(57)【要約】  第１基材（１００）を準備する。第１基材（１００）は、第１面（１０２）を有している。第１面（１０２）は、ウェル（１０２ａ）を含んでいる。ウェル（１０２ａ）は、電極（１２０）及びレジスト（１３０）によって画定されている。次いで、第１基材（１００）の第１面（１０２）上に溶液（Ｌ）を配置する。次いで、第２基材（２００）を準備する。第２基材（２００）は、第２面（２０２）を有している。第２基材（２００）の第２面（２０２）は、疎水性となっている。次いで、第１面（１０２）及び第２面（２０２）が互いに対向するように第１基材（１００）及び第２基材（２００）を互いに押し合わせる。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
核酸を含む溶液の処理方法であって、
電極及びレジストによって画定されたウェルを含む第１面を有する第１基材の前記第１面上に前記溶液を配置し、
前記第１基材の前記第１面上に前記溶液を配置した後、疎水性の第２面を有する第２基材の前記第２面と前記第１基材の前記第１面とが互いに対向するように、前記第１基材及び前記第２基材を互いに押し合わせる、溶液の処理方法。
【請求項２】
前記第１基材及び前記第２基材を互いに押し合わせた状態で、前記溶液に含まれる前記核酸を、前記電極に固定されたプローブにハイブリダイズさせる、請求項１に記載の溶液の処理方法。
【請求項３】
前記核酸を前記プローブにハイブリダイズさせる前に前記電極を用いて電気化学的分析を実施し、
前記核酸を前記プローブにハイブリダイズさせた後に前記電極を用いて電気化学的分析を実施する、請求項２に記載の溶液の処理方法。
【請求項４】
前記核酸は、ＲＮＡ又はＤＮＡである、請求項２又は請求項３に記載の溶液処理方法。
【請求項５】
前記核酸は、ｍｉＲＮＡである、請求項４に記載の溶液の処理方法。
【請求項６】
前記溶液の少なくとも一部分が前記ウェルの外部に配置されるように、前記第１基材の前記第１面上に前記溶液を配置する、請求項１から請求項５のいずれか一項に記載の溶液の処理方法。
【請求項７】
前記第１基材及び前記第２基材は、前記ウェル内の前記溶液が前記電極、前記レジスト及び前記第２基材の前記第２面に接するように、互いに押し合わせられる、請求項１から請求項６のいずれか一項に記載の溶液の処理方法。
【請求項８】
前記ウェルの容積は、１ｎＬ以下である、請求項７に記載の溶液の処理方法。
【請求項９】
核酸を含む溶液の処理装置であって、
電極及びレジストによって画定されたウェルを含む第１面を有する第１基材と、
疎水性の第２面を有する第２基材と、
前記第１面及び前記第２面が互いに対向するように前記第１基材及び前記第２基材を互いに押し合わせるための部材と、
を備える、溶液の処理装置。
【請求項１０】
前記部材は、前記レジストと前記第２基材の前記第２面とが互いに接するように、前記第１基材及び前記第２基材を互いに押し合わせる、請求項９に記載の溶液の処理装置。
【請求項１１】
核酸を含む溶液の処理装置であって、
電極及びレジストによって画定されたウェルを含む第１面を有する第１基材と、
疎水性の第２面を有する第２基材と、
を備え、
前記第１基材及び前記第２基材は、前記第１面及び前記第２面が互いに対向するように互いに接合されている、溶液の処理装置。
【請求項１２】
前記第１基材及び前記第２基材は、前記レジストと前記第２基材の前記第２面とが互いに接するように、互いに接合されている、請求項１１に記載の溶液の処理装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、核酸を含む溶液の処理方法及び核酸を含む溶液の処理装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
核酸を含む溶液を処理するため、各種装置が開発されている。当該装置は、溶液に含まれる核酸を電気化学的に分析することができる。核酸の電気化学的分析では、装置内の電極に固定されたプローブに核酸をハイブリダイズさせることがある。この場合、ハイブリダイゼーション前及びハイブリダイゼーション後の電気化学的分析（例えば、サイクリックボルタンメトリー（ＣＶ）の測定）の比較に基づいて、核酸のハイブリダイゼーション度合を定量的に分析することができる。【０００３】
非特許文献１には、核酸を含む溶液を処理する装置の一例について記載されている。この装置は、電極及びレジストによって画定されたウェルを含んでいる。このような装置は、核酸を含む溶液に含侵させることができる。この場合、溶液は、ウェルの内部からウェルの外部にかけて位置する。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Hiroshi Aoki, Akiko Kitajima and Hiroaki Tao "Electrochemical Sensor Array Chips for Multiple Gene Detection" Sensors and Materials, Vol. 22, No. 7 (2010) 327-336
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
上述したように、核酸を含む溶液の処理には、ウェルが用いられることがある。本発明者は、ウェルを用いて少ターゲットコピー数の核酸を電気化学的に分析することを検討した。例えば、上述したように、溶液がウェルの内部からウェルの外部にかけて位置する場合、核酸のターゲットコピー数は多くなり得る。【０００６】
特に、上述した従来の方法では、がん患者に特有なマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）を検出することが困難であった。例えば、ウェルの内部からウェルの外部にかけて位置する溶液量は、従来の方法では、最小でも１０μＬ程度であった。この場合において相補的な核酸のハイブリダイゼーションを得るために最低限必要な核酸濃度が４ｎＭであるとき、核酸のターゲットコピー数は４００ａｍｏｌ程度となる。後述するように、がん患者の１０ｍＬの血清から得られるｍｉＲＮＡの総量は約１ａｍｏｌ以下であるため、従来の方法では、がん患者に特有なｍｉＲＮＡを検出することは困難である。【０００７】
本発明の目的の一例は、少ターゲットコピー数の核酸を電気化学的に分析することにある。本発明の他の目的は、本明細書の記載から明らかになるであろう。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明の一態様は、
核酸を含む溶液の処理方法であって、
電極及びレジストによって画定されたウェルを含む第１面を有する第１基材の前記第１面上に前記溶液を配置し、
前記第１基材の前記第１面上に前記溶液を配置した後、疎水性の第２面を有する第２基材の前記第２面と前記第１基材の前記第１面とが互いに対向するように、前記第１基材及び前記第２基材を互いに押し合わせる、溶液の処理方法である。【０００９】
本発明の他の態様は、
核酸を含む溶液の処理装置であって、
電極及びレジストによって画定されたウェルを含む第１面を有する第１基材と、
疎水性の第２面を有する第２基材と、
前記第１面及び前記第２面が互いに対向するように前記第１基材及び前記第２基材を互いに押し合わせるための部材と、
を備える、溶液の処理装置である。【００１０】
本発明のさらに他の態様は、
核酸を含む溶液の処理装置であって、
電極及びレジストによって画定されたウェルを含む第１面を有する第１基材と、
疎水性の第２面を有する第２基材と、
を備え、
前記第１基材及び前記第２基材は、前記第１面及び前記第２面が互いに対向するように互いに接合されている、溶液の処理装置である。
【発明の効果】
【００１１】
本発明の上述した態様によれば、少ターゲットコピー数の核酸を電気化学的に分析することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】実施形態に係る溶液の処理方法の一例を説明するための図である。
【図２】実施形態に係る溶液の処理方法の一例を説明するための図である。
【図３】実施形態に係る溶液の処理方法の一例を説明するための図である。
【図４】実施形態に係る溶液の処理方法の一例を説明するための図である。
【図５】第１基材の平面図の一例である。
【図６】実施形態に係る溶液の処理装置の第１例を説明するための図である。
【図７】実施形態に係る溶液の処理装置の第２例を説明するための図である。
【図８】実施例において算出したポテンシャル差ΔＥを説明するための図である。
【図９】実施例におけるポテンシャル差ΔＥの算出結果を示す図である。
【図１０】実施例におけるポテンシャル差ΔＥの算出結果を示す図である。
【図１１】実施例におけるポテンシャル差ΔＥの算出結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
以下、本発明の実施の形態について、図面を用いて説明する。すべての図面において、同様な構成要素には同様の符号を付し、適宜説明を省略する。
【００１４】
図１から図４は、実施形態に係る溶液の処理方法の一例を説明するための図である。図５は、第１基材１００の平面図の一例である。図１から図４は、図５のＡ−Ａ´断面における断面を示している。
【００１５】
図１から図４を用いて、実施形態に係る溶液の処理方法の概要を説明する。まず、図１に示すように、第１基材１００を準備する。第１基材１００は、第１面１０２を有している。第１面１０２は、ウェル１０２ａを含んでいる。ウェル１０２ａは、電極１２０及びレジスト１３０によって画定されている。次いで、図２に示すように、第１基材１００の第１面１０２上に溶液Ｌを配置する。溶液Ｌは、核酸を含んでいる。次いで、図３に示すように、第２基材２００を準備する。第２基材２００は、第２面２０２を有している。第２基材２００の第２面２０２は、疎水性となっている。次いで、図４に示すように、第１面１０２及び第２面２０２が互いに対向するように第１基材１００及び第２基材２００を互いに押し合わせる。図４に示す例では、第１部材３１０及び第２部材３２０を用いて、第１基材１００及び第２基材２００を互いに押し合わせている。他の例において、第１基材１００及び第２基材２００は、図４に示す方法とは異なる方法（例えば、第１基材１００が固定台上に載置された状態で第２基材２００を第１基材１００に向けて押し付ける。）によって、互いに押し合わされてもよい。
【００１６】
実施形態に係る溶液の処理方法によれば、少ターゲットコピー数の核酸を電気化学的に分析することができる。具体的には、実施形態に係る溶液の処理方法においては、図４に示すように、各電極１２０に接触する溶液Ｌは、ウェル１０２ａ内のみに留めさせることができる。すなわち、溶液Ｌは、電極１２０、レジスト１３０、第２基材２００の第２面２０２により画定された空間内に留まることになる（溶液Ｌは、電極１２０、レジスト１３０及び第２面２０２のみに接することになる。）。特に、第２基材２００の第２面２０２は疎水性となっており、毛細管現象による、ウェル１０２ａの内部の溶液Ｌのウェル１０２ａの外部への漏れを抑えることができる。このようにして、実施形態に係る溶液の処理方法によれば、各電極１２０に接触する溶液Ｌ内の核酸のターゲットコピー数をウェル１０２ａの容積にしたがって制限することができる。よって、少ターゲットコピー数の核酸を電気化学的に分析することができる。
【００１７】
実施形態及び実施例において、核酸を含む溶液は、ハイブリダイゼーション溶液及び核酸（例えば、ＲＮＡ（例えば、ｍｉＲＮＡ）又はＤＮＡ）を含んでいる。
【００１８】
図３及び図４に示すように、第１基材１００の第１面１０２は、レジスト１３０のうち、第２基材２００の第２面２０２に対向する面を含んでいる。したがって、第１基材１００及び第２基材２００を互いに押し合わせると、レジスト１３０のうちの第２面２０２に対向する面と第２基材２００の第２面２０２とが互いに接することになる。
【００１９】
図５を用いて、第１基材１００の平面レイアウトの一例の詳細を説明する。図５に示す平面レイアウトは、第１基材１００の平面レイアウトの一例にすぎない。第１基材１００は、図５に示す平面レイアウトとは異なる平面レイアウトを有していてもよい。
【００２０】
第１基材１００は、複数の電極１２０、複数の配線１２２及びレジスト１３０を含んでいる。
【００２１】
レジスト１３０は、複数の開口を有している。図５に示す例において、レジスト１３０の各開口は、円形状を有している。他の例において、レジスト１３０の各開口は、円形状とは異なる形状を有していてもよい。
【００２２】
各電極１２０の一部分は、レジスト１３０の各開口から露出されている。このようにして、各電極１２０及びレジスト１３０によってウェル１０２ａが画定されている。図１から図５に示す例において、ウェル１０２ａは、円筒形状を有している。
【００２３】
各配線１２２の一端は、各電極１２０に接続されている。各配線１２２の他端は、各電極１２０の電気信号を取得するための端子（不図示）に接続されていてもよい。
【００２４】
図１から図４を用いて、本実施形態に係る溶液の処理方法の詳細を説明する。
【００２５】
まず、図１に示すように、第１基材１００を準備する。第１基材１００は、基板１１０、複数の電極１２０及びレジスト１３０を含んでいる。
【００２６】
基板１１０は、例えば、ガラス基板であってもよいし、半導体基板（例えば、シリコン基板）であってもよいし、又は樹脂基板であってもよい。他の例において、第１基材１００は、基板１１０に代えて、電極１２０及びレジスト１３０が形成可能な表面を有する部材（例えば、板形状とは異なる形状を有する部材）を含んでいてもよい。
【００２７】
複数の電極１２０は、基板１１０上にある。電極１２０は、導電材料、例えば、金属からなっている。電極１２０は、作用電極として機能可能になっている。
【００２８】
レジスト１３０は、複数の開口を有している。レジスト１３０の各開口は、各電極１２０の一部分を露出している。レジスト１３０は、絶縁材料、例えば、樹脂からなっている。
【００２９】
電極１２０は、レジスト１３０から露出した面を有している。一例において、電極１２０の露出面は、親水性を有していてもよい。この場合、図２における溶液Ｌの配置において、溶液Ｌを電極１２０の露出面上で広がりやすくすることができる。電極１２０の露出面の親水性は、例えば、レジスト１３０を覆い、電極１２０と重なる開口を有するマスクを用いて、電極１２０の露出面を選択的に親水化処理して付与させてもよい。
【００３０】
レジスト１３０の表面は、電極１２０の露出面よりも低親水性を有していてもよく、例えば、疎水性を有していてもよい。
【００３１】
第１基材１００は、第１面１０２を有しており、第１面１０２は、複数のウェル１０２ａを含んでいる。各ウェル１０２ａは、電極１２０及びレジスト１３０によって画定されている。具体的には、電極１２０は、ウェル１０２ａの底面を形成しており、レジスト１３０は、ウェル１０２ａの内側面を形成している。
【００３２】
一例において、ウェル１０２ａの容積は、１ｎＬ以下にしてもよい。この場合、図４における溶液Ｌの閉じ込めにおいて、ウェル１０２ａ内の溶液Ｌの量を少なくすることができる。
【００３３】
図１に示す例では、第１基材１００は、複数の電極１２０（つまり、複数のウェル１０２ａ）を含んでいる。他の例において、第１基材１００は、１のみの電極１２０（つまり、１のみのウェル１０２ａ）を含んでいてもよい。
【００３４】
次いで、図２に示すように、第１基材１００の第１面１０２上に溶液Ｌを配置する。溶液Ｌは、核酸を含んでいる。
【００３５】
図２に示す例において、溶液Ｌは、ウェル１０２ａの内部からウェル１０２ａの外部にかけて位置している（言い換えると、溶液Ｌの一部分がウェル１０２ａの外部に配置され、例えば、第１面１０２を覆うように配置されている。）。この例においては、図３及び図４における第１基材１００及び第２基材２００の押し合わせによって、ウェル１０２ａの外部の溶液Ｌを第１基材１００及び第２基材２００の外部に排出させることができる。図２に示す例において、ウェル１０２ａの外部に位置する溶液Ｌは、部分的に分離されていてもよい。
【００３６】
他の例において、溶液Ｌのいずれの部分もウェル１０２ａの内部に位置していなくてもよい（言い換えると、溶液Ｌの全体がウェル１０２ａの外部に配置されている。）。この例においては、図３及び図４における第１基材１００及び第２基材２００の押し合わせによって、ウェル１０２ａの外部の溶液Ｌをウェル１０２ａに入り込ませることができる。
【００３７】
さらに他の例において、溶液Ｌは、複数のウェル１０２ａのそれぞれに与えられてもよい。溶液Ｌは、例えば滴下によって各ウェル１０２ａにそれぞれ与えられることができる。この例において、各ウェル１０２ａにおける溶液Ｌは、ウェル１０２ａの容積と実質的に等しい量又はウェル１０２ａの容積より多い量だけ滴下させることができる。各ウェル１０２ａにおける溶液Ｌの体積がウェル１０２ａの容積より大きい場合、溶液Ｌの表面は、第１基材１００の第１面１０２（レジスト１３０の上面）よりも高い位置に突出していてもよい。この例においては、図３及び図４に示すように、疎水性を有する面（第２基材２００の第２面２０２）でウェル１０２ａを覆う場合、流体Ｌの乾燥を抑えることができる。また、各ウェル１０２ａに閉じ込められる溶液Ｌの体積を一定にすることができ、これにより各ウェル１０２ａ間のハイブリダイゼーション度合を比較することが可能となる。さらに、疎水性を有する面（第２基材２００の第２面２０２）がウェル１０２ａを覆う場合、親水性を有する面がウェル１０２ａを覆う場合と比較して、毛細管現象による溶液Ｌのウェル１０２ａの漏れを抑えることができる。
【００３８】
次いで、図３に示すように、第２基材２００を準備する。
【００３９】
図３に示す例において、第２基材２００は、基板であり、板形状を有している。他の例において、第２基材２００は、板形状とは異なる形状を有していてもよい。
【００４０】
第２基材２００の第２面２０２は、疎水性となっている。具体的には、第２基材２００の第２面２０２は、水について９０°以上の接触角を有している。仮に、第２基材２００の第２面２０２が親水性を有していると、ウェル１０２ａ内の溶液Ｌが第１基材１００及び第２基材２００の間の隙間を経由して、毛細管現象によって第１基材１００及び第２基材２００の外部に漏れ出るおそれがある。これに対して、第２基材２００の第２面２０２が疎水性を有していると、ウェル１０２ａ内の溶液Ｌの第１基材１００及び第２基材２００の外部への漏れを抑えることができ、高い信頼性をもって溶液Ｌをウェル１０２ａ内に留めることができる。
【００４１】
一例において、第２基材２００の第２面２０２は、疎水性を有する材料、例えば、ポリテトラフルオロエチレンからなっている。他の例において、第２基材２００の第２面２０２は、疎水化処理されていてもよい。第２基材２００の全体が疎水性を有していなくてもよいが、第２基材２００の全体が疎水性を有していてもよい。
【００４２】
次いで、図４に示すように、第１面１０２及び第２面２０２が互いに対向するように第１基材１００及び第２基材２００を互いに押し合わせる。
【００４３】
図４に示す例では、第１部材３１０によって第１基材１００を第２基材２００に向けて押し付けており、第２部材３２０によって第２基材２００を第１基材１００に向けて押し付けている。つまり、第１部材３１０及び第２部材３２０は、第１基材１００及び第２基材２００を互いに押し合わせるための部材となっている。一例において、第１部材３１０及び第２部材３２０は、クリップであってもよい。
【００４４】
第１部材３１０及び第２部材３２０の押し合わせによって、高い信頼性をもって溶液Ｌをウェル１０２ａ内に留めさせることができる。一例において、第１基材１００及び第２基材２００の押し合わせ前に溶液Ｌがウェル１０２ａの内部からウェル１０２ａの外部にかけて位置する場合、ウェル１０２ａの外部の溶液Ｌを第１基材１００及び第２基材２００の外部に排出させることができる。他の例において、第１基材１００及び第２基材２００の押し合わせ前に溶液Ｌがウェル１０２ａの内部に位置しない場合、ウェル１０２ａの外部の溶液Ｌをウェル１０２ａに入り込ませることができる。
【００４５】
図１から図４に示した溶液の処理方法は、核酸を含む溶液の処理の様々な例に適用させることができ、例えば、核酸のハイブリダイゼーションに適用させることができる。
【００４６】
以下において、図１から図４に示した溶液の処理方法を核酸のハイブリダイゼーションに適用した例を説明する。
【００４７】
この例では、第１基材１００及び第２基材２００を互いに押し合わせたまま（例えば、図４）、溶液Ｌ内の核酸を、電極１２０に固定されたプローブにハイブリダイズさせることができる。この例では、少ターゲットコピー数の核酸をハイブリダイズさせることができる。
【００４８】
さらに、核酸をプローブにハイブリダイズさせる前、具体的には、溶液Ｌの第１基材１００の第１面１０２上への配置前（図２）かつ電極１２０へのプローブ及びチオール（チオールは、ターゲット核酸と結合せず、かつプローブの構造を物理的に支える物質であり、例えば、６−ヒドロキシ−１−ヘキサンチオール（ＨＨＴ）である。）の固定後に、電極１２０を用いて電気化学的分析を実施してもよい。一例において、電極１２０からＣＶによってボルタモグラムを測定してもよい。
【００４９】
さらに、核酸をプローブにハイブリダイズさせた後、具体的には、第１基材１００から第２基材２００を外して第１基材１００を洗浄した後に、電極１２０を用いて電気化学的分析を実施してもよい。一例において、電極１２０からＣＶによってボルタモグラムを測定してもよい。この例では、少ターゲットコピー数の核酸を電気化学的に分析することができる。
【００５０】
上述した例では、ハイブリダイゼーション前の電気化学的分析（例えば、ＣＶによって測定されたボルタモグラム）及びハイブリダイゼーション後の電気化学的分析（例えば、ＣＶによって測定されたボルタモグラム）の比較（例えば、図８を用いて後述するポテンシャル差ΔＥ）に基づいて、核酸のハイブリダイゼーション度合を判定することができる。
【００５１】
本実施形態に係る溶液の処理方法は、上述したＣＶだけでなく、ＣＶ以外の電気化学的分析（例えば、ＳＷＶ（Ｓｑｕａｒｅ  Ｗａｖｅ  Ｖｏｌｔａｍｍｅｔｒｙ））にも適用可能である。
【００５２】
一例において、核酸は、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）にしてもよい。ｍｉＲＮＡは、血液から採取されてもよい。一般に、血液から多量のｍｉＲＮＡを含む試料を得ることは難しい。図１から図４に示した溶液の処理方法によれば、少ターゲットコピー数のｍｉＲＮＡを電気化学的に分析することができる。
【００５３】
図６は、実施形態に係る溶液処理装置１０の第１例を説明するための図である。
【００５４】
溶液処理装置１０は、第１基材１００、第２基材２００、第１部材３１０及び第２部材３２０を備えている。第１部材３１０及び第２部材３２０は、第１面１０２及び第２面２０２が互いに対向するように第１基材１００及び第２基材２００を互いに押し合わせるための部材となっている。第１部材３１０及び第２部材３２０が設けられていない場合、第１基材１００及び第２基材２００は、互いから離間可能になっている。したがって、図１から図４に示した溶液の処理方法を用いて、溶液処理装置１０を用いて、少ターゲットコピー数の核酸を電気化学的に分析することができる。
【００５５】
図７は、実施形態に係る溶液処理装置１０の第２例を説明するための図である。
【００５６】
溶液処理装置１０は、第１基材１００及び第２基材２００を備えている。第１基材１００及び第２基材２００は、第１面１０２及び第２面２０２が互いに対向するように互いに接合されている。第１基材１００及び第２基材２００は、例えば接着層を介して互いに接合されていてもよい。図７に示す例では、ウェル１０２ａに通じる導入路（図７では、不図示）を経由して溶液をウェル１０２ａに導入することができる。図７に示す例においても、少ターゲットコピー数の核酸を電気化学的に分析することができる。
【実施例】
【００５７】
図８は、実施例において算出したポテンシャル差ΔＥを説明するための図である。【００５８】
実施例では、以下の処理によってポテンシャル差ΔＥを算出した。【００５９】
まず、図１に示すように、第１基材１００を準備して、ターゲットｍｉＲＮＡに相補的な配列をそれぞれ有するプローブ及びチオールを電極１２０に固定する。次いで、電極１２０を用いて、ＣＶ測定によって、ボルタモグラムＣ１（図８）を測定する。【００６０】
次いで、図２に示すように、ターゲットｍｉＲＮＡを含む溶液（この溶液は、ターゲットｍｉＲＮＡ及びハイブリダイゼーション溶液を含んでいる。）を第１基材１００の第１面１０２上に滴下する。【００６１】
次いで、図３及び図４に示すように、クリップ（第１部材３１０及び第２部材３２０）によって、第１基材１００及び第２基材２００を互いに押し合わせる。このようにして、ウェル１０２ａ内に溶液を留めた状態で、余分な溶液Ｌを第１基材１００及び第２基材２００の外部へ押し出すことができる。【００６２】
次いで、クリップ（第１部材３１０及び第２部材３２０）によって第１基材１００及び第２基材２００を互いに押し合わせたまま、第１基材１００及び第２基材２００を加熱して、ｍｉＲＮＡをハイブリダイズさせる。【００６３】
次いで、クリップ（第１部材３１０及び第２部材３２０）を第１基材１００及び第２基材２００から取り外して、第１基材１００から第２基材２００を取り外す。次いで、第１基材１００の第１面１０２を洗浄する。【００６４】
次いで、電極１２０を用いて、ＣＶ測定によって、ボルタモグラムＣ２（図８）を測定する。【００６５】
図８に示すように、ボルタモグラムＣ１は、第１酸化波Ｏ１及び第１還元波Ｒ１を含んでおり、ボルタモグラムＣ２は、第２酸化波Ｏ２及び第２還元波Ｒ２を含んでいる。【００６６】
第１酸化波Ｏ１は、ポテンシャルＥｐ０においてピーク電流値Ｉ０をとる。第１酸化波Ｏ１は、ポテンシャルＥ１（Ｅ１＜Ｅｐ０）において電流値Ｉ１をとる。【００６７】
第２酸化波Ｏ２は、ポテンシャルＥｐ０´においてピーク電流値Ｉ０´をとる。第２酸化波Ｏ２は、ポテンシャルＥｐ０において電流値Ｉをとる。第２酸化波Ｏ２は、ポテンシャルＥ２（Ｅ２＜Ｅｐ０´）において電流値Ｉ１をとる。【００６８】
ポテンシャル差ΔＥは、第１酸化波Ｏ１のポテンシャルＥ１及び第２酸化波Ｏ２のポテンシャルＥ２の差である。【００６９】
ポテンシャル差ΔＥが生じる理由は、次の通りである。電極１２０（作用電極）のポテンシャルは、ハイブリダイズされたターゲット核酸によって生じる負の総電荷量ΔＱによって低下し得る。酸化波の測定において、作用電極には、キャパシタンスＣの電気二重層が形成され得る。作用電極のポテンシャルの低下は、ΔＱ／Ｃと見積もることができる。したがって、ハイブリダイゼーション後の酸化波（図８に示す例では、第２酸化波Ｏ２）は、ハイブリダイゼーション前の酸化波（図８に示す例では、第１酸化波Ｏ１）からΔＱ／Ｃだけ高ポテンシャルに向けてシフトし得る。ポテンシャル差ΔＥは、ハイブリダイゼーション前の酸化波（図８に示す例では、第１酸化波Ｏ１）からハイブリダイゼーション後の酸化波（図８に示す例では、第２酸化波Ｏ２）へのシフト量と見積もることができ、ΔＱ／Ｃとおおよそ等しくなり得る。このようにして、ポテンシャル差ΔＥは、核酸のハイブリダイゼーション度合を定量的に分析するための指標となり得る。【００７０】
図９から図１１は、実施例におけるポテンシャル差ΔＥの算出結果を示す図である。【００７１】
図９から図１１では、第１基材１００及び第２基材２００をクリップ（第１部材３１０及び第２部材３２０）で押し合わせたまま（図４）、ｍｉＲＮＡをプローブにハイブリダイズさせた。【００７２】
図９では、ウェル１０２ａの容積は、２．１ｐＬ（ウェル１０２ａの直径：３０μｍ、ウェル１０２ａの深さ：３μｍ）とした。プローブに相補的なｍｉＲＮＡ及びプローブに非相補的なｍｉＲＮＡのそれぞれについて、以下のターゲットコピー数の核酸を含む試料を測定した。図９における相補的なｍｉＲＮＡの各プロットは、７５個の測定系（７５個の電極１２０）のそれぞれを用いて算出された７５個のポテンシャル差ΔＥの中央値を示している。同様にして、図９における非相補的なｍｉＲＮＡの各プロットは、７５個の測定系（７５個の電極１２０）のそれぞれを用いて算出された７５個のポテンシャル差ΔＥの中央値を示している。
１１ｚｍｏｌ（５ｎＭ×２．１ｐＬ）
１７ｚｍｏｌ（８ｎＭ×２．１ｐＬ）
５１ｚｍｏｌ（２４ｎＭ×２．１ｐＬ）
１６８ｚｍｏｌ（８０ｎＭ×２．１ｐＬ）
５０９ｚｍｏｌ（２４０ｎＭ×２．１ｐＬ）
１．７ａｍｏｌ（８００ｎＭ×２．１ｐＬ）【００７３】
図１０では、ウェル１０２ａの容積は、３５ｐＬ（ウェル１０２ａの直径：６７μｍ、ウェル１０２ａの深さ：１０μｍ）とした。プローブに相補的なｍｉＲＮＡ及びプローブに非相補的なｍｉＲＮＡのそれぞれについて、以下のターゲットコピー数の核酸を含む試料を測定した。図１０における相補的なｍｉＲＮＡの各プロットは、７５個の測定系（７５個の電極１２０）のそれぞれを用いて算出された７５個のポテンシャル差ΔＥの中央値を示している。同様にして、図１０における非相補的なｍｉＲＮＡの各プロットは、７５個の測定系（７５個の電極１２０）のそれぞれを用いて算出された７５個のポテンシャル差ΔＥの中央値を示している。
１４１ｚｍｏｌ（４ｎＭ×３５ｐＬ）
０．８４ａｍｏｌ（２４ｎＭ×３５ｐＬ）
１．４ａｍｏｌ（４０ｎＭ×３５ｐＬ）
２．８ａｍｏｌ（８０ｎＭ×３５ｐＬ）
８．４ａｍｏｌ（２４０ｎＭ×３５ｐＬ）【００７４】
図１１では、ウェル１０２ａの容積は、７１ｐＬ（ウェル１０２ａの直径：９５μｍ、ウェル１０２ａの深さ：１０μｍ）とした。プローブに相補的なｍｉＲＮＡ及びプローブに非相補的なｍｉＲＮＡのそれぞれについて、以下のターゲットコピー数の核酸を含む試料を測定した。図１１における相補的なｍｉＲＮＡの各プロットは、７５個の測定系（７５個の電極１２０）のそれぞれを用いて算出された７５個のポテンシャル差ΔＥの中央値を示している。同様にして、図１１における非相補的なｍｉＲＮＡの各プロットは、７５個の測定系（７５個の電極１２０）のそれぞれを用いて算出された７５個のポテンシャル差ΔＥの中央値を示している。
１．７ａｍｏｌ（２４ｎＭ×７１ｐＬ）
５．７ａｍｏｌ（８０ｎＭ×７１ｐＬ）
８．５ａｍｏｌ（１２０ｎＭ×７１ｐＬ）
１７ａｍｏｌ（２４０ｎＭ×７１ｐＬ）【００７５】
図９に示す結果より、図９のウェル１０２ａのターゲットコピー数の検出限界は、約１７ｚｍｏｌと見積もることができる。【００７６】
図１０に示す結果より、図１０のウェル１０２ａのターゲットコピー数の検出限界は、約１４１ｚｍｏｌと見積もることができる。【００７７】
図１１に示す結果より、図１１のウェル１０２ａのターゲットコピー数の検出限界は、約１．７ａｍｏｌと見積もることができる。【００７８】
図９から図１１に示す結果は、第１基材１００及び第２基材２００を互いに押し合わせることで、少ターゲットコピー数のｍｉＲＮＡの電気化学的分析が可能であることを示唆する。【００７９】
さらに、図９から図１１のいずれにおいても、検出限界は、１ａｍｏｌにほぼ達している。したがって、図９から図１１に示した方法は、血液中のｍｉＲＮＡの検出に利用されることができる。１０ｍＬの血清（２０ｍＬの血液）の中に存在するがん患者のｍｉＲＮＡ（１種類）の総量は、約１ａｍｏｌ以下である。したがって、血液中のｍｉＲＮＡの検出には、約１ａｍｏｌ以下の検出限界が必要である。上述したように、図９から図１１に示した方法のいずれにおいても、検出限界は、１ａｍｏｌにほぼ達している。【００８０】
本明細書の記載から明らかなように、本発明の目的は、がん患者に特有なｍｉＲＮＡの検出に限られるものでない。本発明の各態様は、がん患者に特有なｍｉＲＮＡ以外の核酸の検出にも適用可能である。【００８１】
以上、図面を参照して本発明の実施形態について述べたが、これらは本発明の例示であり、上記以外の様々な構成を採用することもできる。【００８２】
この出願は、２０１８年１０月２５日に出願された日本出願特願２０１８−２００５７０号を基礎とする優先権を主張し、その開示の全てをここに取り込む。
【符号の説明】
【００８３】
１０  溶液処理装置
１００  第１基材
１０２  第１面
１０２ａ  ウェル
１１０  基板
１２０  電極
１２２  配線
１３０  レジスト
２００  第２基材
２０２  第２面
３１０  第１部材
３２０  第２部材
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【国際調査報告】
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