(57)【要約】【課題】  イムノクロマト法により測定試料中に含まれる測定対象物質を精度よく測定するためのイムノクロマト試験片およびそれを用いた測定方法を提供する。【解決手段】  本発明は、測定試料中に含まれる測定対象物質を定量するためのイムノクロマト試験片であって、前記イムノクロマト試験片は、サンプルパッド、コンジュゲーションパッド、メンブレン、吸収パッドが順に連接配置された構成であり、前記メンブレンは、抗原抗体反応により発色するテストラインおよびコントロールラインを具備し、前記テストラインは前記コントロールラインより上流に位置し、かつ前記テストラインに捕捉される検出粒子Ａの平均粒子径と前記コントロールラインに捕捉される検出粒子Ｂの平均粒子径の比が３：１〜１００：１である、イムノクロマト試験片である。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
測定試料中に含まれる測定対象物質を定量するためのイムノクロマト試験片であって、前記イムノクロマト試験片は、サンプルパッド、コンジュゲーションパッド、メンブレン、吸収パッドが順に連接配置された構成であり、前記メンブレンは、抗原抗体反応により発色するテストラインおよびコントロールラインを具備し、前記テストラインは前記コントロールラインより上流に位置し、かつ前記テストラインに捕捉される検出粒子Ａの平均粒子径と前記コントロールラインに捕捉される検出粒子Ｂの平均粒子径の比が３：１〜１００：１である、イムノクロマト試験片。
【請求項２】
前記検出粒子Ａと前記検出粒子Ｂとが着色粒子であり、かつ同一色である、請求項１に記載のイムノクロマト試験片。
【請求項３】
前記検出粒子Ａが有機系粒子であり、前記検出粒子Ｂが無機系粒子である、請求項１または２に記載のイムノクロマト試験片。
【請求項４】
前記検出粒子Ａが赤色のセルロース系微粒子であり、前記検出粒子Ｂが赤色の球状金微粒子である、請求項１から３のいずれかに記載のイムノクロマト試験片。
【請求項５】
前記検出粒子Ａが青色のセルロース系微粒子であり、前記検出粒子Ｂが青色のプレート状金微粒子である、請求項１から３のいずれかに記載のイムノクロマト試験片。
【請求項６】
請求項１から５のいずれかに記載のイムノクロマト試験片を用い、下記（ｉ）から（ｉｉｉ）の工程を順に経て、測定試料中に含まれる測定対象物質を定量する方法。
工程（ｉ）：測定試料と希釈液とを混合する工程
工程（ｉｉ）：工程（ｉ）の混合液を、サンプルパッドに点着させる工程
工程（ｉｉｉ）：テストラインおよびコントロールラインの発色強度から測定対象物質を定量する工程
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、イムノクロマト法により測定試料中に含まれる測定対象物質を測定するためのイムノクロマト試験片およびそれを用いた測定方法に関する。詳しくは、測定精度の高いイムノクロマト試験片およびそれを用いた測定方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、医療現場ではＰＯＣＴという言葉が注目を集めている。ＰＯＣＴとはＰｏｉｎｔ Ｏｆ Ｃａｒｅ Ｔｅｓｔｉｎｇの略であり、医療従事者が被験者の傍らで行う臨床検査のことをいう。ＰＯＣＴは大規模病院の中央検査室等で行う臨床検査とは異なり、その場で瞬時に検査結果が得られることから、幅広い検査項目においてＰＯＣＴが広まりつつある。【０００３】
ＰＯＣＴの代表例としてイムノクロマト法が挙げられる。イムノクロマト法とは、測定試料中に含まれる測定対象物質と特異的に結合する抗体を固定化した多孔質体の一端から、測定試料が毛細管現象によって多孔質体内を展開し、その過程で標識された測定対象物質と抗体とが抗原抗体反応によって結合することによって時間経過に伴って集積し、局所的に発色することで測定試料中の測定対象物質の有無を判定する免疫測定法である。【０００４】
イムノクロマト法の利点としては、迅速に結果が得られること、操作が簡便であること、および安価であること等が挙げられる。これらの利点を利用した妊娠検査薬やインフルエンザ診断薬等の体外診断薬が世界的に普及している。従来のイムノクロマト法は目視判定（定性評価）が一般的であったが、近年、発色強度を測定するイムノクロマトリーダー等の分析装置を利用して測定試料中に含まれる測定対象物質の量を定量化する技術が開発されつつある。【０００５】
イムノクロマト法を用いて測定対象物質の量を定量する手法の一つとしては、抗原抗体反応を利用したサンドイッチ法が挙げられる。サンドイッチ法では測定対象物質に対してエピトープの異なる２種類の抗体を利用する。一方の抗体は、多孔質体の表面に線状に固定化した捕捉抗体としてテストラインを形成する。他方の抗体は、前記テストラインを検出するため、金コロイド、着色ラテックス粒子、蛍光粒子等の検出粒子と感作した検出抗体（以下、テストライン検出試薬と称することがある）として使用する。加えて、前記テストライン検出試薬を特異的に捕捉する抗体を、多孔質体の表面の前記テストラインとは異なる位置に線状に固定化しコントロールラインを形成する。測定試料中の測定対象物質は、多孔質体の一端（上流側）から展開し、テストライン検出試薬と免疫複合体を形成しながら移動し、テストライン上で捕捉抗体と接触して捕捉され発色する。テストライン上で捕捉されなかった遊離のテストライン検出試薬は、コントロールラインの捕捉抗体に捕捉され発色する。これらの発色強度をイムノクロマトリーダー等の装置を利用することで測定対象物質の量を定量することができる。【０００６】
従来のイムノクロマト法では、テストライン上で捕捉されなかった遊離のテストライン検出試薬をコントロールラインの捕捉抗体で捕捉する機構であるため、測定対象物質の濃度に影響してコントロールラインの発色強度が変化することが問題であった。例えば、測定試料中に高濃度の測定対象物質が存在した場合、多量のテストライン検出試薬が測定対象物質と免疫複合体を形成し、上流側のテストラインで捕捉されるためテストラインの発色強度は高くなる。つまり、遊離のテストライン検出試薬は少量になるためコントロールラインの発色強度は低くなるといった問題があった。一方、測定試料中に低濃度の測定対象物質が存在した場合、測定対象物質と免疫複合体を形成するテストライン検出試薬も少量になるため、遊離のテストライン検出試薬がコントロールラインで多量に捕捉される結果、コントロールラインの発色強度が高くなるといった問題があった。【０００７】
イムノクロマト法により測定試料中に含まれる測定対象物質を精度よく測定するために、コントロールラインの発色強度が測定試料（または、テストライン検出試薬）の多孔質体への展開量を反映するイムノクロマト試験片を用い、前記コントロールラインの発色強度によりイムノクロマト試験片の個体差に起因する測定試料の多孔質体への展開量のバラツキを補正する場合がある。その場合、一定量の測定試料（または、テストライン検出試薬）が多孔質体に展開した場合、前記コントロールラインの発色強度は常に一定であることが望まれる。【０００８】
特許文献１、２には、低分子化合物を標識した検出粒子（以下、コントロールライン検出試薬と称することがある）と、前記低分子化合物を特異的に捕捉する抗体を多孔質体の表面に線状に固定化したコントロールラインを有するイムノクロマト試験片を使用することで、テストラインとコントロールラインとで独立した抗原抗体反応が進行するため、測定試料中の測定対象物質の濃度の影響を受けず、コントロールラインの発色強度を安定化できる技術が開示されている。前記発明は、コントロールラインが測定試料（または、テストライン検出試薬）の多孔質体への流入量をある程度反映するため、テストラインの発色強度をコントロールラインの発色強度で補正することで、測定試料中に含まれる測定対象物質をある程度精度よく測定できる。しかしながら通常、テストラインとコントロールラインは多孔質体の異なる位置に固定化するため、テストライン検出試薬がテストラインに捕捉されるまでの時間とコントロールライン検出試薬がコントロールラインに捕捉されるまでの時間に差異が生じるため、前記補正が不十分であった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】国際公開第２０１７／０６５２１３号
【特許文献２】国際公開第２０１７／０９４８２５号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明は、イムノクロマト法により測定試料中に含まれる測定対象物質を測定するためのイムノクロマト試験片およびそれを用いた測定方法を提供することを課題とするものである。詳しくは、測定精度の高いイムノクロマト試験片およびそれを用いた測定方法を提供することを課題とするものである。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者は、上記課題を解決するために鋭意研究した結果、テストラインがコントロールラインより上流（サンプルパッド側）に位置し、かつ検出抗体と検出粒子Ａから構成されるテストライン検出試薬における検出粒子Ａの平均粒子径が、低分子化合物で標識した検出粒子Ｂから構成されるコントロールライン検出試薬における検出粒子Ｂの平均粒子径より大きいイムノクロマト試験片を使用することにより、従来技術よりも測定精度が向上することを見出した。これは、上流側に位置するテストラインで捕捉されるテストライン検出試薬における検出粒子Ａの平均粒子径を、下流側に位置するコントロールラインで捕捉されるコントロールライン検出試薬における検出粒子Ｂの平均粒子径より大きくすることで、テストライン検出試薬がテストラインで捕捉されるまでの時間とコントロールライン検出試薬がコントロールラインで捕捉されるまでの滞留時間の差異が低減し、より高精度な補正が可能になったためであると推測している。
さらに、本発明者は前記検出粒子Ａと前記検出粒子Ｂとを同一色にすることで、イムノクロマトリーダーを小型化できることを見出し、本発明を完成させた。【００１２】
すなわち、代表的な本発明は以下の通りである。
（１）  測定試料中に含まれる測定対象物質を定量するためのイムノクロマト試験片であって、前記イムノクロマト試験片は、サンプルパッド、コンジュゲーションパッド、メンブレン、吸収パッドが順に連接配置された構成であり、前記メンブレンは、抗原抗体反応により発色するテストラインおよびコントロールラインを具備し、前記テストラインは前記コントロールラインより上流に位置し、かつ前記テストラインに捕捉される検出粒子Ａの平均粒子径と前記コントロールラインに捕捉される検出粒子Ｂの平均粒子径の比が３：１〜１００：１である、イムノクロマト試験片。
（２）  前記検出粒子Ａと前記検出粒子Ｂとが着色粒子であり、かつ同一色である、（１）に記載のイムノクロマト試験片。
（３）  前記検出粒子Ａが有機系粒子であり、前記検出粒子Ｂが無機系粒子である、（１）または（２）に記載のイムノクロマト試験片。
（４）  前記検出粒子Ａが赤色のセルロース系微粒子であり、前記検出粒子Ｂが赤色の球状金微粒子である、（１）から（３）のいずれかに記載のイムノクロマト試験片。
（５）  前記検出粒子Ａが青色のセルロース系微粒子であり、前記検出粒子Ｂが青色のプレート状金微粒子である、（１）から（３）のいずれかに記載のイムノクロマト試験片。
（６）  （１）から（５）のいずれかに記載のイムノクロマト試験片を用い、下記（ｉ）から（ｉｉｉ）の工程を順に経て、測定試料中に含まれる測定対象物質を定量する方法。
工程（ｉ）：測定試料と希釈液とを混合する工程
工程（ｉｉ）：工程（ｉ）の混合液を、サンプルパッドに点着させる工程
工程（ｉｉｉ）：テストラインおよびコントロールラインの発色強度から測定対象物質を定量する工程
【発明の効果】
【００１３】
本発明のイムノクロマト試験片およびそれを用いた測定方法は、テストラインとコントロールラインとで独立した抗原抗体反応が進行するためコントロールラインの発色強度が安定化し、かつテストライン検出試薬がテストラインで捕捉されるまでの時間とコントロールライン検出試薬がコントロールラインで捕捉されるまでの滞留時間の差異が低減することにより、測定試料中に含まれる測定対象物質を高精度に測定することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】イムノクロマト試験片の一例を示す（上面）図である。
【図２】イムノクロマト試験片の一例を示す（側面）図である。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
本発明において、測定試料は、特に限定されないが、例えば、血液、リンパ液、髄液、汗、尿、涙液、唾液、皮膚、粘膜、毛髪等の生体試料が挙げられる。血液においては、全血のほか、血液を遠心分離して得られた血清、血球または血漿を試料とすることができる。また、測定試料はヒト由来に限らず、イヌ、ネコ、ウシ等の哺乳動物由来の生体試料も対象である。
【００１６】
本発明において、測定項目は、特に限定されないが、例えば、ＨｂＡ１ｃ、Ｃ−ｐｅｐｔｉｄｅ、Ｉｎｓｕｌｉｎ、ｍ−Ａｌｕｍｉｎ、Ｃｙｓ−Ｃ、ＮＧＡＬ、ＴｒｉｐｏｎｉｎＩ、Ｄ−ｄｉｍｅｒ、ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰ、ＣＫ−ＭＢ、Ｍｙｏｇｌｏｂｉｎ、ｈ−ＦＡＢＰ、ｈｓ−ＣＲＰ、ＰＳＡ、ＡＦＰ、ＣＥＡ、ＦＯＢ、Ｆｅｒｒｉｔｉｎ、ＰＣＴ、ＣＲＰ、ＳＡＡ、ＡＳＯ、ｈＣＧ、ＬＨ、ＴＳＨ、ＦＳＨ、Ｔ３、Ｔ４、ＶｉｔａｍｉｎＤ等や、ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  Ａ／Ｂ、Ｄｅｎｇｕｅ、ＨＢＶ、ＨＣＶ、ＨＩＶ、Ｓｙｐｈｉｌｉｓ、Ｍａｌａｒｉａ、Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ、Ｒｏｔａ、Ｃｈｌａｍｙｄｉａ、ＳｔｒｅｐＡ、Ａｄｅｎｏ、Ｚｉｋａ、Ｃｈｉｋｕｎｇｕｎｙａ、ＲＳＶ等の感染症項目が挙げられる。
【００１７】
本発明において、イムノクロマト試験片の構成は、イムノクロマト試験片の測定試料溶液の添加部（滴下部）を上流側として、前記添加部を有するサンプルパッド、コンジュゲーションパッド、メンブレン、吸収パッドの順に連接配置された構成を有するのが好ましい。次いで、本発明のイムノクロマト試験片の一例を、図面を参照して説明するが、本発明を何ら限定するものではない。図１および２において、１はサンプルパッド、２はコンジュゲーションパッド、３はメンブレン、４は吸収パッド、５はバッキングシート、６はテストライン、７はコントロールライン、８は粘着シートを示す。
【００１８】
図１および２において、イムノクロマト試験片は、幅３〜５ｍｍ（好ましくは、４ｍｍ程度）、長さ４０〜１００ｍｍ（好ましくは６０ｍｍ程度）の細長い短冊状の形態をしている。なお、イムノクロマト試験片のメンブレン３の上流側の端部から約１０ｍｍの位置には、測定対象物質と特異的に結合する捕捉抗体を線状に固定化したテストライン６が形成される。また、前記端部から約１５ｍｍの位置に後述の低分子化合物と特異的に結合する捕捉抗体を線状に固定化したコントロールライン７が形成される。さらに、イムノクロマト試験片のコンジュゲーションパッド２には測定対象物質と特異的に結合する検出抗体と検出粒子Ａから構成されるテストライン検出試薬、および低分子化合物で標識された検出粒子Ｂから構成されるコントロールライン検出試薬が坦持されている。
【００１９】
前記テストライン検出試薬における検出粒子Ａの平均粒子径および前記コントロールライン検出試薬における検出粒子Ｂの平均粒子径は、特に限定されないが、１０〜１０００ｎｍが好ましく、１０〜５００ｎｍがより好ましい。検出粒子の平均粒子径が大きいと、下流への展開が遅くなり、測定時間が長くなることがある。また、メンブレン上に捕捉されやすくなり、バックグラウンド自体が発色してしまうことでテストラインおよびコントロールラインでの発色が不明瞭になることがある。一方、検出粒子の平均粒子径が小さいと、テストライン検出試薬の場合は、物理吸着または化学結合できる検出抗体量が低下し、測定感度が低下することがある。また、コントロールライン検出試薬の場合は、標識できる低分子化合物量が低下し、補正が不十分となることがある。
【００２０】
前記検出粒子Ａの平均粒子径と前記検出粒子Ｂの平均粒子径の比は３：１〜１００：１であるのが好ましく、４：１〜５０：１がより好ましく、５：１〜２０：１がさらに好ましい。特に、多孔質体の吸水速度が７５〜１８０秒／４ｃｍのとき、小さい検出粒子はより速く下流へ展開し、大きい検出粒子はより遅く下流へ展開する。そのため、前記検出粒子Ａの平均粒子径と前記検出粒子Ｂの平均粒子径の比は３：１〜１００：１であれば、テストライン検出試薬（つまり検出粒子Ａ）が上流側にあるテストラインに到達するまでの時間と、コントロールライン試薬（つまり検出粒子Ｂ）が下流側にあるコントロールラインに到達するまでの時間の差異が小さくなる。検出粒子Ａの平均粒子径と検出粒子Ｂの平均粒子径の比が３：１より小さいと、テストライン検出試薬がテストラインで捕捉されるまでの滞留時間とコントロールライン検出試薬がコントロールラインで捕捉されるまでの滞留時間に差異が大きくなるため、コントロールラインの発色強度での補正が不十分となる恐れがある。一方、１００：１より大きいと、例えば、検出粒子Ａが１０００ｎｍより大きいか、または検出粒子Ｂが１０ｎｍより小さくなり、前述の通り好ましくない。
【００２１】
前記検出粒子Ａおよび前記検出粒子Ｂは、特に限定されないが、着色粒子や蛍光粒子を用いることができる。着色粒子としては金属粒子、ラテックス粒子、セルロース粒子などを例示することができる。金属粒子としては金コロイド、銀コロイド、白金コロイド、パラジウムコロイド、金ナノロッド、金ナノプレート、銀ナノプレートなどを例示することができる。ラテックス粒子としてはポリスチレン、ポリメタクリル酸メチル、アクリル酸重合体などの材質からなるものを例示することができる。蛍光粒子としてはポリスチレン、ポリメタクリル酸メチル、ポリビニルトルエン、シリカなどの材質からなるものを例示することができ、蛍光色素としてはフルオレセインおよびその誘導体、ローダミンおよびその誘導体、シアニンおよびその誘導体などを例示することができる。
【００２２】
これらの中でも前記検出粒子Ａおよび前記検出粒子Ｂは共に着色粒子であることが好ましく、前記検出粒子Ａおよび前記検出粒子Ｂは同一色であることがより好ましい。ここで、同一色とは、最大吸光波長が±５０ｎｍ以内であることを意味する。また、例えば、検出粒子Ａと検出粒子Ｂの少なくとも一方が蛍光粒子であると、蛍光を検出するためにイムノクロマトリーダーが大型かつ高価になり、ＰＯＣＴの観点から好ましくない。また、検出粒子Ａと検出粒子Ｂとが異なる色であると、例えば一般的な発光ダイオード（以下、ＬＥＤと略す場合がある）−フォトダイオード（以下、ＰＤと略す場合がある）のイムノクロマトリーダーで測定する場合に、テストラインとコントロールラインの各色に対応する複数のＬＥＤ−ＰＤの組み合わせが必要となり、装置が大型かつ高価になり、ＰＯＣＴの観点から好ましくない。
【００２３】
検出粒子Ａの平均粒子径と検出粒子Ｂの平均粒子径の比が３：１〜１００：１で、かつ同一色にするには、前記検出粒子Ａが有機系粒子であり、前記検出粒子Ｂが無機系粒子であることが好ましい。具体的には、検出粒子Ａと検出粒子Ｂとが共に赤色系の場合、検出粒子Ａがセルロース粒子またはラテックス粒子であり、前記検出粒子Ｂが球状金微粒子の組合わせが挙げられる。高感度測定の観点から、検出粒子Ａがセルロース粒子であり、前記検出粒子Ｂが球状金微粒子であることがより好ましい。一方、検出粒子Ａと検出粒子Ｂとが共に青色の場合、検出粒子Ａがセルロース粒子またはラテックス粒子であり、前記検出粒子Ｂがプレート状金微粒子の組合わせが挙げられる。高感度測定の観点から、検出粒子Ａがセルロース粒子であり、前記検出粒子Ｂがプレート状金微粒子であることがより好ましい。なお、金微粒子は球状では赤色を、プレート状では青色をそれぞれ呈する。
【００２４】
前記テストライン検出試薬における検出抗体は、測定対象物質と特異的に結合し得るものであれば特に限定されない。例えば、測定対象物質がｈＣＧであれば抗ｈＣＧ抗体を、測定対象物質がＨｂＡ１ｃであれば抗Ｈｂ抗体または抗ＨｂＡ１ｃ抗体を使用することができる。前記検出抗体は、市販品を用いてもよいし、別途公知の方法で製造してもよい。また、モノクローナル抗体でもポリクローナル抗体でもよく、分子サイズも特に限定されない。
【００２５】
前記テストライン検出試薬における検出抗体と検出粒子との結合方法は、特に限定されないが、疎水結合による物理吸着または共有結合による化学結合で感作するのが好ましく、操作が簡便でありかつコストも安い物理吸着がより好ましい。なお、感作効率を向上させるため、検出粒子に反応性活性基を導入してもよい。反応性活性基としては、特に限定されないが、例えばカルボキシル基、アミノ基、アルデヒド基、チオール基、エポキシ基、水酸基が挙げられる。これらの中でも、カルボキシル基、アミノ基が好ましい。カルボキシル基の場合は、カルボジイミドを用いてリガンドのアミノ基と共有結合を形成することができる。
【００２６】
前記コントロールライン検出試薬における低分子化合物は、特に限定されないが、比較的安価で、入手し易いことやタンパク質標識分野等で実績があることから、ビオチンまたはジゴキシゲニンが好ましく、ビオチンがより好ましい。
【００２７】
前記テストライン検出試薬およびコントロールライン検出試薬は、ブロッキング用タンパク質によりブロッキングするのが好ましい。前記ブロッキング用タンパク質は、特に限定されず、微生物由来タンパク質のＢｌｏｃｋｉｎｇ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｆｒａｇｍｅｎｔ（以下、ＢＰＦと略す場合がある）、動物由来タンパク質のウシ血清アルブミン（以下、ＢＳＡと略す場合がある）、カゼインが好ましい。ブロッキング用タンパク質は、市販品を用いてもよいし、別途公知の方法で製造してもよい。なお、ＢＰＦは、東洋紡株式会社より市販されており容易に入手可能である。
【００２８】
本発明で用いるメンブレン３上のテストライン６を形成する線状に固定化した捕捉抗体は、測定対象物質と特異的に結合し得るものであれば特に限定されない。例えば、測定対象物質がｈＣＧであれば抗ｈＣＧ抗体を、測定対象物質がＨｂＡ１ｃであれば抗Ｈｂ抗体または抗ＨｂＡ１ｃ抗体を使用することができる。なお、前記検出抗体と前記捕捉抗体とは、測定対象物質に対するエピトープが異なるものが好ましい。前記捕捉抗体は、市販品を用いてもよいし、別途公知の方法で製造してもよい。また、モノクローナル抗体でもポリクローナル抗体でもよく、分子サイズも特に限定されない。
【００２９】
本発明で用いるメンブレン３上のコントロールライン７を形成する線状に固定化した捕捉抗体は、コントロールライン検出試薬の低分子化合物と特異的に結合し得るものであれば特に限定されない。例えば、低分子化合物がビオチンの場合は抗ビオチン抗体であり、低分子化合物がジゴキシゲニンの場合は、抗ジゴキシゲニン抗体を使用することができる。前記捕捉抗体は、市販品を用いてもよいし、別途公知の方法で製造してもよい。また、モノクローナル抗体でもポリクローナル抗体でもよいし、分子サイズも特に限定されない。
【００３０】
サンプルパッド１の材質は、測定試料を速やかに吸収した後、下流のコンジュゲーションパッド、メンブレン、吸収パッドへ展開できる材質のものであれば、特に限定されず、例えばセルロース製のろ紙または不織布、ガラス製のろ紙または不織布、ポリエステル製のろ紙または不織布、ポリエチレン製のろ紙または不織布が挙げられる。これらの中でも、セルロース製のろ紙が好ましい。また、前記サンプルパッド１の厚さは、０．１〜２．０ｍｍが好ましく、０．２〜１．０ｍｍがより好ましい。厚さが小さいと、下流での測定試料の流れが不均一となり測定精度が低下することがある。一方、厚さが大きいと、下流への展開が遅くなり測定時間が長くなることがある。また、下流への展開に必要となる測定試料量が多くなる。
【００３１】
コンジュゲーションパッド２の材質は、テストライン検出試薬およびコントロールライン検出試薬を乾燥状態で保持でき、かつ測定試料の下流への展開と共に前記両検出試薬を速やかに放出することができる材質のものであれば、特に限定されず、例えばセルロース製のろ紙または不織布、ガラス製のろ紙または不織布、ポリエステル製のろ紙または不織布、ポリエチレン製のろ紙または不織布が挙げられる。これらの中でも、ガラス製のろ紙が好ましい。また、前記コンジュゲーションパッド２の厚さは、０．１〜２．０ｍｍが好ましく、０．２〜１．０ｍｍがより好ましい。厚さが小さいと、目的量のテストライン検出試薬およびコントロールライン検出試薬を乾燥状態で保持できないことがある。厚さが大きいと、下流への展開が遅くなり測定時間が長くなることがある。また、下流への展開に必要となる測定試料量が多くなる。
【００３２】
メンブレン３の材質は、測定試料を精度よく均一に展開できるものであれば、特に限定されず、例えばセルロース、セルロース誘導体、ニトロセルロース、酢酸セルロース、ポリウレタン、ポリエステル、ポリエチレン、ポリ塩化ビニル、ポリフッ化ビニリデン、またはナイロン製のメンブレンが挙げられる。これらの中でも、ニトロセルロース製のメンブレンが好ましい。
【００３３】
吸収パッド４の材質は、上流より展開してきた測定試料を速やかに吸収した後、逆流しないよう保持できるものであれば、特に限定されず、例えばセルロース製のろ紙または不織布、ガラス製のろ紙または不織布、ポリエステル製のろ紙または不織布、ポリエチレン製のろ紙または不織布が挙げられる。これらの中でも、セルロース製のろ紙が好ましい。また、前記吸収パッド４の厚さは、０．２〜５．０ｍｍが好ましく、０．５〜２．０ｍｍがより好ましい。厚さが小さいと、測定試料の滴下量によっては一度吸収パッドに吸収された測定試料がメンブレン側に逆流することがある。厚さが大きいと、イムノクロマト試験片およびイムノクロマト試験片を覆うハウジングケースのサイズも大きくなり、ＰＯＣＴの観点から好ましくない。
【００３４】
コンジュゲーションパッド２に前記テストライン検出試薬と前記コントロールライン検出試薬を担持させる方法は、特に限定されず、例えば前記テストライン検出試薬と前記コントロールライン検出試薬を一定比率で混合した後、前記混合液をコンジュゲーションパッドに均一に塗布、噴霧または含浸した後、恒温槽内で適当な温度で一定時間乾燥することで作製することができる。前記混合液の塗布量は、特に限定されないが、ライン長１ｃｍ辺り５μＬ〜５０μＬが好ましい。次いで、前記塗布後に乾燥するのが好ましい。乾燥温度は、特に限定されないが、２０℃〜８０℃が好ましく、２０℃〜６０℃がより好ましい。乾燥時間は乾燥温度によって異なるが、通常は５分〜１２０分間である。
【００３５】
メンブレン３に前記テストラインを形成する捕捉抗体と前記コントロールラインを形成する捕捉抗体を線状に固定化する方法は、特に限定されず、例えば前記テストラインを形成する捕捉抗体と前記コントロールラインを形成する捕捉抗体を、それぞれ線上に一定量を異なる位置に塗布した後、恒温槽内で適当な温度で一定時間乾燥することで作製することができる。前記両捕捉抗体の塗布量は、特に限定されないが、ライン長１ｃｍ辺り０．１μＬ〜２μＬが好ましい。次いで、前記塗布後に乾燥するのが好ましい。乾燥温度は、特に限定されないが、２０℃〜８０℃が好ましく、２０℃〜６０℃がより好ましい。乾燥時間は乾燥温度によって異なるが、通常は５分〜１２０分間である。
【００３６】
本発明において、イムノクロマト試験片は、前記作製したメンブレン３を粘着シート８の中央付近に貼り付け、次いでコンジュゲーションパッド２をメンブレン３の一方の末端上に一部重ね合わせて貼り付け、次いでサンプルパッド１をコンジュゲーションパッド２のメンブレン３との重なりとは逆の末端上に一部重ね合わせて貼り付け、次いで吸収パッド４をメンブレン３の他方の末端上に一部重ね合わせて貼り付けた後、一定幅の短冊状に切断することで作製することができる。なお、テストライン６およびコントロールライン７は試験片を作製した後に調製してもよいし、試験片を作製する前に調製してもよい。
【００３７】
前記イムノクロマト試験片は、少なくともサンプルパッド１上に測定試料を滴下するための第一の開口部、メンブレン３上にテストライン６とコントロールライン７を測定するための第二の開口部を有する適当なプラスチック製のハウジングケースに収容されたものでも良い。
【００３８】
本発明において、測定対象物質の濃度は測定試料の展開斑を考慮し、テストラインの発色強度をコントロールラインの発色強度で割り算した補正値から測定するのがより好ましい。
【００３９】
本発明において、イムノクロマト試験片のテストラインおよびコントロールラインの測定方法は、特に限定されず、市販のイムノクロマトリーダーを用いてもよいし、別途公知の方法でイムノクロマトリーダーを製造してもよい。検出系としては、特に限定されないが、例えばＬＥＤ−ＦＤ、ＬＥＤ−ＣＭＯＳ、ＬＥＤ−ＣＣＤを使用することができる。
【実施例】
【００４０】
以下、本発明を実施例に基づいて詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。なお、明細書中の評価法は以下の通りである。【００４１】
＜１．検出粒子の形状＞
各検出粒子を走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ、日立社製Ｓ−４８００）で観察し、［１］球、長球、また楕円体である球状［２］角柱であるプレート状に分類した。【００４２】
＜２．検出粒子の平均粒子径＞
各粒子を走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）で観察し、形状が［１］球状の場合は１００個の粒子の直径を測定し、平均直径（平均粒子径）を算出した。形状が［２］プレート状の場合は１００個の粒子の平面部分の最大長さを測定し、平均長さ（平均粒子径）を算出した。【００４３】
（実施例１）
１．ｈＣＧ測定用テストライン検出試薬の調製
５．０ｍｇ／ｍＬの抗ｈＣＧ−βモノクローナル抗体（５０１４、Ｍｅｄｉｘ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａ社製）を蒸留水（大塚蒸留水、大塚製薬社製）で１．０ｍｇ／ｍＬに調製した。次いで、１．０ｗｔ％のセルロース粒子（ＮａｎｏＡｃｔ（登録商標）、ＲＥ２：Ｄａｒｋ  Ｒｅｄ、赤色、平均粒子径３４０ｎｍ、旭化成社製）１００μＬ、１０ｍＭのトリス緩衝液（２０４−０７８８５、和光純薬工業社製）（ｐＨ７．０）９００μＬ、および前記１．０ｍｇ／ｍＬ（０．１ｗｔ％）の抗ｈＣＧ−βモノクローナル抗体１００μＬを１５ｍＬの遠沈管に加え、ボルテックスで撹拌した。次いで、３７℃に調整した低温インキュベーター（ＩＮ６０４、ヤマト科学社製）に入れ１２０分間静置した。次いで、１．０ｗｔ％のカゼイン（０３０−０１５０５、和光純薬工業社製）、１００ｍＭのホウ酸緩衝液（０２１−０２１９５、和光純薬工業社製）からなるブロッキング液（ｐＨ８．０）１２ｍＬを加え、さらに３７℃に調整した低温インキュベーターで６０分間静置した。次いで、遠心分離機（ＭＸ−３０７、トミー精工社製）とラックインローター（ＴＭＡ−３００、トミー精工社製）とラック（ＡＲ５１０−０４、トミー精工社製）を用い、１３，０００Ｇの遠心を２５℃で１５分間行い、抗体感作セルロース粒子を沈降させた後に上澄みを除去した。次いで、５０ｍＭのホウ酸緩衝液からなる洗浄液（ｐＨ１０．０）１２ｍＬを加え、超音波分散機（ＵＨ−５０、エスエムテー社製）で１０秒間処理した。次いで、遠心分離機とラックインローターとラックを用い、１３，０００Ｇの遠心を２５℃で１５分間行い、抗体感作セルロース粒子を沈降させた後に上澄みを除去した。次いで、１５ｗｔ％のスクロース（１９６−０００１５、和光純薬工業社製）、０．２ｗｔ％のカゼイン、６２ｍＭのホウ酸緩衝液からなる塗布液（ｐＨ９．２）２．０ｍＬを加え、超音波分散機で１０秒間処理し、ｈＣＧ測定用テストライン検出試薬１を得た。【００４４】
（２）コントロールライン検出試薬の調製
Ｄビオチン（０４８２２−９１、ナカライテスク社製）１６ｍｇ、およびジメチルスルホキシド：ＤＭＳＯ（０８９０４−１４、ナカライテスク社製）１，０００μＬを５ｍＬのマイクロチューブに加え、ボルテックスで撹拌し、Ｄビオチン溶液を得た。次いで、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩：ＥＤＣ（１５０２２−８６、ナカライテスク社製）２００ｍｇ、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド：ＮＨＳ（１８９４８−０２、ナカライテスク社製）２００ｍｇ、および蒸留水１，０００μＬを５ｍＬのマイクロチューブに加え、ボルテックスで撹拌し、ＥＤＣ／ＮＨＳ溶液を得た。次いで、前記Ｄビオチン溶液１，０００μＬおよび前記ＥＤＣ／ＮＨＳ溶液１，０００μＬを混合した後、２５℃に調整した低温インキュベーターに入れ１５分間静置し、Ｄビオチン／ＥＤＣ／ＮＨＳ溶液を得た。次いで、Ｂｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍ  ａｌｂｕｍｉｎ：ＢＳＡ（Ａ７９０６、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社製）１００ｍｇ、および蒸留水１，０００μＬを５ｍＬのマイクロチューブに加え、ボルテックスで撹拌し、ＢＳＡ溶液を得た。次いで、前記Ｄビオチン／ＥＤＣ／ＮＨＳ溶液１，０００μＬと前記ＢＳＡ溶液１，０００μＬを混合した後、２５℃に調整した低温インキュベーターに入れ３０分間静置し、Ｄビオチン−ＢＳＡ溶液を得た。次いで、球状の金コロイド液（ＯＤ５２０＝１．０）（ＥＭＧＣ４０、赤色、平均粒子径＝４０ｎｍ、ＢＢＩ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ社製）１３．５ｍＬ、および５０ｍＭのリン酸二水素カリウム（２８７３６−７５、ナカライテスク社製）（ｐＨ７．０）１．５ｍＬを５０ｍＬの遠沈管に加え、軽く撹拌した。次いで、前記Ｄビオチン−ＢＳＡ溶液１．５ｍＬを加え、軽く撹拌した後、２５℃に調整した低温インキュベーターに入れ１０分間静置した。次いで、１．０ｗｔ％のＰＥＧ２０，０００（１６８−１１２８５、和光純薬工業社製）５００μＬを加え、軽く撹拌した後、１０ｗｔ％のＢＳＡ１，０００μＬを加え、軽く撹拌した。次いで、遠心分離機とラックインローターとラックを用い、８，０００Ｇの遠心を２５℃で１５分間行い、Ｄビオチン感作金コロイドを沈降させた後に上澄みを除去した。次いで、０．０５ｗｔ％のＰＥＧ２０，０００、１５０ｍＭの塩化ナトリウム（１９８−０１６７５、和光純薬工業社製）、１．０ｗｔ％のＢＳＡ、２０ｍＭのトリス緩衝液からなる金コロイド保存液（ｐＨ８．２）３０ｍＬを加え、超音波分散機で１０秒間処理した。次いで、遠心分離機とラックインローターとラックを用い、８，０００Ｇの遠心を２５℃で１５分間行い、Ｄビオチン感作金コロイドを沈降させた後に上澄みを除去した。次いで、０．０５ｗｔ％のＰＥＧ２０，０００、３７．５ｍＭの塩化ナトリウム、０．２５ｗｔ％のＢＳＡ、２．５ｗｔ％のスクロース、２０ｍＭのトリス緩衝液からなる金コロイド塗布液（ｐＨ８．２）をＯＤ５２０が３．７５になるよう加え、超音波分散機で１０秒間処理し、コントロールライン検出試薬１を得た。【００４５】
（３）ｈＣＧ測定用メンブレンカードの作製
５．０ｍｇ／ｍＬの抗ｈＣＧ−αモノクローナル抗体（６６０１、ＭｅｄｉｘＢｉｏｃｈｅｍｉｃａ社製）を蒸留水で０．５ｍｇ／ｍＬに調製した。次いで、１．０ｍｇ／ｍＬの抗ビオチンポリクローナル抗体（Ａ１５０−１１１Ａ、ＢＥＴＨＹＬ社製）を蒸留水で０．５ｍｇ／ｍＬに調製した。次いで、上流側に２０ｍｍ×３００ｍｍの粘着テープ部、中央に２５ｍｍ×３００ｍｍのメンブレン部、下流側に１５ｍｍ×３００ｍｍの粘着テープ部から構成される６０ｍｍ×３００ｍｍのメンブレンカード（Ｈｉ−Ｆｌｏｗ  Ｐｌｕｓ  １２０  Ｍｅｍｂｒａｎｅ  Ｃａｒｄｓ、吸水速度１２０秒／４ｃｍ、ＨＦ１２０、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）のメンブレン部の上流側から１０ｍｍの位置に、分注プラットフォーム（ＸＹＺ３０６０、ＢＩＯＤＯＴ社製）と、Ｂｉｏ Ｊｅｔノズル（ＢＨＱＨＲ−ＸＹＺ、ＢＩＯＤＯＴ社製）を用い、前記０．５ｍｇ／ｍＬの抗ｈＣＧ−αモノクローナル抗体を１．０μＬ／ｃｍの塗布量で塗布した後、４５℃に調整した乾燥機（ＷＦＯ−５１０、東京理化器械社製）で３０分間乾燥し、ライン幅約１ｍｍのテストラインを形成した。さらに、前記テストラインを形成したメンブレンカードのメンブレン部の上流側から１５ｍｍの位置に、分注プラットフォームと、Ｂｉｏ Ｊｅｔノズルを用い、前記０．５ｍｇ／ｍＬの抗ビオチンポリクローナル抗体を１．０μＬ／ｃｍの塗布量で塗布した後、４５℃に調整した乾燥機で３０分間乾燥し、ライン幅約１ｍｍのコントロールラインを形成することで、ｈＣＧ測定用メンブレンカード１を得た。【００４６】
（４）ｈＣＧ測定用コンジュゲーションパッドの作製
前記ｈＣＧ測定用テストライン検出試薬および前記コントロールライン検出試薬を、１：１の割合（体積比）で混合した。次いで、１０ｍｍ×３００ｍｍのコンジュゲーションパッド（ＧＬＡＳＳＦＩＢＥＲ  ＤＩＡＧＮＯＳＴＩＣ  ＰＡＤ、ＧＦＤＸ００１０５０、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）の全面に、分注プラットフォームと、Ａｉｒ Ｊｅｔノズル（ＡＪＱＨＲ−ＸＹＺ、ＢＩＯＤＯＴ社製）を用い、前記混合液を１５μＬ／ｃｍの塗布量で２回均一に塗布した後、４５℃に調整した乾燥機で３０分間乾燥し、ｈＣＧ測定用コンジュゲーションパッド１を得た。【００４７】
（５）ｈＣＧ測定用イムノクロマト試験片の作製
前記ｈＣＧ測定用メンブレンカードの上流側の２０ｍｍ×３００ｍｍの粘着テープ部に、メンブレン部と５ｍｍ重なるよう前記ｈＣＧ測定用コンジュゲーションパッドを貼り合わせた。次いで、さらに上流側に前記コンジュゲーションパッドと５ｍｍ重なるよう２０ｍｍ×３００ｍｍのサンプルパッド（ＣＥＬＬＵＬＯＳＥ  ＦＩＢＥＲ  ＳＡＭＰＬＥ  ＰＡＤＳ、ＣＦＳＰ００２０００、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）を貼り合わせた。次いで、前記ｈＣＧ測定用メンブレンカードの下流側の１５ｍｍ×３００ｍｍの粘着テープ部に、メンブレン部と５ｍｍ重なるよう２０ｍｍ×３００ｍｍの吸収パッド（ＣＥＬＬＵＬＯＳＥ  ＦＩＢＥＲ  ＳＡＭＰＬＥ  ＰＡＤＳ、ＣＦＳＰ００２０００、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）を貼り合わせた。次いで、ギロチン式カッティングモジュール（ＣＭ５０００、ＢＩＯＤＯＴ社製）を用い、幅４ｍｍ、長さ６０ｍｍの短冊状にカットすることで、ｈＣＧ測定用イムノクロマト試験片１を得た。【００４８】
（６）希釈ｈＣＧ試料の調製
市販のｈＣＧ抗原（３０−１１３２、Ｆｉｔｚｇｅｒａｌｄ社製）を、５０ｍＭのリン酸二水素カリウム、１．０ｗｔ％のＢＳＡからなる希釈液（ｐＨ７．０）で希釈し、１ＩＵ／Ｌおよび１００ＩＵ／Ｌの希釈ｈＣＧ試料を調整した。【００４９】
（７）ｈＣＧ測定用イムノクロマト試験片の評価：精度の評価
前記ｈＣＧ測定用イムノクロマト試験片を水平な台に設置した。次いで、前記希釈ｈＣＧ試料（１ＩＵ／Ｌ、１００ＩＵ／Ｌ）１００μＬを、マイクロピペットで分取し、サンプルパッドに緩やかに滴下し、２５℃で１０分間静置した。次いで、メンブレン上のコントロールラインおよびテストラインの反射吸光度（ｍＡｂｓ）をイムノクロマトリーダー（Ｃ１００６０−１０、測定モード：Ｇｏｌｄ  Ｃｏｌｌｏｉｄ、Ｌｉｎｅ、浜松ホトニクス社製）を用いて測定した。前記実験操作を前記希釈ｈＣＧ試料（１ＩＵ／Ｌ、１００ＩＵ／Ｌ）に対してそれぞれＮ＝１０で行った。精度の指標として、前記希釈ｈＣＧ試料（１ＩＵ／Ｌ、１００ＩＵ／Ｌ）のテストラインの反射吸光度（ｍＡｂｓ）をコントロールラインの反射吸光度（ｍＡｂｓ）で割算した補正値（１ＩＵ／Ｌ、１００ＩＵ／Ｌ）をそれぞれ算出した後、得られた補正値（１ＩＵ／Ｌ、１００ＩＵ／Ｌ）のＮ＝１０におけるＣＶ（１ＩＵ／Ｌ、１００ＩＵ／Ｌ）（％）をそれぞれ算出し、さらにＣＶ（１ＩＵ／Ｌ）（％）とＣＶ（１００ＩＵ／Ｌ）（％）との平均値：ＣＶ（％）を算出し、ＣＶ≦２％を◎（ｅｘｃｅｌｌｅｎｔ）、２％＜ＣＶ≦３％を○（ｇｏｏｄ）、３％＜ＣＶ≦５％を△（ａｖｅｒａｇｅ）、５％＜ＣＶを×（ｂａｄ）と評価した。実施例１のｈＣＧ測定用イムノクロマト試験片の精度はＣＶ＝１．２％で◎と、高精度な測定が可能であった。得られた評価結果を表１に示す。【００５０】
（８）ｈＣＧ測定用イムノクロマト試験片の評価：感度の評価
前記ｈＣＧ測定用イムノクロマト試験片を水平な台に設置した。次いで、前記希釈ｈＣＧ試料（１ＩＵ／Ｌ、１００ＩＵ／Ｌ）１００μＬを、マイクロピペットで分取し、サンプルパッドに緩やかに滴下し、２５℃で１０分間静置した。次いで、メンブレン上のコントロールラインおよびテストラインの反射吸光度（ｍＡｂｓ）をイムノクロマトリーダー（Ｃ１００６０−１０、測定モード：Ｇｏｌｄ  Ｃｏｌｌｏｉｄ、Ｌｉｎｅ、浜松ホトニクス社製）を用いて測定した。前記実験操作を前記希釈ｈＣＧ試料（１ＩＵ／Ｌ、１００ＩＵ／Ｌ）に対してそれぞれＮ＝１０で行った。感度の指標として、前記希釈ｈＣＧ試料（１００ＩＵ／Ｌ）のテストラインの反射吸光度（ｍＡｂｓ）のＮ＝１０平均値と、前記希釈ｈＣＧ試料（１ＩＵ／Ｌ）のテストラインの反射吸光度（ｍＡｂｓ）のＮ＝１０平均値との差：Δ（ｍＡｂｓ）を算出し、３００Ａｂｓ≦Δを◎（ｅｘｃｅｌｌｅｎｔ）、２００≦Δ＜３００ｍＡｂｓを○（ｇｏｏｄ）、Δ＜２００ｍＡｂｓを×（ｂａｄ）と評価した。実施例１のｈＣＧ測定用イムノクロマト試験片の感度はΔ＝４００ｍＡｂｓで◎と、高感度な測定が可能であった。得られた評価結果を表１に示す。【００５１】
（実施例２〜７）
コントロールライン検出試薬における検出粒子を球状の金コロイド液（ＯＤ５２０＝１．０）（ＥＭＧＣ４０、赤色、平均粒子径＝４０ｎｍ、ＢＢＩ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ社製）の代わりに、球状の金コロイド液（ＯＤ５２０＝１．０）（ＥＭＧＣ５、赤色、平均粒子径＝５ｎｍ、ＢＢＩ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ社製）（実施例２）、球状の金コロイド液（ＯＤ５２０＝１．０）（ＥＭＧＣ１０、赤色、平均粒子径＝１０ｎｍ、ＢＢＩ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ社製）（実施例３）、球状の金コロイド液（ＯＤ５２０＝１．０）（ＥＭＧＣ２０、赤色、平均粒子径＝２０ｎｍ、ＢＢＩ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ社製）（実施例４）、球状の金コロイド液（ＯＤ５２０＝１．０）（ＥＭＧＣ６０、赤色、平均粒子径＝６０ｎｍ、ＢＢＩ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ社製）（実施例５）、球状の金コロイド液（ＯＤ５２０＝１．０）（ＥＭＧＣ８０、赤色、平均粒子径＝８０ｎｍ、ＢＢＩ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ社製）（実施例６）、球状の金コロイド液（ＯＤ５２０＝１．０）（ＥＭＧＣ１００、赤色、平均粒子径＝１００ｎｍ、ＢＢＩ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ社製）（実施例７）を用いる以外は実施例１と同様にして、ｈＣＧ測定用イムノクロマト試験片２〜７を作製し評価した。得られた評価結果を表１に示す。【００５２】
（実施例８）
（１）ｈＣＧ測定用テストライン検出試薬の調製
テストライン検出試薬における検出粒子をセルロース粒子（ＮａｎｏＡｃｔ（登録商標）、ＲＥ２：Ｄａｒｋ  Ｒｅｄ、赤色、平均粒子径３４０ｎｍ、旭化成社製）の代わりに、セルロース粒子（ＮａｎｏＡｃｔ（登録商標）、ＢＬ２：Ｄａｒｋ  Ｎａｖｙ、青色、平均粒子径３６５ｎｍ、旭化成社製）を用いる以外は実施例１と同様にして、ｈＣＧ測定用テストライン検出試薬８を調製した。【００５３】
（２）コントロールライン検出試薬の調製
実施例１と同様にしてＤビオチン−ＢＳＡ溶液を得た。次いで、プレート状の金コロイド液（ＯＤ６１０＝１．０）（Ａｕ−ＷＰＰＬＣ１−Ｃ、青色、平均粒子径＝４５ｎｍ、大日本塗料社製）１４．７ｍＬ、および５０ｍＭのリン酸二水素カリウム（ｐＨ７．５）３００μＬを５０ｍＬの遠沈管に加え、軽く撹拌した。次いで、前記Ｄビオチン−ＢＳＡ溶液１．５ｍＬを加え、軽く撹拌した後、２５℃に調整した低温インキュベーターに入れ１時間静置した。次いで、０．５ｗｔ％のＰＥＧ６，０００（１６９−０９１２５、和光純薬工業社製）７５０μＬを加え、軽く撹拌した後、２５℃に調整した低温インキュベーターに入れ１０分間静置した。次いで、２．０ｗｔ％のＢＳＡ１，５００μＬを加え、軽く撹拌した後、２５℃に調整した低温インキュベーターに入れ１０分間静置した。次いで、遠心分離機とラックインローターとラックを用い、８，０００Ｇの遠心を２５℃で１０分間行い、Ｄビオチン感作金コロイドを沈降させた後に上澄みを除去した。次いで、０．０５ｗｔ％のＰＥＧ６，０００、１５０ｍＭの塩化ナトリウム、１．０ｗｔ％のＢＳＡ、２０ｍＭのトリス緩衝液からなる金コロイド保存液（ｐＨ８．２）１５ｍＬを加え、超音波分散機で１０秒間処理した。次いで、遠心分離機とラックインローターとラックを用い、８，０００Ｇの遠心を２５℃で１０分間行い、Ｄビオチン感作金コロイドを沈降させた後に上澄みを除去した。次いで、０．０５ｗｔ％のＰＥＧ６，０００、３７．５ｍＭの塩化ナトリウム、０．２５ｗｔ％のＢＳＡ、２．５ｗｔ％のスクロース、２０ｍＭのトリス緩衝液からなる金コロイド塗布液（ｐＨ８．２）をＯＤ６１０が３．７５になるよう加え、超音波分散機で１０秒間処理し、コントロールライン検出試薬８を得た。【００５４】
ｈＣＧ測定用テストライン検出試薬１の代わりにｈＣＧ測定用テストライン検出試薬８を、コントロールライン検出試薬１の代わりにコントロールライン検出試薬８を用いる以外は実施例１と同様にして、ｈＣＧ測定用イムノクロマト試験片８を作製し評価した。得られた評価結果を表１に示す。なお、検出粒子の赤から青への変更に伴い、イムノクロマトリーダーの測定モードもＧｏｌｄ  ＣｏｌｌｏｉｄからＬａｔｅｘへ変更した。【００５５】
（実施例９）
コントロールライン検出試薬における検出粒子をプレート状の金コロイド液（ＯＤ６１０＝１．０）（Ａｕ−ＷＰＰＬＣ１−Ｃ、青色、平均粒子径＝４５ｎｍ、大日本塗料社製）の代わりに、プレート状の金コロイド液（ＯＤ６６０＝１．０）（Ａｕ−ＷＰＰＬＣ３−Ｃ、青色、平均粒子径＝１００ｎｍ、大日本塗料社製）（実施例９）を用いる以外は実施例８と同様にして、ｈＣＧ測定用イムノクロマト試験片９を作製し評価した。得られた評価結果を表１に示す。【００５６】
（実施例１０）
（１）ｈＣＧ測定用テストライン検出試薬の調製
５．０ｍｇ／ｍＬの抗ｈＣＧ−βモノクローナル抗体を５０ｍＭのリン酸二水素カリウム（１６６−０４２５５、和光純薬工業社製）（ｐＨ７．０）で１．０ｍｇ／ｍＬに、１０ｗｔ％ラテックス粒子（Ｅｓｔａｐｏｒ（登録商標）Ｋ０３０、赤色、平均粒子径＝３００ｎｍ、Ｍｅｒｋ ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）を５０ｍＭのリン酸二水素カリウム（ｐＨ７．０）で１．０ｗｔ％に、それぞれ調製した。次いで、前記１．０ｗｔ％のラテックス粒子１００μＬ、および前記１．０ｍｇ／ｍＬの抗ｈＣＧ−βモノクローナル抗体１００μＬを１５ｍＬの遠沈管に加え、ボルテックスで撹拌した。次いで、２５℃に調整した低温インキュベーターに入れ６０分間静置した。次いで、１．０ｗｔ％のＢｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍ  ａｌｂｕｍｉｎ：ＢＳＡからなるブロッキング液１２ｍＬを加え、さらに２５℃に調整した低温インキュベーターで６０分間静置した。次いで、遠心分離機とラックインローターとラックを用い、８，０００Ｇの遠心を２５℃で１５分間行い、抗体感作ラテックス粒子を沈降させた後に上澄みを除去した。次いで、１．０ｗｔ％のＢｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍ  ａｌｂｕｍｉｎ：ＢＳＡ、５０ｍＭのリン酸二水素カリウムからなる洗浄液（ｐＨ７．０）１２ｍＬを加え、超音波分散機で１０秒間処理した。次いで、遠心分離機とラックインローターとラックを用い、８，０００Ｇの遠心を２５℃で１５分間行い、抗体感作ラテックス粒子を沈降させた後に上澄みを除去した。次いで、１．０ｗｔ％のＢｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍ  ａｌｂｕｍｉｎ：ＢＳＡ、５０ｍＭのリン酸二水素カリウムからなる塗布液（ｐＨ７．０）２ｍＬを加え、超音波分散機で１０秒間処理し、ｈＣＧ測定用テストライン検出試薬１０を得た。【００５７】
ｈＣＧ測定用テストライン検出試薬１の代わりにｈＣＧ測定用テストライン検出試薬１０を用いる以外は実施例１と同様にして、ｈＣＧ測定用イムノクロマト試験片１０を作製し評価した。得られた評価結果を表１に示す。【００５８】
（実施例１１、１２）
メンブレンカード（Ｈｉ−Ｆｌｏｗ  Ｐｌｕｓ  １２０  Ｍｅｍｂｒａｎｅ  Ｃａｒｄｓ、吸水速度１２０秒／４ｃｍ、ＨＦ１２０、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）の代わりに、メンブレンカード（Ｈｉ−Ｆｌｏｗ  Ｐｌｕｓ  ７５  Ｍｅｍｂｒａｎｅ  Ｃａｒｄｓ、吸水速度７５秒／４ｃｍ、ＨＦ７５、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）（実施例１１）、メンブレンカード（Ｈｉ−Ｆｌｏｗ  Ｐｌｕｓ  １８０  Ｍｅｍｂｒａｎｅ  Ｃａｒｄｓ、吸水速度１８０秒／４ｃｍ、ＨＦ１８０、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）（実施例１２）を用いる以外は実施例１と同様にして、ｈＣＧ測定用イムノクロマト試験片１１、１２を作製し評価した。得られた評価結果を表１に示す。【００５９】
（実施例１３）
テストライン検出試薬における検出抗体を５．０ｍｇ／ｍＬの抗ｈＣＧ−βモノクローナル抗体の代わりに、８．５７ｍｇ／ｍＬの抗ＨｂＡ１ｃモノクローナル抗体（ＨｂＡ１ｃ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ、ＯＡＭＡ０２３２９、ＡＶＩＶＡ  ＳＹＳＴＥＭ  ＢＩＯＬＯＧＹ社製）を、テストラインを形成する捕捉抗体を５．０ｍｇ／ｍＬの抗ｈＣＧ−αモノクローナル抗体の代わりに、３．６ｍｇ／ｍＬの抗Ｈｂモノクローナル抗体（ＨＢＡ１  Ａｎｔｉｂｏｄｙ、ＯＡＭＡ０２３２６、ＡＶＩＶＡ  ＳＹＳＴＥＭ  ＢＩＯＬＯＧＹ社製）を用いる以外は実施例１と同様にして、ＨｂＡ１ｃ測定用イムノクロマト試験片１３を作製した。【００６０】
次いで、市販のＨｂＡ１ｃ標準物質であるＨｂＡ１ｃ測定性能評価用試料（ＱＲＭ  ＨｂＡ１ｃ  ２００７−１、検査医学標準物質機構社製、Ｌ１、Ｌ５）を５０ｍＭのＰＢＳ（１６２−１９３２１、和光純薬工業社製）、１．０ｗｔ％のポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノラウレート：Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０（１６６−２１２１３、和光純薬工業社製）、１．０ｗｔ％のポリオキシエチレン（１０）オクチルフェニルエーテル：ＴｒｉｔｏｎＸ（登録商標）−１００（１６０−２４７５１、和光純薬工業社製）からなる希釈液（ｐＨ７．４）にて１，０００倍に希釈することで、ＨｂＡ１ｃ（％）がＬ１＝５．０１％、Ｌ５＝１１．２６％の希釈ＨｂＡ１ｃ試料（Ｌ１、Ｌ５）を得た。希釈ｈＣＧ試料（１ＩＵ／Ｌ、１００ＩＵ／Ｌ）の代わりに、希釈ＨｂＡ１ｃ試料（Ｌ１、Ｌ５）を使用する以外は実施例１と同様にして、ＨｂＡ１ｃ測定用イムノクロマト試験片１３を評価した。得られた評価結果を表１に示す。【００６１】
【表１】
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【００６２】
（比較例１、２）
コントロールライン検出試薬における検出粒子を球状の金コロイド液（ＯＤ５２０＝１．０）（ＥＭＧＣ４０、赤色、平均粒子径＝４０ｎｍ、ＢＢＩ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ社製）の代わりに、球状の金コロイド液（ＯＤ５２０＝１．０）（ＥＭＧＣ２、赤色、平均粒子径＝２ｎｍ、ＢＢＩ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ社製）（比較例１）、球状の金コロイド液（ＯＤ５２０＝１．０）（ＥＭＧＣ２００、赤色、平均粒子径＝２００ｎｍ、ＢＢＩ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ社製）（比較例２）を用いる以外は実施例１と同様にして、ｈＣＧ測定用イムノクロマト試験片１４、１５を作製し評価した。得られた評価結果を表２に示す。【００６３】
（比較例３）
（２）コントロールライン検出試薬の調製
実施例１と同様にしてＤビオチン−ＢＳＡ溶液を得た。次いで、次いで、１０ｗｔ％ラテックス粒子（Ｅｓｔａｐｏｒ（登録商標）Ｋ０３０、赤色、平均粒子径＝３００ｎｍ、Ｍｅｒｋ ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）を５０ｍＭのリン酸二水素カリウム（ｐＨ７．０）で１．０ｗｔ％に調製した。次いで、前記１．０ｗｔ％のラテックス粒子１００μＬ、および前記Ｄビオチン−ＢＳＡ溶液１００μＬを１５ｍＬの遠沈管に加え、ボルテックスで撹拌した。次いで、２５℃に調整した低温インキュベーターに入れ６０分間静置した。次いで、１．０ｗｔ％のＢｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍ  ａｌｂｕｍｉｎ：ＢＳＡからなるブロッキング液１２ｍＬを加え、さらに２５℃に調整した低温インキュベーターで６０分間静置した。次いで、遠心分離機とラックインローターとラックを用い、８，０００Ｇの遠心を２５℃で１５分間行い、Ｄビオチン感作ラテックス粒子を沈降させた後に上澄みを除去した。次いで、１．０ｗｔ％のＢｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍ  ａｌｂｕｍｉｎ：ＢＳＡ、５０ｍＭのリン酸二水素カリウムからなる洗浄液（ｐＨ７．０）１２ｍＬを加え、超音波分散機で１０秒間処理した。次いで、遠心分離機とラックインローターとラックを用い、８，０００Ｇの遠心を２５℃で１５分間行い、Ｄビオチン感作ラテックス粒子を沈降させた後に上澄みを除去した。次いで、１．０ｗｔ％のＢｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍ  ａｌｂｕｍｉｎ：ＢＳＡ、５０ｍＭのリン酸二水素カリウムからなる塗布液（ｐＨ７．０）２ｍＬを加え、超音波分散機で１０秒間処理しコントロールライン検出試薬１６を得た。【００６４】
コントロールライン検出試薬１の代わりにコントロールライン検出試薬１６を用いる以外は実施例１と同様にして、ｈＣＧ測定用イムノクロマト試験片１６を作製し評価した。得られた評価結果を表２に示す。【００６５】
（比較例４）
ｈＣＧ測定用テストライン検出試薬１の代わりにｈＣＧ測定用テストライン検出試薬１０を用いる以外は比較例３と同様にして、ｈＣＧ測定用イムノクロマト試験片１７を作製し評価した。得られた評価結果を表２に示す。【００６６】
比較例１、３および４で示されるように、テストラインに捕捉される検出粒子Ａの平均粒子径と前記コントロールラインに捕捉される検出粒子Ｂの平均粒子径の比が３：１より小さいと、テストライン検出試薬がテストラインで捕捉されるまでの滞留時間の方が、コントロールライン検出試薬がコントロールラインで捕捉されるまでの滞留時間より短くなり、コントロールラインの発色強度による補正が不十分となる結果、測定精度が悪化した。実際、テストラインの反射吸光度自体のＣＶは約６％なのに対して、補正後のＣＶは５．８％と補正の効果はわずかであった。【００６７】
また、比較例２で示されるように、テストラインに捕捉される検出粒子Ａの平均粒子径と前記コントロールラインに捕捉される検出粒子Ｂの平均粒子径の比が１００：１より大きいと、テストライン検出試薬がテストラインで捕捉されるまでの滞留時間の方が、コントロールライン検出試薬がコントロールラインで捕捉されるまでの滞留時間より長くなり、コントロールラインの発色強度による補正が不十分となる結果、測定精度が悪化した。実際、テストラインの反射吸光度自体のＣＶは約６％なのに対して、補正後のＣＶは７．２％と補正による測定精度はかえって悪化した。また、検出粒子Ｂの平均粒子径が２ｎｍと小さいため、標識できる低分子化合物量が低下した結果、コントロールラインが不明瞭であった。【００６８】
【表２】
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【産業上の利用可能性】
【００６９】
本発明のイムノクロマト試験片を私用することで、測定試料中に含まれる測定対象物質を迅速・簡便・安価でかつ測定精度よく測定できるので、産業に寄与することが大である。
【符号の説明】
【００７０】
１：サンプルパッド
２：コンジュゲーションパッド
３：メンブレン
４：吸収パッド
５：バッキングシート
６：テストライン
７：コントロールライン
８：粘着シート
【図１】
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【図２】
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【国際調査報告】
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