(57)【要約】  自己集合体を形成する新規化合物、その自己集合体並びにこれらの製法及び医薬用途が提供される。式（Ｉ）：2020045570.tif 000037［式中、Ｒｘは、Ｈ又は式（ＩＩ）：2020045570.tif 000038で示される基であり、  Ｒｙは、Ｈ又は式（ＩＩＩ）：2020045570.tif 000039で示される基であり、  Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３及びＲ４は、それぞれ独立して、Ｈ、Ｃ１−６アルキル又はＣ１−６ハロアルキルであり、  波線は結合部位を示し、  ｎは１〜１２の整数である］で示される化合物、その自己集合体並びにこれらの製法及び医薬用途。
2020045570.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
式（Ｉ）：
【化１】
2020045570.tif 000029
［式中、Ｒｘは、Ｈ又は式（ＩＩ）：
【化２】
2020045570.tif 000030
で示される基であり、
Ｒｙは、Ｈ又は式（ＩＩＩ）：
【化３】
2020045570.tif 000031
で示される基であり、
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３及びＲ４は、それぞれ独立して、Ｈ、Ｃ１−６アルキル又はＣ１−６ハロアルキルであり、
波線は結合部位を示し、
ｎは１〜１２の整数である］
で示される化合物が非共有結合により連結してなる、自己集合体。
【請求項２】
ＲｘがＲｙと同一である、請求項１に記載の自己集合体。
【請求項３】
Ｒｘが式（ＩＩ’）：
【化４】
2020045570.tif 000032
で示される基であり、
Ｒｙが式（ＩＩＩ’）：
【化５】
2020045570.tif 000033
で示される基である、請求項１又は２に記載の自己集合体。
【請求項４】
Ｒ３及びＲ４がそれぞれ独立してＣ１−３アルキルである、請求項１〜３のいずれかに記載の自己集合体。
【請求項５】
Ｒｘ及びＲｙがともにＨである、請求項１又は２に記載の自己集合体。
【請求項６】
ｎが５〜１０の整数である、請求項１〜５のいずれかに記載の自己集合体。
【請求項７】
流体力学的サイズ４０ｎｍ〜１２，０００ｎｍを有する凝集体を形成する、請求項１〜６のいずれかに記載の自己集合体。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれかに記載の自己集合体を含む、免疫賦活剤。
【請求項９】
アジュバントである、請求項８に記載の免疫賦活剤。
【請求項１０】
請求項９に記載の免疫賦活剤及び抗原を含む、ワクチン組成物。
【請求項１１】
がん、感染症、アレルギー疾患、自己免疫疾患、高血圧症及びアルツハイマー病からなる群から選択される疾患の治療及び／又は予防のための、請求項１０に記載のワクチン組成物。
【請求項１２】
式（Ｉ）：
【化６】
2020045570.tif 000034
［式中、Ｒｘは、Ｈ又は式（ＩＩ）：
【化７】
2020045570.tif 000035
で示される基であり、
Ｒｙは、Ｈ又は式（ＩＩＩ）：
【化８】
2020045570.tif 000036
で示される基であり、
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３及びＲ４は、それぞれ独立して、Ｈ、Ｃ１−６アルキル又はＣ１−６ハロアルキルであり、
波線は結合部位を示し、
ｎは１〜１２の整数である］
で示される化合物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、自己集合体を形成する新規化合物、その自己集合体並びにこれらの製法及び医薬用途に関する。
【背景技術】
【０００２】
生体における生物学的階層構造の形成において、分子の自発的な自己組織化である自己集合は重要な役割を担っている。例えば、ＤＮＡ、脂質膜や細胞骨格線維等は天然の自己集合体の一例である。一般に、単一の化合物分子は単一の機能を有するのに対し、自己集合体は周囲環境に応じて複雑な物理的又は化学的な特性や機能を有する（非特許文献１）。そのため、新たな自己集合体の合成は、生物系の機能や生物活性を調節する医薬品開発の新たな手法の一つとして注目されている。【０００３】
生物活性のうち免疫賦活作用に関して、１９２０年代にアルミニウム化合物を用いたアジュバントが開発されて以来、種々の免疫賦活剤がジフテリアやインフルエンザ等の感染症等の疾患のワクチンに用いられている。これらの免疫賦活剤には、トール様受容体（ＴＬＲ）等のパターン認識受容体に作用することにより免疫細胞を活性化するものがあり、例えば非メチル化ＣＧ配列を含む合成オリゴヌクレオチド（ＣｐＧ−ＯＤＮ）等が知られている（非特許文献２）。このように、天然の自己集合構造を模した自己集合体がいくつか報告されているが、そのほとんどがペプチドを自己集合体の構成単位としている。非ペプチド合成化学分子の自己集合体の例もいくつか知られているが、それらの生物活性は主に細胞毒性や細胞死に関するものである（非特許文献３〜１０）。したがって、生物活性を示す新規かつ有用なさらなる合成化学分子の自己集合体が望まれている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Li, J. et al., J. Am. Chem. Soc. 2013, 135, 542-545
【非特許文献２】K. J. Ishii et al., Proceedings of the National Academy of Sciences, February 25, 2014, 111(8) pp. 3086-3091
【非特許文献３】Pires, R. A. et al., J. Am. Chem. Soc. 2015, 137, 576-579
【非特許文献４】Zhou, J. et al., J. Am. Chem. Soc. 2016, 138, 3813-3823
【非特許文献５】Tanaka, A. et al., J. Am. Chem. Soc. 2015, 137, 770-775
【非特許文献６】Edwards, A. M. et al., Nat. Chem. Bio. 2009, 5, 436
【非特許文献７】Wolan, D. W. et al., J. A. Science 2009, 326, 853
【非特許文献８】Zorn, J. A. et al., J. Am. Chem. Soc. 2011, 133, 19630-19633
【非特許文献９】Ji, W. et al., Chem. Commun. 2016, 52, 12574-12577
【非特許文献１０】Z. Feng et al., J. Am. Chem. Soc. 2017, 139(43) pp. 15377-15384
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明が解決しようとする課題の一つは、自己集合体を形成する新規化合物、その自己集合体並びにこれらの製法及び医薬用途を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究を重ねた結果、胆汁酸に特定の化学修飾がなされた部分構造をもつ小分子化合物が新たな自己集合体を形成し、当該自己集合体が免疫賦活作用を示すことを見出し、本発明を完成した。【０００７】
ある態様において、式（Ｉ）：
【化１】
2020045570.tif 000003
［式中、Ｒｘは、Ｈ又は式（ＩＩ）：
【化２】
2020045570.tif 000004
で示される基であり、
Ｒｙは、Ｈ又は式（ＩＩＩ）：
【化３】
2020045570.tif 000005
で示される基であり、
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３及びＲ４は、それぞれ独立して、Ｈ、Ｃ１−６アルキル又はＣ１−６ハロアルキルであり、
波線は結合部位を示し、
ｎは１〜１２の整数である］
で示される化合物が非共有結合により連結してなる自己集合体が提供される。【０００８】
別の態様において、式（Ｉ）の化合物が連結してなる自己集合体の医薬用途が提供される。【０００９】
さらに別の態様において、式（Ｉ）の化合物が提供される。【００１０】
さらに別の態様において、式（Ｉ）の化合物が連結してなる自己集合体の製造方法が提供される。
【発明の効果】
【００１１】
式（Ｉ）の化合物が連結してなる自己集合体は、生物活性、例えば免疫賦活作用を示すことができ、アジュバントとして有用であり得る。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】図１は化合物ライブラリーのうち自己集合体を形成した化合物（Hit compounds）の流体力学的直径（ｎｍ）（縦軸）を示す。
【図２】図２は種々の濃度（μＭ）のＤＭＥＭ溶液中の実施例１化合物、参考例２化合物及び参考例３化合物の自己集合体の流体力学的半径（平均Ｒｈ（ｎｍ））（縦軸）を示す。
【図３】図３は種々の濃度（μＭ）のＤＭＥＭ溶液中の実施例１化合物の自己集合体のＩＬ−６産生量（ｎｇ／ｍＬ）（縦軸）を示す。
【図４】図４は３０μＭ ＤＭＥＭ溶液中の実施例１及び参考例１〜３化合物のＩＬ−６産生量（ｎｇ／ｍＬ）（縦軸）を示す。ＤＣＡはデオキシコール酸の結果を示す。ＮＣは陰性対照である１％（ｖ／ｖ）ＤＭＳＯ、ＬＰＳは陽性対照である。
【図５】図５は３０μＭ ＤＭＥＭ溶液中の各実施例化合物の自己集合体のＩＬ−６産生量について陰性対照（ＤＭＳＯ）を１とした場合の相対値（縦軸）を示す。
【図６】図６は３０μＭ ＤＭＥＭ溶液中の実施例１化合物の自己集合体の粒度分布（％）を示す（右側）。左側の分布は血清由来の粒度分布（％）を示す。
【図７】図７は実施例１化合物の自己集合体の各濃度について左から遠心分離前及び後のＩＬ−６産生量（ｎｇ／ｍＬ）を示す。エラーバーは標準偏差（ｎ＝３）を示す。
【図８】図８はＢＭＤＣにおけるＩＬ−６産生量（ｐｇ／ｍＬ）を示す。各試験物質における各プロットは、左からそれぞれ５、１０、３０、５０及び１００μＭでの結果を示す。エラーバーは標準偏差（ｎ＝１〜２）を示す。
【図９】図９はＦｃＲγ／ＭｙＤ８８ダブルノックアウトＢＭＤＣ（右）及び野生型ＢＭＤＣ（ＷＴ）（左）を用いたＩＬ−６ ＥＬＩＳＡアッセイ結果（ｎｇ／ｍＬ）を示す。実施例１化合物の自己集合体は３０μＭ ＤＭＥＭ溶液、ＬＰＳは１００ｎｇ／ｍＬ、カードランは１００ｎｇ／ｍＬ、ＴＤＭは１μg／ウェルにて用いた。データは平均値±標準偏差を示す。エラーバーは標準偏差（ｎ＝２）を示す。
【図１０】図１０は野生型（左）及びＦｃＲγノックアウトＢＭＤＣ（右）を用いた実施例１化合物の自己集合体（３０μＭ ＤＭＥＭ溶液）のＩＬ−６産生量（ｎｇ／ｍＬ）を示す。データは平均値±標準偏差を示す。エラーバーは標準偏差（ｎ＝３）を示す。
【図１１】図１１は野生型（左）及びＭｙＤ８８ノックアウトＢＭＤＣ（右）を実施例１化合物の自己集合体（３０μＭ ＤＭＥＭ溶液）のＩＬ−６産生量（ｐｇ／ｍＬ）を示す。データは平均値±標準偏差を示す。エラーバーは標準偏差（ｎ＝２）を示す。
【図１２】図１２は野生型（ＷＴ）及びＴＬＲ７ノックアウト（Ｔｌｒ７−／−）マウスのＩＬ−６産生量（ｐｇ／ｍＬ）を示す。各試験物質における左側のバーは野生型の結果を示し、右側のバーはＴＬＲ７ノックアウトマウスの結果を示す。
【図１３】図１３は野生型（ＷＴ）及びＴＬＲ７ノックアウト（ＫＯ）マウスのＩＬ−６産生量（ｎｇ／ｍＬ）を示す。エラーバーは標準偏差（ｎ＝１〜３）を示す。
【図１４】図１４は野生型（ＷＴ）及びＴＬＲ９ノックアウト（ＫＯ）マウスのＩＬ−６産生量（ｎｇ／ｍＬ）を示す。エラーバーは標準偏差（ｎ＝１〜３）を示す。
【図１５】図１５は抗ＯＶＡ総抗体（ＩｇＧ）価（１０ｎ）を示す。各試験物質における各プロットは、左からそれぞれ１、１０及び１００μｇでの結果を示す。エラーバーは標準偏差（ｎ＝４）を示す。ＤＣＡ（１００μｇ）に対する有意差として、＊はｐ＜０．０５を示し、＊＊はｐ＜０．０１を示し、＊＊＊はｐ＜０．００１を示す。
【図１６】図１６は抗ＯＶＡ抗体（ＩｇＧ１）価（１０ｎ）を示す。各試験物質における各プロットは、左からそれぞれ１、１０及び１００μｇでの結果を示す。エラーバーは標準偏差（ｎ＝４）を示す。ＤＣＡ（１００μｇ）に対する有意差として、＊はｐ＜０．０５を示し、＊＊はｐ＜０．０１を示し、＊＊＊はｐ＜０．００１を示す。
【図１７】図１７は抗ＯＶＡ抗体（ＩｇＧ２ｃ）価（１０ｎ）を示す。各試験物質における各プロットは、左からそれぞれ１、１０及び１００μｇでの結果を示す。エラーバーは標準偏差（ｎ＝４）を示す。ＤＣＡ（１００μｇ）に対する有意差として、＊はｐ＜０．０５を示す。
【図１８】図１８は抗ＯＶＡ抗体（ＩｇＥ）の産生量（ｎｇ／ｍＬ）を示す。各試験物質における各バーは、左からそれぞれ１、１０及び１００μｇでの結果を示す。エラーバーは標準偏差（ｎ＝４）を示す。
【図１９Ａ】図１９Ａは抗ＨＡ抗体（ＩｇＧ１）価（１０ｎ）を示す。各試験物質における各バーは、左からそれぞれ１、１０及び１００μｇでの結果を示す。エラーバーは標準偏差（ｎ＝３）を示す。
【図１９Ｂ】図１９Ｂは抗ＨＡ抗体（ＩｇＧ２ｃ）価（１０ｎ）を示す。各試験物質における各バーは、左からそれぞれ１、１０及び１００μｇでの結果を示す。エラーバーは標準偏差（ｎ＝３）を示す。
【図２０Ａ】図２０Ａはインフルエンザ感染後の日数（横軸）と体重減少率（％）（縦軸）の関係を示す。●は実施例１化合物の自己集合体、■は実施例７化合物の自己集合体、▲は実施例１０化合物の自己集合体、◆はＤＣＡ、×は１％ＤＭＳＯ、▼はアルミニウム塩をそれぞれ用いた場合のデータを示す。エラーバーは標準偏差（ｎ＝３）を示す。
【図２０Ｂ】図２０Ｂはインフルエンザ感染後の日数（横軸）と生存率（％）（縦軸）の関係を示す。●は実施例１化合物の自己集合体、■は実施例７化合物の自己集合体、◆はＤＣＡ、×は１％ＤＭＳＯ、▼はアルミニウム塩をそれぞれ用いた場合のデータを示す。エラーバーは標準偏差（ｎ＝３）を示す。
【図２１Ａ】図２１Ａは実施例１０化合物の自己集合体の各投与量（●：１μｇ、▲：１０μｇ、■：１００μｇ）に対するインフルエンザＳＶ注射後の日数（横軸）と体重減少率（％）（縦軸）の関係を示す。×は１％ＤＭＳＯ、▼はアルミニウム塩をそれぞれ用いた場合のデータを示す。エラーバーは標準偏差（ｎ＝３）を示す。
【図２１Ｂ】図２１Ｂは実施例１０化合物の自己集合体の各投与量（●：１μｇ、▲：１０μｇ、■：１００μｇ）に対するインフルエンザＳＶ注射後の日数（横軸）と生存率（％）（縦軸）の関係を示す。×は１％ＤＭＳＯ、▼はアルミニウム塩をそれぞれ用いた場合のデータを示す。エラーバーは標準偏差（ｎ＝３）を示す。
【図２２Ａ】図２２Ａはインフルエンザ感染後の日数（横軸）と体重減少率（％）（縦軸）の関係についての実施例１０化合物の自己集合体（▲）と対照（◆：ＤＣＡ）の比較を示す。エラーバーは標準偏差（ｎ＝３）を示す。＊はｐ＜０．０５を示す。
【図２２Ｂ】図２２Ｂはインフルエンザ感染後の日数（横軸）と生存率（％）（縦軸）の関係についての実施例１０化合物の自己集合体（▲）と対照（◆：ＤＣＡ）の比較を示す。エラーバーは標準偏差（ｎ＝３）を示す。
【図２３】図２３はＨＥＫ２９３細胞を用いた、アゴニストなし（ｎｕｌｌ）及びＴＬＲ９に対するＳＥＡＰアッセイ結果を示す。横軸の濃度はＤＭＥＭ溶液中の実施例１化合物の自己集合体の濃度（μＭ）を示す。エラーバーは標準偏差（ｎ＝２）を示す。
【図２４】図２４はＨＥＫ２９３細胞を用いた、アゴニストなし（ｎｕｌｌ）、ＴＬＲ２及びＴＬＲ４に対するＳＥＡＰアッセイ結果を示す。横軸の濃度はＤＭＥＭ溶液中の実施例１化合物の自己集合体の濃度（μＭ）を示す。データは平均値±標準偏差を示す。エラーバーは標準偏差（ｎ＝２）を示す。
【図２５】図２５はＩＬ−６定量的ＰＣＲアッセイ結果（ｑＰＣＲ）を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本発明の具体的態様を以下に例示する。
［項１］
式（Ｉ）：
【化４】
2020045570.tif 000006
［式中、Ｒｘは、Ｈ又は式（ＩＩ）：
【化５】
2020045570.tif 000007
で示される基であり、
Ｒｙは、Ｈ又は式（ＩＩＩ）：
【化６】
2020045570.tif 000008
で示される基であり、
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３及びＲ４は、それぞれ独立して、Ｈ、Ｃ１−６アルキル又はＣ１−６ハロアルキルであり、
波線は結合部位を示し、
ｎは１〜１２の整数である］
で示される化合物が非共有結合により連結してなる、自己集合体。
【００１４】
［項２］
ＲｘがＲｙと同一である、項１に記載の自己集合体。
【００１５】
［項３］
Ｒｘが式（ＩＩ’）：
【化７】
2020045570.tif 000009
で示される基であり、
Ｒｙが式（ＩＩＩ’）：
【化８】
2020045570.tif 000010
で示される基である、項１又は２に記載の自己集合体。
【００１６】
［項４］
Ｒ３及びＲ４がそれぞれ独立してＣ１−３アルキルである、項１〜３のいずれかに記載の自己集合体。
【００１７】
［項５］
Ｒｘ及びＲｙがともにＨである、項１又は２に記載の自己集合体。
【００１８】
［項６］
ｎが５〜１０の整数である、項１〜５のいずれかに記載の自己集合体。
【００１９】
［項７］
流体力学的サイズ４０ｎｍ〜１２，０００ｎｍを有する凝集体を形成する、項１〜６のいずれかに記載の自己集合体。
【００２０】
［項８］
項１〜７のいずれかに記載の自己集合体を含む、免疫賦活剤。
【００２１】
［項９］
アジュバントである、項８に記載の免疫賦活剤。
【００２２】
［項１０］
項９に記載の免疫賦活剤及び抗原を含む、ワクチン組成物。
【００２３】
［項１１］
がん、感染症、アレルギー疾患、自己免疫疾患、高血圧症及びアルツハイマー病からなる群から選択される疾患の治療及び／又は予防のための、項１０に記載のワクチン組成物。
【００２４】
［項１２］
式（Ｉ）：
【化９】
2020045570.tif 000011
［式中、Ｒｘは、Ｈ又は式（ＩＩ）：
【化１０】
2020045570.tif 000012
で示される基であり、
Ｒｙは、Ｈ又は式（ＩＩＩ）：
【化１１】
2020045570.tif 000013
で示される基であり、
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３及びＲ４は、それぞれ独立して、Ｈ、Ｃ１−６アルキル又はＣ１−６ハロアルキルであり、
波線は結合部位を示し、
ｎは１〜１２の整数である］
で示される化合物。
【００２５】
用語「Ｃ１−１２アルキル」とは、炭素数１〜１２の直鎖状又は分枝鎖状の飽和炭化水素基をいう。「Ｃ１−１２アルキル」としては、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ｎ−ペンチル、イソペンチル、ネオペンチル、１，１−ジメチルプロピル、１−エチルプロピル、ｎ−ヘキシル、イソヘキシル、３，３−ジメチルブチル、２，２−ジメチルブチル、１，１−ジメチルブチル、２−エチルブチル、ｎ−ヘプチル、２−メチルヘキシル、２，２−ジメチルペンチル、２，２，３−トリメチルブチル、ｎ−オクチル、３，４−ジメチルヘキシル、２，２，４−トリメチルペンチル、ｎ−ノニル、ｎ−デカニル、ｎ−ウンデカニル、ｎ−ドデカニル等が挙げられる。「Ｃ１−６アルキル」としては、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ｎ−ペンチル、イソペンチル、ネオペンチル、１，１−ジメチルプロピル、１−エチルプロピル、ｎ−ヘキシル、イソヘキシル、３，３−ジメチルブチル、２，２−ジメチルブチル、１，１−ジメチルブチル、２−エチルブチル等が挙げられる。
【００２６】
用語「Ｃ１−１２ハロアルキル」とは、１つ以上の任意の水素原子が同一又は異なるハロゲンで置き換えられたＣ１−１２アルキルをいう。「Ｃ１−１２ハロアルキル」としては、ジフルオロメチル、トリフルオロメチル、２−フルオロエチル、２−クロロエチル、２，２−ジフルオロエチル、２，２，２−トリフルオロエチル、ペンタフルオロエチル、１，１−ジフルオロプロピル、３，３，３−トリフルオロプロピル、２，２，２−トリフルオロ−１−メチル−エチル、１，１−ジフルオロ−２−メチルプロピル、４−クロロブチル、５−フルオロペンチル等が挙げられる。
【００２７】
用語「ハロ」又は「ハロゲン」としては、フルオロ、クロロ、ブロモ、ヨード等が挙げられる。
【００２８】
用語「自己集合体」とは、分子の自発的な自己組織化として定義される自己集合（self-assembling）により形成される、当該分子を構成単位とする集合体をいい、２つ以上の分子が非共有結合により連結して形成される、ミセル状、繊維状、結晶状、コロイド状又は粒子状の凝集体である。ここで、非共有結合としては、疎水結合、π−πスタッキング、水素結合、ファンデルワールス結合及びこれらの任意の組合せが挙げられる。自己集合体を構成する分子としては、胆汁酸に特定の化学修飾がなされた部分構造をもつ小分子化合物が挙げられ、好ましくは式（Ｉ）の化合物である。自己集合体は、複数の疎水性ポケットを有していてもよく、この疎水性ポケットを介して他の分子及び抗原等の種々の物質を集合体構造中に取り込むことができる。自己集合体はまた、Ｒｘ、Ｒｙ及びＲ１〜Ｒ４の相違に基づく異なる構造を有する式（Ｉ）の化合物の集合体であってもよく、また式（Ｉ）の化合物以外の化合物が混入して集合体を形成したものも包含される。自己集合体はまた、構成単位となる分子の化学修飾により、その構造及び特性を適宜コントロールすることができる。自己集合体は、膜タンパク質との相互作用を通じて免疫賦活作用を示してもよい。自己集合体の流体力学的サイズは、特に限定されるものではなく、培地中濃度、血中濃度及び組織中濃度等の周囲環境に依存しうるが、例えば４０〜１２，０００ｎｍであり、好ましくは４５〜５，０００ｎｍであり、より好ましくは１００〜１，０００ｎｍであり、さらに好ましくは１４０〜８００ｎｍであり、特に好ましくは１５０〜５００ｎｍである。ここで、用語「流体力学的サイズ」は、流体力学的直径をいい、例えば動的光散乱法（ＤＬＳ）を用いて測定してもよい。自己集合体はまた、その培地中濃度、血中濃度又は組織中濃度が上昇するに従い、免疫賦活作用が上昇しうる。
【００２９】
用語「免疫賦活作用」とは、細胞表面にあるパターン認識受容体に対する内因性又は外因性アゴニスト活性をいう。当該アゴニスト活性によりマクロファージや樹状細胞等の抗原提示細胞が活性化されてインターロイキン等のサイトカインが産生されうる。免疫賦活作用は、好ましくはトール様受容体（ＴＬＲ）に対するアゴニスト活性であり、より好ましくはＴＬＲ７アゴニスト活性又はＴＬＲ９アゴニスト活性であり、特に好ましくはＴＬＲ７アゴニスト活性である。免疫賦活作用はまた、自己集合体の流体力学的サイズが大きくなると、増大しうる。ＴＬＲ７はウイルス由来の一本鎖ＲＮＡ又は合成低分子リガンドを感知することにより、インターフェロン等の産生を促すため、ＴＬＲ７アゴニストは免疫賦活作用を示し、例えば、感染症及び自己免疫疾患等の種々の疾患の治療薬として有用でありうる。ＴＬＲ９は一般にバクテリア及びウイルスに見られ、非メチル化ＤＮＡに対する自然免疫応答及び適応免疫応答を刺激する役割を担うため、ＴＬＲ９アゴニストはワクチン組成物に用いられる抗原の免疫原性を向上しうる。
【００３０】
用語「免疫賦活剤」とは、免疫賦活作用を示す物質又は組成物をいい、種々の疾患の免疫療法に用いうる。免疫賦活剤は、自己集合体を含有してもよい。免疫賦活剤を、抗原又は抗原を含むワクチン組成物と併用した場合、その抗原に対する免疫原性が獲得又は増強され、免疫持続期間が延長されうる。免疫賦活剤は、それのみで投与してもよく、抗原又は抗原を含むワクチン組成物と一定間隔を空けて別々に、連続して又は同時に投与されるように用いてもよく、或いは、ワクチン組成物の含有成分として用いてもよい。免疫賦活剤としては、例えばアジュバントが挙げられる。免疫賦活剤に含有される自己集合体の量は、免疫学的に許容される量であれば特に制限されるものではないが、例えば０．１〜２０ｗ／ｗ％、好ましくは０．２〜１５ｗ／ｗ％、より好ましくは０．３〜１０ｗ／ｗ％、特に好ましくは０．５〜５ｗ／ｗ％である。
【００３１】
用語「抗原」とは、免疫応答を生じさせる物質をいい、例えばペプチド又はタンパク質が挙げられる。抗原としては、がん抗原、ウイルス抗原、細菌性抗原、真菌性抗原、原虫性又は寄生虫性抗原、アレルギー関連抗原、疾患関連抗原が挙げられる。
【００３２】
用語「ワクチン組成物」とは、抗原を含む組成物をいい、種々の疾患の免疫療法に用いうる。ワクチン組成物は、それのみで投与してもよく、免疫賦活剤と一定間隔を空けて別々に、連続して又は同時に投与されるように用いてもよく、或いは、免疫賦活剤を含有するワクチン組成物として用いてもよい。ワクチン組成物はまた、医薬的に許容される担体を含んでもよい。当該医薬的に許容される担体としては、当分野で通常用いられる賦形剤、等張化剤、緩衝剤、ｐＨ調節剤、懸濁化剤、保存剤等の添加物が挙げられる。ワクチン組成物は、当分野で通常用いられる投与経路で投与してもよい。当該投与経路としては、経口投与；又は静脈内注射、動脈内注射、皮下注射、皮内注射、筋肉内注射、髄腔内投与、経皮投与等の非経口投与が挙げられる。ワクチン組成物に含有される各成分の量は、当分野で通常用いられる、免疫学的に許容される量であれば、特に制限されない。
【００３３】
用語「疾患」としては、がん（例えば白血病、リンパ腫、神経性腫瘍、メラノーマ、乳癌、肺癌、頭頸部癌、胃癌、結腸癌、肝癌、膵癌、子宮頸癌、子宮癌、卵巣癌、腟癌、精巣癌、前立腺癌、陰茎癌、骨腫瘍、血管腫瘍、口唇癌、上咽頭癌、咽頭癌、食道癌、直腸癌、胆嚢癌、胆管癌、喉頭癌、肺癌、膀胱癌、腎臓癌、脳腫瘍、甲状腺癌、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫等）、感染症（例えばインフルエンザ、ヒト免疫不全症候群（ＨＩＶ）、ウイルス性肝炎等の肝炎、エボラ出血熱等のウイルス感染症；百日咳、ジフテリア、破傷風、結核、ヘリコバクター・ピロリ、肺炎球菌等による細菌感染症；カンジダ等の真菌感染症；マラリア等の原虫性又は寄生虫性感染症等）、アレルギー疾患（例えばアトピー性皮膚炎、アレルギー性鼻炎、喘息等）、自己免疫疾患（例えば糖尿病（１型糖尿病及び２型糖尿病を含む）、多発性硬化症、関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、乾癬等）、高血圧症、アルツハイマー病が挙げられる。
【００３４】
ある態様において、Ｒｘ及びＲｙはともにＨである。
【００３５】
Ｒ１及びＲ２は、好ましくは同一である。Ｒ１及びＲ２は、好ましくはＨ、Ｃ１−３アルキル又はＣ１−３ハロアルキルであり、より好ましくはＨ又はイソプロピルである。特に好ましくは、Ｒ１及びＲ２はともにＨである。
【００３６】
Ｒ３及びＲ４は、好ましくは同一である。Ｒ３及びＲ４は、好ましくはＣ１−３アルキル又はＣ１−３ハロアルキルであり、より好ましくはＣ１−３アルキルであり、特に好ましくはメチル又はエチルである。
【００３７】
ｎは、好ましくは２〜１２であり、より好ましくは５〜１０であり、特に好ましくは５〜８である。
【００３８】
式（Ｉ）の化合物は、好ましくは式（Ｉ−１）：
【化１２】
2020045570.tif 000014
［式中、Ｒｘ、Ｒｙ及びｎは式（Ｉ）におけるものと同義である］
で示される化合物である。
【００３９】
本明細書において、以下の略語を用いることがある。
Ｅｘ．：実施例化合物、又は試験例においては当該実施例化合物の自己集合体を示す場合もある。
ＲＥｘ．：参考例
ＡＮＳ：８−アニリノ−１−ナフタレンスルホン酸
ＢＭＤＣ：骨髄由来樹状細胞
ＤＭＡＰ：Ｎ，Ｎ−ジメチル−４−アミノピリジン
ＤＭＥＭ：ダルベッコ改変イーグル培地
ＤＭＳＯ：ジメチルスルホキシド
Ｅｔ：エチル
ＥｔＯＨ：エタノール
ＦＢＳ：ウシ胎児血清
ＧＭ−ＣＳＦ：顆粒球単球コロニー刺激因子
ｉＰｒ：イソプロピル
ＬＰＳ：リポ多糖
ＭＧＭ−５：
ＯＶＡ：オボアルブミン
ＰＢＳ：リン酸緩衝生理食塩水
ＲＰＭＩ：ロズウェルパーク記念研究所培地
ＴＤＭ：トレハロース−６，６’−ジミコレート
ＴＬＣ：薄層クロマトグラフィー
ＷＳＣＩ・ＨＣｌ：１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩
ＷＴ：野生型
【００４０】
［一般製法１］
式（Ｉ）の化合物は、例えば以下のスキームで示されるウギ反応に従い製造することができる。
【化１３】
2020045570.tif 000015
［スキーム中、Ｒａ−ＣＯＯＨは胆汁酸、例えば一次胆汁酸又は二次胆汁酸、好ましくはデオキシコール酸であり、
ＲｂはＣ１−１２アルキルであり、好ましくはＣ２−１０アルキルであり、より好ましくはＣ５−１０アルキルであり、特に好ましくはＣ５−８アルキルであり、
ＲｃはＨ、Ｃ１−６アルキル又はＣ１−６ハロアルキルであり、
ＲｄはＣＨ２Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−Ｒ３又はＣＨ２Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−Ｒ４であり、
Ｒ３及びＲ４は前記定義されるとおりである］
化合物（ａ）、（ｂ）、（ｃ）及び（ｄ）を溶媒中で縮合反応させることにより式（Ｉ）の化合物を得ることができる。縮合反応は、化合物（ｂ）及び（ｃ）を混合してイミン中間体を得た後、当該混合物に化合物（ａ）及び（ｄ）を添加して行ってもよい。溶媒としては、メタノール又はエタノール等のアルコール、ＤＭＦ等の非プロトン性極性溶媒が挙げられ、好ましくはエタノールである。反応温度は、室温から６０℃である。
【００４１】
［一般製法２］
式（Ｉ）の化合物はまた、Ｒｘ及びＲｙがともにＨである場合、例えば以下の方法に従い製造することができる。
化合物（ａ）、化合物（ｂ）及び脱水縮合剤を、溶媒中、適宜塩基存在下にて縮合反応させることにより式（Ｉ）の化合物を得ることができる。脱水縮合剤としては、ＷＳＣＩ・ＨＣｌ、Ｎ，Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド等のカルボジイミドが挙げられる。塩基としては、ＤＭＡＰが挙げられる。溶媒としては、ジクロロメタン等の非極性溶媒が挙げられる。反応温度は、室温から４０℃である。
【００４２】
［自己集合体の製造］
式（Ｉ）の化合物の自己集合体は、上記のようにして製造した式（Ｉ）の化合物から、例えば以下の方法に従い製造することができる。
式（Ｉ）の化合物を非プロトン性極性溶媒（例えば、ＤＭＳＯ）に溶解させた後、当該溶液を、適宜、添加物（例えば、血清）を含む組織培養用培地（例えば、ＤＭＥＭ）に加えて混和する。混和した溶液を静置させて、式（Ｉ）の化合物の自己集合体を得る。
【００４３】
自己集合体の生成は、自己集合体と環境感受性蛍光プローブとを水性溶媒（例えば水）中で混合し、当該混合物の蛍光強度を測定することにより確認することができる。環境感受性蛍光プローブは、本質的には水性溶媒中で非蛍光性であるが、低極性溶媒中又は疎水性環境中では蛍光性を示す。疎水性環境としては、例えば自己集合体の疎水性ポケットが挙げられる。環境感受性蛍光プローブとしては、例えば８−アニリノ−１−ナフタレンスルホン酸（ＡＮＳ）、ナイルレッドが挙げられる。
【実施例】
【００４４】
以下に実施例及び試験例を挙げて本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。【００４５】
［実施例１］ジエチル 6,12-ビス(4-((3R,5R,8R,9S,10S,12S,13R,14S,17S)-3,12-ジヒドロキシ-10,13-ジメチルヘキサデカヒドロ-1H-シクロペンタ[a]フェナントレン-17-イル)ペンタノイル)-4,14-ジオキソ-3,6,12,15-テトラアザヘプタデカンジオエートの製造
ホルムアルデヒド（3.6 mg, 0.12 mmol）、カダベリン（0.06 mmol）及びEtOH（1 ml）をガラス管に充填した。混合物を40℃にて15分間撹拌した。デオキシコール酸（0.12 mmol）及びイソシアノ酢酸エチル（14.1μl, 0.12 mmol）を反応混合物に添加し、12時間撹拌した。窒素雰囲気下EtOHを留去し、粗製物をジクロロメタンに溶解させた。1M塩酸、2M NaOH水溶液及び飽和食塩水で洗浄し、有機層を分取用TLCに充填し、クロロホルム／メタノール（10/1）で展開させた。生成物を含むシリカを掻き取り、アセトニトリル／EtOH溶液の入った平底ガラス瓶に入れた。撹拌棒で粉末化し、ろ過した。溶液を減圧濃縮し、真空乾燥して標題化合物（1.3 mg, 0.0011 mmol）を得た。【００４６】
実施例１の方法に従い、以下の実施例化合物を製造した。
【表１】
2020045570.tif 000016
【００４７】
［実施例１０］(4R,4'R)-N,N'-(ペンタン-1,5-ジイル)ビス(4-((3R,5S,8R,9S,10S,12S,13R,17R)-3,12-ジヒドロキシ-10,13-ジメチルヘキサデカヒドロ-1H-シクロペンタ[a]フェナントレン-17-イル)ペンタアミド)の製造
【化１４】
2020045570.tif 000017
デオキシコール酸（382 mg, 0.97 mmol）、カダベリン（5 mmol）及びジクロロメタン（5 ml）をガラス管に充填し、撹拌した。混合液へWSCI・HCl（230 mg, 1.2 mmol）及びDMAP（122.17 mg, 1.0 mmol）を加えて室温で3時間撹拌した。水を加えて反応を停止させたのちに、クロロホルムで三回抽出を行った。有機層を2M NaOH水溶液、1M 塩酸及び飽和食塩水で洗浄し、減圧下で溶媒を留去した。粗生成物をカラムクロマトグラフィーで精製し、溶液を減圧濃縮し、真空乾燥して標題化合物（160 mg, 0.19 mmol）を得た。【００４８】
各実施例化合物の物性データを以下に示す。
【表２】
2020045570.tif 000018
2020045570.tif 000019
2020045570.tif 000020
2020045570.tif 000021
【００４９】
［参考例１］エチル N-((R)-4-((3R,5R,8R,9S,10S,12S,13R,14S,17R)-3,12-ジヒドロキシ-10,13-ジメチルヘキサデカヒドロ-1H-シクロペンタ[a]フェナントレン-17-イル)ペンタノイル)-N-メチルグリシルグリシネートの製造
【化１５】
2020045570.tif 000022
ホルムアルデヒド（3.6 mg, 0.12 mmol）、メチルアミン（0.12 mmol）及びEtOH（1 ml）をガラス管に充填した。混合物を40℃にて15分間撹拌した。デオキシコール酸（0.12 mmol）及びイソシアノ酢酸エチル（14.1μl, 0.12 mmol）を反応混合物に添加し、12時間撹拌した。窒素雰囲気下EtOHを留去し、粗製物をジクロロメタンに溶解させた。1M塩酸、2M NaOH水溶液及び飽和食塩水で洗浄し、有機層を分取用TLCに充填し、クロロホルム／メタノール（20/1）で展開させた。生成物を含むシリカを掻き取り、アセトニトリル／EtOH溶液の入った平底ガラス瓶に入れた。撹拌棒で粉末化し、ろ過した。溶液を減圧濃縮し、真空乾燥して標題化合物（25 mg, 0.046 mmol）を得た。【００５０】
［参考例２］ジエチル 6,12-ビス(4-((3R,5R,8R,9S,10S,13R,14S,17S)-3-ヒドロキシ-10,13-ジメチルヘキサデカヒドロ-1H-シクロペンタ[a]フェナントレン-17-イル)ペンタノイル)-4,14-ジオキソ-3,6,12,15-テトラアザヘプタデカンジオエートの製造
【化１６】
2020045570.tif 000023
ホルムアルデヒド（3.6 mg, 0.12 mmol）、カダベリン（0.06 mmol）及びEtOH（1 ml）をガラス管に充填した。混合物を40℃にて15分間撹拌した。リトコール酸（0.12 mmol）及びイソシアノ酢酸エチル（14.1μl, 0.12 mmol）を反応混合物に添加し、12時間撹拌した。窒素雰囲気下EtOHを留去し、粗製物をジクロロメタンに溶解させた。1M塩酸、2M NaOH水溶液及び飽和食塩水で洗浄し、有機層を分取用TLCに充填し、クロロホルム／メタノール（20/1）で展開させた。生成物を含むシリカを掻き取り、アセトニトリル／EtOH溶液の入った平底ガラス瓶に入れた。撹拌棒で粉末化し、ろ過した。溶液を減圧濃縮し、真空乾燥して標題化合物（1.7 mg, 0.0015 mmol）を得た。【００５１】
［参考例３］ジエチル 4,14-ジオキソ-6,12-ビス((R)-4-((3R,5S,7R,8R,9S,10S,12S,13R,14S,17R)-3,7,12-トリヒドロキシ-10,13-ジメチルヘキサデカヒドロ-1H-シクロペンタ[a]フェナントレン-17-イル)ペンタノイル)-3,6,12,15-テトラアザヘプタデカンジオエートの製造
【化１７】
2020045570.tif 000024
ホルムアルデヒド（3.6 mg, 0.12 mmol）、カダベリン（0.06 mmol）及びEtOH（1 ml）をガラス管に充填した。混合物を40℃にて15分間撹拌した。コール酸（0.12 mmol）及びイソシアノ酢酸エチル（14.1μl, 0.12 mmol）を反応混合物に添加し、12時間撹拌した。窒素雰囲気下EtOHを留去し、粗製物をジクロロメタンに溶解させた。1M塩酸、2M NaOH水溶液及び飽和食塩水で洗浄し、有機層を分取用TLCに充填し、クロロホルム／メタノール（20/3）で展開させた。生成物を含むシリカを掻き取り、アセトニトリル／EtOH溶液の入った平底ガラス瓶に入れた。撹拌棒で粉末化し、ろ過した。溶液を減圧濃縮し、真空乾燥して標題化合物（0.4 mg, 0.00034 mmol）を得た。【００５２】
各参考例化合物の物性データを以下に示す。
【表３】
2020045570.tif 000025
【００５３】
上記実施例化合物及び参考例化合物から以下の方法に従い、それぞれの自己集合体を製造した。
それぞれの化合物をＤＭＳＯに溶解させ、１０ｍＭのストック溶液を調製した。当該ストック溶液から各化合物の３ｍＭ ＤＭＳＯ溶液（２０μｌ）を調製した後、それぞれの溶液を室温にて１０％ＦＢＳ及び１％ペニシリン−ストレプトマイシン溶液を含むＤＭＥＭ（２ｍｌ）に加え、ピペッティングにより混和した。混和した溶液を１時間静置させ、各化合物の自己集合体を得た。【００５４】
［試験例］
試験例では、特に明記しない場合、以下の動物、細胞及び試薬を用いた。
（マウス）
ＭｙＤ８８欠損マウス（オリエンタル酵母工業株式会社）及びＣ５７ＢＬ／６（日本クレア株式会社）バックグラウンドのＦｃＲγ欠損マウス（理化学研究所）を用いた。
（細胞）
ＲＡＷ−Ｂｌｕｅ（商標）細胞（InvivoGen社）に、ＮＦ−κＢ及びＡＰ−１活性化により分泌型胎児性アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）レポーター遺伝子を発現させた。
骨髄由来樹状細胞は、Ishikawa et al., Cell Host & Microbe, April 17, 2013, 13, 477-488に記載の方法に従い調製した。具体的には、１０％（ｖ／ｖ）ＦＢＳ及びβ−メルカプトエタノールを補充したＲＰＭＩ１６４０培地にて骨髄細胞を、ＭＧＭ−５から放出されるＧＭ−ＣＳＦとともに、３７℃にて１０日間培養し、骨髄由来樹状細胞を調製した。
１０％ＦＢＳ及び１％ペニシリン−ストレプトマイシン溶液を含むＤＭＥＭにてＲＡＷ２６４．７細胞（American Type Culture Collection社）を培養した。
（試薬）
トレハロース−６，６’−ジミコレート（ＴＤＭ；シグマ社）を１ｍｇ／ｍＬにてクロロホルム：メタノール溶液（２：１（ｖ／ｖ））に溶解し、２−プロパノールで最終濃度５０μｇ／ｍＬまで希釈し、９６ウェルプレートに２０μＬ／ウェルにてコーティングした後、溶媒を留去した。コーティングしたＴＤＭの量は１μｇ／ウェルとした。
リポ多糖（ＬＰＳ；L4516；シグマ社）及びカードラン（InvivoGen社）を５％又は１０％ＦＢＳを含むＲＰＭＩ又はＤＭＥＭで希釈し、免疫刺激特性測定に用いた。【００５５】
［試験例１−１］自己集合体の流体力学的サイズ測定（１）
上記のように製造した自己集合体の流体力学的直径を、キュムラント相関関数を用いた動的光散乱光度計（ELS-Z2；165°；オートアジャストモード；大塚電子株式会社）により測定した。
具体的には、上記実施例１化合物を含む化合物ライブラリーの試験化合物のＰＢＳ（pH 7.4；Thermo Fisher Scientific社）溶液（５０μＭ）を、１％（ｖ／ｖ）最終濃度のＤＭＳＯを含むように、Coster Ｖ底ポリプロピレン９６ウェルプレートにて調製した。各サンプルをピペッティングにより混合し、室温にて１５分間インキュベーションした。インキュベーションの後、各サンプルに蛍光試薬（１μＬ）を加え、ピペッティングにより混合した。さらに１５分間インキュベーションした後、マイクロプレートリーダーにより蛍光強度を記録した。蛍光試薬として、ＡＮＳの１．５ｍＭ ＰＢＳ溶液（励起波長＝365 nm、発光波長＝450 nm）またはナイルレッドの０．３ｍＭ ＤＭＳＯ溶液（励起波長＝550 nm、発光波長＝610 nm）のいずれかを用いた。全サンプルについて、５０μＭ ＰＢＳ溶液を２５℃にて調製し、流体力学的直径を測定した。
化合物ライブラリーのうち自己集合体を形成した化合物の流体力学的直径を図１に示す。【００５６】
［試験例１−２］自己集合体の流体力学的サイズ測定（２）
各実施例化合物について、試験例１−１の方法に従い、自己集合体を形成させた。サンプルは１０％ＦＢＳ（Biowest社）及び１％ペニシリン−ストレプトマイシン（Nacalai Tesque Inc.社）を含むＤＭＥＭ培地中２５℃にて種々の濃度で調製し、９６ウェルＵＶプレート（Corning Inc.社）に１００μＬ／ウェルにて移した。自己集合体の流体力学的半径を、DynaPro Plate reader II（Wyatt Technology Corp.社；165°；25℃での自動減衰モード；レーザー波長830 nm；散乱角度58°；データ取得時間10秒／ウェル；10取得／測定）を用いて測定した。
各実施例化合物の自己集合体の３０μＭ ＤＭＥＭ溶液中で測定した流体力学的半径（Ｒｈ）及び当該Ｒｈ値から換算した流体力学的直径は以下のとおりである。
【表４】
2020045570.tif 000026
また、実施例１化合物及び参考例化合物の自己集合体のＤＭＥＭ溶液中のＲｈ値の結果を図２に示す。なお、参考例１化合物は自己集合体を形成しなかった。【００５７】
［試験例１−３］自己集合体の流体力学的サイズ測定（３）
実施例１０化合物について、試験例１−１の方法に従い、自己集合体を形成させた。自己集合体の流体力学的直径を、ゼータサイザーナノS（英国マルバーン・パナリティカル社製）を用いて測定し（auto-attenuationモード、散乱角173度、レーザー波長633 nm）、粒子からの散乱光より得られた自己相関関数をキュムラント法で解析することにより得た。サンプルは蒸留水中２５℃にて種々の濃度で調製し、４０μＬ小容量キュベット（英国マルバーン・パナリティカル社製）を用いて測定した。実施例１０の蒸留水中各濃度における自己集合体の流体力学的直径（Diameter）は以下のとおりである。
【表５】
2020045570.tif 000027
【００５８】
［試験例２−１］免疫刺激特性（１）
自己集合体の免疫刺激特性を、ＩＬ−６産生量を指標としてアッセイした。９６ウェル組織培養プレートにて１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ中で２０，０００ＲＡＷ２６４．７細胞／ウェルを３７℃にて２４時間播種した。次いで、細胞培地を試験化合物のＤＭＥＭ溶液（１０％ＦＢＳ及び最終濃度１％のＤＭＳＯを含む）で置き換えた。１％（ｖ／ｖ）ＤＭＳＯ及び100 pg/mLのＬＰＳをそれぞれ陰性及び陽性対照として用いた。２４時間後、試験化合物を含む細胞培地を回収し、２０，０００ｒｐｍ（４℃）にて遠心分離して微粒子を除去し、−３０℃にて貯蔵するか、又はそのままアッセイした。アッセイは、製造業者のプロトコールに従い、ＩＬ−６ ＥＬＩＳＡキット（Ｒ＆Ｄシステムズ社）を用いて三重又は二重に行った。
ＤＭＥＭ溶液（０、１、３、１０、１５、２０、３０及び５０μＭ）中の実施例１化合物の自己集合体の結果を図３に示す。実施例１化合物と参考例化合物の自己集合体の比較結果を図４に示す。各実施例化合物の自己集合体の結果を図５に示す。実施例１化合物の自己集合体の３０μＭ ＤＭＥＭ溶液中での粒度分布を図６に示す。【００５９】
［試験例２−２］免疫刺激特性（２）
自己集合体のＩＬ−６産生量を、遠心分離（１４，０００ｒｐｍ）の前後で比較した。実施例１化合物の自己集合体のＤＭＥＭ溶液（０、３、１０、３０及び５０μＭ）について、遠心分離前のサンプルではＩＬ−６産生が見られたのに対し、遠心分離後の溶液から微粒子を除去すると免疫応答が消失した。結果を図７に示す。【００６０】
［試験例２−３］免疫刺激特性（３）
自己集合体の免疫刺激特性を、ＩＬ−６産生量を指標としてアッセイした。９６ウェル組織培養プレートに５％FBSを含むＲＰＭＩ１６４０中で１×１０６細胞／ウェルのＢＭＤＣを播種後、それぞれ５、１０、３０、５０及び１００μＭの実施例１、実施例７及び実施例１０化合物の自己集合体のRPMI溶液（５％ＦＢＳを含む）を添加した。０．３７ｐｇ／ｍＬのＬＰＳ（SIGMA社）、Ｋ３  ＣｐＧ（ＴＬＲ９アゴニスト；Gene Design社；２００ｎｇ）、Ｄ３５  ＣｐＧ（ＴＬＲ９アゴニスト；Gene Design社；２００ｎｇ）、Ｒ８４８（ＴＬＲ７アゴニスト；Enzo Life Sciences；２μｇ）、ｐｏｌｙ ＩＣ（ＴＬＲ３アゴニスト；SIGMA社；１μｇ）及びＤＭＳＯ（１％）をそれぞれ対照として用いた。２４時間後、試験化合物を含む細胞培地を回収し、−３０℃にて貯蔵するか、又はそのままアッセイした。アッセイは、製造業者のプロトコールに従い、ＩＬ−６ ＥＬＩＳＡキット（Ｒ＆Ｄシステムズ社）を用いて行った。結果を図８に示す。【００６１】
［試験例３−１］ＦｃＲγ／ＭｙＤ８８ダブルノックアウト骨髄由来樹状細胞を用いたＩＬ−６産生量測定
自己集合体が標的する免疫受容体を評価するために、ＦｃＲγ／ＭｙＤ８８ダブルノックアウト骨髄由来樹状細胞（ＢＭＤＣ）を用いてＩＬ−６産生量を測定した。ＦｃＲγ及びＭｙＤ８８はそれぞれＣ型レクチン受容体（ＣＬＲ）及びＴＬＲの下流シグナルタンパク質である。
実施例１化合物の自己集合体のＤＭＳＯ溶液を５％又は１０％ＲＰＭＩで希釈し、９６ウェルプレートに１００μｌ／ウェルにて加えた。１×１０５ＢＭＤＣを２４時間３７℃にて自己集合体とともに又はなしで培養した。上清中のＩＬ−６濃度をＥＬＩＳＡ（ＢＤバイオサイエンス社）で測定した。陰性対照としてＤＭＳＯを用い、陽性対照としてＬＰＳ、カードラン及びＴＤＭ（シグマ社）を用いた。結果を図９に示す。
次に、ＦｃＲγノックアウト細胞及びＭｙＤ８８ノックアウト細胞を用いたアッセイを行った。陰性対照としてＤＭＳＯを用いた。結果を図１０及び図１１に示す（図中、ＬＰＳ及びＴＤＭは陽性対照である）。
結果は、自己集合体が少なくともＴＬＲファミリーメンバーとの相互作用を通じて免疫刺激作用を奏することを示す。【００６２】
［試験例３−２］Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ（ＷＴ）又はＴｌｒ７−／−骨髄由来樹状細胞を用いたＩＬ−６産生量測定
自己集合体のＴＬＲ−７に対するアゴニスト活性を評価するために、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ（ＷＴ）又はＴｌｒ７−／−骨髄由来樹状細胞（ＢＭＤＣ）を用いてＩＬ−６産生量を測定した。
Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ（ＷＴ）、Ｔｌｒ７＋／−、Ｔｌｒ７−／−、Ｔｌｒ９＋／−又はＴｌｒ９−／−マウスの脛骨及び大腿骨から骨髄細胞を単離し、これらの細胞を２０ｎｇ／ｍＬのＧＭ−ＣＳＦ(PeproTech社)と共に７日間培養することによってＢＭＤＣを調製した。
５％ＦＢＳの存在下、それぞれ１０、３０及び１００μＭの実施例１、実施例７及び実施例１０化合物の自己集合体のＲＰＭＩ１６４０溶液９６ウェルプレートに１００μｌ／ウェルにて加えた。１×１０６細胞／ウェルのＢＭＤＣを２４時間３７℃にて自己集合体とともに又はなしで培養した。上清中のマウスのＩＬ−６濃度をBio-Plex Pro Mouse Cytokine Grp I Panel 23-Plex(Bio-Rad Laboratories, Inc.)を用いて測定した。陰性対照としてデオキシコール酸（ＤＣＡ）及びＤＭＳＯ（１％）を用い、陽性対照としてＬＰＳ（２０ｎｇ）及びＲ８４８（２μｇ）を用いた。結果を図１２に示す。結果は、自己集合体により誘導される免疫刺激作用が、陽性対照であるＲ８４８（ＴＬＲ７アゴニスト）と同様にＴＬＲ７依存性であることを示す。【００６３】
［試験例３−３］Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ（ＷＴ）又はＴｌｒ７−／−骨髄由来樹状細胞を用いたＩＬ−６産生量測定
自己集合体のＴＬＲ−７に対するアゴニスト活性を評価するために、試験例３−２と同様に試験を行った。具体的には、それぞれ１０、３０、５０及び１００μＭの実施例１、実施例７及び実施例１０化合物の自己集合体の溶液を９６ウェルプレートに加え、５％ＦＢＳの存在下、１×１０６細胞／ウェルのＢＭＤＣを２４時間自己集合体とともに又はなしで培養した。上清中のマウスのＩＬ−６濃度をＥＬＩＳＡによって測定した。１％（ｖ／ｖ）ＤＭＳＯを陰性対照、またＬＰＳ（２０ｎｇ）、Ｒ８４８（２μｇ）、Ｋ３  ＣｐＧ（２００ｎｇ）、ｃ−ｄｉ−ＡＭＰ（STINGアゴニスト；ヤマサ醤油株式会社；２μｇ）、Ｄ３５  ＣｐＧ（２００ｎｇ）をそれぞれ陽性対照として用いた。結果を図１３に示す。【００６４】
［試験例３−４］Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ（ＷＴ）又はＴｌｒ９−／−骨髄由来樹状細胞を用いたＩＬ−６産生量測定
自己集合体のＴＬＲ−９に対するアゴニスト活性を評価するために、試験例３−２と同様に試験を行った。具体的には、それぞれ１０、３０、５０及び１００μＭの実施例１、実施例７及び実施例１０化合物の自己集合体の溶液を９６ウェルプレートに加え、５％ＦＢＳの存在下、１×１０６細胞／ウェルのＢＭＤＣを２４時間自己集合体とともに又はなしで培養した。上清中のマウスのＩＬ−６濃度をＥＬＩＳＡによって測定した。１％（ｖ／ｖ）ＤＭＳＯ及びを陰性対照、またＬＰＳ（２０ｎｇ）、Ｒ８４８（２μｇ）、Ｋ３  ＣｐＧ（２００ｎｇ）、ｃ−ｄｉ−ＡＭＰ（２μｇ）、Ｄ３５  ＣｐＧ（２００ｎｇ）をそれぞれ陽性対照として用いた。結果を図１４に示す。【００６５】
［試験例４］マウスモデルにおけるＯＶＡ抗原特異的抗体価の測定
自己集合体のアジュバント活性を評価するために、野生型（C57BL/6JJcl）マウス（クレア社）を用いて、ＯＶＡ特異的抗体反応による抗ＯＶＡ総ＩｇＧ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ｃ及びＩｇＥ力価を測定した。
マウスを、第０日目及び第１４日目において、１０μｇ ＯＶＡ（関東化学株式会社；ロット番号：01103-31）と、ＤＭＳＯ（最終濃度：１％）、実施例１化合物（１、１０及び１００μｇ）、実施例７化合物（１、１０及び１００μｇ）若しくは実施例１０化合物（１、１０及び１００μｇ）の自己集合体、デオキシコール酸（１、１０及び１００μｇ）又は５００μｇ ミョウバンのいずれかを含む、１００μｌ／ショットのＰＢＳ溶液で皮下免疫化した（それぞれの群について、ｎ＝４マウス）。陰性対照として、デオキシコール酸及びＰＢＳを用い、陽性対照として、アルミニウム塩（Ａｌｕｍ）を用いた。最初の免疫化から２１日後に、血清を回収し、ＯＶＡ特異的抗体反応に用いた。
血清中の抗原特異的総ＩｇＧ、ＩｇＧ１及びＩｇＧ２ｃを、ＥＬＩＳＡによって測定した。具体的には、９６ウェルプレートを、１０μｇ／ｍＬ ＯＶＡで、４℃で一晩コーティングした。洗浄後、プレートをブロッキング緩衝液と共に、室温で１時間インキュベートした。プレートを洗浄し、希釈血清と共に２時間インキュベートした。次いで、プレートを洗浄し、西洋ワサビペルオキシダーゼ結合抗マウス総ＩｇＧ、ＩｇＧ１又はＩｇＧ２ｃ抗体（Southern Biotech社）をそれぞれ、プレートに加えた。１時間後、プレートを洗浄し、TMB Microwell Peroxidase Substrate System（KPL）をウェルに加えた。２０分間インキュベートした後、２Ｎ Ｈ２ＳＯ４を加えて反応を停止させた。抗体価は、１００倍希釈した血清を５倍ずつ7段階希釈して、それぞれの吸光度をプロットして標準曲線を描き、ＯＤ＝０．２に対応する希釈値の逆数をその検体の抗体価とした。抗ＯＶＡ 総ＩｇＧ、ＩｇＧ１及びＩｇＧ２ｃの産生量をそれぞれ図１５〜１７に示す。
ＤＳマウスＩｇＥ ＥＬＩＳＡ（ＯＶＡ）キット（ＤＳファーマバイオメディカル社）を用いて、抗ＯＶＡ 総ＩｇＥを測定した。抗ＯＶＡ ＩｇＥの産生量を図１８に示す。【００６６】
［試験例５］ウイルス感染モデルにおける、自己集合体により免疫賦活化されたインフルエンザスプリットワクチン（ＳＶ）の有効性
インフルエンザＳＶ（A/New Caledonia/20/1999 (H1N1)）に対する自己集合体のアジュバント活性を評価するために、野生型（C57BL/6JJcl）マウス（クレア社）を用いて、インフルエンザウイルス特異的抗体反応による抗ＨＡ−ＩｇＧ１及びＩｇＧ２力価を測定した。
マウスを、第０日目及び第１４日目において、インフルエンザＳＶ（１μｇ）と、ＤＭＳＯ（最終濃度：１％）、実施例１化合物（１、１０及び１００μｇ）、実施例７化合物（１、１０及び１００μｇ）若しくは実施例１０化合物（１、１０及び１００μｇ）の自己集合体、デオキシコール酸（１、１０及び１００μｇ）又はアルミニウム塩（５００μｇ）のいずれかを含む、１００μｌ／ショットのＰＢＳ溶液で皮下免疫化した（それぞれの群について、ｎ＝３マウス）。陰性対照として、デオキシコール酸及びＰＢＳを用い、陽性対照として、アルミニウム塩を用いた。第２１日目において、血清を回収し、第３４日目においてマウスに、１０ ＬＤ５０の臨床的に単離したA/Puerto Rico/8/1934インフルエンザ（Ｈ１Ｎ１）ウイルスを鼻腔内感染させた。
第２１日目に回収した血清中の、抗ＨＡ ＩｇＧ１及びＩｇＧ２ｃをＥＬＩＳＡによって測定した。抗ＨＡ ＩｇＧ１及びＩｇＧ２ｃの産生量を、図１９Ａ及びＢに示す。
第３４日目のインフルエンザ感染後２１日間、マウスの体重及び生存率を追跡した。インフルエンザＳＶ（１μｇ）と、ＤＭＳＯ（最終濃度：１％）、実施例１化合物（１００μｇ）、実施例７化合物（１００μｇ）若しくは実施例１０化合物（１００μｇ）の自己集合体、デオキシコール酸（１００μｇ）又はアルミニウム塩（５００μｇ）のいずれかを皮下免疫化に用いたそれぞれのマウスについて、体重及び生存率の変化を、図２０Ａ及びＢに示す。
インフルエンザＳＶ（１μｇ）と、ＤＭＳＯ（最終濃度：１％）、実施例１０化合物の自己集合体（１、１０又は１００μｇ）又はアルミニウム塩（５００μｇ）のいずれかを皮下免疫化に用いたそれぞれのマウスについて、体重及び生存率の変化を、図２１Ａ及びＢに示す。
インフルエンザＳＶ（１μｇ）と、実施例１０化合物（１００μｇ）又は陰性対照としてデオキシコール酸（１００μｇ）のいずれかを皮下免疫化に用いたそれぞれのマウスについて、体重及び生存率の変化を、図２２Ａ及びＢに示す。【００６７】
［試験例６］ＨＥＫ２９３細胞を用いたＳＥＡＰアッセイ
シグナル経路を解明するために、ＮＦ−κＢ応答ＳＥＡＰレポーター遺伝子で安定にトランスフェクトしたヒト胎児腎臓細胞（ＨＥＫ２９３）を用いて、いくつかの主なＴＬＲについて試験した。
ＴＬＲ２、ＴＬＲ４又はＴＬＲ９発現ＨＥＫ細胞を９６ウェル組織培養プレートにて１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ（１００μｌ）中で３×１０４細胞／ウェルにて播種し、実施例１化合物の自己集合体で３７℃２４時間又は４８時間刺激させた。培養液の上清中のＳＥＡＰをアルカリホスファターゼ検出試薬QUANTI-Blue（InvivoGen社）で３時間又は６時間かけて染色し、Multiskanマイクロプレートリーダー（Thermo Fisher Scientific Inc.）により630 nmにて光学濃度（ＯＤ値）を測定した。
結果を図２３及び図２４に示す。陰性対照（ＮＣ）としてＤＭＳＯを用い、陽性対照として図２３ではオリゴデオキシヌクレオチド（ODN1826；tlrl-1826；InvivoGen社）を、図２４ではＴＬＲ２アゴニストＰａｍ３（Pam3CSK4；InvivoGen社）及びＬＰＳを用いた。自己集合体によるＳＥＡＰ応答はＴＬＲ９で上昇した。【００６８】
［試験例７］ＩＬ−６定量的ＰＣＲアッセイ
ＲＡＷ２６４．７細胞について、６ウェル組織培養プレートにて１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ中で６×１０５細胞／ウェルを３７℃にて２４時間播種した。次いで、細胞培地を試験化合物のＤＭＥＭ溶液（１０％ＦＢＳ及び最終濃度１％のＤＭＳＯを含む）で置き換えた。１％ＤＭＳＯ及び100 ng/mLのＬＰＳをそれぞれ陰性及び陽性対照として用いた。４時間後、細胞をＰＢＳで２回洗浄した。細胞をISOGENE（１ｍＬ／ウェル；Nippon Gene Co., Ltd.）で５分間溶解させた。次いで、クロロホルム（２００μＬ）を加えた。試験管を逆さにすることにより混合物を１５分間混合した後、１４，０００ｒｐｍで４℃にて１５分間遠心分離した。水層の上部４００μＬを別の１．５ｍＬ試験管に回収し、イソプロパノール５００μＬと混合した。試験管を１４，０００ｒｐｍにて再度遠心分離し、上清を除去した。残渣をエタノール（７００μＬ）で２回洗浄し、空気乾燥し、ＴＥ緩衝液に再溶解した（ｐＨ５．２）。PrimeScript（商標）II 1st strand cDNA Synthesis Kit（タカラバイオ株式会社）により全ｍＲＮＡサンプル（２μｇ）を逆転写し、ｃＤＮＡの合成に用いた。定量的リアルタイムＰＣＲをFast CYBR Green Master Mixキット（Thermo Fisher Scientific Inc.）を用いて行った。全アッセイは三重に行い、ＴＮＦ−α及びβ−アクチンを内部標準として用いた。特異的な標的遺伝子についての全プライマーを以下に示す：
【表６】
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結果を図２５に示す。
【産業上の利用可能性】
【００６９】
式（Ｉ）の化合物が連結してなる自己集合体はアジュバントとして有用であり得、種々の疾患の治療及び／又は予防のためのワクチン組成物としての利用が期待される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９Ａ】
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【図１９Ｂ】
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【図２０Ａ】
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【図２０Ｂ】
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【図２１Ａ】
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【図２１Ｂ】
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【図２２Ａ】
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【図２２Ｂ】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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