【手続補正書】
【提出日】平成21年11月6日(2009.11.6)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２１２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２１２】
（実施例２１）
（Ａ２Ｂアンタゴニストのマウスモデルの気道再構成における効果）
使用されるモデル方式は、アデノシン依存の肺損傷を有するアデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡ）欠乏のマウスモデルである。このモデルにおいて、肺の炎症および気道のリモデリングの増加はアデノシンの上昇と関連している。これらのマウスで観測された多くの特徴は、重度の喘息、ＣＯＰＤおよび肺線維症を含む慢性肺疾患の様々な形態を有する患者で観測される特徴と似ている。アプローチは、Ａ２ＢＡＲアンタゴニスト３−エチル−１−プロピル−８−｛１−［（３−トリフルオロメチルフェニル）メチル］ピラゾール−４−イル｝−１，３，７−トリヒドロプリン−２，６−ジオンを、ＡＤＡ欠乏のマウスの肺の炎症および損傷へのＡ２ＢＡＲの関与を調査する手段として使用してこれらのマウスを処置することであり、これはこの薬剤の慢性肺疾患の処置に対する有効性の見識を提供すべきである。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２１３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２１３】
１ｍｇ／ｋｇの３−エチル−１−プロピル−８−｛１−［（３−トリフルオロメチルフェニル）メチル］ピラゾール−４−イル｝−１，３，７−トリヒドロプリン−２，６−ジオンを、１日に２回マウスに腹腔内（ｉｐ）注射で処置した。特定のプロトコルは以下のとおりである：マウスの出生の際に、血中内のＡＤＡの酵素活性をスクリーニングすることで、ＡＤＡ欠乏（ＡＤＡ−／−）かＡＤＡ含有（ＡＤＡ＋）マウスかを鑑定した。ＡＤＡ−／−マウスは、出生後２日目から出生後２１日目までＡＤＡ酵素治療を受け続けた。この段階で３−エチル−１−プロピル−８−｛１−［（３−トリフルオロメチルフェニル）メチル］ピラゾール−４−イル｝−１，３，７−トリヒドロプリン−２，６−ジオンを使用した処置またはビヒクル制御（とうもろこし油／エタノール／ＤＭＳＯ）を開始した。処置は朝（午前８〜９時）および夕方（午後５〜６時）のｉｐ注射から成った。処置を１７日間毎日行い、実験を出生後３８日目で終了した。処置群は、３−エチル−１−プロピル−８−｛１−［（３−トリフルオロメチルフェニル）メチル］ピラゾール−４−イル｝−１，３，７−トリヒドロプリン−２，６−ジオンまたはビヒクルを受けるまたは何も受けないＡＤＡ−／−またはＡＤＡ＋マウス含んだ。全てのマウスは同腹の子であり、ゆえに系統は一致した。雄および雌の両方がこれらの実験には含まれた。実験の終了時に、３−エチル−１−プロピル−８−｛１−［（３−トリフルオロメチルフェニル）メチル］ピラゾール−４−イル｝−１，３，７−トリヒドロプリン−２，６−ジオンのレベルの薬物速度論的（ＰＫ）分析のために、血清を収集し、多種の肺の終点を検査した。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２１４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２１４】
これらの研究からの結果は、ＡＤＡ−／−マウスの３−エチル−１−プロピル−８−｛１−［（３−トリフルオロメチルフェニル）メチル］ピラゾール−４−イル｝−１，３，７−トリヒドロプリン−２，６−ジオンによる処置は、肺の炎症および気道の破壊を大幅に低減する結果となったことを示す。おそらく、本研究からの最も劇的な観測結果は、処置プロトコルの最後における動物の総括的健康状態であった。ビヒクル処置されたまたは何も処置されなかったＡＤＡ−／−マウスのいずれかは、速い呼吸および丸まった姿勢を含む重度の呼吸困難の目に見える徴候を示した。これらの特徴は３−エチル−１−プロピル−８−｛１−［（３−トリフルオロメチルフェニル）メチル］ピラゾール−４−イル｝−１，３，７−トリヒドロプリン−２，６−ジオンで処置したＡＤＡ−／−マウスでは観測されなかった。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２２１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２２１】
（結果）
（組織学的分析）
肺の組織学的分析を図１に示す。ビヒクル処置をしたＡＤＡ−／−マウスの肺は、大きな肺胞の気道の単純化（図１Ｂ）を示し、遠位気道中の活性マクロファージの蓄積を主に含む肺の炎症を増大させた（図１Ｅ）。しかしながら、気管支周囲／脈管周囲の炎症もまた明らかであった（図示されていない）。ＡＤＡ＋の、ビヒクル処置したマウス（図１ＡおよびＤ）または３−エチル−１−プロピル−８−｛１−［（３−トリフルオロメチルフェニル）メチル］ピラゾール−４−イル｝−１，３，７−トリヒドロプリン−２，６−ジオン処置をしたマウス、または何も処置しなかったマウス（図示されていない）では、肺胞の気道の単純化および肺の炎症は明らかではなかった。ＡＤＡ−／−マウスのアデノシンＡ２Ｂ受容体アンタゴニストによる処置によって、肺胞の気道の単純化の大幅な低減（図１Ｃ）および肺の炎症の大幅な低減（図１Ｆ）をもたらす結果となった。これらの発見は、Ａ２Ｂアデノシン受容体アンタゴニストを使用した処置は、ＡＤＡ−／−マウスにおける肺の炎症および気道の破壊の発生を予防し得ることを示す。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２２６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２２６】
（コラーゲン沈着への影響）
ＡＤＡ−／−モデルにおける先の作業は、ＡＤＡ−／−マウスはアデノシン上昇と関連して重度の肺線維症を発症することを実証した。ＡＤＡ−／−マウスの線維症に対するＡ２Ｂアデノシン受容体アンタゴニスト処置の影響を決定するために、本発明者らはＭａｓｏｎのトリクローム染色を使用して、コラーゲン沈着の程度を検査した（図６）。コラーゲン沈着の検査は、ビヒクル処置したＡＤＡ−／−マウスでは遠位気道のコラーゲン沈着が顕著であった（図６Ｃ）一方で、ビヒクルまたはアデノシンＡ２Ｂ受容体アンタゴニスト処置をしたＡＤＡ＋マウスの肺では少量〜０のコラーゲン沈着であった（図６ＡおよびＢ）ことを明らかにした。アデノシンＡ２Ｂ受容体アンタゴニスト３−エチル−１−プロピル−８−｛１−［（３−トリフルオロメチルフェニル）メチル］ピラゾール−４−イル｝−１，３，７−トリヒドロプリン−２，６−ジオンを使用したＡＤＡ−／−マウスの処置は、気道中のコラーゲン沈着を減少させる（図６Ｄ）結果となった。全ての肺α１−プロコラーゲンの転写レベル（図６Ｅ）、およびＢＡＬ液内のコラーゲンタンパクのレベル（図６Ｆ）を定量化することにより、コラーゲン生産を測定した。ビヒクルで処置したＡＤＡ−／−マウスの肺内ではコラーゲン生産の大きな増加がみられ、これらの増加はＣＶＴ−６８８３処置によって大幅に予防された。これらの発見は、アデノシンＡ２Ｂ受容体アンタゴニストはＡＤＡ−／−マウスの線維症の発症を予防し得ることを実証し、肺線維症の調節におけるＡ２ＢＡＲシグナルを意味する。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２２９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２２９】
（肺胞破壊への影響）
ＡＤＡ−／−マウスは、肺のアデノシンレベルの上昇によってもたらされる気腫の遠位気道の拡張の特性の特徴を発症する。ＡＤＡ−／−マウスにみられる遠位気道の拡張に対する３−エチル−１−プロピル−８−｛１−［（３−トリフルオロメチルフェニル）メチル］ピラゾール−４−イル｝−１，３，７−トリヒドロプリン−２，６−ジオンの影響を検査するために、組織学的にそして遠位気道の索の長さの平均を決定することで、肺胞破壊を評価した（図９）。ＡＤＡ＋動物の気道は、組織学的に観測される際は充分に整って小さい状態であった（図９Ａ）。ＡＤＡ−／−気道は拡張しており（図９Ｂ）、３−エチル−１−プロピル−８−｛１−［（３−トリフルオロメチルフェニル）メチル］ピラゾール−４−イル｝−１，３，７−トリヒドロプリン−２，６−ジオンを使用したＡＤＡ−／−マウスの処置はこの拡張を予防した（図９Ｃ）。遠位気道のサイズの定量化は、組織学的観察と一致した（図９Ｄ）。これらのデータは、３−エチル−１−プロピル−８−｛１−［（３−トリフルオロメチルフェニル）メチル］ピラゾール−４−イル｝−１，３，７−トリヒドロプリン−２，６−ジオンを使用したＡＤＡ−／−マウスの処置は、ＡＤＡ−／−マウスに見られる肺胞の気道破壊を予防し得ることを実証する。