(57)【要約】  １種類又は複数種類の細菌を含む被検体から、簡便でありながら精度のよい特定のビフィズス菌の生菌数の測定方法を提供すること。  １種類又は複数種類の細菌を含む被検体からビフィドバクテリウム・ブレーベの生菌数を測定する方法であり、  前記被検体を、高浸透圧培地を用いて培養する培養工程、  当該培地に形成されたコロニーをビフィドバクテリウム・ブレーベとして同定する判定工程を含む、方法。【特許請求の範囲】
【請求項１】
１種類又は複数種類の細菌を含む被検体からビフィドバクテリウム・ブレーベの生菌数を測定する方法であり、
前記被検体を、高浸透圧培地を用いて培養する培養工程、
当該培地に形成されたコロニーをビフィドバクテリウム・ブレーベとして同定する判定工程、を含む方法。
【請求項２】
前記高浸透圧培地の浸透圧が８９０ｍＯｓｍ以上である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記高浸透圧培地が、少なくとも塩類及び／又は糖類を含む、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記判定工程は、さらに形成されたコロニーをビフィドバクテリウム・ブレーベとして計測し、希釈倍率により生菌数を算出することを含む、請求項１〜３の何れか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記被験体が、少なくともビフィドバクテリウム・ブレーベ及びビフィドバクテリウム・ロンガムの細菌を含むものである、請求項１〜４の何れか１項に記載の方法。
【請求項６】
１種類又は複数種類の細菌を含む被検体から、以下の（Ａ）及び（Ｂ）によって、ビフィドバクテリウム・ブレーベ及びビフィドバクテリウム・ロンガム・サブスピーシーズ・インファンティスの生菌数を測定する方法であり、
（Ａ）前記請求項１〜５の何れか１項に記載のビフィドバクテリウム・ブレーベの生菌数を測定する方法により、ビフィドバクテリウム・ブレーベの生菌数を測定する工程；
（Ｂ）１種類又は複数種類の細菌を含む被検体をストレプトマイシン含有培地を用いて、形成されたコロニーをビフィドバクテリウム・ロンガム・サブスピーシーズ・インファンティスとして計測し、希釈倍率により生菌数を算出する判定工程、を含むことにより、前記インファンティスの生菌数を測定する工程；を含む方法。
【請求項７】
前記ストレプトマイシン含有培地が、ストレプトマイシン６０ｍｇ／Ｌ以上のものである、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記被験体に含まれる１種類又は複数種類の細菌が、ビフィドバクテリウム・ブレーベ、ビフィドバクテリウム・ロンガム・サブスピーシーズ・インファンティス及びビフィドバクテリウム・ロンガム・サブスピーシーズ・ロンガムからなる群から選択される１種又は２種以上である、請求項６又は７に記載の方法。
【請求項９】
単数又は複数の細菌を含む組成物の製造方法であり、
請求項１〜８の何れか１項に記載の組成物中の前記細菌の生菌数を測定する方法で、前記組成物中の各細菌の生菌数を測定する工程、
前記測定された組成物中の各細菌の生菌数に基づき、前記組成物に対して目的生菌数になるように各細菌の配合量の調整を行う工程を含み、
前記各細菌の配合量の設計に基づき、前記単数または複数種類の細菌を含む組成物を得る、前記組成物の製造方法。
【請求項１０】
ビフィドバクテリウム・ブレーベの生菌数を測定するための高浸透圧培地組成物。
【請求項１１】
前記高浸透圧培地組成物の浸透圧が８９０ｍＯｓｍ以上である、請求項１０に記載の培地組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本技術は、ビフィドバクテリウム属細菌の生菌数の測定方法、並びに当該方法に使用する培地に関する。
【背景技術】
【０００２】
ビフィドバクテリウム（Bifidobacterium）属細菌（以下、「ビフィズス菌」ともいう）は離乳前の乳児腸管内に多く生息しており、乳児の腸内環境を良好に維持することに貢献していると考えられている。ビフィズス菌が有する生理的機能として、宿主に対する腸管感染防御作用、免疫機能の増強作用、栄養、腸内腐敗抑制作用等が知られている。上記のようなビフィズス菌の有用性に着目し、育児用粉乳にビフィズス菌を添加すること、並びに、製剤化したビフィズス菌をヒトに投与することで感染症を防ぐこと若しくはアレルギー疾患の治療を促進することが考案されている。また、ビフィズス菌の他、乳酸菌もプロバイオティクス効果が期待されるものである。【０００３】
ビフィズス菌及び／又は乳酸菌にプロバイオティクス効果を期待する場合、プロバイオティクス効果は使用する菌種又は菌株に依存することが多い。このため、ビフィズス菌及び／又は乳酸菌のなかから期待する効果が発現できる菌種又は菌株を１種類又は複数種類選択し添加されたプロバイオティクス製品（例えば、菌末、飲食品や飼料等）が製造され、市販されている（非特許文献１の表１参照）。例えば、食品にビフィズス菌としてビフィドバクテリウム・ロンガム（ビフィドバクテリウム・ロンガム・サブスピーシーズ・ロンガム、ビフィドバクテリウム・ロンガム・サブスピーシーズ・インファンティス）が添加された製品がよく市販されており、さらにビフィドバクテリウム・ブレーベを併用した製品も存在する。【０００４】
そして、近年、消費者が製品成分を直接確認したいという要望が強まっている。このため、製品中に含まれる有用菌の菌種ごとに生菌数を製品に表示しようとする動きがある。また、国によって、製品中に含まれている有用菌について、菌種ごとに生菌数を表示することが、義務化又は推奨されている。
一方で、複数種類のビフィズス菌の菌種を配合した製品が増えている。このため、簡便でかつ正確な個別のビフィズス菌の菌種ごとの生菌数の同定方法及び測定方法が求められている。【０００５】
例えば、ＢＬ寒天培地に無菌脱繊血を添加した培地を使用し、塗抹培養することで形成されたコロニーの形状から、複数菌種のビフィドバクテリウム属細菌を測り分ける方法が知られている。
また、糖源としてＬ−アラビノースのみを含有する培地を使用して、ビフィドバクテリウム属に属する微生物を含有する被検試料から、ビフィドバクテリウム・ロンガム・サブスピーシーズ・ロンガムのみの生菌数を測定する方法が提案されている（特許文献１）。
また、ビフィドバクテリウム・ロンガム・サブスピーシーズ・インファンティスＭ−６３のストレプトマイシン耐性が高いことが知られている（非特許文献１）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】ＷＯ２０１１／１１８７６５
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Antibiotic Susceptibility of Bifidobacterial Strains Distributed in the Japanese Market.(Biosci, Biotechnol, Biochem, Jin-zhong Xiao et al.、２０１０年、第７４号第２巻、３３６−３４２頁)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
ビフィズス菌の菌種ごとの測定方法として、無菌脱繊血を添加したＢＬ寒天培地を使用しコロニー形状で見分ける方法が知られている。しかし、各菌種のコロニーの見分け方には専門的な知識及び高い熟練度が必要とされる。このため、熟練度が低い者はこれらのコロニー形状の見分けが難しい場合があり、また測定者ごとにばらつきも生じやすい。【０００９】
無菌脱繊血を添加したＢＬ寒天培地におけるビフィドバクテリウム・ブレーベ、ビフィドバクテリウム・ロンガム・サブスピーシーズ・インファンティス及びビフィドバクテリウム・ロンガム・サブスピーシーズ・ロンガムのコロニー形成の違いについて、具体的に以下に述べる。無菌脱繊血添加ＢＬ寒天培地において、ビフィドバクテリウム・ロンガム・サブスピーシーズ・ロンガムでは、黄褐色、半球状に隆起し、周縁が平滑なコロニー形状となっている；ビフィドバクテリウム・ブレーベでは、正円、半球状に隆起し、表面・周縁とも平滑、乳褐色で中心部淡褐色〜茶褐色を呈するコロニー形状となっている；ビフィドバクテリウム・ロンガムのうちさらにビフィドバクテリウム・ロンガム・サブスピーシーズ・インファンティスでは、正円、半球状に隆起し、乳褐色で中心部淡褐色を帯びたコロニー形状となっている。 
しかし、菌種及び菌数の品質管理の観点からすると、測定者の経験や個人差等に影響されることなく、より均質化された測定結果が望まれる。【００１０】
また、ＢＬ寒天培地において、無菌脱繊血は、コロニー形状からビフィドバクテリウム・ロンガム・サブスピーシーズ・ロンガム、ビフィドバクテリウム・ロンガム・サブスピーシーズ・インファンティス及びビフィドバクテリウム・ブレーベを見分けるのに必要な成分であるが、無菌脱繊血を容易に入手できない国や地域が存在する。【００１１】
このような実情から、無菌脱繊血を使用しなくても、複数種類の菌体を含む被験体から、特定のビフィズス菌の生菌数を簡便に測定できる方法が求められている。【００１２】
そこで、本技術は、１種類又は複数種類の細菌を含む被検体から、簡便でありながら精度のよい特定のビフィズス菌の生菌数の測定方法を提供することを主な目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明者らは、鋭意検討した結果、基礎培地組成物を高浸透圧に調整した培地を用いることによって、ビフィズス菌が複数種類存在する被検体であっても、このなかからビフィドバクテリウム・ブレーベ（以下、「ビフィドバクテリウム・ブレーベ」又は「ブレーベ」ともいう）のみの生菌数を測定できることを見出した。
さらに、本発明者らは、基礎培地組成物にストレプトマイシンを含ませた培地を用いることによって、ビフィズス菌が複数種類存在する被検体であっても、このなかからビフィドバクテリウム・ロンガム・サブスピーシーズ・インファンティス（以下、「ビフィドバクテリウム・ロンガム・サブスピーシーズ・インファンティス」又は「インファンティス」ともいう）のみの生菌数を測定できることを見出した。【００１４】
本発明者らは、上述した高浸透圧培地及び／又はストレプトマイシン含有培地を用いることで、被検体にビフィズス菌が複数種類存在する場合であっても、ビフィドバクテリウム・ブレーベの生菌数及び／又はビフィドバクテリウム・ロンガム・サブスピーシーズ・インファンティスの生菌数を選択的に簡便にかつ精度良く測定できることを見出し、本発明を以下のように完成させた。【００１５】
〔１〕
１種類又は複数種類の細菌を含む被検体からビフィドバクテリウム・ブレーベの生菌数を測定する方法であり、
前記被検体を、高浸透圧培地を用いて培養する培養工程、
当該培地上に形成されたコロニーをビフィドバクテリウム・ブレーベとして同定する判定工程、を含む、方法。
〔２〕
前記高浸透圧培地の浸透圧が８９０ｍＯｓｍ以上である、前記〔１〕に記載の方法。
〔３〕
前記高浸透圧培地が、少なくとも塩類及び／又は糖類を含む、前記〔１〕又は〔２〕に記載の方法。
〔４〕
前記判定工程は、さらに形成されたコロニーをビフィドバクテリウム・ブレーベとして計測し、希釈倍率により生菌数を算出することを含む、前記〔１〕〜〔３〕の何れか１つ記載の方法。
〔５〕
前記被験体が、少なくともビフィドバクテリウム・ブレーベ及びビフィドバクテリウム・ロンガムの細菌を含むものである、前記〔１〕〜〔４〕の何れか１つ記載の方法。
〔６〕
１種類又は複数種類の細菌を含む被検体から、以下の（Ａ）及び（Ｂ）によって、ビフィドバクテリウム・ブレーベ及びビフィドバクテリウム・ロンガム・サブスピーシーズ・インファンティスの生菌数を測定する方法であり、
（Ａ）前記〔１〕〜〔５〕の何れか１つ記載のビフィドバクテリウム・ブレーベの生菌数を測定する方法により、ビフィドバクテリウム・ブレーベの生菌数を測定する工程；
（Ｂ）１種類又は複数種類の細菌を含む被検体をストレプトマイシン含有培地を用いて、形成されたコロニーをビフィドバクテリウム・ロンガム・サブスピーシーズ・インファンティスとして計測し、希釈倍率により生菌数を算出する判定工程、を含むことにより、前記インファンティスの生菌数を測定する工程；を含む、方法。
〔７〕
前記ストレプトマイシン含有培地が、ストレプトマイシン６０ｍｇ／Ｌ以上のものである、前記〔６〕に記載の方法。
〔８〕
前記被験体に含まれる１種類又は複数種類の細菌が、ビフィドバクテリウム・ブレーベ、ビフィドバクテリウム・ロンガム・サブスピーシーズ・インファンティス及びビフィドバクテリウム・ロンガム・サブスピーシーズ・ロンガムからなる群から選択される１種又は２種以上である、前記〔６〕又は〔７〕に記載の方法。
〔９〕
単数又は複数の細菌を含む組成物の製造方法であり、
前記〔１〕〜〔８〕の何れか１つに記載の組成物中の前記細菌の生菌数を測定する方法にて、前記組成物中の各細菌の生菌数を測定する工程、
前記測定された組成物中の各細菌の生菌数に基づき、前記組成物に対して目的生菌数になるように各細菌の配合量の調整を行う工程を含み、
前記各細菌の配合量の設計に基づき、前記単数または複数種類の細菌を含む組成物を得る、前記組成物の製造方法。
〔１０〕
ビフィドバクテリウム・ブレーベの生菌数を測定するための高浸透圧培地組成物。
〔１１〕
前記高浸透圧培地組成物の浸透圧が８９０ｍＯｓｍ以上である、前記〔１０〕記載の培地組成物。
【発明の効果】
【００１６】
本技術によれば、１種類又は複数種類の細菌を含む被検体から、簡便でありながら精度のよい特定のビフィズス菌の生菌数の測定方法を提供することができる。
なお、ここに記載された効果は、必ずしも限定されるものではなく、本技術中に記載されたいずれかの効果であってもよい。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
次に、本発明の好ましい実施形態について詳細に説明する。ただし、本発明は以下の好ましい実施形態に限定されず、本発明の範囲内で自由に変更することができるものである。尚、本明細書において百分率は特に断りのない限り質量による表示である。
【００１８】
＜１．ビフィドバクテリウム・ブレーベの生菌数を測定する方法＞
本技術は、１種類又は複数種類の細菌を含む被検体からビフィドバクテリウム・ブレーベの生菌数を測定する方法であり、
前記被検体を、高浸透圧培地を用いて培養する培養工程、
当該培地に形成されたコロニーをビフィドバクテリウム・ブレーベとして同定する判定工程、を含む、生菌数の測定方法である。
【００１９】
〔被検体〕
本技術に用いる被検体は、１種類又は複数種類の細菌（被検菌）を含むものであれば特に限定されない。例えば、飲食品（例えば、発酵乳、菌末、菓子、飲料、健康食品、機能性食品、機能性表示食品、特定保健用食品、育児用粉乳等）、医薬品、家畜用飼料等の製品、前記製品に対して粉砕、希釈液による希釈等の処理を施した製品等が挙げられる。品質管理の必要性の観点から、生菌数の調製がされている製品が好ましく、例えば、飲食品又は医薬品が好ましい。
【００２０】
本技術の生菌数測定方法が適用されうる、食品、健康食品等の製品は、細菌を含む製品であれば特に限定されないが、例えば、有用菌であるビフィズス菌及び／又は乳酸菌が配合される食品、健康食品等が挙げられる。当該有用菌が含まれる製品として、より具体的な例を挙げれば、乳児用粉乳、幼児用粉乳、発酵乳、乳成分を含む又は乳成分を含まない飲料や食品、菌末、チョコレート、タブレット、カプセル、サシェット等が挙げられる。
【００２１】
〔被検体中の細菌〕
本技術による生菌数測定が適用されうる１種類又は複数種類の細菌は、グラム陽性菌が好適である。本技術は、製品中のビフィドバクテリウム・ブレーベの有無を又はこの生菌数を測定し表示する等に利用できる観点から、飲食品に利用可能な有用菌であることが好ましい。当該有用菌は、市販の製品に含まれる有用菌、微生物保存機関でカルチャー・コレクションとして保存されている有用菌、ブダペスト条約に基づく国際寄託機関で受託菌として保存されている有用菌、将来見出される有用菌等が挙げられる。
さらに、本技術の被検菌となる細菌のうち、有用なグラム陽性菌が好ましく、このうちビフィズス菌及び／又は乳酸菌が生菌数の表示推奨又は表示義務の観点から好ましい。さらに本技術の被検菌となる細菌がビフィズス菌であることが、本技術がブレーベの有無を判定し易く、また生菌数を精度よく測定できる観点から、好ましい。
【００２２】
本技術による生菌数測定が適用されうるビフィドバクテリウム属細菌（以下、「ビフィズス菌」ともいう）は特に限定されないが、当該ビフィズス菌として、より具体的な例を挙げれば、ビフィドバクテリウム・ロンガム・サブスピーシーズ・ロンガム（Bifidobacterium longum subsp. longum）；ビフィドバクテリウム・ロンガム・サブスピーシーズ・インファンティス（Bifidobacterium longum subsp. infantis（以下、「インファンティス」ともいう）；ビフィドバクテリウム・ブレーベ（Bifidobacterium breve（以下、「ブレーベ」ともいう）；ビフィドバクテリウム・ビヒィダム（Bifidobacterium bifidum）；ビフィドバクテリウム・アニマリス（Bifidobacterium animalis）；ビフィドバクテリウム・アドレセンティス（Bifidobacterium adolescentis）等が挙げられる。このうち１種類又は複数種類を含むビフィズス菌を被検菌として測定対象とすることが、望ましい。
本技術において高浸透圧培地を用いる場合、Bifidobacterium longum（以下、「ビフィドバクテリウム・ロンガム」ともいう）及びビフィドバクテリウム・ブレーベを含むビフィズス菌を被検菌として測定対象とすることが、測定の簡便さ及び精度の観点から、望ましい。
なお、ビフィドバクテリウム・ロンガムには、例えば、ビフィドバクテリウム・ロンガム・サブスピーシーズ・ロンガム及びビフィドバクテリウム・ロンガム・サブスピーシーズ・インファンティス等が挙げられる。
【００２３】
本技術において、ビフィドバクテリウム・ロンガム・サブスピーシーズ・ロンガム BB-536、ビフィドバクテリウム・ロンガム・サブスピーシーズ・ロンガム NCC2705（CNCM I-2618）、ビフィドバクテリウム・ロンガム・サブスピーシーズ・ロンガムATCC51870、ビフィドバクテリウム・ブレーベ ATCC15700、ビフィドバクテリウム・ブレーベ M-16V、ビフィドバクテリウム・ブレーベ ATCC15700、ビフィドバクテリウム・ブレーベ BP-11175、ビフィドバクテリウム・ロンガム・サブスピーシーズ・インファンティス M-63等を用いることが特に好ましい。
【００２４】
本技術による生菌数測定が適用されうる乳酸菌は特に限定されないが、好適にはLactobacillus属、Lactococcus属、Streptococcus属の細菌である。当該乳酸菌として、より具体的な例を挙げれば、ラクトバチルス・カゼイ（Lactobacillus casei）、ラクトバチルス・パラカゼイ（Lactobacillus paracasei）、ラクトバチルス・ガセリ（Lactobacillus gaserri）、ラクトバチルス・ラムノーサス（Lactobacillus rhamnosus）、ラクトバチルス・アシドフィルス（Lactobacillus acidophilus）、ラクトバチルス・ブルガリカス（Lactobacillus bulgaricus）、ラクトバチルス・サリバリウス（Lactobacillus salivarius）、ラクトバチルス・ファーメンタム（Lactobacillus fermentum）、ラクトバチルス・ブレビス（Lactobacillus brevis）、ラクトバチルス・ジェンセニ（Lactobacillus jensenii）、ラクトバチルス・ジョンソニ（Lactobacillus johnsonii）、ラクトバチルスプランタラム（Lactobacillus plantarum）、ラクトバチルス・ロイテリ（Lactobacillus reuteri）、ラクトバチルス・ヘルベティカス（Lactobacillus helveticus）、ラクトコッカス・ラクティス（Lactococcus lactis subsp. lactis）、ラクトコッカス・クレモリス（Lactococcus lactis subsp. cremoris）、ストレプトコッカス・サーモフィラス（Streptococcus thermophilus）等が挙げられる。
【００２５】
さらに本技術において、本技術の高浸透圧培地及び／又はストレプトマイシン含有培地を用いる場合、（１）ビフィドバクテリウム・ブレーベ及びビフィドバクテリウム・ロンガム・サブスピーシーズ・インファンティスの２種類を被検菌とすること、又は（２）ビフィドバクテリウム・ブレーベ、ビフィドバクテリウム・ロンガム・サブスピーシーズ・インファンティス及びビフィドバクテリウム・ロンガム・サブスピーシーズ・ロンガムの３種類を被検菌とすることが、測定の簡便さ及び精度の観点から好適である。本技術は、これら２又は３種類の各生菌数をより簡便に精度良く測定できる利点を有する。
【００２６】
本技術による生菌数測定が適用されうるビフィズス菌のうち、さらにより好適な具体例として、例えば、  ［１］ビフィドバクテリウム・ロンガム  ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２６２１（別名：ＢＢ５３６又はBifidobacterium longum subsp. longum ATCC BAA-999）；  ［２］ビフィドバクテリウム・インファンティス  ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２６２３（別名：Ｍ−６３又はBifidobacterium longum subsp. infantis BCCM LMG 23728）；  ［３］ビフィドバクテリウム・ブレーベ  ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２６２２（別名：Ｍ−１６Ｖ）；これら［１］〜［３］の３種類の菌は、有用菌として製品に使用されている観点、及び本技術を用いれば各菌の区別が容易でかつ正確に測定できる観点から、好ましい。
【００２７】
なお、ＢＢ５３６、Ｍ−６３、Ｍ−１６Ｖは、森永乳業株式会社等から市販されている製品に含まれるものである。本技術の測定方法をこのような菌が単独又は複数種類含まれている製品に用いることが望ましい。また、市販品から、ＢＢ５３６、Ｍ−６３、Ｍ−１６Ｖとして、採取することも可能である。
【００２８】
さらに、本技術において、前記［１］ビフィドバクテリウム・ロンガム  ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２６２１、前記［２］ビフィドバクテリウム・インファンティス  ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２６２３、及び［３］ビフィドバクテリウム・ブレーベ  ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２６２２からなる群から選ばれる１種又は２種以上（より好適にはこれら３種類のビフィズス菌）が、これらは有用菌として製品に使用されている観点及び本技術を用いれば簡便で精度よく各生菌数を測定できる観点から、好適である。
【００２９】
［１］  ビフィドバクテリウム・ロンガム  ＢＢ５３６（ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２６２１）は、独立行政法人  製品評価技術基盤機構  特許微生物寄託センター（ＮＰＭＤ）（住所：〒２９２−０８１８  日本国千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８  １２２号室）に、２０１８年１月２６日にＮＩＴＥ  ＢＰ−０２６２１の受託番号で、ブダペスト条約に基づく国際寄託がなされたものである。これと同一の細菌であるBifidobacterium longum subsp. longum ATCC BAA-999（番号：ATCC BAA-999）は、American Type Culture Collection（ＡＴＣＣ）から、ATCC BAA-999として入手可能である（例えば、特開2012-223134等参照）。
［２］  ビフィドバクテリウム・インファンティスＭ−６３（ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２６２３）
は、独立行政法人  製品評価技術基盤機構  特許微生物寄託センター（ＮＰＭＤ）（住所：〒２９２−０８１８  日本国千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８  １２２号室）に、２０１８年１月２６日にＮＩＴＥ  ＢＰ−０２６２３の受託番号で、ブダペスト条約に基づく国際寄託がなされたものである。これと同一の細菌であるBifidobacterium longum subsp. infantis BCCM LMG 23728（番号：BCCM／LMG 23728）は、BELGIAN CO-ORDINATED COLLECTIONS OF MICRO-ORGANISMS（ＢＣＣＭ）から、BCCM／LMG 23728として入手可能である（例えば、特開2012-223134等参照）。
［３］  ビフィドバクテリウム・ブレーベ  Ｍ‐１６Ｖ（ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２６２２は、独立行政法人  製品評価技術基盤機構  特許微生物寄託センター（ＮＰＭＤ）（住所：〒２９２−０８１８  日本国千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８  １２２号室）に、２０１８年１月２６日にＮＩＴＥ  ＢＰ−０２６２２の受託番号で、ブダペスト条約に基づく国際寄託がなされたものである。
【００３０】
＜培養工程＞
本技術は、上述した被検体を、高浸透圧培地組成物を含む培地を用いて培養する、培養工程を含むものである。
【００３１】
＜培地＞
〔高浸透圧培地〕
本技術の高浸透圧培地を用いることにより、１種類又は複数種類の細菌を含む被検体を使用する場合であっても、ブレーベと他の菌種とを簡便に精度良く区別できる。そして、高浸透圧培地に形成されたコロニー数に基づきブレーベのみを同定することができ、ブレーベの生菌数をより精度よく簡便に測定することができる。
本技術で用いる「高浸透圧培地」の「浸透圧」とは、培地中の寒天末を加熱溶解する前の〔培地組成物／水１Ｌ〕のときの浸透圧である。
本技術で用いる「高浸透圧培地」は、一般的な基礎培地の寒天末を加熱溶解する前の〔培地組成物／水１Ｌ〕のときの浸透圧と比較したときに、〔培地組成物／水１Ｌ〕のときの浸透圧が高い。この浸透圧が高いことを「高浸透圧」と本技術において定義している。
本技術の「浸透圧」を測定する場合、寒天を含む培地組成物と水とを混合し、寒天末が加熱溶解されていない状態の〔培地組成物／水１Ｌ〕を調製する；そして、寒天末が加熱溶解されていない状態の〔培地組成物／水１Ｌ〕の浸透圧を、浸透圧測定装置にて測定する。この調製するときの水温は、寒天末が加熱溶解されない温度であればよく、例えば５〜５０℃程度である。
浸透圧装置として、例えば、アドバンス  オズモメータ３２５０（氷点降下法浸透圧計：アドバンス社）等が挙げられる。
なお、後記〔実施例〕に示すように、一般的な基礎培地の浸透圧は、寒天末を加熱溶解せずに〔培地組成物／水１Ｌ〕に調製したときに、４００〜６００ｍＯｓｍである。
【００３２】
本技術の高浸透圧培地は、浸透圧が〔培地組成物／水１Ｌ〕のときに８９０ｍＯｓｍ以上であることが好適である。浸透圧が〔培地組成物／水１Ｌ〕のときに８９０ｍＯｓｍ以上にすることで、培地に形成されたコロニーの状態によってブレーベと他の菌種とを簡便に精度良く区別できる。これにより、ブレーベの生菌数をより精度よく測定することができる。
当該浸透圧が〔培地組成物／水１Ｌ〕のときの下限値は、より好ましくは９５０ｍＯｓｍ以上、さらに好ましくは１０５０ｍＯｓｍ以上である。当該浸透圧が〔培地組成物／水１Ｌ〕のときの上限値は、好ましくは１４５０ｍＯｓｍ以下であり、より好ましくは１３５０ｍＯｓｍ以下である。また、当該浸透圧〔培地組成物／水１Ｌ〕のときの範囲は、８９０〜１３５０ｍＯｓｍであることが、ブレーベのみのコロニーが形成できるとともに当該ブレーベの生残率が高い観点から、好ましい。
【００３３】
本技術の高浸透圧培地組成物に使用する高浸透圧調整成分として、浸透圧を高くできる物質であれば特に限定されず、例えば、塩類（例えば、無機塩類、有機塩類等）、糖類（例えば、単糖類・オリゴ糖類、これらの還元物）、アミノ酸類・ペプチド類、有機酸塩等が挙げられ、本技術において、これらを１種又は２種以上使用することができる。また、本技術の高浸透圧調整成分は、水溶性物質が作業性、溶解性及び浸透圧調整が容易なため、好ましい。
【００３４】
本技術で高浸透圧調整成分として用いられる塩類として、特に限定されないが、一般的に培地に使用されている塩類が好ましい。
前記塩類として、例えば任意の酸性基（例えば、ハロゲン、カルボキシル）で形成されるアニオン塩、又は任意の塩基性基（例えば、アルカリ金属、アミノ）で形成されるカチオン塩のいずれでもよい。
前記塩類には、無機塩及び有機塩のいずれでもよく、また、前記塩類として、例えば、金属塩、アンモニウム塩、有機塩基との塩、無機酸との塩、有機酸との塩等が挙げられる。
【００３５】
前記金属塩として、より具体的には、例えば、アルカリ金属（例えば、ナトリウム、カリウム等）、アルカリ土類金属（例えば、カルシウム、マグネシウム等）、亜鉛、銅、鉄、アルミニウム等が挙げられる。また、前記ハロゲンとして、より具体的には、例えば、塩素、臭素、フッ素等が挙げられる。
本技術において、浸透圧の調整が容易な観点から、アルカリ金属塩及びアルカリ土類塩が好ましく、易水溶性の観点から、ハロゲン化アルカリ金属塩（例えば、塩化ナトリウム、塩化カリウム等）が好ましい。
これら塩類の群から１種又は２種以上を選択することができる。
【００３６】
本技術で高浸透圧調整成分として用いられる有機酸として、特に限定されないが、例えばクエン酸回路系の有機酸等が挙げられる。当該有機酸として、例えば、ピルビン酸、乳酸、酢酸、オキサロ酢酸、クエン酸、イソクエン酸、オキサロコハク酸、αケトグルタル酸、コハク酸、フマル酸、リンゴ酸等が挙げられる。
本技術で用いられる無機酸として、特に限定されない。当該無機酸として、例えば、硝酸、硫酸、リン酸等が挙げられる。
これら有機酸及び／又は無機酸の群から１種又は２種以上選択することができ、またこれら有機酸及び／又は無機酸はｐＨ調整によってカチオン塩又はアニオン塩を形成してもよい。
【００３７】
本技術で高浸透圧調整成分として用いられるアミノ酸類・ペプチド類として、特に限定されない。当該アミノ酸類として、例えば、アラニン、アルギニン、アスパラギン、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、フェニルアラニン、チロシン等が挙げられる。また、ペプチド類は、これらアミノ酸残基が同じに又は異なって２〜１０個程度でペプチド結合しているものが挙げられる。
これらアミノ酸類・ペプチド類の群から１種又は２種以上選択することができ、またこれらはｐＨ調整によってカチオン塩又はアニオン塩を形成してもよい。
【００３８】
本技術で高浸透圧調整成分として用いられる糖類は、特に限定されないが、例えば、単糖及びオリゴ糖並びにこれらの還元物（糖アルコール等）が挙げられる。
前記単糖として、アルドース及びケトースのいずれでもよく、中性糖の他、糖のＯＨ基がアミノ基、デオキシ基、カルボニル基になっている、アミノ糖、デオキシ糖、ウロン酸でもよい。中性糖として、例えば、グリセルアルデヒド、エリトロース、トレイトール、キシロース、リボース、アラビノース、グルコース、ガラクトース、マンノース等のアルドース及びフルクトース等のケトース等が挙げられる。また、例えば、アミノ糖として、例えば、グルコサミン、ガラクトサミン等；デオキシ糖として、例えば、フコース、ラムノース等；ウロン酸として、例えば、グルクロン酸、ガラクツロン酸等が挙げられる。さらに、これらの還元物の糖アルコールであってもよく、例えば、ソルビトール（グルコシトール）、ガラクチトール、マンニトール、グルコン酸等が挙げられる。
前記オリゴ糖として、例えば、マルトオリゴ糖（例えば、マルトース等）、イソマルトオリゴ糖、フラクトオリゴ糖、ガラクトオリゴ糖、マンナンオリゴ糖、スクロース、ラクトース、ラフィノース等が挙げられる。二糖類〜四糖類等が好適である。さらにこれらの還元物の還元オリゴ糖であってもよく、還元麦芽糖（マルチトール）等が挙げられる。
また、糖類として、単糖及びオリゴ糖を含むブドウ糖含有製品（例えば、異性化糖、水飴、デンプン加水分解物等）であってもよい。
これら糖類の群から１種又は２種以上選択することができる。
【００３９】
本技術において、上述した塩類等の高浸透圧調整成分を複数組み合わせて用いる場合には、培地組成物に水を加えて寒天末が加熱溶解しない状態で、上述した高浸透圧の範囲になるように高浸透圧調製成分を配合しつつ浸透圧測定装置にて調整できる。本技術では、加熱殺菌前に高浸透圧を調整できるので作業も容易であることから、測定結果の均質化が図りやすい。
本技術の高浸透圧培地は、少なくとも塩類及び／又は糖類を含むものが、浸透圧を調整し易い観点から、好適である。塩類及び糖類は易水溶性物質が多く存在するので、寒天末を加熱溶解しない状態で高浸透圧を調整し易い利点がある。
本技術において、前記培地中の塩類の含有量は、１１〜３０ｇ／培地１Ｌが好ましく、１５〜２５ｇ／培地１Ｌがより好ましい。
本技術の高浸透圧培地組成物において、前記培地中の糖類の含有量は、１３０〜２２０ｇ／培地１Ｌが好ましく、１４０〜１９０ｇ／培地１Ｌがより好ましい。
本技術の高浸透圧培地組成物において、前記培地中の塩類及び糖類を複数含有させる場合、これらの量は、上述の好適な高浸透圧になるように、調整できる。
【００４０】
本技術の高浸透圧培地に用いる高浸透圧培地組成物の製造方法は特に限定されないが、例えば、基礎培地組成物に、上述した高浸透圧調整の成分を加えて高浸透圧になるように調整することによって高浸透圧培地組成物を得ることが好適である。
【００４１】
なお、本技術で用いられる基礎培地組成物は、一般的に細菌が生育可能な培地組成物として使用されているものであればよい。
前記基礎培地組成物として、乳酸菌及び／又はビフィズス菌が生育可能な、乳酸菌及び／又はビフィズス菌用の基礎培地組成物が好ましく、当該基礎培地組成物は、市販品を使用できる。
なお、基礎培地組成物の任意培地成分として、測定目的の菌種のコロニー数及び生菌数に影響を及ぼさない範囲で、任意の抗生物質を添加してもよい。
【００４２】
前記基礎培地組成物のうち、さらにビフィズス菌用の基礎培地組成物が好ましい。ビフィズス菌用であるため本技術のブレーベの生菌数をより正確に測定できる。
一般的に、ビフィズス菌用の基礎培地組成物に使用されうる成分としては、酵母エキス、肉エキス、ぺフトン等の窒素源；塩化ナトリウム、酢酸ナトリウム、プロピオン酸ナトリウム等のナトリウム塩、L−システイン塩酸塩、リン酸塩、硫酸塩等の塩類；グルコース、デンプン、スクロース、ラフィノース、ガラクトース等の糖源等が挙げられ、これらを１種又は２種以上使用することができる。
また、ビフィズス菌用の基礎培地組成物として、市販されている製品又は培地組成物を使用してもよい。前記基礎培地組成物として、例えば、ＴＯＳプロピオン酸寒天培地組成物（以下、「ＴＯＳ寒天培地組成物」ともいう）、強化クロストリジウム寒天培地組成物（以下、「ＲＣＭ寒天培地組成物」ともいう）等が挙げられる。このうち、ＴＯＳ寒天培地組成物、ＲＣＭ寒天培地組成物が好ましい。なお、本技術で「培地組成物」は、固化させる前の培地成分であってもよいし固化された培地であってもよいが、特に言及しなければ固化させる前の培地成分である。
【００４３】
そして、本技術では、上述した高浸透圧調整成分及び基礎培地組成物を含む培地組成物を加熱殺菌にて寒天末等の成分を溶解する。この寒天末溶解物をシャーレ等の容器に注入し冷却することによって、ビフィズス菌の各菌種及び生菌数の判定用の高浸透圧培地を得ることができる。
また、本技術では、寒天末溶解前の基礎培地組成物に高浸透圧調整成分を配合して当該組成物の浸透圧を調整してもよい。そして、調整された高浸透圧培地組成物を加熱殺菌してシャーレ等に注入して高浸透圧培地を作製できる。
なお、固体培養法を用いる場合、寒天末が、最終的に得られる培地中に１〜３％（約１．５％程度）となるように培地に配合されることが好ましい。
【００４４】
本技術の別の態様として、ビフィドバクテリウム・ブレーベの生菌数を測定するための高浸透圧培地組成物を提供することができる。
本技術の高浸透圧培地組成物は、８９０ｍＯｓｍ以上になることが、よりビフィドバクテリウム・ブレーベの生菌数を測定し易い観点から、好適である。当該浸透圧は、上述したｍＯｓｍの範囲に設定することが好ましい。
本技術の高浸透圧培地組成物は、上述した高浸透圧培地組成物の各成分を使用することが好ましく、少なくとも塩類及び／又は糖類を含むものが好適である。
【００４５】
本技術の培養工程は、寒天培地にて行う培養方法（固体培養法）を用いて実施することができる。
本技術の培養工程において、培地で培養する前に、前記被検体を適宜希釈することが、より正確な生菌数を計測する観点から、望ましい。
前記方法は、具体的には；懸濁液を段階的に希釈する液にて希釈して各希釈物を得る。寒天培地を用いて各希釈物を培養する。この寒天培地中に形成されたコロニー数を計測する。このとき形成されたコロニー数が、希釈物中に含まれる微生物の生菌数に該当する。
そのため、コロニー数の値と希釈倍率とから、希釈液中に含まれる細菌の生菌数が求められる。コロニー数３０〜３００個／培地の全面積６０ｃｍ２になるように、希釈液の希釈倍率を調整することが好適である。
このようにして求められた懸濁液中の生菌数と、当該懸濁液中に含まれる検体量から、当該検体中に含まれる細菌の生菌数（ＣＦＵ／ｇ）が求めれれる。
【００４６】
上記の方法において、懸濁液を希釈する液は、一般的に使用されている希釈液を使用することができる。
前記一般的な希釈液としては、例えば、０．８５％生理食塩水、０．１％ペプトン加生理食塩水、光岡バッファー、バッファードペプトンウォーター等が挙げられる。
また、一般社団法人全国はっ酵乳乳酸菌飲料協会が推奨する方法では、希釈液について、食品衛生検査指針に記載された嫌気性検体希釈液が推奨されている。当該嫌気性検体希釈液は、ＫＨ２ＰＯ４：４．５ｇ、Ｎａ２ＨＰＯ４：６．０ｇ、Ｌ−システインＨＣｌ・Ｈ２Ｏ：０．５ｇ、Ｔｗｅｅｎ８０：０．５ｇ、寒天：１．０ｇ、精製水：１，０００ｍＬからなる液体であり、腸内フローラ中に存在する嫌気性菌検出の際に、広く使用されている。当該嫌気性検体希釈液を一次希釈液として使用し、０．８５％生理食塩水を二次希釈液として使用してもよい。
【００４７】
前記培養方法として、具体的には、混釈法、平板塗抹法、スパイラル法等が挙げられる。混釈法は、適宜希釈した懸濁液を、加温溶解した寒天培地と混和し、冷却固形化して培養する方法である。平板塗抹法は、適宜希釈した懸濁液を、寒天培地上に塗抹して培養する方法である。スパイラル法は、試験試料を、機器等を使用して濃度勾配を付けてプレーティングする方法である。
このうち、好ましくは平板塗抹法及び混釈法であり、さらに好ましくは混釈法である。
培養に用いる寒天培地の種類、培養条件（培養温度、培養時間等）については、測定対象の微生物に応じて公知の培養条件を利用でき、例えば、寒天培地としては、測定対象の微生物が生育可能なものでもよい。ビフィズス菌の場合、コロニー数カウントは、主に３７℃で７２時間嫌気培養した後に行われる。
【００４８】
＜判定工程＞
本技術の判定工程において、上述のようにして培養後、高浸透圧培地中又は上に形成されたコロニーをブレーベとして同定する。
本技術の高浸透圧培地を用いて培養した場合、ブレーベが優先的に選択的にコロニー形成できる。このため、本技術は、形成されたコロニー数から、ブレーベの存在の有無（すなわち同定）及び生菌数を測定することができる。
【００４９】
従来の生菌数測定方法は、特殊なコロニー形態（例えば、特殊な発色、立体的な形状、平面的な大きさや形状等）の観察を行う場合がある。しかし、このような場合高い熟練度が必要であり、また同一の者であってもデータのばらつきがあった。
これに対し、本技術は、特殊なコロニーの形態観察を行わずとも、高浸透圧培地を用いて形成されたコロニー及びその数をブレーベ及びその生菌数として判定できる。このため、熟練度が少ない場合でも簡便にかつ精度よくブレーベの同定及びその生菌数を計測できる。また、本技術は、測定者の熟練度や個人差による影響が少ないので、測定結果のさらなる均質化を図ることも可能である。
また、本技術であれば、形成されたコロニー数を計測すればよく高度な経験に基づいたコロニー形態を判定しなくともよいので、カメラ（ＣＣＤ等）を用いて画像解析にて行うことも可能である。画像解析等を利用することで、コロニー判定を自動化できると共に、被検体中の生菌数算出を自動化できる観点で有利である。
【００５０】
本技術の生菌数の計測方法は、本技術の培地を用いる以外は公知の計測方法を利用できる。
本技術において以下のように算出されることが好ましい。
全生菌数（ＣＦＵ／製品１ｇ）＝希釈倍率×培地中に又は上に形成された全コロニー数／塗布量ｍＬ／製品の測定重量。
コロニー数３０〜３００個／培地の全面積６０ｃｍ２あたりとするのが好ましい。
なお、培地の一部エリアを任意設定し、このエリア内の全コロニー数及び（一部エリア／全エリア）の面積比により、培地の全面積の全コロニー数を算出してもよい。
【００５１】
＜２．ビフィドバクテリウム・ロンガム・サブスピーシーズ・インファンティスの生菌数の測定方法＞
本技術では、１種類又は複数種類の細菌を含む被検体をストレプトマイシン含有培地を用いて、形成されたコロニーをビフィドバクテリウム・ロンガム・サブスピーシーズ・インファンティスとして計測し、希釈倍率により生菌数を算出する判定工程、を含むことにより、前記インファンティスの生菌数の測定方法を提供することができる。
本技術のストレプトマイシン含有培地を用いることより、１種類又は複数種類の細菌を含む被検体を使用する場合であっても、ビフィドバクテリウム・ロンガム・サブスピーシーズ・インファンティスと他の菌種とを簡便に精度良く区別できる。そして、ストレプトマイシン含有培地に形成されたコロニー数に基づき、インファンティスのみを同定することができ、ビフィドバクテリウム・ロンガム・サブスピーシーズ・インファンティスの生菌数をより精度良く簡便に測定できる。
なお、上記＜１．ビフィドバクテリウム・ビフィドバクテリウム・ブレーベの生菌数を測定する方法＞と共通する構成（例えば、被検体及び基礎培地組成物等）についてはその説明を省略する。
【００５２】
〔ストレプトマイシン含有培地〕
本技術に用いるストレプトマイシン含有培地は、上述した基礎培地組成物とストレプトマイシンとを混合したものであることが好適である。これにより、ビフィドバクテリウム・ロンガム・サブスピーシーズ・インファンティスの生菌数を優先的に選択的に測定することができる。
【００５３】
前記ストレプトマイシン含有培地中のストレプトマイシンの含有量は、下限値として、インファンティスのみのコロニーを精度良く形成させるため、好ましくは５０ｍｇ／培地１Ｌ以上であり、より好ましくは６０ｍｇ／培地１Ｌ以上である。また当該ストレプトマイシン含有量の上限値として、ビフィドバクテリウム・ロンガム・サブスピーシーズ・インファンティスのコロニーを容易に形成させるために、好ましくは２０００ｍｇ／培地１Ｌ以下、より好ましくは１７００ｍｇ／培地１Ｌ以下、さらに好ましくは１５００ｍｇ／培地１Ｌ以下である。当該ストレプトマイシン含有量の範囲として、より好ましくは５０〜２０００ｍｇ／培地１Ｌ、さらに好ましくは６０〜１７００ｍｇ／培地１Ｌであり、より好ましくは６０〜１５００ｍｇ／培地１Ｌである。
このようにインファンティスが広範囲のストレプトマイシン濃度でもコロニー形成することができることを本発明者らは見出した。このことから、本技術では、培地中のストレプトマイシン濃度の調整作業も容易であることから、測定結果の均質化が図りやすい。
【００５４】
本技術のビフィドバクテリウム・ロンガム・サブスピーシーズ・インファンティスの生菌測定方法は、ストレプトマイシンを含む培地組成物を使用した以外は上述したブレーベの生菌数の測定方法の＜培養工程＞＜判定工程＞と同様にして、培養工程及び判定工程を行い、ビフィドバクテリウム・ロンガム・サブスピーシーズ・インファンティスの生菌数を測定することができる。
【００５５】
本技術は、特殊なコロニーの形態観察を行わずとも、ストレプトマイシン含有培地を用いて形成されたコロニー数をビフィドバクテリウム・ロンガム・サブスピーシーズ・インファンティス及びその生菌数として判定できる。このため、熟練度が低い場合でも簡便にかつ精度よくインファンティスの同定及びその生菌数を計測できる。また、本技術は、測定者の熟練度や個人差による影響が少ないので、測定結果のより均質化を図ることも可能である。さらに、後述するように、同一被験体で高浸透圧培地を用いる方法及びストレプトマイシン含有培地を用いる方法を行うことが、簡便で精度良く各種類の生菌数を測定できるので、好適である。
また、本技術であれば、形成されたコロニー数を計測すればよく高度な経験に基づいたコロニー形態を判定しなくともよいので、カメラ（ＣＣＤ等）を用いて画像解析にて行うことも可能である。画像解析等を利用することで、コロニー判定を自動化できると共に、被検体中の生菌数算出を自動化できる観点で有利である。
なお、本技術の別の態様として、ビフィドバクテリウム・ロンガム・サブスピーシーズ・インファンティスの生菌数を測定するためのストレプトマイシン含有培地組成物を提供することができる。
【００５６】
＜３．ビフィドバクテリウム・ブレーベ及びビフィドバクテリウム・ロンガム・サブスピーシーズ・インファンティスの各生菌数の測定方法＞
本技術では、１種類又は複数種類の細菌を含む被検体を、以下の（１）及び（２）の測定方法又は測定工程；
（１）高浸透圧培地を用いて、形成されたコロニーをビフィドバクテリウム・ブレーベとして計測し生菌数を測定すること、及び（２）ストレプトマイシン含有培地を用いて、形成されたコロニーをビフィドバクテリウム・ロンガム・サブスピーシーズ・インファンティスとして計測し生菌数を測定すること；を含むことにより、ビフィドバクテリウム・ブレーベ及びビフィドバクテリウム・ロンガム・サブスピーシーズ・インファンティスのそれぞれの生菌数の測定方法を提供することができる。
なお、上記＜１．ビフィドバクテリウム・ブレーベの生菌数を測定する方法＞及び＜２．ビフィドバクテリウム・ロンガム・サブスピーシーズ・インファンティスの生菌数の測定方法＞と共通する構成（例えば、被検体及び基礎培地組成物等）についてはその説明を省略する。
【００５７】
本技術の高浸透圧培地を用いることにより、種類又は複数種類の細菌を含む被検体を使用する場合であっても、ビフィドバクテリウム・ブレーベのみを優先的に選択的に同定することができ、当該ビフィドバクテリウム・ブレーベの生菌数を簡便に精度よく測定することができる。
さらに、本技術のストレプトマイシン含有培地を用いることより、１種類又は複数種類の細菌を含む被検体を使用する場合であっても、ビフィドバクテリウム・ロンガム・サブスピーシーズ・インファンティスのみを優先的に選択的に同定することができ、当該ビフィドバクテリウム・ロンガム・サブスピーシーズ・インファンティスの生菌数を簡便に精度よく測定することができる。
この併用の場合、同一被験体を用いることが、簡便に精度良く各種類の生菌数を測定できるので好ましい。
この併用により、本技術は、特に、ビフィドバクテリウム・ブレーベ及び／又はビフィドバクテリウム・ロンガム・サブスピーシーズ・インファンティスをより明確に区別することができ、それぞれの生菌数をより正確に簡便に測定することができる。
【００５８】
この併用により、本技術は、測定者の熟練度や個人差による影響が少ないので、ビフィドバクテリウム・ブレーベ及びビフィドバクテリウム・ロンガム・サブスピーシーズ・インファンティスの測定結果の均質化を図れる。また、画像解析等を利用することで、コロニー判定を自動的化できると共に、被検体中の生菌数算出を自動化できる観点で有利である。
【００５９】
＜４．ビフィドバクテリウム・ブレーベ、ビフィドバクテリウム・ロンガム・サブスピーシーズ・インファンティス及びビフィドバクテリウム・ロンガム・サブスピーシーズ・ロンガムの各生菌数の測定方法＞
本技術では、１種類又は複数種類の細菌を含む被検体を、以下の（１）〜（３）の測定工程又は測定方法；
（１）高浸透圧培地を用いて、形成されたコロニーをブレーベとして計測し生菌数を測定すること；
（２）ストレプトマイシン含有培地を用いて、形成されたコロニーをビフィドバクテリウム・ロンガム・サブスピーシーズ・インファンティスとして計測し生菌数を測定すること；
（３）（i）無菌脱繊血添加なしのＢＬ寒天培地を用いて、形成されたビフィドバクテリウム・ロンガム・サブスピーシーズ・ロンガム特有のコロニーをビフィドバクテリウム・ロンガム・サブスピーシーズ・ロンガムとして計測し生菌数を測定すること、及び／又は（ii）上述した基礎培地（好適にはビフィズス菌用基礎培地）を用いて、形成された全コロニー数を全ての細菌として計測し全菌種の生菌数を測定すること；
を含むことにより、ブレーベ、ビフィドバクテリウム・ロンガム・サブスピーシーズ・インファンティス及びビフィドバクテリウム・ロンガム・サブスピーシーズ・ロンガムのそれぞれの生菌数の測定方法を提供することができる。
【００６０】
なお、上記＜１．ビフィドバクテリウム・ブレーベの生菌数を測定する方法＞、＜２．ビフィドバクテリウム・ロンガム・サブスピーシーズ・インファンティスの生菌数の測定方法＞、＜３．ビフィドバクテリウム・ブレーベ及びビフィドバクテリウム・ロンガム・サブスピーシーズ・インファンティスの各生菌数の測定方法＞と共通する構成（例えば、被検体及び基礎培地組成物等）についてはその説明を省略する。
【００６１】
前記被験体に含まれる細菌の種類が、ビフィドバクテリウム・ブレーベ及びビフィドバクテリウム・ロンガムの２種類であることが好ましい。当該ビフィドバクテリウム・ロンガムのうち、ビフィドバクテリウム・ロンガム・サブスピーシーズ・インファンティス及びビフィドバクテリウム・ロンガム・サブスピーシーズ・ロンガムであることが好ましい。
本技術において、より好ましくは、ビフィドバクテリウム・ブレーベ、ビフィドバクテリウム・ロンガム・サブスピーシーズ・インファンティス及びビフィドバクテリウム・ロンガム・サブスピーシーズ・ロンガムの３種類である。
【００６２】
前記（３）（i）無菌脱繊血添加なしのＢＬ寒天培地を用いて、形成されたコロニーをビフィドバクテリウム・ロンガム・サブスピーシーズ・ロンガムとして計測し生菌数を測定する。本培地での形態観察により、ビフィドバクテリウム・ロンガム・サブスピーシーズ・ロンガムを見分けることが可能である。
【００６３】
前記（３）（ii）基礎培地（好適にはビフィズス菌用基礎培地）を用いて、形成された全コロニー数を全ての細菌として計測し全菌種の生菌数を測定する。さらに、当該全コロニー数から、前記（１）及び（２）の各培地を用いた各生菌数の結果を差し引くことで、ビフィドバクテリウム・ロンガム・サブスピーシーズ・ロンガムの生菌数を算出することができる。
本技術は、特殊なコロニーの形態観察を行わずとも、通常培地を用いて形成されたコロニー数を全菌種の生菌数として判定できる。このため、本技術の高浸透圧培地及びストレプトマイシン含有培地を用いることで、最終的に、熟練度が低い場合でも簡便にかつ精度よくビフィドバクテリウム・ロンガム・サブスピーシーズ・ロンガムの同定及びその生菌数を計測できる。また、本技術は、測定者の熟練度や個人差による影響が少ないので、測定結果のより均質化を図ることも可能である。
また、前記（１）及び（２）の各培地、さらに（３）（i）の培地を用いてもよい。これら各結果を考慮して、ビフィドバクテリウム・ブレーベ、ビフィドバクテリウム・ロンガム・サブスピーシーズ・インファンティス及びビフィドバクテリウム・ロンガム・サブスピーシーズ・ロンガムの各生菌数を判定してもよい。
また、本技術では、一般的な基本培地を使用するので、入手も容易でありまた判定用培地を容易に作製であることから、測定結果の均質化が図りやすい。
【００６４】
従来、ビフィドバクテリウム・ブレーベ、ビフィドバクテリウム・ロンガム・サブスピーシーズ・インファンティス及びビフィドバクテリウム・ロンガム・サブスピーシーズ・ロンガムが含まれている被験体においてこれら各生菌数を測定する場合、無菌脱繊血を添加したＢＬ寒天培地を用いていた。しかしながら、本技術により、無菌脱繊血を用いなくともよく、さらにより簡便に精度よくこれら各生菌数を測定することができる。
【００６５】
＜５．本技術の１種類又は複数種類の細菌を含む組成物の製造方法＞
本技術は、別の側面として、上記＜１．ビフィドバクテリウム・ブレーベの生菌数を測定する方法＞、＜２．ビフィドバクテリウム・ロンガム・サブスピーシーズ・インファンティスの生菌数の測定方法＞、＜３．ビフィドバクテリウム・ブレーベ及びビフィドバクテリウム・ロンガム・サブスピーシーズ・インファンティスの各生菌数の測定方法＞、又は＜４．ビフィドバクテリウム・ブレーベ、ビフィドバクテリウム・ロンガム・サブスピーシーズ・インファンティス及びビフィドバクテリウム・ロンガム・サブスピーシーズ・ロンガムの各生菌数の測定方法＞を用いて、１種類又は複数種類の細菌を含む組成物の製造法を提供することも可能である。
なお、上記＜１．ビフィドバクテリウム・ブレーベの生菌数を測定する方法＞〜＜４．ビフィドバクテリウム・ブレーベ、ビフィドバクテリウム・ロンガム・サブスピーシーズ・インファンティス及びビフィドバクテリウム・ロンガム・サブスピーシーズ・ロンガムの各生菌数の測定方法＞と共通する構成についてはその説明を省略する。
【００６６】
本技術の組成物の製造方法の「組成物」は、特に限定されず、本技術の被検体に使用可能な組成物であればよく、製品であってもよく試作品であってもよい。例えば、飲食品組成物、医薬品組成物、飼料組成物等の何れでも良いが、上記＜１．ブレーベの生菌数を測定する方法＞〔被験体〕にて説明した製品が好適である。
【００６７】
本技術の組成物の製造方法は、１種類又は複数種類の細菌を含む組成物の製造方法であり、（１）上記＜１．ビフィドバクテリウム・ブレーベの生菌数を測定する方法＞、＜２ビフィドバクテリウム・ロンガム・サブスピーシーズ・インファンティスの生菌数の測定方法＞、＜３．ビフィドバクテリウム・ブレーベ及びビフィドバクテリウム・ロンガム・サブスピーシーズ・インファンティスの各生菌数の測定方法＞、又は＜４．ビフィドバクテリウム・ブレーベ、ビフィドバクテリウム・ロンガム・サブスピーシーズ・インファンティス及びビフィドバクテリウム・ロンガム・サブスピーシーズ・ロンガムの各生菌数の測定方法＞の少なくとも何れか１つの生菌数の測定方法を用いて、被検体となる組成物中の各細菌グループ（各細菌グループであってもよい）の生菌数を測定する工程；前記測定された組成物中の各細菌の生菌数に基づいて、目的生菌数になるように組成物中の各細菌の配合量を調整し設計する工程を含み、
前記各細菌の配合量の設計に基づき、前記１種類又は複数種類の細菌を含む組成物を得ることが好適である。
また、前記（１）の生菌数の測定工程は、上記＜１．ビフィドバクテリウム・ブレーベの生菌数を測定する方法＞〜＜４．ビフィドバクテリウム・ロンガム・サブスピーシーズ・ブレーベ、ビフィドバクテリウム・ロンガム・サブスピーシーズ・インファンティス及びビフィドバクテリウム・ロンガム・サブスピーシーズ・ロンガムの各生菌数の測定方法＞の生菌数の測定方法を適宜２つ以上組み合わせて行ってもよい。
【００６８】
本技術の組成物の製造方法における前記（１）の生菌数測定工程は、上記＜１．ビフィドバクテリウム・ブレーベの生菌数を測定する方法＞〜＜４．ビフィドバクテリウム・ブレーベ、ビフィドバクテリウム・ロンガム・サブスピーシーズ・インファンティス及びビフィドバクテリウム・ロンガム・サブスピーシーズ・ロンガムの各生菌数の測定方法＞と共通する構成について、その説明を省略する。
本技術の組成物の製造方法において、被検体となる組成物は、１種類又は複数種類であり、複数の場合には、同一ロット、製造時期が同時期、製造原材料が同一であるものが好ましい。
目的生菌数とは、１種類又は複数種類でもよい。また、目的生菌数とは、特に限定されず、製造者の任意によって設定することができ、製造時に組成物に配合する生菌数である。例えば、目的生菌数として、製造時に基準として設定された生菌数；製造直後の生菌数マイナス製造保管時の生菌数に基づき生菌数の減少分を補充するように補正された生菌数等が挙げられる。
本技術の被検菌は特に限定されないが、好ましくはビフィズス菌であり、より好ましくはビフィドバクテリウム・ブレーベ及びビフィドバクテリウム・ロンガムであり、よりさらに好ましくはビフィドバクテリウム・ブレーベ、ビフィドバクテリウム・ロンガム・サブスピーシーズ・インファンティス及びビフィドバクテリウム・ロンガム・サブスピーシーズ・ロンガムから選択される２種類又は３種類である。
【００６９】
組成物に１種類又は複数種類の細菌が含まれているが、経時的変化によって、この組成物中の１種類の細菌又は複数種類の各細菌の生残率等が変化してくる。このため、細菌を含む組成物の品質管理では、長期間保存したときにこの変化を想定して各細菌の配合量及び細菌割合を調整する対策も必要となっている。本技術では、このような細菌の配合量及び配合割合の調整をより正確に行うことができる。
【００７０】
また、細菌を通常長期間保存すると細菌の生育力も低下しやすいので、特殊な成分を使用して生菌数を測定する方法ではその特殊な成分の影響によって真の生残率よりもより低い生残率を算出しやすく、正確さに欠けるリスクがある。しかしながら、本技術の培地組成物はそのリスクを低減することができる。
【００７１】
また、本技術では、保管による組成物中の各細菌の生菌数及び細菌割合の変化をモニタリングし正確に把握することもできる。そして、本技術では、このモニタリング結果を製造プロセスにフィードバックし、製造プロセスにおける組成物中の各細菌の生菌数及び細菌割合を調整（増量又は減量）することによって、一定期間保存後の組成物中における目的とする生菌数及び細菌割合にすることができる。
【００７２】
本技術であれば、後記実施例（特に実施例４）に示すように、長期間保存した場合でも、本技術の培地組成物及び本技術の生菌数の測定方法を用いれば目的とする生菌数を簡便でありながら精度よく測定できる。
また、本技術であれば、２５℃２年間又はこれに相当する保管期間であれば、目的とする生菌数を簡便でありながら精度良く測定できる。
本技術において、製造時の生菌数と一定期間保存時の生菌数との対比が好ましい。この対比結果より、保存時の生菌数が目的の生菌数になるように細菌の配合を製造時に調整（増減）することが好ましい。これにより、想定される保存期間において一定の生菌数になるように製造時点で制御することができる。
【００７３】
なお、上述した本技術の方法とその結果及び／又は当該結果と組成物の製造方法を、装置のＣＰＵ等を含む制御部、及び記憶媒体（ＵＳＢメモリ、ＨＤＤ、ＣＤ、ネットワークサーバ等）等を備えるハードウエア資源にプログラムとして格納し、制御部によって実現させることも可能である。
また、本技術は、本技術の方法及び／又は当該結果と組成物の製造方法として、コンピュータを機能させるためのプログラムとすることも可能である。
【実施例】
【００７４】
以下、実施例等に基づいて本技術を更に詳細に説明する。なお、以下に説明する実施例等は、本技術の代表的な実施例の一例を示したものであり、これにより本技術の範囲が狭く解釈されることはない。【００７５】
［使用菌］
本実施例で使用されるB. longum subsp. longum BB536（以下、「ロンガムＢＢ５３６」ともいう）、B. breve M-16V（以下、「ブレーベＭ−１６Ｖ」ともいう）、B. longum subsp. infantis M-63（以下、「インファンティスＭ−６３」ともいう）は、森永乳業株式会社から市販されている製品から採取することができる。
また、［１］ロンガムＢＢ５３６として同一細菌であるビフィドバクテリウム・ロンガム  ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２６２１を、［２］ブレーベＭ−１６Ｖとして同一細菌であるビフィドバクテリウム・ブレーベ  ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２６２２を、［３］インファンティスＭ−６３として同一細菌であるビフィドバクテリウム・インファンティス  ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２６２３を、それぞれ使用してもよい。【００７６】
［浸透圧の測定］
各培地組成物の浸透圧は、寒天末を溶解する前の〔培地組成物／水１Ｌ〕をアドバンス  オズモメータ３２５０（氷点降下法浸透圧計：アドバンス社）で測定した値である。「寒天末溶解前の〔培地組成物／水１Ｌ〕」とは、加熱殺菌（オートクレーブ殺菌１００℃以上１５分間）前の寒天末を含む培地組成物を、水１Ｌで混合したものである。
なお、浸透圧測定を行った後に「寒天末溶解前の〔培地組成物／水１Ｌ〕」をオートクレーブにて加熱殺菌する。オートクレーブにて加熱溶解した培地を混釈法又は平板塗抹法に従ってシャーレ容器（１シャーレ；直径９ｃｍ）に流し入れ冷却固形化する。固形化後に培養を行い、シャーレの中に形成されたコロニー数を測定する。【００７７】
［実施例１：高浸透圧培地組成物及びその調整成分］
［実施例１−１：ブレーベＭ−１６Ｖの生菌数の測定（高浸透圧成分：糖類）］
被験試料としてロンガムＢＢ５３６を１．１×１０７ｃｆｕ／ｇ含有する粉末、ブレーベＭ−１６Ｖを１．２×１０７ｃｆｕ／ｇ含有する粉末、インファンティスＭ−６３を６．４×１０６ｃｆｕ／ｇ含有する粉末を調整し、適宜希釈した。
スクロースを１６０．０ｇ／Ｌ添加し浸透圧を１０８４ｍＯｓｍに高めたＴＯＳ寒天培地組成物を含む培地（寒天末溶解前の液体１Ｌ）を調製した。
前記スクロース１６０．０ｇ／Ｌ添加のＴＯＳ寒天培地を用いて、及び対照としてスクロースを添加しないＴＯＳ寒天培地を用いて、プレート上で混釈培養した。各細菌の被験試料についてこれら各培地を用いて混釈培養を行った。
嫌気状態で３７℃７２時間培養し、形成されたコロニー数を測定し、希釈率からビフィズス菌含有粉末の菌数を計算した。
表１は、スクロースを１６０．０ｇ／Ｌ添加したＴＯＳ寒天培地を用いて求められたロンガムＢＢ５３６、ブレーベＭ−１６Ｖ、インファンティスＭ−６３の被験試料１ｇあたりの菌数、及びスクロースを添加していないＴＯＳ寒天培地を用いて求められた菌数と比較した生残率を示した。【００７８】
表１に示すように、１６０．０ｇ／Ｌ  スクロースを添加した高浸透圧培地では、ブレーベＭ−１６Ｖは生残していたが、ロンガムＢＢ５３６及びインファンティスＭ−６３は０．２％未満しか生残出来ず、コロニーは未検出であった。、同じプレート上で、ブレーベＭ−１６Ｖだけを検出することができた。
また、本方法を使用すれば、ロンガムＢＢ５３６、ブレーベＭ−１６Ｖ、インファンティスＭ−６３の菌数比率が、例えば１：１０００：１のように、ビフィズス菌の中でブレーベが多い割合の製品の場合でも、ブレーベだけ及びその生菌数を正確に検出することができる。【００７９】
【表１】
2019215873.tif 000002
【００８０】
[実施例１−２：ブレーベＭ−１６Ｖの生菌数の測定（高浸透圧成分：ハロゲン化アルカリ金属塩）]
被験試料としてロンガムＢＢ５３６を１．０×１０７ｃｆｕ／ｇ含有する粉末、ブレーベＭ−１６Ｖを１．１×１０７ｃｆｕ／ｇ含有する粉末、インファンティスＭ−６３を９．２×１０６ｃｆｕ／ｇ  含有する粉末を調整し、適宜希釈した。
塩化カリウムを２０．０ｇ／Ｌ添加し浸透圧を１０５８ｍＯｓｍに高めたＴＯＳ寒天培地、塩化ナトリウムを２０．０ｇ／Ｌ添加し浸透圧を１２０８ｍＯｓｍに高めたＴＯＳ寒天培地組成物を含む培地（寒天末溶解前の液体１Ｌ）を調製した。
前記塩化カリウム２０．０ｇ／Ｌ添加のＴＯＳ寒天培地、前記塩化ナトリウムを２０．０ｇ／Ｌ添加のＴＯＳ寒天培地、及び対照として塩化カリウム及び塩化ナトリウムの何れも添加しないＴＯＳ寒天培地をそれぞれ用いてプレート上で混釈培養した。各細菌の被験試料についてこれら各培地を用いて混釈培養を行った。
嫌気状態で３７℃７２時間培養し、形成されたコロニー数を測定し、希釈率からビフィズス菌含有粉末の菌数を計算した。
表２は、塩化カリウム又は塩化ナトリウムを２０．０ｇ／Ｌ添加したＴＯＳ寒天培地を用いて求められたロンガムＢＢ５３６、ブレーベＭ−１６Ｖ、インファンティスＭ−６３の被験試料１ｇあたりの菌数、及び塩化カリウム及び塩化ナトリウムの何れも添加していないＴＯＳ寒天培地を用いて求められた菌数と比較した生残率を示した。【００８１】
表１に示すように、２０．０ｇ  ／Ｌ  塩化カリウム又は塩化ナトリウムを添加した培地では、ブレーベＭ−１６Ｖは生残していたが、ロンガムＢＢ５３６及びインファンティスＭ−６３は０．５％未満しか生残出来ずコロニーは未検出であった。同じプレート上で、ブレーベＭ−１６Ｖだけを検出することができた。
従って、高浸透圧培地組成物を用いる方法を使用すれば、ビフィズス菌中でブレーベが多くなった場合でも、ブレーベだけを正確に検出することができる。【００８２】
【表２】
2019215873.tif 000003
【００８３】
実施例１−１及び実施例１−２の結果から、高浸透圧培地組成物を用いる方法を使用すれば、簡便にブレーベを選択的に同定し、ブレーベの生菌数を測定することができる。さらに、高浸透圧培地組成物を用いる方法を使用すれば、ブレーベ及びビフィドバクテリウム・ロンガム・サブスピーシーズ・ロンガム、ビフィドバクテリウム・ロンガム・サブスピーシーズ・インファンティスを簡便に区別でき、さらにブレーベのみの生菌数を測定することができる。
また、高含有させることで高浸透圧にしているので、資化される糖類であっても、資化による影響は少ない。すなわち、高浸透圧調整成分は、高浸透圧調整可能な物質であれば特に限定されず、糖類でも塩類でもよい。
また、水溶性成分の場合、寒天培地中に含まれる水溶性の高浸透圧成分の含有量を適宜測定することで培地の浸透圧の状態も理解することができる。例えば、寒天培地／水１Ｌで粉砕撹拌した後に氷点降下法浸透圧計にて浸透圧を測定すること等が考えられる。【００８４】
［実施例２：浸透圧の調整］
［実施例２−１：ブレーベＭ−１６Ｖの生菌数の測定（浸透圧の範囲）］
被験試料としてロンガムＢＢ５３６を１．１×１０７ｃｆｕ／ｇ含有する粉末、ブレーベＭ−１６Ｖを１．４×１０７ｃｆｕ／ｇ含有する粉末、インファンティスＭ−６３を６．４×１０６ｃｆｕ／ｇ含有する粉末を調整し、適宜希釈した。
スクロースを２２０．０ｇ／Ｌ添加し浸透圧を１３１０ｍＯｓｍに高めたＴＯＳ寒天培地を用いて、及び対照としてスクロースを添加しないＴＯＳ寒天培地を用いてプレート上で混釈培養した。細菌の被験試料についてこれら各培地を用いて混釈培養を行った。
嫌気状態で３７℃７２時間培養し、形成されたコロニー数を測定し、希釈率からビフィズス菌含有粉末の菌数を計算した。
表３は、スクロースを２２０．０ｇ／Ｌ添加したＴＯＳ寒天培地を用いて求められたロンガムＢＢ５３６、ブレーベＭ−１６Ｖ、インファンティスＭ−６３の被験試料１ｇあたりの菌数、及びスクロースを添加していないＴＯＳ寒天培地を用いて求められた菌数と比較した生残率を示した。【００８５】
表３に示すように、浸透圧を１３１０ｍＯｓｍに高めた高浸透圧培地では、ブレーベＭ−１６Ｖは生残していたが、ロンガムＢＢ５３６及びインファンティスＭ−６３は０．２％未満しか生残出来ずコロニーは未検出であった。同じプレート上で、ブレーベＭ−１６Ｖだけを検出することができた。【００８６】
【表３】
2019215873.tif 000004
【００８７】
［実施例２−２：  ブレーベＭ−１６Ｖ生菌数の測定（浸透圧の範囲）］
被験試料としてロンガムＢＢ５３６を１．２×１０１１ｃｆｕ／ｇ含有する粉末、ブレーベＭ−１６Ｖを２．０×１０１１ｃｆｕ／ｇ含有する粉末、インファンティスＭ−６３を８．９×１０１０ｃｆｕ／ｇ含有する粉末を調整し、適宜希釈した。
スクロースを１５０．０ｇ／Ｌ添加し浸透圧を８９５ｍＯｓｍに高めたＲＣＭ寒天培地、及び対照としてスクロースを添加しないＲＣＭ寒天培地を用いてプレート上で混釈培養した。各細菌の被験試料についてこれら各培地を用いて混釈培養を行った。
嫌気状態で３７℃７２時間培養し、形成されたコロニー数を測定し、希釈率からビフィズス菌含有粉末の菌数を計算した。
表４は、スクロースを１５０．０ｇ／Ｌ添加したＲＣＭ寒天培地を用いて求められたロンガムＢＢ５３６、ブレーベＭ−１６Ｖ、インファンティスＭ−６３の被験試料１ｇあたりの菌数、及びスクロースを添加していないＲＣＭ寒天培地を用いて求められた菌数と比較した生残率を示した。【００８８】
表４に示すように、浸透圧を８９５ｍＯｓｍに高めた高浸透圧培地では、ブレーベＭ−１６Ｖは生残していたが、ロンガムＢＢ５３６及びインファンティスＭ−６３は１．２％未満しか生残出来ず、コロニーは未検出であった。同じプレート上で、ブレーベＭ−１６Ｖだけを検出することができた。【００８９】
【表４】
2019215873.tif 000005
【００９０】
実施例２−１及び実施例２−２の結果から、高浸透圧培地組成物を含む培地の浸透圧が少なくとも８９５ｍＯＳｍであれば、ビフィドバクテリウム・ロンガム・サブスピーシーズ・ロンガム、ビフィドバクテリウム・ロンガム・サブスピーシーズ・インファンティスをコロニーが未検出にすることができるので、ブレーベを選択的に同定し、ブレーベの生菌数を測定することができる。また、高浸透圧培地組成物を含む培地の浸透圧が１３１０ｍＯｓｍ以下までであれば、ブレーベの生残率を確保することができるので、簡便にブレーべを選択的に同定し、ブレーベの生菌数を測定することができる。
すなわち、浸透圧が８９５〜１３１０ｍＯsｍの範囲内であれば、簡便にブレーベ及びビフィドバクテリウム・ロンガム・サブスピーシーズ・ロンガム、ビフィドバクテリウム・ロンガム・サブスピーシーズ・インファンティスを簡便に区別でき、さらにブレーベのみの生菌数を測定することができる。
さらに、実施例１及び実施例２から、高浸透圧培地組成物に使用する基礎培地組成物がビフィズス菌生育可能な市販品であれば、簡便にブレーベ、ビフィドバクテリウム・ロンガム・サブスピーシーズ・ロンガム、及びビフィドバクテリウム・ロンガム・サブスピーシーズ・インファンティスを簡便に区別でき、さらにブレーベのみの生菌数を測定することができる。【００９１】
［実施例３：ストレプトマイシン含有培地組成物及びその量］
［実施例３−１：インファンティスＭ−６３の生菌数の測定］
被験試料としてロンガムＢＢ５３６を９．０×１０６ｃｆｕ／ｇ含有する粉末、ブレーベＭ−１６Ｖを１．１×１０７ｃｆｕ／ｇ含有する粉末、インファンティスＭ−６３を７．３×１０６ｃｆｕ／ｇ  含有する粉末を調整し、それぞれ適宜希釈した。
ストレプトマイシンを６０．０ｍｇ／Ｌ添加したＴＯＳ寒天培地及び対照としてストレプトマイシンを添加しないＴＯＳ寒天培地を用いてプレート上で混釈培養した。各細菌の被験試料についてこれら各培地を用いて混釈培養を行った。
嫌気状態で３７℃７２時間培養し、形成されたコロニー数を測定し、希釈率からビフィズス菌含有粉末の菌数を計算した。
表５は、ストレプトマイシンを６０．０ｍｇ／Ｌ添加したＴＯＳ寒天培地を用いて求められたロンガムＢＢ５３６、ブレーベＭ−１６Ｖ、インファンティスＭ−６３の被験試料１ｇあたりの菌数及びストレプトマイシンを添加していないＴＯＳ寒天培地を用いて求められた菌数と比較した生残率を示した。【００９２】
表５に示すように、ストレプトマイシンを６０．０ｍｇ／Ｌ添加した培地では、インファンティスＭ−６３は１００％生残していたが、ロンガムＢＢ５３６及びブレーベＭ−１６Ｖは０．４％以下の生残率となり、同じプレート上でインファンティスＭ−６３だけを検出できることが分かった。
また、本方法を使用すれば、ロンガムＢＢ５３６、ブレーベＭ−１６Ｖ、インファンティスＭ−６３の菌数比率が例えば、１：１：１０００のように、ビフィズス菌中でインファンティスＭ−６３が多い割合の製品の場合でも、インファンティスＭ−６３だけ及びその生菌数を正確に検出することができる。【００９３】
【表５】
2019215873.tif 000006
【００９４】
［実施例３−２：インファンティスＭ−６３の生菌数の測定］
被験試料としてロンガムＢＢ５３６を１．２×１０１１ｃｆｕ／ｇ含有する粉末、ブレーベＭ−１６Ｖを２．５×１０１１ｃｆｕ／ｇ含有する粉末、インファンティスＭ−６３を１．２×１０１１ｃｆｕ／ｇ  含有する粉末を調整し、それぞれ適宜希釈した。
ストレプトマイシンを１５００．０ｍｇ／Ｌ添加したＲＣＭ寒天培地及び対照としてストレプトマイシンを添加しないＲＣＭ寒天培地を用いてプレート上で混釈培養した。各細菌の被験試料についてこれら各培地を用いて混釈培養を行った。
嫌気状態で３７℃７２時間培養し、形成されたコロニー数を測定し、希釈率からビフィズス菌含有粉末の菌数を計算した。
表６は、ストレプトマイシンを１５００．０ｍｇ／Ｌ添加したＲＣＭ寒天培地を用いて求められたロンガムＢＢ５３６、ブレーベＭ−１６Ｖ、インファンティスＭ−６３の被験試料１ｇあたりの菌数及びストレプトマイシンを添加していないＲＣＭ寒天培地を用いて求められた菌数と比較した生残率を示した。【００９５】
表６に示すように、ストレプトマイシンを１５００．０ｍｇ／Ｌ添加した培地では、インファンティスＭ−６３は５１％生残していたが、ロンガムＢＢ５３６及びブレーベＭ−１６Ｖは１．０％未満の生残率となり、同じプレート上でインファンティスＭ−６３だけを検出できることが分かった。【００９６】
【表６】
2019215873.tif 000007
【００９７】
実施例２−１及び実施例２−２の結果から、ストレプトマイシンを含む培地を使用すれば、簡便にビフィドバクテリウム・ロンガム・サブスピーシーズ・インファンティスを選択的に同定し、ビフィドバクテリウム・ロンガム・サブスピーシーズ・インファンティスの生菌数を測定することができる。さらに、ストレプトマイシンを含む培地組成物を用いる方法を使用すれば、ビフィドバクテリウム・ロンガム・サブスピーシーズ・インファンティスと、ビフィドバクテリウム・ブレーベ及びビフィドバクテリウム・ロンガム・サブスピーシーズ・ロンガムとを簡便に区別でき、さらにビフィドバクテリウム・ロンガム・サブスピーシーズ・インファンティスのみの生菌数を測定することができる。
さらに、培地組成物のストレプトマイシン濃度が少なくとも６０．０ｍｇ／Ｌであれば、ブレーベ及びビフィドバクテリウム・ロンガム・サブスピーシーズ・ロンガムをコロニー未検出にすることができるので、簡便にビフィドバクテリウム・ロンガム・サブスピーシーズ・インファンティスを選択的に同定し、ビフィドバクテリウム・ロンガム・サブスピーシーズ・インファンティスの生菌数を測定することができる。また、培地組成物のストレプトマイシン濃度が１５００．０ｍｇ／Ｌ以下までであれば、インファンティスの生残率を確保することができるので、簡便にビフィドバクテリウム・ロンガム・サブスピーシーズ・インファンティスを選択的に同定し、ビフィドバクテリウム・ロンガム・サブスピーシーズ・インファンティスの生菌数を測定することができる。【００９８】
［実施例４：生菌数が測定可能な保存期間］
［実施例４−１：２５℃２年間保管したブレーベＭ−１６Ｖの生菌数の測定］
被験試料として、２５℃２年間保管したブレーベＭ−１６Ｖを１．７×１０１１ｃｆｕ／ｇ含有する粉末を調整し、適宜希釈した。
スクロースを１６０．０ｇ／Ｌ添加し浸透圧を１０８４ｍＯｓｍに高めたＴＯＳ寒天培地、及び対照としてスクロースを添加しないＲＣＭ寒天培地を用いてプレート上で混釈培養した。各細菌の被験試料についてこれら各培地を用いて混釈培養を行った。
嫌気状態で３７℃７２時間培養し、形成されたコロニー数を測定し、希釈率からビフィズス菌含有粉末の菌数を計算した。
表７はスクロースを１６０．０ｇ／Ｌ添加したＴＯＳ寒天培地を用いて求められたブレーベＭ−１６Ｖの被験試料１ｇあたりの菌数、及びスクロースを添加していないＲＣＭ寒天培地を用いて求められた菌数と比較した生残率を示した。
表７に示すように、２５℃２年間保管したブレーベＭ−１６Ｖにおいても、Ｍ−１６Ｖを正確に検出することができた。【００９９】
【表７】
2019215873.tif 000008
【０１００】
［実施例４−２：２５℃２年半保管したインファンティスＭ−６３の生菌数の測定］
被験試料として、２５℃２年半保管したインファンティスＭ−６３を６．７×１０１０ｃｆｕ／ｇ含有する粉末を調整し、適宜希釈した。ストレプトマイシンを８０．０ｍｇ／Ｌ添加したＴＯＳ寒天培地、及び対照としてストレプトマイシンを添加しないＴＯＳ寒天培地を用いてプレート上で混釈培養した。各細菌の被験試料についてこれら各培地を用いて混釈培養を行った。
嫌気状態で３７℃７２時間培養し、形成されたコロニー数を測定し、希釈率からビフィズス菌含有粉末の菌数を計算した。
表８は、ストレプトマイシンを８０．０ｍｇ／Ｌ添加したＴＯＳ寒天培地を用いて求められたインファンティスＭ−６３の被験試料１ｇあたりの菌数、及びストレプトマイシンを添加していないＴＯＳ寒天培地を用いて求められた菌数と比較した生残率を示した。
表８に示すように、２５℃２年半保管したインファンティスＭ−６３においても、インファンティスＭ−６３を正確に検出することができた。【０１０１】
【表８】
2019215873.tif 000009
【０１０２】
実施例４−１の結果から、ブレーベを含む製品の保管期間が数年に及ぶ場合において、本技術の高圧浸透培地を用いてもブレーベの生菌数を正確に測定することができる。
実施例４−２の結果から、ビフィドバクテリウム・ロンガム・サブスピーシーズ・インファンティスを含む製品の保存期間が数年に及ぶ場合において、本技術のストレプトマイシンを含む培地を用いてもビフィドバクテリウム・ロンガム・サブスピーシーズ・インファンティスの生菌数を正確に測定することができる。
従って、ブレーベ及び／又はビフィドバクテリウム・ロンガム・サブスピーシーズ・インファンティスを含む製品の保管期間が数年に及ぶ場合でも、高浸透圧培地組成物を含む培地及びストレプトマイシンを含む培地を用いても、ブレーベ及びビフィドバクテリウム・ロンガム・サブスピーシーズ・インファンティスのそれぞれの生菌数を正確に測定することができる【０１０３】
実施例１〜４の結果より、高浸透圧培地及びストレプトマイシン含有培地をそれぞれ用いて固体培養を行うことで、ブレーベ及びビフィドバクテリウム・ロンガム・サブスピーシーズ・インファンティスをそれぞれ選択的に同定することができ、ブレーベ及びビフィドバクテリウム・ロンガム・サブスピーシーズ・インファンティスのそれぞれの生菌数を測定することができる。
また、ビフィズス菌生育用の基本培養培地を用いてブレーベ、ビフィドバクテリウム・ロンガム・サブスピーシーズ・インファンティス及びビフィドバクテリウム・ロンガム・サブスピーシーズ・ロンガムからなる総生菌数を計測することによって、（総生菌数−上述のブレーベ及びビフィドバクテリウム・ロンガム・サブスピーシーズ・インファンティスの各生菌数）に基づき、ビフィドバクテリウム・ロンガム・サブスピーシーズ・ロンガムの生菌数を計測することができる。【０１０４】
［実施例５：３菌を含む粉末中の個別の生菌数の測定］
ロンガムＢＢ５３６、インファンティスＭ−６３、ブレーベＭ−１６Ｖ含有する粉末を被験試料として用い、適宜希釈した。
表９は、以下の各培養法で求められた被験試料１ｇあたりのロンガムＢＢ５３６、インファンティスＭ−６３、ブレーベＭ−１６Ｖの菌数を示した。【０１０５】
上記希釈物を、無菌脱繊血を添加したＢＬ寒天培地を用いてプレート上で混釈培養した。嫌気状態で３７℃７２時間培養し、形成された菌種ごとのコロニー数を計測し、希釈率から被験試料１ｇあたりのロンガムＢＢ５３６、ブレーベＭ−１６Ｖ、インファンティスＭ−６３、及びこれらの総菌数を計算した。その結果を表９に示す。【０１０６】
（１）総菌数の測定
上記希釈物を、ＲＣＭ寒天培地を用いてプレート上で混釈培養した。嫌気状態で３７℃７２時間培養し、形成されたコロニー数を計測し、希釈率から被験試料１ｇあたりのロンガムＢＢ５３６、ブレーベＭ−１６Ｖ、インファンティスＭ−６３の総菌数を一般的なビフィズス菌生育用基礎培地を用いて計算した。その結果を表９に示す。【０１０７】
（２）ロンガムＢＢ５３６の生菌数の測定
上記希釈物を、無菌脱繊血を添加したＢＬ寒天培地、及び対照として無菌脱繊血を添加しないＢＬ寒天培地を用いて、プレート上で混釈培養した。嫌気状態で３７℃７２時間培養し、形成されたコロニーの中からロンガムＢＢ５３６が特異的なコロニーのみを計測し、希釈率から被験試料１ｇあたりの菌数を計算した。その結果を表９に示す。
表９に示すように、無菌脱繊血を添加しないＢＬ寒天培地において、無菌脱繊血を添加したＢＬ寒天培地と同等の菌数が確認できた。この結果から、無菌脱繊血添加なしＢＬ寒天培地でもロンガムＢＢ５３６計測が可能であることが分かった。【０１０８】
（３）インファンティスＭ−６３の生菌数の測定
上記希釈物を、ストレプトマイシンを８０ｍｇ／Ｌの濃度で添加したＲＣＭ寒天培地を用いてプレート上で混釈培養した。嫌気状態で３７℃７２時間培養し、形成されたコロニー数を計測し、希釈率から被験試料１ｇあたりの菌数を計算した。その結果を表９に示す。
表９に示すように、ストレプトマイシンを含む培地を用いれば、無菌脱繊血を添加したＢＬ寒天培地と同等のインファンティスＭ−６３の菌数が確認できた。【０１０９】
（４）ブレーベＭ−１６Ｖの生菌数の測定
上記希釈物を、スクロースを１６０ｇ／Ｌの濃度で添加したＴＯＳ寒天培地を用いてプレート上で混釈培養した。嫌気状態で３７℃７２時間培養し、形成されたコロニー数を計測し、希釈率から被験試料１ｇあたりの菌数を計算した。その結果を表９に示す。
高浸透圧培地組成物を含む培地を用いれば、無菌脱繊血を添加したＢＬ寒天培地と同等のブレーベの菌数が確認できた。【０１１０】
（５）ブレーベＭ−１６Ｖの生菌数の測定（引き算法）
上記（１）一般的なビフィズス菌生育用基礎培地を用いて求められた総菌数から、上記（２）無菌脱繊血添加なしＢＬ寒天培地を用いて求められたロンガムＢＢ５３６菌数、及び上記（３）ストレプトマイシンを含む培地を用いて求められたインファンティスＭ−６３の菌数を差し引くことでブレーベＭ−１６Ｖの菌数を求めた。
表９に示すように、一般的なビフィズス菌生育用基礎培地、無菌脱繊血添加なしＢＬ寒天培地及びストレプトマイシンを含む培地を組み合わせて用いて求められたブレーベの菌数は、無菌脱繊血を添加したＢＬ培地で検出された菌数と同等の菌数であることが確認できた。【０１１１】
【表９】
2019215873.tif 000010
【０１１２】
以上のことから、一般的なビフィズス菌生育用基礎培地、無菌脱繊血添加なしＢＬ培地、ストレプトマイシンを含む培地、高浸透圧培地組成物を含む培地から１種又は２種以上を選択して用いることによって、ブレーベ、ビフィドバクテリウム・ロンガム・サブスピーシーズ・インファンティス及びビフィドバクテリウム・ロンガム・サブスピーシーズ・ロンガムの各生菌数を計測することができ、これら各生菌数は、無菌脱繊血を添加したＢＬ培地で検出された各菌数と同等であることが確認できた。
上記（１）、（３）、（４）及び（５）を用いる方法では、培地に形成されたコロニー数をカウントできるので、熟練度が低くとも正確に各生菌数を測定することができる。また、培地に形成されたコロニー数をカウントできるので、個人差も生じにくいことから、測定結果の均質化を図ることができる。これにより、ヒトの能力に関係なく、製品中の各生菌数（特にブレーベ、ビフィドバクテリウム・ロンガム・サブスピーシーズ・インファンティス及びビフィドバクテリウム・ロンガム・サブスピーシーズ・ロンガムの生菌数）の情報をより正確に表示又は報告することが可能である。
また、上記（１）〜（５）の培地を用いても、長期間保存した製品中の各生菌数を計測できるので、経時的各生菌数の変化をモニタリングすることができる。モニタリングすることによって目的保存時の各生菌数の割合になるように製造時の生菌数の割合を調整するように設計することも可能である。
【受託番号】
【０１１３】
（１）ビフィドバクテリウム・ロンガム  ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２６２１（受託番号：NITE BP-02621）（受託日：２０１８年１月２６日）、受託先：〒２９２−０８１８  日本国千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８  １２２号室、独立行政法人  製品評価技術基盤機構  特許微生物寄託センター（ＮＰＭＤ）。
（２）ビフィドバクテリウム・ブレーベ  ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２６２２（受託番号：NITE BP-02622）（受託日：２０１８年１月２６日）、受託先：〒２９２−０８１８  日本国千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８  １２２号室、独立行政法人  製品評価技術基盤機構  特許微生物寄託センター（ＮＰＭＤ）。
（３）ビフィドバクテリウム・インファンティス  ＮＩＴＥ  ＢＰ−０２６２３（受託番号：NITE BP-02623）（受託日：２０１８年１月２６日）、受託先：〒２９２−０８１８  日本国千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８  １２２号室、独立行政法人  製品評価技術基盤機構  特許微生物寄託センター（ＮＰＭＤ）。
【国際調査報告】
2019215873.tif 000011
2019215873.tif 000012
2019215873.tif 000013
2019215873.tif 000014