(57)【要約】  本発明により、ＡＧＥｓ、特にグリセルアルデヒド由来ＡＧＥｓまたはグリコールアルデヒド由来ＡＧＥｓに対して高い選択性および親和性を有するモノクローナル抗体、およびそれを利用した分析方法を提供される。さらに本発明の目的は、前記モノクローナル抗体を用いた疾患の診断方法、治療方法および予防方法が提供される。
2020045646.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
式（ＸＩ）または（ＸＩＩ）：
【化１】
2020045646.tif 000034
［式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４は、それぞれ独立に、水素原子、保護基、およびアミノ酸残基数１〜１０００のペプチド基から選択され、
Ｑ１は、水素原子、または基−ＣＨ２−Ｘ１−Ｙ１を表し；
Ｑ２は、水素原子、または基−ＣＨ２−Ｘ２−Ｙ２を表し；
Ｘ１およびＸ２は、−Ｏ−、または−ＮＨ−を表し；
Ｙ１およびＹ２は、水素原子、保護基、または基：
【化２】
2020045646.tif 000035
を表し；
Ｒ５およびＲ６は、それぞれ独立に、水素原子、保護基、およびアミノ酸残基数１〜１０００のペプチド基から選択される］
の化合物、そのカチオンラジカル、またはそのジカチオンと結合するモノクローナル抗体またはその抗原結合断片。
【請求項２】
式（Ｉ）または（ＩＩ）：
【化３】
2020045646.tif 000036
［式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４は、それぞれ独立に、水素原子、保護基、およびアミノ酸残基数１〜１０００のペプチド基から選択され、
Ｘ１およびＸ２は、−Ｏ−、または−ＮＨ−を表し；
Ｙ１およびＹ２は、水素原子、保護基、または基：
【化４】
2020045646.tif 000037
を表し；
Ｒ５およびＲ６は、それぞれ独立に、水素原子、保護基、およびアミノ酸残基数１〜１０００のペプチド基から選択される］
の化合物、そのカチオンラジカル、またはそのジカチオンと結合する、請求項１に記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合断片。
【請求項３】
（１）重鎖可変領域の相補性決定領域（ＶＨ  ＣＤＲ１、ＶＨ  ＣＤＲ２、およびＶＨ  ＣＤＲ３）または軽鎖可変領域の相補性決定領域（ＶＬ  ＣＤＲ１、ＶＬ  ＣＤＲ２、およびＶＬ  ＣＤＲ３）のアミノ酸配列が、
（１−１Ｖ）
（ａ）ＶＨ  ＣＤＲ１：配列番号：１に示すアミノ酸配列、またはそれと実質的に同一のアミノ酸配列；
（ｂ）ＶＨ  ＣＤＲ２：配列番号：２に示すアミノ酸配列、またはそれと実質的に同一のアミノ酸配列；および
（ｃ）ＶＨ  ＣＤＲ３：配列番号：３に示すアミノ酸配列、またはそれと実質的に同一のアミノ酸配列；
（１−１Ｌ）
（ｄ）ＶＬ  ＣＤＲ１：配列番号：５に示すアミノ酸配列、またはそれと実質的に同一のアミノ酸配列；
（ｅ）ＶＬ  ＣＤＲ２：配列番号：６に示すアミノ酸配列、またはそれと実質的に同一のアミノ酸配列；および
（ｆ）ＶＬ  ＣＤＲ３：配列番号：７に示すアミノ酸配列、またはそれと実質的に同一のアミノ酸配列；  
（１−２Ｖ）
（ｇ）ＶＨ  ＣＤＲ１：配列番号：１５に示すアミノ酸配列、またはそれと実質的に同一のアミノ酸配列；
（ｈ）ＶＨ  ＣＤＲ２：配列番号：１６に示すアミノ酸配列、またはそれと実質的に同一のアミノ酸配列；および
（ｉ）ＶＨ  ＣＤＲ３：配列番号：１７に示すアミノ酸配列、またはそれと実質的に同一のアミノ酸配列；または
（１−２Ｌ）
（ｊ）ＶＬ  ＣＤＲ１：配列番号：１９に示すアミノ酸配列、またはそれと実質的に同一のアミノ酸配列；
（ｋ）ＶＬ  ＣＤＲ２：配列番号：２０に示すアミノ酸配列、またはそれと実質的に同一のアミノ酸配列；
（ｌ）ＶＬ  ＣＤＲ３：配列番号：２１に示すアミノ酸配列、またはそれと実質的に同一のアミノ酸配列；  
を含む、モノクローナル抗体またはその抗原結合断片；
または
（２）グリセルアルデヒド由来ＡＧＥｓまたはグリコールアルデヒド由来ＡＧＥｓのエピトープとの結合について、前記（１）の抗体またはその抗原結合断片と交差競合する抗体またはその抗原結合断片であり、
グリセルアルデヒド由来ＡＧＥｓまたはグリコールアルデヒド由来ＡＧＥｓに含まれるエピトープと結合するモノクローナル抗体またはその抗原結合断片。
【請求項４】
（１）重鎖可変領域の相補性決定領域（ＶＨ  ＣＤＲ１、ＶＨ  ＣＤＲ２、およびＶＨ  ＣＤＲ３）および軽鎖可変領域の相補性決定領域（ＶＬ  ＣＤＲ１、ＶＬ  ＣＤＲ２、およびＶＬ  ＣＤＲ３）のアミノ酸配列が、
（１−１）
（ａ）ＶＨ  ＣＤＲ１：配列番号：１に示すアミノ酸配列、またはそれと実質的に同一のアミノ酸配列；
（ｂ）ＶＨ  ＣＤＲ２：配列番号：２に示すアミノ酸配列、またはそれと実質的に同一のアミノ酸配列；
（ｃ）ＶＨ  ＣＤＲ３：配列番号：３に示すアミノ酸配列、またはそれと実質的に同一のアミノ酸配列；
（ｄ）ＶＬ  ＣＤＲ１：配列番号：５に示すアミノ酸配列、またはそれと実質的に同一のアミノ酸配列；
（ｅ）ＶＬ  ＣＤＲ２：配列番号：６に示すアミノ酸配列、またはそれと実質的に同一のアミノ酸配列；および
（ｆ）ＶＬ  ＣＤＲ３：配列番号：７に示すアミノ酸配列、またはそれと実質的に同一のアミノ酸配列；もしくは
（１−２）
（ｇ）ＶＨ  ＣＤＲ１：配列番号：１５に示すアミノ酸配列、またはそれと実質的に同一のアミノ酸配列；
（ｈ）ＶＨ  ＣＤＲ２：配列番号：１６に示すアミノ酸配列、またはそれと実質的に同一のアミノ酸配列；
（ｉ）ＶＨ  ＣＤＲ３：配列番号：１７に示すアミノ酸配列、またはそれと実質的に同一のアミノ酸配列；
（ｊ）ＶＬ  ＣＤＲ１：配列番号：１９に示すアミノ酸配列、またはそれと実質的に同一のアミノ酸配列；
（ｋ）ＶＬ  ＣＤＲ２：配列番号：２０に示すアミノ酸配列、またはそれと実質的に同一のアミノ酸配列；
（ｌ）ＶＬ  ＣＤＲ３：配列番号：２１に示すアミノ酸配列、またはそれと実質的に同一のアミノ酸配列；  
を含む、モノクローナル抗体またはその抗原結合断片；
または
（２）グリセルアルデヒド由来ＡＧＥｓまたはグリコールアルデヒド由来ＡＧＥｓのエピトープとの結合について、前記（１）の抗体またはその抗原結合断片と交差競合する抗体またはその抗原結合断片であり、
グリセルアルデヒド由来ＡＧＥｓまたはグリコールアルデヒド由来ＡＧＥｓに含まれるエピトープと結合する、請求項１〜３のいずれか１項に記載の、モノクローナル抗体またはその抗原結合断片。
【請求項５】
（１）重鎖可変領域および軽鎖可変領域のアミノ酸配列が、
配列番号：４のアミノ酸配列またはそれと実質的に同一のアミノ酸配列、および／または配列番号：８のアミノ酸配列またはそれと実質的に同一のアミノ酸配列；もしくは
配列番号：１８のアミノ酸配列またはそれと実質的に同一のアミノ酸配列、および／または配列番号：２２のアミノ酸配列またはそれと実質的に同一のアミノ酸配列；
または
（２）グリセルアルデヒド由来ＡＧＥｓまたはグリコールアルデヒド由来ＡＧＥｓのエピトープとの結合について、前記（１）に記載の抗体またはその抗原結合断片と交差競合する抗体またはその抗原結合断片であり、
グリセルアルデヒド由来ＡＧＥｓまたはグリコールアルデヒド由来ＡＧＥｓに含まれるエピトープと結合する、請求項１〜４のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合断片。
【請求項６】
グリセルアルデヒド由来ＡＧＥｓに含まれるエピトープと結合する、請求項１〜５のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合断片。
【請求項７】
完全長抗体、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、ｄｓＦｖ、ダイアボディ、またはｓｃ（Ｆｖ）２である、請求項１〜６のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合断片。
【請求項８】
マウス抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、キメラ抗体、またはその抗原結合断片である、請求項１〜７のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合断片。
【請求項９】
１×１０−５Ｍ以下の解離定数（Ｋｄ値）でグリセルアルデヒド由来ＡＧＥｓまたはグリコールアルデヒド由来ＡＧＥｓのエピトープと結合する、請求項１〜８のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合断片。
【請求項１０】
請求項１〜９のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合断片を含む医薬組成物。
【請求項１１】
肥満、糖尿病、糖尿病網膜症、糖尿病白内障、糖尿病神経障害、糖尿病心筋症、糖尿病血管合併症、糖尿病性腎症、糖尿病性腎臓疾患、糖尿病足病変、糖尿病ケトアシドーシス、歯周病、加齢黄斑変性症、肺線維症、特発性肺線維症、細気管支周囲線維症、間質性肺疾患、肺がん、がん線維性肺疾患、慢性閉塞性肺疾患、急性下肢動脈塞栓症、末梢動脈疾患、末梢気道疾患、肺気腫、腎盂腎炎、糸球体硬化症、糸球体腎炎、メサンギウム増殖糸球体腎炎、糖尿病性ネフロパシー、腎性全身性線維症、慢性腎臓病、特発性後腹膜線維症、腎疾患、強皮症、腎間質線維症、女性不妊症、多嚢胞性卵巣症候群、卵巣機能不全、早期卵巣機能不全、卵巣がん、乳がん、子宮体がん、前立腺がん、男性不妊症、肝疾患、肝硬変、非アルコール性脂肪肝炎、肝がん、アテローム血栓性脳梗塞、アテローム性動脈硬化症、内頸動脈狭窄症、大動脈弁狭窄症、大動脈弁閉鎖不全症、心血管疾患、狭心症、うっ血性心不全、急性心不全、慢性心不全、虚血性心疾患、拡張型心筋症、心サルコイドーシス、高血圧、肺動脈性肺高血圧症、肺性心、心筋炎、血管狭窄心線維症、心筋梗塞後心線維症、心筋梗塞後左心室肥大、関節リウマチ、生活習慣病、脂質異常症、アルツハイマー病、血管性認知症、脳梗塞、脳腫瘍、脳血管障害、ぶどう膜炎、内分泌疾患、骨粗しょう症、舌がん、口腔がん、咽頭がん、食道がん、胃がん、大腸がん、直腸がん、膵臓がん、網膜色素変性症、糖尿病黄斑浮腫、レーバー先天性黒内障、シュタルガルト症、アッシャー症候群、コロイデレミア、桿体錐体ジストロフィー、錐体ジストロフィー、進行性網膜萎縮、黄斑ジストロフィー症、脈絡膜硬化症、全脈絡膜萎縮症、類嚢胞黄斑浮腫、ブドウ膜炎、網膜剥離、黄斑円孔、黄斑部毛細血管拡張症、緑内障、視神経症、虚血性網膜疾患、未熟児網膜症、網膜血管閉塞症、および網膜細動脈瘤から選択される疾患の診断、治療、または予防に用いるための、請求項１０に記載の医薬組成物。
【請求項１２】
糖尿病、耐糖能異常、網膜症、腎症、糖尿病に伴う合併症、末梢神経障害、下肢壊疽、動脈硬化、血栓症、非アルコール性脂肪性肝疾患、非アルコール性脂肪肝炎、がん、不妊症、多嚢胞性卵巣症候群、卵巣機能障害、中枢神経障害、およびアルツハイマー病を含む神経変性疾患から選択される疾患の診断、治療、または予防に用いるための、請求項１０に記載の医薬組成物。
【請求項１３】
疾患が、メラノーマ、肺がん、および肝臓がんから選択されるがんである、請求項１２に記載の医薬組成物。
【請求項１４】
眼疾患の診断、治療、または予防に用いるための、請求項１０に記載の医薬組成物。
【請求項１５】
眼疾患が、糖尿病網膜症、糖尿病白内障、網膜色素変性症、糖尿病黄斑浮腫、レーバー先天性黒内障、シュタルガルト症、アッシャー症候群、コロイデレミア、桿体錐体ジストロフィー、錐体ジストロフィー、進行性網膜萎縮、加齢黄斑変性症、黄斑ジストロフィー症、脈絡膜硬化症、全脈絡膜萎縮症、類嚢胞黄斑浮腫、ブドウ膜炎、網膜剥離、黄斑円孔、黄斑部毛細血管拡張症、緑内障、視神経症、虚血性網膜疾患、未熟児網膜症、網膜血管閉塞症、および網膜細動脈瘤から選択される、請求項１４に記載の医薬組成物。
【請求項１６】
請求項１〜９のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合断片をコードする、核酸。
【請求項１７】
請求項１６に記載の核酸を含む発現ベクター。
【請求項１８】
請求項１７の発現ベクターを含む宿主細胞。
【請求項１９】
式（Ｉ）または（ＩＩ）：
【化５】
2020045646.tif 000038
［式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４は、それぞれ独立に、水素原子、保護基、および
アミノ酸残基数１〜１０００のペプチド基から選択され、
Ｘ１およびＸ２は、−Ｏ−、または−ＮＨ−を表し；
Ｙ１およびＹ２は、水素原子、保護基、または基：
【化６】
2020045646.tif 000039
を表し；
Ｒ５およびＲ６は、それぞれ独立に、水素原子、保護基、およびアミノ酸残基数１〜１０００のペプチド基から選択される］
の化合物、そのカチオンラジカル、またはそのジカチオン、またはその塩。
【請求項２０】
１）α位のアミノ基が保護されたリシンおよびグリセルアルデヒドを反応させて、反応混合物を得ること；
２）反応混合物を分画し、式（Ｉａ）、（Ｉｂ）、（ＩＩａ）、または（ＩＩｂ）：  
【化７】
2020045646.tif 000040
［式中、Ｒ１、Ｒ３、およびＲ６は、保護基である］
で表される化合物を含む画分を得ること
３）当該画分を用いて動物への免疫を行い、当該画分を抗原とする抗体を得ること
を含む、抗体の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、終末糖化産物（ＡＧＥｓ）、特にグリセルアルデヒド由来ＡＧＥｓまたはグリコールアルデヒド由来ＡＧＥｓのエピトープと結合するモノクローナル抗体またはその抗原結合断片に関する。
【背景技術】
【０００２】
終末糖化産物（ＡＧＥｓ）は、生体内でアミノ酸、主にリシンのアミノ基が還元糖によって非酵素的に修飾された後、酸化・脱水・縮合などの複雑な反応を経て生成する物質の総称である。加齢や高血糖状態で生成するＡＧＥｓは糖尿病合併症や動脈硬化などの生活習慣病と関連していると考えられている。特に、糖代謝中間体のグリセルアルデヒドに由来するＡＧＥｓ（グリセルＡＧＥｓ；Ｇｌｙｃｅｒ−ＡＧＥｓ）は、診断、予防において有用なバイオマーカーとして注目されている（非特許文献１〜３）。【０００３】
ＡＧＥｓに含まれる構造はいくつか特定されており、その一つであるカルボキシメチルリシン（Ｎε−（カルボキシメチル）リシン、ＣＭＬ）は、グルコースとリシンの反応で生成するアマドリ化合物の糖部分が遷移金属の存在下で酸化的に解裂してエリスロン酸とともに生成される物質として同定されている。ＡＧＥｓ研究の歴史から、ＡＧＥｓの定量は構造が明らかになっているＣＭＬの定量で代替されてきた。Ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおけるＣＭＬの主な生成経路は、シッフ塩基あるいはアマドリ化合物の酸化的開裂によると考えられている。また、ＣＭＬはグリオキサール（ＧＯ）およびグリコールアルデヒドを前駆体とする分子内カニッツァロ反応やグルコースの自動酸化によっても生成することが知られている。タンパク質中のＣＭＬは酸加水分解に安定なこともあり、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）法やガスクロマトグラフィー／質量分析（ＧＣ／ＭＳ）法で定量することが可能である（非特許文献１）。ＡＧＥｓに含まれる構造についていくつかの報告がされている（特許文献１〜３）。【０００４】
エンザイムイムノアッセイ（ＥＩＡ）法によるＡＧＥｓの定量として、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を用いて作製したＡＧＥｓ（ＡＧＥｓ含有ウシ血清アルブミン、ＡＧＥｓ−ＢＳＡ）を抗原とする、抗ＡＧＥｓ−ＢＳＡ抗体を用いた競合ｅｎｚｙｍｅ−ｌｉｎｋｅｄ  ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ  ａｓｓａｙ（ＥＬＩＳＡ）法に始まるが、後にこれらの抗体はＣＭＬ構造をエピトープとする抗ＣＭＬ抗体であることが判明した（非特許文献１）。一方で、ウサギ血清アルブミン（ＲＳＡ）にグリセルアルデヒド、グリコールアルデヒド、メチルグリオキサール、またはグリオキサールを添加してそれぞれ作製したＡＧＥｓを抗原として抗血清を調製し、得られた抗血清を精製してＣＭＬ非結合性の画分を得たとの報告がされている（非特許文献４）。当該画分として得られたポリクローナル抗体を用いたＥＬＩＳＡアッセイが行われており、ＣＭＬ以外のＡＧＥｓの定量方法として利用されている（非特許文献５および６）。【０００５】
例えば、不妊治療の成否とグリセルアルデヒド由来ＡＧＥｓ（Ｇｌｙｃｅｒ−ＡＧＥｓ）との相関についての研究がされており、血中のＧｌｙｃｅｒ−ＡＧＥｓ量が高いと継続妊娠率が不良であるとの報告がされている（非特許文献１〜３、５および６）。また、ＡＧＥｓが内皮間葉転換（endothelial-to-mesenchymal transition）を誘導すること、および内皮間葉転換が心血管疾患や線維性疾患の発生に関与することが報告されている（非特許文献１３および１４）。そういった研究においては、上述のポリクローナル抗体のうちの抗グリセルアルデヒド由来ＡＧＥｓ抗体を用いたＥＬＩＳＡアッセイが利用されている（非特許文献５および６）。ＡＧＥｓに結合活性を有する抗体についていくつかの報告がされている（特許文献４〜６）。【０００６】
各種ＡＧＥｓの具体的な化学構造について多くの報告がされている（例えば、非特許文献８〜１２および１５）。また、グリセルアルデヒド由来のＡＧＥｓを抗原としたモノクローナル抗体の作製について報告がされている（非特許文献７）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開２００１−３１６３８９号公報；
【特許文献２】特開２００３−３００９６１号公報；
【特許文献３】特開２００４−２５０４０４号公報；
【特許文献４】特開２００６−３１２６２１号公報；
【特許文献５】特開２０１７−０４３５９５号公報；
【特許文献６】特開２０１９−０４１６６８号公報；
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】金沢医科大学雑誌、３７（４）：１４１−１６１、２０１２；
【非特許文献２】金沢医科大学雑誌、４０（２／３）：９５−１０３、２０１５；
【非特許文献３】Diagnostics 6(2), 23, 2016; doi:10.3390；
【非特許文献４】Molecular Medicine, 6(2): 114-125, 2000；
【非特許文献５】Human Reproduction, 26(3), 604-610, 2011；
【非特許文献６】日本未病システム学会雑誌、２１（１）：９３−９６、２０１５；
【非特許文献７】Immunology Letters 167(2), 141-146, 2015；
【非特許文献８】Biosci. Biotechnol. Biochem. 67(4), 930-932, 2003；
【非特許文献９】J. Agric. Food Chem. 47(2), 379-390, 1999；
【非特許文献１０】J. Agric. Food Chem. 25(6),1282-1287, 1977；
【非特許文献１１】Agric. Biol. Chem.49(11),3131-3137；
【非特許文献１２】Biochem. J. 369(3), 705-719, 2003；
【非特許文献１３】Biomed. Res. Int. 684242,2015；
【非特許文献１４】Int. J. Mol. Sci. 18(10), 2017。
【非特許文献１５】Free Radic. Biol. Med. 29(6), 557-567, 2000。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明の目的は、ＡＧＥｓ、特にグリセルアルデヒド由来ＡＧＥｓまたはグリコールアルデヒド由来ＡＧＥｓに対して高い選択性および親和性を有するモノクローナル抗体、およびそれを利用した分析方法を提供することである。本発明のさらなる目的は、生体に障害を与えるか疾患の原因となるＡＧＥｓに含まれる化学構造をエピトープとするモノクローナル抗体、およびそれを利用した分析方法を提供することである。さらに本発明の目的は、前記モノクローナル抗体を用いた疾患の診断方法、治療方法および予防方法、特に不妊症または眼疾患の診断方法、治療方法、および予防方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、研究の結果、特定のモノクローナル抗体が、良好な選択性および抗原への高い結合性を有し、分析方法や診断方法、治療方法および予防方法に利用可能であることを見いだし、本発明を完成させるに至った。【００１１】
本発明により、以下の発明が提供される。【００１２】
［Ａ１］１）重鎖可変領域の相補性決定領域（ＶＨ  ＣＤＲ１、ＶＨ  ＣＤＲ２、およびＶＨ  ＣＤＲ３）および軽鎖可変領域の相補性決定領域（ＶＬ  ＣＤＲ１、ＶＬ  ＣＤＲ２、およびＶＬ  ＣＤＲ３）のアミノ酸配列が、
（ａ）ＶＨ  ＣＤＲ１：配列番号：１に示すアミノ酸配列、またはそれと実質的に同一のアミノ酸配列；
（ｂ）ＶＨ  ＣＤＲ２：配列番号：２に示すアミノ酸配列、またはそれと実質的に同一のアミノ酸配列；
（ｃ）ＶＨ  ＣＤＲ３：配列番号：３に示すアミノ酸配列、またはそれと実質的に同一のアミノ酸配列；
（ｄ）ＶＬ  ＣＤＲ１：配列番号：５に示すアミノ酸配列、またはそれと実質的に同一のアミノ酸配列；
（ｅ）ＶＬ  ＣＤＲ２：配列番号：６に示すアミノ酸配列、またはそれと実質的に同一のアミノ酸配列；
（ｆ）ＶＬ  ＣＤＲ３：配列番号：７に示すアミノ酸配列、またはそれと実質的に同一のアミノ酸配列
を含む、モノクローナル抗体またはその抗原結合断片。
または
２）グリセルアルデヒド由来ＡＧＥｓまたはグリコールアルデヒド由来ＡＧＥｓのエピトープとの結合について、前記抗体またはその抗原結合断片と交差競合する抗体またはその抗原結合断片である、
グリセルアルデヒド由来ＡＧＥｓまたはグリコールアルデヒド由来ＡＧＥｓのエピトープと結合するモノクローナル抗体またはその抗原結合断片。【００１３】
［Ａ２］式（Ｉ）または（ＩＩ）：
【化１】
2020045646.tif 000003
［式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４は、それぞれ独立に、水素原子、保護基、およびアミノ酸残基数１〜１０００のペプチド基から選択され、
Ｘ１およびＸ２は、−Ｏ−、または−ＮＨ−を表し；
Ｙ１およびＹ２は、水素原子、保護基、または基：【００１４】
【化２】
2020045646.tif 000004
を表し；
Ｒ５およびＲ６は、それぞれ独立に、水素原子、保護基、およびアミノ酸残基数１〜１０００のペプチド基から選択される］
の化合物、そのカチオンラジカル、またはそのジカチオンと結合するモノクローナル抗体またはその抗原結合断片。【００１５】
［Ａ３］１）重鎖可変領域および軽鎖可変領域のアミノ酸配列が、
配列番号：４のアミノ酸配列またはそれと実質的に同一のアミノ酸配列、および配列番号：８のアミノ酸配列またはそれと実質的に同一のアミノ酸配列；または
２）グリセルアルデヒド由来ＡＧＥｓまたはグリコールアルデヒド由来ＡＧＥｓのエピトープとの結合について、前記抗体またはその抗原結合断片と交差競合する抗体またはその抗原結合断片である、［Ａ１］に記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合断片。【００１６】
［Ａ４］前記エピトープがグリセルアルデヒド由来ＡＧＥｓのエピトープである、［Ａ１］〜［Ａ３］のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合断片。【００１７】
［Ａ５］完全長抗体、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、ｄｓＦｖ、ダイアボディ、またはｓｃ（Ｆｖ）２である、［Ａ１］〜［Ａ４］のいずれかに記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合断片。【００１８】
［Ａ６］マウス抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、キメラ抗体、またはその抗原結合断片である、［Ａ１］〜［Ａ５］のいずれかに記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合断片。【００１９】
［Ａ７］１×１０−５Ｍ以下の解離定数（Ｋｄ値）でグリセルアルデヒド由来ＡＧＥｓまたはグリコールアルデヒド由来ＡＧＥｓのエピトープと結合する、［Ａ１］〜［Ａ６］のいずれかに記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合断片。【００２０】
［Ａ８］［Ａ１］〜［Ａ７］のいずれかに記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合断片を含む医薬組成物。【００２１】
［Ａ９］肥満、糖尿病、糖尿病網膜症、糖尿病白内障、糖尿病神経障害、糖尿病心筋症、糖尿病血管合併症、糖尿病性腎症、糖尿病性腎臓疾患、糖尿病足病変、糖尿病ケトアシドーシス、歯周病、加齢黄斑変性症、肺線維症、特発性肺線維症、細気管支周囲線維症、間質性肺疾患、肺がん、がん線維性肺疾患、慢性閉塞性肺疾患、急性下肢動脈塞栓症、末梢動脈疾患、末梢気道疾患、肺気腫、腎盂腎炎、糸球体硬化症、糸球体腎炎、メサンギウム増殖糸球体腎炎、糖尿病性ネフロパシー、腎性全身性線維症、慢性腎臓病、特発性後腹膜線維症、腎疾患、強皮症、腎間質線維症、女性不妊症、多嚢胞性卵巣症候群、卵巣機能不全、早期卵巣機能不全、卵巣がん、乳がん、子宮体がん、前立腺がん、男性不妊症、肝疾患、肝硬変、非アルコール性脂肪肝炎、肝がん、アテローム血栓性脳梗塞、アテローム性動脈硬化症、内頸動脈狭窄症、大動脈弁狭窄症、大動脈弁閉鎖不全症、心血管疾患、狭心症、うっ血性心不全、急性心不全、慢性心不全、虚血性心疾患、拡張型心筋症、心サルコイドーシス、高血圧、肺動脈性肺高血圧症、肺性心、心筋炎、血管狭窄心線維症、心筋梗塞後心線維症、心筋梗塞後左心室肥大、関節リウマチ、生活習慣病、脂質異常症、アルツハイマー病、血管性認知症、脳梗塞、脳腫瘍、脳血管障害、ぶどう膜炎、内分泌疾患、骨粗しょう症、舌がん、口腔がん、咽頭がん、食道がん、胃がん、大腸がん、直腸がん、膵臓がんから選択される疾患の診断、治療、または予防に用いるための、［Ａ８］に記載の医薬組成物。【００２２】
［Ａ１０］糖尿病、耐糖能異常、網膜症、腎症、糖尿病に伴う合併症、末梢神経障害、下肢壊疽、動脈硬化、血栓症、非アルコール性脂肪性肝疾患、非アルコール性脂肪肝炎、がん、不妊症、多嚢胞性卵巣症候群、卵巣機能障害、中枢神経障害、およびアルツハイマー病
を含む神経変性疾患から選択される疾患の診断、治療、または予防に用いるための、［Ａ８］に記載の医薬組成物。【００２３】
［Ａ１１］疾患が、メラノーマ、肺がん、および肝臓がんから選択されるがんである、［Ａ８］に記載の医薬組成物。【００２４】
［Ａ１２］［Ａ１］〜［Ａ７］のいずれかに記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合断片をコードする、核酸。【００２５】
［Ａ１３］［Ａ１２］に記載の核酸を含む発現ベクター。【００２６】
［Ａ１４］［Ａ１３］の発現ベクターを含む宿主細胞。【００２７】
［Ａ１５］式（Ｉ）または（ＩＩ）：【００２８】
【化３】
2020045646.tif 000005
［式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４は、それぞれ独立に、水素原子、保護基、およびアミノ酸残基数１〜１０００のペプチド基から選択され、
Ｘ１およびＸ２は、−Ｏ−、または−ＮＨ−を表し；
Ｙ１およびＹ２は、水素原子、保護基、または基：【００２９】
【化４】
2020045646.tif 000006
を表し；
Ｒ５およびＲ６は、それぞれ独立に、水素原子、保護基、およびアミノ酸残基数１〜１０００のペプチド基から選択される］
の化合物、そのカチオンラジカル、またはそのジカチオン、またはその塩。【００３０】
［Ａ１６］１）α位のアミノ基が保護されたリシンおよびグリセルアルデヒドを反応させて、反応混合物を得ること；
２）反応混合物を分画し、式（Ｉａ）、（Ｉｂ）、（ＩＩａ）、または（ＩＩｂ）：【００３１】
【化５】
2020045646.tif 000007
［式中、Ｒ１、Ｒ３、およびＲ６は、保護基である］
で表される化合物を含む画分を得ること
３）当該画分を用いて動物への免疫を行い、当該画分を抗原とする抗体を得ること
を含む、抗体の製造方法。【００３２】
［Ｂ１］式（ＸＩ）または（ＸＩＩ）：
【化６】
2020045646.tif 000008
［式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４は、それぞれ独立に、水素原子、保護基、およびアミノ酸残基数１〜１０００のペプチド基から選択され、
Ｑ１は、水素原子、または基−ＣＨ２−Ｘ１−Ｙ１を表し；
Ｑ２は、水素原子、または基−ＣＨ２−Ｘ２−Ｙ２を表し；
Ｘ１およびＸ２は、−Ｏ−、または−ＮＨ−を表し；
Ｙ１およびＹ２は、水素原子、保護基、または基：【００３３】
【化７】
2020045646.tif 000009
を表し；
Ｒ５およびＲ６は、それぞれ独立に、水素原子、保護基、およびアミノ酸残基数１〜１０００のペプチド基から選択される］
の化合物、そのカチオンラジカル、またはそのジカチオンと結合するモノクローナル抗体またはその抗原結合断片。【００３４】
［Ｂ２］式（Ｉ）または（ＩＩ）：【００３５】
【化８】
2020045646.tif 000010
［式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４は、それぞれ独立に、水素原子、保護基、およびアミノ酸残基数１〜１０００のペプチド基から選択され、
Ｘ１およびＸ２は、−Ｏ−、または−ＮＨ−を表し；
Ｙ１およびＹ２は、水素原子、保護基、または基：【００３６】
【化９】
2020045646.tif 000011
を表し；
Ｒ５およびＲ６は、それぞれ独立に、水素原子、保護基、およびアミノ酸残基数１〜１０００のペプチド基から選択される］
の化合物、そのカチオンラジカル、またはそのジカチオンと結合する、［Ｂ１］に記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合断片。【００３７】
［Ｂ３］（１）重鎖可変領域の相補性決定領域（ＶＨ  ＣＤＲ１、ＶＨ  ＣＤＲ２、およびＶＨ  ＣＤＲ３）または軽鎖可変領域の相補性決定領域（ＶＬ  ＣＤＲ１、ＶＬ  ＣＤＲ２、およびＶＬ  ＣＤＲ３）のアミノ酸配列が、
（１−１Ｈ）
（ａ）ＶＨ  ＣＤＲ１：配列番号：１に示すアミノ酸配列、またはそれと実質的に同一のアミノ酸配列；
（ｂ）ＶＨ  ＣＤＲ２：配列番号：２に示すアミノ酸配列、またはそれと実質的に同一のアミノ酸配列；および
（ｃ）ＶＨ  ＣＤＲ３：配列番号：３に示すアミノ酸配列、またはそれと実質的に同一のアミノ酸配列；
（１−１Ｌ）
（ｄ）ＶＬ  ＣＤＲ１：配列番号：５に示すアミノ酸配列、またはそれと実質的に同一のアミノ酸配列；
（ｅ）ＶＬ  ＣＤＲ２：配列番号：６に示すアミノ酸配列、またはそれと実質的に同一のアミノ酸配列；および
（ｆ）ＶＬ  ＣＤＲ３：配列番号：７に示すアミノ酸配列、またはそれと実質的に同一のアミノ酸配列；  
（１−２Ｈ）
（ｇ）ＶＨ  ＣＤＲ１：配列番号：１５に示すアミノ酸配列、またはそれと実質的に同一のアミノ酸配列；
（ｈ）ＶＨ  ＣＤＲ２：配列番号：１６に示すアミノ酸配列、またはそれと実質的に同一のアミノ酸配列；および
（ｉ）ＶＨ  ＣＤＲ３：配列番号：１７に示すアミノ酸配列、またはそれと実質的に同一のアミノ酸配列；または
（１−２Ｌ）
（ｊ）ＶＬ  ＣＤＲ１：配列番号：１９に示すアミノ酸配列、またはそれと実質的に同一のアミノ酸配列；
（ｋ）ＶＬ  ＣＤＲ２：配列番号：２０に示すアミノ酸配列、またはそれと実質的に同一のアミノ酸配列；
（ｌ）ＶＬ  ＣＤＲ３：配列番号：２１に示すアミノ酸配列、またはそれと実質的に同一のアミノ酸配列；  
を含む、モノクローナル抗体またはその抗原結合断片；
または
（２）グリセルアルデヒド由来ＡＧＥｓまたはグリコールアルデヒド由来ＡＧＥｓのエピトープとの結合について、前記（１）のモノクローナル抗体またはその抗原結合断片と交差競合するモノクローナル抗体またはその抗原結合断片であり、
グリセルアルデヒド由来ＡＧＥｓまたはグリコールアルデヒド由来ＡＧＥｓに含まれるエピトープと結合する、モノクローナル抗体またはその抗原結合断片。【００３８】
［Ｂ４］（１）重鎖可変領域の相補性決定領域（ＶＨ  ＣＤＲ１、ＶＨ  ＣＤＲ２、およびＶＨ  ＣＤＲ３）および軽鎖可変領域の相補性決定領域（ＶＬ  ＣＤＲ１、ＶＬ  ＣＤＲ２、およびＶＬ  ＣＤＲ３）のアミノ酸配列が、
（１−１）
（ａ）ＶＨ  ＣＤＲ１：配列番号：１に示すアミノ酸配列、またはそれと実質的に同一のアミノ酸配列；
（ｂ）ＶＨ  ＣＤＲ２：配列番号：２に示すアミノ酸配列、またはそれと実質的に同一のアミノ酸配列；
（ｃ）ＶＨ  ＣＤＲ３：配列番号：３に示すアミノ酸配列、またはそれと実質的に同一のアミノ酸配列；
（ｄ）ＶＬ  ＣＤＲ１：配列番号：５に示すアミノ酸配列、またはそれと実質的に同一のアミノ酸配列；
（ｅ）ＶＬ  ＣＤＲ２：配列番号：６に示すアミノ酸配列、またはそれと実質的に同一のアミノ酸配列；および
（ｆ）ＶＬ  ＣＤＲ３：配列番号：７に示すアミノ酸配列、またはそれと実質的に同一のアミノ酸配列；もしくは
（１−２）
（ｇ）ＶＨ  ＣＤＲ１：配列番号：１５に示すアミノ酸配列、またはそれと実質的に同一のアミノ酸配列；
（ｈ）ＶＨ  ＣＤＲ２：配列番号：１６に示すアミノ酸配列、またはそれと実質的に同一のアミノ酸配列；
（ｉ）ＶＨ  ＣＤＲ３：配列番号：１７に示すアミノ酸配列、またはそれと実質的に同一のアミノ酸配列；
（ｊ）ＶＬ  ＣＤＲ１：配列番号：１９に示すアミノ酸配列、またはそれと実質的に同一のアミノ酸配列；
（ｋ）ＶＬ  ＣＤＲ２：配列番号：２０に示すアミノ酸配列、またはそれと実質的に同一のアミノ酸配列；
（ｌ）ＶＬ  ＣＤＲ３：配列番号：２１に示すアミノ酸配列、またはそれと実質的に同一のアミノ酸配列；  
を含む、モノクローナル抗体またはその抗原結合断片；
または
（２）グリセルアルデヒド由来ＡＧＥｓまたはグリコールアルデヒド由来ＡＧＥｓのエピトープとの結合について、前記（１）のモノクローナル抗体またはその抗原結合断片と交差競合するモノクローナル抗体またはその抗原結合断片であり、
グリセルアルデヒド由来ＡＧＥｓまたはグリコールアルデヒド由来ＡＧＥｓに含まれるエピトープと結合する、［Ｂ１］〜［Ｂ３］のいずれかに記載の、モノクローナル抗体またはその抗原結合断片。【００３９】
［Ｂ５］（１）重鎖可変領域および軽鎖可変領域のアミノ酸配列が、
配列番号：４のアミノ酸配列またはそれと実質的に同一のアミノ酸配列、および／または配列番号：８のアミノ酸配列またはそれと実質的に同一のアミノ酸配列；もしくは
配列番号：１８のアミノ酸配列またはそれと実質的に同一のアミノ酸配列、および／または配列番号：２２のアミノ酸配列またはそれと実質的に同一のアミノ酸配列；
または
（２）グリセルアルデヒド由来ＡＧＥｓまたはグリコールアルデヒド由来ＡＧＥｓのエピトープとの結合について、前記（１）に記載の抗体またはその抗原結合断片と交差競合する抗体またはその抗原結合断片であり、
グリセルアルデヒド由来ＡＧＥｓまたはグリコールアルデヒド由来ＡＧＥｓに含まれるエピトープと結合する、［Ｂ１］〜［Ｂ４］のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合断片。【００４０】
［Ｂ６］グリセルアルデヒド由来ＡＧＥｓに含まれるエピトープと結合する、［Ｂ１］〜［Ｂ５］のいずれかに記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合断片。【００４１】
［Ｂ７］完全長抗体、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、ｄｓＦｖ、ダイアボディ、またはｓｃ（Ｆｖ）２である、［Ｂ１］〜［Ｂ６］のいずれかに記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合断片。【００４２】
［Ｂ８］マウス抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、キメラ抗体、またはその抗原結合断片である、［Ｂ１］〜［Ｂ７］のいずれかに記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合断片。【００４３】
［Ｂ９］１×１０−５Ｍ以下の解離定数（Ｋｄ値）でグリセルアルデヒド由来ＡＧＥｓまたはグリコールアルデヒド由来ＡＧＥｓのエピトープと結合する、［Ｂ１］〜［Ｂ８］のいずれかに記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合断片。【００４４】
［Ｂ１０］［Ｂ１］〜［Ｂ９］のいずれかに記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合断片を含む医薬組成物。【００４５】
［Ｂ１１］肥満、糖尿病、糖尿病網膜症、糖尿病白内障、糖尿病神経障害、糖尿病心筋症、糖尿病血管合併症、糖尿病性腎症、糖尿病性腎臓疾患、糖尿病足病変、糖尿病ケトアシドーシス、歯周病、加齢黄斑変性症、肺線維症、特発性肺線維症、細気管支周囲線維症、間質性肺疾患、肺がん、がん線維性肺疾患、慢性閉塞性肺疾患、急性下肢動脈塞栓症、末梢動脈疾患、末梢気道疾患、肺気腫、腎盂腎炎、糸球体硬化症、糸球体腎炎、メサンギウム増殖糸球体腎炎、糖尿病性ネフロパシー、腎性全身性線維症、慢性腎臓病、特発性後腹膜線維症、腎疾患、強皮症、腎間質線維症、女性不妊症、多嚢胞性卵巣症候群、卵巣機能不全、早期卵巣機能不全、卵巣がん、乳がん、子宮体がん、前立腺がん、男性不妊症、肝疾患、肝硬変、非アルコール性脂肪肝炎、肝がん、アテローム血栓性脳梗塞、アテローム性動脈硬化症、内頸動脈狭窄症、大動脈弁狭窄症、大動脈弁閉鎖不全症、心血管疾患、狭心症、うっ血性心不全、急性心不全、慢性心不全、虚血性心疾患、拡張型心筋症、心サルコイドーシス、高血圧、肺動脈性肺高血圧症、肺性心、心筋炎、血管狭窄心線維症、心筋梗塞後心線維症、心筋梗塞後左心室肥大、関節リウマチ、生活習慣病、脂質異常症、アルツハイマー病、血管性認知症、脳梗塞、脳腫瘍、脳血管障害、ぶどう膜炎、内分泌疾患、骨粗しょう症、舌がん、口腔がん、咽頭がん、食道がん、胃がん、大腸がん、直腸がん、膵臓がん、網膜色素変性症、レーバー先天性黒内障、シュタルガルト症、アッシャー症候群、コロイデレミア、桿体錐体ジストロフィー、錐体ジストロフィー、進行性網膜萎縮、黄斑ジストロフィー症、脈絡膜硬化症、全脈絡膜萎縮症、類嚢胞黄斑浮腫、ブドウ膜炎、網膜剥離、黄斑円孔、黄斑部毛細血管拡張症、緑内障、視神経症、虚血性網膜疾患、未熟児網膜症、網膜血管閉塞症、および網膜細動脈瘤から選択される疾患の診断、治療、または予防に用いるための、［Ｂ１０］に記載の医薬組成物。【００４６】
［Ｂ１２］糖尿病、耐糖能異常、網膜症、腎症、糖尿病に伴う合併症、末梢神経障害、下肢壊疽、動脈硬化、血栓症、非アルコール性脂肪性肝疾患、非アルコール性脂肪肝炎、がん、不妊症、多嚢胞性卵巣症候群、卵巣機能障害、中枢神経障害、およびアルツハイマー病を含む神経変性疾患から選択される疾患の診断、治療、または予防に用いるための、［Ｂ１０］に記載の医薬組成物。【００４７】
［Ｂ１３］疾患が、メラノーマ、肺がん、および肝臓がんから選択されるがんである、［Ｂ１２］に記載の医薬組成物。【００４８】
［Ｂ１４］眼疾患の診断、治療、または予防に用いるための、［Ｂ１０］に記載の医薬組成物。【００４９】
［Ｂ１５］眼疾患が、糖尿病網膜症、糖尿病白内障、網膜色素変性症、糖尿病黄斑浮腫、レーバー先天性黒内障、シュタルガルト症、アッシャー症候群、コロイデレミア、桿体錐体ジストロフィー、錐体ジストロフィー、進行性網膜萎縮、加齢黄斑変性症、黄斑ジストロフィー症、脈絡膜硬化症、全脈絡膜萎縮症、類嚢胞黄斑浮腫、ブドウ膜炎、網膜剥離、黄斑円孔、黄斑部毛細血管拡張症、緑内障、視神経症、虚血性網膜疾患、未熟児網膜症、網膜血管閉塞症、および網膜細動脈瘤から選択される、［Ｂ１４］に記載の医薬組成物。【００５０】
［Ｂ１６］［Ｂ１］〜［Ｂ９］のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合断片をコードする、核酸。【００５１】
［Ｂ１７］［Ｂ１６］に記載の核酸を含む発現ベクター。【００５２】
［Ｂ１８］［Ｂ１７］の発現ベクターを含む宿主細胞。【００５３】
［Ｂ１９］式（Ｉ）または（ＩＩ）：
【化１０】
2020045646.tif 000012
［式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４は、それぞれ独立に、水素原子、保護基、および
アミノ酸残基数１〜１０００のペプチド基から選択され、
Ｘ１およびＸ２は、−Ｏ−、または−ＮＨ−を表し；
Ｙ１およびＹ２は、水素原子、保護基、または基：【００５４】
【化１１】
2020045646.tif 000013
を表し；
Ｒ５およびＲ６は、それぞれ独立に、水素原子、保護基、およびアミノ酸残基数１〜１０００のペプチド基から選択される］
の化合物、そのカチオンラジカル、またはそのジカチオン、またはその塩。【００５５】
［Ｂ２０］１）α位のアミノ基が保護されたリシンおよびグリセルアルデヒドを反応させて、反応混合物を得ること；
２）反応混合物を分画し、式（Ｉａ）、（Ｉｂ）、（ＩＩａ）、または（ＩＩｂ）：【００５６】
【化１２】
2020045646.tif 000014
［式中、Ｒ１、Ｒ３、およびＲ６は、保護基である］
で表される化合物を含む画分を得ること
３）当該画分を用いて動物への免疫を行い、当該画分を抗原とする抗体を得ること
を含む、抗体の製造方法。
【発明の効果】
【００５７】
ＡＧＥｓの中でも、グリセルアルデヒド由来のＡＧＥｓ（Ｇｌｙｃｅｒ−ＡＧＥｓ）は、糖尿病、特に糖尿病血管合併症、糖尿病網膜症、糖尿病性腎症、および糖尿病大血管症などに関わることが報告されている。さらに、Ｇｌｙｃｅｒ−ＡＧＥｓは高血圧症、アルツハイマー病などの認知症、がん（例えば肝臓がん、膵臓がん、子宮がん、結腸がん、直腸がん、乳がん、膀胱がん、悪性黒色腫、および肺がん）、非アルコール性脂肪肝炎（ＮＡＳＨ）、不妊症などに慣用することが報告されている。したがって、Ｇｌｙｃｅｒ−ＡＧＥｓはこれらの疾患の診断のためのバイオマーカーとして使用することができ、本発明の抗体はバイオマーカーの検出において使用することができる。【００５８】
さらに本発明にかかる抗体は、生体におけるＧｌｙｃｅｒ−ＡＧＥｓの効果を中和するために使用することができ、疾患の治療などにおいても使用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００５９】
【図１】図１は、ＥＬＩＳＡ直接法による、新規モノクローナル抗体（ＳＪ−５）と抗グリセルアルデヒド由来ＡＧＥｓポリクローナル抗体の反応性比較試験の結果を示すグラフである。
【図２】図２は、ＥＬＩＳＡ直接法による、抗Ｇｌｙｃｅｒ−ＡＧＥｓポリクローナル抗体の反応性確認試験の結果を示すグラフである。
【図３】図３は、ＥＬＩＳＡ直接法による、ＰＯＤ標識化ＳＪ−５抗体の反応性確認試験の結果を示すグラフである。
【図４】図４は、ＥＬＩＳＡ競合法によるＳＪ−５の特異性の確認試験において、固相化抗原としてＧＡＬ１３−ＢＳＡを用いたときの結果を示す図である。
【図５】図５は、ＥＬＩＳＡ競合法によるＳＪ−５抗体の特異性の確認試験において、固相化抗原としてＧｌｙｃｅｒ−ＡＧＥｓ−ＢＳＡを用いたときの結果を示す図である。
【図６】図６は、Ｇｌｙｃｅｒ−ＡＧＥｓ−Ｚ−ＬｙｓのＨＰＬＣによる分析結果を示す図である（ダイオードアレイ検出（２６０ｎｍ））。
【図７】図７は、Ｇｌｙｃｅｒ−ＡＧＥｓ−Ｚ−ＬｙｓのＨＰＬＣによる分析結果を示す図である（蛍光検出（Ｅｘ３５０ｎｍ、Ｅｍ４５０ｎｍ））。
【図８】図８は、ＧＡＬ１３の質量分析の結果を示すチャートである。
【図９】図９は、ＧＡＬ１３について電子スピン共鳴（ＥＳＲ）を測定した結果を示す図である。
【図１０】図１０は、ＧＡＬ１３を含むサンプルの３，３’−ジアミノベンジジン（ＤＡＢ）を用いた酸化活性の確認試験の結果を示すグラフである。
【図１１】図１１は、競合ＥＬＩＳＡによるＳＪ−５抗体とＧＬＡＰの反応性評価試験の結果を示すグラフである。
【図１２】図１２は、新規なモノクローナル抗体であるＳＪ−５の重鎖可変領域と軽鎖可変領域のアミノ酸配列を示す図である。下線を付した箇所はＣＤＲに該当する。
【図１３】図１３は実施例１４の内皮細胞管腔形成抑制試験において８時間培養したＨＵＶＥＣの形態を示す写真である。
【図１４】図１４は実施例１５のＳＪ−５を用いたＧｌｙｃｅｒ−ＡＧＥｓ−ＢＳＡによる内皮間葉転換阻害試験におけるα−ＳＭＡの発現量を示すグラフである。
【図１５】図１５は実施例１５のＳＪ−５を用いたＧｌｙｃｅｒ−ＡＧＥｓ−ＢＳＡによる内皮間葉転換阻害試験におけるＣＤ３１の発現量を示すグラフである。
【図１６】図１６は実施例１６で調製したＧｌｙｃｅｒ−ＡＧＥｓ−Ｚ−Ｌｙｓの反応液のＬＣ／ＭＳの分析結果を示す（ダイオードアレイ検出（２６０ｎｍ））。
【図１７】図１７は実施例１６で調製したＨＰＬＣ分取時のＧｌｙｃｅｒ−ＡＧＥｓ−Ｚ−ＬｙｓのＵＶスペクトルを示す。
【図１８】図１８は実施例１６で調製したＨＰＬＣ分取時のＧｌｙｃｅｒ−ＡＧＥｓ−Ｚ−ＬｙｓのＭＳスペクトルを示す。
【図１９】図１９は、実施例１８の競合ＥＬＩＳＡによる新規モノクローナル抗体とＧＡＬ６９１、Ｌｙｓ−ヒドロキシ−トリオシジンの反応性評価の結果を示すグラフである。
【図２０Ａ】図２０Ａは、実施例１９で行ったＧＡＬ６９１のＥＳＲスペクトルの測定結果を示す図である。
【図２０Ｂ】図２０Ｂは、亜硫酸ナトリウムを添加したＧＡＬ６９１のＥＳＲスペクトルの測定結果を示す図である。
【図２０Ｃ】図２０Ｃは、ＧＬＡＰのＥＳＲスペクトルの測定結果を示す図である。
【図２０Ｄ】図２０Ｄは、Ｌｙｓ−ヒドロキシ−トリオシジンのＥＳＲスペクトルの測定結果を示す図である。
【図２１】図２１は、ＧＡＬ６９１のＤＡＢに対する酸化活性に関して、白色光照射の影響を確認するための試験結果を示すグラフである。
【図２２】図２２は、実施例２１で行ったＧＡＬ６９１の光増感作用による一重項酸素の生成を確認するための試験の結果を示すグラフである。
【図２３】図２３は、実施例２２で行ったＧＡＬ６９１の光増感作用による一重項酸素の生成を確認するための試験の結果を示すグラフである。
【図２４】図２４は、実施例２３で行ったＧＡＬ６９１の光増感作用によるスーパーオキシドアニオンの生成を確認するための試験の結果を示すグラフである。
【図２５】図２５は、モノクローナル抗体ＰＢ−１の可変領域のアミノ酸配列を示す図である。下線を付した箇所はＣＤＲ配列を示す。
【図２６Ａ】図２６Ａは、固相化抗原としてＡ−ｐｅａｋ−ＢＳＡを用いたときのＰＢ−１抗体の特異性を確認する試験の結果を示すグラフである。
【図２６Ｂ】図２６Ｂは、固相化抗原としてＧｌｙｃｅｒ−ＡＧＥｓ−ＢＳＡを用いたときのＰＢ−１抗体の特異性を確認する試験の結果を示すグラフである。
【図２７】図２７は、競合ＥＬＩＳＡによる新規モノクローナル抗体ＰＢ−１の公知のＡＧＥｓとの反応性評価試験の結果を示すグラフである。
【図２８】図２８は、Ａ−ｐｅａｋ−ＢＳＡによるＤＡＢ酸化活性のＰＢ−１抗体による抑制効果を確認するための試験の結果を示すグラフである。
【図２９】図２９は、ＳＪ−５抗体と抗ＧＡ−ピリジンモノクローナル抗体のＰＢ−１抗体に対する交差競合を確認する試験の結果を示すグラフである。
【図３０】図３０は、網膜色素上皮細胞（ＡＲＰＥ−１９細胞）のタイトジャンクション崩壊抑制試験の結果を示すグラフであり、細胞間タイトジャンクションの形成を確認するためにウェル底面のインピーダンスの測定を行った結果を示すグラフである。
【図３１】図３１は、実施例３５の内皮細胞管腔形成抑制試験において８時間培養したＨＵＶＥＣの形態を示す写真である。
【図３２】図３２は、ＰＢ−１抗体を用いて染色したマウスの網膜組織を共焦点レーザー顕微鏡にて観察した結果を示す写真である。
【図３３】図３３は、実施例３７において作製したＰＢ−１抗体カラムを用いてサンプル精製を行い、各画分を電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）にて解析した結果を示す図である。
【図３４】図３４は、実施例３７において作製したＰＢ−１抗体カラムにて精製したタンパク質を、電気泳動し（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）、ＰＶＤＦ膜に電気転写してウェスタンブロッティングを行った結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００６０】
本発明の１つの側面において、本発明の抗体は単離された抗体である。単離された抗体は、天然に存在して何ら外的操作（人為的操作）が施されていない抗体、即ちある個体の体内で産生され、そこに留まっている状態の抗体は含まれない。本発明の抗体は典型的にはモノクローナル抗体、またはその抗原結合断片である。
【００６１】
本発明の１つの態様において、式（ＸＩ）または（ＸＩＩ）で示される化合物、そのカチオンラジカル、そのジカチオン、またはその塩に結合する抗体が提供される：
【００６２】
【化１３】
2020045646.tif 000015
［式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４は、それぞれ独立に、水素原子、保護基、およびアミノ酸残基数１〜１０００のペプチド基から選択され、
Ｑ１は、水素原子、または基−ＣＨ２−Ｘ１−Ｙ１を表し；
Ｑ２は、水素原子、または基−ＣＨ２−Ｘ２−Ｙ２を表し；
Ｘ１およびＸ２は、−Ｏ−、または−ＮＨ−を表し；
Ｙ１およびＹ２は、水素原子、保護基、または基：
【００６３】
【化１４】
2020045646.tif 000016
を表し；
Ｒ５およびＲ６は、それぞれ独立に、水素原子、保護基、およびアミノ酸残基数１〜１０００のペプチド基から選択される］。
【００６４】
本発明の別の態様において、式（Ｉ）または（ＩＩ）で示される化合物、そのカチオンラジカル、そのジカチオン、またはその塩に結合する抗体が提供される。
【００６５】
【化１５】
2020045646.tif 000017
［式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４は、それぞれ独立に、水素原子、保護基、およびアミノ酸残基数１〜１０００のペプチド基から選択され、
Ｘ１およびＸ２は、−Ｏ−、または−ＮＨ−を表し；
Ｙ１およびＹ２は、水素原子、保護基、または基：
【００６６】
【化１６】
2020045646.tif 000018
を表し；
Ｒ５およびＲ６は、それぞれ独立に、水素原子、保護基、およびアミノ酸残基数１〜１０００のペプチド基から選択される］
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５およびＲ６が保護基の場合、Ｒ１、Ｒ３およびＲ６はアミノ基の保護基であり、Ｒ２、Ｒ４およびＲ５はヒドロキシ基の保護基である。Ｘ１またはＸ２が−Ｏ−の場合、Ｙ１またはＹ２はヒドロキシ基の保護基であってもよく、Ｘ１またはＸ２が−ＮＨ−の場合、Ｙ１またはＹ２はアミノ基の保護基であってもよい。
【００６７】
ヒドロキシの保護基の例としては、Ｃ１−６アルキル、Ｃ１−６アルコキシＣ１−６アルキル、アリールＣ１−６アルキル、ヘテロアリールＣ１−６アルキル、（（アミノＣ１−６アルキル）カルボニルオキシ）Ｃ１−６アルキル、不飽和ヘテロ環カルボニルオキシＣ１−６アルキル、アリールジ（Ｃ１−６アルキル）シリル、トリ（Ｃ１−６アルキル）シリルなどが挙げられる。好ましいヒドロキシの保護基としては、Ｃ１−６アルキルなどが挙げられる。
【００６８】
アミノの保護基の例には、Ｃ１−６アルキルカルボニル、アリールＣ１−６アルキルカルボニル、アリールカルボニル、ヘテロアリールカルボニル、Ｃ１−６アルコキシカルボニル、Ｃ１−６アルキルアミノカルボニル、ジ（Ｃ１−６アルキル）アミノカルボニル、アリールＣ１−６アルキル、ヘテロアリールＣ１−６アルキル、（アリールＣ１−６アルキル）アミノカルボニルなどが含まれる。好ましいアミノの保護基としては、ベンジルオキシカルボニル、ｔ−ブトキシカルボニル、９−フルオレニルメトキシカルボニルなどが挙げられる。また、アミノは保護されることにより、フタル酸イミド、コハク酸イミド、グルタル酸イミド、１−ピロリルなどの飽和または不飽和へテロ環基を形成していてもよい。
【００６９】
本明細書におけるペプチド基は、特に限定はされないが、例えばアミノ酸残基数１〜１００００、１〜５０００、１〜３０００、１〜２０００、１〜１０００、１〜５００、１〜１００のペプチド基を意味する。アミノ酸残基としては、天然アミノ酸から選択される。
【００７０】
式（Ｉ）または（ＩＩ）で表される化合物は、側鎖のアミノ基が保護されたリシンを用いて調製することができる。式（Ｉ）または（ＩＩ）の構造式で表される範囲は以下の式で表される化合物を包含する。
【００７１】
【化１７】
2020045646.tif 000019
【００７２】
【化１８】
2020045646.tif 000020
式中、Ｒ１、Ｒ３、およびＲ６はアミノ基の保護基である。例えば、上記式において、Ｒ１、Ｒ３、およびＲ６はベンジルオキシカルボニルである。
【００７３】
式（Ｉ）および式（ＩＩ）で表される化合物のカチオンラジカルは、以下の式（ＩＩＩ）および式（ＩＶ）で表される。
【００７４】
【化１９】
2020045646.tif 000021
式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｘ１、Ｘ２、Ｙ１、およびＹ２は、式（Ｉ）および式（ＩＩ）において定義されるとおりである。式（ＩＩＩ）および式（ＩＶ）は、以下の式で表されるカチオンラジカルを包含する。
【００７５】
【化２０】
2020045646.tif 000022
式（Ｉ）および式（ＩＩ）で表される化合物のジカチオンは、以下の式（Ｖ）および式（ＶＩ）で表される。
【００７６】
【化２１】
2020045646.tif 000023
式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｘ１、Ｘ２、Ｙ１、およびＹ２は、式（Ｉ）および式（ＩＩ）において定義されるとおりである。式（Ｖ）および式（ＶＩ）は、以下の式で表されるジカチオンを包含する。
【００７７】
【化２２】
2020045646.tif 000024
式（Ｉ）または（ＩＩ）で表される化合物の塩は、具体的には、当該化合物のカルボキシ基において形成される塩、およびペプチド基において形成される塩を包含する。
【００７８】
式（ＸＩ）および式（ＸＩＩ）で表される化合物のカチオンラジカルは、以下の式（ＸＩＩＩ）および式（ＸＩＶ）で表される。
【００７９】
【化２３】
2020045646.tif 000025
式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｑ１、およびＱ２は、式（ＸＩ）および式（ＸＩＩ）において定義されるとおりである。
【００８０】
式（ＸＩ）および式（ＸＩＩ）で表される化合物のジカチオンは、以下の式（ＸＶ）および式（ＸＶＩ）で表される。
【００８１】
【化２４】
2020045646.tif 000026
式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｑ１、およびＱ２は、式（ＸＩ）および式（ＸＩＩ）において定義されるとおりである。
【００８２】
式（ＸＩ）、または（ＸＩＩ）で表される化合物の塩は、具体的には、当該化合物のカルボキシ基において形成される塩、およびペプチド基において形成される塩を包含する。本明細書に記載のカチオンラジカル、およびジカチオンは、適切なアニオンを含んでいてもよい。
【００８３】
アミノ酸配列に関して使用する用語「実質的に同一」とは、比較される二つのアミノ酸配列間で配列上の相違が比較的小さく且つ配列上の相違が抗原に対する特異的結合性に関して実質的な影響を与えないことを意味する。実質的に同一なアミノ酸配列はアミノ酸配列の一部の改変を含んでいてもよく、例えば、アミノ酸配列を構成する１〜数個（例えば、１〜３個）のアミノ酸の欠失、置換、若しくは１〜数個（例えば、１〜３個）のアミノ酸の付加、挿入、又はこれらの組合せによりアミノ酸配列が改変されていてもよい。アミノ酸配列の変異の位置は特に限定されず、複数の位置で変異を生じていてもよい。アミノ酸配列において改変されるアミノ酸の数は示された全アミノ酸の例えば１０％以内に相当する数であり、好ましくは全アミノ酸の５％以内に相当する数である。さらに好ましくは全アミノ酸の１％以内に相当する数である。
【００８４】
アミノ酸を置換する場合には、置換するアミノ酸の側鎖と類似の生化学的特性を持った側鎖を有するアミノ酸と置換することができる（保存的アミノ酸置換）。１つの態様において、実質的に同一なアミノ酸配列は、例えば、１つもしくは複数の保存的置換を含んでいてもよい。保存的アミノ酸置換は当業者に知られており、例えば以下の表に示す例が挙げられる（例えば、ＷＯ２０１０／１４６５５０など）。
【００８５】
【表１】
2020045646.tif 000027
【００８６】
１つの態様において、８０％以上、８５％以上、９０％以上または９５％以上の同一性を有する２つのアミノ酸配列は、実質的に同一である。別の態様において、８０％以上、８５％以上、９０％以上または９５％以上の同一性を有する２つのアミノ酸配列は、置換が上記表に示す保存的置換か例示的置換に示されるアミノ酸を用いて置換されている場合は、実質的に同一である。さらに別の態様において、８０％以上、８５％以上、９０％以上または９５％以上の同一性を有する２つのアミノ酸配列は、置換が上記表の保存的置換に示されるアミノ酸を用いて置換されている場合は、実質的に同一である。
【００８７】
また、天然に存在するアミノ酸は、共通の側鎖特性に基づいて以下の群に分類される：
（１）非極性：ノルロイシン、Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、
（２）極性、荷電なし：Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、
（３）酸性（負荷電）：Ａｓｐ、Ｇｌｕ、
（４）塩基性（正荷電）：Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、
（５）鎖の配向に影響を与える残基：Ｇｌｙ、Ｐｒｏ、および
（６）芳香族：Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ。
【００８８】
１つの態様として、置換するアミノ酸と同じ群に属するアミノ酸を用いて置換してもよい。
【００８９】
１つの態様において、８０％以上、８５％以上、９０％以上または９５％以上の同一性を有する２つのアミノ酸配列は、実質的に同一である。別の態様において、８０％以上、８５％以上、９０％以上または９５％以上の同一性を有する２つのアミノ酸配列は、置換がアミノ酸と上記の群と同じ群に属するアミノ酸を用いて置換されている場合は、実質的に同一である。
【００９０】
二つのアミノ酸配列が実質的に同一であるか否かは、各アミノ酸配列を含む抗体（他の領域の配列は同一）の抗原に対する結合特異性を比較することによって判定できる。例えば、基準となる抗体の生理食塩水環境下での抗原に関する解離定数（Ｋｄ値）をＡとしたとき、比較対象の抗体のＫｄ値がＡ×１０−１〜Ａ×１０の範囲であれば実質的な同一性を認定できる。
【００９１】
本発明に係る核酸は、典型的には、単離された核酸であり、例えばｃＤＮＡ分子など遺伝子組み換え技術によって生産される核酸の場合の「単離された核酸」は好ましくは、細胞成分や培養液などを実質的に含まない状態の核酸をいう。同様に、化学合成によって生産される核酸の場合の「単離された核酸」は好ましくは、ｄＮＴＰなどの前駆体（原材料）や合成過程で使用される化学物質等を実質的に含まない状態の核酸をいう。
【００９２】
本明細書における用語「核酸」はＤＮＡ（ｃＤＮＡおよびゲノムＤＮＡを含む）、ＲＮＡ（ｍＲＮＡを含む）、ＤＮＡ類似体、およびＲＮＡ類似体を含む。本発明の核酸の形態は限定されず、即ち１本鎖および２本鎖のいずれであってもよい。好ましくは２本鎖ＤＮＡである。またコドンの縮重も考慮される。即ちタンパク質をコードする核酸の場合には、その発現産物として当該タンパク質が得られる限り任意の塩基配列を有していてよい。
【００９３】
ＡＧＥｓはタンパク質の糖化反応により形成される。グルコースやフルクトースなどの還元糖とタンパク質の遊離のアミノ基が非酵素的に反応してシッフ塩基からアマドリ化合物を生成し、その後不可逆的な脱水や縮合、酸化、還元などの反応を繰り返し、特有の蛍光を持つ黄褐色の複雑な物質ＡＧＥｓが生成するに至る。一方で、リシンなどのアミノ酸残基が糖と反応して得られる化合物がＡＧＥｓの構造として特定されており、蛍光を有さないピラリン、Ｎε−カルボキシメチルリシン（ＣＭＬ）、Ｎε−カルボキシエチルリシン（ＣＥＬ）、およびＮω−カルボキシメチルアルギニン（ＣＭＡ）などもＡＧＥｓとして知られている。その他、芳香環を有するアルグピリミジン、ペントシジン、クロスリン、ＧＡ−ピリジン、ベスペルリシン、ピロピリジンなどの化合物がＡＧＥｓとして特定されている。これらの化合物をアミノ酸残基として含有するペプチドやタンパク質もＡＧＥｓに含まれる。
【００９４】
ＡＧＥｓを形成するタンパク質糖化反応の基質としては、グルコース、フルクトースなどの還元糖の他に、生体内の糖代謝などにより生成する、グリセルアルデヒド、グリコールアルデヒド、メチルグリオキサール、グリオキサール、および３−デオキシグルコソンなどが想定されている。こうした還元糖およびアルデヒドを使用し、ＢＳＡなどのタンパク質と反応させてＡＧＥｓを形成する試みがされている。このようにして調製されるグリセルアルデヒド由来ＡＧＥｓ（Ｇｌｙｃｅｒ−ＡＧＥｓ）、グルコース由来ＡＧＥｓ（Ｇｌｕ−ＡＧＥｓ）、グリコールアルデヒド由来ＡＧＥｓ（Ｇｌｙｃｏｌ−ＡＧＥｓ）、フルクトース由来ＡＧＥｓ（Ｆｒｕ−ＡＧＥｓ）、メチルグリオキサール由来ＡＧＥｓ（ＭＧＯ−ＡＧＥｓ）、グリオキサール由来ＡＧＥｓ（ＧＯ−ＡＧＥｓ）、および３−デオキシグルコソン由来ＡＧＥｓ（３−ＤＧ−ＡＧＥｓ）などの各種ＡＧＥｓのうち、グリセルアルデヒド由来ＡＧＥｓは、糖尿病などの各種疾患に関与するとの報告がされており、グリセルアルデヒド由来ＡＧＥｓを抗原とするポリクローナル抗体を用いた分析方法により、Ｇｌｙｃｅｒ−ＡＧＥｓの血中濃度を測定する手法が知られている。
【００９５】
本発明のモノクローナル抗体は、α位のアミノ基が保護基（Ｚ基）で保護されたリシンとグリセルアルデヒドを反応させて得られるＡＧＥｓ（Ｇｌｙｃｅｒ−ＡＧＥｓ−Ｚ−Ｌｙｓ）を分画し、得られる特定の画分を抗原として作製することができる。また本発明のモノクローナル抗体は、グリセルアルデヒド由来ＡＧＥｓ（Ｇｌｙｃｅｒ−ＡＧＥｓ）およびグリコールアルデヒド由来ＡＧＥｓ（Ｇｌｙｃｏｌ−ＡＧＥｓ）に対して特異的に結合する特性を有している。
【００９６】
本発明の１つの側面において、グリセルアルデヒド由来ＡＧＥｓ（Ｇｌｙｃｅｒ−ＡＧＥｓ）および／またはグリコールアルデヒド由来ＡＧＥｓ（Ｇｌｙｃｏｌ−ＡＧＥｓ）のエピトープと結合し、グルコース由来ＡＧＥｓ（Ｇｌｕ−ＡＧＥｓ）、フルクトース由来ＡＧＥｓ（Ｆｒｕ−ＡＧＥｓ）、メチルグリオキサール由来ＡＧＥｓ（ＭＧＯ−ＡＧＥｓ）、グリオキサール由来ＡＧＥｓ（ＧＯ−ＡＧＥｓ）、および３−デオキシグルコソン由来ＡＧＥｓ（３−ＤＧ−ＡＧＥｓ）から選択される、１以上のＡＧＥｓとは結合しない、モノクローナル抗体またはその抗原結合断片が提供される。より具体的には、グリセルアルデヒド由来ＡＧＥｓ（Ｇｌｙｃｅｒ−ＡＧＥｓ）およびグリコールアルデヒド由来ＡＧＥｓ（Ｇｌｙｃｏｌ−ＡＧＥｓ）のエピトープと結合し、グルコース由来ＡＧＥｓ（Ｇｌｕ−ＡＧＥｓ）、フルクトース由来ＡＧＥｓ（Ｆｒｕ−ＡＧＥｓ）、メチルグリオキサール由来ＡＧＥｓ（ＭＧＯ−ＡＧＥｓ）、グリオキサール由来ＡＧＥｓ（ＧＯ−ＡＧＥｓ）、および３−デオキシグルコソン由来ＡＧＥｓ（３−ＤＧ−ＡＧＥｓ）とは結合しない、モノクローナル抗体またはその抗原結合断片が提供される。さらに具体的には、グリセルアルデヒド由来ＡＧＥｓおよびグリコールアルデヒド由来ＡＧＥｓのエピトープと結合し、グルコース由来ＡＧＥｓ（Ｇｌｕ−ＡＧＥｓ）、フルクトース由来ＡＧＥｓ（Ｆｒｕ−ＡＧＥｓ）、メチルグリオキサール由来ＡＧＥｓ（ＭＧＯ−ＡＧＥｓ）、グリオキサール由来ＡＧＥｓ（ＧＯ−ＡＧＥｓ）、３−デオキシグルコソン由来ＡＧＥｓ（３−ＤＧ−ＡＧＥｓ）、Ｎε−カルボキシメチルリシン（ＣＭＬ）、およびＮε−カルボキシエチルリシン（ＣＥＬ）とは結合しない、モノクローナル抗体またはその抗原結合断片が提供される。
【００９７】
本発明の１つの側面において、グリセルアルデヒド由来ＡＧＥｓまたはグリコールアルデヒド由来ＡＧＥｓのエピトープと結合するモノクローナル抗体またはその抗原結合断片が提供される。ここで、グリセルアルデヒド由来ＡＧＥｓおよびグリコールアルデヒド由来ＡＧＥｓは、グリセルアルデヒドまたはグリコールアルデヒドの存在下でＢＳＡ、マウス血清アルブミン（ＭＳＡ）などのタンパク質糖化反応により生じるＡＧＥｓであり、ＡＧＥｓを含むタンパク質である。本発明のモノクローナル抗体およびその抗原結合断片は、タンパク質糖化反応で生じた化学構造をエピトープとするという特徴を有している。好ましい態様において、本発明の抗体およびその抗原結合断片は、還元糖および糖代謝などで生じるアルデヒド、特にグルコース由来ＡＧＥｓ、フルクトース由来ＡＧＥｓ、メチルグリオキサール由来ＡＧＥｓ、グリオキサール由来ＡＧＥｓ、および３−デオキシグルコソン由来ＡＧＥｓとは結合しない。これらのＡＧＥｓも各還元糖またはアルデヒドをＢＳＡなどのタンパク質に添加してタンパク質糖化反応により調製される。抗体の結合特異性については、公知の手法、例えば競合ＥＬＩＳＡ法などにより特定することができる。
【００９８】
本発明は、グリセルアルデヒド由来ＡＧＥｓまたはグリコールアルデヒド由来ＡＧＥｓのエピトープと結合するモノクローナル抗体またはその抗原結合断片を提供し、該抗体または断片は、ＡＧＥｓが関与する疾患の治療、予防および／または診断に使用することができる。本発明で使用できる抗体は、本明細書に記載のとおり、複数の形態をとることができ、本発明は、本明細書で定義するとおり６個のＣＤＲのセット（それと実質的に同一のアミノ酸配列、例えば、１〜３個のアミノ酸残基の欠失、置換、付加を含む配列を含む）を含む抗体構造を提供する。
【００９９】
従来の抗体構造ユニットは、典型的には４量体を含む。各４量体は、典型的には、２つの同一のポリペプチチド鎖対からなり、各対は、１つの「軽」鎖（典型的には約２５ｋＤａの分子量を有する）と１つの「重」鎖（典型的には、約５０〜７０ｋＤａの分子量を有する）を有する。ヒト軽鎖は、κ軽鎖とλ軽鎖に分類される。重鎖は、μ、δ、γ、αまたはεに分類され、それぞれ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＡおよびＩｇＥとして抗体アイソタイプを定義する。ＩｇＧは複数のサブクラスを有し、サブクラスとしては、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、およびＩｇＧ４が挙げられるがこれらに限定されない。ＩｇＭは、ＩｇＭ１およびＩｇＭ２を含むサブクラスを有するが、これらに限定されない。従って、本明細書で使用される場合、「アイソタイプ」は、その定常領域の化学的および抗原的特徴により定義される免疫グロブリンの任意のサブクラスを意味する。既知のヒト免疫グロブリンアイソタイプは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＭ１、ＩｇＭ２、ＩｇＤおよびＩｇＥである。治療用抗体には、アイソタイプおよび／またはサブクラスのハイブリッドも含まれ得る。一つの態様において、本発明の抗体は、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＤまたはＩｇＥであり、好ましくはＩｇＧである。
【０１００】
各鎖には、抗原認識に主に関与する約１００〜１１０以上のアミノ酸の可変領域が含まれる。可変領域では３つのループが重鎖および軽鎖の各Ｖドメインについて集合しており、抗原結合部位を形成する。各ループは、相補性決定領域とも称され（以下、「ＣＤＲ」とも称する）、この部分におけるアミノ酸配列の変異（ｖａｒｉａｔｉｏｎ）が最も顕著である。「可変」とは、可変領域の特定のセグメントが、抗体の配列において広範囲に異なるという事実を意味する。可変領域内の可変性は、均一に分布していない。代わりに、Ｖ領域は、それぞれ９〜１５アミノ酸長以上の「超可変領域」と称される極度に可変性の短い領域により分離される１５〜３０アミノ酸のフレームワーク領域（ＦＲ）と称される比較的不変のストレッチからなる。
【０１０１】
各ＶＨおよびＶＬは、３つの超可変領域（「相補性決定領域」、「ＣＤＲ」）と４つのＦＲからなり、以下の順序でアミノ末端からカルボキシ末端へ配置される：ＦＲ１−ＣＤＲ１−ＦＲ２−ＣＤＲ２−ＦＲ３−ＣＤＲ３−ＦＲ４。
【０１０２】
超可変領域は、一般に、軽鎖可変領域における、アミノ酸残基２４〜３４付近（ＶＬ  ＣＤＲ１；「ＶＬ」は軽鎖の可変領域を意味する）、５０〜５６付近（ＶＬ  ＣＤＲ２）および８９〜９７付近（ＶＬ  ＣＤＲ３）と重鎖可変領域における、３１〜３５付近（ＶＨ  ＣＤＲ１；「ＶＨ」は重鎖の可変領域を意味する）、５０〜６５付近（ＶＨ  ＣＤＲ２）および９５〜１０２付近（ＶＨ  ＣＤＲ３）のアミノ酸残基；Kabat et al., SEQUENCES OF PROTEINS OF IMMUNOLOGICAL INTEREST,5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md.(1991)、および／または超可変性ループを形成するそれらの残基（例えば、軽鎖可変領域における残基２６〜３２（ＶＬ  ＣＤＲ１）、５０〜５２（ＶＬ  ＣＤＲ２）および９１〜９６（ＶＬ  ＣＤＲ３）と、重鎖可変領域における２６〜３２（ＶＨ  ＣＤＲ１）、５３〜５５（ＶＨ  ＣＤＲ２）および９６〜１０１（ＶＨ  ＣＤＲ３）；Chothia and Lesk (1987) J. Mol. Biol. 196:901-917）を包含する。
【０１０３】
本明細書にわたり、可変ドメインの残基（およそ、軽鎖可変領域の残基１〜１０７および重鎖可変領域の残基１〜１１３）について言及する場合には、Ｆｃ領域で使用されるＥＵナンバーシステムとともに、Ｋａｂａｔナンバリングシステムを通常用いる（例えば、Kabat et al., 上記（１９９１））。ＫａｂａｔナンバリングによるＣＤＲの特定は、一般に利用可能なソフト（例えば、abYsis (http://www.abysis.org/）を用いて特定することができる。
【０１０４】
ＣＤＲは、抗原結合の形成に寄与し、より詳細には、抗体のエピトープ結合部位の形成に寄与する。「エピトープ」とは、抗体分子の可変領域における特異的な抗原結合部位（パラトープ）と相互作用する決定基を意味する。エピトープは、アミノ酸や糖側鎖などの分子にグループ分けされ、通常、特異的な構造特性および特異的な電荷特性を有する。本明細書で示すとおり、本発明に係る「ＳＪ−５」または「ＰＢ−１」と本明細書で称する抗体は、上記式（ＸＩ）もしくは（ＸＩＩ）、または上記式（Ｉ）もしくは（ＩＩ）で示される構造の一部または全部をエピトープとして抗原に結合すると考えられている。
【０１０５】
各種ＡＧＥｓは、タンパク質（例えば、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、マウス血清アルブミン（ＭＳＡ），ウサギ血清アルブミン（ＲＳＡ）など）とアルデヒドまたは還元糖を混合し、反応をさせることにより調製することができる。例えば、グリセルアルデヒドをＢＳＡと反応させることにより、グリセルアルデヒド由来ＡＧＥｓ含有ＢＳＡを調製することができ、これをＡＧＥｓの標品として使用することができる。グリセルアルデヒド由来ＡＧＥｓにおいて、本発明の抗体は、例えば、グリセルアルデヒド由来ＡＧＥｓ含有ＢＳＡに対して結合性を有し、ＢＳＡに対して結合性を有さない抗体を選抜することにより、調製することができる。本発明の１つの側面において、本発明の抗体が結合するエピトープは、グリセルアルデヒドとタンパク質から非酵素的反応により生成する構造を含む。
【０１０６】
本発明の１つの側面において、以下の（１−１）および（１−２）で特定されるアミノ酸配列を重鎖可変領域および軽鎖可変領域の相補性決定領域に含む抗体、またはその抗原結合断片が提供される：
（１−１）
（ａ）ＶＨ  ＣＤＲ１：配列番号：１に示すアミノ酸配列、またはそれと実質的に同一のアミノ酸配列；
（ｂ）ＶＨ  ＣＤＲ２：配列番号：２に示すアミノ酸配列、またはそれと実質的に同一のアミノ酸配列；
（ｃ）ＶＨ  ＣＤＲ３：配列番号：３に示すアミノ酸配列、またはそれと実質的に同一のアミノ酸配列；
（ｄ）ＶＬ  ＣＤＲ１：配列番号：５に示すアミノ酸配列、またはそれと実質的に同一のアミノ酸配列；
（ｅ）ＶＬ  ＣＤＲ２：配列番号：６に示すアミノ酸配列、またはそれと実質的に同一のアミノ酸配列；および
（ｆ）ＶＬ  ＣＤＲ３：配列番号：７に示すアミノ酸配列、またはそれと実質的に同一のアミノ酸配列；もしくは
（１−２）
（ｇ）ＶＨ  ＣＤＲ１：配列番号：１５に示すアミノ酸配列、またはそれと実質的に同一のアミノ酸配列；
（ｈ）ＶＨ  ＣＤＲ２：配列番号：１６に示すアミノ酸配列、またはそれと実質的に同一のアミノ酸配列；
（ｉ）ＶＨ  ＣＤＲ３：配列番号：１７に示すアミノ酸配列、またはそれと実質的に同一のアミノ酸配列；
（ｊ）ＶＬ  ＣＤＲ１：配列番号：１９に示すアミノ酸配列、またはそれと実質的に同一のアミノ酸配列；
（ｋ）ＶＬ  ＣＤＲ２：配列番号：２０に示すアミノ酸配列、またはそれと実質的に同一のアミノ酸配列；
（ｌ）ＶＬ  ＣＤＲ３：配列番号：２１に示すアミノ酸配列、またはそれと実質的に同一のアミノ酸配列。
【０１０７】
本発明の１つの側面によれば、重鎖可変領域のアミノ酸配列が、配列番号：４のアミノ酸配列またはそれと実質的に同一のアミノ酸配列であり、軽鎖可変領域のアミノ酸配列が配列番号：８のアミノ酸配列またはそれと実質的に同一のアミノ酸配列であるモノクローナル抗体またはその抗原結合断片が提供される。その具体的な態様として、本発明は本明細書記載のモノクローナル抗体であるＳＪ−５を含む。本発明の別の側面によれば、重鎖可変領域のアミノ酸配列が、配列番号：１８のアミノ酸配列またはそれと実質的に同一のアミノ酸配列であり、軽鎖可変領域のアミノ酸配列が配列番号：２２のアミノ酸配列またはそれと実質的に同一のアミノ酸配列であるモノクローナル抗体またはその抗原結合断片が提供される。その具体的な態様として、本発明は本明細書記載のモノクローナル抗体であるＰＢ−１を含む。
【０１０８】
本発明の１つの側面によれば、これらの抗体はマウス由来の抗体であり、上記の配列番号で示される重鎖可変領域と軽鎖可変領域に加えて、マウス抗体の定常領域を有している。なお、上記の配列番号で示される重鎖可変領域または軽鎖可変領域と実質的に同一のアミノ酸配列の例として、Ｎ末端またはＣ末端に１つまたは２つのアミノ酸が付加された配列が挙げられる。例えば、上記の配列番号で示される重鎖可変領域と実質的に同一のアミノ酸配列として、Ｎ末端またはＣ末端に１または２のアミノ酸（例えば、天然型アミノ酸から選択されるアミノ酸）、より具体的にはＧｌｕおよびＧｌｎから選択される１つのアミノ酸が付加した配列が挙げられる。
【０１０９】
本発明の１つの側面によれば、上記の重鎖可変領域および軽鎖可変領域またはそれらのＣＤＲで特定される抗体またはその抗原結合断片を参照抗体として、グリセルアルデヒド由来ＡＧＥｓまたはグリコールアルデヒド由来ＡＧＥｓのエピトープとの結合について、参照抗体と交差競合する抗体またはその抗原結合断片が提供される。本発明の１つの態様において、モノクローナル抗体であるＳＪ−５を参照抗体として、グリセルアルデヒド由来ＡＧＥｓまたはグリコールアルデヒド由来ＡＧＥｓのエピトープとの結合について、参照抗体と交差競合する抗体またはその抗原結合断片が提供される。
【０１１０】
本発明の抗体は、例えばモノクローナル抗体であるＳＪ−５を参照抗体として、Ｇｌｙｃｅｒ−ＡＧＥｓまたはＧｌｙｃｏｌ−ＡＧＥｓとの標準的な結合アッセイを行うことにより交差競合に関する特性を確認することができる。交差競合の確認は、例えば、フローサイトメトリーや交差競合ＥＬＩＳＡアッセイにより確認することができる。
【０１１１】
本発明の１つの側面において、上記の抗体またはその抗原結合断片を含む、疾患の治療、予防または診断のための医薬組成物が提供される。対象疾患としては、Ｇｌｙｃｅｒ−ＡＧＥｓまたはＧｌｙｃｏｌ−ＡＧＥｓが関与する疾患であれば特に限定されず、例えば、糖尿病、糖尿病最小血管合併症（糖尿病網膜症、糖尿病性腎症、および糖尿病神経障害）、および糖尿病大血管症、高血圧症、アルツハイマー病などの認知症、がん（例えば肝臓がん、膵臓がん、子宮がん、結腸がん、直腸がん、乳がん、膀胱がん、悪性黒色腫、および肺がん）、非アルコール性脂肪肝炎（ＮＡＳＨ）、不妊症などが挙げられる。本発明の別の態様によれば、疾患は、糖尿病、耐糖能異常、網膜症、腎症、末梢神経障害、下肢壊疽、動脈硬化、血栓症、非アルコール性脂肪性肝疾患、非アルコール性脂肪肝炎、がん（例えば、メラノーマ、肺がん、および肝臓がんなど）、多嚢胞性卵巣症候群、卵巣機能障害、中枢神経障害、およびアルツハイマー病が挙げられる。
【０１１２】
本発明の１つの側面において、本発明の医薬組成物はＡＧＥｓにより促進される内皮間葉転換に起因する疾患の治療、予防または診断のために用いることができる。対象疾患としては、がん（例えば、卵巣がん、乳がん、子宮体がん、前立腺がん、舌がん、口腔がん、咽頭がん、食道がん、胃がん、大腸がん、直腸がん、膵臓がん、肺がん、肝がん、脳腫瘍など）、肥満、糖尿病、糖尿病性疾患（例えば、糖尿病網膜症、糖尿病白内障、糖尿病神経障害、糖尿病心筋症、糖尿病血管合併症、糖尿病性腎症、糖尿病性腎臓疾患、糖尿病足病変、糖尿病ケトアシドーシス、糖尿病性ネフロパシーなど）、歯周病、加齢黄斑変性症、肺疾患または呼吸器系疾患（例えば、肺線維症、特発性肺線維症、細気管支周囲線維症、間質性肺疾患、がん線維性肺疾患、慢性閉塞性肺疾患、末梢気道疾患、肺気腫など）、腎疾患（腎盂腎炎、糸球体硬化症、糸球体腎炎、メサンギウム増殖糸球体腎炎、腎性全身性線維症、腎間質線維症、慢性腎臓病など）、特発性後腹膜線維症、強皮症、女性不妊症、多嚢胞性卵巣症候群、卵巣機能不全、早期卵巣機能不全、男性不妊症、肝疾患（例えば、肝硬変、非アルコール性脂肪肝炎など）、心血管疾患（例えば、急性下肢動脈塞栓症、末梢動脈疾患、アテローム血栓性脳梗塞、アテローム性動脈硬化症、内頸動脈狭窄症、大動脈弁狭窄症、大動脈弁閉鎖不全症、狭心症、うっ血性心不全、急性心不全、慢性心不全、虚血性心疾患、拡張型心筋症、心サルコイドーシス、高血圧、肺動脈性肺高血圧症、肺性心、心筋炎、血管狭窄心線維症、心筋梗塞後心線維症、心筋梗塞後左心室肥大、脳梗塞、脳血管障害など）、関節リウマチ、生活習慣病、脂質異常症、アルツハイマー病、血管性認知症、ぶどう膜炎、内分泌疾患、骨粗しょう症が挙げられる。より具体的には、糖尿病網膜症、糖尿病性腎症、アテローム血栓性脳梗塞、アテローム性動脈硬化症、慢性腎臓病、慢性心不全、および虚血性心疾患が例示される。
【０１１３】
本発明の医薬組成物は眼疾患の診断、治療、および／または予防に使用することができる。一つの態様において、当該医薬組成物は、眼疾患の進行度の確認、または眼疾患発症リスクの推定のために用いることができる。別の態様において、当該医薬組成物は、発症した眼疾患の進行の防止する、または遅延させるための治療において用いることができ、例えば長期にわたり定期的に投与することができる。さらに別の態様において、当該医薬組成物は、疾患の発症リスクが高い対象に予防的に投与することができる。さらに別の態様において、当該医薬組成物は、発症した眼疾患において、疾患の発症部位を回復させるための治療に用いることができる。
【０１１４】
本発明の医薬組成物の使用に適した眼疾患としては、例えば、糖尿病網膜症、糖尿病白内障、網膜色素変性症、糖尿病黄斑浮腫、レーバー先天性黒内障、シュタルガルト症、アッシャー症候群、コロイデレミア、桿体錐体ジストロフィー、錐体ジストロフィー、進行性網膜萎縮、加齢黄斑変性症、黄斑ジストロフィー症、脈絡膜硬化症、全脈絡膜萎縮症、類嚢胞黄斑浮腫、ブドウ膜炎、網膜剥離、黄斑円孔、黄斑部毛細血管拡張症、緑内障、視神経症、虚血性網膜疾患、未熟児網膜症、網膜血管閉塞症、および網膜細動脈瘤が挙げられる。余地適した眼疾患としては、例えば、糖尿病網膜症、糖尿病黄斑浮腫、網膜色素変性症および加齢黄斑変性症が挙げられる。
【０１１５】
本発明の医薬組成物は、血管内皮細胞の管腔形成におけるＡＧＥｓによる抑制効果を低減または消失させ、さらにＡＧＥｓにより誘導される血管内皮細胞の内皮間葉転換を抑制または阻害する効果を有する。このような効果により管腔形成阻害による血管透過性上昇が低減または消失し、がんの転移が抑制される。したがって、一つの態様において、本発明の医薬組成物はがんの転移の予防または抑制のために使用することができる。
【０１１６】
本発明の１つに態様において、対象の組織（例えば血液）中に存在するＧｌｙｃｅｒ−ＡＧＥｓおよびＧｌｙｃｏｌ−ＡＧＥｓの量を本発明の抗体またはその抗原結合断片を用いて測定する工程を含む、疾患の診断方法が提供される。ここでの診断とは既に記載した通りである。本発明の別の態様において、試料（例えば、採血により得られた血液試料）中に存在するＧｌｙｃｅｒ−ＡＧＥｓおよびＧｌｙｃｏｌ−ＡＧＥｓの量を本発明の抗体またはその抗原結合断片を用いて測定する工程を含む、試料の分析方法が提供される。
【０１１７】
本発明の抗体の抗原結合断片は、例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、ｄｓＦｖ、ダイアボディ、またはｓｃ（Ｆｖ）２である。本発明の抗体は、例えば、マウス抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、またはキメラ抗体である。これらの抗体またはその抗原結合断片は、当業者に公知の方法により調製することができる。
【０１１８】
本発明の抗体の抗原結合断片は、例えば、１×１０−４Ｍ以下、具体的には１×１０−５Ｍ以下、より具体的には１×１０−６Ｍ以下、さらに具体的には１×１０−７Ｍ以下、好ましくは１×１０−８Ｍ以下の平衡解離定数Ｋｄでグリセルアルデヒド由来ＡＧＥｓまたはグリコールアルデヒド由来ＡＧＥｓのエピトープと結合する。抗体のＫｄ値は、当技術分野において十分に確立された方法を用いて決定することができる。抗体のＫｄ値を決定するための好ましい方法は、表面プラズモン共鳴を用いること、好ましくはＢｉａｃｏｒｅ（登録商標）システムのようなバイオセンサーシステムを用いることによる。
【０１１９】
本発明の１つの側面において、グリセルアルデヒド由来ＡＧＥｓまたはグリコールアルデヒド由来ＡＧＥｓのエピトープと結合するモノクローナル抗体またはその抗原結合断片の製造方法が提供される。該方法は、本発明の抗体をコードする核酸がトランスフェクトされた宿主細胞を培養する工程を含み、周知技術に基づいて様々な方法で実施され得る。
【０１２０】
本発明の１つの側面において、本発明の抗体をコードする核酸が提供される。このようなポリヌクレオチドは、例えば、重鎖および軽鎖それぞれの可変領域および定常領域の両方をコードする。ポリヌクレオチドはＲＮＡの形態であってもＤＮＡの形態であってもよい。ポリペプチドをコードするコーディング配列は、遺伝コードの冗長性または縮重を含んでいてもよい。
【０１２１】
いくつかの実施態様において、本発明の抗体をコードする１つ以上の核酸は、発現ベクターに組み込まれ、当該発現ベクターは、導入される宿主細胞の染色体外であるか、またはそのゲノム中にインテグレートされるよう設計され得る。発現ベクターは、任意数の適切な制御配列（転写および翻訳調節配列、プロモーター、リボソーム結合部位、エンハンサー、複製起点などが挙げられるが、これらに限定されない）または他の要素（選択遺伝子など）を含むことができ、これらは全て、当分野でよく知られるように操作可能に連結される。いくつかの場合、２つの核酸を用いて、それぞれを異なる発現ベクターに入れるか（例えば、第一の発現ベクターに重鎖をコードする核酸、第二の発現ベクターに軽鎖をコードする核酸）、あるいはそれらを同一の発現ベクターにいれることができる。制御配列の選択を含む、１つ以上の発現ベクターの設計は、宿主細胞の選択、所望するタンパク質の発現レベルなどの因子によって決まり得る。
【０１２２】
一般に、選択される宿主細胞に適した任意の方法（例えば、トランスフォーメーション、トランスフェクション、エレクトロポレーション、インフェクションなど）を用いて、１つ以上の核酸が１つ以上の発現調節要素に操作可能に連結されるように（例えば、ベクターにおいて、細胞でのプロセスにより作出される構築物において、宿主細胞のゲノムにインテグレートされて）、核酸および／または発現が適した宿主細胞に導入され、組換え宿主細胞が作出される。得られた組換え宿主細胞は、発現に適した条件下（例えば、インデューサーの存在下、適した非ヒト動物中、適した塩、増殖因子、抗生物質、栄養補助剤などを添加した培地など）で維持でき、それによりコードされた１つ以上のポリペプチドが製造される。いくつかの場合において、重鎖が１つの細胞で製造され、軽鎖が別の細胞で製造される。
【０１２３】
発現のための宿主として利用可能な哺乳動物細胞株は当分野で既知であり、American Type Culture Collection（ＡＴＣＣ），Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡから入手可能な多くの不死化細胞株が含まれ、これには、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＨＥＫ  ２９３細胞、ＮＳＯ細胞、ＨｅＬａ細胞、ベビーハムスター腎臓（ＢＨＫ）細胞、サル腎臓細胞（ＣＯＳ）、ヒト肝臓がん細胞（例えば、Ｈｅｐ  Ｇ２）、および多数の他の細胞株が挙げられるが、これらに限定されない。細菌、酵母、昆虫および植物を含む（これらに限定されない）非哺乳動物細胞を用いて、組換え抗体を発現させることもできる。いくつかの実施態様において、抗体は、ウシやニワトリなどのトランスジェニック動物において製造することができる。
【０１２４】
本発明の一つの側面において、式（ＸＩ）もしくは式（ＸＩＩ）、または式（Ｉ）もしくは式（ＩＩ）の化合物を抗原として動物に対して免疫を行って抗体を作製する方法が提供される。式（ＸＩ）もしくは式（ＸＩＩ）、または式（Ｉ）もしくは式（ＩＩ）の化合物の製造方法は特に限定はされないが、例えば、α位のアミノ基が保護されたリシンおよびグリセルアルデヒドを反応させて得られる反応混合物を精製して調製することができる。免疫に使用する抗原として、例えば、上記の反応混合物を分画して得られる画分のうち、式（Ｉａ）または式（Ｉｂ）で表される化合物を含む画分を使用することができる。分画は通常の方法で行うことができ、例えばＨＰＬＣ分取により特定のピークを含む画分を使用することができる。
【０１２５】
免疫は抗体の作製において通常行われる方法を使用することができる。動物はヒト以外の哺乳類、例えばマウス、ラット、ウサギ、イヌ、ブタ、ハムスターなどを使用することができる。
【実施例】
【０１２６】
［実施例１］ＡＧＥｓの調製
ＡＧＥｓは公知の方法により調製することができる（非特許文献５および非特許文献６など）。具体的には以下の方法により各種ＡＧＥｓを調製した。【０１２７】
（１）グリセルアルデヒド由来ＡＧＥｓ含有ウシ血清アルブミン（Ｇｌｙｃｅｒ−ＡＧＥｓ−ＢＳＡ）
ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、ＤＬ−グリセルアルデヒド（ＤＬ−ＧＬＡ、ナカライテスク）、ジエチレントリアミン−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ”，Ｎ”−ペンタ酢酸（ＤＴＰＡ、同仁化学研究所）は購入により入手した。【０１２８】
ＤＬ−ＧＬＡ（１８０ｍｇ）とＤＴＰＡ（３９ｍｇ）を秤量し、５０ｍＬの培養用チューブに移した。チューブにリン酸緩衝液（０．２Ｍ、ｐＨ７．４、２０ｍＬ）を加えてボルテックスミキサーにてＤＬ−ＧＬＡが溶解するまで攪拌した。その後、ＢＳＡ（５００ｍｇ）を加えて溶解するまで攪拌した（溶液中のＢＳＡの濃度：２５ｍｇ／ｍＬ）。【０１２９】
得られた混合物をクリーンベンチ内で０．２μｍフィルターに通して無菌溶液とした。チューブ内の液体が蒸発しないように、パラフィルム（商標）などのフィルムにてチューブの蓋を密閉して３７℃で１週間インキュベートした。【０１３０】
得られた反応溶液（２．５ｍＬずつ）をＰＤ−１０カラム（ＧＥヘルスケア、８本）にアプライし、ＰＤ−１０カラムのプロトコールにしたがって、リン酸緩衝液生理食塩水（ＰＢＳ）（ｐＨ７．４、３．５ｍＬずつ）で溶出させた。【０１３１】
カラム４本分の溶出液（計１４ｍＬ）を集めて分画分子量６〜８ｋＤａの透析チューブ（Spectra/Por Dialysis Membrane、幅：２３ｍｍ）に入れ、１４ｍＬのチューブ２本を予め冷やしておいた２ＬのＰＢＳ中に入れて攪拌して透析した。透析は低温室内（５℃）で行い、２４時間ごとに透析液（ＰＢＳ）を交換し、３日間透析した。【０１３２】
透析終了後、２本の透析チューブ内の液を合わせて５０ｍＬの培養用チューブに入れて、グリセルアルデヒド由来ＡＧＥｓ含有ＢＳＡ（Ｇｌｙｃｅｒ−ＡＧＥｓ−ＢＳＡ）としてタンパク質量を測定し、培養用ＰＢＳにて必要なタンパク質濃度に調整した。【０１３３】
ＤＬ−ＧＬＡを添加しなかったことを除いて実施例１と同じ手法で、対照ＢＳＡを調製した。【０１３４】
（２）グリセルアルデヒド由来ＡＧＥｓ含有マウス血清アルブミン（Ｇｌｙｃｅｒ−ＡＧＥｓ−ＭＳＡ）およびグリセルアルデヒド由来ＡＧＥｓ含有ウサギ血清アルブミン（Ｇｌｙｃｅｒ−ＡＧＥｓ−ＲＳＡ）
０．２Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）中に、２５ｍｇ／ｍＬのマウス血清アルブミン（ＭＳＡ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）あるいはウサギ血清アルブミン（ＲＳＡ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、ＤＬ−グリセルアルデヒド（０．１Ｍ，ナカライテスク）、およびジエチレントリアミン５酢酸（５ｍＭ、ＤＴＰＡ、同仁化学研究所）を含有する溶液を調製した。該溶液を０．２μｍのフィルター滅菌により無菌的な状態にし、３７℃で１週間インキュベートした。低分子量の未反応物などは、ＰＤ−１０ゲルろ過カラム（ＧＥヘルスケア）を用いて除き、さらに、低温室内（５℃）でＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）にて３日間透析（この間、毎日ＰＢＳを交換）を行った。【０１３５】
（３）グルコース由来ＡＧＥｓ含有ＢＳＡ（Ｇｌｕ−ＡＧＥｓ−ＢＳＡ）およびフルクトース由来ＡＧＥｓ含有ＢＳＡ（Ｆｒｕ−ＡＧＥｓ−ＢＳＡ）
０．２Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）中に、２５ｍｇ／ｍＬウシ血清アルブミン（ＢＳＡ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、Ｄ−グルコース（０．５Ｍ、和光純薬）またはＤ−フルクトース（０．５Ｍ、和光純薬）、およびＤＴＰＡ（５ｍＭ、同仁化学研究所）を含む溶液を調製し、該溶液を０．２μｍのフィルター滅菌により無菌的な状態にし、３７℃で８週間インキュベートした。低分子量の未反応物などはＰＤ−１０ゲルろ過カラムを用いて除き、さらに、低温室内（５℃）でＰＢＳにて３日間透析（この間、毎日ＰＢＳを交換）を行った。【０１３６】
（４）グリコールアルデヒド由来ＡＧＥｓ含有ＢＳＡ（Ｇｌｙｃｏｌ−ＡＧＥｓ−ＢＳＡ）、メチルグリオキサール由来ＡＧＥｓ含有ＢＳＡ（ＭＧＯ−ＡＧＥｓ−ＢＳＡ）、およびグリオキサール由来ＡＧＥｓ含有ＢＳＡ（ＧＯ−ＡＧＥｓ−ＢＳＡ）
０．２Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）中に、０．１Ｍのグリコールアルデヒド（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、メチルグリオキサール（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、あるいはグリオキサール（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）と、ＢＳＡ（２５ｍｇ／ｍＬ）およびＤＴＰＡ（５ｍＭ）を含む溶液を調製した。該溶液を０．２μｍのフィルター滅菌により無菌的な状態にし、３７℃で１週間インキュベートした。無菌条件下、３７℃で１週間インキュベートし、その後、低分子量の未反応物などはＰＤ−１０ゲルろ過カラムを用いて除き、さらに、低温室内（５℃）でＰＢＳにて３日間透析（この間、毎日ＰＢＳを交換）を行った。【０１３７】
（５）３−デオキシグルコソン由来ＡＧＥｓ含有ＢＳＡ（３−ＤＧ−ＡＧＥｓ−ＢＳＡ）
０．２Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）中にＢＳＡ（２５ｍｇ／ｍＬ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、３−デオキシグルコソン（０．２Ｍ、同仁化学研究所）およびＤＴＰＡ（５ｍＭ）を含む溶液を調製した。該溶液を０．２μｍのフィルター滅菌により無菌的な状態にし、３７℃で２週間インキュベートした。その後、低分子量の未反応物などはＰＤ−１０ゲルろ過カラムを用いて除き、さらに、低温室内（５℃）でＰＢＳにて３日間透析（この間、毎日ＰＢＳを交換）を行った。【０１３８】
（６）Ｎε−カルボキシメチルリシン含有ＢＳＡ（ＣＭＬ−ＢＳＡ）
０．２  Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）中に、ＢＳＡ（５０ｍｇ／ｍＬ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、グリオキシル酸（４５ｍＭ、和光純薬）およびシアノ水素化ホウ素ナトリウム（１５０ｍＭ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を含む溶液を調製した。該溶液を０．２μｍのフィルター滅菌により無菌的な状態にし、３７℃で２４時間インキュベートした。その後、低分子量の未反応物などはＰＤ−１０ゲルろ過カラムを用いて除き、さらに、低温室内（５℃）でＰＢＳにて３日間透析（この間、毎日ＰＢＳを交換）を行った。【０１３９】
［実施例２］抗原の調製
（１）グリセルアルデヒド由来ＡＧＥｓ化リシン（Ｇｌｙｃｅｒ−ＡＧＥｓ−Ｚ−Ｌｙｓ）の調製
Ｎα−カルボベンゾキシ−Ｌ−リシン（Ｚ−Ｌｙｓ−ＯＨ、東京化成工業）、ＤＬ−グリセルアルデヒド（ＤＬ−ＧＬＡ、ナカライテスク）は購入により入手した。ＤＬ−ＧＬＡ（６７５．６ｍｇ）を秤量し、５０ｍＬ容の遠沈管に移した。遠沈管にリン酸緩衝液（０．２Ｍ、ｐＨ７．４、２５ｍＬ）を加えてボルテックスミキサーにてＤＬ−ＧＬＡが溶解するまで攪拌した。その後、Ｚ−Ｌｙｓ−ＯＨ（７００．８ｍｇ）を加えて溶解するまで攪拌した（溶液中のＤＬ−ＧＬＡ濃度：３００ｍＭ、Ｚ−Ｌｙｓ−ＯＨ濃度：１００ｍＭ）。その後、遠沈管内の液体が蒸発しないように、パラフィルム（商標）などのフィルムにてチューブの蓋を密閉して３７℃で１週間以上静置した。【０１４０】
得られた反応溶液５ｍＬに対して、１０％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ、富士フイルム和光純薬）水溶液１ｍＬを加え、転倒混和した。その後、室温にて１０分間遠心分離（１２，０００×ｇ）し、上清を除去した。得られた沈殿物を含む遠沈管に超純水（５ｍＬ）を加え、再度遠心分離を行い、上清を除去した。この操作を計３回実施することで、沈殿を洗浄した。洗浄後の沈殿は風乾後、乾燥重を測定（２００ｍｇ）し、冷蔵保存した。【０１４１】
（２）Ｇｌｙｃｅｒ−ＡＧＥｓ−Ｚ−Ｌｙｓの分取精製
Ｇｌｙｃｅｒ−ＡＧＥｓ−Ｚ−Ｌｙｓの沈殿物をリン酸緩衝液（０．２Ｍ、ｐＨ７．４）に溶解させ、０．５ｍｇ／ｍＬ（分析用）もしくは５０ｍｇ／ｍＬ（分取用）の試料溶液を調製した。その後、孔径０．２μｍのシリンジフィルター（Ｍｉｌｌｅｘ−ＬＧ、メルク）でろ過し、ろ液を高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）の試料とした。ＨＰＬＣ装置は１２６０  Ｉｎｆｉｎｉｔｙ  ＩＩシステム（アジレント・テクノロジー）を使用し、以下のモジュールで構成した；クォーターナリポンプ（Ｇ７１１１Ｂ）、マルチサンプラ（Ｇ７１６７Ａ）、マルチカラムサーモスタット（Ｇ７１１６Ａ）、ダイオードアレイ検出器（Ｇ７１１５Ａ）、蛍光検出器（Ｇ７１２１Ｂ）、フラクションコレクタ（Ｇ１３６４Ｆ）、OpenLAB CDS ChemStationソフトウェア。移動相は富士フイルム和光純薬のＨＰＬＣ溶媒より調製した。移動相Ａは１Ｍ酢酸アンモニウム溶液１０ｍＬと蒸留水９９０ｍＬを混合した１０ｍＭ酢酸アンモニウム水溶液、移動相Ｂはアセトニトリルとした。分析時間０−１０分は移動相Ａ：Ｂ＝７５：２５で流下し、１０．１−２０分は移動相Ａ：Ｂ＝６５：３５で流下し、２０．１−２５分は移動相Ａ：Ｂ＝１０：９０で流下した。分析カラムはYMC-Triart C18（１５０×４．６ｍｍ、ワイエムシィ）を使用し、流速を０．８ｍＬ／分に設定した。ろ過後の分析用試料溶液（０．５ｍｇ／ｍＬ）をＨＰＬＣ装置に５μＬ注入し、ダイオードアレイ検出器（２６０ｎｍ）及び蛍光検出器（励起波長３５０ｎｍ、蛍光波長４５０ｎｍ）でＧｌｙｃｅｒ−ＡＧＥｓ−Ｚ−Ｌｙｓのピークを検出した。ＨＰＬＣの結果を図６（ダイオードアレイ検出（２６０ｎｍ））および図７（蛍光検出（Ｅｘ３５０ｎｍ、Ｅｍ４５０ｎｍ））に示す。【０１４２】
その結果、分析時間１３．５分にて顕著なピークが認められた。以後、このピークをＧＡＬ１３と呼称する。続いて、ＹＭＣ−Ｔｒｉａｒｔ  Ｃ１８（１５０×１０ｍｍ、ワイエムシィ）をＨＰＬＣ装置に取り付け、流速を２．５ｍＬ／分に設定した。ろ過後の分取用試料溶液（５０ｍｇ／ｍＬ）をＨＰＬＣ装置に５０μＬ注入し、ダイオードアレイ検出器（２６０ｎｍ）でＧＡＬ１３を検出した。そして、ＵＶのピークをトリガーに設定したフラクションコレクタにて、ＧＡＬ１３を分取した。【０１４３】
分取溶液に含まれるアセトニトリルはロータリーエバポレーター（東京理化器械）で除去した。残渣の溶液５ｍＬに対して、１０％ＴＦＡ水溶液１ｍＬを加え、転倒混和した。その後、室温にて１０分間遠心分離（１２，０００×ｇ）し、上清を除去した。得られた沈殿物に超純水（５ｍＬ）を加え、再度遠心分離を行い、上清を除去した。この操作を計３回実施することで、沈殿を洗浄した。洗浄後の沈殿は風乾後、乾燥重を測定し（１ｍｇ）、冷蔵保存した。【０１４４】
（３）ＧＡＬ１３のキャリアタンパク質への結合
分取精製後のＧＡＬ１３の乾燥粉末をリン酸緩衝液（０．２Ｍ、ｐＨ７．４）に溶解させ、終濃度を４０ｍｇ／ｍＬとした。さらに、この溶液をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ、ｐＨ７．４）にて１０倍希釈し、終濃度を４ｍｇ／ｍＬとした。キャリアタンパク質の溶液は以下のように調製した。マウス血清アルブミン（ＭＳＡ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）の凍結乾燥粉末をＰＢＳに溶解させ、終濃度を１０ｍｇ／ｍＬとした。１．５ｍＬ容のEppendorf Safe-Lock Tubes（エッペンドルフ）内で、４ｍｇ／ｍＬのＧＡＬ１３溶液（５００μＬ）と１０ｍｇ／ｍＬのＭＳＡ溶液（２００μＬ）を混合した。続いて、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を超純水に溶解させ、１０ｍｇ／ｍＬ水溶液を作製した。ＧＡＬ１３とＭＳＡの混合溶液（７００μＬ）に、１０ｍｇ／ｍＬＥＤＣ水溶液（１００μＬ）を素早く添加し、転倒混和した後、室温にて一晩インキュベートした。【０１４５】
反応終了後、直ちにZeba Spin Desalting Columns（７Ｋ  ＭＷＣＯ、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で反応溶液をゲルろ過した。さらに、Slide-A-Lyzer MINI Dialysis Device（３．５Ｋ  ＭＷＣＯ、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用し、低温下（４℃）で透析した。透析外液はＰＢＳとした。透析を開始して３時間後に外液を交換し、さらに一晩の透析を行った。透析終了後、透析デバイス内の溶液を回収し、アミコンウルトラ−０．５（３０Ｋ  ＭＷＣＯ、メルク）で濃縮した。Pierce BCA Protein Assay Kit（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）でＧＡＬ１３を架橋させたＭＳＡ（ＧＡＬ１３−ＭＳＡ）のタンパク質濃度を求め、ＰＢＳにて任意のタンパク質濃度に調整した。ＧＡＬ１３−ＭＳＡはマウスモノクローナル抗体作製における免疫抗原として使用した。【０１４６】
Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay（ＥＬＩＳＡ）においては、ＧＡＬ１３をウシ血清アルブミン（ＢＳＡ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）に架橋させ、ＧＡＬ１３−ＢＳＡとして試験に使用した。また、陰性の対照区として、Ｎα，Ｎε−ジカルボベンゾキシ−Ｌ−リシン（Ｚ−Ｌｙｓ（Ｚ）−ＯＨ、渡辺化学工業）をＢＳＡに架橋させ、Ｚ−Ｌｙｓ−ＢＳＡを調製した。これらの試料は、必要に応じて、クリーンベンチ内でフィルターろ過滅菌（孔径０．２２μｍ）を行った。【０１４７】
［実施例３］モノクローナル抗体の作製
（１）マウスへの免疫
免疫抗原として、Ｇｌｙｃｅｒ−ＡＧＥｓ由来新規構造体修飾―マウス血清アルブミン（ＧＡＬ１３−ＭＳＡ、１ｍｇ／ｍＬ）を同じ容量のFreund’s Adjuvant, Complete（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）と混合してエマルジョンを調製し（抗原の濃度：０．５ｍｇ／ｍＬ）、ＢＡＬＢ／ｃマウス５匹の背部皮下に初回免疫をした（抗原の量：２００μｇ／匹）。ＧＡＬ１３−ＭＳＡ（１ｍｇ／ｍＬ）を同じ容量のFreund’s Adjuvant, Incomplete（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）と混合して調製したエマルジョン（抗原の濃度：０．５ｍｇ／ｍＬ）を用いて１週間おきに追加免疫（抗原の量：５０μｇ／匹）を行った。初回免疫から６回免疫した後に尾静脈より採血を行い、抗体価の確認を行った。抗体価の高かったものに対して、追加免疫用のエマルジョン（抗原の量：５０μｇ）をマウスの腹腔内に最終投与し、その３日後に細胞融合用に脾臓を摘出した。【０１４８】
（２）抗体価の測定
抗血清の力価をＥＬＩＳＡで評価した。９６穴マイクロタイタープレート（ＮＵＮＣ）に、免疫抗原であるＧＡＬ１３−ＭＳＡにおいて、キャリアタンパクをＢＳＡに変更したＧｌｙｃｅｒ−ＡＧＥｓ由来新規構造体修飾―ウシ血清アルブミン（ＧＡＬ１３−ＢＳＡ）を１μｇ／ｍＬの濃度で５０μＬ／ウェルずつ加え、一晩４℃で固相化した。０．０５％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ（ＰＢＳ−Ｔ）で３回洗浄後、０．５％（ｗ／ｖ）ゼラチンを含む炭酸緩衝液（ｐＨ９．５）で１時間ブロッキングした。抗血清は１０００倍から３倍ずつ段階希釈し、７２９０００倍までの希釈系列を調製後、抗原固相化プレートに５０μＬ／ウェルずつ入れて１時間静置した。洗浄後、ＰＢＳ−Ｔで２５００倍に希釈した２次抗体（西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）標識化抗マウスＩｇＧ（ＺＹＭＥＤ）を５０μＬ／ウェルずつ入れて１時間静置した。洗浄後、各ウェルに０．０２％（ｗ／ｖ）の過酸化水素を含む０．１Ｍクエン酸リン酸緩衝液（ｐＨ５．０）で０．５ｍｇ／ｍＬに調製した
ｏ−フェニレンジアミン溶液（１００μＬ）を添加し、２５℃で１０分間静置した後に、１Ｍ硫酸溶液（１００μＬ）を各ウェルに添加し、呈色反応を停止した。その後４９０ｎｍの吸光度をマイクロプレートリーダーによって測定した。その結果、抗血清の９０００倍以上の希釈溶液において、抗原と有意な反応性を示したマウスを細胞融合に使用した。【０１４９】
（３）脾臓細胞の調製と細胞融合
マウスから摘出した脾臓をすりつぶし、１匹あたり約１×１０８個の脾臓細胞を調製した。ミエローマ細胞であるＰ３Ｕ１を培養し、細胞融合当日に生細胞率が９５％以上のＰ３Ｕ１を調製した。前記脾臓細胞とＰ３Ｕ１を５：１（細胞数の比）で混ぜ、５０％（ｗ／ｖ）濃度の分子量１，４５０のポリエチレングリコールにより細胞融合を行った。融合後、細胞を培地で洗浄し、ＨＡＴ培地に懸濁させ、９６穴培養プレートの各ウェルに１×１０５個／ウェルとなるように細胞を播きこみ、ハイブリドーマの選択培養を行った。細胞融合１０日目にハイブリドーマ培養上清を回収し、培養上清中の抗体価の測定を行った。【０１５０】
（４）抗体産生陽性ウェルのスクリーニング
細胞融合後、１０日目の培養上清を回収し、抗体産生陽性ウェルのスクリーニングを上記の抗体価測定方法で行った。ＧＡＬ１３−ＢＳＡ、グリセルアルデヒド由来ＡＧＥｓ含有ＢＳＡ（Ｇｌｙｃｅｒ−ＡＧＥｓ−ＢＳＡ）に陽性、Ｚ−リシン修飾ウシ血清アルブミン（Ｚ−Ｌｙｓ−ＢＳＡ）に陰性であるクローンについて選択した。【０１５１】
（５）クローニング
ＧＡＬ１３−ＢＳＡに対する特異性の高かったクローンを限界希釈法でクローニングを行った。すなわち、細胞を１０％のＦＣＳを含むＲＰＭＩ培地で５個／ｍＬに調製し、９６穴培養プレート２枚分の各ウェルに２００μＬずつ添加した。１０日後、培養上清中のＧＡＬ１３−ＢＳＡ、Ｇｌｙｃｅｒ−ＡＧＥｓ−ＢＳＡに陽性、およびＺ−Ｌｙｓ−ＢＳＡに陰性であることを確認し、それぞれのウェルに由来するクローンを得た。特異性を十分に備えた本発明の抗体として、新規モノクローナル抗体ＳＪ−５産生細胞を得た。【０１５２】
（６）抗体の精製
新規モノクローナル抗体ＳＪ−５産生細胞を、１０％のＦＣＳ  を含むＲＰＭＩ培地で培養後、ＰＢＳにて洗浄し、無血清培地（ＳＭＦ培地、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）にて４日〜６日間培養し培養上清を得た。培養上清をＰｒｏｔｅｉｎＧカラム（ＧＥヘルスケア社製）にて、ＩｇＧ画分を精製し、特異性を十分に備えた本発明の抗体として、新規モノクローナル抗体ＳＪ−５を得た。【０１５３】
［実施例４］モノクローナル抗体およびポリクローナル抗体のペルオキシダーゼ（ＰＯＤ）標識方法
得られた新規モノクローナル抗体ＳＪ−５（ＰＢＳ溶液、２００μｇ）または、抗グリセルアルデヒド由来ＡＧＥｓポリクローナル抗体（Molecular Medicine 6(2): 114-125, 2000に記載の竹内らの方法による、ＰＢＳ溶液、２００μｇ）は、Peroxidase Labeling Kit-SH（同仁化学研究所）を用いて、ＰＯＤ標識を行った。標識方法は取扱説明書の手順に従った。得られたＰＯＤ標識化抗体溶液はグリセロール（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）と１：１で混合し、−２０℃で保存した。【０１５４】
［実施例５］ＥＬＩＳＡ直接法による新規モノクローナル抗体の反応性の確認
Ｇｌｙｃｅｒ−ＡＧＥｓ由来新規構造体修飾―ＢＳＡ（ＧＡＬ１３−ＢＳＡ）、を１μｇ／ｍＬの濃度で１００μＬ／ウェルずつ加え、一晩４℃で固相化した。０．０５％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ（ＰＢＳ−Ｔ）で３回洗浄後、０．５％（ｗ／ｖ）ゼラチンを含むＰＢＳ−Ｔで１時間ブロッキングした。実施例４で調製したＰＯＤ標識化新規モノクローナル抗体ＳＪ−５並びにコントロールとして抗グリセルアルデヒド由来ＡＧＥｓポリクローナル抗体は４μｇ／ｍＬから、４倍ずつ段階希釈し、０．０６２５４μｇ／ｍＬまでの希釈系列を調製後、抗原固相化プレートに１００μＬ／ウェルずつ入れて１時間静置した。洗浄後、各ウェルに０．０２％（ｗ／ｖ）の過酸化水素を含む０．１Ｍクエン酸リン酸緩衝液（ｐＨ５．０）で０．５ｍｇ／ｍＬに調製したｏ−フェニレンジアミン溶液（１００μＬ）を添加し、２５℃で１０分間静置した後に、１Ｍ硫酸溶液（５０μＬ）を各ウェルに添加し、呈色反応を停止した。その後４９０ｎｍの吸光度をマイクロプレートリーダーによって測定した。【０１５５】
その結果、図１に示すように、ＰＯＤ標識化ＳＪ−５抗体はＧＡＬ１３−ＢＳＡに良好に反応することが示された。【０１５６】
［実施例６］ＥＬＩＳＡ競合法による新規モノクローナル抗体の反応性の確認
ＧＡＬ１３−ＢＳＡを１μｇ／ｍＬの濃度で１００μＬ／ウェルずつ加え、一晩４℃で固相化した。０．０５％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ（ＰＢＳ−Ｔ）で３回洗浄後、０．５％（ｗ／ｖ）ゼラチンを含む炭酸緩衝液（ｐＨ９．５）で１時間ブロッキングした。ＰＯＤ標識化ＳＪ−５抗体（０．４μｇ／ｍＬ）並びにコントロールとして抗グリセルアルデヒド由来ＡＧＥｓポリクローナル抗体（６μｇ／ｍＬ）を調製後、抗原固相化プレートに、ＧＡＬ１３−ＢＳＡと対照のＢＳＡの１０倍希釈系列溶液（各５０μＬ）およびＰＯＤ標識化ＳＪ−５抗体または、コントロールとして抗グリセルアルデヒド由来ＡＧＥｓポリクローナル抗体（５０μＬ）を加え、プレートミキサーで撹拌後、室温で１時間静置した。洗浄後、各ウェルに０．０２％（ｗ／ｖ）の過酸化水素を含む０．１Ｍクエン酸リン酸緩衝液（ｐＨ５．０）で０．５ｍｇ／ｍＬに調製したｏ−フェニレンジアミン溶液１００μＬを添加し、２５℃で１０分間静置した後に、１Ｍ硫酸溶液５０μＬを各ウェルに添加し、呈色反応を停止した。その後４９０ｎｍの吸光度をマイクロプレートリーダーによって測定した。図２に抗グリセルアルデヒド由来ＡＧＥｓポリクローナル抗体の結果、図３にＰＯＤ標識化ＳＪ−５抗体の結果を示す。【０１５７】
ＰＯＤ標識化ＳＪ−５抗体並び抗グリセルアルデヒド由来ＡＧＥｓポリクローナル抗体ともに、競合法においても、ＧＡＬ１３−ＢＳＡに良好に反応することが示され、ＰＯＤ標識化ＳＪ−５抗体の使用抗体濃度は、抗グリセルアルデヒド由来ＡＧＥｓポリクローナル抗体の１５倍低い濃度にて、同様の結果が得られることが示された。【０１５８】
［実施例７］ＥＬＩＳＡ競合法による新規モノクローナル抗体の特異性の確認
９６穴マイクロタイタープレート（ＮＵＮＣ）の各ウェルに、固相化抗原としてＰＢＳ（ｐＨ７．４）で１μｇ／ｍＬに調製したＧＡＬ１３−ＢＳＡまたはＧｌｙｃｅｒ−ＡＧＥｓ−ＢＳＡを１００μＬずつ添加し、２５℃で１時間放置した。一晩４℃で固相化した。０．０５％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ（ＰＢＳ−Ｔ）で３回洗浄後、０．５％（ｗ／ｖ）ゼラチンを含む炭酸緩衝液（ｐＨ９．５）で１時間ブロッキングした。実施例６と同じ条件でＰＯＤ標識化ＳＪ−５抗体（０．４μｇ／ｍＬ）を調製し、抗原固相化プレートに、特異性確認のためグルコース由来ＡＧＥｓ含有ＢＳＡ（Ｇｌｕ−ＡＧＥｓ−ＢＳＡ）、グリコールアルデヒド由来ＡＧＥｓ含有ＢＳＡ（Ｇｌｙｃｏｌ−ＡＧＥｓ−ＢＳＡ）、メチルグリオキサール由来ＡＧＥｓ含有ＢＳＡ（ＭＧＯ−ＡＧＥｓ−ＢＳＡ）、グリオキサール由来ＡＧＥｓ含有ＢＳＡ（ＧＯ−ＡＧＥｓ−ＢＳＡ）、Ｎε−カルボキシメチルリシン含有ＢＳＡ（ＣＭＬ−ＢＳＡ）、Ｎε−カルボキシエチルリシン含有ＢＳＡ（ＣＥＬ−ＢＳＡ）、およびウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を同様に５０μＬずつ添加し、さらにＰＯＤ標識化ＳＪ−５抗体（５０μＬ）を添加し、プレートミキサーで撹拌後、室温で１時間静置した。洗浄後、各ウェルに０．０２％（ｗ／ｖ）の過酸化水素を含む０．１Ｍクエン酸リン酸緩衝液（ｐＨ５．０）で０．５ｍｇ／ｍＬに調製したｏ−フェニレンジアミン溶液（１００μＬ）を添加し、２５℃で１０分間静置した後に、１Ｍ硫酸溶液５０μＬを各ウェルに添加し、呈色反応を停止した。その後４９０ｎｍの吸光度をマイクロプレートリーダーによって測定した。【０１５９】
図４に固相化抗原として、ＧＡＬ１３−ＢＳＡを用いたときのＰＯＤ標識化ＳＪ−５抗体の特異性の結果、図５に固相化抗原としてＧｌｙｃｅｒ−ＡＧＥｓ−ＢＳＡを用いたときのＰＯＤ標識新規モノクローナル抗体ＳＪ−５の特異性の結果として、対照のＢＳＡを１とした場合の吸光度を示す。【０１６０】
ＧＡＬ１３−ＢＳＡ並びにＧｌｙｃｅｒ−ＡＧＥｓ−ＢＳＡを固相化した場合においても、新規モノクローナル抗体ＳＪ−５の特異性として、Ｇｌｙｃｅｒ−ＡＧＥｓ−ＢＳＡおよびＧｌｙｃｏｌ−ＡＧＥｓ−ＢＳＡに陽性、Ｇｌｕ−ＡＧＥｓ−ＢＳＡ、Ｆｒｕ−ＡＧＥｓ−ＢＳＡ、ＭＧＯ−ＡＧＥｓ−ＢＳＡ、ＧＯ−ＡＧＥｓ−ＢＳＡ、ＣＭＬ−ＢＳＡ、及びＣＥＬ−ＢＳＡに陰性であった。【０１６１】
［実施例８］モノクローナル抗体の解離定数測定
モノクローナル抗体ＳＪ−５について、以下の手法で解離定数（Ｋｄ値）を測定した。グリセルアルデヒド由来ＡＧＥｓ含有ＢＳＡ（Ｇｌｙｃｅｒ−ＡＧＥｓ−ＢＳＡ）を１０ｍＭ  酢酸ナトリウム溶液（ｐＨ４．０）で希釈し、終濃度１００μｇ／ｍＬのリガンド溶液を調製した。リガンドの固定化およびＫＤ値の算出について、Ｂｉａｃｏｒｅ  Ｔ２００（ＧＥヘルスケア）を使用した。アミンカップリングキット（ＧＥヘルスケア）を用いて、センサーチップＣＭ５（ＧＥヘルスケア）上にリガンド溶液を固定化した。続いて、モノクローナル抗体を０〜４００ｎＭの濃度に希釈した抗体希釈液を作成し、Ｋｄ値を算出した。【０１６２】
その結果、モノクローナル抗体のＫｄ値は５７．４ｎＭであった。また、ＨＰＬＣで分取したピークを化学結合させたＢＳＡ（ＧＡＬ１３−ＢＳＡ）を１０ｍＭ  酢酸ナトリウム溶液（ｐＨ５．０）で希釈し、終濃度２５μｇ／ｍＬのリガンド溶液を調製した。上記と同様にモノクローナル抗体のＫｄ値を算出した結果、８７．５ｎＭであった。【０１６３】
［実施例９］ＧＡＬ１３の質量分析
質量分析で使用した溶媒は、富士フイルム和光純薬のＨＰＬＣグレードのものを使用した。実施例２にて調製したＧＡＬ１３の乾燥粉末を５０％アセトニトリル含有０．１％ＴＦＡ溶液で溶解させ、終濃度０．２５ｍｇ／ｍＬとした。マトリクスはα−シアノ−４−ヒドロキシケイ皮酸（ＣＨＣＡ）を島津ジーエルシーより購入し、５０％アセトニトリル含有０．１％ＴＦＡ溶液で１０ｍｇ／ｍＬ溶液を調製した。試料溶液とマトリクス溶液を０．６ｍＬ容のEppendorf Safe-Lock Tubes（エッペンドルフ）内で等量混合した後、測定用プレートのウェルに１μＬ滴下し、風乾させた。質量校正用ペプチドとして、des-Arg1-Bradykinin、Angiotensin I、Glu1-Fibrinopeptide（ＡＢ  ＳＣＩＥＸ）とマトリクスの混合溶液を調製し、同様にプレートに滴下した。風乾後のプレートは、マトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間型質量分析装置（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ）であるＡＸＩＭＡ  Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ（島津製作所）に挿入し、リフレクトロンモードによる陽イオン測定を行った。質量分析の結果を図８に示す。【０１６４】
その結果、ｍ／ｚ＝６５０−７５０及び９５３に試料由来のピークが観察された。特に、ｍ／ｚ＝６９１．２９２６は、Ｃ３４Ｈ４４Ｎ４Ｏ１０のＮａ付加体である［Ｍ＋Ｎａ］＋イオン（モノアイソトピック質量の理論値６９１．２９５７、実測値との誤差４．５ｐｐｍ）であると考えられた。これはＺ−Ｌｙｓ−ＯＨ２分子がＤＬ−ＧＬＡ２分子によって架橋された構造体のモノアイソトピック質量とほぼ一致する。また、ｍ／ｚ＝９５３．３９４５は、Ｃ４８Ｈ６２Ｎ６Ｏ１３のＮａ付加体である［Ｍ＋Ｎａ］＋イオン（モノアイソトピック質量の理論値９５３．４２７６、実測値との誤差３４．７ｐｐｍ）であると考えられた。これはＺ−Ｌｙｓ−ＯＨ３分子がＤＬ−ＧＬＡ２分子によって架橋された構造体のモノアイソトピック質量とほぼ一致する。以上の結果から、ＧＡＬ１３には、少なくとも以下の２種類の化合物が含まれていることが示された。【０１６５】
【化２５】
2020045646.tif 000028
【０１６６】
［実施例１０］ＨＰＬＣで分取したピークのラジカル測定
実施例２にて調製したＧＡＬ１３の乾燥粉末を０．２Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）で溶解させ、終濃度５０ｍｇ／ｍＬとした。この溶液を目盛り付きガラス毛細管マイクロピペット（Ｄｒｕｍｍｏｎｄ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｃｏｍｐａｎｙ）で５０μＬ採取し、ＥＭマイスター  ヘマトクリット毛細管  シーリングワックスプレート（アズワン）で毛細管の下端をシールした。その後、毛細管を電子スピン共鳴（ＥＳＲ）装置用標準試料管（外径４ｍｍ、株式会社シゲミ）に移し、ＥＳＲの共振器に挿入した。ＥＳＲ装置はELEXSYS-II E580（Ｂｒｕｋｅｒ）を使用し、Continuous Wave法にて室温測定を行った。測定条件は以下の通りである：
Field center  3350G;
Field width  150G；
Averaged scan  20；
Sampling time  0.03s；
Field modulation amplitude  0.4mT；
Field modulation Frequency  100kHz；
Microwave power  3mW；
Receiver gain  60。【０１６７】
結果を図９に示す。ｇ値（２．００４３）とスペクトルの線形より、ＨＰＬＣで分取したピークはラジカルを発生させる炭素中心を含むグリセルアルデヒド由来ＡＧＥｓであることが分かった。【０１６８】
［実施例１１］ＧＡＬ１３の酸化活性評価
（１）３，３’−ジアミノベンジジン（ＤＡＢ）の調製
ＤＡＢは同仁化学研究所より購入した。ＤＡＢを秤量し、終濃度５ｍｇ／ｍＬとなるように、Ｔｒｉｓ緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ７．４）に溶解させた。【０１６９】
（２）試料溶液の調製
実施例２に従って調製したＧＡＬ１３の乾燥粉末をリン酸緩衝液（０．２Ｍ、ｐＨ７．４）に溶解させ、２ｍｇ／ｍＬ溶液を調製した。陰性の対照区として、２ｍｇ／ｍＬのＺ−Ｌｙｓ−ＯＨ溶液も調製した。【０１７０】
（３）酸化活性の評価方法
９６穴プレート（ビオラモ）に５ｍｇ／ｍＬのＤＡＢ溶液もしくはＴｒｉｓ緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ７．４）を１０μＬずつ添加した。そして、試料溶液を９０μＬずつ添加し、プレートミキサーで撹拌した。プレートを遮光下で３７℃、３時間インキュベートした後、Ｃｙｔａｔｉｏｎ５プレートリーダー（ＢｉｏＴｅｋ）にて、４６０ｎｍの吸光度を測定した。ＤＡＢ添加区の４６０ｎｍの吸光度からＴｒｉｓ緩衝液添加区の４６０ｎｍの吸光度を差し引くことで、ＤＡＢに対する酸化活性を求めた。結果を図１０のグラフに示す。３回の測定値の平均値と標準偏差を示した。統計解析はＪＭＰ１４．０（ＳＡＳ）によりスチューデントのｔ検定を行い、ＧＡＬ１３のＤＡＢに対する酸化活性はＺ−Ｌｙｓ−ＯＨに比べ、有意に高いことが分かった（Ｐ＜０．０１）。【０１７１】
［実施例１２］グリセルアルデヒド由来ピリジニウム化合物（ＧＬＡＰ）の調製
ＧＬＡＰは公知の方法により調製することができる（Usui et al., Biosci. Biotechnol. Biochem., 2003, 67(4), 930-932）。具体的には以下の方法によりＧＬＡＰを調製した。【０１７２】
（１）ＧＬＡＰ反応溶液の調製
Ｎα−アセチル−Ｌ−リシン（Ａｃ−Ｌｙｓ−ＯＨ、東京化成工業）、ＤＬ−グリセルアルデヒド（ＤＬ−ＧＬＡ、ナカライテスク）は購入により入手した。【０１７３】
ＤＬ−ＧＬＡ（３６０．３ｍｇ）を秤量し、５０ｍＬの遠沈管に移した。チューブにリン酸緩衝液（０．２Ｍ、ｐＨ７．４、２０ｍＬ）を加えてボルテックスミキサーにてＤＬ−ＧＬＡが溶解するまで攪拌した。その後、Ａｃ−Ｌｙｓ−ＯＨ（３７６．５ｍｇ）を加えて溶解するまで攪拌した（溶液中のＤＬ−ＧＬＡの濃度：２００ｍＭ、Ａｃ−Ｌｙｓ−ＯＨの濃度：１００ｍＭ）。チューブ内の液体が蒸発しないように、パラフィルム（商標）などのフィルムにてチューブの蓋を密閉して３７℃で１週間インキュベートした。得られた反応溶液は４℃にて保存した。【０１７４】
（２）ＧＬＡＰの分離精製
ＧＬＡＰ反応溶液は、孔径０．２μｍのシリンジフィルター（Ｍｉｌｌｅｘ−ＬＧ、メルク）でろ過し、ろ液を液体クロマトグラフ質量分析計（ＬＣ−ＭＳ）の試料とした。ＬＣ／ＭＳのＬＣ部は１２６０  Ｉｎｆｉｎｉｔｙ  ＩＩシステム（アジレント・テクノロジー）、ＭＳ部は四重極型質量分析計（ＩｎｆｉｎｉｔｙＬａｂ  ＬＣ／ＭＳＤ、Ｇ６１２５Ｂ、アジレント・テクノロジー）で構成した。なお、ＬＣ部は以下のモジュールで構成される；クォーターナリポンプ（Ｇ７１１１Ｂ）、アイソクラティックポンプ（Ｇ７１１０Ｂ）、マルチサンプラ（Ｇ７１６７Ａ）、マルチカラムサーモスタット（Ｇ７１１６Ａ）、ダイオードアレイ検出器（Ｇ７１１５Ａ）、フラクションコレクタ（Ｇ１３６４Ｆ）、ＭＳフローモジュレータ（Ｇ７１７０Ｂ）、ＯｐｅｎＬＡＢ  ＣＤＳ  ＣｈｅｍＳｔａｔｉｏｎソフトウェア。移動相は富士フイルム和光純薬のＨＰＬＣグレードのものを購入した。移動相Ａは１Ｍ酢酸アンモニウム溶液１０ｍＬと蒸留水９９０ｍＬを混合した１０ｍＭ酢酸アンモニウム水溶液、移動相Ｂはアセトニトリルとした。分析時間０−７分は移動相Ａ：Ｂ＝９９：１で流下し、７．１−１２分は移動相Ａ：Ｂ＝１０：９０で流下した。カラムはＺＯＲＢＡＸ  ＳＢ−Ｃ１８（１５０×９．４ｍｍ、アジレント・テクノロジー）を使用し、流速を４ｍＬ／分に設定した。ろ過後の試料溶液をＬＣ−ＭＳ装置に８０μＬ注入し、ダイオードアレイ検出器（２１５ｎｍ及び２５４ｎｍ）とＭＳ（陽イオン検出）でＧＬＡＰのピークを検出した。分析時間５分において、ＵＶ吸収性を持つピークが観察され、そのピークはｍ／ｚ＝２９７．１の陽イオンを含んでいた。そこで、ｍ／ｚ＝２９７をトリガーとしたＭＳ分取を行うことで、保持時間５分のピークを回収した。分取後の溶液はロータリーエバポレーター（東京理化器械）で濃縮乾固させた。得られた沈殿は４℃で保存した。【０１７５】
（３）ＧＬＡＰの構造確認
得られた沈殿（８ｍｇ）は、重水（０．６ｍＬ、富士フイルム和光純薬）に溶解させ、外径５ｍｍの核磁気共鳴（ＮＭＲ）用サンプル管（シゲミ）に移した。その後、ＮＭＲ装置（AVANCE III HD、500MHz、CryoProbe搭載型、Ｂｒｕｋｅｒ）でＧＬＡＰの構造を確認した。１Ｈ−ＮＭＲ及び１３Ｃ−ＮＭＲのスペクトルデータにて、全水素及び炭素の帰属を決定した。また、１Ｈ−１Ｈ  ＣＯＳＹ、１Ｈ−１３Ｃ  ＨＳＱＣ、１Ｈ−１３Ｃ  ＨＭＢＣ、１Ｈ−１５Ｎ  ＨＳＱＣ、１Ｈ−１５Ｎ  ＨＭＢＣスペクトルを解析することで、帰属の妥当性を確認した。ＧＬＡＰの構造を以下に示す。【０１７６】
【化２６】
2020045646.tif 000029
【０１７７】
［実施例１３］競合ＥＬＩＳＡによる新規モノクローナル抗体とＧＬＡＰの反応性評価
（１）試薬調製
下記試薬をＲＯ水に溶解させて１Ｌとし、コーティング溶液として使用した。
炭酸ナトリウム（富士フイルム和光純薬）                １．５９ｇ
炭酸水素ナトリウム（富士フイルム和光純薬）            ２．９３ｇ【０１７８】
ＢＳＡ（５ｇ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）をＰＢＳ（５００ｍＬ）に溶かし、ブロッキング溶液として使用した。【０１７９】
５０ｍＭトリス（６．１ｇ、富士フイルム和光純薬）をＲＯ水（約９００ｍＬ）に溶解させて、６Ｎ塩酸（富士フイルム和光純薬）でｐＨ７．４に調整した。得られた溶液にグリセロール（１ｍＬ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、Ｔｗｅｅｎ２０（１ｍＬ、ナカライテスク）を加え、ＲＯ水にて１Ｌにメスアップした。得られた溶液を希釈溶液として使用した。【０１８０】
下記試薬をＲＯ水に溶解させて１Ｌとし、さらにＲＯ水を９Ｌ加えた後で、Ｔｗｅｅｎ２０（５ｍＬ）を加えた。得られた溶液を洗浄溶液として使用した。
塩化ナトリウム（富士フイルム和光純薬）                    ８０ｇ
リン酸２水素カリウム（富士フイルム和光純薬）                ２ｇ
リン酸水素２ナトリウム１２水和物（富士フイルム和光純薬）  ２９ｇ【０１８１】
（３）抗原の固相化
コーティング溶液中で１μｇ／ｍＬに調製したグリセルアルデヒド由来ＡＧＥｓ含有ＢＳＡ（原液：１０ｍｇ／ｍＬＰＢＳ溶液）の溶液を、１００μＬずつ９６穴マイクロタイタープレート（ＣＯＳＴＡＲ）に加え、４℃で一晩インキュベートした。【０１８２】
（４）ブロッキング
固相化の処理を行った各ウェルを洗浄溶液（３００μＬ）で３回洗浄し、ブロッキング溶液（２００μＬ）を加え、室温で１時間放置した。【０１８３】
（５）競合実験
ＧＡＬ１３（実施例２にて調製）、ＧＬＡＰ（実施例１２にて調製）、Ｚ−Ｌｙｓ−ＯＨ（東京化成工業）をそれぞれリン酸緩衝液（０．２Ｍ、ｐＨ７．４）に溶解させ、２０ｍｇ／ｍＬ溶液を調製した。さらに、希釈溶液にて希釈することで、０．００６３〜２ｍｇ／ｍＬの２倍希釈系列（６点）の試料溶液を作製した。ＰＯＤ標識化新規モノクローナル抗体（ＳＪ−５）溶液をＢＳＡ（１ｍｇ／ｍＬ、富士フイルム和光純薬）含有希釈溶液にて１６，０００倍に希釈し、ＰＯＤ標識化ＳＪ−５抗体希釈溶液とした。【０１８４】
ブロッキング溶液で処理した各ウェルを洗浄溶液（３００μＬ）で３回洗浄し、２倍希釈系列の試料溶液（各５０μＬ）およびＰＯＤ標識化ＳＪ−５抗体希釈溶液（５０μＬ）を加え、プレートミキサーで２分間撹拌後、２５℃で１時間インキュベートした。【０１８５】
（６）発色
洗浄溶液（３００μＬ）で３回洗浄後、１００μＬの基質溶液（ＥＬＩＳＡ  ＰＯＤ基質ＴＭＢキット（Ｐｏｐｕｌａｒ）、ナカライテスク）を加え、室温、遮光下で１０分間インキュベートした。その後、２Ｎ硫酸（５０μＬ）を加え発色を停止した。【０１８６】
（７）吸光度測定およびデータ解析
マイクロプレートリーダー（Ｃｙｔａｔｉｏｎ５、ＢｉｏＴｅｋ）で主波長４５０ｎｍと副波長６５０ｎｍの吸光度を測定し、主波長の吸光度から副波長の吸光度を差し引いた。その結果を図１１に示す。ＧＡＬ１３では濃度依存的に吸光度が低下していたが、ＧＬＡＰとＺ−Ｌｙｓ−ＯＨは吸光度の低下が観察されなかった。したがって、新規モノクローナル抗体ＳＪ−５は公知のグリセルアルデヒド由来ＡＧＥｓであるＧＬＡＰを認識しない抗体であることが明らかとなった。【０１８７】
［実施例１４］ＳＪ−５を用いたＧｌｙｃｅｒ−ＡＧＥｓ−ＢＳＡによる血管内皮細胞管腔形成抑制中和試験
（１）マトリゲルマトリックスの調製
マトリゲルマトリックス（コーニング）を冷蔵庫に入れ、一晩かけて融解した。融解したマトリゲルマトリックスは１２ウェルプレート（コーニング）に３００μＬ／ウェルで添加し、３７℃、ＣＯ２インキュベータ（エスペック）で１時間静置することで硬化した。  【０１８８】
（２）Ｇｌｙｃｅｒ−ＡＧＥｓ−ＢＳＡまたは対照ＢＳＡと抗体反応液の調製
実施例１で調製したＧｌｙｃｅｒ−ＡＧＥｓ−ＢＳＡ（１０ｍｇ／ｍＬ）１０μＬまたは対照ＢＳＡ（１０ｍｇ／ｍＬ）１０μＬとリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ、和光）、ＳＪ−５（１０ｍｇ／ｍＬ）または対照抗体（１０ｍｇ／ｍＬ）９０μＬを１．５ｍＬチューブ（ワトソン）に加え、室温で１０分間静置した。その後、遠心分離機（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて１４０００ｒｐｍ、１５分間遠心分離し、上清を回収した。【０１８９】
（３）管腔形成試験
ＨＵＶＥＣ（ヒト臍帯静脈血管内皮細胞、国立研究開発法人医薬基盤・健康・栄養研究所ＪＣＲＢ細胞バンク）は１０ｃｍディッシュ（コーニング）でＨＵＶＥＣ用培地（ケー・エー・シー）１０ｍＬを用いて培養した。【０１９０】
培養したＨＵＶＥＣはＰＢＳ１０ｍＬで洗浄した後、トリプシン−ＥＤＴＡ（和光）１ｍＬで添加し、室温で３分間静置した。静置後、ＨＵＶＥＣがディッシュから剥がれた事を確認し、ＨＵＶＥＣ用培地１０ｍＬを添加する事でトリプシン−ＥＤＴＡを中和した。中和後、全量を５０ｍＬチューブ（コーニング）に移し、遠心分離機（久保田）を用いて１５００ｒｐｍ、３分間遠心分離を行った。【０１９１】
遠心分離後、上清を捨て、沈殿している細胞にＨＵＶＥＣ用培地１ｍＬを加え、再懸濁させた。懸濁液を１０μＬ取り、トリパンブルー（ＮａｎｏＥｎＴｅｋ）１０μＬと混和し、血球計算盤（ＮａｎｏＥｎＴｅｋ）に１０μＬを添加した。その後、オートセルカウンターＥＶＥ（ＮａｎｏＥｎＴｅｋ）で生細胞数をカウントした。細胞懸濁液を２．５ｘ１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬになるようにＨＵＶＥＣ用培地で希釈し、（１）で調製したマトリゲルに４００μＬ／ウェルで播種した。播種後、（２）で調製したそれぞれの反応液をＰＢＳで１００μｇ／ｍＬに調整した溶液を１００μＬ／ウェルで添加し、ＣＯ２インキュベータで８時間培養した。【０１９２】
８時間培養後にＢＺ−Ｘ７１０（キーエンス）の対物レンズ２０倍を用いて明視野観察した際のＨＵＶＥＣの形態を図１３に示す。当該図に示されるとおり、ＨＵＶＥＣは対照ＢＳＡ添加した群においてはＳＪ−５抗体及び対照抗体反応液マトリゲルマトリックス中での管腔形成が確認された。しかし、Ｇｌｙｃｅｒ−ＡＧＥｓ−ＢＳＡは管腔形成を阻害した。また、この管腔形成の阻害はＳＪ−５抗体との反応液では中和されるが、対照抗体ではその中和が確認できなかった。この結果から、Ｇｌｙｃｅｒ−ＡＧＥｓ−ＢＳＡがＨＵＶＥＣに及ぼす影響をＳＪ−５が中和可能である事が明らかになった。【０１９３】
［実施例１５］ＳＪ−５抗体を用いたＧｌｙｃｅｒ−ＡＧＥｓ−ＢＳＡによる内皮間葉転換阻害試験
（１）マトリゲルマトリックスの調製は実施例１４と同様に操作を行った。【０１９４】
（２）Ｇｌｙｃｅｒ−ＡＧＥｓ−ＢＳＡまたは対照ＢＳＡと抗体反応液の調製
実施例１で調製したＧｌｙｃｅｒ−ＡＧＥｓ−ＢＳＡ（１０ｍｇ／ｍＬ）１０μＬとＰＢＳ、ＳＪ−５（１０ｍｇ／ｍＬ）または対照抗体（１０ｍｇ／ｍＬ）９０μＬを１．５ｍＬチューブ（ワトソン）に加えた。また、対照ＢＳＡ（１０ｍｇ／ｍＬ）のＰＢＳ溶液９０μＬを加えた。これらの溶液を室温で１０分間静置した。その後、遠心分離機（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて１４０００ｒｐｍ、１５分間遠心分離し、上清を回収した。【０１９５】
（３）管腔形成阻害試験
ＨＵＶＥＣは１０ｃｍディッシュでＨＵＶＥＣ用培地１０ｍＬを用いて培養した。【０１９６】
培養したＨＵＶＥＣはＰＢＳ１０ｍＬで洗浄した後、トリプシン−ＥＤＴＡ１ｍＬを添加し、室温で３分間静置した。静置後、ＨＵＶＥＣがディッシュから剥がれた事を確認し、ＨＵＶＥＣ用培地１０ｍＬを添加することでトリプシン−ＥＤＴＡを中和した。中和後、全量を５０ｍＬチューブに移し、遠心分離機を用いて１５００ｒｐｍ、３分間遠心分離を行った。【０１９７】
遠心分離後、上清を捨て、沈殿している細胞にＨＵＶＥＣ用培地１ｍＬを加え、再懸濁させた。懸濁液１０μＬを取り、トリパンブルー１０μＬと混和させ、血球計算盤に１０μＬを添加した。その後、オートセルカウンターＥＶＥで生細胞数をカウントした。細胞懸濁液を２．５ｘ１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬになるようにＨＵＶＥＣ用培地で希釈し、（１）で調製したマトリゲルに４００μＬ／ウェルで播種した。播種後、（２）で調製したそれぞれの反応液を１００μＬ／ウェルで添加し、ＣＯ２インキュベータで８時間培養した。【０１９８】
（４）細胞の回収
それぞれのウェルを１ｍＬのＰＢＳで三回洗浄し、セルリカバリーソリューション（コーニング）を５００μＬ／ウェルで添加した。【０１９９】
細胞とマトリゲルマトリックスをブルーチップ（ワトソン）を用いてかき取り、１．５ｍＬチューブに回収し、５００μＬのセルリカバリーソリューションでウェルを再度リンスし、１．５ｍＬチューブに移した。１．５ｍＬチューブを５回転倒混和した後、１時間氷上で静置し、マトリゲルマトリックスが完全に分解する事を確認した。マトリゲルマトリックス分解後、４℃、８００ｒｐｍで遠心分離を行い、上清を捨てた。沈殿した細胞を氷冷した１ｍＬでＰＢＳに静かに懸濁し、４℃、８００ｒｐｍで遠心分離を行い、上清を捨て、再度沈殿した細胞を氷冷した１ｍＬでＰＢＳに静かに懸濁させ、４℃、８００ｒｐｍで遠心分離を行った。【０２００】
（５）ｍＲＮＡ回収
ｍＲＮＡ回収はCellAmpTM Direct RNA Prep Kit for RT-PCR（Ｔａｋａｒａ）を用いて行った。実際の操作を下記に示す。【０２０１】
遠心分離し、沈殿した細胞にＫｉｔ付属のCellAmp Washing Buffer１２５μＬ添加し、混和させた。３００ｘｇ、５分間遠心分離を行い、上清を除去し、Ｋｉｔ付属のCellAmp Processing Buffer ４９μＬとDNase I for Direct RNA Prep １μＬを各チューブに添加した。室温で５分間静置後、ＰＣＲチューブ（日本ジェネティクス）に移し、サーマルサイクラー（日本ジェネティクス）を用いて７５℃、５分間静置することでｍＲＮＡを得た。【０２０２】
（６）逆転写反応
逆転写反応はPrimeScriptTM RT Master Mix （Ｔａｋａｒａ）を用いて行った。実際の操作を下記に示す。（５）で得たｍＲＮＡ１μＬ、5 × PrimeScript RT Master Mix２μＬとＭａｓｔｅｒ  Ｍｉｘに付属のRNase Free dH2O７μＬをＰＣＲチューブで混和させ、サーマルサイクラーを用いて３７℃１５分、８５℃５秒で反応させた。【０２０３】
（７）リアルタイムＰＣＲ
リアルタイムＰＣＲはLuna Universal qPCR Master Mix（ＢｉｏＬａｂｓ）を用いて行った。（６）で得た逆転写反応産物を９０μＬの超純水（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で希釈した。希釈後、下表の組成で反応液を調製し、３８４ウェルプレート（日本ジェネティクス）に添加した。【０２０４】
【表２】
2020045646.tif 000030
【０２０５】
Ｐｒｉｍｅｒは下記の配列を株式会社ファスマックに合成委託して入手したものを使用した。
ヒトα−ＳＭＡα−ＳＭＡ
フォワード：ＣＧＧＣＴＴＴＧＣＴＧＧＧＧＡＣＧＡＴ
リバーズ：ＣＡＧＧＧＧＣＡＡＣＡＣＧＡＡＧＣＴＣＡＴ
ヒトＣＤ３１
フォワード：ＡＴＴＧＣＡＧＴＧＧＴＴＡＴＣＡＴＣＧＧＡＧＴＧ
リバーズ：ＣＴＣＧＴＴＧＴＴＧＧＡＧＴＴＣＡＧＡＡＧＴＧＧ
ヒトβ−アクチン
フォワード：ＣＴＧＧＡＡＣＧＧＴＧＡＡＧＧＴＧＡＣＡ
リバーズ：ＡＡＧＧＧＡＣＴＴＣＣＴＧＴＡＡＣＡＡＴＧＣＡ【０２０６】
添加後、ＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏTM  １２Ｋ  Ｆｌｅｘ  リアルタイム  ＰＣＲ  システム（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）でリアルタイムＰＣＲを行い、遺伝子発現量を定量した。【０２０７】
ＣＤ３１は内皮細胞のマーカーとして、α−平滑筋アクチン（α−ＳＭＡ）は間葉細胞のマーカーとしてそれぞれ知られている（非特許文献１４、Ｆｉｇｕｒｅ  ２など）。α−ＳＭＡ及びＣＤ３１の発現量をβ―アクチンの発現量を内部標準として計算することで評価したグラフを図１４および図１５に示す。図１４より、Ｇｌｙｃｅｒ−ＡＧＥｓ−ＢＳＡ添加によってα−ＳＭＡの発現量が増加することが明らかになった。また、この作用はＳＪ−５で抑制可能であるが、対照抗体では抑制が認められなかった。また図１５より、ＣＤ３１に関してはＧｌｙｃｅｒ−ＡＧＥｓ−ＢＳＡ添加によってＣＤ３１の発現量が低下することが明らかになった。また、この作用はＳＪ−５で抑制可能であるが、対照抗体では抑制が認められなかった。α−ＳＭＡの発現量増加とＣＤ３１の発現量低下は血管内皮細胞が間葉系の細胞へと形質転換を起こす内皮間葉転換で認められる作用である。これらの結果からＧｌｙｃｅｒ−ＡＧＥｓ−ＢＳＡが内皮間葉転換を引き起こす作用を有しており、ＳＪ−５はこの作用を抑制可能であることが確認された。【０２０８】
［実施例１６］Ｇｌｙｃｅｒ−ＡＧＥｓ−Ｚ−Ｌｙｓの分取精製（高純度化）
実施例２で沈殿物として得たＧｌｙｃｅｒ−ＡＧＥｓ−Ｚ−Ｌｙｓを０．２Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）に溶解させ、５０ｍｇ／ｍＬの試料溶液を調製した。その後、孔径０．２μｍのシリンジフィルター（Ｍｉｌｌｅｘ−ＬＧ、メルク）でろ過し、ろ液を液体クロマトグラフ質量分析計（ＬＣ／ＭＳ）の試料とした。ＬＣ／ＭＳのＬＣ部及びＭＳ部は実施例１２と同様に構成した。移動相は富士フイルム和光純薬のＨＰＬＣグレードのものを購入した。移動相Ａは１Ｍ酢酸アンモニウム溶液１０ｍＬと蒸留水９９０ｍＬを混合した１０ｍＭ酢酸アンモニウム水溶液、移動相Ｂはアセトニトリルとした。分析時間０−２分において、移動相Ａ：Ｂ＝１００：０−８５：１５の濃度勾配で流下した。分析時間２−１５分において、移動相Ａ：Ｂ＝８５：１５−７０：３０の濃度勾配で、１５−１７分において移動相Ａ：Ｂ＝７０：３０−１０：９０で流下した。カラムはＺＯＲＢＡＸ  ＳＢ−Ｃ１８（１５０×９．４ｍｍ、アジレント・テクノロジー）を使用し、流速を４ｍＬ／分に設定した。ろ過後の試料溶液をＬＣ／ＭＳ装置に５０μＬ注入し、ダイオードアレイ検出器（２６０ｎｍ）とＭＳ（陽イオン検出）でＧｌｙｃｅｒ−ＡＧＥｓ−Ｚ−Ｌｙｓのピークを検出した。分析時間１２．３分において、ＵＶ吸収性を持つピークが観察され、そのピークはｍ／ｚ＝６９１．３の［Ｍ＋Ｎａ］＋を含んでいた。そこで、ｍ／ｚ＝６９１をトリガーとしたＭＳ分取を行うことで、保持時間１２．３分のピークを回収した。以後、このピークをＧＡＬ６９１と呼称する。ＬＣ／ＭＳの分析結果を図１６（ダイオードアレイ検出（２６０ｎｍ））、図１７（ＵＶスペクトル）、および図１８（ＭＳスペクトル）に示す。【０２０９】
分取溶液に含まれるアセトニトリルをロータリーエバポレーター（東京理化器械）で除去した。残渣の溶液５ｍＬに対して、１０％ＴＦＡ水溶液１ｍＬを加え、転倒混和した。その後、室温にて１０分間遠心分離（１２，０００×ｇ）し、上清を除去した。得られた沈殿物に超純水（５ｍＬ）を加え、再度遠心分離を行い、上清を除去した。この操作を計３回実施することで、沈殿を洗浄した。洗浄後の沈殿は風乾後、乾燥重を測定し（１ｍｇ）、冷蔵保存した。【０２１０】
［実施例１７］グリセルアルデヒド由来ピリジニウム化合物（Ｌｙｓ−ヒドロキシ−トリオシジン）の調製
Ｌｙｓ−ヒドロキシ−トリオシジンは公知の方法により調製することができる（非特許文献１２）。具体的には以下の方法によりＬｙｓ−ヒドロキシ−トリオシジンを調製した。【０２１１】
（１）Ｌｙｓ−ヒドロキシ−トリオシジン反応溶液の調製
メタノール（富士フイルム和光純薬）、ジエチレントリアミン−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ”，Ｎ”−ペンタ酢酸（ＤＴＰＡ、同仁化学研究所）、Ｎα−アセチル−Ｌ−リシン（Ａｃ−Ｌｙｓ−ＯＨ、東京化成工業）、ＤＬ−グリセルアルデヒド（ＤＬ−ＧＬＡ、ナカライテスク）は購入により入手した。【０２１２】
５０ｍＬの遠沈管でリン酸緩衝液（０．２６７Ｍ、ｐＨ１０．５、３０ｍＬ）、メタノール（１０ｍＬ）を混合した（２５％メタノール含有０．２Ｍリン酸緩衝液）。上記の溶液３６ｍＬに対して、ＤＴＰＡ（１５．７ｍｇ）とＤＬ−ＧＬＡ（３５６．７ｍｇ）を加え、ボルテックスミキサーにて溶解させた。その後、Ａｃ−Ｌｙｓ−ＯＨ（７９９．６ｍｇ）を加えて溶解するまで攪拌した（溶液中のＤＴＰＡの濃度：１ｍＭ、ＤＬ−ＧＬＡの濃度：１１０ｍＭ、Ａｃ−Ｌｙｓ−ＯＨの濃度：１１８ｍＭ）。さらに、チューブ内の液体が蒸発しないように、パラフィルム（商標）などのフィルムにてチューブの蓋を密閉して３７℃で９日間インキュベートした。なお、反応３日目と６日目の反応液にＤＬ−ＧＬＡを２６０ｍｇ、１９６ｍｇ追加し、溶解させた。得られた反応溶液は４℃にて保存した。【０２１３】
（２）Ｌｙｓ−ヒドロキシ−トリオシジンの分離精製
Ｌｙｓ−ヒドロキシ−トリオシジン反応溶液は、孔径０．２μｍのシリンジフィルター（Ｍｉｌｌｅｘ−ＬＧ、メルク）でろ過し、ろ液を液体クロマトグラフ質量分析計（ＬＣ／ＭＳ）の試料とした。ＬＣ／ＭＳのＬＣ部及びＭＳ部は実施例１２と同様に構成した。移動相は富士フイルム和光純薬のＨＰＬＣグレードのものを購入した。移動相Ａは１Ｍ酢酸アンモニウム溶液１０ｍＬと蒸留水９９０ｍＬを混合した１０ｍＭ酢酸アンモニウム水溶液、移動相Ｂはアセトニトリルとした。分析時間０−８分において、移動相Ａ：Ｂ＝９７：３−９５：５の濃度勾配で流下した。分析時間８−１０分において、移動相Ａ：Ｂ＝９５：５−１０：９０の濃度勾配で、１０−１３分において移動相Ａ：Ｂ＝１０：９０で流下した。カラムはＺＯＲＢＡＸ  ＳＢ−Ｃ１８（１５０×９．４ｍｍ、アジレント・テクノロジー）を使用し、流速を４ｍＬ／分に設定した。ろ過後の試料溶液をＬＣ／ＭＳ装置に５０μＬ注入し、ダイオードアレイ検出器（２６９ｎｍ）とＭＳ（陽イオン検出）でＬｙｓ−ヒドロキシ−トリオシジンのピークを検出した。分析時間５．７分において、ＵＶ吸収性を持つピークが観察され、そのピークはｍ／ｚ＝４６７．３の陽イオンを含んでいた。そこで、ｍ／ｚ＝４６７をトリガーとしたＭＳ分取を行うことで、保持時間５．７分のピークを回収した。分取後の溶液はロータリーエバポレーター（東京理化器械）で濃縮乾固させた。得られた沈殿は−２０℃で保存した。【０２１４】
（３）Ｌｙｓ−ヒドロキシ−トリオシジンの構造確認
得られた沈殿（１０ｍｇ）は、重水（０．６ｍＬ、富士フイルム和光純薬）に溶解させ、外径５ｍｍの核磁気共鳴（ＮＭＲ）用サンプル管（シゲミ）に移した。その後、ＮＭＲ装置（AVANCE III HD、500MHz、CryoProbe搭載型、Ｂｒｕｋｅｒ）でＬｙｓ−ヒドロキシ−トリオシジンの構造を確認した。１Ｈ−ＮＭＲ及び１３Ｃ−ＮＭＲのスペクトルデータにて、全水素及び炭素の帰属を決定した。また、１Ｈ−１Ｈ  ＣＯＳＹ、１Ｈ−１３Ｃ  ＨＳＱＣ、１Ｈ−１３Ｃ  ＨＭＢＣスペクトルを解析することで、帰属の妥当性を確認した。Ｌｙｓ−ヒドロキシ−トリオシジンの構造を以下に示す。【０２１５】
【化２７】
2020045646.tif 000031
【０２１６】
［実施例１８］競合ＥＬＩＳＡによる新規モノクローナル抗体とＧＡＬ６９１、Ｌｙｓ−ヒドロキシ−トリオシジンの反応性評価
（１）試薬調製
下記試薬をＲＯ水に溶解させて１Ｌとし、コーティング溶液として使用した。
炭酸ナトリウム（富士フイルム和光純薬）                １．５９ｇ
炭酸水素ナトリウム（富士フイルム和光純薬）            ２．９３ｇ【０２１７】
ＢＳＡ（５ｇ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）をＰＢＳ（５００ｍＬ）に溶かし、ブロッキング溶液として使用した。【０２１８】
５０ｍＭトリス（６．１ｇ、富士フイルム和光純薬）をＲＯ水（約９００ｍＬ）に溶解させて、６Ｎ塩酸（富士フイルム和光純薬）でｐＨ７．４に調整した。得られた溶液にグリセロール（１ｍＬ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、Ｔｗｅｅｎ２０  （１ｍＬ、ナカライテスク）を加え、ＲＯ水にて１Ｌにメスアップした。得られた溶液を希釈溶液として使用した。【０２１９】
下記試薬をＲＯ水に溶解させて１Ｌとし、さらにＲＯ水を９Ｌ加えた後で、Ｔｗｅｅｎ２０（５ｍＬ）を加えた。得られた溶液を洗浄溶液として使用した。
塩化ナトリウム（富士フイルム和光純薬）                      ８０ｇ
リン酸２水素カリウム（富士フイルム和光純薬）                  ２ｇ
リン酸水素２ナトリウム１２水和物（富士フイルム和光純薬）    ２９ｇ【０２２０】
（２）抗原の固相化
コーティング溶液中で１μｇ／ｍＬに調製したグリセルアルデヒド由来ＡＧＥｓ含有ＢＳＡ（原液：１０ｍｇ／ｍＬＰＢＳ溶液）の溶液を、１００μＬずつ９６穴マイクロタイタープレート（ＣＯＳＴＡＲ）に加え、４℃で一晩インキュベートした。【０２２１】
（３）ブロッキング
固相化の処理を行った各ウェルを洗浄溶液（３００μＬ）で３回洗浄し、ブロッキング溶液（２００μＬ）を加え、室温で１時間放置した。【０２２２】
（４）競合実験
ＧＡＬ６９１（実施例１６にて調製）、Ｌｙｓ−ヒドロキシ−トリオシジン（実施例１７にて調製）をそれぞれリン酸緩衝液（０．２Ｍ、ｐＨ７．４）に溶解させ、１０ｍｇ／ｍＬ溶液を調製した。そして、希釈溶液にて希釈することで、０．６２５〜１０ｍｇ／ｍＬの２倍希釈系列（５点）の試料溶液を作製した。試料を含まないブランク溶液も同様に希釈溶液を調製した。ＰＯＤ標識化新規モノクローナル抗体（ＳＪ−５）溶液をＢＳＡ（１ｍｇ／ｍＬ、富士フイルム和光純薬）含有希釈溶液にて１２，０００倍に希釈し、ＰＯＤ標識化ＳＪ−５抗体希釈溶液とした。【０２２３】
ブロッキング溶液で処理した各ウェルを洗浄溶液（３００μＬ）で３回洗浄し、２倍希釈系列の試料溶液（各５０μＬ）およびＰＯＤ標識化ＳＪ−５抗体希釈溶液（５０μＬ）を加え、プレートミキサーで２分間撹拌後、２５℃で１時間インキュベートした。【０２２４】
（５）発色
洗浄溶液（３００μＬ）で３回洗浄後、１００μＬの基質溶液（ＥＬＩＳＡ  ＰＯＤ基質ＴＭＢキット（Ｐｏｐｕｌａｒ）、ナカライテスク）を加え、室温、遮光下で１０分間インキュベートした。その後、２Ｎ硫酸（５０μＬ）を加え発色を停止した。【０２２５】
（６）吸光度測定およびデータ解析
マイクロプレートリーダー（Ｃｙｔａｔｉｏｎ５、ＢｉｏＴｅｋ）で主波長４５０ｎｍと副波長６５０ｎｍの吸光度を測定し、主波長の吸光度から副波長の吸光度を差し引いた。ブランク溶液の吸光度に対するＧＡＬ６９１とＬｙｓ−ヒドロキシ−トリオシジンの吸光度変化を相対値として表記した。その結果を図１９に示す。ＧＡＬ６９１では濃度依存的に吸光度が低下していたが、Ｌｙｓ−ヒドロキシ−トリオシジンは吸光度の低下が観察されなかった。したがって、新規モノクローナル抗体ＳＪ−５は新規構造体のグリセルアルデヒド由来ＡＧＥｓと結合し、公知のグリセルアルデヒド由来ＡＧＥｓであるＬｙｓ−ヒドロキシ−トリオシジンを認識しない抗体であることが明らかとなった。【０２２６】
［実施例１９］ＧＡＬ６９１及び公知のＧｌｙｃｅｒ−ＡＧＥｓのラジカル測定
実施例１６で調製したＧＡＬ６９１（１０ｍｇ／ｍＬのＰＢＳ溶液）について、ＥＳＲによるラジカルの解析を行った。ＥＳＲの測定条件は以下のパラメータを除いて実施例１０と同様である：
Sampling time: 0.06s;
Field modulation Amplitude: 0.2mT;および
Microwave power: 15mW。【０２２７】
磁場はα，γ−ビスジフェニレン−β−フェニルアリル（ＢＤＰＡ）のｇ値（２．００２６４）で補正した。【０２２８】
図２０ＡのＥＳＲスペクトルより、ＧＡＬ６９１はｇ＝２．００３２８の有機ラジカルを示すシグナルが検出された。このシグナルは１０％（ｗ／ｖ）の亜硫酸ナトリウム（Ｎａ２ＳＯ３、富士フイルム和光純薬工業）の添加により大きく減衰した（図２０Ｂ）。また、ＧＬＡＰ（実施例１２）、Ｌｙｓ−ヒドロキシ−トリオシジン（実施例１７）（各１０ｍｇ／ｍＬのＰＢＳ溶液）も同様にＥＳＲ測定に供試したところ、ラジカルに由来するシグナルを検出できなかった（図２０Ｃ、図２０Ｄ）。以上の結果より、ＧＡＬ６９１は公知のＧｌｙｃｅｒ−ＡＧＥｓでは認められないラジカル性を有することが確認された。【０２２９】
［実施例２０］ＧＡＬ６９１の酸化活性に対する光照射の影響
ＡＧＥｓは眼の硝子体、ブルッフ膜、水晶体などの組織に蓄積しており、糖尿病性網膜症や加齢黄斑変性症を含む様々な疾患に関与することが指摘されている（Yokoi et al., Br. J. Ophthalmol., 2005, 89, 673-675; Glenn et al., Invest. Ophthalmol. Vis. Sci., 2009, 50(1), 441-451; Nagaraj et al., Amino Acids, 201242, 1205-1220; Katagiri et al., Int. Ophthalmol., 2017, 38(2), 1-9; Kanda et al., Sci. Rep., 2017, 7, 16168）。また、眼は光を電気信号に変換することで脳へ情報を伝達する重要な器官である。そこで、ＡＧＥｓと光の関係に注目し、ＧＡＬ６９１の酸化活性に対する光の影響を検討した。【０２３０】
実施例１６で調製したＧＡＬ６９１およびＺ−Ｌｙｓ（各２ｍｇ／ｍＬのＰＢＳ溶液）について、実施例１１と同様にＤＡＢに対する酸化活性を検討した。このとき、白色ＬＥＤの照射下（３０００ｌｕｘ）で一晩反応させた。【０２３１】
図２１に示すように、ＤＡＢの酸化による生成物はＧＡＬ６９１単独処理（遮光下）に比べ、ＧＡＬ６９１と光照射下での処理で２．６倍増加していた。したがって、ＧＡＬ６９１の酸化活性は光照射下でより強力になることが明らかとなった。【０２３２】
［実施例２１］ＧＡＬ６９１の光増感作用による一重項酸素の生成
実施例１６で調製したＧＡＬ６９１について、光増感作用による一重項酸素の生成能を検証した。ＧＡＬ６９１の対照区として用いたＮ−α，Ｎ−ε−ジ（カルボベンゾキシ）−Ｌ−リシン（Ｚ−Ｌｙｓ（Ｚ）−ＯＨ）について、渡辺化学工業より購入した。
０．６ｍＬ容マイクロチューブ（ワトソン）にて、２５μＬのＧＡＬ６９１もしくはＺ−Ｌｙｓ（Ｚ）−ＯＨ（１０ｍＭ、ＰＢＳ溶液）、１２．５μＬの４−ヒドロキシ−２，２，６，６−テトラメチルピペリジン（４−ＯＨ−ＴＥＭＰ；東京化成工業、４００ｍＭ、ＰＢＳ溶液）、１２．５μＬのＰＢＳを混合し、反応溶液を調製した。４−ＯＨ−ＴＥＭＰは一重項酸素を捕捉してニトロキシドラジカルに変化するため、ＥＳＲを用いた一重項酸素の検出によく利用されている（Nakamura et al., J. Clin. Biochem. Nutr., 2011, 49(2), 87-95）。携帯型ＬＥＤ光源（美舘イメージング）を用いて、反応溶液にＵＶ３６５ｎｍ、青色４７０ｎｍ、緑色５３０ｎｍ、または赤色６３０ｎｍの光を１時間照射した。その後、各反応溶液の一部（５０μＬ）を用いてＥＳＲの測定を行った。ＥＳＲの測定は一部のパラメータを除いて実施例１０と同様の条件で実施した。変更した測定パラメータについて、以下の通りである：
Field center: 3354.47G; Field width: 70G; Sampling time: 0.06s; Field modulation amplitude: 0.1mT; Microwave power: 15mW。【０２３３】
生成したニトロキシドラジカルの濃度を定量するため、以下の解析を行った。まず、観察されたニトロキシドラジカルのスペクトルをＸｅｐｒソフトウェア（Ｂｒｕｋｅｒ）内のＳｐｉｎＦｉｔモジュールでシミュレーションし、ラジカル種を同定した（ｇ＝２．００５８、Ｉ＝１、ＡＮ＝１７．０５Ｇ）。その後、ＳｐｉｎＣｏｕｎｔモジュールにて、シミュレーションしたニトロキシドラジカルのスピン濃度（μＭ）を求めた。【０２３４】
図２２に示すように、ＧＡＬ６９１は特に青色光照射によって、ニトロキシドラジカルを顕著に生成させることが分かった。したがって、ＧＡＬ６９１は光増感作用により一重項酸素を生成するグリセルアルデヒド由来ＡＧＥｓであることが示された。【０２３５】
［実施例２２］ＧＡＬ６９１と既知のグリセルアルデヒド由来ＡＧＥｓにおける光増感作用を介した一重項酸素生成量の比較
ＧＡＬ６９１（実施例１６）、ＧＬＡＰ（実施例１２）、Ｌｙｓ−ヒドロキシ−トリオシジン（実施例１７）について、青色光照射下における一重項酸素の生成量を比較した。試料の調製方法、光源、ＥＳＲ分析条件、ＥＳＲスペクトルの解析条件は実施例２１に準じた。測定試料の調製において、一重項酸素の捕捉剤であるアスタキサンチン（富士フイルム和光純薬）は１０ｍＭのジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ、富士フイルム和光純薬）溶液を調製し、ＰＢＳの替わりに１２．５μＬ加えた（終濃度２．５ｍＭ）。アスタキサンチン未処理の試料については、ＰＢＳではなく、ＤＭＳＯを１２．５μＬ加えた。【０２３６】
その結果を図２３に示す。青色光照射による一重項酸素の生成量はＧＬＡＰやＬｙｓ−ヒドロキシ−トリオシジンに比べ、ＧＡＬ６９１は９倍多かった。また、ＧＡＬ６９１と光照射により発生した一重項酸素はアスタキサンチンにより捕捉されていた。これらのことから、公知のグリセルアルデヒド由来ＡＧＥｓに比べ、ＧＡＬ６９１は強力な光増感作用を示す新規グリセルアルデヒド由来ＡＧＥであることが示された。【０２３７】
［実施例２３］ＧＡＬ６９１のスーパーオキシドアニオン生成能の検討
ＧＡＬ６９１（実施例１６）、ＧＬＡＰ（実施例１２）、Ｌｙｓ−ヒドロキシ−トリオシジン（実施例１７）について、青色光照射下におけるスーパーオキシドアニオンの生成量を比較した。スーパーオキシドアニオンの生成は１−ヒドロキシ−４−ホスホノオキシ−２，２，６，６−テトラメチルピペリジン（ＰＰＨ）を用いてＥＳＲを測定することにより確認した。すなわち、スーパーオキシドアニオンを捕捉したＰＰＨは安定な窒素酸化物に変化するため、そのラジカル濃度をＥＳＲで測定し、スーパーオキシドアニオン量として評価した（Dikalov et al., Biochemical and Biophysical Research Communications, 1998, 248, 211-215）。ＰＰＨ−ＨＣｌ（Ｅｎｚｏ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）について１０ｍＭのＰＢＳ溶液（ｐＨ７．４）を調製した。各２５μＬのＧＡＬ６９１、Ｚ−Ｌｙｓ（Ｚ）、ＧＬＡＰ、Ｌｙｓ−ヒドロキシ−トリオシジン（１０ｍＭのＰＢＳ溶液）を０．６ｍＬ容マイクロチューブに加えた。そして、１２．５μＬのＰＰＨ溶液、１２．５μＬのＤＴＰＡ（０．４ｍＭ）含有ＰＢＳを加え、計５０μＬの反応溶液を調製した。その後、青色光照射を１時間行い、ＥＳＲを測定した。なお、光源、ＥＳＲ分析条件、ＥＳＲスペクトルの解析条件は実施例２１と同様であるが、Ｍｉｃｒｏｗａｖｅ  ｐｏｗｅｒのみ５ｍＷに変更した。【０２３８】
結果を図２４に示す。光を照射しない場合（遮光下）、ＧＡＬ６９１は他のグリセルアルデヒド由来ＡＧＥｓに比べ、４倍量以上のスーパーオキシドアニオンを生成していた。さらに、その生成量は青色光照射により約３倍増加した。したがって、ＧＡＬ６９１は光に依存せずスーパーオキシドアニオンを生成するグリセルアルデヒド由来ＡＧＥであり、その生成量は光によって増強されることが示された。【０２３９】
［実施例２４］免疫抗原の調製
実施例２で沈殿物として得たＧｌｙｃｅｒ−ＡＧＥｓ−Ｚ−Ｌｙｓを０．２Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）に溶解させ、５０ｍｇ／ｍＬの試料溶液を調製した。その後、孔径０．２μｍのシリンジフィルター（Ｍｉｌｌｅｘ−ＬＧ、メルク）でろ過し、ろ液をＬＣ／ＭＳの試料とした。ＬＣ／ＭＳの分析条件は実施例１６と同様である。新規構造体であるＧＡＬ６９１を含む保持時間１０−１６分の画分を分取した。分取溶液に含まれるアセトニトリルはロータリーエバポレーター（東京理化器械）で除去した。残渣の溶液（５ｍＬ）に対して、１０％ＴＦＡ水溶液（１ｍＬ）を加え、転倒混和した。その後、室温にて１０分間遠心分離（１２，０００×ｇ）し、上清を除去した。得られた沈殿物に超純水（５ｍＬ）を加え、再度遠心分離を行い、上清を除去した。この操作を計３回実施することで、沈殿を洗浄した。洗浄後の沈殿は風乾後、乾燥重を測定し、冷蔵保存した。５０ｍｇ／ｍＬの試料溶液１ｍＬあたり２０ｍｇの沈殿を得た。【０２４０】
乾燥後の沈殿を０．２Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）に溶解させ、終濃度を４０ｍｇ／ｍＬとした（Ａ−ｐｅａｋ溶液）。さらに、この溶液をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ、ｐＨ７．４）にて１０倍希釈し、終濃度を４ｍｇ／ｍＬとした。キャリアタンパク質の溶液は以下のように調製した。ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）の凍結乾燥粉末をＰＢＳに溶解させ、終濃度を１０ｍｇ／ｍＬとした。１．５ｍＬ容のEppendorf Safe-Lock Tubes（エッペンドルフ）内で、４ｍｇ／ｍＬのＡ−ｐｅａｋ溶液（５００μＬ）と１０ｍｇ／ｍＬのＢＳＡ溶液（２００μＬ）を混合した。続いて、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を超純水に溶解させ、１０ｍｇ／ｍＬ水溶液を作製した。Ａ−ｐｅａｋとＢＳＡの混合溶液（７００μＬ）に、１０ｍｇ／ｍＬ  ＥＤＣ水溶液（１００μＬ）を素早く添加し、転倒混和した後、室温にて一晩インキュベートした。【０２４１】
反応終了後、直ちにZeba Spin Desalting Columns（７Ｋ  ＭＷＣＯ、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で反応溶液をゲルろ過した。さらに、Slide-A-Lyzer MINI Dialysis Device（３．５Ｋ  ＭＷＣＯ、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用し、低温下（４℃）で透析した。透析外液はＰＢＳとした。透析を開始して３時間後に外液を交換し、さらに一晩の透析を行った。【０２４２】
透析終了後、透析デバイス内の溶液を回収し、アミコンウルトラ−０．５（３０Ｋ  ＭＷＣＯ、メルク）で濃縮した。Pierce BCA Protein Assay Kit（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）でＡ−ｐｅａｋを架橋させたＢＳＡ（Ａ−ｐｅａｋ−ＢＳＡ）のタンパク質濃度を求め、ＰＢＳにて任意のタンパク質濃度に調整した。Ａ−ｐｅａｋ−ＢＳＡはマウスモノクローナル抗体作製における免疫抗原として使用した。【０２４３】
［実施例２５］モノクローナル抗体の作製（ＰＢ−１）
（１）マウスへの免疫
免疫抗原として、Ａ−ｐｅａｋ−ＢＳＡ（４ｍｇ／ｍＬ）を同じ容量のAdjuvant Complete Freund（ＢＤ）と混合してエマルジョンを調製し（抗原の濃度：２ｍｇ／ｍＬ）、ＢＡＬＢ／ｃマウス１０匹の背部皮下に初回免疫をした（抗原の量：２００μｇ／匹）。Ａ−ｐｅａｋ−ＢＳＡ（１ｍｇ／ｍＬ）を同じ容量のAdjuvant Complete Freund（ＢＤ）と混合して調製したエマルジョン（抗原の濃度：０．５ｍｇ／ｍＬ）を用いて１週間おきに追加免疫（抗原の量：５０μｇ／匹）を行った。初回免疫から６回免疫した後に尾静脈より採血を行い、抗体価の確認を行った。抗体価の高かったものに対して、追加免疫用の抗原（抗原の量：５０μｇ／匹）をマウスの腹腔内に最終投与し、その３日後に細胞融合用に脾臓を摘出した。【０２４４】
（２）抗体価の測定
抗血清の力価をＥＬＩＳＡで評価した。９６穴マイクロタイタープレート（ＮＵＮＣ）に、免疫抗原であるＡ−ｐｅａｋ−ＢＳＡを５μｇ／ｍＬの濃度で５０μＬ／ウェルずつ加え、一晩４℃で固相化した。０．０５％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ（ＰＢＳ−Ｔ）で３回洗浄後、０．５％（ｗ／ｖ）ゼラチンを含むＰＢＳ−Ｔで１時間ブロッキングした。抗血清は５００倍から５倍ずつ段階希釈し、１５６２５００倍までの希釈系列を調製後、抗原固相化プレートに５０μＬ／ウェルずつ入れて１時間静置した。洗浄後、０．１％ゼラチンＰＢＳ−Ｔで１００００倍に希釈した２次抗体（西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）標識化抗マウスＩｇＧ（ＫＰＬ）を５０μＬ／ウェルずつ入れて１時間静置した。洗浄後、各ウェルに０．０２％（ｗ／ｖ）の過酸化水素を含む０．１Ｍクエン酸リン酸緩衝液（ｐＨ５．０）で０．５ｍｇ／ｍＬに調整したｏ−フェニレンジアミン溶液（１００μＬ）を添加し、２５℃で２０分間静置した後に、２Ｎ硫酸溶液（５０μＬ）を各ウェルに添加し、呈色反応を停止した。その後４９０ｎｍの吸光度をマイクロプレートリーダーによって測定した。その結果、抗血清の１２５００倍以上の希釈溶液において、抗原と有意な反応性を示したマウスを細胞融合に使用した。【０２４５】
（３）脾臓細胞の調製と細胞融合
マウスから摘出した脾臓をすりつぶし、１匹あたり約１×１０８個の脾臓細胞を調製した。ミエローマ細胞であるＰ３Ｕ１を培養し、細胞融合当日に生細胞率が９５％以上のＰ３Ｕ１を調製した。前記脾臓細胞とＰ３Ｕ１を５：１（細胞数の比）で混ぜ、５０％（ｗ／ｖ）濃度の分子量４０００のポリエチレングリコールにより細胞融合を行った。融合後、細胞を培地で洗浄し、ＨＡＴ培地に懸濁させ、９６穴培養プレートの各ウェルに１×１０５個／ウェルとなるように細胞を播きこみ、ハイブリドーマの選択培養を行った。細胞融合１０日目にハイブリドーマ培養上清を回収し、培養上清中の抗体価の測定を行った。【０２４６】
（４）抗体産生陽性ウェルのスクリーニング
細胞融合後、１０日目の培養上清を回収し、抗体産生陽性ウェルのスクリーニングを上記の抗体価測定方法で行った。Ａ−ｐｅａｋ−ＢＳＡ、グリセルアルデヒド由来ＡＧＥｓ含有ＫＬＨ（Ｇｌｙｃｅｒ−ＡＧＥｓ−ＫＬＨ）に陽性、ＢＳＡに陰性であるクローンについて選択した。なお、Ｇｌｙｃｅｒ−ＡＧＥｓ−ＫＬＨの調製方法は実施例２７に示した。【０２４７】
（５）クローニング
Ａ−ｐｅａｋ−ＢＳＡに対する特異性の高かったクローンを限界希釈法でクローニングを行った。すなわち、細胞を１０％のＦＢＳを含むＲＰＭＩ培地で１０個／ｍＬに調製し、９６穴培養プレート２枚分の各ウェルに２００μＬずつ添加した。１０日後、培養上清中のＡ−ｐｅａｋ−ＢＳＡ、Ｇｌｙｃｅｒ−ＡＧＥｓ−ＫＬＨに陽性、およびＢＳＡに陰性であることを確認し、それぞれのウェルに由来するクローンを得た。特異性を十分に備えた本発明の抗体として、新規モノクローナル抗体ＰＢ−１産生細胞を得た。【０２４８】
（６）抗体の精製
新規モノクローナル抗体ＰＢ−１産生細胞を、１０％のＦＢＳを含むＲＰＭＩ培地で培養後、ＰＢＳにて洗浄し、無血清培地（ＳＦＭ培地、ＧＩＢＣＯ）にて５日〜７日間培養し培養上清を得た。培養上清をプロテインＧカラム（ＧＥヘルスケア）にて、ＩｇＧ画分を精製し、特異性を十分に備えた本発明の抗体として、新規モノクローナル抗体ＰＢ−１を得た。【０２４９】
［実施例２６］モノクローナル抗体ＰＢ−１の解離定数測定
モノクローナル抗体ＰＢ−１について、以下の手法で解離定数（Ｋｄ値）を測定した。Ａ−ｐｅａｋ−ＢＳＡを１０ｍＭ酢酸ナトリウム溶液（ｐＨ５．０）で希釈し、終濃度５０μｇ／ｍＬのリガンド溶液を調製した。リガンドの固定化およびＫｄ値の算出について、Ｂｉａｃｏｒｅ  Ｔ２００（ＧＥヘルスケア）を使用した。アミンカップリングキット（ＧＥヘルスケア）を用いて、センサーチップＣＭ５（ＧＥヘルスケア）上にリガンド溶液を固定化した（最終固定化量７２ＲＵ）。続いて、ランニング緩衝液のＨＢＳ−Ｐ＋（ＧＥヘルスケア）にて０．１９５３〜５０ｎＭのＰＢ−１抗体希釈溶液を作製し、センサーグラムを取得した。【０２５０】
フィッティングモデルとして１：１  ｂｉｎｄｉｎｇを採用し、センサーグラムを解析した結果、ＰＢ−１モノクローナル抗体のＫｄ値は４．１５ｎＭであった。【０２５１】
常法により決定した可変領域のアミノ酸配列を図２５に示す。下線部分はＣＤＲ配列を表す。【０２５２】
［実施例２７］グリセルアルデヒド由来ＡＧＥｓ含有スカシガイヘモシアニン（Ｇｌｙｃｅｒ−ＡＧＥｓ−ＫＬＨ）の調製
Ｇｌｙｃｅｒ−ＡＧＥｓ−ＫＬＨの調製方法は、実施例１に記載したＧｌｙｃｅｒ−ＡＧＥｓ−ＢＳＡの調製方法に準じた。ただし、５００ｍｇのＢＳＡではなく、１６７ｍｇのヘモシアニン、スカシガイ製（ＫＬＨ、富士フイルム和光純薬）をＤＬ−グリセルアルデヒドと反応させた（溶液中のＫＬＨの濃度：８．３ｍｇ／ｍＬ）。【０２５３】
［実施例２８］グリコールアルデヒド由来ピリジニウム化合物（ＧＡ−ピリジン）の調製
ＧＡ−ピリジンは公知の方法により調製することができる（Murakami et al. Bioscience Biotechnology and Biochemistry, 2018, 82(2), 312-319）。具体的には以下の方法によりＧＡ−ピリジンを調製した。【０２５４】
（１）ＧＡ−ピリジン反応溶液の調製
Ｎα−アセチル−Ｌ−リシン（Ａｃ−Ｌｙｓ−ＯＨ、東京化成工業）、グリコールアルデヒドダイマー（ＧＡ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）は購入により入手した。５０ｍＬの遠沈管に０．９６ｇのＧＡ（０．２Ｍ）を加え、４０ｍＬのリン酸緩衝液（０．２Ｍ、ｐＨ７．４）で完全に溶解させた。その後、０．７５ｇのＡｃ−Ｌｙｓ−ＯＨ（０．１Ｍ）を加えて溶解するまで攪拌した。チューブ内の液体が蒸発しないように、パラフィルム（商標）などのフィルムにてチューブの蓋を密閉し、５０℃で３日間インキュベートした。得られた反応溶液は４℃にて保存した。【０２５５】
（２）ＧＡ−ピリジンの分離精製
ＧＡ−ピリジン反応溶液は、孔径０．２μｍのシリンジフィルター（Ｍｉｌｌｅｘ−ＬＧ、メルク）でろ過し、ろ液を液体クロマトグラフ質量分析計（ＬＣ／ＭＳ）の試料とした。ＬＣ／ＭＳのＬＣ部及びＭＳ部は実施例１２と同様に構成した。移動相は富士フイルム和光純薬のＨＰＬＣグレードのものを購入した。移動相Ａはギ酸１ｍＬと蒸留水１０００ｍＬを混合した０．１％ギ酸水溶液、移動相Ｂはアセトニトリル５００ｍＬ、蒸留水５００ｍＬ、ギ酸１ｍＬと混合した５０％アセトニトリル／０．１％ギ酸溶液とした。分析時間０−１０分において、移動相Ａ：Ｂ＝１００：０−９０：１０の濃度勾配で流下した。分析時間１０−１２分において、移動相Ａ：Ｂ＝９０：１０−０：１００の濃度勾配で、１２−１５分において移動相Ａ：Ｂ＝０：１００で流下した。カラムは３５℃にてＺＯＲＢＡＸ  ＳＢ−Ｃ１８（１５０×９．４ｍｍ、アジレント・テクノロジー）を使用し、流速を４ｍＬ／分に設定した。ろ過後の試料溶液をＬＣ／ＭＳ装置に８０μＬ注入し、ダイオードアレイ検出器（２９０ｎｍ）とＭＳ（陽イオン検出）でＧＡ−ピリジンのピークを検出した。分析時間６分において、ＵＶ吸収性を持つピークが観察され、そのピークはｍ／ｚ＝２９７．１の陽イオンを含んでいた。そこで、ｍ／ｚ＝２９７をトリガーとしたＭＳ分取を行うことで、保持時間６分のピークを回収した。分取後の溶液はロータリーエバポレーター（東京理化器械）で濃縮乾固させた。得られた沈殿は−２０℃で保存した。【０２５６】
（３）ＧＡ−ピリジンの構造確認
得られた沈殿（４．７ｍｇ）は、重水（０．６ｍＬ、富士フイルム和光純薬）に溶解させ、外径５ｍｍの核磁気共鳴（ＮＭＲ）用サンプル管（シゲミ）に移した。その後、ＮＭＲ装置（AVANCE III HD、500MHz、CryoProbe搭載型、Ｂｒｕｋｅｒ）でＧＡ−ピリジンの構造を確認した。得られた１Ｈ−ＮＭＲのスペクトルデータを非特許文献（Nagai et al., Journal of Biological chemistry, 2002, 277(50), 48905-48912）と比較し、全水素の帰属を決定した。また、１Ｈ−１３Ｃ  ＨＳＱＣスペクトルを解析することで、帰属の妥当性を確認した。ＧＡ−ピリジンの構造を以下に示す。【０２５７】
【化２８】
2020045646.tif 000032
【０２５８】
［実施例２９］グリオキサール由来リシンダイマー（ＧＯＬＤ）の調製
ＧＯＬＤ（Wells-Knecht et al., J. Org. Chem. 1995, 60, 6264-6247）は以下の方法により調製した。【０２５９】
（１）反応溶液の調製
Ｎα−アセチル−Ｌ−リシン（Ａｃ−Ｌｙｓ−ＯＨ、東京化成工業）、４０％グリオキサール溶液（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）は購入により入手した。リン酸緩衝液（０．５Ｍ、ｐＨ７．４、１ｍＬ）に１８８ｍｇのＡｃ−Ｌｙｓ−ＯＨを溶解させ、１Ｍ溶液を調製した。マイクロチューブ内にて、１Ｍ  Ａｃ−Ｌｙｓ−ＯＨ溶液（５００μＬ）、４０％グリオキサール溶液（７３μＬ）、０．５Ｍリン酸緩衝液（４２７μＬ）を混合し、ボルテックスミキサーで攪拌した。その後、チューブを密閉して９５℃で５分間加熱した。得られた反応溶液は４℃にて保存した。【０２６０】
（２）ＧＯＬＤの分離精製
ＧＯＬＤ反応溶液は、孔径０．２μｍのシリンジフィルター（Ｍｉｌｌｅｘ−ＬＧ、メルク）でろ過し、ろ液を液体クロマトグラフ質量分析計（ＬＣ／ＭＳ）の試料とした。ＬＣ／ＭＳのＬＣ部及びＭＳ部は実施例１２と同様に構成した。移動相は富士フイルム和光純薬のＨＰＬＣグレードのものを購入した。移動相Ａはギ酸１ｍＬと蒸留水１０００ｍＬを混合した０．１％ギ酸水溶液、移動相Ｂはアセトニトリル５００ｍＬ、蒸留水５００ｍＬ、ギ酸１ｍＬと混合した５０％アセトニトリル／０．１％ギ酸溶液とした。分析時間０−１０分において、移動相Ａ：Ｂ＝９５：５−７０：３０の濃度勾配で流下した。分析時間１０−１２分において、移動相Ａ：Ｂ＝７０：３０−０：１００の濃度勾配で、１２−１５分において移動相Ａ：Ｂ＝０：１００で流下した。カラムは３５℃にてＺＯＲＢＡＸ  ＳＢ−Ｃ１８（１５０×９．４ｍｍ、アジレント・テクノロジー）を使用し、流速を４ｍＬ／分に設定した。ろ過後の試料溶液をＬＣ／ＭＳ装置に２０μＬ注入し、ダイオードアレイ検出器（２１５ｎｍ）とＭＳ（陽イオン検出）でＧＯＬＤのピークを検出した。分析時間４．２分において、ＵＶ吸収性を持つピークが観察され、そのピークはｍ／ｚ＝４１１．２の陽イオンを含んでいた。そこで、ｍ／ｚ＝４１１をトリガーとしたＭＳ分取を行うことで、保持時間４．２分のピークを回収した。分取後の溶液はロータリーエバポレーター（東京理化器械）で濃縮乾固させた。得られた沈殿は−２０℃で保存した。【０２６１】
（３）ＧＯＬＤの構造確認
得られた沈殿（６．７ｍｇ）は、重水（０．６ｍＬ、富士フイルム和光純薬）に溶解させ、外径５ｍｍの核磁気共鳴（ＮＭＲ）用サンプル管（シゲミ）に移した。その後、ＮＭＲ装置（AVANCE III HD、500MHz、CryoProbe搭載型、Ｂｒｕｋｅｒ）でＧＯＬＤの構造を確認した。１Ｈ−ＮＭＲ及び１３Ｃ−ＮＭＲのスペクトルデータについて、上記文献を参照し、全水素及び炭素の帰属を決定した。また、１Ｈ−１Ｈ  ＣＯＳＹ、１Ｈ−１３Ｃ  ＨＳＱＣ、１Ｈ−１３Ｃ  ＨＭＢＣスペクトルを解析することで、帰属の妥当性を確認した。ＧＯＬＤの構造を以下に示す。【０２６２】
【化２９】
2020045646.tif 000033
【０２６３】
［実施例３０］ＥＬＩＳＡ競合法による新規モノクローナル抗体ＰＢ−１の特異性の確認
（１）抗原の固相化
９６穴マイクロタイタープレート（Ｃｏｓｔｅｒ）の各ウェルに、コーティング溶液（実施例１３）で１μｇ／ｍＬの濃度に調製したＡ−ｐｅａｋ−ＢＳＡもしくはＧｌｙｃｅｒ−ＡＧＥｓ−ＢＳＡを１００μＬ加え、一晩４℃で固相化した。【０２６４】
（２）ブロッキング
０．０５％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ（ＰＢＳ−Ｔ）で３回洗浄後、０．５％（ｗ／ｖ）ゼラチンを含むＰＢＳ−Ｔで１時間ブロッキングした。【０２６５】
（３）競合反応
０．１％（ｗ／ｖ）ゼラチン含有ＰＢＳ−Ｔで１０μｇ／ｍＬに希釈したウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、グルコース由来ＡＧＥｓ含有ＢＳＡ（Ｇｌｕ−ＡＧＥｓ−ＢＳＡ）、フルクトース由来ＡＧＥｓ含有ＢＳＡ（Ｆｒｕ−ＡＧＥｓ−ＢＳＡ）、グリコールアルデヒド由来ＡＧＥｓ含有ＢＳＡ（Ｇｌｙｃｏｌ−ＡＧＥｓ−ＢＳＡ）、グリセルアルデヒド由来ＡＧＥｓ含有ＢＳＡ（Ｇｌｙｃｅｒ−ＡＧＥｓ−ＢＳＡ）、Ｎε−カルボキシエチルリシン含有ＢＳＡ（ＣＥＬ−ＡＧＥｓ−ＢＳＡ）、Ｎε−カルボキシメチルリシン含有ＢＳＡ（ＣＭＬ−ＡＧＥｓ−ＢＳＡ）、グリオキサール由来ＡＧＥｓ含有ＢＳＡ（ＧＯ−ＡＧＥｓ−ＢＳＡ）、メチルグリオキサール由来ＡＧＥｓ含有ＢＳＡ（ＭＧＯ−ＡＧＥｓ−ＢＳＡ）、Ａ−ｐｅａｋ−ＢＳＡを抗原固相化プレートに各５０μＬずつ添加し、さらに０．１％（ｗ／ｖ）ゼラチン含有ＰＢＳ−Ｔで０．０５μｇ／ｍＬに希釈したＰＢ−１抗体を５０μＬ加え、プレートミキサーで撹拌後、室温で１時間静置した。【０２６６】
（４）検出用抗体との反応
洗浄後、０．１％（ｗ／ｖ）ゼラチン含有ＰＢＳ−Ｔで０．０５μｇ／ｍＬに希釈したペルオキシダーゼ標識抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）ポリクローナル抗体、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント（ＫＰＬ）を１００μＬずつウェルに加え、室温で１時間静置した。【０２６７】
（５）発色および吸光度測定
洗浄後、ＥＬＩＳＡ  ＰＯＤ基質ＴＭＢキット（ナカライテスク）を各ウェル１００μＬ加え、暗所、室温下で静置した。１０分後に２Ｎ硫酸を５０μＬずつ加え、発色を停止させた。マイクロプレートリーダー（Ｃｙｔａｔｉｏｎ５、ＢｉｏＴｅｋ）で主波長４５０ｎｍと副波長６５０ｎｍの吸光度を測定し、主波長の吸光度から副波長の吸光度を差し引いた。【０２６８】
図２６Ａに固相化抗原としてＡ−ｐｅａｋ−ＢＳＡを用いたときのＰＢ−１抗体の特異性の結果、図２６Ｂに固相化抗原としてＧｌｙｃｅｒ−ＡＧＥｓ−ＢＳＡを用いたときのＰＢ−１抗体の特異性の結果を示す。グラフの縦軸は対照のＢＳＡを１とした場合の吸光度変化で表した。Ａ−ｐｅａｋ−ＢＳＡ並びにＧｌｙｃｅｒ−ＡＧＥｓ−ＢＳＡを固相化した場合においても、新規モノクローナル抗体ＰＢ−１の特異性として、Ｇｌｙｃｏｌ−ＡＧＥｓ−ＢＳＡ、Ｇｌｙｃｅｒ−ＡＧＥｓ−ＢＳＡ、Ａ−ｐｅａｋ−ＢＳＡに陽性、Ｇｌｕ−ＡＧＥｓ−ＢＳＡ、Ｆｒｕ−ＡＧＥｓ−ＢＳＡ、ＣＥＬ−ＡＧＥｓ−ＢＳＡ、ＣＭＬ−ＡＧＥｓ−ＢＳＡ、ＧＯ−ＡＧＥｓ−ＢＳＡ、ＭＧＯ−ＡＧＥｓ−ＢＳＡに陰性であった。【０２６９】
［実施例３１］競合ＥＬＩＳＡによる新規モノクローナル抗体ＰＢ−１の反応性評価
（１）抗原の固相化
実施例１３に記載した試薬を用いて競合ＥＬＩＳＡを行った。コーティング溶液中で１μｇ／ｍＬに調製したＡ−ｐｅａｋ−ＢＳＡの溶液を、１００μＬずつ９６穴マイクロタイタープレート（Ｃｏｓｔａｒ）に加え、４℃で一晩インキュベートした。【０２７０】
（２）ブロッキング
固相化の処理を行った各ウェルを洗浄溶液（３００μＬ）で３回洗浄し、ブロッキング溶液（２００μＬ）を加え、室温で１時間放置した。【０２７１】
（３）競合実験
ＧＡＬ６９１（実施例１６にて調製）、ＧＬＡＰ（実施例１２にて調製）、Ｌｙｓ−ヒドロキシ−トリオシジン（実施例１７にて調製）、ＧＡ−ピリジン（実施例２８にて調製）、ＧＯＬＤ（実施例２９にて調製）、Ｚ−Ｌｙｓをそれぞれリン酸緩衝液（０．２Ｍ、ｐＨ７．４）に溶解させ、１００ｍＭ溶液を調製した。その後、ＢＳＡ（１ｍｇ／ｍＬ、富士フイルム和光純薬）含有希釈溶液にて１０倍希釈し、１０ｍＭ溶液を作製した。さらに、１０％（ｖ／ｖ）リン酸緩衝液及び１ｍｇ／ｍＬ  ＢＳＡ含有希釈液にて、０．０４、０．１６、０．６３、２．５ｍＭの４倍希釈系列の試料溶液を作製した。試料を含まないブランク溶液として、リン酸緩衝液を同様に１ｍｇ／ｍＬ  ＢＳＡ含有希釈溶液で１０倍希釈したものを調製した。ＰＢ−１抗体については、１ｍｇ／ｍＬ  ＢＳＡ含有希釈液にて、０．１μｇ／ｍＬ溶液を調製した。【０２７２】
ブロッキング溶液で処理した各ウェルを洗浄溶液（３００μＬ）で３回洗浄し、４倍希釈系列の試料溶液（各５０μＬ）およびＰＢ−１抗体希釈溶液（５０μＬ）を加え、プレートミキサーで２分間撹拌後、室温で１時間インキュベートした。【０２７３】
（４）検出用抗体との反応
競合反応後の各ウェルを洗浄溶液（３００μＬ）で３回洗浄し、１ｍｇ／ｍＬ  ＢＳＡ含有希釈溶液で０．０５μｇ／ｍＬに希釈したペルオキシダーゼ標識抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）ポリクローナル抗体、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント（ＫＰＬ）を１００μＬずつウェルに加え、室温で１時間静置した。【０２７４】
（５）発色
洗浄溶液（３００μＬ）で３回洗浄後、１００μＬの基質溶液（ＥＬＩＳＡ  ＰＯＤ基質ＴＭＢキット（Ｐｏｐｕｌａｒ）、ナカライテスク）を加え、室温、遮光下で１０分間インキュベートした。その後、２Ｎ硫酸（５０μＬ）を加え発色を停止した。【０２７５】
（６）吸光度測定およびデータ解析
マイクロプレートリーダー（Ｃｙｔａｔｉｏｎ５、ＢｉｏＴｅｋ）で主波長４５０ｎｍと副波長６５０ｎｍの吸光度を測定し、主波長の吸光度から副波長の吸光度を差し引いた。ブランク溶液の吸光度に対するＧＡＬ６９１、ＧＬＡＰ、Ｌｙｓ−ヒドロキシ−トリオシジン、ＧＡ−ピリジン、ＧＯＬＤ、Ｚ−Ｌｙｓの吸光度変化を相対値として表記した。その結果を図２７に示す。ＧＡＬ６９１では濃度依存的に吸光度が低下していたが、その他の化合物では吸光度の低下が観察されなかった。したがって、新規モノクローナル抗体ＰＢ−１は新規構造体のグリセルアルデヒド由来ＡＧＥｓと結合し、公知のグリセルアルデヒド由来ＡＧＥｓであるＧＬＡＰやＬｙｓ−ヒドロキシ−トリオシジン、公知のグリコールアルデヒド由来ＡＧＥｓであるＧＡ−ピリジンやグリオキサール由来ＡＧＥｓであるＧＯＬＤを認識しない抗体であることが明らかとなった。
ポリクローナル【０２７６】
［実施例３２］ＰＢ−１抗体を用いたＡ−ｐｅａｋ−ＢＳＡによるＤＡＢ酸化の抑制試験
（１）反応溶液の調製
ジアミノベンシジン（ＤＡＢ、同仁化学）は５ｍｇ／ｍＬのＰＢＳ溶液を調製した。Ａ−ｐｅａｋ−ＢＳＡ（２ｍｇ／ｍＬ、ＰＢＳ溶液）の調製は実施例２４と同様である。０．６ｍＬ容のマイクロチューブ（ワトソン）にＤＡＢ溶液を１０μＬ加え、さらにＰＢＳ、ＰＢ−１抗体（１．８ｍｇ／ｍＬ）、またはマウスＩｇＧアイソタイプコントロール（Ｃｔｒｌ−ｍＩｇＧ、Thermo Fisher Scientific）を１００μＬ加えた。ボルテックスミキサーで撹拌後、Ａ−ｐｅａｋ−ＢＳＡ溶液を１０μＬ加えた。これらの溶液をボルテックスミキサーで撹拌後、白色ＬＥＤ（３０００ｌｕｘ）を一晩照射した。光照射後の溶液について、ボルテックスミキサーで撹拌後、スピンダウンし、１００μＬをビオラモ９６ウェルプレート（アズワン）に回収した。【０２７７】
（２）吸光度測定およびデータ解析
マイクロプレートリーダー（Ｃｙｔａｔｉｏｎ５、ＢｉｏＴｅｋ）で波長４６０ｎｍの吸光度を測定し、酸化されたＤＡＢを検出した。その結果を図２８に示す。グラフの縦軸は抗体未処理区（ＰＢＳ添加区）において検出された酸化型ＤＡＢに対する相対値として表記した。ＰＢＳ処理区やＣｔｒｌ−ｍＩｇＧ処理区に比べ、ＰＢ−１抗体処理区において、酸化型ＤＡＢが大きく減少していた。この結果より、ＰＢ−１抗体は新規構造体のグリセルアルデヒド由来ＡＧＥｓと結合することで、新規構造体によるＤＡＢの酸化作用を抑制できることが示された。【０２７８】
［実施例３３］ＳＪ−５抗体と抗ＧＡ−ピリジンモノクローナル抗体の交差競合
グリコールアルデヒド由来ＡＧＥｓであるＧＡ−ピリジンは、Ｎａｇａｉらによって報告されており（Nagai et al., Journal of Biological chemistry, 2002, 277(50), 48905-48912）、ＧＡ−ピリジンに対するモノクローナル抗体（クローン名２Ａ２）も樹立されている。そこで、新しく樹立したＳＪ−５抗体、ＰＢ−１抗体、および抗ＧＡ−ピリジン抗体２Ａ２の交差性について、競合ＥＬＩＳＡにて検討した。競合ＥＬＩＳＡに用いた一部の試薬について、実施例１３と同様に調製した。【０２７９】
（１）抗原の固相化
コーティング溶液中で１μｇ／ｍＬに調製したＡ−ｐｅａｋ−ＢＳＡの溶液を、１００μＬずつ９６穴マイクロタイタープレート（Ｃｏｓｔａｒ）に加え、４℃で一晩インキュベートした。【０２８０】
（２）ブロッキング
固相化の処理を行った各ウェルを洗浄溶液（３００μＬ）で３回洗浄し、０．５％ゼラチンを溶解させた０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０含有ＰＢＳ（ＰＢＳ−Ｔ）（２００μＬ）を加え、室温で１時間静置した。【０２８１】
（３）競合実験
ＰＢ−１抗体、マウスＩｇＧアイソタイプコントロール（Ｃｔｒｌ−ｍＩｇＧ、Thermo Fisher Scientific）、抗ＧＡ−ピリジン抗体２Ａ２（コスモ・バイオ）を０．１％ゼラチン含有ＰＢＳ−Ｔにて希釈し、４倍希釈系列を作製した（０．０４９〜５０μｇ／ｍＬ）。また、ＨＲＰ標識ＳＪ−５抗体（実施例４）について、０．１％ゼラチン含有ＰＢＳ−Ｔで１００００倍希釈した。【０２８２】
ブロッキング溶液で処理した各ウェルを洗浄溶液（３００μＬ）で３回洗浄し、４倍希釈系列の試料溶液（各５０μＬ）およびＨＲＰ標識ＳＪ−５抗体希釈溶液（５０μＬ）を加え、プレートミキサーで２分間撹拌後、室温で１時間インキュベートした。【０２８３】
（４）発色
洗浄溶液（３００μＬ）で３回洗浄後、１００μＬの基質溶液（ＥＬＩＳＡ  ＰＯＤ基質ＴＭＢキット（Ｐｏｐｕｌａｒ）、ナカライテスク）を加え、室温、遮光下で１０分間インキュベートした。その後、２Ｎ硫酸（５０μＬ）を加え発色を停止した。【０２８４】
（５）吸光度測定およびデータ解析
マイクロプレートリーダー（Ｃｙｔａｔｉｏｎ５、ＢｉｏＴｅｋ）で主波長４５０ｎｍと副波長６５０ｎｍの吸光度を測定し、主波長の吸光度から副波長の吸光度を差し引いた。その結果を図２９に示す。Ａ−ｐｅａｋ−ＢＳＡとＳＪ−５抗体の反応において、ＰＢ−１の添加により、ＰＢ−１濃度依存的に吸光度が減少した。一方、Ｃｔｒｌ−ｍＩｇＧや抗ＧＡ−ピリジン抗体２Ａ２では吸光度の減少が観察されず、交差競合しなかった。したがって、ＳＪ−５抗体とＰＢ−１抗体は同一のエピトープを認識する抗体であるが、抗ＧＡ−ピリジン抗体はＳＪ−５抗体のエピトープを認識しない抗体であることが示された。【０２８５】
［実施例３４］網膜色素上皮細胞（ＡＲＰＥ−１９細胞）のタイトジャンクション崩壊抑制試験
網膜色素上皮細胞は細胞間タイトジャンクションによる血液網膜関門を形成することで脈絡膜血管からの物質の移動を制限し、網膜の機能を維持している。血液網膜関門の崩壊は糖尿病網膜症などの疾患の原因であると考えられており、網膜色素上皮細胞のタイトジャンクションは網膜の機能保持において極めて重要である（Willermain et al., Int. J. Mol. Sci., 2018, 19(4), pii: E1056.）。xCELLigence RTCA DPシステムは、ウェル底面に電極が設置された機器である。この機器は、ウェル底面に微弱な電流を流すことにより、細胞の機能に影響を与えず、ウェル底面のインピーダンスを測定することが可能である。インピーダンスは細胞間タイトジャンクションの形成により増加し、タイトジャンクションの崩壊によって低下することが明らかになっている（Wittchen et al., Invest. Ophthalmol. Vis. Sci., 2011, 52(10), 7455-63）。本実施例ではxCELLigence RTCA DP システムを用いて、網膜色素上皮細胞（ＡＲＰＥ−１９）のＡ−Ｐｅａｋ−ＢＳＡによるタイトジャンクションへの影響を確認し、ＳＪ―５抗体及びＰＢ−１抗体でのその抑制効果を評価した。【０２８６】
（１）細胞培養
Ｄ−ＭＥＭ（富士フイルム和光純薬)にＦＢＳ（富士フイルム和光純薬）を１０％添加、ペニシリン―ストレプトマイシン（ナカライテスク）を１％添加し、ＤＭＥＭ培地を調製し、ＡＲＰＥ−１９細胞（ＡＴＣＣ）はＤＭＥＭ培地で１０ｃｍディッシュ（コーニング）を用いて培養した。【０２８７】
（２）測定プレート
ＣＯ２インキュベータ内にxCELLigence RTCA DP システム（ＡＣＥＡ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を設置し、安定化させるために、設置後一晩以上セットした状態で使用した。細胞調製直前にＥ−ｐｌａｔｅ（ＡＣＥＡ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）にＤＭＥＭ培地を５０μＬ／ｗｅｌｌで添加し、バックグラウンドを測定した。【０２８８】
（３）細胞調製
上記（１）で培養したＡＲＰＥ−１９細胞の培地を除去し、１０ｍＬのＰＢＳ（−）（富士フイルム和光純薬）の添加・除去を２回繰り返すことで洗浄した。トリプシン-ＥＤＴＡ（富士フイルム和光純薬）を１ｍＬ添加し、ＣＯ２インキュベータ（タイテック）で３７℃、３分間インキュベートすることで細胞を分散させた。その後、１０ｍＬのＤＭＥＭ培地を添加し、トリプシンの活性を中和した。中和した細胞分散液は５０ｍＬのチューブ（ファルコン）に移し、遠心分離機（久保田）を用いて、１５００ｒｐｍ、５分間遠心分離した。その後、上清を捨て、沈殿を１ｍＬのＤＭＥＭ培地に再懸濁させた。再懸濁させた細胞分散液を１０μＬ取り、トリパンブルー（ＮａｎｏＥｎＴｅｋ）１０μＬと混和し、血球計算盤（ＮａｎｏＥｎＴｅｋ）に１０μＬを添加した。その後、オートセルカウンターＥＶＥ（ＮａｎｏＥｎＴｅｋ）で生細胞数をカウントした。細胞懸濁液を４．０ｘ１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬになるようにＤＭＥＭ培地で希釈し、Ｅ−ｐｌａｔｅ（ＡＣＥＡ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）に８０μＬ／ウェルで播種した。【０２８９】
（４）抗体及びＡ−ｐｅａｋ−ＢＳＡの添加
xCELLigence RTCA DPシステムを用いて１５分毎のプレートのインピーダンスを測定し、細胞のプレートへの接着を確認した。細胞播種後、２０〜２４時間後に９μＬのＰＢ−１抗体（１０ｍｇ／ｍＬ）、ＰＢ−１抗体（３ｍｇ／ｍＬ）、ＰＢ−１抗体（１ｍｇ／ｍＬ）、ＰＢ−１抗体（０．３ｍｇ／ｍＬ）、ＳＪ−５抗体（１０ｍｇ／ｍＬ）、もしくはＰＢＳと１μＬのＡ−ｐｅａｋ−ＢＳＡ(１０ｍｇ／ｍＬ)を添加した。Ｃｏｎｔｒｏｌは２０〜２４時間後にＰＢＳ１０μＬを添加した。添加後も１５分間隔でインピーダンスを測定した。【０２９０】
Ａ−ｐｅａｋ−ＢＳＡ添加１０〜１２時間後のインピーダンスを測定し、Ａ−ｐｅａｋ−ＢＳＡ添加群を０に標準化した結果を図３０に示す。当該図に示すようにＡ−Ｐｅａｋ−ＢＳＡの添加によってインピーダンスの有意に低下することが確認された。このインピーダンスの低下はＰＢ−１抗体の添加によって有意に抑制された。また、ＳＪ−５抗体添加群では終濃度１ｍｇ／ｍＬにおいて定価の抑制が認められたが、ＰＢ−１抗体の添加ではより低濃度域においてもＳＪ−５抗体よりも強い抑制が認められた。以上の結果から、Ａ−ｐｅａｋ−ＢＳＡが網膜色素上皮細胞のタイトジャンクションの崩壊を誘導すること、それをＰＢ−１抗体及びＳＪ−５抗体の添加により抑制可能であることが示唆された。【０２９１】
［実施例３５］ＰＢ−１抗体を用いたＧｌｙｃｅｒ−ＡＧＥｓ−ＢＳＡによる血管内皮細胞管腔形成抑制中和試験
（１）マトリゲルマトリックスの調製
マトリゲルマトリックスの調製は実施例１４と同様に操作を行った。【０２９２】
（２）Ｇｌｙｃｅｒ−ＡＧＥｓ−ＢＳＡと抗体反応液の調製
実施例１で調製したＧｌｙｃｅｒ−ＡＧＥｓ−ＢＳＡ（１０ｍｇ／ｍＬ）１０μＬと１０μＬのリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ、富士フイルム和光純薬）、ＰＢ−１抗体（１０ｍｇ／ｍＬ）または対照抗体（１０ｍｇ／ｍＬ）９０μＬを１．５ｍＬチューブ（ワトソン）に加え、室温で１０分間静置した。その後、遠心分離機（Thermo Fisher Scientific）を用いて１４０００ｒｐｍ、１５分間遠心分離し、上清を回収した。【０２９３】
（３）管腔形成阻害試験は実施例１４と同様に操作を行った。８時間培養後のＨＵＶＥＣの形態を図３１に示す。当該図に示されるとおり、ＨＵＶＥＣは対照ＢＳＡ添加した群においてはマトリゲルマトリックス中での管腔形成が確認された。しかし、Ｇｌｙｃｅｒ−ＡＧＥｓ−ＢＳＡは管腔形成を阻害した。また、この管腔形成の阻害はＰＢ−１との反応液では中和された。この結果から、Ｇｌｙｃｅｒ−ＡＧＥｓ−ＢＳＡがＨＵＶＥＣに及ぼす影響をＰＢ−１抗体が中和可能であることが明らかになった。【０２９４】
［実施例３６］糖尿病マウス及び対照マウスのＰＢ−１抗体による網膜組織染色
（１）マウスの飼育
妊娠１３日のＣ５７ＢＬ６／Ｊマウス（日本クレア）を購入し、仔マウスを得た。糖尿病マウスには生理食塩水（大塚製薬）でストレプトゾトシン（富士フィルム和光純薬）を５ｍｇ／ｍＬになるように溶解させ、生後２日後に雄性の仔マウスに３００μＬ皮下投与した。対照マウスには生理食塩水を生後２日後に雄性の仔マウスに３００μＬ皮下投与した。４週間母親マウスと同居させた後に離乳し、糖尿病マウスはＨＦＤ３２（日本クレア）で８週間飼育した。対照マウスはＣＥ−２（日本クレア）で８週間飼育した。【０２９５】
（２）解剖
１．８７５ｍＬのドミトール（日本全薬工業）、２ｍＬのミダゾラム（サンド）、２．５ｍＬのベトルファール（Ｍｅｉｊｉ  Ｓｅｉｋａファルマ）と１８．６２５ｍＬの生理食塩水を混和し、三種混合麻酔を調製した。マウスの体重を体重計（タニタ）で計測し、三種混合麻酔を０．１ｍＬ／ｇで腹腔内投与した。麻酔の効果を後肢引き込み反射の消失で確認し、ピンセット（夏目製作所）及び剪刀（夏目製作所）で開腹、開胸し、下大静脈を切断した。生理食塩水を左室から１０ｍＬ投与することにより潅流し、潅流後眼球を摘出した。摘出した眼球は、ＯＣＴコンパウンド（サクラファインテックジャパン）を満たしたクリオモルド（サクラファインテックジャパン）内に沈め、液体窒素で凍結させることで新鮮凍結ブロックを作製した。作製後、−８０℃に設定したディープフリーザー（Thermo Fisher Scientific）で保存した。【０２９６】
（３）薄切・染色
−３０℃に設定したフリーザー（福島工業）でアセトン（富士フィルム和光純薬）を１６時間以上インキュベートし、冷アセトンを調製した。ＰＢＳにＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００（ナカライテスク）を０．１％添加し、ＰＢＳ−Ｔを調製した。新鮮凍結ブロックをクリオスタットＣＭ１９５０（ライカ）で薄切厚１０μｍで薄切した。薄切した組織はＭＡＳコートスライドガラス（松波硝子工業）に貼り付け、乾燥させた。乾燥後、冷アセトンで１０分間インキュベートすることで組織を固定した。固定後、ＰＢＳ−Ｔで１０分間、２回洗浄した。洗浄後、Ｆｃ  ｂｌｏｃｋ（バイオレジェンド）を５％のＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）が溶解したＴＢＳ−Ｔで５０倍希釈することでブロッキング液を調製し、室温３０分インキュベートすることでブロッキングを行った。ブロッキング後、ＰＢ−１抗体（１ｍｇ／ｍＬ）または対照抗体（１ｍｇ／ｍＬ）を１％のＢＳＡが溶解したＴＢＳ−Ｔで５００倍希釈した一次抗体反応液を調製し、４℃に設定した冷蔵庫（福島工業）で一晩インキュベートした。一次抗体反応後、ＰＢＳ−Ｔで１０分間、２回洗浄した。Ａｌｅｘａ５９４標識Goat Anti-Mouse IgG H&L（Ａｂｃａｍ）を１％のＢＳＡが溶解したＴＢＳ−Ｔで１００倍希釈した二次抗体反応液を調製し、遮光下で室温１時間反応させた。二次抗体反応後、ＰＢＳ−Ｔで１０分間、２回洗浄した。包埋剤としてベクターシールド（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を染色組織に添加し、カバーガラス（松波硝子工業）で封入した。その後、共焦点レーザー顕微鏡（オリンパス）で網膜のＡｌｅｘａ５９４の蛍光を観察した。【０２９７】
（４）結果
結果を図３２に示す。ＰＢ−１抗体は対照マウスに比べ、糖尿病マウスの網膜神経節細胞層、内顆粒層、外顆粒層、網膜色素上皮細胞層に強く結合するこが明らかになった。また、対照抗体で糖尿病マウスの染色性を確認した所、同様の染色結果が得られない事から、この染色性はＰＢ−１抗体の可変領域による特異的な結合に起因することが明らかになった。これらの結果から、ＰＢ−１抗体のエピトープ構造を有するＡＧＥが生体内に存在し、糖尿病マウスの網膜においては網膜神経節細胞層、内顆粒層、外顆粒層、網膜色素上皮細胞層に存在することが明らかになった。また、ＰＢ−１抗体は新規構造体の存在を免疫染色学的に確認するために有用なツールであることが明らかになった。【０２９８】
［実施例３７］ＰＢ−１抗体カラムを用いたヒト血清タンパク質の精製及びウェスタンブロッティングによる検出
（１）ＰＢ−１抗体カラムの作製
ＰＢ−１抗体の溶媒をＰＤ１０カラム（ＧＥヘルスケア）にて、カップリング緩衝液（０．２Ｍ炭酸ナトリウム，０．５Ｍ  ＮａＣｌ，ｐＨ８．３）に置換し、１０ｍｇ／ｍＬ  ＰＢ−１抗体溶液を１ｍＬ調製した。カップリング担体としてはNHS-activated Sepharose 4 Fast Flow（ＧＥヘルスケア）を使用した。NHS-activated Sepharose 4 Fast Flow １ｍＬに氷浴で冷やした１ｍＭ  ＨＣｌを１０ｍＬ流し、その後すぐに、先に調製した１０ｍｇ／ｍＬ  ＰＢ−１抗体溶液と混合し、ローテーター（ＴＡＩＴＥＣ）を用いて転倒混和（４℃、終夜）することで、ＰＢ−１抗体をカップリング担体に固定した。その後、ブロッキング用緩衝液（０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０）、洗浄用緩衝液（０．１Ｍ酢酸ナトリウム，０．５Ｍ  ＮａＣｌ，ｐＨ５．０）の順に各３ｍＬずつ流し、この操作を３回繰り返した。最後にＰＢＳ  １０ｍＬ流して溶媒を置換した後、４℃で保存した。【０２９９】
（２）ＰＢ−１抗体カラムを用いたヒト血清タンパク質の精製
精製試料として、ヒト血清（プール）（コスモ・バイオ株式会社）を用いた。最初に１０ｍＬのヒト血清（プール）を結合緩衝液（０．０２Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、０．０３ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．４）で７倍に希釈し、SP Sepharose Fast Flow（ＧＥヘルスケア）３０ｍＬを用いて、製品マニュアルにしたがい精製した。得られた溶出画分を結合緩衝液を用いて透析した後、Protein G Sepharose 4 Fast Flow（ＧＥヘルスケア）３ｍＬを用いて、製品マニュアルにしたがい精製し、ＩｇＧを取り除いた。得られた素通り画分をサンプルとしてＰＢ−１抗体カラム１ｍＬを用いて精製した。精製により得られた各画分は常法に従い電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）にて解析した。【０３００】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を図３３に示す。ＰＢ−１抗体カラムにサンプル（図中、Ｓａｍｐｌｅ）を通した後（図中、Ｆｌｏｗ  Ｔｈｒｏｕｇｈ）、結合緩衝液２５ｍＬを２回繰り返し流した（図中、Ｗａｓｈ１、Ｗａｓｈ２）。その後、溶出緩衝液（０．１Ｍグリシン，ｐＨ３．０）１０ｍＬでＰＢ−１抗体カラムに結合したタンパク質を溶出した（図中、Ｅｌｕｔｅ）。溶出液は直ちに０．４ｍＬの中和緩衝液（１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ９．０）を加えて中和したＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果、大半の夾雑タンパク質が除去され、精製試料の純度が上がることが示された。  【０３０１】
（３）ＰＢ−１抗体を用いたウェスタンブロッティング
ＰＢ−１抗体カラムにて精製したタンパク質を、常法に従い電気泳動し（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ），ＰＶＤＦ膜に電気転写してウェスタンブロッティングを行った。抗体反応は、一次抗体としてＰＢ−１抗体、二次抗体としてPeroxidase-conjugated AffiniPure Goast Anti-Mouse IgG (H+L)（Jackson ImmunoResearch）  を用いて行った。また、二次抗体の結合による非特異的なシグナルを区別するため、二次抗体のみを用いた抗体反応も行った。次に、ECL Western Blotting Detection Reagents（ＧＥヘルスケア）を用いて発色させ、タンパク質のバンドを検出した。【０３０２】
二次抗体のみを反応させたＰＶＤＦ膜ではバンドは全く検出されなかった。一方、ＰＢ−１抗体を反応させたＰＶＤＦ膜でのみ、バンドが検出された（図３４）。この結果より、ＰＢ−１抗体を用いたウェスタンブロット法はヒト血清中に存在する新規構造体修飾タンパク質を検出可能であることが示された。
【図１】
2020045646.tif 000041
【図２】
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【図３】
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【図４】
2020045646.tif 000044
【図５】
2020045646.tif 000045
【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０Ａ】
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【図２０Ｂ】
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【図２０Ｃ】
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【図２０Ｄ】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６Ａ】
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【図２６Ｂ】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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