(57)【要約】【課題】  本発明は、核酸を細胞内に送達させて所望の機能をより効率的に発揮させるための、特に抗原提示細胞内に核酸を送達させてトランスフェクションされた細胞の抗原提示強度をより高めるための、新たな細胞内送達手段を提供することを目的とする。【解決手段】  ペプチド鎖中にK-A-L-Aの繰り返し単位を少なくとも3個含む（ただし該繰り返し単位のうちのいずれか1個又は2個以上においてKがRとなっていてもよく、及び／又は該繰り返し単位のうちのいずれか1個若しくは2個以上においてKとLに挟まれるAがHとなっていてもよい）アミノ酸残基数が12〜50個のポリペプチドの1種以上により脂質膜が修飾された、細胞内に核酸を送達するための脂質膜構造体であって、核酸をその表面に保持した、前記脂質膜構造体が提供される。【選択図】図１
2019103151.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ペプチド鎖中にK-A-L-Aの繰り返し単位を少なくとも3個含む（ただし該繰り返し単位のうちのいずれか1個若しくは2個以上においてKがRとなっていてもよく、及び／又は該繰り返し単位のうちのいずれか1個若しくは2個以上においてKとLに挟まれるAがHとなっていてもよい）アミノ酸残基数が12〜50個のポリペプチドの1種以上により脂質膜が修飾された、細胞内に核酸を送達するための脂質膜構造体であって、核酸をその表面に保持した、前記脂質膜構造体。
【請求項２】
ポリペプチドが、ペプチド鎖中にK-A-L-Aの繰り返し単位を3又は4個含む（ただし該繰り返し単位のうちのいずれか1個若しくは2個以上においてKがRとなっていてもよく、及び／又は該繰り返し単位のうちのいずれか1個においてKとLに挟まれるAがHとなっていてもよい）アミノ酸残基数が12〜30個のポリペプチドである、請求項１に記載の脂質膜構造体。
【請求項３】
ポリペプチドが下記ａ）〜ｇ）に示されるアミノ酸配列のいずれかからなるポリペプチドである、請求項１又は２に記載の脂質膜構造体。
ａ）WEAKLAKALAKALAKHLAKALAKALKA（配列番号１）
ｂ）WEAKLAKALAKALAKHLAKALAKALKACEA（配列番号２）
ｃ）WEAKLAKALAKALAKHLAKALA（配列番号３）
ｄ）WEAKLAKALAKALAKHLA（配列番号４）
ｅ）KALAKALAKALAKALA（配列番号５）
ｆ）KALAKALAKALA（配列番号６）
ｇ）WEARLARALARALARHLARALARALRA（配列番号７）
【請求項４】
脂質膜構造体がリポソームである、請求項１〜３のいずれか一項に記載の脂質膜構造体。
【請求項５】
ポリペプチドが疎水性基で修飾されており、前記疎水性基が脂質膜に挿入されてなる、請求項１〜４のいずれか一項に記載の脂質膜構造体。
【請求項６】
核酸が核酸アジュバント及び／又は抗原性ポリペプチドをコードするmRNAである、請求項１〜５のいずれか一項に記載の脂質膜構造体。
【請求項７】
脂質アジュバントをさらに含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載の脂質膜構造体。
【請求項８】
免疫細胞の細胞質に核酸を送達するための、請求項１〜７のいずれか一項に記載の脂質膜構造体。
【請求項９】
免疫細胞と請求項１〜８のいずれか一項に記載の脂質膜構造体とをインキュベーションする工程を含む、免疫療法に用いるためのトランスフェクションされた免疫細胞をインビトロで製造する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、核酸を細胞内に導入するための脂質膜構造体に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、免疫応答を誘導又は増強することで疾患を治療する免疫療法が、がんの治療を中心に注目されている。免疫療法の主な態様において、抗原性物質を生体に投与したり又は分離された免疫細胞に導入したりすることによる、抗原性物質に対する特異的免疫応答を誘導することが求められる。抗原性物質がポリペプチドである場合、ポリペプチドそのものに代えて、ポリペプチドをコードするDNAを利用して所望の免疫応答を誘導することも可能である。このようなDNAは、一般にDNAワクチンと呼ばれる。【０００３】
DNAワクチンを用いた免疫療法では、DNAからのポリペプチドの発現効率を高めることが重要である。DNAからmRNAへの転写は細胞核内で行われることから、DNAを細胞核内に効率よく送達するための脂質膜構造体、特にDNAを封入したリポソームの利用が提唱されている。例えば、特許文献１には、免疫細胞、特に樹状細胞の核内にDNAを送達するための、脂質膜がKALAペプチドと称される特定のペプチドで修飾された、DNAを封入したリポソームが開示されている。【０００４】
KALAペプチドは、K-A-L-A（Kはリジン、Aはアラニン、Lはロイシン）というアミノ酸配列の繰り返し単位を含む短鎖のポリペプチドである。なお本願では、配列表を除き、アミノ酸配列は一文字表記で表す。KALAペプチドは、DNAとコンプレックスを形成することが知られているペプチドである（非特許文献１）が、特許文献１においては、リポソームの核内移行能を促進するための機能性ペプチドとして利用されている。また、特許文献２には、KALAペプチドの核内移行促進機能を維持した改変ペプチドで修飾された、DNAを封入したリポソームが開示されている。【０００５】
特許文献１及び特許文献２に開示されているリポソームはいずれも、DNAとポリカチオン性物質との複合体を脂質膜で封入したリポソームの形態を例示している。リポソームを用いたトランスフェクションでは、エンドサイトーシスによる細胞内へのリポソームの取り込み、エンドソームから細胞質へのリポソームの脱出、細胞核内へのリポソームの移行と細胞核内での前記複合体の放出、核酸の転写、タンパク質の翻訳、さらに細胞表面への抗原提示等、送達された核酸の機能の発揮までに多数のプロセスが要求される。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】国際公開WO2011/132713
【特許文献２】国際公開WO2015/098907
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Wyman, T. B. et al., Biochemistry, 1997, 36, 3008-17
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明者らは、抗原性ポリペプチドをコードするmRNAを抗原提示細胞内に送達し、DNAからmRNAの転写を省略することで免疫応答誘導能を高めることを目的として、mRNAを封入した特許文献１に記載の脂質膜構造体を調製し、これを抗原提示細胞にトランスフェクションした。しかしながら、トランスフェクションされた細胞の抗原提示強度は、比較対象としてDNAを封入した特許文献１に記載の脂質膜構造体によってトランスフェクションされた細胞のそれと殆ど変わらないことが、新たに確認された。【０００９】
本発明は、核酸を細胞内に送達させて所望の機能をより効率的に発揮させるための、特に抗原提示細胞内に核酸を送達させてトランスフェクションされた細胞の抗原提示強度をより高めるための、新たな細胞内送達手段を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、脂質膜の表面にmRNAを保持した脂質膜構造体を抗原提示細胞にトランスフェクションすることで、DNAを封入した脂質膜構造体を導入したときと比較してトランスフェクション細胞の抗原提示強度を高めることができることを見出し、以下の発明を完成させた。【００１１】
（１）ペプチド鎖中にK-A-L-Aの繰り返し単位を少なくとも3個含む（ただし該繰り返し単位のうちのいずれか1個若しくは2個以上においてKがRとなっていてもよく、及び／又は該繰り返し単位のうちのいずれか1個若しくは2個以上においてKとLに挟まれるAがHとなっていてもよい）アミノ酸残基数が12〜50個のポリペプチドの1種以上により脂質膜が修飾された、細胞内に核酸を送達するための脂質膜構造体であって、核酸をその表面に保持した、前記脂質膜構造体。
（２）ポリペプチドが、ペプチド鎖中にK-A-L-Aの繰り返し単位を3又は4個含む（ただし該繰り返し単位のうちのいずれか1個若しくは2個以上においてKがRとなっていてもよく、及び／又は該繰り返し単位のうちのいずれか1個においてKとLに挟まれるAがHとなっていてもよい）アミノ酸残基数が12〜30個のポリペプチドである、（１）に記載の脂質膜構造体。
（３）ポリペプチドが下記ａ）〜ｇ）に示されるアミノ酸配列のいずれかからなるポリペプチドである、（１）又は（２）に記載の脂質膜構造体。
ａ）WEAKLAKALAKALAKHLAKALAKALKA（配列番号１）
ｂ）WEAKLAKALAKALAKHLAKALAKALKACEA（配列番号２）
ｃ）WEAKLAKALAKALAKHLAKALA（配列番号３）
ｄ）WEAKLAKALAKALAKHLA（配列番号４）
ｅ）KALAKALAKALAKALA（配列番号５）
ｆ）KALAKALAKALA（配列番号６）
ｇ）WEARLARALARALARHLARALARALRA（配列番号７）
（４）脂質膜構造体がリポソームである、（１）〜（３）のいずれか一項に記載の脂質膜構造体。
（５）ポリペプチドが疎水性基で修飾されており、前記疎水性基が脂質膜に挿入されてなる、（１）〜（４）のいずれか一項に記載の脂質膜構造体。
（６）核酸が核酸アジュバント及び／又は抗原性ポリペプチドをコードするmRNAである、（１）〜（５）のいずれか一項に記載の脂質膜構造体。
（７）脂質アジュバントをさらに含む、（１）〜（６）のいずれか一項に記載の脂質膜構造体。
（８）免疫細胞の細胞質に核酸を送達するための、（１）〜（７）のいずれか一項に記載の脂質膜構造体。
（９）免疫細胞と（１）〜（８）のいずれか一項に記載の脂質膜構造体とをインキュベーションする工程を含む、免疫療法に用いるためのトランスフェクションされた免疫細胞をインビトロで製造する方法。
【発明の効果】
【００１２】
本発明によると、KALAペプチド又はそのバリアントにより修飾された脂質膜構造体を用いて細胞内に核酸を送達することで、核酸に求められる機能を効率的に発揮させることができる。例えば、抗原性ポリペプチドをコードするmRNAを抗原提示細胞内に送達することで、当該抗原提示細胞における抗原提示強度を高めることができ、所望の抗原性ポリペプチドを標的とした免疫療法において利用可能な免疫細胞を製造することができるようになる。また、核酸をその表面に保持したKALAペプチド又はそのバリアントにより修飾された脂質膜構造体は、脂質膜の内側に核酸を封入した脂質膜構造体と比較して、所望の機能の発揮に必要とされる核酸の使用量を減らすことができ、製造コストの低減及び望ましくない副作用等の回避等において有利である。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】ルシフェラーゼをコードするプラスミドDNA（pDNA）又はmRNAをその表面に保持したKALAペプチド修飾リポソームでトランスフェクションされた樹状細胞におけるルシフェラーゼ活性を示すグラフである。
【図２】OVAをコードするpDNA又はmRNAをその表面に保持したKALAペプチド修飾リポソームでトランスフェクションされた樹状細胞における抗原提示量を示すグラフである。
【図３】OVAをコードするmRNAをその表面に保持したKALAペプチド修飾リポソームでトランスフェクションされた樹状細胞による抗原特異的CD8+T細胞誘導を示すグラフである。
【図４】OVAをコードするmRNAをその表面に保持したKALAペプチド修飾リポソームでトランスフェクションされた樹状細胞によるCTL活性誘導を示すグラフである。
【図５】OVAをコードするmRNAをその表面に保持したKALAペプチド修飾リポソームの膜融合性を示すグラフである。
【図６】OVAをコードするmRNAをその表面に保持したKALAペプチド修飾リポソームのmRNA放出を示すグラフである。
【図７】がん抗原NY-ESO-1をコードするmRNAをその表面に保持したKALAペプチド修飾リポソームでトランスフェクションされた樹状細胞による、腫瘍細胞CT26/NY-ESO-1が皮下移植されたマウスにおける腫瘍増殖の抑制を示すグラフである。
【図８】ルシフェラーゼをコードするmRNAをその表面に保持し、脂質アジュバントであるモノホスホリルリピドＡ（MPLA）を脂質膜に含むKALAペプチド修飾リポソームでトランスフェクションされた樹状細胞における、ルシフェラーゼ活性及びインターロイキン-6の産生量を示すグラフである。
【図９】異なる量のOVA mRNAをその表面に保持したKALAペプチド修飾リポソームを皮下投与又は静脈投与したときの、CTL活性誘導を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本発明の第１の態様は、ペプチド鎖中にK-A-L-Aの繰り返し単位を少なくとも3個含む（ただし該繰り返し単位のうちのいずれか1個若しくは2個以上においてKがRとなっていてもよく、及び／又は該繰り返し単位のうちのいずれか1個若しくは2個以上においてKとLに挟まれるAがHとなっていてもよい）アミノ酸残基数が12〜50個のポリペプチドの1種以上により脂質膜が修飾された、細胞内に核酸を送達するための脂質膜構造体であって、核酸をその表面に保持した、前記脂質膜構造体に関する。
【００１５】
本発明において使用されるポリペプチドは、ペプチド鎖中にK-A-L-Aの繰り返し単位を少なくとも3個含む（ただし該繰り返し単位のうちのいずれか1個若しくは2個以上においてKがRとなっていてもよく、及び／又は該繰り返し単位のうちのいずれか1個若しくは2個以上においてKとLに挟まれるAがHとなっていてもよい）アミノ酸残基数が12〜50個のポリペプチドである。
【００１６】
本発明において使用されるポリペプチドは、ペプチド鎖中にK-A-L-Aの繰り返し単位を少なくとも3個、例えば3〜10個、好ましくは3〜7個、より好ましくは3又は4個含む。また、該繰り返し単位のうちのいずれか1個若しくは2個以上においてKがRとなっていてもよく、及び／又は該繰り返し単位のうちのいずれか1個若しくは2個以上、好ましくは1〜3個、より好ましくは1個においてKとLに挟まれるAがHとなっていてもよい。また、ポリペプチドのアミノ酸残基数は12〜50個、好ましくは12〜40個、より好ましくは12〜30個である。
【００１７】
本発明において使用されるポリペプチドの典型例は、下記ａ）〜ｇ）に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドである。
ａ）WEAKLAKALAKALAKHLAKALAKALKA（配列番号１）
ｂ）WEAKLAKALAKALAKHLAKALAKALKACEA（配列番号２）
ｃ）WEAKLAKALAKALAKHLAKALA（配列番号３）
ｄ）WEAKLAKALAKALAKHLA（配列番号４）
ｅ）KALAKALAKALAKALA（配列番号５）
ｆ）KALAKALAKALA（配列番号６）
ｇ）WEARLARALARALARHLARALARALRA（配列番号７）
【００１８】
ａ）は、前出の非特許文献１（Wyman, T. B. et al., Biochemistry, 1997, 36, 3008-17；この文献は、その全てが参照により本明細書に組み込まれる）に開示されたKALAペプチドである。KALAペプチドは、pH7.4前後の中性条件下では前記繰り返し単位を１周期とするいわゆるαヘリックス構造を、またpH5.0前後の弱酸性条件下ではランダムコイル構造をそれぞれ呈することが知られている。KALAペプチドは、前出の特許文献１（国際公開WO2011/132713）に開示されるように、脂質膜構造体の表面に配置されることで、脂質膜構造体の細胞核内への移行能を高める機能を有する。また、複数のLys残基によってペプチド全体が正に荷電しており、負に荷電しているDNAとコンプレックスを形成する機能を有することも知られている（国際公開WO2011/132713）。
【００１９】
ｂ）は、前記KALAペプチドのC末端に3アミノ酸残基が付加されたアミノ酸配列からなるペプチドであり、KALAペプチドと同様に、pHに依存してαヘリックス構造とランダムコイル構造を呈する性質、脂質膜構造体の細胞核内への移行能を高める機能、及び核酸とのコンプレックス形成能を有する。ｃ）はKALAペプチドのC末端のKALKAが欠失したアミノ酸配列からなるペプチド、ｄ）はｃ）のアミノ酸配列からなるペプチドのC末端からK-A-L-Aの繰り返し単位が１個欠失したアミノ酸配列からなるペプチド、ｅ）及びｆ）はK-A-L-Aの繰り返し単位がそれぞれ4又は3個繰り返されたアミノ酸配列からなるペプチド、ｇ）はａ）のアミノ酸配列においてKが全てRに置換されたアミノ酸配列からなるペプチドである。ｃ）〜ｆ）は、前出の特許文献２（国際公開WO2015/098907）に開示されているペプチドであり、KALAペプチドと同様の機能を有する。国際公開WO2011/132713及びこれに対応する米国出願公開US2013/0122054、並びに国際公開WO2015/098907は、その全てが参照により本明細書に組み込まれる。
【００２０】
本発明においては、以下のポリペプチドも使用することができる：
前記ａ）〜ｆ）に示されるアミノ酸配列においてK-A-L-Aの繰り返し単位のうちのいずれか1個又は2個以上においてKがRとなっているアミノ酸配列からなるポリペプチド；
前記ｅ）又はｆ）に示されるアミノ酸配列においてK-A-L-Aの繰り返し単位のいずれか1個においてKとLに挟まれるAがHとなっているアミノ酸配列からなるポリペプチド；
前記ａ）〜ｄ）に示されるアミノ酸配列においてK-H-L-AがK-A-L-Aとなっているアミノ酸配列からなるポリペプチド；
前記ｇ）に示されるアミノ酸配列においてR-H-L-AがR-A-L-Aとなっているアミノ酸配列からなるポリペプチド。
【００２１】
本発明において特に好ましいポリペプチドは、前記ａ）に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、ｃ）に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、ｅ）に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド及びｇ）に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドである。以下、特に個別に示さない限り、本発明で使用されるポリペプチドを纏めてKALAペプチドバリアントと表す。
【００２２】
KALAペプチドバリアントは、当業者に利用可能な各種の遺伝子組み換え技術を利用し、適当な宿主ベクター系を用いて生物学的に調製することができる。KALAペプチドバリアントは、固相合成法その他のペプチド合成反応を利用した有機化学的方法又はペプチドシンセサイザー等のペプチド自動合成装置を利用して調製してもよい。
【００２３】
本発明において「ポリペプチドの1種以上により脂質膜が修飾された」脂質膜構造体とは、KALAペプチドバリアントの１種又はそれ以上を脂質膜の表面に有する脂質膜構造体、具体的にはこれらが他の物質と接触可能な状態で脂質膜の表面に、特に脂質膜構造体がリポソームの形態であるときは脂質膜の外表面に存在している脂質膜構造体を意味し、KALAペプチドバリアントの全てが脂質二重層の層内に埋没している脂質膜構造体、又はKALAペプチドバリアントの全てが脂質膜で閉鎖された内部空間に存在する、いわゆるポリペプチドが封入された脂質膜構造体とは区別される。ただし、KALAペプチドバリアントが脂質膜の表面に存在する限り、脂質二重層の内部、脂質膜で閉鎖される脂質膜構造体の内部空間、又はこの内部空間に向いた脂質膜の内側の面にもポリペプチドが存在することは差し支えない。
【００２４】
KALAペプチドバリアントは、ステアリル基、コレステリル基その他の任意の疎水性基を有する誘導体、特にポリペプチドのN末端のアミノ基と中鎖以上の鎖長を有する脂肪酸のカルボン酸基との間の脱水反応によって調製される脂肪酸誘導体の形態で使用されることが好ましい。KALAペプチドバリアントの誘導体は、その疎水性基が脂質膜構造体の脂質膜に埋没することで、ポリペプチド部分が脂質膜の表面に残るようにポリペプチドを脂質膜の表面にアンカリングさせることができる。
【００２５】
本発明において使用される核酸は、DNA又はRNAのほか、これらの類似体又は誘導体（例えば、ペプチド核酸（PNA）やホスホロチオエートDNA等）が包含される。核酸は一本鎖又は二本鎖のいずれであってもよく、線状又は環状のいずれであってもよい。また、STING ligandであるcGAMP （AMPとGMPの二量体）等のヌクレオチド化合物であってもよい。核酸の長さは、特に限定されない。
【００２６】
本発明において好ましい核酸は、細胞内、特に細胞質内に送達されることが望まれる核酸であり、例として、dsRNA、cGAMP、CpG ODN、polyIC等の核酸アジュバント、抗原性ポリペプチドをコードするmRNA、及びアンチセンス核酸、siRNA等の阻害性核酸を挙げることができる。２種以上の核酸を同時に脂質膜構造体に保持させることもできる。
【００２７】
第１の態様の脂質膜構造体は、免疫細胞、特に抗原提示細胞の細胞質内に核酸を送達する機能に優れており、この目的で使用される核酸としては、抗原性ポリペプチドをコードするmRNAが好ましく、該mRNAと核酸アジュバントとを組み合わせてもよい。抗原性ポリペプチドは、抗原性を有する任意のポリペプチドを選択することができる。
【００２８】
本発明において「核酸をその表面に保持した」脂質膜構造体とは、核酸を脂質膜の表面に有する脂質膜構造体、具体的には核酸が他の物質と接触可能な状態で脂質膜の表面に存在している脂質膜構造体、特に脂質膜構造体がリポソームの形態であるときは脂質膜の外表面に存在している脂質膜構造体を意味し、核酸が脂質膜で閉鎖された内部空間に存在する、いわゆる核酸が封入された脂質膜構造体とは区別される。ただし、核酸が脂質膜の表面に存在する限り、脂質膜で閉鎖された内部空間にも核酸が存在することは差し支えない。また、核酸は主に脂質膜構造体表面のKALAペプチドバリアントと静電的に結合して存在するが、目的とする機能を損なわない限り、他の態様により脂質膜の表面に結合していてもよい。
【００２９】
遊離のKALAペプチドバリアントは核酸と静電的相互作用によりコンプレックスを形成するが、このコンプレックスをそのまま細胞に導入しても、脂質膜を持たないことから突破すべき生体膜との融合が困難であり、結果として細胞質への核酸の送達に不適であると考えられる。実際に遊離のKALAペプチドとpDNAとのコンプレックスを樹状細胞に加えても、細胞質内核酸センサーに認識されずにサイトカイン産生が認められないことが示されている（Miura, N. et al., Nucleic Acids Res., 2015, 43, 1317-31）。これに対し、第１の態様の脂質膜構造体は膜融合性のある脂質を有することから、細胞内に効率的に核酸を送達し、その機能を発揮させることができるものと期待される。
【００３０】
第１の態様における脂質膜構造体の形態は特に限定されず、例えばリポソーム、O/W型エマルション、W/O/W型エマルション、球状ミセル、ひも状ミセル、又は不定型の層状構造物等を挙げることができる。脂質膜構造体の好ましい形態はリポソームである。以下、脂質膜構造体をリポソームを例として説明することがあるが、第１の態様の脂質膜構造体はリポソームには限定されない。
【００３１】
脂質膜構造体の脂質膜を構成する脂質としては、例えば、リン脂質、糖脂質、ステロール、又は飽和若しくは不飽和の脂肪酸等が挙げられる。
【００３２】
リン脂質及びリン脂質誘導体としては、例えば、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファリジルコリン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルグリセロール、カルジオリピン、スフィンゴミエリン、セラミドホスホリルエタノールアミン、セラミドホスホリルグリセロール、セラミドホスホリルグリセロールホスファート、1,2-ジミリストイル-1,2-デオキシホスファチジルコリン、プラスマロゲン、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジン酸等を挙げることができ、これらは1種又は2種以上を組み合わせて用いることができる。これらリン脂質における脂肪酸残基は特に限定されないが、例えば、炭素数12〜20の飽和又は不飽和の脂肪酸残基を挙げることができ、具体的には、ラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、オレイン酸、リノール酸等の脂肪酸由来のアシル基を挙げることができる。また、卵黄レシチン、大豆レシチン等の天然物由来のリン脂質を用いることもできる。
【００３３】
糖脂質としては、例えば、グリセロ糖脂質（例えば、スルホキシリボシルグリセリド、ジグリコシルジグリセリド、ジガラクトシルジグリセリド、ガラクトシルジグリセリド、グリコシルジグリセリド）、スフィンゴ糖脂質（例えば、ガラクトシルセレブロシド、ラクトシルセレブロシド、ガングリオシド）等が挙げられる。
【００３４】
ステロールとしては、例えば、動物由来のステロール（例えば、コレステロール、コレステロールコハク酸、ラノステロール、ジヒドロラノステロール、デスモステロール、ジヒドロコレステロール）、植物由来のステロール（フィトステロール）（例えば、スチグマステロール、シトステロール、カンペステロール、ブラシカステロール）、微生物由来のステロール（例えば、チモステロール、エルゴステロール）等が挙げられる。
【００３５】
飽和又は不飽和の脂肪酸としては、例えば、パルミチン酸、オレイン酸、ステアリン酸、アラキドン酸、ミリスチン酸等の炭素数12〜20の飽和又は不飽和の脂肪酸が挙げられる。
【００３６】
第１の態様の脂質膜構造体では、脂質成分として第3級アミン及びジスルフィド結合を有する脂質を用いることもできる。このような脂質は、例えば国際公開WO2013/73480に開示されており、分子内に第3級アミン及びジスルフィド結合を有することによりpH応答性及び還元的環境下における膜不安定化作用を有することが知られている。上記国際公開に開示された下記式(1)で表される脂質は脂質膜構造体の構成脂質として好ましい。
【化１】
2019103151.tif 000003
（式中、Ｘａ及びＸｂは独立して、Ｘ１又はＸ２であり；
【化２】
2019103151.tif 000004
ｓは1又は2であり、
Ｒ４は炭素数1〜6のアルキル基を表し、
ｎａ及びｎｂは独立して、0又は1であり、
Ｒ１ａ及びＲ１ｂは独立して、炭素数1〜6のアルキレン基を表し、
Ｒ２ａ及びＲ２ｂは独立して、炭素数1〜6のアルキレン基を表し、
Ｙａ及びＹｂは独立して、エステル結合、アミド結合、カーバメート結合、エーテル結合又は尿素結合を表し、
Ｒ３ａ及びＲ３ｂは独立して、ステロール残基、脂溶性ビタミン残基又は炭素数12〜22の脂肪族炭化水素基を表す）
【００３７】
式(1)で表される脂質において、側鎖として、例えばミリスチン酸を結合した脂質（PalmM）、レチノイン酸を結合した脂（(PalmA）、及びトコフェロールを結合した脂質（PalmE）等のPalm類脂質が知られているが、これらのうち、PalmEは中性脂質であり血清存在下においても遺伝子発現を達成できることから本発明において好ましく用いることができる。PalmEは国際公開WO2013/73480の段落[0056]の表1中の化合物B-2-5
【化３】
2019103151.tif 000005
である。上記国際公開及びこれに対応する米国出願公開US2014/0335157の開示の全てを参照により本明細書の開示として含める。
【００３８】
上記の脂質の使用量は特に限定されないが、一般的には脂質膜構造体を構成する全脂質に対して5〜50重量％程度の量とすることができる。また、これらのPalm類については応用例が知られているので（Immunity, 21(4), pp.527-538, 2004; Int. Immunol., 21(4), pp.361-377, 2009; Blood, 115(10), pp.1958-1968, 2010)、これらの刊行物を参照しつつ適宜のPalm類を目的に応じて選択することができる。
【００３９】
第１の態様の脂質膜構造体の脂質膜を構成する特に好ましい脂質としては、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（DOPE）、ホスファチジン酸（PA）、ホスファチジルセリン（PS）、カルジオリピン（CL）を挙げることができる。また、国際公開WO2016/121942、国際公開WO2016/027699、国際公開WO2013/073480に記載された細胞内環境応答性を示す脂質様材料も挙げることが出来る。それらの混合量は、KALAペプチドバリアントの添加量、KALAペプチドバリアントの電荷量、KALAペプチドバリアントと核酸の電荷比に応じて、核酸と静電的に結合することができる脂質膜構造体を構成し得る範囲で適宜調整することができる。
【００４０】
第１の態様の脂質膜構造体は、ステロール、又はグリセリン若しくはその脂肪酸エステル等の膜安定化剤、トコフェロール、没食子酸プロピル、パルミチン酸アスコルビル、又はブチル化ヒドロキシトルエン等の抗酸化剤、荷電物質、及び膜ポリペプチド等からなる群から選ばれる1種又は2種以上の物質を、脂質膜の構成成分又は脂質膜で封入される成分として有していてもよい。
【００４１】
正電荷を付与する荷電物質としては、例えば、ステアリルアミン、オレイルアミン等の飽和又は不飽和脂肪族アミン；ジオレオイルトリメチルアンモニウムプロパン等の飽和又は不飽和カチオン性合成脂質；あるいはカチオン性ポリマー等を挙げることができ、負電荷を付与する荷電物質としては、例えば、ジセチルホスフェート、コレステリルヘミスクシネート、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジン酸等を挙げることができる。膜ポリペプチドとしては、例えば、膜表在性ポリペプチド、又は膜内在性ポリペプチド等が挙げられる。これらの物質の配合量は特に限定されず、目的に応じて適宜選択することができる。
【００４２】
また、第１の態様の脂質膜構造体には、例えば、温度変化感受性機能、膜透過機能、遺伝子発現機能、及びpH感受性機能等のいずれか1つ又は2つ以上の機能を付与することができる。これらの機能を適宜付加することにより、例えば遺伝子を含む核酸等を内包する脂質膜構造体の血液中での滞留性を向上させ、肝臓や脾臓等の細網内皮系組織による捕捉率を低下させるとともに、標的細胞におけるエンドサイトーシスの後にエンドソームから効率的に脂質膜構造体を脱出させることが可能になる。
【００４３】
温度変化感受性機能を付与することができる温度変化感受性脂質誘導体としては、例えば、ジパルミトイルホスファチジルコリン等を挙げることができる。また、pH感受性機能を付与することができるpH感受性脂質誘導体としては、例えば、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン等を挙げることができる。
【００４４】
第１の態様の脂質膜構造体は、その血中滞留性を高めることができるグリコフォリン、ガングリオシドGM1、ホスファチジルイノシトールその他の脂質誘導体又はポリアルキレングリコールその他の親水性ポリマー、エンドソーム脱出能を促進するGALAペプチド、生体適合性を高めるMPCポリマー、対象となる細胞表面の受容体や抗原に対して特異的に結合可能な抗体、連続した複数個のアルギニン残基を含むポリペプチド、脂質膜の構造破壊を促進するINF7等を、その表面に有していてもよい。
【００４５】
また、使用目的に応じて、抗腫瘍剤、抗炎症剤、抗菌剤、抗ウイルス剤等の任意の医薬の有効成分のほか、例えばリピドＡ、モノホスホリルリピドＡ（MPLA）、Endocine（Eurocine社）、グルコピラノシル脂質アジュバントといった脂質アジュバントその他のアジュバント、糖類、ペプチド類、低分子化合物、金属化合物等を脂質膜構成成分として、又は脂質膜内に封入される成分として有していてもよい。本発明において特に好ましい脂質アジュバントはMPLAである。脂質膜構造体における脂質アジュバントの含有量は、総脂質量のおよそ0.0003〜3重量％であればよく、好ましくは総脂質量の0.001〜1重量％、より好ましくは0.003〜0.3重量％である。
【００４６】
脂質膜構造体の好ましい形態であるリポソームの製造は、当業者に一般的な任意の方法を基づいて製造することができる。例えば水和法による場合、脂質膜を構成する脂質成分をクロロホルム等の有機溶媒に溶解した溶液を乾燥させて脂質混合物を形成した後、水系溶媒を乾燥した脂質混合物に添加して、ホモジナイズ、超音波処理又は高圧噴射等を行って乳化する等で、水系溶媒を封入したリポソームを調製する。次に、リポソームに前述のKALAペプチドバリアントの誘導体を添加してインキュベートし、リポソームの表面にKALAペプチドバリアントの誘導体をアンカリングさせた後、核酸をさらに加えることで、第１の態様の好ましい形態であるリポソームを製造することができる。リポソームは、水和法以外の公知の方法、例えば逆相蒸発法等によって調製してもよい。第１の態様の好ましい形態であるリポソームは、一枚膜リポソーム又は多重膜リポソームのいずれでもよいが、一枚膜リポソームが好ましい。
【００４７】
また、上記の水和法に基づいた方法において、KALAペプチドバリアントの誘導体を脂質膜を構成する脂質成分とともにクロロホルム等の有機溶媒に溶解し、KALAペプチドバリアントの誘導体を含む脂質混合物を形成してから、水系溶媒を添加する等してリポソームを調製し、核酸をさらに加えることで第１の態様の好ましい形態であるリポソームを製造してもよい。
【００４８】
第１の態様の脂質膜構造体の製造において、KALAペプチドバリアントの誘導体の添加量は、脂質膜構造体の総脂質量に対して、1〜50モル%、好ましくは5〜30モル%であることが好ましい。また、核酸の添加量は特に制限は無いが、脂質膜構造体1重量部に対して、1〜20%重量部の範囲で適宜調節すればよい。
【００４９】
第１の態様の脂質膜構造体において、その内部に封入される水系溶媒（分散媒）は、脂質膜構造体を安定に分散させることができるものであれば、その組成は特に限定されず、例えば、リン酸緩衝液、クエン酸緩衝液、リン酸緩衝生理食塩液等の緩衝液、生理食塩水、細胞培養用の培地等を挙げることができる。これら水系溶媒（分散媒）は、さらに単糖類、二糖類、三糖類、多糖類、糖アルコール、多価アルコール（水溶液）等を含んでいてもよい。また必要に応じて、薬物、タンパク質その他の生理活性物質を含んでいてもよい。
【００５０】
第１の態様の好ましい形態であるリポソームは、脂質膜封入体又は製造後のリポソームを高圧下でメンブランフィルターに通してイクストルージョンすることで、その大きさを揃えることもできる。大きさは特に限定されないが、その平均粒子径は50 nm〜5μm程度、好ましくは50 nmから400 nm程度、より好ましくは50 nmから300 nm程度、さらに好ましくは100 nmから250 nm程度であればよい。
【００５１】
第１の態様の好ましい形態であるリポソームとしては、水系溶媒に分散した形態又は水性分散物を凍結乾燥又は噴霧乾燥した形態である一枚膜リポソーム又は多重層リポソーム等を挙げることができる。水性分散物の形態又は乾燥物の形態にあるリポソームは、当業者に一般的な方法によって調製することができる。脂質膜構造体の好ましい形態は、水性分散物の形態又は乾燥物の形態にある一枚膜リポソームである。
【００５２】
第１の態様の脂質膜構造体によって核酸を送達する対象となる細胞の種類は特に限定されず、核酸に期待される機能又は送達目的等に応じて、適宜の細胞を標的とすることができる。細胞として、好ましくは免疫細胞を挙げることができ、免疫細胞のなかでもマクロファージ、樹状細胞、B細胞等の抗原提示細胞が特に好ましく、特に樹状細胞が最も好ましい。
【００５３】
例えば、第１の態様の脂質膜構造体を用いて、樹状細胞等の抗原提示細胞の細胞質内に抗原性ポリペプチドをコードするmRNAを送達することで、抗原提示細胞はmRNAから翻訳されたポリペプチドを抗原提示細胞の表面に提示し、生体は当該ポリペプチドに対する免疫を獲得することができるので、所望の抗原性ポリペプチドを標的とした有効な免疫療法を行うことができるようになる。
【００５４】
本発明は、免疫細胞と前述の第１の態様である脂質膜構造体とをインキュベーションする工程を含む、免疫療法用のトランスフェクションされた免疫細胞をインビトロで製造する方法を、別の態様として提供する。免疫細胞としては、マクロファージ、樹状細胞、B細胞等の抗原提示細胞が特に好ましく、特に樹状細胞が最も好ましい。
【００５５】
例えば、抗原性タンパク質をコードするmRNAを保持した第１の態様の脂質膜構造体と生体から分離した免疫細胞、好ましくは抗原提示細胞とを適当な培地中でインキュベーションすることで、当該抗原性タンパク質に関する抗原提示能を有するトランスフェクションされた抗原提示細胞を製造することができる。さらには、上記脂質膜構造体に代えて、抗原性ポリペプチドをコードするmRNA及び核酸アジュバントの両方を保持した脂質膜構造体又は抗原性ポリペプチドをコードするmRNAを保持した脂質膜構造体と核酸アジュバントを保持した脂質膜構造体との混合物を用いることで、免疫誘導能がさらに高められた抗原提示細胞を製造することもできる。トランスフェクションされた免疫細胞を免疫療法を必要とする対象に投与する場合、免疫細胞は当該対象から採取したものを用いることが好ましい。
【００５６】
本態様により製造されるトランスフェクションされた免疫細胞は、当該抗原性ポリペプチドを標的とした免疫療法を必要とする対象、好ましくはヒト、特にがん患者に対して、当該抗原性タンパク質に特異的な免疫応答を誘導することができ、免疫療法、特にがんの免疫療法において使用することができる。したがって本発明は、免疫細胞と前述の第１の態様である脂質膜構造体とをインキュベーションして免疫細胞をトランスフェクションする工程、及びトランスフェクションされた免疫細胞の有効量を免疫療法を必要とする対象に投与する工程を含む免疫療法もさらなる別の態様として提供するものである。
【００５７】
また、第１の態様の脂質膜構造体を用いた細胞、好ましくは免疫細胞への核酸の送達は、生体に脂質膜構造体を直接投与して行うこともできる。本発明は、したがって、第１の態様の脂質膜構造体を有効成分として含む医薬組成物をさらなる態様として提供する。上記態様の医薬組成物において用いられる脂質膜構造体は、前出の国際公開WO2011/132713及びWO2015/098907に記載された、脂質膜融合体の生体適合性や血中滞留性を向上させる手段を採用することが好ましい。
【００５８】
上記態様の医薬組成物は、リポソーム医薬又は製剤として一般に知られている剤形、用法、用量等に準じて利用することができる。例えば、医薬組成物は、注射剤、点滴剤等の非経口製剤の形態で用いられることができ、このような非経口製剤に用いることができる担体としては、例えば、生理食塩水や、ブドウ糖、Ｄ−ソルビトール等を含む等張液といった水性担体が挙げられる。
【００５９】
上記態様の医薬組成物はさらに、薬学的に許容される緩衝剤、安定剤、保存剤その他の添加剤といった成分を含み得る。薬学的に許容される成分は当業者において周知であり、当業者が通常の実施能力の範囲内で、例えば第十七改訂日本薬局方その他の規格書に記載された成分から製剤の形態に応じて適宜選択して使用することができる。
【００６０】
例えば、抗原性タンパク質をコードするmRNAを保持した第１の態様の脂質膜構造体を有効成分として含む上記態様の医薬組成物は、当該抗原性ポリペプチドを標的とした免疫療法を必要とする対象、好ましくはヒト、特にがん患者に投与されることで、その体内の免疫細胞に対して当該抗原性タンパク質に特異的な免疫応答を誘導することができ、免疫療法、特にがんの免疫療法において好適に使用される。したがって、有効量の上記態様の医薬組成物を、免疫療法を必要とする対象に投与する工程を含む免疫療法も、本発明のさらなる別の態様として提供される。
【００６１】
医薬組成物の投与方法は、特に制限されないが、非経口製剤である場合は、例えば血管内投与（好ましくは静脈内投与）、腹腔内投与、腸管内投与、皮下投与等を挙げることができる。好ましい実施形態の一つにおいて、医薬組成物は、静脈内投与により生体に投与される。
【００６２】
以下の実施例によって本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。遺伝子導入能評価、免疫誘導能評価等のリポソームの活性評価の方法は、国際公開WO2011/132713及びWO2015/098907に記載されたものを参照することができる。
【実施例】
【００６３】
実施例１  リポソームの調製
（１）核酸をその表面に保持したKALAペプチド修飾リポソームの調製
2mM DOPE（エタノール溶液）45μL、2mM PA（クロロホルム：エタノール＝1：1） 10μL及びクロロホルム45μLを試験管内で混合し、DOPE：PA＝9：2（クロロホルム：エタノール＝1：1）とした後、真空デシケーターで溶媒を留去して、脂質混合物の薄膜を形成した。【００６４】
200μLの10mM HEPES緩衝液（pH7.4）を脂質混合物に添加し、室温で15分静置してから浴槽型ソニケーターで30秒間超音波処理することで、脂質濃度に換算して0.55mM相当のリポソーム懸濁液を調製した。100μLのリポソーム懸濁液と100μLのHEPES緩衝液（pH7.4）を混合し、ボルテックスミキサーで攪拌しながら、8.25μLの1mM STR-KALAペプチド（配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるKALAペプチドのN末端がステアリル化されたもの）を素早く添加して、脂質膜表面にKALAペプチドを配置させた。さらにボルテックスミキサーで攪拌しながら100μLの40μg/mLのpDNA又はmRNA溶液を滴下することで、核酸をその表面に保持したKALAペプチド修飾リポソーム（脂質終濃度：0.183mM、核酸終濃度：0.013mg/mL、核酸脂質比  4μg 核酸／55 nmol 脂質；以下、pDNA KALA-Lipoplex又はmRNA KALA-Lipoplexと表す）を製造した。【００６５】
（２）核酸を封入したKALAペプチド修飾リポソームの調製
2mM DOPE（エタノール溶液） 42.8μL、2mM PA（クロロホルム：エタノール＝1：1） 12.2μL、クロロホルム 42.8μLを試験管内で混合し、DOPE：PA＝7：2（クロロホルム：エタノール＝1：1）とした後、真空デシケーターで溶媒を留去して、脂質混合物の薄膜を形成した。【００６６】
0.12mg/mL 硫酸プロタミン溶液（10mM HEPES緩衝液、pH7.4）100μLを1.5mLチューブへ加え、ボルテックスミキサーで攪拌しながら、0.15mg/mLのpDNA又はmRNA溶液（10mM HEPES緩衝液、pH7.4）100μLをそれぞれ滴下して、プロタミンとpDNAとからなるコア粒子及びプロタミンとmRNAとからなるコア粒子の各懸濁液を調製した。前記脂質混合物に各コア粒子懸濁液200μLを添加し、室温で10分静置してから浴槽型ソニケーターで30秒間超音波処理することで、脂質濃度に換算して0.55mM相当のリポソーム懸濁液を調製した。100μLのリポソーム懸濁液と100μLのHEPES緩衝液（pH7.4）とを混合し、ボルテックスミキサーで攪拌しながら、5.5μLの1mM STR-KALAペプチドを素早く添加して脂質膜表面にKALAペプチドを配置させることで、核酸をその内部に封入したKALAペプチド修飾リポソーム（脂質終濃度：0.275mM、核酸終濃度：0.020mg/mL；以下、pDNA KALA-MEND又はmRNA KALA-MEND等と表す）を製造した。【００６７】
（３）比較用カチオン性リポソームの調製
4mM DOTAP（エタノール溶液） 13.8μL、2mM DOPE（エタノール溶液） 27.5μL、クロロホルム 41.3μLを試験管内で混合し、DOTAP：DOPE＝1：1（クロロホルム：エタノール＝1：1）とした後、真空デシケーターで溶媒を留去して、脂質混合物の薄膜を形成した。【００６８】
200μLの10mM HEPES緩衝液（pH7.4）を脂質混合物に添加し、室温で15分静置してから浴槽型ソニケーターで30秒間超音波処理することで、脂質濃度に換算して0.55mM相当のリポソーム懸濁液を調製した。100μLのリポソーム懸濁液と100μLのHEPES緩衝液（pH7.4）を混合し、ボルテックスミキサーで攪拌しながら、100μLの40μg/mLのmRNA溶液を滴下することで、DOTAPを構成脂質とし、KALAペプチドを有しない比較用カチオン性リポソーム（脂質終濃度：0.183mM、mRNA終濃度：0.013mg/mL；以下、mRNA DOTAP-Lipoplexと表す）を製造した。【００６９】
（１）及び（２）においてOVAをコードするmRNA（1239ヌクレオチド、調製方法は実施例３（２）に記載）を核酸として用いて製造したリポソームの粒度分布及びゼータ電位を測定した結果を表１に示す。粒子径、ζ（ゼータ）電位及び多分散指数（Pdl）のいずれについても両リポソーム間に大きな差は認められなかった。
【表１】
2019103151.tif 000006
【００７０】
実施例２  KALA-Lipoplexの樹状細胞に対する遺伝子導入能評価
（１）マウス骨髄由来樹状細胞の誘導
500mLのRPMI-1640（Sigma-aldrich）培地に対し、5mLの1M HEPES（ナカライテスク）、5mLの100mM Sodium Pyruvate（ナカライテスク）、500μLの2-Mercaptethanol（Gibco）、5mLの10000μg/mL Penicillin+10000U/mL Streptomycin（ナカライテスク）、50mLの非働化FCSを添加して完全培地を調製した。頸椎脱臼により安楽死させたC57BL/6Jマウス又はBalb/cマウス（6〜8週齢メス）から大腿骨・脛骨を摘出し、70%エタノールで消毒後、滅菌シャーレ内で20mLのPBS（-）に浸した。骨の両端を切断し、26G注射針（テルモ）を装着した1mLシリンジを用いて、20mLの完全培地を用いて骨髄細胞をシャーレ中に押し出した。細胞懸濁液を40μmセルストレイナー（Falcon）を通して、50mLコニカルチューブへ回収し、4℃、500g、5分で遠心した。上清を除き、残った細胞ペレットを1mLのACK Lysing buffer（Lonza）で懸濁し、室温、5分インキュベートすることで、赤血球を破壊した。9mLの完全培地を加え、混合した後、4℃、500g、5分で遠心した。上清を除き、残った細胞ペレットを10mLの完全培地で懸濁し、4℃、500g、5分で遠心した。同様の操作をもう一度行った後、10mLの完全培地で懸濁後、100mm培養ディッシュへ播種し、37℃、5%CO2下でインキュベートした。4時間以上経過した後、上清でディッシュ底を軽く洗浄することで、非接着細胞を回収した。セルカウントの後、1.0×106cells/mLとなるように、10ng/mL mGM-CSF（R&D systems）含有完全培地（BMDC用完全培地）で懸濁し、24well plateへ1mL/wellとなるように播種した。播種から2日後及び4日後に細胞の凝集塊を残して浮遊細胞を除去した後、1mLのBMDC用完全培地を各wellに添加した。播種から6日後に、各wellの浮遊細胞および弱接着細胞をピペッティングにより回収し、未成熟樹状細胞（Bone Marrow-derived Dendritic Cell、BMDC）として実験に用いた。【００７１】
（２）レポーター遺伝子を用いた遺伝子導入能評価
LuciferaseをコードするpDNA（pCpGfree-MCS (invivogen)にLuciferaseをコードするDNA断片を挿入し、Endofree Plasmid Giga Kitを用いて大腸菌より調製した）又はmRNA（T7 promoterの下流にLuciferaseをコードする配列を有するpDNAを、mMESSAGE mMACHINE（商標） T7 ULTRA Transcription Kit (Thermofischer Scientific)によりin vitro転写する事で調製した（1924ヌクレオチド））を核酸として用いて、実施例１に示した方法により、4種類のリポソームmRNA KALA- Lipoplex、pDNA KALA-MEND、mRNA KALA-MEND、及びmRNA DOTAP-Lipoplexを調製した。【００７２】
C57BL/6Jマウス由来のBMDCと上記の各リポソームとを、4.0×105cellsのBMDC/pDNA又はmRNA量で0.4μg相当の各リポソーム/500μLの血清不含BMDC用完全培地となるように1.5mLチューブ内で混合し、これを24 well plateに播種して、3時間インキュベートした。1000μLのBMDC用完全培地を各wellに添加して更に3時間インキュベートした後に、上清1000μLを1.5mLチューブに回収し、4℃、500g、5分で遠心後、上清を除いた。各wellに残った上清を対応する1.5mLチューブに回収後、wellを1000μLのPBS（-）で洗浄し、対応する1.5mLチューブに回収した。wellにはReporter Lysis Buffer（Promega）をDDWで5倍希釈したものを75μLずつ添加した。上清を入れた1.5mLチューブを4℃、500g、5分で遠心後、上清を除いた。生じた細胞ペレットを、対応するwell内のLysis buffer 40μLで懸濁し、元のwellに戻した。-80℃で30分以上インキュベートした。室温で融解し、セルスクレイパーで細胞をはがした後、well内のLysis bufferを1.5mLチューブに回収し、4℃、20000g、2分で遠心した。上清を別の1.5mLチューブに分注した。上清20μLをLuciferase assay system（Promega）50μLと混合した際の発光量（RLU）をGLOMAX（Promega）により定量した。上清20μL中のタンパク質量（mg）をTaKaRa BCA Protein Assay Kit（タカラバイオ）を用いて定量した。得られた発光量（RLU）をタンパク質量（mg）で除することで、Luciferase activity （RLU/mg protein）として算出した。【００７３】
図１に示されるように、同量のpDNA又はmRNAを使用した場合において、mRNA KALA- LipoplexでトランスフェクションされたBMDCが最も高いルシフェラーゼ活性を示すことが確認された。【００７４】
実施例３  KALA-LipoplexでトランスフェクションされたBMDCの抗原提示強度評価
オボアルブミン（OVA）をコードするpDNA（pCpGfree-MCS (invivogen)にOVAをコードするDNA断片を挿入し、Endofree Plasmid Giga Kitを用いて大腸菌より調製した）又はmRNA（T7 promoterの下流にOVAをコードする配列を有するpDNAを、mMESSAGE mMACHINE（商標） T7 ULTRA Transcription Kit (Thermofischer Scientific)によりin vitro転写する事で調製した）を核酸として用いて、実施例１に示した方法により、pDNA KALA- Lipoplex、mRNA KALA- Lipoplex、pDNA KALA-MEND、mRNA KALA-MEND、及びmRNA DOTAP-Lipoplexをそれぞれ調製した。また、実施例１（１）においてSTR-KALAを同量のSTR-オクタアルギニン（R8）に代えてmRNA R8- Lipoplexを調製した。【００７５】
C57BL/6Jマウス由来のBMDCと上記の各リポソームとを、2.0×106cellsのBMDC/pDNA又はmRNA量で0.25〜1.0μg相当の各リポソーム/1000μLの血清不含BMDC用完全培地となるように1.5mLチューブ内で混合し、これを12 well plateに播種して、2時間インキュベートした。1000μLのBMDC用完全培地を添加して更に21時間インキュベートした後に、細胞をピペッティングにより回収し、4℃、500g、5分で遠心後、上清を除いた。1000μLの完全培地で2回細胞を洗浄した。400μLの完全培地で細胞を懸濁後、細胞濃度を測定した。2.0×105cellsのBMDCと1.0×105cellsのB3Z細胞（OVA257-264を特異的に認識するT細胞レセプターを発現するT細胞ハイブリドーマ。OVA257-264を提示する抗原提示細胞との相互作用により活性化されるとβ-Galを発現する）を200μLの完全培地中で混合し、96well plateに播種後、37℃、5%CO2下で16時間インキュベートした。各wellの上清を1.5mLチューブへ回収し、200μLのPBS（-）で洗浄し、対応する1.5mLチューブに回収した。4℃、500g、5分で遠心後、上清を除いた。各wellに50μLのCPRG bufferを加えると同時に、1.5mLチューブ中の細胞ペレットを50μLのCPRG bufferで懸濁し、対応するwellに加えた。37℃で4時間インキュベート後、各wellの595nmにおける吸光度を測定した。吸光度が1を超える場合は、CPRG diluentを用いて希釈し測定した。【００７６】
図２に示されるように、同量例えば1.0μgのpDNA又はmRNAを使用した場合において、mRNA KALA- LipoplexでトランスフェクションされたBMDCが最も高い抗原提示強度を示すこと、1μg相当のpDNA KALA-LipoplexでトランスフェクションされたBMDCよりも0.25μg相当のmRNA KALA-LipoplexでトランスフェクションされたBMDCの方が高い抗原提示強度を示すこと、mRNA KALA-LipoplexでトランスフェクションされたBMDCの抗原提示強度は、mRNAの量に依存して上昇すること等が確認された。【００７７】
実施例４  KALA-LipoplexでトランスフェクションされたBMDCの免疫誘導能評価
（１）KALA-Lipoplexにより抗原遺伝子を導入されたBMDCの免疫
C57BL/6Jマウス由来のBMDCと実施例３で調製したmRNA KALA- Lipoplex、mRNA KALA-MEND及びmRNA DOTAP-Lipoplexの各リポソームとを、2.0×106cellsのBMDC/ mRNA量で0.025〜2.0μg相当の各リポソーム/1000μLの血清不含BMDC用完全培地となるように1.5mLチューブ内で混合し、これを12well plateへ播種して2時間インキュベートした。1000μLの完全培地を添加して更に4時間インキュベートした後に、細胞をピペッティングにより回収し、4℃、500g、5分で遠心後、上清を除いた。1000μLのPBS（-）で2回細胞を洗浄した。400μLのPBSで細胞を懸濁後、細胞濃度を測定した。4℃、500g、5分で遠心後、上清を除いた後、125×105cells/mLとなるように細胞をPBS（-）で懸濁し、氷中へ移して、トランスフェクションされた3種のBMDCを用意した。このBMDC又はPBSをC57BL/6Jマウス（6〜8週齢メス）の両足裏皮下に20μLずつ投与することで免疫処置を行った。1回目の免疫の1週間後に2回目の免疫処置を同様に行った。【００７８】
（２）細胞内IFNγ染色による抗原特異的CD8+T細胞の誘導能評価
2回目の免疫から1週間後に、各マウスより脾臓を摘出し、完全培地中に加えた。脾臓内部の脾臓細胞を完全培地中に出し、ピペッティングにより細胞塊をほぐした後、40μmセルストレイナーに通して50mLコニカルチューブへ回収した。4℃、500g、5分で遠心後、上清を除いた。1mLのACK Lysing bufferにより懸濁し、室温、5分インキュベートすることで、赤血球を破壊した。9mLの完全培地を加え、混合した後、4℃、500g、5分で遠心した。上清を除き、残った細胞ペレットを5mLの完全培地で2回洗浄した。5mLの完全培地で懸濁後、細胞濃度を測定した。15×106cellsの脾臓細胞を1500μLの1μg/mL OVA257-264含有完全培地で懸濁し、6well plateに播種した後、37℃、5%CO2下で1時間インキュベートした。1000μLの2.5μL/mL Goldi Plug（BD）、1μg/mL OVA257-264含有完全培地をwellに加え、ピペッティングにより懸濁した。37℃、5%CO2下で6時間インキュベートすることで脾臓細胞をOVA刺激した。wellからピペッティングにより細胞を回収し、5mLの氷冷完全培地で2回洗浄した。5mLの氷冷完全培地に懸濁し、細胞濃度を測定した。【００７９】
1.0×106cellsのOVAペプチド処理脾臓細胞を4℃、500g、5分で遠心後、上清を除き、1mLのFACS buffer（2.5% BSA、0.5% NaN3）で2回洗浄した。50μLの10μg/mL anti-mouse CD16/32 antibodyで細胞を懸濁し、4℃、10分インキュベートすることでブロッキングを行った。50μLのAPC anti-mouse CD3（4μg/mL）、FITC anti-mouse CD8a（10μg/mL）を各細胞に添加し、タッピングにより混和後、4℃、30分インキュベートすることで細胞表面分子の染色を行った。1mLのFACS bufferで2回洗浄した。250μLのTF Fix/Perm Buffer（BD）で細胞を懸濁し、ボルテックスミキサーで3秒間攪拌後、4℃、45分インキュベートすることで、膜透過処理及び固定処理を行った。500μLのTF Perm/Wash buffer（BD）で2回洗浄した。50μLの1.2μg/mL PE anti-mouse IFNγ で細胞を懸濁し、4℃、30分インキュベートすることで、細胞内染色を行った。500μLのTF Perm/Wash buffer（BD）で2回洗浄し、500μLのFACS bufferで懸濁し、フローサイトメーターにより解析し、CD3+CD8+細胞におけるインターフェロンγ（IFNγ）産生細胞の割合を測定した。【００８０】
図３に示されるように、mRNA KALA-Lipoplexを投与したマウスにおいて、最も効率的に抗原特異的CD8+T細胞が誘導されることが確認された。【００８１】
（３）in vivo CTLアッセイによる抗原特異的細胞傷害性活性評価
上記（１）と同様にC57BL/6Jマウスに3種類のBMDCのいずれかを１回免疫し、免疫から1週間後に以下の方法で調製した標的細胞を投与した。まずC57BL/6Jマウスより脾臓を摘出し、完全培地中に加えた。脾臓内部の脾臓細胞を完全培地中に出し、ピペッティングにより細胞塊をほぐした後、40μmセルストレイナーに通して50mLコニカルチューブへ回収した。4℃、500g、5分で遠心後、上清を除いた。脾臓1つあたり1mLのACK Lysing bufferにより懸濁し、室温、5分インキュベートすることで、赤血球を破壊した。5倍量の完全培地を加え、混合した後、4℃、500g、5分で遠心した。上清を除き、残った細胞ペレットを10mLの完全培地で洗浄した。30mLの完全培地で懸濁後、細胞濃度を測定した。40μmのセルストレイナーを通して脾臓細胞を2群に分けた（ペプチド処理群、及び非処理群）。4℃、500g、5分で遠心後、上清を除き、1.0×107cells/mLとなるように完全培地で懸濁した。ペプチド処理群に、2mM OVA257-264ペプチドを培地量の1/400量を添加し素早く懸濁した。ペプチド処理群、及び非処理群を37℃、5%CO2下で1時間インキュベートした。4℃、500g、5分で遠心後、上清を除き、10mLの完全培地で2回洗浄した。10mLのPBS（-）で洗浄した。3.0×107cells/mLとなるように、ペプチド処理群を1μM CFSE/PBSで、非処理群を0.1μM CFSE/PBSで懸濁し、遮光しながら37℃の水浴で10分間インキュベートした。10mLの完全培地を添加し、4℃、500g、5分で遠心後、上清を除去後、10mLの完全培地、及び10mLのPBS（-）で洗浄した。10mLのPBS（-）で細胞を懸濁し、細胞濃度を測定した。5.0×107cells/mLとなるようにPBS（-）で懸濁し、ペプチド処理群と非処理群を100μLずつ混合したものを標的細胞として、免疫マウスの尾静脈より投与した。【００８２】
標的細胞投与の20時間後、マウスより脾臓を摘出し、完全培地中に加えた。脾臓内部の脾臓細胞を完全培地中に出し、ピペッティングにより細胞塊をほぐした後、ナイロンメッシュを通して1.5mLチューブへ回収した。4℃、500g、5分で遠心後、上清を除いた。1mLのACK Lysing bufferにより懸濁し、室温、5分インキュベートすることで、赤血球を破壊した。9mLのFACS bufferで希釈し、4℃、500g、5分で遠心後、上清を除いた。5mLのFACS bufferで細胞を洗浄後、5mLのFACS bufferで細胞を懸濁した。フローサイトメーターを用いて、ペプチド処理群と非処理群の比から、CTL活性を算出した。【００８３】
図４に示されるように、いずれのリポソームでトランスフェクションされたBMDCも、mRNAの量に依存した抗原特異的CTL活性を示した。特にmRNA KALA-LipoplexでトランスフェクションされたBMDCは、mRNA KALA-MENDに封入されたmRNA量の1/10以下の量でも、生体において抗原特異的な細胞傷害活性を誘導することができることが確認された。【００８４】
実施例５  KALA-Lipoplexの膜融合性評価
ICRマウス（4〜6週齢オス）よりヘパリン存在下で採取した血液を、氷冷生理食塩水と混合して10mLとした。4℃、400g、10分で遠心後、上清を除いた。同様の操作を3回繰り返し、赤血球懸濁液とした。Triton-X100/PBS（Triton-X100終濃度:0.02%（w/v））と適当量の赤血球懸濁液を混合して250μLとし、ボルテックスミキサーで攪拌後、200μLを96well plateへ加え、540nmにおける吸光度を測定した。540nmにおける吸光度が1.0となる赤血球懸濁液量を算出した。その量の赤血球懸濁液と、実施例３で調製したmRNA KALA- Lipoplex、mRNA KALA-MEND、mRNA DOTAP-Lipoplex、及びmRNA R8- Lipoplex（脂質換算終濃度:2.5、5.0、10μM）、及び20mM リンゴ酸/PBS（pH5.5、6.5、7.4）を混合し、250μLとした。37℃、1600rpmの条件で30分間攪拌しながらインキュベートした。4℃、400g、5分で遠心後、200μLの上清を透明96well plateへ加え、540nmの吸光度を測定した。0.02%（w/v）Triron-X100中での吸光度を100%Lysis時の値として、緩衝液中での吸光度を0%Lysisの値として、それぞれのリポソームの溶血活性（%Lysis）を算出した。【００８５】
図５に示されるように、いずれのリポソームもpH5.5において溶血活性を示した一方、pH6.5及びpH7.4では溶血はあまり認められなかった。なかでもmRNA KALA-Lipoplexは特に高い溶血活性を示していたことから、酸性条件であるエンドライソソームにおいてmRNA KALA-Lipoplexはその高い生体膜膜融合能により脱出効率に優れる可能性が示唆された。【００８６】
実施例６  KALA-LipoplexのmRNA放出能評価
0.1μg mRNAに相当する量の実施例３で調製したmRNA KALA- Lipoplex、mRNA KALA-MEND若しくはmRNA DOTAP-Lipoplex、又は0.1μgのOVA mRNAを含む懸濁液10μLを、0.031〜10mg/mL Poly-（α,β）-DL-aspartic acid sodium salt mol wt 2,000-11,000（Sigma） 8μL、1.45M NaCl 2μLと混合し、37℃、30分間インキュベートした。6×Loading dye（TOYOBO） 4μLを混合し、10,000倍希釈Gel Red（Biotium）含有1%アガロースゲルに全量をアプライした。4℃で2時間電気泳動し、Gel Doc EZ（Bio-rad）により撮影し、各リポソームからのmRNA放出量を比較した。【００８７】
図６に示されるように、mRNA KALA-Lipoplexは、mRNA KALA-MEND又はmRNA DOTAP-Lipoplexと比較してmRNAを効率的に放出することが確認された。【００８８】
実施例７  NY-ESO-1をコードするmRNAを表面に有するKALA-Lipoplexの抗腫瘍効果
（１）NY-ESO-1 mRNA搭載KALA-Lipoplexの調製
T7 promoterの下流にがん抗原NY-ESO-1をコードするcDNA（配列番号８）を有するpDNAを元に、mMESSAGE mMACHINE（商標） T7 ULTRA Transcription Kit (Thermofischer Scientific）によりin vitro転写することで調製したmRNA（UTRを含む814ヌクレオチド、NYESO1 mRNAと表す）を核酸として用いて、実施例１（１）に示した方法により、NYESO1 mRNAを表面に保持したKALA-Lipoplex（NYESO1 mRNA KALA-Lipoplex；脂質終濃度：0.183mM、核酸終濃度：0.013mg/mL、核酸脂質比  4μg 核酸／55nmol 脂質）を作製した。【００８９】
（２）アジュバントを含むKALA-Lipoplexの調製
CpG ODN 0.06μg：NYESO1 mRNA 3.94μg（CpG ODN/mRNA =1/64）、pDNA .（pCpGfree-NewMCS）12μg：NYESO1 mRNA 3.88μg（pDNA/mRNA = 1/32）、及びtpRNA 2.00μg：NYESO1 mRNA 2.00μg（tpRNA/mRNA = 1/1）の各混合物を核酸として用いて、実施例１（１）に示した方法により、NYESO1 mRNAと各核酸アジュバントとを表面に保持したKALA-Lipoplex（mRNA+CpG-ODN、mRNA+pDNA、mRNA+tpRNA、脂質終濃度：0.183mM、核酸終濃度：0.013mg/mL、核酸脂質比  4μg 核酸／55nmol 脂質）を作製した。【００９０】
さらに、NYESO1 mRNAと、2mM DOPE（エタノール溶液）45μL、2mM PA（クロロホルム：エタノール＝1：1） 10μL、0.09 mg/mL MPLA（クロロホルム：メタノール＝75：25）をクロロホルムで16倍希釈した0.0056 mg/mL MPLA 6.25μL及びクロロホルム45μLを試験管内で混合して調製される脂質混合物の薄膜とを用いて、実施例１（１）と同様の操作を行い、NYESO1 mRNAを表面に保持し、脂質膜にMPLAを含むKALAペプチド修飾リポソーム（NYESO1/MPLA KALA-Lipoplex；脂質終濃度：0.183 mM、核酸終濃度：0.01 mg/mL、核酸脂質比  3μg 核酸／55nmol 脂質）を製造した。【００９１】
NYESO1 mRNA KALA-Lipoplex、mRNA＋CpG-ODN、mRNA＋pDNA、mRNA+tpRNA及びNYESO1/MPLA KALA-Lipoplexの粒子径、ζ電位及び多分散指数（Pdl）を表２に示す。
【表２】
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【００９２】
（３）NYESO1 mRNAを表面に保持したKALA-Lipoplexの抗腫瘍効果
実施例２（１）で誘導したBalb/cマウス由来の未成熟樹状細胞（BMDC）と上記（１）で製造したKALA-Lipoplexとを用いて、実施例４の（１）と同様の操作を行い、NYESO1 mRNA KALA-Lipoplex 及びNYESO1/MPLA KALA-LipoplexでトランスフェクションされたBMDCをそれぞれ作製した。【００９３】
6〜8週齢のBalb/cマウス（n=5）にNY-ESO-1を発現しているCT26腫瘍細胞（1.0×106 cells）を皮下移植し（0日）、7日目に腫瘍サイズを測定した。7日目と14日目に上記BMDC（各1.0 × 106 cells、mRNA量1.0μg）をそれぞれ足裏皮下に投与して免疫処置を行い、30日目まで腫瘍サイズを経時的に測定した。結果を図７に示す。【００９４】
BMDCに代えてPBSを足裏皮下に投与したコントロールマウス群（図７のPBS）と比較して、NYESO1 mRNA KALA-Lipoplex 又はNYESO1/MPLA KALA-LipoplexでトランスフェクションされたBMDCを投与した群（図７のmRNA及びmRNA/MPLA）では移植腫瘍の増殖が抑制されることが、特にNYESO1/MPLA KALA-LipoplexでトランスフェクションされたBMDCを投与した群では腫瘍の増殖が強く抑制されることが確認された。【００９５】
（４）MPLAによるアジュバント効果の確認
本実施例７（１）の操作に準じて、NYESO1 mRNAに代えて同量のLuciferase mRNAを表面に保持し、さらに脂質膜に含まれるMPLAの含有量を0、0.0015μg、0.0059μg、0.023μg又は0.094μgにそれぞれ調節したKALA-Lipoplex（Luc/MPLA KALA Lipoplex）を製造した。実施例２（１）で誘導したBalb/cマウス由来の未成熟樹状細胞（BMDC）とLuc/MPLA KALA Lipoplexとを用いて、実施例２（２）と同様の操作を行って、トランスフェクションしたBMDCにおけるLuciferase activityを測定した。また、BMDCのinterleukin-6（IL-6）産生量を、Mouse IL-6 Quantikine ELISA Kit（R&D systems）を用いて測定した。結果を図８に示す。【００９６】
脂質膜中のMPLA含有量を増加させてもLuciferase activityの変化は殆ど見られなかった一方、IL-6産生量はMPLA含有量と共に増加することが確認された。【００９７】
実施例８  OVA mRNAを表面に保持したKALA-Lipoplexの抗原特異的細胞傷害性活性評価
実施例３に示される操作に準じて、OVA mRNAを表面に保持したmRNA KALA- LipoplexのmRNA含有量を8μg／55 nmol 脂質、10μg／55 nmol 脂質又は12μg／55 nmol 脂質としたOVA mRNAを表面に保持したKALA-Lipoplex（OVA mRNA KALA-Lipoplex 8〜12、脂質終濃度：0.183 mM、核酸終濃度：0.013mg/mL、0.017mg/mL、0.020mg/mL））を製造した。OVA mRNA KALA-Lipoplex 8〜12の粒子径、ζ電位及び多分散指数（Pdl）を表３に示す。
【表３】
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【００９８】
実施例４（３）のin vivo CTLアッセイにおいてBMDCの代わりにOVA mRNA KALA-Lipoplex 8〜12を静脈内投与（iv、投与量1μg mRNA／匹）又は皮下投与（sc、投与量2μg mRNA／匹）したときの抗原特異的細胞傷害性活性（CTL activity）を測定した。結果を図９に示す。【００９９】
PBSを投与したコントロール群のCTL activityは10％未満であるのに対して、OVA mRNA KALA-Lipoplex 8〜12を投与した群ではいずれもCTL activityの上昇が確認され、特にOVA mRNA KALA-Lipoplex 8を静脈投与した群においてCTL activityの顕著な上昇が確認された。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】令和1年9月9日(2019.9.9)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ペプチド鎖中にＫ−Ａ−Ｌ−Ａの繰り返し単位を少なくとも３個含む（ただし該繰り返し単位のうちのいずれか１個若しくは２個以上においてＫがＲとなっていてもよく、及び／又は該繰り返し単位のうちのいずれか１個若しくは２個以上においてＫとＬに挟まれるＡがＨとなっていてもよい）アミノ酸残基数が１２〜５０個のポリペプチドの１種以上により脂質膜が修飾された脂質膜構造体であって、核酸をその表面に保持した前記脂質膜構造体を含む、医薬組成物。
【請求項２】
ポリペプチドが、ペプチド鎖中にＫ−Ａ−Ｌ−Ａの繰り返し単位を３又は４個含む（ただし該繰り返し単位のうちのいずれか１個若しくは２個以上においてＫがＲとなっていてもよく、及び／又は該繰り返し単位のうちのいずれか１個においてＫとＬに挟まれるＡがＨとなっていてもよい）アミノ酸残基数が１２〜３０個のポリペプチドである、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項３】
ポリペプチドが下記ａ）〜ｇ）に示されるアミノ酸配列のいずれかからなるポリペプチドである、請求項１又は２に記載の医薬組成物。
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【請求項４】
脂質膜構造体がリポソームである、請求項１〜３のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項５】
ポリペプチドが疎水性基で修飾されており、前記疎水性基が脂質膜に挿入されてなる、請求項１〜４のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項６】
核酸が核酸アジュバント及び／又は抗原性ポリペプチドをコードするｍＲＮＡである、請求項１〜５のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項７】
脂質アジュバントをさらに含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項８】
（削除）
【請求項９】
（削除）
【請求項１０】
皮下投与のための、請求項１〜７のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項１１】
静脈内投与のための、脂質膜構造体中の核酸の含有量が８〜１０μｇ／５５ｎｍｏｌ脂質である、請求項１〜７のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【国際調査報告】
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