(57)【要約】  ５’位修飾ヌクレオシドおよびそれを用いたヌクレオチドを開示する。本発明のヌクレオシドは、以下の式（Ｉ）：    【化１】2020158910.tif 000127で表される。本発明の５’位修飾ヌクレオシドは、特定の臓器への集積などが懸念されるホスホロチオエート修飾核酸の代替とすることができ、かつその製造においてジアステレオマーの分離工程を必要としないため、工業的生産性にも優れている。
2020158910.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の式（Ｉ）で表される化合物またはその塩：
【化１】
2020158910.tif 000120
（式中、
Ｂａｓｅは、α群から選択される任意の置換基を１以上有していてもよいプリン−９−イル基または２−オキソ−１，２−ジヒドロピリミジン−１−イル基を表し、ここで、該α群は、水酸基、核酸合成の保護基で保護された水酸基、炭素数１から６の直鎖アルキル基、炭素数１から６の直鎖アルコキシ基、メルカプト基、核酸合成の保護基で保護されたメルカプト基、炭素数１から６の直鎖アルキルチオ基、アミノ基、炭素数１から６の直鎖アルキルアミノ基、核酸合成の保護基で保護されたアミノ基、およびハロゲン原子からなり、
Ｒ２およびＲ３は、それぞれ独立して、水素原子、核酸合成の水酸基の保護基、分岐または環を形成していてもよい炭素数１から７のアルキル基、分岐または環を形成していてもよい炭素数２から７のアルケニル基、該α群から選択される任意の置換基を１以上有していてもよくそしてヘテロ原子を含んでいてもよい炭素数３から１０のアリール基、該α群から選択される任意の置換基を１以上有していてもよくそしてヘテロ原子を含んでいてもよい炭素数３から１２のアリール部分を有するアラルキル基、該α群から選択される任意の置換基を１以上有していてもよいアシル基、該α群から選択される任意の置換基を１以上有していてもよいシリル基、該α群から選択される任意の置換基を１以上有していてもよいリン酸基、核酸合成の保護基で保護されたリン酸基、−Ｐ（Ｒ４）Ｒ５［式中、Ｒ４およびＲ５は、それぞれ独立して、水酸基、核酸合成の保護基で保護された水酸基、メルカプト基、核酸合成の保護基で保護されたメルカプト基、アミノ基、炭素数１から６のアルコキシ基、炭素数１から６のアルキルチオ基、炭素数１から６のシアノアルコキシ基、または炭素数１から６のアルキル基を有するジアルキルアミノ基を表す］を表し、
Ｒ６およびＲ７は、それぞれ独立して、水素原子、ハロゲン原子、またはメチル基であり、そして
Ｒ８は水素原子でありかつＲ９は水素原子、ハロゲン原子；炭素数１から６の直鎖アルコキシ基で置換されていてもよい炭素数１から６の直鎖アルコキシ基；または−ＯＲ１０［式中、Ｒ１０は水素原子、または核酸合成の水酸基の保護基である］であるか、あるいは
Ｒ８およびＲ９は一緒になって以下の式：
【化２】
2020158910.tif 000121
［式中、
Ｒ２１は、水素原子、分岐または環を形成していてもよい炭素数１から６のアルキル基、分岐または環を形成していてもよい炭素数２から６のアルケニル基、該α群から選択される任意の置換基を１以上有していてもよくそしてヘテロ原子を含んでいてもよい炭素数３から１０のアリール基、該α群から選択される任意の置換基を１以上有していてもよくそしてヘテロ原子を含んでいてもよい炭素数３から１２のアリール部分を有するアラルキル基、または核酸合成のアミノ基の保護基であり；
Ｒ２２およびＲ２３は、それぞれ独立して、水素原子；ヘテロ原子を含んでいてもよい炭素数３から１２のアリール基で置換されていてもよく、かつ分岐または環を形成していてもよい炭素数１から６のアルキル基；またはヘテロ原子を含んでいてもよい炭素数３から１２のアリール部分を有するアラルキル基；であるか、あるいは
Ｒ２２およびＲ２３は一緒になって、−（ＣＨ２）ｑ−［式中、ｑは２から５の整数である］を表し；
Ｒ２４およびＲ２５は、それぞれ独立して、水素原子；水酸基；分岐または環を形成していてもよい炭素数１から６のアルキル基；分岐または環を形成していてもよい炭素数１から６のアルコキシ基；アミノ基；および核酸合成の保護基で保護されたアミノ基；からなる群から選択される基であるか、あるいは、
Ｒ２４およびＲ２５は一緒になって、＝Ｃ（Ｒ３６）Ｒ３７［式中、Ｒ３６およびＲ３７は、それぞれ独立して、水素原子、水酸基、核酸合成の保護基で保護された水酸基、メルカプト基、核酸合成の保護基で保護されたメルカプト基、アミノ基、炭素数１から６の直鎖または分岐鎖アルコキシ基、炭素数１から６の直鎖または分岐鎖アルキルチオ基、炭素数１から６のシアノアルコキシ基、または炭素数１から６の直鎖または分岐鎖アルキルアミノ基を表す］を表し；
Ｒ２６およびＲ２７は、それぞれ独立して、水素原子、分岐または環を形成していてもよい炭素数１から６のアルキル基、分岐または環を形成していてもよい炭素数１から６のアルコキシ基、または炭素数１から６の直鎖または分岐鎖アルキルチオ基であり；
Ｒ２８は、水素原子、分岐または環を形成していてもよい炭素数１から６のアルキル基、分岐または環を形成していてもよい炭素数１から６のアルコキシ基、または炭素数１から６の直鎖または分岐鎖アルキルチオ基であり；
Ｒ２９は、水素原子、水酸基、分岐または環を形成していてもよい炭素数１から６のアルキル基、分岐または環を形成していてもよい炭素数１から６のアルコキシ基、アミノ基、あるいは核酸合成の保護基で保護されたアミノ基であり；
Ｒ３１、Ｒ３２、およびＲ３３は、それぞれ独立して、水素原子、分岐または環を形成していてもよい炭素数１から６のアルキル基、あるいは核酸合成のアミノ基の保護基であり；
Ｒ３４およびＲ３５は、それぞれ独立して、水素原子、水酸基、分岐または環を形成していてもよい炭素数１から６のアルキル基、分岐または環を形成していてもよい炭素数１から６のアルコキシ基、アミノ基、または核酸合成の保護基で保護されたアミノ基であり；
ｍは０から２の整数であり；
ｎは０から１の整数であり；
ｐは０から１の整数であり；
Ｘ１は、酸素原子、硫黄原子、またはアミノ基であり；そして
Ｘ２は酸素原子または硫黄原子である]
で表される二価の基を表す）。
【請求項２】
前記式（Ｉ）において、前記Ｂａｓｅが、６−アミノプリン−９−イル基、２，６−ジアミノプリン−９−イル基、２−アミノ−６−クロロプリン−９−イル基、２−アミノ−６−フルオロプリン−９−イル基、２−アミノ−６−ブロモプリン−９−イル基、２−アミノ−６−ヒドロキシプリン−９−イル基、６−アミノ−２−メトキシプリン−９−イル基、６−アミノ−２−クロロプリン−９−イル基、６−アミノ−２−フルオロプリン−９−イル基、２，６−ジメトキシプリン−９−イル基、２，６−ジクロロプリン−９−イル基、６−メルカプトプリン−９−イル基、２−オキソ−４−アミノ−１，２−ジヒドロピリミジン−１−イル基、４−アミノ−２−オキソ−５−フルオロ−１，２−ジヒドロピリミジン−１−イル基、４−アミノ−２−オキソ−５−クロロ−１，２−ジヒドロピリミジン−１−イル基、２−オキソ−４−メトキシ−１，２−ジヒドロピリミジン−１−イル基、２−オキソ−４−メルカプト−１，２−ジヒドロピリミジン−１−イル基、２−オキソ−４−ヒドロキシ−１，２−ジヒドロピリミジン−１−イル基、２−オキソ−４−ヒドロキシ−５−メチル−１，２−ジヒドロピリミジン−１−イル基、または４−アミノ−５−メチル−２−オキソ−１，２−ジヒドロピリミジン−１−イル基である、請求項１に記載の化合物またはその塩。
【請求項３】
前記式（Ｉ）において、前記Ｂａｓｅが、以下の式：
【化３】
2020158910.tif 000122
で表される基である、請求項１に記載の化合物またはその塩。
【請求項４】
前記式（Ｉ）において、Ｒ６およびＲ７がともに水素原子である、請求項１から３のいずれかに記載の化合物またはその塩。
【請求項５】
前記式（Ｉ）において、Ｒ８およびＲ９がともに水素原子である、請求項１から４のいずれかに記載の化合物またはその塩。
【請求項６】
以下の式（ＩＩ）で表されるヌクレオシド構造を少なくとも１つ含有するオリゴヌクレオチドまたはその薬理学上許容される塩：
【化４】
2020158910.tif 000123
（式中、
Ｂａｓｅは、α群から選択される任意の置換基を１以上有していてもよいプリン−９−イル基または２−オキソ−１，２−ジヒドロピリミジン−１−イル基を表し、ここで、該α群は、水酸基、核酸合成の保護基で保護された水酸基、炭素数１から６の直鎖アルキル基、炭素数１から６の直鎖アルコキシ基、メルカプト基、核酸合成の保護基で保護されたメルカプト基、炭素数１から６の直鎖アルキルチオ基、アミノ基、炭素数１から６の直鎖アルキルアミノ基、核酸合成の保護基で保護されたアミノ基、およびハロゲン原子からなり、
Ｒ６およびＲ７は、それぞれ独立して、水素原子、ハロゲン原子、またはメチル基であり、そして
Ｒ８は水素原子でありかつＲ９は水素原子、ハロゲン原子、または炭素数１から６の直鎖アルコキシ基で置換されていてもよい炭素数１から６の直鎖アルコキシ基であるか、あるいはＲ８およびＲ９は一緒になって以下の式：
【化５】
2020158910.tif 000124
［式中、
Ｒ２１は、水素原子、分岐または環を形成していてもよい炭素数１から６のアルキル基、分岐または環を形成していてもよい炭素数２から６のアルケニル基、該α群から選択される任意の置換基を１以上有していてもよくそしてヘテロ原子を含んでいてもよい炭素数３から１０のアリール基、該α群から選択される任意の置換基を１以上有していてもよくそしてヘテロ原子を含んでいてもよい炭素数３から１２のアリール部分を有するアラルキル基、または核酸合成のアミノ基の保護基であり；
Ｒ２２およびＲ２３は、それぞれ独立して、水素原子；ヘテロ原子を含んでいてもよい炭素数３から１２のアリール基で置換されていてもよく、かつ分岐または環を形成していてもよい炭素数１から６のアルキル基；またはヘテロ原子を含んでいてもよい炭素数３から１２のアリール部分を有するアラルキル基；であるか、あるいは
Ｒ２２およびＲ２３は一緒になって、−（ＣＨ２）ｑ−［式中、ｑは２から５の整数である］を表し；
Ｒ２４およびＲ２５は、それぞれ独立して、水素原子；水酸基；分岐または環を形成していてもよい炭素数１から６のアルキル基；分岐または環を形成していてもよい炭素数１から６のアルコキシ基；アミノ基；および核酸合成の保護基で保護されたアミノ基；からなる群から選択される基であるか、あるいは、
Ｒ２４およびＲ２５は一緒になって、＝Ｃ（Ｒ３６）Ｒ３７［式中、Ｒ３６およびＲ３７は、それぞれ独立して、水素原子、水酸基、核酸合成の保護基で保護された水酸基、メルカプト基、核酸合成の保護基で保護されたメルカプト基、アミノ基、炭素数１から６の直鎖または分岐鎖アルコキシ基、炭素数１から６の直鎖または分岐鎖アルキルチオ基、炭素数１から６のシアノアルコキシ基、または炭素数１から６の直鎖または分岐鎖アルキルアミノ基を表す］を表し；
Ｒ２６およびＲ２７は、それぞれ独立して、水素原子、分岐または環を形成していてもよい炭素数１から６のアルキル基、分岐または環を形成していてもよい炭素数１から６のアルコキシ基、または炭素数１から６の直鎖または分岐鎖アルキルチオ基であり；
Ｒ２８は、水素原子、分岐または環を形成していてもよい炭素数１から６のアルキル基、分岐または環を形成していてもよい炭素数１から６のアルコキシ基、または炭素数１から６の直鎖または分岐鎖アルキルチオ基であり；
Ｒ２９は、水素原子、水酸基、分岐または環を形成していてもよい炭素数１から６のアルキル基、分岐または環を形成していてもよい炭素数１から６のアルコキシ基、アミノ基、あるいは核酸合成の保護基で保護されたアミノ基であり；
Ｒ３１、Ｒ３２、およびＲ３３は、それぞれ独立して、水素原子、分岐または環を形成していてもよい炭素数１から６のアルキル基、あるいは核酸合成のアミノ基の保護基であり；
Ｒ３４およびＲ３５は、それぞれ独立して、水素原子、水酸基、分岐または環を形成していてもよい炭素数１から６のアルキル基、分岐または環を形成していてもよい炭素数１から６のアルコキシ基、アミノ基、または核酸合成の保護基で保護されたアミノ基であり；
ｍは０から２の整数であり；
ｎは０から１の整数であり；
ｐは０から１の整数であり；
Ｘ１は、酸素原子、硫黄原子、またはアミノ基であり；そして
Ｘ２は酸素原子または硫黄原子である]
で表される二価の基を表す）。
【請求項７】
前記式（ＩＩ）において、Ｒ６およびＲ７がともに水素原子である、請求項６に記載のオリゴヌクレオチドまたはその薬理学上許容される塩。
【請求項８】
前記式（ＩＩ）において、Ｒ８およびＲ９がともに水素原子である、請求項６または７に記載のオリゴヌクレオチドまたはその薬理学上許容される塩。
【請求項９】
請求項６に記載のオリゴヌクレオチドまたはその薬理学上許容される塩の製造方法であって、
以下の式（Ｉ）で表される化合物またはその薬理学上許容される塩：
【化６】
2020158910.tif 000125
（式中、
Ｂａｓｅは、α群から選択される任意の置換基を１以上有していてもよいプリン−９−イル基または２−オキソ−１，２−ジヒドロピリミジン−１−イル基を表し、ここで、該α群は、水酸基、核酸合成の保護基で保護された水酸基、炭素数１から６の直鎖アルキル基、炭素数１から６の直鎖アルコキシ基、メルカプト基、核酸合成の保護基で保護されたメルカプト基、炭素数１から６の直鎖アルキルチオ基、アミノ基、炭素数１から６の直鎖アルキルアミノ基、核酸合成の保護基で保護されたアミノ基、およびハロゲン原子からなり、
Ｒ２およびＲ３は、それぞれ独立して、水素原子、核酸合成の水酸基の保護基、分岐または環を形成していてもよい炭素数１から７のアルキル基、分岐または環を形成していてもよい炭素数２から７のアルケニル基、該α群から選択される任意の置換基を１以上有していてもよくそしてヘテロ原子を含んでいてもよい炭素数３から１０のアリール基、該α群から選択される任意の置換基を１以上有していてもよくそしてヘテロ原子を含んでいてもよい炭素数３から１２のアリール部分を有するアラルキル基、該α群から選択される任意の置換基を１以上有していてもよいアシル基、該α群から選択される任意の置換基を１以上有していてもよいシリル基、該α群から選択される任意の置換基を１以上有していてもよいリン酸基、核酸合成の保護基で保護されたリン酸基、−Ｐ（Ｒ４）Ｒ５［式中、Ｒ４およびＲ５は、それぞれ独立して、水酸基、核酸合成の保護基で保護された水酸基、メルカプト基、核酸合成の保護基で保護されたメルカプト基、アミノ基、炭素数１から６のアルコキシ基、炭素数１から６のアルキルチオ基、炭素数１から６のシアノアルコキシ基、または炭素数１から６のアルキル基を有するジアルキルアミノ基を表す］を表し、
Ｒ６およびＲ７は、それぞれ独立して、水素原子、ハロゲン原子、またはメチル基であり、そして
Ｒ８は水素原子でありかつＲ９は水素原子、ハロゲン原子；炭素数１から６の直鎖アルコキシ基で置換されていてもよい炭素数１から６の直鎖アルコキシ基；または−ＯＲ１０［式中、Ｒ１０は水素原子、または核酸合成の水酸基の保護基である］であるか、あるいは
Ｒ８およびＲ９は一緒になって以下の式：
【化７】
2020158910.tif 000126
［式中、
Ｒ２１は、水素原子、分岐または環を形成していてもよい炭素数１から６のアルキル基、分岐または環を形成していてもよい炭素数２から６のアルケニル基、該α群から選択される任意の置換基を１以上有していてもよくそしてヘテロ原子を含んでいてもよい炭素数３から１０のアリール基、該α群から選択される任意の置換基を１以上有していてもよくそしてヘテロ原子を含んでいてもよい炭素数３から１２のアリール部分を有するアラルキル基、または核酸合成のアミノ基の保護基であり；
Ｒ２２およびＲ２３は、それぞれ独立して、水素原子；ヘテロ原子を含んでいてもよい炭素数３から１２のアリール基で置換されていてもよく、かつ分岐または環を形成していてもよい炭素数１から６のアルキル基；またはヘテロ原子を含んでいてもよい炭素数３から１２のアリール部分を有するアラルキル基；であるか、あるいは
Ｒ２２およびＲ２３は一緒になって、−（ＣＨ２）ｑ−［式中、ｑは２から５の整数である］を表し；
Ｒ２４およびＲ２５は、それぞれ独立して、水素原子；水酸基；分岐または環を形成していてもよい炭素数１から６のアルキル基；分岐または環を形成していてもよい炭素数１から６のアルコキシ基；アミノ基；および核酸合成の保護基で保護されたアミノ基；からなる群から選択される基であるか、あるいは、
Ｒ２４およびＲ２５は一緒になって、＝Ｃ（Ｒ３６）Ｒ３７［式中、Ｒ３６およびＲ３７は、それぞれ独立して、水素原子、水酸基、核酸合成の保護基で保護された水酸基、メルカプト基、核酸合成の保護基で保護されたメルカプト基、アミノ基、炭素数１から６の直鎖または分岐鎖アルコキシ基、炭素数１から６の直鎖または分岐鎖アルキルチオ基、炭素数１から６のシアノアルコキシ基、または炭素数１から６の直鎖または分岐鎖アルキルアミノ基を表す］を表し；
Ｒ２６およびＲ２７は、それぞれ独立して、水素原子、分岐または環を形成していてもよい炭素数１から６のアルキル基、分岐または環を形成していてもよい炭素数１から６のアルコキシ基、または炭素数１から６の直鎖または分岐鎖アルキルチオ基であり；
Ｒ２８は、水素原子、分岐または環を形成していてもよい炭素数１から６のアルキル基、分岐または環を形成していてもよい炭素数１から６のアルコキシ基、または炭素数１から６の直鎖または分岐鎖アルキルチオ基であり；
Ｒ２９は、水素原子、水酸基、分岐または環を形成していてもよい炭素数１から６のアルキル基、分岐または環を形成していてもよい炭素数１から６のアルコキシ基、アミノ基、あるいは核酸合成の保護基で保護されたアミノ基であり；
Ｒ３１、Ｒ３２、およびＲ３３は、それぞれ独立して、水素原子、分岐または環を形成していてもよい炭素数１から６のアルキル基、あるいは核酸合成のアミノ基の保護基であり；
Ｒ３４およびＲ３５は、それぞれ独立して、水素原子、水酸基、分岐または環を形成していてもよい炭素数１から６のアルキル基、分岐または環を形成していてもよい炭素数１から６のアルコキシ基、アミノ基、または核酸合成の保護基で保護されたアミノ基であり；
ｍは０から２の整数であり；
ｎは０から１の整数であり；
ｐは０から１の整数であり；
Ｘ１は、酸素原子、硫黄原子、またはアミノ基であり；そして
Ｘ２は酸素原子または硫黄原子である]
で表される二価の基を表す）
を用いてオリゴヌクレオチドを合成する工程を包含する、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、５’位修飾ヌクレオシドおよびそれを用いたヌクレオチドに関する。より詳細には、良好なヌクレアーゼ耐性能を有しかつ効率よく製造することのできる５’位修飾ヌクレオシドおよびそれを用いたヌクレオチドに関する。
【背景技術】
【０００２】
核酸医薬による疾病の治療法として、アンチセンス法、アンチジーン法、アプタマー、ｓｉＲＮＡなどがある。このうち、アンチセンス法は、疾病に関わるｍＲＮＡと相補的なオリゴヌクレオチド（アンチセンス鎖）を外部から導入し、二重鎖を形成させることにより、病原ＲＮＡの翻訳過程を阻害し、疾病の治療や予防を行う手法である。ｓｉＲＮＡもこれに類似しており、生体に投与した二重鎖ＲＮＡによりｍＲＮＡからタンパク質への翻訳を阻害する。一方、アンチジーン法は、病原ＲＮＡを転写するＤＮＡ部位に対応する三重鎖形成オリゴヌクレオチドを外部から導入することによりＤＮＡからＲＮＡへの転写を抑制する。また、アプタマーは、短い核酸分子（オリゴヌクレオチド）であるため、疾病の原因となるタンパク質などの生体成分と結合することにより機能を発揮する。【０００３】
こうした核酸医薬の素材として、種々の人工核酸が開発されている。中でも核酸の糖部コンホメーションを架橋によって固定化した２’，４’−ＢＮＡ（ｂｒｉｄｇｅｄ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ、別名ＬＮＡ）は一本鎖ＲＮＡ（ｓｓＲＮＡ）に対して優れた結合親和性を有することが報告されており（非特許文献１および２）アンチセンス法などの様々な核酸医薬への適応が期待されている。【０００４】
一方、核酸の５’位にメチル基を導入した人工核酸は、ヌクレアーゼ耐性能の面で優れた特性を有することが報告されている（特許文献１〜３）。このため、５’位に置換基を導入した人工核酸についても診断や医薬への応用が期待されている。【０００５】
しかし、このような５’位に置換基を導入した人工核酸は、その合成においてジアステレオマーの分離を必要とするため（非特許文献３および４）、製造工程が全体として煩雑となり、工業的生産に向けたさらなる開発が所望されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】国際公開第２０１０／０４８５４９号
【特許文献２】国際公開第２０１０／０４８５８５号
【特許文献３】国際公開第２０１０／０７７５７８号
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】S.Obikaら, T. Tetrahedron Lett. 1997, 38, 8735-8738
【非特許文献２】S. Singhら, J. Chem. Commun. 1998, 455-456.
【非特許文献３】Yawmanら, J. Org. Chem. 1995, 60, 788-789
【非特許文献４】Manoharanら, J. Org. Chem. 2016, 81, 2261-2279
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、上記課題を解決するものであり、その目的とするところは、良好なヌクレアーゼ耐性能を有し、かつその合成経路においてジアステレオマー分離操作を必要とすることなく効率的に製造することのできる５’位が修飾されたヌクレオシドおよびそれを用いたヌクレオチドを提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明は、以下の式（Ｉ）で表される化合物またはその塩：【００１０】
【化１】
2020158910.tif 000003
【００１１】
（式中、
Ｂａｓｅは、α群から選択される任意の置換基を１以上有していてもよいプリン−９−イル基または２−オキソ−１，２−ジヒドロピリミジン−１−イル基を表し、ここで、該α群は、水酸基、核酸合成の保護基で保護された水酸基、炭素数１から６の直鎖アルキル基、炭素数１から６の直鎖アルコキシ基、メルカプト基、核酸合成の保護基で保護されたメルカプト基、炭素数１から６の直鎖アルキルチオ基、アミノ基、炭素数１から６の直鎖アルキルアミノ基、核酸合成の保護基で保護されたアミノ基、およびハロゲン原子からなり、
Ｒ２およびＲ３は、それぞれ独立して、水素原子、核酸合成の水酸基の保護基、分岐または環を形成していてもよい炭素数１から７のアルキル基、分岐または環を形成していてもよい炭素数２から７のアルケニル基、該α群から選択される任意の置換基を１以上有していてもよくそしてヘテロ原子を含んでいてもよい炭素数３から１０のアリール基、該α群から選択される任意の置換基を１以上有していてもよくそしてヘテロ原子を含んでいてもよい炭素数３から１２のアリール部分を有するアラルキル基、該α群から選択される任意の置換基を１以上有していてもよいアシル基、該α群から選択される任意の置換基を１以上有していてもよいシリル基、該α群から選択される任意の置換基を１以上有していてもよいリン酸基、核酸合成の保護基で保護されたリン酸基、−Ｐ（Ｒ４）Ｒ５［式中、Ｒ４およびＲ５は、それぞれ独立して、水酸基、核酸合成の保護基で保護された水酸基、メルカプト基、核酸合成の保護基で保護されたメルカプト基、アミノ基、炭素数１から６のアルコキシ基、炭素数１から６のアルキルチオ基、炭素数１から６のシアノアルコキシ基、または炭素数１から６のアルキル基を有するジアルキルアミノ基を表す］を表し、
Ｒ６およびＲ７は、それぞれ独立して、水素原子、ハロゲン原子、またはメチル基であり、そして
Ｒ８は水素原子でありかつＲ９は水素原子、ハロゲン原子；炭素数１から６の直鎖アルコキシ基で置換されていてもよい炭素数１から６の直鎖アルコキシ基；または−ＯＲ１０［式中、Ｒ１０は水素原子、または核酸合成の水酸基の保護基である］であるか、あるいは
Ｒ８およびＲ９は一緒になって以下の式：【００１２】
【化２】
2020158910.tif 000004
【００１３】
［式中、
Ｒ２１は、水素原子、分岐または環を形成していてもよい炭素数１から６のアルキル基、分岐または環を形成していてもよい炭素数２から６のアルケニル基、該α群から選択される任意の置換基を１以上有していてもよくそしてヘテロ原子を含んでいてもよい炭素数３から１０のアリール基、該α群から選択される任意の置換基を１以上有していてもよくそしてヘテロ原子を含んでいてもよい炭素数３から１２のアリール部分を有するアラルキル基、または核酸合成のアミノ基の保護基であり；
Ｒ２２およびＲ２３は、それぞれ独立して、水素原子；ヘテロ原子を含んでいてもよい炭素数３から１２のアリール基で置換されていてもよく、かつ分岐または環を形成していてもよい炭素数１から６のアルキル基；またはヘテロ原子を含んでいてもよい炭素数３から１２のアリール部分を有するアラルキル基；であるか、あるいは
Ｒ２２およびＲ２３は一緒になって、−（ＣＨ２）ｑ−［式中、ｑは２から５の整数である］を表し；
Ｒ２４およびＲ２５は、それぞれ独立して、水素原子；水酸基；分岐または環を形成していてもよい炭素数１から６のアルキル基；分岐または環を形成していてもよい炭素数１から６のアルコキシ基；アミノ基；および核酸合成の保護基で保護されたアミノ基；からなる群から選択される基であるか、あるいは、
Ｒ２４およびＲ２５は一緒になって、＝Ｃ（Ｒ３６）Ｒ３７［式中、Ｒ３６およびＲ３７は、それぞれ独立して、水素原子、水酸基、核酸合成の保護基で保護された水酸基、メルカプト基、核酸合成の保護基で保護されたメルカプト基、アミノ基、炭素数１から６の直鎖または分岐鎖アルコキシ基、炭素数１から６の直鎖または分岐鎖アルキルチオ基、炭素数１から６のシアノアルコキシ基、または炭素数１から６の直鎖または分岐鎖アルキルアミノ基を表す］を表し；
Ｒ２６およびＲ２７は、それぞれ独立して、水素原子、分岐または環を形成していてもよい炭素数１から６のアルキル基、分岐または環を形成していてもよい炭素数１から６のアルコキシ基、または炭素数１から６の直鎖または分岐鎖アルキルチオ基であり；
Ｒ２８は、水素原子、分岐または環を形成していてもよい炭素数１から６のアルキル基、分岐または環を形成していてもよい炭素数１から６のアルコキシ基、または炭素数１から６の直鎖または分岐鎖アルキルチオ基であり；
Ｒ２９は、水素原子、水酸基、分岐または環を形成していてもよい炭素数１から６のアルキル基、分岐または環を形成していてもよい炭素数１から６のアルコキシ基、アミノ基、あるいは核酸合成の保護基で保護されたアミノ基であり；
Ｒ３１、Ｒ３２、およびＲ３３は、それぞれ独立して、水素原子、分岐または環を形成していてもよい炭素数１から６のアルキル基、あるいは核酸合成のアミノ基の保護基であり；
Ｒ３４およびＲ３５は、それぞれ独立して、水素原子、水酸基、分岐または環を形成していてもよい炭素数１から６のアルキル基、分岐または環を形成していてもよい炭素数１から６のアルコキシ基、アミノ基、または核酸合成の保護基で保護されたアミノ基であり；
ｍは０から２の整数であり；
ｎは０から１の整数であり；
ｐは０から１の整数であり；
Ｘ１は、酸素原子、硫黄原子、またはアミノ基であり；そして
Ｘ２は酸素原子または硫黄原子である]
で表される二価の基を表す）である。【００１４】
１つの実施形態では、上記式（Ｉ）において、上記Ｂａｓｅは、６−アミノプリン−９−イル基、２，６−ジアミノプリン−９−イル基、２−アミノ−６−クロロプリン−９−イル基、２−アミノ−６−フルオロプリン−９−イル基、２−アミノ−６−ブロモプリン−９−イル基、２−アミノ−６−ヒドロキシプリン−９−イル基、６−アミノ−２−メトキシプリン−９−イル基、６−アミノ−２−クロロプリン−９−イル基、６−アミノ−２−フルオロプリン−９−イル基、２，６−ジメトキシプリン−９−イル基、２，６−ジクロロプリン−９−イル基、６−メルカプトプリン−９−イル基、２−オキソ−４−アミノ−１，２−ジヒドロピリミジン−１−イル基、４−アミノ−２−オキソ−５−フルオロ−１，２−ジヒドロピリミジン−１−イル基、４−アミノ−２−オキソ−５−クロロ−１，２−ジヒドロピリミジン−１−イル基、２−オキソ−４−メトキシ−１，２−ジヒドロピリミジン−１−イル基、２−オキソ−４−メルカプト−１，２−ジヒドロピリミジン−１−イル基、２−オキソ−４−ヒドロキシ−１，２−ジヒドロピリミジン−１−イル基、２−オキソ−４−ヒドロキシ−５−メチル−１，２−ジヒドロピリミジン−１−イル基、または４−アミノ−５−メチル−２−オキソ−１，２−ジヒドロピリミジン−１−イル基である。【００１５】
１つの実施形態では、上記式（Ｉ）において、上記Ｂａｓｅは、以下の式：【００１６】
【化３】
2020158910.tif 000005
【００１７】
で表される基である。【００１８】
１つの実施形態では、上記式（Ｉ）において、Ｒ６およびＲ７はともに水素原子である。【００１９】
１つの実施形態では、上記式（Ｉ）において、Ｒ８およびＲ９はともに水素原子である。【００２０】
本発明はまた、以下の式（ＩＩ）で表されるヌクレオシド構造を少なくとも１つ含有するオリゴヌクレオチドまたはその薬理学上許容される塩：【００２１】
【化４】
2020158910.tif 000006
【００２２】
（式中、
Ｂａｓｅは、α群から選択される任意の置換基を１以上有していてもよいプリン−９−イル基または２−オキソ−１，２−ジヒドロピリミジン−１−イル基を表し、ここで、該α群は、水酸基、核酸合成の保護基で保護された水酸基、炭素数１から６の直鎖アルキル基、炭素数１から６の直鎖アルコキシ基、メルカプト基、核酸合成の保護基で保護されたメルカプト基、炭素数１から６の直鎖アルキルチオ基、アミノ基、炭素数１から６の直鎖アルキルアミノ基、核酸合成の保護基で保護されたアミノ基、およびハロゲン原子からなり、
Ｒ６およびＲ７は、それぞれ独立して、水素原子、ハロゲン原子、またはメチル基であり、そして
Ｒ８は水素原子でありかつＲ９は水素原子、ハロゲン原子、または炭素数１から６の直鎖アルコキシ基で置換されていてもよい炭素数１から６の直鎖アルコキシ基であるか、あるいはＲ８およびＲ９は一緒になって以下の式：【００２３】
【化５】
2020158910.tif 000007
【００２４】
［式中、
Ｒ２１は、水素原子、分岐または環を形成していてもよい炭素数１から６のアルキル基、分岐または環を形成していてもよい炭素数２から６のアルケニル基、該α群から選択される任意の置換基を１以上有していてもよくそしてヘテロ原子を含んでいてもよい炭素数３から１０のアリール基、該α群から選択される任意の置換基を１以上有していてもよくそしてヘテロ原子を含んでいてもよい炭素数３から１２のアリール部分を有するアラルキル基、または核酸合成のアミノ基の保護基であり；
Ｒ２２およびＲ２３は、それぞれ独立して、水素原子；ヘテロ原子を含んでいてもよい炭素数３から１２のアリール基で置換されていてもよく、かつ分岐または環を形成していてもよい炭素数１から６のアルキル基；またはヘテロ原子を含んでいてもよい炭素数３から１２のアリール部分を有するアラルキル基；であるか、あるいは
Ｒ２２およびＲ２３は一緒になって、−（ＣＨ２）ｑ−［式中、ｑは２から５の整数である］を表し；
Ｒ２４およびＲ２５は、それぞれ独立して、水素原子；水酸基；分岐または環を形成していてもよい炭素数１から６のアルキル基；分岐または環を形成していてもよい炭素数１から６のアルコキシ基；アミノ基；および核酸合成の保護基で保護されたアミノ基；からなる群から選択される基であるか、あるいは、
Ｒ２４およびＲ２５は一緒になって、＝Ｃ（Ｒ３６）Ｒ３７［式中、Ｒ３６およびＲ３７は、それぞれ独立して、水素原子、水酸基、核酸合成の保護基で保護された水酸基、メルカプト基、核酸合成の保護基で保護されたメルカプト基、アミノ基、炭素数１から６の直鎖または分岐鎖アルコキシ基、炭素数１から６の直鎖または分岐鎖アルキルチオ基、炭素数１から６のシアノアルコキシ基、または炭素数１から６の直鎖または分岐鎖アルキルアミノ基を表す］を表し；
Ｒ２６およびＲ２７は、それぞれ独立して、水素原子、分岐または環を形成していてもよい炭素数１から６のアルキル基、分岐または環を形成していてもよい炭素数１から６のアルコキシ基、または炭素数１から６の直鎖または分岐鎖アルキルチオ基であり；
Ｒ２８は、水素原子、分岐または環を形成していてもよい炭素数１から６のアルキル基、分岐または環を形成していてもよい炭素数１から６のアルコキシ基、または炭素数１から６の直鎖または分岐鎖アルキルチオ基であり；
Ｒ２９は、水素原子、水酸基、分岐または環を形成していてもよい炭素数１から６のアルキル基、分岐または環を形成していてもよい炭素数１から６のアルコキシ基、アミノ基、あるいは核酸合成の保護基で保護されたアミノ基であり；
Ｒ３１、Ｒ３２、およびＲ３３は、それぞれ独立して、水素原子、分岐または環を形成していてもよい炭素数１から６のアルキル基、あるいは核酸合成のアミノ基の保護基であり；
Ｒ３４およびＲ３５は、それぞれ独立して、水素原子、水酸基、分岐または環を形成していてもよい炭素数１から６のアルキル基、分岐または環を形成していてもよい炭素数１から６のアルコキシ基、アミノ基、または核酸合成の保護基で保護されたアミノ基であり；
ｍは０から２の整数であり；
ｎは０から１の整数であり；
ｐは０から１の整数であり；
Ｘ１は、酸素原子、硫黄原子、またはアミノ基であり；そして
Ｘ２は酸素原子または硫黄原子である]
で表される二価の基を表す）である。【００２５】
１つの実施形態では、上記式（ＩＩ）において、Ｒ６およびＲ７はともに水素原子である。【００２６】
１つの実施形態では、上記式（ＩＩ）において、Ｒ８およびＲ９はともに水素原子である。【００２７】
本発明はまた、上記オリゴヌクレオチドまたはその薬理学上許容される塩の製造方法であって、
以下の式（Ｉ）で表される化合物またはその薬理学上許容される塩：【００２８】
【化６】
2020158910.tif 000008
【００２９】
（式中、
Ｂａｓｅは、α群から選択される任意の置換基を１以上有していてもよいプリン−９−イル基または２−オキソ−１，２−ジヒドロピリミジン−１−イル基を表し、ここで、該α群は、水酸基、核酸合成の保護基で保護された水酸基、炭素数１から６の直鎖アルキル基、炭素数１から６の直鎖アルコキシ基、メルカプト基、核酸合成の保護基で保護されたメルカプト基、炭素数１から６の直鎖アルキルチオ基、アミノ基、炭素数１から６の直鎖アルキルアミノ基、核酸合成の保護基で保護されたアミノ基、およびハロゲン原子からなり、
Ｒ２およびＲ３は、それぞれ独立して、水素原子、核酸合成の水酸基の保護基、分岐または環を形成していてもよい炭素数１から７のアルキル基、分岐または環を形成していてもよい炭素数２から７のアルケニル基、該α群から選択される任意の置換基を１以上有していてもよくそしてヘテロ原子を含んでいてもよい炭素数３から１０のアリール基、該α群から選択される任意の置換基を１以上有していてもよくそしてヘテロ原子を含んでいてもよい炭素数３から１２のアリール部分を有するアラルキル基、該α群から選択される任意の置換基を１以上有していてもよいアシル基、該α群から選択される任意の置換基を１以上有していてもよいシリル基、該α群から選択される任意の置換基を１以上有していてもよいリン酸基、核酸合成の保護基で保護されたリン酸基、−Ｐ（Ｒ４）Ｒ５［式中、Ｒ４およびＲ５は、それぞれ独立して、水酸基、核酸合成の保護基で保護された水酸基、メルカプト基、核酸合成の保護基で保護されたメルカプト基、アミノ基、炭素数１から６のアルコキシ基、炭素数１から６のアルキルチオ基、炭素数１から６のシアノアルコキシ基、または炭素数１から６のアルキル基を有するジアルキルアミノ基を表す］を表し、
Ｒ６およびＲ７は、それぞれ独立して、水素原子、ハロゲン原子、またはメチル基であり、そして
Ｒ８は水素原子でありかつＲ９は水素原子、ハロゲン原子；炭素数１から６の直鎖アルコキシ基で置換されていてもよい炭素数１から６の直鎖アルコキシ基；または−ＯＲ１０［式中、Ｒ１０は水素原子、または核酸合成の水酸基の保護基である］であるか、あるいは
Ｒ８およびＲ９は一緒になって以下の式：【００３０】
【化７】
2020158910.tif 000009
【００３１】
［式中、
Ｒ２１は、水素原子、分岐または環を形成していてもよい炭素数１から６のアルキル基、分岐または環を形成していてもよい炭素数２から６のアルケニル基、該α群から選択される任意の置換基を１以上有していてもよくそしてヘテロ原子を含んでいてもよい炭素数３から１０のアリール基、該α群から選択される任意の置換基を１以上有していてもよくそしてヘテロ原子を含んでいてもよい炭素数３から１２のアリール部分を有するアラルキル基、または核酸合成のアミノ基の保護基であり；
Ｒ２２およびＲ２３は、それぞれ独立して、水素原子；ヘテロ原子を含んでいてもよい炭素数３から１２のアリール基で置換されていてもよく、かつ分岐または環を形成していてもよい炭素数１から６のアルキル基；またはヘテロ原子を含んでいてもよい炭素数３から１２のアリール部分を有するアラルキル基；であるか、あるいは
Ｒ２２およびＲ２３は一緒になって、−（ＣＨ２）ｑ−［式中、ｑは２から５の整数である］を表し；
Ｒ２４およびＲ２５は、それぞれ独立して、水素原子；水酸基；分岐または環を形成していてもよい炭素数１から６のアルキル基；分岐または環を形成していてもよい炭素数１から６のアルコキシ基；アミノ基；および核酸合成の保護基で保護されたアミノ基；からなる群から選択される基であるか、あるいは、
Ｒ２４およびＲ２５は一緒になって、＝Ｃ（Ｒ３６）Ｒ３７［式中、Ｒ３６およびＲ３７は、それぞれ独立して、水素原子、水酸基、核酸合成の保護基で保護された水酸基、メルカプト基、核酸合成の保護基で保護されたメルカプト基、アミノ基、炭素数１から６の直鎖または分岐鎖アルコキシ基、炭素数１から６の直鎖または分岐鎖アルキルチオ基、炭素数１から６のシアノアルコキシ基、または炭素数１から６の直鎖または分岐鎖アルキルアミノ基を表す］を表し；
Ｒ２６およびＲ２７は、それぞれ独立して、水素原子、分岐または環を形成していてもよい炭素数１から６のアルキル基、分岐または環を形成していてもよい炭素数１から６のアルコキシ基、または炭素数１から６の直鎖または分岐鎖アルキルチオ基であり；
Ｒ２８は、水素原子、分岐または環を形成していてもよい炭素数１から６のアルキル基、分岐または環を形成していてもよい炭素数１から６のアルコキシ基、または炭素数１から６の直鎖または分岐鎖アルキルチオ基であり；
Ｒ２９は、水素原子、水酸基、分岐または環を形成していてもよい炭素数１から６のアルキル基、分岐または環を形成していてもよい炭素数１から６のアルコキシ基、アミノ基、あるいは核酸合成の保護基で保護されたアミノ基であり；
Ｒ３１、Ｒ３２、およびＲ３３は、それぞれ独立して、水素原子、分岐または環を形成していてもよい炭素数１から６のアルキル基、あるいは核酸合成のアミノ基の保護基であり；
Ｒ３４およびＲ３５は、それぞれ独立して、水素原子、水酸基、分岐または環を形成していてもよい炭素数１から６のアルキル基、分岐または環を形成していてもよい炭素数１から６のアルコキシ基、アミノ基、または核酸合成の保護基で保護されたアミノ基であり；
ｍは０から２の整数であり；
ｎは０から１の整数であり；
ｐは０から１の整数であり；
Ｘ１は、酸素原子、硫黄原子、またはアミノ基であり；そして
Ｘ２は酸素原子または硫黄原子である]
で表される二価の基を表す）
を用いてオリゴヌクレオチドを合成する工程を包含する、方法である。
【発明の効果】
【００３２】
本発明によれば、新規な５’位修飾ヌクレオシドおよびそれを用いたヌクレオチドが提供される。本発明の５’位修飾ヌクレオシドは、特定の臓器への集積などが懸念されるホスホロチオエート修飾核酸の代替とすることも可能である。本発明の５’位修飾ヌクレオシドはまた、その製造においてジアステレオマーの分離工程を必要としないため、工業的生産性にも優れている。
【図面の簡単な説明】
【００３３】
【図１】５’−ＴＴＴＴＴＴＴＴＴＸ−３’の配列の各種オリゴヌクレオチドを３’−エキソヌクレアーゼで処理した場合の、未切断オリゴヌクレオチドの割合の経時変化を示すグラフである。
【図２】各種オリゴヌクレオチドによるジストロフィン遺伝子のエキソン５８をスキップしたｍＲＮＡ相対発現量を示すグラフである。
【図３】ＡＳＯ１、ＡＳＯ２、ＡＳＯ３およびＡＳＯ４の各被験オリゴヌクレオチドを投与した場合ならびに生理食塩水投与の場合のマウス肝臓中の標的遺伝子ＮＲ３Ｃ１のｍＲＮＡ量を示すグラフであり、生理食塩水を投与した場合のｍＲＮＡ量を１００とした場合の相対値にて表す各種オリゴヌクレオチドによるアンチセンス効果を示すグラフである。
【図４】ＡＳＯ１、ＡＳＯ２、ＡＳＯ３およびＡＳＯ４の各被験オリゴヌクレオチドを投与した場合ならびに生理食塩水投与の場合の血液中のアスパラギン酸トランスアミナーゼ（ＡＳＴ）およびアラニントランスアミナーゼ（ＡＬＴ）の活性を示すグラフであり、ＡＳＯ１投与の場合のＡＬＴ値およびＡＳＴ値のそれぞれを１００とした場合の相対値にて表す。
【発明を実施するための形態】
【００３４】
まず、本明細書中で用いられる用語を定義する。
【００３５】
本明細書において、用語「炭素数１から６の直鎖アルキル基」は、炭素数１〜６の任意の直鎖アルキル基をいい、具体的にはメチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、ｎ−ブチル基、ｎ−ペンチル基、またはｎ−ヘキシル基をいう。一方、用語「炭素数１から６のアルキル基」という場合は、炭素数１〜６の任意の直鎖、分岐鎖または環状のアルキル基をいう。
【００３６】
本明細書において、用語「炭素数１から６の直鎖アルコキシ基」は、炭素数１〜６の任意の直鎖アルキル基を有するアルコキシ基を包含する。例えば、メトキシ基、エトキシ基、ｎ−プロポキシ基などが挙げられる。一方、用語「炭素数１から６のアルコキシ基」という場合は、炭素数１〜６の任意の直鎖、分岐鎖または環状のアルコキシ基をいう。また、用語「炭素数１から６の直鎖アルコキシ基で置換されていてもよい炭素数１から６の直鎖アルコキシ基」という場合は、上記「炭素数１から６の直鎖アルコキシ基」、ならびに「炭素数１から６の直鎖アルコキシ基」を構成する１つまたはそれ以上の水素原子が、同一または異なっていてもよい他の「炭素数１から６の直鎖アルコキシ基」で置換されたアルコキシ基をいう。このような「炭素数１から６の直鎖アルコキシ基で置換されていてもよい炭素数１から６の直鎖アルコキシ基」としては、例えばメトキシ基、エトキシ基、ｎ−プロポキシ基、メトキシメトキシ基、エトキシメトキシ基、ｎ−プロポキシメトキシ基、メトキシエトキシ基（例えば２−メトキシエトキシ基）、エトキシエトキシ基（例えば２−エトキシエトキシ基）、およびｎ−プロポキシエトキシ基が挙げられる。
【００３７】
本明細書において、用語「炭素数１から６のシアノアルコキシ基」は、炭素数１〜６の任意の直鎖、分岐鎖または環状のアルコキシ基における少なくとも１つの水素原子がシアノ基で置換された基をいう。
【００３８】
本明細書において、用語「炭素数１から６の直鎖アルキルチオ基」は、炭素数１〜６の任意の直鎖アルキル基を有するアルキルチオ基を包含する。例えば、メチルチオ基、エチルチオ基、ｎ−プロピルチオ基などが挙げられる。一方、用語「炭素数１から６のアルキルチオ基」という場合は、炭素数１〜６の任意の直鎖、分岐鎖または環状のアルキルチオ基をいう。
【００３９】
本明細書において、用語「炭素数１から６の直鎖アルキルアミノ基」は、炭素数１〜６の任意の直鎖アルキル基を有するアルキルアミノ基を１つまたは２つ有するアルキルアミノ基を包含する。例えば、メチルアミノ基、ジメチルアミノ基、エチルアミノ基、メチルエチルアミノ基、ジエチルアミノ基などが挙げられる。
【００４０】
本明細書において、用語「分岐または環を形成していてもよい炭素数１から７のアルキル基」は、炭素数１〜７の任意の直鎖アルキル基、炭素数３〜７の任意の分岐鎖アルキル基、および炭素数３〜７の任意の環状アルキル基を包含する。単に、「低級アルキル基」という場合もある。例えば、炭素数１〜７の任意の直鎖アルキル基としては、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、ｎ−ブチル基、ｎ−ペンチル基、ｎ−ヘキシル基、およびｎ−ヘプチル基が挙げられ、炭素数３〜７の任意の分岐鎖アルキル基としては、イソプロピル基、イソブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基、イソペンチル基などが挙げられ、そして炭素数３〜７の任意の環状アルキル基としては、シクロブチル基、シクロペンチル基、シクロヘキシル基などが挙げられる。
【００４１】
本明細書において、用語「分岐または環を形成していてもよい炭素数２から７のアルケニル基」は、炭素数２〜７の任意の直鎖アルケニル基、炭素数３〜７の任意の分岐鎖アルケニル基、および炭素数３〜７の任意の環状アルケニル基を包含する。単に、「低級アルケニル基」という場合もある。例えば、炭素数２〜７の任意の直鎖アルケニル基としては、エテニル基、１−プロペニル基、２−プロペニル基、１−ブテニル基、２−ブテニル基、１−ペンテニル基、２−ペンテニル基、３−ペンテニル基、４−ペンテニル基、１−ヘキセニル基などが挙げられ、炭素数３〜７の任意の分岐鎖アルケニル基としては、イソプロペニル基、１−メチル−１−プロペニル基、１−メチル−２−プロペニル基、２−メチル−１−プロペニル基、２−メチル−２−プロペニル基、１−メチル−２−ブテニル基などが挙げられ、そして炭素数３〜７の任意の環状アルケニル基としては、シクロブテニル基、シクロペンテニル基、シクロヘキセニル基などが挙げられる。
【００４２】
本明細書において、用語「ヘテロ原子を含んでいてもよい炭素数３から１０のアリール基」は、炭化水素のみで構成された、炭素数６〜１０の任意のアリール基と、当アリール基の環構造を構成する少なくとも１つの炭素原子がヘテロ原子（例えば、窒素原子、酸素原子、および硫黄原子、ならびにこれらの組合せ）で置換された、炭素数３〜１２の任意のヘテロアリール基とを包含する。当該炭素数６〜１０のアリール基としては、フェニル基、ナフチル基、インデニル基、アズレニル基などが挙げられ、そして当該炭素数３〜１２の任意のヘテロアリール基としては、ピリジル基、ピロリル基、キノリル基、インドリル基、イミダゾリル基、フリル基、チエニル基などが挙げられる。
【００４３】
本明細書において、用語「ヘテロ原子を含んでいてもよい炭素数３から１２のアリール部分を有するアラルキル基」の例としては、ベンジル基、フェネチル基、ナフチルメチル基、３−フェニルプロピル基、２−フェニルプロピル基、４−フェニルブチル基、２−フェニルブチル基、ピリジルメチル基、インドリルメチル基、フリルメチル基、チエニルメチル基、ピロリルメチル基、２−ピリジルエチル基、１−ピリジルエチル基、３−チエニルプロピル基などが挙げられる。
【００４４】
本明細書において、用語「アシル基」の例としては、脂肪族アシル基および芳香族アシル基が挙げられる。具体的には、脂肪族アシル基の例としては、ホルミル基、アセチル基、プロピオニル基、ブチリル基、イソブチリル基、ペンタノイル基、ピバロイル基、バレリル基、イソバレリル基、オクタノイル基、ノナノイル基、デカノイル基、３−メチルノナノイル基、８−メチルノナノイル基、３−エチルオクタノイル基、３，７−ジメチルオクタノイル基、ウンデカノイル基、ドデカノイル基、トリデカノイル基、テトラデカノイル基、ペンタデカノイル基、ヘキサデカノイル基、１−メチルペンタデカノイル基、１４−メチルペンタデカノイル基、１３，１３−ジメチルテトラデカノイル基、ヘプタデカノイル基、１５−メチルヘキサデカノイル基、オクタデカノイル基、１−メチルヘプタデカノイル基、ノナデカノイル基、アイコサノイル基およびヘナイコサノイル基のようなアルキルカルボニル基；スクシノイル基、グルタロイル基、アジポイル基のようなカルボキシ化アルキルカルボニル基；クロロアセチル基、ジクロロアセチル基、トリクロロアセチル基、トリフルオロアセチル基のようなハロゲノ低級アルキルカルボニル基；メトキシアセチル基のような低級アルコキシ低級アルキルカルボニル基；（Ｅ）−２−メチル−２−ブテノイル基のような不飽和アルキルカルボニル基が挙げられる。また、芳香族アシル基の例としては、ベンゾイル基、α−ナフトイル基、β−ナフトイル基のようなアリールカルボニル基；２−ブロモベンゾイル基、４−クロロベンゾイル基のようなハロゲノアリールカルボニル基；２，４，６−トリメチルベンゾイル基、４−トルオイル基のような低級アルキル化アリールカルボニル基；４−アニソイル基のような低級アルコキシ化アリールカルボニル基；２−カルボキシベンゾイル基、３−カルボキシベンゾイル基、４−カルボキシベンゾイル基のようなカルボキシ化アリールカルボニル基；４−ニトロベンゾイル基、２−ニトロベンゾイル基のようなニトロ化アリールカルボニル基；２−（メトキシカルボニル）ベンゾイル基のような低級アルコキシカルボニル化アリールカルボニル基；４−フェニルベンゾイル基のようなアリール化アリールカルボニル基などが挙げられる。好適には、ホルミル基、アセチル基、プロピオニル基、ブチリル基、イソブチリル基、ペンタノイル基、ピバロイル基、ベンゾイル基である。
【００４５】
本明細書において、用語「シリル基」の例としては、トリメチルシリル基、トリエチルシリル基、イソプロピルジメチルシリル基、ｔ−ブチルジメチルシリル基、メチルジイソプロピルシリル基、メチルジ−ｔ−ブチルシリル基、トリイソプロピルシリル基のようなトリ低級アルキルシリル基；ジフェニルメチルシリル基、ブチルジフェニルブチルシリル基、ジフェニルイソプロピルシリル基、フェニルジイソプロピルシリル基のような１〜２個のアリール基で置換されたトリ低級アルキルシリル基などが挙げられる。好適には、トリメチルシリル基、トリエチルシリル基、トリイソプロピルシリル基、ｔ−ブチルジメチルシリル基、ｔ−ブチルジフェニルシリル基であり、さらに好適にはトリメチルシリル基である。
【００４６】
本明細書において、用語「ハロゲン原子」としては、例えば、フッ素原子、塩素原子、臭素原子、またはヨウ素原子が挙げられる。好適には、フッ素原子または塩素原子である。
【００４７】
本明細書において、用語「核酸合成のアミノ基の保護基」、「核酸合成の水酸基の保護基」、「核酸合成の保護基で保護された水酸基」、「核酸合成の保護基で保護されたリン酸基」、「核酸合成の保護基で保護されたメルカプト基」の「保護基」とは、核酸合成の際に安定してアミノ基、水酸基、リン酸基またはメルカプト基を保護し得るものであれば、特に制限されない。具体的には、酸性または中性条件で安定であり、加水素分解、加水分解、電気分解、および光分解のような化学的方法により開裂し得る保護基のことをいう。このような保護基としては、例えば、低級アルキル基、低級アルケニル基、アシル基、テトラヒドロピラニルまたはテトラヒドロチオピラニル基、テトラヒドロフラニルまたはテトラヒドロチオフラニル基、シリル基、低級アルコキシメチル基、低級アルコキシ化低級アルコキシメチル基、ハロゲノ低級アルコキシメチル基、低級アルコキシ化エチル基、ハロゲン化エチル基、１〜３個のアリール基で置換されたメチル基、「低級アルキル基、低級アルコキシ基、ハロゲン原子またはシアノ基でアリール環が置換された１〜３個のアリール基で置換されたメチル基」、低級アルコキシカルボニル基、「ハロゲン原子、低級アルコキシ基またはニトロ基で置換されたアリール基」、「ハロゲン原子またはトリ低級アルキルシリル基で置換された低級アルコキシカルボニル基」、アルケニルオキシカルボニル基、「低級アルコキシまたはニトロ基でアリール環が置換されていてもよいアラルキルオキシカルボニル基」などが挙げられる。
【００４８】
より具体的には、テトラヒドロピラニル基またはテトラヒドロチオピラニル基としては、テトラヒドロピラン−２−イル基、３−ブロモテトラヒドロピラン−２−イル基、４−メトキシテトラヒドロピラン−４−イル基、テトラヒドロチオピラン−４−イル基、４−メトキシテトラヒドロチオピラン−４−イル基などが挙げられる。テトラヒドロフラニル基またはテトラヒドロチオフラニル基としては、テトラヒドロフラン−２−イル基、テトラヒドロチオフラン−２−イル基が挙げられる。低級アルコキシメチル基としては、メトキシメチル基、１，１−ジメチル−１−メトキシメチル基、エトキシメチル基、プロポキシメチル基、イソプロポキシメチル基、ブトキシメチル基、ｔ−ブトキシメチル基などが挙げられる。低級アルコキシ化低級アルコキシメチル基としては、２−メトキシエトキシメチル基などが挙げられる。ハロゲノ低級アルコキシメチル基としては、２，２，２−トリクロロエトキシメチル基、ビス（２−クロロエトキシ）メチル基などが挙げられる。低級アルコキシ化エチル基としては、１−エトキシエチル基、１−（イソプロポキシ）エチル基などが挙げられる。ハロゲン化エチル基としては、２，２，２−トリクロロエチル基などが挙げられる。１〜３個のアリール基で置換されたメチル基としては、ベンジル基、α−ナフチルメチル基、β−ナフチルメチル基、ジフェニルメチル基、トリフェニルメチル基、α−ナフチルジフェニルメチル基、９−アンスリルメチル基などが挙げられる。「低級アルキル基、低級アルコキシ基、ハロゲン原子またはシアノ基でアリール環が置換された１〜３個のアリール基で置換されたメチル基」としては、４−メチルベンジル基、２，４，６−トリメチルベンジル基、３，４，５−トリメチルベンジル基、４−メトキシベンジル基、４−メトキシフェニルジフェニルメチル基、４，４’−ジメトキシトリフェニルメチル基、２−ニトロベンジル基、４−ニトロベンジル基、４−クロロベンジル基、４−ブロモベンジル基、４−シアノベンジル基などが挙げられる。低級アルコキシカルボニル基としては、メトキシカルボニル基、エトキシカルボニル基、ｔ−ブトキシカルボニル基、イソブトキシカルボニル基などが挙げられる。「ハロゲン原子、低級アルコキシ基またはニトロ基で置換されたアリール基」としては、４−クロロフェニル基、２−フロロフェニル基、４−メトキシフェニル基、４−ニトロフェニル基、２，４−ジニトロフェニル基などが挙げられる。「ハロゲン原子またはトリ低級アルキルシリル基で置換された低級アルコキシカルボニル基」としては、２，２，２−トリクロロエトキシカルボニル基、２−トリメチルシリルエトキシカルボニル基などが挙げられる。アルケニルオキシカルボニル基としては、ビニルオキシカルボニル基、アリールオキシカルボニル基などが挙げられる。「低級アルコキシまたはニトロ基でアリール環が置換されていてもよいアラルキルオキシカルボニル基」としては、ベンジルオキシカルボニル基、４−メトキシベンジルオキシカルボニル基、３，４−ジメトキシベンジルオキシカルボニル基、２−ニトロベンジルオキシカルボニル基、４−ニトロベンジルオキシカルボニル基などが挙げられる。
【００４９】
１つの実施形態では、「核酸合成の水酸基の保護基」としては、例えば脂肪族アシル基、芳香族アシル基、１〜３個のアリール基で置換されたメチル基、「低級アルキル、低級アルコキシ、ハロゲン、シアノ基でアリール環が置換された１〜３個のアリール基で置換されたメチル基」、およびシリル基が挙げられる。あるいは、１つの実施形態では、「核酸合成の水酸基の保護基」としては、例えばアセチル基、ベンゾイル基、ベンジル基、ｐ−メトキシベンゾイル基、ジメトキシトリチル基、モノメトキシトリチル基、ｔｅｒｔ−ブチルジフェニルシリル基、ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル（ＴＢＤＭＳ）基、［（トリイソプロピルシリル）オキシ］メチル（ＴＯＭ）基、［（２−ニトロベンジル）オキシ］メチル（ＮＢＯＭ）基、ビス（アセトキシエトキシ）メチルエーテル（ＡＣＥ）基、テトラヒドロ−４−メトキシ−２Ｈ−ピラン−２−イル（Ｍｔｈｐ）基、１−（２−シアノエトキシ）エチル（ＣＥＥ）基、２−シアノエトキシメチル（ＣＥＭ）基、ｔｅｒｔ−ブチルジチオメチル（ＤＴＭ）基、２−（４−トリルスルホニル）エトキシメチル（ＴＥＭ）基、および４−（Ｎ−ジクロロアセチル−Ｎ−メチルアミノ）ベンジルオキシメチル（４−ＭＡＢＯＭ）基が挙げられる。
【００５０】
１つの実施形態では、「核酸合成の保護基で保護された水酸基」の保護基としては、例えば脂肪族アシル基、芳香族アシル基、「１〜３個のアリール基で置換されたメチル基」、「ハロゲン原子、低級アルコキシ基またはニトロ基で置換されたアリール基」、低級アルキル基、および低級アルケニル基が挙げられる。あるいは、１つの実施形態では、「核酸合成の保護基で保護された水酸基」の保護基としては、例えばベンゾイル基、ベンジル基、２−クロロフェニル基、４−クロロフェニル基、および２−プロペニル基が挙げられる。
【００５１】
１つの実施形態では、「核酸合成のアミノ基の保護基」としては、例えばアシル基、好適には、ベンゾイル基が挙げられる。
【００５２】
１つの実施形態では、「核酸合成の保護基で保護されたリン酸基」の「保護基」としては、例えば低級アルキル基、シアノ基で置換された低級アルキル基、アラルキル基、「ニトロ基またはハロゲン原子でアリール環が置換されたアラルキル基」、および「低級アルキル基、ハロゲン原子、またはニトロ基で置換されたアリール基」が挙げられる。あるいは、１つの実施形態では、「核酸合成の保護基で保護されたリン酸基」の「保護基」としては、例えば２−シアノエチル基、２，２，２−トリクロロエチル基、ベンジル基、２−クロロフェニル基、および４−クロロフェニル基が挙げられる。
【００５３】
１つの実施形態では、「核酸合成の保護基で保護されたメルカプト基」の「保護基」としては、例えば脂肪族アシル基および芳香族アシル基、好適には、ベンゾイル基が挙げられる。
【００５４】
本明細書において、−Ｐ（Ｒ４）Ｒ５［式中、Ｒ４およびＲ５は、それぞれ独立して、水酸基、核酸合成の保護基で保護された水酸基、メルカプト基、核酸合成の保護基で保護されたメルカプト基、アミノ基、炭素数１から６のアルコキシ基、炭素数１から６のアルキルチオ基、炭素数１から６のシアノアルコキシ基、または炭素数１から６のアルキル基を有するジアルキルアミノ基を表す］で表される基のうち、Ｒ４がＯＲ４ａでありそしてＲ５がＮＲ５ａである基は、「ホスホロアミダイト基」という（ここで、Ｒ４ａは例えば炭素数１から６のシアノアルコキシ基であり、そしてＲ５ａは例えば炭素数１から６のアルキル基である）。ホスホロアミダイト基としては、好適には、式−Ｐ（ＯＣ２Ｈ４ＣＮ）（Ｎ（ｉＰｒ）２）で表される基、または式−Ｐ（ＯＣＨ３）（Ｎ（ｉＰｒ）２）で表される基が挙げられる。ここで、ｉＰｒはイソプロピル基を表す。
【００５５】
本明細書において、用語「ヌクレオシド」および「ヌクレオシド類縁体」とは、プリンまたはピリミジン塩基と糖とが結合した「ヌクレオシド」のうち非天然型のもの、ならびに、プリンおよびピリミジン以外の芳香族複素環および芳香族炭化水素環でプリンまたはピリミジン塩基との代用が可能なものと糖が結合したものをいう。
【００５６】
本明細書において、用語「人工オリゴヌクレオチド」および「オリゴヌクレオチド類縁体」とは、同一または異なる「ヌクレオシド」または「ヌクレオシド類縁体」がリン酸ジエステル結合で例えば２〜５０個結合した「オリゴヌクレオチド」の非天然型誘導体をいう。そのような類縁体としては、好適には、糖部分が修飾された糖誘導体；リン酸ジエステル部分がチオエート化されたチオエート誘導体；末端のリン酸部分がエステル化されたエステル体；プリン塩基上のアミノ基がアミド化されたアミド体が挙げられ、さらに好適には、糖部分が修飾された糖誘導体が挙げられる。
【００５７】
本明細書において、用語「その塩」とは、本発明の式（Ｉ）または（ＩＩ）で表される化合物の塩をいう。そのような塩としては、例えば、ナトリウム塩、カリウム塩、リチウム塩のようなアルカリ金属塩、カルシウム塩、マグネシウム塩のようなアルカリ土類金属塩、アルミニウム塩、鉄塩、亜鉛塩、銅塩、ニッケル塩、コバルト塩などの金属塩；アンモニウム塩のような無機塩、ｔ−オクチルアミン塩、ジベンジルアミン塩、モルホリン塩、グルコサミン塩、フェニルグリシンアルキルエステル塩、エチレンジアミン塩、Ｎ−メチルグルカミン塩、グアニジン塩、ジエチルアミン塩、トリエチルアミン塩、ジシクロヘキシルアミン塩、Ｎ，Ｎ’−ジベンジルエチレンジアミン塩、クロロプロカイン塩、プロカイン塩、ジエタノールアミン塩、Ｎ−ベンジル−フェネチルアミン塩、ピペラジン塩、テトラメチルアンモニウム塩、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン塩のような有機塩等のアミン塩；フッ化水素酸塩、塩酸塩、臭化水素酸塩、ヨウ化水素酸塩のようなハロゲン原子化水素酸塩、硝酸塩、過塩素酸塩、硫酸塩、リン酸塩等の無機酸塩；メタンスルホン酸塩、トリフルオロメタンスルホン酸塩、エタンスルホン酸塩のような低級アルカンスルホン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、ｐ−トルエンスルホン酸塩のようなアリールスルホン酸塩、酢酸塩、リンゴ酸塩、フマル酸塩、コハク酸塩、クエン酸塩、酒石酸塩、シュウ酸塩、マレイン酸塩等の有機酸塩；および、グリシン塩、リジン塩、アルギニン塩、オルニチン塩、グルタミン酸塩、アスパラギン酸塩のようなアミノ酸塩が挙げられる。
【００５８】
本明細書において、用語「その薬理学上許容される塩」としては、本発明の式（ＩＩ）で表されるヌクレオシド構造を少なくとも１つ含有するオリゴヌクレオチド類縁体の塩をいう。そのような塩としては、例えば、ナトリウム塩、カリウム塩、リチウム塩のようなアルカリ金属塩、カルシウム塩、マグネシウム塩のようなアルカリ土類金属塩、アルミニウム塩、鉄塩、亜鉛塩、銅塩、ニッケル塩、コバルト塩などの金属塩；アンモニウム塩のような無機塩、ｔ−オクチルアミン塩、ジベンジルアミン塩、モルホリン塩、グルコサミン塩、フェニルグリシンアルキルエステル塩、エチレンジアミン塩、Ｎ−メチルグルカミン塩、グアニジン塩、ジエチルアミン塩、トリエチルアミン塩、ジシクロヘキシルアミン塩、Ｎ，Ｎ’−ジベンジルエチレンジアミン塩、クロロプロカイン塩、プロカイン塩、ジエタノールアミン塩、Ｎ−ベンジル−フェネチルアミン塩、ピペラジン塩、テトラメチルアンモニウム塩、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン塩のような有機塩等のアミン塩；フッ化水素酸塩、塩酸塩、臭化水素酸塩、ヨウ化水素酸塩のようなハロゲン原子化水素酸塩、硝酸塩、過塩素酸塩、硫酸塩、リン酸塩等の無機酸塩；メタンスルホン酸塩、トリフルオロメタンスルホン酸塩、エタンスルホン酸塩のような低級アルカンスルホン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、ｐ−トルエンスルホン酸塩のようなアリールスルホン酸塩、酢酸塩、リンゴ酸塩、フマル酸塩、コハク酸塩、クエン酸塩、酒石酸塩、シュウ酸塩、マレイン酸塩等の有機酸塩；および、グリシン塩、リジン塩、アルギニン塩、オルニチン塩、グルタミン酸塩、アスパラギン酸塩のようなアミノ酸塩が挙げられる。
【００５９】
以下、本発明について詳述する。
【００６０】
本発明の５’位修飾ヌクレオシドは、以下の式（Ｉ）：
【００６１】
【化８】
2020158910.tif 000010
【００６２】
（式中、
Ｂａｓｅは、α群から選択される任意の置換基を１以上有していてもよいプリン−９−イル基または２−オキソ−１，２−ジヒドロピリミジン−１−イル基を表し、ここで、該α群は、水酸基、核酸合成の保護基で保護された水酸基、炭素数１から６の直鎖アルキル基、炭素数１から６の直鎖アルコキシ基、メルカプト基、核酸合成の保護基で保護されたメルカプト基、炭素数１から６の直鎖アルキルチオ基、アミノ基、炭素数１から６の直鎖アルキルアミノ基、核酸合成の保護基で保護されたアミノ基、およびハロゲン原子からなり、
Ｒ２およびＲ３は、それぞれ独立して、水素原子、核酸合成の水酸基の保護基、分岐または環を形成していてもよい炭素数１から７のアルキル基、分岐または環を形成していてもよい炭素数２から７のアルケニル基、該α群から選択される任意の置換基を１以上有していてもよくそしてヘテロ原子を含んでいてもよい炭素数３から１０のアリール基、該α群から選択される任意の置換基を１以上有していてもよくそしてヘテロ原子を含んでいてもよい炭素数３から１２のアリール部分を有するアラルキル基、該α群から選択される任意の置換基を１以上有していてもよいアシル基、該α群から選択される任意の置換基を１以上有していてもよいシリル基、該α群から選択される任意の置換基を１以上有していてもよいリン酸基、核酸合成の保護基で保護されたリン酸基、−Ｐ（Ｒ４）Ｒ５［式中、Ｒ４およびＲ５は、それぞれ独立して、水酸基、核酸合成の保護基で保護された水酸基、メルカプト基、核酸合成の保護基で保護されたメルカプト基、アミノ基、炭素数１から６のアルコキシ基、炭素数１から６のアルキルチオ基、炭素数１から６のシアノアルコキシ基、または炭素数１から６のアルキル基を有するジアルキルアミノ基を表す］を表し、
Ｒ６およびＲ７は、それぞれ独立して、水素原子、ハロゲン原子、またはメチル基であり、そして
Ｒ８は水素原子でありかつＲ９は水素原子、ハロゲン原子；炭素数１から６の直鎖アルコキシ基で置換されていてもよい炭素数１から６の直鎖アルコキシ基；または−ＯＲ１０［式中、Ｒ１０は水素原子、または核酸合成の水酸基の保護基である］であるか、あるいは
Ｒ８およびＲ９は一緒になって以下の式：
【００６３】
【化９】
2020158910.tif 000011
【００６４】
［式中、
Ｒ２１は、水素原子、分岐または環を形成していてもよい炭素数１から６のアルキル基、分岐または環を形成していてもよい炭素数２から６のアルケニル基、該α群から選択される任意の置換基を１以上有していてもよくそしてヘテロ原子を含んでいてもよい炭素数３から１０のアリール基、該α群から選択される任意の置換基を１以上有していてもよくそしてヘテロ原子を含んでいてもよい炭素数３から１２のアリール部分を有するアラルキル基、または核酸合成のアミノ基の保護基であり；
Ｒ２２およびＲ２３は、それぞれ独立して、水素原子；ヘテロ原子を含んでいてもよい炭素数３から１２のアリール基で置換されていてもよく、かつ分岐または環を形成していてもよい炭素数１から６のアルキル基；またはヘテロ原子を含んでいてもよい炭素数３から１２のアリール部分を有するアラルキル基；であるか、あるいは
Ｒ２２およびＲ２３は一緒になって、−（ＣＨ２）ｑ−［式中、ｑは２から５の整数である］を表し；
Ｒ２４およびＲ２５は、それぞれ独立して、水素原子；水酸基；分岐または環を形成していてもよい炭素数１から６のアルキル基；分岐または環を形成していてもよい炭素数１から６のアルコキシ基；アミノ基；および核酸合成の保護基で保護されたアミノ基；からなる群から選択される基であるか、あるいは、
Ｒ２４およびＲ２５は一緒になって、＝Ｃ（Ｒ３６）Ｒ３７［式中、Ｒ３６およびＲ３７は、それぞれ独立して、水素原子、水酸基、核酸合成の保護基で保護された水酸基、メルカプト基、核酸合成の保護基で保護されたメルカプト基、アミノ基、炭素数１から６の直鎖または分岐鎖アルコキシ基、炭素数１から６の直鎖または分岐鎖アルキルチオ基、炭素数１から６のシアノアルコキシ基、または炭素数１から６の直鎖または分岐鎖アルキルアミノ基を表す］を表し；
Ｒ２６およびＲ２７は、それぞれ独立して、水素原子、分岐または環を形成していてもよい炭素数１から６のアルキル基、分岐または環を形成していてもよい炭素数１から６のアルコキシ基、または炭素数１から６の直鎖または分岐鎖アルキルチオ基であり；
Ｒ２８は、水素原子、分岐または環を形成していてもよい炭素数１から６のアルキル基、分岐または環を形成していてもよい炭素数１から６のアルコキシ基、または炭素数１から６の直鎖または分岐鎖アルキルチオ基であり；
Ｒ２９は、水素原子、水酸基、分岐または環を形成していてもよい炭素数１から６のアルキル基、分岐または環を形成していてもよい炭素数１から６のアルコキシ基、アミノ基、あるいは核酸合成の保護基で保護されたアミノ基であり；
Ｒ３１、Ｒ３２、およびＲ３３は、それぞれ独立して、水素原子、分岐または環を形成していてもよい炭素数１から６のアルキル基、あるいは核酸合成のアミノ基の保護基であり；
Ｒ３４およびＲ３５は、それぞれ独立して、水素原子、水酸基、分岐または環を形成していてもよい炭素数１から６のアルキル基、分岐または環を形成していてもよい炭素数１から６のアルコキシ基、アミノ基、または核酸合成の保護基で保護されたアミノ基であり；
ｍは０から２の整数であり；
ｎは０から１の整数であり；
ｐは０から１の整数であり；
Ｘ１は、酸素原子、硫黄原子、またはアミノ基であり；そして
Ｘ２は酸素原子または硫黄原子である]
で表される二価の基を表す）で表される化合物またはその塩である。
【００６５】
上記式（Ｉ）において、「Ｂａｓｅ」は、例えばプリン塩基（すなわち、プリン−９−イル基）またはピリミジン塩基（すなわち、２−オキソ−１，２−ジヒドロピリミジン−１−イル基）である。これらの塩基は、水酸基、炭素数１から６の直鎖アルキル基、炭素数１から６の直鎖アルコキシ基、メルカプト基、炭素数１から６の直鎖アルキルチオ基、アミノ基、炭素数１から６の直鎖アルキルアミノ基、およびハロゲン原子からなるα群より選択される任意の置換基を１以上有していてもよい。
【００６６】
上記「Ｂａｓｅ」の具体例としては、アデニニル基、グアニニル基、シトシニル基、ウラシニル基、およびチミニル基、ならびに６−アミノプリン−９−イル基、２，６−ジアミノプリン−９−イル基、２−アミノ−６−クロロプリン−９−イル基、２−アミノ−６−フルオロプリン−９−イル基、２−アミノ−６−ブロモプリン−９−イル基、２−アミノ−６−ヒドロキシプリン−９−イル基、６−アミノ−２−メトキシプリン−９−イル基、６−アミノ−２−クロロプリン−９−イル基、６−アミノ−２−フルオロプリン−９−イル基、２，６−ジメトキシプリン−９−イル基、２，６−ジクロロプリン−９−イル基、６−メルカプトプリン−９−イル基、２−オキソ−４−アミノ−１，２−ジヒドロピリミジン−１−イル基、４−アミノ−２−オキソ−５−フルオロ−１，２−ジヒドロピリミジン−１−イル基、４−アミノ−２−オキソ−５−クロロ−１，２−ジヒドロピリミジン−１−イル基、２−オキソ−４−メトキシ−１，２−ジヒドロピリミジン−１−イル基、２−オキソ−４−メルカプト−１，２−ジヒドロピリミジン−１−イル基、２−オキソ−４−ヒドロキシ−１，２−ジヒドロピリミジン−１−イル基、２−オキソ−４−ヒドロキシ−５−メチル−１，２−ジヒドロピリミジン−１−イル基、および４−アミノ−５−メチル−２−オキソ−１，２−ジヒドロピリミジン−１−イル基が挙げられる。
【００６７】
あるいは、「Ｂａｓｅ」は、核酸医薬への導入という観点から、以下の構造式：
【００６８】
【化１０】
2020158910.tif 000012
【００６９】
でそれぞれ表される基、ならびに２−オキソ−４−ヒドロキシ−５−メチル−１，２−ジヒドロピリミジン−１−イル基、２−オキソ−４−アミノ−１，２−ジヒドロピリミジン−１−イル基、６−アミノプリン−９−イル基、２−アミノ−６−ヒドロキシプリン−９−イル基、４−アミノ−５−メチル−２−オキソ−１，２−ジヒドロピリミジン−１−イル基、および２−オキソ−４−ヒドロキシ−１，２−ジヒドロピリミジン−１−イル基が好ましい。「Ｂａｓｅ」はまた、オリゴヌクレオチドの合成の際には、上記基を構成する水酸基およびアミノ基が保護基により保護されているものであることが好ましい。
【００７０】
本発明の５’位修飾ヌクレオシドでは、式（Ｉ）の５’位のシクロプロパン部分を構成する１つの炭素原子に２つの同一のＲ６が結合し、かつ他の１つの炭素原子に２つの同一のＲ７が結合している。このような構造を有していることにより、本発明のヌクレオシドは当該５’位においてジアステレオマーの構造を有し得ず、従来の５’位に置換基を導入した人工核酸と比較して、その合成の際にジアステレオマーの分離を行う必要性から解放される。
【００７１】
このようなＲ６およびＲ７の組合せの観点において、上記式（Ｉ）の例としては：
【００７２】
【化１１】
2020158910.tif 000013
【００７３】
（式中、Ｂａｓｅ、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ８およびＲ９は、上記式（Ｉ）で定義されるものと同様である）が挙げられる。本発明においては、上記式（Ｉ）のＲ６およびＲ７がともに水素原子であることが好ましい。
【００７４】
さらに、本発明の５’位修飾ヌクレオシドでは、式（Ｉ）の２’位および４’位は、以下：
【００７５】
【化１２】
2020158910.tif 000014
【００７６】
（式中、Ｂａｓｅ、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ６およびＲ７は、上記式（Ｉ）で定義されるものと同様である）のように、Ｒ８とＲ９とが一緒になって架橋構造を有していてもよく、あるいはＲ８およびＲ９のぞれぞれが水素原子であってもよい。本発明の１つの実施形態では、上記式（Ｉ）のＲ８およびＲ９がともに水素原子である。
【００７７】
本発明の５’位修飾ヌクレオシドは、式（Ｉ）の５’位にシクロプロパン部分が導入されていることにより、後述するオリゴヌクレオチドにおけるヌクレアーゼ耐性能が向上する。また、このようなシクロプロパン基における環のひずみは、糖部のコンホメーションに直接的に影響を及ぼすものである。このため、本発明の５’位修飾ヌクレオシドは、得られたオリゴヌクレオチドに対し、当該影響によるｓｓＲＮＡとの結合親和性をも一層向上させ得る。
【００７８】
本発明において、オリゴヌクレオチドは、このような式（Ｉ）の５’位修飾ヌクレオシドを用い、例えば、当該分野において周知のアミダイト法、またはM. Kuwaharaら、Nucleic Acids Res.，2008年，36巻，13号，4257-4265頁に記載されるような三リン酸化を経て容易に製造することができる。
【００７９】
本発明のオリゴヌクレオチドまたはその薬理学上許容される塩（以下、これらをまとめて「本発明のオリゴヌクレオチド」を言うことがある）は、以下の式（ＩＩ）：
【００８０】
【化１３】
2020158910.tif 000015
【００８１】
（式中、
Ｂａｓｅは、α群から選択される任意の置換基を１以上有していてもよいプリン−９−イル基または２−オキソ−１，２−ジヒドロピリミジン−１−イル基を表し、ここで、該α群は、水酸基、核酸合成の保護基で保護された水酸基、炭素数１から６の直鎖アルキル基、炭素数１から６の直鎖アルコキシ基、メルカプト基、核酸合成の保護基で保護されたメルカプト基、炭素数１から６の直鎖アルキルチオ基、アミノ基、炭素数１から６の直鎖アルキルアミノ基、核酸合成の保護基で保護されたアミノ基、およびハロゲン原子からなり、
Ｒ６およびＲ７は、それぞれ独立して、水素原子、ハロゲン原子、またはメチル基であり、そして
Ｒ８は水素原子でありかつＲ９は水素原子、ハロゲン原子、または炭素数１から６の直鎖アルコキシ基で置換されていてもよい炭素数１から６の直鎖アルコキシ基であるか、あるいはＲ８およびＲ９は一緒になって以下の式（ＣＲ０１）〜（ＣＲ１１）：
【００８２】
【化１４】
2020158910.tif 000016
【００８３】
［式中、
Ｒ２１は、水素原子、分岐または環を形成していてもよい炭素数１から６のアルキル基、分岐または環を形成していてもよい炭素数２から６のアルケニル基、該α群から選択される任意の置換基を１以上有していてもよくそしてヘテロ原子を含んでいてもよい炭素数３から１０のアリール基、該α群から選択される任意の置換基を１以上有していてもよくそしてヘテロ原子を含んでいてもよい炭素数３から１２のアリール部分を有するアラルキル基、または核酸合成のアミノ基の保護基であり；
Ｒ２２およびＲ２３は、それぞれ独立して、水素原子；ヘテロ原子を含んでいてもよい炭素数３から１２のアリール基で置換されていてもよく、かつ分岐または環を形成していてもよい炭素数１から６のアルキル基；またはヘテロ原子を含んでいてもよい炭素数３から１２のアリール部分を有するアラルキル基；であるか、あるいは
Ｒ２２およびＲ２３は一緒になって、−（ＣＨ２）ｑ−［式中、ｑは２から５の整数である］を表し；
Ｒ２４およびＲ２５は、それぞれ独立して、水素原子；水酸基；分岐または環を形成していてもよい炭素数１から６のアルキル基；分岐または環を形成していてもよい炭素数１から６のアルコキシ基；アミノ基；および核酸合成の保護基で保護されたアミノ基；からなる群から選択される基であるか、あるいは、
Ｒ２４およびＲ２５は一緒になって、＝Ｃ（Ｒ３６）Ｒ３７［式中、Ｒ３６およびＲ３７は、それぞれ独立して、水素原子、水酸基、核酸合成の保護基で保護された水酸基、メルカプト基、核酸合成の保護基で保護されたメルカプト基、アミノ基、炭素数１から６の直鎖または分岐鎖アルコキシ基、炭素数１から６の直鎖または分岐鎖アルキルチオ基、炭素数１から６のシアノアルコキシ基、または炭素数１から６の直鎖または分岐鎖アルキルアミノ基を表す］を表し；
Ｒ２６およびＲ２７は、それぞれ独立して、水素原子、分岐または環を形成していてもよい炭素数１から６のアルキル基、分岐または環を形成していてもよい炭素数１から６のアルコキシ基、または炭素数１から６の直鎖または分岐鎖アルキルチオ基であり；
Ｒ２８は、水素原子、分岐または環を形成していてもよい炭素数１から６のアルキル基、分岐または環を形成していてもよい炭素数１から６のアルコキシ基、または炭素数１から６の直鎖または分岐鎖アルキルチオ基であり；
Ｒ２９は、水素原子、水酸基、分岐または環を形成していてもよい炭素数１から６のアルキル基、分岐または環を形成していてもよい炭素数１から６のアルコキシ基、アミノ基、あるいは核酸合成の保護基で保護されたアミノ基であり；
Ｒ３１、Ｒ３２、およびＲ３３は、それぞれ独立して、水素原子、分岐または環を形成していてもよい炭素数１から６のアルキル基、あるいは核酸合成のアミノ基の保護基であり；
Ｒ３４およびＲ３５は、それぞれ独立して、水素原子、水酸基、分岐または環を形成していてもよい炭素数１から６のアルキル基、分岐または環を形成していてもよい炭素数１から６のアルコキシ基、アミノ基、または核酸合成の保護基で保護されたアミノ基であり；
ｍは０から２の整数であり；
ｎは０から１の整数であり；
ｐは０から１の整数であり；
Ｘ１は、酸素原子、硫黄原子、またはアミノ基であり；そして
Ｘ２は酸素原子または硫黄原子である]
で表される二価の基を表す）で表されるヌクレオシド構造を少なくとも１つ含む。
【００８４】
なお、本発明において、上記式（ＣＲ０１）〜（ＣＲ１１）で表される架橋構造のうち、式（ＣＲ０７）および（ＣＲ０９）で表される構造は、当該架橋構造の周辺に存在する任意のアニオン（例えば、水酸化物イオン、リン酸イオン、塩化物イオン）により電気的に中性に保持されている。
【００８５】
ここで、Ｒ６およびＲ７の組合せの観点において、本発明のオリゴヌクレオチドに含まれる式（ＩＩ）のヌクレオシド構造の例としては：
【００８６】
【化１５】
2020158910.tif 000017
【００８７】
（式中、Ｂａｓｅ、Ｒ８およびＲ９は、上記式（ＩＩ）で定義されるものと同様である）が挙げられる。本発明においては、上記式（ＩＩ）のＲ６およびＲ７がともに水素原子であることが好ましい。
【００８８】
さらに、Ｒ８およびＲ９の組合せの観点において、本発明のオリゴヌクレオチドに含まれる式（ＩＩ）のヌクレオシド構造の例としては：
【００８９】
【化１６】
2020158910.tif 000018
【００９０】
（式中、Ｂａｓｅ、Ｒ６およびＲ７は、上記式（ＩＩ）で定義されるものと同様である）が挙げられる。本発明の１つの実施形態では、上記式（ＩＩ）のＲ６およびＲ７がともに水素原子である。
【００９１】
本発明のオリゴヌクレオチドは、上記ヌクレオシド構造を、任意の位置に少なくとも１つ有する。その位置および数は、特に限定されず、目的に応じて適宜設計され得る。
【００９２】
このようなヌクレオシド構造を含むオリゴヌクレオチド（アンチセンス分子）は、従来の２’，４’−ＢＮＡ／ＬＮＡを用いる場合と比較して、ヌクレアーゼ耐性能が飛躍的に向上する。また、公知の２’，４’−ＢＮＡ／ＬＮＡに匹敵するｓｓＲＮＡ結合親和性を有する。さらに当該オリゴヌクレオチドは、アンチセンス活性を損なうことなく肝毒性を低減させることもできる。
【００９３】
これらのことから、本発明の５’位修飾ヌクレオシドを用いて合成された本発明のオリゴヌクレオチドは、抗腫瘍剤、抗ウイルス剤をはじめとした、特定の遺伝子の働きを阻害または回復して疾病を治療する医薬品（アンチセンス分子）としての有用性が期待される。このような有用性が期待される医薬品の例としては、筋ジストロフィー治療薬が挙げられる。
【００９４】
特に、アンチセンス法では、相補センス鎖ＲＮＡに対する結合親和性および生体内ＤＮＡ分解酵素への耐性の両方が必要とされる。一般的に、核酸は、一本鎖状態では、糖部の構造が絶えずＤＮＡ二重鎖に近い形と、ＤＮＡ−ＲＮＡ二重鎖やＲＮＡ二重鎖に近い形との間で揺らいでいることが知られている。一本鎖核酸が相補的なＲＮＡ鎖と二重鎖を形成する場合、その糖部構造は固定される。そこで、本発明の５’位修飾ヌクレオシドでは、糖部を予め二重鎖を形成する場合の状態に固定されているため、目的のＲＮＡ鎖と二重鎖を形成しやすく、安定に存在させることができる。また、核酸二重鎖は、水分子のネットワークと呼ばれる鎖のようにつながった水和水により安定化されていることも知られている。
【００９５】
本発明のオリゴヌクレオチドは、例えば、賦形剤、結合剤、防腐剤、酸化安定剤、崩壊剤、滑沢剤、矯味剤などの医薬の製剤技術分野において通常用いられる補助剤を配合して、非経口投与製剤またはリポソーム製剤とすることができる。また、例えば、当該技術分野で通常用いられる医薬用担体を配合して、液剤、クリーム剤、軟膏剤などの局所用の製剤を調製することができる。
【実施例】
【００９６】
以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例により限定されるものではない。【００９７】
（実施例１：５’位修飾ヌクレオシドの合成（１））【００９８】
【化１７】
2020158910.tif 000019
【００９９】
（１−１）化合物２の合成【０１００】
【化１８】
2020158910.tif 000020
【０１０１】
Caruthersら、Tetrahedron Lett., 1996年,37巻,35号,6239-6242頁に記載の方法により作製した化合物１（１．５０ｇ，４．２０ｍｍｏｌ）のジクロロメタン溶液（３１ｍＬ）にヨードベンゼンジアセタート（ＰｈＩ（ＯＡｃ）２；２．９８ｇ，９．２４ｍｍｏｌ）と２，２，６，６−テトラメチルピペリジン１−オキシルフリーラジカル（ＴＥＭＰＯ；１５１ｍｇ，０．９６ｍｍｏｌ）とを０℃で順次添加した。室温で２時間撹拌した後、アセトニトリル／水（＝１：１（容量比），２３０μＬ）を添加し、さらに室温で２時間撹拌した。反応終了後に過剰量のメタノールを加え、１０分間室温で撹拌し、溶媒の減圧留去およびトルエン共沸を行って、白色固体の化合物２（４．２０ｍｍｏｌ以下，粗生成物）を得た。この化合物２を精製することなく即座に次の反応に用いた。【０１０２】
（１−２）化合物３の合成【０１０３】
【化１９】
2020158910.tif 000021
【０１０４】
上記で得られた化合物２（４．２０ｍｍｏｌ以下，粗生成物）のジクロロメタン溶液（４２ｍＬ）にメタノール（１．７０ｍＬ，４２．０ｍｍｏｌ）と１−（３−ジメチルアミノプロピル）−３−エチルカルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ・ＨＣｌ；９６６ｍｇ，５．０４ｍｍｏｌ）を順次添加し、０℃で１時間撹拌した。反応終了後に水を添加し、酢酸エチルで抽出した。有機層を水と飽和食塩水とで洗浄した後、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、溶媒を減圧留去した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ＳｉＯ２，酢酸エチル／ヘキサン＝３７％から５８％）により精製し、化合物３（１．４４ｇ，収率９０％，２工程）を白色固体として得た。【０１０５】
得られた化合物３の物性データを表１に示す。【０１０６】
【表１】
2020158910.tif 000022
【０１０７】
（１−３）化合物４の合成【０１０８】
【化２０】
2020158910.tif 000023
【０１０９】
窒素気流下、上記で得られた化合物３（４５５ｍｇ，１．１８ｍｍｏｌ）とチタンテトライソプロポキシド（Ｔｉ（ＯｉＰｒ）４；３５０μＬ，１．１８ｍｍｏｌ）のと無水テトラヒドロフラン溶液（１２ｍＬ）に、１．０Ｍのエチルマグネシウムブロミド（ＥｔＭｇＢｒ）のテトラヒドロフラン溶液（６．０ｍＬ，６．０ｍｍｏｌ）を０℃で２時間かけて滴下した。滴下後、反応溶液を室温まで加温し、さらに２時間撹拌した。反応終了後、飽和塩化アンモニウム水溶液を加えてセライト濾過を行い、濾液を酢酸エチルで抽出した。有機層を水と飽和食塩水とで洗浄した後、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、溶媒を減圧留去した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ＳｉＯ２，酢酸エチル／ヘキサン＝５０％から７１％）により精製し、化合物４（２５７ｍｇ，収率５７％）を白色固体として得た。【０１１０】
得られた化合物４の物性データを表２に示す。【０１１１】
【表２】
2020158910.tif 000024
【０１１２】
（１−４）化合物５の合成【０１１３】
【化２１】
2020158910.tif 000025
【０１１４】
窒素気流下、上記で得られた化合物４（５．００ｇ，１３．１ｍｍｏｌ）の無水ピリジン／テトラヒドロフラン混合溶液（＝１：４（容量比），５２０ｍＬ）に、４−メトキシトリチルクロリド（ＭＭＴｒＣｌ；１７．８ｇ，５７．６ｍｍｏｌ）と硝酸銀（９．６５ｇ，５６．８ｍｍｏｌ）とを順次添加し、５０℃で２１時間撹拌した。反応終了後、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液を添加してセライト濾過を行い、濾液を酢酸エチルで抽出した。有機層を飽和チオ硫酸ナトリウム水溶液で２回、水／飽和食塩水混合溶液（＝１：１（容量比））で１回洗浄した後、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、溶媒の減圧留去およびトルエン共沸を行った。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ＳｉＯ２，１％トリエチルアミン含有、酢酸エチル／ヘキサン＝２４％から４５％）により精製し、化合物５（６．７８ｇ，収率７９％）を黄色固体として得た。【０１１５】
得られた化合物５の物性データを表３に示す。【０１１６】
【表３】
2020158910.tif 000026
【０１１７】
（１−５）化合物６の合成【０１１８】
【化２２】
2020158910.tif 000027
【０１１９】
上記で得られた化合物５（２．６５ｇ，４．０５ｍｍｏｌ）のテトラヒドロフラン溶液（８１ｍＬ）に、１．０Ｍのテトラブチルアンモニウムフルオリド（ＴＢＡＦ）のテトラヒドロフラン溶液（４．５０ｍＬ，４．５０ｍｍｏｌ）を０℃で添加し、室温で１９時間撹拌した。反応終了後、反応液を減圧留去して水を添加し、酢酸エチルで抽出した。有機層を飽和食塩水で洗浄後、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、溶媒を減圧留去した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ＳｉＯ２，１％トリエチルアミン含有、酢酸エチル／ヘキサン＝８０％から１００％）により精製し、化合物６（２．０２ｇ，収率９２％）を白色固体として得た。【０１２０】
得られた化合物６の物性データを表４に示す。【０１２１】
【表４】
2020158910.tif 000028
【０１２２】
（１−６）化合物７の合成【０１２３】
【化２３】
2020158910.tif 000029
【０１２４】
窒素気流下、上記で得られた化合物６（１．９２ｇ，３．５６ｍｍｏｌ）の無水アセトニトリル溶液（３６ｍＬ）に、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ；１．８５ｍＬ，１０．８ｍｍｏｌ）と２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルホスホロクロリダート（ｉＰｒ２ＮＰ（Ｃｌ）ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＮ；１．２０ｍＬ，５．３４ｍｍｏｌ）を０℃で順次添加し、室温で３時間撹拌した。反応終了後に溶媒を減圧留去し、得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ＳｉＯ２，１％トリエチルアミン含有、酢酸エチル／ヘキサン＝３９％から６０％）により精製し、化合物７（１．９３ｇ，収率７３％）を白色固体として得た。【０１２５】
得られた化合物７の物性データを表５に示す。【０１２６】
【表５】
2020158910.tif 000030
【０１２７】
（実施例２：５’位修飾ヌクレオシドの合成（２））【０１２８】
【化２４】
2020158910.tif 000031
【０１２９】
（２−１）化合物８の合成【０１３０】
【化２５】
2020158910.tif 000032
【０１３１】
窒素気流下、上記で得られた化合物５（３．５９ｇ，５．４８ｍｍｏｌ）の無水アセトニトリル溶液（５５ｍＬ）に、トリエチルアミン（ＴＥＡ；１１．４ｍＬ，８２．２ｍｍｏｌ）、１，２，４−トリアゾール（５．７２ｇ，８２．８ｍｍｏｌ）、塩化ホスホリル（ＰＯＣｌ３；１．５０ｍＬ，１６．４ｍｍｏｌ）を０℃で順次添加し、室温で２時間撹拌した。次いで、１，４−ジオキサン（５５ｍＬ）と２８％アンモニア水（１６．４ｍＬ）とを添加し、室温で５時間撹拌した。反応終了後、反応液を減圧留去して水／飽和食塩水混合溶液（＝１：１（容量比））を添加し、酢酸エチルで抽出した。有機層を飽和食塩水で洗浄した後、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、溶媒を減圧留去した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ＳｉＯ２，１％トリエチルアミン含有、メタノール／クロロホルム＝０％から３％）により精製し、化合物８（３．３１ｇ，収率９２％）を淡黄色固体として得た。【０１３２】
得られた化合物８の物性データを表６に示す。【０１３３】
【表６】
2020158910.tif 000033
【０１３４】
（２−２）化合物９の合成【０１３５】
【化２６】
2020158910.tif 000034
【０１３６】
上記で得られた化合物８（３．２０ｇ，４．８９ｍｍｏｌ）の無水ピリジン溶液（５０ｍＬ）に、塩化ベンゾイル（ＢｚＣｌ；８５０μＬ，７．３４ｍｍｏｌ）を添加し、０℃で１．５時間撹拌した。反応終了後に水を添加し、酢酸エチルで抽出した。有機層を水で洗浄した後、溶媒の減圧留去およびトルエン共沸を行った。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ＳｉＯ２，１％トリエチルアミン含有、酢酸エチル／ヘキサン＝５％から２６％）により精製し、化合物９（２．９９ｇ，収率８１％）を白色固体として得た。【０１３７】
得られた化合物９の物性データを表７に示す。【０１３８】
【表７】
2020158910.tif 000035
【０１３９】
（２−３）化合物１０の合成【０１４０】
【化２７】
2020158910.tif 000036
【０１４１】
上記で得られた化合物９（２．９１ｇ，３．８４ｍｍｏｌ）のテトラヒドロフラン溶液（７７ｍＬ）に、１．０Ｍのテトラブチルアンモニウムフルオリド（ＴＢＡＦ）・テトラヒドロフラン溶液（４．２０ｍＬ，４．２０ｍｍｏｌ）を０℃で添加し、室温で２４時間撹拌した。反応終了後、反応液を減圧留去して水を添加し、酢酸エチルで抽出した。有機層を飽和食塩水で洗浄後、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、溶媒を減圧留去した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ＳｉＯ２，１％トリエチルアミン含有、酢酸エチル／ヘキサン＝２９％から７０％）により精製し、化合物１０（２．３８ｇ，収率９６％）を白色固体として得た。【０１４２】
得られた化合物１０の物性データを表８に示す。【０１４３】
【表８】
2020158910.tif 000037
【０１４４】
（２−４）化合物１１の合成【０１４５】
【化２８】
2020158910.tif 000038
【０１４６】
窒素気流下、上記で得られた化合物１０（２．２９ｇ，３．５６ｍｍｏｌ）の無水アセトニトリル溶液（３６ｍＬ）に、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＰＡ；１．８５ｍＬ，１０．８ｍｍｏｌ）と２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルホスホロクロリダート（ｉＰｒ２ＮＰ（Ｃｌ）ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＮ；１．２０ｍＬ，５．３４ｍｍｏｌ）を０℃で順次添加し、室温で３時間撹拌した。反応終了後に溶媒を減圧留去し、得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ＳｉＯ２，１％トリエチルアミン含有、酢酸エチル／ヘキサン＝２０％から４０％）により精製し、化合物１１（２．０８ｇ，収率６９％）を黄色固体として得た。【０１４７】
得られた化合物１１の物性データを表９に示す。【０１４８】
【表９】
2020158910.tif 000039
【０１４９】
（実施例３：５’位修飾ヌクレオシドの合成（３））【０１５０】
【化２９】
2020158910.tif 000040
【０１５１】
（３−１）化合物１３の合成【０１５２】
【化３０】
2020158910.tif 000041
【０１５３】
窒素気流下、Lomholtら、J. Org. Chem., 2001年,66巻,25号,8504-8512頁に記載の方法により作製した化合物１２（１１．７ｇ，３１．９ｍｍｏｌ）の無水ピリジン溶液（３２０ｍＬ）に、イミダゾール（１０．９ｇ，１６０ｍｍｏｌ）とｔｅｒｔ−ブチルジメチルクロロシラン（ＴＢＳＣｌ；２４．２ｇ，１６１ｍｍｏｌ）を室温で順次添加した。１７時間の加熱還流後、イミダゾール（２．１６ｇ，３１．７ｍｍｏｌ）とｔｅｒｔ−ブチルジメチルクロロシラン（ＴＢＳＣｌ；４．８９ｇ，３２．４ｍｍｏｌ）を再度添加し、３時間加熱還流した。反応終了後に水を添加し、ピリジン溶媒を減圧留去した後、酢酸エチルで抽出した。有機層を水で洗浄した後、溶媒の減圧留去およびトルエン共沸を行った。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ＳｉＯ２，酢酸エチル／ヘキサン＝３０％，次いで６０％）により精製し、化合物１３（１７．６ｇ，収率９３％）を白色固体として得た。【０１５４】
得られた化合物１３の物性データを表１０に示す。【０１５５】
【表１０】
2020158910.tif 000042
【０１５６】
（３−２）化合物１４の合成【０１５７】
【化３１】
2020158910.tif 000043
【０１５８】
上記で得られた化合物１３（１７．６ｇ，２９．６ｍｍｏｌ）のテトラヒドロフラン溶液（３５５ｍＬ）に、トリフルオロ酢酸／水混合溶液（＝１：１（容量比），１７８ｍＬ）を添加し、０℃で６時間撹拌した。反応溶液を飽和炭酸水素ナトリウム水溶液へ滴下し、酢酸エチルで抽出した。有機層を飽和食塩水で洗浄した後、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、溶媒を減圧留去した。得られた残渣を再結晶（ヘキサン／酢酸エチル）にて精製した他、残りの濾液をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ＳｉＯ２，メタノール／クロロホルム＝０％から８％）により精製し、化合物１４（１３．９ｇ，定量的）を白色固体として得た。【０１５９】
得られた化合物１４の物性データを表１１に示す。【０１６０】
【表１１】
2020158910.tif 000044
【０１６１】
（３−３）化合物１５の合成【０１６２】
【化３２】
2020158910.tif 000045
【０１６３】
上記で得られた化合物１４（１２．９ｇ，２７．０ｍｍｏｌ）のジクロロメタン溶液（２７０ｍＬ）に、アセトニトリル／水（＝１：１（容量比），１．４８ｍＬ）とヨードベンゼンジアセタート（ＰｈＩ（ＯＡｃ）２；４３．４ｇ，１３４．８ｍｍｏｌ）と２，２，６，６−テトラメチルピペリジン１−オキシルフリーラジカル（ＴＥＭＰＯ；１．２９ｇ，８．５９ｍｍｏｌ）を０℃で順次添加し、室温で３時間撹拌した。反応終了後にメタノール（３０ｍＬ）を添加し、２０分間室温で撹拌し、溶媒の減圧留去およびトルエン共沸を行った。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ＤＩＯＬ−ＳｉＯ２，メタノール／クロロホルム＝０％から２０％）により精製した。また、精製しきれなかった粗生成物をトリチュレーション（酢酸エチル／ヘキサン）により精製し、化合物１５（１１．０ｇ，収率８３％）を白色固体として得た。【０１６４】
得られた化合物１５の物性データを表１２に示す。【０１６５】
【表１２】
2020158910.tif 000046
【０１６６】
（３−４）化合物１６の合成【０１６７】
【化３３】
2020158910.tif 000047
【０１６８】
窒素気流下、上記で得られた化合物１５（１１．０ｇ，２２．３ｍｍｏｌ）の１，２−ジクロロエタン溶液（２２０ｍＬ）に、１−（３−ジメチルアミノプロピル）−３−エチルカルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ・ＨＣｌ；８．５６ｇ，４４．７ｍｍｏｌ）を室温で添加し、５０℃で２時間撹拌した。原料消失後、無水メタノール（２２０ｍＬ）を添加し、さらに６０℃で５時間撹拌した。反応終了後、反応液を減圧留去して水を添加し、クロロホルムで抽出した。有機層を水と飽和食塩水で洗浄した後、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、溶媒を減圧留去した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ＳｉＯ２，メタノール／クロロホルム＝０％から４％）により精製し、化合物１６（８．５３ｇ，収率７５％）を白色固体として得た。【０１６９】
得られた化合物１６の物性データを表１３に示す。【０１７０】
【表１３】
2020158910.tif 000048
【０１７１】
（３−５）化合物１７の合成【０１７２】
【化３４】
2020158910.tif 000049
【０１７３】
窒素気流下、上記で得られた化合物１６（５１４ｍｇ，１．０１ｍｍｏｌ）とチタンテトライソプロポキシド（Ｔｉ（ＯｉＰｒ）４；３００μＬ，１．０１ｍｍｏｌ）の無水テトラヒドロフラン溶液（１０ｍＬ）に、１．０Ｍのエチルマグネシウムブロミド（ＥｔＭｇＢｒ）・テトラヒドロフラン溶液（８．１ｍＬ，８．１ｍｍｏｌ）を０℃で２．５時間掛けて滴下した。滴下後、反応溶液を室温まで加温し、さらに３時間撹拌した。反応終了後、飽和塩化アンモニウム水溶液を添加してセライト濾過を行い、濾液を酢酸エチルで抽出した。有機層を水と飽和食塩水で洗浄後、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、溶媒を減圧留去した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ＮＨ２−ＳｉＯ２，メタノール／クロロホルム＝０％から２％，次いで５％）により精製し、化合物１７（１１４ｍｇ，２２％）を黄色固体として得た。【０１７４】
得られた化合物１７の物性データを表１４に示す。【０１７５】
【表１４】
2020158910.tif 000050
【０１７６】
（３−６）化合物１８の合成【０１７７】
【化３５】
2020158910.tif 000051
【０１７８】
窒素気流下、上記で得られた化合物１７（１．５９ｇ，３．１４ｍｍｏｌ）の無水ピリジン／テトラヒドロフラン混合溶液（＝１：４（容量比），１２５ｍＬ）に、４−メトキシトリチルクロリド（ＭＭＴｒＣｌ；４．３０ｇ，１３．９ｍｍｏｌ）と硝酸銀（２．２９ｇ，１３．５ｍｍｏｌ）を順次添加し、５０℃で２時間撹拌した。反応終了後、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液を添加してセライト濾過を行い、濾液を酢酸エチルで抽出した。有機層を飽和チオ硫酸ナトリウム水溶液で２回、水／飽和食塩水混合溶液（＝１：１（容量比））で１回洗浄した後、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、溶媒の減圧留去およびトルエン共沸を行った。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ＮＨ２−ＳｉＯ２，メタノール／クロロホルム＝０％から２％）により精製し、化合物１８（２．０８ｇ，収率８５％）を黄色固体として得た。【０１７９】
得られた化合物１８の物性データを表１５に示す。【０１８０】
【表１５】
2020158910.tif 000052
【０１８１】
（３−７）化合物１９の合成【０１８２】
【化３６】
2020158910.tif 000053
【０１８３】
上記で得られた化合物１８（２．０１ｇ，２．５９ｍｍｏｌ）のテトラヒドロフラン溶液（５２ｍＬ）に、１．０Ｍのテトラブチルアンモニウムフルオリド（ＴＢＡＦ）・テトラヒドロフラン溶液（２．９０ｍＬ，２．９０ｍｍｏｌ）を０℃で添加し、室温で１時間撹拌した。反応終了後、反応液を減圧留去して水を添加し、酢酸エチルで抽出した。有機層を水と飽和食塩水で洗浄した後、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、溶媒を減圧留去した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ＮＨ２−ＳｉＯ２，メタノール／クロロホルム＝０％から７％）により精製し、さらに水による分液精製を行って、化合物１９（１．５３ｇ，８９％）を淡黄色固体として得た。【０１８４】
得られた化合物１９の物性データを表１６に示す。【０１８５】
【表１６】
2020158910.tif 000054
【０１８６】
（３−８）化合物２０の合成【０１８７】
【化３７】
2020158910.tif 000055
【０１８８】
窒素気流下、上記で得られた化合物１９（７３３ｍｇ，１．１１ｍｍｏｌ）の脱酸素ジクロロメタン溶液（１１ｍＬ）に、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ；１．５ｍＬ，８．７７ｍｍｏｌ）と２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルホスホロクロリダート（ｉＰｒ２ＮＰ（Ｃｌ）ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＮ；１．０ｍＬ，４．４８ｍｍｏｌ）を０℃で順次添加し、室温で３．５時間撹拌した。反応終了後に溶媒を減圧留去し、得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ＳｉＯ２，ヘキサン：酢酸エチル：メタノール＝１５：１５：１（容量比））により精製した後、再びシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ＮＨ２−ＳｉＯ２，メタノール／クロロホルム＝０％から３％）を行った。最終的に再沈殿（酢酸エチル／ヘキサン）を行うことにより、化合物２０（６２６ｍｇ，収率７２％）を白色固体として得た。【０１８９】
得られた化合物２０の物性データを表１７に示す。【０１９０】
【表１７】
2020158910.tif 000056
【０１９１】
（実施例４：５’位修飾ヌクレオシドの合成（４））【０１９２】
【化３８】
2020158910.tif 000057
【０１９３】
（４−１）化合物２２の合成【０１９４】
【化３９】
2020158910.tif 000058
【０１９５】
Lomholtら、J. Org. Chem., 2001年,66巻,25号,8504-8512頁に記載の方法により作製した化合物２１（２９５ｍｇ，０．７７ｍｍｏｌ）のジクロロメタン溶液（７．７ｍＬ）に、アセトニトリル／水（＝  １：１（容量比），４２．２μＬ）とヨードベンゼンジアセタート（ＰｈＩ（ＯＡｃ）２；５４８ｍｇ，１．７０ｍｍｏｌ）と２，２，６，６−テトラメチルピペリジン１−オキシルフリーラジカル（ＴＥＭＰＯ；３７ｍｇ，０．２４ｍｍｏｌ）を０℃で順次添加し、室温で１４時間撹拌した。反応終了後にメタノール（７．７ｍＬ）を添加し、１５分間室温で撹拌し、溶媒の減圧留去を行った。得られた残渣をトリチュレーション（酢酸エチル／ヘキサン）により精製し、化合物２２（２４０ｍｇ，収率７８％）を白色固体として得た。【０１９６】
得られた化合物２２の物性データを表１８に示す。【０１９７】
【表１８】
2020158910.tif 000059
【０１９８】
（４−２）化合物２３の合成【０１９９】
【化４０】
2020158910.tif 000060
【０２００】
窒素気流下、上記で得られた化合物２２（１８８ｍｇ，０．４７ｍｍｏｌ）の１，２−ジクロロエタン溶液（４．７ｍＬ）に、１−（３−ジメチルアミノプロピル）−３−エチルカルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ・ＨＣｌ；１８９ｍｇ，０．９９ｍｍｏｌ）を室温で添加し、５０℃で１．５時間撹拌した。原料消失後、無水メタノール（４．７ｍＬ）を添加し、さらに６０℃で２．５時間撹拌した。反応終了後、反応液を減圧留去して水を添加し、酢酸エチルで抽出した。有機層を水と飽和食塩水で洗浄した後、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、溶媒を減圧留去した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ＳｉＯ２，酢酸エチル／ヘキサン＝４０％から６５％）により精製し、化合物２３（１３５ｍｇ，収率６９％）を白色固体として得た。【０２０１】
得られた化合物２３の物性データを表１９に示す。【０２０２】
【表１９】
2020158910.tif 000061
【０２０３】
（４−３）化合物２４の合成【０２０４】
【化４１】
2020158910.tif 000062
【０２０５】
窒素気流下、上記で得られた化合物２３（８．５６ｇ，２０．８ｍｍｏｌ）とチタンテトライソプロポキシド（Ｔｉ（ＯｉＰｒ）４；６．１５ｍＬ，２０．８ｍｍｏｌ）の無水テトラヒドロフラン溶液（２０８ｍＬ）に、１．０Ｍのエチルマグネシウムブロミド（ＥｔＭｇＢｒ）・テトラヒドロフラン溶液（１０６ｍＬ，１０６ｍｍｏｌ）を０℃で２．５時間かけて滴下した。滴下後、反応溶液を室温まで加温し、さらに３時間撹拌した。反応終了後、飽和塩化アンモニウム水溶液を添加してセライト濾過を行い、濾液を酢酸エチルで抽出した。有機層を水と飽和食塩水で洗浄した後、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、溶媒を減圧留去した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ＳｉＯ２，酢酸エチル／ヘキサン＝５０％から８０％）により精製し、化合物２４（３．０１ｇ，収率３５％）を淡黄色固体として得た。【０２０６】
得られた化合物２４の物性データを表２０に示す。【０２０７】
【表２０】
2020158910.tif 000063
【０２０８】
（４−４）化合物２５の合成【０２０９】
【化４２】
2020158910.tif 000064
【０２１０】
窒素気流下、上記で得られた化合物２４（２．８４ｇ，６．９２ｍｍｏｌ）の無水ピリジン／テトラヒドロフラン混合溶液（＝１：４（容量比），２７６ｍＬ）に、４−メトキシトリチルクロリド（ＭＭＴｒＣｌ；９．４０ｇ，３０．４ｍｍｏｌ）と硝酸銀（５．０５ｇ，２９．７ｍｍｏｌ）を順次添加し、５０℃で４．５時間撹拌した。反応終了後、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液を添加してセライト濾過を行い、濾液を酢酸エチルで抽出した。有機層を飽和チオ硫酸ナトリウム水溶液で２回、水／飽和食塩水混合溶液（＝１：１（容量比））で１回、飽和食塩水で１回洗浄した後、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、溶媒の減圧留去およびトルエン共沸を行った。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ＮＨ２−ＳｉＯ２，酢酸エチル／ヘキサン＝６０％から１００％，次いでメタノール／酢酸エチル＝２％）により精製し、再びシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ＮＨ２−ＳｉＯ２，メタノール／クロロホルム＝０％から１％）を行うことにより、化合物２５（１．７０ｇ，収率３６％）を黄色固体として得た。【０２１１】
得られた化合物２５の物性データを表２１に示す。【０２１２】
【表２１】
2020158910.tif 000065
【０２１３】
（４−５）化合物２６の合成【０２１４】
【化４３】
2020158910.tif 000066
【０２１５】
上記で得られた化合物２５（７３１ｍｇ，１．０７ｍｍｏｌ）のテトラヒドロフラン溶液（２１ｍＬ）に、１．０Ｍのテトラブチルアンモニウムフルオリド（ＴＢＡＦ）・テトラヒドロフラン溶液（１．１５ｍＬ，１．１５ｍｍｏｌ）を０℃で添加し、室温で１時間撹拌した。反応終了後、反応液を減圧留去して水を添加し、酢酸エチルで抽出した。有機層を飽和食塩水で洗浄した後、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、溶媒を減圧留去した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ＳｉＯ２，メタノール／クロロホルム＝０％から５％）により精製し、化合物２６（５９２ｍｇ，収率９７％）を淡黄色固体として得た。【０２１６】
得られた化合物２６の物性データを表２２に示す。【０２１７】
【表２２】
2020158910.tif 000067
【０２１８】
（４−６）化合物２７の合成【０２１９】
【化４４】
2020158910.tif 000068
【０２２０】
窒素気流下、上記で得られた化合物２６（５４０ｍｇ，０．９５ｍｍｏｌ）の無水アセトニトリル溶液（９．５ｍＬ）に、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ；４９０μＬ，２．８７ｍｍｏｌ）と２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルホスホロクロリダート（ｉＰｒ２ＮＰ（Ｃｌ）ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＮ；３２０μＬ，１．４３ｍｍｏｌ）を０℃で順次添加し、室温で４時間撹拌した。反応終了後に溶媒を減圧留去し、得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ＳｉＯ２，酢酸エチル／ヘキサン＝５０％から７７％）により精製した。最終的に再沈殿（クロロホルム／ヘキサン）を行うことにより、化合物２７（５６２ｍｇ，収率７７％）を白色固体として得た。【０２２１】
得られた化合物２７の物性データを表２３に示す。【０２２２】
【表２３】
2020158910.tif 000069
【０２２３】
（実施例５：５’位修飾ヌクレオシドの合成（５））【０２２４】
【化４５】
2020158910.tif 000070
【０２２５】
（５−１）化合物２５ａの合成【０２２６】
【化４６】
2020158910.tif 000071
【０２２７】
窒素気流下、上記で得られた化合物２５（８３８ｍｇ，１．２３ｍｍｏｌ）とトリエチルアミン（２．６ｍＬ，１８．７ｍｍｏｌ）と１，２，４―トリアゾール（１．２８ｇ，１８．５ｍｍｏｌ）と無水アセトニトリル溶液（１２．５ｍＬ）との混合溶液に、塩化ホスホリル（３４０μＬ，３．７３ｍｍｏｌ）を０℃で添加した。室温で４０分間撹拌した後、反応溶液に１，４―ジオキサン（１２．５ｍＬ）と２８％アンモニア水３．７ｍＬ）とを続けて添加し、室温で４時間撹拌した。反応終了後、反応液を減圧留去した。残渣を酢酸エチルで希釈し、水／飽和食塩水（１：１）と飽和食塩水で洗浄後、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、溶媒を減圧留去した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ＳｉＯ２，メタノール／クロロホルム＝０％から３％）により精製し、化合物２５ａ（７８８ｍｇ，９４％）を淡黄色固体として得た。【０２２８】
得られた化合物２５ａの物性データを表２４に示す。【０２２９】
【表２４】
2020158910.tif 000072
【０２３０】
（５−２）化合物２６ａの合成【０２３１】
【化４７】
2020158910.tif 000073
【０２３２】
窒素気流下、上記で得られた化合物２５ａ（７２８ｍｇ，１.０７ｍｍｏｌ）の無水ピリジン溶液（１０.７ｍＬ）に塩化ベンゾイル（１９０μＬ，１.６４ｍｍｏｌ）を０℃で添加し、０℃で４０分間撹拌した。反応終了後、水を添加し、酢酸エチルで抽出した。有機層を水で洗浄した後、溶媒を減圧留去およびトルエン共沸した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ＳｉＯ２，酢酸エチル／ヘキサン＝４％から２５％）により精製し、化合物２６ａ（６６４ｍｇ，７９％）を白色固体として得た。【０２３３】
得られた化合物２６ａの物性データを表２５に示す。【０２３４】
【表２５】
2020158910.tif 000074
【０２３５】
（５−３）化合物２７ａの合成【０２３６】
【化４８】
2020158910.tif 000075
【０２３７】
上記で得られた化合物２６ａ（６１１ｍｇ，０.７８ｍｍｏｌ）のテトラヒドロフラン溶液（８５０μＬ，０.８５ｍｍｏｌ）に、１．０Ｍのテトラブチルアンモニウムフルオリド（ＴＢＡＦ）のテトラヒドロフラン溶液（８５５μＬ，０.８６ｍｍｏｌ）を０℃で添加し、室温で１時間撹拌した。反応終了後、反応溶液を減圧留去し、酢酸エチルで希釈した。溶液を水と飽和食塩水で洗浄した後、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、溶媒を減圧留去した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ＳｉＯ２，酢酸エチル／ヘキサン＝３０％から５０％）により精製し、化合物２７ａ（４６４ｍｇ，８９％）を白色固体として得た。【０２３８】
得られた化合物２７ａの物性データを表２６に示す。【０２３９】
【表２６】
2020158910.tif 000076
【０２４０】
（５−４）化合物２８の合成【０２４１】
【化４９】
2020158910.tif 000077
【０２４２】
窒素気流下、上記で得られた化合物２７ａ（４１０ｍｇ，０.６１ｍｍｏｌ）の無水アセトニトリル溶液（６.１ｍＬ）にＮ，Ｎ―ジイソプロピルエチルアミン（４２０μＬ，２.４６ｍｍｏｌ）と２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルホスホロクロリダート（２７０μＬ，１.２１ｍｍｏｌ）を０℃で添加し、室温で３時間撹拌した。反応終了後、反応溶液を減圧留去した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ＳｉＯ２，酢酸エチル／ヘキサン＝２０％から４１％）により精製し、化合物２８（２３６ｍｇ，４４％）を白色固体として得た。【０２４３】
得られた化合物２８の物性データを表２７に示す。【０２４４】
【表２７】
2020158910.tif 000078
【０２４５】
（実施例６：５’位修飾ヌクレオシドの合成（６））【０２４６】
【化５０】
2020158910.tif 000079
【０２４７】
（６−１）化合物３０の合成【０２４８】
【化５１】
2020158910.tif 000080
【０２４９】
公知の方法（Ｓｕｚｕｋｉら、Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ，  ２０１１年，１２巻，５号，１４４９−１４５９頁）より得られた化合物２９（１．６０ｇ，３．４１ｍｍｏｌ）のジクロロメタン溶液（１７ｍＬ）にヨードベンゼンジアセテート（２．４１ｇ；７．４８ｍｍｏｌ）と２，２，６，６−テトラメチルピペリジン１−オキシルフリーラジカル（１２３ｍｇ；０．７９ｍｍｏｌ）とを０℃で順次添加し、室温で２時間撹拌した後、アセトニトリル／水（＝１：１（容量比），２００μＬ）を添加し、さらに室温で１２時間撹拌した。反応終了後に過剰量のメタノールを添加し、１０分間室温で撹拌し、溶媒の減圧留去およびトルエン共沸を行って、黄色固体の化合物３０を得た。この化合物３０を精製することなく即座に次の反応に用いた。【０２５０】
（６−２）化合物３１の合成【０２５１】
【化５２】
2020158910.tif 000081
【０２５２】
上記で得られた化合物３０のジクロロメタン溶液（１７ｍＬ）にメタノール（１．５０ｍＬ，３６ｍｍｏｌ）と１−（３−ジメチルアミノプロピル）−３−エチルカルボジイミド塩酸塩（１．５７ｇ，８．２ｍｍｏｌ）を順次添加し、０℃で３時間撹拌した。反応終了後に水を添加し、酢酸エチルで抽出した。有機層を水と飽和食塩水とで洗浄した後、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、溶媒を減圧留去した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ＳｉＯ２，ヘキサン／酢酸エチル＝５０％）により精製し、化合物３１（１．２１ｇ，収率７１％，２工程）を白色固体として得た。【０２５３】
得られた化合物３１の物性データを表２８に示す。【０２５４】
【表２８】
2020158910.tif 000082
【０２５５】
（６−３）化合物３２の合成【０２５６】
【化５３】
2020158910.tif 000083
【０２５７】
窒素気流下、上記で得られた化合物３１（５．９８ｇ，１２．０ｍｍｏｌ）とチタンテトライソプロポキシド（４．０ｍＬ，１５ｍｍｏｌ）の無水テトラヒドロフラン溶液（１２０ｍＬ）に、１．０Ｍのエチルマグネシウムブロミドのテトラヒドロフラン溶液（６０ｍＬ，６０ｍｍｏｌ）を０℃で１５分かけて滴下した。滴下後、反応溶液を室温まで加温し、さらに５時間撹拌した。反応終了後、飽和塩化アンモニウム水溶液を加えてセライト濾過を行い、濾液を酢酸エチルで抽出した。有機層を水と飽和食塩水とで洗浄した後、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、溶媒を減圧留去した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ＳｉＯ２，アセトン／クロロホルム＝１０％から１５％）により精製し化合物３２（１．４０ｇ，収率２３％）を黄色固体として得た。【０２５８】
得られた化合物３２の物性データを表２９に示す。【０２５９】
【表２９】
2020158910.tif 000084
【０２６０】
（６−４）化合物３３の合成【０２６１】
【化５４】
2020158910.tif 000085
【０２６２】
窒素気流下、上記で得られた化合物３２（８９０ｍｇ，１．８ｍｍｏｌ）の無水ピリジン／テトラヒドロフラン混合溶液（＝１：４（容量比），７０ｍＬ）に、４−メトキシトリチルクロリド（２．９ｇ，９４ｍｍｏｌ）と硝酸銀（１．４ｇ，８．３ｍｍｏｌ）とを順次添加し、５０℃で６時間撹拌した。反応終了後、飽和炭酸水素ナトリウムを添加してセライト濾過を行い、濾液を酢酸エチルで抽出した。有機層を水と飽和食塩水とで洗浄した後、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、溶媒を減圧留去した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ＳｉＯ２，１％トリエチルアミン含有、酢酸エチル／ヘキサン＝１００％→メタノール／クロロホルム＝０％→１０％）により精製し、化合物３３（８４９ｍｇ，収率６２％）を黄色固体として得た。【０２６３】
得られた化合物３３の物性データを表３０に示す。【０２６４】
【表３０】
2020158910.tif 000086
【０２６５】
（６−５）化合物３４の合成【０２６６】
【化５５】
2020158910.tif 000087
【０２６７】
上記で得られた化合物３３（７８３ｍｇ，１．０ｍｍｏｌ）のテトラヒドロフラン溶液（２４ｍＬ）に１．０Ｍのテトラブチルアンモニウムフルオリド（ＴＢＡＦ）のテトラヒドロフラン溶液（２．４０ｍＬ，２．４０ｍｍｏｌ）を０℃で添加し、室温で１２時間撹拌した。反応終了後、反応液を減圧留去して水を添加し、酢酸エチルで抽出した。有機層を飽和食塩水で洗浄後、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、溶媒を減圧留去した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ＳｉＯ２，１％トリエチルアミン含有，アセトン／クロロホルム＝２０％から２５％により精製し、化合物３４（５７４ｍｇ，収率８６％）を白色固体として得た。【０２６８】
得られた化合物３４の物性データを表３１に示す。【０２６９】
【表３１】
2020158910.tif 000088
【０２７０】
（６−６）化合物３５の合成【０２７１】
【化５６】
2020158910.tif 000089
【０２７２】
窒素気流下、上記で得られた化合物３４（９８ｍｇ，０．１５ｍｍｏｌ）を無水アセトニトリル溶媒（１．５ｍＬ）にＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ；８０μＬ）と２−シアノエチルＮ，Ｎ−ジイソプロピルホスホクロリダート（ｉＰｒ２ＮＰ（Ｃｌ）ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＮ；５５μＬ）を順次添加し、室温で３時間撹拌した。反応終了後に溶媒を減圧留去し、得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ＳｉＯ２，酢酸エチル／ヘキサン＝１５０％）により精製を行った。最終的に再沈殿（酢酸エチル／ヘキサン）を行うことにより、化合物３５（８８ｍｇ，収率６９％）を白色固体として得た。【０２７３】
得られた化合物３５の物性データを表３２に示す。【０２７４】
【表３２】
2020158910.tif 000090
【０２７５】
（実施例７：５’位修飾ヌクレオシドの合成（７））【０２７６】
【化５７】
2020158910.tif 000091
【０２７７】
（７−１）化合物３７の合成【０２７８】
【化５８】
2020158910.tif 000092
【０２７９】
公知の方法（Ｗｅｘｓｅｌｌｂｌａｔｔら、Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，２０１０年，１８巻，１２号，４４８５−４４９７頁）により得られた化合物３６（２８．３ｇ，６３ｍｍｏｌ）のジクロロメタン溶液（３００ｍＬ）にヨードベンゼンジアセテート（４４．８ｇ，１４０ｍｍｏｌ）と２，２，６，６−テトラメチルピペリジン１−オキシルフリーラジカル（２．５ｇ，１６ｍｍｏｌ）とを０℃で順次添加し、室温で２時間撹拌した後、アセトニトリル／水（＝１：１（容量比），８．０ｍＬ）を添加し、さらに室温で１４時間撹拌した。反応終了後に過剰量のメタノールを加え、１０分間室温で撹拌し、溶媒の減圧留去およびトルエン共沸を行って、黄色個体の化合物３７を得た。この化合物３７を精製することなく即座に次の反応に用いた。【０２８０】
（７−２）化合物３８の合成【０２８１】
【化５９】
2020158910.tif 000093
【０２８２】
上記で得られた化合物３７のジクロロメタン溶液（４０ｍＬ）にメタノール（３０ｍＬ，７４０ｍｍｏｌ）と１−（３−ジメチルアミノプロピル）−３−エチルカルボジイミド塩酸塩（１９ｇ，９９ｍｍｏｌ）を順次添加し、０℃で２時間撹拌した。反応終了後に水を添加し、酢酸エチルで抽出した。有機層を水と飽和食塩水とで洗浄した後、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、溶媒を減圧留去した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ＳｉＯ２，メタノール／クロロホルム＝１０％）により精製し、化合物３８（２２．２ｇ，収率７４％，２工程）を白色固体として得た。【０２８３】
得られた化合物３８の物性データを表３３に示す。【０２８４】
【表３３】
2020158910.tif 000094
【０２８５】
（７−３）化合物３９の合成【０２８６】
【化６０】
2020158910.tif 000095
【０２８７】
窒素気流下、上記で得られた化合物３８（６．０２ｇ，１２ｍｍｏｌ）とチタンテトライソプロポキシド（４．０ｍＬ，１４．７ｍｍｏｌ）の無水テトラヒドロフラン溶液に１．０Ｍのエチルマグネシウムブロミドのテトラヒドロフラン溶液（６０ｍＬ，６０ｍｍｏｌ）を０℃で１５分かけて滴下した。滴下後、反応溶液を室温まで加温し、さらに７時間撹拌した。反応終了後、飽和塩化アンモニウム水溶液を加えてセライト濾過を行い、濾液を酢酸エチルで抽出した。有機層を水と飽和食塩水とで洗浄した後、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、溶媒を減圧留去した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ＳｉＯ２，アセトン／クロロホルム＝２０％から２５％）により精製し化合物３９（２．０８ｇ，収率３５％）を黄色固体として得た。【０２８８】
得られた化合物３９の物性データを表３４に示す。【０２８９】
【表３４】
2020158910.tif 000096
【０２９０】
（７−３）化合物４０の合成【０２９１】
【化６１】
2020158910.tif 000097
【０２９２】
窒素気流下、上記で得られた化合物３９（２５６ｍｇ，０．５４ｍｍｏｌ）とレブリン酸（９３７ｍｇ，８．１ｍｍｏｌ）の無水ジクロロメタン溶液（１２．５ｍＬ）に１−（３−ジメチルアミノプロピル）−３−エチルカルボジイミド塩酸塩（５２４ｍｇ，２．７ｍｍｏｌ）、Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノピリジン（９３ｍｇ，０．７２ｍｍｏｌ）、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（５６０μＬ，３．２ｍｍｏｌ）を順次添加し、２５時間撹拌した。反応終了後に水を添加し、反応液をクロロホルムで抽出した。有機層を水と飽和食塩水とで洗浄した後、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、溶媒を減圧留去した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ＳｉＯ２，アセトン／クロロホルム＝２０％およびメタノール／クロロホルム＝１０％）により精製し、化合物４０（２３９ｍｇ，収率７８％）を茶色固体として得た。【０２９３】
得られた化合物４０の物性データを表３５に示す。【０２９４】
【表３５】
2020158910.tif 000098
【０２９５】
（７−４）化合物４１の合成【０２９６】
【化６２】
2020158910.tif 000099
【０２９７】
上記で得られた化合物４０（１４８ｍｇ，０．２６ｍｍｏｌ）のテトラヒドロフラン溶液（５．０ｍＬ）に１．０Ｍのテトラブチルアンモニウムフルオリド（ＴＢＡＦ）のテトラヒドロフラン溶液（３５０μＬ，０．３５ｍｍｏｌ）を０℃で添加し、室温で１６時間撹拌した。反応終了後、反応液を減圧留去して水を添加し、酢酸エチルで抽出した。有機層を飽和食塩水で洗浄後、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、溶媒を減圧留去した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ＳｉＯ２，メタノール／クロロホルム＝１０％）により精製し、化合物４１（７４ｍｇ，収率６２％）を白色固体として得た。【０２９８】
得られた化合物４１の物性データを表３６に示す。【０２９９】
【表３６】
2020158910.tif 000100
【０３００】
（７−５）化合物４２の合成【０３０１】
【化６３】
2020158910.tif 000101
【０３０２】
窒素気流下、上記で得られた化合物４１（６７ｍｇ，０．１５ｍｍｏｌ）を無水アセトニトリル溶媒（４４０μＬ）にＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ；７５μＬ）と２−シアノエチルＮ，Ｎ−ジイソプロピルホスホクロリダート（ｉＰｒ２ＮＰ（Ｃｌ）ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＮ；６５μＬ）を順次添加し、室温で３時間撹拌した。反応終了後に溶媒を減圧留去し、得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ＳｉＯ２，酢酸エチル／ヘキサン＝７５％から１００％、そしてメタノール／クロロホルム５％）により精製を行った。最終的に再沈殿（酢酸エチル／ヘキサン）を行うことにより、化合物４２（７０ｍｇ，収率７３％）を白色固体として得た。【０３０３】
得られた化合物４２の物性データを表３７に示す。【０３０４】
【表３７】
2020158910.tif 000102
【０３０５】
（実施例８：５’位修飾ヌクレオシドの合成（８））【０３０６】
【化６４】
2020158910.tif 000103
【０３０７】
（８−１）化合物４４の合成【０３０８】
【化６５】
2020158910.tif 000104
【０３０９】
窒素気流下、化合物４３（４０３ｍｇ，１．４ｍｍｏｌ）の無水ピリジン溶液（１７ｍｌ）に、イミダゾール（５７６ｍｇ，８．５ｍｍｏｌ）とｔｅｒｔ−ブチルジメチルクロロシラン（１．３ｇ，８．５ｍｍｏｌ）を室温で順次添加し、１２．５時間加熱還流した。反応終了後に水および飽和炭酸水素ナトリウム水溶液を添加し、ピリジン溶媒を減圧留去した後、酢酸エチルで抽出した。有機層を水と飽和食塩水とで洗浄した後、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、溶媒を減圧留去およびトルエン共沸をし、粗生成物として化合物４４（８０６ｍｇ）を得た。この化合物４４を精製することなく、次の反応に用いた。なお、解析用に一部をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ＳｉＯ２，酢酸エチル／ヘキサン＝３０％から６０％）により精製した。【０３１０】
得られた化合物４４の物性データを表３８に示す。【０３１１】
【表３８】
2020158910.tif 000105
【０３１２】
（８−２）化合物４５の合成【０３１３】
【化６６】
2020158910.tif 000106
【０３１４】
上記で得られた化合物４４のピリジン溶液（８．５ｍｌ）に、塩化ベンゾイル（３９０μｌ，３．４ｍｍｏｌ）を０℃で添加し、７０℃で１２．５時間撹拌した。反応終了後に飽和炭酸水素ナトリウム水溶液を０℃で添加し、酢酸エチルで抽出した。有機層を水と飽和食塩水とで洗浄した後、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、溶媒を減圧留去した。その後テトラヒドロフラン（１７ｍｌ）を添加し、アンモニア水溶液（１．７ｍｌ）を０℃で添加し、４０℃で３時間撹拌した。反応終了後に溶媒を減圧留去し、粗生成物として化合物４５（８２５ｍｇ）を得た。この化合物を精製することなく、次の反応に用いた。なお、解析用に一部をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ＳｉＯ２，酢酸エチル／ヘキサン＝３０％から５０％）により精製した。【０３１５】
得られた化合物４５の物性データを表３９に示す。【０３１６】
【表３９】
2020158910.tif 000107
【０３１７】
（８−３）化合物４６の合成【０３１８】
【化６７】
2020158910.tif 000108
【０３１９】
上記で得られた化合物４５のテトラヒドロフラン溶液（４１ｍｌ）に、トリフルオロ酢酸／水（＝１：１（容量比），２０ｍｌ）を０℃で添加し、５時間撹拌した。反応終了後に飽和炭酸水素ナトリウム水溶液を０℃で添加し、酢酸エチルで抽出した。有機層を水と飽和食塩水とで洗浄した後、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、溶媒を減圧留去した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ＳｉＯ２，メタノール／クロロホルム＝０％から３％）により精製し、化合物４６（４２５ｍｇ，５０％，３工程）を黄色固体として得た。【０３２０】
得られた化合物４６の物性データを表４０に示す。【０３２１】
【表４０】
2020158910.tif 000109
【０３２２】
（８−４）化合物４７の合成【０３２３】
【化６８】
2020158910.tif 000110
【０３２４】
上記で得られた化合物４６（３３６ｍｇ，０．６８ｍｍｏｌ）のジクロロメタン溶液（６．８ｍＬ）に、アセトニトリル／水（＝１：１（容量比），３７μＬ）とヨードベンゼンジアセテート（１．１ｇ，３．４ｍｍｏｌ）を順次添加後、２，２，６，６−テトラメチルピペリジン１−オキシルフリーラジカル（３４ｍｇ，０．２２ｍｍｏｌ）を０℃で添加し、室温で２．５時間撹拌した。反応終了後にメタノール（０．７５ｍｌ）を添加し、２０分間室温で撹拌し、溶媒の減圧留去およびトルエン共沸をし、粗生成物として化合物４７を得た。この化合物を精製することなく次の反応に用いた。なお、解析用に一部をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ＳｉＯ２，酢酸エチル／ヘキサン＝３０％から５０％）により精製した。【０３２５】
得られた化合物４７の物性データを表４１に示す。【０３２６】
【表４１】
2020158910.tif 000111
【０３２７】
（８−５）化合物４８の合成【０３２８】
【化６９】
2020158910.tif 000112
【０３２９】
窒素気流下、上記で得られた化合物４７の１，２−ジクロロエタン溶液（６．８ｍＬ）に１−（３−ジメチルアミノプロピル）−３−エチルカルボジイミド塩酸塩（２６０ｍｇ，１．４ｍｍｏｌ）を添加し、５０℃で２．５時間撹拌した後、無水メタノール（６．８ｍｌ）添加し、さらに５０℃で５時間撹拌した。反応終了後に水を添加し、クロロホルムで抽出した。有機層を水と飽和食塩水とで洗浄した後、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、溶媒を減圧留去した。得られた残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ＳｉＯ２，メタノール／クロロホルム＝０％から３％）により精製し、化合物４８（１９９ｍｇ，５６％，２工程）を茶色固体として得た。【０３３０】
得られた化合物４８の物性データを表４２に示す。【０３３１】
【表４２】
2020158910.tif 000113
【０３３２】
（８−６）化合物４９の合成【０３３３】
【化７０】
2020158910.tif 000114
【０３３４】
窒素気流下、上記で得られた化合物４８（２９０ｍｇ，０．５５ｍｍｏｌ）とチタンテトライソプロポキシド（０．１５ｍＬ，０．５５ｍｍｏｌ）の無水テトラヒドロフラン溶液（５．５ｍＬ）に、１．０Ｍのエチルマグネシウムブロミドのテトラヒドロフラン溶液（２．７ｍＬ，２．７ｍｍｏｌ）を０℃で１０分かけて滴下した。滴下後、反応溶液を室温まで加温し、さらに８．５時間撹拌した。反応終了後に飽和炭酸水素ナトリウム水溶液を添加し、セライト濾過を行い、濾液を酢酸エチルで抽出した。有機層を水と飽和食塩水とで洗浄した後、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、溶媒を減圧留去し、粗生成物として化合物４９（２０ｍｇ）を得た。なお、解析用に一部をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ＳｉＯ２，酢酸エチル／ヘキサン＝３０％から５０％）により精製した。【０３３５】
得られた化合物４９の物性データを表４３に示す。【０３３６】
【表４３】
2020158910.tif 000115
【０３３７】
（８−７）化合物５０の合成【０３３８】
【化７１】
2020158910.tif 000116
【０３３９】
上記で得られた化合物４９を用い、以下の合成スキームにしたがって、例えば上記実施例６の（６−３）〜（６−６）に記載した試薬および反応条件により化合物５０を得ることができる。【０３４０】
（実施例９）オリゴヌクレオチドの合成および精製
実施例１〜３、６、７で作製された化合物７、１１、２０、３５および４２をアミダイトブロックとして用い、以下のようにしてオリゴヌクレオチドを合成した。オリゴヌクレオチドを構成する化合物７、１１、２０、３５および４２以外の化合物は、特に表記がない限り、Proligo社から購入した。【０３４１】
実施例１〜３、６、７で作製された化合物７、１１、２０、３５および４２から、各々０．１Ｍの無水アセトニトリル溶液として調製し、ＧｅｎｅＤｅｓｉｇｎ社製ｎＳ−８  Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒに仕込んだ。各合成をトリチルオン条件で行った。活性化剤には４，５−ジシアノイミダゾール（０．２５Ｍアセトニトリル溶液）を用い、縮合時間は化合物７、１１、２０、３５および４２と、その次に導入するアミダイト体を２４０秒×４に延長した。キャッピング時間は２００秒へと変更した。また、デブロッキング時間も１２０秒×２へと延長した。５’−ｃｐＧ（化合物４２）については、導入後、一度合成機からカラムを取り外し、０．５Ｍヒドラジン溶液と反応させることでレブリニル基の脱保護を行なった。その他の操作については通常のホスホロアミダイト法に従って合成を行った。【０３４２】
合成完了後、生成物を、２８％アンモニア水溶液を用いて室温下で１．５時間処理してカラム担体からの切り出しを行い、次いで５５℃で５時間以上静置することで塩基部の脱保護を行った。その後、簡易逆相カラム（Ｗａｔｅｒｓ社製Ｓｅｐ−Ｐａｋ（登録商標）Ｐｌｕｓ  Ｃ１８  Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ  Ｃａｒｔｒｉｄｇｅｓ）により精製し、さらに逆相ＨＰＬＣにて精製を行った。【０３４３】
精製したオリゴヌクレオチドの組成をＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ測定により決定した。当該測定にあたり、まず、３−ヒドロキシピコリン酸水溶液（１０ｍｇ／ｍＬ）とクエン酸二アンモニウム水溶液（１ｍｇ／ｍＬ）とを１：１の容量比で混合したマトリックス（１μＬ）を乾燥させたアンカーチップ上に、オリゴヌクレオチド水溶液（５０μＭ，１μＬ）を載せて再度乾燥させ、その後ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ測定を行った。分子量の測定をネガティブモードで行い、オリゴチミジル酸（７ｍｅｒ、１５ｍｅｒおよび２３ｍｅｒ）を外部標準として用いた。また、合成したオリゴヌクレオチドの定量を、吸光度測定装置（株式会社島津製作所製ＳＨＩＭＡＤＺＵ  ＵＶ−１８００）を用いて２６０ｎｍにおける紫外部吸収を測定することで行った。【０３４４】
（実施例１０）二重鎖形成能の評価
実施例９に記載のようにして、以下の配列のオリゴヌクレオチドを合成および精製した：
５’−ｄ（ＧＣＧＴＴＸＴＴＴＧＣＴ）−３’（配列番号１〜１０）
（１）Ｘ＝チミジン（Ｔ）（配列番号１）
（２）Ｘ＝化合物７（５’−シクロプロピレンチミジン（５’−ｃｐ−Ｔ））（配列番号２）
（３）Ｘ＝シチジン（Ｃ）（配列番号３）
（４）Ｘ＝化合物１１（５’−シクロプロピレン−５−メチル−２’−デオキシシチジン（５’−ｃｐ−ＭｅＣ））（配列番号４）
（５）Ｘ＝アデノシン（Ａ）（配列番号５）
（６）Ｘ＝化合物３５（５’−シクロプロピレン−２’−デオキシアデノシン（５’−ｃｐ−Ａ））（配列番号６）
（７）Ｘ＝グアノシン（Ｇ）（配列番号７）
（８）Ｘ＝化合物４２（５’−シクロプロピレン−２’−デオキシグアノシン（５’−ｃｐ−Ｇ）））（配列番号８）
（９）Ｘ＝ＬＮＡ−グアニン（下記表４３中「ＧＬ」）（配列番号９）
（１０）Ｘ＝化合物２０（５’−シクロプロピレン−ＬＮＡ−グアニン（５’−ｃｐ−ＬＮＡ−Ｇ）：下記表４３中「ＧｃｐＬ」）（配列番号１０）【０３４５】
以下のように標的鎖を用いて二重鎖形成能（結合親和性）を調べた：
配列（１）および（２）の標的鎖：一本鎖オリゴＲＮＡ５’−ｒ（ＡＧＣＡＡＡＡＡＡＣＧＣ）−３’（配列番号１１）および一本鎖オリゴＤＮＡ５’−ｄ（ＡＧＣＡＡＡＡＡＡＣＧＣ）−３’（配列番号１２）；
配列（３）および（４）の標的鎖：一本鎖オリゴＲＮＡ５’−ｒ（ＡＧＣＡＡＡＧＡＡＣＧＣ）−３’（配列番号１３）および一本鎖オリゴＤＮＡ５’−ｄ（ＡＧＣＡＡＡＧＡＡＣＧＣ）−３’（配列番号１４）；
配列（５）および（６）の標的鎖：一本鎖オリゴＲＮＡ５’−ｒ（ＡＧＣＡＡＡＵＡＡＣＧＣ）−３’（配列番号１５）および一本鎖オリゴＤＮＡ５’−ｄ（ＡＧＣＡＡＡＴＡＡＣＧＣ）−３’（配列番号１６）；ならびに
配列（７）〜（１０）の標的鎖：一本鎖オリゴＲＮＡ５’−ｒ（ＡＧＣＡＡＡＣＡＡＣＧＣ）−３’（配列番号１７）および一本鎖オリゴＤＮＡ５’−ｄ（ＡＧＣＡＡＡＣＡＡＣＧＣ）−３’（配列番号１８）。【０３４６】
オリゴヌクレオチドの二重鎖形成能を、各種オリゴヌクレオチドと標的鎖とをアニーリング処理して二重鎖を形成させた後、Ｔｍ値を測定することにより調べた。より詳細には、各オリゴヌクレオチド（終濃度４μＭ）と塩化ナトリウム（終濃度１００ｍＭ）のリン酸緩衝液（１０ｍＭ，ｐＨ７．２，１３０μＬ）の混合液を沸騰水中に浴し、室温までゆっくり冷却した。その後、窒素気流下で５℃まで冷却し、測定を開始した。０．５℃／分で９０℃まで昇温し、０．５℃間隔で２６０ｎｍにおける吸光度をプロットした。Ｔｍ値を中線法により算出し、独立した３回の測定における平均値とした。【０３４７】
表４４に二重鎖形成能の結果を示す：
（Ａ）：配列（１）および（２）；
（Ｂ）：配列（３）および（４）；
（Ｃ）：配列（５）および（６）；
（Ｄ）：配列（７）および（８）；
（Ｅ）：配列（７）、（９）および（１０）。
表４４中、一本鎖オリゴＲＮＡに対する結果を「ｓｓＲＮＡ」、一本鎖オリゴＮＡに対する結果を「ｓｓＤＮＡ」に示し、そして各オリゴヌクレオチドのＴｍと、人工修飾核酸１塩基当たりのＴｍ変動温度（「ΔＴｍ／ｍｏｄ．」）とを示す。【０３４８】
【表４４】
2020158910.tif 000117
【０３４９】
化合物７、１１、３５または４２を用いた場合（配列（２）、（４）、（６）または（８））、一本鎖オリゴＤＮＡおよび一本鎖オリゴＲＮＡの両方とも、天然のオリゴヌクレオチド（配列（１）、（３）、（５）または（７））と比べてＴｍ値はわずかに低下したのみであり、結合親和性を損なわなかった。化合物２０を用いた場合（配列（１０））、特に一本鎖オリゴＲＮＡに対して、天然のオリゴヌクレオチド（配列（７））と比べてＴｍ値が上昇し、よって、一本鎖オリゴＲＮＡに対する高い結合親和性を示し、これは、２’，４’−ＢＮＡ／ＬＮＡ含有オリゴヌクレオチド（配列（９））に匹敵した。【０３５０】
（実施例１１）ヌクレアーゼ耐性能の評価
実施例９に記載のようにして、以下の１０ｍｅｒの配列のオリゴヌクレオチドを合成および精製し、被験オリゴヌクレオチドとして用いた：
５’−ＴＴＴＴＴＴＴＴＴＸ−３’
Ｘ＝チミジン（Ｔ）
Ｘ＝ホスホロチオエートチミジン（ｐｓ−Ｔ）
Ｘ＝化合物７（５’−シクロプロピレンチミジン（５’−ｃｐ−Ｔ））【０３５１】
７．５μＭ被験オリゴヌクレオチドと１０ｍＭ塩化マグネシウムを含む５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）に、２．５μｇ／ｍＬの３’−エキソヌクレアーゼ（Crotalus adamanteus venom phosphodiesterase，ＣＡＶＰ）を加え、３７℃でインキュベートした。インキュベーションの開始時（０分）、２．５分後、５分後、１０分後、２０分後、４０分後にそれぞれ１０μＬずつ試料を取り出し、逆相ＨＰＬＣで解析し、未切断のオリゴヌクレオチドの割合を算出した。また、評価は独立した３回の測定により導き出した。【０３５２】
結果を図１に示す。図１中、白抜き丸はＸ＝チミジン（Ｔ）の結果を表し、白抜き四角はＸ＝ホスホロチオエートチミジン（ｐｓ−Ｔ）の結果を表し、そして黒三角はＸ＝化合物７（５’−シクロプロピレンチミジン（５’−ｃｐ−Ｔ））を表す。図１から明らかなように、ホスホロチオエート化（ＰＳ）オリゴ（Ｘ＝ホスホロチオエートチミジン（ｐｓ−Ｔ））において、ヌクレアーゼ処理４０分後の未切断オリゴヌクレオチドの残存率は約３０％ほどであったのに対し、化合物７を含有するオリゴヌクレオチド（Ｘ＝化合物７（５’−シクロプロピレンチミジン（５’−ｃｐ−Ｔ）））は、ヌクレアーゼ処理の４０分後でも約７０％が未切断で残存しており、分解されにくかった。このことから、５’−シクロプロピレン修飾によって、ホスホロチオエート修飾と比べて高いヌクレアーゼ耐性が獲得できることが確認された。【０３５３】
（実施例１２）ＲＮａｓｅ  Ｈ活性の評価
実施例９に記載のようにして、以下の配列（１１）〜（１２）のオリゴヌクレオチドを合成および精製し、被験オリゴヌクレオチドとして用いた：
（１１）５’−ＧｍＣｍＧｍｔｔｔｔｔｔｔｔＧｍＣｍＵｍ−３’（配列番号１９）
（１２）５’−ＧｍＣｍＧｍｔｔｔＸｔｔｔＸＧｍＣｍＵｍ−３’（配列番号２０）
（１３）５’−ＧｍＣｍＧｍｔＸｔｔＸｔｔＸＧｍＣｍＵｍ−３’（配列番号２１）
Ｇｍ、Ｃｍ、Ｕｍ：２’−Ｏ−メチル修飾
ｔ＝チミジン
Ｘ＝化合物７（５’−シクロプロピレンチミジン（５’−ｃｐ−Ｔ））【０３５４】
５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）と３ｍＭ塩化マグネシウム、７５ｍＭ塩化カリウム、１０ｍＭジチオトレイトールを含む混合溶液に、被験オリゴヌクレオチド（６０ｐｍｏｌ）とフルオレセインで標識された相補鎖ＲＮＡ（５’−ＦＡＭ−ｒ（ＡＧＣＡＡＡＡＡＡＡＡＣＧＣ）−３’）（配列番号２２）（３００ｐｍｏｌ）を溶解させた。各試料を７０℃まで加熱した後、室温までゆっくり冷却した。２．０ユニットの大腸菌由来ＲＮａｓｅ  Ｈを各試料に加え、３０℃でインキュベートした。４０分後、ホルムアミド／０．１Ｍエチレンジアミン四酢酸混合溶液（＝１４：１（容量比））を試料容積の３倍量加え、反応を停止させた。切断産物を２０％変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって解析した。切断率をバンドの蛍光強度比によって算出した。上記の配列（１１）、（１２）および（１３）のＲＮａｓｅ  Ｈによる切断率の結果を以下の表４５に示す。【０３５５】
【表４５】
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【０３５６】
化合物７を３個置きに導入したオリゴヌクレオチド（配列（１２））および２個置きに導入したオリゴヌクレオチド（配列（１３））は、化合物７を含まないオリゴヌクレオチド（配列（１１））と同程度の切断率を示した。このことから、５’−シクロプロピレン修飾は、ＲＮａｓｅ  Ｈ誘導型アンチセンスオリゴヌクレオチドへの利用も可能であることが確認された。【０３５７】
（実施例１３）エキソンスキッピング活性の評価
実施例９に記載のようにして、以下の配列のオリゴヌクレオチドを合成および精製し、被験オリゴヌクレオチドとして用いた：
ＳＳＯ１：５’−ｔＣｃＣｔＣｔＴｇＡａＧｇＣｃ−３’（配列番号２３）
ＳＳＯ２：５’−ｔ＾ＣｃＣｔＣｔＴｇＡａ＾ＧｇＣ＾ｃ−３’（配列番号２４）
ＳＳＯ３：５’−<ｔ>ＣｃＣｔＣｔＴｇＡａ<Ｇ>ｇＣ<ｃ>−３’（配列番号２５）
ａ、ｇ、ｃおよびｔ＝ＤＮＡ
Ａ＝ＬＮＡ−Ａ、Ｇ＝ＬＮＡ−Ｇ、Ｃ＝ＬＮＡ−５−メチルシトシン、Ｔ＝ＬＮＡ−Ｔ、
<ｔ>＝化合物７（５’−シクロプロピレンチミジン）
<ｃ>＝化合物１１（５’−シクロプロピレン−５−メチル−２’−デオキシシチジン））
<Ｇ>＝化合物２０（５’−シクロプロピレン−ＬＮＡ−グアニン）
＾＝ホスホロチオエート結合（ヌクレオチド間の結合部位のリン酸基を硫黄化（Ｓ化）した）。【０３５８】
ジストロフィン遺伝子のエキソン５８周辺を有する評価系細胞を、Obikaら、Nucleic Acids Res., 2014年,42巻,12号,8174-8187頁に記載の方法により樹立し、この樹立した細胞を、ポリ−Ｌ−リジン（ＰＬＬ）でコーティングした２４ウェルプレートに対して２．０×１０５細胞／ウェルで播種した。その２４時間後、約５０％コンフルエンスの細胞に対し、３０ｎＭ  ＳＳＯとリポフェクタミン２０００（Invitrogen）２．０μＬの混合液を、リポフェクタミン２０００の添付文書に従いトランスフェクションした。その２４時間後にｔｏｔａｌ  ＲＮＡの回収を行った。ｔｏｔａｌ  ＲＮＡの抽出には、QuickGene 800およびQuickGene RNA培養細胞キットS（クラボウ）を用いた。ＲＮＡ  Ｐｌｕｓモードで抽出を行い、途中で２× RQ1 RNase-Free DNase（プロメガ）を添加した。また、ｃＤＮＡ化はRever-Tra Ace qPCR RT Master Mix（東洋紡株式会社製）を用いて添付文書に従い行った。続いて、ＰＣＲ反応試薬として、SYBRGreen Real-time PCR Master Mix（東洋紡）を使用し、StepOnePlus（Applied Biosystems）にてＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲ反応条件は、SYBRGreen Real-time PCR Master Mix（東洋紡）の添付文書のプロトコールに対して、アニーリング温度を６５℃、時間を１５秒としたプロトコールで行った。ハウスキーピング遺伝子としてＲＰＬＰ２を用い、ジストロフィンミニ遺伝子の発現量の補正を行った。ＰＣＲに用いたプライマー情報を以下の表４６に示す。また、解析は検量線法にて行うことで、エキソン５８のスキッピング活性を算出した。コントロール群として、トランスフェクション時に何も添加していないもの、および、定量ＰＣＲの際にｃＤＮＡの代わりにＤＥＰＣ水（ジエチルピロカーボネート処理水）を添加したものを用いた。【０３５９】
【表４６】
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【０３６０】
結果は図２に示した通りである。結果は、ＳＳＯ１〜ＳＳＯ３の各オリゴヌクレオチドによるジストロフィン遺伝子のエキソン５８をスキップしたｍＲＮＡ相対発現量として表した。図２中、「処理なし」はトランスフェクション時に何も添加していないものであり、そして「水」は、定量ＰＣＲの際にｃＤＮＡの代わりにＤＥＰＣ水を添加したものである。【０３６１】
図２から明らかなように、ＬＮＡのみを導入したＳＳＯ１と比べて、５’−シクロプロピレン修飾を導入したＳＳＯ３は、大きくエキソンスキッピング活性を向上させた。また、ＳＳＯ３の活性はホスホロチオエート修飾したＳＳＯ２と同程度であることから、５’−シクロプロピレン修飾はホスホロチオエート修飾と同等のエキソンスキッピング活性の向上能力を有していることが判明した。【０３６２】
（実施例１３）アンチセンス活性ならびに肝毒性の評価
実施例９に記載のようにして、以下の配列のオリゴヌクレオチドを合成および精製し、被験オリゴヌクレオチドとして用いた：
ＡＳＯ１：５’−Ｇ＾Ｔ＾ｍＣ＾ｔ＾ｃ＾ｔ＾ｔ＾ｔ＾ａ＾ｃ＾ｃ＾Ｔ＾Ｇ＾Ｇ−３’（配列番号３０）
ＡＳＯ２：５’−Ｇ＾Ｔ＾ｍＣＸ＾ｃ＾ｔ＾ｔ＾ｔ＾ａ＾ｃ＾ｃ＾Ｔ＾Ｇ＾Ｇ−３’（配列番号３１）
ＡＳＯ３：５’−Ｇ＾Ｔ＾ｍＣ＾ｔ＾ｃ＾ｔＸ＾ｔ＾ａ＾ｃ＾ｃ＾Ｔ＾Ｇ＾Ｇ−３’（配列番号３２）
ＡＳＯ４：５’−Ｇ＾Ｔ＾ｍＣＸ＾ｃ＾ｔ＾ｔＸ＾ａ＾ｃ＾ｃ＾Ｔ＾Ｇ＾Ｇ−３’（配列番号３３）
ａ、ｇ、ｃおよびｔ＝ＤＮＡ
Ａ＝ＬＮＡ−Ａ、Ｇ＝ＬＮＡ−Ｇ、ｍＣ＝ＬＮＡ−５−メチルシトシン、Ｔ＝ＬＮＡ−Ｔ、
大文字（Ａ、Ｇ、ｍＣ、Ｔ）はＬＮＡであり、そして小文字（ａ、ｇ、ｃ、ｔ）はＤＮＡである。
Ｘ＝化合物７（５’−シクロプロピレンチミジン（５’−ｃｐ−Ｔ））。
＾＝ホスホロチオエート結合（ヌクレオチド間の結合部位のリン酸基を硫黄化（Ｓ化）した）。【０３６３】
６週齢のマウス（Ｃ５７ＢＬ／６ＮＣｒｌ、雄）の尾静脈に、上記被験オリゴヌクレオチド（２０ｍｇ／ｋｇ）を投与した。コントロールとして生理食塩水を投与した。９６時間後、吸入麻酔下（イソフルラン）で採血を行い、放血安楽死させた。その後、肝臓を採取し、肝臓重量の測定ならびにＲＮＡ抽出（ＴＲＩｚｏｌでホモジナイズ後、フェノール・クロロホルム抽出）を行った。血液中のアスパラギン酸トランスアミナーゼ（ＡＳＴ）およびアラニントランスアミナーゼ（ＡＬＴ）の活性を自動分析装置（日本電子株式会社製ＪＣＡ−ＢＭ６０７０）により測定した。また、標的遺伝子ＮＲ３Ｃ１ならびにハウスキーピング遺伝子ＧＡＰＤＨのｍＲＮＡ発現量をリアルタイムＰＣＲ（使用キット：Ｏｎｅ  Ｓｔｅｐ  ＳＹＢＲ  ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ  ＲＴ−ＰＣＲ  Ｋｉｔ（タカラバイオ株式会社製）、プライマー配列：ＮＲ３Ｃ１  ｆｏｒｗａｒｄ（ａｃｔｇｔｃｃａｇｃａｔｇｃｃｇｃｔａｔ）（配列番号３４）、ＮＲ３Ｃ１  ｒｅｖｅｒｓｅ（ｇｃａｇｔｇｇｃｔｔｇｃｔｇａａｔｔｃｃ）（配列番号３５）、ＧＡＰＤＨ  ｆｏｒｗａｒｄ（ｇｔｇｔｇａａｃｇｇａｔｔｔｇｇｃｃｇｔ）（配列番号３６）、ＧＡＰＤＨ  ｒｅｖｅｒｓｅ（ｇａｃａａｇｃｔｔｃｃｃａｔｔｃｔｃｇｇ）（配列番号３７））により測定した。【０３６４】
得られた結果を図３および図４に示す。図３は、ＡＳＯ１、ＡＳＯ２、ＡＳＯ３およびＡＳＯ４の各被験オリゴヌクレオチドを投与した場合ならびに生理食塩水投与の場合のマウス肝臓中の標的遺伝子ＮＲ３Ｃ１のｍＲＮＡ量を示すグラフであり、生理食塩水を投与した場合のｍＲＮＡ量を１００とした場合の相対値にて表す。図４は、ＡＳＯ１、ＡＳＯ２、ＡＳＯ３およびＡＳＯ４の各被験オリゴヌクレオチドを投与した場合ならびに生理食塩水投与の場合の血液中のアスパラギン酸トランスアミナーゼ（ＡＳＴ）およびアラニントランスアミナーゼ（ＡＬＴ）の活性を示すグラフであり、ＡＳＯ１投与の場合のＡＬＴ値およびＡＳＴ値のそれぞれを１００とした場合の相対値にて表す。【０３６５】
図３に示すように、ＡＳＯ１、ＡＳＯ２、ＡＳＯ３およびＡＳＯ４の各被験オリゴヌクレオチドの間でｍＲＮＡ発現量はコントロールの生理食塩水投与の場合と比べて同程度に抑制されており、よって、これらの被験オリゴヌクレオチドにおいてアンチセンス活性はほぼ同程度であった。図４に示すように、化合物７を用いないＡＳＯ１と比較して、化合物７を用いたＡＳＯ２、ＡＳＯ３およびＡＳＯ４では、肝毒性の指標となるＡＳＴおよびＡＬＴの値を有意に減少させた。このことから、５’−シクロプロピレン修飾によって、アンチセンスオリゴヌクレオチドのアンチセンス活性を損なうことなく肝毒性を減少させることができることが確認された。
【産業上の利用可能性】
【０３６６】
本発明によれば、ホスホロチオエート修飾核酸の代替とすることが可能な新規な５’位修飾ヌクレオシドおよびそれを用いたヌクレオチドが提供される。本発明の５’位修飾ヌクレオシドはまた、その製造においてジアステレオマーの分離工程を必要としないため、工業的生産性にも優れている。本発明の５’位修飾ヌクレオシドを用いて得られるオリゴヌクレオチドは、例えば、核酸医薬への素材として有用である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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