(57)【要約】  本発明は、効率的に細胞又はミトコンドリアへ薬物を送達する技術を提供する。本発明の薬物複合体は、薬物と該薬物に結合された標的指向性部位とを含む、薬物複合体であって、該標的指向性部位が、下記式（Ｉ）で表されるホスホコリン基を含む、薬物複合体。【化１】2020116640.tif 000023
2020116640.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
薬物と該薬物に結合された標的指向性部位とを含む、薬物複合体であって、
該標的指向性部位が、下記式（Ｉ）で表されるホスホコリン基を含む、薬物複合体。
【化１】
2020116640.tif 000017
【請求項２】
薬物送達用ポリマーと該薬物送達用ポリマーに結合された標的指向性部位とを含む、ポリマー複合体であって、
該標的指向性部位が、下記式（Ｉ）で表されるホスホコリン基を含む、ポリマー複合体。
【化２】
2020116640.tif 000018
【請求項３】
前記薬物送達用ポリマーが、親水性ポリマーセグメントと疎水性ポリマーセグメントとを含む、請求項２に記載のポリマー複合体。
【請求項４】
さらに薬物が結合されている、請求項２又は３に記載のポリマー複合体。
【請求項５】
請求項２から４のいずれかに記載のポリマー複合体を含む、薬物送達用組成物。
【請求項６】
薬物をさらに含む、請求項５に記載の薬物送達用組成物。
【請求項７】
送達対象化合物と、下記式（Ｉ）で表されるホスホコリン基を有する化合物と、を結合させる工程を含む、標的指向性を有する化合物の製造方法。
【化３】
2020116640.tif 000019
【請求項８】
送達対象物を下記式（Ｉ）で表されるホスホコリン基を含む標的指向性部位で修飾することを含む、送達対象物に細胞又はミトコンドリアへの指向性を付与する方法。
【化４】
2020116640.tif 000020
【請求項９】
前記送達対象物が、リポソーム、高分子ミセル、ポリイオンコンプレックス、ポリプレックス、リポプレックス、リポポリプレックス、無機金属粒子、脂質ナノ粒子及びゲルから選択される、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
細胞又はミトコンドリアへの指向性を有する化合物の製造のための、下記式（Ｉ）で表されるホスホコリン基又は下記式（Ｉ）で表されるホスホコリン基を有する化合物の使用。
【化５】
2020116640.tif 000021
【請求項１１】
標的指向性部位を含み、標識物質によって標識化された検出試薬であって、
該標的指向性部位が、下記式（Ｉ）で表されるホスホコリン基を含む、検出試薬。
【化６】
2020116640.tif 000022
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ホスホコリン基を含む薬物複合体及びポリマー複合体、ならびに該ポリマー複合体を含む薬物送達用組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
一般に、経口や静脈内注射によって薬物を全身投与すると、投薬対象の患部だけでなく、正常組織にも薬物が集積する。この結果、薬物投与による副作用が認められ、治療方法の変更や中断が必要になる場合がある。これに対し、副作用の低減を目的として、患部に薬物を選択的に輸送する薬物送達システム（ＤＤＳ）が開発されている。【０００３】
薬物の患部への集積量の増大に向けて、患部を指向するリガンド分子の開発が進められている。従来は、細胞取り込み量を増大するための研究が中心であったが、近年では細胞内のミトコンドリアへの薬物送達にも関心が向けられており、ミトコンドリアへのタンパク質や核酸等の薬物送達による難治性疾患の治療が期待されている。細胞内及びミトコンドリアへの薬物送達に関しては、例えば、トリフェニルホスホニウムをリガンド分子として利用する技術が検討されている（例えば、非特許文献１〜３）。【０００４】
しかしながら、上記技術では、生体内分布の制御が不十分であり、効率的に細胞内又はミトコンドリアへ薬物を送達する技術の開発が望まれている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ，２０１４，１１（８），２６４０−２６４９
【非特許文献２】Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍｕｎ．，２０１７，５３，８７９０−８７９３
【非特許文献３】Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，２０１５，１３７（１８），５９３０−５９３８
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、上記課題を解決するためになされたものであり、その主たる目的は、効率的に細胞内又はミトコンドリアへ薬物を送達する技術を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
上記課題を解決すべく本発明者らが鋭意検討したところ、送達対象の薬物や薬物を担持するキャリア又はその構成要素にホスホコリン基を含む標的指向性部位を導入することにより、がん細胞及びミトコンドリアへの指向性を付与できることを見出し、本発明を完成するに至った。【０００８】
すなわち、本発明の１つの局面によれば薬物と該薬物に結合された標的指向性部位とを含む、薬物複合体であって、該標的指向性部位が、下記式（Ｉ）で表されるホスホコリン基を含む、薬物複合体が提供される。
【化１】
2020116640.tif 000003
本発明の別の局面によれば、薬物送達用ポリマーと該薬物送達用ポリマーに結合された標的指向性部位とを含む、ポリマー複合体であって、該標的指向性部位が、上記式（Ｉ）で表されるホスホコリン基を含む、ポリマー複合体が提供される。
１つの実施形態において、上記薬物送達用ポリマーが、親水性ポリマーセグメントと疎水性ポリマーセグメントとを含む。
１つの実施形態において、上記ポリマー複合体には、さらに薬物が結合されている。
本発明のさらに別の局面によれば、上記ポリマー複合体を含む、薬物送達用組成物が提供される。
１つの実施形態において、上記薬物送達用組成物は、薬物をさらに含む。
本発明のさらに別の局面によれば、送達対象化合物と、上記式（Ｉ）で表されるホスホコリン基を有する化合物と、を結合させる工程を含む、標的指向性を有する化合物の製造方法が提供される。
本発明のさらに別の局面によれば、送達対象物を上記式（Ｉ）で表されるホスホコリン基を含む標的指向性部位で修飾することを含む、送達対象物に細胞又はミトコンドリアへの指向性を付与する方法が提供される。
１つの実施形態において、上記送達対象物が、リポソーム、高分子ミセル、ポリイオンコンプレックス、ポリプレックス、リポプレックス、リポポリプレックス、無機金属粒子、脂質ナノ粒子及びゲルから選択される。
本発明はまた、細胞又はミトコンドリアへの指向性を有する化合物の製造のための、上記式（Ｉ）で表されるホスホコリン基又は上記式（Ｉ）で表されるホスホコリン基を有する化合物の使用に関する。
本発明のさらに別の局面によれば、標的指向性部位を含み、標識物質によって標識化された検出試薬であって、該標的指向性部位が、上記式（Ｉ）で表されるホスホコリン基を含む、検出試薬が提供される。
【発明の効果】
【０００９】
ＤＤＳキャリアの設計においては、一般に、正の電荷は負に帯電する細胞膜との静電相互作用に有利であり、また、疎水的性質は、疎水的な細胞膜表面と親和性が高くなることから好ましいと考えられる。上記従来の標的指向性部位として利用されてきたトリフェニルホスホニウムも当該設計方針に沿ったものであり、疎水性であり、かつ、正電荷を帯びている。これに対し、本発明によれば、全体として電荷が中和され、かつ、親水性であるホスホコリン基を標的指向性部位として利用することにより、生体内分布を制御しながら、標的指向性部位が結合された薬物やキャリアに良好な細胞取り込み性とミトコンドリアへの指向性とを付与することができる。これは、電荷が中和されているホスホコリン基により、正常組織やタンパク質との非特異的な相互作用を低減できるとともに、細胞及びミトコンドリアが有するリン脂質及びリン脂質誘導体の取り込み機能を利用できるためと考えられる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】ＰＩＣミセルの細胞取り込み試験、競合試験及び阻害試験の結果を示すグラフである。
【図２】ＰＩＣミセルのミトコンドリアへの局在レベルを示すグラフである。
【図３】細胞生存率及びＩＣ５０を示すグラフである。
【図４】ｍＲＮＡ内包ミセルの遺伝子発現効率を示すグラフである。
【図５】アルブミンＰＣコンジュゲートの細胞取り込みレベルを示すグラフである。
【図６】アルブミンＰＣコンジュゲートのミトコンドリアへの局在レベルを示すグラフである。
【図７】ＰＣ搭載金ナノ粒子のミトコンドリアへの移行を示すＴＥＭ観察画像である。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
以下、本発明の好ましい実施形態について説明するが、本発明はこれらの実施形態には限定されない。また、各実施形態は、適宜組み合わせることができる。
【００１２】
Ａ．薬物複合体
本発明の１つの実施形態における薬物複合体（コンジュゲート）は、薬物と該薬物に結合された標的指向性部位とを含み、該標的指向性部位は、下記式（Ｉ）で表されるホスホコリン基を含む。
【化２】
2020116640.tif 000004
【００１３】
上記薬物としては、特に限定されず、所望の活性を有する薬物を用いることができる。好ましくは、細胞内、例えば、ミトコンドリアへの送達を所望される薬物が用いられる。なお、本明細書において、薬物とは、何らかの生理活性を有する物質をいう。薬物が有する生理活性は、医薬品の有効成分として機能し得る生理活性であればよく、例えば、抗腫瘍活性、免疫賦活活性、抗ウイルス活性、抗菌活性、抗炎症活性等が挙げられる。薬物は、酵素、ホルモン、ワクチン、抗体等のタンパク質、ｍＲＮＡ、ｐＤＮＡ、アンチセンス、リボザイム、ｓｉＲＮＡ、デコイ核酸、アプタマー等の核酸、多糖等の高分子医薬品であってもよい。
【００１４】
薬物と標的指向部位とは、直接結合されていてもよく、リンカー部位を介して間接的に結合されていてもよい。
【００１５】
１つの実施形態において、本発明の薬物複合体は、下記式（ＩＩ）で表され得る。
【化３】
2020116640.tif 000005
（式ＩＩにおいて、Ｌ０は、単結合又は二価の原子団を表し、Ｄは、薬物の残基を表し、ｓは、１〜２０００の整数を表す。）
【００１６】
Ｌ０が表し得る二価の原子団としては、本発明の効果が得られる限りにおいて特に限定されない。二価の原子団は、例えば、後述する、薬物が有する官能基と結合可能な官能基と、標的指向性部位と、を有する化合物と薬物との反応によって形成される原子団であり、当該反応によって生じる結合と当該化合物の残基とを含み得る。二価の原子団は、例えば、直鎖又は分岐の炭素数１〜６のアルキレン基、−ＣＯＯ−、−ＣＯＮＨ−、−ＮＨ−、−ＣＯ−、−Ｏ−、−Ｓ−、及びこれらの任意の組み合せであり得る。二価の原子団の主鎖の原子数は、例えば１〜２０、好ましくは１〜１５、より好ましくは１〜１０とすることができる。
【００１７】
ｓは、薬物に結合される標的指向性部位の数（１分子あたりの結合数）を表す。ｓは、薬物の化学構造、立体構造、分子量等に応じて適切に選択され得る。例えば、薬物の分子量が大きい場合（薬物が高分子医薬品である場合等）、ｓは２以上であり得、例えば２〜２００、また例えば２〜１００又は２〜５０であり得る。
【００１８】
上記薬物複合体は、任意の適切な方法で調製され得る。例えば、薬物が有する官能基と結合可能な官能基と、標的指向性部位と、を有する化合物を用いて、当該化合物の官能基と薬物の官能基とを反応させることによって、標的指向性部位と薬物とが結合した薬物複合体を得ることができる。この場合、薬物が有する官能基は、薬物に内在するものであってもよく、付加的に導入されたものであってもよい。上記官能基の組合せの具体例としては、例えば、チオール基と（メタ）アクリロイル基、チオール基とマレイミド基、チオール基とチオール基、チオール基とカルボキシル基、（メタ）アクリロイル基とヒドロキシル基、（メタ）アクリロイル基とアミノ基、カルボキシル基とアミノ基、カルボキシル基とヒドロキシル基、アミノ基とヒドロキシル基等が挙げられる。
【００１９】
上記薬物が有する官能基と結合可能な官能基と、標的指向性部位と、を有する化合物としては、上記官能基とホスホコリン基とを有する任意の適切な化合物を用いることができる。具体例としては、２−（メタ）アクリロイルオキシエチルホスホリルコリン、３−（メタ）アクリロイルオキシプロピルホスホリルコリン、４−（メタ）アクリロイルオキシブチルホスホリルコリン、６−（メタ）アクリロイルオキシヘキシルホスホリルコリン、１０−（メタ）アクリロイルオキシデシルホスホリルコリン、ω−（メタ）アクリロイル（ポリ）オキシエチレンホスホリルコリン、２−（メタ）アクリルアミドエチルホスホリルコリン、３−（メタ）アクリルアミドプロピルホスホリルコリン、４−（メタ）アクリルアミドブチルホスホリルコリン、６−（メタ）アクリルアミドヘキシルホスホリルコリン、１０−（メタ）アクリルアミドデシルホスホリルコリン、ω−（メタ）アクリルアミド（ポリ）オキシエチレンホスホリルコリン等が挙げられる。
【００２０】
Ｂ．ポリマー複合体
本発明の別の局面によれば、薬物送達用ポリマーと該薬物送達用ポリマーに結合された標的指向性部位とを含み、該標的指向性部位が上記式（Ｉ）で表されるホスホコリン基を含む、ポリマー複合体（コンジュゲート）が提供される。
【００２１】
上記薬物送達用ポリマーとしては、ＤＤＳの分野に適用可能な任意の適切なポリマーを用いることができ、例えば、従来用いられている公知の薬物送達用ポリマーが好ましく用いられ得る。
【００２２】
上記公知の薬物送達用ポリマーとしては、静電相互作用によって電荷を有する薬物と会合してポリイオンコンプレックス（ＰＩＣ）を形成し得る荷電性ポリマー、薬物を内包可能な高分子ミセルを形成し得るブロックコポリマー、薬物を担持可能な微粒子を形成し得る生体適合性ポリマー、送達対象物の修飾に用いられる水溶性ポリマーが好ましく例示される。
【００２３】
Ｂ−１．荷電性ポリマーを用いた複合体
上記静電相互作用によって電荷を有する薬物と会合してＰＩＣを形成し得る荷電性ポリマーとしては、ポリマーとしての荷電の種類により、カチオン性ポリマーと、アニオン性ポリマーとに分けられる。
【００２４】
上記カチオン性ポリマーは、生理的ｐＨにおいて、カチオン基を有し、正電荷を有するポリマーである。カチオン性ポリマーは、ポリマー全体としてのカチオン性を妨げない範囲で、多少のアニオン基を有していてもよい。
【００２５】
カチオン性ポリマーは、単一の繰り返し単位から構成されてもよく、二種以上の繰り返し単位を任意の組み合わせ及び比率で含有してもよい。カチオン性ポリマーは、主鎖にアミノ基を含有するポリマー又は側鎖にアミノ基を含有するポリマーであり得る。
【００２６】
主鎖にアミノ基を含有するポリマーとしては、例えば、ポリエチレンイミン等が挙げられる。
【００２７】
側鎖にアミノ基を含有するポリマーとしては、例えば、側鎖にアミノ基を含有するアミノ酸をモノマーユニットとして含むポリアミノ酸又はその誘導体が挙げられる。側鎖にアミノ基を含有するアミノ酸をモノマーユニットとして含むポリアミノ酸又はその誘導体としては、ポリアスパルタミド、ポリグルタミド、ポリリジン、ポリアルギニン、ポリヒスチジン、及びこれらの誘導体等が挙げられる。ポリアスパラギン酸（又はポリグルタミン酸）を１，５−ジアミノペンタンと反応させることにより、アスパラギン酸（グルタミン酸）の側鎖カルボン酸にアミノペンタン（ＡＰ）が導入されたポリ（Ａｓｐ−ＡＰ）（又はポリ（Ｇｌｕ−ＡＰ））及びポリアスパラギン酸（又はポリグルタミン酸）をＤＥＴ（Ｈ２ＮＣＨ２ＣＨ２ＮＨ‐ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ２）と反応させることにより、アスパラギン酸（又はグルタミン酸）の側鎖カルボン酸にＤＥＴが導入された、ポリ（Ａｓｐ−ＤＥＴ）（又はポリ（Ｇｌｕ−ＤＥＴ））等が好適に用いられる。
【００２８】
側鎖にアミノ基を含有するアミノ酸をモノマーユニットとして含むポリアミノ酸又はその誘導体は、必要に応じて、側鎖に疎水性基を含有する非荷電性アミノ酸をモノマーユニットとしてさらに含んでいてもよい。側鎖に疎水性基を含有する非荷電性アミノ酸としては、例えば２５℃の水１００ｇに対する溶解度が５ｇ以下、さらに好ましくは４ｇ以下であるアミノ酸が挙げられる。このようなアミノ酸としては、例えば、ロイシン、イソロイシン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン等の非極性天然アミノ酸や、側鎖に疎水性基が導入されたアミノ酸の疎水性誘導体が挙げられる。アミノ酸の疎水性誘導体としては、好ましくはアスパラギン酸、グルタミン酸等の酸性アミノ酸の疎水性誘導体が挙げられる。上記導入される疎水性基としては、炭素数６〜２７の飽和もしくは不飽和の直鎖又は分枝状の脂肪族炭化水素基、炭素数６〜２７の芳香族炭化水素基あるいはコレステロール残基が好ましく例示され得る。
【００２９】
側鎖にアミノ基を含有するアミノ酸をモノマーユニットとして含むポリアミノ酸又はその誘導体のより詳細な説明については、ＷＯ２００６／０８５６６４、ＷＯ２０１０／０９３０３６、ＷＯ２０１１／１０５４０２等（これらの出願の教示は、その全体が参照により本明細書中に援用される）を参照することができる。
【００３０】
上記アニオン性ポリマーは、生理的ｐＨにおいて、アニオン基を有し、負電荷を有するポリマーである。アニオン性ポリマーは、ポリマー全体としてのアニオン性を妨げない範囲で、多少のカチオン基を有していてもよい。
【００３１】
アニオン性ポリマーは、単一の繰り返し単位から構成されてもよく、二種以上の繰り返し単位を任意の組み合わせ及び比率で含有してもよい。アニオン性ポリマーとしては、カルボキシル基を含有するモノマーユニットを含むポリマー、硫酸基を含有するモノマーユニットを含むポリマー、リン酸基を含有するモノマーユニットを含むポリマー等を挙げることができる。カルボキシル基を含有するモノマーユニットは、好ましくは側鎖にカルボキシル基を含有するアミノ酸であり、アスパラギン酸、グルタミン酸等が例示できる。
【００３２】
上記荷電性ポリマーに対して、標的指向性部位は、任意の適切な部位に結合される。例えば、ポリマーの一方又は両方の末端に結合されてもよく、側鎖に導入されてもよい。ポリマーに結合される標的指向性部位の数（ポリマー１分子あたりの結合数）は、本発明の効果が得られる範囲で制限はなく、１又は２以上であり得る。ポリマーと標的指向性部位との結合は、ポリマーが有する官能基と結合可能な官能基と、標的指向性部位と、を有する化合物を用いて、Ａ項に記載の薬物と標的指向性部位との結合と同様の方法で行うことができる。
【００３３】
Ｂ−２．ブロックコポリマーを用いた複合体
上記薬物を内包可能な高分子ミセルを形成し得るブロックコポリマーは、代表的には、親水性ポリマーセグメントと疎水性ポリマーセグメントとを含むブロックコポリマーであり、好ましくはこれらのセグメントが直列に結合されたブロックコポリマーである。
【００３４】
親水性ポリマーセグメントを構成するポリマーとしては、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、ポリ（２−オキサゾリン）、ポリサッカライド、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリアクリルアミド、ポリメタクリルアミド、ポリアクリル酸エステル、ポリメタクリル酸エステル等が挙げられ、ポリエチレングリコールが好ましく用いられ得る。親水性ポリマーセグメントは、直鎖状であってもよく、分岐鎖状であってもよい。
【００３５】
疎水性ポリマーセグメントを構成するポリマーとしては、ブロックコポリマーが水性溶媒中で親水性ポリマーセグメントを外側に向け、疎水性ポリマーセグメントを内側に向けた状態のミセルを形成可能な程度に親水性ポリマーセグメントよりも低い親水性度を有するポリマーが選択される。このようなポリマーとしては、例えば、ポリグリコール酸（ＰＧＡ）、ポリ乳酸（ＰＬＡ）及びその共重合体（ＰＬＧＡ）、ポリアミノ酸及びその誘導体、ポリエーテル及びその誘導体が挙げられ、ポリアミノ酸及びその誘導体、ポリエーテル及びその誘導体が好ましく用いられ得る。
【００３６】
上記ポリアミノ酸としては、側鎖にアミノ基を含有するアミノ酸、側鎖に疎水性基を含有する非荷電性アミノ酸、側鎖にカルボキシル基を含有するアミノ酸から選択される１種以上のアミノ酸又はその誘導体をモノマーユニットとして含むポリアミノ酸又はその誘導体が好ましく用いられ得る。側鎖にアミノ基を含有するアミノ酸としては、リシン、アルギニン、ヒスチジン、オルニチン等の塩基性アミノ酸、アスパラギン酸、グルタミン酸等の酸性アミノ酸の側鎖にアミノ基を導入したアミノ酸誘導体等が挙げられる。側鎖に疎水性基を含有する非荷電性アミノ酸及び側鎖にカルボキシル基を含有するアミノ酸については、上述のとおりである。ポリアミノ酸としては、Ｂ−１項に記載の荷電性ポリマーを用いることもできる。
【００３７】
上記ポリエーテルとしては、側鎖構造を有するポリグリシジルエーテルが挙げられる。
【００３８】
上記ブロックコポリマーの具体例については、ＷＯ２００７／０９９６６０、ＷＯ２００７／０９９６６１、ＷＯ２０１０／０９３０３６、ＷＯ２０１２／０９６３９９、ＷＯ２０１４／１３３１７２、ＷＯ２０１５／１７０７５７等（これらの出願の教示は、その全体が参照により本明細書中に援用される）を参照することができる。
【００３９】
上記ブロックコポリマーに対して、標的指向性部位は、任意の適切な部位に結合され得、好ましくは親水性ポリマーセグメント側の末端に結合される。ポリマーに結合される標的指向性部位の数は、本発明の効果が得られる範囲で制限はなく、１又は２以上であり得る。ポリマーと標的指向性部位との結合は、Ａ項に記載の薬物と標的指向性部位との結合と同様の方法で行うことができる。
【００４０】
ブロックコポリマーに標的指向性部位を結合させた構成を有するポリマー複合体は、例えば、式：Ｚ−Ａ１−Ｂ１で表され得る（式中、Ｚは、式（Ｉ）で表されるホスホコリン基を表し、Ａ１は、親水性ポリマーセグメントを表し、Ｂ１は、疎水性ポリマーセグメントを表す）。
【００４１】
上記ポリマー複合体の具体例を以下の式（ＩＩＩ）又は（ＩＶ）に示す。
【化４】
2020116640.tif 000006
【化５】
2020116640.tif 000007
（上記式中、
Ｚは、式（Ｉ）で表されるホスホコリン基を表し；
Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、及びＬ４はそれぞれ独立して、二価の連結基を表し；
Ｒ１は、水素原子、未置換又は置換された直鎖もしくは分枝の炭素数１〜１２のアルキル基あるいは未置換又は置換された直鎖もしくは分枝の炭素数１〜２４のアルキルカルボニル基を表し；
Ｒ２は、水酸基、オキシベンジル基、−Ｏ−Ｒ２ａ又はＮＨ−Ｒ２ｂ基を表し、ここでＲ２ａ又はＲ２ｂはそれぞれ独立して、未置換又は置換された直鎖もしくは分枝の炭素数１〜１２アルキル基を表し；
Ｒ３ａ、Ｒ３ｂ、Ｒ４ａ及びＲ４ｂは、相互に独立して、メチレン基又はエチレン基を表し；
Ｒ５ａ及びＲ５ｂは、相互に独立して、−Ｏ−又はＮＨ−を表し；
Ｒ６ａ及びＲ６ｂは、相互に独立して、水素原子又は疎水性有機基を表し；
Ｒ７ａ及びＲ７ｂは、相互に独立して、下記の基：
−ＮＨ−（ＣＨ２）ｐ１−〔ＮＨ−（ＣＨ２）ｑ１−〕ｒ１ＮＨ２      （ｉ）；
−ＮＨ−（ＣＨ２）ｐ２−Ｎ〔−（ＣＨ２）ｑ２−ＮＨ２〕２      （ｉｉ）；
−ＮＨ−（ＣＨ２）ｐ３−Ｎ｛〔−（ＣＨ２）ｑ３−ＮＨ２〕〔−（ＣＨ２）ｑ４−ＮＨ−〕ｒ２Ｈ｝      （ｉｉｉ）；
−ＮＨ−（ＣＨ２）ｐ４−Ｎ｛−（ＣＨ２）ｑ５−Ｎ〔−（ＣＨ２）ｑ６−ＮＨ２〕２｝２      （ｉｖ）；及び
−ＮＨ−（ＣＨ２）ｐ５−ＮＨ２      （ｖ）
からなる群の同一もしくは異なる基から選ばれ、
ここで、ｐ１〜ｐ５、ｑ１〜６、及びｒ１〜ｒ２は、それぞれ相互に独立して、１〜５の整数であり；
Ｒ８は、リシン、オルニチン、アルギニン、ホモアルギニン、及びヒスチジンからなる群より選択されるアミノ酸の側鎖を表し；
ｋは、２０〜２０，０００の整数を表し；
ａ、ｂ、ｃ、ｄ、及びｅは、それぞれ独立して、０〜４００の整数であり；
ただし、５≦ａ＋ｂ＋ｃ＋ｄ＋ｅ≦４００の関係を満たし；
上記各アミノ酸繰り返し単位の結合順は任意であり；
Ｒ６ａ、Ｒ６ｂ、Ｒ７ａ、Ｒ７ｂ及びＲ８は、ポリマー分子内のアミノ酸繰り返し単位毎に任意に選択可能である。）
【００４２】
上記Ｌ１及びＬ３はそれぞれ独立して、例えば、直鎖又は分岐の炭素数１〜６のアルキレン基、−ＣＯＯ−、−ＣＯＮＨ−、−ＮＨ−、−ＣＯ−、−Ｏ−、−Ｓ−、及びこれらの任意の組み合せであり得る。二価の連結基の主鎖の原子数は、例えば１〜２０、好ましくは１〜１５、より好ましくは１〜１０とすることができる。具体例としては、−ＳＣＨ２ＣＨＣＯＨ−、−ＳＳ−、−ＳＣＯ−、−ＯＣＨ２ＣＨＣＯＨ−、−ＮＨＣＨ２ＣＨＣＯＨ−、−ＮＨＣＯＯ−、−ＣＨ２ＣＨ２ＳＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）ＣＯＯＣＨ２ＣＨ２−等が挙げられる。
【００４３】
上記Ｌ２は、例えば、−ＮＨ−、−Ｏ−、−Ｏ−Ｌ２ａ−ＮＨ−、−ＣＯ−、−ＣＨ２−、及びＯ−Ｌ２ａ−Ｓ−Ｌ２ａ−ＮＨ−（ここで、Ｌ２ａは独立して炭素数１〜６のアルキレン基である）から選ばれる連結基であり得る。
【００４４】
上記Ｌ４は、例えば、−ＯＣＯ−Ｌ４ａ−ＣＯ−、及びＮＨＣＯ−Ｌ４ａ−ＣＯ−（ただし、Ｌ４ａは炭素数１〜６のアルキレン基である）から選ばれる連結基であり得る。
【００４５】
上記Ｒ１、Ｒ２ａ及びＲ２ｂの基で定義する、炭素数１〜１２の直鎖又は分枝状のアルキル基としては、例えば、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基、ｎ−ブチル基、ｓｅｃ−ブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基、ｎ−ヘキシル基、デシル基、及びウンデシル基等を挙げることができる。
【００４６】
Ｒ１の基で定義する、炭素数１〜２４の直鎖又は分枝状のアルキルカルボニル基の内の炭素数１〜１２の直鎖又は分枝状のアルキル部分は上述した例示を参考にでき、炭素数１３以上のアルキル部分は、例えば、トリデシル基、テトラデシル基、ペンタデシル基、ノナデシル基、ドコサニル基及びテトラコシル基等を挙げることができる。
【００４７】
上記アルキル基又はアルキル部分について、「置換された」場合の置換基としては、限定されるものでないが、Ｃ１−６アルコキシ基、アリールオキシ基、アリールＣ１−３オキシ基、シアノ基、カルボキシル基、アミノ基、Ｃ１−６アルコキシカルボニル基、Ｃ２−７アシルアミド基、トリ−Ｃ１−６アルキルシロキシ基、シロキシ基、シリルアミノ基を示すか、又はアセタール化ホルミル基、ホルミル基、塩素又はフッ素等のハロゲン原子を挙げることができる。ここで、例えば、Ｃ１−６のごとき表示は、炭素数１〜６を意味する。
【００４８】
上記Ｒ６ａ及びＲ６ｂの基で定義する疎水性有機基は、例えば、炭素数６〜２７の飽和もしくは不飽和の直鎖又は分枝状の脂肪族炭化水素基、炭素数６〜２７のアリール基又はアラルキル基、あるいはステロールに由来する残基である。
【００４９】
上記Ｒ７ａ及びＲ７ｂの基は、相互に独立して、式（ｉ）又は（ｖ）の基であることが好ましい。式（ｉ）において、ｐ１及びｑ１は、それぞれ相互に独立して２又は３であることが好ましく、より好ましくは２である。一方、ｒ１は、１〜３の整数であることが好ましい。
【００５０】
上記Ｒ８の基は、好ましくはリシン又はオルニチンの側鎖である。
【００５１】
各アミノ酸残基の繰り返し数を表すａ、ｂ、ｃ、ｄ、及びｅは、それぞれ独立して好ましくは０〜３００の整数、より好ましくは０〜２５０の整数である。また、ポリアミノ酸の重合度（ａ＋ｂ＋ｃ＋ｄ＋ｅ）は、好ましくは１０〜３００の整数、より好ましくは２０〜２５０の整数である。
【００５２】
エチレングリコールの繰り返し数を表すｋは、好ましくは４０〜２，０００、さらに好ましくは４５〜１，０００の整数を表す。
【００５３】
上記式（ＩＩＩ）又は（ＩＶ）に示されるポリマー複合体は、例えば、α末端に官能基を有するポリエチレングリコールと所望のポリアミノ酸とをそのまま、又は必要により分子量分布を狭くするように精製した後、公知の方法によりカップリングすることによってブロックコポリマーを調製し、該ブロックコポリマーのα末端の官能基を利用して、標的指向性部位を有する化合物を縮合又は付加反応させることによって形成できる。標的指向性部位の結合は、後述するミセル形成の後に行ってもよい。
【００５４】
また、例えば、式（ＩＩＩ）に示されるポリマー複合体は、α末端に官能基を有し、ω末端にアミノ基を有するポリエチレングリコールを準備し、そのアミノ末端からβ−ベンジル−Ｌ−アスパルテート、γ−ベンジル−Ｌ−グルタメート、Ｎε−Ｚ−Ｌ−リシンといった保護されたアミノ酸のＮ−カルボン酸無水物（ＮＣＡ）を重合させ、必要に応じて、得られたポリアミノ酸の側鎖に脱保護及び／又は（ｉ）〜（ｖ）の基の導入を行うことによってブロックコポリマーを調製し、該ブロックコポリマーのα末端の官能基を利用して、標的指向性部位を有する化合物を縮合又は付加反応させることによって形成できる。標的指向性部位の結合は、後述するミセル形成の後に行ってもよい。なお、カチオン性ポリアミノ酸を合成する場合、その合成過程でアミノ酸エステル残基の一部にポリアミンの求核攻撃に起因した構造変化（例えば、アミノ酸エステル残基の脱アルコールによるイミド環の形成）が生じる場合があるが、本明細書ではブロックコポリマーがこのような構造変化を経た残基を含む場合についても、上記式（ＩＩＩ）及び（ＩＶ）に含めて取り扱うこととする。また、カチオン性アミノ酸残基における一部のＮＨ基及びＮＨ２基が合成過程での酸（主に塩酸）の使用に起因して塩（主に塩酸塩）になる場合があるが、本明細書ではブロックコポリマーがこうした構造を含む場合についても、上記式（ＩＩＩ）及び（ＩＶ）に含めて取り扱うこととする。
【００５５】
上記ポリマー複合体の別の具体例を以下の式（Ｖ）に示す。
【化６】
2020116640.tif 000008
（上記式中、
Ｚは、式（Ｉ）で表されるホスホコリン基を表し；
Ｌ５及びＬ６はそれぞれ独立して、単結合又は二価の連結基を表し；
Ｒ９は、水素原子、未置換又は置換された直鎖もしくは分枝の炭素数１〜１２のアルキル基あるいは未置換又は置換された直鎖もしくは分枝の炭素数１〜２４のアルキルカルボニル基を表し；
Ｒ１０は、アルキレン基又はエステル結合を介した１級アミンを表し；
ｍは、５〜２０，０００の整数を表し；
ｎは、２〜５，０００の整数を表す。）
【００５６】
上記Ｒ９については、式（ＩＩＩ）で規定するＲ１と同様の説明が適用される。
【００５７】
上記Ｒ１０について規定されるアルキレン基又はエステル結合を介した１級アミンとしては、例えば、下記式（ＶＩ）又は（ＶＩＩ）に示すものが挙げられる。
【化７】
2020116640.tif 000009
（上記式中、Ｒ１１は水素原子、又は下記式（ＶＩＩＩ）
【化８】
2020116640.tif 000010
（式中、Ｒ１２は炭素数１〜２０の直鎖状若しくは分岐状の炭化水素基、置換基を有していてもよいフェニル基、又は置換基を有していてもよい複素環式官能基を表し、ｗは１〜５の整数を表す。）で示される基を表し、ｘ、ｙはそれぞれ独立して、１〜５の整数を表す。）
【００５８】
上記Ｒ１２に関して規定される置換基を有していてもよい複素環式官能基としては、例えばインドリル環、ピロリドン基、フラン環、ピリジン環、モルホリン環、エポキシ環、プリン環、ピリミジン環等が挙げられる。
【００５９】
１つの実施形態において、ｘは、例えば１、２又は３であり、また例えば１又は２、また例えば１であり得る。
【００６０】
１つの実施形態において、ｙおよびｗはそれぞれ独立して、例えば１、２又は３であり、また例えば１又は２、また例えば１であり得る。また、Ｒ１２は、例えばインドリル環であり得る。
【００６１】
上記Ｌ５は、例えば、直鎖又は分岐の炭素数１〜６のアルキレン基、−ＣＯＯ−、−ＣＯＮＨ−、−ＮＨ−、−ＣＯ−、−Ｏ−、−Ｓ−、及びこれらの任意の組み合せであり得る。二価の連結基の主鎖の原子数は、例えば１〜２０、好ましくは１〜１５、より好ましくは１〜１０とすることができる。具体例としては、−ＮＨＣＯＣＨ２ＣＨ２−、−ＣＨ２ＣＨ２ＮＨＣＨ２ＣＨ２−、−ＣＨ２ＣＨ２ＳＣＨ２ＣＨ２−、−ＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ２ＣＨ２−等が挙げられる。
【００６２】
上記Ｌ６は、例えば、単結合又は−ＣＨ２ＣＨ２Ｏ−である。
【００６３】
ｍは、好ましくは４０〜２，０００の整数、より好ましくは４５〜１，０００の整数を表す。また、ｎは、好ましくは１０〜３００の整数、より好ましくは２０〜２５０の整数を表す。
【００６４】
上記式（Ｖ）に示されるポリマー複合体は、例えば、α末端に官能基を有するポリエチレングリコールを準備し、エピクロロヒドリン、１，２−エポキシ−５−ヘキセン、１−アリル−２，３−エポキシプロパン、エピブロモヒドリン、３，４−エポキシ−１−ブタン、１，２−エポキシ−９−デセン、２，３−エポキシプロピルプロパルギルエーテル等のエポキシ基含有モノマーを用いたエポキシ開環重合を行って、ポリエチレングリコールと、側鎖を有するポリグリシジル鎖とのブロックコポリマーを得ること、得られたブロックコポリマーのα末端の官能基を利用して、標的指向性部位を有する化合物を縮合又は付加反応させること、及び、標的指向性部位が付加されたブロックコポリマーのポリグリシジル鎖の側鎖に１級アミンを導入することを含む方法によって得られ得る。
【００６５】
１つの実施形態において、ポリマー複合体には、薬物が結合されていてもよい。薬物は、ブロックコポリマーの疎水性ポリマーセグメントの側鎖及び／又は末端に導入され得る。ポリマーに結合される薬物の数は、本発明の効果が得られる範囲で制限はなく、例えば１〜２００、好ましくは２〜１００とすることができる。
【００６６】
薬物が結合されたポリマー複合体は、例えば、式：Ｚ−Ａ２−Ｂ２（−Ｄ）で表され得る（式中、Ｚは、式（Ｉ）で表されるホスホコリン基を表し、Ａ２は、親水性ポリマーセグメントを表し、Ｂ２は、疎水性ポリマーセグメントを表し、Ｄは、薬物の残基を表す）。具体例としては、上記式（ＩＩＩ）〜（Ｖ）に示されるポリマー複合体の疎水性ポリマー側鎖に薬物が結合された実施形態が挙げられる。
【００６７】
例えば、ブロックコポリマーが疎水性ポリマーセグメント側鎖にカルボキシル基を有する場合（式（ＩＩＩ）及び（ＩＶ）において、Ｒ５ａ＝Ｏ、Ｒ６ａ＝Ｈ及び／又はＲ５ｂ＝Ｏ、Ｒ６ｂ＝Ｈの場合）、水酸基を有する薬物と当該カルボキシル基とを反応させることによって、ブロックコポリマーの疎水性ポリマーセグメント側鎖にエステル結合を介して薬物を結合させることができる。
【００６８】
また例えば、疎水性ポリマーセグメント側鎖にエステル基を有するブロックコポリマーと、アミンである薬物との間の反応によって形成されるアミド結合又は疎水性ポリマーセグメント側鎖にカルボキシル基を有するブロックコポリマーと、アミノ基を有する薬物との間の反応によって形成されるアミド結合によって、ブロックコポリマーの疎水性ポリマーセグメント側鎖に薬物を結合させることができる。
【００６９】
Ｂ−３．生体適合性ポリマーを用いた複合体
上記薬物を担持可能な微粒子を形成し得る生体適合性ポリマーとしては、例えば、ポリグリコール酸（ＰＧＡ）、ポリ乳酸（ＰＬＡ）及びそれらの共重合体（ＰＬＧＡ）、ポリε−カプロラクトン、キトサン等が挙げられる。これらのポリマーに対して、標的指向性部位は、任意の適切な部位に結合される。例えば、ポリマーの一方又は両方の末端に結合されてもよく、側鎖に導入されてもよい。ポリマーに結合される標的指向性部位の数は、本発明の効果が得られる範囲で制限はなく、１又は２以上であり得る。ポリマーと標的指向性部位との結合は、ポリマーが有する官能基と結合可能な官能基と、標的指向性部位と、を有する化合物を用いて、Ａ項に記載の薬物と標的指向性部位との結合と同様の方法で行うことができる。
【００７０】
Ｂ−４．水溶性ポリマーを用いた複合体
上記水溶性ポリマーは、可溶化、徐放化、血中滞留性の向上、酵素分解の回避等を目的とした送達対象物の修飾に用いられる。このような水溶性ポリマーとしては、例えば、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール及びこれらの共重合体、アルブミン等の可溶性タンパク質、多糖等が挙げられ、なかでもポリエチレングリコールが好ましく用いられ得る。
【００７１】
修飾される送達対象物は、薬物であってもよく、リポソーム、ミセル、ゲル、金ナノ粒子等の薬物を担持するキャリアであってもよい。例えば、ポリエチレングリコールによる修飾（ＰＥＧ修飾）は当該技術分野で周知であり、ＰＥＧ化インターフェロン等のＰＥＧ化タンパク質やＰＥＧ修飾リポソームが得られ得る。
【００７２】
上記水溶性ポリマーに対して、標的指向性部位は、任意の適切な部位に結合される。例えば、ポリマーの一方又は両方の末端に結合されてもよく、側鎖に導入されてもよい。ポリマーに結合される標的指向性部位の数（ポリマー１分子あたりの結合数）は、本発明の効果が得られる範囲で制限はなく、１又は２以上であり得る。ポリマーと標的指向性部位との結合は、ポリマーが有する官能基と結合可能な官能基と、標的指向性部位と、を有する化合物を用いて、Ａ項に記載の薬物と標的指向性部位との結合と同様の方法で行うことができる。
【００７３】
リポソーム等のキャリアを修飾する水溶性ポリマーを用いたポリマー複合体は、一方の末端に上記式（Ｉ）で表されるホスホコリン基を含む標的指向性部位を有し、他方の末端にキャリア表面と相互作用し得る基を有することが好ましい。リポソームを修飾する場合、当該ポリマー複合体は、式：Ｚ−Ｅ−ＲＸで表され得る（式中、Ｚは、式（Ｉ）で表されるホスホコリン基を表し、Ｅは水溶性ポリマーセグメントを表し、ＲＸは、リン脂質、長鎖脂肪酸、ステロール等に由来する疎水性基を表す）。
【００７４】
Ｃ．薬物送達用組成物
本発明のさらに別の局面によれば、Ｂ項に記載のポリマー複合体を含む薬物送達用組成物が提供される。１つの実施形態において、薬物送達用組成物は、上記ポリマー複合体によって形成される粒子を含む。粒子の平均粒径は、用いるポリマー複合体によって変動し得るが、例えば１０００ｎｍ以下、好ましくは４００ｎｍ以下、２００ｎｍ以下、１５０ｎｍ以下、１００ｎｍ以下又は８０ｎｍ以下であり、例えば２０ｎｍ以上又は３０ｎｍ以上である。当該粒子の平均粒子径は、市販の動的光散乱（ＤＬＳ）測定装置を用いて測定することができる。
【００７５】
１つの実施形態において、薬物送達用組成物は、上記ポリマー複合体に加えて薬物をさらに含み得る。薬物を含むことにより、上記粒子に薬剤を担持（例えば、内包）させて、細胞内、さらにはミトコンドリア内に薬物を効率的に送達することができる。当該実施形態は、ポリマー複合体に薬物が結合されていない場合に特に有用であるが、薬物が結合されたポリマー複合体と薬物とを組み合わせて用いることもできる。
【００７６】
１つの実施形態において、薬物送達用組成物は、上記ポリマー複合体に加えて標的指向性部位を含まない薬物送達用ポリマーをさらに含み得る。標的指向性部位を含まない薬物送達用ポリマーとしては、上記Ｂ項に記載の公知の薬物送達用ポリマーを用いることができる。ポリマーの組合せは、目的に応じて適切に選択され得、例えば、標的指向性部位が結合されたブロックコポリマー（すなわち、Ｂ−２項に記載のポリマー複合体）と標的指向性部位が結合されていない荷電性ポリマーとを組合せて用いることができる。薬物送達用組成物中における、ポリマー複合体と標的指向性部位を含まない薬物送達用ポリマーとの含有割合（モル比）は、例えば５：９５〜９５：５、また例えば１０：９０〜９０：１０とすることができる。
【００７７】
荷電性ポリマーと標的指向性部位とを含むポリマー複合体を用いる場合、必要により緩衝化された水溶液中で、当該荷電性ポリマーと反対の電荷を有する薬物と、当該ポリマー複合体とを混合することにより、これらが静電相互作用によって結合又は集合して粒子状のＰＩＣを形成することができる。カチオン性ポリマーの複合体とアニオン性薬物とを用いる場合、組成物中におけるアニオン性薬物由来のアニオン基のモル数（Ａ）に対するカチオン性ポリマー由来のカチオン基のモル数（Ｎ）の比（Ｎ／Ａ比）が、例えば１以上、好ましくは３以上、より好ましくは５〜１００とすることができる。一方、アニオン性ポリマーの複合体とカチオン性薬物とを用いる場合、組成物中におけるカチオン性薬物由来のカチオン基のモル数（Ｎ）に対するアニオン性ポリマー由来のアニオン基のモル数（Ａ）の比（Ａ／Ｎ比）が、例えば１以上、好ましくは３以上、より好ましくは５〜１００とすることができる。
【００７８】
ブロックコポリマーと標的指向性部位とを含むポリマー複合体を用いる場合、必要により緩衝化された水溶液中に当該ポリマー複合体を添加して撹拌することにより、高分子ミセルが形成され得る。あるいは、当該ポリマー複合体を有機溶媒に溶解及び混合して均一化された溶液を減圧留去してポリマーフィルムを調製し、得られたポリマーのフィルムに水を加えて混合して自己組織化させることにより、高分子ミセルが形成され得る。高分子ミセル中に薬物を内包させる場合は、薬物の存在下でミセルの形成を行えばよい。互いに反対の電荷を有するブロックコポリマーと薬物とを用いる場合における組成物中のＮ／Ａ比又はＡ／Ｎ比は、荷電性ポリマーに関して記載したとおりである。また、必要に応じて、架橋剤を用いて、あるいは、側鎖にある官能基を利用して疎水性ポリマーセグメント間に架橋構造を形成してもよい。高分子ミセルの調製方法については、ＷＯ２００７／０９９６６０、ＷＯ２００７／０９９６６１、ＷＯ２０１０／０９３０３６、ＷＯ２０１２／０９６３９９、ＷＯ２０１４／１３３１７２、ＷＯ２０１５／１７０７５７等を参照することができる。
【００７９】
生体適合性ポリマーと標的指向性部位とを含むポリマー複合体を用いる場合、水中エマルション溶媒拡散（ＥＳＤ）法等の高分子球形晶析法、エマルション溶媒蒸発法、相分離法、相転移法等によって薬物を担持した粒子を形成することができる。
【００８０】
水溶性ポリマーと標的指向性部位とを含むポリマー複合体を用いる場合、必要により緩衝化された水溶液中で、キャリアと混合することにより、表面がポリマー複合体で修飾されたキャリアが得られ得る。キャリアには、予め薬物を内包させておくことができる。例えば、リポソームは、代表的には、リン脂質の２分子膜よって形成される小胞であり、当業者であれば適宜調製することができ、薬物を内包させることも可能である。
【００８１】
Ｄ．薬物複合体又は薬物送達用組成物の使用方法
上記薬物複合体又は薬物送達用組成物は、薬物の投与を必要とする個体に対して投与される。１つの実施形態において、薬物は、細胞内に取り込まれることが所望される薬物であり、好ましくはミトコンドリアに送達されること所望される薬物である。
【００８２】
投与対象の個体としては、例えばヒト又はヒト以外の哺乳動物が挙げられる。投与方法は、経口投与であってもよく、非経口投与であってもよい。好ましくは、非経口投与であり、皮下投与、筋肉内投与、静脈内投与、腹腔内投与、髄腔内投与等が例示できる。
【００８３】
本発明の薬物複合体又は薬物送達用組成物によれば、薬物を効率的に細胞内に送達し、さらには、ミトコンドリアに局在させることができる。
【００８４】
Ｅ．標的指向性を有する化合物の製造方法
本発明の別の局面によれば、送達対象化合物と、式（Ｉ）で表されるホスホコリン基を有する化合物と、を結合させる工程を含む、標的指向性を有する化合物の製造方法が提供される。送達対象化合物に付与される標的指向性は、細胞内への指向性であり、より具体的にはミトコンドリア内への指向性である。
【００８５】
送達対象化合物としては、薬物又は薬物送達用ポリマーが挙げられる。これらの具体例としては、それぞれＡ項に記載の薬物及びＢ項に記載の公知の薬物送達用ポリマーを挙げることができる。
【００８６】
送達対象化合物と、式（Ｉ）で表されるホスホコリン基を有する化合物と、を結合させる方法としては、任意の適切な方法が選択され得る。例えば、送達対象化合物が有する官能基と反応可能な官能基と、式（Ｉ）で表されるホスホコリン基と、を有する化合物を選択し、当該化合物の官能基と送達対象化合物の官能基とを反応させる方法が用いられ得る。このような化合物の具体例としては、Ａ項に記載の薬物複合体の製造に用いられるホスホコリン基含有化合物が挙げられる。
【００８７】
Ｆ．送達対象物にミトコンドリアへの指向性を付与する方法
本発明の別の局面によれば、送達対象物を上記式（Ｉ）で表されるホスホコリン基を含む標的指向性部位で修飾することを含む、送達対象物に細胞又はミトコンドリアへの指向性を付与する方法が提供される。
【００８８】
送達対象物は、薬物であってもよく、薬物を担持するキャリアであってもよい。薬物を担持するキャリアとしては、ＤＤＳに適用可能であれば、制限はなく、リポソーム、高分子ミセル、ポリイオンコンプレックス、ポリプレックス、リポプレックス、リポポリプレックス、無機金属粒子、脂質ナノ粒子、ゲル等が挙げられる。これらのキャリアは、ＤＤＳ分野において広く知られており、当業者によって容易に調製され得る。
【００８９】
上記キャリアを上記式（Ｉ）で表されるホスホコリン基を含む標的指向性部位で修飾する方法としては、キャリア表面に式（Ｉ）で表されるホスホコリン基を含む標的指向性部位を結合させることが挙げられる。この場合、結合は、共有結合に限定されず、静電相互作用、疎水的相互作用等の分子間力に起因する非共有結合であってもよい。薬物を修飾する方法は、Ａ項に記載のとおりである。
【００９０】
共有結合によるキャリアの修飾は、例えば、予めキャリアの構成要素に標的指向性部位を結合しておき、当該標的指向性部位が結合された構成要素を用いてキャリアを形成する方法、又は、官能基を有する構成要素を用いて当該官能基がキャリア表面に露出するようにキャリアを形成した後に、当該官能基と反応し得る官能基と標的指向性部位とを有する化合物と反応させる方法によって行われ得る。前者の具体例としては、例えば、Ｂ項に記載のポリマー複合体を用いてキャリアを形成する方法、より具体的には、Ｂ−２項に記載のポリマー複合体を用いて高分子ミセルを形成する方法が挙げられる。後者の具体例としては、親水性ポリマーセグメントと疎水性ポリマーセグメントとを含み、親水性ポリマーセグメント側の末端に官能基（ヒドロキシル基、カルボキシル基、アミノ基、アルデヒド基、チオール基、マレイミド基等）を有するブロックコポリマーを用いて高分子ミセルを形成し、次いで、当該官能基と反応し得る官能基と標的指向性部位とを有する化合物と反応させる方法が挙げられる。
【００９１】
非共有結合によるキャリアの修飾は、例えば、キャリアを形成した後に、該キャリアをその表面と相互作用し得る基と標的指向性部位とを有する化合物と相互作用させることによって行われ得る。具体例としては、帯電性のキャリア（例えば、帯電性のリポソーム、ポリイオンコンプレックス）を形成し、当該キャリアと反対の電荷を有する荷電基と標的指向性部位とを有する化合物（例えば、一方の末端に荷電基を有し、他方の末端にホスホコリン基を有するＢ−４項に記載のポリマー複合体）を静電結合させる方法、疎水性表面を有するキャリア（例えば、リポソーム、脂質ナノ粒子、リポプレックス）を形成し、疎水性基と標的指向性部位とを有する化合物（例えば、一方の末端に疎水性基を有し、他方の末端にホスホコリン基を有するＰＥＧ）を、当該疎水性基をアンカーとしてキャリア表面に固定する方法等が挙げられる。
【００９２】
上記方法によれば、ホスホコリン基を含む標的指向性部位を表面に有するＤＤＳキャリアが得られ得る。
【００９３】
Ｇ．検出試薬
本発明のさらに別の局面によれば、標的指向性部位を含み、標識物質によって標識化された検出試薬であって、該標的指向性部位が、上記式（Ｉ）で表されるホスホコリン基を含む、検出試薬が提供される。上記式（Ｉ）で表されるホスホコリン基は、ミトコンドリアへの指向性を発揮することから、上記検出試薬を用いることにより、細胞又は個体におけるミトコンドリアの観察を好適に行うことができる。
【００９４】
標識物質としては、目的に応じて、任意の適切な標識が用いられ得る。具体的には、蛍光標識、発光物質標識、放射標識、酵素標識等が好ましく例示できる。蛍光標識としては、蛍光色素、例えば、Ａｌｅｘａ化合物、Ｃｙ３、Ｃｙ５、フィコエチニン、フィコシアニン、アロフィコシアニン、ＦＩＴＣ、ローダミン、ランタニド等、もしくはこれらの蛍光色素の誘導体、又は、蛍光タンパク質、例えば、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）等もしくはその変異体を利用することができる。また、発光物質による標識の場合には、ルミノール、フルオロセイン、ローダミンＢ等の化学発光物質、ルシフェリン、イオクリン等の生物発光物質を用いてもよい。放射標識の場合には、放射性同位元素、例えば、３３Ｐ、３Ｈ、１４Ｃ、３５Ｓ、１２５Ｉ、３２Ｐ、１３１Ｉ等を利用することができる。酵素を用いて標識する場合には、β‐ガラクトシダーゼ、β−ラクタマーゼ、ＧＵＳ、カラシペルオキシダーゼ、アルカリ性ホスファターゼ又はルシフェラーゼ等を用いることができる。
【００９５】
検出試薬は、例えば、標識物質と、式（Ｉ）で表されるホスホコリン基を有する化合物とを結合させることによって得られ得る。また例えば、検出試薬は、標識物質と、式（Ｉ）で表されるホスホコリン基を有する化合物とをそれぞれ、ポリマー、金属粒子等の他の担体に結合させることによっても得られ得る。
【実施例】
【００９６】
以下、実施例によって本発明を具体的に説明するが、本発明はこれら実施例によって限定されるものではない。なお、以下の実施例の記載において、ホスホコリン基を「ＰＣ」と略記する場合がある。【００９７】
［製造例１］  ＰＣ−ＰＥＧ−ＰＡｓｐの合成
以下に示すスキームに従って、ＰＣ−ＰＥＧ−ＰＡｓｐを合成した。
【化９】
2020116640.tif 000011
【００９８】
まず、ＳＨ−ＰＥＧ−ＮＨ２（分子量：１０ｋＤａ）をエタノール（２０ｍｇ／ｍＬ）に溶解し、２−メタクリロイルオキシエチルホスホコリン（ＭＰＣ、１０当量）を加えた。１５分間のアルゴンバブリング後に、ジイソプロピルアミン（ＤＩＰＡ、１０当量）を加え、３０度で４８時間反応した。エタノールを減圧乾燥で取り除き、ポリマーを純水に溶解させ、純水に対する透析（ＭＷＣＯ：３，５００）後に凍結乾燥によりＰＣ−ＰＥＧ−ＮＨ２を得た。重クロロホルム中での１Ｈ−ＮＭＲからＰＣの導入率が９８％であることが確認された。【００９９】
次に、ＰＣ−ＰＥＧ−ＮＨ２を開始剤とするＮＣＡ重合法によりＰＣ−ＰＥＧ−ＰＢＬＡを合成した。具体的には、ＰＣ−ＰＥＧ−ＮＨ２をジクロロメタン（ＤＣＭ、６７ｍｇ／ｍＬ）に溶解し、ＤＣＭとＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）との混合溶媒（ＤＣＭ：ＤＭＦ＝１０：１、６７ｍｇ／ｍＬ）に溶解したβ−ベンジル−Ｌ−アスパラギン酸−Ｎ−カルボン酸無水物（ＢＬＡ−ＮＣＡ、１００当量）を加え、３５度で３日間反応した。反応溶液を過剰量のジエチルエーテルに加え、減圧乾燥することによりＰＣ−ＰＥＧ−ＰＢＬＡを得た。重ＤＭＳＯ中での１Ｈ−ＮＭＲから、ＰＢＬＡ鎖の重合度が７６であることが確認された。【０１００】
最後に、ＰＣ−ＰＥＧ−ＰＢＬＡのＰＢＬＡ鎖の側鎖構造のベンジルエステルを脱保護することによりＰＣ−ＰＥＧ−ＰＡｓｐを合成した。具体的には、ＰＣ−ＰＥＧ−ＰＢＬＡに水酸化ナトリウム水溶液（０．５Ｍ、３８０当量）を加え、室温で１時間反応した。純水に対する透析（ＭＷＣＯ：６，０００−８，０００）後の凍結乾燥によりＰＣ−ＰＥＧ−ＰＡｓｐを得た。重水中での１Ｈ−ＮＭＲから、ベンジル基が完全に脱保護されていることが確認された。末端がメトキシ基であり、ＰＣがついていないコントロールのポリマー（ＭｅＯ−ＰＥＧ−ＰＡｓｐ）についてもＭｅＯ−ＰＥＧ−ＮＨ２を開始剤とするＮＣＡ重合法及びベンジルエステルの脱保護により同様に合成した。【０１０１】
［製造例２］Ｈｏｍｏ−Ｐ（Ａｓｐ−ＡＰ）の合成
Ｎ−ブチルアミンを開始剤とするＮＣＡ重合法によりＨｏｍｏ−ＰＢＬＡを合成した。具体的には、Ｎ−ブチルアミンに、ＤＣＭとＤＭＦの混合溶媒（ＤＣＭ：ＤＭＦ＝１０：１、６７ｍｇ／ｍＬ）に溶解したＢＬＡ−ＮＣＡ（１００当量）を加え、３５度で３日間反応した。反応溶液を過剰量のジエチルエーテルに加え、減圧乾燥することによりＨｏｍｏ−ＰＢＬＡを得た。重ＤＭＳＯ中での１Ｈ−ＮＭＲから、ＰＢＬＡ鎖の重合度が６５であることが確認された。【０１０２】
次に、Ｈｏｍｏ−ＰＢＬＡの側鎖構造のベンジルエステルのアミノリシス反応によりＨｏｍｏ−Ｐ（Ａｓｐ−ＡＰ）を合成した。具体的には、Ｈｏｍｏ−ＰＢＬＡをＤＣＭ（４０ｍｇ／ｍＬ）に溶解し、ベンゼン（４ｍｇ／ｍＬ）を加えて凍結乾燥した。ポリマーをＮ−メチル−２−ピロリドン（ＮＭＰ）に溶解し、ＮＭＰ中のジアミノペンタン（ＤＡＰ、６，５００当量）に加え、１２度で１時間反応した。塩酸による中和後に純水に対する透析（ＭＷＣＯ：３，５００）を行い、凍結乾燥によりＨｏｍｏ−Ｐ（Ａｓｐ−ＡＰ）が得られた。重水中での１Ｈ−ＮＭＲから、ベンジル基が完全に脱保護され、アミノペンタンが導入されたことが確認された。なお、必要に応じて、得られたＨｏｍｏ−Ｐ（Ａｓｐ−ＡＰ）にＣｙ５又はＣｙ３蛍光標識を付したものを実験に用いた。【０１０３】
［製造例３］ポリイオンコンプレックス（ＰＩＣ）ミセルの調製
ＰＣ−ＰＥＧ−ＰＡｓｐとＨｏｍｏ−Ｐ（Ａｓｐ−ＡＰ）をそれぞれ、１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）に溶解し、ＰＡｓｐ鎖のカルボキシル基とＰ（Ａｓｐ−ＡＰ）鎖の１級アミンのモル比が１になるように混合してＰＣ搭載ＰＩＣミセルを調製した。また、コントロールのＰＩＣミセルとして、ＰＣ−ＰＥＧ−ＰＡｓｐの代わりにコントロールのポリマー（ＭｅＯ−ＰＥＧ−ＰＡｓｐ）を用いたこと以外は上記と同様にして、非ＰＣ搭載ＰＩＣミセルを調製した。次に、ＰＩＣミセルにＰＡｓｐのカルボキシル基に対して１０当量の１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）を添加し、室温で１晩反応した。限外ろ過法（ＭＷＣＯ：１００，０００）により精製し、ＥＤＣ架橋後のＰＩＣミセルのサイズ及び多分散度（ＰＤＩ）を動的光散乱（ＤＬＳ）法により測定した。また、ＰＩＣミセルのゼータ電位を電気泳動光散乱（ＥＬＳ）法により測定した。結果を表１に示す。【０１０４】
【表１】
2020116640.tif 000012
【０１０５】
≪ＰＣ搭載ＰＩＣミセルの細胞取り込み試験≫
ヒトすい腺がん細胞（ＢｘＰＣ３）を９６ウェルプレートに播種（５，０００ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ、培地：１００μＬ）した。２４時間後に培地を交換し、Ｃｙ５で蛍光標識したＰＣ搭載ＰＩＣミセルとＣｙ３で蛍光標識したコントロールの非ＰＣ搭載ＰＩＣミセルを添加（Ｃｙ３及びＣｙ５の蛍光強度：１，０００）した。１、６、２４時間後にＰＢＳにより洗浄し、ヘキストによる核染色を行った。Ｃｙ５、Ｃｙ３及びヘキスト由来の蛍光を共焦点レーザー顕微鏡法により測定し、蛍光強度をＩｍａｇｅＪにより定量した。【０１０６】
≪ＰＣ搭載ＰＩＣミセルの細胞取り込みの競合試験≫
２−メタクリロイルオキシエチルホスホコリン（ＭＰＣ）を用いてＰＣ搭載ＰＩＣミセルの細胞取り込みの競合試験を行った。具体的には、ヒトすい腺がん細胞（ＢｘＰＣ３）を９６ウェルプレートに播種（５，０００  ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ、培地：１００μＬ）した。２４時間後に培地を交換し、Ｃｙ５で蛍光標識したＰＣ搭載ＰＩＣミセルとＣｙ３で蛍光標識したコントロールのＰＩＣミセルとを添加（Ｃｙ３及びＣｙ５の蛍光強度：１，０００）し、競合実験群についてはＭＰＣ溶液（ＰＢＳ、１０ｍＭ）を添加した。１、６、２４時間後にＰＢＳにより洗浄し、ヘキストによる核染色を行った。Ｃｙ５、Ｃｙ３及びヘキスト由来の蛍光を共焦点レーザー顕微鏡法により測定し、蛍光強度をＩｍａｇｅＪにより定量した。【０１０７】
≪ＰＣ搭載ＰＩＣミセルの細胞取り込みの阻害試験≫
ＭＰＣ溶液（ＰＢＳ、１０ｍＭ）の代わりにリン脂質転送タンパク質（ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐｉｄ  ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｐｒｏｔｅｉｎ  （ＰＬＴＰ））の阻害剤であるチメロサール溶液（ＰＢＳ、１０ｎＭ）を添加したこと以外は上記競合試験と同様にして、ＰＣ搭載ＰＩＣミセルの細胞取り込みの阻害実験を行った。【０１０８】
上記ＰＩＣミセルの細胞取り込み試験、競合試験及び阻害試験の結果を図１にまとめて示す。【０１０９】
図１に示すとおり、ＰＣ搭載ＰＩＣミセルを単独で添加した実験群は、非ＰＣ搭載ＰＩＣミセルを添加した実験群よりも顕著に高い蛍光強度を示し、このことから、細胞取り込み量が増大されたことがわかる。また、ＭＰＣを添加した実験群及びチメロサールを添加した実験群では、このような細胞取り込み量の増大が抑制されていることから、当該細胞取り込み量の増大がＰＣと細胞表面のＰＬＴＰとの相互作用によってエンドサイトーシスが増大したことによるものであることが示唆される。【０１１０】
≪ミトコンドリア染色によるＰＣ搭載ＰＩＣミセルの細胞内分布の評価≫
ヒトすい腺がん細胞（ＢｘＰＣ３）を９６ウェルプレートに播種（５，０００ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ、培地：１００μＬ）した。２４時間後に培地を交換し、製品名「ＣｅｌｌＬｉｇｈｔ  Ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａ−ＧＦＰ」（２μＬ／ｗｅｌｌ）によりミトコンドリアを染色した。２４時間後にＣｙ５で蛍光標識したＰＣ搭載ＰＩＣミセルとＣｙ３で蛍光標識した非ＰＣ搭載ＰＩＣミセルとを添加（Ｃｙ３及びＣｙ５の蛍光強度：１，０００）し、製品名「ＣｅｌｌＬｉｇｈｔ  Ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａ−ＧＦＰ」（２μＬ／ｗｅｌｌ）をさらに添加した。１、６、２４時間後にＰＢＳにより洗浄し、ヘキストによる核染色を行った。Ｃｙ５、Ｃｙ３、ＧＦＰ及びヘキスト由来の蛍光を共焦点レーザー顕微鏡法により測定し、Ｃｙ５とＧＦＰ又はＣｙ３とＧＦＰの共局在比（ミトコンドリア全量に対するミセルと共局在しているミトコンドリアの比率）をそれぞれＩｍａｇｅＪにより定量した。結果を図２に示す。【０１１１】
図２に示すとおり、ＰＣ搭載ＰＩＣミセルは、コントロールの非ＰＣ搭載ＰＩＣミセルよりも数倍高い共局在比でミトコンドリア内に局在化していた。【０１１２】
［製造例４］  ＰＣ−ＰＥＧ−Ｐ（Ａｓｐ−ｓｉｍｖａｓｔａｔｉｎ）の合成
以下に示すスキームに従って、ＰＣ−ＰＥＧ−Ｐ（Ａｓｐ−ｓｉｍｖａｓｔａｔｉｎ）を合成した。
【化１０】
2020116640.tif 000013
【０１１３】
具体的には、ＰＣ−ＰＥＧ−ＰＡｓｐ−Ａｃを１０ｍＭ  ＬｉＣｌを含むＤＭＦ（１０ｍｇ／ｍＬ）に溶解し、ＥＤＣ（３４５当量）、ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ、３４５当量）及びシンバスタチン（３４５当量）を添加した。室温で２４時間反応後、過剰量のジエチルエーテルに添加し、減圧乾燥によりＰＣ−ＰＥＧ−Ｐ（Ａｓｐ−ｓｉｍｖａｓｔａｔｉｎ）−Ａｃを得た。重ＤＭＦ中での１Ｈ−ＮＭＲよりシンバスタチンの導入率を算出したところ８６％であった。結果を表２に示す。
また、ＰＣ−ＰＥＧ−ＰＡｓｐの代わりにＭｅＯ−ＰＥＧ−ＰＡｓｐを用いたこと以外は上記と同様にして、ＰＣのついていないシンバスタチン結合ポリマー（ＭｅＯ−ＰＥＧ−Ｐ（Ａｓｐ−ｓｉｍｖａｓｔａｔｉｎ）−Ａｃ）を得た。【０１１４】
［製造例５］  ＰＣ搭載シンバスタチン内包ミセルの調製
ＰＣ−ＰＥＧ−Ｐ（Ａｓｐ−ｓｉｍｖａｓｔａｔｉｎ）−Ａｃをメタノール（１０ｍｇ／ｍＬ）に溶解し、メタノールを減圧乾燥により取り除いてポリマー薄膜を得た。得られたポリマー薄膜に純水（１ｍｇ／ｍＬ）を添加し、室温で３０分間超音波処理によりミセル化してＰＣ搭載シンバスタチン内包ミセルを調製した。また、ＰＣ−ＰＥＧ−Ｐ（Ａｓｐ−ｓｉｍｖａｓｔａｔｉｎ）−Ａｃの代わりにＭｅＯ−ＰＥＧ−Ｐ（Ａｓｐ−ｓｉｍｖａｓｔａｔｉｎ）−Ａｃを用いたこと以外は上記と同様にして、非ＰＣ搭載シンバスタチン内包ミセルを調製した。フィルターによる精製後にミセルのサイズ及びＰＤＩをＤＬＳ法により測定し、ミセルのゼータ電位をＥＬＳ法により測定した。結果を表２に示す。【０１１５】
【表２】
2020116640.tif 000014
【０１１６】
≪ＰＣ搭載シンバスタチン内包ミセルの毒性試験≫
ヒトすい腺がん細胞（ＢｘＰＣ３）を９６ウェルプレートに播種（５，０００ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ、培地：１００μＬ）した。２４時間後に培地を交換し、ＰＣ搭載シンバスタチン内包ミセル溶液、非ＰＣ搭載シンバスタチン内包ミセル溶液又はシンバスタチン溶液を添加した。４８時間後にＰＢＳにより洗浄し、Ｃｅｌｌ  Ｃｏｕｎｔｉｎｇ  Ｋｉｔ−８（ＣＣＫ−８、１０μＬ／ｗｅｌｌ）を添加した。３０分後にプレートリーダーにより吸光度を測定し、細胞生存率及びＩＣ５０を算出した。結果を図３に示す。【０１１７】
図３に示すとおり、ＰＣ搭載シンバスタチン内包ミセル溶液は、シンバスタチン溶液よりも顕著に低く、非ＰＣ搭載シンバスタチン内包ミセル溶液よりもやや高い細胞毒性を示した。このことから、ミセル化によってシンバスタチンの細胞障害性が顕著に抑制されること、及び、ＰＣの付加に起因する細胞取り込みの増大によってミセル化されていてもシンバスタチンの細胞障害性を発揮できることがわかる。【０１１８】
［製造例６］  ＰＣ−ＰＥＧ−ＰＧＴｒｐの合成
以下に示すＰＣ−ＰＥＧ−ＰＧＴｒｐを合成した。具体的な手順は以下のとおりである。
【化１１】
2020116640.tif 000015
ＮＨ２−ＰＥＧ−ｐｏｌｙ（Ｇｌｙｃｅｒｏｌ）（ＰＥＧ分子量：１２ｋＤａ、Ｇｌｙｃｅｒｏｌ重合度：８０）を純水（３０ｍｇ／ｍＬ）に溶解し、ＭＰＣ（１０当量）、ＥＤＣ（１０当量）、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ−ＯＨ、１０当量）を加えた。室温で２４時間の反応後、純水に対する透析（ＭＷＣＯ：６，０００−８，０００）を行い、凍結乾燥によりＰＣ−ＰＥＧ−ｐｏｌｙ（Ｇｌｙｃｅｒｏｌ）を得た。重水中での１Ｈ−ＮＭＲよりＰＣの導入率を算出したところ、７３％であった。【０１１９】
ＰＣ−ＰＥＧ−ｐｏｌｙ（Ｇｌｙｃｅｒｏｌ）をＤＭＦ（１０ｍｇ／ｍＬ）に溶解し、Ｆｍｏｃ−ＮＨ−ｔｒｙｐｔｏｐｈａｎ−ＯＨ（８１０当量）、ＥＤＣ（８１０当量）及びＤＭＡＰ（８１０当量）を添加した。室温で２４時間の反応後に、過剰量のジエチルエーテルに添加し、減圧乾燥によりＰＣ−ＰＥＧ−Ｐ（Ｇｌｙｃｉｄｙｌ  Ｔｒｙｐｔｏｐｈａｎ（Ｆｍｏｃ））を得た。重ＤＭＳＯ中での１Ｈ−ＮＭＲよりＦｍｏｃ−ＮＨ−ｔｒｙｐｔｏｐｈａｎ−ＯＨの導入率を算出したところ、８８％であった。【０１２０】
ＰＣ−ＰＥＧ−ｐｏｌｙ（Ｇｌｙｃｉｄｙｌ  Ｔｒｙｐｔｏｐｈａｎ（Ｆｍｏｃ））を２０％のピペリジンを含むＤＭＦ（１０ｍｇ／ｍＬ）に溶解し、室温で２４時間反応した。反応後に過剰量のジエチルエーテルに添加し、減圧乾燥によりＰＣ−ＰＥＧ−ＰＧＴｒｐを得た。重水中での１Ｈ−ＮＭＲよりＦｍｏｃ基の脱保護を確認した。また、ＰＣ−ＰＥＧ−ｐｏｌｙ（Ｇｌｙｃｅｒｏｌ）の代わりにＭｅＯ−ＰＥＧ−ｐｏｌｙ（Ｇｌｙｃｅｒｏｌ）を用いたこと以外は上記と同様にして、ＰＣのついていないポリマー（ＭｅＯ−ＰＥＧ−ＰＧＴｒｐ）を得た。【０１２１】
［製造例７］  ＰＣ搭載ｍＲＮＡミセルの調製
ＰＣ−ＰＥＧ−ＰＧＴｒｐとｍＲＮＡ（Ｇａｕｓｓｉａ  ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  （ＧＬｕｃ））を１０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ緩衝液（ｐＨ７．３）に溶解し、ＰＧＴｒｐ鎖の１級アミン（Ｎ）とｍＲＮＡ中のリン酸基（Ｐ）のモル比（Ｎ／Ｐ）が３になるように混合し、ＰＣ搭載ｍＲＮＡミセルを調製した。また、ＰＣ−ＰＥＧ−ＰＧＴｒｐの代わりにＭｅＯ−ＰＥＧ−ＰＧＴｒｐを用いたこと以外は上記と同様にして、非ＰＣ搭載ｍＲＮＡミセルを調製した。ｍＲＮＡミセルのサイズ及びＰＤＩをＤＬＳ法により測定した。また、ミセル１つあたりのｍＲＮＡ分子の会合数を蛍光相関分光（ＦＣＳ）法により測定した。結果を表３に示す。【０１２２】
【表３】
2020116640.tif 000016
【０１２３】
≪ＰＣ搭載ｍＲＮＡミセルの遺伝子発現効率≫
ヒトすい腺がん細胞（ＢｘＰＣ３）を９６ウェルプレートに播種（５，０００  ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ）した。２４時間後に培地を交換し、ＧＬｕｃ  ｍＲＮＡミセル溶液（５０μｇ／ｗｅｌｌ）を添加した。２４時間後に上清をプレートに添加し、ルシフェリン添加後に発光強度をルミノメーターにより測定した。結果を図４に示す。【０１２４】
図４に示すとおり、ＰＣ搭載ｍＲＮＡミセルは、非ＰＣ搭載ｍＲＮＡミセルよりも有意に高い遺伝子発現効率を示した。ＰＣの付加に起因する細胞取り込みの増大によって遺伝子発現効率も増大したことが示唆される。【０１２５】
［製造例８］アルブミンＰＣコンジュゲートの合成
Ａｌｅｘａ６４７修飾アルブミンを１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４、５ｍｇ／ｍＬ）に溶解し、１００ｍＭ  トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ、１ｍＬ）を添加した。室温で３０分の反応後にＭＰＣ（３５０当量）とＤＩＰＡ（３５０当量）を添加し、室温で４８時間反応した。反応後に限外ろ過法（ＭＷＣＯ：３，０００）により精製し、アルブミンへのＰＣの導入を行った。イールマン試薬によるチオール基の定量から、アルブミン１分子あたりに導入されたＰＣは１０分子であった。【０１２６】
≪アルブミンＰＣコンジュゲートの細胞取り込み試験≫
ヒトすい腺がん細胞（ＢｘＰＣ３）を９６ウェルプレートに播種（５，０００  ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ）した。２４時間後に培地を交換し、Ａｌｅｘａ６４７修飾アルブミンＰＣコンジュゲート溶液を添加した。また、コントロール群には、Ａｌｅｘａ６４７修飾アルブミンを添加した。６、２４時間後にＰＢＳにより洗浄し、ヘキストによる核染色を行った。Ａｌｅｘａ６４７及びヘキスト由来の蛍光を共焦点レーザー顕微鏡法により測定し、蛍光強度をＩｍａｇｅＪにより定量した。結果を図５に示す。【０１２７】
図５に示すとおり、アルブミンＰＣコンジュゲートを添加した実験群は、アルブミン単体を添加した実験群よりも顕著に高い蛍光強度を示した。このことから、アルブミンＰＣコンジュゲートの細胞取り込みが増大したことがわかる。【０１２８】
≪ミトコンドリア染色によるアルブミンＰＣコンジュゲートの細胞内分布の評価≫
ヒトすい腺がん細胞（ＢｘＰＣ３）を９６ウェルプレートに播種（５，０００ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ、培地：１００μＬ）した。２４時間後に培地を交換し、製品名「ＣｅｌｌＬｉｇｈｔ  Ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａ−ＧＦＰ」（２μＬ／ｗｅｌｌ）によりミトコンドリアを染色した。２４時間後にＡｌｅｘａ６４７修飾アルブミンＰＣコンジュゲート溶液又はＡｌｅｘａ６４７修飾アルブミン（コントロール）を添加（蛍光強度：１，０００）し、製品名「ＣｅｌｌＬｉｇｈｔ  Ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａ−ＧＦＰ」（２μＬ／ｗｅｌｌ）をさらに添加した。６、２４時間後にＰＢＳにより洗浄し、ヘキストによる核染色を行った。Ａｌｅｘａ６４７、ＧＦＰ及びヘキスト由来の蛍光を共焦点レーザー顕微鏡法により測定し、Ａｌｅｘａ６４７とＧＦＰの共局在比をそれぞれＩｍａｇｅＪにより定量した。結果を図６に示す。【０１２９】
図６に示すとおり、アルブミンＰＣコンジュゲートは、アルブミン単独よりも高い共局在比でミトコンドリア内に局在化していた。このことから、ＰＣを薬物に結合することにより、薬物をミトコンドリア内に効率的に送達できることがわかる。【０１３０】
［製造例９］ＰＣ搭載金ナノ粒子の調製
≪ＰＣ−ＰＥＧ−ｌｉｐｏｉｃ  ａｃｉｄの合成≫
製造例１と同様の方法で調製したＰＣ−ＰＥＧ−ＮＨ２（１０ｋＤａ，３０ｍｇ）をＤＭＳＯ（４ｍＬ）に溶解し、α−リポ酸（２０当量，１２ｍｇ）、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（２０当量，１２ｍｇ）、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（２０当量，７ｍｇ）を添加し、３５度で１晩撹拌した。その後、反応溶液を透析用バック（ＭＷＣＯ：３，５００Ｄａ）に入れて純水に対して１晩透析を行った。凍結乾燥後に得られたポリマーを重クロロホルム中の１Ｈ−ＮＭＲにより、ポリマーへのα−リポ酸の導入率が７７％であることが確認された。【０１３１】
≪ＰＣ搭載金ナノ粒子の調製≫
金ナノ粒子（４．０×１０１１ｐａｒｔｉｃｌｅｓ／ｍＬ、溶液：５０μＬ）にＰＣ−ＰＥＧ−ｌｉｐｏｉｃ  ａｃｉｄ溶液（０．０１ｍｇ／ｍＬ，ＰＢＳ，１７μＬ）を添加し、常温で１晩反応した。その後、フィルター（ポアサイズ：２２０ｎｍ）により不純物を除き、動的光散乱法（ＤＬＳ）によりサイズおよび多分散度を測定したところ、８６ｎｍ（ＰＤＩ＝０．１７）であった。【０１３２】
≪ＰＣ搭載金ナノ粒子のミトコンドリア移行の確認≫
ＢｘＰＣ３細胞（ヒトすい臓腺がん細胞）を６ウェルプレートに播種した（１×１０６ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ、培地：２ｍＬ）。２４時間後に上記の手順で作製したＰＣ搭載金ナノ粒子を各ウェルに１×１０１０個ずつ（２ｍＬ）添加し、２４時間インキュベートした（ＰＣ搭載金ナノ粒子数は、動的光散乱法（ＤＬＳ）により測定した）。細胞をトリプシン処理して、遠心にて回収し、前固定液（４％パラホルムアルデヒド、０．１ＭＰＢＳ、２５％グルタールアルデヒドの５：４：１の混合溶液）を用いた前固定および後固定液（２％オスミウム酸、０．１ＰＢＳの１：１混合液）を用いた後固定を行った。次いで、上昇エタノール脱水を行い、エポン樹脂で包埋した後、ダイアモンドカッターで１μｍの厚さに切断することにより、超薄切片を作製した。得られた超薄切片に対して、ウラン染色液（酢酸ウラン，５０％アルコール溶液）を用いた染色、次いで、レイノルズ鉛染色液（硝酸鉛２．６６ｇ、クエン酸ナトリウム３．５２ｇ、１Ｍ  ＮａＯＨ１６ｍＬ）を用いた染色を各１０分行い、透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）観察に供した。ＴＥＭ観察画像を図７に示す。【０１３３】
図７（ａ）は、ＢｘＰＣ３細胞の断面画像であり、図７（ｂ）は図７（ａ）中の四角で囲まれた部分の拡大画像であり、その中央部にミトコンドリアが撮像されている。図７（ｂ）に示されるとおり、ミトコンドリア内部には、ＰＣ基が結合した金ナノ粒子に基づく黒点が観察でき、このことから、ＰＣ搭載金ナノ粒子は細胞内に取り込まれた後、ミトコンドリア内に移行したことが確認された。
【産業上の利用可能性】
【０１３４】
本発明は、例えば、ＤＤＳ分野において好適に用いられ得る。
【図１】
2020116640.tif 000024
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【国際調査報告】
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