第２のＩｇＧ半量体の２量体、第１のＩｇＧ半量体と第２のＩｇＧ半量体との２量体が挙げられる。
【００５４】
本発明の「互いに異なる第１の抗原及び第２の抗原に対する抗体組成物」は、同一抗原中の第１の抗原決定基（エピトープ）に対するＩｇＧ半量体及び第２の抗原決定基（エピトープ）に対するＩｇＧ半量体を含む抗体組成物をも包含する。
【００５５】
「ＩｇＧ半量体」とは、１つのＬ鎖及び１つのＨ鎖からなる２量体タンパク質であり、Ｈ鎖は、Ｈ鎖可変領域及びＣＨ１〜ＣＨ３ドメインを含む。ＩｇＧ半量体のＨ鎖のＣＨ２ドメインには、互いに異なる２箇所のＣＤ１６ａ結合領域（第１及び第２のＣＤ１６ａ結合領域）が存する。
【００５６】
また、「ＩｇＧ半量体」とは、抗原結合ドメイン及びＦｃを有する、ＩｇＧに機能が類似する人工的な亜種の改変分子の半量体をも含む。具体的には、ＩｇＧのアミノ酸の置換、欠失もしくは付加、または修飾された改変分子の半量体、さらにはポリペプチドやドメインの付加体の半量体などを含む。また、ＩｇＧのＶＨ、ＶＬ、あるいはＦａｂからなる抗原結合部位の一部もしくは全部を、他の抗原結合ドメインに置き換えたものの半量体、具体的には、図１に示されるｓｉｎｇｌｅ−ｃｈａｉｎ  Ｆｖ（ｓｃＦｖ）−Ｆｃ、ＶＨＨ−Ｆｃなどの半量体も含む。
【００５７】
「ＣＤ１６ａ結合領域」とは、ＩｇＧのＦｃに存在するＣＤ１６ａと結合する領域をいう。ＩｇＧ１のＦｃ上におけるＣＤ１６ａ結合領域はＦｃの構造の点対称性より二箇所存在し、Ｆｃを構成する二つのＣＨ２ドメインにおいてそれぞれ異なる領域でＣＤ１６ａと接している。
【００５８】
第１のＣＤ１６ａ結合領域としては、ＥＵインデックスで表される２３５位、２３６位、２３７位、２３８位、２３９位、２６５位、２６６位、２６７位、２６８位、２６９位、２９４位、２９５位、２９６位、２９７位、２９８位、２９９位、３０１位、３２５位、３２７位、３３２位のアミノ酸残基から選ばれる少なくとも１を含む領域が挙げられる。
【００５９】
ＣＨ２ドメインのイムノグロブリンサブクラスがＩｇＧ１である場合、第１のＣＤ１６ａ結合領域としては、ＥＵインデックスで表される２３５位のＬｅｕ、２３６位のＧｌｙ、２３７位のＧｌｙ、２３８位のＰｒｏ、２３９位のＳｅｒ、２６５位のＡｓｐ、２６６位のＶａｌ、２６７位のＳｅｒ、２６８位のＨｉｓ、２６９位のＧｌｕ、２９４位のＧｌｕ、２９５位のＧｌｎ、２９６位のＴｙｒ、２９７位のＡｓｎ、２９８位のＳｅｒ、２９９のＴｈｒ、３０１位のＡｒｇ、３２５位のＡｓｎ、３２７位のＡｌａ、３３２位のＩｌｅのアミノ酸残基から選ばれる少なくとも１を含む領域が挙げられる。
【００６０】
第２のＣＤ１６ａ結合領域としては、ＥＵインデックスで表される２３５位、２３６位、２３７位、３２６位、３２７位、３２８位、３２９位、３３０位のアミノ酸残基から選ばれる少なくとも１を含む領域が挙げられる。
【００６１】
ＣＨ２ドメインのイムノグロブリンサブクラスがＩｇＧ１である場合、第２のＣＤ１６ａ結合領域としては、ＥＵインデックスで表される２３５位のＬｅｕ、２３６位のＧｌｙ、２３７位のＧｌｙ、３２６位のＬｙｓ、３２７位のＡｌａ、３２８位のＬｅｕ、３２９位のＰｒｏ、３３０位のＡｌａのアミノ酸残基から選ばれる少なくとも１を含む領域が挙げられる。
【００６２】
「ＣＤ１６ａ結合活性」とは、ＩｇＧのＦｃがＣＤ１６ａに結合する活性をいう。ＩｇＧ半量体のＣＤ１６ａ結合活性は、２分子のＩｇＧ半量体を組み合わせてＩｇＧを構成し、遺伝子組み換えＣＤ１６ａタンパク質を作製して、結合活性を測定することで確認することができる（米国特許出願公開第２００４／０２５９１５０号明細書）。また、ＩｇＧ半量体のＦｃにおいて後述するエフェクター活性（ＡＤＣＣ活性等）を備えさせ、該ＩｇＧ半量体を２分子組み合わせたＩｇＧを構成し、該ＩｇＧのエフェクター活性を測定することで確認することもできる。
【００６３】
「ＣＤ１６ａ結合領域におけるＣＤ１６ａ結合活性が減弱している」とは、Ｆｃにおいて第１又は第２のＣＤ１６ａ結合領域におけるＣＤ１６ａ結合活性を減弱させる改変を加えたＩｇＧ半量体を２分子組み合わせたＩｇＧのエフェクター活性（ＡＤＣＣ活性等）が、改変する前のＩｇＧ半量体を２分子組み合わせたＩｇＧのエフェクター活性と比較して、低下していることをいう。
【００６４】
ＣＤ１６ａ結合領域におけるＣＤ１６ａ結合活性は、ＣＤ１６ａ結合領域における改変により減弱させる。改変としては、例えば、アミノ酸残基の置換、欠失もしくは付加、または修飾が挙げられる。
【００６５】
第１のＣＤ１６ａ結合領域におけるＣＤ１６ａ結合活性を減弱させる改変として、ＥＵインデックスで表される２３５位、２３６位、２３７位、２３８位、２３９位、２６５位、２６６位、２６７位、２６８位、２６９位、２９４位、２９５位、２９６位、２９７位、２９８位、２９９位、３０１位、３２５位、３２７位、３３２位のアミノ酸残基から選ばれる少なくとも１のアミノ酸残基の置換が挙げられ、２３５位、２３８位、２３９位、２６５位、２６６位、２６７位、２６８位、２６９位、２９４位、２９５位、２９６位、２９７位、２９８位、２９９位、３０１位、３２５位、３３２位のアミノ酸残基から選ばれる少なくとも１のアミノ酸残基の置換が好ましく、２３５位、２３８位、２３９位、２６５位、２６７位、２６９位、２９６位、２９８位、２９９位、３２７位のアミノ酸残基から選ばれる少なくとも１のアミノ酸残基の置換がより好ましい。アミノ酸残基置換の組合せとしては、例えば、２３８位及び２６５位の組合せ（以下、このような組合せを２３８位／２６５位等と表記する）、２３８位／２６７位、２６５位／２６７位、２３８位／２６５位／２６７位のアミノ酸残基の置換が挙げられる。
【００６６】
ＣＨ２ドメインのイムノグロブリンサブクラスがＩｇＧ１である場合、第１のＣＤ１６ａ結合領域におけるＣＤ１６ａ結合活性を減弱させる改変としては、ＥＵインデックスで表される２３５位のＬｅｕ、２３６位のＧｌｙ、２３７位のＧｌｙ、２３８位のＰｒｏ、２３９位のＳｅｒ、２６５位のＡｓｐ、２６６位のＶａｌ、２６７位のＳｅｒ、２６８位のＨｉｓ、２６９位のＧｌｕ、２９４位のＧｌｕ、２９５位のＧｌｎ、２９６位のＴｙｒ、２９７位のＡｓｎ、２９８位のＳｅｒ、２９９位のＴｈｒ、３０１位のＡｒｇ、３２５位のＡｓｎ、３２７位のＡｌａ、３３２位のＩｌｅから選ばれる少なくとも１のアミノ酸残基の置換が挙げられ、２３５位のＬｅｕ、２３８位のＰｒｏ、２３９位のＳｅｒ、２６５位のＡｓｐ、２６６位のＶａｌ、２６７位のＳｅｒ、２６８位のＨｉｓ、２６９位のＧｌｕ、２９４位のＧｌｕ、２９５位のＧｌｎ、２９６位のＴｙｒ、２９７位のＡｓｎ、２９８位のＳｅｒ、２９９位のＴｈｒ、３０１位のＡｒｇ、３２５位のＡｓｎ、３３２位のＩｌｅから選ばれる少なくとも１のアミノ酸残基の置換が好ましく、２３５位のＬｅｕ、２３８位のＰｒｏ、２３９位のＳｅｒ、２６５位のＡｓｐ、２６７位のＳｅｒ、２６９位のＧｌｕ、２９６位のＴｙｒ、２９８位のＳｅｒ、２９９位のＴｈｒ、３２７位のＡｌａから選ばれる少なくとも１のアミノ酸残基の置換がより好ましい。具体的には例えば、Ｌ２３５Ｒ、Ｐ２３８Ａ、Ｓ２３９Ｒ、Ｄ２６５Ａ、Ｄ２６５Ｎ、Ｄ２６５Ｅ、Ｓ２６７Ｌ、Ｓ２６７Ｋ、Ｅ２６９Ｐ、Ｙ２９６Ｐ、Ｓ２９８Ｅ、Ｔ２９９Ａ、Ａ３２７Ｉから選ばれる少なくとも１のアミノ酸残基置換が挙げられる。
【００６７】
第２のＣＤ１６ａ結合領域におけるＣＤ１６ａ結合活性を減弱させる改変として、ＥＵインデックスで表される２３５位、２３６位、２３７位、３２６位、３２７位、３２８位、３２９位、３３０位のアミノ酸残基から選ばれる少なくとも１から選ばれる少なくとも１のアミノ酸残基の置換が挙げられ、３２６位、３２８位、３２９位、３３０位のアミノ酸残基から選ばれる少なくとも１のアミノ酸残基の置換が好ましく、３２６位、３２８位、３２９位のアミノ酸残基から選ばれる少なくとも１のアミノ酸残基の置換がより好ましい。アミノ酸残基置換の組合せとしては、例えば、３２６位／３２８位、３２６位／３２９位、３２８位／３２９位、３２６位／３２８位／３２９位のアミノ酸残基の置換が挙げられる。
【００６８】
ＣＨ２ドメインのイムノグロブリンサブクラスがＩｇＧ１である場合、第２のＣＤ１６ａ結合領域におけるＣＤ１６ａ結合活性を減弱させる改変としては、ＥＵインデックスで表される２３５位のＬｅｕ、２３６位のＧｌｙ、２３７位のＧｌｙ、３２６位のＬｙｓ、３２７位のＡｌａ、３２８位のＬｅｕ、３２９位のＰｒｏ、３３０位のＡｌａから選ばれる少なくとも１のアミノ酸残基の置換が挙げられ、３２６位のＬｙｓ、３２８位のＬｅｕ、３２９位のＰｒｏ、３３０位のＡｌａから選ばれる少なくとも１のアミノ酸残基の置換が好ましく、３２６位のＬｙｓ、３２８位のＬｅｕ、３２９位のＰｒｏから選ばれる少なくとも１のアミノ酸残基の置換がより好ましい。具体的には、Ｋ３２６Ｗ、Ｋ３２６Ｇ、Ｌ３２８Ｖ、Ｌ３２８Ｒ、Ｐ３２９Ｙ、Ｐ３２９Ｋ、Ｐ３２９Ｗ、Ａ３３０Ｐから選ばれる少なくとも１のアミノ酸残基置換が挙げられる。
【００６９】
第１のＩｇＧ半量体のＣＤ１６ａ結合領域におけるＣＤ１６ａ結合活性を減弱させる改変と、第２のＩｇＧ半量体のＣＤ１６ａ結合領域におけるＣＤ１６ａ結合活性を減弱させる改変との組み合わせは、非対称な改変となる限り特に制限されず、適宜上記した改変を組み合わせることができる。具体的には例えば、下記アミノ酸残基の置換の組み合わせが挙げられる。
・第１のＩｇＧ半量体における２６５位、及び第２のＩｇＧ半量体における３２９位のアミノ酸残基の置換
・第１のＩｇＧ半量体における３２９位、及び第２のＩｇＧ半量体における２６５位のアミノ酸残基の置換
・第１のＩｇＧ半量体における２３８位／２６７位、及び第２のＩｇＧ半量体における３２９位のアミノ酸残基の置換
・第１のＩｇＧ半量体における３２９位、及び第２のＩｇＧ半量体における２３８位／２６７位のアミノ酸残基の置換
【００７０】
第１のＩｇＧ半量体のＣＤ１６ａ結合領域におけるＣＤ１６ａ結合活性を減弱させる改変（第１の改変）と、第２のＩｇＧ半量体のＣＤ１６ａ結合領域におけるＣＤ１６ａ結合活性を減弱させる改変（第２の改変）との組み合わせは、以下の表１に記載する組み合わせが好ましく、第１の改変と第２の改変がＳ２６７ＫとＰ３２９Ｙ、Ｙ２９６ＰとＰ３２９Ｙ、Ｓ２９８ＥとＰ３２９Ｙ、Ｄ２６５ＡとＰ３２９ＹまたはＳ２３９ＲとＰ３２９Ｙとなる組み合わせがより好ましい。
【００７１】
【表１】
2020067541.tif 000002
【００７２】
上記した置換後のアミノ酸残基は相互に置換可能なアミノ酸としてもよい。以下に、相互に置換可能なアミノ酸の例を示す。同一群に含まれるアミノ酸は相互に置換可能である。
Ａ群：ロイシン、イソロイシン、ノルロイシン、バリン、ノルバリン、アラニン、２−アミノブタン酸、メチオニン、Ｏ−メチルセリン、ｔ−ブチルグリシン、ｔ−ブチルアラニン、シクロヘキシルアラニン
Ｂ群：アスパラギン酸、グルタミン酸、イソアスパラギン酸、イソグルタミン酸、２−アミノアジピン酸、２−アミノスベリン酸
Ｃ群：アスパラギン、グルタミン
Ｄ群：リジン、アルギニン、オルニチン、２，４−ジアミノブタン酸、２，３−ジアミノプロピオン酸
Ｅ群：プロリン、３−ヒドロキシプロリン、４−ヒドロキシプロリン
Ｆ群：セリン、スレオニン、ホモセリン
Ｇ群：フェニルアラニン、チロシン
【００７３】
上記置換されるアミノ酸は天然型と非天然型とを問わない。天然型アミノ酸としては、Ｌ−アラニン、Ｌ−アスパラギン、Ｌ−アスパラギン酸、Ｌ−グルタミン、Ｌ−グルタミン酸、グリシン、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−リジン、Ｌ−アルギニン、Ｌ−メチオニン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−プロリン、Ｌ−セリン、Ｌ−スレオニン、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−チロシン、Ｌ−バリン、Ｌ−システインなどが挙げられる。非天然型アミノ酸としては、アミノ基とカルボキシル基を有する種々のアミノ酸が挙げられるが、好ましくは各種天然アミノ酸の誘導体が望ましい。多くの非天然アミノ酸は、各試薬会社（Sigma-Aldrich社、TCI社）より入手できる。非天然アミノ酸については、文献（Chem.Today 2003, 65. ；Curr Opin Chem Biol. 2000, 6, 645.）に多くの開示がある。
【００７４】
第１のＩｇＧ半量体においては第１のＣＤ１６ａ結合領域におけるＣＤ１６ａ結合活性が改変により減弱しており、且つ第２のＩｇＧ半量体においては第２のＣＤ１６ａ結合領域におけるＣＤ１６ａ結合領域活性が改変により減弱している。このことから、第１のＩｇＧ半量体同士、又は第２のＩｇＧ半量体同士によりホモ会合体の抗体構造を構成しても、ＣＤ１６ａと結合することはできず、抗体の有する活性を発揮し得ない。
【００７５】
一方、第１及び第２のＩｇＧ半量体によりヘテロ会合体の抗体構造が構成されると、第１のＩｇＧ半量体における第２のＣＤ１６ａ結合領域と、第２のＩｇＧ半量体における第１のＣＤ１６ａ結合領域とを介してＣＤ１６ａに対し結合可能となる。
【００７６】
第１及び第２のＩｇＧ半量体は互いに異なる抗原結合ドメインを有する。したがって、第１及び第２のＩｇＧ半量体からなるヘテロ会合体の抗体構造を構成することにより、互いに異なる２種の抗原を同一細胞上に発現している標的細胞に対して結合した場合にのみ、ＣＤ１６ａが結合しＡＤＣＣ活性を選択的に発揮し得る抗体組成物となる。
【００７７】
第１及び第２のＩｇＧ半量体におけるヒンジドメインが、一部又は全体の置換もしくは欠失、または修飾によりジスルフィド結合が形成されないように改変されている。このことにより、第１のＩｇＧ半量体と第２のＩｇＧ半量体との間において、Ｈ鎖間におけるジスルフィド結合が形成されない。したがって、第１及び第２のＩｇＧ半量体の併存により、第１及び第２のＩｇＧ半量体を会合体又は半量体の平衡状態で存在させることが可能となり、両陽性細胞に対する高い選択性を発揮し得る。
【００７８】
第１のＩｇＧ半量体と第２のＩｇＧ半量体との間において、Ｈ鎖間におけるジスルフィド結合が形成されないような、ヒンジドメインにおける一部の置換としては、例えば、ＥＵインデックスで表される２２６位及び２２９位の少なくとも一方のアミノ酸残基置換が挙げられる。
【００７９】
上記の平衡状態で存在させるためには、第１及び第２のＩｇＧ半量体における、Ｌ鎖、Ｈ鎖のＨ鎖可変領域及びＣＨ１ドメイン及びＣＨ２ドメインのイムノグロブリンサブクラスに属するＣＨ３ドメイン間相互作用と比較して、Ｈ鎖のＣＨ３ドメインは、ＣＨ３ドメイン間相互作用が弱いことが好ましい。
【００８０】
具体的には例えば、第１及び第２のＩｇＧ半量体におけるＨ鎖のＣＨ３ドメインは、ＣＨ３ドメイン間相互作用が、ＩｇＧ１サブクラスのＣＨ３ドメイン間相互作用よりも弱いことが好ましい。
【００８１】
ＣＨ３ドメイン間相互作用が、ＩｇＧ１サブクラスのＣＨ３ドメイン間相互作用よりもＣＨ３ドメイン間相互作用の弱いＣＨ３ドメインとしては、アミノ酸改変（アミノ酸の置換、欠失もしくは付加、または修飾等）によりＣＨ３ドメイン間相互作用が減弱したＩｇＧ１のＣＨ３ドメイン、ＩｇＧ４のＣＨ３ドメインが挙げられる。
【００８２】
２．抗体組成物のエフェクター活性の制御
本発明の抗体組成物は、第１及び第２のＩｇＧ半量体におけるＦｃに依存したエフェクター活性を付与することもできる。抗体組成物のエフェクター活性は、種々の方法により制御することができる。
【００８３】
例えば、第１及び第２のＩｇＧ半量体が、ＣＨ２ドメインにおいて、さらにＣＤ１６ａ結合活性を増強させる少なくとも１のアミノ酸残基置換を含むことにより、さらにＣＤ１６ａ結合活性を増強させることが好ましい。このことにより、抗体組成物のエフェクター活性を増強することができる。
【００８４】
抗体組成物のＣＤ１６ａ結合活性を増強するためのアミノ酸残基置換は、第１及び第２のＩｇＧ半量体におけるＣＤ１６ａ結合活性を減弱させるために改変された領域とは異なる領域におけるアミノ酸残基置換であることが好ましい。
【００８５】
エフェクター活性とは、抗体のＦｃを介して引き起こされる抗体依存性の活性をいい、ＡＤＣＣ活性、ＣＤＣ活性、又はマクロファージ若しくは樹状細胞などの食細胞による抗体依存性ファゴサイトーシス（Ａｎｔｉｂｏｄｙ−Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｐｈａｇｏｃｙｔｏｓｉｓ  ａｃｔｉｖｉｔｙ；ＡＤＣＰ活性）などが知られている。本発明においてＡＤＣＣ活性及びＣＤＣ活性は、公知の測定方法［Cancer Immunol. Immunother., 36, 373 (1993)］を用いて測定できる。
【００８６】
ＡＤＣＣ活性とは、標的細胞上の抗原に結合した抗体が、抗体のＦｃを介して免疫細胞のＦｃ受容体と結合することにより免疫細胞（ナチュラルキラー細胞など）を活性化し、標的細胞を傷害する活性をいう。
【００８７】
Ｆｃ受容体（以下、ＦｃＲと記すこともある）とは、抗体のＦｃに結合する受容体であり、抗体の結合によりさまざまなエフェクター活性を誘導する。
【００８８】
ＦｃＲは抗体のサブクラスに対応しており、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＡ、ＩｇＭはそれぞれＦｃγＲ、ＦｃεＲ、ＦｃαＲ、ＦｃμＲに特異的に結合する。更にＦｃγＲには、ＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）、ＦｃγＲＩＩ（ＣＤ３２）及びＦｃγＲＩＩＩ（ＣＤ１６）のサブタイプが存在し、それぞれＦｃγＲＩＡ、ＦｃγＲＩＢ、ＦｃγＲＩＣ、ＦｃγＲＩＩＡ、ＦｃγＲＩＩＢ、ＦｃγＲＩＩＣ、ＦｃγＲＩＩＩＡ（ＣＤ１６ａ）、ＦｃγＲＩＩＩＢのアイソフォームが存在する。これらの異なるＦｃγＲは異なる細胞上に存在している［Annu. Rev. Immunol. 9: 457-492 (1991)］。
【００８９】
ヒトにおいては、ＦｃγＲＩＩＩＢは好中球に特異的に発現しており、ＦｃγＲＩＩＩＡは、単球、Ｎａｔｕｒａｌ  Ｋｉｌｌｅｒ細胞（ＮＫ細胞）及び一部のＴ細胞に発現している。ＦｃγＲＩＩＩＡを介した抗体の結合は、ＮＫ細胞依存的なＡＤＣＣ活性を誘導する。
【００９０】
ＣＤＣ活性とは標的細胞上の抗原に結合した抗体が血液中の補体関連タンパク質群からなる一連のカスケード（補体活性化経路）を活性化し、標的細胞を傷害する活性をいう。また、補体の活性化により生じるタンパク質断片により免疫細胞の遊走、活性化を誘導することができる。
【００９１】
ＣＤＣ活性のカスケードは、抗体のＦｃとの結合ドメインを有するＣ１ｑが、Ｆｃに結合し、２つのセリンプロテアーゼであるＣ１ｒ及びＣ１ｓと結合することでＣ１複合体を形成することで開始する。
【００９２】
本発明の抗体組成物のエフェクター活性を制御する方法としては以下のような方法が挙げられる。
【００９３】
例えば、第１及び第２のＩｇＧ半量体において、ＩｇＧ１サブクラスのＦｃのアミノ酸配列を用いて、ＥＵインデックス２９７位のＡｓｎに結合するＮ結合複合型糖鎖（以下、単にコンプレックス糖鎖と略記する場合もある）の還元末端に存在するＮ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）にα−１，６結合するフコース（コアフコースともいう）の量を制御する方法（国際公開第２００５／０３５５８６号、国際公開第２００２／３１１４０号、国際公開第００／６１７３９号）、又は抗体のＦｃのアミノ酸残基を置換することで、抗体組成物のエフェクター活性を制御することができる。
【００９４】
１）糖鎖改変によるエフェクター活性の制御
第１及び第２のＩｇＧ半量体のＦｃに結合しているコンプレックス糖鎖の還元末端のＮ−アセチルグルコサミンに付加するフコースの含量を制御することで、抗体組成物のエフェクター活性を増加又は低下させることができる。
【００９５】
ＩｇＧ半量体のＦｃに結合しているＮ結合複合型糖鎖に付加するフコースの含量を低下させる方法としては、α１，６−フコース転移酵素遺伝子（ＦＵＴ８）が欠損したＣＨＯ細胞を用いてＩｇＧ半量体を発現することで、フコースが結合していないＩｇＧ半量体を取得できる。フコースが結合していないＩｇＧ半量体からなる抗体組成物は高いＡＤＣＣ活性を有する。
【００９６】
一方、ＩｇＧ半量体のＦｃに結合しているＮ結合複合型糖鎖に付加するフコースの含量を増加させる方法としては、α１，６−フコース転移酵素遺伝子を導入した宿主細胞を用いてＩｇＧ半量体を発現させることで、フコースが結合しているＩｇＧ半量体を取得できる。フコースが結合しているＩｇＧ半量体からなる抗体組成物は、フコースが結合していないＩｇＧ半量体からなる抗体組成物よりも低いＡＤＣＣ活性を有する。
【００９７】
ＩｇＧ半量体のＦｃには、ＥＵインデックス２９７位のＡｓｎ残基にＮ結合型糖鎖が結合するが、それ以外のＦｃのＡｓｎ残基には糖鎖は結合することは知られていない。従って、通常、抗体組成物１分子あたり２本のＮ−グリコシド結合糖鎖が結合している。
【００９８】
Ｎ結合型糖鎖としてはハイマンノース型、コンプレックス型及びハイブリッド型が知られており、いずれのＮ結合型糖鎖でもフコースが結合していない糖鎖であれば、フコースが結合している糖鎖と比べて高いＡＤＣＣ活性を得ることができる。
【００９９】
ＩｇＧ半量体のＦｃに結合するコンプレックス糖鎖としては、コア構造（トリマンノシルコア構造）の非還元末端側のマンノース（Ｍａｎ）に、１つ以上のＮ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）又はガラクトース−Ｎ−アセチルグルコサミン（以下、Ｇａｌ−ＧｌｃＮＡｃと表記する）がα１−２結合又はα１−４結合している糖鎖が挙げられる。
【０１００】
更にＧａｌ−ＧｌｃＮＡｃの非還元末端側にシアル酸、バイセクティングのＮ−アセチルグルコサミン（以下、ｂｉｓｅｃｔｉｎｇ  ＧｌｃＮＡｃと記す）などを有するコンプレックス型（複合型）糖鎖を挙げることができる。
【０１０１】
本発明において、コアフコース（ｃｏｒｅ−ｆｕｃｏｓｅ）又はα１，６−フコースとは、Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミン（以下、ＧｌｃＮＡｃと記す場合もある）の６位とフコース（以下、Ｆｕｃと記す場合もある）の１位がα結合した糖鎖構造をいう。また、Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンにフコースが結合していないことを、単にフコースが無い又はコアフコースが無い糖鎖という。
【０１０２】
また、本発明において、コア構造又はトリマンノシルコア構造（ｔｒｉ−ｍａｎｎｏｓｙｌ  ｃｏｒｅ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ）とは、Ｍａｎα１−６（Ｍａｎα１−３）Ｍａｎβ１−４ＧｌｃＮＡｃβ１−４ＧｌｃＮＡｃ構造をいう。
【０１０３】
ＩｇＧ半量体に結合している糖鎖として、２本鎖Ｎ−グリコシド結合コンプレックス糖鎖（バイアンテナリーコンプレックス糖鎖ともいう）は、下記化学式で示される。
【０１０４】
【化１】
2020067541.tif 000003
【０１０５】
第１及び第２のＩｇＧ半量体は、ＥＵインデックス２９７位のＡｓｎにコンプレックス型糖鎖が結合したＦｃを有することが好ましい。上記の糖鎖構造を有していれば、単一または複数の異なる糖鎖構造を有していてもよい。具体的には、第１及び第２のＩｇＧ半量体における、Ｆｃに結合する全Ｎ−グリコシド結合型糖鎖のうち、糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンにフコースが結合していない糖鎖（コアフコースが無い糖鎖）の割合が２０％以上である抗体組成物が挙げられる。
【０１０６】
コアフコースが無い糖鎖の割合としては、抗体組成物のＡＤＣＣ活性が増加すれば、いずれの割合も含まれるが、好ましくは２０％以上、より好ましくは５１％〜１００％、更に好ましくは８０％〜１００％、特に好ましくは９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、最も好ましくは１００％の割合が挙げられる。
【０１０７】
コアフコースが無い糖鎖の割合が５０％とは、例えば、第１及び第２のＩｇＧ半量体に結合しているＮ−グリコシド結合糖鎖の片方の糖鎖にフコースが結合していない分子が１００％含まれる抗体組成物、又は第１及び第２のＩｇＧ半量体に結合しているＮ−グリコシド結合糖鎖の両方の糖鎖にフコースが結合していない分子が５０％含まれ、かつ第１及び第２のＩｇＧ半量体に結合しているＮ−グリコシド結合糖鎖の両方の糖鎖にフコースが結合している分子が５０％含まれる抗体組成物のいずれも含まれる。
【０１０８】
本発明において、フコースが無い糖鎖としては、上記で示された化学式中、還元末端側のＮ−アセチルグルコサミンにフコースが結合していなければ、非還元末端の糖鎖の構造はいかなるものであってもよい。
【０１０９】
本発明において、糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンにフコースが結合していない（コアフコースが無い）とは、実質的にフコースが結合していないことをいう。実質的にフコースが結合していないＩｇＧ半量体とは、具体的には、後述に記載の糖鎖分析において、フコースが実質的に検出できない程度のＩｇＧ半量体である場合をいう。実質的に検出できない程度とは、測定の検出限界以下であることをいう。全ての糖鎖にコアフコースが無い第１及び第２のＩｇＧ半量体からなる抗体組成物は、最も高いＡＤＣＣ活性を有する。
【０１１０】
Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖が結合したＦｃを有するＩｇＧ半量体中における、フコースが無い糖鎖を有するＩｇＧ半量体の割合は、ＩｇＧ半量体からヒドラジン分解又は酵素消化などの公知の方法［生物化学実験法２３−糖蛋白質糖鎖研究法（学会出版センター）高橋禮子編（１９８９）］を用い、糖鎖を遊離させ、遊離させた糖鎖を蛍光標識又は同位元素標識し、標識した糖鎖をクロマトグラフィ法にて分離することによって決定することができる。
【０１１１】
また、コンプレックス糖鎖が結合したＦｃを含むＩｇＧ半量体中に含まれる、フコースが無い糖鎖が結合したＩｇＧ半量体の割合は、遊離させた糖鎖をＨＰＡＥＤ−ＰＡＤ法（J. Liq. Chromatogr., 6, 1577, 1983）によって分析することで決定することができる。
【０１１２】
２）アミノ酸残基置換によるエフェクター活性の制御
本発明の抗体組成物は、第１のＩｇＧ半量体及び第２の半量体におけるＦｃの抗体サブクラスの変換又はＦｃのアミノ酸残基置換により、ＡＤＣＣ活性、ＡＤＣＰ活性及びＣＤＣ活性を増加又は低下させることができる。
【０１１３】
ＩｇＧ１サブクラスの抗体は、ＩｇＧサブクラスの中で最も高いＡＤＣＣ活性、ＣＤＣ活性を有することが知られており、ＣＨ２ドメインのイムノグロブリンサブクラスはＩｇＧ１であることが好ましい。
【０１１４】
Ｆｃのアミノ酸残基置換としては例えば、米国特許出願公開第２００７／０１４８１６５号明細書に記載のＦｃのアミノ酸配列を用いることで、抗体のＣＤＣ活性を増加させることができる。また、米国特許第６，７３７，０５６号明細書、米国特許第７，２９７，７７５号明細書及び米国特許第７，３１７，０９１号明細書に記載のアミノ酸残基置換を行うことで、抗体組成物のＡＤＣＣ活性又はＣＤＣ活性を増加させることも低下させることもできる。
【０１１５】
ＡＤＣＣ活性を増強させる具体的なアミノ酸残基置換としては、Ｐ２４７Ｉ、Ａ３３９Ｄ、Ｆ２４３Ｌ、Ｒ２９２Ｐ、Ｙ３００Ｌ、Ｐ３９６Ｌ、Ｔ３９３Ａ、Ｈ４３３Ｐ、Ｓ２３９Ｄ、Ｓ２９８Ａ、Ａ３３０Ｌ、Ｉ３３２Ｅ、Ｅ３３３Ａ及びＫ３３４Ａなどが挙げられる。一方、ＡＤＣＣ活性を減少させる具体的なアミノ酸残基置換としては、Ｌ２３５Ｅ、Ｐ２３８Ａ、Ｎ２９７Ａ、Ｋ３２２Ａ及びＰ３３１Ｓなどが挙げられる。
【０１１６】
ＣＤＣ活性を増加させる具体的なアミノ酸残基置換としては、Ｋ３２６Ａ、Ｓ２６７Ｅ、Ｈ２６８Ｆ、Ｓ３２４Ｔ、Ｋ２７４Ｑ、Ｎ２７６Ｋ、Ｙ２９６Ｆ、Ｙ３００Ｆ、Ｋ３２６Ｗ、Ｋ３２６Ｙ、Ｅ３３３Ａ、Ｅ３３３Ｓ、Ａ３３９Ｔ、Ｄ３５６Ｅ、Ｌ３５８Ｍ、Ｎ３８４Ｓ、Ｋ３９２Ｎ、Ｔ３９４Ｆ、Ｔ３９４Ｙ、Ｖ３９７Ｍ及びＶ４２２Ｉから選ばれる少なくとも１つのアミノ酸残基置換が挙げられる。
【０１１７】
いずれのアミノ酸残基置換を２つ以上組み合わせてＣＤＣ活性を増加させることもでき、目的に応じて置換するアミノ酸残基を増やすことができる。ＣＤＣ活性を増加させるアミノ酸残基置換として好ましくは、Ｎ２７６Ｋ、Ａ３３９Ｔ、Ｔ３９４Ｆ及びＴ３９４Ｙから選ばれる少なくとも１つのアミノ酸残基置換、Ｎ２７６Ｋ及びＡ３３９Ｔのアミノ酸残基置換、並びにＫ２７４Ｑ、Ｎ２７６Ｋ、Ｙ２９６Ｆ、Ｙ３００Ｆ、Ａ３３９Ｔ、Ｄ３５６Ｅ、Ｌ３５８Ｍ、Ｎ３８４Ｓ、Ｖ３９７Ｍ及びＶ４２２Ｉのアミノ酸残基置換などが挙げられる。一方、ＣＤＣ活性を減少させる具体的なアミノ酸残基置換としては、Ｌ２３５Ｅ、Ｎ２９７Ａ、Ｋ３２２Ａ、Ｐ３２９Ａ及びＰ３３１Ｓなどが挙げられる。
【０１１８】
またＴ２５０Ｑ、Ｍ４２８Ｌ、Ｍ２５２Ｙ、Ｓ２５４Ｔ、Ｔ２５６Ｅなどのアミノ酸変異をヒトＩｇＧ１サブクラスのＦｃに導入することにより血中半減期を延長することができる。またＮ２９７位にアミノ酸変異を導入することによりＮ結合型糖鎖を除去したＦｃ又はヒトＩｇＧ２若しくはＩｇＧ４サブクラスのＦｃ、ＩｇＧ２とＩｇＧ４のキメラＦｃなどを用いることにより、ＡＤＣＣ活性、ＡＤＣＰ活性、ＣＤＣ活性などの細胞傷害活性を低下させることができる。
【０１１９】
３．抗体組成物の製造方法
本発明の抗体組成物の製造方法は、以下の工程１〜３を含む製造方法が挙げられる。
工程１：ＩｇＧ半量体のアミノ酸配列をコードするＤＮＡを含む組換えベクター（以下、ＩｇＧ半量体発現用組換えベクターとも略す）を細胞へ導入して形質転換体を得る工程。
工程２：工程１で得られた形質転換体を培養し、培養物中にＩｇＧ半量体を蓄積させ、培養物からＩｇＧ半量体を採取する工程。
工程３：工程２で採取されたＩｇＧ半量体からなる抗体組成物を得る工程。
以下、各工程について説明する。
【０１２０】
［工程１］
工程１は、第１及び第２のＩｇＧ半量体の少なくとも一方のアミノ酸配列をコードするＤＮＡを含む組換えベクターを細胞へ導入して形質転換体を得る工程である。
工程（１）は、具体的には、以下の工程（１−１）〜（１−３）を含む。
（１−１）第１のＩｇＧ半量体における第１のＣＤ１６ａ結合領域におけるＣＤ１６ａ結合活性を改変により減弱させる工程。
（１−２）第２のＩｇＧ半量体における第２のＣＤ１６ａ結合領域におけるＣＤ１６ａ結合活性を改変により減弱させる工程。
（１−３）第１及び第２のＩｇＧ半量体のヒンジドメインにおいて一部又は全体の置換もしくは欠失、または修飾を行うことにより、Ｈ鎖間におけるジスルフィド結合が形成されないように改変する工程。
【０１２１】
工程（１−１）については、例えば、第１のＩｇＧ半量体発現用組換えベクターの作製において、ＥＵインデックスで表される２３５位、２３６位、２３７位、２３８位、２３９位、２６５位、２６６位、２６７位、２６８位、２６９位、２９４位、２９５位、２９６位、２９７位、２９８位、２９９位、３０１位、３２５位、３２７位、３３２位のアミノ酸残基から選ばれる少なくとも１のアミノ酸残基を置換する工程を、ＣＨ２ドメインのサブクラスに応じて適宜行うことが挙げられる。
【０１２２】
工程（１−２）については、例えば、第２のＩｇＧ半量体発現用組換えベクターの作製において、ＥＵインデックスで表される２３５位、２３６位、２３７位、３２６位、３２７位、３２８位、３２９位、３３０位のアミノ酸残基から選ばれる少なくとも１のアミノ酸残基を置換する工程を、ＣＨ２ドメインのサブクラスに応じて適宜行うことが挙げられる。
【０１２３】
工程（１−３）については、例えば、ＩｇＧ半量体発現用組換えベクターの作製において、ＥＵインデックスで表される２２６位及び２２９位の少なくとも一方のアミノ酸残基の置換を加える工程を、ヒンジドメインのサブクラスに応じて適宜行うことが挙げられる。
【０１２４】
ＩｇＧ半量体は、モレキュラー・クローニング第２版、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー、Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988、Monoclonal Antibodies: principles and practice, Third Edition,Acad.Press,1993, Antibody Engineering, A Practical Approach, IRL Press at Oxford University Press,1996等に記載された方法を用い、例えば、以下のように形質転換体中で発現させて取得することができる。
【０１２５】
（１）ＩｇＧ半量体発現用の組換えベクターの構築
ＩｇＧ半量体発現用組換えベクターとは、本発明の抗体組成物を構成するＩｇＧ半量体のアミノ酸配列をコードする遺伝子が組み込まれた動物細胞用発現ベクターである。
【０１２６】
組換えベクターは、動物細胞用発現ベクターにＩｇＧ半量体のアミノ酸配列をコードするＤＮＡをクローニングすることにより構築することができる。
【０１２７】
ＤＮＡは、全ＤＮＡを合成してもよいし、ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ（ＰＣＲ法）による合成も可能である（モレキュラー・クローニング第２版）。さらに、これらの手法を複数組み合わせることにより、ＩｇＧ半量体をコードする遺伝子を作製することもできる。
【０１２８】
動物細胞を宿主として用いる場合、発現ベクターとしては、動物細胞中で機能を発揮できるものであればいずれも用いることができる。例えば、ｐｃＤＮＡＩ、ｐＣＤＭ８（フナコシ社製）、ｐＡＧＥ１０７［日本国特開平３−２２９７９号公報；Cytotechnology, 3, 133 (1990)］、ｐＡＳ３−３（日本国特開平２−２２７０７５号公報）、ｐＣＤＭ８［Nature, 329, 840 (1987)］、ｐｃＤＮＡＩ／Ａｍｐ（インビトロジェン社製）、ｐｃＤＮＡ３．１（インビトロジェン社製）、ｐＲＥＰ４（インビトロジェン社製）、ｐＡＧＥ１０３［J. Biochemistry, 101, 1307 (1987)］、ｐＡＧＥ２１０、ｐＭＥ１８ＳＦＬ３、ｐＫＡＮＴＥＸ９３（国際公開第９７／１０３５４号）、Ｎ５ＫＧ１ｖａｌ（米国特許第６，００１，３５８号明細書）及びＴｏｌ２トランスポゾンベクター（国際公開第２０１０／１４３６９８号）などが挙げられる。
【０１２９】
プロモーターとしては、動物細胞中で機能を発揮できるものであればいずれも用いることができる。例えば、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）のｉｍｍｅｄｉａｔｅ  ｅａｒｌｙ（ＩＥ）遺伝子のプロモーター、ＳＶ４０の初期プロモーター、レトロウイルスのプロモーター、メタロチオネインプロモーター、ヒートショックプロモーター、ＳＲαプロモーター、又はモロニーマウス白血病ウイルスのプロモーターあるいはエンハンサーが挙げられる。また、ヒトＣＭＶのＩＥ遺伝子のエンハンサーをプロモーターと共に用いてもよい。
【０１３０】
発現ベクターは、抗体Ｈ鎖及びＬ鎖が別々のベクター上に存在するタイプあるいは同一のベクター上に存在するタイプ（以下、タンデム型と表記する）のどちらでも用いることができる。
【０１３１】
（２）可変領域をコードするｃＤＮＡの取得
任意の抗体のＶＨ及びＶＬをコードするｃＤＮＡは次のようにして取得できる。任意の抗体を産生するハイブリドーマ細胞から抽出したｍＲＮＡを鋳型として用い、ｃＤＮＡを合成する。合成したｃＤＮＡをファージ又はプラスミド等のベクターに挿入してｃＤＮＡライブラリーを作製する。
【０１３２】
前記ライブラリーより、既存の抗体の定常領域又は可変領域をコードするＤＮＡをプローブとして用い、ＶＨをコードするｃＤＮＡを有する組換えファージ或いは組換えプラスミド及びＬ鎖可変領域をコードするｃＤＮＡを有する組換えファージ又は組換えプラスミドをそれぞれ単離する。組換えファージ或いは組換えプラスミド上の目的の抗体のＶＨ及びＶＬの全塩基配列を決定し、塩基配列よりＶＨ及びＶＬの全アミノ酸配列を推定する。
【０１３３】
任意の非ヒト動物抗体を生産するハイブリドーマ細胞は、抗体が結合する抗原を非ヒト動物に免疫し、周知の方法［モレキュラー・クローニング第２版、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー、Antibodies, A Laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988、Monoclonal Antibodies: principles and practice, Third Edition, Acad. Press, 1993、Antibody Engineering, A Practical Approach, IRL Press at Oxford University Press,1996］に従って、免疫された動物の抗体産生細胞とミエローマ細胞とでハイブリドーマを作製する。次いでシングルセルクローニングしたハイブリドーマを選択し、これを培養し、培養上清から精製し、取得することができる。
【０１３４】
非ヒト動物としては、マウス、ラット、ハムスター又はウサギ等、ハイブリドーマ細胞を作製することが可能であれば、いかなるものも用いることができる。
【０１３５】
ハイブリドーマ細胞から全ＲＮＡを調製する方法としては、例えば、チオシアン酸グアニジン−トリフルオロ酢酸セシウム法［Methods in Enzymol., 154, 3 (1987)］、ＲＮｅａｓｙ  ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）、また全ＲＮＡからｍＲＮＡを調製する方法としては、オリゴ（ｄＴ）固定化セルロースカラム法［モレキュラー・クローニング：ア・ラボラトリー・マニュアル（Molecular Cloning: A Laboratory Manual），Cold Spring Harbor Lab. Press New York, 1989］等が挙げられる。
【０１３６】
また、ハイブリドーマ細胞からｍＲＮＡを調製するキットとしては、例えば、Ｆａｓｔ  Ｔｒａｃｋ  ｍＲＮＡ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）、Ｑｕｉｃｋ  Ｐｒｅｐ  ｍＲＮＡ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）等が挙げられる。
【０１３７】
ｃＤＮＡの合成及びｃＤＮＡライブラリー作製法としては、常法（Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Lab. Press New York, 1989; Current Protocols in Molecular Biology, Supplement 1-34）、又は市販のキットを用いる方法が挙げられる。市販のキットとしては、例えば、Ｓｕｐｅｒ  Ｓｃｒｉｐｔ（登録商標）Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｓｙｓｔｅｍ  ｆｏｒ  ｃＤＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ａｎｄ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｃｌｏｎｉｎｇ（ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ社製）又はＺＡＰ−ｃＤＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）が挙げられる。
【０１３８】
ｃＤＮＡライブラリーの作製の際、ハイブリドーマ細胞から抽出したｍＲＮＡを鋳型として合成したｃＤＮＡを組み込むベクターは、該ｃＤＮＡを組み込めるベクターであればいかなるものでも用いることができる。
【０１３９】
例えば、ＺＡＰ  Ｅｘｐｒｅｓｓ（Strategies, 5, 58, 1992）、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＳＫ（＋）（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１７，９４９４，１９８９）、λＺＡＰ  ＩＩ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）、λｇｔ１０、λｇｔ１１（DNA Cloning: A Practical Approach, I, 49, 1985）、Ｌａｍｂｄａ  ＢｌｕｅＭｉｄ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）、λＥｘＣｅｌｌ、ｐＴ７Ｔ３  １８Ｕ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）、ｐｃＤ２（Mol. Cell. Biol., 3, 280, 1983）及びｐＵＣ１８（Gene, 33, 103, 1985）等を用いることができる。
【０１４０】
ファージ又はプラスミドベクターにより構築されるｃＤＮＡライブラリーを導入する大腸菌としては該ｃＤＮＡライブラリーを導入、発現及び維持できるものであればいかなるものでも用いることができる。
【０１４１】
例えば、ＸＬ１−Ｂｌｕｅ  ＭＲＦ（Strategies, 5, 81 , 1992）、Ｃ６００（Genetics, 39, 440, 1954）、Ｙ１０８８、Ｙ１０９０（Science, 222, 778, 1983）、ＮＭ５２２  ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー（J. Mol. Biol., 166, 1, 1983）、Ｋ８０２（J. Mol. Biol., 16, 118, 1966）及びＪＭ１０５（Gene, 38, 275, 1985）等が用いられる。
【０１４２】
ｃＤＮＡライブラリーからの非ヒト動物抗体のＶＨ及びＶＬをコードするｃＤＮＡクローンを選択する方法としては、アイソトープ又は蛍光などで標識したプローブを用いたコロニー・ハイブリダイゼーション法又はプラーク・ハイブリダイゼーション法（Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Lab. Press New York, 1989）により選択することができる。
【０１４３】
また、プライマーを調製し、ｃＤＮＡ又はｃＤＮＡライブラリーを鋳型として、ＰＣＲ（Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Lab. Press New York, 1989;Current Protocols in Molecular Biology, Supplement 1-34）によりＶＨ及びＶＬをコードするｃＤＮＡを調製することもできる。
【０１４４】
上記方法により選択されたｃＤＮＡを、適当な制限酵素などで切断後、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＳＫ（−）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）等のプラスミドにクローニングし、通常用いられる塩基配列解析方法、例えば、Ｓａｎｇｅｒらのジデオキシ法（Proc. Natl. Acad. Sci., U. S. A., 74, 5463, 1977）等の反応を行い、塩基配列自動分析装置、例えば、ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ３７７  ＤＮＡシークエンサー（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）等の塩基配列分析装置を用いて分析することにより該ｃＤＮＡの塩基配列を決定することができる。
【０１４５】
決定した塩基配列からＶＨ及びＶＬの全アミノ酸配列を推定し、既知の抗体のＶＨ及びＶＬの全アミノ酸配列（Sequences of Proteins of Immunological Interest, US Dept. Health and Human Services, 1991）と比較することにより、取得したｃＤＮＡが分泌シグナル配列を含む抗体のＶＨ及びＶＬを完全に含んでいるアミノ酸配列をコードしているかを確認することができる。
【０１４６】
さらに、抗体可変領域のアミノ酸配列又は該可変領域をコードするＤＮＡの塩基配列がすでに公知である場合には、以下の方法を用いて製造することができる。
【０１４７】
アミノ酸配列が公知である場合には、コドンの使用頻度（Sequences of Proteins of Immunological Interest, US Dept. Health and Human Services, 1991）を考慮して該可変領域をコードするＤＮＡの塩基配列を設計し、設計したＤＮＡの塩基配列に基づき、１００〜１５０塩基前後の長さからなる数本の合成ＤＮＡを合成し、それらを用いてＰＣＲ法を行うか、完全長のＤＮＡを合成することで、ＤＮＡを得ることができる。塩基配列が公知である場合には、その情報を基に上述と同様にしてＤＮＡを得ることができる。
【０１４８】
（３）抗体の可変領域のアミノ酸配列の解析
分泌シグナル配列を含む抗体のＶＨ及びＶＬの完全なアミノ酸配列に関しては、既知の抗体のＶＨ及びＶＬのアミノ酸配列（Sequences of Proteins of Immunological Interest, US Dept. Health and Human Services,1991）と比較することにより、分泌シグナル配列の長さ及びＮ末端アミノ酸配列を推定でき、更には抗体が属するサブグループを知ることができる。また、ＶＨ及びＶＬの各ＣＤＲのアミノ酸配列についても、同様の方法で見出すことができる。
【０１４９】
（４）ヒト化抗体の可変領域をコードするｃＤＮＡの構築
ヒト化抗体のＶＨ及びＶＬをコードするｃＤＮＡは、以下のようにして構築することができる。まず、目的の非ヒト動物抗体のＶＨ及びＶＬのＣＤＲを移植するヒト抗体のＶＨ及びＶＬのフレームワーク領域（以下、ＦＲと表記する）のアミノ酸配列を選択する。ヒト抗体のＶＨ及びＶＬのＦＲのアミノ酸配列としては、ヒト抗体のものであれば、いかなるものでも用いることができる。
【０１５０】
例えば、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄａｔａ  Ｂａｎｋ等のデータベースに登録されているヒト抗体のＶＨ及びＶＬのＦＲのアミノ酸配列、ヒト抗体のＶＨ及びＶＬのＦＲの各サブグループの共通アミノ酸配列（Sequences of Proteins of Immunological Interest, US Dept. Health and Human Services, 1991）等が挙げられる。
【０１５１】
その中でも、十分な活性を有するヒト化抗体を作製するためには、目的の非ヒト動物抗体のＶＨ及びＶＬのＦＲのアミノ酸配列とできるだけ高い相同性（少なくとも６０％以上）を有するアミノ酸配列を選択することが好ましい。
【０１５２】
次に、選択したヒト抗体のＶＨ及びＶＬのＦＲのアミノ酸配列に目的の非ヒト動物抗体のＶＨ及びＶＬのＣＤＲのアミノ酸配列を移植し、ヒト化抗体のＶＨ及びＶＬのアミノ酸配列を設計する。設計したアミノ酸配列を抗体の遺伝子の塩基配列に見られるコドンの使用頻度（Sequences of Proteins of Immunological Interest, US Dept. Health and Human Services, 1991）を考慮してＤＮＡの塩基配列に変換し、ヒト化抗体のＶＨ及びＶＬのアミノ酸配列をコードするＤＮＡの塩基配列を設計する。設計したＤＮＡの塩基配列を完全合成する。
【０１５３】
また、両端に位置する合成ＤＮＡの５’末端に適当な制限酵素の認識配列を導入することで、上述３（１）で構築したＩｇＧ半量体発現用組換えベクターに容易にクローニングすることができる。ＰＣＲ後、増幅産物をｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＳＫ（−）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）等のプラスミドにクローニングし、上述３（２）に記載の方法により、塩基配列を決定し、所望のヒト化抗体のＶＨ及びＶＬのアミノ酸配列をコードするＤＮＡの塩基配列を有するプラスミドを取得する。
【０１５４】
（５）ヒト化抗体の可変領域のアミノ酸配列の改変
ヒト化抗体は、非ヒト動物抗体のＶＨ及びＶＬのＣＤＲのみをヒト抗体のＶＨ及びＶＬのＦＲに移植しただけでは、その抗原結合活性は元の非ヒト動物抗体に比べて低下してしまうことが知られている（BIO / TECHNOLOGY, 9, 266, 1991）。
【０１５５】
この原因としては、元の非ヒト動物抗体のＶＨ及びＶＬでは、ＣＤＲのみならず、ＦＲのいくつかのアミノ酸残基が直接的或いは間接的に抗原結合活性に関与しており、それらアミノ酸残基がＣＤＲの移植に伴い、ヒト抗体のＶＨ及びＶＬのＦＲの異なるアミノ酸残基へと変化してしまうことが考えられている。
【０１５６】
この問題を解決するため、ヒト化抗体では、ヒト抗体のＶＨ及びＶＬのＦＲのアミノ酸配列の中で、直接抗原との結合に関与しているアミノ酸残基又はＣＤＲのアミノ酸残基と相互作用させて、抗体の立体構造を維持し、間接的に抗原との結合に関与しているアミノ酸残基を同定し、それらを元の非ヒト動物抗体に由来するアミノ酸残基に改変し、低下した抗原結合活性を上昇させることが行われている（BIO / TECHNOLOGY, 9, 266, 1991）。
【０１５７】
ヒト化抗体の作製においては、それら抗原結合活性に関わるＦＲのアミノ酸残基を如何に効率よく同定するかが、最も重要な点であり、そのためにＸ線結晶解析（J. Mol. Biol., 112, 535, 1977）或いはコンピューターモデリング（Protein Engineering, 7, 1501, 1994）等による抗体の立体構造の構築及び解析が行われている。
【０１５８】
これら抗体の立体構造の情報は、ヒト化抗体の作製に多くの有益な情報をもたらして来た。しかしながら、あらゆる抗体に適応可能なヒト化抗体の作製法は未だ確立されていない。現状ではそれぞれの抗体について数種の改変体を作製し、それぞれの抗原結合活性との相関を検討する等の種々の試行錯誤が必要である。
【０１５９】
ヒト抗体のＶＨ及びＶＬのＦＲのアミノ酸残基の改変は、改変用合成ＤＮＡを用いて３（４）に記載のＰＣＲ法を行うことにより、達成できる。ＰＣＲ後の増幅産物について３（２）に記載の方法により、塩基配列を決定し、目的の改変が施されたことを確認する。
【０１６０】
（６）ＩｇＧ半量体の発現
上述３（１）のＩｇＧ半量体発現用組換えベクターを適当な動物細胞に導入することにより一過性又は安定的に第１及び第２のＩｇＧ半量体の少なくとも一方を生産する形質転換体を得ることができる。
【０１６１】
（６−ａ）抗体組成物の一過性発現
（３）及び（６）で得られるＩｇＧ半量体発現用組換えベクター、又はそれらを改変した組換えベクターを用いて抗体組成物の一過性発現を行い、作製した多種類の抗体組成物の抗原結合活性を効率的に評価することができる。
【０１６２】
ＩｇＧ半量体発現用組換えベクターを導入する宿主細胞には、第１及び第２のＩｇＧ半量体の少なくとも一方を発現できる宿主細胞であれば、いかなる細胞でも用いることができる。例えば、ＣＯＳ−７細胞［Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）番号：ＣＲＬ１６５１］が挙げられる（Methods in Nucleic Acids Res., CRC press, 283, 1991）。
【０１６３】
ＣＯＳ−７細胞へのＩｇＧ半量体発現用組換えベクターの導入には、ＤＥＡＥ−デキストラン法（Methods in Nucleic Acids Res., CRC press,1991）、又はリポフェクション法（Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84, 7413, 1987）などを用いる。
【０１６４】
ＩｇＧ半量体発現用組換えベクターの導入後、培養上清中のＩｇＧ半量体の発現量及び抗原結合活性は酵素免疫抗体法［Monoclonal Antibodies-Principles and practice, Third Edition, Academic Press(1996)、Antibodies - A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory(1988)、単クローン抗体実験マニュアル，講談社サイエンティフィック（１９８７）］などを用いて測定する。
【０１６５】
（６−ｂ）ＩｇＧ半量体の安定発現
（１）で得られたＩｇＧ半量体発現用組換えベクターを適当な宿主細胞に導入することによりＩｇＧ半量体を安定に発現する形質転換体を得ることができる。
【０１６６】
宿主細胞への組換えベクターの導入には、宿主細胞にＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、エレクトロポレーション法（Cytotechnology, 3, 133, 1990）、リン酸カルシウム法（日本国特開平２−２２７０７５号公報）、リポフェクション法（Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., 84, 7413, 1987）、インジェクション法［マニピュレイティング・ザ・マウス・エンブリオ・ア・ラボラトリー・マニュアル］、パーティクルガン（遺伝子銃）を用いる方法（日本国特許第２６０６８５６号明細書、日本国特許第２５１７８１３号明細書）、ＤＥＡＥ−デキストラン法［バイオマニュアルシリーズ４―遺伝子導入と発現・解析法（羊土社）横田崇・新井賢一編（１９９４）］、ウイルスベクター法（マニピュレーティング・マウス・エンブリオ第２版）等が挙げられる。
【０１６７】
組換えベクターを導入する宿主細胞としては、第１及び第２のＩｇＧ半量体の少なくとも一方を発現させることができる宿主細胞であれば、いかなる細胞でも用いることができる。例えば、ヒト白血病細胞ナマルバ（Ｎａｍａｌｗａ）細胞、サルＣＯＳ細胞、チャイニーズ・ハムスターの細胞であるＣＨＯ細胞、ＨＢＴ５６３７（日本国特開昭６３−２９９号公報）、ラットミエローマ細胞、マウスミエローマ細胞、シリアンハムスター腎臓由来細胞、胚性幹細胞、受精卵細胞等が挙げられる。
【０１６８】
具体的には、例えば、ＰＥＲ．Ｃ６、ＣＨＯ−Ｋ１（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−６１）、ＤＵＫＸＢ１１（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−９０９６）、Ｐｒｏ−５（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−１７８１）、ＣＨＯ−Ｓ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃａｔ  ＃１１６１９）、Ｌｅｃ１３細胞、ラットミエローマ細胞ＹＢ２／３ＨＬ．Ｐ２．Ｇ１１．１６Ａｇ．２０（ＡＴＣＣ番号：ＣＲＬ１６６２、又はＹＢ２／０ともいう）、マウスミエローマ細胞ＮＳ０、マウスミエローマ細胞ＳＰ２／０−Ａｇ１４（ＡＴＣＣ番号：ＣＲＬ１５８１）、マウスＰ３Ｘ６３−Ａｇ８．６５３細胞（ＡＴＣＣ番号：ＣＲＬ１５８０）、ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子（Ｄｉｈｙｄｒｏｆｏｒａｔｅ  Ｒｅｄｕｃｔａｓｅ、以下、ｄｈｆｒと表記する）が欠損したＣＨＯ細胞（ＣＨＯ／ＤＧ４４）［Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77, 4216 (1980)］、シリアンハムスター細胞ＢＨＫ、ＨＢＴ５６３細胞、上述細胞株の亜株細胞及び上述細胞株を無血清培養下で馴化した細胞、非接着条件下の培養条件で馴化した細胞などが挙げられる。
【０１６９】
ＩｇＧ半量体の生産に用いる細胞としては、ＦｃにおけるＥＵインデックス２９７のＡｓｎに結合する糖鎖のコアフコース量を低下又は欠損させる細胞を用いることもできる。具体的には、ＧＤＰ−Ｌ−フコースの合成又はゴルジ体への輸送に関与する酵素又はコアフコースの結合に関与する酵素が低下又は欠損した細胞を選択するか、又は種々の人為的手法により得られた細胞を宿主細胞として用いることもできる。
【０１７０】
具体的には、コアフコース糖鎖修飾に関連する酵素活性を減少又は欠損させる方法、又はコアフコース切断酵素活性を増加させる方法など、コアフコースを制御した細胞を作製することができる。
【０１７１】
コアフコース糖鎖修飾に関連する酵素としては、例えば、ＧＤＰ−Ｌ−フコースの合成あるいは輸送に関与する酵素又はＮ−グリコシド結合複合型糖鎖のコアフコースの結合に関与する酵素が挙げられる。
【０１７２】
ＧＤＰ−Ｌ−フコースの合成又はゴルジ体への輸送に関与する酵素としては、具体的には例えば、ＧＤＰ−マンノース  ４，６−デヒドラターゼ（以下、ＧＭＤと表記する）、ＧＤＰ−４−ケト−６−デオキシ−Ｄ−マンノース−３，５−エピメラーゼ（以下、Ｆｘと表記する）、ＧＤＰ−ベータ−Ｌ−フコース−ピロホスフォリラーゼ（ＧＦＰＰ）、フコキナーゼ、ＧＤＰ−Ｌ−フコーストランスポーターなどが挙げられる。
【０１７３】
コアフコースの結合に関与する酵素としては、例えば、α１，６−フコシルトランスフェラーゼ（以下、ＦＵＴ８と表記する）などが挙げられる。
【０１７４】
ＩｇＧ半量体を生産する細胞としては、上述の１つの酵素活性を低下又は欠損させてもよいし、複数の酵素活性を組み合わせて低下又は欠損させてもいずれでもよい。
【０１７５】
上述の酵素活性を低下又は欠損させる方法としては、例えば、（ａ）酵素の遺伝子を標的とした遺伝子破壊の手法；（ｂ）酵素の遺伝子のドミナントネガティブ体を導入する手法；（ｃ）酵素についての突然変異を導入する手法；（ｄ）酵素の遺伝子の転写又は翻訳を抑制する手法；（ｅ）Ｎ−グリコシド結合糖鎖還元末端のＮ−アセチルグルコサミンの６位とフコースの１位がα結合した糖鎖構造を認識するレクチンに耐性である株を選択する手法などが挙げられる。
【０１７６】
レクチンとしては、例えば、レンズマメレクチンＬＣＡ（Ｌｅｎｓ  Ｃｕｌｉｎａｒｉｓ由来のＬｅｎｔｉｌ  Ａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ）エンドウマメレクチンＰＳＡ（Ｐｉｓｕｍ  ｓａｔｉｖｕｍ由来のＰｅａ  Ｌｅｃｔｉｎ）、ソラマメレクチンＶＦＡ（Ｖｉｃｉａｆａｂａ由来のＡｇｇｌｕｔｉｎｉｎ）、ヒイロチャワンタケレクチンＡＡＬ（Ａｌｅｕｒｉａ  ａｕｒａｎｔｉａ由来のＬｅｃｔｉｎ）などのα１，６フコースに結合するレクチンが挙げられる。
【０１７７】
具体的な細胞としては、例えば、ＦＵＴ８遺伝子が欠損したＣＨＯ細胞（国際公開第２００５／０３５５８６号、国際公開第２００２／３１１４０号、国際公開第２０００／０６１７３９号）、レクチン耐性を獲得したＬｅｃ１３（Somatic Cell and Molecular genetics, 12, 55, 1986）、ＧＤＰ−フコーストランスポーター遺伝子が欠損した細胞（国際公開第２００３／０８５１０２号）、ＧＤＰ−ｍａｎｎｏｓｅ  ４，６−ｄｅｈｙｄｒａｔａｓｅ（ＧＭＤ）遺伝子が欠損した細胞（国際公開第２００２／３１１４０号）、ＷＧＡレクチン耐性細胞及びＬＣＡレクチン耐性細胞（国際公開第２００２／３１１４０号）などが挙げられる。
【０１７８】
上述の方法以外に、Ｎ結合型糖鎖の合成系に関する酵素であるｍａｎｎｏｓｉｄａｓｅ  Ｉ、ｍａｎｎｏｓｉｄａｓｅ  ＩＩなどの酵素を阻害することにより、ｈｉｇｈ  ｍａｎｎｏｓｅ型のＮ結合型糖鎖が結合し、コアフコース量が減少したＩｇＧ半量体を発現させることもできる。
【０１７９】
また、Ｎ−ａｃｅｔｙｌｇｌｕｃｏｓａｍｉｎｅ  ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ  ＩＩＩ（ＧｎＴＩＩＩ）を過剰発現させた宿主細胞を用いることで、ｂｉｓｅｃｔｉｎｇ  ＧｌｃＮＡｃが結合したコンプレックス及びハイブリッド糖鎖が結合し、かつコアフコース量が減少したＩｇＧ半量体を生産することもできる。
【０１８０】
組換えベクターの導入後、ＩｇＧ半量体を安定に発現する形質転換体は、Ｇ４１８硫酸塩（以下、Ｇ４１８と表記する）、シクロヘキシミド（以下、ＣＨＸと略記する）、メトトレキセート（以下、ＭＴＸと略記する）などの薬剤を含む動物細胞培養用培地で培養することにより選択する（日本国特開平２−２５７８９１号公報）。
【０１８１】
動物細胞培養用培地としては、例えば、ＲＰＭＩ１６４０培地（インビトロジェン社製）、ＧＩＴ培地（日本製薬社製）、ＥＸ−ＣＥＬＬ３０１培地、ＥＸ−ＣＥＬＬ３０２、ＥＸ−ＣＥＬＬ３２５培地（ＪＲＨ社製）、ＩＭＤＭ培地（インビトロジェン社製）、Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ−ＳＦＭ培地（インビトロジェン社製）、又はこれら培地にウシ胎児血清（以下、ＦＢＳと略記する）などの各種添加物を添加した培地などが挙げられる。
【０１８２】
得られた形質転換体を培地中で培養することで培養上清中にＩｇＧ半量体を発現させて蓄積させる。培養上清中のＩｇＧ半量体の発現量及び抗原結合活性はＥＬＩＳＡ法などにより測定できる。また、ｄｈｆｒ遺伝子増幅系（日本国特開平２−２５７８９１号公報）などを利用して、形質転換体の産生するＩｇＧ半量体の発現量を向上させることができる。
【０１８３】
以上、動物細胞を宿主としたＩｇＧ半量体の発現方法を示したが、酵母、昆虫細胞、植物細胞又は動物個体あるいは植物個体においても、公知技術に基づいて動物細胞と同様の方法によりＩｇＧ半量体を発現させることができる。
【０１８４】
酵母を宿主細胞とする場合は、サッカロミセス属、シゾサッカロミセス属、クリュイベロミセス属、トリコスポロン属、シュワニオミセス属等に属する微生物、例えば、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓ、Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ  ｐｕｌｌｕｌａｎｓ、Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ  ａｌｌｕｖｉｕｓ等を挙げることができる。
【０１８５】
組換えベクターの導入方法としては、酵母にＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、エレクトロポレーション法（Methods. Enzymol., 194,182,1990）、スフェロプラスト法（Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A, 84, 1929, 1978）、酢酸リチウム法（J. Bacteriology, 153, 163, 1983; Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A, 75, 1929, 1978）に記載の方法等が挙げられる。
【０１８６】
昆虫細胞を宿主として用いる場合には、例えば、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー（Baculovirus Expression Vectors, A Laboratory Manual, W. H. Freeman and Company, New York, 1992）、Bio / Technology, 6, 47, 1988等に記載された方法によって、ＩｇＧ半量体を発現することができる。
【０１８７】
［工程２］
工程２は、工程１で得られた形質転換体を培養し、培養物中にＩｇＧ半量体を生成・蓄積させ、培養物からＩｇＧ半量体を採取し、精製する工程である。
【０１８８】
第１及び第２のＩｇＧ半量体は同一の形質転換体から採取してもよいし、各々を単独で発現する形質転換体から採取してもよい。通常は第１及び第２のＩｇＧ半量体は、各々を単独で発現する形質転換体から採取、精製後に混合して抗体組成物を調製する。
【０１８９】
工程１で調製した宿主細胞がＩｇＧ半量体を発現する能力を有する場合には、以下に示す宿主細胞にＩｇＧ半量体を導入した後に、該細胞を培養し、該培養物から目的とするＩｇＧ半量体を採取できる。
【０１９０】
さらに、遺伝子導入した動物又は植物の細胞を再分化させることにより、遺伝子が導入された動物個体（トランスジェニック非ヒト動物）又は植物個体（トランスジェニック植物）を造成し、これらの個体を用いてＩｇＧ半量体を採取してもよい。
【０１９１】
形質転換体が動物個体又は植物個体の場合は、通常の方法に従って、飼育又は栽培し、ＩｇＧ半量体を生成蓄積させ、該動物個体又は植物個体より該ＩｇＧ半量体を採取できる。
【０１９２】
動物個体を用いてＩｇＧ半量体を生産させる方法としては、例えば、公知の方法（American Journal of Clinical Nutrition, 63, 639S, 1996; American Journal of Clinical Nutrition, 63, 627S, 1996; Bio / Technology, 9, 830, 1991）に準じて遺伝子を導入して造成した動物中に目的とするＩｇＧ半量体を生産させる方法が挙げられる。
【０１９３】
動物個体の場合は、例えば、ＩｇＧ半量体をコードするＤＮＡを導入したトランスジェニック非ヒト動物を飼育し、ＩｇＧ半量体を該動物中に生成、蓄積させ、該動物中よりＩｇＧ半量体を採取できる。
【０１９４】
前記動物中の生成及び蓄積場所としては、例えば、該動物のミルク（日本国特開昭６３−３０９１９２号公報）又は卵等を挙げることができる。この際に用いられるプロモーターとしては、動物で発現できるものであればいずれも用いることができる。例えば、乳腺細胞特異的なプロモーターであるαカゼインプロモーター、βカゼインプロモーター、βラクトグロブリンプロモーター及びホエー酸性プロテインプロモーター等が好適に用いられる。
【０１９５】
植物個体を用いてＩｇＧ半量体を生産させる方法としては、例えばＩｇＧ半量体をコードするＤＮＡを導入したトランスジェニック植物を公知の方法［組織培養，２０（１９９４）；組織培養，２１（１９９５）；Trends in Biotechnology, 15, 45 (1997)］に準じて栽培し、ＩｇＧ半量体を該植物中に生成、蓄積させ、該植物中より該ＩｇＧ半量体を採取する方法が挙げられる。
【０１９６】
ＩｇＧ半量体は以下のようにして精製することができる。ＩｇＧ半量体をコードする遺伝子を導入した形質転換体により製造されたＩｇＧ半量体は、例えばＩｇＧ半量体が、細胞内に可溶性タンパク質として発現した場合には、培養終了後、細胞を遠心分離により回収し、水系緩衝液に懸濁後、超音波破砕機、フレンチプレス、マントンガウリンホモゲナイザー、ダイノミル等により細胞を破砕し、無細胞抽出液を得る。
【０１９７】
前記無細胞抽出液を遠心分離することにより得られる上清から、通常の酵素の単離精製法、即ち、溶媒抽出法、硫安等による塩析法、脱塩法、有機溶媒による沈殿法、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）−セファロース、ＤＩＡＩＯＮ  ＨＰＡ−７５（三菱ケミカル社製）等レジンを用いた陰イオン交換クロマトグラフィ法、Ｓ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＦＦ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社）等のレジンを用いた陽イオン交換クロマトグラフィ法、ブチルセファロース、フェニルセファロース等のレジンを用いた疎水性クロマトグラフィ法、分子篩を用いたゲルろ過法、アフィニティクロマトグラフィ法、クロマトフォーカシング法、等電点電気泳動等の電気泳動法等の手法を単独あるいは組み合わせて用い、ＩｇＧ半量体を精製できる。
【０１９８】
本発明においては、アフィニティクロマトグラフィとして、ＣＨ結合体又はＦｃ結合体を用いたアフィニティクロマトグラフィが用いられる（Monoclonal Antibodies - Principles and practice, Third edition, Academic Press,1996; Antibodies - A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988）。
【０１９９】
また、ＩｇＧ半量体が細胞内に不溶体を形成して発現した場合は、同様に細胞を回収後破砕し、遠心分離を行うことにより、沈殿画分としてＩｇＧ半量体の不溶体を回収する。回収したＩｇＧ半量体の不溶体をタンパク質変性剤で可溶化する。該可溶化液を希釈又は透析することにより、該ＩｇＧ半量体を正常な立体構造に戻した後、上記と同様の単離精製法により該ＩｇＧ半量体を精製できる。
【０２００】
ＩｇＧ半量体が細胞外に分泌された場合には、培養上清に該ＩｇＧ半量体又はその誘導体を回収することができる。即ち、該培養物を上記と同様の遠心分離等の手法により処理することにより培養上清を取得し、該培養上清から、上記と同様の単離精製法を用いることにより、ＩｇＧ半量体を精製できる。
【０２０１】
ＣＨ結合体又はＦｃ結合体として、具体的には、ＣＨ又はＦｃに結合するものであればタンパク質、樹脂などいかなるものであってもよく、例えば、Ｆｃ結合タンパク質、抗体Ｈ鎖定常領域（ＣＨ）に結合する抗体などが挙げられる。
【０２０２】
Ｆｃ結合タンパク質として、例えば、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  Ａｕｒｅｕｓ由来Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ、ｈｅｍｏｌｙｔｉｃ  Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ由来Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｇ、Ｆｃ受容体及び該サブクラス（ＦｃγＲＩ、ＩＩＡ、ＩＩＢ、ＩＩＩＡ、ＩＩＩＢ）並びにこれらの結合部分断片などが挙げられる。
【０２０３】
ＣＨに結合する抗体としては、例えば、ＣＨ１ドメイン、ヒンジドメイン、ＣＨ２ドメイン又はＣＨ３ドメインに結合する抗体が挙げられる。
【０２０４】
本発明においてＣＨ結合体としてより好ましくは、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｇ、抗ＣＨ１抗体及び該結合部分断片が挙げられる。
【０２０５】
ＩｇＧ半量体の精製方法として、例えば、［工程１］（６）において上述した形質転換体を用いて培養した培養上清を、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａカラム又はＰｒｏｔｅｉｎ  Ｇカラムのロードした後、該カラムをリン酸バッファー（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｂｕｆｆｅｒ  ｓａｌｉｎｅ、以下ＰＢＳと略記する）を用いて洗浄する。
【０２０６】
その後、低ｐＨ（ｐＨ２．０〜６．０）のクエン酸バッファー等でカラムからＩｇＧ半量体を溶出させ、溶出液をアルカリ性のＴｒｉｓバッファー等で中和する。中和された溶出液は十分量のＰＢＳ等で透析を行い、精製されたＩｇＧ半量体を取得することができる。
【０２０７】
精製したＩｇＧ半量体の分子量は、ポリアクリルアミドゲル電気泳動法［Nature, 227, 680 (1970)］、又はウェスタンブロッティング法［Monoclonal Antibodies - Principles and practice, Third edition, Academic Press (1996); Antibodies - A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1988)］など用いて測定することができる。
【０２０８】
［工程３］
工程３は、工程２で採取、精製された、第１及び第２のＩｇＧ半量体を混合し、抗体組成物を得る工程である。第１及び第２のＩｇＧ半量体の混合割合は、抗原に対する結合活性、抗原陽性培養細胞株に対する結合活性、各々のＣＤ１６ａ結合領域におけるＣＤ１６ａ結合活性の強さ、第１のＩｇＧ半量体と第２のＩｇＧ半量体とのＣＨ３間の相互作用等により適宜設定することが好ましい。
【０２０９】
４．抗体組成物の活性評価
精製したＩｇＧ半量体のタンパク質量、ＩｇＧ半量体から構成される抗体組成物のＦｃＲ結合活性、Ｃ１ｑ結合活性、抗原結合活性、又はＡＤＣＣ活性若しくはＣＤＣ活性等の細胞傷害活性を測定する方法としては、例えば、Molecular Cloning 2nd Edition, Current Protocols in Molecular Biology; Antibodies, A Laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988; Monoclonal Antibodies: principles and practice, Third Edition, Acad. Press, 1993; Antibody Engineering, A Practical Approach, IRL Press at Oxford University Press, 1996等に記載の公知の方法が挙げられる。
【０２１０】
具体的な例としては、抗体組成物の、抗原との結合活性、抗原陽性培養細胞株に対する結合活性はＥＬＩＳＡ法及び蛍光抗体法（Cancer Immunol. Immunother, 36, 373, 1993）等により測定できる。抗原陽性培養細胞株に対する細胞傷害活性は、ＣＤＣ活性、ＡＤＣＣ活性等を測定することにより、評価することができる（Cancer Immunol. Immunother, 36, 373, 1993；米国特許出願公開第２００４／０２５９１５０号明細書）。
【０２１１】
抗体組成物がＣＤ１６ａへの結合活性を有することは、遺伝子組み換えＣＤ１６ａタンパク質を作製して、結合活性を測定することで確認することができる（米国特許出願公開２００４／０２５９１５０号明細書）。
【０２１２】
ＡＤＣＣ活性を測定する方法としては、例えば、放射性同位体、蛍光物質又は色素等で標識された標的細胞、抗体組成物及びエフェクター細胞を接触させた後、傷害された標的細胞から遊離される標識物質の活性又は遊離する酵素の生理活性等を測定する方法など挙げられる。
【０２１３】
ＣＤＣ活性を測定する方法としては、例えば、放射性同位体、蛍光物質又は色素等で標識された標的細胞、抗体組成物及び補体成分を含む血清等の生体試料を接触させた後、傷害された標的細胞から遊離される標識物質の活性又は遊離する酵素の生理活性を測定する方法など挙げられる。
【０２１４】
５．糖鎖構造の分析
各種細胞で発現させたＩｇＧ半量体の糖鎖構造は、通常の糖タンパク質の糖鎖構造の解析に準じて行うことができる。
【０２１５】
例えば、ＩｇＧ半量体に結合している糖鎖はガラクトース（Ｇａｌ）、マンノース（Ｍａｎ）若しくはフコース（Ｆｕｃ）などの中性糖、Ｎ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）などのアミノ糖又はシアル酸（Ｓｉａｌ）などの酸性糖から構成されており、糖組成分析及び二次元糖鎖マップ法などを用いた糖鎖構造解析等の手法を用いて行うことができる。
【０２１６】
（１）中性糖・アミノ糖組成分析
ＩｇＧ半量体の糖鎖の組成分析は、トリフルオロ酢酸等で、糖鎖の酸加水分解を行うことにより、中性糖又はアミノ糖を遊離し、その組成比を分析することができる。
【０２１７】
具体的な方法として、例えば、Ｄｉｏｎｅｘ社製糖組成分析装置を用いる方法が挙げられる。ＢｉｏＬＣはＨＰＡＥＣ−ＰＡＤ（ｈｉｇｈ  ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ  ａｎｉｏｎ−ｅｘｃｈａｎｇｅ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ−ｐｕｌｓｅｄ  ａｍｐｅｒｏｍｅｔｒｉｃ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ）法（J. Liq. Chromatogr., 6, 1577, 1983）によって糖組成を分析する装置である。
【０２１８】
また、２−アミノピリジンによる蛍光標識化法でも組成比を分析することができる。具体的には、公知の方法［Agric. Biol. Chem., 55(1), 283-284, 1991］に従って酸加水分解した試料を２−アミノピリジル化で蛍光ラベル化し、ＨＰＬＣ分析して組成比を算出することができる。
【０２１９】
（２）糖鎖構造解析
ＩｇＧ半量体における糖鎖の構造解析は、２次元糖鎖マップ法（Anal. Biochem., 171, 73, 1988；生物化学実験法２３−糖蛋白質糖鎖研究法、学会出版センター、高橋禮子編、１９８９年）により行うことができる。２次元糖鎖マップ法は、例えば、Ｘ軸には逆相クロマトグラフィによる糖鎖の保持時間又は溶出位置を、Ｙ軸には順相クロマトグラフィによる糖鎖の保持時間又は溶出位置を、それぞれプロットし、既知糖鎖のそれらの結果と比較することにより、糖鎖構造を推定する方法である。
【０２２０】
具体的には、ＩｇＧ半量体をヒドラジン分解して、ＩｇＧ半量体から糖鎖を遊離し、２−アミノピリジン（以下、ＰＡと略記する）による糖鎖の蛍光標識（J. Biochem., 95, 197, 1984）を行った後、ゲルろ過により糖鎖を過剰のＰＡ化試薬などと分離し、逆相クロマトグラフィを行う。次いで、分取した糖鎖の各ピークについて順相クロマトグラフィを行う。これらの結果をもとに、２次元糖鎖マップ上にプロットし、糖鎖スタンダード（ＴａＫａＲａ社製）、文献（Anal. Biochem., 171, 73, 1988）とのスポットの比較より糖鎖構造を推定することができる。
【０２２１】
さらに各糖鎖のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳなどの質量分析を行い、２次元糖鎖マップ法により推定される構造を確認することができる。
【０２２２】
ＩｇＧ半量体のＦｃのいずれの部分に糖鎖が結合しているのかは、還元アルキル化処理したＩｇＧ半量体をトリプシン、ペプシン、Ｌｙｓ−Ｃ、Ａｓｐ−Ｎなどのエンドプロテアーゼで処理したものを、逆相クロマトグラフィ（ＬＣ）で分離した後に、質量分析計（ＭＳ）などで分析することにより確認できる。
【０２２３】
即ち、目的とするＩｇＧ半量体のＦｃのアミノ酸配列に基づき、プロテアーゼ処理により生成しうるペプチドの分子量及び糖鎖が結合したペプチドの分子量と、ＭＳの分析値が一致するか否かにより、実際に糖鎖が結合しているか否かを確かめることができる。
【０２２４】
６．糖鎖構造の識別方法
ＩｇＧ半量体におけるＦｃに結合する全Ｎ−グリコシド結合複合型糖鎖のうち、コアフコースの無い糖鎖の割合は、上記５．に記載の糖鎖構造の分析法を用いることにより識別できる。また、レクチンを用いた免疫学的定量方法を用いることによっても識別できる。
【０２２５】
レクチンを用いた免疫学的定量方法を用いたＩｇＧ半量体における糖鎖構造の識別は、文献［Monoclonal Antibodies: Principles and Applications, Wiley-Liss, Inc., (1995)；酵素免疫測定法，第３版，医学書院（１９８７）；改訂版，酵素抗体法，学際企画（１９８５）］等に記載のウエスタン染色、ＲＩＡ（Ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ）、ＶＩＡ（Ｖｉｒｏｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ）、ＥＩＡ（Ｅｎｚｙｍｏｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ）、ＦＩＡ（Ｆｌｕｏｒｏｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ）、ＭＩＡ（Ｍｅｔａｌｌｏｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ）などの免疫学的定量方法に準じて、例えば、以下のように行うことができる。
【０２２６】
ＩｇＧ半量体の糖鎖構造を認識するレクチンを標識し、標識したレクチンと試料である抗体組成物を反応させる。次に、標識したレクチンと抗体組成物の複合体の量を測定する。
【０２２７】
ＩｇＧ半量体の糖鎖構造を識別に用いられるレクチンとしては、例えば、ＷＧＡ（Ｔ．ｖｕｌｇａｒｉｓ由来のｗｈｅａｔ−ｇｅｒｍ  ａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ）、ＣｏｎＡ（Ｃ．ｅｎｓｉｆｏｒｍｉｓ由来のｃｏｎｃａｎａｖａｌｉｎ  Ａ）、ＲＩＣ（Ｒ．ｃｏｍｍｕｎｉｓ由来の毒素）、Ｌ−ＰＨＡ（Ｐ．ｖｕｌｇａｒｉｓ由来のｌｅｕｋｏａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ）、ＬＣＡ（Ｌ．ｃｕｌｉｎａｒｉｓ由来のｌｅｎｔｉｌ  ａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ）、ＰＳＡ（Ｐ．ｓａｔｉｖｕｍ由来のＰｅａ  Ｌｅｃｔｉｎ）、ＡＡＬ（Ａｌｅｕｒｉａ  ａｕｒａｎｔｉａ  Ｌｅｃｔｉｎ）、ＡＣＬ（Ａｍａｒａｎｔｈｕｓ  ｃａｕｄａｔｕｓ  Ｌｅｃｔｉｎ）、ＢＰＬ（Ｂａｕｈｉｎｉａ  ｐｕｒｐｕｒｅａ  Ｌｅｃｔｉｎ）、ＤＳＬ（Ｄａｔｕｒａ  ｓｔｒａｍｏｎｉｕｍ  Ｌｅｃｔｉｎ）、ＤＢＡ（Ｄｏｌｉｃｈｏｓ  ｂｉｆｌｏｒｕｓ  Ａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ）、ＥＢＬ（Ｅｌｄｅｒｂｅｒｒｙ  Ｂａｌｋ  Ｌｅｃｔｉｎ）、ＥＣＬ（Ｅｒｙｔｈｒｉｎａ  ｃｒｉｓｔａｇａｌｌｉ  Ｌｅｃｔｉｎ）、ＥＥＬ（Ｅｕｏｎｙｍｕｓ  ｅｕｒｏｐａｅｕｓ  Ｌｅｃｔｉｎ）、ＧＮＬ（Ｇａｌａｎｔｈｕｓ  ｎｉｖａｌｉｓ  Ｌｅｃｔｉｎ）、ＧＳＬ（Ｇｒｉｆｆｏｎｉａ  ｓｉｍｐｌｉｃｉｆｏｌｉａ  Ｌｅｃｔｉｎ）、ＨＰＡ（Ｈｅｌｉｘ  ｐｏｍａｔｉａ  Ａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ）、ＨＨＬ（Ｈｉｐｐｅａｓｔｒｕｍ  Ｈｙｂｒｉｄ  Ｌｅｃｔｉｎ）、Ｊａｃａｌｉｎ、ＬＴＬ（Ｌｏｔｕｓ  ｔｅｔｒａｇｏｎｏｌｏｂｕｓ  Ｌｅｃｔｉｎ）、ＬＥＬ（Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ  ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍ  Ｌｅｃｔｉｎ）、ＭＡＬ（Ｍａａｃｋｉａ  ａｍｕｒｅｎｓｉｓ  Ｌｅｃｔｉｎ）、ＭＰＬ（Ｍａｃｌｕｒａ  ｐｏｍｉｆｅｒａ  Ｌｅｃｔｉｎ）、ＮＰＬ（Ｎａｒｃｉｓｓｕｓ  ｐｓｅｕｄｏｎａｒｃｉｓｓｕｓ  Ｌｅｃｔｉｎ）、ＰＮＡ（Ｐｅａｎｕｔ  Ａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ）、Ｅ−ＰＨＡ（Ｐｈａｓｅｏｌｕｓ  ｖｕｌｇａｒｉｓ  Ｅｒｙｔｈｒｏａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ）、ＰＴＬ（Ｐｓｏｐｈｏｃａｒｐｕｓ  ｔｅｔｒａｇｏｎｏｌｏｂｕｓ  Ｌｅｃｔｉｎ）、ＲＣＡ（Ｒｉｃｉｎｕｓ  ｃｏｍｍｕｎｉｓ  Ａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ）、ＳＴＬ（Ｓｏｌａｎｕｍ  ｔｕｂｅｒｏｓｕｍ  Ｌｅｃｔｉｎ）、ＳＪＡ（Ｓｏｐｈｏｒａ  ｊａｐｏｎｉｃａ  Ａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ）、ＳＢＡ（Ｓｏｙｂｅａｎ  Ａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ）、ＵＥＡ（Ｕｌｅｘ  ｅｕｒｏｐａｅｕｓ  Ａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ）、ＶＶＬ（Ｖｉｃｉａ  ｖｉｌｌｏｓａ  Ｌｅｃｔｉｎ）、ＷＦＡ（Ｗｉｓｔｅｒｉａ  ｆｌｏｒｉｂｕｎｄａ  Ａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ）が挙げられる。
【０２２８】
コアフコースを特異的に認識するレクチンを用いることが好ましく、具体的には、例えば、レンズマメレクチンＬＣＡ（Ｌｅｎｓ  Ｃｕｌｉｎａｒｉｓ由来のＬｅｎｔｉｌ  Ａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ）エンドウマメレクチンＰＳＡ（Ｐｉｓｕｍ  ｓａｔｉｖｕｍ由来のＰｅａ  Ｌｅｃｔｉｎ）、ソラマメレクチンＶＦＡ（Ｖｉｃｉａ  ｆａｂａ由来のＡｇｇｌｕｔｉｎｉｎ）及びヒイロチャワンタケレクチンＡＡＬ（Ａｌｅｕｒｉａ  ａｕｒａｎｔｉａ由来のＬｅｃｔｉｎ）を挙げることができる。
【０２２９】
７．本発明の抗体組成物の使用
本発明の抗体組成物は、互いに異なる抗原に対する抗原結合ドメインを有する第１及び第２のＩｇＧ半量体から構成されることで、互いに異なる２種の抗原を認識することができる。
【０２３０】
従って、本発明の抗体組成物は、異なる２種類の標的とする抗原に合わせた分子形体をとることができるため、該２種類の抗原を発現する両陽性細胞に対して高い選択性を有する抗体組成物医薬品となる。
【０２３１】
本発明の抗体組成物が結合する抗原としては、いずれの抗原であってもよく、好ましくは癌、免疫疾患、アレルギー疾患又は循環器疾患等に関する抗原分子が挙げられる。例えば、サイトカイン、ケモカイン、増殖因子及び該受容体並びにＣＤ抗原などが挙げられる。
【０２３２】
サイトカイン又は増殖因子の受容体としては、例えば、インターフェロン（以下、ＩＦＮと記す）−α、ＩＦＮ−β、ＩＦＮ−γ、インターロイキン（以下、ＩＬと記す）−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１５、ＩＬ−１７、ＩＬ−１８、ＩＬ−２１、ＩＬ−２３、ＩＬ−２７、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、顆粒球／マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、又はマクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）に対する受容体などが挙げられる。
【０２３３】
ケモカイン受容体としては、例えば、ＳＬＣ、ＥＬＣ、Ｉ−３０９、ＴＡＲＣ、ＭＤＣ、ＭＩＰ−３α、ＣＴＡＣＫに対する受容体が挙げられる。
【０２３４】
増殖因子の受容体としては、例えば、Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ（ＥＧＦ）、ｖａｓｃｕｌａｒ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ（ＶＥＧＦ）、ａｎｇｉｏｐｏｉｅｔｉｎ、ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ（ＦＧＦ）、ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ（ＨＧＦ）、ｐｌａｔｅｌｅｔ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ（ＰＤＧＦ）、ｉｎｓｕｌｉｎ−ｌｉｋｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ（ＩＧＦ）、ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｔｉｎ（ＥＰＯ）、ＴＧＦβ、Ｉｅｐｈｒｉｎ、ａｎｇｉｏｐｏｉｅｔｉｎ、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ  ｌｉｇａｎｄ、ＳＤＦ−１に対する受容体などが挙げられる。
【０２３５】
Ｃｌｕｓｔｅｒ  ｏｆ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ（以下、ＣＤと記載する）抗原としては、ＣＤ１ａ、ＣＤ１ｃ（ＢＤＣＡ１）、ＣＤ１ｄ、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ６、ＣＤ７、ＣＤ８、ＣＤ１０、ＣＤ１１ａ、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ１４、ＣＤ１６、ＣＤ１８、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２１、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ２４、ＣＤ２５、ＣＤ２６（ＤＰＰ−４）、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ３２、ＣＤ３４、ＣＤ３７、ＣＤ３８、ＣＤ３９、ＣＤ４０、ＣＤ４３、ＣＤ４４、ＣＤ４５、ＣＤ４７、ＣＤ４９、ＣＤ５１、ＣＤ５２、ＣＤ５３、ＣＤ５４、ＣＤ５５、ＣＤ５６、ＣＤ５７、ＣＤ５９、ＣＤ６２Ｅ、ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ６２Ｐ、ＣＤ６４、ＣＤ６６ａ（ＣＥＡＣＡＭ１）、ＣＤ６６ｂ（ＮＣＡ−９５）、ＣＤ６６ｃ（ＮＣＡ−５０／９０）、ＣＤ６６ｄ（ＣＧＭ１）、ＣＤ６６ｅ（ＣＥＡ）、ＣＤ６６ｆ（ＰＳＧ）、ＣＤ６８、ＣＤ６９、ＣＤ７０、ＣＤ７２、ＣＤ７３、ＣＤ７４、ＣＤ７５、ＣＤ７６、ＣＤ７７、ＣＤ７８、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ８０（Ｂ７．１）、ＣＤ８１、ＣＤ８２、ＣＤ８３、ＣＤ８４（ＳＬＡＭＦ５）、ＣＤ８５ａ（ＩＬＴ−５）、ＣＤ８５ｂ（ＩＬＴ８）、ＣＤ８５ｃ（ＬＩＲ８）、ＣＤ８５ｄ（ＩＬＴ４）、ＣＤ８５ｆ（ＩＬＴ１１）、ＣＤ８５ｇ（ＩＬＴ７）、ＣＤ８５ｈ（ＩＬＴ１）、ＣＤ８５ｉ（ＬＩＲ６ａ）、ＣＤ８５ｊ（ＩＬＴ２）、ＣＤ８５ｋ（ＩＬＴ３）、ＣＤ８５ｍ（ＩＬＴ１０）、ＣＤ８６（Ｂ７．２）、ＣＤ８７、ＣＤ８９、ＣＤ９４（ＮＫＧ２）、ＣＤ９５（Ｆａｓ）、ＣＤ９８、ＣＤ１０３、ＣＤ１０７ａ（ＬＡＭＰ１）、ＣＤ１１４（Ｇ−ＣＳＦＲ）、ＣＤ１１５（Ｍ−ＣＳＦＲ）、ＣＤ１１６（ＧＭ−ＣＳＦＲ）、ＣＤ１１７（ＳＣＦ−Ｒ）、ＣＤ１１９（ＩＦＮＧＲ１）、ＣＤ１２１ａ（ＩＬ−１Ｒ１）、ＣＤ１２２（ＩＬ−２Ｒｂ）、ＣＤ１２３（ＩＬ−３Ｒａ）、ＣＤ１２４（ＩＬ−４Ｒａ）、ＣＤ１２５（ＩＬ−５Ｒａ）、ＣＤ１２６（ＩＬ−６Ｒａ）、ＣＤ１２７（ＩＬ−７Ｒａ）、ＣＤ１３４（ＯＸ４０）、ＣＤ１３５（ＦＬＴ３）、ＣＤ１３７（４−１ＢＢ）、ＣＤ１３８（Ｓｙｎｄｅｃａｎ−１）、ＣＤ１４０（ＰＤＧＦＲ）、ＣＤ１４６（ＭＵＣ１８）、ＣＤ１４７（ＥＭＭＲＲＩＮ）、ＣＤ１５２（ＣＴＬＡ−４）、ＣＤ１５８ａ（ＫＩＲ２ＤＬ１）、ＣＤ１５８ｂ１（ＫＩＲ２ＤＬ２）、ＣＤ１５８ｂ２（ＫＩＲ２ＤＬ３）、ＣＤ１５８ｃ（ＫＩＲ２ＤＳ６）、ＣＤ１５８ｄ（ＫＩＲ２ＤＬ４）、ＣＤ１５８ｅ１（ＫＩＲ３ＤＬ１）、ＣＤ１５８ｅ２（ＫＩＲ３ＤＳ１）、ＣＤ１５８ｆ（ＫＩＲ２ＤＬ５）、ＣＤ１５８ｇ（ＫＩＲ２ＤＳ５）、ＣＤ１５８ｈ（ＫＩＲ２ＤＳ１）、ＣＤ１５８ｉ（ＫＩＲ２ＤＳ４）、ＣＤ１５８ｊ（ＫＩＲ２ＤＳ２）、ＣＤ１５８ｋ（ＫＩＲ３ＤＬ２）、ＣＤ１５９ａ（ＮＫＧ２Ａ）、ＣＤ１５９ｃ（ＮＫＧ２Ｃ）、ＣＤ１６１（ＮＫＲＰ１Ａ）、ＣＤ１６２（ＰＳＧＬ−１）、ＣＤ１６３、ＣＤ１６９（ＳＩＧＬＥＣ１）、ＣＤ１７８（ＦａｓＬ）、ＣＤ１８３（ＣＸＣＲ３）、ＣＤ１８４（ＣＸＣＲ４）、ＣＤ１８５（ＣＸＣＲ５）、ＣＤ１９１（ＣＣＲ１）、ＣＤ１９３（ＣＣＲ３）、ＣＤ１９４（ＣＣＲ４）、ＣＤ１９５（ＣＣＲ５）、Ｃ��１９６（ＣＣＲ６）、ＣＤ１９７（ＣＣＲ７）、ＣＤ１９８（ＣＣＲ８）、ＣＤ１９９（ＣＣＲ９）、ＣＤ２００（ＯＸ２）、ＣＤ２０６（ＭＭＲ）、ＣＤ２０７（Ｌａｎｇｅｒｉｎ），ＣＤ２０９（ＤＣ−ＳＩＧＮ）、ＣＤ２１２（ＩＬ−１２Ｒβ１）、ＣＤ２１３ａ１（ＩＬ−１３Ｒａ１）、ＣＤ２１３ａ２（ＩＬ−１３Ｒａ２）、ＣＤ２１５（ＩＬ−１５ＲＡ）、ＣＤ２１７（ＩＬ−１７Ｒ）、ＣＤ２１８ａ（ＩＬ−１８Ｒａ）、ＣＤ２１８ｂ（ＩＬ−１８Ｒβ）、ＣＤ２２３（ＬＡＧ３）、ＣＤ２２６（ＤＮＡＭ−１）、ＣＤ２２９（ＳＬＡＭＦ３）、ＣＤ２５２（ＯＸ４０Ｌ）、ＣＤ２６９（ＢＣＭＡ）、ＣＤ２７２（ＢＴＬＡ）、ＣＤ２７４（ＰＤ−Ｌ１）、ＣＤ２７６（Ｂ７Ｈ３）、ＣＤ２７８（ＩＣＯＳ）、ＣＤ２７９（ＰＤ−１）、ＣＤ２８１（ＴＬＲ１）、ＣＤ２８２（ＴＬＲ２）、ＣＤ２８３（ＴＬＲ３）、ＣＤ２８４（ＴＬＲ４）、ＣＤ２８６（ＴＬＲ６）、ＣＤ２８８（ＴＬＲ８）、ＣＤ２８９（ＴＬＲ９）、ＣＤ２９４（ＣＲＴＨ２）、ＣＤ３０１（ＭＧＬ）、ＣＤ３０２（ＤＣＬ１）、ＣＤ３０３（ＢＤＣＡ２）、ＣＤ３０４（ＢＤＣＡ４）、ＣＤ３１７（ＢＳＴ２）、ＣＤ３２４（Ｅ−ｃａｄｈｅｒｉｎ）、ＣＤ３２６（ＥｐＣＡＭ）、ＣＤ３５７（ＧＩＴＲ）、ＣＤ３５８（ＤＲ６）、ＣＤ３６０（ＩＬ−２１Ｒ）、ＣＤ３６５（ＴＩＭ−１）、ＣＤ３６６（ＴＩＭ−３）、ＣＤ３６９（ＤＥＣＴＩＮ−１）、ＣＤ３７０（ＣＬＥＣ９Ａ）、ｈｕｍａｎ  ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ  ａｎｔｉｇｅｎ（ＨＬＡ）−Ｃｌａｓｓ  ＩＩ及びＨＬＡ−Ｉなどが挙げられる。
【０２３６】
更に、腫瘍の病態形成に関わる抗原又は免疫機能を調節する抗体の抗原としては、例えば、ガングリオシドＧＭ１、ＧＭ２、ＧＤ２、ＧＤ３、Ｌｅｗｉｓ  Ｘ、Ｌｅｗｉｓ  Ｙ、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ４０、ＣＤ４０リガンド、Ｂ７ファミリー分子（例えば、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ２７４、Ｂ７−ＤＣ、Ｂ７−Ｈ２、Ｂ７−Ｈ３又はＢ７−Ｈ４）、Ｂ７ファミリー分子のリガンド（例えば、ＣＤ２８、ＣＴＬＡ−４、ＩＣＯＳ、ＰＤ−１又はＢＴＬＡ）、ＯＸ−４０、ＯＸ−４０リガンド、ＣＤ１３７、ｔｕｍｏｒ  ｎｅｃｒｏｓｉｓ  ｆａｃｔｏｒ（ＴＮＦ）受容体ファミリー分子（例えば、ＤＲ３、ＤＲ４、ＤＲ５、ＢＡＦＦＲ、ＬＩＧＨＴ、ＴＮＦＲ１又はＴＮＦＲ２）、ＴＮＦ−ｒｅｌａｔｅｄ  ａｐｏｐｔｏｓｉｓ−ｉｎｄｕｃｉｎｇ  ｌｉｇａｎｄ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＴＲＡＩＬ）ファミリー分子、ＴＲＡＩＬファミリー分子の受容体ファミリー（例えば、ＴＲＡＩＬ−Ｒ１、ＴＲＡＩＬ−Ｒ２、ＴＲＡＩＬ−Ｒ３又はＴＲＡＩＬ−Ｒ４）、ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ａｃｔｉｖａｔｏｒ  ｏｆ  ｎｕｃｌｅａｒ  ｆａｃｔｏｒ  ｋａｐｐａ  Ｂ  ｌｉｇａｎｄ（ＲＡＮＫ）、ＲＡＮＫリガンド、ＣＤ２５、葉酸受容体、Ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎ、ＳＩＧＬＥＣ８、サイトカイン・ケモカイン受容体［例えば、ＩＬ−１ＲＩＩ、ＩＬ−１２Ｒβ２、ＩＬ−１７ＲＢ、ＩＬ−２３Ｒ、ＩＬ−２７Ｒα、ＩＬ−３１Ｒ、ＩＬ−３３Ｒα、ＩＬ−３６Ｒ、ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ（ＴＧＦ）βＲＩＩ、ＣＣＲ２、ＣＣＲ１０、ＣＸＣＲ１、ＣＸＣＲ２］、ＮＫ細胞受容体（例えば、ＮＫＧ２Ｄ、Ｅ４ＢＰ４、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ４６、ＡｈＲ）、Ｔ細胞受容体（例えば、ＴＣＲα／β、ＴＣＲ  Ｖβ１１、ＴＣＲγ／δ、ＴＳＬＰＲ、ＳＬＡＭ、ＳＬＡＭＦ６、ＬＡＰ，ＧＡＲＰ、ＳＲ−Ａ１、ＣＤ２００Ｒ、ＤＣＲ３、ＴＩＧＩＴ）、Ｂ細胞受容体（例えば、ＢＬＹＳ、ＡＰＲＩＬ、ＴＳＬＰＲ）、樹状細胞受容体（例えば、ＦＣＥＲ１Ａ、ＴＬＲ７、ＣＡＤＭ１、ＸＣＲ１、ＢＴＬＡ、ＳＩＲＰＡ、ＤＣＩＲ、ＴＲＯＰ２、ＡＸＬ、ＳＩＧＬＥＣ６、ＳＩＧＬＥＣ１５、ＣＸ３ＣＲ１、Ｓ１００Ａ８、Ｓ１００Ａ９、ＡＳＧＲ１）などが挙げられる。
【０２３７】
受容体チロシンキナーゼとしては、例えば、ＥＧＦ受容体、インスリン受容体、ＩＧＦ−１受容体、ＮＧＦ受容体、ＰＤＧＦ受容体、Ｍ−ＣＳＦ受容体、ＦＧＦ受容体、ＶＥＧＦ受容体及びＥｐｈ受容体などが挙げられる。チロシンキナーゼ会合型受容体としては、例えば、サイトカイン受容体及びＦｃ受容体などが挙げられる。また、細胞接着分子としては、例えば、カドヘリン及びインテグリンなどが挙げられる。Ｇタンパク共役型受容体としては、例えば、アデノシン受容体及びグルカゴン受容体などが挙げられる。
【０２３８】
具体的には、例えば受容体チロシンキナーゼとして、Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＥＧＦＲ）、Ｖ−ＥＲＢ−Ｂ２  Ａｖｉａｎ  Ｅｒｙｔｈｒｏｂｌａｓｔｉｃ  Ｌｅｕｋｅｍｉａ  Ｖｉｒａｌ  Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  Ｈｏｍｏｌｏｇ２（ＨＥＲ２）、Ｖ−ＥＲＢ−Ｂ２  Ａｖｉａｎ  Ｅｒｙｔｈｒｏｂｌａｓｔｉｃ  Ｌｅｕｋｅｍｉａ  Ｖｉｒａｌ  Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  Ｈｏｍｏｌｏｇ３（ＨＥＲ３）、Ｖ−ＥＲＢ−Ｂ２  Ａｖｉａｎ  Ｅｒｙｔｈｒｏｂｌａｓｔｉｃ  Ｌｅｕｋｅｍｉａ  Ｖｉｒａｌ  Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  Ｈｏｍｏｌｏｇ４（ＨＥＲ４）、Ｉｎｓｕｌｉｎ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＩＮＳＲ）、Ｉｎｓｕｌｉｎ−ｌｉｋｅ  Ｇｒｏｗｔｈ  ＦａｃｔｏｒＩ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＩＧＦ１Ｒ）、Ｎｅｒｖｅ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＮＧＦＲ）、Ｐｌａｔｅｌｅｔ−ｄｅｒｉｖｅｄ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ，  Ａｌｐｈａ（ＰＤＧＦＲＡ）、Ｐｌａｔｅｌｅｔ−ｄｅｒｉｖｅｄ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ，  Ｂｅｔａ（ＰＤＧＦＲＢ）、Ｃｏｌｏｎｙ−ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ  Ｆａｃｔｏｒ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＣＳＦ１Ｒ）、Ｃｏｌｏｎｙ−ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ  Ｆａｃｔｏｒ２  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ，  Ａｌｐｈａ（ＣＳＦ２ＲＡ）、Ｃｏｌｏｎｙ−ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ  Ｆａｃｔｏｒ３  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ，  Ｇｒａｎｕｌｏｃｙｔｅ（ＣＳＦ３Ｒ）、Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ１（ＦＧＦＲ１）、Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ２（ＦＧＦＲ２）、Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ３（ＦＧＦＲ３）、Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ４（ＦＧＦＲ４）、Ｋｉｎａｓｅ  Ｉｎｓｅｒｔ  Ｄｏｍａｉｎ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＫＤＲ）、Ｅｐｈｒｉｎ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ＥｐｈＡ１（ＥＰＨＡ１）、Ｅｐｈｒｉｎ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ＥｐｈＡ２（ＥＰＨＡ２）、Ｅｐｈｒｉｎ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ＥｐｈＡ３（ＥＰＨＡ３）、などが挙げられる。
また、チロシンキナーゼ会合型受容体として、ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−１  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  １（ＩＬ−１Ｒ１）、ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−１  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ａｃｃｅｓｓｏｒｙ  ｐｒｏｔｅｉｎ（ＩＬ−１ＲＡＰ）、ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ｃ−Ｍｅｔ）、ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ  ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ  １  ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＲＯＮ）、ｐｌａｔｅｌｅｔ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＰＤＧＦＲ）、ｊｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ａｄｈｅｓｉｏｎ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ−ｌｉｋｅ（ＪＡＭＬ）、ｎｅｃｔｉｎ−ｌｉｋｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ５（Ｎｅｃｌ−５）、ｔｕｍｏｒ  ｎｅｃｒｏｓｉｓ  ｆａｃｔｏｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  １（ＴＮＦ−Ｒ１）、ｔｕｍｏｒ  ｎｅｃｒｏｓｉｓ  ｆａｃｔｏｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ２（ＴＮＦ−Ｒ２）、ＴＮＦ−ｒｅｌａｔｅｄ  ａｐｏｐｔｏｓｉｓ−ｉｎｄｕｃｉｎｇ  ｌｉｇａｎｄ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  １（ＴＲＡＩＬ−Ｒ１）、ＴＮＦ−ｒｅｌａｔｅｄ  ａｐｏｐｔｏｓｉｓ−ｉｎｄｕｃｉｎｇ  ｌｉｇａｎｄ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ２（ＴＲＡＩＬ−Ｒ２）、ｄｅａｔｈ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ３（ＤＲ３）、ｄｅａｔｈ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ６（ＤＲ６）、ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ａｃｔｉｖａｔｏｒ  ｏｆ  ＮＦ−ｋＢ（ＲＡＮＫ）、ｎｅｒｖｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＮＧＦＲ）、ｌｙｍｐｈｏｔｏｘｉｎ−ｂｅｔａ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＬＴβＲ）、ＯＸ４０（ＴＮＦＲＳＦ４）、Ｆａｓ（ＴＮＦＲＳＦ６）、４−１ＢＢ（ＴＮＦＲＳＦ９）、Ｆｎ１４（ＴＮＦＲＳＦ１２Ａ）、ＴＡＣＩ（ＴＮＦＲＳＦ１３Ｂ）、ＢＡＦＦ−Ｒ（ＴＮＦＲＳＦ１３Ｃ）、ＨＶＥＭ（ＴＮＦＲＳＦ１４）、ＢＣＭＡ（ＴＮＦＲＳＦ１７）、ＧＩＴＲ（ＴＮＦＲＳＦ１８）、ＴＲＯＹ（ＴＮＦＲＳＦ１９）、ｅｃｔｏｄｙｓｐｌａｓｉｎ  Ａ１  ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＥＤＡＲ）、ｅｃｔｏｄｙｓｐｌａｓｉｎ  Ａ２  ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＸＥＤＡＲ）、ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ  ｉｎ  ｌｙｍｐｈｏｉｄ  ｔｉｓｓｕｅｓ（ＲＥＬＴ）、ＣＤ３、ＣＤ２７、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＦｃαＲＩ、ＦｃγＲＩＩＩ及びＦｃεＲＩ、Ｆｃ  Ｆｒａｇｍｅｎｔ  ｏｆ  ＩｇＧ，Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  Ｔｒａｎｓｐｏｔｅｒ，Ａｌｐｈａ（ＦＣＧＲＴ）、などが挙げられる。
また、細胞接着分子としては、Ｉｎｔｅｇｒｉｎ，Ａｌｐｈａ９（ＩＴＧＡ９）、Ｐ−ｓｅｌｅｃｔｉｎ  Ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ  Ｌｉｇａｎｄ−１（ＰＳＧＬ−１）、Ｃａｄｈｅｒｉｎ１１（ＣＤＨ１１）、Ｍｕｃｏｓａｌ  Ｖａｓｃｕｌａｒ  Ａｄｄｒｅｓｓｉｏｎ  Ｃｅｌｌ  Ａｄｈｅｓｉｏｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌｅ１（ＭＡＤＣＡＭ１）、Ｉｎｔｅｇｒｉｎ，Ａｌｐｈａ４（ＩＴＧＡ４）、Ｉｎｔｅｇｒｉｎ，Ｂｅｔａ４（ＩＴＧＢ４）、Ｇタンパク共役型受容体としては、Ａｄｅｎｏｓｉｎｅ  Ａ２Ａ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＡＤＯＲＡ２Ａ）、Ａｄｅｎｏｓｉｎｅ  Ａ２Ｂ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＡＤＯＲＡ２Ｂ）、Ｒｅｐｕｌｓｉｖｅ  Ｇｕｉｄａｎｃｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌｅａ（ＲＧＭＡ）、Ｇｌｕｃａｇｏｎ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＧＣＧＲ）、Ｐｒｏｌａｃｔｉｎ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＰＲＬＲ）、Ｇｌｕｃａｇｏｎ−ｌｉｋｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ１  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＧＬＰ１Ｒ）、などが挙げられる。
【０２３９】
本発明の抗体組成物を含有する医薬は、治療薬として単独で投与することも可能ではあるが、通常は薬理学的に許容される一つ又はそれ以上の担体と一緒に混合し、製剤学の技術分野においてよく知られる任意の方法により製造した医薬製剤として提供するのが好ましい。
【０２４０】
投与経路は、治療に際して最も効果的なものを使用するのが好ましい。例えば、経口投与、又は口腔内、気道内、直腸内、皮下、筋肉内及び静脈内等の非経口投与を挙げることができ、抗体組成物製剤の場合、好ましくは静脈内投与を挙げることができる。
【０２４１】
投与形態としては、例えば、噴霧剤、カプセル剤、錠剤、顆粒剤、シロップ剤、乳剤、座剤、注射剤、軟膏、テープ剤等が挙げられる。
【０２４２】
経口投与に適当な製剤としては、例えば、乳剤、シロップ剤、カプセル剤、錠剤、散剤、顆粒剤等が挙げられる。
【０２４３】
乳剤及びシロップ剤のような液体調製物は、水、ショ糖、ソルビトール、果糖等の糖類、ポリエチレングリコール若しくはプロピレングリコール等のグリコール類、ごま油若しくはオリーブ油、大豆油等の油類、ｐ−ヒドロキシ安息香酸エステル類等の防腐剤、又はストロベリーフレーバー若しくはペパーミント等のフレーバー類等を添加剤として用いて製造できる。
【０２４４】
カプセル剤、錠剤、散剤又は顆粒剤等は、乳糖、ブドウ糖、ショ糖若しくはマンニトール等の賦形剤、デンプン若しくはアルギン酸ナトリウム等の崩壊剤、ステアリン酸マグネシウム若しくはタルク等の滑沢剤、ポリビニルアルコール、ヒドロキシプロピルセルロース若しくはゼラチン等の結合剤、脂肪酸エステル等の界面活性剤、又はグリセリン等の可塑剤等を添加剤として用いて製造できる。
【０２４５】
非経口投与に適当な製剤としては、例えば、注射剤、座剤、噴霧剤等が挙げられる。
【０２４６】
注射剤は、塩溶液若しくはブドウ糖溶液又は両者の混合物からなる担体等を用いて調製される。又は、抗体組成物を常法に従って凍結乾燥し、これに塩化ナトリウムを加えることによって粉末注射剤を調製することもできる。
【０２４７】
座剤はカカオ脂、水素化脂肪又はカルボン酸等の担体を用いて調製される。
【０２４８】
また、噴霧剤は該抗体組成物そのもの、ないしは受容者の口腔及び気道粘膜を刺激せず、かつ該抗体組成物を微細な粒子として分散させ吸収を容易にさせる担体等を用いて調製される。
【０２４９】
担体として、具体的には、乳糖、グリセリン等が例示される。該抗体組成物及び用いる担体の性質により、エアロゾル、ドライパウダー等の製剤が可能である。また、これらの非経口剤においても経口剤で添加剤として例示した成分を添加することもできる。
【０２５０】
投与量又は投与回数は、目的とする治療効果、投与方法、治療期間、年齢、体重等により異なるが、有効成分の量として、通常成人１日当たり１０μｇ／ｋｇ〜２０ｍｇ／ｋｇである。
【０２５１】
また、抗体組成物の各種腫瘍細胞に対する抗腫瘍効果を検討する方法は、インビトロ実験としては、ＣＤＣ活性測定法、ＡＤＣＣ活性測定法等が挙げられ、インビボ実験としては、マウス等の実験動物での腫瘍系を用いた抗腫瘍実験等が挙げられる。
【０２５２】
本発明の一態様としては、第１及び第２のＩｇＧ半量体を含むキットが挙げられる。キットには、任意で、適当な容器（例えば、ボトル、バイアル、試験管）、説明等が示されたラベル、フィルター、針、注射器、及び使用説明書を含む、その他の材料を含んでいてもよい。
【０２５３】
上記のキットにおいては、有効成分であるＩｇＧ半量体以外に、例えば、滅菌水、生理食塩水、植物油、界面活性剤、脂質、溶解補助剤、緩衝剤、タンパク質安定剤（例えば、ＢＳＡ又はゼラチンなど）、保存剤、ブロッキング溶液、反応溶液、反応停止液、試料を処理するための試薬等が必要に応じて混合されていてもよい。
【０２５４】
上記キットの使用態様としては、例えば、（１）第１のＩｇＧ半量体及び第２のＩｇＧ半量体を予め混合した上で投与する方法、並びに（２）第１のＩｇＧ半量体及び第２のＩｇＧ半量体を別々に投与する方法が挙げられる。前記（２）第１のＩｇＧ半量体及び第２のＩｇＧ半量体を別々に投与する方法としては、例えば、第１のＩｇＧ半量体及び第２のＩｇＧ半量体を同時に又は逐次的に投与する方法が挙げられる。第１のＩｇＧ半量体及び第２の半量体の量及び比率は適宜調整できる。
【０２５５】
また、本発明の一態様として、第１のＩｇＧ半量体と第２のＩｇＧ半量体とからなり、且つ互いに異なる第１の抗原及び第２の抗原に対する抗体組成物の製造に用いるための、第１のＩｇＧ半量体が挙げられる。
【０２５６】
本発明の別の一態様として、第１のＩｇＧ半量体と第２のＩｇＧ半量体とからなり、且つ互いに異なる第１の抗原及び第２の抗原に対する抗体組成物の製造に用いるための、第２のＩｇＧ半量体が挙げられる。
【０２５７】
本発明の一態様として、第２のＩｇＧ半量体と併用する、第１のＩｇＧ半量体が挙げられる。また、本発明の一態様として、第１のＩｇＧ半量体と併用する、第２のＩｇＧ半量体が挙げられる。ここで、第１のＩｇＧ半量体と第２のＩｇＧ半量体とを「併用する」とは、第１のＩｇＧ半量体と第２のＩｇＧ半量体を同時又は逐次的に投与して、第１のＩｇＧ半量体と第２のＩｇＧ半量体とからなり、かつ互いに異なる第１の抗原及び第２の抗原に対する抗体組成物とすることをいう。
【０２５８】
以下、本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明は下記実施例に限定されるものではない。
【実施例】
【０２５９】
本発明者らは本発明の抗体分子の定常領域には、通常のヒトＩｇＧ１抗体と異なる下記の要素が必要であると着想した。
１）図４に示すよう、異なる抗原分子Ｘ及びＹに対する抗体の半量体の混合物であること、すなわちヒンジ領域におけるＨ鎖間のジスルフィド結合による共有結合が存在しない「ＨＬ体」であること。
２）図３に示すように、抗原分子Ｘ、Ｙに対するそれぞれのＨＬ体が、Ｘ、Ｙの両方を発現する標的細胞表面に結合した後に会合して通常のＩｇＧと同様のＨ２Ｌ２体を形成し、ＣＤ１６ａ結合領域を構成し、抗体の活性（例えば、ＡＤＣＣ活性）を惹起すること。
３）図３に示すように、単一の抗原分子のみを発現する細胞に対しては抗体の活性を惹起しないよう、ＸもしくはＹに対するＨＬ体同士が細胞表面で会合しても、ＣＤ１６ａ結合領域を構成しないこと。【０２６０】
本実施例において、上記１）についてはヒンジドメインのシステインをアラニンに置換することにより試みた。【０２６１】
Ｘ線結晶構造解析により、ヒトＩｇＧ１のＦｃとＣＤ１６ａとは非対称な結合様式を示すことが知られている（Nature 2000; 406: 267-73, J Biol Chem 2001; 276: 16469-77, Mizushima T, Genes Cells 2011; 16: 1071-80）。したがって、本発明者らは、上記２）及び３）を達成するために、上記のＨＬ体のＣＨ２ドメインに、かかる非対称の結合様式を利用した下記に述べるアミノ酸改変を導入することを着想した。【０２６２】
図５に示すように、ＣＤ１６ａはＦｃ中の二つのＣＨ２ドメインに、それぞれ別の部位で接する。仮に二つのＣＨ２ドメインをＣＨ２−Ａ、ＣＨ２−Ｂと名付け、ＣＨ２−Ａ上でのＣＤ１６ａとの相互作用部位を領域１、ＣＨ２−Ｂ上でのＣＤ１６ａとの相互作用部位を領域２とする。【０２６３】
領域１としてはＬ２３５、Ｇ２３６、Ｇ２３７、Ｐ２３８、Ｓ２３９、Ｄ２６５、Ｖ２６６、Ｓ２６７、Ｈ２６８、Ｅ２６９、Ｅ２９４、Ｑ２９５、Ｙ２９６、Ｎ２９７、Ｓ２９８、Ｔ２９９、Ｒ３０１、Ｎ３２５、Ａ３２７、Ｉ３３２等が知られる。また、領域２としてはＬ２３５、Ｇ２３６、Ｇ２３７、Ｋ３２６、Ａ３２７、Ｌ３２８、Ｐ３２９、Ａ３３０等が知られる。【０２６４】
図５に示すように、Ｆｃの構造の対称性により、実際のＦｃとＣＤ１６ａが結合している結合領域の反対側に、ＣＨ２−Ａの領域２、及びＣＨ２−Ｂの領域１からなる、実際にはＣＤ１６ａとの結合に使われていない結合領域がもう一つ存在する。【０２６５】
図６に示すように、このＣＤ１６ａとの結合に使われていないＣＨ２−Ａの領域２、及びＣＨ２−Ｂの領域１を、それぞれアミノ酸改変を導入して「破壊」する。この場合、そのような改変ＣＨ２−Ａを有するＨＬ体（Ｘ）同士、あるいは改変ＣＨ２−Ｂを有するＨＬ体（Ｙ）同士がホモ会合してＨ２Ｌ２体を構成した場合（ＸＸ、ＹＹ）には、領域１のみ、あるいは領域２のみしか存在しないこととなる。したがって、これらのホモ会合体は、ＣＤ１６ａは十分な親和性を持って結合することができない可能性が考えられる。これに対し、そのような改変ＣＨ２−Ａ、改変ＣＨ２−Ｂをそれぞれ構成要素として有するＨＬ体がヘテロ会合したＨ２Ｌ２体（ＸＹ）は、上記２）及び３）の条件を満たす可能性が考えられる。【０２６６】
［実施例１］
ＣＤ１６ａ結合を「破壊」したヒトＩｇＧ１抗ＣＣＲ６抗体の作製
ＣＤ１６ａの結合を減弱させることができるＣＨ２上の部位を特定するため、上記の領域１又は領域２をアミノ酸改変によって「破壊」した抗体を作製した。すなわち、図７に示すように、通常のヒトＩｇＧ１のフォーマット上で、候補となる部位のアミノ酸残基を改変した。【０２６７】
この場合組換え抗体としてヒトＩｇＧ１を発現させるために二つのＨ鎖は発現ベクター上で同一の遺伝子でコードされＣＨ２−ＡとＣＨ２−Ｂの区別はなく両方に同時にアミノ酸残基が改変され、ＣＤ１６ａの結合部位は表裏の二か所が同時に破壊されるため、ＡＤＣＣ活性が低下する改変部位を探索することとなる。【０２６８】
なお、本実施例において、特に説明の無い限り抗体分子は全てＨ鎖２９７位のアスパラギンに結合するＮ−結合型糖鎖のα１，６フコースを完全に除去されＡＤＣＣ活性が増強されているものを作製している。そのため抗体を発現するための宿主細胞には、フコース転移酵素（ＦＵＴ８）ノックアウトＣＨＯ細胞（国際公開第２００５／０３５５８６号、国際公開第０２／３１１４０号）を用いた。【０２６９】
（１）ＣＤ１６ａ結合を「破壊」したヒトＩｇＧ１抗ＣＣＲ６抗体発現ベクターの作製
図５及び６にＣＨ２ドメイン上の「領域１」及び「領域２」の模式図を示す。図６に示すように、ＣＤ１６ａに対する結合を「破壊」するために、ＣＨ２ドメイン上の「領域１」でＣＤ１６ａと結合するアミノ酸部位Ｐ２３８、Ｄ２６５、Ｓ２６７、ＣＨ２ドメイン上の「領域２」でＣＤ１６ａと結合するアミノ酸部位Ｋ３２６、Ｌ３２８、Ｐ３２９に対して、アミノ酸改変を導入したヒトＩｇＧ１抗ヒトＣＣＲ６抗体（国際公開第２０１３／００５６４９号）の発現ベクターを構築した。構築に用いた抗体の遺伝子配列とアミノ酸配列を表２に示す。【０２７０】
【表２】
2020067541.tif 000004
【０２７１】
配列番号１、３、５、７に示す遺伝子配列からなる、ヒトＩｇＧ１抗ヒトＣＣＲ６抗体発現ベクターｐＣＩ−ＩｇＧ１＿ＫＧ１６８４を鋳型に用い、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ  Ｍａｘ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（タカラバイオ）及び改変部位を導入したプライマー（シグマオリゴ）を用い、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ  Ｍａｘ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅの添付文書に従いＰＣＲ反応を行った。【０２７２】
ＰＣＲ反応はＧｅｎｅＡｍｐ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ  ９７００（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用い、９８℃、１分間にて熱変性後、９８℃にて１０秒間、５８℃にて５秒間、７２℃にて５秒間の反応を３０サイクル行った。０．８％アガロースゲルを用いた電気泳動に反応液を供し、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて、増幅断片を回収した。Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ  ＨＤ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔ（クロンテック）を用いてプラスミドｐＣＩ  ｖｅｃｔｏｒ（プロメガ）と連結反応を行い、該反応液を用いて大腸菌ＤＨ５αコンピテントセル（タカラバイオ）を形質転換した。【０２７３】
得られた形質転換株のクローンより各プラスミドＤＮＡを調製し、Ｂｉｇ  Ｄｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｋｉｔ  ｖ３．１（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて添付の説明書に従って反応後、同社のＤＮＡシーケンサーＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ３７００  ＤＮＡ  Ａｎａｌｙｚｅｒによりプラスミドに挿入されたＤＮＡの塩基配列を解析した。【０２７４】
（２）ＣＤ１６ａ結合を「破壊」したヒトＩｇＧ１抗ＣＣＲ６抗体の発現
以下の方法で、宿主細胞に（１）で作製された発現ベクターを導入した。宿主細胞には、ＦＵＴ８ノックアウトＣＨＯ細胞（国際公開第２００５／０３５５８６号、国際公開第０２／３１１４０号）使用した。プラスミド導入の方法は添付の説明書に従った。【０２７５】
培養液量は２００ｍＬで行い、３７℃、５％ＣＯ２、１２５ｒｐｍの設定条件下で、５日間培養した。培養後、細胞懸濁液の遠心分離を行い、０．２μｍフィルター（ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を通して改変抗体を含む培養上清を回収した。【０２７６】
各抗体の、精製した抗体サンプルの名称を表３に示す。【０２７７】
【表３】
2020067541.tif 000005
【０２７８】
（３）ＣＤ１６ａ結合を「破壊」したヒトＩｇＧ１抗ＣＣＲ６抗体の精製
以下に示す、ＭａｂＳｅｌｅｃｔ  ＳｕＲｅ（ＧＥヘルスケア）を用いたアフィニティ精製により、改変抗体を精製した。レジンをＰＢＳで平衡化した後、（２）で取得された培養上清をロードし、ＰＢＳで２回洗浄した。洗浄後、溶出バッファー（１００ｍＭクエン酸、ｐＨ３．５）を用いて抗体を溶出し、中和バッファー（２Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０）を１／１０量加えて中和した。【０２７９】
続いて、Ａｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ−４  Ｃｅｎｔｅｒｉｆｕｇａｌ  Ｆｉｌｔｅｒ  Ｕｎｉｔｓ（ミリポア）を用いて限外濾過による濃縮及びバッファー（１０ｍＭクエン酸、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ６．０）置換を行い、Ｎａｎｏｄｒｏｐ８０００（ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して２８０ｎＭにおける吸光度（Ａ２８０）を測定し、抗体溶液の濃度測定及び調製を行った。【０２８０】
（４）ＣＤ１６ａ結合を「破壊」したヒトＩｇＧ１抗ＣＣＲ６抗体のＳＤＳ−ＰＡＧＥによる精製度の評価
各種ＣＤ１６結合を欠損したヒトＩｇＧ１抗ＣＣＲ６抗体精製サンプルの精製度を評価するため、抗体精製サンプル約１μｇを用いて、公知の方法［Nature, 227 680 (1970)］に従ってＳＤＳ変性ポリアクリルアミド電気泳動（以下、ＳＤＳ−ＰＡＧＥと表記する）を行った。【０２８１】
その結果、還元条件下において、各種ＣＤ１６結合を欠損したヒトＩｇＧ１抗ＣＣＲ６抗体は、通常ＩｇＧ１型と同様に、Ｈ鎖が約５０キロダルトン（以下、ｋＤａと表記する）、Ｌ鎖が約２５ｋＤａ付近にバンドが認められた。また、非還元条件においては、約１５０ｋＤａ付近にバンドが認められたことから、作製した抗ＣＣＲ６ドメイン交換抗体は目的のＨ鎖及びＬ鎖から構成されていることが確認された。【０２８２】
以上の結果より、本実施例の第３項で得られた各種ＣＤ１６結合を欠損したヒトＩｇＧ１抗ＣＣＲ６抗体の精製サンプル中には、それぞれＨ鎖及びＬ鎖から構成される目的のＩｇＧ分子が十分な割合で含まれることが確認された。【０２８３】
（５）ＣＤ１６ａ結合領域を「破壊」したヒトＩｇＧ１抗ＣＣＲ６抗体のＡＤＣＣ活性
エフェクター細胞としてＮＫ細胞株であるＮＫ−９２（ＡＴＣＣ）にヒトＣＤ１６ａ  （Ｖａｌ型）を遺伝子導入して安定的に発現させた、ＮＫ−９２／ＣＤ１６トランスフェクタントを、標的細胞としてヒトＣＣＲ６／ＣＨＯトランスフェクタントを用いた。培養していたそれぞれの細胞を回収・細胞をカウントし、それぞれ８ｘ１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬ、２ｘ１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬになるようにＲＰＭＩ培地（５％ＦＢＳ／１％ＰＳを添加したフェノールレッド不含のＲＰＭＩ１６４０培地）を用いて調製した。【０２８４】
９６ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅに抗体溶液を５０μＬ／ｗｅｌｌずつ連続分注機で分注後、標的細胞を５０μＬ／ｗｅｌｌずつ分注した。エフェクター細胞を５０μＬ／ｗｅｌｌずつ分注し、１８００ｒｐｍで２分間遠心分離し、細胞が均等に播種されていることを確認した。【０２８５】
ＣＯ２インキュベーターで３７℃、３時間１５分間静置後、Ｔｏｔａｌコントロールに１０分の１量の可溶化溶液を分注し、３７℃、４５分間静置した。１８００ｒｐｍで２分間遠心分離後、上清５０μＬをＥＬＩＳＡプレートに分注した。基質（粉）を懸濁バッファー１２ｍＬに溶かし発色溶液を作製し、発色溶液を５０μＬ／ｗｅｌｌずつアプライし反応させた。停止溶液５０μＬ／ｗｅｌｌ加え、プレートリーダーにて吸光度（Ａ４５０）を測定した。【０２８６】
なおＡＤＣＣ測定用キットとして、ＣｙｔｏＴｏｘ９６（Ｒ）Ｎｏｎ−Ｒａｄｉｏａｃｔｉｖｅ  Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ  Ａｓｓａｙ（プロメガ）を用いた。以下の式を用いてＡＤＣＣ活性（％）を算出した。【０２８７】
ＡＤＣＣ活性（％）＝１００ｘ（Ｓ−Ｅ−Ｔ）／（Ｍａｘ−Ｔ）
Ｓ＝サンプル反応ウェル吸光度−培地ウェル吸光度
Ｅ＝エフェクターウェル吸光度−培地ウェル吸光度
Ｔ＝標的ウェル吸光度−培地ウェル吸光度
Ｍａｘ＝１００％反応ウェル−１００％反応対照ウェル【０２８８】
結果を図８に示す。図８に示されるように、ＣＨ２の領域１ではＩｇＧ１＿Ｄ２６５Ａ、ＩｇＧ１＿Ｐ２３８Ａ／Ｓ２６７Ｌ、ＩｇＧ１＿Ｄ２６５Ａ／Ｓ２６７Ｌからなる改変体が、標的細胞に対して顕著にＡＤＣＣ活性が低下することが確認された。【０２８９】
またＣＨ２の領域２では、ＩｇＧ１＿Ｐ３２９Ｙ、ＩｇＧ１＿Ｋ３２６Ｗ／Ｐ３２９Ｙ、ＩｇＧ１＿Ｌ３２８Ｖ／Ｐ３２９Ｙ、ＩｇＧ１＿Ｋ３２６Ｗ／Ｌ３２８Ｖ／Ｐ３２９Ｙからなる改変体が、顕著にＡＤＣＣ活性が低下することが確認され、いずれの改変体においてもＰ３２９Ｙ改変が含まれることがわかった。【０２９０】
以上の結果より、ＣＨ２ドメイン上の「領域１」では、Ｄ２６５Ａ又はＰ２３８Ａ／Ｓ２６７Ｌのアミノ酸改変を導入することによって、ＣＨ２ドメイン上の「領域２」では少なくともＰ３２９Ｙのアミノ酸改変を導入することによって、ＣＤ１６ａ結合部位を破壊できることが明らかとなった。【０２９１】
［実施例２］
ＣＤ１６ａ結合非対称改変を導入したヒトＩｇＧ１抗ＣＣＲ６一価抗体の作製
実施例１において、ＣＤ１６ａとＦｃの非対称の結合部位を破壊できるアミノ酸配列の一例として、ＣＨ２−Ａでは「領域１」由来のＤ２６５Ａ又はＰ２３８Ａ／Ｓ２６７Ｌ、ＣＨ２−Ｂでは「領域２」由来のＰ３２９Ｙを選択した。【０２９２】
本項では、ＣＨ２−ＡとＣＨ２−Ｂのみにそれぞれ上記の改変を非対称に導入してＡＤＣＣ活性を評価するために、二分子のＨ鎖を個別の遺伝子にコードし発現させ、それらをヘテロ会合させることができる「一価抗体」（国際公開第２０１１／１０８５０２号）を基本骨格に用いることとした。図９にかかる一価抗体の一態様の模式図を示す。図９中、前記ヘテロ会合体は、「非対称改変体＃１」である。【０２９３】
（１）ＣＤ１６ａ結合非対称改変一価抗体発現ベクターの作製
ＣＨ２−Ａ（Ｄ２６５Ａ又はＰ２３８Ａ／Ｓ２６７Ｌ）、ＣＨ２−Ｂ（Ｐ３２９Ｙ）を非対称あるいは対称に導入したヒトＩｇＧ１抗ＣＣＲ６一価抗体（国際公開第２０１１／１０８５０２号）の発現ベクターを構築した。【０２９４】
ヒトＩｇＧ１抗ＣＣＲ６一価抗体発現ベクターｐＣＩ−ｍｖＧ１＿ＫＧ１６８４を鋳型に用い、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ  Ｍａｘ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（タカラバイオ）及び改変部位を導入したプライマー（シグマオリゴ）を用い、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ  Ｍａｘ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅの添付文書に従いＰＣＲ反応を行った。【０２９５】
ＰＣＲ反応はＧｅｎｅＡｍｐ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ  ９７００（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用い、９８℃、１分間にて熱変性後、９８℃にて１０秒間、５８℃にて５秒間、７２℃にて５秒間の反応を３０サイクル行った。【０２９６】
０．８％アガロースゲルを用いた電気泳動に反応液を供し、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて、増幅断片を回収した。Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ  ＨＤ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔ（クロンテック）を用いてプラスミドｐＣＩ  ｖｅｃｔｏｒ（プロメガ）と連結反応を行い、該反応液を用いて大腸菌ＤＨ５αコンピテントセル（タカラバイオ）を形質転換した。【０２９７】
得られた形質転換株のクローンより各プラスミドＤＮＡを調製し、Ｂｉｇ  Ｄｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｋｉｔ  ｖ３．１（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて添付の説明書に従って反応後、同社のＤＮＡシーケンサーＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ３７００  ＤＮＡ  Ａｎａｌｙｚｅｒによりプラスミドに挿入されたＤＮＡの塩基配列を解析した。【０２９８】
（２）ＣＤ１６ａ結合非対称改変一価抗体の発現
実施例１の第２項と同様の方法で、当該抗体の発現を行い、抗体を含む培養上清を回収した。各精製抗体サンプルとその改変部位を表４に示す。なお、改変部位におけるアミノ酸残基置換は実施例１と同様の方法により行った。【０２９９】
【表４】
2020067541.tif 000006
【０３００】
（３）ＣＤ１６ａ結合非対称改変一価抗体の精製
実施例１の第３項と同様の方法で、当該抗体の精製を行った。溶出バッファーは１００ｍＭクエン酸、ｐＨ３．９を用いた。その後、ＡＫＴＡ  ＦＰＬＣ（ＧＥヘルスケア）及びＳｕｐｅｒｄｅｘ  Ｈｉｇｈ−ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ  Ｃｏｌｕｍｎ（ＧＥヘルスケア）を用いて、該抗体溶液より単量体画分を分取した。ＡＫＴＡシステム孔径０．２２μｍのメンブランフィルター（Ｍｉｌｌｅｘ−ＧＶ，ミリポア）で濾過滅菌することにより精製抗体を得た。Ｎａｎｏｄｒｏｐ８０００（ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して２８０ｎｍにおける吸光度（Ａ２８０）を測定した。【０３０１】
（４）ＣＤ１６ａ結合非対称改変を導入したヒトＩｇＧ１抗ＣＣＲ６一価抗体のＳＤＳ−ＰＡＧＥによる精製度の評価
各種ＣＤ１６ａ結合非対称改変を導入したヒトＩｇＧ１抗ＣＣＲ６一価抗体精製サンプルの精製度を評価するため、抗体精製サンプル約１μｇを用いてＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った。【０３０２】
その結果、還元条件下において、すべての改変体は、野生型一価抗体と同様に、Ｈ鎖及びＦｃ融合Ｌ鎖が約５０ｋＤａ付近にバンドが認められた。また、非還元条件においては、約１００ｋＤａ付近にバンドが認められたことから、作製した非対称改変体及び対称改変体は目的のＨ鎖及びＬ鎖から構成されていることが確認された。【０３０３】
以上の結果より、本実施例の第３項で得られた各種ＣＤ１６ａ結合非対称改変を導入したヒトＩｇＧ１抗ＣＣＲ６一価抗体の精製サンプル中には、それぞれＨ鎖及びＦｃ融合Ｌ鎖から構成される目的の一価抗体分子が十分な割合で含まれることが確認された。【０３０４】
（５）ＣＤ１６ａ結合非対称改変一価抗体のＡＤＣＣ活性
実施例１の第５項と同様の方法で、ＡＤＣＣ活性を測定した。結果を図１０示す。図１０に示されるように、ＣＤ１６ａ結合の非対称改変を導入した一価抗体（非対称改変体＃１〜４）は、抗体濃度依存的に標的細胞を傷害することが確認された。一方、ＣＤ１６ａ結合の対称改変を導入した一価抗体（対称改変体＃１〜＃５）は、標的細胞に対してＡＤＣＣ活性を示さないことが確認された。【０３０５】
以上の結果より、ＣＤ１６ａ結合の非対称改変を導入した一価抗体はヒトＣＤ１６ａに対する結合性が維持され、標的細胞に対してＡＤＣＣ活性を発揮することできることが確認された。【０３０６】
一方で両方のＣＨ２ドメインに同じ改変を導入した場合はＡＤＣＣ活性が失われることから、同じ改変ＣＨ２を有する抗体が細胞表面上でホモフィリックな会合をした場合にはＡＤＣＣ活性が誘導されないことが確認され、本発明が目指す二つの抗原に細胞表面上でヘテロ会合して初めてＡＤＣＣ活性を発揮するＨＬ抗体を構成するための改変ＣＨ２ドメインが見出された。【０３０７】
［実施例３］
本実施例では、実施例１，２で得られたヘテロ会合して初めてＡＤＣＣ活性を誘導できる改変ＣＨ２を、異なる抗原に対する二種類の抗体の半量体（ＨＬ体）に搭載し、二種類の抗原を共発現する標的細胞選択的にＡＤＣＣ活性が誘導できるか否かを検証した。【０３０８】
ＣＨ３ドメイン同士の相互作用はJ Immunol 2011; 187: 3238-3246で報告されている。ヒトＩｇＧ１のＣＨ３ドメインの相互作用（ＫＤ値）は３．０×１０−９Ｍ、ヒトＩｇＧ４のＣＨ３ドメインのＫＤ値は４．８ｘ１０−８Ｍで、ヒトＩｇＧ４のＣＨ３ドメインの相互作用はＩｇＧ１よりも約６〜７倍弱い。【０３０９】
この性質とヒンジ領域におけるＨ鎖間のジスルフィド結合を切断するアミノ酸改変（Ｃ２２６Ａ／Ｃ２２９Ａ：ＡＡ）を利用することで抗体の半量体の作製を試みた。半量体のＨ鎖定常領域はヒトＩｇＧ１を基本骨格とし、ＣＨ３ドメインのみをヒトＩｇＧ４配列に交換し、さらにヒンジ領域にアミノ酸改変（ＡＡ）を加えたドメイン交換抗体（以下ＩｇＧ１１１４＿ＡＡ型と称する）を用いた。【０３１０】
加えて、ＡＤＣＣ活性を強化するために公知のＡＤＣＣ活性増強アミノ酸改変をＣＨ２ドメインに施し、さらにＡｓｎ２９７に結合するＮ−結合型糖鎖のα１，６フコースを除去、最後にＣＤ１６ａ結合非対称アミノ酸改変を導入した。図１１に、ＩｇＧ１１１４＿ＡＡ＿ＡＡＡ＿Ｄ２６５Ａ（／Ｐ３２９Ｙ）型のＩｇＧ半量体の模式図を示す。二種類のモデル抗原として、ＣＤ４とＣＤ７０を用いた。【０３１１】
上記に示す改変を組み合わせた、抗ＣＤ４抗体（J. Immunol. 1992; 149:1779-1787）及び抗ＣＤ７０抗体（国際公開第２００７／０３６３７号）を以下の手順に従い作製した。ＩｇＧ１１１４＿ＡＡ型に公知のＡＤＣＣ活性増強アミノ酸改変（Ｓ２９８Ａ／Ｅ３３３Ａ／Ｋ３３４Ａ：ＡＡＡ）改変、ＣＤ１６ａ結合非対称アミノ酸改変（Ｄ２６５ＡあるいはＰ３２９Ｙ）を導入したアミノ酸配列から構成される重鎖定常領域を有する抗ＣＤ４及びＣＤ７０抗体をＩｇＧ１１１４＿ＡＡ＿ＡＡＡ＿Ｄ２６５Ａ（／Ｐ３２９Ｙ）型抗ＣＤ４半量体、ＩｇＧ１１１４＿ＡＡ＿ＡＡＡ＿Ｄ２６５Ａ（／Ｐ３２９Ｙ）型抗ＣＤ７０半量体とそれぞれ称する。【０３１２】
設計された各種抗ＣＤ４及びＣＤ７０半量体の各ドメインが由来するサブクラス、及び重鎖定常領域のアミノ酸配列の対応を表５に示す。また、用いたＣＤ４及びＣＤ７０に対する抗体の遺伝子配列とアミノ酸配列を表６に示す。【０３１３】
【表５】
2020067541.tif 000007
【０３１４】
【表６】
2020067541.tif 000008
【０３１５】
（１）抗ＣＤ４半量体及び抗ＣＤ７０半量体発現ベクターの作製
ヒトＩｇＧ１抗ＣＤ４抗体発現ベクターｐＣＩ−ＩｇＧ１＿ＣＤ４（ｉｂａｌｉｚｕｍａｂ）（配列番号５、７、４１、４３）あるいは、ヒトＩｇＧ１抗ＣＤ７０抗体発現ベクターｐＣＩ−ＩｇＧ１＿ＣＤ７０（２Ｈ５）（配列番号５、７、４５、４７）より、制限酵素ＮｈｅＩ及びＮｏｔＩを用いて、約９ｋｂｐのＤＮＡ断片を切り出し精製した。【０３１６】
精製したＤＮＡ断片と、ヒトＩｇＧ１抗体のＣＨ１ドメイン、ヒンジドメイン（Ｃ２２６Ａ／Ｃ２２９Ａ改変を加えたもの）、ＣＨ２ドメイン（Ｓ２９８Ａ／Ｋ３３３Ａ／Ｅ３３４Ａ改変、Ｄ２６５ＡあるいはＰ３２９Ｙ改変を加えたもの）、ヒトＩｇＧ４抗体のＣＨ３ドメインからなる人工合成遺伝子とをＩｎ−Ｆｕｓｉｏｎ  ＨＤ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔ（クロンテック）を用いて連結反応を行い、該反応液を用いて大腸菌ＤＨ５αコンピテントセル（タカラバイオ）を形質転換した。得られた形質転換株のクローンより各プラスミドＤＮＡを調製し、ファスマックでＤＮＡの塩基配列を解析した。【０３１７】
（２）各種抗ＣＤ４ＩｇＧ１抗体及び抗ＣＤ７０ＩｇＧ１抗体並びにこれら抗体の半量体の発現
実施例１の第２項と同様の方法で、当該抗体の発現を行い、抗体を含む培養上清を回収した。【０３１８】
精製した抗体サンプルの名称を表７に示す。【０３１９】
【表７】
2020067541.tif 000009
【０３２０】
（３）抗ＣＤ４半量体及び抗ＣＤ７０半量体の精製
実施例１の第３項と同様の方法で、当該抗体の精製を行い、抗体溶液の濃度測定及び調製を行った。【０３２１】
（４）抗ＣＤ４半量体及び抗ＣＤ７０半量体のＳＤＳ−ＰＡＧＥによる精製度の評価
調製した各種抗体サンプルの精製度を評価するため、抗体精製サンプル約１μｇを用いて、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った。結果を図１２に示す。【０３２２】
図１２に示すように、精製した抗体はすべて、還元条件下でＨ鎖が約５０ｋＤａ、Ｌ鎖が約２５ｋＤａ付近にバンドが認められた。また、非還元条件では、抗ＣＤ４  ＩｇＧ１抗体及び抗ＣＤ７０  ＩｇＧ１抗体は約１５０ｋＤａ、抗ＣＤ４半量体及び抗ＣＤ７０半量体は約７５ｋＤａ付近にバンドが認められたことから、作製したＣＤ４及びＣＤ７０  ＩｇＧ１抗体は目的のＨ鎖及びＬ鎖から構成された抗体構造であること、抗ＣＤ４半量体及び抗ＣＤ７０半量体は目的のＨ鎖及びＬ鎖から構成され、半量体を形成しやすい抗体構造になっていることが確認された。【０３２３】
以上の結果より、本実施例の第３項で得られた抗ＣＤ４半量体及び抗ＣＤ７０半量体精製サンプル中には、目的の抗体分子が十分な割合で含まれることが確認された。【０３２４】
（５）抗ＣＤ４  ＩｇＧ１抗体及び抗ＣＤ７０  ＩｇＧ１、並びにこれら抗体の半量体のＣＤ４／ＣＤ７０両陽性細胞、ＣＤ４及びＣＤ７０単陽性細胞に対するＡＤＣＣ活性
実施例１の第５項と同様の方法で、ＡＤＣＣ活性を測定した。標的細胞は、ＣＤ４単陽性細胞としてＣＤ４／ＥＬ−４トランスフェクタント、ＣＤ７０単陽性細胞としてＭＴ−１、ＣＤ４／ＣＤ７０両陽性細胞としてＴＬ−Ｏｍ１を用いた。これらの細胞におけるＣＤ４及びＣＤ７０の発現量を、フローサイトメーターを用いて測定した結果を図１３示す。【０３２５】
図１３に示されるように、目的の抗原が細胞に発現していることが確認された。また、ＡＤＣＣ活性評価の結果を図１４に示す。ポジティブコントロール抗体として、通常ＩｇＧ１型抗ＣＤ４及びＣＤ７０抗体を用いた。【０３２６】
図１４に示すように、予想通り、ＣＤ４／ＥＬ−４トランスフェクタントに対しては抗ＣＤ４抗体が、ＭＴ−１に対しては抗ＣＤ７０抗体が、ＴＬ−Ｏｍ１に対しては抗ＣＤ４抗体及び抗ＣＤ７０抗体がＡＤＣＣ活性を発揮することが示された。【０３２７】
一方、抗ＣＤ４抗体の半量体１と抗ＣＤ７０抗体の半量体２を混合した抗体溶液、あるいは抗ＣＤ４抗体の半量体２と抗ＣＤ７０抗体の半量体１を混合した抗体溶液は、ＣＤ４及びＣＤ７０単陽性細胞に対してはＡＤＣＣ活性を示さず、ＣＤ４／ＣＤ７０両陽性細胞に対してのみ特異的にＡＤＣＣ活性を発揮することが示された。【０３２８】
［実施例４］
第１のＣＤ１６ａ結合領域で、ＥＵインデックスで表される２３５位、２３９位、２６５位、２６７位、２６９位、２９６位、２９８位、２９９位、３２７位を、第２のＣＤ１６ａ結合領域で、ＥＵインデックスで表される３２６位、３２８位、３２９位、３３０位をそれぞれ置換することによりＣＤ１６ａ結合を破壊した改変ＣＨ２を、異なる抗原に対する二種類の抗体の半量体（ＨＬ体）に搭載し、二種類の抗原を共発現する標的細胞選択的にＡＤＣＣ活性が誘導できるか否かを検証した。【０３２９】
設計された各種抗ＣＤ４半量体及びＣＤ７０半量体は、実施例３と同様の方法で調製し、ＡＤＣＣ活性を評価した。抗ＣＤ４半量体と抗ＣＤ７０半量体を混合した抗体溶液は１μｇ／ｍＬとなるように添加した。同じく、ポジティブコントロール抗体として使用した、通常ＩｇＧ１型抗ＣＤ４抗体及び抗ＣＤ７０抗体も１μｇ／ｍＬとなるように添加した。設計された各種抗ＣＤ４半量体及びＣＤ７０半量体の各ドメインが由来するサブクラス、及び重鎖定常領域のアミノ酸配列の対応を表８に示す。【０３３０】
【表８】
2020067541.tif 000010
【０３３１】
図１５Ａ〜図１５Ｈに示されるように、第１のＣＤ１６ａ結合領域を改変したＣＨ２を搭載した抗ＣＤ４半量体と、第２のＣＤ１６ａ結合領域を改変したＣＨ２を搭載した抗ＣＤ７０半量体を混合した抗体溶液は、ＣＤ４及びＣＤ７０単陽性細胞に対してはＡＤＣＣ活性を示さず、ＣＤ４／ＣＤ７０両陽性細胞に対してのみ特異的にＡＤＣＣ活性を発揮することが示された。【０３３２】
本発明を特定の態様を用いて詳細に説明したが、本発明の意図と範囲を離れることなく様々な変更および変形が可能であることは、当業者にとって明らかである。なお、本出願は、２０１８年９月２８日付けで出願された日本特許出願（特願２０１８−１８５３６７）に基づいており、その全体が引用により援用される。
【配列表フリーテキスト】
【０３３３】
配列番号１：ヒトＣＣＲ６（ＫＧ１６８４）ＶＬの塩基配列
配列番号２：ヒトＣＣＲ６（ＫＧ１６８４）ＶＬのアミノ酸配列
配列番号３：ヒトＣＣＲ６（ＫＧ１６８４）ＶＨの塩基配列
配列番号４：ヒトＣＣＲ６（ＫＧ１６８４）ＶＨのアミノ酸配列
配列番号５：ヒトＩｇＧ１  ＣＫの塩基配列
配列番号６：ヒトＩｇＧ１  ＣＫのアミノ酸配列
配列番号７：ヒトＩｇＧ１  ＣＨの塩基配列
配列番号８：ヒトＩｇＧ１  ＣＨのアミノ酸配列
配列番号９：ヒトＩｇＧ１＿Ｐ２３８Ａ  ＣＨの塩基配列
配列番号１０：ヒトＩｇＧ１＿Ｐ２３８Ａ  ＣＨのアミノ酸配列
配列番号１１：ヒトＩｇＧ１＿Ｄ２６５Ａ  ＣＨの塩基配列
配列番号１２：ヒトＩｇＧ１＿Ｄ２６５Ａ  ＣＨのアミノ酸配列
配列番号１３：ヒトＩｇＧ１＿Ｓ２６７Ｌ  ＣＨの塩基配列
配列番号１４：ヒトＩｇＧ１＿Ｓ２６７Ｌ  ＣＨのアミノ酸配列
配列番号１５：ヒトＩｇＧ１＿Ｐ２３８Ａ／Ｄ２６５Ａ  ＣＨの塩基配列
配列番号１６：ヒトＩｇＧ１＿Ｐ２３８Ａ／Ｄ２６５Ａ  ＣＨのアミノ酸配列
配列番号１７：ヒトＩｇＧ１＿Ｐ２３８Ａ／Ｓ２６７Ｌ  ＣＨの塩基配列
配列番号１８：ヒトＩｇＧ１＿Ｐ２３８Ａ／Ｓ２６７Ｌ  ＣＨのアミノ酸配列
配列番号１９：ヒトＩｇＧ１＿Ｄ２６５Ａ／Ｓ２６７Ｌ  ＣＨの塩基配列
配列番号２０：ヒトＩｇＧ１＿Ｄ２６５Ａ／Ｓ２６７Ｌ  ＣＨのアミノ酸配列
配列番号２１：ヒトＩｇＧ１＿Ｐ２３８Ａ／Ｄ２６５Ａ／Ｓ２６７Ｌ  ＣＨの塩基配列
配列番号２２：ヒトＩｇＧ１＿Ｐ２３８Ａ／Ｄ２６５Ａ／Ｓ２６７Ｌ  ＣＨのアミノ酸配列
配列番号２３：ヒトＩｇＧ１＿Ｋ３２６Ｗ  ＣＨの塩基配列
配列番号２４：ヒトＩｇＧ１＿Ｋ３２６Ｗ  ＣＨのアミノ酸配列
配列番号２５：ヒトＩｇＧ１＿Ｌ３２８Ｖ  ＣＨの塩基配列
配列番号２６：ヒトＩｇＧ１＿Ｌ３２８Ｖ  ＣＨのアミノ酸配列
配列番号２７：ヒトＩｇＧ１＿Ｐ３２９Ｙ  ＣＨの塩基配列
配列番号２８：ヒトＩｇＧ１＿Ｐ３２９Ｙ  ＣＨのアミノ酸配列
配列番号２９：ヒトＩｇＧ１＿Ｋ３２６Ｗ／Ｌ３２８Ｖ  ＣＨの塩基配列
配列番号３０：ヒトＩｇＧ１＿Ｋ３２６Ｗ／Ｌ３２８Ｖ  ＣＨのアミノ酸配列
配列番号３１：ヒトＩｇＧ１＿Ｋ３２６Ｗ／Ｐ３２９Ｙ  ＣＨの塩基配列
配列番号３２：ヒトＩｇＧ１＿Ｋ３２６Ｗ／Ｐ３２９Ｙ  ＣＨのアミノ酸配列
配列番号３３：ヒトＩｇＧ１＿Ｌ３２８Ｖ／Ｐ３２９Ｙ  ＣＨの塩基配列
配列番号３４：ヒトＩｇＧ１＿Ｌ３２８Ｖ／Ｐ３２９Ｙ  ＣＨのアミノ酸配列
配列番号３５：ヒトＩｇＧ１＿Ｋ３２６Ｗ／Ｌ３２８Ｖ／Ｐ３２９Ｙ  ＣＨの塩基配列
配列番号３６：ヒトＩｇＧ１＿Ｋ３２６Ｗ／Ｌ３２８Ｖ／Ｐ３２９Ｙ  ＣＨのアミノ酸配列
配列番号３７：ヒトＩｇＧ１１１４＿ＡＡ＿ＡＡＡ＿Ｄ２６５Ａ  ＣＨの塩基配列
配列番号３８：ヒトＩｇＧ１１１４＿ＡＡ＿ＡＡＡ＿Ｄ２６５Ａ  ＣＨのアミノ酸配列
配列番号３９：ヒトＩｇＧ１１１４＿ＡＡ＿ＡＡＡ＿Ｐ３２９Ｙ  ＣＨの塩基配列
配列番号４０：ヒトＩｇＧ１１１４＿ＡＡ＿ＡＡＡ＿Ｐ３２９Ｙ  ＣＨのアミノ酸配列
配列番号４１：ヒトＣＤ４（ｉｂａｌｉｚｕｍａｂ）ＶＬの塩基配列
配列番号４２：ヒトＣＤ４（ｉｂａｌｉｚｕｍａｂ）ＶＬのアミノ酸配列
配列番号４３：ヒトＣＤ４（ｉｂａｌｉｚｕｍａｂ）ＶＨの塩基配列
配列番号４４：ヒトＣＤ４（ｉｂａｌｉｚｕｍａｂ）ＶＨのアミノ酸配列
配列番号４５：ヒトＣＤ７０（２Ｈ５）ＶＬの塩基配列
配列番号４６：ヒトＣＤ７０（２Ｈ５）ＶＬのアミノ酸配列
配列番号４７：ヒトＣＤ７０（２Ｈ５）ＶＨの塩基配列
配列番号４８：ヒトＣＤ７０（２Ｈ５）ＶＨのアミノ酸配列
配列番号４９：ヒトＩｇＧ１１１４＿ＡＡ＿ＡＡＡ＿Ｓ２３９Ｒ  ＣＨの塩基配列
配列番号５０：ヒトＩｇＧ１１１４＿ＡＡ＿ＡＡＡ＿Ｓ２３９Ｒ  ＣＨのアミノ酸配列
配列番号５１：ヒトＩｇＧ１１１４＿ＡＡ＿ＡＡＡ＿Ｄ２６５Ｎ  ＣＨの塩基配列
配列番号５２：ヒトＩｇＧ１１１４＿ＡＡ＿ＡＡＡ＿Ｄ２６５Ｎ  ＣＨのアミノ酸配列
配列番号５３：ヒトＩｇＧ１１１４＿ＡＡ＿ＡＡＡ＿Ｄ２６５Ｅ  ＣＨの塩基配列
配列番号５４：ヒトＩｇＧ１１１４＿ＡＡ＿ＡＡＡ＿Ｄ２６５Ｅ  ＣＨのアミノ酸配列
配列番号５５：ヒトＩｇＧ１１１４＿ＡＡ＿ＡＡＡ＿Ｓ２６７Ｋ  ＣＨの塩基配列
配列番号５６：ヒトＩｇＧ１１１４＿ＡＡ＿ＡＡＡ＿Ｓ２６７Ｋ  ＣＨのアミノ酸配列
配列番号５７：ヒトＩｇＧ１１１４＿ＡＡ＿ＡＡＡ＿Ｅ２６９Ｐ  ＣＨの塩基配列
配列番号５８：ヒトＩｇＧ１１１４＿ＡＡ＿ＡＡＡ＿Ｅ２６９Ｐ  ＣＨのアミノ酸配列
配列番号５９：ヒトＩｇＧ１１１４＿ＡＡ＿ＡＡＡ＿Ｙ２９６Ｐ  ＣＨの塩基配列
配列番号６０：ヒトＩｇＧ１１１４＿ＡＡ＿ＡＡＡ＿Ｙ２９６Ｐ  ＣＨのアミノ酸配列
配列番号６１：ヒトＩｇＧ１１１４＿ＡＡ＿ＡＡＡ＿Ｓ２９８Ｅ  ＣＨの塩基配列
配列番号６２：ヒトＩｇＧ１１１４＿ＡＡ＿ＡＡＡ＿Ｓ２９８Ｅ  ＣＨのアミノ酸配列
配列番号６３：ヒトＩｇＧ１１１４＿ＡＡ＿ＡＡＡ＿Ｔ２９９Ａ  ＣＨの塩基配列
配列番号６４：ヒトＩｇＧ１１１４＿ＡＡ＿ＡＡＡ＿Ｔ２９９Ａ  ＣＨのアミノ酸配列
配列番号６５：ヒトＩｇＧ１１１４＿ＡＡ＿ＡＡＡ＿Ｌ２３５Ｒ  ＣＨの塩基配列
配列番号６６：ヒトＩｇＧ１１１４＿ＡＡ＿ＡＡＡ＿Ｌ２３５Ｒ  ＣＨのアミノ酸配列
配列番号６７：ヒトＩｇＧ１１１４＿ＡＡ＿ＡＡＡ＿Ａ３２７Ｉ  ＣＨの塩基配列
配列番号６８：ヒトＩｇＧ１１１４＿ＡＡ＿ＡＡＡ＿Ａ３２７Ｉ  ＣＨのアミノ酸配列
配列番号６９：ヒトＩｇＧ１１１４＿ＡＡ＿ＡＡＡ＿Ｋ３２６Ｇ  ＣＨの塩基配列
配列番号７０：ヒトＩｇＧ１１１４＿ＡＡ＿ＡＡＡ＿Ｋ３２６Ｇ  ＣＨのアミノ酸配列
配列番号７１：ヒトＩｇＧ１１１４＿ＡＡ＿ＡＡＡ＿Ｌ３２８Ｒ  ＣＨの塩基配列
配列番号７２：ヒトＩｇＧ１１１４＿ＡＡ＿ＡＡＡ＿Ｌ３２８Ｒ  ＣＨのアミノ酸配列
配列番号７３：ヒトＩｇＧ１１１４＿ＡＡ＿ＡＡＡ＿Ｐ３２９Ｋ  ＣＨの塩基配列
配列番号７４：ヒトＩｇＧ１１１４＿ＡＡ＿ＡＡＡ＿Ｐ３２９Ｋ  ＣＨのアミノ酸配列
配列番号７５：ヒトＩｇＧ１１１４＿ＡＡ＿ＡＡＡ＿Ｐ３２９Ｗ  ＣＨの塩基配列
配列番号７６：ヒトＩｇＧ１１１４＿ＡＡ＿ＡＡＡ＿Ｐ３２９Ｗ  ＣＨのアミノ酸配列
配列番号７７：ヒトＩｇＧ１１１４＿ＡＡ＿ＡＡＡ＿Ａ３３０Ｐ  ＣＨの塩基配列
配列番号７８：ヒトＩｇＧ１１１４＿ＡＡ＿ＡＡＡ＿Ａ３３０Ｐ  ＣＨのアミノ酸配列
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
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【図１５Ｃ】
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【図１５Ｄ】
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【図１５Ｅ】
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【図１５Ｆ】
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【図１５Ｇ】
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【図１５Ｈ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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