(57)【要約】血液を微細流路中に流すことで血液中の細胞を分級する前に、細胞を含む血液を多孔質材の有する多孔質性の表面に接触させる（Ｓ８０）。一例において、多孔質材を、細胞を含む血液中に添加するとともにこれと混合することで、細胞を含む血液を多孔質性の表面に接触させる。一例において、多孔質材は多孔質性の表面が多糖類からなる粒子である。かかる多孔質材は液体中に懸濁された状態で細胞を含む血液中に添加される。一例において、粒子は所定の粒子径分布を有する。その体積基準の積算分布における中央粒子径ｄ５０Ｖが２５〜２８０μｍである。
2020085000.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
血液を微細流路中に流すことで血液中の細胞を分級する前に、
前記細胞を含む血液を多孔質材の有する多孔質性の表面に接触させる、
血液の前処理方法。
【請求項２】
前記多孔質材を、前記細胞を含む血液中に添加するとともにこれと混合することで、前記細胞を含む血液を前記多孔質性の表面に接触させる、
請求項１に記載の前処理方法。
【請求項３】
前記多孔質材は前記多孔質性の表面が多糖類からなる粒子であるとともに、液体中に懸濁された状態で前記細胞を含む血液中に添加される、
請求項２に記載の前処理方法。
【請求項４】
前記粒子は粒子径分布を有するとともに、その体積基準の積算分布における中央粒子径ｄ５０Ｖが２５〜２８０μｍである、
請求項３に記載の前処理方法。
【請求項５】
前記多孔質材は、前記多孔質材をゲル濾過クロマトグラフィーに用いた場合にＤＮＡを分画することができるものであり、ここで、前記多孔質材の前記ＤＮＡに対する排除限界は４５塩基対以上である、
請求項４に記載の前処理方法。
【請求項６】
前記多孔質材は、前記多孔質材をゲル濾過クロマトグラフィーに用いた場合にタンパク質を分画することができるものであり、前記多孔質材の前記タンパク質に対する分画範囲の下限が１×１０４Ｄａ以上であるか、前記多孔質材の前記タンパク質に対する分画範囲の上限が４×１０６Ｄａ以上であるかの少なくともいずれかを満たす、
請求項４に記載の前処理方法。
【請求項７】
前記粒子からは、カットオフ径以下の粒子径を有する小さな粒子が予め除去されており、
前記カットオフ径は２５〜１００μｍの範囲にある、
請求項４に記載の前処理方法。
【請求項８】
前記多孔質材の表面に接触させる血液は他の液体によって希釈されていない全血であるとともに前記多孔質材の表面に接触させた後に全血を他の液体で希釈する、又は
前記多孔質材の表面に接触させる血液は、他の液体によって予め希釈された全血である、
請求項３に記載の前処理方法。
【請求項９】
請求項３に記載の前処理方法に基づき、前記細胞を含む血液を前処理した後、
前記前処理した血液を前記微細流路中に流すことで前記血液中の細胞を水力学的に分級する、
血液中の細胞の分級方法。
【請求項１０】
前記前処理において、
前記粒子は粒子径分布を有しているとともに、その体積基準の積算分布における中央粒子径ｄ５０Ｖが２５〜２８０μｍであり、さらに
前記粒子からは篩い分けによりカットオフ径以下の小さな粒子が予め除去されており、
前記分級において、
前記微細流路中の前記水力学的な分級を行う箇所の上流には、血液の流れを平面的なものとする扁平なエントリー流路が設けられており、
前記カットオフ径は、前記エントリー流路の断面における短手方向の長さよりも大きい、
請求項９に記載の分級方法。
【請求項１１】
前記エントリー流路には、前記血液の流れを横切るようにピラー密集帯が設けられており、
前記ピラー密集帯中の各ピラーは前記短手方向に沿って立っている、
請求項１０に記載の分級方法。
【請求項１２】
前記分級は胎児由来有核赤血球、循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）及び骨髄腫細胞のいずれかを濃縮するものである、
請求項１１に記載の分級方法。
【請求項１３】
血液の前処理に対する評価方法であって、
細胞を含む血液に対して前処理を施した後、前記血液を微細流路中に流すところ、前記微細流路の途中には前記血液の流れを横切るようにピラー密集帯が設けられており、
前記ピラー密集帯及びその下流側でこれと隣り合う、ピラーが疎になっている区画中に生じるデブリを、血液を流し始めてから一定時間経過後に観測する、
評価方法。
【請求項１４】
前記区画は、最も上流のピラー密集帯及びその次に位置するピラー密集帯と前記微細流路の側壁とによって囲まれており、
前記区画を平面視したときに、前記区画に対して前記デブリの占める割合を面積比で求める、
請求項１３に記載の評価方法。
【請求項１５】
前記細胞を含む血液を被験材料の表面に接触させることで前記前処理を行う、
請求項１４に記載の評価方法。
【請求項１６】
前記細胞を含む血液中に被験材料を添加するとともにこれと混合することで前記前処理を行う、
請求項１４に記載の評価方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は血液の前処理に関し、特に微細流路による血球の分級のための血液の前処理に関する。また血液の前処理の評価方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
特許文献１には微細流路による血球の分級が記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】国際公開第２０１８／１２３２２０号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
血液を微細流路中に流すと微細流路中で目詰まりが生じることがある。本発明は目詰まりの解消に適した方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
＜１＞
血液を微細流路中に流すことで血液中の細胞を分級する前に、
前記細胞を含む血液を多孔質材の有する多孔質性の表面に接触させる、
血液の前処理方法。
＜２＞
前記多孔質材を、前記細胞を含む血液中に添加するとともにこれと混合することで、前記細胞を含む血液を前記多孔質性の表面に接触させる、
＜１＞に記載の前処理方法。
＜３＞
前記多孔質材は前記多孔質性の表面が多糖類からなる粒子であるとともに、液体中に懸濁された状態で前記細胞を含む血液中に添加される、
＜２＞に記載の前処理方法。
＜４＞
前記粒子は粒子径分布を有するとともに、その体積基準の積算分布における中央粒子径ｄ５０Ｖが２５〜２８０μｍである、
＜３＞に記載の前処理方法。
＜５＞
前記多孔質材は、前記多孔質材をゲル濾過クロマトグラフィーに用いた場合にＤＮＡを分画することができるものであり、ここで、前記多孔質材の前記ＤＮＡに対する排除限界は４５塩基対以上である、
＜４＞に記載の前処理方法。
＜６＞
前記多孔質材は、前記多孔質材をゲル濾過クロマトグラフィーに用いた場合にタンパク質を分画することができるものであり、前記多孔質材の前記タンパク質に対する分画範囲の下限が１×１０４Ｄａ以上であるか、前記多孔質材の前記タンパク質に対する分画範囲の上限が４×１０６Ｄａ以上であるかの少なくともいずれかを満たす、
＜４＞に記載の前処理方法。
＜７＞
前記粒子からは、カットオフ径以下の粒子径を有する小さな粒子が予め除去されており、
前記カットオフ径は２５〜１００μｍの範囲にある、
＜４＞に記載の前処理方法。
＜８＞
前記多孔質材の表面に接触させる血液は他の液体によって希釈されていない全血であるとともに前記多孔質材の表面に接触させた後に全血を他の液体で希釈する、又は
前記多孔質材の表面に接触させる血液は、他の液体によって予め希釈された全血である、
＜３＞に記載の前処理方法。
＜９＞
＜３＞に記載の前処理方法に基づき、前記細胞を含む血液を前処理した後、
前記前処理した血液を前記微細流路中に流すことで前記血液中の細胞を水力学的に分級する、
血液中の細胞の分級方法。
＜１０＞
前記前処理において、
前記粒子は粒子径分布を有しているとともに、その体積基準の積算分布における中央粒子径ｄ５０Ｖが２５〜２８０μｍであり、さらに
前記粒子からは篩い分けによりカットオフ径以下の小さな粒子が予め除去されており、
前記分級において、
前記微細流路中の前記水力学的な分級を行う箇所の上流には、血液の流れを平面的なものとする扁平なエントリー流路が設けられており、
前記カットオフ径は、前記エントリー流路の断面における短手方向の長さよりも大きい、
＜９＞に記載の分級方法。
＜１１＞
前記エントリー流路には、前記血液の流れを横切るようにピラー密集帯が設けられており、
前記ピラー密集帯中の各ピラーは前記短手方向に沿って立っている、
＜１０＞に記載の分級方法。
＜１２＞
前記分級は胎児由来有核赤血球、循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）及び骨髄腫細胞のいずれかを濃縮するものである、
＜１１＞に記載の分級方法。
＜１３＞
血液の前処理に対する評価方法であって、
細胞を含む血液に対して前処理を施した後、前記血液を微細流路中に流すところ、前記微細流路の途中には前記血液の流れを横切るようにピラー密集帯が設けられており、
前記ピラー密集帯及びその下流側でこれと隣り合う、ピラーが疎になっている区画中に生じるデブリを、血液を流し始めてから一定時間経過後に観測する、
評価方法。
＜１４＞
前記区画は、最も上流のピラー密集帯及びその次に位置するピラー密集帯と前記微細流路の側壁とによって囲まれており、
前記区画を平面視したときに、前記区画に対して前記デブリの占める割合を面積比で求める、
＜１３＞に記載の評価方法。
＜１５＞
前記細胞を含む血液を被験材料の表面に接触させることで前記前処理を行う、
＜１４＞に記載の評価方法。
＜１６＞
前記細胞を含む血液中に被験材料を添加するとともにこれと混合することで前記前処理を行う、
＜１４＞に記載の評価方法。
【発明の効果】
【０００６】
本発明により微細流路中の目詰まりの解消に適した方法を提供することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【０００７】
【図１】前処理のステップを含む流れ図。
【図２】多孔質の粒子の粒子径分布。
【図３】微細流路の平面図。
【図４】微細流路の部分平面図。
【図５】微細流路の詳細な部分斜視図。
【図６】エントリー流路の斜視図。
【図７】微細流路の観察像１（上段）及びそのスケッチ（下段）。
【図８】前処理に対する評価作業の流れ図。
【図９】微細流路の観察像２（上段）及びそのスケッチ（下段）。
【図１０】目詰まり率のグラフ１。
【図１１】目詰まり率のグラフ２。
【発明を実施するための形態】
【０００８】
＜１．血液の前処理方法の位置づけ＞
【０００９】
本発明の一態様は血液の前処理に関する。血液の前処理の詳細を説明する前に、図を参照しつつ前処理の位置づけを説明する。図には血液の前処理のステップＳ８０を含む流れ図が示されている。ステップＳ８０の実施にあたり、事前にステップＳ７９において生体から血液の採取が行われる。
【００１０】
前処理のステップＳ８０は、血液中の細胞に対する分級のステップＳ８１を行う前に実施する。血液中の細胞に対する分級とは、血液中の細胞をその大きさによって分画することである。ステップＳ８１は特に血液を微細流路中に流すことで行われるものである。ステップＳ８１の分級の例は微細流路内にて行う水力学的分級である。微細流路はマイクロメートルオーダーの流路構造を有する。このようなマイクロ流路構造は血液の分級に適したものである（特許文献１）。血液の分級に用いられる微細流路を有するチップを特に血球分離チップと呼ぶ場合がある。
【００１１】
図１においてステップＳ８１の分級によって特定の粒子径分布を有する細胞の集団が得られる。血液中の細胞は様々な大きさの細胞が混じりあっている。各細胞種は細胞の大きさに関して固有の粒子径分布を示す。したがって分級により得られた細胞の集団には特定の細胞種が濃縮されている。
【００１２】
図１において、ステップＳ８２で濃縮した細胞種が利用される。濃縮した細胞種から、例えば医師による診断に利用可能なデータを取得できる。診断の対象者と濃縮すべき細胞種には以下の組み合わせが挙げられる。これらは例示である。
【００１３】
図１において対象とする血液には濃縮すべき細胞種として血球が含まれる。血球は胎児由来有核赤血球でもよい。ステップＳ７９において取得される血液は胎児由来有核赤血球を含有する。胎児由来有核赤血球は妊婦血に含まれる。診断の対象者は胎児及び妊婦である。ステップＳ８０において妊婦血を前処理する。ステップＳ８１において分級により胎児由来有核赤血球を濃縮する。ステップＳ８２において胎児に対する診断に有用なデータを取得する。
【００１４】
図１において対象とする血液には濃縮すべき細胞種として、血液中を循環する細胞であって血球ではない他の細胞が含まれる。それは循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）でもよい。ステップＳ７９において取得される血液はＣＴＣを含有する。ＣＴＣは例えばがんの疑われる被験者、がん患者及びがんの治療をすでに受けた被験者の血液に含まれる可能性がある。これらの者が診断の対象者となる。ステップＳ８０においてこれらの血液を前処理する。ステップＳ８１において分級によりＣＴＣを濃縮する。ＣＴＣが血液に含まれているか否かに関わらずＣＴＣを濃縮するのに必要な工程を実行する。ステップＳ８２においてがんの診断に有用なデータを取得する。
【００１５】
図１において対象とする血液に含まれる細胞であって濃縮すべき細胞種は骨髄腫細胞でもよい。ステップＳ７９において取得される血液は骨髄腫細胞を含有する。骨髄腫細胞は例えば骨髄腫の治療を行った患者から微小残存病変（ＭＲＤ）として検出される可能性がある。これらの者が診断の対象者となる。骨髄腫の一例は多発性骨髄腫である。ステップＳ８０においてかかる患者から採取した血液を前処理する。ステップＳ８１において分級により骨髄腫細胞を濃縮する。骨髄腫細胞が血液に含まれているか否かに関わらず骨髄腫細胞を濃縮するのに必要な工程を実行する。ステップＳ８２においてＭＲＤに対する診断に有用なデータを取得する。
【００１６】
図１において、ステップＳ７９、ステップＳ８１及びステップＳ８２はステップＳ８０の技術的意味を理解するために説明した。したがってこれらのステップは本態様において必須ではない。またこれらのステップの間に他のステップが導入されてもよい。ステップＳ８０の前及び後のいずれかに他のステップが導入されてもよい。
【００１７】
＜２．血液の前処理方法の詳細＞
【００１８】
図１に示す前処理のステップＳ８０をさらに詳細に説明する。ステップＳ８０では血液を多孔質材の有する多孔質性の表面に接触させる。血液には、血球及び血液中を循環する他の細胞が含まれる。血液は細胞及び血漿を含んでいる。血液を多孔質性の表面に接触させるために多孔質材を血液中に添加する。容器に分取した血液に対して多孔質材を添加することで行ってもよい。予め容器中に多孔質材を分取しておくとともに、さらにかかる容器に血液を取り入れることで行ってもよい。さらに多孔質材と血液とを混合する。多孔質材が血液全体に散らばるようにこれらをよく混合することがよい。
【００１９】
多孔質材は血液中で沈むものでもよい。多孔質材は粒子でもよい。粒子は球状でもよい。粒子はビーズでもよい。本明細書においてビーズとは、各粒子が球状となるような手法で形成された粒子群をいう。粒子を血液に懸濁してもよい。多孔質材が粒子である場合、多孔質材を血液ではない液体に予め懸濁してもよい。血液ではない液体は緩衝液や保存液でもよい。血液ではない液体に血清を添加してもよい。血清としてＦＢＳを使用してもよい。多孔質材の粒子の懸濁液を血液中に添加することで、血液と多孔質材とを接触させてもよい。
【００２０】
多孔質性の表面に接触させる血液は、他の液体によって希釈されていない全血でもよい。全血とは血液が血液成分ごとに分離されておらず、血球、血漿等の全ての成分を含んでいるものを言う。
【００２１】
図１に示すステップＳ７９で全血を採取した後、ステップＳ８０で前処理するまでの間、全血を一定期間保存してもよい。保存期間は１〜７２時間でもよい。保存の温度は室温１〜３０℃（日本薬局方）でもよい。保存の温度は４〜２５℃が好ましく、４℃が特に好ましい。なお保存の温度にはプラスマイナス２℃の範囲内の揺れがあってもよい。揺れの範囲はプラスマイナス１℃であることが好ましい。ステップＳ７９で採血後に採血の施設外に全血を輸送してからステップＳ８０の前処理をするときは全血を４℃に保ちながら輸送することが好ましい。また保存の工程を挟むことなく、ステップＳ７９で全血を採取した後、速やかにステップＳ８０で前処理をしてもよい。
【００２２】
図１に示すステップＳ８０の前処理において、多孔質材と血液とを混合した上で、所定の時間、所定の温度でインキュベートすることが好ましい。時間は例えば１〜６０分とすることができる。３０分±５分としてもよい。インキュベートの温度は室温１〜３０℃（日本薬局方）でもよい。インキュベートの温度は４〜２５℃でもよい。インキュベートの温度は全血中の細胞や物質の状態を著しく害するものでなければ特に制限されない。例えば４℃の環境下で全血を保存した後、２５℃の環境下で、すでに冷やされている全血をインキュベートしてもよい。
【００２３】
多孔質材が粒子である場合、多孔質材の添加量は、希釈していない血液１ｍＬあたり１０〜５０μＬである。希釈血の希釈倍率に合わせて多孔質材の添加量を調整してもよい。この場合、希釈率が高いほど、多孔質材の添加量を少なくしてもよい。例えば１ｍＬの血液を５倍に希釈した場合、５ｍＬの希釈血に対して１０μＬの多孔質材を添加してもよい。１ｍＬの血液を２．５倍に希釈した場合、２．５ｍＬの希釈血に対して２０μＬの多孔質材を添加してもよい。
【００２４】
上記において多孔質材の体積を特定するにあたり多孔質材は水で膨潤しているものとする。多孔質材のビーズである場合は、多孔質材をビーズ液の状態で取り扱ってもよい。ビーズ液は多孔質材をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中に混ぜたものである。ここでビーズの間の隙間はビーズの体積に便宜的に含めた上で、多孔質材のビーズを計り取るものとする。例として５０％を多孔質材のビーズが占め、残りの５０％をＰＢＳが占めているビーズ液を用いてもよい。
【００２５】
上記において多孔質材は事前に洗浄しておいてもよい。洗浄はＰＢＳで行ってもよい。洗浄は血液の希釈用の液体や蒸留水で行ってもよい。洗浄は２回行ってもよく、３回以上行ってもよい。
【００２６】
図１において、例えばステップＳ７９の血液の採取と同時にステップＳ８０の前処理を行ってもよい。例えば多孔質材を採血管内に予め配置しておく。これにより血液の採取と同時に採取した全血と多孔質材とを採血管内で接触させる。採血管を振って血液を多孔質材にさらによく接触させてもよい。
【００２７】
図１において前処理のステップＳ８０では、多孔質性の表面に接触させる血液は、他の液体によって希釈された全血でもよい。例えばステップＳ７９の血液の採取の後、ステップＳ８０にて血液を多孔質材に接触させる前に生体から採取された血液を他の液体で希釈する。本明細書において希釈済みの全血も血液に含むものとする。希釈率は１倍より大きく、１０倍以下でもよい。すなわち全血の体積１に対して体積０より大きく、体積９以下の他の液体を添加してもよい。希釈率は１．５、２．０、２．５、３．０、３．５、４．０、４．５及び５．０倍のいずれかでもよい。希釈率は６、７、８及び９倍のいずれかでもよい。
【００２８】
一例において、全血１ｍＬに対し５０〜１００μＬのビーズ液（ビーズ５０体積％）を加え、３０分、２５℃の環境条件下で回転混和する。この回転混和中に多孔質材のビーズと血球とはインキュベートされる。これをＰＢＳで希釈したものに対して血球の分級を行う。他の一例において、全血をＰＢＳで希釈した後に多孔質材を加えてもよい。この場合インキュベートは行わずに分級する。また多孔質材を大きめのチューブ内にあらかじめ添加しておき、ここに希釈血をさらに添加してもよい。また予め用意した希釈溶液に多孔質材を添加しておき、ここに全血を添加することで希釈と、多孔質材との接触を同時に行ってもよい。
【００２９】
多孔質材が血漿中に含まれる成分と反応してもよい。例えば多孔質材が血漿中に含まれる成分を吸着してもよい。吸着される成分は直接に微細流路を目詰まりさせるものであってもよい。吸着される成分は微細流路の目詰まりを間接的に促進するものであってもよい。
【００３０】
多孔質材の表面には多数の微細孔が形成されている。多孔質材は多孔質ではないその他の材料と結合していてもよい。例えば多孔質ではない粒子が多孔質材でコートされていることで多孔質性の粒子となっていてもよい。粒子の中心は多孔質性でなくてもよい。粒子の中心は強磁性体でもよい。
【００３１】
多孔質材の材質は多糖類でもよい。多孔質材の微細孔は多糖類で形成されたものでもよい。多糖類は架橋されていてもよい。多糖類はアガロース、デキストラン及びアリルデキストランのいずれかでもよい。多糖類は修飾されていてもよい。修飾はDEAE（Diethylethanolamine）修飾でもよい。
【００３２】
粒子状の多孔質材はゲル濾過クロマトグラフィーに用いることのできるものでもよい。ゲル濾過クロマトグラフィーとは移動相が水溶液であるサイズ排除クロマトグラフィーである。またこの時にＤＮＡを分画することができるものでもよい。多孔質材のＤＮＡに対する排除限界は４５塩基対以上であることが好ましい。多孔質材のＤＮＡに対する排除限界は１６５塩基対以上でもよく、以下でもよい。多孔質材のＤＮＡに対する排除限界は１０７８塩基対以上でもよく、以下でもよい。
【００３３】
粒子状の多孔質材はタンパク質を分画することができるものでもよい。多孔質材のタンパク質に対する分画範囲の下限が１×１０４Ｄａ以上であることが好ましい。多孔質材のタンパク質に対する分画範囲の上限が４×１０６Ｄａ以上であることが好ましい。粒子状の多孔質材は少なくとも上記いずれかを満たすことが好ましい。
【００３４】
図２には多孔質の粒子の粒子径分布が体積基準の積算分布で示されている。多孔質材の粒子は粒子径分布を有する。多孔質材の中央粒子径ｄ５０Ｖ（Median particle size of the cumulative volume distribution）は体積基準の積算分布における中央粒子径である。粒子が多糖類からなる場合、粒子が緩衝液中で膨潤した状態における粒子径を基準とする。粒子径の測定例はレーザ回折・散乱法で求めた有効径やコールター法で求めた球体積相当径である。
【００３５】
図２において、中央粒子径ｄ５０Ｖは５００μｍ未満であることが好ましい。中央粒子径ｄ５０Ｖは好ましくは２５〜２８０μｍ、より好ましくは２５〜１６５μｍ、さらに好ましくは４５〜１６５μｍである。中央粒子径ｄ５０Ｖがかかる範囲にあることで、多孔質材の表面積を、血液との接触に好適なものとすることができる。
【００３６】
図２において多孔質材の粒子からは、必要に応じて小さい粒子がカットオフされていることが好ましい。カットオフとは、多孔質材の粒子から、小さい粒子が取り除かれることである。一態様において、カットオフ径ＣＦ以下の粒子径を有する小さな粒子が予め除去される。カットオフ径ＣＦの範囲は２５〜１００μｍである。カットオフ径ＣＦは４０〜７０μｍでもよい。小さな粒子の除去はメッシュによる篩い分けで行うことが好ましい。例えばセルストレーナーを用いて多孔質材の粒子の集団から小さな粒子を除去してもよい。小さな粒子が除去されていることで、血中に混ざった小さな粒子による微細流路の目詰まりを抑制できる。微細流路の種類によっては微細流路に進入した小さな粒子が何事もなく微細流路から流し出される。そのような流路では小さな粒子による目詰まりを考慮しなくてもよい。しかしながらそのような微細流路でも血中の何らかの化学的成分による目詰まり（後に述べるデブリ）は生じることがある。したがってカットオフしていない粒子の使用は目詰まりの抑制に有効である。
【００３７】
元の粒子から小さな粒子が除去されると元の粒子の粒子径分布が変わる。すなわちカットオフにはサイズセレクションの効果がある。サイズセレクション後は中央粒子径も変化する。便宜上、本明細書において中央粒子径ｄ５０Ｖは、カットオフにより元の粒子から小さな粒子を除去する前の粒子径分布に基づくものとする。
【００３８】
＜３．血液中の細胞の分級方法＞
【００３９】
図１を改めて参照する。本発明の一態様はステップＳ８０とステップＳ８１とを組み合わせた血液中の細胞の分級方法である。まず上述した前処理方法に基づき細胞を含む血液を処理する（ステップＳ８０）。次に、前処理した血液を微細流路中に流すことで血液中の細胞を水力学的に分級する（ステップＳ８１）。
【００４０】
図１において血液を予め希釈してから、ステップＳ８１で分級をしてもよい。希釈はステップＳ８０の前処理の前に行ってもよく、後に行ってもよい。分級する時点での全血に対する希釈率は１倍より大きく、１０倍以下でもよい。すなわち全血の体積１に対して体積０より大きく、体積９以下の他の液体を添加してもよい。希釈率は１．５、２．０、２．５、３．０、３．５、４．０、４．５及び５．０倍のいずれかでもよい。希釈は前処理の前と後の両方で行ってもよい。例えば、前処理を行う前に２〜３倍に全血を希釈しておいて、前処理が終わった後にさらにこれを希釈して全血に対する５倍希釈としてもよい。
【００４１】
図１に示すステップＳ８０で血液の前処理をした後、ステップＳ８１で分級するまでの間、前処理済みの血液を保存してもよい。前処理後の保存の温度の範囲は４±２℃でもよい。保存の工程を挟むことなく、前処理後速やかにステップＳ８１で分級をしてもよい。
【００４２】
＜４．分級デバイス＞
【００４３】
以下に水力学的な分級のためのデバイスの一例を示す。図３には平面視した微細流路２０が示されている。微細流路２０は血球を初めとする浮遊細胞の分離用の流路チップである。図中のＸ、Ｙ及びＺの各軸は微細流路２０の機能を理解するために便宜的に示したものである。これらの軸は、微細流路２０の形状を具体的に限定するものではない。
【００４４】
図３において微細流路２０は主流路２３を有する。主流路２３の一方の端は入口２１ａとなっている。主流路２３のもう一方の端は出口２２ｃとなっている。微細流路２０はさらに副流路２４を有する。副流路２４の端は入口２１ｂとなっている。副流路２４の端は合流部２８にて主流路２３に接続している。
【００４５】
図３において主流路２３は入口２１ａから出口２２ｃに向かって順に流路パート２５ａ〜ｄを有する。流路パート２５ａ〜ｄは入口２１ａから出口２２ｃまで一つながりとなっている。流路パート２５ａと流路パート２５ｂとの間に合流部２８がある。
【００４６】
図３において微細流路２０は枝流路２６ａ及び２６ｂを有する。枝流路２６ａ及び２６ｂはいずれも主流路２３から分岐する流路である。上流側から順に枝流路２６ａ及び枝流路２６ｂがこの順で主流路２３から分岐する。枝流路２６ａ及び２６ｂの一端は流路パート２５ｃで主流路２３と接続する。流路パート２５ｃにおいて、副流路２４と対向する側に枝流路２６ａ及び２６ｂが配置されている。枝流路２６ａ及び２６ｂの他端に出口２２ａ及び出口２２ｂがある。
【００４７】
図３において枝流路２６ａ及び２６ｂはいずれも主流路２３から分岐する細流路を複数個有する。各細流路は主流路２３の上流から下流への方向に沿って並ぶ。各細流路はそれぞれ出口２２ａ及び２２ｂに達する。各細流路はそれぞれ出口２２ａ及び２２ｂの手前で合流する。流路パート２５ｃの下流には流路パート２５ｄがある。流路パート２５ｄは出口２２ｃに達する。
【００４８】
図３において入口２１ａは前処理された血液ＢＬを入れたシリンジ３０と接続される。シリンジ３０からは、所定の流量で血液ＢＬを入口２１ａに送る。血液ＢＬは入口２１ａを経由して流路パート２５ａに入る。血液ＢＬの前処理はシリンジ３０内で行ってもよい。シリンジ３０内で血液ＢＬの前処理を行ってからシリンジ３０より微細流路２０に血液ＢＬを送る。
【００４９】
図３において微細流路２０は副流路２４を有する。副流路２４はシリンジ３５と接続されている。シリンジ３５には清澄液ＣＬが入れられている。清澄液ＣＬは浮遊細胞を含まない液体である。清澄液ＣＬは血球やその他の細胞にダメージを与えない液体である。清澄液ＣＬは緩衝液である。清澄液ＣＬはＰＢＳでもよい。シリンジ３５内に圧力をかけることで清澄液ＣＬは入口２１ｂから副流路２４に入る。清澄液ＣＬは副流路２４を流れる。清澄液ＣＬは流路パート２５ｂに流入する。
【００５０】
各出口には細胞懸濁液の画分が排出される。出口２２ｃには画分Ｆ３が、出口２２ｂには画分Ｆ２が、出口２２ａには画分Ｆ１が得られる。画分Ｆ１及び画分Ｆ２には流路パート２５ｃで分級された細胞がそれぞれ含まれる。画分Ｆ３には流路パート２５ｃを通過した血漿が含まれる。
【００５１】
図４には平面視した微細流路２０が示されている。図は微細流路２０による浮遊細胞の分別の過程を模式的に表している。説明を簡単にするため、枝流路２６ａには１０本の細流路が、枝流路２６ｂには３本の細流路が示されている。
【００５２】
なお図４及び図５は特開２００７−１７５６８４号公報より引用し一部を変更した。分級のメカニズムは特開２００７−１７５６８４号公報において特に詳細に説明されている。
【００５３】
図４に示すように、流路パート２５ｂのさらに上流から血液ＢＬが連続的に流れてくる。血液ＢＬは細胞を大量に含んでいる。血液ＢＬの流れに対して、その側方より清澄液ＣＬの流れを連続的に接触させる。これにより主流路２３を流れる細胞を、主流路２３の側方から連続的に押し込む。結果として血液ＢＬの流れは清澄液ＣＬの流れとは反対側に連続的に押し込まれる。流路パート２５ｂ〜ｃにおいて、枝流路２６ａ及び２６ｂ側に連続的に浮遊細胞が押しやられるとともに、これらの枝流路に浮遊細胞が連続的に流れ込む。
【００５４】
図４に示すように、枝流路２６ａには無核赤血球２７が連続的に流れ込む。流路パート２５ｂにおいて血液ＢＬ中の無核赤血球２７を水力学的に分級する。分級は血液ＢＬの流れのうち、清澄液ＣＬの流れとは接触していない側で連続的に行われる。
【００５５】
図４に示すように、枝流路２６ａは無核赤血球２７の除去流路として働く。枝流路２６ａの有する細流路の内接径は１２〜１９μｍである。内接径は１３、１４、１５、１６、１７、及び１８μｍのいずれかでもよい。
【００５６】
図４に示すように枝流路２６ｂには有核細胞２９ａ−ｃが連続的に流れ込む。流路パート２５ｂの下流の流路パート２５ｃにおいて、血液ＢＬ中の有核細胞２９ａ−ｃを水力学的に分級する。分級は血液ＢＬの流れのうち、清澄液ＣＬの流れとは接触していない側で連続的に行われる。特に枝流路２６ｂより有核細胞の細胞懸濁液を連続的に得る。
【００５７】
図４に示すように枝流路２６ｂは有核細胞２９ａ−ｃの回収流路として働く。枝流路２６ｂの有する細流路の内接径は２０〜３０μｍである。内接径は２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８及び２９μｍのいずれかでもよい。有核赤血球を初めとする有核細胞の径の大きさは１１〜１３μｍと考えられる。
【００５８】
図４に示す枝流路２６ａ及び２６ｂの各細流路の内接径は細流路の直交断面における内接円の直径である。細流路の断面は四角形でも他の多角形でも円でもよい。他の枝流路において同様である。枝流路２６ａ及び２６ｂに取り込まれなかった浮遊細胞や血漿はフロースルーＦＴとして連続的に流路パート２５ｄを通過する。その後、図３において出口２２ｃに到達する。例えば凝集した血球などがフロースルーＦＴに含まれる。
【００５９】
図５において流路パート２５ｃに焦点を絞りつつ微細流路の詳細が示されている。本実施例に係る水力学的な分級では、細流路の内接径の値が分級される浮遊細胞の径の最大値と等しくなっているわけではない。したがって本実施例に係る水力学的な分級は単純な濾過と異なる。本実施例に係る水力学的な分級を以下に説明する。
【００６０】
図５には流路パート２５ｃが示されている。さらに枝流路２６ａの持つ細流路が表されている。説明を簡単にするため枝流路２６ａを構成する細流路を一本のみとする。図５の説明において枝流路２６ａを構成する細流路を単に枝流路２６ａと称する。
【００６１】
図５に示すように流路パート２５ｃには液流ＬＦが連続的に導入される。液流ＬＦは上述の血液ＢＬと清澄液ＣＬとを含む。液流ＬＦ中でこれらの液はその界面で部分的に混じり合っている。液流ＬＦ中には大きな細胞として有核細胞２９ａと、小さな細胞として無核赤血球２７とが含まれている。図中において有核細胞２９ａは他の有核細胞を代表して描かれている。
【００６２】
図５において液流ＬＦのうち、枝流路２６ａへ導入される部分を液流ＬＥとする。液流ＬＦのうち、枝流路２６ａへ導入されず、下流に向かって流れていく部分を液流ＬＧとする。液流の内、液流ＬＧにのみハッチングがなされている。ここで液流ＬＥの流量は液流ＬＥの断面に比例する。液流ＬＥは枝流路２６ａ側の流路パート２５ｃの内壁に沿って流れる。液流ＬＥの流量は枝流路２６ａ中の液流ＬＥの流速にも比例する。
【００６３】
図５において液流ＬＥ中を流れる無核赤血球２７が枝流路２６ａへ導入される。一方、有核細胞２９ａはその体積の半分以上が液流ＬＧ側に属している。有核細胞２９ａは液流ＬＥに対して一部接触するに過ぎない。このため有核細胞２９ａは枝流路２６ａへは導入されない。このとき有核細胞２９ａの径は枝流路２６ａの内接径より小さくてもよい。仮に液流ＬＥの流量が大きくなれば液流ＬＥの断面が大きくなる。この場合、有核細胞２９ａが液流ＬＥに飲み込まれることで、枝流路２６ａへ誘導されることも考えられる。
【００６４】
図５において有核細胞２９ａは液流ＬＧに乗ってさらに下流に運ばれる。以上により、枝流路２６ａからはある大きさ以上の浮遊細胞を含まない流体を回収することができる。結果として無核赤血球２７がここで分級を受ける。また有核細胞２９ａ及びその他の有核細胞は下流で分級を受ける。
【００６５】
＜５．エントリー流路＞
【００６６】
図３に戻る。微細流路２０中の流路パート２５ａは水力学的な分級を行う流路パート２５ｃの上流に位置する。流路パート２５ａはさらに清澄液ＣＬの流れが合流する合流部２８の上流に位置する。流路パート２５ａは入口２１ａに接続する。以下流路パート２５ａをエントリー流路という場合がある。
【００６７】
図６にはエントリー流路に当たる流路パート２５ａが示されている。血液は入口２１ａから流路パート２５ａに進入する。流路パート２５ａは扁平である。流路パート２５ａ中の血液の流れは平面的なものとなる。流路パート２５ａのＹＺ断面における短手方向の長さは寸法ＳＤとして表されている。
【００６８】
図６に即して言えば寸法ＳＤは流路パート２５ａの高さにあたる。寸法ＳＤは２５±５μｍであることが好ましい。好適な寸法ＳＤを選択することで血球中の細胞が流れやすくなる。また流路パート２５ａで血球中の細胞をＹ方向に広げることができる。さらに寸法ＳＤは他の流路パートにわたって維持されていることが好ましい。かかる構成により＋Ｙ方向から来る清澄液の流れによって＋Ｘ方向に流れる血液の流れを−Ｙ方向に押し込みやすくなる（図４参照）。
【００６９】
図２に戻る。先に述べた通り、前処理に用いる多孔質の粒子は粒子径分布を有する。また一態様においてその中央粒子径ｄ５０Ｖが５００μｍ未満である。中央粒子径ｄ５０Ｖは好ましくは２５〜２８０μｍ、より好ましくは２５〜１６５μｍ、さらに好ましくは４５〜１６５μｍである。
【００７０】
図２において、先に述べたところに従い前処理において粒子からは篩い分けによりカットオフ径ＣＦ以下の小さな粒子が予め除去されていることが好ましい。カットオフ径ＣＦの範囲は２５〜７０μｍであり、好ましくは２５〜４０μｍである。
【００７１】
図６には多孔質の粒子ＰＰが示されている。粒子ＰＰはカットオフ径ＣＦよりも大きな粒子径を有する。好ましい一態様においてカットオフ径ＣＦは寸法ＳＤよりも大きい。言い換えればほぼ全ての粒子ＰＰの粒子径は寸法ＳＤよりも大きい。ここで寸法ＳＤよりも小さな粒子径を有する粒子ＰＰが残っていたとしても、これは例えば篩い分けの不完全さなどにより偶発的に混入した粒子と考えられる。
【００７２】
図６において、粒子ＰＰの粒子径を上記の通り設定することで、粒子ＰＰの流路パート２５ａへの侵入を防ぐことができる。好ましい一態様において流路パート２５ａの途中にはピラー密集帯１１が設けられている。ピラー密集帯１１中の各ピラーは流路パート２５ａの上面と下面とを接続している。粒子ＰＰの粒子径を上記の通り設定することで、粒子ＰＰがピラー密集帯１１を塞ぐことを防止できる。ピラー密集帯１１の構成と働きは以下に述べる。
【００７３】
＜６．ピラー密集帯＞
【００７４】
図７には流路パート２５ａの観察像及びそのスケッチが示されている。流路パート２５ａはピラー密集帯１１を備える。ピラー密集帯１１は流路パート２５ａ中の血液の流れを横切るように設けられている。血液は図中の上流の左側から下流の右側に流れる。
【００７５】
図７において流路パート２５ａは区画１２を有する。区画１２はピラー密集帯１１の下流側でピラー密集帯１１と隣り合う。区画１２ではピラーが疎になっている。流路パート２５ａはピラー密集帯１３をさらに備える。ピラー密集帯１３はピラー密集帯１１から見た下流方向においてピラー密集帯１１の次に位置するピラー密集帯である。ピラー密集帯１３の構成はピラー密集帯１１と同等であってもよい。
【００７６】
図７において、区画１２はピラー密集帯１１と、ピラー密集帯１３と、流路パート２５ａの側壁すなわち微細流路の側壁とによって囲まれている。流路パート２５ａはさらに区画１４を有する。区画１４はピラー密集帯１３の下流側でピラー密集帯１３と隣り合う。流路パート２５ａは区画１４の下流にもさらにピラー密集帯を備える。符号１５〜１７は実施例にて説明する。
【００７７】
図７において、上述したピラー密集帯１１は血液の流れに対して大きな抵抗となるものではない。またピラー密集帯１１は血液の流速を著しく低下させるものではない。ピラー密集帯１１はフィルターの役割を果たす。ピラー密集帯１１は血液中の不純物、例えば血球よりも大きな不溶成分がピラー密集帯１１の下流の流路パートに入り込まないようにする。また凝集塊となっている血球があれば、一つ一つの血球をバラバラにするという役割を果たす。
【００７８】
＜７．前処理の実施例＞
【００７９】
本実施例では、図７〜図１１に基づき血液の前処理方法の例とその効果を説明する。図７は後述する。図８は前処理に対する評価作業の流れ図である。ステップＳ８９において人体より採血する。血液はステップＳ９０における前処理の前に４℃で、１〜４８時間保存したものである。
【００８０】
図８のステップＳ９０において血液を多孔質材の多糖類ビーズで前処理する。これにあたりビーズを事前に洗浄する。まず１．５ｍＬチューブにＰＢＳで２倍希釈したビーズを加える。ＰＢＳとビーズとを混和した後に、５００×ｇで２分、ＲＴ（室温、２５℃）で遠心することで上清を廃棄する。さらにＰＢＳを加えて洗浄を繰り返すことで、全部で３回の洗浄作業を行う。洗浄後、元の２倍希釈時の体積までＰＢＳでメスアップする。このＰＢＳとビーズの混合物をビーズ液として血液に添加する。
【００８１】
図８のステップＳ９０において血液にビーズを添加することで血液を前処理する。実施例において血液に対して多糖類の多孔性のビーズＢ０１、Ｂ０２及びＢ０３を添加しそれぞれ混合する。ビーズの添加量は、希釈した血液１ｍＬあたり５０μＬである。混合は２５℃で３０分間、回転混和することで行う。３０分間経過後、回転混和をやめ、さらに３０分間、ＲＴで放置する。ビーズ（Beads）の一覧は次の通りである。
【００８２】
【表１】
2020085000.tif 000003
【００８３】
ビーズはいずれもMerck(Sigma-Aldrich)より入手した。製品名（Product name）の欄に記載のSepharose、Sephacryl及びSephadexはいずれも商標である。
【００８４】
DNA排除限界（DNA Exclusion Limit, Fractionation Range [Mr] DNA Exclusion Limit）は以下の通り説明される。すなわちビーズの微細孔の径の最大値より大きい溶質粒子は微細孔から排除される。溶質粒子としてDNAが選択された場合には、その塩基数を基準とした排除の限界がある。Mrは相対分子質量（relative molecular mass）。
【００８５】
タンパク質分画範囲（Protein fractionation range）は球状タンパク質の分子サイズ（Da）に関する分画範囲（Fractionation range [Mr], Globular proteins）である。
【００８６】
ビーズＢ０１、Sepharose CL-6Bのゲルマトリックスは６％架橋アガロースからなる球状体である。粒子径は４５〜１６５μｍ。
【００８７】
ビーズＢ０２、Sephacryl 500-HR（Sigma-Aldrich、製品番号S500HR）のゲルマトリックスはアリルデキストランとＮ，Ｎ′−メチレンビスアクリルアミドとの架橋性共重合体からなる。体積基準の積算分布における中央粒子径（Median particle size of the cumulative volume distribution, Particle size, d50V）は５０μｍ以下。粒子径は２５−７５μｍ。デキストランを基準とした分画範囲（Fractionation [Mp] Dextrans）は４×１０４〜２×１０７。Mpはピークトップ分子量（Peak molecular weight）。デキストランに対する排除限界は１００×１０６。
【００８８】
ビーズＢ０３、Sephadex G-75のゲルマトリックスは架橋デキストランからなる。ウェット状態の粒子径は９０〜２８０μｍ。ドライ状態の粒子径は４０〜１２０μｍ。デキストランを基準とした分画範囲（Fractionation [Mp] Dextrans）は１×１０３−５×１０４。デキストランに対する排除限界は７×１０４よりも大きい。Sephadex G-50のDNA排除限界は20bpである。またSephadex G-100のDNA排除限界は25bpである。Sephadex G-75はこれらの中間のDNA排除限界を有すると考えられる。したがってSephadex G-75のDNA排除限界は20以上、25以下の範囲にあると推定される。
【００８９】
次に図８に示すステップＳ９１で血液をＰＢＳで希釈する。希釈倍率は２〜３倍である。
【００９０】
次に図８に示すステップＳ９２で血球分離チップ（微細流路）に血液を流す。なおビーズを血液中より取り除く処理は一切しなかった。
【００９１】
次に図８に示すステップＳ９３でチップを観察する。観察はステップＳ９２で血液を流し始めてから３０〜９０分後に行う。観察は血液を血球分離チップに流しながら行う。
【００９２】
図７に戻る。観察は区画１２に対して行う。USBカメラ（ホーザン株式会社）の下にチップを配置する。チップを平面視しながら観察する。チップをHOZAN USB cam softwareで撮影して図７の上段に示す画像データを得る。画像データはImageJソフトウェアに読み込み、同ソフトウェア上で解析する。
【００９３】
図７において画像データ中から区画１２に相当するエリア１５を切り取る。エリア１５中の総ピクセル数を区画１２の総面積として取り扱う。エリア１５中のデブリ部１６を目視により流動部１７と区別する。デブリ部１６はピラー密集帯１１を起点に蓄積したデブリで占められている。このデブリがピラー密集帯１１の中にまで入り込むとピラー密集帯１１の目詰まりの原因となる。デブリ部１６によって血球の流れが押しのけられる。これに対して流動部１７では血球がスムーズに流れている。
【００９４】
図７において目視によりデブリ部１６と流動部１７との間に線を引く。線で区切られたデブリ部１６内のピクセルの数を求める。区画１２内の全てのデブリ部１６のピクセル数の総和をデブリ面積とする。区画１２の総面積に占めるデブリ面積を百分率で求める。かかる値を目詰まり率とする。
【００９５】
図９には比較例Ｃ０１における流路パート２５ａの観察像及びそのスケッチが示されている。比較例Ｃ０１ではビーズを添加しないこと以外は上記実施例と同様に血液を調製する（No beads）。かかる血液を上記同様に血球分離チップに流す。観察も上記同様に行ったところ、エリア１５中、デブリ部１６が大部分（７０％以上）を占めていた。またデブリが細分化されていた。
【００９６】
図９に示す比較例Ｃ０１では目詰まり率の算出方法を変更する。エリア１５からデブリ部１６を除いた部分、すなわち流動部１７のピクセル数の総和を得る。これを流動部１７の面積として特定する。エリア１５の総面積から流動部１７の面積を減算して、デブリ部１６の推定面積を得る。この推定面積をデブリ面積とする。
【００９７】
図９に示すエリア１５は区画１２の全範囲に一致する。エリア１５は区画１２の一部範囲でもよい。
【００９８】
図９において区画１２とピラー密集帯１１との境界から、ピラー密集帯１１の内部に向かってデブリが侵入している。あるいはピラー密集帯１１の内部に発生したデブリが区画１２にまで連なっているとも推察される。
【００９９】
図１０は目詰まり率を表すグラフ１である。ビーズＢ０１及びビーズＢ０３で前処理した血液は、比較例Ｃ０１の血液に比べて目詰まり率が低い。したがって、多孔質性の表面を有する多糖類ビーズは目詰まり防止効果をもたらすことが分かった。
【０１００】
図１１は目詰まり率を表すグラフ２である。ビーズＢ０２及びビーズＢ０３で前処理した血液は、比較例Ｃ０２（Control）の血液に比べて目詰まり率が低い。図１１の結果からも多孔質性の表面を有する多糖類ビーズは目詰まり防止効果をもたらすことが確認できた。なお比較例Ｃ０２のControlでは血液に対してビーズ及びＰＢＳの混合物を加えることなく、血液に対して回転混和操作のみ行う。
【０１０１】
図１０及び図１１に示すようにビーズＢ０１及びビーズＢ０２はビーズＢ０３よりも強い目詰まり防止効果を有している。表１に示すようにビーズＢ０１及びビーズＢ０２はビーズＢ０３よりもＤＮＡの排除限界が高い。またビーズＢ０１及びビーズＢ０２はビーズＢ０３に比較して、タンパク質の分画範囲がより大きなタンパク質の側に偏っている。
【０１０２】
比較例Ｃ０３として多孔性のないアガロース粉末を上記同様に血液に混合して前処理を行った。比較例Ｃ０４としてアガロース粉末を溶解して形成したアガロースゲルのスラント型のゼリーの表面に血液を接触させることで前処理を行った。いずれの比較例でも前処理を行わなかった場合と比較して顕著な目詰まり防止効果は見られなかった。多糖類の化学的性質よりも、前処理に用いる材料に多孔性のあることが、目詰まり防止効果を得るのに重要であることが分かった。
【０１０３】
他の一例として図８においてステップＳ９０で前処理する前に、ステップＳ９１の希釈を先に行う。すなわちステップＳ９０とステップＳ９１の順序を入れ替える。ビーズはＢ０１（Sepharose CL-6B）を用いる。この場合でも目詰まり防止効果のあることが確認できた。
【０１０４】
＜８．前処理と分級の組み合わせの実施例＞
【０１０５】
（１）カットオフと前処理
【０１０６】
本実施例では前処理用の多孔質の粒子に対して小さな粒子のカットオフを行う。本実施例ではビーズＢ０１のSepharose CL-6Bを用いる。１ｍＬのビーズをナイロン製のセルストレーナー（FALCON、商標）に入れる。スターラーで撹拌しながら一晩かけてビーズに対する濾別を行う。濾別にかける時間は数時間から２４時間でもよい。濾別は蒸留水中で行う。セルストレーナーのメッシュサイズは４０μｍ、７０μｍ及び１００μｍである。濾別は各メッシュサイズのセルストレーナーごとに行う。ここでは７０μｍメッシュのセルストレーナーの使用例について詳述する。メッシュサイズがカットオフ径に対応する。カットオフにより濾別された大きな粒子を前処理に用いる。なおメッシュサイズが小さいほど、大きな粒子の収量が多い。ビーズの洗浄をＰＢＳで２回行う。
【０１０７】
各ビーズを、ビーズと同体積の清澄液で懸濁する。２ｍＬの清澄液に対してビーズの懸濁液２０μＬを添加して、これらをよく混合する。清澄液は予め１％のＦＢＳを添加したＰＢＳである。ビーズと清澄液の混合液を、さらに清澄液に添加する。清澄液の一部を予め血球分離チップに流すことで事前に血球分離チップの内部を緩衝液に浸す。血球分離チップを浸す処理は４０分行う。
【０１０８】
（２）カットオフ径の評価
【０１０９】
分級を終えた血球分離チップを顕微鏡で観察する。カットオフ径７０μｍ及び１００μｍのビーズで前処理した場合、それぞれ図６に示すようなエントリー流路（流路パート２５ａ）の内部や入口２１ａの近傍でデブリが観察された。流路はデブリによってやや閉塞していた。これに対し、カットオフ径４０μｍのビーズで前処理した場合デブリは見られなかった。また２時間４０分にわたって試料血の分級を続けたが流路の閉塞が見られなかった。デブリによる流路閉塞に対する抑制効果を得るにはカットオフ径を７０μｍ以下とするのが望ましいことが分かった。カットオフ径は６０μｍでもよく、５０μｍでもよい。
【０１１０】
なおカットオフ径４０μｍ、７０μｍ及び１００μｍのいずれの場合においても、試料血は全量を血球分離チップで処理することができた。デブリによって血球分離チップが閉塞し分画できない試料血が余ることはなかった。以下の試験ではカットオフ径７０μｍを採用する。
【０１１１】
（３）細胞スパイク
【０１１２】
本実施例ではK562細胞を全血にスパイクすることでＣＴＣのモデルとする。健康なヒトから全血を採取するとともに４℃で保管する。採血後１日目の全血に対してK562細胞の懸濁液を添加することで試料血を得る。添加量は血液２ｍＬに対して865.4個とする。K562細胞は慢性骨髄性白血病の患者に由来する、リンパ球様の浮遊性の培養細胞である。
【０１１３】
添加するK562細胞の数は次のようにして予め推定しておく。まずK562細胞をヘキスト染色する。染色後、顕微鏡で細胞を観察することで細胞数をカウントする。以上によりK562細胞の懸濁液の体積当たりのK562細胞の数が確認できる。
【０１１４】
試料血を上述のビーズを混合した清澄液（1% FBS-PBS）で５倍に希釈する。ビーズと試料血が接触することで前処理が行われる。希釈した試料血を速やかに血球分離チップに流すことで血球を分級する。分級の結果を図３及び図４に沿って説明すると画分Ｆ２にはリンパ球を含む白血球が多く得られる。画分Ｆ１に無核の成熟赤血球が多く得られる。なお血球分離チップに流入した細胞は大部分（＞９９．９％）が画分Ｆ１に流出する。Ｆ３には多くの血球は得られない。K562細胞はリンパ球様であるから画分Ｆ２に含まれることが期待される。
【０１１５】
（４）分級の定量評価
【０１１６】
分級の定量結果を表２に示す。上段はビーズを試料血に接触させなかった場合（Beads less）を表す。下段は７０μｍでカットオフしたビーズを試料血に接触させた場合（Cut off）を表す。分級を開始後の経過時間（Time course、分）は０〜１５分、１５〜４５分、４５〜７５分の３つの時間区間に区切られている。
【０１１７】
【表２】
2020085000.tif 000004
【０１１８】
表２の左側には全血（Whole blood）に関して、血球を含む試料血中の細胞の数の集計が示されている。血球分離チップに流入する細胞数（Input cell number）は、希釈血の単位体積（ｍＬ）あたりの血球数を測定することで得る。測定はPBSで所定の希釈率にて希釈した全血１０μＬを、TC20 Automated Cell Counter (BIO RAD)で処理することで行う。さらに得られた測定値に希釈率と全血の体積とを掛け合わせて算出する。
【０１１９】
表２の左側には血球分離チップに流入する試料血中の細胞数（Input cell number）が示されている。さらに血球分離チップに流入する試料血の体積（Input volume）が全血に換算された状態で示されている。
【０１２０】
さらに表２には画分Ｆ１、Ｆ２及び画分Ｆ３に流出する細胞の合計数（Output cell number）（×１０９）が示されている。流入する細胞数（Input cell number）に対する、流出する細胞の合計数（Output cell number）の比が回収率（Rate of Collection, %）として示されている。表２中には回収率（Rate of Collection, %）が１００％を超えているサンプルがいくつかある。これは、分画を行った全血の体積が小さいことから、細胞数の測定時の希釈や細胞数の測定で誤差が発生することに起因すると推察される。
【０１２１】
全血中の細胞をビーズとの接触無しで分級する。この場合は、血球分離チップ内に詰まりが発生してしまう。したがって４５分を超えて細胞の分級を継続することは困難である。一方でカットオフしたビーズに接触させた全血中の細胞は、そのほぼ全てが回収される。
【０１２２】
（５）有核細胞の回収率の評価
【０１２３】
表２の右側にはスパイクしたK562細胞に関して、血球を含む試料血中の細胞の数の集計が示されている。画分Ｆ２及び画分Ｆ３に流出するK562細胞の数を実測する。なお細胞数の実測に当たりK562細胞と、全血に由来する他の有核細胞とを見分ける必要がある。これはスパイクする前にあらかじめK562細胞をHoechst33342（Sigma-Aldrich製）で染色しておき、分画後に回収されたフラクションの細胞をキーエンス社のオールインワン蛍光顕微鏡 BZ-X710で観察し、核が蛍光標識されている細胞をK562細胞、無いものを全血に由来する他の有核細胞と区別することにより行う。
【０１２４】
得られた数値（Output cell number）は回収率（Rate of Collection）の算出に用いる。ここで回収率とは、実際に画分Ｆ２及び画分Ｆ３中に回収されたK562細胞の数を血球分離チップに流入するK562細胞の数（Input cell number）に対する百分率で示したものである。
【０１２５】
血球分離チップに流入するK562細胞の数（Input cell number）は次の通り説明される。ビーズ無し（Beads less）の試験では、試料血を用意するために用いた全血１ｍＬあたり４４３個となるようにK562細胞を試料血に混和する。この値は流入する細胞の濃度（Input cell conc.）として表２に表されている。分級開始後０〜１５分における、分画された試料血の体積（Input cell volume）は０．０７５ｍＬである。ただしこの値は希釈を考慮し、全血の体積に換算されている。この時間区間において流入する細胞の数（Input cell number）は４４３×０．０７５＝３３．２３個である。この時間区間において全てのK562細胞が画分Ｆ２及び画分Ｆ３のいずれかに回収されると仮定すると、３３．２３個のK562細胞が回収される。ビーズ無し（Beads less）のこの時間区間（Time course, ０〜１５分）では、画分Ｆ２及び画分Ｆ３に流出するK562細胞の数（Output cell number）が３４個である。この値は回収されたK562細胞の数の実測値である。K562細胞の回収率（Rate of Collection）は３４／３３．２３×１００＝１０２．３％になる。
【０１２６】
表２において分級開始後１５〜４５分における、分画された試料血の体積（Input cell volume）は０．１５０ｍＬである。ただしこの値は希釈を考慮し、全血の体積に換算されている。この時間区間において流入する細胞の数（Input cell number）は４４３×０．１５０＝６６．４５個である。画分Ｆ２及び画分Ｆ３に流出するK562細胞の数（Output cell number、実測値）は９１個である。K562細胞の回収率（Rate of Collection）は９１／６６．４５×１００＝１３６．９％になる。
【０１２７】
表２の下段にはカットオフ径７０μｍの場合のK562細胞の回収率（Rate of Collection）がさらに示されている。画分Ｆ２及び画分Ｆ３からなる画分中に見つかったK562細胞の測定数（Output cell number）は、各時間区間において２６、５７及び５４個であった。カットオフ径７０μｍのビーズによる前処理においてK562細胞の回収率（Rate of Collection）はいずれの時間区間でも８０％以上であったことから、回収率（Rate of Collection）は十分に高いものと判断される。
【０１２８】
本実施例はＣＴＣの濃縮のモデル実験として行われる。上記の結果から前処理はＣＴＣの濃縮において有用であることが示される。具体的にはチップの目詰まりを防止することで長時間の分級を行うことができることが示される。本実施例の方法により長時間の分級を行うことで大量の試料血を処理することができる。このことは一回の処理あたりのＣＴＣの取得量が大きいことを示す。またＣＴＣと同様に血液中に微量しか含まれない細胞、例えば妊婦血中の胎児赤芽球の濃縮にもこれらが有効であると考えられる。
【０１２９】
＜９．前処理の評価方法＞
【０１３０】
本発明の他の一態様は血液の前処理に対する評価方法である。図８に戻り、これを参照しながら説明する。ステップＳ８９で細胞を含む血液を採取する。ステップＳ９０で細胞を含む血液に対して前処理を施す。
【０１３１】
ステップＳ９０の前処理においては、細胞を含む血液を被験材料の表面に接触させる。被験材料は粉末状でもよい。被験材料は容器の表面に形成された構造体でもよい。あるいは細胞を含む血液中に被験材料を添加するとともにこれと混合する。被験材料は血液に溶け込むものでもよい。
【０１３２】
図８に示すようにステップＳ９１で血液を希釈する。希釈倍率は少なくとも２倍であることが好ましい。希釈倍率は例えば２〜３倍である。希釈は例えばＰＢＳで行う。希釈はステップＳ９０の前に行ってもよい。すなわちステップＳ９０とステップＳ９１の順序を入れ替えてもよい。ステップＳ９０の前に希釈してからステップＳ９１でさらに希釈してもよい。
【０１３３】
ステップＳ９２で血液を微細流路中に流す。図７に示すように微細流路の途中には血液の流れを横切るようにピラー密集帯１１が設けられている。ピラー密集帯１１及びその下流側でこれと隣り合う区画１２中に生じるデブリ部１６を観察する。区画１２ではピラーが無いか、ピラーが疎になっている。
【０１３４】
血液を流し始めてから一定時間経過後に、図７に示す区画１２中に生じるデブリ部１６を観測する。時間の長さは例えば３０〜９０分である。エリア１５に対してデブリ部１６の占める割合を面積比で求める。求め方は上述の実施例にならってもよい。
【０１３５】
なお、本発明は上記実施の形態に限られたものではなく、趣旨を逸脱しない範囲で適宜変更することが可能である。
【０１３６】
この出願は、２０１８年１０月２５日に出願された日本出願特願２０１８−２００７１２を基礎とする優先権を主張し、その開示の全てをここに取り込む。
【符号の説明】
【０１３７】
１１  ピラー密集帯、１２  区画、１３  ピラー密集帯、１４  区画、１５  エリア、１６  デブリ部、１７  流動部、２０  微細流路、２１ａ−ｂ  入口、２２ａ−ｃ  出口、２３  主流路、２４  副流路、２５ａ−ｄ  流路パート、２６ａ−ｂ  枝流路、２７  無核赤血球、２８  合流部、２９ａ−ｃ  有核細胞、３０  シリンジ、３５  シリンジ、Ｂ０１−０３  ビーズ、ＢＬ  血液、Ｃ０１−０４  比較例、ＣＦ  カットオフ径、ＣＬ  清澄液、ｄ５０Ｖ  中央粒子径、ＬＥ  液流、ＬＦ  液流、ＬＧ  液流、ＰＰ  粒子、Ｓ７９−８２  ステップ、Ｓ８９−９３  ステップ、ＳＤ  寸法
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【国際調査報告】
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