(57)【要約】  細胞外小胞の分泌を抑制するための組成物を提供すること。  細胞外小胞の分泌を抑制するための組成物であって、式ＩＩ（式中、各置換基は、明細書に定義されるとおりである）の構造を有する化合物、又はその薬学的に許容し得る塩、或いは式Ｉ（式中、各置換基は、明細書に定義されるとおりである）の構造を有する化合物、若しくはその金属錯体、又はその薬学的に許容し得る塩を含む、組成物。
2020138266.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞外小胞の分泌を抑制するための組成物であって、式ＩＩ：
【化１】
2020138266.tif 000035
［式中
各Ｒａは、独立して、ハロゲン；ヒドロキシ；アミノ；ニトロ；ハロゲン、ヒドロキシ、アミノ若しくはニトロで置換されていてもよいＣ１−６アルキル；又はハロゲン、ヒドロキシ、アミノ若しくはニトロで置換されていてもよいＣ１−６アルコキシであり、
各Ｒｂは、独立して、ハロゲン；ヒドロキシ；アミノ；ニトロ；ハロゲン、ヒドロキシ、アミノ若しくはニトロで置換されていてもよいＣ１−６アルキル；又はハロゲン、ヒドロキシ、アミノ若しくはニトロで置換されていてもよいＣ１−６アルコキシであり、
ｏは、０〜４であり、
ｐは、０〜５である］
の構造を有する化合物、又はその薬学的に許容し得る塩を含む、組成物。
【請求項２】
細胞外小胞の分泌を抑制するための組成物であって、式Ｉ：
【化２】
2020138266.tif 000036
［式中
Ｒ１及びＲ２は、独立して、水素、又はハロゲン、−Ｃ（Ｏ）Ｒ５、−ＮＲ６Ｒ７、−Ｎ＋Ｒ８Ｒ９Ｒ１０及びニトロからなる群より選択される１〜５個の置換基で置換されていてもよいフェニルであり、
各Ｒ３は、独立して、ハロゲン、−Ｃ（Ｏ）Ｒ５、−ＮＲ６Ｒ７、−Ｎ＋Ｒ８Ｒ９Ｒ１０又はニトロであり、
各Ｒ４は、独立して、ハロゲン、−Ｃ（Ｏ）Ｒ５、−ＮＲ６Ｒ７、−Ｎ＋Ｒ８Ｒ９Ｒ１０又はニトロであり、
各Ｒ５は、独立して、水素、ヒドロキシ、又はハロゲン、ヒドロキシ、アミノ若しくはニトロで置換されていてもよいＣ１−６アルキルであり、
各Ｒ６、各Ｒ７、各Ｒ８、各Ｒ９及び各Ｒ１０は、独立して、水素、又はハロゲン、ヒドロキシ、アミノ若しくはニトロで置換されていてもよいＣ１−６アルキルであり、
ｍは、０〜５であり、
ｎは、０〜５である］
の構造を有する化合物、若しくはその金属錯体、又はその薬学的に許容し得る塩を含む、組成物。
【請求項３】
ｏが、０である、請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
ｐが、１又は２である、請求項１又は３に記載の組成物。
【請求項５】
各Ｒｂが、ハロゲンである、請求項１、３及び４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項６】
式ＩＩの構造を有する化合物が、以下：
【化３】
2020138266.tif 000037
からなる群より選択される、請求項１に記載の組成物。
【請求項７】
Ｒ１及びＲ２が、ハロゲン、−Ｃ（Ｏ）Ｒ５、−ＮＲ６Ｒ７、−Ｎ＋Ｒ８Ｒ９Ｒ１０及びニトロからなる群より選択される１〜５個の置換基で置換されていてもよいフェニルである、請求項２に記載の組成物。
【請求項８】
ｍが、１である、請求項２又は７に記載の組成物。
【請求項９】
Ｒ１及びＲ２が、水素である、請求項２に記載の組成物。
【請求項１０】
式Ｉの構造を有する化合物が、以下：
【化４】
2020138266.tif 000038
からなる群より選択される、請求項２に記載の組成物。
【請求項１１】
ガンを治療又は予防するための、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１２】
ガンの転移を予防するための、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１３】
培地組成物である、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１４】
細胞外小胞の分泌を抑制するための方法であって、ｉｎ ｖｉｔｒｏ又はｅｘ ｖｉｖｏで、請求項１〜１０のいずれかで定義される化合物、若しくはその金属錯体、又はその薬学的に許容し得る塩と、細胞又は組織とを接触させることを含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞外小胞の分泌を抑制するための組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
細胞外小胞は、細胞から分泌される小胞であり、その膜構造は細胞自身や細胞内小器官と同様に脂質二重層からなっており、唾液、血液、尿、羊水等のあらゆる体液中や細胞培養液中に安定して存在することが知られている。【０００３】
細胞外小胞としては、例えば、Ｅｘｏｓｏｍｅｓ（エクソソーム）、Ｍｉｃｒｏｖｅｓｉｃｌｅｓ（ＭＶ；微小小胞体）、Ａｐｏｐｔｏｔｉｃ Ｂｏｄｉｅｓ（アポトーシス小体）等が知られている。エクソソームは、エンドサイト−シス・パスウエイに由来する約２０〜約２００ｎｍの小胞であり、その構成成分としてタンパク質、核酸（ｍＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ノン・コーティングＲＮＡ等）等が知られており、細胞間コミュニケーションを司る機能等を有しうる。微小小胞体（ＭＶ）は、細胞質膜に由来する約５０〜約１０００ｎｍの小胞であり、その構成成分としてタンパク質、核酸（ｍＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ノン・コーティングＲＮＡ等）等が知られており、細胞間コミュニケーションを司る機能等を有しうる。アポトーシス小体は、細胞質膜に由来する約５００〜約２０００ｎｍの小胞であり、その構成成分として断片化された核、細胞小器官（オルガネラ）等が知られており、ファゴサイトーシスを誘導する機能等を有しうる。【０００４】
近年、細胞外小胞は、生体内の細胞間コミュニケーションの媒介役として機能することや、ガンや神経変性疾患等の疾患との関連性が注目されている。【０００５】
非特許文献１においては、線維芽細胞が分泌したエクソソームが肺ガン細胞の隆起に関与していることが報告されている。非特許文献２、３には、メラノーマ由来のエクソソームが原発巣の転移を促進することや、ニュートラルスフィンゴミエリナーゼ２（ｎＳＭａｓｅ）の刺激より転移巣から分泌されたエクソソームがガンの転移を更に促進することが報告されている。非特許文献４には、ヒト特異的ＣＤ９又はＣＤ６３抗体を投与することで、ＣＤ９又はＣＤ６３陽性の細胞外小胞をマクロファージに除去させ、マウスモデルの乳ガン原発巣からの肺、リンパ節及び胸腔への転移を抑制できることが報告されている。また、非特許文献５には、卵巣ガンにおいて、ＭＭＰ１ ｍＲＮＡを内包する悪性の細胞外小胞が腹膜の中皮細胞のアポトーシスを誘導し、結果として卵巣ガンの腹膜播種性転移を促進することが報告されている。更に、非特許文献６には、ミクログリアからのエクソソームの分泌を抑制することで、アルツハイマー病におけるタウの沈着の進展を予防できる可能性が示唆されている。【０００６】
このような背景から、近年、細胞外小胞の分泌を抑制する物質について研究が進められている。例えば、特許文献１では、特定の化合物がメラニン形成細胞から分泌されるエクソソーム量を抑制し、美白作用を示すことが報告されている。また、特許文献２では、ＮＡＰＧ、ＨＩＮＴ３若しくはＧＸＹＬＴ１遺伝子の発現を抑制する物質、又はＮＡＰＧ、ＨＩＮＴ３若しくはＧＸＹＬＴ１タンパク質の活性を抑制する物質が、エクソソームの分泌を阻害することが報告されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】国際公開第２０１７／００３１１４号
【特許文献２】国際公開第２０１７／０４３３７０号
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Ｌｕｇａ Ｖ，ｅｔ ａｌ，Ｃｅｌｌ，Ｄｅｃ ２１，２０１２，１５１（７），１５４２−５６
【非特許文献２】Ｐｅｉｎａｄｏ Ｈ，ｅｔ ａｌ，Ｎａｔ Ｍｅｄ．，２０１２ Ｊｕｎ；１８（６）：８８３−９１
【非特許文献３】Ｎｏｂｕｙｏｓｈｉ Ｋｏｓａｋａ，ｅｔ ａｌ，Ｊ Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ，２０１３，２８８：１０３４９−１０８５９
【非特許文献４】Ｎｉｓｈｉｄａ−Ａｏｋｉ Ｎ，ｅｔ ａｌ，Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ.,２０１７，２５（１）：１８１−１９１
【非特許文献５】Ｙｏｋｏｉ Ａ, ｅｔ ａｌ， Ｎａｔ Ｃｏｍｍｕｎ.,２０１７，８:１４４７０
【非特許文献６】Ａｓａｉ Ｈ，ｅｔ ａｌ，Ｎａｔ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．，２０１５ Ｎｏｖ；１８（１１）：１５８４−９３
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
しかしながら、細胞外小胞の分泌を抑制する物質に関しては、その報告数が限られており、細胞外小胞の分泌を抑制するための新たな組成物の開発が望まれている。【００１０】
したがって、本発明の課題は、細胞外小胞の分泌を抑制するための組成物を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
上記課題に鑑み、鋭意検討を重ねたところ、本発明者は、意外にも、特定の化合物を含む組成物が、細胞外小胞の分泌を抑制することを見出し、本発明を完成するに至った。【００１２】
したがって、本発明は、要旨、以下のものを提供する。
〔１〕  細胞外小胞の分泌を抑制するための組成物であって、式Ｉ：
【化１】
2020138266.tif 000003
［式中
Ｒ１及びＲ２は、独立して、水素、又はハロゲン、−Ｃ（Ｏ）Ｒ５、−ＮＲ６Ｒ７、−Ｎ＋Ｒ８Ｒ９Ｒ１０及びニトロからなる群より選択される１〜５個の置換基で置換されていてもよいフェニルであり、
各Ｒ３は、独立して、ハロゲン、−Ｃ（Ｏ）Ｒ５、−ＮＲ６Ｒ７、−Ｎ＋Ｒ８Ｒ９Ｒ１０又はニトロであり、
各Ｒ４は、独立して、ハロゲン、−Ｃ（Ｏ）Ｒ５、−ＮＲ６Ｒ７、−Ｎ＋Ｒ８Ｒ９Ｒ１０又はニトロであり、
各Ｒ５は、独立して、水素、ヒドロキシ、又はハロゲン、ヒドロキシ、アミノ若しくはニトロで置換されていてもよいＣ１−６アルキルであり、
各Ｒ６、各Ｒ７、各Ｒ８、各Ｒ９及び各Ｒ１０は、独立して、水素、又はハロゲン、ヒドロキシ、アミノ若しくはニトロで置換されていてもよいＣ１−６アルキルであり、
ｍは、０〜５であり、
ｎは、０〜５である］
の構造を有する化合物、若しくはその金属錯体、又はその薬学的に許容し得る塩、或いは
式ＩＩ：
【化２】
2020138266.tif 000004
［式中
各Ｒａは、独立して、ハロゲン；ヒドロキシ；アミノ；ニトロ；ハロゲン、ヒドロキシ、アミノ若しくはニトロで置換されていてもよいＣ１−６アルキル；又はハロゲン、ヒドロキシ、アミノ若しくはニトロで置換されていてもよいＣ１−６アルコキシであり、
各Ｒｂは、独立して、ハロゲン；ヒドロキシ；アミノ；ニトロ；ハロゲン、ヒドロキシ、アミノ若しくはニトロで置換されていてもよいＣ１−６アルキル；又はハロゲン、ヒドロキシ、アミノ若しくはニトロで置換されていてもよいＣ１−６アルコキシであり、
ｏは、０〜４であり、
ｐは、０〜５である］
の構造を有する化合物、又はその薬学的に許容し得る塩
を含む、組成物。
〔２〕  式Ｉの構造を有する化合物、又はその薬学的に許容し得る塩を含む、〔１〕に記載の組成物。
〔３〕  Ｒ１及びＲ２が、ハロゲン、−Ｃ（Ｏ）Ｒ５、−ＮＲ６Ｒ７、−Ｎ＋Ｒ８Ｒ９Ｒ１０及びニトロからなる群より選択される１〜５個の置換基で置換されていてもよいフェニルである、〔１〕又は〔２〕に記載の組成物。
〔４〕  ｍが、１である、〔１〕〜〔３〕のいずれかに記載の組成物。
〔５〕  Ｒ１及びＲ２が、水素である、〔１〕又は〔２〕に記載の組成物。
〔６〕  式ＩＩの構造を有する化合物、又はその薬学的に許容し得る塩を含む、〔１〕に記載の組成物。
〔７〕  ｏが、０である、〔１〕又は〔６〕に記載の組成物。
〔８〕  ｐが、１又は２である、〔１〕、〔６〕及び〔７〕のいずれかに記載の組成物。
〔９〕  各Ｒｂが、ハロゲンである、〔１〕及び〔６〕〜〔８〕のいずれかに記載の組成物。
〔１０〕  式Ｉの構造を有する化合物又は式ＩＩの構造を有する化合物が、以下：
【化３】
2020138266.tif 000005
2020138266.tif 000006
からなる群より選択される、〔１〕に記載の組成物。
〔１１〕  ガンを治療又は予防するための、〔１〕〜〔１０〕のいずれかに記載の組成物。
〔１２〕  ガンの転移を予防するための、〔１〕〜〔１０〕のいずれかに記載の組成物。
〔１３〕  培地組成物である、〔１〕〜〔１０〕のいずれか一項に記載の組成物。
〔１４〕  細胞外小胞の分泌を抑制するための方法であって、ｉｎ ｖｉｔｒｏ又はｅｘ ｖｉｖｏで、〔１〕〜〔１０〕のいずれかで定義される化合物、若しくはその金属錯体、又はその薬学的に許容し得る塩と、細胞又は組織とを接触させることを含む、方法。
【発明の効果】
【００１３】
本発明によれば、細胞外小胞の分泌を抑制するための組成物を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１Ａ】試験例１−１において、実施例１〜５又は比較例２，３，５の化合物 ０〜１０μＭをＵ−８７ＭＧ細胞に添加した際の細胞外小胞の分泌量をＴｉｍ４−ＣＤ６３ ＥＬＩＳＡ法で評価した結果を示す。
【図１Ｂ】試験例１−１において、実施例１，６〜８又は比較例１，４の化合物 ０〜１０μＭをＵ−８７ＭＧ細胞に添加した際の細胞外小胞の分泌量をＴｉｍ４−ＣＤ６３ ＥＬＩＳＡ法で評価した結果を示す。
【図１Ｃ】試験例１−１において、実施例９〜１６又は比較例６〜８の化合物 ０〜１０μＭをＵ−８７ＭＧ細胞に添加した際の細胞外小胞の分泌量をＴｉｍ４−ＣＤ９ ＥＬＩＳＡ法で評価した結果を示す。
【図１Ｄ】試験例１−１において、実施例９〜１６又は比較例６〜８の化合物 ０〜１０μＭをＵ−８７ＭＧ細胞に添加した際の細胞外小胞の分泌量をＴｉｍ４−ＣＤ６３ ＥＬＩＳＡ法で評価した結果を示す。
【図１Ｅ】試験例１−２において、実施例９の化合物 ０〜２０μＭをＵ−８７ＭＧ細胞に添加した際の細胞外小胞の分泌量をＴｉｍ４−ＣＤ６３ ＥＬＩＳＡ法で評価した結果を示す。
【図１Ｆ】試験例１−３において、実施例９の化合物 ０〜１０μＭを種々の細胞に添加した際の細胞外小胞の分泌量をＴｉｍ４−ＥＬＩＳＡ法で評価した結果を示す。
【図２Ａ】試験例２−１において、実施例１〜５若しくは比較例２，３，５の化合物 ０〜１０μＭ、又はポジティブコントロールとして死細胞群（培養液回収の１５分前に、化合物未処置細胞に９μＬのＬｙｓｉｓ Ｂｕｆｆｅｒを添加したサンプル）（ＰＣ）の細胞傷害性を、培養上清中のＬＤＨ量で評価した結果を示す。
【図２Ｂ】試験例２−１において、実施例１，６〜８若しくは比較例１，４の化合物 ０〜１０μＭ、又はポジティブコントロールとして死細胞群（培養液回収の１５分前に、化合物未処置細胞に９μＬのＬｙｓｉｓ Ｂｕｆｆｅｒを添加したサンプル）（ＰＣ）の細胞傷害性を、培養上清中のＬＤＨ量で評価した結果を示す。
【図２Ｃ】試験例２−１において、実施例９〜１６又は比較例６〜８の化合物 ０〜１０μＭ、又はポジティブコントロールとして死細胞群（培養液回収の１５分前に、化合物未処置細胞に９μＬのＬｙｓｉｓ Ｂｕｆｆｅｒを添加したサンプル）（ＰＣ）の細胞傷害性を、培養上清中のＬＤＨ量で評価し、吸光度のＰＣに対する％として表した結果を示す。
【図２Ｄ】試験例２−１において、実施例９の化合物 ０〜４０μＭ又はポジティブコントロールとして死細胞群（培養液回収の１５分前に、化合物未処置細胞に９μＬのＬｙｓｉｓ Ｂｕｆｆｅｒを添加したサンプル）（ＰＣ）の細胞傷害性を、培養上清中のＬＤＨ量で評価した結果を示す。
【図２Ｅ】試験例２−２において、種々の細胞における実施例９の化合物 １０μＭの細胞障害性を、溶媒のみ（０μＭ）の細胞障害性に対する％として表した結果を示す。
【図３Ａ】試験例３において、実施例９の化合物 ０〜２０μＭをＵ−８７ＭＧ細胞に添加した際の細胞外小胞の分泌量を、Ｎａｎｏ ＳＩＧＨＴで評価した結果を示す。
【図３Ｂ】試験例３において、実施例９，１１〜１５の化合物 ０又は１０μＭをＵ−８７ＭＧ細胞に添加した際の細胞外小胞の分泌量を、Ｎａｎｏ ＳＩＧＨＴで評価した結果を示す。
【図４】試験例４において、実施例９の化合物 ０〜２０μＭをＵ−８７ＭＧ細胞に添加した際の細胞外小胞の分泌量を、Ｔｉｍ４−ＣＤ６３ ＥＬＩＳＡ法で評価した結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
本発明は、細胞外小胞の分泌を抑制するための組成物であって、式Ｉ：
【化４】
2020138266.tif 000007
［式中
Ｒ１及びＲ２は、独立して、水素、又はハロゲン、−Ｃ（Ｏ）Ｒ５、−ＮＲ６Ｒ７、−Ｎ＋Ｒ８Ｒ９Ｒ１０及びニトロからなる群より選択される１〜５個の置換基で置換されていてもよいフェニルであり、
各Ｒ３は、独立して、ハロゲン、−Ｃ（Ｏ）Ｒ５、−ＮＲ６Ｒ７、−Ｎ＋Ｒ８Ｒ９Ｒ１０又はニトロであり、
各Ｒ４は、独立して、ハロゲン、−Ｃ（Ｏ）Ｒ５、−ＮＲ６Ｒ７、−Ｎ＋Ｒ８Ｒ９Ｒ１０又はニトロであり、
各Ｒ５は、独立して、水素、ヒドロキシ、又はハロゲン、ヒドロキシ、アミノ若しくはニトロで置換されていてもよいＣ１−６アルキルであり、
各Ｒ６、各Ｒ７、各Ｒ８、各Ｒ９及び各Ｒ１０は、独立して、水素、又はハロゲン、ヒドロキシ、アミノ若しくはニトロで置換されていてもよいＣ１−６アルキルであり、
ｍは、０〜５であり、
ｎは、０〜５である］
の構造を有する化合物、若しくはその金属錯体、又はその薬学的に許容し得る塩、或いは
式ＩＩ：
【化５】
2020138266.tif 000008
［式中
各Ｒａは、独立して、ハロゲン；ヒドロキシ；アミノ；ニトロ；ハロゲン、ヒドロキシ、アミノ若しくはニトロで置換されていてもよいＣ１−６アルキル；又はハロゲン、ヒドロキシ、アミノ若しくはニトロで置換されていてもよいＣ１−６アルコキシであり、
各Ｒｂは、独立して、ハロゲン；ヒドロキシ；アミノ；ニトロ；ハロゲン、ヒドロキシ、アミノ若しくはニトロで置換されていてもよいＣ１−６アルキル；又はハロゲン、ヒドロキシ、アミノ若しくはニトロで置換されていてもよいＣ１−６アルコキシであり、
ｏは、０〜４であり、
ｐは、０〜５である］
の構造を有する化合物、又はその薬学的に許容し得る塩
を含む、組成物を提供する。
【００１６】
本発明はまた、細胞外小胞の分泌を抑制するための、式Ｉの構造を有する化合物、若しくはその金属錯体、又はその薬学的に許容し得る塩、或いは式ＩＩの構造を有する化合物、又はその薬学的に許容し得る塩を提供する。
【００１７】
本発明はまた、細胞外小胞の分泌を抑制するための組成物を製造するための使用であって、式Ｉの構造を有する化合物、若しくはその金属錯体、又はその薬学的に許容し得る塩、或いは式ＩＩの構造を有する化合物、又はその薬学的に許容し得る塩の、使用を提供する。
【００１８】
本発明はまた、細胞外小胞の分泌を抑制するための方法であって、それを必要とする被験体に式Ｉの構造を有する化合物、若しくはその金属錯体、又はその薬学的に許容し得る塩、或いは式ＩＩの構造を有する化合物、又はその薬学的に許容し得る塩を投与することを含む、方法を提供する。
【００１９】
本明細書中で用いられる「ハロゲン」とは、これらに限定されるものではないが、例えば、フッ素、塩素、臭素、ヨウ素等を意味する。
【００２０】
本明細書中で用いられる「ニトロ」とは、式「−ＮＯ２」で表される基を意味する。
【００２１】
本明細書中で用いられる「ハロゲン、−Ｃ（Ｏ）Ｒ５、−ＮＲ６Ｒ７、−Ｎ＋Ｒ８Ｒ９Ｒ１０及びニトロからなる群より選択される１〜５個の置換基で置換されていてもよいフェニル」とは、フェニルの１〜５個の水素原子が、−Ｃ（Ｏ）Ｒ５、−ＮＲ６Ｒ７、−Ｎ＋Ｒ８Ｒ９Ｒ１０又はニトロ（これらの式中、Ｒ６〜Ｒ１０は、本明細書中に定義されるとおりである）により置換されていてもよいし、置換されていなくてもよい基を意味する。
【００２２】
本明細書中で用いられる「ヒドロキシ」とは、式「−ＯＨ」で表される基を意味する。
【００２３】
本明細書中で用いられる「アミノ」とは、式「−ＮＨ２」で表される基を意味する。
【００２４】
本明細書中で用いられる「Ｃ１−６アルキル」とは、１〜６個の炭素原子を含む飽和の直鎖又は分岐鎖の炭化水素基（これらに限定されるものではないが、例えば、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、ｉ−ブチル、ｔ−ブチル、ペンチル、へキシル等を含む）を意味する。好ましいＣ１−６アルキルは、Ｃ１−４アルキル（例えば、メチル、エチル、プロピル、ブチル、イソプロピル等を含む）であり、より好ましくは、メチルである。
【００２５】
本明細書中で用いられる「ハロゲン、ヒドロキシ、アミノ若しくはニトロで置換されていてもよいＣ１−６アルキル」とは、Ｃ１−Ｃ６アルキルの１つ以上の水素原子が、ハロゲン、ヒドロキシ、アミノ又はニトロにより置換されていてもよいし、置換されていなくてもよい基を意味する。
【００２６】
本明細書中で用いられる「Ｃ１−６アルコキシ」とは、式「−Ｏ−Ｃ１−６アルキル」で表される基（これらに限定されるものではないが、例えば、メトキシ、エトキシ、プロポキシ、イソプロポキシ等を含む）を意味する。好ましいＣ１−６アルコキシは、メトキシ、エトキシ又はプロポキシであり、より好ましくは、メトキシである。
【００２７】
本明細書中で用いられる「ハロゲン、ヒドロキシ、アミノ若しくはニトロで置換されていてもよいＣ１−６アルコキシ」とは、Ｃ１−６アルコキシ中の１つ以上の水素原子が、ハロゲン、ヒドロキシ、アミノ又はニトロで置換されていてもよいし、置換されていなくてもよい基を意味する。
【００２８】
本明細書中で用いられる「金属錯体」とは、式Ｉの構造を有する化合物中のポルフィン環に、中心金属が配位した金属錯体を意味する。金属錯体を形成することのできる中心金属としては、これらに限定されるものではないが、例えば、鉄、亜鉛、銅、金、コバルト、ニッケル、クロム、マグネシウム等が挙げられる。
【００２９】
本明細書中で用いられる「薬学的に許容しうる塩」とは、これらに限定されるものではないが、例えば、無機酸（これらに限定されるものではないが、例えば、塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、炭酸、リン酸等）又は有機酸（これらに限定されるものではないが、例えば、ギ酸、酢酸、プロピオン酸、グリコール酸、グルコン酸、乳酸、メシル酸、ピルビン酸、シュウ酸、リンゴ酸、マレイン酸、マロン酸、コハク酸、フマル酸、酒石酸、クエン酸、アスパラギン酸、アスコルビン酸、グルタミン酸、アントラニル酸、安息香酸、ケイ皮酸、マンデル酸、エンボン酸、フェニル酢酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸、サリチル酸等）との酸付加塩；金属（これらに限定されるものではないが、例えば、ナトリウム、カリウム、カルシウム、マグネシウム、鉄、亜鉛、銅、マンガン）との塩；アンモニウム塩；有機塩基（これらに限定されるものではないが、例えば、イソプロピルアミン、トリメチルアミン、ジエチルアミン、トリエチルアミン、トリプロピルアミン、エタノールアミン、２−ジエチルアミノエタノール、トリメタミン、ジシクロへキシルアミン、リジン、アルギニン、ヒスチジン、カフェイン、プロカイン、ヒドラバミン、コリン、ベタイン、エチレンジアミン、グルコサミン、メチルグルカミン、テオブロミン、プリン類、ピペラジン、ピペリジン、Ｎ−エチルピペリジン等）との塩等が挙げられる。
【００３０】
（本明細書中に記載の組成物に含まれる）式Ｉの構造を有する化合物、若しくはその金属錯体、又はその薬学的に許容し得る塩、或いは式ＩＩの構造を有する化合物、又はその薬学的に許容し得る塩は、その溶媒和物（例えば、その水和物）、その結晶多形等も包含される。
【００３１】
本明細書中で用いられる「溶媒和物」とは、１つ以上の溶媒分子と、式Ｉの構造を有する化合物、若しくはその金属錯体、又はその薬学的に許容し得る塩、或いは式ＩＩの構造を有する化合物、又はその薬学的に許容し得る塩との会合体、複合体等を意味する。溶媒としては、これらに限定されるものではないが、例えば、水、メタノール、エタノール、イソプロパノール、ＤＭＳＯ、酢酸、酢酸エチル等が挙げられる。
【００３２】
本発明の一実施態様では、式Ｉの構造を有する化合物、若しくはその金属錯体、又はその薬学的に許容し得る塩を含む、本明細書中に記載の組成物を提供する。
【００３３】
本発明の別の実施態様では、細胞外小胞の分泌を抑制するための、式Ｉの構造を有する化合物、若しくはその金属錯体、又はその薬学的に許容し得る塩を提供する。
【００３４】
本発明の別の実施態様では、細胞外小胞の分泌を抑制するための組成物を製造するための使用であって、式Ｉの構造を有する化合物、若しくはその金属錯体、又はその薬学的に許容し得る塩の、使用を提供する。
【００３５】
本発明の別の実施態様では、細胞外小胞の分泌を抑制するための方法であって、それを必要とする被験体に式Ｉの構造を有する化合物、若しくはその金属錯体、又はその薬学的に許容し得る塩を投与することを含む、方法を提供する。
【００３６】
本発明の一実施態様では、Ｒ１が、ハロゲン、−Ｃ（Ｏ）Ｒ５、−ＮＲ６Ｒ７、−Ｎ＋Ｒ８Ｒ９Ｒ１０及びニトロからなる群より選択される１〜５個の置換基で置換されていてもよいフェニルである、本明細書中に記載の組成物（或いは、化合物、使用又は方法）を提供する。
【００３７】
本発明の一実施態様では、Ｒ１が、１〜５個の−Ｎ＋Ｒ８Ｒ９Ｒ１０で置換されていてもよいフェニルである、本明細書中に記載の組成物（或いは、化合物、使用又は方法）を提供する。
【００３８】
本発明の一実施態様では、Ｒ１が、１個の−Ｎ＋Ｒ８Ｒ９Ｒ１０で置換されていているフェニルである、本明細書中に記載の組成物（或いは、化合物、使用又は方法）を提供する。
【００３９】
本発明の一実施態様では、Ｒ２が、ハロゲン、−Ｃ（Ｏ）Ｒ５、−ＮＲ６Ｒ７、−Ｎ＋Ｒ８Ｒ９Ｒ１０及びニトロからなる群より選択される１〜５個の置換基で置換されていてもよいフェニルである、本明細書中に記載の組成物（或いは、化合物、使用又は方法）を提供する。
【００４０】
本発明の一実施態様では、Ｒ２が、１〜５個の−Ｎ＋Ｒ８Ｒ９Ｒ１０で置換されていてもよいフェニルである、本明細書中に記載の組成物（或いは、化合物、使用又は方法）を提供する。
【００４１】
本発明の一実施態様では、Ｒ２が、１個の−Ｎ＋Ｒ８Ｒ９Ｒ１０で置換されていているフェニルである、本明細書中に記載の組成物（或いは、化合物、使用又は方法）を提供する。
【００４２】
本発明の好ましい一実施態様では、Ｒ１及びＲ２が、ハロゲン、−Ｃ（Ｏ）Ｒ５、−ＮＲ６Ｒ７、−Ｎ＋Ｒ８Ｒ９Ｒ１０及びニトロからなる群より選択される１〜５個の置換基で置換されていてもよいフェニルである、本明細書中に記載の組成物（或いは、化合物、使用又は方法）を提供する。
【００４３】
本発明の好ましい一実施態様では、Ｒ１及びＲ２が、１〜５個の−Ｎ＋Ｒ８Ｒ９Ｒ１０で置換されていてもよいフェニルである、本明細書中に記載の組成物（或いは、化合物、使用又は方法）を提供する。
【００４４】
本発明の好ましい一実施態様では、Ｒ１及びＲ２が、１個の−Ｎ＋Ｒ８Ｒ９Ｒ１０で置換されているフェニルである、本明細書中に記載の組成物（或いは、化合物、使用又は方法）を提供する。
【００４５】
本発明の一実施態様では、ｍが、１又は２である、本明細書中に記載の組成物（或いは、化合物、使用又は方法）を提供する。
【００４６】
本発明の一実施態様では、ｍが、１である、本明細書中に記載の組成物（或いは、化合物、使用又は方法）を提供する。
【００４７】
本発明の一実施態様では、ｎが、１又は２である、本明細書中に記載の組成物（或いは、化合物、使用又は方法）を提供する。
【００４８】
本発明の一実施態様では、ｎが、１である、本明細書中に記載の組成物（或いは、化合物、使用又は方法）を提供する。
【００４９】
本発明の一実施態様では、Ｒ１が、水素である、本明細書中に記載の組成物（或いは、化合物、使用又は方法）を提供する。
【００５０】
本発明の一実施態様では、Ｒ２が、水素である、本明細書中に記載の組成物（或いは、化合物、使用又は方法）を提供する。
【００５１】
本発明の好ましい一実施態様では、Ｒ１及びＲ２が、水素である、本明細書中に記載の組成物（或いは、化合物、使用又は方法）を提供する。
【００５２】
本発明の一実施態様では、式ＩＩの構造を有する化合物、又はその薬学的に許容し得る塩を含む、本明細書中に記載の組成物を提供する。
【００５３】
本発明の別の実施態様では、細胞外小胞の分泌を抑制するための、式ＩＩの構造を有する化合物、又はその薬学的に許容し得る塩を提供する。
【００５４】
本発明の別の実施態様では、細胞外小胞の分泌を抑制するための組成物を製造するための使用であって、式ＩＩの構造を有する化合物、又はその薬学的に許容し得る塩の、使用を提供する。
【００５５】
本発明の別の実施態様では、細胞外小胞の分泌を抑制するための方法であって、それを必要とする被験体に式ＩＩの構造を有する化合物、又はその薬学的に許容し得る塩を投与することを含む、方法を提供する。
【００５６】
本発明の一実施態様では、ｏが、０である、本明細書中に記載の組成物（或いは、化合物、使用又は方法）を提供する。
【００５７】
本発明の一実施態様では、ｐが、１又は２である、本明細書中に記載の組成物（或いは、化合物、使用又は方法）を提供する。
【００５８】
本発明の一実施態様では、ｐが、２である、本明細書中に記載の組成物（或いは、化合物、使用又は方法）を提供する。
【００５９】
本発明の一実施態様では、各Ｒｂが、ハロゲンである、本明細書中に記載の組成物（或いは、化合物、使用又は方法）を提供する。
【００６０】
本発明の一実施態様では、各Ｒｂが、塩素である、本明細書中に記載の組成物（或いは、化合物、使用又は方法）を提供する。
【００６１】
本発明の好ましい一実施態様では、ｐが、２であり、各Ｒｂが、ハロゲンである、本明細書中に記載の組成物（或いは、化合物、使用又は方法）を提供する。
【００６２】
本発明の好ましい一実施態様では、ｐが、２であり、各Ｒｂが、塩素である、本明細書中に記載の組成物（或いは、化合物、使用又は方法）を提供する。
【００６３】
本発明の一実施態様では、式Ｉの構造を有する化合物又は式ＩＩの構造を有する化合物が、以下：
【化６】
2020138266.tif 000009
2020138266.tif 000010
からなる群より選択される、本明細書中に記載の組成物（或いは、化合物、使用又は方法）を提供する。
【００６４】
式Ｉの構造を有する化合物、若しくはその金属錯体、又はその薬学的に許容し得る塩、或いは式ＩＩの構造を有する化合物、又はその薬学的に許容し得る塩は、市販されているか、或いは公知若しくは周知の方法により又はこれに類似する方法により製造することができる。例えば、これらの化合物は、Ｐｈａｒｍｅｋｓ社やＥｎａｍｉｎｅ社等から購入することができる。
【００６５】
本明細書中で用いられる「細胞外小胞」とは、細胞から分泌される小胞である限り特段限定されるものではないが、例えば、Ｅｘｏｓｏｍｅｓ（エクソソーム）、Ｍｉｃｒｏｖｅｓｉｃｌｅｓ（ＭＶ；微小小胞体）、Ａｐｏｐｔｏｔｉｃ Ｂｏｄｉｅｓ（アポトーシス小体）等が挙げられる。
【００６６】
本明細書中で用いられる「エクソソーム」とは、エンドサイト−シス・パスウエイに由来する、約２０〜約２００ｎｍの小胞を意味する。エクソソームの構成成分としては、例えば、タンパク質、核酸（ｍＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ノン・コーティングＲＮＡ）等が挙げられる。エクソソームは、細胞間コミュニケーションを司る機能を有しうる。エクソソームのマーカー分子としては、例えば、Ａｌｉｘ、Ｔｓｇ１０１、テトラスパニン（例えば、ＣＤ８１、ＣＤ６３、ＣＤ９）、ｆｌｏｔｉｌｌｉｎ、フォスファチジルセリン等が挙げられる。
【００６７】
本明細書中で用いられる「微小小胞体」とは、細胞質膜に由来する、約５０〜約１０００ｎｍの小胞を意味する。微小小胞体の構成成分としては、例えば、タンパク質、核酸（ｍＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ノン・コーティングＲＮＡ等）等が挙げられる。微小小胞体は、細胞間コミュニケーションを司る機能等を有しうる。微小小胞体のマーカー分子としては、例えば、インテグリン、セレクチン、ＣＤ４０、ＣＤ１５４等が挙げられる。
【００６８】
本明細書中で用いられる「アポトーシス小体」とは、細胞質膜に由来する、約５００〜約２０００ｎｍの小胞を意味する。アポトーシス小体の構成成分としては、例えば、断片化された核、細胞小器官（オルガネラ）等が挙げられる。アポトーシス小体は、ファゴサイトーシスを誘導する機能等を有しうる。アポトーシス小体のマーカー分子としては、例えば、Ａｎｎｅｘｉｎ Ｖ、フォスファチジルセリン等が挙げられる。
【００６９】
本発明の一実施態様では、細胞外小胞が、エクソソームである、本明細書中に記載の組成物（或いは、化合物、使用又は方法）を提供する。
【００７０】
本発明の一実施態様では、細胞外小胞が、ＣＤ９、ＣＤ６３及び／又はＣＤ８１陽性の細胞外小胞（好ましくは、ＣＤ９、ＣＤ６３及び／又はＣＤ８１陽性のエクソソーム）である、本明細書中に記載の組成物（或いは、化合物、使用又は方法）を提供する。
【００７１】
細胞外小胞を分泌する細胞は、細胞外小胞を分泌できる細胞である限り特段限定されるものではないが、例えば、表皮細胞（ケラチノサイト等）、色素細胞（メラノサイト等）、基底細胞、有棘細胞、顆粒細胞、角質細胞、線維芽細胞、肥満細胞等の皮膚細胞；神経幹細胞、神経膠細胞、神経細胞、ミクログリア等の脳細胞；脂肪細胞（白色脂肪細胞、褐色脂肪細胞等を含む）、間葉系幹細胞等の脂肪組織由来の細胞；これら以外の、リンパ球（Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞等）、単球、上皮細胞、内皮細胞、筋肉細胞、神経細胞、線維芽細胞、毛細胞、肝細胞、胃粘膜細胞、腸細胞、脾細胞、膵細胞(膵外分泌細胞等)、肺細胞、腎細胞、間葉系細胞等；組織前駆細胞；造血幹細胞、間葉系幹細胞（骨髄由来のもの、胎盤組織由来のもの、臍帯組織由来のもの、歯髄由来のもの等を含む）、その他の組織幹細胞（体性幹細胞）；等の動物由来細胞、或いは、柔組織細胞、厚角組織細胞、厚壁組織細胞、木部細胞、師部細胞、表皮細胞等の植物由来細胞が挙げられ、これらは、生体内の細胞であってもよいし、初代培養細胞であっても、継代細胞であっても、株化細胞であってもよく、これらは正常細胞であっても、ガン化又は腫瘍化した細胞を含む病変細胞であってもよい。細胞外小胞を分泌する細胞は、動物由来細胞であることが好ましく、皮膚細胞、又はガン化若しくは腫瘍化した細胞を含む病変細胞であることがより好ましく、ガン化又は腫瘍化した細胞であることが更に好ましい。
【００７２】
本発明の一実施態様では、動物由来細胞からの細胞外小胞の分泌を抑制するための、本明細書中に記載の組成物（或いは、化合物、使用又は方法）を提供する。
【００７３】
本発明の一実施態様では、皮膚細胞、又はガン化若しくは腫瘍化した細胞を含む病変細胞からの細胞外小胞の分泌を抑制するための、本明細書中に記載の組成物（或いは、化合物、使用又は方法）を提供する。
【００７４】
本発明の一実施態様では、ガン化若しくは腫瘍化した細胞からの細胞外小胞の分泌を抑制するための、本明細書中に記載の組成物（或いは、化合物、使用又は方法）を提供する。
【００７５】
本明細書中に記載の組成物は、細胞外小胞の分泌を抑制することができるため、細胞外小胞が関与し得る疾患の治療又は予防に使用することができる。
【００７６】
細胞外小胞が関与し得る疾患としては、これらに限定されるものではないが、例えば、ガン、神経変性疾患等が挙げられる。
【００７７】
本発明の一実施態様では、ガン又は神経変性疾患を治療又は予防するための、本明細書中に記載の組成物（或いは、化合物、使用又は方法）を提供する。
【００７８】
本発明の一実施態様では、ガンを治療又は予防するための、本明細書中に記載の組成物（或いは、化合物、使用又は方法）を提供する。
【００７９】
本発明の一実施態様では、神経変性疾患を治療又は予防するための、本明細書中に記載の組成物（或いは、化合物、使用又は方法）を提供する。
【００８０】
細胞外小胞は、ガンの転移、増悪化等に関与し得ることが報告されている。したがって、本発明の一実施態様では、ガンの転移を予防するための、本明細書中に記載の組成物（或いは、化合物、使用又は方法）を提供する。
【００８１】
ガンとしては、何れの固形ガン及び血液ガンが含まれ、これらに限定されるものではないが、例えば、小細胞肺ガン、非小細胞肺ガン、乳ガン、食道ガン、胃ガン、小腸ガン、大腸ガン、結腸ガン、直腸ガン、膵臓ガン、前立腺ガン、骨髄ガン、腎臓ガン（腎細胞ガン等を含む）、副甲状腺ガン、副腎ガン、尿管ガン、肝ガン、胆管ガン、子宮頸ガン、卵巣ガン（例えば、その組織型が、漿液性腺ガン、粘液性腺ガン、明細胞腺ガン等）、精巣ガン、膀胱ガン、外陰部ガン、陰茎ガン、甲状腺ガン、頭頸部ガン、頭蓋咽頭ガン、咽頭ガン、舌ガン、皮膚ガン、メルケル細胞ガン、黒色腫（悪性黒色腫等）、上皮ガン、扁平上皮細胞ガン、基底細胞ガン、小児ガン、原発不明ガン、繊維肉腫、粘膜肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨原生肉腫、脊索腫、血管肉腫、リンパ管肉腫、リンパ管内皮肉腫、カポジ肉腫、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、滑膜腫、中皮腫、ユーイング腫瘍、精上皮腫、ウィルムス腫瘍、脳腫瘍、神経膠腫、膠芽腫、星状細胞腫、骨髄芽腫、髄膜腫、神経芽細胞腫、髄芽腫、網膜芽細胞腫、脊椎腫瘍、悪性リンパ腫（例えば、非ホジキンリンパ腫、ホジキンリンパ腫等）、単球性白血病（慢性又は急性）、慢性又は急性リンパ球性白血病、成人Ｔ細胞白血病等が挙げられる。
【００８２】
神経変性疾患としては、これらに限定されるものではないが、例えば、アルツハイマー病、パーキンソン病、脳萎縮性側索硬化症、脊髄小脳変性症、前頭側頭葉変性症、進行性核上性麻痺、大脳皮質基底核変性症、ハンチントン病、ジストニア、プリオン病、多系統委縮症、レビー小体病、ポリグルタミン病等が挙げられる。
【００８３】
細胞外小胞の分泌を抑制する対象となる被験体は、これらに限定されるものではないが、例えば、マウス、ラット、ハムスター、モルモット等のげっ歯類；ウサギ等のウサギ目；ブタ、ウシ、ヤギ、ウマ、ヒツジ等の有蹄類；イヌ、ネコ等のネコ目；ヒト、サル、アカゲザル、カニクイザル、マーモセット、オランウータン、チンパンジー等の霊長類；等の哺乳動物等の動物、或いは植物が挙げられるが、好ましくは動物であり、より好ましくはげっ歯類又は霊長類であり、更に好ましくは霊長類であり、より更に好ましくはヒトである。
【００８４】
本発明の一実施態様では、本明細書中に記載の組成物は、医薬、食用又は化粧組成物である。
【００８５】
本明細書中に記載の組成物は、例えば医薬、食用又は化粧組成物として使用する場合、これらに限定されるものではないが、例えば、賦形剤、滑沢剤、結合剤、崩壊剤、ｐＨ調整剤、溶剤、溶解補助剤、懸濁化剤、等張化剤、緩衝剤、無痛化剤、防腐剤、抗酸化剤、着色剤、甘味剤、界面活性剤等の添加剤を含むことができる。
【００８６】
賦形剤としては、これらに限定されるものではないが、例えば、乳糖水和物、白糖、ブドウ糖、デンプン、ショ糖、結晶セルロース、マンニトール等が挙げられ、これらは、単独で用いても、２種以上を組み合わせて用いてもよい。
【００８７】
滑沢剤としては、これらに限定されるものではないが、例えば、軽質無水ケイ酸、ステアリン酸、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウム、ショ糖脂肪酸エステル、ポリエチレングリコール、タルク等が挙げられ、これらは、単独で用いても、２種以上を組み合わせて用いてもよい。
【００８８】
結合剤としては、これらに限定されるものではないが、例えば、アラビアゴム、結晶セルロース、白糖、マンニトール、デキストリン、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシメチルセルロース、ポリビニルピロリドン等が挙げられ、これらは、単独で用いても、２種以上を組み合わせて用いてもよい。
【００８９】
崩壊剤としては、これらに限定されるものではないが、例えば、デンプン、カルボキシメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースカルシウム、クロスカルメロースナトリウム、クロスカルメロースカルシウム、カルボキシメチルスターチナトリウム、クロスポビドン、低置換度ヒドロキシプロピルセルロース等が挙げられ、これらは、単独で用いても、２種以上を組み合わせて用いてもよい。
【００９０】
ｐＨ調整剤としては、これらに限定されるものではないが、例えば、酢酸、乳酸、酒石酸、シュウ酸、グリコール酸、リンゴ酸、クエン酸、コハク酸、フマル酸、リン酸、塩酸、硫酸、硝酸及びこれらの塩、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、炭酸水素ナトリウム、炭酸カリウム等が挙げられ、これらは、単独で用いても、２種以上を組み合わせて用いてもよい。
【００９１】
溶剤としては、これらに限定されるものではないが、例えば、水道水、常水、蒸留水、精製水、注射用水等の水；メタノール、エタノール、プロパノール、イソプロパノール等のアルコール；アセトン；酢酸、プロパン酸、ブタン酸、ペンタン酸、ヘキサン酸、ヘプタン酸、ミリスチン酸、ステアリン酸、オレイン酸等の単一の脂肪酸又はそのエステル；ゴマ油、ピーナッツ油、ヤシ油、パーム油、大豆油、オリーブ油、ココナッツ油、コーン油、綿実油、ヒマシ油、ナタネ油、ヒマワリ油等の植物性油；プロピレングリコール；マクロゴール等が挙げられ、これらは、単独で用いても、２種以上を組み合わせて用いてもよい。
【００９２】
溶解補助剤としては、これらに限定されるものではないが、例えば、ポリエチレングリコール；プロピレングリコール；シクロデキストリン；マンニトール等の糖アルコール；安息香酸ベンジル；トリスアミノメタン；コレステロール；トリエタノールアミン；炭酸ナトリウム；クエン酸ナトリウム；メタノール、エタノール、プロパノール、イソプロパノール等のアルコール；酢酸、プロパン酸、ブタン酸、ペンタン酸、ヘキサン酸、ヘプタン酸、ミリスチン酸、ステアリン酸、オレイン酸等の単一の脂肪酸又はそのエステル；ゴマ油、ピーナッツ油、ヤシ油、パーム油、大豆油、オリーブ油、ココナッツ油、コーン油、綿実油、ヒマシ油、ナタネ油、ヒマワリ油等の植物性油等が挙げられ、これらは、単独で用いても、２種以上を組み合わせて用いてもよい。
【００９３】
懸濁化剤としては、これらに限定されるものではないが、例えば、ステアリルトリエタノールアミン、ラウリル硫酸ナトリウム、ラウリルアミノプロピオン酸、レシチン、モノステアリン酸グリセリン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、カルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、ヒドロキシメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース等が挙げられ、これらは、単独で用いても、２種以上を組み合わせて用いてもよい。
【００９４】
等張化剤としては、これらに限定されるものではないが、例えば、塩化ナトリウム、グリセリン、マンニトール等が挙げられ、これらは、単独で用いても、２種以上を組み合わせて用いてもよい。
【００９５】
緩衝剤としては、これらに限定されるものではないが、例えば、リン酸塩、酢酸塩、炭酸塩、クエン酸塩等の緩衝液等が挙げられ、これらは、単独で用いても、２種以上を組み合わせて用いてもよい。
【００９６】
無痛化剤としては、これらに限定されるものではないが、例えば、ベンジルアルコール等が挙げられる。
【００９７】
防腐剤としては、これらに限定されるものではないが、例えば、ソルビン酸、ソルビン酸カリウム、ソルビン酸カルシウム、安息香酸、安息香酸ナトリウム、プロピオン酸、プロピオン酸ナトリウム、プロピオン酸カルシウム、デヒドロ酢酸ナトリウム、ナタマイシン、ピマリシン、ポリリジン、ナイシン、パラオキシ安息香酸イソプロピル、パラハイドロキシ安息香酸イソプロピル、イソプロピルパラベン等が挙げられ、これらは、単独で用いても、２種以上を組み合わせて用いてもよい。
【００９８】
抗酸化剤としては、これらに限定されるものではないが、例えば、亜硫酸塩、アスコルビン酸等が挙げられ、これらは、単独で用いても、２種以上を組み合わせて用いてもよい。
【００９９】
着色剤としては、これらに限定されるものではないが、例えば、黄色三二酸化鉄、黒色酸化鉄、食用黄色４号、食用赤色３号、タール色素、カラメル、酸化チタン、リボフラビン類等が挙げられ、これらは、単独で用いても、２種以上を組み合わせて用いてもよい。
【０１００】
甘味剤としては、これらに限定されるものではないが、例えば、ショ糖、フルクトース等の糖類；キシリトール、ソルビトール等の糖アルコール；アスパルテーム、アセスルファカリウム、スクラロース等の人工甘味料等が挙げられ、これらは、単独で用いても、２種以上を組み合わせて用いてもよい。
【０１０１】
界面活性剤としては、これらに限定されるものではないが、例えば、ポリソルベート類、ラウリル硫酸ナトリウム、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油等が挙げられ、これらは、単独で用いても、２種以上を組み合わせて用いてもよい。
【０１０２】
本明細書中に記載の組成物は、上述した添加剤と共に、自体公知の方法により、例えば、錠剤、被覆錠剤、口腔内崩壊錠、チュアブル剤、丸剤、顆粒剤、細粒剤、散剤、硬カプセル剤、軟カプセル剤、液剤（例えば、シロップ剤、注射剤、ローション剤等を含む）、懸濁剤、乳剤、ゼリー剤、貼付剤、軟膏剤、クリーム剤、吸入剤、坐剤等に製剤化することができる。これらは、経口剤であってもよいし、非経口剤であってもよい。製剤化されたものは、式Ｉの構造を有する化合物、若しくはその金属錯体、又はその薬学的に許容し得る塩、或いは式ＩＩの構造を有する化合物、又はその薬学的に許容し得る塩だけではなく、その目的に応じて、有益な他の成分（例えば、治療上有益な他の成分）を含んでもよい。
【０１０３】
錠剤の場合であれば、例えば、以下のようにして製剤化することができる。
式Ｉの構造を有する化合物、若しくはその金属錯体、又はその薬学的に許容し得る塩、或いは式ＩＩの構造を有する化合物、又はその薬学的に許容し得る塩と、賦形剤、崩壊剤、結合剤等とを混合し、水と共に造粒する。得られた顆粒を乾燥し、該顆粒を必要に応じて粉砕する。そして、これに滑沢剤等を加えて更に混合し、これを圧縮成形することで錠剤を得ることができる。
【０１０４】
硬カプセル剤の場合であれば、例えば、以下のようにして製剤化することができる。
式Ｉの構造を有する化合物、若しくはその金属錯体、又はその薬学的に許容し得る塩、或いは式ＩＩの構造を有する化合物、又はその薬学的に許容し得る塩と、賦形剤等とを混合し、これに滑沢剤等を加え、更に混合する。そして、得られた混合物を硬カプセル（例えば、ゼラチンカプセル等）に充填することで、硬カプセル剤を得ることができる。
【０１０５】
本明細書中に記載の組成物中又はこれを製剤化したもの中の、式Ｉの構造を有する化合物、若しくはその金属錯体、又はその薬学的に許容し得る塩、或いは式ＩＩの構造を有する化合物、又はその薬学的に許容し得る塩の含有量は、例えば、組成物又はこれを製剤化したもの全体に対して、約０．０１〜約９９．９質量％、好ましくは約０．１〜約８０質量％、より好ましくは約１〜約５０質量％であることができる。
【０１０６】
本明細書中に記載の組成物又はこれを製剤化したものの投与量は、投与する被験体の性別、年齢、体重、健康状態、病状の程度若しくは食事；投与時間；投与方法；他の薬物との組み合わせ；その他の要因を考慮して適宜決定することができる。
本明細書中に記載の組成物又はこれを製剤化したものの投与量は、特段限定されるものではないが、例えば、式Ｉの構造を有する化合物、若しくはその金属錯体、又はその薬学的に許容し得る塩、或いは式ＩＩの構造を有する化合物、又はその薬学的に許容し得る塩として、一日当たり約０．０１〜約１０ｍｇ／ｋｇ体重、好ましくは約０．０５〜約５ｍｇ／ｋｇ体重、より好ましくは約０．１〜約１ｍｇ／ｋｇ体重であることができる。これらは、単回投与してもよいし、２回以上に分けて投与してもよい。但し、必要に応じて、上述した投与量の範囲を超えてもよい。
投与スケジュールとしては、投与する被験体の性別、年齢、体重、健康状態、病状の程度若しくは食事；投与時間；投与方法；他の薬物との組み合わせ；その他の要因を考慮して決定することができるが、例えば、毎日、二日に１回、三日に１回、一週に１回、一月に１回、三月に１回、六月に１回等が挙げられる。
【０１０７】
上述のように製剤化したものは、例えば、抗ガン剤、抗神経変性疾患剤として使用してもよい。
【０１０８】
本明細書中に記載の組成物又はこれを製剤化したものは、例えば、他の抗ガン剤等と併用することで、相乗効果を発揮し、治療効果や治療成績の向上をもたらすことや、治療期間の短縮や他の抗ガン剤の濃度の低減、副作用の抑制、費用削減等を期待できる場合がある。
本明細書中に記載の組成物又はこれを製剤化したものと併用されうる他の抗ガン剤としては、これらに限定されるものではないが、例えば、イマチニブ、ニロチニブ、ダサチニブ、ゲフィチニブ、エルロチニブ、ラパチニブ、ソラフェニブ、スニチニブ、クリゾチニブ、アキシチニブ等のチロシンキナーゼ阻害薬；トラスツマブ、セツキシマブ、パニツムマブ、ベバシズマブ、リツキシマブ、イブリツモマブ・チウキセタン、ゲムツズマブ・オゾガマイシン、デノスマブ、ニボルマブ等の抗体；テムシロリムス、エベロリムス、ラパマイシン等のｍＴＯＲ阻害薬；ボルテゾミブ等のプロテアソーム阻害薬；トレチノイン、タミバロテン等のビタミンＡ誘導体；フルオロウラシル、テガフール・ウラシル、テガフール・ギメラシル・オテラシルカリウム、カペシタビン、シタラビン、ゲムシタビン、エノシタビン、カルモフール等のピリミジン拮抗薬；メルカプトプリン、フルダラビン、グラドリビン等のプリン拮抗薬；メトトレキサート、ペメトレキセド等の葉酸拮抗薬；トリフルリジン・チピラシル塩酸塩、ネララビン、ペントスタチン等の代謝拮抗薬；シスプラチン、カルボプラチン、オキサリプラチン、ネダプラチン等の白金化合物；シクロホスファミド、イホスファミド、メルファラン、ダカルバジン、テモゾロミド、ニムスチン、ブスルファン等のアルキル化薬；ドキソルビシン、エピルビシン、アムルビシン、イダルビシン、ダウノルビシン、ミトキサントロン、ブレオマイシン、マイトマイシンＣ、アクチノマイシンＤ、Ｌ−アスパラギナーゼ、アクラルビシン、ピラルビシン、ペプロマイシン等の抗生物質；イリノテカン、ノギテカン、エトポシド等のトポイソメラーゼ阻害薬；ビンクリスチン、ビンデシン、ビンブラスチン、ビノレルビン、エリブリン、パクリタキセル、ドセタキセル等の微小管阻害薬；タモキシフェン、トレミフェン、アナストロゾール、レトロゾール、エキセメスタン、ゴセレリン、リュープロレリン、エチニルエストラジオール、クロルマジノン、ビカルタミド、フルタミド、プレドニゾロン等のホルモン剤等が挙げられ、これらは、単独で用いても、２種以上を組み合わせて用いてもよい。
【０１０９】
本発明の一実施態様では、本明細書中に記載の組成物は、培地組成物である。
【０１１０】
本明細書中に記載の組成物を培地組成物として使用する場合、これらに限定されるものではないが、例えば、細胞培養培地；ナトリウム、カリウム、カルシウム、マグネシウム、リン、塩素、各種アミノ酸、各種ビタミン、抗生物質、血清、脂肪酸、糖、生理活性化合物、その他の化学成分、その他の生体成分等の添加剤；を更に含むことができる。
【０１１１】
細胞培養培地としては、例えば、公知のもの、市販されているもの等を用いることができる。市販されている細胞培養培地としては、これらに限定されるものではないが、例えば、ダルベッコ改変イーグル培地（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ’ｓ Ｍｅｄｉｕｍ；ＤＭＥＭ）、ハムＦ１２培地（Ｈａｍ’ｓ Ｎｕｔｒｉｅｎｔ Ｍｉｘｔｕｒｅ Ｆ１２）、ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地、マッコイ５Ａ培地（ＭｃＣｏｙ’s ５Ａ ｍｅｄｉｕｍ）、イーグルＭＥＭ（Ｅａｇｌｅ’s Ｍｉｎｉｍｕｍ Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｍｅｄｉｕｍ；ＥＭＥＭ）、αＭＥＭ（ａｌｐｈａ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ’s Ｍｉｎｉｍｕｍ Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｍｅｄｉｕｍ；αＭＥＭ）、ＭＥＭ（Ｍｉｎｉｍｕｍ Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｍｅｄｉｕｍ）、ＲＰＭＩ１６４０培地、イスコフ改変ダルベッコ培地（Ｉｓｃｏｖｅ’s Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’s Ｍｅｄｉｕｍ；ＩＭＤＭ）、ＭＣＤＢ１３１培地、ウィリアム培地Ｅ、ＩＰＬ４１培地、Ｆｉｓｃｈｅｒ’s培地、ＳｔｅｍＰｒｏ３４（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）、Ｘ−ＶＩＶＯ １０（ケンブレックス社製）、Ｘ−ＶＩＶＯ １５（ケンブレックス社製）、ＨＰＧＭ（ケンブレックス社製）、ＳｔｅｍＳｐａｎ Ｈ３０００（ステムセルテクノロジー社製）、ＳｔｅｍＳｐａｎＳＦＥＭ（ステムセルテクノロジー社製）、ＳｔｅｍｌｉｎｅＩＩ（シグマアルドリッチ社製）、ＱＢＳＦ−６０（クオリティバイオロジカル社製）、ＳｔｅｍＰｒｏｈＥＳＣＳＦＭ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）、Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ８（登録商標）培地（ギブコ社製）、ｍＴｅＳＲ１又は２培地（ステムセルテクノロジー社製）、ＴｅＳＲ−Ｅ８培地（ステムセルテクノロジー社製）、リプロＦＦ又はリプロＦＦ２（リプロセル社製）、Ｐｒｉｍａｔｅ ＥＳ Ｃｅｌｌ Ｍｅｄｉｕｍ（リプロセル社製）、ＰＳＧｒｏ ｈＥＳＣ／ｉＰＳＣ培地（システムバイオサイエンス社製）、ＮｕｔｒｉＳｔｅｍ（登録商標）培地（バイオロジカルインダストリーズ社製）、ＳｔｅｍＦｉｔ（登録商標）培地（味の素株式会社製）、ＣＳＴＩ−７培地（細胞科学研究所社製）、ＭｅｓｅｎＰＲＯ ＲＳ培地（ギブコ社製）、ＭＦ−Ｍｅｄｉｕｍ（登録商標）間葉系幹細胞増殖培地（東洋紡株式会社製）、間葉系幹細胞用培地（プロモセル社製）、間葉系幹細胞用培地２（プロモセル社製）、ＭＳＣＧＭ（ロンザ社製）、ＭｅｓｅｎＣｕｌｔ ＸＦ（ステムセルテクノロジー社製）、ＳｔｅｍＰｒｏ ＭＳＣ ＸＦ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）、Ｓｆ−９００ＩＩ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）、Ｏｐｔｉ−Ｐｒｏ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）等が挙げられる。
【０１１２】
各種アミノ酸、各種ビタミン、抗生物質、血清、脂肪酸、糖、生理活性化合物、その他の化学成分、その他の生体成分等の添加剤の種類は、目的に応じて当業者が適宜選択することができる。
【０１１３】
細胞培養培地や添加剤の使用量は、目的に応じて当業者が適宜選択することができる。
【０１１４】
本明細書中に記載の組成物を培地組成物として使用する場合、例えば、上述した添加剤等と共に、当業者に公知の方法により粉末状、凍結乾燥体、液状等の形態にしてもよい。
【０１１５】
本明細書中に記載の組成物（例えば、培地組成物）又はこれを粉末状等の形態にしたもの中の、式Ｉの構造を有する化合物、若しくはその金属錯体、又はその薬学的に許容し得る塩、或いは式ＩＩの構造を有する化合物、又はその薬学的に許容し得る塩の含有量は、例えば細胞培養培地中の該化合物の最終濃度等を考慮して、当業者が適宜調節することができる。
【０１１６】
本明細書中に記載の組成物を培地組成物として使用する場合、例えば、細胞培養培地等と本明細書中に記載の組成物（或いは化合物）とを予め混合して、細胞培養に供してもよいし、細胞培養培地中で細胞を培養しているところに、本明細書中に記載の組成物（或いは化合物）を添加してもよい。
【０１１７】
本明細書中に記載の組成物（或いは、化合物）は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ、ｅｘ ｖｉｖｏ等において、細胞、組織等と接触させることによって、該細胞、組織等からの細胞外小胞の分泌を抑制してもよい。したがって、本発明の別の実施態様では、細胞外小胞の分泌を抑制するための方法であって、ｉｎ ｖｉｔｒｏ又はｅｘ ｖｉｖｏで、本明細書中に記載の組成物（或いは、化合物）と、細胞又は組織とを接触させることを含む、方法を提供する。
【実施例】
【０１１８】
以下、実施例を用いて本発明をより詳細に説明するが、これら実施例は、本発明の範囲を何ら限定するものではない。【０１１９】
［実施例１］
【化７】
2020138266.tif 000011
実施例１の化合物は、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社製のもの（商品コード：Ｄ４０７１−１０ＭＧ、ＣＡＳ登録番号：２２１１２−８９−６）を用いた。【０１２０】
［実施例２］
【化８】
2020138266.tif 000012
実施例２の化合物は、東京化成工業株式会社製のもの（商品コード：Ａ５０１２、ＣＡＳ登録番号：９１７−２３−７）を用いた。【０１２１】
［実施例３］
【化９】
2020138266.tif 000013
実施例３の化合物は、東京化成工業株式会社製のもの（商品コード：Ｔ１４３８、ＣＡＳ登録番号：３７０８３−３７−７）を用いた。【０１２２】
［実施例４］
【化１０】
2020138266.tif 000014
実施例４の化合物は、東京化成工業株式会社製のもの（商品コード：Ｍ１３３８、ＣＡＳ登録番号：１１９７３０−０６−２）を用いた。【０１２３】
［実施例５］
【化１１】
2020138266.tif 000015
実施例５の化合物は、東京化成工業株式会社製のもの（商品コード：Ｔ１７３０、ＣＡＳ登録番号：２５４４０−１４−６）を用いた。【０１２４】
［実施例６］
【化１２】
2020138266.tif 000016
実施例６の化合物は、東京化成工業株式会社製のもの（商品コード：Ｔ１４９４、ＣＡＳ登録番号：２２１１２−８４−１）を用いた。【０１２５】
［実施例７］
【化１３】
2020138266.tif 000017
実施例７の化合物は、東京化成工業株式会社製のもの（商品コード：Ａ５０１５、ＣＡＳ登録番号：１４６０９−５４−２）を用いた。【０１２６】
［実施例８］
【化１４】
2020138266.tif 000018
実施例８の化合物は、関東化学株式会社製のもの（商品コード：３１８８１−１Ａ、ＣＡＳ登録番号：６９４５８−２０−４）を用いた。【０１２７】
［比較例１］
【化１５】
2020138266.tif 000019
比較例１の化合物は、東京化成工業株式会社製のもの（商品コード：Ａ５０１３、ＣＡＳ登録番号：３５２１８−７５−８）を用いた。【０１２８】
［比較例２］
【化１６】
2020138266.tif 000020
比較例２の化合物は、東京化成工業株式会社製のもの（商品コード：Ｔ１７２９、ＣＡＳ登録番号：５６３９６−１２−４）を用いた。【０１２９】
［比較例３］
【化１７】
2020138266.tif 000021
比較例３の化合物は、東京化成工業株式会社製のもの（商品コード：Ｔ１８３２、ＣＡＳ登録番号：７４６８４−３４−７）を用いた。【０１３０】
［比較例４］
【化１８】
2020138266.tif 000022
比較例４の化合物は、東京化成工業株式会社製のもの（商品コード：Ｔ１４９７、ＣＡＳ登録番号：５１０９４−１７−８）を用いた。【０１３１】
［比較例５］
【化１９】
2020138266.tif 000023
比較例５の化合物は、東京化成工業株式会社製のもの（商品コード：Ｔ１３６０、ＣＡＳ登録番号：２２１１２−７８−３）を用いた。【０１３２】
［実施例９］
【化２０】
2020138266.tif 000024
実施例９の化合物は、Ｍｅｄｃｈｅｍｅｘｐｒｅｓｓ社製のもの（商品コード：ＨＹ−１８６３３、ＣＡＳ登録番号：７９１８３−１９−０）を用いた。【０１３３】
［実施例１０］
【化２１】
2020138266.tif 000025
実施例１０の化合物は、ＢＩＯＮＥＴ社製のもの（商品コード：１２Ｆ−３２１Ｓ、ＣＡＳ登録番号：７９１８３−３２−７）を用いた。【０１３４】
［実施例１１］
【化２２】
2020138266.tif 000026
実施例１１の化合物は、Ｅｎａｍｉｎｅ社製のもの（商品コード：ＥＮ３００−０１０９０、ＣＡＳ登録番号：２６９６０−６６−７）を用いた。【０１３５】
［実施例１２］
【化２３】
2020138266.tif 000027
実施例１２の化合物は、Ｅｎａｍｉｎｅ社製のもの（商品コード：Ｚ５７８２３２００、ＣＡＳ登録番号：７９１８３−３７−２）を用いた。【０１３６】
［実施例１３］
【化２４】
2020138266.tif 000028
実施例１３の化合物は、Ｐｈａｒｍｅｋｓ社製のもの（商品コード：Ｐ２００１Ｓ−１５１３２３、ＣＡＳ登録番号：３０３９９７−００−４）を用いた。【０１３７】
［実施例１４］
【化２５】
2020138266.tif 000029
実施例１４の化合物は、Ｐｈａｒｍｅｋｓ社製のもの（商品コード：Ｐ２０００Ｓ−１９７７１、ＣＡＳ登録番号：３１３２４５−１８−０）を用いた。【０１３８】
［実施例１５］
【化２６】
2020138266.tif 000030
実施例１５の化合物は、Ｖｉｔａｓ−Ｍ社製のもの（商品コード：ＳＴＬ１６３７０５、ＣＡＳ登録番号：２０６５３７−５７−７）を用いた。【０１３９】
［実施例１６］
【化２７】
2020138266.tif 000031
実施例１６の化合物は、ＭｅｄＣｈｅｍｅｘｐｒｅｓｓ社製のもの（商品コード：ＨＹ−１２１５７、ＣＡＳ登録番号：１１６０２４７−９２−６）を用いた。【０１４０】
［比較例６］
【化２８】
2020138266.tif 000032
比較例６の化合物は、Ｅｎａｍｉｎｅ社製のもの（商品コード：Ｚ５４７４９７１２、ＣＡＳ登録番号：６０３７−７３−６）を用いた。【０１４１】
［比較例７］
【化２９】
2020138266.tif 000033
比較例７の化合物は、Ｖｉｔａｓ−Ｍ社製のもの（商品コード：ＳＴＫ０７３５５８、ＣＡＳ登録番号：９０８１５−０２−４）を用いた。【０１４２】
［比較例８］
【化３０】
2020138266.tif 000034
比較例８の化合物は、Ｐｈａｒｍｅｋｓ社製のもの（商品コード：Ｐ２０００Ｎ−００２３９、ＣＡＳ登録番号：１３２２０−５７−０）を用いた。【０１４３】
［試験例１−１：細胞外小胞の分泌抑制の評価１］
＜培養上清の調製＞
１０ｍＬの非働化処理ＦＢＳと２ｍＬの５０％ Ｐｏｌｙ（ｅｔｈｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ）１０，０００溶液（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社製、＃８１２８０）を４℃、２時間撹拌した後に、１５００×ｇ、４℃、３０分間の遠心条件で細胞外小胞を沈殿させ、上清を回収することで、ｅｘｏｓｏｍｅ−ｆｒｅｅ ＦＢＳを調製した。次に、Ｕ−８７ＭＧ細胞（ＡＴＣＣ社製、ＨＴＢ−１４ＴＭ）を、０．０３％ ＳｐｈｅｒｅＭａｘ（商標）（日産化学社製）及び２％ ｅｘｏｓｏｍｅ−ｆｒｅｅ ＦＢＳを含有するＡｄｖａｎｃｅｄ ＤＭＥＭ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製、＃１２４９１０１５）中で２×１０４ｃｅｌｌｓ／８１μＬに懸濁し、超低接着表面３８４ウェル黒クリアボトムプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ社製、＃３８２７）に播種した。播種したＵ−８７ ＭＧ細胞に、Ａｄｖａｎｃｅｄ ＤＭＥＭ（２％ ｅｘｏｓｏｍｅ−ｆｒｅｅ ＦＢＳを含有）中に調製した実施例１〜１６又は比較例１〜８の化合物 ５〜１０μＬ（終濃度：０〜１０μＭ；０μＭは「溶媒のみ」に対応する）を添加し、２４時間培養した。その後、プレートを１２００×ｇ、４℃、１時間の遠心条件で細胞を沈殿させ、培養上清を回収した。培養上清中に含まれる細胞外小胞の検出には、後述するＴｉｍ４−ＣＤ６３ ＥＬＩＳＡ法又はＴｉｍ４−ＣＤ９ ＥＬＩＳＡ法を用いた。
結果を図１Ａ〜図１Ｄに示す。
＜Ｔｉｍ４−ＣＤ６３ ＥＬＩＳＡ法＞
Ｃａｒｂｏｎａｔｅ Ｂｕｆｆｅｒ（７１．４ｍＭ ＮａＨＣＯ３、及び２８．６ｍＭ Ｎａ２ＣＯ３を含有する溶液）中に調製した１μｇ／ｍＬ Ｔｉｍ４タンパク質を３８４ウェルプレート（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製、＃４６４７１８）に添加し、固相化した。３８４ウェルプレートを０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０含有ＴＢＳ（Ｔｒｉｓ−Ｂｕｆｆｅｒ Ｓａｌｉｎｅ）溶液（以下、「ＴＢＳＴ溶液」と称することもある。）で洗浄した後に、１％ＢＳＡを含有するＴＢＳＴ溶液 ５０μＬ／ｗｅｌｌを添加して１時間のブロッキング処理を行った。次に、上記で回収した培養上清 ３０μＬをウェルに添加し、更に８ｍＭ ＣａＣｌ２溶液 １０μＬを添加することでＴｉｍ４タンパク質に細胞外小胞を結合させた。続いて、２ｍＭ ＣａＣｌ２を含有するＴＢＳＴ溶液で希釈した１μｇ／ｍＬ Ａｎｔｉ−ｈｕｍａｎ ＣＤ６３ Ａｎｔｉｂｏｄｙ（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ社製、＃３５３０１４） ３０μＬ／ｗｅｌｌを添加し、１時間反応させた。２ｍＭ ＣａＣｌ２を含有するＴＢＳＴ溶液 ５０μＬ／ｗｅｌｌを添加し、その後、ＴＢＳＴ溶液を除去した。この操作を３回繰り返した後、２ｍＭ ＣａＣｌ２を含有するＴＢＳＴ溶液で希釈した８０ｎｇ／ｍＬ ＨＲＰ−ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ Ａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ社製、＃４０５３０６） ３０μＬ／ｗｅｌｌを添加し、１時間反応させた。最後に、ＴＭＢ溶液（Ｎａｃａｌａｉ ｔｅｓｑｕｅ社製、＃０５２９８−８０） ３０μＬ／ｗｅｌｌを添加し、３０分間反応させた後、１Ｍ Ｈ２ＳＯ４溶液 ３０μＬ／ｗｅｌｌを添加することで反応を停止させ、４５０ｎｍの吸光度を測定することにより細胞外小胞を検出した。
＜Ｔｉｍ４−ＣＤ９ ＥＬＩＳＡ法＞
Ｔｉｍ４−ＣＤ９ ＥＬＩＳＡ法は、上述したＴｉｍ４−ＣＤ６３ ＥＬＩＳＡ法において、１μｇ／ｍＬ Ａｎｔｉ−ｈｕｍａｎ ＣＤ６３ Ａｎｔｉｂｏｄｙを０．５μｇ／ｍＬ Ａｎｔｉ−ｈｕｍａｎ ＣＤ９ Ａｎｔｉｂｏｄｙ（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ社製、＃３１２１０２）に置き換えた以外、同様の方法で行った。【０１４４】
［試験例１−２：細胞外小胞の分泌抑制の評価２］
＜上清の調製＞
１０ｍＬの非働化処理ＦＢＳと２ｍＬの５０％ Ｐｏｌｙ（ｅｔｈｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ）１０，０００溶液（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社製、＃８１２８０）を４℃、２時間撹拌した後に、１５００×ｇ、４℃、３０分間の遠心条件で細胞外小胞を沈殿させ、上清を回収することで、ｅｘｏｓｏｍｅ−ｆｒｅｅ ＦＢＳを調製した。次に、Ｕ−８７ ＭＧ細胞（ＡＴＣＣ社製、ＨＴＢ−１４ＴＭ）を、０．０３％ ＳｐｈｅｒｅＭａｘ（商標）（日産化学社製）及び２％ ｅｘｏｓｏｍｅ−ｆｒｅｅ ＦＢＳを含有するＡｄｖａｎｃｅｄ ＤＭＥＭ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製、＃１２４９１０１５）中で３×１０５ｃｅｌｌｓ／９９８μＬに懸濁し、非接着表面１２ウェルプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ ｂｉｏ−ｏｎｅ社製、＃６６５１０２）に播種した。播種したＵ−８７ ＭＧ細胞に、ＤＭＳＯ中に調製した２．５又は１０ｍＭの実施例９の化合物 ２μＬを添加し、２４時間培養した。その後、培養液を１．５ｍＬチューブに回収し、３００×ｇ、４℃、５分間の遠心条件で細胞を沈殿させ、培養上清を回収した。続いて、回収した培養上清を２０００×ｇ、４℃、２０分間の遠心条件で細胞断片を沈殿させ、上清を回収した。更に、回収した上清を１００００×ｇ、４℃、３０分間の条件で遠心し、上清を回収した。この際に、比較対象として、化合物未処置群（０μＭ、溶媒のみ）も上記と同様に処理し、上清を回収した。１００００×ｇの遠心後の上清中に含まれる細胞外小胞の検出には、後述するＴｉｍ４−ＣＤ６３ ＥＬＩＳＡ法を用いた。
結果を図１Ｅに示す。
＜Ｔｉｍ４−ＣＤ６３ＥＬＩＳＡ法＞
Ｃａｒｂｏｎａｔｅ Ｂｕｆｆｅｒ（７１．４ｍＭ ＮａＨＣＯ３、及び２８．６ｍＭ Ｎａ２ＣＯ３を含有する溶液）中に調製した１μｇ／ｍＬ Ｔｉｍ４タンパク質を９６ウェルプレート（ＩＷＡＫＩ社製、＃３８０１−０９６）に１００μＬ／ｗｅｌｌ添加し、固相化した。９６ウェルプレートをＴＢＳＴ溶液で洗浄した後に、１％ＢＳＡを含有するＴＢＳＴ溶液 ２００μＬ／ｗｅｌｌを添加して１時間のブロッキング処理を行った。次に、上記で回収した上清 ９０μＬをウェルに添加し、更に２０ｍＭ ＣａＣｌ２溶液 １０μＬを添加することでＴｉｍ４タンパク質に細胞外小胞を結合させた。続いて、２ｍＭ ＣａＣｌ２を含有するＴＢＳＴ溶液で希釈した１μｇ／ｍＬ Ａｎｔｉ−ｈｕｍａｎ ＣＤ６３ Ａｎｔｉｂｏｄｙ（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ社製、＃３５３０１４） １００μＬ／ｗｅｌｌを添加し、１時間反応させた。２ｍＭ ＣａＣｌ２を含有するＴＢＳＴ溶液 ２００μＬ／ｗｅｌｌを添加し、その後、ＴＢＳＴ溶液を除去した。この操作を３回繰り返した後、２ｍＭ ＣａＣｌ２を含有するＴＢＳＴ溶液で希釈した８０ｎｇ／ｍＬ ＨＲＰ−ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ Ａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ社製、＃４０５３０６） １００μＬ／ｗｅｌｌを添加し、１時間反応させた。最後に、ＴＭＢ溶液（Ｎａｃａｌａｉ ｔｅｓｑｕｅ社製、＃０５２９８−８０） １００μＬ／ｗｅｌｌを添加し、３０分間反応させた後、１Ｍ Ｈ２ＳＯ４溶液 １００μＬ／ｗｅｌｌを添加することで反応を停止させ、４５０ｎｍの吸光度を測定することにより細胞外小胞を検出した。【０１４５】
［試験例１−３：様々な細胞における細胞外小胞の分泌抑制の評価］
＜上清の調製＞
１０ｍＬの非働化処理ＦＢＳと２ｍＬの５０％ Ｐｏｌｙ（ｅｔｈｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ）１０，０００溶液（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社製、＃８１２８０）を４℃、２時間撹拌した後に、１５００×ｇ、４℃、３０分間の遠心条件で細胞外小胞を沈殿させ、上清を回収することで、ｅｘｏｓｏｍｅ−ｆｒｅｅ ＦＢＳを調製した。次に、ＳＷ６２０細胞（ＡＴＣＣ、ＣＣＬ−２２７）、ＨＣＴ１１６細胞（ＡＴＣＣ、ＣＣＬ−２４７）、ＳＷ４８０細胞（ＡＴＣＣ、ＣＣＬ−２２８）、Ｕ−８７ ＭＧ細胞（ＡＴＣＣ、ＨＴＢ−１４ＴＭ）又はＨＥＫ２９３Ｔ細胞（ＡＴＣＣ、ＣＲＬ−３２１６）を、２％ ｅｘｏｓｏｍｅ−ｆｒｅｅ ＦＢＳを含有するＡｄｖａｎｃｅｄ ＤＭＥＭ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製、＃１２４９１０１５）中に２×１０４〜６×１０４ｃｅｌｌｓ／２００μＬに懸濁し、接着表面９６ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ社製、＃３５９５）に播種し、２４時間の前培養を行った。２４時間後、培養液を除去し、２％ ｅｘｏｓｏｍｅ−ｆｒｅｅ ＦＢＳ含有するＡｄｖａｎｃｅｄ ＤＭＥＭ １９９．６μＬと、ＤＭＳＯ中に調製した０．５〜５ｍＭの実施例９の化合物 ０．４μＬとの混合液を添加し、２４時間培養した。その後、培養液を１．５ｍＬチューブに回収し、３００×ｇ、４℃、５分間の遠心条件で細胞を沈殿させ、上清を回収した。続いて、回収した上清を２０００×ｇ、４℃、２０分間の遠心条件で細胞断片を沈殿させ、上清を回収した。更に、回収した上清を１００００×ｇ、４℃、３０分間の条件で遠心し、上清を回収した。この際に、比較対象として、化合物未処置群（溶媒のみ、０μＭ）も上記と同様に処理し、上清を回収した。
Ｊｕｒｋａｔ細胞（ＲＩＫＥＮ、ＲＣＢ０８０６）又はＴＨＰ−１細胞（ＡＴＣＣ、ＴＩＢ−２０２）からの培養上清の回収は、上記方法におけるＡｄｖａｎｃｅｄ ＤＭＥＭをＡｄｖａｎｃｅｄ ＲＰＭＩ１６４０（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製、＃１２６３３０１２）に置き換えた以外、同様の方法で行った。
上記１００００×ｇの遠心後の上清中に含まれる細胞外小胞の検出には、後述するＴＩｍ４−ＥＬＩＳＡ法（Ｔｉｍ４−ヒトＣＤ９ ＥＬＩＳＡ法、Ｔｉｍ４−ヒトＣＤ６３ ＥＬＩＳＡ法、Ｔｉｍ４−ヒトＣＤ８１ ＥＬＩＳＡ法、Ｔｉｍ４−マウスＣＤ６３ ＥＬＩＳＡ法、又はＴｉｍ４−マウスＣＤ８１ ＥＬＩＳＡ法）を用いた。
結果を図１Ｆに示す。
＜Ｔｉｍ４−ＥＬＩＳＡ法＞
Ｃａｒｂｏｎａｔｅ Ｂｕｆｆｅｒ（７１．４ ｍＭ ＮａＨＣＯ３、２８．６ ｍＭ Ｎａ２ＣＯ３を含有する溶液）中で調製した１μｇ／ｍＬ Ｔｉｍ４タンパク質を９６ウェルプレート（ＩＷＡＫＩ社製、＃３８０１−０９６）に１００μＬ／ｗｅｌｌ添加し、固相化した。９６ウェルプレートをＴＢＳＴ溶液で洗浄した後に、１％ＢＳＡを含有するＴＢＳＴ溶液 ２００μＬ／ｗｅｌｌを添加して１時間のブロッキング処理を行った。次に、上記で回収した上清 ９０μＬをウェルに添加し、更に２０ｍＭ ＣａＣｌ２溶液 １０μＬを添加することでＴｉｍ４タンパク質に細胞外小胞を結合させた。続いて、２ｍＭ ＣａＣｌ２を含有するＴＢＳＴ溶液で希釈した一次抗体 １００μＬ／ｗｅｌｌを添加し、１時間反応させた。２ｍＭ ＣａＣｌ２を含有するＴＢＳＴ溶液 ２００μＬ／ｗｅｌｌを添加し、その後、ＴＢＳＴ溶液を除去した。この操作を３回繰り返した後、２ｍＭ ＣａＣｌ２を含有するＴＢＳＴ溶液で希釈した二次抗体 １００μＬ／ｗｅｌｌを添加し、１時間反応させた。最後に、ＴＭＢ溶液（Ｎａｃａｌａｉ ｔｅｓｑｕｅ社製、＃０５２９８−８０） １００μＬ／ｗｅｌｌを添加し、３０分間反応させた後、１Ｍ Ｈ２ＳＯ４溶液 １００μＬ／ｗｅｌｌを添加することで反応を停止させ、４５０ｎｍの吸光度を測定することにより細胞外小胞を検出した。化合物未処置群の測定値を１００％として、実施例９の化合物を添加した場合における細胞外小胞を化合物未処置群に対する％として評価した。なお、各細胞の培養上清中の細胞外小胞を検出する際に使用した一次抗体及び二次抗体の組み合わせは、以下のとおりである。
・ＳＷ６２０細胞の培養上清
一次抗体：１μｇ／ｍＬ Ａｎｔｉ−ｈｕｍａｎ ＣＤ９ Ａｎｔｉｂｏｄｙ（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ社製、＃３１２１０２）
二次抗体：８０ｎｇ／ｍＬ ＨＲＰ−ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ Ａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ社製、＃４０５３０６）
・ＨＣＴ１１６細胞、ＳＷ４８０細胞及びＵ−８７ ＭＧ細胞の培養上清
一次抗体：１μｇ／ｍＬ Ａｎｔｉ−ｈｕｍａｎ ＣＤ６３ Ａｎｔｉｂｏｄｙ（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ社製、＃３５３０１４）
二次抗体：８０ｎｇ／ｍＬ ＨＲＰ−ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ Ａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ
・ＨＥＫ２９３Ｔ細胞、Ｊｕｒｋａｔ細胞及びＴＨＰ−１細胞の培養上清
一次抗体：１μｇ／ｍＬ Ａｎｔｉ−ｈｕｍａｎ ＣＤ８１Ａｎｔｉｂｏｄｙ（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ社製、＃３４９５０１）
二次抗体：８０ｎｇ／ｍＬ ＨＲＰ−ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ Ａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ【０１４６】
［試験例２−１：細胞傷害性の評価］
１０ｍＬの非働化処理ＦＢＳと２ｍＬの５０％ Ｐｏｌｙ（ｅｔｈｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ）１０，０００溶液（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社製、＃８１２８０）を４℃、２時間撹拌した後に、１５００×ｇ、４℃、３０分間の遠心条件で細胞外小胞を沈殿させ、上清を回収することで、ｅｘｏｓｏｍｅ−ｆｒｅｅ ＦＢＳを調製した。次に、Ｕ−８７ ＭＧ細胞（ＡＴＣＣ社製、ＨＴＢ−１４ＴＭ）を、０．０３％ ＳｐｈｅｒｅＭａｘ（商標）（日産化学社製）及び２％ ｅｘｏｓｏｍｅ−ｆｒｅｅ ＦＢＳを含有するＡｄｖａｎｃｅｄ ＤＭＥＭ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製、＃１２４９１０１５）中で２×１０４ｃｅｌｌｓ／８１μＬに懸濁し、超低接着表面３８４ウェル黒クリアボトムプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ社製、＃３８２７）に播種した。播種したＵ−８７ ＭＧ細胞に、Ａｄｖａｎｃｅｄ ＤＭＥＭ（２％ ｅｘｏｓｏｍｅ−ｆｒｅｅ ＦＢＳを含有）中に調製した実施例１〜１６又は比較例１〜８の化合物 ５〜１０μＬ（終濃度：０〜４０μＭ）を添加し、２４時間培養した。その後、プレートを１２００×ｇ、４℃、１時間の遠心条件で細胞を沈殿させ、２０μＬの培養上清を３８４ウェルマイクロプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ ｂｉｏ−ｏｎｅ社製、＃７８１１０１）に移した。培養上清中に含まれる乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）の活性は、Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ ＬＤＨ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ−ＷＳＴ（同仁化学研究所社製、＃ＣＫ１２）を用いて測定した。５００ｔｅｓｔｓ分のＤｙｅ Ｍｉｘｔｕｒｅに５ｍＬのＡｓｓａｙ Ｂｕｆｆｅｒを加えて溶解し、Ｗｏｒｋｉｎｇ Ｓｏｌｕｔｉｏｎを調製した。２０μＬの培養上清を移した３８４ウェルマイクロプレートに、２０μＬのＷｏｒｋｉｎｇ Ｓｏｌｕｔｉｏｎを添加し、よく混和した後に、室温で３０分間、呈色反応を行った。１０μＬのＳｔｏｐ Ｓｏｌｕｔｉｏｎを添加することで反応を停止させ、４９０ｎｍの吸光度を測定することで、細胞傷害性を評価した。死細胞群（培養液回収の１５分前に、化合物未処置細胞に９μＬのＬｙｓｉｓ Ｂｕｆｆｅｒを添加したサンプル、ＰＣ）も同様にＬＤＨの活性を測定した。一部の試験については、ＰＣの測定値を１００％の細胞傷害性として、各化合物による細胞傷害性を吸光度のＰＣに対する％として評価した。
結果を図２Ａ〜図２Ｄに示す。【０１４７】
［試験例２−２：様々な細胞における細胞傷害性の評価］
１０ｍＬの非働化処理ＦＢＳと２ｍＬの５０％ Ｐｏｌｙ（ｅｔｈｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ）１０，０００溶液（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社製、＃８１２８０）を４℃、２時間撹拌した後に、１５００×ｇ、４℃、３０分間の遠心条件で細胞外小胞を沈殿させ、上清を回収することで、ｅｘｏｓｏｍｅ−ｆｒｅｅ ＦＢＳを調製した。次に、ＳＷ６２０細胞（ＡＴＣＣ、ＣＣＬ−２２７）、ＨＣＴ１１６細胞（ＡＴＣＣ、ＣＣＬ−２４７）、ＳＷ４８０細胞（ＡＴＣＣ、ＣＣＬ−２２８）、Ｕ−８７ ＭＧ細胞（ＡＴＣＣ、ＨＴＢ−１４ＴＭ）又はＨＥＫ２９３Ｔ細胞（ＡＴＣＣ、ＣＲＬ−３２１６）を、２％ ｅｘｏｓｏｍｅ−ｆｒｅｅ ＦＢＳを含有するＡｄｖａｎｃｅｄ ＤＭＥＭ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製、＃１２４９１０１５）中に２×１０４〜６×１０４ｃｅｌｌｓ／１００μＬに懸濁し、接着表面９６ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ社製、＃３５９５）に播種し、２４時間の前培養を行った。２４時間後、培養液を除去し、２％ ｅｘｏｓｏｍｅ−ｆｒｅｅ ＦＢＳ含有するＡｄｖａｎｃｅｄ ＤＭＥＭ １９９．６μＬと、ＤＭＳＯ中に調製した０．５〜５ｍＭの実施例９の化合物 ０．４μＬとの混合液を添加し、２４時間培養した。この際に、比較対象として、化合物未処置群（溶媒のみ、０μＭ）も上記と同様に処理し、培養を行った。その後、プレートを１２００×ｇ、４℃、１時間の遠心条件で細胞を沈殿させ、５０μＬの培養上清を９６ウェルマイクロプレート（ＷＡＴＳＯＮ社製、＃１９５−９６Ｆ）に移した。
Ｊｕｒｋａｔ細胞（ＲＩＫＥＮ、ＲＣＢ０８０６）又はＴＨＰ−１細胞（ＡＴＣＣ、ＴＩＢ−２０２）からの培養上清の回収は、上記方法におけるＡｄｖａｎｃｅｄ ＤＭＥＭをＡｄｖａｎｃｅｄ ＲＰＭＩ１６４０（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製、＃１２６３３０１２）に置き換えた以外、同様の方法で行った。
培養上清中に含まれる乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）の活性は、Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ ＬＤＨ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ−ＷＳＴ（同仁化学研究所社製、＃ＣＫ１２）を用いて測定した。５００ｔｅｓｔｓ分のＤｙｅ Ｍｉｘｔｕｒｅに５ｍＬのＡｓｓａｙ Ｂｕｆｆｅｒを加えて溶解し、Ｗｏｒｋｉｎｇ Ｓｏｌｕｔｉｏｎを調製した。５０μＬの培養上清を移した９６ウェルマイクロプレートに、５０μＬのＷｏｒｋｉｎｇ Ｓｏｌｕｔｉｏｎを添加し、よく混和した後に、室温で３０分間、呈色反応を行った。２５μＬのＳｔｏｐ Ｓｏｌｕｔｉｏｎを添加することで反応を停止させ、４９０ｎｍの吸光度を測定することで、細胞傷害性を評価した。化合物未処置群の測定値を１００％として、実施例９の化合物による細胞傷害性を化合物未処置群に対する％として評価した。
結果を図２Ｅ示す。【０１４８】
［試験例３：細胞外小胞の分泌抑制の評価３］
１０ｍＬの非働化処理ＦＢＳと２ｍＬの５０％ Ｐｏｌｙ（ｅｔｈｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ）１０，０００溶液（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社製、＃８１２８０）を４℃、２時間撹拌した後に、１５００×ｇ、４℃、３０分間の遠心条件で細胞外小胞を沈殿させ、上清を回収することで、ｅｘｏｓｏｍｅ−ｆｒｅｅ ＦＢＳを調製した。次に、Ｕ−８７ＭＧ細胞（ＡＴＣＣ社製、ＨＴＢ−１４ＴＭ）を、０．０３％ ＳｐｈｅｒｅＭａｘ（商標）（日産化学社製）及び２％ ｅｘｏｓｏｍｅ−ｆｒｅｅ ＦＢＳを含有するＡｄｖａｎｃｅｄ ＤＭＥＭ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製、＃１２４９１０１５）中で３×１０５ｃｅｌｌｓ／９９８μＬに懸濁し、非接着表面１２ウェルプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ ｂｉｏ−ｏｎｅ社製、＃６６５１０２）に播種した。播種したＵ−８７ ＭＧ細胞に、ＤＭＳＯ中に調製した実施例９，１１〜１５の化合物 ２μＬ（終濃度：０〜２０μＭ）を添加し、２４時間培養した。その後、培養液を１．５ｍＬチューブに回収し、３００×ｇ、４℃、５分間の遠心条件で細胞を沈殿させ、培養上清を回収した。続いて、回収した培養上清を２０００×ｇ、４℃、２０分間の遠心条件で細胞断片を沈殿させ、上清を回収した。更に、回収した上清を１００００×ｇ、４℃、３０分間の条件で遠心し、上清を回収した。この際に、比較対象として、化合物未処置群（溶媒のみ、０μＭ）も上記と同様に処理し、上清を回収した。１００００×ｇの遠心後の上清 ５００μＬ中に含まれる細胞外小胞の量を、ナノ粒子解析システム（Ｍａｌｖｅｒｎ Ｐａｎａｌｙｔｉｃａｌ社製、＃ＮａｎｏＳＩＧＨＴ ＬＭ１０）を用いて定量した。
結果を図３Ａ及び図３Ｂに示す。【０１４９】
［試験例４：細胞外小胞の分泌抑制の評価４］
＜上清の調製＞
１０ｍＬの非働化処理ＦＢＳと２ｍＬの５０％ Ｐｏｌｙ（ｅｔｈｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ）１０，０００溶液（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社製、＃８１２８０）を４℃、２時間撹拌した後に、１５００×ｇ、４℃、３０分間の遠心条件で細胞外小胞を沈殿させ、上清を回収することで、ｅｘｏｓｏｍｅ−ｆｒｅｅ ＦＢＳを調製した。次に、Ｕ−８７ ＭＧ細胞（ＡＴＣＣ社製、ＨＴＢ−１４ＴＭ）を、２％ ｅｘｏｓｏｍｅ−ｆｒｅｅ ＦＢＳを含有するＡｄｖａｎｃｅｄ ＤＭＥＭ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製、＃１２４９１０１５）中で３×１０５ｃｅｌｌｓ／１０００μＬに懸濁し、接着表面１２ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ社製、＃３５１３）に播種し、２４時間の前培養を行った。２４時間後、培養液を除去し、２％ ｅｘｏｓｏｍｅ−ｆｒｅｅ ＦＢＳを含有するＡｄｖａｎｃｅｄ ＤＭＥＭ ９９８μＬと、ＤＭＳＯ中に調製した２．５又は１０ｍＭの実施例９の化合物 ２μＬとの混合液を添加し、２時間培養した。２時間後に培養液を除去し、２％ ｅｘｏｓｏｍｅ−ｆｒｅｅ ＦＢＳを含有するＡｄｖａｎｃｅｄ ＤＭＥＭ １０００μＬを添加し、更に２４時間培養した。その後、培養液を１．５ｍＬチューブに回収し、３００×ｇ、４℃、５分間の遠心条件で細胞を沈殿させ、培養上清を回収した。続いて、回収した培養上清を２０００×ｇ、４℃、２０分間の遠心条件で細胞断片を沈殿させ、上清を回収した。更に、回収した上清を１００００×ｇ、４℃、３０分間の条件で遠心し、上清を回収した。この際に、比較対象として、化合物未処置群（溶媒のみ、０μＭ）も上記と同様に処理し、上清を回収した。１００００×ｇの遠心後の上清中に含まれる細胞外小胞の検出には、後述するＴｉｍ４−ＣＤ６３ ＥＬＩＳＡ法を用いた。
＜Ｔｉｍ４−ＣＤ６３ＥＬＩＳＡ法＞
Ｃａｒｂｏｎａｔｅ Ｂｕｆｆｅｒ（７１．４ ｍＭ ＮａＨＣＯ３、２８．６ ｍＭ Ｎａ２ＣＯ３を含有する溶液）中で調製した１μｇ／ｍＬ Ｔｉｍ４タンパク質を９６ウェルプレート（ＩＷＡＫＩ社製、＃３８０１−０９６）に１００μＬ／ｗｅｌｌ添加し、固相化した。９６ウェルプレートをＴＢＳＴ溶液で洗浄した後に、１％ＢＳＡを含有するＴＢＳＴ溶液 ２００μＬ／ｗｅｌｌを添加して１時間のブロッキング処理を行った。次に、上記で回収した上清 ９０μＬをウェルに添加し、更に２０ｍＭ ＣａＣｌ２溶液 １０μＬを添加することでＴｉｍ４タンパク質に細胞外小胞を結合させた。続いて、２ｍＭ ＣａＣｌ２を含有するＴＢＳＴ溶液で希釈した１μｇ／ｍＬ Ａｎｔｉ−ｈｕｍａｎ ＣＤ６３ Ａｎｔｉｂｏｄｙ（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ社製、＃３５３０１４） １００μＬ／ｗｅｌｌを添加し、１時間反応させた。２ｍＭ ＣａＣｌ２を含有するＴＢＳＴ溶液 ２００μＬ／ｗｅｌｌを添加し、その後、ＴＢＳＴ溶液を除去した。この操作を３回繰り返した後、２ｍＭ ＣａＣｌ２を含有するＴＢＳＴ溶液で希釈した８０ｎｇ／ｍＬ ＨＲＰ−ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ Ａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ社製、＃４０５３０６） １００μＬ／ｗｅｌｌを添加し、１時間反応させた。最後に、ＴＭＢ溶液（Ｎａｃａｌａｉ ｔｅｓｑｕｅ社製、＃０５２９８−８０） １００μＬ／ｗｅｌｌを添加し、３０分間反応させた後、１Ｍ Ｈ２ＳＯ４溶液 １００μＬ／ｗｅｌｌを添加することで反応を停止させ、４５０ｎｍの吸光度を測定することにより細胞外小胞を検出した。
結果を図４に示す。【０１５０】
［結果］
試験例１，３，４の結果より、実施例１〜１６の化合物は、種々の細胞（例えば、Ｕ−８７ ＭＧ細胞、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞、Ｊｕｒｋａｔ細胞、ＴＨＰ−１細胞、ＨＣＴ１１６細胞、ＳＷ４８０細胞、ＳＷ６２０細胞）からの、ＣＤ９、ＣＤ６３及び／又はＣＤ８１陽性の細胞外小胞の分泌量を減少させたことが分かる。
更に、試験例２の結果より、実施例１〜１６の化合物は、培養上清中のＬＤＨ量が少ないことから、種々の細胞（例えば、Ｕ−８７ ＭＧ細胞、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞、Ｊｕｒｋａｔ細胞、ＴＨＰ−１細胞、ＨＣＴ１１６細胞、ＳＷ４８０細胞、ＳＷ６２０細胞）に対して細胞傷害性が低いものと考えられる。
したがって、実施例１〜１６の化合物を含む組成物は、種々の細胞（例えば、Ｕ−８７ ＭＧ細胞、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞、Ｊｕｒｋａｔ細胞、ＴＨＰ−１細胞、ＨＣＴ１１６細胞、ＳＷ４８０細胞、ＳＷ６２０細胞）からの細胞外小胞の分泌を抑制するものである。更に、実施例１〜１６の化合物を含む組成物は、種々の細胞（例えば、Ｕ−８７ ＭＧ細胞、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞、Ｊｕｒｋａｔ細胞、ＴＨＰ−１細胞、ＨＣＴ１１６細胞、ＳＷ４８０細胞、ＳＷ６２０細胞）に対して細胞傷害性が低いにもかかわらず、これらの細胞からの細胞外小胞の分泌を抑制するものである。【０１５１】
以上、試験例１，３，４の結果より、実施例１〜１６の化合物は、種々の細胞又は組織由来の細胞外小胞（好ましくは、ガン細胞又はガン由来の細胞外小胞）の分泌を抑制することが分かる。したがって、式Ｉの構造を有する化合物、若しくはその金属錯体、又はその薬学的に許容し得る塩、或いは式ＩＩの構造を有する化合物、又はその薬学的に許容し得る塩は、種々の細胞又は組織由来の細胞外小胞（好ましくは、ガン細胞又はガン由来の細胞外小胞）の分泌を抑制するものである。
更に、試験例２の結果より、実施例１〜１６の化合物は、培養上清中のＬＤＨ量の顕著な上昇が認められなかった。したがって、式Ｉの構造を有する化合物、若しくはその金属錯体、又はその薬学的に許容し得る塩、或いは式ＩＩの構造を有する化合物、又はその薬学的に許容し得る塩は、例えば、化合物濃度として約４０μＭ以下（好ましくは、約２０μＭ以下、より好ましくは、約１０μＭ以下）の濃度において、細胞傷害性が低く、安全なものであると考えられる。【０１５２】
更に、式Ｉの構造を有する化合物、若しくはその金属錯体、又はその薬学的に許容し得る塩、或いは式ＩＩの構造を有する化合物、又はその薬学的に許容し得る塩は、上述のとおり、好ましくは、ガン細胞又はガン由来の細胞外小胞の分泌を抑制することができるから、ガンを治療若しくは予防すること、又はガンの転移を予防することができると考えられる。
【図１Ａ】
2020138266.tif 000039
【図１Ｂ】
2020138266.tif 000040
【図１Ｃ】
2020138266.tif 000041
【図１Ｄ】
2020138266.tif 000042
【図１Ｅ】
2020138266.tif 000043
【図１Ｆ】
2020138266.tif 000044
【図２Ａ】
2020138266.tif 000045
【図２Ｂ】
2020138266.tif 000046
【図２Ｃ】
2020138266.tif 000047
【図２Ｄ】
2020138266.tif 000048
【図２Ｅ】
2020138266.tif 000049
【図３Ａ】
2020138266.tif 000050
【図３Ｂ】
2020138266.tif 000051
【図４】
2020138266.tif 000052
【国際調査報告】
2020138266.tif 000053
2020138266.tif 000054
2020138266.tif 000055
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