(57)【要約】  本発明は、野生型ステビア種と比べブロウソネチンをより高い含量で含む高ブロウソネチン含有ステビア植物体を提供する。本発明はまた、そのような高ブロウソネチン含有ステビア植物体を作出する方法、そのような植物体から得られる乾燥葉や抽出物も提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
野生型よりブロウソネチン含量が高い、変異型ステビア植物体。
【請求項２】
乾燥葉の単位質量当たり１％以上のレバウジオシドＤを含むこと、及び／又は
乾燥葉の単位質量当たり０．６％超のレバウジオシドＭを含むことを特徴とする、請求項１に記載のステビア植物体。
【請求項３】
ブロウソネチンが、ブロウソネチンＦ、ブロウソネチンＨ、ブロウソネチンＲ、ブロウソネチンＴ又はこれらの組合せを含む、請求項１又は２に記載の植物体。
【請求項４】
非遺伝子組換植物体である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の植物体。
【請求項５】
突然変異誘発処理を行ったステビア植物体及びその子孫植物体を含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の植物体。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか一項に記載の植物体の種子、組織、組織培養物又は細胞。
【請求項７】
胚、分裂組織細胞、花粉、葉、根、根端、花弁、プロトプラスト、葉の切片及びカルスから選択される、請求項６に記載の組織、組織培養物又は細胞。
【請求項８】
請求項１〜５のいずれか一項に記載の植物体と第２のステビア植物体とを交雑させる工程を含む、野生型よりブロウソネチン含量が高いステビア植物体を作出する方法。
【請求項９】
第２の植物体が請求項１〜５のいずれか一項に記載の植物体である、請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
請求項１〜５のいずれか一項に記載の植物体、請求項６又は７に記載の種子、組織、組織培養物又は細胞の抽出物。
【請求項１１】
ステビア植物体、その種子、組織、組織培養物又は細胞から抽出物を得る工程を含む、ブロウソネチン含有抽出物の製造方法。
【請求項１２】
ステビア植物体が請求項１〜５のいずれか一項に記載の植物体である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
ブロウソネチン含有抽出物がステビオール配糖体をさらに含有する、請求項１１又は１２に記載の方法。
【請求項１４】
請求項１１〜１３のいずれか一項に記載の方法で得たブロウソネチン含有抽出物からブロウソネチンを精製する工程を含む、ブロウソネチンの製造方法。
【請求項１５】
請求項１１〜１３のいずれか一項に記載の方法を用いてブロウソネチン含有抽出物を提供する工程、
任意選択で前記ブロウソネチン含有抽出物を精製してブロウソネチンを提供する工程、及び
前記抽出物又はブロウソネチンを、飲食品、甘味組成物、香料又は医薬品の原料に添加する工程
を含む、ブロウソネチンを含む飲食品、甘味組成物、香料又は医薬品の製造方法。
【請求項１６】
被験ステビア植物体におけるブロウソネチンの含量を決定する工程を含む、高レバウジオシドＤ含有ステビア植物体及び／又は高レバウジオシドＭ含有ステビア植物体をスクリーニングする方法。
【請求項１７】
ブロウソネチンの含量を決定する工程が、クロマトグラフィー又は質量分析を用いて行われる、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
被験ステビア植物組織のレバウジオシドＤ及び／又はレバウジオシドＭの含有量を測定する工程をさらに含む、請求項１６又は１７に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ブロウソネチンの含有量が高いステビア植物に関する。
【背景技術】
【０００２】
ブロウソネチンは、コウゾ（Broussonetia kazinoki Sieb.）の樹皮などに含まれるピロリジンアルカロイドであり（非特許文献１〜３）、グリコシダーゼ阻害活性を有することから、腫瘍、糖尿病、ウイルス疾患などへの効果が期待されている。しかしながら、他の植物がブロウソネチンを含むことは報告されていない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００３】
【非特許文献１】Shibano et al., Chem Pharm Bull. 1997;45(4):700-5
【非特許文献２】Shibano et al., Chem Pharm Bull. 1998;46(6):1048-50
【非特許文献１】Tsukamoto et al., Chem Pharm Bull. 2001;49(4):492-6
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
近年の健康志向の高まりを受け、機能性の高い食品へのニーズが高まっている。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明は、高含有量でブロウソネチンを含む高ブロウソネチン含有型ステビア植物体並びに当該植物体の作出方法及びスクリーニング方法を提供する。【０００６】
一態様において、本発明は以下を提供する。
［１］
野生型よりブロウソネチン含量が高い、変異型ステビア植物体。
［２］
乾燥葉の単位質量当たり１％以上のレバウジオシドＤを含むこと、及び／又は
乾燥葉の単位質量当たり０．６％超のレバウジオシドＭを含むことを特徴とする、［１］に記載のステビア植物体。
［３］
ブロウソネチンが、ブロウソネチンＦ、ブロウソネチンＨ、ブロウソネチンＲ、ブロウソネチンＴ又はこれらの組合せを含む、［１］又は［２］に記載の植物体。
［４］
非遺伝子組換植物体である、［１］〜［３］のいずれか一項に記載の植物体。
［５］
突然変異誘発処理を行ったステビア植物体及びその子孫植物体を含む、［１］〜［４］のいずれか一項に記載の植物体。【０００７】
［６］
［１］〜［５］のいずれか一項に記載の植物体の種子、組織、組織培養物又は細胞。
［７］
胚、分裂組織細胞、花粉、葉、根、根端、花弁、プロトプラスト、葉の切片及びカルスから選択される、［６］に記載の組織、組織培養物又は細胞。
［８］
［１］〜［５］のいずれか一項に記載の植物体と第２のステビア植物体とを交雑させる工程を含む、野生型よりブロウソネチン含量が高いステビア植物体を作出する方法。
［９］
第２の植物体が［１］〜［５］のいずれか一項に記載の植物体である、［７］に記載の方法。
［１０］
［１］〜［５］のいずれか一項に記載の植物体、［６］又は［７］に記載の種子、組織、組織培養物又は細胞の抽出物。【０００８】
［１１］
ステビア植物体、その種子、組織、組織培養物又は細胞から抽出物を得る工程を含む、ブロウソネチン含有抽出物の製造方法。
［１２］
ステビア植物体が［１］〜［５］のいずれか一項に記載の植物体である、［１１］に記載の方法。
［１３］
ブロウソネチン含有抽出物がステビオール配糖体をさらに含有する、［１１］又は［１２］に記載の方法。
［１４］
［１１］〜［１３］のいずれか一項に記載の方法で得たブロウソネチン含有抽出物からブロウソネチンを精製する工程を含む、ブロウソネチンの製造方法。
［１５］
［１１］〜［１３］のいずれか一項に記載の方法を用いてブロウソネチン含有抽出物を提供する工程、
任意選択で前記ブロウソネチン含有抽出物を精製してブロウソネチンを提供する工程、及び
前記抽出物又はブロウソネチンを、飲食品、甘味組成物、香料又は医薬品の原料に添加する工程
を含む、ブロウソネチンを含む飲食品、甘味組成物、香料又は医薬品の製造方法。【０００９】
［１６］
被験ステビア植物体におけるブロウソネチンの含量を決定する工程を含む、高レバウジオシドＤ含有ステビア植物体及び／又は高レバウジオシドＭ含有ステビア植物体をスクリーニングする方法。
［１７］
ブロウソネチンの含量を決定する工程が、クロマトグラフィー又は質量分析を用いて行われる、［１６］に記載の方法。
［１８］  被験ステビア植物組織のレバウジオシドＤ及び／又はレバウジオシドＭの含有量を測定する工程をさらに含む、［１６］又は［１７］に記載の方法。
【発明の効果】
【００１０】
本発明によって、ステビア植物体にブロウソネチンが含まれていることが明らかとなったことにより、ブロウソネチンの供給源の多様化が可能となる。また、ブロウソネチン含量の高いステビア植物体はレバウジオシドＤ及びＭの含量も高い傾向にあることから、本発明によりこのような有益な成分の含量の高いステビア植物体の取得、スクリーニングなどが可能になる。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
以下、本発明を詳細に説明する。以下の実施の形態は、本発明を説明するための例示であり、本発明をそのような実施の形態のみに限定する趣旨ではない。本発明は、その要旨を逸脱しない限り、様々な形態で実施をすることができる。
なお、本明細書において引用した全ての文献、及び公開公報、特許公報その他の特許文献は、参照として本明細書に組み込むものとする。また、本明細書は、２０１８年１２月２８日に出願された本願優先権主張の基礎となる日本国特許出願（特願２０１８−２４８６９７号）の明細書及び図面に記載の内容を包含する。
【００１２】
１．高ブロウソネチン含有ステビア植物体
一態様において、本発明は、野生型よりブロウソネチン含量が高い、変異型ステビア植物体（以下、「本発明の植物体」又は「本発明のステビア植物体」と称する場合がある）を提供する。
ブロウソネチンとしては、ブロウソネチンＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｊ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｏ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｕ、Ｖ等が挙げられる。好ましいブロウソネチンは、ブロウソネチンＦ、Ｈ、Ｒ及びＴである。より好ましいブロウソネチンは、ブロウソネチンＦ、Ｈ及びＴである。
【００１３】
ブロウソネチンは、既知の種々の手法、例えば、非特許文献１〜３に記載された手法や、下記実施例に記載の手法などにより抽出、定量することができる。
ブロウソネチンは、限定されずに、以下の手法により抽出、定量することができる（以下、「測定方法Ａ」と称する場合がある）。まずステビア植物体の新鮮葉をフリーズドライにより乾燥し、破砕物乾物を終濃度７５％のメタノール中に投入する。ビーズ式ホモジナイザーでホモジナイズし、１５，０００ｒｐｍで１０分間遠心後、上清を回収する。上清をコンディショニング済みのMonoSpin(R)C18カラム（GL Sciences）に適用し、５０００ｇで２分間遠心後、溶出液を回収し、０．２μｍフィルターでろ過したものをＬＣ−ＭＳ分析に供する。ＬＣ−ＭＳ分析は以下の条件で行う。
【００１４】
【表１】
2020138366.tif 000002
【表２】
2020138366.tif 000003
【表３】
2020138366.tif 000004
【００１５】
本発明の植物体に含まれるブロウソネチンの含量は野生型より高ければ特に限定されないが、例えば、上記測定方法Ａで測定した場合のピーク強度として、ブロウソネチンＦについては５００００以上、６００００以上、３０００００以上、１５０００００以上など、ブロウソネチンＨについては７０００以上、８０００以上、４００００以上、４０００００以上など、ブロウソネチンＴについては４００００以上、５００００以上、３０００００以上、１５０００００以上などであってよい。ブロウソネチンの含量の上限は特に限定されないが、例えば、上記測定方法Ａで測定した場合のピーク強度として、ブロウソネチンＦについては２００００００００など、ブロウソネチンＨについては３０００００００など、ブロウソネチンＴについては３０００００００などであってよい。
【００１６】
また、例えば、上記測定方法Ａで測定した場合のピーク強度比として、ブロウソネチンＦについては０．０１％以上、０．０２％以上、０．０３％以上、０．０５％以上、０．０８％以上、０．１％以上、０．２％以上、０．３％以上、０．４％以上、０．５％以上、０．６％以上、０．７％以上、０．８％以上、０．９％以上、１．０％以上、２．０％以上、３．０％以上、４．０％以上など、ブロウソネチンＨについては０．００１％以上、０．００２％以上、０．０１％以上、０．０４％以上、０．０５％以上、０．０６％以上、０．０７％以上、０．０８％以上、０．０９％以上、０．１％以上、０．２％以上、０．３％以上など、ブロウソネチンＴについては０．００５％以上、０．０１％以上、０．０２％以上、０．０３％以上、０．０４％以上、０．０５％以上、０．０６％以上、０．０７％以上、０．０８％以上、０．０９％以上、０．１％以上、０．２％以上、０．３％以上、０．４％以上、０．５％以上、０．６％以上、０．７％以上などであってよい。ブロウソネチンの含量の上限は特に限定されないが、例えば、上記測定方法Ａで測定した場合のピーク強度比として、ブロウソネチンＦについては５０％など、ブロウソネチンＨについては７％など、ブロウソネチンＴについては８％などであってよい。
ブロウソネチンの測定値として、複数回、例えば、２回、３回、４回、５回又はそれ以上の測定値の平均値を用いることが好ましい。
【００１７】
本発明の植物体は、以下の（ａ）、（ｂ）の特徴の少なくとも１つをさらに有してもよい。
（ａ）乾燥葉の単位質量当たり１％以上、好ましくは２％以上、より好ましくは３％以上のレバウジオシド（Rebaudioside、以下「Ｒｅｂ」ともいう）Ｄを含む。
（ｂ）乾燥葉の単位質量当たり０．６％超、好ましくは０．７％超、より好ましくは０．８％超のＲｅｂＭを含む。
【００１８】
特定の態様において、本発明の植物体は、以下の（１）〜（４）の特徴の少なくとも１つをさらに有してもよい。
（１）乾燥葉の単位質量当たり３．３％以上のＲｅｂＤを含む（以下、「本発明の植物体Ａ」又は「本発明のステビア植物体Ａ」と称する場合がある）。
（２）乾燥葉の単位質量当たり２．６％以上のＲｅｂＤと０．４％以上のＲｅｂＭとを含む（以下、「本発明の植物体Ｂ」又は「本発明のステビア植物体Ｂ」と称する場合がある）。
（３）乾燥葉の単位質量当たりＲｅｂＤとＲｅｂＭを合計で３．７％以上含む（以下、「本発明の植物体Ｃ」又は「本発明のステビア植物体Ｃ」と称する場合がある）。
（４）総ステビオール配糖体に対するＲｅｂＤとＲｅｂＭの質量比が合計で３７．８％以上（以下、「本発明の植物体Ｄ」又は「本発明のステビア植物体Ｄ」と称する場合がある）。
【００１９】
総ステビオール配糖体（Total Steviol Glycoside：ＴＳＧ）とは、測定可能なステビオール配糖体の総称であり、未知のステビオール配糖体や、検出限界未満の量で存在するステビオール配糖体を含まない。好ましくは、総ステビオール配糖体とは、ＲｅｂＡ、ＲｅｂＢ、ＲｅｂＤ、ＲｅｂＥ、ＲｅｂＦ、ＲｅｂＩ、ＲｅｂＪ、ＲｅｂＫ、ＲｅｂＭ、ＲｅｂＮ、ＲｅｂＯ、ＲｅｂＱ、ＲｅｂＲ、ズルコシドＡ、ルブソシド、ステビオール、ステビオールモノシド、ステビオールビオシド及びステビオシドからなる群より選択される２つ以上の任意の組み合わせである。例えば、ある実施形態では、総ステビオール配糖体は、ＲｅｂＡ、ＲｅｂＢ、ＲｅｂＭ、ＲｅｂＤ、ＲｅｂＦ、ＲｅｂＭ及びステビオールからなり、別の実施形態では総ステビオール配糖体は、ＲｅｂＡ、ＲｅｂＢ、ＲｅｂＭ、ＲｅｂＤ、ＲｅｂＦ、ＲｅｂＭ、ＲｅｂＮ、ＲｅｂＯ及びステビオールからなるものであってもよい。
【００２０】
本発明の植物体Ａにおいて、乾燥葉の単位質量当たり３．３％以上のＲｅｂＤを含むとは、例えば、所定の質量の乾燥葉（例えば、５０ｍｇ）に、３．３質量％以上の割合のＲｅｂＤ（例えば、１．６５ｍｇ以上）が含まれることを意味する。この態様における乾燥葉の単位質量当たりのＲｅｂＤの割合は、限定されずに、例えば、３．３％以上、３．４％以上、３．５％以上、３．６％以上、３．７％以上、３．８％以上、３．９％以上、４．０％以上、４．１％以上、４．２％以上、４．３％以上、４．４％以上、４．５％以上、４．６％以上、４．７％以上、４．８％以上、４．９％以上、５．０％以上、５．１％以上、５．２％以上、５．３％以上、５．４％以上、５．５％以上、５．６％以上、５．７％以上、５．８％以上、５．９％以上、６．０％以上等であってよく、３．６％以上が好ましい。乾燥葉の単位質量当たりのＲｅｂＤの割合の上限は特に限定されないが、例えば、２０％、１５％、１０％などであってよい。
ここで乾燥葉とは、本発明のステビア植物体の新鮮葉を乾燥させることにより含水量を３〜４重量％にまで減らしたものをいう。
【００２１】
本発明の植物体Ｂにおいて、乾燥葉の単位質量当たり２．６％以上のＲｅｂＤと０．４％以上のＲｅｂＭとを含むとは、例えば、所定の質量の乾燥葉（例えば、５０ｍｇ）に、２．６質量％以上の割合のＲｅｂＤ（例えば、乾燥葉５０ｍｇ当たり１．３ｍｇ以上）と、０．４質量％以上のＲｅｂＭ（例えば、乾燥葉５０ｍｇ当たり０．２ｍｇ以上）とが含まれることを意味する。この態様における乾燥葉の単位質量当たりのＲｅｂＤとＲｅｂＭの割合は、（ＲｅｂＤの割合：ＲｅｂＭの割合）とした場合、限定されずに、例えば、（２．６％以上：０．４％以上）、（２．８％以上：０．４％以上）、（３％以上：０．４％以上）、（３．２％以上：０．４％以上）、（３．４％以上：０．４％以上）、（３．６％以上：０．４％以上）、（３．８％以上：０．４％以上）、（４％以上：０．４％以上）、（４．２％以上：０．４％以上）、（４．４％以上：０．４％以上）、（４．６％以上：０．４％以上）、（４．８％以上：０．４％以上）、（５％以上：０．４％以上）、（２．６％以上：０．５％以上）、（２．８％以上：０．５％以上）、（３％以上：０．５％以上）、（３．２％以上：０．５％以上）、（３．４％以上：０．５％以上）、（３．６％以上：０．５％以上）、（３．８％以上：０．５％以上）、（４％以上：０．５％以上）、（４．２％以上：０．５％以上）、（４．４％以上：０．５％以上）、（４．６％以上：０．５％以上）、（４．８％以上：０．５％以上）、（５％以上：０．５％以上）、（２．６％以上：０．６％以上）、（２．８％以上：０．６％以上）、（３％以上：０．６％以上）、（３．２％以上：０．６％以上）、（３．４％以上：０．６％以上）、（３．６％以上：０．６％以上）、（３．８％以上：０．６％以上）、（４％以上：０．６％以上）、（４．２％以上：０．６％以上）、（４．４％以上：０．６％以上）、（４．６％以上：０．６％以上）、（４．８％以上：０．６％以上）、（５％以上：０．６％以上）、（２．６％以上：０．７％以上）、（２．８％以上：０．７％以上）、（３％以上：０．７％以上）、（３．２％以上：０．７％以上）、（３．４％以上：０．７％以上）、（３．６％以上：０．７％以上）、（３．８％以上：０．７％以上）、（４％以上：０．７％以上）、（４．２％以上：０．７％以上）、（４．４％以上：０．７％以上）、（４．６％以上：０．７％以上）、（４．８％以上：０．７％以上）、（５％以上：０．７％以上）、（２．６％以上：０．８％以上）、（２．８％以上：０．８％以上）、（３％以上：０．８％以上）、（３．２％以上：０．８％以上）、（３．４％以上：０．８％以上）、（３．６％以上：０．８％以上）、（３．８％以上：０．８％以上）、（４％以上：０．８％以上）、（４．２％以上：０．８％以上）、（４．４％以上：０．８％以上）、（４．６％以上：０．８％以上）、（４．８％以上：０．８％以上）、（５％以上：０．８％以上）等であってよく、（３．６％以上：０．４％以上）が好ましい。乾燥葉の単位質量当たりのＲｅｂＤの割合の上限は特に限定されないが、例えば、２０％、１５％、１０％等であってよく、ＲｅｂMの割合の上限も特に限定されないが、１０％、５％、３％等であ��てよい。
【００２２】
本発明の植物体Ｃにおいて、乾燥葉の単位質量当たりＲｅｂＤとＲｅｂＭを合計で３．７％以上含むとは、例えば、所定の質量の乾燥葉（例えば、５０ｍｇ）に含まれるＲｅｂＤとＲｅｂＭとの合計質量が、３．７質量％以上（例えば、１．８５ｍｇ以上）であることを意味する。この態様における乾燥葉の単位質量当たりのＲｅｂＤとＲｅｂＭの合計の割合は、限定されずに、例えば、３．７％以上、３．８％以上、３．９％以上、４．０％以上、４．１％以上、４．２％以上、４．３％以上、４．４％以上、４．５％以上、４．６％以上、４．７％以上、４．８％以上、４．９％以上、５．０％以上、５．１％以上、５．２％以上、５．３％以上、５．４％以上、５．５％以上、５．６％以上、５．７％以上、５．８％以上、５．９％以上、６．０％以上、６．１％以上、６．２％以上、６．３％以上、６．４％以上、６．５％以上、６．６％以上、６．７％以上、６．８％以上、６．９％以上、７．０％以上等であってよく、４．９％以上が好ましい。乾燥葉の単位質量当たりのＲｅｂＤとＲｅｂＭとの合計の割合の上限は特に限定されないが、例えば、２５％、２０％、１５％などであってよい。
【００２３】
本発明の植物体Ｄにおいて、総ステビオール配糖体に対するＲｅｂＤとＲｅｂＭの質量比が合計で３７．８％以上であるとは、例えば葉（例えば、乾燥葉又は新鮮葉）に含まれるＲｅｂＤとＲｅｂＭの合計質量を、葉から得られたステビオール配糖体の総質量に対する比率としてＲｅｂＤ＋ＲｅｂＭ／ＴＳＧ％で表した場合、ＲｅｂＤ＋ＲｅｂＭ／ＴＳＧの値が３７．８％以上であることを意味する。この態様におけるＲｅｂＤ＋ＲｅｂＭ／ＴＳＧの値は、限定されずに、例えば、３７．８％以上、３７．９％以上、３８．０％以上、３８．１％以上、３８．２％以上、３８．３％以上、３８．４％以上、３８．５％以上、３８．６％以上、３８．７％以上、３８．８％以上、３８．９％以上、３９．０％以上、３９．２％以上、３９．４％以上、３９．６％以上、３９．８％以上、４０．０％以上、４０．２％以上、４０．４％以上、４０．６％以上、４０．８％以上、４１．０％以上、４１．２％以上、４１．４％以上、４１．６％以上、４１．８％以上、４２．０％以上、４２．４％以上、４２．８％以上、４３．２％以上、４３．６％以上、４４．０％以上、４４．４％以上、４４．８％以上、４５．２％以上、４５．６％以上、４６．０％以上等であってよく、３８．１％以上が好ましい。総ステビオール配糖体に対するＲｅｂＤ＋ＲｅｂＭの質量比の上限は特に限定されないが、例えば、８５％、７５％、６５％、５５％などであってよい。
【００２４】
ＲｅｂＤ及びＲｅｂＭは、本発明の植物体の新鮮葉又は乾燥葉に適切な溶媒（水等の水性溶媒又はアルコール、エーテル及びアセトン等の有機溶媒）を反応させることにより抽出液の状態で抽出することができる。抽出条件等はOhta et al.,J. Appl. Glycosci., Vol. 57, No. 3 (2010)又はWO2010/038911に記載の方法や、後述の実施例に記載の方法を参照することができる。
さらに、このようにして得られた抽出液に対し、酢酸エチルその他の有機溶媒：水の勾配、高速液体クロマトグラフィー（High Performance Liquid Chromatography:HPLC）、ガスクロマトグラフィー、飛行時間型質量分析（Time-of-Flight mass spectrometry:TOF-MS）、超高性能液体クロマトグラフィー（Ultra (High) Performance Liquid chromatography:UPLC）等の公知の方法を用いることによりＲｅｂＤ及びＲｅｂＭを精製することができる。
【００２５】
ＲｅｂＤ及びＲｅｂＭの含量は、Ohta et al.,J. Appl. Glycosci., Vol. 57, No. 3 (2010)又はWO2010/038911に記載の方法や、後述の実施例に記載の方法で測定することができる。具体的には本発明のステビア植物体から新鮮葉をサンプリングし、ＬＣ／ＭＳ−ＭＳを行うことにより測定することができる。
【００２６】
本発明の植物体には植物体全体のみならず、植物器官（例えば葉、花弁、茎、根、種子など）、植物組織（例えば表皮、師部、柔組織、木部、維管束、柵状組織、海綿状組織など）あるいは種々の形態の植物細胞（例えば、懸濁培養細胞）、プロトプラスト、葉の切片、カルスなどが含まれ得る。また、葉は先に述べた乾燥葉であってもよい。
【００２７】
また、本発明の植物体には、組織培養物又は植物培養細胞も含まれ得る。このような組織培養物又は植物培養細胞を培養することにより、植物体を再生することができるからである。本発明の植物体の組織培養物又は植物培養細胞の例としては、胚、分裂組織細胞、花粉、葉、根、根端、花弁、プロトプラスト、葉の切片及びカルス等が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００２８】
２．本発明の植物体の作出方法
本発明は、別の実施態様において、本発明のステビア植物体と第２のステビア植物体とを交雑させる工程を含む、野生型よりブロウソネチン含量が高い、高ブロウソネチン含有ステビア植物体を作出する方法（以下、「本発明の作出方法」と称する場合がある）を提供する。
当該方法により作出される植物体は、本発明の植物体と同じ表現型を有する。
【００２９】
本発明の作出方法において、「交雑させる」とは、本発明の植物体（第一代（Ｓ１））と、第２の植物体（Ｓ１）とを交配させることにより、その子植物体（本発明の作出方法により作出される植物体（第二代（Ｓ２）））を得ることを意味する。交雑方法としては、戻し交雑が好ましい。「戻し交雑」とは、本発明の植物体と第２の植物体との間に生まれた子植物体（Ｓ２）を、さらに本発明の植物体（つまり、本発明の遺伝的特徴を有する植物体）（Ｓ１）と交雑させて、本発明の遺伝子的特徴を有する植物体を作出する手法である。本発明の作出方法に用いられる第２の植物体（Ｓ１）が、本発明の植物体と同じ表現型と遺伝的性質を有する場合には、実質的に戻し交雑となる。本発明の遺伝子多型はメンデルの法則に従って遺伝し、これに伴って当該遺伝子多型と相関する表現型、つまり高ブロウソネチン含有という表現型も、メンデルの法則に従って遺伝する。
【００３０】
あるいは、本発明の植物体は自殖により作出することもできる。自殖は、本発明の植物体のおしべの花粉を本発明の植物体のめしべに自家受粉させることにより行うことができる。
【００３１】
本発明の作出方法により作出される植物体は、表現型が本発明の植物体と同じであるため、本発明の作出方法により作出される植物体をさらに第３のステビア植物体とを交雑させることにより、野生型よりブロウソネチン含量が高い高ブロウソネチン含有ステビア植物体を作出することも可能である。また、本発明の作出方法により作出される植物体は、本発明の植物体と同じ遺伝的特徴を有してもよい。
【００３２】
別の態様として、本発明の植物体は、先に述べた組織培養物又は植物培養細胞を培養することにより植物体を再生することで作出することも可能である。培養条件については、野生型ステビア植物の組織培養物又は植物培養細胞を培養する条件と同じであり、公知である（Protocols for In Vitro cultures and secondary metabolite analysis of aromatic and medicinal plants, Method in molecular biology, vo. 1391, pp113-123.）。
【００３３】
あるいは、本発明の植物体は、野生型のステビア植物体のゲノムを非遺伝子組換え的手法により変異させることによって作出することもできる。「非遺伝子組換え的手法」の例としては、外来遺伝子の導入を行わずに宿主細胞（又は宿主植物体）の遺伝子に変異を誘発する方法が挙げられる。そのような方法としては植物細胞の変異誘発剤を作用させる方法が挙げられる。そのような変異誘発剤としては、エチルメタンスルホン酸（ＥＭＳ）及びアジ化ナトリウム等が挙げられる。例えば、エチルメタンスルホン酸（ＥＭＳ）は、０．１％、０．２％、０．３％、０．４％、０．５％、０．６％、０．７％、０．８％、０．９％、１．０％などの濃度で植物細胞を処理することができる。処理時間は１〜４８時間、２〜３６時間、３〜３０時間、４〜２８時間、５〜２６時間、６〜２４時間である。処理の手順自体は公知であるが、吸水過程を経た吸水種子を上記濃度で変異誘発剤を含む処理液に、上記処理時間浸漬することで行うことができる。
【００３４】
あるいは、非遺伝子組換え的手法の例としてＸ線、γ線、紫外線などの放射線や光線を植物細胞に照射する方法もできる。この場合、適当な紫外線の照射量（紫外線ランプ強さ、距離、時間）を用いて照射した細胞を、選択培地などで培養させた後、目的の形質を有する細胞、カルス、植物体を選択できる。その際の照射強度は０．０１〜１００Ｇｒ、０．０３〜７５Ｇｒ、０．０５〜５０Ｇｒ、０．０７〜２５Ｇｒ、０．０９〜２０Ｇｒ、０．１〜１５Ｇｒ、０．１〜１０Ｇｒ、０．５〜１０Ｇｒ、１〜１０Ｇｒであり、照射距離は１ｃｍ〜２００ｍ、５ｃｍ〜１００ｍ、７ｃｍ〜７５ｍ、９ｃｍ〜５０ｍ、１０ｃｍ〜３０ｍ、１０ｃｍ〜２０ｍ、１０ｃｍ〜１０ｍであり、照射時間は１分〜２年、２分〜１年、３分〜０．５年、４分〜１か月、５分〜２週間、１０分〜１週間である。照射の強度、距離及び時間は、放射線の線種や照射対象となる状態（細胞、カルス、植物体）により異なるが、当業者であれば適宜調整することができる。
【００３５】
また、細胞融合、葯培養（半数体育成）、遠縁交雑（半数体育成）などの手法も公知である。
一般に、植物細胞は、培養の間に変異を伴うことがあるため、より安定した形質維持のために植物個体に戻すことが好ましい。
本発明の植物体を宿主として事後的に遺伝子組み換え（例えばゲノム編集等により）を行って得られた植物体（例えば、本発明の植物体を宿主として遺伝子組み換えを行って、さらに別の形質を付加した植物体）も、本発明の範囲から除外されるものではない。
【００３６】
３．高ブロウソネチン含有ステビア植物体、又は、高ＲｅｂＤ含有及び／又は高ＲｅｂＭ含有ステビア植物体のスクリーニング方法
ステビア植物体のブロウソネチン含量はＲｅｂＤ及びＲｅｂＭ含量と相関性を有することから、高ブロウソネチン含有ステビア植物体を、ＲｅｂＤ又はＲｅｂＭ含量に基づいてスクリーニングすることや、高ＲｅｂＤ含有及び／又は高ＲｅｂＭ含有ステビア植物体を、ブロウソネチン含量に基づいてスクリーニングすることができる。ここで、「スクリーニング」とは、本発明の植物体とそれ以外の植物体とを識別し、本発明の植物体を選択することを意味する。
したがって、本発明の別の側面は、
（Ａ）被験ステビア植物体におけるブロウソネチンの含量を決定する工程を含む、高ＲｅｂＤ含有ステビア植物体及び／又は高ＲｅｂＭ含有ステビア植物体をスクリーニングする方法（以下、本発明のスクリーニング方法Ａと称する場合がある）、及び
（Ｂ）被験ステビア植物体におけるＲｅｂＤ及び／又はＲｅｂＭの含量を決定する工程を含む、高ブロウソネチン含有ステビア植物体をスクリーニングする方法（以下、本発明のスクリーニング方法Ｂと称する場合がある）
に関する。
【００３７】
本発明のスクリーニング方法Ａにおいては、ブロウソネチン含量が基準値以上の場合に、被験ステビア植物体が高ＲｅｂＤ含有型及び／又は高ＲｅｂＭ含有型であると判定し、基準値未満の場合に被験ステビア植物体が低ＲｅｂＤ含有型及び／又は低ＲｅｂＭ含有型であると判定することができる。
基準値は、高ＲｅｂＤ含有型及び／又は高ＲｅｂＭ含有型ステビア植物体と、低ＲｅｂＤ含有型及び／又は低ＲｅｂＭ含有型ステビア植物体を識別できるものであれば特に限定されないが、例えば、上記測定方法Ａで測定した場合のピーク強度として、ブロウソネチンＦについては５０００００、７０００００、１００００００、１５０００００など、ブロウソネチンＨについては９００００、１２００００、１３００００、４０００００など、ブロウソネチンＴについては４０００００、５０００００、１００００００、１５０００００などであってよい。
【００３８】
また、基準値は、例えば、上記測定方法Ａで測定した場合のピーク強度比として、ブロウソネチンＦについては０．１５％、０．３％、０．５％、０．７％など、ブロウソネチンＨについては０．０２％、０．０２５％、０．０３％、０．０４％など、ブロウソネチンＴについては０．１％、０．２％、０．３％、０．４％などであってよい。
ブロウソネチンの測定値として、複数回、例えば、２回、３回、４回、５回又はそれ以上の測定値の平均値を用いることが好ましい。
【００３９】
本発明のスクリーニング方法Ｂにおいては、ＲｅｂＤ及び／又はＲｅｂＭ含量が基準値以上の場合に、被験ステビア植物体が高ブロウソネチン含有型であると判定し、基準値未満の場合に被験ステビア植物体が低ブロウソネチン含有型であると判定することができる。
基準値は、高ブロウソネチン含有型ステビア植物体と、低ブロウソネチン含有型ステビア植物体を識別できるものであれば特に限定されないが、例えば、乾燥葉中の含量として、ＲｅｂＤについては１質量％、２質量％、３質量％、３．３質量％、３．６質量％など、ＲｅｂＭについては０．４質量％、０．６質量％、０．７質量％、０．８質量％などであってよい。
【００４０】
本発明のスクリーニング方法Ａは、基準値以上のブロウソネチンが検出された被験ステビア植物の組織（例えば葉）のＲｅｂＤ及び／又はＲｅｂＭの含有量を測定する工程をさらに含んでもよい。ＲｅｂＤ及びＲｅｂＭの含有量の測定は、本発明の植物体の項に記載したとおりである。また、この態様において、基準値以上のブロウソネチンが検出された被験ステビア植物体のうち、ＲｅｂＤ及び／又はＲｅｂＭの含有量が高い個体を選択して、これを他のステビア植物体と交配し、得られた子植物体について、本発明のスクリーニング方法を適用してもよい。したがって、本発明のスクリーニング方法は、以下の１以上の工程を含み得る。
（ｉ）被験ステビア植物におけるブロウソネチン含量を測定する工程、
（ｉｉ）基準値以上のブロウソネチンが検出された被験ステビア植物組織のＲｅｂＤ及び／又はＲｅｂＭの含有量を測定する工程、
（ｉｉｉ）基準値以上のブロウソネチンが検出された被験ステビア植物体のうち、ＲｅｂＤ及び／又はＲｅｂＭの含有量が高い個体を選択する工程、
（ｉｖ）選択したＲｅｂＤ及び／又はＲｅｂＭの含有量が高い個体を他のステビア植物体と交配する工程、
（ｖ）交配により得られた子植物体におけるブロウソネチン含量を測定する工程、
（ｖｉ）基準値以上のブロウソネチンが検出された子植物組織のＲｅｂＤ及び／又はＲｅｂＭの含有量を測定する工程、
（ｖｉｉ）基準値以上のブロウソネチンが検出された子植物体のうち、ＲｅｂＤ及び／又はＲｅｂＭの含有量が高い個体を選択する工程。
【００４１】
選択するＲｅｂＤ及び／又はＲｅｂＭの含有量が高い個体は、例えば、基準値以上のブロウソネチンが検出された被験ステビア植物体のうち、ＲｅｂＤ及び／又はＲｅｂＭの含有量の高さに関し上位５０％まで、上位４０％まで、上位３０％まで、上位２０％まで、上位１０％まで、上位５％まで、上位４％まで、上位３％まで、上位２％まで又は上位１％までの個体などであってよい。また、交配する他のステビア植物体は、基準値以上のブロウソネチンを含んでいても含んでいなくてもよい。上記態様において、工程（ｉｖ）〜（ｖｉｉ）は、複数回繰り返すことができる。このようにして、ＲｅｂＤ及び／又はＲｅｂＭの含有量がより高いステビア植物体をスクリーニングすることができる。
【００４２】
本発明のスクリーニング方法Ｂは、基準値以上のＲｅｂＤ及び／又はＲｅｂＭが検出された被験ステビア植物の組織（例えば葉）のブロウソネチン含有量を測定する工程をさらに含んでもよい。ブロウソネチンの含有量の測定は、本発明の植物体の項に記載したとおりである。また、この態様において、基準値以上のＲｅｂＤ及び／又はＲｅｂＭが検出された被験ステビア植物体のうち、ブロウソネチンの含有量が高い個体を選択して、これを他のステビア植物体と交配し、得られた子植物体について、本発明のスクリーニング方法を適用してもよい。したがって、本発明のスクリーニング方法は、以下の１以上の工程を含み得る。
（ｉ）被験ステビア植物におけるＲｅｂＤ及び／又はＲｅｂＭ含量を測定する工程、
（ｉｉ）基準値以上のＲｅｂＤ及び／又はＲｅｂＭが検出された被験ステビア植物組織のブロウソネチンの含有量を測定する工程、
（ｉｉｉ）基準値以上のＲｅｂＤ及び／又はＲｅｂＭが検出された被験ステビア植物体のうち、ブロウソネチンの含有量が高い個体を選択する工程、
（ｉｖ）選択したブロウソネチンの含有量が高い個体を他のステビア植物体と交配する工程、
（ｖ）交配により得られた子植物体におけるＲｅｂＤ及び／又はＲｅｂＭ含量を測定する工程、
（ｖｉ）基準値以上のＲｅｂＤ及び／又はＲｅｂＭが検出された子植物組織のブロウソネチンの含有量を測定する工程、
（ｖｉｉ）基準値以上のＲｅｂＤ及び／又はＲｅｂＭが検出された子植物体のうち、ブロウソネチンの含有量が高い個体を選択する工程。
【００４３】
選択するブロウソネチンの含有量が高い個体は、例えば、基準値以上のＲｅｂＤ及び／又はＲｅｂＭが検出された被験ステビア植物体のうち、ブロウソネチンの含有量の高さに関し上位５０％まで、上位４０％まで、上位３０％まで、上位２０％まで、上位１０％まで、上位５％まで、上位４％まで、上位３％まで、上位２％まで又は上位１％までの個体などであってよい。また、交配する他のステビア植物体は、基準値以上のＲｅｂＤ及び／又はＲｅｂＭを含んでいても含んでいなくてもよい。上記態様において、工程（ｉｖ）〜（ｖｉｉ）は、複数回繰り返すことができる。このようにして、ブロウソネチンの含有量がより高いステビア植物体をスクリーニングすることができる。
【００４４】
本発明のスクリーニング方法において、被験ステビア植物体は、天然植物体であっても、非遺伝子組換植物体であってもよい。非遺伝子組換植物体については、本発明の植物体の項に記載したとおりである。
本発明のスクリーニング方法において、被験ステビア植物体は、突然変異誘発処理を行ったステビア植物及びその子孫植物を含んでもよい。突然変異誘発処理については、本発明の植物体の項に記載したとおりであり、変異誘発剤による処理や、放射線又は光線の照射による処理等を含む。
【００４５】
４．植物体由来抽出物の製造方法及び当該抽出物を用いた製品
本発明のさらなる態様において、本発明の植物体、又は当該植物体の種子若しくは葉（例えば、乾燥葉又は新鮮葉）から抽出物を得る工程を含む、ブロウソネチン含有抽出物の製造方法（以下、「本発明の抽出物の製造方法」と称する場合がある）が提供される。さらに、本発明の抽出物の製造方法により得られた抽出物からブロウソネチンを精製する工程を含む、ブロウソネチンの製造方法（以下、「本発明のブロウソネチンの製造方法」と称する場合がある）が提供される。
具体的には、本発明の高ブロウソネチン含有型ステビア植物体、本発明のスクリーニング方法により選別された高ブロウソネチン含有型ステビア植物体又は本発明の方法により製造された高ブロウソネチン含有型ステビア植物体からブロウソネチンを含む抽出物を得る工程を含む、ブロウソネチンの製造方法が提供される。
ブロウソネチンを含む抽出物は、本発明の植物体の新鮮葉又は乾燥葉に適切な溶媒（水等の水性溶媒又はアルコール、エーテル及びアセトン等の有機溶媒）を反応させることにより得ることができる。抽出条件等は非特許文献１〜３に記載の方法や、後述の実施例に記載の方法を参照することができる。
また、ブロウソネチンを含む抽出物を酢酸エチルその他の有機溶媒：水の勾配、高速液体クロマトグラフィー（High Performance Liquid Chromatography:HPLC）、ガスクロマトグラフィー、飛行時間型質量分析（Time-of-Flight mass spectrometry:TOF-MS）、超高性能液体クロマトグラフィー（Ultra (High) Performance Liquid chromatography:UPLC）等の公知の方法を用いることによりブロウソネチンを精製することができる。
【００４６】
本発明の抽出物の製造方法により得られた抽出物（以下、「本発明の抽出物」という）は、野生型ステビア種と比べブロウソネチンをより高い含量で含む。
本発明の抽出物は、野生型ステビア種から得られた抽出物と比べブロウソネチンを１５０％以上、２００％以上、３００％以上、４００％以上、５００％以上、６００％以上、７００％以上、８００％以上、９００％以上、１１００％以上、１２００％以上、１３００％以上、１４００％以上、１５００％以上、１６００％以上、１７００％以上、１８００％以上、１９００％以上、２０００％以上、２１００％以上、２２００％以上、２３００％以上、２４００％以上、２５００％以上、２６００％以上、２７００％以上、２８００％以上、２９００％以上、３０００％以上、３１００％以上、３２００％以上、３３００％以上、３４００％以上、３５００％以上、３６００％以上、３７００％以上、３８００％以上、３９００％以上、４０００％以上、４１００％以上、４２００％以上、４３００％以上、４４００％以上、４５００％以上、４６００％以上、４７００％以上、４８００％以上、４９００％以上、５０００％以上高い含量で含んでいてもよい。ここで、本発明の抽出物と、野生型ステビア種から得られた抽出物は、同じ方法で得られたものであってよい。
【００４７】
また、本発明の抽出物はステビオール配糖体をさらに含んでいてもよい。ステビオール配糖体はステビオール骨格に糖が付加した化合物であり、その非限定例としては、例えば、ＲｅｂＡ、ＲｅｂＢ、ＲｅｂＤ、ＲｅｂＥ、ＲｅｂＦ、ＲｅｂＩ、ＲｅｂＪ、ＲｅｂＫ、ＲｅｂＭ、ＲｅｂＮ、ＲｅｂＯ、ＲｅｂＱ、ＲｅｂＲ、ズルコシドＡ、ルブソシド、ステビオール、ステビオールモノシド、ステビオールビオシド、ステビオシドなどが挙げられる。本発明の抽出物に含まれる好ましいステビオール配糖体としては、例えば、ＲｅｂＤ及びＲｅｂＭが挙げられる。
【００４８】
このようにして得られた本発明の抽出物及び／又は本発明のブロウソネチンの製造方法により得られるブロウソネチンと他の成分とを混合することにより、ブロウソネチンの含量を高めた新規な医薬品、香料、飲食品等を製造することができる。そこで、本発明は、別の実施態様として、本発明の抽出物及び／又は本発明のブロウソネチンの製造方法により得られるブロウソネチンと他の成分とを混合する工程を含む、医薬品、香料又は飲食品の製造方法を提供する。さらに、本発明は、前記製造方法により得られた、ブロウソネチンの含量を高めた新規な医薬品、香料又は飲食品を提供する。ここで飲食品とは、飲料及び食品を意味する。したがって、ある実施態様では、本発明は新規な医薬品、香料、飲料又は食品を提供し、また、当該医薬品、香料、飲料又は食品の製造方法を提供する。一態様において、ブロウソネチンを含む本発明の医薬品、香料、飲料又は食品はグリコシダーゼ阻害活性を有し、腫瘍、糖尿病、ウイルス疾患などの処置に有用である。
【実施例】
【００４９】
以下に本発明に関する実験例、実施例等を記載するが、本発明はこれらの具体的な態様に限定されるものではない。【００５０】
［実施例１］ブロウソネチン含量の測定
種々の系統のステビア植物体の乾燥葉に含まれるブロウソネチン含量を測定した。具体的には、各個体より適量の新鮮葉をサンプリングし、０．２５ｇの新鮮葉をフリーズドライにより乾燥し、破砕物乾物０．０５ｇを終濃度７５％のメタノール中に投入した。ビーズ式ホモジナイザーでホモジナイズし、１５，０００ｒｐｍで１０分間遠心後、上清を回収した。上清をコンディショニング済みのMonoSpin(R)C18カラム（GL Sciences）に適用し、５０００ｇで２分間遠心後、溶出液を回収し、０．２μｍフィルターでろ過した。これをＬＣ−ＭＳ分析用試料とした。ＬＣ−ＭＳ分析には、Ultimate 3000 RSLC(Thermo Fisher Scientific）を接続したQ Exactive(Thermo Fisher Scientific）を用いた。分析条件及び分析結果を以下に示す。なお、分析結果は、５回の反復実験で得たマスクロマトグラムにおけるピーク強度の平均値及び総ピーク強度に対する各ブロウソネチンのピーク強度比（％）を示す。また、使用したステビア植物体は、いずれもエチルメタンスルホン酸（ＥＭＳ）での変異誘発処理により遺伝子が改変された個体の子孫である。【００５１】
【表４】
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【表５】
2020138366.tif 000006
【表６】
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【００５２】
【表７】
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【００５３】
【表８】
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上記結果が示すとおり、ステビア植物体に各種ブロウソネチンが含まれることが明らかとなった。【００５４】
［実施例２］ステビオール配糖体含量の測定
実施例1と同じ個体より適量の新鮮葉をサンプリングし、０．２５ｇの新鮮葉をフリーズドライにより乾燥し、破砕物乾物０．０５ｇを純水中に投入した。超音波処理２０分にて抽出し、遠心・濾過した後に０．３３ｍＬの抽出液を得た。この抽出液をLCMS-8050（島津）にてＬＣ／ＭＳ／ＭＳ分析を行い、ＲｅｂＡ、ＲｅｂＢ、ＲｅｂＣ、ＲｅｂＤ、ＲｅｂＦ、ＲｅｂＭ、ＲｅｂＮ及びＲｅｂＯの濃度を定量し、その合計を総ステビオール配糖体（ＴＳＧ）濃度とした。結果を下表に示す。なお、各数値は乾燥葉中の質量％又はＴＳＧに対する比率（％）を示す。【００５５】
【表９】
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【００５６】
［実施例３］ブロウソネチン含量とステビオール配糖体含量との相関性の検討
実施例１〜２で得られた結果を基に、ブロウソネチン含量とステビオール配糖体含量との間に相関性があるか検討した。各ブロウソネチンの含量と、各ステビオール配糖体又はＴＳＧの含量との間の相関係数を下表に示す。
【表１０】
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【表１１】
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上記結果が示すとおり、ブロウソネチン含量とＲｅｂＤ含量及びＲｅｂＭ含量との間に正の相関性が存在することが明らかとなった。
【産業上の利用可能性】
【００５７】
本発明によってブロウソネチンの供給源が多様化され、ブロウソネチンを含む機能性の高い医薬品、香料又は飲食品などの提供が容易となる。
【国際調査報告】
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