(57)【要約】  副作用が少なく作用の緩和な、オートファジーを活性化するために使用される化合物の提供。  Ｓ１ＰＣ又はその塩を有効成分とするオートファジー活性化剤。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｓ−１−プロペニルシステイン又はその塩を有効成分とするオートファジー活性化剤。
【請求項２】
Ｓ−１−プロペニルシステインにおけるトランス体の割合が、トランス体とシス体の合計を１００％とした場合に、５０〜１００％である請求項１記載のオートファジー活性化剤。
【請求項３】
Ｓ−１−プロペニルシステイン又はその塩が、ニンニク、タマネギ、エレファントガーリック、ニラ及びネギから選ばれる１種以上のアリウム属植物に由来するものである請求項１又は２記載のオートファジー活性化剤。
【請求項４】
Ｓ−１−プロペニルシステイン又はその塩が、アリウム属植物を１０〜５０％のエタノール水溶液中、０〜８０℃で、１ヶ月以上抽出し、得られた抽出物を陽イオン交換樹脂に吸着させた後、０．１〜３Ｎのアンモニア水で溶出し、該溶出物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー及び／又は逆相カラムクロマトグラフィーに付し、回収することにより取得される、請求項３記載のオートファジー活性化剤。
【請求項５】
医薬である、請求項１〜４のいずれか１項記載のオートファジー活性化剤。
【請求項６】
食品である、請求項１〜４のいずれか１項記載のオートファジー活性化剤。
【請求項７】
アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、筋萎縮性側索硬化症、筋ジストロフィー、心不全、拡張性心筋症、感染症、自己免疫疾患、肥満、糖尿病、動脈硬化若しくは脂肪性肝炎の予防、治療又は改善に使用するための請求項１〜６のいずれか１項記載のオートファジー活性化剤。
【請求項８】
Ｓ−１−プロペニルシステイン又はその塩を有効成分とするオートファジー活性化用食品。
【請求項９】
Ｓ−１−プロペニルシステイン又はその塩を有効成分とする神経変性疾患の予防、治療又は改善剤。
【請求項１０】
Ｓ−１−プロペニルシステイン又はその塩を有効成分とする神経変性疾患の予防又は改善用食品。
【請求項１１】
オートファジー活性化剤を製造するための、Ｓ−１−プロペニルシステイン若しくはその塩の使用。
【請求項１２】
オートファジー活性化のために使用される、Ｓ−１−プロペニルシステイン若しくはその塩。
【請求項１３】
Ｓ−１−プロペニルシステイン若しくはその塩を対象に投与することを特徴とするオートファジー活性化方法。
【請求項１４】
神経変性疾患の予防、治療又は改善剤、又は神経変性疾患の予防又は改善用食品を製造するための、Ｓ−１−プロペニルシステイン若しくはその塩の使用。
【請求項１５】
神経変性疾患を予防、治療又は改善するために使用される、Ｓ−１−プロペニルシステイン若しくはその塩。
【請求項１６】
Ｓ−１−プロペニルシステイン若しくはその塩を対象に投与することを特徴とする神経変性疾患の予防、治療又は改善方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、オートファジーの機能を高める、オートファジー活性化剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
オートファジーは、タンパク質凝集体や損傷したオルガネラ等の莫大な量のタンパク質を分解するシステムであり、生体の恒常性を維持している。タンパク質凝集体や損傷したオルガネラは隔離膜に囲まれ、オートファゴソームを形成し、オートファゴソームは、リソソームと結合してオートリソソームを形成することにより分解を行う。オートファジーの活性化は、負に制御する哺乳類ラパマイシン標的タンパク質（mammalian target of rapamycin；ｍＴＯＲ）を細胞内エネルギーセンサーであるＡＭＰ活性化プロテインキナーゼ（AMP-activated protein kinase；ＡＭＰＫ）が抑制することによりｕｎｃ−５１  ｌｉｋｅ  ｋｉｎａｓｅ（ＵＬＫ）複合体が活性化されることで誘導される。ＵＬＫ複合体は様々なオートファジー関連遺伝子群（autophagy related gene；Ａｔｇ）を活性化させる。特にＡｔｇ７は、ユビキチン様酵素活性により、ＬＣ３（Microtubule-associated protein light chain 3）にホスファチジルエタノールアミンを結合させＬＣ３−ＩＩに変化させる過程に重要なタンパク質である。ＬＣ３−ＩＩは隔離膜の伸長および閉鎖を行うことでオートファジーを誘導する。【０００３】
オートファジーは非選択的に細胞内タンパク質を分解するが、タンパク質凝集体等を選択的に分解するメカニズムがある。タンパク質凝集体はユビキチン化され、ユビキチン結合タンパク質であるｐ６２が認識する。ユビキチン化タンパク質凝集体と結合したｐ６２はＬＣ３と結合することによりオートファジーで選択的に分解される。【０００４】
オートファジー機能の低下は、神経変性疾患、心血管疾患、肺疾患、感染症等の様々な疾患を引き起こすと考えられており、近年、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、筋ジストロフィー、ニーマン・ピック病、心不全、拡張性心筋症、感染症、慢性炎症、脂肪肝等の疾患とオートファジーとの関連が報告され、各疾患の発症にオートファジーの機能の低下が関与していることが示唆されている。したがって、オートファジーの活性化は、これらの疾患の予防又は治療に有用であると考えられる。
例えば、非特許文献４には、アルツハイマー病では、初期にオートファジーの機能低下が起こり、通常オートファジーにより分解されるタウタンパク質の凝集体が細胞内に蓄積され、アルツハイマーの発症に繋がることが開示されている。
非特許文献５には、パーキンソン病の原因がオートファジーの機能低下によるα―シヌクレインタンパク質の蓄積であり、オートファジーの活性化により改善される可能性が開示されている。
非特許文献６には、ハンチントン病は、変異ハンチンチン（変異Ｈｔｔ）の蓄積が引き金となること、変異Ｈｔｔは、ユビキチンープロテアソーム系およびオートファジーによって分解されることが開示されている。
非特許文献７には、ＡＬＳは、疾患関連タンパク質の誤った局在化やタンパク質凝集体形成により引き起こされる運動ニューロンの機能不全が原因であり、オートファジーの機能低下は、ＡＬＳを含む神経変性を引き起こすことが開示されている。
非特許文献８には、筋肉においては、オートファジーの活性化が一定のレベルに保たれているが、活性化のレベルが高まると筋肉の消耗が促進され、そのレベルが低下して異常タンパク質やオルガネラの蓄積が起こること、筋ジストロフィーにおいてはオートファジー機能低下が知られており、オートファジーの活性化がその治療に繋がることが開示されている。
非特許文献９には、ニーマン・ピック病が、オートファゴソームとエンドソームの融合により形成されるアンフィソームの不形成に基づいて、細胞内にコレステロールが蓄積されることにより引き起こされること、Ｎｐｃ遺伝子のノックアウトや変異マウスでは、オートファジー機能の低下やコレステロールの蓄積が起こり、ニーマン・ピック病と同様の病態を示すこと、Ｎｐｃ遺伝子の変異マウスあるいは細胞株にオートファジーの誘導剤であるラパマイシンを添加することでニーマン・ピック病と同様の病態が抑制されたことが示され、オートファジーを誘導することにより、有効的な治療できることが示唆されている。
非特許文献１０には、心肥大や心不全のような心疾患にオートファジーの変化が関連していること、オートファジーの活性化を誘導するタンパク質であるＡｔｇ５の欠損マウスにおいて、左心室の拡張や収縮不全を起こし、心肥大が誘導されることが開示されている。
非特許文献１１には、結核の原因である結核菌が、マクロファージ等の宿主細胞においてファゴソーム形成を抑制することにより細胞質へ回避されること、宿主細胞内の結核菌量はオートファジーによってコントロールされていることが開示されている。
非特許文献１２には、生体防御と炎症のバランスは、オートファジーによって維持されていること、オートファジーの機能低下は、がん、自己免疫疾患、神経変性疾患を引き起こすことが開示されている。
非特許文献１３には、脂質の分解に関与するｌｉｐｏｐｈａｇｙの機能低下が、肥満、糖尿病、動脈硬化や脂肪性肝炎等の脂肪性の疾患に関与しており、オートファジーの活性化が治療のターゲットとなる可能性があることが開示されている。【０００５】
ニンニクは古くより食品としてだけでなく、様々な疾病の治療に利用されてきた。ニンニクの特徴的な成分としては、γ−グルタミル−Ｓ−１−プロペニルシステインがある。該成分はニンニクを切ったり、つぶしたり、すりおろしたり、又は熟成することにより、ニンニク中に含まれるγ−グルタミルトランスペプチダーゼという酵素により、水溶性のＳ−１−プロペニルシステイン（以下、Ｓ１ＰＣと略す）に変換される。このような酵素反応により生成される水溶性化合物として、Ｓ１ＰＣの他にＳ−メチルシステイン、Ｓ−アリルシステイン（以下、ＳＡＣと略す）などがある（非特許文献１）。【０００６】
Ｓ１ＰＣには、免疫調整作用（非特許文献２、特許文献１）や血圧降下作用（非特許文献３、特許文献２）を有することが報告されているが、オートファジーの活性化については全く知られていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】国際公開第２０１６／０８８８９２号
【特許文献２】国際公開第２０１６／１９９８８５号
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】ニンニクの化学,初版,2000, 93-122,
【非特許文献２】Nutrition., 2016, 32,884-9
【非特許文献３】J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci., 2017 1046,147-155.
【非特許文献４】Rev Neurosci. 2015 ; 26(4): 385-395.
【非特許文献５】Cold Spring Harb Perspect Med．2012 2(4), a009357
【非特許文献６】Front Mol Neurosci. 2016;9:27
【非特許文献７】Front Mol Neurosci. 2017;10:263
【非特許文献８】Front Aging Neurosci. 2014;6:188
【非特許文献９】Cell Rep. 2013;5(5):1302-15.
【非特許文献１０】Nat Med. 2007;13(5):619-24
【非特許文献１１】Curr Issues Mol Biol. 2017;21:63-72.
【非特許文献１２】Autophagy. 2016;12(2):245-6
【非特許文献１３】Sci Signal. 2017;10(468)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、副作用が少なく作用の緩和な、オートファジーを活性化するために使用される化合物を提供することに関する。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、Ｓ１ＰＣ又はその塩の有用性について種々検討したところ、Ｓ１ＰＣ又はその塩に優れたオートファジー活性化作用、更にはアポトーシス抑制作用及びタウタンパク質除去作用が有り、オートファジー活性化剤、及び神経変性疾患の予防、治療又は改善剤として有用であることを見出し、本発明を完成するに至った。【００１１】
すなわち、本発明は、以下の１）〜１０）に係るものである。
１）Ｓ１ＰＣ又はその塩を有効成分とするオートファジー活性化剤。
２）Ｓ１ＰＣにおけるトランス体の割合が、トランス体とシス体の合計を１００％とした場合に、５０〜１００％である１）のオートファジー活性化剤。
３）Ｓ１ＰＣ又はその塩が、ニンニク、タマネギ、エレファントガーリック、ニラ及びネギから選ばれる１種以上のアリウム属植物に由来するものである１）又は２）のオートファジー活性化剤。
４）Ｓ１ＰＣ又はその塩が、アリウム属植物を１０〜５０％のエタノール水溶液中、０〜８０℃で、１ヶ月以上抽出し、得られた抽出物を陽イオン交換樹脂に吸着させた後、０．１〜３Ｎのアンモニア水で溶出し、該溶出物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー及び／又は逆相カラムクロマトグラフィーに付し、回収することにより取得される、３）のオートファジー活性化剤。
５）医薬である、１）〜４）のいずれかのオートファジー活性化剤。
６）食品である、１）〜４）のいずれかのオートファジー活性化剤。
７）アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、筋萎縮性側索硬化症、筋ジストロフィー、心不全、拡張性心筋症、感染症、自己免疫疾患、肥満、糖尿病、動脈硬化若しくは脂肪性肝炎の予防、治療又は改善に使用するための１）〜６）のいずれかのオートファジー活性化剤。
８）Ｓ１ＰＣ又はその塩を有効成分とするオートファジー活性化用食品。
９）Ｓ１ＰＣ又はその塩を有効成分とする神経変性疾患の予防、治療又は改善剤。
１０）Ｓ１ＰＣ又はその塩を有効成分とする神経変性疾患の予防又は改善用食品。
１１）オートファジー活性化剤を製造するための、Ｓ−１−プロペニルシステイン若しくはその塩の使用。
１２）オートファジー活性化のために使用される、Ｓ−１−プロペニルシステイン若しくはその塩。
１３）Ｓ−１−プロペニルシステイン若しくはその塩を対象に投与することを特徴とするオートファジー活性化方法。
１４）神経変性疾患の予防、治療又は改善剤、又は神経変性疾患の予防又は改善用食品を製造するための、Ｓ−１−プロペニルシステイン若しくはその塩の使用。
１５）神経変性疾患を予防、治療又は改善するために使用される、Ｓ−１−プロペニルシステイン若しくはその塩。
１６）Ｓ−１−プロペニルシステイン若しくはその塩を対象に投与することを特徴とする神経変性疾患の予防、治療又は改善方法。
【発明の効果】
【００１２】
本発明オートファジー活性化の有効成分であるＳ１ＰＣ又はその塩は、優れたオートファジー作用、更にはアポトーシス抑制作用及びタウタンパク質の除去作用を有する。そして、当該成分は長年、ヒトによって食されている植物由来の化合物である。したがって、本発明によれば、神経変性疾患を始めとするオートファジーの機能低下により発症する疾患の、安全性の高い予防、治療又は改善が可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】Ｓ１ＰＣのオートファジー活性化作用及びタウタンパク質の除去作用を示す。
【図２】Ｓ１ＰＣのオートファジー活性化作用及びタウタンパク質の除去作用に与えるオートファジー阻害剤の影響を示す。
【図３】Ｓ１ＰＣのアポトーシス抑制作用を示す。
【図４】Ｓ１ＰＣとＳＡＣのタウタンパク質の除去作用を示す。
【図５】Ｓ１ＰＣのα−シヌクレインタンパク質除去作用を示す。
【図６】Ｓ１ＰＣのα−シヌクレインタンパク質除去作用（ＳＡＣとの比較）を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本発明において、Ｓ１ＰＣは、下記式（１）で示されるシステイン誘導体である。
【００１５】
【化１】
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【００１６】
この化合物は、式（1）中の波線で示されるように、シス又はトランスの立体配置が存在するが、トランス体の割合が多いのが好ましく、トランス体の割合がトランス体とシス体の合計を１００％とした場合に、５０〜１００％であるのがより好ましく、７５〜１００％であるのがより好ましく、８０〜１００％であるのがより好ましく、９０〜１００％であるのが更に好ましい。
また、システイン由来の不斉炭素を有することから光学異性体が存在するが、Ｄ体、Ｌ体はあるいはラセミ体のいずれであってもよい。
【００１７】
Ｓ１ＰＣの塩は、酸付加塩又は塩基付加塩の何れでもよい。酸付加塩としては、たとえば、（イ）塩酸、硫酸、硝酸、リン酸などの鉱酸との塩、（ロ）ギ酸、酢酸、クエン酸、フマル酸、グルコン酸、リンゴ酸、コハク酸、酒石酸、トリクロロ酢酸、トリフルオロ酢酸などの有機カルボン酸との塩、（ハ）メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸、メシチレンスルホン酸、ナフタレンスルホン酸などのスルホン酸類との塩を、また、塩基付加塩としては、たとえば、（イ）ナトリウム、カリウムなどのアルカリ金属との塩、（ロ）カルシウム、マグネシウムなどのアルカリ土類金属との塩、（ハ）アンモニウム塩、（ニ）トリメチルアミン、トリエチルアミン、トリブチルアミン、ピリジン、Ｎ，Ｎ−ジメチルアニリン、Ｎ−メチルピペリジン、Ｎ−メチルモルホリン、ジエチルアミン、ジシクロヘキシルアミン、プロカイン、ジベンジルアミン、Ｎ−ベンジル−β−フェネチルアミン、１−エフェナミン、Ｎ，Ｎ′−ジベンジルエチレンジアミンなどの含窒素有機塩基との塩を挙げることができる。
【００１８】
更に、Ｓ１ＰＣ又はその塩は、未溶媒和型のみならず、水和物や溶媒和物としても存在することができ、斯かる水和物又は溶媒和物は製造条件により任意の結晶形として存在することができる。従って、本発明におけるＳ１ＰＣ又はその塩は、全ての立体異性体、水和物、溶媒和物、及び全ての多形結晶形態もしくは非晶形を包含するものである。
【００１９】
本発明におけるＳ１ＰＣ又はその塩は、有機合成手法〔１〕H Nishimura, A Mizuguchi, J Mizutani, Stereoselective synthesis of S-(trans-prop-1-enyl)-cysteine sulphoxide. Tetrahedron Letter, 1975, 37, 3201-3202；２〕JC Namyslo, C Stanitzek, A palladium-catalyzed synthesis of isoalliin, the main cysteine sulfoxide in Onion(Allium cepa). Synthesis, 2006, 20, 3367-3369；３〕S Lee, JN Kim, DH Choung, HK Lee, Facile synthesis of trans-S-1-propenyl- L-cysteine sulfoxide (isoalliin) in onions(Allium cepa). Bull. Korean Chem. Soc. 2011, 32(1), 319-320〕、酵素若しくは微生物を用いた生化学的手法、又はこれらを組み合わせた方法によって取得することができる。また、この他、当該化合物を含有する植物、例えばアリウム属植物あるいはその加工物から抽出・精製することにより取得できる。
したがって、本発明のＳ１ＰＣ又はその塩としては、単離・精製されたもののみならず、粗生成物、上記植物からの抽出操作によりＳ１ＰＣ又はその塩の含有量が高められた画分を用いることができる。
【００２０】
ここで、Ｓ１ＰＣ又はその塩を含有するアリウム属植物としては、ニンニク（Allium sativum  L.）、タマネギ（Allium  cepa  L.）、エレファントガーリック（Allium  mpeloprazum  L.）、（Allium tuberosum.  Rottl. Ex K. Spreng.）及びネギ（Allium  fistulosum  L.）等が挙げられる。これらの植物は、単独あるいは組み合わせて用いてもよい。また、上記アリウム属植物は生のものをそのまま、あるいは必要に応じて外皮を取り除き、切断又は細断したものを使用することもできる。あるいは、これらを粉末化したもの、また、医薬や食品の製造に可能な溶媒を用いて抽出したものを用いることができる。溶媒としては、水やアルコールなどや、酸あるいは塩基性物質を溶媒に添加したものなどが挙げられる。
【００２１】
本発明におけるＳ１ＰＣ又はその塩として、アリウム属植物からの抽出画分を用いる場合、当該画分は、例えば１）アリウム属植物を１０〜５０％のエタノール水溶液中、０〜８０℃で、１ヶ月以上抽出し、２）得られた抽出物を固液分離後、エタノール溶出画分を回収する、ことにより取得することができる。
【００２２】
工程１）で使用するエタノール水溶液は、１０〜５０％のエタノール水溶液を使用することができるが、好ましくは２０〜４０％のエタノール濃度に調製されたものである。また、処理温度は０〜８０℃の範囲に設定することができるが、好ましくは１０〜６０℃、更に好ましくは２０〜４０℃である。処理期間は上記条件下で少なくとも１ヶ月以上抽出に付すことができるが、好ましくは１〜２０ヶ月、更に好ましくは１〜１０ヶ月である。また、本工程は衛生面やエタノールの揮発等を考慮し、気密、密封あるいは密閉容器内で行うことができるが、密閉容器を使用するのが好ましい。
【００２３】
工程２）では、工程１）で得られた抽出物を固液分離後、エタノール溶出画分が回収される。回収物を適宜濃縮することにより、Ｓ１ＰＣ又はその塩を含む抽出画分を得ることができる。当該抽出画分は、そのまま使用することができるが、適宜、スプレードライなどにより乾燥させて使用することもできる。
【００２４】
更に、上記Ｓ１ＰＣ又はその塩を含む抽出画分からのＳ１ＰＣ又はその塩の単離は、必要に応じて分子排除サイズ３０００〜４０００の透析膜を用いて透析に付し、次いで陽イオン交換樹脂を用いた吸着・分離、順相クロマトグラフィー又は逆相クロマトグラフィーによる分離精製手段を適宜組み合わせることにより行うことができる。
ここで、陽イオン交換樹脂を用いた吸着・分離は、陽イオン交換樹脂（例えば、アンバーライト（ダウ・ケミカル社）、ＤＯＷＥＸ（ダウ・ケミカル社製）、ＤＩＡＩＯＮ（三菱化学製）等）に吸着させ、０．１〜３Ｎのアンモニア水で溶出させる方法が挙げられる。
順相クロマトグラフィーとしては、例えばシリカゲルカラムを用いて、クロロフォルム／メタノール／水混合物等で溶出させる方法が挙げられる。
逆相クロマトグラフィーとしては、例えばオクタデシルシリルカラムを用いて、０．０１〜３％ギ酸水溶液等で溶出させる方法が挙げられる。
【００２５】
好ましくは、上記エタノール抽出画分を透析（透析膜：分子排除サイズ３０００〜４０００）し、次いで陽イオン交換樹脂に吸着させた後、０．５〜２Ｎのアンモニア水で溶出し、溶出物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶媒：クロロフォルム／メタノール／水混合物）に付して目的物を含む画分を回収し、更に分取用逆相カラムクロマトグラフィー（溶媒：０．１〜０．５％ギ酸水溶液）に付して目的物を回収する方法が挙げられる。
斯くして得られたＳ１ＰＣは、トランス体の割合が、トランス体とシス体の合計を１００％とした場合に、５０〜１００％であるのがより好ましく、６０〜１００％であるのがより好ましく、７０〜１００％であるのがより好ましい。
【００２６】
本発明におけるＳ１ＰＣ又はその塩は、例えば原料の一つであるニンニクの希エタノール抽出液（エキス分１４．５％，アルコール数１．１８）のＬＤ50値が、経口、腹腔および皮下のいずれの投与経路においても、５０ｍｌ／Ｋｇ以上であること（The Journal of   Toxicological Sciences,9,57（1984））およびニンニクやタマネギ等のアリウム属植物が食品として常用されていること、等により一般に低毒性である。
【００２７】
後記実施例に示すように、Ｓ１ＰＣ又はその塩は、ヒト神経芽細胞において、Ａｔｇ７のタンパク質量を増加させる作用を有する。Ａｔｇ７は、オートファジーに関与するタンパク質で、特にオートファゴゾームの形成においては必須の重要な因子である。オートファジーの進行につれて発現量が増えることから、オートファジーのマーカーとされている。よって、Ｓ１ＰＣ又はその塩は、オートファジー活性化作用を有し、オートファジー活性化剤となり得る。
本発明において、「オートファジー」とは、タンパク質凝集体や損傷したオルガネラ等を分解するシステムを意味し、その活性化とはオートファジーの当該機能を促進し高めることを意味する。
【００２８】
オートファジーの機能低下は、既に述べたように、神経変性疾患、心血管疾患、肺疾患、感染症等、多くの疾患に関わっているとされている（非特許文献４〜１３）。したがって、本発明のオートファジー活性化剤は、オートファジーの機能低下により発症する疾患の予防、治療又は改善剤として有用である。
【００２９】
例えば、神経変性疾患の一種であるアルツハイマー病は、アミロイドβ前駆体タンパク質（ＡＰＰ）がセクレターゼによって切断されることにより産生されたアミロイドβが引き金となる。アミロイドβはそれ自身が神経毒性を示すと共に神経細胞表面に沈着し、プラークを形成する。アミロイドβプラークは、微小管結合タンパク質であるタウタンパク質を異常リン酸化し、細胞内で不溶性の凝集体を形成させる。斯かるタウタンパク質の凝集体が細胞内に蓄積し、細胞死を引き起こすことによりアセチルコリンが低下し、アルツハイマー病を発症すると考えられている。また、パーキンソン病は、遺伝性および孤発性に分けられ、孤発性パーキンソン病は、中脳ドーパミン神経の変性を特徴とする神経変性疾患であるが、その原因は、神経細胞内におけるα−シヌクレインの凝集および蓄積によるドーパミン神経の欠落であると考えられている。遺伝性のパーキンソン病は、ユビキチンリガーゼであるパーキンの変異により除去できなかった異常ミトコンドリアや変性タンパク質が蓄積し、発症すると考えられている。斯かる脳神経組織における異常タンパク質や変性タンパク質の凝集及び蓄積は、オートファジーの機能低下が要因となっている（前記非特許文献４，５）。
したがって、Ｓ１ＰＣ又はその塩は、アルツハイマー病やパーキンソン病といった神経変性疾患の予防、治療又は改善剤としても有用であると考えられ、実際に、Ｓ１ＰＣ又はその塩は、ヒト神経芽細胞において、アポトーシスの早期に関連するプロテアーゼであるカスパーゼ−３の活性化を抑制する作用を示した。また、オートファジー阻害剤を添加した神経芽細胞において、Ｓ１ＰＣを処理することでタウタンパク質の蓄積が抑制されること、すなわちタウタンパク質の除去作用を有することが確認された。
【００３０】
その他、オートファジー機能低下により発症し得る疾患としては、ハンチントン病、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、筋ジストロフィー、ニーマン・ピック病、心不全、拡張性心筋症、感染症、自己免疫疾患、肥満、糖尿病、動脈硬化、脂肪性肝炎等が挙げられる（前記非特許文献６〜１３）。
【００３１】
本発明のオートファジー活性化は、オートファジーの機能促進を発揮する医薬又は食品であってもよく、或いはこれらに配合して使用される素材又は製剤であってもよい。
【００３２】
また、当該食品には、異常タンパク質等の分解促進をコンセプトとし、必要に応じてその機能に基づく作用を説明表示した食品、機能性食品、機能性表示食品、病者用食品、特定保健用食品が包含される。
【００３３】
本発明のＳ１ＰＣ又はその塩を含有する医薬の投与形態は、特に限定されるものではなく、経口に適した剤形をとることができるが、経口に適した剤形であることが好ましい。経口投与製剤の具体的な剤形として、例えば、固形剤としては錠剤、カプセル剤、細粒剤、丸剤、顆粒剤、液剤としては乳濁剤、溶液剤、懸濁剤、シロップ剤等の形態が挙げられる。斯かる医薬製剤は、本発明のＳ１ＰＣ又はその塩に、必要に応じて賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、着色料、矯味矯臭剤、ｐＨ調整剤等を適宜配合し、常法に従って調製することができる。
【００３４】
本発明のＳ１ＰＣ又はその塩を含有する食品の形態は、特に限定されるものではなく、例えば、固形食品、半流動食品、ゲル状食品、錠剤、キャプレット、カプセル剤等、種々の形態をとることができ、更に具体的には、菓子、飲料、調味料、水産加工食品、食肉加工食品、パン、健康食品等の種々の食品の形態であり得る。
斯かる食品は、これらの食品を通常製造する場合に用いられる食品素材と、本発明のＳ１ＰＣ又はその塩を適宜配合し、常法により製造することができる。
【００３５】
上記医薬又は食品には、更に、神経細胞索の伸長を促す作用や神経伝達にかかわりのある他の物質、例えば、γ−グルタミル−Ｓ−アリルシステインやＳＡＣなどの含硫アミノ酸類、ニンジン、イチョウ等の生薬類、グルタミン酸やＧＡＢＡなどのアミノ酸類を含有することができる。また、炎症を和らげるようなビタミン類、脂質類、ミネラル類、例えば、ビタミンＣ、ビタミンＥ，ビタミンＢ２，ビタミンＢ６，ナイアシン、ヘスペリジン、α-リポ酸、グルタチオン、コエンザイムＱ１０、亜鉛、マグネシウム、オメガ３脂肪酸などを含有することができる。
【００３６】
上記医薬又は食品の、一日当たりの好ましい摂取量は、摂取する対象、摂取の形態、同時に摂取する素材や添加剤等の種類、摂取の間隔等の要因に依存して変動するものであるが、通常Ｓ１ＰＣ又はその塩類として、一日当たり０．１〜２．７ｍｇ／ｋｇ摂取することが好ましく、０．３〜０．９ｍｇ／ｋｇ摂取することがより好ましい。また、所望により、この一日量を２〜４回に分割して摂取することもできる。
投与又は摂取対象としては、オートファジー機能が低下或いはその可能性があるヒト、神経変性疾患、心血管疾患、肺疾患、感染症等のオートファジー機能の低下によって発症する疾患に罹患したヒト或いはその予防を望むヒト等が挙げられる。
【実施例】
【００３７】
製造例１  Ｓ１ＰＣ含有植物抽出画分の製造
（１）ニンニクのエタノール抽出画分
外皮を取り除いたニンニク鱗茎約１ｋｇと約１０００ｍＬの３０％エタノールを容器に入れ密閉した。この容器を室温で１〜１０ヶ月放置し、適宜攪拌した。この混合物から固体と液体を分離し、液体をスプレードライによって乾燥させ、黄褐色の粉末を得た。【００３８】
（２）タマネギのエタノール抽出画分
外皮を取り除いたタマネギ球を２〜４分割し、その約５ｋｇと約５０００ｍＬの３４％エタノールを容器に入れ密閉した。この容器を室温で１〜１０ヶ月放置し、適宜攪拌した。この混合物から固体と液体を分離し、液体を減圧濃縮した。【００３９】
（３）ニラのエタノール抽出画分
洗浄したニラを約５〜１０ｃｍの長さに切り、その約５ｋｇと約５０００ｍＬの３４％エタノールを容器に入れ密閉した。この容器を室温で１〜１０ヶ月放置し、適宜攪拌した。この混合物から固体と液体を分離し、液体を減圧濃縮した。【００４０】
製造例２  ニンニクのエタノール抽出画分からのＳ１ＰＣの単離
（１）製造例１（１）で得られたニンニクのエタノール抽出画分をポアサイズ３５００の透析チューブに入れ、精製水に対して透析を行った。透析外液を陽イオン交換樹脂Ｄｏｗｅｘ５０Ｗｘ８（Ｈ＋）に通じ、精製水で樹脂を良く洗浄した。樹脂に吸着したアミノ酸類を２Ｎのアンモニアで溶出させ、減圧濃縮した。濃縮物をシリカゲルカラムに付し、クロロフォルム／メタノール／水混合物を溶媒としてカラムクロマトグラフーを行った。目的物（Ｓ１ＰＣ）を含む画分を回収し、濃縮した。濃縮物を水に溶解し、分取用逆相カラム（オクタデシルシリルカラム）を用いて、０．１％ギ酸を溶媒としてクロマトグラフを行い、目的物を回収し溶媒を凍結乾燥によって取り除いた。得られた凍結乾燥物は、ＮＭＲ（溶媒：重水）及び質量分析装置にて、構造を以下に示す標準物質から得られたスペクトルと比較し、トランス−Ｓ１ＰＣとシス−Ｓ１ＰＣ（トランス体：シス体＝8：2）の混合物であることを確認した。【００４１】
trans-Ｓ１ＰＣ
1H-NMR (500 MHz, in D2O-NaOD, δ): 1.76 (d, 3H, J = 7.0 Hz), 2.98 (dd, 1H, J = 7.5, 14.5 Hz), 3.14 (dd, 1H, J = 4.5, 14.5 Hz) 3.69 (dd, 1H, J = 4.5, 7.5Hz), 5.10-5.14 (m, 1H), 6.02(d, 1H, J = 15.5 Hz); 
13C-NMR (125 MHz, in D2O-NaOD, δ): 17.61, 33.53, 53.70, 119.92, 132.12, 172.73,
HRMS: observed [M+H]+ = 162.0583, calculated [M+H] +  = 162.0581【００４２】
cis-Ｓ１ＰＣ
1H-NMR (500 MHz, in D2O, δ): 1.74 (d, 3H, J = 7.0 Hz), 3.21 (dd, 1H, J = 7.5, 15.0 Hz), 3.31 (dd, 1H, J = 4.5, 15.0 Hz), 3.95 (dd, 1H, J = 4.5, 7.5 Hz), 5.82-5.86 (m, 1H), 6.01(d, 1H, J = 9.5 Hz);
13C-NMR (125 MHz, in D2O-NaOD, δ): 13.89, 33.88, 54.16, 122.58, 127.78, 172.63.
HRMS: observed [M+H] +  = 162.0580, calculated [M+H] +  = 162.0581【００４３】
（２）ニンニクのエタノール抽出画分中のＳ１ＰＣの測定
製造例１（１）で得られたニンニクのエタノール抽出画分を５００ｍｇから１ｇ容器に取り、内部標準としてＳ−ｎ−３−ブテニルシステインの２０ｍＭ塩酸溶液を加え、２０ｍＭ塩酸にて２０ｍＬとした。良く攪拌した後、一部を取り１７５０Ｇにて遠心分離を約１０分間行った。得られた上清を一部取り、遠心式ろ過ユニット（Ａｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ、ｃｕｔｏｆｆ：３０００）を用いて遠心ろ過を行った（１５０００ｒｐｍ、１０分）。得られたろ過物２０μＬを取り、ＡｃｃＱ・Ｔａｇ  Ｄｅｒｉｖａｔｉｚａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｗａｔｅｒｓ）を用いて誘導体化をおこなった。別途、標準化合物を２０ｍＭ塩酸に溶解し、試料と同様の操作を行い、検量線用標準液を調製した。試料溶液及び標準液をＡｃｑｕｉｔｙ  ＵＰＬＣシステム（Ｗａｔｅｒｓ）にてクロマトグラフを行い、含量を求めた。その結果、Ｓ１ＰＣは、３．７±０．３ｍｇ／ｇ乾燥物であった。【００４４】
試験例
オートファジー活性化および変異タンパク質分解促進作用
（１）試料の調製
生物活性を評価するための被検液の調製を以下の通り行った。生物活性評価に際し、被検液はいずれも用時調製を行った。【００４５】
製造例１で製造したＳ１ＰＣ（シス／トランス混合物） を約４ｍｇ精密に量り取り、培養液１ｍＬに溶解した。この液を原液とし、適宜希釈して試験に供した。【００４６】
（２）評価試験用ヒト神経芽細胞の調製
ヒト神経芽細胞株ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞を１０％ウシ胎児血清、抗生物質ペニシリン、ストレプトマイシン溶液を添加したダルベッコ改変イーグル培地で培養し、評価試験用細胞とした。【００４７】
（３）ウエスタンブロット法
（ａ）オートファジー活性化及びタウタンパク質除去作用
上記（２）で調整した評価試験用ヒト神経芽細胞にオカダ酸１００ｎＭ、Ｓ１ＰＣを０．０３、０．１および０．３ｍＭの濃度で添加し、６時間培養した。培養後にリン酸緩衝液で洗浄後に、サーモフィッシャーサイエンティフィック社製のプロテアーゼ／ホスファターゼ混合型阻害剤を添加した精製水で１０倍に希釈したミリポア社製のＲＩＰＡ細胞溶解用緩衝液により細胞を溶解した後、遠心（１００００ ｒｐｍ、１０分、４℃）し、上清を細胞抽出液とした。この細胞抽出液を用いて定法に従いウエスタンブロッティング法により解析した。抗体は抗Ａｔｇ７抗体（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）、抗４Ｔ−タウ抗体（和光純薬社製）、および抗β−アクチン抗体（和光純薬社製）を用いた。結果を図１に示す。Ｓ１ＰＣは、Ａｔｇ７発現を増加させ、タウタンパク質の除去を促進した。【００４８】
（ｂ）オートファジーを介したタウタンパク質除去作用
上記（２）で調整した評価試験用ヒト神経芽細胞にオカダ酸１０ｎＭ、Ｓ１ＰＣを０．３ｍＭおよびオートファジー阻害剤（３−メチルアデニン）を１０ｍＭの濃度で添加し、２４時間培養した。上記（ａ）と同様に細胞抽出液を作製し、定法に従いウエスタンブロッティング法により解析した。抗体は抗Ａｔｇ７抗体（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）、抗４Ｔ−タウ抗体（和光純薬社製）および抗β−アクチン抗体（和光純薬社製）を用いた。結果を図２に示す。
Ｓ１ＰＣによるＡｔｇ７発現の増加作用及びタウタンパク質の除去作用は、オートファジー阻害剤の添加により抑制された。以上の結果より、Ｓ１ＰＣは、オートファジー活性化作用を介してタウタンパク質除去作用を発揮したと云える。【００４９】
（ｃ）アポトーシス抑制作用
上記（２）で調整した評価試験用ヒト神経芽細胞にオカダ酸１００ｎＭ、Ｓ１ＰＣを０．３ｍＭの濃度で添加し、６時間培養した。上記（ａ）と同様に細胞抽出液を作製し、定法に従いウエスタンブロッティング法により解析した。抗体は抗Ｃａｓｐａｓｅ−３抗体（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）および抗β−アクチン抗体（和光純薬社製）を用いた。結果を図３に示す。
図３より、Ｓ１ＰＣには、Ｃａｓｐａｓｅ−３の活性化を抑制することが確認された。
Ｃａｓｐａｓｅ−３は、標的タンパク質を切断することでアポトーシスを誘導することから、Ｓ１ＰＣには、アポトーシスを抑制する作用があると云える。【００５０】
（ｄ）タウタンパク質除去作用のＳＡＣとの比較
上記（２）で調整した評価試験用ヒト神経芽細胞にオカダ酸５０ｎＭ、Ｓ１ＰＣあるいはＳＡＣを０．３ｍＭの濃度で添加し、６時間培養した。上記（ａ）と同様に細胞抽出液を作製し、定法に従いウエスタンブロッティング法により解析した。抗体は抗４Ｔ−タウ抗体（和光純薬社製）および抗β−アクチン抗体（和光純薬社製）を用いた。結果を図４に示す。
図４よりタウタンパク質は、Ｓ１ＰＣの添加により減少し、その効果はＳＡＣより優れていた。よって、Ｓ１ＰＣは、タウタンパク質の蓄積を伴うアルツハイマー病等の神経変性疾患に有用と考えられる。【００５１】
（ｅ）オートファジーを介したα−シヌクレインタンパク質除去作用
上記（２）で調整した評価試験用ヒト神経芽細胞にロテノン１０μＭ、Ｓ１ＰＣを０．３ｍＭおよびオートファジー阻害剤（３−メチルアデニン）を１ｍＭの濃度で添加し、３時間培養した。上記（ａ）と同様に細胞抽出液を作製し、定法に従いウエスタンブロッティング法により解析した。抗体は抗α−シヌクレイン抗体、抗ＬＣ３Ｂ抗体（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）および抗β−アクチン抗体（株式会社医学生物学研究所製）を用いた。結果を図５に示す。
Ｓ１ＰＣによるＬＣ３Ｂ−ＩＩ発現の増加作用及びα−シヌクレインタンパク質の除去作用は、オートファジー阻害剤の添加により抑制された。
以上の結果より、Ｓ１ＰＣは、オートファジー活性化作用を介してα−シヌクレインタンパク質除去作用を発揮したと云える。【００５２】
（ｆ）α−シヌクレインタンパク質除去作用のＳＡＣとの比較
上記（３）で調整した評価試験用ヒト神経芽細胞にロテノン５００ｎＭ、Ｓ１ＰＣあるいはＳＡＣを０．３ｍＭの濃度で添加し、３時間培養した。上記（ａ）と同様に細胞抽出液を作製し、定法に従いウエスタンブロッティング法により解析した。抗α−シヌクレイン抗体、抗ＬＣ３Ｂ抗体（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）および抗β−アクチン抗体（株式会社医学生物学研究所製）を用いた。結果を図６に示す。α−シヌクレインタンパク質は、Ｓ１ＰＣの添加により減少し、その効果はＳＡＣより優れていた。よって、Ｓ１ＰＣは、α−シヌクレインタンパク質の蓄積を伴うパーキンソン病等に有用と考えられる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【国際調査報告】
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