(57)【要約】非限定的な一態様において、本発明は、互いに連結された２つ以上の抗原結合ドメインを含む抗原結合分子に関する。非限定的な一態様において、本開示の抗原結合分子は、２つ以上の抗原分子を空間的に近接した位置に保持する活性、２つ以上の抗原分子間での相互作用を制御する活性、互いに会合することによって活性化される２つ以上の抗原分子の活性化を制御する活性、またはプロテアーゼ切断に対する抵抗性等を有する。
2020027330.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
第一の抗原結合ドメインおよび第二の抗原結合ドメインを含む抗原結合分子であって、当該２つの抗原結合ドメインが、１カ所以上の結合を介して互いに連結されている、抗原結合分子。
【請求項２】
前記２つの抗原結合ドメインを連結する結合のうちの少なくとも１カ所の結合が共有結合である、請求項１に記載の抗原結合分子。
【請求項３】
第一および第二の抗原結合ドメインのうちの少なくとも一方が、特定の抗原に結合する抗体断片を含む、請求項１または２に記載の抗原結合分子。
【請求項４】
抗体断片が、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、ｓｃＦａｂ、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、シングルドメイン抗体のいずれかである、請求項３に記載の抗原結合分子。
【請求項５】
抗原結合ドメイン間の結合の起点となるアミノ酸残基のうちの少なくとも１つが定常領域内に存在する、請求項３または４に記載の抗原結合分子。
【請求項６】
抗原結合ドメイン間の結合の起点となるアミノ酸残基のうちの少なくとも１つが可変領域内に存在する、請求項３または４に記載の抗原結合分子。
【請求項７】
第一の抗原結合ドメインおよび第二の抗原結合ドメインが、２カ所以上の結合を介して互いに連結されている、請求項１から６のいずれかに記載の抗原結合分子。
【請求項８】
抗原結合ドメイン間の結合の起点となるアミノ酸残基のうちの少なくとも１つがヒンジ領域内に存在する、請求項７に記載の抗原結合分子。
【請求項９】
抗原結合ドメイン間の結合の起点となるアミノ酸残基のうちの少なくとも１つが抗体断片内に存在し、かつ少なくとも１つがヒンジ領域内に存在する、請求項７または８に記載の抗原結合分子。
【請求項１０】
抗原結合ドメインがＦｃ領域を含む、請求項１から９のいずれかに記載の抗原結合分子。
【請求項１１】
２つの抗原分子間での相互作用を制御する活性を有する、請求項１から１０のいずれかに記載の抗原結合分子。
【請求項１２】
プロテアーゼ切断に対して抵抗性を有する、請求項１から１０のいずれかに記載の抗原結合分子。
【請求項１３】
請求項１から１２のいずれかに記載の抗原結合分子および薬学的に許容される担体を含む医薬組成物。
【請求項１４】
２つの抗原分子間での相互作用を制御する方法であって、以下を含む方法；
（ａ）２つの抗原結合ドメインを含む抗原結合分子を提供すること、
（ｂ）当該抗原結合分子に、２つの抗原結合ドメインを互いに連結させる少なくとも１カ所の結合を追加すること、および
（ｃ）（ｂ）で作製された抗原結合分子を当該２つの抗原分子と接触させること。
【請求項１５】
２つの抗原分子間での相互作用を制御する活性を有する抗原結合分子を製造する方法であって、以下を含む方法；
（ａ）第一の抗原結合ドメインを含むポリペプチドをコードする核酸、および第二の抗原結合ドメインを含むポリペプチドをコードする核酸を提供すること、
（ｂ）当該２つの抗原結合ドメインを連結する少なくとも１カ所の結合が追加されるように、当該２つの抗原結合ドメインをコードする核酸に変異を導入すること、
（ｃ）（ｂ）で作製された核酸を宿主細胞に導入すること、
（ｄ）当該２つのポリペプチドが発現するように宿主細胞を培養すること、ならびに
（ｅ）第一および第二の抗原結合ドメインを含むポリペプチドであって、当該２つの抗原結合ドメインが１カ所以上の結合を介して互いに連結されているポリペプチドである抗原結合分子を得ること。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本開示は、互いに連結された第一および第二の抗原結合ドメインを含む抗原結合分子；当該抗原結合分子を製造する方法；当該抗原結合分子を使用する方法；および当該抗原結合分子を含む医薬組成物に関する。また、本開示は、抗原結合分子のプロテアーゼ切断に対する抵抗性を増大させる方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
抗体は高い親和性で特異的に抗原と結合するタンパク質である。低分子化合物からタンパク質まで様々な分子が抗原となることが知られている。モノクローナル抗体の作製技術が開発されて以降、抗体改変技術が発達し、特定の分子を認識する抗体の取得が容易となった。そして抗体改変技術は、タンパク質自体の改変のみならず、低分子化合物とのコンジュゲーションを視野に入れた新機能付加を目指す分野にも発展している。例えば、重鎖または軽鎖に遊離システインアミノ酸を含む、システイン操作抗体は、抗体薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）として医療用途に用いられる（特許文献１）。
一方、抗体改変技術は、タンパク質の検出、分析および精製のためのツールとして抗体工学の発展に留まらず、抗体分子自体がモデルタンパク質となって抗体以外のタンパク質の機能の改良などタンパク質工学全般の発展にも貢献している。【０００３】
抗体は、血漿中での安定性が高く副作用が少ないことから、医薬品として注目されている。抗体は、抗原に結合する作用、アゴニスト作用やアンタゴニスト作用だけでなく、ADCC（Antibody Dependent Cell Cytotoxicity：抗体依存性細胞傷害活性）、ADCP（Antibody Dependent Cell phagocytosis：抗体依存性細胞貪食作用）、CDC（Complement Dependent Cytotoxicity：補体依存性細胞傷害活性）といったエフェクター細胞による細胞傷害活性（エフェクター機能とも言う）を誘導する。このような抗体の機能を利用して、癌、免疫疾患、慢性疾患、感染症等の医薬品が開発されてきている（非特許文献１）。【０００４】
例えば、抗癌剤として、細胞傷害活性を有するＴ細胞の活性化を促進する共刺激分子に対するアゴニスト抗体を利用した医薬品が開発されてきている（非特許文献２）。近年、共抑制分子に対するアンタゴニスト活性を有する免疫チェックポイントの阻害抗体が抗癌剤して有用であることが明らかとなり、CTLA4/CD80やPD-1/PD-L1の相互作用を阻害する抗体医薬、イピリムマブ（Ipilimumab）、ニボルマブ（Nivolumab）、ペンブロリズマブ（Pembrolizumab）、アテゾリズマブ（Atezolizumab）が相次いで上市された（非特許文献１）。【０００５】
しかしながら、天然のIgG型抗体のままでは期待される効果を十分に発揮できない事があるため、天然のIgG型抗体の機能を人工的に増強もしくは付加させること、または減弱もしくは欠失させることにより、抗体の用途にあわせてその機能が増強もしくは付加された、または減弱もしくは欠失された第２世代の抗体医薬が開発されてきている。第２世代の抗体医薬としては、例えば、エフェクター機能を増強あるいは欠失させた抗体（非特許文献３）、pH依存的に抗原と結合する抗体（非特許文献４）、１分子で２種類以上の抗原と結合する抗体（２種類の抗原と結合する抗体を一般に「二重特異性抗体」と称する）（非特許文献５）が挙げられる。【０００６】
二重特異性抗体は、より効果の高い医薬品になることが期待されている。例えば、一方の抗原をＴ細胞の細胞膜に発現するタンパク質とし、他方の抗原を癌抗原として、細胞傷害活性をもつＴ細胞と癌細胞をクロスリンクさせることにより、抗腫瘍活性が高められた抗体が開発されている（非特許文献７、非特許文献８、特許文献２）。二重特異性抗体としては、抗体の２つのFab領域が異なる配列を有する分子（共通軽鎖二重特異性抗体およびハイブリッドハイブリドーマ）、抗体のN末端やC末端に抗原結合部位を付加した分子（DVD-IgやscFv-IgG）、１つのFab領域が２つの抗原に結合する分子（Two-in-one IgG）、CH3領域のループ部位を新たな抗原結合部位とした分子（Fcab）（非特許文献９）、Fab-Fabを直列させた分子（非特許文献１０）等が報告されている。【０００７】
一方、エフェクター機能を利用した抗体は、標的抗原の発現が低い正常細胞に対しても作用し副作用が生じやすい。そこで、抗体医薬のエフェクター機能を標的組織特異的に発揮させる試みがなされている。例えば、細胞代謝物に結合することで結合能が変化する抗体（特許文献３）、プロテアーゼによる切断を受けて抗原結合能を示す抗体（特許文献４）、抗体を介したキメラ抗原受容体 T細胞（CAR-T細胞）とがん細胞のクロスリンクを化合物（ABT-737）の添加により制御する技術（非特許文献１１）が報告されている。【０００８】
標的によってはアゴニスト抗体の取得は困難な事があり、特にGタンパク質共役受容体（G-protein-coupled receptors）等の膜タンパク質に対しては多様な手法が開発されている（非特許文献１２）。そのため、このような標的に対する抗体のアゴニスト作用を簡便に増強する手法が求められている。既存のものとして、抗DR4（Death Receptor 4）または抗DR5（Death Receptor 5）抗体をクロスリンクする手法（非特許文献１３）、抗DR5（Death Receptor 5）抗体のナノボディーをマルチマー化する手法（非特許文献１４）、抗トロンボポエチン受容体（thrombopoietin receptor）抗体をsc(Fv)2のcovalent diabodyにする手法（非特許文献１５）、抗CD40抗体のIgGサブクラスを変更する手法（非特許文献１６）、抗CD20抗体を六量体化させる手法（非特許文献１７）、球状の抗体様分子を作製する手法（特許文献５）等が知られている。また、二重特異性抗体を用いた手法として、エピトープの異なる二種類の適切な抗エリスロポエチン抗体を二重特異性抗体として組み合わせて用いる手法（非特許文献１８）、ガイドおよびエフェクター機能用の抗体それぞれを二重特異性抗体として組み合わせて用いる手法（非特許文献１９）、Cys残基を導入したエピトープの異なる複数種類の抗体断片同士を組み合わせてコンジュゲートする手法（非特許文献２０、非特許文献２１、特許文献６）等が報告されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】国際公開第２０１６／０４０８５６号
【特許文献２】国際公開第２００８／１５７３７９号
【特許文献３】国際公開第２０１３／１８０２００号
【特許文献４】国際公開第２００９／０２５８４６号
【特許文献５】国際公開第２０１７／１９１１０１号
【特許文献６】国際公開第２０１８／０２７２０４号
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Nature Reviews Drug Discovery (2018) 17, 197-223
【非特許文献２】Clinical and Experimental Immunology (2009) 157, 9-19
【非特許文献３】Current Pharmaceutical Biotechnology (2016) 17, 1298-1314
【非特許文献４】Nature Biotechnology (2010) 28, 1203-1208
【非特許文献５】MAbs (2012) 4, 182-197
【非特許文献６】Nature Reviews Immunology (2010) 10, 301-316
【非特許文献７】Sci Transl Med (2017) 9(410), eaal4291
【非特許文献８】Blood (2011) 117(17): 4403-4404
【非特許文献９】Protein Eng Des Sel (2010) 23(4), 289-297
【非特許文献１０】J Immunol (2016) 196(7): 3199-3211
【非特許文献１１】Nature Chemical Biology (2018) 14, 112-117
【非特許文献１２】Exp Mol Med (2016) 48(2): e207
【非特許文献１３】Nature Reviews Drug Discovery (2008) 7, 1001-1012
【非特許文献１４】MAbs (2014) 6(6): 1560-1570
【非特許文献１５】Blood (2005) 105(2): 562-566
【非特許文献１６】J Biol Chem (2008) 283(23): 16206-16215
【非特許文献１７】PLoS Biol (2016) 14(1): e1002344
【非特許文献１８】Proc Natl Acad Sci U S A (2012) 109(39): 15728-15733
【非特許文献１９】Scientific Reports (2018) 8, Article number: 766
【非特許文献２０】PLoS One (2012) 7(12): e51817
【非特許文献２１】Nucleic Acids Res (2010) 38(22): 8188-8195
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
上述した抗体医薬のアゴニスト作用やエフェクター機能を増強または減弱させる試みはまだ発展途上で、更なる試みが期待されている。本発明はこのような状況に鑑みてなされたものであり、２つ以上の抗原分子間での相互作用を制御する活性を有する新規な抗原結合分子、あるいはそのような抗原結合分子を製造もしくは使用する方法を提供することを目的とする。本発明は、抗体医薬のスクリーニングおよびその開発に有用であり、さらには他の様々なタンパク質工学にも応用可能であると考えられる。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
非限定的な一態様において、本発明者らは、２つの抗原結合ドメイン（例えばFab部分）を含む抗原結合分子（例えば抗体）であってアゴニスト活性を有する抗原結合分子の当該抗原結合ドメインにアミノ酸変異の導入を行い、抗原結合ドメイン同士が連結された構造の分子を作製したところ、当該アゴニスト活性が大きく向上することを見出した。また、非限定的な一態様において、本発明者らは、抗原結合ドメイン間の連結によってプロテアーゼ消化に対する耐性を獲得した抗原結合分子を見出した。【００１３】
本開示はこのような知見に基づくものであり、具体的には以下に例示的に記載する実施態様を包含するものである。
〔１〕 第一の抗原結合ドメインおよび第二の抗原結合ドメインを含む抗原結合分子であって、当該２つの抗原結合ドメインが、１カ所以上の結合を介して互いに連結されている、抗原結合分子。
〔２〕 前記２つの抗原結合ドメインを連結する結合のうちの少なくとも１カ所の結合が共有結合である、〔１〕に記載の抗原結合分子。
〔３〕 第一の抗原結合ドメインにおけるアミノ酸残基と、第二の抗原結合ドメインにおけるアミノ酸残基とが直接的に架橋されることによって共有結合が形成される、〔２〕に記載の抗原結合分子。
〔４〕 架橋されるアミノ酸残基の種類がシステインである、〔３〕に記載の抗原結合分子。
〔５〕 形成される共有結合がジスルフィド結合である、〔４〕に記載の抗原結合分子。
〔６〕 第一の抗原結合ドメインにおけるアミノ酸残基と、第二の抗原結合ドメインにおけるアミノ酸残基とが架橋剤を介して架橋されることによって共有結合が形成される、〔２〕に記載の抗原結合分子。
〔７〕 架橋剤がアミン反応性架橋剤である、〔６〕に記載の抗原結合分子。
〔８〕 架橋されるアミノ酸残基の種類がリジンである、〔７〕に記載の抗原結合分子。
〔９〕 前記２つの抗原結合ドメインを連結する結合のうちの少なくとも１カ所の結合が非共有結合である、〔１〕に記載の抗原結合分子。
〔１０〕 非共有結合がイオン結合、水素結合、疎水結合のいずれかである、〔９〕に記載の抗原結合分子。
〔１１〕 イオン結合が酸性アミノ酸と塩基性アミノ酸との間で形成される、〔１０〕に記載の抗原結合分子。
〔１２〕 酸性アミノ酸がアスパラギン酸(Asp)またはグルタミン酸(Glu)であり、塩基性アミノ酸がヒスチジン(His)、リジン(Lys)、またはアルギニン(Arg)である、〔１１〕に記載の抗原結合分子。
〔１３〕 抗原結合ドメイン間の結合の起点となるアミノ酸残基のうちの少なくとも１つが、人工的に導入された変異アミノ酸残基である、〔１〕から〔１２〕のいずれかに記載の抗原結合分子。
〔１４〕 当該変異アミノ酸残基がシステイン残基である、〔１３〕に記載の抗原結合分子。
〔１５〕 第一および第二の抗原結合ドメインのうちの少なくとも一方が単体で抗原に結合する活性を有している、〔１〕から〔１４〕のいずれかに記載の抗原結合分子。
〔１６〕 第一および第二の抗原結合ドメインがともに同じ種類の抗原結合ドメインである、〔１〕から〔１５〕のいずれかに記載の抗原結合分子。
〔１７〕 前記２つの抗原結合ドメインを連結する結合のうちの少なくとも１カ所の結合が、第一の抗原結合ドメインおよび第二の抗原結合ドメイン上のそれぞれ同じ位置に存在するアミノ酸残基を互いに連結させることによって形成される、〔１〕から〔１６〕のいずれかに記載の抗原結合分子。
〔１８〕 前記２つの抗原結合ドメインを連結する結合のうちの少なくとも１カ所の結合が、第一の抗原結合ドメインおよび第二の抗原結合ドメイン上のそれぞれ異なる位置に存在するアミノ酸残基を互いに連結させることによって形成される、〔１〕から〔１６〕のいずれかに記載の抗原結合分子。
〔１９〕 第一および第二の抗原結合ドメインのうちの少なくとも一方が、特定の抗原に結合する抗体断片を含む、〔１〕から〔１８〕のいずれかに記載の抗原結合分子。
〔２０〕 抗体断片が、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、ｓｃＦａｂ、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、シングルドメイン抗体のいずれかである、〔１９〕に記載の抗原結合分子。
〔２１〕 抗原結合ドメイン間の結合の起点となるアミノ酸残基のうちの少なくとも１つが抗体断片内に存在する、〔１９〕または〔２０〕に記載の抗原結合分子。
〔２２〕 抗原結合ドメイン間の結合の起点となる当該アミノ酸残基が定常領域内に存在する、〔２１〕に記載の抗原結合分子。
〔２３〕 定常領域がヒト由来である、〔２２〕に記載の抗原結合分子。
〔２４〕 抗原結合ドメイン間の結合の起点となる当該アミノ酸残基がＣＨ１領域内に存在する、〔２２〕または〔２３〕に記載の抗原結合分子。
〔２５〕 ＣＨ１領域のサブクラスがγ１、γ２、γ３、γ４、α１、α２、μ、δ、εのいずれかである、〔２４〕に記載の抗原結合分子。
〔２６〕 抗原結合ドメイン間の結合の起点となる当該アミノ酸残基がＣＨ１領域のＥＵナンバリング１１９位から１２３位、１３１位から１４０位、１４８位から１５０位、１５５位から１６７位、１７４位から１７８位、１８８位から１９７位、２０１位から２１４位、２１８位から２１９位のいずれかに存在する、〔２４〕または〔２５〕に記載の抗原結合分子。
〔２７〕 抗原結合ドメイン間の結合の起点となる当該アミノ酸残基がＣＨ１領域のＥＵナンバリング１１９位、１２２位、１２３位、１３１位、１３２位、１３３位、１３４位、１３５位、１３６位、１３７位、１３８位、１３９位、１４０位、１４８位、１５０位、１５５位、１５６位、１５７位、１５９位、１６０位、１６１位、１６２位、１６３位、１６４位、１６５位、１６７位、１７４位、１７６位、１７７位、１７８位、１８８位、１８９位、１９０位、１９１位、１９２位、１９３位、１９４位、１９５位、１９６位、１９７位、２０１位、２０３位、２０５位、２０６位、２０７位、２０８位、２１１位、２１２位、２１３位、２１４位、２１８位、および２１９位からなる群より選択されるいずれかに存在する、〔２６〕に記載の抗原結合分子。
〔２８〕 抗原結合ドメイン間の結合の起点となる当該アミノ酸残基がＣＨ１領域のＥＵナンバリング１３４位、１３５位、１３６位、１３７位、１９１位、１９２位、１９３位、１９４位、１９５位、または１９６位に存在する、〔２７〕に記載の抗原結合分子。
〔２９〕 抗原結合ドメイン間の結合の起点となる当該アミノ酸残基がＣＨ１領域のＥＵナンバリング１３５位、１３６位、または１９１位に存在する、〔２８〕に記載の抗原結合分子。
〔３０〕 前記２つの抗原結合ドメインを連結する結合のうちの少なくとも１カ所の結合が、第一の抗原結合ドメインのＣＨ１領域におけるアミノ酸残基と、第二の抗原結合ドメインのＣＨ１領域におけるアミノ酸残基とを連結させることによって形成される、〔２４〕から〔２９〕のいずれかに記載の抗原結合分子。
〔３１〕 第一の抗原結合ドメインおよび第二の抗原結合ドメインにおける前記アミノ酸残基が、ＥＵナンバリング１１９位、１２０位、１２１位、１２２位、および１２３位からなる群よりそれぞれ独立に選択される、〔３０〕に記載の抗原結合分子。
〔３２〕 第一の抗原結合ドメインおよび第二の抗原結合ドメインにおける前記アミノ酸残基が、ＥＵナンバリング１３１位、１３２位、１３３位、１３４位、１３５位、１３６位、１３７位、１３８位、１３９位、および１４０位からなる群よりそれぞれ独立に選択される、〔３０〕に記載の抗原結合分子。
〔３３〕 第一の抗原結合ドメインおよび第二の抗原結合ドメインにおける前記アミノ酸残基が、ＥＵナンバリング１４８位、１４９位、および１５０位からなる群よりそれぞれ独立に選択される、〔３０〕に記載の抗原結合分子。
〔３４〕 第一の抗原結合ドメインおよび第二の抗原結合ドメインにおける前記アミノ酸残基が、ＥＵナンバリング１５５位、１５６位、１５７位、１５８位、１５９位、１６０位、１６１位、１６２位、１６３位、１６４位、１６５位、１６６位、および１６７位からなる群よりそれぞれ独立に選択される、〔３０〕に記載の抗原結合分子。
〔３５〕 第一の抗原結合ドメインおよび第二の抗原結合ドメインにおける前記アミノ酸残基が、ＥＵナンバリング１７４位、１７５位、１７６位、１７７位、および１７８位からなる群よりそれぞれ独立に選択される、〔３０〕に記載の抗原結合分子。
〔３６〕 第一の抗原結合ドメインおよび第二の抗原結合ドメインにおける前記アミノ酸残基が、ＥＵナンバリング１８８位、１８９位、１９０位、１９１位、１９２位、１９３位、１９４位、１９５位、１９６位、および１９７位からなる群よりそれぞれ独立に選択される、〔３０〕に記載の抗原結合分子。
〔３７〕 第一の抗原結合ドメインおよび第二の抗原結合ドメインにおける前記アミノ酸残基が、ＥＵナンバリング２０１位、２０２位、２０３位、２０４位、２０５位、２０６位、２０７位、２０８位、２０９位、２１０位、２１１位、２１２位、２１３位、および２１４位からなる群よりそれぞれ独立に選択される、〔３０〕に記載の抗原結合分子。
〔３８〕 第一の抗原結合ドメインおよび第二の抗原結合ドメインにおける前記アミノ酸残基が、ＥＵナンバリング２１８位および２１９位からなる群よりそれぞれ独立に選択される、〔３０〕に記載の抗原結合分子。
〔３９〕 第一の抗原結合ドメインおよび第二の抗原結合ドメインにおける前記アミノ酸残基の位置の差が３アミノ酸以内である、〔３０〕から〔３８〕のいずれかに記載の抗原結合分子。
〔４０〕 前記２つの抗原結合ドメインを連結する結合のうちの少なくとも１カ所の結合が、第一の抗原結合ドメインのＣＨ１領域におけるＥＵナンバリング１３５位のアミノ酸残基と、第二の抗原結合ドメインのＣＨ１領域におけるＥＵナンバリング１３２位から１３８位のいずれかのアミノ酸残基とを連結させることによって形成される、〔３９〕に記載の抗原結合分子。
〔４１〕 前記２つの抗原結合ドメインを連結する結合のうちの少なくとも１カ所の結合が、第一の抗原結合ドメインのＣＨ１領域におけるＥＵナンバリング１３６位のアミノ酸残基と、第二の抗原結合ドメインのＣＨ１領域におけるＥＵナンバリング１３３位から１３９位のいずれかのアミノ酸残基とを連結させることによって形成される、〔３９〕に記載の抗原結合分子。
〔４２〕 前記２つの抗原結合ドメインを連結する結合のうちの少なくとも１カ所の結合が、第一の抗原結合ドメインのＣＨ１領域におけるＥＵナンバリング１９１位のアミノ酸残基と、第二の抗原結合ドメインのＣＨ１領域におけるＥＵナンバリング１８８位から１９４位のいずれかのアミノ酸残基とを連結させることによって形成される、〔３９〕に記載の抗原結合分子。
〔４３〕 前記２つの抗原結合ドメインを連結する結合のうちの少なくとも１カ所の結合が、２つの抗原結合ドメインのＣＨ１領域におけるＥＵナンバリング１３５位のアミノ酸残基どうしを連結させることによって形成される、〔４０〕に記載の抗原結合分子。
〔４４〕 前記２つの抗原結合ドメインを連結する結合のうちの少なくとも１カ所の結合が、２つの抗原結合ドメインのＣＨ１領域におけるＥＵナンバリング１３６位のアミノ酸残基どうしを連結させることによって形成される、〔４１〕に記載の抗原結合分子。
〔４５〕 前記２つの抗原結合ドメインを連結する結合のうちの少なくとも１カ所の結合が、２つの抗原結合ドメインのＣＨ１領域におけるＥＵナンバリング１９１位のアミノ酸残基どうしを連結させることによって形成される、〔４２〕に記載の抗原結合分子。
〔４６〕 抗原結合ドメイン間の結合の起点となる当該アミノ酸残基がＣＬ領域内に存在する、〔２２〕または〔２３〕に記載の抗原結合分子。
〔４７〕 ＣＬ領域のサブクラスがκまたはλである、〔４６〕に記載の抗原結合分子。
〔４８〕 抗原結合ドメイン間の結合の起点となる当該アミノ酸残基がＣＬ領域のＫａｂａｔナンバリング１０８位から１１２位、１２１位から１２８位、１５１位から１５６位、１８４位から１９０位、１９５位から１９６位、２００位から２０３位、２０８位から２１３位のいずれかに存在する、〔４６〕または〔４７〕に記載の抗原結合分子。
〔４９〕 抗原結合ドメイン間の結合の起点となる当該アミノ酸残基がＣＬ領域のＫａｂａｔナンバリング１０８位、１０９位、１１２位、１２１位、１２３位、１２６位、１２８位、１５１位、１５２位、１５３位、１５６位、１８４位、１８６位、１８８位、１８９位、１９０位、１９５位、１９６位、２００位、２０１位、２０２位、２０３位、２０８位、２１０位、２１１位、２１２位、および２１３位からなる群より選択されるいずれかに存在する、〔４８〕に記載の抗原結合分子。
〔５０〕 抗原結合ドメイン間の結合の起点となる当該アミノ酸残基がＣＬ領域のＫａｂａｔナンバリング１２６位に存在する、〔４９〕に記載の抗原結合分子。
〔５１〕 前記２つの抗原結合ドメインを連結する結合のうちの少なくとも１カ所の結合が、第一の抗原結合ドメインのＣＬ領域におけるアミノ酸残基と、第二の抗原結合ドメインのＣＬ領域におけるアミノ酸残基とを連結させることによって形成される、〔４６〕から〔５０〕のいずれかに記載の抗原結合分子。
〔５２〕 第一の抗原結合ドメインおよび第二の抗原結合ドメインにおける前記アミノ酸残基が、Ｋａｂａｔナンバリング１０８位、１０９位、１１０位、１１１位、および１１２位からなる群よりそれぞれ独立に選択される、〔５１〕に記載の抗原結合分子。
〔５３〕 第一の抗原結合ドメインおよび第二の抗原結合ドメインにおける前記アミノ酸残基が、Ｋａｂａｔナンバリング１２１位、１２２位、１２３位、１２４位、１２５位、１２６位、１２７位、および１２８位からなる群よりそれぞれ独立に選択される、〔５１〕に記載の抗原結合分子。
〔５４〕 第一の抗原結合ドメインおよび第二の抗原結合ドメインにおける前記アミノ酸残基が、Ｋａｂａｔナンバリング１５１位、１５２位、１５３位、１５４位、１５５位、および１５６位からなる群よりそれぞれ独立に選択される、〔５１〕に記載の抗原結合分子。
〔５５〕 第一の抗原結合ドメインおよび第二の抗原結合ドメインにおける前記アミノ酸残基が、Ｋａｂａｔナンバリング１８４位、１８５位、１８６位、１８７位、１８８位、１８９位、および１９０位からなる群よりそれぞれ独立に選択される、〔５１〕に記載の抗原結合分子。
〔５６〕 第一の抗原結合ドメインおよび第二の抗原結合ドメインにおける前記アミノ酸残基が、Ｋａｂａｔナンバリング１９５位および１９６位からなる群よりそれぞれ独立に選択される、〔５１〕に記載の抗原結合分子。
〔５７〕 第一の抗原結合ドメインおよび第二の抗原結合ドメインにおける前記アミノ酸残基が、Ｋａｂａｔナンバリング２００位、２０１位、２０２位、および２０３位からなる群よりそれぞれ独立に選択される、〔５１〕に記載の抗原結合分子。
〔５８〕 第一の抗原結合ドメインおよび第二の抗原結合ドメインにおける前記アミノ酸残基が、Ｋａｂａｔナンバリング２０８位、２０９位、２１０位、２１１位、２１２位、および２１３位からなる群よりそれぞれ独立に選択される、〔５１〕に記載の抗原結合分子。
〔５９〕 第一の抗原結合ドメインおよび第二の抗原結合ドメインにおける前記アミノ酸残基の位置の差が３アミノ酸以内である、〔５１〕から〔５８〕のいずれかに記載の抗原結合分子。
〔６０〕 前記２つの抗原結合ドメインを連結する結合のうちの少なくとも１カ所の結合が、２つの抗原結合ドメインのＣＬ領域におけるＫａｂａｔナンバリング１２６位のアミノ酸残基どうしを連結させることによって形成される、〔５９〕に記載の抗原結合分子。
〔６１〕 前記２つの抗原結合ドメインを連結する結合のうちの少なくとも１カ所の結合が、第一の抗原結合ドメインのＣＨ１領域におけるアミノ酸残基と、第二の抗原結合ドメインのＣＬ領域におけるアミノ酸残基とを連結させることによって形成される、〔２４〕から〔２９〕、〔４６〕から〔５０〕のいずれかに記載の抗原結合分子。
〔６２〕 ＣＨ１領域における前記アミノ酸残基が、ＥＵナンバリング１８８位、１８９位、１９０位、１９１位、１９２位、１９３位、１９４位、１９５位、１９６位、および１９７位からなる群より選択され、かつＣＬ領域における前記アミノ酸残基が、Ｋａｂａｔナンバリング１２１位、１２２位、１２３位、１２４位、１２５位、１２６位、１２７位、および１２８位からなる群より選択される、〔６１〕に記載の抗原結合分子。
〔６３〕 前記２つの抗原結合ドメインを連結する結合のうちの少なくとも１カ所の結合が、第一の抗原結合ドメインのＣＨ１領域におけるＥＵナンバリング１９１位のアミノ酸残基と、第二の抗原結合ドメインのＣＬ領域におけるＫａｂａｔナンバリング１２６位のアミノ酸残基とを連結させることによって形成される、〔６２〕に記載の抗原結合分子。
〔６４〕 抗原結合ドメイン間の結合の起点となる当該アミノ酸残基が可変領域内に存在する、〔２１〕に記載の抗原結合分子。
〔６５〕 抗原結合ドメイン間の結合の起点となる当該アミノ酸残基がＶＨ領域内に存在する、〔６４〕に記載の抗原結合分子。
〔６６〕 抗原結合ドメイン間の結合の起点となる当該アミノ酸残基がＶＨ領域のＫａｂａｔナンバリング６位、８位、１６位、２０位、２５位、２６位、２８位、７４位、および８２ｂ位からなる群より選択されるいずれかに存在する、〔６５〕に記載の抗原結合分子。
〔６７〕 抗原結合ドメイン間の結合の起点となる当該アミノ酸残基がＶＬ領域内に存在する、〔６４〕に記載の抗原結合分子。
〔６８〕 抗原結合ドメイン間の結合の起点となる当該アミノ酸残基がＶＬ領域（サブクラスκ）のＫａｂａｔナンバリング２１位、２７位、５８位、７７位、１００位、１０５位、および１０７位からなる群より選択されるいずれかに存在する、〔６７〕に記載の抗原結合分子。
〔６９〕 抗原結合ドメイン間の結合の起点となる当該アミノ酸残基がＶＬ領域（サブクラスλ）のＫａｂａｔナンバリング６位、１９位、３３位、および３４位からなる群より選択されるいずれかに存在する、〔６７〕に記載の抗原結合分子。
〔７０〕 抗原結合ドメイン間の結合の起点となる当該アミノ酸残基がＶＨＨ領域内に存在する、〔６４〕に記載の抗原結合分子。
〔７１〕 抗原結合ドメイン間の結合の起点となる当該アミノ酸残基がＶＨＨ領域のＫａｂａｔナンバリング４位、６位、７位、８位、９位、１０位、１１位、１２位、１４位、１５位、１７位、２０位、２４位、２７位、２９位、３８位、３９位、４０位、４１位、４３位、４４位、４５位、４６位、４７位、４８位、４９位、６７位、６９位、７１位、７８位、８０位、８２位、８２ｃ位、８５位、８８位、９１位、９３位、９４位、および１０７位からなる群より選択されるいずれかに存在する、〔７０〕に記載の抗原結合分子。
〔７２〕 第一および第二の抗原結合ドメインのうちの少なくとも一方が、特定の抗原に結合する非抗体タンパク質またはその断片を含む、〔１〕から〔１８〕のいずれかに記載の抗原結合分子。
〔７３〕 非抗体タンパク質が、互いに特異的に結合する一組のリガンドおよび受容体のどちらか一方である、〔７２〕に記載の抗原結合分子。
〔７４〕 抗原結合ドメインがヒンジ領域を含む、〔１〕から〔７３〕のいずれかに記載の抗原結合分子。
〔７５〕 野生型のヒンジ領域内に存在するシステイン残基のうちの少なくとも１つが他のアミノ酸残基に置換されている、〔７４〕に記載の抗原結合分子。
〔７６〕 当該システイン残基がヒンジ領域のＥＵナンバリング２２６位および／または２２９位に存在する、〔７５〕に記載の抗原結合分子。
〔７７〕 抗原結合ドメイン間の結合の起点となるアミノ酸残基のうちの少なくとも１つがヒンジ領域内に存在する、〔７４〕または〔７６〕に記載の抗原結合分子。
〔７８〕 抗原結合ドメイン間の結合の起点となる当該アミノ酸残基がヒンジ領域のＥＵナンバリング２１６位、２１８位、および２１９位からなる群より選択されるいずれかに存在する、〔７７〕に記載の抗原結合分子。
〔７９〕 第一の抗原結合ドメインおよび第二の抗原結合ドメインが、２カ所以上の結合を介して互いに連結されている、〔１〕から〔７８〕のいずれかに記載の抗原結合分子。
〔８０〕 抗原結合ドメイン間の結合の起点となるアミノ酸残基のうちの少なくとも１つが、野生型の配列に存在するアミノ酸残基である、〔７９〕に記載の抗原結合分子。
〔８１〕 抗原結合ドメイン間の結合の起点となる当該アミノ酸残基がヒンジ領域内に存在する、〔８０〕に記載の抗原結合分子。
〔８２〕 抗原結合ドメイン間の結合の起点となる当該アミノ酸残基が、ヒンジ領域におけるシステイン残基である、〔８１〕に記載の抗原結合分子。
〔８３〕 前記２つの抗原結合ドメインを連結する結合のうちの少なくとも１カ所の結合が、ヒンジ領域内に存在するシステイン残基どうしが架橋して形成されるジスルフィド結合である、〔８０〕から〔８２〕のいずれかに記載の抗原結合分子。
〔８４〕 当該システイン残基がヒンジ領域のＥＵナンバリング２２６位および／または２２９位に存在する、〔８３〕に記載の抗原結合分子。
〔８５〕 抗原結合ドメイン間の結合の起点となるアミノ酸残基のうちの少なくとも１つが抗体断片内に存在し、かつ少なくとも１つがヒンジ領域内に存在する、〔７９〕から〔８４〕のいずれかに記載の抗原結合分子。
〔８６〕 第一および第二の抗原結合ドメインがそれぞれＦａｂおよびヒンジ領域を含み、当該２つの抗原結合ドメインを含む抗原結合分子がＦ（ａｂ’）２である、〔８５〕に記載の抗原結合分子。
〔８７〕 抗原結合ドメインがＦｃ領域を含む、〔１〕から〔８６〕のいずれかに記載の抗原結合分子。
〔８８〕 Ｆｃ領域に、Ｆｃ領域の多量体化を促進する１つ以上のアミノ酸変異が導入されている、〔８７〕に記載の抗原結合分子。
〔８９〕 多量体化を促進するアミノ酸変異が、ＥＵナンバリング２４７、２４８、２５３、２５４、３１０、３１１、３３８、３４５、３５６、３５９、３８２、３８５、３８６、４３０、４３３、４３４、４３６、４３７、４３８、４３９、４４０、および４４７番目からなる群より選択される少なくとも１つの部位におけるアミノ酸変異を含む、〔８８〕に記載の抗原結合分子。
〔９０〕 多量体化が六量体化である、〔８８〕または〔８９〕に記載の抗原結合分子。
〔９１〕 全長抗体である、〔８７〕から〔９０〕のいずれかに記載の抗原結合分子。【００１４】
〔９２〕 第一および第二の抗原結合ドメインがいずれも同じ種類の抗原に結合する、〔１〕から〔９１〕のいずれかに記載の抗原結合分子。
〔９３〕 第一および第二の抗原結合ドメインが当該抗原上のいずれも同じエピトープに結合する、〔９２〕に記載の抗原結合分子。
〔９４〕 第一および第二の抗原結合ドメインが当該抗原上の互いに異なるエピトープに結合する、〔９２〕に記載の抗原結合分子。
〔９５〕 第一および第二の抗原結合ドメインが互いに異なる種類の抗原に結合する、〔１〕から〔９１〕のいずれかに記載の抗原結合分子。
〔９６〕 第一および第二の抗原結合ドメインがいずれも同じアミノ酸配列を有する、〔９３〕に記載の抗原結合分子。
〔９７〕 第一および第二の抗原結合ドメインが互いに異なるアミノ酸配列を有する、〔９３〕から〔９５〕のいずれかに記載の抗原結合分子。
〔９８〕 第一および第二の抗原結合ドメインが結合する２つの抗原のうちの少なくとも１つが可溶型タンパク質である、〔１〕から〔９１〕のいずれかに記載の抗原結合分子。
〔９９〕 第一および第二の抗原結合ドメインが結合する２つの抗原のうちの少なくとも１つが膜タンパク質である、〔１〕から〔９１〕のいずれかに記載の抗原結合分子。【００１５】
〔１００〕 ２つの抗原分子間での相互作用を制御する活性を有する、〔１〕から〔９９〕のいずれかに記載の抗原結合分子。
〔１０１〕 対照となる抗原結合分子に比べて、２つの抗原分子間での相互作用を増強または減弱させることができる、〔１００〕に記載の抗原結合分子であって、当該対照となる抗原結合分子は、２つの抗原結合ドメイン間の結合の数が１カ所少ないという点でのみ〔１００〕に記載の抗原結合分子とは異なる、抗原結合分子。
〔１０２〕 ２つの抗原分子がそれぞれリガンドとその受容体であり、当該リガンドによる当該受容体の活性化を促進する活性を有する、〔１００〕または〔１０１〕に記載の抗原結合分子。
〔１０３〕 ２つの抗原分子がそれぞれ酵素とその基質であり、当該酵素の当該基質に対する触媒反応を促進する活性を有する、〔１００〕または〔１０１〕に記載の抗原結合分子。
〔１０４〕 ２つの抗原分子がともに細胞表面に存在するタンパク質であり、第一の抗原を発現する細胞と第二の抗原を発現する細胞との間での相互作用を促進する活性を有する、〔１００〕または〔１０１〕に記載の抗原結合分子。
〔１０５〕 第一の抗原を発現する細胞が細胞障害活性を有する細胞であり、第二の抗原を発現する細胞がその標的となる細胞であって、当該細胞障害活性を有する細胞による当該標的となる細胞の障害が促進される、〔１０４〕に記載の抗原結合分子。
〔１０６〕 細胞障害活性を有する細胞がＴ細胞、ＮＫ細胞、単球、マクロファージのいずれかである、〔１０５〕に記載の抗原結合分子。
〔１０７〕 互いに会合することによって活性化される２つの抗原分子の活性化を制御する活性を有する、〔１〕から〔９９〕のいずれかに記載の抗原結合分子。
〔１０８〕 対照となる抗原結合分子に比べて、２つの抗原分子の活性化を増強または減弱させる、〔１０７〕に記載の抗原結合分子であって、対照となる抗原結合分子は、２つの抗原結合ドメイン間の結合の数が１カ所少ないという点でのみ〔１０７〕に記載の抗原結合分子とは異なる、抗原結合分子。
〔１０９〕 抗原分子がサイトカイン受容体スーパーファミリーに属する受容体、Ｇタンパク質結合型受容体、イオンチャネル型受容体、チロシンキナーゼ型受容体、免疫チェックポイント受容体、抗原受容体、ＣＤ抗原、共刺激分子、および細胞接着分子からなる群より選択される、〔１０７〕または〔１０８〕に記載の抗原結合分子。
〔１１０〕 ２つの抗原分子を空間的に近接した位置に保持する活性を有する、〔１〕から〔９９〕のいずれかに記載の抗原結合分子。
〔１１１〕 対照となる抗原結合分子に比べて、２つの抗原分子をより近接した位置に保持することができる、〔１１０〕に記載の抗原結合分子であって、当該対照となる抗原結合分子は、２つの抗原結合ドメイン間の結合の数が１カ所少ないという点でのみ〔１１０〕に記載の抗原結合分子とは異なる、抗原結合分子。
〔１１２〕 ２つの抗原結合ドメインが空間的に近接した位置に存在し、かつ／または２つの抗原結合ドメインの可動性が減少している、〔１〕から〔９９〕のいずれかに記載の抗原結合分子。
〔１１３〕 対照となる抗原結合分子に比べて、２つの抗原結合ドメインがより近接した位置に存在し、かつ／または２つの抗原結合ドメインの可動性がより減少している、〔１１２〕に記載の抗原結合分子であって、当該対照となる抗原結合分子は、２つの抗原結合ドメイン間の結合の数が１カ所少ないという点でのみ〔１１２〕に記載の抗原結合分子とは異なる、抗原結合分子。
〔１１４〕 プロテアーゼ切断に対して抵抗性を有する、〔１〕から〔９９〕のいずれかに記載の抗原結合分子。
〔１１５〕 対照となる抗原結合分子に比べて、プロテアーゼ切断に対する抵抗性が増大した、〔１１４〕に記載の抗原結合分子であって、当該対照となる抗原結合分子は、２つの抗原結合ドメイン間の結合の数が１カ所少ないという点でのみ〔１１４〕に記載の抗原結合分子とは異なる、抗原結合分子。
〔１１６〕 前記対照となる抗原結合分子に比べて、プロテアーゼ処理後に残存する全長分子の割合が増加している、〔１１５〕に記載の抗原結合分子。
〔１１７〕 前記対照となる抗原結合分子に比べて、プロテアーゼ処理後に生成される特定の断片の割合が減少している、〔１１５〕または〔１１６〕に記載の抗原結合分子。
〔１１８〕 プロテアーゼで処理した場合、抗原結合ドメインまたはその断片の二量体が切り出される、〔１〕から〔９９〕のいずれかに記載の抗原結合分子。
〔１１９〕 対照となる抗原結合分子を当該プロテアーゼで処理した場合、抗原結合ドメインまたはその断片の単量体が切り出される、〔１１８〕に記載の抗原結合分子であって、対照となる抗原結合分子は、２つの抗原結合ドメイン間の結合の数が１カ所少ないという点でのみ〔１１８〕に記載の抗原結合分子とは異なる、抗原結合分子。
〔１２０〕 プロテアーゼがヒンジ領域を切断する、〔１１８〕または〔１１９〕に記載の抗原結合分子。
〔１２１〕 １カ所少ない結合が、変異アミノ酸残基を起点として形成される結合である、〔１０１〕から〔１０６〕、〔１０８〕から〔１０９〕、〔１１１〕、〔１１３〕、〔１１５〕から〔１１７〕、〔１１９〕から〔１２０〕のいずれかに記載の抗原結合分子。
〔１２２〕 変異アミノ酸残基がシステイン残基である、〔１２１〕に記載の抗原結合分子。【００１６】
〔１２３〕 〔１〕から〔１２２〕のいずれかに記載の抗原結合分子および薬学的に許容される担体を含む医薬組成物。【００１７】
〔１２４〕 ２つの抗原分子間での相互作用を制御する方法であって、以下を含む方法；
（ａ）２つの抗原結合ドメインを含む抗原結合分子を提供すること、
（ｂ）当該抗原結合分子に、２つの抗原結合ドメインを互いに連結させる少なくとも１カ所の結合を追加すること、および
（ｃ）（ｂ）で作製された抗原結合分子を当該２つの抗原分子と接触させること。
〔１２５〕 ２つの互いに会合することによって活性化される抗原分子の活性を制御する方法であって、以下を含む方法；
（ａ）２つの抗原結合ドメインを含む抗原結合分子を提供すること、
（ｂ）当該抗原結合分子に、２つの抗原結合ドメインを互いに連結させる少なくとも１カ所の結合を追加すること、および
（ｃ）（ｂ）で作製された抗原結合分子を当該２つの抗原分子と接触させること。
〔１２６〕 ２つの抗原分子を空間的に近接した位置に保持する方法であって、以下を含む方法；
（ａ）２つの抗原結合ドメインを含む抗原結合分子を提供すること、
（ｂ）当該抗原結合分子に、２つの抗原結合ドメインを互いに連結させる少なくとも１カ所の結合を追加すること、および
（ｃ）（ｂ）で作製された抗原結合分子を当該２つの抗原分子と接触させること。
〔１２７〕 ２つの抗原結合ドメインを空間的に近接した位置に存在させ、かつ／または２つの抗原結合ドメインの可動性を減少させる方法であって、以下を含む方法；
（ａ）２つの抗原結合ドメインを含む抗原結合分子を提供すること、および
（ｂ）当該抗原結合分子に、２つの抗原結合ドメインを互いに連結させる少なくとも１カ所の結合を追加すること。
〔１２８〕 抗原結合分子のプロテアーゼ切断に対する抵抗性を増大させる方法であって、以下を含む方法；
（ａ）２つの抗原結合ドメインを含む抗原結合分子を提供すること、および（ｂ）当該抗原結合分子に、２つの抗原結合ドメインを互いに連結させる少なくとも１カ所の結合を追加すること。【００１８】
〔１２９〕 ２つの抗原分子間での相互作用を制御する活性を有する抗原結合分子を製造する方法であって、以下を含む方法；
（ａ）第一の抗原結合ドメインを含むポリペプチドをコードする核酸、および第二の抗原結合ドメインを含むポリペプチドをコードする核酸を提供すること、
（ｂ）当該２つの抗原結合ドメインを連結する少なくとも１カ所の結合が追加されるように、当該２つの抗原結合ドメインをコードする核酸に変異を導入すること、
（ｃ）（ｂ）で作製された核酸を宿主細胞に導入すること、
（ｄ）当該２つのポリペプチドが発現するように宿主細胞を培養すること、および
（ｅ）第一および第二の抗原結合ドメインを含むポリペプチドであって、当該２つの抗原結合ドメインが１カ所以上の結合を介して互いに連結されているポリペプチドである抗原結合分子を得ること。
〔１３０〕 ２つの互いに会合することによって活性化される抗原分子の活性化を制御する活性を有する抗原結合分子を製造する方法であって、以下を含む方法；
（ａ）第一の抗原結合ドメインを含むポリペプチドをコードする核酸、および第二の抗原結合ドメインを含むポリペプチドをコードする核酸を提供すること、
（ｂ）当該２つの抗原結合ドメインを連結する少なくとも１カ所の結合が追加されるように、当該２つの抗原結合ドメインをコードする核酸に変異を導入すること、
（ｃ）（ｂ）で作製された核酸を宿主細胞に導入すること、
（ｄ）当該２つのポリペプチドが発現するように宿主細胞を培養すること、および
（ｅ）第一および第二の抗原結合ドメインを含むポリペプチドであって、当該２つの抗原結合ドメインが１カ所以上の結合を介して互いに連結されているポリペプチドである抗原結合分子を得ること。
〔１３１〕 ２つの抗原分子を空間的に近接した位置に保持する活性を有する抗原結合分子を製造する方法であって、以下を含む方法；
（ａ）第一の抗原結合ドメインを含むポリペプチドをコードする核酸、および第二の抗原結合ドメインを含むポリペプチドをコードする核酸を提供すること、
（ｂ）当該２つの抗原結合ドメインを連結する少なくとも１カ所の結合が追加されるように、当該２つの抗原結合ドメインをコードする核酸に変異を導入すること、
（ｃ）（ｂ）で作製された核酸を宿主細胞に導入すること、
（ｄ）当該２つのポリペプチドが発現するように宿主細胞を培養すること、および
（ｅ）第一および第二の抗原結合ドメインを含むポリペプチドであって、当該２つの抗原結合ドメインが１カ所以上の結合を介して互いに連結されているポリペプチドである抗原結合分子を得ること。
〔１３２〕 ２つの抗原結合ドメインが空間的に近接した位置に存在し、かつ／または２つの抗原結合ドメインの可動性が減少している抗原結合分子を製造する方法であって、以下を含む方法；
（ａ）第一の抗原結合ドメインを含むポリペプチドをコードする核酸、および第二の抗原結合ドメインを含むポリペプチドをコードする核酸を提供すること、
（ｂ）当該２つの抗原結合ドメインを連結する少なくとも１カ所の結合が追加されるように、当該２つの抗原結合ドメインをコードする核酸に変異を導入すること、
（ｃ）（ｂ）で作製された核酸を宿主細胞に導入すること、
（ｄ）当該２つのポリペプチドが発現するように宿主細胞を培養すること、および
（ｅ）第一および第二の抗原結合ドメインを含むポリペプチドであって、当該２つの抗原結合ドメインが１カ所以上の結合を介して互いに連結されているポリペプチドである抗原結合分子を得ること。
〔１３３〕 プロテアーゼ切断に対する抵抗性が増大した抗原結合分子を製造する方法であって、以下を含む方法；
（ａ）第一の抗原結合ドメインを含むポリペプチドをコードする核酸、および第二の抗原結合ドメインを含むポリペプチドをコードする核酸を提供すること、
（ｂ）当該２つの抗原結合ドメインを連結する少なくとも１カ所の結合が追加されるように、当該２つの抗原結合ドメインをコードする核酸に変異を導入すること、
（ｃ）（ｂ）で作製された核酸を宿主細胞に導入すること、
（ｄ）当該２つのポリペプチドが発現するように宿主細胞を培養すること、および
（ｅ）第一および第二の抗原結合ドメインを含むポリペプチドであって、当該２つの抗原結合ドメインが１カ所以上の結合を介して互いに連結されているポリペプチドである抗原結合分子を得ること。【００１９】
〔１３４〕 互いに会合することによって活性化される、新規な一組のタンパク質分子を同定する方法であって、以下を含む方法；
（ａ）任意の２つのタンパク質分子を提供すること、
（ｂ）〔１２９〕から〔１３３〕のいずれかに記載の方法により、当該２つのタンパク質分子にそれぞれ結合する２つの抗原結合ドメインを含む抗原結合分子を製造すること、
（ｃ）（ｂ）で製造された抗原結合分子と当該２つのタンパク質分子とを接触させること、および
（ｄ）当該２つのタンパク質分子が活性化されているかどうかを測定すること。
〔１３５〕 少なくとも一方のタンパク質分子が、サイトカイン受容体スーパーファミリーに属する受容体、Ｇタンパク質結合型受容体、イオンチャネル型受容体、チロシンキナーゼ型受容体、免疫チェックポイント受容体、抗原受容体、ＣＤ抗原、共刺激分子、および細胞接着分子からなる群より選択される、〔１３４〕に記載の方法。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】図1は、実施例１に記載されるように、Fabどうしが架橋された改変抗体の例を示す図である。ここでは、野生型抗体（WT）と、抗体H鎖のCH1領域どうしが架橋された改変抗体（HH型）、抗体L鎖のCL領域どうしが架橋された改変抗体（LL型）、および抗体H鎖のCH1領域と抗体L鎖のCL領域が架橋された改変抗体（HL型、LH型）との構造的な違いが模式的に示されている。
【図２】図2は、実施例４−３に記載されるように、天然型抗CD3ε抗体分子（CD3-G4s）、およびそのFab-Fab間を追加のジスルフィド結合で連結した改変抗体分子（CD3-G4sLL、CD3-G4sHH）について、CD3を介したアゴニスト活性を測定した結果を示す図である。
【図３】図3は、実施例４−３に記載されるように、天然型抗CD3ε抗体分子（OKT3-G1s）、およびそのFab-Fab間を追加のジスルフィド結合で連結した改変抗体分子（OKT3-G1sLL、OKT3-G1sHH）について、CD3を介したアゴニスト活性を測定した結果を示す図である。
【図４】図4は、実施例４−３に記載されるように、天然型抗CD3ε抗体分子（CD3-G1s）、抗CD28抗体分子（CD28-G1s）、抗CD3ε×抗CD28二重特異性抗体（CD3//CD28-G1s）、およびそのFab-Fab間を追加のジスルフィド結合で連結した改変抗体分子（CD3//CD28-G1sLL、CD3//CD28-G1sHH、CD3//CD28-G1sLH、CD3//CD28-G1sHL）について、CD3および／またはCD28を介したアゴニスト活性を測定した結果を示す図である。
【図５】図5は、実施例４−３に記載されるように、天然型抗CD3ε抗体分子（OKT3-G1s）、抗CD28抗体分子（CD28-G1s）、抗CD3ε×抗CD28二重特異性抗体（OKT3//CD28-G1s）、およびそのFab-Fab間を追加のジスルフィド結合で連結した改変抗体分子（OKT3//CD28-G1sHH、OKT3//CD28-G1sHL）について、CD3および／またはCD28を介したアゴニスト活性を測定した結果を示す図である。
【図６】図6は、実施例５−２に記載されるように、抗IL6R抗体（MRA）とその重鎖可変領域にシステイン置換を行った改変抗体（MRAH.xxx-G1T4）、重鎖定常領域にシステイン置換を行った改変抗体（MRAH-G1T4.xxx）に対して、それぞれプロテアーゼ処理を行った結果を示す図である（1/8）。プロテアーゼ処理された各抗体は、非還元キャピラリー電気泳動にアプライされ、抗カッパ鎖抗体を用いてバンドの検出が行われた。
【図７】図7は、実施例５−２に記載されるように、抗IL6R抗体（MRA）とその重鎖可変領域にシステイン置換を行った改変抗体（MRAH.xxx-G1T4）、重鎖定常領域にシステイン置換を行った改変抗体（MRAH-G1T4.xxx）に対して、それぞれプロテアーゼ処理を行った結果を示す図である（2/8）。プロテアーゼ処理された各抗体は、非還元キャピラリー電気泳動にアプライされ、抗カッパ鎖抗体を用いてバンドの検出が行われた。
【図８】図8は、実施例５−２に記載されるように、抗IL6R抗体（MRA）とその重鎖可変領域にシステイン置換を行った改変抗体（MRAH.xxx-G1T4）、重鎖定常領域にシステイン置換を行った改変抗体（MRAH-G1T4.xxx）に対して、それぞれプロテアーゼ処理を行った結果を示す図である（3/8）。プロテアーゼ処理された各抗体は、非還元キャピラリー電気泳動にアプライされ、抗カッパ鎖抗体を用いてバンドの検出が行われた。
【図９】図9は、実施例５−２に記載されるように、抗IL6R抗体（MRA）とその重鎖可変領域にシステイン置換を行った改変抗体（MRAH.xxx-G1T4）、重鎖定常領域にシステイン置換を行った改変抗体（MRAH-G1T4.xxx）に対して、それぞれプロテアーゼ処理を行った結果を示す図である（4/8）。プロテアーゼ処理された各抗体は、非還元キャピラリー電気泳動にアプライされ、抗カッパ鎖抗体を用いてバンドの検出が行われた。
【図１０】図10は、実施例５−２に記載されるように、抗IL6R抗体（MRA）とその重鎖可変領域にシステイン置換を行った改変抗体（MRAH.xxx-G1T4）、重鎖定常領域にシステイン置換を行った改変抗体（MRAH-G1T4.xxx）に対して、それぞれプロテアーゼ処理を行った結果を示す図である（5/8）。プロテアーゼ処理された各抗体は、非還元キャピラリー電気泳動にアプライされ、抗カッパ鎖抗体を用いてバンドの検出が行われた。
【図１１】図11は、実施例５−２に記載されるように、抗IL6R抗体（MRA）とその重鎖可変領域にシステイン置換を行った改変抗体（MRAH.xxx-G1T4）、重鎖定常領域にシステイン置換を行った改変抗体（MRAH-G1T4.xxx）に対して、それぞれプロテアーゼ処理を行った結果を示す図である（6/8）。プロテアーゼ処理された各抗体は、非還元キャピラリー電気泳動にアプライされ、抗カッパ鎖抗体を用いてバンドの検出が行われた。
【図１２】図12は、実施例５−２に記載されるように、抗IL6R抗体（MRA）とその重鎖可変領域にシステイン置換を行った改変抗体（MRAH.xxx-G1T4）、重鎖定常領域にシステイン置換を行った改変抗体（MRAH-G1T4.xxx）に対して、それぞれプロテアーゼ処理を行った結果を示す図である（7/8）。プロテアーゼ処理された各抗体は、非還元キャピラリー電気泳動にアプライされ、抗カッパ鎖抗体を用いてバンドの検出が行われた。
【図１３】図13は、実施例５−２に記載されるように、抗IL6R抗体（MRA）とその重鎖可変領域にシステイン置換を行った改変抗体（MRAH.xxx-G1T4）、重鎖定常領域にシステイン置換を行った改変抗体（MRAH-G1T4.xxx）に対して、それぞれプロテアーゼ処理を行った結果を示す図である（8/8）。プロテアーゼ処理された各抗体は、非還元キャピラリー電気泳動にアプライされ、抗カッパ鎖抗体を用いてバンドの検出が行われた。
【図１４】図14は、実施例６−２に記載されるように、抗IL6R抗体（MRA）とその軽鎖可変領域にシステイン置換を行った改変抗体（MRAL.xxx-k0）、軽鎖定常領域にシステイン置換を行った改変抗体（MRAL-k0.xxx）に対して、それぞれプロテアーゼ処理を行った結果を示す図である（1/10）。プロテアーゼ処理された各抗体は、非還元キャピラリー電気泳動にアプライされ、抗カッパ鎖抗体を用いてバンドの検出が行われた。
【図１５】図15は、実施例６−２に記載されるように、抗IL6R抗体（MRA）とその軽鎖可変領域にシステイン置換を行った改変抗体（MRAL.xxx-k0）、軽鎖定常領域にシステイン置換を行った改変抗体（MRAL-k0.xxx）に対して、それぞれプロテアーゼ処理を行った結果を示す図である（2/10）。プロテアーゼ処理された各抗体は、非還元キャピラリー電気泳動にアプライされ、抗カッパ鎖抗体を用いてバンドの検出が行われた。
【図１６】図16は、実施例６−２に記載されるように、抗IL6R抗体（MRA）とその軽鎖可変領域にシステイン置換を行った改変抗体（MRAL.xxx-k0）、軽鎖定常領域にシステイン置換を行った改変抗体（MRAL-k0.xxx）に対して、それぞれプロテアーゼ処理を行った結果を示す図である（3/10）。プロテアーゼ処理された各抗体は、非還元キャピラリー電気泳動にアプライされ、抗カッパ鎖抗体を用いてバンドの検出が行われた。
【図１７】図17は、実施例６−２に記載されるように、抗IL6R抗体（MRA）とその軽鎖可変領域にシステイン置換を行った改変抗体（MRAL.xxx-k0）、軽鎖定常領域にシステイン置換を行った改変抗体（MRAL-k0.xxx）に対して、それぞれプロテアーゼ処理を行った結果を示す図である（4/10）。プロテアーゼ処理された各抗体は、非還元キャピラリー電気泳動にアプライされ、抗カッパ鎖抗体を用いてバンドの検出が行われた。
【図１８】図18は、実施例６−２に記載されるように、抗IL6R抗体（MRA）とその軽鎖可変領域にシステイン置換を行った改変抗体（MRAL.xxx-k0）、軽鎖定常領域にシステイン置換を行った改変抗体（MRAL-k0.xxx）に対して、それぞれプロテアーゼ処理を行った結果を示す図である（5/10）。プロテアーゼ処理された各抗体は、非還元キャピラリー電気泳動にアプライされ、抗カッパ鎖抗体を用いてバンドの検出が行われた。
【図１９】図19は、実施例６−２に記載されるように、抗IL6R抗体（MRA）とその軽鎖可変領域にシステイン置換を行った改変抗体（MRAL.xxx-k0）、軽鎖定常領域にシステイン置換を行った改変抗体（MRAL-k0.xxx）に対して、それぞれプロテアーゼ処理を行った結果を示す図である（6/10）。プロテアーゼ処理された各抗体は、非還元キャピラリー電気泳動にアプライされ、抗カッパ鎖抗体を用いてバンドの検出が行われた。
【図２０】図20は、実施例６−２に記載されるように、抗IL6R抗体（MRA）とその軽鎖可変領域にシステイン置換を行った改変抗体（MRAL.xxx-k0）、軽鎖定常領域にシステイン置換を行った改変抗体（MRAL-k0.xxx）に対して、それぞれプロテアーゼ処理を行った結果を示す図である（7/10）。プロテアーゼ処理された各抗体は、非還元キャピラリー電気泳動にアプライされ、抗カッパ鎖抗体を用いてバンドの検出が行われた。
【図２１】図21は、実施例６−２に記載されるように、抗IL6R抗体（MRA）とその軽鎖可変領域にシステイン置換を行った改変抗体（MRAL.xxx-k0）、軽鎖定常領域にシステイン置換を行った改変抗体（MRAL-k0.xxx）に対して、それぞれプロテアーゼ処理を行った結果を示す図である（8/10）。プロテアーゼ処理された各抗体は、非還元キャピラリー電気泳動にアプライされ、抗カッパ鎖抗体を用いてバンドの検出が行われた。
【図２２】図22は、実施例６−２に記載されるように、抗IL6R抗体（MRA）とその軽鎖可変領域にシステイン置換を行った改変抗体（MRAL.xxx-k0）、軽鎖定常領域にシステイン置換を行った改変抗体（MRAL-k0.xxx）に対して、それぞれプロテアーゼ処理を行った結果を示す図である（9/10）。プロテアーゼ処理された各抗体は、非還元キャピラリー電気泳動にアプライされ、抗カッパ鎖抗体を用いてバンドの検出が行われた。
【図２３】図23は、実施例６−２に記載されるように、抗IL6R抗体（MRA）とその軽鎖可変領域にシステイン置換を行った改変抗体（MRAL.xxx-k0）、軽鎖定常領域にシステイン置換を行った改変抗体（MRAL-k0.xxx）に対して、それぞれプロテアーゼ処理を行った結果を示す図である（10/10）。プロテアーゼ処理された各抗体は、非還元キャピラリー電気泳動にアプライされ、抗カッパ鎖抗体を用いてバンドの検出が行われた。
【図２４】図24は、実施例７−２に記載されるように、抗IL6R抗体（MRA）とその軽鎖定常領域にシステイン置換を行った改変抗体（MRAL-k0.K126C）に対して、それぞれプロテアーゼ処理を行った結果を示す図である。プロテアーゼ処理された各抗体は、非還元キャピラリー電気泳動にアプライされ、抗カッパ鎖抗体または抗ヒトFc抗体を用いてバンドの検出が行われた。
【図２５】図25は、実施例７−２に記載されるように、抗体サンプルをプロテアーゼ処理した結果得られる各バンドの分子量とその想定される構造との対応を示す図である。各分子の構造の下に、当該分子が抗カッパ鎖抗体あるいは抗Fc抗体と反応し得るかどうか（図24の電気泳動においてバンドが検出されるかどうか）も併せて記載されている。
【図２６】図26は、実施例１３−４に記載されるように、抗CD3抗体分子（OKT3）、そのFab-Fab間を追加のジスルフィド結合で連結した改変抗体分子（H_T135C、H_S136C、H_S191C、L_K126C）、および抗KLH抗体分子（IC17）（ネガティブコントロール）について、CD3を介したアゴニスト活性を測定した結果を示す図である。
【図２７】図27は、実施例１４−４に記載されるように、抗CD3抗体分子（OKT3）、OKT3の重鎖定常領域にヘテロ二量体化を促進するKnobs-into-Holes（KiH）改変が導入された改変抗体分子（OKT3_KiH）、そのFab-Fab間を追加のジスルフィド結合で連結した改変抗体分子（H_S191C_KiH、H_S191C/V188C_KiH、H_S191C/P189C_KiH、H_S191C/S190C_KiH、H_S191C/S192C_KiH、H_S191C/L193C_KiH、H_S191C/G194C_KiH）、および抗KLH抗体分子（IC17）（ネガティブコントロール）について、CD3を介したアゴニスト活性を測定した結果を示す図である。
【図２８】図28は、実施例１５−４に記載されるように、抗CD3抗体分子（OKT3）、そのFab-Fab間を追加のジスルフィド結合で連結した改変抗体分子（H_S191C）、OKT3の重鎖定常領域にヘテロ二量体化を促進するKnobs-into-Holes（KiH）改変が導入された改変抗体分子（OKT3_KiH）、そのFab-Fab間を追加のジスルフィド結合で連結した改変抗体分子（H_S191C_KiH）、OKT3_KiHの片方の重鎖定常領域に正の電荷アミノ酸置換を、もう一方の重鎖定常領域に負の電荷アミノ酸置換を導入した改変抗体分子（0004//0004、0004//0006）、OKT3_KiHの片方の重鎖定常領域に正または負の電荷アミノ酸置換を導入した改変抗体分子（0004//OKT3、OKT3//0004、OKT3//0006）、および抗KLH抗体分子（IC17）（ネガティブコントロール）について、CD3を介したアゴニスト活性を測定した結果を示す図である。
【図２９】図29は、実施例１６−４に記載されるように、抗CD3抗体分子（OKT3）、そのヒンジ領域のジスルフィド結合を除去した改変抗体分子（dh1、dh2、dh3）、さらにそれらのFab-Fab間を追加のジスルフィド結合で連結した改変抗体分子（H_S191C_dh1、H_S191C_dh2、H_S191C_dh3）、および抗KLH抗体分子（IC17）（ネガティブコントロール）について、CD3を介したアゴニスト活性を測定した結果を示す図である。
【図３０】図30は、実施例２０に記載されるように、抗CD3モノスペシフィック抗体分子（OKT3-G1s）、そのFab-Fab間を追加のジスルフィド結合で連結した改変抗体分子（OKT3-G1sHH）、抗CD3モノスペシフィック抗体（CD3-G1s）のFab-Fab間を追加のジスルフィド結合で連結した改変抗体分子（CD3-G1sLL）、抗CD3バイパラトピック抗体分子（CD3//OKT3-G1s）、そのFab-Fab間を追加のジスルフィド結合で連結した改変抗体分子（CD3//OKT3-G1sHH、CD3//OKT3-G1sLH）、およびCD3-G1sLLとOKT3-G1sの組合せ（CD3-G1sLL+OKT3-G1s）について、CD3を介したアゴニスト活性を測定した結果を示す図である。
【図３１Ａ】図31A〜Dは、実施例２２−１に記載されるように、抗CD3×抗PD1二重特異性抗体、およびそのFab-Fab間を追加のジスルフィド結合で連結した改変抗体分子について、CD3および／またはPD1を介したアゴニスト活性を測定した結果を示す図である。(A) 抗CD3抗体（OKT3）および抗PD1抗体（117）から構成される抗CD3×抗PD1二重特異性抗体分子（OKT3//117-G1silent）、ならびにそのFab-Fab間を追加のジスルフィド結合で連結した改変抗体分子（OKT3//117-G1silentHH、OKT3//117-G1silentHL、OKT3//117-G1silentLL）のアゴニスト活性を示す。
【図３１Ｂ】(B) 抗CD3抗体（OKT3）および抗PD1抗体（10）から構成される抗CD3×抗PD1二重特異性抗体分子（OKT3//10-G1silent）、ならびにそのFab-Fab間を追加のジスルフィド結合で連結した改変抗体分子（OKT3//10-G1silentHH、OKT3//10-G1silentHL）のアゴニスト活性を示す。
【図３１Ｃ】(C) 抗CD3抗体（CD3）および抗PD1抗体（949）から構成される抗CD3×抗PD1二重特異性抗体分子（CD3//949-G1silent）、ならびにそのFab-Fab間を追加のジスルフィド結合で連結した改変抗体分子（CD3//949-G1silentLH、CD3//949-G1silentHH、CD3//949-G1silentLL、CD3//949-G1silentHL）のアゴニスト活性を示す。
【図３１Ｄ】(D) 抗CD3抗体（OKT3）および抗PD1抗体（949）から構成される抗CD3×抗PD1二重特異性抗体分子（OKT3//949-G1silent）、ならびにそのFab-Fab間を追加のジスルフィド結合で連結した改変抗体分子（OKT3//949-G1silentHL、OKT3//949-G1silentHH、OKT3//949-G1silentLL）のアゴニスト活性を示す。
【図３２】図32は、実施例２２−２に記載されるように、抗CD3抗体（OKT3）および抗PD1抗体（949）から構成される抗CD3×抗PD1二重特異性抗体分子（OKT3//949-G1silent）、ならびにそのFab-Fab間を追加のジスルフィド結合で連結した改変抗体分子（OKT3//949-G1silentHH、OKT3//949-G1silentHL、OKT3//949-G1silentLH、OKT3//949-G1silentLL）について、CD3および／またはPD1を介したアゴニスト活性を測定した結果を示す図である。
【図３３Ａ】図33A,Bは、実施例２３−１に記載されるように、CD28/ CD3クランピング二重特異性抗体およびGPC3/結合減弱CD3二重特異性抗体を併用した場合の、T細胞依存的な癌細胞増殖抑制効果を評価した結果を示す図である。標的細胞（GPC3発現癌細胞）およびエフェクター細胞（T細胞）の存在下において、上記のCD28/ CD3クランピング二重特異性抗体およびGPC3/結合減弱CD3二重特異性抗体を組み合わせて作用させた場合、GPC3/結合減弱CD3二重特異性抗体が標的細胞とエフェクター細胞を近接化させるとともに、CD28/ CD3クランピング二重特異性抗体がエフェクター細胞を活性化させる。(A) 癌細胞にT細胞をターゲッティングさせるための抗体として、GPC3/結合減弱CD3二重特異性抗体分子（GPC3/attCE115）、T細胞を活性化させるための抗体として、GPC3/ CD3クランピング二重特異性抗体分子（GPC3/clamp CD3）、KLH/ CD3クランピング二重特異性抗体分子（KLH/clamp CD3）、CD28/ CD3クランピング二重特異性抗体分子（CD28/clamp CD3）、およびそのFab-Fab間を追加のジスルフィド結合で連結した改変抗体分子（CD28/clamp CD3_HH）をそれぞれ用いた場合の癌細胞増殖抑制効果を示す。
【図３３Ｂ】(B) 癌細胞にT細胞をターゲッティングさせるための抗体として、GPC3/結合減弱CD3二重特異性抗体のFab-Fab間を追加のジスルフィド結合で連結した改変抗体分子（GPC3/attCE115_LL）、T細胞を活性化させるための抗体として、GPC3/ CD3クランピング二重特異性抗体分子（GPC3/clamp CD3）、KLH/ CD3クランピング二重特異性抗体分子（KLH/clamp CD3）、CD28/ CD3クランピング二重特異性抗体分子（CD28/clamp CD3）、およびそのFab-Fab間を追加のジスルフィド結合で連結した改変抗体分子（CD28/clamp CD3_HH）をそれぞれ用いた場合の癌細胞増殖抑制効果を示す。
【図３４Ａ】図34A〜Cは、実施例２３−２に記載されるように、CD28/ CD3クランピング二重特異性抗体およびGPC3/結合減弱CD3二重特異性抗体を併用した場合の、T細胞からのサイトカイン産生を評価した結果を示す図である。標的細胞（GPC3発現癌細胞）およびエフェクター細胞（T細胞）の存在下において、上記のCD28/ CD3クランピング二重特異性抗体およびGPC3/結合減弱CD3二重特異性抗体を組み合わせて用いた場合、GPC3/結合減弱CD3二重特異性抗体が標的細胞とエフェクター細胞を近接化させるとともに、CD28/ CD3クランピング二重特異性抗体がエフェクター細胞を活性化させる。(A) 標的細胞（GPC3発現癌細胞）およびエフェクター細胞（T細胞）の存在下において、GPC3/結合減弱CD3二重特異性抗体分子（GPC3/attCE115）、およびCD28/ CD3クランピング二重特異性抗体のFab-Fab間を追加のジスルフィド結合で連結した改変抗体分子（CD28/clamp CD3_HH）をそれぞれ単独または組み合わせて用いた場合のIL-6産生量を示す。
【図３４Ｂ】(B) エフェクター細胞（T細胞）のみの存在下において、GPC3/結合減弱CD3二重特異性抗体分子（GPC3/attCE115）、CD28/ CD3クランピング二重特異性抗体のFab-Fab間を追加のジスルフィド結合で連結した改変抗体分子（CD28/clamp CD3_HH）をそれぞれ単独または組み合わせて用いた場合のIL-6産生量を示す。
【図３４Ｃ】(C) 標的細胞（GPC3発現癌細胞）およびエフェクター細胞（T細胞）の存在下において、GPC3/結合減弱CD3二重特異性抗体分子（GPC3/attCE115）、およびCD28/ CD3クランピング二重特異性抗体のFab-Fab間を追加のジスルフィド結合で連結した改変抗体分子（CD28/clamp CD3_HH）をそれぞれ単独または組み合わせて用いた場合の癌細胞増殖抑制効果を示す。
【図３５Ａ】図35A,Bは、実施例２３−１に記載されるように、CD28/ CD3クランピング二重特異性抗体およびGPC3/結合減弱CD3二重特異性抗体を併用した場合の、T細胞依存的な癌細胞増殖抑制の作用機序を示す模式図である（図中のεはCD3εを表す）。(A) 標的細胞（GPC3発現癌細胞）およびエフェクター細胞（T細胞）の存在下において、CD28/ CD3クランピング二重特異性抗体およびGPC3/結合減弱CD3二重特異性抗体を組み合わせて用いた場合の癌細胞増殖抑制の作用機序を示す。
【図３５Ｂ】(B) 標的細胞（GPC3発現癌細胞）およびエフェクター細胞（T細胞）の存在下において、CD28/ CD3クランピング二重特異性抗体のFab-Fab間に追加のジスルフィド結合を導入するための改変を加えた改変抗体分子およびGPC3/結合減弱CD3二重特異性抗体を組み合わせて用いた場合の癌細胞増殖抑制の作用機序を示す。
【図３６Ａ】図36A,Bは、実施例２３−２に記載されるように、CD28/ CD3クランピング二重特異性抗体およびGPC3/結合減弱CD3二重特異性抗体を組み合わせて用いた場合の、T細胞からのサイトカイン産生の作用機序を示す模式図である（図中のεはCD3εを表す）。(A) 標的細胞（GPC3発現癌細胞）およびエフェクター細胞（T細胞）の存在下において、CD28/ CD3クランピング二重特異性抗体のFab-Fab間に追加のジスルフィド結合を導入するための改変を加えた改変抗体分子およびGPC3/結合減弱CD3二重特異性抗体を組み合わせて用いた場合のサイトカイン産生の作用機序を示す。
【図３６Ｂ】(B) エフェクター細胞（T細胞）のみの存在下において、CD28/ CD3クランピング二重特異性抗体のFab-Fab間に追加のジスルフィド結合を導入するための改変を加えた改変抗体分子およびGPC3/結合減弱CD3二重特異性抗体を組み合わせて用いた場合のサイトカイン産生の作用機序を示す。
【図３７Ａ】図37A,Bは、実施例２４に記載されるように、CD8/CD28二重特異性抗体分子（CD8/CD28-P587）、およびそのFab-Fab間を追加のジスルフィド結合で連結した改変抗体分子（CD8/CD28-P587(HH)、CD8/CD28-P587(LL)、CD8/CD28-P587(HL)、CD8/CD28-P587(LH)）について、アゴニスト活性を測定した結果を示す図である。ネガティブコントロールとして抗KLH抗体分子（KLH-P587）が用いられている。それぞれ２人の異なるドナー由来の末梢血単核細胞（PBMC）を用いた結果が示されている（上：ドナーＡ、下：ドナーＢ）。(A) PBMC中に含まれる分裂した制御性T（Treg）細胞の割合を示す。
【図３７Ｂ】(B) PBMC中に含まれる分裂したCD8α陽性 T細胞の割合を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
Ｉ．定義
本明細書で用語「抗原結合分子」は、その最も広い意味において、抗原決定基（エピトープ）に特異的に結合する分子を指す。一態様において、抗原結合分子は、抗体、抗体断片、または抗体誘導体である。一態様において、抗原結合分子は、非抗体タンパク質、またはその断片、もしくはその誘導体である。
【００２２】
本明細書において「抗原結合ドメイン」とは、抗原の一部または全部に特異的に結合し且つ相補的である領域をいう。本明細書において、抗原結合分子は抗原結合ドメインを含んで成る。抗原の分子量が大きい場合、抗原結合ドメインは抗原の特定部分にのみ結合することができる。当該特定部分はエピトープと呼ばれる。一態様において、抗原結合ドメインは特定の抗原に結合する抗体断片を含む。抗原結合ドメインは一または複数の抗体の可変ドメインより提供され得る。非限定的な一態様において、抗原結合ドメインは抗体軽鎖可変領域（VL）と抗体重鎖可変領域（VH）とを含む。こうした抗原結合ドメインの例としては、「scFv（single chain Fv）」、「単鎖抗体（single chain antibody）」、「Fv」、「scFv2（single chain Fv 2）」、「Fab」または「Fab'」等が挙げられる。別の態様において、抗原結合ドメインは特定の抗原に結合する非抗体タンパク質またはその断片を含む。特定の態様において、抗原結合ドメインはヒンジ領域を含む。
【００２３】
本明細書において「特異的に結合する」とは、特異的に結合する分子の一方の分子がその一または複数の結合する相手方の分子以外の分子に対しては何ら有意な結合を示さない状態で結合することをいう。また、抗原結合ドメインが、ある抗原中に含まれる複数のエピトープのうち特定のエピトープに対して特異的である場合にも用いられる。また、抗原結合ドメインが結合するエピトープが複数の異なる抗原に含まれる場合には、当該抗原結合ドメインを有する抗原結合分子は当該エピトープを含む様々な抗原と結合することができる。
【００２４】
本開示において、「同じエピトープに結合する」とは、2つの抗原結合ドメインが結合するエピトープが少なくとも一部重複することを意味する。重複する程度は、限定されないが、少なくとも10％以上、好ましくは20％以上、30％以上、40％以上、50％以上、60％以上、70％以上、80％以上、特に好ましくは90％以上、最も好ましくは100％重複する。
【００２５】
本明細書で用語「抗体」は、最も広い意味で使用され、所望の抗原結合活性を示す限りは、これらに限定されるものではないが、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）および抗体断片を含む、種々の抗体構造を包含する。
【００２６】
本明細書でいう用語「モノクローナル抗体」は、実質的に均一な抗体の集団から得られる抗体のことをいう。すなわち、その集団を構成する個々の抗体は、生じ得る変異抗体（例えば、自然に生じる変異を含む変異抗体、またはモノクローナル抗体調製物の製造中に発生する変異抗体。そのような変異体は通常若干量存在している。）を除いて、同一でありおよび／または同じエピトープに結合する。異なる決定基（エピトープ）に対する異なる抗体を典型的に含むポリクローナル抗体調製物とは対照的に、モノクローナル抗体調製物の各モノクローナル抗体は、抗原上の単一の決定基に対するものである。したがって、修飾語「モノクローナル」は、実質的に均一な抗体の集団から得られるものである、という抗体の特徴を示し、何らかの特定の方法による抗体の製造を求めるものと解釈されるべきではない。例えば、本発明にしたがって用いられるモノクローナル抗体は、これらに限定されるものではないが、ハイブリドーマ法、組換えDNA法、ファージディスプレイ法、ヒト免疫グロブリン遺伝子座の全部または一部を含んだトランスジェニック動物を利用する方法を含む、様々な手法によって作成されてよく、モノクローナル抗体を作製するためのそのような方法および他の例示的な方法は、本明細書に記載されている。
【００２７】
「天然型抗体」は、天然に生じる様々な構造を伴う免疫グロブリン分子のことをいう。例えば、天然型IgG抗体は、ジスルフィド結合している2つの同一の軽鎖と2つの同一の重鎖から構成される約150,000ダルトンのヘテロ四量体糖タンパク質である。N末端からC末端に向かって、各重鎖は、可変重鎖ドメインまたは重鎖可変ドメインとも呼ばれる可変領域 (VH) を有し、それに3つの定常ドメイン（CH1、CH2、およびCH3）が続く。同様に、N末端からC末端に向かって、各軽鎖は、可変軽鎖ドメインまたは軽鎖可変ドメインとも呼ばれる可変領域 (VL) を有し、それに定常軽鎖 (CL) ドメインが続く。抗体の軽鎖は、その定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、カッパ（κ）およびラムダ（λ）と呼ばれる、2つのタイプの1つに帰属させられてよい。
【００２８】
用語「キメラ」抗体は、重鎖および／または軽鎖の一部分が特定の供給源または種に由来する一方で、重鎖および／または軽鎖の残りの部分が異なった供給源または種に由来する抗体のことをいう。
【００２９】
抗体の「クラス」は、抗体の重鎖に備わる定常ドメインまたは定常領域のタイプのことをいう。抗体には5つの主要なクラスがある：IgA、IgD、IgE、IgG、およびIgMである。そして、このうちいくつかはさらにサブクラス（アイソタイプ）に分けられてもよい。例えば、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、およびIgA2である。異なるクラスの免疫グロブリンに対応する重鎖定常ドメインを、それぞれ、α、δ、ε、γ、およびμと呼ぶ。
【００３０】
本発明の一つの実施態様としての定常領域とは、好ましくは抗体定常領域であり、より好ましくはIgG1、IgG2、IgG3、IgG4型の抗体定常領域であり、さらにより好ましくはヒトIgG1、IgG2、IgG3、IgG4型の抗体定常領域である。また本発明の別の一つの実施態様としての定常領域とは、好ましくは重鎖定常領域であり、より好ましくはIgG1、IgG2、IgG3、IgG4型の重鎖定常領域であり、さらにより好ましくはヒトIgG1、IgG2、IgG3、IgG4型の重鎖定常領域である。ヒトIgG1定常領域、ヒトIgG2定常領域、ヒトIgG3定常領域およびヒトIgG4定常領域のアミノ酸配列は公知である。ヒトIgG1、ヒトIgG2、ヒトIgG3、ヒトIgG4抗体の定常領域としては、遺伝子多型による複数のアロタイプ配列がSequences of proteins of immunological interest, NIH Publication No.91-3242に記載されているが、本発明においてはそのいずれであっても良い。なお本発明のアミノ酸が改変された定常領域は、本発明のアミノ酸変異を含むものである限り、他のアミノ酸変異や修飾を含んでもよい。
【００３１】
「ヒンジ領域」という用語は、野生型抗体重鎖においてCH1ドメインおよびCH2ドメインを連結する、例えばEUナンバリングシステムによれば216位あたりから230位あたりまでの、またはKabatナンバリングシステムによれば226位あたりから243位あたりまでの、抗体重鎖ポリペプチド部分を意味する。天然型IgG抗体において、ヒンジ領域におけるEUナンバリング220位のシステイン残基は、抗体軽鎖における214位のシステイン残基とジスルフィド結合を形成することが知られている。さらに、２つの抗体重鎖の間では、ヒンジ領域におけるEUナンバリング226位のシステイン残基どうし、および229位のシステイン残基どうしがジスルフィド結合を形成することが知られている。本明細書におけるヒンジ領域は、野生型のほか、野生型においてアミノ酸残基の置換、付加、または欠失させた改変体も包含する。
【００３２】
本明細書で用語「Fc領域」は、少なくとも定常領域の一部分を含む免疫グロブリン重鎖のC末端領域を定義するために用いられる。この用語は、天然型配列のFc領域および変異体Fc領域を含む。一態様において、ヒトIgG重鎖Fc領域はCys226から、またはPro230から、重鎖のカルボキシル末端まで延びる。ただし、Fc領域のC末端のリジン (Lys447) またはグリシン‐リジン（Gly446-Lys447）は、存在していてもしていなくてもよい。本明細書では別段特定しない限り、Fc領域または定常領域中のアミノ酸残基の番号付けは、Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD 1991 に記載の、EUナンバリングシステム（EUインデックスとも呼ばれる）にしたがう。
【００３３】
「エフェクター機能」は、抗体のFc領域に起因する、抗体のアイソタイプによって異なる生物学的活性のことをいう。抗体のエフェクター機能の例には次のものが含まれる：C1q結合および補体依存性細胞傷害（complement dependent cytotoxicity:CDC）；Fc受容体結合；抗体依存性細胞介在性細胞傷害（antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity: ADCC）；貪食作用；細胞表面受容体（例えば、B細胞受容体）の下方制御；および、B細胞活性化。
【００３４】
「Fc受容体」または「FcR」は、抗体のFc領域に結合する受容体のことをいう。いくつかの態様において、FcRは、天然型ヒトFcRである。いくつかの態様において、FcRは、IgG抗体に結合するもの（ガンマ受容体）であり、FcγRI、FcγRII、およびFcγRIIIサブクラスの受容体を、これらの受容体の対立遺伝子変異体および選択的スプライシングによる形態を含めて、含む。FcγRII受容体は、FcγRIIA（「活性化受容体」）およびFcγRIIB（「阻害受容体」）を含み、これらは主としてその細胞質ドメインにおいて相違する類似のアミノ酸配列を有する。活性化受容体FcγRIIAは、その細胞質ドメインに免疫受容体チロシン活性化モチーフ (immunoreceptor tyrosine-based activation motif: ITAM) を含む。阻害受容体FcγRIIBは、その細胞質ドメインに免疫受容体チロシン阻害モチーフ（immunoreceptor tyrosine-based inhibition motif: ITIM）を含む。（例えば、Daeron, Annu. Rev. Immunol. 15:203-234 (1997) を参照のこと。）FcRは、例えば、Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol 9:457-92 (1991)；Capel et al., Immunomethods 4:25-34 (1994)；およびde Haas et al., J. Lab. Clin. Med 126:330-41 (1995)において総説されている。将来同定されるものを含む他のFcRも、本明細書の用語「FcR」に包含される。
【００３５】
用語「Fc受容体」または「FcR」はまた、母体のIgGの胎児への移動（Guyer et al., J. Immunol. 117:587 (1976)およびKim et al., J. Immunol. 24:249 (1994)）ならびに免疫グロブリンのホメオスタシスの調節を担う、新生児型受容体FcRnを含む。FcRnへの結合を測定する方法は公知である（例えば、Ghetie and Ward., Immunol. Today 18(12):592-598 (1997); Ghetie et al., Nature Biotechnology, 15(7):637-640 (1997); Hinton et al., J. Biol. Chem. 279(8):6213-6216 (2004); WO2004/92219 (Hinton et al.)を参照のこと）。
【００３６】
用語「可変領域」または「可変ドメイン」は、抗体を抗原へと結合させることに関与する、抗体の重鎖または軽鎖のドメインのことをいう。天然型抗体の重鎖および軽鎖の可変ドメイン（それぞれVHおよびVL）は、通常、各ドメインが4つの保存されたフレームワーク領域 (FR) および3つの超可変領域 (HVR) を含む、類似の構造を有する。（例えば、Kindt et al. Kuby Immunology, 6th ed., W.H. Freeman and Co., page 91 (2007) 参照。）1つのVHまたはVLドメインで、抗原結合特異性を与えるに充分であろう。さらに、ある特定の抗原に結合する抗体は、当該抗原に結合する抗体からのVHまたはVLドメインを使ってそれぞれVLまたはVHドメインの相補的ライブラリをスクリーニングして、単離されてもよい。例えばPortolano et al., J. Immunol. 150:880-887 (1993)； Clarkson et al., Nature 352:624-628 (1991) 参照。
【００３７】
本明細書で用いられる用語「超可変領域」または「HVR」は、配列において超可変であり（「相補性決定領域」または「CDR」(complementarity determining region)）、および／または構造的に定まったループ（「超可変ループ」）を形成し、および／または抗原接触残基（「抗原接触」）を含む、抗体の可変ドメインの各領域のことをいう。通常、抗体は6つのHVRを含む：VHに3つ（H1、H2、H3）、およびVLに3つ（L1、L2、L3）である。本明細書での例示的なHVRは、以下のものを含む：
(a) アミノ酸残基26-32 (L1)、50-52 (L2)、91-96 (L3)、26-32 (H1)、53-55 (H2)、および96-101 (H3)のところで生じる超可変ループ (Chothia and Lesk, J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987))；
(b) アミノ酸残基24-34 (L1)、50-56 (L2)、89-97 (L3)、31-35b (H1)、50-65 (H2)、 および95-102 (H3)のところで生じるCDR (Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991))；
(c) アミノ酸残基27c-36 (L1)、46-55 (L2)、89-96 (L3)、30-35b (H1)、47-58 (H2)、および93-101 (H3) のところで生じる抗原接触 (MacCallum et al. J. Mol. Biol. 262: 732-745 (1996))；ならびに、
(d) HVRアミノ酸残基46-56 (L2)、47-56 (L2)、48-56 (L2)、49-56 (L2)、26-35 (H1)、26-35b (H1)、49-65 (H2)、93-102 (H3)、および94-102 (H3)を含む、(a)、(b)、および／または(c)の組合せ。
別段示さない限り、HVR残基および可変ドメイン中の他の残基（例えば、FR残基）は、本明細書では上記のKabatらにしたがって番号付けされる。
【００３８】
「フレームワーク」または「FR」は、超可変領域 (HVR) 残基以外の、可変ドメイン残基のことをいう。可変ドメインのFRは、通常4つのFRドメイン：FR1、FR2、FR3、およびFR4からなる。それに応じて、HVRおよびFRの配列は、通常次の順序でVH（またはVL）に現れる：FR1-H1(L1)-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4。
【００３９】
用語「全長抗体」、「完全抗体」、および「全部抗体」は、本明細書では相互に交換可能に用いられ、天然型抗体構造に実質的に類似した構造を有する、または本明細書で定義するFc領域を含む重鎖を有する抗体のことをいう。
【００４０】
用語「宿主細胞」、「宿主細胞株」、および「宿主細胞培養物」は、相互に交換可能に用いられ、外来核酸を導入された細胞（そのような細胞の子孫を含む）のことをいう。宿主細胞は「形質転換体」および「形質転換細胞」を含み、これには初代の形質転換細胞および継代数によらずその細胞に由来する子孫を含む。子孫は、親細胞と核酸の内容において完全に同一でなくてもよく、変異を含んでいてもよい。オリジナルの形質転換細胞がスクリーニングされたまたは選択された際に用いられたものと同じ機能または生物学的活性を有する変異体子孫も、本明細書では含まれる。
【００４１】
本明細書で用いられる用語「ベクター」は、それが連結されたもう1つの核酸を増やすことができる、核酸分子のことをいう。この用語は、自己複製核酸構造としてのベクター、および、それが導入された宿主細胞のゲノム中に組み入れられるベクターを含む。あるベクターは、自身が動作的に連結された核酸の、発現をもたらすことができる。そのようなベクターは、本明細書では「発現ベクター」とも称される。
【００４２】
「ヒト抗体」は、ヒトもしくはヒト細胞によって産生された抗体またはヒト抗体レパートリーもしくは他のヒト抗体コード配列を用いる非ヒト供給源に由来する抗体のアミノ酸配列に対応するアミノ酸配列を備える抗体である。このヒト抗体の定義は、非ヒトの抗原結合残基を含むヒト化抗体を、明確に除外するものである。
【００４３】
「ヒト化」抗体は、非ヒトHVRからのアミノ酸残基およびヒトFRからのアミノ酸残基を含む、キメラ抗体のことをいう。ある態様では、ヒト化抗体は、少なくとも1つ、典型的には2つの可変ドメインの実質的にすべてを含み、当該可変領域においては、すべてのもしくは実質的にすべてのHVR（例えばCDR）は非ヒト抗体のものに対応し、かつ、すべてのもしくは実質的にすべてのFRはヒト抗体のものに対応する。ヒト化抗体は、任意で、ヒト抗体に由来する抗体定常領域の少なくとも一部分を含んでもよい。抗体（例えば、非ヒト抗体）の「ヒト化された形態」は、ヒト化を経た抗体のことをいう。
【００４４】
「抗体断片」は、完全抗体が結合する抗原に結合する当該完全抗体の一部分を含む、当該完全抗体以外の分子のことをいう。抗体断片の例は、これらに限定されるものではないが、Fv、Fab、Fab'、Fab’-SH、F(ab')2；ダイアボディ；線状抗体；単鎖抗体分子（例えば、scFv）；単鎖Fab（scFab）；シングルドメイン抗体；および、抗体断片から形成された多重特異性抗体を含む。
【００４５】
Fv（variable fragment）
本明細書において、「Fv（variable fragment）」という用語は、抗体の軽鎖可変領域（VL（light chain variable region））と抗体の重鎖可変領域（VH（heavy chain variable region））とのペアからなる抗体由来の抗原結合ドメインの最小単位を意味する。1988年にSkerraとPluckthunは、バクテリアのシグナル配列の下流に抗体の遺伝子を挿入し大腸菌中で当該遺伝子の発現を誘導することによって、均一でかつ活性を保持した状態で大腸菌のペリプラズム画分から調製されることを見出した（Science (1988) 240 (4855), 1038-1041）。ペリプラズム画分から調製されたFvは、抗原に対する結合を有する態様でVHとVLが会合していた。
【００４６】
scFv、単鎖抗体、またはsc(Fv)2
本明細書において、「scFv」、「単鎖抗体」、または「sc(Fv)2」という用語は、単一のポリペプチド鎖内に、重鎖および軽鎖の両方に由来する可変領域を含むが、定常領域を欠いている抗体断片を意味する。一般に、単鎖抗体は、抗原結合を可能にすると思われる所望の構造を形成するのを可能にする、VHドメインとVLドメインの間のポリペプチドリンカーをさらに含む。単鎖抗体は、The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, 113巻, Rosenburg、及び、Moore編, Springer-Verlag, New York, 269〜315（1994）においてPluckthunによって詳細に考察されている。同様に、国際特許出願公開WO1988/001649および米国特許第4,946,778号および同第5,260,203号を参照。特定の態様において、単鎖抗体はまた、二重特異性であるか、かつ／またはヒト化され得る。
【００４７】
scFvはFvを構成するVHとVLとがペプチドリンカーによって連結された抗原結合ドメインである（Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. (1988) 85 (16), 5879-5883）。当該ペプチドリンカーによってVHとVLとが近接した状態に保持され得る。
【００４８】
sc(Fv)2は二つのVLと二つのVHの4つの可変領域がペプチドリンカー等のリンカーによって連結され一本鎖を構成する単鎖抗体である（J Immunol. Methods (1999) 231 (1-2), 177-189）。この二つのVHとVLは異なるモノクローナル抗体から由来することもあり得る。例えば、Journal of Immunology (1994) 152 (11), 5368-5374に開示されるような同一抗原中に存在する二種類のエピトープを認識する二重特異性（bispecific sc(Fv)2）も好適に挙げられる。sc(Fv)2は、当業者に公知の方法によって作製され得る。例えば、scFvをペプチドリンカー等のリンカーで結ぶことによって作製され得る。
【００４９】
本明細書におけるsc(Fv)2を構成する抗原結合ドメインの構成としては、二つのVH及び二つのVLが、一本鎖ポリペプチドのN末端側を基点としてVH、VL、VH、VL（［VH］リンカー［VL］リンカー［VH］リンカー［VL］）の順に並んでいることを特徴とする抗体が挙げられるが、二つのVHと2つのVLの順序は特に上記の構成に限定されず、どのような順序で並べられていてもよい。例えば以下のような、順序の構成も挙げることができる。
［VL］リンカー［VH］リンカー［VH］リンカー［VL］
［VH］リンカー［VL］リンカー［VL］リンカー［VH］
［VH］リンカー［VH］リンカー［VL］リンカー［VL］
［VL］リンカー［VL］リンカー［VH］リンカー［VH］
［VL］リンカー［VH］リンカー［VL］リンカー［VH］
【００５０】
Fab、F(ab’)2、またはFab’
「Fab」は、一本の軽鎖、ならびに一本の重鎖のCH1領域および可変領域から構成される。野生型のFab分子の重鎖は、別の重鎖分子とのジスルフィド結合を形成できない。本明細書では野生型のFabのほか、野生型においてアミノ酸残基の置換、付加、または欠失させた改変型のFabも包含する。特定の態様において、改変型のFabに含まれる変異アミノ酸残基（例えば、置換、付加、または挿入されたシステイン残基やリジン残基）は、別の重鎖分子またはその一部（例えばFab分子）とジスルフィド結合を形成できる。
【００５１】
scFabはFabを構成する一本の軽鎖と一本の重鎖のCH1領域および可変領域とがペプチドリンカーによって連結された抗原結合ドメインである。当該ペプチドリンカーによって軽鎖と重鎖のCH1領域および可変領域とが近接した状態に保持され得る。
【００５２】
「F(ab’)2」及び「Fab’」とは、イムノグロブリン（モノクローナル抗体）をタンパク質分解酵素（プロテアーゼ）であるペプシンあるいはパパイン等で処理することにより製造され、ヒンジ領域中の2本のH鎖間に存在するジスルフィド結合の前後で消化されて生成される抗体フラグメントを意味する。例えば、IgGをパパインで処理することにより、ヒンジ領域中の2本のH鎖間に存在するジスルフィド結合の上流で切断されてVL（L鎖可変領域）とCL（L鎖定常領域）からなるL鎖、及びVH（H鎖可変領域）とCHγ1（H鎖定常領域中のγ1領域）とからなるH鎖フラグメントがC末端領域でジスルフィド結合により結合した相同な2つの抗体フラグメントが製造され得る。これら2つの相同な抗体フラグメントはそれぞれFab'といわれる。
【００５３】
「F(ab’)2」は、二本の軽鎖、ならびに、鎖間のジスルフィド結合が2つの重鎖間で形成されるようにCH1ドメインおよびCH2ドメインの一部分の定常領域を含む二本の重鎖を含む。本明細書において開示されるF(ab’)2は、所望の抗原結合ドメインを有する全長モノクローナル抗体等をペプシン等の蛋白質分解酵素にて部分消化した後に、Fc断片をプロテインAカラムに吸着させて除去することにより、好適に取得され得る。かかる蛋白質分解酵素としてはpH等の酵素の反応条件を適切に設定することにより制限的にF(ab’)2を生じるように全長抗体を消化し得るものであれば特段の限定はされず、例えば、ペプシンやフィシン等が例示できる。
【００５４】
シングルドメイン抗体（単ドメイン抗体ともいう）
本明細書で用語「シングルドメイン抗体」は、そのドメイン単独で抗原結合活性を発揮できるかぎりその構造は限定されない。IgG抗体等で例示される通常の抗体は、VHとVLのペアリングにより可変領域を形成された状態では抗原結合活性を示すのに対し、シングルドメイン抗体は他のドメインとペアリングすることなく、シングルドメイン抗体自身のドメイン構造単独で抗原結合活性を発揮できると知られている。シングルドメイン抗体は通常比較的に低分子量を有し、単量体の形態で存在する。
シングルドメイン抗体の例として、それだけに限定されないが、例えば、ラクダ科の動物のVHH、サメのＶＮＡＲのような、先天的に軽鎖を欠如する抗原結合分子、または抗体のVHドメインのすべてもしくは一部分またはVLドメインのすべてもしくは一部分を含む抗体断片が挙げられる。抗体のVH／VLドメインのすべてもしくは一部分を含む抗体断片であるシングルドメイン抗体の例として、それだけに限定されないが、例えば、米国特許第6,248,516号B1等に記載されているようなヒト抗体VHまたはヒト抗体VLから出発して人工的に作製されたシングルドメイン抗体が挙げられる。本発明のいくつかの実施態様において、1つのシングルドメイン抗体は3つのCDR（CDR1、CDR2及びCDR3）を有する。
シングルドメイン抗体は、シングルドメイン抗体を産生できる動物から、またはシングルドメイン抗体を産生できる動物を免疫することにより取得し得る。シングルドメイン抗体を産生できる動物の例として、それだけに限定されないが、例えば、ラクダ科動物、シングルドメイン抗体を産生できる遺伝子が導入された遺伝子導入動物（transgenic animals）が挙げられる。ラクダ科動物はラクダ、ラマ、アルパカ、ヒトコブラクダおよびグアナコ等を含む。シングルドメイン抗体を産生できる遺伝子が導入された遺伝子導入動物の例として、それだけに限定されないが、国際公開WO2015/143414号、米国特許公開US2011/0123527号A1に記載の遺伝子導入動物が挙げられる。動物から取得したシングルドメイン抗体のフレームワーク配列をヒトジャームライン配列あるいはそれに類似した配列とすることで、ヒト化したシングルドメイン抗体を取得することも出来る。ヒト化したシングルドメイン抗体（例えば、ヒト化VHH）はまた、本発明のシングルドメイン抗体の一実施態様である。
また、シングルドメイン抗体は、シングルドメイン抗体を含むポリペプチドライブラリから、ELISA、パニング等により取得し得る。シングルドメイン抗体を含むポリペプチドライブラリの例として、それだけに限定されないが、例えば、各種動物若しくはヒトから取得したナイーブ抗体ライブラリ（例：Methods in Molecular Biology 2012 911 (65-78)、Biochimica et Biophysica Acta - Proteins and Proteomics 2006 1764:8 (1307-1319)）、各種動物を免疫することで取得した抗体ライブラリ（例：Journal of Applied Microbiology 2014 117:2 (528-536)）、または各種動物若しくはヒトの抗体遺伝子より作成した合成抗体ライブラリ（例：Journal of Biomolecular Screening 2016 21:1 (35-43)、Journal of Biological Chemistry 2016 291:24 (12641-12657)、AIDS 2016 30:11 (1691-1701)）が挙げられる。
【００５５】
「結合活性（binding activity）」は、分子（例えば、抗体）の1個またはそれ以上の結合部位と、分子の結合パートナー（例えば、抗原）との間の、非共有結合的な相互作用の合計の強度のことをいう。ここで、結合活性は、ある結合対のメンバー（例えば、抗体と抗原）の間の１：１相互作用に厳密に限定されない。例えば、結合対のメンバーが１価での１：１相互作用を反映する場合、結合活性は固有の結合アフィニティ（「アフィニティ」）のことをいう。結合対のメンバーが、１価での結合および多価での結合の両方が可能である場合、結合活性は、これらの結合力の総和となる。分子XのそのパートナーYに対する結合活性は、一般的に、解離定数 (KD) または「単位リガンド量当たりのアナライト結合量」により表すことができる。結合活性は、本明細書に記載のものを含む、当該技術分野において知られた通常の方法によって測定され得る。
【００５６】
本明細書で用いられる「アゴニスト」抗原結合分子または「アゴニスト」抗体は、それが結合する抗原の生物学的活性を有意に増強する抗原結合分子または抗体である。
【００５７】
本明細書で用いられる「阻止」抗原結合分子もしくは「阻止」抗体または「アンタゴニスト」抗原結合分子もしくは「アンタゴニスト」抗体は、それが結合する抗原の生物学的活性を（部分的にまたは完全にのいずれでも）有意に阻害する抗原結合分子または抗体である。
【００５８】
本明細書で用いられる表現「実質的に減少した」または「実質的に異なる」は、2つの数値の間（通常、ある分子に関するものと、参照／比較用分子に関するものの間）の差が、当業者がそれら2つの数値の間の差が該数値（例えば、KD値）によって測定される生物学的特徴の観点で統計学的に有意であるとみなす程度に、充分に大きいことをいう。
【００５９】
本明細書で用いられる用語「実質的に類似の」または「実質的に同じ」は、2つの数値の間（例えば、本発明の抗体に関するものと、参照／比較用抗体に関するものの間）の類似性が、当業者がそれら2つの数値の間の差が該数値（例えば、KD値）によって測定される生物学的特徴の観点でほとんどまたはまったく生物学的および／または統計学的に有意性がないとみなす程度に、充分高いことをいう。
【００６０】
用語「薬学的製剤」および「医薬組成物」は、その中に含まれた有効成分の生物学的活性が効果を発揮し得るような形態にある調製物であって、かつ製剤が投与される被験体に許容できない程度に毒性のある追加の要素を含んでいない、調製物のことをいう。
【００６１】
「薬学的に許容される担体」は、被験体に対して無毒な、薬学的製剤中の有効成分以外の成分のことをいう。薬学的に許容される担体は、これらに限定されるものではないが、緩衝液、賦形剤、安定化剤、または保存剤を含む。
【００６２】
「個体」または「被験体」は哺乳動物である。哺乳動物は、これらに限定されるものではないが、飼育動物（例えば、ウシ、ヒツジ、ネコ、イヌ、ウマ）、霊長類（例えば、ヒト、およびサルなどの非ヒト霊長類）、ウサギ、ならびに、げっ歯類（例えば、マウスおよびラット）を含む。特定の態様では、個体または被験体は、ヒトである。
【００６３】
ＩＩ．抗原結合分子
一局面において、本開示は、第一の抗原結合ドメインおよび第二の抗原結合ドメインを含む抗原結合分子であって、当該抗原結合ドメインが１カ所以上の結合を介して互いに連結されている、抗原結合分子が、当該連結のない、またはより少ない結合を介して連結されている抗原結合ドメインを含む対照抗原結合分子に比べて種々の活性が増強または減弱されているという発見に一部基づくものである。特定の態様において、２つ以上の抗原分子を空間的に近接した位置に保持する活性を有する抗原結合分子が提供される。本開示の抗原結合分子は、例えば、互いに会合することによって活性化される２つの抗原分子の活性化を制御することができる点で有用である。別の特定の態様において、抗原結合ドメイン間の連結によってプロテアーゼ消化に対する耐性を獲得した抗原結合分子が提供される。
【００６４】
Ａ．例示的抗原結合分子
＜抗原結合分子の構造＞
一局面において、本開示は、第一の抗原結合ドメインおよび第二の抗原結合ドメインを含む抗原結合分子であって、当該抗原結合ドメインが、１カ所以上の結合（bond）を介して互いに連結されている、抗原結合分子を提供する。
【００６５】
前記局面の一態様において、２つの抗原結合ドメインを連結する１カ所以上の結合のうちの少なくとも１つは共有結合である。特定の態様において、第一の抗原結合ドメインにおけるアミノ酸残基と、第二の抗原結合ドメインにおけるアミノ酸残基とが直接的に架橋されることによって、共有結合が形成される。架橋されるアミノ酸残基の種類は、例えばシステインであり、形成される共有結合は例えばジスルフィド結合である。
別の特定の態様において、第一の抗原結合ドメインにおけるアミノ酸残基と、第二の抗原結合ドメインにおけるアミノ酸残基とが架橋剤を介して架橋されることによって、共有結合が形成される。架橋剤は、例えばアミン反応性架橋剤であり、架橋されるアミノ酸残基の種類は、例えばリジンである。
【００６６】
前記局面の一態様において、抗原結合ドメインを連結する１カ所以上の結合のうちの少なくとも１つは非共有結合である。特定の態様において、非共有結合は、イオン結合、水素結合、疎水結合のいずれかである。イオン結合は、例えば酸性アミノ酸と塩基性アミノ酸との間で形成される。酸性アミノ酸は、例えばアスパラギン酸(Asp)またはグルタミン酸(Glu)であり、塩基性アミノ酸は、例えばヒスチジン(His)、リジン(Lys)、またはアルギニン(Arg)である。
【００６７】
抗原結合ドメイン間の結合（２つの抗原結合ドメインを連結する結合）は、第一および第二の抗原結合ドメインにそれぞれ結合の起点となるアミノ酸残基が存在し、それらのアミノ酸残基の間を連結する形で形成される。前記局面の一態様において、抗原結合ドメイン間の結合の起点となるアミノ酸残基のうち少なくとも１つは、人工的に導入された変異アミノ酸残基であり、例えば、人工的に導入されたシステイン残基である。そのような変異アミノ酸残基は、野生型の抗原結合ドメインに対して、例えばアミノ酸置換などの手法を用いることにより導入することができる。抗原結合ドメインが、例えば抗体断片を含む場合、定常領域としてＣＨ１領域、ＣＬ領域、およびヒンジ領域、可変領域としてＶＨ領域、ＶＬ領域、およびＶＨＨ領域のそれぞれにおいて、抗原結合ドメイン間の結合の起点となり得るアミノ酸残基の部位が本明細書中に開示されており、例えばそれらの部位にシステイン残基を導入することができる。
【００６８】
前記局面の一態様において、第一および第二の抗原結合ドメインのうちの少なくとも一方は、単体で抗原に結合する活性を有している（すなわち、１つの抗原結合ドメイン単独で抗原結合活性を有する）。特定の態様において、第一および第二の抗原結合ドメインはいずれも、単体で抗原に結合する活性を有している。
【００６９】
前記局面の一態様において、第一および第二の抗原結合ドメインは、ともに同じ種類の抗原結合ドメインである。後述されるように、抗原結合ドメインを構成するタンパク質の例として、抗体または非抗体タンパク質に由来するポリペプチドおよびそれらの断片などが挙げられる（例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、ｓｃＦａｂ、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、シングルドメイン抗体など）。このような分子形の観点から見て、第一および第二の抗原結合ドメインを構成するタンパク質の構造が同一である場合、それらは同じ種類であると判断される。
【００７０】
前記局面の一態様において、第一の抗原結合ドメインおよび第二の抗原結合ドメインを連結する少なくとも１カ所の結合は、第一の抗原結合ドメインおよび第二の抗原結合ドメイン上のそれぞれ同じ位置に存在するアミノ酸残基を互いに連結させることによって形成されてもよく、あるいはそれぞれ異なる位置に存在するアミノ酸残基を互いに連結させることによって形成されてもよい。
【００７１】
抗原結合ドメイン上のアミノ酸残基の位置は、Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD 1991 に記載のKabatナンバリングまたはEUナンバリングシステム（EUインデックスとも呼ばれる）にしたがって示すことができる。例えば、第一および第二の抗原結合ドメイン間の結合の起点となるアミノ酸残基が、各抗原結合ドメイン上の対応する同じ位置に存在する場合、それらのアミノ酸残基の位置は、KabatナンバリングまたはEUナンバリングシステムにしたがって同じ番号で示すことができる。また、第一および第二の抗原結合ドメイン間の結合の起点となるアミノ酸残基が、各抗原結合ドメイン上の対応しない異なる位置に存在する場合、それらのアミノ酸残基の位置は、KabatナンバリングまたはEUナンバリングシステムにしたがって異なる番号で示すことができる。
【００７２】
前記局面の一態様において、第一および第二の抗原結合ドメインのうちの少なくとも一方は、特定の抗原に結合する抗体断片を含む。特定の態様において、抗体断片は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、ｓｃＦａｂ、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、シングルドメイン抗体のいずれかである。特定の態様において、抗原結合ドメイン間の結合の起点となるアミノ酸残基のうちの少なくとも１つは、抗体断片内に存在する。
【００７３】
前記局面の一態様において、抗原結合ドメイン間の結合の起点となるアミノ酸残基のうちの少なくとも１つは、定常領域内に存在する。特定の態様において、当該アミノ酸残基はＣＨ１領域内に存在し、例えば、ＣＨ１領域のＥＵナンバリング１１９位から１２３位、１３１位から１４０位、１４８位から１５０位、１５５位から１６７位、１７４位から１７８位、１８８位から１９７位、２０１位から２１４位、２１８位から２１９位のいずれかに存在する。特定の態様において、当該アミノ酸残基は、ＣＨ１領域のＥＵナンバリング１１９位、１２２位、１２３位、１３１位、１３２位、１３３位、１３４位、１３５位、１３６位、１３７位、１３８位、１３９位、１４０位、１４８位、１５０位、１５５位、１５６位、１５７位、１５９位、１６０位、１６１位、１６２位、１６３位、１６４位、１６５位、１６７位、１７４位、１７６位、１７７位、１７８位、１８８位、１８９位、１９０位、１９１位、１９２位、１９３位、１９４位、１９５位、１９６位、１９７位、２０１位、２０３位、２０５位、２０６位、２０７位、２０８位、２１１位、２１２位、２１３位、２１４位、２１８位、および２１９位からなる群より選択されるいずれかに存在する。特定の態様において、当該アミノ酸残基は、ＣＨ１領域のＥＵナンバリング１３４位、１３５位、１３６位、１３７位、１９１位、１９２位、１９３位、１９４位、１９５位、または１９６位に存在する。特定の態様において、当該アミノ酸残基は、ＣＨ１領域のＥＵナンバリング１３５位、１３６位、または１９１位に存在する。
前記局面の一態様において、定常領域はヒト由来である。特定の態様において、重鎖定常領域のサブクラスは、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、IgA2、IgM、IgD、およびIgEのいずれかである。特定の態様において、ＣＨ１領域のサブクラスは、γ１、γ２、γ３、γ４、α１、α２、μ、δ、およびεのいずれかである。
【００７４】
前記局面の一態様において、第一の抗原結合ドメインおよび第二の抗原結合ドメインを連結する少なくとも１カ所の結合は、第一の抗原結合ドメインのＣＨ１領域におけるアミノ酸残基と、第二の抗原結合ドメインのＣＨ１領域におけるアミノ酸残基とを連結させることによって形成される。特定の態様において、第一の抗原結合ドメインおよび第二の抗原結合ドメインにおけるアミノ酸残基は、ＥＵナンバリング１１９位、１２０位、１２１位、１２２位、および１２３位からなる群よりそれぞれ独立に選択される。特定の態様において、第一の抗原結合ドメインおよび第二の抗原結合ドメインにおけるアミノ酸残基は、ＥＵナンバリング１３１位、１３２位、１３３位、１３４位、１３５位、１３６位、１３７位、１３８位、１３９位、および１４０位からなる群よりそれぞれ独立に選択される。特定の態様において、第一の抗原結合ドメインおよび第二の抗原結合ドメインにおけるアミノ酸残基は、ＥＵナンバリング１４８位、１４９位、および１５０位からなる群よりそれぞれ独立に選択される。特定の態様において、第一の抗原結合ドメインおよび第二の抗原結合ドメインにおけるアミノ酸残基は、ＥＵナンバリング１５５位、１５６位、１５７位、１５８位、１５９位、１６０位、１６１位、１６２位、１６３位、１６４位、１６５位、１６６位、および１６７位からなる群よりそれぞれ独立に選択される。特定の態様において、第一の抗原結合ドメインおよび第二の抗原結合ドメインにおけるアミノ酸残基は、ＥＵナンバリング１７４位、１７５位、１７６位、１７７位、および１７８位からなる群よりそれぞれ独立に選択される。特定の態様において、第一の抗原結合ドメインおよび第二の抗原結合ドメインにおけるアミノ酸残基は、ＥＵナンバリング１８８位、１８９位、１９０位、１９１位、１９２位、１９３位、１９４位、１９５位、１９６位、および１９７位からなる群よりそれぞれ独立に選択される。特定の態様において、第一の抗原結合ドメインおよび第二の抗原結合ドメインにおけるアミノ酸残基は、ＥＵナンバリング２０１位、２０２位、２０３位、２０４位、２０５位、２０６位、２０７位、２０８位、２０９位、２１０位、２１１位、２１２位、２１３位、および２１４位からなる群よりそれぞれ独立に選択される。特定の態様において、第一の抗原結合ドメインおよび第二の抗原結合ドメインにおけるアミノ酸残基は、ＥＵナンバリング２１８位および２１９位からなる群よりそれぞれ独立に選択される。
【００７５】
前記局面の一態様において、第一の抗原結合ドメインおよび第二の抗原結合ドメインにおいてそれぞれ結合の起点となるアミノ酸残基の位置の差は、３アミノ酸以内である。これは、第一の抗原結合ドメインのＣＨ１領域において結合の起点となるアミノ酸残基の位置と、第二の抗原結合ドメインのＣＨ１領域において結合の起点となるアミノ酸残基の位置とをそれぞれＥＵナンバリングで比較した場合、その差が３アミノ酸以内となることを意味する。特定の態様において、第一の抗原結合ドメインおよび第二の抗原結合ドメインを連結する少なくとも１カ所の結合は、第一の抗原結合ドメインのＣＨ１領域におけるＥＵナンバリング１３５位のアミノ酸残基と、第二の抗原結合ドメインのＣＨ１領域におけるＥＵナンバリング１３２位から１３８位のいずれかのアミノ酸残基とを連結させることによって形成される。特定の態様において、第一の抗原結合ドメインおよび第二の抗原結合ドメインを連結する少なくとも１カ所の結合は、第一の抗原結合ドメインのＣＨ１領域におけるＥＵナンバリング１３６位のアミノ酸残基と、第二の抗原結合ドメインのＣＨ１領域におけるＥＵナンバリング１３３位から１３９位のいずれかのアミノ酸残基とを連結させることによって形成される。特定の態様において、第一の抗原結合ドメインおよび第二の抗原結合ドメインを連結する少なくとも１カ所の結合は、第一の抗原結合ドメインのＣＨ１領域におけるＥＵナンバリング１９１位のアミノ酸残基と、第二の抗原結合ドメインのＣＨ１領域におけるＥＵナンバリング１８８位から１９４位のいずれかのアミノ酸残基とを連結させることによって形成される。例示的な一態様において、第一の抗原結合ドメインおよび第二の抗原結合ドメインを連結する少なくとも１カ所の結合は、２つの抗原結合ドメインのＣＨ１領域におけるＥＵナンバリング１３５位のアミノ酸残基どうしを連結させることによって形成される。例示的な一態様において、第一の抗原結合ドメインおよび第二の抗原結合ドメインを連結する少なくとも１カ所の結合は、２つの抗原結合ドメインのＣＨ１領域におけるＥＵナンバリング１３６位のアミノ酸残基どうしを連結させることによって形成される。例示的な一態様において、第一の抗原結合ドメインおよび第二の抗原結合ドメインを連結する少なくとも１カ所の結合は、２つの抗原結合ドメインのＣＨ１領域におけるＥＵナンバリング１９１位のアミノ酸残基どうしを連結させることによって形成される。
【００７６】
前記局面の一態様において、抗原結合ドメイン間の結合の起点となるアミノ酸残基のうちの少なくとも１つは、ＣＬ領域内に存在し、例えば、ＣＬ領域のＫａｂａｔナンバリング１０８位から１１２位、１２１位から１２８位、１５１位から１５６位、１８４位から１９０位、１９５位から１９６位、２００位から２０３位、２０８位から２１３位のいずれかに存在する。特定の態様において、当該アミノ酸残基は、ＣＬ領域のＫａｂａｔナンバリング１０８位、１０９位、１１２位、１２１位、１２３位、１２６位、１２８位、１５１位、１５２位、１５３位、１５６位、１８４位、１８６位、１８８位、１８９位、１９０位、１９５位、１９６位、２００位、２０１位、２０２位、２０３位、２０８位、２１０位、２１１位、２１２位、および２１３位からなる群より選択されるいずれかに存在する。特定の態様において、当該アミノ酸残基は、ＣＬ領域のＫａｂａｔナンバリング１２６位に存在する。
前記局面の一態様において、定常領域はヒト由来である。特定の態様において、ＣＬ領域のサブクラスは、κまたはλである。
【００７７】
前記局面の一態様において、第一の抗原結合ドメインおよび第二の抗原結合ドメインを連結する少なくとも１カ所の結合は、第一の抗原結合ドメインのＣＬ領域におけるアミノ酸残基と、第二の抗原結合ドメインのＣＬ領域におけるアミノ酸残基とを連結させることによって形成される。特定の態様において、第一の抗原結合ドメインおよび第二の抗原結合ドメインにおけるアミノ酸残基は、Ｋａｂａｔナンバリング１０８位、１０９位、１１０位、１１１位、および１１２位からなる群よりそれぞれ独立に選択される。特定の態様において、第一の抗原結合ドメインおよび第二の抗原結合ドメインにおけるアミノ酸残基は、Ｋａｂａｔナンバリング１２１位、１２２位、１２３位、１２４位、１２５位、１２６位、１２７位、および１２８位からなる群よりそれぞれ独立に選択される。特定の態様において、第一の抗原結合ドメインおよび第二の抗原結合ドメインにおけるアミノ酸残基は、Ｋａｂａｔナンバリング１５１位、１５２位、１５３位、１５４位、１５５位、および１５６位からなる群よりそれぞれ独立に選択される。特定の態様において、第一の抗原結合ドメインおよび第二の抗原結合ドメインにおけるアミノ酸残基は、Ｋａｂａｔナンバリング１８４位、１８５位、１８６位、１８７位、１８８位、１８９位、および１９０位からなる群よりそれぞれ独立に選択される。特定の態様において、第一の抗原結合ドメインおよび第二の抗原結合ドメインにおけるアミノ酸残基は、Ｋａｂａｔナンバリング１９５位および１９６位からなる群よりそれぞれ独立に選択される。特定の態様において、第一の抗原結合ドメインおよび第二の抗原結合ドメインにおけるアミノ酸残基は、Ｋａｂａｔナンバリング２００位、２０１位、２０２位、および２０３位からなる群よりそれぞれ独立に選択される。特定の態様において、第一の抗原結合ドメインおよび第二の抗原結合ドメインにおけるアミノ酸残基は、Ｋａｂａｔナンバリング２０８位、２０９位、２１０位、２１１位、２１２位、および２１３位からなる群よりそれぞれ独立に選択される。
【００７８】
前記局面の一態様において、第一の抗原結合ドメインおよび第二の抗原結合ドメインにおいてそれぞれ結合の起点となるアミノ酸残基の位置の差は、３アミノ酸以内である。これは、第一の抗原結合ドメインのＣＬ領域において結合の起点となるアミノ酸残基の位置と、第二の抗原結合ドメインのＣＬ領域において結合の起点となるアミノ酸残基の位置とをそれぞれＥＵナンバリングで比較した場合、その差が３アミノ酸以内となることを意味する。例示的な一態様において、第一の抗原結合ドメインおよび第二の抗原結合ドメインを連結する少なくとも１カ所の結合は、２つの抗原結合ドメインのＣＬ領域におけるＫａｂａｔナンバリング１２６位のアミノ酸残基どうしを連結させることによって形成される。
【００７９】
前記局面の一態様において、第一の抗原結合ドメインおよび第二の抗原結合ドメインを連結する少なくとも１カ所の結合は、第一の抗原結合ドメインのＣＨ１領域におけるアミノ酸残基と、第二の抗原結合ドメインのＣＬ領域におけるアミノ酸残基とを連結させることによって形成される。特定の態様において、第一の抗原結合ドメインのＣＨ１領域におけるアミノ酸残基は、ＥＵナンバリング１８８位、１８９位、１９０位、１９１位、１９２位、１９３位、１９４位、１９５位、１９６位、および１９７位からなる群より選択され、かつ第二の抗原結合ドメインのＣＬ領域におけるアミノ酸残基は、Ｋａｂａｔナンバリング１２１位、１２２位、１２３位、１２４位、１２５位、１２６位、１２７位、および１２８位からなる群より選択される。例示的な一態様において、第一の抗原結合ドメインおよび第二の抗原結合ドメインを連結する少なくとも１カ所の結合は、第一の抗原結合ドメインのＣＨ１領域におけるＥＵナンバリング１９１位のアミノ酸残基と、第二の抗原結合ドメインのＣＬ領域におけるＫａｂａｔナンバリング１２６位のアミノ酸残基とを連結させることによって形成される。
【００８０】
前記局面の一態様において、抗原結合ドメイン間の結合の起点となるアミノ酸残基のうちの少なくとも１つは、可変領域内に存在する。特定の態様において、当該アミノ酸残基はＶＨ領域内に存在し、例えば、ＶＨ領域のＫａｂａｔナンバリング６位、８位、１６位、２０位、２５位、２６位、２８位、７４位、および８２ｂ位からなる群より選択されるいずれかに存在する。特定の態様において、前記アミノ酸残基はＶＬ領域内に存在し、例えば、ＶＬ領域（サブクラスκ）のＫａｂａｔナンバリング２１位、２７位、５８位、７７位、１００位、１０５位、および１０７位、ならびにＶＬ領域（サブクラスλ）のＫａｂａｔナンバリング６位、１９位、３３位、および３４位からなる群より選択されるいずれかに存在する。特定の態様において、当該アミノ酸残基はＶＨＨ領域内に存在し、例えば、ＶＨＨ領域のＫａｂａｔナンバリング４位、６位、７位、８位、９位、１０位、１１位、１２位、１４位、１５位、１７位、２０位、２４位、２７位、２９位、３８位、３９位、４０位、４１位、４３位、４４位、４５位、４６位、４７位、４８位、４９位、６７位、６９位、７１位、７８位、８０位、８２位、８２ｃ位、８５位、８８位、９１位、９３位、９４位、および１０７位からなる群より選択されるいずれかに存在する。
【００８１】
前記局面の一態様において、第一および第二の抗原結合ドメインのうちの少なくとも一方は、特定の抗原に結合する非抗体タンパク質またはその断片を含む。特定の態様において、前記非抗体タンパク質は、互いに特異的に結合する一組のリガンドおよび受容体のどちらか一方である。ここでの受容体として、例えば、サイトカイン受容体スーパーファミリーに属する受容体、Ｇタンパク質結合型受容体、イオンチャネル型受容体、チロシンキナーゼ型受容体、免疫チェックポイント受容体、抗原受容体、ＣＤ抗原、共刺激分子、および細胞接着分子などを挙げることができる。
【００８２】
前記局面の一態様において、第一および／または第二の抗原結合ドメインは、ヒンジ領域を含む。特定の態様において、野生型のヒンジ領域内に存在するシステイン残基のうちの少なくとも１つが他のアミノ酸残基に置換されている。そのようなシステイン残基は、例えば野生型のヒンジ領域のＥＵナンバリング２２６位および／または２２９位に存在する。特定の態様において、抗原結合ドメイン間の結合の起点となるアミノ酸残基のうちの少なくとも１つは、ヒンジ領域内に存在し、例えば、ヒンジ領域のＥＵナンバリング２１６位、２１８位、および２１９位からなる群より選択されるいずれかに存在する。
【００８３】
前記局面の一態様において、第一の抗原結合ドメインおよび第二の抗原結合ドメインは、２カ所以上の結合を介して互いに連結されている。
【００８４】
特定の態様において、抗原結合ドメイン間の結合の起点となるアミノ酸残基のうちの少なくとも１つは、野生型の配列に存在するアミノ酸残基であり、例えば、野生型のヒンジ領域におけるシステイン残基である。特定の態様において、第一の抗原結合ドメインおよび第二の抗原結合ドメインを連結する少なくとも１カ所の結合は、野生型のヒンジ領域内に存在するシステイン残基どうしが架橋して形成されるジスルフィド結合である。そのようなシステイン残基は、例えば野生型のヒンジ領域のＥＵナンバリング２２６位および／または２２９位に存在する。
【００８５】
特定の態様において、抗原結合ドメイン間の結合の起点となるアミノ酸残基のうちの少なくとも１つは抗体断片内に存在し、かつ少なくとも１つはヒンジ領域内に存在する。例示的な一態様において、本開示の抗原結合分子は、第一および第二の抗原結合ドメインにいずれもＦａｂおよびヒンジ領域を含む、Ｆ（ａｂ’）２である。
【００８６】
前記局面の一態様において、本開示の抗原結合分子は、さらにＦｃ領域を含み、例えば全長抗体である。特定の態様において、本開示の抗原結合分子のＦｃ領域に、Ｆｃ領域の多量体化を促進する１つ以上のアミノ酸変異が導入されている。そのようなアミノ酸変異は、例えば、ＥＵナンバリング２４７、２４８、２５３、２５４、３１０、３１１、３３８、３４５、３５６、３５９、３８２、３８５、３８６、４３０、４３３、４３４、４３６、４３７、４３８、４３９、４４０、および４４７番目からなる群より選択される少なくとも１つの部位におけるアミノ酸変異を含む（例えばWO2016/164480などを参照）。特定の態様において、多量体化は六量体化である。
【００８７】
＜抗原結合分子が結合する抗原の種類＞
前記局面の一態様において、第一および第二の抗原結合ドメインは、いずれも同じ種類の抗原に結合する。特定の態様において、第一および第二の抗原結合ドメインは、同じ種類の抗原上の同じエピトープに結合する。別の特定の態様において、第一および第二の抗原結合ドメインは、同じ種類の抗原上の互いに異なるエピトープに結合する。特定の態様において、本開示の抗原結合分子は、１種類の特定の抗原を標的とするバイパラトピック（biparatopic）抗原結合分子（例えばバイパラトピック抗体）である。
前記局面の別の一態様において、第一および第二の抗原結合ドメインは、互いに異なる種類の抗原に結合する。
前記局面の別の一態様において、本開示の抗原結合分子はクランピング（clamping）抗原結合分子（例えばクランピング抗体）である。本明細書においてクランピング抗原結合分子とは、ある抗原Ａおよび抗原Ａに結合する抗原結合分子から形成される抗原−抗原結合分子複合体に特異的に結合することによって、当該抗原Ａに結合する抗原結合分子の当該抗原Ａに対する結合活性を増加させる（あるいは、当該抗原Ａおよび当該抗原Ａに結合する抗原結合分子から形成される抗原−抗原結合分子複合体を安定化させる）抗原結合分子を意味する。例えば、CD3クランピング抗体は、CD3およびCD3への結合能が低下した抗体（結合減弱CD3抗体）から形成される抗原−抗体複合体に特異的に結合することによって、当該結合減弱CD3抗体のCD3に対する結合活性を増加させる（あるいは、CD3および当該結合減弱CD3抗体から形成される抗原−抗体複合体を安定化させる）ことができる。特定の態様において、本開示の抗原結合分子における第一および／または第二の抗原結合ドメインは、クランピング抗原結合分子に由来する抗原結合ドメイン（クランピング抗原結合ドメイン）であることができる。
前記局面の一態様において、第一および第二の抗原結合ドメインは、いずれも同じアミノ酸配列を有する。別の一態様において、第一および第二の抗原結合ドメインは、互いに異なるアミノ酸配列を有する。
【００８８】
前記局面の一態様において、第一および第二の抗原結合ドメインが結合する２つの抗原のうちの少なくとも１つは、可溶型タンパク質または膜タンパク質である。
【００８９】
＜抗原結合分子の機能＞
前記局面の一態様において、本開示の抗原結合分子は、２つの抗原分子を空間的に近接した位置に保持する活性を有する。特定の態様において、本開示の抗原結合分子は、対照となる抗原結合分子に比べて、２つの抗原分子をより近接した位置に保持することができ、当該対照となる抗原結合分子は、２つの抗原結合ドメイン間の結合の数が１カ所少ないという点でのみ本開示の抗原結合分子と異なる。さらなる態様において、当該１カ所少ない結合は、抗原結合ドメイン間の結合の起点となるアミノ酸残基が、野生型のＦａｂまたはヒンジ領域に存在しない変異アミノ酸残基（例えば野生型のＦａｂまたはヒンジ領域に存在しないシステイン残基）に由来する結合の中から選択することができる。
前記局面の別の態様において、本開示の抗原結合分子は、２つの抗原分子間での相互作用を制御する活性を有する。特定の理論に拘束されるわけではないが、当該相互作用を制御する活性は、本開示の抗原結合分子が２つの抗原分子を空間的に近接した位置に保持する結果としてもたらされるものと考えられる。特定の態様において、本開示の抗原結合分子は、対照となる抗原結合分子に比べて、２つの抗原分子間での相互作用を増強または減弱させることができ、当該対照となる抗原結合分子は、２つの抗原結合ドメイン間の結合の数が１カ所少ないという点でのみ本開示の抗原結合分子と異なる。さらなる態様において、当該１カ所少ない結合は、抗原結合ドメイン間の結合の起点となるアミノ酸残基が、野生型のＦａｂまたはヒンジ領域に存在しない変異アミノ酸残基（例えば野生型のＦａｂまたはヒンジ領域に存在しないシステイン残基）に由来する結合の中から選択することができる。
特定の態様において、本開示の抗原結合分子が結合する２つの抗原分子は、それぞれリガンドとその受容体であり、本開示の抗原結合分子は、当該リガンドによる当該受容体の活性化を促進する活性を有する。別の特定の態様において、本開示の抗原結合分子が結合する２つの抗原分子は、それぞれ酵素とその基質であり、本開示の抗原結合分子は、当該酵素の当該基質に対する触媒反応を促進する活性を有する。
また別の特定の態様において、本開示の抗原結合分子が結合する２つの抗原分子は、ともに細胞表面に存在する抗原（例えばタンパク質）であり、本開示の抗原結合分子は、第一の抗原を発現する細胞と第二の抗原を発現する細胞との間での相互作用を促進する活性を有する。第一の抗原を発現する細胞および第二の抗原を発現する細胞は、例えばそれぞれ、細胞障害活性を有する細胞およびその標的となる細胞であり、本開示の抗原結合分子によって、当該細胞障害活性を有する細胞による当該標的となる細胞の障害が促進される。細胞障害活性を有する細胞は、例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、単球、マクロファージのいずれかである。
【００９０】
前記局面の一態様において、本開示の抗原結合分子は、互いに会合することによって活性化される２つの抗原分子の活性化を制御する活性を有する。特定の理論に拘束されるわけではないが、当該活性化を制御する活性は、本開示の抗原結合分子が２つの抗原分子を空間的に近接した位置に保持する結果としてもたらされるものと考えられる。特定の態様において、本開示の抗原結合分子は、対照となる抗原結合分子に比べて、２つの抗原分子の活性化を増強または減弱させることができ、当該対照となる抗原結合分子は、２つの抗原結合ドメイン間の結合の数が１カ所少ないという点でのみ本開示の抗原結合分子と異なる。さらなる態様において、当該１カ所少ない結合は、抗原結合ドメイン間の結合の起点となるアミノ酸残基が、野生型のＦａｂまたはヒンジ領域に存在しない変異アミノ酸残基（例えば野生型のＦａｂまたはヒンジ領域に存在しないシステイン残基）に由来する結合の中から選択することができる。前記抗原分子は、例えば、サイトカイン受容体スーパーファミリーに属する受容体、Ｇタンパク質結合型受容体、イオンチャネル型受容体、チロシンキナーゼ型受容体、免疫チェックポイント受容体、抗原受容体、ＣＤ抗原、共刺激分子、および細胞接着分子からなる群より選択される。
【００９１】
前記局面の一態様において、本開示の抗原結合分子は、２つの抗原結合ドメインが空間的に近接した位置に存在し、かつ／または２つの抗原結合ドメインの可動性が減少している。特定の態様において、本開示の抗原結合分子は、対照となる抗原結合分子に比べて、２つの抗原結合ドメインがより近接した位置に存在し、かつ／または２つの抗原結合ドメインの可動性がより減少しており、当該対照となる抗原結合分子は、２つの抗原結合ドメイン間の結合の数が１カ所少ないという点でのみ本開示の抗原結合分子と異なる。さらなる態様において、当該１カ所少ない結合は、抗原結合ドメイン間の結合の起点となるアミノ酸残基が、野生型のＦａｂまたはヒンジ領域に存在しない変異アミノ酸残基（例えば野生型のＦａｂまたはヒンジ領域に存在しないシステイン残基）に由来する結合の中から選択することができる。
【００９２】
前記局面の一態様において、本開示の抗原結合分子は、プロテアーゼ切断に対して抵抗性を有する。特定の態様において、本開示の抗原結合分子は、対照となる抗原結合分子に比べて、プロテアーゼ切断に対する抵抗性が増大しており、当該対照となる抗原結合分子は、２つの抗原結合ドメイン間の結合の数が１カ所少ないという点でのみ本開示の抗原結合分子と異なる。さらなる態様において、当該１カ所少ない結合は、抗原結合ドメイン間の結合の起点となるアミノ酸残基が、野生型のＦａｂまたはヒンジ領域に存在しない変異アミノ酸残基（例えば野生型のＦａｂまたはヒンジ領域に存在しないシステイン残基）に由来する結合の中から選択することができる。特定の態様において、本開示の抗原結合分子は、対照となる抗原結合分子に比べて、プロテアーゼ処理後に残存する全長分子（例えば、全長IgG分子）の割合が増加している。特定の態様において、本開示の抗原結合分子は、対照となる抗原結合分子に比べて、プロテアーゼ処理後に生成される特定の断片（例えば、Fab単量体）の割合が減少している。
【００９３】
前記局面の一態様において、本開示の抗原結合分子をプロテアーゼで処理した場合、抗原結合ドメインまたはその断片の二量体（例えば、架橋されたFab二量体）が切り出される。特定の態様において、２つの抗原結合ドメイン間の結合の数が１カ所少ないという点でのみ本開示の抗原結合分子と異なる対照となる抗原結合分子を当該プロテアーゼで処理した場合、抗原結合ドメインまたはその断片の単量体が切り出される。さらなる態様において、当該１カ所少ない結合は、抗原結合ドメイン間の結合の起点となるアミノ酸残基が、野生型のＦａｂまたはヒンジ領域に存在しない変異アミノ酸残基（例えば野生型のＦａｂまたはヒンジ領域に存在しないシステイン残基）に由来する結合の中から選択することができる。これらの態様において、プロテアーゼは抗原結合分子のヒンジ領域を切断し得る。
【００９４】
さらなる態様において、前記対照となる抗原結合分子は、２つの抗原結合ドメイン間の結合の数が１カ所少ないという点でのみ本開示の抗原結合分子と異なっていて、かつ当該１カ所少ない結合は、変異アミノ酸残基を起点として形成される結合である。当該変異アミノ酸残基は、例えば人工的に導入されたシステイン残基である。
【００９５】
＜医薬組成物＞
一局面において、本開示は、本開示の抗原結合分子および薬学的に許容される担体を含む医薬組成物を提供する。
【００９６】
＜抗原結合分子の用途＞
一局面において、本開示は、２つの抗原分子を空間的に近接した位置に保持する方法であって、（ａ）２つの抗原結合ドメインを含む抗原結合分子を提供すること；（ｂ）当該抗原結合分子に、２つの抗原結合ドメインを互いに連結させる少なくとも１カ所の結合を追加すること；および（ｃ）（ｂ）で作製された抗原結合分子を当該２つの抗原分子と接触させること、を含む方法を提供する。特定の態様において、上記（ａ）における抗原結合分子は、当該２つの抗原結合ドメインが１カ所以上の結合を介して互いに連結されていてもよく、その場合、当該１カ所以上の結合のうちのいくつかの結合、あるいは全ての結合は、抗原結合ドメイン間の結合の起点となるアミノ酸残基が、野生型のＦａｂまたはヒンジ領域に存在するアミノ酸残基（例えばヒンジ領域におけるシステイン残基）に由来する結合である。さらなる態様において、上記（ｂ）における当該少なくとも１カ所の結合は、抗原結合ドメイン間の結合の起点となるアミノ酸残基が、野生型のＦａｂまたはヒンジ領域に存在しない変異アミノ酸残基（例えば野生型のＦａｂまたはヒンジ領域に存在しないシステイン残基）に由来する結合である。本開示はまた、本開示の抗原結合分子または医薬組成物を２つの抗原分子と接触させることを含む、２つの抗原分子を空間的に近接した位置に保持する方法を提供する。本開示はさらに、２つの抗原分子を空間的に近接した位置に保持するための、本開示の抗原結合分子または医薬組成物を提供する。
【００９７】
別の局面において、本開示は、２つの抗原分子間での相互作用を制御する方法であって、（ａ）２つの抗原結合ドメインを含む抗原結合分子を提供すること；（ｂ）当該抗原結合分子に、２つの抗原結合ドメインを互いに連結させる少なくとも１カ所の結合を追加すること；および（ｃ）（ｂ）で作製された抗原結合分子を当該２つの抗原分子と接触させること、を含む方法を提供する。特定の態様において、上記（ａ）における抗原結合分子は、当該２つの抗原結合ドメインが１カ所以上の結合を介して互いに連結されていてもよく、その場合、当該１カ所以上の結合のうちのいくつかの結合、あるいは全ての結合は、抗原結合ドメイン間の結合の起点となるアミノ酸残基が、野生型のＦａｂまたはヒンジ領域に存在するアミノ酸残基（例えばヒンジ領域におけるシステイン残基）に由来する結合である。さらなる態様において、上記（ｂ）における当該少なくとも１カ所の結合は、抗原結合ドメイン間の結合の起点となるアミノ酸残基が、野生型のＦａｂまたはヒンジ領域に存在しない変異アミノ酸残基（例えば野生型のＦａｂまたはヒンジ領域に存在しないシステイン残基）に由来する結合である。本開示はまた、本開示の抗原結合分子または医薬組成物を２つの抗原分子と接触させることを含む、２つの抗原分子間での相互作用を制御する方法を提供する。本開示はさらに、２つの抗原分子間での相互作用を制御するための、本開示の抗原結合分子または医薬組成物を提供する。
【００９８】
また別の局面において、本開示は、２つの互いに会合することによって活性化される抗原分子の活性を制御する方法であって、（ａ）２つの抗原結合ドメインを含む抗原結合分子を提供すること；（ｂ）当該抗原結合分子に、２つの抗原結合ドメインを互いに連結させる少なくとも１カ所の結合を追加すること；および（ｃ）（ｂ）で作製された抗原結合分子を当該２つの抗原分子と接触させること、を含む方法を提供する。特定の態様において、上記（ａ）における抗原結合分子は、当該２つの抗原結合ドメインが１カ所以上の結合を介して互いに連結されていてもよく、その場合、当該１カ所以上の結合のうちのいくつかの結合、あるいは全ての結合は、抗原結合ドメイン間の結合の起点となるアミノ酸残基が、野生型のＦａｂまたはヒンジ領域に存在するアミノ酸残基（例えばヒンジ領域におけるシステイン残基）に由来する結合である。さらなる態様において、上記（ｂ）における当該少なくとも１カ所の結合は、抗原結合ドメイン間の結合の起点となるアミノ酸残基が、野生型のＦａｂまたはヒンジ領域に存在しない変異アミノ酸残基（例えば野生型のＦａｂまたはヒンジ領域に存在しないシステイン残基）に由来する結合である。本開示はまた、本開示の抗原結合分子または医薬組成物を２つの抗原分子と接触させることを含む、２つの互いに会合することによって活性化される抗原分子の活性を制御する方法を提供する。本開示はさらに、２つの互いに会合することによって活性化される抗原分子の活性を制御するための、本開示の抗原結合分子または医薬組成物を提供する。
【００９９】
また別の局面において、本開示は、２つの抗原結合ドメインを空間的に近接した位置に存在させ、かつ／または２つの抗原結合ドメインの可動性を減少させる方法であって、（ａ）２つの抗原結合ドメインを含む抗原結合分子を提供すること；および（ｂ）当該抗原結合分子に、２つの抗原結合ドメインを互いに連結させる少なくとも１カ所の結合を追加すること、を含む方法を提供する。特定の態様において、上記（ａ）における抗原結合分子は、当該２つの抗原結合ドメインが１カ所以上の結合を介して互いに連結されていてもよく、その場合、当該１カ所以上の結合のうちのいくつかの結合、あるいは全ての結合は、抗原結合ドメイン間の結合の起点となるアミノ酸残基が、野生型のＦａｂまたはヒンジ領域に存在するアミノ酸残基（例えばヒンジ領域におけるシステイン残基）に由来する結合である。さらなる態様において、上記（ｂ）における当該少なくとも１カ所の結合は、抗原結合ドメイン間の結合の起点となるアミノ酸残基が、野生型のＦａｂまたはヒンジ領域に存在しない変異アミノ酸残基（例えば野生型のＦａｂまたはヒンジ領域に存在しないシステイン残基）に由来する結合である。
【０１００】
さらに別の局面において、本開示は、抗原結合分子のプロテアーゼ切断に対する抵抗性を増大させる方法であって、（ａ）２つの抗原結合ドメインを含む抗原結合分子を提供すること；および（ｂ）当該抗原結合分子に、２つの抗原結合ドメインを互いに連結させる少なくとも１カ所の結合を追加すること、を含む方法を提供する。特定の態様において、上記（ａ）における抗原結合分子は、当該２つの抗原結合ドメインが１カ所以上の結合を介して互いに連結されていてもよく、その場合、当該１カ所以上の結合のうちのいくつかの結合、あるいは全ての結合は、抗原結合ドメイン間の結合の起点となるアミノ酸残基が、野生型のＦａｂまたはヒンジ領域に存在するアミノ酸残基（例えばヒンジ領域におけるシステイン残基）に由来する結合である。さらなる態様において、上記（ｂ）における当該少なくとも１カ所の結合は、抗原結合ドメイン間の結合の起点となるアミノ酸残基が、野生型のＦａｂまたはヒンジ領域に存在しない変異アミノ酸残基（例えば野生型のＦａｂまたはヒンジ領域に存在しないシステイン残基）に由来する結合である。
【０１０１】
これらの種々の方法において用いる抗原結合分子は、本明細書に記載の抗原結合分子の諸特徴を有していてもよい。
【０１０２】
＜抗原結合分子の製造方法＞
一局面において、本開示は、２つの抗原分子を空間的に近接した位置に保持する活性を有する抗原結合分子を製造する方法であって、（ａ）第一の抗原結合ドメインを含むポリペプチドをコードする核酸、および第二の抗原結合ドメインを含むポリペプチドをコードする核酸を提供すること；（ｂ）当該２つの抗原結合ドメインを連結する少なくとも１カ所の結合が追加されるように、当該２つの抗原結合ドメインをコードする核酸に変異を導入すること；（ｃ）（ｂ）で作製された核酸を宿主細胞に導入すること；（ｄ）当該２つのポリペプチドが発現するように宿主細胞を培養すること；および（ｅ）第一および第二の抗原結合ドメインを含むポリペプチドであって、当該２つの抗原結合ドメインが１カ所以上の結合を介して互いに連結されているポリペプチドである抗原結合分子を得ること、を含む方法を提供する。特定の態様において、上記（ａ）における２つの抗原結合ドメインのそれぞれには、当該２つの抗原結合ドメインを連結させるための結合の起点となるアミノ酸残基が１つ以上含まれていてもよく、その場合、抗原結合ドメイン間の結合の起点となる１つ以上のアミノ酸残基のうちのいくつか、あるいは全ては、野生型のＦａｂまたはヒンジ領域に存在するアミノ酸残基（例えばヒンジ領域におけるシステイン残基）である。さらなる態様において、上記（ｂ）における当該少なくとも１カ所の結合は、抗原結合ドメイン間の結合の起点となるアミノ酸残基が、野生型のＦａｂまたはヒンジ領域に存在しない変異アミノ酸残基（例えば野生型のＦａｂまたはヒンジ領域に存在しないシステイン残基）に由来する結合である。
【０１０３】
別の局面において、本開示は、２つの抗原分子間での相互作用を制御する活性を有する抗原結合分子を製造する方法であって、（ａ）第一の抗原結合ドメインを含むポリペプチドをコードする核酸、および第二の抗原結合ドメインを含むポリペプチドをコードする核酸を提供すること；（ｂ）当該２つの抗原結合ドメインを連結する少なくとも１カ所の結合が追加されるように、当該２つの抗原結合ドメインをコードする核酸に変異を導入すること；（ｃ）（ｂ）で作製された核酸を宿主細胞に導入すること；（ｄ）当該２つのポリペプチドが発現するように宿主細胞を培養すること；および（ｅ）第一および第二の抗原結合ドメインを含むポリペプチドであって、当該２つの抗原結合ドメインが１カ所以上の結合を介して互いに連結されているポリペプチドである抗原結合分子を得ること、を含む方法を提供する。特定の態様において、上記（ａ）における２つの抗原結合ドメインのそれぞれには、当該２つの抗原結合ドメインを連結させるための結合の起点となるアミノ酸残基が１つ以上含まれていてもよく、その場合、抗原結合ドメイン間の結合の起点となる１つ以上のアミノ酸残基のうちのいくつか、あるいは全ては、野生型のＦａｂまたはヒンジ領域に存在するアミノ酸残基（例えばヒンジ領域におけるシステイン残基）である。さらなる態様において、上記（ｂ）における当該少なくとも１カ所の結合は、抗原結合ドメイン間の結合の起点となるアミノ酸残基が、野生型のＦａｂまたはヒンジ領域に存在しない変異アミノ酸残基（例えば野生型のＦａｂまたはヒンジ領域に存在しないシステイン残基）に由来する結合である。
【０１０４】
また別の局面において、本開示は、２つの互いに会合することによって活性化される抗原分子の活性化を制御する活性を有する抗原結合分子を製造する方法であって、（ａ）第一の抗原結合ドメインを含むポリペプチドをコードする核酸、および第二の抗原結合ドメインを含むポリペプチドをコードする核酸を提供すること；（ｂ）当該２つの抗原結合ドメインを連結する少なくとも１カ所の結合が追加されるように、当該２つの抗原結合ドメインをコードする核酸に変異を導入すること；（ｃ）（ｂ）で作製された核酸を宿主細胞に導入すること；（ｄ）当該２つのポリペプチドが発現するように宿主細胞を培養すること；および（ｅ）第一および第二の抗原結合ドメインを含むポリペプチドであって、当該２つの抗原結合ドメインが１カ所以上の結合を介して互いに連結されているポリペプチドである抗原結合分子を得ること、を含む方法を提供する。特定の態様において、上記（ａ）における２つの抗原結合ドメインのそれぞれには、当該２つの抗原結合ドメインを連結させるための結合の起点となるアミノ酸残基が１つ以上含まれていてもよく、その場合、抗原結合ドメイン間の結合の起点となる１つ以上のアミノ酸残基のうちのいくつか、あるいは全ては、野生型のＦａｂまたはヒンジ領域に存在するアミノ酸残基（例えばヒンジ領域におけるシステイン残基）である。さらなる態様において、上記（ｂ）における当該少なくとも１カ所の結合は、抗原結合ドメイン間の結合の起点となるアミノ酸残基が、野生型のＦａｂまたはヒンジ領域に存在しない変異アミノ酸残基（例えば野生型のＦａｂまたはヒンジ領域に存在しないシステイン残基）に由来する結合である。
【０１０５】
また別の局面において、本開示は、２つの抗原結合ドメインが空間的に近接した位置に存在し、かつ／または２つの抗原結合ドメインの可動性が減少している抗原結合分子を製造する方法であって、（ａ）第一の抗原結合ドメインを含むポリペプチドをコードする核酸、および第二の抗原結合ドメインを含むポリペプチドをコードする核酸を提供すること；（ｂ）当該２つの抗原結合ドメインを連結する少なくとも１カ所の結合が追加されるように、当該２つの抗原結合ドメインをコードする核酸に変異を導入すること；（ｃ）（ｂ）で作製された核酸を宿主細胞に導入すること；（ｄ）当該２つのポリペプチドが発現するように宿主細胞を培養すること；および（ｅ）第一および第二の抗原結合ドメインを含むポリペプチドであって、当該２つの抗原結合ドメインが１カ所以上の結合を介して互いに連結されているポリペプチドである抗原結合分子を得ること、を含む方法を提供する。特定の態様において、上記（ａ）における２つの抗原結合ドメインのそれぞれには、当該２つの抗原結合ドメインを連結させるための結合の起点となるアミノ酸残基が１つ以上含まれていてもよく、その場合、抗原結合ドメイン間の結合の起点となる１つ以上のアミノ酸残基のうちのいくつか、あるいは全ては、野生型のＦａｂまたはヒンジ領域に存在するアミノ酸残基（例えばヒンジ領域におけるシステイン残基）である。さらなる態様において、上記（ｂ）における当該少なくとも１カ所の結合は、抗原結合ドメイン間の結合の起点となるアミノ酸残基が、野生型のＦａｂまたはヒンジ領域に存在しない変異アミノ酸残基（例えば野生型のＦａｂまたはヒンジ領域に存在しないシステイン残基）に由来する結合である。
【０１０６】
さらに別の局面において、本開示は、プロテアーゼ切断に対する抵抗性が増大した抗原結合分子を製造する方法であって、（ａ）第一の抗原結合ドメインを含むポリペプチドをコードする核酸、および第二の抗原結合ドメインを含むポリペプチドをコードする核酸を提供すること；（ｂ）当該２つの抗原結合ドメインを連結する少なくとも１カ所の結合が追加されるように、当該２つの抗原結合ドメインをコードする核酸に変異を導入すること；（ｃ）（ｂ）で作製された核酸を宿主細胞に導入すること；（ｄ）当該２つのポリペプチドが発現するように宿主細胞を培養すること；および（ｅ）第一および第二の抗原結合ドメインを含むポリペプチドであって、当該２つの抗原結合ドメインが１カ所以上の結合を介して互いに連結されているポリペプチドである抗原結合分子を得ること、を含む方法を提供する。特定の態様において、上記（ａ）における２つの抗原結合ドメインのそれぞれには、当該２つの抗原結合ドメインを連結させるための結合の起点となるアミノ酸残基が１つ以上含まれていてもよく、その場合、抗原結合ドメイン間の結合の起点となる１つ以上のアミノ酸残基のうちのいくつか、あるいは全ては、野生型のＦａｂまたはヒンジ領域に存在するアミノ酸残基（例えばヒンジ領域におけるシステイン残基）である。さらなる態様において、上記（ｂ）における当該少なくとも１カ所の結合は、抗原結合ドメイン間の結合の起点となるアミノ酸残基が、野生型のＦａｂまたはヒンジ領域に存在しない変異アミノ酸残基（例えば野生型のＦａｂまたはヒンジ領域に存在しないシステイン残基）に由来する結合である。
【０１０７】
これらの種々の局面において製造される抗原結合分子は、本明細書に記載の抗原結合分子の諸特徴を有していてもよい。
【０１０８】
＜抗原結合分子のスクリーニング方法＞
一局面において、本開示は、互いに会合することによって活性化される、新規な一組のタンパク質分子を同定する方法であって、（ａ）任意の２つのタンパク質分子を提供すること；（ｂ）本開示の製造方法により、当該２つのタンパク質分子にそれぞれ結合する２つの抗原結合ドメインを含む抗原結合分子を製造すること；（ｃ）（ｂ）で製造された抗原結合分子と当該２つのタンパク質分子とを接触させること；および（ｄ）当該２つのタンパク質分子が活性化されているかどうかを測定すること、を含む方法を提供する。
特定の態様において、前記２つのタンパク質分子のうちの少なくとも一方は、サイトカイン受容体スーパーファミリーに属する受容体、Ｇタンパク質結合型受容体、イオンチャネル型受容体、チロシンキナーゼ型受容体、免疫チェックポイント受容体、抗原受容体、ＣＤ抗原、共刺激分子、および細胞接着分子からなる群より選択される。
【０１０９】
Ａ．例示的抗原結合分子
＜抗原結合分子の構造＞
一局面において、本開示は、第一の抗原結合ドメインおよび第二の抗原結合ドメインを含む抗原結合分子であって、当該抗原結合ドメインが、２カ所以上の結合（bond）を介して互いに連結されている、抗原結合分子を提供する。一態様において、第一および第二の抗原結合ドメインのうちの少なくとも一方は、単体で抗原に結合する活性を有している（すなわち、１つの抗原結合ドメイン単独で抗原結合活性を有する）。特定の態様において、第一および第二の抗原結合ドメインはいずれも、単体で抗原に結合する活性を有している。
【０１１０】
前記局面の一態様において、第一および第二の抗原結合ドメインのうちの少なくとも一方は、特定の抗原に結合する抗体断片を含む。特定の態様において、第一および／または第二の抗原結合ドメインは、ヒンジ領域を含む。抗原結合ドメイン間の結合は、第一および第二の抗原結合ドメインにそれぞれ結合の起点となるアミノ酸残基が存在し、それらのアミノ酸残基の間を連結する形で形成される。特定の態様において、抗原結合ドメイン間の結合の起点となるアミノ酸残基のうちの少なくとも１つは、抗体断片内に存在する。特定の態様において、抗原結合ドメイン間の結合の起点となるアミノ酸残基のうちの少なくとも１つは、ヒンジ領域内に存在する。特定の態様において、抗原結合ドメイン間の結合の起点となるアミノ酸残基のうちの少なくとも１つは抗体断片内に存在し、かつ少なくとも１つはヒンジ領域内に存在する。
【０１１１】
前記局面の一態様において、第一および第二の抗原結合ドメインのうちの少なくとも一方において、一次構造上で互いに７アミノ酸以上離れた位置に、抗原結合ドメイン間の結合の起点となる複数のアミノ酸残基が存在する。これは、当該複数のアミノ酸残基のうちのいずれか２つのアミノ酸残基の間に当該アミノ酸残基でないアミノ酸残基が６アミノ酸以上存在することを意味する。特定の態様において、抗原結合ドメイン間の結合の起点となる複数のアミノ酸残基の組み合わせの中には、一次構造上で７アミノ酸未満離れた位置に存在するアミノ酸残基の対が含まれてもよい。特定の態様において、第一および第二の抗原結合ドメインが３カ所以上の結合を介して互いに連結されている場合、一次構造上で互いに７アミノ酸以上離れた位置に存在するアミノ酸残基の対を含む３つ以上のアミノ酸残基が、抗原結合ドメイン間の結合の起点となることができる。
特定の態様において、第一の抗原結合ドメインおよび第二の抗原結合ドメイン上のそれぞれ同じ位置に存在するアミノ酸残基が、互いに連結して結合を形成する。特定の態様において、第一の抗原結合ドメインおよび第二の抗原結合ドメイン上のそれぞれ異なる位置に存在するアミノ酸残基が、互いに連結して結合を形成する。
【０１１２】
抗原結合ドメイン上のアミノ酸残基の位置は、Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD 1991 に記載のKabatナンバリングまたはEUナンバリングシステム（EUインデックスとも呼ばれる）にしたがって示すことができる。例えば、第一および第二の抗原結合ドメイン間の結合の起点となるアミノ酸残基が、各抗原結合ドメイン上の対応する同じ位置に存在する場合、それらのアミノ酸残基の位置は、KabatナンバリングまたはEUナンバリングシステムにしたがって同じ番号で示すことができる。また、第一および第二の抗原結合ドメイン間の結合の起点となるアミノ酸残基が、各抗原結合ドメイン上の対応しない異なる位置に存在する場合、それらのアミノ酸残基の位置は、KabatナンバリングまたはEUナンバリングシステムにしたがって異なる番号で示すことができる。
【０１１３】
前記局面の一態様において、抗原結合ドメインを連結する２カ所以上の結合のうち少なくとも１つは共有結合である。特定の態様において、第一の抗原結合ドメインにおけるアミノ酸残基と、第二の抗原結合ドメインにおけるアミノ酸残基とが直接的に架橋されることによって、共有結合が形成される。架橋されるアミノ酸残基の種類は、例えばシステインであり、形成される共有結合は例えばジスルフィド結合である。架橋されるシステイン残基のうちの少なくとも１つはヒンジ領域内に存在してもよい。
別の特定の態様において、第一の抗原結合ドメインにおけるアミノ酸残基と、第二の抗原結合ドメインにおけるアミノ酸残基とが架橋剤を介して架橋されることによって、共有結合が形成される。架橋剤は、例えばアミン反応性架橋剤であり、架橋されるアミノ酸残基の種類は、例えばリジンである。
【０１１４】
前記局面の一態様において、抗原結合ドメインを連結する２カ所以上の結合のうちの少なくとも１つは非共有結合である。特定の態様において、非共有結合は、イオン結合、水素結合、疎水結合のいずれかである。
【０１１５】
前記局面の一態様において、抗体断片は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、ｓｃＦａｂ、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、シングルドメイン抗体のいずれかである。
【０１１６】
前記局面の一態様において、抗原結合ドメイン間の結合の起点となるアミノ酸残基のうちの少なくとも１つは、定常領域内に存在する。特定の態様において、当該アミノ酸残基はＣＨ１領域内に存在し、例えば、ＣＨ１領域のＥＵナンバリング１１９位、１２２位、１２３位、１３１位、１３２位、１３３位、１３４位、１３５位、１３６位、１３７位、１３９位、１４０位、１４８位、１５０位、１５５位、１５６位、１５７位、１５９位、１６０位、１６１位、１６２位、１６３位、１６５位、１６７位、１７４位、１７６位、１７７位、１７８位、１９０位、１９１位、１９２位、１９４位、１９５位、１９７位、２１３位、および２１４位からなる群より選択されるいずれかに存在する。例示的な一態様において、前記アミノ酸残基はＣＨ１領域のＥＵナンバリング１９１位に存在し、２つの抗原結合ドメインのＣＨ１領域におけるＥＵナンバリング１９１位のアミノ酸残基どうしが連結して結合を形成する。
特定の態様において、抗原結合ドメイン間の結合の起点となるアミノ酸残基のうちの少なくとも１つは、ヒンジ領域内に存在し、例えば、ヒンジ領域のＥＵナンバリング２１６位、２１８位、および２１９位からなる群より選択されるいずれかに存在する。
特定の態様において、抗原結合ドメイン間の結合の起点となるアミノ酸残基のうちの少なくとも１つは、ＣＬ領域内に存在し、例えば、ＣＬ領域のＥＵナンバリング１０９位、１１２位、１２１位、１２６位、１２８位、１５１位、１５２位、１５３位、１５６位、１８４位、１８６位、１８８位、１９０位、２００位、２０１位、２０２位、２０３位、２０８位、２１０位、２１１位、２１２位、および２１３位からなる群より選択されるいずれかに存在する。例示的な一態様において、前記アミノ酸残基はＣＬ領域のＥＵナンバリング１２６位に存在し、２つの抗原結合ドメインのＣＬ領域におけるＥＵナンバリング１２６位のアミノ酸残基どうしが連結して結合を形成する。
特定の態様において、第一の抗原結合ドメインのＣＨ１領域におけるアミノ酸残基と、第二の抗原結合ドメインのＣＬ領域におけるアミノ酸残基が連結して結合を形成する。例示的な一態様において、第一の抗原結合ドメインのＣＨ１領域におけるＥＵナンバリング１９１位のアミノ酸残基と、第二の抗原結合ドメインのＣＬ領域におけるＥＵナンバリング１２６位のアミノ酸残基が連結して結合を形成する。
【０１１７】
前記局面の一態様において、定常領域はヒト由来である。特定の態様において、重鎖定常領域のサブクラスは、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、IgA2、IgM、IgD、およびIgEのいずれかである。特定の態様において、ＣＨ１領域のサブクラスは、γ１、γ２、γ３、γ４、α１、α２、μ、δ、およびεのいずれかである。特定の態様において、ＣＬ領域のサブクラスは、κまたはλである。
【０１１８】
前記局面の一態様において、抗原結合ドメイン間の結合の起点となるアミノ酸残基のうちの少なくとも１つは、可変領域内に存在する。特定の態様において、当該アミノ酸残基はＶＨ領域内に存在し、例えば、ＶＨ領域のＫａｂａｔナンバリング８位、１６位、２８位、７４位、および８２ｂ位からなる群より選択されるいずれかに存在する。特定の態様において、前記アミノ酸残基はＶＬ領域内に存在し、例えば、ＶＬ領域のＫａｂａｔナンバリング１００位、１０５位、および１０７位からなる群より選択されるいずれかに存在する。
【０１１９】
前記局面の一態様において、第一および第二の抗原結合ドメインはいずれもＦａｂおよびヒンジ領域を含む。
特定の態様において、抗原結合ドメイン間の結合の起点となるアミノ酸残基のうちの少なくとも１つは、野生型のＦａｂまたはヒンジ領域に存在するアミノ酸残基であり、例えば、ヒンジ領域におけるシステイン残基である。そのようなシステイン残基として、例えば、EUナンバリング226位および229位のシステイン残基などを挙げることができる。
別の特定の態様において、抗原結合ドメイン間の結合の起点となるアミノ酸残基のうちの少なくとも１つは、野生型のＦａｂまたはヒンジ領域に存在しない変異アミノ酸残基であり、例えば、野生型のＦａｂまたはヒンジ領域に存在しないシステイン残基である。そのような変異アミノ酸残基は、野生型のＦａｂまたはヒンジ領域に対して、例えばアミノ酸置換などの手法を用いることにより導入することができる。ＣＨ１領域、ヒンジ領域、ＣＬ領域、ＶＨ領域、およびＶＬ領域のそれぞれにおいて、抗原結合ドメイン間の結合の起点となり得るアミノ酸残基の部位が本明細書中に開示されており、例えばそれらの部位にシステイン残基を導入することができる。
あるいは別の態様において、野生型のＦａｂまたはヒンジ領域に存在するアミノ残基であって、抗原結合ドメイン間の結合に関与し得るアミノ酸残基（例えばシステイン残基）を、他のアミノ酸残基に置換または欠失させてもよい。そのようなシステイン残基として、例えば、ヒンジ領域におけるEUナンバリング220位、226位、229位のシステイン残基、ＣＬ領域における214位のシステイン残基などを挙げることができる。
特定の態様において、本開示の抗原結合分子は、第一および第二の抗原結合ドメインにいずれもＦａｂおよびヒンジ領域を含む、Ｆ（ａｂ’）２である。
【０１２０】
前記局面の一態様において、第一および第二の抗原結合ドメインのうちの少なくとも一方は、特定の抗原に結合する非抗体タンパク質またはその断片を含む。特定の態様において、前記非抗体タンパク質は、互いに特異的に結合する一組のリガンドおよび受容体のどちらか一方である。ここでの受容体として、例えば、サイトカイン受容体スーパーファミリーに属する受容体、Ｇタンパク質結合型受容体、イオンチャネル型受容体、チロシンキナーゼ型受容体、免疫チェックポイント受容体、抗原受容体、ＣＤ抗原、共刺激分子、および細胞接着分子などを挙げることができる。
【０１２１】
前記局面の一態様において、本開示の抗原結合分子は、さらにＦｃ領域を含み、例えば全長抗体である。特定の態様において、本開示の抗原結合分子のＦｃ領域に、Ｆｃ領域の多量体化を促進する１つ以上のアミノ酸変異が導入されている。そのようなアミノ酸変異は、例えば、ＥＵナンバリング２４７、２４８、２５３、２５４、３１０、３１１、３３８、３４５、３５６、３５９、３８２、３８５、３８６、４３０、４３３、４３４、４３６、４３７、４３８、４３９、４４０、および４４７番目からなる群より選択される少なくとも１つの部位におけるアミノ酸変異を含む（例えばWO2016/164480などを参照）。特定の態様において、多量体化は六量体化である。
【０１２２】
＜抗原結合分子が結合する抗原の種類＞
前記局面の一態様において、第一および第二の抗原結合ドメインは、いずれも同じ種類の抗原に結合する。特定の態様において、第一および第二の抗原結合ドメインは、同じ種類の抗原上の同じエピトープに結合する。別の特定の態様において、第一および第二の抗原結合ドメインは、同じ種類の抗原上の互いに異なるエピトープに結合する。特定の態様において、本開示の抗原結合分子は、１種類の特定の抗原を標的とするバイパラトピック抗原結合分子（例えばバイパラトピック抗体）である。
前記局面の別の一態様において、第一および第二の抗原結合ドメインは、互いに異なる種類の抗原に結合する。
前記局面の別の一態様において、本開示の抗原結合分子はクランピング（clamping）抗原結合分子（例えばクランピング抗体）である。本明細書においてクランピング抗原結合分子とは、ある抗原Ａおよび抗原Ａに結合する抗原結合分子から形成される抗原−抗原結合分子複合体に特異的に結合することによって、当該抗原Ａに結合する抗原結合分子の当該抗原Ａに対する結合活性を増加させる（あるいは、当該抗原Ａおよび当該抗原Ａに結合する抗原結合分子から形成される抗原−抗原結合分子複合体を安定化させる）抗原結合分子を意味する。例えば、CD3クランピング抗体は、CD3およびCD3への結合能が低下した抗体（結合減弱CD3抗体）から形成される抗原−抗体複合体に特異的に結合することによって、当該結合減弱CD3抗体のCD3に対する結合活性を増加させる（あるいは、CD3および当該結合減弱CD3抗体から形成される抗原−抗体複合体を安定化させる）ことができる。特定の態様において、本開示の抗原結合分子における第一および／または第二の抗原結合ドメインは、クランピング抗原結合分子に由来する抗原結合ドメイン（クランピング抗原結合ドメイン）であることができる。
前記局面の一態様において、第一および第二の抗原結合ドメインは、いずれも同じアミノ酸配列を有する。別の一態様において、第一および第二の抗原結合ドメインは、互いに異なるアミノ酸配列を有する。
【０１２３】
前記局面の一態様において、第一および第二の抗原結合ドメインが結合する２つの抗原のうちの少なくとも１つは、可溶型タンパク質または膜タンパク質である。
【０１２４】
＜抗原結合分子の機能＞
前記局面の一態様において、本開示の抗原結合分子は、２つの抗原分子を空間的に近接した位置に保持する活性を有する。特定の態様において、本開示の抗原結合分子は、対照となる抗原結合分子に比べて、２つの抗原分子をより近接した位置に保持することができ、当該対照となる抗原結合分子は、２つの抗原結合ドメイン間の結合の数が１カ所少ないという点でのみ本開示の抗原結合分子と異なる。さらなる態様において、当該１カ所少ない結合は、抗原結合ドメイン間の結合の起点となるアミノ酸残基が、野生型のＦａｂまたはヒンジ領域に存在しない変異アミノ酸残基（例えば野生型のＦａｂまたはヒンジ領域に存在しないシステイン残基）に由来する結合の中から選択することができる。
【０１２５】
前記局面の別の態様において、本開示の抗原結合分子は、２つの抗原分子間での相互作用を制御する活性を有する。特定の理論に拘束されるわけではないが、当該相互作用を制御する活性は、本開示の抗原結合分子が２つの抗原分子を空間的に近接した位置に保持する結果としてもたらされるものと考えられる。特定の態様において、本開示の抗原結合分子は、対照となる抗原結合分子に比べて、２つの抗原分子間での相互作用を増強または減弱させることができ、当該対照となる抗原結合分子は、２つの抗原結合ドメイン間の結合の数が１カ所少ないという点でのみ本開示の抗原結合分子と異なる。さらなる態様において、当該１カ所少ない結合は、抗原結合ドメイン間の結合の起点となるアミノ酸残基が、野生型のＦａｂまたはヒンジ領域に存在しない変異アミノ酸残基（例えば野生型のＦａｂまたはヒンジ領域に存在しないシステイン残基）に由来する結合の中から選択することができる。
【０１２６】
特定の態様において、本開示の抗原結合分子が結合する２つの抗原分子は、それぞれリガンドとその受容体であり、本開示の抗原結合分子は、当該リガンドによる当該受容体の活性化を促進する活性を有する。別の特定の態様において、本開示の抗原結合分子が結合する２つの抗原分子は、それぞれ酵素とその基質であり、本開示の抗原結合分子は、当該酵素の当該基質に対する触媒反応を促進する活性を有する。
【０１２７】
また別の特定の態様において、本開示の抗原結合分子が結合する２つの抗原分子は、ともに細胞表面に存在する抗原（例えばタンパク質）であり、本開示の抗原結合分子は、第一の抗原を発現する細胞と第二の抗原を発現する細胞との間での相互作用を促進する活性を有する。第一の抗原を発現する細胞および第二の抗原を発現する細胞は、例えばそれぞれ、細胞障害活性を有する細胞およびその標的となる細胞であり、本開示の抗原結合分子によって、当該細胞障害活性を有する細胞による当該標的となる細胞の障害が促進される。細胞障害活性を有する細胞は、例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、単球、マクロファージのいずれかである。
【０１２８】
前記局面の一態様において、本開示の抗原結合分子は、互いに会合することによって活性化される２つの抗原分子の活性化を制御する活性を有する。特定の理論に拘束されるわけではないが、当該活性化を制御する活性は、本開示の抗原結合分子が２つの抗原分子を空間的に近接した位置に保持する結果としてもたらされるものと考えられる。特定の態様において、本開示の抗原結合分子は、対照となる抗原結合分子に比べて、２つの抗原分子の活性化を増強または減弱させることができ、当該対照となる抗原結合分子は、２つの抗原結合ドメイン間の結合の数が１カ所少ないという点でのみ本開示の抗原結合分子と異なる。さらなる態様において、当該１カ所少ない結合は、抗原結合ドメイン間の結合の起点となるアミノ酸残基が、野生型のＦａｂまたはヒンジ領域に存在しない変異アミノ酸残基（例えば野生型のＦａｂまたはヒンジ領域に存在しないシステイン残基）に由来する結合の中から選択することができる。前記抗原分子は、例えば、サイトカイン受容体スーパーファミリーに属する受容体、Ｇタンパク質結合型受容体、イオンチャネル型受容体、チロシンキナーゼ型受容体、免疫チェックポイント受容体、抗原受容体、ＣＤ抗原、共刺激分子、および細胞接着分子からなる群より選択される。
【０１２９】
前記局面の一態様において、本開示の抗原結合分子は、プロテアーゼ切断に対して抵抗性を有する。特定の態様において、本開示の抗原結合分子は、対照となる抗原結合分子に比べて、プロテアーゼ切断に対する抵抗性が増大しており、当該対照となる抗原結合分子は、２つの抗原結合ドメイン間の結合の数が１カ所少ないという点でのみ本開示の抗原結合分子と異なる。さらなる態様において、当該１カ所少ない結合は、抗原結合ドメイン間の結合の起点となるアミノ酸残基が、野生型のＦａｂまたはヒンジ領域に存在しない変異アミノ酸残基（例えば野生型のＦａｂまたはヒンジ領域に存在しないシステイン残基）に由来する結合の中から選択することができる。特定の態様において、本開示の抗原結合分子は、対照となる抗原結合分子に比べて、プロテアーゼ処理後に残存する全長分子（例えば、全長IgG分子）の割合が増加している。特定の態様において、本開示の抗原結合分子は、対照となる抗原結合分子に比べて、プロテアーゼ処理後に生成される特定の断片（例えば、Fab単量体）の割合が減少している。
【０１３０】
前記局面の一態様において、本開示の抗原結合分子をプロテアーゼで処理した場合、抗原結合ドメインまたはその断片の二量体（例えば、架橋されたFab二量体）が切り出される。特定の態様において、２つの抗原結合ドメイン間の結合の数が１カ所少ないという点でのみ本開示の抗原結合分子と異なる対照となる抗原結合分子を当該プロテアーゼで処理した場合、抗原結合ドメインまたはその断片の単量体が切り出される。さらなる態様において、当該１カ所少ない結合は、抗原結合ドメイン間の結合の起点となるアミノ酸残基が、野生型のＦａｂまたはヒンジ領域に存在しない変異アミノ酸残基（例えば野生型のＦａｂまたはヒンジ領域に存在しないシステイン残基）に由来する結合の中から選択することができる。これらの態様において、プロテアーゼは抗原結合分子のヒンジ領域を切断し得る。
【０１３１】
＜医薬組成物＞
一局面において、本開示は、本開示の抗原結合分子および薬学的に許容される担体を含む医薬組成物を提供する。
【０１３２】
＜抗原結合分子の用途＞
一局面において、本開示は、２つの抗原分子を空間的に近接した位置に保持する方法であって、（ａ）２つの抗原結合ドメインを含む抗原結合分子であって、当該２つの抗原結合ドメインが１カ所以上の結合を介して互いに連結されている抗原結合分子を提供すること；（ｂ）当該抗原結合分子に、２つの抗原結合ドメインを互いに連結させるもう１カ所別の結合を追加すること；および（ｃ）（ｂ）で作製された抗原結合分子を当該２つの抗原分子と接触させること、を含む方法を提供する。特定の態様において、上記（ａ）における当該１カ所以上の結合のうちのいくつかの結合、あるいは全ての結合は、抗原結合ドメイン間の結合の起点となるアミノ酸残基が、野生型のＦａｂまたはヒンジ領域に存在するアミノ酸残基（例えばヒンジ領域におけるシステイン残基）に由来する結合である。さらなる態様において、上記（ｂ）における当該もう１カ所別の結合は、抗原結合ドメイン間の結合の起点となるアミノ酸残基が、野生型のＦａｂまたはヒンジ領域に存在しない変異アミノ酸残基（例えば野生型のＦａｂまたはヒンジ領域に存在しないシステイン残基）に由来する結合である。本開示はまた、本開示の抗原結合分子または医薬組成物を２つの抗原分子と接触させることを含む、２つの抗原分子を空間的に近接した位置に保持する方法を提供する。本開示はさらに、２つの抗原分子を空間的に近接した位置に保持するための、本開示の抗原結合分子または医薬組成物を提供する。
【０１３３】
別の局面において、本開示は、２つの抗原分子間での相互作用を制御する方法であって、（ａ）２つの抗原結合ドメインを含む抗原結合分子であって、当該２つの抗原結合ドメインが１カ所以上の結合を介して互いに連結されている抗原結合分子を提供すること；（ｂ）当該抗原結合分子に、２つの抗原結合ドメインを互いに連結させるもう１カ所別の結合を追加すること；および（ｃ）（ｂ）で作製された抗原結合分子を当該２つの抗原分子と接触させること、を含む方法を提供する。特定の態様において、上記（ａ）における当該１カ所以上の結合のうちのいくつかの結合、あるいは全ての結合は、抗原結合ドメイン間の結合の起点となるアミノ酸残基が、野生型のＦａｂまたはヒンジ領域に存在するアミノ酸残基（例えばヒンジ領域におけるシステイン残基）に由来する結合である。さらなる態様において、上記（ｂ）における当該もう１カ所別の結合は、抗原結合ドメイン間の結合の起点となるアミノ酸残基が、野生型のＦａｂまたはヒンジ領域に存在しない変異アミノ酸残基（例えば野生型のＦａｂまたはヒンジ領域に存在しないシステイン残基）に由来する結合である。本開示はまた、本開示の抗原結合分子または医薬組成物を２つの抗原分子と接触させることを含む、２つの抗原分子間での相互作用を制御する方法を提供する。本開示はさらに、２つの抗原分子間での相互作用を制御するための、本開示の抗原結合分子または医薬組成物を提供する。
【０１３４】
また別の局面において、本開示は、２つの互いに会合することによって活性化される抗原分子の活性を制御する方法であって、（ａ）２つの抗原結合ドメインを含む抗原結合分子であって、当該２つの抗原結合ドメインが１カ所以上の結合を介して互いに連結されている抗原結合分子を提供すること；（ｂ）当該抗原結合分子に、２つの抗原結合ドメインを互いに連結させるもう１カ所別の結合を追加すること；および（ｃ）（ｂ）で作製された抗原結合分子を当該２つの抗原分子と接触させること、を含む方法を提供する。特定の態様において、上記（ａ）における当該１カ所以上の結合のうちのいくつかの結合、あるいは全ての結合は、抗原結合ドメイン間の結合の起点となるアミノ酸残基が、野生型のＦａｂまたはヒンジ領域に存在するアミノ酸残基（例えばヒンジ領域におけるシステイン残基）に由来する結合である。さらなる態様において、上記（ｂ）における当該もう１カ所別の結合は、抗原結合ドメイン間の結合の起点となるアミノ酸残基が、野生型のＦａｂまたはヒンジ領域に存在しない変異アミノ酸残基（例えば野生型のＦａｂまたはヒンジ領域に存在しないシステイン残基）に由来する結合である。本開示はまた、本開示の抗原結合分子または医薬組成物を２つの抗原分子と接触させることを含む、２つの互いに会合することによって活性化される抗原分子の活性を制御する方法を提供する。本開示はさらに、２つの互いに会合することによって活性化される抗原分子の活性を制御するための、本開示の抗原結合分子または医薬組成物を提供する。
【０１３５】
さらに別の局面において、本開示は、抗原結合分子のプロテアーゼ切断に対する抵抗性を増大させる方法であって、（ａ）２つの抗原結合ドメインを含む抗原結合分子であって、当該２つの抗原結合ドメインが１カ所以上の結合を介して互いに連結されている抗原結合分子を提供すること；および（ｂ）当該抗原結合分子に、２つの抗原結合ドメインを互いに連結させるもう１カ所別の結合を追加すること、を含む方法を提供する。特定の態様において、上記（ａ）における当該１カ所以上の結合のうちのいくつかの結合、あるいは全ての結合は、抗原結合ドメイン間の結合の起点となるアミノ酸残基が、野生型のＦａｂまたはヒンジ領域に存在するアミノ酸残基（例えばヒンジ領域におけるシステイン残基）に由来する結合である。さらなる態様において、上記（ｂ）における当該もう１カ所別の結合は、抗原結合ドメイン間の結合の起点となるアミノ酸残基が、野生型のＦａｂまたはヒンジ領域に存在しない変異アミノ酸残基（例えば野生型のＦａｂまたはヒンジ領域に存在しないシステイン残基）に由来する結合である。
【０１３６】
これらの種々の方法において用いる抗原結合分子は、本明細書に記載の抗原結合分子の諸特徴を有していてもよい。
【０１３７】
＜抗原結合分子の製造方法＞
一局面において、本開示は、２つの抗原分子を空間的に近接した位置に保持する活性を有する抗原結合分子を製造する方法であって、（ａ）第一の抗原結合ドメインを含むポリペプチドをコードする核酸、および第二の抗原結合ドメインを含むポリペプチドをコードする核酸を提供することであって、当該２つの抗原結合ドメインのそれぞれには、当該２つの抗原結合ドメインを連結させるための結合の起点となるアミノ酸残基が１つ以上含まれていること；（ｂ）当該２つの抗原結合ドメインを連結するもう一つ別の結合が追加されるように、当該２つの抗原結合ドメインをコードする核酸に変異を導入すること；（ｃ）（ｂ）で作製された核酸を宿主細胞に導入すること；（ｄ）当該２つのポリペプチドが発現するように宿主細胞を培養すること；および（ｅ）第一および第二の抗原結合ドメインを含むポリペプチドであって、当該２つの抗原結合ドメインが２カ所以上の結合を介して互いに連結されているポリペプチドである抗原結合分子を得ること、を含む方法を提供する。特定の態様において、上記（ａ）における、抗原結合ドメイン間の結合の起点となる１つ以上のアミノ酸残基のうちのいくつか、あるいは全ては、野生型のＦａｂまたはヒンジ領域に存在するアミノ酸残基（例えばヒンジ領域におけるシステイン残基）である。さらなる態様において、上記（ｂ）における当該もう１つ別の結合は、抗原結合ドメイン間の結合の起点となるアミノ酸残基が、野生型のＦａｂまたはヒンジ領域に存在しない変異アミノ酸残基（例えば野生型のＦａｂまたはヒンジ領域に存在しないシステイン残基）に由来する結合である。
【０１３８】
別の局面において、本開示は、２つの抗原分子間での相互作用を制御する活性を有する抗原結合分子を製造する方法であって、（ａ）第一の抗原結合ドメインを含むポリペプチドをコードする核酸、および第二の抗原結合ドメインを含むポリペプチドをコードする核酸を提供することであって、当該２つの抗原結合ドメインのそれぞれには、当該２つの抗原結合ドメインを連結させるための結合の起点となるアミノ酸残基が１つ以上含まれていること；（ｂ）当該２つの抗原結合ドメインを連結するもう一つ別の結合が追加されるように、当該２つの抗原結合ドメインをコードする核酸に変異を導入すること；（ｃ）（ｂ）で作製された核酸を宿主細胞に導入すること；（ｄ）当該２つのポリペプチドが発現するように宿主細胞を培養すること；および（ｅ）第一および第二の抗原結合ドメインを含むポリペプチドであって、当該２つの抗原結合ドメインが２カ所以上の結合を介して互いに連結されているポリペプチドである抗原結合分子を得ること、を含む方法を提供する。特定の態様において、上記（ａ）における、抗原結合ドメイン間の結合の起点となる１つ以上のアミノ酸残基のうちのいくつか、あるいは全ては、野生型のＦａｂまたはヒンジ領域に存在するアミノ酸残基（例えばヒンジ領域におけるシステイン残基）である。さらなる態様において、上記（ｂ）における当該もう１つ別の結合は、抗原結合ドメイン間の結合の起点となるアミノ酸残基が、野生型のＦａｂまたはヒンジ領域に存在しない変異アミノ酸残基（例えば野生型のＦａｂまたはヒンジ領域に存在しないシステイン残基）に由来する結合である。
【０１３９】
また別の局面において、本開示は、２つの互いに会合することによって活性化される抗原分子の活性化を制御する活性を有する抗原結合分子を製造する方法であって、（ａ）第一の抗原結合ドメインを含むポリペプチドをコードする核酸、および第二の抗原結合ドメインを含むポリペプチドをコードする核酸を提供することであって、当該２つの抗原結合ドメインのそれぞれには、当該２つの抗原結合ドメインを連結させるための結合の起点となるアミノ酸残基が１つ以上含まれていること；（ｂ）当該２つの抗原結合ドメインを連結するもう一つ別の結合が追加されるように、当該２つの抗原結合ドメインをコードする核酸に変異を導入すること；（ｃ）（ｂ）で作製された核酸を宿主細胞に導入すること；（ｄ）当該２つのポリペプチドが発現するように宿主細胞を培養すること；および（ｅ）第一および第二の抗原結合ドメインを含むポリペプチドであって、当該２つの抗原結合ドメインが２カ所以上の結合を介して互いに連結されているポリペプチドである抗原結合分子を得ること、を含む方法を提供する。特定の態様において、上記（ａ）における、抗原結合ドメイン間の結合の起点となる１つ以上のアミノ酸残基のうちのいくつか、あるいは全ては、野生型のＦａｂまたはヒンジ領域に存在するアミノ酸残基（例えばヒンジ領域におけるシステイン残基）である。さらなる態様において、上記（ｂ）における当該もう１つ別の結合は、抗原結合ドメイン間の結合の起点となるアミノ酸残基が、野生型のＦａｂまたはヒンジ領域に存在しない変異アミノ酸残基（例えば野生型のＦａｂまたはヒンジ領域に存在しないシステイン残基）に由来する結合である。
【０１４０】
さらに別の局面において、本開示は、プロテアーゼ切断に対する抵抗性が増大した抗原結合分子を製造する方法であって、（ａ）第一の抗原結合ドメインを含むポリペプチドをコードする核酸、および第二の抗原結合ドメインを含むポリペプチドをコードする核酸を提供することであって、当該２つの抗原結合ドメインのそれぞれには、当該２つの抗原結合ドメインを連結させるための結合の起点となるアミノ酸残基が１つ以上含まれていること；（ｂ）当該２つの抗原結合ドメインを連結するもう一つ別の結合が追加されるように、当該２つの抗原結合ドメインをコードする核酸に変異を導入すること；（ｃ）（ｂ）で作製された核酸を宿主細胞に導入すること；（ｄ）当該２つのポリペプチドが発現するように宿主細胞を培養すること；および（ｅ）第一および第二の抗原結合ドメインを含むポリペプチドであって、当該２つの抗原結合ドメインが２カ所以上の結合を介して互いに連結されているポリペプチドである抗原結合分子を得ること、を含む方法を提供する。特定の態様において、上記（ａ）における、抗原結合ドメイン間の結合の起点となる１つ以上のアミノ酸残基のうちのいくつか、あるいは全ては、野生型のＦａｂまたはヒンジ領域に存在するアミノ酸残基（例えばヒンジ領域におけるシステイン残基）である。さらなる態様において、上記（ｂ）における当該もう１つ別の結合は、抗原結合ドメイン間の結合の起点となるアミノ酸残基が、野生型のＦａｂまたはヒンジ領域に存在しない変異アミノ酸残基（例えば野生型のＦａｂまたはヒンジ領域に存在しないシステイン残基）に由来する結合である。
これらの種々の局面において製造される抗原結合分子は、本明細書に記載の抗原結合分子の諸特徴を有していてもよい。
【０１４１】
＜抗原結合分子のスクリーニング方法＞
一局面において、本開示は、互いに会合することによって活性化される、新規な一組のタンパク質分子を同定する方法であって、（ａ）任意の２つのタンパク質分子を提供すること；（ｂ）本開示の製造方法により、当該２つのタンパク質分子にそれぞれ結合する２つの抗原結合ドメインを含む抗原結合分子であって、当該２つのタンパク質分子を近接した位置に保持する活性を有する抗原結合分子を製造すること；（ｃ）（ｂ）で製造された抗原結合分子と当該２つのタンパク質分子とを接触させること；および（ｄ）当該２つのタンパク質分子が活性化されているかどうかを測定すること、を含む方法を提供する。
特定の態様において、前記２つのタンパク質分子のうちの少なくとも一方は、サイトカイン受容体スーパーファミリーに属する受容体、Ｇタンパク質結合型受容体、イオンチャネル型受容体、チロシンキナーゼ型受容体、免疫チェックポイント受容体、抗原受容体、ＣＤ抗原、共刺激分子、および細胞接着分子からなる群より選択される。
【０１４２】
＜抗原結合ドメインの連結＞
非限定的な一態様において、本開示の抗原結合分子に含まれる２つ以上の抗原結合ドメインは、１カ所以上の結合（bond）を介して互いに連結されている。好ましい一態様において、本開示の抗原結合分子に含まれる抗原結合ドメインは、単体で抗原に結合する活性を有している。当該態様において、２つの抗原結合ドメインを含む本開示の抗原結合分子は２つ以上の抗原分子と結合することができ、３つの抗原結合ドメインを含む本開示の抗原結合分子は３つ以上の抗原分子と結合することができ、４つの抗原結合ドメインを含む本開示の抗原結合分子は４つ以上の抗原分子と結合することができ、ｎ個の抗原結合ドメインを含む本開示の抗原結合分子はｎ個以上の抗原分子と結合することができる。
【０１４３】
特定の態様において、本開示の抗原結合分子に含まれる抗原結合ドメイン間の結合のうちの少なくとも１つは、天然型抗体において（例えば野生型のＦａｂまたはヒンジ領域において）見出されるものとは異なる結合である。天然型抗体（例えば、天然型IgG抗体）の抗原結合ドメイン間において見出される結合の例としては、ヒンジ領域におけるジスルフィド結合等が挙げられる。ヒンジ領域以外に位置するアミノ酸残基同士の結合は、抗体断片（例えばFab）内のアミノ酸残基同士の結合であってもよく、重鎖間の結合（HH体）、軽鎖間の結合（LL体）、および重鎖-軽鎖間の結合（HL体またはLH体）が挙げられる（図１参照）。抗原結合ドメイン間の結合の起点となる重鎖または軽鎖におけるアミノ酸残基の例としては、可変領域（VH領域もしくはVL領域）内または定常領域（CH1領域、ヒンジ領域、もしくはCL領域）内の前述の位置のアミノ酸残基を挙げることができる。
【０１４４】
非限定的な一態様において、本開示の抗原結合分子に含まれる２つ以上の抗原結合ドメインのうちの少なくとも一つにおける、一次構造上で互いに離れた位置に存在する複数のアミノ酸残基が、抗原結合ドメイン間の結合の起点となる。当該複数のアミノ酸残基間の距離は、各アミノ酸残基を起点とする結合による抗原結合ドメイン間の連結の結果として、十分近接した２つ以上の抗原結合ドメインの構造が達成されるような距離であり、当該複数のアミノ酸残基は、例えば、４アミノ酸以上、５アミノ酸以上、６アミノ酸以上、７アミノ酸以上、８アミノ酸以上、９アミノ酸以上、１０アミノ酸以上、１１アミノ酸以上、１２アミノ酸以上、１３アミノ酸以上、１４アミノ酸以上、１５アミノ酸以上、２０アミノ酸以上、２５アミノ酸以上、３０アミノ酸以上、３５アミノ酸以上、４０アミノ酸以上、４５アミノ酸以上、５０アミノ酸以上、６０アミノ酸以上、７０アミノ酸以上、８０アミノ酸以上、９０アミノ酸以上、１００アミノ酸以上、１１０アミノ酸以上、１２０アミノ酸以上、１３０アミノ酸以上、１４０アミノ酸以上、１５０アミノ酸以上、１６０アミノ酸以上、１７０アミノ酸以上、１８０アミノ酸以上、１９０アミノ酸以上、２００アミノ酸以上、２１０アミノ酸以上、または２２０アミノ酸以上離れていてもよい。
また、抗原結合ドメイン間の結合の数、および当該結合の起点となるアミノ酸残基の数は、当該結合による抗原結合ドメイン間の連結の結果として、十分近接した２つ以上の抗原結合ドメインの構造が達成されるような数であり、例えば、２カ所もしくはそれ以上、３カ所もしくはそれ以上、４カ所もしくはそれ以上、５カ所もしくはそれ以上、６カ所もしくはそれ以上、７カ所もしくはそれ以上、８カ所もしくはそれ以上、９カ所もしくはそれ以上、または１０カ所もしくはそれ以上であってもよい。
特定の態様において、抗原結合ドメイン上の３つ以上のアミノ酸残基をそれぞれ起点とする３つ以上の結合による抗原結合ドメイン間の連結の結果として、十分近接した２つ以上の抗原結合ドメインの構造が達成される限りにおいて、当該３つ以上のアミノ酸残基の中から選択される任意の２つのアミノ酸残基の一次構造上での互いの距離は、少なくとも一組のアミノ酸残基のペアにおいて７アミノ酸以上であればよく、残りのアミノ酸残基のペアでは７アミノ酸未満であってもよい。
【０１４５】
本開示の抗原結合分子に含まれる抗原結合ドメインとの関連において、「十分近接した」とは、本開示の抗原結合分子の所望の機能（活性）が達成されるのに十分なほど、２つ以上の抗原結合ドメインが近接していることを意味する。当該所望の機能（活性）の例としては、２つの抗原分子を空間的に近接した位置に保持する活性、２つの抗原分子間での相互作用を制御する活性、リガンドによる受容体の活性化を促進する活性、酵素の基質に対する触媒反応を促進する活性、第一の抗原を発現する細胞と第二の抗原を発現する細胞との間での相互作用を促進する活性、細胞障害活性を有する細胞（例えばＴ細胞、ＮＫ細胞、単球、マクロファージなど）による標的となる細胞の障害を促進する活性、互いに会合することによって活性化される２つの抗原分子の活性化を制御する活性、および当該抗原結合分子のプロテアーゼ切断に対する抵抗性等が挙げられる。
【０１４６】
非限定的な一態様において、本開示の抗原結合分子に含まれる抗原結合ドメイン間の結合は、共有結合であってもよいし、非共有結合であってもよい。そのような共有結合は、第一の抗原結合ドメインにおけるアミノ酸残基と、第二の抗原結合ドメインにおけるアミノ酸残基とが直接的に架橋されることによって形成される共有結合であってもよく、例えばシステイン残基同士のジスルフィド結合であってもよい。直接的に架橋されるアミノ酸残基は、Fab等の抗体断片上に存在してもよいし、ヒンジ領域内に存在してもよい。
別の態様においては、第一の抗原結合ドメインにおけるアミノ酸残基と、第二の抗原結合ドメインにおけるアミノ酸残基とが架橋剤を介して架橋されることによって、共有結合が形成される。例えばアミン反応性架橋剤を用いて架橋される場合、抗原結合ドメインのN末端アミノ酸の遊離アミノ基や、抗原結合ドメイン上のリジン残基の側鎖の第一級アミンを介して架橋することができる。アミン反応性架橋剤は、第一級アミンと化学結合を形成する官能基（例えば、イソチオシアネート、イソシアネート、アシルアジド、NHSエステル、スルホニルクロリド、アルデヒド、グリオキサール、エポキシド、オキシラン、カーボネート、アリールハライド、イミドエステル、カルボジイミド、無水物（アンハイドライド）、フルオロエステルなど）を含み、代表的な例としては、DSG (disuccinimidyl glutarate)、DSS (disuccinimidyl suberate)、BS3 (bis(sulfosuccinimidyl) suberate)、DSP (dithiobis(succinimidyl propionate))、DTSSP (3,3'-dithiobis (sulfosuccinimidyl propionate))、DST (disuccinimidyl tartrate)、BSOCOES (bis(2-(succinimidooxycarbonyloxy)  ethyl)sulfone)、EGS (ethylene glycol bis(succinimidyl succinate))、Sulfo-EGS (ethylene glycol bis(sulfosuccinimidyl succinate))、DMA (dimethyl adipimidate)、DMP (dimethyl pimelimidate)、DMS (dimethyl suberimidate)、DFDNB (1,5-difluoro-2,4-dinitrobenzene)などを挙げることができる。他の架橋剤の例としては、カルボキシル-アミン反応性、スルフヒドリル反応性、アルデヒド反応性、光反応性の架橋剤などを挙げることができる。
抗原結合ドメインを連結する非共有結合は、イオン結合、水素結合、疎水結合であってもよい。
【０１４７】
対照抗原結合分子（例えば、天然型抗体構造に実質的に類似した構造を有する抗原結合分子）に比べて抗原結合ドメイン間の結合が多いか否かは、例えば次の方法によって評価することができる。まず、関心対象の抗原結合分子および対照抗原結合分子を、抗原結合ドメインを切り出すプロテアーゼ（例えば、パパイン、Lys-Cなどのヒンジ領域どうしが架橋される部位よりN末端側を切断するプロテアーゼ）で処理した後に、非還元電気泳動に供する。次に、抗原結合ドメインの一部を認識する抗体（例えば、抗kappa鎖HRP標識抗体）を用いて、プロテアーゼ処理後に存在する断片を検出する。対照抗原結合分子の場合は抗原結合ドメインの単量体（例えばFab単量体）のみが検出されたのに対し、関心対象の抗原結合分子の場合は抗原結合ドメインの多量体（例えばFab二量体）が検出された場合に、当該関心対象の抗原結合分子は対照抗原結合分子に比べて抗原結合ドメイン間の結合が多いと評価することができる。
対照抗原結合分子にシステインを導入した改変抗原結合分子のシステイン間におけるジスルフィド結合の形成は、例えば次の方法によって評価することができる。まず、関心対象の抗原結合分子を、20mMリン酸緩衝液 (pH7.0) 中でキモトリプシンとインキュベートし、各抗体のアミノ酸配列から生成が想定されるペプチドの質量をLC/MSで検出する。新規に導入したシステイン同士がジスルフィド結合を形成した際に生成するペプチドの理論質量に相当する成分が検出された場合に、導入したシステイン同士がジスルフィド結合を形成したと評価することができる。さらに、上記の抗原結合分子を含む試料にジスルフィド結合を還元する作用を持つ薬剤（例えば、トリス（2-カルボキシエチル）ホスフィン）を添加し分析すると当該成分が検出されなくなった場合には、上記の評価が正しかったことがより強く裏付けられる。
【０１４８】
＜プロテアーゼ切断に対する抵抗性＞
非限定的な一態様において、本開示の抗原結合分子は、プロテアーゼ切断に対して抵抗性を有する。特定の態様において、本開示の抗原結合分子は、当該抗原結合分子に比べて抗原結合ドメイン間の結合の数が１カ所以上少ない対照抗原結合分子（例えば、天然型抗体構造に実質的に類似した構造を有する抗原結合分子）に比べて、プロテアーゼ切断に対する抵抗性が増大している。さらなる態様において、当該１カ所少ない結合は、抗原結合ドメイン間の結合の起点となるアミノ酸残基が、野生型のＦａｂまたはヒンジ領域に存在しない変異アミノ酸残基（例えば野生型のＦａｂまたはヒンジ領域に存在しないシステイン残基）に由来する結合の中から選択することができる。抗原結合分子が、例えば、対照抗原結合分子に比べて、プロテアーゼ処理後に残存する全長分子（例えば、全長IgG分子）の割合が増加している場合、またはプロテアーゼ処理後に生成される特定の断片（例えば、Fab単量体）の割合が減少している場合に、プロテアーゼ切断に対する抵抗性が増大している（プロテアーゼ耐性が向上している）と評価することができる。
特定の態様において、プロテアーゼ処理後に残存する全長分子の割合は、抗原結合分子全体から見た場合、例えば0.5%以上、1%以上、1.5%以上、2%以上、2.5%以上、3%以上、3.5%以上、4%以上、4.5%以上、5%以上、7.5%以上、10%以上、12.5%以上、15%以上、20%以上、25%以上、30%以上、35%以上、40%以上、45%以上、または50%以上であることができる。別の特定の態様において、プロテアーゼ処理後に生成される抗原結合ドメイン（例えばFab）の単量体の割合は、抗原結合分子全体から見た場合、例えば99%以下、98%以下、97%以下、96%以下、95%以下、94%以下、93%以下、92%以下、91%以下、90%以下、85%以下、80%以下、75%以下、70%以下、60%以下、50%以下、40%以下、30%以下、20%以下、または10%以下であることができる。別の特定の態様において、プロテアーゼ処理後に生成される抗原結合ドメイン（例えばFab）の二量体の割合は、抗原結合分子全体から見た場合、例えば0.5%以上、1%以上、1.5%以上、2%以上、2.5%以上、3%以上、3.5%以上、4%以上、4.5%以上、5%以上、7.5%以上、10%以上、12.5%以上、15%以上、20%以上、25%以上、30%以上、35%以上、40%以上、45%以上、または50%以上であることができる。
プロテアーゼとしては、例えば、Lys-C、プラスミン、ヒト好中球エラスターゼ（HNE）、パパイン等を挙げることができるが、これらに限定されない。
【０１４９】
さらなる局面において、上述の態様の任意のものによる抗原結合分子は、単独または組み合わせで、以下の項目1〜7に記載の任意の特徴を取り込んでもよい。 
【０１５０】
１．抗原結合分子のアフィニティ
特定の態様において、本明細書で提供される抗原結合分子は、≦1μM、≦100nM、≦10nM、≦1nM、≦0.1nM、≦0.01nMまたは≦0.001nM（例えば、10-8M以下、例えば10-8M〜10-13M、例えば10-9M〜10-13M）の解離定数 (KD) を有する。
【０１５１】
２．抗体断片
特定の態様において、本明細書で提供される抗原結合分子は、抗体断片である。抗体断片は、これらに限定されるものではないが、Fab、Fab’、Fab’-SH、F(ab’)2、Fv、および scFv断片、ならびに、本明細書中に記載の他の断片を含む。特定の抗体断片についての総説として、Hudson et al. Nat. Med. 9:129-134 (2003) を参照のこと。scFv断片の総説として、例えば、Pluckthun, in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds., (Springer-Verlag, New York), pp.269-315 (1994)；加えて、WO93/16185；ならびに米国特許第5,571,894号および第5,587,458号を参照のこと。サルベージ受容体結合エピトープ残基を含みインビボ (in vivo) における半減期の長くなったFabおよびF(ab')2断片についての論説として、米国特許第5,869,046号を参照のこと。
【０１５２】
ダイアボディは、二価または二重特異的であってよい、抗原結合部位を2つ伴う抗体断片である。例えば、EP404,097号; WO1993/01161; Hudson et al., Nat. Med. 9:129-134 (2003); Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448 (1993) 参照。トリアボディ (triabody) やテトラボディ (tetrabody) も、Hudson et al., Nat. Med. 9:129-134 (2003) に記載されている。
【０１５３】
３．キメラおよびヒト化抗体
特定の態様において、本明細書で提供される抗原結合分子は、キメラ抗体である。特定のキメラ抗体が、例えば、米国特許第4,816,567号；および、Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851-6855 (1984) に記載されている。一例では、キメラ抗体は、非ヒト可変領域（例えば、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、またはサルなどの非ヒト霊長類に由来する可変領域）およびヒト定常領域を含む。さらなる例において、キメラ抗体は、親抗体のものからクラスまたはサブクラスが変更された「クラススイッチ」抗体である。キメラ抗体は、その抗原結合断片も含む。
【０１５４】
特定の態様において、キメラ抗体は、ヒト化抗体である。典型的には、非ヒト抗体は、親非ヒト抗体の特異性およびアフィニティを維持したままでヒトへの免疫原性を減少させるために、ヒト化される。通常、ヒト化抗体は1つまたは複数の可変ドメインを含み、当該可変ドメイン中、HVR（例えばCDR（またはその部分））は非ヒト抗体に由来し、FR（またはその部分）はヒト抗体配列に由来する。ヒト化抗体は、任意で、ヒト定常領域の少なくとも一部分を含む。いくつかの態様において、ヒト化抗体中のいくつかのFR残基は、例えば、抗体の特異性またはアフィニティを回復または改善するために、非ヒト抗体（例えば、HVR残基の由来となった抗体）からの対応する残基で置換されている。
【０１５５】
４．ヒト抗体
特定の態様において、本明細書で提供される抗原結合分子は、ヒト抗体である。ヒト抗体は、当該技術分野において知られる種々の手法によって製造され得る。ヒト抗体は、van Dijk and van de Winkel, Curr. Opin. Pharmacol. 5: 368-74 (2001) および Lonberg, Curr. Opin. Immunol. 20:450-459 (2008) に、概説されている。
【０１５６】
５．ライブラリ由来抗原結合分子
本発明の抗原結合分子は、所望の1つまたは複数の活性を伴う抗原結合分子についてコンビナトリアルライブラリをスクリーニングすることによって単離してもよい。例えば、ファージディスプレイライブラリの生成や、所望の結合特性を備える抗原結合分子についてそのようなライブラリをスクリーニングするための、様々な方法が当該技術分野において知られている。そのような方法は、Hoogenboom et al. in Methods in Molecular Biology 178:1-37 (O'Brien et al., ed., Human Press, Totowa, NJ, 2001) において総説されており、さらに例えば、McCafferty et al., Nature 348:552-554；Clackson et al., Nature 352: 624-628 (1991)； Marks et al., J. Mol. Biol. 222: 581-597 (1992)； Marks and Bradbury, in Methods in Molecular Biology 248:161-175 (Lo, ed., Human Press, Totowa, NJ, 2003)； Sidhu et al., J. Mol. Biol. 338(2): 299-310 (2004)； Lee et al., J. Mol. Biol. 340(5): 1073-1093 (2004)； Fellouse, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101(34):12467-12472 (2004)；およびLee et al., J. Immunol. Methods 284(1-2): 119-132(2004) に記載されている。
【０１５７】
６．多重特異性抗原結合分子
特定の態様において、本明細書で提供される抗原結合分子は、多重特異性抗原結合分子（例えば、二重特異性抗原結合分子）である。多重特異性抗原結合分子は、少なくとも2つの異なる部位に結合特異性を有する、モノクローナル抗原結合分子である。特定の態様において、結合特異性の1つは、ある特定の抗原（例えばCD3など）に対するものであり、もう1つは他の任意の抗原（例えばCD28や癌抗原など）へのものである。特定の態様において、二重特異性抗原結合分子は、ある１つの抗原上の異なった2つのエピトープに結合してもよい。二重特異性抗原結合分子は、全長抗体としてまたは抗体断片として調製され得る。
【０１５８】
多重特異性抗原結合分子を作製するための手法は、これらに限定されるものではないが、異なる特異性を有する2つの免疫グロブリン重鎖−軽鎖ペアの組み換え共発現（Milstein and Cuello, Nature 305: 537 (1983)、WO93/08829、およびTraunecker et al., EMBO J. 10: 3655 (1991) 参照）、およびknob-in-hole技術（例えば、米国特許第5,731,168号参照）を含む。多重特異性抗原結合分子は、Fcヘテロ二量体分子を作製するために静電ステアリング効果 (electrostatic steering effects) を操作すること (WO2009/089004A1)；2つ以上の抗体または断片を架橋すること（米国特許第4,676,980号およびBrennan et al., Science, 229: 81 (1985)参照）；ロイシンジッパーを用いて2つの特異性を有する抗体を作成すること（Kostelny et al., J. Immunol., 148(5):1547-1553 (1992) 参照）；「ダイアボディ」技術を用いて二重特異性抗体断片を作製すること（Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448 (1993) 参照）；および、単鎖Fv (scFv) 二量体を用いること（Gruber et al., J. Immunol., 152:5368 (1994) 参照）；および、例えばTutt et al. J. Immunol. 147: 60 (1991) に記載されるように三重特異性抗体を調製すること、によって作製してもよい。
【０１５９】
「オクトパス抗体」を含む、3つ以上の機能的抗原結合部位を伴う改変抗体も、本明細書では含まれる（例えば、米国特許出願公開第2006/0025576号A1参照）。
【０１６０】
７．抗原結合分子変異体
特定の態様において、本明細書で提供される抗原結合分子のアミノ酸配列変異体も、考慮の内である。例えば、抗原結合分子の結合アフィニティおよび／または他の生物学的特性を改善することが、望ましいこともある。抗原結合分子のアミノ酸配列変異体は、抗原結合分子をコードするヌクレオチド配列に適切な修飾を導入すること、または、ペプチド合成によって、調製されてもよい。そのような修飾は、例えば、抗原結合分子のアミノ酸配列からの欠失、および／または抗原結合分子のアミノ酸配列中への挿入、および／または抗原結合分子のアミノ酸配列中の残基の置換を含む。最終構築物が所望の特徴（例えば、抗原結合性）を備えることを前提に、欠失、挿入、および置換の任意の組合せが、最終構築物に至るために行われ得る。
【０１６１】
ａ）置換、挿入、および欠失変異体
特定の態様において、1つまたは複数のアミノ酸置換を有する抗原結合分子変異体が提供される。置換的変異導入の目的部位は、HVRおよびFRを含む。保存的置換を、以下の表の「好ましい置換」の見出しの下に示す。より実質的な変更を、当該表の「例示的な置換」の見出しの下に提供するとともに、アミノ酸側鎖のクラスに言及しつつ下で詳述する。アミノ酸置換は目的の抗原結合分子に導入されてもよく、産物は、例えば、保持／改善された抗原結合性、減少した免疫原性、または改善したADCCまたはCDCなどの、所望の活性についてスクリーニングされてもよい。
【０１６２】
2020027330.tif 000003
【０１６３】
アミノ酸は、共通の側鎖特性によって群に分けることができる：
(1) 疎水性：ノルロイシン、メチオニン (Met)、アラニン (Ala)、バリン (Val)、ロイシン (Leu)、イソロイシン (Ile)；
(2) 中性の親水性：システイン (Cys)、セリン (Ser)、トレオニン (Thr)、アスパラギン (Asn)、グルタミン (Gln)；
(3) 酸性：アスパラギン酸 (Asp)、グルタミン酸 (Glu)；
(4) 塩基性：ヒスチジン (His)、リジン (Lys)、アルギニン (Arg)；
(5) 鎖配向に影響する残基：グリシン (Gly)、プロリン (Pro)；
(6) 芳香族性：トリプトファン (Trp)、チロシン (Tyr)、フェニルアラニン (Phe)。
非保存的置換は、これらのクラスの1つのメンバーを、別のクラスのものに交換することをいう。
【０１６４】
置換変異体の1つのタイプは、親抗原結合分子（例えば、ヒト化またはヒト抗体）の1つまたは複数の超可変領域残基の置換を含む。通常、その結果として生じ、さらなる研究のために選ばれた変異体は、親抗原結合分子と比較して特定の生物学的特性における修飾（例えば、改善）（例えば、増加したアフィニティ、減少した免疫原性）を有する、および／または親抗原結合分子の特定の生物学的特性を実質的に保持しているであろう。例示的な置換変異体は、アフィニティ成熟抗体であり、これは、例えばファージディスプレイベースのアフィニティ成熟技術（例えば本明細書に記載されるもの）を用いて適宜作製され得る。簡潔に説明すると、1つまたは複数のHVR残基を変異させ、そして変異抗体をファージ上に提示させ、特定の生物学的活性（例えば、結合アフィニティ）に関してスクリーニングを行う。
【０１６５】
改変（例えば、置換）は、例えば抗原結合分子のアフィニティを改善するために、HVRにおいて行われ得る。そのような改変は、HVRの「ホットスポット」、すなわち、体細胞成熟プロセスの間に高頻度で変異が起こるコドンによってコードされる残基（例えば、Chowdhury, Methods Mol. Biol. 207:179-196 (2008) を参照のこと）および／または抗原に接触する残基において行われ得、得られた変異VHまたはVLが結合アフィニティに関して試験され得る。二次ライブラリからの構築および再選択によるアフィニティ成熟が、例えば、Hoogenboom et al. in Methods in Molecular Biology 178:1-37 (O’Brien et al., ed., Human Press, Totowa, NJ, (2001)) に記載されている。アフィニティ成熟のいくつかの態様において、多様性は、任意の様々な方法（例えば、エラープローンPCR、チェーンシャッフリングまたはオリゴヌクレオチド指向変異導入）によって成熟のために選択された可変遺伝子に導入される。次いで、二次ライブラリが作製される。次いで、このライブラリは、所望のアフィニティを有する任意の抗原結合分子変異体を同定するためにスクリーニングされる。多様性を導入する別の方法は、いくつかのHVR残基（例えば、一度に4〜6残基）を無作為化するHVR指向アプローチを含む。抗原結合に関与するHVR残基は、例えばアラニンスキャニング変異導入またはモデリングを用いて、具体的に特定され得る。特に、CDR-H3およびCDR-L3がしばしば標的化される。
【０１６６】
特定の態様において、置換、挿入、または欠失は、そのような改変が抗原に結合する抗原結合分子の能力を実質的に減少させない限り、1つまたは複数のHVR内で行われ得る。例えば、結合アフィニティを実質的に減少させない保存的改変（例えば、本明細書で提供されるような保存的置換）が、HVRにおいて行われ得る。そのような改変は、例えば、HVRの抗原接触残基の外側であり得る。上記の変異VHおよびVL配列の特定の態様において、各HVRは改変されていないか、わずか1つ、2つ、もしくは3つのアミノ酸置換を含む。
【０１６７】
変異導入のために標的化され得る抗原結合分子の残基または領域を同定するのに有用な方法は、Cunningham and Wells (1989) Science, 244:1081-1085によって記載される、「アラニンスキャニング変異導入」と呼ばれるものである。この方法において、一残基または一群の標的残基（例えば、荷電残基、例えばアルギニン、アスパラギン酸、ヒスチジン、リジン、およびグルタミン酸）が同定され、中性または負に荷電したアミノ酸（例えば、アラニンもしくはポリアラニン）で置き換えられ、抗原結合分子と抗原の相互作用が影響を受けるかどうかが決定される。この初期置換に対して機能的感受性を示したアミノ酸位置に、さらなる置換が導入され得る。あるいはまたは加えて、抗原結合分子と抗原の間の接触点を同定するために、抗原と抗原結合分子の複合体の結晶構造を解析してもよい。そのような接触残基および近隣の残基を、置換候補として標的化してもよく、または置換候補から除外してもよい。変異体は、それらが所望の特性を含むかどうかを決定するためにスクリーニングされ得る。
【０１６８】
アミノ酸配列の挿入は、配列内部への単一または複数のアミノ酸残基の挿入と同様、アミノ末端および／またはカルボキシル末端における1残基から100残基以上を含むポリペプチドの長さの範囲での融合も含む。末端の挿入の例は、N末端にメチオニル残基を伴う抗原結合分子を含む。抗原結合分子の他の挿入変異体は、抗原結合分子のN-またはC-末端に、酵素（例えば、ADEPTのための）または抗原結合分子の血漿半減期を増加させるポリペプチドを融合させたものを含む。
【０１６９】
ｂ）グリコシル化変異体
特定の態様において、本明細書で提供される抗原結合分子は、抗原結合分子がグリコシル化される程度を増加させるまたは減少させるように改変されている。抗原結合分子へのグリコシル化部位の追加または削除は、1つまたは複数のグリコシル化部位を作り出すまたは取り除くようにアミノ酸配列を改変することにより、簡便に達成可能である。
【０１７０】
抗原結合分子がFc領域を含む場合、そこに付加される炭水化物が改変されてもよい。哺乳動物細胞によって産生される天然型抗体は、典型的には、枝分かれした二分岐のオリゴ糖を含み、当該オリゴ糖は通常Fc領域のCH2ドメインのAsn297にN-リンケージによって付加されている。例えば、Wright et al. TIBTECH 15:26-32 (1997) 参照。オリゴ糖は、例えば、マンノース、N‐アセチルグルコサミン (GlcNAc)、ガラクトース、およびシアル酸などの種々の炭水化物、また、二分岐のオリゴ糖構造の「幹」中のGlcNAcに付加されたフコースを含む。いくつかの態様において、本発明の抗原結合分子中のオリゴ糖の修飾は、特定の改善された特性を伴う抗原結合分子変異体を作り出すために行われてもよい。
【０１７１】
一態様において、Fc領域に（直接的または間接的に）付加されたフコースを欠く炭水化物構造体を有する抗原結合分子変異体が提供される。例えば、そのような抗原結合分子におけるフコースの量は、1％〜80％、1％〜65％、5％〜65％または20％〜40％であり得る。フコースの量は、例えばWO2008/077546に記載されるようにMALDI-TOF質量分析によって測定される、Asn297に付加されたすべての糖構造体（例えば、複合、ハイブリッド、および高マンノース構造体）の和に対する、Asn297における糖鎖内のフコースの平均量を計算することによって決定される。Asn297は、Fc領域の297位のあたりに位置するアスパラギン残基を表す（Fc領域残基のEUナンバリング）。しかし、複数の抗原結合分子間のわずかな配列の多様性に起因して、Asn297は、297位の±3アミノ酸上流または下流、すなわち294位〜300位の間に位置することもあり得る。そのようなフコシル化変異体は、改善されたADCC機能を有し得る。例えば、米国特許出願公開第2003/0157108号 (Presta, L.) ；第2004/0093621号 (Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd) を参照のこと。「脱フコシル化」または「フコース欠損」抗原結合分子変異体に関する刊行物の例は、US2003/0157108; WO2000/61739; WO2001/29246; US2003/0115614; US2002/0164328; US2004/0093621; US2004/0132140; US2004/0110704; US2004/0110282; US2004/0109865; WO2003/085119; WO2003/084570; WO2005/035586; WO2005/035778; WO2005/053742; WO2002/031140; Okazaki et al. J. Mol. Biol. 336:1239-1249 (2004); Yamane-Ohnuki et al. Biotech. Bioeng. 87: 614 (2004) を含む。脱フコシル化抗原結合分子を産生することができる細胞株の例は、タンパク質のフコシル化を欠くLec13 CHO細胞（Ripka et al. Arch. Biochem. Biophys. 249:533-545 (1986)；米国特許出願公開第US2003/0157108号A1、Presta, L；およびWO2004/056312A1、Adams et al.、特に実施例11）およびノックアウト細胞株、例えばアルファ-1,6-フコシルトランスフェラーゼ遺伝子FUT8ノックアウトCHO細胞（例えば、Yamane-Ohnuki et al. Biotech. Bioeng. 87: 614 (2004)；Kanda, Y. et al., Biotechnol. Bioeng., 94(4):680-688 (2006)；およびWO2003/085107を参照のこと）を含む。
【０１７２】
例えば抗原結合分子のFc領域に付加された二分枝型オリゴ糖がGlcNAcによって二分されている、二分されたオリゴ糖を有する抗原結合分子変異体がさらに提供される。そのような抗原結合分子変異体は、減少したフコシル化および／または改善されたADCC機能を有し得る。そのような抗原結合分子変異体の例は、例えば、WO2003/011878 (Jean-Mairet et al.) ；米国特許第6,602,684号 (Umana et al.)；およびUS2005/0123546 (Umana et al.) に記載されている。Fc領域に付加されたオリゴ糖中に少なくとも1つのガラクトース残基を有する抗原結合分子変異体も提供される。そのような抗原結合分子変異体は、改善されたCDC機能を有し得る。そのような抗原結合分子変異体は、例えば、WO1997/30087 (Patel et al.)；WO1998/58964 (Raju, S.)； およびWO1999/22764 (Raju, S.) に記載されている。
【０１７３】
ｃ）Fc領域変異体
特定の態様において、本明細書で提供される抗原結合分子のFc領域に1つまたは複数のアミノ酸修飾を導入して、それによりFc領域変異体を生成してもよい。Fc領域変異体は、1つまたは複数のアミノ酸ポジションのところでアミノ酸修飾（例えば、置換）を含む、ヒトFc領域配列（例えば、ヒトIgG1、IgG2、IgG3、またはIgG4のFc領域）を含んでもよい。
【０１７４】
特定の態様において、すべてではないがいくつかのエフェクター機能を備える抗原結合分子変異体も、本発明の考慮の内であり、当該エフェクター機能は、抗原結合分子を、そのインビボでの半減期が重要であるが、特定のエフェクター機能（補体およびADCCなど）は不要または有害である場合の適用に望ましい候補とするものである。CDCおよび／またはADCC活性の減少／欠乏を確認するために、インビトロ および／またはインビボ の細胞傷害測定を行うことができる。例えば、Fc受容体（FcR）結合測定は、抗原結合分子がFcγR結合性を欠く（よってADCC活性を欠く蓋然性が高い）一方でFcRn結合能を維持することを確かめるために行われ得る。ADCCを媒介するプライマリ細胞であるNK細胞はFcγRIIIのみを発現するが、一方単球はFcγRI、FcγRII、FcγRIIIを発現する。造血細胞上のFcRの発現は、Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol. 9:457-492 (1991) の第464頁のTable 3にまとめられている。目的の分子のADCC活性を評価するためのインビトロ測定法（アッセイ）の非限定的な例は、米国特許第5,500,362号（例えば、 Hellstrom, I. et al. Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 83:7059-7063 (1986) 参照）および Hellstrom, I et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 82:1499-1502 (1985)；米国特許第5,821,337号（Bruggemann, M. et al., J. Exp. Med. 166:1351-1361 (1987) 参照）に記載されている。あるいは、非放射性の測定法を用いてもよい（例えば、ACT1（商標）non-radioactive cytotoxicity assay for flow cytometry (CellTechnology, Inc. Mountain View, CA)；および、CytoTox 96（登録商標）non-radioactive cytotoxicity assays 法 (Promega, Madison, WI) 参照）。このような測定法に有用なエフェクター細胞は、末梢血単核細胞 (peripheral blood mononuclear cell: PBMC) およびナチュラルキラー (natural killer: NK) 細胞を含む。あるいはまたは加えて、目的の分子のADCC活性は、例えば、Clynes et al. Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 95:652-656 (1998) に記載されるような動物モデルにおいて、インビボで評価されてもよい。また、抗原結合分子がC1qに結合できないこと、よってCDC活性を欠くことを確認するために、C1q結合測定を行ってもよい。例えば、WO2006/029879 および WO2005/100402のC1qおよびC3c結合ELISAを参照のこと。また、補体活性化を評価するために、CDC測定を行ってもよい（例えば、Gazzano-Santoro et al., J. Immunol. Methods 202:163 (1996)；Cragg, M.S. et al., Blood 101:1045-1052 (2003)；およびCragg, M.S. and M.J. Glennie, Blood 103:2738-2743 (2004) 参照）。さらに、FcRn結合性およびインビボでのクリアランス／半減期の決定も、当該技術分野において知られた方法を用いて行い得る（例えばPetkova, S.B. et al., Int'l. Immunol. 18(12):1759-1769 (2006) 参照）。
【０１７５】
減少したエフェクター機能を伴う抗原結合分子は、Fc領域残基238、265、269、270、297、327、および329の1つまたは複数の置換を伴うものを含む（米国特許第6,737,056号）。このようなFc変異体は、残基265および297のアラニンへの置換を伴ういわゆる「DANA」Fc変異体（米国特許第7,332,581号）を含む、アミノ酸ポジション265、269、270、297、および327の2つ以上の置換を伴うFc変異体を含む。
【０１７６】
FcRsへの増加または減少した結合性を伴う特定の抗原結合分子変異体が、記述されている。（米国特許第6,737,056号；WO2004/056312、およびShields et al., J. Biol. Chem. 9(2): 6591-6604 (2001) を参照のこと。）
【０１７７】
特定の態様において、抗原結合分子変異体は、ADCCを改善する1つまたは複数のアミノ酸置換（例えば、Fc領域のポジション298、333、および／または334（EUナンバリングでの残基）のところでの置換）を伴うFc領域を含む。
【０１７８】
いくつかの態様において、例えば米国特許第6,194,551号、WO99/51642、およびIdusogie et al. J. Immunol. 164: 4178-4184 (2000) に記載されるように、改変された（つまり、増加したか減少したかのいずれかである）C1q結合性および／または補体依存性細胞傷害 (CDC) をもたらす改変が、Fc領域においてなされる。
【０１７９】
増加した半減期、および新生児型Fc受容体（FcRn：母体のIgG類を胎児に移行させる役割を負う（Guyer et al., J. Immunol. 117:587 (1976) and Kim et al., J. Immunol. 24:249 (1994)））に対する増加した結合性を伴う抗体が、米国特許出願公開第2005/0014934号A1(Hinton et al.) に記載されている。これらの抗体は、Fc領域のFcRnへの結合性を増加する1つまたは複数の置換をその中に伴うFc領域を含む。このようなFc変異体は、Fc領域残基：238、256、265、272、286、303、305、307、311、312、317、340、356、360、362、376、378、380、382、413、424、または434の1つまたは複数のところでの置換（例えば、Fc領域残基434の置換（米国特許第7,371,826号））を伴うものを含む。
【０１８０】
Fc領域変異体の他の例については、Duncan & Winter, Nature 322:738-40 (1988)；米国特許第5,648,260号；米国特許第5,624,821号；およびWO94/29351も参照のこと。
【０１８１】
ｄ）システイン改変抗原結合分子変異体
特定の態様において、抗原結合分子の1つまたは複数の残基がシステイン残基で置換された、システイン改変抗原結合分子（例えば、「thioMAbs」）を作り出すことが望ましいだろう。特定の態様において、置換を受ける残基は、抗原結合分子の、アクセス可能な部位に生じる。それらの残基をシステインで置換することによって、反応性のチオール基が抗原結合分子のアクセス可能な部位に配置され、当該反応性のチオール基は、当該抗原結合分子を他の部分（薬剤部分またはリンカー‐薬剤部分など）にコンジュゲートして本明細書でさらに詳述するようにイムノコンジュゲートを作り出すのに使用されてもよい。特定の態様において、以下の残基の任意の1つまたは複数が、システインに置換されてよい：軽鎖のV205（Kabatナンバリング）；重鎖のA118（EUナンバリング）；および重鎖Fc領域のS400（EUナンバリング）。システイン改変抗原結合分子は、例えば、米国特許第7,521,541号に記載されるようにして生成されてもよい。
【０１８２】
ｅ）抗原結合分子誘導体
特定の態様において、本明細書で提供される抗原結合分子は、当該技術分野において知られておりかつ容易に入手可能な追加の非タンパク質部分を含むように、さらに修飾されてもよい。抗原結合分子の誘導体化に好適な部分は、これに限定されるものではないが、水溶性ポリマーを含む。水溶性ポリマーの非限定的な例は、これらに限定されるものではないが、ポリエチレングリコール (PEG)、エチレングリコール／プロピレングリコールのコポリマー、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリ１,3ジオキソラン、ポリ1,3,6,トリオキサン、エチレン／無水マレイン酸コポリマー、ポリアミノ酸（ホモポリマーまたはランダムコポリマーのいずれでも）、および、デキストランまたはポリ（n-ビニルピロリドン）ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコールホモポリマー、ポリプロピレンオキシド／エチレンオキシドコポリマー、ポリオキシエチル化ポリオール類（例えばグリセロール）、ポリビニルアルコール、および、これらの混合物を含む。ポリエチレングリコールプロピオンアルデヒドは、その水に対する安定性のために、製造において有利であるだろう。ポリマーは、いかなる分子量でもよく、枝分かれしていてもしていなくてもよい。抗原結合分子に付加されるポリマーの数には幅があってよく、1つ以上のポリマーが付加されるならそれらは同じ分子であってもよいし、異なる分子であってもよい。一般的に、誘導体化に使用されるポリマーの数および／またはタイプは、これらに限定されるものではないが、改善されるべき抗原結合分子の特定の特性または機能、抗原結合分子誘導体が規定の条件下での療法に使用されるか否か、などへの考慮に基づいて、決定することができる。
【０１８３】
本開示の抗原結合分子との関連において、所望の特性（活性）は、特に限定されるものではないが、例えば、結合活性、中和活性、細胞傷害活性、アゴニスト活性、アンタゴニスト活性、酵素活性等を挙げることができる。アゴニスト活性とは、受容体などの抗原に抗体が結合することにより、細胞内にシグナルが伝達される等して、何らかの生理的活性の変化を誘導する活性である。生理的活性としては、例えば、増殖活性、生存活性、分化活性、転写活性、膜輸送活性、結合活性、タンパク質分解活性、リン酸化／脱リン酸化活性、酸化還元活性、転移活性、核酸分解活性、脱水活性、細胞死誘導活性、アポトーシス誘導活性等を挙げることができるが、これらに限定されない。
【０１８４】
別の態様において、抗原結合分子と、放射線に曝露することにより選択的に熱せられ得る非タンパク質部分との、コンジュゲートが提供される。一態様において、非タンパク質部分は、カーボンナノチューブである（Kam et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102: 11600-11605 (2005)）。放射線はいかなる波長でもよく、またこれらに限定されるものではないが、通常の細胞には害を与えないが抗原結合分子‐非タンパク質部分に近接した細胞を死滅させる温度まで非タンパク質部分を熱するような波長を含む。
【０１８５】
Ｂ．組み換えの方法および構成
例えば、米国特許第4,816,567号に記載されるとおり、抗原結合分子は組み換えの方法や構成を用いて製造することができる。一態様において、本開示の抗原結合分子（本明細書に記載の抗原結合ドメインを含むポリペプチド）をコードする、単離された核酸が提供される。そのような核酸は、抗原結合分子のVLを含むアミノ酸配列および／またはVHを含むアミノ酸配列（例えば、抗原結合分子の軽鎖および／または重鎖）をコードしてもよい。さらなる態様において、このような核酸を含む1つまたは複数のベクター（例えば、発現ベクター）が提供される。さらなる態様において、このような核酸を含む宿主細胞が提供される。このような態様の1つでは、宿主細胞は、(1)抗原結合分子のVLを含むアミノ酸配列および抗原結合分子のVHを含むアミノ酸配列をコードする核酸を含むベクター、または、(2)抗原結合分子のVLを含むアミノ酸配列をコードする核酸を含む第一のベクターと抗原結合分子のVHを含むアミノ酸配列をコードする核酸を含む第二のベクターを含む（例えば、形質転換されている）。一態様において、宿主細胞は、真核性である（例えば、チャイニーズハムスター卵巣 (CHO) 細胞）またはリンパ系の細胞（例えば、Y0、NS0、Sp2/0細胞））。一態様において、本開示の抗原結合分子の発現に好適な条件下で、上述のとおり当該抗原結合分子をコードする核酸を含む宿主細胞を培養すること、および任意で、当該抗原結合分子を宿主細胞（または宿主細胞培養培地）から回収することを含む、抗原結合分子を作製する方法が提供される。
【０１８６】
本開示の抗原結合分子の組み換え製造のために、（例えば、上述したものなどの）抗原結合分子をコードする核酸を単離し、さらなるクローニングおよび／または宿主細胞中での発現のために、1つまたは複数のベクターに挿入する。そのような核酸は、従来の手順を用いて容易に単離および配列決定されるだろう（例えば、抗原結合分子の重鎖および軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合することができるオリゴヌクレオチドプローブを用いることで）。
【０１８７】
抗原結合分子をコードするベクターのクローニングまたは発現に好適な宿主細胞は、本明細書に記載の原核細胞または真核細胞を含む。例えば、抗原結合分子は、特にグリコシル化およびFcエフェクター機能が必要とされない場合は、細菌で製造してもよい。細菌での抗体断片およびポリペプチドの発現に関して、例えば、米国特許第5,648,237号、第5,789,199号、および第5,840,523号を参照のこと。（加えて、大腸菌における抗体断片の発現について記載したCharlton, Methods in Molecular Biology, Vol. 248 (B.K.C. Lo, ed., Humana Press, Totowa, NJ, 2003), pp.245-254も参照のこと。）発現後、抗原結合分子は細菌細胞ペーストから可溶性フラクション中に単離されてもよく、またさらに精製することができる。
【０１８８】
原核生物に加え、部分的なまたは完全なヒトのグリコシル化パターンを伴う抗原結合分子の産生をもたらす、グリコシル化経路が「ヒト化」されている菌類および酵母の株を含む、糸状菌または酵母などの真核性の微生物は、抗原結合分子コードベクターの好適なクローニングまたは発現宿主である。Gerngross, Nat. Biotech. 22:1409-1414 (2004)および Li et al., Nat. Biotech. 24:210-215 (2006) を参照のこと。
【０１８９】
多細胞生物（無脊椎生物および脊椎生物）に由来するものもまた、グリコシル化された抗原結合分子の発現のために好適な宿主細胞である。無脊椎生物細胞の例は、植物および昆虫細胞を含む。昆虫細胞との接合、特にSpodoptera frugiperda細胞の形質転換に用いられる、数多くのバキュロウイルス株が同定されている。
【０１９０】
植物細胞培養物も、宿主として利用することができる。例えば、米国特許第5,959,177号、第6,040,498号、第6,420,548号、第7,125,978号、および第6,417,429号（トランスジェニック植物で抗原結合分子を産生するための、PLANTIBODIES（商標）技術を記載）を参照のこと。
【０１９１】
脊椎動物細胞もまた宿主として使用できる。例えば、浮遊状態で増殖するように適応された哺乳動物細胞株は、有用であろう。有用な哺乳動物宿主細胞株の他の例は、SV40で形質転換されたサル腎CV1株 (COS-7)；ヒト胎児性腎株（Graham et al., J. Gen Virol. 36:59 (1977) などに記載の293または293細胞）；仔ハムスター腎細胞 (BHK)；マウスセルトリ細胞（Mather, Biol. Reprod. 23:243-251 (1980) などに記載のTM4細胞）；サル腎細胞 (CV1)；アフリカミドリザル腎細胞 (VERO-76)；ヒト子宮頸部癌細胞 (HELA)；イヌ腎細胞 (MDCK)；Buffalo系ラット肝細胞 (BRL 3A)；ヒト肺細胞 (W138)；ヒト肝細胞 (Hep G2)；マウス乳癌 (MMT 060562)；TRI細胞（例えば、Mather et al., Annals N.Y. Acad. Sci. 383:44-68 (1982) に記載）；MRC5細胞；および、FS4細胞などである。他の有用な哺乳動物宿主細胞株は、DHFR− CHO細胞 (Urlaub et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216 (1980)) を含むチャイニーズハムスター卵巣 (CHO) 細胞；およびY0、NS0、およびSp2/0などの骨髄腫細胞株を含む。抗原結合分子産生に好適な特定の哺乳動物宿主細胞株の総説として、例えば、Yazaki and Wu, Methods in Molecular Biology, Vol. 248 (B.K.C. Lo, ed., Humana Press, Totowa, NJ), pp. 255-268 (2003) を参照のこと。
【０１９２】
Ｃ．測定法（アッセイ）
本明細書で提供される抗原結合分子は、当該技術分野において知られている種々の測定法によって、同定され、スクリーニングされ、または物理的／化学的特性および／または生物学的活性について明らかにされてもよい。
【０１９３】
１．結合測定法およびその他の測定法
一局面において、本開示の抗原結合分子は、例えばELISA、ウエスタンブロット等の公知の方法によって、その抗原結合活性に関して試験される。
【０１９４】
２．活性測定法
一局面において、生物学的活性を有する抗原結合分子のそれを同定するための測定法が提供される。生物学的活性は、例えば、２つの抗原分子を空間的に近接した位置に保持する活性、２つの抗原分子間での相互作用を制御する活性、リガンドによる受容体の活性化を促進する活性、酵素の基質に対する触媒反応を促進する活性、第一の抗原を発現する細胞と第二の抗原を発現する細胞との間での相互作用を促進する活性、細胞障害活性を有する細胞（例えばＴ細胞、ＮＫ細胞、単球、マクロファージなど）による標的となる細胞の障害を促進する活性、互いに会合することによって活性化される２つの抗原分子の活性化を制御する活性、およびプロテアーゼ切断に対する抵抗性を含んでよい。また、このような生物学的活性をインビボおよび／またはインビトロで有する抗原結合分子が、提供される。
【０１９５】
また、本開示の抗原結合分子は、それが結合する抗原分子の種類に依存して、種々の生物学的活性を発揮することができる。そのような抗原結合分子の例としては、T細胞受容体（TCR）複合体（例えばCD3）に結合する抗原結合分子であって、T細胞の活性化を誘導する活性（アゴニスト活性）を有する抗原結合分子；TNF受容体スーパーファミリー（例えば、OX40や4-1BB）や他の共刺激分子（例えばCD28やICOS）に結合する抗原結合分子であって、当該活性化を促進する活性（アゴニスト活性）を有する抗原結合分子；等を挙げることができる。特定の態様において、そのような抗原分子との結合を介して発揮される生物学的活性は、本開示の抗原結合分子に含まれる２つ以上の抗原結合ドメインの連結によって増強または減弱される。理論によって限定されるものではないが、特定の態様において、そのような増強または減弱は、本開示の抗原結合分子との結合によって２つ以上の抗原分子間の相互作用が制御される（例えば、２つ以上の抗原分子の会合が促進される）ことによって達成されうる。
【０１９６】
特定の態様において、本開示の抗原結合分子は、このような生物学的活性について試験される。２つの抗原分子が空間的に近接しているかどうかは、抗原および抗原結合分子からなる複合体の結晶構造解析や電子顕微鏡観察、電子線トモグラフィー（electron tomography）による構造解析などの手法を用いて評価を行うことができる。２つの抗原結合ドメインが空間的に近接しているかどうか、あるいは２つの抗原結合ドメインの可動性が減少しているかどうかも上記と同様の手法を用いて評価を行うことができる。特に、電子線トモグラフィーを用いたIgG分子の三次元構造の解析手法については、Zhang et al., Sci. Rep. 5:9803 (2015) などを参照されたい。電子線トモグラフィーでは、測定対象の分子が取り得る構造の出現頻度をヒストグラムで表すことが可能なため、ドメインの可動性の減少といった構造的変化を分布で評価することができる。例えば、２つのドメイン間の距離や角度といった構造に関するパラメーターが取り得る数値とその出現頻度との関係をヒストグラムで表した場合、その分布範囲が減少すれば、２つのドメインの可動性も減少したと判断することができる。２つの抗原分子が相互作用等することによって発揮される活性については、対象となる抗原分子の種類に応じて、公知の活性測定系の中から適切なものを選択し、それらを用いて評価を行うことができる。プロテアーゼ切断に対する影響については、当業者公知の方法、あるいは後述の実施例に記載の方法などを用いて評価を行うことができる。
【０１９７】
Ｄ．薬学的製剤（医薬組成物）
本明細書に記載の抗原結合分子の薬学的製剤は、所望の純度を有する抗原結合分子を、1つまたは複数の任意の薬学的に許容される担体 (Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)) と混合することによって、凍結乾燥製剤または水溶液の形態で、調製される。薬学的に許容される担体は、概して、用いられる際の用量および濃度ではレシピエントに対して非毒性であり、これらに限定されるものではないが、以下のものを含む：リン酸塩、クエン酸塩、および他の有機酸などの緩衝液；アスコルビン酸およびメチオニンを含む、抗酸化剤；保存料（オクタデシルジメチルベンジル塩化アンモニウム；塩化ヘキサメトニウム；塩化ベンザルコニウム；塩化ベンゼトニウム；フェノール、ブチル、またはベンジルアルコール；メチルまたはプロピルパラベンなどのアルキルパラベン；カテコール；レソルシノール；シクロヘキサノール；3-ペンタノール；およびm-クレゾールなど）；低分子（約10残基未満）ポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチン、または免疫グロブリンなどのタンパク質；ポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、またはリジンなどのアミノ酸；グルコース、マンノース、またはデキストリンを含む、単糖、二糖、および他の炭水化物；EDTAなどのキレート剤；スクロース、マンニトール、トレハロース、ソルビトールなどの、砂糖類；ナトリウムなどの塩形成対イオン類；金属錯体（例えば、Zn-タンパク質錯体）；および／またはポリエチレングリコール (PEG) などの非イオン系表面活性剤。本明細書の例示的な薬学的に許容される担体は、さらに、可溶性中性活性型ヒアルロニダーゼ糖タンパク質 (sHASEGP)（例えば、rHuPH20 (HYLENEX（登録商標）、Baxter International, Inc.) などのヒト可溶性PH-20ヒアルロニダーゼ糖タンパク質）などの間質性薬剤分散剤を含む。特定の例示的sHASEGPおよびその使用方法は（rHuPH20を含む）、米国特許出願公開第2005/0260186号および第2006/0104968号に記載されている。一局面において、sHASEGPは、コンドロイチナーゼなどの1つまたは複数の追加的なグリコサミノグリカナーゼと組み合わせられる。
【０１９８】
例示的な凍結乾燥抗原結合分子製剤は、米国特許第6,267,958号に記載されている。水溶液抗原結合分子製剤は、米国特許第6,171,586号およびWO2006/044908に記載のものを含み、後者の製剤はヒスチジン−アセテート緩衝液を含んでいる。
【０１９９】
本明細書の製剤は、治療される特定の適応症のために必要であれば1つより多くの有効成分を含んでもよい。互いに悪影響を与えあわない相補的な活性を伴うものが好ましい。このような有効成分は、意図された目的のために有効である量で、好適に組み合わせられて存在する。
【０２００】
有効成分は、例えば液滴形成（コアセルベーション）手法によってまたは界面重合によって調製されたマイクロカプセル（それぞれ、例えば、ヒドロキシメチルセルロースまたはゼラチンマイクロカプセル、およびポリ（メタクリル酸メチル）マイクロカプセル）に取り込まれてもよいし、コロイド状薬剤送達システム（例えば、リポソーム、アルブミン小球体、マイクロエマルション、ナノ粒子、およびナノカプセル）に取り込まれてもよいし、マクロエマルションに取り込まれてもよい。このような手法は、Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980) に開示されている。
【０２０１】
徐放性製剤を調製してもよい。徐放性製剤の好適な例は、抗原結合分子を含んだ固体疎水性ポリマーの半透過性マトリクスを含み、当該マトリクスは例えばフィルムまたはマイクロカプセルなどの造形品の形態である。
【０２０２】
生体内 (in vivo) 投与のために使用される製剤は、通常無菌である。無菌状態は、例えば滅菌ろ過膜を通して濾過することなどにより、容易に達成される。
【実施例】
【０２０３】
以下は、本開示の抗原結合分子および方法の実施例である。上述の一般的な記載に照らし、種々の他の態様が実施され得ることが、理解されるであろう。【０２０４】
〔実施例１〕Fab架橋抗体のコンセプト
アゴニスト抗体は天然リガンドやその融合タンパク質と比較し安定性や薬物動態、製造手法等において優れた特性を持ち医薬品としての開発が進められている。しかしながら、単なる結合抗体や中和抗体に比べ強力な活性を持つアゴニスト抗体の取得は一般的に困難であり、その課題の解決手法が求められている。
アゴニスト抗体に必要とされる特性はリガンドの種類に依存すると考えられ、Death receptor（DR）、OX40、4-1BB、CD40等に代表されるTNF受容体スーパーファミリー（TNF receptor superfamily）に対するアゴニスト抗体は、その活性化に抗体およびリガンドの多量体化が寄与する事が報告されている。この作用を高める手法として、天然リガンドの利用、抗Fc抗体による架橋、FcγRsを介した架橋、抗体結合ドメインの多量体化、抗体Fcを介した多量体化等によりアゴニスト活性が増強する事が報告されている。また、多量体化によらず、抗体のFab構造やscFvを用いた抗原結合部位の距離の調整等も抗原の種類によってはアゴニスト活性の増強につながることが知られている。
他の手法として、サイトカイン受容体に対するアゴニスト抗体として、同一抗原内の異なるエピトープにそれぞれ結合できる二重特異性抗体の例が報告されている。更に、化学的コンジュゲーション法を用いることで、同様に二種類のFabを架橋しアゴニスト活性を向上させる手法が報告されている。
上記以外にも、アゴニスト抗体の活性を向上させる手法が求められているが、それを達成する簡便な方法は報告されていない。そこで、発明者らは最小限の変異導入によりFab同士を架橋する手法を開発し、実際にアゴニスト活性が増強されることを示しこれを発明として完成させた。一例となる態様を図1に示す。【０２０５】
〔実施例２〕改変抗体の発現ベクターの作製および改変抗体の発現と精製
動物細胞用発現ベクターに挿入された抗体遺伝子について、PCRまたはIn fusion Advantage PCR cloning kit (TAKARA)等を用いて当業者公知の方法でアミノ酸残基配列置換を行い、改変抗体発現ベクターを構築した。得られた発現ベクターの塩基配列は当業者公知の方法で決定した。作製した発現ベクターをFreeStyle293（登録商標）あるいはExpi293（登録商標）細胞(Invitrogen社)に一過性に導入する事で培養上清中に改変抗体を発現させた。得られた培養上清から、rProtein A Sepharose（登録商標） Fast Flow（GEヘルスケア）を用いて当業者公知の方法で改変抗体を精製した。分光光度計を用いて280 nmでの吸光度を測定し、得られた値からPACE法により算出された吸光係数を用いて抗体濃度を算出した（Protein Science 1995 ; 4 : 2411-2423）。
改変抗体の会合体量はHPLCであるAgilent 1260 Infinity（登録商標）（Agilent Technologies）、およびゲル濾過クロマトグラフィーカラムとしてG3000SWXL(TOSOH)を用いて当業者公知の方法で分析した。精製抗体濃度は0.1 mg/mLとして10 μL注入した。
本手法により調製した抗体（抗CD3ε抗体、抗CD28抗体、および抗CD3ε×抗CD28二重特異性抗体）を表１に示す。【０２０６】
【表１】
2020027330.tif 000004
HH：2つのH鎖定常領域におけるEUナンバリング191位をCysに改変
LL：2つのL鎖定常領域におけるEUナンバリング126位をCysに改変
HL, LH：1つのH鎖定常領域におけるEUナンバリング191位をCysに改変、および
1つのL鎖定常領域におけるEUナンバリング126位をCysに改変【０２０７】
〔実施例３〕二重特異性抗体の調製
精製抗体をTBS (WAKO)バッファーに透析し濃度を1mg /mLに調製した。また、10×反応バッファーとして250 mM 2-MEA (SIGMA)を調製した。実施例２で調製された二種類のホモ二量体抗体を等量ずつ混合し、そこに1/10量の10×反応バッファーを加え混合した後、37℃で90分間静置した。反応後、TBSに透析する事で、上記の二種類の抗体がヘテロ二量体化した二重特異性抗体の溶液を得た。上述の方法で抗体濃度を測定し後の実験に供した。【０２０８】
〔実施例４〕アゴニスト活性評価
実施例４−１  Jurkat cell溶液の調製
Jurkat cells (TCR/CD3 Effector Cells (NFAT), Promega) をフラスコより回収しAssay Buffer（RPMI 1640培地 (Gibco)、10%FBS (HyClone)、 1%MEM Non Essential Amino Acids (Invitrogen)、1mM Sodium Pyrubate (Invitrogen)）により洗浄した後、当該細胞がAssay Buffer中に3 ×106 cells/mLとなるよう懸濁した。当該細胞懸濁液をJurkat cells溶液として以後の実験に供した。【０２０９】
実施例４−２  発光試薬溶液の調製
Bio-Glo Luciferase Assay Buffer 100mL (Promega)をBio-Glo Luciferase Assay Substrate (Promega)のボトルに加え転倒混和した。ボトルを遮光し-20℃で凍結した。当該発光試薬溶液を以後の実験に供した。【０２１０】
実施例４−３  T細胞活性化アッセイ
アゴニストシグナルによるT細胞活性化をルシフェラーゼ発光の倍率変化（Fold change）によって評価した。上記のJurkat cellsは、NFAT応答配列を有するルシフェラーゼレポーター遺伝子によって形質転換されており、抗TCR/CD3抗体による刺激を受けると細胞内シグナルを介したNFAT経路の活性化が起こり、ルシフェラーゼの発現が誘導される。上記で調製したJurkat cells溶液を384 well Flat底白色プレートの各ウェル中に10 μLずつ（3 x 104 cells/ウェル）添加した。次に、各濃度（150、15、1.5、0.15、0.015、0.0015、0.00015、0.000015 nM）に調製した抗体溶液を各ウェル中に20 μLずつ添加した。当該プレートを37℃、5%炭酸ガスインキュベータ中で24時間静置した。この後、発光試薬溶液を融解し各ウェルに30 μLずつ加え室温で10分間静置した。当該プレートの各ウェル中のルシフェラーゼの発光をルミノメーターにより測定した。
この結果、図2，図3に示すように、抗CD3ε抗体のFab-Fab間を追加のジスルフィド結合で連結した改変分子は天然型分子（改変前の分子）に比べCD3を介したシグナル伝達が変動した。更に図4、図5に示すように、抗CD3ε抗体と抗CD28抗体からなる二重特異性抗体においてFab-Fab間を追加のジスルフィド結合で連結した改変分子でも天然型分子に比べCD3および／またはCD28を介したシグナル伝達が大きく変動した。
以上の結果から、本発明における改変を導入する事で、抗体のような抗原結合分子が有するアゴニスト活性を増強あるいは減弱する事が可能と考えられた。【０２１１】
〔実施例５〕重鎖の多様な位置にシステインを置換した抗体の評価
実施例５−１    重鎖の多様な位置にシステインを置換した抗体の評価
ヒトIL6Rに対する中和抗体であるMRA（重鎖：MRAH-G1T4（配列番号：15）、軽鎖：MRAL-k0（配列番号：16））の重鎖の可変領域と定常領域のうち、構造的に表面へ露出している任意のアミノ酸残基をシステインに置換する検討を行った。
MRA重鎖可変領域（MRAH、配列番号：17）内のアミノ酸残基をシステインに置換し、表2で示すMRA重鎖可変領域の改変体を作製した。これらのMRA重鎖可変領域の改変体をそれぞれMRA重鎖定常領域（G1T4、配列番号：18）と連結させMRA重鎖改変体を作製し、対応する遺伝子をコードする発現ベクターを当業者公知の方法で作製した。
また、MRA重鎖定常領域（G1T4、配列番号：18）内のアミノ酸残基をシステインに置換し、表3で示すMRA重鎖定常領域の改変体を作製した。これらのMRA重鎖定常領域の改変体をそれぞれMRA重鎖可変領域（MRAH、配列番号：17）と連結させMRA重鎖改変体を作製し、対応する遺伝子をコードする発現ベクターを当業者公知の方法で作製した。
上記で作製したMRA重鎖改変体とMRA軽鎖を組み合わせて、表4に示すMRA改変体を当業者公知の方法でFreeStyle293細胞(Invitrogen) もしくはExpi293細胞(Life technologies)を用いた一過性発現により発現し、プロテインAを用いた当業者公知の方法により精製を行った。【０２１２】
【表２】
2020027330.tif 000005
2020027330.tif 000006
【０２１３】
【表３】
2020027330.tif 000007
2020027330.tif 000008
2020027330.tif 000009
【０２１４】
【表４】
2020027330.tif 000010
2020027330.tif 000011
2020027330.tif 000012
2020027330.tif 000013
【０２１５】
実施例５−２    重鎖の多様な位置にシステインを置換した抗体のプロテアーゼによるFab化の評価
抗体の重鎖ヒンジ領域を切断してFab断片化するプロテアーゼを用いて、実施例５−１で作製したMRA改変体がプロテアーゼ耐性を獲得して断片化が阻害されるかどうかを検証した。プロテアーゼとしてLys-C (Endoproteinase Lys-C Sequencing Grade) (SIGMA; 11047825001) を用い、プロテアーゼ 2 ng/μL、抗体 100 μg/mL、80% 25 mM Tris-HCl pH 8.0, 20% PBS、35℃の条件下で2時間、もしくは、プロテアーゼ 2 ng/μL、抗体 20 μg/mL、80% 25 mM Tris-HCl pH 8.0, 20% PBS、35℃の条件下で1時間反応させたのちに、非還元キャピラリー電気泳動に供した。キャピラリー電気泳動にはWes (Protein Simple) を使用し、検出には抗kappa鎖HRP標識抗体 (abcam; ab46527) を使用した。結果は図6〜図13に示す。Lys-C処理後のMRAは、重鎖ヒンジ領域が切断されることで、150kDa付近のIgGのバンドが消失し、50kDa付近にFabのバンドが出現した。一方で、実施例５−１で作製したMRA改変体では、プロテアーゼ処理後に96kDa付近にFab二量体のバンドが出現する改変体や、150kDa付近に未消化のIgGのバンドが検出される改変体も見られた。プロテアーゼ処理後に得られた各バンドの面積をWes専用のソフトウェア (Compass for SW; Protein Simple) で出力し、未消化のIgGや生成されたFab二量体等のバンド面積の割合を算出した。算出した各バンド割合を表5に示す。【０２１６】
【表５】
2020027330.tif 000014
2020027330.tif 000015
2020027330.tif 000016
2020027330.tif 000017
【０２１７】
この結果から、表6で示すMRA改変体では、重鎖可変領域または重鎖定常領域のシステインの置換により重鎖ヒンジ領域のプロテアーゼ耐性が向上したことが確認された。あるいは、Fab-Fab間の共有結合によりFab二量体が形成されたことが示唆された。【０２１８】
【表６】
2020027330.tif 000018
2020027330.tif 000019
【０２１９】
〔実施例６〕軽鎖の多様な位置にシステインを置換した抗体の評価
実施例６−１  軽鎖の多様な位置にシステインを置換した抗体の評価
ヒトIL6Rに対する中和抗体であるMRA（重鎖：MRAH-G1T4（配列番号：15）、軽鎖：MRAL-k0（配列番号：16））の軽鎖の可変領域と定常領域のうち、構造的に表面へ露出している任意のアミノ酸残基をシステインに置換する検討を行った。
MRA軽鎖可変領域（MRAL、配列番号：19）内のアミノ酸残基をシステインに置換し、表7で示すMRA軽鎖可変領域の改変体を作製した。これらのMRA軽鎖可変領域の改変体をそれぞれMRA軽鎖定常領域（k0、配列番号：20）と連結させMRA軽鎖改変体を作製し、対応する遺伝子をコードする発現ベクターを当業者公知の方法で作製した。
また、MRA軽鎖定常領域（k0、配列番号：20）内のアミノ酸残基をシステインに置換し、表8で示すMRA軽鎖定常領域の改変体を作製した。これらのMRA軽鎖定常領域の改変体をそれぞれMRA軽鎖可変領域（MRAL、配列番号：19）と連結させMRA軽鎖改変体を作製し、対応する遺伝子をコードする発現ベクターを当業者公知の方法で作製した。
上記で作製したMRA軽鎖改変体とMRA重鎖を組み合わせて、表9に示すMRA改変体を当業者公知の方法でFreeStyle293細胞(Invitrogen) もしくはExpi293細胞(Life technologies)を用いた一過性発現により発現し、プロテインAを用いた当業者公知の方法により精製を行った。【０２２０】
【表７】
2020027330.tif 000020
2020027330.tif 000021
【０２２１】
【表８】
2020027330.tif 000022
2020027330.tif 000023
2020027330.tif 000024
【０２２２】
【表９】
2020027330.tif 000025
2020027330.tif 000026
2020027330.tif 000027
2020027330.tif 000028
2020027330.tif 000029
【０２２３】
実施例６−２  軽鎖の多様な位置にシステインを置換した抗体のプロテアーゼによるFab化の評価
抗体の重鎖ヒンジ領域を切断してFab断片化するプロテアーゼを用いて、実施例６−１で作製したMRA改変体がプロテアーゼ耐性を獲得して断片化が阻害されるかどうかを検証した。プロテアーゼとしてLys-C (Endoproteinase Lys-C Sequencing Grade) (SIGMA; 11047825001) を用い、プロテアーゼ 2 ng/μL、抗体 100 μg/mL、80% 25 mM Tris-HCl pH 8.0, 20% PBS、35℃の条件下で2時間、もしくは、プロテアーゼ 2 ng/μL、抗体 20 μg/mL、80% 25 mM Tris-HCl pH 8.0, 20% PBS、35℃の条件下で1時間反応させたのちに、非還元キャピラリー電気泳動に供した。キャピラリー電気泳動にはWes (Protein Simple) を使用し、検出には抗kappa鎖HRP標識抗体 (abcam; ab46527) を使用した。結果は図14〜図23に示す。Lys-C処理後のMRAは、重鎖ヒンジ領域が切断されることで、150kDa付近のIgGのバンドが消失し、50kDa付近にFabのバンドが出現した。一方で、実施例６−１で作製したMRA改変体では、プロテアーゼ処理後に96kDa付近にFab二量体のバンドが出現する改変体や、150kDa付近に未消化のIgGのバンドが検出される改変体も見られた。プロテアーゼ処理後に得られた各バンドの面積をWes専用のソフトウェア (Compass for SW; Protein Simple) で出力し、未消化のIgGや生成されたFab二量体等のバンド面積の割合を算出した。算出した各バンド割合を表10に示す。【０２２４】
【表１０】
2020027330.tif 000030
2020027330.tif 000031
2020027330.tif 000032
2020027330.tif 000033
2020027330.tif 000034
【０２２５】
この結果から、表11で示すMRA改変体では、軽鎖可変領域または軽鎖定常領域のシステインの置換により重鎖ヒンジ領域のプロテアーゼ耐性が向上したことが確認された。あるいは、Fab-Fab間の共有結合によりFab二量体が形成されたことが示唆された。【０２２６】
【表１１】
2020027330.tif 000035
【０２２７】
〔実施例７〕システインを置換した抗体の評価方法の検証
実施例７−１  軽鎖にシステインを置換した抗体の作製
ヒトIL6Rに対する中和抗体であるMRA（重鎖：MRAH-G1T4（配列番号：15）、軽鎖：MRAL-k0（配列番号：16））の軽鎖定常領域（k0、配列番号：20）内のKabatナンバリング126番目のアミノ酸残基をシステインに置換し、MRA軽鎖定常領域の改変体であるk0.K126C（配列番号：231）を作製した。このMRA軽鎖定常領域の改変体をMRA軽鎖可変領域（MRAL、配列番号：19）と連結させMRA軽鎖改変体を作製し、対応する遺伝子をコードする発現ベクターを当業者公知の方法で作製した。
上記で作製したMRA軽鎖改変体とMRA重鎖を組み合わせて、MRA改変体であるMRAL-k0.K126C（重鎖：MRAH-G1T4（配列番号：15）、軽鎖可変領域：MRAL（配列番号：19）、軽鎖定常領域：k0.K126C（配列番号：231））を当業者公知の方法でFreeStyle293細胞(Invitrogen) もしくはExpi293細胞(Life technologies)を用いた一過性発現により発現し、プロテインAを用いた当業者公知の方法により精製を行った。【０２２８】
実施例７−２  軽鎖にシステインを置換した抗体のプロテアーゼによるキャピラリー電気泳動の評価
抗体の重鎖ヒンジ領域を切断してFab断片化するプロテアーゼを用いて、実施例７−１で作製したMRA軽鎖改変体がプロテアーゼ耐性を獲得して断片化が阻害されるかどうかを検証した。プロテアーゼとしてLys-C (Endoproteinase Lys-C Sequencing Grade) (SIGMA; 11047825001) を用い、プロテアーゼ 0.1、0.4、1.6、6.4 ng/μL、抗体 100 μg/mL、80% 25 mM Tris-HCl pH 8.0, 20% PBS、35℃の条件下で2時間反応させたのちに、非還元キャピラリー電気泳動に供した。キャピラリー電気泳動にはWes (Protein Simple) を使用し、検出には抗kappa鎖HRP標識抗体 (abcam; ab46527) もしくは抗ヒトFc HRP標識抗体 (Protein Simple; 043-491) を使用した。結果は図24に示す。Lys-C処理後のMRAは、抗kappa鎖抗体の検出では、150kDa付近のバンドが消失して50kDa付近に新たにバンドが出現し、また低Lys-C濃度では113kDaにも僅かにバンドが出現した。また抗ヒトFc抗体の検出では、150kDa付近のバンドが消失して61kDa付近に新たにバンドが出現し、また低Lys-C濃度では113kDaにも僅かにバンドが出現した。一方で、実施例７−１で作製したMRA改変体では、150kDa付近のバンドはほとんど消失せず、96kDa付近に新たにバンドが出現した。抗ヒトFc抗体の検出では、150kDa付近のバンドはほとんど消失せず、61kDa付近に新たにバンドが出現し、また低Lys-C濃度では113kDaにも僅かにバンドが出現した。以上の結果から、図25に示す通り、150kDa付近のバンドはIgG、113kDa付近のバンドは重鎖ヒンジが1回切断されたone-arm体、96kDa付近のバンドはFab二量体、61kDa付近のバンドはFc、50kDa付近のバンドはFabだと考えられた。【０２２９】
〔実施例８〕IgG1の多様な位置にシステイン置換を導入した抗体の評価
実施例８−１  IgG1の多様な位置にシステイン置換を導入した抗体の作製
ヒトIL6Rに対する中和抗体であるMRA-IgG1（重鎖：MRAH-G1T4（配列番号：15）、軽鎖：MRAL-k0（配列番号：16））の重鎖と軽鎖のうち、構造的に表面へ露出している任意のアミノ酸残基をシステインに置換する検討を行った。
MRA-IgG1重鎖可変領域（MRAH、配列番号：17）内のアミノ酸残基をシステインに置換し、表12で示すMRA-IgG1重鎖可変領域の改変体を作製した。これらのMRA-IgG1重鎖可変領域の改変体をそれぞれMRA-IgG1重鎖定常領域（G1T4、配列番号：18）と連結させMRA-IgG1重鎖改変体を作製し、対応する遺伝子をコードする発現ベクターを当業者公知の方法で作製した。また、MRA-IgG1重鎖定常領域（G1T4、配列番号：18）内のアミノ酸残基をシステインに置換し、表13で示すMRA-IgG1重鎖定常領域の改変体を作製した。これらのMRA-IgG1重鎖定常領域の改変体をそれぞれMRA-IgG1重鎖可変領域（MRAH、配列番号：17）と連結させMRA-IgG1重鎖改変体を作製し、対応する遺伝子をコードする発現ベクターを当業者公知の方法で作製した。【０２３０】
【表１２】
2020027330.tif 000036
2020027330.tif 000037
【０２３１】
【表１３】
2020027330.tif 000038
2020027330.tif 000039
【０２３２】
同様に、MRA-IgG1軽鎖可変領域（MRAL、配列番号：19）内のアミノ酸残基をシステインに置換し、表14で示すMRA-IgG1軽鎖可変領域の改変体を作製した。これらのMRA-IgG1軽鎖可変領域の改変体をそれぞれMRA-IgG1軽鎖定常領域（k0、配列番号：20）と連結させMRA-IgG1軽鎖改変体を作製し、対応する遺伝子をコードする発現ベクターを当業者公知の方法で作製した。また、MRA-IgG1軽鎖定常領域（k0、配列番号：20）内のアミノ酸残基をシステインに置換し、表15で示すMRA-IgG1軽鎖定常領域の改変体を作製した。これらのMRA-IgG1重鎖定常領域の改変体をそれぞれMRA-IgG1軽鎖可変領域（MRAL、配列番号：19）と連結させMRA-IgG1軽鎖改変体を作製し、対応する遺伝子をコードする発現ベクターを当業者公知の方法で作製した。【０２３３】
【表１４】
2020027330.tif 000040
2020027330.tif 000041
【０２３４】
【表１５】
2020027330.tif 000042
2020027330.tif 000043
2020027330.tif 000044
【０２３５】
上記で作製したMRA-IgG1重鎖改変体とMRA-IgG1軽鎖、あるいはMRA-IgG1重鎖とMRA-IgG1軽鎖改変体を組み合わせて、表16と表17で示したMRA-IgG1重鎖改変体とMRA-IgG1軽鎖改変体を、当業者公知の方法でFreeStyle293細胞(Invitrogen) もしくはExpi293細胞(Life technologies)を用いた一過性発現により発現し、プロテインAを用いた当業者公知の方法により精製を行った。【０２３６】
【表１６】
2020027330.tif 000045
2020027330.tif 000046
2020027330.tif 000047
2020027330.tif 000048
【０２３７】
【表１７】
2020027330.tif 000049
2020027330.tif 000050
2020027330.tif 000051
2020027330.tif 000052
【０２３８】
実施例８−２  IgG1の多様な位置にシステイン置換を導入した抗体のポリアクリルアミドゲル中泳動度の評価
非還元SDS-PAGEによって、実施例８−１で作製したMRA-IgG1改変体がMRA-IgG1と異なる泳動度を示すかどうかを検証した。泳動サンプルの調製にはSample Buffer Solution (2ME-) (x4)(Wako; 198-13282)を用い、検体濃度 50 μg/mL、70℃の条件下で10分間処理したのちに、非還元SDS-PAGEに供した。非還元SDS-PAGEでは、4% SDS-PAGE mini 15well 1.0mm 15well (TEFCO; Cat#01-052-6) を用いて125 Vで90分間泳動を行った。その後CBB染色液でゲルを染色し、ChemiDocTouchMP (BIORAD) でゲル画像の取り込みとImage Lab (BIORAD)でバンドの定量を行った。
取得したゲル画像より、各MRA-IgG1改変体のバンドパターンに応じてSingle（MRA-IgG1と同様の分子量域に1本のバンド）、Double（MRA-IgG1と同様の分子量域に2本のバンド）、Triple（MRA-IgG1と同様の分子量域に3本のバンド）、Several（MRA-IgG1と同様の分子量域に4本以上のバンド）、LMW（MRA-IgG1よりも低分子量域にバンド）、HMW（MRA-IgG1よりも高分子量域にバンド）、Faint（バンドがぼんやりとして判別不可）の7つのグループに分類した。またDoubleに分類したMRA-IgG1改変体に関しては、2本のバンドのうち一方のバンドはMRA-IgG1と同じ泳動度を示し、もう一方のバンドはそれよりもやや速いもしくはやや遅い泳動度を示していた。そのため、Doubleに分類したMRA-IgG1改変体においてはMRA-IgG1と異なる泳動度を示したバンドの割合（新規バンド割合 (%)）も算出した。MRA-IgG1重鎖改変体とMRA-IgG1軽鎖改変体におけるバンドパターンのグループ分けとバンド割合の算出結果を、それぞれ表18、表19に示す。表18、表19のうち、Double、Tripleのグループに分類された改変体を表20に示す。これらの改変体では、システイン置換によりFab間が架橋されるなどの構造変化が起こり、その結果、泳動度に変化が生じた可能性が高いと考えられる。なお、表19においてMRAL.K107C-IgG1はno dataではあるが、この改変体におけるシステイン置換位置であるKabatナンバリング107位は、ヒンジ領域で構造的に表面へ露出した残基が存在する位置である。そのため、この改変体でもシステイン置換によりFab間が架橋されるなどの構造変化が起こり、その結果、泳動度に変化が生じる可能性が高いと考えられる。【０２３９】
【表１８】
2020027330.tif 000053
2020027330.tif 000054
2020027330.tif 000055
2020027330.tif 000056
【０２４０】
【表１９】
2020027330.tif 000057
2020027330.tif 000058
2020027330.tif 000059
2020027330.tif 000060
【０２４１】
【表２０】
2020027330.tif 000061
2020027330.tif 000062
【０２４２】
〔実施例９〕IgG4の多様な位置にシステイン置換を導入した抗体の評価
実施例９−１  IgG4の多様な位置にシステイン置換を導入した抗体の作製
ヒトIL6Rに対する中和抗体であるMRA-IgG4（重鎖：MRAH-G4T1（配列番号：310）、軽鎖：MRAL-k0（配列番号：16））の重鎖と軽鎖のうち、構造的に表面へ露出している任意のアミノ酸残基をシステインに置換する検討を行った。
MRA-IgG4重鎖可変領域（MRAH、配列番号：17）内のアミノ酸残基をシステインに置換し、表21で示すMRA-IgG4重鎖可変領域の改変体を作製した。これらのMRA-IgG4重鎖可変領域の改変体をそれぞれMRA-IgG4重鎖定常領域（G4T1、配列番号：311）と連結させMRA-IgG4重鎖改変体を作製し、対応する遺伝子をコードする発現ベクターを当業者公知の方法で作製した。また、MRA-IgG4重鎖定常領域（G4T1、配列番号：311）内のアミノ酸残基をシステインに置換し、表22で示すMRA-IgG4重鎖定常領域の改変体を作製した。これらのMRA-IgG4重鎖定常領域の改変体をそれぞれMRA-IgG4重鎖可変領域（MRAH、配列番号：17）と連結させMRA-IgG4重鎖改変体を作製し、対応する遺伝子をコードする発現ベクターを当業者公知の方法で作製した。【０２４３】
【表２１】
2020027330.tif 000063
2020027330.tif 000064
【０２４４】
【表２２】
2020027330.tif 000065
2020027330.tif 000066
【０２４５】
上記で作製したMRA-IgG4重鎖改変体とMRA-IgG4軽鎖、あるいはMRA-IgG4重鎖と実施例８−１で作製したMRA-IgG4軽鎖改変体を組み合わせて、表23と表24で示したMRA-IgG4重鎖改変体とMRA-IgG4軽鎖改変体を、当業者公知の方法でFreeStyle293細胞(Invitrogen) もしくはExpi293細胞(Life technologies)を用いた一過性発現により発現し、プロテインAを用いた当業者公知の方法により精製を行った。【０２４６】
【表２３】
2020027330.tif 000067
2020027330.tif 000068
2020027330.tif 000069
2020027330.tif 000070
【０２４７】
【表２４】
2020027330.tif 000071
2020027330.tif 000072
2020027330.tif 000073
2020027330.tif 000074
【０２４８】
実施例９−２  IgG4の多様な位置にシステイン置換を導入した抗体のポリアクリルアミドゲル中泳動度の評価
実施例８−２と同様に、実施例９−１で作製したMRA-IgG4改変体で非還元SDS-PAGEを行い、ゲル画像の取り込みとバンドの定量を行った。
取得したゲル画像より、各MRA-IgG4改変体のバンドパターンに応じてSingle（MRA-IgG4と同様の分子量域に1本のバンド）、Double（MRA-IgG4と同様の分子量域に2本のバンド）、Triple（MRA-IgG4と同様の分子量域に3本のバンド）、Several（MRA-IgG4と同様の分子量域に4本以上のバンド）、LMW（MRA-IgG4よりも低分子量域にバンド）、HMW（MRA-IgG4よりも高分子量域にバンド）、Faint（バンドがぼんやりとして判別不可）の7つのグループに分類した。またDoubleに分類したMRA-IgG4改変体に関しては、2本のバンドのうち一方のバンドはMRA-IgG4と同じ泳動度を示し、もう一方のバンドはそれよりもやや速いもしくはやや遅い泳動度を示していた。そのため、Doubleに分類したMRA-IgG4改変体においてはMRA-IgG4と異なる泳動度を示したバンドの割合（新規バンド割合 (%)）も算出した。MRA-IgG4重鎖改変体とMRA-IgG4軽鎖改変体におけるバンドパターンのグループ分けとバンド割合の算出結果を、それぞれ表25、表26に示す。表25、表26のうち、Double、Tripleのグループに分類された改変体を表27に示す。これらの改変体では、システイン置換によりFab間が架橋されるなどの構造変化が起こり、その結果、泳動度に変化が生じた可能性が高いと考えられる。なお、表26においてMRAL.K107C-IgG4はno dataではあるが、この改変体におけるシステイン置換位置であるKabatナンバリング107位は、ヒンジ領域で構造的に表面へ露出した残基が存在する位置である。そのため、この改変体でもシステイン置換によりFab間が架橋されるなどの構造変化が起こり、その結果、泳動度に変化が生じる可能性が高いと考えられる。【０２４９】
【表２５】
2020027330.tif 000075
2020027330.tif 000076
2020027330.tif 000077
2020027330.tif 000078
【０２５０】
【表２６】
2020027330.tif 000079
2020027330.tif 000080
2020027330.tif 000081
2020027330.tif 000082
【０２５１】
【表２７】
2020027330.tif 000083
2020027330.tif 000084
【０２５２】
〔実施例１０〕IgG2の多様な位置にシステイン置換を導入した抗体の評価
実施例１０−１  IgG2の多様な位置にシステイン置換を導入した抗体の作製
ヒトIL6Rに対する中和抗体であるMRA-IgG2（重鎖：MRAH-G2d（配列番号：312）、軽鎖：MRAL-k0（配列番号：16））の重鎖と軽鎖のうち、構造的に表面へ露出している任意のアミノ酸残基をシステインに置換する検討を行った。
MRA-IgG2重鎖可変領域（MRAH、配列番号：17）内のアミノ酸残基をシステインに置換し、表28で示すMRA-IgG2重鎖可変領域の改変体を作製した。これらのMRA-IgG2重鎖可変領域の改変体をそれぞれMRA-IgG2重鎖定常領域（G2d、配列番号：313）と連結させMRA-IgG2重鎖改変体を作製し、対応する遺伝子をコードする発現ベクターを当業者公知の方法で作製した。また、MRA-IgG2重鎖定常領域（G2d、配列番号：313）内のアミノ酸残基をシステインに置換し、表29で示すMRA-IgG2重鎖定常領域の改変体を作製した。これらのMRA-IgG2重鎖定常領域の改変体をそれぞれMRA-IgG2重鎖可変領域（MRAH、配列番号：17）と連結させMRA-IgG2重鎖改変体を作製し、対応する遺伝子をコードする発現ベクターを当業者公知の方法で作製した。【０２５３】
【表２８】
2020027330.tif 000085
2020027330.tif 000086
【０２５４】
【表２９】
2020027330.tif 000087
2020027330.tif 000088
【０２５５】
上記で作製したMRA-IgG2重鎖改変体とMRA-IgG2軽鎖、あるいはMRA-IgG2重鎖と実施例８−１で作製したMRA-IgG2軽鎖改変体を組み合わせて、表30と表31で示したMRA-IgG2重鎖改変体とMRA-IgG2軽鎖改変体を、当業者公知の方法でFreeStyle293細胞(Invitrogen) もしくはExpi293細胞(Life technologies)を用いた一過性発現により発現し、プロテインAを用いた当業者公知の方法により精製を行った。【０２５６】
【表３０】
2020027330.tif 000089
2020027330.tif 000090
2020027330.tif 000091
2020027330.tif 000092
【０２５７】
【表３１】
2020027330.tif 000093
2020027330.tif 000094
2020027330.tif 000095
2020027330.tif 000096
【０２５８】
実施例１０−２  IgG2の多様な位置にシステイン置換を導入した抗体のポリアクリルアミドゲル中泳動度の評価
実施例８−２と同様に、実施例１０−１で作製したMRA-IgG2改変体で非還元SDS-PAGEを行い、ゲル画像の取り込みとバンドの解析を行った。
取得したゲル画像より、各MRA-IgG2改変体のバンドパターンに応じてSingle（140 kDa付近の分子量域に1本のバンド）、Double（140 kDa付近の分子量域に2本のバンド）、Triple（140 kDa付近の分子量域に3本のバンド）、Several（140 kDa付近の分子量域に4本以上のバンド）、LMW（140 kDa付近よりも低分子量域にバンド）、HMW（140 kDa付近よりも高分子量域にバンド）、Faint（バンドがぼんやりとして判別不可）の7つのグループに分類した。MRA-IgG2重鎖改変体とMRA-IgG2軽鎖改変体におけるバンドパターンのグループ分け結果を、それぞれ表32、表33に示す。表32、表33のうち、Double、Tripleのグループに分類された改変体を表34に示す。なお、表33においてMRAL.K107C-IgG2はno dataではあるが、この改変体におけるシステイン置換位置であるKabatナンバリング107位は、ヒンジ領域で構造的に表面へ露出した残基が存在する位置である。そのため、この改変体でもDoubleとなる可能性がある。【０２５９】
【表３２】
2020027330.tif 000097
2020027330.tif 000098
2020027330.tif 000099
2020027330.tif 000100
【０２６０】
【表３３】
2020027330.tif 000101
2020027330.tif 000102
2020027330.tif 000103
2020027330.tif 000104
【０２６１】
【表３４】
2020027330.tif 000105
2020027330.tif 000106
2020027330.tif 000107
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2020027330.tif 000109
【０２６２】
〔実施例１１〕Lambda鎖の多様な位置にシステイン置換を導入した抗体の評価
実施例１１−１  Lambda鎖の多様な位置にシステイン置換を導入した抗体の作製
ヒトCXCL10に対する中和抗体であるG7-IgG1（重鎖：G7H-G1T4（配列番号：314）、軽鎖：G7L-LT0（配列番号：316））の軽鎖（Lambda鎖）のうち、構造的に表面へ露出している任意のアミノ酸残基をシステインに置換する検討を行った。
G7-IgG1軽鎖可変領域（G7L、配列番号：317）内のアミノ酸残基をシステインに置換し、表35で示すG7-IgG1軽鎖可変領域の改変体を作製した。これらのG7-IgG1軽鎖可変領域の改変体をそれぞれG7-IgG1軽鎖定常領域（LT0、配列番号：318）と連結させG7-IgG1軽鎖改変体を作製し、対応する遺伝子をコードする発現ベクターを当業者公知の方法で作製した。また、G7-IgG1軽鎖定常領域（LT0、配列番号：318）内のアミノ酸残基をシステインに置換し、表36で示すG7-IgG1軽鎖定常領域の改変体を作製した。これらのG7-IgG1重鎖定常領域の改変体をそれぞれG7-IgG1軽鎖可変領域（G7L、配列番号：317）と連結させG7-IgG1軽鎖改変体を作製し、対応する遺伝子をコードする発現ベクターを当業者公知の方法で作製した。【０２６３】
【表３５】
2020027330.tif 000110
2020027330.tif 000111
【０２６４】
【表３６】
2020027330.tif 000112
2020027330.tif 000113
2020027330.tif 000114
【０２６５】
上記で作製したG7-IgG1軽鎖改変体とG7-IgG1重鎖を組み合わせて、表37で示したG7-IgG1軽鎖改変体を、当業者公知の方法でFreeStyle293細胞(Invitrogen) もしくはExpi293細胞(Life technologies)を用いた一過性発現により発現し、プロテインAを用いた当業者公知の方法により精製を行った。【０２６６】
【表３７】
2020027330.tif 000115
2020027330.tif 000116
2020027330.tif 000117
2020027330.tif 000118
【０２６７】
実施例１１−２  Lambda鎖の多様な位置にシステイン置換を導入した抗体のポリアクリルアミドゲル中泳動度の評価
実施例８−２と同様に、実施例１１−１で作製したG7-IgG1改変体で非還元SDS-PAGEを行い、ゲル画像の取り込みとバンドの定量を行った。
取得したゲル画像より、各G7-IgG1改変体のバンドパターンに応じてSingle（G7-IgG1と同様の分子量域に1本のバンド）、Double（G7-IgG1と同様の分子量域に2本のバンド）、Triple（G7-IgG1と同様の分子量域に3本のバンド）、Several（G7-IgG1と同様の分子量域に4本以上のバンド）、LMW（G7-IgG1よりも低分子量域にバンド）、HMW（G7-IgG1よりも高分子量域にバンド）、Faint（バンドがぼんやりとして判別不可）の7つのグループに分類した。またDoubleに分類したG7-IgG1改変体に関しては、2本のバンドのうち一方のバンドはG7-IgG1と同じ泳動度を示し、もう一方のバンドはそれよりもやや速いもしくはやや遅い泳動度を示していた。そのため、Doubleに分類したG7-IgG1改変体においてはG7-IgG1と異なる泳動度を示したバンドの割合（新規バンド割合 (%)）も算出した。G7-IgG1軽鎖改変体のバンドパターンのグループ分けとバンド割合の算出結果を、表38に示す。表38のうち、Double、Tripleのグループに分類された改変体を表39に示す。これらの改変体では、システイン置換によりFab間が架橋されるなどの構造変化が起こり、その結果、泳動度に変化が生じた可能性が高いと考えられる。なお今実施例において、107a位（Kabatナンバリング）のアミノ酸残基をシステインに置換した改変体は未評価である。しかし、107a位（Kabatナンバリング）はヒンジ領域で構造的に表面へ露出した残基が存在する位置である。そのため、この改変体でもシステイン置換によりFab間が架橋されるなどの構造変化が起こり、その結果、泳動度に変化が生じる可能性が高いと考えられる。【０２６８】
【表３８】
2020027330.tif 000119
2020027330.tif 000120
2020027330.tif 000121
2020027330.tif 000122
【０２６９】
【表３９】
2020027330.tif 000123
【０２７０】
〔実施例１２〕VHHの多様な位置にシステイン置換を導入した抗体の評価
実施例１２−１  VHHの多様な位置にシステイン置換を導入した抗体の作製
ヒトIL6Rに対する中和VHHであるIL6R90（配列番号：319）をヒトIgG1のFc領域（G1T3dCH1dC、配列番号：320）に融合したIL6R90-Fc（IL6R90-G1T3dCH1dC、配列番号：321）を作製し、IL6R90領域のうち構造的に表面へ露出している任意のアミノ酸残基をシステインに置換する検討を行った。
IL6R90領域内のアミノ酸残基をシステインに置換し、表40で示すIL6R90-FcのVHH領域改変体遺伝子をコードする発現ベクターを当業者公知の方法で作製した。これらのIL6R90-FcのVHH領域の改変体をそれぞれヒトIgG1のFc領域（G1T3dCH1dC、配列番号：320）と連結させIL6R90-Fc改変体を作製し、対応する遺伝子をコードする発現ベクターを当業者公知の方法で作製した。【０２７１】
【表４０】
2020027330.tif 000124
2020027330.tif 000125
上記で作製した表41で示すIL6R90-Fc改変体を、当業者公知の方法でFreeStyle293細胞(Invitrogen) もしくはExpi293細胞(Life technologies)を用いた一過性発現により発現し、プロテインAを用いた当業者公知の方法により精製を行った。【０２７２】
【表４１】
2020027330.tif 000126
2020027330.tif 000127
【０２７３】
実施例１２−２  VHHの多様な位置にシステイン置換を導入した抗体のポリアクリルアミドゲル中泳動度の評価
非還元SDS-PAGEによって、実施例１２−１で作製したIL6R90-Fc改変体がIL6R90-Fcと異なる泳動度を示すかどうかを検証した。泳動サンプルの調製にはSample Buffer Solution (2ME-) (x4)(Wako; 198-13282)を用い、検体濃度 50 μg/mL、70℃の条件下で10分間処理したのちに、非還元SDS-PAGEに供した。非還元SDS-PAGEでは、Mini-PROTEAN TGX Precast gel 4-20% 15well (BIORAD; 456-1096) を用いて200 Vで2.5 時間泳動を行った。その後CBB染色液でゲルを染色し、ChemiDocTouchMP (BIORAD) でゲル画像の取り込みとImage Lab (BIORAD)でバンドの定量を行った。
取得したゲル画像より、各IL6R90-Fc改変体のバンドパターンに応じてSingle（IL6R90-Fcと同様の分子量域に1本のバンド）、Double（IL6R90-Fcと同様の分子量域に2本のバンド）、Triple（IL6R90-Fcと同様の分子量域に3本のバンド）、Several（IL6R90-Fcと同様の分子量域に4本以上のバンド）、LMW（IL6R90-Fcよりも低分子量域にバンド）、HMW（IL6R90-Fcよりも高分子量域にバンド）、Faint（バンドがぼんやりとして判別不可）の7つのグループに分類した。またDoubleに分類したIL6R90-Fc改変体に関しては、2本のバンドのうち一方のバンドはIL6R90-Fcと同じ泳動度を示し、もう一方のバンドはそれよりもやや速いもしくはやや遅い泳動度を示していた。そのため、Doubleに分類したIL6R90-Fc改変体においてはIL6R90-Fcと異なる泳動度を示したバンドの割合（新規バンド割合 (%)）も算出した。IL6R90-Fc改変体のバンドパターンのグループ分けとバンド割合の算出結果を、表42に示す。表42のうち、Double、Tripleのグループに分類された改変体を表43に示す。これらの改変体では、システイン置換によりVHH間が架橋されるなどの構造変化が起こり、その結果、泳動度に変化が生じた可能性が高いと考えられる。【０２７４】
【表４２】
2020027330.tif 000128
2020027330.tif 000129
【０２７５】
【表４３】
2020027330.tif 000130
【０２７６】
〔実施例１３〕Fab内にシステイン置換を導入した抗体のCD3アゴニスト活性の評価
実施例１３−１  定常領域にシステイン置換を導入した抗体の作製
ヒトCD3に対するアゴニスト抗体であるOKT3（重鎖：OKT3VH0000-G1T4（配列番号：1007）、軽鎖：OKT3VL0000-KT0（配列番号：1008））のうち、構造的に表面へ露出している任意のアミノ酸残基をシステインに置換する検討を行った。
OKT3重鎖定常領域（G1T4、配列番号：1009）内のアミノ酸残基をシステインに置換し、表44で示すOKT3重鎖定常領域の改変体を作製した。これらのOKT3重鎖定常領域の改変体をそれぞれOKT3重鎖可変領域（OKT3VH0000、配列番号：1010）と連結させOKT3重鎖改変体を作製し、対応する遺伝子をコードする発現ベクターを当業者公知の方法で作製した。【０２７７】
【表４４】
2020027330.tif 000131
【０２７８】
同様に、OKT3軽鎖定常領域（KT0、配列番号：1011）内のアミノ酸残基をシステインに置換し、表45で示すOKT3軽鎖定常領域の改変体を作製した。これらのOKT3軽鎖定常領域の改変体をそれぞれOKT3軽鎖可変領域（OKT3VL0000、配列番号：1012）と連結させOKT3軽鎖改変体を作製し、対応する遺伝子をコードする発現ベクターを当業者公知の方法で作製した。【０２７９】
【表４５】
2020027330.tif 000132
【０２８０】
上記で作製したOKT3重鎖改変体とOKT3軽鎖改変体をそれぞれOKT3軽鎖とOKT3重鎖に組み合わせて、表46に示すOKT3改変体を当業者公知の方法でFreeStyle293細胞(Invitrogen) もしくはExpi293細胞(Life technologies)を用いた一過性発現により発現し、プロテインAを用いた当業者公知の方法により精製を行った。またネガティブコントロールとして、抗KLH抗体であるIC17（重鎖：IC17HdK-G1T4（配列番号：1013）、軽鎖：IC17L-k0（配列番号：1014））も同様に調製した。【０２８１】
【表４６】
2020027330.tif 000133
【０２８２】
実施例１３−２  Jurkat cell溶液の調製
Jurkat cells (TCR/CD3 Effector Cells (NFAT), Promega) をフラスコより回収しAssay Buffer（RPMI 1640培地 (Gibco)、10%FBS (HyClone)、 1%MEM Non Essential Amino Acids (Invitrogen)、1mM Sodium Pyrubate (Invitrogen)）により洗浄した後、当該細胞がAssay Buffer中に3 ×106 cells/mLとなるよう懸濁した。当該細胞懸濁液をJurkat cell溶液として以後の実験に供した。【０２８３】
実施例１３−３  発光試薬溶液の調製
Bio-Glo Luciferase Assay Buffer 100mL (Promega)をBio-Glo Luciferase Assay Substrate (Promega) のボトルに加え転倒混和した。ボトルを遮光し、-20℃で凍結した。当該発光試薬溶液を以後の実験に供した。【０２８４】
実施例１３−４  定常領域にシステイン置換を導入した抗体のT細胞活性化評価
アゴニストシグナルによるT細胞活性化をルシフェラーゼ発光の倍率変化（Fold change）によって評価した。上記のJurkat cellsは、NFAT応答配列を有するルシフェラーゼレポーター遺伝子によって形質転換されており、抗TCR/CD3抗体による刺激を受けると細胞内シグナルを介したNFAT経路の活性化が起こり、ルシフェラーゼの発現が誘導される。上記で調製したJurkat cells溶液を384 well Flat底白色プレートの各ウェル中に10 μLずつ（3 x 104 cells/ウェル）添加した。次に、各濃度（10,000、1,000、100、10、1、0.1 ng/mL）に調製した抗体溶液を各ウェル中に20 μLずつ添加した。当該プレートを37℃、5%炭酸ガスインキュベータ中で24時間静置した。この後、発光試薬溶液を融解し各ウェルに30 μLずつ加え室温で10分間静置した。当該プレートの各ウェル中のルシフェラーゼの発光をルミノメーターにより測定した。 発光量（fold）は、抗体添加ウェルでの発光量を抗体非添加ウェルでの発光量で割ることで求めた。
この結果、図26に示すように、定常領域にシステイン置換を導入したOKT3改変体のうち、複数の改変体がOKT3に比べT細胞活性化状態を大きく上昇させた。このことから、Fab間を架橋しCD3アゴニスト活性を増強させることができるシステイン改変が複数存在することが示された。【０２８５】
〔実施例１４〕2つのFab同士で異なるシステイン置換を導入した抗体のCD3アゴニスト活性の評価
実施例１４−１  定常領域にヘテロなシステイン置換を導入した抗体の作製
ヒトCD3に対するアゴニスト抗体であるOKT3（重鎖：OKT3VH0000-G1T4（配列番号：1007）、軽鎖：OKT3VL0000-KT0（配列番号：1008））のうち、構造的に表面へ露出している任意のアミノ酸残基をシステインに置換する検討を行った。
OKT3重鎖定常領域１（G1T4k、配列番号：配列番号：1015）内のアミノ酸残基をシステインに置換し、表47で示すOKT3重鎖定常領域の改変体を作製した。これらのOKT3重鎖定常領域の改変体をそれぞれOKT3重鎖可変領域（OKT3VH0000、配列番号：1010）と連結させOKT3重鎖改変体１を作製し、対応する遺伝子をコードする発現ベクターを当業者公知の方法で作製した。同様に、OKT3重鎖定常領域２（G1T4h、配列番号：1016）内のアミノ酸残基をシステインに置換し、表48で示すOKT3重鎖定常領域の改変体を作製した。これらのOKT3重鎖定常領域の改変体をそれぞれOKT3重鎖可変領域（OKT3VH0000、配列番号：1010）と連結させOKT3重鎖改変体２を作製し、対応する遺伝子をコードする発現ベクターを当業者公知の方法で作製した。なお、ここでの重鎖定常領域１および２には、CH3領域にヘテロ二量体化を促進するKnobs-into-Holes（KiH）改変が導入されている。【０２８６】
【表４７】
2020027330.tif 000134
【０２８７】
【表４８】
2020027330.tif 000135
【０２８８】
上記で作製したOKT3重鎖改変体１とOKT3重鎖改変体２とOKT3軽鎖と組み合わせて、表49に示すOKT3改変体を当業者公知の方法でFreeStyle293細胞(Invitrogen) もしくはExpi293細胞(Life technologies)を用いた一過性発現により発現し、プロテインAを用いた当業者公知の方法により精製を行った。またネガティブコントロールとして、抗KLH抗体であるIC17（重鎖：IC17HdK-G1T4（配列番号：1013）、軽鎖：IC17L-k0（配列番号：1014））も同様に調製した。【０２８９】
【表４９】
2020027330.tif 000136
【０２９０】
実施例１４−２  Jurkat cell溶液の調製
実施例１３−２と同様にJurkat cell溶液を調製した。【０２９１】
実施例１４−３  発光試薬溶液の調製
実施例１３−３と同様に発光試薬溶液を調製した。【０２９２】
実施例１４−４  定常領域にヘテロなシステイン置換を導入した抗体のT細胞活性化評価
実施例１３−４と同様にT細胞活性化を評価した。
この結果、図27に示すように、抗体内の2つの定常領域同士で異なるシステイン置換を導入したOKT3改変体はOKT3に比べT細胞活性化状態を大きく上昇させた。このことから、Fab同士で異なるシステイン置換であってもFab間が架橋されCD3アゴニスト活性を増強させることができることが示された。【０２９３】
〔実施例１５〕Fab内に電荷改変を導入した抗体のCD3アゴニスト活性の評価
実施例１５−１  定常領域に電荷アミノ酸置換を導入した抗体の作製
ヒトCD3に対するアゴニスト抗体であるOKT3（重鎖：OKT3VH0000-G1T4（配列番号：1007）、軽鎖：OKT3VL0000-KT0（配列番号：1008））の重鎖のうち、構造的に表面へ露出している任意のアミノ酸残基を電荷アミノ酸に置換する検討を行った。
OKT3重鎖定常領域１（G1T4k、配列番号：1015）内のアミノ酸残基をアルギニン（R）もしくはリジン（K）に置換し、表50で示すOKT3重鎖定常領域の改変体を作製した。これらのOKT3重鎖定常領域の改変体をそれぞれOKT3重鎖可変領域（OKT3VH0000、配列番号：1010）と連結させOKT3重鎖改変体１を作製し、対応する遺伝子をコードする発現ベクターを当業者公知の方法で作製した。同様に、OKT3重鎖定常領域２（G1T4h、配列番号：1016）内のアミノ酸残基をアスパラギン酸（D）もしくはグルタミン酸（E）に置換し、表51で示すOKT3重鎖定常領域の改変体を作製した。これらのOKT3重鎖定常領域の改変体をそれぞれOKT3重鎖可変領域（OKT3VH0000、配列番号：1010）と連結させOKT3重鎖改変体２を作製し、対応する遺伝子をコードする発現ベクターを当業者公知の方法で作製した。なお、ここでの重鎖定常領域１および２のCH3領域には、ヘテロ二量体化を促進するためのKnobs-into-Holes（KiH）改変が導入されている。【０２９４】
【表５０】
2020027330.tif 000137
【０２９５】
【表５１】
2020027330.tif 000138
【０２９６】
上記で作製したOKT3重鎖改変体１とOKT3重鎖改変体２とOKT3軽鎖と組み合わせて、表52に示すOKT3改変体を当業者公知の方法でFreeStyle293細胞(Invitrogen) もしくはExpi293細胞(Life technologies)を用いた一過性発現により発現し、プロテインAを用いた当業者公知の方法により精製を行った。またネガティブコントロールとして、抗KLH抗体であるIC17（重鎖：IC17HdK-G1T4（配列番号：1013）、軽鎖：IC17L-k0（配列番号：1014））も同様に調製した。【０２９７】
【表５２】
2020027330.tif 000139
【０２９８】
実施例１５−２  Jurkat cell溶液の調製
実施例１３−２と同様にJurkat cell溶液を調製した。【０２９９】
実施例１５−３  発光試薬溶液の調製
実施例１３−３と同様に発光試薬溶液を調製した。【０３００】
実施例１５−４  定常領域にシステイン以外のアミノ酸置換を導入した抗体のT細胞活性化評価
実施例１３−４と同様にT細胞活性化を評価した。
この結果、図28に示すように、片方の定常領域に正の電荷アミノ酸置換を、もう一方の定常領域に負の電荷アミノ酸置換を導入したOKT3改変体は、OKT3に比べT細胞活性化状態を大きく上昇させた。一方で、片方の定常領域に正もしくは負の電荷アミノ酸置換、もう一方の定常領域には改変を導入しなかったOKT3改変体は、OKT3に比べT細胞活性化状態をほとんど変化させなかった。このことから、システイン置換だけでなく電荷アミノ酸置換でも非共有結合によってFab間が架橋されCD3アゴニスト活性を増強させることができることが示された。【０３０１】
〔実施例１６〕ヒンジ領域のジスルフィド結合を除去しFab内にシステイン置換を導入した抗体のCD3アゴニスト活性の評価
実施例１６−１  ヒンジ領域のジスルフィド結合を除去しFab内にシステイン置換を導入した抗体の作製
ヒトCD3に対するアゴニスト抗体であるOKT3（重鎖：OKT3VH0000-G1T4（配列番号：1007）、軽鎖：OKT3VL0000-KT0（配列番号：1008））の重鎖のうち、ヒンジ領域のジスルフィド結合を除去し、構造的に表面へ露出しているアミノ酸残基をシステインに置換する検討を行った。
OKT3重鎖定常領域（G1T4、配列番号：1009）のヒンジ領域のシステインをセリンに置換し、表53で示すOKT3重鎖定常領域の改変体を作製した。これらのOKT3重鎖定常領域の改変体に対し、１９１位（EUナンバリング）のアミノ酸残基をシステインに置換し、表54で示すOKT3重鎖定常領域の改変体を作製した。これらのOKT3重鎖定常領域の改変体をそれぞれOKT3重鎖可変領域（OKT3VH0000、配列番号：1010）と連結させOKT3重鎖改変体を作製し、対応する遺伝子をコードする発現ベクターを当業者公知の方法で作製した。【０３０２】
【表５３】
2020027330.tif 000140
【０３０３】
【表５４】
2020027330.tif 000141
【０３０４】
上記で作製したOKT3重鎖改変体とOKT3軽鎖と組み合わせて、表55に示すOKT3改変体を当業者公知の方法でFreeStyle293細胞(Invitrogen) もしくはExpi293細胞(Life technologies)を用いた一過性発現により発現し、プロテインAを用いた当業者公知の方法により精製を行った。またネガティブコントロールとして、抗KLH抗体であるIC17（重鎖：IC17HdK-G1T4（配列番号：1013）、軽鎖：IC17L-k0（配列番号：1014））も同様に調製した。【０３０５】
【表５５】
2020027330.tif 000142
【０３０６】
実施例１６−２  Jurkat cell溶液の調製
実施例１３−２と同様にJurkat cell溶液を調製した。【０３０７】
実施例１６−３  発光試薬溶液の調製
実施例１３−３と同様に発光試薬溶液を調製した。【０３０８】
実施例１６−４  ヒンジ領域のジスルフィド結合を除去しFab内にシステイン置換を導入した抗体のT細胞活性化評価
実施例１３−４と同様にT細胞活性化を評価した。
この結果、図29に示すように、ヒンジ領域のジスルフィド結合を除去しただけのOKT3改変体では、OKT3に比べT細胞活性化状態を低下させたかほとんど変化させなかった。一方で、ヒンジ領域のジスルフィド結合を除去し、定常領域にシステイン置換を導入したOKT3改変体は、OKT3に比べT細胞活性化状態を大きく上昇させた。このことから、ヒンジ領域のジスルフィド結合が存在しない場合でも、Fab内のシステイン置換によりFab間が架橋されCD3アゴニスト活性を増強させることができることが示された。【０３０９】
〔実施例１７〕改変抗体の発現ベクターの作製および改変抗体の発現と精製
動物細胞用発現ベクターに挿入された抗体遺伝子について、PCRまたはIn fusion Advantage PCR cloning kit (TAKARA)等を用いて当業者公知の方法でアミノ酸残基配列置換を行い、改変抗体発現ベクターを構築した。得られた発現ベクターの塩基配列は当業者公知の方法で決定した。作製した発現ベクターをFreeStyle293（登録商標）あるいはExpi293（登録商標）細胞(Invitrogen社)に一過性に導入する事で培養上清中に改変抗体を発現させた。得られた培養上清から、Protein A等を用いて当業者公知の方法で改変抗体を精製した。分光光度計を用いて280 nmでの吸光度を測定し、得られた値からPACE法により算出された吸光係数を用いて抗体濃度を算出した（Protein Science 1995 ; 4 : 2411-2423）。【０３１０】
〔実施例１８〕二重特異性抗体の調製
精製抗体をTBSあるいはPBSバッファーに透析し濃度を1mg /mLに調製した。また、10×反応バッファーとして250 mM 2-MEA (SIGMA)を調製した。実施例１７で調製された二種類のホモ二量体抗体を等量ずつ混合し、そこに1/10量の10×反応バッファーを加え混合した後、37℃で90分間静置した。反応後、TBSあるいはPBSに透析する事で、上記の二種類の抗体がヘテロ二量体化した二重特異性抗体の溶液を得た。上述の方法で抗体濃度を測定し後の実験に供した。【０３１１】
〔実施例１９〕アゴニスト活性評価
実施例１９−１  Jurkat cell溶液の調製
Jurkat cells (TCR/CD3 Effector Cells (NFAT), Promega) をフラスコより回収しAssay Buffer（RPMI 1640培地 (Gibco)、10%FBS (HyClone)、 1%MEM Non Essential Amino Acids (Invitrogen)、1mM Sodium Pyrubate (Invitrogen)）により洗浄した後、当該細胞がAssay Buffer中に3 ×106 cells/mLとなるよう懸濁した。当該細胞懸濁液をJurkat cells溶液として以後の実験に供した。【０３１２】
実施例１９−２  発光試薬溶液の調製
Bio-Glo Luciferase Assay Buffer 100mL (Promega)をBio-Glo Luciferase Assay Substrate (Promega) のボトルに加え転倒混和した。ボトルを遮光し、-20℃で凍結した。当該発光試薬溶液を以後の実験に供した。【０３１３】
実施例１９−３  T細胞活性化アッセイ
アゴニストシグナルによるT細胞活性化をルシフェラーゼ発光の倍率変化（Fold change）によって評価した。上記のJurkat cellsは、NFAT応答配列を有するルシフェラーゼレポーター遺伝子によって形質転換されており、抗TCR/CD3抗体による刺激を受けると細胞内シグナルを介したNFAT経路の活性化が起こり、ルシフェラーゼの発現が誘導される。上記で調製したJurkat cells溶液を384 well Flat底白色プレートの各ウェル中に10 μLずつ（3 x 104 cells/ウェル）添加した。次に、各濃度（150、15、1.5、0.15、0.015、0.0015、0.00015、0.000015 nM）に調製した抗体溶液を各ウェル中に20 μLずつ添加した。当該プレートを37℃、5%炭酸ガスインキュベータ中で24時間静置した。この後、発光試薬溶液を融解し各ウェルに30 μLずつ加え室温で10分間静置した。当該プレートの各ウェル中のルシフェラーゼの発光をルミノメーターにより測定した。【０３１４】
〔実施例２０〕Jurkat細胞を用いたCD3 biparatopic抗体のアゴニスト活性の評価
抗体調製および活性評価は実施例１７、実施例１８、実施例１９に準じて実施した。使用した抗体を表56に示す。【０３１５】
【表５６】
2020027330.tif 000143
【０３１６】
この結果、図30に示すように、二種類の抗CD3二重特異性抗体のFab-Fab間を追加のジスルフィド結合で連結した改変分子は追加のジスルフィド結合が無い二重特異性抗体と比べCD3を介したシグナル伝達が変動した。
以上の結果から、本発明における改変を導入する事で、同じ標的に対して異なるエピトープを持つ二重特異性抗原結合分子が有するアゴニスト活性を増強あるいは減弱する事が可能と考えられた。【０３１７】
〔実施例２１〕Jurkat細胞を用いたCD137アゴニスト活性の評価
抗体調製および活性評価は実施例１７、実施例１８、実施例１９に準じて実施した。使用した抗体は、通常の抗CD137抗体、その重鎖定常領域に抗体どうしの会合（６量体化）を促進する改変が導入された抗体、さらに上記の各抗体について、Fab-Fab間を追加のジスルフィド結合で連結した改変抗体である。【０３１８】
アゴニストシグナルによるT細胞活性化をルシフェラーゼ発光の倍率変化（Fold change）によって評価した。GloResponseTM NF-κB-Luc2/4-1BB Jurkat cell line (Promega)はNFAT応答配列を有するルシフェラーゼレポーター遺伝子によって形質転換されており、抗CD137抗体による刺激を受けると細胞内シグナルを介したNFAT経路の活性化が起こり、ルシフェラーゼの発現が誘導される。Assay medium (99% RPMI, 1% FBS)で2×106 cells/mLに調製されたJurkat cells溶液を96 well Flat底白色プレートの各ウェル中に25 μLずつ（5 x 104 cells/ウェル）添加した。次に、ATPを含む抗体溶液またはATPを含まない抗体濃度（終濃度45, 15, 5, 1.667, 0.556, 0.185, 0.062, 0.021 μg/mL）に調製した抗体溶液を各ウェル中に25 μLずつ添加した。ATPは最終濃度250 nMである。当該プレートを37℃、5%炭酸ガスインキュベータ中で6時間静置した。この後、発光試薬溶液を融解し各ウェルに75 μLずつ加え室温で10分間静置した。当該プレートの各ウェル中のルシフェラーゼの発光をルミノメーターにより測定した。各ウェルの発光の値を抗体未添加ウェルの発光の値で割った値をLuminescence foldとし、各抗体の活性を評価する指標とした。【０３１９】
得られた結果としては、通常の抗CD137抗体に比べて、６量体化改変が導入された抗体ではアゴニスト活性の向上が認められた。更にそれらの各抗体に追加のジスルフィド結合が加えられた改変抗体では、相乗的なアゴニスト活性の向上が認められた。
以上の結果から、本発明における改変を導入する事で、CD137に対するアゴニスト抗体の活性を増強する事が可能と考えられた。【０３２０】
〔実施例２２〕Jurkat細胞を用いたCD3//PD1二重特異性抗体のアゴニスト活性の評価
実施例２２−１
抗体調製および活性評価は実施例１７、実施例１８、実施例１９に準じて実施した。使用した抗体を表58に示す。【０３２１】
【表５８】
2020027330.tif 000144
【０３２２】
この結果、図31に示すように、複数の抗CD3抗体と抗PD1抗体の組み合わせからなる二重特異性抗体において、Fab-Fab間を追加のジスルフィド結合で連結した改変分子は追加のジスルフィド結合が無い二重特異性抗体に比べCD3および／またはPD1を介したシグナル伝達が大きく変動した。
以上の結果から、本発明における改変を導入する事で、抗体のような抗原結合分子が有するアゴニスト活性を増強あるいは減弱する事が可能と考えられた。【０３２３】
実施例２２−２
抗体調製および活性評価は実施例２、実施例３、実施例４に準じて実施した。使用した抗体を表59に示す。【０３２４】
【表５９】
2020027330.tif 000145
【０３２５】
PD-1アゴニストシグナルの有無を、PD-1とSHP2の近接時のBRETによる蛍光シグナル(618nm)と、ドナーであるSHP2由来の発光(460nm)の比率で評価した。アッセイの前日にPD-L1を発現する抗原提示細胞(Promega, #J109A)を10%FBS入りのF-12培地（Gibco, 11765-054）で4.0 x 104 cells/100 μL/wellで96 well plate (Costar, #3917)に播種し、37℃のCO2インキュベータで16-24時間培養した。アッセイ当日にHaloTag nanoBRET 618 Ligand (Promega, #G980A)をOpti-MEM(Gibco, #31985-062)で250倍希釈した。培養していたPD-L1発現抗原提示細胞の培地を除き、希釈したHaloTag nanoBRET 618 Ligandを25 μL/well添加した。PD-L1阻害抗体 10 μg/mLを含むOpti-MEMで希釈した評価検体(40, 8, 1.6 μg/mL)を25 μL/wellで添加した。PD-1/SHP2 Jurkat cell (Promega, #CS2009A01)を5 x 104 cells/50 μL/wellで上記の96 well plateに添加して、よく懸濁した後に37℃のCO2インキュベータで2.5時間培養した。nanoBRET Nano-Glo substrate (Promega, #N157A)をOpti-MEMで100倍希釈し、25 μL/wellで培養した96 well plateに添加し、室温で30分静置したのちEnvision (PerkinElmer, 2104 EnVision)でEm460mMおよびEm618nmを測定した。得られた値を以下の計算式に当てはめ、 BRET Ratio (mBU)を算出した。
2020027330.tif 000146
この結果、図32に示すように、抗CD3抗体と抗PD-1抗体からなる二重特異性抗体において、Fab-Fab間を追加のジスルフィド結合で連結した改変分子は追加のジスルフィド結合が無い二重特異性抗体に比べCD3および／またはPD1を介したシグナル伝達が大きく変動した。【０３２６】
〔実施例２３〕CD28/CD3クランピング二重特異性抗体のアゴニスト活性の評価
実施例２３−１  リアルタイム細胞増殖抑制アッセイ（xCELLigenceアッセイ）
抗体調製は実施例１７、実施例１８に準じて実施した。使用した抗体を表60に示す。【０３２７】
【表６０】
2020027330.tif 000147
【０３２８】
xCELLigence RTCA MP instrument（ACEA Biosciences）を用いて、抗体によるT細胞依存的な癌細胞増殖抑制効果を評価した。Glypican-3（GPC3）（配列番号：1241）を強制発現されたヒト肝がん細胞株SK-Hep-1（SK-pca31a）を標的細胞に、ヒト末梢血単核球（PBMC: CTL社）をエフェクター細胞として用いた。1 × 104細胞のSK-pca31aをE-Plate 96（ACEA Biosciences）に播種した。翌日、2 × 105細胞のPBMCおよび終濃度がそれぞれ0.001, 0.01, 0.1, 1または10 μg/mLになるように抗体が添加された。細胞増殖はxCELLigenceにより15分ごとにモニターされ、培養は72時間続けられた。細胞増殖抑制作用（CGI: %）は下記の式により算出された。
CGI (%) = 100 - (CIAb × 100 / CINoAb)
上記式において、“CIAb”は抗体を添加されたウェルの72時間後のCell index（xCELLigenceにより測定された細胞増殖指数）を示す。また、“CINoAb”は抗体を添加されていないウェルの72時間後のCell indexを示す。【０３２９】
実施例２３−２  サイトカイン産生アッセイ
抗体によるT細胞からのサイトカイン産生は以下の通り評価された。
SK-pca31aを標的細胞に、PBMC（CTL社）をエフェクター細胞として用いた。1 × 104細胞のSK-pca31aを96穴プレートに播種した。翌日、2 × 105細胞のPBMCおよび終濃度がそれぞれ0.01, 0.1, 1または10 μg/mLになるように抗体が添加された。72時間後に培養上清が回収され、AlphaLISA（PerkinElmer）を用いてヒトIL-6が測定された。【０３３０】
結果
CD28/ CD3クランピング二重特異性抗体とGPC3/結合減弱CD3二重特異性抗体の併用では細胞増殖抑制作用は見られなかった。しかし、CD28/ CD3クランピング二重特異性抗体のFab-Fab間に追加のジスルフィド結合を導入するための改変を入れることにより癌細胞の増殖抑制作用が見られた（図33および図35）。さらに、GPC3発現株とPBMCおよび上記改変を入れたCD28/ CD3クランピング二重特異性抗体とGPC3/結合減弱CD3二重特異性抗体を共培養するとサイトカイン産生が見られたが、PBMCに上記改変を入れたCD28/ CD3クランピング二重特異性抗体とGPC3/結合減弱CD3二重特異性抗体を添加しただけではサイトカイン産生は見られなかった（図34および図36）。したがって、上記改変を入れたCD28/ CD3クランピング二重特異性抗体とGPC3/結合減弱CD3二重特異性抗体による癌細胞の増殖抑制作用およびT細胞へのサイトカイン産生誘導能は癌抗原の発現に依存していると考えられた。【０３３１】
〔実施例２４〕CD8/CD28二重特異性抗体のアゴニスト活性の評価
抗体調製は実施例１７、実施例１８に準じて実施した。使用した抗体を表61に示す。【０３３２】
【表６１】
2020027330.tif 000148
【０３３３】
調製した検体の評価には、健常なボランティア採血より単離したヒト末梢血単核細胞（PBMC）が用いられた。50 mLの血液に0.5 mLのヘパリンが混和され、さらに50 mLのPBSで希釈された。ヒトPBMCは次の２ステップで単離された。第1ステップではFicoll-Paque PLUS（GE Healthcare）を添加されたLeucosep（greiner bio-one）が1000xg、1分間、室温にて遠心されたのちにPBSで希釈された血液を添加され、400xg、30分間、室温にて遠心が行われた。第2ステップでは遠心後のチューブよりバフィーコートが採取された後に、60 mLのPBS（Wako）により洗浄された。単離されたヒトPBMCは培地（5%ヒト血清（SIGMA）、95%AIM-V（Thermo Fischer Scientific）にて細胞密度1x107 /mLに調製された。細胞懸濁液は24 well plateの各wellに1mLずつ播種されたのち、5%CO2インキュベーター内にて37℃で培養された。
2日後、播種された細胞は培地を除去され、500 μLのPBSで洗浄された後にaccutase (nacalai tesque)を用いて回収された。続いて、終濃度が2 μMとなるようPBSで希釈されたViaFluor 405 (Biotium) 溶液で細胞密度1x106 /mLに調製され、37℃で15分間静置された。その後、細胞は培地で再懸濁され、96 well plateの各wellへ2x105個ずつ播種された。抗体溶液が終濃度0.1, 1, 10 μg/mLとなるよう加えられ、5%CO2インキュベーター内にて37℃で4日間培養された。
培養終了後、フローサイトメーター(BD LSRFortessa（商標）X-20（BD Biosciences）)（FCM）を用いて増殖している細胞の割合が調べられた。増殖している細胞の割合はViaFluor 405の蛍光強度が低下している割合から算出された。CD8α陽性 T細胞および制御性T（Treg）細胞での解析を行うため、蛍光標識された抗CD8α抗体、抗CD4抗体および抗Foxp3抗体等が用いられた。この結果、図37に示すように、いくつかの検体で活性の上昇が見られた。【０３３４】
〔実施例２５〕導入システイン間におけるジスルフィド結合形成の評価
ヒト化モデル抗体の軽鎖、重鎖にシステインを導入した改変抗体を作製し、新規に導入したシステイン間におけるジスルフィド結合形成の評価を実施した。評価は試料抗体を20mMリン酸緩衝液 (pH7.0) 中でキモトリプシンとインキュベートし、各抗体のアミノ酸配列から生成が想定されるペプチドの質量をLC/MSで検出することで行った。各抗体の調製は実施例１７、実施例１８に準じて実施した。使用した抗体を表62に示す。【０３３５】
【表６２】
2020027330.tif 000149
【０３３６】
まず、軽鎖126位（Kabatナンバリング）のリジンをシステインに置換したサブクラスが異なる改変抗体 (IgG1, IgG2, IgG4) を分析した。結果は表63に示した通り、分析した全ての抗体において126位システイン同士がジスルフィド結合を形成した際に生成するペプチドの理論質量に相当する成分が検出された。さらにIgG1試料にジスルフィド結合を還元する作用を持つトリス（2-カルボキシエチル）ホスフィンを添加し分析したところ本成分が消失したことより、本成分は126位システイン同士がジスルフィド結合を形成したペプチドであることが示唆された。同時に、サブクラスの違いは本ジスルフィド結合形成に影響しないことも示唆された。【０３３７】
【表６３】
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【０３３８】
次に、IgG1 重鎖162位（EUナンバリング）アラニンまたは191位（EUナンバリング）セリンをシステインに置換した改変抗体について分析を実施した。結果はそれぞれ表64, 65に示した通りとなり、導入したシステイン同士がジスルフィド結合を形成した際に生成するペプチドの理論質量に相当する成分が検出された。さらに191位にシステインを導入した改変抗体試料にトリス（2-カルボキシエチル）ホスフィンを添加し分析したところ本成分の消失が観察された（表65）。以上より、重鎖に導入したシステインにおいてもこれらのシステイン同士でジスルフィド結合を形成することが示唆された。【０３３９】
【表６４】
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【０３４０】
【表６５】
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【０３４１】
前述の発明は、明確な理解を助ける目的のもと、実例および例示を用いて詳細に記載したが、本明細書における記載および例示は、本発明の範囲を限定するものと解釈されるべきではない。本明細書で引用したすべての特許文献および科学文献の開示は、その全体にわたって、参照により明示的に本明細書に組み入れられる。
【産業上の利用可能性】
【０３４２】
非限定的な一態様において、本開示の抗原結合分子は、複数の抗原分子を空間的に近接した位置に保持する、複数の抗原分子間での相互作用を制御する、および/または互いに会合することによって活性化される複数の抗原分子の活性化を制御することができる点で有用である。別の態様において、本開示の抗原結合分子は、従来の抗原結合分子に比べてプロテアーゼ切断に対する抵抗性が高い点で有用である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１Ａ】
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【図３１Ｂ】
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【図３１Ｃ】
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【図３１Ｄ】
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【図３２】
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【図３３Ａ】
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【図３３Ｂ】
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【図３４Ａ】
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【図３４Ｂ】
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【図３４Ｃ】
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【図３５Ａ】
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【図３５Ｂ】
2020027330.tif 000194
【図３６Ａ】
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【図３６Ｂ】
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【図３７Ａ】
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【図３７Ｂ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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