(57)【要約】  バーコード配列とそれに連結した少なくとも一つのレポータータンパク質異常発現カセットを導入した細胞集団を調製するステップ；任意のバーコード配列を標的とするバーコード配列認識モジュールと核酸変異修復酵素とを細胞に導入するステップ；標的とされたバーコード配列を有する細胞において、上記少なくとも一つのレポータータンパク質異常発現カセットにおける異常発現の原因である核酸変異を、上記バーコード配列認識モジュールと上記核酸変異修復酵素の複合体の発現により修復し、それにより上記レポータータンパク質を正常に発現させるステップ；上記レポータータンパク質が発現したターゲットクローン細胞を単離又は同定するステップ；を含む、細胞集団からターゲットクローン細胞を単離又は同定する方法を開示する。
2020036181.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞集団からターゲットクローン細胞を単離又は同定する方法であって、
（ｉ）バーコード配列とそれに連結した少なくとも一つのレポータータンパク質異常発現カセットを導入した細胞集団を調製するステップ；
（ｉｉ）任意のバーコード配列を標的とするバーコード配列認識モジュールと核酸変異修復酵素とを細胞に導入するステップ；
（ｉｉｉ）標的とされたバーコード配列を有する細胞において、前記少なくとも一つのレポータータンパク質異常発現カセットにおける異常発現の原因である核酸変異を、前記バーコード配列認識モジュールと前記核酸変異修復酵素の複合体の発現により修復し、それにより前記レポータータンパク質を正常に発現させるステップ；
（ｉｖ）前記レポータータンパク質が発現したターゲットクローン細胞を単離又は同定するステップ；
を含む、方法。
【請求項２】
前記複合体は、前記核酸変異部位において１以上のヌクレオチドを他の１以上のヌクレオチドに変換する若しくは欠失させる、又は１以上のヌクレオチドを挿入するものである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記核酸変異が、Ｎ末端から最初に現れるメチオニンをコードする配列（ＡＴＧ）における変異である、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記バーコード配列にはＡＴＧが含まれない、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記バーコード配列認識モジュールが、ガイドＲＮＡであり、
前記核酸変異修復酵素がＣａｓタンパク質と連結しており、
前記ガイドＲＮＡは前記バーコード配列の少なくとも一部と相補的な配列を含む、請求項１〜４いずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
バーコード配列とそれに連結した少なくとも一つのレポータータンパク質異常発現カセットが、個々の細胞に導入されている、細胞集団。
【請求項７】
前記少なくとも一つのレポータータンパク質異常発現カセットにおける核酸変異が、Ｎ末端から最初に現れるメチオニンをコードする配列（ＡＴＧ）における変異である、請求項６に記載の細胞集団。
【請求項８】
前記バーコード配列にはＡＴＧが含まれない、請求項６又は７に記載の細胞集団。
【請求項９】
任意のバーコードを標的とする核酸配列認識モジュールと核酸変異修復酵素とが結合した複合体を含む、請求項６〜８のいずれか一項に記載の細胞集団。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞を単離又は同定する方法及び細胞集団に関する。
【背景技術】
【０００２】
細胞分化、がん細胞の増殖や個体発生において細胞集団の不均質性が重要であることが指摘されている。例えば、がんの悪性化や細胞分化又はそれらのモデルとなる培養細胞の系は、ゲノム解析により、不均質で異なる細胞クローンであることが明らかにされ、これががん治療を困難なものとする原因の１つとして着目されている。一方で、不均質な細胞集団に関する研究においては、「将来特定の形質を示す細胞クローン」が複雑性の高い初期状態の不均質な細胞集団中に埋没し、多様な細胞の中から同定・単離・培養することができないということが問題となる。【０００３】
ゲノム解析のみでがんの悪性化等を生じる機構を解明するのは困難であるため、不均質な細胞集団を何らかの手法で分離して解析する必要がある。フローサイトメトリー等の従来の細胞分離法では、通常細胞表面のマーカーを基準として細胞を選別することから、表面抗原が特定された免疫細胞等を選別するのには有用な方法である。しかしながら、表面抗原マーカー等を用いた従来法による細胞の分取り・解析では、目的とするクローンを集団中から選択的に分離できる遺伝子セットが必要となる。そのため、マーカーの発現が自明ではない細胞や既知のマーカーでは分離できない集団については、分取り・解析が困難となる。例えば、造血幹細胞が血液細胞へと分化、成熟するまでの過程に未知の亜集団の存在が指摘されているが、現状では、これらの細胞集団を分取りし、解析することは出来ない。また、例えば、線維芽細胞からｉＰＳ細胞への誘導の過程においては、その誘導効率がクローン毎に異なる現象が見出されているものの、現状では誘導効率の高いクローンを分取りし、遺伝子発現やＤＮＡメチル化の状態等を解析することは難しい。【０００４】
さらに、細胞は集団内で相互作用を繰り返し、各々の細胞内動態を変化させる。この一例として、がん細胞における薬剤耐性獲得プロセスが挙げられる。がん細胞集団の抗がん剤に対する応答を理解することは、理想的な抗がん剤開発において急迫した課題である。その一方、各々のがん細胞クローンの持つゲノム構造や遺伝子発現といった分子動態は、がん細胞集団全体に対してどのように作用・応答しているのか、今日の技術では解析が難しく明らかにされていない。例えば、米ノバルティスとハーバード大学のチームは、非小細胞肺がん由来細胞株を対象に、複雑性の高いＤＮＡバーコードをレンチウィルスによりゲノムに導入し、抗がん剤暴露下における細胞の増殖変動を計測した (非特許文献１)。長期に及ぶ複数の抗がん剤暴露下で、集団内においてＤＮＡバーコードの多様性が縮小し、異なる細胞クローンの増減の一斉追跡法を確立したものの、この方法によっても、特定の遺伝子の増幅又は細胞形態の変化が確認された細胞クローンの分子動態について、時間発展とともにどのように細胞集団環境下で変動してきたか、そのダイナミクスを解析することはできない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Bhang HE et al.,Nat Med., 2015,21(5):440-8
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、細胞集団から任意の細胞を単離又は同定する方法及び当該方法に用いる細胞集団を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らは、バーコード技術による細胞集団の一斉標識化と、核酸編集技術を用いて、細胞集団から任意の細胞クローンを同定・単離できる方法を見出し、本発明を完成するに至った。【０００８】
本発明は、例えば、以下の各発明を提供する。
［１］
細胞集団からターゲットクローン細胞を単離又は同定する方法であって、
（ｉ）バーコード配列とそれに連結した少なくとも一つのレポータータンパク質異常発現カセットを導入した細胞集団を調製するステップ；
（ｉｉ）任意のバーコード配列を標的とするバーコード配列認識モジュールと核酸変異修復酵素とを細胞に導入するステップ；
（ｉｉｉ）標的とされたバーコード配列を有する細胞において、上記少なくとも一つのレポータータンパク質異常発現カセットにおける異常発現の原因である核酸変異を、上記バーコード配列認識モジュールと上記核酸変異修復酵素の複合体の発現により修復し、それにより上記レポータータンパク質を正常に発現させるステップ；
（ｉｖ）上記レポータータンパク質が発現したターゲットクローン細胞を単離又は同定するステップ；
を含む、方法。
［２］
上記複合体は、上記核酸変異部位において１以上のヌクレオチドを他の１以上のヌクレオチドに変換する若しくは欠失させる、又は１以上のヌクレオチドを挿入するものである、［１］に記載の方法。
［３］
上記核酸変異が、Ｎ末端から最初に現れるメチオニンをコードする配列（ＡＴＧ）における変異である、［１］又は［２］に記載の方法。
［４］
上記バーコード配列にはＡＴＧが含まれない、［３］に記載の方法。
［５］
上記バーコード配列認識モジュールが、ガイドＲＮＡであり、
上記核酸変異修復酵素がＣａｓタンパク質と連結しており、
上記ガイドＲＮＡは上記バーコード配列の少なくとも一部と相補的な配列を含む、［１］〜［４］のいずれかに記載の方法。
［６］
バーコード配列とそれに連結した少なくとも一つのレポータータンパク質異常発現カセットが、個々の細胞に導入されている、細胞集団。
［７］
上記少なくとも一つのレポータータンパク質異常発現カセットにおける核酸変異が、Ｎ末端から最初に現れるメチオニンをコードする配列（ＡＴＧ）における変異である、［６］に記載の細胞集団。
［８］
上記バーコード配列にはＡＴＧが含まれない、［６］又は［７］に記載の細胞集団。
［９］
任意のバーコードを標的とする核酸配列認識モジュールと核酸変異修復酵素とが結合した複合体を含む、［６］〜［８］のいずれかに記載の細胞集団。
【発明の効果】
【０００９】
本発明によれば、細胞集団から任意の細胞を単離又は同定する方法及び当該方法に用いる細胞集団を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】実施例１の結果を示す蛍光顕微鏡写真である。
【図２】実施例１における、ＲＦＰの蛍光強度を表したグラフである。ｔａｒｇｅはｔａｒｇｅ  ｓｇＲＮＡを用いた場合、ｓｃｒａｍｂｌｅｄは、ｓｃｒａｍｂｌｅｄ  ｓｇＲＮＡを用いた場合をそれぞれ示す。
【図３】実施例２の実験を示す概略図である。
【図４】実施例２の結果を示すグラフである。各グラフ中に記載された％は、ＧＦＰ蛍光が確認された集団の割合を示す。
【図５】実施例３において、各バーコードを用いた場合のＡＴＧ変換効率を示すグラフである。
【図６】実施例４において、各システムにおける、異なるインデューサー及び細胞株の組み合わせを用いた結果を示すグラフである。
【図７】実施例４において、各システムにおける、ＧＦＰ陽性細胞の割合（活性化  ％）と偽陽性（エラー  ％）の関係を示すグラフである。
【図８】実施例５において、ＲＦＰ発現が期待されるコロニーの例示を示す。左はｓｇＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ＿ＢＣ７）を用いた場合、右はｓｇＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ＿ＢＣ８）を用いた場合の結果を示す。
【図９】実施例５において、サンプリングされたコロニーにおけるバーコード配列付近の配列を、次世代シーケンサーによりにより確認した結果を示す。網掛けはバーコード配列、囲み線は変異により修復された開始コドンＡＴＧを示す。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
以下、本発明を実施するための形態について詳細に説明する。ただし、本発明は以下の実施形態に限定されるものではない。
【００１２】
一実施形態に係る細胞集団からターゲットクローン細胞を単離又は同定する方法は、以下の（ｉ）〜（ｉｖ）のステップを含むことを特徴とする。
（ｉ）バーコード配列とそれに連結した少なくとも一つのレポータータンパク質異常発現カセットを導入した細胞集団を調製するステップ、
（ｉｉ）任意のバーコード配列を標的とするバーコード配列認識モジュールと核酸変異修復酵素とを細胞に導入するステップ、
（ｉｉｉ）標的とされたバーコード配列を有する細胞において、上記少なくとも一つのレポータータンパク質異常発現カセットにおける異常発現の原因である核酸変異を、上記バーコード配列認識モジュールと上記核酸変異修復酵素の複合体の発現により修復し、それにより上記レポータータンパク質を正常に発現させるステップ、
（ｉｖ）上記レポータータンパク質が発現したターゲットクローン細胞を単離又は同定するステップ。
【００１３】
本発明において細胞は特に限定されず、例えば、がん細胞、造血幹細胞、血液細胞、線維芽細胞、ｉＰＳ細胞等の様々な細胞を使用することが可能である。
【００１４】
細胞集団は、細胞の集まりを意味する。細胞集団は、単一のクローンのみが存在する均質な細胞からなるものであってもよいが、不均質な細胞集団であると、本発明の効果がより顕著に発揮されるため好ましい。不均質な細胞集団とは、複数のクローンが存在する細胞の集まりを意味する。
【００１５】
本発明は、レポータータンパク質の発現に基づき選抜することで、ターゲットクローン細胞を単離又は同定する。ターゲットクローン細胞は、単離又は同定の目的となる細胞であり、単一の細胞であってもよく、該細胞が増殖した後代の細胞群であってもよい。
【００１６】
［ステップ（ｉ）］
ステップ（ｉ）は、バーコード配列とそれに連結した少なくとも一つのレポータータンパク質異常発現カセット（遺伝学的回路）を導入した細胞集団を調製するステップである。
【００１７】
本発明のバーコード配列とは、タグ（特表平１０−５０７３５７号公報、特表２００２−５１８０６０号公報）、ジップコード（特表２００１−５１９６４８号公報）もしくは正規直交化配列（特開２００２−１８１８１３号公報）、バーコード配列（Ｘｕ，  Ｑ．，  Ｓｃｈｌａｂａｃｈ，  Ｍ．Ｒ．，  Ｈａｎｎｏｎ，  Ｇ．Ｊ．  ｅｔ  ａｌ．  （２００９）  ＰＮＡＳ  １０６，  ２２８９−２２９４）などと呼ばれる配列である。バーコード配列は、ＤＮＡ配列を用いたもの（ＤＮＡバーコード配列）であってもよく、ＤＮＡやＲＮＡの類似体であるペプチド核酸（ＰＮＡ）を用いたものであってもよい。バーコード配列は、交差反応性（クロスハイブリダイゼーション）が少ないことが望ましい。また、バーコード配列の塩基長は、８〜３０塩基長であってよく、１０〜２５塩基長であってよく、１５〜２０塩基長であってよく、１７〜２０塩基長であってよく、１６〜１８塩基長であってよい。また、下流に配置された遺伝子のタンパク質発現の安定性の観点等から、バーコードは、開始コドンに対応する配列（ＡＴＧ）を含まないことが好ましく、開始コドンに対応する配列及び終止コドンに対応する配列（ＴＡＡ、ＴＡＧ、ＴＧＡ）の両方を含まないことがより好ましい。バーコードの具体例としては、４塩基ＷＳＮＳ（Ｗ＝Ａ／Ｔ、Ｓ＝Ｇ／Ｃ、Ｎ＝Ａ／Ｔ／Ｇ／Ｃ）を１つのユニットとし、連続する４つのユニットと一塩基のＮを持った計１７塩基から構成されるＤＮＡバーコードが挙げられる（（ＷＳＮＳ）４Ｎ）。上記バーコードの各ＷＳＮＳユニットは理論上、開始コドンに対応する配列と終止コドンに対応する配列が出現しないため、下流に配置された遺伝子（例えば、レポーター遺伝子）の意図しない読み枠での翻訳開始と終結を防止することが期待でき、本実施形態に係る方法の安定性と高感度化に寄与すると期待される。
【００１８】
レポータータンパク質異常発現カセットは、レポータータンパク質発現カセットにおける核酸変異により、レポータータンパク質を正常に発現しないように設計されたものを意味する。レポータータンパク質が正常に発現している場合には、その発現に基づき、目的とする選抜ができる。レポータータンパク質の異常発現は、上記核酸変異の存在により、レポータータンパク質を全く発現しない場合だけではなく、発現するタンパク質の構造が異常であったり、タンパク質の発現量が小さすぎたりするために、レポータータンパク質の発現に基づき目的とする選抜ができない場合も含む。したがって、レポータータンパク質の異常発現は、レポータータンパク質をコードする遺伝子における核酸変異によるものに限定されず、レポータータンパク質を発現するためのプロモーター等における核酸変異によるものであってもよい。レポータータンパク質異常発現カセットは、上記核酸変異が修正された場合にレポータータンパク質が正常に発現するように設計される。
【００１９】
異常発現の原因となる核酸変異は、レポータータンパク質異常発現カセットにおけるヌクレオチドの変異であり、レポータータンパク質をコードするポリヌクレオチドにおけるヌクレオチドの塩基の変異であることが好ましい。ヌクレオチドの塩基の変異数は特に制限されず、１〜５、１〜４、１〜３、１若しくは２、又は１の塩基における変異であってよい。また、塩基の変異は連続していてもよく、複数の変異が別個に存在していてもよい。変異の種類としては、置換、挿入、欠失及びそれらの組み合わせのいずれであってもよい。変異は、レポータータンパク質のアミノ酸配列においてＮ末端から最初に現れるＡＴＧ（開始コドンに該当するメチオニン）における変異であることが好ましく、ＡＴＧのＡをＧに置換する変異であることがより好ましい。
【００２０】
レポータータンパク質発現カセットは、細胞内でレポータータンパク質を発現可能なポリヌクレオチドである限り特に制限されない。該発現カセットの典型例としては、プロモーター、及び該プロモーターの制御下に配置されたレポータータンパク質コード配列を含むポリヌクレオチドが挙げられる。
【００２１】
プロモーターとしては、特に制限されず、例えばＣＭＶプロモーター、ＥＦ１ａプロモーター、ＵｂｉＣプロモーター、ＰＧＫプロモーター、Ｕ６プロモーター、ＣＡＧプロモーター等の恒常性プロモーターが挙げられる。レポータータンパク質発現カセットのプロモーターとしては、ＣＭＶプロモーターを使用することが好ましい。
【００２２】
レポータータンパク質としては、特に制限されず、例えば、特定の基質と反応して発光（発色）する発光（発色）タンパク質、或いは励起光によって蛍光を発する蛍光タンパク質等が挙げられる。発光（発色）タンパク質としては、例えば、ルシフェラーゼ、βガラクトシダーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、βグルクロニダーゼ等が挙げられ、蛍光タンパク質としては、例えば、ＧＦＰ、Ａｚａｍｉ−Ｇｒｅｅｎ、ＺｓＧｒｅｅｎ、ＧＦＰ２、ＥＧＦＰ、ＨｙＰｅｒ、Ｓｉｒｉｕｓ、ＢＦＰ、ＣＦＰ、Ｔｕｒｑｕｏｉｓｅ、Ｃｙａｎ、ＴＦＰ１、ＹＦＰ、Ｖｅｎｕｓ、ＺｓＹｅｌｌｏｗ、Ｂａｎａｎａ、ＫｕｓａｂｉｒａＯｒａｎｇｅ、ＲＦＰ、ＤｓＲｅｄ、ＡｓＲｅｄ、Ｓｔｒａｗｂｅｒｒｙ、Ｊｒｅｄ、ＫｉｌｌｅｒＲｅｄ、Ｃｈｅｒｒｙ、ＨｃＲｅｄ、ｍＰｌｕｍ等が挙げられる。薬剤耐性レポータータンパク質としては、例えば、クロラムフェニコール耐性遺伝子、テトラサイクリン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子、エリスロマイシン耐性遺伝子、スペクチノマイシン耐性遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子、ピューロマイシン耐性遺伝子等の薬剤耐性遺伝子にコードされるタンパク質が挙げられる。レポータータンパク質には、発光（発色）タンパク質や蛍光タンパク質との融合タンパク質や、発光（発色）タンパク質や蛍光タンパク質に公知のタンパク質タグ、公知のシグナル配列等が付加されてなるタンパク質も包含される。また、レポータータンパク質は、正常に発現する限り、公知のタンパク質の一部であってもよい。
【００２３】
レポータータンパク質コード配列は、レポータータンパク質のアミノ酸配列をコードする塩基配列である限り特に制限されない。上述したように、レポータータンパク質は、公知のタンパク質の一部であってもよいため、レポータータンパク質コード配列は、公知のタンパク質の一部のＯＲＦをコードする塩基配列であってもよい。例えば、公知のタンパク質のアミノ酸配列において途中に現れるメチオニンを開始コドンとして使用することもできる。
【００２４】
レポータータンパク質異常発現カセットは、各バーコード配列に連結している。レポータータンパク質異常発現カセットと各バーコード配列は、直接連結していてもよく、間接的に連結していてもよく、各バーコード配列がレポータータンパク質異常発現カセット内に組み込まれていてもよい。バーコード配列がレポータータンパク質異常発現カセット内に組み込まれる場合には、バーコード配列の直下に、変異を含むレポータータンパク質をコードする配列が配置されてもよく、バーコード配列と変異を含むレポータータンパク質をコードする配列の間に何らかの他の核酸が配置されていてもよい。バーコード配列の３’末端からレポータータンパク質異常発現カセットにおける核酸変異までの距離（バーコード配列が上流の場合）、又はレポータータンパク質異常発現カセットにおける核酸変異までの距離からバーコード配列の５’末端までの距離（バーコード配列が下流の場合）は、例えば、塩基数にして０〜３塩基長、０〜２塩基長又は０〜１塩基長であってよい。
【００２５】
バーコード配列とそれに連結した少なくとも一つのレポータータンパク質異常発現カセットを細胞に導入する方法は、特に制限されず、例えば、発現ベクターを使用した方法等当業者に周知の方法を用いることができる。
【００２６】
発現ベクターは、例えば、該ＤＮＡを適当な発現ベクター中のプロモーターの下流に連結することにより製造することができる。また、発現ベクターは、所望によりターミネーター、リプレッサー、薬剤耐性遺伝子、栄養要求性相補遺伝子等の選択マーカー、宿主で機能し得る複製起点などを含有することができる。
【００２７】
発現ベクターの導入は、宿主の種類に応じ、公知の方法（例えば、リゾチーム法、コンピテント法、ＰＥＧ法、ＣａＣｌ２共沈殿法、エレクトロポレーション法、マイクロインジェクション法、パーティクルガン法、リポフェクション法、アグロバクテリウム法など）に従って実施することができる。
【００２８】
［ステップ（ｉｉ）］
ステップ（ｉｉ）は、任意のバーコード配列を標的とするバーコード配列認識モジュールと核酸変異修復酵素とを細胞に導入するステップである。
【００２９】
任意のバーコード配列とは、上述したバーコード配列群から選択されたバーコード配列を意味する。
【００３０】
バーコード配列認識モジュールは、上記選択されたバーコード配列を標的とするモジュールであり、バーコード認識領域を含む。バーコード認識領域は、バーコード配列の少なくとも一部と相補的な配列であることが好ましい。
【００３１】
本発明のバーコード配列認識モジュールとしては、例えば、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムを利用するもの、Ｃａｓの少なくとも１つのＤＮＡ切断能が失活したＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステム（以下、「ＣＲＩＳＰＲ−変異Ｃａｓ」ともいい、ＣＲＩＳＰＲ−変異Ｃｐｆ１も包含される）を利用するもの、ジンクフィンガーモチーフ、ＴＡＬエフェクター及びＰＰＲモチーフ等の他、制限酵素、転写因子、ＲＮＡポリメラーゼ等のＤＮＡと特異的に結合し得るタンパク質のＤＮＡ結合ドメインを含み、ＤＮＡ二重鎖切断能を有しないフラグメント等が用いられ得るが、これらに限定されない。好ましくは、ＣＲＩＳＰＲ−変異Ｃａｓ、ジンクフィンガーモチーフ、ＴＡＬエフェクター、ＰＰＲモチーフ等が挙げられる。
【００３２】
ジンクフィンガーモチーフは、Ｃｙｓ２Ｈｉｓ２型の異なるジンクフィンガーユニット（１フィンガーが約３塩基を認識する）を３〜６個連結させたものであり、９〜１８塩基の標的ヌクレオチド配列を認識することができる。ジンクフィンガーモチーフは、Ｍｏｄｕｌａｒ  ａｓｓｅｍｂｌｙ法（Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  （２００２）  ２０：  １３５−１４１）、ＯＰＥＮ法（Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  （２００８）  ３１：  ２９４−３０１）、ＣｏＤＡ法（Ｎａｔ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  （２０１１）  ８：  ６７−６９）、大腸菌ｏｎｅ−ｈｙｂｒｉｄ法（Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  （２００８）  ２６：  ６９５−７０１）等の公知の手法により作製することができる。ジンクフィンガーモチーフの作製の詳細については、上記特許文献１を参照することができる。
【００３３】
ＴＡＬエフェクターは、約３４アミノ酸を単位としたモジュールの繰り返し構造を有しており、１つのモジュールの１２及び１３番目のアミノ酸残基（ＲＶＤと呼ばれる）によって、結合安定性と塩基特異性が決定される。各モジュールは独立性が高いので、モジュールを繋ぎ合わせるだけで、標的ヌクレオチド配列に特異的なＴＡＬエフェクターを作製することが可能である。ＴＡＬエフェクターは、オープンリソースを利用した作製方法（ＲＥＡＬ法（Ｃｕｒｒ  Ｐｒｏｔｏｃ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  （２０１２）  Ｃｈａｐｔｅｒ  １２：  Ｕｎｉｔ  １２．１５）、ＦＬＡＳＨ法（Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  （２０１２）  ３０：  ４６０−４６５）、Ｇｏｌｄｅｎ  Ｇａｔｅ法（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  （２０１１）  ３９：  ｅ８２）等）が確立されており、比較的簡便に標的ヌクレオチド配列に対するＴＡＬエフェクターを設計することができる。ＴＡＬエフェクターの作製の詳細については、上記特許文献２を参照することができる。
【００３４】
ＰＰＲモチーフは、３５アミノ酸からなり１つの核酸塩基を認識するＰＰＲモチーフの連続によって、特定のヌクレオチド配列を認識するように構成されており、各モチーフの１、４及びｉｉ（−２）番目のアミノ酸のみで標的塩基を認識する。モチーフ構成に依存性はなく、両脇のモチーフからの干渉はないので、ＴＡＬエフェクター同様、ＰＰＲモチーフを繋ぎ合わせるだけで、標的ヌクレオチド配列に特異的なＰＰＲタンパク質を作製することが可能である。ＰＰＲモチーフの作製の詳細については、特開２０１３−１２８４１３号公報を参照することができる。
【００３５】
また、制限酵素、転写因子、ＲＮＡポリメラーゼ等のフラグメントを用いる場合、これらのタンパク質のＤＮＡ結合ドメインは周知であるので、該ドメインを含み、且つＤＮＡ二重鎖切断能を有しない断片を容易に設計し、構築することができる。
【００３６】
ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムを利用する場合、標的となるバーコード配列に対して相補的な配列を含むガイドＲＮＡにより目的の二本鎖ＤＮＡの配列を認識するので、標的となるバーコード配列と特異的にハイブリッド形成し得るオリゴＤＮＡを合成するだけで、任意の配列を標的化することができる。
【００３７】
本発明のより好ましい実施態様においては、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムを利用することが好ましく、少なくとも１つのＤＮＡ切断能が失活したＣａｓタンパク質（例えば、ニッカーゼ）を用いた、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステム（ＣＲＩＳＰＲ−変異Ｃａｓ）を利用することがより好ましい。
【００３８】
ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムを利用する場合のバーコード配列認識モジュールとしては、例えば、ガイドＲＮＡが挙げられる。
【００３９】
例えば、バーコード配列認識モジュールは、標的となるバーコード配列と相補的な配列（バーコード配列認識領域）を含むＣＲＩＳＰＲ−ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）と、Ｃａｓタンパク質のリクルートに必要なｔｒａｎｓ−ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ  ＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）とからなるガイドＲＮＡ（キメラＲＮＡ）であってよい。
【００４０】
ガイドＲＮＡコード配列は、ガイドＲＮＡをコードする塩基配列である限り特に制限されない。
【００４１】
ガイドＲＮＡは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムにおいて用いられるものであれば特に制限されず、例えば、標的部位に結合し、かつＣａｓタンパク質と結合することにより、Ｃａｓタンパク質を標的部位に誘導可能なものを各種使用することができる。
【００４２】
本明細書において、ガイドＲＮＡが結合する標的部位とは、ＰＡＭ（Ｐｒｏｔｏ−ｓｐａｃｅｒ  Ａｄｊａｃｅｎｔ  Ｍｏｔｉｆ）配列及びその５’側に隣接するバーコード配列（標的鎖）とその相補鎖（非標的鎖）からなる、部位である。ＰＡＭ配列の最も５’側の配列からレポータータンパク質異常発現カセットにおける核酸変異までの距離は、例えば、塩基数にして、１５〜２０塩基長であってよい。
【００４３】
ＰＡＭ配列は、利用するＣａｓタンパク質の種類によって異なる。例えば、Ｓ．  ｐｙｏｇｅｎｅｓ由来のＣａｓ９タンパク質（ＩＩ型）に対応するＰＡＭ配列は５’−ＮＧＧであり、Ｓ．  ｓｏｌｆａｔａｒｉｃｕｓ由来のＣａｓ９タンパク質（Ｉ−Ａ１型）に対応するＰＡＭ配列は５’−ＣＣＮであり、Ｓ．  ｓｏｌｆａｔａｒｉｃｕｓ由来のＣａｓ９タンパク質（Ｉ−Ａ２型）に対応するＰＡＭ配列は５’−ＴＣＮであり、Ｈ．  ｗａｌｓｂｙｌ由来のＣａｓ９タンパク質（Ｉ−Ｂ型）に対応するＰＡＭ配列は５’−ＴＴＣであり、Ｅ．  ｃｏｌｉ由来のＣａｓ９タンパク質（Ｉ−Ｅ型）に対応するＰＡＭ配列は５´−ＡＷＧであり、Ｅ．  ｃｏｌｉ由来のＣａｓ９タンパク質（Ｉ−Ｆ型）に対応するＰＡＭ配列は５’−ＣＣであり、Ｐ．  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ由来のＣａｓ９タンパク質（Ｉ−Ｆ型）に対応するＰＡＭ配列は５´−ＣＣであり、Ｓ．  Ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ由来のＣａｓ９タンパク質（ＩＩ−Ａ型）に対応するＰＡＭ配列は５’−ＮＮＡＧＡＡであり、Ｓ．  ａｇａｌａｃｔｉａｅ由来のＣａｓ９タンパク質（ＩＩ−Ａ型）に対応するＰＡＭ配列は５’−ＮＧＧであり、Ｓ．  ａｕｒｅｕｓ由来のＣａｓ９タンパク質に対応するＰＡＭ配列は、５’−ＮＧＲＲＴ又は５’−ＮＧＲＲＮであり、Ｎ．  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ由来のＣａｓ９タンパク質に対応するＰＡＭ配列は、５´−ＮＮＮＮＧＡＴＴであり、Ｔ．  ｄｅｎｔｉｃｏｌａ由来のＣａｓ９タンパク質に対応するＰＡＭ配列は、５’−ＮＡＡＡＡＣである。
【００４４】
ガイドＲＮＡは標的部位への結合に関与する配列（ｃｒＲＮＡ（ＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ）配列といわれることもある）を有しており、このｃｒＲＮＡ配列が、非標的鎖のＰＡＭ配列相補配列を除いてなる配列に相補的（好ましくは、相補的且つ特異的）に結合することにより、ガイドＲＮＡは標的部位に結合することができる。本実施形態においては、ｃｒＲＮＡ配列は、バーコード配列に相補的に結合する。
【００４５】
具体的には、ｃｒＲＮＡ配列の内、バーコード配列に結合する配列は、バーコード配列と例えば、８０％以上、９０％以上、好ましくは９５％以上、より好ましくは９８％以上、さらに好ましくは９９％以上、特に好ましくは１００％の同一性を有する。なお、ガイドＲＮＡの標的部位への結合には、ｃｒＲＮＡ配列のうち、標的配列に結合する配列の３’側の１２塩基が重要であるといわれている。このため、ｃｒＲＮＡ配列のうち、バーコード配列に結合する配列が、バーコード配列と完全同一ではない場合、バーコード配列と異なる塩基は、ｃｒＲＮＡ配列のうち、バーコード配列に結合する配列の３’側の１２塩基以外に存在することが好ましい。
【００４６】
ｔｒａｃｒＲＮＡ配列は、特に制限されない。ｔｒａｃｒＲＮＡ配列は、典型的には、複数（通常、３つ）のステムループを形成可能な５０〜１００塩基長程度の配列からなるＲＮＡであり、利用するＣａｓタンパク質の種類に応じてその配列は異なる。ｔｒａｃｒＲＮＡ配列としては、利用するＣａｓタンパク質の種類に応じて、公知の配列を各種採用することができる。
【００４７】
ガイドＲＮＡは、通常、上記したｃｒＲＮＡ配列とｔｒａｃｒ  ＲＮＡ配列を含む。ガイドＲＮＡの態様は、ｃｒＲＮＡ配列とｔｒａｃｒ  ＲＮＡ配列を含む一本鎖ＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）であってもよいし、ｃｒＲＮＡ配列を含むＲＮＡとｔｒａｃｒＲＮＡ配列を含むＲＮＡとが相補的に結合してなるＲＮＡ複合体であってもよい。
【００４８】
ガイドＲＮＡの発現カセットの具体例としては、例えばガイドＲＮＡがｃｒＲＮＡ配列とｔｒａｃｒ  ＲＮＡ配列を含む一本鎖ＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）である場合は、プロモーター、並びにそのプロモーターの制御下に配置されたｃｒＲＮＡコード配列挿入用サイト及び該サイトの下流に配置されたｔｒａｃｒＲＮＡコード配列を含むポリヌクレオチドや、プロモーター、及びそのプロモーターの制御下に配置されたｓｇＲＮＡコード配列を含むポリヌクレオチド等が挙げられる。別の例として、ガイドＲＮＡがｃｒＲＮＡ配列を含むＲＮＡとｔｒａｃｒＲＮＡ配列を含むＲＮＡとが相補的に結合してなるＲＮＡ複合体である場合は、ガイドＲＮＡの発現カセットの典型例としては、プロモーター、及びそのプロモーターの制御下に配置された「ｃｒＲＮＡ配列を含むＲＮＡ」コード配列（或いは、ｃｒＲＮＡコード配列挿入用サイト）を含む発現カセット（ｃｒＲＮＡ発現カセット）と、プロモーター、及びそのプロモーターの制御下に配置された「ｔｒａｃｒＲＮＡ配列を含むＲＮＡ」コード配列を含む発現カセット（ｔｒａｃｒＲＮＡ発現カセット）との組合せが挙げられる。
【００４９】
ｃｒＲＮＡコード配列挿入用サイトは、任意のｃｒＲＮＡコード配列を含むポリヌクレオチドの挿入に適した配列を有する限りにおいて特に制限されない。該サイトとしては、例えば１又は複数の制限酵素サイトを含む配列が挙げられる。
【００５０】
核酸変異修復酵素としては、レポータータンパク質異常発現カセットにおける異常の原因である核酸変異を修復できる酵素であれば特に制限されないが、後述するバーコード配列認識モジュールとの複合体は、核酸変異部位において１以上のヌクレオチドを他の１以上のヌクレオチドに変換する若しくは欠失させる、又は１以上のヌクレオチドを挿入するものであることが好ましい。核酸変異修復酵素としては、例えば、シチジンデアミナーゼ、アデノシンデアミナーゼ、グアノシンデアミナーゼ等の核酸塩基変換酵素が挙げられる。核酸変異修復酵素の由来は特に制限されないが、例えば、シチジンデアミナーゼであれば、ヤツメウナギ由来の（Ｐｅｔｒｏｍｙｚｏｎ  ｍａｒｉｎｕｓ  ｃｙｔｉｄｉｎｅ  ｄｅａｍｉｎａｓｅ  １）（ＰｍＣＤＡ１）、脊椎動物（例、ヒト、ブタ、ウシ、イヌ、チンパンジー等の哺乳動物、ニワトリ等の鳥類、アフリカツメガエル等の両生類、ゼブラフィッシュ、アユ、ブチナマズ等の魚類など）由来のＡＩＤ（Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｃｙｔｉｄｉｎｅ  ｄｅａｍｉｎａｓｅ；  ＡＩＣＤＡ）を用いることができる。
【００５１】
ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムを利用する場合の核酸変異修復酵素は、Ｃａｓタンパク質と直接又は間接的に連結していてもよい。
【００５２】
Ｃａｓタンパク質コード配列は、Ｃａｓタンパク質のアミノ酸配列をコードする塩基配列である限り特に制限されない。
【００５３】
Ｃａｓタンパク質は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムにおいて用いられるものであれば特に制限されず、例えばガイドＲＮＡと複合体を形成した状態で標的部位に結合し、該標的部位を切断できるものを各種使用することができる。Ｃａｓタンパク質としては、各種生物由来のものが知られており、例えばＳ．  ｐｙｏｇｅｎｅｓ由来のＣａｓ９タンパク質（ＩＩ型）、Ｓ．  ｓｏｌｆａｔａｒｉｃｕｓ由来のＣａｓ９タンパク質（Ｉ−Ａ１型）、Ｓ．  ｓｏｌｆａｔａｒｉｃｕｓ由来のＣａｓ９タンパク質（Ｉ−Ａ２型）、Ｈ．  ｗａｌｓｂｙｌ由来のＣａｓ９タンパク質（Ｉ−Ｂ型）、Ｅ．  ｃｏｌｉ由来のＣａｓ９タンパク質（Ｉ−Ｅ型）、Ｅ．  ｃｏｌｉ由来のＣａｓ９タンパク質（Ｉ−Ｆ型）、Ｐ．  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ由来のＣａｓ９タンパク質（Ｉ−Ｆ型）、Ｓ．  Ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ由来のＣａｓ９タンパク質（ＩＩ−Ａ型）、Ｓ．  ａｇａｌａｃｔｉａｅ由来のＣａｓ９タンパク質（ＩＩ−Ａ型）、Ｓ．  ａｕｒｅｕｓ由来のＣａｓ９タンパク質、Ｎ．  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ由来のＣａｓ９タンパク質、Ｔ．  ｄｅｎｔｉｃｏｌａ由来のＣａｓ９タンパク質、Ｆ．  ｎｏｖｉｃｉｄａ由来のＣｐｆ１タンパク質（Ｖ型）等が挙げられる。これらの中でも、好ましくはＣａｓ９タンパク質が挙げられ、より好ましくはストレプトコッカス属に属する細菌が内在的に有するＣａｓ９タンパク質が挙げられる。
【００５４】
Ｃａｓタンパク質は、野生型の２本鎖切断型Ｃａｓタンパク質であってもよいし、ニッカーゼ型Ｃａｓタンパク質であってもよい。２本鎖切断型Ｃａｓタンパク質は、通常、標的鎖の切断に関与するドメイン（ＲｕｖＣドメイン）及び非標的鎖の切断に関与するドメイン（ＨＮＨドメイン）を含む。ニッカーゼ型Ｃａｓタンパク質としては、例えば２本鎖切断型Ｃａｓタンパク質のこれら２つのドメインの内のいずれかのドメインにおいて、その切断活性を損なわせる（例えば、その切断活性を１／２、１／５、１／１０、１／１００、１／１０００以下にする）変異を有するタンパク質が挙げられる。Ｃａｓタンパク質の二本鎖ＤＮＡの両方の鎖の切断能が失活したものと、一方の鎖の切断能のみを失活したニッカーゼ活性を有するものの、いずれも使用可能である。このような変異としては、例えばストレプトコッカス・ピオゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ）由来のＣａｓ９（ＳｐＣａｓ９）の場合、ｎＣａｓ及びｄＣａｓを用いることができる。本明細書においてｎＣａｓは、１０番目のＡｓｐ残基がＡｌａ残基に変換した、ガイドＲＮＡと相補鎖を形成する鎖の反対鎖の切断能を欠くＤ１０Ａ変異体、又は８４０番目のＨｉｓ残基がＡｌａ残基で変換した、ガイドＲＮＡと相補鎖の切断能を欠くＨ８４０Ａ変異体を意味し、ｄＣａｓはその二重変異体を意味する。ｎＣａｓ及びｄＣａｓ以外の変異Ｃａｓも同様に用いることができる。
【００５５】
Ｃａｓタンパク質は、その活性を損なわない限りにおいて、アミノ酸配列の変異（例えば、置換、欠失、挿入、付加等）を有していてもよい。この観点から、Ｃａｓタンパク質は、野生型２本鎖切断型Ｃａｓタンパク質、又は該野生型２本鎖切断型Ｃａｓタンパク質に基づくニッカーゼ型Ｃａｓタンパク質のアミノ酸配列と、例えば８５％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９８％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つその活性（ガイドＲＮＡと複合体を形成した状態で標的部位に結合し、該標的部位を切断する活性）を有するタンパク質であってもよい。或いは、同様の観点から、Ｃａｓタンパク質は、野生型２本鎖切断型Ｃａｓタンパク質、又は該野生型２本鎖切断型Ｃａｓタンパク質に基づくニッカーゼ型Ｃａｓタンパク質のアミノ酸配列に対して１若しくは複数個（例えば２〜１００個、好ましくは２〜５０個、より好ましくは２〜２０個、さらに好ましくは２〜１０個、よりさらに好ましくは２〜５個、特に好ましくは２個）のアミノ酸が置換、欠失、付加、又は挿入（好ましくは保存的置換）されたアミノ酸配列からなり、且つその活性（ガイドＲＮＡと複合体を形成した状態で標的部位に結合し、該標的部位を切断する活性）を有するタンパク質であってもよい。不活性型のＣａｓ９変異体としては、例えば、上述したｎＣａｓ及びｄＣａｓ等を用いることができる。
【００５６】
Ｃａｓタンパク質は、公知のタンパク質タグ、シグナル配列、酵素タンパク質等のタンパク質が付加されたものであってもよい。タンパク質タグとしては、例えばビオチン、Ｈｉｓタグ、ＦＬＡＧタグ、Ｈａｌｏタグ、ＭＢＰタグ、ＨＡタグ、Ｍｙｃタグ、Ｖ５タグ、ＰＡタグ等が挙げられる。シグナル配列としては、例えば核移行シグナル等が挙げられる。酵素タンパク質としては、例えば、各種ヒストン修飾酵素、脱アミノ酵素等が挙げられる。
【００５７】
ＣＲＩＳＰＲを用いたゲノム編集技術として、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９以外にも、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃｐｆ１を用いた例が報告されている（Ｚｅｔｓｃｈｅ  Ｂ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｅｌｌ，  １６３：７５９−７７１  （２０１５））。哺乳動物細胞でのゲノム編集が可能なＣｐｆ１としては、Ａｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．  ＢＶ３Ｌ６由来のＣｐｆ１や、Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ  ｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ＮＤ２００６由来のＣｐｆ１などが挙げられるが、これらに制限されない。また、ＤＮＡ切断能を欠く変異Ｃｐｆ１としては、Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ  ｎｏｖｉｃｉｄａ  Ｕ１１２由来のＣｐｆ１（ＦｎＣｐｆ１）の９１７番目のＡｓｐ残基がＡｌａ残基で変換したＤ９１７Ａ変異体、１００６番目のＧｌｕ残基がＡｌａ残基で変換したＥ１００６Ａ変異体、１２５５番目のＡｓｐ残基がＡｌａ残基で変換したＤ１２５５Ａ変異体などが挙げられるが、ＤＮＡ切断能を欠く変異Ｃｐｆ１であれば、これらの変異体に制限されることなく、本発明に用いることができる。
【００５８】
ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムを利用する場合、バーコード配列認識モジュールがガイドＲＮＡであり、核酸変異修復酵素がＣａｓタンパク質と連結しており、ガイドＲＮＡがバーコード配列の少なくとも一部と相補的な配列を含むことが好ましい。このような構成とすることで、ターゲットクローン細胞の単離又は同定する方法を、特異性がより高く（偽陽性がより少ない）、発現効率がより高いものとすることができる。
【００５９】
本実施形態のバーコード配列認識モジュール及び核酸変異修復酵素の複合体と、バーコード配列との接触は、目的のバーコード配列を有する細胞に、該複合体又はそれをコードする核酸を導入することにより実施される。したがって、バーコード配列認識モジュール及び核酸変異修復酵素は、細胞へ導入する前に複合体を形成していてもよく、細胞へ導入後細胞内において複合体を形成してもよい。導入及び発現効率を考慮すると、核酸改変酵素複合体自体としてよりも、それをコードする核酸の形態で細胞に導入し、細胞内で該複合体を発現させることが望ましい。
【００６０】
したがって、バーコード配列認識モジュールと、核酸変異修復酵素と（さらに場合によっては後述する塩基除去修復の阻害剤と）は、それらの融合タンパク質をコードする核酸として、あるいは、結合ドメインやインテイン等を利用してタンパク質に翻訳後、宿主細胞内で複合体を形成し得るような形態で、それらをそれぞれコードする核酸として調製することが好ましい。ここで核酸は、ＤＮＡであってもＲＮＡであってもよい。ＤＮＡの場合は、好ましくは二本鎖ＤＮＡであり、宿主細胞内で機能的なプロモーターの制御下に配置した発現ベクターの形態で提供される。ＲＮＡの場合は、好ましくは一本鎖ＲＮＡである。
【００６１】
上記核酸改変酵素複合体をコードする核酸が導入される細胞は、原核生物である大腸菌などの細菌や下等真核生物である酵母などの微生物の細胞から、ヒト等の哺乳動物を含む脊椎動物、昆虫、植物など高等真核生物の細胞にいたるまで、あらゆる生物種の細胞をも包含し得る。
【００６２】
細胞へ導入する方法については、ステップ（ｉ）と同様に、例えば、発現ベクターを使用した方法等当業者に周知の方法を用いることができる。
【００６３】
核酸配列認識モジュール及び／又は核酸塩基変換酵素／又は塩基除去修復の阻害剤をコードするＤＮＡを含む発現ベクターは、例えば、該ＤＮＡを適当な発現ベクター中のプロモーターの下流に連結することにより製造することができる。
【００６４】
プロモーターとしては、遺伝子の発現に用いる宿主に対応して適切なプロモーターであればいかなるものでもよい。ＤＳＢを伴う従来法では毒性のために宿主細胞の生存率が著しく低下する場合があるので、誘導プロモーターを使用して誘導開始までに細胞数を増やしておくことが望ましいが、本発明の核酸改変酵素複合体を発現させても十分な細胞増殖が得られるので、構成プロモーターも制限なく使用することができる。
【００６５】
発現ベクターは、所望によりターミネーター、リプレッサー、薬剤耐性遺伝子、栄養要求性相補遺伝子等の選択マーカー、宿主で機能し得る複製起点などを含有することができる。
【００６６】
核酸配列認識モジュール及び／又は核酸塩基変換酵素／又は塩基除去修復の阻害剤をコードするＲＮＡは、例えば、上記した核酸配列認識モジュール及び／又は核酸塩基変換酵素をコードするＤＮＡをコードするベクターを鋳型として、自体公知のインビトロ転写系にてｍＲＮＡに転写することにより調製することができる。
【００６７】
発現ベクターの導入は、宿主の種類に応じ、公知の方法（例えば、リゾチーム法、コンピテント法、ＰＥＧ法、ＣａＣｌ２共沈殿法、エレクトロポレーション法、マイクロインジェクション法、パーティクルガン法、リポフェクション法、アグロバクテリウム法など）に従って実施することができる。
【００６８】
［ステップ（ｉｉｉ）］
ステップ（ｉｉｉ）は、標的とされたバーコード配列を有する細胞において、上記少なくとも一つのレポータータンパク質異常発現カセットにおける異常発現の原因である核酸変異を、上記バーコード配列認識モジュールと上記核酸変異修復酵素の複合体の発現により修復し、それにより上記レポータータンパク質を正常に発現させるステップである。
【００６９】
バーコード配列認識モジュールと核酸変異修復酵素との複合体が細胞内で発現すると、該バーコード配列認識モジュールが目的の二本鎖ＤＮＡ内の標的となるバーコード配列を特異的に認識して結合し、該バーコード配列認識モジュールに連結した核酸変異修復酵素の作用により、異常発現の原因である核酸変異が修復される。例えば、核酸変異修復酵素が、核酸塩基変換酵素である場合には、バーコード配列認識モジュールに連結した核酸塩基変換酵素の作用により、核酸変異部位（核酸変異全体もしくは一部又はそれらの近傍）のセンス鎖もしくはアンチセンス鎖で塩基変換が起こり、二本鎖ＤＮＡ内にミスマッチが生じる。このミスマッチが正しく修復されずに、反対鎖の塩基が、変換した鎖の塩基と対形成するように修復されたり、修復の際にさらに他のヌクレオチドに置換、あるいは１ないし数十塩基の欠失もしくは挿入を生じたりすることにより、種々の変異が導入される。レポータータンパク質の開始コドンＡＴＧのＡがＧに変換されたレポータータンパク質異常発現カセットを使用し、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムを利用した具体例を以下説明する。ガイドＲＮＡとシチジンデアミナーゼの複合体が発現すると、ガイドＲＮＡが標的のバーコード配列を認識することで、Ｃａｓ９の作用によりに二本鎖が解け、そこにシチジンデアミナーゼが作用することで、シトシンがウラシルに変換する。生成されたミスマッチ配列は、修復機構により対応する配列に変換され、Ｃ→Ｕ（Ｔ）という一塩基変換が達成される。これにより、異常発現の原因であるＡＴＧにおけるＧへの変異がＡに修復（野生型へ修正）され、レポータータンパク質を正常に発現可能となる。
【００７０】
上記核酸変異修復酵素により修復のために導入した核酸変異が、グリコシラーゼ等による塩基除去修復（ＢＥＲ）機構によって分解されてしまう場合がある。したがって、そのような塩基除去修復機構を阻害することが好ましい。ＢＥＲの阻害は、上述のＢＥＲの阻害剤又はそれをコードする核酸を導入すること、又はＢＥＲを阻害する低分子化合物を導入することにより行うことができる。あるいは、ＢＥＲ経路に関与する遺伝子の発現を抑制することにより、細胞のＢＥＲを阻害することができる。遺伝子の発現の抑制は、例えば、ＢＥＲ経路に関与する遺伝子の発現を特異的に抑制し得るｓｉＲＮＡ、アンチセンス核酸、又はこれらのポリヌクレオチドを発現し得る発現ベクターを細胞に導入することにより行うことができる。または、ＢＥＲ経路に関与する遺伝子のノックアウトにより、遺伝子の発現を抑制することができる。
【００７１】
ＢＥＲを阻害する方法としては、例えば、ＢＥＲの阻害剤又はそれをコードする核酸をステップ（ｉｉ）において、バーコード配列認識モジュールと核酸変異修復酵素とともに細胞に導入することが挙げられる。塩基除去修復の阻害剤としては、結果的にＢＥＲを阻害するものであれば特に制限はないが、効率の観点からは、ＢＥＲ経路の上流に位置するＤＮＡグリコシラーゼの阻害剤が好ましい。ＤＮＡグリコシラーゼの阻害剤としては、例えば、チミンＤＮＡグリコシラーゼの阻害剤、ウラシルＤＮＡグリコシラーゼの阻害剤、オキソグアニンＤＮＡグリコシラーゼの阻害剤、アルキルグアニンＤＮＡグリコシラーゼの阻害剤などが挙げられる。例えば、核酸塩基変換酵素としてシチジンデアミナーゼ（例えば、ＰｍＣＤＡ１）を用いる場合には、変異により生じたＤＮＡのＵ：Ｇ又はＧ：Ｕミスマッチの修復を阻害するため、ウラシルＤＮＡグリコシラーゼの阻害剤を使用することが好ましい。
【００７２】
そのようなウラシルＤＮＡグリコシラーゼの阻害剤としては、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）バクテリオファージであるＰＢＳ１由来のウラシルＤＮＡグリコシラーゼ阻害剤（Ｕｇｉ）又は枯草菌バクテリオファージであるＰＢＳ２由来のウラシルＤＮＡグリコシラーゼ阻害剤（Ｕｇｉ）が挙げられるが（Ｗａｎｇ，  Ｚ．，  ａｎｄ  Ｍｏｓｂａｕｇｈ，  Ｄ．  Ｗ．  （１９８８）  Ｊ．  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．  １７０，  １０８２−１０９１）、これらに制限されない。上記ＤＮＡのミスマッチの修復阻害剤であれば、本発明に用いることができる。特に、ＰＢＳ２由来のＵｇｉは、ＤＮＡ上のＣ  からＴ以外の変異や切断、及び組み換えを起こさせにくくするとの効果も知られていることから、ＰＢＳ２由来のＵｇｉを使用することがより好ましい。
【００７３】
上述のように、塩基除去修復（ＢＥＲ）機構において、ＤＮＡグリコシラーゼによって塩基が除去されると、ＡＰエンドヌクレアーゼが無塩基部位（ＡＰ部位）にニックを入れ、さらにエキソヌクレアーゼによってＡＰ部位は完全に除去される。ＡＰ部位が除去されると、ＤＮＡポリメラーゼが反対鎖の塩基を鋳型に新しく塩基を作り、最後にＤＮＡリガーゼがニックを埋めて修復が完了する。酵素活性を失っているがＡＰ部位への結合能を保持している変異ＡＰエンドヌクレアーゼは、競合的にＢＥＲを阻害することが知られている。従って、これらの変異ＡＰエンドヌクレアーゼも、本発明の塩基除去修復の阻害剤として用いることができる。変異ＡＰエンドヌクレアーゼの由来は特に制限されないが、例えば、大腸菌、酵母、哺乳動物（例、ヒト、マウス、ブタ、ウシ、ウマ、サル等）など由来のＡＰエンドヌクレアーゼを用いることができる。酵素活性を失っているがＡＰ部位への結合能を保持している変異ＡＰエンドヌクレアーゼの例としては、活性サイトや補因子であるＭｇ結合サイトが変異したタンパク質が挙げられる。例えば、ヒトＡｐｅ１の場合、Ｅ９６Ｑ、Ｙ１７１Ａ、Ｙ１７１Ｆ、Ｙ１７１Ｈ、Ｄ２１０Ｎ、Ｄ２１０Ａ、Ｎ２１２Ａ等が挙げられる。
【００７４】
上述したバーコード配列認識モジュールが細胞に導入する前に核酸変異修復酵素と複合体を形成する場合には、上記核酸変異修復酵素及び／又は塩基除去修復の阻害剤との融合タンパク質として提供することもできるし、あるいは、ＳＨ３ドメイン、ＰＤＺドメイン、ＧＫドメイン、ＧＢドメイン等のタンパク質結合ドメインとそれらの結合パートナーとを、バーコード配列認識モジュールと、核酸塩基変換酵素及び／又は塩基除去修復のインヒビターとにそれぞれ融合させ、該ドメインとその結合パートナーとの相互作用を介してタンパク質複合体として提供してもよい。あるいは、核酸配列認識モジュールと、核酸変異修復酵素及び／又は塩基除去修復のインヒビターとにそれぞれインテイン（ｉｎｔｅｉｎ）を融合させ、各タンパク質合成後のライゲーションにより、両者を連結することもできる。
【００７５】
［ステップ（ｉｖ）］
ステップ（ｉｖ）は、上記レポータータンパク質が発現したターゲットクローン細胞を単離又は同定するステップである。
【００７６】
ターゲットクローン細胞を単離又は同定する方法は、特に制限されず、レポータータンパク質の種類等に基づき、当業者に周知の方法を適宜用いることができるが、例えば、レポータータンパク質が蛍光タンパク質の場合、フローサイトメーターを使用したセルソーティングにより、選択されたプールから細胞クローンを単離すること、レポータータンパク質が薬剤耐性遺伝子の場合、薬剤投与によりマーカー遺伝子の発現に基づいて細胞クローンを単離すること及び細胞を低密度で播種し、単一コロニー形成させて単離すること等が挙げられる。ここで単離されるターゲットクローン細胞は細胞群である必要はなく単一の細胞でもよい。
【００７７】
一実施形態に係る細胞集団は、バーコード配列とそれに連結した少なくとも一つのレポータータンパク質異常発現カセットが、個々の細胞に導入されていることを特徴とするものである。バーコード配列とそれに連結した少なくとも一つのレポータータンパク質異常発現カセット、細胞の種類、細胞への導入方法等については、上述したとおりである。
【００７８】
少なくとも一つのレポータータンパク質異常発現カセットにおける核酸変異が、Ｎ末端から最初に現れるメチオニンをコードする配列（ＡＴＧ）における変異であることが好ましい。また、バーコード配列に開始コドンに対応する配列が含まれないことが好ましい。また、細胞集団が、任意のバーコードを標的とする核酸配列認識モジュールと核酸変異修復酵素とが結合した複合体を含むことが好ましい。
【実施例】
【００７９】
［実施例で使用したプラスミド］
以下の実施例で使用したプラスミドの一部を表１に示す。【００８０】
【表１】
2020036181.tif 000003
【００８１】
表１のプラスミドは、いずれもＢｅｎｃｈｌｉｎｇ（Ｂｅｎｃｈｌｉｎｇ社製）に登録されたデータに基づき設計された。【００８２】
［実施例１  酵母細胞における実証実験（１）］
＜レポーター発現・異常発現ベクター＞
レポーター異常発現ベクターとして、以下のＲＦＰベクターを構築した。
５’  ＡＤＨ１  ｐｒｏｍｏｔｅｒ−ＰＡＭ−ｂａｒｃｏｄｅ−９ｔｈＧＴＧ−ＲＦＰ−ＡＤＨ１  ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  ３’（配列番号４）
９ｔｈＲＦＰは、ＲＦＰのアミノ酸配列において９番目に出現するメチオニンを開始コドンとして用い、それより上流（Ｎ末端側）の配列を削除した通常より短いＯＲＦをもつＲＦＰを意味し、９ｔｈＧＴＧ−ＲＦＰは、上記９ｔｈＲＦＰにおける開始コドンであるメチオニンをコードするＡＴＧをＧＴＧに変換した変異体であることを意味する。バーコード配列（ｂａｒｃｏｄｅ）として、（ＷＳＮＳ）４Ｎで表されるランダムＤＮＡバーコードから５’  ＡＧＣＧＴＧＴＣＡＧＧＧＴＧＡＣＣ  ３’（配列番号９）を使用した。【００８３】
上記９ｔｈＲＦＰにおける開始コドンであるメチオニンに変異を加えないこと以外は同様に、レポーター発現ベクターと同様であるレポーター発現ベクターを構築した（「９ｔｈＡＴＧ−ＲＦＰ」とも表す）、配列番号５）。【００８４】
＜Ｃａｓ９タンパク質−核酸変異修復酵素発現ベクター（Ｔａｒｇｅｔ−ＡＩＤ）＞
Ｃａｓ９タンパク質−核酸変異修復酵素発現ベクターとして、５’ＡＤＨ１  ｐｒｏｍｏｔｅｒ−Ｃａｓ９  ｖａｒｉａｎｔ（−ＰｍＣＤＡ１−ＵＧＩ）−ＣＹＣ１  ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  ３’から構成されるベクターを使用した（配列番号２）。ネガティブコントロールとしては、５’ＡＤＨ１  ｐｒｏｍｏｔｅｒ−ｄＣａｓ９−ＣＹＣ１  ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  ３’（配列番号１）を使用した。【００８５】
＜バーコード配列認識モジュール（ガイドＲＮＡ）発現ベクター＞
バーコード配列認識モジュール（ガイドＲＮＡ）発現ベクター（Ｔａｒｇｅｔ  ｓｇＲＮＡ、配列番号７）を以下のように構築した。
５’  ＳＮＲ５２  ｐｒｏｍｏｔｅｒ−ｆｉｌｌｅｒ−ｓｇＲＮＡ  ｓｃａｆｆｏｌｄ−ＳＵＰ４  ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  ３’から構成されるベクター（配列番号６）をバックボーンとして使用した。上記バックボーンからｆｉｌｌｅｒ配列を除去し、その代わりとしてバーコード配列に対応するスペーサー配列（バーコード認識領域、５’  ＣＡＣＧＧＴＣＡＣＣＣＴＧＡＣＡＣＧＣＴ  ３’（配列番号１０））をインサートした。【００８６】
目的の配列を標的としないネガティブコントロールとしては、５’  ＳＮＲ５２  ｐｒｏｍｏｔｅｒ−ＣＴＧＡＡＡＡＡＧＧＡＡＧＧＡＧＴＴＧＡ−ｓｇＲＮＡ  ｓｃａｆｆｏｌｄ−ＳＵＰ４  ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  ３’から構成されるベクター（Ｓｃｒａｍｂｌｅｄ  ｓｇＲＮＡ、配列番号８）を使用した。【００８７】
＜酵母の形質転換＞
酵母は、酵母ツーハイブリッド用のＹ８８００株を使用した。市販のキット（Ｆｒｏｚｅｎ−ＥＺ  Ｙｅａｓｔ  Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ＩＩＴＭ，  ＺＹＭＯ  ＲＥＳＥＡＲＣＨ社）を用いて、上述したベクターを形質転換した。寒天培地はＳＤ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−Ｕｒａ＋Ａｄｅを用い、植菌後４８時間から７２時間程度３０℃で培養してコロニーを得た。以下表２に、実施例にて使用した選択寒天培地の組成を示す。【００８８】
【表２】
2020036181.tif 000004
【００８９】
＜ＲＦＰ発現の確認＞
酵母のコロニーを表３に示す選択液体培地でコロニーを直接懸濁あるいは５時間以上培養した後、上清を除き、２μＬ程度の菌体をスライドグラスに載せ、カバーグラスで固定し、蛍光顕微鏡（ＢＺ−Ｘ７１０，ＫＥＹＥＮＣＥ社）を用い細胞観察を行った。結果を図１に示す。また、マイクロプレートリーダー（インフィニットＦ２００  Ｐｒｏ−ＦＬ／Ｔ、ＴＥＣＡＮ社）を用いてＲＦＰの蛍光強度を測定した結果を図２に示す。Ｔａｒｇｅｔ  ｓｇＲＮＡ及びｄＣａｓ９−ＡＩＤ−ＵＧＩを用いた場合において、一部ＲＦＰ蛍光が確認された。これは、核酸変異修復酵素であるＰｍＣＤＡ１による一塩基ゲノム編集によって、開始コドンが修正によるものであると考えられた。なお、酵母としてＢＹ４７４１株を用いた場合にも同様の結果が得られた。上記方法は、細胞の単離法のレポーターシステムとして有用である可能性が示唆された。
【表３】
2020036181.tif 000005
【表４】
2020036181.tif 000006
【００９０】
［実施例２  ヒト細胞における実証実験］
＜レポーター異常発現ベクター＞
レンチウィルスベクターｐＬＶＳＩＮ−ＣＭＶ−Ｐｕｒｏ（Ｔａｋａｒａ）に、（ＷＳＮＳ）４Ｎで表されるランダムＤＮＡから任意のバーコード配列が付与された変異ＥＧＦＰ（ｐＬＶ−ｅＧＦＰから配列を取得し、開始コドンをコードするＡＴＧをＧＴＧに変換させたもの）をそれぞれＰＣＲ法により増幅し、クローニングした。【００９１】
＜細胞ゲノムへのレポーターの配置＞
上記レポーター異常発現ベクターを二つのヘルパープラスミドｐＭＤ２．Ｇ（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ａｄｄｇｅｎｅ．ｏｒｇ／１２２５９／（配列番号１１）及びｐｓＰＡＸ２（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ａｄｄｇｅｎｅ．ｏｒｇ／１２２６０／（配列番号１２））とともにＨＥＫ２９３Ｔａ細胞へトランスフェクションし、レンチウィルスを産生させた。レンチウィルス粒子を回収後、このウィルスをＨＥＫ２９３Ｔａ細胞に感染させ、ピューロマイシン選択により本レポーターがゲノムに組み込まれた細胞株を得た（図３  バーコード化された２９３Ｔａ細胞）。【００９２】
＜ＣｌｏｎｅＳｅｌｅｃｔレポーターシステムの機能性に関する実証実験＞
これと同時に、レポーター異常発現ベクター（ｐＬＶ−ＣＳ−１１０（ｌｅｎｔｉ−Ｔ００２−ＧＴＧ−ＥＧＦＰ）、配列番号１３）の構築に使用したランダムＤＮＡバーコード配列群のうち、Ｔ００２バーコード配列（ＡＡＣＴＡＴＡＡＣＡＴＣＡＴＴＴＣＧＴＧ、配列番号１４）を標的とするガイドＲＮＡ（Ｏｎ−ｔａｒｇｅｔ  ｇＲＮＡ、配列番号１５）（ｐＬＶ−ＣＳ−０７６（ｌｅｎｔｉＧｕｉｄｅ−Ｔ００２））、並びにＴ００２バーコード配列を標的としないネガティブコントロールガイドＲＮＡ（Ｏｆｆ−ｔａｒｇｅｔ  ｇＲＮＡ、配列番号１６）（ｐＬＶ−ＣＳ−０７７（ｌｅｎｔｉＧｕｉｄｅ−Ｓｃｒａｍｂｌｅ１）を得た。前記細胞株に対し、前記Ｃａｓ９タンパク質−核酸変異修復酵素発現ベクター（Ｔａｒｇｅｔ−ＡＩＤ、ＣＭＶｐ−Ｓｐ＿ｎＣａｓ９−ＰｍＣＤＡ１−ＵＧＩ、配列番号１７）（ｐｃＤＮＡ３．１＿ｐＣＭＶ−ｎＣａｓ−ＰｍＣＤＡ１−ｕｇｉ  ｐＨ１−ｇＲＮＡ（ＨＰＲＴ））並びに前記ガイドＲＮＡ発現ベクターをトランスフェクションし、３日後にフローサイトメーターＦＡＣＳ  Ｖｅｒｓｅ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）によりＧＦＰ陽性細胞の割合を解析した。【００９３】
その結果、Ｔａｒｇｅｔ−ＡＩＤ及びＯｎ−ｔａｒｇｅｔ  ｇＲＮＡを用いた場合に、およそ５％程度の集団においてＧＦＰ蛍光が確認された（図４）。一方、ｏｆｆ−ｔａｒｇｅｔガイドＲＮＡを用いた場合では、ＧＦＰ陽性細胞の割合は０．０９％以下と非常に低いことが明らかとなった。したがって、検出されたＧＦＰ蛍光は一塩基ゲノム編集による開始コドンの修正によるものと考えられた。上記方法は、細胞の単離法のレポーターシステムとして有用である可能性が示唆された。【００９４】
［実施例３  開始コドンの変換効率］
実施例２に記載の方法で、レンチウィルスの標的細胞への感染効率を１０％以下となるようにコントロールし、平均で１コピーのバーコードが各ゲノム組み込まれることに想定し、レポータープラスミドをＨＥＫ２９３Ｔａ細胞へ配置した。これにより、およそ１００種類程度のバーコード化されたレポーターＧＦＰをゲノムに有するヒト培養細胞（ＨＥＫ２９３Ｔａ）を調製することができた。【００９５】
前記Ｃａｓ９タンパク質−核酸変異修復酵素発現ベクター（ＣＭＶｐ−Ｓｐ＿ｎＣａｓ９−ＰｍＣＤＡ１−ＵＧＩ）並びに１３種類のバーコード（表５参照）を標的とするガイドＲＮＡ発現ベクターをそれぞれトランスフェクションし、３日後にフローサイトメーターＦＡＣＳ  Ｊａｚｚ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）を用いてＧＦＰ陽性細胞をソーティングした。【００９６】
【表５】
2020036181.tif 000007
【００９７】
ＧＦＰ陽性細胞について、そのバーコード領域をＰＣＲ増幅し、次世代シーケンサーのライブラリを調製した。次世代シーケンサーのライブラリは、ＭｉＳｅｑ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）による６００サイクルのペアエンドモードでシーケンスされた。得られたシーケンスデータは、各サンプル特異的なインデックス配列をもとに分類され、各実験に用いたガイドＲＮＡ毎にＧＴＧからＡＴＧに変換された割合が計算された（図５）。【００９８】
その結果、多くのバーコードにおいて、ＧＴＧがＡＴＧへ８０％以上の効率で変換されていることが明らかとなった。【００９９】
ＧＴＧが開始コドンへと高効率に塩基置換されることで変異ＥＧＦＰにおける変異が修復され、ＥＧＦＰレポーターが野生型（正常な活性が持続）へと変換された結果であることが明らかとなった。【０１００】
［実施例４  異なるレポーターシステムとの特異性と効率に関する定量的評価］
＜ＣＲＩＳＰＲ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ，  ＣＲＩＳＰＲａ＞
ｄＣａｓ９（不活性型のＣａｓ９変異体）に転写因子が融合された複合体を用いることで、バーコード依存的に下流のマーカー遺伝子を転写レベルで活性化できると考えられる。そのため、ＣＲＩＳＰＲａレポーター又はガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）によっても細胞集団のバーコード化は可能である。そこで、ＡＴＧをＧＴＧに変換したレポーターを使用する方法による特異性を、ＣＲＩＳＰＲａレポーターを使用する方法及びガイドＲＮＡを使用する方法の特異性と比較した。【０１０１】
具体的には、同一のバーコード配列２種類、ＢＣ４（ＡＧＴＣＴＧＴＣＴＣＴＣＡＣＡＧＣＧＴＧ（配列番号３１））とＢＣ６（ＡＧＴＣＴＧＧＣＡＧＴＣＡＣＴＧＧＧＴＧ（配列番号３２））を準備し、下記の３つの異なるシステムを比較検討した。
（１）ＧＴＧ−ＥＧＦＰレポーターをゲノムに持つ細胞株に対する、Ｃａｓ９タンパク質−核酸変異修復酵素発現ベクター（ＣＭＶｐ−Ｓｐ＿ｎＣａｓ９−ＰｍＣＤＡ１−ＵＧＩ）並びにバーコードを標的とするガイドＲＮＡによる一塩基置換を介した発現誘導（ＧＴＧ−ＧＦＰバーコードシステム）；
（２）ＣＲＩＳＰＲａレポーターをゲノムに持つ細胞株に対する（バーコード配列をＣＲＩＳＰＲａレポーターにクローニングし、ＨＥＫ２９３Ｔａ細胞へレンチウィルスで感染させ、ピューロマイシン又はブラストサイジン選択より細胞株を樹立）、ｇＲＮＡ−ｄＣａｓ９−転写因子複合体による発現誘導（ＣＲＩＳＰＲａバーコードシステム）；
（３）ガイドＲＮＡをゲノムに持つ細胞株に対し（バーコード配列をＣＲＩＳＰＲａ用のガイドＲＮＡにクローニングし、ＨＥＫ２９３Ｔａ細胞へレンチウィルスで感染させ、ピューロマイシン又はブラストサイジン選択より細胞株を樹立）、ＣＲＩＳＰＲａレポーターをそのあと細胞へトランスフェクションすることによる発現誘導（ｇＲＮＡバーコードシステム）；【０１０２】
３日後に細胞を回収し、ＦＡＣＳ  Ｖｅｒｓｅ  （ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）によりＧＦＰの陽性細胞の割合を解析した。縦軸にＦＳＣ−Ａ（細胞の大きさを示す）、及び横軸にＦＩＴＣ（ＧＦＰ強度を示す）して、２つのパラメーターを同時に表示するドットプロットを作成した（図６）。横軸の１０２より右側のエリアはＧＦＰ陽性であるとみなし、陽性細胞をＦＩＴＣ（ＧＦＰ強度）により示した。【０１０３】
（２）及び（３）の方法では、発現が誘導される組み合わせ（図６中の「Ｏｎ−ｔａｒｇｅｔ」と記載されている組み合わせ）とそれ以外の組み合わせにおけるＧＦＰ強度にあまり差が見られなかったのに対し、ＧＴＧ−ＧＦＰバーコードシステムにおいては、発現が誘導される組み合わせにおいて顕著なＧＦＰ強度が認められ、ＧＴＧ−ＧＦＰバーコードシステムの特異性が高いことが示された（図６）。【０１０４】
また、フローサイトメトリーによるＧＦＰの発現誘導の効率とそれに伴う偽陽性を適切に比較検討するため、それぞれ３つのシステムにおいてＦＩＴＣ（ＧＦＰ）のゲートの閾値を連続的に変化させ、それぞれの閾値におけるＧＦＰ陽性細胞の割合（％  活性化）と偽陽性（％  エラー）を解析し、比較した。【０１０５】
その結果、ＧＴＧ−ＧＦＰバーコードシステムでは、３％から２５％のＧＦＰ陽性細胞の分画において偽陽性が検出されなかった（図７）。一方、ＣＲＩＳＰＲａを用いた２つの転写誘導型のシステムでは５％から２０％程度の偽陽性が観察された。【０１０６】
本発明を用いたレポーターの発現誘導システムは、効率及び偽陽性の二面において、優れた性能を有することが示唆された。【０１０７】
［実施例５  酵母細胞における実証実験（２）］
＜レポーター異常発現ベクター＞
５’  ＡＤＨ１  ｐｒｏｍｏｔｅｒ−ＢｓｍＢＩ−ｆｉｌｌｅｒ−ＢｓｍＢＩ−９ｔｈＲＦＰ−ＡＤＨ１  ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  ３’から構成されるベクター（配列番号３）をＢｓｍＢＩ（ＮＥＷ  ＥＮＧＬＡＮＤ  ＢｉｏＬａｂ社）で制限酵素処理し（５５℃、１時間以上）、精製したものをバックボーンとして使用した。【０１０８】
インサートとして、配列が５’  ＢｓｍＢＩ−ＰＡＭ−ｂａｒｃｏｄｅ−ＧＴＧ  ３’及び５’  ＢｓｍＢＩ−ＧＴＧ−ｂａｒｃｏｄｅ−ＰＡＭ  ５’となるオリゴをデザインした。バーコード配列は（ＷＳＮＳ）４Ｎで表わされるセミランダムバーコードから成る。インサートはプライマー１（５’  ＡＣＴＧＡＣＴＧＣＡＧＴＣＴＧＡＧＴＣＴＧＡＣＡＧ  ３’）（配列番号３３）とプライマー２（５’  ＣＴＡＧＣＧＴＡＧＡＧＴＧＣＧＴＡＧＣＴＣＴＧＣＴ  ３’）（配列番号３４）を用いＰＣＲにより増幅された。【０１０９】
バックボーンベクターとインサートは１：１０の割合で混合され、Ｇｏｌｄｅｎ  Ｇａｔｅ法（３７℃で５分、２０℃で５分のサイクルを合計１５回繰り返した後に５５℃で３０分）で反応させた。反応後のサンプルは大腸菌（ＮＥＢ  ５α）に形質転換された。【０１１０】
得られたシングルコロニー１００個分を培養プレートからかき集め、抽出キット（日本ジェネティクス社）を使用してプラスミド抽出し、セミランダムＤＮＡバーコードが挿入された目的のＤＮＡバーコードプールを得た。精製後のＤＮＡバーコードプールの配列を制限酵素処理及び次世代シーケンサーにより確認した。【０１１１】
【表６】
2020036181.tif 000008
【０１１２】
＜Ｃａｓ変異体−核酸変異修復酵素発現ベクター＞
Ｃａｓ９変異体−核酸変異修復酵素発現ベクターとして５’  ＡＤＨ１  ｐｒｏｍｏｔｅｒｎ−ｎＣａｓ９−ＰｍＣＤＡ１−ＵＧＩ−ＣＹＣ１  ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  ３’から構成されるベクターを使用した（表６参照、配列番号３５）。
＜バーコード認識モジュール（ガイドＲＮＡ）発現ベクター＞【０１１３】
バーコード認識モジュール（ガイドＲＮＡ）発現ベクター（ｓｇＲＮＡ）を以下のように構築した。
５’  ＳＮＲ５２  ｐｒｏｍｏｔｅｒ−ＢｓｍＢＩ−ｆｉｌｌｅｒ−ＢｓｍＢＩ−ｓｇＲＮＡ  ｓｃａｆｆｏｌｄ−ＳＵＰ４  ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  ３’から構成されるベクター（配列番号６）をＢｓｍＢＩ（ＮＥＷ  ＥＮＧＬＡＮＤ  ＢｉｏＬａｂ社）で制限酵素処理し（５５℃，  １時間以上）、精製したものをバックボーンとして使用した。インサートとして、配列が５’  ＢｓｍＢＩ−ＰＡＭ−ｂａｒｃｏｄｅ−ＧＴＧ  ３’及び５’  ＢｓｍＢＩ−ＧＴＧ−ｂａｒｃｏｄｅ−ＰＡＭ  ５’となるオリゴ対をデザインし、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ（タカラバイオ社）によるリン酸化とアニーリングを同時に行なうことにより、突出末端のＢｓｍＢＩ切断面を有するＤＮＡ断片を得た（アニーリングは３７℃で３０分、９５℃で５分の反応ののち、９５℃から２５℃になるまで１２秒の反応を１サイクルごとに１℃ずつ温度を低下させる工程を合計７０回繰り返した）。バーコード認識配列（バーコード認識領域）は（ＷＳＮＳ）４Ｎで表わされるセミランダムＤＮＡバーコード配列に対応し、ＤＮＡバーコードプールの次世代シーケンサーでの配列解析結果から、任意のｓｇＲＮＡのバーコード認識配列を決めた。バックボーンベクターとインサートは１：１０の割合で混合され、Ｇｏｌｄｅｎ  Ｇａｔｅ法（３７℃で５分、２０℃で５分を合計１５回繰り返したのちに５５℃で３０分）で反応させた。反応後のサンプルは大腸菌（ＮＥＢ  ５α）に形質転換され、コロニーを培養・プラスミド抽出（日本ジェネティクス社抽出キットを使用）してそれぞれ１２種類の目的のベクターを得た。精製後のベクターはサンガーシーケンシング法により配列を確認した。上記１２種類のベクターにそれぞれ含まれるバーコード認識配列を表７に示す。【０１１４】
【表７】
2020036181.tif 000009
【０１１５】
＜酵母の形質転換＞
酵母は、出芽酵母の標準株であるＢＹ４７４１株を使用した。市販のキット（Ｆｒｏｚｅｎ−ＥＺ  Ｙｅａｓｔ  Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ＩＩＴＭ，  ＺＹＭＯ  ＲＥＳＥＡＲＣＨ社）を用いた。【０１１６】
まず、ＤＮＡバーコードプールをＢＹ４７４１株に形質転換した。寒天培地はＳＤ−Ｈｉｓ＋Ａｄｅを用い、植菌後４８時間から７２時間程度３０℃で培養してコロニーを得た。得られたコロニーを培養プレートからかき集めて、コンピテントセルを調製し（Ｆｒｏｚｅｎ−ＥＺ  Ｙｅａｓｔ  Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ＩＩＴＭ，  ＺＹＭＯ  ＲＥＳＥＡＲＣＨ社）、Ｃａｓ９変異体（ｎＣａｓ９−ＡＩＤ−ＵＧＩ，配列番号３５）とｓｇＲＮＡのベクター（配列番号３６〜４７のバーコード認識配列をそれぞれ含む１２種類の各ベクター）をそれぞれ用いて形質転換した。寒天培地はＳＤ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−Ｕｒａ＋Ａｄｅを用い、植菌後４８時間から７２時間程度３０℃で培養してコロニーを得た。なお、培養プレートからかき集めたコロニーは、次世代シーケンサーによりそのバーコード配列を確認済みである。【０１１７】
＜ＲＦＰ発現の確認＞
Ｃａｓ９変異体とｓｇＲＮＡを形質転換したのちに得られた酵母コロニーのプレートをゲル撮影装置に内蔵されたブルーライト（ＦＡＳ−Ｖ，日本ジェネティクス社）で照射し、赤く光る（ＲＦＰ発現が期待される）コロニーをサンプリングした。ＲＦＰ発現が期待されるものとしてサンプリングされたコロニーの例示を図８に示す。左は配列番号４２のバーコード認識配列を含むｓｇＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ＿ＢＣ７）を用いた場合、右は配列番号４３のバーコード認識配列を含むｓｇＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ＿ＢＣ８）を用いた場合の結果を示す。【０１１８】
＜濁度測定及び蛍光（ＲＦＰ）強度測定＞
ブルーライト照射によりサンプリングされたＲＦＰ発現コロニーのスクリーニング（コロニーの突き間違いの確認）のため、酵母コロニーサンプルの濁度及び蛍光強度の測定を行なった。測定にはマイクロプレートリーダー（インフィニットＦ２００ＰＲＯ，ＴＥＣＡＮ社）を使用した。酵母コロニーを選択液体培地（ＳＤ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−Ｕｒａ＋Ａｄｅ）で培養あるいは懸濁した後、必要に応じて培養液を希釈し、９６穴プレート（透明）にサンプルを２００μＬ添加して濁度を測定した。同様にして、９６穴プレート（黒色，不透明）にサンプルを２００μＬ添加して蛍光強度を測定した。濁度及び蛍光強度の測定の結果、目的のコロニーをサンプリングできたことが確認された。【０１１９】
＜サンプリングされたコロニーの配列の確認＞
サンプリングされた目的のコロニーにおけるバーコード配列付近の配列を、サンガーシーケンシング法によりにより確認した。その結果、バーコード配列下流の９ｔｈＲＦＰにおけるＧＴＧが開始コドンへ変換され、変異が修復されていることが確認された（図９）。【０１２０】
［実施例６  バーコードシグナルの検証］
細胞集団から任意の細胞を単離又は同定するためには、１コロニーにおいて単一のバーコードシグナルが観察されることが好ましい。そこで、以下のように、Ｃａｓ９タンパク質−核酸変異修復酵素発現ベクターを形質転換したのちにレポーター発現ベクターを形質転換した場合（Ｍｅｔｈｏｄ  Ａ）と、レポーター発現ベクターを形質転換したのちにＣａｓ９タンパク質−核酸変異修復酵素発現ベクターを形質転換した場合（Ｍｅｔｈｏｄ  Ｂ）におけるバーコードシグナルの比較を行った。【０１２１】
＜レポーター異常発現ベクター＞
５’  ＡＤＨ１  ｐｒｏｍｏｔｅｒ−ＢｓｍＢＩ−ｆｉｌｌｅｒ−ＢｓｍＢＩ−９ｔｈＲＦＰ−ＡＤＨ１  ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  ３’から構成されるベクター（配列番号３）をＢｓｍＢＩ（ＮＥＷ  ＥＮＧＬＡＮＤ  ＢｉｏＬａｂ社）で制限酵素処理し（５５℃、１時間以上）、精製したものをバックボーンとして使用した。【０１２２】
インサートとして、配列が５’  ＢｓｍＢＩ−ＰＡＭ−ｂａｒｃｏｄｅ−ＧＴＧ  ３’及び５’  ＢｓｍＢＩ−ＧＴＧ−ｂａｒｃｏｄｅ−ＰＡＭ  ５’となるオリゴをデザインした。バーコード配列は（ＷＳＮＳ）４Ｎで表わされるセミランダムバーコードから成る。インサートはプライマー１（５’  ＡＣＴＧＡＣＴＧＣＡＧＴＣＴＧＡＧＴＣＴＧＡＣＡＧ  ３’）（配列番号３３）とプライマー２（５’  ＣＴＡＧＣＧＴＡＧＡＧＴＧＣＧＴＡＧＣＴＣＴＧＣＴ  ３’）（配列番号３４）を用いＰＣＲにより増幅された。【０１２３】
バックボーンベクターとインサートは１：１０の割合で混合され、Ｇｏｌｄｅｎ  Ｇａｔｅ法（３７℃で５分、２０℃で５分のサイクルを合計１５回繰り返した後に５５℃で３０分）で反応させた。反応後のサンプルは大腸菌（ＮＥＢ  ５α）に形質転換された。【０１２４】
得られたシングルコロニー約４万個分を培養プレートからかき集め、抽出キット（日本ジェネティクス社）を使用してプラスミド抽出し、セミランダムＤＮＡバーコードが挿入された目的のＤＮＡバーコードプールを得た。精製後のＤＮＡバーコードプールの配列を制限酵素処理及び次世代シーケンサーにより確認した。【０１２５】
＜Ｃａｓ変異体−核酸変異修復酵素発現ベクター＞
Ｃａｓ９変異体−核酸変異修復酵素発現ベクターとして５’  ＡＤＨ１  ｐｒｏｍｏｔｅｒｎ−ｎＣａｓ９−ＰｍＣＤＡ１−ＵＧＩ−ＣＹＣ１  ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  ３’から構成されるベクターを使用した（表６参照、配列番号３５）。【０１２６】
＜酵母の形質転換＞
酵母は、出芽酵母の標準株であるＢＹ４７４１株を使用した。市販のキット（Ｆｒｏｚｅｎ−ＥＺ  Ｙｅａｓｔ  Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ＩＩＴＭ，  ＺＹＭＯ  ＲＥＳＥＡＲＣＨ社）を用いて、上述したベクターを形質転換した。【０１２７】
（以下  Ｍｅｔｈｏｄ  Ａに相当する実験）
第一段階として、Ｃａｓ９タンパク質−核酸変異修復酵素発現ベクター（Ｔａｒｇｅｔ−ＡＩＤ）を形質転換した。寒天培地はＳＤ−Ｌｅｕ＋Ａｄｅを用い、植菌後４８時間から７２時間程度３０℃で培養してコロニーを得た。
第一段階で得られたコロニーからコンピテントセルを調製した。調製には市販のキット（Ｆｒｏｚｅｎ−ＥＺ  Ｙｅａｓｔ  Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ＩＩＴＭ，  ＺＹＭＯ  ＲＥＳＥＡＲＣＨ社）を使用した。【０１２８】
前述のコンピテントセルを用い、第二段階として、レポーター発現ベクターを形質転換した。寒天培地はＳＤ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ＋Ａｄｅを用い、植菌後４８時間から７２時間程度３０℃で培養してコロニーを得た。【０１２９】
（以下  Ｍｅｔｈｏｄ  Ｂに相当する実験）
第一段階として、レポーター発現ベクターを形質転換した。寒天培地はＳＤ−Ｈｉｓ＋Ａｄｅを用い、植菌後４８時間から７２時間程度３０℃で培養してコロニーを得た。【０１３０】
第一段階で得られたコロニーからコンピテントセルを調製した。調製には市販のキット（Ｆｒｏｚｅｎ−ＥＺ  Ｙｅａｓｔ  Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ＩＩＴＭ，  ＺＹＭＯ  ＲＥＳＥＡＲＣＨ社）を使用した。【０１３１】
前述のコンピテントセルを用い、第二段階として、Ｃａｓ９タンパク質−核酸変異修復酵素発現ベクター（Ｔａｒｇｅｔ−ＡＩＤ）を形質転換した。寒天培地はＳＤ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ＋Ａｄｅを用い、植菌後４８時間から７２時間程度３０℃で培養してコロニーを得た。【０１３２】
＜サンプリングされたコロニーの配列の確認＞
サンプリングされたシングルコロニーにおけるバーコード配列付近の配列を、サンガーシーケンシング法によりにより確認した。その結果、Ｃａｓ９タンパク質−核酸変異修復酵素発現ベクター（Ｔａｒｇｅｔ−ＡＩＤ）を形質転換したのちにレポーター発現ベクターを形質転換したサンプル（Ｍｅｔｈｏｄ  Ａ）においては、複数のバーコードシグナルが混じった配列が確認された。一方、レポーター発現ベクターを形質転換したのちにＣａｓ９タンパク質−核酸変異修復酵素発現ベクター（Ｔａｒｇｅｔ−ＡＩＤ）を形質転換したサンプル（Ｍｅｔｈｏｄ  Ｂ）においては、それぞれのサンプルから単一のバーコード配列が確認され、１コロニーが単一のプラスミド（バーコード）を保持していることが示された。なお、Ｍｅｔｈｏｄ  Ａの順番で形質転換をした場合には、プラスミドプールを酵母へ形質転換する際のＤＮＡ濃度、使用する酵母株、バーコードの複雑性及び液体培地における培養時間を変化させても、１コロニーに複数のバーコードが保持させる結果は変わらなかった。
【産業上の利用可能性】
【０１３３】
さらに、本発明によりターゲットクローン細胞を単離又は同定し、各々の細胞を標識する固有のバーコード配列を特定できれば、マーカー遺伝子等が自明でない未知の細胞クローンを不均質性の高い細胞集団からマーカーフリーで単離・解析することが可能になる。この多用途性から、今後さらに展開、発展が予想されるシングルセルのトランスクリプトーム解析、エピゲノム解析とは親和性が高い。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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