(57)【要約】  本発明は、目的遺伝子を双子葉植物の種子胚、発芽種子または幼植物体に電気穿孔法により直接導入することを含む、双子葉植物への遺伝子導入方法、目的遺伝子を双子葉植物の種子胚、発芽種子または幼植物体に電気穿孔法により直接導入することを含む、遺伝子導入双子葉植物の作製方法、ならびにゲノム編集に用いられるタンパク質をコードする遺伝子を双子葉植物の種子胚、発芽種子または幼植物体に電気穿孔法により直接導入することを含む、ゲノム編集双子葉植物の作製方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
目的遺伝子を双子葉植物の種子胚、発芽種子または幼植物体に電気穿孔法により直接導入することを含む、双子葉植物への遺伝子導入方法。
【請求項２】
目的遺伝子が植物体への再生が可能なシュート頂を含む組織に導入されるものである請求項１記載の方法。
【請求項３】
目的遺伝子が植物体への再生が可能なシュート頂を含む組織で発現可能なプロモーターを含むベクターに挿入されている、請求項１または２記載の方法。
【請求項４】
目的遺伝子を植物中で一過的に発現させるものである請求項１〜３のいずれか１項記載の方法。
【請求項５】
目的遺伝子を双子葉植物の種子胚、発芽種子または幼植物体に電気穿孔法により直接導入し、次いで、目的遺伝子を導入した種子胚、発芽種子または幼植物体を成長させることを含む、遺伝子導入双子葉植物の作製方法。
【請求項６】
目的遺伝子が植物体への再生が可能なシュート頂を含む組織に導入されるものである請求項５記載の方法。
【請求項７】
目的遺伝子が植物体への再生が可能なシュート頂を含む組織で発現可能なプロモーターを含むベクターに挿入されている、請求項５または６記載の方法。
【請求項８】
目的遺伝子を植物中で一過的に発現させるものである請求項５〜７のいずれか１項記載の方法。
【請求項９】
ゲノム編集に用いられるタンパク質をコードする遺伝子を双子葉植物の種子胚、発芽種子または幼植物体に電気穿孔法により直接導入し、次いで、目的遺伝子を導入した種子胚、発芽種子または幼植物体を成長させることを含む、ゲノム編集双子葉植物の作製方法。
【請求項１０】
ゲノム編集に用いられるタンパク質をコードする遺伝子が植物体への再生が可能なシュート頂を含む組織に導入されるものである請求項９記載の方法。
【請求項１１】
植物体への再生が可能なシュート頂を含む組織で発現可能なプロモーターを含むベクターにゲノム編集に用いられるタンパク質をコードする遺伝子を挿入して、植物に導入する、請求項９または１０記載の方法。
【請求項１２】
ゲノム編集に用いられるタンパク質をコードする遺伝子を植物中で一過的に発現させるものである請求項９〜１１のいずれか１項記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、植物の育種に関する。詳細には、本発明は、植物細胞への遺伝子導入手段および方法、遺伝子導入植物の作製方法、ならびにゲノム編集植物の作製方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
植物細胞への遺伝子導入にはアグロバクテリウムを用いた方法が広く利用されているが、植物種によっては、アグロバクテリウムの感染が可能でない、あるいは可能であっても形質転換が行えないものがある。さらにアグロバクテリウムを利用する場合には、アグロバクテリウムの感染後に植物体の再生技術が必須であり、再生技術が確立されていない植物では、アグロバクテリウムによる遺伝子導入法は利用できなかった。ジーンガン法やウィスカー法による直接遺伝子導入法も同様に、組織培養による再生技術が必要である。【０００３】
遺伝子の直接導入法として電気穿孔（エレクトロポレーション）法もあるが、この方法を実施するために植物プロトプラストを作成する必要がある（非特許文献１〜３）。遺伝子導入後にプロトプラストから植物体を再生させることも必要であり、再生が困難な場合もある。そのため、プロトプラストを用いた電気穿孔法は簡便な遺伝子導入法とはいえない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Fromm M, Taylor LP, Walbot V (1985) Expression of genes transferred into monocot and dicot plant cells by electroporation. Proc Natl Acad Sci USA, 82:5824-5828.
【非特許文献２】Riggs CD, Bates GW (1986) Stable transformation of tobacco by electroporation: evidence for plasmid concatenation. Proc Natl Acad Sci USA, 83(15):5602-5606.
【非特許文献３】Joersbo M, Brunstedt J (1990) Direct gene transfer to plant protoplasts by electroporation by alternating, rectangular and exponentially decaying pulses. Plant Cell Rep, 8:701-705.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
アグロバクテリウムの感染によらず、しかも組織培養による植物個体への再生技術を必要としない、植物への直接遺伝子導入法およびその成果物の作製方法であって、しかも簡便かつ短時間で済む方法が望まれていた。また、特にゲノム編集技術との組み合わせにおいて、遺伝子組み換え体でない変異植物の作製も望まれていた。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を重ね、双子葉植物の種子胚、発芽種子または幼植物体に電気穿孔法により目的遺伝子を直接導入することに成功した。本発明者らは、かかる成功に基づいて本発明を完成させた。本発明は以下のものを提供する。
（１）目的遺伝子を双子葉植物の種子胚、発芽種子または幼植物体に電気穿孔法により直接導入することを含む、双子葉植物への遺伝子導入方法。
（２）目的遺伝子が植物体への再生が可能なシュート頂を含む組織に導入されるものである（１）記載の方法。
（３）目的遺伝子が植物体への再生が可能なシュート頂を含む組織で発現可能なプロモーターを含むベクターに挿入されている、（１）または（２）記載の方法。
（４）目的遺伝子を植物中で一過的に発現させるものである（１）〜（３）のいずれかに記載の方法。
（５）目的遺伝子を双子葉植物の種子胚、発芽種子または幼植物体に電気穿孔法により直接導入し、次いで、目的遺伝子を導入した種子胚、発芽種子または幼植物体を成長させることを含む、遺伝子導入双子葉植物の作製方法。
（６）目的遺伝子が植物体への再生が可能なシュート頂を含む組織に導入されるものである（５）記載の方法。
（７）目的遺伝子が植物体への再生が可能なシュート頂を含む組織で発現可能なプロモーターを含むベクターに挿入されている、（５）または（６）記載の方法。
（８）目的遺伝子を植物中で一過的に発現させるものである（５）〜（７）のいずれかに記載の方法。
（９）ゲノム編集に用いられるタンパク質をコードする遺伝子を双子葉植物の種子胚、発芽種子または幼植物体に電気穿孔法により直接導入し、次いで、目的遺伝子を導入した種子胚、発芽種子または幼植物体を成長させることを含む、ゲノム編集双子葉植物の作製方法。
（１０）ゲノム編集に用いられるタンパク質をコードする遺伝子が植物体への再生が可能なシュート頂を含む組織に導入されるものである（９）記載の方法。
（１１）ゲノム編集に用いられるタンパク質をコードする遺伝子が植物体への再生が可能なシュート頂を含む組織で発現可能なプロモーターを含むベクターに挿入されている、（９）または（１０）記載の方法。
（１２）ゲノム編集に用いられるタンパク質をコードする遺伝子を植物中で一過的に発現させるものである（９）〜（１１）のいずれかに記載の方法。
【発明の効果】
【０００７】
本発明によれば、アグロバクテリウムの感染によらず、しかも組織培養による再生技術を必要としない、直接遺伝子導入法およびその成果物の作製方法が提供される。本発明の方法によれば、従来法に比べて簡便にかつ短期間で成果物を作出することができる。本発明の方法によれば、植物組織へ一過的に導入した遺伝子を細胞内で働かせることが可能になる。本発明の方法を用いて、ゲノム編集ツールを植物に導入し一過的に発現させることにより、遺伝子組換えとならない変異植物系統を得ることが可能である。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】図１は、ｐＣＲ８＿Ｐ３５ｓＧＦＰ（図１ａ）およびｐＣＲ８＿Ｐａｅｆ１ＧＦＰの構造（図１ｂ）を示す。図１ａにおいて、Ｐｒｏ  ２ｘ３５Ｓは、２ｘカリフラワーモザイクウィルス３５Ｓ遺伝子プロモーターおよびオメガ翻訳エンハンサー配列を示す。Ｔｅｒ  １８．２は、シロイヌナズナ熱ショックタンパク質１８．２ｋＤａ遺伝子ターミネーターを示す。図１ｂにおいて、Ｐｒｏ  ａｅｆ１は、シロイヌナズナ翻訳伸長因子１Ａ遺伝子プロモーターを示す。Ｔｅｒ  １８．２は、シロイヌナズナ熱ショックタンパク質１８．２ｋＤａ遺伝子ターミネーターを示す。
【図２】図２は、電気穿孔法によるｐＣＲ８＿Ｐ３５ｓＧＦＰおよびｐＣＲ８＿Ｐａｅｆ１ＧＦＰ導入植物体のＧＦＰ発現を調べた結果を示す。図２ａは、ｐＣＲ８＿Ｐ３５ｓＧＦＰ導入  ４８時間後のシロイヌナズナ幼植物体を示す。図２ｂは、ｐＣＲ８＿Ｐａｅｆ１ＧＦＰ導入  ４８時間後のシロイヌナズナ幼植物体を示す。図２ｂにおいて、ＧＦＰ蛍光が観察された茎頂を白矢印で示す。
【図３】図３は、ゲノム編集ベクターｐＤｇＰａｅｆ０３７の構造（図３ａ）およびシロイヌナズナＯＳＴ２遺伝子の標的配列（図３ｂ）を示す。図３ａにおいて、Ｕ６は、シロイヌナズナＵ６  ｓｎＲＮＡ遺伝子プロモーターを示す。ｇＲＮＡは、標的認識配列を含むガイドＲＮＡを示す。Ｐｒｏ  ａｅｆ１は、シロイヌナズナ翻訳伸長因子１Ａ遺伝子プロモーターを示す。Ｃａｓ９は、３ｘ核移行シグナルを含むＣａｓ９を示す。２Ａは、Ｔｈｏｓｅａ  ａｓｉｇｎａ由来自己開裂ペプチド２Ａ配列を示す。Ｔｅｒ  １８．２は、シロイヌナズナ熱ショックタンパク質１８．２ｋＤａ遺伝子ターミネーターを示す。図３ｂにおいて、小文字はＳｐＣａｓ９のＰＡＭ配列を示す。
【図４】図４は、シロイヌナズナＯＳＴ２遺伝子上に導入された変異配列解析結果を示す。図４ａは、シーケンス解析による遺伝子導入当代植物体の変異解析結果を示す。図４ｂは、シーケンス解析による遺伝子導入当代植物体の変異解析結果を示す。下線は標的配列を示し、枠内はＳｐＣａｓ９のＰＡＭ配列を示す。ハイフン（−）は塩基欠失を、黒色太文字小文字アルファベットは塩基挿入を示す。各配列の右側に、体細胞変異効率（変異配列が確認されたクローン数／解析クローン総数）を示す。
【図５】図５は、電気穿孔法処理植物体の次世代におけるプラスミドのゲノムへの組込みの有無を調べた結果を示す。
【図６】図６は、電気穿孔法によるｐＤｇＰａｅｆ０３７導入ダイコン植物体のＧＦＰ発現を調べた結果を示す。図６ａは、未処理の野生型ダイコン幼植物体を示す。図６ｂは、ｐＤｇＰａｅｆ０３７導入  ４８時間後のダイコン幼植物体を示す。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
本発明は、１の態様において、目的遺伝子を双子葉植物の種子胚、発芽種子または幼植物体に電気穿孔法により直接導入することを含む、双子葉植物への遺伝子導入方法を提供する。
【００１０】
本発明は、もう１つの態様において、目的遺伝子を双子葉植物の種子胚、発芽種子または幼植物体に電気穿孔法により直接導入し、次いで、目的遺伝子を導入した種子胚、発芽種子または幼植物体を成長させることを含む、遺伝子導入双子葉植物の作製方法を提供する。
【００１１】
本発明において、目的遺伝子は、双子葉植物の細胞に導入されるべき遺伝子である。目的遺伝子の種類は特に限定されず、いずれの種類であってもよい。例えば、目的遺伝子は、中性タンパク質、酸性タンパク質、塩基性タンパク質をコードしていてもよい。また例えば目的遺伝子は、病虫害に対する抵抗性を植物に付与するタンパク質をコードしていてもよい。目的遺伝子がコードするタンパク質のサイズや形態も特に限定されない。目的遺伝子がコードするタンパク質は天然のタンパク質であってもよく、遺伝子組換えや突然変異などにより改変されたものであってもよい。
【００１２】
双子葉植物は、被子植物のうち子葉が２枚のものである。膨大な種類の双子葉植物が知られており、いずれの種類の双子葉植物であっても本発明の方法にて遺伝子導入を行うことができる。本発明の方法は、とりわけ組織培養や植物体再生が困難な双子葉植物の遺伝子導入に好ましく用いられる。本発明はあらゆる双子葉植物に適用できる。組織培養や植物体再生が困難な双子葉植物の例としては、トマト、ダイズ、アズキ、ソバ、ダイコン、エンドウ、サツマイモ、ジャガイモなどが挙げられるが、これらに限定されない。
【００１３】
種子胚は、種子中にある発芽前の植物体をいう。
【００１４】
発芽種子は、幼根が出現した種子をいう。種子の発芽は、種子が吸水して、幼根が種皮を破って出現するまでの過程をいう。本明細書において、発芽種子は、上記発芽過程にある種子も包含するものとする。
【００１５】
幼植物体は、発根した若い植物体をいう。幼植物体は、幼根が出現した種子、ならびに子葉や第一葉および第二葉のある若い植物体を包含する。
【００１６】
本発明において、種子胚、発芽種子または幼植物体のいずれにも遺伝子導入できるが、好ましくは発芽種子に遺伝子導入する。
【００１７】
種子の発芽方法および条件は公知である。発芽方法および条件は、一般的には、種子を滅菌水に浸漬して吸水させた後、適切な培地にて適切な明暗周期のもと培養することにより発芽させることができる。これらの条件は、植物の種類や種子の状態、サイズ等に応じて選択することができる。
【００１８】
本発明において、目的遺伝子は電気穿孔法によって植物に直接導入される。電気穿孔法は公知の方法である。電気穿孔法を用いて、キュベットと呼ばれる容器中の細胞懸濁液に電気パルスをかけることで細胞膜に微小な穴を空け、遺伝子を細胞内部に送り込むことができる。キュベット体積、電極間距離、電圧、内部抵抗、キャパシタンス、パルス波形、パルス回数、バッファーの組成などの電気穿孔法の条件は、公知の条件であってもよく、当業者が簡単な予備試験を行って決定できるものであってもよい。これらの条件は、植物の種類、種子胚、発芽種子、幼植物体の状態やサイズ、装置の性能に応じて選択することができる。様々な電気穿孔装置が市販されており、キュベット等の部品も様々なものが用意されているので、当業者はこれらを適宜選択して用いることができ、あるいは電気穿孔装置やその部品を作製することもできる。
【００１９】
本発明において、目的遺伝子は種子胚、発芽種子または幼植物体のいずれの組織に導入されてもよいが、好ましくはそれらの植物体への再生が可能なシュート頂を含む組織に導入される。したがって、本発明において、植物体への再生が可能なシュート頂を含む組織で発現可能なプロモーターを含むベクターに目的遺伝子を挿入して、植物に導入することが好ましい。植物体への再生が可能なシュート頂を含む組織は、例えば茎頂や側芽があげられる。植物体への再生が可能なシュート頂として、組織培養により得られる不定芽を用いることもできる。
【００２０】
植物体への再生が可能なシュート頂を含む組織で発現可能なプロモーターとして、シロイヌナズナ翻訳伸長因子遺伝子プロモーター、シロイヌナズナＷＵＳＣＨＥＬ遺伝子プロモーター、あるいはリボソームタンパク質Ｐ１６遺伝子プロモーターなどが挙げられるが、これらのプロモーター配列に限定されない。このようなプロモーターは、当業者が容易に作製できるものであり、また市販もされている。
【００２１】
本発明において、植物中で導入遺伝子を恒常的に発現させてもよく、一過的に発現させてもよい。恒常的発現に用いるベクター、および一過的発現に用いるベクターは公知であり、適宜選択して使用することができる。
【００２２】
電気穿孔を行った後、種子胚、発芽種子または幼植物体を培養して、植物を成長させてもよい。これらの方法や条件は公知である。一般的には、電気穿孔を行った後、種子胚、発芽種子または幼植物体を暗所で培養し、次いで、適切な培地中、適切な明暗周期のもとで培養して植物体を成長させることができる。これらの条件は、植物の種類や種子胚、発芽種子または幼植物体の状態に応じて選択することができる。
【００２３】
遺伝子導入の結果、発現するタンパク質の確認方法は公知であり、様々な方法が知られている。例えば、目的タンパク質にＧＦＰなどの蛍光タンパク質が融合している場合は、蛍光顕微鏡を用いて行うことができる。また例えば、薬剤耐性遺伝子とともに目的遺伝子を導入する場合は、当該薬剤耐性を指標にしてタンパク質の発現を確認することができる。
【００２４】
本発明における植物組織への目的遺伝子の導入効率は極めて高く、例えば数％〜約２０％あるいは約２０％以上であり得る。これらの値は、従来法を用いた場合よりも遙かに高い。
【００２５】
本発明は、さらにもう１つの態様において、ゲノム編集に用いられるタンパク質をコードする遺伝子を双子葉植物の種子胚、発芽種子または幼植物体に電気穿孔法により直接導入し、次いで、目的遺伝子を導入した種子胚、発芽種子または幼植物体を成長させることを含む、ゲノム編集双子葉植物の作製方法を提供する。
【００２６】
本発明の方法を用いて、ゲノム編集に用いられるタンパク質をコードする遺伝子を植物に一過的に導入することにより、遺伝子組み換え体でないゲノム編集双子葉植物を得ることができる。このことは、作物植物の育種や品種改良により好ましい。ゲノム編集に用いられるタンパク質としてはＣａｓ９、ＺＮＦ、ＴＡＬＥＮなどが例示されるが、これらに限定されない。Ｃａｓ９をコードする遺伝子を本発明の方法を用いて植物に導入する場合は、ガイドＲＮＡをとともに導入する。Ｃａｓ９をコードする遺伝子とガイドＲＮＡを１つのベクターに挿入して植物に導入してもよく、これらを別々のベクターに挿入して植物に導入してもよい。好ましくは、Ｃａｓ９をコードする遺伝子とガイドＲＮＡを１つのベクターに挿入して植物に導入する。
【００２７】
本発明の双子葉植物への遺伝子導入方法および遺伝子導入双子葉植物の作製方法に関する本明細書中の説明は、ゲノム編集双子葉植物の作製方法にもあてはまる。
【００２８】
本発明は、さらなる態様において、上で説明したいずれかの本発明の方法を実施するために用いられるキットであって、植物体への再生が可能なシュート頂を含む組織で発現可能なプロモーターを含むベクターを含むキットを提供する。目的遺伝子を該ベクターに挿入して、上記のいずれかの本発明の方法を実施することができる。目的遺伝子はいずれの遺伝子であってもよく、例えばゲノム編集に用いられるタンパク質をコードする遺伝子であってもよい。通常、キットには取り扱い説明書が添付される。
【００２９】
本明細書中の用語は、特に断らないかぎり、植物学、遺伝学および生化学等の分野において一般的に理解されている意味に解される。
【００３０】
以下に実施例を示して本発明をより詳細かつ具体的に説明するが、本発明の範囲は実施例によって限定されるものではない。
【実施例１】
【００３１】
実施例１．シロイヌナズナ幼植物体組織への直接遺伝子導入
（１）シロイヌナズナ幼植物体の育成
植物組織への電気穿孔法による直接遺伝子導入の実施例として、シロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）幼植物体への導入実験を行った。次亜塩素酸を用いて表面殺菌を行ったシロイヌナズナの種子を滅菌水に浸漬し、４℃、暗所にて一晩静置した後、１％スクロースを含むＭＳ液体培地に再懸濁し、照度１０，０００ルクス、温度２３℃、および光周期：１６時間明期／８時間暗期の条件で２４−３６時間培養し、発芽を行った。発芽種子は再び滅菌水で数回の洗浄を行った後、電気穿孔実験に用いた。【００３２】
（２）直接遺伝子導入用ベクター
シロイヌナズナ幼植物体への直接遺伝子導入実験の実証例としてＧＦＰ遺伝子（配列番号：３）の導入を行った。用いたベクターを図１に示す。ＧＦＰ遺伝子の発現制御には、２Ｘカリフラワーモザイクウィルス３５Ｓ遺伝子プロモーター（配列番号：１）、オメガ翻訳エンハンサー配列（配列番号：２）およびシロイヌナズナ熱ショックタンパク質１８．２ｋＤａ遺伝子ターミネーター（Ｔｅｒ  １８．２）（配列番号：４）により発現制御を行った。ＧＦＰ遺伝子発現カセットをｐＣＲ８ＴＯＰＯ（登録商標）ベクター（Thermofisher Scientific社製）に組込んだｐＣＲ８＿Ｐ３５ｓＧＦＰを構築した（図１ａ）。この他に、ＧＦＰ遺伝子の発現制御プロモーターとしてシロイヌナズナ翻訳伸長因子１Ａ遺伝子プロモーター（Ｐｒｏ  ａｅｆ１）（配列番号：５）を用いたｐＣＲ８＿Ｐａｅｆ１ＧＦＰを構築した（図１ｂ）。この実験では、２Ｘカリフラワーモザイクウィルス３５Ｓ遺伝子プロモーターおよびシロイヌナズナ翻訳伸長因子１Ａ遺伝子プロモーターを使用したが、本発明の使用形態の一例であり、これらのプロモーターに限定されるものではない。構築したプラスミドは、EndoFree Plasmid Mega kit（QIAGEN社製）により大量プラスミドＤＮＡ調製を行い、電気穿孔法に用いた。【００３３】
（３）シロイヌナズナ発芽幼植物体への電気穿孔法によるＧＦＰ遺伝子導入
３０−４０粒シロイヌナズナ発芽種子を５００μＬの電気穿孔用バッファーに懸濁した。電気穿孔用バッファーは、１００μｇのプラスミドＤＮＡの他、塩化カルシウム、細胞壁分解酵素、浸透圧調整剤などを含んでいた。【００３４】
電気穿孔用バッファーに懸濁した種子は、減圧処理を行った後、直ちにＮＥＰＡ２１（ネッパジーン社製）を用い、１００−３００Ｖのポアリングパルスおよび１０−２５Ｖのトランスファーパルスの印加を行った。【００３５】
電気穿孔処理を行った種子は滅菌水にて数回洗浄を行った後、１％スクロースを含むＭＳ液体培地に懸濁し、暗所、温度２３℃の条件で一晩培養を行った後、照度１０，０００ルクス、温度２３℃、および光周期：１６時間明期／８時間暗期の条件で移し、培養を続けた。遺伝子導入後２４時間から７２時間の間に蛍光実体顕微鏡により導入されたＧＦＰ遺伝子の一過的発現を観察した。ｐＣＲ８＿Ｐ３５ｓＧＦＰおよびｐＣＲ８＿Ｐａｅｆ１ＧＦＰのいずれのプラスミド導入においても、導入４８時間程度で明確なＧＦＰ発現による蛍光が観察され、電気穿孔法処理した種子の約２０％においてＧＦＰ蛍光が認められた（図２）。またｐＣＲ８＿Ｐａｅｆ１ＧＦＰでは、シロイヌナズナ茎頂部分において特異的なＧＦＰ発現が観察された（図２ｂ）。
【実施例２】
【００３６】
実施例２. シロイヌナズナ幼植物体組織への一過的直接遺伝子導入によるゲノム編集
シロイヌナズナ幼植物体への直接遺伝子導入実施例の一形態として、ゲノム編集ベクターを直接遺伝子導入し一過的な遺伝子発現により導入した遺伝子が有効に機能することを実証した。【００３７】
（１）ゲノム編集ベクターの構造
ゲノム編集としてＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムを用い、ゲノム編集ベクターを構築した。Ｃａｓ９遺伝子（配列番号：６）およびＧＦＰ遺伝子をＴｈｏｓｅａ  ａｓｉｇｎａ由来自己開裂ペプチド２Ａ配列（配列番号：７）により連結し、シロイヌナズナ翻訳伸長因子１Ａ遺伝子プロモーターおよびシロイヌナズナ熱ショックタンパク質１８．２ｋＤａ遺伝子ターミネーターにより発現制御を行った。また標的配列認識を行なうｇＲＮＡ（配列番号：９）の発現には、シロイヌナズナＵ６  ｓｎＲＮＡ遺伝子プロモーター（配列番号：８）を用いた。標的としてシロイヌナズナＯＳＴ２遺伝子を選び、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９の標的配列として５’−ＣＡＧＴＧＣＣＧＡＡＡＣＣＡＴＴＣＧＴＡｇｇｇ−３’（配列番号：１０）（小文字はＳｐＣａｓ９のＰＡＭ配列を示す）を設計した。構築したゲノム編集ベクターｐＤｇＰｑｅｆ０３７を図３に示す。【００３８】
（２）電気穿孔法およびシロイヌナズナ植物体の育成
電気穿孔法およびシロイヌナズナ植物体の育成は、実施例１と同様に行った。【００３９】
（３）ｐＤｇＰａｅｆ０３７導入植物体の変異解析
前述、電気穿孔法によりｐＤｇＰａｅｆ０３７を導入した植物体のうち、茎頂部分においてＧＦＰ蛍光が観察された植物体の本葉からゲノムＤＮＡを調製した。ゲノ
ムＤＮＡは、NucleoSpin（登録商標）Plant IIキット（タカラバイオ社製）を用いて、メーカーの提供するプロトコールに従って行った。ＯＳＴ２遺伝子の標的配列近傍を、TaKaRa Ex Taq（登録商標）Hot Start Version（タカラバイオ社製）を用いて増幅した。得られたＰＣＲ産物を用いてＣｅｌ−１解析あるいはヘテロ二本鎖移動度分析により変異解析を行い、変異導入が確認された植物体については、さらにシーケンス解析により変異配列を解析した。茎頂部分においてＧＦＰ蛍光が観察された植物体から発生した本葉を用いてシーケンス解析を行った結果、図４ａに示すＯＳＴ２遺伝子の標的配列部に変異が導入されており、変異導入効率は約２０％であった。次に変異導入が確認された植物体の次世代種子を得、次世代における変異と導入プラスミドのゲノムへの組込みを解析した。電気穿孔処理当代においてＯＳＴ２遺伝子の標的に変異が生じた植物体から得られた次世代植物体では、変異が伝搬しており、変異はｂｉ−ａｌｌｅｌｉｃに生じた次世代個体が得られた。また、次世代植物体ゲノムにおける電気穿孔法導入したプラスミドＤＮＡの組込みをＰＣＲ法により解析したところ、ｐＤｇＰａｅｆ１のＣａｓ９遺伝子およびｇＲＮＡ配列はゲノムに組み込まれていないと考えられた（図５）。【００４０】
実施例３．  ダイコン幼植物体組織への一過的直接遺伝子導入によるゲノム編集
（１）植物組織への電気穿孔法による直接遺伝子導入の実験例として、ダイコン（Raphanus sativus）幼植物体の茎頂組織への導入実験を行った。次亜塩素酸を用いて表面殺菌を行ったダイコンの種子を滅菌水に浸漬し、４℃、暗所にて一晩静置した後、１％スクロースを含むＭＳ液体培地に再懸濁し、照度１０，０００ルクス、温度２３℃、および光周期：１６時間明期／８時間暗期の条件で２４−３６時間培養し、発芽を行った。発芽種子は再び滅菌水で数回の洗浄を行った後、電気穿孔実験に用いた。【００４１】
（２）直接遺伝子導入用ベクター
実施例２のシロイヌナズナ幼植物体組織への一過的直接遺伝子導入によるゲノム編集に使用したｐＤｇＰａｅｆ０３７を用いた。【００４２】
（３）ダイコン発芽幼植物体への電気穿孔法による遺伝子導入
実施例１のシロイヌナズナ幼植物体組織への直接遺伝子導入で実施した方法に従って、電気穿孔処理を行った。
電気穿孔処理を行った種子は滅菌水にて数回洗浄を行った後、１％スクロースを含むＭＳ液体培地に懸濁し、暗所、温度２３℃の条件で一晩培養を行った後、照度１０，０００ルクス、温度２３℃、および光周期：１６時間明期／８時間暗期の条件で移し、培養を続けた。遺伝子導入後２４時間から７２時間の間に蛍光実体顕微鏡により導入されたＧＦＰ遺伝子の一過的発現を観察した。ｐＤｇＰａｅｆ０３７プラスミドを導入していない野生型ダイコン幼植物体ではＧＦＰ蛍光は認められなかったが（図６ａ）、一方、ｐＤｇＰａｅｆ０３７プラスミドを導入したダイコン幼植物体においては、導入４８時間程度で明確なＧＦＰ発現による蛍光が全身的に観察された（図６ｂ）。【００４３】
以上の結果から、本発明によって、特別な組織培養を用いずに、一過的に導入した遺伝子を効果的に機能させる直接遺伝子導入法が提供されることが確認された。
【産業上の利用可能性】
【００４４】
本発明は、植物の育種や遺伝学的研究などの分野において利用可能である。
【配列表フリーテキスト】
【００４５】
配列番号：１は、２Ｘカリフラワーモザイクウィルス３５Ｓ遺伝子プロモーターの塩基配列を示す。
配列番号：２は、タバコモザイクウィルスオメガ翻訳エンハンサーの塩基配列を示す。
配列番号：３は、ＧＦＰ遺伝子およびブラストサイジン耐性遺伝子の融合遺伝子の塩基配列を示す。
配列番号：４は、シロイヌナズナ熱ショックタンパク質１８．２ｋＤａ遺伝子ターミネーターの塩基配列を示す。
配列番号：５は、シロイヌナズナ翻訳伸長因子遺伝子プロモーターの塩基配列を示す。
配列番号：６は、Streptococcus pyogenesのＣａｓ９（核移行シグナルを含む）の塩基配列を示す。
配列番号：７は、Thosea asigna由来自己開裂ペプチド２Ａペプチドの塩基配列を示す。
配列番号：８は、シロイヌナズナＵ６ ｓｎＲＮＡ遺伝子プロモーターの塩基配列を示す。
配列番号：９は、Streptococcus pyogenesのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９に用いられるｇＲＮＡの塩基配列を示す。
配列番号：１０は、シロイヌナズナＯＳＴ２遺伝子の標的配列を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】令和1年8月23日(2019.8.23)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
目的遺伝子を双子葉植物の種子胚、発芽種子または幼植物体に電気穿孔法により直接導入することを含む、双子葉植物への遺伝子導入方法であって、目的遺伝子を植物体への再生が可能なシュート頂を含む組織に導入し、発現させるものである方法であって、目的遺伝子が植物体への再生が可能なシュート頂を含む組織で発現可能なプロモーターを含むベクターに挿入されている、方法。
【請求項２】
（削除）
【請求項３】
（削除）
【請求項４】
目的遺伝子を植物中で一過的に発現させるものである請求項１記載の方法。
【請求項５】
目的遺伝子を双子葉植物の種子胚、発芽種子または幼植物体に電気穿孔法により直接導入し、次いで、目的遺伝子を導入した種子胚、発芽種子または幼植物体を成長させることを含む、遺伝子導入双子葉植物の作製方法であって、目的遺伝子を植物体への再生が可能なシュート頂を含む組織に導入し、発現させるものである方法であって、目的遺伝子が植物体への再生が可能なシュート頂を含む組織で発現可能なプロモーターを含むベクターに挿入されている、方法。
【請求項６】
（削除）
【請求項７】
（削除）
【請求項８】
目的遺伝子を植物中で一過的に発現させるものである請求項５記載の方法。
【請求項９】
ゲノム編集に用いられるタンパク質をコードする遺伝子および目的遺伝子を双子葉植物の種子胚、発芽種子または幼植物体に電気穿孔法により直接導入し、次いで、目的遺伝子を導入した種子胚、発芽種子または幼植物体を成長させることを含む、ゲノム編集双子葉植物の作製方法であって、ゲノム編集に用いられるタンパク質をコードする遺伝子を植物体への再生が可能なシュート頂を含む組織に導入し、発現させるものである方法であって、植物体への再生が可能なシュート頂を含む組織で発現可能なプロモーターを含むベクターにゲノム編集に用いられるタンパク質をコードする遺伝子および目的遺伝子を挿入して、植物に導入する、方法。
【請求項１０】
（削除）
【請求項１１】
（削除）
【請求項１２】
ゲノム編集に用いられるタンパク質をコードする遺伝子を植物中で一過的に発現させるものである請求項９項記載の方法。
【国際調査報告】
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