(57)【要約】  分析方法は、試料を、液体クロマトグラフィに供することと、液体クロマトグラフィに供された試料の第１質量分析を行い、コレステリルエステルに対応する第１イオンと、コレステリルエステル過酸化物に対応する第２イオンとを検出することと、検出された第１イオンの強度と、検出された第２イオンの強度との比に基づいて、試料の酸化度の解析を行うことと、を備える。
2019235011.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料を、液体クロマトグラフィに供することと、
前記液体クロマトグラフィに供された前記試料の第１質量分析を行い、コレステリルエステルに対応する第１イオンと、コレステリルエステル過酸化物に対応する第２イオンとを検出することと、
検出された前記第１イオンの強度と、検出された前記第２イオンの強度との比に基づいて、前記試料の酸化度の解析を行うことと、
を備える分析方法。
【請求項２】
請求項１に記載の分析方法において、
前記第１イオンの強度と、前記第２イオンの強度とのいずれか一方を他方で割った比率に基づいて前記試料の酸化度を示す指標を算出すること
を備える分析方法。
【請求項３】
請求項２に記載の分析方法において、
前記指標、または前記指標に基づく前記試料の酸化度を示す情報を出力すること
を備える分析方法。
【請求項４】
請求項２に記載の分析方法において、
前記指標に基づいて、前記第１質量分析により得られた測定データを解析すること
を備える分析方法。
【請求項５】
請求項１から４までのいずれか一項に記載の分析方法において、
前記第１質量分析により、前記試料のそれぞれの成分に対応する試料由来イオンを検出することと、
前記試料由来イオンのうち、リン脂質に対応するイオンの強度の和を算出することと、
検出されたそれぞれの前記試料由来イオンの強度を、前記和を用いて規格化することと、
を備える分析方法。
【請求項６】
請求項５に記載の分析方法において、
前記リン脂質は、リゾリン脂質と、アシル基を複数備えるリン脂質とを含む分析方法。
【請求項７】
請求項５に記載の分析方法において、
同一の前記試料に対し、所定の時間を隔てて少なくとも２度の前記第１質量分析が行なわれた際、規格化された前記強度の変動が所定の割合以下であった非変動イオンを、第２質量分析により検出し、前記第２質量分析により検出されたそれぞれのイオンの強度を、前記非変動イオンの強度を用いて規格化することを備える分析方法。
【請求項８】
請求項１から４までのいずれか一項に記載の分析方法において、
前記第１質量分析において検出された、前記試料のそれぞれの成分に対応する試料由来イオンの強度を、所定の物質に対応するイオンの強度を用いて規格化することを備え、
前記物質は、
炭素数が１８で炭素間に１か所の二重結合を備えるアシル基を備えるコレステリルエステル、炭素数が２０で炭素間に５か所の二重結合を備えるアシル基を備えるコレステリルエステル、炭素数が２０で炭素間に５か所の二重結合を備えるアシル基を備えるリゾホスファチジルコリン、炭素数の合計が３２で炭素間の二重結合の数の合計が１の２つのアシル基を備えるホスファチジルコリン、炭素数の合計が３４で炭素間の二重結合の数の合計が１の２つのアシル基を備えるホスファチジルコリン、炭素数の合計が３６で炭素間の二重結合の数の合計が２の２つのアシル基を備えるホスファチジルコリン、炭素数の合計が３８で炭素間の二重結合の数の合計が４の２つのアシル基を備えるホスファチジルコリン、炭素数の合計が３４で炭素間の二重結合の数の合計が２の２つのアシル基を備えるホスファチジルエタノールアミン、炭素数の合計が３６で炭素間の二重結合の数の合計が２の２つのアシル基を備えるホスファチジルエタノールアミン、および、炭素数の合計が３８で炭素間の二重結合の数の合計が４の２つのアシル基を備えるホスファチジルエタノールアミンからなる群から選択される少なくとも一つの分子である分析方法。
【請求項９】
請求項８に記載の分析方法において、
前記第１質量分析において検出された、前記試料のそれぞれのコレステリルエステルに対応する前記試料由来イオンの強度を、前記物質に含まれるコレステリルエステルに対応するイオンの強度の和を用いて規格化する分析方法。
【請求項１０】
請求項８に記載の分析方法において、
前記第１質量分析において検出された、前記試料のそれぞれのリゾリン脂質に対応する前記試料由来イオンの強度を、前記物質に含まれるリゾホスファチジルコリンに対応するイオンの強度を用いて規格化する分析方法。
【請求項１１】
請求項８に記載の分析方法において、
前記第１質量分析において検出された、前記試料のそれぞれの、複数のアシル基を含むリン脂質に対応する試料由来イオンの強度を、前記物質に含まれるホスファチジルコリンおよびホスファチジルエタノールアミンに対応するイオンの強度の和を用いて規格化する分析方法。
【請求項１２】
請求項１から４までのいずれか一項に記載の分析方法において、
前記第１質量分析により、前記試料のそれぞれの成分に対応する試料由来イオンを検出することと、
前記試料由来イオンのうち、リゾリン脂質と、アシル基を複数備えるリン脂質とに対応するイオンの強度の和を算出することと、
検出されたそれぞれの前記試料由来イオンの強度を、前記和を用いて規格化することと、
を備え、
前記リン脂質は、炭素数が２０で炭素間の二重結合の数が４のアシル基を含む分子を含まない分析方法。
【請求項１３】
請求項５に記載の分析方法において、
前記試料由来イオンは、炭素数が２０で炭素間の二重結合の数が４の脂肪酸またはアシル基を含む脂質分子を含み、
前記脂質分子に対応するイオンの規格化された強度に基づいて前記試料が健常者から取得されたものか否かを判定することを備える分析方法。
【請求項１４】
請求項１から４までのいずれか一項に記載の分析方法において、
前記試料は、血液の状態で保管された試料である分析方法。
【請求項１５】
試料を導入する試料導入部と、
前記試料を分離する液体クロマトグラフと、
前記液体クロマトグラフで分離された前記試料の第１質量分析を行い、コレステリルエステルに対応する第１イオンと、コレステリルエステル過酸化物に対応する第２イオンとを検出する質量分析部と、
検出された前記第１イオンの強度と、検出された前記第２イオンの強度との比に基づいて、前記試料の酸化度の解析を行う酸化度解析部と、
を備える分析装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、分析方法および分析装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
試料に含まれる、脂質を構成する各分子を解析することは、生体試料の解析、医学的診断および創薬等のために非常に重要である。特に、脂質を構成する多種多様な分子の総体を網羅的に解析するリピドミクスは、疾患バイオマーカーの探索や疾患メカニズムの研究にきわめて有用である。リピドミクスにおける新規バイオマーカーの探索では、多くの個体から長期間試料を逐次採取、保管し、一部の個体が特定の疾患を発症した場合、保管された試料を遡って解析することにより、当該疾患に関連する分子を発見することができる。【０００３】
脂質を含む試料の解析を適切に行うために、保管された試料の品質を評価することは重要である。非特許文献１では、３年以上にわたり、冷凍保存された血漿中のリン脂質やコレステリルエステルの量を逐次測定し、質量分析による定量精度を評価しており、冷凍保存された脂質の安定性にも知見が得られている。非特許文献２では、血液試料を数時間室温で放置した後、血液試料中の脂質と代謝物について、放置前と放置後とにおける質量分析による検出強度の増減を報告している。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Laura A. Heiskanen, Matti Suoniemi, Hung Xuan Ta, Kirill Tarasov, and Kim Ekroos, “Long-Term Performance and Stability of Molecular Shotgun LipidomicAnalysis of Human Plasma Samples” Analytical Chemistry（米国）, ACS Publications, 2013年9月、Volume 85, Issue 18, pp.8757-8763
【非特許文献２】Beate Kamlage, Sandra Gonzalez Maldonado, Bianca Bethan, Erik Peter, Oliver Schmitz, Volker Liebenberg, Philipp Schatz "Quality markers addressing preanalytical variations of blood and plasma processing identified by broad and targeted metabolite profiling," Clinical Chemistry（米国）, American Association for Clinical Chemistry, 2014年2月、Volume 60, Issue 2, pp.399-412
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
保管された試料等の品質の評価のために、質量分析により、試料の酸化度を定量的に評価できることが望ましい。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明の第１の態様によると、分析方法は、試料を、液体クロマトグラフィに供することと、前記液体クロマトグラフィに供された前記試料の第１質量分析を行い、コレステリルエステルに対応する第１イオンと、コレステリルエステル過酸化物に対応する第２イオンとを検出することと、検出された前記第１イオンの強度と、検出された前記第２イオンの強度との比に基づいて、前記試料の酸化度の解析を行うことと、を備える。
本発明の第２の態様によると、第１の態様の分析方法において、前記第１イオンの強度と、前記第２イオンの強度とのいずれか一方を他方で割った比率に基づいて前記試料の酸化度を示す指標を算出することを備えることが好ましい。
本発明の第３の態様によると、第２の態様の分析方法において、前記指標、または前記指標に基づく前記試料の酸化度を示す情報を出力することを備えることが好ましい。
本発明の第４の態様によると、第２または第３の態様の分析方法において、前記指標に基づいて、前記第１質量分析により得られた測定データを解析することを備える。
本発明の第５の態様によると、第１から第４までのいずれかの態様の分析方法において、前記第１質量分析により、前記試料のそれぞれの成分に対応する試料由来イオンを検出することと、前記試料由来イオンのうち、リン脂質に対応するイオンの強度の和を算出することと、検出されたそれぞれの前記試料由来イオンの強度を、前記和を用いて規格化することと、を備えることが好ましい。
本発明の第６の態様によると、第５の態様の分析方法において、前記リン脂質は、リゾリン脂質と、アシル基を複数備えるリン脂質とを含むことが好ましい。
本発明の第７の態様によると、第５または第６の態様の分析方法において、同一の前記試料に対し、所定の時間を隔てて少なくとも２度の前記第１質量分析が行なわれた際、規格化された前記強度の変動が所定の割合以下であった非変動イオンを、第２質量分析により検出し、前記第２質量分析により検出されたそれぞれのイオンの強度を、前記非変動イオンの強度を用いて規格化することを備えることが好ましい。
本発明の第８の態様によると、第１から第４までのいずれかの態様の分析方法において、前記第１質量分析において検出された、前記試料のそれぞれの成分に対応する試料由来イオンの強度を、所定の物質に対応するイオンの強度を用いて規格化することを備え、前記物質は、炭素数が１８で炭素間に１か所の二重結合を備えるアシル基を備えるコレステリルエステル、炭素数が２０で炭素間に５か所の二重結合を備えるアシル基を備えるコレステリルエステル、炭素数が２０で炭素間に５か所の二重結合を備えるアシル基を備えるリゾホスファチジルコリン、炭素数の合計が３２で炭素間の二重結合の数の合計が１の２つのアシル基を備えるホスファチジルコリン、炭素数の合計が３４で炭素間の二重結合の数の合計が１の２つのアシル基を備えるホスファチジルコリン、炭素数の合計が３６で炭素間の二重結合の数の合計が２の２つのアシル基を備えるホスファチジルコリン、炭素数の合計が３８で炭素間の二重結合の数の合計が４の２つのアシル基を備えるホスファチジルコリン、炭素数の合計が３４で炭素間の二重結合の数の合計が２の２つのアシル基を備えるホスファチジルエタノールアミン、炭素数の合計が３６で炭素間の二重結合の数の合計が２の２つのアシル基を備えるホスファチジルエタノールアミンおよび炭素数の合計が３８で炭素間の二重結合の数の合計が４の２つのアシル基を備えるホスファチジルエタノールアミンからなる群から選択される少なくとも一つの分子であることが好ましい。
本発明の第９の態様によると、第８の態様の分析方法において、前記第１質量分析において検出された、前記試料のそれぞれのコレステリルエステルに対応する前記試料由来イオンの強度を、前記物質に含まれるコレステリルエステルに対応するイオンの強度の和を用いて規格化することが好ましい。
本発明の第１０の態様によると、第８または第９の態様の分析方法において、前記第１質量分析において検出された、前記試料のそれぞれのリゾリン脂質に対応する前記試料由来イオンの強度を、前記物質に含まれるリゾホスファチジルコリンに対応するイオンの強度を用いて規格化することが好ましい。
本発明の第１１の態様によると、第８から第１１までのいずれかの態様の分析方法において、前記第１質量分析において検出された、前記試料のそれぞれの、複数のアシル基を含むリン脂質に対応する試料由来イオンの強度を、前記物質に含まれるホスファチジルコリンおよびホスファチジルエタノールアミンに対応するイオンの強度の和を用いて規格化することが好ましい。
本発明の第１２の態様によると、第１から第４までのいずれかの態様の分析方法において、前記第１質量分析により、前記試料のそれぞれの成分に対応する試料由来イオンを検出することと、前記試料由来イオンのうち、リゾリン脂質と、アシル基を複数備えるリン脂質とに対応するイオンの強度の和を算出することと、検出されたそれぞれの前記試料由来イオンの強度を、前記和を用いて規格化することと、を備え、前記リン脂質は、炭素数が２０で炭素間の二重結合の数が４のアシル基を含む分子を含まないことが好ましい。
本発明の第１３の態様によると、第５から第１１までのいずれかの態様の分析方法において、前記試料由来イオンは、炭素数が２０で炭素間の二重結合の数が４の脂肪酸またはアシル基を含む脂質分子を含み、前記脂質分子に対応するイオンの規格化された強度に基づいて前記試料が健常者から取得されたものか否かを判定することを備えることが好ましい。
本発明の第１４の態様によると、第１から第１３までのいずれかの態様の分析方法において、前記試料は、血液の状態で保管された試料であることが好ましい。
本発明の第１５の態様によると、分析装置は、試料を導入する試料導入部と、前記試料を分離する液体クロマトグラフと、前記液体クロマトグラフで分離された前記試料の第１質量分析を行い、コレステリルエステルに対応する第１イオンと、コレステリルエステル過酸化物に対応する第２イオンとを検出する質量分析部と、検出された前記第１イオンの強度と、検出された前記第２イオンの強度との比に基づいて、前記試料の酸化度の解析を行う酸化度解析部と、を備える。
【発明の効果】
【０００７】
本発明によれば、質量分析により、試料の酸化度を定量的に評価し、保管された試料の品質を評価することができる。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】図１は、分析装置を説明するための概念図である。
【図２】図２は、一実施形態の分析方法の流れを示すフローチャートである。
【図３】図３は、一実施形態の分析方法の流れを示すフローチャートである。
【図４】図４は、一実施形態の分析方法の流れを示すフローチャートである。
【図５】図５は、２０１７年３月に試料を質量分析して得られたマスクロマトグラムである。
【図６】図６は、２０１８年３月に試料を質量分析して得られたマスクロマトグラムである。
【図７】図７（Ａ）は、２０１７年３月に試料を質量分析して得られたコレステリルエステルに対応するピークを示すマスクロマトグラムであり、図７（Ｂ）は、２０１８年３月に試料を質量分析して得られたコレステリルエステルに対応するピークを示すマスクロマトグラムである。
【図８】図８（Ａ）は、２０１７年３月に試料を質量分析して得られたリゾホスファチジルコリンに対応するピークを示すマスクロマトグラムであり、図８（Ｂ）は、２０１８年３月に試料を質量分析して得られたリゾホスファチジルコリンに対応するピークを示すマスクロマトグラムである。
【図９】図９は、２０１７年３月に試料を質量分析して得られたホスファチジルコリンに対応するピークを示すマスクロマトグラムである。
【図１０】図１０は、２０１８年３月に試料を質量分析して得られたホスファチジルコリンに対応するピークを示すマスクロマトグラムである。
【図１１】図１１は、２０１７年３月に試料を質量分析して得られたホスファチジルエタノールアミンに対応するピークを示すマスクロマトグラムである。
【図１２】図１２は、２０１８年３月に試料を質量分析して得られたホスファチジルエタノールアミンに対応するピークを示すマスクロマトグラムである。
【図１３】図１３は、複数のアシル基の炭素数の合計が３２で、炭素間の二重結合の数の合計が１のホスファチジルコリンのマスクロマトグラムと、このホスファチジルコリンを構成する複数の異なる分子のマスクロマトグラムである。
【図１４】図１４は、複数のアシル基の炭素数の合計が３４で、炭素間の二重結合の数の合計が１のホスファチジルコリンのマスクロマトグラムと、このホスファチジルコリンを構成する複数の異なる分子のマスクロマトグラムである。
【図１５】図１５は、複数のアシル基の炭素数の合計が３６で、炭素間の二重結合の数の合計が２のホスファチジルコリンのマスクロマトグラムと、このホスファチジルコリンを構成する複数の異なる分子のマスクロマトグラムである。
【図１６】図１６は、複数のアシル基の炭素数の合計が３８で、炭素間の二重結合の数の合計が４のホスファチジルコリンのマスクロマトグラムと、このホスファチジルコリンを構成する複数の異なる分子のマスクロマトグラムである。
【図１７】図１７は、複数のアシル基の炭素数の合計が３４で、炭素間の二重結合の数の合計が２のホスファチジルエタノールアミンのマスクロマトグラムと、このホスファチジルエタノールアミンを構成する複数の異なる分子のマスクロマトグラムである。
【図１８】図１８は、複数のアシル基の炭素数の合計が３６で、炭素間の二重結合の数の合計が２のホスファチジルエタノールアミンのマスクロマトグラムと、このホスファチジルエタノールアミンを構成する複数の異なる分子のマスクロマトグラムである。
【図１９】図１９は、複数のアシル基の炭素数の合計が３８で、炭素間の二重結合の数の合計が４のホスファチジルエタノールアミンのマスクロマトグラムと、このホスファチジルエタノールアミンを構成する複数の異なる分子のマスクロマトグラムである。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
以下、図を参照して本発明を実施するための形態について説明する。以下の実施形態で「脂質」とは、脂肪酸または炭化水素鎖を含む生物由来の物質を指すものとする。
【００１０】
−第１の実施形態−
本実施形態の分析方法は、液体クロマトグラフィ／質量分析（ＬＣ／ＭＳ）により、試料中のコレステリルエステルおよびコレステリルエステル過酸化物に対応するイオンの検出を行い、この検出により得られた測定データに基づいて、試料の酸化度の解析を行うものである。
【００１１】
試料は、脂質を含む液体または固体であって、液体クロマトグラフへ導入する分析用の試料として調製することができれば特に限定されない。本実施形態の分析方法が、生物学的または医学的用途に好適に用いられる観点から、試料は、人間等の生体から取得された、血液等の体液が好ましい。あるいは、同様の観点から、試料は、人間等の生体から取得された、臓器等の組織、細胞若しくはエクソソーム等の固体を含む試料であることが好ましい。以下では、人間から採血により取得された血液を試料として分析する例を説明する。
【００１２】
試料の前処理の方法は特に限定されず、試料に含まれる脂質を構成する分子（以下、脂質分子と呼ぶ）のうち分析対象となっているものが、ＬＣ／ＭＳにより分離されて検出可能であればよい。このような分析対象の脂質分子は特に限定されないが、コレステリルエステルおよびコレステリルエステル過酸化物の他、コレステリルエステル水酸化物、アシル基を１つのみ備えるリン脂質（以下、リゾリン脂質と呼ぶ）、アシル基を複数備えるリン脂質、トリグリセロール等を含むことができる。分析対象のリゾリン脂質としてはリゾホスファチジルコリン、分析対象のリン脂質としてはホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミンまたはホスファチジルセリン等を含むことができる。
なお、脂質分子以外の分子を分析対象に含めてもよい。例えば、コレステロールや、コレステロールサルフェート等のコレステロールの誘導体を分析対象とすることができる。
【００１３】
好適な前処理の方法としては、例えばメタノールにより脂質分子等を抽出する方法が挙げられる。この方法では、冷凍保存された全血を秤量した後、液体での体積の数十倍から数百倍等の量のメタノールを加え、撹拌して脂質分子をメタノール側に抽出し、遠心分離した後、上清を採取する。冷蔵保存された血液や、血液以外の試料でも同様に行うことができる。これにより、迅速に試料の前処理を行うことができ、自動化も容易である。前処理が行われた試料は、分析装置の液体クロマトグラフに導入される。
なお、生体から採取された試料が固体を含む場合は、緩衝液等の液体を適宜加えて組織を破砕し、ホモジェナイズ等した後、液体成分を前処理に供することができる。
【００１４】
図１は、本実施形態の分析方法に係る分析装置の構成を示す概念図である。分析装置１は、測定部１００と、情報処理部４０とを備える。測定部１００は、液体クロマトグラフ１０と、質量分析計２０とを備える。
なお、分析装置１は、分注装置および遠心分離機を備え、前処理を行う前処理部と一体化されていてもよい。
【００１５】
液体クロマトグラフ１０は、移動相容器１１ａ，１１ｂと、送液ポンプ１２ａ，１２ｂと、試料導入部１３と、分析カラム１４とを備える。質量分析計２０は、イオン化部２１１を備えるイオン化室２１と、イオンレンズ２２１を備える第１真空室２２ａと、イオン化室２１から第１真空室２２ａへイオンを導入するキャピラリ２１２と、イオンガイド２２２を備える第２真空室２２ｂと、第３真空室２２ｃとを備える。第３真空室２２ｃは、第１質量分離部２３と、コリジョンセル２４と、第２質量分離部２５と、検出部３０とを備える。コリジョンセル２４は、イオンガイド２４０とＣＩＤガス導入口２４１とを備える。
【００１６】
情報処理部４０は、入力部４１と、通信部４２と、記憶部４３と、出力部４４と、制御部５０とを備える。制御部５０は、装置制御部５１と、解析部５２と、出力制御部５３とを備える。解析部５２は、クロマトグラフ作成部５２１と、酸化度解析部５２２と、規格化部５２３とを備える。
【００１７】
液体クロマトグラフ（ＬＣ）１０は、移動相と分析カラム１４の固定相とに対する試料中の各成分の親和性の違いを利用して、当該成分を分離し異なる保持時間で溶出させる。質量分析計２０により分析対象の脂質分子を分離して検出できるように、所望の精度で当該脂質分子を分離することができれば液体クロマトグラフ１０の種類は限定されない。液体クロマトグラフ１０として、ナノＬＣ、マイクロＬＣ、高速液体クロマトグラフ（ＨＰＬＣ）および超高速液体クロマトグラフ（ＵＨＰＬＣ）等を用いることができる。液体クロマトグラフィでは、インフュージョン分析に比べ、イオン化抑制等が低減されるため、定量精度が高くなる。
【００１８】
移動相容器１１ａおよび１１ｂは、バイアルやボトル等の液体を格納可能な容器を備え、それぞれ異なる組成の移動相を格納する。移動相容器１１ａおよび１１ｂに格納されている移動相をそれぞれ移動相Ａおよび移動相Ｂと呼ぶ。移動相Ａおよび移動相Ｂは、所望の精度で分析対象の脂質分子を分離することができればその組成は特に限定されない。例えば、移動相Ａとしてギ酸アンモニウム水溶液、移動相Ｂとしてアセトニトリルおよびイソプロパノールを体積比で１：１等の所定の割合で含む液体等を用いることができる。
【００１９】
送液ポンプ１２ａおよび１２ｂは、それぞれ移動相Ａおよび移動相Ｂを所定の流量になるように送液する。送液ポンプ１２ａおよび１２ｂからそれぞれ送出された移動相Ａおよび移動相Ｂは、流路の途中で混合され、試料導入部１３へと導入される。送液ポンプ１２ａおよび１２ｂは、それぞれ移動相Ａおよび移動相Ｂの流量を変化させることにより、時間によって分析カラム１４に導入される移動相の組成を変化させる。
【００２０】
試料の導入等の分析の開始に対応する時点からの各時間における、移動相の組成を示すデータをグラジエントデータと呼ぶ。グラジエントデータに基づいて後述の装置制御部５１により送液ポンプ１２ａおよび１２ｂが制御され、設定された組成の移動相が分析カラム１４に導入される。移動相の組成の時間変化は、所望の精度で分析対象の脂質分子を分離することができれば特に限定されない。
【００２１】
試料導入部１３は、オートサンプラー等の試料導入装置を備え、前処理が行われた試料Ｓを移動相に導入する（矢印Ａ１）。試料導入部１３により導入された試料Ｓは、適宜不図示のガードカラムを通過して分析カラム１４に導入される。
【００２２】
分析カラム１４は、固定相を備え、導入された試料Ｓに含まれる分析対象の脂質分子を、移動相と固定相とに対する各脂質分子の親和性の違いを利用して異なる時間に溶出させる。分析カラム１４の種類は、所望の精度で脂質分子を分離することができれば特に限定されないが、逆相カラムが取扱いの容易さや質量分析でのイオン化の容易さの観点から好ましい。分析カラム１４の固定相は、例えばシリカゲル等の担体に担持された、Ｃ８やＣ１８等の直鎖炭化水素が結合されたシランが好ましい。
【００２３】
分析カラム１４から溶出された脂質分子を含む溶出試料は、質量分析計２０のイオン化部２１に導入される。分析カラム１４の溶出液は、分析装置１のユーザー（以下、単に「ユーザー」と呼ぶ）による分注等の操作を必要とせず、オンライン制御により質量分析計２０に入力されることが好ましい。
【００２４】
質量分析計２０は、分析カラム１４から導入された溶出試料に対してタンデム質量分析を行い、分析対象の脂質分子を検出する。溶出試料がイオン化されて得られた、試料Ｓに由来する試料由来イオンＳｉの経路を、一点鎖線の矢印Ａ２により模式的に示した。
【００２５】
質量分析計２０のイオン化部２１は、導入された溶出試料をイオン化する。イオン化の方法は、所望の精度で分析対象の脂質分子が検出される程度に脂質分子がイオン化されれば特に限定されないが、本実施形態のようにＬＣ／ＭＳ／ＭＳを行う場合にはエレクトロスプレー法（ＥＳＩ）が好ましく、以下の実施形態でもＥＳＩを行うものとして説明する。溶出試料がイオン源２１１から出射されイオン化されることにより得られた試料由来イオンＳｉは、イオン化室２１と第１真空室２２ａとの間の圧力差等により移動し、キャピラリ２１２を通過して第１真空室２２ａに入射する。
【００２６】
第１真空室２２ａ、第２真空室２２ｂおよび第３真空室２２ｃは、この順に真空度が高くなっており、不図示の真空ポンプにより、第３真空室２２ｃでは例えば１０−２Ｐａ以下等の高真空まで排気されている。第１真空室２２ａに入射した試料由来イオンＳｉは、イオンレンズ２２１を通過して第２真空室２２ｂに導入される。第２真空室２２ｂに入射した試料由来イオンＳｉは、イオンガイド２２２の間を通過して第３真空室２２ｃに導入される。第３真空室２２ｃに導入された試料由来イオンＳｉは、第１質量分離部２３へと出射される。第１質量分離部２３に入射するまでの間に、イオンレンズ２２１やイオンガイド２２２等は、通過する試料由来イオンＳｉを電磁気学的作用により収束させる。
【００２７】
第１質量分離部２３は、四重極マスフィルタを備え、四重極マスフィルタに印加される電圧に基づく電磁気学的作用により設定されたｍ／ｚを有する試料由来イオンＳｉをプリカーサーイオンとして選択的に通過させてコリジョンセル２４に向けて出射する。第１質量分離部２３は、試料由来イオンＳｉに含まれるイオン化された分析対象の脂質分子をプリカーサーイオンとして選択的に通過させる。
【００２８】
コリジョンセル２４は、イオンガイド２４０により試料由来イオンＳｉの移動を制御しながら、衝突誘起解離（Ｃｏｌｌｉｓｉｏｎ  Ｉｎｄｕｃｅｄ  Ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ；ＣＩＤ）によりイオン化された分析対象の脂質分子を解離させ、フラグメントイオンを生成する。ＣＩＤの際に試料由来イオンＳｉが衝突させられるアルゴンや窒素等を含むガス（以下、ＣＩＤガスと呼ぶ）は、コリジョンセル内で所定の圧力になるようにＣＩＤガス導入口２４１から導入される（矢印Ａ３）。生成されたフラグメントイオンを含む試料由来イオンＳｉは、第２質量分離部２５に向けて出射される。
なお、フラグメントイオンが検出可能であれば、解離の方法はＣＩＤに限定されない。
【００２９】
第２質量分離部２５は、四重極マスフィルタを備え、四重極マスフィルタに印加される電圧に基づく電磁気学的作用により、設定されたｍ／ｚを有する試料由来イオンＳｉをプロダクトイオンとして選択的に通過させて検出部３０に向けて出射する。第２質量分離部２５は、試料由来イオンＳｉに含まれる、分析対象の脂質分子のフラグメントイオンを選択的に通過させる。
【００３０】
検出部３０は、二次電子増倍管や光電子増倍管等のイオン検出器を備え、入射した分析対象の脂質分子のフラグメントイオンを含む試料由来イオンＳｉを検出する。検出モードは正イオンを検出する正イオンモードと、負イオンを検出する負イオンモードとのいずれでもよい。試料由来イオンＳｉを検出して得た検出信号は不図示のＡ／Ｄ変換器によりＡ／Ｄ変換され、デジタル信号となって情報処理部４０の制御部５０に測定データとして入力される（矢印Ａ４）。
【００３１】
情報処理部４０は、電子計算機等の情報処理装置を備え、適宜ユーザーとのインターフェースとなる他、様々なデータに関する通信、記憶、演算等の処理を行う。情報処理部４０は、測定部１００の制御や、解析、表示の処理を行う処理装置となる。
なお、情報処理部４０は、液体クロマトグラフ１０および／または質量分析計２０と一体になった一つの装置として構成してもよい。また、本実施形態の分析方法に用いるデータの一部は遠隔のサーバ等に保存してもよく、当該分析方法で行う演算処理の一部は遠隔のサーバ等で行ってもよい。測定部１００の各部の動作の制御は、情報処理部４０が行ってもよいし、各部を構成する装置がそれぞれ行ってもよい。
【００３２】
情報処理部４０の入力部４１は、マウス、キーボード、各種ボタンおよび／またはタッチパネル等の入力装置を含んで構成される。入力部４１は、検出する試料由来イオンＳｉのｍ／ｚの値等の制御部５０が行う処理に必要な情報等を、ユーザーから受け付ける。
【００３３】
情報処理部４０の通信部４２は、インターネット等のネットワークを介して無線や有線の接続により通信可能な通信装置を含んで構成される。通信部４２は、測定部１００の測定に必要なデータを受信したり、解析部５２の解析結果等の制御部５０が処理したデータを送信したり、適宜必要なデータを送受信する。
【００３４】
情報処理部４０の記憶部４３は、不揮発性の記憶媒体を備える。記憶部４３は、測定部１００から出力された測定データ、および制御部５０が処理を実行するためのプログラム等を記憶する。
【００３５】
情報処理部４０の出力部４４は、出力制御部５３により制御され、液晶モニタ等の表示装置および／またはプリンターを含んで構成され、測定部１００の測定に関する情報や、解析部５２の解析結果等を、表示装置に表示したり印刷媒体に印刷して出力する。
【００３６】
情報処理部４０の制御部５０は、ＣＰＵ等のプロセッサを含んで構成される。制御部５０は、測定部１００の制御や、測定部１００から出力された測定データを解析する等、記憶部４３等に記憶されたプログラムを実行することにより各種処理を行う。
【００３７】
処理部５０の装置制御部５１は、入力部４１を介した入力等に応じて設定された分析条件等に基づいて、測定部１００の測定動作を制御する。
【００３８】
解析部５２は、測定部１００から出力された測定データに基づいて試料Ｓの酸化度の解析や、分析対象の脂質分子の定量等の解析を行う。
【００３９】
解析部５２のクロマトグラム作成部５２１は、マスクロマトグラムに対応するマスクロマトグラムデータを作成する。マスクロマトグラムデータでは、保持時間と、当該保持時間におけるそれぞれの分析対象の脂質分子のフラグメントイオンに対応する検出強度とが対応している。クロマトグラム作成部５２１は、作成されたマスクロマトグラムデータを記憶部４３に記憶させる。
【００４０】
解析部５２の酸化度解析部５２２は、検出されたコレステリルエステルのフラグメントイオン（以下、非過酸化体イオンと呼ぶ）の強度と、検出されたコレステリルエステル過酸化物のフラグメントイオン（以下、過酸化体イオンと呼ぶ）の強度との比に基づいて、試料Ｓの酸化度の解析を行う。これらの強度としては、非過酸化体イオンおよび過酸化体イオンのピークに対応するピーク強度またはピーク面積（すなわち、ピークにおける積算された強度）の値を用いることが好ましいが、特に限定されず、非過酸化体イオンおよび過酸化体イオンに対応する検出信号の大きさを示す任意の統計値等を用いることができる。ここで、ピーク強度とは、ピークにおける最大強度を指す。酸化度解析部５２２は、ピーク強度およびピーク面積等の統計値を、適宜スムージングやバックグラウンドの除去等のノイズを低減する処理を行って算出することが好ましい。
【００４１】
質量分析計２０により質量分析され、酸化度の解析に用いるコレステリルエステルおよびコレステリルエステル過酸化物は、特に限定されないが、炭素数が１８のアシル基を有するものが好ましく、炭素数が１８で炭素間に２または３か所の二重結合を備えるアシル基を有するものがより好ましい。酸化度解析部５２２は、炭素数および炭素間の二重結合の数が同一のアシル基を有するコレステリルエステルについて、非過酸化体イオンの強度と過酸化体イオンの強度との比に基づいて酸化度の解析を行うことが好ましい。これにより、同一の構成を有する分子について非過酸化体と過酸化体を定量して酸化度を解析するため、より正確に酸化度を解析することができる。
なお、酸化度の解析に用いるコレステリルエステルおよびコレステリルエステル過酸化物としては、検出された複数のコレステリルエステルにそれぞれ対応する複数のフラグメントイオンの強度の和と、検出された複数のコレステリルエステル過酸化物にそれぞれ対応する複数のフラグメントイオンの強度の和との比に基づいて試料Ｓの酸化度の解析を行ってもよい。
【００４２】
酸化度解析部５２２は、過酸化体イオンの強度を、非過酸化体イオンの強度で割った比率（以下、酸化度比率と呼ぶ）を、試料Ｓの酸化度の指標（以下、酸化度指標と呼ぶ）として算出する。酸化度指標の値が大きい程、試料Ｓの酸化度が高いものと解釈される。
なお、酸化度指標は、酸化度比率に基づけば、酸化度比率の値そのものでなくともよい。また、非過酸化体イオンの強度を、過酸化体イオンの強度で割った比率を酸化度比率にしてもよい。この場合、酸化度指標が大きい程、試料Ｓの酸化度が低いものと解釈される。このように、酸化度指標は試料Ｓの酸化度と対応付けて適宜設定される。
【００４３】
酸化度解析部５２２は、酸化度指標と、所定の閾値（以下、酸化度閾値と呼ぶ）とに基づいて、試料Ｓの酸化度を評価する。酸化度閾値は、特に限定されず、適宜任意の値に設定することができる。例えば、２つの酸化度閾値が０．５および２．０であり、酸化度解析部５２２は、酸化度指標が０．５未満であれば試料Ｓの品質が高く、０．５以上２．０未満であれば試料Ｓの品質は中程度で、２．０以上であれば試料Ｓの品質が低いと評価することができる。酸化度閾値の個数は特に限定されず、１つでもよいし、３以上でもよい。酸化度閾値の値は、酸化度と試料の品質との関係を示すデータや理論等から適宜予め設定され、記憶部４３等に記憶されている。酸化度解析部５２２は、算出した酸化度指標や、試料の品質の上記評価を示す情報（品質の「低」「中」および「高」等）を記憶部４３に記憶させる。
【００４４】
解析部５２の規格化部５２３は、分析対象の脂質分子のフラグメントイオンに対応する強度を、規格化因子により割って規格化された強度（以下、規格化強度と呼ぶ）を算出する。規格化部５２３は、規格化因子として、後述の実施例で血液試料の長期保管における変動量の少なかった以下の物質（以下、非変動物質と呼ぶ）に対応する、フラグメントイオン等の検出されたイオン（以下、非変動イオンと呼ぶ）の強度を用いる。この場合も、当該強度としてピーク強度やピーク面積等の統計値を適宜用いることができる。
【００４５】
上記非変動物質は、炭素数が１８で炭素間に１か所の二重結合を備えるアシル基を備えるコレステリルエステル、炭素数が２０で炭素間に５か所の二重結合を備えるアシル基を備えるコレステリルエステル、炭素数が２０で炭素間に５か所の二重結合を備えるアシル基を備えるリゾホスファチジルコリン、炭素数の合計が３２で炭素間の二重結合の数の合計が１の２つのアシル基を備えるホスファチジルコリン、炭素数の合計が３４で炭素間の二重結合の数の合計が１の２つのアシル基を備えるホスファチジルコリン、炭素数の合計が３６で炭素間の二重結合の数の合計が２の２つのアシル基を備えるホスファチジルコリン、炭素数の合計が３８で炭素間の二重結合の数の合計が４の２つのアシル基を備えるホスファチジルコリン、炭素数の合計が３４で炭素間の二重結合の数の合計が２の２つのアシル基を備えるホスファチジルエタノールアミン、炭素数の合計が３６で炭素間の二重結合の数の合計が２の２つのアシル基を備えるホスファチジルエタノールアミンおよび炭素数の合計が３８で炭素間の二重結合の数の合計が４の２つのアシル基を備えるホスファチジルエタノールアミンからなる群から選択される少なくとも一つであることが好ましい。これにより、試料Ｓの保管の際に変動が少ない分子を基準にして、試料Ｓの各成分に対応する試料由来イオンＳｉを定量するため、異なる試料間で脂質濃度が異なっていた場合にも、定量的な比較が可能となる。
【００４６】
上記非変動物質において、炭素数の合計が３２で炭素間の二重結合の数の合計が１の２つのアシル基を備えるホスファチジルコリンは、炭素数が１６で炭素間の二重結合の数が０のアシル基と、炭素数が１６で炭素間の二重結合の数が１のアシル基とを含むホスファチジルコリンが好ましい。
【００４７】
上記非変動物質において、炭素数の合計が３４で炭素間の二重結合の数の合計が１の２つのアシル基を備えるホスファチジルコリンは、炭素数が１６で炭素間の二重結合の数が０のアシル基と、炭素数が１８で炭素間の二重結合の数が１のアシル基とを含むホスファチジルコリンが好ましい。
【００４８】
上記非変動物質において、炭素数の合計が３６で炭素間の二重結合の数の合計が２の２つのアシル基を備えるホスファチジルコリンは、炭素数が１８の２つのアシル基を含むホスファチジルコリンが好ましい。
【００４９】
上記非変動物質において、炭素数の合計が３８で炭素間の二重結合の数の合計が４の２つのアシル基を備えるホスファチジルコリンは、炭素数が１８で炭素間の二重結合の数が０のアシル基と、炭素数が２０で炭素間の二重結合の数が４のアシル基とを含むホスファチジルコリンが好ましい。
【００５０】
上記非変動物質において、炭素数の合計が３４で炭素間の二重結合の数の合計が２の２つのアシル基を備えるホススファチジルエタノールアミンは、炭素数が１６で炭素間の二重結合の数が０のアシル基と、炭素数が１８で炭素間の二重結合の数が２のアシル基とを含むホスファチジルエタノールアミンが好ましい。
【００５１】
上記非変動物質において、炭素数の合計が３６で炭素間の二重結合の数の合計が２の２つのアシル基を備えるホスファチジルエタノールアミンは、炭素数が１８の２つのアシル基を含むホスファチジルエタノールアミンが好ましい。
【００５２】
上記非変動物質において、炭素数の合計が３８で炭素間の二重結合の数の合計が４の２つのアシル基を備えるホスファチジルエタノールアミンは、炭素数が１８で炭素間の二重結合の数が０のアシル基と、炭素数が２０で炭素間の二重結合の数が４のアシル基とを含むホスファチジルエタノールアミンが好ましい。
【００５３】
規格化部５２３は、質量分析計２０における質量分析において検出された、試料Ｓのそれぞれのコレステリルエステルに対応する試料由来イオンＳｉの強度を、上記非変動物質に含まれるコレステリルエステルに対応する非変動イオンの強度の和を用いて規格化することが好ましい。これにより、異なる試料間でコレステリルエステル全体の濃度が異なっていた場合にも、定量的な比較が可能となる。
【００５４】
規格化部５２３は、質量分析計２０における質量分析において検出された、試料Ｓのそれぞれのリゾリン脂質に対応する試料由来イオンＳｉの強度を、上記非変動物質に含まれるリゾホスファチジルコリンに対応する非変動イオンの強度を用いて規格化することが好ましい。これにより、異なる試料間でリゾホスファチジルコリン等のリゾリン脂質の濃度が異なっていた場合にも、定量的な比較が可能となる。
【００５５】
規格化部５２３は、質量分析計２０における質量分析において検出された、試料Ｓのそれぞれの、複数のアシル基を含むリン脂質に対応する試料由来イオンＳｉの強度を、上記非変動物質に含まれるホスファチジルコリンおよびホスファチジルエタノールアミンに対応する非変動イオンの強度の和を用いて規格化することが好ましい。これにより、異なる試料間でホスファチジルコリンおよびホスファチジルエタノールアミン等の複数のリン脂質を含むリン脂質の濃度が異なっていた場合にも、定量的な比較が可能となる。
なお、規格化部５２３による、非変動物質の検出強度を用いた規格化の方法は特に限定されない。例えば、全ての上記非変動物質に対応する非変動イオンの強度の和を用いて規格化してもよい。これにより、異なる試料間で全体的な脂質濃度が異なっていた場合にも、定量的な比較が可能となる。
【００５６】
非変動物質は、予め設定されており、非変動物質を質量分析する際の、保持時間や、プリカーサーイオンおよびプロダクトイオンとして検出する２つのｍ／ｚの値（以下では、この２つのｍ／ｚの値の組合せを、トランジションと呼ぶ）等の分析条件に関するデータが記憶部４３等に記憶されている。規格化部５２３は、このデータを参照して、クロマトグラム作成部５２１が作成したマスクロマトグラムデータから、非変動物質に対応する検出強度を算出する。
【００５７】
非変動物質が未だ設定されていない等の理由で非変動物質に関するデータが記憶部４３等に記憶されていなかったり、質量分析計２０が、上記非変動物質に対応する非変動イオンを検出しない場合、規格化部５２３は、非変動イオンの強度を用いずに規格化を行う。この場合、規格化部５２３は、試料由来イオンＳｉのうち、リン脂質に対応する、フラグメントイオン等の検出されたイオンの強度の和を算出し、検出されたそれぞれの試料由来イオンＳｉの強度を、この和で割って規格化し、規格化された強度（以下、この場合も規格化強度と呼ぶ）を算出する。ここで、このリン脂質は、リゾリン脂質と、アシル基を複数含むリン脂質とを含むことが好ましい。これにより、試料Ｓの保管中に、アシル基を複数含むリン脂質から脂肪酸が脱離してリゾリン脂質になったり、リゾリン脂質に脂肪酸が結合してリゾリン脂質ではなくなった場合にも、規格化因子の値が変動しないために、より安定的に脂質濃度を反映した規格化を行うことができる。
なお、非変動物質を用いる規格化が可能な場合にも、リン脂質に対応するイオンの強度の和を用いて規格化したデータを作成し、これを用いた解析を行ってもよい。
【００５８】
上記のような非変動物質を探索して選択する方法では、同一の試料Ｓに対し、所定の時間を隔てて少なくとも２度の質量分析が行われた際、リン脂質に対応するイオンの強度の和を用いて規格化された強度の変動が所定の割合以下であったイオンに対応する物質を非変動物質として選択することができる。上記所定の時間は、１ヶ月以上、１年以上等、適宜設定される。上記所定の割合は、２０％以下、１５％以下、１０％以下等、適宜設定される。
【００５９】
解析部５２は、酸化度解析部５２２が算出した酸化度指標や、試料Ｓの品質の評価を示す情報に基づいて、試料Ｓの質量分析により得られた測定データを解析する。例えば、解析部５２は、試料Ｓの品質の評価が低い場合、信頼性が低いため一部の解析を行わないことができる。
【００６０】
出力制御部５３は、測定部１００の測定条件および／または解析部５２の解析結果等についての情報等を含む出力画像を作成し、出力部４４に出力させる。出力制御部５３は、酸化度指標、または酸化度指標に基づく試料Ｓの酸化度を示す情報を含む出力画像を作成し、出力部４４に出力させる。
【００６１】
図２から図４までは、本実施形態の分析方法の流れを示すフローチャートである。図２は、非変動物質を探索し設定するための質量分析（以下、非変動物質探索質量分析と呼ぶ）の流れを示すフローチャートであり、図３および図４は、設定された非変動物質に基づく規格化因子を用いて解析を行う分析方法の流れを示すフローチャートである。非変動物質が既知であれば、図２のフローチャートの各工程は行わなくてもよい。
なお、図２から図４までの各質量分析は、異なる分析装置により行われてもよい。
【００６２】
ステップＳ１００１（図２）において、医療従事者等により、生体から血液が取得される。ステップＳ１００１が終了したら、ステップＳ１００３が開始される。ステップＳ１００３において、医療従事者、分析者またはユーザー等により、取得された血液の一部が保管され、血液の他の一部に対して前処理が行われ、試料Ｓが調製される。ステップＳ１００３が終了したら、ステップＳ１００５が開始される。
【００６３】
ステップＳ１００５において、試料導入部１３は、試料Ｓを液体クロマトグラフ１０に導入し、試料Ｓが液体クロマトグラフィに供される。ステップＳ１００５が終了したら、ステップＳ１００７が開始される。ステップＳ１００７において、質量分析計２０は、液体クロマトグラフィに供された試料Ｓの質量分析（非変動物質探索質量分析）を行い、試料Ｓのそれぞれの成分に対応する試料由来イオンＳｉを検出する。ステップＳ１００７が終了したら、ステップＳ１００９が開始される。
【００６４】
ステップＳ１００９において、規格化部５２３は、試料由来イオンＳｉのうち、リン脂質に対応するイオンの強度の和を算出する。ステップＳ１００９が終了したら、ステップＳ１０１１が開始される。ステップＳ１０１１において、検出されたそれぞれの試料由来イオンＳｉの強度を、ステップＳ１００９で算出した和により規格化し、それぞれの試料由来イオンＳｉの規格化強度を算出する。ステップＳ１０１１が終了したら、ステップＳ１０１３が開始される。
【００６５】
ステップＳ１０１３において、医療従事者、分析者またはユーザー等により、ステップＳ１００３で保管した血液について、所定の期間経過後、前処理が行われ試料Ｓが調製される。ステップＳ１０１３が終了したら、ステップＳ１０１５が開始される。ステップＳ１０１５において、分析装置１は、ステップＳ１０１５で調製された試料Ｓについて、ステップＳ１００５〜Ｓ１０１１と同様に液体クロマトグラフィおよび非変動物質探索質量分析を行い、試料由来イオンＳｉの規格化強度を算出する。ステップＳ１０１５が終了したら、ステップＳ１０１７が開始される。
【００６６】
ステップＳ１０１７において、解析部５２は、ステップＳ１０１１で算出された規格化強度とステップＳ１０１５で算出された規格化強度とを比較し、変動が所定の割合以下の物質を非変動物質として選択し、記憶部４３は、非変動物質の保持時間および非変動物質を質量分析する際のトランジションを記憶する。ステップＳ１０１７が終了したら、非変動物質の探索処理が終了され、ステップＳ２００１が開始され、非変動物質に基づく規格化因子を用いた分析が行われる。
【００６７】
ステップＳ２００１（図３）において、医療従事者等により、生体から血液が取得される。ステップＳ２００１が終了したら、ステップＳ２００３が開始される。当該生体は、ステップＳ１００１で血液を取得した個体と異なる個体でもよいし同一の個体でもよい。ステップＳ２００３において、医療従事者、分析者またはユーザー等により、取得された血液に対して前処理が行われ、試料Ｓが調製される。ステップＳ２００３が終了したら、ステップＳ２００５が開始される。
【００６８】
ステップＳ２００５において、試料導入部１３は、試料Ｓを液体クロマトグラフ１０に導入し、試料Ｓが液体クロマトグラフィに供される。ステップＳ２００５が終了したら、ステップＳ２００７が開始される。ステップＳ２００７において、質量分析計２０は、液体クロマトグラフィに供された試料Ｓの質量分析を行い、コレステリルエステルおよびコレステリルエステル過酸化物、ならびに非変動物質を含む、試料Ｓのそれぞれの成分に対応する試料由来イオンＳｉを検出する。ステップＳ２００７が終了したら、ステップＳ２００９が開始される。
【００６９】
ステップＳ２００９において、酸化度解析部５２２は、検出された、コレステリルエステルに対応するイオンの強度と、コレステリルエステル過酸化物に対応するイオンの強度とのいずれか一方を他方で割った酸化度比率に基づいて試料Ｓの酸化度を示す酸化度指標を算出する。ステップＳ２００９が終了したら、ステップＳ２０１１が開始される。
【００７０】
ステップＳ２０１１において、規格化部５２３は、非変動物質に基づく規格化因子を用いて、試料Ｓのそれぞれの成分の規格化強度を算出する。
【００７１】
図４は、ステップＳ２０１１の流れを示すフローチャートである。ステップＳ２０１１−１において、規格化部５２３は、非変動物質に該当するコレステリルエステルに対応する強度の和を算出する。ステップＳ２０１１−１が終了したらステップＳ２０１１−２が開始される。ステップＳ２０１１−２において、規格化部５２３は、検出されたそれぞれのコレステリルエステルに対応する試料由来イオンＳｉの強度を、ステップＳ２０１１−１で算出された和により規格化し、それぞれのコレステリルエステルに対応する試料由来イオンＳｉの規格化強度を算出する。ステップＳ２０１１−２が終了したら、ステップＳ２０１１−３が開始される。
【００７２】
ステップＳ２０１１−３において、規格化部５２３は、非変動物質に該当するリゾホスファチジルコリンに対応する強度を算出する。ステップＳ２０１１−３が終了したらステップＳ２０１１−４が開始される。ステップＳ２０１１−４において、規格化部５２３は、検出されたそれぞれのリゾリン脂質に対応する試料由来イオンＳｉの強度を、ステップＳ２０１１−３で算出された強度により規格化し、それぞれのリゾリン脂質に対応する試料由来イオンＳｉの規格化強度を算出する。ステップＳ２０１１−４が終了したら、ステップＳ２０１１−５が開始される。
【００７３】
ステップＳ２０１１−５において、規格化部５２３は、非変動物質に該当するホスファチジルコリンおよびホスファチジルエタノールアミンに対応する強度の和を算出する。ステップＳ２０１１−５が終了したらステップＳ２０１１−６が開始される。ステップＳ２０１１−６において、規格化部５２３は、検出された、複数のアシル基を含むそれぞれのリン脂質に対応する試料由来イオンＳｉの強度を、ステップＳ２０１１−５で算出された和により規格化し、それぞれの当該リン脂質に対応する試料由来イオンＳｉの規格化強度を算出する。ステップＳ２０１１−６が終了したら、ステップＳ２０１３が開始される。
なお、コレステリルエステル、リゾリン脂質および上記リン脂質についての試料由来イオンＳｉの強度を規格化する順番は特に限定されない。
【００７４】
図３に戻って、ステップＳ２０１３において、解析部５２は、酸化度指標または酸化度指標に基づく試料Ｓの酸化度についての情報、およびステップＳ２０１１で算出された規格化強度を用いて試料Ｓの解析を行う。ステップＳ２０１３が終了したら、ステップＳ２０１５が開始される。ステップＳ２０１５において、出力部４４は、ステップＳ２０１３で行った解析で得られた情報を表示する。ステップＳ２０１５が終了したら、処理が終了される。
【００７５】
上述の実施の形態によれば、次の作用効果が得られる。
（１）本実施形態の分析方法は、試料Ｓを、液体クロマトグラフィに供することと、液体クロマトグラフィに供された試料Ｓの質量分析を行い、コレステリルエステルに対応する非過酸化体イオンと、コレステリルエステル過酸化物に対応する過酸化体イオンとを検出することと、検出された非過酸化体イオンの強度と、検出された過酸化体イオンの強度との比に基づいて、試料Ｓの酸化度の解析を行うことと、を備える。これにより、質量分析を用いて試料Ｓの酸化度を定量的に評価し、保管された試料Ｓの品質を評価することができる。
【００７６】
（２）本実施形態の分析方法および分析装置１において、酸化度解析部５２２は、非過酸化体イオンの強度と、過酸化体イオンの強度とのいずれか一方を他方で割った酸化度比率に基づいて試料Ｓの酸化度を示す酸化度指標を算出することができる。これにより、指標を用いて定量的に試料Ｓの酸化度を比較することができる。
【００７７】
（３）本実施形態の分析方法および分析装置１において、出力部４４は、酸化度指標、または酸化度指標に基づく試料Ｓの酸化度を示す情報を出力する。これにより、試料Ｓの酸化度を定量的な値に基づいてわかりやすくユーザー等に伝えることができる。
【００７８】
（４）本実施形態の分析方法および分析装置１において、解析部５２は、酸化度指標に基づいて、試料Ｓの質量分析により得られた測定データを解析する。これにより、試料Ｓの酸化度等の品質に基づいて、より精密に測定データを解析することができる。
【００７９】
（５）本実施形態の分析方法および分析装置１において、規格化部５２３は、質量分析において検出された、試料Ｓのそれぞれの成分に対応する試料由来イオンＳｉの強度を、予め設定された非変動物質に対応するイオンの強度を用いて規格化する。これにより、異なる試料Ｓにおいて脂質濃度が異なる場合にも、分析対象の脂質分子の量を定量的に比較することができる。
【００８０】
（６）本実施形態の分析方法は、同一の試料Ｓに対し、所定の時間を隔てて少なくとも２度の非変動物質探索質量分析が行なわれた際、規格化強度の変動が所定の割合以下であった非変動イオンを、その後の質量分析により検出し、当該質量分析により検出されたそれぞれの試料由来イオンＳｉの強度を、上記非変動イオンの強度を用いて規格化することを備える。これにより、実際の質量分析で得られた非変動物質に基づいて、異なる試料Ｓにおいて脂質濃度が異なる場合にも、分析対象の脂質分子の量を定量的に比較することができる。
【００８１】
（７）本実施形態の分析方法において、試料Ｓは、血液の状態で保管された試料である。これにより、迅速、簡便に採取可能であり、多種多様な成分を含む血液における脂質分子の解析により、多くの知見を得られることができる。
【００８２】
（８）本実施形態の分析装置は、試料Ｓを導入する試料導入部１３と、試料Ｓを分離する液体クロマトグラフ１０と、液体クロマトグラフ１０で分離された試料Ｓの質量分析を行い、非過酸化体イオンと、過酸化体イオンとを検出する質量分析部（質量分析計２０）と、検出された非過酸化体イオンの強度と、検出された過酸化体イオンの強度との比に基づいて、試料Ｓの酸化度の解析を行う酸化度解析部５２２と、を備える。これにより、質量分析を用いて試料Ｓの酸化度を定量的に評価し、保管された試料Ｓの品質を評価することができる。
【００８３】
次のような変形も本発明の範囲内であり、上述の実施形態と組み合わせることが可能である。以下の変形例において、上述の実施形態と同様の構造、機能を示す部位に関しては、同一の符号で参照し、適宜説明を省略する。
（変形例１）
上述の実施形態では、質量分析計２０は２つの四重極マスフィルタにより質量分離を行うタンデム質量分析計としたが、質量分析計２０の構成、質量分析計２０の種類や質量分析の方法は、試料Ｓ中の分析対象の脂質分子に対応する試料由来イオンＳｉを所望の精度で検出可能であれば特に限定されない。例えば、試料Ｓが付着した探針に高電圧を印加してイオン化を行う探針エレクトロスプレー法により試料Ｓのイオン化を行ってもよい。探針エレクトロスプレー法の詳細については、国際公開第２０１０／０４７３９９号を参照されたい。
【００８４】
（変形例２）
上述の実施形態では、コレステリルエステルに対応する検出されたイオンの強度と、コレステリルエステル過酸化物に対応する検出されたイオンの強度との比に基づいて酸化度指標を算出した。しかし、コレステリルエステルに対応する検出されたイオンの強度と、コレステリルエステル水酸化物またはコレステリルサルフェートに対応する検出されたイオンの強度との比に基づいて酸化度指標を算出してもよい。コレステリルエステル水酸化物およびコレステリルサルフェートは、酸化された試料において顕著な増加が観察されているため、酸化度指標として適切に用いることができる。
【００８５】
（変形例３）
上述の実施形態において、複数の検出されたイオンの強度の和により規格化因子を算出する際に、炭素数が２０で炭素間の二重結合の数が４のアシル基を備える分子に対応する、フラグメントイオン等の検出されたイオンの強度をこの和に含めないようにしてもよい。この分子は、アラキドン酸に対応するアシル基を備えるものであることが好ましい。人間等の生体に感染や外傷等が起きると、アラキドン酸は酵素（ＰＬＡ２）によりリン脂質から切り出される。従って、アトピー性皮膚炎やぜんそく等のアレルギー性疾患または糖尿病等の、慢性的に炎症が起きている疾患をはじめとして、様々な疾患により、リン脂質におけるアラキドン酸の量が減少する可能性がある。従って、規格化因子にアラキドン酸またはアラキドン酸に対応するアシル基（以下、「アラキドン酸等」と呼ぶ）を含む分子に対応するイオンの強度を含めないことで、より安定な規格化因子を用いて精密に分析対象の脂質分子の解析を行うことができる。
【００８６】
例えば、規格化部５２３が、リゾリン脂質を含むリン脂質に対応するイオンの強度の和により規格化因子を算出する際は、このリン脂質にアラキドン酸等を含むリン脂質を含めないようにすることができる。他の例として、規格化部５２３は、上述の非変動物質のうちアラキドン酸等を含まないもの、すなわち、炭素数が１８で炭素間に１か所の二重結合を備えるアシル基を備えるコレステリルエステル、炭素数が２０で炭素間に５か所の二重結合を備えるアシル基を備えるコレステリルエステル、炭素数が２０で炭素間に５か所の二重結合を備えるアシル基を備えるリゾホスファチジルコリン、炭素数の合計が３２で炭素間の二重結合の数の合計が１の２つのアシル基を備えるホスファチジルコリン、炭素数の合計が３４で炭素間の二重結合の数の合計が１の２つのアシル基を備えるフォスファチジルコリン、炭素数の合計が３６で炭素間の二重結合の数の合計が２の２つのアシル基を備えるホスファチジルコリン、炭素数の合計が３４で炭素間の二重結合の数の合計が２の２つのアシル基を備えるホスファチジルエタノールアミンおよび炭素数の合計が３６で炭素間の二重結合の数の合計が２の２つのアシル基を備えるホスファチジルエタノールアミンからなる群から選択される少なくとも一つに対応するイオンの強度を用いて規格化することができる。
【００８７】
解析部５２は、アラキドン酸等を含む分子に対応する、フラグメントイオン等の検出されたイオンの強度を用いて、試料Ｓが健常人由来か、慢性炎症等の疾患を有する人間由来かを判定し、出力制御部５３は、当該判定に関する情報を出力部４４に出力させてもよい。解析部５２は、予め取得された、健常人から取得した試料における検出強度と、慢性炎症等の疾患を有する人間から取得した試料における検出強度とに基づいた閾値に基づいて、この判定を行う。アラキドン酸等を含む分子に対応するイオンの強度は、適宜上述の規格化因子により規格化された値を用いることができる。
【００８８】
本変形例の分析方法において、試料由来イオンＳｉは、炭素数が２０で炭素間の二重結合の数が４の脂肪酸またはアシル基を含む脂質分子を含み、解析部５２は、脂質分子に対応するイオンの規格化された強度に基づいて試料Ｓが健常者から取得されたものか否かを判定する。これにより、試料Ｓが由来する生体の健康状態を分析でき、また、採取されたときの生体の健康状態の観点から試料Ｓの品質の評価を行うことができる。
【００８９】
本発明は上記実施形態の内容に限定されるものではない。本発明の技術的思想の範囲内で考えられるその他の態様も本発明の範囲内に含まれる。
【実施例】
【００９０】
以下の実施例では、人間から採取した血液の一部を２０１７年３月に質量分析し、他の一部を冷蔵保存して２０１８年３月に質量分析し、血液中の成分の変動を分析した実験結果と、２０１７年５月に各化合物のアシル基の構成を分析した実験結果とが説明される。
なお、本発明は、以下の実施例に示された数値、条件に限定されない。【００９１】
（２０１７年３月および２０１８年３月に行った質量分析）
前処理
全血５μＬに５００μＬのメタノールを加え、数分撹拌して脂質成分を抽出した後、遠心分離を行い、上清１μＬを採取して液体クロマトグラフ‐質量分析計へ導入する試料とした。【００９２】
液体クロマトグラフィの条件
試料を、以下の条件で液体クロマトグラフィで分離した。
システム：  ＬＣＭＳ−８０６０（島津製作所）
分析カラム：  Ｋｉｎｅｔｅｘ  Ｃ８（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ）（内径２．１ｍｍ、長さ１５０ｍｍ、粒径２．６μｍ）
注入量：  ３μＬ
カラム温度：  ４５℃
移動相：
（Ａ）２０ｍＭギ酸アンモニウム水溶液
（Ｂ）アセトニトリルとイソプロパノールを体積比１：１の割合で混合した溶液
流速：  ０．３ｍＬ／ｍｉｎ
グラジエントプログラム：
時間（分）        移動相Ｂの濃度（％）
０                ２０
１                ２０
２                ４０
２５              ９２．５
移動相Ｂの濃度は、ジアシルリン脂質の溶出時間において成分間の溶出時間差を大きくするため、２分から２５分にかけて、時間に対して非線形に変化させた。【００９３】
質量分析の条件
上記液体クロマトグラフィにおいて溶出された溶出試料を、溶出口に直接接続したタンデム質量分析により検出した。
システム：  ＬＣＭＳ−８０６０（島津製作所）
イオン化の方法：  エレクトロスプレー法、正イオンモード／負イオンモード
測定モード：  多重反応モニタリング（ＭＲＭ）
温度：
脱溶媒管（Ｄｅｓｏｌｖａｔｉｏｎ  Ｌｉｎｅ；ＤＬ）温度：  ２５０℃
ヒートブロック温度：  ４００℃
インターフェイス温度（イオン化部の周囲の加熱ガスの温度に対応）：  −
インターフェイス電圧（キャピラリ先端からＤＬ入口に印加される電圧）：１．０ｋＶ
ガス流量：
ネブライザーガス流量：  ２．０Ｌ／ｍｉｎ
ドライングガス流量：  １０．０Ｌ／ｍｉｎ
ヒーティングガス流量：  １０．０Ｌ／ｍｉｎ【００９４】
溶出試料に含まれる各化合物の保持時間と、トランジションと、各トランジションにおけるピーク強度と、当該ピーク強度を、検出されたリゾリン脂質を含むリン脂質のピーク強度の和で割って得られた規格化強度とを以下の表Ａおよび表Ｂに示した。なお、表Ａが２０１７年３月の質量分析、表Ｂが２０１８年３月の質量分析についてのものである。表Ｂについては、２０１７年３月の質量分析での規格化強度に対する、２０１８年３月の質量分析での規格化強度の増加率をさらに示した。【００９５】
化合物名において、ＣＥはコレステリルエステル、Ｃｈｏｌはコレステロール、Ｃｈｏｌ＿ｓｕｌｆａｔｅはコレステロールサルフェート、ＬＰＣはリゾホスファチジルコリン、ＬＰＥはリゾホスファチジルエタノールアミン、ＰＣはホスファチジルコリン、ＰＥはホスファチジルエタノールアミン、ＰＳはホスファチジルセリンを指す。さらに、化合物名におけるｘ：ｙの記載において、ｘは各化合物が含むアシル基の炭素数の合計を示し、ｙは各化合物が含むアシル基における、炭素間の二重結合の数の合計を示す。ＣＥ１８：２−ＯＨは、炭素数が１８で炭素間の二重結合が２個のアシル基を備えるコレステリルエステル水酸化物である。ＣＥ１８：２−ＯＯＨは、炭素数が１８で炭素間の二重結合が２個のアシル基を備えるコレステリルエステル過酸化物である。ＣＥ１８：３−ＯＯＨは、炭素数が１８で炭素間の二重結合が３個のアシル基を備えるコレステリルエステルの過酸化物である。【００９６】
トランジションの記載では、「＞」の左側にプリカーサーイオンのｍ／ｚを、「＞」の右側にプロダクトイオンのｍ／ｚを示した。【００９７】
【表１】
2019235011.tif 000003
【００９８】
【表２】
2019235011.tif 000004
【００９９】
【表３】
2019235011.tif 000005
【０１００】
【表４】
2019235011.tif 000006
【０１０１】
【表５】
2019235011.tif 000007
【０１０２】
【表６】
2019235011.tif 000008
【０１０３】
なお、上述のリゾリン脂質を含むリン脂質に対応するピーク強度の和には、ＰＣ（３４：２）（ＩＤ８）は強度が飽和したために加えていない。【０１０４】
図５および図６には、分析対象とした分子の一部について、それぞれ２０１７年３月および２０１８年３月の質量分析で取得されたマスクロマトグラムを示した。図５および図６のマスクロマトグラムの中に、保持時間が１７．５分の付近のピークを拡大したマスクロマトグラムＭｉを示している。これらのマスクロマトグラムには、コレステリルエステル（ＣＥ）と、コレステリルエステル過酸化物（ＣＥ−ＯＯＨ）と、リン脂質（ＰＬｓ）と、リゾリン脂質（ＬＰＬｓ）に対応するピークが観察されている。表ＢにおけるＩＤ２、ＩＤ１２、ＩＤ６８よび６９から示されるように、試料中のコレステリルエステルの量に対するコレステリルエステル過酸化物の量は、約１年の保存により大きく増加した。コレステロールサルフェートおよびコレステリルエステル水酸化物についても、約１年の保存による増加が観察された（ＩＤ６６および６７）。【０１０５】
表Ｂに示されたように、ＩＤ＃２３〜３６に対応する各化合物は、２０１７年３月の質量分析における規格化強度に対する、２０１８年３月の質量分析における規格化強度の変動の割合が１５％以下であり、１年以上の冷蔵保存でも変動の少ない化合物と考えられた。【０１０６】
図７（Ａ）および図７（Ｂ）は、それぞれ２０１７年３月および２０１８年３月の質量分析において取得されたマスクロマトグラムのうち、（ａ）コレステリルエステル（１８：１）（ＩＤ３６）および（ｂ）コレステリルエステル（２０：５）（ＩＤ２３）に対応するピークを拡大して示したものである。【０１０７】
図８（Ａ）および図８（Ｂ）は、それぞれ２０１７年３月および２０１８年３月の質量分析において取得されたマスクロマトグラムのうち、リゾホスファチジルコリン（２０：５）（ＩＤ３３）に対応するピークを拡大して示したものである。【０１０８】
図９および図１０は、それぞれ２０１７年３月および２０１８年３月の質量分析において取得されたマスクロマトグラムのうち、（ａ）ホスファチジルコリン（３２：１）（ＩＤ２８）、（ｂ）ホスファチジルコリン（３４：１）（ＩＤ３４）、（ｃ）ホスファチジルコリン（３６：２）（ＩＤ３５）およびホスファチジルコリン（３８：４）（ＩＤ３２）に対応するピークを拡大して示したものである。【０１０９】
図１１および図１２は、それぞれ２０１７年３月および２０１８年３月の質量分析において取得されたマスクロマトグラムのうち、（ａ）ホスファチジルエタノールアミン（３４：２）（ＩＤ３１）、（ｂ）ホスファチジルエタノールアミン（３６：２）（ＩＤ２４）および（ｃ）ホスファチジルエタノールアミン（３８：４）（ＩＤ２５）に対応するピークを拡大して示したものである。【０１１０】
（２０１８年５月に行った質量分析）
冷蔵保存された上記試料に対し、以下の分析条件でＬＣ／ＭＳを行った。
液体クロマトグラフィの条件
システム：  ＬＣＭＳ−８０６０（島津製作所）
分析カラム：  Ｋｉｎｅｔｅｘ  Ｃ８（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ）（内径２．１ｍｍ、長さ１５０ｍｍ、粒径２．６μｍ）
カラム温度：  ５０℃
移動相：
（Ａ）２０ｍＭギ酸アンモニウム水溶液
（Ｂ）アセトニトリルとイソプロパノールを体積比１：１の割合で混合した溶液
流速：  ０．４ｍＬ／ｍｉｎ
グラジエントプログラム：
時間（分）        移動相Ｂの濃度（％）
０                ２５
０．５            ２５
１                ４０
１４              ９２．５
移動相Ｂの濃度は、ジアシルリン脂質の溶出時間において成分間の溶出時間差を大きくするため、１分から１４分にかけて、時間に対して非線形に変化させた。【０１１１】
質量分析の条件は、２０１７年３月および２０１８年３月に行われた上述の質量分析と同様であり、表ＢのＩＤ２３〜３６の各化合物のうち、複数のアシル基を備える一部の化合物について、アシル基の炭素数および炭素間の二重結合の数を区別して解析できるようにトランジションを設定した。以下では、炭素数がｘ１で炭素間の二重結合の数がｙ１のアシル基と、炭素数がｘ２で炭素間の二重結合がｙ２のアシル基との両方を備えるホスファチジルコリン（ＰＣ）およびホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）を、それぞれＰＣ（ｘ１：ｙ１−ｘ２：ｙ２）およびＰＥ（ｘ１：ｙ１−ｘ２：ｙ２）と記載する。【０１１２】
図１３は、ＰＣ（３２：１）全体に対応するマスクロマトグラムと、ＰＣ（１６：０−１６：１）に対応する、異なるトランジションによる２つのマスクロマトグラムとを示す図である。ＰＣ（３２：１）全体のピークに対応する保持時間にＰＣ（１６：０−１６：１）のピークが観察された。【０１１３】
図１４は、ＰＣ（３４：１）全体に対応するマスクロマトグラムと、ＰＣ（１６：０−１８：１）に対応する、異なるトランジションによる２つのマスクロマトグラムと、ＰＣ（１６：１−１８：０）に対応する、異なるトランジションによる２つのマスクロマトグラムとを示す図である。ＰＣ（３４：１）全体のピークに対応する保持時間にＰＣ（１６：０−１８：１）のピークが観察された。【０１１４】
図１５は、ＰＣ（３６：２）全体に対応するマスクロマトグラムと、ＰＣ（１８：０−１８：２）に対応する、異なるトランジションによる２つのマスクロマトグラムと、ＰＣ（１８：１−１８：１）に対応するマスクロマトグラムとを示す図である。ＰＣ（３６：２）全体のピークに対応する保持時間にＰＣ（１８：０−１８：２）およびＰＣ（１８：１−１８：１）のピークが観察された。【０１１５】
図１６は、ＰＣ（３８：４）全体に対応するマスクロマトグラムと、ＰＣ（１８：０−２０：４）に対応する、異なるトランジションによる２つのマスクロマトグラムと、ＰＣ（１８：１−２０：３）に対応する、異なるトランジションによる２つのマスクロマトグラムと、ＰＣ（１８：２−２０：２）に対応する、異なるトランジションによる２つのマスクロマトグラムとを示す図である。ＰＣ（３８：４）全体のピークに対応する保持時間にＰＣ（１８：０−２０：４）のピークが観察された。【０１１６】
図１７は、ＰＥ（３４：２）全体に対応するマスクロマトグラムと、ＰＥ（１６：０−１８：２）に対応する、異なるトランジションによる２つのマスクロマトグラムと、ＰＥ（１６：１−１８：１）に対応する、異なるトランジションによる２つのマスクロマトグラムとを示す図である。ＰＥ（３４：２）全体のピークに対応する保持時間にＰＥ（１６：０−１８：２）のピークが観察された。【０１１７】
図１８は、ＰＥ（３６：２）全体に対応するマスクロマトグラムと、ＰＥ（１８：０−１８：２）に対応する、異なるトランジションによる２つのマスクロマトグラムと、ＰＥ（１８：１−１８：１）に対応するマスクロマトグラムとを示す図である。ＰＥ（３６：２）全体のピークに対応する保持時間にＰＥ（１８：０−１８：２）およびＰＥ（１８：１−１８：１）のピークが観察された。【０１１８】
図１９は、ＰＥ（３８：４）全体に対応するマスクロマトグラムと、ＰＥ（１８：０−２０：４）に対応する、異なるトランジションによる２つのマスクロマトグラムと、ＰＥ（１８：１−２０：３）に対応する、異なるトランジションによる２つのマスクロマトグラムとを示す図である。ＰＥ（３８：４）全体のピークに対応する保持時間にＰＥ（１８：０−２０：４）のピークが観察された。【０１１９】
次の優先権基礎出願の開示内容は引用文としてここに組み込まれる。
日本国特許出願２０１８年第１０９０２３号（２０１８年６月６日出願）
【符号の説明】
【０１２０】
１…分析装置、１０…液体クロマトグラフ、１４…分析カラム、２０…質量分析計、２１…イオン化室、２３…第１質量分離部、２４…コリジョンセル、２５…第２質量分離部、３０…検出部、４０…情報処理部、４３…記憶部、４４…出力部、５０…制御部、５２…解析部、１００…測定部、５２１…クロマトグラム作成部、５２２…酸化度解析部、５２３…規格化部、Ｓ…試料、Ｓｉ…試料由来イオン。
【図１】
2019235011.tif 000009
【図２】
2019235011.tif 000010
【図３】
2019235011.tif 000011
【図４】
2019235011.tif 000012
【図５】
2019235011.tif 000013
【図６】
2019235011.tif 000014
【図７】
2019235011.tif 000015
【図８】
2019235011.tif 000016
【図９】
2019235011.tif 000017
【図１０】
2019235011.tif 000018
【図１１】
2019235011.tif 000019
【図１２】
2019235011.tif 000020
【図１３】
2019235011.tif 000021
【図１４】
2019235011.tif 000022
【図１５】
2019235011.tif 000023
【図１６】
2019235011.tif 000024
【図１７】
2019235011.tif 000025
【図１８】
2019235011.tif 000026
【図１９】
2019235011.tif 000027
【国際調査報告】
2019235011.tif 000028
2019235011.tif 000029
2019235011.tif 000030
2019235011.tif 000031