(57)【要約】要約  ハイブリダイゼーションによって標的核酸を検出する際に、標的核酸とその類似配列相補鎖を有する核酸との間のクロスハイブリダイゼーションを効果的に抑制し、かつ、製造ロット間での品質が安定した非特異結合抑制剤、及びそれを用いた核酸のハイブリダイゼーション方法が開示されている。核酸の非特異結合抑制剤は、塩基長が２〜１１塩基であって、全塩基配列中のグアニン塩基又はメチル化グアニン塩基の含有率が７０％以上である核酸を含む。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
塩基長が２〜１１塩基であって、全塩基配列中のグアニン塩基又はメチル化グアニン塩基の含有率が７０％以上である核酸を含む、核酸の非特異結合抑制剤。
【請求項２】
前記核酸の塩基長が５〜７塩基である、請求項１に記載の抑制剤。
【請求項３】
前記グアニン塩基又はメチル化グアニン塩基がグアニン塩基である請求項１又は２記載の非特異結合抑制剤。
【請求項４】
前記核酸が連続する５塩基のグアニン塩基配列を有する、請求項１〜３のいずれか１項に記載の抑制剤。
【請求項５】
前記核酸の全塩基がグアニンである、請求項１〜３のいずれか１項に記載の抑制剤。
【請求項６】
前記核酸がＤＮＡである、請求項１〜５のいずれかに記載の抑制剤。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれかに記載の抑制剤を含む、核酸のハイブリダイゼーション用試薬。
【請求項８】
標的核酸と、当該標的核酸と特異的に結合可能な核酸とをハイブリダイズさせる、核酸のハイブリダイゼーション方法であって、当該ハイブリダイゼーションにおいて請求項１〜６のいずれかに記載の抑制剤を共存させることを含む、方法。
【請求項９】
標的核酸と、当該標的核酸と特異的に結合可能な核酸とをハイブリダイズさせるハイブリダイゼーション工程、および、当該ハイブリダイゼーション工程で形成された核酸複合体を検出する検出工程、とを含む標的核酸の検出方法であって、当該ハイブリダイゼーション工程において請求項１〜６のいずれかに記載の抑制剤を共存させることを含む、検出方法。
【請求項１０】
核酸アレイを用いる、請求項９に記載の検出方法。
【請求項１１】
塩基長が２〜１１塩基であって、全塩基配列中のグアニン塩基又はメチル化グアニン塩基の含有率が７０％以上である核酸の、核酸の非特異結合抑制剤としての使用。
【請求項１２】
塩基長が２〜１１塩基であって、全塩基配列中のグアニン塩基又はメチル化グアニン塩基の含有率が７０％以上である核酸の、核酸の非特異結合抑制剤の製造のための使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、核酸ハイブリダイゼーションにおける非特異結合を抑制するための抑制剤、当該抑制剤を含むハイブリダイゼーション用試薬、当該抑制剤を用いる核酸のハイブリダイゼーション方法、当該ハイブリダイゼーション工程を含む標的核酸の検出方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）およびリボ核酸（ＲＮＡ）は、生体情報を担う核酸であり、ＤＮＡはアデニン（ｄＡ）、チミン（ｄＴ）、シトシン（ｄＣ）およびグアニン（ｄＧ）を、ＲＮＡはアデニン（Ａ）、ウラシル（Ｕ）、シトシン（Ｃ）およびグアニン（Ｇ）を塩基として含む。ＤＮＡおよびＲＮＡは、それぞれ相補配列である相補鎖と特異的に結合する性質を有し、その結合親和性および特異性はＡ−Ｔ（またはＵ）およびＣ−Ｇの２種類の特異的結合様式の組合せによって実現される。相補鎖との結合親和性および特異性は、配列に含まれる各塩基種の配列順序、構成比率および結合鎖長、また塩基配列に依存した高次構造などによって規定されるが、さらに外部要因として反応液の温度および反応液中のイオン強度、さらにホルムアミドなどの核酸変性剤の存在有無によっても調節される。この相補鎖との核酸結合はハイブリダイゼーションと呼ばれる。【０００３】
近年、各種の生体試料において特定の核酸を標的核酸としてその発現量を測定することにより、疾患の発症予測や診断を行う研究がなされている。例えば、ヒトでは総遺伝子が２６０００以上も存在すると報告されている。また、近年では、非翻訳ＲＮＡとして短鎖核酸であるマイクロＲＮＡにも注目されており、ヒトでは２６００種以上のマイクロＲＮＡが存在すると報告されている。特に、マイクロＲＮＡは、１種類の配列が最大１００種類超の遺伝子発現量を調節するなど、ヒトなどの高等生物の遺伝子発現調節においてＦｉｎｅ−Ｔｕｎｉｎｇを担う重要なプレーヤーであるとの認識が高まっており、疾患との関連が精力的に研究されている。これら膨大な候補遺伝子の中から、疾患に関連する遺伝子を探索することは容易ではない。その目的のために多用されている技術として、核酸アレイ（ＤＮＡマイクロアレイまたはＤＮＡチップとも呼ばれる。）を用いた網羅的遺伝子発現探索が挙げられる。【０００４】
核酸アレイは、支持体となる基板上に多数の標的核酸に対する相補的塩基配列を有する核酸プローブが固定化されており、生体試料から抽出された試料中の標的核酸を予め蛍光物質等の標識分子で標識しておき、核酸アレイにアプライし、標的核酸と核酸プローブの間でハイブリダイゼーションさせることにより、標的核酸の発現量を、形成された核酸複合体の蛍光シグナルとして検出することができる。核酸アレイにおいて標的核酸と相補鎖の間の結合親和性および特異性を調節する方法として、前述の通りハイブリダイゼーションの反応温度の変更や、ハイブリダイゼーション溶液の組成変更が行われる。特にハイブリダイゼーション溶液の組成は当業者ごとに最適化されており、核酸アレイにおいて特異的な核酸検出を行うためには必須の技術である。【０００５】
しかし、一般的な核酸アレイは、ガラス基板上に相補鎖プローブが固定化されているが、ガラスは核酸をその配列非特異的に吸着結合する性質を有する。そのため、ガラス基板上に標的核酸が吸着してしまい、その結果、バックグラウンドシグナルの増加をもたらす。標的核酸のシグナル値が低い場合には、高バックグラウンドのために検出が困難となる。【０００６】
また、核酸アレイ等を用いて標的核酸を検出しようとする場合、標的核酸とこれと類似する配列の相補鎖を有する核酸との間でクロスハイブリダイゼーションが生じることがある。その場合、標的核酸のシグナル値に比してクロスハイブリダイズした標的核酸のシグナル値が相対的に高くなり、標的核酸の発現量の検出が困難となるおそれがある。【０００７】
また、特にゲノム配列の解析において、ゲノム中には特定配列が高度に繰り返したリピート配列が多く含まれるため、標的核酸の検出において、当該標的核酸のリピート配列が標的核酸に対する相補鎖を有する核酸プローブとクロスハイブリダイズする場合には、測定値のベースラインが上昇し、標的核酸を検出することが困難となる。【０００８】
以上のような、核酸アレイ基板に対する非特異的な吸着や、標的核酸と類似する配列の相補鎖を有する核酸とのクロスハイブリダイゼーションを抑制するため、ハイブリダイゼーション溶液には、緩衝剤、塩、水和剤、核酸変性剤等のほかに、これら核酸の非特異結合の抑制剤（ブロッキング剤）が添加される。例えば、サケ精子ＤＮＡは、最も汎用される非特異結合抑制剤の１つである。また、この他に、Ｈｕｍａｎ Ｃｏｔ−１ ＤＮＡ、大腸菌ｔＲＮＡ、ＰＣＲ増幅物（特許文献１）、ｐｏｌｙ-ｄＡ（非特許文献１、非特許文献２）、ランダムオリゴ等、これらの混合物（特許文献２）などが、核酸の非特異結合抑制剤として、ハイブリダイゼーション溶液に添加して用いられている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】特表２００９−５１８００４号公報
【特許文献２】特開２０１０−２９１７４号公報
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Technical Note,“Implementation of DNA Microarray Hybridization Protocols, Translation of Manual Methods to Tecan Hybridization Station"、[online]、テカンジャパン株式会社、［2018年10月22日検索］、インターネット〈URL：http://www.tecan.co.jp/pdf/technote_hs.pdf〉
【非特許文献２】Ｐａｎ ＳＪ．ら、ＢＭＣ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ、２００２年、第３巻、３５号、ｐ．１−１２
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
上記のような従来使用されている核酸の非特異結合抑制剤のうち、サケ精子ＤＮＡは、サケ精巣由来のＤＮＡを超音波破砕または物理剪断処理することにより断片化したものである。提供者によって異なるが、通常、数百ｂｐ〜数千ｂｐの分子量分布を有しており、製造ロットによりその分子量分布等の性状が異なることが知られている。また、Ｈｕｍａｎ Ｃｏｔ−１ ＤＮＡは、ヒト胎盤由来のＤＮＡを剪断処理することにより断片化したものであり、同じく生物試料由来であることから、製造ロットごとに分子量分布等の性状は異なる。また、大腸菌ｔＲＮＡは、大腸菌破砕物より抽出されたｔＲＮＡであるが、生物試料由来であることから、製造ロット間で性状が異なるおそれがある。【００１２】
以上のように、生物試料由来の非特異結合抑制剤を使用して標的核酸の検出をする場合には、製造ロットが切り替わる度に測定結果も影響を受ける可能性がある。そのため、複数の製造ロットの非特異結合抑制剤を入手して比較評価し、同等の測定結果を得られる特異的な製造ロットを特定し、また当該製造ロットを大量に確保する必要があるなど、多大な労力が必要であった。【００１３】
それに対して、ＰＣＲ増幅物はＰＣＲ増幅により、ランダムオリゴは化学合成によって、それぞれ製造されるため、製造ロットごとの品質差は比較的小さい。しかし、ＰＣＲ増幅物は、厳密には、ＰＣＲエラーによる目的外配列の混入率が製造ロットごとに異なる。また、ランダムオリゴは、一般に１０塩基以下の鎖長が使用されるが、やはり製造ロットごとに含まれる塩基構成が同一とはならないおそれがある。したがって、これら非特異結合抑制剤においても、ロット切り替えの影響は残存している。【００１４】
一方、ｐｏｌｙ-ｄＡは、単一塩基（アデニン）により構成されるＤＮＡであり、化学合成可能であるため、製造ロット間差は少ないと期待される。ｐｏｌｙ-ｄＡは、ｍＲＮＡを逆転写した際に生じるｃＤＮＡ上のｐｏｌｙ-ｄＴをブロッキングする用途で使用されており、ｃＤＮＡサンプルを核酸アレイで評価する際には、ｃＤＮＡ上のｐｏｌｙ-ｄＴと相補鎖プローブ上のアデニン（Ａ）リッチな配列間での擬陽性シグナルを抑制することが報告されている（非特許文献２）。しかしながら、核酸アレイでは、様々な類似配列間でのクロスハイブリダイゼーションも生じており、ｐｏｌｙ-ｄＡ単独ではこれらの様々な類似配列間でのクロスハイブリダイゼーションに対する抑制効果は期待できない。そのため、非特許文献２においても、Ｈｕｍａｎ Ｃｏｔ−１ ＤＮＡが同時に添加されており、様々な類似配列間でのクロスハイブリダイゼーションに対する抑制効果は、実質的にはＨｕｍａｎ Ｃｏｔ−１ ＤＮＡによって得られているといえる。【００１５】
以上のとおり、従来、ハイブリダイゼーションによって標的核酸を検出する際に、標的核酸とその類似配列相補鎖を有する核酸との間のクロスハイブリダイゼーションを効果的に抑制し、かつ、製造ロット間での品質が安定した非特異結合抑制剤は存在していない。本発明は、これら特性を両立する非特異結合抑制剤を提供しようとするものである。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
本発明者は鋭意研究の結果、グアニン（Ｇ）を含む核酸が非特異結合を抑制する効果が高く、かつ、当該核酸の製造ロット間での品質が安定であることを見出し、本発明を完成させるに至った。すなわち、本発明は、以下の（１）〜（１２）を提供する。【００１７】
(1)  塩基長が２〜１１塩基であって、全塩基配列中のグアニン塩基又はメチル化グアニン塩基の含有率が７０％以上である核酸を含む、核酸の非特異結合抑制剤。
(2)  前記核酸の塩基長が５〜７塩基である、(1)に記載の抑制剤。
(3)  前記グアニン塩基又はメチル化グアニン塩基が、グアニン塩基である(1)又は(2)記載の非特異結合抑制剤。
(4)  前記核酸が連続する５塩基のグアニン塩基配列を有する、(1)〜(3)のいずれか１項に記載の抑制剤。
(5)  前記核酸の全塩基がグアニンである、(1)〜(3)のいずれか１項に記載の抑制剤。
(6)  前記核酸がＤＮＡである、(1)〜(5)のいずれかに記載の抑制剤。
(7)  (1)〜(6)のいずれかに記載の抑制剤を含む、核酸のハイブリダイゼーション用試薬。
(8)  標的核酸と、当該標的核酸と特異的に結合可能な核酸とをハイブリダイズさせる、核酸のハイブリダイゼーション方法であって、当該ハイブリダイゼーションにおいて(1)〜(6)のいずれかに記載の抑制剤を共存させることを含む、方法。
(9)  標的核酸と、当該標的核酸と特異的に結合可能な核酸とをハイブリダイズさせるハイブリダイゼーション工程、および、当該ハイブリダイゼーション工程で形成された核酸複合体を検出する検出工程、とを含む標的核酸の検出方法であって、当該ハイブリダイゼーション工程において(1)〜(6)のいずれかに記載の抑制剤を共存させることを含む、検出方法。
(10)  核酸アレイを用いる、(9)に記載の検出方法。
(11)  塩基長が２〜１１塩基であって、全塩基配列中のグアニン塩基又はメチル化グアニン塩基の含有率が７０％以上である核酸の、核酸の非特異結合抑制剤としての使用。
(12)  塩基長が２〜１１塩基であって、全塩基配列中のグアニン塩基又はメチル化グアニン塩基の含有率が７０％以上である核酸の、核酸の非特異結合抑制剤の製造のための使用。
【発明の効果】
【００１８】
本発明の核酸の非特異結合抑制剤は、サケ精子ＤＮＡ等の従来の抑制剤と同等またはそれ以上の非特異結合の抑制効果を有し、かつ、製造ロット間での品質が安定であるためにその選定や調製の労力を不要とするものである。特に、ハイブリダイゼーションによる標的核酸の検出において、クロスハイブリダイゼーションの抑制効果を安定して実現することが可能である。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】サケ精子ＤＮＡ、ランダムプライマーとｐｏｌｙ−ｄＧ５のクロスハイブリダイゼーション抑制効果を示す図である（実施例１、２、比較例１、２）。
【図２】ｐｏｌｙ−ｄＧ５、ｐｏｌｙ−ｄＧ７およびｐｏｌｙ−ｄＧ１０のクロスハイブリダイゼーション抑制効果を示す図である（実施例３−８）。
【図３】ｐｏｌｙ−ｄＧ５、ＧＧＡＧＧ，ＧＧＧＡＧおよびＴＧＧＧＧのクロスハイブリダイゼーション抑制効果を示す図である（実施例９−１２）。
【図４】ｐｏｌｙ−ｄＧ５のロット間でのクロスハイブリダイゼーション抑制効果の安定性を示す図である（実施例１３）。
【図５】サケ精子ＤＮＡのロット間でのクロスハイブリダイゼーション抑制効果の不安定性を示す図である（比較例３）。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
本発明の第一の態様(aspect)は、核酸のハイブリダイゼーションの際に生じる非特異結合を抑制するための抑制剤であって、塩基長が２〜１１塩基であり、当該全塩基配列中のグアニン塩基又はメチル化グアニン塩基の含有率が７０％以上である核酸を含むものである。グアニン塩基とメチル化グアニン塩基の両方が含まれる場合には、その合計の含有率が７０％以上である。以下の全ての説明において、文脈からそうでないことが明らかな場合を除き、「グアニン」という語は「メチル化グアニン」をも包含する意味で用いている。ただし、実施例(actual working examples）では、「グアニン」は、メチル化されていない通常のグアニンを意味する。また、以下の全ての説明において、メチル化されていない通常のグアニンの方が、メチル化グアニンよりも好ましい。なお、メチル化グアニンの例としては、７−メチルグアニン（ｍ７Ｇ）、Ｏ６−メチルグアニン（Ｏ６−ＭｅＧ）等を挙げることができる。
【００２１】
ここで、核酸の「非特異結合」とは、標的とする核酸と、当該標的核酸の配列に相補的な配列を有する核酸（プローブ等）との間でのハイブリダイゼーションの際に生じる、標的核酸の関与する当該ハイブリダイゼーション（特異的結合）以外の全ての結合型反応をいう。
【００２２】
この核酸の非特異結合の一の態様は、核酸アレイ（ＤＮＡマイクロアレイ、ＤＮＡチップともいう。）など、標的核酸を検出するために用いる核酸であって当該標的核酸に相補的な塩基配列を有する核酸（核酸プローブ）が固定化された支持体（基板等）を用いる場合に、標的核酸と、標的核酸と類似する配列の相補鎖を有する核酸との間で生じるクロスハイブリダイゼーションである。また、非特異結合の別の態様は、前記標的核酸に相補的な配列を有する核酸が固定化された支持体の材料自体に標的核酸が吸着（ファンデルワールス力による物理吸着、疎水性相互作用による化学吸着のいずれも含まれる。）するものである。本発明における核酸の「非特異結合」には、これらいずれの態様も含まれる。
【００２３】
本発明の非特異結合抑制剤に含まれる核酸（以下、本明細書において「本発明の核酸」ともいう。）は、その塩基長が２〜１１塩基であり、より好ましくは５〜７塩基であり、さらに好ましくは５塩基である。また、当該核酸の全塩基配列中のグアニン塩基の含有率は７０％以上である。
【００２４】
本発明の核酸の好ましい様態は、複数のグアニン塩基が連続して配列しているものであり、その中でも５塩基のグアニン塩基が連続して並列しているものがより好ましい。
【００２５】
本発明の核酸は、グアニン塩基以外の塩基を前記の条件に従って含むことが可能であるが、複数種の塩基を混合して目的の配列を有する核酸を合成する場合には、目的外の配列が一定確率で混入する可能性があるので、当該核酸はグアニン塩基１種のみで構成されることがより好ましい。
【００２６】
本発明の非特異結合抑制剤に含まれる核酸は、一般に使用される核酸合成法によって合成することができ、固相合成法および液相合成法のいずれも当該核酸の合成に使用することが可能である。例えば、固相合成法では、アミダイトと呼ばれる修飾ヌクレオチドモノマーをビーズ上に固相化しておき、オリゴヌクレオチドの配列の３’末端側から５’末端に向けてヌクレオチドモノマーを付加していくことで合成が進行する。すべての鎖長伸長が完了した後に固相ビーズから分離を行うことで、目的の核酸が得られる。液相合成法では、高分散性液相支持体等に同じくヌクレオチドモノマーを付加することで目的の核酸が得られる。
【００２７】
合成した核酸は、一般に使用される脱塩精製、逆相カラム精製、ＨＰＬＣ精製、ＰＡＧＥ精製等の精製方法により精製して用いてもよい。好ましくは、逆相カラム精製、ＨＰＬＣ精製またはＰＡＧＥ精製、より好ましくはＨＰＬＣ精製またはＰＡＧＥ精製により精製された核酸を用いる。
【００２８】
本発明の非特異結合抑制剤に含まれる核酸は、ＤＮＡ、ＲＮＡであっても、人工核酸であってよい。人工核酸としては、ＬＮＡ（Ｌｏｃｋｅｄ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ）、ＰＮＡ（Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ）、ＥＮＡ（Ｅｔｈｙｌｅｎｅ‐Ｂｒｉｄｇｅｄ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ）等が挙げられる。また、複数の核酸種を組み合わせて合成した核酸を用いることも可能である。ＬＮＡ、ＰＮＡ、ＥＮＡ等の人工核酸は、酵素安定性が高い一方で、製造コストも高い。したがって、本発明の核酸は、ＤＮＡまたはＲＮＡが好ましく、酵素安定性が比較的高いＤＮＡがより好ましい。また、本発明の非特異結合抑制剤に含まれる核酸には、塩基としてアデニン（Ａ）、チミン（Ｔ）、シトシン（Ｃ）、グアニン（Ｇ）、ウラシル（Ｕ）以外にイノシン（Ｉ）を含有することも可能である。
【００２９】
本発明の核酸は、修飾塩基を含んでいてもよい。例えば、Ｃは、５−メチルシトシン（５ｍＣ）、５−ヒドロキシメチルシトシン（５ｈｍＣ）、５−ホルミルシトシン（５ｆＣ）、５−カルボキシルシトシン（５ｃａＣ）等としても含むこともできる。また、上記のとおり、Ｇは、７−メチルグアニン（ｍ７Ｇ）、Ｏ６−メチルグアニン（Ｏ６−ＭｅＧ）等として、または２’−Ｏ−メチルリボヌクレオシドとして含むことも可能である。
【００３０】
また、本発明の核酸は、その５’末端、３’末端のいずれか一方または両方が、リン酸基、アルキル基、アルコキシ基、アミノ基、アデニル基、ビオチン、チオール、ハロゲン、蛍光色素等により修飾されていてもよく、これに限定されず、その使用目的に応じて任意の修飾基を用いることができる。
【００３１】
本発明の非特異結合抑制剤に含まれる核酸は、その塩基長が２塩基または３塩基の場合は、すべてがグアニン塩基により構成される。
【００３２】
本発明の核酸は、その塩基長が４塩基の場合は、グアニン塩基３塩基および任意の１塩基（グアニン塩基でもよい）で構成され、当該１塩基の配置される位置は当該配列中で任意である。当該１塩基がグアニン塩基である場合は、全てがグアニン塩基のみにより構成され（すなわち、塩基配列が「ＧＧＧＧ」）、より好ましい配列である。
【００３３】
本発明の核酸は、その塩基長が５塩基の場合は、グアニン塩基４塩基および任意の１塩基（グアニン塩基であってもよい）で構成され、当該１塩基の配置される位置は当該配列中で任意である。例えば、当該１塩基がアデニン塩基でかつ５’末端から３番目に位置する核酸（核酸名（ＤＮＡ）：「ＧＧＡＧＧ」）、および当該１塩基がアデニン塩基でかつ５’末端から４番目に位置する核酸（核酸名（ＤＮＡ）：「ＧＧＧＡＧ」）、および当該１塩基がチミン塩基でかつ５’末端から１番目に位置する核酸（核酸名（ＤＮＡ）：「ＴＧＧＧＧ」）等がこれらに含まれる。また、当該１塩基がグアニン塩基である場合は、全てがグアニン塩基のみである連続する５塩基により構成され（すなわち、塩基配列が「ＧＧＧＧＧ」）、特に好ましい核酸である（核酸名（ＤＮＡ）：「ｐｏｌｙ−ｄＧ５」）。
【００３４】
本発明の核酸は、その塩基長が６塩基の場合は、グアニン塩基５塩基および任意の１塩基（グアニン塩基であってもよい）で構成され、当該１塩基の配置される位置は当該配列中で任意である。このうち、連続するグアニン５塩基の配列を有し、そのいずれかの末端に任意の１塩基を含む構成が好ましい。また、当該任意の１塩基がグアニン塩基である場合は、全てがグアニン塩基のみである連続する６塩基により構成され（すなわち、塩基配列が「ＧＧＧＧＧＧ」）、より好ましい配列である。
【００３５】
本発明の核酸は、その塩基長が７塩基の場合は、グアニン塩基５塩基および任意の２塩基（グアニン塩基であってもよい）で構成され、当該２塩基の配置される位置は当該配列中で任意である。このうち、連続するグアニン５塩基の配列を有し、その両末端に任意の１塩基ずつを含むことまたはいずれかの末端に任意の２塩基を含むことが好ましい。また、当該２塩基がどちらもグアニン塩基である場合は、全てがグアニン塩基のみである連続する７塩基により構成され（すなわち、塩基配列が「ＧＧＧＧＧＧＧ」）、より好ましい配列である。
【００３６】
本発明の核酸は、その塩基長が８塩基の場合は、グアニン塩基６塩基および任意の２塩基（グアニン塩基であってもよい）で構成され、当該２塩基の配置される位置は当該配列中で任意である。このうち、連続するグアニン６塩基の配列を有し、その両末端に任意の１塩基ずつを含むことまたはそのいずれかの末端に任意の２塩基を含むことが好ましい。また、当該２塩基がどちらもグアニン塩基である場合は、全てがグアニン塩基のみである連続する８塩基により構成され（すなわち、塩基配列が「ＧＧＧＧＧＧＧＧ」）、より好ましい配列である（核酸名（ＤＮＡ）：「ｐｏｌｙ−ｄＧ８」）。
【００３７】
本発明の核酸は、その塩基長が９塩基の場合は、グアニン塩基７塩基および任意の２塩基（グアニン塩基を含む）で構成され、当該２塩基の配置される位置は当該配列中で任意である。このうち、連続するグアニン７塩基の配列を有し、その両末端に任意の１塩基ずつを含むことまたはそのいずれかの末端に任意の２塩基を含むことが好ましい。また当該２塩基がどちらもグアニン塩基である場合は、全てがグアニン塩基のみである連続する９塩基により構成され（すなわち、塩基配列が「ＧＧＧＧＧＧＧＧＧ」）、より好ましい配列である。
【００３８】
本発明の核酸は、その塩基長が１０塩基の場合は、グアニン塩基７塩基および任意の３塩基（グアニン塩基を含む）で構成され、当該３塩基の配置される位置は当該配列中で任意である。このうち、連続するグアニン７塩基の配列を有し、その両末端に任意の１塩基もしくは２塩基を含むことまたはそのいずれかの末端に任意の３塩基を含むことが好ましい。また、当該３塩基の全てがグアニン塩基である場合は、全てがグアニン塩基のみである連続する１０塩基により構成され、より好ましい配列である（核酸名（ＤＮＡ）：「ｐｏｌｙ−ｄＧ１０」、配列番号１）。
【００３９】
本発明の核酸は、その塩基長が１１塩基の場合は、グアニン塩基８塩基および任意の３塩基（グアニン塩基を含む）で構成され、当該３塩基の配置される位置は当該配列中で任意である。このうち、連続するグアニン８塩基の配列を有し、その両末端に任意の１塩基もしくは２塩基を含むことまたはそのいずれかの末端に任意の３塩基を含むことが好ましい。また、当該３塩基の全てがグアニン塩基である場合は、全てがグアニン塩基のみである連続する１１塩基により構成され、より好ましい配列である（配列番号２）。
【００４０】
本発明の第二の態様は、核酸のハイブリダイゼーションにおいて使用するハイブリダイゼーション用試薬であって、本発明の核酸を含む試薬である。
【００４１】
本発明のハイブリダイゼーション用試薬は、本発明の核酸を含む溶液として調製できる。本発明のハイブリダイゼーション用試薬に含まれる本発明の核酸の濃度は、０．３μＭ−１００μＭが好ましい。高濃度の核酸溶液は粘性を有するために、実験操作および製造管理の観点から、０．３μＭ−３０μＭで使用することがより好ましい。本発明の核酸の濃度は、使用目的や使用方法に応じて適宜選択することができる。
【００４２】
本発明のハイブリダイゼーション用試薬は、多糖を含むことができ、好ましくはデキストラン硫酸ナトリウムを含むことができる。デキストラン硫酸ナトリウムは、その水和作用により標的核酸の濃度を高めた状態を模倣できることから、ハイブリダイゼーションの反応速度を高める効果が期待できる。デキストラン硫酸ナトリウムの濃度は、１−３０重量％が好ましく、より好ましくは１−２０重量％であり、さらに３−１０重量％で使用することが最も好ましい。また、デキストラン硫酸ナトリウムの分子量は３，０００−１００，０００Ｄａの範囲で利用することが可能である。より好ましくは、分子量５，０００−３０，０００Ｄａのデキストラン硫酸ナトリウムを使用する。
【００４３】
本発明のハイブリダイゼーション用試薬には、変性剤を含むことができる。例えば、ホルムアミドまたはジメチルスルホキシドを含むことができる。ホルムアミドまたはジメチルスルホキシドは、核酸塩基間の水素結合を弱める作用があり、水素結合数の異なるＡ−Ｔ間、Ｇ−Ｃ間の結合親和性を調節することにより、ハイブリダイゼーションの結合特異性を向上させる効果が期待できる。ホルムアミドの濃度は、１−５０容量％が好ましく、より好ましくは１−３０容量％であり、さらに３−２５容量％で使用することが最も好ましい。ジメチルスルホキシドの濃度は、１−４０容量％が好ましく、より好ましくは１−２０容量％であり、３−１０容量％で使用することが最も好ましい。
【００４４】
本発明のハイブリダイゼーション用試薬には、タンパク質に対する非特異的吸着の抑制剤を含むこともできる。当該抑制剤としては、牛血清アルブミン（ＢＳＡ）を用いることが好ましい。ＢＳＡは、バックグラウンドノイズとなる非特異的吸着を抑制することにより、シグナル／ノイズ比が向上する効果が期待できる。ＢＳＡ等の非特異的吸着抑制剤の濃度は、１−１００ｍｇ／ｍＬが好ましく、より好ましくは５−５０ｍｇ／ｍＬであり、１０ｍｇ／ｍＬで使用することが最も好ましい。
【００４５】
本発明のハイブリダイゼーション用試薬には、ハイブリダイゼーション反応の感度を高めるために有用な物質を含んでもよい。例えば、ハイブリダイゼーション反応中に生じる気泡は、ハイブリダイゼーション反応を物理的に阻害するおそれがあるため、気泡の発生を抑制する消泡剤等を含んでいてもよい。消泡剤の例としては、界面活性剤であるＴｗｅｅｎ２０（商品名）、Ｔｗｅｅｎ６０（商品名）、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００（商品名）、あるいはシリコーンオイル等を挙げることができる。また、消泡剤の使用濃度は、特に限定されず、通常、０．００１−１０重量％程度、好ましくは０．０１−１重量％程度である。
【００４６】
本発明のハイブリダイゼーション用試薬は、上記した本発明の核酸を含むこと以外は周知の組成を採用することができ、具体的な調製例としては、例えば、「Ｋｕ ＷＣ．ら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎs、２００４年、第３１５巻、１号、ｐ．３０−３７」に記載の組成を参考として、「６×ＳＳＰＥ、０．１％ＳＤＳ、２５％ホルムアミド、１０ｍｇ/ｍＬ  ＢＳＡ、１０％デキストラン硫酸ナトリウム、１５μＭ  ｐｏｌｙ−ｄＧ５」とすることができる。
【００４７】
本発明の第三の態様は、核酸のハイブリダイゼーション方法であって、本発明の核酸の非特異結合抑制剤を共存させて、または本発明のハイブリダイゼーション用試薬を使用して、ハイブリダイゼーションを行う方法である。
【００４８】
核酸のハイブリダイゼーション方法自体は、上記した本発明の核酸を共存させること以外は、周知の方法で行うことができ、例えば、「Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ら、（１９９８）  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  （２ｎｄ  ｅｄ．），Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ」に記載された方法を用いることができる。具体的には、予め相補鎖核酸プローブが固定化された支持体に、標的核酸と本発明の非特異的結合抑制剤または本発明のハイブリダイゼーション用試薬を添加し、一定温度にてインキュベートすることにより、ハイブリダイゼーションを行うことができる。本発明の非特異的結合抑制剤または本発明のハイブリダイゼーション用試薬の添加前に、標的核酸を高温にて一定時間熱変性させることで、より核酸結合の特異性を向上させることも可能である。また、標的核酸と相補鎖核酸プローブ、および本発明の非特異的結合抑制剤またはハイブリダイゼーション用試薬を混合し、一定温度にてインキュベートすることによりハイブリダイゼーションを行った後に、相補鎖核酸プローブを支持体に固定化することも可能である。
【００４９】
本発明の第四の態様は、核酸の検出方法であって、本発明の核酸の非特異結合抑制剤を共存させてまたは本発明のハイブリダイゼーション用試薬を用いて、標的核酸とこれに特異的に結合可能な核酸とをハイブリダイゼーションさせる工程と、当該ハイブリダイゼーションで形成された核酸複合体を検出する工程とを含む方法である。
【００５０】
標的核酸とこれに特異的に結合可能な核酸とをハイブリダイゼーションさせる工程は、上記の本発明の第三の態様に記載した核酸のハイブリダイゼーション方法をそのまま適用して実施することができる。
【００５１】
ハイブリダイゼーション工程で形成された核酸複合体を検出する工程自体は、周知の核酸の検出方法を適用して行うことができる。例えば、ハイブリダイゼーション工程において、予め標的核酸を標識分子により標識することにより、核酸複合体の量を標識分子の量として検出することができる。標識分子としては、有機蛍光色素、燐光色素、量子ドット、蛍光タンパク質などの蛍光体、化学発光タンパク質、放射性同位体、電子の授受が可能な酸化還元種、アルカリフォスファターゼやホースラディッシュペルオキシダーゼなどの酵素自体、またはこれらの標識分子を含む核酸モノマー等を用いることができる。標識分子を含む核酸モノマーの場合は、標的核酸の末端に酵素反応的に導入することで標識可能である。
【００５２】
核酸複合体の検出は、感度面や簡便性から標識分子として蛍光体を用いることが好ましく、その場合は、核酸複合体の量を蛍光体の発する蛍光シグナル値として蛍光顕微鏡やプレートリーダー等で測定することが可能である。
【００５３】
核酸複合体の検出は、標的核酸とこれに特異的に結合可能な核酸プローブとの結合を、核酸インターカレーターの蛍光波長変化として検出することも可能である。核酸インターカレーターとしては、エチジウムブロマイド、「ＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｒｅｅｎ」、またはこれらの代替製品を使用することができる。例えば、核酸アレイを用いたハイブリダイゼーション工程後、標的核酸と核酸プローブとの複合体が形成された核酸アレイを核酸インターカレーター液に浸漬し、緩衝液等で洗浄した後、核酸複合体の量を核酸インターカレーターの発する蛍光シグナル値として蛍光顕微鏡やプレートリーダーで測定することが可能である。
【００５４】
複合体核酸の検出は、ｉｎ  ｓｉｔｕ  ハイブリダイゼーション、コロニーハイブリダイゼーション、ドットブロッティング、サザンブロッティング、ノーザンブロッティングなどの公知の方法、また、標的核酸に特異的に結合する核酸であって標的核酸に相補的な塩基配列を有する核酸（核酸プローブ）が支持体に固定化された核酸アレイ（ＤＮＡマクロアレイ、ＤＮＡチップ等）を用いて実施され得る。
【００５５】
核酸アレイとしては、一般に販売されているものを用いることができる。例えば、アフィメトリックス社の「ＧｅｎｅＣｈｉｐ（登録商標）Ａｒｒａｙｓ」、アジレント・テクノロジー社のオリゴＤＮＡチップ、東レ社の「３Ｄ−Ｇｅｎｅ（登録商標）」などが挙げられるが、支持体が樹脂製であるために核酸の物理的吸着が少なく、ハイブリダイゼーション溶液をマイクロビーズで攪拌することにより攪拌効率が向上した東レ社の「３Ｄ−Ｇｅｎｅ（登録商標）」を使用することが好ましい。
【実施例】
【００５６】
以下の実施例により本発明を具体的に説明するが、本発明は、実施例の範囲に限定されるものではなく、単に特許請求する発明について考えられる多くの実施形態のうちのいくつかを記載したにすぎない。【００５７】
実施例１、２、比較例１、２
核酸アレイとして、東レ社製のＤＮＡマイクロアレイ「３Ｄ−Ｇｅｎｅ（登録商標）  ｈｕｍａｎ  ｍｉＲＮＡ  ｏｌｉｇｏ  ｃｈｉｐ（ｍｉＲＢａｓｅ  ｒｅｌｅａｓｅ  ２１対応）」を用い、クロスハイブリダイゼーションを生じ得るｍｉＲＮＡであるｈｓａ−ｍｉＲ−６８５８−５ｐ（ｍｉＲＢａｓｅ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＭＩＭＡＴ００２７６１６、配列番号３）を標的核酸として選択し、ハイブリダイゼーション反応における本発明の核酸の非特異結合抑制剤のクロスハイブリダイゼーション抑制効果を評価した。【００５８】
標的核酸ｈｓａ−ｍｉＲ−６８５８−５ｐは、５’末端リン酸基修飾体として化学合成した（ファスマック社委託合成、ＨＰＬＣ精製グレード）。この標的核酸を蒸留水に溶解して２．５ｆｍｏｌ/μＬに調製し、その５ｆｍｏｌ分を「３Ｄ−Ｇｅｎｅ（登録商標）ｍｉＲＮＡ  ｌａｂｅｌｉｎｇ  ｋｉｔ」（東レ社）を用いて蛍光標識し、その標準プロトコールに従い、前記核酸アレイを用いてハイブリダイゼーションを行った。【００５９】
核酸の非特異結合抑制剤として「ｐｏｌｙ−ｄＧ５」（ファスマック社委託合成、逆相カラム精製グレード）を用い、「ｍｉＲＮＡ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ｂｕｆｆｅｒ Ｖ３」に対して、それぞれ最終濃度１μＭ（実施例１）、１０μＭ（実施例２）となるようにハイブリダイゼーション溶液を調製し、ハイブリダイゼーションに用いた。【００６０】
また、比較対照として、サケ精子ＤＮＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、型番：１５６３２０１１）を最終濃度９２μｇ／ｍＬ（比較例１）、「Ｒａｎｄｏｍ  Ｐｒｉｍｅｒ（Ｎ）９」(タカラバイオ社、型番：３８０２)を最終濃度６．５μｇ／ｍＬ（２．２μＭ相当）（比較例２）として、それぞれハイブリダイゼーション溶液を調製し、ハイブリダイゼーションを行った。【００６１】
ハイブリダイゼーション後のＤＮＡマイクロアレイを「マイクロアレイスキャナー」（東レ社）に供して蛍光強度を測定した。スキャナーの設定は、レーザー出力１００％、フォトマルチプライヤーの電圧設定をＡＵＴＯ設定にした。数値化ソフトウェア「“３Ｄ−Ｇｅｎｅ”  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ」（東レ社）を用いて、得られたスキャン画像の各スポットの蛍光強度をシグナル値として数値化した。標的核酸のシグナル値と、クロスハイブリダイゼーションとして検出されたシグナルのうち最も高かったｈｓａ−ｍｉＲ−４４９８（ｍｉＲＢａｓｅ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＭＩＭＡＴ００１９０３３、配列番号４）のシグナル値との比（ｈｓａ−ｍｉＲ−６８５８−５ｐのシグナル値／ｈｓａ−ｍｉＲ−４４９８のシグナル値）をＳ／Ｎ比として算出した。【００６２】
その結果を図１に示す。核酸の非特異結合抑制剤を非添加の場合のＳ／Ｎ比（１．５８）と比べて、サケ精子ＤＮＡを添加した場合のＳ／Ｎ比は、２．７８に向上しており、クロスハイブリダイゼーションの抑制効果が認められた。Ｒａｎｄｏｍ  Ｐｒｉｍｅｒ（Ｎ）９を添加した場合のＳ／Ｎ比は１．３３であり、クロスハイブリダイゼーションの抑制効果が認められなかった。一方、本発明の非特異結合抑制剤であるｐｏｌｙ−ｄＧ５を１μＭ、１０μＭの濃度で用いた場合には、それぞれＳ／Ｎ比は１．９５、２．４７となり、添加濃度に応じてクロスハイブリダイゼーションの抑制効果が向上した。つまり、ｐｏｌｙ−ｄＧ５は、少なくとも１μＭ以上の濃度でクロスハイブリダイゼーションの抑制効果を示すことがわかった。【００６３】
実施例３−８
核酸の非特異結合抑制剤として、「ｐｏｌｙ−ｄＧ５」（ファスマック社委託合成、ＨＰＬＣ精製グレード）を最終濃度１０μＭ（実施例３）、１５μＭ（実施例４）となるように、また「ｐｏｌｙ−ｄＧ７」（ファスマック社委託合成、ＨＰＬＣ精製グレード）を最終濃度１０μＭ（実施例５）、１５μＭ（実施例６）となるように、また「ｐｏｌｙ−ｄＧ１０」（ファスマック社委託合成、ＨＰＬＣ精製グレード、配列番号１）を最終濃度１０μＭ（実施例７）、１５μＭ（実施例８）となるように、それぞれハイブリダイゼーション溶液を調製し、ハイブリダイゼーションに用いたこと以外は、実施例１と同様にして、標的核酸ｈｓａ−ｍｉＲ−６８５８−５ｐのハイブリダイゼーションを行い、クロスハイブリダイゼーションの抑制効果を評価した。【００６４】
その結果を図２に示す。ｐｏｌｙ−ｄＧ５を１０μＭ、１５μＭで添加した場合、Ｓ／Ｎ比はそれぞれ３．１１、３．９２へと向上し、サケ精子ＤＮＡ（比較例１）以上のクロスハイブリダイゼーションの抑制効果を発揮した。また、ｐｏｌｙ−ｄＧ７を１０μＭ、１５μＭで添加した場合、ｐｏｌｙ−ｄＧ１０を１０μＭ、１５μＭで添加した場合、非添加の場合と比べて、それぞれＳ／Ｎ比が向上した。この結果から、塩基長が５−１０であるグアニン塩基連続配列を有する核酸は、クロスハイブリダイゼーションの抑制効果を有しており、なかでもｐｏｌｙ−ｄＧ５（１５μＭ）は突出して高いクロスハイブリダイゼーションの抑制効果を示すことがわかった。【００６５】
実施例９−１２
核酸の非特異結合抑制剤として、「ｐｏｌｙ−ｄＧ５」（ファスマック社委託合成、逆相カラム精製グレード）（実施例９）、「ＧＧＡＧＧ」（ファスマック社委託合成、ＨＰＬＣ精製グレード）（実施例１０）、「ＧＧＧＡＧ」（ファスマック社委託合成、ＨＰＬＣ精製グレード）（実施例１１）、「ＴＧＧＧＧ」（ファスマック社委託合成、ＨＰＬＣ精製グレード）（実施例１２）を最終濃度１５μＭとなるように、それぞれハイブリダイゼーション溶液を調製し、ハイブリダイゼーションに用いたこと以外は、実施例１と同様にして、標的核酸ｈｓａ−ｍｉＲ−６８５８−５ｐのハイブリダイゼーションを行い、クロスハイブリダイゼーションの抑制効果を評価した。【００６６】
その結果を図３に示す。本発明のいずれの核酸の非特異結合抑制剤を添加した場合にも、非添加の場合と比べて、Ｓ／Ｎ比が向上した。この結果から、高いクロスハイブリダイゼーションの抑制効果を示したｐｏｌｙ−ｄＧ５のようなグアニン塩基のみで構成される核酸ではなくても、グアニン塩基を高率に含む核酸は総じてクロスハイブリダイゼーションの抑制効果を有することがわかった。【００６７】
実施例１３
本発明の核酸の非特異結合抑制剤の製造ロット差によるクロスハイブリダイゼーション抑制効果への影響を評価した。【００６８】
核酸の非特異結合抑制剤として、「ｐｏｌｙ−ｄＧ５」（ファスマック社委託合成、逆相カラム精製グレード）の異なる製造ロットを４ロット用意し、実施例４（または実施例９）と同様にして、それぞれ最終濃度１５μＭとなるようハイブリダイゼーション溶液を調製し、各ロットについて４回ずつ（Ｎ＝４；４ロット合計で測定Ｎ＝１６）ハイブリダイゼーションを行った。【００６９】
その結果を図４に示す。ｐｏｌｙ−ｄＧ５の各ロット（Ｎ＝４）のＳ／Ｎ比の平均値およびＣＶ値は、ロット１：平均値３．７５およびＣＶ値４．２５％、ロット２：平均値３．７９およびＣＶ値３．８２％、ロット３：平均値３．６９およびＣＶ値４．２２％、ロット４：平均値３．６０およびＣＶ値５．３３％であり、４ロット全体では平均値３．７１およびＣＶ値４．４７％であった。本発明の核酸の非特異結合抑制剤は、製造ロット間での大きな性能差はなく、安定したクロスハイブリダイゼーションの抑制効果を発揮した。【００７０】
比較例３
従来使用されてきた核酸の非特異結合抑制剤として、サケ精子ＤＮＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、型番：１５６３２０１１）の異なる製造ロットを４ロット用意し、実施例１３と同様にして、それぞれ最終濃度９２μｇ／ｍＬとなるようハイブリダイゼーション溶液を調製し、各ロットについて４回ずつ（Ｎ＝４；４ロット合計で測定Ｎ＝１６）ハイブリダイゼーションを行った。【００７１】
その結果を図５に示す。サケ精子ＤＮＡの各ロット（Ｎ＝４）のＳ／Ｎ比の平均値およびＣＶ値は、ロット１：平均値２．４３およびＣＶ値３．２４％、ロット２：平均値２．７２およびＣＶ値５．２６％、ロット３：平均値２．９０およびＣＶ値３．２０％、ロット４：平均値２．６３およびＣＶ値５．５１％であり、４ロット全体では平均値２．６７およびＣＶ値７．７５％であった。本発明の核酸の非特異結合抑制剤と比較して、従来使用されてきたサケ精子ＤＮＡは、クロスハイブリダイゼーションの抑制効果に大きなロット間差が存在することが示された。
【配列表フリーテキスト】
【００７２】
配列番号１：  Designed Sequence, poly-dG10
配列番号２：  Designed Sequence
【図１】
2020090822.tif 000003
【図２】
2020090822.tif 000004
【図３】
2020090822.tif 000005
【図４】
2020090822.tif 000006
【図５】
2020090822.tif 000007
【配列表】
2020090822000001.app
【国際調査報告】
2020090822.tif 000008
2020090822.tif 000009