(57)【要約】  免疫チェックポイント阻害剤を用いた腫瘍免疫療法において、免疫応答を活性化する新たな手段を提供する。  プロバイオティクス及びプレバイオティクスを有効成分とする免疫チェックポイント阻害剤による抗腫瘍効果増強剤。
2020067170.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
プロバイオティクス及びプレバイオティクスを有効成分とする免疫チェックポイント阻害剤による抗腫瘍効果増強剤。
【請求項２】
プロバイオティクスが、ラクトバチルス属細菌及びビフィドバクテリウム属細菌から選ばれる１以上である請求項１記載の抗腫瘍効果増強剤。
【請求項３】
プロバイオティクスがラクトバチルス・カゼイ及びビフィドバクテリウム・ブレーベから選ばれる１以上である請求項１又は２記載の抗腫瘍効果増強剤。
【請求項４】
プロバイオティクスがラクトバチルス・カゼイＹＩＴ９０２９株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１３６６）及びビフィドバクテリウム・ブレーベＹＩＴ１２２７２株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１３２０）から選ばれる１以上である請求項１〜３のいずれか１項記載の抗腫瘍効果増強剤。
【請求項５】
プレバイオティクスが、ガラクトオリゴ糖である請求項１〜４のいずれか１項記載の抗腫瘍効果増強剤。
【請求項６】
プレバイオティクスが、β−１，４ガラクトシルラクトースを主成分とするガラクトオリゴ糖である請求項１〜５のいずれか１項記載の抗腫瘍効果増強剤。
【請求項７】
免疫チェックポイント阻害剤が、抗ＰＤ−１抗体、抗ＰＤ−Ｌ１抗体及びＰＤ−１拮抗剤から選ばれる１以上である請求項１〜６のいずれか１項記載の抗腫瘍効果増強剤。
【請求項８】
プロバイオティクス、プレバイオティクス及び免疫チェックポイント阻害剤を有効成分とする腫瘍免疫活性化剤。
【請求項９】
制御性Ｔ細胞を介した免疫抑制状態を解除すること及び／又はＮＫ細胞を活性化することにより腫瘍免疫を活性化する、請求項８記載の腫瘍免疫活性化剤。
【請求項１０】
プロバイオティクス、プレバイオティクス及び免疫チェックポイント阻害剤を組みあわせてなる医薬。
【請求項１１】
プロバイオティクス及びプレバイオティクスを含有する、免疫チェックポイント阻害剤と組み合わせるための医薬組成物。
【請求項１２】
免疫チェックポイント阻害剤による抗腫瘍効果増強剤を製造するための、プロバイオティクス及びプレバイオティクスの使用。
【請求項１３】
腫瘍免疫活性化剤を製造するための、プロバイオティクス、プレバイオティクス及び免疫チェックポイント阻害剤の使用。
【請求項１４】
医薬を製造するための、プロバイオティクス、プレバイオティクス及び免疫チェックポイント阻害剤の組みあわせの使用。
【請求項１５】
免疫チェックポイント阻害剤による抗腫瘍効果増強に使用するための、プロバイオティクス及びプレバイオティクス。
【請求項１６】
腫瘍免疫活性化に使用するための、プロバイオティクス、プレバイオティクス及び免疫チェックポイント阻害剤。
【請求項１７】
医薬に使用するための、プロバイオティクス、プレバイオティクス及び免疫チェックポイント阻害剤の組みあわせ。
【請求項１８】
プロバイオティクス及びプレバイオティクスを、それを必要とする対象に投与する免疫チェックポイント阻害剤による抗腫瘍効果増強方法。
【請求項１９】
プロバイオティクス、プレバイオティクス及び免疫チェックポイント阻害剤を、それを必要とする対象に投与する腫瘍免疫活性化方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、腫瘍免疫応答を活性化し、それによる抗腫瘍効果を増強する抗腫瘍効果増強剤及び腫瘍免疫活性化剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
腫瘍免疫療法は、がん患者自身に元来備わっている免疫監視機構に作用して、がんに対する免疫力を強化することによって、がんの進行を抑制ないし治療する療法である。近年、がんの進展には、がん細胞自身が免疫監視機構を回避するシステムを有していることが明らかにされ、そのような回避システムに利用される分子として、ＣＴＬＡ−４やＰＤ−１あるいはそのリガンドであるＰＤ−Ｌ１等の免疫チェックポイント分子群が知られている。そして、これらの免疫チェックポイント分子群の機能を阻害する免疫チェックポイント阻害剤ががんに対する免疫力の強化に極めて有用であることが報告されている（特許文献１）。
また、免疫応答の抑制的制御を司る制御性Ｔ細胞（Regulatory T cells：Ｔｒｅｇ）は、がんや感染性細菌の罹患時における免疫応答の誘起を抑制することから、腫瘍免疫療法において、制御性Ｔ細胞の働きを制御する様々な試みもなされている。
しかしながら、免疫チェックポイント阻害剤等を用いた免疫系の賦活によっても十分な治療効果が認められないがん患者が存在し、さらなる治療法の開発が求められている。【０００３】
一方、ラクトバチルス属細菌等に代表される乳酸菌やビフィドバクテリウム属細菌は、腸内フローラの改善、便性の改善、腸管機能の改善、感染防御、免疫賦活等、種々の効果を有することが明らかにされている。これらの細菌は、腸内環境の改善を通して、ヒトの健康に寄与しているものと考えられており、所謂プロバイオティクスと呼ばれる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特許第５８８５７６４号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、免疫チェックポイント阻害剤を用いた腫瘍免疫療法において、免疫応答を活性化する新たな手段を提供することに関する。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、斯かる課題に鑑み鋭意検討した結果、ラクトバチルス属細菌、ビフィドバクテリウム属細菌等のプロバイオティクスとガラクトオリゴ糖等のプレバイオティクスとを組み合わせ、これを免疫チェックポイント阻害剤と併用した場合に、抗腫瘍効果が顕著に増強されることを始め、腫瘍免疫が活性化されることを見出した。【０００７】
すなわち、本発明は、以下の１）〜１９）に係るものである。
１）プロバイオティクス及びプレバイオティクスを有効成分とする免疫チェックポイント阻害剤による抗腫瘍効果増強剤。
２）プロバイオティクスが、ラクトバチルス属細菌及びビフィドバクテリウム属細菌から選ばれる１以上である１）の抗腫瘍効果増強剤。
３）プロバイオティクスが、ラクトバチルス・カゼイ及びビフィドバクテリウム・ブレーベから選ばれる１以上である１）又は２）の抗腫瘍効果増強剤。
４）プロバイオティクスが、ラクトバチルス・カゼイＹＩＴ９０２９株（ＦＥＲＭ ＢＰ−１３６６）及びビフィドバクテリウム・ブレーベＹＩＴ１２２７２株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１３２０）から選ばれる１以上である１）〜３）のいずれかの抗腫瘍効果増強剤。
５）プレバイオティクスが、ガラクトオリゴ糖である１）〜４）のいずれかの抗腫瘍効果増強剤。
６）プレバイオティクスが、β−１，４ガラクトシルラクトースを主成分とするガラクトオリゴ糖である１）〜５）のいずれかの抗腫瘍効果増強剤。
７）免疫チェックポイント阻害剤が、抗ＰＤ−１抗体、抗ＰＤ−Ｌ１抗体及びＰＤ−１拮抗剤から選ばれる１以上である１）〜６）のいずれかの抗腫瘍効果増強剤。
８）プロバイオティクス、プレバイオティクス及び免疫チェックポイント阻害剤を有効成分とする腫瘍免疫活性化剤。
９）制御性Ｔ細胞を介した免疫抑制状態を解除すること及び／又はＮＫ細胞を活性化することにより腫瘍免疫を活性化する、８）の腫瘍免疫活性化剤。
１０）プロバイオティクス、プレバイオティクス及び免疫チェックポイント阻害剤を組みあわせてなる医薬。
１１）プロバイオティクス及びプレバイオティクスを含有する、免疫チェックポイント阻害剤と組み合わせるための医薬組成物。
１２）免疫チェックポイント阻害剤による抗腫瘍効果増強剤を製造するための、プロバイオティクス及びプレバイオティクスの使用。
１３）腫瘍免疫活性化剤を製造するための、プロバイオティクス、プレバイオティクス及び免疫チェックポイント阻害剤の使用。
１４）医薬を製造するための、プロバイオティクス、プレバイオティクス及び免疫チェックポイント阻害剤の組みあわせの使用。
１５）免疫チェックポイント阻害剤による抗腫瘍効果増強に使用するための、プロバイオティクス及びプレバイオティクス。
１６）腫瘍免疫活性化に使用するための、プロバイオティクス、プレバイオティクス及び免疫チェックポイント阻害剤。
１７）医薬に使用するための、プロバイオティクス、プレバイオティクス及び免疫チェックポイント阻害剤の組みあわせ。
１８）プロバイオティクス及びプレバイオティクスを、それを必要とする対象に投与する免疫チェックポイント阻害剤による抗腫瘍効果増強方法。
１９）プロバイオティクス、プレバイオティクス及び免疫チェックポイント阻害剤を、それを必要とする対象に投与する腫瘍免疫活性化方法。
【発明の効果】
【０００８】
本発明によれば、腫瘍免疫を賦活することができ、がんの進行抑制、再発抑制又は治療が可能となる。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】シンバイオティクス／免疫チェックポイント阻害剤併用による抗腫瘍作用。
【図２】シンバイオティクス／免疫チェックポイント阻害剤併用による免疫細胞への影響。
【図３】シンバイオティクス／免疫チェックポイント阻害剤併用による制御性Ｔ細胞（Treg）への影響。
【図４】シンバイオティクス／免疫チェックポイント阻害剤併用による免疫抑制状態への影響。
【図５】シンバイオティクス／免疫チェックポイント阻害剤併用による腫瘍における骨髄由来免疫抑制細胞（MDSC）への影響。
【図６】シンバイオティクス／免疫チェックポイント阻害剤併用による免疫状態への影響。
【図７】各種腸内細菌製剤／免疫チェックポイント阻害剤併用によるＮＫ細胞活性増強作用。Ｃ：コントロール群、Ｐ：抗ＰＤ−１抗体投与群、ＬＰ：プロバイオティクス＋抗ＰＤ−１抗体投与群、ＧＰ：プレバイオティクス＋抗ＰＤ−１抗体投与群、ＬＧ：シンバイオティクス投与群、ＬＧＰ：シンバイオティクス＋抗ＰＤ−１抗体投与群。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
本発明において、「プロバイオティクス」とは、適正な量を摂取した時に、宿主の健康に有益な作用をもたらす生きた微生物をいう。「プレバイオティクス」とは、ビフィズス菌や乳酸菌の「餌」となって、これらの菌を増やすことで有益な働きをするものをいう。
本発明におけるプロバイオティクスとしては、具体的には、例えばラクトバチルス属細菌、ビフィドバクテリウム属細菌、ストレプトコッカス属細菌、ラクトコッカス属細菌から選ばれる１以上の微生物が挙げられる。
【００１１】
ラクトバチルス属細菌としては、例えばラクトバチルス・カゼイ（Ｌ．ｃａｓｅｉ）、ラクトバチルス・アシドフィルス（Ｌ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ）、ラクトバチルス・プランタラム（Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ）、ラクトバチルス・ブヒネリ（Ｌ．ｂｕｃｈｎｅｒｉ）、ラクトバチルス・ガリナラム（Ｌ．ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ）、ラクトバチルス・アミロボラス（Ｌ．ａｍｙｌｏｖｏｒｕｓ）、ラクトバチルス・ブレビス（Ｌ．ｂｒｅｖｉｓ）、ラクトバチルス・ラムノーザス（Ｌ．ｒｈａｍｎｏｓｕｓ）、ラクトバチルス・ケフィア（Ｌ．ｋｅｆｉｒ）、ラクトバチルス・クルバタス（Ｌ．ｃｕｒｖａｔｕｓ）、ラクトバチルス・ゼアエ（Ｌ．ｚｅａｅ）、ラクトバチルス・ヘルベティカス（Ｌ．ｈｅｌｖｅｔｉｃｕｓ）、ラクトバチルス・サリバリウス（Ｌ．ｓａｌｉｖａｌｉｕｓ）、ラクトバチルス・ガセリ（Ｌ．ｇａｓｓｅｒｉ）、ラクトバチルス・ファーメンタム（Ｌ．ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ）、ラクトバチルス・ロイテリ（Ｌ．ｒｅｕｔｅｒｉ）、ラクトバチルス・クリスパータス（Ｌ．ｃｒｉｓｐａｔｕｓ）、ラクトバチルス・デルブルッキィ  サブスピーシーズ．ブルガリカス（Ｌ．ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ  ｓｕｂｓｐ．ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ）、ラクトバチルス・デルブルッキィ  サブスピーシーズ．デルブルッキィ（Ｌ．ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ  ｓｕｂｓｐ．ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ）、ラクトバチルス・ジョンソニー（Ｌ．ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ）等が挙げられる。
このうち、抗腫瘍効果増強の点から、ラクトバチルス・カゼイ、ラクトバチルス・アシドフィルスが好ましく、より好ましくは、ラクトバチルス・カゼイ ＹＩＴ ９０１８（ＦＥＲＭ ＢＰ−６６５）、ラクトバチルス・カゼイ ＹＩＴ ９０２９（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１３６６）、ラクトバチルス・カゼイ ＹＩＴ １０００３（ＦＥＲＭ ＢＰ−７７０７）、ラクトバチルス・アシドフィルス ＹＩＴ ０１９８が挙げられ、このうちラクトバチルス・カゼイ ＹＩＴ ９０２９（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１３６６）がさらに好ましい。
【００１２】
ビフィドバクテリウム属細菌としては、例えば、ビフィドバクテリウム・ブレーベ（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｒｅｖｅ）、ビフィドバクテリウム・ロンガム（Ｂ．ｌｏｎｇｕｍ）、ビフィドバクテリウム・ビフィダム（Ｂ．ｂｉｆｉｄｕｍ）、ビフィドバクテリウム・アニマーリス（Ｂ．ａｎｉｍａｌｉｓ）、ビフィドバクテリウム・ズイス（Ｂ．ｓｕｉｓ）、ビフィドバクテリウム・インファンティス（Ｂ．ｉｎｆａｎｔｉｓ）、ビフィドバクテリウム・アドレセンティス（Ｂ．ａｄｏｌｅｓｃｅｎｔｉｓ）、ビフィドバクテリウム・カテヌラータム（Ｂ．ｃａｔｅｎｕｌａｔｕｍ）、ビフィドバクテリウム・シュードカテヌラータム（Ｂ．ｐｓｅｕｄｏｃａｔｅｎｕｌａｔｕｍ）、ビフィドバクテリウム・ラクチス（Ｂ．ｌａｃｔｉｓ）、ビフィドバクテリウム・グロボサム（Ｂ．ｇｌｏｂｏｓｕｍ）等が挙げられる。
このうち、抗腫瘍効果増強の点から、ビフィドバクテリウム・ブレーベ、ビフィドバクテリウム・ビフィダム、ビフィドバクテリウム・シュードカテヌラータムが好ましく、ビフィドバクテリウム・ブレーベＹＩＴ１２２７２株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１３２０）、ビフィドバクテリウム・ブレーベＹＩＴ１０００１株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−８２０５）、ビフィドバクテリウム・ビフィダム ＹＩＴ １０３４７（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１０６１３）がより好ましい。
【００１３】
ストレプトコッカス属細菌としては、例えば、ストレプトコッカス・サーモフィルス（Ｓｔｒｅｐｔｃｏｃｃｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、ストレプトコッカス・ラクチス（Ｓｔｒｅｐｔｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ）等が挙げられる。
このうち、抗腫瘍効果増強の点から、ストレプトコッカス・サーモフィルスが好ましく、ストレプトコッカス・サーモフィルス ＹＩＴ ２０２１株（ＦＥＲＭ ＢＰ−７５３７）がより好ましい。
【００１４】
ラクトコッカス属細菌としては、ラクトコッカス・ラクチス サブスピーシーズ．ラクチス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ  ｓｕｂｓｐ．ｌａｃｔｉｓ）、ラクトコッカス・ラクチス サブスピーシーズ．クレモリス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ  ｓｕｂｓｐ．ｃｒｅｍｏｒｉｓ）、ラクトコッカス・プランタラム（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ）、ラクトコッカス・ラフィノラクチス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｒａｆｆｉｎｏｌａｃｔｉｓ）等が挙げられる。
このうち、抗腫瘍効果増強の点から、ラクトコッカス・ラクチスが好ましく、ラクトコッカス・ラクチス ＹＩＴ ２０２７（ＦＥＲＭ  ＢＰ−６２２４）がより好ましい。
【００１５】
本発明におけるプレバイオティクスとしては、好ましくは本発明のプロバイオティクスに作用することで、宿主にとって有益な作用を与えるような物質が好ましく、具体的にはガラクトオリゴ糖、フラクトオリゴ糖、乳果オリゴ糖、イソマルトオリゴ糖、大豆オリゴ糖、ニゲロオリゴ糖、ゲンチオオリゴ糖、ペクチンオリゴ糖、シクロデキストリン等のオリゴ糖、ポリデキストロース、イヌリン、発芽大麦、イヌリン、難消化性デキストリン、レジスタントスターチ等の食物繊維から選ばれる１種以上が挙げられる。
本発明において、斯かるプレバイオティクスは、抗腫瘍効果増強の点から、ガラクトオリゴ糖が好ましい。
ここで、ガラクトオリゴ糖とは、分子内に少なくとも１以上のガラクトース残基を有するオリゴ糖の総称であり、例えば単糖が２〜９個、好ましくは３〜４個結合した糖が挙げられる。また、ガラクトオリゴ糖としては、ガラクトースがβ１−２結合したもの、β１−３結合したもの、β１−４結合したもの、β１−６結合したものが挙げられるが、β１−４結合したもの、β１−６結合したものを有するガラクトオリゴ糖が特に好ましい。
より好ましいガラクトオリゴ糖としては、β−１，４ガラクトシルラクトース（Ｇａｌβ１−４Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃ）、β−１，６ガラクトシルラクトース（Ｇａｌβ１−６Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃ）、β−１，３ガラクトシルラクトース（Ｇａｌβ１−３Ｇａｌβ１−４Ｇｌｃ）等が挙げられ、抗腫瘍効果増強の点から、β−１，４ガラクトシルラクトースを主成分とするガラクトオリゴ糖がより好ましく、例えばオリゴメイト５５Ｎ（ヤクルト薬品工業（株）、固形分中のβ−１，４ガラクトシルラクトースの含有量が１８．５％）を使用できる。
【００１６】
本発明において、プロバイオティクスとプレバイオティクスは、これらを組み合わせてシンバイオティクスとして使用される。シンバイオティクスは、両者を混合して調製される製剤（腸内細菌製剤）として用いるのが好ましい。
【００１７】
斯かる製剤中のプロバイオティクスの含有量は、特に限定されないが、製剤１００ｇ中に、例えば０．１×１０１１〜１００×１０１１ＣＦＵ（colony forming units）、好ましくは１×１０１１〜１０×１０１１ＣＦＵである。
また、当該製剤中のプロバイオティクスとプレバイオティクスの含有量の比率は、例えば、プレバイオティクス合計質量１ｇに対して、プロバイオティクスが０．０１×１０１１〜２０×１０１１ＣＦＵ、好ましくは、０．２×１０１１〜２×１０１１ＣＦＵである。
【００１８】
製剤中のプレバイオティクスの含有量は、特に限定されないが、製剤中、０．５〜４０質量％、好ましくは２〜１０質量％、より好ましくは３〜６質量％である。
【００１９】
シンバイオティクスには、本発明の効果を損なわない範囲内で、他の成分を含有していてもよい。他の成分としては、カルシウム、マグネシウム、亜鉛、鉄、ドロマイト等のミネラル又はその塩；クエン酸、リンゴ酸、アスコルビン酸、乳酸、酢酸、アミノ酸等の酸類、コラーゲン、コンドロイチン硫酸、ヒドロキシプロリン、フラボン、フラボノール、イソフラボン、アントシアン、カテキン、プロアントシアニジン等の添加物類、ビタミンＡ、ビタミンＢ類、ビタミンＣ、ビタミンＥ、ビタミンＤ類、ビタミンＫ類、ベータカロチン、レチノイン酸、葉酸等の各種ビタミン類等を挙げることができる。これらは１種を単独で又は２種以上を組み合わせて使用することができる。
【００２０】
シンバイオティクスの投与形態は、特に限定されないが、経口投与や経腸投与可能な形態が挙げられ、経口投与の形態が好ましい。
経口投与の形態としては、例えば、錠剤（糖衣錠、腸溶性コーティング錠、バッカル錠を含む）、散剤、カプセル剤（腸溶性カプセル、ソフトカプセルを含む）、顆粒剤（コーティングしたものを含む）、丸剤、トローチ剤、封入リポソーム剤、液剤、及びこれらの徐放製剤等の医薬製剤が挙げられる。また、食品（例えば、清涼飲料、炭酸飲料、栄養飲料、果汁飲料、乳酸菌飲料等の飲料；加工乳、乳飲料、発酵乳、バター等の乳製品；健康補助食品等の機能性食品等）の形態であっても良い。
【００２１】
製剤化においては、通常の医薬製剤に汎用される担体、賦形剤（例えば、乳糖、ブドウ糖、白糖、マンニトール、馬鈴薯澱粉、トウモロコシ澱粉、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム、硫酸カルシウム、結晶セルロース等）、結合剤（例えば、澱粉、ゼラチン、グルコース、ガラクトース、ポリビニルアルコール、ポリビニルエーテル、ポリビニルピロリドン、ヒドロキシプロピルセルロース、エチルセルロース、メチルセルロース、及びカルボキシメチルセルロース等）、崩壊剤（例えば、澱粉、寒天、ゼラチン、カルボキシメチルセルロースナトリウム、カルボキシメチルセルロースカルシウム、結晶セルロース、炭酸カルシウム、炭酸水素ナトリウム、及びアルギン酸ナトリウム等）、滑沢剤（例えば、ステアリン酸マグネシウム、水素添加植物油、及びマクロゴール等）、安定剤、矯味矯臭剤、希釈剤、界面活性剤、溶剤等の添加剤を使用することができる。
【００２２】
本発明において、「免疫チェックポイント阻害剤」とは、ＣＴＬＡ−４やＰＤ−１或いはそのリガンドであるＰＤ−Ｌ１等の免疫チェックポイント分子群の機能を阻害する分子を意味する。
免疫チェックポイント阻害剤としては、例えば、抗ＰＤ−１抗体（例えば、Ｎｉｖｏｌｕｍａｂ、Ｐｅｍｂｒｏｌｉｚｕｍａｂ）、抗ＰＤ−Ｌ１抗体（例えば、Ａｔｅｚｏｌｉｚｕｍａｂ、Ａｖｅｌｕｍａｂ、Ｄｕｒｖａｌｕｍａｂ）、ＰＤ−１拮抗剤（例えば、ＡＵＮＰ−１２）、抗ＣＴＬＡ−４抗体（例えば、Ｉｐｉｌｉｍｕｍａｂ及びＴｒｅｍｅｌｉｍｕｍａｂ）、抗ＬＡＧ−３抗体（例えば、ＢＭＳ−９８６０１６及びＬＡＧ５２５）等が挙げられる。
このうち、抗腫瘍効果増強の点から、抗ＰＤ−１抗体、抗ＰＤ−Ｌ１抗体、ＰＤ−１拮抗剤が好ましく、抗ＰＤ−１抗体がより好ましい。
【００２３】
後記実施例に示すとおり、本発明に係るプロバイオティクス及びプレバイオティクスの組み合わせは、免疫チェックポイント阻害剤と併用した場合に、免疫チェックポイント阻害剤による抗腫瘍効果を増強する。したがって、プロバイオティクス及びプレバイオティクスの組み合わせは、免疫チェックポイント阻害剤による抗腫瘍効果増強剤となり得る。
また、プロバイオティクス及びプレバイオティクス、並びに免疫チェックポイント阻害剤の併用は、Ｔｈ１細胞（ＣＤ３＋／ＣＤ４＋／ＩＦＮ−γ＋、ＣＤ３＋／ＣＤ８＋／ＩＦＮ−γ＋）やＮＫ細胞を活性化し、また制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）、骨髄由来免疫抑制細胞（ＭＤＳＣ）、免疫抑制サイトカイン（ＴＧＦ−β）の発現や機能を抑制する等、腫瘍免疫抑制系を抑制する。したがって、プロバイオティクス及びプレバイオティクス、並びに免疫チェックポイント阻害剤の組み合わせは抗腫瘍免疫活性化剤となり得る。
斯かる免疫チェックポイント阻害剤による抗腫瘍効果増強剤及び腫瘍免疫活性化剤は、がんの進行抑制、再発抑制、治療のために使用できる。
また、本発明の免疫チェックポイント阻害剤による抗腫瘍効果増強剤及び腫瘍免疫活性化剤によれば、免疫チェックポイント阻害剤の投与量の低減、副作用の軽減を図ることもできる。
【００２４】
本発明の免疫チェックポイント阻害剤による抗腫瘍効果増強剤又は抗腫瘍免疫活性化剤において、対象とされるがんは特に限定されず何れの固形がん及び血液がんも含まれる。例えば、頭頸部がん、食道がん、胃がん、結腸・直腸がん、肝臓がん、胆のう・胆管がん、膵臓がん、肺がん、乳がん、卵巣がん、膀胱がん、前立腺がん、睾丸がん、骨・軟部肉腫、悪性リンパ腫、白血病、子宮頚がん、皮膚がん、脳腫瘍等が挙げられるが、このうち、免疫チェックポイント阻害剤による腫瘍免疫療法が有効ながんが好ましい。
【００２５】
本発明のプロバイオティクス及びプレバイオティクスと、免疫チェックポイント阻害剤は、両者を同時に投与することでもよく、プロバイオティクス及びプレバイオティクスを先に投与し、その投与の後に免疫チェックポイント阻害剤を投与してもよいし、免疫チェックポイント阻害剤を先に投与し、プロバイオティクス及びプレバイオティクスを後に投与してもよい。
また、プロバイオティクス及びプレバイオティクスと、免疫チェックポイント阻害剤の投与形態は、同一でも異なっていてもよく、それぞれに適した形で投与されればよい。また、プロバイオティクス及びプレバイオティクス並びに免疫チェックポイント阻害剤は、これらを組み合わせたキットとして一つの医薬製剤とすることも可能である。
【００２６】
本発明の免疫チェックポイント阻害剤による抗腫瘍効果増強剤又は腫瘍免疫活性化剤において、プロバイオティクス及びプレバイオティクスの投与量は、年齢、体重、症状、治療効果、投与方法、処理時間等により異なるが、通常、成人一日あたり、プロバイオティクスとして３×１０７〜３×１０１１ＣＦＵ、好ましくは３×１０８〜３×１０１０ＣＦＵ、プレバイオティクスとして１〜１０ｇ、好ましくは３〜９ｇの範囲で、一日一回から数回投与するのが好ましい。
【００２７】
免疫チェックポイント阻害剤の投与量は、臨床上用いられている用量を基準として適宜選択することができる。また、免疫チェックポイント阻害剤は任意の２種以上を組み合わせて投与してもよい。
【実施例】
【００２８】
本発明を以下の実施例によってさらに詳しく説明するが、本発明の範囲はこれに限定されない。
＜試験品＞
１）プロバイオティクス
使用菌株についてラクトバチルス・カゼイＹＩＴ９０２９株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１３６６）、ビフィドバクテリウム・ブレーベＹＩＴ１２２７２株（ＦＥＲＭ  ＢＰ−１１３２０）
２）プレバイオティクス
β−１，４ガラクトシルラクトースを主成分とするガラクトオリゴ糖
３）シンバイオティクス
１ｍＬ ＧＯＳ（１００ｍｇ/１ｍＬ）、０．５ｍＬ（２０×１０８ＣＦＵ/１ｍＬ）ラクトバチルス・カゼイＹＩＴ９０２９株、０．５ｍＬ（２０×１０８ＣＦＵ/１ｍＬ）ビフィドバクテリウム・ブレーベＹＩＴ１２２７２株を混和する。
４）抗ＰＤ−１抗体
「Anti-PD1 (J43) Hamster IgG ms」（BioxCell社）(コントロール抗体「IgG Isotype Hamster IgG ms」（BioxCell）)【００２９】
実施例１  In vivo におけるシンバイオティクス／免疫チェックポイント阻害剤併用による抗腫瘍作用
７週齢の雄性Ｃ５７ＢＬ／６ＮＣｒＳｌｃマウスにマウス結腸癌細胞株ＭＣ３８細胞を移植し、細胞株移植モデルマウスを作製した。コントロール（Vehicle）群、シンバイオティクス投与群、抗ＰＤ−１抗体投与群、シンバイオティクス＋抗ＰＤ−１抗体投与群に分けた｛ｎ＝１０（Vehicle群）、５（シンバイオティクス投与群、抗ＰＤ−１抗体投与群）、６（シンバイオティクス＋抗ＰＤ−１抗体投与群）｝。
シンバイオティクスについては、移植後１日１回、シンバイオティクス０．２ｍＬ／ｍｏｕｓｅを２８日間毎日経口投与し、抗ＰＤ−１抗体については、腫瘍移植７日目より抗ＰＤ−１抗体を初回に２０ｍｇ／ｋｇ、以後６日おきに２〜４回目は１０ｍｇ／ｋｇで腹腔内投与した。
腫瘍体積はノギスにて測定した。（Ｔｕｋｅｙ−Ｋｒａｍｅｒ  ｔｅｓｔ）。
腫瘍体積は腫瘍の長径と短径を計測し、｛（長径）×（短径）２｝／２の計算式を用いて算出した。【００３０】
結果を図１に示す。図１より、抗ＰＤ−１抗体とシンバイオティクスの併用群の腫瘍体積が有意に小さいことが示された。一方で、両薬剤の単独使用群では有意な腫瘍体積の縮小は見られていない。また、単独使用時の腫瘍サイズはVehicle群およびシンバイオティクス＋抗ＰＤ−１抗体投与群の中点よりも大きいため、単なる相加効果とも異なる。よって、抗ＰＤ−１抗体とシンバイオティクスの併用時特異的に腫瘍成長抑制作用が発揮されていると判断することができる。【００３１】
実施例２  In vivo におけるシンバイオティクス／免疫チェックポイント併用による免疫細胞への影響
７週齢の雄性Ｃ５７ＢＬ／６ＮＣｒＳｌｃマウスにマウス結腸癌細胞株ＭＣ３８細胞を移植し、細胞株移植モデルマウスを作製した。コントロール（Vehicle）群、シンバイオティクス投与群、抗ＰＤ−１抗体投与群、シンバイオティクス＋抗ＰＤ−１抗体投与群に分けた。
シンバイオティクスについては、移植後１日１回シンバイオティクス０．２ｍＬ／ｍｏｕｓｅを２８日間毎日経口投与し、抗ＰＤ−１抗体については、腫瘍移植７日目より抗ＰＤ−１抗体を初回に２０ｍｇ／ｋｇ、以後６日おきに２〜４回目は１０ｍｇ／ｋｇで腹腔内投与した。
解剖時、各組織（脾臓、腫瘍）を回収し、細胞を単細胞状態に分離した。分離した細胞を各種免疫細胞のマーカータンパク特異的な抗体で標識し、フローサイトメーターにて識別した。識別データより、Ｔｈ１細胞（ＣＤ３＋／ＣＤ４＋／ＩＦＮ−γ＋、ＣＤ３＋／ＣＤ８＋／ＩＦＮ−γ＋）、Ｔｒｅｇの各細胞集団の細胞割合を測定した。｛ｎ＝８（Vehicle群）、５（シンバイオティクス投与群、抗ＰＤ−１抗体投与群）、６（シンバイオティクス＋抗ＰＤ−１抗体投与群）、Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ  ｔ  ｔｅｓｔ｝【００３２】
結果を図２に示す。図２より、周囲の免疫細胞の活性を抑制するＴｒｅｇ数がシンバイオティクス＋抗ＰＤ−１抗体投与群でのみ、有意な減少を示していることを確認した。Ｔｒｅｇは腫瘍細胞の対免疫機構としても利用されているため、この結果は両剤併用によって腫瘍の対免疫防御が抑制されたものと推察できる。一方で、脾臓中の活性化されたＴ細胞（活性化マーカーＣＤ８、ＣＤ４陽性）の数はシンバイオティクス＋抗ＰＤ−１抗体投与群で特異的な増加をしていないことから、併用による効果は免疫細胞の活性化を介していると示唆された。【００３３】
実施例３  In vivo におけるシンバイオティクス／免疫チェックポイント阻害剤併用による小腸における制御性Ｔ細胞（Treg）への影響
７週齢の雄性Ｃ５７ＢＬ／６ＮＣｒＳｌｃマウスにマウス結腸癌細胞株ＭＣ３８細胞を移植し、細胞株移植モデルマウスを作製した。コントロール（Vehicle）群、シンバイオティクス投与群、抗ＰＤ−１抗体投与群、シンバイオティクス＋抗ＰＤ−１抗体投与群に分けた｛ｎ＝１０（Vehicle群）、５（シンバイオティクス投与群、抗ＰＤ−１抗体投与群）、６（シンバイオティクス＋抗ＰＤ−１抗体投与群）｝。
シンバイオティクスについては、移植後１日１回、シンバイオティクス０．２ｍＬ／ｍｏｕｓｅを２８日間毎日経口投与し、抗ＰＤ−１抗体については、腫瘍移植７日目より抗ＰＤ−１抗体を初回に２０ｍｇ／ｋｇ、以後６日おきに２〜４回目は１０ｍｇ／ｋｇで腹腔内投与した。
解剖時、小腸を回収し、ＦＯＸＰ３を指標にリアルタイムＰＣＲにてＴｒｅｇを評価した。（Ｍａｎｎ  Ｗｈｉｔｎｅｙ  Ｕ  ｔｅｓｔ）【００３４】
結果を図３に示す。図３より、Ｔｒｅｇにおけるマスター転写因子であるＦＯＸＰ３遺伝子発現量はシンバイオティクス＋抗ＰＤ−１抗体投与群で有意に低下していることを示した。この結果は、先に示したＴｒｅｇ数の減少を支持するものである。【００３５】
実施例４  In vivo におけるシンバイオティクス／免疫チェックポイント阻害剤併用による全身における免疫抑制状態への影響
７週齢の雄性Ｃ５７ＢＬ／６ＮＣｒＳｌｃマウスにマウス結腸癌細胞株ＭＣ３８細胞を移植し、細胞株移植モデルマウスを作製した。コントロール（Vehicle）群、シンバイオティクス投与群、抗ＰＤ−１抗体投与群、シンバイオティクス＋抗ＰＤ−１抗体投与群に分けた｛ｎ＝１０（Vehicle群）、５（シンバイオティクス投与群、抗ＰＤ−１抗体投与群）、６（シンバイオティクス＋抗ＰＤ−１抗体投与群）｝。
シンバイオティクスについては、移植後１日１回、シンバイオティクス０．２ｍＬ／ｍｏｕｓｅを２８日間毎日経口投与し、抗ＰＤ−１抗体については、腫瘍移植７日目より抗ＰＤ−１抗体を初回に２０ｍｇ／ｋｇ、以後６日おきに２〜４回目は１０ｍｇ／ｋｇ腹腔内投与した。
解剖時、各組織（小腸、パイエル板）を回収し、ＴＧＦβを指標にリアルタイムＰＣＲにて免疫抑制状態を評価した。（Ｍａｎｎ  Ｗｈｉｔｎｅｙ  Ｕ  ｔｅｓｔ）【００３６】
結果を図４に示す。図４より、ＴＧＦβは免疫抑制的に作用するサイトカインであり、腸内細菌由来の物質により誘導を受ける。図４より、小腸全体および小腸免疫の中心組織であるパイエル板ではVehicle群と比較してシンバイオティクス＋抗ＰＤ−１抗体投与群で有意にＴＧＦβの遺伝子発現量が低く、小腸免疫の活性化が示唆された。【００３７】
実施例５  In vivo におけるシンバイオティクス／免疫チェックポイント阻害剤併用による腫瘍における骨髄由来免疫抑制細胞（ＭＤＳＣ）への影響
７週齢の雄性Ｃ５７ＢＬ／６ＮＣｒＳｌｃマウスにマウス結腸癌細胞株ＭＣ３８細胞を移植し、細胞株移植モデルマウスを作製した。コントロール（Vehicle）群、シンバイオティクス投与群、抗ＰＤ−１抗体投与群、シンバイオティクス＋抗ＰＤ−１抗体投与群に分けた｛ｎ＝１０（Vehicle群）、５（シンバイオティクス投与群、抗ＰＤ−１抗体投与群）、６（シンバイオティクス＋抗ＰＤ−１抗体投与群）｝。
シンバイオティクスについては、移植後１日１回、シンバイオティクス０．２ｍＬ／ｍｏｕｓｅを２８日間毎日経口投与し、抗ＰＤ−１抗体については、腫瘍移植７日目より抗ＰＤ−１抗体を初回に２０ｍｇ／ｋｇ、以後６日おきに２〜４回目は１０ｍｇ／ｋｇ腹腔内投与した。
解剖時、腫瘍を回収し、Ｂｖ８を指標にリアルタイムＰＣＲにてＭＤＳＣｓを評価した。（Ｍａｎｎ  Ｗｈｉｔｎｅｙ  Ｕ  ｔｅｓｔ）【００３８】
結果を図５に示す。Ｂｖ８はＭＤＳＣのマーカーであり、腫瘍内に存在するＭＤＳＣの数が減少し、抗腫瘍効果をもたらしたことが示唆される。【００３９】
実施例６  In vivo におけるシンバイオティクス／免疫チェックポイント阻害剤併用による全身における免疫状態への影響
７週齢の雄性Ｃ５７ＢＬ／６ＮＣｒＳｌｃマウスにマウス結腸癌細胞株ＭＣ３８細胞を移植し、細胞株移植モデルマウスを作製した。コントロール（Vehicle）群、シンバイオティクス投与群、抗ＰＤ−１抗体投与群、シンバイオティクス＋抗ＰＤ−１抗体投与群に分けた｛ｎ＝１０（Vehicle群）、５（シンバイオティクス投与群、抗ＰＤ−１抗体投与群）、６（シンバイオティクス＋抗ＰＤ−１抗体投与群）｝。
シンバイオティクスについては、移植後１日１回、シンバイオティクス０．２ｍＬ／ｍｏｕｓｅを２８日間毎日経口投与し、抗ＰＤ−１抗体については、腫瘍移植７日目より抗ＰＤ−１抗体を初回に２０ｍｇ／ｋｇ、以後６日おきに２〜４回目は１０ｍｇ／ｋｇで腹腔内投与した。
解剖時、各組織（小腸、腫瘍）を回収し、リアルタイムＰＣＲにて各サイトカイン（ＩＦＮ−β、ＩＬ−１７）遺伝子の発現量を評価した。（Ｍａｎｎ  Ｗｈｉｔｎｅｙ  Ｕ  ｔｅｓｔ）【００４０】
結果を図６に示す。図６より、シンバイオティクス＋抗ＰＤ−１抗体投与群の小腸において抗炎症性サイトカインであるＩＦＮ−βの遺伝子発現量が特異的に高発現しており、図４に示したＴＧＦβが低値であったことと併せ、小腸での免疫機能が亢進している可能性が高い。一方で、ＩＬ−１７は免疫細胞が高発現するサイトカインであり、これがシンバイオティクス＋抗ＰＤ−１抗体投与群において有意に高値であることは、腫瘍内の免疫細胞の増加を示唆している。これらの結果はともに、腫瘍免疫の活性化を支持するものである。【００４１】
実施例７  In vivo における各種腸内細菌製剤／免疫チェックポイント阻害剤併用によるＮＫ細胞活性増強作用
７週齢の雄性Ｃ５７ＢＬ／６ＮＣｒＳｌｃマウスにマウス結腸癌細胞株ＭＣ３８細胞を移植し、移植モデルマウスを作製した。コントロール（Vehicle）群（Ｃ）、抗ＰＤ−１抗体投与群（Ｐ）、プロバイオティクス＋抗ＰＤ−１抗体投与群（ＬＰ）、プレバイオティクス＋抗ＰＤ−１抗体投与群（ＧＰ）、シンバイオティクス投与群（ＬＧ）、シンバイオティクス＋抗ＰＤ−１抗体投与群（ＬＧＰ）に分けた｛ｎ＝９（Ｃ、ＬＧ、ＬＧＰ）、８（Ｐ、ＧＰ、ＬＰ）｝。
シンバイオティクスについては、移植後、日曜日を除く６日間１日１回のサイクルで、シンバイオティクス０．２ｍＬ／ｍｏｕｓｅ計１５日間経口投与し、抗ＰＤ−１抗体については、腫瘍移植６日目より抗ＰＤ−１抗体を初回に２０ｍｇ／ｋｇ、以後６日おきに２〜３回目は１０ｍｇ／ｋｇで腹腔内投与した。解剖時に採取した脾臓からシングル細胞を調製し、エフェクター細胞とした。ターゲット細胞としてはマウスリンパ腫であるＹＡＣ−１細胞を用いた。ターゲット細胞（４×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬ）をｃａｌｃｅｉｎ−ａｃｅｔｏｘｙｍｅｔｈｙｌｅｓｔｅｒ（ｃａｌｃｅｉｎ−ＡＭ，細胞標識試薬、最終濃度１ｍｇ／ｍＬ）添加状態で、３７℃、３０分間培養することで蛍光染色した。染色したターゲット細胞（１×１０４ｃｅｌｌｓ／１００ｍＬ）と前培養したエフェクター細胞（４×１０５ｃｅｌｌｓ／１００ｍＬ）をＵ−ｂｏｔｔｏｍ  ９６ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅで４時間共培養した（エフェクター細胞：ターゲット細胞＝４０：１）。その後、３００×ｇで５分間遠心分離し、上清８０μＬを黒色９６ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅに移し、蛍光プレートリーダーを用い培養上清に移行したｃａｌｃｅｉｎ−ＡＭ量を測定した（Ｅｘ．４８８ｎｍ、Ｅｍ．５３５ｎｍ）。得られた結果を以下の式に従い細胞傷害活性を算出した（ｎ＝６，標準誤差，Ｄｕｎｎｅｔ’ｓ  ｔｅｓｔ）。
細胞傷害活性（% cytolysis）＝（（サンプル蛍光強度−自然遊離蛍光強度）×１００）／（最大蛍光強度−自然遊離蛍光強度）【００４２】
結果を図７に示す。図７より、プロバイオティクス、プレバイオティクス、抗ＰＤ−１抗体の３者がそろったＬＧＰ群でのみＮＫ細胞の細胞傷害活性が有意に活性化されていることがわかる。図２に示したＴｒｅｇ数の減少により腫瘍の対免疫防御機能が抑制された結果、腫瘍に対する免疫細胞の活性が高まったものであり、両剤併用による腫瘍免疫の活性化を支持する結果である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【国際調査報告】
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