(57)【要約】  ＤＮＡメチル化分析方法を提供する。  （１）メチル化シトシン又はメチル化される可能性のあるシトシンを認識配列中に含み、且つ、前記認識部位がメチル化の影響を受ける制限酵素で、分析対象ＤＮＡを消化する工程、（２）前記工程（１）で得られたＤＮＡ断片混合物を、リガーゼで処理して連結する工程、（３）前記工程（２）で得られたＤＮＡ構築物混合物に含まれる各ＤＮＡ構築物の塩基配列を決定する工程、（４）前記工程（３）で得られた各塩基配列情報について、前記制限酵素の各認識部位およびその周辺の塩基配列を既知のゲノム配列と比較することにより、前記の各認識部位が、前記制限酵素により切断されなかった認識部位であるか、それとも、前記制限酵素で切断された後、前記リガーゼによる連結により再生された認識部位であるか否かを決定し、それに基づいて各認識部位のメチル化の状態を決定する工程を含む。【特許請求の範囲】
【請求項１】
（１）メチル化シトシン又はメチル化される可能性のあるシトシンを認識配列中に含み、且つ、前記認識部位がメチル化の影響を受ける制限酵素で、分析対象ＤＮＡを消化する工程、
（２）前記工程（１）で得られたＤＮＡ断片混合物を、リガーゼで処理して連結する工程、
（３）前記工程（２）で得られたＤＮＡ構築物混合物に含まれる各ＤＮＡ構築物の塩基配列を決定する工程、
（４）前記工程（３）で得られた各塩基配列情報について、前記制限酵素の各認識部位およびその周辺の塩基配列を既知のゲノム配列と比較することにより、前記の各認識部位が、前記制限酵素により切断されなかった認識部位であるか、それとも、前記制限酵素で切断された後、前記リガーゼによる連結により再生された認識部位であるか否かを決定し、それに基づいて各認識部位のメチル化の状態を決定する工程
を含む、分析対象ＤＮＡのメチル化の状態を決定する方法。
【請求項２】
前記工程（２）において、前記工程（１）で得られたＤＮＡ断片混合物を、その両端に連結可能なアダプターの存在下で、リガーゼで処理して連結する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記工程（２）において、前記リガーゼ処理の前に、前記工程（１）で得られたＤＮＡ断片混合物から所望のＤＮＡ断片群を分画する、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記工程（２）において、前記リガーゼ処理の後に、鎖置換型ＤＮＡポリメラーゼによるＤＮＡ増幅を実施する、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記工程（４）において、前記制限酵素の隣り合う認識部位間の塩基配列を既知のゲノム配列にマッピングし、前記の隣り合う認識部位の少なくとも一方の認識部位の外側の配列を、マッピングしたレファレンス配列と比較することにより、前記認識部位が、前記制限酵素により切断されなかった認識部位であるか、それとも、前記制限酵素で切断された後、前記リガーゼの連結により再生された認識部位であるかを決定する、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記工程（４）において、特定の認識部位に関して、制限酵素により切断されなかった認識部位と、制限酵素で切断された後、リガーゼによる連結により再生された認識部位との比率を算出することにより、前記認識部位のメチル化率を決定する、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
ゲノムＤＮＡをメチル化感受性制限酵素処理によって断片化した後、その両端に連結可能なアダプターの存在下で、あるいは、非存在下で、リガーゼ処理により多重連結した、メチル化情報保持長鎖連結ＤＮＡ。
【請求項８】
前記制限酵素処理の断片化の後に、得られたＤＮＡ断片混合物から所望のＤＮＡ断片群を分画する、請求項７に記載のメチル化情報保持長鎖連結ＤＮＡ。
【請求項９】
請求項７又は８に記載のメチル化情報保持長鎖連結ＤＮＡを鋳型として鎖置換型ＤＮＡポリメラーゼにより増幅した、メチル化情報保持長鎖連結ＤＮＡ増幅物。
【請求項１０】
（１）メチル化シトシン又はメチル化される可能性のあるシトシンを認識配列中に含み、且つ、突出末端を生じさせるメチル化感受性制限酵素で、分析対象ＤＮＡを消化する工程、
（２）前記工程（１）で得られたＤＮＡ断片の両端に、前記メチル化感受性制限酵素の認識配列を再生しない標識化アダプターを連結させる工程、
（３）前記工程（２）で得られた標識化ＤＮＡ構築物を、前記メチル化感受性制限酵素と同じ認識配列を認識し、且つ、突出末端を生じさせるメチル化非感受性制限酵素で消化する工程、
（４）前記工程（３）で得られたＤＮＡ断片混合物から、前記標識の特異的結合パートナーを用いて、標識化ＤＮＡ断片のみを除去することにより、両端の突出末端の両方にメチル化シトシンが存在するＤＮＡ断片のみからなるＤＮＡ断片群を取得する工程
を含む、前記ＤＮＡ断片群の取得方法。
【請求項１１】
（１）メチル化シトシン又はメチル化される可能性のあるシトシンを認識配列中に含み、且つ、突出末端を生じさせるメチル化感受性制限酵素で、分析対象ＤＮＡを消化する工程、
（２）前記工程（１）で得られたＤＮＡ断片の両端を、標識化デオキシヌクレオシド三リン酸の存在下で平滑化する工程、
（３）前記工程（２）で得られた標識化ＤＮＡ断片を、前記メチル化感受性制限酵素と同じ認識配列を認識し、且つ、突出末端を生じさせるメチル化非感受性制限酵素で消化する工程、
（４）前記工程（３）で得られたＤＮＡ断片混合物から、前記標識の特異的結合パートナーを用いて、標識化ＤＮＡ断片のみを除去することにより、両端の突出末端の両方にメチル化シトシンが存在するＤＮＡ断片のみからなるＤＮＡ断片群を取得する工程
を含む、前記ＤＮＡ断片群の取得方法。
【請求項１２】
請求項１０又は１１に記載の方法により得られた、両端の突出末端の両方にメチル化シトシンが存在するＤＮＡ断片のみからなるＤＮＡ断片群を、リガーゼ処理により多重連結した、メチル化情報保持長鎖連結ＤＮＡ。
【請求項１３】
請求項１２に記載のメチル化情報保持長鎖連結ＤＮＡを鋳型として増幅した、メチル化情報保持長鎖連結ＤＮＡ増幅物。
【請求項１４】
（１）メチル化シトシン又はメチル化される可能性のあるシトシンを認識配列中に含み、且つ、突出末端を生じさせるメチル化感受性制限酵素で、分析対象ＤＮＡを消化する工程、
（２）前記工程（１）で得られたＤＮＡ断片の両端に、前記メチル化感受性制限酵素の認識配列を再生しないステムループアダプターを連結させる工程、
（３）前記工程（２）で得られたＤＮＡ構築物を、前記メチル化感受性制限酵素と同じ認識配列を認識し、且つ、突出末端を生じさせるメチル化非感受性制限酵素で消化する工程、
（４）前記工程（３）で得られたＤＮＡ断片の各突出末端に、５’末端がヌクレアーゼ耐性を示し、且つ、前記メチル化非感受性制限酵素の認識配列を再生するヌクレアーゼ耐性標識化アダプターを連結させる工程、
（５）前記工程（４）で得られたＤＮＡ構築物を、一本鎖特異的エンドヌクレアーゼで処理し、続いて、二本鎖特異的ヌクレアーゼ及び一本鎖特異的ヌクレアーゼの組合せで処理することにより、ステムループアダプターが連結されたＤＮＡ断片のみを完全消化し、両端にヌクレアーゼ耐性標識化アダプターが連結されたＤＮＡ断片のみからなるＤＮＡ断片群を取得する工程
を含む、前記ＤＮＡ断片群の取得方法。
【請求項１５】
（１）請求項１４に記載の方法で得られたＤＮＡ断片群を、請求項１４に記載のメチル化非感受性制限酵素で消化する工程、
（２）前記工程（１）で得られた消化処理物から、前記標識の特異的結合パートナーを用いて、ヌクレアーゼ耐性標識化アダプターを除去することにより、両端の突出末端の両方にメチル化シトシンが存在するＤＮＡ断片のみからなるＤＮＡ断片群を取得する工程
を含む、前記ＤＮＡ断片群の取得方法。
【請求項１６】
請求項１５に記載の方法により得られた、両端の突出末端の両方にメチル化シトシンが存在するＤＮＡ断片のみからなるＤＮＡ断片群を、リガーゼ処理により多重連結した、メチル化情報保持長鎖連結ＤＮＡ。
【請求項１７】
請求項１６に記載のメチル化情報保持長鎖連結ＤＮＡを鋳型として増幅した、メチル化情報保持長鎖連結ＤＮＡ増幅物。
【請求項１８】
（１）メチル化シトシン又はメチル化される可能性のあるシトシンを認識配列中に含み、且つ、突出末端を生じさせるメチル化感受性制限酵素で、分析対象ＤＮＡを消化する工程、
（２）前記工程（１）で得られたＤＮＡ断片の両端に、５’末端がヌクレアーゼ耐性を示し、８塩基以上の長さからなる制限酵素認識配列を有し、且つ、前記メチル化感受性制限酵素の認識配列を再生しないヌクレアーゼ耐性標識化アダプターを連結させる工程、
（３）前記工程（２）で得られたＤＮＡ構築物を、前記メチル化感受性制限酵素と同じ認識配列を認識し、且つ、突出末端を生じさせるメチル化非感受性制限酵素で消化する工程、
（４）前記工程（３）で得られたＤＮＡ断片の両端にステムループアダプターを連結させる工程、
（５）前記工程（４）で得られたＤＮＡ構築物を、一本鎖特異的エンドヌクレアーゼで処理し、続いて、二本鎖特異的ヌクレアーゼ及び一本鎖特異的ヌクレアーゼの組合せで処理することにより、ステムループアダプターが連結されたＤＮＡ断片のみを完全消化し、両端にヌクレアーゼ耐性標識化アダプターが連結されたＤＮＡ断片のみからなるＤＮＡ断片群を取得する工程
を含む、前記ＤＮＡ断片群の取得方法。
【請求項１９】
（１）請求項１８に記載の方法で得られたＤＮＡ断片群を、請求項１８に記載の標識化アダプター中の８塩基以上の長さからなる制限酵素認識配列を認識する制限酵素で消化する工程、
（２）前記工程（１）で得られた消化処理物から、前記標識の特異的結合パートナーを用いて、ヌクレアーゼ耐性標識化アダプターを除去することにより、両端の突出末端の両方にシトシンが存在するＤＮＡ断片のみからなるＤＮＡ断片群を取得する工程
を含む、前記ＤＮＡ断片群の取得方法。
【請求項２０】
請求項１９に記載の方法により得られた、両端の突出末端の両方にメチル化シトシンが存在するＤＮＡ断片のみからなるＤＮＡ断片群を、リガーゼ処理により多重連結した、メチル化情報保持長鎖連結ＤＮＡ。
【請求項２１】
請求項２０に記載のメチル化情報保持長鎖連結ＤＮＡを鋳型として増幅した、メチル化情報保持長鎖連結ＤＮＡ増幅物。
【請求項２２】
前記制限酵素消化工程またはヌクレアーゼ消化工程における少なくとも１つの消化工程の後に、得られたＤＮＡ断片混合物から所望のＤＮＡ断片群を分画する、請求項１０、１１、１４、１５、１８、又は１９のいずれか一項に記載のＤＮＡ断片群の取得方法。
【請求項２３】
請求項７、８、１２、１６、又は２０に記載のメチル化情報保持長鎖連結ＤＮＡ、又は請求項９、１３、１７、又は２１に記載のメチル化情報保持長鎖連結ＤＮＡ増幅物の塩基配列を決定する工程を含む、分析対象ＤＮＡのメチル化の状態を決定する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＤＮＡメチル化分析方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来のＤＮＡメチル化分析は、メチル化感受性制限酵素を用いる方法、亜硫酸水素イオン（Ｂｉｓｕｌｆｉｔｅ）を用いる方法、及びアフィニティーカラムを用いた方法に大別される。【０００３】
Ｂｉｓｕｌｆｉｔｅ法では、ゲノムワイドなメチル化分析を行う場合、次世代シーケンサー等を用いたゲノムワイドな分析方法が主流となりつつある（非特許文献１）。Ｂｉｓｕｌｆｉｔｅ法に関しては、ゲノム中の多数の非メチル化シトシンがｂｉｓｕｌｆｉｔｅ処理によってウラシルに変換され、その後のＰＣＲによる増幅処理によってこれらのウラシルがチミンに変換される。これにより、特定のＤＮＡ断片の塩基配列中のチミン含量が増え、ＤＮＡ断片の塩基配列の複雑性が低下し、ゲノム上へのマッピング処理において、マッピング不可能な塩基配列情報が多数産出される。このため、使用する装置や得られるＤＮＡ鎖長にもよるが、得られた断片情報の３分の１程度がマッピング不可能なＤＮＡ配列情報として廃棄されてしまう現状がある。こうした方法であるが故に分析コストが非常に高く、生命科学の研究に十分に活かされていないのが現状といえる。【０００４】
ＤＮＡメチル化分析法の一つである制限酵素法では、同じ認識配列をもつ制限酵素群において、シトシンのメチル化感受性を持つものと、非感受性の制限酵素を組み合わせて解析を行うことにより、制限酵素認識部位に存在する−ＣｐＧ−配列中のシトシンの定量的なメチル化分析が可能である（ＭＩＡＭＩ（Microarray-based Integrated Analysis of Methylation by Isoschizomers）法；非特許文献２、ＭＳ−ＲＤＡ（Methylation-Sensitive Representational Difference Analysis）；非特許文献３）。例えば、メチル化非感受性制限酵素のＭｓｐＩとメチル化感受性のＨｐａIIを組み合わせて解析することにより、認識部位中のシトシンのメチル化分析を定量的に行うことができる。特定部位のメチル化を分析する場合、メチル化率は０％から１００％まで非連続的に定量されるのが一般的であるが、定量性が高い方法であれば、再現性良く解析することが可能である。【０００５】
ただし、認識配列中のシトシンのメチル化の有無によって切断又は切断しない２つの制限酵素の組み合わせが必要となり、こういった制限酵素の組み合わせが希少であるがために、その制限酵素の認識配列中のシトシンのメチル化分析に留まってしまうという問題があり、分析対象領域の設定の自由度には大きな制限があり、分析を行えない遺伝子群があり、本分野の研究に大きな障壁となっていた。また、植物ゲノムにおいてシトシンのメチル化を受ける可能性がある塩基配列は−ＣｐＮｐＧ−である事から、上記の条件に合致する制限酵素の組み合わせがなく、動物のエピゲノム解析に比較し、植物のエピゲノム解析は大きく遅れを取っていると言っても過言ではない。【０００６】
従来法の一つでは、ゲノムＤＮＡをメチル化非感受性制限酵素で完全消化し、その粘着末端に特異的に接合するアダプターを接合させ、それを更にメチル化感受性制限酵素で消化することにより、アダプター除去の可否によってメチル化を評価する方法がある（特許文献１）。この方法では使用する制限酵素によって特異的に接合するアダプターを個別に設計しなくてはならず、反応処理も多段階の工程を必要としている。また、この方法とＤＮＡアレイによる評価分析法では、そのメチル化評価領域に対応したＤＮＡアレイを準備する必要があった。また、分析対象ＤＮＡは蛍光標識等を施し、ＤＮＡアレイと長時間のハイブリダイズ処理を行うなど、操作が煩雑であった。また、ＤＮＡアレイ分析であるが故に分析対象ＤＮＡ断片のどちらの末端がメチル化されているかについては同定できない。その為、認識部位毎ではなくＤＮＡ断片毎のメチル化タイピングのみしか行うことができなかった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】国際公開第２００９／１３１２２３号
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Lister R, O'Malley RC, Tonti-Filippini J, Gregory BD, Berry CC, Millar AH and Ecker JR., Highly integrated single-base resolution maps of the epigenome in Arabidopsis., Cell, 2008;133:523-536.
【非特許文献２】Hatada I, et al., Genome-wide profiling of promoter methylation in human., Oncogene, 2006;25:3059-3064.
【非特許文献３】Ushijima T, Morimura K, Hosoya Y, Okonogi H, Tatematsu M, Sugimura T, Nagao M., Establishment of methylation-sensitive-representational difference analysis and isolation of hypo- and hypermethylated genomic fragments in mouse liver tumors., Proc Natl Acad Sci U S A. 1997 Mar 18;94(6):2284-9.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
これまで述べたように、従来法では種々の制限や欠点があり、ＤＮＡメチル化分析法を広く適用するにあたり大きな障害となっていた。本発明の課題は、これらの制限や欠点を克服できる新たなメチル化分析方法を提供すると共に、その分析効率を向上させることのできる特定のメチル化断片群の取得方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明は、
［１］（１）メチル化シトシン又はメチル化される可能性のあるシトシンを認識配列中に含み、且つ、前記認識部位がメチル化の影響を受ける制限酵素で、分析対象ＤＮＡを消化する工程、
（２）前記工程（１）で得られたＤＮＡ断片混合物を、リガーゼで処理して連結する工程、
（３）前記工程（２）で得られたＤＮＡ構築物混合物に含まれる各ＤＮＡ構築物の塩基配列を決定する工程、
（４）前記工程（３）で得られた各塩基配列情報について、前記制限酵素の各認識部位およびその周辺の塩基配列を既知のゲノム配列と比較することにより、前記の各認識部位が、前記制限酵素により切断されなかった認識部位であるか、それとも、前記制限酵素で切断された後、前記リガーゼによる連結により再生された認識部位であるか否かを決定し、それに基づいて各認識部位のメチル化の状態を決定する工程
を含む、分析対象ＤＮＡのメチル化の状態を決定する方法、
［２］前記工程（２）において、前記工程（１）で得られたＤＮＡ断片混合物を、その両端に連結可能なアダプターの存在下で、リガーゼで処理して連結する、［１］の方法、
［３］前記工程（２）において、前記リガーゼ処理の前に、前記工程（１）で得られたＤＮＡ断片混合物から所望のＤＮＡ断片群を分画する、［１］又は［２］の方法、
［４］前記工程（２）において、前記リガーゼ処理の後に、鎖置換型ＤＮＡポリメラーゼによるＤＮＡ増幅を実施する、［１］〜［３］のいずれかの方法、
［５］前記工程（４）において、前記制限酵素の隣り合う認識部位間の塩基配列を既知のゲノム配列にマッピングし、前記の隣り合う認識部位の少なくとも一方の認識部位の外側の配列を、マッピングしたレファレンス配列と比較することにより、前記認識部位が、前記制限酵素により切断されなかった認識部位であるか、それとも、前記制限酵素で切断された後、前記リガーゼの連結により再生された認識部位であるかを決定する、［１］〜［４］のいずれかの方法、
［６］前記工程（４）において、特定の認識部位に関して、制限酵素により切断されなかった認識部位と、制限酵素で切断された後、リガーゼによる連結により再生された認識部位との比率を算出することにより、前記認識部位のメチル化率を決定する、［１］〜［５］のいずれかの方法、
［７］ゲノムＤＮＡをメチル化感受性制限酵素処理によって断片化した後、リガーゼ処理により多重連結した、メチル化情報保持長鎖連結ＤＮＡ、
［８］
前記制限酵素処理の断片化の後に、得られたＤＮＡ断片混合物から所望のＤＮＡ断片群を分画する、［７］のメチル化情報保持長鎖連結ＤＮＡ、
［９］［７］又は［８］のメチル化情報保持長鎖連結ＤＮＡを鋳型として増幅した、メチル化情報保持長鎖連結ＤＮＡ増幅物、
［１０］（１）メチル化シトシン又はメチル化される可能性のあるシトシンを認識配列中に含み、且つ、突出末端を生じさせるメチル化感受性制限酵素で、分析対象ＤＮＡを消化する工程、
（２）前記工程（１）で得られたＤＮＡ断片の両端に、前記メチル化感受性制限酵素の認識配列を再生しない標識化アダプターを連結させる工程、
（３）前記工程（２）で得られた標識化ＤＮＡ構築物を、前記メチル化感受性制限酵素と同じ認識配列を認識し、且つ、突出末端を生じさせるメチル化非感受性制限酵素で消化する工程、
（４）前記工程（３）で得られたＤＮＡ断片混合物から、前記標識の特異的結合パートナーを用いて、標識化ＤＮＡ断片のみを除去することにより、両端の突出末端の両方にメチル化シトシンが存在するＤＮＡ断片のみからなるＤＮＡ断片群を取得する工程
を含む、前記ＤＮＡ断片群の取得方法、
［１１］（１）メチル化シトシン又はメチル化される可能性のあるシトシンを認識配列中に含み、且つ、突出末端を生じさせるメチル化感受性制限酵素で、分析対象ＤＮＡを消化する工程、
（２）前記工程（１）で得られたＤＮＡ断片の両端を、標識化デオキシヌクレオシド三リン酸の存在下で平滑化する工程、
（３）前記工程（２）で得られた標識化ＤＮＡ断片を、前記メチル化感受性制限酵素と同じ認識配列を認識し、且つ、突出末端を生じさせるメチル化非感受性制限酵素で消化する工程、
（４）前記工程（３）で得られたＤＮＡ断片混合物から、前記標識の特異的結合パートナーを用いて、標識化ＤＮＡ断片のみを除去することにより、両端の突出末端の両方にメチル化シトシンが存在するＤＮＡ断片のみからなるＤＮＡ断片群を取得する工程
を含む、前記ＤＮＡ断片群の取得方法、
［１２］［１０］又は［１１］の方法により得られた、両端の突出末端の両方にメチル化シトシンが存在するＤＮＡ断片のみからなるＤＮＡ断片群を、リガーゼ処理により多重連結した、メチル化情報保持長鎖連結ＤＮＡ、
［１３］［１２］のメチル化情報保持長鎖連結ＤＮＡを鋳型として増幅した、メチル化情報保持長鎖連結ＤＮＡ増幅物、
［１４］（１）メチル化シトシン又はメチル化される可能性のあるシトシンを認識配列中に含み、且つ、突出末端を生じさせるメチル化感受性制限酵素で、分析対象ＤＮＡを消化する工程、
（２）前記工程（１）で得られたＤＮＡ断片の両端に、前記メチル化感受性制限酵素の認識配列を再生しないステムループアダプターを連結させる工程、
（３）前記工程（２）で得られたＤＮＡ構築物を、前記メチル化感受性制限酵素と同じ認識配列を認識し、且つ、突出末端を生じさせるメチル化非感受性制限酵素で消化する工程、
（４）前記工程（３）で得られたＤＮＡ断片の各突出末端に、５’末端がヌクレアーゼ耐性を示し、且つ、前記メチル化非感受性制限酵素の認識配列を再生するヌクレアーゼ耐性標識化アダプターを連結させる工程、
（５）前記工程（４）で得られたＤＮＡ構築物を、一本鎖特異的エンドヌクレアーゼで処理し、続いて、二本鎖特異的ヌクレアーゼ及び一本鎖特異的ヌクレアーゼの組合せで処理することにより、ステムループアダプターが連結されたＤＮＡ断片のみを完全消化し、両端にヌクレアーゼ耐性標識化アダプターが連結されたＤＮＡ断片のみからなるＤＮＡ断片群を取得する工程
を含む、前記ＤＮＡ断片群の取得方法、
［１５］（１）［１４］の方法で得られたＤＮＡ断片群を、［１４］に記載のメチル化非感受性制限酵素で消化する工程、
（２）前記工程（１）で得られた消化処理物から、前記標識の特異的結合パートナーを用いて、ヌクレアーゼ耐性標識化アダプターを除去することにより、両端の突出末端の両方にメチル化シトシンが存在するＤＮＡ断片のみからなるＤＮＡ断片群を取得する工程
を含む、前記ＤＮＡ断片群の取得方法、
［１６］［１５］の方法により得られた、両端の突出末端の両方にメチル化シトシンが存在するＤＮＡ断片のみからなるＤＮＡ断片群を、リガーゼ処理により多重連結した、メチル化情報保持長鎖連結ＤＮＡ、
［１７］［１６］のメチル化情報保持長鎖連結ＤＮＡを鋳型として増幅した、メチル化情報保持長鎖連結ＤＮＡ増幅物、
［１８］（１）メチル化シトシン又はメチル化される可能性のあるシトシンを認識配列中に含み、且つ、突出末端を生じさせるメチル化感受性制限酵素で、分析対象ＤＮＡを消化する工程、
（２）前記工程（１）で得られたＤＮＡ断片の両端に、５’末端がヌクレアーゼ耐性を示し、８塩基以上の長さからなる制限酵素認識配列を有し、且つ、前記メチル化感受性制限酵素の認識配列を再生しないヌクレアーゼ耐性標識化アダプターを連結させる工程、
（３）前記工程（２）で得られたＤＮＡ構築物を、前記メチル化感受性制限酵素と同じ認識配列を認識し、且つ、突出末端を生じさせるメチル化非感受性制限酵素で消化する工程、
（４）前記工程（３）で得られたＤＮＡ断片の両端にステムループアダプターを連結させる工程、
（５）前記工程（４）で得られたＤＮＡ構築物を、一本鎖特異的エンドヌクレアーゼで処理し、続いて、二本鎖特異的ヌクレアーゼ及び一本鎖特異的ヌクレアーゼの組合せで処理することにより、ステムループアダプターが連結されたＤＮＡ断片のみを完全消化し、両端にヌクレアーゼ耐性標識化アダプターが連結されたＤＮＡ断片のみからなるＤＮＡ断片群を取得する工程
を含む、前記ＤＮＡ断片群の取得方法、
［１９］（１）［１８］の方法で得られたＤＮＡ断片群を、［１８］に記載の標識化アダプター中の８塩基以上の長さからなる制限酵素認識配列を認識する制限酵素で消化する工程、
（２）前記工程（１）で得られた消化処理物から、前記標識の特異的結合パートナーを用いて、ヌクレアーゼ耐性標識化アダプターを除去することにより、両端の突出末端の両方にシトシンが存在するＤＮＡ断片のみからなるＤＮＡ断片群を取得する工程
を含む、前記ＤＮＡ断片群の取得方法、
［２０］［１９］の方法により得られた、両端の突出末端の両方にメチル化シトシンが存在するＤＮＡ断片のみからなるＤＮＡ断片群を、リガーゼ処理により多重連結した、メチル化情報保持長鎖連結ＤＮＡ、
［２１］［２０］のメチル化情報保持長鎖連結ＤＮＡを鋳型として増幅した、メチル化情報保持長鎖連結ＤＮＡ増幅物、
［２２］前記制限酵素消化工程またはヌクレアーゼ消化工程における少なくとも１つの消化工程の後に、得られたＤＮＡ断片混合物から所望のＤＮＡ断片群を分画する、［１０］、［１１］、［１４］、［１５］、［１８］、又は［１９］のいずれかのＤＮＡ断片群の取得方法、
［２３］［７］、［８］、［１２］、［１６］、又は［２０］に記載のメチル化情報保持長鎖連結ＤＮＡ、又は［９］、［１３］、［１７］、又は［２１］に記載のメチル化情報保持長鎖連結ＤＮＡ増幅物の塩基配列を決定する工程を含む、分析対象ＤＮＡのメチル化の状態を決定する方法、
に関する。
【発明の効果】
【００１１】
今回開発した分析技術では、複数のＤＮＡメチル化感受性制限酵素を自由に組み合わせて使用でき、使用する制限酵素毎に特異的アダプターの設計も必要としない。メチル化分析の対象は制限酵素認識部位そのものであるため、前記のＤＮＡアレイを用いた方法に比較し、分析対象領域を格段に増やす事ができ、極めて高い分析解像度を実現する事ができた。【００１２】
本方法のもう一つの大きな特徴は、メチル化感受性の制限酵素法を任意に複数組み合わせて行えるところである。これにより、一度に分析可能な制限酵素認識サイトを自由に増やすことが可能となり、これまでの制限酵素を利用した分析方法に比べて分析解像度を飛躍的に向上させることができた。本方法の応用としては、がん細胞の良性か悪性かの診断や、原発巣が分からない原発不明がんに対し、がんの起源となる組織を解析によって予測し、適切な治療方針を立てられるようにすることなど、医療分野においても多くの応用が期待できる。人体はおよそ２００種類の細胞によって構成されているが、各組織から得られたゲノムＤＮＡのメチル化パターンの分析を行い、各細胞に特徴あるメチル化パターンを予め抽出しておき、任意の細胞をこれと比較することにより、がん細胞の発生起源細胞腫を予測することが可能となる。本発明の技術はこうした医療分野への応用を睨んで開発したもので、十分な分析解像度、低コスト、および自動化を可能とした。【００１３】
更に、本発明のメチル化分析方法では、同じ塩基配列を認識する二種類の制限酵素を用いる必要がないため、植物にみられる−ＣｐＮｐＧ−配列中のシトシンのメチル化を分析することができる。【００１４】
また、通常のＤＮＡ増幅（例えば、ＰＣＲ）では、得られるＤＮＡ増幅産物において、メチル化シトシンは全てシトシンに置換される（すなわち、メチル化情報が消滅する）が、本発明においては、ＤＮＡ増幅を行っても、後述するとおり、消化前のメチル化状態を決定することができるところに大きな特徴を持つ。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】本発明方法において重要な長鎖連結ＤＮＡの構造を理解するために、メチル化感受性制限酵素で消化する前のゲノムＤＮＡ（部分領域）の構造を模式的に示す説明図である。
【図２】図１に示すゲノムＤＮＡをメチル化感受性制限酵素ＨｐａＩＩ及びＨｈａＩで消化後、ライゲーションにより得られる長鎖連結ＤＮＡの構造を模式的に示す説明図である。
【図３】図３は、ヒト線維肉腫（ｆｉｂｒｏｓａｒｃｏｍａ）ＨＴ−１０８０株のゲノムＤＮＡをメチル化感受性制限酵素ＨｐａＩＩ及びＨｈａＩで消化して得られるＤＮＡ断片混合物（レーン１）、前記ＤＮＡ断片混合物をライゲーションして得られる高分子化した長鎖連結ＤＮＡ（レーン２）の電気泳動写真である。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
本明細書において「シトシンのメチル化」とは、細胞分化や生体制御に係るシトシンのメチル化修飾全般を意味し、シトシンのメチル化に加え、例えば、ヒドロキシメチル化を含む。
【００１７】
《メチル化分析方法》
本発明の分析対象ＤＮＡのメチル化の状態を決定する方法（以下、本発明のメチル化分析方法とも称する）は、
（１）メチル化シトシン又はメチル化される可能性のあるシトシンを認識配列中に含み、且つ、前記認識部位がメチル化の影響を受ける制限酵素（以下、消化用制限酵素と称する）で、分析対象ＤＮＡを消化する工程（消化工程）、
（２）前記工程（１）で得られたＤＮＡ断片混合物を、リガーゼで処理して連結する工程（連結工程）、
（３）前記工程（２）で得られたＤＮＡ構築物（長鎖連結ＤＮＡ）混合物に含まれる各ＤＮＡ構築物の塩基配列を決定する工程（シーケンス工程）、
（４）前記工程（３）で得られた各塩基配列情報について、前記制限酵素の各認識部位およびその周辺の塩基配列を既知のゲノム配列と比較することにより、前記の各認識部位が、前記制限酵素により切断されなかった認識部位であるか、それとも、前記制限酵素で切断された後、前記リガーゼによる連結により再生された認識部位であるか否かを決定し、それに基づいて各認識部位のメチル化の状態を決定する工程（解析工程）
を含む。
【００１８】
本発明のメチル化分析方法では、前記工程（２）に代えて、
（２’）前記工程（１）で得られたＤＮＡ断片混合物を、リガーゼで処理して連結し、前記リガーゼ処理の後に、鎖置換型ＤＮＡポリメラーゼによるＤＮＡ増幅を実施する工程（連結・増幅工程）
を実施することができる。
【００１９】
本発明のメチル化分析方法では、前記工程（２）又は前記工程（２’）におけるリガーゼ処理を、前記工程（１）で得られたＤＮＡ断片混合物の両端に連結可能なアダプターの存在下で実施することができる。
【００２０】
本発明のメチル化分析方法における工程（１）、すなわち、消化工程では、消化用制限酵素で分析対象ＤＮＡを消化する。
【００２１】
本発明のメチル化分析方法を適用することのできるＤＮＡは、メチル化シトシン又はメチル化される可能性のあるシトシンを含む可能性のあるＤＮＡである限り、特に限定されるものではなく、例えば、細胞（例えば、動物細胞又は植物細胞）のゲノムＤＮＡ、あるいは、生体試料又はそれに由来する試料（例えば、血液、血漿、血清、尿、リンパ液、髄液、唾液、腹水、羊水、粘液、乳汁、胆汁、胃液、又は透析実施後の人工透析液など）に存在する遊離ＤＮＡ断片混合物、人工的に合成したＤＮＡを挙げることができる。
【００２２】
工程（１）で用いる消化用酵素は、メチル化シトシン又はメチル化される可能性のあるシトシンを認識配列中に含み、且つ、前記認識部位がメチル化の影響を受ける制限酵素である限り、特に限定されるものではなく、例えば、メチル化感受性制限酵素、メチル化依存性制限酵素などを挙げることができ、メチル化感受性制限酵素が好ましい。また、制限酵素でＤＮＡを切断した際に、その認識配列が突出末端になることが好ましい。更に、２以上の制限酵素を用いる場合には、突出末端の塩基配列が同一の制限酵素同士を組み合わせることができるが、複数種類の制限酵素を用いた消化によって得られたＤＮＡ断片をライゲーション処理することによって高分子化して長鎖となったり、一部環状化してＤＮＡ増幅の鋳型となる事ができる限りにおいては、制限酵素の組み合わせに特に制限はない。本発明で用いることのできるメチル化感受性制限酵素を表１に例示する。
【００２３】
【表１】
2019088069.tif 000002
【００２４】
分析対象ＤＮＡを、例えば、メチル化感受性制限酵素で消化すると、認識部位中のメチル化感受性に関与する特定のシトシンがメチル化等の化学修飾がされていない認識部位（以下、非メチル化認識部位と称する）では、前記制限酵素によるＤＮＡの切断が起こるが、一方、前記の特定のシトシンがメチル化（ヒドロキシメチル化を含む）されている認識部位（以下、メチル化認識部位と称する）では、ＤＮＡの切断は強く抑制される。従って、メチル化感受性制限酵素による充分な消化の後に得られるＤＮＡ断片混合物は、その両端が、いずれも、非メチル化認識部位に由来する突出末端または平滑末端を有するＤＮＡ断片の混合物であり、そして、メチル化認識部位およびその周辺（上流域および下流域）の塩基配列は、各ＤＮＡ断片の配列中にそのまま維持される。
【００２５】
一方、分析対象ＤＮＡを、メチル化依存性制限酵素（例えば、ＭｃｒＢＣ）で消化すると、認識部位中のメチル化依存性に関与する特定のシトシンがメチル化されている認識部位（すなわち、メチル化認識部位）では、前記制限酵素によるＤＮＡの切断が起こるが、一方、前記の特定のシトシンがメチル化されていない認識部位（すなわち、非メチル化認識部位）では、ＤＮＡの切断は強く抑制される。従って、メチル化依存性制限酵素による充分な消化の後に得られるＤＮＡ断片混合物は、その両端が、いずれも、メチル化認識部位に由来する突出末端または平滑末端を有するＤＮＡ断片の混合物であり、そして、非メチル化認識部位およびその周辺（上流域および下流域）の塩基配列は、各ＤＮＡ断片の配列中にそのまま維持される。
【００２６】
以下、本発明のメチル化分析方法における工程（２）〜（４）について説明するが、消化工程においてメチル化感受性制限酵素で消化した態様を例にとり、説明する。
【００２７】
本発明のメチル化分析方法における工程（２）、すなわち、連結工程では、前記工程（１）、すなわち、消化工程で得られたＤＮＡ断片混合物を、リガーゼで処理して連結することにより、ＤＮＡ構築物の混合物が得られる。得られた各ＤＮＡ構築物は、各連結部において認識部位が再生されているが、認識部位を挟んで、該認識部位より上流に位置していた元配列（すなわち、消化前の配列）と、該認識部位より下流に位置していた元配列（すなわち、消化前の配列）とが連結して元の塩基配列（すなわち、消化前の認識部位およびその周辺の塩基配列）が再生されることは確率的にほとんどあり得ないため、メチル化感受性制限酵素で切断された非メチル化認識部位であった認識部位では、元の配列と異なる新たな配列が連結した様態になる。一方、メチル化認識部位であった認識部位では、消化工程において、各ＤＮＡ断片の配列中に、該認識部位およびその周辺の塩基配列がそのまま維持されていたため、各ＤＮＡ構築物においても、元の配列と同じ配列が維持されている。
【００２８】
また、本発明における連結工程では、消化工程で得られたＤＮＡ断片混合物を、その両端に連結可能な二本鎖ＤＮＡアダプターの存在下で、リガーゼで処理して連結することができる。両端の５’末端がリン酸化された、過剰量のアダプターの存在下で前記リガーゼ処理を実施すると、メチル化感受性制限酵素で切断された非メチル化認識部位であった認識部位では、１又はそれ以上のアダプター配列を挟んだ状態で、元の配列と異なる新たな配列が連結した様態になる。前記アダプター配列は、後述する解析工程において、切断部位の特定を補助するためのマーカーとして利用することができる。
【００２９】
再生される制限酵素認識配列に挟まれるアダプターの数は、特に制限されるものではないが、前記アダプターとして、アダプターのアンチセンス鎖用オリゴヌクレオチドの５’末端がリン酸化されていないものを使用することにより、アダプター配列を１つだけ挿入することができる。
【００３０】
また、本発明における連結工程では、前記リガーゼ処理の前に、前記工程（１）で得られたＤＮＡ断片混合物から所望のＤＮＡ断片群を分画することができる。
分画法としては、例えば、ゲル濾過、イオン交換樹脂またはイオン交換膜、限外濾過、電気泳動分画、アルコール沈殿、シリコン系フィルター、ガラス系フィルター、その他のＤＮＡ結合性樹脂又は膜（例えば、ニトロセルロース系、ナイロン系、カチオン性、抗ＤＮＡ抗体、ＤＮＡ結合タンパク質、メチル化シトシン結合タンパク質、ＤＮＡ結合化合物、インターカレーター）、ＤＮＡ結合性分子を樹脂又は膜に結合させたものを挙げることができる。
【００３１】
ゲル濾過や限外濾過膜による分画では、ある特定の分子量のＤＮＡ断片群をエンリッチし、それらをライゲーションで接合して高分子化することができる。エンリッチとは、制限酵素によって消化したゲノムＤＮＡを、例えば、１）低分子量群、２）高分子量群、３）樹脂又は膜結合画分、４）樹脂又は膜非結合画分などに分画し、そのいずれか１又は複数の画分に含まれるＤＮＡ群をライゲーションによって接合して高分子量ＤＮＡを生成する。
【００３２】
本発明におけるＤＮＡ断片群の分画工程は分析対象ＤＮＡを制限酵素による消化で得られたＤＮＡ断片群のうちの所望の分画をエンリッチして効率よく解析することを目的としているため、制限酵素消化工程からＤＮＡ断片のライゲーション工程までの間のいかなるタイミングで本工程を実施したとしても目的は達成される。すなわち、分画工程は制限酵素処理工程の直後でも良く、またはライゲーションの直前であっても同様の効果が期待できる。
【００３３】
なお、ＤＮＡ断片混合物から所望のＤＮＡ断片群を分画する操作は、本発明のメチル化分析方法において実施できるだけでなく、後述する本発明のＤＮＡ断片群の取得方法における制限酵素消化工程またはヌクレアーゼ消化工程においても実施することができる。本発明のＤＮＡ断片群の取得方法が１又は複数の消化工程を含む場合、１つの消化工程の後に分画操作を実施することもできるし、あるいは、２以上の消化工程の後に分画操作を実施することもできるし、あるいは、分画操作を実施しないこともできる。
【００３４】
また、本発明における連結工程では、前記リガーゼ処理の後に、ＤＮＡ増幅を実施することができる。ＤＮＡ増幅方法は、特に限定されるものではないが、例えば、鎖置換型ＤＮＡポリメラーゼ（例えば、ｐｈｉ２９  ＤＮＡポリメラーゼ）を用いるＤＮＡ増幅を挙げることができる。
５’末端がリン酸化された二本鎖ＤＮＡアダプターを用いる場合には、リガーゼ処理によりＤＮＡ断片とアダプターとが共有結合で連結されているため、通常の手順でＤＮＡ増幅を実施することができる。
一方、５’末端がリン酸化されていない二本鎖ＤＮＡアダプターを用いる場合には、リガーゼ処理でＤＮＡ断片に連結した二本鎖ＤＮＡアダプターの５’末端をヌクレオチドキナーゼ処理によりリン酸化した後、更にリガーゼ処理を行うことにより、得られたニック修復ＤＮＡ断片は、鎖置換型ＤＮＡポリメラーゼの鋳型となることができる。また、このニックを埋めるためには、例えば、ＰｒｅＣＲ  Ｒｅｐａｉｒ  Ｍｉｘ（ＮＥＢ社）を用いることができる。
【００３５】
本発明のメチル化分析方法における工程（３）、すなわち、シーケンス工程では、前記工程（２）、すなわち、連結工程で得られたＤＮＡ構築物混合物に含まれる各ＤＮＡ構築物の塩基配列を決定する。塩基配列は、公知の手段、例えば、シーケンサーにより決定することができるが、ゲノム全体を網羅した情報を得られることができる点で、次世代シーケンサーを用いることが好ましい。
【００３６】
本発明のメチル化分析方法における工程（４）、すなわち、解析工程では、前記工程（３）、すなわち、シーケンス工程で得られた各塩基配列情報について、消化用制限酵素の各認識部位およびその周辺の塩基配列を既知のゲノム配列と比較することにより、前記の各認識部位が、前記制限酵素により切断されなかった認識部位であるか、それとも、前記制限酵素で切断された後、前記リガーゼの連結により再生された認識部位であるかを決定し、それに基づいて各認識部位のメチル化の状態を決定する。
【００３７】
本発明における解析工程では、シーケンス工程で得られた各塩基配列情報と、既知のゲノム配列とを比較する方法は、特に限定されるものではないが、例えば、隣り合う認識部位間の塩基配列を既知のゲノム配列にマッピングし、前記の隣り合う認識部位の少なくとも一方の認識部位の外側の配列（すなわち、上流側の認識部位であれば、該認識部位よりも上流の配列であり、下流側の認識部位であれば、該認識部位よりも下流の配列である）を、マッピングしたレファレンス配列と比較することにより、実施することができる。
【００３８】
より具体的には、例えば、
（ａ）得られた各塩基配列情報について、消化用制限酵素の第１の認識部位を任意に選択する工程、
（ｂ）その下流の隣り合う制限酵素認識部位を第２の認識部位として選択する工程、
（ｃ）第１認識部位と第２認識部位とに挟まれる塩基配列を既知のゲノム配列にマッピングする工程、
（ｄ）第２認識部位から下流の塩基配列と、マッピングしたレファレンス配列とを比較することにより、第２認識部位が、前記制限酵素により切断されなかった認識部位であるか、前記制限酵素で切断された後、前記リガーゼの連結により再生された認識部位であるかを決定する工程、
（ｅ）第２認識部位の下流の隣り合う制限酵素認識部位を第３の認識部位として選択し、前記工程（ｃ）及び（ｄ）を繰り返す（但し、第１認識部位を第２認識部位と読み替え、第２認識部位を第３認識部位と読み替えるものとし、以下、同じ）工程
を含む方法により実施することができる。
【００３９】
また、例えば、
（ａ）得られた各塩基配列情報について、消化用制限酵素の第１の認識部位を任意に選択する工程、
（ｂ）その上流の隣り合う制限酵素認識部位を第２の認識部位として選択する工程、
（ｃ）第１認識部位と第２認識部位とに挟まれる塩基配列を既知のゲノム配列にマッピングする工程、
（ｄ）第２認識部位から上流の塩基配列と、マッピングしたレファレンス配列とを比較することにより、第２認識部位が、前記制限酵素により切断されなかった認識部位であるか、前記制限酵素で切断された後、前記リガーゼの連結により再生された認識部位であるかを決定する工程、
（ｅ）第２認識部位の上流の隣り合う制限酵素認識部位を第３の認識部位として選択し、前記工程（ｃ）及び（ｄ）を繰り返す（但し、第１認識部位を第２認識部位と読み替え、第２認識部位を第３認識部位と読み替えるものとし、以下、同じ）工程
を含む方法により実施することができる。
【００４０】
これらの方法の工程（ｄ）では、第２認識部位の下流（または上流）の塩基配列と、それに対応するマッピングしたレファレンス配列とを比較し、一致していれば、消化用制限酵素（例えば、メチル化感受性制限酵素）により切断されなかった認識部位であると判断することができ、その結果、消化前の分析対象ＤＮＡにおける該認識部位は、認識部位中のメチル化感受性に関与する特定のシトシンがメチル化されていた認識部位（すなわち、メチル化認識部位）であると判断することができる。
【００４１】
一方、不一致であれば、消化用制限酵素（例えば、メチル化感受性制限酵素）で切断された後、前記リガーゼの連結により再生された認識部位であると判断することができ、その結果、前記の再生された認識部位の元となった、消化前の分析対象ＤＮＡにおける該認識部位（２箇所）は、いずれも、認識部位中のメチル化感受性に関与する特定のシトシンがメチル化されていない認識部位（すなわち、非メチル化認識部位）であると判断することができる。
【００４２】
アダプターを用いる場合の有効性としては、シーケンス解析データの中からアダプター配列を含むものだけを膨大なデータから先に抽出することができるため、その後のゲノムへのマッピングをコンピュータを用いて効率よく実施することができる。すなわち、先ず、非メチル化認識部位近傍の塩基配列情報のみを先に抽出できるため、演算効率が大幅に向上し、計算機負担が大幅に軽減される。
【００４３】
このように、本発明によれば、各塩基配列情報から、特定の位置のメチル化の有無を決定することができるが、複数の塩基配列情報から、特定位置のメチル化率を算出することもできる。すなわち、全領域の平均的リード回数のうち、特定箇所のリードの割合を数えることにより、メチル化率を算出することができる。
【００４４】
本発明は、これまで述べたように、分析対象ＤＮＡ（例えば、ゲノムＤＮＡ）を１種類または複数種類の消化用制限酵素（例えば、メチル化感受性制限酵素）を組み合わせて消化し、それをライゲーション処理し、各ＤＮＡ断片をランダムに接合したＤＮＡ断片連結物の塩基配列を解析し、使用した制限酵素認識部位のメチル化状態を評価する方法である。以下に、メチル化感受性制限酵素を例にとり、より具体的な態様に基づいて、その原理の例を記す。
【００４５】
先ず分析対象ＤＮＡ（ヒトゲノムＤＮＡ等）を１種類又は複数種類のメチル化感受性制限酵素で消化する。
ゲノムＤＮＡは長鎖であるため、立体障害などの影響で消化に時間を要する場合がある。その為、使用する制限酵素は活性半減期が長いものや、酵素反応温度が高い制限酵素を利用することが望ましい。本発明では、例えば、以下に示す制限酵素を使用することができるが、本発明は、本明細書に記載の条件に合致する制限酵素であれば、いずれの制限酵素でも使用可能で、下記に例示する制限酵素に限定しない。
ＨｉｎＰII    （至適温度：３７℃、Ｇ：ＣＧＣ）
ＨｐａII      （至適温度：３７℃、Ｃ：ＣＧＧ）
ＨｐｙＣＨ４IV（至適温度：３７℃、Ａ：ＣＧＴ）
ＢｓｔＵＩ    （至適温度：６０℃、ＣＧ：ＣＧ）
ＨｈａＩ      （至適温度：３７℃、ＧＣＧ：Ｃ）
ＢｓｔＢＩ    （至適温度：６５℃、ＴＴ：ＣＧＡＡ）
ＢｓｓＫＩ    （至適温度：６０℃、：ＣＣＮＧＧ）
例えば、前記のような認識配列中のシトシンのメチル化に感受性を持つ制限酵素、ＨｉｎＰII、ＨｐａIIあるいはＨｐｙＣＨ４IVが利用できる。これらの制限酵素は至適温度において活性持続時間が長く、数時間の消化反応でも安定に酵素活性を持続発現する。
【００４６】
ゲノムＤＮＡ中の−ＣｐＧ−配列中のシトシンのメチル化を解像度よく分析するためには、分析対象ＤＮＡにおいて分析対象サイト数が多いほど良いが、そのためには認識配列が異なる複数種類の制限酵素を組み合わせて使用することにより、分析解像度をより高くすることができる。例えばＨｉｎＰII、ＨｐａII及びＨｐｙＣＨ４IVのうち２種類又は３種類を組み合わせてゲノムＤＮＡを消化する場合、生成される断片の５’側突出末端の塩基配列はいずれも−ＣｐＧ−（５’−ＣＧ−ＸＸＸＸ−−−−−３’）（Ｘは任意の塩基）となるため、異なる制限酵素で切断されたＤＮＡ断片同士であっても、その粘着末端はライゲーション処理により、接合パートナーを選ばずに相互に接合することができる。異なる制限酵素で生成された粘着末端のうち、突出末端の塩基配列が異なった断片を連結した連結ＤＮＡの場合には、使用した制限酵素による再切断はできなくなるが、シーケンス解析には影響はない。
【００４７】
また、平滑末端を生成するメチル化感受性制限酵素も同様に本方法に利用できる。例えば、平滑末端を有する断片を生成する制限酵素と粘着末端を生成する制限酵素を組み合わせて用いた場合であっても、それぞれの制限酵素で生成されたＤＮＡ断片はライゲーションにおいて接合パートナーを有するので、特に前処理を行うことなく、ライゲーション処理を実施することができる。
【００４８】
本発明方法の消化工程に使用する制限酵素については、特に突出末端が共通の核酸配列を持つ必要はなく、後述の実施例に示すように、異なる突出末端が生成される制限酵素の組み合わせによっても、特定の制限酵素により生成された粘着末端同士が接合できるので、生成される突出末端の塩基配列が共通である制限酵素を組み合わせることは必須ではなく、メチル化感受性制限酵素を自由に組み合わせて使用することができる。このように自由に制限酵素を組み合わせる事ができる点で、従来法に比較し、大きなアドバンテージがある。従来の制限酵素によるメチル化解析では、例えばメチル化感受性制限酵素であるＨｐａIIとメチル化非感受性制限酵素のＭｓｐＩといった、同じ認識配列を持つ制限酵素の組み合わせが必須であったが、このような制限酵素の組み合わせは極めて希少であり、メチル化分析対象領域にこれらの制限酵素の認識配列に拘束されており、この認識配列を持たない遺伝子領域や植物ゲノムにおいては、分析する事さえできなかった。本発明の方法はこの課題を解決し、従来の制限酵素を用いたメチル化分析手法を植物ゲノムにも応用可能としただけではなく、分析解像度を飛躍的に向上させ、更には分析対象領域の塩基配列に応じて、数多くの制限酵素を組み合わせて使用する事が可能となっている。
【００４９】
また、上記のゲノムの制限酵素の処理工程や前処理において、メチル化感受性を有しない制限酵素を組み合わせて使用することも可能で、こうした場合であっても、メチル化分析の対象となるサイトのメチル化分析には影響を及ぼさないので、必要に応じて、メチル化感受性制限酵素の認識配列とは異なる認識配列を持つメチル化非感受性制限酵素を同時に使用することが可能である。例えば、ゲノムＤＮＡの完全消化を促進するなどの目的で、ゲノムＤＮＡの立体構造を不安定にできる高温を至適温度とするメチル化非感受性制限酵素で前消化を行い、その後、メチル化感受性制限酵素で消化することも可能である。
【００５０】
次に、メチル化感受性制限酵素としてＨｉｎＰIIとＨｐａIIを用いた場合を例示する。
ＤＮＡをＨｉｎＰIIとＨｐａIIで消化すると、下記に示すＤＮＡ断片が生成される。
１）両末端共にＨｉｎＰIIサイトを有するＤＮＡ断片
２）両末端共にＨｐａIIサイトを有するＤＮＡ断片
３）一方がＨｐａIIサイトで他方がＨｉｎＰIIを有するＤＮＡ断片
これらが含まれるＤＮＡ断片混合液に対してライゲーション処理を行うと、下記に例示する長鎖の連結ＤＮＡが生成される。
５’−−−ＨｉｎＰII−−−−−−−ＨｉｎＰII−ｐ−ＨｉｎＰII−−−−−−−ＨｐａII−ｐ−ＨｉｎＰII−−−−−−−  ＨｐａII−ｐ−ＨｐａII−−−−３’  
各制限酵素で生成された粘着末端はその酵素名で示した。また、−ｐ−はライゲーションで結合した箇所を示す。
また、前記断片１）〜３）の各組合せ（３’末端側と５’末端側との組合せ）により生成する配列を表２に示す。
【００５１】
【表２】
2019088069.tif 000003
【００５２】
このように、各制限酵素で生成されたＤＮＡ断片は、両末端が同種の認識配列を有するものと異なる認識配列を有するものが生成されるが、ＨｉｎＰIIとＨｐａIIで生成される突出末端の塩基は共に−ＣｐＧ−を有することから、異なる制限酵素で切断されたＤＮＡ断片同士もライゲーションによって接合することができる。このようにＤＮＡ断片群は接合可能なパートナー同士がライゲーションによって接合して高分子化する。
【００５３】
こうして得られた長鎖連結ＤＮＡは汎用のシーケンサーで分析できるＤＮＡ試料として取り扱うことができる。一般的には、分析対象ＤＮＡを超音波又は酵素で低分子化し（任意の箇所で切断）、それぞれのシーケンス解析装置のメーカーが提供するアダプターなどを接合し、シーケンサーで塩基配列を解析する。得られた個々のＤＮＡの塩基配列情報は、分析対象とするゲノムＤＮＡ配列情報にマッピングすることにより、制限酵素で切断された箇所が明確になる。一方、シーケンス解析で得られた塩基配列中に分析で使用した制限酵素サイトが残存している場合には、そのサイトの−ＣｐＧ−配列中のシトシンはメチル化されていたために制限酵素消化に抵抗したと考えられる。このようにして、特定の制限酵素で切断されたＤＮＡ断片も切断されなかったＤＮＡ断片も、参照するゲノム配列情報上にマッピングすることにより、使用した制限酵素の認識配列中のシトシンのメチル化解析が可能となる。
【００５４】
《ＤＮＡ断片群の取得方法》
本発明には、特定のＤＮＡのみからなるＤＮＡ断片群の取得方法が含まれる。
本発明におけるＤＮＡ断片群の取得方法の特徴は、以下に詳述するように、認識配列が同じで、突出末端を生じさせる、メチル化感受性制限酵素とメチル化非感受性制限酵素との組合せを用いること、そして、メチル化感受性制限酵素による第一消化工程の後に行う第一連結工程で前記突出末端に連結するアダプターとして、認識配列を再生しない配列を有するアダプターを使用することにある。
【００５５】
本発明のＤＮＡ断片群の取得方法によれば、後述するように、両端の突出末端の両方にメチル化シトシンが存在するＤＮＡ断片（以下、両端メチル化シトシンＤＮＡ断片と称する）のみからなるＤＮＡ断片群、あるいは、両端の突出末端の両方にシトシン（すなわち、非メチル化シトシン）が存在するＤＮＡ断片（以下、両端シトシンＤＮＡ断片と称する）のみからなるＤＮＡ断片群を取得することができる。これらのＤＮＡ断片群は、リガーゼで処理することにより長鎖連結ＤＮＡとした後、その塩基配列を決定することにより、特定のＤＮＡ断片（すなわち、両端メチル化シトシンＤＮＡ断片、あるいは、両端シトシンＤＮＡ断片）に限定して、メチル化の状態を決定することができる。従って、塩基配列解析の対象となるＤＮＡ断片が濃縮されるため、塩基配列の解析効率が格段に上がり、分析時間の大幅な短縮と、経費節減が期待できる。
【００５６】
［両端メチル化シトシンＤＮＡ断片のみからなるＤＮＡ断片群の取得方法］
本発明の第一の両端メチル化シトシンＤＮＡ断片のみからなるＤＮＡ断片群の取得方法（以下、両端メチル化シトシンＤＮＡ取得方法と称する）は、
（１）メチル化シトシン又はメチル化される可能性のあるシトシンを認識配列中に含み、且つ、突出末端を生じさせるメチル化感受性制限酵素で、分析対象ＤＮＡを消化する工程（第一消化工程）、
（２）前記工程（１）で得られたＤＮＡ断片の両端に、前記メチル化感受性制限酵素の認識配列を再生しない標識化アダプターを連結させる工程（連結工程）、
（３）前記工程（２）で得られた標識化ＤＮＡ構築物を、前記メチル化感受性制限酵素と同じ認識配列を認識し、且つ、突出末端を生じさせるメチル化非感受性制限酵素で消化する工程（第二消化工程）、
（４）前記工程（３）で得られたＤＮＡ断片混合物から、前記標識の特異的結合パートナーを用いて、標識化ＤＮＡ断片のみを除去することにより、両端の突出末端の両方にメチル化シトシンが存在するＤＮＡ断片のみからなるＤＮＡ断片群を取得する工程（除去工程）
を含む。
【００５７】
本発明の第二の両端メチル化シトシンＤＮＡ取得方法は、
（１）メチル化シトシン又はメチル化される可能性のあるシトシンを認識配列中に含み、且つ、突出末端を生じさせるメチル化感受性制限酵素で、分析対象ＤＮＡを消化する工程（第一消化工程）、
（２）前記工程（１）で得られたＤＮＡ断片の両端を、標識化デオキシヌクレオシド三リン酸の存在下で平滑化する工程（平滑化工程）、
（３）前記工程（２）で得られた標識化ＤＮＡ断片を、前記メチル化感受性制限酵素と同じ認識配列を認識し、且つ、突出末端を生じさせるメチル化非感受性制限酵素で消化する工程（第二消化工程）、
（４）前記工程（３）で得られたＤＮＡ断片混合物から、前記標識の特異的結合パートナーを用いて、標識化ＤＮＡ断片のみを除去することにより、両端の突出末端の両方にメチル化シトシンが存在するＤＮＡ断片のみからなるＤＮＡ断片群を取得する工程（除去工程）
を含む。
【００５８】
本発明の第三の両端メチル化シトシンＤＮＡ取得方法は、
（１）メチル化シトシン又はメチル化される可能性のあるシトシンを認識配列中に含み、且つ、突出末端を生じさせるメチル化感受性制限酵素で、分析対象ＤＮＡを消化する工程（第一消化工程）、
（２）前記工程（１）で得られたＤＮＡ断片の両端に、前記メチル化感受性制限酵素の認識配列を再生しないステムループアダプターを連結させる工程（第一連結工程）、
（３）前記工程（２）で得られたＤＮＡ構築物を、前記メチル化感受性制限酵素と同じ認識配列を認識し、且つ、突出末端を生じさせるメチル化非感受性制限酵素で消化する工程（第二消化工程）、
（４）前記工程（３）で得られたＤＮＡ断片の各突出末端に、５’末端がヌクレアーゼ耐性を示し、且つ、前記メチル化非感受性制限酵素の認識配列を再生するヌクレアーゼ耐性標識化アダプターを連結させる工程（第二連結工程）、
（５）前記工程（４）で得られたＤＮＡ構築物を、一本鎖特異的エンドヌクレアーゼで処理し、続いて、二本鎖特異的エキソヌクレアーゼ及び一本鎖特異的ヌクレアーゼの組合わせで処理することにより、ステムループアダプターが連結されたＤＮＡ断片のみを完全消化し、両端にヌクレアーゼ耐性標識化アダプターが連結されたＤＮＡ断片のみからなるＤＮＡ断片群を取得する工程（第三消化工程）
を含む。
【００５９】
本発明の両端メチル化シトシンＤＮＡ取得方法では、認識配列が同一の二種類の制限酵素を使用する。第一消化工程では、メチル化シトシン又はメチル化される可能性のあるシトシンを認識配列中に含み、且つ、突出末端を生じさせるメチル化感受性制限酵素（以下、メチル化感受性制限酵素（ＭＳ制限酵素）と称する）を使用し、第二消化工程では、前記メチル化感受性制限酵素と同じ認識配列を認識し、且つ、突出末端を生じさせるメチル化非感受性制限酵素（以下、メチル化非感受性制限酵素（ＭＩ制限酵素）と称する）を使用する。
本発明方法で用いることのできるＭＳ制限酵素とＭＩ制限酵素としては、例えば、ＨｐａII（ＭＳ制限酵素）とＭｓｐＩ（ＭＩ制限酵素）との組合せを挙げることができる。
【００６０】
本発明の第一の両端メチル化シトシンＤＮＡ取得方法では、分析対象ＤＮＡをメチル化感受性制限酵素で消化することにより、ＤＮＡを断片化する。このＤＮＡ断片は、全て、両端の突出末端の両方にシトシンが存在するＤＮＡ断片である。
得られたＤＮＡ断片の両端の突出末端に、メチル化感受性制限酵素の認識配列を再生しない標識化アダプター（例えば、ビオチン化アダプター、ジゴキシゲニン修飾アダプター）を連結させた後、得られた、両端に標識化アダプターが連結した標識化ＤＮＡ構築物をメチル化非感受性制限酵素で消化することにより、メチル化シトシンを含む認識配列を切断し、ＤＮＡを更に断片化する。メチル化非感受性制限酵素は、標識化ＤＮＡ構築物の内部のメチル化された認識配列を切断するため、得られたＤＮＡ断片は、（１）切断されなかった、両端に標識化アダプターが連結した標識化ＤＮＡ構築物、（２）一端に標識化アダプターが連結し、他端がメチル化シトシンが存在する突出末端であるＤＮＡ断片、（３）両端がメチル化シトシンが存在する突出末端であるＤＮＡ断片の混合物である。
前記ＤＮＡ断片混合物を、前記標識の特異的結合パートナー（例えば、アビジン、抗ジゴキシゲニン抗体）と接触させ（例えば、アビジンビーズやアビジンカラム、抗ジゴキシゲニン抗体ビーズや抗ジゴキシゲニン抗体カラムと接触させる）、標識化アダプターが連結したＤＮＡ断片（１）及び（２）を除去することにより、両端の突出末端の両方にメチル化シトシンが存在するＤＮＡ断片（３）のみからなるＤＮＡ断片群（両端メチル化シトシンＤＮＡ断片）を取得することができる。
【００６１】
本発明の第二の両端メチル化シトシンＤＮＡ取得方法では、分析対象ＤＮＡをメチル化感受性制限酵素で消化することにより、ＤＮＡを断片化する。このＤＮＡ断片は、全て、両端の突出末端の両方にシトシンが存在するＤＮＡ断片である。
得られたＤＮＡ断片の両端の突出末端を、標識化デオキシヌクレオシド三リン酸（例えば、ビオチン化デオキシヌクレオシド三リン酸、ジゴキシゲニン修飾デオキシヌクレオシド三リン酸）の存在下で平滑化した後、得られた、両端が平滑化且つ標識化されたＤＮＡ断片をメチル化非感受性制限酵素で消化することにより、メチル化シトシンを含む認識配列を切断し、ＤＮＡを更に断片化する。メチル化非感受性制限酵素は、標識化ＤＮＡ断片の内部のメチル化された認識配列を切断するため、得られたＤＮＡ断片は、（１）切断されなかった、両端が平滑化且つ標識化されたＤＮＡ断片、（２）一端が平滑化且つ標識化され、他端がメチル化シトシンが存在する突出末端であるＤＮＡ断片、（３）両端がメチル化シトシンが存在する突出末端であるＤＮＡ断片の混合物である。
前記ＤＮＡ断片混合物を、前記標識の特異的結合パートナー（例えば、アビジン、抗ジゴキシゲニン抗体）と接触させ（例えば、アビジンビーズやアビジンカラム、抗ジゴキシゲニン抗体ビーズや抗ジゴキシゲニン抗体カラムと接触させる）、標識化ＤＮＡ断片（１）及び（２）を除去することにより、両端の突出末端の両方にメチル化シトシンが存在するＤＮＡ断片（３）のみからなるＤＮＡ断片群（両端メチル化シトシンＤＮＡ断片）を取得することができる。
【００６２】
本発明の第一もしくは第二の両端メチル化シトシンＤＮＡ取得方法、又は、後述の本発明の両端シトシンＤＮＡ断片のみからなるＤＮＡ断片群の取得方法では、標識化アダプター又は標識化デオキシヌクレオシド三リン酸における標識物質と、それに特異的なパートナーとの組合せとして、アフィニティーを利用した公知の組合せ、例えば、ビオチン／アビジン、ジゴキシゲニン／抗ジゴキシゲニン抗体などを用いることができる。
【００６３】
本発明の第三の両端メチル化シトシンＤＮＡ取得方法では、分析対象ＤＮＡをメチル化感受性制限酵素で消化することにより、ＤＮＡを断片化する。このＤＮＡ断片は、全て、両端の突出末端の両方にシトシンが存在するＤＮＡ断片である。
得られたＤＮＡ断片の両端の突出末端に、メチル化感受性制限酵素の認識配列を再生しないステムループアダプター（標識化は特に必要ない）を連結させた後、得られた、両端にステムループアダプターが連結したＤＮＡ構築物をメチル化非感受性制限酵素で消化することにより、メチル化シトシンを含む認識配列を切断し、ＤＮＡを更に断片化する。メチル化非感受性制限酵素は、ステムループアダプターが結合したＤＮＡ構築物の内部のメチル化された認識配列を切断するため、得られたＤＮＡ断片は、（１）切断されなかった、両端にステムループアダプターが連結したＤＮＡ構築物、（２）一端にステムループアダプターが連結し、他端がメチル化シトシンが存在する突出末端であるＤＮＡ断片、（３）両端がメチル化シトシンが存在する突出末端であるＤＮＡ断片の混合物である。
【００６４】
続いて、前記ＤＮＡ断片混合物の各突出末端に、５’末端がヌクレアーゼ耐性を示し、且つ、前記メチル化非感受性制限酵素の認識配列を再生するヌクレアーゼ耐性標識化アダプターを連結させる。なお、前記ＤＮＡ構築物（１）の両端、あるいは、ＤＮＡ断片（２）の一端は、ステムループアダプターが連結しているため、前記ヌクレアーゼ耐性標識化アダプターは、それ以上、連結することはなく、結果的に、（１）切断されなかった、両端にステムループアダプターが連結したＤＮＡ構築物、（２’）一端にステムループアダプターが連結し、他端のメチル化シトシンが存在する突出末端にヌクレアーゼ耐性標識化アダプターが連結したＤＮＡ構築物、（３’）両端のメチル化シトシンが存在する突出末端にヌクレアーゼ耐性標識化アダプターが連結したＤＮＡ構築物の混合物が得られる。
【００６５】
得られたＤＮＡ構築物混合物を、ｓｓＤＮＡに対してエンドヌクレアーゼ特異性を有する一本鎖特異的エンドヌクレアーゼ（例えば、マングビーンヌクレアーゼ又はＳ１ヌクレアーゼ。反応液性は酸性）で処理することにより、前記ＤＮＡ構築物（１）及び（２’）が有するｓｓＤＮＡ領域およびｄｓＤＮＡ領域とからなるステムループ構造領域を分解する。続いて、二本鎖特異的エキソヌクレアーゼ（例えば、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有するλエキソヌクレアーゼ）及び一本鎖特異的エキソヌクレアーゼ（例えば、エキソヌクレアーゼＩ）の組合せ（反応液性はアルカリ性）で処理することにより、前記ＤＮＡ構築物（１）及び（２’）を完全分解することができ、一方、両端にヌクレアーゼ耐性標識化アダプターが連結されたＤＮＡ構築物（３’）（両端はメチル化シトシンが存在する突出末端に由来）のみが消化されずに残るため、ＤＮＡ構築物（３’）のみからなるＤＮＡ断片群を取得することができる。
【００６６】
なお、λエキソヌクレアーゼとエキソヌクレアーゼＩは、いずれもアルカリ性液性を至適ｐＨとするため、同一の反応液（例えば、ＮＥＢｕｆｆｅｒ  ４又はＣｕｔＳｍａｒｔバッファー（共にＮＥＢ社））中で同時に使用（すなわち、同時消化）することができる。
また、一本鎖特異的エンドヌクレアーゼの反応液性と、二本鎖特異的エキソヌクレアーゼ及び一本鎖特異的エキソヌクレアーゼ（例えば、エキソヌクレアーゼＩ）の組合せの反応液性は異なるため、常法（例えば、ＱＩＡａｍｐ  ＤＮＡ  Ｍｉｎｉ  ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社））により、一本鎖特異的エンドヌクレアーゼ処理後のＤＮＡを精製することができる。また、その後の酵素処理を考慮して、消化されずに残ったＤＮＡ構築物（３’）を常法（例えば、ＱＩＡａｍｐ  ＤＮＡ  Ｍｉｎｉ  ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社））により精製することもできる。
【００６７】
続いて、前記ＤＮＡ断片群を前記メチル化非感受性制限酵素で消化すると、メチル化シトシンが存在する突出末端とヌクレアーゼ耐性標識化アダプターとの先の連結によってメチル化非感受性制限酵素の認識配列が再生されているため、各ＤＮＡ構築物から標識化アダプターを切断排除することができる。得られた消化処理物を、前記標識の特異的結合パートナーと接触させ（例えば、アビジンビーズやアビジンカラムと接触させる）、ヌクレアーゼ耐性標識化アダプターを除去することにより、両端の突出末端の両方にメチル化シトシンが存在するＤＮＡ断片のみからなるＤＮＡ断片群（両端メチル化シトシンＤＮＡ断片）を取得することができる。
【００６８】
本発明の第一〜第三の両端メチル化シトシンＤＮＡ取得方法により得られた両端メチル化シトシンＤＮＡ断片は、リガーゼで処理することにより長鎖連結ＤＮＡとした後、その塩基配列を決定することにより、両端メチル化シトシンＤＮＡ断片に関して、メチル化の状態を決定することができる。
【００６９】
［両端シトシンＤＮＡ断片のみからなるＤＮＡ断片群の取得方法］
本発明の両端シトシンＤＮＡ断片のみからなるＤＮＡ断片群の取得方法（以下、両端シトシンＤＮＡ取得方法と称する）は、
（１）メチル化シトシン又はメチル化される可能性のあるシトシンを認識配列中に含み、且つ、突出末端を生じさせるメチル化感受性制限酵素で、分析対象ＤＮＡを消化する工程（第一消化工程）、
（２）前記工程（１）で得られたＤＮＡ断片の両端に、５’末端がヌクレアーゼ耐性を示し、８塩基以上の長さからなる制限酵素認識配列を有し、且つ、前記メチル化感受性制限酵素の認識配列を再生しないヌクレアーゼ耐性標識化アダプターを連結させる工程（第一連結工程）、
（３）前記工程（２）で得られたＤＮＡ構築物を、前記メチル化感受性制限酵素と同じ認識配列を認識し、且つ、突出末端を生じさせるメチル化非感受性制限酵素で消化する工程（第二消化工程）、
（４）前記工程（３）で得られたＤＮＡ断片の両端にステムループアダプターを連結させる工程（第二連結工程）、
（５）前記工程（４）で得られたＤＮＡ構築物を、一本鎖特異的エンドヌクレアーゼで処理し、続いて、二本鎖特異的ヌクレアーゼ及び一本鎖特異的ヌクレアーゼの組合せで処理することにより、ステムループアダプターが連結されたＤＮＡ断片のみを完全消化し、両端にヌクレアーゼ耐性標識化アダプターが連結されたＤＮＡ断片のみからなるＤＮＡ断片群を取得する工程（第三消化工程）
を含む。
【００７０】
本発明の両端シトシンＤＮＡ取得方法では、分析対象ＤＮＡをメチル化感受性制限酵素で消化することにより、ＤＮＡを断片化する。このＤＮＡ断片は、全て、両端の突出末端の両方のＣＧ配列中に非メチル化シトシンが存在するＤＮＡ断片である。
得られたＤＮＡ断片の両端の突出末端に、５’末端がヌクレアーゼ耐性を示し、８塩基以上の長さからなる制限酵素認識配列を有し、且つ、前記メチル化感受性制限酵素の認識配列を再生しないヌクレアーゼ耐性標識化アダプター（例えば、ヌクレアーゼ耐性ビオチン化アダプター、ヌクレアーゼ耐性ジゴキシゲニン修飾アダプター）を連結させる。得られた、両端にヌクレアーゼ耐性標識化アダプターが連結したＤＮＡ構築物をメチル化非感受性制限酵素で消化することにより、ＤＮＡを更に断片化する。メチル化非感受性制限酵素は、ヌクレアーゼ耐性標識化ＤＮＡ構築物の内部のメチル化された認識配列を切断するため、得られたＤＮＡ断片は、（１）切断されなかった、両端にヌクレアーゼ耐性標識化アダプターが連結したＤＮＡ構築物、（２）一端にヌクレアーゼ耐性標識化アダプターが連結し、他端の制限酵素認識配列中に非メチル化シトシンが存在する突出末端を持つＤＮＡ断片、（３）両端の制限酵素認識配列中に非メチル化シトシンが存在する突出末端であるＤＮＡ断片の混合物である。
【００７１】
得られたＤＮＡ断片の各突出末端に、ステムループアダプター（標識化は特に必要ない。認識配列を再生できるか否かも問わない）を連結させる。なお、前記ＤＮＡ構築物（１）の両端、あるいは、ＤＮＡ断片（２）の一端は、ヌクレアーゼ耐性標識化アダプターが連結しているため、前記ステムループアダプターは、それ以上、連結することはなく、結果的に、（１）両端にヌクレアーゼ耐性標識化アダプターが連結したＤＮＡ構築物、（２’）一端にヌクレアーゼ耐性標識化アダプターが連結し、他端の非メチル化シトシンが存在する突出末端にステムループアダプターが連結したＤＮＡ構築物、（３’）両端の非メチル化シトシンが存在する突出末端にステムループアダプターが連結したＤＮＡ構築物の混合物が得られる。
【００７２】
得られたＤＮＡ構築物混合物を、ｓｓＤＮＡに対してエンドヌクレアーゼ特異性を有する一本鎖特異的エンドヌクレアーゼ（例えば、マングビーンヌクレアーゼ又はＳ１ヌクレアーゼ。反応液性は酸性）で処理することにより、前記ＤＮＡ構築物（２’）及び（３’）が有するｓｓＤＮＡ領域およびｄｓＤＮＡ領域とからなるステムループ構造領域を分解する。続いて、二本鎖特異的エキソヌクレアーゼ（例えば、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有するλエキソヌクレアーゼ）及び一本鎖特異的エキソヌクレアーゼ（例えば、エキソヌクレアーゼＩ）の組合せ（反応液性はアルカリ性）で処理することにより、前記ＤＮＡ構築物（２’）及び（３’）を完全分解することができ、一方、両端にヌクレアーゼ耐性標識化アダプターが連結されたＤＮＡ構築物（１）（両端はシトシンが存在する突出末端に由来）のみが消化されずに残るため、ＤＮＡ構築物（１）のみからなるＤＮＡ断片群を取得することができる。
【００７３】
なお、λエキソヌクレアーゼとエキソヌクレアーゼＩは、いずれもアルカリ性液性を至適ｐＨとするため、同一の反応液（例えば、ＮＥＢｕｆｆｅｒ  ４又はＣｕｔＳｍａｒｔバッファー（共にＮＥＢ社））中で同時に使用（すなわち、同時消化）することができる。
また、一本鎖特異的エンドヌクレアーゼの反応液性と、二本鎖特異的エキソヌクレアーゼ及び一本鎖特異的エキソヌクレアーゼ（例えば、エキソヌクレアーゼＩ）の組合せの反応液性は異なるため、常法（例えば、ＱＩＡａｍｐ  ＤＮＡ  Ｍｉｎｉ  ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社））により、一本鎖特異的エンドヌクレアーゼ処理後のＤＮＡを精製することができる。また、その後の酵素処理を考慮して、消化されずに残ったＤＮＡ構築物（１）を常法（例えば、ＱＩＡａｍｐ  ＤＮＡ  Ｍｉｎｉ  ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社））により精製することもできる。
【００７４】
続いて、前記ＤＮＡ断片群を、ヌクレアーゼ耐性標識化アダプター中の８塩基以上の長さからなる制限酵素認識配列を認識する制限酵素で消化すると、各ＤＮＡ構築物から標識化アダプターを切断排除することができる。得られた消化処理物を、前記標識の特異的結合パートナー（例えば、アビジン、抗ジゴキシゲニン抗体）と接触させ（例えば、アビジンビーズやアビジンカラム、抗ジゴキシゲニン抗体ビーズや抗ジゴキシゲニン抗体カラムと接触させる）、ヌクレアーゼ耐性標識化アダプターを除去することにより、両端の突出末端の両方の近傍に非メチル化シトシン（からなるＣｐＧ配列）が存在するＤＮＡ断片のみからなるＤＮＡ断片群（両端非メチル化シトシンＤＮＡ断片）を取得することができる。
【００７５】
本発明の両端非メチル化シトシンＤＮＡ取得方法により得られた両端非メチル化シトシンＤＮＡ断片は、リガーゼで処理することにより長鎖連結ＤＮＡとした後、その塩基配列を決定することにより、両端シトシンＤＮＡ断片に関して、メチル化の状態を決定することができる。
【００７６】
《本発明で利用可能なＤＮＡ増幅法》
二本鎖ＤＮＡはマグネシウムなどの２価カチオンの存在により構造の柔軟性が変化する。例えば、二本鎖ＤＮＡはマグネシウムイオン存在下では直鎖構造を形成しやすく、同イオン濃度が低いとＤＮＡ鎖は構造柔軟性を呈する。そのため、ＤＮＡ断片をライゲーションする時の条件によって長鎖を形成させたり、自己閉鎖型の環状構造を形成させることができる。したがって、長鎖の２本鎖ＤＮＡを鋳型としてＤＮＡを増幅する場合には、例えばｉｌｌｕｓｔｒａ  ＧｅｎｏｍｉＰｈｉ  ＤＮＡ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＧＥヘルスケア社）などで提供される鎖置換型ＤＮＡポリメラーゼ（例えば、ｐｈｉ２９  ＤＮＡポリメラーゼ）を用いることができるし、環状構造型ＤＮＡを鋳型としてＤＮＡ増幅したい場合には、Ｒｏｌｌｉｎｇ  Ｃｉｒｃｌｅ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ（ＲＣＡ）法を利用した、プラスミドＤＮＡの増幅などに汎用されるｉｌｌｕｓｔｒａ  ＴｅｍｐｌｉＰｈｉ  ＤＮＡ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＧＥヘルスケア社）など、鎖置換型ＤＮＡポリメラーゼ（例えば、ｐｈｉ２９  ＤＮＡポリメラーゼ）を用いたＤＮＡ増幅を行うことができる。本発明に記載のＤＮＡ増幅法は本発明に記載のＤＮＡ断片の分画法とともに、所望に応じてその方法を選択することができるし、いずれの方法の組み合わせで実施しても、本発明の目的を達成することができる。
【実施例】
【００７７】
《実施例１：メチル化率の決定方法》
＜次世代シーケンサー分析用長鎖連結ＤＮＡ（高分子量ランダム接合ＤＮＡ）の調製（ＤＮＡ増幅工程を含まない場合）＞
ヒト線維芽細胞ＷＩ−３８（１０×１０６個）より、ゲノムＤＮＡ精製キットＱＩＡａｍｐ  ＤＮＡ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社）を用いてゲノムＤＮＡを精製した。ただし本精製工程のＰｒｏｔｅｉｎａｓｅＫによる処理時間を５６℃、４時間とした。本キットの精製カラムからＤＮＡを溶出する際には、事前に本精製カラムを減圧条件下で５分間乾燥させ、残留するアルコールを除去した後、４０μＬの１Ｘ  ＣｕｔＳｍａｒｔ  Ｂｕｆｆｅｒ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社）でＤＮＡを溶出した。【００７８】
精製したＤＮＡのうち１００ｎｇに相当する溶液量を分取し、１Ｘ  ＣｕｔＳｍａｒｔ  Ｂｕｆｆｅｒで全量を５０μＬに調整し、これにメチル化感受性の制限酵素であるＨｐａＩＩ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社）およびＨｈａＩ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社）を各０．４ユニットずつ添加し、３７℃で４時間消化した。なお、ＨｐａＩＩの認識配列はＣ↓ＣＧＧであり、５’末端がオーバーハングとなる粘着末端が生じ、また、ＨｈａＩの認識配列はＧＣＧ↓Ｃであり、３’末端がオーバーハングとなる粘着末端を生じる。ＨｐａＩＩによる生成する粘着末端どうし、あるいは、ＨｈａＩによる生成する粘着末端どうしは、それぞれ、連結できるが、ＨｐａＩＩによる生成する粘着末端と、ＨｈａＩによる生成する粘着末端とは、連結しない。【００７９】
得られたＤＮＡ消化溶液はＭｉｎＥｌｕｔｅ  ＰＣＲ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社）を用い、マニュアルに従って１０μＬのＤＮＡ溶出用緩衝液を用いてＤＮＡを精製カラムから溶出してＤＮＡ含有液を取得した。分取したＤＮＡに対し、Ｑｕｉｃｋ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社）を用いてライゲーションを行い、ＤＮＡ断片のランダム接合体（長鎖連結ＤＮＡ）を作製した。【００８０】
前記の手順で得られた長鎖連結ＤＮＡを含んだ溶液に対し、ＱＩＡａｍｐ  ＤＮＡ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社）を用いて長鎖連結ＤＮＡを精製した。次世代シーケンサ（イルミナ社）による分析を行うにあたっては前記工程で精製した長鎖連結ＤＮＡを用い、メーカーが推奨する手順に沿ってシーケンス解析用サンプルを調製し、次世代シーケンサーに供してシーケンス解析を行った。【００８１】
＜次世代シーケンサー分析用長鎖連結ＤＮＡ（高分子量ランダム接合ＤＮＡ）の調製（ＤＮＡ増幅工程を含む場合）＞
前記と同様にしてゲノムＤＮＡを精製後、制限酵素で消化したが、ＤＮＡ増幅を行う場合にはＴａＫａＲａ  ＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  ＬＯＮＧ（タカラバイオ社）を用いてＤＮＡ断片のランダム接合を行ない、前記と同様にＱＩＡａｍｐ  ＤＮＡ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社）を用いて長鎖連結ＤＮＡを精製した。精製された前記ＤＮＡを増幅する場合は、前記工程で得られたＤＮＡ精製溶液の一部を分取し、ｉｌｌｕｓｔｒａ  ＧｅｎｏｍｉＰｈｉ  Ｖ２  Ｋｉｔ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｊａｐａｎ）に添付のマニュアルに従ってＤＮＡを増幅した。【００８２】
増幅ＤＮＡはＱＩＡａｍｐ  ＤＮＡ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔで精製し、前記と同様に次世代シーケンサー（イルミナ社）が推奨する手順に従って分析用サンプルを調製し、シーケンス解析を行った。【００８３】
ここで得られた長鎖連結ＤＮＡの構造を理解するために、メチル化感受性制限酵素で消化する前のゲノムＤＮＡの構造を図１に示し、前記制限酵素で消化後、ライゲーションにより得られる長鎖連結ＤＮＡの構造を図２に示す。
図１は、ゲノムＤＮＡの部分領域Ａ及びＢの構造を模式的に示す説明図であり、メチル化感受性制限酵素ＨｐａＩＩ及びＨｈａＩの認識部位［（１）〜（１４）］を示すと共に、ＣｐＧ配列中のシトシンがメチル化されている認識部位を記号「＊」で示す。ゲノムＤＮＡをメチル化感受性制限酵素ＨｐａＩＩ及びＨｈａＩで消化すると、ＣｐＧ配列中のシトシンがメチル化されていない認識部位（すなわち、非メチル化サイト）でのみ、両制限酵素による切断が起きるため、部分領域Ａからは、断片Ａ１、断片Ａ２、断片Ａ３が生じ、部分領域Ｂからは、断片Ｂ１、断片Ｂ２、断片Ｂ３、断片Ｂ４が生じる。【００８４】
各ＤＮＡ断片の両端は、ＨｐａＩＩにより生成する粘着末端、あるいは、ＨｈａＩにより生成する粘着末端のいずれかであるので、ＨｐａＩＩによる生成する粘着末端どうし、あるいは、ＨｈａＩによる生成する粘着末端どうしが、それぞれ、連結し、例えば、図２に示すような、断片Ａ１、Ｂ３、Ｂ２、Ａ２、Ｂ１がこの順に連結した長鎖連結ＤＮＡが生じる。例えば、断片Ａ１と断片Ｂ３との連結は、メチル化されていないＨｈａＩサイト（３）から生じた粘着末端と、メチル化されていないＨｈａＩサイト（１２）から生じた粘着末端とが連結したものである。【００８５】
ここで、図２に示すＨｐａＩＩ認識部位及びＨｈａＩ認識部位と、その各々の上流配列及び下流配列に注目すると、メチル化されていた認識部位、すなわち、ＨｐａＩＩ（２）、ＨｐａＩＩ（４）、ＨｈａＩ（９）、ＨｐａＩＩ（１０）の各々の上流配列及び下流配列は、オリジナルの塩基配列が保持されている。一方、異なるＤＮＡ断片が連結して再生された認識部位［例えば、断片Ａ１と断片Ｂ３との連結により再生されたＨｈａＩサイト（３）／（１２）］は、全て、非メチル化サイトに由来しており、また、再生された認識部位の上流配列及び下流配列は、それぞれ、異なるＤＮＡ断片（例えば、前記ＨｈａＩサイト（３）／（１２）では、断片Ａ１と断片Ｂ３）に由来する。従って、ライゲーションにより得られた長鎖連結ＤＮＡにおいて、ゲノムＤＮＡの消化に用いた制限酵素の各認識部位の上流と下流の各塩基配列をヒトゲノムリファレンス配列にマッピングすることにより、オリジナルのゲノム配列における各認識配列に含まれるＣｐＧ配列中のシトシンのメチル化の状態を決定することができる。【００８６】
＜メチル化部位および非メチル化部位の識別＞
本実施例では、次世代シーケンスより出力されたＤＮＡ配列情報に基づいて、メチル化の状態を決定した。前記ＤＮＡ配列情報は、常法に従って汎用ソフト等を用い、ヒトゲノムリファレンス配列上にマッピングし、本解析で使用した制限酵素認識サイトのメチル化の有無を識別した。具体的には、切断された制限酵素認識サイトでは、通常は隣接していない他のＤＮＡ断片とランダムに接合しているので、リファレンス配列へのマッピングを行なった場合に、制限酵素認識サイトを挟んで上流又は下流のうちの一方がリファレンス配列にマッピングされる。このように制限酵素認識配列を挟んでその一方のＤＮＡ断片のみがマッピング可能な場合は、当該の制限酵素認識サイトがメチル化感受性制限酵素で切断されていることを示すので、当該の制限酵素認識サイトを非メチル化部位としてカウントした。制限酵素サイトのＣｐＧ配列のうちのシトシンがメチル化されている場合には、前記のメチル化感受性制限酵素によって切断されないので、当該の制限酵素認識サイトを挟んだ上流および下流のＤＮＡ断片はオリジナルの塩基配列が保持されており、ゲノムリファレンス配列上にすべての塩基配列を同一箇所にマッピングすることができる。このような制限酵素認識サイトをメチル化サイトとしてカウントした。【００８７】
このマッピング処理を次世代シーケンサーから出力された全データに対して行い、特定の一つの制限酵素認識サイトに対して平均１０回程度の重複したメチル化情報を蓄積する。このようにして１箇所の制限酵素認識配列について平均１０回重複してマッピングした場合において、このうちの５つのリードシーケンス情報、すなわち解析対象ＤＮＡ断片に存在する制限酵素認識サイトを挟んだ上流および下流の塩基配列がオリジナルのゲノム塩基配列のまま保持されている場合、１０分の５となる５０％を当該制限酵素認識サイトのメチル化率と決定した。また、特定の一つの制限酵素サイトが平均１０回重複してマッピングした場合において、このうちの２つのリードシーケンス情報が制限酵素認識サイトを挟んだ上流および下流の塩基配列がオリジナルのゲノム塩基配列のまま保持されていた場合は当該の制限酵素認識サイトは１０分の２となる２０％を当該認識サイトのメチル化率と決定した。【００８８】
《実施例２》
ヒト線維芽細胞ＷＩ−３８の代わりに、ヒト線維肉腫（ｆｉｂｒｏｓａｒｃｏｍａ）ＨＴ−１０８０株を用いること以外は、実施例１に示す操作を繰り返すことにより、ゲノムＤＮＡをメチル化感受性制限酵素ＨｐａＩＩ及びＨｈａＩで消化して得られるＤＮＡ断片混合物と、前記ＤＮＡ断片混合物をライゲーションして得られる高分子化した長鎖連結ＤＮＡとを取得し、電気泳動を実施した。
結果を図３に示す。レーン１は、ＨｐａＩＩ及びＨｈａＩで消化して得られるＤＮＡ断片混合物であり、レーン２は、前記ＤＮＡ断片混合物をライゲーションして得られる高分子化した長鎖連結ＤＮＡである。
【産業上の利用可能性】
【００８９】
本発明は、ＤＮＡのメチル化分析の用途に適用することができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【国際調査報告】
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