【手続補正書】
【提出日】平成20年11月20日(2008.11.20)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記工程を含む、イオンチャンネル受容体の活性を調節しうる化合物を選択または同定するための方法：
ａ）該イオンチャンネル受容体およびＰ２Ｘ受容体を発現する組換え細胞を用意する工程、
ｂ）該組換え細胞を、該Ｐ２Ｘ受容体のアゴニストの存在下、または該Ｐ２Ｘ受容体のアゴニストおよび該イオンチャンネル受容体のアゴニストの存在下で、試験すべき化合物に接触させる工程、
ｃ）Ｐ２Ｘ受容体を介したカルシウム流入を測定する工程、
ｄ）工程ｃ）で得られた測定値を、工程ｂ）において試験すべき化合物が存在しない第１の参照対照について同じ条件で得られた測定値と比較する工程、および
ｅ）工程ｄ）における比較により、該化合物の存在下で組換え細胞におけるカルシウム流入が有意に増加または減少することが示された場合、該化合物を選択する工程。
【請求項２】
工程ａ）において前記組換え細胞が、前記Ｐ２Ｘ受容体のアゴニスト、または前記イオンチャンネル受容体のアゴニストにより調節されうる受容体を内在的に発現しない、請求項１記載の方法。
【請求項３】
工程ａ）における前記組換え細胞が、哺乳動物細胞またはアフリカツメガエル卵母細胞である、請求項１または２記載の方法。
【請求項４】
前記Ｐ２Ｘ受容体が天然のＰ２Ｘ受容体であるか、前記イオンチャンネル受容体と相互作用しうる変異型のＰ２Ｘ受容体である、請求項１〜３のいずれかの項記載の方法。
【請求項５】
前記Ｐ２Ｘ受容体が、Ｐ２Ｘ 1、Ｐ２Ｘ 2、Ｐ２Ｘ３、Ｐ２Ｘ４、Ｐ２Ｘ５、Ｐ２Ｘ６およびＰ２Ｘ７受容体、およびＡＴＰ活性化チャンネル−受容体機能を果たしうるＰ２Ｘサブユニット受容体の会合もしくは組み合わせにより得られる任意のＰ２Ｘ受容体からなる群より選ばれる、請求項４記載の方法。
【請求項６】
前記イオンチャンネル受容体またはＰ２Ｘ受容体がヒト、ラットまたはマウス由来である、請求項１〜５のいずれかの項記載の方法。
【請求項７】
前記Ｐ２Ｘ受容体のアゴニストが、ＡＴＰ、α, βｍＡＴＰ（アルファベータ−メチルＡＴＰ）、ベンゾイルベンゾイックＡＴＰ（２’および３’混合異性体または２’，３’−Ｏ−（４−ベンゾイルベンゾイル）−ＡＴＰ（ＢｚＡＴＰ）など）、および２−メチルチオ−ＡＴＰ（２−ＭｅＳＡＴＰ）からなる群より選ばれ、好ましくはＡＴＰである、請求項１〜６のいずれかの項記載の方法。
【請求項８】
工程ｃ）においてカルシウム流入が、カルシウムプローブにより測定される、請求項１〜７のいずれかの項記載の方法。
【請求項９】
カルシウム流入が、カルシウムグリーン、Ｆｌｕｏ−３もしくはＦｌｕｏ−４などの蛍光カルシウムプローブにより測定される、請求項８記載の方法。
【請求項１０】
前記試験すべき化合物が、前記Ｐ２Ｘ受容体と特異的に相互作用する能力について試験され、好ましくは該特異的相互作用が、第２の参照対照について同じ条件でカルシウム流入の有意な増加または低下が得られるかどうかを測定することにより証明され、ここで工程ａ）において該第２の参照対照に使用される組換え細胞は前記Ｐ２Ｘ受容体を発現し、前記イオンチャンネル受容体を発現しないものである、請求項１〜９のいずれかの項記載の方法。
【請求項１１】
前記第２の参照対照について組換え細胞でカルシウム流入の有意な増加または低下が見られる場合、前記試験すべき化合物を選択しない、請求項１０記載の方法。
【請求項１２】
下記工程を含む、イオンチャンネル受容体のアゴニストを選択または同定する方法：
Ａ）工程ｂ）において前記組換え細胞を前記Ｐ２Ｘ受容体のアゴニストの存在下のみで試験すべき化合物と接触させることを特徴とする請求項１〜１１のいずれかの項記載の方法により、前記イオンチャンネル受容体の活性を調節しうる化合物を選択または同定する工程、および
Ｂ）請求項１〜１１のいずれかの項記載の方法の工程ｄ）において行われる比較により、第１の参照対照について得られる結果と比べて、該化合物の存在下で組換え細胞においてカルシウム流入の有意な減少が見られることが示された場合、アゴニストとして該化合物を選択する工程。
【請求項１３】
下記工程を含む、イオンチャンネル受容体の正のモジュレーターを選択する方法：
Ａ）工程ｂ）において前記組換え細胞を前記Ｐ２Ｘ受容体のアゴニストおよび前記イオンチャンネル受容体のアゴニストの存在下で試験すべき化合物と接触させることを特徴とする請求項１〜１１のいずれかの項記載の方法により、イオンチャンネル受容体の活性を調節しうる化合物を選択または同定する工程、および
Ｂ）請求項１〜１１のいずれかの項記載の方法の工程ｄ）において行われる比較により、第１の参照対照について得られる結果と比べて、該化合物の存在下で組換え細胞においてカルシウム流入の有意な減少が見られることが示された場合、正のモジュレーターとして該化合物を選択する工程。
【請求項１４】
請求項１〜１１のいずれかの項記載の方法の工程ｂ）において、前記イオンチャンネル受容体のアゴニストを、非飽和濃度で使用する、請求項１３記載のイオンチャンネル受容体の正のモジュレーターを選択する方法。
【請求項１５】
下記工程を含む、イオンチャンネル受容体の負のモジュレーター、インヒビターまたはアンタゴニストを選択または同定する方法：
Ａ）工程ｂ）において前記組換え細胞を前記Ｐ２Ｘ受容体のアゴニストおよび前記イオンチャンネル受容体のアゴニストの存在下で試験すべき化合物と接触させることを特徴とする、請求項１〜１１のいずれかの項記載の方法により、前記イオンチャンネル受容体の活性を調節しうる化合物を選択する工程、および
Ｂ）請求項１〜１１のいずれかの項記載の方法の工程ｄ）において行われる比較により、第１の参照対照について得られる結果と比べて、該化合物の存在下で組換え細胞においてカルシウム流入の有意な増加が見られることが示された場合、負のモジュレーターとして該化合物を選択する工程。
【請求項１６】
第１の化合物を試験するために使用する同じ組換え細胞が、少なくとも第２の試験すべき化合物を試験するために使用できる、請求項１〜１５のいずれかの項記載の方法。
【請求項１７】
前記イオンチャンネル受容体が、ＧＡＢＡ受容体、グリシン受容体、アセチルコリン受容体およびセロトニン受容体からなる群より選ばれる、請求項１〜１６のいずれかの項記載の方法。
【請求項１８】
前記イオンチャンネル受容体がＧＡＢＡ受容体である、請求項１７記載の方法。
【請求項１９】
前記イオンチャンネル受容体が、任意のＧＡＢＡ受容体サブユニット間のホモメリックまたはヘテロメリックな会合から生じるイオンチャンネルＧＡＢＡ受容体であり、該サブユニットがα１〜６、β１〜３、γ１〜３、δ、ε、θ、πおよびρ１〜３サブユニットからなるＧＡＢＡ受容体サブユニットの群から選ばれ、該ホモメリックまたはヘテロメリックな会合がＧＡＢＡにより活性化され得るイオンチャンネル受容体を形成する、請求項１７または１８記載の方法。
【請求項２０】
前記イオンチャンネル受容体のアゴニストが、ＧＡＢＡまたは、ムシモールやイソガバシンなどの他の周知のＧＡＢＡ受容体アゴニストの任意のものである、請求項１８または１９記載の方法。
【請求項２１】
以下を含む、イオンチャンネル受容体の活性を調節しうる化合物の選択のためのキット：
−イオンチャンネル受容体およびＰ２Ｘ受容体を共発現しうる組換え細胞、または場合により該組換え細胞を得るための材料；
−ＡＴＰ、α, βｍＡＴＰ（アルファベータ−メチルＡＴＰ）、ベンゾイルベンゾイックＡＴＰ（２’および３’混合異性体または２’，３’−Ｏ−（４−ベンゾイルベンゾイル）−ＡＴＰ（ＢｚＡＴＰ）など）および２−メチルチオ−ＡＴＰ（２−ＭｅＳＡＴＰ）からなる群より選ばれるＰ２Ｘ受容体のアゴニスト、好ましくはＡＴＰ；
−場合により、該イオンチャンネル受容体のアゴニスト、好ましくはＧＡＢＡ；および
−場合により、該組換え細胞においてカルシウム流入を測定するためのマーカーとしてのカルシウムプローブ、好ましくは蛍光カルシウムプローブ。
【請求項２２】
前記イオンチャンネル受容体、Ｐ２Ｘ受容体、組換え細胞およびカルシウムプローブが、請求項１〜２０に記載のものの中から独立に選択される、請求項２１記載のキット。
【請求項２３】
請求項１〜２２に記載の必須の要素を含む、イオンチャンネル受容体の活性を調節しうる化合物を選択するための装置。
【請求項２４】
請求項１〜２０のいずれかの項記載の方法により選択または同定された化合物。
【請求項２５】
前記イオンチャンネル受容体がＧＡＢＡ受容体、特にＧＡＢＡ−Ａ受容体である請求項１〜２０のいずれかの項記載の方法により選択または同定された、請求項２４記載の化合物。
【請求項２６】
Ｐ２Ｘ受容体と機能的に相互作用しうるイオンチャンネル受容体に関連する、ヒトを含む哺乳動物の疾患または障害を診断、予防または治療するための、請求項２４または２５記載の化合物の使用。
【請求項２７】
Ｐ２Ｘ受容体と機能的に相互作用しうるイオンチャンネル受容体に関連する、ヒトを含む哺乳動物の疾患または障害の予防または治療への、あるいはそのための医薬の製造への、請求項２４または２５記載の化合物の使用。
【請求項２８】
ＧＡＢＡ−Ａ受容体の機能不全に関連する、ヒトを含む哺乳動物の疾患、障害または症状を診断、治療または予防するための、請求項２５記載の化合物の使用。
【請求項２９】
喘息、急性心疾患、低血圧、尿閉、骨粗鬆症、高血圧、狭心症、心筋梗塞、潰瘍、アレルギー、良性前立腺肥大、前立腺がん、パーキンソン病、精神病性および神経学的障害、不安、分裂病、躁病、鬱病、運動異常、記憶障害、睡眠障害、痙攣疾患または癲癇の予防または治療への、あるいはそのための医薬の製造への、請求項２５記載の化合物の使用、または請求項２８記載の使用。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３７】
第３の面において、本発明は、以下の工程を含む、イオンチャンネル受容体の負のモジュレーター、インヒビターまたはアンタゴニストを選択または同定する方法に関する：
Ａ）工程ｂ）において上記組換え細胞をＡＴＰなどの上記Ｐ２Ｘ受容体のアゴニストおよびイオンチャンネル受容体のアゴニストの存在下で試験すべき化合物と接触させることを特徴とする、イオンチャンネル受容体の活性を調節しうる化合物を選択または同定するための本発明方法により、イオンチャンネル受容体の活性を調節しうる化合物を選択または同定する工程、および
Ｂ）本発明方法の工程ｄ）において行われる比較により、第１の参照対照について得られる結果と比べて、該化合物の存在下で組換え細胞においてカルシウム流入の有意な増加が見られることが示された場合、負のモジュレーターとして該化合物を選択する工程。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６０】
(Ｐ２Ｘ２およびＧＡＢＡ−Ａ受容体を共発現する卵母細胞での記録）
ＡＴＰの適用（１００μＭ）はカルシウムプローブの蛍光の著しい一時的増加を誘導し、これはＰ２Ｘ受容体の活性化とそれに続くカルシウム流入を実証する（図３）。ＡＴＰの連続適用は同様の大きさの応答を誘導する。この蛍光における増加が細胞の静止電位で見られることに注意することは重要である。