(57)【要約】ＣＤＫ阻害剤を含有する癌治療用医薬組成物を提供すること。ＣＤＫ阻害剤を含む、アンドロゲン除去療法に対して抵抗性を示す癌を治療するための医薬組成物。前記ＣＤＫ阻害剤が、アルボシジブ又はその製薬学的に許容される塩を含む。前記癌が、アンドロゲン受容体拮抗剤及び／又はアンドロゲン合成阻害剤に対して治療抵抗性を示す癌である。アンドロゲン受容体のリン酸化が亢進している被験者に投与される、アルボシジブ又はその製薬学的に許容される塩を有効成分として含む、癌治療用組成物。
2020138370.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
アルボシジブ又はその製薬学的に許容される塩を含む、アンドロゲン受容体拮抗剤及び／又はアンドロゲン合成阻害剤に対して治療抵抗性を示す癌を治療するための医薬組成物。
【請求項２】
癌が、アンドロゲン除去療法に対して抵抗性を示す癌である、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項３】
前記癌が、急性白血病、慢性リンパ性白血病、慢性骨髄性白血病、真性多血症、悪性リンパ腫、形質細胞腫瘍、多発性骨髄腫、骨髄異形成症候群、脳腫瘍、頭頸部がん、食道がん、甲状腺がん、小細胞肺がん、非小細胞肺がん、胸腺腫・胸腺がん、乳がん、胃がん、胆のう・胆管がん、肝がん、肝細胞がん、膵がん、結腸がん、直腸がん、肛門がん、消化管間質腫瘍、絨毛上皮がん、子宮体がん、子宮頸がん、卵巣がん、膀胱がん、前立腺がん、尿路上皮がん、腎がん、腎細胞がん、睾丸腫瘍、精巣胚細胞腫瘍、卵巣胚細胞腫瘍、ウイルムス腫瘍、皮膚がん、悪性黒色腫、神経芽細胞腫、骨肉腫、ユーイング肉腫、及び軟部肉腫からなる群から選択される少なくとも一種の癌である、請求項１又は２のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項４】
前記癌が、前立腺がん、乳がん、卵巣がん、又は膀胱がんである、請求項１〜３のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項５】
前記癌が、前立腺がんである、請求項１〜４のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項６】
前記癌が、去勢抵抗性前立腺がんである、請求項１〜５のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項７】
前記癌が、変異型アンドロゲン受容体が発現していることを特徴とする、請求項１〜６のいずれ一項に記載の医薬組成物。
【請求項８】
前記変異型アンドロゲン受容体が、アルドステロン受容体のスプライシングバリアントである、請求項７に記載の医薬組成物。
【請求項９】
前記変異型アンドロゲン受容体が、スプライシングバリアントＡＲ−Ｖ７、ＡＲ−Ｖ１２、又はＡＲ−Ｖ５６７ｅｓである、請求項７又は請求項８に記載の医薬組成物。
【請求項１０】
前記変異型アンドロゲン受容体が、スプライシングバリアントＡＲ−Ｖ７である、請求項７〜９のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項１１】
前記アンドロゲン受容体拮抗剤が、エンザルタミドである、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項１２】
前記アンドロゲン合成阻害剤が、アビラテロンである、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項１３】
前記有効成分が、アルボシジブ又はその塩酸塩である、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項１４】
前記有効成分が、アルボシジブである、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項１５】
前記癌が、アンドロゲン受容体のセリン８１、及びセリン２１０又はセリン２１３のリン酸化が亢進しているがんである、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項１６】
去勢術及び／又は薬物療法により血清テストステロン濃度が去勢レべルに低下している患者に投与される、アルボシジブ又はその製薬学的に許容される塩を有効成分として含む、癌治療用組成物。
【請求項１７】
アンドロゲン受容体のリン酸化が亢進している被験者に投与される、アルボシジブ又はその製薬学的に許容される塩を有効成分として含む、癌治療用組成物。
【請求項１８】
前記アンドロゲン受容体のリン酸化が亢進している対象が、
（１）被験者より取得した癌細胞のアンドロゲン受容体のリン酸化を定量する工程、
（２）（１）で定量したリン酸化の量を、健常者より採取した細胞中の前記リン酸化の量（以下、対照値という）と比較する工程、及び
（３）（２）の結果に基づき、（１）で定量した前記リン酸化の量が、対照値よりも大きい場合に、リン酸化が亢進していると判定する工程
を含む工程で決定されることを特徴とする、請求項１７に記載の組成物。
【請求項１９】
前記工程（１）及び（２）におけるリン酸化の量を、抗アンドロゲン受容体抗体を用いて、測定することを特徴とする、請求項１８に記載の組成物。
【請求項２０】
前記工程（１）及び（２）におけるリン酸化の量を、抗アンドロゲン受容体抗体を一次抗体とし、さらに抗ベータアクチン抗体を用いて、測定することを特徴とする、請求項１９に記載の組成物。
【請求項２１】
前記アンドロゲン受容体のリン酸化が、アンドロゲン受容体のセリン８１、及びセリン２１０又はセリン２１３のリン酸化である、請求項１７〜請求項２０のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２２】
有効成分が、アルボシジブ又はその製薬学的に許容される塩である、請求項１７〜請求項２１のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２３】
前記癌が、急性白血病、慢性リンパ性白血病、慢性骨髄性白血病、真性多血症、悪性リンパ腫、形質細胞腫瘍、多発性骨髄腫、骨髄異形成症候群、脳腫瘍、頭頸部がん、食道がん、甲状腺がん、小細胞肺がん、非小細胞肺がん、胸腺腫・胸腺がん、乳がん、胃がん、胆のう・胆管がん、肝がん、肝細胞がん、膵がん、結腸がん、直腸がん、肛門がん、消化管間質腫瘍、絨毛上皮がん、子宮体がん、子宮頸がん、卵巣がん、膀胱がん、前立腺がん、尿路上皮がん、腎がん、腎細胞がん、睾丸腫瘍、精巣胚細胞腫瘍、卵巣胚細胞腫瘍、ウイルムス腫瘍、皮膚がん、悪性黒色腫、神経芽細胞腫、骨肉腫、ユーイング肉腫、及び軟部肉腫からなる群から選択される少なくとも一種の癌である、請求項１７〜請求項２２のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２４】
前記癌が、前立腺がん、乳がん、卵巣がん、又は膀胱がんである、請求項１７〜請求項２３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２５】
前記癌が、前立腺がんである、請求項１７〜請求項２４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２６】
前記前立腺がんが、去勢抵抗性前立腺がんである、請求項１７〜請求項２５のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２７】
前記癌が、変異型アンドロゲン受容体が発現していることを特徴とする、請求項１７〜請求項２６のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２８】
前記変異型アンドロゲン受容体が、アルドステロン受容体のスプライシングバリアントである、請求項２７に記載の組成物。
【請求項２９】
前記変異型アンドロゲン受容体が、スプライシングバリアントＡＲ−Ｖ７、ＡＲ−Ｖ１２、又はＡＲ−Ｖ５６７ｅｓである、請求項２７又は請求項２８に記載の組成物。
【請求項３０】
前記変異型アンドロゲン受容体が、スプライシングバリアントＡＲ−Ｖ７である、請求項２７〜請求項２９のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項３１】
前記癌が、アンドロゲン受容体拮抗剤、及び／又はアンドロゲン合成阻害剤に対して治療抵抗性を示す癌である、請求項１７〜請求項３０のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項３２】
前記アンドロゲン受容体拮抗剤が、エンザルタミドである、請求項３１に記載の組成物。
【請求項３３】
前記アンドロゲン合成阻害剤が、アビラテロンである、請求項３１又は請求項３２に記載の組成物。
【請求項３４】
被験者のアンドロゲン受容体のリン酸化を測定することを特徴とする、アルボシジブ又はその製薬学的に許容される塩への有効性を予測する方法。
【請求項３５】
前記アンドロゲン受容体のリン酸化の測定が、
（１）被験者より取得した癌細胞のリン酸化を定量する工程、
（２）（１）で定量したリン酸化の量を、健常者より採取した細胞中の前記リン酸化の量（以下、対照値という）と比較する工程、及び
（３）（２）の結果に基づき、（１）で定量した前記リン酸化の量が、対照値よりも大きい場合に、リン酸化が亢進しているか否かを判定する工程
を含む工程で決定されることを特徴とする、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記工程（１）及び（２）におけるリン酸化の量を、抗アンドロゲン受容体抗体を用いて、測定することを特徴とする、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記工程（１）及び（２）におけるリン酸化の量を、抗アンドロゲン受容体抗体を一次抗体とし、さらに抗ベータアクチン抗体を用いて、測定することを特徴とする、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
前記アンドロゲン受容体のリン酸化が、アンドロゲン受容体のセリン８１、及びセリン２１０又はセリン２１３のリン酸化である、請求項３４〜請求項３７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３９】
前記癌が、急性白血病、慢性リンパ性白血病、慢性骨髄性白血病、真性多血症、悪性リンパ腫、形質細胞腫瘍、多発性骨髄腫、骨髄異形成症候群、脳腫瘍、頭頸部がん、食道がん、甲状腺がん、小細胞肺がん、非小細胞肺がん、胸腺腫・胸腺がん、乳がん、胃がん、胆のう・胆管がん、肝がん、肝細胞がん、膵がん、結腸がん、直腸がん、肛門がん、消化管間質腫瘍、絨毛上皮がん、子宮体がん、子宮頸がん、卵巣がん、膀胱がん、前立腺がん、尿路上皮がん、腎がん、腎細胞がん、睾丸腫瘍、精巣胚細胞腫瘍、卵巣胚細胞腫瘍、ウイルムス腫瘍、皮膚がん、悪性黒色腫、神経芽細胞腫、骨肉腫、ユーイング肉腫、及び軟部肉腫からなる群から選択される少なくとも一種の癌である、請求項３４〜請求項３８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４０】
前記癌が、前立腺がん、乳がん、卵巣がん、又は膀胱がんである、請求項３４〜請求項３９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４１】
前記癌が、前立腺がんである、請求項３４〜請求項４０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４２】
前記前立腺がんが、去勢抵抗性前立腺がんである、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
前記癌が、変異型アンドロゲン受容体が発現していることを特徴とする、請求項３４〜請求項４２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４４】
前記変異型アンドロゲン受容体が、アルドステロン受容体のスプライシングバリアントである、請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
前記変異型アンドロゲン受容体が、スプライシングバリアントＡＲ−Ｖ７、ＡＲ−Ｖ１２、又はＡＲ−Ｖ５６７ｅｓである、請求項４３又は請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
前記変異型アンドロゲン受容体が、スプライシングバリアントＡＲ−Ｖ７である、請求項４３〜請求項４５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４７】
前記癌が、アンドロゲン受容体拮抗剤、及び／又はアンドロゲン合成阻害剤に対して治療抵抗性を示す癌である、請求項３４〜請求項４６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４８】
前記アンドロゲン受容体拮抗剤が、エンザルタミドである、請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
前記アンドロゲン合成阻害剤が、アビラテロンである、請求項４７又は請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
アルボシジブ又はその製薬学的に許容される塩を投与する工程を含む、アンドロゲン除去療法に対して抵抗性を示す癌を治療するための方法。
【請求項５１】
アンドロゲン除去療法に対して抵抗性を示す癌を治療するための医薬を製造するための、アルボシジブ又はその製薬学的に許容される塩の使用。
【請求項５２】
アンドロゲン除去療法に対して抵抗性を示す癌の治療において使用するためのアルボシジブ又はその製薬学的に許容される塩。
【請求項５３】
被験者がアルボシジブ又はその製薬学的に許容される塩での治療に適しているか否かを診断するための方法であって、被験者のアンドロゲン受容体のリン酸化を測定する工程を含む、方法。
【請求項５４】
被験者がアルボシジブ又はその製薬学的に許容される塩での治療に適しているか否かを診断するためのキットであって、被験者のアンドロゲン受容体のリン酸化を測定するための手段を含む、キット。
【請求項５５】
アンドロゲン非依存的な細胞増殖を有する細胞であって、ＡＲ−Ｖ７の発現を伴うエンザルタミド耐性である、細胞。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、有効成分としてＣＤＫ阻害剤を含有する、アンドロゲン除去療法に対して抵抗性を示す癌（例えば、アンドロゲン受容体拮抗剤及び／又はアンドロゲン合成阻害剤に対して抵抗性を示す癌）を治療又は予防するための医薬組成物に関する。また、特定のＣＤＫ阻害剤に対して有効性を示す患者を選別する方法を提供することにある。
【背景技術】
【０００２】
ステロイドホルモンに代表される特定のホルモンは、細胞増殖に関与しており、発癌や癌の転移に大きな影響を与えることが知られている。【０００３】
例えば、前立腺がんは、テストステロンやアンドロステロンに代表される男性ホルモン（アンドロゲン）によって増悪することが広く知られている。これは、精巣や副腎から分泌されたアンドロゲンが前立腺がん細胞のアンドロゲン受容体（ＡＲ）に作用することで細胞増殖を引き起こし、癌が分化・増殖することによりもたらされる。【０００４】
アンドロゲン受容体は、核内受容体の一種であり、「リガンド結合領域」、「ＤＮＡ結合領域」及び「Ｎ末端領域」から構成され、アンドロゲンホルモンが細胞質内でアンドロゲン受容体のリガンド結合領域に結合すると、アンドロゲン受容体は活性化されて核内に移行する。核内に移行したアンドロゲン受容体は、ＤＮＡ上のＡＲ結合領域に結合し、特定の標的遺伝子の転写を活性化する。本転写活性化により、前立腺特異抗原（ＰＳＡ；Ｐｒｏｓｔａｔｅ  Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ａｎｔｉｇｅｎ）の発現が亢進することが知られている。前立腺特異抗原は、前立腺がんの腫瘍マーカーとして広く使用されており、前立腺がん患者のＰＳＡ濃度が上昇することは、細胞内のアンドロゲン受容体転写活性が亢進していることを意味している。【０００５】
また、近年、アンドロゲン受容体を介したアンドロゲンシグナルは、前立腺がん患者に留まらず、胱がん（非特許文献１）、卵巣がん（非特許文献２）、及び乳がん（非特許文献３）といった複数のがんに、深く関与することが報告されている。【０００６】
上記のアンドロゲン依存性を示す癌の治療方法として、アンドロゲンの産生や分泌を抑制する他、アンドロゲンのアンドロゲン受容体への結合を遮断する治療方法（アンドロゲン除去療法）が挙げられる。例えば、前立腺がんに対しては、精巣からのアンドロゲン分泌を抑制すべく、外科的去勢が行われる他、ＬＨ−ＲＨアゴニスト（ゴセレリン、又はリュープロレリン等）、フルタミド、ビカルタミド、又はニルタミド等の投与が行われる。【０００７】
このようなアンドロゲン除去療法により一旦は病変が縮小するものの、９割以上の症例が、約２年経過後に、当該治療への抵抗性（以下、「耐性」ということもある。）を獲得し、再発・再燃することが大きな問題となっている。前立腺がんの場合、このようなアンドロゲン除去療法に対して抵抗性を示す状態のがんを、「去勢抵抗性前立腺がん（Ｃａｓｔｒａｔｉｏｎ  Ｒｅｓｉｓｔａｎｔ  Ｐｒｏｓｔａｔｅ  Ｃａｎｃｅｒ（ＣＲＰＣ））」という。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】：国際公開第２０１６／１８７３１６号
【特許文献２】：国際公開第２０１８／０９４２７５号
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】：Koji  Izumi  et  al.  Oncotarget  5:  12665-12674.(2014)
【非特許文献２】：Haiyan  Zhu  et  al.  Oncotarget  8:  29395-29405.(2017)
【非特許文献３】：Nicolas  Diaz-Chico  et  al.  Journal  of  Steroid  Biochemistry  &Molecular  Biology  105:  1-15.(2007)
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明は、ＣＤＫ阻害剤の新規用途を提供することにある。また、特定のＣＤＫ阻害剤に対して有効性を示す患者を選別する方法を提供することにある。さらに、該選別した患者に対してＣＤＫ阻害剤を有効成分として含む医薬組成物を提供することにある。【００１１】
本発明者らは、鋭意検討した結果、アルボシジブ又はその製薬学的に許容される塩（以下、「本発明の化合物」と称することがある。）が、「アンドロゲン受容体拮抗剤又はアンドロゲン合成阻害剤に対して抵抗性を示す癌」に対して、格別な癌細胞増殖抑制効果を示すことを見出し、本発明を完成させるに至った。【００１２】
より具体的には、本発明者らは、「アンドロゲン依存性前立腺がん細胞株（ＬＮＣａＰ細胞株）」から、アンドロゲン受容体拮抗剤に対して治療抵抗性を示す去勢抵抗性前立腺がんの病態を反映した「ＡＩＬＮＣａＰ１４細胞株」及び「ＡＩＬＮＣａＰ１５細胞株」を樹立した。これら細胞株に対するアルボシジブの効果を検証したところ、アルボシジブが当該細胞株のアンドロゲン受容体の特定の残基のリン酸化を阻害するとともに、アンドロゲン受容体の核内移行を阻害することで、細胞増殖を低濃度かつ強力に抑制する格別かつ異質な効果を見出し、本発明を完成させるに至った。【００１３】
すなわち、本発明は、以下の通りである。
［項１］
アルボシジブ又はその製薬学的に許容される塩を含む、アンドロゲン受容体拮抗剤及び／又はアンドロゲン合成阻害剤に対して治療抵抗性を示す癌を治療するための医薬組成物。
［項２］
癌が、アンドロゲン除去療法に対して抵抗性を示す癌である、項２に記載の医薬組成物。
［項３］
前記癌が、急性白血病、慢性リンパ性白血病、慢性骨髄性白血病、真性多血症、悪性リンパ腫、形質細胞腫瘍、多発性骨髄腫、骨髄異形成症候群、脳腫瘍、頭頸部がん、食道がん、甲状腺がん、小細胞肺がん、非小細胞肺がん、胸腺腫・胸腺がん、乳がん、胃がん、胆のう・胆管がん、肝がん、肝細胞がん、膵がん、結腸がん、直腸がん、肛門がん、消化管間質腫瘍、絨毛上皮がん、子宮体がん、子宮頸がん、卵巣がん、膀胱がん、前立腺がん、尿路上皮がん、腎がん、腎細胞がん、睾丸腫瘍、精巣胚細胞腫瘍、卵巣胚細胞腫瘍、ウイルムス腫瘍、皮膚がん、悪性黒色腫、神経芽細胞腫、骨肉腫、ユーイング肉腫、及び軟部肉腫からなる群から選択される少なくとも一種の癌である、項１又は項２に記載の医薬組成物。
［項４］
前記癌が、前立腺がん、乳がん、卵巣がん、又は膀胱がんである、項１〜３のいずれか一項に記載の医薬組成物。
［項５］
前記癌が、前立腺がんである、項１〜４のいずれか一項に記載の医薬組成物。
［項６］
前記癌が、去勢抵抗性前立腺がんである、項１〜５のいずれか一項に記載の医薬組成物。
［項７］
前記癌が、変異型アンドロゲン受容体が発現していることを特徴とする、項１〜６のいずれ一項に記載の医薬組成物。
［項８］
前記変異型アンドロゲン受容体が、アルドステロン受容体のスプライシングバリアントである、項７に記載の医薬組成物。
［項９］
前記変異型アンドロゲン受容体が、スプライシングバリアントＡＲ−Ｖ７、ＡＲ−Ｖ１２、又はＡＲ−Ｖ５６７ｅｓである、項７又は項８に記載の医薬組成物。
［項１０］
前記変異型アンドロゲン受容体が、スプライシングバリアントＡＲ−Ｖ７である、項７〜９のいずれか一項に記載の医薬組成物。
［項１１］
前記アンドロゲン受容体拮抗剤が、エンザルタミドである、項１〜１０のいずれか一項に記載の医薬組成物。
［項１２］
前記アンドロゲン合成阻害剤が、アビラテロンである、項１〜１１のいずれか一項に記載の医薬組成物。
［項１３］
前記有効成分が、アルボシジブ又はその塩酸塩である、項１〜１２のいずれか一項に記載の医薬組成物。
［項１４］
前記有効成分が、アルボシジブである、項１〜１３のいずれか一項に記載の医薬組成物。
［項１５］
前記癌が、アンドロゲン受容体のセリン８１、及びセリン２１０又はセリン２１３のリン酸化が亢進しているがんである、項１〜１４のいずれか一項に記載の医薬組成物。
［項１６］
去勢術及び／又は薬物療法により血清テストステロン濃度が去勢レべルに低下している患者に投与される、アルボシジブ又はその製薬学的に許容される塩を有効成分として含む、癌治療用組成物。
［項１７］
アンドロゲン受容体のリン酸化が亢進している被験者に投与される、アルボシジブ又はその製薬学的に許容される塩を有効成分として含む、癌治療用組成物。
［項１８］
前記アンドロゲン受容体のリン酸化が亢進している対象が、
（１）被験者より取得した癌細胞のアンドロゲン受容体のリン酸化を定量する工程、
（２）（１）で定量したリン酸化の量を、健常者より採取した細胞中の前記リン酸化の量（以下、対照値という）と比較する工程、及び
（３）（２）の結果に基づき、（１）で定量した前記リン酸化の量が、対照値よりも大きい場合に、リン酸化が亢進していると判定する工程
を含む工程で決定されることを特徴とする、項１７に記載の組成物。
［項１９］
前記工程（１）及び（２）におけるリン酸化の量を、抗アンドロゲン受容体抗体を用いて、測定することを特徴とする、項１８に記載の組成物。
［項２０］
前記工程（１）及び（２）におけるリン酸化の量を、抗アンドロゲン受容体抗体を一次抗体とし、さらに抗ベータアクチン抗体を用いて、測定することを特徴とする、項１９に記載の組成物。
［項２１］
前記アンドロゲン受容体のリン酸化が、アンドロゲン受容体のセリン８１、及びセリン２１０又はセリン２１３のリン酸化である、項１７〜項２０のいずれか一項に記載の組成物。
［項２２］
有効成分が、アルボシジブ又はその製薬学的に許容される塩である、項１７〜項２１のいずれか一項に記載の組成物。
［項２３］
前記癌が、急性白血病、慢性リンパ性白血病、慢性骨髄性白血病、真性多血症、悪性リンパ腫、形質細胞腫瘍、多発性骨髄腫、骨髄異形成症候群、脳腫瘍、頭頸部がん、食道がん、甲状腺がん、小細胞肺がん、非小細胞肺がん、胸腺腫・胸腺がん、乳がん、胃がん、胆のう・胆管がん、肝がん、肝細胞がん、膵がん、結腸がん、直腸がん、肛門がん、消化管間質腫瘍、絨毛上皮がん、子宮体がん、子宮頸がん、卵巣がん、膀胱がん、前立腺がん、尿路上皮がん、腎がん、腎細胞がん、睾丸腫瘍、精巣胚細胞腫瘍、卵巣胚細胞腫瘍、ウイルムス腫瘍、皮膚がん、悪性黒色腫、神経芽細胞腫、骨肉腫、ユーイング肉腫、及び軟部肉腫からなる群から選択される少なくとも一種の癌である、項１７〜項２２のいずれか一項に記載の組成物。
［項２４］
前記癌が、前立腺がん、乳がん、卵巣がん、又は膀胱がんである、項１７〜項２３のいずれか一項に記載の組成物。
［項２５］
前記癌が、前立腺がんである、項１７〜項２４のいずれか一項に記載の組成物。
［項２６］
前記前立腺がんが、去勢抵抗性前立腺がんである、項１７〜項２５のいずれか一項に記載の組成物。
［項２７］
前記癌が、変異型アンドロゲン受容体が発現していることを特徴とする、項１７〜項２６のいずれか一項に記載の組成物。
［項２８］
前記変異型アンドロゲン受容体が、アルドステロン受容体のスプライシングバリアントである、項２７に記載の組成物。
［項２９］
前記変異型アンドロゲン受容体が、スプライシングバリアントＡＲ−Ｖ７、ＡＲ−Ｖ１２、又はＡＲ−Ｖ５６７ｅｓである、項２７又は項２８に記載の組成物。
［項３０］
前記変異型アンドロゲン受容体が、スプライシングバリアントＡＲ−Ｖ７である、項２７〜項２９のいずれか一項に記載の組成物。
［項３１］
前記癌が、アンドロゲン受容体拮抗剤、及び／又はアンドロゲン合成阻害剤に対して治療抵抗性を示す癌である、項１７〜項３０のいずれか一項に記載の組成物。
［項３２］
前記アンドロゲン受容体拮抗剤が、エンザルタミドである、項３１に記載の組成物。
［項３３］
前記アンドロゲン合成阻害剤が、アビラテロンである、項３１又は項３２に記載の組成物。
［項３４］
被験者のアンドロゲン受容体のリン酸化を測定することを特徴とする、アルボシジブ又はその製薬学的に許容される塩への有効性を予測する方法。
［項３５］
前記アンドロゲン受容体のリン酸化の測定が、
（１）被験者より取得した癌細胞のリン酸化を定量する工程、
（２）（１）で定量したリン酸化の量を、健常者より採取した細胞中の前記リン酸化の量（以下、対照値という）と比較する工程、及び
（３）（２）の結果に基づき、（１）で定量した前記リン酸化の量が、対照値よりも大きい場合に、リン酸化が亢進しているか否かを判定する工程
を含む工程で決定されることを特徴とする、項３４に記載の方法。
［項３６］
前記工程（１）及び（２）におけるリン酸化の量を、抗アンドロゲン受容体抗体を用いて、測定することを特徴とする、項３５に記載の方法。
［項３７］
前記工程（１）及び（２）におけるリン酸化の量を、抗アンドロゲン受容体抗体を一次抗体とし、さらに抗ベータアクチン抗体を用いて、測定することを特徴とする、項３６に記載の方法。
［項３８］
前記アンドロゲン受容体のリン酸化が、アンドロゲン受容体のセリン８１、及びセリン２１０又はセリン２１３のリン酸化である、項３４〜項３７のいずれか一項に記載の方法。
［項３９］
前記癌が、急性白血病、慢性リンパ性白血病、慢性骨髄性白血病、真性多血症、悪性リンパ腫、形質細胞腫瘍、多発性骨髄腫、骨髄異形成症候群、脳腫瘍、頭頸部がん、食道がん、甲状腺がん、小細胞肺がん、非小細胞肺がん、胸腺腫・胸腺がん、乳がん、胃がん、胆のう・胆管がん、肝がん、肝細胞がん、膵がん、結腸がん、直腸がん、肛門がん、消化管間質腫瘍、絨毛上皮がん、子宮体がん、子宮頸がん、卵巣がん、膀胱がん、前立腺がん、尿路上皮がん、腎がん、腎細胞がん、睾丸腫瘍、精巣胚細胞腫瘍、卵巣胚細胞腫瘍、ウイルムス腫瘍、皮膚がん、悪性黒色腫、神経芽細胞腫、骨肉腫、ユーイング肉腫、及び軟部肉腫からなる群から選択される少なくとも一種の癌である、項３４〜項３８のいずれか一項に記載の方法。
［項４０］
前記癌が、前立腺がん、乳がん、卵巣がん、又は膀胱がんである、項３４〜項３９のいずれか一項に記載の方法。
［項４１］
前記癌が、前立腺がんである、項３４〜項４０のいずれか一項に記載の方法。
［項４２］
前記前立腺がんが、去勢抵抗性前立腺がんである、項４１に記載の方法。
［項４３］
前記癌が、変異型アンドロゲン受容体が発現していることを特徴とする、項３４〜項４２のいずれか一項に記載の方法。
［項４４］
前記変異型アンドロゲン受容体が、アルドステロン受容体のスプライシングバリアントである、項４３に記載の方法。
［項４５］
前記変異型アンドロゲン受容体が、スプライシングバリアントＡＲ−Ｖ７、ＡＲ−Ｖ１２、又はＡＲ−Ｖ５６７ｅｓである、項４３又は項４４に記載の方法。
［項４６］
前記変異型アンドロゲン受容体が、スプライシングバリアントＡＲ−Ｖ７である、項４３〜項４５のいずれか一項に記載の方法。
［項４７］
前記癌が、アンドロゲン受容体拮抗剤、及び／又はアンドロゲン合成阻害剤に対して治療抵抗性を示す癌である、項３４〜項４６のいずれか一項に記載の方法。
［項４８］
前記アンドロゲン受容体拮抗剤が、エンザルタミドである、項４７に記載の方法。
［項４９］
前記アンドロゲン合成阻害剤が、アビラテロンである、項４７又は項４８に記載の方法。
［項５０］
アルボシジブ又はその製薬学的に許容される塩を投与する工程を含む、アンドロゲン除去療法に対して抵抗性を示す癌を治療するための方法。
［項５１］
アンドロゲン除去療法に対して抵抗性を示す癌を治療するための医薬を製造するための、アルボシジブ又はその製薬学的に許容される塩の使用。
［項５２］
アンドロゲン除去療法に対して抵抗性を示す癌の治療において使用するためのアルボシジブ又はその製薬学的に許容される塩。
［項５３］
被験者がアルボシジブ又はその製薬学的に許容される塩での治療に適しているか否かを診断するための方法であって、被験者のアンドロゲン受容体のリン酸化を測定する工程を含む、方法。
［項５４］
被験者がアルボシジブ又はその製薬学的に許容される塩での治療に適しているか否かを診断するためのキットであって、被験者のアンドロゲン受容体のリン酸化を測定するための手段を含む、キット。
［項５５］
アンドロゲン非依存的な細胞増殖を有する細胞であって、ＡＲ−Ｖ７の発現を伴うエンザルタミド耐性である、細胞。
［項５６］
アンドロゲン非依存的な増殖能を有する細胞をスクリーニングする方法であって、
アンドロゲン依存性細胞株を培養する工程、
培地交換を繰り返しながら長期間細胞培養を継続する工程、
増殖能を獲得した細胞クローンを分離し、培養する工程
を包含する、方法。【００１４】
本発明において、上記の一つまたは複数の特徴は、明示された組み合わせに加え、さらに組み合わせて提供され得ることが意図される。本発明のなおさらなる実施形態および利点は、必要に応じて以下の詳細な説明を読んで理解すれば、当業者に認識される。
【発明の効果】
【００１５】
本発明のアルボシジブ又はその製薬学的に許容される塩は、アンドロゲン受容体拮抗剤及び／又はアンドロゲン合成阻害剤に対して治療抵抗性を示す癌の治療及び／又は予防に有効であり、特に変異型アンドロゲン受容体を発現する前立腺がんの治療及び／又は予防に特に有効である。【００１６】
また、本発明に基づき、被験者由来の癌細胞のアンドロゲン受容体のリン酸化状態を測定することにより、アルボシジブ又はその製薬学的に許容される塩が有効な患者を予測することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】図１は、各細胞のＰＳＡ産生量を、免疫ブロット法にて測定した図である。
【図２】図２は、アンドロゲン除去下で培養したＡＩＬＮＣａＰ１４細胞株、及びＡＩＬＮＣａＰ１５細胞株の位相差顕微鏡写真である。
【図３】図３は、アガロースゲル電気泳動法を用いてＬＮＣａＰ細胞株、ＡＩＬＮＣａＰ４細胞株、ＡＩＬＮＣａＰ７細胞株、ＡＩＬＮＣａＰ１４細胞株及びＡＩＬＮＣａＰ１５細胞のＡＲ及びＡＲ−Ｖ７のｍＲＮＡの発現を同定した図である。
【図４】図４は、ＬＮＣａＰ細胞株、ＡＩＬＮＣａＰ１４細胞株、及びＡＩＬＮＣａＰ１５細胞株に対する、エンザルタミドによる細胞増殖抑制効果を示した図である。
【図５】図５は、ＬＮＣａＰ細胞株、ＡＩＬＮＣａＰ１４細胞株、及びＡＩＬＮＣａＰ１５細胞株に対する、アルボシジブによる細胞増殖抑制効果を示した図である。
【図６】図６は、ＡＩＬＮＣａＰ１４細胞株及びＡＩＬＮＣａＰ１５細胞株に対するアルボシジブによるＡＲリン酸化の経時的な抑制効果を、免疫ブロットにて測定した図である。
【図７】図７は、ＡＩＬＮＣａＰ１４細胞株において、アルボシジブ投与群及び非投与群における、ＡＲの免疫蛍光染色結果を示した図である。
【図８】図８は、ＡＩＬＮＣａＰ１４細胞株に対するボルシクリブによるＡＲリン酸化の抑制効果を、免疫ブロットにて測定した図である。
【図９】図９は、ＡＩＬＮＣａＰ１４細胞由来皮下ゼノグラフトマウスの腫瘍増殖抑制試験における試験計画の概要を示した図である。
【図１０】図１０は、ＡＩＬＮＣａＰ１４細胞由来皮下ゼノグラフトマウスの腫瘍増殖抑制試験において、アルボシジブ投与群及び陰性対照群における、腫瘍体積増加比を示した図である。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
以下、本発明につき、さらに詳しく説明する。本明細書の全体にわたり、単数形の表現は、特に言及しない限り、その複数形の概念をも含むことが理解されるべきである。従って、単数形の冠詞（例えば、英語の場合は「ａ」、「ａｎ」、「ｔｈｅ」など）は、特に言及しない限り、その複数形の概念をも含むことが理解されるべきである。また、本明細書において使用される用語は、特に言及しない限り、当該分野で通常用いられる意味で用いられることが理解されるべきである。したがって、他に定義されない限り、本明細書中で使用される全ての専門用語及び科学技術用語は、本発明の属する分野の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。矛盾する場合、本明細書（定義を含めて）が優先する。
【００１９】
サイクリン依存性キナーゼ（ＣＤＫ）は、細胞周期の進行等を調節する重要な制御因子であり、選択的ＣＤＫ阻害剤は、有用な化学療法剤となる。代表的なＣＤＫ阻害剤として、アルボシジブ、ロニシクリブ、ディナシクリブ、及びボルシクリブが知られている。
【００２０】
アルボシジブ（フラボピリドール、化学名：２−（２−クロロフェニル）−５，７−ジヒドロキシ−８−［（３Ｓ，４Ｒ）−３−ヒドロキシ−１−メチルピペリジン−４−イル］−４Ｈ−１−ベンゾピラン−４−オン）は、下記の構造：
【００２１】
【化１】
2020138370.tif 000003
【００２２】
を有する合成フラボンである。
【００２３】
アルボシジブは、ＣＤＫの強力且つ選択的な阻害剤であり、ヒトの肺癌及び乳癌などの種々の腫瘍細胞系に対して抗腫瘍活性を有し、異種移植片モデルの腫瘍成長を阻害する。アルボシジブは、ＣＤＫ９阻害によるポリメラーゼＩＩ駆動転写を阻害する。アルボシジブを処置することにより、陽性転写伸長因子、又はＰ−ＴＥＦｂとして公知の複合体の一部を形成するＣＤＫ９が阻害され、ＭＹＣなどの重要な癌遺伝子、及びＭＣＬ１などの重要な抗アポトーシスタンパク質の発現を減少させる。したがって、アルボシジブは、魅力的ながんの治療剤であり、現在、血液癌を用途とする臨床開発が進められている。
【００２４】
本発明における「アルボシジブ」は、水和物及び／又は溶媒和物の形で存在することもあるので、「アルボシジブ又はその製薬学的に許容される塩」の水和物及び／又は溶媒和物もまた本発明化合物に包含される。
【００２５】
本発明におけるアルボシジブは、適宜、その製薬学的に許容される塩で用いられ得る。
【００２６】
「製薬学的に許容される塩」は、製薬学的に無毒な酸（無機酸及び有機酸を含む）から調整される塩を意味する。製薬学的に許容される塩としては、例えば、限定されないが、酢酸塩、アルギン酸塩、アントラニル酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、安息香酸塩、カンファースルホン酸塩、クエン酸塩、エテンスルホン塩酸、ギ酸塩、フマル酸塩、グルコン酸塩、グルタミン酸塩、グルコレン酸塩、ガラクツロン酸塩、グリシド酸塩、臭化水素酸塩、塩酸塩、イセチオン酸塩、乳酸塩、マレイン酸塩、リンゴ酸塩、マンデル酸塩、メタンスルホン酸塩、ムチン酸塩、硝酸塩、パモ酸塩、パントテン酸塩、フェニル酢酸塩、プロピオン酸塩、リン酸塩、サリチル酸塩、ステアリン酸塩、コハク酸塩、スルファニル酸塩、硫酸塩、酒石酸塩、及びｐ−トルエンスルホン酸塩などが挙げられる。製薬学的に許容される塩として好ましくは、臭化水素酸塩、及び塩酸塩が挙げられる。製薬学的に許容される塩として最も好ましくは、塩酸塩が挙げられる。
【００２７】
結晶として得られる「アルボシジブ又はその製薬学的に許容される塩」は、結晶多型が存在する場合があり、本発明の「アルボシジブ又はその製薬学的に許容される塩」には、あらゆる結晶形のものが含まれる。
【００２８】
「アルボシジブ又はその製薬学的に許容される塩」は、１個又は場合によりそれ以上の不斉炭素原子を有する場合があり、また幾何異性や軸性キラリティーを生じることがあるので、数種の立体異性体として存在することがある。本発明においては、これらの立体異性体、それらの混合物及びラセミ体も本発明化合物に包含される。
【００２９】
「アルボシジブ又はその製薬学的に許容される塩」のいずれか１つ又は２つ以上の１Ｈを２Ｈ（Ｄ）に変換した重水素変換体も、本発明化合物に包含される。
【００３０】
本発明における「アンドロゲン受容体拮抗剤」とは、アンドロゲンがアンドロゲン受容体に結合するのを阻害する薬剤であって、適用症にＣＲＰＣを含む薬剤を意味する。
【００３１】
「アンドロゲン受容体拮抗剤」として、例えば、エンザルタミド、アパルタミド、及びダロルタミドなどが挙げられる。「アンドロゲン受容体拮抗剤」として、好ましくは、エンザルタミドが挙げられる
本発明における「アンドロゲン合成阻害剤」とは、アンドロゲンの生合成を阻害する薬剤を意味する。「アンドロゲン合成阻害剤」としては、ＣＹＰ１７を選択的に阻害することで、プロゲステロンからアンドロゲンへの変換を阻害する作用を有する薬剤が好ましい。「アンドロゲン受容体拮抗剤」の具体例として、例えば、アビラテロン、及びガレテロンなどが挙げられる。
【００３２】
野生型アンドロゲン受容体（野生型ＡＲ）とは、正常細胞で認められる基本となるアンドロゲン受容体の表現型を意味する。本明細書において、野生型アンドロゲン受容体と正常型アンドロゲン受容体（正常型ＡＲ）とは同義であり、変異が起こっていないアンドロゲン受容体を意味する。なお単に、アンドロゲン受容体（ＡＲ）と記載されている場合、野生型アンドロゲン受容体（野生型ＡＲ）を意味する。
【００３３】
変異型アンドロゲン受容体（変異型ＡＲ）とは、野生型アンドロゲン受容体から変異したアンドロゲン受容体を意味する。変異型アンドロゲン受容体における変異としては、例えば、「スプライシングバリアントによる変異」、「点変異」及び「翻訳後プロセシングによる変異」が挙げられる。「点変異」としては、「アミノ酸置換による変異」、「アミノ酸欠失による変異」及び「アミノ酸挿入による変異」が挙げられる。従って、変異型アンドロゲン受容体としては、「スプライシングバリアント」、「点変異による変異型アンドロゲン受容体」、及び「翻訳後プロセシングによる変異型アンドロゲン受容体」が挙げられる。
【００３４】
「スプライシングバリアント」の具体例として、例えば、ＡＲ−Ｖ１（アンドロゲン受容体−バリアント１）、ＡＲ−Ｖ２（アンドロゲン受容体−バリアント２）、ＡＲ−Ｖ３（アンドロゲン受容体−バリアント３）、ＡＲ−Ｖ４（アンドロゲン受容体−バリアント４）、ＡＲ−Ｖ５（アンドロゲン受容体−バリアント５）、ＡＲ−Ｖ５６７ｅｓ（アンドロゲン受容体−バリアント５６７ｅｓ）、ＡＲ−Ｖ６（アンドロゲン受容体−バリアント６）、ＡＲ−Ｖ７（アンドロゲン受容体−バリアント７）、及びＡＲ−Ｖ１２（アンドロゲン受容体−バリアント１２）が挙げられる。
【００３５】
「スプライシングバリアント」として、好ましくは、ＡＲ−Ｖ７、ＡＲ−Ｖ１２、及びＡＲ−Ｖ５６７ｅｓが挙げられる。
【００３６】
「スプライシングバリアント」の具体例として、より好ましくは、ＡＲ−Ｖ７が挙げられる。
【００３７】
「点変異による変異型アンドロゲン受容体」の具体例として、例えば、Ｔ８７７Ａ（Ｔ８７８Ａ）、Ｄ８７９Ｇ（Ｄ８７８Ｇ）、Ｗ７４１Ｃ、Ｗ７４１Ｌ、Ｍ７４９Ｌ、Ｒ６２９Ｑ、Ｇ１４２Ｖ、Ｐ５３３Ｓ、Ｔ５７５Ａ、Ｈ８７４Ｙ、及びＦ８７６Ｌが挙げられる。
【００３８】
「点変異による変異型アンドロゲン受容体」の具体例として、好ましくは、Ｆ８７６Ｌが挙げられる。なお、通常のアンドロゲン受容体に対してアンタゴニスト活性を示すアパルタミド、及びエンザルタミドは、点変異による変異型アンドロゲン受容体Ｆ８７６Ｌに対して、アゴニストとして働く特徴を有する。
【００３９】
「抗アンドロゲン受容体抗体」とは、アンドロゲン受容体を特異的に認識する抗体を意味し、「抗アンドロゲン受容体抗体」には、野生型のアンドロゲン受容体を認識する抗体の他、特定の残基がリン酸化されたアンドロゲン受容体を特異的に認識する抗体が含まれる。抗アンドロゲン受容体抗体の具体例としては、抗ＡＲ抗体  （Ｓａｎｔａ  ＣｒｕｚＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｃ．，Ｃａｔ  ｎｏ．ｓｃ−８１６）、抗ｐＡＲｓｅｒ８１抗体（Ｍｅｒｃｋ，Ｃａｔ  ｎｏ．０４−０７８）、抗ｐＡＲｓｅｒ２１０＋２１３抗体＊（Ａｂｃａｍ，Ｃａｔ  ｎｏ．ａｂ４５０８９）が挙げられる。
【００４０】
本発明における「癌」は悪性腫瘍を意味する。
【００４１】
「癌」としては、例えば、急性白血病、慢性リンパ性白血病、慢性骨髄性白血病、真性多血症、悪性リンパ腫、形質細胞腫瘍、多発性骨髄腫、骨髄異形成症候群、脳腫瘍、頭頸部がん、食道がん、甲状腺がん、小細胞肺がん、非小細胞肺がん、胸腺腫・胸腺がん、乳がん、胃がん、胆のう・胆管がん、肝がん、肝細胞がん、膵がん、結腸がん、直腸がん、肛門がん、消化管間質腫瘍、絨毛上皮がん、子宮体がん、子宮頸がん、卵巣がん、膀胱がん、前立腺がん、尿路上皮がん、腎がん、腎細胞がん、睾丸腫瘍、精巣胚細胞腫瘍、卵巣胚細胞腫瘍、ウイルムス腫瘍、皮膚がん、悪性黒色腫、神経芽細胞腫、骨肉腫、ユーイング肉腫、及び軟部肉腫が挙げられる。好ましくは、アンドロゲン除去療法に対して抵抗性を示す状態の癌が挙げられる。
【００４２】
「癌」として、好ましくは、前立腺がん、乳がん、卵巣がん、及び膀胱がんが挙げられる。
【００４３】
「癌」として、より好ましくは、前立腺がんが挙げられる。
【００４４】
「癌」として、別の好ましい態様として、「アンドロゲン受容体拮抗剤及び／又はアンドロゲン合成阻害剤に対して治療抵抗性を示す癌」が挙げられる。
【００４５】
「癌」として、別のより好ましい態様として、エンザルタミドに対して治療抵抗性を示す癌が挙げられる。
【００４６】
「癌」として、別のより好ましい態様として、アビラテロンに対して治療抵抗性を示す癌が挙げられる。
【００４７】
「癌」として、さらに別の好ましい態様として、「変異型アンドロゲン受容体が発現している癌」が挙げられる。
【００４８】
本発明において、「前立腺がん」として、例えば、「去勢抵抗性前立腺がん（ＣＲＰＣ））」が挙げられる。より好ましくは「アンドロゲン受容体拮抗剤及び／又はアンドロゲン合成阻害剤に対して治療抵抗性を示す去勢抵抗性前立腺がん」が挙げられる。さらに好ましくは、「エンザルタミド、アパルタミド及び／又はアビラテロンに治療抵抗性を示す去勢抵抗性前立腺がん」が挙げられる。
【００４９】
「前立腺がん」として、別の好ましい態様として、「アンドロゲン受容体のセリン８１、及びセリン２１０又はセリン２１３のリン酸化が亢進している去勢抵抗性前立腺がん」が挙げられる。アンドロゲン受容体のリン酸化は、例えば、後述の実施例３に記載された方法によって測定することができる。
【００５０】
セリン８１、セリン２１０、及びセリン２１３における、セリンの後に記載された「数値」は、アンドロゲン受容体のアミノ酸配列の残基番号を意味する。例えば、ｐＡＲｓｅｒ８１とは、アンドロゲン受容体の８１番目のセリン残基がリン酸化されているアンドロゲン受容体のことを意味する。また、ｐＡＲｓｅｒ210+213は、２１０番目、又は２１３番目のセリン残基がリン酸化されているアンドロゲン受容体のことを意味する。なお、この２１０＋２１３は、野生型アンドロゲン受容体でみられる遺伝子多型で起こる配列のずれにより、ある遺伝子多型では２１０番目のセリン残基が、他の遺伝子多型では２１３番目になるため、このような表記にしているものであり、２つのセリン残基がリン酸化されているアンドロゲン受容体を意味するものではない。
【００５１】
「去勢抵抗性前立腺がん（ＣＲＰＣ））」は、ホルモン難治性前立腺がん（ｈｏｒｍｏｎｅ−ｒｅｆｒａｃｔｏｒｙ  ｐｒｏｓｔａｔｅ  ｃａｎｃｅｒ）とも呼ばれる。アンドロゲン除去療法に対して抵抗を示す状態の前立腺がんを示す。アンドロゲン除去療法とは、アンドロゲン依存性を示す癌に対して、アンドロゲンの産生や分泌を抑制する他、アンドロゲンのアンドロゲン受容体への結合を遮断する治療方法である。例えば、前立腺がんに対しては、精巣からのアンドロゲン分泌を抑制すべく、外科的去勢が行われる他、ＬＨ−ＲＨアゴニスト（ゴセレリン、又はリュープロレリン等）、フルタミド、ビカルタミド、又はニルタミド等の投与が行われる。前立腺癌診療ガイドライン２０１６年版、日本泌尿器科学会編、メディカルレビュー社を参照のこと。この文献には、去勢抵抗性前立腺がんについて、以下のように記載している：２０１２年版の「前立腺癌診療ガイドライン」ではホルモン療法後のＰＳＡ値でみた病勢進行について、「４週以上空けて測定したＰＳＡ値が最低値から２５％以上、かつ上昇幅２．０ｎｇ／ｍＬ以上により定義される」と『前立腺癌取扱い規約』（２０１０年）を踏襲して記載されている。最近の欧米諸国のガイドラインでのＣＲＰＣの定義とＰＳＡ値について、Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｕｒｏｌｏｇｙ（ＥＡＵ）のガイドラインでは、血清テストステロン値が５０ｎｇ／ｄＬ未満で、（１）１週間以上の測定間隔でＰＳＡ値が３回連続で上昇し、最低値から５０％以上の上昇が２回みられた場合、かつＰＳＡ値が２．０ｎｇ／ｍＬ以上、もしくは（２）画像上の増悪や新規病変の出現と定義されている。Ｐｒｏｓｔａｔｅ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｗｏｒｋｉｎｇ  Ｇｒｏｕｐ  ２（ＰＣＷＧ２）（２００８  年）におけるＰＳＡ値でみた病勢進行の基準は、１週間以上の測定間隔でＰＳＡ値が連続で上昇、かつＰＳＡ値が２．０ｎｇ／ｍＬ以上と定義されている。ＰＣＷＧ３（２０１５  年）ではＰＳＡ値が１．０ｎｇ／ｍＬに変更されている。
【００５２】
「アンドロゲン除去療法に対して抵抗性を示す癌」とは、アンドロゲン依存性を示す癌が、一定期間のアンドロゲン除去療法が行われた後に、抵抗性（耐性）を獲得した癌を示す。アンドロゲン除去療法に対して抵抗性を示す癌か否かについては、本明細書では、上記前立腺癌診療ガイドライン２０１６年版に示される基準に照らし、４週以上空けて測定した癌特異抗原の値（例えば、ＰＳＡ値）が最低値から２５％以上、かつ上昇幅が特定値（例えば、２．０ｎｇ／ｍＬ）以上である場合に、抵抗性を示す癌と判断する。本明細書において特に言及しない場合には、ＰＳＡ値が最低値から２５％以上、かつ上昇幅が、２．０ｎｇ／ｍＬ以上である場合に、抵抗性を示す癌と判断する。
【００５３】
「アンドロゲン受容体拮抗剤に対して治療抵抗性を示す癌」とは、アンドロゲン依存性を示す癌が、一定期間のアンドロゲン受容体拮抗剤での治療が行われた後に、抵抗性（耐性）を獲得した癌を示す。アンドロゲン受容体拮抗剤に対して治療抵抗性を示す癌か否かについては、本明細書では、上記前立腺癌診療ガイドライン２０１６年版に示される基準に照らし、４週以上空けて測定した癌特異抗原の値（例えば、ＰＳＡ値）が最低値から２５％以上、かつ上昇幅が特定値（例えば、２．０ｎｇ／ｍＬ）以上である場合に、抵抗性を示す癌と判断する。本明細書において特に言及しない場合には、ＰＳＡ値が最低値から２５％以上、かつ上昇幅が、２．０ｎｇ／ｍＬ以上である場合に、抵抗性を示す癌と判断する。
【００５４】
「アンドロゲン合成阻害剤に対して治療抵抗性を示す癌」とは、アンドロゲン依存性を示す癌が、一定期間のアンドロゲン合成阻害剤での治療が行われた後に、抵抗性（耐性）を獲得した癌を示す。アンドロゲン合成阻害剤に対して治療抵抗性を示す癌か否かについては、本明細書では、上記前立腺癌診療ガイドライン２０１６年版に示される基準に照らし、４週以上空けて測定した癌特異抗原の値（例えば、ＰＳＡ値）が最低値から２５％以上、かつ上昇幅が特定値（例えば、２．０ｎｇ／ｍＬ）以上である場合に、抵抗性を示す癌と判断する。本明細書において特に言及しない場合には、ＰＳＡ値が最低値から２５％以上、かつ上昇幅が、２．０ｎｇ／ｍＬ以上である場合に、抵抗性を示す癌と判断する。
【００５５】
「去勢術及び／又は薬物療法により血清テストステロン濃度が去勢レべルに低下している患者」とは、血清テストステロン濃度が、去勢術及び／又は薬物療法により去勢レベル（０．５ｎｇ／ｍＬ以下）に低下している患者を示す。
【００５６】
本発明における、「予防」とは、対象となる疾患を発症していない人に対して本発明の有効成分を投与する行為であり、例えば、疾患の発症を防止することを目的とするものである。
【００５７】
本発明における、「治療」とは、医師により疾患を発症していると診断をされた人（患者）に対して本発明の有効成分を投与する行為であり、例えば、疾患や症状を軽減すること、癌腫を増大させないこと又は疾患発症前の状態に戻すことを目的とするものである。また、投与の目的が疾患や症状の悪化防止又は癌腫の増大防止であっても、投与されるのが患者であれば、治療行為である。
【００５８】
本発明の化合物を投与する場合、その使用量は、症状、年齢、投与方法等によって異なるが、例えば、静脈内注射の場合には、成人に対して、１日当たり、下限として、０．０１ｍｇ（好ましくは０．１ｍｇ）、上限として、１０００ｍｇ（好ましくは１００ｍｇ）を、１回または数回に分けて、症状に応じて投与することにより効果が期待される。その投与スケジュールとしては、例えば単回投与、１日１回３日間連日投与、又は１日２回１週間連続投与、等を挙げることができる。さらに上記記載の各投与方法を、約１日間〜約６０日間の間隔をあけて繰り返すこともできる。
【００５９】
本発明の化合物は、非経口投与又は経口投与により投与しうるが、好ましくは非経口的方法、より好ましくは静脈内注射により投与される。
【００６０】
（１）本発明の化合物の有効量を投与することと、（２）（ｉ）他の抗癌剤の有効量を投与すること、（ｉｉ）ホルモン療法剤の有効量を投与すること、及び（ｉｉｉ）非薬剤療法からなる群からなる群から選ばれる１ないし３種とを組み合わせることにより、より効果的に癌を予防治療することができる。非薬剤療法としては、例えば、手術、放射線療法、遺伝子治療、温熱療法、凍結療法、レーザー灼熱療法などが挙げられ、これらを２種以上組み合わせることもできる。
【００６１】
本発明の化合物は、その効果の増強を目的として、他の薬物と併用して用いることができる。具体的には、本発明の化合物は、ホルモン療法剤、化学療法剤、免疫療法剤または細胞増殖因子ならびにその受容体作用を阻害する薬剤等の薬物と併用して用いることができる。以下、本発明の化合物と併用し得る薬物を併用薬物と略記する。
【００６２】
本発明の化合物は単剤として使用しても優れた抗癌作用を示すが、さらに前記併用薬物の一つまたは幾つかと併用（多剤併用）することによって、その効果をより一層増強または患者のQOLを改善させることができる。
【００６３】
「ホルモン療法剤」としては、例えば、ホスフェストロール、ジエチルスチルベストロール、クロロトリアニセン、酢酸メドロキシプロゲステロン、酢酸メゲストロール、酢酸クロルマジノン、酢酸シプロテロン、ダナゾール、ジエノゲスト、アソプリスニル、アリルエストレノール、ゲストリノン、ノメゲストール、タデナン、メパルトリシン、ラロキシフェン、オルメロキシフェン、レボルメロキシフェン、抗エストロゲン（例えば、クエン酸タモキシフェン、クエン酸トレミフェン等）、ピル製剤、メピチオスタン、テストロラクトン、アミノグルテチイミド、ＬＨ−ＲＨ誘導体（ＬＨ−ＲＨアゴニスト（例えば、酢酸ゴセレリン、ブセレリン、リュープロレリンなど）、ＬＨ−ＲＨアンタゴニスト）、ドロロキシフェン、エピチオスタノール、スルホン酸エチニルエストラジオール、アロマターゼ阻害剤（例えば、塩酸ファドロゾール、アナストロゾール、レトロゾール、エキセメスタン、ボロゾール、フォルメスタンなど）、フルタミド、ビカルタミド、ニルタミド、アンドロゲン受容体拮抗剤（例えば、アパルタミド、エンザルタミド）、アンドロゲン合成阻害剤（例えば、アビラテロンなど）、副腎皮質ホルモン系薬剤（例えば、デキサメタゾン、プレドニゾロン、ベタメタゾン、トリアムシノロンなど）、レチノイド、及びレチノイドの代謝を遅らせる薬剤（例えば、リアロゾールなど）などが挙げられる。
【００６４】
「化学療法剤」としては、例えば、アルキル化剤、代謝拮抗剤、抗癌性抗生物質、植物由来抗癌剤、分子標的治療剤、免疫調節剤、その他の化学療法剤などが用いられる。代表的な例を次に記載する。
【００６５】
「アルキル化剤」としては、例えば、ナイトロジェンマスタード、塩酸ナイトロジェンマスタード−Ｎ−オキシド、クロラムブチル、シクロフォスファミド、イホスファミド、チオテパ、カルボコン、トシル酸インプロスルファン、ブスルファン、塩酸ニムスチン、ミトブロニトール、メルファラン、ダカルバジン、ラニムスチン、リン酸エストラムスチンナトリウム、トリエチレンメラミン、カルムスチン、ロムスチン、ストレプトゾジン、ピポブロマン、エトグルシド、カルボプラチン、シスプラチン、ミボプラチン、ネダプラチン、オキサリプラチン、アルトレタミン、アンバムスチン、塩酸ジブロスピジウム、フォテムスチン、プレドニムスチン、プミテパ、リボムスチン、テモゾロミド、チオテパ、トレオスルファン、トロフォスファミド、ジノスタチンスチマラマー、アドゼレシン、システムスチン、ビゼレシン及びそれらのＤＤＳ製剤などが挙げられる。
【００６６】
「代謝拮抗剤」としては、例えば、メルカプトプリン、６−メルカプトプリンリボシド、チオイノシン、メトトレキサート、ペメトレキセド、エオシタビン、シタラビン、シタラビンオクフォスファート、塩酸アンシタビン、５−ＦＵ系薬剤（例えば、フルオロウラシル、テガフール、ＵＦＴ、ドキシフルリジン、カルモフール、ガロシタビン、エミテフール、カペシタビンなど）、アミノプテリン、ネルザラビン、ロイコポリンカルシウム、タブロイド、ブトシン、フォリネイトカルシウム、レボフォリネイトカルシウム、クラドリビン、エミテフール、フルダラビン、ゲムシタビン、ヒドロキシカルパミド、ペントスタチン、ピリトレキシム、イドキシウリジン、ミトグアゾン、チアゾフリン、アンバムスチン、ベンダムスチン、及びそれらのＤＤＳ製剤などが挙げられる。
【００６７】
「抗癌性抗生物質」としては、例えば、アクチノマイシンＤ、アクチノマイシンＣ、マイトマイシンＣ、クロモマイシンＡ３、塩酸ブレオマイシン、硫酸ブレオマイシン、硫酸ペプロマイシン、塩酸ダウノルビシン、塩酸ドキソルビシン、塩酸アクラルビシン、塩酸ピラルビシン、塩酸エピルビシン、ネオカルチノスタチン、ミスラマイシン、ザルコマイシン、カルチノフィリン、ミトタン、塩酸ゾルビシン、塩酸ミトキサントロン、塩酸イダルビシン、及びそれらのＤＤＳ製剤などが挙げられる。
【００６８】
「植物由来抗癌剤」としては、例えば、エトポシド、リン酸エトポシド、硫酸ビンブラスチン、硫酸ビンクリスチン、硫酸ビンデシン、テニポシド、パクリタキセル、ドセタクセル、DJ-927、ビノレルビン、イリノテカン、トポテカン、及びそれらのＤＤＳ製剤などが挙げられる。
【００６９】
「分子標的治療剤」としては、例えば、イマチニブ、ゲフィチニブ、エルロチニブ、ソラフェニブ、ダサチニブ、スニチニブ、ニロチニブ、ラパチニブ、パゾパニブ、ルキソリチニブ、クリゾチニブ、ベムラフェニブ、バンデタニブ、ポナチニブ、カボザンチニブ、トファシチニブ、レゴラフェニブ、ボスチニブ、アキシチニブ、ダブラフェニブ、トラメチニブ、ニンテダニブ、イデラリシブ、セリチニブ、レンバチニブ、パルボシクリブ、アレクチニブ、アファチニブ、オシメルチニブ、リボシクリブ、アベマシクリブ、ブリガチニブ、ネラチニブ、コパンリシブ、コビメチニブ、イブルチニブ、アカラブルチニブ、エンコラフェニブ、ビニメチニブ、バリシチニブ、フォスタマチニブ、ロルラチニブ、エルダフィチニブ、エントレクチニブ、ダコミチニブ、シロリムス、エベロリムス、テムシロリムス、オラパリブ、ルカパリブ、ニラパリブ、ベネトクラックス、アザシチジン、デシタビン、ボリノスタット、パノビノスタット、ロミデプシン、ボルテゾミブ、カルフィルゾミブ、及びイキサゾミブなどが挙げられる。
【００７０】
「免疫調節剤」としては、例えば、レナリドミド及びポマリドミドなどが挙げられる。
【００７１】
「その他の化学療法剤」としては、例えば、ソブゾキサンなどが挙げられる。
【００７２】
「免疫療法剤（ＢＲＭ）」としては、例えば、ピシバニール、クレスチン、シゾフィラン、レンチナン、ウベニメクス、インターフェロン、インターロイキン、マクロファージコロニー刺激因子、顆粒球コロニー刺激因子、エリスロポイエチン、リンホトキシン、ＢＣＧワクチン、コリネバクテリウムパルブム、レバミゾール、ポリサッカライドＫ、プロコダゾール、抗ＣＴＬＡ４抗体、抗ＰＤ−１抗体、抗ＰＤ−Ｌ１抗体、Ｔｏｌｌ−ｌｉｋｅ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ作動薬（例えば、ＴＬＲ７作動薬、ＴＬＲ８作動薬、ＴＬＲ９作動薬など）が挙げられる。
【００７３】
細胞増殖因子ならびにその受容体の作用を阻害する薬剤における細胞増殖因子としては、細胞増殖を促進する物質であれば、どのようなものでもよく、通常、分子量が２０，０００以下のペプチドで、受容体との結合により低濃度で作用が発揮される因子があげられる。具体的には、ＥＧＦ（ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ）またはそれと実質的に同一の活性を有する物質（例えば、ＴＧＦａｌｐｈａなど）、インスリンまたはそれと実質的に同一の活性を有する物質（例えば、インスリン、ＩＧＦ（ｉｎｓｕｌｉｎ−ｌｉｋｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ）−１、ＩＧＦ−２など）、ＦＧＦ（ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ）またはそれと実質的に同一のアッセイを有する物質（例えば、酸性ＦＧＦ、塩基性ＦＧＦ、ＫＧＫ（ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ）、ＦＧＦ−１０など）、及び、その他の細胞増殖因子（例えば、ＣＳＦ（ｃｏｌｏｎｙ  ｓｔｉｍｕｋａｔｉｎｇ  ｆａｃｔｏｒ）、ＥＰＯ（ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｔｉｎ）、ＩＬ−２（ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−２）、ＮＧＦ（ｎｅｒｖｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ）、ＰＤＧＦ（ｐｌａｔｅｌｅｔ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ）、ＴＧＦ−ｂｅｔａ（ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｂｅｔａ）、ＨＧＦ（ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ）、ＶＥＧＦ（ｖａｓｃｕｌａｒ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ）、へレグリン、アンジオポエチンなど）が挙げられる。
【００７４】
本発明の化合物、及び併用薬剤の投与期間は限定されず、これらを投与対象に対し、同時に投与してもよいし、時間差をおいて投与してもよい。また、本発明の化合物と併用薬剤の合剤としてもよい。併用薬剤の投与量は、臨床上用いられている用量を基準として適宜選択することができる。また、本発明の化合物と併用薬剤の配合比は、投与対象、投与ルート、対象疾患、症状、組み合わせなどにより適宜選択することができる。例えば投与対象がヒトである場合、本発明の化合物１重量部に対し、併用薬剤を０．０１〜１００重量部用いればよい。また、その副作用抑制の目的として、制吐剤、睡眠導入剤、抗痙攣薬などの薬剤（併用薬剤）と組み合わせて用いることができる。
【００７５】
以下に実施例を挙げて本発明を詳細に説明するが、本発明は何らこれらに限定されるものではない。
【実施例】
【００７６】
実施例１
下記実施例１−１〜１−５により、ＡＲ−Ｖ７の発現を伴うエンザルタミド耐性ＣＲＰＣの病態を反映する新規なモデル細胞株（ＡＩＬＮＣａＰ１４細胞株及びＡＩＬＮＣａＰ１５細胞株）を樹立した。
実施例１−１
アンドロゲン非依存的な細胞増殖能を獲得したクローンの取得
ｐ１００細胞培養プレートに１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を含有するＲＰＭＩ１６４０培地を分注し、１×１０６個の「アンドロゲン依存性前立腺がん細胞株（ＬＮＣａＰ細胞株、アメリカ培養細胞系統保存機関（ＡＴＣＣ）より入手）」を播種して、３７℃で５％ＣＯ２存在下に４８時間培養した。培養後、プレートから培地を除去し、培養細胞をリン酸緩衝液（ＰＢＳ）にて２回洗浄した後、活性炭処理した１０％ウシ胎児血清  （ｃｓＦＢＳ）を含有するフェノールレッド不含ＲＰＭＩ１６４０培地にて、３７℃で５％ＣＯ２存在下に４〜５日毎に培地交換を繰り返しながら３ヶ月間にわたり細胞培養を継続した。本培養条件下において大半の細胞がアポトーシスにより死滅するものの、培養開始より３ヶ月経過した時点で増殖能を獲得した複数の細胞クローンが形成された。これらのクローンを４８ウェルプレートに個別に移し替え、さらに同培養条件下にて培養を継続した。本培養により８０％コンフルエントに達した細胞クローンについて、２４ウェルプレートに移し替え培養した後、最終的に６ウェルプレートにて維持培養した。【００７７】
上記の培養方法により、アンドロゲン非依存的な細胞増殖能を獲得した複数個のクローンを取得した。
実施例１−２
免疫ブロット法によるＰＳＡ産生量の測定
実施例１−１で得られたクローンの内、５個のクローンについてＰＳＡ産生量を測定した。実施例１−１記載のＬＮＣａＰ細胞株を対照として使用した。【００７８】
実施例１−１と同様にして活性炭処理した１０％ウシ胎児血清（ｃｓＦＢＳ）を含有するフェノールレッド不含ＲＰＭＩ１６４０培地にて、３７℃で５％ＣＯ２存在下に１８０日間培養した。培養後、それぞれ１×１０６個の細胞を、氷冷したＰＢＳで洗浄した後、８Ｍ  尿素、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ塩酸（ｐＨ７．４）、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、及びプロテアーゼ阻害剤（Ｎａｃａｌａｉ  ｔｅｓｑｕｅ，Ｃａｔ  ｎｏ．０３９６９）並びにフォスファターゼ阻害剤（Ｎａｃａｌａｉ  ｔｅｓｑｕｅ，Ｃａｔ  ｎｏ．０７５７５−５１）を添加した１．０％  ＴｒｉｔｏｎＸを含有する細胞溶解緩衝液で処理した後、細胞溶解物を４℃にて２０分間、高速遠心分離（２１，５００Ｇ）した。細胞蛋白量の総量はタンパク質定量試薬（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｃ，Ｃａｔ  ｎｏ．２３２２７）を用いて定量した。細胞溶解物をＳＤＳ−ＰＡＧＥにて分離し、ニトロセルロースメンブラン（Ｍｅｒｃｋ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｃａｔ  ｎｏ．ＰＶＨ３０４Ｆ０）に転写した後、一次抗体として抗ＰＳＡ抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｃ．，Ｃａｔ  ｎｏ．ｓｃ−７６３８）及び抗ベータアクチン抗体（Ｗａｋｏ，Ｃａｔ  ｎｏ．０１３−２４５５３）を用い、ＨＲＰ（Ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ  ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ）標識された二次抗体を用いた免疫ブロットによる化学発光を検出することによりＰＳＡ産生量を測定した。【００７９】
ＰＳＡ産生量を測定した結果を図１に示した。上記の測定結果より、クローン番号１４及び１５の細胞株では、ＬＮＣａＰ細胞に比較し、アンドロゲン除去下（ｃｓＦＢＳ）においても高いＰＳＡ産生が認められた。本結果は実臨床におけるＣＲＰＣを反映している。以下、これらの細胞株をそれぞれ「ＡＩＬＮＣａＰ１４細胞株」及び「ＡＩＬＮＣａＰ１５細胞株」と称す。
実施例１−３
アンドロゲン除去下におけるＡＩＬＮＣａＰ１４細胞株及びＡＩＬＮＣａＰ１５細胞株の増殖能の確認
実施例１−１と同様にして、２．５×１０６個／ウェルのＡＩＬＮＣａＰ１４細胞株及びＡＩＬＮＣａＰ１５細胞株を、活性炭処理した１０％ウシ胎児血清  （ｃｓＦＢＳ）を含有するフェノールレッド不含ＲＰＭＩ１６４０培地にて、３７℃で５％ＣＯ２存在下に６日間培養した。培養後、Ｋｅｙｅｎｃｅ社のＢＺ−９０００シリーズ（ＢＩＯＲＥＶＯ）で位相差条件にて撮影を行った。【００８０】
位相差顕微鏡写真の結果を図２に示した。培養後の細胞数は、両細胞株でともに５×１０６個／ウェルとなり、培養前に比べて２倍に増加した。本結果より、ＡＩＬＮＣａＰ１４細胞株及びＡＩＬＮＣａＰ１５細胞株はアンドロゲン除去下において、良好に増殖することが確認された。
実施例１−４
ＡＩＬＮＣａＰ４細胞株、ＡＩＬＮＣａＰ７細胞株、ＡＩＬＮＣａＰ１４細胞株及びＡＩＬＮＣａＰ１５細胞株の変異ＡＲ遺伝子の同定
逆転写ＰＣＲ及びアガロースゲル電気泳動法によりＡＲ及びＡＲ−Ｖ７スプライシングバリアントのｍＲＮＡの発現を同定した。【００８１】
２．５×１０６個／ウェルのＡＩＬＮＣａＰ１４細胞株及びＡＩＬＮＣａＰ１５細胞株を１０ｍＬ／ウェルの培地を分注した６ウェルプレートに播種した６日間培養した後、ＲＮｅａｓｙ（登録商標）Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ  Ｃａｔ  ｎｏ．７４１０６）を用いて培養細胞より全ＲＮＡを抽出した。２μグラムの全ＲＮＡを使用し、ＲｅｖｅｒＴｒａ  ＡＣＥ  ｑＰＣＲ  ＲＴ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（ＴＯＹＯＢＯ  Ｃｏｄｅ  ｎｏ．ＦＳＱ−２０１）を用いてそのプロトコールに従いｃＤＮＡを合成した。ＰＣＲ増副産物はアガロースゲル電気泳動法により同定した。【００８２】
逆転写ＰＣＲに用いたプライマーの配列を表１に示した。また、逆転写ＰＣＲの条件を表２に示した。また、本結果を図３に示した。【００８３】
【表１】
2020138370.tif 000004
【００８４】
【表２】
2020138370.tif 000005
【００８５】
実施例１−４の結果より、アンドロゲン除去下において、「ＬＮＣａＰ細胞株」は野生型ＡＲのｍＲＮＡの発現が認められたものの、スプライシングバリアントであるＡＲ−Ｖ７のｍＲＮＡの発現は殆ど認められなかった。一方、「ＡＩＬＮＣａＰ１４細胞株」及び「ＡＩＬＮＣａＰ１５細胞株」においては、野生型ＡＲのｍＲＮＡの発現以外に、スプライシングバリアントであるＡＲ−Ｖ７のｍＲＮＡの発現が認められることを確認した。
実施例１−５
エンザルタミドによる細胞増殖抑制試験
５×１０３個のＬＮＣａＰ細胞株、４×１０４個のＡＩＬＮＣａＰ１４細胞株、及び６×１０４個のＡＩＬＮＣａＰ１５細胞株を各々、１ｍＬ／ウェルの培地を分注した２４ウェルプレートに播種した。３７℃で５％ＣＯ２存在の条件下に７２時間培養した後、各々のプレートについて、エンザルタミドのＤＭＳＯ溶液をエンザルタミドの終濃度が０．６２５、１．２５、２．５、及び５ｕＭとなるように培地で希釈し各ウェルに添加した（３ウェル／濃度、終容積２ｍＬ）。コントロールとして、エンザルタミドを含まないＤＭＳＯを同様に培地で希釈し添加した。さらに各細胞株を２週間培養した後、クリスタルバイオレットを用いた細胞染色法（Ｂｏｍｍｉ−Ｒｅｄｄｙ  ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．１０５：  １６４８４−１６４８９（２００８））により細胞増殖の状態を測定した。【００８６】
実施例１−５の結果を図４に示した。実施例１−５の試験結果より、ＬＮＣａＰ細胞株においては、終濃度０．６２５ｕＭ以上のエンザルタミドの添加において明らかな細胞増殖抑制が観察されたのに対し、ＡＩＬＮＣａＰ１４細胞株及びＡＩＬＮＣａＰ１５細胞株においては、終濃度５ｕＭにおいても、ＬＮＣａＰ細胞株に比べ細胞の増殖抑制は著しく弱いことが確認された（ＩＣ５０＞５ｕＭ）。したがって、ＡＩＬＮＣａＰ１４細胞株及びＡＩＬＮＣａＰ１５細胞株は、ＬＮＣａＰ細胞株と比較しても、エンザルタミドへ耐性を獲得していることを見出した。【００８７】
実施例１−１及び実施例１−２より単離された「ＡＩＬＮＣａＰ１４細胞株」及び「ＡＩＬＮＣａＰ１５細胞株」は、ＰＳＡを高発現するとともに、アンドロゲン除去下においても良好に増殖した（実施例１−３）。さらに、アンドロゲン受容体スプライシングバリアントＡＲ−Ｖ７を発現するとともに（実施例１−４）、エンザルタミドへ耐性を獲得していること見出した。以上より、「ＡＩＬＮＣａＰ１４細胞株」及び「ＡＩＬＮＣａＰ１５細胞株」は、アンドロゲン受容体拮抗剤及び／又はアンドロゲン合成阻害剤に対して治療抵抗性を示す去勢抵抗性前立腺がんの病態を反映する有益なモデル細胞株である。
実施例２
アルボシジブ（フラボピリドール）による細胞増殖抑制試験
エンザルタミドの代わりにアルボシジブ塩酸塩を使用し、実施例１−５と同様の実験手順にて、ＡＩＬＮＣａＰ１４細胞株およびＡＩＬＮＣａＰ１５細胞株に対するアルボシジブの細胞増殖抑制効果を確認した。なお、アルボシジブの終濃度は、０．１２５、０．２５、０．５、及び１．０ｕＭとなるよう設定した。【００８８】
実施例２の結果を図５に示した。ＡＩＬＮＣａＰ１４細胞株、及びＡＩＬＮＣａＰ１５細胞株に対し、終濃度０．２５ｕＭ以上のアルボシジブを作用させることより、いずれの細胞においても極めて強力な細胞増殖抑制作用が観察されることが確認された（ＩＣ５０＝０．１２５ｕＭ〜０．２５ｕＭ）。本結果は、去勢抵抗性前立腺がんの治療に使用されるエンザルタミドをもってしても、細胞増殖抑制効果がほとんど認められない、ＡＩＬＮＣａＰ１４細胞株、及びＡＩＬＮＣａＰ１５細胞株に対して、低濃度から細胞増殖抑制を示したという点で、格別かつ異質な効果を示したといえる。
実施例３
アルボシジブによるＡＲリン酸化抑制試験
２．５×１０６個／ウェルのＡＩＬＮＣａＰ１４細胞株及びＡＩＬＮＣａＰ１５細胞株を、１０ｍＬ／ウェルの培地を分注した６ウェルプレートに播種して６日間３７℃で５％ＣＯ２存在の条件下で培養後、アルボシジブのＤＭＳＯ溶液をアルボシジブの終濃度が０．２５ｕＭとなるように培地で希釈して添加した。１〜４日間の培養の後、一次抗体として抗ＡＲ抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｃ．，  Ｃａｔ  ｎｏ．ｓｃ−８１６）、抗ｐＡＲｓｅｒ８１抗体（Ｍｅｒｃｋ，Ｃａｔ  ｎｏ．０４−０７８）、抗ｐＡＲ  ｓｅｒ２１０＋２１３  抗体＊（Ａｂｃａｍ，Ｃａｔ  ｎｏ．ａｂ４５０８９）、及び抗ベータアクチン抗体（Ｗａｋｏ，Ｃａｔ  ｎｏ．０１３−２４５５３）を用い、実施例１−２に準じた手法により免疫ブロットを実施した。【００８９】
実施例３の結果を図６に示した。ＡＩＬＮＣａＰ１４細胞株及びＡＩＬＮＣａＰ１５細胞株に対し、０．２５ｕＭのアルボシジブを作用させることにより、ＡＲセリン８１、およびセリン２１０又はセリン２１３のリン酸化が経時的に抑制されることが確認された。
実施例４
免疫蛍光染色法を用いたアルボシジブによるＡＲ核内移行抑制試験
１×１０５個のＡＩＬＮＣａＰ１４細胞株を０．５ｍＬ培地／ウェルの培地を分注した４８ウェルプレートに播種した。３日間３７℃で５％ＣＯ２存在の条件下で培養した後、アルボシジブのＤＭＳＯ溶液をアルボシジブの終濃度が０．２５ｕＭとなるように培地で希釈し各ウェルに添加した（終容量１．０ｍＬ）。コントロールとしてアルボシジブを含まないＤＭＳＯを同様に希釈し添加した。４日間の培養後、細胞をＰＢＳで穏やかに１回洗浄し、４％パラホルムアルデヒドリン酸緩衝液を１５分間作用させ固定化した。細胞をＰＢＳで穏やかに２回洗浄した後、４％ＰＢＳＴ溶液中で１５分間インキュベートした。さらに細胞をブロッキング試薬（ＤＳ  Ｐｈａｒｍａ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ，Ｃａｔ  ｎｏ．ＵＫ−Ｂ８０）中にて１５分間インキュベートした後、抗ＡＲ抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｃ．，Ｃａｔ  ｎｏ．ｓｃ−８１６）を添加し、４℃にて一晩インキュベートした。細胞をＰＢＳで穏やかに２回洗浄した後、免疫蛍光染色用二次抗体（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｃ，Ｃａｔ  ｎｏ  Ａ−２１２０６）を添加し、室温にて４５分間インキュベートした。さらに、細胞をＰＢＳで穏やかに２回洗浄した後、ＤＡＰＩ（Ｎａｃａｌａｉ  ｔｅｓｑｕｅ，Ｃａｔ  ｎｏ．１１０３４−５６）を添加し１０分間インキュベートした。細胞を１％ＰＢＳにて１０分間、２回洗浄した後、蛍光顕微鏡にてシグナルを測定した。【００９０】
実施例４の結果を図７に示した。ＡＩＬＮＣａＰ１４細胞株において、ＤＭＳＯ対照（アルボシジブを作用させていない）では、ＡＲ染色により細胞質及び核がともに染色（細胞が全体的に白く見える）されており、ＡＲが細胞質及び核の両方に存在していることが分かる。一方、アルボシジブを作用させたＡＩＬＮＣａＰ１４細胞株において、細胞質はＡＲ染色されているが、核においてＡＲ染色が低下している（中央部分が黒く抜けている）ことが明らかとなった。このことから、ＡＩＬＮＣａＰ１４細胞株をアルボシジブで処理することにより、ＡＲの核移行が抑制されたことが見出された。治療抵抗性の去勢抵抗性前立腺がんにおいては、リガンド非依存的かつ恒常的に変異型ＡＲが活性化していることを鑑みると、アルボシジブは該変異型ＡＲの核内移行を抑制する、格別かつ異質な効果を有する。
実施例５  皮下ゼノグラフトマウスモデルを用いたアルボシジブによる腫瘍増殖抑制試験
２×１０６個のＡＩＬＮＣａＰ１４細胞を、活性炭処理した１０％ウシ胎児血清（ｃｓＦＢＳ）を含有するフェノールレッド不含ＲＰＭＩ１６４０培地にて、ＰｒｉｍｅＳｕｒｆａｃｅ（登録商標）シャーレ９０ｍｍ（製品コードＭＳ−９０９０Ｘ）を使用して４日間浮遊培養した。培養細胞を回収し、３５０ｕＬのマトリゲル（Ｃｏｒｎｉｎｇ（登録商標）  Ｍａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）基底膜マトリックス；カタログ番号３５６２３７）と混合させた後、３等分したものを、去勢７日後のＮＯＤ−ＳＣＩＤマウス（雄、８匹、６〜８週齢）の皮下３箇所に移植した。皮下移植後、飼育を継続し、いずれか1もしくは2箇所の腫瘍移植部位において、皮下に形成された腫瘍体積が25mm3以上かつ100mm3以下となった時点（デイ０）から、アルボシジブ塩酸塩（３ｍｇ/ｋｇ）の生理食塩水溶液を２日に１回の間隔で計３回、当該マウスの腹腔内に投与した。【００９１】
３回目の投与から３日後（デイ７）の当該腫瘍体積を測定し、下記の計算式に従い、腫瘍体積増加比を計算した。
腫瘍体積増加比＝デイ７における腫瘍体積／デイ０における腫瘍体積
また陰性対照群として、薬剤投与液の代わりに生理食塩水を用いて、同様の試験を実施し、腫瘍体積増加比を計算した。【００９２】
なお参考として、実施例５の試験計画の概要を図９に示した。【００９３】
実施例５の試験結果を図１０に示した。図１０において、薬剤投与群の腫瘍体積増加比はマウス５匹（６腫瘍）の平均及び標準偏差として、また、陰性対照群の腫瘍体積増加比はマウス３匹（３腫瘍）の平均及び標準偏差として示した。【００９４】
図１０で示すように、アルボシジブ投与群では陰性対照群に比べ、有意差をもって（p値＝0.0497）、腫瘍体積増加比が低減し、より高い腫瘍増殖抑制効果が認められた。なお、何れの投与群においても、マウスの体重減少は認められなかった。【００９５】
以上の結果より、本発明のアルボシジブがアンドロゲン受容体拮抗剤及び／又はアンドロゲン合成阻害剤に対して治療抵抗性を示す癌に対し、体重減少を起こさずに、顕著な抗癌作用を有する、格別かつ異質な効果を示すことが裏付けられた。
比較例１
ボルシクリブによるＡＲリン酸化抑制試験
実施例３の実験手順に従い、ボルシクリブによるＡＲリン酸化抑制試験を行った。【００９６】
２．５×１０６個／ウェルのＡＩＬＮＣａＰ１４細胞株を、１０ｍＬ／ウェルの培地を分注した６ウェルプレートに播種して６日間３７℃で５％ＣＯ２存在の条件下で培養後、ボルシクリブ（ＣＤＫ１，９阻害剤）のＤＭＳＯ溶液をボルシクリブの終濃度が０．１２５ｕＭ、０．２５ｕＭ、０．５ｕＭ及び１ｕＭとなるように添加した。４日間の培養の後、一次抗体として抗ＡＲ抗体  （Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｃ．，  Ｃａｔ  ｎｏ．  ｓｃ−８１６）、抗ｐＡＲｓｅｒ８１抗体  （Ｍｅｒｃｋ，Ｃａｔ  ｎｏ．  ０４−０７８）、抗ｐＡＲ  ｓｅｒ２１０＋２１３  抗体＊  （Ａｂｃａｍ，Ｃａｔ  ｎｏ．ａｂ４５０８９）、及び抗ベータアクチン抗体  （Ｗａｋｏ，Ｃａｔ  ｎｏ．０１３−２４５５３）を用い、実施例１−２に準じた手法により免疫ブロットを実施した。ポジティブコントロールとして、ＪＱ１（Ｃａｙｍａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ社製）を使用した。【００９７】
比較例１の実験結果を図８に示した。ボルシクリブ投与により、ＡＲのＳｅｒ８１のリン酸化は僅かに抑制されているが、Ｓｅｒ２１０、２１３のリン酸化抑制は認められなかった。このことから、ＡＩＬＮＣａＰ１４細胞株に対するボルシクリブの増殖抑制効果は極めて低いものと推測される。アルボシジブとボルシクリブは、ＣＤＫ阻害剤であるものの、ＡＩＬＮＣａＰ１４細胞株に対する効果は全く異なることが明らかとなった。これは同じＣＤＫ阻害剤であったとしても、治療抵抗性前立腺癌への有効性を予測することができないことを意味する。【００９８】
以上のように、本発明の好ましい実施形態を用いて本発明を例示してきたが、本発明は、特許請求の範囲によってのみその範囲が解釈されるべきであることが理解される。本願は、日本国出願である特願２０１８−２４４１７４（２０１８年１２月２７日出願）に対して優先権を主張するものであり、その内容はその全体が本明細書において参考として援用される。本明細書において引用した特許、特許出願および他の文献は、その内容自体が具体的に本明細書に記載されているのと同様にその内容が本明細書に対する参考として援用されるべきであることが理解される。
【産業上の利用可能性】
【００９９】
本発明に係るアルボシジブ又はその製薬学的に許容される塩は、「アンドロゲン受容体拮抗剤又はアンドロゲン合成阻害剤に対して抵抗性を示す癌」に対して、極めて有用である。
【配列表フリーテキスト】
【０１００】
配列番号１：ＡＲ順行プライマー
配列番号２：ＡＲ逆行プライマー
配列番号３：ＡＲ−Ｖ７順行プライマー
配列番号４：ＡＲ−Ｖ７逆行プライマー
配列番号５：ベータアクチン順行プライマー
配列番号６：ベータアクチン逆行プライマー
【図１】
2020138370.tif 000006
【図２】
2020138370.tif 000007
【図３】
2020138370.tif 000008
【図４】
2020138370.tif 000009
【図５】
2020138370.tif 000010
【図６】
2020138370.tif 000011
【図７】
2020138370.tif 000012
【図８】
2020138370.tif 000013
【図９】
2020138370.tif 000014
【図１０】
2020138370.tif 000015
【配列表】
2020138370000001.app
【国際調査報告】
2020138370.tif 000016
2020138370.tif 000017
2020138370.tif 000018
2020138370.tif 000019
2020138370.tif 000020
2020138370.tif 000021
2020138370.tif 000022
2020138370.tif 000023
2020138370.tif 000024