(57)【要約】  本発明は、簡便かつ効率よく、機能的かつ成熟した神経筋接合部（NMJ）をインビトロで調製する方法を提供することを課題とし、（i）多能性幹細胞にMyoDを一過的に発現させて筋分化を誘導する工程、および（ii）（i）で得られた細胞を神経栄養因子を含む培地で培養して神経分化を誘導する工程、を含む、人工神経筋接合部の製造方法で該課題を解決する。
2019078263.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（i）多能性幹細胞にMyoDを一過的に発現させて筋分化を誘導する工程、および
（ii）（i）で得られた細胞を神経栄養因子を含む培地で培養して神経分化を誘導する工程、
を含む、人工神経筋接合部の製造方法。
【請求項２】
工程（i）のMyoDの一過的発現が薬剤を用いた発現誘導によって行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
工程（ii）の神経栄養因子がGlial cell line-derived Neurotrophic Factor (GDNF) 、Brain-derived Neurotrophic Factor (BDNF)およびNeurotrophin 3 (NT-3)である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
工程（i）が４〜２０日間行われる、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
工程（ii）が２０〜１２０日間行われる、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
人工神経筋接合部が運動ニューロン、筋細胞、およびシュワン細胞を含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
多能性幹細胞が人工多能性幹細胞である、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
多能性幹細胞がヒト多能性幹細胞である、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
それぞれ多能性幹細胞から誘導された、運動ニューロン、筋細胞、およびシュワン細胞を含む、細胞集団。
【請求項１０】
請求項９に記載の細胞集団を含む医薬組成物。
【請求項１１】
請求項９に記載の細胞集団に被検物質を添加して培養する工程、
培養後、該細胞における筋収縮またはカルシウム濃度を評価する工程、
を含む、神経筋接合部の障害によって引き起こされる疾患の治療薬のスクリーニングまたは評価方法。
【請求項１２】
（i）多能性幹細胞にMyoDを一過的に発現させて筋分化を誘導する工程、および
（ii）（i）で得られた細胞を神経栄養因子を含む培地で培養して神経分化を誘導する工程、
を含む、人工神経筋接合部の製造工程において、工程（i）及び／または（ii）に被検物質を存在させ、得られた人工神経筋接合部の形態または細胞組成を解析することにより、被検物質を評価する、神経筋接合部の障害によって引き起こされる疾患の治療薬のスクリーニングまたは評価方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、多能性幹細胞を利用して、神経筋接合部をインビトロで調製する方法並びに該方法で得られた人工神経接合部およびその利用に関する。
【背景技術】
【０００２】
神経筋接合部（Neuromuscular junction: NMJ）は、運動神経終末と筋肉の接合部であり、神経終末から放出されるアセチルコリンにより、筋収縮が引き起こされる。
NMJの形成と維持は、神経細胞や筋細胞などのNMJの構成要素間での制御された連続的相互作用を必要とする多段階プロセスである。NMJ関連疾患の発病プロセスにはNMJの機能障害だけでなくその発生段階での障害も関与することが知られている。インビボのNMJの形成と維持を再現するヒト多能性幹細胞（hiPSC）由来のNMJはこれらの疾患の病態生理学の解明とそれらの治療薬の発見にとって優れたモデルとなりうる。近年、インビトロでNMJを再構築する幾つかの試みがなされた。例えば、非特許文献１および非特許文献２では、それぞれ、hiPSC由来運動ニューロン（MN）と初代筋細胞との共培養またはhiPSC由来MNとhiPSC由来筋細胞との共培養により得られるNMJモデルがアセチルコリン受容体（AChR）の集合体を形成することが示されたが、形態面及び機能面での成熟には至っておらず、NMJモデルとして不十分であった。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００３】
【非特許文献１】Steinbeck JA. et, al. Cell Stem Cell. 2016 Jan.7;18(1) : 134-43
【非特許文献２】Demestra M, et, al. Stem Cell Res. 2015 Sep;15(2): 328-36
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明は、簡便かつ効率よく、機能的かつ成熟したNMJをインビトロで調製する方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者らは上記課題を解決するために鋭意検討を行った結果、多能性幹細胞においてMyoD（myogenic differentiation）遺伝子を一時的に発現させ、次いで、培養条件を筋誘導から神経誘導に切り替えることで運動ニューロン、筋細胞（筋管）およびシュワン細胞を含む機能的かつ成熟したNMJを効率よく分化誘導できることを見出し、本発明を完成するに至った。【０００６】
本発明は以下を提供する。
［１］（i）多能性幹細胞にMyoDを一過的に発現させて筋分化を誘導する工程、および
（ii）（i）で得られた細胞を神経栄養因子を含む培地で培養して神経分化を誘導する工程、
を含む、人工神経筋接合部の製造方法。
［２］工程（i）のMyoDの一過的発現が薬剤を用いた発現誘導によって行われる、［１］に記載の方法。
［３］工程（ii）の神経栄養因子がGlial cell line-derived Neurotrophic Factor (GDNF) 、Brain-derived Neurotrophic Factor (BDNF)およびNeurotrophin 3 (NT-3)である、［１］または［２］に記載の方法。
［４］工程（i）が４〜２０日間行われる、［１］〜［３］のいずれかに記載の方法。
［５］工程（ii）が２０〜１２０日間行われる、［１］〜［４］のいずれかに記載の方法。
［６］人工神経筋接合部が運動ニューロン、筋細胞、およびシュワン細胞を含む、［１］〜［５］のいずれか一項に記載の方法。
［７］多能性幹細胞が人工多能性幹細胞である、［１］〜［６］のいずれかに記載の方法。
［８］多能性幹細胞がヒト多能性幹細胞である、［７］に記載の方法。
［９］それぞれ多能性幹細胞から誘導された、運動ニューロン、筋細胞、およびシュワン細胞を含む、細胞集団。
［１０］［９］に記載の細胞集団を含む医薬組成物。
［１１］［９］に記載の細胞集団に被検物質を添加して培養する工程、
培養後、該細胞における筋収縮またはカルシウム濃度を評価する工程、
を含む、神経筋接合部の障害によって引き起こされる疾患の治療薬のスクリーニングまたは評価方法。
［１２］（i）多能性幹細胞にMyoDを一過的に発現させて筋分化を誘導する工程、および（ii）（i）で得られた細胞を神経栄養因子を含む培地で培養して神経分化を誘導する工程、
を含む、人工神経筋接合部の製造工程において、工程（i）及び／または（ii）に被検物質を存在させ、得られた人工神経筋接合部の形態または細胞組成を解析することにより、被検物質を評価する、神経筋接合部の障害によって引き起こされる疾患の治療薬のスクリーニングまたは評価方法。
【発明の効果】
【０００７】
本発明によれば、インビトロの系で効率よくNMJを得ることができる。形成されたNMJは、AChRを始めとするNMJの特徴を備え、NMJを介した神経による筋収縮を呈する。
シュワン細胞は神経終末の成熟、AChRクラスタの成熟およびNMJの維持にかかわっているという報告があり（The Journal of Neuroscience, September 21, 2016, 36(38):9770-9781）、本発明の方法によれば、シュワン細胞を含有する、より成熟した機能的なNMJが得られる。
本発明の方法により、約30日程度の短期間でヒトNMJが形成可能であり、形成後約100日程度の長期間にわたって培養・維持することが可能である。
本発明の方法によれば、インビボシナプス形成ステップが再現されるがこれはNMJシナプス形成の理解からNMJ関連疾患の発病の解明および候補治療薬のスクリーニング等に有用である。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１Ａ】インビトロhNMJ形成および形態分析。hiPSCからのインビトロhNMJ形成のスキーム。
【図１Ｂ】インビトロhNMJ形成および形態分析(写真）。インビトロhNMJの免疫染色。プラーク様からプレッツェル様へのAChRクラスタリングの形態変化。（右）AChRのεサブユニットの検出。表示の無いスケールバー＝１０μｍ。
【図１Ｃ】インビトロhNMJ形成および形態分析(写真）。インビトロhNMJの免疫染色。MNの分化マーカーの検出。表示の無いスケールバー＝１０μｍ。
【図１Ｄ】インビトロhNMJ形成および形態分析(写真）。インビトロhNMJの免疫染色。筋原性細胞の分化マーカーの検出。表示の無いスケールバー＝１０μｍ。
【図１Ｅ】インビトロhNMJ形成および形態分析(写真）。インビトロhNMJの免疫染色。初期から後期にかけてのニューロフィラメント密度の変化。
【図１Ｆ】インビトロhNMJ形成および形態分析(写真）。インビトロhNMJの免疫染色。シュワン細胞マーカーの検出。表示の無いスケールバー＝１０μｍ。
【図１Ｇ】インビトロhNMJ形成および形態分析(写真）。インビトロhNMJの電子顕微鏡による解析。筋管に結合する軸索末端の膨張を示すSEM。
【図１Ｈ】インビトロhNMJ形成および形態分析(写真）。インビトロhNMJの電子顕微鏡による解析。シナプス前部位におけるシナプス小胞（矢頭）、活動帯（矢印）およびシナプス後部位に蓄積されたミトコンドリアを示すTEM。
【図１Ｉ】インビトロhNMJ形成および形態分析(写真）。インビトロhNMJの電子顕微鏡による解析。筋管の内側に観察される拡大化された軸索末端。高電子密度の線として示される接合部ひだ。
【図１Ｊ】インビトロhNMJ形成および形態分析(写真）。インビトロhNMJの電子顕微鏡による解析。終末ボタンの上を覆うシュワン細胞。
【図２】TEMによるhNMJ発生ステージの分析(写真）。（ａ）筋管（ｍ）に神経を分布させているMN。筋肉原形質膜上に観察された高電子密度領域。（ｂ）筋管に観察された多分岐軸索末端。高電子密度領域（矢印）が各軸索末端に局在する。ミトコンドリア（mt）が近くに見られた。（ｃ）軸索末端に観察されたネクローシス（矢印）。（ｄ）活動帯（矢頭）、並列するシナプス後肥厚部（PSD、矢印）、それらの間に観察されるシナプス間隙。（ｅ）シナプス小胞（sv）が活動帯（矢印）にドッキングする。（ｆ）筋鞘により取り囲まれ、AChRがその中に存在する神経下間隙（subneural cleft）。（ｇ）アグリン処理により増加するNMJ領域の比率。（ｈ）アグリン処理：軸索末端の境界となる接合部のひだで筋管がよく限局された。ミトコンドリアが接合領域の近くで見られる。抗アグリン処理：筋管の残余物と劣化した軸索末端だけが培養物の中に残された。統計分析のために一元配置ANOVAを実施した。
【図３Ａ】NMJ分化の２０日目におけるインビトロhNMJの機能分析(左上は写真）。２か所の目的領域（ROI）における一過性Ca2+上昇の検出およびそれと同時の筋管の運動の検出。筋管がCa2+の上昇に対する応答として収縮した。
【図３Ｂ】NMJ分化の２０日目におけるインビトロhNMJの機能分析(左上は写真）。５か所のROIにおけるCaイメージング。カルシウムの添加により一過性Ca2+上昇が亢進し、クラーレ処理により停止された。
【図３Ｃ】NMJ分化の２０日目におけるインビトロhNMJの機能分析(上は写真）。４か所のROIにおける運動分析が筋管収縮の伝播を示している。
【図３Ｄ】NMJ分化の２０日目におけるインビトロhNMJの機能分析。GAP27によるギャップジャンクション阻害から１５分後に４か所のROI内の筋管が独立して収縮し始めた。
【図４】インビトロhNMJ培養物の光活性化による運動分析(ａ，ｃ，ｂ下は写真）。（ａ）チャネルChR2-EYFPを発現するhNMJ培養物の神経性細胞。（ｂおよびｃ）hNMJ培養物の運動分析。（ｂ）筋肉収縮は青色光（４８８ｎｍ）によってのみ引き起こされた。（ｃ）クラーレにより筋肉収縮が阻害された。
【図５Ａ】hNMJ培養におけるＭＮの検出および定量(上は写真）。培養60日目におけるＭＮ特異的マーカー陽性細胞の画像とグラフ（n=2、平均±SEM）。
【図５Ｂ】hNMJ培養におけるＭＮの検出および定量。フローサイトメトリーによる、培養30日目及び60日目における全細胞数に対するHB9陽性細胞数とIslet1陽性細胞数の結果（n=3、平均±SEM）。
【図６Ａ】SMNタンパクをノックダウンしたiPSCs（201B7MYOD-SMNKD）からのhNMJへの分化(上は写真）。SMNタンパクのウェスタンブロッティング解析の結果であり、ゲルの画像とシグナル強度による定量結果（n=3、平均±SEM）。
【図６Ｂ】SMNタンパクをノックダウンしたiPSCs（201B7MYOD-SMNKD）からのhNMJへの分化(上は写真）。培養30日目の201B7MYOD-SMNKD細胞（SMN KD）と201B7MYOD細胞（Control）とにおける、NF+SV2免疫染色とAChR免疫染色の結果を示す画像と細胞面積の解析結果。スケールバー：10μm。
【図６Ｃ】SMNタンパクをノックダウンしたiPSCs（201B7MYOD-SMNKD）からのhNMJへの分化(写真）。201B7MYOD-SMNKD細胞（SMN KD）と201B7MYOD細胞（Control）とにおける、myotubeと軸索末端の形態を示す走査電子顕微鏡画像。スケールバー：500 nm。図中のMfはmyotubeを示し、Axは軸索を示す。
【図６Ｄ】SMNタンパクをノックダウンしたiPSCs（201B7MYOD-SMNKD）からのhNMJへの分化(写真）。201B7MYOD-SMNKD細胞（SMN KD）と201B7MYOD細胞（Control）とにおける、myotubeと軸索末端の細胞内を示す透過電子顕微鏡画像。Lは脂肪滴を示し、Mtはミトコンドリアを示し、Mfはmyotubeを示し、SVはシナプス小胞を示し、Axは軸索を示し、Nuは核を示す。
【図６Ｅ】SMNタンパクをノックダウンしたiPSCs（201B7MYOD-SMNKD）からのhNMJへの分化(上は写真）。培養30日目の201B7MYOD-SMNKD細胞（SMN KD）と201B7MYOD細胞（Control）におけるmyotubeの収縮の時間経過を示す画像とグラフ。
【図６Ｆ】SMNタンパクをノックダウンしたiPSCs（201B7MYOD-SMNKD）からのhNMJへの分化(写真）。201B7MYOD-SMNKD細胞における収縮中のmyotubeの崩壊を示した明視野画像。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
＜人工神経接合部の製造法＞
本発明の人工神経接合部の製造法は、
（i）多能性幹細胞にMyoDを一過的に発現させて筋分化を誘導する工程、および
（ii）（i）で得られた細胞を神経栄養因子を含む培地で培養して神経分化を誘導する工程
を含む。
【００１０】
＜人工神経筋接合部＞
人工神経筋接合部とは、インビトロで多能性幹細胞から誘導された神経筋接合部を意味する。神経筋接合部とは、運動神経細胞の突起末端よりアセチルコリンが放出され、筋管細胞に存在する受容体が受け取ることができる構造を意味する。神経筋接合部の存在は、例えば、免疫染色や蛍光顕微鏡観察を行い、運動神経細胞が発現するシナプス小胞タンパク質（例えば、SV2）と筋管細胞が発現するアセチルコリン受容体が共局在することによって確認することができる。
【００１１】
人工神経筋接合部は運動ニューロン、筋細胞（筋管）、およびシュワン（Schwann）細胞を含むことが好ましい。なお、人工神経筋接合部としての機能が維持されている限り、これら以外の細胞を有していてもよい。
運動ニューロンは、HB9、Islet1、ChATから選択される一つ以上のマーカーの陽性を指標にして同定することができる。
筋細胞は、ミオシン重鎖（MHC）およびMEF2cから選択される一つ以上のマーカーの陽性を指標にして同定することができる。
シュワン細胞は、S-100マーカーなどの陽性を指標にして同定することができる。
人工神経筋接合部は運動ニューロン、筋細胞、およびシュワン細胞の割合は、神経筋接合部としての機能が維持できる割合であれば特に制限されない。
【００１２】
＜多能性幹細胞＞
本発明において多能性幹細胞とは、生体に存在する多くの細胞に分化可能である多能性を有し、かつ、増殖能をも併せもつ幹細胞であり、本発明で使用される中間中胚葉細胞に誘導される任意の細胞が包含される。多能性幹細胞には、特に限定されないが、例えば、胚性幹（ＥＳ）細胞、核移植により得られるクローン胚由来の胚性幹（ｎｔＥＳ）細胞、精子幹細胞（「ＧＳ細胞」）、胚性生殖細胞（「ＥＧ細胞」）、人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞、培養線維芽細胞や骨髄幹細胞由来の多能性細胞（Ｍｕｓｅ細胞）などが含まれる。好ましい多能性幹細胞は、製造工程において胚、卵子等の破壊をしないで入手可能であるという観点から、ｉＰＳ細胞であり、より好ましくはヒトｉＰＳ細胞である。
【００１３】
ｉＰＳ細胞の製造方法は当該分野で公知であり、任意の体細胞へ初期化因子を導入することによって製造され得る。ここで、初期化因子とは、例えば、Ｏｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、Ｓｏｘ１、Ｓｏｘ３、Ｓｏｘ１５、Ｓｏｘ１７、Ｋｌｆ４、Ｋｌｆ２、ｃ−Ｍｙｃ、Ｎ−Ｍｙｃ、Ｌ−Ｍｙｃ、Ｎａｎｏｇ、Ｌｉｎ２８、Ｆｂｘ１５、ＥＲａｓ、ＥＣＡＴ１５−２、Ｔｃｌ１、ｂｅｔａ−ｃａｔｅｎｉｎ、Ｌｉｎ２８ｂ、Ｓａｌｌ１、Ｓａｌｌ４、Ｅｓｒｒｂ、Ｎｒ５ａ２、Ｔｂｘ３またはＧｌｉｓ１等の遺伝子または遺伝子産物が例示され、これらの初期化因子は、単独で用いても良く、組み合わせて用いても良い。初期化因子の組み合わせとしては、ＷＯ２００７／０６９６６６、ＷＯ２００８／１１８８２０、ＷＯ２００９／００７８５２、ＷＯ２００９／０３２１９４、ＷＯ２００９／０５８４１３、ＷＯ２００９／０５７８３１、ＷＯ２００９／０７５１１９、ＷＯ２００９／０７９００７、ＷＯ２００９／０９１６５９、ＷＯ２００９／１０１０８４、ＷＯ２００９／１０１４０７、ＷＯ２００９／１０２９８３、ＷＯ２００９／１１４９４９、ＷＯ２００９／１１７４３９、ＷＯ２００９／１２６２５０、ＷＯ２００９／１２６２５１、ＷＯ２００９／１２６６５５、ＷＯ２００９／１５７５９３、ＷＯ２０１０／００９０１５、ＷＯ２０１０／０３３９０６、ＷＯ２０１０／０３３９２０、ＷＯ２０１０／０４２８００、ＷＯ２０１０／０５０６２６、ＷＯ２０１０／０５６８３１、ＷＯ２０１０／０６８９５５、ＷＯ２０１０／０９８４１９、ＷＯ２０１０／１０２２６７、ＷＯ２０１０／１１１４０９、ＷＯ２０１０／１１１４２２、ＷＯ２０１０／１１５０５０、ＷＯ２０１０／１２４２９０、ＷＯ２０１０／１４７３９５、ＷＯ２０１０／１４７６１２、Ｈｕａｎｇｆｕ  Ｄ，ｅｔ  ａｌ．（２００８），Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，２６：７９５−７９７、Ｓｈｉ  Ｙ，ｅｔ  ａｌ．（２００８），Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ，２：５２５−５２８、Ｅｍｉｎｌｉ  Ｓ，ｅｔ  ａｌ．（２００８），Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ．２６：２４６７−２４７４、Ｈｕａｎｇｆｕ  Ｄ，ｅｔ  ａｌ．（２００８），Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２６：１２６９−１２７５、Ｓｈｉ  Ｙ，ｅｔ  ａｌ．（２００８），Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ，３，５６８−５７４、Ｚｈａｏ  Ｙ，ｅｔ  ａｌ．（２００８），Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ，３：４７５−４７９、Ｍａｒｓｏｎ  Ａ，（２００８），Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ，３，１３２−１３５、Ｆｅｎｇ  Ｂ，ｅｔ  ａｌ．（２００９），Ｎａｔ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１１：１９７−２０３、Ｒ．Ｌ．Ｊｕｄｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，（２００９），Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，２７：４５９−４６１、Ｌｙｓｓｉｏｔｉｓ  ＣＡ，ｅｔ  ａｌ．（２００９），Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ．１０６：８９１２−８９１７、Ｋｉｍ  ＪＢ，ｅｔ  ａｌ．（２００９），Ｎａｔｕｒｅ．４６１：６４９−６４３、Ｉｃｈｉｄａ  ＪＫ，ｅｔ  ａｌ．（２００９），Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ．５：４９１−５０３、Ｈｅｎｇ  ＪＣ，ｅｔ  ａｌ．（２０１０），Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ．６：１６７−７４、Ｈａｎ  Ｊ，ｅｔ  ａｌ��（２０１０），Ｎａｔｕｒｅ．４６３：１０９６−１００、Ｍａｌｉ  Ｐ，ｅｔ  ａｌ．（２０１０），Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ．２８：７１３−７２０、Ｍａｅｋａｗａ  Ｍ，ｅｔ  ａｌ．（２０１１），Ｎａｔｕｒｅ．４７４：２２５−９．に記載の組み合わせが例示される。
【００１４】
体細胞には、非限定的に、胎児（仔）の体細胞、新生児（仔）の体細胞、および成熟した健全なもしくは疾患性の体細胞のいずれも包含されるし、また、初代培養細胞、継代細胞、および株化細胞のいずれも包含される。具体的には、体細胞は、例えば（１）神経幹細胞、造血幹細胞、間葉系幹細胞、歯髄幹細胞等の組織幹細胞（体性幹細胞）、（２）組織前駆細胞、（３）血液細胞（末梢血細胞、臍帯血細胞等）、リンパ球、上皮細胞、内皮細胞、筋肉細胞、線維芽細胞（皮膚細胞等）、毛細胞、肝細胞、胃粘膜細胞、腸細胞、脾細胞、膵細胞（膵外分泌細胞等）、脳細胞、肺細胞、腎細胞および脂肪細胞等の分化した細胞などが例示される。
【００１５】
また、ｉＰＳ細胞を移植用細胞の材料として用いる場合、拒絶反応が起こらないという観点から、移植先の個体のＨＬＡ遺伝子型が同一または実質的に同一である体細胞を用いることが望ましい。ここで、「実質的に同一」とは、移植した細胞に対して免疫抑制剤により免疫反応が抑制できる程度にＨＬＡ遺伝子型が一致していることであり、例えば、ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−ＢおよびＨＬＡ−ＤＲの３遺伝子座またはＨＬＡ−Ｃを加えた４遺伝子座が一致するＨＬＡ型を有する体細胞である。
【００１６】
多能性幹細胞にMyoDを一過的に発現させて筋分化を誘導する工程、
本発明で用いられるMyoDとしては、配列番号２で表されるアミノ酸配列からなるヒトmyogenic differentiation 1（MYOD1）および他の哺乳動物におけるそのオルソログ、並びにそれらの転写変異体、スプライシング変異体などが挙げられる。あるいは、上記いずれかのタンパク質と90％以上、好ましくは95％以上、より好ましくは97％以上のアミノ酸同一性を有し、且つ該タンパク質と同等の機能（例、筋特異的プロモーターの転写活性化など）を有するタンパク質であってもよい。
MyoDをコードする核酸としては、配列番号１の塩基番号２２１〜１１８３で表されるヌクレオチド配列からなるヒトmyogenic differentiation 1（MYOD1）cDNAおよび他の哺乳動物におけるそのオルソログ、並びにそれらの転写変異体、スプライシング変異体などが挙げられる。あるいは、上記いずれかの核酸と90％以上、好ましくは95％以上、より好ましくは97％以上のヌクレオチド同一性を有し、且つ該核酸にコードされるタンパク質と同等の機能（例、筋特異的プロモーターの転写活性化など）を有するタンパク質をコードする核酸であってもよい。あるいは、上記いずれかの核酸の相補鎖とストリンジェントな条件でハイブリダイズすることができる程度の相補関係を有するセンス鎖を有するものであってもよい。なお、ここでストリンジェントな条件は、Berger and Kimmel（1987, Guide to Molecular Cloning Techniques Methods in Enzymology, Vol. 152, Academic Press, San Diego CA）に教示されるように、複合体或いはプローブを結合する核酸の融解温度（Tm）に基づいて決定することができる。例えばハイブリダイズ後の洗浄条件として、「0. 1×SSC、0.1％SDS、60℃」の条件を挙げることができ、かかる条件で洗浄してもハイブリダイズ状態を維持するものであることが好ましい。
【００１７】
MyoDをコードする核酸は、DNAであってもRNAであってもよく、あるいはDNA/RNAキメラであってもよい。また、該核酸は、一本鎖であっても、二本鎖DNA、二本鎖RNAもしくはDNA: RNAハイブリッドであってもよい。好ましくは二本鎖DNAもしくは一本鎖RNAである。当該RNAは、分解を抑制するため、5-メチルシチジンおよびシュードウリジン（pseudouridine）（TriLink Biotechnologies）を取り込ませたRNAを用いても良く、フォスファターゼ処理による修飾RNAであってもよい。
【００１８】
MyoDを多能性幹細胞において一過的に発現させる方法は特に限定されないが、例えば、以下の方法を用いることができる。尚、ここで「発現」とは、MyoDをコードする核酸である場合においては、細胞内で、該核酸からMyoDタンパク質が転写および翻訳され生成することを意味し、MyoDタンパク質である場合においては、該タンパク質が細胞内に導入されることと同義である。
【００１９】
MyoDがDNAの形態の場合、例えば、ウイルス、プラスミド、人工染色体などのベクターをリポフェクション、リポソーム、マイクロインジェクションなどの手法によって多能性幹細胞内に導入することができる。ウイルスベクターとしては、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、センダイウイルスベクターなどが例示される。また、人工染色体ベクターとしては、ヒト人工染色体（HAC）、酵母人工染色体（YAC）、細菌人工染色体（BAC、PAC）などが例示される。プラスミドとしては、哺乳動物細胞用プラスミドが例示される。
ベクターには、MyoDをコードするDNAが発現可能なように、プロモーター、エンハンサー、リボゾーム結合配列、ターミネーター、ポリアデニル化サイトなどの制御配列を含むことができるし、さらに、必要に応じて、薬剤耐性遺伝子（例えば、カナマイシン耐性遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、ピューロマイシン耐性遺伝子など）、チミジンキナーゼ遺伝子、ジフテリアトキシン遺伝子などの選択マーカー配列、蛍光タンパク質、βグルクロニダーゼ（GUS）、FLAGなどのレポーター遺伝子配列などを含むことができる。プロモーターとして、SV40プロモーター、LTRプロモーター、CMV（cytomegalovirus）プロモーター、RSV（Rous sarcoma virus）プロモーター、MoMuLV（Moloney mouse leukemia virus）LTR、HSV-TK（herpes simplex virus thymidine kinase）プロモーター、EF-αプロモーター、CAGプロモーターおよびTREプロモーター（tetO配列が7回連続したTet応答配列をもつCMV最小プロモーター）が例示される。
【００２０】
MyoDを一過的に発現させるためには、一過的発現ベクターを用いてMyoD遺伝子を多能性幹細胞に導入してもよいが、より厳密に発現を制御するためには、誘導発現システムを使用することが好ましい。誘導発現システムとしてはテトラサイクリンやその誘導体（例えば、ドキシサイクリン）などを用いた薬剤誘導発現システムが挙げられ、予めMyoDの薬剤誘導発現が可能な遺伝子コンストラクトが導入された多能性幹細胞を用いることが好ましい。
例えば、上記のTREプロモーターを用いた場合、同一の細胞において、tetRおよびVP16ADとの融合タンパク質またはリバース（reverse）tetR（rtetR）およびVP16ADとの融合タンパク質（rtTA）を同時に発現させることが望ましい。このTet-Onシステムでは薬剤が存在しないときは該融合タンパク質がTREに結合せず、転写は起こらないが、薬剤を添加することにより該融合タンパク質がTREプロモーターに結合し、転写が起こるので、薬剤を添加している間に一過的にMyoDを発現させることができる。
【００２１】
また、上記ベクターには、多能性幹細胞の染色体へ、プロモーターとそれに結合するMyoDをコードするDNAからなる発現カセットを取り込み、さらに必要に応じて切除するために、この発現カセットの前後にトランスポゾン配列を有していてもよい。トランスポゾン配列として特に限定されないが、piggyBacが例示される。他の態様として、発現カセットを除去する目的のため、発現カセットの前後にLoxP配列を有してもよい。
【００２２】
また、MyoDがRNAの形態の場合、例えばエレクトロポレーション、リポフェクション、マイクロインジェクションなどの手法によって多能性幹細胞内に導入してもよい。MyoDがタンパク質の形態の場合、例えばリポフェクション、細胞膜透過性ペプチド（例えば、HIV由来のTATおよびポリアルギニン）との融合、マイクロインジェクションなどの手法によって多能性幹細胞内に導入してもよい。
【００２３】
MyoDを多能性幹細胞内で一過的に発現させて筋細胞を誘導する期間は、筋分化が十分行われる期間であればよく、用いる多能性幹細胞の種類や性質によって適宜変更できるが、例えば、約４〜２０日が挙げられ、約４〜１２日が好ましく、約６〜１０日がより好ましい。例えば、上記の薬剤誘導発現システムを使用する場合は、この期間薬剤を加えて培養することが好ましい。また、他の態様として、トランスポゾン配列を有するベクターを用いる場合、上記の期間経過後、トランスポゼースを細胞内に導入することで発現を停止する方法およびLoxP配列を有するベクターを用いる場合、所望の期間経過後、Creを細胞内に導入することで発現を停止する方法などが例示される。
一方、MyoDがRNAまたはタンパク質の場合、上記の期間においてMyoDが細胞内で存在するように導入を複数回行ってもよい。
【００２４】
MyoDを多能性幹細胞内で一過的に発現させた状態で筋細胞を誘導する際の多能性幹細胞の培養条件は、接着培養条件であることが好ましい。例えば、細胞外マトリクスなどの細胞接着分子、具体的には、マトリゲル（BD）、I型コラーゲン、IV型コラーゲン、ゼラチン、ラミニン、ヘパラン硫酸プロテオグリカン、またはエンタクチン、およびこれらの組み合わせを用いてコーティング処理された培養皿を用い、動物細胞の培養に用いられる培地を基本培地として血清または血清代替物を添加した培地で培養することが好ましい。ここで、基本培地としては、例えば、GMEM（グラスゴー最小必須培地：Glasgow Minimum Essential Medium）、IMDM（イスコフ改変ダルベッコ培地：Iscove's Modified Dulbecco's Medium）、199培地、イーグル最小必須培地（Eagle’s Minimum Essential Medium）（EMEM）、αMEM培地、ダルベッコ改変イーグル培地（Dulbecco’s modified Eagle’s Medium）（DMEM）、Ham’s F12培地、RPMI 1640培地、フィッシャー培地（Fischer’s medium）、およびこれらの混合培地などが包含される。また、血清代替物として、アルブミン、トランスフェリン、脂肪酸、インスリン、コラーゲン前駆体、微量元素、Knockout Serum Replacement（KSR）（ES細胞培養時のFBSの血清代替物）、ITS-サプリメントおよびこれらの混合物などが包含される。
好ましい分化誘導条件は、マトリゲルでコーティングされた培養皿に接着させた多能性幹細胞を10％KSRを含有するαMEM培地で培養する条件である。
【００２５】
培養温度は、特に限定されないが、約30〜40℃、好ましくは約37℃であり、CO2含有空気の雰囲気下で培養が行われ、CO2濃度は、好ましくは約2〜5％である。
【００２６】
筋分化が誘導されたことはMHCやMEF2cなどの筋マーカーの存在により確認できる。なお、このように製造された筋細胞を含む細胞集団は、単一の細胞集団ではなく、他の種類の細胞が含有された細胞集団であってもよい。
【００２７】
工程（i）で得られた細胞を神経栄養因子を含む培地で培養して神経分化を誘導する工程
＜神経栄養因子＞
神経栄養因子とは、運動ニューロンの生存と機能維持に重要な役割を果たしている膜受容体へのリガンドであり、例えば、Nerve Growth Factor (NGF)、Brain-derived Neurotrophic Factor (BDNF)、Neurotrophin 3 (NT-3)、Neurotrophin 4/5 (NT-4/5)、Neurotrophin 6 (NT-6)、basic FGF、acidic FGF、FGF-5、Epidermal Growth Factor (EGF)、Hepatocyte Growth Factor (HGF)、Insulin、Insulin Like Growth Factor 1 (IGF 1)、Insulin Like Growth Factor 2 (IGF 2)、Glia cell line-derived Neurotrophic Factor (GDNF)、TGF-b2、TGF-b3、Interleukin 6 (IL-6)、Ciliary Neurotrophic Factor (CNTF)およびLIFなどが挙げられる。本発明において好ましい神経栄養因子は、NT-3、GDNF、およびBDNFである。神経栄養因子は、例えばWako社やR&D systems社等から市販されており容易に利用することが可能であるが、当業者に公知の方法によって細胞へ強制発現させることによって得てもよい。
【００２８】
培養液中におけるNT-3の濃度は、例えば、0.1ng/mL〜100 ng/mL、好ましくは1ng/mL〜50ng/mL、より好ましくは5ng/mL〜20ng/mLとすることができる。
【００２９】
培養液中におけるGDNFの濃度は、例えば、0.1ng/mL〜100 ng/mL、好ましくは1ng/mL〜50ng/mL、より好ましくは5ng/mL〜20ng/mLとすることができる。
【００３０】
培養液中におけるBDNFの濃度は、例えば、0.1ng/mL〜100 ng/mL、好ましくは1ng/mL〜50ng/mL、より好ましくは5ng/mL〜20ng/mLとすることができる。
【００３１】
本発明において、工程（ii）で用いる培養液は、動物細胞の培養に用いられる培地を基礎培地として調製することができる。基礎培地としては、例えば、Glasgow's Minimal Essential Medium(GMEM)培地、IMDM培地、Medium 199培地、Eagle's Minimum Essential Medium (EMEM)培地、αMEM培地、Dulbecco's modified Eagle's Medium (DMEM)培地、Ham's F12培地、RPMI 1640培地、Fischer's培地、Neurobasal Medium（ライフテクノロジーズ）およびこれらの混合培地などが包含される。培地には、血清が含有されていてもよいし、あるいは無血清でもよい。必要に応じて、培地は、例えば、アルブミン、トランスフェリン、Knockout Serum Replacement(KSR)(ES細胞培養時のFBSの血清代替物)、N2サプリメント（Invitrogen）、B27サプリメント（Invitrogen）、脂肪酸、インスリン、コラーゲン前駆体、微量元素、2-メルカプトエタノール、3'-チオールグリセロールなどの1つ以上の血清代替物を含んでもよいし、脂質、アミノ酸、L-グルタミン、Glutamax（Invitrogen）、非必須アミノ酸、ビタミン、増殖因子、低分子化合物、抗生物質、抗酸化剤、ピルビン酸、緩衝剤、無機塩類などの1つ以上の物質も含有し得る。好ましい培養液は、N2サプリメント、B27サプリメント、NT-3、GDNF、およびBDNFを含有するNeurobasal Mediumである。
【００３２】
工程（i）において筋分化を誘導した後、MyoDの発現を停止し、培地を神経分化用の培地に変更することで、神経分化を誘導することができる。
【００３３】
培養条件について、培養温度は、特に限定されないが、約30〜40℃、好ましくは約37℃であり、CO2含有空気の雰囲気下で培養が行われ、CO2濃度は、好ましくは約2〜5％である。
【００３４】
培養期間は、運動ニューロンおよびシュワン細胞が出現する期間であれば、特に限定されないが、工程（ii）は、少なくとも20日間行われることが望ましい。より好ましくは20日間から120日間であり、さらに好ましくは、30日間から100日間である。
【００３５】
これにより、人工神経筋接合部、すなわち、運動ニューロン、筋細胞およびシュワン細胞を含む細胞集団を得ることができる。
【００３６】
多能性幹細胞から人工神経筋接合部を作製するキット
本発明での他の実施態様において、多能性幹細胞から人工神経筋接合部を作製するキットが含まれる。当該キットには、上述した工程（i）および（ii）に使用する細胞、培養液、添加剤または培養容器等が含まれる。例えば、MyoDが誘導可能な状態で導入された多能性幹細胞、テトラサイクリンまたはその誘導体などの薬剤、神経栄養因子、細胞外マトリクスでコートされた培養器、基礎培地から成る群より選択される1種類以上の試薬を含むキットが挙げられる。本キットには、さらに製造工程の手順を記載した書面や説明書を含んでもよい。
【００３７】
神経筋接合部を含有する細胞培養物
本発明の人工神経筋接合部は運動ニューロン、筋細胞およびシュワン細胞を含む細胞培養物として得ることができる。
当該神経筋接合部を含有する細胞培養物は、神経筋接合部の障害（機能不全や形成不全）によって引き起こされる病態（例えば、重症筋無力症、ランバート−イートン症候群、ミラー・フィッシャー症候群、先天性筋無力症症候群、脊髄性筋委縮症）の病態のモデル系として有用である。したがって、例えば、神経筋接合部の障害によって引き起こされる病態を治療するための細胞製剤や当該病態の治療薬のスクリーニング系として使用できる。
【００３８】
本発明は、上述した方法により得られた人工神経筋接合部を含む医薬組成物（細胞製剤）、該人工神経筋接合部を含む、神経筋接合部の障害によって引き起こされる病態の治療剤、該人工神経筋接合部の治療有効量を投与する工程を包含する神経筋接合部の障害によって引き起こされる病態を治療する方法をそれぞれ提供する。
治療を必要とする患者への治療剤の投与方法としては、例えば、得られた人工神経筋接合部（筋細胞およびシュワン細胞を含む細胞培養物）を患部に注射等で局所投与する方法などが挙げられる。治療剤に含まれる細胞培養物の細胞数は、疾患の程度などに合わせて適宜調整される。医薬組成物（細胞製剤）の使用においては、該細胞を保護するためにジメチルスルフォキシド（ＤＭＳＯ）や血清アルブミン等を、また、細菌の混入及び増殖を防ぐために抗生物質等を細胞製剤に含有させてもよい。さらに、製剤上許容される他の成分（例えば、担体、賦形剤、崩壊剤、緩衝剤、乳化剤、懸濁剤、無痛化剤、安定剤、保存剤、防腐剤、生理食塩水など）を細胞製剤に含有させてもよい。
【００３９】
薬剤のスクリーニング方法または評価方法
本発明では、上記のようにして得られた運動ニューロン、筋細胞およびシュワン細胞を含む細胞集団に被検物質を添加して培養する工程、
培養後、該細胞における筋収縮またはカルシウム濃度を評価する工程を含む、神経筋接合部の障害によって引き起こされる疾患の治療薬のスクリーニングまたは評価方法を提供する。
【００４０】
被検物質は、例えば、細胞抽出物、細胞培養上清、微生物発酵産物、海洋生物由来の抽出物、植物抽出物、精製タンパク質又は粗タンパク質、ペプチド、非ペプチド化合物、合成低分子化合物、及び天然化合物が例示される。
【００４１】
被検物質はまた、（1）生物学的ライブラリー、（2）デコンヴォルーションを用いる合成ライブラリー法、（3）「1ビーズ1化合物（one-bead one-compound）」ライブラリー法、及び（4）アフィニティクロマトグラフィ選別を使用する合成ライブラリー法を含む当技術分野で公知のコンビナトリアルライブラリー法における多くのアプローチのいずれかを使用して得ることができる。アフィニティクロマトグラフィー選別を使用する生物学的ライブラリー法はペプチドライブラリーに限定されるが、その他の4つのアプローチはペプチド、非ペプチドオリゴマー、又は化合物の低分子化合物ライブラリーに適用できる（Lam (1997) Anticancer Drug Des. 12: 145-67）。分子ライブラリーの合成方法の例は、当技術分野において見出され得る（DeWitt et al. (1993) Proc. Natl.Acad. Sci. USA 90: 6909-13; Erb et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 11422-6; Zuckermann et al. (1994) J. Med. Chem. 37: 2678-85; Cho et al. (1993) Science 261: 1303-5; Carell et al. (1994) Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33: 2059; Carell et al. (1994) Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33: 2061; Gallop et al. (1994) J. Med. Chem. 37: 1233-51）。化合物ライブラリーは、溶液（Houghten (1992) Bio/Techniques 13: 412-21を参照のこと）又はビーズ（Lam (1991) Nature 354: 82-4）、チップ（Fodor (1993) Nature 364: 555-6）、細菌（米国特許第5,223,409号）、胞子（米国特許第5,571,698号、同第5,403,484号、及び同第5,223,409号）、プラスミド（Cull et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 1865-9）若しくはファージ（Scott and Smith (1990) Science 249: 386-90; Devlin (1990) Science 249: 404-6; Cwirla et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 6378-82; Felici (1991) J. Mol. Biol. 222: 301-10; 米国特許出願第2002103360号）として作製され得る。
【００４２】
筋収縮またはカルシウム濃度を溶媒などの対照と比較して増強する物質を神経筋接合部の障害によって引き起こされる疾患の治療薬候補物質として選択または評価することができる。
【００４３】
本発明の薬剤のスクリーニング方法または評価方法の他の態様は、
（i）多能性幹細胞にMyoDを一過的に発現させて筋分化を誘導する工程、および
（ii）（i）で得られた細胞を神経栄養因子を含む培地で培養して神経分化を誘導する工程、
を含む、人工神経筋接合部の製造工程において、工程（i）及び／または（ii）に被検物質を存在させ、得られた人工神経筋接合部の形態または細胞組成を解析することにより、薬剤を選択または評価する、神経筋接合部の障害によって引き起こされる疾患の治療薬のスクリーニング方法または評価方法である。
【００４４】
例えば、神経筋接合部の障害によって引き起こされる疾患の患者由来のiPS細胞を用いて人工神経筋接合部の製造工程を行い、被検物質無添加では人工神経筋接合部の形成が不十分なところ、被検物質を添加した時に人工神経筋接合部の形成が改善された場合、その物質は疾患の神経筋接合部の障害によって引き起こされる疾患の治療薬となりうる。
【実施例】
【００４５】
以下、実施例を挙げて本発明をより具体的に説明するが、本発明の態様は以下の実施例に限定されるものではない。【００４６】
材料と方法
細胞株
ＭｙｏＤ−２０１Ｂ７は、Tanaka et al., PLOS ONE 2013, Volume 8, Issue 4, e61540に記載されたように、２０１Ｂ７ヒトｉＰＳ細胞株にドキシサイクリン（ＤＯＸ）誘導性ＭＹＯＤ１発現piggy bacベクターを形質移入することにより構築された。ＭＹＯＤ１はｍＣｈｅｒｒｙタンパク質およびｒｔＴＡとともに発現され、ＭＹＯＤ１の発現はｍＣｈｅｒｒｙタンパク質の発光により検出した。【００４７】
神経筋接合部の分化
Tanaka et al., PLOS ONE 2013に記載された手順に従って、ＭｙｏＤ−２０１Ｂ７株の筋分化を行った。具体的には、マトリゲル被覆プレート上にＭｙｏＤ−２０１Ｂ７細胞を播種し、筋分化培地（１０％ＫＳＲ＋αＭＥＭ）にドキシサイクリンを１μｇ／ｍＬ添加することで筋分化を誘導した。ドキシサイクリン添加後１０日目の時点で培地を神経栄養因子（ＢＤＮＦ、ＧＤＮＦ、ＮＴ３；１０ｎｇ／ｍｌずつ、Ｒ＆Ｄシステムズ）を添加したニューロベーサル（Neurobasal）培地に変更することで神経分化を誘導した。その後、同培地を３〜４日毎に交換して培養を継続した。【００４８】
ｍＣｈｅｒｒｙ陽性細胞のフローソーティング
筋分化の２日目にＦＡＣＳ  Ａｒｉａ  ＢＤおよびＦＡＣＳ  Ｄｉｖａソフトウェアを使用してｍＣｈｅｒｒｙ陽性細胞を選別した。選別された細胞をマトリゲル被覆９６ウェルプレートに再播種し（８．８×１０４細胞／ウェル）、ドキシサイクリンを含む、または含まない筋分化培地中で培養した。２０日目にニューロンに対する筋管の比率を免疫細胞化学により定量した。【００４９】
運動ベクトル分析
α７ｓ  ＩＬＣＥ−７Ｓ（ソニー株式会社）を使用して赤色フィルター処理光源および蛍光（Ｆｌｕｏ８、緑色）を使用した位相差像を１５ｆｐｓで連続撮像した。ブロックマッチング法に基づく運動ベクトル分析を提供するＳＩ８０００セルモーションイメージングシステム（ソニー株式会社）を使用して目的領域（ＲＯＩ）における赤色分離像を使用する運動定量と緑色分離像を使用する明度分析を実施した。
ＳＩ８０００セルモーションイメージングシステム（ソニー株式会社）を使用して３８ｆｐｓで移動像の撮像と運動分析の両方を実施した。【００５０】
カルシウムイメージング
ＭｙｏＤ−２０１Ｂ７細胞を２．２×１０４細胞／ウェルの密度で播種し、Ｃｏｓｔａｒ９６ウェル黒壁／透明底プレート内でＮＭＪに分化させた。２０日目に増殖培地を取り除き、３７℃で１時間にわたって細胞に１００μＬのＦｌｕｏ−８記録培地を添加した。それらの細胞をＰＢＳで２度洗浄し、次にＩｎ  Ｃｅｌｌ  Ａｎａｌｙｚｅｒ  ２０００で撮像した。Ｆ／Ｆ０比率として蛍光強度を表した。【００５１】
ＦＤＳＳ（浜松ホトニクス）による解析
ＭｙｏＤ−２０１Ｂ７細胞を２．２×１０４細胞／ウェルの密度でマトリゲル被覆９６ウェル黒壁／透明底プレートに播種した。それらの培養物が収縮し始めるまで毎日各ウェルの半量の培地を交換した。増殖培地を取り除き、３７℃で１時間にわたって細胞に１００μＬのＦｌｕｏ−８記録培地を負荷した。それらの細胞をＰＢＳで２度洗浄し、次にウェルに分化培地を添加した。ＦＤＳＳマイクロプレートリーダーでＣａオシレーションをモニターし、１分の間隔でデータポイントを収集し、頻度および振幅の定量用のＦＤＳＳソフトウェアを使用してそれらのデータポイントを分析した。【００５２】
統計
統計分析にはＭｉｃｒｏｓｏｆｔ  Ｅｘｃｅｌ  ２０１３の統計関数を使用した。結果を平均値±ＳＥＭとして表した。ステューデントのｔ検定およびウィルコクソンの順位和検定を用いて統計学的有意性を決定した。Ｐ＜０．０５を有意であると見なした。【００５３】
透過電子顕微鏡法
ＮＭＪ培養物を４℃で０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）中の２％パラホルムアルデヒドと２％グルタルアルデヒド中で一晩にわたって前固定した。１％四酸化オスミウム溶液中で後固定を室温で１時間にわたって行った。エタノール（３０％、５０％、７０％、９０％、９５％および１００％）内で試料を脱水し、Ｅｐｏｎ樹脂中に包埋した。超薄切片（８０ｎｍ）を切断し、酢酸ウラニルとアルカリ性クエン酸鉛で染色した。透過電子顕微鏡（Ｈ−７６５０、日立）でそれらの標本を検査した。【００５４】
走査電子顕微鏡法
ＳＥＭ観察用の試料を４℃で２％パラホルムアルデヒドと２％グルタルアルデヒド中で一晩にわたって前固定した。１％四酸化オスミウム溶液中で後固定を室温で１時間にわたって行った。濃度等級を割り当てたエタノール（３０％、５０％、７０％、９０％、９５％および１００％）内で試料を脱水し、残留水分を除去するために臨界点乾燥機で乾燥した。それらの試料に陰極スプレー法によりプラチナを被覆し、その後で走査電子顕微鏡（Ｓ−４７００、日立）で撮像した。【００５５】
免疫細胞化学（ＩＣＣ）標識
使用した一次抗体は、抗ニューロフィラメント（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ番号ＭＡＢ５２５４、１：５００）、抗シナプス小胞プロテイン２（ＤＳＨＢ番号ＳＶ２、１：２０）、抗ＭＨＣ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ番号Ａ４．１０２５、１：１０００）、抗Ｉｓｌｅｔ１（ＤＳＨＢ番号４０．２Ｄ６、１：１００）、抗ＨＢ９（ＤＳＨＢ番号８１．５Ｃ１０、１：１００）、抗ＣｈＡＴ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ番号ＡＢ１４４Ｐ、１：１００）および抗Ｔｕｊ１（Ｃｏｖａｎｃｅ番号ＭＭＳ４３５Ｐ、１：１０００）であった。複合体化抗ＢＴＸ−６４７（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を０．５ｕｇ／ｍｌの濃度で使用した。共焦点顕微鏡（Ｆｌｕｏ  Ｖｉｅｗ−１０００、オリンパス、またはＬＳＭ−７１０、Ｚｅｉｓｓ）により試料を画像化した。【００５６】
光遺伝学的活性化
光活性化ドメインを含むプラスミド（ｐＬｅｎｔｉ−Ｓｙｎａｐｓｉｎ−ｈＣｈＲ２（Ｈ１３４Ｒ）−ＥＹＦＰ−ＷＰＲＥ、Ａｄｄｇｅｎｅプラスミド番号２０９４５）はカール・ダイセロス（Karl Deisseroth）からＡｄｄｇｅｎｅに寄託されたものを購入して用いた。標的遺伝子を神経性細胞に形質導入するためにレンチウイルス形質導入システム（ＶｉｒａＰｏｗｅｒ  ｈｉｐｅｒｆｏｒｍレンチウイルス発現システム、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用した。ＮＭＪ培養物を３７℃で４８時間にわたって５％ＣＯ２でウイルスを含む培地で処理した。ウイルス感染後、その培地を取り除き、ニューロベーサル培地を標的遺伝子の発現のために加えた。その培地を３〜４日毎に交換した。適切な光学的設定を用いた共焦点顕微鏡観察によりＥＹＦＰ発現を検査した。光活性化を４８８ｎｍのレーザー波長により実施した。ＥＹＦＰシグナルに加えて筋肉運動分析のために明視野像を同時に撮像した。【００５７】
定量
ＭｅｔａＭｏｒｐｈソフトウェア（モレキュラーデバイス、米国）により画像分析と定量を行った。【００５８】
結果と考察
ドキシサイクリン（ＤＯＸ）誘導性ベクターによるＭＹＯＤ１の一時的発現によってｈｉＰＳＣは効率的に成熟筋管（myotubes）に誘導される。この方法を用いることによって我々はまずＤｏｘ誘導性コンストラクトを形質移入した２０１Ｂ７−ｉＰＳＣクローン（２０１Ｂ７ＭＹＯＤ）を筋管に分化させた。１０日目に神経細胞分化に適した培地に切り替えることで（図１Ａ）、２０日目に筋管の表面上に集合し、軸索末端に対して並置されたＡＣｈＲが検出され、ＮＭＪ様の構造体を得ることができた（図１Ｅ）。その構造体中にはシュワン細胞も検出された（図１Ｆ）。
シナプス前細胞種およびシナプス後細胞種に関係するマーカーが検出された（図１Ｃ、１Ｄ）。
電子顕微鏡（ＥＭ）像よりＮＭＪ培養物の中で筋管に結合する軸索末端の膨張および終末ボタンの上を覆うシュワン細胞が示された（図１Ｇおよび図１Ｉ）。
シナプス小胞とミトコンドリアが、高電子密度活動帯によって明確に分割される（図１Ｈ、Ｉ）ＮＭＪの前シナプス部位と後シナプス部位に蓄積した。
これらの観察結果より我々のインビトロＮＭＪはＮＭＪの主要な細胞種を含有しており、構造的にもＮＭＪの特徴を備えていた。【００５９】
次に我々はｈＮＭＪ培養物がインビボのシナプス形成を通した構造的および形態的変化を再現するか観察した。２０日目にいわゆる「プラーク様」クラスタリングという神経終末によって占められている、全てではないが輪郭がはっきりとした領域がＡＣｈＲによって形成され、未熟な胚性ＮＭＪであることを表した。６０日目までにそのプラークに穴が開き、ＭＮ軸索末端と完全に並び、接合部に「プレッツェル様」の外観を与えた（図１Ｂ）。ＡＣｈＲの形態変化と並行してγからεへのＡＣｈＲサブユニットの変換も起こった（図１Ｂ）。インビボのＮＭＪの発生では多重神経支配が最初に起こり、各筋管への１本を除いて全ての軸索の入力が神経可塑性の結果として取り除かれる。我々の培養条件では後期ステージになるとニューロンとＮＭＪの数が減少し（図１Ｅ）、インビトロでのｈＮＭＪの成熟中に神経選別が実際に起こることを示した。ＥＭ画像分析を通して筋肉の構造線維とＺ線、多分岐軸索末端およびネクローシス様のシナプス除去の過程が観察された（図２ａ〜ｃ）。内側に密集したシナプス小胞を有する成熟ＮＭＪの軸索末端はシナプス後肥厚部に対して並列している細胞マトリックス沈着部、活動帯を示した（図２ｄ、ｅ）。神経下間隙（subneural cleft）の突出している空間が筋鞘によって囲まれており、その空間にＡＣｈＲが局在した（図２ｆ）。
このように、我々はＮＭＪ培養系において一連のｈＮＭＪ発生ステージを観察することができた。【００６０】
シナプス部位にＡＣｈＲを蓄積し、且つ、安定化させる神経因子であるアグリンのインビトロＮＭＪ系に対する寄与を調べた。アグリンの投与は長期培養物においてＮＭＪの領域を増大させたが、一方で抗アグリン抗体の存在下では筋管の残余物と劣化した軸索末端だけがその培養物の中に残された（図２ｇ、ｈ）。したがって、アグリンはインビボと同様、我々のインビトロ系において、ｈＮＭＪの形成と維持に重要な役割を果たすことがわかった。【００６１】
１５日目〜２５日目に各培養物の全領域が突発的な同期された収縮様運動をよく示した。その運動は筋管の細胞内Ｃａ２＋濃度の上昇と完全に同期され、且つ、骨格筋弛緩薬ダントロレンによって阻害されたが、これはその運動が実際に筋管収縮であることを示している（図３Ａ）。さらに、筋管の興奮はニューロンからのＡｃｈの放出を促進するＣａ２＋によって増強され、且つ、ＡＣｈＲの競合的阻害剤であるクラーレによって縮小された。これはＡＣｈＲを介して筋肉の収縮が引き起こされたことを示している（図３Ｂ）。したがって、筋管の収縮はニューロンと筋管との間の機能的シナプス連結を介した突発的な神経細胞活性によって支配されると考えられた。
電気的活動の細胞間伝播を可能にする筋管と筋管との間の細胞間チャネルであるギャップジャンクションがＮＭＪの発生中に一時的に発現される。我々が運動ベクトル分析のフレームレートを増加することにより収縮を詳しく観察したとき、筋管の収縮は完全に同期されていなかったが、それは隣接する領域に伝播した（図３Ｃ）。その収縮の伝播はギャップジャンクション阻害剤ｇａｐ２７によって中断され、この収縮がギャップジャンクションを介した活動電位の伝播によって引き起こされることを示した（図３Ｄ）。
このように、我々のインビトロＮＭＪがインビボＮＭＪ発生の初期ステージにおける重要な特徴を再現していることがこれらの機能分析から示された。【００６２】
次に、我々はレンチウイルス感染により長期ＮＭＪ培養物に光活性化チャネルを導入することでニューロンを活性化した。ＮＭＪ分化の１００日目にｓｙｎａｐｓｉｎ１プロモーターにより駆動されるチャネルロドプシン−ＥＹＦＰ（ＣｈＲ２−ＥＹＦＰ）の発現によってＮＭＪの分子的改変神経性細胞を可視化した（図４ａ）。青色光によってのみ筋肉収縮が引き起こされ、このことからその光活性化系の確立に成功していることが示された（図４ｂ）。青色光レーザーによって刺激されてもＣｈＲ２−ＥＹＦＰが無いウェルでは収縮が観察されなかった（データを示さず）。その培養物へのクラーレ投与により収縮が阻害され、このインビトロ系ではＡｃｈ−Ａｃｈ軸によって実際に筋肉収縮が引き起こされることが示された（図４ｃ）。
このように、光遺伝学的ＮＭＪ系により長期培養中の我々のＮＭＪの機能的成熟が証明された。【００６３】
次に、我々はＮＭＪ培養における運動神経の存在比を、免疫染色とフローサイトメトリーで確認した。詳細は次の通りである。【００６４】
免疫染色と画像解析
ＮＭＪ培養から培地を除去し、ＰＢＳで１分間の洗浄を３回行い、４％パラホルムアルデヒド／ＰＢＳを用いて室温で１０分間固定した。0.1% BSA/PBSで３回洗浄し、４％パラホルムアルデヒド＋0.1% Tritonを用いて室温で１０分間透過処理をした。0.1% BSA/PBSで５分間の再水和を３回行い、0.1% BSA/PBS + 0.5% Tween-20を用いて室温で１時間のブロッキング処理をし、パラフィルム層を備えたペトリ皿にカバースリップを移動して乾燥させた。５０μｌのPBSで希釈した一次抗体（Islet1又はNeuNに対する抗体）を用いて室温で１時間反応させ、PBSで５分間の洗浄を３回行い、PBSで希釈した二次抗体を用いて室温で１時間反応させ（遮光下）、PBSで５分間の洗浄を３回行った。スライドをddH2Oで数回洗浄して乾燥した。５μｌのグリセロール：PBS (1:1)を加え、共焦点顕微鏡（LSM-710, Zeiss）で観察した。画像解析にはMetaMorphソフトウェア (Molecular devices、米国) を用いた。【００６５】
フローサイトメトリー
ＮＭＪ培養から培地を除去し、トリプシンで細胞を剥離し、PBSで１分間の洗浄を３回行い、４％パラホルムアルデヒド／ＰＢＳを用いて室温で１０分間固定した。0.1% BSA/PBSで３回洗浄し、４％パラホルムアルデヒド＋0.1% Tritonを用いて室温で５分間透過処理をした。0.1% BSA/PBSで１分間の洗浄を３回行い、0.1% BSA/PBSを用いて室温で２０分間のブロッキング処理をした。PBSで希釈した一次抗体（Islet1又はHB9に対する抗体）を用いて室温で１時間反応させ、PBSで洗浄を３回行い、PBSで希釈した二次抗体を用いて室温で４５分間反応させ（遮光下）、PBSで１分間の洗浄を３回行った。フローサイトメーター（Aria 2, BD）とFlowJoソフトウェア（BD）を用いて解析を行った。【００６６】
結果
免疫染色の結果から、運動神経は30日目くらいから認められ、その割合は60日目で神経細胞全体の27.4%（NeuN陽性細胞に対するIslet1陽性細胞の割合）であることがわかった（図５Ａ）。
また、フローサイトメトリーの結果から、培養30日目においては全細胞数の13.16%がHB9陽性細胞であり、19.61%がIslet1陽性細胞であり、培養60日目においては全細胞数の4.56%がHB9陽性細胞であり、10.84%がIslet1陽性細胞であることがわかった（図５Ｂ）。【００６７】
次に、我々は脊髄性筋萎縮症患者の病態モデル構築のため、ＭｙｏＤ−２０１Ｂ７細胞のSMN（survival of motor neuron）タンパクをノックダウンした細胞（201B7MYOD-SMNKD細胞）を作成し、上記と同様の方法によりNMJを形成させた。詳細は次の通りである。【００６８】
ウェスタンブロット
作成した201B7MYOD-SMNKD細胞におけるSMNタンパク発現をウェスタンブロット法で解析した。【００６９】
免疫染色
培養30日目の201B7MYOD-SMNKD細胞について、一次抗体としてNF+SV2又はAChRに対する抗体を用いて前述の免疫染色と同様のプロトコールで免疫染色をした。【００７０】
走査電子顕微鏡法
ＰＢＳ（ｐＨ７．４）で希釈した、２％パラホルムアルデヒド＋２％グルタルアルデヒドで組織を１時間固定し、０．１Ｍカコジル酸緩衝液で５分間、３回の完全な洗浄を行い、０．１Ｍカコジル酸緩衝液で希釈した１％四酸化オスミウムで組織を６０分間固定し、０．１Ｍカコジル酸緩衝液で１５分間、３回の完全な洗浄を行った。リン酸緩衝液で希釈した下記グレードのエタノールで順に脱水した：３０％エタノールで５分間、５０％エタノールで５分間、７０％エタノールで５分間、９０％エタノールで１０分間、９５％エタノールで１５分間を２回、１００％エタノールで３０分間を３回。その後、臨界点乾燥し、スタッドに固定し、スパッタ被覆し、デシケーターに保管し、走査電子顕微鏡（S-4700, Hitachi）で観察した。【００７１】
透過電子顕微鏡法
１００ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で希釈した、２％パラホルムアルデヒド＋２％グルタルアルデヒドでサンプルを２〜２４時間にわたり前固定し、０．１Ｍカコジル酸緩衝液で希釈した１％四酸化オスミウムで１〜２時間にわたり室温で後固定し、次の順で脱水した：３０％アセトンで１５分間、５０％アセトンで１５分間、７０％アセトンで１５分間、９０％アセトンで１５分間、１００％アセトンで３０分間を３回。その後、樹脂包埋（Epon mixを用い、アセトンで１５分間の処理を２回）、樹脂浸透（２：１混合のアセトン：樹脂で１時間、次いで、１：１混合のアセトン：樹脂で１時間、１：２混合のアセトン：樹脂で１時間、１００％樹脂でオーバーナイト）をし、その後、新鮮な樹脂に置換して１時間処理した。その後、鋳型中で新鮮な樹脂に包埋し、６０〜７０℃で７２時間重合した。超薄切片化し、透過型電子顕微鏡（H-7650, Hitachi）で観察し、成熟筋管（myotubes）の収縮の運動解析を行った。記録及び解析は、SI8000 Cell Motion Imaging System（Sony Corporation)を用いて行った。【００７２】
結果
201B7MYOD-SMNKD細胞におけるSMNタンパク発現量は、SMNタンパクをノックダウンしていない201B7MYOD細胞の同発現量に対して６０％程度低下することがわかった（図６Ａ）。
201B7MYOD-SMNKD細胞（SMN KD）におけるＮＭＪの領域は、201B7MYOD細胞（Control）のそれよりも顕著に小さかった（図６Ｂ）。
201B7MYOD細胞（Control）培養のＳＥＭ画像では、非常に伸長したmyotubeと軸索の束が観察され、広がった軸索末端にアンカーしたmyotubeが観察された（図６Ｃ）。
201B7MYOD-SMNKD細胞（SMN KD）培養では、201B7MYOD細胞（Control）培養よりも、myotubeが平坦で薄く、軸索末端は少なかった。また、細胞内のmyotube、及びＮＭＪ関連構造の細部は、201B7MYOD細胞（Control）培養との間で全く異なっていた。201B7MYOD-SMNKD細胞におけるミトコンドリアの形態及び状態は損傷しており、筋繊維はその構造の中で完全な状態であるものは少なかった（図６Ｄ）。
機能的な差異を評価するために観察したＮＭＪ依存性筋肉収縮の振幅とパターンについては、201B7MYOD細胞（Control）に比べ、201B7MYOD-SMNKD細胞（SMN KD）では、収縮領域が小さかった。また、201B7MYOD-SMNKD細胞（SMN KD）では収縮の同期は崩壊しており、201B7MYOD細胞（Control）に比べ、筋肉収縮の最大速さは小さかった（図６Ｅ）。
201B7MYOD-SMNKD細胞では、筋肉収縮の間、myotubeの崩壊がよく観察されたが、201B7MYOD細胞では脆弱性は観察されなかった（図６Ｆ）。
この現象は、SMA-myotubeが筋肉収縮に影響を受けやすい可能性を有しており、SMA患者で見られる筋委縮と関連があることを示唆していると考えられる。【００７３】
以上のように、NMJ形成頻度の低下と、筋肉細胞の脆弱化が見られ、NMJからの刺激によって収縮する筋肉細胞の領域が低下することがわかった。
したがって、本発明のインビトロＮＭＪ誘導方法が疾患モデルや薬剤評価に使用できることが明らかとなった。【００７４】
本発明のインビトロＮＭＪ培養法により、ｉＰＳＣにおいてＭｙｏＤを一時的に発現させ、その後神経分化を誘導するという簡便な二次元培養の操作で、骨格筋、ＭＮおよびシュワン細胞という３種類の細胞から構成されるＮＭＪがインビボの発生過程に従って分化した。本発明の方法はＮＭＪ構築における筋形成と神経形成のバランスが適切であり、ＮＭＪの形成と維持における神経、筋およびシュワン細胞等の各細胞間の複雑な相互のシグナルを再現している。そして、得られたＮＭＪは外観的にも機能的にも成熟したＮＭＪの特徴を示しているので、疾患モデルのプラットフォームとすることができ、ＮＭＪの発生や機能障害に基づく疾患に対して、細胞療法や薬剤効果などに貢献するものである。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図１Ｅ】
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【図１Ｆ】
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【図１Ｇ】
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【図１Ｈ】
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【図１Ｉ】
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【図１Ｊ】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図６Ｄ】
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【図６Ｅ】
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【図６Ｆ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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