(57)【要約】  試料中に含まれる菌の全ゲノム解析を行う工程：および得られた全ゲノムの塩基配列と、配列番号１または２の塩基配列とを比較し、一致率に基づいて試料中の菌がpan-resistant K. pneumoniaeであるか否かを判定する工程を含む。【特許請求の範囲】
【請求項１】
pan-resistant K. pneumoniaeの検出方法であって、
試料中に含まれる菌の全ゲノム解析を行う工程：および
得られた全ゲノムに含まれる塩基配列と、配列番号１または２の塩基配列とを比較し、一致率に基づいて試料中の菌がpan-resistant K. pneumoniaeであるか否かを判定する工程
を含むことを特徴とするpan-resistant K. pneumoniaeの検出方法。
【請求項２】
配列番号１の塩基配列からなる染色体DNAと、配列番号２の塩基配列からなるプラスミドDNAを有するpan-resistant K. pneumoniaeに対して、抗菌薬の候補物質を含むサンプルを供給する工程を含むことを特徴とする抗菌薬のスクリーニング方法。
【請求項３】
配列番号１または２の塩基配列情報が格納されていることを特徴とする記憶媒体またはデータベース。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、pan-resistant K. pneumoniaeの検出方法、抗菌薬のスクリーニング方法および記録媒体・データベースに関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、カルバペネマーゼおよび基質特異性拡張型β-ラクタマーゼ（ESBL）産生菌などの多剤耐性（MDR）菌が、世界の特定の地域で非常に流行していることが報告されている（非特許文献１、２）。特に、Klebsiella pneumoniae carbapenem（KPC）を産生するグラム陰性菌は、世界的に大きな問題となっており（非特許文献３、４）、特に流行地域からの旅行者はMDR菌に感染する危険がある。そして、カルバペネム耐性腸内細菌の感染は、従来の抗菌剤を用いて治療することが困難であるため、臨床上の深刻な問題となっている。【０００３】
また、日本では、病院関連腸内細菌感染症の1％未満がカルバペネム耐性菌によるものであることが報告されている（非特許文献６）。通常、カルバペネムに対する耐性は、イミペネマーゼ（IMP）型メタロ-β-ラクタマーゼによって、またはポーリン変異と組み合わせたAmpCセファロスポリナーゼの過剰発現が介在している。KPC、ニューデリーメタロ-β-ラクタマーゼ（NDM）、およびオキサシリナーゼ-48（OXA-48）を含むカルバペネマーゼが一般的になりつつあるが、その検出は散発的なものに留まっている（非特許文献４、７）。【０００４】
アジアでは、KPC分離株は東南アジアを含む東アジアに限定されている（非特許文献３、７）。日本で報告されたKPC産生肺炎桿菌の最初の症例（2014年）は、もともとブラジルで入院した患者から分離されたものである（非特許文献８）。KPC産生肺炎桿菌はしばしばMDRであり、臨床治療および感染管理の点で深刻な問題を提起している。【０００５】
さらに、例えば、ESKAPE（Enterococcus faecium、Staphylococcus aureus、Klebsiella pneumoniae、Acinetobacter baumannii、Pseudomonas aeruginosa、Enterobacter sp.）と呼ばれる病原菌はしばしば薬剤耐性を獲得する。菌が耐性を示す薬物の数に応じて、それらはMDR、広範な薬物耐性（XDR）、そして最終的にはpandrug-resistant（PDR）として分類され、pandrug-resistant（PDR）を獲得した病原菌は、あらゆる利用可能な抗菌剤の影響を受けないことが知られている（非特許文献９、１０）。そして、PDRを獲得した病原菌の全ゲノム配列はほとんど入手することができないため、薬剤耐性の遺伝的構造および系についての報告はなされていないのが現状である。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Jacoby GA, Munoz-Price LS. The New β-Lactamases. N. Engl. J. Med. 2005; 352:380-391.
【非特許文献２】Wellington EM, Boxall AB, Cross P, et al. The role of the natural environment in the emergence of antibiotic resistance in Gram-negative bacteria. Lancet Infect. Dis. 2013;13:155-165.
【非特許文献３】Munoz-Price LS, Poirel L, Bonomo RA, et al. Clinical epidemiology of the global expansion of Klebsiella pneumoniae carbapenemases. Lancet Infect. Dis. 2013; 13:785-796.
【非特許文献４】Nordmann P, Poirel L. The difficult-to-control spread of carbapenemase producers among Enterobacteriaceae worldwide. Clin. Microbiol. Infect. 2014; 20:821-830.
【非特許文献５】van der Bij AK, Pitout JDD. The role of international travel in the worldwide spread of multiresistant Enterobacteriaceae. J. Antimicrob. Chemother. 2012; 67:2090-2100.
【非特許文献６】Infectious Disease Surveillance Center NI of ID. Carbapenem-resistant Enterobacteriaceae Infection, Japan. Infect. Agents Surveill. Rep. 2014; 35:281.
【非特許文献７】Lee C-R, Lee JH, Park KS, Kim YB, Jeong BC, Lee SH. Global Dissemination of Carbapenemase-Producing Klebsiella pneumoniae: Epidemiology, Genetic Context, Treatment Options, and Detection Methods. Front. Microbiol. 2016; 7:895.
【非特許文献８】Saito R, Takahashi R, Sawabe E, et al. First report of KPC-2 Carbapenemase-producing Klebsiella pneumoniae in Japan. Antimicrob. Agents Chemother. 2014; 58:2961-3.
【非特許文献９】Falagas ME, Bliziotis IA. Pandrug-resistant Gram-negative bacteria: the dawn of the postantibiotic era? Int. J. Antimicrob. Agents 2007; 29:630-636.
【非特許文献１０】Magiorakos A-P, Srinivasan A, Carey RB, et al. Multidrug-resistant, extensively drugresistant and pandrug-resistant bacteria: an international expert proposal for interim standard definitions for acquired resistance. Clin. Microbiol. Infect. 2012; 18:268-281.
【非特許文献１１】Jolley KA, Maiden MCJ. BIGSdb: Scalable analysis of bacterial genome variation at the population level. BMC Bioinformatics 2010; 11:595.
【非特許文献１２】Jia B, Raphenya AR, Alcock B, et al. CARD 2017: expansion and model-centric curation of the comprehensive antibiotic resistance database. Nucleic Acids Res. 2017; 45:D566-D573.
【非特許文献１３】Arndt D, Grant JR, Marcu A, et al. PHASTER: a better, faster version of the PHAST phage search tool. Nucleic Acids Res. 2016; 44:W16-W21.
【非特許文献１４】Sullivan MJ, Petty NK, Beatson SA. Easyfig: a genome comparison visualizer. Bioinformatics 2011; 27:1009-1010.
【非特許文献１５】Alikhan N-F, Petty NK, Ben Zakour NL, Beatson SA. BLAST Ring Image Generator (BRIG): simple prokaryote genome comparisons. BMC Genomics 2011; 12:402.
【非特許文献１６】Darling AE, Mau B, Perna NT. progressiveMauve: Multiple Genome Alignment with Gene Gain, Loss and Rearrangement. PLoS One 2010; 5:14
【非特許文献１７】Zhang Z, Schwartz S, Wagner L, Miller W. A Greedy Algorithm for Aligning DNA Sequences. J. Comput. Biol. 2000; 7:203-214.
【非特許文献１８】Xiang D-R, Li J-J, Sheng Z-K, et al. Complete Sequence of a Novel IncR-F33:A-:B- Plasmid, pKP1034, Harboring fosA3, blaKPC-2, blaCTX-M-65, blaSHV-12, and rmtB from an Epidemic Klebsiella pneumoniae Sequence Type 11 Strain in China. Antimicrob. Agents Chemother. 2015; 60:1343-8.
【非特許文献１９】Liu P, Li P, Jiang X, et al. Complete Genome Sequence of Klebsiella pneumoniae subsp. pneumoniae HS11286, a Multidrug-Resistant Strain Isolated from Human Sputum. J.Bacteriol. 2012; 194:1841-1842.
【非特許文献２０】Lam MMC, Wick RR, Wyres KL, et al. Genetic diversity, mobilisation and spread of the yersiniabactin-encoding mobile element ICEKp in Klebsiella pneumoniae populations. Microb. Genomics 2018;
【非特許文献２１】Blankschien MD, Potrykus K, Grace E, et al. TraR, a Homolog of a RNAP Secondary Channel Interactor, Modulates Transcription. PLoS Genet. 2009; 5:e1000345.
【非特許文献２２】Gopalkrishnan S, Ross W, Chen AY, Gourse RL. TraR directly regulates transcription initiation by mimicking the combined effects of the global regulators DksA and ppGpp. Proc. Natl. Acad. Sci. 2017; 114:E5539-E5548.
【非特許文献２３】Gu D, Dong N, Zheng Z, et al. A fatal outbreak of ST11 carbapenem-resistant hypervirulent Klebsiella pneumoniae in a Chinese hospital: a molecular epidemiological study. Lancet Infect. Dis. 2017;
【非特許文献２４】Huang Y-H, Chou S-H, Liang S-W, et al. Emergence of an XDR and carbapenemaseproducing hypervirulent Klebsiella pneumoniae strain in Taiwan. J. Antimicrob. Chemother. 2018; 73:2039-2046.
【非特許文献２５】Shoma S, Kamruzzaman M, Ginn AN, Iredell JR, Partridge SR. Characterization of multidrug-resistant Klebsiella pneumoniae from Australia carrying blaNDM-1. Diagn. Microbiol. Infect. Dis. 2014; 78:93-97.
【非特許文献２６】Zhang Y, Jiang X, Wang Y, et al. Contribution of β-Lactamases and Porin Proteins OmpK35 and OmpK36 to Carbapenem Resistance in Clinical Isolates of KPC-2- Producing Klebsiella pneumoniae. Antimicrob. Agents Chemother. 2014; 58:1214-1217.
【非特許文献２７】Deguchi T, Fukuoka A, Yasuda M, Nakano M, Ozeki S, Kanematsu E, et al. Alterations in the GyrA subunit of DNA gyrase and the ParC subunit of topoisomerase IV in quinolone resistant clinical isolates of Klebsiella pneumoniae. Antimicrob Agents Chemother 1997;41:699-701.
【非特許文献２８】Sheng Z-K, Hu F, Wang W, Guo Q, Chen Z, Xu X, et al. Mechanisms of Tigecycline Resistance among Klebsiella pneumoniae Clinical Isolates. Antimicrob Agents Chemother 2014;58:6982-5. doi:10.1128/AAC.03808-14.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明者らは、インドネシアのジャカルタの病院から移送された患者からの3つの異なるカルバペネム耐性グラム陰性菌のうちの１つとして、新規なPDR K. pneumoniae ST11分離株を取得し、この菌株の全ゲノム解析を行った。【０００８】
本発明は、以上のような事情に鑑みてなされたものであり、新規なPDR K. pneumoniaeと、この全ゲノム解析による塩基配列情報を利用して、pan-resistant K. pneumoniaeの検出方法、抗菌薬のスクリーニング方法および記録媒体・データベースを提供することを課題としている。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明は、pan-resistant K. pneumoniaeの検出方法であって、  試料中に含まれる菌の全ゲノム解析を行う工程：および
得られた全ゲノムに含まれる塩基配列と、配列番号１または２の塩基配列とを比較し、一致率に基づいて試料中の菌がpan-resistant K. pneumoniaeであるか否かを判定する工程
を含むことを特徴としている。【００１０】
抗菌薬のスクリーニング方法は、配列番号１の塩基配列からなる染色体DNAと、配列番号２の塩基配列からなるプラスミドDNAを有するpan-resistant K. pneumoniaeに対して、抗菌薬の候補物質を含むサンプルを供給する工程を含むことを特徴としている。【００１１】
本発明の記憶媒体またはデータベースは、配列番号１または２の塩基配列情報が格納されていることを特徴としている。
【発明の効果】
【００１２】
本発明のpan-resistant K. pneumoniaeの検出方法によれば、試料中の菌がpan-resistant K. pneumoniaeか否かを正確に判定することができる。本発明の抗菌薬のスクリーニング方法によれば、pan-resistant K. pneumoniaeのみならず他の菌に対しても有効な抗菌薬を確実にスクリーニングすることができる。本発明の記憶媒体またはデータベースによれば、pan-resistant K. pneumoniaeの塩基配列情報による各種の分析、研究などのための利用や商業的利用が実現される。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】K. pneumoniae染色体の系統樹を示した図である。全ゲノムで構築されたK. pneumoniae染色体完全配列の系統樹 PathoBacTyperを使用した一塩基多型を示している。
【図２】K. pneumoniae ST11分離株の系統解析を示す図である。（a）PathoBacTyperを使用した全ゲノム一塩基多型分析で構築された48のK. pneumoniae ST11分離株の系統樹を示している。 黒丸は、病原性プラスミドを保有していると報告されている株を示している。 （b）K. pneumoniae ST11分離株が保有するプラスミドの比較分析を示した図である。 Easyfigを使用して、プラスミド配列を比較している。 上部、中間、下部のシーケンスは、それぞれpKP1034、p69-2、およびpTK1401を表している。
【図３】K. pneumoniae ST11分離株KP69およびTK1401の比較ゲノム解析を示した図である。KP69およびTK1401の染色体配列は、BLAST Ring Image Generator（BRIG）を使用して比較している。
【図４】K. pneumoniae ST11分離株KP69およびTK1401の比較ゲノム解析を示した図である。KP69およびTK1401のプラスミド配列をBRIGを使用して比較している。
【図５】K. pneumoniae ST11分離株のゲノムを比較解析した図である。（a）は、K. pneumoniae ST11分離株JM45、HS11286、KP69、およびTK1401の染色体の比較分析を示している（progressiveMauveを使用して実施）。プロファージおよびltrA（グループIIイントロン逆転写酵素）遺伝子の位置が矢印で示されている。（b）は、K. pneumoniae ST11分離株が保有するプラスミドの比較分析を示した図である。 Easyfigを用いてプラスミド配列を比較した。 上、中央、および下の配列はそれぞれ、pKP1034、pTK1401およびpKSH203-KPCを表す。
【図６】K. pneumoniaeプラスミド完全配列の系統樹を示す図である。parsnp を使用して一塩基多型を示している。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本発明者らは、インドネシアでの治療歴がある日本人患者から分離されたK. pneumoniaeについて、全ゲノム解析を行い、5.5Mbの染色体DNAの塩基配列（配列表：配列番号１）、128kbのプラスミドDNAの塩基配列（配列表：配列番号２）を決定している。
【００１５】
そして、このK. pneumoniaeは、9クラスの抗菌薬に対する16種類の薬剤耐性遺伝子を有しており、市販の抗菌薬が効果を示さないpan-resistant （PDR）であることが確認されている。
【００１６】
本発明のpan-resistant K. pneumoniaeの検出方法の一実施形態について説明する。
【００１７】
本発明のpan-resistant K. pneumoniaeの検出方法は、（１）試料中に含まれる菌の全ゲノム解析を行う工程、および
（２）前記工程（１）で得られた全ゲノムに含まれる塩基配列と、配列番号１または２の塩基配列とを比較し、一致率に基づいて試料中の菌がpan-resistant K. pneumoniaeであるか否かを判定する工程
を含む。
【００１８】
工程（１）では、例えば、患者や環境中から採取した試料について、公知の方法でゲノムDNAを単離し、公知の方法で菌のゲノム解析を行う（例えば、illumina社のMiSeq, Genome Analyzerシリーズ、HiSeqシリーズ、Lifetechnologies社のion proton、ion PGM, SoLid シリーズ、Roche社のGSシリーズ、PacBio社のPacBio RSシリーズなど）。これによって、試料中に含まれる菌の全ゲノムに関する塩基配列情報を得る。
【００１９】
工程（２）では、前記工程（１）で得られた全ゲノムの塩基配列と、配列番号１または２の塩基配列とを比較し、一致率に基づいて試料中の菌がpan-resistant K. pneumoniaeか否かを判定する。
【００２０】
コンピューターに入力された全ゲノムの塩基配列情報について、市販のソフトウェアを用いた処理によって、配列番号１または２の塩基配列との比較（一致率の算出など）を行うことができる。また、例えば、塩基配列の一致率が99.9％以上の場合は、pan-resistant K. pneumoniaeであると判定することができる。また、判定に際しては、本発明者らによって見出されたpan-resistant K. pneumoniae が有する16種類の薬剤耐性遺伝子に着目することができる。
【００２１】
さらに、本発明では、配列番号１または２の塩基配列情報が格納されている記憶媒体またはデータベースをも提供する。記憶媒体は特に限定されないが、磁気保存媒体、例えばフロッピーディスク、ハードディスク保存媒体及び磁気チープ; CD−ROMのような光学保存媒体; RAM及びROMのような電気保存媒体などを例示することができる。また、データベースは、特に、データ保存手段に保存された配列番号１または２の塩基配列情報を有しているコンピューターに基づくシステムの形態を例示することができる。
【００２２】
次に、本発明の抗菌薬のスクリーニング方法について説明する。
【００２３】
本発明の抗菌薬のスクリーニング方法は、配列番号１の塩基配列からなる染色体DNAと、配列番号２の塩基配列からなるプラスミドDNAを有するpan-resistant K. pneumoniaeに対して、抗菌薬の候補物質を含むサンプルを供給する工程を含む。
【００２４】
本発明者らによって見出されたpan-resistant K. pneumoniaeは、配列番号１の塩基配列からなる染色体DNAと、配列番号２の塩基配列からなるプラスミドDNAを有し、9クラスの抗菌薬に対する16種類の薬剤耐性遺伝子を含んでいるため、市販の抗菌薬が効果を示さない。したがって、pan-resistant K. pneumoniaeに対する有効性が期待される抗菌薬の候補物質を含むサンプルをpan-resistant K. pneumoniaeに与え、例えばpan-resistant K. pneumoniaeの生存数の減少などが確認できた場合は、pan-resistant K. pneumoniaeのみならず他の菌に対しても有効な抗菌薬として評価することができる。このように、本発明者らによって見出されたpan-resistant K. pneumoniaeを利用することで、新たな抗菌薬の有効成分をスクリーニングすることができる。
【００２５】
さらに、このK. pneumoniaeのゲノム解析から得られた塩基配列情報（配列番号１、２）またはその代表的なフラグメントは、当業者による各種の分析、研究などのために利用され得る。
【００２６】
例えば、配列番号１、２に示される塩基配列情報に基づいて、本発明者らによって見出されたpan-resistant K. pneumoniaeを検出するために利用されるプライマーやプローブを設計に利用することなどが考慮される。例えば、プライマーセットを用いたPCR（Polymerase Chain Reaction）や、プローブを用いたサザンハイブリダイゼーション法、FISH（Fluorescent in situ hybridization）法などのゲノムDNAを特異的に検出するための方法の確立に利用することができる。
【００２７】
本発明のpan-resistant K. pneumoniaeの検出方法、抗菌薬のスクリーニング方法および記録媒体、データベースは、以上の実施形態に限定されることはない。
【実施例】
【００２８】
以下、実施例により本発明をさらに詳しく説明するが、本発明はこれらの実施例に何ら限定されるものではない。【００２９】
＜１＞分離株の取得
K. pneumoniae分離株TK1401は、以前、感染防止のためのサーベイランススクリーニングプログラムの一部として、患者の糞便サンプル、気管サンプル（吸引液および痰を含む）、ならびに咽頭および創傷スワブから採取された。この患者は、インドネシアのジャカルタにある病院での入院歴がある74歳の日本人男性であった。【００３０】
＜２＞菌株の培養と単離
スクリーニングサンプルは、CHROM Agar mSuperCARBA（関東化学株式会社、東京、日本）で培養し、グリセロール中で-80℃で保存した。単離物の凍結ストックをLysogeny broth（LB）（Miller）寒天（Becton Dickinson、Franklin Lakes、NJ、USA）上に画線し、37℃でインキュベートした。LB（Miller）（Sigma-Aldrich、St Louis、MO、米国）中で37℃で増殖させ、単一コロニーを、Bio-shaker BR-40LF（株式会社タイテック社、東京、日本）中で液体培養した。そして、DNeasy Blood＆Tissue Kit（QIAGEN、ヒルデン、ドイツ）を用いて、ゲノムDNAを単離した。【００３１】
＜３＞抗菌剤感受性試験
MicroScan WalkAway装置(Beckman Coulter, Brea, CA, USA)を使用して試験を実施した。 コリスチンの最小阻止濃度（MIC）は、Ｅテスト（バイオメリュー、マルシーエトワール、フランス）およびブロス微量希釈法を用いて確認した。 抗菌薬感受性は、Clinical and Laboratory Standards Institute（CLSI）のガイドライン（M100-S24）に記載されているブレークポイントによって定義されている。【００３２】
＜４＞ゲノム解析
DNeasy Blood＆Tissue Kit（QIAGEN, Hilden, Germany）を用いて、K. pneumoniae TK1401の細胞からゲノムDNAを単離した。全ゲノム配列は、PacBio RSII（Pacific Biosciences、Menlo Park、CA、USA）を用いた単一分子リアルタイムシークエンシング（single-molecule realtime sequencing：SMRT）によって決定した。210,166リード長および12,144 bpのN50リード長からなる1,896 Mbの配列を得た。Hierarchical Genome Assembly Process version 3を２つの環状コンティグのアセンブリに使用した。染色体およびプラスミドの全配列は、それぞれ、57.4％のＧＣ含有量を有する5,488,304bp、および54.4％のＧＣ含有量を有する128,638bpを含んでいた（配列番号１、２）。DDBJ Fast Annotation and Submission Tool betaによって、プラスミド中に173個のタンパク質コード領域および染色体中に5,156個のタンパク質コード領域を同定し、9コピーの5S、8コピーの16S、および23S rRNA、および86個のtRNAが含まれることが確認された。【００３３】
ゲノム配列は、細菌分離ゲノム配列データベース（BIGSdb; http://bigsdb.pasteur.fr/klebsiella/）（非特許文献１１）、包括的な抗生物質耐性データベース（CARD; http://arpcard.mcmaster.ca）（非特許文献１２）を用いて分析し、Phage Search Tool Enhanced Release（PHASTER; http://phaster.ca）（非特許文献１３）、Easyfig v2.2.2 （非特許文献１４）、BLAST Ring Image Generator（BRIG）（非特許文献１５）、およびprogressiveMauve（非特許文献１６）を使用して比較した。 ゲノム類似性は、NCBI BLASTN 2.10.0を使用して分析した（非特許文献１７）。系統解析は、PathoBacTyper（http://hast.nhri.org.tw/PathoBacTyper/）およびHarvest v1.1.2を使用した全ゲノム一塩基多型（wgSNP）分析で行い、系統樹は、FigTree v1.4.3を使用して表した。ゲノム配列は、DDBJに登録されている（BioProject number PRJDB8036）。【００３４】
＜５＞結果
（抗菌剤感受性試験）
抗菌剤感受性試験の結果を表１に示す。【００３５】
【表１】
2020148990.tif 000002
【００３６】
分離された菌株TK1401は、ペニシリン、セファロスポリン、カルバペネム、モノバクタム、アミノグリコシド、フルオロキノロン、ポリミキシン、テトラサイクリン、グリシルサイクリン、フェニコール、トリメトプリム - スルファメトキサゾール、またはホスホマイシンに感受性がなかった。これらの結果は、菌株TK1401がPDR表現型を有することを示唆している。これは日本でPDR （pan-resistant）K. pneumoniaeを保有する患者の最初の報告であると考えられる。【００３７】
このK. pneumoniae分離株のゲノム配列決定により、genomic MLST（gMLST） ST11に属する129kbのプラスミドおよび5.5Mbの染色体であることが明らかになった。プラスミドincompatibility群は、ハイブリッドincompatibility群であるIncR-F33：A-：B-であった。このincompatibility群プラスミドは非伝達性プラスミドである（非特許文献１８）。また、K. pneumoniae分離株TK1401と大腸菌JE53との間の接合は確認されなかった。【００３８】
（ゲノム解析）
K. pneumoniae分離株TK1401の全ゲノム配列として、染色体DNAを配列表の配列番号１に、プラスミドDNAを配列表の配列番号２に示す。【００３９】
K. pneumoniae分離株TK1401の染色体は、トップ100ヒットで、38から4,351までの範囲の一塩基多型（SNP）に分類された。それはアジアで同定されたST11分離株の集団であった（図１）。
図２（a）は、K. pneumoniae ST11株TK1401のゲノム配列と中国を中心とする他のK. pneumoniae ST11株のゲノム配列を比較したwgSNPから構築された系統樹を示している。BIGSdbのwzcおよびwzi配列を使用したGenomic capsular typingにより、K.pneumoniae ST11分離株は主に、K47タイプ（wzc47、wzi209）、K64タイプ（wzc64、wzi64）、およびその他のカプセル合成（cps）遺伝子と集団を形成していることが明らかになった。
K. pneumoniae分離株TK1401の染色体は、中国、上海の復旦大学、上海医科大学のHuashan病院で単離されたKPC-2産生K. pneumoniae分離株KP69（GenBank accession number CP025456）に最も類似していた（99％の検索範囲、99％の同一性）。CARDを使用したKP69のゲノム分析では、KP69がpan-resistant遺伝子型ではないことが明らかになった（表２）。チゲサイクリンおよびポリミキシン耐性変異は、分離株TK1401のramRおよびmgrB遺伝子において同定されたが、KP69のそれらにおいては同定されなかった。【００４０】
【表２】
2020148990.tif 000003
【００４１】
K. pneumoniae ST11株TK1401のゲノム配列と中国に由来するK. pneumoniae ST11株（JM45、HS11286、およびKP69）のゲノム配列を比較した（図１）。比較のために、ST11分離株JM45（GenBank accession number CP006656）およびHS11286（GenBank accession number CP003200）をKP69に加えて使用した。全体として、ゲノム構造は保存されていた。違いは、SNPと、可動遺伝因子（プロファージ、統合型共役因子（ICE）、トランスポゾン（Tn））の挿入および欠失と、挿入配列であった。 【００４２】
HS11286は、２つのICE（ICEKpnHS11286-1とICEKpnHS11286-2）有している（非特許文献１９）。ICEKpnHS11286-2はJM45、HS11286、KP69、およびTK1401で保存されていた。対照的に、最近ICEKp3として分類されたICEKpnHS11286-1は、HS11286、KP69、およびTK1401において保存されていた（図１）。これらの結果は、TK1401がこれらのICEの両方を保有するST11株に属することを示唆しており、これはST11株の病原性に寄与している可能性がある。【００４３】
pan-resistant TK1401およびnon- pan-resistant KP69のゲノムを比較すると、TK1401における遺伝子の欠失が明らかになった（図３-図５）。ISKpn25トランスポザーゼの上流にある欠失領域には、DinI、LtrA（グループIIイントロン逆転写酵素）、DNAアデニンメチラーゼ、DNA複製エンドヌクレアーゼ、および８つの仮想タンパク質および3つのプロファージ関連タンパク質をコードする遺伝子が含まれている。 KP69およびTK1401はそれぞれ８つおよび７つのltrA遺伝子を有する。 【００４４】
DNAアデニンメチラーゼおよびDNA複製エンドヌクレアーゼを含むタンパク質の大部分はプロファージ機能に関連すると考えられている。 DinIは組換えを制御するため、DinIの喪失は組換えを上方制御する可能性がある。仮想タンパク質の１つであるCYD98_21555は、DskA_TraRスーパーファミリーに属するTraRに類似している。TraRは包括的な転写調節因子として知られている（非特許文献２１、２２）
また、7つの耐性遺伝子fosA3、blaKPC-2、blaCTXM-65、blaSHV-12、blaTEM-1、rmtB、およびcatA2を含むIncR-F33：A-：B-プラスミドを見つけるために、NCBI BLASTN 2.10.0を使用してヌクレオチドコレクション（nr / nt）を検索した。rmtB、blaKPC-2、blaSHV-12、fosA3、およびcatA2配列は、遺伝子マーカーとして、3つのGenBankデータを使用した（accession number KP893385、CP034324、LR59607）。各プラスミドを保持する3つの株はすべてST11に属している。これらのデータは、遺伝子マーカー（rmtB、blaKPC-2、blaSHV-12、fosA3、およびcatA2）が、多剤耐性IncR-F33：A-：B-プラスミド（特に7つの耐性遺伝子fosA3、blaKPC-2、blaCTX-M-65、blaSHV-12、blaTEM-1、rmtB、およびcatA2Kを有するもの）を見つけるのに役立つこと、K. pneumoniae ST11の進化を理解するのに役立つこと、を示している。
fosA3遺伝子は、wzi209（K47）およびwzi64（K67）タイプのcps遺伝子を含むK. pneumoniae ST11で検出されているので（非特許文献１８）、fosA3プラスミドがK47およびK67 K. pneumoniae ST11で進化している可能性が示唆される。 Easyfigを使用して、pKP1034、pTK1401、およびpKSH203-KPCを比較した（図５（b））。この比較により、pKP1034様プラスミドおよび組換えによる再配列は、転位因子（ISおよびTn）によって引き起こされる可能性があることが確認された。
TK1401ゲノム配列から同定されたプラスミドpTK1401は、K．pneumoniae分離株の上位97のBLASTヒットのうち41で系統学的に分析された（図６）。これは、KPC-2産生K．pneumoniae分離株KP69のプラスミドp69-2に最も類似していた  （GenBank accession number  CP025458、99％の検索範囲、99％の同一性）。pKP69-2は、伝染性KPC-2産生K．pneumoniae分離株KP1034由来のfosA3、blaKPC-2、blaCTX-M-65、blaSHV-12、およびrmtBを有するIncR-F33：A-：B-プラスミドpKP1034（GenBank accession number KP893385）と非常に類似していた。 【００４５】
次に、Easyfigを使用して、KPC-2をコードするプラスミドpKP1034、p69-2、およびpTK1401を比較した（図２（ｂ））。この比較は、pKP1034様プラスミドがp69−2を形成するための組換えにより再配列された可能性を示唆している。p69−2様プラスミドのさらなる組換えによってpTK1401が形成された可能性がある。【００４６】
fosA3、blaKPC-2、blaCTX-M-65、blaSHV-12、およびrmtBを有するIncR-F33：A-：B-プラスミドは、pKP1034、pKP69-2、pKPGD4、pKPC-CR-HvKP4、およびpTK1401と集団を形成していた。これらのプラスミドは、KL47型cps遺伝子を有するK. pneumoniae ST11から同定された。pKPC-CRHvKP4は、病原性プラスミドpVir-CR-HvKP4を保有する高毒性のKPC-2産生K. pneumoniae ST11株から単離され、配列決定されている（非特許文献２３）。本実施例においては、pTK1401は、BIGSdbを用いたゲノム分析によって、KL47-type cps 遺伝子を有し、病原性プラスミドを欠いているpan-resistant K. pneumoniae ST11 から同定された。また、主要な病原性遺伝子はKL47 ST11分離株で保存されていた（表３）。【００４７】
【表３】
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【００４８】
K. pneumoniae分離株TK1401は、最近中国と台湾で確認された高病原性カルバペネム耐性K. pneumoniae (hvpk-5 GenBank accession number NJPJ00000000 and TVGHCRE225 GenBank accession number CP023722)に関連しているが、病原性プラスミドを欠いている（非特許文献２３、２４）。【００４９】
TK1401分離株のプラスミドおよび染色体に含まれる耐性遺伝子を表１に列挙している。染色体gyrA（D87G）およびparC（S80I）遺伝子のキノロン耐性決定因子領域の変異は、フルオロキノロンに対する耐性と関係している（非特許文献２８）。ramR（T162I）転写抑制遺伝子の突然変異は、チゲサイクリンに対する耐性を付与する（非特許文献２７）。 AcrAB排出ポンプの過剰発現は、クロラムフェニコール、フルオロキノロン、テトラサイクリン、グリシルサイクリンなどの複数の薬剤に対する耐性に寄与する可能性がある。TK1401のコリスチン耐性は、mgrBのフレームシフト変異（FS_aa8）に関連していることが確認された。
また、表１に示したように、このプラスミドは、カルバペネマーゼ遺伝子blaKPC-2、ESBL遺伝子blaCTX-M-65、ならびにβ-ラクタマーゼ遺伝子blaTEM-1BおよびblasHV-12、blaSHV-11を有している。５つのβラクタマーゼによって、表１に列挙されたすべてのβラクタムに対する耐性を備えていると考えられる。さらに、βラクタマーゼに加えて、膜透過性と薬剤耐性に関連する外膜ポーリン（ompK35、ompK36、およびompK37）をコードする染色体遺伝子が検出された。TK1401は、ompK35（FS_aa29）にフレームシフト変異を持っているが、これはKPCを産生するK. pneumoniae ST11株HS11286が有するompK35（FS_aa134）のものとは異なっている（非特許文献２５）。TK1401のompK36遺伝子は、中国で分離されたKPC産生K. pneumoniae ST11株HS092187が保有するompK36変異体（GenBank accession number JX310552）と同一であり、カルバペネム耐性と関連している（非特許文献２６）。TK1401のompK37遺伝子は、HS11286およびNDM産生K. pneumoniae ST11分離株JIE2713（GenBank accession number KC534871）のものと同一である（非特許文献２６）。 TK1401のすべてのompK遺伝子はKP69で保存されており、これはKP69が祖先株である可能性を示唆している。また、pan-resistant K. pneumoniaeのコリスチン耐性がmgrB（FS_aa8）のフレームシフト変異と関連していることが見出された。コリスチン耐性ST11株およびKPC-2産生ST11株がアジアで報告されているが、両方の表現型を有するpan-resistant K. pneumoniae ST11の出現は、臨床治療と感染管理の両方にとって脅威となる。【００５０】
以上の通り、本発明者らによって解析されたK. pneumoniae分離株TK1401の全ゲノム配列を利用することで、試料中に含まれる菌の全ゲノムの塩基配列と、配列番号１または２の塩基配列とを比較し、一致率に基づいて試料中の菌がpan-resistant K. pneumoniaeか否かを判定することができる。また、本発明者らによって見出されたpan-resistant K. pneumoniaeに対して、抗菌薬の候補物質を含むサンプルを供給することで、有効な抗菌薬をスクリーニングすることができる。【００５１】
K. pneumoniaeの系統樹解析に使用した菌株、プラスミドを表４〜表７に示す。
【表４】
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【表５】
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【表６】
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【表７】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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