(57)【要約】哺乳動物の内胚葉組織又は器官（肝臓を除く）由来の細胞から、当該細胞の幹／前駆細胞を作製する方法であって、インビトロで前記内胚葉組織又は器官由来の細胞にＴＧＦβ受容体阻害薬を接触させることを含む、前記方法。【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳動物の内胚葉組織又は器官（肝臓を除く）由来の細胞から、当該細胞の幹／前駆細胞を作製する方法であって、インビトロで前記内胚葉組織又は器官由来の細胞にＴＧＦβ受容体阻害薬を接触させることを含む、前記方法。
【請求項２】
さらに、ＧＳＫ３阻害薬及び／又はＲＯＣＫ阻害薬を、インビトロで前記内胚葉組織又は器官由来の細胞に接触させることを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
さらに、ＧＳＫ３阻害薬及びＲＯＣＫ阻害薬を、インビトロで前記内胚葉組織又は器官由来の細胞に接触させることを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
内胚葉組織又は器官が、消化管、肺、甲状腺、膵臓、分泌腺、腹膜、胸膜、喉頭、耳管、気管、気管支、膀胱、尿道又は尿管である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
内胚葉組織又は器官が膵臓である請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
膵臓由来の細胞が膵外分泌細胞である請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記膵外分泌細胞と前記ＴＧＦβ受容体阻害薬との接触が、該阻害薬の存在下で該膵外分泌細胞を培養することにより実施される、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記膵外分泌細胞と前記ＧＳＫ３阻害薬及び／又は前記ＲＯＣＫ阻害薬との接触が、該阻害薬の存在下で該膵外分泌細胞を培養することにより実施される、請求項６又は７に記載の方法。
【請求項９】
哺乳動物がヒト、ラット又はマウスである、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
以下の特徴を有する哺乳動物の膵外分泌細胞由来の膵幹／前駆細胞。
（ａ）自己再生能を有する
（ｂ）膵内分泌細胞に分化し得る
（ｃ）Ｐｄｘ１及びＮｋｘ６．１を発現するが、インスリンを発現しない
【請求項１１】
ＴＧＦβ受容体阻害薬を含む、哺乳動物の内胚葉組織又は器官（肝臓を除く）由来の細胞から当該細胞の幹／前駆細胞への誘導剤。
【請求項１２】
ＧＳＫ３阻害薬及び／又はＲＯＣＫ阻害薬の組み合わせをさらに含む、請求項１１に記載の誘導剤。
【請求項１３】
ＧＳＫ３阻害薬及びＲＯＣＫ阻害薬の組み合わせをさらに含む、請求項１１に記載の誘導剤。
【請求項１４】
内胚葉組織又は器官が、消化管、肺、甲状腺、膵臓、分泌腺、腹膜、胸膜、喉頭、耳管、気管、気管支、膀胱、尿道又は尿管である、請求項１１〜１３のいずれか１項に記載の誘導剤。
【請求項１５】
内胚葉組織又は器官が膵臓である請求項１１〜１３のいずれか１項に記載の誘導剤。
【請求項１６】
膵臓由来の細胞が膵外分泌細胞である請求項１５に記載の誘導剤。
【請求項１７】
哺乳動物がヒト、ラット又はマウス由来である、請求項１１〜１６のいずれか１項に記載の誘導剤。
【請求項１８】
請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法により得られた幹／前駆細胞、又は請求項１０に記載の膵幹／前駆細胞の維持又は増幅剤として使用される、請求項１１〜１７のいずれか１項に記載の誘導剤。
【請求項１９】
請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法により得られた幹／前駆細胞、又は請求項１０に記載の膵幹／前駆細胞の維持又は増幅方法であって、コラーゲン又はマトリゲルでコーティングした培養容器上で、ＴＧＦβ受容体阻害薬、ＧＳＫ３阻害薬及びＲＯＣＫ阻害薬の存在下で、当該幹／前駆細胞又は膵幹／前駆細胞を継代培養することを特徴とする、前記方法。
【請求項２０】
請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法により得られた幹／前駆細胞、又は請求項１０に記載の膵幹／前駆細胞から、哺乳動物の内胚葉組織又は器官由来の細胞、又は膵外分泌細胞に誘導する方法であって、ＴＧＦβ受容体阻害薬、ＧＳＫ３阻害薬及びＲＯＣＫ阻害薬の存在下で前記幹／前駆細胞、又は膵幹／前駆細胞を培養する工程を含む、前記方法。
【請求項２１】
被検化合物の哺乳動物体内での代謝を評価する方法であって、
（ｉ）請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法により得られた幹／前駆細胞、請求項１０に記載の膵幹／前駆細胞、又は請求項２０に記載の方法により得られた細胞に被検化合物を接触させる工程、及び
（ｉｉ）前記細胞における被検化合物の代謝を測定する工程
を含む、方法。
【請求項２２】
細胞が分泌する酵素の分泌誘導物質のスクリーニング方法であって、
（ｉ）請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法により得られた幹／前駆細胞、請求項１０に記載の膵幹／前駆細胞、又は請求項２０に記載の方法により誘導された細胞に被検化合物を接触させる工程、及び
（ｉｉ）前記細胞において分泌された物質を測定する工程、
を含む、前記方法。
【請求項２３】
哺乳動物に対する被検化合物の内胚葉組織又は器官毒性を評価する方法であって、
（ｉ）請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法により得られた幹／前駆細胞、請求項１０に記載の膵幹／前駆細胞、又は請求項２０に記載の方法により得られた細胞に被検化合物を接触させる工程、及び
（ｉｉ）被検化合物と接触した細胞における障害の有無又はその程度を測定する工程
を含む、前記方法。
【請求項２４】
請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法により得られた幹／前駆細胞、請求項１０に記載の膵幹／前駆細胞、又は請求項２０に記載の方法により得られた細胞を含む、内胚葉組織又は器官障害改善剤。
【請求項２５】
哺乳動物における内胚葉組織又は器官障害の改善方法であって、当該組織又は器官障害を有する哺乳動物に、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法により得られた幹／前駆細胞、請求項１０に記載の膵幹／前駆細胞、又は請求項２０に記載の方法により誘導された細胞の有効量を投与することを含む、前記方法。
【請求項２６】
内胚葉組織又は器官障害改善剤として使用するための、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法により得られた幹／前駆細胞、請求項１０に記載の膵幹／前駆細胞、又は請求項２０に記載の方法により得られた細胞。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、低分子化合物による内胚葉組織又は器官由来細胞からの幹／前駆細胞の作製方法に関し、特に、低分子化合物による成熟膵外分泌細胞からの膵幹／前駆細胞の作製方法、及び当該低分子化合物を含んでなる成熟膵外分泌細胞からの膵幹／前駆細胞誘導剤等に関する。
【背景技術】
【０００２】
幹細胞生物学の進歩は、再生医療におけるその応用に対する大きな関心を呼んでいるが、いまだその実現には至っていない。最も期待される細胞ソースの１つである人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）は腫瘍形成リスクが依然として存在し、実臨床への応用の目処はたっていない（Ｃｅｌｌ．２０１４  Ｏｃｔ  ９；１５９（２）：４２８−３９）（Ｃｅｌｌ  Ｍｅｔａｂ．２０１６  Ａｐｒ  １２；２３（４）：６２２−６３４．）。一方、最近の研究により、異なる系譜の細胞を前駆細胞様の細胞に直接転換（ダイレクトリプログラミング）し得ることが示されたが、ダイレクトリプログラミングは、ｉＰＳ細胞の場合と同様、遺伝子改変を伴うため、予期せぬリスクが依然として存在し、再生医療に応用できないでいる。（Ｎａｔ  Ｃｏｍｍｕｎ．２０１６  Ｊａｎ  ６；７：１００８０．）（Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ．２０１６  Ｍａｒ  ３；１８（３）：４１０−２１．）（Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０１４  Ｄｅｃ；３２（１２）：１２２３−３０．）【０００３】
最近、膵臓が傷害されると、成体膵外分泌細胞より増殖性かつ両能性の膵幹／前駆細胞を単離し得るという驚くべき発見が報告された（ＥＭＢＯ  Ｊ．２０１３  Ｏｃｔ  １６；３２（２０）：２７０８−２１．）。これらの革新的な発見は、膵幹細胞理論だけでなく、膵再生研究にも大いなる洞察を与えるものである。即ち、このようなリプログラミングをインビトロで再現することができれば、そうして得られる幹／前駆細胞は、再生医療における新たな細胞ソースとなるものと期待される。
しかしながら、遺伝子改変を伴わずに、成熟細胞を幹／前駆細胞にリプログラムする方法は全く知られていない。【０００４】
本発明者らや他のグループは以前、ある種の低分子阻害薬の組み合わせが、幹細胞の多能性の誘導及び維持に寄与することを報告した（Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ．２０１０  Ａｕｇ  １０；１０７（３２）：１４２２３−８．）（Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ．２０１７  Ｊａｎ  ５；２０（１）：４１−５５）（Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ．２０１６  Ｏｃｔ  ６；１９（４）：４４９−４６１）。
また本発明者は、低分子化合物による成熟肝細胞から肝幹／前駆細胞を作製することに成功した（ＷＯ２０１７／１１９５１２）
しかしながら、これらの低分子阻害薬の、肝細胞以外についての成熟細胞から幹／前駆細胞へのリプログラミングに対する寄与に関する報告は皆無である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】国際公開２０１７／１１９５１２号パンフレット
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｃｅｌｌ．２０１４  Ｏｃｔ  ９；１５９（２）：４２８−３９
【非特許文献２】Ｃｅｌｌ  Ｍｅｔａｂ．２０１６  Ａｐｒ  １２；２３（４）：６２２−６３４．
【非特許文献３】Ｎａｔ  Ｃｏｍｍｕｎ．２０１６  Ｊａｎ  ６；７：１００８０．
【非特許文献４】Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ．２０１６  Ｍａｒ  ３；１８（３）：４１０−２１．
【非特許文献５】Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０１４  Ｄｅｃ；３２（１２）：１２２３−３０．
【非特許文献６】ＥＭＢＯ  Ｊ．２０１３  Ｏｃｔ  １６；３２（２０）：２７０８−２１．
【非特許文献７】Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ．２０１０  Ａｕｇ  １０；１０７（３２）：１４２２３−８．
【非特許文献８】Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ．２０１７  Ｊａｎ  ５；２０（１）：４１−５５
【非特許文献９】Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ．２０１６  Ｏｃｔ  ６；１９（４）：４４９−４６１
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の目的は、遺伝子改変を伴わずに、成熟細胞を幹／前駆細胞に効率よくリプログラムする方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明者らは、上記の目的を達成すべく鋭意研究を重ねた結果、ＴＧＦβ受容体阻害薬、グリコーゲン合成酵素キナーゼ３（ＧＳＫ３）阻害薬、およびＲｈｏキナーゼ（ＲＯＣＫ）阻害薬の存在下で哺乳動物の成熟細胞（例えば成熟膵外分泌細胞）を培養すると、膵外分泌細胞を、増殖性でかつ膵内分泌細胞に分化し得る細胞にリプログラムし得ることを見出した。このようにして得られた成熟膵外分泌細胞由来の膵幹／前駆細胞は、糖尿病モデルマウスに移植すると、成熟膵内分泌細胞として生着しうることを示した。
本発明者らは、これらの知見に基づいてさらに研究を重ねた結果、本発明を完成させるに至った。【０００９】
即ち、本発明は以下の通りである。
（１）哺乳動物の内胚葉組織又は器官（肝臓を除く）由来の細胞から、当該細胞の幹／前駆細胞を作製する方法であって、インビトロで前記内胚葉組織又は器官由来の細胞にＴＧＦβ受容体阻害薬を接触させることを含む、前記方法。
（２）さらに、ＧＳＫ３阻害薬及び／又はＲＯＣＫ阻害薬を、インビトロで前記内胚葉組織又は器官由来の細胞に接触させることを含む、（１）に記載の方法。
（３）さらに、ＧＳＫ３阻害薬及びＲＯＣＫ阻害薬を、インビトロで前記内胚葉組織又は器官由来の細胞に接触させることを含む、（１）に記載の方法。
（４）内胚葉組織又は器官が、消化管、肺、甲状腺、膵臓、分泌腺、腹膜、胸膜、喉頭、耳管、気管、気管支、膀胱、尿道又は尿管である、（１）〜（３）のいずれか１項に記載の方法。
（５）内胚葉組織又は器官が膵臓である（１）〜（４）のいずれか１項に記載の方法。
（６）膵臓由来の細胞が膵外分泌細胞である（５）に記載の方法。
（７）前記膵外分泌細胞と前記ＴＧＦβ受容体阻害薬との接触が、該阻害薬の存在下で該膵外分泌細胞を培養することにより実施される、（６）に記載の方法。
（８）前記膵外分泌細胞と前記ＧＳＫ３阻害薬及び／又は前記ＲＯＣＫ阻害薬との接触が、該阻害薬の存在下で該膵外分泌細胞を培養することにより実施される、（６）又は（７）に記載の方法。
（９）哺乳動物がヒト、ラット又はマウスである、（１）〜（８）のいずれか１項に記載の方法。
（１０）以下の特徴を有する哺乳動物の膵外分泌細胞由来の膵幹／前駆細胞。
（ａ）自己再生能を有する
（ｂ）膵内分泌細胞に分化し得る
（ｃ）Ｐｄｘ１及びＮｋｘ６．１を発現するが、インスリンを発現しない
（１１）ＴＧＦβ受容体阻害薬を含む、哺乳動物の内胚葉組織又は器官（肝臓を除く）由来の細胞から当該細胞の幹／前駆細胞への誘導剤。
（１２）ＧＳＫ３阻害薬及び／又はＲＯＣＫ阻害薬の組み合わせをさらに含む、（１１）に記載の誘導剤。
（１３）ＧＳＫ３阻害薬及びＲＯＣＫ阻害薬の組み合わせをさらに含む、（１１）に記載の誘導剤。
（１４）内胚葉組織又は器官が、消化管、肺、甲状腺、膵臓、分泌腺、腹膜、胸膜、喉頭、耳管、気管、気管支、膀胱、尿道又は尿管である、（１１）〜（１３）のいずれか１項に記載の誘導剤。
（１５）内胚葉組織又は器官が膵臓である（１１）〜（１３）のいずれか１項に記載の誘導剤。
（１６）膵臓由来の細胞が膵外分泌細胞である（１５）に記載の誘導剤。
（１７）哺乳動物がヒト、ラット又はマウス由来である、（１１）〜（１６）のいずれか１項に記載の誘導剤。
（１８）（１）〜（９）のいずれか１項に記載の方法により得られた幹／前駆細胞、又は（１０）に記載の膵幹／前駆細胞の維持又は増幅剤として使用される、（１１）〜（１７）のいずれか１項に記載の誘導剤。
（１９）（１）〜（９）のいずれか１項に記載の方法により得られた幹／前駆細胞、又は（１０）に記載の膵幹／前駆細胞の維持又は増幅方法であって、コラーゲン又はマトリゲルでコーティングした培養容器上で、ＴＧＦβ受容体阻害薬、ＧＳＫ３阻害薬及びＲＯＣＫ阻害薬の存在下で、当該幹／前駆細胞又は膵幹／前駆細胞を継代培養することを特徴とする、前記方法。
（２０）（１）〜（９）のいずれか１項に記載の方法により得られた幹／前駆細胞、又は（１０）に記載の膵幹／前駆細胞から、哺乳動物の内胚葉組織又は器官由来の細胞、又は膵外分泌細胞に誘導する方法であって、ＴＧＦβ受容体阻害薬、ＧＳＫ３阻害薬及びＲＯＣＫ阻害薬の存在下で前記幹／前駆細胞、又は膵幹／前駆細胞を培養する工程を含む、前記方法。
（２１）被検化合物の哺乳動物体内での代謝を評価する方法であって、
（ｉ）（１）〜（９）のいずれか１項に記載の方法により得られた幹／前駆細胞、（１０）に記載の膵幹／前駆細胞、又は（２０）に記載の方法により得られた細胞に被検化合物を接触させる工程、及び
（ｉｉ）前記細胞における被検化合物の代謝を測定する工程
を含む、方法。
（２２）細胞が分泌する酵素の分泌誘導物質のスクリーニング方法であって、
（ｉ）（１）〜（９）のいずれか１項に記載の方法により得られた幹／前駆細胞、（１０）に記載の膵幹／前駆細胞、又は（２０）に記載の方法により誘導された細胞に被検化合物を接触させる工程、及び
（ｉｉ）前記細胞において分泌された物質を測定する工程、
を含む、前記方法。
（２３）哺乳動物に対する被検化合物の内胚葉組織又は器官毒性を評価する方法であって、
（ｉ）（１）〜（９）のいずれか１項に記載の方法により得られた幹／前駆細胞、（１０）に記載の膵幹／前駆細胞、又は（２０）に記載の方法により得られた細胞に被検化合物を接触させる工程、及び
（ｉｉ）被検化合物と接触した細胞における障害の有無又はその程度を測定する工程
を含む、前記方法。
（２４）（１）〜（９）のいずれか１項に記載の方法により得られた幹／前駆細胞、（１０）に記載の膵幹／前駆細胞、又は（２０）に記載の方法により得られた細胞を含む、内胚葉組織又は器官障害改善剤。
（２５）哺乳動物における内胚葉組織又は器官障害の改善方法であって、当該組織又は器官障害を有する哺乳動物に、（１）〜（９）のいずれか１項に記載の方法により得られた幹／前駆細胞、（１０）に記載の膵幹／前駆細胞、又は（２０）に記載の方法により誘導された細胞の有効量を投与することを含む、前記方法。
（２６）内胚葉組織又は器官障害改善剤として使用するための、（１）〜（９）のいずれか１項に記載の方法により得られた幹／前駆細胞、（１０）に記載の膵幹／前駆細胞、又は（２０）に記載の方法により得られた細胞。
【発明の効果】
【００１０】
本発明によれば、遺伝子改変を伴わずに、成熟細胞（例えば膵外分泌細胞）から、自己複製能と膵内分泌細胞への分化能（両能性）を有する膵幹／前駆細胞を、安全かつ迅速に誘導することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】膵前駆細胞誘導時における細胞形態の変化を示す図である。
【図２】膵前駆細胞誘導時における膵前駆細胞マーカーｍＲＮＡ発現の変化（マウス）を示す図である。
【図３】初回継代後における膵前駆細胞マーカーｍＲＮＡ発現（ラット）を示す図である。
【図４】インスリン分泌細胞クラスターを示す図である。
【図５】インスリン分泌細胞クラスターにおけるβ細胞マーカー分子ｍＲＮＡとＣペプチド分泌を示す図である。
【図６】Ｉｎｓｕｌｉｎ及びＧＬＵＴ２のｍＲＮＡ発現を示す図である。
【図７】膵内分泌細胞のグルコース濃度応答性を示す図である。
【図８】初回継代後における膵前駆細胞マーカーｍＲＮＡ発現を示す図である。
【図９】Ｉｎ  ｖｉｖｏでの糖尿病環境における移植細胞の組織像である。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
１．概要
本発明は、哺乳動物の内胚葉組織又は器官（肝臓を除く）由来の細胞から、当該細胞の幹／前駆細胞を作製する方法であって、インビトロで前記内胚葉組織又は器官由来の細胞にＴＧＦβ受容体阻害薬を接触させることを含む、前記方法を提供する。
前記の通り、低分子化合物を用いて、成熟肝細胞から肝幹／前駆細胞を作製する方法は、本発明者により成功している（ＷＯ２０１７／１１９５１２）。しかしながら、肝細胞以外の内胚葉器官又は組織については、成熟細胞から幹細胞又は前駆細胞（以下「幹／前駆細胞」という）にリプログラミングできるか否かは不明である。
【００１３】
本発明者は、肝細胞以外の細胞として膵臓を用いて、低分子化合物により膵幹細胞又は膵前駆細胞（以下「膵幹／前駆細胞」という）にリプログラミングすることに成功した。
本明細書において、「幹細胞」とは、自己複製能と、様々な細胞に分化する多分化能とを持つ細胞を意味し、「前駆細胞」とは、幹細胞から発生し、体を構成する特定の最終分化細胞へ分化する中間段階にある細胞を意味する。本明細書では、幹細胞又は前駆細胞を総称して、「幹／前駆細胞」と呼び、リプログラミングの対象となった細胞が膵臓細胞であれば「膵幹／前駆細胞」と表示する。
【００１４】
本発明において、「内胚葉」とは、後生動物の発生途中に生ずる三胚葉の一つであり、発生学的には、原腸形成の時期（嚢胚期）に原腸壁の全部又は一部を構成する。内胚葉は、消化管の主要部分とその付属腺（肝臓・膵臓）、甲状腺、肺などの呼吸器官に発達する。
本発明において、「内胚葉組織又は器官」としては、例えば消化管（食道、胃、小腸、大腸）、肺、膵臓、甲状腺、副甲状腺、喉頭、気管、気管支、膀胱、尿道、前立腺などである（但し、肝臓は除く）。
【００１５】
ところで、肝臓には２，０００種類以上もの酵素が存在し，様々な物質を化学的に作り変える代謝反応が絶え間なく営まれている。これが、肝臓が「生体の化学工場」と言われる所以であり、例えばインシュリンという単一のホルモン物質を作る機能しか持たない膵臓のベータ細胞や、内胚葉に属する一連の消化器系細胞など肝臓以外の内胚葉組織とは大きく異なっている。肝臓は体内で最も再生能力の高い細胞、臓器であり、肝臓と他の内胚葉組織とでリプログラミングの難度を比較した場合、肝臓以外の内胚葉組織のリプログラミングの方が、大幅に難度が高い。すなわち、成熟細胞へと分化を遂げた内胚葉由来細胞は、増殖能や代謝能、液性因子の分泌能などにおいて各臓器によって固有の特徴を有しており、成熟肝細胞において見出した現象が、成熟肝細胞特異的な現象であるのか、もしくは内胚葉由来成熟細胞において普遍的な現象であるのかはこれまで未知であった。
【００１６】
本発明は、肝臓以外の内胚葉組織又は器官についても、成熟細胞から幹／前駆細胞にリプログラミングし得ることを見出した。
本発明は、哺乳動物の内胚葉組織又は器官（肝臓を除く）由来の細胞に、ＴＧＦβ受容体阻害薬を、インビトロで接触させることを特徴とするが、グリコーゲン合成酵素キナーゼ３（ＧＳＫ３）阻害薬及びＲｈｏキナーゼ（ＲＯＣＫ）阻害薬のいずれか一方又は両者を、ＴＧＦβ受容体阻害薬とともに接触させることも含む。これにより、内胚葉組織又は器官由来の成熟細胞から、当該内胚葉組織又は器官の幹／前駆細胞を作製することができる。本発明の方法を、「本発明のリプログラミング法」ともいう。
【００１７】
２．成熟細胞からの幹／前駆細胞の誘導
本発明は、哺乳動物の内胚葉組織又は器官（肝臓を除く）由来の細胞から、当該細胞の幹／前駆細胞を作製する方法であって、インビトロで前記内胚葉組織又は器官由来の細胞にＴＧＦβ受容体阻害薬を接触させることを含む、前記方法を提供する。
本発明において、成熟膵外分泌細胞からの膵幹／前駆細胞を作製又は誘導するには、哺乳動物の膵外分泌細胞に、ＴＧＦβ受容体阻害薬、グリコーゲン合成酵素キナーゼ３（ＧＳＫ３）阻害薬、およびＲｈｏキナーゼ（ＲＯＣＫ）阻害薬を含む低分子シグナル伝達経路阻害薬を、インビトロで接触させることを含む。
【００１８】
本発明のリプログラミング法の出発材料として使用される内胚葉組織又は器官（肝臓を除く）由来の細胞（「成熟細胞」ともいう）としては、例えば、消化管上皮細胞、肺胞上皮細胞、膵実質細胞、甲状腺濾胞上皮細胞、尿路上皮細胞、前立腺上皮細胞が挙げられる。出発材料として膵実質細胞を使用する場合は、膵外分泌細胞、膵内分泌細胞などを使用することができる。「膵外分泌細胞」は、腺房細胞と膵管細胞に分類され、いずれか一方又は両者が膵幹／前駆細胞の始源になると考えられる。また、「膵内分泌細胞」はα細胞、β細胞、δ細胞、ε細胞、ＰＰ細胞に分類され、いずれかはすべてが膵幹／前駆細胞の始源になると考えられる。
【００１９】
本発明のリプログラミング法に用いる細胞は、いかなるソースから提供されてもよく、例えば、哺乳動物（例えば、ヒト、ラット、マウス、モルモット、ウサギ、ヒツジ、ウマ、ブタ、ウシ、サル等、好ましくはヒト、ラット、マウス）の胚性幹細胞（ＥＳ細胞）もしくはｉＰＳ細胞等の多能性幹細胞が挙げられる。
【００２０】
しかしながら、遺伝子改変を伴わない幹／前駆細胞を安全かつ迅速に提供するという本発明の主たる課題を考慮すれば、例えば膵外分泌細胞を使用する場合は、哺乳動物から摘出した膵臓から単離精製された膵外分泌細胞を使用することが望ましい。
例えばラットの場合、１０−２０週齢の成体ラットから摘出した膵臓を用いることが好ましいが、２ヶ月齢以下の幼若ラット由来の膵臓を用いてもよい。ヒトの場合、生検又は外科手術により得ることができる。例えば、膵実質、消化管上皮、肺胞上皮、前立腺上皮などいずれも生検により採取することができる。外科手術の場合は、切除した成人の膵臓組織片を用いることも、死亡胎児から切除した膵臓を用いることもできる。あるいは、これら摘出した膵臓から単離精製された膵外分泌細胞を凍結した細胞（凍結膵外分泌細胞）を用いることもできる。
【００２１】
哺乳動物の内胚葉組織又は器官由来の細胞を精製するには、組織を単離した後、酵素処理したのち、濾過、遠心分離等により精製する。
哺乳動物の膵臓又はその組織片から膵外分泌細胞を精製する方法としては、膵組織を単離した後、コラゲナーゼで膵臓を消化し、濾過、遠心等によってランゲルハンス島や非実質細胞、細胞片を除去して膵外分泌細胞を精製する。
【００２２】
上記のようにして調製された成熟細胞（例えば膵外分泌細胞）に、ＴＧＦβ受容体阻害薬を含む１以上の低分子シグナル伝達経路阻害薬を、インビトロで接触させる。
本発明に用いられるＴＧＦβ受容体阻害薬としては、トランスフォーミング増殖因子（ＴＧＦ）β受容体の機能を阻害する作用を有するものであれば特に限定されることはなく、例えば、２−（５−ベンゾ［１，３］ジオキソール−４−イル−２−ｔｅｒｔ−ブチル−１Ｈ−イミダゾール−４−イル）−６−メチルピリジン、３−（６−メチルピリジン−２−イル）−４−（４−キノリル）−１−フェニルチオカルバモイル−１Ｈ−ピラゾール（Ａ−８３−０１）、２−（５−クロロ−２−フルオロフェニル）プテリジン−４−イル）ピリジン−４−イルアミン（ＳＤ−２０８）、３−（ピリジン−２−イル）−４−（４−キノニル）］−１Ｈ−ピラゾール、２−（３−（６−メチルピリジン−２−イル）−１Ｈ−ピラゾール−４−イル）−１，５−ナフチリジン（以上、メルク社）、ＳＢ４３１５４２（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ社）などが挙げられる。好ましくはＡ−８３−０１が挙げられる。ＴＧＦβ受容体阻害薬には、ＴＧＦβ受容体アンタゴニストも含まれる。
これらのＴＧＦβ受容体阻害薬は、１種の化合物を用いてもよいし、２種以上の化合物を組み合わせて用いてもよい。
【００２３】
ＴＧＦβ受容体阻害薬以外の低分子シグナル伝達経路阻害薬としては、好ましくはＧＳＫ３阻害薬とＲＯＣＫ阻害薬とが挙げられる。
【００２４】
本発明に用いられるＧＳＫ３阻害薬としては、グリコーゲン合成酵素キナーゼ（ＧＳＫ）３の機能を阻害する作用を有するものであれば特に限定されることはなく、例えば、ＳＢ２１６７６３（Ｓｅｌｌｅｃｋ社）、ＣＨＩＲ９８０１４、ＣＨＩＲ９９０２１（以上、Ａｘｏｎ  ｍｅｄｃｈｅｍ社）、ＳＢ４１５２８６（Ｔｏｃｒｉｓ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）、Ｋｅｎｐａｕｌｌｏｎｅ（コスモ・バイオ社）などが挙げられる。好ましくはＣＨＩＲ９９０２１が挙げられる。
これらのＧＳＫ３阻害薬は、１種の化合物を用いてもよいし、２種以上の化合物を組み合わせて用いてもよい。
【００２５】
本発明に用いられるＲＯＣＫ阻害薬としては、Ｒｈｏ結合キナーゼの機能を阻害する作用を有するものであれば特に限定されない。ＲＯＣＫ阻害薬としては、例えば、ＧＳＫ２６９９６２Ａ（Ａｘｏｎ  ｍｅｄｃｈｅｍ社）、Ｆａｓｕｄｉｌ  ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ（Ｔｏｃｒｉｓ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）、Ｙ−２７６３２、Ｈ−１１５２（以上、和光純薬工業社）などが挙げられる。好ましくはＹ−２７６３２が挙げられる。
これらのＲＯＣＫ阻害薬は、１種の化合物を用いてもよいし、２種以上の化合物を組み合わせて用いてもよい。
【００２６】
ＧＳＫ３阻害薬とＲＯＣＫ阻害薬は、それぞれ単独で又は両者を組み合わせてＴＧＦβ受容体阻害薬とともに成熟細胞（例えば膵外分泌細胞）に接触させると、ＴＧＦβ受容体阻害薬のみを接触させた場合と比較して、幹／前駆細胞の誘導効率（「リプログラミング効率」ともいう）が顕著に上昇する。従って、本発明のリプログラミング法においては、ＴＧＦβ受容体阻害薬に加えて、ＧＳＫ３阻害薬及び／又はＲＯＣＫ阻害薬をさらに成熟細胞（例えば膵外分泌細胞）に接触させることが好ましい。
【００２７】
本発明において、ＴＧＦβ受容体阻害薬とＧＳＫ３阻害薬及び／又はＲＯＣＫ阻害薬との組み合わせを以下に示す。
（ａ）ＴＧＦβ受容体阻害薬としてＡ−８３−０１（Ａ）と、ＧＳＫ３阻害薬としてＣＨＩＲ９９０２１（Ｃ）との組み合わせ（ＡＣ）。
（ｂ）ＴＧＦβ受容体阻害薬としてＡ−８３−０１（Ａ）と、ＲＯＣＫ阻害薬としてＹ−２７６３２（Ｙ）との組み合わせ（ＹＡ）。
（ｃ）ＴＧＦβ受容体阻害薬としてＡ−８３−０１（Ａ）と、ＧＳＫ３阻害薬としてＣＨＩＲ９９０２１（Ｃ）及びＲＯＣＫ阻害薬としてＹ−２７６３２（Ｙ）との組み合わせ（ＹＡＣ）。
【００２８】
ＴＧＦβ受容体阻害薬にＧＳＫ３阻害薬及びＲＯＣＫ阻害薬を組み合わせて用いた場合、ＴＧＦβ受容体阻害薬とＧＳＫ３阻害薬とを組み合わせて用いた場合と比較して、リプログラミング効果には大きな差は認められないが、前者の方が、後者に比べて、得られる幹／前駆細胞の増殖能に優れている。従って、本発明の実施態様においては、ＴＧＦβ受容体阻害薬、ＧＳＫ３阻害薬及びＲＯＣＫ阻害薬の組み合わせを、成熟細胞（例えば膵外分泌細胞）に接触させることがさらに好ましい。
【００２９】
本発明のリプログラミング法においては、ＧＳＫ３阻害薬、ＲＯＣＫ阻害薬以外の低分子シグナル伝達経路阻害薬をＴＧＦβ受容体阻害薬と組み合わせることもできる。そのような阻害薬としては、例えばＭＥＫ阻害薬等が挙げられるが、これに限定されない。ＭＥＫ阻害薬としては、ＭＥＫ（ＭＡＰ  ｋｉｎａｓｅ−ＥＲＫ  ｋｉｎａｓｅ）の機能を阻害する作用を有するものであれば特に限定されることはなく、例えば、ＡＺＤ６２４４、ＣＩ−１０４０（ＰＤ１８４３５２）、ＰＤ０３２５９０１、ＲＤＥＡ１１９（ＢＡＹ８６−９７６６）、ＳＬ３２７、Ｕ０１２６−ＥｔＯＨ（以上、Ｓｅｌｌｅｃｋ社）、ＰＤ９８０５９、Ｕ０１２４、Ｕ０１２５（以上、コスモ・バイオ社）などが挙げられる。
【００３０】
本発明のリプログラミング法において、成熟細胞（例えば膵外分泌細胞）とＴＧＦβ受容体阻害薬を含む低分子シグナル伝達経路阻害薬との接触は、これらの阻害薬の存在下で成熟細胞を培養することにより行うことができる。具体的には、培地中に有効な濃度でこれらの阻害薬を添加して培養を行う。ここで培地としては、広く動物細胞の培養に用いられる培地を基礎培地として利用することができる。市販されている基礎培地を利用してもよく、それらとしては、例えば、最少必須培地（ＭＥＭ）、ダルベッコ改変最少必須培地（ＤＭＥＭ）、ＲＰＭＩ１６４０培地、１９９培地、Ｈａｍ’ｓ  Ｆ１２培地、Ｗｉｌｌｉａｍ’ｓ  Ｅ培地等が挙げられ、これらを単独で又は２種以上を組み合わせて用いることができるが、これらに特に限定されない。
【００３１】
培地への添加剤としては、例えば、各種アミノ酸（例えば、Ｌ−グルタミン、Ｌ−プロリン等）、各種無機塩（亜セレン酸塩、ＮａＨＣＯ３等）、各種ビタミン（ニコチンアミド、アスコルビン酸誘導体等）、各種抗生物質（例えば、ペニシリン、ストレプトマイシン等）、抗真菌剤（例えば、アンホテリシン等）、緩衝剤（ＨＥＰＥＳ等）などが挙げられる。
また、培地には、５−２０％の血清（ＦＢＳ等）を添加することもできるが、無血清培地であってもよい。無血清培地の場合、血清代替物（ＢＳＡ、ＨＡＳ、ＫＳＲ等）を添加してもよい。さらに、通常、増殖因子、サイトカイン、ホルモン等の因子が添加される。これらの因子としては、例えば上皮増殖因子（ＥＧＦ）、インスリン、トランスフェリン、ヒドロコルチゾン２１−ヘミコハク酸又はその塩、デキサメタゾン（Ｄｅｘ）等が挙げられるが、それらに限定されない。
【００３２】
ＴＧＦβ受容体阻害薬の培地への添加濃度は、例えば、０．０１−１０μＭ、好ましくは０．１−１μＭの範囲から適宜選択され得る。
ＧＳＫ３阻害薬の培地への添加濃度は、例えば、０．０１−１００μＭ、好ましくは１−１０μＭの範囲から適宜選択され得る。
ＲＯＣＫ阻害薬の培地への添加濃度は、例えば、０．０００１−５００μＭ、好ましくは１−５０μＭの範囲から適宜選択され得る。
これらの阻害薬が水不溶性又は水難溶性の化合物の場合、少量の低毒性の有機溶媒（例えば、ＤＭＳＯ等）に溶解した後、上記の最終濃度となるよう培地に添加することができる。
【００３３】
培養に用いられる培養容器は、接着培養に適したものであれば特に限定されないが、例えば、デッシュ、ペトリデッシュ、組織培養用デッシュ、マルチデッシュ、マイクロプレート、マイクロウエルプレート、マルチプレート、マルチウエルプレート、チャンバースライド、シャーレ、チューブ、トレイ、培養バックなどが挙げられる。培養容器は、細胞の浮遊培養を行うために細胞が接着できないように表面が加工された培養容器を用いることができる。あるいは、接着培養の場合は、内表面が、細胞との接着性を向上させる目的で細胞支持用基質によりコーティングされたものを用いることができる。そのような細胞支持用基質としては、例えば、コラーゲン、ゼラチン、マトリゲル、ポリ−Ｌ−リジン、ラミニン、フィブロネクチンなどが挙げられる。好ましくはコラーゲン又はマトリゲルが挙げられる。
【００３４】
成熟細胞は、１０２〜１０６細胞／ｃｍ２、好ましくは１０３〜１０５細胞／ｃｍ２の細胞密度で培養容器上に播種することができる。
膵外分泌細胞の場合も、１０２〜１０６細胞／ｃｍ２、好ましくは１０３〜１０５細胞／ｃｍ２の細胞密度で培養容器上に播種することができる。培養は、ＣＯ２インキュベータ中、１−１０％、好ましくは２−５％、より好ましくは約５％のＣＯ２濃度の雰囲気下において、３０−４０℃、好ましくは３５−３７．５℃、より好ましくは約３７℃で行うことができる。培養期間としては、例えば１−４週間、好ましくは１−３週間が挙げられる。１−３日ごとに新鮮な培地に交換する。
【００３５】
上記のようにして、成熟細胞（膵外分泌細胞）をＴＧＦβ受容体阻害薬、並びに任意でＧＳＫ３阻害薬及び／又はＲＯＣＫ阻害薬に接触させることにより、成熟細胞幹／前駆細胞にリプログラムすることができる。例えば、ＴＧＦβ受容体阻害薬としてＡ−８３−０１（Ａ）を用い、ＧＳＫ３阻害薬としてＣＨＩＲ９９０２１（Ｃ）及びＲＯＣＫ阻害薬としてＹ−２７６３２（Ｙ）を組み合わせて（ＹＡＣ）、マウス初代成熟膵外分泌細胞を培養した場合、３０日の培養により約３０００倍に増殖し、ＹＡＣ非存在下で培養した場合に比べて著しく増加する。
【００３６】
本明細書において「膵幹／前駆細胞」（「ＰＳＣ」ともいう）とは、（ａ）自己再生能を有し、かつ（ｂ）膵内分泌細胞（例えばランゲルハンス島を構成する細胞）又は膵外分泌細胞に分化し得る性質を有する細胞であって、幹細胞又は前駆細胞を意味する。
胎児膵臓の膵芽細胞も膵幹／前駆細胞（ＰＳＣ）に包含される。
好ましい一実施態様において、本発明のリプログラミング方法により得られるＰＳＣは、上記（ａ）及び（ｂ）の性質に加えて、（ｃ）マスター因子であるＰｄｘ１及びＮｋｘ６．１を発現するほか、Ｇａｔａ４、Ｈｅｓ１、Ｓｏｘ９、Ｆｏｘａ２、ＣＫ１９、ＣＤ１３３などを発現する。但し、本発明のリプログラミング方法により得られるＰＳＣは、他の既知ＰＳＣで発現しているＬｇｒ５を発現していない。従って、本発明のＰＳＣは新規なＰＳＣであるといえる。
【００３７】
本発明のＰＳＣは、さらに以下の特徴のうちの１以上を有する。
（ｄ）少なくとも１０継代、好ましくは２０継代以上、みかけ上の増殖速度が低下しない。
（ｅ）少なくとも１０継代、好ましくは２０継代以上、膵内分泌細胞への分化能を保持する。
（ｆ）膵外分泌細胞と比較して核／細胞質（Ｎ／Ｃ）比が高い。
（ｇ）Ｐｄｘ１、Ｎｋｘ６．１より選択される１以上のＰＳＣマーカー遺伝子の発現が、膵外分泌細胞と比較して上昇している
（ｈ）Ｐｄｘ１、Ｎｋｘ６．１より選択される１以上のタンパク質の発現が、膵外分泌細胞と比較して上昇している
好ましい実施態様においては、本発明のＰＳＣは、上記（ｄ）〜（ｈ）の特徴をすべて有するものである。
【００３８】
以上のように、成熟細胞（例えば膵外分泌細胞）をＴＧＦβ受容体阻害薬、ＧＳＫ３阻害薬及び／又はＲＯＣＫ阻害薬に接触させることにより、幹／前駆細胞に誘導（例えば膵外分泌細胞からＰＳＣを誘導）することができる。
従って、本発明は、哺乳動物の内胚葉組織又は器官（肝臓を除く）由来の細胞から、当該細胞の幹／前駆細胞を誘導する方法であって、インビトロで前記内胚葉組織又は器官由来の細胞に、ＴＧＦβ受容体阻害薬、又はＴＧＦβ受容体阻害薬とＧＳＫ３阻害薬及び／又はＲＯＣＫ阻害薬との組み合わせを接触させることを含む方法が提供される。
【００３９】
特に膵外分泌細胞からＰＳＣを誘導する場合は、膵外分泌細胞をＴＧＦβ受容体阻害薬、ＧＳＫ３阻害薬及び／又はＲＯＣＫ阻害薬に接触させることにより、膵外分泌細胞からＰＳＣを誘導する方法を提供する。本発明はまた、ＴＧＦβ受容体阻害薬を含む、膵外分泌細胞からのＰＳＣ誘導剤を提供する。好ましくは、本発明のＰＳＣ誘導剤は、ＴＧＦβ受容体阻害薬と、ＧＳＫ３阻害薬及び／又はＲＯＣＫ阻害薬との組み合わせを含み、より好ましくは、ＴＧＦβ受容体阻害薬と、ＧＳＫ３阻害薬及びＲＯＣＫ阻害薬との組み合わせを含む。
ＴＧＦβ受容体阻害薬、ＧＳＫ３阻害薬及びＲＯＣＫ阻害薬はそのままＰＳＣ誘導剤として使用できるが、適当な溶媒に溶解して液剤とすることもできる。あるいは、これらの阻害薬は、上記した膵外分泌細胞からＰＳＣを誘導用培地と組み合わせてキット化することもできる。
【００４０】
３．幹／前駆細胞維持・増幅
上記のようにして得られた本発明の幹／前駆細胞は、コラーゲン又はマトリゲルでコーティングした培養容器上で、それぞれＴＧＦβ受容体阻害薬、ＧＳＫ３阻害薬及びＲＯＣＫ阻害薬の存在下で継代培養することにより、効率よく維持・増幅することができる。
培養容器としては、成熟細胞から幹／前駆細胞を誘導するために用いた培養容器と同様の培養容器を用いることができる。
【００４１】
膵外分泌細胞を用いた場合は、本発明の方法により得られたＰＳＣは、コラーゲン又はマトリゲルでコーティングした培養容器上で、それぞれＴＧＦβ受容体阻害薬、ＧＳＫ３阻害薬及びＲＯＣＫ阻害薬の存在下で継代培養することにより、効率よく維持・増幅することができる。
培養容器としては、膵外分泌細胞からのＰＳＣの誘導に用いたのと同様の培養容器を用いることができる。
【００４２】
上記のようにして得られた初代ＰＳＣを、７０−１００％コンフルエントに達した段階で、上記コラーゲン又はマトリゲルコートした培養容器上に、１０３〜１０５細胞／ｃｍ２の密度で播種する。培地としては、ＰＳＣの誘導培養について上記した培地を同様に使用することができる。ＴＧＦβ受容体阻害薬、ＧＳＫ３阻害薬、ＲＯＣＫ阻害薬の添加濃度も、ＰＳＣの誘導培養について上記した濃度範囲から適宜選択することができる。培養温度、ＣＯ２濃度もＰＳＣ誘導培養の条件に準じる。７０−１００％コンフルエントに達した段階で、細胞をトリプシン処理して解離させ、継代を行う。５−８継代程度で安定なＰＳＣを得ることができる。１０継代以上継代した後に、常法によりクローン化を行うことができる。
【００４３】
上記のように、ＴＧＦβ受容体阻害薬、ＧＳＫ３阻害薬、ＲＯＣＫ阻害薬は、幹／前駆細胞（例えばＰＳＣ）の誘導培養のみならず、維持・増幅培養においても培地に添加される。従って、本発明はまた、ＴＧＦβ受容体阻害薬、ＧＳＫ３阻害薬、ＲＯＣＫ阻害薬を含有してなる幹／前駆細胞（例えばＰＳＣ）の維持・増幅剤を提供する。
【００４４】
４．幹／前駆細胞から成熟細胞への分化
幹／前駆細胞から成熟細胞への分化誘導は、例えばＹＡＣ添加ＳＨＭ（Ｓｍａｌｌ  ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ  ｍｅｄｉｕｍ）培地を用いて超低吸着培養皿上で７日間浮遊培養させることにより行うことができる。あるいは、Ｐｈｏｒｂｏｌ  １２，１３−ｄｉｂｕｔｙｒａｔｅ、ＬＤＮ１９３１８９、Ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ、ＳＡＮＴ１、Ｒｅｔｉｎｏｉｃ  Ａｃｉｄ、ＸＸＩ、Ｂｅｔａｃｅｌｌｕｌｉｎ等を添加した培養液で培養する方法（Ｃｅｌｌ．２０１４  Ｏｃｔ  ９；１５９（２）：４２８−３９．）等を用いてもよい。
ＰＳＣから膵内分泌細胞への分化誘導についても、上記と同様の方法を適用することができる。あるいは、Ｐｈｏｒｂｏｌ  １２，１３−ｄｉｂｕｔｙｒａｔｅ、ＬＤＮ１９３１８９、Ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ、ＳＡＮＴ１、Ｒｅｔｉｎｏｉｃ  Ａｃｉｄ、ＸＸＩ、Ｂｅｔａｃｅｌｌｕｌｉｎ等を添加した培養液で培養する方法（Ｃｅｌｌ．２０１４  Ｏｃｔ  ９；１５９（２）：４２８−３９．）等を用いてもよい。
【００４５】
本発明のＰＳＣを分化誘導することによって得られた膵外分泌細胞は、成熟膵内分泌細胞に典型的なインスリン産生機能を有し、インスリン分泌を反映するＣペプチド分泌も検出される。また、膵内分泌細胞のマスター転写因子であるＮｇｎ３やグルコーストランスポーター（ＧＬＵＴ２）のｍＲＮＡ上昇が認められる。即ち、本発明のＰＳＣは、機能的な膵内分泌細胞に分化することができる。
【００４６】
５．本発明の幹／前駆細胞の用途
上記４．に記載されるようにして本発明の幹／前駆細胞から再分化した成熟細胞は、例えば、被検化合物の代謝や細胞又は組織毒性の評価等に利用できる。
被検化合物の代謝や毒性の評価には、従来、動物モデル等が用いられていたが、一度に評価できる被検化合物の数に制限があり、また動物モデル等で得られた評価を、そのままヒトに適用できないという問題があった。そのため、ヒト癌細胞株や初代正常ヒト培養細胞を用いる評価方法が採用されている。しかしながら、ヒト癌細胞株は、ヒト癌細胞株で得られた評価が、ヒト正常細胞に適用できないという可能性が残る。また、初代正常ヒト培養細胞は安定供給やコストの面での問題がある。さらに、初代正常ヒト培養細胞を不死化した細胞株は、不死化していない場合と比較して、その活性が低下していることが示されている。本発明の方法により製造された細胞を利用することで、このような問題を解決し得る。
【００４７】
従って、本発明は、被検化合物の哺乳動物体内での代謝を評価する方法であって、本発明の方法により得られた幹／前駆細胞、膵幹／前駆細胞、又は本発明の誘導方法により得られた細胞に被検化合物を接触させる工程、及び前記細胞における被検化合物の代謝を測定する工程を含む方法を提供する。
従って、本発明の方法において、膵外分泌細胞を用いる場合は、本発明の方法により製造された膵外分泌細胞に被検化合物を接触させる。次いで、膵外分泌細胞に接触させた被検化合物の代謝を測定する。
【００４８】
本発明で用いる被検化合物としては、特に制限はない。例えば、生体異物、天然化合物、有機化合物、無機化合物、タンパク質、ペプチド等の単一化合物、並びに、化合物ライブラリー、遺伝子ライブラリーの発現産物、細胞抽出物、細胞培養上清、発酵微生物産生物、海洋生物抽出物、植物抽出物等が挙げられるが、これらに限定されない。
生体異物としては、例えば薬剤や食品の候補化合物、既存の薬剤や食品が挙げられるが、これらに限定されるものではなく、生体にとって異物である限り、本発明の生体異物に含まれる。より具体的には、Ｒｉｆａｍｐｉｎ、Ｄｅｘａｍｅｔｈａｓｏｎｅ、Ｐｈｅｎｏｂａｒｂｉｔａｌ、Ｃｉｇｌｉｒａｚｏｎｅ、Ｐｈｅｎｙｔｏｉｎ、Ｅｆａｖｉｒｅｎｚ、Ｓｉｍｖａｓｔａｔｉｎ、β−Ｎａｐｈｔｈｏｆｌａｖｏｎｅ、Ｏｍｅｐｒａｚｏｌｅ、Ｃｌｏｔｒｉｍａｚｏｌｅ、３−Ｍｅｔｈｙｌｃｈｏｌａｎｔｈｒｅｎｅ等が例示できる。
【００４９】
成熟細胞（例えば膵外分泌細胞）と被検化合物との接触は、通常、培地や培養液に被検化合物を添加することによって行うが、この方法に限定されない。被検化合物がタンパク質等の場合には、該タンパク質を発現するＤＮＡベクターを、該細胞へ導入することにより、接触を行うこともできる。
【００５０】
被検化合物の代謝は、当業者に周知の方法で測定することが可能である。例えば被検化合物の代謝産物が検出された場合に、被検化合物が代謝されたと判定される。
例えば、被検化合物の接触により、インスリン等の酵素遺伝子の発現が誘導された場合や、これら酵素の活性が上昇した場合に、被検化合物が代謝されたと判定される。
【００５１】
膵臓以外の組織又は器官についても、当該組織又は器官に存在する遺伝子の発現を指標として被検化合物が代謝されたと判定することができる。
また本発明は、細胞が分泌する酵素の分泌誘導物質のスクリーニング方法であって、本発明の方法により得られた幹／前駆細胞、本発明の膵幹／前駆細胞、又は本発明の誘導方法により誘導された細胞に被検化合物を接触させる工程、及び前記細胞において分泌された物質を測定する工程を含む、前記方法が提供される。
例えば、被検物質を、膵幹／前駆細胞又は誘導された膵細胞に接触させた後、細胞から分泌される各酵素が分泌誘導されるか否かを指標として、分泌調整物質をスクリーニングすることができる。
【００５２】
また本発明は、哺乳動物に対する被検化合物の内胚葉組織又は器官毒性を評価する方法を提供する。この方法では、本発明の方法により得られた幹／前駆細胞、膵幹／前駆細胞、又は本発明の誘導方法により誘導された細胞に被検化合物を接触させる工程、及び被検化合物と接触した細胞における障害の有無又はその程度を測定する工程を含む。
本発明において、被検化合物の膵毒性を評価する場合は、本発明の方法により製造された膵外分泌細胞に被検化合物を接触させる。次いで、被検化合物を接触させた膵外分泌細胞の障害の程度を測定する。障害の程度は、例えば膵外分泌細胞の生存率や膵障害マーカーを指標に測定できる。
【００５３】
例えば、膵外分泌細胞の培養液に被検化合物を添加することにより、膵外分泌細胞の生存率が低下する場合、該被検化合物は膵毒性を有すると判定され、生存率に有意な変化がない場合、該被検化合物は膵毒性を有さないと判定される。
なお、すでに膵毒性の有無が判明している化合物を対照として用いることで、より正確に、被検化合物が膵毒性を有するか否かを評価することができる。
【００５４】
さらに本発明は、本発明の方法により得られた幹／前駆細胞、膵幹／前駆細胞、又は本発明の誘導の方法により誘導された細胞を含む、内胚葉組織又は器官障害改善剤を提供する。さらに本発明は、本発明の方法により得られた幹／前駆細胞、膵幹／前駆細胞、又は本発明の誘導の方法により誘導された細胞の有効量を、内胚葉組織又は器官障害を有する哺乳動物に投与することを含む、前記方法を提供する。
【００５５】
例えば膵障害を改善するには、本発明のＰＳＣを慢性的な膵障害を有する免疫不全マウスに移植することにより、初代成熟膵外分泌細胞を移植した場合と同等の膵再生能を発揮することができる。従って、本発明はまた、本発明のＰＳＣを含有してなる、膵障害改善剤を提供する。
【００５６】
本発明のＰＳＣは、必要に応じて表面抗原マーカーに対する抗体を用いてフローサイトメトリーにより精製して用いることができる。ＰＳＣは適当な等張緩衝液（例えば、ＰＢＳ）に懸濁して製剤化することができる。必要に応じて、医薬上許容される添加物をさらに含有させることができる。ＰＳＣ懸濁液は、膵疾患の種類、膵障害の重篤度等によっても異なるが、例えば成人の場合、１０８−１０１１細胞を移植することができる。
【００５７】
以下に実施例を挙げて本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に何ら限定されるものではない。
【実施例】
【００５８】
１．実験手順
膵前駆細胞の樹立
マウスまたはラットの膵外分泌細胞を既知の手法に従ってコラゲナーゼ処理および単離した（Ｒｅｉｃｈｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ．Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂ  Ｐｒｏｔｏｃ．２０１５  Ｊｕｎ  １；２０１５（６）：５５８−６１）。単離した細胞内にインスリン分泌細胞が含まれていないことを、ジチゾン（ＤＴＺ）染色により確認した。単離した膵外分泌細胞を、３種類の低分子化合物（Ｙ−２７６３２［１０μＭ］，Ａ−８３−０１［０．５μＭ］，ＣＨＩＲ９９０２１［３μＭ］；以下ＹＡＣ）を添加したＳｍａｌｌ  ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ  ｍｅｄｉｕｍ（ＳＨＭ）培地を用いてＩ型コラーゲンコート培養皿上で平面培養した。【００５９】
ＳＨＭ培地：ＤＭＥＭ／Ｆ１２  ４７２．７ｍＬに以下の添加物を加えた培地（Ｋａｔｓｕｄａ  ｅｔ  ａｌ．Ｂｉｏ  Ｐｒｏｔｏｃ．２０１８  Ｊａｎ  ２０；８（２））
２Ｍ  ＨＥＰＥＳ，１．２５ｍＬ
３０ｇ／Ｌ  Ｌ−ｐｒｏｌｉｎｅ，５００μＬ
１００ｘ  ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ／ａｎｔｉｍｙｃｏｔｉｃ，５ｍｌ
５Ｎ  ＮａＯＨ，２５０μＬ（ｐＨ７．５に調整するため）
５％  ＢＳＡ，５ｍＬ
１０μｇ／ｍＬ  ＥＧＦ，５００μＬ
１００ｘ  ＩＴＳ−Ｘ，５ｍＬ
１０−４Ｍ  ｄｅｘａｍｅｔｈａｓｏｎｅ，５００μＬ
１Ｍ  ｎｉｃｏｔｉｎａｍｉｄｅ，５ｍＬ
１００ｍＭ  Ａｓｃ２Ｐ，５ｍＬ【００６０】
ＰＳＣの継代培養
初代培養の１４日目に、ＹＡＣ存在下で培養した細胞をトリプシン処理して回収し、ＹＡＣを添加したＳＨＭ中に９ｘ１０３細胞／ｃｍ２で播種した。マウスの場合、Ｉ型コラーゲンコート培養皿上で、ラットの場合、マトリゲルコーティングした培養皿上で細胞を培養した。ＣＥＬＬＢＡＮＫＥＲ（登録商標）１（宝酒造、大津）を用いて凍結ストックを調製した。少なくとも１０継代後、ＢＤ  ＦＡＣＳＡｒｉａ  ＩＩセルソーターを用いてＰＳＣのクローニングを実施した。【００６１】
低細胞密度での低速度撮影
初代膵外分泌細胞をコラーゲンでコーティングした３５ｍｍプレート（ＩＷＡＫＩ）上に、ＹＡＣの存在下又は非存在下で１ｘ１０２細胞／ｃｍ２で播種した。１日目に培地を交換した。２回目の培地交換後、ＢＺ９０００オールインワン蛍光顕微鏡（キーエンス、大阪）を用いて低速度撮影を行った。位相差像は２日目から６日目まで３０分間隔で３００回撮影し、動画は解析野ごとに作成した。次に、個々の細胞を撮影期間を通じて追跡し、目的の細胞に由来する最終の細胞数を計測した。また、個々の細胞に由来するアポトーシス細胞の総計も計数し、アポトーシス頻度を、総アポトーシス細胞／最初の総細胞数（低速度撮影の開始時に計数）として定量した。【００６２】
定量的ＲＴ−ＰＣＲ
膵外分泌細胞およびＰＳＣ細胞から、ｍｉＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いて全ＲＮＡを単離した。逆転写反応は、Ｈｉｇｈ−Ｃａｐａｃｉｔｙ  ｃＤＮＡ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｌｉｆｅｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用い、製造者のガイドラインに従って実施した。得られたｃＤＮＡを鋳型として、Ｐｌａｔｉｎｕｍ  ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  ｑＰＣＲ  ＳｕｐｅｒＭｉｘ  ＵＤＧ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてＰＣＲを行った。標的遺伝子の発現レベルは内在性コントロールであるβ−アクチンで標準化した。【００６３】
免疫細胞化学、免疫組織化学
細胞を４％パラホルムアルデヒドにより１５分間固定した。ブロッキング液（Ｂｌｏｃｋｉｎｇ  Ｏｎｅ）（ナカライテスク、京都）で、４℃、３０分インキュベートした後、細胞を一次抗体と室温で１時間又は４℃で一晩インキュベートした。次に、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８又はＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５９４−結合二次抗体（Ｌｉｆｅｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて、一次抗体を検出した。核をＨｏｅｃｈｓｔ  ３３３４２（Ｄｏｊｉｎｄｏ）で共染色した。【００６４】
組織サンプルはホルマリン固定し、パラフィン包埋した。脱ろう及び再水和後、標本を１／２００希釈したＩｍｍｕｎｏＳａｖｅｒ（日新ＥＭ、東京）中、９８℃で４５分煮沸することにより、熱誘導性エピトープ回復を行った。次に、標本を０．１％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ  １００で処理して膜透過化した。ブロッキング試薬（ナカライテスク）で４℃、３０分処理した後、標本を室温で１時間一次抗体とインキュベートした。これらの切片を、ＩｍｍＰＲＥＳＳ  ＩｇＧ−ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ  ｋｉｔ（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｓ）及びｍｅｔａｌ−ｅｎｈａｎｃｅｄ  ＤＡＢ  ｓｕｂｓｔｒａｔｅ  ｋｉｔ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を製造者の指示に従って用いることで染色した。ヘマトキシリンで対比染色した後、標本を脱水しマウントした。【００６５】
ＰＳＣの膵内分泌細胞誘導
細胞を、５％ＦＢＳを添加したＳＨＭ＋ＹＡＣ中に懸濁し（細胞濃度：１ｘ１０４〜１ｘ１０６細胞／ｃｍ２）、超低吸着培養皿上で７日間培養した。培地交換は４日目に行った。【００６６】
２．結果
１）膵前駆細胞の樹立
膵外分泌細胞含有培地にＹＡＣを添加することにより、図１に示す様に高い増殖能を有する小型上皮細胞を樹立した。この細胞は２０回以上の継代が可能であり、一細胞培養も可能であった。またインスリン合成能を有する内分泌系細胞へと分化しうることから、膵前駆細胞としての特徴を有していると言える。【００６７】
２）誘導された膵前駆細胞の性状
樹立した細胞は、図２，３に示されるように膵前駆細胞におけるマスター転写因子であるＰｄｘ１とＮｋｘ６．１を含む幹細胞マーカーを発現していた。【００６８】
３）膵前駆細胞からインスリン産生細胞への分化誘導
樹立した膵前駆細胞は、ＹＡＣ添加ＳＨＭ培地を用いて超低吸着培養皿上で７日間浮遊培養させることにより、図４に示されるように細胞がクラスター状に集積しながら増殖し、このクラスターはＤＴＺ染色陽性、また免疫染色によってインスリンの染色性が検出された。このことから、膵前駆細胞はインスリン産生細胞へと分化したことがわかる。実際、インスリンに加えて膵内分泌細胞のマスター転写因子であるＮｇｎ３やグルコーストランスポーター（ＧＬＵＴ２）のｍＲＮＡ上昇がみられた（図５）。またインスリン分泌を反映するＣペプチド分泌も検出された（図５）。【００６９】
また、ＹＡＣにＡＬＫ５阻害薬ＩＩ（Ｅｎｚｏ，ＡＬＸ−２７０−４４５−Ｍ００１）を加えて７日間の浮遊培養を行うことにより、ＩｎｓｕｌｉｎやＧＬＵＴ２のｍＲＮＡ発現をさらに向上させることができた（図６）。
さらに、膵内分泌細胞への分化誘導後、培地のグルコース濃度を低濃度（３ｍＭ）と高濃度（２０ｍＭ）の条件で比較すると、高濃度グルコースによるＩｎｓｕｌｉｎ  ｍＲＮＡや培地中Ｃペプチドの上昇がみられ、グルコース濃度応答性を獲得していることが示された（図７）。【００７０】
４）動物での実施例
ストレプトゾトシン投与糖尿病モデルマウスを用い、インスリン産生細胞への分化誘導処理を行った膵前駆細胞をＭａｔｒｉｇｅｌに封入し膵被膜下へ移植した。図８に示されるように、移植３日後において血糖値の改善が得られた。さらに移植部位において移植細胞のクラスターの多くは腺管様の細胞に分化している一方、一部の細胞はＩｎｓｕｌｉｎ，Ｐｄｘ１，Ｎｋｘ６．１が陽性であり、β細胞へと分化している様子が観察された（図９）。
【産業上の利用可能性】
【００７１】
本発明によれば、遺伝子改変を伴わずに、膵外分泌細胞から、自己再生能と膵外分泌細胞への分化能（両能性）を有する膵幹／前駆細胞を、安全かつ迅速に誘導することができるので、薬物評価システムや膵再生医療への応用が可能となる点で本発明の方法は極めて有用である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【国際調査報告】
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