(57)【要約】本発明は、内耳などの狭く複雑な構造をしている組織に安定して留置可能であり、薬剤の徐放制御を可能とする薬物送達用担体、及びこれを含む薬物送達用システム、を提供することを目的とする。本発明の薬物送達用担体は、架橋性官能基を有する多糖を含むハイドロゲルを含む。
2020045162.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
架橋性官能基を有する多糖を含むハイドロゲルを含む、薬物送達用担体。
【請求項２】
前記架橋性官能基を有する多糖は、アルギン酸、又はその塩である、請求項１に記載の薬物送達用担体。
【請求項３】
前記ハイドロゲルは、シート状、ビーズ状、又はファイバ状である、請求項１又は２に記載の薬物送達用担体。
【請求項４】
前記ハイドロゲルは、ビーズ状である、請求項３に記載の薬物送達用担体。
【請求項５】
前記ハイドロゲルは、ファイバ状である、請求項３に記載の薬物送達用担体。
【請求項６】
ファイバ状の細胞外マトリクスを更に含み、前記細胞外マトリクスは、前記ハイドロゲルを含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の薬物送達用担体。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか一項に記載の薬物送達用担体と、薬物とを含む、薬物送達システム。
【請求項８】
前記ハイドロゲルの可溶化剤を更に含む、請求項７に記載の薬物送達システム。
【請求項９】
疾患治療剤である、請求項７又は８に記載の薬物送達システム。
【請求項１０】
前記疾患治療剤は、難聴治療剤である、請求項９に記載の薬物送達システム。
【請求項１１】
前記薬物は、核酸を含む、請求項７〜１０のいずれか一項に記載の薬物送達システム。
【請求項１２】
ウイルスベクターを更に含み、当該ウイルスベクターが前記核酸を含む、請求項１１に記載の薬物送達システム。
【請求項１３】
前記核酸は、以下の（Ａ）〜（Ｄ）のいずれか一つの塩基配列からなり、且つ、支持細胞を感覚有毛細胞に分化させる能力を有するタンパク質をコードする遺伝子を含む、請求項１１又は１２に記載の薬物送達システム：
（Ａ）配列番号１で表される塩基配列、
（Ｂ）配列番号１で表される塩基配列において、１又は数個の塩基が欠失、置換、挿入、又は付加されている塩基配列、
（Ｃ）配列番号１で表される塩基配列において、同一性が７０％以上である塩基配列、
（Ｄ）配列番号１で表される塩基配列からなる遺伝子と相補的な塩基配列からなる遺伝子とストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる塩基配列、及び
（Ｅ）前記（Ａ）〜（Ｄ）の塩基配列の縮重異性体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、薬物送達用担体に関する。より詳細には、本発明は、薬物送達用担体、及び薬物送達システムに関する。
【背景技術】
【０００２】
この数年、難聴に対する新規治療法開発が国内外で活発化している。特に、内耳性難聴については、老人性難聴、突発性難聴、メニエール病等、罹患数も多く、６５歳以上の日本人口の３０〜４０％が罹患している。しかも哺乳類蝸牛は、自発的再生能に乏しいため、慢性化した感音難聴は難治性である。この現状ゆえに海外の数々の大小企業が内耳性難聴をアンメット・メディカルニーズとして捉え、特に根治治療を目指した内耳への遺伝子治療の開発研究にしのぎを削っている。例えば、大手製薬メーカーは、アデノウイルスでの遺伝子導入において既に臨床試験を進めている。遺伝子導入においては、安全性を鑑み、アデノ随伴ウイルス（以下、ＡＡＶともいう。）による遺伝子導入媒体が主流となりつつある。【０００３】
内耳に存在し、音を神経活動に変換する臓器「蝸牛」は、側頭骨という緻密骨の中に埋もれて存在し、正円窓および卵円窓という構造を通して中耳腔と接している。特に前者は正円窓窩と呼ばれる凹みの底に位置する膜様構造であり、内耳への薬剤投与経路として期待されている。
例えば、薬剤としてＡＡＶを用いた場合、ＡＡＶが正円窓膜を通過して蝸牛内へ拡散するが、他方中耳手術によって鼓膜を挙上し明視化で正円窓窩に確実にアプローチしても、投与した薬剤と正円窓膜の接触面積や滞留時間、さらには徐放化といったドラッグデリバリーシステム（以下、ＤＤＳともいう。）の課題が残る。内耳への局所投与に関するＤＤＳ開発研究は世界的にもまだ端を発した段階であり、現在まさにシーズ探索〜開発研究をはじめる萌芽期にある。【０００４】
遺伝子治療を目的としたＤＤＳには、コラーゲンによるＤＮＡベクターの傷口への徐放などが報告されている（例えば、非特許文献１参照。）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Lois A. Chandler, et al., “FGF2-Targeted Adenovirus Encoding Platelet-Derived Growth Factor-B Enhances de Novo Tissue Formation,” Molecular Therapy, 2 (2), 153 (2000).
【非特許文献２】K Maeda, et al., Controlled Synthesis of 3D Multi-Compartmental Particles with Centrifuge-Based Microdroplet Formation from a Multi-Barrelled Capillary, Adv. Mater., 24, 1340−1346 (2012).
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかしながら、非特許文献１の技術は、傷口など体表面への塗布などが主であり、狭い複雑な組織に適用は困難である。また、徐放の任意のタイミングでの制御も実現されてはいない。【０００７】
本発明は上記事情を鑑みてなされたものであり、内耳などの狭く複雑な構造をしている組織に安定して留置可能であり、薬剤の徐放制御を可能とする薬物送達用担体を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は以下の態様を含む。
［１］架橋性官能基を有する多糖を含むハイドロゲルを含む、薬物送達用担体。
［２］前記架橋性官能基を有する多糖は、アルギン酸、又はその塩である、［１］に記載の薬物送達用担体。
［３］前記ハイドロゲルは、シート状、ビーズ状、又はファイバ状である、［１］又は［２］に記載の薬物送達用担体。
［４］前記ハイドロゲルは、ビーズ状である、［３］に記載の薬物送達用担体。
［５］前記ハイドロゲルは、ファイバ状である、［３］に記載の薬物送達用担体。
［６］ファイバ状の細胞外マトリクスを更に含み、前記細胞外マトリクスは、前記ハイドロゲルを含む、［１］〜［４］のいずれか一つに記載の薬物送達用担体。
［７］［１］〜［６］のいずれか一つに記載の薬物送達用担体と、薬物とを含む、薬物送達システム。
［８］前記ハイドロゲルの可溶化剤を更に含む、［７］に記載の薬物送達システム。
［９］疾患治療剤である、［７］又は［８］に記載の薬物送達システム。
［１０］前記疾患治療剤は、難聴治療剤である、［９］に記載の薬物送達システム。
［１１］前記薬物は、核酸を含む、［７］〜［１０］のいずれかに記載の薬物送達システム。
［１２］ウイルスベクターを更に含み、当該ウイルスベクターが前記核酸を含む、［１１］に記載の薬物送達システム。
［１３］前記核酸は、以下の（Ａ）〜（Ｄ）のいずれか一つの塩基配列からなり、且つ、支持細胞を感覚有毛細胞に分化させる能力を有するタンパク質をコードする遺伝子を含む、［１１］又は［１２］に記載の薬物送達システム：
（Ａ）配列番号１で表される塩基配列、
（Ｂ）配列番号１で表される塩基配列において、１又は数個の塩基が欠失、置換、挿入、又は付加されている塩基配列、
（Ｃ）配列番号１で表される塩基配列において、同一性が７０％以上である塩基配列、
（Ｄ）配列番号１で表される塩基配列からなる遺伝子と相補的な塩基配列からなる遺伝子とストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる塩基配列、及び
（Ｅ）前記（Ａ）〜（Ｄ）の塩基配列の縮重異性体。
【発明の効果】
【０００９】
本発明によれば、内耳などの狭く複雑な構造をしている組織に安定して留置可能であり、薬剤の徐放制御を可能とする薬物送達用担体を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１Ａ】作製直後のマイクロビーズの蛍光像である。
【図１Ｂ】塩化カルシウム溶液内で３日保存後のマイクロビーズの蛍光像である。
【図２Ａ】アルギン酸リアーゼを滴下し、３日間培養した細胞の生死判定試験における生細胞の染色像である。
【図２Ｂ】アルギン酸リアーゼを滴下し、３日間培養した細胞の生死判定試験における死細胞の染色像である。
【図３】ＧＦＰを発現するＡＡＶ含有アルギン酸カルシウムゲルビーズ、及び、アルギン酸リアーゼを滴下した細胞における、７２時間後のＧＦＰ発現細胞の割合を示すグラフである。
【図４】４℃又は−８０℃で保存したＧＦＰを発現するＡＡＶ含有アルギン酸カルシウムゲルビーズの安定性試験の結果を示すグラフである。
【図５】ＡＡＶ含有アルギン酸カルシウムゲルビーズの感染力の経時変化試験の結果を示すグラフである。
【図６】ＡＡＶ含有コラーゲンゲルビーズ(Low Density及びHigh Density)をアルギン酸リアーゼ処理にかけた後のウイルス感染力の試験結果を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
［薬物送達用担体］
一の実施形態において、本発明は、架橋性官能基を有する多糖を含むハイドロゲルを含む、薬物送達用担体を提供する。
【００１２】
架橋性官能基を有する多糖は、架橋剤により架橋されハイドロゲルを形成する。本発明において、ハイドロゲルとは、水又は水系の溶液を含むゲルを意味する。多糖の架橋方法としては、ハイドロゲルが３次元網目構造を形成する方法であれば限定されず、化学的架橋又は物理的架橋が挙げられる。具体的には、共有結合、水素結合、イオン結合による架橋が挙げられ、イオン結合による架橋が好ましい。イオン結合による架橋としては、２価の金属イオンによる架橋が好ましい。
【００１３】
架橋性官能基としては、酸性官能基が好ましく、カルボキシル基、アルコール性水酸基、フェノール性水酸基が挙げられ、カルボキシル基がより好ましい。
架橋性官能基を有する多糖としては、アルギン酸、ペクチン酸、ヒアルロン酸、セルロース、キトサン、キチン、澱粉、デキストラン、ヘパリン、コンドロイチン、陽イオングアー、陽イオン澱粉、カルボキシメチルセルロース、カルボキシメチルキトサン、カルボキシメチルデキストラン、カルボキシメチル澱粉、キサンタン、カラヤゴム、ガッティゴム、ジェラン、寒天、ヘパリンスルフェート、コンドロイチンスルフェート、又はこれらの塩若しくは誘導体が挙げられる。
中でも、アルギン酸、ペクチン酸、ヒアルロン酸、又はこれらの塩若しくは誘導体が好ましく、アルギン酸、又はアルギン酸塩がより好ましい。アルギン酸塩としては、アルギン酸ナトリウム、アルギン酸カリウムが挙げられる。
【００１４】
架橋剤としては、２価の金属イオンを含むものが好ましく、Ｐｂ２+、Ｃｕ２+、Ｃｄ２+、Ｂａ２+、Ｓｒ２+、Ｃａ２＋、Ｃｏ２＋、Ｎｉ２＋、Ｚｎ２＋、Ｍｎ２＋、Ｍｇ２＋を含むものが挙げられ、Ｃａ２＋、Ｂａ２＋を含むものが好ましく、Ｃａ２＋を含むものがより好ましい。
【００１５】
更に架橋剤は、水に溶かして水溶液の形態で用いることができることから、上記の２価の金属イオンを含む塩が好ましく、上記の陽イオンを含むハロゲン化物、水酸化物、炭酸塩、硝酸塩、酢酸塩がより好ましく、ハロゲン塩が更に好ましく、塩化カルシウムが特に好ましい。
【００１６】
ハイドロゲルは、例えば、架橋剤を含む溶液中に、架橋性官能基を有する多糖を含む溶液を押し出すことにより得られる。
架橋剤を含む溶液中の架橋剤の濃度としては、１ｍＭ〜１０Ｍが好ましく、１０ｍＭ〜５Ｍがより好ましく、１００ｍＭ〜１０００ｍＭが特に好ましい。
架橋性官能基を有する多糖を含む溶液中の多糖の濃度としては、０．１重量％〜５０重量％が好ましく、０．５重量％〜２０重量％がより好ましく、１重量％〜１０重量％が特に好ましい。ハイドロゲルは送達する部位、目的に合わせていかなる形状もとることができる。例えばビーズ上、シート状、ファイバー状などの形状があげられるが、これに限るものではない。
【００１７】
ハイドロゲルは、ビーズ状とすることができる。ハイドロゲルビーズは、例えば、遠心力を用いたマイクロゲルビーズ作製法(非特許文献２参照。)により作製することができる。
ハイドロゲルビーズの有するポアサイズ（直径）としては、１ｎｍ〜１０μｍが好ましく、５ｎｍ〜１μｍがより好ましく、１０ｎｍ〜２００ｎｍが特に好ましい。
ハイドロゲルビーズのサイズ（直径）としては、１μｍ〜１０００μｍが好ましく、１０μｍ〜５００μｍがより好ましく、５０μｍ〜２００μｍが特に好ましい。
【００１８】
本発明の薬物送達用担体は、ハイドロゲルを含むファイバ状の細胞外マトリクスを含むことが好ましく、その場合、前記ハイドロゲルは、ビーズ状であることが好ましい。本発明の薬物送達用担体を所望の形状を有するものとすることにより、生体内の所望の箇所に、係る薬物送達用担体を安定に留置することができる。例えば、本発明の薬物送達用担体をファイバ状の形状に調製することにより、アブミ骨が位置する空間の隙間といった、特異的形状を有する耳内空間に、本発明の薬物送達用担体を適切に留置することができる。
【００１９】
ファイバ状の細胞外マトリクスの直径としては、１μｍ〜１０００μｍが好ましく、１０μｍ〜５００μｍがより好ましく、５０μｍ〜２００μｍが特に好ましい。
ファイバ状の細胞外マトリクスの長さとしては、１０μｍ〜１００ｃｍが好ましく、１００μｍ〜１０ｃｍがより好ましく、１ｍｍ〜１ｃｍが特に好ましい。
ハイドロゲルを含むファイバ状の細胞外マトリクスの製造方法としては、例えば、ファイバ形状の型に、細胞外マトリクスを流し込むことにより作製することができる。
【００２０】
細胞外マトリクスとしては、コラーゲン（Ｉ型、ＩＩ型、ＩＩＩ型、Ｖ型、ＸＩ型等）、マウスＥＨＳ腫瘍抽出物（ＩＶ型コラーゲン、ラミニン、ヘパラン硫酸プロテオグリカン等を含む）より再構成された基底膜成分（商品名：マトリゲル）、グリコサミノグリカン、ヒアルロン酸、プロテオグリカン、ゼラチン等が挙げられる。
【００２１】
また、ハイドロゲル自体は、ファイバ状とすることもできる。
ファイバ状のハイドロゲルの直径としては、１μｍ〜１０００μｍが好ましく、１０μｍ〜５００μｍがより好ましく、５０μｍ〜２００μｍが特に好ましい。
ファイバ状のハイドロゲルの長さとしては、１０μｍ〜１００ｃｍが好ましく、１００μｍ〜１０ｃｍがより好ましく、１ｍｍ〜１ｃｍが特に好ましい。
【００２２】
［薬物送達システム］
一の実施形態において、本発明は、上述した薬物送達用担体と、薬物とを含む、薬物送達システムを提供する。実施例において後述するように、本実施形態の薬物送達システムにより、細胞毒性を有さず、薬物を所望の器官へ、徐放性を制御した状態で送達することができる。
【００２３】
本実施形態の薬物送達システムは、疾患治療剤、造影剤等を薬剤として含む形態で利用することができる。
【００２４】
疾患治療剤の有効成分としては、低分子化合物、核酸、タンパク質、ペプチド等が挙げられる。低分子化合物としては、ハイドロゲルビーズの有するポアに担持されるように、ミセル化等によりサイズを調整したものが好ましい。核酸としては、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ等が挙げられる。タンパク質としては、酵素、抗体等が挙げられ、ペプチドとしては、リガンド、ワクチン等が挙げられる。
【００２５】
本実施形態の薬物送達システムを遺伝子治療に用いる場合、疾患治療剤としては、核酸が好ましい。遺伝子配列の欠損、挿入又は変異等により、患者において野生型遺伝子の発現が喪失又は抑制されている場合には、疾患治療剤として野生型遺伝子のｃＤＮＡを用いることが好ましい。また、疾患治療剤が核酸である場合には、デリバリー及び発現効率の観点から、ウイルスベクターが、疾患治療剤としての係るｃＤＮＡを含む形態をとることが好ましい。
【００２６】
ここで使用するウイルスベクターとしては、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター（ＡＡＶ）、ヘルペスウイルスベクター等が挙げられ、毒性が少ないという観点から、アデノ随伴ウイルスベクター（ＡＡＶ）が好ましい。
【００２７】
本実施形態の薬物送達システムを、難聴に対する遺伝子治療に用いる場合、ａｔｏｎａｌ関連因子をコードする核酸を含むＡＡＶを用いることが好ましい。ａｔｏｎａｌ関連因子は、塩基性へリックス−ループ−へリックスファミリーに属する転写因子である。
【００２８】
ａｔｏｎａｌ関連因子をコードする遺伝子としては、以下の（Ａ）〜（Ｄ）のいずれか一つの塩基配列からなり、且つ、支持細胞を感覚有毛細胞に分化させる能力を有するタンパク質をコードする遺伝子が挙げられる：
（Ａ）配列番号１で表される塩基配列、
（Ｂ）配列番号１で表される塩基配列において、１又は数個の塩基が欠失、置換、挿入、又は付加されている塩基配列、
（Ｃ）配列番号１で表される塩基配列において、同一性が７０％以上である塩基配列、
（Ｄ）配列番号１で表される塩基配列からなる遺伝子と相補的な塩基配列からなる遺伝子とストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる塩基配列、及び
（Ｅ）前記（Ａ）〜（Ｄ）の塩基配列の縮重異性体。
【００２９】
上記（Ａ）において配列番号１で表される塩基配列からなる遺伝子は、Ｈａｔｈ１（Ｈｕｍａｎ  ａｔｏｎａｌ  ｈｏｍｏｌｏｇ１）のｃＤＮＡである。
【００３０】
上記（Ｂ）において、欠失、置換、挿入、又は付加されてもよい塩基の数としては、１ 〜３２０個が好ましく、１〜１６０個がより好ましく、１〜８０個が更に好ましく、１〜４０個が更に好ましく、１〜２０個が特に好ましく、１〜１０個が最も好ましい。
【００３１】
上記（Ｃ）において、同一性は、好ましくは７５％以上、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは８５％以上、特に好ましくは、９０％以上である。
【００３２】
上記（Ｄ）において、「ストリンジェントな条件下」とは、例えば、５×ＳＳＣ（２０×ＳＳＣの組成：３Ｍ 塩化ナトリウム，０．３Ｍ クエン酸溶液，ｐＨ７．０）、０．１重量％ Ｎ−ラウロイルサルコシン、０．０２重量％のＳＤＳ、２重量％の核酸ハイブルダイゼーション用ブロッキング試薬、及び５０％フォルムアミドから成るハイブリダイゼーションバッファー中で、５５〜７０℃で数時間から一晩インキュベーションを行うことによりハイブリダイズさせる条件を挙げることができる。なお、インキュベーション後の洗浄の際に用いる洗浄バッファーとしては、好ましくは０．１重量％ＳＤＳ含有１×ＳＳＣ溶液、より好ましくは０．１重量％ＳＤＳ含有０．１×ＳＳＣ溶液である。
【００３３】
メチオニンとトリプトファン以外のアミノ酸は、１つのアミノ酸に対して複数のコドンが対応する。このことを遺伝暗号の縮重という。上記（Ｅ）において、塩基配列の縮重異性体とは、ある塩基配列がコードするアミノ酸に対応する他の塩基配列を意味する。
【００３４】
また、徐放性を制御する観点から、本実施形態の薬物送達システムは、前記ハイドロゲルの可溶化剤を更に含むことが好ましい。
ハイドロゲルの可溶化剤としては、イオン結合により架橋されてなる場合には、二価の金属イオンが取り除くキレート剤が挙げられる。また、架橋性官能基を有する多糖自体を分解する酵素も挙げられる。
【００３５】
キレート剤としては、クエン酸、エチレンジアミン、エチレンジアミン四酢酸、ニトリロ三酢酸、ジエチレントリアミン五酢酸、グリコールエーテルジアミン四酢酸等が挙げられる。
酵素としては、例えば、アルギン酸リアーゼ等が挙げられる。
【００３６】
本実施形態の薬物送達システムは、ハイドロゲルのサイズや形状を調節することにより、またはこのハイドロゲルをゲルファイバなどの高分子構造物内に封入することにより、複雑な組織の内部に確実に留置することができる。
更に、上記ＡＡＶが担持されたハイドロゲルビーズを、アルギン酸リアーゼなどの酵素による分解、又は超音波などの照射にかけることにより、ＡＡＶの失活や周辺組織へのダメージなく、且つ意図したタイミングでのＡＡＶの徐放が可能となる。徐放されたＡＡＶは、ターゲットとする組織に所望の遺伝子を導入できる。
【００３７】
また、本実施形態の薬物送達システムにおいて薬剤として造影剤を用いる場合、当該薬剤として、硫酸バリウム、次炭酸ビスマス、酸化ビスマス、酸化ジルコニウム、フッ化イッテルビウム、ヨードホルム、バリウムアパタイト、チタン酸バリウム、ランタンガラス、バリウムガラス、ストロンチウムガラス等のＸ線造影剤；ヨード造影剤等のＣｏｍｐｕｔｅｄ  Ｔｏｍｏｇｒａｐｈｙ（ＣＴ）用造影剤；ガドリニウム製剤、超常磁性酸化鉄製剤（Ｓｕｐｅｒ  Ｐａｒａｍａｇｎｅｔｉｃ  Ｉｒｏｎ  Ｏｘｉｄｅ、ＳＰＩＯ）等のＭＲＩ用造影剤；テクネチウム９９ｍ（９９ｍＴｃ）、モリブデン９９（９９Ｍｏ）等のＳｉｎｇｌｅ  ｐｈｏｔｏｎ  ｅｍｉｓｓｉｏｎ  ｃｏｍｐｕｔｅｄ  ｔｏｍｏｇｒａｐｈｙ（ＳＰＥＣＴ）用放射性同位体等を好ましい薬剤として挙げることができる。
【００３８】
［治療方法］
一の実施形態において、本発明は、上述した薬物送達システムを、治療を必要とする患者に投与することを含む、感覚有毛細胞の欠陥又は喪失によって生じる疾患の治療方法を提供する。
【００３９】
感覚有毛細胞の欠陥又は喪失によって生じる疾患としては、難聴又は平衡障害が挙げられ、難聴が好ましい。内耳有毛細胞は、長期にわたって大きな音にさらされると破壊され、自然に再生することはないため、上述したａｔｏｎａｌ関連因子をコードする核酸を含むＡＡＶを担持したハイドロゲルを薬物送達システムとして用いた遺伝子治療を行うことが好ましい。
薬物送達用担体としては、ファイバ状のハイドロゲルを含むか、ビーズ状のハイドロゲルを含むファイバ状の細胞外マトリクスを含むことが好ましい。係る形状を有することにより、アブミ骨が位置する空間の隙間といった、内耳における空間に、内視鏡で確認しながら、本発明の薬物送達用担体を安定に留置することができる。
【００４０】
留置した後は、アルギン酸リアーゼを複数回、定期的に内耳に投与してもよい。係る投与により、ハイドロゲルに担持されたａｔｏｎａｌ関連因子をコードする核酸を含むＡＡＶの徐放を制御することができる。
【００４１】
ハイドロゲルに担持させるＡＡＶの用量としては、１０５ｇｃ／ｍＬ〜１０１２ｇｃ／ｍＬが挙げられ、下限値としては、１０５ｇｃ／ｍＬ、１０６ｇｃ／ｍＬ、１０７ｇｃ／ｍＬ、１０８ｇｃ／ｍＬ、１０９ｇｃ／ｍＬ、１０１０ｇｃ／ｍＬ、１０１１ｇｃ／ｍＬが挙げられ、上限値としては、１０１２ｇｃ／ｍＬ、１０１１ｇｃ／ｍＬ、１０１０ｇｃ／ｍＬ、１０９ｇｃ／ｍＬ、１０８ｇｃ／ｍＬ、１０７ｇｃ／ｍＬ、１０６ｇｃ／ｍＬが挙げられる。
【００４２】
アルギン酸リアーゼの投与量としては、１回の投与につき、１μｇ〜１０ｍｇが挙げられ、下限値としては、１μｇ、１０μｇ、１００μｇ、１ｍｇが挙げられ、上限値としては、１０ｍｇ、１ｍｇ、１００μｇ、１０μｇが挙げられる。
【００４３】
アルギン酸リアーゼの投与の代わりに、耳の所定の箇所に超音波を当てて、内耳に留置されたハイドロゲルを物理的に溶解させてもよい。
【００４４】
［その他の実施形態］
【００４５】
一の実施形態において、本発明は、感覚有毛細胞の欠陥又は喪失によって生じる疾患の治療のための薬物送達システムを提供する。薬物送達システムとしては、上述したものと同様のものを使用することができる。
【００４６】
一の実施形態において、本発明は、感覚有毛細胞の欠陥又は喪失によって生じる疾患の治療のための医薬組成物であって、薬物送達用担体と、薬物とを含む、医薬組成物を提供する。薬物送達用担体、薬物としては、上述したものと同様のものを使用することができる。
【００４７】
一の実施形態において、本発明は、感覚有毛細胞の欠陥又は喪失によって生じる疾患の治療として使用ための薬物送達システムを提供する。薬物送達システムとしては、上述したものと同様のものを使用することができる。
【実施例】
【００４８】
次に実施例を示して本発明を更に詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。【００４９】
［実験例１］
（シリカビーズ含有マイクロビーズの安定性試験）
ＡＡＶが担持された直径約１００μｍのアルギン酸カルシウムゲルビーズを作製するための検証として、ＡＡＶと同程度の直径をもつ２０ｎｍ径の蛍光シリカビーズをＡＡＶと見立て、アルギン酸カルシウムゲルのマイクロビーズに封入した。
最終濃度が、アルギン酸ナトリウム２重量％、蛍光シリカ１０重量％となるように溶液を調製し、遠心力を用いたマイクロゲルビーズ作製法(K Maeda, et al., Controlled Synthesis of 3D Multi-Compartmental Particles with Centrifuge-Based Microdroplet Formation from a Multi-Barrelled Capillary, Adv. Mater., 24, 1340−1346 (2012)参照。)により、５００ｍＭ塩化カルシウム溶液中に射出した。
このマイクロビーズの塩化カルシウム溶液内での３日後の安定性を評価した。【００５０】
図１Ａは、作製直後のマイクロビーズの蛍光像であり、図１Ｂは、塩化カルシウム溶液内で３日保存後のマイクロビーズの蛍光像である。図１Ｂに示されるように、マイクロゲルビーズ内にシリカビーズが安定して封入されることが確認された。【００５１】
［実験例２］
（マイクロビーズの徐放試験）
次に封入されたシリカビーズの徐放試験を行った。アルギン酸ナトリウム３重量％の水溶液を、１００ｍＭ塩化カルシウム溶液中に、実験例１と同様の手法で、射出し、アルギン酸カルシウムゲルのマイクロビーズ（直径約８０μｍ）を作製した。
このマイクロビーズを、ＮＩＨ／３Ｔ３細胞を培養したディシュに滴下した後、アルギン酸リアーゼを最終濃度が５０μｇ／ｍＬとなるようにディシュに滴下し、ビーズが溶けるまでの様子を観察したところ、数分で分解することに成功した。その後、アルギン酸リアーゼを滴下したこの細胞を３日間培養した後、生死判定試験により評価した。生細胞の染色に、カルセイン-ＡＭを用い（図２Ａ参照。）、死細胞の染色にエチジウムホモダイマーを用いた（図２Ｂ参照。）。図２Ａ及び図２Ｂの結果からわかるように、培養したほぼ全ての細胞が生存しており、徐放のプロセスにより細胞がダメージを受けないことが確認された。【００５２】
［実験例３］
（ＡＡＶ含有アルギン酸カルシウムゲルビーズの徐放試験）
シリカビーズの替わりにＡＡＶを用いたＤＤＳの検証試験を実施した。具体的には、感染により細胞にＧＦＰを発現するよう調製されたＡＡＶをアルギン酸カルシウムゲルのマイクロビーズに封入し、実施例２と同様の徐放試験を実施した。実施例３は、ＤＤＳ担体がＡＡＶの感染機能を維持できるかを実証するものである。
実験例１〜２と同様の手法で、１．７×１０１０ｇｃ／ｍＬのＧＦＰを発現するＡＡＶを含むアルギン酸ナトリウム３重量％の水溶液を、１００ｍＭ、５００ｍＭ、１０００ｍＭの塩化カルシウム溶液中に、実験例１と同様の手法で、射出し、アルギン酸カルシウムゲルのマイクロビーズ（直径約８０μｍ）を作製した。
作製したＧＦＰを発現するＡＡＶ含有アルギン酸カルシウムゲルビーズ、及び、最終濃度１０μｇ／ｍＬ、３０μｇ／ｍＬのアルギン酸リアーゼを、ＨｅＬａ細胞に滴下し、７２時間後のＧＦＰ発現細胞の割合を計測した。結果を図３に示す。図３中、左のレーンから、Ｃｏｎｔｒｏｌは、ＧＦＰを発現するＡＡＶ含有アルギン酸カルシウムゲルビーズ、及び、アルギン酸リアーゼ共に無添加のＨｅＬａ細胞を示し、ＡＡＶ＋Ｌｙａｓｅ＿０は、ＧＦＰを発現するＡＡＶのみを添加したＨｅＬａ細胞を示し、ＡＡＶ＋Ｌｙａｓｅ＿１０は、ＧＦＰを発現するＡＡＶ、及び、最終濃度１０μｇ／ｍＬのアルギン酸リアーゼを添加したＨｅＬａ細胞を示し、ＡＡＶ＋Ｌｙａｓｅ＿３０は、ＧＦＰを発現するＡＡＶ、及び、最終濃度３０μｇ／ｍＬのアルギン酸リアーゼを添加したＨｅＬａ細胞を示し、ＡＡＶ−Ｂｅａｄｓ＋Ｌｙａｓｅ＿０は、１００ｍＭの塩化カルシウム溶液中で作製したＧＦＰを発現するＡＡＶ含有アルギン酸カルシウムゲルビーズのみを添加したＨｅＬａ細胞を示し、ＡＡＶ−Ｂｅａｄｓ＋Ｌｙａｓｅ＿３０は、１００ｍＭの塩化カルシウム溶液中で作製したＧＦＰを発現するＡＡＶ含有アルギン酸カルシウムゲルビーズ、及び、最終濃度３０μｇ／ｍＬのアルギン酸リアーゼを添加したＨｅＬａ細胞を示し、ＡＡＶ−Ｂｅａｄｓ＋Ｌｙａｓｅ＿３０＋ＣａＣｌ２＿５００は、５００ｍＭの塩化カルシウム溶液中で作製したＧＦＰを発現するＡＡＶ含有アルギン酸カルシウムゲルビーズ、及び、最終濃度３０μｇ／ｍＬのアルギン酸リアーゼを添加したＨｅＬａ細胞を示し、ＡＡＶ−Ｂｅａｄｓ＋Ｌｙａｓｅ＿３０＋ＣａＣｌ２＿１０００は、１０００ｍＭの塩化カルシウム溶液中で作製したＧＦＰを発現するＡＡＶ含有アルギン酸カルシウムゲルビーズ、及び、最終濃度３０μｇ／ｍＬのアルギン酸リアーゼを添加したＨｅＬａ細胞を示す。【００５３】
図３に示すように、ＧＦＰを発現するＡＡＶ含有アルギン酸カルシウムゲルビーズのみを添加したＨｅＬａ細胞では、ＡＡＶの感染が抑えられ、アルギン酸カルシウムゲルが、ＡＡＶを担持することができることが確認された。更に、アルギン酸リアーゼを添加することにより、ＧＦＰを発現するＡＡＶの徐放が制御され、培養細胞におけるＧＦＰ遺伝子の発現が確認された。【００５４】
［実験例４］
（４℃又は−８０℃で保存したＧＦＰを発現するＡＡＶ含有アルギン酸カルシウムゲルビーズの安定性試験）
実験例３と同様の手法で、１．７×１０１０ｇｃ／ｍＬのＧＦＰを発現するＡＡＶを含むアルギン酸ナトリウム３重量％の水溶液を、１００ｍＭの塩化カルシウム溶液中に、射出し、アルギン酸カルシウムゲルのマイクロビーズ（直径約８０μｍ）を作製した。
作製したＧＦＰを発現するＡＡＶ含有アルギン酸カルシウムゲルビーズをＰＢＳに懸濁したビーズ懸濁液を、４℃又は−８０℃で７２時間保存した後、実験例３と同様の感染実験を行った。結果を図４に示す。図４中左のレーンから、Ｆｒｅｓｈ  Ｂ（−）Ｌ（−）は、保存を行っていないフレッシュなＧＦＰを発現するＡＡＶのみを添加したＨｅＬａ細胞を示し、Ｆｒｅｓｈ  Ｂ（−）Ｌ（＋）は、保存を行っていないフレッシュなＧＦＰを発現するＡＡＶ、及び、最終濃度３０μｇ／ｍＬのアルギン酸リアーゼを添加したＨｅＬａ細胞を示し、Ｆｒｅｓｈ  Ｂ（＋）Ｌ（＋）は、保存を行っていないフレッシュなＧＦＰを発現するＡＡＶ含有アルギン酸カルシウムゲルビーズ、及び、最終濃度３０μｇ／ｍＬのアルギン酸リアーゼを添加したＨｅＬａ細胞を示し、４Ｂ（＋）Ｌ（＋）は、４℃で７２時間保存したＧＦＰを発現するＡＡＶ含有アルギン酸カルシウムゲルビーズ、及び、最終濃度３０μｇ／ｍＬのアルギン酸リアーゼを添加したＨｅＬａ細胞を示し、−８０Ｂ（＋）Ｌ（＋）は、−８０℃で７２時間保存したＧＦＰを発現するＡＡＶ含有アルギン酸カルシウムゲルビーズ、及び、最終濃度３０μｇ／ｍＬのアルギン酸リアーゼを添加したＨｅＬａ細胞を示す。
図４に示すように、コントロールと比較して、４℃又は−８０℃で保存した後でも感染効率に違いがいないことから、ＡＡＶ含有アルギン酸カルシウムゲルビーズを４℃又は−８０℃で保存可能なことが確認された。【００５５】
[実施例５]
（ハイドロゲルマイクロビーズへのＡＡＶ封入後、時間経過した後のウイルスの感染力評価試験）
感染により細胞にＧＦＰを発現するよう調製されたＡＡＶをアルギン酸カルシウムゲルのマイクロビーズに封入し、(i)封入から７２時間後まで保持した試料、(ii)マイクロビーズに封入後すぐにアルギン酸リアーゼにかけて分解し、封入から７２時間後まで保持した試料、及び(iii)マイクロビーズに封入後２４時間保持し、その後アルギン酸リアーゼにかけて分解し、封入から７２時間後まで保持した試料を調製した。リアーゼ濃度は、３３μｇ/ｍLとした。１well当たり５×１０3個の細胞に対して、MOI=1×１０6で上記(i)〜(iii)の試料を使用した。細胞の感染率を試料(i)〜資料(iii)、コントロール（ポジティブ、ネガティブ）について求めた。結果を図５に示す。【００５６】
図５に示されるように、試料(i)〜試料(iii)の全てにおいて感染力が認められた。試料(i)における感染力は、試料(ii)及び試料(iii)における感染力と比較して有為に低かった。この結果は、AAVの感染がビーズによって抑制されたことを示すものである。【００５７】
[実施例６]
（コラーゲンゲルへのＡＡＶ含有ビーズの封入と、その後に分解処理にかけた試料の感染力評価試験）
感染により細胞にＧＦＰを発現するよう調製されたＡＡＶを含有するビーズ（Low Density, High Density）に関して、(i)Low Densityビーズをコラーゲンゲルに封入して７２時間保持した試料、 (ii)Low Densityビーズをコラーゲンゲルに封入してからすぐにアルギン酸リアーゼにかけて分解し、封入から７２時間後まで保持した試料、(iii)High Densityビーズをコラーゲンゲルに封入して７２時間保持した試料、(iv)High Densityビーズをコラーゲンゲルに封入してからすぐにアルギン酸リアーゼにかけて分解し、封入から７２時間後まで保持した試料を調製した。High Densityビーズは、ビーズ数がLow densityの１/１０であり、ウイルス濃度が１０倍のものとなっている。
リアーゼ濃度は、３３μｇ/ｍLとした。１well当たり５×１０3個の細胞に対して、MOI=1×１０6で上記(i)〜(iv)の試料を使用した。細胞の感染率を試料(i)〜試料(iv)、コントロール（ポジティブ、ネガティブ）について求めた。結果を図６に示す。【００５８】
図６に示されるように、試料(iii)を除く、試料(i)、試料(ii)、及び試料(iv)において感染力が認められた。
【産業上の利用可能性】
【００５９】
本発明によれば、内耳などの狭く複雑な構造をしている組織に安定して留置可能であり、薬剤の徐放制御を可能とする薬物送達用担体を提供することができる。
【図１Ａ】
2020045162.tif 000003
【図１Ｂ】
2020045162.tif 000004
【図２Ａ】
2020045162.tif 000005
【図２Ｂ】
2020045162.tif 000006
【図３】
2020045162.tif 000007
【図４】
2020045162.tif 000008
【図５】
2020045162.tif 000009
【図６】
2020045162.tif 000010
【配列表】
2020045162000001.app
【国際調査報告】
2020045162.tif 000011
2020045162.tif 000012
2020045162.tif 000013
2020045162.tif 000014
2020045162.tif 000015
2020045162.tif 000016