(57)【要約】本発明の目的は、経済性が良好であり、かつ、リグニンの種類に依拠せずに、リグニン由来の芳香族化合物からムコン酸の製造を可能にする微生物及び該微生物を利用したムコン酸の製造方法を提供することにある。上記目的は、宿主微生物が染色体上にｐｃａＨ遺伝子、ｐｃａＧ遺伝子、ｃａｔＡ遺伝子及びｃａｔＢ遺伝子を有し、かつ、シリンギルリグニン由来の芳香族化合物を資化するシュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属微生物であり、染色体上にある該ｐｃａＨ遺伝子及び該ｐｃａＧ遺伝子からなる群から選ばれる少なくとも１種の遺伝子及び該ｃａｔＢ遺伝子が欠失しており、かつ、挿入されたａｒｏＹ遺伝子を発現する、形質転換微生物及び該形質転換微生物を用いたムコン酸の製造方法などにより解決される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
宿主微生物が染色体上にｐｃａＨ遺伝子、ｐｃａＧ遺伝子、ｃａｔＡ遺伝子及びｃａｔＢ遺伝子を有し、かつ、シリンギルリグニン由来の芳香族化合物を資化するシュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属微生物であり、
染色体上にある該ｐｃａＨ遺伝子及び該ｐｃａＧ遺伝子からなる群から選ばれる少なくとも１種の遺伝子及び該ｃａｔＢ遺伝子が欠失しており、かつ、
挿入されたａｒｏＹ遺伝子を発現する、
形質転換微生物。
【請求項２】
宿主微生物が染色体上にｐｃａＨ遺伝子、ｐｃａＧ遺伝子、ｃａｔＡ遺伝子及びｃａｔＢ遺伝子を有し、かつ、シリンギルリグニン由来の芳香族化合物を資化するシュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属微生物であり、
染色体上にある該ｐｃａＨ遺伝子及び該ｐｃａＧ遺伝子からなる群から選ばれる少なくとも１種の遺伝子及び該ｃａｔＢ遺伝子が欠失しており、
挿入されたｐｃａＨ遺伝子及びｐｃａＧ遺伝子を発現し、かつ、
挿入されたａｒｏＹ遺伝子を発現する、
形質転換微生物。
【請求項３】
挿入された前記ａｒｏＹ遺伝子と、挿入された前記ｐｃａＨ遺伝子及び前記ｐｃａＧ遺伝子とは、同一プロモーターの制御下にある、請求項２に記載の形質転換微生物。
【請求項４】
さらに挿入されたｃａｔＡ遺伝子、ｖａｎＡ遺伝子、ｖａｎＢ遺伝子及びｋｐｄＢ遺伝子からなる群から選ばれる少なくとも１種の遺伝子を発現する、請求項１又は２に記載の形質転換微生物。
【請求項５】
前記シュードモナス属微生物がシュードモナス・プチダ（Ｐ．ｐｕｔｉｄａ）、シュードモナス・プレコグロッシチダ（Ｐ．ｐｌｅｃｏｇｌｏｓｓｉｃｉｄａ）、シュードモナス・タイワネンシス（Ｐ．ｔａｉｗａｎｅｎｓｉｓ）、シュードモナス・モンテイリー（Ｐ．ｍｏｎｔｅｉｌｉｉ）、シュードモナス・フルヴァ（Ｐ．ｆｕｌｖａ）及びこれらの近縁種であるシュードモナス・スピーシーズ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．）からなる群から選ばれる、請求項１又は２に記載の形質転換微生物。
【請求項６】
ｐ−ヒドロキシフェニルリグニン由来の芳香族化合物及び／又はグアイアシルリグニン由来の芳香族化合物と、シリンギルリグニン由来の芳香族化合物とを、請求項１又は２に記載の形質転換微生物に作用させることにより、ムコン酸を得る工程
を含む、ムコン酸の製造方法。
【請求項７】
ｐ−ヒドロキシフェニルリグニン由来の芳香族化合物及び／又はグアイアシルリグニン由来の芳香族化合物を、請求項２に記載の形質転換微生物に作用させることにより、ムコン酸を得る工程
を含む、ムコン酸の製造方法。
【請求項８】
前記工程が、溶存酸素濃度が１％〜１３％である条件下で行われる工程である、請求項７に記載の製造方法。
【請求項９】
宿主微生物が染色体上にｐｃａＨ遺伝子、ｐｃａＧ遺伝子、ｃａｔＡ遺伝子及びｃａｔＢ遺伝子を有し、かつ、シリンギルリグニン由来の芳香族化合物を資化するシュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属微生物であり、かつ、
染色体上にある該ｐｃａＨ遺伝子及び該ｐｃａＧ遺伝子からなる群から選ばれる少なくとも１種の遺伝子が欠失している、
形質転換微生物。
【請求項１０】
ｐ−ヒドロキシフェニルリグニン由来の芳香族化合物及び／又はグアイアシルリグニン由来の芳香族化合物と、シリンギルリグニン由来の芳香族化合物とを、請求項９に記載の形質転換微生物に作用させることにより、プロトカテク酸を得る工程
を含む、プロトカテク酸の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ムコン酸が生産可能な形質転換微生物及び該形質微生物を利用したムコン酸の製造方法に関する。特に、本発明は、リグニン由来の芳香族化合物を炭素源として増殖及びムコン酸の生産が可能な形質転換微生物に関する。
【背景技術】
【０００２】
リグニンは植物の維管束細胞壁成分として存在する無定形高分子物質であって、フェニルプロパン系の構成単位が複雑に縮合したものであり、メトキシ基を含有することが化学構造上の大きな特徴になっている。リグニンは木質化した植物細胞を相互に膠着し、組織を強化する働きをしており、木材中に約１８％〜３６％、草本中には約１５％〜２５％存在する。そこで、木材を有効利用するために、リグニンを分解し、有用化合物を得ようとする試みが種々なされている。木材などのバイオマスに由来するリグニンには、ｐ−ヒドロキシフェニルリグニン、グアイアシルリグニン及びシリンギルリグニンの３種があることが知られている。【０００３】
一方、ｃｉｓ，ｃｉｓ−ムコン酸（以下、単にムコン酸とよぶ場合がある。）は、分子内に二重結合及びカルボキシ基が２個あることにより、反応性が高い化合物である。ムコン酸を出発物質とする種々のムコン酸誘導体が知られており、例えば、ラクトン、スルホン、ポリアミド、ポリエステル、チオエステル、付加ポリマーなどが挙げられる。このようなムコン酸誘導体は、様々な用途を有するものとして知られており、例えば、界面活性剤、難燃剤、ＵＶ光安定化剤、熱硬化性プラスチック、コーティング剤などとして使用され得る。【０００４】
このように、ムコン酸は、ムコン酸誘導体の形で種々の用途に供されるところ、リグニンからムコン酸を製造することができれば、資源の再生が達成され、非常に有用である。そこで、リグニン又はリグニンに由来する物質から、ムコン酸を製造する方法が試みられている。特にこのような方法として、微生物を用いたバイオコンバージョンが研究されている。【０００５】
例えば、下記非特許文献１（該文献の全記載はここに開示として援用される。）には、シュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ）を宿主微生物として、染色体上のｐｃａＨ遺伝子及びｐｃａＧ遺伝子（以下、合わせてｐｃａＨＧ遺伝子とよぶ場合がある。）並びにｃａｔＲ遺伝子、ｃａｔＢ遺伝子、ｃａｔＣ遺伝子及びｃａｔＡ遺伝子を破壊し、かつ、挿入したｃａｔＡ遺伝子とａｒｏＹ遺伝子とを、又はｃａｔＡ遺伝子とａｒｏＹ遺伝子とｅｃｄＢ遺伝子とを発現する形質転換微生物を作製し、該形質転換微生物をグルコースにより増殖させ、次いでｐ−クマル酸によりムコン酸を製造したことが記載されている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】C.W. Johnson et al., Metabolic Engineering Communications, 3, 111-119, 2016.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
確かに、非特許文献１に記載の形質転換微生物を用いることにより、ｐ−クマル酸からムコン酸を製造することができる。しかし、非特許文献１に記載の形質転換微生物は、増殖のための炭素源として高価なグルコースを要求することから、非特許文献１に記載の形質転換微生物を用いるムコン酸の製造方法は経済性が悪いという問題がある。【０００８】
一方、本発明者らは、これまでにシュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ）を宿主微生物として、染色体上のｐｃａＨＧ遺伝子及びｃａｔＢ遺伝子を欠失させ、さらに挿入したｐｃａＨＧ遺伝子及びａｒｏＹ遺伝子を発現する形質転換微生物を作製し、グルコースを用いなくとも、リグニン由来の芳香族化合物を利用して増殖しつつ、ムコン酸を製造する方法を創作して、平成３０年４月２４日に国際出願した（ＰＣＴ／ＪＰ２０１８／１６６７４）。【０００９】
しかし、国際出願ＰＣＴ／ＪＰ２０１８／１６６７４号明細書に記載の宿主微生物は、シリンギルリグニン由来の芳香族化合物を資化することができない。したがって、国際出願ＰＣＴ／ＪＰ２０１８／１６６７４号明細書に記載の形質転換微生物を用いる方法は、シリンギルリグニンを多く含む広葉樹をバイオマスとして利用することができないという問題がある。【００１０】
そこで、本発明は、経済性が良好であり、かつ、リグニンの種類に依拠せずに、リグニン由来の芳香族化合物からムコン酸の製造を可能にする微生物及び該微生物を利用したムコン酸の製造方法を提供することを、発明が解決しようとする課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは、上記課題の解決を試みるために、日本全国の土壌を採取して、シリンギルリグニン由来の芳香族化合物を資化する可能性があるシュードモナス属微生物を単離することについて鋭意検討した。【００１２】
その結果、広葉樹であるシラカバのニトロベンゼン分解物に含まれるリグニン由来化合物を単一炭素源として増殖することができるシュードモナス属微生物数株を得ることに成功した。このうち増殖性の良かった株を選び出し、国際出願ＰＣＴ／ＪＰ２０１８／１６６７４号明細書に記載の方法に準じて染色体上のｐｃａＨＧ遺伝子及びｃａｔＢ遺伝子を破壊した後、別途、外来遺伝子として挿入したａｒｏＹ遺伝子を過剰発現する形質転換微生物を創作することに成功した。【００１３】
驚くべきことに、本発明者らが作製した形質転換微生物は、グルコースを用いなくとも、シリンギルリグニン由来の芳香族化合物を利用して増殖しつつ、ｐ−ヒドロキシフェニルリグニン及び／又はグアイアシルリグニンに由来する芳香族化合物からムコン酸を製造し得ることを見出した。【００１４】
さらに驚くべきことに、外来遺伝子としてａｒｏＹ遺伝子に加えてｐｃａＨＧ遺伝子を過剰発現する形質転換微生物を創作したところ、ｐ−ヒドロキシフェニルリグニン及び／又はグアイアシルリグニンに由来する芳香族化合物により微生物の増殖及びムコン酸の生産が可能であることを見出した。【００１５】
また、本発明者らは、これまでにスフィンゴビウム・スピーシーズ（Ｓｐｈｉｎｇｏｂｉｕｍ  ｓｐ．）を宿主微生物として、染色体上のプロトカテク酸分解酵素遺伝子であるｌｉｇＡＢ遺伝子を欠失させ、さらに挿入したｃａｔＡ遺伝子及びａｒｏＹ遺伝子を発現する形質転換微生物を作製し、シリンギルリグニン由来の芳香族化合物を利用して増殖しつつ、ムコン酸を製造する方法を創作して、平成３０年４月２４日に国際出願した（ＰＣＴ／ＪＰ２０１８／１６６７５）。【００１６】
国際出願ＰＣＴ／ＪＰ２０１８／１６６７４号明細書に記載の形質転換微生物は栄養要求性を示す。具体的には、該形質転換微生物は、トリプトンの非存在下においては、増殖速度及びムコン酸の製造速度が低下する傾向にある。【００１７】
それに対して、本発明者らが今回作製した形質転換微生物は、トリプトンの非存在下においても、増殖速度が変わらずに、効率良くムコン酸を製造することができる。【００１８】
このようにして、本発明者らは、リグニンの種類に依拠せずに、リグニン由来の芳香族化合物からムコン酸の製造を可能にする形質転換微生物及び該形質転換微生物を利用したムコン酸の製造方法を創作することに成功した。【００１９】
言及するまでもなく、リグニン由来の芳香族化合物は、廃資材などのバイオマスから得ることができ、グルコースと比べて非常に安価である。したがって、本発明者らが作製した形質転換微生物を用いるムコン酸の製造方法は、非特許文献１に記載の形質転換微生物を用いる方法と比べて経済的に有利な方法である。本発明は、これらの知見及び成功例に基づき完成された発明である。【００２０】
したがって、本発明の一態様によれば、以下の（１）〜（５）の形質転換微生物が提供される。
（１）宿主微生物が染色体上にｐｃａＨ遺伝子、ｐｃａＧ遺伝子、ｃａｔＡ遺伝子及びｃａｔＢ遺伝子を有し、かつ、シリンギルリグニン由来の芳香族化合物を資化するシュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属微生物であり、
染色体上にある該ｐｃａＨ遺伝子及び該ｐｃａＧ遺伝子からなる群から選ばれる少なくとも１種の遺伝子及び該ｃａｔＢ遺伝子が欠失しており、かつ、
挿入されたａｒｏＹ遺伝子を発現する、
形質転換微生物。
（２）宿主微生物が染色体上にｐｃａＨ遺伝子、ｐｃａＧ遺伝子、ｃａｔＡ遺伝子及びｃａｔＢ遺伝子を有し、かつ、シリンギルリグニン由来の芳香族化合物を資化するシュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属微生物であり、
染色体上にある該ｐｃａＨ遺伝子及び該ｐｃａＧ遺伝子からなる群から選ばれる少なくとも１種の遺伝子及び該ｃａｔＢ遺伝子が欠失しており、
挿入されたｐｃａＨ遺伝子及びｐｃａＧ遺伝子を発現し、かつ、
挿入されたａｒｏＹ遺伝子を発現する、
形質転換微生物。
（３）挿入された前記ａｒｏＹ遺伝子と、挿入された前記ｐｃａＨ遺伝子及び前記ｐｃａＧ遺伝子とは、同一プロモーターの制御下にある、（２）に記載の形質転換微生物。
（４）さらに挿入されたｃａｔＡ遺伝子、ｖａｎＡ遺伝子、ｖａｎＢ遺伝子及びｋｐｄＢ遺伝子からなる群から選ばれる少なくとも１種の遺伝子を発現する、（１）〜（３）のいずれか１項に記載の形質転換微生物。
（５）前記シュードモナス属微生物がシュードモナス・プチダ（Ｐ．ｐｕｔｉｄａ）、シュードモナス・プレコグロッシチダ（Ｐ．ｐｌｅｃｏｇｌｏｓｓｉｃｉｄａ）、シュードモナス・タイワネンシス（Ｐ．ｔａｉｗａｎｅｎｓｉｓ）、シュードモナス・モンテイリー（Ｐ．ｍｏｎｔｅｉｌｉｉ）、シュードモナス・フルヴァ（Ｐ．ｆｕｌｖａ）及びこれらの近縁種であるシュードモナス・スピーシーズ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．）からなる群から選ばれる、（１）〜（４）のいずれか１項に記載の形質転換微生物。【００２１】
本発明の別の一態様によれば、以下（６）〜（８）の製造方法が提供される。
（６）ｐ−ヒドロキシフェニルリグニン由来の芳香族化合物及び／又はグアイアシルリグニン由来の芳香族化合物と、シリンギルリグニン由来の芳香族化合物とを、（１）〜（５）のいずれか１項に記載の形質転換微生物に作用させることにより、ムコン酸を得る工程
を含む、ムコン酸の製造方法。
（７）ｐ−ヒドロキシフェニルリグニン由来の芳香族化合物及び／又はグアイアシルリグニン由来の芳香族化合物を、（２）〜（５）のいずれか１項に記載の形質転換微生物に作用させることにより、ムコン酸を得る工程
を含む、ムコン酸の製造方法。
（８）前記工程が、溶存酸素濃度が１％〜１３％である条件下で行われる工程である、（７）に記載の製造方法。【００２２】
本発明の別の一態様によれば、以下（９）の形質転換微生物が提供される。
（９）宿主微生物が染色体上にｐｃａＨ遺伝子、ｐｃａＧ遺伝子、ｃａｔＡ遺伝子及びｃａｔＢ遺伝子を有し、かつ、シリンギルリグニン由来の芳香族化合物を資化するシュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属微生物であり、かつ、
染色体上にある該ｐｃａＨ遺伝子及び該ｐｃａＧ遺伝子からなる群から選ばれる少なくとも１種の遺伝子が欠失している、
形質転換微生物。【００２３】
本発明の別の一態様によれば、以下（１０）の製造方法が提供される。
（１０）ｐ−ヒドロキシフェニルリグニン由来の芳香族化合物及び／又はグアイアシルリグニン由来の芳香族化合物と、シリンギルリグニン由来の芳香族化合物とを、（９）に記載の形質転換微生物に作用させることにより、プロトカテク酸を得る工程
を含む、プロトカテク酸の製造方法。
【発明の効果】
【００２４】
本発明の一態様の形質転換微生物及び本発明の一態様の製造方法によれば、従前の微生物を用いる方法と比べて、安価かつリグニンの種類に依拠せずに、リグニン由来の芳香族化合物からムコン酸及びプロトカテク酸を製造することができる。したがって、本発明の一態様の形質転換微生物及び本発明の一態様の製造方法によれば、リグニンを含むバイオマスの有効利用の一環として、工業的規模でのムコン酸及びプロトカテク酸の製造が期待できる。
【発明を実施するための形態】
【００２５】
以下、本発明の一態様である形質転換微生物及び製造方法の詳細について説明するが、本発明の技術的範囲は本項目の事項によってのみに限定されるものではなく、本発明はその目的を達成する限りにおいて種々の態様をとり得る。
【００２６】
本明細書における各用語は、別段の定めがない限り、当業者により通常用いられている意味で使用され、不当に限定的な意味を有するものとして解釈されるべきではない。
【００２７】
例えば、「及び／又は」との用語は、列記した複数の関連項目のいずれか１つ、又は２つ以上の任意の組み合わせ若しくは全ての組み合わせを意味する。
【００２８】
（形質転換微生物の概要）
本発明の一態様である形質転換微生物は、宿主微生物の染色体上にある特定の遺伝子が欠失するように、宿主微生物を形質転換した微生物である。また、本発明の一態様である形質転換微生物は、さらに外来遺伝子として挿入したプロトカテク酸からのムコン酸の合成経路に関与する特定の遺伝子を発現するように、宿主微生物を形質転換しているか否かなどによって、３種類の態様に大別される。
【００２９】
本明細書における「遺伝子の欠失」は、遺伝子が正常に転写されないこと、遺伝子の発現によって産生されるべきタンパク質が正常に翻訳されないことなどのように、遺伝子が正常に機能せずに遺伝子の発現が妨げられていることを意味する。遺伝子の欠失は、例えば、遺伝子の全部又は一部が破壊、欠損、置換、挿入などにより遺伝子の構造が変化することによって生じ得る。ただし、遺伝子の欠失は、遺伝子の構造に変化が生じずに、例えば、遺伝子の制御領域をブロックするなどの手段によって遺伝子の発現が抑えられることによっても生じ得る。
【００３０】
本明細書における「遺伝子の発現」とは、転写や翻訳などを介して、遺伝子によってコードされるタンパク質が本来の構造や活性を有する態様で生産されることを意味する。また、本明細書における「遺伝子の過剰発現」とは、遺伝子が挿入されたことにより、宿主微生物が本来発現する量を超えて、該遺伝子によってコードされるタンパク質が生産されることを意味する。
【００３１】
（欠失又は挿入する遺伝子）
形質転換微生物について、宿主微生物は染色体上にｐｃａＨ遺伝子、ｐｃａＧ遺伝子、ｃａｔＡ遺伝子及びｃａｔＢ遺伝子を有する。これらの遺伝子のうち、形質転換微生物は、宿主微生物の染色体上にあるｐｃａＨ遺伝子、ｐｃａＧ遺伝子及びｃａｔＢ遺伝子が欠失している。形質転換微生物について、宿主微生物は染色体上に本来有するｐｃａＨ遺伝子及びｐｃａＧ遺伝子の両方が欠失していることが好ましいが、ｐｃａＨ遺伝子及びｐｃａＧ遺伝子のいずれか一方が欠失していればよい。
【００３２】
ｐｃａＨ遺伝子及びｐｃａＧ遺伝子は、それぞれプロトカテク酸・３，４−ジオキシゲナーゼのβサブユニット及びαサブユニットを発現する遺伝子であれば特に限定されないが、例えば、それぞれ配列番号３７及び３８の塩基配列を有する遺伝子などが挙げられる。プロトカテク酸・３，４−ジオキシゲナーゼは、例えば、シュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ）  ＫＴ２４４０株が保有する。プロトカテク酸・３，４−ジオキシゲナーゼは、一般的に、プロトカテク酸から３−カルボキシムコン酸を生成する反応を触媒する活性を有し、Ｆｅ３＋を補因子として要求することが知られている。なお、本明細書ではｐｃａＨ遺伝子及びｐｃａＧ遺伝子のいずれか一方又は両方をまとめてｐｃａＨＧ遺伝子とよぶ場合がある。
【００３３】
ｃａｔＢ遺伝子は、ｃｉｓ，ｃｉｓ−ムコン酸・サイクロイソメラーゼを発現する遺伝子であれば特に限定されないが、例えば、配列番号４０の塩基配列を有する遺伝子などが挙げられる。
【００３４】
ｃａｔＡ遺伝子は、カテコール・１，２−ジオキシゲナーゼ（Ｃａｔｅｃｈｏｌ  １，２−ｄｉｏｘｙｇｅｎａｓｅ）を発現する遺伝子であれば特に限定されないが、例えば、配列番号３９の塩基配列を有する遺伝子などが挙げられる。カテコール・１，２−ジオキシゲナーゼ（ＥＣ  １．１３．１１．１）は、１，２−ジヒドロキシベンゼン・１，２−ジオキシゲナーゼなどともよばれる。カテコール・１，２−ジオキシゲナーゼは、例えば、シュードモナス・プチダ  ＫＴ２４４０株が保有する。カテコール・１，２−ジオキシゲナーゼは、一般的に、カテコールからｃｉｓ，ｃｉｓ−ムコン酸を生成する反応を触媒する活性を有し、Ｆｅ３＋を補因子として要求する酵素として知られている。
【００３５】
カテコール・１，２−ジオキシゲナーゼのアミノ酸配列（ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｏ．Ｑ８８Ｉ３５）中にＩｎｔｒａｄｉｏｌ  ｄｉｏｘｙｇｅｎａｓｅドメインを有する。該ドメインは ［ＬＩＶＭＦ］−ｘ−Ｇ−ｘ−［ＬＩＶＭ］−ｘ（４）−［ＧＳ］−ｘ（２）−［ＬＩＶＭＡ］−ｘ（４）−［ＬＩＶＭ］−［ＤＥ］−［ＬＩＶＭＦＹＣ］−ｘ（６）−Ｇ−ｘ−［ＦＹ］（Ｐｒｏｓｉｔｅ  ｅｎｔｒｙ  ｎｏ．Ｐ０００８３）からなり、配列中のＹが補因子であるＦｅ３＋の結合に関わる。カテコール・１，２−ジオキシゲナーゼのアミノ酸配列中のＬ１３７からＹ１６５が上記ドメインに相当する。
【００３６】
本発明の一態様の形質転換微生物（以下、形質転換微生物（１）とよぶ。）は、少なくとも、挿入されたａｒｏＹ遺伝子を発現する。本発明別の一態様の形質転換微生物（以下、形質転換微生物（２）とよぶ。）は、少なくとも、挿入されたａｒｏＹ遺伝子を発現し、かつ、挿入されたｐｃａＨＧ遺伝子を発現する。ただし、形質転換微生物（２）において、宿主微生物が染色体上に本来有するｐｃａＨ遺伝子及びｐｃａＧ遺伝子のいずれか一方が欠失している場合は、その欠失した遺伝子を挿入して発現するか、ｐｃａＨ遺伝子及びｐｃａＧ遺伝子の両方を挿入して発現すればよい。一方で、本発明の別の一態様の形質転換微生物（以下、形質転換微生物（３）とよぶ。）は、ａｒｏＹ遺伝子及びｐｃａＨＧ遺伝子のいずれも挿入されていない。すなわち、形質転換微生物（３）は、プロトカテク酸からムコン酸を製造することが実質的にできない。本明細書では、形質転換微生物（１）〜（３）をまとめて指すときには、単に「形質転換微生物」とよぶ。また、遺伝子挿入に関する部分についての形質転換微生物は、形質転換微生物（１）及び／又は（２）を指す。
【００３７】
ａｒｏＹ遺伝子は、プロトカテク酸・デカルボキシラーゼを発現する遺伝子であれば特に限定されないが、例えば、配列番号４１の塩基配列を有する遺伝子などが挙げられる。プロトカテク酸・デカルボキシラーゼ（ＥＣ  ４．１．１．６３）は、３，４−ジヒドロキシ安息香酸・カルボキシリアーゼ（３，４−ｄｉｈｙｄｒｏｘｙｂｅｎｚｏａｔｅ  ｃａｒｂｏｘｙ−ｌｙａｓｅ）ともよばれる。プロトカテク酸・デカルボキシラーゼは、プロトカテク酸からカテコールを生成する反応を触媒する酵素であれば、特に限定されない。なお、３−Ｏ−メチルガリック酸から３−メトキシカテコールを生成する反応やガリック酸からピロガロールを生成する反応を触媒する活性を有する酵素についても、プロトカテク酸・デカルボキシラーゼとして使用できる可能性がある。また、バニリン酸脱炭酸酵素や４−ヒドロキシ安息香酸の脱炭酸酵素についても、プロトカテク酸を脱炭酸する可能性があることから、プロトカテク酸・デカルボキシラーゼとして使用できる可能性がある。プロトカテク酸・デカルボキシラーゼは、構造上は、ＵｂｉＤドメイン（Ｄｏｍａｉｎ  ａｒｃｈｉｔｅｃｈｔｕｒｅ  ＩＤ  １０４８７９５３）を含むタンパク質群（ＵｂｉＤ  スーパーファミリー）に分類される。
【００３８】
プロトカテク酸・デカルボキシラーゼの具体例としては、クレブシエラ・ニューモニエ・サブスピーシーズ・ニューモニエ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ  ｓｕｂｓｐ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）  Ａ１７０−４０株（ＡＴＣＣ  ２５５９７株）に由来するタンパク質（ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｏ．ＡＢ４７９３８４；ＡＢ４７９３８４タンパク質）などが挙げられる。ＡＢ４７９３８４タンパク質のアミノ酸配列と配列同一性の高いアミノ酸配列を有するタンパク質としては、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｃｌｏａｃａｅ  ＭＢＲＬ１０７７株由来のｐｒｏｔｏｃａｔｅｃｈｕａｔｅ  ｄｅｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅ（ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｏ．ＡＭＪ７０６８６；配列同一性  ８７．２％）、Ｅ．ｃｌｏａｃａｅ  ｅ１０２６株由来のｐｒｏｔｏｃａｔｅｃｈｕａｔｅ  ｄｅｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅ（ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｏ．ＣＺＵ７６０２２；配列同一性  ８５．７％）などのｐｒｏｔｏｃａｔｅｃｈｕａｔｅ  ｄｅｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅとして登録されているタンパク質などが挙げられるが、これらに限定されない。これらの酵素は、補因子としてＭｎ２＋、プレニル化フラビン・モノヌクレオチド（ｐｒｅｎｙｌａｔｅｄ  ｆｌａｖｉｎ  ｍｏｎｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ；ｐｒｅｎｙｌ−ＦＭＮ）を要求する一連の酵素群として特徴付けられる。
【００３９】
形質転換微生物は、ｋｐｄＢ遺伝子を挿入したものであってもよい。ｋｐｄＢ遺伝子は、プロトカテク酸脱炭酸酵素の補因子であるプレニル−ＦＭＮの合成を行っていると想定されるタンパク質であり、一細胞内でプロトカテク酸脱炭酸酵素とともに発現することによってプレニル−ＦＭＮの供給が高まり、プロトカテク酸脱炭酸酵素活性が向上する蓋然性がある。そこで、ａｒｏＹ遺伝子とともにｋｐｄＢ遺伝子を発現させて脱炭酸活性を向上することができれば、ムコン酸の生産収率が上昇すると想定される。
【００４０】
ｋｐｄＢ遺伝子は、フラビン・プレニルトランスフェラーゼとしての酵素活性を有する４−ヒドロキシ安息香酸・デカルボキシラーゼ・サブユニットＢを発現する遺伝子であれば特に限定されないが、例えば、配列番号４２の塩基配列を有する遺伝子などが挙げられる。ＵｂｉＸファミリーの中にＰｈｅｎｏｌｉｃ  ａｃｉｄ（ｈｙｄｒｏｘｙａｒｙｌｉｃ  ａｃｉｄ）ｄｅｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅ  ｓｕｂｕｎｉｔＢがあり、その１つが４−ヒドロキシ安息香酸・デカルボキシラーゼ・サブユニットＢである。なお、Ｐｈｅｎｏｌｉｃ  ａｃｉｄ  ｄｅｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅの中には、ＡｒｏＹやＦｄｃ（酵母由来のＦｅｒｕｌｉｃ  ａｃｉｄ  ｄｅｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅ）のようにホモオリゴマーの酵素もあれば、４−ヒドロキシ安息香酸・デカルボキシラーゼやバニリン酸・デカルボキシラーゼのようにＢＣＤサブユニットからなるヘテロオリゴマーの酵素がある。
【００４１】
フラビン・プレニルトランスフェラーゼは、ジメチルアリル一リン酸（ＤＭＡＰ）からジメチルアリル構造をフラビンモノヌクレオチド（ＦＭＮ）のフラビン骨格へと結合し、ｐｒｅｎｙｌ−ＦＭＮを合成する反応を触媒する。
【００４２】
４−ヒドロキシ安息香酸・デカルボキシラーゼ・サブユニットＢは、フラボプロテイン、ＵｂｉＸ／Ｐａｄ１ファミリーに分類される酵素であることから、そのアミノ酸配列は、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｋ−１２株由来のＦｌａｖｉｎ  ｐｒｅｎｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ（ＵｂｉＸ）のアミノ酸配列（ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｏ．Ｐ０ＡＧ０３）と配列同一性が５０％であり；Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  Ｓ２８８ｃ由来のＦｌａｖｉｎ  ｐｒｅｎｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ（Ｐａｄ１）のアミノ酸配列（ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｏ．Ｐ３３７５１）と配列同一性が３９．８％であり；Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ  １６８株由来のＰｈｅｎｏｌｉｃ  ａｃｉｄ  ｄｅｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅ  ｓｕｂｕｎｉｔ  Ｂ（ＢｃｄＢ）のアミノ酸配列（ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｏ．Ｐ９４４０４）と配列同一性が５４．５％である。Ｗｈｉｔｅ  ＭＤらの文献（Ｎａｔｕｒｅ，５２２：５０２−５０６，２０１５；該文献の全記載はここに開示として援用される。）により、ＵｂｉＸのアミノ酸配列中にＦＭＮの結合に関わるＳ３７及びＲ１２３、ＤＭＡＰの結合に関わるＹ１５３及びＲ１６９が同定され、ＫｐｄＢなどのＵｂｉＸ／Ｐａｄ１ファミリーに分類されるタンパク質のアミノ酸配列にもこれらＦＭＮ及びＤＭＡＰの結合に関わるアミノ酸残基が保存されている。
【００４３】
形質転換微生物は、宿主微生物が染色体上に、ｐｃａＨ遺伝子、ｐｃａＧ遺伝子、ｃａｔＡ遺伝子及びｃａｔＢ遺伝子に加えて、ｐｏｂＡ遺伝子、ｖａｎＡ遺伝子及びｖａｎＢ遺伝子の１種、２種又は３種全部の遺伝子を有することが好ましい。本明細書では、ｖａｎＡ遺伝子及びｖａｎＢ遺伝子のいずれか一方又は両方をまとめてｖａｎＡＢ遺伝子とよぶ場合がある。また、宿主微生物がｐｏｂＡ遺伝子、ｖａｎＡ遺伝子及び／又はｖａｎＢ遺伝子を染色体上に有していない場合は、これらの遺伝子を発現するように形質転換微生物に挿入することが好ましい。さらに、形質転換微生物は、宿主微生物が染色体上に、バニリン・デヒドロゲナーゼ（ｖｄｈ）遺伝子、ｐ−ヒドロキシベンズアルデヒド・デヒドロゲナーゼ（ＰＰ＿１９４８）遺伝子及び／又はスフィンゴビウム（Ｓｐｈｉｎｇｏｂｉｕｍ）  ｓｐ．ＳＹＫ−６株由来のアルデヒド・デヒドロゲナーゼ（ｌｉｇＶ）遺伝子を有することが好ましい。また、宿主微生物がｖｄｈ遺伝子、ＰＰ＿１９４８遺伝子及び／又はｌｉｇＶ遺伝子を染色体上に有していない場合は、これらの遺伝子を発現するように形質転換微生物に挿入することが好ましい。
【００４４】
形質転換微生物について、宿主微生物はシリンガ酸やシリンガアルデヒドなどのシリンギルリグニン由来の芳香族化合物を炭素源として増殖する（資化する）能力を有する。宿主微生物がシリンガ酸やシリンガアルデヒドなどのシリンギル核を有する芳香族化合物を唯一の炭素源として利用して増殖する能力を有するためには、宿主微生物は染色体上にシリンガ酸・デメチラーゼ遺伝子（例えばｄｅｓＡ）、３−Ｏ−メチルガリック酸・３，４−ジオキシゲナーゼ遺伝子（例えばｄｅｓＺ）、３−Ｏ−メチルガリック酸・デメチラーゼ遺伝子（例えばｖａｎＡＢ、ｌｉｇＭ）、２−ピロン−４，６−ジカルボン酸・ヒドロラーゼ遺伝子（例えばｌｉｇＩ）、ガリック酸・ジオキシゲナーゼ遺伝子（例えばｄｅｓＢ）、４−オキサロメサコン酸・トートメラーゼ（例えばｌｉｇＵ）、４−オキサロメサコン酸・ヒドラターゼ遺伝子（例えばｌｉｇＪ）、４−カルボキシ−４−ヒドロキシ−２−オキソアジピン酸・アルドラーゼ遺伝子（例えばｌｉｇＫ）、オキサロ酢酸・デカルボキシラーゼ遺伝子（例えばｌｉｇＫ）など、シリンガ酸をピルビン酸へと代謝するための酵素を生産する遺伝子を有することが好ましい。なお、シリンガ酸をピルビン酸へと代謝するための酵素を生産する遺伝子は、上記した遺伝子のいずれか１種又は２種以上であり得る。例えば、宿主微生物がｖａｎＡＢ遺伝子を有する場合は、ｄｅｓＡ遺伝子やｌｉｇＭ遺伝子を有さなくともよい。
【００４５】
ｐｏｂＡ遺伝子は、ｐ−ヒドロキシ安息香酸・モノオキシゲナーゼ（ｐ−ｈｙｄｒｏｘｙｂｅｎｚｏａｔｅ  ｍｏｎｏｏｘｙｇｅｎａｓｅ）を発現する遺伝子であれば特に限定されないが、例えば、配列番号４３の塩基配列を有する遺伝子などが挙げられる。ｐ−ヒドロキシ安息香酸・モノオキシゲナーゼ（ＥＣ  １．１４．１３．２又はＥＣ  １．１４．１３．３３）としては、例えば、シュードモナス・プチダ  ＫＴ２４４０株由来のＰｏｂＡ（ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｏ．Ｑ８８Ｈ２８）などが挙げられる。
【００４６】
ｖａｎＡ遺伝子は、バニリン酸・デメチラーゼ・オキシゲナーゼ成分（ｖａｎｉｌｌａｔｅ  ｄｅｍｅｔｈｙｌａｓｅ  ｏｘｙｇｅｎａｓｅ  ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ）を発現する遺伝子であれば特に限定されないが、例えば、配列番号４４の塩基配列を有する遺伝子などが挙げられる。
【００４７】
バニリン酸・デメチラーゼ・オキシゲナーゼ成分（ＥＣ  １．１４．１３．８２）としては、例えば、シュードモナス・プチダ  ＫＴ２４４０株由来のＶａｎＡ（ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｏ．Ｑ８８ＧＩ６）などが挙げられる。バニリン酸・デメチラーゼ・オキシゲナーゼ成分は、Ｏｘｉｄｏｒｅｄｕｃｔａｓｅ  ｃｏｍｐｏｎｅｎｔを介して供給されるＮＡＤＨ又はＮＡＤＰＨ由来の電子と、分子状酸素から供給される酸素原子とを利用して、バニリン酸のメチルエーテル結合を開裂し、プロトカテク酸、ホルムアルデヒド及び水を生成する。
【００４８】
バニリン酸・デメチラーゼ・オキシゲナーゼ成分は、そのアミノ酸配列中にＲｉｅｓｋｅ［２Ｆｅ−２Ｓ］ｉｒｏｎ−ｓｕｌｆｕｒ  ｄｏｍａｉｎ（Ｗ７−Ｖ１０７，ＰＲＯＳＩＴＥ  ｅｎｔｒｙ  ｎｏ．ＰＳ５１２９６）を有し、該ドメイン中のＣ及びＨ（Ｃ４７，Ｈ４９，Ｃ６６，Ｈ６９）がＦｅ−Ｓの結合に関わる。
【００４９】
ｖａｎＢ遺伝子は、バニリン酸・デメチラーゼ・オキドレダクターゼ成分（ｖａｎｉｌｌａｔｅ  ｄｅｍｅｔｈｙｌａｓｅ  ｏｘｉｄｏｒｅｄｕｃｔａｓｅ  ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ）を発現する遺伝子であれば特に限定されないが、例えば、配列番号４５の塩基配列を有する遺伝子などが挙げられる。
【００５０】
バニリン酸・デメチラーゼ・オキドレダクターゼ成分（ＥＣ  １．１４．１３．８２）としては、例えば、シュードモナス・プチダ  ＫＴ２４４０株由来のＶａｎＢ（ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｏ．Ｑ８８ＧＩ５）などが挙げられる。バニリン酸・デメチラーゼ・オキドレダクターゼ成分は、ＮＡＤＨ又はＮＡＤＰＨから電子を抜き取り、酸素添加酵素（オキシゲナーゼ）へと伝達する酸化還元酵素の一つとして知られている。バニリン酸・デメチラーゼ・オキドレダクターゼ成分はバニリン酸・デメチラーゼ・オキシゲナーゼ成分であるＶａｎＡにＮＡＤＨ又はＮＡＤＰＨ由来の電子を伝達する。
【００５１】
バニリン酸・デメチラーゼ・オキドレダクターゼ成分は、そのアミノ酸配列中に、２Ｆｅ−２Ｓ  Ｆｅｒｒｅｄｏｘｉｎ  ｔｙｐｅ  ｉｒｏｎ−ｓｕｌｆｅｒ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｄｏｍａｉｎ（Ｇ２２９−Ｉ３１６、ＰＲＯＳＩＴＥ  ｅｎｔｒｙ  ｎｏ．ＰＳ５１０８５）を有し、該アミノ酸配列中のＣ（Ｃ２６５、Ｃ２７０、Ｃ２７３、Ｃ３０３）がＦｅ−Ｓの結合に関わる。また、バニリン酸・デメチラーゼ・オキドレダクターゼ成分は、そのアミノ酸配列中に、ＮＡＤ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｄｏｍａｉｎ（Ｌ１０９−Ｄ２０１，Ｐｆａｍ  ｅｎｔｒｙ  ｎｏ．ＰＦ００１７５）及びＦｅｒｒｅｄｏｘｉｎ  ｒｅｄｕｃｔａｓｅ  ｔｙｐｅ  ＦＡＤ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｄｏｍａｉｎ（Ｍ１−Ａ１０１、ＰＲＯＳＩＴＥ  ｅｎｔｏｒｙ ｎｏ．ＰＳ５１３８４）を有する。
【００５２】
ｖａｎＡ遺伝子及びｖａｎＢ遺伝子の発現産物（ＶａｎＡＢ）は、バニリン酸脱メチル化酵素として機能するが、シリンガ酸を３−Ｏ−メチルガリック酸へ、３−Ｏ−メチルガリック酸をガリック酸へ変換することができるので、シリンガ酸・デメチラーゼ、３−Ｏ−メチルガリック酸・デメチラーゼとしても使用することができる。
【００５３】
ｖｄｈ遺伝子はバニリン・デヒドロゲナーゼ（ｖａｎｉｌｌｉｎ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）を発現する遺伝子であれば特に限定されないが、例えば、配列番号５１の塩基配列を有する遺伝子などが挙げられる。バニリン・デヒドロゲナーゼ（ＥＣ  １．２．１．６７）としては、例えば、シュードモナス・プチダ  ＫＴ２４４０株由来のＶｄｈ（ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｏ．Ｑ８８ＨＪ９）などが挙げられる。
【００５４】
ＰＰ＿１９４８遺伝子はｐ−ヒドロキシベンズアルデヒド・デヒドロゲナーゼ（ｐ−ｈｙｄｒｏｘｙｂｅｎｚａｌｄｅｈｙｄｅ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）を発現する遺伝子であれば特に限定されないが、例えば、配列番号５２の塩基配列を有する遺伝子などが挙げられる。ｐ−ヒドロキシベンズアルデヒド・デヒドロゲナーゼ（ＥＣ  １．２．１．６４）としては、例えば、シュードモナス・プチダ  ＫＴ２４４０株由来のｐ−ヒドロキシベンズアルデヒド・デヒドロゲナーゼ（ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｏ．Ｑ８８ＬＩ４）、シュードモナス・プチダ  ｍｔ−２株由来のｐ−ヒドロキシベンズアルデヒド・デヒドロゲナーゼ（ＸｙｌＣ、ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｏ．Ｐ４３５０３）などが挙げられる。
【００５５】
ｌｉｇＶ遺伝子は、バニリン、ｐ−ヒドロキシベンズアルデヒド、シリンガアルデヒド、プロトカテクアルデヒド、ベンズアルデヒドなどの芳香族アルデヒド類を基質とするアルデヒド・デヒドロゲナーゼ（ａｌｄｅｈｙｄｅ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）を発現する遺伝子であれば特に限定されないが、例えば、配列番号５３の塩基配列を有する遺伝子などが挙げられる。アルデヒド・デヒドロゲナーゼ（ＥＣ  １．２．１．−）としては、例えば、スフィンゴビウム（Ｓｐｈｉｎｇｏｂｉｕｍ）  ｓｐ．ＳＹＫ−６株由来のアルデヒド・デヒドロゲナーゼ（ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｏ．ＡＢ２８７３３２）が挙げられる。
【００５６】
ｄｅｓＡ遺伝子は、シリンガ酸・デメチラーゼ（Ｓｙｒｉｎｇａｔｅ  Ｏ−ｄｅｍｅｔｈｙｌａｓｅ）を発現する遺伝子であれば特に限定されないが、例えば、配列番号５４の塩基配列を有する遺伝子などが挙げられる。シリンガ酸・デメチラーゼは、例えば、スフィンゴビウム・スピーシーズ  ＳＹＫ−６株などが保有し、シリンガ酸から３−Ｏ−メチルガリック酸を生成する反応を触媒する活性を有する。
【００５７】
ｌｉｇＭ遺伝子は、テトラヒドロ葉酸依存型バニリン酸／３−Ｏ−メチルガリック酸・Ｏ−デメチラーゼ（ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏｆｏｌａｔｅ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｖａｎｉｌｌａｔｅ／３−Ｏ−ｍｅｔｈｙｌｇａｌｌａｔｅ  Ｏ−ｄｅｍｅｔｈｙｌａｓｅ）を発現する遺伝子であれば特に限定されないが、例えば、配列番号５５の塩基配列を有する遺伝子などが挙げられる。
【００５８】
形質転換微生物について、宿主微生物が染色体上にｖａｎＡ遺伝子及びｖａｎＢ遺伝子を有することが好ましい。また、宿主微生物がｖａｎＡ遺伝子及びｖａｎＢ遺伝子を染色体上に有していない場合は、ｖａｎＡ遺伝子及びｖａｎＢ遺伝子を形質転換微生物に挿入することが好ましい。
【００５９】
挿入する遺伝子は、遺伝子を有する由来生物が本来保有する遺伝子（すなわち、野生型遺伝子）と完全に同一でなくともよく、少なくとも野生型遺伝子が発現するタンパク質（すなわち、野生型タンパク質）と同一の、又は近似する酵素学的性質を有するタンパク質を発現する遺伝子である限り、野生型遺伝子の塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を有するＤＮＡなどであってもよい。
【００６０】
本明細書における「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列」とは、野生型遺伝子の塩基配列を有するＤＮＡをプローブとして使用し、コロニーハイブリダイゼーション法、プラークハイブリダイゼーション法、サザンブロットハイブリダイゼーション法などを用いることにより得られるＤＮＡの塩基配列を意味する。
【００６１】
本明細書における「ストリンジェントな条件」とは、特異的なハイブリッドのシグナルが非特異的なハイブリッドのシグナルと明確に識別される条件であり、使用するハイブリダイゼーションの系と、プローブの種類、配列及び長さによって異なる。そのような条件は、ハイブリダイゼーションの温度を変えること、洗浄の温度及び塩濃度を変えることにより決定可能である。例えば、非特異的なハイブリッドのシグナルまで強く検出されてしまう場合には、ハイブリダイゼーション及び洗浄の温度を上げるとともに、必要により洗浄の塩濃度を下げることにより特異性を上げることができる。また、特異的なハイブリッドのシグナルも検出されない場合には、ハイブリダイゼーション及び洗浄の温度を下げるとともに、必要により洗浄の塩濃度を上げることにより、ハイブリッドを安定化させることができる。
【００６２】
ストリンジェントな条件の具体例としては、例えば、プローブとしてＤＮＡプローブを用い、ハイブリダイゼーションは、５×ＳＳＣ、１．０％（ｗ／ｖ）  核酸ハイブリダイゼーション用ブロッキング試薬（ロシュ・ダイアグノスティクス社）、０．１％（ｗ／ｖ）  Ｎ−ラウロイルサルコシン、０．０２％（ｗ／ｖ）  ＳＤＳを用い、一晩（８時間〜１６時間程度）で行う。洗浄は、０．１〜０．５×ＳＳＣ、０．１％（ｗ／ｖ）  ＳＤＳ、好ましくは０．１×ＳＳＣ、０．１％（ｗ／ｖ）  ＳＤＳを用い、１５分間、２回行う。ハイブリダイゼーションおよび洗浄を行う温度は６５℃以上、好ましくは６８℃以上である。
【００６３】
また、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を有するＤＮＡとしては、例えば、コロニー若しくはプラーク由来の野生型遺伝子の塩基配列を有するＤＮＡ又は該ＤＮＡの断片を固定化したフィルターを用いて、上記したストリンジェントな条件下でハイブリダイゼーションすることによって得られるＤＮＡや０．５Ｍ〜２．０ＭのＮａＣｌ存在下にて、４０℃〜７５℃でハイブリダイゼーションを実施した後、好ましくは０．７Ｍ〜１．０ＭのＮａＣｌ存在下にて、６５℃でハイブリダイゼーションを実施した後、０．１〜１×ＳＳＣ溶液（１×ＳＳＣ溶液は、１５０ｍＭ  塩化ナトリウム、１５ｍＭ  クエン酸ナトリウム）を用い、６５℃条件下でフィルターを洗浄することにより同定できるＤＮＡなどを挙げることができる。プローブの調製やハイブリダイゼーションの方法は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ−Ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ．，１９８９、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ  １−３８，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，１９８７−１９９７（以下、これらの文献を参考技術文献とよぶ場合がある；該文献の全記載はここに開示として援用される。）などに記載されている方法に準じて実施することができる。なお、当業者であれば、このようなバッファーの塩濃度や温度などの条件に加えて、その他のプローブ濃度、プローブ長さ、反応時間などの諸条件を加味して、野生型遺伝子の塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を有するＤＮＡを得るための条件を適宜設定することができる。
【００６４】
ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を含むＤＮＡとしては、プローブとして使用する野生型遺伝子の塩基配列を有するＤＮＡの塩基配列と一定以上の配列同一性を有するＤＮＡが挙げられ、例えば、野生型遺伝子の塩基配列と８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上又は９９％以上、さらに好ましくは９９．５％以上の配列同一性を有するＤＮＡが挙げられる。該配列同一性の上限は特に限定されず、典型的には１００％である。
【００６５】
野生型遺伝子の塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列としては、例えば、塩基配列における塩基数１００個を一単位とすれば、野生型遺伝子の塩基配列において、該一単位あたり、１から数個、好ましくは１から２０個、より好ましくは１から１５個、さらに好ましくは１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０個の塩基の欠失、置換、付加などを有する塩基配列を含む。ここで、「塩基の欠失」とは配列中の塩基に欠落又は消失があることを意味し、「塩基の置換」は配列中の塩基が別の塩基に置き換えられていることを意味し、「塩基の付加」とは新たな塩基が挿入するように付け加えられていることを意味する。
【００６６】
野生型遺伝子の塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列によってコードされるタンパク質は、野生型遺伝子の塩基配列によってコードされるタンパク質が有するアミノ酸配列において１から数個のアミノ酸の欠失、置換、付加などを有するアミノ酸配列を有するタンパク質である蓋然性があるが、野生型遺伝子の塩基配列によってコードされるタンパク質と同じ酵素活性を有するものである。
【００６７】
野生型タンパク質と同一の、又は近似する酵素学的性質を有するタンパク質は、そのアミノ酸配列が、野生型タンパク質が有するアミノ酸配列において１から数個のアミノ酸の欠失、置換、付加などを有するアミノ酸配列からなるものであってもよい。ここで、アミノ酸配列の「１から数個のアミノ酸の欠失、置換、付加」における「１から数個」の範囲は特に限定されないが、例えば、アミノ酸配列におけるアミノ酸数１００個を一単位とすれば、該一単位あたり、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９又は２０個程度、好ましくは１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０個程度、より好ましくは１、２、３、４又は５個程度を意味する。また、「アミノ酸の欠失」とは配列中のアミノ酸残基の欠落又は消失を意味し、「アミノ酸の置換」は配列中のアミノ酸残基が別のアミノ酸残基に置き換えられていることを意味し、「アミノ酸の付加」とは配列中に新たなアミノ酸残基が挿入するように付け加えられていることを意味する。
【００６８】
「１から数個のアミノ酸の欠失、置換、付加」の具体的な態様としては、１から数個のアミノ酸が別の化学的に類似したアミノ酸で置き換えられた態様がある。例えば、ある疎水性アミノ酸を別の疎水性アミノ酸に置換する場合、ある極性アミノ酸を同じ電荷を有する別の極性アミノ酸に置換する場合などを挙げることができる。このような化学的に類似したアミノ酸は、アミノ酸毎に当該技術分野において知られている。具体例を挙げると、非極性（疎水性）アミノ酸としては、アラニン、バリン、イソロイシン、ロイシン、プロリン、トリプトファン、フェニルアラニン、メチオニンなどが挙げられる。極性（中性）アミノ酸としては、グリシン、セリン、スレオニン、チロシン、グルタミン、アスパラギン、システインなどが挙げられる。陽電荷をもつ塩基性アミノ酸としては、アルギニン、ヒスチジン、リジンなどが挙げられる。また、負電荷をもつ酸性アミノ酸としては、アスパラギン酸、グルタミン酸などが挙げられる。
【００６９】
野生型タンパク質が有するアミノ酸配列において１から数個のアミノ酸の欠失、置換、付加などを有するアミノ酸配列としては、野生型タンパク質が有するアミノ酸配列と一定以上の配列同一性を有するアミノ酸配列が挙げられ、例えば、野生型タンパク質が有するアミノ酸配列と８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上又は９９％以上、さらに好ましくは９９．５％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列などが挙げられる。該配列同一性の上限は特に限定されず、典型的には１００％である。
【００７０】
（配列同一性を算出するための手段）
塩基配列やアミノ酸配列の配列同一性を求める方法は特に限定されないが、例えば、通常知られる方法を利用して、野生型遺伝子や野生型遺伝子が発現する野生型タンパク質のアミノ酸配列と対象となる塩基配列やアミノ酸配列とをアラインメントし、両者の配列の一致率を算出するためのプログラムを用いることにより求められる。
【００７１】
２つの塩基配列やアミノ酸配列における一致率を算出するためのプログラムとしては、例えば、Ｋａｒｌｉｎ及びＡｌｔｓｃｈｕｌのアルゴリズム（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８７：２２６４−２２６８、１９９０；Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：５８７３−５８７７、１９９３；該文献の全記載はここに開示として援用される。）が知られており、このアルゴリズムを用いたＢＬＡＳＴプログラムがＡｌｔｓｃｈｕｌなどによって開発されている（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０、１９９０；該文献の全記載はここに開示として援用される。）。さらに、ＢＬＡＳＴより感度よく配列同一性を決定するプログラムであるＧａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴも知られている（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：３３８９−３４０２、１９９７；該文献の全記載はここに開示として援用される。）。したがって、当業者は例えば上記のプログラムを利用して、与えられた配列に対し、高い配列同一性を示す配列をデータベース中から検索することができる。これらは、例えば、米国Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎのインターネット上のウェブサイト（ｈｔｔｐ：／／ｂｌａｓｔ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／Ｂｌａｓｔ．ｃｇｉ）において利用可能である。
【００７２】
上記の各方法は、データベース中から配列同一性を示す配列を検索するために通常的に用いられ得るが、個別の配列の配列同一性を決定する手段としては、Ｇｅｎｅｔｙｘネットワーク版  ｖｅｒｓｉｏｎ  １２．０．１（ジェネティックス社）のホモロジー解析を用いることもできる。この方法は、Ｌｉｐｍａｎ−Ｐｅａｒｓｏｎ法（Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２７：１４３５−１４４１、１９８５；該文献の全記載はここに開示として援用される。）に基づくものである。塩基配列の配列同一性を解析する際は、可能であればタンパク質をコードしている領域（ＣＤＳ又はＯＲＦ）を用いる。
【００７３】
（挿入する遺伝子の由来）
挿入する遺伝子は、挿入する遺伝子を保有する微生物及び該微生物に近縁の微生物などに由来する。挿入する遺伝子の由来生物としては、例えば、プロトカテク酸からムコン酸を製造することができる微生物やプロトカテク酸を資化することによって増殖可能な微生物などが挙げられる。
【００７４】
挿入する遺伝子の由来生物の具体例としては、ｐｃａＨ遺伝子及びｐｃａＧ遺伝子についてはシュードモナス・プチダ、シュードモナス・プレコグロッシチダ、シュードモナス・タイワネンシス、シュードモナス・モンテイリー、シュードモナス・フルヴァ、シュードモナス・フルオレッセンス、シュードモナス・アルカリゲネス、シュードモナス・シュードアルカリゲネス、シュードモナス・メンドシナ、シュードモナス・エルギノーサ、シュードモナス・セパシアといったシュードモナス属微生物やアシネトバクター・ベイリー、アシネトバクター・カルコアセチカスといったアシネトバクター属微生物など；ｃａｔＡ遺伝子についてはシュードモナス・プチダ、シュードモナス・プレコグロッシチダ、シュードモナス・タイワネンシス、シュードモナス・モンテイリー、シュードモナス・フルヴァ、シュードモナス・エルギノーサ、シュードモナス・フルオレッセンス、シュードモナス・レイネケイといったシュードモナス属微生物やアシネトバクター・カルコアセチカス、アシネトバクター・ラジオレシステンスといったアシネトバクター属微生物、ロドコッカス・オパカス、ロドコッカス・ピリジニボラス、ロドコッカス・ロドクロウスなどロドコッカス属微生物など；ａｒｏＹ遺伝子についてはクレブシエラ・ニューモニエ、クレブシエラ・オキシトカ、クレブシエラ・クアシニューモニエといったクレブシエラ属微生物やエンテロバクター・クロアカ、エンテロバクター・アエロゲネスといったエンテロバクター属微生物、セディメントバクター・ヒドロキシベンゾイカスなど；ｐｏｂＡ遺伝子についてはシュードモナス・プチダ、シュードモナス・プレコグロッシチダ、シュードモナス・タイワネンシス、シュードモナス・モンテイリー、シュードモナス・フルヴァ、シュードモナス・フルオレセンス、シュードモナス・エルギノーサといったシュードモナス属微生物やアシネトバクター・ベイリー、アシネトバクター・カルコアセチカス、アシネトバクター・バウマンニといったアシネトバクター属微生物、クレブシエラ・ニューモニエ、クレブシエラ・バリコラといったクレブシエラ属微生物など；ｖａｎＡ遺伝子及びｖａｎＢ遺伝子についてはシュードモナス・プチダ、シュードモナス・プレコグロッシチダ、シュードモナス・タイワネンシス、シュードモナス・モンテイリー、シュードモナス・フルヴァ、シュードモナス・フルオレセンス、シュードモナス・レジノボランス、シュードモナス・エルギノーサといったシュードモナス属微生物やコマモナス・テストステロニ、コマモナス・チオオキシダンスといったコマモナス属微生物、アセトバクター・パツツリアヌス、アセトバクター・アセチ、アセトバクター・トロピカリスといったアセトバクタ―属微生物など；ｖｄｈ遺伝子についてはシュードモナス・プチダ、シュードモナス・プレコグロッシチダ、シュードモナス・タイワネンシス、シュードモナス・モンテイリー、シュードモナス・フルヴァ、シュードモナス・フルオレセンス、シュードモナス・シリンゲなどのシュードモナス属微生物、ロドコッカス・ジョスティ、ロドコッカス・エリスロポリスといったロドコッカス属微生物、バークホルデリア・セパシア、バークホルデリア・セノセパシアといったバークホルデリア属微生物、スフィンゴビウム・スピーシーズといったスフィンゴビウム属微生物；ＰＰ＿１９４８遺伝子についてはシュードモナス・プチダ、シュードモナス・プレコグロッシチダ、シュードモナス・タイワネンシス、シュードモナス・モンテイリー、シュードモナス・フルヴァ、シュードモナス・メンドシナ、シュードモナス・フルオレセンス、シュードモナス・シリンゲなどのシュードモナス属微生物、スフィンゴビウム・ヤノイクヤエ、スフィンゴビウム・スピーシーズといったスフィンゴビウム属微生物、ロドコッカス・ジョスティ、ロドコッカス・エリスロポリスといったロドコッカス属微生物、バークホルデリア・セパシア、バークホルデリア・セノセパシアといったバークホルデリア属微生物；ｌｉｇＭ遺伝子及びｄｅｓＡ遺伝子についてはスフィンゴビウム・スピーシーズ、スフィンゴモナス・スピーシーズ、ノボスフィンゴビウム・アロマティシボランス、オルターエリスロバクター・スピーシーズ、エリスロバクターといったスフィンゴモナド目微生物やアルスロバクター・カステリ、アルスロバクター・スピーシーズといったアルスロバクター属微生物、レイフソニア・スピーシーズといったマイクロバクテリ科微生物、コクリア・ポラリス、コクリア・スピーシーズ、ネオマイクロコッカス・エスツアリ、ペニグルタミシバクター・ガンゴトリエンシス、シトロコッカス・スピーシーズ、テルシコッカス・スピーシーズといったマイクロコッカス科微生物、マイクロバクテリウム・スピーシーズといったマイクロバクテリア科微生物などが挙げられるが、これらに限定されない。
【００７５】
上記のとおり、挿入する遺伝子の由来生物は特に限定されないが、形質転換微生物において発現される遺伝子が宿主微生物の生育条件によって不活化せず、又は活性を示すために、遺伝子を挿入することによって形質転換すべき宿主微生物や宿主微生物と生育条件が近似する微生物であることが好ましい。すなわち、挿入する遺伝子の由来生物は、シュードモナス属微生物、スフィンゴビウム属微生物、クレブシエラ属微生物、アシネトバクター属微生物、ロドコッカス属微生物、エンテロバクター属微生物、アセトバクタ―属微生物、バークホルデリア属微生物などが好ましい。
【００７６】
（遺伝子工学的手法による遺伝子のクローニング）
欠失及び挿入する遺伝子は、適当な公知の各種ベクター中に挿入することができる。さらに、このベクターを適当な公知の宿主微生物に導入して、遺伝子を欠失した、又は遺伝子を挿入した形質転換体（形質転換微生物）を作製できる。欠失する遺伝子は野生型遺伝子の全部又は一部が破壊、欠損、置換、挿入などにより遺伝子の構造が変化したものであることが好ましい。挿入する遺伝子は、野生型遺伝子と同一又は近似するタンパク質を発現する遺伝子であることが好ましい。
【００７７】
欠失及び挿入する遺伝子の取得方法、これらの遺伝子の塩基配列やこれらの遺伝子が発現するタンパク質のアミノ酸配列に関する情報の取得方法、各種ベクターの製造方法や形質転換微生物の作製方法などは、当業者にとって適宜選択することができる。また、本明細書では、形質転換や形質転換体にはそれぞれ形質導入や形質導入体を包含する。欠失及び挿入する遺伝子のクローニングの一例を非限定的に後述する。
【００７８】
例えば、欠失又は挿入する遺伝子に関連する野生型遺伝子を有する由来生物や種々の微生物から、常法、例えば、参考技術文献に記載の方法により、染色体ＤＮＡやｍＲＮＡを抽出することができる。抽出したｍＲＮＡを鋳型としてｃＤＮＡを合成することができる。このようにして得られた染色体ＤＮＡやｃＤＮＡを用いて、染色体ＤＮＡやｃＤＮＡのライブラリーを作製することができる。
【００７９】
例えば、挿入する遺伝子は、該遺伝子に関連する野生型遺伝子を有する由来生物の染色体ＤＮＡやｃＤＮＡを鋳型としたクローニングにより得ることができる。野生型遺伝子の由来生物は上記したとおりのものであり、具体的な例としては、遺伝子の種類によって、シュードモナス・プチダ  ＫＴ２４４０株、クレブシエラ・ニューモニエ・サブスピーシーズ・ニューモニエ  Ａ１７０−４０株及びシュードモナス・スピーシーズ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．）  ＮＧＣ７株などを挙げることができるが、これらに限定されない。例えば、シュードモナス・プチダ  ＫＴ２４４０株を培養し、得られた菌体から水分を取り除き、液体窒素中で冷却しながら乳鉢などを用いて物理的に磨砕することにより細かい粉末状の菌体片とし、該菌体片から通常の方法により染色体ＤＮＡ画分を抽出する。染色体ＤＮＡ抽出操作には、ＤＮｅａｓｙ  Ｂｌｏｏｄ  ＆  ＴｉｓｓｕｅＫｉｔ（キアゲン社）などの市販の染色体ＤＮＡ抽出キットなどが利用できる。本明細書において、染色体ＤＮＡとゲノムＤＮＡとは同義である。
【００８０】
次いで、染色体ＤＮＡを鋳型として、５’末端配列及び３’末端配列に相補的な合成プライマーを用いてポリメラーゼ連鎖反応（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ；ＰＣＲ）を行うことにより、ＤＮＡを増幅する。プライマーとしては、挿入する遺伝子を含むＤＮＡ断片の増幅が可能であれば特に限定されない。その例としては、ｐｃａＨ遺伝子及びｐｃａＧ遺伝子を増幅するものとして、シュードモナス・プチダ  ＫＴ２４４０株のゲノム配列を参考として設計した配列番号１及び２で表されるプライマーなどが挙げられる。なお、このようなプライマーを用いると、目的遺伝子全長が増幅できる。別の方法として、ショットガンライブラリーからの目的遺伝子クローンのスクリーニングや、Ｉｎｖｅｒｓｅ  ＰＣＲ、Ｎｅｓｔｅｄ  ＰＣＲ、５’ＲＡＣＥ法、３’ＲＡＣＥ法などの適当なＰＣＲにより、目的の遺伝子断片を含むＤＮＡを増幅させ、これらを連結させて全長の目的遺伝子を含むＤＮＡを得ることなどができる。
【００８１】
また、欠失又は挿入する遺伝子を取得する方法は、上記したとおりに特に限定されず、遺伝子工学的手法によらなくとも、例えば、化学合成法を用いて遺伝子を構築することが可能である。
【００８２】
ＰＣＲにより増幅された増幅産物や化学合成した遺伝子における塩基配列の確認は、例えば、次のように行うことができる。まず、配列を確認したいＤＮＡを通常の方法に準じて適当なベクターに挿入して組換え体ＤＮＡを作製する。ベクターへのクローニングには、Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ  ＨＤ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔ（タカラバイオ社）、ＴＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔ（インビトロジェン社）などの公知又は市販のキット；ｐＵＣ４Ｋ（Ｇｅｎｅ，ｖｏｌ．１９、ｐ２５９−２６８、１９８２を参照；該文献の全記載はここに開示として援用される。）、ｐＥＸ１８Ａｍｐ（Ｇｅｎｅ，ｖｏｌ．２１２，ｐ７７−８６，１９９８を参照；該文献の全記載はここに開示として援用される。）、ｐＰＳ８５８（Ｇｅｎｅ，ｖｏｌ．２１２，ｐ７７−８６，１９９８を参照；該文献の全記載はここに開示として援用される。）、ｐＵＣ１１８（タカラバイオ社）、ｐＪＢ８６６（Ｐｌａｓｍｉｄ，ｖｏｌ．３８，ｐ３５−５１，１９９７を参照；該文献の全記載はここに開示として援用される。）、ｐＭＣＬ２００（Ｇｅｎｅ，ｖｏｌ．１６２，ｐ１５７−１５８，１９９５を参照；該文献の全記載はここに開示として援用される。）、ｐＱＥ３０（キアゲン社）、ｐＵＣ１１９（タカラバイオ社）、ｐＵＣ１８（タカラバイオ社）、ｐＢＲ３２２（タカラバイオ社）などの公知又は市販のプラスミドベクター；λＥＭＢＬ３（ストラタジーン社）；ｐＡＫ４０５（Ａｎｄｒｅａｓ  Ｋａｃｚｍａｒｃｚｙｋら、Ａｐｐｌｉｅｄ  ａｎｄ  Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，２０１２，７８（１０）３７７４−３７７７；該文献の全記載はここに開示として援用される。）などの公知又は市販のバクテリオファージベクターなどが使用できる。
【００８３】
構築した組換え体ＤＮＡを大量に得たい場合は、組換え体ＤＮＡを、例えば、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、好ましくは大腸菌  ＪＭ１０９株（タカラバイオ社）や大腸菌  ＤＨ５α株（タカラバイオ社）などに導入して形質転換し、次いで得られた形質転換体に含まれる組換え体ＤＮＡを、ＱＩＡＧＥＮ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（キアゲン社）などを用いて精製することができる。
【００８４】
組換え体ＤＮＡに挿入されている各遺伝子の塩基配列の決定は、ジデオキシ法（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、１０１、２０−７８、１９８３などを参照；該文献の全記載はここに開示として援用される。）などにより行う。塩基配列の決定の際に使用する配列解析装置は特に限定されないが、例えば、Ｌｉ−ＣＯＲ  ＭＯＤＥＬ  ４２００Ｌシークエンサー（アロカ社）、３７０ＤＮＡシークエンスシステム（パーキンエルマー社）、ＣＥＱ２０００ＸＬ  ＤＮＡアナリシスシステム（ベックマン社）などが挙げられる。そして、決定された塩基配列を元に、翻訳されるタンパク質のアミノ酸配列を知り得る。
【００８５】
（遺伝子を含む組換えベクターの構築）
欠失又は挿入する遺伝子を含む組換えベクター（組換え体ＤＮＡ）は、欠失又は挿入する遺伝子を含むＰＣＲ増幅産物と各種ベクターとを、遺伝子の欠失又は発現が可能な形で結合することにより構築することができる。なお、欠失する遺伝子の場合は、組換えベクターを宿主微生物に導入して、相同組換えによって、組換えベクター中の遺伝子が宿主微生物中の遺伝子に置き換わるために、組換えベクターは欠失する遺伝子の上流及び下流の領域を含むことが好ましい。
【００８６】
非限定的な例として挿入する遺伝子を含む組換えベクターを作製する方法は、例えば、適当な制限酵素で挿入する遺伝子のいずれかを含むＤＮＡ断片を切り出し、該ＤＮＡ断片を適当な制限酵素で切断したプラスミドベクターとを、Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ  ＨＤ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔ（タカラバイオ社）などの市販の組換えベクター作製キットなどを用いて連結することにより構築することができる。または、プラスミドベクターと相同的な配列を両末端に付加した遺伝子を含むＤＮＡ断片と、インバースＰＣＲにより増幅したプラスミド由来のＤＮＡ断片とを、Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ  ＨＤ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔ（タカラバイオ社）などの市販の組換えベクター作製キットを用いて連結させることにより得ることができる。
【００８７】
欠失又は挿入する遺伝子を含む組換えベクターは、欠失又は挿入する遺伝子とプラスミドベクター由来の遺伝子（塩基配列）とを少なくとも含む。組換えベクターの一例として、ａｒｏＹ遺伝子を含む組換えベクター；ａｒｏＹ遺伝子と、ｐｃａＨ遺伝子及び／又はｐｃａＧ遺伝子とを含む組換えベクターなどが挙げられる。組換えベクターは、ａｒｏＹ遺伝子とｐｃａＨＧ遺伝子とに加えて、ｐｏｂＡ遺伝子、ｖａｎＡＢ遺伝子、ｖｄｈ遺伝子及びＰＰ＿１９４８遺伝子からなる群から選ばれる少なくとも１種、２種、３種又は４種の遺伝子を含むことができる。また、組換えベクターは、上記した遺伝子以外の遺伝子を、本発明の課題解決を妨げない限りに含むものであってもよい。
【００８８】
組換えベクターは、異種遺伝子又は異種核酸配列を含むことが好ましい。異種遺伝子は宿主微生物に本来的に存在しない（ｎｏｔ  ｎａｔｕｒａｌｌｙ  ｏｃｃｕｒｉｎｇ）遺伝子であれば特に限定されず、例えば、宿主微生物由来の核酸配列に依拠しない合成遺伝子、挿入する遺伝子と由来生物が相違する生物に由来する遺伝子、宿主微生物と相違する他の微生物、植物、動物、ウイルスなどの生物に由来する遺伝子などが挙げられる。宿主微生物がシュードモナス属微生物である場合の異種遺伝子の具体例としては、ｐＵＣ１１８由来のＤＮＡ断片、例えば、ラクトースプロモーター領域（Ｐｌａｃ）などが挙げられるが、これに限定されない。
【００８９】
組換えベクターの具体的態様は、後述する実施例に記載があるｐＴＳ１１０プラスミドベクター、ｐＴＳ１１９プラスミドベクター及びｐＴＳ０８４プラスミドベクターなどであるが、これらに限定されない。
【００９０】
（形質転換微生物の作製方法）
形質転換微生物の作製方法は特に限定されず、例えば、常法に従って、遺伝子の欠失又は挿入が実現する態様で宿主微生物に挿入する方法などが挙げられる。具体的には、挿入する遺伝子のいずれかを発現誘導プロモーター及びターミネーターの間に挿入したＤＮＡコンストラクトを作製し、次いで該ＤＮＡコンストラクトによって宿主微生物を形質転換することなどにより、挿入する遺伝子を発現する形質転換微生物が得られる。又は、欠失する遺伝子並びに該遺伝子の上流及び下流の領域を含むＤＮＡコンストラクトを作製し、次いで該ＤＮＡコンストラクトによって宿主微生物を形質転換することなどにより、遺伝子を欠失する形質転換微生物が得られる。本明細書では、宿主微生物を形質転換するために作製された組換えベクターをＤＮＡコンストラクトと総称してよぶ。
【００９１】
ＤＮＡコンストラクトを宿主微生物に導入する方法は特に限定されないが、例えば、当業者に知られているとおりである、導入したＤＮＡコンストラクトが自律的に増殖して遺伝子を発現するように宿主微生物に導入する方法；相同組換えを利用することによりＤＮＡコンストラクトを宿主微生物の染色体上に直接的に挿入する方法などが挙げられる。
【００９２】
挿入する遺伝子を含むＤＮＡコンストラクトを宿主微生物に導入する方法として、相同組換えを利用する方法では、染色体上の組換え部位の上流領域及び下流領域と相同な配列の間に、ＤＮＡコンストラクトを連結し、宿主微生物のゲノム中に挿入することができる。
【００９３】
形質転換微生物の作製に用いられるベクター−宿主系は、宿主微生物中において、挿入する遺伝子が発現し得る系又は染色体上の遺伝子が欠失し得る系であれば特に限定されないが、例えば、ｐＪＢ８６６−シュードモナス属微生物の系、ｐＫＴ２３０（Ｇｅｎｅ，ｖｏｌ．１６，ｐ２３７−２４７，１９８１；該文献の全記載はここに開示として援用される。）−シュードモナス属微生物の系などが挙げられる。
【００９４】
挿入する遺伝子を含むＤＮＡコンストラクトは、宿主微生物の染色体に導入しない形で、自律的に増幅して、挿入する遺伝子を発現しても、宿主微生物の染色体に導入した形で挿入する遺伝子を発現しても、どちらでもよい。
【００９５】
ＤＮＡコンストラクトには、形質転換された細胞を選択することを可能にするためのマーカー遺伝子が含まれていてもよい。マーカー遺伝子は特に限定されず、例えば、ゲンタマイシン、カナマイシン、テトラサイクリン、アンピシリン、カルベニシリンなどの薬剤に対する薬剤耐性遺伝子などが挙げられる。マーカー遺伝子は、欠失する遺伝子の途中に、又は欠失する遺伝子に置換するように含まれていてもよい。
【００９６】
挿入する遺伝子を含むＤＮＡコンストラクトは、遺伝子の種類によっては、宿主微生物中で遺伝子を発現することを可能にするプロモーター及びターミネーターに加えて、その他の制御配列（例えば、オペレーターなどの転写制御に関わるシス配列など）を含むことができる。
【００９７】
ＤＮＡコンストラクトの一実施態様は、例えば、後述する実施例に記載があるｐＴＳ１０８プラスミドベクター、ｐＴＳ１１０プラスミドベクター、ｐＴＳ１１９プラスミドベクター、ｐＴＳ０８４プラスミドベクターなどが挙げられるが、これらに限定されない。
【００９８】
シュードモナス属微生物への形質転換方法としては、当業者に知られる方法を適宜選択することができ、例えば、エレクトロポレーション（電気穿孔）法、接合伝達法などによって実施できる。
【００９９】
形質転換微生物を選択及び増殖させるための培地は、用いる宿主微生物とマーカー遺伝子とに応じて適切なものを用いる。例えば、宿主微生物としてシュードモナス・プチダ、シュードモナス・プレコグロッシチダ、シュードモナス・タイワネンシス、シュードモナス・モンテイリー、シュードモナス・フルヴァ、これらの近縁種であるシュードモナス・スピーシーズを用い、マーカー遺伝子としてカナマイシン、ゲンタマイシン及びテトラサイクリンの耐性遺伝子を用いた場合は、形質転換微生物の選択及び増殖は、例えば、形質転換微生物をこれらの薬剤を含むＬＢ培地で培養することなどによって実施できる。本明細書における「近縁種」は、シュードモナス・プチダ、シュードモナス・プレコグロッシチダ、シュードモナス・タイワネンシス、シュードモナス・モンテイリー及びシュードモナス・フルヴァの中の少なくとも１種と、１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列の同一性が９９．０％〜９９．９％であるシュードモナス属微生物（シュードモナス・スピーシーズ）を指す。
【０１００】
形質転換微生物が作製されたことの確認は、例えば、遺伝子の欠失した形質転換微生物のみが生存し得る条件や挿入する遺伝子を発現する形質転換微生物のみが生存し得る条件下で形質転換微生物を培養することなどにより達成し得る。また、形質転換微生物を培養し、次いで培養後に得られた培養物におけるムコン酸の量が、同じ条件下で培養した宿主微生物の培養物におけるムコン酸の量よりも大きいことを確認することなどにより、形質転換微生物が作製されたことを確認することができる。
【０１０１】
形質転換微生物が作製されたことの確認は、形質転換微生物から染色体ＤＮＡを抽出し、これを鋳型としてＰＣＲを行い、形質転換が起きた場合に増幅が可能なＰＣＲ産物が生じることやＰＣＲ産物の特性や塩基配列を確認することなどにより行ってもよい。
【０１０２】
例えば、欠失又は挿入する遺伝子のプロモーターの塩基配列に対するフォワードプライマーと、マーカー遺伝子の塩基配列に対するリバースプライマーとの組み合わせでＰＣＲを行い、想定の長さの産物が生じることを確認する。
【０１０３】
相同組換えにより形質転換を行う場合には、用いた上流側の相同領域より上流に位置するフォワードプライマーと、用いた下流側の相同領域より下流に位置するリバースプライマーとの組み合わせでＰＣＲを行い、相同組換えが起きた場合に想定される長さの産物が生じることを確認することが好ましい。 
【０１０４】
（宿主微生物）
宿主微生物は、染色体上にｐｃａＨ遺伝子、ｐｃａＧ遺伝子、ｃａｔＡ遺伝子及びｃａｔＢ遺伝子を有し、かつ、シリンギルリグニン由来の芳香族化合物を資化するシュードモナス属微生物であれば特に限定されず、好ましくは染色体上にｐｃａＨ遺伝子、ｐｃａＧ遺伝子、ｃａｔＡ遺伝子、ｃａｔＢ遺伝子、ｐｏｂＡ遺伝子、ｖａｎＡ遺伝子、ｖａｎＢ遺伝子、ｖｄｈ遺伝子及びＰＰ＿１９４８遺伝子を有、かつ、シリンギルリグニン由来の芳香族化合物を資化する、シュードモナス・プチダ、シュードモナス・フルオレッセンス、シュードモナス・エルギノーサ、シュードモナス・プレコグロッシチダ、シュードモナス・タイワネンシス、シュードモナス・モンテイリー、シュードモナス・フルヴァ、これらの近縁種（シュードモナス・スピーシーズ）といったシュードモナス属微生物であり、より好ましくはこれらの遺伝子を有し、シリンギルリグニン由来の芳香族化合物を資化し、かつ、プロトカテク酸からムコン酸を製造することができるシュードモナス・プチダ並びにこれらの近縁種であるシュードモナス・スピーシーズである。
【０１０５】
宿主微生物を入手する方法は特に限定されないが、後述する実施例に記載されているように土壌などの天然試料、好ましくは広葉樹の根本付近の表面から５ｃｍ〜１０ｃｍ程度掘り返した土壌中の微生物群について、シリンガ酸を単一炭素源として含有するシュードモナス属微生物用培地を用いて単離する方法、市販されているコレクション株を購入する方法、個別に管理されている菌株の分譲を受ける方法などが挙げられる。
【０１０６】
宿主微生物がシリンギルリグニン由来の芳香族化合物を資化するか否かは、後述する実施例に記載がある方法などにより、シラカバリグニン由来芳香族化合物を単一炭素源として含有するシュードモナス属微生物用培地を用いて、宿主微生物の増殖の有無を評価することにより、確認することができる。
【０１０７】
後述する実施例を参照すれば、シュードモナス属微生物の単離の経験がある当業者であれば、天然からシュードモナス属微生物を単離し、さらにその中からシリンギルリグニン由来の芳香族化合物の資化能があるシュードモナス属微生物を取得することができる。
【０１０８】
例えば、広葉樹の根本付近の表面から５ｃｍ〜１０ｃｍ程度掘り返した土壌中のシュードモナス属微生物群を、５ｍＭ  シリンガ酸を唯一の炭素源として含むＷｘ液体培地を用いて培養し、得られた培養液を新鮮な５ｍＭ  シリンガ酸を唯一の炭素源として含むＷｘ液体培地に接種し、さらに培養する。この操作をさらに複数回繰返した後、得られた培養液を、５ｍＭ  シリンガ酸を唯一の炭素源として含むＷｘ寒天培地に塗抹し、静置培養する。寒天培地上に形成されたコロニーを単離し、抗生物質に感受性を示す菌株を選抜する。次いで、選抜した菌株を、１０ｍＭ  シリンガ酸を唯一の炭素源として含むＷｘ液体培地で培養し、良好な生育を示すシュードモナス属微生物を宿主微生物として用いる。なお、「良好な生育」とは、例えば、３０℃にて４８時間で培養した場合に、培養液中の吸光度（６６０ｎｍ）について、培養前の値（例えば、０．０５）が２倍以上の値（例えば、０．１以上）になることを意味する。
【０１０９】
（欠失又は挿入する遺伝子の具体例）
欠失又は挿入する遺伝子として、ｐｃａＨ遺伝子、ｐｃａＧ遺伝子、ｃａｔＡ遺伝子、ｃａｔＢ遺伝子、ｐｏｂＡ遺伝子、ｖａｎＡ遺伝子及びｖａｎＢ遺伝子の具体例は、シュードモナス・プチダ  ＫＴ２４４０株が保有するｐｃａＨ遺伝子、ｐｃａＧ遺伝子、ｃａｔＡ遺伝子、ｃａｔＢ遺伝子、ｐｏｂＡ遺伝子、ｖａｎＡ遺伝子及びｖａｎＢ遺伝子であり、それぞれの塩基配列は配列番号３７〜４０及び４３〜４５に記載のものである。同様に、ａｒｏＹ遺伝子の具体例は、クレブシエラ・ニューモニエ・サブスピーシーズ・ニューモニエ  Ａ１７０−４０株が保有するａｒｏＹ遺伝子であり、塩基配列は配列番号４１に記載のものである。ｋｐｄＢ遺伝子の具体例は、クレブシエラ・ニューモニエ・サブスピーシズ・ニューモニエ  ＮＢＲＣ１４９４０株が保有するｋｐｄＢ遺伝子であり、塩基配列は配列番号４２に記載のものである。また、これらの遺伝子が発現するタンパク質のアミノ酸配列は、それぞれ配列番号３３〜３６及び４６〜５０に記載のものである。
【０１１０】
上記の微生物以外の微生物から欠失又は挿入する遺伝子を得る方法は特に限定されないが、例えば、シュードモナス・プチダ  ＫＴ２４４０株が保有するｐｃａＨ遺伝子、ｐｃａＧ遺伝子、ｃａｔＡ遺伝子、ｃａｔＢ遺伝子、ｐｏｂＡ遺伝子、ｖａｎＡ遺伝子及びｖａｎＢ遺伝子の塩基配列（配列番号３７〜４０及び４３〜４５）；クレブシエラ・ニューモニエ・サブスピーシーズ・ニューモニエ  Ａ１７０−４０株が保有するａｒｏＹ遺伝子の塩基配列（配列番号４１）に基づいて、その他の微生物のゲノムＤＮＡをＢＬＡＳＴ相同性検索して、上記塩基配列と配列同一性の高い塩基配列を有する遺伝子を特定することにより得ることができる。また、その他の微生物の総タンパク質を基に、上記遺伝子が発現するタンパク質のアミノ酸配列（配列番号３３〜３６及び４６〜５０）と配列同一性の高いアミノ酸配列を有するタンパク質を特定し、該タンパク質を発現する遺伝子を特定することにより得ることができる。得られた遺伝子が欠失又は挿入する遺伝子に相当することは、得られた遺伝子により由来生物を宿主微生物として形質転換し、宿主微生物に比してムコン酸の生産量が増強されていることで確認できる。
【０１１１】
シュードモナス・プチダ、シュードモナス・プレコグロッシチダ、シュードモナス・タイワネンシス、シュードモナス・モンテイリー、シュードモナス・フルヴァ、シュードモナス・フルオレッセンス及びシュードモナス・エルギノーサは生育条件が近似していることから、これらそれぞれが有する遺伝子を挿入することにより、相互に形質転換できる蓋然性がある。例えば、シュードモナス・プチダから得られた遺伝子を、宿主微生物としてシュードモナス・プレコグロッシチダ、シュードモナス・タイワネンシス、シュードモナス・モンテイリー、シュードモナス・フルヴァ、シュードモナス・フルオレッセンスやシュードモナス・エルギノーサに導入して形質転換することができる。また、シュードモナス・プチダから得られた遺伝子を、宿主微生物としてクレブシエラ属微生物、エンテロバクター属微生物、大腸菌、スフィンゴビウム属微生物などに導入して、発現させることも可能である。なお、挿入する遺伝子は、宿主微生物に発現させるために、コドン、二次構造、ＧＣ含量などを最適化した遺伝子であってもよい。
【０１１２】
（形質転換微生物の一実施態様）
形質転換微生物（１）の具体的一態様は、宿主微生物がシリンギルリグニン由来の芳香族化合物を資化するシュードモナス・プチダ、シュードモナス・プレコグロッシチダ、シュードモナス・タイワネンシス、シュードモナス・モンテイリー、シュードモナス・フルヴァ及びこれらの近縁種であるシュードモナス・スピーシーズからなる群から選ばれるシュードモナス属微生物であって、染色体上にあるｐｃａＨ遺伝子又はｐｃａＧ遺伝子とｃａｔＢ遺伝子とが欠失し、挿入されたａｒｏＹ遺伝子を発現する、形質転換シュードモナス属微生物である。形質転換微生物（１）の別の具体的一態様は、宿主微生物がシリンギルリグニン由来の芳香族化合物を資化するシュードモナス・プチダ又はシュードモナス・スピーシーズであって、染色体上にあるｐｃａＨ遺伝子、ｐｃａＧ遺伝子及びｃａｔＢ遺伝子が欠失し、挿入されたａｒｏＹ遺伝子を発現する、形質転換シュードモナス属微生物である。
【０１１３】
形質転換微生物（２）の具体的一態様は、宿主微生物がシリンギルリグニン由来の芳香族化合物を資化するシュードモナス・プチダ、シュードモナス・プレコグロッシチダ、シュードモナス・タイワネンシス、シュードモナス・モンテイリー、シュードモナス・フルヴァ及びこれらの近縁種であるシュードモナス・スピーシーズからなる群から選ばれるシュードモナス属微生物であって、染色体上にあるｐｃａＨ遺伝子又はｐｃａＧ遺伝子とｃａｔＢ遺伝子とが欠失し、挿入されたａｒｏＹ遺伝子を発現し、欠失したｐｃａＨ遺伝子又はｐｃａＧ遺伝子に対応する、挿入されたｐｃａＨ遺伝子又はｐｃａＧ遺伝子を発現する、形質転換シュードモナス属微生物である。形質転換微生物（２）の別の具体的一態様は、宿主微生物がシリンギルリグニン由来の芳香族化合物を資化するシュードモナス・プチダ又はシュードモナス・スピーシーズであって、染色体上にあるｐｃａＨ遺伝子、ｐｃａＧ遺伝子及びｃａｔＢ遺伝子が欠失し、挿入されたｐｃａＨ遺伝子、ｐｃａＧ遺伝子及びａｒｏＹ遺伝子を発現する、形質転換シュードモナス属微生物である。
【０１１４】
形質転換微生物（１）及び（２）の別の具体的一態様は、上記形質転換シュードモナス属微生物において、挿入されたｐｏｂＡ遺伝子、ｃａｔＡ遺伝子、ｖａｎＡ遺伝子及びｖａｎＢ遺伝子からなる群から選ばれる少なくとも１種の遺伝子を発現する、形質転換シュードモナス属微生物である。
【０１１５】
形質転換微生物（１）及び（２）は、染色体上にあるｐｃａＨ遺伝子及び／又はｐｃａＧ遺伝子とｃａｔＢ遺伝子とが欠失し、挿入されたａｒｏＹ遺伝子が発現するという態様を少なくともとることにより、非特許文献１に記載の形質転換微生物では不可能である、バニリン酸などのグアイアシルリグニン由来の芳香族化合物やｐ−ヒドロキシ安息香酸などのｐ−ヒドロキシフェニルリグニン由来の芳香族化合物と、シリンガ酸などのシリンギルリグニン由来の芳香族化合物とを炭素源として、増殖及びムコン酸の製造が可能である。また、形質転換微生物（２）は、染色体上にあるｐｃａＨ遺伝子及び／又はｐｃａＧ遺伝子とｃａｔＢ遺伝子とが欠失し、挿入された対応するｐｃａＨ遺伝子及び／又はｐｃａＧ遺伝子とａｒｏＹ遺伝子とが発現するという態様を少なくともとることにより、グアイアシルリグニン由来の芳香族化合物やｐ−ヒドロキシフェニルリグニン由来の芳香族化合物を唯一の炭素源として、増殖及びムコン酸の製造が可能である。後述する実施例に記載があるとおり、リグニン由来の芳香族化合物の資化性を考えれば、形質転換微生物（１）及び（２）の好ましい態様は、挿入されたｃａｔＡ遺伝子、ｖａｎＡ遺伝子及びｖａｎＢ遺伝子を過剰発現する形質転換微生物である。
【０１１６】
形質転換微生物（１）及び（２）の具体的態様は、後述する実施例に記載があるＮＧＣ７ΔｐｃａＨＧΔｃａｔＢ／ｐＴＳ１１０株、ＮＧＣ７ΔｐｃａＨＧΔｃａｔＢ／ｐＴＳ１１９株、ＮＧＣ７ΔｐｃａＨＧΔｃａｔＢ／ｐＴＳ０８４株などであるが、これらに限定されない。
【０１１７】
形質転換微生物（３）の具体的一態様は、宿主微生物がシリンギルリグニン由来の芳香族化合物を資化する、シュードモナス・プチダ、シュードモナス・プレコグロッシチダ、シュードモナス・タイワネンシス、シュードモナス・モンテイリー、シュードモナス・フルヴァ及びこれらの近縁種であるシュードモナス・スピーシーズからなる群から選ばれるシュードモナス属微生物であって、染色体上にあるｐｃａＨ遺伝子又はｐｃａＧ遺伝子が欠失した、形質転換シュードモナス属微生物である。形質転換微生物（３）の別の具体的一態様は、宿主微生物がシリンギルリグニン由来の芳香族化合物を資化するシュードモナス・プチダ又はシュードモナス・スピーシーズであって、染色体上にあるｐｃａＨ遺伝子及びｐｃａＧ遺伝子が欠失した、形質転換シュードモナス属微生物である。
【０１１８】
このような形質転換微生物（３）は、染色体上にあるｐｃａＨ遺伝子及び／又はｐｃａＧ遺伝子が欠失したという態様を少なくともとることにより、グアイアシルリグニン由来の芳香族化合物やｐ−ヒドロキシフェニルリグニン由来の芳香族化合物と、シリンギルリグニン由来の芳香族化合物とを炭素源として、増殖及びプロトカテク酸の製造が可能である。
【０１１９】
形質転換微生物（３）の具体的態様は、後述する実施例に記載があるＮＧＣ７ΔｐｃａＨＧΔｃａｔＢ株などであるが、これらに限定されない。
【０１２０】
なお、特開２０１０−２０７０９４号公報には、シュードモナス・プチダを宿主微生物として、染色体上のｐｃａＨＧ遺伝子並びにプロトカテク酸５位酸化酵素遺伝子を破壊又は変異させ、かつ、挿入したｔｐａＫ遺伝子とｔｐａＡａ遺伝子とｔｐａＡｂ遺伝子とｔｐａＢ遺伝子とｔｐａＣ遺伝子とを発現する形質転換微生物を作製し、該形質転換微生物をグルコースにより増殖させ、次いでテレフタル酸によりプロトカテク酸を製造したことが記載されている。しかし、特開２０１０−２０７０９４号公報には、リグニン又はリグニン由来の芳香族化合物によりプロトカテク酸を製造していない。
【０１２１】
（製造方法）
本発明の一態様の製造方法（以下、製造方法（１）とよぶ。）は、バニリン酸といったグアイアシルリグニン由来の芳香族化合物及び／又はｐ−ヒドロキシ安息香酸といったｐ−ヒドロキシフェニルリグニン由来の芳香族化合物と、シリンガ酸やシリンガアルデヒドといったシリンギルリグニン由来の芳香族化合物とを、形質転換微生物（１）及び／又は（２）に作用させることにより、ムコン酸を得る工程を少なくとも含む。
【０１２２】
本発明の別の一態様の製造方法（以下、製造方法（２）とよぶ。）は、グアイアシルリグニン由来の芳香族化合物及び／又はｐ−ヒドロキシフェニルリグニン由来の芳香族化合物を、形質転換微生物（２）に作用させることにより、ムコン酸を得る工程を少なくとも含む。
【０１２３】
本発明の一態様の製造方法（以下、製造方法（３）とよぶ。）は、グアイアシルリグニン由来の芳香族化合物及び／又はｐ−ヒドロキシフェニルリグニン由来の芳香族化合物と、シリンギルリグニン由来の芳香族化合物とを、形質転換微生物（３）に作用させることにより、プロトカテク酸を得る工程を少なくとも含む。
【０１２４】
本明細書では、製造方法（１）〜（３）をまとめて指すときには、単に「製造方法」とよぶ。
【０１２５】
リグニン由来の芳香族化合物を形質転換微生物に作用させる方法は、リグニン由来の芳香族化合物と形質転換微生物とが接触して、形質転換微生物が有する酵素によってムコン酸又はプロトカテク酸が生産できる方法であれば特に限定されないが、例えば、リグニン由来の芳香族化合物を含有し、かつ、形質転換微生物の生育に適した培地を用いて、形質転換微生物に適した各種培養条件下で形質転換微生物を培養することによって、ムコン酸又はプロトカテク酸を製造する方法などが挙げられる。培養方法は特に限定されず、例えば、通気条件下で行う固体培養法や液体培養法などが挙げられる。
【０１２６】
グアイアシルリグニン由来の芳香族化合物、ｐ−ヒドロキシフェニルリグニン由来の芳香族化合物及びシリンギルリグニン由来の芳香族化合物と形質転換微生物との接触の順序は特に限定されないが、シリンギルリグニン由来の芳香族化合物に次いでグアイアシルリグニン由来の芳香族化合物及び／又はｐ−ヒドロキシフェニルリグニン由来の芳香族化合物を形質転換微生物に接触させること、シリンギルリグニン由来の芳香族化合物とグアイアシルリグニン由来の芳香族化合物及び／又はｐ−ヒドロキシフェニルリグニン由来の芳香族化合物とを同時に形質転換微生物に作用させることのいずれかが好ましい。
【０１２７】
培地は、宿主微生物を培養する通常の培地、すなわち、炭素源、窒素源、無機物、その他の栄養素を適切な割合で含有するものであれば、合成培地及び天然培地のいずれでも使用できる。宿主微生物はシュードモナス属微生物であることから、後述する実施例に記載があるようなＷｘ最少培地やＭＭ培地などを利用することができるが、特に限定されない。炭素源は、リグニン由来の芳香族化合物、糖や有機酸などのその他の炭素源又はこれらの組み合わせを用いることができる。ただし、培地成分には、ムコン酸又はプロトカテク酸の製造に関与する酵素の活性化に必要な成分、例えば、Ｆｅ２＋が含まれることが好ましい。鉄イオン、マグネシウムイオンなどを化合物として培地に添加することができるが、ミネラル含有物として添加してもよい。
【０１２８】
リグニン由来の芳香族化合物は、シリンギルリグニン、グアイアシルリグニン及びｐ−ヒドロキシフェニルリグニンのいずれかのリグニン並びにこれらのリグニンから誘導し得る芳香族化合物であれば特に限定されないが、例えば、シリンギルリグニン、ｐ−ヒドロキシフェニルリグニン、グアイアシルリグニンの分解物に相当する化合物などが挙げられ、具体的には、シリンガ酸、シリンガアルデヒド、ｐ−クマル酸、フェルラ酸、ｐ−ヒドロキシ安息香酸、バニリン酸、プロトカテク酸、バニリン、ｐ−ヒドロキシベンズアルデヒドなどが挙げられるが、フェノール、安息香酸、グアイアコールなどからのカテコールであってもよい。リグニン由来の芳香族化合物は、リグニンのモデル化合物とされている化合物、例えば、グアイアシルグリセロール−β−グアイアシルエーテルなどを含む。リグニン由来の芳香族化合物は、リグニンを含むバイオマスや該バイオマスを前処理に供して抽出したものであることが好ましいが、該バイオマスとは関係なく化学的に合成及び精製したものであってもよい。リグニン由来の芳香族化合物は、上記したものを単独で、又は２種以上を組み合わせて使用できる。
【０１２９】
リグニンを含むバイオマス（以下、リグノセルロースとよぶ場合がある。）は特に限定されないが、例えば、草や木などの天然物、これら天然物に処理を加えて得られるもの、農業廃棄物などが挙げられるが、具体的には広葉樹や針葉樹などの木質系のバイオマスなどが挙げられる。例えば、広葉樹はシリンギルリグニンを多く含むことが知られており、針葉樹はグアイアシルリグニンを多く含むことが知られている。
【０１３０】
リグノセルロースは、前処理の有無などによって、例えば、固体状、懸濁状、液体状などであり得る。例えば、リグノセルロースを粉砕したものを液体に加えて得られる懸濁液とすることもできる。
【０１３１】
リグノセルロースは、リグニン抽出物であってもよい。リグニン抽出物としては、例えば、リグノセルロースの粉末化したものを、０．１％Ｗ／Ｖ〜５０％Ｗ／Ｖ、好ましくは１％Ｗ／Ｖ〜２０％Ｗ／Ｖとなるように、リグニンの抽出に適した溶媒中に懸濁した懸濁液などが挙げられる。また、リグニン抽出物は、該懸濁液を１０℃〜１５０℃、好ましくは２０℃〜１３０℃、より好ましくは２０℃〜８０℃で、数時間〜数日間、好ましくは１時間〜６日間の抽出処理に供し、次いで抽出処理液から固形分を除いた液体状のリグニン抽出物、又は液体状のリグニン抽出物から溶媒を留去し、乾固することにより得られる、固体状のリグニン抽出物などであってもよい。
【０１３２】
リグニン抽出物の調製方法は特に限定されないが、例えば、以下の方法などが挙げられる。すなわち、小型オートクレーブ装置（耐圧硝子工業株式会社、ポータブルリアクター  ＴＶＳ−１）のステンレスベッセルに２Ｍ  ＮａＯＨ  ５０ｍＬ、脱脂スギ木粉  １．５ｇ、ニトロベンゼン  ３ｍＬを入れ、５００ｒｐｍで攪拌しながら１７０℃で２．５時間処理する。６０℃以下まで放冷し、遠心分離（６，０００ｇ、１０ｍｉｎ）により上清を回収する。得られた上清を、ジエチルエーテル抽出を３回繰り返す（水層を回収）。水層を塩酸で酸性化した後、ジエチルエーテル抽出を３回繰り返す（エーテル層を回収）。エーテル層に硫酸ナトリウムを加え、冷蔵庫内で一晩脱水処理する。エーテル層を回収し、抽出物を減圧乾固する。エーテル抽出物を、水酸化ナトリウムを加えながらイオン交換水に溶解し（ｐＨ≒９）、スギリグニン由来の芳香族化合物溶液とする。脱脂スギ木粉に代えて脱脂シラカバ木粉を用いることにより、シラカバリグニン由来の芳香族化合物溶液が得られる。
【０１３３】
リグニンの抽出や処理に適した溶媒は特に限定されず、例えば、水、ジオキサン、メタノール、イソプロパノールなどの低分子アルコール、ジエチルエーテル、ジメチルホルムアミドなどが挙げられる。
【０１３４】
培養条件は、当業者により通常知られるシュードモナス属微生物の培養条件を採用すればよく、例えば、培地の初発ｐＨは５〜１０に調整し、培養温度は２０℃〜４０℃、培養時間は数時間〜数日間、好ましくは１日間〜７日間、より好ましくは２日間〜５日間など、適宜設定することができる。培養手段は特に限定されず、通気撹拌深部培養、振盪培養、静置培養などを採用することができるが、通気をするなどして溶存酸素濃度が十分になるような条件で培養することが好ましく、溶存酸素濃度が０．１％〜１５％になるような条件で培養することがより好ましく、溶存酸素濃度が１％〜１３％になるような条件で培養することがさらに好ましく、溶存酸素濃度が２％〜１０％になるような条件で培養することがなおさらに好ましい。また、炭素源の減少、ムコン酸又はプロトカテク酸の増加などに応じて、炭素源を追加する流加培養を採用してもよい。
【０１３５】
例えば、培地及び培養条件の一例として、後述する実施例に記載があるとおりの、炭素源としてシリンガ酸、シリンガアルデヒド及び／又はシラカバリグニン由来芳香族化合物水溶液を含有するＷｘ最少培地を用いた、３０℃、１８０ｒｐｍでの１日間〜５日間の振盪培養や撹拌培養などが挙げられる。培地及び培養条件の別の一例として、後述する実施例に記載があるとおりの、炭素源としてバニリン酸、ｐ−ヒドロキシ安息香酸及び／又はスギリグニン由来芳香族化合物水溶液を含有するＭＭ培地を用いた、３０℃、１８０ｒｐｍ、溶存酸素濃度が５％〜１０％での１日間〜５日間の振盪培養や撹拌培養などが挙げられる。なお、炭素源その他の成分は、培養開始後に適宜追加することができる。
【０１３６】
培養終了後に培養物からムコン酸又はプロトカテク酸を取得する方法は特に限定されない。ムコン酸又はプロトカテク酸は培養液中に蓄積することから、培養物から濾過、遠心分離などの通常の固液分離操作により菌体と培養上清とを分離し、回収した培養上清からカラムを用いた固相抽出やムコン酸又はプロトカテク酸が可溶性のある溶媒を用いた溶媒抽出などによりムコン酸又はプロトカテク酸を抽出する。
【０１３７】
抽出溶媒はムコン酸又はプロトカテク酸が溶解するものであれば特に限定されず、例えば、メタノール、エタノール、イソプロパノール、アセトンなどの有機溶媒；これらの有機溶媒と水とを混合させた含水有機溶媒などが挙げられる。抽出温度は特に限定されないが、例えば、室温から１００℃に設定することができる。
【０１３８】
ムコン酸の抽出方法の具体的一態様としては、例えば、Ｖａｒｄｏｎらの方法（Ｇｒｅｅｎ  ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，ｖｏｌ．１８，ｐ３３９７−３４１３，２０１６；該文献の全記載はここに開示として援用される。）や該方法を一部変更した方法などが挙げられる。具体的には、培養上清に活性炭（１２．５％（ｗ／ｖ）、１００メッシュ）を添加し、１時間攪拌する。吸引ろ過により活性炭を除去し、ろ液を回収する。回収したろ液に塩酸を加え、ｐＨ≒２に調製した後、４℃で一晩静置する。吸引ろ過により沈殿物を回収し、沈殿物はイオン交換水で洗浄した後、吸引ろ過により回収し、減圧乾燥する。乾燥した固体をエタノールに懸濁し、吸引ろ過により不要物を除去し、ろ液を回収する。ろ液をエバポレーターで減圧乾固して、精製ムコン酸を得る。
【０１３９】
プロトカテク酸の抽出方法の一態様としては、例えば、培養上清に塩酸を加え、ｐＨ≒２に調製した後、酢酸エチル等の有機溶媒によって抽出することが出来る。得られた抽出物を再結晶化又はイオン交換樹脂を用いることによってプロトカテク酸を得る方法が挙げられる。
【０１４０】
ムコン酸若しくはプロトカテク酸の定性的又は定量的分析は特に限定されず、例えば、ＨＰＬＣなどにより行うことができる。ＨＰＬＣ分離条件は当業者であれば適宜選択することができ、例えば、後述する実施例に記載がある条件で実施できる。
【０１４１】
形質転換微生物を用いれば、ムコン酸又はプロトカテク酸を高収率で得ることができる。例えば、形質転換微生物（１）を用いれば、５ｍＭ  バニリン酸及び１０ｍＭ  シリンガ酸を炭素源とした場合は４８時間の培養で１５ｗｔ％以上の収率でムコン酸を得ることができ；５ｍＭ  ｐ−ヒドロキシ安息香酸及び１０ｍＭ  シリンガ酸を炭素源とした場合は２４時間の培養で２０ｗｔ％以上の収率でムコン酸を得ることができ；５ｍＭ  バニリン酸及び５ｍＭ  ｐ−ヒドロキシ安息香酸及び１０ｍＭ  シリンガ酸を炭素源とした場合は２４時間の培養で２０ｗｔ％以上の収率でムコン酸を得ることができる。収率の上限は特に限定されず、典型的には消費された全炭素源の量に対するムコン酸の理論収量［消費したグアイアシルリグニン由来のフェノール類（例えば、バニリン酸）及びｐ−ヒドロキシフェニルリグニン由来のフェノール類（例えば、ｐ−ヒドロキシ安息香酸）から得られるムコン酸の理論収量］から算出される量である。また、形質転換微生物（１）を用いれば、シラカバリグニン由来芳香族化合物水溶液を炭素源とした場合は６０時間の培養で１００ｍｇ／Ｌ〜１，０００ｍｇ／Ｌ程度のムコン酸を得ることができる。
【０１４２】
例えば、形質転換微生物（２）を用いれば、２５ｍＭ  バニリン酸を炭素源とした場合は２４時間の培養で３ｗｔ％以上の収率でムコン酸を得ることができ；２５ｍＭ  ｐ−ヒドロキシ安息香酸を炭素源とした場合は２４時間の培養で３ｗｔ％以上の収率でムコン酸を得ることができ；２５ｍＭ  バニリン酸及び２５ｍＭ  ｐ−ヒドロキシ安息香酸を炭素源とした場合は３０時間の培養で１０ｗｔ％以上の収率でムコン酸を得ることができる。収率の上限は特に限定されず、典型的には消費された全炭素源の量に対するムコン酸の理論収量［消費したグアイアシルリグニン由来のフェノール類（例えば、バニリン酸）及びｐ−ヒドロキシフェニルリグニン由来のフェノール類（例えば、ｐ−ヒドロキシ安息香酸）から得られるムコン酸の理論収量］から算出される量である。また、形質転換微生物（２）を用いれば、スギリグニン由来フェノール類水溶液を炭素源とした場合は４８時間の培養で５ｍｇ／Ｌ〜１，０００ｍｇ／Ｌ程度のムコン酸を得ることができる。
【０１４３】
例えば、形質転換微生物（３）を用いれば、５ｍＭ  バニリン酸及び１０ｍＭ  シリンガ酸を炭素源とした場合は２４時間の培養で５ｗｔ％以上の収率でプロトカテク酸を得ることができ；５ｍＭ  ｐ−ヒドロキシ安息香酸及び１０ｍＭ  シリンガ酸を炭素源とした場合は１２時間の培養で１５ｗｔ％以上の収率でプロトカテク酸を得ることができ；５ｍＭ  バニリン酸、５ｍＭ  ｐ−ヒドロキシ安息香酸及び１０ｍＭ  シリンガ酸を炭素源とした場合は２４時間の培養で１５ｗｔ％以上の収率でプロトカテク酸を得ることができる。収率の上限は特に限定されず、典型的には消費された全炭素源の量に対するプロトカテク酸の理論収量［消費したグアイアシルリグニン由来のフェノール類（例えば、バニリン酸）及びｐ−ヒドロキシフェニルリグニン由来のフェノール類（例えば、ｐ−ヒドロキシ安息香酸）から得られるプロトカテク酸の理論収量］から算出される量である。
【０１４４】
本発明の製造方法では、本発明の目的を達成し得る限り、上記した工程の前段若しくは後段又は工程中に、種々の工程や操作を加入することができる。
【０１４５】
（ムコン酸及びプロトカテク酸の用途）
本発明の一態様の形質転換微生物や製造方法を利用して得られたムコン酸及びプロトカテク酸は、種々の産業上有用な化合物に変換することができる。ムコン酸は、例えば、界面活性剤、難燃剤、ＵＶ光安定化剤、熱硬化性プラスチック、コーティング剤などとしての利用が期待できるムコン酸誘導体の原料として利用することができる。具体的には、ムコン酸誘導体の一つであるアジピン酸は、ナイロン６６（ポリアミドの一つ）として現実に利用されている。
【０１４６】
プロトカテク酸はムコン酸の前駆体であるとともに、プロトカテク酸・２，３−、３，４−、４，５−環開裂代謝産物の前駆体でもあり、該代謝産物の中には、例えば２−ピロン−４，６−ジカルボン酸（例えば、特許第４６５８２４４号）などの合成樹脂原料としての用途を有するものもある。また、プロトカテク酸は、医薬、農薬、香料などに対する合成原料としての用途もある。
【０１４７】
以下、本発明を実施例によってさらに具体的に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではなく、本発明の課題を解決し得る限り、本発明は種々の態様をとることができる。
【実施例】
【０１４８】
［１．Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．  ＮＧＣ７株の単離］
北海道、岩手県、新潟県、栃木県、群馬県、長野県、愛知県、静岡県を含む日本国内の４０の地点の土壌をサンプリングした。土壌のサンプリングは、シリンギルリグニンを含む広葉樹の根本付近の土壌について、表面から５ｃｍ〜１０ｃｍ程度掘り返した部分を採取することにより実施した。サンプリングは２０１７年５月〜９月の間に、気温が１５℃〜３０℃の下で実施した。【０１４９】
５ｍＭ  シリンガ酸を含む１０ｍＬのＷｘ液体培地（ＫＨ２ＰＯ４  １．７ｇ／Ｌ、Ｎａ２ＨＰＯ４・１２Ｈ２Ｏ  ９．８ｇ／Ｌ、（ＮＨ４）２ＳＯ４  １ｇ／Ｌ、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ  ０．１ｇ／Ｌ、ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ  ９．５ｍｇ／Ｌ、ＭｇＯ  １０．７５ｍｇ／Ｌ、ＣａＣＯ３  ２ｍｇ／Ｌ、ＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ  １．４４ｍｇ／Ｌ、ＭｎＳＯ４・４Ｈ２Ｏ  １．１２ｍｇ／Ｌ、ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ  ０．２５ｍｇ／Ｌ、ＣｏＳＯ４・７Ｈ２Ｏ  ０．２８ｍｇ／Ｌ、Ｈ３ＢＯ３  ０．０６ｍｇ／Ｌ及び１２Ｎ  ＨＣｌ  ５１．３μＬ／Ｌ）に、サンプリングした各土壌試料  １００ｍｇを添加し、３０℃で振盪培養した。培養開始２４時間後、５ｍＭ  シリンガ酸を含む１０ｍＬのＷｘ液体培地に培養液  １００μＬを接種し、３０℃で２４時間振盪培養した。この操作をさらに４回繰返した後、５ｍＭ  シリンガ酸を唯一の炭素源として含むＷｘ寒天培地に培養液を塗抹し、静置培養した。形成されたコロニーを単離し、テトラサイクリン及びカナマイシンに感受性を示した株を選抜した。さらに１０ｍＭ  シリンガ酸を唯一の炭素源として含むＷｘ液体培地で良好な生育を示した微生物株９株を選抜した。【０１５０】
常法に従い、シラカバ木粉をアルコール−ベンゼン抽出処理に供し、次いで処理後のシラカバ木粉  １．５ｇをアルカリニトロベンゼン酸化分解処理及びジエチルエーテル抽出処理に供した（木質科学実験マニュアル、日本木材学会編、文永堂出版を参照；該文献の全記載はここに開示として援用される。）。ニトロベンゼン酸化分解後のアルカリ溶液をジエチルエーテル抽出処理し、得られた水層を酸性化処理に供し、さらにジエチルエーテル抽出処理に供した。エーテル層として得られたジエチルエーテル抽出物をシラカバリグニン由来芳香族化合物とし、シラカバリグニン由来芳香族化合物を水に溶解してシラカバリグニン由来芳香族化合物水溶液（ｐＨ≒９）を得た。５ｖｏｌ％  シラカバリグニン由来芳香族化合物水溶液を含有するＷｘ液体培地を用いて、３０℃で５０時間にて、上記選抜した微生物株９株を培養した。【０１５１】
培養した微生物株９株のうち、培養中の吸光度（６００ｎｍ）をモニタリングすることにより、シラカバリグニン由来芳香族化合物を炭素源として生育する微生物株は４株であることがわかった。得られた微生物４株をそれぞれＮＧＣ５〜ＮＧＣ８株と名付けた。また、ＮＧＣ５〜ＮＧＣ８株は、ｐ−ヒドロキシフェニルリグニン及びグアイアシルリグニン由来の芳香族化合物を資化して増殖することがわかった。【０１５２】
ＮＧＣ５〜ＮＧＣ８株のうち、培養後３０時間までの増殖性が最も優れていたのはＮＧＣ−７株であった。そこで、ＮＧＣ７株の１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列を決定し、ＮＣＢＩ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）のＢＬＡＳＴプログラム、ＲＤＰ（ｈｔｔｐｓ：／／ｒｄｐ．ｃｍｅ．ｍｓｕ．ｅｄｕ／）のＳｅｑｕｅｎｃｅ  Ｍａｔｃｈプログラム並びにＥＭＢＬ−ＥＢＩ（ｈｔｔｐ：／／ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／）のＣｌｕｓｔａｌ  Ｏｍｅｇａプログラム及びＥＭＢＯＳＳプログラムを利用して相同性検索を行った。その結果、ＮＧＣ７株はＰ．ｐｕｔｉｄａ  ＮＢＲＣ１４１６４株、Ｐ．ｐｌｅｃｏｇｌｏｓｓｉｃｉｄａ  ＡＴＣＣ７００３８３株、Ｐ．ｔａｉｗａｎｅｎｓｉｓ  ＤＳＭ２１２４５株、Ｐ．ｍｏｎｔｅｉｌｉｉ  ＡＴＣＣ７００４７６株及びＰ．ｆｕｌｖａ  ＮＢＲＣ１６６３７株の１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列とそれぞれ９９．５％、９９．４％。９９．４％、９９．２％、９９．０％及び９６．１％で一致したことから１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列解析からは、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．  ＮＧＣ７株と分類した。また、ＮＧＣ５、６及び８株についても１６Ｓ  ｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列を決定したところ、ＮＧＣ５及び６株もＮＧＣ７株と同様、複数の微生物種の基準株と９９％以上一致したことから、それぞれＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．  ＮＧＣ５株、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．ＮＧＣ６株とした。ＮＧＣ８株はＰ．ｐｕｔｉｄａ  ＮＢＲＣ１４１６４株と９９．９％一致したことからＰ．ｐｕｔｉｄａ  ＮＧＣ８株とした。【０１５３】
シリンガ酸、シリンガアルデヒド、バニリン酸、バニリン、フェルラ酸、４−ヒドロキシ安息香酸、４−ヒドロキシベンズアルデヒド又はプロトカテク酸のそれぞれを唯一の炭素源としたＷｘ液体培地での生育能を評価した結果、ＮＧＣ７株及びＮＧＣ５、６及び８株は全ての炭素源で旺盛に生育した。【０１５４】
［２ａ．Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．ＮＧＣ７ΔｐｃａＨＧΔｃａｔＢ株の作製］
以下の手順により、シュードモナス・スピーシーズ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．）ＮＧＣ７株からプロトカテク酸・３，４−ジオキシゲナーゼ遺伝子（ｐｃａＨＧ遺伝子）及びｃｉｓ，ｃｉｓ−ムコン酸・サイクロイソメラーゼ遺伝子（ｃａｔＢ遺伝子）を破壊した変異株である、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．  ＮＧＣ７ΔｐｃａＨＧΔｃａｔＢ株を作製した。なお、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．  ＮＧＣ７株は下記の条件で国際寄託されている。
（１）寄託機関名：独立行政法人製品評価技術基盤機構  特許微生物寄託センター（ＮＰＭＤ）
（２）連絡先：〒２９２−０８１８  千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８ １２２号室
（３）受託番号：ＮＩＴＥ  ＢＰ−０３０４３
（４）識別の表示：ＮＧＣ７
（５）受託日：２０１９年１０月４日
（６）分類学上の位置：Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．
（７）科学的性質：
桿菌、グラム陰性、芽胞無、運動性有。
ＬＢ寒天培地上（３０℃、４８時間）でのコロニー形態は、直径３〜４ｍｍ、淡黄色、円形、レンズ状、全縁、スムース、不透明、バター様。
カタラーゼ反応・オキシダーゼ反応は陽性、グルコース酸化能あり。
硝酸塩を還元せず、アルギニンジヒドラーゼ活性有り。
ゼラチン加水分解活性無。グルコース、グルコン酸カリウム、ｎ−カプリン酸資化性有り。
Ｌ−アラビノース、アジピン酸資化性無し。
Ｋｉｇｓ’Ｂ寒天上で蛍光色素を産生。
４℃および６％ＮａＣｌ存在下で生育し、４１℃および７％ＮａＣｌ存在下では生育しない。
レチシナーゼ、リバーゼ活性無し。
生理性状試験からはＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａに属すると推測される。【０１５５】
上記１で単離したＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．  ＮＧＣ７株のゲノムＤＮＡを鋳型として、配列番号１及び２のプライマー１及び２からなるプライマーセットを用いたＰＣＲ法によって、プロトカテク酸・３，４−ジオキシゲナーゼ・βサブユニット（ｐｒｏｔｏｃａｔｅｃｈｕａｔｅ  ３，４−ｄｉｏｘｙｇｅｎａｓｅ  ｂｅｔａ  ｓｕｂｕｎｉｔ；ｐｃａＨ）遺伝子、プロトカテク酸・３，４−ジオキシゲナーゼ・αサブユニット（ｐｒｏｔｏｃａｔｅｃｈｕａｔｅ  ３，４−ｄｉｏｘｙｇｅｎａｓｅ  ａｌｐｈａ  ｓｕｂｕｎｉｔ；ｐｃａＧ）遺伝子を含む約１．２ｋｂｐのＤＮＡ断片を増幅した。【０１５６】
増幅したＤＮＡ断片をＥｃｏＲＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで消化し、予めＥｃｏＲＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで消化したｐＫ１９ｍｏｂｓａｃＢ（Ｇｅｎｅ、Ｖｏｌ．１４５、ｐ６９−７３、１９９４を参照；該文献の全記載はここに開示として援用される。）と連結することにより、ｐＰｃａＨＧプラスミドＤＮＡを得た。ｐＰｃａＨＧプラスミドをＡｐａＩ及びＤｒａＩＩＩで消化して得られる約６．４ｋｂｐＤＮＡ断片を、ＤＮＡ末端の平滑化処理した後、ライゲーション反応を行い、ｐｃａＨ及びｐｃａＧ遺伝子の一部が欠失したｐＰｃａＨＧｄｅｌプラスミドＤＮＡを得た。【０１５７】
三親接合伝達法を用いてｐＰｃａＨＧｄｅｌプラスミドＤＮＡをＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．  ＮＧＣ７株に導入した形質転換体を得た。形質転換体は、カナマイシン（Ｋｍ）  ５０ｍｇ／Ｌを含むＬＢ寒天培地上で生育可能であるＫｍ耐性株として選抜した。得られたＫｍ耐性株を、５ｍＭ  シリンガ酸及び１０％（ｗ／ｖ）ショ糖を含むＷｘ液体培地に接種し、３０℃で定常期に至るまで生育させた。【０１５８】
培養液の一部を、５ｍＭ  シリンガ酸及び１０％（ｗ／ｖ）ショ糖を含む新しいＷｘ液体培地に接種し、３０℃で定常期に至るまで生育させる操作をさらに４回繰り返した。次いで、得られた培養液を、５ｍＭ  シリンガ酸及び１０％（ｗ／ｖ）ショ糖を含む新しいＷｘ寒天培地に塗抹し、３０℃で静置培養した。コロニーダイレクトＰＣＲによりゲノムＤＮＡ上のｐｃａＨ遺伝子及びｐｃａＧ遺伝子の一部が欠失したことが確認できた形質転換体を、プロトカテク酸・３，４−ジオキシゲナーゼ遺伝子破壊株（ＮＧＣ７ΔｐｃａＨＧ株）とした。【０１５９】
Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．  ＮＧＣ７株のゲノムＤＮＡを鋳型として、配列番号３及び４のプライマー３及び４からなるプライマーセットを用いたＰＣＲ法によって、ｃｉｓ，ｃｉｓ−ムコン酸・サイクロイソメラーゼ（ｃｉｓ，ｃｉｓ−ｍｕｃｏｎａｔｅ  ｃｙｃｌｏｉｓｏｍｅｒａｓｅ；ｃａｔＢ）、ムコノラクトン・デルタ―イソメラーゼ（ｍｕｃｏｎｏｌａｃｔｏｎｅ  ｄｅｌｔａ―ｉｓｏｍｅｒａｓｅ；ｃａｔＣ）及びカテコール・１，２−ジオキシゲナーゼ（ｃａｔｅｃｈｏｌ  １，２−ｄｉｏｘｙｇｅｎａｓｅ；ｃａｔＡ）遺伝子を含む約２．２ｋｂｐのＤＮＡ断片を増幅した。【０１６０】
増幅したＤＮＡ断片をＥｃｏＲＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで消化し、予めＥｃｏＲＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで消化したｐＫ１９ｍｏｂｓａｃＢと連結することにより、ｐＣａｔＢＣＡプラスミドＤＮＡを得た。ｐＣａｔＢＣＡプラスミドをＥｃｏＲＶ及びＳｃａＩで消化して得られた約７．７ｋｂｐのＤＮＡ断片をライゲーション反応により環状化し、ｃａｔＢ遺伝子の一部が欠失したｐＣａｔＢＣＡｄｅｌプラスミドＤＮＡを得た。【０１６１】
三親接合伝達法を用いてｐＣａｔＢＣＡｄｅｌプラスミドＤＮＡをＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．  ＮＧＣ７ΔｐｃａＨＧ株に導入して形質転換体を得た。形質転換体は、Ｋｍ  ５０ｍｇ／Ｌを含むＬＢ寒天培地上で生育可能であるＫｍ耐性株として選抜した。得られたＫｍ耐性株を、５ｍＭ  シリンガ酸及び１０％（ｗ／ｖ）ショ糖を含むＷｘ液体培地に接種し、３０℃で定常期に至るまで生育させた。【０１６２】
培養液の一部を、５ｍＭ  シリンガ酸及び１０％（ｗ／ｖ）ショ糖を含む新しいＷｘ液体培地に接種し、３０℃で定常期に至るまで生育させる操作をさらに４回繰り返した。次いで、得られた培養液を、５ｍＭ  シリンガ酸及び１０％（ｗ／ｖ）ショ糖を含む新しいＷｘ寒天培地に塗抹し、３０℃で静置培養した。コロニーダイレクトＰＣＲによりゲノムＤＮＡ上のｃａｔＢ遺伝子の一部が欠失したことが確認できた形質転換体を、プロトカテク酸・３，４−ジオキシゲナーゼ遺伝子及びｃｉｓ，ｃｉｓ−ムコン酸・サイクロイソメラーゼ遺伝子の両方が破壊された変異株であるものとして、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．  ＮＧＣ７ΔｐｃａＨＧΔｃａｔＢ株と命名した。【０１６３】
［２ｂ．ＮＧＣ７ΔｐｃａＨＧΔｃａｔＢ／ｐＴＳ１１０株の作製］
以下の手順により、ｐｃａＨ遺伝子、ｐｃａＧ遺伝子及びａｒｏＹ遺伝子を発現するプラスミドであるｐＴＳ１１０プラスミドＤＮＡを用いて、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．  ＮＧＣ７ΔｐｃａＨＧΔｃａｔＢ株を形質転換し、ＮＧＣ７ΔｐｃａＨＧΔｃａｔＢ／ｐＴＳ１１０株を作製した。【０１６４】
ｐＵＣ１１８プラスミドＤＮＡ（Ｇｅｎｅ，ｖｏｌ．２８，ｐ３５１−３５９）を鋳型として、配列番号５及び６のプライマー５及び６からなるプライマーセットを用いたＰＣＲ法によって、ラクトースプロモーター領域（Ｐｌａｃ）を含む約２００ｂｐのＤＮＡ断片を得た。得られたＤＮＡ断片を、Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ  ＨＤ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔ（タカラバイオ社）によって、ｐＪＢ８６６プラスミドＤＮＡのＮｏｔＩサイトにクローニングすることにより、ｐＴＳ０９３プラスミドＤＮＡを得た。【０１６５】
シュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ）  ＫＴ２４４０株（独立行政法人  製品評価技術基盤機構  バイオテクノロジーセンター（ＮＢＲＣ）から購入したＰ．ｐｕｔｉｄａ  ＮＢＲＣ１００６５０株）のゲノムＤＮＡを鋳型として、配列番号７及び８のプライマー７及び８からなるプライマーセットを用いたＰＣＲ法によって、ｐｃａＧ遺伝子及びｐｃａＨ遺伝子を含む約１．３ｋｂｐのＤＮＡ断片を増幅した。増幅したＤＮＡ断片をＳａｃＩ及びＢａｍＨＩで消化し、予めＳａｃＩ及びＢａｍＨＩで消化したｐＵＣ１１８プラスミドＤＮＡにクローニングすることにより、ｐＴＳ１０７プラスミドＤＮＡを得た。【０１６６】
ｐＴＳ１０７プラスミドＤＮＡをＳａｃＩ及びＢａｍＨＩで消化することによって得られたｐｃａＧ遺伝子及びｐｃａＨ遺伝子を含む約１．３ｋｂｐ ＤＮＡ断片を、ｐＴＳ０９３プラスミドＤＮＡのＳａｃＩ−ＢａｍＨＩサイトに連結することにより、ｐＴＳ１０８プラスミドＤＮＡを得た。【０１６７】
クレブシエラ・ニューモニエ・サブスピーシーズ・ニューモニエ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ  ｓｕｂｓｐ．  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）  Ａ１７０−４０株（ｐＫＤ１３６；アメリカンタイプカルチャーコレクション（ＡＴＣＣ）から購入したＡＴＣＣ６９８７５）のゲノムＤＮＡの部分断片を鋳型として、配列番号９及び１０のプライマー９及び１０からなるプライマーセットを用いたＰＣＲ法によってプロトカテク酸・デカルボキシラーゼ（ｐｒｏｔｏｃａｔｅｃｈｕａｔｅ  ｄｅｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅ；ａｒｏＹ）遺伝子を含む約１．５ｋｂｐのＤＮＡ断片を得た。得られたＤＮＡ断片を、ＫｐｎＩで消化し、予めＫｐｎＩで消化したｐＭＣＬ２００プラスミドＤＮＡにクローニングすることにより、ｐＴＳ０３６プラスミドＤＮＡを得た。【０１６８】
ｐＴＳ０３６プラスミドＤＮＡを鋳型として、配列番号１１及び１２のプライマー１１及び１２からなるプライマーセットを用いたＰＣＲ法によって、ａｒｏＹ遺伝子を含む約１．５ｋｂｐのＤＮＡ断片を得た。得られたＤＮＡ断片を、Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ  ＨＤ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔによって、ｐＴＳ０９３プラスミドＤＮＡのＮｏｔＩサイトにクローニングすることにより、ｐＴＳ１０９プラスミドＤＮＡを得た。ｐＴＳ１０７プラスミドＤＮＡをＳａｃＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで消化して得られた約１．３ｋｂｐのＤＮＡ断片を、ｐＴＳ１０９プラスミドＤＮＡのＳａｃＩ−ＨｉｎｄＩＩＩサイトに連結することにより、ｐＴＳ１１０プラスミドＤＮＡを得た。【０１６９】
得られたｐＴＳ１１０プラスミドＤＮＡを用いて、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．  ＮＧＣ７ΔｐｃａＨＧΔｃａｔＢ株を形質転換することにより、ＮＧＣ７ΔｐｃａＨＧΔｃａｔＢ／ｐＴＳ１１０株を作製した。【０１７０】
［２ｃ．ＮＧＣ７ΔｐｃａＨＧΔｃａｔＢ／ｐＴＳ１１９株の作製］
以下の手順により、ｐｃａＨ遺伝子、ｐｃａＧ遺伝子、ａｒｏＹ遺伝子、ｃａｔＡ遺伝子、ｖａｎＡ遺伝子及びｖａｎＢ遺伝子を発現するプラスミドであるｐＴＳ１１９プラスミドＤＮＡを用いて、ＮＧＣ７ΔｐｃａＨＧΔｃａｔＢ株を形質転換し、ＮＧＣ７ΔｐｃａＨＧΔｃａｔＢ／ｐＴＳ１１９株を作製した。【０１７１】
Ｐ．ｐｕｔｉｄａ  ＫＴ２４４０株のゲノムＤＮＡを鋳型として、配列番号１３及び１４のプライマー１３及び１４からなるプライマーセットを用いたＰＣＲ法によってカテコール・１，２−ジオキシゲナーゼ（ｃａｔｅｃｈｏｌ  １，２−ｄｉｏｘｙｇｅｎａｓｅ；ｃａｔＡ）遺伝子を含む約１ｋｂｐのＤＮＡ断片を得た。得られたＤＮＡ断片をＫｐｎＩ及びＳｍａＩで消化し、予めＫｐｎＩ及びＳｍａＩで消化したｐＵＣ１１８プラスミドにクローニングすることにより、ｐＮＩ００１プラスミドＤＮＡを得た。【０１７２】
ｐＮＩ００１プラスミドＤＮＡを鋳型として、配列番号１５及び１６のプライマー１５及び１６からなるプライマーセットを用いたＰＣＲ法によって増幅することにより、ｃａｔＡ遺伝子を含む約１ｋｂｐのＤＮＡ断片を得た。得られたＤＮＡ断片を、予めＮｏｔＩで消化したｐＴＳ１０９プラスミドＤＮＡにＩｎｆｕｓｉｏｎ  ｃｌｏｎｉｎｇ  ＨＤ  ｋｉｔを用いて連結することにより、ｐＴＳ１１５プラスミドＤＮＡを得た。【０１７３】
Ｐ．ｐｕｔｉｄａ  ＫＴ２４４０株のゲノムＤＮＡを鋳型として、配列番号１７及び１８のプライマー１７及び１８からなるプライマーセットを用いたＰＣＲ法によって増幅することにより、バニリン酸・デメチラーゼ・オキシゲナーゼ成分（ｖａｎｉｌｌａｔｅ  ｄｅｍｅｔｈｙｌａｓｅ  ｏｘｙｇｅｎａｓｅ  ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ；ｖａｎＡ）遺伝子及びバニリン酸・デメチラーゼ・オキシドレダクターゼ成分（ｖａｎｉｌｌａｔｅ  ｄｅｍｅｔｈｙｌａｓｅ  ｏｘｉｄｏｒｅｄｕｃｔａｓｅ  ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ；ｖａｎＢ）遺伝子を含む約２．０ｋｂｐのＤＮＡ断片を得た。得られたＤＮＡ断片をＳａｃＩ及びＳｍａＩで消化し、予めＳａｃＩ及びＳｍａＩで消化してｐＱＥ３０プラスミドＤＮＡと連結することにより、ｐＫＹ００１プラスミドＤＮＡを得た。【０１７４】
ｐＫＹ００１プラスミドＤＮＡを鋳型として、配列番号１９及び２０のプライマー１９及び２０からなるプライマーセットを用いたＰＣＲ法により増幅することによって、ｖａｎＡ遺伝子及びｖａｎＢ遺伝子を含む約２．０ｋｂｐのＤＮＡ断片を得た。得られたＤＮＡ断片を、予めＮｏｔＩで消化したｐＴＳ１１５プラスミドＤＮＡとＩｎｆｕｓｉｏｎ  ＨＤ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔを用いて連結することにより、ｐＴＳ１１６プラスミドＤＮＡを得た。【０１７５】
ｐＴＳ１０７プラスミドＤＮＡを鋳型として、配列番号２１及び２２のプライマー２１及び２２からなるプライマーセットを用いたＰＣＲにより増幅することにより、ｐｃａＧ遺伝子及びｐｃａＨ遺伝子を含む約１．３ｋｂｐのＤＮＡ断片を得た。得られたＤＮＡ断片を、予めＨｉｎｄＩＩＩで消化したｐＴＳ１１６プラスミドＤＮＡとＩｎｆｕｓｉｏｎ  ＨＤ  ｃｌｏｎｉｎｇ  ｋｉｔを用いて連結することにより、ｐＴＳ１１９プラスミドＤＮＡを得た。【０１７６】
得られたｐＴＳ１１９プラスミドＤＮＡを用いて、ＮＧＣ７ΔｐｃａＨＧΔｃａｔＢ株を形質転換することにより、ＮＧＣ７ΔｐｃａＨＧΔｃａｔＢ／ｐＴＳ１１９株を作製した。【０１７７】
［２ｄ．ＮＧＣ７ΔｐｃａＨＧΔｃａｔＢ／ｐＴＳ０８４株の作製］
クレブシエラ・ニューモニエ・サブスピーシーズ・ニューモニエ  ＮＢＲＣ１４１９０株のＤＮＡ（ＮＢＲＣから購入したＮＢＲＣ１４１９０Ｇ）を鋳型として、配列番号２３及び２４のプライマー２３及び２４のプライマーセットを用いたＰＣＲ法によって、４−ヒドロキシ安息香酸・デカルボキシラーゼ・サブユニットＢ（４−ｈｙｄｒｏｘｙｂｅｎｚｏａｔｅ  ｄｅｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅ  ｓｕｂｕｎｉｔ  Ｂ；ｋｐｄＢ）遺伝子を含む約０．６ｋｂｐのＤＮＡ断片を増幅した。増幅したＤＮＡ断片の両末端を平滑化処理に供し、次いでＸｂａＩで消化した後、予め平滑化処理したｐＴＳ０３６プラスミドＤＮＡに連結することにより、ｐＴＳ０５２プラスミドＤＮＡを得た。ｐＴＳ０５２プラスミドＤＮＡとしては、ｐＴＳ０３６プラスミドＤＮＡに含まれるａｒｏＹ遺伝子と順方向にｋｐｄＢ遺伝子が連結されたクローンとして選択して得た。【０１７８】
ｐＴＳ０５２プラスミドＤＮＡを鋳型として、配列番号２５及び２６のプライマー２５及び２６からなるプライマーセットを用いたＰＣＲ法により、ａｒｏＹ遺伝子及びｋｐｄＢ遺伝子を含む約２．２ｋｂｐのＤＮＡ断片を増幅した。増幅したＤＮＡ断片を、予めＢａｍＨＩ及びＥｃｏＲＩで消化したｐＪＢ８６６プラスミドＤＮＡ（Ｐｌａｓｍｉｄ，ｖｏｌ．３８，ｐ３５−５１，１９９７）にＩｎｆｕｓｉｏｎ  ＨＤ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔを用いて連結することにより、ｐＴＳ０７４プラスミドＤＮＡを得た。【０１７９】
Ｐ．ｐｕｔｉｄａ  ＫＴ２４４０株のゲノムＤＮＡを鋳型として、配列番号２７及び２８のプライマー２７及び２８からなるプライマーセットを用いたＰＣＲ法により、カテコール・１，２−ジオキシゲナーゼ（ｃａｔｅｃｈｏｌ  １，２−ｄｉｏｘｙｇｅｎａｓｅ；ｃａｔＡ）遺伝子を含む約１．０ｋｂｐのＤＮＡ断片を得た。得られたＤＮＡ断片を、予めＳａｃＩで消化したｐＴＳ０７４プラスミドＤＮＡにＩｎｆｕｓｉｏｎ  ＨＤ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔを用いて連結することにより、ｐＴＳ０７９プラスミドＤＮＡを得た。【０１８０】
ｐＵＣ１１８プラスミドＤＮＡを鋳型として、配列番号２９及び３０のプライマー２９及び３０からなるプライマーセットを用いたＰＣＲ法によって、ラクトースプロモーター領域（Ｐｌａｃ）を含む約２００ｂｐのＤＮＡ断片を得た。得られたＤＮＡ断片を、ｐＴＳ０７９プラスミドＤＮＡのＮｏｔＩサイトにＩｎｆｕｓｉｏｎ  ＨＤ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔを用いてクローニングすることにより、ｐＴＳ０８２プラスミドＤＮＡを得た。【０１８１】
ｐＫＹ００１プラスミドＤＮＡを鋳型として、配列番号３１及び３２のプライマー３１及び３２からなるプライマーセットを用いたＰＣＲ法により、ｖａｎＡ遺伝子及びｖａｎＢ遺伝子を含む約２．０ｋｂｐのＤＮＡ断片を増幅した。増幅したＤＮＡ断片を、予めＮｏｔＩで消化したｐＴＳ０８２プラスミドＤＮＡとＩｎｆｕｓｉｏｎ  ＨＤ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｋｉｔを用いて連結することにより、ｐＴＳ０８４プラスミドＤＮＡを得た。【０１８２】
得られたｐＴＳ０８４プラスミドＤＮＡを用いてＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．  ＮＧＣ７ΔｐｃａＨＧΔｃａｔＢ株を形質転換することにより、ＮＧＣ７ΔｐｃａＨＧΔｃａｔＢ／ｐＴＳ０８４株を作製した。【０１８３】
［３．バニリン酸（ＶＡ）を炭素源としたｃｉｓ，ｃｉｓ−ムコン酸（ｃｃＭＡ）生産］
ＮＧＣ７ΔｐｃａＨＧΔｃａｔＢ／ｐＴＳ１１０株を、テトラサイクリン（Ｔｃ）  １５ｍｇ／Ｌを含むＬＢ液体培地  ５ｍＬに接種し、３０℃で１６時間振盪培養した。得られた培養液を、炭素源を含まないＭＭ培地（Ｎａ２ＨＰＯ４  １３．５６ｇ／Ｌ、ＫＨ２ＰＯ４  ６ｇ／Ｌ、ＮａＣｌ  １ｇ／Ｌ、ＮＨ４Ｃｌ  ２ｇ／Ｌ、２ｍＭ  ＭｇＳＯ４、１００μＭ  ＣａＣｌ２及び１８μＭ  ＦｅＳＯ４）で洗浄した後、Ｔｃ  １５ｍｇ／Ｌ及び２５ｍＭ  ＶＡを含むＭＭ液体培地  ５ｍＬに接種し、３０℃で振盪培養した。【０１８４】
培養開始後、一定時間毎に、培養液の光学密度（ｏｐｔｉｃａｌ  ｄｅｎｓｉｔｙ；ＯＤ）を測定し、さらに培養液を遠心分離して得た培養上清について、ＶＡ及びｃｃＭＡの濃度を測定した。【０１８５】
ＯＤ測定には６００ｎｍの波長を使用し、ｍｉｎｉｐｈｏｔｏ  ５１８Ｒ（タイテック株式会社）を用いてＯＤ６００値を測定した。【０１８６】
ＶＡ及びｃｃＭＡの濃度は、高速液体クロマトグラフ（Ａｇｉｌｅｎｔ１２００シリーズ；アジレントテクノロジー株式会社）を用いて測定した。カラムはＺＯＲＢＡＸ  Ｅｃｌｉｐｓｅ  Ｐｌｕｓ  Ｃ１８  ｃｏｌｕｍｎ（径  ４．６ｍｍ、長さ  １５０ｍｍ、粒径  ０．５μｍ）を使用し、４０℃で保温した。勾配（グラジエント）溶離モード（溶媒Ａ：５％（ｖ／ｖ）ＣＨ３ＯＨ、１％（ｖ／ｖ）ＣＨ３ＣＯＯＨ、溶媒Ｂ：５０％（ｖ／ｖ）ＣＨ３ＯＨ、１％（ｖ／ｖ）ＣＨ３ＣＯＯＨ）を使用し、溶媒Ａで平衡化した後、分析開始から８分かけて溶媒Ｂの割合を２０％まで上昇させ、その後５分かけて溶媒Ｂの割合を１００％まで上昇させた。移動相の流速は１．０ｍＬ／ｍｉｎとし、測定波長は２８０ｎｍとした。【０１８７】
ＮＧＣ７ΔｐｃａＨＧΔｃａｔＢ／ｐＴＳ１１０株について、培養開始から０及び２４時間後のＯＤ６００値、ＶＡ濃度及びｃｃＭＡ濃度の測定結果をまとめたものを表１に示す。【０１８８】
【表１】
2020080467.tif 000002
【０１８９】
表１が示すとおり、ＮＧＣ７ΔｐｃａＨＧΔｃａｔＢ／ｐＴＳ１１０株は、ＶＡを利用して増殖し、かつ、ｃｃＭＡを生産した（収率は５．１ｗｔ％）。なお、収率は、消費された基質（ＶＡ）の量に対するｃｃＭＡの量により求めた。【０１９０】
［４．ｐ−ヒドロキシ安息香酸（ＨＢＡ）を炭素源としたｃｃＭＡ生産］
ＮＧＣ７ΔｐｃａＨＧΔｃａｔＢ／ｐＴＳ１１０株を、Ｔｃ  １５ｍｇ／Ｌを含むＬＢ液体培地  ５ｍＬに接種し、３０℃で１６時間振盪培養した。得られた培養液を、炭素源を含まないＭＭ培地で洗浄した後、Ｔｃ  １５ｍｇ／Ｌ及び２５ｍＭ  ＨＢＡを含むＭＭ液体培地５ｍＬに接種し、３０℃で振盪培養した。【０１９１】
培養開始後、一定時間毎に培養液の光学密度（ＯＤ６００）と、培養液中のＨＢＡ及びｃｃＭＡ濃度とを測定した。ＯＤ６００測定並びにＨＢＡ及びｃｃＭＡの濃度測定は上記３に記載の方法と同様に行った。【０１９２】
ＮＧＣ７ΔｐｃａＨＧΔｃａｔＢ／ｐＴＳ１１０株について、培養開始から０及び２４時間後のＯＤ６００値、ＨＢＡ濃度及びｃｃＭＡ濃度の測定結果をまとめたものを表２に示す。【０１９３】
【表２】
2020080467.tif 000003
【０１９４】
表２が示すとおり、ＮＧＣ７ΔｐｃａＨＧΔｃａｔＢ／ｐＴＳ１１０株は、ＨＢＡを利用して増殖し、かつ、ｃｃＭＡを生産した（収率は６．３ｗｔ％）。なお、収率は、消費された基質（ＨＢＡ）の量に対するｃｃＭＡの量により求めた。【０１９５】
［５．ＶＡ及びＨＢＡの混合物を炭素源としたｃｃＭＡ生産］
ＮＧＣ７ΔｐｃａＨＧΔｃａｔＢ／ｐＴＳ１１０株を、Ｔｃ  １５ｍｇ／Ｌを含むＬＢ液体培地  ５ｍＬに接種し、３０℃で１６時間振盪培養した。得られた培養液を、炭素源を含まないＭＭ培地で洗浄した後、Ｔｃ  １５ｍｇ／Ｌ、２５ｍＭ  ＶＡ及び２５ｍＭ  ＨＢＡを含むＭＭ液体培地  ５ｍＬに接種し、３０℃で振盪培養した。【０１９６】
培養開始後、一定時間毎に培養液の光学密度（ＯＤ６００）と、培養液中のＶＡ、ＨＢＡ及びｃｃＭＡ濃度とを測定した。ＯＤ６００測定並びにＶＡ、ＨＢＡ及びｃｃＭＡの濃度測定は上記３に記載の方法と同様に行った。【０１９７】
培養開始から０、２４及び３０時間後のＯＤ６００値、ＶＡ濃度、ＨＢＡ濃度及びｃｃＭＡ濃度の測定結果をまとめたものを表３に示す。【０１９８】
【表３】
2020080467.tif 000004
【０１９９】
表３が示すとおり、ＮＧＣ７ΔｐｃａＨＧΔｃａｔＢ／ｐＴＳ１１０株は、ＶＡ及びＨＢＡを利用して増殖し、かつ、ｃｃＭＡを経時的に生産した（収率は１６．７ｗｔ％）。なお、収率は、消費された基質（ＶＡ及びＨＢＡ）の量に対するｃｃＭＡの量により求めた。【０２００】
［６．バニリン（ＶＮ）及び４−ヒドロキシベンズアルデヒド（ＨＢＮ）の混合物を炭素源としたｃｃＭＡ生産］
ＮＧＣ７ΔｐｃａＨＧΔｃａｔＢ／ｐＴＳ１１０株を、Ｔｃ  １５ｍｇ／Ｌを含むＬＢ液体培地  ５ｍＬに接種し、３０℃で１６時間振盪培養した。得られた培養液を、炭素源を含まないＭＭ培地で洗浄した後、Ｔｃ  １５ｍｇ／Ｌ、５ｍＭ  ＶＮ及び５ｍＭ  ＨＢＮを含むＭＭ液体培地  ５ｍＬに接種し、３０℃で振盪培養した。【０２０１】
培養開始後、一定時間毎に培養液の光学密度（ＯＤ６００）と、培養液中のＶＮ、ＨＢＮ及びｃｃＭＡ濃度とを測定した。ＯＤ６００測定並びにＶＮ、ＨＢＮ及びｃｃＭＡの濃度測定は上記３に記載の方法と同様に行った。【０２０２】
培養開始から０、２４、３０及び４８時間後のＯＤ６００値、ＶＮ濃度、ＨＢＮ濃度及びｃｃＭＡ濃度の測定結果をまとめたものを表４に示す。【０２０３】
【表４】
2020080467.tif 000005
【０２０４】
表４が示すとおり、ＮＧＣ７ΔｐｃａＨＧΔｃａｔＢ／ｐＴＳ１１０株は、ＶＮ及びＨＢＮを利用して増殖し、かつ、ｃｃＭＡを生産した（収率は１．６ｗｔ％）。なお、収率は、消費された基質（ＶＮ及びＨＢＮ）の量に対するｃｃＭＡの量により求めた。【０２０５】
［７．ＶＮ、ＨＢＮ、ＶＡ、ＨＢＡの混合物を炭素源としたｃｃＭＡ生産］
ＮＧＣ７ΔｐｃａＨＧΔｃａｔＢ／ｐＴＳ１１０株を、Ｔｃ  １５ｍｇ／Ｌを含むＬＢ液体培地  ５ｍＬに接種し、３０℃で１６時間振盪培養した。得られた培養液を、炭素源を含まないＭＭ培地で洗浄した後、Ｔｃ  １５ｍｇ／Ｌ、５ｍＭ  ＶＮ、５ｍＭ  ＨＢＮ、１０ｍＭ  ＶＡ及び１０ｍＭ  ＨＢＡを含むＭＭ液体培地  ５ｍＬに接種し、３０℃で振盪培養した。【０２０６】
培養開始後、一定時間毎に培養液の光学密度（ＯＤ６００）と、培養液中のＶＮ濃度、ＨＢＮ濃度、ＶＡ濃度、ＨＢＡ濃度及びｃｃＭＡ濃度とを測定した。ＯＤ６００測定並びにＶＮ、ＨＢＮ、ＶＡ、ＨＢＡ及びｃｃＭＡの濃度測定は上記３に記載の方法と同様に行った。【０２０７】
培養開始から０、２４、３０及び４８時間後のＯＤ６００値、ＶＮ濃度、ＨＢＮ濃度、ＶＡ濃度、ＨＢＡ濃度及びｃｃＭＡ濃度の測定結果をまとめたものを表５に示す。【０２０８】
【表５】
2020080467.tif 000006
【０２０９】
表５が示すとおり、ＮＧＣ７ΔｐｃａＨＧΔｃａｔＢ／ｐＴＳ１１０株は、ＶＮ、ＨＢＮ、ＶＡ及びＨＢＡを利用して増殖し、かつ、ｃｃＭＡを経時的に生産した（収率は６．３ｗｔ％）。なお、収率は、消費された基質（ＶＮ、ＨＢＮ、ＶＡ及びＨＢＡ）の量に対するｃｃＭＡの量により求めた。【０２１０】
［８．スギリグニン由来フェノール類を炭素源としたｃｃＭＡ生産（１）］
常法に従い、スギ木粉をアルコール−ベンゼン抽出処理に供し、次いで処理後のスギ木粉  １．５ｇをアルカリニトロベンゼン酸化分解処理及びジエチルエーテル抽出処理に供した（木質科学実験マニュアル、日本木材学会編、文永堂出版を参照；該文献の全記載はここに開示として援用される。）。ニトロベンゼン酸化分解後のアルカリ溶液をジエチルエーテル抽出処理し、得られた水層を酸性化処理に供し、さらにジエチルエーテル抽出処理に供した。エーテル層として得られたジエチルエーテル抽出物をスギリグニン由来芳香族化合物とし、スギリグニン由来芳香族化合物水溶液（ｐＨ≒９）を唯一の炭素源として添加したＭＭ培地におけるｃｃＭＡ生産を評価した。【０２１１】
ＮＧＣ７ΔｐｃａＨＧΔｃａｔＢ／ｐＴＳ１１０株を、Ｔｃ  １５ｍｇ／Ｌを含むＬＢ液体培地  ５ｍＬに接種し、３０℃で１６時間振盪培養した。得られた培養液を、炭素源を含まないＭＭ培地で洗浄した後、Ｔｃ  １５ｍｇ／Ｌを含むＭＭ液体培地  ５ｍＬに接種し、炭素源としてスギリグニン由来フェノール類水溶液  ０．５ｍＬを添加し、３０℃で振盪培養した。培養開始２４時間後に、スギリグニン由来芳香族化合物水溶液  ０．５ｍＬをさらに添加して、３０℃で振盪培養した。【０２１２】
培養開始後、一定時間毎に培養液の光学密度（ＯＤ６００）と、培養液中のｃｃＭＡ濃度とを測定した。ＯＤ６００測定及びｃｃＭＡの濃度測定は上記３に記載の方法と同様に行った。【０２１３】
培養開始から０、２４及び４８時間後のＯＤ６００値及びｃｃＭＡ濃度の測定結果をまとめたものを表６に示す。【０２１４】
【表６】
2020080467.tif 000007
【０２１５】
表６が示すとおり、ＮＧＣ７ΔｐｃａＨＧΔｃａｔＢ／ｐＴＳ１１０株は、実バイオマスから得られたリグニン由来の芳香族化合物を利用して増殖し、かつ、ｃｃＭＡを経時的に生産した。【０２１６】
［９．スギリグニン由来フェノール類を炭素源としたｃｃＭＡ生産（２）］
ＮＧＣ７ΔｐｃａＨＧΔｃａｔＢ／ｐＴＳ１１９株を、Ｔｃ  １５ｍｇ／Ｌを含むＬＢ液体培地  ５ｍＬに接種し、３０℃で１６時間振盪培養した。得られた培養液  ５０μＬを、Ｔｃ  １５ｍｇ／Ｌを含むＭＭ液体培地  ５ｍＬに接種し、炭素源としてスギリグニン由来フェノール類水溶液  ０．５ｍＬを添加し、３０℃で振盪培養した。培養開始２４時間後に、スギリグニン由来芳香族化合物水溶液  ０．５ｍＬをさらに添加して、３０℃で振盪培養した。【０２１７】
培養開始後、一定時間毎に培養液の光学密度（ＯＤ６００）と、培養液中のｃｃＭＡ濃度とを測定した。ＯＤ６００測定及びｃｃＭＡの濃度測定は上記３に記載の方法と同様に行った。【０２１８】
培養開始から０、２４及び４８時間後のＯＤ６００値及びｃｃＭＡ濃度の測定結果をまとめたものを表７に示す。【０２１９】
【表７】
2020080467.tif 000008
【０２２０】
表７が示すとおり、ＮＧＣ７ΔｐｃａＨＧΔｃａｔＢ／ｐＴＳ１１９株は、実バイオマスから得られたリグニン由来の芳香族化合物を利用して増殖し、かつ、ｃｃＭＡを経時的に生産した。【０２２１】
［１０．ＶＡ及びＨＢＡの混合物を炭素源としたｃｃＭＡ生産（２）］
ＮＧＣ７ΔｐｃａＨＧΔｃａｔＢ／ｐＴＳ１１０株を、Ｔｃ  ２０ｍｇ／Ｌを含むＬＢ液体培地  １０ｍＬに接種し、３０℃で一晩振盪培養した。得られた培養液  １ｍＬを、Ｔｃ  ２０ｍｇ／Ｌ、２５ｍＭ  ＶＡ及び２５ｍＭ  ＨＢＡを含むＭＭ液体培地  ０．１Ｌに接種し、３０℃、ｐＨ  ７、１２時間〜４８時間で、培養期間中の溶存酸素濃度（ＤＯ）を一定の範囲に保ちながら通気撹拌培養した。ＤＯセンサーは培養開始前に、空気飽和したＭＭ培地（ＤＯ＝１００％）及び５％亜硫酸ナトリウム溶液（ＤＯ＝０％）を用いて校正した。【０２２２】
培養後のＶＡ濃度、ＨＢＡ濃度及びｃｃＭＡ濃度について、上記３に記載の方法と同様に測定した。得られた測定結果より、消費された基質（ＶＡ及びＨＢＡ）の量に対するｃｃＭＡの量により、ｃｃＭＡの収率を算出した。ｃｃＭＡの収率及びＤＯの値をまとめたものを表８に示す。【０２２３】
【表８】
2020080467.tif 000009
【０２２４】
表８が示すとおり、生産されるｃｃＭＡの収率は、培養液中の溶存酸素濃度が１．０％〜１０％である条件下において良好な結果となった（収率が約１７ｗｔ％以上）。【０２２５】
［１１．シリンガ酸（ＳＡ）及びＶＡを炭素源としたｃｉｓ，ｃｉｓ−ムコン酸（ｃｃＭＡ）生産（１）］
ＮＧＣ７ΔｐｃａＨＧΔｃａｔＢ／ｐＴＳ０８４株を、Ｔｃ  １２．５ｍｇ／Ｌを含むＬＢ液体培地  １０ｍＬに接種し、３０℃で１６時間振盪培養した。得られた培養液を、Ｗｘ緩衝液で洗浄した後、Ｔｃ  １２．５ｍｇ／Ｌ、１０ｍＭ  ＳＡ及び５ｍＭ  ＶＡを含むＷｘ最少培地  １０ｍＬに接種し、３０℃で振盪培養した。【０２２６】
培養開始後、一定時間毎に、培養液のＯＤ６００を測定し、さらに培養液を遠心分離して得た培養上清について、ＳＡ、ＶＡ及びｃｃＭＡの濃度を測定した。【０２２７】
ＯＤ６００測定にはＧｅｎｅＱｕａｎｔ  １００（ＧＥヘルスケア・ジャパン株式会社）を用いた。【０２２８】
ＳＡ、ＶＡ及びｃｃＭＡの濃度は、高速液体クロマトグラフ（Ａｃｑｕｉｔｙ  ｕｌｔｒａｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ  ｌｉｑｕｉｄ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  ｓｙｓｔｅｍ；日本ウォーターズ株式会社）を用いて測定した。カラムはＴＳＫｇｅｌ  ＯＤＳ−１４０ＨＴＰ  ｃｏｌｕｍｎ（径  ２．１ｍｍ、長さ  １００ｍｍ、粒径  ２．３μｍ；東ソー株式会社）を使用し、３０℃で保温した。勾配（グラジエント）溶離モード（溶媒Ａ：９９．９％（ｖ／ｖ）Ｈ２Ｏ、０．１％（ｖ／ｖ）ＨＣＯＯＨ、溶媒Ｂ：９９．９％（ｖ／ｖ）ＣＨ３ＣＮ、０．１％（ｖ／ｖ）ＨＣＯＯＨ）を使用し、溶媒Ａを９９％、溶媒Ｂを１％で平衡化した後、分析を開始して３分後から６分後にかけて溶媒Ｂの割合を２５％まで上昇させ、次いで１分かけて溶媒Ｂの割合を１％まで低下させた。移動相の流速は０．５ｍＬ／ｍｉｎとし、測定波長はＳＡについて２７０ｎｍとし、ＶＡ及びｃｃＭＡについて２６０ｎｍとした。【０２２９】
培養開始から０、１２、２４、３６及び４８時間後のＯＤ６００値、ＳＡ濃度、ＶＡ濃度及びｃｃＭＡ濃度の測定結果をまとめたものを表９に示す。【０２３０】
【表９】
2020080467.tif 000010
【０２３１】
表９が示すとおり、ＮＧＣ７ΔｐｃａＨＧΔｃａｔＢ／ｐＴＳ０８４株は、ＳＡを利用して増殖し、かつ、ＶＡからｃｃＭＡを経時的に生産した（収率は２１．８ｗｔ％）。なお、収率は、消費された基質（ＳＡ及びＶＡ）の量に対するｃｃＭＡの量により求めた。【０２３２】
［１２．ＳＡ及びＶＡを炭素源としたｃｃＭＡ生産（２）］
ＮＧＣ７ΔｐｃａＨＧΔｃａｔＢ／ｐＴＳ０８４株を、Ｔｃ  １２．５ｍｇ／Ｌを含むＬＢ液体培地  １０ｍＬに接種し、３０℃で１６時間振盪培養した。得られた培養液を、Ｗｘ緩衝液で洗浄した後、Ｔｃ  １２．５ｍｇ／Ｌ並びに表１０に示す条件のＳＡ及びＶＡの混合物を含むＷｘ最少培地  １０ｍＬに接種し、３０℃で４８時間振盪培養した。【０２３３】
【表１０】
2020080467.tif 000011
【０２３４】
培養開始４８時間後、培養液を遠心分離して得た培養上清について、ＳＡ、ＶＡ及びｃｃＭＡの濃度を測定した。結果を表１１に示す。ＳＡ、ＶＡ及びｃｃＭＡの濃度測定は上記１１に記載の方法と同様に行った。【０２３５】
【表１１】
2020080467.tif 000012
【０２３６】
表１１に示すとおり、培養開始時点のＳＡ及びＶＡの濃度を高くしてもＮＧＣ７ΔｐｃａＨＧΔｃａｔＢ／ｐＴＳ０８４株は増殖し、かつ、ｃｃＭＡを生産した（収率は１７％以上）。なお、収率は、消費された基質（ＳＡ及びＶＡ）の量に対するｃｃＭＡの量により求めた。【０２３７】
［１３．ＳＡ及びＶＡを炭素源としたｃｃＭＡ生産（３）］
ＮＧＣ７ΔｐｃａＨＧΔｃａｔＢ／ｐＴＳ０８４株を、Ｔｃ  １２．５ｍｇ／Ｌを含むＬＢ液体培地  １０ｍＬに接種し、３０℃で１６時間振盪培養した。得られた培養液を、Ｗｘ緩衝液で洗浄した後、Ｔｃ  １２．５ｍｇ／Ｌ並びに表１１に示す条件のＳＡ及びＶＡの混合物を含むＷｘ最少培地  ２００ｍＬ（５００ｍＬ容バッフル付きフラスコを培養容器に使用した）に接種し、３０℃で回転培養した。【０２３８】
【表１２】
2020080467.tif 000013
【０２３９】
培養開始後、一定時間毎に、培養液のＯＤ６００を測定し、さらに培養液を遠心分離して得た培養上清について、ＳＡ、ＶＡ及びｃｃＭＡの濃度を測定した。ＯＤ６００測定並びにＳＡ、ＶＡ及びｃｃＭＡの濃度測定は上記１１に記載の方法と同様に行った。【０２４０】
培養開始から０、１２、２４、３６及び４８時間後のＯＤ６００値、ＳＡ濃度、ＶＡ濃度及びｃｃＭＡ濃度の測定結果をまとめたものを表１３（条件１）、表１４（条件２）及び表１５（条件３）に示す。【０２４１】
【表１３】
2020080467.tif 000014
【０２４２】
【表１４】
2020080467.tif 000015
【０２４３】
【表１５】
2020080467.tif 000016
【０２４４】
表１３〜表１５に示すとおり、培養開始時点のＳＡ及びＶＡの濃度を高くしてもＮＧＣ７ΔｐｃａＨＧΔｃａｔＢ／ｐＴＳ０８４株はＳＡを利用して増殖し、かつ、ＶＡからｃｃＭＡを経時的に生産した（収率は１７ｗｔ％以上）。なお、収率は、消費された基質（ＳＡ及びＶＡ）の量に対するｃｃＭＡの量により求めた。【０２４５】
［１４．ＳＡ及びＶＡを炭素源としたｃｃＭＡ生産（４）］
ＮＧＣ７ΔｐｃａＨＧΔｃａｔＢ／ｐＴＳ０８４株を、Ｔｃ  １２．５ｍｇ／Ｌを含むＬＢ液体培地  １０ｍＬに接種し、３０℃で１６時間振盪培養した。得られた培養液を、Ｗｘ緩衝液で洗浄した後、Ｔｃ  １２．５ｍｇ／Ｌ、１０ｍＭ  ＳＡ及び５ｍＭ  ＶＡを含むＷｘ最少培地  ２００ｍＬ（５００ｍＬ容バッフル付きフラスコを培養容器に使用した）に接種し、３０℃で回転培養した。培養開始から１２時間ごとに１０ｍＭ  ＳＡ及び５ｍＭ  ＶＡを添加する操作を６回繰り返した。【０２４６】
培養開始後、一定時間毎に、培養液のＯＤ６００を測定し、さらに培養液を遠心分離して得た培養上清について、ＳＡ、ＶＡ及びｃｃＭＡの濃度を測定した。ＯＤ６００測定並びにＳＡ、ＶＡ及びｃｃＭＡの濃度測定は上記１１に記載の方法と同様に行った。【０２４７】
培養開始から０、１２、２４、３６、４８、６０及び７２時間後のＯＤ６００値、ＳＡ濃度、ＶＡ濃度及びｃｃＭＡ濃度の測定結果をまとめたものを表１６に示す。【０２４８】
【表１６】
2020080467.tif 000017
【０２４９】
表１６に示すとおり、一定時間毎にＳＡ及びＶＡを添加しても、ＮＧＣ７ΔｐｃａＨＧΔｃａｔＢ／ｐＴＳ０８４株はＳＡを利用して増殖し、かつ、ＶＡからｃｃＭＡを経時的に生産した。【０２５０】
［１５．シリンガアルデヒド（ＳＮ）及びＶＮを炭素源としたｃｃＭＡ生産］
ＮＧＣ７ΔｐｃａＨＧΔｃａｔＢ／ｐＴＳ０８４株を、Ｔｃ  １２．５ｍｇ／Ｌを含むＬＢ液体培地  １０ｍＬに接種し、３０℃で１６時間振盪培養した。得られた培養液を、Ｗｘ緩衝液で洗浄した後、Ｔｃ  １２．５ｍｇ／Ｌ、１０ｍＭ  ＳＮ及び５ｍＭ  ＶＮを含むＷｘ最少培地  １０ｍＬに接種し、３０℃で振盪培養した。【０２５１】
培養開始後、一定時間毎に、培養液を遠心分離して得た培養上清について、ＳＮ、ＳＡ、ＶＮ、ＶＡ及びｃｃＭＡの濃度を測定した。結果を表１７に示す。ＳＮ、ＳＡ、ＶＮ、ＶＡ及びｃｃＭＡの濃度測定は上記１１に記載の方法と同様に行った。測定波長はＳＮについて２７０ｎｍ、ＶＮについて２６０ｎｍとした。【０２５２】
【表１７】
2020080467.tif 000018
【０２５３】
表１７が示すとおり、ＮＧＣ７ΔｐｃａＨＧΔｃａｔＢ／ｐＴＳ０８４株は、ＳＮを利用して増殖し、かつ、ＶＮからｃｃＭＡを経時的に生産した（収率は２４．１ｗｔ％）。なお、収率は、消費された基質（ＳＮ及びＶＮ）の量に対するｃｃＭＡの量により求めた。【０２５４】
［１６．シラカバリグニン由来フェノール類を炭素源としたｃｃＭＡ生産］
常法に従い、シラカバ木粉をアルコール−ベンゼン抽出処理に供し、次いで処理後のシラカバ木粉  １．５ｇをアルカリニトロベンゼン酸化分解処理及びジエチルエーテル抽出処理に供した（木質科学実験マニュアル、日本木材学会編、文永堂出版を参照；該文献の全記載はここに開示として援用される。）。ニトロベンゼン酸化分解後のアルカリ溶液をジエチルエーテル抽出処理し、得られた水層を酸性化処理に供し、さらにジエチルエーテル抽出処理に供した。エーテル層として得られたジエチルエーテル抽出物をシラカバリグニン由来芳香族化合物とし、シラカバリグニン由来芳香族化合物水溶液（ｐＨ≒９）を唯一の炭素源として添加したＭＭ培地におけるｃｃＭＡ生産を評価した。【０２５５】
ＮＧＣ７ΔｐｃａＨＧΔｃａｔＢ／ｐＴＳ０８４株を、Ｔｃ  １２．５ｍｇ／Ｌを含むＬＢ液体培地  １０ｍＬに接種し、３０℃で１６時間振盪培養した。得られた培養液を、Ｗｘ緩衝液で洗浄した後、Ｔｃ  １２．５ｍｇ／Ｌを含むＷｘ最少培地  １０ｍＬに接種し、炭素源としてシラカバリグニン由来芳香族化合物水溶液  ６０μＬを添加し、３０℃で振盪培養した。培養開始から１２時間ごとにシラカバリグニン由来芳香族化合物水溶液  ６０μＬを５回添加した。【０２５６】
培養開始後、一定時間毎に、培養液のＯＤ６００を測定し、さらに培養液を遠心分離して得た培養上清について、ｃｃＭＡの濃度を測定した。結果を表１８に示す。ＯＤ６００測定並びにｃｃＭＡの濃度測定は上記１１に記載の方法と同様に行った。【０２５７】
【表１８】
2020080467.tif 000019
【０２５８】
表１８が示すとおり、ＮＧＣ７ΔｐｃａＨＧΔｃａｔＢ／ｐＴＳ０８４株は、シラカバリグニン由来芳香族化合物を利用して増殖し、かつ、ｃｃＭＡを経時的に生産した。【０２５９】
［１７．ＳＡ及びＶＡを炭素源としたプロトカテク酸（ＰＣＡ）生産（１）］
ＮＧＣ７ΔｐｃａＨＧΔｃａｔＢ株を、Ｔｃ  １２．５ｍｇ／Ｌを含むＬＢ液体培地  １０ｍＬに接種し、３０℃で１６時間振盪培養した。得られた培養液を、Ｗｘ緩衝液で洗浄した後、Ｔｃ  １２．５ｍｇ／Ｌ、１０ｍＭ  ＳＡ及び５ｍＭ  ＶＡを含むＷｘ最少培地２００ｍＬ（５００ｍＬ容バッフル付きフラスコを培養容器に使用した）に接種し、３０℃で回転培養した。【０２６０】
培養開始後、一定時間毎に、培養液のＯＤ６００を測定し、さらに培養液を遠心分離して得た培養上清について、ＳＡ、ＶＡ及びＰＣＡの濃度を測定した。結果を表１９に示す。ＯＤ６００測定並びにＳＡ、ＶＡ及びＰＣＡの濃度測定は上記１１に記載の方法と同様に行った。測定波長はＰＣＡについては２６０ｎｍとした。【０２６１】
【表１９】
2020080467.tif 000020
【０２６２】
表１９が示すとおり、ＮＧＣ７ΔｐｃａＨＧΔｃａｔＢ株は、ＳＡを利用して増殖し、かつ、ＶＡからＰＣＡを経時的に生産した（収率は１２．８ｗｔ％）。なお、収率は、消費された基質（ＳＡ及びＶＡ）の量に対するＰＣＡの量により求めた。【０２６３】
［１８．ＳＡ及びＨＢＡを炭素源としたＰＣＡ生産］
ＮＧＣ７ΔｐｃａＨＧΔｃａｔＢ株を、Ｔｃ  １２．５ｍｇ／Ｌを含むＬＢ液体培地  １０ｍＬに接種し、３０℃で１６時間振盪培養した。得られた培養液を、Ｗｘ緩衝液で洗浄した後、Ｔｃ  １２．５ｍｇ／Ｌ、１０ｍＭ  ＳＡ及び５ｍＭ  ＨＢＡを含むＷｘ最少培地２００ｍＬ（５００ｍＬ容バッフル付きフラスコを培養容器に使用した）に接種し、３０℃で回転培養した。【０２６４】
培養開始後、一定時間毎に、培養液のＯＤ６００を測定し、さらに培養液を遠心分離して得た培養上清について、ＳＡ、ＨＢＡ及びＰＣＡの濃度を測定した。ＯＤ６００測定並びにＳＡ、ＶＡ及びＰＣＡの濃度測定は上記１１に記載の方法と同様に行った。結果を表２０に示す。【０２６５】
【表２０】
2020080467.tif 000021
【０２６６】
表２０が示すとおり、ＮＧＣ７ΔｐｃａＨＧΔｃａｔＢ株は、ＳＡを利用して増殖し、かつ、ＨＢＡからＰＣＡを経時的に生産した（収率は２５．７ｗｔ％）。なお、収率は、消費された基質（ＳＡ及びＨＢＡ）の量に対するＰＣＡの量により求めた。【０２６７】
［１９．ＳＡ、ＶＡ及びＨＢＡを炭素源としたＰＣＡ生産］
ＮＧＣ７ΔｐｃａＨＧΔｃａｔＢ株を、Ｔｃ  １２．５ｍｇ／Ｌを含むＬＢ液体培地  １０ｍＬに接種し、３０℃で１６時間振盪培養した。得られた培養液を、Ｗｘ緩衝液で洗浄した後、Ｔｃ  １２．５ｍｇ／Ｌ、１０ｍＭ  ＳＡ、５ｍＭ  ＶＡ及び５ｍＭ  ＨＢＡを含むＷｘ最少培地  ２００ｍＬ（５００ｍＬ容バッフル付きフラスコを培養容器に使用した）に接種し、３０℃で回転培養した。【０２６８】
培養開始後、一定時間毎に、培養液のＯＤ６００を測定し、さらに培養液を遠心分離して得た培養上清について、ＳＡ、ＶＡ，ＨＢＡ及びＰＣＡの濃度を測定した。ＯＤ６００測定並びにＳＡ、ＶＡ及びＰＣＡの濃度測定は上記１１に記載の方法と同様に行った。結果を表２１に示す。【０２６９】
【表２１】
2020080467.tif 000022
【０２７０】
表２１が示すとおり、ＮＧＣ７ΔｐｃａＨＧΔｃａｔＢ株は、ＳＡを利用して増殖し、かつ、ＶＡ及びＨＢＡからＰＣＡを経時的に生産した（収率は２６．１ｗｔ％）。なお、収率は、消費された基質（ＳＡ、ＶＡ及びＨＢＡ）の量に対するＰＣＡの量により求めた。【０２７１】
［２０．ＳＡ及びＶＡを炭素源としたｃｃＭＡ生産（５）］
ＮＧＣ７ΔｐｃａＨＧΔｃａｔＢ／ｐＴＳ０８４株を、Ｔｃ  １２．５ｍｇ／Ｌを含むＬＢ液体培地  １０ｍＬに接種し、３０℃で１６時間振盪培養した。得られた培養液を、Ｗｘ緩衝液で洗浄した後、Ｔｃ  １２．５ｍｇ／Ｌ、１０ｍＭ  ＳＡ及び５ｍＭ  ＶＡを含むＷｘ最少培地  ２００ｍＬ（５００ｍＬ容バッフル付きフラスコを培養容器に使用した）に接種し、３０℃で回転培養した。【０２７２】
培養開始後、一定時間毎に、培養液のＯＤ６００を測定し、さらに培養液を遠心分離して得た培養上清について、ＳＡ、ＶＡ及びｃｃＭＡの濃度を測定した。結果を表２２に示す。ＯＤ６００測定並びにＳＡ、ＶＡ及びｃｃＭＡの濃度測定は上記１１に記載の方法と同様に行った。【０２７３】
【表２２】
2020080467.tif 000023
【０２７４】
表２２が示すとおり、ＮＧＣ７ΔｐｃａＨＧΔｃａｔＢ／ｐＴＳ０８４株は、ＳＡを利用して増殖し、かつ、ＶＡからｃｃＭＡを経時的に生産した（収率は２６．８ｗｔ％）。なお、収率は、消費された基質（ＳＡ及びＶＡ）の量に対するＰＣＡの量により求めた。【０２７５】
［２１．ＳＡ及びＨＢＡを炭素源としたｃｃＭＡ生産］
ＮＧＣ７ΔｐｃａＨＧΔｃａｔＢ／ｐＴＳ０８４株を、Ｔｃ  １２．５ｍｇ／Ｌを含むＬＢ液体培地  １０ｍＬに接種し、３０℃で１６時間振盪培養した。得られた培養液を、Ｗｘ緩衝液で洗浄した後、Ｔｃ  １２．５ｍｇ／Ｌ、１０ｍＭ  ＳＡ及び５ｍＭ  ＨＢＡを含むＷｘ最少培地  ２００ｍＬ（５００ｍＬ容バッフル付きフラスコを培養容器に使用した）に接種し、３０℃で回転培養した。【０２７６】
培養開始後、一定時間毎に、培養液のＯＤ６００を測定し、さらに培養液を遠心分離して得た培養上清について、ＳＡ、ＨＢＡ及びｃｃＭＡの濃度を測定した。結果を表２３に示す。ＯＤ６００測定並びにＳＡ、ＨＢＡ及びｃｃＭＡの濃度測定は上記１１に記載の方法と同様に行った。【０２７７】
【表２３】
2020080467.tif 000024
【０２７８】
表２３が示すとおり、ＮＧＣ７ΔｐｃａＨＧΔｃａｔＢ／ｐＴＳ０８４株は、ＳＡを利用して増殖し、かつ、ＨＢＡからｃｃＭＡを経時的に生産した（収率は２９．１ｗｔ％）。なお、収率は、消費された基質（ＳＡ及びＨＢＡ）の量に対するＰＣＡの量により求めた。【０２７９】
［２２．ＳＡ、ＶＡ及びＨＢＡを炭素源としたｃｃＭＡ生産］
ＮＧＣ７ΔｐｃａＨＧΔｃａｔＢ／ｐＴＳ０８４株を、Ｔｃ  １２．５ｍｇ／Ｌを含むＬＢ液体培地  １０ｍＬに接種し、３０℃で１６時間振盪培養した。得られた培養液を、Ｗｘ緩衝液で洗浄した後、Ｔｃ  １２．５ｍｇ／Ｌ、１０ｍＭ  ＳＡ、５ｍＭ  ＶＡ及び５ｍＭ  ＨＢＡを含むＷｘ最少培地  ２００ｍＬ（５００ｍＬ容バッフル付きフラスコを培養容器に使用した）に接種し、３０℃で回転培養した。【０２８０】
培養開始後、一定時間毎に、培養液のＯＤ６００を測定し、さらに培養液を遠心分離して得た培養上清について、ＳＡ、ＨＢＡ及びｃｃＭＡの濃度を測定した。結果を表２４に示す。ＯＤ６００測定並びにＳＡ、ＨＢＡ及びｃｃＭＡの濃度測定は上記１１に記載の方法と同様に行った。【０２８１】
【表２４】
2020080467.tif 000025
【０２８２】
表２４が示すとおり、ＮＧＣ７ΔｐｃａＨＧΔｃａｔＢ／ｐＴＳ０８４株は、ＳＡを利用して増殖し、かつ、ＶＡ及びＨＢＡからｃｃＭＡを経時的に生産した（収率は２７．６ｗｔ％）。なお、収率は、消費された基質（ＳＡ、ＶＡ及びＨＢＡ）の量に対するＰＣＡの量により求めた。【０２８３】
［２３．ＶＡ及びＨＢＡの混合物を炭素源としたｃｃＭＡ生産（３）］
ＮＧＣ７ΔｐｃａＨＧΔｃａｔＢ／ｐＴＳ１１９株を、ナリジクス酸（Ｎａｌ）  ２５ｍｇ／Ｌ、Ｋｍ  ２５ｍｇ／Ｌ、ゲンタマイシン（Ｇｍ）  ５０ｍｇ／Ｌ及びＴｃ  ２０ｍｇ／Ｌを含むＬＢ液体培地  １０ｍＬに接種し、３０℃で一晩振盪培養した。得られた培養液  １ｍＬを、Ｎａｌ  ２５ｍｇ／Ｌ、Ｋｍ  ２５ｍｇ／Ｌ、Ｇｍ  ５０ｍｇ／Ｌ、Ｔｃ  ２０ｍｇ／Ｌ、２５ｍＭ  ＶＡ及び２５ｍＭ  ＨＢＡを含むＭＭ液体培地  ０．１Ｌに接種し、３０℃、ｐＨ  ７、３２時間〜５２時間で、培養期間中の溶存酸素濃度（ＤＯ）を一定の範囲に保ちながら通気撹拌培養した。ＤＯセンサーは培養開始前に、空気飽和したＭＭ培地（ＤＯ＝１００％）と５％亜硫酸ナトリウム溶液（ＤＯ＝０％）を用いて校正した。【０２８４】
培養後のＶＡ濃度、ＨＢＡ濃度及びｃｃＭＡ濃度について、上記３に記載の方法と同様に測定した。得られた測定結果より、消費された基質（ＶＡ及びＨＢＡ）の量に対するｃｃＭＡの量により、ｃｃＭＡの収率を算出した。ｃｃＭＡの収率及びＤＯの値をまとめたものを表２５に示す。【０２８５】
【表２５】
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【０２８６】
表２５が示すとおり、生産されるｃｃＭＡの収率は、培養液中の溶存酸素濃度が２．５％〜１０％である条件下において良好な結果となった（収率が約２３ｗｔ％以上）。【０２８７】
［２４．ＶＡ及びＨＢＡの混合物を炭素源としたｃｃＭＡ生産（４）］
ＮＧＣ７ΔｐｃａＨＧΔｃａｔＢ／ｐＴＳ１１９株を、Ｔｃ  ２０ｍｇ／Ｌを含むＬＢ液体培地  １０ｍＬに接種し、３０℃で一晩振盪培養した。得られた細胞を生理食塩水で洗浄した後、ＯＤ６００＝５０になるように生理食塩水で懸濁した。【０２８８】
得られた懸濁液  １ｍＬを、Ｔｃ  ２０ｍｇ／Ｌ、２５ｍＭ  ＶＡ及び２５ｍＭ  ＨＢＡを含むＭＭｘ−３液体培地［３４．２ｇ／Ｌ  Ｎａ２ＨＰＯ４・１２Ｈ２Ｏ、６．０ｇ／Ｌ  ＫＨ２ＰＯ４、２．５ｇ／Ｌ  （ＮＨ４）２ＳＯ４、１ｇ／Ｌ  ＮａＣｌ、０．４９ｇ／Ｌ  ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．００５ｇ／Ｌ  ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．０１５ｇ／Ｌ  ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ］０．１Ｌに接種し、３０℃、ｐＨ  ７、ＤＯ＝２．５％に保ちながら通気撹拌培養した。ＤＯセンサーは培養開始前に、空気飽和したＭＭｘ−３液体培地（ＤＯ＝１００％）と５％亜硫酸ナトリウム溶液（ＤＯ＝０％）を用いて校正した。【０２８９】
ＶＡの濃度が１ｇ／Ｌ以下になった時点からＦｅｅｄ溶液［１００ｇ／Ｌ  ＶＡ、８２．１ｇ／Ｌ  ＨＢＡ、１４８．８ｇ／Ｌ  （ＮＨ４）２ＳＯ４］を２時間おきに、ＶＡ及びＨＢＡの消費速度に併せて０．４２ｇ〜２．５２ｇの範囲で添加した。【０２９０】
一定時間毎に培養液のＯＤ６００と、培養液中のＶＡ濃度、ＨＢＡ濃度及びｃｃＭＡ濃度を測定した。ＯＤ６００測定並びにＶＡ、ＨＢＡ及びｃｃＭＡの濃度測定は上記３に記載の方法と同様に行った。培養開始から０、１２、２４、３６、４８及び５２時間後のＯＤ６００値、ＶＡ濃度、ＨＢＡ濃度及びｃｃＭＡ濃度の測定結果をまとめたものを表２６に示す。【０２９１】
【表２６】
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【０２９２】
表２６が示すとおり、ＮＧＣ７ΔｐｃａＨＧΔｃａｔＢ／ｐＴＳ１１９株は、ＶＡ及びＨＢＡを利用して増殖し、かつ、ｃｃＭＡを経時的に高濃度で生産した。
【産業上の利用可能性】
【０２９３】
本発明の一態様の形質転換微生物や製造方法によって、リグニン由来の芳香族化合物やリグニンを含むバイオマスから、ムコン酸及びプロトカテク酸が得られる。ムコン酸は、種々の産業上有用な化合物に変換することができ、例えば、界面活性剤、難燃剤、ＵＶ光安定化剤、熱硬化性プラスチック、コーティング剤などの用途があるムコン酸誘導体の原料として利用することができる。
【関連出願の相互参照】
【０２９４】
本出願は、２０１８年１０月１７日出願の日本特願２０１８−１９６００１号の優先権を主張し、その全記載は、ここに開示として援用される。
【配列表】
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【国際調査報告】
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