(57)【要約】  本発明は、下記、式（Ｉ）で示される化合物またはその塩を含む、細胞のパラクライン因子生産促進用培地添加剤を提供する：2020067477.tif 000059 ｛式中、各記号は明細書中で定義される通りである。｝。
2020067477.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記、式（Ｉ）で示される化合物またはその塩を含む、細胞のパラクライン因子生産促進用培地添加剤：
【化１】
2020067477.tif 000043
｛式中、Ｘは、−ＮＨＣＯ−であり、Ｒ１は、−Ｙ−ＮＨ−Ｚ−Ａｒであり（式中、Ｙ、およびＺは、単結合、または置換基を有していてもよい炭素数１〜６のアルキレン基であり、Ａｒは、置換基を有していてもよいアリール基またはヘテロアリール基である。）、Ｒ２は、置換基を有していてもよい炭素数１〜６のアルキル基であり、Ｒ３は、水酸基であり、ｎは、０、１または２の整数である。｝
【請求項２】
Ｒ２が、メチル基、エチル基、またはイソブチル基であり、
ｎが０であり、
Ａｒが、水酸基またはメチル基で置換されていてもよいフェニル基であり、
Ｙが、メチル基またはエチル基で置換されていてもよいメチレン基である、
請求項１記載の剤。
【請求項３】
化合物が、以下からなる群より選択される化合物またはその塩である、請求項１又は２記載の剤。
【化２】
2020067477.tif 000044
【化３】
2020067477.tif 000045
【化４】
2020067477.tif 000046
および、
【化５】
2020067477.tif 000047
【請求項４】
前記化合物が、以下で示される化合物またはその塩である、請求項１記載の剤。
【化６】
2020067477.tif 000048
【請求項５】
前記化合物が、以下で示される化合物またはその塩である、請求項１記載の剤。
【化７】
2020067477.tif 000049
または、
【化８】
2020067477.tif 000050
【請求項６】
パラクライン因子が、抗炎症性蛋白質及び血管新生促進蛋白質からなる群から選択される少なくとも１種の蛋白質である、請求項１〜５のいずれか一項記載の剤。
【請求項７】
抗炎症性蛋白質が、ＴＮＦ−ｓｔｉｍｕｌａｔｅｄ  ｇｅｎｅ  ６  ｐｒｏｔｅｉｎ（ＴＳＧ−６）及びＳｔａｎｎｉｏｃａｌｃｉｎ−１（ＳＴＣ−１）からなる群から選択される少なくとも１種の蛋白質である、請求項６記載の剤。
【請求項８】
血管新生促進蛋白質が、Ａｎｇｉｏｇｅｎｉｎ（ＡＮＧ）、Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ（ＥＧＦ）、Ｍｏｎｏｃｙｔｅ Ｃｈｅｍｏｔａｃｔｉｃ Ｐｒｏｔｅｉｎ−１（ＭＣＰ−１）、Ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌ−ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ７８（ＥＮＡ−７８）、Ｂａｓｉｃ  ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ（ｂＦＧＦ）、Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−６（ＩＬ−６）、Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−８（ＩＬ−８）、Ｖａｓｃｕｌａｒ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ（ＶＥＧＦ）、Ｖａｓｃｕｌａｒ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ−Ｄ（ＶＥＧＦ−Ｄ）、Ｔｉｓｓｕｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ  ｏｆ  ｍａｔｒｉｘ  ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ（ＴＩＭＰ）、Ｐｌａｔｅｌｅｔ−Ｄｅｒｉｖｅｄ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ（ＰＤＧＦ）、Ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ−β（ＴＧＦ−β）からなる群から選択される少なくとも１種の蛋白質である、請求項６記載の剤。
【請求項９】
細胞が、間葉系幹細胞である、請求項１〜８のいずれか一項記載の剤。
【請求項１０】
請求項１〜９のいずれか一項記載の剤を含む、細胞培養培地。
【請求項１１】
下記、式（Ｉ）で示される化合物またはその塩を含む培地中において細胞を培養することを含む、パラクライン因子の産生が促進された細胞の生産方法：
【化９】
2020067477.tif 000051
｛式中、Ｘは、−ＮＨＣＯ−であり、Ｒ１は、−Ｙ−ＮＨ−Ｚ−Ａｒであり（式中、Ｙ、およびＺは、単結合、または置換基を有していてもよい炭素数１〜６のアルキレン基であり、Ａｒは、置換基を有していてもよいアリール基またはヘテロアリール基である。）、Ｒ２は、置換基を有していてもよい炭素数１〜６のアルキル基であり、Ｒ３は、水酸基であり、ｎは、０、１または２の整数である。｝
【請求項１２】
Ｒ２が、メチル基、エチル基、またはイソブチル基であり、
ｎが０であり、
Ａｒが、水酸基またはメチル基で置換されていてもよいフェニル基であり、
Ｙが、メチル基またはエチル基で置換されていてもよいメチレン基である、
請求項１１記載の方法。
【請求項１３】
化合物が、以下からなる群より選択される化合物またはその塩である、請求項１１又は１２記載の方法。
【化１０】
2020067477.tif 000052
【化１１】
2020067477.tif 000053
【化１２】
2020067477.tif 000054
および、
【化１３】
2020067477.tif 000055
【請求項１４】
前記化合物が、以下で示される化合物またはその塩である、請求項１１記載の方法。
【化１４】
2020067477.tif 000056
【請求項１５】
前記化合物が、以下で示される化合物またはその塩である、請求項１１記載の方法。
【化１５】
2020067477.tif 000057
または、
【化１６】
2020067477.tif 000058
【請求項１６】
パラクライン因子が、抗炎症性蛋白質及び血管新生促進蛋白質からなる群から選択される少なくとも１種の蛋白質である、請求項１１〜１５のいずれか一項記載の方法。
【請求項１７】
抗炎症性蛋白質が、ＴＮＦ−ｓｔｉｍｕｌａｔｅｄ  ｇｅｎｅ  ６  ｐｒｏｔｅｉｎ（ＴＳＧ−６）及びＳｔａｎｎｉｏｃａｌｃｉｎ−１（ＳＴＣ−１）からなる群から選択される少なくとも１種の蛋白質である、請求項１６記載の方法。
【請求項１８】
血管新生促進蛋白質が、Ａｎｇｉｏｇｅｎｉｎ（ＡＮＧ）、Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ（ＥＧＦ）、Ｍｏｎｏｃｙｔｅ Ｃｈｅｍｏｔａｃｔｉｃ Ｐｒｏｔｅｉｎ−１（ＭＣＰ−１）、Ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌ−ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ７８（ＥＮＡ−７８）、Ｂａｓｉｃ  ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ（ｂＦＧＦ）、Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−６（ＩＬ−６）、Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−８（ＩＬ−８）、Ｖａｓｃｕｌａｒ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ（ＶＥＧＦ）、Ｖａｓｃｕｌａｒ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ−Ｄ（ＶＥＧＦ−Ｄ）、Ｔｉｓｓｕｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ  ｏｆ  ｍａｔｒｉｘ  ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ（ＴＩＭＰ）、Ｐｌａｔｅｌｅｔ−Ｄｅｒｉｖｅｄ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ（ＰＤＧＦ）、Ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ−β（ＴＧＦ−β）からなる群から選択される少なくとも１種の蛋白質である、請求項１６記載の方法。
【請求項１９】
細胞が、間葉系幹細胞である、請求項１１〜１８のいずれか一項記載の方法。
【請求項２０】
培養が、３次元培養で行われる、請求項１１〜１９のいずれか一項記載の方法。
【請求項２１】
請求項１１〜２０のいずれか一項記載の方法により生産された細胞を含む、生体移植用組成物。
【請求項２２】
請求項１９又は２０記載の方法により生産された細胞を含む、炎症性疾患又は虚血性疾患の治療用組成物。
【請求項２３】
炎症性疾患が、炎症性腸疾患、潰瘍性大腸炎、クローン病、腎炎、急性腎炎、慢性腎炎、糸球体腎炎、ＩｇＡ腎症、糖尿病性腎症、膜性腎症、水腎症、造影剤腎症、腎盂腎炎、腎不全、間質性腎炎、腎障害、ネフローゼ症候群、高血圧性腎硬化症、糖尿病性糸球体硬化症、腎結石、アミロイド腎、腎静脈血栓症、Ａｌｐｏｒｔ症候群、肝炎、肝硬変、膵炎、肺炎、副鼻腔炎、鼻炎、関節炎、変形性膝関節症、変形性手関節症、変形性足関節症、変形性股関節症、関節リウマチ、周期性発熱、アフタ性口内炎、咽頭炎、リンパ節炎症候群、成人発症型スティル病、ベーチェット病、痛風、偽痛風、Ｓｃｈｎｉｔｚｌｅｒ症候群、慢性再発性多発性骨髄炎、クリオピリン関連周期熱症候群、家族性寒冷蕁麻疹、Ｍｕｃｋｌｅ−Ｗｅｌｌｓ症候群、慢性乳児神経皮膚関節炎症候群、新生児発症多臓器炎症疾患、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）受容体関連周期性症候群、高ＩｇＤ症候群、ブラウ症候群、若年発症サルコイドーシス、家族性地中海熱、化膿性関節炎、壊疽性膿皮症、座瘡、中條−西村症候群、Ｍａｊｅｅｄ症候群、ＮＬＲＰ１２関連周期熱症候群、インターロイキン１受容体アンタゴニスト欠損症、インターロイキン３６受容体アンタゴニスト欠損症、フォスフォリパーゼＣγ２関連抗体欠損・免疫異常症、ＨＯＩＬ−１欠損症、ＳＬＣ２９Ａ３欠損症、ＣＡＲＤ１４異常症、アデノシンデアミナーゼ２欠損症、ＳＴＩＮＧ-Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  Ｖａｓｃｕｌｏｐａｔｈｙ  ｗｉｔｈ  Ｏｎｓｅｔ  ｉｎ  Ｉｎｆａｎｃｙ、及びＮＬＲＣ４異常症からなる群から選択される、請求項２２記載の治療用組成物。
【請求項２４】
虚血性疾患が、狭心症、心筋梗塞、たこつぼ心筋症、中枢性肺水腫、脳梗塞、虚血性脳卒中、閉塞性動脈硬化症、及び重症下肢虚血からなる群から選択される、請求項２０記載の治療用組成物。
【請求項２５】
以下の工程を含む、パラクライン因子の生産方法：
（１）請求項１０記載の培地において細胞を培養する工程、及び、
（２）（１）で用いられた培地の上清を回収する工程。
【請求項２６】
細胞が、間葉系幹細胞である、請求項２５記載の方法。
【請求項２７】
パラクライン因子が、抗炎症性蛋白質及び血管新生促進蛋白質からなる群から選択される少なくとも１種の蛋白質である、請求項２５又は２６記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、パラクライン因子生産促進用培地添加剤、該培地添加剤を添加した培地及び該培地を用いたパラクライン因子の産生が促進した細胞の生産方法に関する。また、本発明は、該細胞の生産方法により生産された細胞を含む、炎症性疾患又は虚血性疾患の治療剤及び移植用組成物に関する。さらに、本発明は、該培地添加剤を添加した培地中で細胞を培養することを含む、パラクライン因子の生産方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、生体の細胞あるいは組織を利用した医薬品の開発や再生医療の研究が進み、注目されている。特に、ＥＳ細胞、ｉＰＳ細胞等の多能性幹細胞を用いた臓器再生技術の研究が加速している。一方、間葉系幹細胞（以下、「ＭＳＣ」と称することがある。）や骨髄幹細胞等の体性幹細胞を利用する細胞療法は、病気により障害を受けた組織を修復する本来の体性幹細胞の機能を利用するもので、再生医療の中でもより実現性の高いものとして注目され、研究が進められている。【０００３】
ＭＳＣ移植治療のメカニズムについては、複数の作用機序が推測されているが、非特許文献１や非特許文献２で示すように、移植したＭＳＣがもつパラクライン効果により、生体内の修復機能が亢進することによる機序が知られている。治療効果を示すＭＳＣのパラクライン効果としては、サイトカインや増殖因子等のパラクライン因子の分泌による血管新生作用や抗炎症作用等が挙げられる。【０００４】
また近年、単層培養系の細胞と生体内組織の細胞との間で、種々の性質、刺激応答性、細胞機能等が異なることが明らかになり、単層構造を形成させる単層培養よりも、生体内の組織構造に近い３Ｄ構造を形成させる３Ｄ培養、特に、スフェロイド培養の需要が拡大している。【０００５】
ＭＳＣについても、スフェロイド培養によりパラクライン効果が増強されるという報告がある。非特許文献３には、スフェロイド培養されたＭＳＣは、抗炎症性蛋白質であるＴＮＦ  ａｌｐｈａ  ｉｎｄｕｃｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ６（以下、ＴＳＧ−６）やＳｔａｎｎｉｏｃａｌｃｉｎ−１（以下、ＳＴＣ−１）の分泌が増加したことが記載されている。また非特許文献４には、スフェロイド培養されたＭＳＣでは血管新生促進蛋白質であるＶＥＧＦ（Ｖａｓｃｕｌａｒ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ）やＦＧＦ−２（Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒｓ−２）の産生量が増加しており、さらにＭＳＣスフェロイドをマウスの虚血肢へ移植すると血管新生が促進され、壊死が改善されたことが記載されている。【０００６】
ＭＳＣスフェロイドの移植療法に向けて、より高い治療効果をもつスフェロイド作製のために様々な培養法の開発が行われている。特許文献１には、生体親和性高分子ブロックを用いてＭＳＣをスフェロイド化することにより、抗炎症性蛋白質等の分泌量が増加し、炎症疾患が改善されたことが記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】国際公開第２０１７／２２１８７９号
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Gnecchi M et al, Circ Res. 2008 Nov 21;103(11):1204-19.
【非特許文献２】Madrigal M et al, J Transl Med. 2014 Oct 11;12:260.
【非特許文献３】Bartosh TJ et al, Proc Natl Acad Sci U S A. 2010 Aug 3;107(31):13724-9.
【非特許文献４】Bhang SH et al, Tissue Eng Part A. 2012 Oct;18(19-20):2138-47.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
上述のＭＳＣの例をはじめとし、細胞のパラクライン効果を利用した疾患の治療方法は非常に有効であり得る。しかしながら、特許文献１に教示される方法では、生体親和性高分子ブロックとＭＳＣをスフェロイド化する必要があり、煩雑な操作が求められる。また、非特許文献１又は２に教示される方法では、パラクライン因子の産生量が充分とは言えない等、従来技術には解決すべき課題も多い。そこで、本発明は、簡便且つ効果的に細胞のパラクライン因子の産生量を促進させる手段の提供を目的とする。また、該手段を用いて生産したパラクライン因子の産生が促進された細胞を利用した新規治療手段の提供を目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは、上記課題に対して鋭意検討した結果、特定の化合物が細胞のパラクライン因子の産生を促進させ得ることを見出し、かかる知見に基づいてさらに研究を進めることによって本発明を完成するに至った。すなわち、本発明は以下の通りである。【００１１】
［１］下記、式（Ｉ）で示される化合物またはその塩を含む、細胞のパラクライン因子生産促進用培地添加剤：【００１２】
【化１】
2020067477.tif 000003
【００１３】
｛式中、Ｘは、−ＮＨＣＯ−であり、Ｒ１は、−Ｙ−ＮＨ−Ｚ−Ａｒであり（式中、Ｙ、およびＺは、単結合、または置換基を有していてもよい炭素数１〜６のアルキレン基であり、Ａｒは、置換基を有していてもよいアリール基またはヘテロアリール基である。）、Ｒ２は、置換基を有していてもよい炭素数１〜６のアルキル基であり、Ｒ３は、水酸基であり、ｎは、０、１または２の整数である。｝
［２］Ｒ２が、メチル基、エチル基、またはイソブチル基であり、
ｎが０であり、
Ａｒが、水酸基またはメチル基で置換されていてもよいフェニル基であり、
Ｙが、メチル基またはエチル基で置換されていてもよいメチレン基である、
［１］記載の剤。
［３］化合物が、以下からなる群より選択される化合物またはその塩である、［１］又は［２］記載の剤。【００１４】
【化２】
2020067477.tif 000004
【００１５】
【化３】
2020067477.tif 000005
【００１６】
【化４】
2020067477.tif 000006
【００１７】
および、【００１８】
【化５】
2020067477.tif 000007
【００１９】
［４］前記化合物が、以下で示される化合物またはその塩である、［１］記載の剤。【００２０】
【化６】
2020067477.tif 000008
【００２１】
［５］前記化合物が、以下で示される化合物またはその塩である、［１］記載の剤。【００２２】
【化７】
2020067477.tif 000009
【００２３】
または、【００２４】
【化８】
2020067477.tif 000010
【００２５】
［６］パラクライン因子が、抗炎症性蛋白質及び血管新生促進蛋白質からなる群から選択される少なくとも１種の蛋白質である、［１］〜［５］のいずれか記載の剤。
［７］抗炎症性蛋白質が、ＴＮＦ−ｓｔｉｍｕｌａｔｅｄ  ｇｅｎｅ  ６  ｐｒｏｔｅｉｎ（ＴＳＧ−６）及びＳｔａｎｎｉｏｃａｌｃｉｎ−１（ＳＴＣ−１）からなる群から選択される少なくとも１種の蛋白質である、［６］記載の剤。
［８］血管新生促進蛋白質が、Ａｎｇｉｏｇｅｎｉｎ（ＡＮＧ）、Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ（ＥＧＦ）、Ｍｏｎｏｃｙｔｅ Ｃｈｅｍｏｔａｃｔｉｃ Ｐｒｏｔｅｉｎ−１（ＭＣＰ−１）、Ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌ−ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ７８（ＥＮＡ−７８）、Ｂａｓｉｃ  ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ（ｂＦＧＦ）、Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−６（ＩＬ−６）、Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−８（ＩＬ−８）、Ｖａｓｃｕｌａｒ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ（ＶＥＧＦ）、Ｖａｓｃｕｌａｒ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ−Ｄ（ＶＥＧＦ−Ｄ）、Ｔｉｓｓｕｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ  ｏｆ  ｍａｔｒｉｘ  ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ（ＴＩＭＰ）、Ｐｌａｔｅｌｅｔ−Ｄｅｒｉｖｅｄ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ（ＰＤＧＦ）、Ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ−β（ＴＧＦ−β）からなる群から選択される少なくとも１種の蛋白質である、［６］記載の剤。
［９］細胞が、間葉系幹細胞である、［１］〜［８］のいずれか記載の剤。
［１０］［１］〜［９］のいずれか記載の剤を含む、細胞培養培地。
［１１］下記、式（Ｉ）で示される化合物またはその塩を含む培地中において細胞を培養することを含む、パラクライン因子の産生が促進された細胞の生産方法：【００２６】
【化９】
2020067477.tif 000011
【００２７】
｛式中、Ｘは、−ＮＨＣＯ−であり、Ｒ１は、−Ｙ−ＮＨ−Ｚ−Ａｒであり（式中、Ｙ、およびＺは、単結合、または置換基を有していてもよい炭素数１〜６のアルキレン基であり、Ａｒは、置換基を有していてもよいアリール基またはヘテロアリール基である。）、Ｒ２は、置換基を有していてもよい炭素数１〜６のアルキル基であり、Ｒ３は、水酸基であり、ｎは、０、１または２の整数である。｝
［１２］Ｒ２が、メチル基、エチル基、またはイソブチル基であり、
ｎが０であり、
Ａｒが、水酸基またはメチル基で置換されていてもよいフェニル基であり、
Ｙが、メチル基またはエチル基で置換されていてもよいメチレン基である、
［１１］記載の方法。
［１３］化合物が、以下からなる群より選択される化合物またはその塩である、［１１］又は［１２］記載の方法。【００２８】
【化１０】
2020067477.tif 000012
【００２９】
【化１１】
2020067477.tif 000013
【００３０】
【化１２】
2020067477.tif 000014
【００３１】
および、【００３２】
【化１３】
2020067477.tif 000015
【００３３】
［１４］前記化合物が、以下で示される化合物またはその塩である、［１１］記載の方法。【００３４】
【化１４】
2020067477.tif 000016
【００３５】
［１５］前記化合物が、以下で示される化合物またはその塩である、［１１］記載の方法。【００３６】
【化１５】
2020067477.tif 000017
【００３７】
または、【００３８】
【化１６】
2020067477.tif 000018
【００３９】
［１６］パラクライン因子が、抗炎症性蛋白質及び血管新生促進蛋白質からなる群から選択される少なくとも１種の蛋白質である、［１１］〜［１５］のいずれか記載の方法。
［１７］抗炎症性蛋白質が、ＴＮＦ−ｓｔｉｍｕｌａｔｅｄ  ｇｅｎｅ  ６  ｐｒｏｔｅｉｎ（ＴＳＧ−６）及びＳｔａｎｎｉｏｃａｌｃｉｎ−１（ＳＴＣ−１）からなる群から選択される少なくとも１種の蛋白質である、［１６］記載の方法。
［１８］血管新生促進蛋白質が、Ａｎｇｉｏｇｅｎｉｎ（ＡＮＧ）、Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ（ＥＧＦ）、Ｍｏｎｏｃｙｔｅ Ｃｈｅｍｏｔａｃｔｉｃ Ｐｒｏｔｅｉｎ−１（ＭＣＰ−１）、Ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌ−ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ７８（ＥＮＡ−７８）、Ｂａｓｉｃ  ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ（ｂＦＧＦ）、Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−６（ＩＬ−６）、Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−８（ＩＬ−８）、Ｖａｓｃｕｌａｒ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ（ＶＥＧＦ）、Ｖａｓｃｕｌａｒ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ−Ｄ（ＶＥＧＦ−Ｄ）、Ｔｉｓｓｕｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ  ｏｆ  ｍａｔｒｉｘ  ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ（ＴＩＭＰ）、Ｐｌａｔｅｌｅｔ−Ｄｅｒｉｖｅｄ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ（ＰＤＧＦ）、Ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ−β（ＴＧＦ−β）からなる群から選択される少なくとも１種の蛋白質である、［１６］記載の方法。
［１９］細胞が、間葉系幹細胞である、［１１］〜［１８］のいずれか記載の方法。
［２０］培養が、３次元培養で行われる、［１１］〜［１９］のいずれか記載の方法。
［２１］［１１］〜［２０］のいずれか記載の方法により生産された細胞を含む、生体移植用組成物。
［２２］［１９］又は［２０］記載の方法により生産された細胞を含む、炎症性疾患又は虚血性疾患の治療用組成物。
［２３］炎症性疾患が、炎症性腸疾患、潰瘍性大腸炎、クローン病、腎炎、急性腎炎、慢性腎炎、糸球体腎炎、ＩｇＡ腎症、糖尿病性腎症、膜性腎症、水腎症、造影剤腎症、腎盂腎炎、腎不全、間質性腎炎、腎障害、ネフローゼ症候群、高血圧性腎硬化症、糖尿病性糸球体硬化症、腎結石、アミロイド腎、腎静脈血栓症、Ａｌｐｏｒｔ症候群、肝炎、肝硬変、膵炎、肺炎、副鼻腔炎、鼻炎、関節炎、変形性膝関節症、変形性手関節症、変形性足関節症、変形性股関節症、関節リウマチ、周期性発熱、アフタ性口内炎、咽頭炎、リンパ節炎症候群、成人発症型スティル病、ベーチェット病、痛風、偽痛風、Ｓｃｈｎｉｔｚｌｅｒ症候群、慢性再発性多発性骨髄炎、クリオピリン関連周期熱症候群、家族性寒冷蕁麻疹、Ｍｕｃｋｌｅ−Ｗｅｌｌｓ症候群、慢性乳児神経皮膚関節炎症候群、新生児発症多臓器炎症疾患、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）受容体関連周期性症候群、高ＩｇＤ症候群、ブラウ症候群、若年発症サルコイドーシス、家族性地中海熱、化膿性関節炎、壊疽性膿皮症、座瘡、中條−西村症候群、Ｍａｊｅｅｄ症候群、ＮＬＲＰ１２関連周期熱症候群、インターロイキン１受容体アンタゴニスト欠損症、インターロイキン３６受容体アンタゴニスト欠損症、フォスフォリパーゼＣγ２関連抗体欠損・免疫異常症、ＨＯＩＬ−１欠損症、ＳＬＣ２９Ａ３欠損症、ＣＡＲＤ１４異常症、アデノシンデアミナーゼ２欠損症、ＳＴＩＮＧ-Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  Ｖａｓｃｕｌｏｐａｔｈｙ  ｗｉｔｈ  Ｏｎｓｅｔ  ｉｎ  Ｉｎｆａｎｃｙ、及びＮＬＲＣ４異常症からなる群から選択される、［２２］記載の治療用組成物。
［２４］虚血性疾患が、狭心症、心筋梗塞、たこつぼ心筋症、中枢性肺水腫、脳梗塞、虚血性脳卒中、閉塞性動脈硬化症、及び重症下肢虚血からなる群から選択される、［２０］記載の治療用組成物。
［２５］以下の工程を含む、パラクライン因子の生産方法：
（１）［１０］記載の培地において細胞を培養する工程、及び、
（２）（１）で用いられた培地の上清を回収する工程。
［２６］細胞が、間葉系幹細胞である、［２５］記載の方法。
［２７］パラクライン因子が、抗炎症性蛋白質及び血管新生促進蛋白質からなる群から選択される少なくとも１種の蛋白質である、［２５］又は［２６］記載の方法。【００４０】
また、一態様において、本発明は以下のとおりである：
［１’］下記、式（Ｉ）で示される化合物またはその塩を含む、細胞のパラクライン因子生産促進用培地添加剤：【００４１】
【化１７】
2020067477.tif 000019
【００４２】
｛式中、Ｘは、−ＮＨＣＯ−であり、Ｒ１は、−Ｙ−ＮＨ−Ｚ−Ａｒであり（式中、Ｙ、およびＺは、単結合、または置換基を有していてもよい炭素数１〜６のアルキレン基であり、Ａｒは、置換基を有していてもよいアリール基である。）、Ｒ２は、置換基を有していてもよい炭素数１〜６のアルキル基であり、Ｒ３は、水酸基であり、ｎは、０、１または２の整数である。｝
［２’］Ｒ２が、メチル基、エチル基、またはイソブチル基であり、
ｎが０であり、
Ａｒが、水酸基またはメチル基で置換されていてもよいフェニル基であり、
Ｙが、メチル基またはエチル基で置換されていてもよいメチレン基である、
［１’］記載の剤。
［３’］化合物が、以下からなる群より選択される化合物またはその塩である、［１’］又は［２’］記載の剤。【００４３】
【化１８】
2020067477.tif 000020
【００４４】
および、【００４５】
【化１９】
2020067477.tif 000021
【００４６】
［４’］前記化合物が、以下で示される化合物またはその塩である、［１’］記載の剤。【００４７】
【化２０】
2020067477.tif 000022
【００４８】
［５’］パラクライン因子が、抗炎症性蛋白質及び血管新生促進蛋白質からなる群から選択される少なくとも１種の蛋白質である、［１’］〜［４’］のいずれか記載の剤。
［６’］抗炎症性蛋白質が、ＴＮＦ−ｓｔｉｍｕｌａｔｅｄ  ｇｅｎｅ  ６  ｐｒｏｔｅｉｎ（ＴＳＧ−６）及びＳｔａｎｎｉｏｃａｌｃｉｎ−１（ＳＴＣ−１）からなる群から選択される少なくとも１種の蛋白質である、［５’］記載の剤。
［７’］血管新生促進蛋白質が、Ａｎｇｉｏｇｅｎｉｎ（ＡＮＧ）、Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ（ＥＧＦ）、Ｍｏｎｏｃｙｔｅ Ｃｈｅｍｏｔａｃｔｉｃ Ｐｒｏｔｅｉｎ−１（ＭＣＰ−１）、Ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌ−ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ７８（ＥＮＡ−７８）、Ｂａｓｉｃ  ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ（ｂＦＧＦ）、Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−６（ＩＬ−６）、Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−８（ＩＬ−８）、Ｖａｓｃｕｌａｒ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ（ＶＥＧＦ）、Ｖａｓｃｕｌａｒ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ−Ｄ（ＶＥＧＦ−Ｄ）、Ｔｉｓｓｕｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ  ｏｆ  ｍａｔｒｉｘ  ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ（ＴＩＭＰ）、Ｐｌａｔｅｌｅｔ−Ｄｅｒｉｖｅｄ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ（ＰＤＧＦ）、Ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ−β（ＴＧＦ−β）からなる群から選択される少なくとも１種の蛋白質である、［５’］記載の剤。
［８’］細胞が、間葉系幹細胞である、［１’］〜［７’］のいずれか記載の剤。
［９’］［１’］〜［８’］のいずれか記載の剤を含む、細胞培養培地。
［１０’］下記、式（Ｉ）で示される化合物またはその塩を含む培地中において細胞を培養することを含む、パラクライン因子の産生が促進された細胞の生産方法：【００４９】
【化２１】
2020067477.tif 000023
【００５０】
｛式中、Ｘは、−ＮＨＣＯ−であり、Ｒ１は、−Ｙ−ＮＨ−Ｚ−Ａｒであり（式中、Ｙ、およびＺは、単結合、または置換基を有していてもよい炭素数１〜６のアルキレン基であり、Ａｒは、置換基を有していてもよいアリール基である。）、Ｒ２は、置換基を有していてもよい炭素数１〜６のアルキル基であり、Ｒ３は、水酸基であり、ｎは、０、１または２の整数である。｝
［１１’］Ｒ２が、メチル基、エチル基、またはイソブチル基であり、
ｎが０であり、
Ａｒが、水酸基またはメチル基で置換されていてもよいフェニル基であり、
Ｙが、メチル基またはエチル基で置換されていてもよいメチレン基である、
［１０’］記載の方法。
［１２’］化合物が、以下からなる群より選択される化合物またはその塩である、［１０’］又は［１１’］記載の方法。【００５１】
【化２２】
2020067477.tif 000024
【００５２】
および、【００５３】
【化２３】
2020067477.tif 000025
【００５４】
［１３’］前記化合物が、以下で示される化合物またはその塩である、［１０’］記載の方法。【００５５】
【化２４】
2020067477.tif 000026
【００５６】
［１４’］パラクライン因子が、抗炎症性蛋白質及び血管新生促進蛋白質からなる群から選択される少なくとも１種の蛋白質である、［１０’］〜［１３’］のいずれか記載の方法。
［１５’］抗炎症性蛋白質が、ＴＮＦ−ｓｔｉｍｕｌａｔｅｄ  ｇｅｎｅ  ６  ｐｒｏｔｅｉｎ（ＴＳＧ−６）及びＳｔａｎｎｉｏｃａｌｃｉｎ−１（ＳＴＣ−１）からなる群から選択される少なくとも１種の蛋白質である、［１４’］記載の方法。
［１６’］血管新生促進蛋白質が、Ａｎｇｉｏｇｅｎｉｎ（ＡＮＧ）、Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ（ＥＧＦ）、Ｍｏｎｏｃｙｔｅ Ｃｈｅｍｏｔａｃｔｉｃ Ｐｒｏｔｅｉｎ−１（ＭＣＰ−１）Ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌ−ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ７８（ＥＮＡ−７８）、Ｂａｓｉｃ  ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ（ｂＦＧＦ）、Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−６（ＩＬ−６）、Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−８（ＩＬ−８）、Ｖａｓｃｕｌａｒ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ（ＶＥＧＦ）、Ｖａｓｃｕｌａｒ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ−Ｄ（ＶＥＧＦ−Ｄ）、Ｔｉｓｓｕｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ  ｏｆ  ｍａｔｒｉｘ  ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ（ＴＩＭＰ）、Ｐｌａｔｅｌｅｔ−Ｄｅｒｉｖｅｄ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ（ＰＤＧＦ）、Ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ−β（ＴＧＦ−β）からなる群から選択される少なくとも１種の蛋白質である、［１４’］記載の方法。
［１７’］細胞が、間葉系幹細胞である、［１０’］〜［１６’］のいずれか記載の方法。
［１８’］培養が、３次元培養で行われる、［１０’］〜［１７’］のいずれか記載の方法。
［１９’］［１０’］〜［１８’］のいずれか記載の方法により生産された細胞を含む、生体移植用組成物。
［２０’］［１７’］又は［１８’］記載の方法により生産された細胞を含む、炎症性疾患又は虚血性疾患の治療用組成物。
［２１’］炎症性疾患が、炎症性腸疾患、潰瘍性大腸炎、クローン病、腎炎、急性腎炎、慢性腎炎、糸球体腎炎、ＩｇＡ腎症、糖尿病性腎症、膜性腎症、水腎症、造影剤腎症、腎盂腎炎、腎不全、間質性腎炎、腎障害、ネフローゼ症候群、高血圧性腎硬化症、糖尿病性糸球体硬化症、腎結石、アミロイド腎、腎静脈血栓症、Ａｌｐｏｒｔ症候群、肝炎、肝硬変、膵炎、肺炎、副鼻腔炎、鼻炎、関節炎、変形性膝関節症、変形性手関節症、変形性足関節症、変形性股関節症、関節リウマチ、周期性発熱、アフタ性口内炎、咽頭炎、リンパ節炎症候群、成人発症型スティル病、ベーチェット病、痛風、偽痛風、Ｓｃｈｎｉｔｚｌｅｒ症候群、慢性再発性多発性骨髄炎、クリオピリン関連周期熱症候群、家族性寒冷蕁麻疹、Ｍｕｃｋｌｅ−Ｗｅｌｌｓ症候群、慢性乳児神経皮膚関節炎症候群、新生児発症多臓器炎症疾患、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）受容体関連周期性症候群、高ＩｇＤ症候群、ブラウ症候群、若年発症サルコイドーシス、家族性地中海熱、化膿性関節炎、壊疽性膿皮症、座瘡、中條−西村症候群、Ｍａｊｅｅｄ症候群、ＮＬＲＰ１２関連周期熱症候群、インターロイキン１受容体アンタゴニスト欠損症、インターロイキン３６受容体アンタゴニスト欠損症、フォスフォリパーゼＣγ２関連抗体欠損・免疫異常症、ＨＯＩＬ−１欠損症、ＳＬＣ２９Ａ３欠損症、ＣＡＲＤ１４異常症、アデノシンデアミナーゼ２欠損症、ＳＴＩＮＧ-Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  Ｖａｓｃｕｌｏｐａｔｈｙ  ｗｉｔｈ  Ｏｎｓｅｔ  ｉｎ  Ｉｎｆａｎｃｙ、及びＮＬＲＣ４異常症からなる群から選択される、［２０’］記載の治療用組成物。
［２２’］虚血性疾患が、狭心症、心筋梗塞、たこつぼ心筋症、中枢性肺水腫、脳梗塞、虚血性脳卒中、閉塞性動脈硬化症、及び重症下肢虚血からなる群から選択される、［２０’］記載の治療用組成物。
［２３’］以下の工程を含む、パラクライン因子の生産方法：
（１）［９’］記載の培地において細胞を培養する工程、及び、
（２）（１）で用いられた培地の上清を回収する工程。
［２４’］細胞が、間葉系幹細胞である、［２３’］記載の方法。
［２５’］パラクライン因子が、抗炎症性蛋白質及び血管新生促進蛋白質からなる群から選択される少なくとも１種の蛋白質である、［２３’］又は［２４’］記載の方法。
【発明の効果】
【００５７】
本発明によれば、非常に簡便且つ効率よく、細胞のパラクライン因子（例、抗炎症性蛋白質及び血管新生促進タンパク質）の産生を促進させることができる。また、本発明を用いて生産した細胞は、パラクライン因子の産生及び分泌が促進されているため、移植用細胞として非常に好適であると考えられる。また、本発明を用いて生産した細胞（例、間葉系幹細胞）は、パラクライン因子のうち、複数の抗炎症性蛋白質及び血管新生促進蛋白質の産生及び分泌が顕著に促進されている。従って、本発明を用いて産生した細胞（例、間葉系幹細胞）は、抗炎症性疾患及び虚血性疾患の治療に好適に用いられる。さらに、本発明によれば、医薬上有用な細胞由来のパラクライン因子を非常に簡便且つ効率よく生産・回収することができる。
【発明を実施するための形態】
【００５８】
本明細書において使用する用語を以下に定義する。
【００５９】
本明細書において、ｎ−はノルマル、ｉ−はイソ、ｓｅｃ−はセカンダリー及びｔｅｒｔ−はターシャリーを各々意味する。また、本明細書において、ｏ−はオルト、ｍ−はメタ及びｐ−はパラを各々意味する。
【００６０】
「ハロゲン原子」とは、フッ素原子、塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子である。「ハロゲノ基」とは、フルオロ、クロロ、ブロモ、ヨードである。
【００６１】
「アルキル基」および「炭素数１〜６のアルキル基」とは、直鎖または分岐状のアルキル基を意味し、具体的には、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ｎ−ペンチル、イソペンチル、ｔｅｒｔ−ペンチル、ネオペンチル、２−ペンチル、３−ペンチル、ｎ−ヘキシル、２−ヘキシル等の基が挙げられる。かかるアルキル基としては、炭素数１〜４の低級アルキル基、特にメチル基及びエチル基が好ましい。
【００６２】
「アリール基」とは、少なくとも１つの環が芳香族であり、各環が５〜８の環原子を有する単環式、二環式、三環式および四環式炭素環式基が挙げられ、具体的には、フェニル、インデニル、ナフチル、フルオレニル等が挙げられる。特に、アリール基は、Ｃ６−１０の芳香族のフェニル、インデニル、ナフチルであり得る。また、「ヘテロアリール基」とは、ヘテロアリール基とは、炭素以外の原子を一個または複数個環内に有する環状芳香族基であり、具体的には、フラニル基、チオフェニル基、ピリジル基、キノリニル基、ピラジニル基、ナフチリジル基、ベンゾフラニル基、ベンゾチオフェニル基、インドリル基、ジベンゾフラニル基、ジベンゾチオフェニル基、カルバゾリル基等が挙げられる。
【００６３】
「アルキレン基」および「炭素数１〜６のアルキレン基」とは、直鎖の炭素鎖を意味し、具体的には、メチレン、エチレン、プロピレン、ブチレン、ペンチレン、ヘキシレン等の基が挙げられる。
【００６４】
「アルキル基」、「アリール基」及び「アルキレン基」は、それぞれ置換基を有していてもよく、そのような置換基としては、例えば以下が挙げられる。尚、「アルキル基」に対する置換基としては下記（１）〜（４０）が挙げられ、「アリール基」及び「アルキレン基」に対する置換基としては下記（１）〜（４１）が挙げられる。
(1)ハロゲノ基、
(2)水酸基、
(3)シアノ基、
(4)ニトロ基、
(5)カルボキシル基、
(6)アルケニル基（Ｃ２−１０アルケニル基；例、ビニル、アリル、プロペニル、ブテニル、ペンテニル、へキセニル、ヘプテニル、ブタジエニル、ヘキサトリエニル、およびその各異性体）、
(7)アルキニル基（Ｃ２−１０アルキニル基；例、エチニル、プロピニル、ブチニル、ペンチニル、ヘキシニル、および、その各異性体）、
(8)ハロゲノアルキル基（例、モノフルオロメチル、ジフルオロメチル、トリフルオロメチル、モノフルオロエチル、ジフルオロエチル、トリフルオロエチル、クロロメチル、クロロエチル、ジクロロエチル、およびその各異性体）、
(9)環状アルキル基（環中にヘテロ原子を含んでもよい）（例、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、テトラヒドロフラニル、テトラヒドロピラニル、アジリジニル、アゼチジニル、ピロリジニル、ピペリジニル、モルホリニル）、
(10)アリール基（例、フェニル、ナフチル）、
(11)ヘテロアリール基（例、ピリジル、ピリダジニル、ピリミジニル、ピラジニル、フリル、チオフェニル、ピロリル、ピラゾリル、イミダゾリル、トリアゾリル（例、１，２，３−トリアゾリル、１，２，４−トリアゾリル）、テトラゾリル、オキサゾリル、イソオキサゾリル、チアゾリル、イソチアゾリル、オキサジアゾリル（例、１，２，３−オキサジアゾリル、１，２，４−オキサジアゾリル、１，３，４−オキサジアゾリル）、チアジアゾリル（例、１，２，３−チアジアゾリル、１，２，４−チアジアゾリル、１，３，４−チアジアゾリル）、ベンゾフリル、ベンゾチオフェニル、インドリル、イソインドリル、ベンゾオキサゾリル、ベンゾチアゾリル、ベンズイミダゾリル、インダゾリル、ベンズイソオキサゾリル、ベンズイソチアゾリル、ベンゾオキサジアゾリル、ベンゾチアジアゾリル、プリニル、キノリニル、イソキノリニル、シンノリニル、フタラジニル、キナゾリニル、キノキサリニル、プテリジニル、イミダゾオキサゾリル、イミダゾチアゾリル、イミダゾイミダゾリル）、
(12)アルコキシ基（例、メトキシ、エトキシ、ｎ−プロポキシ、イソプロポキシ、ｎ−ブトキシ、イソブトキシ、ｓｅｃ−ブトキシ、ｔｅｒｔ−ブトキシ、ｎ−ペンチルオキシ、イソペンチルオキシ、ｔｅｒｔ−ペンチルオキシ、ネオペンチルオキシ、２−ペンチルオキシ、３−ペンチルオキシ、ｎ−ヘキシルオキシ、２−ヘキシルオキシ）、
(13)アルキルチオ基（例、メチルチオ、エチルチオ、ｎ−プロピルチオ、イソプロピルチオ、ｎ−ブチルチオ、イソブチルチオ、ｓｅｃ−ブチルチオ、ｔｅｒｔ−ブチルチオ、ｎ−ペンチルチオ、イソペンチルチオ、ｔｅｒｔ−ペンチルチオ、ネオペンチルチオ、２−ペンチルチオ、３−ペンチルチオ、ｎ−ヘキシルチオ、２−ヘキシルチオ）、
(14)アリール基（上記(10)と同義）で置換された、アルコキシ基（上記(12)と同義）、
(15)アリール基（上記(10)と同義）で置換された、アルキルチオ基（上記(13)と同義）、
(16)ヘテロアリール基（上記(11)と同義）で置換された、アルコキシ基（上記(12)と同義）、
(17)ヘテロアリール基（上記(11)と同義）で置換された、アルキルチオ基（上記(13)と同義）、
(18)環状アルキル（環中にヘテロ原子を含んでもよい）オキシ基（例、シクロプロピルオキシ、シクロブチルオキシ、シクロペンチルオキシ、シクロヘキシルオキシ、テトラヒドロフラニルオキシ、テトラヒドロピラニルオキシ、アジリジニルオキシ、アゼチジニルオキシ、ピロリジニルオキシ、ピペリジニルオキシ、モルホリニルオキシ）、
(19)アリールオキシ基（例、アリール基（上記(10)と同義）が酸素原子に結合した基）、
(20)ヘテロアリールオキシ基（例、ヘテロアリール基（上記(11)と同義）が酸素原子に結合した基）、
(21)ハロゲノアルコキシ基（例、ハロゲノアルキル基（上記(8)と同義）が酸素原子に結合した基）、
(22)ハロゲノアルキルチオ基（例、ハロゲノアルキル基（上記(8)と同義）が硫黄原子に結合した基）、
(23)水酸基で置換された、アルコキシ基（上記(12)と同義）、
(24)アルコキシ基（上記(12)と同義）で置換された、アルコキシ基（上記(12)と同義）、
(25)アミノ基、
(26)アルキル基でモノまたはジ置換されたアミノ基、
ここで、「アルキル基」とは、Ｃ１−６アルキル基が挙げられ、具体的には、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ｎ−ペンチル、イソペンチル、ｔｅｒｔ−ペンチル、ネオペンチル、２−ペンチル、３−ペンチル、ｎ−ヘキシル、２−ヘキシル等が挙げられる、
(27)カルバモイル基、
(28)アルキル基（上記(26)における「アルキル基」と同義）でモノまたはジ置換されたカルバモイル基（例、メチルカルバモイル、エチルカルバモイル、ジメチルカルバモイル、ジエチルカルバモイル、エチルメチルカルバモイル）、
(29)スルファモイル基、
(30)アルキル基（上記(26)における「アルキル基」と同義）でモノまたはジ置換されたスルファモイル基（例、メチルスルファモイル、エチルスルファモイル、ジメチルスルファモイル、ジエチルスルファモイル、エチルメチルスルファモイル）、
(31)アルカノイル基（例、水素原子若しくはアルキル基（上記(26)における「アルキル基」と同義）が炭素原子に結合したカルボニル基）、
(32)アロイル基（例、アリール基（上記（10）と同義）が炭素原子に結合したカルボニル基）、
(33)アルキルスルホニルアミノ基（例、アルキル基（上記(26)における「アルキル基」と同義）で置換されたスルホニルアミノ基）、
(34)アリールスルホニルアミノ基（例、アリール基（上記（10）と同義）で置換されたスルホニルアミノ基）、
(35)へテロアリールスルホニルアミノ基（例、ヘテロアリール基（上記（11）と同義）で置換されたスルホニルアミノ基）、
(36)アシルアミノ基（例、アシル基で置換されたアミノ基）、
ここで、「アシル基」とは、Ｃ１−６アルキル基、またはＣ６−１０アリール基を有するアシル基である。ここで、「Ｃ１−６アルキル基」とは、上記「アルキル基」のうち、炭素数が１〜６のものであり、「Ｃ6−１０アリール基」とは、上記「アリール基」のうち、炭素数が６〜１０のものである。アシル基としては、具体的には、アセチル基、プロピオニル基、ブチロイル基、イソブチロイル基、バレロイル基、イソバレロイル基、ピバロイル基、ヘキサノイル基、アクリロイル基、メタクリロイル基、クロトノイル基、イソクロトノイル基、ベンゾイル基、ナフトイル基等が挙げられる、
(37)アルコキシカルボニルアミノ基（例、アルコキシ基（上記(12)と同義）で置換されたカルボニルアミノ基）、
(38)アルキルスルホニル基（例、アルキル基（上記(26)における「アルキル基」と同義）で置換されたスルホニル基）、
(39)アルキルスルフィニル基（例、アルキル基（上記(26)における「アルキル基」と同義）で置換されたスルフィニル基）、
(40)アルコキシカルボニル基（例、メトキシカルボニル基、エトキシカルボニル基）、
(41)アルキル基（Ｃ1−６アルキル基；例、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ｎ−ペンチル、イソペンチル、ｔｅｒｔ−ペンチル、ネオペンチル、２−ペンチル、３−ペンチル、ｎ−ヘキシル、２−ヘキシル等）等が挙げられる。
置換基が２以上存在する場合は、それらは同一でも異なっていてもよい。
【００６５】
式（Ｉ）に示される化合物は、塩の形態であってもよい。前記式（Ｉ）で表される化合物の塩としては、例えば、塩酸及び臭化水素酸等の無機酸との塩ならびに酢酸、プロピオン酸、酒石酸、フマル酸、マレイン酸、リンゴ酸、シュウ酸、コハク酸、クエン酸及び安息香酸等の有機酸との塩が挙げられる。これらの塩は、自体公知の方法によって製造される。
【００６６】
式（Ｉ）に示される化合物は、置換基の種類によってはＥの立体配置を有するＥ体及びＺの立体配置を有するＺ体の幾何異性体が存在する場合がある。本発明はこれらＥ体、Ｚ体またはＥ体およびＺ体を任意の割合で含む混合物を包含するものである。
【００６７】
また、式（Ｉ）に示される化合物は、１個又は２個以上の不斉炭素原子の存在に起因する光学活性体が存在するが、式（Ｉ）に示される化合物は全ての光学活性体又はラセミ体を包含する。
【００６８】
［式（Ｉ）に示される化合物の合成］
式（Ｉ）に示される化合物は、下記式で表されるように、ケトン化合物とＨ２Ｎ−Ｘ−Ｒ１（式中、Ｘ及びＲ１は前記の意味を表し、例えば、ヒドラジド化合物、セミカルバジド化合物等）、それぞれを１当量ずつ用い、トルエン、１,４−ジオキサン、Ｎ、Ｎ−ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド等の溶媒中、１００℃以上の温度範囲で、１時間から３日間反応を行なうのが好ましい。
［反応式１］
【００６９】
【化２５】
2020067477.tif 000027
【００７０】
反応終了後の反応混合物は、蒸留水を加えて析出させる、又は析出しない場合は、有機溶媒抽出後濃縮といった通常の後処理を行ない、目的の特定化合物を得ることができる。また、精製の必要が生じたときには、再結晶、カラムクロマトグラフ、薄層クロマトグラフ、液体クロマトグラフ分取等の任意の精製方法によって分離、精製することができる。
【００７１】
[光学活性体の取得]
上述の方法により合成される化合物のうち、光学異性体を有するものについては、光学活性体（ユートマー）が存在し得る。光学活性体の取得は、結晶化による方法、酵素反応を用いる方法、又はＨＰＬＣを用いる方法（例、光学活性担持法）等の自体公知の方法を用いて行うことができる。また、光学活性体を、不斉合成法等を用いて調製することもできる。
【００７２】
１．細胞のパラクライン因子の産生促進用培地添加剤
本発明は、以下の特定化合物またはその塩を含む、細胞のパラクライン因子生産促進用培地添加剤（以下、「本発明の培地添加剤」と称することがある）を提供する。
【００７３】
本発明の培地添加剤に含まれる化合物は、式（Ｉ）：
【００７４】
【化２６】
2020067477.tif 000028
【００７５】
｛式中、Ｘは、−ＮＨＣＯ−であり、
Ｒ１は、−Ｙ−ＮＨ−Ｚ−Ａｒであり（式中、Ｙ、およびＺは、単結合、または置換基を有していてもよい炭素数１〜６のアルキレン基であり、Ａｒは、置換基を有していてもよいアリール基またはヘテロアリール基である。）、Ｒ２は、置換基を有していてもよい炭素数１〜６のアルキル基であり、Ｒ３は、水酸基であり、ｎは、０、１または２の整数である。｝で表される化合物、またはその塩である（以下、式（I）で示される化合物またはその塩を総称して、単に「本発明に用いられる特定化合物」等と称する場合がある）。
【００７６】
一態様において、Ｙが、単結合である場合は、Ｚは、置換基を有していてもよいアルキレン基（より好ましくは、置換基を有していないアルキレン基、特に好ましくは、メチレン基）であり、Ａｒは、置換基（より好ましくは、ハロゲン原子、メチル基、水酸基、またはメトキシ基）を有していてもよいアリール基（より好ましくは、水酸基を有するアリール基または置換基を有していないアリール基、特に好ましくはフェニル基または水酸基を有するフェニル基）、または置換基（より好ましくは、ハロゲン原子、メチル基、水酸基、またはメトキシ基）を有していてもよいヘテロアリール基（より好ましくは、置換基を有していてもよいピリジル基、特に好ましくは、置換基を有していないピリジル基又はフルオロ基を有するピリジル基）であり、Ｒ２は、置換基を有していてもよい炭素数１〜６のアルキル基（より好ましくは、置換基を有していない炭素数１〜６のアルキル基、特に好ましくは、エチル基）であり、ｎは、０、１または２の整数であり、好ましくは、ｎは０である。
【００７７】
また、Ｙが、置換基を有していてもよい炭素数１〜６のアルキレン基（より好ましくは、置換基を有していない炭素数１〜６のアルキレン基、特に好ましくはメチレン基、エチリデン基またはプロピリデン基）である場合は、Ｚは、単結合であり、Ａｒは、置換基を有していてもよいアリール基（より好ましくは、置換基を有しているアリール基、特に好ましくは、ハロゲノ基、メチル基、水酸基もしくはエトキシ基を有するフェニル基、またはナフチル基）、または置換基を有していてもよいヘテロアリール基（より好ましくは、ハロゲノ基を有していてもよいヘテロアリール基、特に好ましくは、置換基を有していないピリジル基またはフルオロ基を有するピリジル基）であり、Ｒ２は、置換基を有していてもよい炭素数１〜６のアルキル基（より好ましくは、置換基を有していない炭素数１〜６のアルキル基、特に好ましくは、メチル基、エチル基、またはイソプロピル基）であり、ｎは、０、１または２の整数であり、好ましくは、ｎは０である。
【００７８】
本発明の培地添加剤に配合される、本発明に用いられる特定化合物の量は、所望の効果を得られ得る限り特に限定されないが、通常０．０１〜１００重量％、好ましくは０．１〜１００重量％、より好ましくは１〜１００重量％、さらに好ましくは５〜１００重量％、特に好ましくは１０〜１００重量％で有り得る。
【００７９】
本発明の培地添加剤は、提供時あるいは保存時に任意の形状であり得る。本発明の培地添加剤は、固形状、液体状、及びゲル状等の形状であり得る。
【００８０】
また、本発明の培地添加剤は、必要に応じて滅菌処理を施してもよい。滅菌方法は特に制限はなく、本発明の培地添加剤の形状に合わせて適宜選択すればよい。滅菌方法としては、例えば、放射線滅菌、エチレンオキサイドガス滅菌、オートクレーブ滅菌、フィルター滅菌等が挙げられる。フィルター滅菌（以下、ろ過滅菌という場合もある。）を行う際のフィルター部分の材質は特に制限されないが、例えば、グラスファイバー、ナイロン、ＰＥＳ（ポリエーテルスルホン）、親水性ＰＶＤＦ（ポリフッ化ビニリデン）、セルロース混合エステル、セルロースアセテート、ポリテトラフルオロエチレン等が挙げられる。フィルターの細孔の大きさは特に制限されないが、好ましくは、０．１μｍ〜１０μｍ、より好ましくは、０．１μｍ〜１μｍ、最も好ましくは、０．１μｍ〜０．５μｍである。
【００８１】
本発明の培地添加剤において「細胞のパラクライン因子の産生を促進させる」とは、細胞のパラクライン因子の産生能力を高め、該因子の細胞外への分泌量を増加させることを意味する。尚、本明細書において、本発明の培地添加剤により増加するパラクライン因子の量は、対照となる所定のパラクライン因子の分泌量と比較して、少なくとも１２０％以上、少なくとも１３０％以上、少なくとも１４０％以上、少なくとも１５０％以上、少なくとも１６０％以上、少なくとも１７０％以上、少なくとも１８０％以上、少なくとも１９０％以上、少なくとも２００％以上、少なくとも３００％以上、少なくとも４００％以上、少なくとも５００％以上、少なくとも６００％以上、少なくとも７００％以上、少なくとも８００％以上、少なくとも９００％以上、少なくとも１０００％以上、蛋白質の産生・分泌量が増大することを意味する。分泌される蛋白質量の測定は、以下の実施例において説明されるように、ＥＬＩＳＡ（Ｅｎｚｙｍｅ−Ｌｉｎｋｅｄ  ＩｍｍｕｎｏＳｏｒｂｅｎｔ  Ａｓｓａｙ）法やフローサイトメーター法などの自体公知の方法を用いることができる。
【００８２】
本発明の培地添加剤により産生が促進されるパラクライン因子には、ＴＳＧ−６（ＴＮＦ−ｓｔｉｍｕｌａｔｅｄ  ｇｅｎｅ  ６  ｐｒｏｔｅｉｎ）、及び、ＳＴＣ−１（Ｓｔａｎｎｉｏｃａｌｃｉｎ−１）等の抗炎症性蛋白質、並びに、ＡＮＧ（Ａｎｇｉｏｇｅｎｉｎ）、ＥＧＦ（Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ）、ＭＣＰ−１（Ｍｏｎｏｃｙｔｅ Ｃｈｅｍｏｔａｃｔｉｃ Ｐｒｏｔｅｉｎ−１）、ＥＮＡ−７８（ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌ−ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ７８）、ｂＦＧＦ（Ｂａｓｉｃ  ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ）、ＩＬ−６（Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−６）、ＩＬ−８（Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−８）、ＶＥＧＦ（Ｖａｓｃｕｌａｒ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ）、ＶＥＧＦ−Ｄ（Ｖａｓｃｕｌａｒ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ−Ｄ）、ＴＩＭＰ（Ｔｉｓｓｕｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ  ｏｆ  ｍａｔｒｉｘ  ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ）、ＰＤＧＦ（Ｐｌａｔｅｌｅｔ−Ｄｅｒｉｖｅｄ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ）、ＴＧＦ−β（ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ−β）等の血管新生促進蛋白質が挙げられるが、これらに限定されない。特に、細胞が間葉系幹細胞である場合、ＴＳＧ−６、ＳＴＣ−１ＡＮＧ、及びＭＣＰ−１の産生・分泌量を顕著に増加させることができる。
【００８３】
本発明の培地添加物を添加した培地で培養し得る細胞は、所望の効果を得られる限り特に限定されないが、哺乳動物由来の細胞であり得る。かかる細胞の例としては、生体を構成する体細胞、正常細胞株、がん細胞株、前駆細胞、幹細胞、生体から分離され人為的に遺伝子改変が成された細胞、生体から分離され人為的に核が交換された細胞等の細胞が挙げられるが、これらに限定されない。なお、これらの細胞の由来も特に限定されず、ラット、マウス、ウサギ、モルモット、リス、ハムスター、ハタネズミ、カモノハシ、イルカ、クジラ、イヌ、ネコ、ヤギ、ウシ、ウマ、ヒツジ、ブタ、ゾウ、コモンマーモセット、リスザル、アカゲザル、チンパンジー、ヒト等の哺乳動物由来の細胞が挙げられる。また、かかる細胞が由来する組織または臓器も、特に限定されず、組織の例としては、皮膚、腎臓、脾臓、副腎、肝臓、肺、卵巣、膵臓、子宮、胃、結腸、小腸、大腸、膀胱、前立腺、精巣、胸腺、筋肉、結合組織、骨、軟骨、血管組織、血液、心臓、眼、脳または神経組織等の組織が挙げられ、また、臓器の例としては、肝臓、肺、腎臓、心臓、膵臓、胃、脾臓、小腸、大腸、生殖器等の臓器が挙げられる。尚、本明細書において「幹細胞」とは、自分自身を複製する能力と他の複数系統の細胞に分化する能力を兼ね備えた細胞を意味し、その例としては、以下に限定されるものではないが、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）、胚性腫瘍細胞、胚性生殖幹細胞、人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）、神経幹細胞、造血幹細胞、間葉系幹細胞、肝幹細胞、膵幹細胞、筋幹細胞、生殖幹細胞、腸幹細胞、癌幹細胞、毛包幹細胞などが挙げられる。多能性幹細胞としては、前記幹細胞のうち、ＥＳ細胞、胚性生殖幹細胞、ｉＰＳ細胞が挙げられる。前駆細胞とは、前記幹細胞から特定の体細胞や生殖細胞に分化する途中の段階にある細胞である。好ましい一態様において、細胞は、ヒト間葉系幹細胞（ｈＭＳＣ）である。
【００８４】
本発明の培地添加剤の培地への好ましい添加量は、本発明の所望の効果を得られる限り特に限定されないが、例えば、本発明に用いられる特定化合物の培地中の濃度が、通常０．００１〜１００μＭ、好ましくは０．０１Ｍ〜５０μＭ、より好ましくは０．１〜３０μＭ、さらに好ましくは１〜２０μＭ、特に好ましくは５〜１０μＭとなるように、本発明の培地添加剤を培地へ添加することができる。
【００８５】
本発明の培地添加剤を適用し得る培地は特に限定されず、市販の培地に添加することで、本発明の培地添加剤の所望の効果を得ることができる。好適な市販培地としては、例えば、ダルベッコ改変イーグル培地（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ’ｓ Ｍｅｄｉｕｍ；ＤＭＥＭ）、ハムＦ１２培地（Ｈａｍ’ｓ Ｎｕｔｒｉｅｎｔ Ｍｉｘｔｕｒｅ Ｆ１２）、ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地、マッコイ５Ａ培地（ＭｃＣｏｙ’s ５Ａ ｍｅｄｉｕｍ）、イーグルＭＥＭ（Ｅａｇｌｅ’s Ｍｉｎｉｍｕｍ Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｍｅｄｉｕｍ；ＥＭＥＭ）、αＭＥＭ（ａｌｐｈａ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ’s Ｍｉｎｉｍｕｍ Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｍｅｄｉｕｍ；αＭＥＭ）、ＭＥＭ（Ｍｉｎｉｍｕｍ Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｍｅｄｉｕｍ）、ＲＰＭＩ１６４０培地、イスコフ改変ダルベッコ培地（Ｉｓｃｏｖｅ’s Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’s Ｍｅｄｉｕｍ；ＩＭＤＭ）、ＭＣＤＢ１３１培地、ウィリアム培地Ｅ、ＩＰＬ４１培地、Ｆｉｓｃｈｅｒ’s培地、ＳｔｅｍＰｒｏ３４（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）、Ｘ−ＶＩＶＯ １０（ケンブレックス社製）、Ｘ−ＶＩＶＯ １５（ケンブレックス社製）、ＨＰＧＭ（ケンブレックス社製）、ＳｔｅｍＳｐａｎ Ｈ３０００（ステムセルテクノロジー社製）、ＳｔｅｍＳｐａｎＳＦＥＭ（ステムセルテクノロジー社製）、ＳｔｅｍｌｉｎｅＩＩ（シグマアルドリッチ社製）、ＱＢＳＦ−６０（クオリティバイオロジカル社製）、ＳｔｅｍＰｒｏｈＥＳＣＳＦＭ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）、Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ８（登録商標）培地（ギブコ社製）、ｍＴｅＳＲ１或いは２培地（ステムセルテクノロジー社製）、ＴｅＳＲ−Ｅ８培地（ステムセルテクノロジー社製）、リプロＦＦ或いはリプロＦＦ２（リプロセル社製）、Ｐｒｉｍａｔｅ  ＥＳ  Ｃｅｌｌ  Ｍｅｄｉｕｍ（リプロセル社製）、ＰＳＧｒｏ ｈＥＳＣ／ｉＰＳＣ培地（システムバイオサイエンス社製）、ＮｕｔｒｉＳｔｅｍ（登録商標）培地（バイオロジカルインダストリーズ社製）、ＳｔｅｍＦｉｔ（登録商標）培地（味の素社製）、ＣＳＴＩ−７培地（細胞科学研究所社製）、ＭｅｓｅｎＰＲＯ ＲＳ培地（ギブコ社製）、ＭＦ−Ｍｅｄｉｕｍ（登録商標）間葉系幹細胞増殖培地（東洋紡株式会社製）、間葉系幹細胞用培地（プロモセル社製）、間葉系幹細胞用培地２（プロモセル社製）、ＭＳＣＧＭ（ロンザ社製）、ＭｅｓｅｎＣｕｌｔ  ＸＦ（ステムセルテクノロジー社製）、ＳｔｅｍＰｒｏ  ＭＳＣ  ＸＦ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）、Ｓｆ−９００ＩＩ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）、Ｏｐｔｉ−Ｐｒｏ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）等の培地が挙げられるが、これらに限定されない。
【００８６】
また、上記の培地に、ナトリウム、カリウム、カルシウム、マグネシウム、リン、塩素、各種アミノ酸、各種ビタミン、抗生物質、血清、脂肪酸、糖、細胞増殖因子、分化誘導因子、細胞接着因子、抗体、酵素、サイトカイン、ホルモン、レクチン、細胞外マトリックス、生理活性物質等の更なる物質を適宜添加することができる。具体的な例としては、ＴＮＦ（Ｔｕｍｏｒ Ｎｅｃｒｏｓｉｓ Ｆａｃｔｏｒ）α、ＬＰＳ（リポ多糖）、ＢＭＰ２（Ｂｏｎｅ  Ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｔｉｃ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  ２）等が挙げられる。
【００８７】
細胞培養条件（例えば、温度、二酸化炭素濃度、培養期間等）は自体公知の条件を用いればよく、あるいは、目的に応じて、適宜改変してもよい。例えば、細胞を培養する際の温度は、通常２５〜３９℃、好ましくは３３〜３９℃（例、３７℃）である。二酸化炭素濃度は、通常、培養の雰囲気中、４〜１０体積％であり、４〜６体積％が好ましい。培養期間は、通常１〜３５日間であるが、培養の目的に合わせて適宜設定すればよい。
【００８８】
本発明の培地添加剤を３次元細胞培養培地に添加すると、より顕著なパラクライン産生促進効果を得ることができる。本明細書における３次元細胞培養（３Ｄ細胞培養）とは、例えば、包埋培養法、マイクロキャリア培養法、スフェア培養法、ハンギングドロップ培養法などを用いて細胞を３次元的な環境にて培養することを意味する。包埋培養は、マトリゲル（登録商標）、Ｇｅｌｔｒｅｘ（登録商標）、寒天、メチルセルロース、コラーゲン、ゼラチン、フィブリン、アガロース、アルギン酸塩等の固形または半固体のゲル基材の中に細胞を埋め込み、固定させて培養する方法である。マイクロキャリア培養法は、水よりも僅かに重い微粒子（以下、マイクロキャリアともいう）の表面上に細胞を単層に増殖させ、当該微粒子をフラスコ等の培養容器内で撹拌し、浮遊状態での培養を行うものである。スフェア培養法は、目的の細胞が、数十〜数百個から成る凝集塊（以下、スフェアまたはスフェロイドともいう）を形成させた後、当該凝集塊を培地中で静置または振とうして培養する方法である。ハンギングドロップ培養法は、例えば細胞懸濁液の液滴（容量として１０〜５０μＬ程度）を培養容器の蓋等の天井側に点着し、載せた液滴がぶら下がるように逆さの状態で培養する方法が挙げられる。このように培養することで、細胞は平面との接触により受ける影響が最小限となり、液滴の下部においてスフェアを形成する。このような液滴は、ＧｒａｖｉｔｙＰＬＵＳ Ｐｌａｔｅ（パーキンエルマー社製）の様な特殊な培養容器を用いて調製することもできる。また、本発明の培地添加剤を適用し得る３次元細胞培養（３Ｄ細胞培養）として、ヒアルロン酸、脱アシル化ジェランガム、キサンタンガムなどの多糖類又はこれらの派生物を培地中で分散させることにより、不定型な３次元ネットワークを形成させ、これをスキャフォールドとして接着性細胞を培地中に浮遊した状態に維持することにより、より生体内に近い３次元的な状態において細胞を培養する手法も用いることができる。この際、３次元細胞培養中の細胞は、該３次元ネットワークにトラップされており沈殿しないため、振とう、回転操作等を要することなく培養することが可能となる。３次元細胞培養は、自体公知の方法により実施することができる（例えば、ＷＯ２０１４／０１７５１３を参照）。
【００８９】
細胞の培養は、細胞培養に一般的に用いられるシャーレ、フラスコ、プラスチックバック、テフロン（登録商標）バック、ディッシュ、ペトリデッシュ、組織培養用ディッシュ、マルチディッシュ、マイクロプレート、マイクロウエルプレート、マルチプレート、マルチウエルプレート、チャンバースライド、チューブ、トレイ、培養バック、ローラーボトル等の培養容器を用いて実施することができる。一態様において、培養容器として、培養容器の表面が、細胞との接着性を向上させる目的で人工的に処理（例えば、細胞外マトリクス等によるコーティング処理）されているものを用いてもよい。このような容器の例としては、マトリゲル（登録商標）、Ｇｅｌｔｒｅｘ（登録商標）、コラーゲン、ゼラチン、ポリ−Ｌ−リジン、ポリ−Ｄ−リジン、ラミニン、フィブロネクチン、ビトロネクチン、テネイシン、セレクチン、ヒアルロン酸、フィブリン等をコーティングした容器が挙げられるが、これに限定されない。また、細胞の培養器材に対する接着を阻害するためのコーティング材料を用いることもできる。このようなコーティング材料としては、ハイドロゲル、ｐｒｅｖｅｌｅｘ（登録商標）、シリコン、ポリ（２−ヒドロキシメチルメタクリレート）、ポリ（２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン）等が挙げられるが、これらに限られるわけではない。
【００９０】
細胞の培養は、機械的な制御下のもと閉鎖環境下で細胞播種、培地交換、細胞画像取得、培養細胞回収を自動で実行し、ｐＨ、温度、酸素濃度などを制御しながら、高密度での培養が可能なバイオリアクターや自動培養装置によって行うこともできる。これら装置を用いて培養の途中に新しい培地を補給し、要求する物質を過不足なく細胞および／または組織に供給する手法には、流加培養、連続培養、灌流培養が含まれるが、これらに限定されない。
【００９１】
２．細胞培養用培地
本発明はまた、本発明の培地添加剤を含む、細胞培養培地（以下、「本発明の培地」と称することがある）を提供する。
【００９２】
本発明の培地は、細胞培養用の培地に本発明の培地添加剤を添加することにより調製される。本発明の培地の調製に用い得る細胞培養用培地には、「１．細胞のパラクライン因子の産生促進用培地添加剤」において例示した市販培地が含まれるが、これらに限定されない。本発明の培地添加剤に含有される本発明に用いられる特定化合物の濃度も、「１．細胞のパラクライン因子の産生促進用培地添加剤」において説明したものと同様とすることができる。
【００９３】
好ましい一態様において、本発明の培地は３次元細胞培養が可能な細胞培養培地であり得る。
【００９４】
３．パラクライン因子の産生が促進された細胞の生産方法
本発明はまた、本発明に用いられる特定化合物を含有する培地中において細胞を培養することを含む、パラクライン因子の産生が促進された細胞の生産方法（以下、「本発明の生産方法」と称することがある）を提供する。
【００９５】
本発明の生産方法における、本発明に用いられる特定化合物、その培地中の濃度、使用し得る培地、培養し得る細胞種、培養条件等は、「１．細胞のパラクライン因子の産生促進用培地添加剤」において説明したものと同様とすることができる。また、本発明の生産方法に用いる培地として、上述した本発明の培地を用いてもよい。
【００９６】
本発明の生産方法の一態様において、細胞の培養は３次元細胞培養法を用いて行い得る。３次元細胞培養法において培養することにより、パラクライン因子の生産がより顕著に促進され得る。３次元細胞培養法に関しては、上述した通りである。
【００９７】
４．生体移植用組成物
本発明はまた、本発明の生産方法により生産された細胞を含む、生体移植用組成物（以下、「本発明の組成物」と称することがある）を提供する。
【００９８】
本発明の組成物が移植される組織は、含有される細胞種に応じて決定すればよい。例えば、間葉系幹細胞を主に含有する場合は、間葉系細胞により構成される組織である、骨組織、軟骨組織、脂肪組織、及び血管組織等の修復ないし再生に好適に用いることができるが、これらに限定されない。
【００９９】
本発明の組成物に含まれる細胞の含有量は特に限定されず、適用する部位、適用、経路等に応じて適宜決定すればよい。
【０１００】
本発明の組成物は、本発明の方法で生産された細胞に加えて、薬学的に許容可能な医薬品添加物を含んでいてもよい。医薬品添加物は、等張化剤、緩衝剤、ｐＨ調整剤、安定化剤、キレート剤、防腐剤などが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１０１】
等張化剤は、塩化ナトリウム、塩化カリウム、糖類、グリセリン等が例示できる。緩衝剤は、ホウ酸、リン酸、酢酸、クエン酸、およびそれらに対応する塩（例えばそれらのナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩、マグネシウム塩等のアルカリ金属塩やアルカリ土類金属塩）等が例示できる。ｐＨ調整剤は、塩酸、硫酸、リン酸、ポリリン酸、ホウ酸、またはホウ砂などの無機酸類；酢酸、プロピオン酸、シュウ酸、グルコン酸、フマル酸、乳酸、クエン酸、コハク酸、酒石酸、リンゴ酸などの有機酸類；水酸化カリウム、または水酸化ナトリウムなどの無機塩基；モノエタノールアミン、トリエタノールアミン、ジイソプロパノールアミン、またはトリイソプロパノールアミンなどの有機塩基；酢酸アンモニウム、乳酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム、炭酸カリウム、炭酸水素ナトリウム、炭酸ナトリウム、炭酸水素アンモニウム、リン酸二カリウム、リン酸二水素カリウム、リン酸水素ナトリウム、リン酸二水素ナトリウム、乳酸カルシウムなどが例示できる。安定化剤は、ヒト血清アルブミンや通常のＬ−アミノ酸、糖類、セルロース誘導体等が例示でき、これらは単独でまたは界面活性剤等と組み合せて使用できる。上記Ｌ−アミノ酸は、グリシン、システイン、グルタミン酸等のいずれでもよいが、これらに限定されない。糖類は、グルコース、マンノース、ガラクトース、果糖等の単糖類、マンニトール、イノシトール、キシリトール等の糖アルコール、ショ糖、マルトース、乳糖等の二糖類、デキストラン、ヒドロキシプロピルスターチ、コンドロイチン硫酸、ヒアルロン酸等の多糖類等、およびそれらの誘導体等のいずれでもよく、これらに限定されるものではない。セルロース誘導体は、メチルセルロース、エチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム等のいずれでもよいが、これらに限定されない。キレート剤は、エデト酸ナトリウム、クエン酸等が例示できる。
【０１０２】
本発明の組成物の形状としては、生体に移植可能な形状であれば特に限定されないが、例えば、細胞と適切な分散媒とからなる液体状や、適切な生体適合性材料上に細胞を固着させたシート状等の形状が例示される。
【０１０３】
本発明の組成物に含まれる、本発明の方法により生産された細胞は、上述した通り、パラクライン因子の生産・分泌が促進されている。例えば、本発明の方法により生産された間葉系幹細胞は、本発明に用いられる特定化合物による処理が行われていない間葉系幹細胞と比較して、より高い抗炎症効果及び血管新生促進効果を有している。従って、かかる間葉系幹細胞を成分として含む本発明の組成物は、生体へ移植することにより、適用部位のより高い再生効果が期待される。
【０１０４】
５．炎症性疾患又は虚血性疾患治療用組成物
本発明はまた、本発明の生産方法により生産された間葉系幹細胞を含む、炎症性疾患又は虚血性疾患の治療用組成物（以下、「本発明の治療用組成物」と称することがある）を提供する。本発明の治療用組成物は、炎症性疾患又は虚血性疾患を罹患する対象に投与することで、疾患を治療することができる。
【０１０５】
本発明の治療組成物の対象への投与方法は、所望の効果を得ることができれば特に限定されないが、非常に簡便であることから、血中内投与が好ましい。また、特に治療対象において重症部が認められる場合等には、該部位に直接本発明の治療用組成物を移植することもできる。
【０１０６】
本発明の治療用組成物に含まれる間葉系幹細胞は、本発明の方法により生産された間葉系幹細胞であればよい。
【０１０７】
本発明の治療用組成物に含まれる間葉系幹細胞の含有量は、治療有効量であれば特に限定されず、組成物の形状等を考量して適宜決定すればよい。
【０１０８】
本発明の治療用組成物の形状としては、対象に非経口投与可能な形状であれば特に限定されないが、例えば、細胞と適切な分散媒とからなる液体状とすることができる。また、重症部に本発明の治療用組成物を直接移植する場合等では、本発明の治療用組成物の形状を、生体適合性材料上に間葉系幹細胞を固着させたシート状とすることもできる。
【０１０９】
本発明の治療用組成物を対象へ投与する量は特に限定されず、治療有効量であればいかなる量であってもよい。治療有効量は、疾患の程度、対象の年齢や体重、投与方法、投与回数、本発明の治療組成物の形状等を考慮の上、適宜決定することができる。
【０１１０】
本発明の治療用組成物は、本発明の方法で生産された間葉系幹細胞に加えて、薬学的に許容可能な医薬品添加物を含んでいてもよい。医薬品添加物は、等張化剤、緩衝剤、ｐＨ調整剤、安定化剤、キレート剤、防腐剤などが挙げられるが、これらに限定されない。医薬品添加物の具体例は、「４．生体移植用組成物」に記載したものと同様である。
【０１１１】
本発明の治療用組成物が好適に使用される疾患としては、炎症性疾患及び虚血性疾患が挙げられる。
【０１１２】
本発明の治療用組成物が適用され得る炎症性疾患としては、炎症性腸疾患、潰瘍性大腸炎、クローン病、腎炎、急性腎炎、慢性腎炎、糸球体腎炎、ＩｇＡ腎症、糖尿病性腎症、膜性腎症、水腎症、造影剤腎症、腎盂腎炎、腎不全、間質性腎炎、腎障害、ネフローゼ症候群、高血圧性腎硬化症、糖尿病性糸球体硬化症、腎結石、アミロイド腎、腎静脈血栓症、Ａｌｐｏｒｔ症候群、肝炎、肝硬変、膵炎、肺炎、副鼻腔炎、鼻炎、関節炎、変形性膝関節症、変形性手関節症、変形性足関節症、変形性股関節症、関節リウマチ、周期性発熱・アフタ性口内炎・咽頭炎・リンパ節炎症候群（ＰＦＡＰＡ）、成人発症型スティル病、ベーチェット病、痛風、偽痛風、Ｓｃｈｎｉｔｚｌｅｒ症候群、慢性再発性多発性骨髄炎（ＣＲＭＯ）、クリオピリン関連周期熱症候群（ＣＡＰＳ）、家族性寒冷蕁麻疹、Ｍｕｃｋｌｅ−Ｗｅｌｌｓ症候群、慢性乳児神経皮膚関節炎症候群（ＣＩＮＣＡ症候群）／新生児発症多臓器炎症疾患（ＮＯＭＩＤ）、ＴＮＦ（腫瘍壊死因子）受容体関連周期性症候群（ＴＲＡＰＳ）、高ＩｇＤ症候群（メバロン酸キナーゼ欠損症）、ブラウ症候群／若年発症サルコイドーシス、家族性地中海熱、ＰＡＰＡ（化膿性関節炎・壊疽性膿皮症・座瘡）症候群、中條−西村症候群、Ｍａｊｅｅｄ症候群、ＮＬＲＰ１２関連周期熱症候群（ＮＡＰＳ１２）、インターロイキン１受容体アンタゴニスト欠損症（ＤＩＲＡ）、インターロイキン３６受容体アンタゴニスト欠損症（ＤＩＴＲＡ）、フォスフォリパーゼＣγ２関連抗体欠損・免疫異常症（ＰＬＡＩＤ）、ＨＯＩＬ−１欠損症、ＳＬＣ２９Ａ３欠損症、ＣＡＲＤ１４異常症、ＡＤＡ２（アデノシンデアミナーゼ２）欠損症、ＳＴＩＮＧ-Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  Ｖａｓｃｕｌｏｐａｔｈｙ  ｗｉｔｈ  Ｏｎｓｅｔ  ｉｎ  Ｉｎｆａｎｃｙ（ＳＡＶＩ）およびＮＬＲＣ４異常症などが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１１３】
また、本発明の治療用組成物が適用され得る虚血性疾患としては、狭心症、心筋梗塞、たこつぼ心筋症、中枢性肺水腫、脳梗塞、虚血性脳卒中、閉塞性動脈硬化症、重症下肢虚血などが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１１４】
６．炎症性疾患又は虚血性疾患治療用組成物
本発明はまた、以下の工程を含む、パラクライン因子の生産方法（以下、「本発明のパラクライン因子の生産方法」と称することがある）：
（１）本発明の培地において細胞を培養する工程、及び、
（２）（１）で用いられた培地の上清を回収する工程。
【０１１５】
本発明のパラクライン因子の生産方法の工程（１）において用いられる細胞は、パラクライン因子を生産・分泌し得るいかなる細胞であってもよく、例えば、「１．細胞のパラクライン因子の産生促進用培地添加剤」において説明したものが挙げられる。好ましい一態様において、細胞は間葉系幹細胞である。
【０１１６】
細胞培養の条件は特に限定されず、培養する細胞が維持・増殖する条件であればいかなるものであってもよい。好適な細胞培養条件は、当業者であれば公知の方法を用いて容易に決定することができる。好ましい一態様において、細胞は、３次元培養により培養される。
【０１１７】
細胞の培養は、機械的な制御下のもと閉鎖環境下で細胞播種、培地交換、細胞画像取得、培養細胞回収を自動で実行し、ｐＨ、温度、酸素濃度などを制御しながら、高密度での培養が可能なバイオリアクターや自動培養装置によって行うこともできる。これら装置を用いて培養の途中に新しい培地を補給し、要求する物質を過不足なく細胞に供給する手法には、流加培養、連続培養、灌流培養が含まれるが、これらに限定されない。
【０１１８】
本発明の培地を用いて細胞を培養することにより、該細胞はパラクライン因子を効率よく産生し、その結果、生産されたパラクライン因子が大量に培地中に分泌される。従って、該培地の上清を回収することにより、大量に産生・分泌されたパラクライン因子を回収することができる。
【０１１９】
本発明のパラクライン因子の生産方法の工程（２）における上清の回収方法も、特に制限されず、公知の上清回収方法を用いればよい。例えば、培養後の細胞を含有する培地を遠心分離に供し、細胞を沈殿させた後に、ピペット等を用いて上清を回収することができるが、これに限定されない。
【０１２０】
沈殿させた細胞を再度工程（１）の培養に供し、本発明のパラクライン因子の生産方法を繰り返すことで、さらに大量のパラクライン因子を回収することもできる。
【０１２１】
以下の実施例において本発明を更に具体的に説明するが、本発明はこれらの例によってなんら限定されるものではない。
【実施例】
【０１２２】
［化合物の合成例］
本明細書において２’，４’−ジヒドロキシ−３’−メチルプロピオフェノン（「ｋ−１」とも称することがある。）のケトンについては自体公知の方法により合成が可能である（Sum TH et al., Tetrahedron. 2015 Jul 1;71(26-27): 4557-4564.）。また、２−（フェニルアミノ)アセトヒドラジド（「Ｈ−１」とも称することがある。）のヒドラジンも、自体公知の方法により合成が可能である（Samal RP et al., Chem Biol Drug Des. 2013 Jun;81(6):715-29.）。【０１２３】
［合成例１］ｋ−１：Ｂ−１の合成法
２−ブロモプロピオン酸メチル（１０９）（５００ｍｇ、３．０ｍｍｏｌ）をＤＭＳＯ（６ｍＬ）に溶解させ、アニリン（０．３６ｍＬ、３．９ｍｍｏｌ）、炭酸カリウム（０．５４ｇ、３．９ｍｍｏｌ）を加えて室温で２１時間撹拌した。酢酸エチル（３０ｍＬ）、水（５０ｍＬ）を加えて分液し、有機層を飽和食塩水（３０ｍＬ）で洗浄、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。ろ過、減圧下濃縮して得られた残渣を中圧シリカゲルクロマトグラフィー（シリカゲル３０ｇ、酢酸エチル／ヘキサン＝２／９８〜１５／８５）で精製し、Ｎ-フェニルアラニン  メチル  エステル（１１０）（３４３ｍｇ、１．９１ｍｍｏｌ、収率６４％）を薄黄色液体として得た。【０１２４】
上記のようにして得られた１１０（３４０ｍｇ、１．９ｍｍｏｌ）をメタノール（３．８ｍＬ）に溶解させ、ヒドラジン一水和物（０．１８ｍＬ、３．８ｍｍｏｌ）を加えて６０℃で２４時間撹拌した。ヒドラジン一水和物（０．３６ｍＬ、７．４ｍｍｏｌ）を追加して６０℃で更に１７時間撹拌した。反応溶液を減圧下濃縮して得られた残渣を中圧シリカゲルクロマトグラフィー（アミンシリカゲル１０ｇ、酢酸エチル／塩化メチレン＝０／１００〜２０／８０）で精製し、２−（フェニルアミノ）プロパンヒドラジド（１１１）（３２１ｍｇ、１．７９ｍｍｏｌ、収率９４％）を無色固体として得た。【０１２５】
上記のようにして得られた１１１（１６８ｍｇ、０．９３７ｍｍｏｌ）、２’，４’−ジヒドロキシ−３’−メチルプロピオフェノン（ｋ−１）（１３０ｍｇ、０．７２ｍｍｏｌ）をＤＭＳＯ（１．４ｍＬ）に溶解させ１００℃で１９時間撹拌した。放冷後、蒸留水（１５ｍＬ）を加え、析出した固体をろ取、乾燥して得られた黄色固体を塩化メチレンで懸濁洗浄後、減圧下乾燥し、ｋ−１：Ｂ−１（１７３ｍｇ、０．５０７ｍｍｏｌ、収率７０％）を薄黄色固体として得た。【０１２６】
［合成例２］ｋ−１：Ｄ−１の合成法
３−ベンジルオキシアニリン（１２９）（２．４４ｇ、１２．２ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（２４ｍＬ）に溶解させ、酢酸ナトリウム（１．１０ｇ、１３．５ｍｍｏｌ）、ブロモ酢酸エチル（１２８）（１．４９ｍＬ、１３．５ｍｍｏｌ）を加えて室温で４時間撹拌した。水（３００ｍＬ）、酢酸エチル（１５０ｍＬ）を加えて分液し、有機層を飽和食塩水（１００ｍＬ）で洗浄した。無水硫酸ナトリウムで乾燥、ろ過、減圧下濃縮して得られた残渣を中圧シリカゲルカラムクロマトグラフィー（シリカゲル５０ｇ、酢酸エチル／ヘキサン＝２／９８〜１０／９０）にて精製し、Ｎ−（３−ベンジルオキシフェニル）グリシン  エチル  エステル（１３０）（２．８２ｇ、９．８８ｍｍｏｌ、収率８１％）を薄黄色固体として得た。【０１２７】
上記のようにして得られた１３０（１．０ｇ、３．５ｍｍｏｌ）をメタノール（１８ｍＬ）に懸濁させ、１０％Ｐｄ／Ｃ（０．１ｇ）を加えて水素雰囲気下室温で５時間撹拌した。反応溶液をセライトろ過し、ろ液を減圧下濃縮して得られた残渣を中圧シリカゲルカラムクロマトグラフィー（シリカゲル３０ｇ、酢酸エチル／ヘキサン＝３／９７〜３５／６５）にて精製し、Ｎ−（３−ヒドロキシフェニル）グリシン  エチル  エステル（１３１）（２９５ｍｇ、１．５１ｍｍｏｌ、収率４３％）を薄黄色液体として得た。  【０１２８】
上記のようにして得られた１３１（０．２９ｇ、１．５ｍｍｏｌ）をエタノール（３．５ｍＬ）に溶解させ、ヒドラジン一水和物（０．３２ｍＬ、６．５ｍｍｏｌ）を加えて６０℃で１８時間撹拌した。反応溶液を減圧下濃縮し、得られた残渣を中圧シリカゲルクロマトグラフィー（アミンシリカゲル１０ｇ、メタノール／塩化メチレン＝１／９９〜１０／９０）で精製した。得られた固体をＩＰＥで懸濁洗浄後、減圧下乾燥し、２−［（３−ヒドロキシフェニル）アミノ］アセトヒドラジド（１３２）（２３９ｍｇ、１．３２ｍｍｏｌ、収率８８％）を薄黄色固体として得た。【０１２９】
上記のようにして得られた１３２（１３０ｍｇ、０．７２ｍｍｏｌ）、２’，４’−ジヒドロキシ−３’−メチルプロピオフェノン（ｋ−１）（１００ｍｇ、０．５５ｍｍｏｌ）をＤＭＳＯ（１．１ｍＬ）に溶解させ１００℃で２１時間撹拌した。放冷後、反応溶液をそのまま中圧シリカゲルカラムクロマトグラフィー（シリカゲル１０ｇ、酢酸エチル／塩化メチレン＝５／９５〜５０／５０）にて精製した。得られた固体を水、およびＩＰＥで懸濁洗浄後、減圧下乾燥し、ｋ−１：Ｄ−１（９５．９ｍｇ、０．２７９ｍｍｏｌ、収率５１％）を無色固体として得た。【０１３０】
［合成例３］ｋ−１：Ｊ−１の合成法
氷冷したＴＨＦ（１０ｍＬ）に水素化アルミニウム（１．０ｇ、２６ｍｍｏｌ）、３−シアノフェノール（１４８）（０．６３ｇ、５．３ｍｍｏｌ）を順次加え、室温で１．５時間、６０℃で３．５時間撹拌した。放冷後、水素化アルミニウム（１．０ｇ、２６ｍｍｏｌ）、ＴＨＦ（１０ｍＬ）を追加して６０℃で更に１６時間撹拌した。反応溶液を氷冷し、水（１．５ｍＬ）、１５％水酸化ナトリウム水溶液（１．５ｍＬ）、水（４．５ｍＬ）を順次加えて室温で３時間撹拌した。懸濁溶液をセライトろ過し、ろ液を減圧下濃縮して得られた残渣を中圧シリカゲルカラムクロマトグラフィー（アミンシリカゲル１０ｇ、メタノール／塩化メチレン＝０／１００〜８／９２）にて精製した。得られた固体をＩＰＥで懸濁洗浄後、減圧下乾燥し、３−（アミノメチル）フェノール（１４９）（４７７ｍｇ、３．８７ｍｍｏｌ、収率７３％）を無色固体として得た。【０１３１】
上記のようにして得られた１４９（２００ｍｇ、１．６ｍｍｏｌ）を塩化メチレン（２ｍＬ）、水（２ｍＬ）に溶解させ、炭酸水素ナトリウム（０．２７ｇ、３．２ｍｍｏｌ）を加えて氷冷下クロロギ酸フェニル（１３６）（０．２２ｍＬ、１．７ｍｍｏｌ）をゆっくり滴下した。室温で２０時間撹拌し、酢酸エチル（２０ｍＬ）、水（２０ｍＬ）を加えて分液した。有機層を飽和食塩水（２０ｍＬ）で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥、ろ過、減圧下濃縮して得られた残渣を中圧シリカゲルカラムクロマトグラフィー（シリカゲル１０ｇ、酢酸エチル／ヘキサン＝５／９５〜３５／６５）にて精製しフェニル  （３−ヒドロキシベンジル）カーバメート（１５０）（３６９ｍｇ、１．５２ｍｍｏｌ、収率９５％）を無色液体として得た。【０１３２】
上記のようにして得られた１５０（３６５ｍｇ、１．５０ｍｍｏｌ）をアセトニトリル（３．８ｍＬ）に懸濁させ、ヒドラジン一水和物（０．１８ｍＬ、３．８ｍｍｏｌ）を加えて室温で２．５時間、ヒドラジン一水和物（０．１８ｍＬ、３．８ｍｍｏｌ）を追加して５５℃で更に２０時間撹拌した。反応溶液を減圧下濃縮し、得られた固体をＩＰＥ／塩化メチレン（３／１）で懸濁洗浄後、減圧下乾燥し、Ｎ−（３−ヒドロキシベンジル）ヒドラジンカルボキシアミド（１５１）（２３３ｍｇ、１．２９ｍｍｏｌ、収率８６％）を無色固体として得た。【０１３３】
上記のようにして得られた１５１（１３０ｍｇ、０．７２ｍｍｏｌ）、２’，４’−ジヒドロキシ−３’−メチルプロピオフェノン（ｋ−１）（１００ｍｇ、０．５５ｍｍｏｌ）をＤＭＳＯ（１．１ｍＬ）に溶解させ１００℃で１５時間撹拌した。放冷後、反応溶液をそのまま中圧シリカゲルカラムクロマトグラフィー（シリカゲル１０ｇ、酢酸エチル／塩化メチレン＝１０／９０〜５５／４５）にて精製した。得られた精製物に水を加えて析出した固体をろ取後、減圧下乾燥し、ｋ−１：Ｊ−１（１０２ｍｇ、０．２９７ｍｍｏｌ、収率５４％）を無色固体として得た。【０１３４】
［合成例４］ｋ−１：Ｈ−１の合成法
ｋ−１（１００ｍｇ、０．５５５ｍｍｏｌ）、Ｈ−１（１１０ｍｇ、０．６６６ｍｍｏｌ）をＤＭＳＯ（１．１ｍＬ）に溶解させ、１００℃で１４時間撹拌した。放冷後、蒸留水（１１ｍＬ）を加え、再度１００℃で撹拌後、熱時ろ過してｋ−１：Ｈ−１（７０．１ｍｇ、０．２１４ｍｍｏｌ、収率３９％）を薄黄色固体として得た。【０１３５】
［合成例５］ＧＡ−００２Ａの合成法
前述の合成例１で合成したｋ−１：Ｂ−１（ラセミ体）を下記分取条件に従ってＷａｔｅｒｓ社製超臨界流体クロマトグラフィー（ＳＦＣ）にて光学分割を行い、以下の２つのエナンチオマーを取得した。両エナンチオマーの比旋光度は、旋光度計Ｐ−１０２０（日本分光社製）を用いて測定した。また、エナンチオマーの立体配置（Ｒ体、Ｓ体）は、Ｘ線結晶構造解析によって決定した。
化合物ＧＡ−００２Ａ（ｋ−１：Ｂ−１の左旋性エナンチオマー）；保持時間１１．９５分、分取量４７５．１ｍｇ、光学純度９９．９ｅｅ％、純度９９．０％、比旋光度[α]２２Ｄ  −１０．５（ｃ＝０．１０１９、エタノール）、立体配置Ｒ体
＜分取条件＞
カラム：ＣＨＩＲＡＬＰＡＫ  ＩＡ＜ダイセル社製、２０＊２５０ｍｍ、５μｍ＞、弱溶媒：ＣＯ２（７０％）、強溶媒：ＭｅＯＨ（３０％）、カラム温度：４０℃、総チャージ量：１ｇ、流速：１５ｍＬ／分【０１３６】
［合成例６］ＧＡ−００５Ａの合成法【０１３７】
【化２７】
2020067477.tif 000029
【０１３８】
（式中、Ｂｎはベンジル基を示す）
Ｄ−アラニンメチル塩酸塩（１５７）（１．４０ｇ、１０．０ｍｍｏｌ）、３−ベンジルオキシフェニルボロン酸（１５８）（３．４３ｇ、１５．１ｍｍｏｌ）、酢酸銅（ＩＩ）一水和物（３．００ｇ、１５．１ｍｍｏｌ）、モレキュラーシーブ４Ａ（ＭＳ４Ａ；２０ｇ）を塩化メチレン（２００ｍＬ）に溶解させ、トリエチルアミン（４．１７ｍＬ、３０．１ｍｍｏｌ）を加えて酸素雰囲気下室温で２３時間撹拌した。反応溶液をセライトろ過し、ろ液を半分まで減圧下濃縮、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液（５０ｍＬ）を加えて分液した。有機層を飽和食塩水（２０ｍＬ）で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥、ろ過、減圧下濃縮した。得られた残渣を中圧シリカゲルカラムクロマトグラフィー（シリカゲル３０ｇ、酢酸エチル／ヘキサン＝１／９９〜１０／９０）にて精製し、１５９（５９５ｍｇ、２．０９ｍｍｏｌ、収率２１％）を黄色液体として得た。【０１３９】
【化２８】
2020067477.tif 000030
【０１４０】
（式中、Ｂｎはベンジル基を示す）
上記のようにして得られた１５９（５９５ｍｇ、２．０９ｍｍｏｌ）をメタノール（２１ｍＬ）に溶解させ、パラジウム炭素エチレンジアミン複合体（２４１ｍｇ）を加えて水素雰囲気下、室温で３．５時間撹拌した。パラジウム炭素をろ別し、ろ液を減圧下濃縮して得られた残渣を中圧シリカゲルカラムクロマトグラフィー（シリカゲル３０ｇ、酢酸エチル／ヘキサン＝１０／９０〜３０／７０）にて精製し、１６０（４１３ｍｇ、２．１２ｍｍｏｌ、ｑｕａｎｔ．）を黄色液体として得た。【０１４１】
【化２９】
2020067477.tif 000031
【０１４２】
上記のようにして得られた１６０（４１３ｍｇ、２．１２ｍｍｏｌ）をメタノール（４．２ｍＬ）に溶解させ、ヒドラジン一水和物（１．０ｍＬ、２１ｍｍｏｌ）を加えて６０℃で３．５時間撹拌した。反応溶液を減圧下濃縮、トルエン共沸して得られた残渣を中圧シリカゲルカラムクロマトグラフィー（シリカゲル１０ｇ、メタノール／塩化メチレン＝１／９９〜１０／９０）にて精製し、１６１（３９１ｍｇ、２．００ｍｍｏｌ、収率９５％）を褐色アモルファスとして得た。【０１４３】
【化３０】
2020067477.tif 000032
【０１４４】
上記のようにして得られた１６１（７２ｍｇ、０．３７ｍｍｏｌ）、２’，４’−ジヒドロキシ−３’−メチルプロピオフェノン（１００）（６０ｍｇ、０．３３ｍｍｏｌ）をＤＭＳＯ（０．６７ｍＬ）に溶解させ１００℃で３日撹拌した。放冷後、反応溶液をそのまま中圧シリカゲルカラムクロマトグラフィー（シリカゲル１０ｇ、酢酸エチル／塩化メチレン＝５／９５〜５０／５０）にて精製し、得られた精製物を蒸留水、イソプロピルアルコール（ＩＰＡ）／ヘキサン、蒸留水で順次懸濁洗浄して、ＧＡ−００５Ａ（ＺＸ−０１−Ｒ（４０．５ｍｇ、０．１１３ｍｍｏｌ、収率３４％））を薄茶色固体として得た。比旋光度は、旋光度計Ｐ−１０２０（日本分光社製）を用いて測定した。  【０１４５】
1H-NMR(270MHz); ;δ13.65(s, 1H), 10.75(s, 1H), 9.70(s, 1H), 8.97(s, 1H), 7.25(d, J=8.1Hz, 1H), 6.83(t, J=8.1Hz, 1H), 6.39(d, J=8.1Hz, 1H), 6.15-5.95(m, 3H), 5.81(d, J=8.1Hz, 1H), 4.18(m, 1H), 2.78(q, J=8.1Hz, 2H), 1.95(s, 3H), 1.37(d, J=8.1Hz, 3H), 1.03(t, J=8.1Hz, 3H).
化合物ＧＡ−００５Ａ；光学純度９９．９ｅｅ％、純度９９．２％、比旋光度[α]２２Ｄ−１１．４（ｃ＝０．０２６４、エタノール）、立体配置Ｒ体【０１４６】
［合成例７］Ａ−００４の合成法
合成例１に準じた方法により、２−（ピリジン−３−アミノ)プロパンヒドラジド１３５ｍｇ及び２’，４’−ジヒドロキシ−３’−メチルプロピオフェノン１３５ｍｇよりＡ−００４を８１．６ｍｇ合成した。【０１４７】
［合成例８］Ａ−００４Ａの合成法
Ｗａｔｅｒｓ社製超臨界流体クロマトグラフィー（ＳＦＣ）を用いてＡ-００４を光学分割し、６．６ｍｇのＡ−００４Ａを得た。【０１４８】
〔光学分割条件〕
カラム；ＣＨＩＲＡＬＰＡＫ  ＩＡ−３（２０×２５０ｍｍ、５μｍ；ダイセル社製）
移動相；ＣＯ２：ＭｅＯＨ＝６０：４０（体積比）
カラム温度；４０℃
流速；１５ｍＬ／分【０１４９】
上記条件においてＡ−００４Ａ（光学純度９９．９ｅｅ％）の保持時間は８．１４分であった。
［合成例９］Ａ−００７の合成法
合成例１に準じた方法により、２−（ピリジン−３−アミノ−５−フルオロ)プロパンヒドラジド１４３ｍｇ及び２’，４’−ジヒドロキシ−３’−メチルプロピオフェノン１００ｍｇよりＡ−００７を９４．４ｍｇ合成した。  【０１５０】
式（Ｉ）に示される化合物は、前記の合成例１〜９に準じて合成することができる。前記の合成例により合成した式（Ｉ）に示される化合物の例を第１表乃至第３表に示すが、本発明に用いられる特定化合物はこれらのみに限定されるものではない。【０１５１】
表中、Ｍｅとの記載はメチルを表し、以下同様に、Ｅｔとの記載はエチルを、ｎ−Ｐｒ及びＰｒ−ｎはノルマルプロピルを、ｉ−Ｂｕはイソブチルをそれぞれ表す。また、Ｒ５は、アリール基の置換基であり、前記したものと同様である。なお、（Ｒ３）ｎおよび（Ｒ５）ｍにおける「−」との記載は無置換を表す。構造式に記載された番号は、（Ｒ３）ｎまたは（Ｒ５）ｍの置換位置を表す。ｎは、０、１または２の整数であり、ｍは、０、１、２、３、４または５の整数である。Ｒ５が複数存在する場合、Ｒ５は、それぞれ同一であってもよく、または異なっていてもよい。【０１５２】
〔第１表〕
【化３１】
2020067477.tif 000033
【０１５３】
【表１】
2020067477.tif 000034
【０１５４】
〔第２表〕【０１５５】
【化３２】
2020067477.tif 000035
【０１５６】
【表２】
2020067477.tif 000036
【０１５７】
〔第３表〕【０１５８】
【化３３】
2020067477.tif 000037
【０１５９】
【表３】
2020067477.tif 000038
【０１６０】
式（Ｉ）に示される化合物のうち、第１表乃至第３表に記載の化合物の１Ｈ−ＮＭＲデータを以下に示す（ＧＡ−００５ＡのＮＭＲデータは上記したことから以下では省略した）。【０１６１】
プロトン核磁気共鳴ケミカルシフト値は、重ジメチルスルホキシドの値を２．４９ｐｐｍとして、重ジメチルスルホキシド中で、２７０ＭＨｚまたは４００ＭＨｚにて測定した。尚、表中の記号は下記の意味を表す。ｓ：シングレット、ｂｒｓ：ブロードシングレット、ｄ：ダブレット、ｄｄ：ダブルダブレット、ｔ：トリプレット、ｑ：カルテット、ｍ：マルチプレット。【０１６２】
k-1:B-1; 400MHz
δ10.82(s, 1H), 9.71(s, 1H), 7.25(d, J=8.0Hz, 1H), 7.07(t, J=8.0Hz, 2H), 6.63(d, J=8.0Hz, 2H), 6.56(t, J=8.0Hz, 1H), 6.39(d, J=8.0Hz, 1H), 5.93(d, J=12Hz, 1H), 4.28(m, 1H), 2.80(q, J=8.0Hz, 2H), 1.95(s, 3H), 1.40(d, J=8.0Hz, 3H)1.03(t, J=8.0Hz, 3H).(NHの一つのシグナルは観測されなかった。)【０１６３】
k-1:D-1;270MHz
δ 13.66(s, 1H), 10.76(s, 1H), 9.70(s, 1H), 8.98(s, 1H), 7.25(d, J=10.8Hz, 1H), 6.86(t, J=10.8Hz, 1H), 6.40(d, J=8.1Hz, 1H), 6.20-5.95(m, 3H), 5.87(t, J=5.4Hz, NH), 3.88(d, J=5.4Hz, 2H), 2.78(q, J=8.0Hz, 2H), 1.97(s, 3H), 1.05(t, J=8.1Hz, 3H).【０１６４】
k-1:J-1;270MHz
δ13.45(br, 1H), 9.57(s, 1H), 9.53(s, 1H), 9.36(s, 1H), 7.17(d, J=8.1Hz, 1H), 7.11(d, J=8.1Hz, 1H), 6.80-6.70(m, 3H), 6.64(br, NH), 6.37(d, J=8.1Hz, 1H), 4.25(d, J=5.4Hz, 2H), 2.65(q, J=8.1Hz, 2H), 1.97(s, 3H), 1.08(t, J=8.1Hz, 3H).【０１６５】
k-1:H-1;270MHz
δ13.98(s, 1H), 11.13(s, 1H), 10.01(s, 1H), 7.58(d, J=8.1Hz, 1H), 7.41(t, J=8.1Hz, 2H), 6.95(d, J=8.1Hz, 2H), 6.89(t, J=8.1Hz, 1H), 6.72(d, J=8.1Hz, 1H), 6.29(t, J=8.1Hz, NH), 4.27(d, J=8.1Hz, 2H), 3.11(q, J=8.1Hz, 2H), 2.29(s, 3H), 1.37(t, J=8.1Hz, 3H).【０１６６】
A-004;270MHz
δ13.63(s, 1H), 10.91(s, 1H), 9.71(s, 1H), 8.02(d, J=2.7Hz, 1H),, 7.79(d, J=5.4Hz, 1H), 7.26(d, J=8.1Hz, 1H), 7.08(t, J=8.1Hz, 1H), 6.94(d, J=8.1Hz, 1H), 6.40(d, J=8.1Hz, 1H), 6.23(d, J=8.1Hz, 1H), 4.33(m, J=8.1Hz, 1H), 2.82(q, J=8.1Hz, 2H), 1.95(s, 3H), 1.42(d, J=8.1Hz, 3H), 1.05(t, J=8.1Hz, 3H).【０１６７】
A-007;270MHz
δ13.61(s, 1H), 10.97(s, 1H), 9.73(s, 1H), 7.89(brs, 1H), 7.71(brs, 1H), 7.26(d,J=8.1Hz, 1H), 6.98(d, J=8.1Hz, 1H), 6.79(d, J=13.5Hz, 1H), 6.69(d, J=8.1Hz, 1H), 6.38(d, J=8.1Hz, 1H), 4.34(m, 1H), 2.82(q, J=8.1Hz, 2H), 1.93(s, 3H), 1.40(d, J=8.1Hz, 3H) , 1.05(t, J=8.1Hz, 3H).【０１６８】
［実施例１］パラクライン因子放出量試験１
（培養上清の回収）
ヒト骨髄由来間葉系幹細胞（ｈＭＳＣ、ＰｒｏｍｏＣｅｌｌ社製）を、間葉系幹細胞増殖培地２（ＰｒｏｍｏＣｅｌｌ社製）を用いた単層培養法（２Ｄ）にて前培養した。ｈＭＳＣを同培地に懸濁した後、３次元培養法（３Ｄ）では、底面に窪み部を有する細胞非接着性の６ウェルＥＺＳＰＨＥＲＥプレート（ＡＧＣテクノグラス社製、＃４８１０−９００）に５×１０５ｃｅｌｌｓ／２ｍＬ／ウェルとなるように播種した。２Ｄでは、６ウェル平底プレート（コーニング社製、＃３５１６）に５×１０５ｃｅｌｌｓ／２ｍＬ／ウェルとなるように播種した。引き続き、終濃度５μＭとなるように、ＤＭＳＯに溶解した化合物ｋ−１：Ｂ−１、ｋ−１：Ｄ−１、ｋ−１：Ｊ−１を２μＬ／ウェル添加し、３７℃、５％ ＣＯ２インキュベーターにて４８時間培養した。対照として、ＤＭＳＯを終濃度０．０５％となるよう添加した。４８時間後、化合物を含まない培地に交換し、３７℃、５％ ＣＯ２インキュベーターにて培養し、４８時間後に培養上清を回収した。また培養上清回収時の細胞数は、Ｄｅｔａｃｈ  Ｋｉｔ（ＰｒｏｍｏＣｅｌｌ社製）を用いてシングルセルに分散し、一部をトリパンブルー（和光純薬工業社製）で懸濁してＴＣ−２０（ＢＩＯ−ＲＡＤ社製）にて生細胞数をカウントすることで計測した。【０１６９】
（ＥＬＩＳＡを用いた定量）
培養上清中に含まれるパラクライン因子の一種であり、サイトカインであるＡｎｇｉｏｇｅｎｉｎ（ＡＮＧ）を、プレートリーダーを用いて定量した。定量にあたっては、Ｈｕｍａｎ  Ａｎｇｉｏｇｅｎｉｎ  ＥＬＩＳＡ  Ｋｉｔ（アブカム社製、＃ａｂ９９９７０）を使用した。【０１７０】
ＡＮＧの培養上清中濃度を細胞数で補正し、２Ｄ培養した対照群に対する相対値を表４に示した。その結果、化合物ｋ−１：Ｂ−１、ｋ−１：Ｄ−１、および化合物ｋ−１：Ｊ−１を添加することで、２Ｄ培養及び３Ｄ培養ともに分泌量が増加した。これにより、間葉系幹細胞に化合物ｋ−１：Ｂ−１、ｋ−１：Ｄ−１、および化合物ｋ−１：Ｊ−１を添加することで、パラクライン因子の分泌を促進することが明らかとなった。【０１７１】
【表４】
2020067477.tif 000039
【０１７２】
［実施例２］パラクライン因子放出量試験２
（培養上清の回収）
ヒト骨髄由来間葉系幹細胞（ｈＭＳＣ、ＰｒｏｍｏＣｅｌｌ社製）を、間葉系幹細胞増殖培地２（ＰｒｏｍｏＣｅｌｌ社製）を用いた単層培養法（２Ｄ）にて前培養した。ｈＭＳＣを同培地に懸濁した後、３次元培養法（３Ｄ）では、底面に窪み部を有する細胞非接着性の６ウェルＥＺＳＰＨＥＲＥプレート（ＡＧＣテクノグラス社製、＃４８１０−９００）に５×１０５ｃｅｌｌｓ／２ｍＬ／ウェルとなるように播種した。２Ｄでは、６ウェル平底プレート（コーニング社製、＃３５１６）に５×１０５ｃｅｌｌｓ／２ｍＬ／ウェルとなるように播種した。引き続き、終濃度５μＭとなるように、ＤＭＳＯに溶解した化合物ｋ−１：Ｂ−１を２μＬ／ウェル添加し、３７℃、５％ ＣＯ２インキュベーターにて４８時間培養した。対照として、ＤＭＳＯを終濃度０．０５％となるよう添加した。４８時間後、化合物を含まない培地に交換し、３７℃、５％ ＣＯ２インキュベーターにて培養し、４８時間後に培養上清を回収した。また培養上清回収時の細胞数は、Ｄｅｔａｃｈ  Ｋｉｔ（ＰｒｏｍｏＣｅｌｌ社製）を用いてシングルセルに分散し、一部をトリパンブルー（和光純薬工業社製）で懸濁してＴＣ−２０（ＢＩＯ−ＲＡＤ社製）にて生細胞数をカウントすることで計測した。【０１７３】
（ＥＬＩＳＡを用いた定量）
培養上清中に含まれるパラクライン因子の一種であり、サイトカインであるＳｔａｎｎｉｏｃａｌｃｉｎ−１（ＳＴＣ−１）を、プレートリーダーを用いて定量した。定量にあたっては、Ｈｕｍａｎ  Ｓｔａｎｎｉｏｃａｌｃｉｎ  ＥＬＩＳＡ  Ｋｉｔ（アブカム社製、＃ａｂ２１３８２９）を使用した。【０１７４】
ＳＴＣ−１の培養上清中濃度を細胞数で補正し、２Ｄ培養した対照群に対する相対値を表５に示した。その結果、２Ｄ培養と比較して３Ｄ培養においてこれらの分泌量が増加した。また、化合物ｋ−１：Ｂ−１を添加することで、２Ｄ培養及び３Ｄ培養ともに分泌量が増加し、２Ｄ培養の対照群と比較して３Ｄ培養の化合物添加群においてＳＴＣ−１は８．９５倍分泌量が増加した。これにより、３Ｄ培養した間葉系幹細胞に化合物ｋ−１：Ｂ−１を添加することで、最もパラクライン因子の分泌を促進することが明らかとなった。【０１７５】
【表５】
2020067477.tif 000040
【０１７６】
［実施例３］炎症刺激下でのパラクライン因子放出量試験
（培養上清の回収）
ヒト骨髄由来間葉系幹細胞（ｈＭＳＣ、ＰｒｏｍｏＣｅｌｌ社製）を、間葉系幹細胞増殖培地２（ＰｒｏｍｏＣｅｌｌ社製）を用いた単層培養法（２Ｄ）にて前培養した。ｈＭＳＣを同培地に懸濁した後、３次元培養法（３Ｄ）では、底面に窪み部を有する細胞非接着性の６ウェルＥＺＳＰＨＥＲＥプレート（ＡＧＣテクノグラス社製、＃４８１０−９００）に５×１０５ｃｅｌｌｓ／２ｍＬ／ウェルとなるように播種した。２Ｄでは、６ウェル平底プレート（コーニング社製、＃３５１６）に５×１０５ｃｅｌｌｓ／２ｍＬ／ウェルとなるように播種した。引き続き、終濃度５μＭとなるように、ＤＭＳＯに溶解した化合物ｋ−１：Ｊ−１を２μＬ／ウェル添加し、３７℃、５％ ＣＯ２インキュベーターにて４８時間培養した。対照として、ＤＭＳＯを終濃度０．０５％となるよう添加した。４８時間後、１０ｎｇ／ｍＬのＴＮＦα（Ｒ＆Ｄｓｙｓｔｅｍｅｓ， ＃２１０−ＴＡ−０２０）のみを添加した培地に交換し、３７℃、５％ ＣＯ２インキュベーターにて培養し、４８時間後に培養上清を回収した。また培養上清回収時の細胞数は、Ｄｅｔａｃｈ  Ｋｉｔ（ＰｒｏｍｏＣｅｌｌ社製）を用いてシングルセルに分散し、一部をトリパンブルー（和光純薬工業社製）で懸濁してＴＣ−２０（ＢＩＯ−ＲＡＤ社製）にて生細胞数をカウントすることで計測した。【０１７７】
（ＥＬＩＳＡを用いた定量）
培養上清中に含まれるパラクライン因子の一種であり、サイトカインであるＴｕｍｏｒ  ｎｅｃｒｏｓｉｓ  ｆａｃｔｏｒ−ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ  ｇｅｎｅ  ６  ｐｒｏｔｅｉｎ（ＴＳＧ−６）を、プレートリーダーを用いて定量した。定量にあたっては、ＴＳＧ−６抗体(ＳａｎｔａＣｒｕｚ社、♯ｓｃ−６５８８６)をＮｕｎｃＭａｘｉｓｏｒｐ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、＃４４−２４０４−２１）プレートへ固相化し、培養上清サンプルと反応させ、ビオチン修飾ＴＳＧ−６抗体（Ｒ＆Ｄｓｙｓｔｅｍｓ社，♯ＢＡＦ−２１０４）、ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ−ＨＲＰ（アブカム社、＃ａｂ７４０３）、基質溶液（ＫＰＬ社、＃５２−００−０３）、反応停止液（ＫＰＬ社、＃５０−８５−０６）を用いて検出した。検量線の作成には、リコンビナントヒトＴＳＧ−６タンパク質（Ｒ＆Ｄｓｙｓｔｅｍｓ社、♯２１０４−ＴＳ）を使用した。【０１７８】
（フローサイトメーターを用いた定量）
培養上清中に含まれるパラクライン因子の一種であり、サイトカインであるＭｏｎｏｃｙｔｅ Ｃｈｅｍｏｔａｃｔｉｃ Ｐｒｏｔｅｉｎ−１（ＭＣＰ−１）を、フローサイトメーターを用いて定量した。定量解析にはＢＤＴＭ  ＣＢＡ  Ｆｌｅｘ  Ｓｅｔ（ＢＤ社製５５８２８７）を用いて、ＢＤ社プロトコルに従って実施した。【０１７９】
ＴＳＧ−６、ＭＣＰ−１の培養上清中濃度を細胞数で補正し、２Ｄ培養した対照群に対する相対値を表６に示した。その結果、ＴＳＧ−６については２Ｄ培養と比較して３Ｄ培養においてこれらの分泌量が増加した。また、化合物ｋ−１：Ｊ−１を添加することで、２Ｄ培養及び３Ｄ培養ともにＴＳＧ−６の分泌量が増加し、２Ｄ培養の対照群と比較して３Ｄ培養の化合物添加群において、ＴＳＧ−６は３．２１倍分泌量が増加した。ＭＣＰ−１は３Ｄ培養の化合物添加群においてのみ、分泌量が増加した。ＴＮＦα刺激がＴＳＧ−６やＭＣＰ−１の産生を促進することは既知の事実であるが、３Ｄ培養した間葉系幹細胞に化合物ｋ−１：Ｊ−１を添加することで、ＴＮＦα刺激への応答性が向上し、パラクライン因子の分泌を促進することが明らかとなった。このことは、化合物ｋ−１：Ｊ−１は炎症刺激への応答性を高め、抗炎症サイトカインを多く放出することを示しており、化合物ｋ−１：Ｊ−１が抗炎症治療剤として非常に有用であることを示している。【０１８０】
【表６】
2020067477.tif 000041
【０１８１】
［実施例４］パラクライン因子放出量試験３
（培養上清の回収）
ヒト骨髄由来間葉系幹細胞（ｈＭＳＣ、ＰｒｏｍｏＣｅｌｌ社製）を、間葉系幹細胞増殖培地２（ＰｒｏｍｏＣｅｌｌ社製）を用いた単層培養法（２Ｄ）にて前培養した。ｈＭＳＣを同培地に懸濁した後、３次元培養法（３Ｄ）では、底面に窪み部を有する細胞非接着性の６ウェルＥＺＳＰＨＥＲＥプレート（ＡＧＣテクノグラス社製、＃４８１０−９００）に５×１０５ｃｅｌｌｓ／２ｍＬ／ウェルとなるように播種した。２Ｄでは、６ウェル平底プレート（コーニング社製、＃３５１６）に５×１０５ｃｅｌｌｓ／２ｍＬ／ウェルとなるように播種した。引き続き、終濃度５μＭとなるように、ＤＭＳＯに溶解した化合物ｋ−１：Ｂ−１、ｋ−１：Ｄ−１、ｋ−１：Ｊ−１を２μＬ／ウェル添加し、３７℃、５％ ＣＯ２インキュベーターにて４８時間培養した。対照として、ＤＭＳＯを終濃度０．０５％となるよう添加した。４８時間後、化合物を含まない培地に交換し、３７℃、５％ ＣＯ２インキュベーターにて培養し、４８時間後に培養上清を回収した。また培養上清回収時の細胞数は、Ｄｅｔａｃｈ  Ｋｉｔ（ＰｒｏｍｏＣｅｌｌ社製）を用いてシングルセルに分散し、一部をトリパンブルー（和光純薬工業社製）で懸濁してＴＣ−２０（ＢＩＯ−ＲＡＤ社製）にて生細胞数をカウントすることで計測した。【０１８２】
（ＥＬＩＳＡを用いた定量）
培養上清中に含まれるパラクライン因子の一種であり、サイトカインであるｖａｓｃｕｌａｒ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ（ＶＥＧＦ）を、プレートリーダーを用いて定量した。定量にあたっては、Ｈｕｍａｎ  ＶＥＧＦ  ＥＬＩＳＡ  Ｋｉｔ（アブカム社製、＃ａｂ１００６６２）を使用した。【０１８３】
ＶＥＧＦの培養上清中濃度を細胞数で補正し、２Ｄ培養した対照群に対する相対値を表７に示した。その結果、化合物ｋ−１：Ｂ−１、ｋ−１：Ｄ−１、および化合物ｋ−１：Ｊ−１を添加することで、２Ｄ培養及び３Ｄ培養ともに分泌量が増加した。これにより、間葉系幹細胞に化合物ｋ−１：Ｂ−１、ｋ−１：Ｄ−１、および化合物ｋ−１：Ｊ−１を添加することで、パラクライン因子の分泌を促進することが明らかとなった。【０１８４】
【表７】
2020067477.tif 000042
【０１８５】
［実施例５］３Ｄ培養条件下でのパラクライン因子放出量試験
（培養上清の回収）
ヒト骨髄由来間葉系幹細胞（ｈＭＳＣ、ＰｒｏｍｏＣｅｌｌ社製）を、間葉系幹細胞増殖培地２（ＰｒｏｍｏＣｅｌｌ社製）を用いた単層培養法（２Ｄ）にて前培養した。ｈＭＳＣを同培地に懸濁した後、底面に窪み部を有する細胞非接着性の２４ウェルＥＺＳＰＨＥＲＥプレート（ＡＧＣテクノグラス社製、＃４８２０−９００ＳＰ）に２００００ｃｅｌｌｓ／２５０μＬ／ウェルとなるように播種した。引き続き、終濃度１０μＭとなるように、ＤＭＳＯに溶解した本発明に用いられる特定化合物を２５０μＬ／ウェル添加し、３７℃、５％ ＣＯ２インキュベーターにて７２時間培養した。対照として、ＤＭＳＯを終濃度０．１％となるよう添加した。７２時間後、特定化合物を含まない培地に交換し、３７℃、５％ ＣＯ２インキュベーターにて培養し、２４時間後に培養上清を回収した。培養上清回収時の細胞数の補正には、プロテインアッセイＢＣＡキット（富士フイルム和光純薬社製、♯２９７−７３１０１）にて測定した総蛋白量を用いた。【０１８６】
（ＥＬＩＳＡを用いた定量）
培養上清中に含まれるパラクライン因子の一種であり、サイトカインであるｖａｓｃｕｌａｒ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ（ＶＥＧＦ）及びＡｎｇｉｏｇｅｎｉｎ（ＡＮＧ）をプレートリーダーを用いて定量した。定量にあたっては、Ｈｕｍａｎ  ＶＥＧＦ  ＥＬＩＳＡ  Ｋｉｔ （アブカム社製、＃ａｂ１００６６２）、Ｈｕｍａｎ  Ａｎｇｉｏｇｅｎｉｎ  ＥＬＩＳＡ  Ｋｉｔ（アブカム社製、＃ａｂ９９９７０）をそれぞれ使用した。【０１８７】
ＶＥＧＦおよびＡＮＧの培養上清中濃度を総蛋白量で補正し、対照群に対する相対値を算出した。サイトカインの相対的分泌量が増加した化合物番号を下記に記載する。本試験の結果、本発明に用いられる特定化合物はパラクライン因子の分泌を促進することが明らかとなった。【０１８８】
ＶＥＧＦの相対的分泌量が１．２倍以上増加した化合物番号：
ｋ−１：Ｂ−１、ｋ−１：Ｊ−１、Ａ−００４、ＧＡ−００２Ａ、Ａ−００４Ａ
ＶＥＧＦの相対的分泌量が２倍以上増加した化合物番号：
ｋ−１：Ｂ−１、Ａ−００４Ａ【０１８９】
ＡＮＧの相対的分泌量が２倍以上増加した化合物番号：
ｋ−１：Ｈ−１、ｋ−１：Ｂ−１、ｋ−１：Ｄ−１、ｋ−１：Ｊ−１、Ａ−００４、ＧＡ−００２Ａ、Ａ−００４Ａ、Ａ−００７、ＧＡ−００５Ａ
ＡＮＧの相対的分泌量が４倍以上増加した化合物番号：
ｋ−１：Ｈ−１、ｋ−１：Ｂ−１、ｋ−１：Ｄ−１、Ａ−００４Ａ
【産業上の利用可能性】
【０１９０】
本発明によれば、非常に簡便且つ効率よく、細胞のパラクライン因子の産生を促進させることができる。また、本発明を用いて生産した細胞は、パラクライン因子の産生及び分泌が促進されているため、移植用細胞として非常に好適であると考えられる。また、本発明を用いて生産した細胞（例、間葉系幹細胞）は、パラクライン因子のうち、複数の抗炎症性蛋白質及び血管新生促進蛋白質の産生及び分泌が顕著に促進されている。従って、本発明を用いて産生した細胞（例、間葉系幹細胞）は、抗炎症性疾患及び虚血性疾患の治療に好適に用いられる。以上から、本発明は細胞培養分野や医療分野において極めて有益である。【０１９１】
本出願は、日本で出願された特願２０１８−１８５７９９（出願日：２０１８年９月２８日）を基礎としており、その内容は本明細書に全て包含されるものである。
【国際調査報告】
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