(57)【要約】  本発明は、より高い生検回避率で前立腺癌を判定できる新たな判定方法を提供することを課題とする。  本発明は、「被検者由来試料中の遊離型前立腺特異抗原量と糖鎖の末端シアル酸残基が糖鎖の末端から２番目のガラクトース残基にα(2, 3)結合した糖鎖を有する遊離型前立腺特異抗原であるα(2, 3)糖鎖遊離型PSAの量との比率１を決定し、該比率１と当該被検者の前立腺の体積との比率２を決定し、得られた比率２を基に前立腺癌を判定する方法。」に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
被検者由来試料中の遊離型前立腺特異抗原量と糖鎖の末端シアル酸残基が糖鎖の末端から２番目のガラクトース残基にα(2, 3)結合した糖鎖を有する遊離型前立腺特異抗原であるα(2, 3)糖鎖遊離型PSAの量との比率１を決定し、該比率１と当該被検者の前立腺の体積との比率２を決定し、得られた比率２を基に前立腺癌を判定する方法。
【請求項２】
α(2, 3)糖鎖遊離型PSA量を測定する方法が、α(2, 3)糖鎖遊離型PSAと、糖鎖の末端シアル酸残基が糖鎖の末端から２番目のガラクトース残基にα(2, 3)結合した糖鎖に親和性を有する物質であるα(2, 3)糖鎖親和性アフィニティ−物質とを反応させて、α(2, 3)糖鎖遊離型PSAと該α(2, 3)糖鎖親和性アフィニティー物質との複合体を生成させた後、該複合体の量を測定し、得られた測定結果に基づいてα(2, 3)糖鎖遊離型PSA量を求める方法である、請求項１に記載の前立腺癌を判定する方法。
【請求項３】
α(2, 3)糖鎖親和性アフィニティー物質がレクチンである、請求項２に記載の前立腺癌を判定する方法。
【請求項４】
レクチンがイヌエンジュレクチンである、請求項３に記載の前立腺癌を判定する方法。
【請求項５】
被検者由来試料中の遊離型前立腺特異抗原量とα(2, 3)糖鎖遊離型PSA量との比率１を決定し、該比率１と当該被検者の前立腺の体積との比率２を決定する、前立腺癌の判定を行うためのデータを得る方法。
【請求項６】
（１）α(2, 3)糖鎖親和性アフィニティ−物質と、
（２）被検者由来試料中の遊離型前立腺特異抗原量とα(2, 3)糖鎖遊離型PSA量との比率１を決定し、該比率１と当該被検者の前立腺の体積との比率２を決定し、得られた比率２を基に前立腺癌を判定する判定手順が記載された取扱説明書と
を含む、前立腺癌判定用キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、前立腺癌の新規な判定方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
前立腺癌(prostate carcinoma)は、欧米人男性の悪性腫瘍の中で最も罹患率が高く、近年は、日本においても患者数が急増している。2015年の統計では、前立腺癌が、胃癌を抜いて日本人男性において最も罹患率の高い癌になった。【０００３】
前立腺特異抗原(prostate specific antigen：以下「PSA」と略記する。)は、前立腺で産生される、前立腺に特異的な、分子量約３万の糖タンパク質の一種であり、アスパラギン結合型（N型）糖鎖を有する。前立腺癌に罹患すると血液中のPSA値が高くなることから、PSA値は、前立腺癌を判定するための最も重要な腫瘍マーカーとして認識されている(非特許文献１)。【０００４】
PSAは、血液中では大部分がα１-アンチキモトリプシンやα2-マクログロブリンなどの結合タンパク質と結合して複合体を形成した結合型PSAとして存在する（以下、「結合型PSA」と略記する。）。また、一部のPSAは複合体を形成していない遊離型として存在する(以下、「遊離型PSA」と略記する。)。【０００５】
現在広く行われている前立腺癌の診断方法は、血清中のPSAの総量（すなわち、遊離型PSAと結合型PSAの合計の量、以下、「トータルPSA値」と略記する。)を指標とする方法である。トータルPSA値の基準値(正常値)は4 ng/mL未満である。前立腺に罹患すると、血清中のトータルPSA値は上昇する。【０００６】
しかし、トータルPSA値は、前立腺肥大症(benign prostatic hyperplasia)や前立腺炎等の、前立腺癌以外の前立腺の病気がある場合にもしばしば高値になることが知られている。また、トータルPSA値が4.1〜10 ng/mLの範囲は、所謂グレーゾーン(gray zone)と呼ばれている。トータルPSA値がグレーゾーンにある患者の場合、前立腺癌と前立腺肥大とをトータルPSA値で鑑別することは困難である。【０００７】
そのため、トータルPSA値を指標とした検査の結果、値が高かった患者及びグレーゾーンであった患者には、前立腺癌に罹患しているのか、又はその他の疾患（前立腺肥大症等）に罹患しているのかを鑑別する必要がある。通常は超音波検査、更には組織検査（生検）を行う。しかし、生検の結果前立腺癌ではないと判定される場合も多かった。すなわち、本来ならば生検を行う必要がない患者にも生検を行うという、過剰な検査を行っていた場合が多かった。しかも生検には感染の危険が伴い、また患者の身体的負担・経済的負担が大きい。【０００８】
そこで、診断の特異度を向上させ、不要な生検を回避する目的で、様々な指標を用いた付加的な診断が試みられている。【０００９】
例えば、遊離型PSA／トータルPSAの比を指標とした診断では。遊離型PSA／トータルPSAの比は、前立腺癌では低くなり、前立腺肥大症では高くなる傾向がある（非特許文献３）。【００１０】
また、前立腺に何らかの疾患（前立腺癌、前立腺肥大症等）があると、前立腺の体積が増大する。そこで、前立腺の体積とPSAに関係した値とを組み合わせた指標を用いた診断、例えばPSA密度（PSA density, PSAD、PSA量／前立腺体積）を指標とした診断が、前立腺癌を判定するための一つの選択肢として行われている。PSA密度が高くなるほど前立腺癌である可能性が高いといわれている。【００１１】
さらに、前立腺癌患者ではPCA3（prostate cancer gene 3）遺伝子が高レベルで発現していることから、患者から採取した尿中のPCA3 RNAを検出するPCA3検査法が知られている。PCA3検査は、トータルPSA検査で異常が認められ、生検の結果が陰性であった患者に対して、前立腺の疾患に罹患している可能性をモニターするために日常診療で一般的に行われている。【００１２】
また、total PSA、遊離型PSA、及びp2PSA（PSA前駆体）を組み合わせたProstate Health Index (PHI)という指標を用いた前立腺癌の診断も行われている。PHIは［p2PSA/freePSA×PSA0.5］で計算する。PHIが25以上の場合は、トータルPSA値が基準値以下であっても生検が必要であると判定される。【００１３】
また、前立腺癌患者の血清中には、糖鎖の末端シアル酸残基がα(2,6)結合でガラクトースに結合したPSAよりもα(2,3)結合でガラクトースに結合したPSAが増加することが明らかになった(非特許文献２)。【００１４】
大山らは、試料中の遊離型PSA量に対する、糖鎖の末端シアル酸残基が糖鎖の末端から２番目のガラクトース残基にα(2, 3)結合した糖鎖を有する遊離型PSAの量の比率が、前立腺癌か否かを判定する指標となることを見出した。そして、該比率が40％又はそれより高い場合に前立腺癌であるかその可能性が高いと判定することができること、更に該比率が47％又はそれより高い場合に前立腺癌の悪性度が高いと判定することができることを見出し、特許出願している（特許文献１）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１５】
【特許文献１】ＷＯ２０１７／１３０５７８号パンフレット
【非特許文献】
【００１６】
【非特許文献１】Stamey T.A. et al., N. Engl. J. Med., 1987, vol. 317, pp.909-916
【非特許文献２】Tajiri M., Ohyama C., Wada Y., Glycobiolgy, 2008, vol. 18, pp. 2-8
【非特許文献３】Suzuki H. et al., Urology, 2006, vol. 67, No. 1, pp.131-136。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１７】
しかし、上記したようないずれの判定方法でも、患者の不要な生検を回避できる確率（生検回避率）を改善することは困難であった。そのため、前立腺癌の確定診断を得るためには、相変わらず患者に対し過剰な検査を行わざるを得ないのが現状である。【００１８】
本発明は、上記した状況に鑑みなされたもので、より高い生検回避率で前立腺癌を判定できる新たな判定方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１９】
以下、「前立腺特異抗原」を「PSA」と略記する。【００２０】
本発明者等は、上記問題点を解決すべく鋭意研究の結果、「被検者の前立腺の体積」と、「同じ被検者由来試料中の遊離型PSA量と糖鎖の末端シアル酸残基が糖鎖の末端から２番目のガラクトース残基にα(2, 3)結合した糖鎖を有する遊離型PSAの量との比率」との比率が、前立腺癌か否かを判定する指標となることを見出した。そして更に鋭意研究の結果、該比率を指標として用いた判定を行えば、生検回避率が向上することを見出し、本発明を完成した。【００２１】
すなわち、本発明は以下の構成よりなる。
「（１）被検者由来試料中の遊離型前立腺特異抗原量と糖鎖の末端シアル酸残基が糖鎖の末端から２番目のガラクトース残基にα(2, 3)結合した糖鎖を有する遊離型前立腺特異抗原であるα(2, 3)糖鎖遊離型PSAの量との比率１を決定し、該比率１と当該被検者の前立腺の体積との比率２を決定し、得られた比率２を基に前立腺癌を判定する方法。
（２）α(2, 3)糖鎖遊離型PSA量を測定する方法が、α(2, 3)糖鎖遊離型PSAと、糖鎖の末端シアル酸残基が糖鎖の末端から２番目のガラクトース残基にα(2, 3)結合した糖鎖に親和性を有する物質であるα(2, 3)糖鎖親和性アフィニティ−物質とを反応させて、α(2, 3)糖鎖遊離型PSAと該α(2, 3)糖鎖親和性アフィニティー物質との複合体を生成させた後、該複合体の量を測定し、得られた測定結果に基づいてα(2, 3)糖鎖遊離型PSA量を求める方法である、上記(１)に記載の前立腺癌を判定する方法。
（３）α(2, 3)糖鎖親和性アフィニティー物質がレクチンである、上記(２)に記載の前立腺癌を判定する方法。
（４）レクチンがイヌエンジュレクチンである、上記(３)に記載の前立腺癌を判定する方法。
（５）被検者由来試料中の遊離型前立腺特異抗原量とα(2, 3)糖鎖遊離型PSA量との比率１を決定し、該比率１と当該被検者の前立腺の体積との比率２を決定する、前立腺癌の判定を行うためのデータを得る方法。
（６）被検者由来試料中の遊離型前立腺特異抗原量を求め、また当該被検者由来試料中のα(2, 3)糖鎖遊離型PSAとα(2, 3)糖鎖親和性アフィニティ−物質とを反応させて、α(2, 3)糖鎖遊離型PSAと該α(2, 3)糖鎖親和性アフィニティー物質との複合体を生成させた後、該複合体の量を測定し、得られた測定結果に基づいてα(2, 3)糖鎖遊離型PSA量を求め、得られた遊離型PSA量とα(2, 3)糖鎖遊離型PSA量との比率１を決定し、該比率１と当該被検者の前立腺の体積との比率２を決定し、得られた比率２を基に前立腺癌を判定する方法。
（７）被検者由来試料中の遊離型前立腺特異抗原量を求め、また当該被検者由来試料中のα(2, 3)糖鎖遊離型PSAと糖鎖の末端シアル酸残基が糖鎖の末端から２番目のガラクトース残基にα(2, 3)結合した糖鎖に親和性を有するレクチンとを反応させて、α(2, 3)糖鎖遊離型PSAと該レクチンとの複合体を生成させた後、該複合体の量を測定し、得られた測定結果に基づいてα(2, 3)糖鎖遊離型PSA量を求め、得られた遊離型PSA量とα(2, 3)糖鎖遊離型PSA量との比率１を決定し、該比率１と当該被検者の前立腺の体積との比率２を決定し、得られた比率２を基に前立腺癌を判定する方法。
（８）被検者由来試料中の遊離型前立腺特異抗原量を求め、また当該被検者由来試料中のα(2, 3)糖鎖遊離型PSAとイヌエンジュレクチンとを反応させて、α(2, 3)糖鎖遊離型PSAとイヌエンジュレクチンとの複合体を生成させた後、該複合体の量を測定し、得られた測定結果に基づいてα(2, 3)糖鎖遊離型PSA量を求め、得られた遊離型PSA量とα(2, 3)糖鎖遊離型PSA量との比率１を決定し、該比率１と当該被検者の前立腺の体積との比率２を決定し、得られた比率２を基に前立腺癌を判定する方法。
（９）（i）α(2, 3)糖鎖親和性アフィニティ−物質と、
（ii）被検者由来試料中の遊離型前立腺特異抗原量とα(2, 3)糖鎖遊離型PSA量との比率１を決定し、該比率１と当該被検者の前立腺の体積との比率２を決定し、得られた比率２を基に前立腺癌を判定する判定手順が記載された取扱説明書と
を含む、前立腺癌判定用キット。
なお、本発明の前立腺癌を判定する方法は、医師等の診断を補助する方法として用いることができる。
【発明の効果】
【００２２】
本発明の前立腺癌を判定する方法は、高い生検回避率で前立腺癌を判定できるので、生検が必要な被検者の数を減らすことができる。言い換えれば、前立腺癌のない患者に対する不要な生検を高い確率で回避することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】糖鎖の末端シアル酸残基が糖鎖の末端から２番目のガラクトース残基にα(2, 3)結合した糖鎖の一例の模式図である。
【図２】実施例１におけるDNA標識抗PSA抗体の調製方法を示した図である。
【図３】実施例１で使用したマイクロチップの模式図である。
【図４】実施例１で使用したマイクロチップのチップ内流路の模式図である。
【図５】実施例１で得られた測定結果をもとに得られたROC解析の結果である。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
《本発明に係るPSAについて》
本発明に係る「結合型PSA」とは、一般に「結合型PSA」と呼ばれるPSAである。すなわち、本発明に係る「結合型PSA」とは、「α１-アンチキモトリプシンやα2-マクログロブリンなどの結合タンパク質と結合して複合体を形成したPSA」をいう。
【００２５】
本発明に係る「遊離型PSA」とは、一般に「遊離型PSA」と呼ばれるPSAである。すなわち、本発明に係る「遊離型PSA」とは、「α１-アンチキモトリプシンやα2-マクログロブリンなどの結合タンパク質と結合していないPSA」をいう。
【００２６】
本発明に係る「糖鎖の末端シアル酸残基が糖鎖の末端から２番目のガラクトース残基にα(2, 3)結合した糖鎖」とは、糖鎖の末端（非還元末端）がSiaα2→3 Galの構造である糖鎖（以下、「α(2, 3)糖鎖」と略記する場合がある。）を意味し、末端シアル酸残基としては、例えばN-アセチルノイラミン酸が挙げられる。
【００２７】
本発明に係る「α(2, 3)糖鎖」とは、具体的には以下の構造をいう。
2019221279.tif 000002
【００２８】
本発明に係る「α(2, 3)糖鎖」を有するPSAの糖鎖の構造の一例を下記式(I)に示す。
【００２９】
2019221279.tif 000003
【００３０】
式(I)の糖鎖を有するPSAの一例を、図１に模式図で示す。図１において、糖鎖の末端シアル酸残基は糖鎖の末端から２番目のガラクトース残基にα(2, 3)結合している。また図１では、糖鎖はPSAタンパク質のイソロイシン−アルギニン−アスパラギン−リジン（IRNK）のアミノ酸配列のアスパラギン残基(N)に結合している。
【００３１】
本発明に係るα(2, 3)糖鎖を有するPSAは、前立腺癌患者の血清中に出現する（非特許文献２）。
【００３２】
本発明に係る「α(2, 3)糖鎖を有する遊離型PSA」とは、遊離型PSAであって、α(2, 3)糖鎖を有するPSAをいう。以下、「α(2, 3)糖鎖遊離型PSA」と略記する。
【００３３】
《前立腺癌を判定する方法》
本発明の前立腺癌を判定する方法は、「被検者由来試料中の遊離型PSA量とα(2, 3)糖鎖遊離型PSA量との比率１を決定し、該比率１と当該被検者の前立腺の体積との比率２を決定し、得られた比率２を基に前立腺癌を判定する方法。」である。
【００３４】
本発明の前立腺癌を判定する方法は、医師等の診断を補助する方法として用いることができる。
【００３５】
＜１．被検者由来試料＞
本発明に係る被検者由来試料（以下、「被検試料」又は単に「試料」ともいう。）としては、被検者であるヒト由来の試料であって、例えば血液、血漿、血清、精液、膀胱洗浄物、尿、組織抽出液、前立腺組織切片、前立腺組織生検試料等、あるいはこれらから調製されたもの等が挙げられる。中でも血清、血漿等が好ましい。特に血清が好ましい。
【００３６】
＜２．比率１を決定する方法＞
本発明に係る比率１とは、被検者由来試料中の「遊離型PSA量とα(2, 3)糖鎖遊離型PSA量との比率」である。
以下に、比率１に係る「遊離型PSA量」を測定する方法と「α(2, 3)糖鎖遊離型PSA量」を測定する方法について説明する。
【００３７】
（１）遊離型PSA量を測定する方法
本発明に係る遊離型PSA量とは、試料中の遊離型PSAの総量である。α(2, 3)糖鎖遊離型PSA量と、α(2, 3)糖鎖遊離型PSA以外の遊離型PSA量の和でも求められる。
【００３８】
本発明に係るα(2, 3)糖鎖遊離型PSA以外の遊離型PSAとは、α(2, 3)糖鎖を有さない遊離型PSAを意味する。
【００３９】
本発明に係る試料中の遊離型PSA量を測定する方法としては、
（１）−１．試料中の遊離型PSA量を直接測定する方法、又は
（１）−２．試料中のα(2, 3)糖鎖遊離型PSA量とα(2, 3)糖鎖遊離型PSA以外の遊離型PSA量を測定し、その量の和から遊離型PSA量を求める方法
が挙げられる。
【００４０】
（１）−１．試料中の遊離型PSA量を直接測定する方法
遊離型PSA量を直接測定する方法としては、公知の遊離型PSA量を測定する方法が挙げられる。例えば、遊離型PSAに特異的に結合する抗体を用いた公知の免疫学的測定法等が挙げられる。
【００４１】
本発明に係る抗PSA抗体は、PSAに親和性を有する抗体である。具体的には、PSAのコアタンパク質に親和性を有する抗体である。すなわち、本発明に係る抗PSA抗体は、遊離型PSAと結合型PSAに結合できる抗体と、遊離型PSAに特異的に結合する抗体(抗遊離型PSA抗体)を含む。
抗PSA抗体が特に遊離型PSAに特異的に結合する抗体である場合には、「抗遊離型PSA抗体」と明記する。また、抗PSA抗体が、遊離型PSAと結合型PSAに結合できる抗体と抗遊離型PSA抗体を含む場合は、単に「抗PSA抗体」と記載する。
【００４２】
なお、本明細書において「親和性を有する」とは、例えば「結合する」を意味する。
【００４３】
本発明に係る抗PSA抗体は、それぞれ上記した性質を持っているものであればよく、市販品でも常法により適宜調製されたものでもよく、それぞれモノクローナル抗体でもポリクローナル抗体でもよい。また、これらを単独であるいはこれらを適宜組み合わせて用いる等は任意である。
【００４４】
本発明に係る抗PSA抗体がモノクローナル抗体の場合、その由来は特に限定されず、市販品、あるいは細胞融合技術や遺伝子組換え技術等を利用した自体公知の方法〔Eur.J immunol, 6, 511 (1976)〕等によって産生された、上記した如き性質を有するものは全て使用可能である。
【００４５】
本発明に係る抗PSA抗体がポリクローナル抗体の場合、その由来は特に限定されないが、例えばウサギ、ラット、マウス、羊、山羊、馬等に由来する、上記した性質を有するものが挙げられる。市販品、あるいは例えば「免疫学実験入門、第2刷、松橋直ら、（株）学会出版センター、1981」等に記載の方法で取得されるポリクローナル抗体を使用すればよい。
【００４６】
また、本発明に係る抗PSA抗体は、抗体のFab、Fab’、F(ab')2、Fv、Fd、一本鎖Fv（scFv）、ジスルフィド結合したFv（sdFv）、VL、VH、ダイアボディー（(VL-VH)2もしくは(VH-VL)2）、トリアボディー（三価抗体）、テトラボディー（四価抗体）、ミニボディー（(scFV-CH3)2）、IgG-delta-CH2、scFv-Fc、（scFv）2-Fcフラグメント等であってもよい。
【００４７】
本発明に係る抗PSA抗体のうち、遊離型PSAと結合型PSAに結合できる抗体の市販品としては、例えばAnti PSAモノクローナル抗体 PSA10（Anti PSAモノクローナル抗体 クローンNo. PSA10、和光純薬工業(株)）、Anti PSAモノクローナル抗体 （5A6）（HyTest社）、Anti PSAモノクローナル抗体（5G6）（HyTest社）、Anti PSAモノクローナル抗体（PS6）（HyTest社）、Anti PSAモノクローナル抗体（PSA14）（和光純薬工業(株)）、Anti-Prostate Specific Antigen 抗体（EP1588Y）（アブカム社）、Anti-Prostate Specific Antigen 抗体（A67-B/E3）（アブカム社）、Anti-Prostate Specific Antigen 抗体（35H9）（アブカム社）、Anti-Prostate Specific Antigen 抗体（KLK3/801）（アブカム社）、Anti-Prostate Specific Antigen 抗体（3E6）（アブカム社）、Anti-Prostate Specific Antigen 抗体（8301）（アブカム社）、Anti-Prostate Specific Antigen 抗体（A5D5）（アブカム社）、Anti-Prostate Specific Antigen 抗体（PSA 28/A4）（アブカム社）、Anti-Prostate Specific Antigen 抗体（1H12）（アブカム社）等が挙げられる。
【００４８】
本発明に係る抗PSA抗体のうち、抗遊離型PSA抗体の市販品としては、例えばAnti PSAモノクローナル抗体 PSA12（Anti PSAモノクローナル抗体 クローンNo. PSA12、和光純薬工業(株)）、Anti PSAモノクローナル抗体（8A6）（HyTest社）、Anti PSAモノクローナル抗体（PS1）（HyTest社）、Anti PSAモノクローナル抗体（クローン108）（Anogen社）、Anti-Prostate Specific Antigen 抗体（PS2）（アブカム社）、Anti-Prostate Specific Antigen 抗体（2H9）（アブカム社）等が挙げられる。
【００４９】
本発明に係る抗PSA抗体は、検出可能な標識物質で標識されていてもよい。
【００５０】
該抗体を標識するために用いられる標識物質としては、アルカリホスファターゼ，β-ガラクトシダーゼ，パーオキシダーゼ，マイクロパーオキシダーゼ，グルコースオキシダーゼ，グルコース-6-リン酸脱水素酵素，アセチルコリンエステラーゼ，リンゴ酸脱水素酵素，ルシフェラーゼ等の酵素類、99mTc，131I，125I，14C，3H，32P，35S等の放射性同位元素、HiLyte 647（AhaSpec社製），フルオレセイン，ダンシル，フルオレスカミン，クマリン，ナフチルアミン，フルオレセインイソチオシアネート（FITC）、ローダミン、ローダミンＸイソチオシアネート、スルフォローダミン101、ルシファーイエロー、アクリジン、アクリジンイソチオシアネート、リボフラビン，あるいはこれらの誘導体等の蛍光性物質、ルシフェリン，イソルミノール，ルミノール，ビス(2,4,6-トリフロロフェニル)オキザレート等の発光性物質、フェノール，ナフトール，アントラセン或はこれらの誘導体等の紫外部に吸収を有する物質、4-アミノ-2,2,6,6-テトラメチルピペリジン-1-オキシル，3-アミノ-2,2,5,5-テトラメチルピロリジン-1-オキシル，2,6-ジ-t-ブチル-α-(3,5-ジ-t-ブチル-4-オキソ-2,5-シクロヘキサジエン-1-イリデン)-p-トリルオキシル等のオキシル基を有する化合物に代表されるスピンラベル化剤としての性質を有する物質、例えばHiLyte Fluor 647、HiLyte Fluor 488、HiLyte Fluor 555、HiLyte Fluor 680、HiLyte Fluor 750等のHiLyte系色素〔いずれもハイライトバイオサイエンス社（HiLyte Bioscience, Inc.）商品名〕、例えばAlexa Fluor Dye 350、Alexa Fluor Dye 430、Alexa Fluor Dye 488、Alexa Fluor Dye 532、Alexa Fluor Dye 546、Alexa Fluor Dye 555、Alexa Fluor Dye 568、Alexa Fluor Dye 594、Alexa Fluor Dye 633、Alexa Fluor Dye 647、Alexa Fluor Dye 660、Alexa Fluor Dye 680、Alexa Fluor Dye 700、Alexa Fluor Dye 750等のAlexa系色素〔何れもモレキュラープローブス社（Molecular Probes）商品名〕、例えばCy3、Cy3.5、Cy5、Cy5.5、Cy7等のCyDye系色素〔いずれもアマシャムバイオサイエンス社（Amersham Biosciences）商品名〕、例えばクーマシーブリリアントブルーR250，メチルオレンジ等の色素等、通常この分野で用いられている標識物質が全て挙げられる。
【００５１】
上記した標識物質を抗PSA抗体に結合させる方法としては、例えば自体公知のEIA、RIAあるいはFIA等において一般に行われている自体公知の標識方法［例えば、医化学実験講座、第8巻、山村雄一監修、第1版、中山書店、1971；図説  蛍光抗体、川生明著、第1版、(株)ソフトサイエンス社、1983；酵素免疫測定法、石川栄治、河合忠、室井潔編、第2版、医学書院、1982等］等が挙げられる。アビジン（又はストレプトアビジン）とビオチンの反応を利用した常法により標識物質を抗体に結合させる方法も利用できる。これらの標識方法を適宜領して行えばよい。
【００５２】
本発明に係る試料中の遊離型PSA量を直接測定する方法の具体例としては、例えば以下の方法が挙げられる。
【００５３】
［方法i］
試料と検出可能な標識物質で標識した抗遊離型PSA抗体とを反応させ、標識抗遊離型PSA抗体と遊離型PSAとの複合体を生成させる。次いで、該複合体を構成する標識抗遊離型PSA抗体の標識物質に由来するシグナルを測定することにより、該複合体の量を測定する。得られた測定値をもとに、常法により試料中の遊離型PSA量を求める。該複合体の量を測定する前に、遊離型PSAに結合しなかった標識抗遊離型PSA抗体を除去する操作を適宜行ってもよい。
【００５４】
［方法ii］
試料と抗PSA抗体である第１抗体と、抗PSA抗体が検出可能な標識物質で標識された標識第２抗体とを反応させ、第１抗体と遊離型PSAと標識第２抗体との複合体を生成させる。次いで、該複合体を構成する標識第２抗体の標識物質に由来するシグナルを測定することにより、該複合体の量を測定する。得られた測定値をもとに、常法により試料中の遊離型PSA量を求める。該複合体の量を測定する前に、遊離型PSAに結合しなかった第１抗体及び標識第２抗体を除去する操作を適宜行ってもよい。
【００５５】
上記［方法ii］において、第１抗体と第２抗体の少なくとも一方は抗遊離型PSA抗体である。また、第１抗体と第２抗体のエピトープは異なることが好ましい。
【００５６】
上記［方法i］及び［方法ii］において、遊離型PSA量は、予め濃度既知の遊離型PSA標準を用いて同様に測定を行って得られた結果を用いた、常法による定量置換算を行って求めればよい。すなわち、濃度既知の遊離型PSAを用いて、試料中の遊離型PSA量を測定したときと同じ試薬を用い同様の操作を行って、シグナルを測定する。得られた測定値と使用した遊離型PSA標準の濃度の検量線を作成する。試料を用いた測定で得られたシグナル測定値を、当該検量線にあてはめることにより、該試料中の遊離型PSA量を求める。
【００５７】
上記［方法ii］に用いられる第１抗体は、固相に固定化されていることが好ましい。固相に固定化させる第１抗体は、抗遊離型PSA抗体であることが好ましい。
【００５８】
固相に固定化された抗体を用いる場合、遊離型PSAに結合しなかった標識第２抗体は、公知のB/F分離法により分離することができる。
【００５９】
該固相としては、例えば通常の免疫学的測定法等で用いられる不溶性担体が挙げられる。具体的には例えばポリスチレン，ポリプロピレン，ポリアクリル酸，ポリメタクリル酸，ポリアクリルアミド，ポリグリシジルメタクリレート，ポリ塩化ビニール，ポリエチレン，ポリクロロカーボネート，シリコーン樹脂，シリコーンラバー等の合成高分子化合物、例えば多孔性ガラス，スリガラス，セラミックス，アルミナ，シリカゲル，活性炭，金属酸化物等の無機物質等が挙げられる。また、これら不溶性担体は、マイクロタイタープレート、ビーズ、チューブ、多数のチューブが一体成形された専用のトレイ、ディスク状片、微粒子（ラテックス粒子）、等多種多様の形態で使用し得る。
【００６０】
上記不溶性担体に抗PSA抗体を固定化させる方法としては、抗PSA抗体と不溶性担体とを接触させることによってなされればよく、特に限定されない。通常この分野で利用される自体公知の担持方法（例えば、所謂物理的吸着法）が、代表的なものとして挙げられる。
【００６１】
また、市販の不溶性担体を用いる場合には、その取扱説明書で推奨されている固定化方法に従って、抗PSA抗体を不溶性担体に固定化させればよい。
【００６２】
上記した標識抗PSA抗体の標識物質に由来するシグナルを測定する方法としては、標識物質の種類により異なるが、標識物質が有している何らかの方法により検出し得る性質に応じて、それぞれ所定の方法に従い実施すればよい。例えば、標識物質が酵素の場合には免疫測定法の常法、例えば「酵素免疫測定法」（蛋白質 核酸 酵素 別冊 No.31、北川常廣・南原利夫・辻章夫・石川榮治編集、51〜63,共立出版（株）、1987）等に記載された方法に準じて測定を行えばよく、標識物質が放射性物質の場合には、例えばRIAで行われている常法に従い、該放射性物質の出す放射線の種類および強さに応じて液浸型GMカウンター、液体シンチレーションカウンター、井戸型シンチレーションカウンター、HPLC用カウンター等の測定機器を適宜選択して使用し、測定を行えばよい（例えば医化学実験講座、第8巻、山村雄一監修、第1版、中山書店、1971等参照）。また、標識物質が蛍光性物質の場合には、例えば蛍光光度計等の測定機器を用いるFIAで行われている常法、例えば「図説 蛍光抗体、川生明著、第1版、（株）ソフトサイエンス社、1983」等に記載された方法に準じて測定を行えばよく、標識物質が発光性物質の場合にはフォトカウンター等の測定機器を用いる常法、例えば「酵素免疫測定法」（蛋白質 核酸 酵素 別冊 No.31、北川常廣・南原利夫・辻章夫・石川榮治編集、252〜263、共立出版（株）、1987）等に記載された方法に準じて測定を行えばよい。さらに、標識物質が紫外部に吸収を有する物質の場合には分光光度計等の測定機器を用いる常法によって測定を行えばよく、標識物質がスピンの性質を有する場合には電子スピン共鳴装置を用いる常法、例えば「酵素免疫測定法」（蛋白質  核酸 酵素 別冊 No.31、北川常廣・南原利夫・辻章夫・石川榮治編集、264〜271、共立出版（株）、1987）等に記載された方法に準じてそれぞれ測定を行えばよい。
【００６３】
遊離型PSA量は、市販されている遊離型PSA測定用キットを用いて測定してもよい。そのようなキットとしては、例えばHuman Circulating Cancer BioMarker Panel 1 セレクトキット（LUMINEX社製）等）、フリーPSA・アボット（アボット社）、ルミパルス フリーＰＳＡ（富士レビオ(株)）、ビトロス フリーPSA（オーソ・クリニカル・ダイアグノスティックス(株)）、ST AIA-PACK free PSA（東ソー(株)）、エクルーシスTM試薬 free PSA（ロシュ・ダイアグノスティックス(株)）等が挙げられる。
【００６４】
上記(１)−１の方法において、自体公知の免疫学的測定方法等の分野で通常用いられている分離・測定装置、各種試薬類等は、全て使用できる。測定に使用する抗PSA抗体及び試薬類の使用濃度は、通常この分野で用いられる濃度範囲から適宜選択すればよい。本発明に係る抗PSA抗体を標識するために用いられる標識物質は、該標識物質の測定方法や測定装置などに応じて適宜設定される。また、固相の種類は、用いられる測定装置や実施する測定方法に従って適宜選択される。測定を実施するに際しての測定条件等（反応温度、反応時間、反応時のｐＨ，測定波長、測定装置等）は、自体公知の方法に従い、適宜選択すればよい。
【００６５】
なお、上記(１)−１の方法は、用手法に限らず、自動分析装置を用いた測定系にも十分利用可能であり、容易にかつ迅速に測定を行う事ができる。なお、用手法又は自動分析装置を用いて測定を行う場合の試薬類等の組み合わせ等については、特に制約はなく、適用する自動分析装置の環境、機種に合わせて、或いは、他の要因を考慮にいれて最も良いと思われる試薬類等の組み合わせを適宜選択して用いれば良い。
【００６６】
上記(１)−１の方法では、[方法ii]であって、第１抗体として不溶性担体に結合した抗遊離型PSA抗体を用いる方法が、より好ましい。
【００６７】
（１）−２．試料中のα(2, 3)糖鎖遊離型PSA量とα(2, 3)糖鎖遊離型PSA以外の遊離型PSA量を測定し、その量の和から遊離型PSA量を求める方法
上記の方法としては、例えばα(2, 3)糖鎖に親和性を有する物質（以下、「α(2, 3)糖鎖親和性アフィニティー物質と略記する。」）を用いる方法、又は質量分析法等が挙げられ、α(2, 3)糖鎖親和性アフィニティー物質を用いる方法が好ましい。
【００６８】
以下に、「α(2, 3)糖鎖親和性アフィニティー物質を用い、試料中のα(2, 3)糖鎖遊離型PSA量とα(2, 3)糖鎖遊離型PSA以外の遊離型PSA量を測定し、その量の和から遊離型PSA量を求める方法」について、説明する。なお、質量分析法の詳細については、後記する「(３)比率１を測定する方法」の項の最後に記載する。
【００６９】
［α(2, 3)糖鎖親和性アフィニティー物質］
上記の方法に用いられる本発明に係るα(2, 3)糖鎖親和性アフィニティー物質とは、α(2, 3)糖鎖に親和性を有する物質である。α(2, 3)糖鎖に親和性を有するが、それ以外の糖鎖（例えば糖鎖の末端シアル酸残基が糖鎖の末端から２番目のガラクトース残基にα(2, 6)結合した糖鎖であるα(2, 6)糖鎖等）には親和性を有さない、α(2, 3)糖鎖に特異的な物質が好ましい。
【００７０】
本発明に係るα(2, 3)糖鎖親和性アフィニティー物質としては、例えばそのような性質を持つレクチン又は抗体が挙げられる。中でもレクチンが好ましい。以下に、α(2, 3)糖鎖親和性アフィニティー物質としてのレクチン及び抗体について、より詳細に説明する。
【００７１】
・α(2, 3)糖鎖親和性アフィニティー物質：レクチン
本発明に係るα(2, 3)糖鎖親和性アフィニティー物質として用いられるレクチンとしては、α(2, 3)糖鎖に親和性を有するレクチンが挙げられる。α(2, 3)糖鎖に親和性を有するが、それ以外の糖鎖には親和性を有さない、α(2, 3)糖鎖に特異的なレクチンが好ましい。
【００７２】
そのような性質を持つレクチンとしては、例えばイヌエンジュ(Maackia amurensis)由来レクチンであるMAA，ヤナギマツタケ(Agrocybe cylindracea)由来レクチンであるACG等の植物例レクチンや、CD169 （シアル酸結合Ig様レクチン１)，ラットMAG，CD328，siglec-9（シアル酸結合イムノグロブリン様 レクチン−９）等の動物性レクチンが挙げられる。中でも、MAAが好ましい。
【００７３】
レクチンは、検出可能な標識物質で標識されていてもよい。
【００７４】
レクチンを標識するために用いられる標識物質としては、例えば蛍光色素（フルオレセインイソチオシアネート(FITC)、Cy5、Alexa Fluor 647等）、酵素（西洋ワサビ由来ペルオキシダーゼ）、補酵素、化学発光物質、放射性物質（32P、14C、125I、3H、131I等）、ビオチン等の標識物質が挙げられる。また、標識物質は直接レクチンに結合させてもよいし、適当なスペーサーを介して結合させてもよい。レクチンは、標識物質の種類に応じた自体公知の標識方法で、標識すればよい。
【００７５】
・α(2, 3)糖鎖親和性アフィニティー物質：抗体
本発明に係るα(2, 3)糖鎖親和性アフィニティー物質として用いられる抗体としては、α(2, 3)糖鎖に親和性を有する抗体が挙げられる。α(2, 3)糖鎖に特異的な親和性を有する抗体が好ましい。α(2, 3)糖鎖に親和性を有するが、それ以外の糖鎖（例えばα(2, 6)糖鎖等）には親和性を有さない抗体が特に好ましい。
【００７６】
本発明に係るα(2, 3)糖鎖親和性アフィニティー物質として用いられる抗体の種類は特に限定されず、上記したα(2, 3)糖鎖親和性アフィニティー物質としての性質を持っているものであればよく、市販品でも常法により適宜調製されたものでもよい。また、モノクローナル抗体でもポリクローナル抗体でもよい。また、これらを単独であるいはこれらを適宜組み合わせて用いる等は任意である。
【００７７】
α(2, 3)糖鎖親和性アフィニティー物質として用いられる抗体がモノクローナル抗体の場合、その由来は特に限定されず、市販品、あるいは細胞融合技術や遺伝子組換え技術等を利用した自体公知の方法〔Eur.J immunol, 6, 511 (1976)〕等によって産生された、上記したα(2, 3)糖鎖親和性アフィニティー物質としての性質を有するものは全て使用可能である。
【００７８】
α(2, 3)糖鎖親和性アフィニティー物質として用いられる抗体がポリクローナル抗体の場合、その由来は特に限定されないが、例えばウサギ、ラット、マウス、羊、山羊、馬等に由来する、上記したα(2, 3)糖鎖親和性アフィニティー物質としての性質を有するものが挙げられる。市販品、あるいは例えば「免疫学実験入門、第2刷、松橋直ら、（株）学会出版センター、1981」等に記載の方法で取得されたものを使用すればよい。
【００７９】
α(2, 3)糖鎖親和性アフィニティー物質として用いられる抗体は、抗体のFab、Fab’、F(ab')2、Fv、Fd、一本鎖Fv（scFv）、ジスルフィド結合したFv（sdFv）、VL、VH、ダイアボディー（(VL-VH)2もしくは(VH-VL)2）、トリアボディー（三価抗体）、テトラボディー（四価抗体）、ミニボディー（(scFV-CH3)2）、IgG-delta-CH2、scFv-Fc、（scFv）2-Fcフラグメント等であってもよい。
【００８０】
本発明に係るα(2, 3)糖鎖親和性アフィニティー物質として用いられる抗体の市販品としては、例えばAnti Siaα2-3, Monoclonal Antibody (HYB4)（和光純薬工業(株)製）、抗GM3(Neu Ac), モノクローナル抗体 (Clone : M2590)（和光純薬工業(株)製）、抗シアリルLea抗原, モノクローナル抗体(MSW113)（和光純薬工業(株)製）、Anti-GM3 Monoclonal Antibody（東京化成工業(株)）、Anti-シアリルルイスA Monoclonal Antibody(1H4)（東京化成工業(株)）、Anti-シアリルルイスA Monoclonal Antibody(NKH3)（GLYCONEX INC.）等が挙げられる。
【００８１】
本発明に係るα(2, 3)糖鎖親和性アフィニティー物質として用いられる抗体は、検出可能な標識物質で標識されていてもよい。
【００８２】
本発明に係るα(2, 3)糖鎖親和性アフィニティー物質として用いられる抗体を標識するために用いられる標識物質の例及びその結合方法は、上記「（１）−１試料中の遊離型PSA量を直接測定する方法」の項で、抗PSA抗体を標識するために用いられる標識物質及びその抗体への結合方法について記載したものと同じものが挙げられる。
【００８３】
「(１)−２．α(2, 3)糖鎖親和性アフィニティー物質を用い、試料中のα(2, 3)糖鎖遊離型PSA量とα(2, 3)糖鎖遊離型PSA以外の遊離型PSA量を測定し、その和から遊離型PSA量を求める方法」としては、例えば
（１）−２−１．α(2, 3)糖鎖親和性アフィニティー物質を用い、試料中のα(2, 3)糖鎖遊離型PSA量とα(2, 3)糖鎖遊離型PSA以外の遊離型PSA量を別々に測定し、その和から遊離型PSA量を求める方法、及び
（１）−２−２．α(2, 3)糖鎖親和性アフィニティー物質を用い、試料中のα(2, 3)糖鎖遊離型PSA量とα(2, 3)糖鎖遊離型PSA以外の遊離型PSA量の両方をワンステップで分別測定し、その和から遊離型PSA量を求める方法、
が挙げられる。
【００８４】
（１）−２−１．α(2, 3)糖鎖親和性アフィニティー物質を用い、試料中のα(2, 3)糖鎖遊離型PSA量とα(2, 3)糖鎖遊離型PSA以外の遊離型PSA量を別々に測定し、その和から遊離型PSA量を求める方法
【００８５】
当該方法としては、例えば以下の方法が挙げられる。
【００８６】
「試料をα(2, 3)糖鎖親和性アフィニティー物質と反応させて、α(2, 3)糖鎖遊離型PSAとα(2, 3)糖鎖親和性アフィニティー物質との複合体を生成させる。次いで、該複合体とα(2, 3)糖鎖親和性アフィニティー物質に結合しなかったα(2, 3)糖鎖遊離型PSA以外の遊離型PSAを含有する溶液とを分離する。分離した該複合体中の遊離型PSA量を測定することによりα(2, 3)糖鎖遊離型PSA量を求める。また、分離した溶液中の遊離型PSA量を測定することにより、α(2, 3)糖鎖遊離型PSA以外の遊離型PSA量を求める。得られたα(2, 3)糖鎖遊離型PSA量とα(2, 3)糖鎖遊離型PSA以外の遊離型PSA量の和を求めることにより、遊離型PSA量を得る。」。
【００８７】
当該(１)−２−１の方法で用いられるα(2, 3)糖鎖親和性アフィニティー物質としては、上記した本発明に係るα(2, 3)糖鎖親和性アフィニティー物質が挙げられる。α(2, 3)糖鎖親和性アフィニティー物質として用いられるレクチン又はα(2, 3)糖鎖親和性アフィニティー物質として用いられる抗体が好ましい。α(2, 3)糖鎖親和性アフィニティー物質として用いられるレクチンがより好ましい。
【００８８】
(１)−２−１の方法として、例えば下記［方法１］及び［方法２］が挙げられ、［方法２］が好ましい。
【００８９】
［方法１］
試料を、α(2, 3)糖鎖親和性アフィニティー物質をアガロースビーズ等の固相に固定化した充填剤を充填したカラムに流す。α(2, 3)糖鎖遊離型PSAは充填剤上のα(2, 3)糖鎖親和性アフィニティー物質に結合し、α(2, 3)糖鎖遊離型PSA以外の遊離型PSAは、α(2, 3)糖鎖親和性アフィニティー物質に結合せずにカラムから溶出される。そこで、溶出液中の遊離型PSA量を測定すれば、「α(2, 3)糖鎖遊離型PSA以外の遊離型PSA量」が得られる。次いで、カラムを適当な緩衝液で洗浄後、そのカラムに約２〜５倍のカラム容量の乳糖含有緩衝液（0.4Ｍ）を流し、α(2, 3)糖鎖遊離型PSAを溶出させる。溶出液中の遊離型PSA量を測定すれば、「α(2, 3)糖鎖遊離型PSA量」が得られる。
【００９０】
上記［方法１］におけるα(2, 3)糖鎖遊離型PSA量及びα(2, 3)糖鎖遊離型PSA以外の遊離型PSA量の測定は、上記「（１）−１．試料中の遊離型PSA量を直接測定する方法」の項に記載された方法と同様になされればよい。
【００９１】
得られた「α(2, 3)糖鎖遊離型PSA以外の遊離型PSA量」と「α(2, 3)糖鎖遊離型PSA量」との和を求めることにより、「遊離型PSA量」が得られる。
【００９２】
［方法２］
試料を、α(2, 3)糖鎖親和性アフィニティー物質を固定化したマイクロタイタープレートやポリスチレンビーズ等の固相と接触させる。α(2, 3)糖鎖遊離型PSAは固相上のα(2, 3)糖鎖親和性アフィニティー物質に結合する。α(2, 3)糖鎖遊離型PSA以外の遊離型PSAは、α(2, 3)糖鎖親和性アフィニティー物質に結合せず、液相中に存在する。固相と液相を分離し、液相中の遊離型PSA量を測定すれば、「α(2, 3)糖鎖遊離型PSA以外の遊離型PSA量」が得られる。次いで、固相に結合した遊離型PSA量を測定すれば、α(2, 3)糖鎖遊離型PSA量が得られる。
【００９３】
上記［方法２］における液相中のα(2, 3)糖鎖遊離型PSA以外のPSA量の測定は、上記(１)−１の項に記載された方法と同様になされればよい。
【００９４】
上記［方法２］において、固相に結合したα(2, 3)糖鎖遊離型PSA量は、例えば以下の方法で測定すればよい。
【００９５】
固相に結合したα(2, 3)糖鎖遊離型PSAと標識抗遊離型PSA抗体とを反応させ、固相上にα(2, 3)糖鎖遊離型PSAと標識抗遊離型PSA抗体との複合体を形成させる。次いで、該複合体を構成する標識抗遊離型PSA抗体の標識物質に由来するシグナルを測定することにより、該複合体の量を測定する。予め濃度既知のα(2, 3)糖鎖遊離型PSA標準を用いて同様に測定を行って得られた結果を用いた、常法による定量値換算を行ってα(2, 3)糖鎖遊離型PSAを求めればよい。
【００９６】
ここで、本発明で用いられるα(2, 3)糖鎖遊離型PSA標準の作製方法としては、例えばYoneyama T. et al., Biochem Biophys Res Commun. 2014 vol. 448, No. 4, pp. 390-396に記載された方法が挙げられる。具体的には、該文献の「2. Materials and methods (2.7 Forced expression of FLAG-tag-fusedα(2, 3)PSA)」に開示された方法に従ってリコンビナント遊離型PSA（以下、「r遊離型PSA」と記載する。）を取得する。取得したr遊離型PSAは、リコンビナントα(2, 3)糖鎖遊離型PSA（以下、「r α(2, 3)糖鎖遊離型PSA」と記載する。）とリコンビナントα(2, 6)糖鎖遊離型PSA（以下、「r α(2, 6)糖鎖遊離型PSA」と記載する）を含む。なお、α(2, 6)糖鎖遊離型PSAとは、「α(2, 6)糖鎖を有するPSA」をいう。
【００９７】
取得したr遊離型PSAから、r α(2, 3)糖鎖遊離型PSAとr α(2, 6)糖鎖遊離型PSAを公知の方法で分離・精製する。例えば、まずシアリルα2,3-ガラクトース構造に対して高い親和性を示すレクチンを用いたレクチンカラムクロマトグラフィーによりr α(2, 3)糖鎖遊離型PSAとr α(2, 6)糖鎖遊離型PSAとを分離する。次いでゲルろ過を行って、r α(2, 3)糖鎖遊離型PSA及びr α(2, 6)糖鎖遊離型PSAを、それぞれ精製する。得られた精製r α(2, 3)糖鎖遊離型PSAを、「α(2, 3)糖鎖遊離型PSA標準」として用いることができる。また、得られた精製r α(2, 6)糖鎖遊離型PSAを、必要に応じ「α(2, 6)糖鎖遊離型PSA標準」として用いることができる。
【００９８】
上記［方法２］で用いられる抗遊離型PSA抗体を標識するために用いられる標識物質及びその該抗体への結合方法は、上記（１）−１の項で、抗PSA抗体を標識するために用いられる標識物質及びその結合方法について記載したものと同じものが挙げられる。また、標識抗遊離型PSA抗体を用いて複合体の標識物質に由来するシグナルを測定する方法は、上記(１)−１の項に記載されたそれらと同じものが挙げられる。
【００９９】
上記［方法１］及び［方法２］で用いられる固相の種類、及び使用する抗体の該固相への固定化方法の例としては、上記（１）−１の項に記載されたそれらと同じものが挙げられる。
【０１００】
得られた「α(2, 3)糖鎖遊離型PSA以外の遊離型PSA量」と「α(2, 3)糖鎖遊離型PSA量」との和を求めることにより、「遊離型PSA量」が得られる。
【０１０１】
上記［方法１］及び［方法２］において、自体公知の免疫学的測定法等の分野で用いられている分離・測定装置、各種試薬類等は、全て該方法に使用できる。測定に使用するα(2, 3)糖鎖親和性アフィニティー物質及び固相の種類は、使用する測定装置や、実施する測定方法に従って適宜選択される。測定に使用する抗遊離型PSA抗体及び試薬類の使用濃度は、通常この分野で用いられる濃度範囲から適宜選択すればよい。抗遊離型PSA抗体を標識するために用いられる標識物質は、該標識物質の測定方法や測定装置などに応じて適宜選択される。また、測定を実施するに際しての測定条件等（反応温度、反応時間、反応時のｐＨ，測定波長、測定装置等）は、自体公知の方法に従い、適宜選択すればよい。
【０１０２】
（１）−２−２．α(2, 3)糖鎖親和性アフィニティー物質を用い、試料中のα(2, 3)糖鎖遊離型PSA量とα(2, 3)糖鎖遊離型PSA以外の遊離型PSA量の両方をワンステップで分別測定し、その和から遊離型PSA量を求める方法
【０１０３】
上記の方法としては、例えば以下の方法が挙げられる。
【０１０４】
「試料と、α(2, 3)糖鎖親和性アフィニティー物質と抗遊離型PSA抗体とを反応させて、α(2, 3)糖鎖親和性アフィニティー物質とα(2, 3)糖鎖遊離型PSAと抗遊離型PSA抗体との複合体（第１複合体）と、α(2, 3)糖鎖遊離型PSA以外の遊離型PSAと抗遊離型PSA抗体との複合体（第２複合体）を生成させる。両複合体を分離（分別）した後、第１複合体の量と第２複合体の量を測定することにより、α(2, 3)糖鎖遊離型PSAとα(2, 3)糖鎖遊離型PSA以外の遊離型PSAの両方をワンステップで分別測定する。得られた第１複合体の量と第２複合体の量の和を求めることにより遊離型PSA量を得る。」
【０１０５】
上記（１）−２−２の方法で用いられるα(2, 3)糖鎖親和性アフィニティー物質としては、上記した本発明に係るα(2, 3)糖鎖親和性アフィニティー物質が挙げられる。、α(2, 3)糖鎖親和性アフィニティー物質として用いられるレクチン又はα(2, 3)糖鎖親和性アフィニティー物質として用いられる抗体が好ましい。α(2, 3)糖鎖親和性アフィニティー物質として用いられるレクチンがより好ましい。
【０１０６】
（１）−２−２の方法の具体例として、例えば下記［方法３］〜［方法８］の工程による方法が挙げられる。
【０１０７】
下記［方法３］〜［方法８］の方法において、「親和性に基づいて分離する」とは、例えば、分離する対象を、その「結合の強さの違いに基づいて分離する」ことを意味する。例えば「第１複合体と第２複合体とをα(2, 3)糖鎖親和性アフィニティー物質のα(2, 3)糖鎖に対する親和性に基づいて分離する」とは、「第１複合体と第２複合体とを、第１複合体の該α(2, 3)糖鎖親和性アフィニティー物質に対する結合の強さと第２複合体の該α(2, 3)糖鎖親和性アフィニティー物質に対する結合の強さの違いに基づいて分離する」ことを意味する。
【０１０８】
［方法３］
１）試料と、標識物質で標識された標識抗遊離型PSA抗体と、α(2, 3)糖鎖親和性アフィニティー物質とを接触させて、標識抗遊離型PSA抗体とα(2, 3)糖鎖遊離型PSAとα(2, 3)糖鎖親和性アフィニティー物質との複合体（第１複合体）と、標識抗遊離型PSA抗体とα(2, 3)糖鎖遊離型PSA以外の遊離型PSAとの複合体（第２複合体）を形成させる工程、
２）上記１）の工程で得られた第１複合体と第２複合体とを分離（分別）する工程、
３）第１複合体及び第２複合体を構成する標識抗遊離型PSA抗体の標識物質に由来するシグナルを測定することにより、上記２）の工程で分離した第１複合体の量及び第２複合体の量を測定する工程、
４）上記３）の工程で得られた第１複合体の量と第２複合体の量の和を求め、その和を遊離型PSA量とする工程。
【０１０９】
第１複合体と第２複合体とは、α(2, 3)糖鎖親和性アフィニティー物質のα(2, 3)糖鎖に対する親和性に基づいて分離してもよいし、第１複合体と第２複合体の質量、電荷、サイズ等の差に基づいて分離してもよい（例えば電気泳動等）。
【０１１０】
［方法４］
１）試料と、抗PSA抗体が標識物質で標識された標識第１抗体と、抗PSA抗体である第２抗体と、α(2, 3)糖鎖親和性アフィニティー物質とを接触させて、標識第１抗体とα(2, 3)糖鎖遊離型PSAと第２抗体とα(2, 3)糖鎖親和性アフィニティー物質との複合体（第１複合体）と、標識第１抗体とα(2, 3)糖鎖遊離型PSA以外の遊離型PSAと第２抗体との複合体（第２複合体）を形成させる工程、
２）上記１）の工程で得られた第１複合体と第２複合体とを分離（分別）する工程、
３）第１複合体及び第２複合体を構成する標識第１抗体の標識物質に由来するシグナルを測定することにより、上記２）の工程で分離した第１複合体の量及び第２複合体の量を測定する工程、
４）上記３）の工程で得られた第１複合体の量と第２複合体の量の和を求め、その和を遊離型PSA量とする工程。
【０１１１】
上記[方法４]に用いられる第１抗体と第２抗体の少なくとも一方は、抗遊離型PSA抗体である。第１抗体と第２抗体のエピトープは異なることが好ましい。第１抗体は抗遊離型PSA抗体でああることがより好ましい。
【０１１２】
また、第１複合体と第２複合体とは、α(2, 3)糖鎖親和性アフィニティー物質のα(2, 3)糖鎖に対する親和性に基づいて分離してもよいし、第１複合体と第２複合体の質量、電荷、サイズ等の差に基づいて分離してもよい（例えば電気泳動等）。
【０１１３】
［方法５］
１）試料と、抗遊離型PSA抗体が標識物質で標識された標識第１抗体と、α(2, 3)糖鎖に親和性を有する第２抗体（α(2, 3)糖鎖親和性アフィニティー物質１）と、α(2, 3)糖鎖に親和性を有するレクチン（α(2, 3)糖鎖親和性アフィニティー物質２）とを接触させて、標識第１抗体とα(2, 3)糖鎖遊離型PSAと第２抗体とレクチンとの複合体（第１複合体）と、標識第１抗体とα(2, 3)糖鎖遊離型PSA以外の遊離型PSAとの複合体（第２複合体）を形成させる工程、
２）上記１）の工程で得られた第１複合体と第２複合体とを分離（分別）する工程、
３）第１複合体及び第２複合体を構成する標識第１抗体の標識物質に由来するシグナルを測定することにより、上記２）の工程で分離した第１複合体の量及び第２複合体の量を測定する工程、
４）上記３）の工程で得られた第１複合体の量と第２複合体の量の和を求め、その和を遊離型PSA量とする工程。
【０１１４】
第１複合体と第２複合体とは、α(2, 3)糖鎖親和性アフィニティー物質１又はα(2, 3)糖鎖親和性アフィニティー物質２のα(2, 3)糖鎖に対する親和性に基づいて分離してもよいし、第１複合体と第２複合体の質量、電荷、サイズ等の差に基づいて分離してもよい（例えば電気泳動等）。
【０１１５】
［方法６］
１）試料と、抗遊離型PSA抗体と、α(2, 3)糖鎖親和性アフィニティー物質とを接触させて、抗遊離型PSA抗体とα(2, 3)糖鎖遊離型PSAとα(2, 3)糖鎖親和性アフィニティー物質との複合体（第１複合体）と、抗遊離型PSA抗体とα(2, 3)糖鎖遊離型PSA以外の遊離型PSAとの複合体（第２複合体）を形成させる工程、
２）上記１）の工程で得られた第１複合体と第２複合体とを分離（分別）する工程、
３）上記２）の工程で分離した第１複合体の量及び第２複合体の量を測定する工程、
４）上記３）の工程で得られた第１複合体の量と第２複合体の量の和を求め、その和を遊離型PSA量とする工程。
【０１１６】
第１複合体と第２複合体とは、α(2, 3)糖鎖親和性アフィニティー物質のα(2, 3)糖鎖に対する親和性に基づいて分離してもよいし、第１複合体と第２複合体の質量、電荷、サイズ等の差に基づいて分離してもよい（例えば電気泳動等）。
【０１１７】
第１複合体の量と第２複合体の量を測定するには、例えば各複合体のPSAタンパク量を測定すればよい。具体的には、第１複合体と第２複合体を電気泳動で分離した場合には、例えば一次抗体として上記した本発明に係る抗PSA抗体を用い、二次抗体として測定可能な標識物質で標識した標識抗体を用いた公知のウエスタンブロッティング法を実施して、分離した各画分の中のPSAタンパク量を測定する方法等が挙げられる。
【０１１８】
［方法７］
１）試料と、抗PSA抗体である第１抗体と、抗PSA抗体である第２抗体と、α(2, 3)糖鎖親和性アフィニティー物質とを接触させて、第１抗体とα(2, 3)糖鎖遊離型PSAと第２抗体とα(2, 3)糖鎖親和性アフィニティー物質との複合体（第１複合体）と、第１抗体とα(2, 3)糖鎖遊離型PSA以外の遊離型PSAと第２抗体との複合体（第２複合体）を形成させる工程、
２）上記１）の工程で得られた第１複合体と第２複合体とを分離（分別）する工程、
３）上記２）の工程で分離した第１複合体の量及び第２複合体の量を測定する工程、
４）上記３）の工程で得られた第１複合体の量と第２複合体の量の和を求め、その和を遊離型PSA量とする工程。
【０１１９】
上記[方法７]に用いられる第１抗体及び第２抗体の少なくとも一方は、抗遊離型PSA抗体である。第１抗体と第２抗体のエピトープは異なることが好ましい。
【０１２０】
また、第１複合体と第２複合体とは、α(2, 3)糖鎖親和性アフィニティー物質のα(2, 3)糖鎖に対する親和性に基づいて分離してもよいし、第１複合体と第２複合体の質量、電荷、サイズ等の差に基づいて分離してもよい（例えば電気泳動等）。
【０１２１】
第１複合体の量と第２複合体の量を測定するには、例えば各複合体のPSAタンパク量を測定すればよい。具体的には、第１複合体と第２複合体を電気泳動で分離した場合には、例えば一次抗体として上記した本発明に係る抗PSA抗体を用い、二次抗体として測定可能な標識物質で標識した標識抗体を用いた公知のウエスタンブロッティング法を実施して、分離した各画分の中のPSAタンパク量を測定する方法等が挙げられる。
【０１２２】
［方法８］
１）試料と、抗遊離型PSA抗体である第１抗体と、α(2, 3)糖鎖に親和性を有する第２抗体（α(2, 3)糖鎖親和性アフィニティー物質１）と、α(2, 3)糖鎖に親和性を有するレクチン（α(2, 3)糖鎖親和性アフィニティー物質２）とを接触させて、第１抗体とα(2, 3)糖鎖遊離型PSAと第２抗体とレクチンとの複合体（第１複合体）と、第１抗体とα(2, 3)糖鎖遊離型PSA以外の遊離型PSAとの複合体（第２複合体）を形成させる工程、
２）上記１）の工程で得られた第１複合体と第２複合体とを分離（分別）する工程、
３）上記２）の工程で分離した第１複合体の量及び第２複合体の量を測定する工程、
４）上記３）の工程で得られた第１複合体の量と第２複合体の量の和を求め、その和を遊離型PSA量とする工程。
【０１２３】
第１複合体と第２複合体とは、レクチンのα(2, 3)糖鎖に対する親和性に基づいて分離してもよいし、第１複合体と第２複合体の質量、電荷、サイズ等の差に基づいて分離してもよい（例えば電気泳動等）。
【０１２４】
第１複合体の量と第２複合体の量を測定するには、例えば各複合体のPSAタンパク量を測定すればよい。具体的には、第１複合体と第２複合体を電気泳動で分離した場合には、例えば一次抗体として上記した本発明に係る抗PSA抗体を用い、二次抗体として測定可能な標識物質で標識した標識抗体を用いた公知のウエスタンブロッティング法を実施して、分離した各画分の中のPSAタンパク量を測定する方法等が挙げられる。
【０１２５】
上記［方法１］〜［方法８］で用いられる抗PSA抗体を標識するために用いられる標識物質及びその該抗体への結合方法は、上記（１）−１の項で、抗PSA抗体を標識するために用いられる標識物質及びその結合方法について記載したものと同じものが挙げられる。また、標識抗PSA抗体を用いて複合体中の標識物質に由来するシグナルを測定する方法は、上記（１）−１の項で記載したそれらと同じものが挙げられる。
【０１２６】
上記［方法３］〜［方法８］において、抗PSA抗体、及びα(2, 3)糖鎖親和性アフィニティー物質は、測定方法に応じて固相に固定化されていてもよい。
【０１２７】
上記［方法３］〜［方法８］で用いられる固相、使用する各抗体の該固相への固定化方法の例としては、上記（１）−１の項に記載されたそれらと同じものが挙げられる。
【０１２８】
上記［方法３］〜［方法８］において、自体公知の免疫学的測定法等の分野で用いられている分離・測定装置、各種試薬類等は、全て該方法に使用できる。測定に使用するα(2, 3)糖鎖親和性アフィニティー物質及び固相の種類は、使用する装置や、実施する測定方法に従って適宜選択される。測定に使用する抗PSA抗体及び試薬類の使用濃度は、通常この分野で用いられる濃度範囲から適宜選択すればよい。抗PSA抗体を標識するために用いられる標識物質は、該標識物質の測定方法や測定装置などに応じて適宜選択される。また、測定を実施するに際しての測定条件等（反応温度、反応時間、反応時のｐＨ，測定波長、測定装置等）は、自体公知の方法に従い、適宜選択すればよい。
【０１２９】
「（１）遊離型PSA量を測定する方法」としては、（１）−２の方法が好ましいく、（１）−２−２の方法がより好ましい。（１）−２−２の方法の中でも、［方法３］、［方法４］、［方法６］、及び［方法７］が好ましく、［方法４］がより好ましい。
【０１３０】
（２）α(2, 3)糖鎖遊離型PSA量を測定する方法
該方法としては、以下の方法が挙げられる。
（２）−１．試料中のα(2, 3)糖鎖遊離型PSA量を直接測定する方法、
（２）−２．試料中の遊離型PSA量からα(2, 3)糖鎖遊離型PSA以外の遊離型PSA量を差し引いた値をα(2, 3)糖鎖遊離型PSA量とする方法。
【０１３１】
（２）−１．試料中のα(2, 3)糖鎖遊離型PSA量を直接測定する方法
当該方法としては、「α(2, 3)糖鎖遊離型PSAとα(2, 3)糖鎖親和性アフィニティ−物質とを反応させて、α(2, 3)糖鎖遊離型PSAとα(2, 3)糖鎖親和性アフィニティ−物質との複合体を生成させた後、該複合体の量を測定し、得られた測定結果に基づいてα(2, 3)糖鎖遊離型PSA量を求める方法」が挙げられる。
【０１３２】
具体的には、例えば上記（１）−２−１の項に記載された方法に従って、α(2, 3)糖鎖遊離型PSAとα(2, 3)糖鎖遊離型PSA以外の遊離型PSAを分離し、α(2, 3)糖鎖遊離型量を測定すればよい。なお、この場合にはα(2, 3)糖鎖遊離型PSA以外の遊離型PSA量を測定する必要はない。
【０１３３】
より具体的には、例えば下記［方法１’］及び［方法２’］が挙げられ、［方法２’］が好ましい。
【０１３４】
［方法１’］
試料を、α(2, 3)糖鎖親和性アフィニティー物質をアガロースビーズ等の固相に固定化した充填剤を充填したカラムに流す。α(2, 3)糖鎖遊離型PSAは充填剤上のα(2, 3)糖鎖親和性アフィニティー物質に結合し、α(2, 3)糖鎖遊離型PSA以外の遊離型PSAは、α(2, 3)糖鎖親和性アフィニティー物質に結合せずにカラムから溶出される。カラムを適当な緩衝液で洗浄後、カラムに５倍のカラム容量の乳糖含有緩衝液（0.4Ｍ）を流し、α(2, 3)糖鎖遊離型PSAを溶出させる。溶出液中の遊離型PSA量を測定すれば、「α(2, 3)糖鎖遊離型PSA量」が得られる。
【０１３５】
上記［方法１’］において、α(2, 3)糖鎖遊離型PSA量の測定は、上記（１）−１の項に記載された方法と同様になされればよい。
【０１３６】
［方法２’］
試料を、α(2, 3)糖鎖親和性アフィニティー物質を固定化したマイクロタイタープレートやポリスチレンビーズ等の固相と接触させる。α(2, 3)糖鎖遊離型PSAは固相上のα(2, 3)糖鎖親和性アフィニティー物質に結合する。固相と液相を分離し、固相に結合した遊離型PSA量を測定すれば、α(2, 3)糖鎖遊離型PSA量が得られる。
【０１３７】
上記［方法２’］において、固相に結合したα(2, 3)糖鎖遊離型PSA量は、例えば以下の方法で測定すればよい。
【０１３８】
固相に結合したα(2, 3)糖鎖遊離型PSAと標識抗遊離型PSA抗体とを反応させ、固相上にα(2, 3)糖鎖遊離型PSAと標識抗遊離型PSA抗体との複合体を形成させる。次いで、該複合体を構成する標識抗遊離型PSA抗体の標識物質に由来するシグナルを測定することにより、該複合体の量を測定する。予め濃度既知のα(2, 3)糖鎖遊離型PSA標準を用いて同様に測定を行って得られた結果を用いた、常法による定量値換算を行ってα(2, 3)糖鎖遊離型PSAを求めればよい。
【０１３９】
上記［方法２’］で用いられる標識抗遊離型PSA抗体を標識するために用いられる標識物質及びその該抗体への結合方法は、上記（１）−１の項で、抗PSA抗体を標識するために用いられる標識物質及びその結合方法について記載したものと同じものが挙げられる。また、標識抗遊離型PSA抗体を用いて複合体の標識物質に由来するシグナルを測定する方法は、上記(１)−１の項で記載したそれらと同じものが挙げられる。
【０１４０】
上記［方法１’］及び［方法２’］で用いられる固相の種類、及び使用する各抗体の該固相への固定化方法の例としては、上記（１）−１の項に記載されたそれらと同じものが挙げられる。
【０１４１】
上記［方法１’］及び［方法２’］において、自体公知の免疫学的測定法等の分野で用いられている分離・測定装置、各種試薬類等は、全て該方法に使用できる。測定に使用するα(2, 3)糖鎖親和性アフィニティー物質及び固相の種類は、使用する測定装置や実施する測定方法に従って適宜選択される。測定に使用する抗遊離型PSA抗体及び試薬類の使用濃度は、通常この分野で用いられる濃度範囲から適宜選択すればよい。抗遊離型PSA抗体を標識するために用いられる標識物質は、該標識物質の測定方法や測定装置などに応じて適宜選択される。また、測定を実施するに際しての測定条件等（反応温度、反応時間、反応時のｐＨ，測定波長、測定装置等）は、自体公知の方法に従い、適宜選択すればよい。
【０１４２】
また、標識物質で標識されたα(2, 3)糖鎖親和性アフィニティー物質を用いる下記［方法９］〜［方法１１］の方法によっても、α(2, 3)糖鎖遊離型PSA量を直接測定することができる。
【０１４３】
下記［方法９］〜［方法１１］の方法で用いられるα(2, 3)糖鎖親和性アフィニティー物質としては、上記した本発明に係るα(2, 3)糖鎖親和性アフィニティー物質が挙げられる。中でも、α(2, 3)糖鎖親和性アフィニティー物質として用いられるレクチン又はα(2, 3)糖鎖親和性アフィニティー物質として用いられる抗体が好ましい。α(2, 3)糖鎖親和性アフィニティー物質として用いられるレクチンがより好ましい。
【０１４４】
［方法９］
１）試料と、標識物質で標識されたα(2, 3)糖鎖に親和性を有する標識第１抗体（α(2, 3)糖鎖親和性アフィニティー物質１）と、抗遊離型PSA抗体である第２抗体と、α(2, 3)糖鎖に親和性を有するレクチン（α(2, 3)糖鎖親和性アフィニティー物質２）とを接触させて、標識第１抗体とα(2, 3)糖鎖遊離型PSAと第２抗体とレクチンとの複合体（第１複合体）と、α(2, 3)糖鎖遊離型PSA以外の遊離型PSAと第２抗体との複合体（第２複合体）を形成させる工程、
２）必要に応じ、上記１）で得られた第１複合体と第２複合体とを分離する工程、
３）第１複合体を構成する標識第１抗体の標識物質に由来するシグナルを測定することにより、第１複合体の量を測定し、その測定値をもとにα(2, 3)糖鎖遊離型PSA量を求める工程。
【０１４５】
第１複合体と第２複合体とは、α(2, 3)糖鎖親和性アフィニティー物質１又はα(2, 3)糖鎖親和性アフィニティー物質２のα(2, 3)糖鎖に対する親和性に基づいて分離してもよいし、第１複合体と第２複合体の質量、電荷、サイズ等の差に基づいて分離してもよい（例えば電気泳動等）。
【０１４６】
上記[方法９]において、α(2, 3)糖鎖遊離型PSA量は、予め濃度既知のα(2, 3)糖鎖遊離型PSA標準を用いて同様に測定を行って得られた結果を用いた、常法による定量値換算を行って求めればよい。
【０１４７】
［方法１０］
１）試料と、標識物質で標識された標識α(2, 3)糖鎖親和性アフィニティー物質と、抗遊離型PSA抗体とを接触させて、標識α(2, 3)糖鎖親和性アフィニティー物質とα(2, 3)糖鎖遊離型PSAと抗遊離型PSA抗体との複合体（第１複合体）と、α(2, 3)糖鎖遊離型PSA以外の遊離型PSAと抗遊離型PSA抗体との複合体（第２複合体）を形成させる工程、
２）必要に応じ、上記１）の工程で得られた第１複合体と第２複合体とを分離する工程、
３）第１複合体を構成する標識α(2, 3)糖鎖親和性アフィニティー物質の標識物質に由来するシグナルを測定することにより、第１複合体の量を測定し、その測定値をもとにα(2, 3)糖鎖遊離型PSA量を求める工程。
【０１４８】
第１複合体と第２複合体とは、第１抗体のα(2, 3)糖鎖に対する親和性に基づいて分離してもよいし、第１複合体と第２複合体の質量、電荷、サイズ等の差に基づいて分離してもよい（例えば電気泳動等）。
【０１４９】
上記[方法１０]において、α(2, 3)糖鎖遊離型PSA量は、予め濃度既知のα(2, 3)糖鎖遊離型PSA標準を用いて同様に測定を行って得られた結果を用いた、常法による定量値換算を行って求めればよい。
【０１５０】
［方法１１］
１）試料と、標識物質で標識された標識α(2, 3)糖鎖親和性アフィニティー物質と、抗PSA抗体である第１抗体と、抗PSA抗体である第２抗体とを接触させて、標識α(2, 3)糖鎖親和性アフィニティー物質とα(2, 3)糖鎖遊離型PSAと第１抗体と第２抗体との複合体（第１複合体）と、α(2, 3)糖鎖遊離型PSA以外の遊離型PSAと第１抗体と第２抗体との複合体（第２複合体）を形成させる工程、
２）必要に応じ、上記１）の工程で得られた第１複合体と第２複合体とを分離する工程、
３）第１複合体を構成する標識α(2, 3)糖鎖親和性アフィニティー物質の標識物質に由来するシグナルを測定することにより、第１複合体の量を測定し、その測定値をもとにα(2, 3)糖鎖遊離型PSA量を求める工程。
【０１５１】
上記[方法１１]に用いられる第１抗体及び第２抗体の少なくとも一方は、抗遊離型PSA抗体である。第１抗体と第２抗体のエピトープは異なることが好ましい。
【０１５２】
また、第１複合体と第２複合体とは、α(2, 3)糖鎖親和性アフィニティー物質のα(2, 3)糖鎖に対する親和性に基づいて分離してもよいし、第１複合体と第２複合体の質量、電荷、サイズ等の差に基づいて分離してもよい（例えば電気泳動等）。
【０１５３】
上記[方法１１]において、α(2, 3)糖鎖遊離型PSA量は、予め濃度既知のα(2, 3)糖鎖遊離型PSA標準を用いて同様に測定を行って得られた結果を用いた常法による定量値換算を行って求めればよい。
【０１５４】
上記［方法９］〜［方法１１］で用いられるα(2, 3)糖鎖親和性アフィニティー物質が抗体の場合、該抗体を標識するために用いられる標識物質及びその該抗体への結合方法は、上記（１）−１の項で、抗PSA抗体を標識するために用いられる標識物質及びその結合方法について記載したものと同じものが挙げられる。また、標識抗PSA抗体を用いて複合体の標識物質に由来するシグナルを測定する方法は、上記(１)−１の項で記載したそれらと同じものが挙げられる。
【０１５５】
上記［方法９］〜［方法１１］で用いられるα(2, 3)糖鎖親和性アフィニティー物質がレクチンの場合、該レクチンを標識するために用いられる標識物質及びその該レクチンへの結合方法は、上記（１）−２の項において、「α(2, 3)糖鎖親和性アフィニティー物質：レクチン」の項で記載したものと同じものが挙げられる。また、該標識レクチンを用いて複合体中の標識物質に由来するシグナルを測定する方法は、上記（１）−１の項で記載した方法に準じて、使用する標識物質の種類に応じて好ましい方法を適宜選択すればよい。
【０１５６】
上記［方法９］〜［方法１１］において、抗PSA抗体、又はα(2, 3)糖鎖親和性アフィニティー物質は、実施する測定方法に応じて固相に固定化されていてもよい。
【０１５７】
上記［方法９］〜［方法１１］で用いられる固相、使用する各抗体の該固相への固定化方法の例としては、上記（１）−１の項に記載されたそれらと同じものが挙げられる。また、α(2, 3)糖鎖親和性アフィニティー物質である抗体の該固相への固定化方法の例としては、上記(１)−１の項に記載されたそれらと同じものが挙げられる。α(2, 3)糖鎖親和性アフィニティー物質であるレクチンの該固相への固定化は、通常この分野で利用される自体公知の固定化方法で行えばよい。
【０１５８】
上記［方法９］〜［方法１１］において、自体公知の免疫学的測定法等の分野で用いられている分離・測定装置、各種試薬類等は、全て該方法に使用できる。測定に使用するα(2, 3)糖鎖親和性アフィニティー物質及び固相の種類は、使用する測定装置や、実施する測定方法に従って適宜選択される。測定に使用する抗PSA抗体、及び試薬類の使用濃度は、通常この分野で用いられる濃度範囲から適宜選択すればよい。α(2, 3)糖鎖親和性アフィニティー物質を標識するために用いられる標識物質は、該標識物質の測定方法や測定装置などに応じて適宜選択される。また、測定を実施するに際しての測定条件等（反応温度、反応時間、反応時のｐＨ，測定波長、測定装置等）は、自体公知の方法に従い、適宜選択すればよい
【０１５９】
さらに、上記（１）−２−２における、α(2, 3)糖鎖遊離型PSA量を測定する方法等でも、α(2, 3)糖鎖遊離型PSA量を測定することができる。
【０１６０】
すなわち、上記（１）−２−２に記載の方法に従って、α(2, 3)糖鎖遊離型PSAとα(2, 3)糖鎖遊離型PSA以外の遊離型PSAとを分離し、α(2, 3)糖鎖遊離型PSA量を測定すればよい。この場合には、α(2, 3)糖鎖遊離型PSA以外の遊離型PSA量を測定する必要はない。またα(2, 3)糖鎖遊離型PSA量とα(2, 3)糖鎖遊離型PSA以外の遊離型PSA量の和を求める必要もない。
【０１６１】
具体的には、例えば、以下の方法が挙げられる
【０１６２】
［方法３’］
１）試料と、標識物質で標識された標識抗遊離型PSA抗体と、α(2, 3)糖鎖親和性アフィニティー物質とを接触させて、標識抗遊離型PSA抗体とα(2, 3)糖鎖遊離型PSAとα(2, 3)糖鎖親和性アフィニティー物質との複合体（第１複合体）と、標識抗遊離型PSA抗体とα(2, 3)糖鎖遊離型PSA以外の遊離型PSAとの複合体（第２複合体）を形成させる工程、
２）上記１）の工程で得られた第１複合体と第２複合体とを分離（分別）する工程、
３）第１複合体を構成する標識抗遊離型PSA抗体の標識物質に由来するシグナルを測定することにより、上記２）の工程で分離した第１複合体の量を測定する工程。
【０１６３】
第１複合体と第２複合体とは、α(2, 3)糖鎖親和性アフィニティー物質のα(2, 3)糖鎖に対する親和性に基づいて分離してもよいし、第１複合体と第２複合体の質量、電荷、サイズ等の差に基づいて分離してもよい（例えば電気泳動等）。
【０１６４】
［方法４’］
１）試料と、抗PSA抗体が標識物質で標識された標識第１抗体と、抗PSA抗体である第２抗体と、α(2, 3)糖鎖親和性アフィニティー物質とを接触させて、標識第１抗体とα(2, 3)糖鎖遊離型PSAと第２抗体とα(2, 3)糖鎖親和性アフィニティー物質との複合体（第１複合体）と、標識第１抗体とα(2, 3)糖鎖遊離型PSA以外の遊離型PSAと第２抗体との複合体（第２複合体）を形成させる工程、
２）上記１）の工程で得られた第１複合体と第２複合体とを分離（分別）する工程、
３）第１複合体を構成する標識第１抗体の標識物質に由来するシグナルを測定することにより、上記２）の工程で分離した第１複合体の量を測定する工程。
【０１６５】
上記[方法４’]に用いられる第１抗体と第２抗体の少なくとも一方は抗遊離型PSA抗体である。第１抗体は抗遊離型PSA抗体であることがより好ましい。
【０１６６】
また、第１複合体と第２複合体とは、α(2, 3)糖鎖親和性アフィニティー物質のα(2, 3)糖鎖に対する親和性に基づいて分離してもよいし、第１複合体と第２複合体の質量、電荷、サイズ等の差に基づいて分離してもよい（例えば電気泳動等）。
【０１６７】
［方法５’］
１）試料と、抗遊離型PSA抗体が標識物質で標識された標識第１抗体と、α(2, 3)糖鎖に親和性を有する第２抗体（α(2, 3)糖鎖親和性アフィニティー物質１）と、糖鎖の末端シアル酸残基が糖鎖の末端から２番目のガラクトース残基にα(2, 3) 結合した糖鎖に親和性を有するレクチン（α(2, 3)糖鎖親和性アフィニティー物質２）とを接触させて、標識第１抗体とα(2, 3)糖鎖遊離型PSAと第２抗体とレクチンとの複合体（第１複合体）と、標識第１抗体とα(2, 3)糖鎖遊離型PSA以外の遊離型PSAとの複合体（第２複合体）を形成させる工程、
２）上記１）の工程で得られた第１複合体と第２複合体とを分離（分別）する工程、
３）第１複合体を構成する標識第１抗体の標識物質に由来するシグナルを測定することにより、上記２）の工程で分離した第１複合体の量を測定する工程。
【０１６８】
第１複合体と第２複合体とは、α(2, 3)糖鎖親和性アフィニティー物質１又はα(2, 3)糖鎖親和性アフィニティー物質２のα(2, 3)糖鎖に対する親和性に基づいて分離してもよいし、第１複合体と第２複合体の質量、電荷、サイズ等の差に基づいて分離してもよい（例えば電気泳動等）。
【０１６９】
［方法６’］
１）試料と、抗遊離型PSA抗体と、α(2, 3)糖鎖親和性アフィニティー物質とを接触させて、抗遊離型PSA抗体とα(2, 3)糖鎖遊離型PSAとα(2, 3)糖鎖親和性アフィニティー物質との複合体（第１複合体）と、抗遊離型PSA抗体とα(2, 3)糖鎖遊離型PSA以外の遊離型PSAとの複合体（第２複合体）を形成させる工程、
２）上記１）の工程で得られた第１複合体と第２複合体とを分離（分別）する工程、
３）上記２）の工程で分離した第１複合体の量を測定する工程。
【０１７０】
第１複合体と第２複合体とは、α(2, 3)糖鎖親和性アフィニティー物質のα(2, 3)糖鎖に対する親和性に基づいて分離してもよいし、第１複合体と第２複合体の質量、電荷、サイズ等の差に基づいて分離してもよい（例えば電気泳動等）。
【０１７１】
第１複合体の量を測定するには、例えば第１複合体のPSAタンパク量を測定すればよい。具体的には、第１複合体と第２複合体を電気泳動で分離した場合には、例えば一次抗体として上記した本発明に係る抗PSA抗体を用い、二次抗体として測定可能な標識物質で標識した標識抗体を用いた公知のウエスタンブロッティング法を実施して、分離した第１複合体の画分の中のPSAタンパク量を測定する方法等が挙げられる。
【０１７２】
［方法７’］
１）試料と、抗PSA抗体である第１抗体と、抗PSA抗体である第２抗体と、α(2, 3)糖鎖親和性アフィニティー物質とを接触させて、第１抗体とα(2, 3)糖鎖遊離型PSAと第２抗体とα(2, 3)糖鎖親和性アフィニティー物質との複合体（第１複合体）と、第１抗体とα(2, 3)糖鎖遊離型PSA以外の遊離型PSAと第２抗体との複合体（第２複合体）を形成させる工程、
２）上記１）の工程で得られた第１複合体と第２複合体とを分離（分別）する工程、
３）上記２）の工程で分離した第１複合体の量を測定する工程。
【０１７３】
上記[方法７’]に用いられる第１抗体及び第２抗体の少なくとも一方は、抗遊離型PSA抗体である。第１抗体と第２抗体のエピトープは異なることが好ましい。
【０１７４】
また、第１複合体と第２複合体とは、α(2, 3)糖鎖親和性アフィニティー物質のα(2, 3)糖鎖に対する親和性に基づいて分離してもよいし、第１複合体と第２複合体の質量、電荷、サイズ等の差に基づいて分離してもよい（例えば電気泳動等）。
【０１７５】
第１複合体の量を測定するには、例えば第１複合体のPSAタンパク量を測定すればよい。具体的には、第１複合体と第２複合体を電気泳動で分離した場合には、例えば一次抗体として上記した本発明に係る抗PSA抗体を用い、二次抗体として測定可能な標識物質で標識した標識抗体を用いた公知のウエスタンブロッティング法を実施して、分離した第１複合体の画分の中のPSAタンパク量を測定する方法等が挙げられる。
【０１７６】
［方法８’］
１）試料と、抗遊離型PSA抗体である第１抗体と、α(2, 3)糖鎖に親和性を有する第２抗体（α(2, 3)糖鎖親和性アフィニティー物質１）と、α(2, 3)糖鎖に親和性を有するレクチン（α(2, 3)糖鎖親和性アフィニティー物質２）とを接触させて、第１抗体とα(2, 3)糖鎖遊離型PSAと第２抗体とレクチンとの複合体（第１複合体）と、第１抗体とα(2, 3)糖鎖遊離型PSA以外の遊離型PSAとの複合体（第２複合体）を形成させる工程、
２）上記１）の工程で得られた第１複合体と第２複合体とを分離（分別）する工程、
３）上記２）の工程で分離した第１複合体の量を測定する工程。
【０１７７】
第１複合体と第２複合体とは、レクチンのα(2, 3)糖鎖に対する親和性に基づいて分離してもよいし、第１複合体と第２複合体の質量、電荷、サイズ等の差に基づいて分離してもよい（例えば電気泳動等）。
【０１７８】
第１複合体の量を測定するには、例えば第１複合体のPSAタンパク量を測定すればよい。具体的には、第１複合体と第２複合体を電気泳動で分離した場合には、例えば一次抗体として上記した本発明に係る抗PSA抗体を用い、二次抗体として測定可能な標識物質で標識した標識抗体を用いた公知のウエスタンブロッティング法を実施して、分離した第１複合体の画分の中のPSAタンパク量を測定する方法等が挙げられる。
【０１７９】
上記［方法３’］〜［方法８’］で用いられる抗PSA抗体を標識するために用いられる標識物質及びその該抗体への結合方法は、上記（１）−１の項で、抗PSA抗体を標識するために用いられる標識物質及びその結合方法について記載したものと同じものが挙げられる。また、標識抗PSA抗体を用いて複合体中の標識物質に由来するシグナルを測定する方法は、上記（１）−１の項で記載したそれらと同じものが挙げられる。
【０１８０】
上記［方法３’］〜［方法８’］において、抗PSA抗体、抗遊離型PSA抗体及びα(2, 3)糖鎖親和性アフィニティー物質は、測定方法に応じて固相に固定化されていてもよい。。
【０１８１】
上記［方法３’］〜［方法８’］で用いられる固相、使用する各抗体の該固相への固定化方法の例としては、上記（１）−１の項に記載されたそれらと同じものが挙げられる。
【０１８２】
上記［方法３’］〜［方法８’］において、自体公知の免疫学的測定法等の分野で用いられている分離・測定装置、各種試薬類等は、全て該方法に使用できる。測定に使用するα(2, 3)糖鎖親和性アフィニティー物質及び固相の種類は、使用する測定装置や実施する測定方法に従って適宜選択される。測定に使用する抗PSA抗体及び試薬類の使用濃度は、通常この分野で用いられる濃度範囲から適宜選択すればよい。抗PSA抗体を標識するために用いられる標識物質は、該標識物質の測定方法や測定装置などに応じて適宜選択される。抗PSA抗体を標識するために用いられる標識物質は、該標識物質の測定方法や測定装置などに応じて適宜選択される。また、測定を実施するに際しての測定条件等（反応温度、反応時間、反応時のｐＨ，測定波長、測定装置等）は、自体公知の方法に従い、適宜選択すればよい。
【０１８３】
（２）−２．試料中の遊離型PSA量からα(2, 3)糖鎖遊離型PSA以外の遊離型PSA量を差し引いた値をα(2, 3)糖鎖遊離型PSA量とする方法
【０１８４】
（２）−２の方法において、「遊離型PSA量」は、上記した「(１)．遊離型PSA量を測定する方法」の項に記載された方法により求めればよい。
【０１８５】
（２）−２の方法において、「α(2, 3)糖鎖遊離型PSA以外の遊離型PSA量」は、例えば以下の方法で求めることができる。
「試料をα(2, 3)糖鎖親和性アフィニティー物質と反応させて、α(2, 3)糖鎖遊離型PSAとα(2, 3)糖鎖親和性アフィニティー物質との複合体を生成させる。次いで、該複合体とα(2, 3)糖鎖親和性アフィニティー物質に結合しなかったα(2, 3)糖鎖遊離型PSA以外の遊離型PSAを含有する溶液を分離する。分離した溶液中の遊離型PSA量を測定することにより、α(2, 3)糖鎖遊離型PSA以外の遊離型PSA量を求める。」
【０１８６】
すなわち、上記（１）−２−１又は(１)−２−２の項に記載された方法に従って、α(2, 3)糖鎖遊離型PSAとα(2, 3)糖鎖遊離型PSA以外の遊離型PSAを分離する。次いで、分離したα(2, 3)糖鎖遊離型PSA以外の遊離型PSA量を測定すればよい。この場合には、α(2, 3)糖鎖遊離型PSA量を測定する必要はない。
【０１８７】
具体的には、例えば上記（１）−２の項に記載された［方法１］〜［方法８］の方法に従い、α(2, 3)糖鎖遊離型PSAとα(2, 3)糖鎖遊離型PSA以外の遊離型PSAを分離する。次いで分離したα(2, 3)糖鎖遊離型PSA以外の遊離型PSAの量を測定する。別途測定した同じ試料中の遊離型PSA量から、得られたα(2, 3)糖鎖遊離型PSA以外の遊離型PSA量を差し引くことにより、α(2, 3)糖鎖遊離型PSA量を求めればよい。
【０１８８】
上記(２)−２の方法において、α(2, 3)糖鎖遊離型PSA以外の遊離型PSA量の測定方法としては、上記した［方法３］、［方法４］、［方法６］、又は［方法７］の方法に従って分離されたα(2, 3)糖鎖遊離型PSA以外の遊離型PSA量のみを測定する方法が、好ましい。［方法４］の方法に従って分離されたα(2, 3)糖鎖遊離型PSA以外の遊離型PSA量のみを測定する方法が、より好ましい。
【０１８９】
「（２）α(2, 3)糖鎖遊離型PSA量を測定する方法」としては、（２）−１の方法が好ましい。（２）−１の方法において、［方法３’］、［方法４’］、［方法６’］、［方法７’］、［方法１０’］、及び［方法１１’］が好ましい。［方法４’］及び［方法１０’］がより好ましい。［方法４’］が特に好ましい。
【０１９０】
なお、本発明において、α(2, 3)糖鎖親和性アフィニティー物質を用いた測定方法を実施する場合において、α(2, 3)糖鎖遊離型PSA量を測定する際に用いられるα(2, 3)糖鎖親和性アフィニティー物質の量は、試料中のα(2, 3)糖鎖遊離型PSAの80%以上を測定できるのに十分な量でなくてはならない。
【０１９１】
そのようなα(2, 3)糖鎖親和性アフィニティー物質の使用量は、例えばα(2, 3)糖鎖親和性アフィニティー物質のα(2, 3)糖鎖遊離型PSAに対する結合定数と、試料中のα(2, 3)糖鎖遊離型PSAの量を考慮して定めてもよい。
【０１９２】
例えば、α(2, 3)糖鎖遊離型PSAに対する親和性が強く、α(2, 3)糖鎖遊離型PSAに結合すれば再解離しないα(2, 3)糖鎖親和性アフィニティー物質を用いる場合には、測定時には、試料中のα(2, 3)糖鎖遊離型PSAの80%以上がα(2, 3)糖鎖親和性アフィニティー物質と複合体を形成している程度に、十分な量のα(2, 3)糖鎖親和性アフィニティー物質を使用する。
【０１９３】
例えば、α(2, 3)糖鎖遊離型PSAに対する親和性が十分ではなく、一旦α(2, 3)糖鎖遊離型PSAに結合しても再解離してしまうようなα(2, 3)糖鎖親和性アフィニティー物質を用いる場合には、再解離した後でも、測定時には、試料中のα(2, 3)糖鎖遊離型PSAの80%以がα(2, 3)糖鎖親和性アフィニティー物質と複合体を形成している程度に、十分な量のα(2, 3)糖鎖親和性アフィニティー物質を使用する必要がある。
【０１９４】
以上の条件を満たすために使用するα(2, 3)糖鎖親和性アフィニティー物質の量は、試料中のα(2, 3)糖鎖遊離型PSAに対して過剰量（飽和量）のα(2, 3)糖鎖親和性アフィニティー物質を使用することが好ましい。
【０１９５】
（３）比率１の測定方法
本発明に係る比率１を決定する方法としては、「試料中の遊離型PSA量及びα(2, 3)糖鎖遊離型PSA量を測定し、得られた遊離型PSA量とα(2, 3)糖鎖遊離型PSA量との比率を算出し、決定する方法」があげられる。
【０１９６】
すなわち、本発明の比率１は、「遊離型PSA量とα(2, 3)糖鎖遊離型PSA量との比率」である。以下、単に「比率１」と記載する場合がある。
【０１９７】
比率１としては、
（ａ）遊離型PSA量に対するα(2, 3)糖鎖遊離型PSA量の比率（α(2, 3)糖鎖遊離型PSA量／遊離型PSA量）、
又は
（ｂ）α(2, 3)糖鎖遊離型PSA量に対する遊離型PSA量の比率（遊離型PSA量／α(2, 3)糖鎖遊離型PSA量）
が挙げられる。
【０１９８】
上記（ａ)の比率、すなわち「遊離型PSA量に対するα(2, 3)糖鎖遊離型PSA量の比率（α(2, 3)糖鎖遊離型PSA量／遊離型PSA量）」を比率１として用いることがより好ましい。
【０１９９】
上記方法に用いられる遊離型PSA量の測定方法としては、上記した「２．比率１を決定する方法」の「（１）遊離型PSA量を測定する方法」の項に記載された方法が挙げられる。
【０２００】
上記方法に用いられるα(2, 3)糖鎖遊離型PSA量の測定方法としては、上記した「２．比率１を決定する方法」の「（２）α(2, 3)糖鎖遊離型PSA量を測定する方法」の項に記載された方法が挙げられる。
【０２０１】
比率１を求める具体的方法の例としては、例えば以下の方法Ａ及び方法Ｂが挙げられる。
【０２０２】
方法Ａ：上記［方法１’］、［方法２’］、［方法９］、［方法１０］、及び［方法１１］の何れかの方法でα(2, 3)糖鎖遊離型PSA量を測定する。別途、上記「(１)遊離型PSA量を測定する方法」の項に記載された方法で遊離型PSA量を測定する。得られた遊離型PSA量とα(2, 3)糖鎖遊離型PSA量との比率を求め、比率１を決定する。
【０２０３】
方法Ａにおける比率１としては［α(2, 3)糖鎖遊離型PSA量／遊離型PSA量］、又は［遊離型PSA量／α(2, 3)糖鎖遊離型PSA量］が挙げられる。中でも、［α(2, 3)糖鎖遊離型PSA量／遊離型PSA量］を比率１とすることが好ましい。
【０２０４】
方法Ａでは、(１)−１の項に記載の方法で遊離型PSA量を測定し、［方法１０］又は［方法１１］でα(2, 3)糖鎖遊離型PSA量を測定することが好ましい。(１)−１の項に記載の方法で遊離型PSA量を測定し、［方法１０］でα(2, 3)糖鎖遊離型PSA量を測定することがより好ましい。
【０２０５】
方法Ｂ：上記［方法３’］〜［方法８’］の何れかの方法で遊離型PSA量を測定する。得られたα(2, 3)糖鎖遊離型PSA量と上記した［方法３］〜［方法８］の何れかの方法によって得られた［α(2, 3)糖鎖遊離型PSA量とα(2, 3)糖鎖遊離型PSA以外の遊離型PSA量の和］との比率を求め、比率１を決定する。
【０２０６】
方法Ｂにおける比率１としては、［α(2, 3)糖鎖遊離型PSA量／（α(2, 3)糖鎖遊離型PSA量＋α(2, 3)糖鎖遊離型PSA以外の遊離型PSA量）］、又は［（α(2, 3)糖鎖遊離型PSA量＋α(2, 3)糖鎖遊離型PSA以外の遊離型PSA量）／α(2, 3)糖鎖遊離型PSA量］が挙げられる。中でも、［α(2, 3)糖鎖遊離型PSA量／（α(2, 3)糖鎖遊離型PSA量＋α(2, 3)糖鎖遊離型PSA以外の遊離型PSA量）］を比率１とすることが好ましい。
【０２０７】
比率１を得るための遊離型PSA量とα(2, 3)糖鎖遊離型PSA量の測定は、［方法３］及び［方法３’］、［方法４］及び［方法４’］、［方法５］及び［方法５’］、［方法６］及び［方法６’］、［方法７］及び［方法７’］、並びに［方法８］及び［方法８’］の何れか一つの方法で行うことが好ましい。
【０２０８】
中でも、［方法３］及び［方法３’］、［方法４］及び［方法４’］、［方法６］及び［方法６’］、並びに［方法７］及び［方法７’］の何れか一つの方法で測定を行うことがより好ましい［方法４］及び［方法４’］で測定を行うことが、さらに好ましい。
【０２０９】
上記した［方法４］及び［方法４’］の方法で遊離型PSA量とα(2, 3)糖鎖遊離型PSA量の両方をワンステップで分離測定し、そしてα(2, 3)糖鎖遊離型PSA量と［α(2, 3)糖鎖遊離型PSA量とα(2, 3)糖鎖遊離型PSA以外の遊離型PSA量の和］との比率を求め、比率１を決定する方法が特に好ましい。該方法において、［α(2, 3)糖鎖遊離型PSA量／（α(2, 3)糖鎖遊離型PSA量＋α(2, 3)糖鎖遊離型PSA以外の遊離型PSA量）］を比率１とする方法が特に好ましい。
【０２１０】
なお、本発明において遊離型PSA量とα(2, 3)糖鎖遊離型PSA量との比率（比率１）を求める場合、遊離型PSA量、α(2, 3)糖鎖遊離型PSA量、α(2, 3)糖鎖遊離型PSA以外の遊離型PSA量の絶対量（PSAタンパク質量）を用いなくてもよい。測定の実測値（蛍光強度、吸光度等のシグナル値、ピーク面積、又はピーク高さ等）を、遊離型PSA量及びα(2, 3)糖鎖遊離型PSA量として用いて、比率１を求めることもできる。該実測値としては、面積が好ましい。
【０２１１】
例えば、上記（１）−２−２又は（２）の方法において、α(2, 3)糖鎖遊離型PSAとα(2, 3)糖鎖遊離型PSA以外の遊離型PSAを後記するキャピラリー電気泳動法で分離（分別）した場合には、各分離画分のピーク面積を求め、［α(2, 3)糖鎖遊離型PSA画分のピーク面積］と［α(2, 3)糖鎖遊離型PSA画分のピーク面積＋α(2, 3)糖鎖遊離型PSA以外の遊離型PSA画分のピーク面積］との比率を、比率１とすればよい。
【０２１２】
例えば、
・［α(2, 3)糖鎖遊離型PSA画分のピーク面積／（α(2, 3)糖鎖遊離型PSA画分のピーク面積＋α(2, 3)糖鎖遊離型PSA以外の遊離型PSA画分のピーク面積）］、又は
・［（α(2, 3)糖鎖遊離型PSA画分のピーク面積＋α(2, 3)糖鎖遊離型PSA以外の遊離型PSA画分のピーク面積）／α(2, 3)糖鎖遊離型PSA画分のピーク面積］
を、比率１とすればよい。
【０２１３】
［α(2, 3)糖鎖遊離型PSA画分のピーク面積／（α(2, 3)糖鎖遊離型PSA画分のピーク面積＋α(2, 3)糖鎖遊離型PSA以外の遊離型PSA画分のピーク面積）］を、比率１とすることが好ましい。
【０２１４】
また、例えば、α(2, 3)糖鎖遊離型PSAとα(2, 3)糖鎖遊離型PSA以外の遊離型PSAを分離（分別）し、それぞれを蛍光標識抗PSA抗体を用いて検出した場合、例えば以下の方法で求めた比率を、比率１としてもよい。
・［α(2, 3)糖鎖遊離型PSA画分の蛍光量／（α(2, 3)糖鎖遊離型PSA画分の蛍光量＋α(2, 3)糖鎖遊離型PSA以外の遊離型PSA画分の蛍光量）］、又は
・［（α(2, 3)糖鎖遊離型PSA画分の蛍光量＋α(2, 3)糖鎖遊離型PSA以外の遊離型PSA画分の蛍光量）／α(2, 3)糖鎖遊離型PSA画分の蛍光量］
【０２１５】
［α(2, 3)糖鎖遊離型PSA画分の蛍光量／（α(2, 3)糖鎖遊離型PSA画分の蛍光量＋α(2, 3)糖鎖遊離型PSA以外の遊離型PSA画分の蛍光量）］を比率１として用いることが好ましい。
【０２１６】
比率１を決定する方法の一実施態様として、α(2, 3)糖鎖親和性アフィニティー物質としてレクチンを用い、［方法４］及び［方法４’］の方法で遊離型PSA量とα(2, 3)糖鎖遊離型PSA量を測定し、比率１を決定する方法を例に取り、以下に説明する。
【０２１７】
１）試料と、抗PSA抗体が標識物質で標識された標識第１抗体と、抗PSA抗体である第２抗体と、糖鎖の末端シアル酸残基が糖鎖の末端から２番目のガラクトース残基にα(2, 3) 結合した糖鎖に親和性を有するレクチン（α(2, 3)糖鎖親和性アフィニティー物質）とを接触させて、標識第１抗体とα(2, 3)糖鎖遊離型PSAと第２抗体とレクチンとの複合体（第１複合体）と、標識第１抗体とα(2, 3)糖鎖遊離型PSA以外の遊離型PSAと第２抗体との複合体（第２複合体）を形成させる。
２）上記１）の工程で得られた第１複合体と第２複合体とを分離（分別）する。
３）該第１複合体及び第２複合体を構成する標識第１抗体の標識物質に由来するシグナルを測定することにより、上記２）の工程で分離した第１複合体の量及び第２複合体の量を測定する。
４）上記３）の工程で得られた第１複合体の量と第２複合体の量の和（遊離型PSA量）を求め、その和と上記３）の工程で得られた第１複合体の量との比率を求めることにより、遊離型PSA量とα(2, 3)糖鎖遊離型PSA量との比率１を決定する。
第１抗体と第２抗体の少なくとも一方は、抗遊離型PSA抗体である。第１抗体は、抗遊離型PSA抗体であることが好ましい。
【０２１８】
第１複合体と第２複合体とは、レクチンのα(2, 3)糖鎖に対する親和性に基づいて分離してもよいし、第１複合体と第２複合体の質量、電荷、サイズ等の差に基づいて分離してもよい（例えば電気泳動等）。
【０２１９】
また、上記４）の工程で得られる遊離型PSA量とα(2, 3)糖鎖遊離型PSA量との比率１とは、好ましくは［第１複合体の量／（第１複合体の量＋第２複合体の量）］＝α(2, 3)糖鎖遊離型PSA量／遊離型PSA量］である。
【０２２０】
上記のα(2, 3)糖鎖親和性アフィニティー物質を用いた測定において、α(2, 3)糖鎖親和性アフィニティー物質と結合したα(2, 3)糖鎖遊離型PSAと、α(2, 3)糖鎖親和性アフィニティー物質に結合しなかったα(2, 3)糖鎖遊離型PSA以外の遊離型PSAとを分離（分別）する工程は、例えばキャピラリー電気泳動、表面プラズモン共鳴法、レクチンマイクロアレイ、免疫学的測定法により実施することができる。中でも、キャピラリー電気泳動、表面プラズモン共鳴法、又は免疫学的測定法が好ましく、キャピラリー電気泳動法がより好ましい。
【０２２１】
以下に、上記のそれぞれの方法で、α(2, 3)糖鎖親和性アフィニティー物質を用いてα(2, 3)糖鎖遊離型PSA及び遊離型PSA量を測定し、比率１を決定する方法の具体例を説明する。
【０２２２】
・キャピラリー電気泳動
キャピラリー電気泳動によりα(2, 3)糖鎖遊離型PSA量を求め、遊離型PSA量とα(2, 3)糖鎖遊離型PSA量との比率（比率１）を決定する方法としては、例えばまずPSAを含有する試料と、本発明に係る抗遊離型PSA抗体を標識物質で標識した標識抗遊離型PSA抗体とを接触・反応させ、得られた反応液中の[標識抗遊離型PSA抗体−α(2, 3)糖鎖遊離型PSA]複合体と[標識抗遊離型PSA抗体−α(2, 3)糖鎖遊離型PSA以外の遊離型PSA]複合体とを、α(2, 3)糖鎖親和性アフィニティー物質の存在下でキャピラリー電気泳動を実施することにより分離し、[標識抗遊離型PSA抗体−α(2, 3)糖鎖遊離型PSA]（第１複合体）由来の標識物質の量、及び[標識抗遊離型PSA抗体−α(2, 3)糖鎖遊離型PSA以外の遊離型PSA]（第２複合体）由来の標識物質の量を測定する。試料中の遊離型PSA量は、第１複合体と第２複合体の標識物質の量の和とする。そして、得られた遊離型PSA量とα(2, 3)糖鎖遊離型PSA量との比率を求める。
【０２２３】
第１複合体由来の標識物質の量及び第２複合体由来の標識物質の量は、キャピラリー電気泳動で得られたそれぞれのピーク面積値に対応するので、それぞれのピーク面積値を使用して、該比率を求めればよい。
【０２２４】
上記の方法に用いられる抗遊離型PSA抗体及びその標識物質の具体例は、上記した通りである。
【０２２５】
試料と標識抗遊離型PSA抗体とを反応させる際の溶媒としては、例えば緩衝液が挙げられる。そのために用いられる緩衝液としては、通常この分野で使用されるものであれば特に限定されないが、通常pH 5.0〜10.0、好ましくはpH 6.5〜8.5の中性付近に緩衝作用を有するものが挙げられる。具体的には、例えばTris-HCl緩衝液、MES緩衝液、HEPES緩衝液、ホウ酸緩衝液、リン酸緩衝液、ベロナール緩衝液、グッド緩衝液等が挙げられる。また、これらの緩衝液の緩衝剤濃度としては、通常5〜1000 mM、好ましくは5〜300 mMの範囲から適宜選択される。
【０２２６】
該緩衝液には、更に増感剤、界面活性剤、防腐剤（例えばアジ化ナトリウム、サリチル酸、安息香酸等）、安定化剤（例えばアルブミン、グロブリン、水溶性ゼラチン、界面活性剤、糖類等）、賦活剤その他この分野で用いられているものであって、共存する試薬との安定性を阻害したり、抗原抗体反応を阻害しないものを有していてもよい。またこれら試薬類等の濃度範囲等も、自体公知の該測定方法において通常用いられる濃度範囲等を適宜選択して用いればよい。
【０２２７】
キャピラリー電気泳動装置専用の市販のキットを用いる場合は、該キットに添付の緩衝液を用いてもよい。
【０２２８】
標識抗遊離型PSA抗体を含有する溶液中の該抗体の濃度は、試料と標識抗遊離型PSA抗体を含有する溶液を混合したときに目的の濃度範囲内になるような濃度であればよい。例えば0.1〜200μM、好ましくは0.5〜50μM、より好ましくは0.5〜20μM、更に好ましくは0.5〜10μMであればよい。すなわち、下限値は0.1μM、好ましくは0.5μMである。またその上限値は200μM、好ましくは50μM、より好ましくは20μM、更に好ましくは10μMである。
【０２２９】
試料と本発明に係る標識抗遊離型PSA抗体を接触・反応させる際の本発明に係る標識抗遊離型PSA抗体の反応液中の濃度は、試料中のPSAの濃度により異なり、特に限定されないが、通常0.1〜1000nM、好ましくは0.1〜500nM、より好ましくは0.5〜200nMである。すなわち、下限値は0.1nM、好ましくは0.5nMである。またその上限値は1000nM、好ましくは500nM、より好ましくは200nMである。
【０２３０】
また、試料と本発明に係る標識抗遊離型PSA抗体の反応時のpHとしては、抗原抗体反応を抑制しない範囲であれば特に限定されず、通常6.0〜10.0、好ましくは6.0〜8.0の範囲が挙げられ、反応時の温度も抗原抗体反応を抑制しない範囲であれば特に限定されず、通常10〜50℃、好ましくは20〜40℃の範囲が挙げられる。また、その反応時間は、用いられる本発明に係る抗体並びにpH及び温度等の反応条件により異なるので、各々に応じて１〜60分、好ましくは1〜15分程度で反応させればよい。
【０２３１】
反応後、得られた反応液中の第１複合体と第２複合体とを、α(2, 3)糖鎖親和性アフィニティー物質の存在下でキャピラリー電気泳動を実施することにより分離し、第１複合体と第２複合体の量を測定する。
【０２３２】
本発明においては、キャピラリー電気泳動の中でも、キャピラリーチップ又はマイクロキャピラリーチップで行われる電気泳動を実施することが好ましい。マイクロチップキャピラリー電気泳動とは、チップ基板上に断面の直径100μm以下のキャピラリーを形成させ、このキャピラリー中で電気泳動を行なう技術であり、キャピラリー内に電圧をかけることによってサンプル内に存在する物質の電荷の差をその移動度の差として分離する方法である。
【０２３３】
キャピラリー電気泳動は、用いられる泳動溶液により、キャピラリーゾーン電気泳動やキャピラリーゲル電気泳動に分類されるが、本発明の方法は何れにも適用し得る。分離の精度を考慮すると、上記の中でもキャピラリーゲル電気泳動が好ましい。
【０２３４】
キャピラリー電気泳動で用いられる泳動溶液としては、通常この分野で用いられているものであればよく、特に限定されない
【０２３５】
α(2, 3)糖鎖親和性アフィニティー物質は、泳動溶液に含有させればよい。但し、キャピラリー電気泳動により分離する間、α(2, 3)糖鎖親和性アフィニティー物質はα(2, 3)糖鎖遊離型PSAと該α(2, 3)糖鎖親和性アフィニティー物質とが完全に結合することができる量よりも高濃度であることが望ましい。
【０２３６】
例えば、α(2, 3)糖鎖親和性アフィニティー物質がレクチンの場合、0.1 mg/mL〜20 mg/mL、好ましくは1.0mg/mL〜10mg/mL、更に好ましくは2.0mg/mL〜5.0mg/mLである。α(2, 3)糖鎖親和性アフィニティー物質が抗体の場合、0.01 mg/mL〜20 mg/mL、好ましくは0.05mg/mL〜10mg/mL、更に好ましくは0.1mg/mL〜5.0mg/mLである。
【０２３７】
α(2, 3)糖鎖親和性アフィニティー物質のマイクロ流路内での濃度は、0.1 mg/mL〜20 mg/mLであればよい。
【０２３８】
キャピラリー電気泳動によって複合体を分離する場合、α(2, 3)糖鎖親和性アフィニティー物質としてレクチンを用いる場合でも抗体を用いる場合でも、抗PSA抗体、α(2, 3)糖鎖親和性アフィニティー物質としての抗体等の測定系に使用するいずれかの抗体は、陰イオン性物質等の荷電キャリヤー分子で標識されていることが好ましい。具体的には、例えば核酸鎖で標識されていることが好ましい。この場合、抗体は荷電キャリヤー分子と上記した検出に係る標識物質の両方で標識されていてもよい。また、例えば検出に係る標識物質で標識された抗遊離型PSA抗体と荷電キャリヤー分子で標識された抗PSA抗体を用いてもよい。
【０２３９】
このような目的に使用される核酸鎖の種類、長さ、及び
核酸鎖と抗体を結合させる方法としては、例えば特許第4214779号、特許第4862093号等に開示された公知の方法が挙げられる。
【０２４０】
また、核酸鎖に予め反応性官能基を導入した後、特許第４２１４７７９号に記載の方法により本発明に係る抗体と反応性官能基導入核酸鎖を結合させてもよい。核酸鎖へ反応性官能基を導入する方法としては、自体公知の方法が挙げられる。
【０２４１】
また、核酸鎖と抗体を結合させる方法として、例えば、5'末端に反応性官能基を導入したPCRプライマーを用いてPCRを行い、PCR産物として5'末端に反応性官能基が導入された核酸鎖を得る方法（モレキュラー クローニング ア ラボラトリー マニュアル セカンド エディション、J. サムブルック, E. F. フリッシュ, T. マニアティス、コールド スプリング ハーバー ラボラトリー プレス等）等により核酸末端へ反応性官能基を導入することができる。
【０２４２】
キャピラリー電気泳動に供せられる試料や抗体等を溶解させる溶液、泳動溶液の種類、添加剤、キャピラリー電気泳動の具体的な条件は、自体公知の方法に準ずればよい。例えばキャピラリー電気泳動を用いる場合には、Ｊ.Chromatogr. 593 253−258 （1992）、Anal.Chem. 64 1926−1932 （1992）、WO2007/027495、特許第4214779号等に記載の方法に準じて行えばよい。
【０２４３】
キャピラリー電気泳動を自動分析装置で行う場合は、該装置に添付の取扱説明書に記載の条件で、該取扱説明書に記載の方法に従って、キャピラリー電気泳動を実施すればよい。
【０２４４】
キャピラリー電気泳動によるα(2, 3)糖鎖遊離型PSAの測定方法の具体例として、α(2, 3)糖鎖親和性アフィニティー物質としてMAAを用い、抗遊離型PSA抗体を蛍光物質で標識した標識第１抗体を用い、抗PSA抗体をDNAで標識した第２抗体を用いて、レクチン親和性を利用したマイクロチップキャピラリー電気泳動を行い、PSAの糖鎖に対するレクチンの親和性の程度に基づいてPSAを分離し、蛍光検出器で測定する方法を以下に示す。
【０２４５】
すなわち、PSAを含有する試料１〜50μLと、通常0.001〜10μM、好ましくは0.01〜1μMの蛍光標識抗遊離型PSA抗体を含有する試液とを反応させる。
【０２４６】
キャピラリー電気泳動に用いられる試料は、生体から採取した試料であってもよいし、生体から採取した試料を脱塩や各種の精製工程を得て調製した試料であってもよい。
【０２４７】
得られた反応液と、通常0.001〜10μM、好ましくは0.01〜1μMのDNA標識抗PSA抗体を含有する試液2〜50μLと、泳動用緩衝液と、内部標準物質（例えば蛍光物質：HiLyte647（AnaSpec社製）等）を、1〜10psiで30〜60秒の加圧法により、例えば、内径5〜500μm、好ましくは50〜200μm、より好ましくは50〜100μm、長さ１〜10cmのキャピラリーに導入する。20〜40℃保温下に5秒〜30分、好ましくは10秒〜15分反応させる。得られた[蛍光標識抗遊離型PSA抗体−α(2, 3)糖鎖遊離型PSA−DNA標識抗PSA抗体]の複合体と[蛍光標識抗遊離型PSA抗体−α(2, 3)糖鎖遊離型PSA以外の遊離型PSA−DNA標識抗PSA抗体]の複合体とを、MAA（0.1 mg/mL〜20 mg/mL）の存在下に1000〜5000Vの電圧を10秒〜60分印加することにより電気泳動を行って、分離する。そして、複合体の泳動状態を蛍光検出器やUV検出器等の検出器により測定してエレクトロフェログラムを得る。
【０２４８】
α(2, 3)糖鎖遊離型PSAのピーク（［蛍光標識抗遊離型PSA抗体］−［α(2, 3)糖鎖遊離型PSA］−［DNA標識抗PSA抗体］の複合体を含む）と、その他の遊離型PSAのピーク（［蛍光標識抗遊離型PSA抗体］−［α(2, 3)糖鎖遊離型PSA以外の遊離型PSA］−［DNA標識抗PSA抗体］の複合体を含む）は、その泳動位置から区別することができる。そこで、試料中のα(2, 3)糖鎖遊離型PSA量はそのピークのピーク面積とする。また、得られたα(2, 3)糖鎖遊離型PSAのピーク面積と、α(2, 3)糖鎖遊離型PSA以外の遊離型PSAのピーク面積の和を遊離PSA量とする。
【０２４９】
以上のように、キャピラリー電気泳動を用いれば、遊離型PSA量とα(2, 3)糖鎖遊離型PSA量とを、同一検体で一度に測定することができる。
【０２５０】
比率１は、得られたピーク面積の比率、すなわち
・［α(2, 3)糖鎖遊離型PSA画分のピーク面積／（α(2, 3)糖鎖遊離型PSA画分のピーク面積＋α(2, 3)糖鎖遊離型PSA以外の遊離型PSA画分のピーク面積）］、又は
・［（α(2, 3)糖鎖遊離型PSA画分のピーク面積＋α(2, 3)糖鎖遊離型PSA以外の遊離型PSA画分のピーク面積）／α(2, 3)糖鎖遊離型PSA画分のピーク面積］
を求めることにより得られる。
【０２５１】
［α(2, 3)糖鎖遊離型PSA画分のピーク面積／（α(2, 3)糖鎖遊離型PSA画分のピーク面積＋α(2, 3)糖鎖遊離型PSA以外の遊離型PSA画分のピーク面積）］を、比率１として用いることがより好ましい。
【０２５２】
キャピラリー電気泳動は、市販の全自動測定装置を用いて行ってもよい。例えばミュータスワコーi30（和光純薬工業(株)製）等が挙げられる。
【０２５３】
・表面プラズモン共鳴法
表面プラズモン共鳴法は、表面プラズモンが金属／液体界面で励起した場合に起こる、いわゆる表面プラズモン共鳴（Surface Plasmon Resonance ＝ SPR）の光学現象を利用して生体分子間の相互作用を解析する分子間相互作用解析システムである。表面プラズモン共鳴法は、表面プラズモン共鳴分光装置を用いて、2分子間の結合と解離にともなってセンサーチップ表面で生じる微量な質量変化をSPR シグナルとして検出する。生体分子間の相互作用をリアルタイムにモニターするので、生体分子間の結合・解離が早い・遅いというカイネティクス情報が得られる。
【０２５４】
表面プラズモン共鳴法の代表的な分析システムとして、ビアコアＴＭ法がある。ビアコア法は、一般には単にビアコア（Biacore）と呼ばれる。また、「ビアコア」といった場合、ビアコアの分析システムに用いられるビアコア機器を指すこともある。
【０２５５】
表面プラズモン共鳴法での測定は、添付の使用説明書に従って、その測定にとって至適な条件で行えばよい。
【０２５６】
表面プラズモン共鳴法により比率１を決定する方法としては、例えば以下の方法が挙げられる。
【０２５７】
すなわち、センサーチップの表面に抗遊離型PSA抗体を固定化する。検出光をセンサーチップの裏側からセンサーチップの金薄膜とガラスの境界面で全反射するように当てると、反射光の一部に反射強度が低下した部分があらわれる。この光の暗い部分が現れる角度はセンサーチップ表面の溶媒の屈折率に依存する。次に試料を表面プラズモン共鳴分光装置の流路からセンサーチップの表面に流す。金薄膜表面に固定化した抗遊離型PSA抗体と流路を流れてきた試料に含まれるPSA分子とが結合すると、金薄膜表面に固定化した分子の質量が増加し、溶媒の屈折率が変化する。このとき、反射光の暗い部分は質量の変化に応じて位置がシフトする。逆に分子同士が解離すると、暗い部分の位置がシフトした位置から戻る。そのシフトする角度はセンサーチップの表面の質量変化を表す。表面プラズモン共鳴法ではこの角度変化から、分子間の結合・解離をモニターする。得られた結果を基に、まず試料中の遊離型PSA量を測定することができる。
【０２５８】
次いで、α(2, 3)糖鎖親和性アフィニティー物質を含有する溶液を表面プラズモン共鳴分光装置の流路からセンサーチップの表面に流す。金薄膜表面に生成した複合体である［抗PSA遊離型抗体−遊離型PSA］のPSAと流路を流れてきたα(2, 3)糖鎖親和性アフィニティー物質が結合すると、同様に溶媒の屈折率が変化するので、同様に分子間の結合・解離をモニターする。得られた結果を基に、試料中のα(2, 3)糖鎖遊離型PSA量を測定することができる。
【０２５９】
得られた試料中の遊離型PSA量とα(2, 3)糖鎖遊離型PSA量との比率（比率１）を決定する。
【０２６０】
［α(2, 3)糖鎖遊離型PSA量／遊離型PSA量］を比率１として用いることがより好ましい。
【０２６１】
表面プラズモン共鳴法により比率１を決定する別の方法としては、例えば以下の方法が挙げられる。
【０２６２】
すなわち、α(2, 3)糖鎖遊離型PSA標準を用いて予め作製した、遊離型PSA量に対するα(2, 3)糖鎖遊離型PSA量の比率がわかっている基準液１種以上を用いて表面プラズモン共鳴法による測定を行い、それぞれのセンサーグラムを得る。次いで、被検試料を用いて同様に測定を行い、センサーグラムを得る。基準液を用いて得られたセンサーグラムと被検試料を用いて得られたセンサーグラムを比較することにより、被検試料の遊離型PSA量とα(2, 3)糖鎖遊離型PSA量との比率（比率１）を決定する。
【０２６３】
［α(2, 3)糖鎖遊離型PSA量/遊離型PSA量］を比率１とすることが好ましい。
【０２６４】
上記方法において用いられる基準液は、遊離型PSA量に対するα(2, 3)糖鎖遊離型PSA量の比率が、続いて行う前立腺癌の判定を行う際に指標となるような数値のものを用いる。例えば、該比率が25%、45%、50%の基準液を用いればよい。
【０２６５】
該基準液の作成方法としては、例えば以下の方法が挙げられる。
【０２６６】
すなわち、α(2, 3)糖鎖遊離型PSA標準とα(2, 6)糖鎖遊離型PSA標準を、それぞれ適当な緩衝液に溶解し、各溶液の蛋白質量が同じになるように調整する。次いで、α(2, 6)糖鎖遊離型PSA標準溶液でα(2, 3)糖鎖遊離型PSA標準溶液を希釈して、目的の比率となるように調整することにより、基準液を得ることができる。
【０２６７】
α(2, 3)糖鎖遊離型PSA標準とα(2, 6)糖鎖遊離型PSA標準の作製方法の詳細は、上記（１）−２−１の項において説明した通りである。
【０２６８】
・レクチンマイクロアレイ法
産業技術総合研究所糖鎖医工学研究センター等の開発したレクチンマイクロアレイ法も、本発明に用いることができる。
【０２６９】
レクチンマイクロアレイとは、糖鎖に対する特異性の異なる数十種のレクチンをスライドガラス上にスポット状に並べて固定化したアレイである。また、エバネッセント場とは微弱な光が基板（スライドガラス）界面からしみ出る状態のことをいう。蛍光標識した糖タンパク質とレクチンマイクロアレイとを相互作用させた後、スライドガラスに励起光を照射してエバネッセント場を発生させる。励起光が届くのは界面から100nm〜200nm程度であり、レクチンと結合した糖鎖が存在するのも界面から100nm〜200nmなので、レクチンマイクロアレイに結合した糖鎖だけを発光できる。この技術により、洗浄操作を行うことなく、レクチンマイクロアレイの蛍光を検出できる。糖タンパク質を蛍光標識せずにレクチンマイクロアレイと相互作用させた後、糖タンパク質のコアタンパク質に対する抗体を蛍光標識した蛍光抗体と反応させた後、上記と同様の方法で蛍光を検出してもよい。
【０２７０】
レクチンマイクロアレイによる測定は、例えばMICROARRAY METHODS AND PROTOCOLS（CRC Press）, edited by Robert S. Matson, “Chapter 9：Lectin Microarrays”, Masao Yamada, p.141, 2009に記載のプロトコルに従って実施すればよい。
【０２７１】
レクチンマイクロアレイ法によりα(2, 3)糖鎖遊離型PSA量を求め、遊離型PSA量とα(2, 3)糖鎖遊離型PSA量との比率（比率１）を決定する方法としては、例えば以下の方法が挙げられる。
【０２７２】
本発明に係るα(2, 3)糖鎖親和性アフィニティー物質であるレクチンと、α(2, 3)糖鎖以外の、PSAの糖鎖に親和性を有する複数のレクチンを固定化したマイクロアレイを作製する。目的のマイクロアレイは、例えばKuno A. et al., Nat Methods. 2005 Nov, vol.2, No.11, pp.851-856に記載の方法に順じて作製すればよい。あるいは、市販のマイクロアレイ（LecChipTM(株)グライコテクニカ製)等を使用してもよい。
【０２７３】
必要に応じ前処理した試料と蛍光標識抗遊離型PSA抗体をマイクロアレイに滴下して反応させて、マイクロアレイ上に[蛍光標識抗遊離型PSA抗体−α(2, 3)糖鎖遊離型PSA−レクチン]の複合体を形成させる。次いで、蛍光標識抗遊離型PSA抗体由来の蛍光をエバネッセント波励起蛍光型スキャナーを用いて測定する。濃度既知のα(2, 3)糖鎖遊離型PSA標準を用いて同様に測定を行い、得られた測定値をもとに定量値換算することによって、試料中のα(2, 3)糖鎖遊離型PSA量を求める。
【０２７４】
別途求めた遊離型PSAの量と、マイクロアレイ法で測定したα(2, 3)糖鎖遊離型PSA量との比率（比率１）を決定する。
【０２７５】
［α(2, 3)糖鎖遊離型PSA量/遊離型PSA量］を比率１とすることが好ましい。
【０２７６】
遊離型PSAの量の測定方法は、上記した「（１）遊離型PSA量を測定する方法」に記載した通りである。
【０２７７】
・免疫学的測定法
通常の免疫学的測定法によりα(2, 3)糖鎖遊離型PSA量を求め、遊離型PSA量とα(2, 3)糖鎖遊離型PSA量との比率（比率１）を決定する方法としては、例えば以下の［方法ａ］及び［方法ｂ］が挙げられる。
【０２７８】
［方法ａ］
α(2, 3)糖鎖親和性アフィニティー物質を固相に固定化する。試料を該固相と接触させ、反応させる。固相を洗浄処理した後、抗遊離型PSA抗体を検出可能な標識物質で標識した標識抗遊離型PSA抗体を、固相と接触させ、反応させて、固相上にα(2, 3)糖鎖親和性アフィニティー物質とα(2, 3)糖鎖遊離型PSAと標識抗遊離型PSA抗体との複合体を生成させる。未反応の標識抗遊離型PSA抗体を洗浄等により除去した後、標識抗遊離型PSA抗体の標識物質に応じた測定方法で標識物質の量を測定する。得られた測定結果をもとに、予め濃度既知のα(2, 3)糖鎖遊離型PSA標準を用いて測定を行って得られた結果を用いた常法による定量値換算を行い、α(2, 3)糖鎖遊離型PSA量を求める。別途上記した試料中の遊離型PSA量を測定する方法で、同じ試料中の遊離型PSA量を求める。得られた遊離型PSA量とα(2, 3)糖鎖遊離型PSA量との比率（比率１）を求める。
【０２７９】
［α(2, 3)糖鎖遊離型PSA量／遊離型PSA量］を比率１とすることが好ましい。
［方法ｂ］
抗遊離型PSA抗体を固相に固定化する。試料を、該固相と接触させ、反応させる。固相を洗浄処理した後、α(2, 3)糖鎖親和性アフィニティー物質を検出可能な標識物質で標識した標識α(2, 3)糖鎖親和性アフィニティー物質を、固相と接触させ、反応させて、固相上に抗遊離型PSA抗体とα(2, 3)糖鎖遊離型PSAと標識α(2, 3)糖鎖親和性アフィニティー物質との複合体を生成させる。未反応の標識α(2, 3)糖鎖親和性アフィニティー物質を洗浄等により除去した後、標識α(2, 3)糖鎖親和性アフィニティー物質の標識物質に応じた方法で標識物質を測定する。得られた測定結果をもとに、予め濃度既知のα(2, 3)糖鎖遊離型PSA標準を用いて測定を行って得られた結果を用いた常法による定量値換算を行い、α(2, 3)糖鎖遊離型PSA量を求める。別途上記した試料中の遊離型PSA量を測定する方法で、同じ試料中の遊離型PSA量を求める。得られた遊離型PSA量とα(2, 3)糖鎖遊離型PSA量との比率（比率１）を求める。
【０２８０】
［α(2, 3)糖鎖遊離型PSA量／遊離型PSA量］を比率１とすることが好ましい。
【０２８１】
上記の免疫学的測定法において、固相として用いられる不溶性担体及び遊離型PSA抗体、該抗体の該不溶性担体への固定化方法の例としては、上記「（１）−１．試料中の遊離型PSA量を直接測定する方法」の項に記載されたそれらと同じものが挙げられる。また、測定に用いられる各種試薬類の種類及び使用濃度、測定を実施するに際しての測定条件等（反応温度、反応時間、反応時のｐＨ，測定波長、測定装置等）は、すべて自体公知の免疫学的測定法等の測定操作に準じて設定すれば良い。
【０２８２】
上記方法において、標識物質、固相、抗遊離型PSA抗体、標識物質の測定方法、測定条件その他の詳細は、前述と同じである。
【０２８３】
・質量分析法
なお、本発明に係る比率１を求める更に別の方法として、α(2, 3)糖鎖親和性アフィニティー物質を用いずにα(2, 3)糖鎖遊離型PSA量を測定する方法を用いた方法が挙げられる。例えば、多段階タンデム質量分析装置や高速液体クロマトグラフ質量分析計を用いた質量分析方法が挙げられる。
【０２８４】
質量分析法により比率１を求める方法の一例を以下に示す。
【０２８５】
まず、抗遊離型PSA抗体を固定化した固相を用い、常法により試料中の遊離型PSAを単離する。次いで、例えば高速液体クロマトグラフ質量分析計等を用いて、単離した遊離型PSAの糖鎖構造を解析する。この方法により、α(2, 3)糖鎖親和性アフィニティー物質を用いずに、試料中のα(2, 3)糖鎖遊離型PSA量及びα(2, 3)糖鎖遊離型PSA以外の遊離型PSA量を測定することができる。得られた測定値をもとに、α(2, 3)糖鎖遊離型PSA量と［α(2, 3)糖鎖遊離型PSA量とα(2, 3)糖鎖遊離型PSA以外の遊離型PSA量］との比率（比率１）を求める。［α(2, 3)糖鎖遊離型PSA量／（α(2, 3)糖鎖遊離型PSA量＋(2, 3)糖鎖遊離型PSA以外の遊離型PSA量）］を比率１とすることが好ましい。
【０２８６】
＜３．前立腺の体積の測定方法＞
前立腺体積（prostate volume：PV）は、通常の超音波検査、磁気共鳴画像（Magnetic Resonance Imaging、MRI）検査等の、非侵襲的方法により測定することができる。超音波検査により行うのが好ましい。
超音波検査の方法は何等限定されない。通常超音波を発信する装置を、下腹部からあてる、あるいは肛門から挿入する、いずれかの方法で行われればよい。
【０２８７】
超音波を発信する装置としては、通常臨床の現場で用いられている汎用超音波画像診断装置等の超音波診断装置等が挙げられるが、これに限定されない。
【０２８８】
前立腺体積は、当業者に周知の従来方法（式  Ｈ×Ｗ×Ｌ×０．５２を用いたＴＲＵＳ検査等）を含む、前立腺の体積を測定する任意の方法によって測定すればよい。例えば超音波検査により、前立腺を描出して、前立腺の大きさ（体積）を計測する。通常は、前立腺の体積は、超音波画像診断装置に付属の診断ソフトにより自動計算される。
【０２８９】
＜４．比率２を決定する方法＞
本発明に係る比率２とは、上記「２．比率１を決定する方法」の項に記載された方法で得られた比率１と、比率１を求めるために使用した試料を採取した被検者と同じ被検者の前立腺の体積との比率である。
【０２９０】
すなわち、比率２とは、以下の４通りの場合が挙げられる.
(i)［α(2, 3)糖鎖遊離型PSA量／遊離型PSA量］／［前立腺の体積］、
(ii)［遊離型PSA量／α(2, 3)糖鎖遊離型PSA量］／［前立腺の体積］、
(iii)［前立腺の体積］／［α(2, 3)糖鎖遊離型PSA量／遊離型PSA量］、
(iv)［前立腺の体積］／［遊離型PSA量／α(2, 3)糖鎖遊離型PSA量］。
【０２９１】
以上の中でも、(i)により求めた比率２が特に好ましい、
【０２９２】
比率１及び比率２が下記の場合の比率２（上記(i)の場合）を決定する方法の一例を説明する。
比率１＝［α(2, 3)糖鎖遊離型PSA量／遊離型PSA量］
比率２＝［比率１／前立腺の体積］
【０２９３】
比率１が40%で、前立腺の体積が50 cm3の場合、比率２は、
比率２＝［α(2, 3)糖鎖遊離型PSA量／遊離型PSA量］／［比前立腺の体積］
＝0.80 
となる。
【０２９４】
＜５．前立腺癌を判定する方法＞
本発明の前立腺癌を判定する方法は、「被検者由来試料中の遊離型PSA量とα(2, 3)糖鎖遊離型PSA量との比率１を決定し、該比率１と当該被検者の前立腺の体積との比率２を決定し、得られた比率２を基に前立腺癌を判定する方法。」である。
【０２９５】
すなわち、上記「４．比率２を決定する方法」の項に記載の方法により比率２を決定する。その結果をもとに、比率２を指標として前立腺癌を判定するための、データ（例えば比率２の値、比率２の値とカットオフ値との比較、比率２の増加の程度等の情報）を得る。
【０２９６】
得られたデータを用いて、前立腺癌の判定（診断・検査）を行う。
以下に、比率２として上記（i）［α(2, 3)糖鎖遊離型PSA量／遊離型PSA量］／［前立腺の体積］を用いた場合の判定方法を例にとって説明する。
【０２９７】
被検者由来試料を用いて得られた該比率２が、予め定めたカットオフ値（基準値）と同値又はそれより高い場合には、試料を提供した被検者は前立腺癌に罹患している（前立腺癌陽性）、またはその可能性が高い、等の判定が可能である。比率２がカットオフ値未満の場合には、被検者は前立腺癌に罹患していない（前立腺癌陰性）又はその可能性が低い、等の判定が可能である。
【０２９８】
また、当該比率２のカットオフ値又はその値の範囲に対応させて複数の判定区分を設定して判定する方法が挙げられる。例えば、［（１）前立腺のおそれはない、（２）前立腺のおそれは低い、（３）前立腺の兆候がある、（４）前立腺のおそれが高い、等］の判定区分を設定する。そして、被検者由来試料の比率２の値がどの判定区分に入るかを判定することにより、前立腺癌の判定を行うことが可能である。
【０２９９】
また、同一被験者において、ある時点で決定した被験者由来試料の比率２の値と、異なる時点で決定した当該比率２の値とを比較し、当該比率２の値の増減の有無及び／又は増減の程度を評価することによって、前立腺癌の進行度や悪性度の診断、あるいは術後の予後診断が可能である。
すなわち、当該比率２の値の増加が認められたという検査結果が得られた場合には、前立腺癌へ病態が進行した（あるいは前立腺癌の悪性度が増した）、又は前立腺癌への病態の進行の兆候が認められる（あるいは前立腺癌の悪性度が増す兆候が認められる）との判定が行える。
また、当該比率２の変動が認められないという検査結果が得られた場合には、前立腺癌の病態に変化はないとの判定が可能である。
更にまた、当該比率２の減少が認められたという検査結果が得られた場合には、前立腺癌の病態が改善されたとの判定が可能である。
【０３００】
上記カットオフ値（基準値）は、前立腺癌患者由来試料と、非癌者由来試料を用いて、上記測定方法により、比率２を求める。そして、前立腺癌者における比率２と非癌者における比率２の値の境界値等を元に設定されればよい。非癌者の比率２の平均値をカットオフ値と設定してもよい。
【０３０１】
なお、本発明において「非癌者」とは、前立腺癌でないことが確認された「非前立腺癌者」を意味する。「非癌者」は健常者でもよく、前立腺肥大等の患者であってもよい。    
【０３０２】
また、カットオフ値は、例えば常法により、Relative Operating Characteristic curve（ROC曲線）を用いた解析により求めてもよい。
【０３０３】
カットオフ値をROC曲線を用いた解析により求める方法の一例としては、例えば以下の方法が挙げられる。
【０３０４】
まず、得られた比率２をもとに、常法によりROC曲線を作成する。
次に、常法通り、ROC曲線に接する45度の角度をもつ直線を引き、その直線との交点すなわち「感度 % −（100−特異度 %）」（「Sensitivity % - (100-Specificity %)」）が最大となる値を求める。その値をカットオフ値とすればよい。
【０３０５】
比率２として上記（i）［α(2, 3)糖鎖遊離型PSA量／遊離型PSA量］／［前立腺の体積］を用いて本発明の前立腺癌を判定する場合の具体例を以下に示す。
【０３０６】
［例１］
（１）非癌者由来試料を用いて比率２を決定する。
（２）被検者由来試料を用いて比率２´を決定する。
（３）該比率２´を該比率２と比較し、該比率２´が該比率２と同じ又はそれより高い場合に、試料を提供した被検者は前立腺癌に罹患している（前立腺癌陽性）、またはその可能性が高いと判定する。
【０３０７】
［例２］
（１）非癌者由来試料中を用いて比率２を決定し、該比率２に基づいて前立腺癌を判定するための、該比率２のカットオフ値を設定する。
（２）被検者由来試料中を用いて比率２を決定する。
（３）該比率２を上記(1)で設定したカットオフ値と比較し、該比率２が該カットオフ値と同じかそれより高い場合に、試料を提供した被検者は前立腺癌に罹患している（前立腺癌陽性）、またはその可能性が高いと判定する。
なお、適切なカットオフ値を定めれば、被検者の判定の度に改めてカットオフ値を設定する必要はない。
【０３０８】
本発明の前立腺癌を判定する方法により被検者である患者が前立腺癌に罹患していると判定された場合には、その後、当該被検者に対して前立腺癌の適切な治療を施すことができる。
【０３０９】
また、本発明の前立腺癌を判定する方法により被検者である患者が前立腺癌に罹患している可能性がある、又はその可能性が高いと判定された場合には、組織検査（生検）を行うことを選択することができる。また、前立腺癌に罹患していない又はその可能性が低いと判定された場合には、生検を行わず、必要に応じて経過観察を行うという治療方針を選択することができる。
【０３１０】
＜６．生検回避率について＞
不要な生検を回避できる確率は「生検回避率」で示される。「生検回避率」とは、「診断感度90%を維持した状態での特異度」のことをいう。
【０３１１】
例えばカットオフ値0.8で生検回避率が55%である場合とは、カットオフ値が0.8以下を示す症例において、生検を実施することなく陰性として診断（確定）できる割合が55%であることを示唆するものである。言い換えれば、カットオフ値 0.8で前立腺癌を判定する方法は、前立腺癌の診断感度が90%となる水準を前提として、前立腺癌ではない被検者に対して、不要な生検の実施を55%回避できる、ということを意味する。
【０３１２】
従来のトータルPSA値を指標とする前立腺癌の方法等は、特異度が著しく不足していた。そのため、生検所見が陰性であった患者でも、前立腺癌の可能性を排除するために繰り返し生検を受ける必要があった。その結果、生検には感染等の危険性があるにも関わらず、不必要な生検が多数行われているという問題点があった。
【０３１３】
これに対し、本発明の前立腺癌を判定する方法は、高い特異度及び高い感度で、且つ非侵襲的手段によって、前立腺癌を判定することができる。
【０３１４】
また、高い生検回避率で前立腺癌を判定できるので、生検が必要な被検者の数を減らすことができる。言い換えれば、本発明の前立腺癌を判定する方法による判定を行えば、前立腺癌ではない被検者に対する不要な生検を回避することができる。
【０３１５】
また、前立腺癌には良性前立腺癌と悪性前立腺癌があり、良性前立腺癌の場合にはその進行が遅いことから、手術等の侵襲性の治療はせずに経過観察する選択肢もある。一方、悪性前立腺癌は急速に進行するので、早い段階で前立腺癌を発見し、且つその悪性度を判別する必要がある。また、前立腺癌の悪性度を判定できれば、前立腺癌の治療方針を設定する上で重要な指針となる。
【０３１６】
前立腺癌の悪性度に関わる前立腺癌再発の可能性、生命予後などを推測し評価する方法として、ダミコ（D'Amico）分類が用いられている。前立腺癌患者を本発明の前立腺癌を判定する方法とダミコ分類による分類を行って比較した結果、本発明に係る比率２の値が低い患者は、ダミコ分類で低リスク群に分類される傾向があった。また比率２の値が高い患者は、ダミコ分類で高リスク群に分類される傾向があった。このことから、本発明の方法による前立腺癌を判定した結果は、ダミコ分類による分類と関係性があることが示唆された。
【０３１７】
《前立腺癌判定用キット》
本発明に係る前立腺癌判定用キットは、
「（１）α(2, 3)糖鎖親和性アフィニティ−物質と、
（２）被検者由来試料中の遊離型前立腺特異抗原量とα(2, 3)糖鎖遊離型PSA量との比率１を決定し、該比率１と当該被検者の前立腺の体積との比率２を決定し、得られた比率２を基に前立腺癌を判定する判定手順が記載された取扱説明書と
を含む、前立腺癌判定用キット。」
である。
【０３１８】
α(2, 3)糖鎖親和性アフィニティー物質及びその好ましい態様と具体例等の詳細は、上記の（１）−２の「α(2, 3)糖鎖親和性アフィニティー物質」の項に記載した通りである。
α(2, 3)糖鎖親和性アフィニティー物質は、適当な緩衝液中に懸濁させた懸濁液等の溶液状態の試液での形態であってもよく、若しくは凍結品や凍結乾燥品であってもよい。
【０３１９】
該キットは、更に本発明に係る抗PSA抗体（遊離型PSAと結合型PSAに結合できる抗体又は／及び抗遊離型PSA抗体）を含んでいてもよい。その好ましい態様と具体例等の詳細は、上記の「２．比率１を決定する方法」の本発明に係るPSA抗体に関する説明に記載した通りである。
【０３２０】
本発明に係る抗PSA抗体は、適当な緩衝液中に懸濁させた懸濁液等の溶液状態の試液での形態であってもよく、若しくは凍結品や凍結乾燥品であってもよい。
α(2, 3)糖鎖親和性アフィニティー物質が試液の形態である場合、本発明に係る抗PSA抗体は、α(2, 3)糖鎖親和性アフィニティー物質を含有する試液中に共存させてもよいし、α(2, 3)糖鎖親和性アフィニティー物質とは別の試液、凍結品、又は凍結乾燥品として含んでいてもよい。
【０３２１】
α(2, 3)糖鎖親和性アフィニティー物質及び本発明に係る抗PSA抗体の該試液中の濃度は、各試液を混合した時点で目的の測定の反応が開始されるような濃度であればよい。具体的には、前記した「《前立腺癌を判定する方法》」の項に記載した通りである。また該試液を構成する溶媒の具体例も、前記した「《前立腺癌を判定する方法》」の項に記載した通りである。
【０３２２】
本発明のキットを構成するα(2, 3)糖鎖親和性アフィニティー物質又は／及び本発明に係る抗PSA抗体を含有する試液中には、通常この分野で用いられる添加剤、例えば試薬類、例えば緩衝剤、反応促進剤、糖類、タンパク質、塩類、界面活性剤等の安定化剤、防腐剤等であって、α(2, 3)糖鎖遊離型PSAとα(2, 3)糖鎖親和性アフィニティー物質との反応を阻害しないものが含まれていてもよい。またこれら試薬の濃度等も、通常この分野で通常用いられる濃度範囲から適宜選択すればよい。
【０３２３】
以下に実施例等を挙げて本発明を更に詳細に説明するが、本発明はこれにより何ら限定されるものではない。
【実施例】
【０３２４】
実施例１．前立腺癌患者及び前立腺肥大症患者由来試料を用いて得られた比率の比較【０３２５】
（１）患者の背景及び試料の採取
前立腺癌（PCa）であると診断された患者174名、及び非癌であり且つ前立腺肥大症（BPH）であると診断された患者94名から採取した血清を試料として用いた。各患者の前立腺の生検を行って、組織病理学的診断を行った。
患者の背景（年齢、トータルPSA値、病理組織学的悪性度分類（生検グリーソンスコア、術後グリーソンスコア等）を表１に示す。【０３２６】
【表１】
2019221279.tif 000004
PSAD: トータルPSA値／前立腺の体積
prostate biopsy GS: prostate biopsy Gleason score 
pathological GS: Gleason Score after PR【０３２７】
（２）前立腺の体積の測定
各患者の前立腺の体積を、超音波診断による測定で求めた。診断は汎用超音波画像診断装置 プロサウンドα７（日立アロカメディカル(株)）を用い、前立腺の体積（cm3）は、プロサウンドα４に付属のソフトによって求めた。【０３２８】
（３）トータルPSAの測定
体外診断用医薬品であるアーキテクトＴＭ トータルPSA・アボット（アボット・ジャパン(株)）を用いてキット添付のプロトコルに従って、各試料中のトータルPSA値を求めた。【０３２９】
（４）キャピラリー電気泳動
（i）DNA標識抗PSA抗体の調製
図２に示した手順に従って、DNAが結合したPSA抗体Fab’フラグメントを調製した。【０３３０】
すなわち、先ず、常法により５'末端にNH2基が導入された250bpのDNA断片を精製し（精製末端アミノ化DNA）、次いで、このDNA断片に導入されたNH2基とスルホサクシニミジル 4-（p-マレイミドフェニル）ブチレイト（Sulfo-SMPB）リンカー（スクシンイミド基とマレイミド基を有するリンカー、ピアス社製）のスクシンイミド基とを常法により反応させた後、ゲルろ過処理を行い、未反応リンカーを除去して、リンカーが結合した250bpDNA断片を得た。得られたリンカー結合250bpDNA断片と、予め抗ヒトPSAマウスモノクローナル抗体 PSA10（Anti PSAモノクローナル抗体 クローンNo. PSA10、和光純薬工業(株)製）を用いて常法に従い調製した抗PSA抗体PSA10 Fab'フラグメントとを反応させた。得られた反応物を、DEAEカラムを用いて精製し、250bpDNA断片が結合した抗PSA抗体PSA10 Fab'フラグメント（以下、「DNA標識抗PSA抗体」と略記する。）を調製した。【０３３１】
なお、用いた抗ヒトPSAマウスモノクローナル抗体（Anti PSAモノクローナル抗体 クローンNo.PSA10）は、ヒトPSAに対して親和性を有する抗体で、結合型PSAと遊離型PSAに結合する。すなわち該抗体は、α(2, 3)糖鎖遊離型PSAとα(2, 3)糖鎖遊離型PSA以外の遊離型PSAに結合する。【０３３２】
（ii）蛍光標識抗遊離型PSA抗体の調製        
Anti PSAモノクローナル抗体 PSA10とは異なるPSAのエピトープを認識し、遊離型PSAのみと特異的に結合する抗ヒトPSAモノクローナル抗体 PSA12（Anti PSAモノクローナル抗体 クローンNo. PSA12、和光純薬工業(株)製）を常法により処理して、抗PSA抗体PSA12 Fab'フラグメントを得た。得られたフラグメントのアミノ基に、常法により蛍光物質HiLyte647（AnaSpec社製）を導入して、HiLyte647標識抗遊離型PSA抗体PSA12 Fab'フラグメント（以下、「蛍光標識抗遊離型PSA抗体」と略記する。）を得た。【０３３３】
（iii）試料・試液の調製
・泳動用試料Ａの調製
試料２μL、上記(ii)で調製した1μM 蛍光標識抗遊離型PSA抗体を１μL、及び泳動緩衝液１[5％ (w/v) ポリエチレングリコール(PEG20000)、3％(w/v) グリセロール、150mM NaCl、0.01％ BSA、75mM Tris-HCl(pH 7.5)、10mM MESを含有する]７μLを0.5mLチューブに加えて混合して、10μLの反応液を調製した。
上記反応で得られた、[蛍光標識抗遊離型PSA抗体−遊離型PSA]複合体を含有する反応液（10μL）を、泳動用試料Ａとした。
なお、この反応液中の蛍光標識抗遊離型PSA抗体の最終濃度は、100nMである。【０３３４】
・泳動緩衝液２（MAA含有）の調製
4.5％ (w/v) ポリエチレングリコール(PEG8000)、3％(w/v) グリセロール、10mM NaCl、0.01 ％ BSAを含有する75mM Tris-HClバッファー(pH 7.5)を調製した。これにMAA（VECTOR社製）を終濃度4mg/mLとなるように添加・混合したものを調製し、泳動緩衝液２とした。
・泳動緩衝液３の調製
2％ (w/v) ポリエチレングリコール(PEG20000)、3％(w/v) グリセロール、0.01 ％ BSA、125mM HEPES、75mM Tris-HClを含有するバッファー(pH調製なし)を、泳動緩衝液３とした。
・泳動緩衝液４の調製
2％ (w/v) ポリエチレングリコール(PEG20000)、3％(w/v) グリセロール、0.01 ％ BSAを含有する75mM Tris-HClバッファー(pH 7.5)を、泳動緩衝液４とした。
・DNA標識抗体液（DNA標識抗PSA抗体含有）の調製
上記(i)１)で得られたDNA標識抗PSA抗体 100nMを含有するバッファー[2％ (w/v) ポリエチレングリコール(PEG20000)、0.5mM EDTA(2Na)、3％(w/v) グリセロール、50mM NaCl、0.01 ％ BSA、75mM BisTris(pH 6.0)を含有する。]を調製し、DNA標識抗体液とした。
・蛍光液の調製
30nM HiLyte647、20％(w/v) グリセロールを含有する50mM BisTris(pH 6.0)を、蛍光液とした。蛍光液は測定装置（ミュータスワコー i30）の検出部での位置確認等の調整のために用いられる。【０３３５】
（iv）電気泳動
全自動蛍光免疫測定装置ミュータスワコー i30（和光純薬工業（株）製）を用い、装置の取扱説明書に従い、以下に示した手順にてマイクロチップキャピラリー電気泳動を行った。
すなわち、上記(iii)で調製した泳動用試料Ａ 5.4μLを、ミュータスワコー i30専用マイクロチップの所定ウェル（SPウェル）に分注した。次いで、下記のように該マイクロチップの各ウェルに上記(iii)で調製した各試液を分注した。
・R2ウェル（R2(FLB)ウェル、R2(LB)ウェル）：泳動緩衝液２（MAA含有）を10.0μLずつ、
・R3ウェル：泳動緩衝液３を10.0μL、
・R4ウェル：泳動緩衝液４を5.4μL、
・C1ウェル：DNA標識抗体液を3.0μL、
・FDウェル：蛍光液を7.0μL。【０３３６】
使用したマイクロチップの模式図を図３に示す。【０３３７】
図３においてWasteウェルは、各ウェル（R2、R3、R4、C1）の試液及び泳動用試料Ａを分析用流路に導入する際の廃液だめ（ドレイン用ウェル）として使用する。【０３３８】
次いで、各4つのWasteウェル（ドレイン用ウェル）間に30秒間、-５psiの圧力を印加して、チップの分析用流路に泳動用試料Ａ及び各試液を導入した。【０３３９】
更に、チップの分析用流路に泳動用試料Ａ及び各試液を導入した後、以下の方法でPSAの分離及び検出を行った。
使用したマイクロチップのチップ内流路を模式化したものを図４に示す。
図４において、WはWasteウェルを示す。R3ウェル側が陰極、R2(LB)ウェル側が陽極になる。また、図４において、泳動用試料Ａ及び各ウェルの試液の配置部分を点部分と白部分（点のない部分）とに色分けして示す。【０３４０】
図４のR3ウェル−R2(LB)ウェル間に4000Vの電圧を印加して、30℃で、試液中のDNA標識抗PSA抗体を泳動用試料Ａ中の[蛍光標識抗遊離型PSA抗体−遊離型PSA]複合体と接触させて、[蛍光標識抗遊離型PSA抗体−遊離型PSA−DNA標識抗PSA抗体]の複合体を形成させ、これを等速電気泳動（ITP）で濃縮した。等速電気泳動の泳動方向は図４に“ITP”と点線により示される。【０３４１】
遊離型PSAを捕捉するための各標識抗体による免疫反応時間は約200秒であった。【０３４２】
ここで形成された複合体は、具体的には[蛍光標識抗遊離型PSA抗体−α(2, 3)糖鎖遊離型PSA−DNA標識抗PSA抗体]の複合体（第１複合体）と[蛍光標識抗遊離型PSA抗体−α(2, 3)糖鎖遊離型PSA以外の遊離型PSA−DNA標識抗PSA抗体]の複合体（第２複合体）である。【０３４３】
R2(FLB)ウェルまで等速電気泳動されて、複合体がR2(FLB)ウェルを通り抜けたことを電圧の変化で判断して、陰電極をR3からR2(FLB)に切り替えた。そして、更に検出部分（R2(FLB)とR2(LB)のチャネルクロス部分から２cm下流のキャピラリー部分）で、[蛍光標識抗遊離型PSA抗体−遊離型PSA−DNA標識抗PSA抗体]の複合体のピークが検出されるまでMAAの存在下でキャピラリーゲル電気泳動(CE)を行った。CEが行われた位置及び電気泳動の泳動方向は、図４に“CE”と点線により示した。【０３４４】
検出は、635nmレーザー励起によりR2(FLB)とR2(LB)のチャネルクロス部分から２cm下流のキャピラリー部分の蛍光強度を、フォトダイオード（富士フィルム(株）製）により経時的に測定することによって行った。【０３４５】
また、MAAを含有しない泳動緩衝液２を用いる以外は、上記と同じ泳動用試料Ａ及び泳動用試液及び測定装置を用い、上記と同様の方法を実施して、PSAの分離及び検出を行った。【０３４６】
第２複合体のピークはMAAを含有しない泳動緩衝液２を用いた場合に出現するピークと同じ位置に出現する。一方、MAAと反応した[蛍光標識抗遊離型PSA抗体-α(2, 3)糖鎖遊離型PSA-DNA標識抗PSA抗体]の複合体（第１複合体）は、MAAと反応しない[蛍光標識抗遊離型PSA抗体-α(2, 3)糖鎖遊離型PSA以外のPSA -DNA標識抗PSA抗体]の複合体（第２複合体）と比べて泳動に時間がかかるので、ピークの出現が遅れる。すなわち、第１複合体のピークは、第２複合体のピークの後に出現する。【０３４７】
得られた第１複合体の画分のピーク面積及び第２複合体の画分のピーク面積を、測定装置付属の解析用ソフトで求めた。【０３４８】
次いで、得られた第１複合体の画分のピーク面積と第２複合体の画分のピーク面積を用い、試料中の遊離型PSA量に対するα(2, 3)糖鎖遊離型PSA量の比率（％）を計算した。【０３４９】
具体的な算出方法は、以下の通りである。
・遊離型PSA量＝[第１複合体の画分のピーク面積]＋[第２複合体の画分のピーク面積]
・遊離型PSA量に対するα(2, 3)糖鎖遊離型PSA量の比率（％）（比率１）
＝［第１複合体の画分のピーク面積］/[遊離型PSA量]×100【０３５０】
次いで、各患者の前立腺体積に対する、上記で得られた、同じ患者の比率１の比率（比率２）を求めた。
・比率２：前立腺体積に対する比率１の比率（％）
＝［（第１複合体の画分のピーク面積/遊離型PSA量）×100］／前立腺体積
＝比率１（％）／前立腺体積【０３５１】
表１に、前立腺癌患者（PCa）及び前立腺肥大症患者（BPH）について得られた結果を示す。表１において、前立腺の体積の平均値（cm3）、比率１の平均値（%）、比率２の平均値（%/cm3）をそれぞれ記載する。【０３５２】
以上の結果をもとに、更にRelative Operating Characteristic curve（ROC曲線）による解析を行った。【０３５３】
（５）結果
結果を図５に示す。【０３５４】
図５において（１）及び（２）は、比率２を基に作成したROC曲線である。（３）及び（４）は、比率１をもとに作成したROC曲線である。【０３５５】
また、図５において、（１）及び（３）は、血清中のトータルPSA値が50ng/mL以下である被検者由来血清を用いた場合の結果を示す。（２）及び（４）は、血清中のトータルPSA値が10ng/mL以下である被検者由来血清を用いた場合の結果を示す。【０３５６】
次いで、公知の方法に従い、診断感度（Sensitivity）90%における特異度（Specificity）の値から生検回避率を求めた。図５では、横軸は［100−特異度］を示す。よって、図５より、［100−診断感度90%における横軸の値］＝診断感度90%における特異度(%)＝生検回避率(%)、となる。【０３５７】
ROC曲線解析により得られた結果を、下記表２にまとめた。【０３５８】
【表２】
2019221279.tif 000005
【０３５９】
図５及び表２から明らかな通り、比率２を指標として前立腺癌を判定した場合のAUC（曲線下面積＝Area Under the Curve）は、比率１を指標として前立腺癌を判定した場合のAUCよりも高かった。このことから、比率２を指標として用いた判定方法の方が、比率１を指標として用いた判定方法よりも判定の感度・特異度の点で優れていることが判る。【０３６０】
トータルPSA値が10ng/mL以下である試料を用いた場合（図５において(２)の場合）の、ROC曲線の解析結果を下記表３にまとめた。【０３６１】
【表３】
2019221279.tif 000006
【０３６２】
表３において、カットオフ値は、ROC曲線を用いてカットオフ値を求める常法に従い、図５のROC曲線に接する45度の角度をもつ直線を引き、その直線との交点の値、すなわち「Sensitivity−（100%-Specificity%）」が最大となる値を求めた。【０３６３】
表３から明らかな通り、比率２を用いた場合の生検回避率（Avoided Biopsies (%)）は55%であった。一方、比率１を用いた場合の生検回避率は36%であった。【０３６４】
以上のことから比率２を用いて前立腺癌を判定する本発明の方法は、比率１を用いて前立腺癌を判定する方法よりも、生検回避率、及びAUCが高いことが明らかになった。【０３６５】
また、本実施例の検証では、比率１をもとに前立腺癌を判定する場合のカットオフ値は「40%」となった。また、比率２をもとに前立腺癌を判定する場合のカットオフ値は「0.895」となった。【０３６６】
なお、データは示していないが、本実施例で得られた前立腺癌患者の比率２と、ダミコ分類による分類を行って比較した結果、本発明に係る比率２の値が低い患者は、ダミコ分類で低リスク群に分類される傾向があった。また比率２の値が高い患者は、ダミコ分類で高リスク群に分類される傾向があった。このことから、本発明の方法による前立腺癌を判定した結果は、ダミコ分類による分類と関係性があることが示唆された。【０３６７】
また、上記で別途得られたトータルPSA値をもとに同様にROC曲線により解析を行った。その結果、トータルPSA値をもとに前立腺癌を判定する場合の、生検回避率は20%であった。【０３６８】
トータルPSA値をもとに前立腺癌を判定する場合のカットオフ値は4.0である。
しかし、トータルPSA値をもとに前立腺癌を判定する方法は特異度が低いため、トータルPSA値がカットオフ値未満であっても、他の症状から前立腺癌が疑われる場合がある。その場合にはトータルPSA値がカットオフ値未満であっても、確定診断に供されるケースが大半を占める。そのため、実際の臨床診断の現場では、トータルPSA値をもとに前立腺癌を判定する方法の生検回避率は、20%よりもかなり低いと考えられる。【０３６９】
また、参考までにPCA3（prostate cancer gene 3）を指標とした判定法のデータ、及びPHI（Prostate Health Index）を指標とした判定法のデータを表３に併せて記載する。【０３７０】
表３に記載されたPCA3を指標とした判定法に関する各データは、それぞれ以下の文献に記載されているデータを転載した。
Cutoff：Gittelman M et al. J Urol 2013;190:64-9、Wei JT et al. J Clin Oncol 2014;20;32:4066-72、Haese A et al. Eur Urol 2008;54:1081-8。
AUC：Haese A et al. Eur Urol 2008;54:1081-8、Aubin SM et al. J Urol 2010;184:1947-52、
NPV(%)：Wei JT et al. J Clin Oncol 2014;20;32:4066-72、
Risk of Pca(%)：Gittelman M et al. J Urol 2013;190:64-9、Wei JT et al. J Clin Oncol 2014;20;32:4066-72、Haese A et al. Eur Urol 2008;54:1081-8、Aubin SM et al. J Urol 2010;184:1947-52、
Avoided Biopsies (%)：Haese A et al. Eur Urol 2008;54:1081-8、Aubin SM et al. J Urol 2010;184:1947-52。【０３７１】
また、表３に記載されたPHIを指標とした判定法に関する各データは、それぞれ以下の文献に記載されているデータを転載した。
AUC：Filella X et al. Clin Chem Lab Med 2013;51:729-39、
PPV(%)：Filella X et al. Clin Chem Lab Med 2013;51:729-39、
NPV(%)：Filella X et al. Clin Chem Lab Med 2013;51:729-39、
Risk of missing Pca(%)：Filella X et al. Clin Chem Lab Med 2013;51:729-39、De la Calle C et al. J Urol 2015;194:65-72、
Avoided Biopsies (%)：Filella X et al. Clin Chem Lab Med 2013;51:729-39。【０３７２】
表３から明らかな通り、比率２を用いて前立腺癌を判定する本発明の方法は、従来のPCA3を指標とした判定法及びPHIを指標とした判定法よりも生検回避率、及びAUCが高いことが判った。【０３７３】
以上のことから、本発明の前立腺癌を判定する方法は、従来の判定方法と比べて高い精度で、且つ高い生検回避率で、前立腺癌を判定することができることが判った。【０３７４】
従って、本発明の方法によれば、従来の血清マーカー（トータルPSA値）に基づき前立腺癌疑いとされる症例において、不必要な生検すなわち過剰な診断により不利益を被るリスクを低減する事に大きく貢献できる。
【産業上の利用可能性】
【０３７５】
本発明の前立腺癌を判定する方法は、高い生検回避率で前立腺癌を判定することができるので、被検者が過剰な生検を受けるという問題を回避することができるという、顕著な効果を奏する。
【図１】
2019221279.tif 000007
【図２】
2019221279.tif 000008
【図３】
2019221279.tif 000009
【図４】
2019221279.tif 000010
【図５】
2019221279.tif 000011
【国際調査報告】
2019221279.tif 000012
2019221279.tif 000013
2019221279.tif 000014
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