(57)【要約】  第１の容器１０と分割器２０とを接続し、細胞塊を分割し継代培養するための細胞培養システムを構成する。分割器の出口は第１の容器に接続される。分割器２０の分割用管路中には細胞塊を分割するための網状構造２２が配置され、細胞塊が該網状構造を通過することによって分割される。分割された細胞塊は、好ましい態様として外気に接触することなく第１の容器１０に送られ、そこでさらなる培養が行われる。これにより、閉鎖系を維持したまま、細胞塊の分割と浮遊培養とを行うことが可能になる。培養された細胞塊を自己の細胞培養システムの分割器や別途用意した細胞培養システムの分割器に送ることで、細胞塊の分割と浮遊培養とを繰り返し行うことが可能になる。
2020032041.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞塊を分割し継代培養するための細胞培養システムであって、
供給源から液体培地と共に供給される分割すべき細胞塊をより小さい細胞塊へと分割するための分割器と、
前記分割器によって分割された細胞塊を浮遊培養するための第１の容器と
を少なくとも有し、
前記分割器は、入口と内部の分割用管路と出口を有し、前記入口は、前記の分割すべき細胞塊と液体培地を、前記供給源から前記分割用管路内に受け入れるように構成され、前記分割用管路中には、分割すべき細胞塊を分割するための網状構造が配置され、該分割すべき細胞塊が、液体培地と共に該網状構造を通過することによって分割されるようになっており、前記出口は、前記分割された細胞塊を、前記第１の容器へと送出するように該第１の容器に接続され、
前記第１の容器は、分割された細胞塊と液体培地とを、受入れ、かつ、該第１の容器内で浮遊培養された細胞塊を送出する構成を有する、
前記細胞培養システム。
【請求項２】
第１の容器が、柔軟な細胞培養バッグである、請求項１に記載の細胞培養システム。
【請求項３】
前記網状構造が、線材で編まれたメッシュである、請求項１または２に記載の細胞培養システム。
【請求項４】
前記網状構造が、フィルムの主面の所定の領域に多数の貫通孔が配置された多孔フィルムであって、該網状構造は、前記所定の領域をフィルム厚さの方向に貫通する多数の貫通孔と、該貫通孔同士の間の隔壁であるビーム部とを有し、
前記貫通孔は、上記のより小さい細胞塊が通過可能な大きさの開口形状を持っており、
前記ビーム部は、前記所定の領域における前記本体部分から前記貫通孔を差し引いた残部であって、分割すべき細胞塊を切断する部分であり、かつ、網状をなすように一体的につながっている、
請求項１または２に記載の細胞培養システム。
【請求項５】
前記網状構造のビーム部の長手方向に垂直な断面の形状が、矩形であるか、該矩形の入口側の２つの角部が丸みを帯びた形状である、請求項４に記載の細胞培養システム。
【請求項６】
前記多数の貫通孔の開口形状が、互いに合同な四角形であって、前記ビーム部が直交格子状に互いにつながっているか、または、
前記多数の貫通孔の開口形状が、互いに合同な六角形であって、前記ビーム部がハニカム状に互いにつながっている、
請求項４または５に記載の細胞培養システム。
【請求項７】
所定の大きさの細胞塊を回収するための回収器をさらに有し、
該回収器は、前記第１の容器内で浮遊培養された細胞塊と液体培地を受け入れるように、該第１の容器に接続され、
該回収器は分離室を有し、該分離室は、分離用網状構造によって第１室と第２室とに仕切られており、該回収器内に入った液体培地が、第１室から分離用網状構造を通過して第２室へと移動して該回収器外に出て行くように内部流路が構成されており、
前記分離用網状構造は、回収を意図する大きさの細胞塊が通過しないように予め定められた大きさの網の目を持っており、それにより、該回収器内に液体培地と共に入った細胞塊のうち、回収を意図する大きさの細胞塊が、該分離用網状構造を通過せず、第１室に滞留する、
請求項１〜６のいずれか１項に記載の細胞培養システム。
【請求項８】
前記分離用網状構造の全体の形状が、シート状であるか、または、袋状である、請求項７に記載の細胞培養システム。
【請求項９】
前記回収器の分離用網状構造の網の目を液体培地が通過するときの該液体培地の進行方向が鉛直上向きの方向成分を有するように、前記回収器の分離室中に該分離用網状構造が配置されている、請求項７または８に記載の細胞培養システム。
【請求項１０】
前記回収器の分離室の第１室が、
前記第１の容器内で浮遊培養された細胞塊と液体培地を第１室に受け入れるための第１の流入ポートと、
試薬、および／または、細胞塊と液体培地とを有してなる懸濁液を希釈するための液体を外部から第１室に流入させるための第２の流入ポートと、
一部の細胞塊を、第１室から外部に流出させるための流出ポートと
を有する、請求項７〜９のいずれか１項に記載の細胞培養システム。
【請求項１１】
液体培地と細胞塊を移動させるための送液装置をさらに有し、該送液装置は、第１の容器を圧縮変形して内部に収容された液体培地と細胞塊を送出させる装置、シリンジポンプ、および、蠕動ポンプからなる群から選択される１以上のものである、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の細胞培養システム。
【請求項１２】
前記分割すべき細胞塊が液体培地と共に前記網状構造を通過する方向とは逆方向に所定の液体が該網状構造を通過するように、該所定の液体を移動させるための逆方向送液機能または逆方向送液装置をさらに有する、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の細胞培養システム。
【請求項１３】
前記細胞塊が、多能性幹細胞からなる細胞塊である、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の細胞培養システム。
【請求項１４】
前記液体培地中には、細胞または細胞塊を該液体培地中に浮遊させるための微細な構造体が含まれており、該微細な構造体が該液体培地中に分散し浮遊している、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の細胞培養システム。
【請求項１５】
細胞塊の製造方法であって、
請求項１〜１４のいずれか１項に記載された細胞培養システムを用い、
分割すべき細胞塊と液体培地を、前記細胞培養システムの分割器を通過させて、該細胞塊を分割する工程と、
前記分割器で分割された細胞塊を液体培地と共に第１の容器内へと送り、該第１の容器内で浮遊培養する工程とを、
有することを特徴する、前記製造方法。
【請求項１６】
細胞塊を液体培地と共に前記分割器を通過させる際の該液体培地の流速が、１０ｍｍ／秒〜５００ｍｍ／秒である、請求項１５に記載の製造方法。
【請求項１７】
逆流洗浄工程をさらに有し、該逆流洗浄工程は、
前記細胞塊を分割する工程において所定量の細胞塊が分割された後に、該細胞塊が分割のために分割器の網状構造を通過した方向とは逆方向に、所定の液体を該網状構造を通過させて、それにより、該網状構造を洗浄する工程である、
請求項１５または１６に記載の製造方法。
【請求項１８】
前記細胞培養システムが、請求項７〜１０のいずれか１項に記載の細胞培養システムであって、
第１の容器内で浮遊培養した細胞塊を液体培地と共に、前記細胞培養システムの回収器へと送り、該回収器の第１室に滞留する細胞塊を回収容器に送り回収する工程をさらに有する、
請求項１５〜１７のいずれか１項に記載の製造方法。
【請求項１９】
細胞塊を前記回収器で液体培地と分離するための、該回収器を通過する該液体培地の流速が、０．０１ｍｍ／秒〜２５ｍｍ／秒である、請求項１７に記載の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞を浮遊培養し成長させた細胞塊の分割とさらなる浮遊培養とを閉鎖系において繰り返すことを可能にする細胞培養システム、および、該細胞培養システムを用いた細胞塊の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、多能性幹細胞などの種々の細胞を液体培地中に浮遊させながら細胞塊へと３次元的に成長させる細胞培養方法（浮遊培養法とも呼ばれている）が開発されている（例えば、特許文献１など）。また、浮遊培養法を好ましく実施するための液体培地やその製造方法も開発されている（例えば、特許文献１など）。【０００３】
浮遊培養法では、細胞塊がより大きく成長するにつれて、多能性幹細胞の未分化性が低下する可能性がある。例えば、非特許文献１では、１５０μｍ以上の大きい細胞塊では未分化性が低下してしまう可能性が示唆されている。【０００４】
一方、特許文献１に記載された多能性幹細胞の培養方法では、多能性幹細胞を平均直径が約２００〜約３００μｍの大きい細胞塊となるまで浮遊培養し、得られた該大きい細胞塊を平均直径が約８０〜約１２０μｍ程度のより小さい細胞塊へと分割し、その後、さらなる浮遊培養を継続して、該多能性幹細胞を維持増幅させている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】国際公開第２０１３／０７７４２３号
【特許文献２】国際公開第２０１６／１６３４４４号
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Andreas Elanzew et al., “A reproducible and versatile system for the dynamic expansion of human pluripotent stem cells in suspension”, Biotechnology Journal, 2015, 10, 1589-1599.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
しかしながら、本発明者らが、特許文献１に記載された多能性幹細胞の培養方法を詳細に検討したところ、次の改善すべき問題が含まれていることがわかった。
即ち、前記の培養方法では、細胞塊の分割工程と、分割された細胞塊をさらに培養する工程は、互いに分かれた別の容器と分割器具とを用いて行われている。よって、細胞塊とそれを含んだ液体培地は、分割工程に送り込む際に外気に接触し、また、分割工程で分割された細胞塊とそれを含んだ液体培地は、さらなる培養のために次段の培養容器に移される際に外気に接触する。よって、細胞塊の分割工程と、分割された細胞塊をさらに培養する工程とを繰り返す場合には、細胞塊と液体培地は何度も外気に接触し、汚染される可能性がある。【０００８】
本発明の目的は、上記の問題を解消し得、細胞塊の分割と、分割された細胞塊のさらなる培養とを、閉鎖系において行うことを可能にする細胞培養システムを提供し、かつ、該細胞培養システムを用いた細胞塊の製造方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明の主たる構成は、次のとおりである。
〔１〕細胞塊を分割し継代培養するための細胞培養システムであって、
供給源から液体培地と共に供給される分割すべき細胞塊をより小さい細胞塊へと分割するための分割器と、
前記分割器によって分割された細胞塊を浮遊培養するための第１の容器と
を少なくとも有し、
前記分割器は、入口と内部の分割用管路と出口を有し、前記入口は、前記の分割すべき細胞塊と液体培地を、前記供給源から前記分割用管路内に受け入れるように構成され、前記分割用管路中には、分割すべき細胞塊を分割するための網状構造が配置され、該分割すべき細胞塊が、液体培地と共に該網状構造を通過することによって分割されるようになっており、前記出口は、前記分割された細胞塊を、前記第１の容器へと送出するように該第１の容器に接続され、
前記第１の容器は、分割された細胞塊と液体培地とを、受入れ、かつ、該第１の容器内で浮遊培養された細胞塊を送出する構成を有する、
前記細胞培養システム。
〔２〕第１の容器が、柔軟な細胞培養バッグである、上記〔１〕に記載の細胞培養システム。
〔３〕前記網状構造が、線材で編まれたメッシュである、上記〔１〕または〔２〕に記載の細胞培養システム。
〔４〕前記網状構造が、フィルムの主面の所定の領域に多数の貫通孔が配置された多孔フィルムであって、該網状構造は、前記所定の領域をフィルム厚さの方向に貫通する多数の貫通孔と、該貫通孔同士の間の隔壁であるビーム部とを有し、
前記貫通孔は、上記のより小さい細胞塊が通過可能な大きさの開口形状を持っており、
前記ビーム部は、前記所定の領域における前記本体部分から前記貫通孔を差し引いた残部であって、分割すべき細胞塊を切断する部分であり、かつ、網状をなすように一体的につながっている、
上記〔１〕または〔２〕に記載の細胞培養システム。
〔５〕前記網状構造のビーム部の長手方向に垂直な断面の形状が、矩形であるか、該矩形の入口側の２つの角部が丸みを帯びた形状である、上記〔４〕に記載の細胞培養システム。
〔６〕前記多数の貫通孔の開口形状が、互いに合同な四角形であって、前記ビーム部が直交格子状に互いにつながっているか、または、
前記多数の貫通孔の開口形状が、互いに合同な六角形であって、前記ビーム部がハニカム状に互いにつながっている、
上記〔４〕または〔５〕に記載の細胞培養システム。
〔７〕所定の大きさの細胞塊を回収するための回収器をさらに有し、
該回収器は、前記第１の容器内で浮遊培養された細胞塊と液体培地を受け入れるように、該第１の容器に接続され、
該回収器は分離室を有し、該分離室は、分離用網状構造によって第１室と第２室とに仕切られており、該回収器内に入った液体培地が、第１室から分離用網状構造を通過して第２室へと移動して該回収器外に出て行くように内部流路が構成されており、
前記分離用網状構造は、回収を意図する大きさの細胞塊が通過しないように予め定められた大きさの網の目を持っており、それにより、該回収器内に液体培地と共に入った細胞塊のうち、回収を意図する大きさの細胞塊が、該分離用網状構造を通過せず、第１室に滞留する、
上記〔１〕〜〔６〕のいずれかに記載の細胞培養システム。
〔８〕前記分離用網状構造の全体の形状が、シート状であるか、または、袋状である、上記〔７〕に記載の細胞培養システム。
〔９〕前記回収器の分離用網状構造の網の目を液体培地が通過するときの該液体培地の進行方向が鉛直上向きの方向成分を有するように、前記回収器の分離室中に該分離用網状構造が配置されている、上記〔７〕または〔８〕に記載の細胞培養システム。
〔１０〕前記回収器の分離室の第１室が、
前記第１の容器内で浮遊培養された細胞塊と液体培地を第１室に受け入れるための第１の流入ポートと、
試薬、および／または、細胞塊と液体培地とを有してなる懸濁液を希釈するための液体を外部から第１室に流入させるための第２の流入ポートと、
一部の細胞塊を、第１室から外部に流出させるための流出ポートと
を有する、上記〔７〕〜〔９〕のいずれかに記載の細胞培養システム。
〔１１〕液体培地と細胞塊を移動させるための送液装置をさらに有し、該送液装置は、第１の容器を圧縮変形して内部に収容された液体培地と細胞塊を送出させる装置、シリンジポンプ、および、蠕動ポンプからなる群から選択される１以上のものである、上記〔１〕〜〔１０〕のいずれかに記載の細胞培養システム。
〔１２〕前記分割すべき細胞塊が液体培地と共に前記網状構造を通過する方向とは逆方向に所定の液体が該網状構造を通過するように、該所定の液体を移動させるための逆方向送液機能または逆方向送液装置をさらに有する、上記〔１〕〜〔１１〕のいずれかに記載の細胞培養システム。
〔１３〕前記細胞塊が、多能性幹細胞からなる細胞塊である、上記〔１〕〜〔１２〕のいずれかに記載の細胞培養システム。
〔１４〕前記液体培地中には、細胞または細胞塊を該液体培地中に浮遊させるための微細な構造体が含まれており、該微細な構造体が該液体培地中に分散し浮遊している、請求項〔１〕〜〔１３〕のいずれかに記載の細胞培養システム。
〔１５〕細胞塊の製造方法であって、
上記〔１〕〜〔１４〕のいずれかに記載された細胞培養システムを用い、
分割すべき細胞塊と液体培地を、前記細胞培養システムの分割器を通過させて、該細胞塊を分割する工程と、
前記分割器で分割された細胞塊を液体培地と共に第１の容器内へと送り、該第１の容器内で浮遊培養する工程とを、
有することを特徴する、前記製造方法。
〔１６〕細胞塊を液体培地と共に前記分割器を通過させる際の該液体培地の流速が、１０ｍｍ／秒〜５００ｍｍ／秒である、上記〔１５〕に記載の製造方法。
〔１７〕逆流洗浄工程をさらに有し、該逆流洗浄工程は、
前記細胞塊を分割する工程において所定量の細胞塊が分割された後に、該細胞塊が分割のために分割器の網状構造を通過した方向とは逆方向に、所定の液体を該網状構造を通過させて、それにより、該網状構造を洗浄する工程である、
上記〔１５〕または〔１６〕に記載の製造方法。
〔１８〕前記細胞培養システムが、上記〔７〕〜〔１０〕のいずれかに記載の細胞培養システムであって、
第１の容器内で浮遊培養した細胞塊を液体培地と共に、前記細胞培養システムの回収器へと送り、該回収器の第１室に滞留する細胞塊を回収容器に送り回収する工程をさらに有する、
上記〔１５〕〜〔１７〕のいずれかに記載の製造方法。
〔１９〕細胞塊を前記回収器で液体培地と分離するための、該回収器を通過する該液体培地の流速が、０．０１ｍｍ／秒〜２５ｍｍ／秒である、上記〔１７〕に記載の製造方法。
【発明の効果】
【００１０】
本発明による細胞培養システムおよび製造方法によって、細胞塊は、液体培地と共に、閉鎖系内を移動することが可能になり、この閉鎖系内での移動において、細胞塊の分割と、分割後の細胞塊の成長とが行われることも可能になる。液体培地は、新しいものが適宜に注入され、古いものは適宜に抜き取られるように、ポートが設けられる。よって、外界からの汚染を抑制しながら、目的の細胞塊を自動的に大量に増殖させることが可能になる。【００１１】
また、前記のように好ましい態様として閉鎖系内で培養された細胞塊は液体培地と共に回収器に移され（好ましくは、外気に触れることなく回収器に移され）、細胞塊が安全に回収される。回収された細胞塊の一部または全部は、再度、当該細胞培養システムに戻されてもよいし、別途必要数だけ用意された他の当該細胞培養システムへと移されてもよく、そこで細胞塊の分割と培養が必要回数だけ繰り返されてもよい。この必要数だけ用意された他の当該細胞培養システムは、１つのシステムから複数のシステムへと細胞塊が分配されるように並列的に配置されてもよいし、１つのシステムから次の１つのシステムへと細胞塊が順に供給されるように直列的に配置されてもよい。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】図１は、本発明による細胞培養システムの構成の一例を概略的に示す図である。図では、説明のために培養容器を小さく描き、管路を太く描いているが、実際には、培養容器は一般的な培養バッグの大きさであり、管路はフレキシブルな配管チューブである。分割器の網状構造は、太い点線で描いている。
【図２】図２は、細胞塊の分割に用いられるメッシュの構造を示す図である。図２（ａ）は、メッシュのシート面の所定の領域を示す部分拡大図であり、図２（ｂ）は、図２（ａ）のＸ１−Ｘ１断面図である。図２（ｂ）では、線材の断面にハッチングを施している。
【図３】図３は、好ましい分割器の網状構造として提案する多孔フィルムの態様の一例を示す図である。図３（ａ）は、フィルム状の本体部分のフィルム面の所定の領域を示す部分拡大図であり、図３（ｂ）は、図３（ａ）のＸ２−Ｘ２断面図である。図３（ｃ）〜（ｅ）は、図３（ｂ）に示すビーム部の断面の他の態様を例示する図である。図３（ｂ）〜（ｅ）では、ビーム部の断面にハッチングを施している。
【図４】図４は、本発明において提案する多孔フィルムにおいて、フィルム面に網状構造が設けられる領域を例示する図である。同図では、貫通孔の開口の図示を省略し、網状構造が設けられる領域をハッチングで示している。
【図５】図５は、本発明において提案する多孔フィルムの他の例を示す図であり、本体部分のフィルム面の所定の領域を示す部分拡大図である。
【図６】図６は、網状構造を分割器として好ましく使用し得るように構成されたホルダーの構造の一例を示す断面図である。
【図７】図７は、回収器が加えられた、本発明による細胞培養システムの構成例を概略的に示す図である。回収器内の分離用網状構造は、太い点線で描いている。図では、図１と同様に、説明のために培養容器を小さく描き、管路を太く描いている。また、細胞培養の流れを太い矢印で示し、回収器を用いた回収に関する流れを細い破線の矢印で示している。
【図８】図８は、回収器の好ましい態様の一例を示す図である。図８（ａ)は、回収器の内部を見せるために、側壁部を除いた図であり、図８（ｂ)は、図８（ａ)のＸ３−Ｘ３断面図である。
【図９】図９は、回収器の好ましい態様の他の例を示す図である。図９（ａ)は、回収器の内部を見せるために、側壁部を除いた図であり、図９（ｂ)は、図９（ａ)のＸ４−Ｘ４断面図である。
【図１０】図１０は、回収器の好ましい態様の他の例を示す断面図である。図では、分離用網状構造の断面を太い点線で表している。該点線における点同士の間隔と、実際の網の目の大きさは関係がない。細胞塊は、白い円形のシンボルを用いて示している。図１１、図１５も同様である。
【図１１】図１１は、回収器の好ましい態様の他の例を示す断面図である。
【図１２】図１２は、回収器の好ましい態様の他の例を概略的に示す断面図である。
【図１３】図１３は、回収器の好ましい態様の他の例を示す図である。図１３（ａ)は、回収器の内部を見せるために、側壁部を除いた図であり、図１３（ｂ)は、図１３（ａ)のＸ５−Ｘ５断面図である。
【図１４】図１４は、回収器の好ましい態様の他の例を示す図である。図１４（ａ)は、回収機の内部を見せるために、側壁部を除いた図である。図１４（ｂ)は、図１４（ａ)の回収器の構成の一例を模式的に示す斜視図である。図１４（ｃ)は、図１４（ａ)の回収器の構成の他の例を模式的に示す斜視図である。
【図１５】図１５は、回収器の好ましい態様の他の例を示す断面図である。
【図１６】図１６は、本発明による細胞塊を分割する方法を用いた細胞培養方法の一例を示すフローチャートである。
【図１７】図１７は、本発明において、分割器に対する逆流洗浄の効果を調べた試験結果を示すグラフである。図１７（ａ）、（ｂ）は、逆流洗浄を行わずに細胞塊の分割を継続した場合における、分割された細胞塊に含まれる細胞の生存率を示すグラフであり、図１７（ｃ）、（ｄ）は、所定量の分割毎に逆流洗浄を行いながら細胞塊の分割を継続した場合における、分割された細胞塊に含まれる細胞の生存率を示すグラフである。
【図１８】図１８は、本発明において、網状構造のビーム部の断面形状と分割性能の関係を調べた試験結果を示すグラフである。
【図１９】図１９は、本発明の実施例において用いた細胞培養システムの構成を示すブロック図である。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
以下、本発明の細胞培養システム（当該細胞培養システムとも呼ぶ）の構成を、実施例を挙げながら詳細に説明する。
当該細胞培養システムは、好ましい態様では、全体が閉鎖系（ガス分子の透過を除いて外気から遮断された系）であるように構成され、外界から隔離された管路内において、細胞塊が分割され、分割後の細胞塊がさらに培養（継代培養）される。培養された細胞塊は、その後、同じ当該細胞培養システム内へとフィードバックされ、また、別の当該細胞培養システムへと送られ、さらなる分割と培養が繰り返されてもよい。このような閉鎖系での細胞塊の分割と培養とを繰り返すことができるように、当該細胞培養システムは、図１に好ましい態様の一例を示すように、供給源Ｓ１から液体培地と共に供給される分割すべき細胞塊をより小さい細胞塊へと分割するための分割器２０と、該分割器２０によって分割された細胞塊を浮遊培養するための第１の容器１０とを少なくとも有し、これらが気密に接続されている。図１の例では、分割器２０と第１の容器１０とは、配管Ｐ２を介して接続されているが、両者は直接的に接続されていてもよい。Ｆ１は、液体培地と細胞塊を管路に沿って送るための送液装置（ポンプ）である。送液装置Ｆ１の位置は限定されない。送液装置については後述する。
【００１４】
（供給源）
図１に示す供給源Ｓ１は、当該細胞培養システムに、分割すべき細胞塊と液体培地（即ち、液体培地とその液中に存在する細胞塊）を供給するためのものである。供給源Ｓ１は、細胞塊と液体培地とが収容された外部の培養容器であってもよいし、当該細胞培養システムに付与される回収器に付帯した回収容器であってもよい。図１の例では、外部の細胞培養装置において、接着培養によって成長させたコロニーを足場から剥離した細胞塊（または、浮遊培養によって形成された細胞塊）が、液体培地と共に、シリンジ等の容器に収容され、好ましい態様として外気に接触することなく、管路Ｐ１を通じて分割器２０に送り込まれるようになっている。その際、分割後の培養に必要な量の液体培地が合流管路等から加えられてもよいし、供給源Ｓ１において、分割後の培養に必要な量の液体培地と細胞塊と収容されていてもよい。培養に必要な液体培地や廃棄すべき液体培地の交換のための配管は適宜加えられてもよい。
当該細胞培養システムに付与される回収器が供給源である場合、該回収器は、管路Ｐ３上に設けられてもよく、細胞塊の分割と培養が閉ループ内で循環的に繰り返されてもよい。細胞塊の分割と培養が閉ループ内で好ましく循環的に繰り返されるように、開閉弁、切替弁、容器、送液装置などが適宜設けられてもよい。
また、当該細胞培養システムを複数用い、第１段目の当該細胞培養システムの回収容器を供給源Ｓ１として、そこから供給される細胞塊と液体培地が第２段目以降の当該細胞培養システムへと順に供給されるというように、各細胞培養システムが次段の細胞培養システムの供給源となる構成としてもよい。
【００１５】
（分割器）
図１に示すように、分割器２０は、入口２０ａと出口２０ｂを有し、該出口２０ｂは第１の容器１０に気密に（即ち、好ましい態様として外気が入り込まないように）接続されている。図１の例では、管路Ｐ２（軟質樹脂チューブなどの配管部材）を介して、分割器２０の出口と第１の容器１０の入口とが接続されているが、両者は直接的に接続されていてもよい。また、管路Ｐ２の途上には、切替弁や注入ポートなどが必要に応じて接続されていてもよい。
【００１６】
分割器２０は、入口２０ａと出口２０ｂを連絡する分割用管路２１を有する。分割用管路２１中には、細胞塊を分割（解砕）するための網状構造２２が配置されており、第１の容器１０から液体培地と共に分割用管路２１中に送出された細胞塊が、好ましい態様として外気に接触することなく該網状構造２２を通過するように構成されている。ここでいう「網状構造を通過する」とは、網状構造の網の目を、一方の側から他方の側へと通過することをいう。
網状構造の好ましい態様、および、該網状構造を好ましく保持する構造については、後述する。
【００１７】
（第１の容器）
第１の容器１０は、液体培地と分割された細胞塊を好ましい態様として外気に接触させないように収容し得る構成を有し、かつ、収容された液体培地と細胞塊（液体培地中に分散した細胞塊）を好ましい態様として外気に接触させないように送出し得る構成を有する。
本発明の好ましい態様において、（液体培地と細胞塊が、外気に接触しない）とは、液体培地および／または細胞塊が、外気に直接的に接触または露出しないことを意味する。例えば、ガス透過性フィルムを通して外気（酸素など）が容器内に透過する場合は、接触には該当しない。また、細胞培養のために容器内に積極的に特定の気体が注入される場合は、そのような培養への寄与を意図して注入される気体は外気ではなく、よって、外気への接触には該当しない。
【００１８】
前記のような第１の容器１０としては、柔軟な細胞培養バッグやフラスコなどが挙げられ、容積が可変の容器が好ましいものとして挙げられる。とりわけ、柔軟なポリマーフィルムを壁部に用いた細胞培養バッグは、安価で容積が大きく、液体培地と細胞塊の出入りに応じて収縮、膨張するので（液体培地と細胞塊の出／入に応じて、外気を補填的に入／出させる必要が無いので）、液体培地と細胞塊が外気に接触することのない好ましい容器である。該細胞培養バッグは、ガス透過性のものなど、従来公知のものを利用することができ、また、フラスコも従来公知のものを利用することができ、これらは必要に応じた容積のものを選択することができる。
【００１９】
（分割器の網状構造）
分割器は、上記したように、分割用管路を有し、該分割用管路中には、細胞塊を分割するための網状構造が配置されている。細胞塊は、この網状構造を通過する際に、網の目の大きさに応じた大きさに分割される。網状構造の網の目よりも大きい細胞塊が、網状構造によって分割されて該網状構造を通過するか、あるいは、網状構造を通過できずに網状構造のシート面に残るかは、主として、該網状構造を通過する液体培地の流速と、網状構造を構成する線材やビーム部（後述）の太さによって決定される。
網状構造は、線材で編まれたメッシュであってもよいし、フィルムの主面の所定の領域に多数の貫通孔が配置された多孔フィルムであってもよい。線材で編まれたメッシュによって細胞塊を分割すること自体は、上記特許文献１に記載されている。よって、メッシュはそのような切断に用いられている公知のものを利用可能である。本発明では、メッシュや多孔フィルムを閉鎖系の管路中に組み込むための後述のホルダーを提案しており、メッシュであっても、閉鎖系で用いることが可能になっている。
【００２０】
特許文献１に記載された多能性幹細胞の培養方法では、ナイロン製や金属製の線材を編み込んでなるメッシュを用い、大きい細胞塊を該メッシュに通過させることで、該メッシュの網の目（正方形の通過孔）に応じた大きさの小さい細胞塊へと分割している。
しかしながら、本発明者らが、前記のようなメッシュを用いた細胞塊の分割を詳細に検討したところ、メッシュ特有の構造に起因して、該メッシュを通過する細胞塊が好ましく分割されない場合があることがわかった。即ち、メッシュは一種のシート状物であり、そのシート面を巨視的に正視した場合には、図２（ａ）に示すように、縦糸と横糸が直線的に交差しているように見え、かつ、網の目も、平面的な正方形に見える。しかし、個々の網の目を微視的に観察すると、縦糸と横糸は互いをよけるように３次元的に編まれているので、１つの正方形の網の目１００を取り囲む４辺を構成する４本の線材（２本の縦糸（１０１、１０２）と、２本の横糸（１１１、１１２））は、図２（ｂ）に示すように、それぞれにメッシュの厚さ方向に大きく波打っている。
【００２１】
このような波打った４本の線材によって囲まれた網の目を細胞塊が通過する場合、各線材の断面形状は円形であり、線材の胴体表面は曲面であるから、細胞塊は適切にまたは鋭利に分割されない場合がある。このようなメッシュの欠点を改善するために、より細い線材を用いると、メッシュの強度が低下する。これを改善するために線材の強度をより高めると、メッシュがより高価になる。また、線材によって形成されたメッシュによって細胞塊を分割する場合、液体培地の流速が低いと細胞塊を切断することができず、メッシュの網にトラップされるだけであるため、分割が適切に行われず、細胞塊の回収率が低くなる。よって、ある程度の高い流速が必要である。一方で、液体培地の流速を高くすると、分割した細胞塊が高速の流れによるせん断を受け、さらに小さくなってしまう。多能性幹細胞の細胞塊は、外径４０μｍ以下に分割されると、細胞がアポトーシスを起こすなど、細胞へのダメージが大きく好ましくない。
以上のように、従来のメッシュを用いた細胞塊の分割では、液体培地の流速が低いと、細胞の回収率が低くなり、液体培地の流速が高いと、細胞塊へのダメージが大きく、拡大培養効率の低下に繋がる。
【００２２】
そこで、本発明では、フィルムの主面の所定の領域に多数の貫通孔が配置された多孔フィルムを網状構造として用いることを提案する。以下、好ましい多孔フィルムの態様を、実施例を挙げながら詳細に説明する。
【００２３】
多孔フィルムは、フィルム状の本体部分を有する。該本体部分の外周縁部などには、取り扱い性を向上させるための剛性の高いフレームやタブなどがさらに設けられていてもよいが、以下に説明として挙げる態様では、多孔フィルム全体がフィルム状の本体部分であり、よって、全体が１枚のフィルムとなっている。多孔フィルムの本体部分のフィルム面における所定の領域は、図３（ａ）に示すように、該フィルム面に多数の貫通孔２２０が配置された網状構造２１０になっている。フィルム面の所定の領域は、フィルム面の一部または全部の領域であってよい。例えば、図４（ａ）の例では、フィルム状の本体部分２００の外周領域２００ｂは、貫通孔のない平坦なフィルムとなっており、中央領域２００ａに貫通孔が配置されている。網状構造の外周を定める外径線（例えば、中央領域２００ａの外周の境界線）が貫通孔の開口を横切る場合、その貫通孔の開口は外形線の内側だけの小さい開口となってしまう。このような場合、小さい開口の貫通孔をそのまま設けてもよいし、または、そのような小さい開口の貫通孔は設けなくともよいし、または、本来の形状の開口が外形線を外側に超えるように貫通孔を設けてもよい。
【００２４】
（網状構造）
多孔フィルムの網状構造２１０は、図３（ａ）に示すように、前記所定の領域をフィルム厚さの方向に貫通する多数の貫通孔２２０と、該貫通孔同士の間の隔壁であるビーム部２３０とによって構成されている。貫通孔２２０は、分割後の細胞塊が通過可能な大きさの開口形状を持っている。一方、ビーム部２３０は、前記所定の領域における本体部分から前記貫通孔を差し引いた残部である。該ビーム部は、分割すべき細胞塊を切断する部分として機能し、かつ、網状をなすように一体的につながっている。この構成によって、前記したメッシュの問題が抑制され、大きく成長した細胞塊を好ましく分割することができる。
【００２５】
本発明に利用可能な多孔フィルムでは、前記したように、フィルム面に貫通孔が多数配置されて、該フィルム面の所定の領域（一部または全部の領域）が網状構造となっている。この網状構造は、網の目として機能する貫通孔と、隣り合った貫通孔同士の間の隔壁部として機能するビーム部とからなる、一種の多孔フィルムである。この網状構造の領域では、図３（ａ）に示すように、ビーム部２３０が、フィルムから貫通孔を除いた残部として２次元状に網としてつながっており、メッシュの線材のような波打ちがない。よって、このような波打ちのないビーム部に衝突した細胞塊は、上記した波打ったメッシュの線材よりも好ましく分割され得る。またさらに、該ビーム部２３０の断面形状は、図３（ｂ）または図３（ｃ）に示すように、円形ではなく、四角形や矩形（厚さ方向を長辺とする長方形、厚さ方向を短辺とする長方形、または、正方形）に近い。よって、各貫通孔の開口部におけるビーム部２３０のエッジによって、該細胞塊はより抵抗なく鋭利に分割され得るので、切断時に該細胞塊が受けるダメージはより小さくなる場合がある。
よって、多孔フィルムを用いた細胞塊の分割では、網状の領域を通過する液体（分割すべき細胞塊が分散した液体培地など）の流速を、従来のメッシュを用いた分割の場合より高くしても、細胞塊が過度に細かい細胞塊へと解砕されることも抑制される。
【００２６】
ビーム部の断面形状（ビーム部の長手方向に垂直な断面の形状）は、該ビーム部の幅Ｗ２と、多孔フィルムの厚さｔ１との関係によっては、図３（ｂ）または図３（ｃ）に示すように、矩形（直角四辺形）となり得る。
この矩形の入口側の２つの角部は、図３（ｄ）または図３（ｅ）に示すように、丸みを帯びた形状である方が、分割された細胞塊の生存率がより高くなり、好ましい場合もある。これは、入口側の２つの角部が鋭い直角のエッジである場合に比べて、細胞が受けるダメージが減少し、個々の細胞自体が切断される可能性がより低くなり、かつ、細胞同士が互いに接着する境界面において該細胞同士が分離する可能性がより高くなった結果と考えられる。
図３（ｄ）の態様では、矩形の入口側の２つの角部だけが局所的に丸みを帯びた形状であり、よって、ビーム部の入口側の面には平面が残っている。一方、図３（ｅ）の態様では、矩形の入口側の２つの角部が図３（ｄ）の態様よりもさらに丸みを帯びており、断面形状全体が、半円形（より厳密には、円弧と弦とを有する形状）である。よって、ビーム部の入口側の面は、あたかも、円柱の胴体表面のように全体が曲面となっている。前記したように、細胞が受けるダメージの低減という観点からは、角部の丸みの半径はより大きい方が好ましく、図３（ｄ）の態様よりも、図３（ｅ）の態様の方が好ましい。該丸みの半径は、ビーム部の幅Ｗ２や多孔フィルムの厚さｔ１によっても異なるが、１μｍ〜１００μｍ程度が例示される。また、該丸みの半径は、円弧のように一様であってもよく、場所によって異なっていてもよい。
【００２７】
本発明に利用可能な多孔フィルムの好ましい態様では、貫通孔の開口形状を、より円形に近い形状（例えば、正方形や正六角形）とし、同じ開口形状の貫通孔が行列状または細密状に配置された構成とし、かつ、ビーム部の幅を均一にすることによって、切断時に該細胞塊が受けるダメージをより小さくし、かつ、好ましい大きさのスフェア状の細胞塊を得ることができる。
【００２８】
また、本発明に利用可能な多孔フィルムでは、ビーム部の幅をより狭くすることは、加工上、比較的容易であり、正六角形の開口形状であれば、網状構造全体の強度が高いので、ビーム部の幅をより狭くすることができる。よって、細胞塊をさらに抵抗なく分断することができ、かつ、開口率（網状構造の領域の単位面積に占める、開口面積の総和の割合）を大きくすることができるので、前記のようなメッシュの問題が解決され得る。
【００２９】
（多孔フィルムの貫通孔の開口形状の寸法限定）
貫通孔の開口形状の円相当直径は、分割すべき細胞塊を構成する細胞の種類によっても異なるが、例えば、細胞が多能性幹細胞や胚性幹細胞などであれば、４０〜９０μｍ程度が挙げられ、より好ましくは５０〜８０μｍであり、さらに好ましくは６０〜７０μｍである。以下、細胞が多能性幹細胞や胚性幹細胞などの場合に対する、各部の好ましい寸法等を例示するが、それら以外の他の細胞についても、それぞれに適宜応じた寸法へと変更してよい。
【００３０】
前記の円相当直径の規定だけでは、スリットのような細長い開口形状や迷路のように入り組んだ開口形状も含まれてしまう。そこで、本発明では、前記の円相当直径の限定に加えて、該開口形状が、直径３５μｍ〜８５μｍの円（以下、収容円と呼ぶ）を収容し得る形状であることをも限定条件に加える。ここで、開口形状が収容円を収容し得るとは、収容円が開口形状に内接する場合や、収容円が開口形状と一致する場合をも含む。
同じ円相当直径を有する形状を比較する場合、正方形よりも正六角形の方が、収容円の直径が大きい。円相当直径の好ましい下限値である４０μｍに対応する正方形の場合、そのような正方形の一辺の長さは、約３５．４４９μｍであり、その場合の収容円の直径は、約３５．４４９μｍ以下である。よって、本発明では、３５μｍを収容円の直径の好ましい下限とする。また、円相当直径の好ましい上限値である９０μｍに対応する正六角形の場合、そのような正六角形における対向する二辺間の距離は、約８５．７０８μｍであり、その場合の収容円の直径は、約８５．７０８μｍ以下である。よって、本発明では、８５μｍを収容円の直径の好ましい上限とする。
前記収容円の直径は、４４μｍ〜７６μｍがより好ましく、５３μｍ〜６７μｍがさらに好ましい。開口形状が円形である場合は、収容円の直径＝円相当直径であり、それ以外の場合は、収容円の直径＜円相当直径である。
【００３１】
（多孔フィルムの貫通孔の開口形状）
網状構造に設けられる多数の貫通孔の開口形状は、特に限定はされず、円形、楕円形、三角形、四角形、六角形、その他の多角形や異形などであってもよいが、三角形など、鋭角の内角を持った形状である場合、フィルムの強度の観点から開口率を高くすることができないため、回収率の低下などの問題が生じる可能性がある。また、円形は、ビーム部の幅が一定せず、かつ、ビーム部が互いに連結される部分の面積が大きいので、ビーム部による細胞塊の切断性が好ましくない。これに対して、正六角形であれば、内角が鈍角であり、かつ、ビーム部が互いに連結される部分の面積が小さいので、前記のような問題が抑制され、好ましい。
また、切断後に均一な細胞塊を得る点から、全ての開口形状が互いに合同であることが好ましい。
また、ビーム部の幅（互いに隣り合った貫通孔同士の離間距離）は、均一である方が、該ビーム部の長さに沿った切断性が均一であるため好ましい。
これらの点から、貫通孔の開口形状は、四角形や六角形が好ましく、開口周囲の辺（ビーム部）の長さが互いに等しい正方形や正六角形がより好ましく、より円形に近い点では正六角形が好ましい。
【００３２】
（多孔フィルムの開口の配置パターン）
全ての開口形状が合同な正六角形である場合、フィルム面への開口の配置パターンは細密状が好ましく、その場合、ビーム部は、図３（ａ）に示すようなハニカム状に互いにつながった網状体となる。この態様では、３つのビーム部の端部同士が結合する部分を除いては、全てのビーム部の幅Ｗ２が均一となるので好ましい。
また、全ての開口形状が合同な正方形である場合、フィルム面への開口部の配置パターンは、正方行列状が好ましく、その場合、ビーム部は、図５（ａ）に示すような直交格子状に互いにつながった網状体となる。この態様でも、４つのビーム部の端部同士が結合する部分を除いては、全てのビーム部の幅Ｗ２１が均一となるので好ましい。尚、図５（ｂ）に示すように、正方形の開口部が一行ごとに横方向にずれた配置パターンなどであってもよいが、一点鎖線で囲んだ部分２３１のように、横方向のビーム部が２つに分かれるので、図５（ａ）に示すような直交格子とは切断性が異なる。
【００３３】
図３（ａ）に示すように、正六角形の開口が細密状に配置されている場合、該正六角形の６辺のうち、互いに対向する平行な２辺の間の距離Ｗ１は、前記収容円の直径であってよく、３８μｍ〜８５μｍが好ましく、４８μｍ〜７６μｍがより好ましく、５７μｍ〜６７μｍがさらに好ましい。この場合、ビーム部の幅Ｗ２は、１０μｍ〜６０μｍが好ましく、２０μｍ〜４０μｍがより好ましい。
また、図５（ａ）に示すように、正方形の開口が正方行列状に配置されている場合、該正方形の４辺のうち、互いに対向する平行な２辺の間の距離Ｗ１１は、前記収容円の直径であってよく、３５μｍ〜８０μｍが好ましく、４４μｍ〜７１μｍがより好ましく、５３μｍ〜６２μｍがさらに好ましい。この場合、ビーム部の幅Ｗ２１は、１０μｍ〜６０μｍが好ましく、２０μｍ〜４０μｍがより好ましい。
【００３４】
（本体部分の厚さ）
フィルム状の本体部分の厚さは、特に限定はされないが、ビーム部を細い線状にする点から、１０μｍ〜６０μｍが好ましく、２０μｍ〜４０μｍがより好ましい。
【００３５】
（本体部分の材料）
フィルム状の本体部分の材料は、特に限定はされないが、金、銀、銅、鉄、亜鉛、白金、ニッケル、クロム、パラジウムなどの金属材料、または、これらの任意の材料の組み合わせからなる合金が挙げられ、好ましい合金としては、ステンレス鋼や真鍮などが例示される。
【００３６】
（多孔フィルムの製造方法）
多孔フィルムの製造方法は、特に限定はされず、樹脂成型、打ち抜き、ＬＩＧＡ（Lithographie Galvanoformung Abformung）など、材料に応じて適当な方法を選択すればよいが、開口形状およびビーム部の幅が微小である点からは、ＬＩＧＡを用いた製造方法として例示される。ＬＩＧＡを用いた製造方法では、例えば、リソグラフィーによって電鋳用の金型を作成し、電鋳槽内で電気化学反応を利用し、該金型の表面に多孔フィルムとなる金属メッキ層を形成し、該金属メッキ層を、該金型から剥離して多孔フィルムとして用いる。
図３（ｄ）、（ｅ）に示すような、ビーム部の断面形状の入口側の２つの角部が丸みを帯びた形状も、例えば、前記の金型の凹部の形状を隅部が丸みを帯びた形状とすることで得ることができる。
【００３７】
網状構造は、必要に応じて、２つ以上を直列的に配置して使用しても良い。例えば、次に説明するホルダー内に２つ以上の網状構造を重ねて配置してもよいし、１つの網状構造を収容したホルダーを２つ以上直列的に接続して使用しても良い。２つ以上用いる際の網状構造の仕様は、互いに異なっていても良いし、同一でもよい。
【００３８】
（網状構造を好ましく使用するためのホルダー）
本発明では、網状構造（メッシュまたは多孔フィルム）を好ましく使用するためのホルダーを提案する。該ホルダーに該網状構造をセットすることによって、好ましい分割器が構成される。該ホルダーは、分割すべき細胞塊が液体と共に網状構造を好ましく通過できるようにするだけでなく、細胞培養、細胞塊の分割、分割後の細胞塊の継代培養を、閉鎖系で連続的に行うことを可能にする。
【００３９】
図６は、前記ホルダーの構造の一例を示す断面図である。同図に示すように、ホルダー２４０は、網状構造２２を配置するための配置面２４１ｓをもったホルダー本体部２４１と、該配置面２４１ｓに配置される網状構造２２を覆って、該ホルダー本体部に着脱可能に固定されるキャップ部２４２とを有して構成される。図６の例では、網状構造（多孔フィルム）２２が、２枚のガスケット（シート状のシール部材）２４３と２４４の間に挟まれており、これによって、液体培地がホルダー外に漏洩しないようにシールされている。キャップ部２４２の内側の面は、網状構造２２をホルダー本体部２４１へと押さえ付けるための押さえ面２４２ｓとなっている。
【００４０】
ホルダー本体部２４１は、配置面２４１ｓに開口する第１貫通孔２４１ｐを有しており、キャップ部２４２は、押さえ面２４２ｓに開口する第２貫通孔２４２ｐを有している。これら第１貫通孔および第２貫通孔が分割用管路として機能する。図６に示すように、キャップ部２４２がホルダー本体部２４１に固定された状態では、第１貫通孔４１ｐの開口の中心と、第２貫通孔４２ｐの開口の中心は互いに一致する。多孔フィルム２２は、従来のメッシュとは異なり、表裏面がフラットであるから、液体培地を横方向に漏洩させることが無いように、容易にかつ好ましく気密に挟み込むことが可能である。
【００４１】
ガスケット２４３、２４４の外形は、網状構造の外形以上が好ましい。該ガスケット２４３、２４４の材料は、例えば、シリコンなど、生体に影響を与えることなく、好ましいシール性を有するものであればよい。
【００４２】
図６の例では、２枚のガスケットのそれぞれの中央には、第１貫通孔２４１ｐ、第２貫通孔２４２ｐと同じ断面形状である円形の貫通孔が設けられている。これらの貫通孔は、分割用管路に含まれる。図の例では、これらの貫通孔の内径は約１．６ｍｍであって、一線上に位置合わせされている。これにより、これらの貫通孔の断面形状にて、液体培地の流れが網状構造を通過する。網状構造を通過する際に、流れが変化すると、分割された細胞塊が流れによるせん断力をも受けてしまい、より小さくなってしまう可能性がある。よって、第１貫通孔２４１ｐ、第２貫通孔２４２ｐ、２枚のガスケットの各貫通孔の内径は、同一であることが好ましいが、悪影響を与えるような乱流を生じさせない範囲であれば、これらの貫通孔の内径は、互いに異なっていてもよい。
【００４３】
図６の例では、第１貫通孔２４１ｐ、第２貫通孔２４２ｐの管路の内径は一定であり、該管路の内径（Ｄ１）と、網状構造を通過する流れの有効径を決定するガスケットの貫通孔の内径（ｄ１）との比（Ｄ１／ｄ１）は、０．３３〜３程度が好ましく、０．５〜２がより好ましく、より１に近い方が好ましい。好ましい態様では、Ｄ１／ｄ１＝１である。各貫通孔の内径、ガスケットの外径、配置面２４１ｓの径などには、流路の中心軸線を一致させることなどを考慮して、適宜の許容寸法を与えてもよい。
【００４４】
図６の例では、ホルダー本体部２４１の胴体外周にはオネジ２４１ｔが設けられ、キャップ部２４２の胴体内側面にはメネジ２４２ｔが設けられ、これらのネジによってホルダー本体部２４１をキャップ部２４２の内部にねじ込んで固定し、網状構造２２を漏洩なきように挟み込んで押さえ付けるようになっている。ホルダー本体部２４１およびキャップ部２４２のそれぞれの胴体外周には、これらを回す力（または、保持する力）を作用させるためのローレットや六角ボルトのヘッド部などが設けられてもよい。
ホルダー本体部とキャップ部との着脱構造は、前記のねじ込む構造だけには限定されず、ワンタッチカップリングの構造や、ボルトとメネジを用いてキャップ部をホルダー本体部に締め付ける構造などであってもよい。
【００４５】
ホルダーの材料は、特に限定はされないが、ポリスチレンやポリプロピレン、ポリエチレンテレフタレート、ポリカーボネート、アクリル、シリコン、ポリビニリデンフロライドなどの有機高分子材料や、ステンレスなどの金属材料が挙げられる。安価に成形可能であり、かつ、オートクレーブやガンマ線に対する耐性の観点からは、ポリプロピレンやポリカーボネート、アクリルが好ましい材料として例示される。
【００４６】
ホルダー本体部２４１およびキャップ部２４２のそれぞれの管路２４１ｐ、２４２ｐ（断面形状は円形）の内径は特に限定はされず、当該細胞培養システムの規模や流量に応じて適宜決定してよく、０．５ｍｍ〜１５ｍｍ程度が汎用的でありかつ有用である。図６の例では、管路の内径は１．６ｍｍである。
また、これらの管路と外部の配管とを接続するため、ホルダー本体部およびキャップ部からは、それぞれ接続用のパイプ部２４１ｃ、２４２ｃが突き出している。これらパイプ部の胴体外面は、例えば、ホースニップル（「タケノコ継手」とも呼ばれる）の形状となっていてもよく、また、軟質チューブ等内に圧入して（または、軟質チューブ等を圧入して）接続し得るようになっていてもよい。また、公知のワンタッチ継手（クイックカップリング）のメス側やオス側などの公知のコネクターとの接続性を持った構造体、樹脂チューブ用のプッシュイン継手や締込み継手などであってもよい。
【００４７】
ホルダーの外形は特に限定はされない。図６の例では、ホルダーの全体的な外形（パイプ部を除く）は円柱状であって、直径は２０ｍｍである。また、全長は約２０〜２５ｍｍ程度である。これらの数値は一例であって、管路の内径やコネクターの構造などに応じて適宜決定してよい。
【００４８】
上記したようなホルダーを用いれば、網状構造に残存する（捕捉される）細胞のロスが無く、細胞塊が液体と共に網状構造を通過する際に乱流が発生し難く、層流に沿った移動によって細胞塊がより抵抗無く切断されるようになり、細胞へのダメージが減少し、分割後の細胞塊の生存率が改善され得る。
【００４９】
網状構造は、必要に応じて、２つ以上を直列的に配置して使用しても良い。例えば、１つのホルダー内に２つ以上の網状構造を重ねて配置してもよいし、２つ以上のホルダーを直列的に接続して使用しても良い。２つ以上用いる際の網状構造は、互いに異なっていても良いし、同一でもよい。
【００５０】
（細胞塊）
当該細胞培養システムによって培養される細胞塊（即ち、本発明の製造方法によって製造される細胞塊）を構成する細胞の種類としては、浮遊培養によって細胞塊（「スフェロイド」とも称される）を形成する細胞であれば特に限定はされず、いかなる細胞であってもよい。かかる細胞塊を構成する細胞は、動物または植物由来細胞であり得、特に動物細胞由来であることが好ましい。かかる細胞が由来する動物種としては、ラット、マウス、ウサギ、モルモット、リス、ハムスター、ハタネズミ、カモノハシ、イルカ、クジラ、イヌ、ネコ、ヤギ、ウシ、ウマ、ヒツジ、ブタ、ゾウ、コモンマーモセット、リスザル、アカゲザル、チンパンジーおよびヒトなどの哺乳動物由来細胞がより好ましい。また、細胞塊を構成する細胞は、培養細胞として株化されたものや生物組織から得られた初代細胞であってもよい。さらに、細胞塊を構成する細胞は、多能性幹細胞であってもよく、これには、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）、誘導多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）、間葉系幹細胞、神経幹細胞等が含まれる。また、細胞塊を構成する細胞は、分化細胞であってもよく、例えば、肝細胞、膵島細胞、腎細胞、神経細胞、角膜内皮細胞、軟骨細胞、心筋細胞等であり得る。さらに、細胞塊を構成する細胞は、臍帯血、骨髄、脂肪、血液由来組織性幹細胞から分化誘導される細胞であってもよく、あるいは腫瘍化した細胞、遺伝子工学的手法により形質転換された細胞やウイルスベクターにより感染された細胞であってもよい。本発明の一態様において、細胞塊を構成する細胞は、ヒト由来の多能性幹細胞が好ましく、とりわけ、ヒトｉＰＳ細胞であることが好ましい。なお、本明細書において、「浮遊培養」とは、細胞又は細胞塊（すなわち細胞が多数集合して形成された３次元構造（球状やぶどうの房状等）を有する細胞の塊）を、培養器に接着させない条件で培養することを意味する。
一態様において、本発明の細胞培養システムの第１の容器における細胞又は細胞塊の浮遊培養時の細胞播種密度は、所望の効果が得られる限り特に限定されないが、通常１×１０３〜１×１０７ｃｅｌｌｓ／ｍＬであり、好ましくは１×１０４〜１×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬ、より好ましくは５×１０４〜１×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬ、さらに好ましくは１×１０５〜１×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬ、よりさらに好ましくは１×１０５〜８×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬ、特に好ましくは、１．０×１０５〜３．０×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬであり得る。
【００５１】
（分割すべき細胞塊の大きさ）
分割すべき細胞塊の外径は、特に限定はされないが、細胞が多能性幹細胞や胚性幹細胞などであれば、５０μｍ〜３００μｍが好ましく、１００μｍ〜２００μｍがより好ましく、１２０μｍ〜１８０μｍがさらに好ましい。
細胞塊の外径は、顕微鏡（電子顕微鏡、光学顕微鏡を含む）によって得られる細胞塊像の面積を測定し、その面積と同じ面積を持った円の直径（円相当直径）を採用することができる。
前記の外径の細胞塊は、分割器によって分割されて、４０μｍ〜１２０μｍ程度、より好ましくは５０μｍ〜９０μｍ程度の外径となる。
分割された細胞塊の外径（円相当直径）は、分割器の網状構造の貫通孔の開口形状の円相当直径には必ずしも一致せず、開口形状の円相当直径よりも大きい場合や小さい場合がある。例えば、貫通孔を通過することで長い柱状に分断成形された細胞塊は、観察する角度によっては、開口形状の円相当直径よりも大きい円相当直径を有する場合がある。また、細胞塊が貫通孔内を完全に充填せず、貫通孔の内壁（ビーム部の壁面）との間に隙間を生じさせながら通過した小さい細胞塊は、観察する角度によっては、開口形状の円相当直径よりも小さい円相当直径を有する場合がある。
【００５２】
（液体培地）
前記の細胞培養に利用可能な液体培地は、特に限定はされないが、培養する細胞に適した培地であり、且つ、該細胞が浮遊した状態で培養される結果、細胞塊を形成し得る培地が含まれる。このような培地としては、細胞または細胞塊を該液体培地中に浮遊させるための微細な構造体が該液体培地中に含まれており、該微細な構造体が該液体培地中に分散し浮遊しているものが好ましく、例えばスフェア培養可能な培地や、特定の多糖類を含有する培地が挙げられ、細胞培養の効率性等の点から、特定の多糖類を含有する培地がより好ましい（詳細は、ＷＯ２０１４／０１７５１３を参照）。かかる培地に含有される多糖類としては、例えば、脱アシル化ジェランガム、ダイユータンガム、カラギーナン及びキサンタンガム、又はこれらの塩等が挙げられるが、脱アシル化ジェランガムが好ましい。かかる多糖類を公知の培地に添加することで、前記の細胞培養に利用可能な液体培地を容易に調製することができる。なお、使用することができる公知の培地としては、例えば、細胞が動物由来細胞である場合は、例えばダルベッコ改変イーグル培地（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅｓ’ｓ Ｍｅｄｉｕｍ；ＤＭＥＭ）、ハムＦ１２培地（Ｈａｍ’ｓ Ｎｕｔｒｉｅｎｔ Ｍｉｘｔｕｒｅ Ｆ１２）、ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地、マッコイ５Ａ培地（ＭｃＣｏｙ’ｓ ５Ａ ｍｅｄｉｕｍ）、イーグルＭＥＭ培地（Ｅａｇｌｅｓ’ｓ Ｍｉｎｉｍｕｍ Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｍｅｄｉｕｍ；ＥＭＥＭ）、αＭＥＭ培地（ａｌｐｈａ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅｓ’ｓ Ｍｉｎｉｍｕｍ Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｍｅｄｉｕｍ；αＭＥＭ）、ＭＥＭ培地（Ｍｉｎｉｍｕｍ Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｍｅｄｉｕｍ）、ＲＰＭＩ１６４０培地、イスコフ改変ダルベッコ培地（Ｉｓｃｏｖｅ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｅｄｉｕｍ；ＩＭＤＭ）、ＭＣＤＢ１３１培地、ウィリアム培地Ｅ、ＩＰＬ４１培地、Ｆｉｓｃｈｅｒ’s培地、ＳｔｅｍＰｒｏ３４（インビトロジェン社製）、Ｘ−ＶＩＶＯ １０（ケンブレックス社製）、Ｘ−ＶＩＶＯ １５（ケンブレックス社製）、ＨＰＧＭ（ケンブレックス社製）、ＳｔｅｍＳｐａｎ Ｈ３０００（ステムセルテクノロジー社製）、ＳｔｅｍＳｐａｎＳＦＥＭ（ステムセルテクノロジー社製）、ＳｔｅｍｌｉｎｅＩＩ（シグマアルドリッチ社製）、ＱＢＳＦ−６０（クオリティバイオロジカル社製）、ＳｔｅｍＰｒｏｈＥＳＣＳＦＭ（インビトロジェン社製）、Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ８（登録商標）培地（ギブコ社製）、Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ８（登録商標）Ｆｌｅｘ培地（サーモフィッシャー社製）、ＳｔｅｍＦｌｅｘ培地（サーモフィッシャー社製）、ｍＴｅＳＲ（登録商標）１或いは２或いはＰｌｕｓ培地（ステムセルテクノロジー社製）、リプロＦＦ或いはリプロＦＦ２（リプロセル社製）、ＰＳＧｒｏ ｈＥＳＣ／ｉＰＳＣ培地（システムバイオサイエンス社製）、ＮｕｔｒｉＳｔｅｍ（登録商標）培地（バイオロジカルインダストリーズ社製）、ＣＳＴＩ−７培地（細胞科学研究所社製）、ＭｅｓｅｎＰＲＯ ＲＳ培地（ギブコ社製）、ＭＦ−Ｍｅｄｉｕｍ（登録商標）間葉系幹細胞増殖培地（東洋紡株式会社製）、Ｓｆ−９００ＩＩ（インビトロジェン社製）、Ｏｐｔｉ−Ｐｒｏ（イン��トロジェン社製）、ＳｔｅｍＦｉｔ（登録商標）ＡＫ０２Ｎ或いはＢａｓｉｃ０２或いはＡＫ０３Ｎ或いはＢａｓｉｃ０３或いはＢａｓｉｃ０４培地（味の素ヘルシーサプライ株式会社製）、ＳＴＥＭＵＰ培地（日産化学株式会社製）などが挙げられる。ＦＣｅＭ（登録商標）培地（日産化学株式会社製）は、細胞凝集塊を均一分散できる多糖類が含有されているため、好適に使用できる。
【００５３】
液体培地中に細胞塊を浮遊させるための構造体（上記脱アシル化ジェランガムなど）が分散して浮遊している場合、そのような構造体が細胞塊と共に分割器を通過すると、該構造体の一部が崩壊し、細胞塊を浮遊状態で維持する性能が低下する。
【００５４】
（送液装置と配管）
当該細胞培養システムは、細胞塊が分散した液体培地を送るための送液装置Ｆ１と共に用いられる。送液装置Ｆ１は、当該細胞培養システムを構成する要素であってもよいし、当該細胞培養システムには属さないが当該細胞培養システムを作動させるときに使用される外部の装置であってもよい。送液装置Ｆ１の位置は、特に限定されず、例えば図１の構成では、管路Ｐ１上であっても、管路Ｐ２上であってもよい。
【００５５】
当該細胞培養システムに利用可能な送液装置は、特に限定はされないが、チューブポンプ（ローラーポンプとも呼ばれる）に代表される蠕動ポンプや、シリンジポンプが好ましいものとして挙げられ、とりわけ、閉鎖系の配管を容易に構成し得る点からは、蠕動ポンプが好ましい。また、各容器自体がシリンジのように内部の液体を送り出すことができる構造を有していてもよい。
【００５６】
蠕動ポンプは、弾性および柔軟性を持ったポンピングチューブを押しつぶす位置を、送り方向に移動させることで、セットされたポンピングチューブ内の液体を移動させるポンプである。蠕動ポンプを用いても、多数の細胞塊は潰されることなく、液体培地と共に好ましく送られる。蠕動ポンプの送り構造の詳細については、従来技術を参照することができる。蠕動ポンプを用いる場合、管路に用いられる配管用のチューブは、該蠕動ポンプに対してポンピングチューブとして装着され得、かつ、ポンピングチューブとして機能・作動し得る形状、柔軟性、弾性を持った部分を有することが好ましい。
配管用のコネクターやカップリングは、特に限定はされないが、無菌コネクターなど、無菌的に接続が可能なものコネクターを用いることが好ましい。
【００５７】
（分割器を洗浄するための構成）
本発明者らは、細胞塊の分割のために分割器を継続して用いた場合、該分割器内の網状構造におけるビーム部（または線材）に細胞塊の破片や培地に含まれる微細な構造体等の固形成分等が堆積し、その堆積に伴って分割器の有効面積（液体が通過し得る開口の面積の総和）が次第に低下し、その結果、細胞塊は高速の流れによるせん断を受け、それによってダメージを受けたものとなり、また小さい細胞塊へと分割されたものとなり、生存率が低下する場合があることがわかった。
よって、当該細胞培養システム中の分割器または網状構造は、細胞塊の破片等が堆積していないものと定期的に交換することが好ましい。
これに対して、本発明者らは、細胞塊を含んだ液体が所定の量だけ網状構造を通過する毎に、所定の液体（後述の、細胞塊を含んだ液体培地や洗浄専用の液体など）を逆流させることによって、網状構造のビーム部にまとわりついた細胞塊の破片等が除去され、網状構造の有効面積の低下が抑制されることを見出した。即ち、網状構造に対して分割時とは逆方向に所定の液体を通過させることにより、網状構造の有効面積の低下を抑制し得、結果として、分割される細胞塊に含まれる細胞の生存率の低下を抑制できることが分かった。以下、このような網状構造の有効面積の低下の抑制のために行う、所定の液体の逆流プロセスを、「網状構造の逆流洗浄」と呼ぶ。
【００５８】
網状構造の逆流洗浄を定期的に行うことによって、分割器や網状構造の交換回数が減少し、よって、閉鎖系を維持しながらも、網状構造の切断性の低下を抑制することができる。
【００５９】
当該細胞培養システムの好ましい態様では、網状構造の逆流洗浄が可能であるように（即ち、分割すべき細胞塊を含有する懸濁液が前記網状構造を通過する方向とは逆方向に、懸濁液又は洗浄用の液体が網状構造を通過するように）、該懸濁液又は洗浄用の液体を移動させるための逆方向送液機能または逆方向送液装置がさらに設けられる。
【００６０】
前記逆方向送液機能は、当該細胞培養システムに設けられる上記送液装置の逆流機能を利用したものであってもよく、また、該送液装置に逆流機能をさらに加えてもよい。該送液装置の逆流機能は、例えば、蠕動ポンプの逆回転、シリンジポンプの逆動作（押し出しに対する吸引）、柔軟な容器の押圧などであってよい。
また、網状構造の逆流洗浄を実施するための逆方向送液装置とその配管構成は特に限定はされない。例えば、図７における回収器に関する構成では、液体供給容器５１から新しい液体培地が、順に、管路Ｐ７、管路Ｐ６、回収器４０、管路Ｐ５、管路Ｐ８を流れ、回収容器５２内に達するように、切替弁Ｖ１、Ｖ２が操作される。この操作によって、新しい液体培地が、回収器４０を逆方向に通過する。このような逆流のための構成を網状構造の逆流洗浄にも適用し、切替弁や流体供給容器などを適宜追加し、網状構造の逆流洗浄を実施するための、液体を逆流させる構成を適宜に構築することができる。
前記の構成およびその作動によって、細胞塊を含んだ懸濁液や新たな液体培地が網状構造を逆方向に通過し、該網状構造のビーム部に絡みついた細胞塊等を該ビーム部から除去する。
【００６１】
（網状構造の逆流洗浄において逆流させるべき所定の液体）
網状構造の逆流洗浄において逆流させるべき「所定の液体」は、特に限定はされず、網状構造を継続して利用可能であるような液体が挙げられ、例えば、網状構造を通過した直後の液体（即ち、分割された細胞塊を含んだ液体培地（懸濁液））、細胞塊の分割時に用いた液体培地と同様の液体培地（細胞塊は含まれていない）、細胞塊の分割時に用いた液体培地から細胞塊および細胞を浮遊させるための微細な構造体を除去した液体、などが挙げられる。
【００６２】
（網状構造の逆流洗浄の態様例）
網状構造の逆流洗浄の態様は、特に限定はされないが、次のものが例示される。
（ｉ）分割すべき細胞塊を含んだ液体培地が網状構造を通過した後に流れを逆流させ、それにより、分割された細胞塊を含んだ液体培地が網状構造を逆方向に通過する態様。
（ｉｉ）分割すべき細胞塊を含んだ液体培地が網状構造を通過した後に、流路を切り替え、網状構造の下流側（出口側）に細胞塊等を含んでいない液体（液体培地など）を供給し、かつ、流れを逆流させ、それにより、細胞塊等を含んでいない液体培地が網状構造を逆方向に通過する態様。
（ｉｉｉ）分割すべき細胞塊を含んだ液体培地が網状構造を通過した直後に、それに続けて、細胞塊等を含んでいない液体培地を同じ方向に流し、その液体培地が網状構造を通過した後で流れを逆流させ、それにより、細胞塊等を含んでいない液体培地が網状構造を逆方向に通過する態様。
【００６３】
網状構造の逆流洗浄の頻度は、特に限定はされず、１回の分割ごとであってもよく、また、２以上の分割ごとであってもよく、網状構造の単位面積を通過した細胞塊の総数に応じて、また、（分割された細胞塊に含まれる細胞の生存率の低下抑制という利益と、網状構造の逆流洗浄の手間やシステムの増設による不利益）とを総合的に考慮して、適宜決定することができる。網状構造の単位面積をどれだけの数の細胞塊が通過すれば、網状構造の切断性がどれだけ低下するかは、事前の実験によって決定することができる。
【００６４】
網状構造の逆流洗浄を行う場合の前記所定の液体の流速や洗浄時間は、該液体の種類、該逆流洗浄の効果に応じて適宜決定することができる。流速は、特に限定はされないが、例えば、１０ｍｍ／秒〜５００ｍｍ／秒程度が例示され、なかでも、５０ｍｍ／秒〜３００ｍｍ／秒程度が好ましい範囲として挙げられる。該流速としては、液体（懸濁液）が分割器に入る流速（または分割器から出る流速）を採用することができる。該流速は、シリンジなどの送液ポンプを用いて所定量の溶液を所定の時間で一定の速さで押し出すまたは吸引する操作に基づいて得ることができる。また、液体が網状構造の網目を通過するときの流速は、前記送液ポンプによる流量を網目の開口面積の総和で除することで算出することができる。また、洗浄時間（逆流の時間）も、特に限定はされないが、該液体の流速が前記の範囲である場合には、０．１秒〜５秒程度が例示され、なかでも、０．３秒〜２秒程度が好ましい範囲として挙げられる。
【００６５】
（回収器）
当該細胞培養システムの好ましい態様では、分割と培養とによって所定の大きさに成長した細胞塊を回収するための回収器がさらに設けられる。図７は、図１に示した構成に回収器を加えた一例を示す図である。図７の例では、回収器４０は、第１の容器１０内で浮遊培養された細胞塊と液体培地を、外気に接触させずに受け入れるように、該第１の容器１０に管路Ｐ４を介して接続されている。第１の容器１０と管路Ｐ４との接続部分には、開閉弁が設けられることが好ましい。
【００６６】
図７に示すように、回収器４０は分離室４１を有し、該分離室は、液体培地と細胞塊とを分離するための分離用網状構造４２によって第１室４１ａと第２室４１ｂとに仕切られており、該回収器４０内に入った液体培地が、第１室４１ａから分離用網状構造４２を通過して第２室４１ｂへと移動して該回収器４０の外に出て行くように内部流路が構成されている。閉鎖系を保つためには、回収器４０の後段に、液体培地を受け入れるための廃液用容器５０が接続されることが好ましい。回収された細胞塊は、リン酸緩衝液（ＰＢＳ）や所望の培地で洗浄することが出来る。
【００６７】
（分離用網状構造）
分離用網状構造４２は、回収を意図する大きさの細胞塊が通過しないように（即ち、トラップされるように）予め定められた大きさの網の目を持っている。これにより、回収器内に液体培地と共に入った細胞塊のうち、回収を意図する大きさの細胞塊が、該分離用網状構造４２を通過できず、第１室４１ａに滞留する。よって、第１室４１ａに滞留した細胞塊を回収することができる。
【００６８】
分離用網状構造は、分割器の網状構造と同様、メッシュであっても、多孔フィルムであってもよいが、メッシュは、種々の線径の線材および種々の開口率を有する素材が安価で市販されており、また、丸線（断面形状が円形の線材）からなるメッシュであれば、細胞塊を切断せずに受け止める可能性が高くなるので好ましい。以下、メッシュについて説明するが、同様の構成を多孔フィルムによって達成してもよい。
分離用網状構造の貫通孔（網の目）の開口形状の円相当直径は、回収すべき細胞塊を構成する細胞の種類によっても異なるが、例えば、細胞が多能性幹細胞や胚性幹細胞などであれば、５μｍ〜１５０μｍ程度が挙げられ、より好ましくは１０μｍ〜１００μｍであり、さらに好ましくは２０μｍ〜８０μｍである。以下、細胞が多能性幹細胞や胚性幹細胞などの場合に対する、各部の好ましい寸法等を例示するが、それら以外の他の細胞についても、それぞれに適宜応じた寸法へと変更してよい。
線材の径は、１０μｍ〜１００μｍ程度が挙げられ、より好ましくは３０μｍ〜８０μｍである。
【００６９】
前記の円相当直径の規定だけでは、スリットのような細長い開口形状や迷路のように入り組んだ開口形状も含まれてしまい、小さい細胞塊も全てトラップされる。そこで、本発明では、前記の円相当直径の限定に加えて、該開口形状が、直径５μｍ〜１５０μｍの円（以下、収容円と呼ぶ）を収容し得る形状であることをも限定条件に加える。ここで、開口形状が収容円を収容し得るとは、収容円が開口形状に内接する場合や、収容円が開口形状と一致する場合をも含む。
収容円の直径は、５μｍ〜１５０μｍがより好ましく、１０μｍ〜１００μｍがさらに好ましい。開口形状が円形である場合は、収容円の直径＝円相当直径であり、それ以外の場合は、収容円の直径＜円相当直径である。
【００７０】
（網目の開口形状）
分離用網状構造の網の目の開口形状は、特に限定はされず、三角形、四角形、六角形、その他の多角形や異形などであってもよいが、一般的な安価で高品質なメッシュの開口形状として、正方形が挙げられる。この場合、縦横の線材は、図４（ａ）に示す分割器の網状構造の例のように、直交格子状となる。該正方形の開口の４辺のうち、互いに対向する平行な２辺の間の距離は、前記収容円の直径であってよく、５μｍ〜１５０μｍが好ましく、１０μｍ〜１００μｍがより好ましい。
【００７１】
回収器の分離用網状構造は、分割器の網状構造と同様の構造であるが、線材（ビーム部材）をより太くすることで、細胞塊の分断は抑制される。また、線材（ビーム部材）の太さが分割器の網状構造と同じであっても、分離用網状構造を通過する液体培地の流速を、分割器の網状構造を通過する液体培地の流速よりも遅くすることで、細胞塊の分断は抑制される。
分離用網状構造が配置される分離室の容積をより大きくし、流れの断面積を他の管路の断面積よりも大きくし、分離用網状構造の網の目の開口面積の総和を他の管路の断面積よりも大きくすることで、分離用網状構造を通過する液体培地の流速は遅くなり、細胞塊は分離用網状構造では分割されない。これにより、細胞塊は、分離用網状構造でトラップされ、第１室４１ａに滞留する。分離用網状構造の網の目の開口面積の総和は、他の管路の断面積の０．０１倍〜１０００倍程度が好ましく、０．１倍〜５００倍程度がより好ましい。例えば、他の管路（配管チューブ）の断面積が、１ｍｍ２〜５０ｍｍ２程度である場合、分離用網状構造の網の目の開口面積の総和は、０．０１ｍｍ２〜５００００ｍｍ２程度が好ましい。
【００７２】
図８は、回収器の好ましい構造の一例を示す図である。図８の例では、分離用網状構造４２の全体の形状が袋状（ネットで形成された袋の形態）であって、袋状の分離用網状構造４２の内部側が第１室４１ａである。回収器の分離室４１には、流入ポート４３と、排出ポート４４が設けられており、分離用網状構造４２は、流入ポート４３の内部開口を覆っている。即ち、流入ポート４３は、分離用網状構造４２の内部である第１室４１ａに開口している。一方、排出ポート４４は、分離用網状構造４２の外部である第２室４１ｂに開口している。図８の例とは逆に、液体培地が分離用網状構造４２の外部から内部へと流れるように用いられてもよいが、該分離用網状構造が変形し易い柔軟なものである場合には、該分離用網状構造が外部から内部への流れの圧力を受けて萎んでしまい、液体培地の流れが阻害される場合がある。よって、袋状の変形しやすい分離用網状構造を用いる場合には、図８に示すように、液体培地が袋状の分離用網状構造の内部から外部へと流れる態様が好ましい。袋状の分離用網状構造であっても、流れの圧力によって変形し難いものや補強部材が付与されたものであれば、流れの方向は限定されない。また、液体培地が袋状の分離用網状構造を流れる方向（内部から外部へ、または、外部から内部へ）は、細胞塊の数や流速、培地の粘度等を考慮して、最適な方を決定することが好ましい。
【００７３】
図９は、回収器の好ましい構造の他の例を示す図である。図９の例では、回収器の分離室４１は、全体的に円板状（円柱状）であり、分離用網状構造４２の全体の形状は平坦なシート状である。図８の例と同様に、回収器の分離室４１には、流入ポート４３と、排出ポート４４が設けられている。分離用網状構造４２は、回収器の分離室４１内を斜めに横切ることで、該分離室４１を第１室４１ａと第２室４１ｂに仕切っている。このような構成であれば、液体培地の流れは分離用網状構造４２に対して直角ではなく、斜めに当たるので、目詰まりが防止される効果が期待される。
【００７４】
図１０は、回収器の好ましい構造の他の例を示す図である。図１０に示す例では、分離用網状構造４２の全体の形状は平坦なシート状である。回収器の分離室４１の形状は特に限定はされない。図８の例と同様に、回収器の分離室４１には、細胞塊を含んだ液体培地（以下、懸濁液ともいう）Ｑ１が入ってくるための流入ポート４３と、細胞塊が除去された後の液体培地Ｑ２が出て行くための排出ポート４４が設けられている。分離用網状構造４２は、回収器の分離室４１内を斜めに横切ることで、該分離室４１を第１室４１ａと第２室４１ｂに仕切っている。ここで重要な特徴は、液体培地が分離用網状構造４２の網の目を通過するときの該液体培地の進行方向ｆが、鉛直上向きの方向成分ｆｖを有するように、分離室４１中に分離用網状構造４２が配置されていることである。図１０の例では、液体培地の進行方向ｆは、水平方向成分ｆｈをも有している。図１０の例では、分離用網状構造４２は、平坦なシート状のメッシュである。該分離用網状構造は、第２室４１ｂ側の面が傾斜面となるように、斜めに傾いて配置されており、よって、該分離用網状構造の第１室４１ａ側の面は、オーバーハング面となっている。分離用網状構造の第１室４１ａ側の面は、全面的にオーバーハング面となっていなくともよく、該分離用網状構造が湾曲や屈曲することで、局所的にオーバーハング面でない面が含まれていてもよい。また、流入ポート４３は、必ずしも分離室の最下部に設けられる必要はなく、流出ポート４４は、必ずしも分離室の最上部に設けられる必要はない。図１０の構成において、流入ポート４３が第１室４１ａの上部に設けられ、流出ポート４４が第２室４１ｂの下部に設けられる場合、流入ポート４３が流出ポート４４よりも高い位置に設けられる場合であっても、液体培地が分離用網状構造４２の網の目を通過するときの該液体培地の進行方向ｆは、鉛直上向きの方向成分ｆｖを有する。
以上の構成により、分離用網状構造４２の第１室４１ａ側の面にトラップされた細胞塊Ｅ１は、該分離用網状構造から剥がれ落ちて沈降する。よって、該分離用網状構造の網の目が細胞塊Ｅ１によって目詰まりすることが抑制され、液体培地は、効率よく分離用網状構造を通過することができる。
【００７５】
（分離用網状構造の配置姿勢）
図１０の例では、分離用網状構造は、網状の部分がシート状（即ち、薄い平板状）のメッシュであって、該分離用網状構造の第１室４１ａ側の面（下面）は、オーバーハング面となっており、水平面に対して仰角θだけ傾いている。このような構成であれば、分離室の形状によっても異なるが、分離用網状構造が分離室を斜めに横切るので、該分離用網状構造の面積（網の目が存在する面の面積）がより広くなる場合が多く、流量が多くても線流速を下げることが可能であるので好ましい。
一方、図１１の例では、分離用網状構造は、図１０の例と同様に、網状の部分がシート状のメッシュであるが、該分離用網状構造の第１室４１ａ側の面（下面）は、水平面（仰角θは０度）となっており、真下の方向を向いている（換言すると、液体培地が分離用網状構造４２の網の目を通過するときの該液体培地の進行方向ｆは、鉛直上向きの方向成分ｆｖだけを有する）。このような態様は、網の目にトラップされた細胞塊に作用する重力の全てが、分離用網状構造の下面に垂直に引き剥がす力として該細胞塊に作用するので、最も効果的に目詰まりを解消することができるので好ましい。
【００７６】
分離用網状構造の下面と水平面との間の角度（図１０の仰角θ）は、０度以上、９０度未満であればよいが、図１０の態様のように、分離用網状構造を斜めに配置しかつ液体培地を下方から第１室に流入させる場合には、分離用網状構造に付着した細胞塊が、該液体培地の流れにより剥がれやすくなるといった作用を期待し、細胞塊による目詰まりを抑制する観点からは、４５度≦θ＜９０度が仰角θの好ましい範囲である。上記したように、分離用網状構造の下面を水平面にする態様（仰角θ＝０度）と、分離用網状構造の下面を斜めのオーバーハング面とする態様とは、それぞれに利点があるので、用途や分離室の内部形状に応じて、好ましい態様を選択してもよい。
【００７７】
（分離用網状構造の形状）
図１２（ａ）に例示する態様では、袋の開口が下方を向くように分離用網状構造４２が配置されており、該袋の内部が第１室４１ａの一部または全部であり、該袋の外部が第２室４１ｂである。図１２（ａ）の例では、該袋の内部が第１室４１ａの全部であるが、該袋の位置が分離室内で上方へと移動すると、該袋の内部が第１室４１ａの一部となる。該袋の壁部は、互いに向かい合った内面が、互いに平行ではなく、前記開口から袋内を奥へと進むにつれて、該内面同士の間の距離が狭くなっていく。これによって、該袋の内面は、全て斜めのオーバーハング面または真下を向いた面となっている。
図１２（ｂ）に例示する態様では、袋の開口が上方を向くように分離用網状構造４２が配置されており、該袋の外部が第１室４１ａであり、該袋の内部が第２室４１ｂの一部または全部である。図１２（ｂ）の例では、該袋の内部が第２室４１ｂの全部であるが、該袋の位置が分離室内で下方へと移動すると、該袋の内部が第２室４１ｂの一部となる。該袋の壁部は、互いに向かい合った内面が、互いに平行ではなく、前記開口から袋内を奥へと進むにつれて、該内面同士の間の距離が狭くなっていく。これによって、該袋の外面は、全て斜めのオーバーハング面または真下を向いた面となっている。
【００７８】
（分離用網状構造を分離室内に配置するための構成）
分離用網状構造を分離室内に配置するための構成としては、特に限定はされないが、例えば、第１室と第２室とを別個の部品として用意し、これらによって分離用網状構造を挟み込んで固定する構成や、１つの分離室内に、接着しろを持った分離用網状構造を挿入に、該分離室の内壁に分離用網状構造を接着しろを利用して接着して固定し、該分離室を第１室と第２室とに分ける構成などが挙げられる。接着は、接着剤を用いた接着、部品自体同士の溶着などであってよい。
【００７９】
（第１室が、複数の入出ポートを有する態様）
当該回収器には、目的に応じて、第１室、第２室にそれぞれ複数のポートが設けられてもよい。
図１３に示す態様例では、第１室に３つのポート（第１の流入ポート４３１、第２の流入ポート４３２、および、流出ポート４３３）が設けられており、第２室には、流出ポート４４だけが設けられている。図１３に示す態様例では、分離室の外形が円板状（円柱状）であり、各ポート４３１、４３２、４３３、４４は、分離室の外周側面に角度９０度の間隔をおいた位置にある。
図１４に示す態様例も同様に、第１室に３つのポート（第１の流入ポート４３１、第２の流入ポート４３２、および、流出ポート４３３）が設けられており、第２室には、流出ポート４４だけが設けられている。図１４に示す態様例では、分離室の外形が直方体状（薄い板状）であり、各ポート４３１、４３２、４３３、４４は、分離室の外周側面の４面のうち、互いに対向する２面にそれぞれ２つ設けられている。
図１４（ｂ）に示す態様では、分離室は８つの頂点（Ｃ11、Ｃ12、Ｃ13、Ｃ14、Ｃ31、Ｃ32、Ｃ33、Ｃ34）を持った直方体状（薄い四角形の板を水平に寝かせたような形状）である。該分離室は、水平に配置された方形のシート状の分離用網状構造４２によって、下側の第１室４１ａと、上側の第２室４１ｂとに仕切られている。該分離用網状構造４２の４つの頂点は、Ｃ21、Ｃ22、Ｃ23、Ｃ24である。第１室における第１の流入ポート４３１および第２の流入ポート４３２は、側面（Ｃ22、Ｃ23、Ｃ33、Ｃ32）内に位置し、第１室における流出ポート４３３は、側面（Ｃ21、Ｃ24、Ｃ34、Ｃ31）内に位置する。また、第２室の流出ポート４４は、側面（Ｃ11、Ｃ14、Ｃ24、Ｃ21）内に位置する。
図１４（ｃ）に示す態様では、分離室は８つの頂点（Ｃ41、Ｃ42、Ｃ43、Ｃ44、Ｃ51、Ｃ52、Ｃ53、Ｃ54）を持った直方体状（薄い四角形の板を垂直に立てたような形状）である。該分離室は、斜めに配置された方形のシート状の分離用網状構造４２によって、下側の第１室４１ａと、その斜め上側の第２室４１ｂとに仕切られている。方形のシート状の分離用網状構造４２の４つの頂点は、Ｃ41、Ｃ52、Ｃ53、Ｃ44である。第１室における第１の流入ポート４３１および第２の流入ポート４３２は、側面（Ｃ41、Ｃ51、Ｃ52）内に位置し、第１室における流出ポート４３３は、側面（Ｃ44、Ｃ54、Ｃ53）内に位置する。また、第２室の流出ポート４４は、側面（Ｃ44、Ｃ53、Ｃ43）内に位置する。
図１３、図１４のいずれの態様でも、第１の流入ポート４３１は、懸濁液を外部から第１室に流入させるためのポートである。また、第２の流入ポート４３２は、試薬、および／または、懸濁液を希釈するための液体を、外部から第１室に流入させるためのポートである。また、第１室に設けられる流出ポート４３３は、一部の細胞塊を、第１室から外部に流出させるためのポートである。これらの試薬や液体は、液体培地の浮遊力を低下させ、細胞塊の分離及び／又は回収を容易ならしめるものであれば特に限定されない。かかる試薬としては、例えば、液体培地に脱アシル化ジェランガムといった特定の多糖類からなる構造体が含まれている場合に、該構造体から２価イオンを奪い、それにより該構造体を分解するように作用するキレート剤（例えば、ＥＤＴＡなど）が挙げられるが、これに限定されない。また、かかる懸濁液を希釈するための液体としては、例えば、細胞塊等を浮遊させるための微細な構造体（例、脱アシル化ジェランガム等）を含まない液体培地および緩衝液等が挙げられるが、これらに限定されない。
これらのポートによって、回収器において、液体培地の浮遊力を低下させて細胞塊を沈降させる処理が可能となる。
【００８０】
（第１室の流入ポートの位置）
図１５に示す態様例では、第２室４１ｂは、第１室４１ａの上に位置し、シート状の分離用網状構造４２が水平に配置されている。よって、分離用網状構造４２の網の目を通過するときの液体の進行方向ｆは、鉛直上向きの方向である。
図１５に示す態様例では、第１室は、懸濁液Ｑ１が外部から流入するための流入ポート４３を少なくとも有し、該流入ポート４３は、第１室４１ａの側壁に設けられている。これにより、分離室の底面は平坦になり、回収器を安定してベース面上に配置することができる。
また、好ましい態様として、流入ポート４３の中心軸線の高さｈ１は、第１室４１ａの室内の全高さＨ１の４０％以上の高さ、好ましくは６０％以上の高さに位置する。これによって、第１室内には、流入ポートの中心軸線の高さｈ１よりも下に、スペースが存在する。このスペースの存在と、側面に設けられた流入ポート４３から流入する懸濁液Ｑ１の流れとによって、第１室４１ａ内では、細胞塊が好ましく循環し、該細胞塊が分離用網状構造から剥がれ落ちながら、前記スペースに溜まることができる。該スペースに溜まった細胞塊は、新たに流入する懸濁液の障害にはならない。また、流入ポートは第１室の底面に設けられていないので、新たに流入する懸濁液が、該スペースの底に溜まった分離対象物を上方へと吹き上げることもない。よって、液体培地が分離用網状構造を好ましく通過する。流入ポート４３の中心軸線の高さｈ１の上限は、該流入ポート４３の開口の上端が分離用網状構造の下面に接触する位置である。即ち、開口の口径をｄとすると、流入ポート４３の中心軸線の高さｈ１の上限は、分離用網状構造の下面からｄ／２だけ下がった位置である。
【００８１】
第２室に設けられる流出ポートの位置は特に限定されないが、図１５に示す態様例のように、第２室の側面に設けられてもよい。図１５に示す態様例では、第１室に設けられた流入ポートと、第２室に設けられた流出ポートは、分離室の側面のうち、互いに反対側の面に設けられているが、互いに同じ側の面に設けられてもよい。流入ポートと流出ポートの位置は、配管作業やチューブが占める配管スペースを考慮して適宜決定することが好ましい。
【００８２】
（回収器の接続例）
上記したように、細胞塊は、回収器の第１室内に滞留して液体培地から分離され、液体培地だけが回収器を通過する。図７は、閉鎖系を維持しながらも、第１室内に滞留した細胞塊を回収容器５２に移動させるための好ましい配管接続例をも示している。同図の例では、第１の容器１０から細胞塊を回収器に通す際には、液体培地が、順に、管路Ｐ４、管路Ｐ５、管路Ｐ６、管路Ｐ７を流れ、廃液用容器５０内に達するように、切替弁Ｖ１、Ｖ２が操作される。この操作によって、回収器４０の第１室４１ａには細胞塊が滞留する。次に、第１室４１ａに滞留した細胞塊を外部に取り出すために、液体供給容器５１から新しい液体培地が、順に、管路Ｐ７、管路Ｐ６、回収器４０、管路Ｐ５、管路Ｐ８を流れ、回収容器５２内に達するように、切替弁Ｖ１、Ｖ２が操作される。この操作によって、新しい液体培地は、回収器４０を逆方向に（第２室４１ｂから第１室４１ａへ）通過し、それにより第１室４１ａに滞留していた細胞塊は、回収容器５２内へと移動し、好ましい態様として外気に露出することなく回収される。液体供給容器５１は、シリンジであってもよい。送液装置は適宜設けてよい。以上例示した配管例のように、第１室４１ａに滞留した細胞塊を液体培地によって移動させて細胞塊を回収する配管は、種々構成することができる。
【００８３】
当該細胞培養システムの管路には、細胞塊の状態を調べるために細胞塊や液体培地を抜き取るためのポートが適宜設けられてよい。また、液体培地の状態を監視するためのセンサー（例えば、乳酸濃度、グルコース濃度、ｐＨ、酸素濃度、二酸化炭素濃度などを測定するためのセンサー）が管路中の液体培地中に露出するよう設けられてもよく、光学的、電気的な測定装置が設けられてもよい。
【００８４】
（細胞塊の製造方法）
本発明による細胞塊の製造方法は、上記した本発明の細胞培養システムを用いて行われる。よって、当該製造方法では、図１に示すように、分割すべき細胞塊と液体培地を、供給源から当該細胞培養システムの分割器２０を通過させて、該細胞塊を分割する工程と、前記分割器２０で分割された細胞塊を液体培地と共に、好ましい態様として外気に接触させないように第１の容器１０内へと送り、該第１の容器内で浮遊培養する工程とが、好ましい態様として外気に接触させることなしに行われる。供給源Ｓ１から供給される細胞塊は、分割すべき大きさに成長した細胞塊であることが好ましい。
【００８５】
（細胞塊の培養条件）
本発明の細胞培養システムを用いて細胞塊を３次元培養するための条件は、細胞塊が成長する限り特に限定されず、培養する細胞に適した自体公知の培養条件を適宜用いることができる。例えば、ｈｉＰＳ細胞を用いる場合を例示する場合、温度条件は３０℃〜３９℃（例えば、３７℃）、ＣＯ２濃度は１％〜１０％（例えば、５％）とすることができる。また、第１の細胞塊の分割から第２の細胞塊の分割までの培養期間としては、１日間〜７日間（例えば、２日間、３日間、４日間、５日間、６日間）とすることができる。なお、一態様において、第１の分割を経て得られたより小さな細胞塊の培養開始後に、培地を追加することにより、細胞塊をより効率よく培養することができる。培地の追加のタイミングとしては、細胞塊の培養開始から１日目〜３日目、好ましくは１日目〜２日目、特に好ましくは１日目に、細胞塊を培養している培養液の容量に対して、１倍量〜５倍量、好ましくは２倍量〜４倍量、特に好ましくは２倍量〜３倍量の培地を追加することで、細胞塊を効率よく培養することが可能となる。また、別態様において、第１の細胞塊の分割から第２の細胞塊の分割までの培養期間中に、培地を２回以上追加することもできる。培地を２回追加する態様の一例としては、培養開始１日目の時点で、細胞塊を培養している培養液の容量に対して、１倍量〜５倍量（例えば、２倍量〜３倍量）を、１回目の追加培地として添加し、培養開始４日目の時点で、細胞塊を培養している培養液の容量に対して、０．１倍量〜２倍量（例えば、０．４倍量〜０．７倍量）を、２回目の追加培地として添加することができる。さらに、細胞塊を培養する培地中の乳酸濃度を測定し、乳酸濃度が特定の範囲に収まるようにすることによっても、細胞塊を効率よく培養することができる。そのような乳酸濃度としては、通常０ｍＭ〜２０ｍＭ、好ましくは０ｍＭ〜１８ｍＭ、特に好ましくは０ｍＭ〜１６ｍＭとすることができる。なお、培地中の乳酸濃度は、上述した通り、本発明の細胞培養システムに備えられたセンサー等を用いて測定すればよい。
【００８６】
（分割のための流速）
細胞塊が液体培地と共に分割器の網状構造を通過する際の、好ましく分割するための流速は、細胞の種類、細胞塊の大きさ、液体培地の粘性などによっても異なるが、概ね、１０ｍｍ／秒〜５００ｍｍ／秒、好ましくは５０ｍｍ／秒〜１５０ｍｍ／秒である。
前記の流速としては、液体（懸濁液）が分割器に入る流速（または分割器から出る流速）を採用することができる。該流速は、シリンジなどの送液ポンプを用いて所定量の溶液を所定の時間で一定の速さで押し出すまたは吸引する操作に基づいて得ることができる。また、液体が網状構造の網目を通過するときの流速は、前記送液ポンプによる流量を網目の開口面積の総和で除することで算出することができる。
【００８７】
（分割器を洗浄するための逆流洗浄工程）
当該製造方法の好ましい態様では、上記した網状構造の逆流洗浄を実施するための逆流洗浄工程がさらに加えられる。該逆流洗浄工程は、細胞塊を分割する工程において所定量の細胞塊が分割された後に、該細胞塊が分割のために分割器の網状構造を通過した方向とは逆方向に、上記した所定の液体（細胞塊を含有する懸濁液や洗浄用の液体など）が該網状構造を通過するようにし、それによって、該網状構造を洗浄する工程である。
【００８８】
逆流洗浄工程を実施する頻度、該懸濁液の逆流又は該洗浄用の液体を流すための構成、逆流洗浄工程で用いられる洗浄用の所定の液体、洗浄時の流速、洗浄時間は、本発明の細胞培養システムの説明において述べたとおりである。
【００８９】
（細胞塊の回収）
当該製造方法では、図７に示すように、当該細胞培養システムで分割され浮遊培養されて増殖した細胞塊を、回収器４０によって回収する。回収器では、分離用網状構造によって細胞塊と液体培地とが分離される。
図１６は、本発明による細胞培養システムを用いた、細胞培養と分割と回収のプロセスの好ましい一例を示すフローチャートである。各ステップ間における液体培地（細胞塊を含む）の移動は、いずれも閉鎖系の配管によって外気に触れることなく行われる。図１に示すように、例えば、供給源Ｓ１において、接着培養によって成長させたコロニーを足場から剥離した細胞塊（または、浮遊培養によって形成された細胞塊）を、分割器２０を通過させて分割する。次に、分割された細胞塊を用いて、第１の容器１０内で新たな液体培地に播種を行い、そこで浮遊培養を行い、細胞塊を成長させる。次に、成長した細胞塊を回収し、培地を交換し、もとの分割工程へと送り、または、次段の細胞培養システムの分割工程へと送り、それら分割器を通過させて分割する。このとき、全ての細胞塊を分割工程へと送るのではなく、所定の割合の細胞塊を収穫分として取り出してもよい。
【００９０】
（回収のための流速）
細胞塊を前記回収器で液体培地と分離するために、該回収器を通過する該液体培地の流速は、細胞の種類、網状構造の仕様、該液体培地の量、該液体培地の粘度などによっても異なるが、０．０１〜２５ｍｍ／秒が好ましく、０．１〜１５ｍｍ／秒がより好ましく、１〜１０ｍｍ／秒が特に好ましい。同じ細胞の種類で比較した場合、分割器の網状構造の個々の網の目を通過する液体培地の速度よりも、回収器の分離用網状構造の個々の網の目を通過する液体培地の速度の方が遅くなるように、流路の断面積または送液装置の送り量を設定することが好ましい。これによって、同じ網状の構造であっても、分割と回収に使用可能である。
前記の流速としては、液体（懸濁液）が回収器に入る流速（または回収器から出る流速）を採用することができる。該流速は、シリンジなどの送液ポンプを用いて所定量の溶液を所定の時間で一定の速さで押し出すまたは吸引する操作に基づいて得ることができる。また、液体が回収器の分離用網状構造の網目を通過するときの流速は、前記送液ポンプによる流量を網目の開口面積の総和で除することで算出することができる。
【実施例】
【００９１】
〔試験例１〕ヒト多能性幹細胞（ｈｉＰＳ細胞）の細胞塊の分割
ｈｉＰＳ細胞を浮遊培養して細胞塊を形成し、該細胞塊を、多孔フィルム、および、従来のメッシュを用いて分割し、それぞれの分割後の細胞塊の生存率を観察することで、多孔フィルムによる分割性能を確認する試験を行った。【００９２】
（分割前のｈｉＰＳ細胞の三次元培養）
培地１：
１０ｍＭ  Ｙ−２７６３２（富士フイルム和光純薬社製）を含有するｍＴｅＳＲ−１培地（Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）に対して、特許文献２に記載された混合方法に従い、０．０１６％（ｗ／ｖ）の脱アシル化ジェランガム（ＫＥＬＣＯＧＥＬ  ＣＧ−ＬＡ、三栄源エフ・エフ・アイ社製）を、ＦＣｅＭ−ｓｅｒｉｅｓ  Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（日産化学株式会社製）を用いて注入し調製してなる、液状の培地組成物。
培地２：
ｍＴｅＳＲ−１培地に対して、特許文献２に記載された混合方法に従い、０．０１６％（ｗ／ｖ）の脱アシル化ジェランガムを、ＦＣｅＭ−ｓｅｒｉｅｓ  Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  Ｋｉｔを用いて注入し、調製した、液状の培地組成物。
ｈｉＰＳ細胞株２５３Ｇ１（理化学研究所より分譲）を、１５ｍＬチューブ、培地１及び培地２を用いて、ＣＯ２インキュベーター（３７℃、５％ＣＯ２）内にて静置状態で培養した（分割前培養）。
分割前培養０日目に培地１にｈｉＰＳ細胞株２５３Ｇ１を播種し、１〜２日毎に培地２を添加して、５〜６日間これを継続し細胞塊を形成した。最終日に、遠心（１００×Ｇ、３分間）して細胞塊を沈降させ、上清を除去後、培地１で懸濁した後、培地と細胞塊とを多孔フィルムを通過させ、細胞塊を分割したものを培地１に播種した（分割後培養０日目）。【００９３】
（多孔フィルムの仕様）
以下の事例で用いた器具は、いずれも滅菌したものを使用した。
多孔フィルムの実施例品として、図１に示すタイプの多孔フィルムを製作した。
フィルム本体の材料は、ニッケルである。
下記表１のとおり、フィルム本体の厚さは、２０μｍまたは４０μｍである。
各貫通孔の開口の形状は互いに合同な正六角形であり、フィルム本体のフィルム面の全体に該貫通孔が配置されている。各貫通孔の孔径（開口の形状である正六角形の６辺のうち、互いに対向する平行な２辺の間の距離）は、下記表１のとおり、６０μｍまたは７０μｍである。
線径（ビーム部の幅）は、２０μｍまたは４０μｍである。
フィルム本体の外周形状は、円形であり、円の寸法（直径）は１３ｍｍである。【００９４】
（多孔フィルムを保持するホルダー）
図６に示すように、多孔フィルムをセットするためのホルダーを作製した。細胞塊が分散した液状の培地組成物を流すための管路（断面円形）の内径は、１．６ｍｍであり、多孔フィルムを通過する液状の培地組成物の流れの有効径も１．６ｍｍである。【００９５】
（メッシュを用いた分割）
分割器の網状構造の他の検討例として従来のメッシュを用いた。
上記多孔フィルムと同一の外形を有するナイロンメッシュ（ナイロン製の線材からなるメッシュ）とステンレスメッシュ（ステンレス鋼製の線材からなるメッシュ）を用意し、上記多孔フィルムの代わりに上記ホルダーに装着し、細胞塊の分割を行った。
ナイロンメッシュの貫通孔の開口形状は、略正方形であり、１辺の長さは７０μｍである。線材の径は、縦糸、横糸ともに、５０μｍである。
ステンレスメッシュの貫通孔の開口形状は、略正方形であり、１辺の長さは７０μｍである。線材の径は、縦糸、横糸ともに、４０μｍである。【００９６】
（ｈｉＰＳ細胞の細胞塊の分割）
５〜６日間の分割前浮遊培養後、遠心（１００×Ｇ，３分間）して細胞塊を沈降させ、上清を除去後、培地１で２．０×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように懸濁した。５ｍＬシリンジ（テルモ社製）に懸濁液を４ｍＬ移し、所定の通過速度で懸濁液を、多孔フィルムおよびメッシュに通過させた。【００９７】
（分割後の培養）
多孔フィルムおよびメッシュを通過させた後の懸濁液を、１５ｍＬチューブに播種し、ＣＯ２インキュベーター（３７℃、５％ＣＯ２）内にて静置状態で培養した（分割後培養）。なお、１５ｍＬチューブのキャップは半開状態とした。分割後培養２日目に予め３７℃に温めた培地２を２．５ｍＬずつ添加した。分割後培養４日目に予め３７℃に温めた培地２を３．５ｍＬずつ添加した。【００９８】
（細胞生存率）
分割の２時間後に、培養チューブをインキュベーターから取出し、細胞塊をよく分散させた後、培養液０．２５ｍＬを採取し、ＡＴＰ試薬０．２５ｍＬ（ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（登録商標）Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ Ｃｅｌｌ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ Ａｓｓａｙ、Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を添加し、ピペットマンで撹拌し、１０分間室温にて静置した後、白色９６ウェルプレートに１００μＬずつ分注し、Ｅｎｓｐｉｒｅ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ社製）にて発光強度（ＲＬＵ値）を測定し、培地のみの発光値を差し引くことで生細胞の数を測定した。
分割前の懸濁液のＲＬＵ値（ＡＴＰ測定、発光強度）を１００％としたときの相対値を細胞生存率とした。【００９９】
（細胞増殖率）
分割後培養５日目に、培養チューブをインキュベーターから取出し、細胞塊をよく分散させた後、培養液０．５ｍＬを採取し、ＡＴＰ試薬０．５ｍＬ（ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（登録商標）Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ Ｃｅｌｌ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ Ａｓｓａｙ、 Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を添加し、ピペットマンで撹拌し、１０分間室温にて静置した後、白色９６ウェルプレートに１００μＬずつ分注し、Ｅｎｓｐｉｒｅ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ社製）にて発光強度（ＲＬＵ値）を測定し、培地のみの発光値を差し引くことで生細胞の数を測定した。培養体積比を考慮した上で、分割２時間後の培養液のＲＬＵ値（ＡＴＰ測定、発光強度）との相対値を細胞増殖率とした。【０１００】
（分割後の細胞塊の大きさ及び個数）
分割２時間後に、培養チューブをインキュベーターから取出し、細胞塊をよく分散させた後、培養液１ｍＬを６ウェルプレートに移し、Ｃｅｌｌ３ｉＭａｇｅｒ（ＳＣＲＥＥＮホールディングス社製）にて細胞塊の大きさ、個数を計測した。なお、計測に用いた培養液はチューブには戻さなかった。計測結果から細胞塊の円相当直径、個数、円相当直径が１２０μｍ以上の細胞塊の割合を算出した。
以上の試験結果を、以下の表１に示す。【０１０１】
【表１】
2020032041.tif 000003
【０１０２】
上記表１からも明らかなとおり、１５ｃｍ／秒以下の処理速度領域において、メッシュよりも、多孔フィルムの方がより小さい細胞塊に分割でき、分割後の細胞塊の個数が多いことが明らかになった。
また、メッシュよりも多孔フィルムの方が１２０μｍ以上の細胞塊の割合を下げることができ、より均一な大きさの細胞塊に分割できることが明らかになった。【０１０３】
〔試験例２〕ヒト多能性幹細胞（ｈｉＰＳ細胞）の培養
（接着維持培養）
ｈｉＰＳ細胞株２５３Ｇ１（理化学研究所より分譲）はビトロネクチンＶＴＮ−Ｎ（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製、＃Ａ１４７００）をコートした６ｃｍ培養ディッシュ上に５．０×１０４ｃｅｌｌｓ〜５．０×１０５ｃｅｌｌｓの細胞を播種し、ｍＴｅＳＲ１（登録商標）培地（ステムセルテクノロジーズ社製、＃ＳＴ−０５８５０）を用いて培養を行った。播種後２４時間は１０μＭ  Ｙ−２７６３２（富士フィルム和光純薬社製、＃０３０−２４０２１）を含有するｍＴｅＳＲ１培地にて培養し、その後、１０μＭ  Ｙ−２７６３２を含有しないｍＴｅＳＲ１培地に毎日培地交換を行った。播種３〜４日後に０．５ｍＭ  ＥＤＴＡ含有ＰＢＳ溶液を用いて細胞を剥離することで継代維持した。【０１０４】
（浮遊維持培養）
・培地１：１０μＭ  Ｙ−２７６３２を含有するｍＴｅＳＲ１培地に、特許文献１（ＷＯ２０１６／１６３４４４）の方法に従い、０．０１６％（ｗ／ｖ）の脱アシル化ジェランガム（ＫＥＬＣＯＧＥＬ  ＣＧ−ＬＡ、三栄源エフ・エフ・アイ社製）をＦＣｅＭ−ｓｅｒｉｅｓ  Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（日産化学社製）を用いて調製した組成物
・培地２：ｍＴｅＳＲ１培地に、特許文献１の方法に従い、０．０１６％（ｗ／ｖ）の脱アシル化ジェランガムをＦＣｅＭ−ｓｅｒｉｅｓ  Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  Ｋｉｔを用いて調製した組成物【０１０５】
三次元培養を行うため、播種に用いるｈｉＰＳ細胞株２５３Ｇ１を、Ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ  ｆｏｒ  ｈｕｍａｎ  ＥＳ／ｉＰＳ  Ｃｅｌｌｓ（リプロセル社製、＃ＲＣＨＥＴＰ００２）を用いてコロニー状態に剥離した。剥離した細胞を培地１で懸濁後、多孔フィルム（開口形状は正六角形、孔径（平行な２辺の間の距離）６０μｍ、線径（ビーム幅）２０μｍ、通過速度５ｃｍ／秒）を用いて分割することで細胞塊を作製し、１．０×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬ〜２．０×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬの細胞濃度で播種し、ＣＯ２インキュベーター（３７℃、５％ＣＯ２）内にて静置状態で三次元培養した。培養０日目に培地１で播種し、１〜２日毎に培地２を添加して、５〜７日間これを継続し培養を行った。形成した細胞塊は３０μｍのメッシュ（ミルテニーバイオテック社製、＃１３０−１１０−９１５）を用いて回収し、培地１に懸濁後、多孔フィルム（開口形状は正六角形、孔径（平行な２辺の間の距離）６０μｍ、線径（ビーム幅）２０μｍ、通過速度５ｃｍ／秒）を用いて細胞塊を分割すること継代維持した。【０１０６】
〔試験例３〕ヒト多能性幹細胞（ｈｉＰＳ細胞）の三次元培養条件の検討
試験例２の方法で作製し、三次元培養で１継代以上培養した５日目のｈｉＰＳ細胞株２５３Ｇ１の細胞塊を計数し、０．３×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬまたは０．６×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬまたは１．２×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬに細胞濃度を調整した後、多孔フィルム（開口形状は正六角形、孔径（平行な２辺の間の距離）６０μｍ、線径（ビーム幅）２０μｍ、通過速度５ｃｍ／秒）を用いて分割し、１５ｍＬチューブ（ファルコン社製、型番３５２０９５）に播種し、フタを密閉しない状態でＣＯ２インキュベーター（３７℃、５％ＣＯ２）内にて静置状態で三次元培養した。培養０日目に培地１で播種し、１日目以降は各種条件で培地２を添加することで４〜６日間培養を行った。また、細胞を培養しない条件で同様の操作を実施した条件を陰性対照とした。【０１０７】
条件１：培地添加なし
条件２：細胞培養液に対して等量の新鮮な培地２を１日目に添加
条件３：細胞培養液に対して等量の新鮮な培地２を２日目に添加
条件４：細胞培養液に対して等量の新鮮な培地２を１及び３日目に添加
条件５：細胞培養液に対して２倍量の新鮮な培地２を１日目に添加
条件６：細胞培養液に対して３倍量の新鮮な培地２を１日目に添加【０１０８】
（細胞塊の大きさの推移）
培養チューブをインキュベーターから取出し、細胞塊をよく分散させた後、培養液の一部を１２ウェルプレートに移し、ＤＭＥＭ／Ｈａｍ’ｓ  Ｆ−１２（富士フイルム和光純薬社製、＃０４８−２９７８５）で希釈後、Ｃｅｌｌ３ｉＭａｇｅｒｄｕｏｓ（ＳＣＲＥＥＮホールディングス社製）にて直径５０μｍ以上の細胞塊の大きさを計測し、平均直径を算出した。
細胞塊の大きさの測定では、細胞塊の円相当直径を計測し、その平均値を平均径とした。細胞塊の平均径が１００μｍ未満を△、１００μｍ以上１２０μｍ未満を○、１２０μｍ以上を◎とした。また、試験を実施していない条件は−と記載した。【０１０９】
【表２】
2020032041.tif 000004
【０１１０】
（培地環境測定）
培養チューブをインキュベーターから取出し、細胞塊をよく分散させた後、培養液０．１ｍＬを採取しＶｉ−ＣＥＬＬ  ＭｅｔａＦＬＥＸ（ベックマン・コールター社製）を用いて培地中の乳酸濃度（ｍＭ）を測定した。乳酸は、細胞代謝の副産物であり、細胞にとって有毒である場合もある。従って、培養液中の乳酸の濃度をモニタリングすることで最適な培地添加の量や継代時期を決定することが可能になる。また、試験を実施していない条件は−と記載した。【０１１１】
【表３】
2020032041.tif 000005
【０１１２】
本試験の結果、播種後に培地を添加しない条件及び２日目に培養液と等量の培地を添加する条件では細胞塊は４日間で１２０μｍ以上に成長しなかった。一方、培養１日目及び培養１、３日目に培養液と等量の培地を添加する条件では細胞濃度０．３×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬ条件のみ細胞塊は４日間で１２０μｍ以上に成長した。さらに、培養１日目に培養液に対して３倍量の培地を添加する条件ではいずれの細胞濃度条件においても細胞塊は４日間で１２０μｍ以上に成長した。以上の結果から、培養１日目に培養液に対して３倍量の培地を添加することでいずれの細胞濃度でも細胞塊を効率よく培養可能であることが明らかとなった。また、培地環境測定結果から、乳酸濃度は０〜１５．７ｍＭで培養可能であり、０〜１４．０ｍＭで効率よく培養できることが示唆された。【０１１３】
〔試験例４〕ヒト多能性幹細胞（ｈｉＰＳ細胞）塊の回収条件の検討
試験例２の方法により、三次元培養で１継代以上培養した７日目のｈｉＰＳ細胞株２５３Ｇ１の細胞培養液を使用した。分離用網状構造として、線材径５０μｍ、孔径（正方形の一辺の長さ）１５μｍ、３６μｍ、５０μｍ、７０μｍのナイロンメッシュをフィルターホルダー（メルク社製、＃ＳＸ０００１３００、有効面積０．７ｃｍ２）に取り付け、細胞培養液を種々の流速で流すことで細胞塊をメッシュ上にトラップさせた。
ここで、有効面積とは、細胞塊の分離に寄与するメッシュの面積、即ち、実際に培養液が通過可能でありかつ細胞塊がトラップされ得る領域の面積（開口の面積と線材が占める面積との総和）である。【０１１４】
（細胞塊個数及び平均径の測定）
細胞塊をよく分散させた後、試験で使用した培養液の一部を１２ウェルプレートに移し、Ｃｅｌｌ３ｉＭａｇｅｒｄｕｏｓを用いて、培養液中の直径５０μｍ以上の細胞塊の個数及び大きさを計測した。細胞塊の大きさの測定では、細胞塊の円相当直径を計測し、その平均値を平均径とした。その結果、細胞塊は７００個／ｍＬの濃度で平均径は１４５．８μｍであった。【０１１５】
（メッシュ通過細胞の算出）
培養液、ろ液を０．５ｍＬ採取し、各々にＡＴＰ試薬０．５ｍＬ（ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（登録商標）Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ Ｃｅｌｌ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ Ａｓｓａｙ, Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を添加し、ピペットマンで撹拌し、１０分間室温にて静置した後、白色９６ウェルプレートに２００μＬずつ分注し、Ｅｎｓｐｉｒｅ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ社製）にて発光強度（ＲＬＵ値）を測定し、培地のみの発光値を差し引くことでメッシュを通過したろ液中の生細胞数を測定した。培養液のＲＬＵ値（ＡＴＰ測定、発光強度）を１００％としたときのろ液の相対値をメッシュ通過細胞とした。試験結果を表４に示す。【０１１６】
【表４】
2020032041.tif 000006
【０１１７】
表４のとおり、０．１ｃｍ／秒の通過速度で細胞塊の回収を実施した場合、孔径（正方形の一辺の長さ）７０μｍのメッシュでは孔径３６μｍ及び５０μｍのメッシュと比較してろ液へ８倍以上の細胞が流出することが明らかとなった。一方、孔径１５μｍのメッシュを用いた場合、孔径３６μｍ及び５０μｍのメッシュと比較してろ液へ約１．７〜１．９倍程度の細胞が流出することが明らかとなった。以上の結果から、０．１ｃｍ／秒の通過速度で細胞塊を回収する場合は孔径３６μｍ及び５０μｍのメッシュを用いることで効率よく細胞を回収できることが示唆された。【０１１８】
また、線材径５０μｍ、孔径（正方形の一辺の長さ）５０μｍのメッシュを用い、通過速度を変更して、メッシュを通過する細胞塊の割合を調べた。試験結果を表５に示す。【０１１９】
【表５】
2020032041.tif 000007
【０１２０】
表５のとおり、孔径５０μｍのメッシュを用いて細胞塊の回収を実施した場合、通過速度０．１ｃｍ／秒で効率よく細胞塊を回収できることが示唆された。【０１２１】
また、線材径５０μｍ、孔径（正方形の一辺の長さ）５０μｍのメッシュを用い、通過速度を０．１ｃｍ／秒とし、単位面積当たりの細胞塊（（総細胞塊数）/（フィルター有効面積））の数を変更して、メッシュを通過する細胞塊の割合を調べた。試験結果を表６に示す。【０１２２】
【表６】
2020032041.tif 000008
【０１２３】
表６のとおり、孔径５０μｍのメッシュを用いて通過速度０．１ｃｍ／秒で細胞塊の回収を実施した場合、単位面積当たり１２０００個の細胞塊を回収すると約４割の細胞がろ液へ流出することが明らかとなった。一方、単位面積当たり６０００個以下であれば効率よく細胞塊を回収できることが示唆された。【０１２４】
〔試験例５〕ヒト多能性幹細胞（ｈｉＰＳ細胞）の細胞塊の回収
試験例２の方法により、三次元培養で１継代以上培養した５〜６日目のｈｉＰＳ細胞株２５３Ｇ１の細胞培養液を、メッシュ孔径、有効面積、形状が異なる各種条件の回収用メッシュ容器に１ｍＬ／ｓｅｃの速度で通過させ、細胞塊をメッシュにトラップさせた。その後、試験例２に記載の新鮮な培地２を逆流させることで細胞塊を回収した。【０１２５】
（回収器の仕様）
条件７〜９では、図８に示す袋形のメッシュが内部に配置された回収器を使用した。条件７ではメッシュ孔径２１μm、有効面積は約１．５ｃｍ２のものを使用した。
回収器の有効面積とは、細胞塊の回収に寄与するメッシュの面積、即ち、実際に培養液が通過可能でありかつ細胞塊がトラップされ得る領域の面積（開口の面積と線材が占める面積との総和）である。
条件８ではメッシュ孔径４０μm、有効面積は約１．５ｃｍ２のものを使用した。条件９ではメッシュ孔径３０μｍ、有効面積は約１６ｃｍ２のものを使用した。トラップ時の流れ方向に対して、回収時の流れ方向を逆にすることによって、トラップされた細胞塊を回収容器へと移動させた。【０１２６】
条件１０では、図９に示す円板形のメッシュが内部に配置された回収器を使用した。メッシュの孔径は７０μｍで、有効面積は約１２ｃｍ２であった。トラップ時の流れ方向に対して、回収時の流れ方向を逆にすることによって、トラップされた細胞塊を回収容器へと移動させた。【０１２７】
（細胞塊個数及び平均径の測定）
細胞塊をよく分散させた後、試験で使用した培養液の一部を１２ウェルプレートに移し、Ｃｅｌｌ３ｉＭａｇｅｒｄｕｏｓを用いて、培養液中の直径５０μｍ以上の細胞塊の個数及び大きさを計測した。細胞塊の大きさの測定では、細胞塊の円相当直径を計測し、その平均値を平均径とした。【０１２８】
（回収率の算出）
培養液及び回収液０．５ｍＬを採取し、各々にＡＴＰ試薬０．５ｍＬ（ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（登録商標）Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ Ｃｅｌｌ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ Ａｓｓａｙ, Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を添加し、ピペットマンで撹拌し、１０分間室温にて静置した後、白色９６ウェルプレートに２００μＬずつ分注し、Ｅｎｓｐｉｒｅ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ社製）にて発光強度（ＲＬＵ値）を測定し、培地のみの発光値を差し引くことで生細胞の数を測定した。培養液のＲＬＵ値（ＡＴＰ測定、発光強度）を１００％としたときの回収液の相対値を回収率とした。
回収率の結果を表７に示す。【０１２９】
【表７】
2020032041.tif 000009
【０１３０】
表７のとおり、図８の形状を有する回収器を用いて細胞塊の回収を実施した場合、条件７及び条件８で示すように同一の有効面積であればメッシュ孔径が小さい方が効率よく細胞塊を回収できることが明らかとなった。一方、図９の形状を有する回収器を用いて細胞塊の回収を実施した場合、条件１０では条件９と比較してメッシュ孔径が大きいにも関わらず、効率よく細胞塊を回収できることが明らかとなった。以上の結果から、効率よく細胞を回収するためには、メッシュ孔径の大きさに加えて、回収器の形状を工夫する必要があることが示唆された。【０１３１】
〔試験例６〕網状構造の逆流洗浄の効果の確認
本試験例では、次の（ｉ）〜（ｉｉｉ）の操作を繰り返すことによって、網状構造に対する逆流洗浄の効果を調べた。
（ｉ）所定の密度の細胞塊を含んだ試料液を用い、かつ、所定の流速にて、分割器の網状構造による細胞塊の分割を行う。
（ｉｉ）所定量の細胞塊が通過する度に、通過した細胞塊の生存率を測定する。
（ｉｉｉ）前記（ｉｉ）における所定量の細胞塊の通過の度に、網状構造に対する逆流洗浄を行う。
試験に用いた細胞塊は、ヒト多能性幹細胞（ｈｉＰＳ細胞）からなる細胞塊である。【０１３２】
（分割前のｈｉＰＳ細胞の三次元培養）
培地１：
１０μＭ  Ｙ−２７６３２（富士フイルム和光純薬社製）を含有するｍＴｅＳＲ１培地（Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）に対して、特許文献２に記載された混合方法に従い、０．０１６％（ｗ／ｖ）の脱アシル化ジェランガム（ＫＥＬＣＯＧＥＬ  ＣＧ−ＬＡ、三栄源エフ・エフ・アイ社製）を、ＦＣｅＭ−ｓｅｒｉｅｓ  Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（日産化学株式会社製）を用いて注入し調製してなる、液状の培地組成物。
培地２：
ｍＴｅＳＲ１培地に対して、特許文献２に記載された混合方法に従い、０．０１６％（ｗ／ｖ）の脱アシル化ジェランガムを、ＦＣｅＭ−ｓｅｒｉｅｓ  Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  Ｋｉｔを用いて注入し、調製した、液状の培地組成物。【０１３３】
ｈｉＰＳ細胞株２５３Ｇ１（理化学研究所より分譲）を、容量可変２００ｍＬ培養バック（ニプロ社製）、培地１及び培地２を用いて、ＣＯ２インキュベーター（３７℃、５％ＣＯ２）内にて静置状態で維持培養した。
培養０日目に培地１で播種し、１〜３日毎に培地２を添加して、６〜８日間これを継続し細胞塊を形成した。
最終日に、ＭＡＣＳ（登録商標）ＳｍａｒｔＳｔｒａｉｎｅｒｓ（７０μｍ、ＭＡＣＳ社製）を用いて細胞塊を回収し、培地１で懸濁した後、本発明のデバイスに準じたものを通過させ、細胞塊を分割したものを播種した（０日目）。
これを繰り返して、細胞の維持培養を行った。【０１３４】
（分割器の仕様）
本試験で用いた各部の器具には、電子線滅菌したものを使用した。
網状構造の実施例品としては、図３に示すタイプの多孔フィルムを製作した。
該多孔フィルムの材料はニッケルであり、多孔フィルムの厚さは２０μｍであり、ビーム部の幅は２０μｍである。各貫通孔の孔径（開口の形状である正六角形の６辺のうち、互いに対向する平行な２辺の間の距離）は７０μｍである。特記した事項以外については、試験例１で用いた多孔フィルムと同様である。
多孔フィルムの外周形状は円形であり、円の直径は６ｍｍである。【０１３５】
（網状構造を保持するホルダー）
図６に示すように、網状構造をセットするためのホルダーを作製した。該ホルダーに網状構造をセットすることにより分割器となる。細胞塊が分散した液状の培地組成物を流すための管路（断面円形）の内径は、２．６ｍｍであり、当該デバイスを通過する液状の培地組成物の流れの有効径も２．６ｍｍである。【０１３６】
（ｈｉＰＳ細胞の細胞塊の分割）
７日間の浮遊培養後、ＭＡＣＳ（登録商標）ＳｍａｒｔＳｔｒａｉｎｅｒｓ（７０μｍ、ＭＡＣＳ社製）を用いて細胞塊を回収し、培地１に混合して懸濁し、濃度の異なる２種類の懸濁液（３．０×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬ、および、６．０×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬ）を作製した。
（ｉ）網状構造の逆流洗浄を行わずに分割を継続した試験例
２つの５０ｍＬシリンジ（ニプロ社製）に前記２種類の懸濁液をそれぞれ５０ｍＬ移し、各懸濁液を、１０ｃｍ／ｓｅｃの速度で前記分割器を通過させ、１０ｍＬの懸濁液が分割器を通過する毎に１５ｍＬチューブに分配し、濃度３．０×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬの懸濁液の分割後試料を収容したチューブ５本と、６．０×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬの懸濁液の分割後試料を収容したチューブ５本を得た。
（ｉｉ）定期的な網状構造の逆流洗浄を行いながら、分割を継続した試験例
２つの５０ｍＬシリンジ（ニプロ社製）に前記２種類の懸濁液をそれぞれ５０ｍＬ移し、各懸濁液を、１０ｃｍ／ｓｅｃの速度で前記分割器を通過させ、１０ｍＬの懸濁液が分割器を通過する毎に、１５ｍＬチューブに分配し、かつ、チューブへの分配後にシリンジを操作して、該懸濁液を１ｍＬだけ１００ｍｍ／秒の流速で逆流させて網状構造の逆流洗浄を行い、その後、１０ｍＬの懸濁液を再度流して分割し、別の１５ｍＬチューブに分配するという操作を繰り返した。これにより、前記（ｉ）と同様に、濃度３．０×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬの懸濁液の分割後試料を収容したチューブ５本と、６．０×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬの懸濁液の分割後試料を収容したチューブ５本を得た。
分配後の１５ｍＬチューブ（４種類、計２０本）を、インキュベーター（３７℃、５％ＣＯ２）にて２時間静置した。【０１３７】
（細胞生存率の測定）
２時間の静置後に、前記の１５ｍＬチューブをインキュベーターから取出し、転倒混和により細胞塊をよく分散させた後、培養液０．７５ｍＬを採取し、ＡＴＰ試薬０．７５ｍＬ（ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（登録商標）Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ Ｃｅｌｌ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ Ａｓｓａｙ, Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を添加し、ピペットマンでよく撹拌し、１０分間室温にて静置した後、白色９６ウェルプレートに１００μＬずつ分注し、Ｅｎｓｐｉｒｅ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ社製）にて発光強度（ＲＬＵ値）を測定し、培地のみの発光値を差し引くことで生細胞の数を測定した。
分割前の懸濁液のＲＬＵ値（ＡＴＰ測定、発光強度）を１００％としたときの相対値を細胞生存率とした。該細胞生存率を、図１７のグラフに示す。【０１３８】
（網状構造の逆流洗浄の効果の評価）
図１７（ａ）、（ｂ）のグラフは、上記（ｉ）の網状構造の逆流洗浄を行わずに分割を継続した試験例の結果を示している。図１７（ａ）のグラフは、細胞濃度３．０×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬの懸濁液に関する結果を示し、図１７（ｂ）のグラフは、細胞濃度６．０×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬの懸濁液に関する結果を示している。
図１７（ｃ）、（ｄ）のグラフは、上記（ｉｉ）の網状構造の逆流洗浄を行いながら分割を継続した試験例の結果を示している。図１７（ｃ）のグラフは、細胞濃度３．０×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬの懸濁液に関する結果を示し、図１７（ｄ）のグラフは、細胞濃度６．０×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬの懸濁液に関する結果を示している。
図１７（ａ）、（ｂ）のグラフに示すように、網状構造の逆流洗浄を行なわない場合、どちらの細胞密度においても分割処理の量が多くなるにつれて細胞生存率が低下している。これに対して、図１７（ｃ）、（ｄ）のグラフに示すように、網状構造の逆流洗浄を行なった場合、３×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬの細胞密度では、細胞生存率の低下が十分に抑制されており、また、６×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬの細胞密度でも、図１７（ｂ）のグラフに示す結果に比べて、細胞生存率の低下が抑制されている。
以上より、網状構造を用いた細胞塊の分割において、該網状構造の定期的な逆流洗浄を行うと、分割後の細胞塊の生存率の低下の抑制に非常に有効であることが明らかとなった。また、細胞密度がより高い場合には、より多くの細胞塊が網状構造を通過するので、網状構造の逆流洗浄の頻度をより高くすることで（即ち、所定数の細胞塊が網状構造の単位面積を通過した時点で）、細胞生存率の低下を抑制できるものと考えられる。【０１３９】
〔試験例７〕ヒト多能性幹細胞（ｈｉＰＳ細胞）の細胞塊の分割
ｈｉＰＳ細胞を浮遊培養して細胞塊を形成し、該細胞塊を、上記網状構造を用いて分割し、容量毎のそれぞれの分割後の細胞塊の生存率を観察することで、該網状構造による分割性能及び分割プロセスを確認する試験を行った。【０１４０】
（分割前のｈｉＰＳ細胞の三次元培養）
培地１：
１０μＭ  Ｙ−２７６３２（富士フイルム和光純薬社製）を含有するｍＴｅＳＲ１培地（Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）に対して、特許文献２に記載された混合方法に従い、０．０１６％（ｗ／ｖ）の脱アシル化ジェランガム（ＫＥＬＣＯＧＥＬ  ＣＧ−ＬＡ、三栄源エフ・エフ・アイ社製）を、ＦＣｅＭ−ｓｅｒｉｅｓ  Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（日産化学株式会社製）を用いて注入し調製してなる、液状の培地組成物。
培地２：
ｍＴｅＳＲ１培地に対して、特許文献２に記載された混合方法に従い、０．０１６％（ｗ／ｖ）の脱アシル化ジェランガムを、ＦＣｅＭ−ｓｅｒｉｅｓ  Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  Ｋｉｔを用いて注入し、調製した、液状の培地組成物。
ｈｉＰＳ細胞株２５３Ｇ１（理化学研究所より分譲）を、容量可変２００ｍＬ培養バック（ニプロ社製）、培地１及び培地２を用いて、ＣＯ２インキュベーター（３７℃、５％ＣＯ２）内にて静置状態で維持培養した。【０１４１】
培養０日目に培地１で播種し、１〜３日毎に培地２を添加して、６〜８日間これを継続し細胞塊を形成した。最終日に、ＭＡＣＳ（登録商標）ＳｍａｒｔＳｔｒａｉｎｅｒｓ（７０μｍ、ＭＡＣＳ社製）を用いて細胞塊を回収し、培地１で懸濁した後、本発明のデバイスに準じたものを通過させ、細胞塊を分割したものを播種した（０日目）。これを繰り返して、細胞の維持培養を行った。【０１４２】
（網状構造の仕様）
以下の事例で用いた器具は、消毒用エタノールで滅菌したものを使用した。
網状構造の実施例品として、次に示す形状を持った多孔フィルムを製作した。
（ａ）開口の形状が図３（ａ）に示す正六角形であり、ビーム部の断面形状が図３（ｃ）に示す長方形である。
（ｂ）開口の形状が図５（ａ）に示す正方形であり、ビーム部の断面形状が図３（ｃ）に示す長方形である。
（ｃ）開口の形状が図３（ａ）に示す正六角形であり、ビーム部の断面形状が図３（ｅ）に示す、入口側の角部が丸くなった形状（円弧と弦とを有する形状）である。
（ｄ）開口の形状が図５（ａ）に示す正方形であり、ビーム部の断面形状が図３（ｅ）に示す、入口側の角部が丸くなった形状（円弧と弦とを有する形状）である。【０１４３】
フィルム本体の材料はニッケルであり、フィルム本体の厚さ（図３（ｃ）、（ｅ）の厚さｔ１）は２０μｍであり、線径（ビーム部の幅）は５０μｍである。各貫通孔の孔径（開口の形状である正六角形の６辺のうち、互いに対向する平行な２辺の間の距離、または開口の形状である正方形の２辺の間の距離）は６０μｍである。
フィルム本体の外周形状は円形であり、円の寸法（直径）は６ｍｍである。【０１４４】
（本発明のデバイスを保持するホルダー）
図６に示すように、網状構造をセットするためのホルダーを作製した。細胞塊が分散した液状の培地組成物を流すための管路（断面円形）の内径は、３．０ｍｍであり、網状構造を通過する液状の培地組成物の流れの有効径も３．０ｍｍである。【０１４５】
（ｈｉＰＳ細胞の細胞塊の分割）
７日間の浮遊培養後、ＭＡＣＳ（登録商標）ＳｍａｒｔＳｔｒａｉｎｅｒｓ（７０μｍ、ＭＡＣＳ社製）を用いて細胞塊を回収し、培地１で３．０×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬの細胞密度となるように懸濁した。５０ｍＬシリンジ（ニプロ社製）にそれぞれの懸濁液を４５ｍＬ移し、懸濁液を本発明のデバイスの実施例品に１０ｃｍ／ｓｅｃの処理速度で通過させ、１５ｍＬ毎に１５ｍＬチューブに分注した。
また、１０ｍＬ毎にシリンジを１ｍＬ戻すことで逆洗工程を含む分割も行った。
分注後の１５ｍＬチューブは、インキュベーター（３７℃、５％ＣＯ２）にて静置した。【０１４６】
（細胞生存率）
分割の２時間後に、分注した１５ｍＬチューブをインキュベーターから取出し、転倒混和により細胞塊をよく分散させた後、培養液０．７５ｍＬを採取し、ＡＴＰ試薬０．７５ｍＬ（ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（登録商標）Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ Ｃｅｌｌ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ Ａｓｓａｙ, Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を添加し、ピペットマンでよく撹拌し、１０分間室温にて静置した後、白色９６ウェルプレートに１００μＬずつ分注し、Ｅｎｓｐｉｒｅ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ社製）にて発光強度（ＲＬＵ値）を測定し、培地のみの発光値を差し引くことで生細胞の数を測定した。
分割前の懸濁液のＲＬＵ値（ＡＴＰ測定、発光強度）を１００％としたときの相対値を細胞生存率とした。【０１４７】
以上の試験結果を、図１８のグラフ図に示す。
図１８のグラフに示した結果からも明らかなように、すべての条件で容量依存的に細胞生存率は下がることが分かった。さらに、開口の形状が正六角形より正方形の方が細胞生存率が高く、かつ、ビーム部の断面形状が矩形よりも入口側の角部にまるみがついた形状の方が細胞生存率が高くなることが分かった。
本試験における開口の形状についての結果は、単純に開口形状の影響のみではなく、正六角形の開口面積が３１１８μｍ２、正方形の開口面積が３６００μｍ２であることから、より大きい開口面積をもつ正方形の方が細胞生存率が高くなったことも考察される。
以上よりスケールアップした際の分割において、ビーム部の断面形状が矩形の入口側の角部にまるみがついた形状とすることが非常に有効であることが明らかとなった。【０１４８】
〔試験例８〕ヒト多能性幹細胞（ｈｉＰＳ細胞）の培養
（接着維持培養）
ｈｉＰＳ細胞株２５３Ｇ１（理化学研究所より分譲）はビトロネクチンＶＴＮ−Ｎ（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製、＃Ａ１４７００）をコートした６ｃｍ培養ディッシュ上に５．０×１０４ｃｅｌｌｓ〜５．０×１０５ｃｅｌｌｓの細胞を播種し、ｍＴｅＳＲ（登録商標）１培地（ステムセルテクノロジーズ社製、＃ＳＴ−０５８５０）を用いて培養を行った。播種後２４時間は１０μＭ  Ｙ−２７６３２（富士フィルム和光純薬社製、＃０３０−２４０２１）を含有するｍＴｅＳＲ１培地にて培養し、その後、１０μＭ  Ｙ−２７６３２を含有しないｍＴｅＳＲ１培地に毎日培地交換を行った。播種３〜４日後に０．５ｍＭ  ＥＤＴＡ含有ＰＢＳ溶液を用いて細胞を剥離することで継代維持した。【０１４９】
（浮遊維持培養）
・培地１：１０μＭ  Ｙ−２７６３２を含有するｍＴｅＳＲ１培地に、特許文献１（ＷＯ２０１６／１６３４４４）の方法に従い、０．０１６％（ｗ／ｖ）の脱アシル化ジェランガム（ＫＥＬＣＯＧＥＬ  ＣＧ−ＬＡ、三栄源エフ・エフ・アイ社製）をＦＣｅＭ−ｓｅｒｉｅｓ  Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（日産化学社製）を用いて調製した組成物
・培地２：ｍＴｅＳＲ１培地に、特許文献１の方法に従い、０．０１６％（ｗ／ｖ）の脱アシル化ジェランガムをＦＣｅＭ−ｓｅｒｉｅｓ  Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  Ｋｉｔを用いて調製した組成物【０１５０】
三次元培養を行うため、播種に用いるｈｉＰＳ細胞株２５３Ｇ１を、Ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ  ｆｏｒ  ｈｕｍａｎ  ＥＳ／ｉＰＳ  Ｃｅｌｌｓ（リプロセル社製、＃ＲＣＨＥＴＰ００２）を用いてコロニー状態に剥離した。
剥離した細胞を培地１で懸濁後、多孔フィルム（開口形状は正六角形、孔径（平行な２辺の間の距離）７０μｍ、線径（ビーム幅）２０μｍ、通過速度１０ｃｍ／秒）を用いて分割することで細胞塊を作製した。
分割後の細胞を一部分取し、ＴｒｙｐＬＥ  Ｓｅｌｅｃｔ (サーモフィッシャーサイエンティフィック社製、♯１２５６３０１１) 処理によりシングルセル化後、細胞計数装置（ＣｈｅｍｏＭｅｔｅｃ社製、＃ＮＣ−２００） を用いて生細胞数を計測した。
生細胞が２．０×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように細胞濃度を調整した後、ガス透過性培養バッグ（ニプロ社製、＃８７−３５２）に播種し、ＣＯ２インキュベーター（３７℃、５％ＣＯ２）内にて静置状態で三次元培養した。
培養０日目に培地１で播種し、培養１及び４日目に培地２を播種量に対して２倍量添加して７日間培養を行った。形成した細胞塊は７０μｍのメッシュ（ミルテニーバイオテック社製、＃１３０−０９８−４６２）を用いて回収し、培地１に懸濁後、多孔フィルム（開口形状は正六角形、孔径（平行な２辺の間の距離）７０μｍ、線径（ビーム幅）２０μｍ、通過速度１０ｃｍ／秒）を用いて細胞塊を分割すること継代維持した。【０１５１】
〔試験例９〕浮遊培養時の最適な細胞播種密度
試験例８に記載の方法で継代維持した細胞を用いて、浮遊培養時の最適な細胞播種密度を検証した。
接着培養したｈｉＰＳ細胞株２５３Ｇ１細胞をＤｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ  ｆｏｒ  ｈｕｍａｎ  ＥＳ／ｉＰＳ  Ｃｅｌｌｓ（リプロセル社製、＃ＲＣＨＥＴＰ００２）を用いてコロニー状態に剥離した。剥離した細胞を培地１で懸濁後、多孔フィルム（開口形状は正六角形、孔径（平行な２辺の間の距離）７０μｍ、線径（ビーム幅）２０μｍ、通過速度１０ｃｍ／秒）を用いて分割することで細胞塊を作製した。
分割後の細胞を一部分取し、ＴｒｙｐＬＥ  Ｓｅｌｅｃｔ (サーモフィッシャーサイエンティフィック社製、♯１２５６３０１１) 処理によりシングルセル化後、細胞計数装置（ＣｈｅｍｏＭｅｔｅｃ社製、＃ＮＣ−２００） を用いて生細胞数を計測した。
生細胞が１或いは２或いは４或いは６或いは８×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように細胞濃度を調整した後、１５ｍＬチューブ（ファルコン社製、型番３５２０９５）に播種し、フタを密閉しない状態でＣＯ２インキュベーター（３７℃、５％ＣＯ２）内にて静置状態で三次元培養した。
培養０日目に培地１で播種し、培養１及び４日目に培地２を播種量に対して２倍量添加して７日間培養を行った。【０１５２】
（増殖率の算出）
培養０、１、２、３、４、７日目に各条件の培養液を一部採取し、各々に培養液と等量のＡＴＰ試薬（ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（登録商標）Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ Ｃｅｌｌ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ Ａｓｓａｙ, Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を添加し、ピペットマンで撹拌し、１０分間室温にて静置した後、白色９６ウェルプレートに１５０μＬずつ分注し、Ｅｎｓｐｉｒｅ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ社製）にて発光強度（ＲＬＵ値）を測定し、培地のみの発光値を差し引くことで生細胞数を測定した。培養０日目の培養液のＲＬＵ値（ＡＴＰ測定、発光強度）を１００％としたときの各測定日における相対値を増殖率とした。試験結果を表８に示す。【０１５３】
【表８】
2020032041.tif 000010
【０１５４】
表８のとおり、細胞播種密度が２×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬの条件において、７日目の増殖率が最も高いことが明らかとなった。効率よく細胞を増殖させるためには、適切な濃度で細胞を播種する必要がある。【０１５５】
〔試験例１０〕浮遊培養時の最適な培地添加方法
試験例８に記載の浮遊維持培養で継代維持した細胞を用いて、浮遊培養時の最適な培地添加方法を検証した。
三次元培養で１継代以上培養した７〜８日目のｈｉＰＳ細胞株２５３Ｇ１細胞を回収し、細胞を培地１で懸濁後、多孔フィルム（開口形状は正六角形、孔径（平行な２辺の間の距離）７０μｍ、線径（ビーム幅）２０μｍ、通過速度１０ｃｍ／秒）を用いて分割することで細胞塊を作製した。
分割後の細胞を一部分取し、ＴｒｙｐＬＥ  Ｓｅｌｅｃｔ (サーモフィッシャーサイエンティフィック社製、♯１２５６３０１１) 処理によりシングルセル化後、細胞計数装置（ＣｈｅｍｏＭｅｔｅｃ社製、＃ＮＣ−２００）を用いて生細胞数を計測した。
生細胞が２×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように細胞濃度を調整した後、ガス透過性培養バッグ（ニプロ社製、＃８７−３５２）に播種し、ＣＯ２インキュベーター（３７℃、５％ＣＯ２）内にて静置状態で三次元培養した。培養１日目に培養バッグ内の細胞培養液１ｍＬを１５ｍＬチューブ（ファルコン社製、型番３５２０９５）に播種し、表９に記載のように、培養１〜６日目に培地２を添加した。細胞を播種した１５ｍＬチューブはフタを密閉しない状態でＣＯ２インキュベーター（３７℃、５％ＣＯ２）内にて静置状態で三次元培養した。【０１５６】
（増殖率の算出）
培養７日目に各条件の培養液１ｍＬを採取し、各々にＡＴＰ試薬１ｍＬ（ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（登録商標）Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ Ｃｅｌｌ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ Ａｓｓａｙ, Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を添加し、ピペットマンで撹拌し、１０分間室温にて静置した後、白色９６ウェルプレートに１５０μＬずつ分注し、Ｅｎｓｐｉｒｅ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ社製）にて発光強度（ＲＬＵ値）を測定し、培地のみの発光値を差し引くことで生細胞数を測定した。培養１日目の培養液のＲＬＵ値（ＡＴＰ測定、発光強度）を１としたときの７日目における相対値を増殖率とした。試験結果を表９に示す。【０１５７】
（細胞塊平均径の測定）
細胞塊をよく分散させた後、試験で使用した各条件の培養液の一部を１２ウェルプレートに移し、Ｃｅｌｌ３ｉＭａｇｅｒｄｕｏｓを用いて、培養液中の直径５０μｍ以上の細胞塊の大きさを計測した。細胞塊の大きさの測定では、細胞塊の円相当直径を計測し、その平均値を平均径とした。【０１５８】
【表９】
2020032041.tif 000011
【０１５９】
表９のとおり、添加する培地量が多いほど増殖率が高く、スフェア平均直径も大きくなる傾向があることが明らかとなった。効率よく細胞を増殖させるためには適切なタイミングで培地を添加し、適切な量を添加する必要がある。【０１６０】
〔試験例１１〕ガス透過性培養バッグを用いた培養
試験例８に記載の浮遊維持培養で継代維持した細胞を用いて、ガス透過性培養バッグを用いた浮遊培養を検証した。
三次元培養で１継代以上培養した７日目のｈｉＰＳ細胞株２５３Ｇ１細胞を回収し、細胞を培地１で懸濁後、多孔フィルム（開口形状は正六角形、孔径（平行な２辺の間の距離）７０μｍ、線径（ビーム幅）２０μｍ、通過速度１０ｃｍ／秒）を用いて分割することで細胞塊を作製した。
分割後の細胞を一部分取し、ＴｒｙｐＬＥ  Ｓｅｌｅｃｔ (サーモフィッシャーサイエンティフィック社製、♯１２５６３０１１) 処理によりシングルセル化後、細胞計数装置（ＣｈｅｍｏＭｅｔｅｃ社製、＃ＮＣ−２００） を用いて生細胞数を計測した。
生細胞が２×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように細胞濃度を調整した後、２００ｍＬ培養用ガス透過性培養バッグ（ニプロ社製、＃８７−３５２）または１Ｌ培養用ガス透過性培養バッグ（ニプロ社製、＃８７−３０２）に播種し、ＣＯ２インキュベーター（３７℃、５％ＣＯ２）内にて静置状態で三次元培養した。
培養０日目に培地１で播種し、培養１及び４日目に培地２を播種量に対して２倍量添加して７日間培養を行った。培養後、メッシュを用いて細胞を回収し、培地１に懸濁後、多孔フィルム（開口形状は正六角形、孔径（平行な２辺の間の距離）７０μｍ、線径（ビーム幅）２０μｍ、通過速度１０ｃｍ／秒）を用いて細胞塊を分割することで継代維持した。【０１６１】
（増殖率の算出）
培養７日目の細胞を一部分取し、ＴｒｙｐＬＥ  Ｓｅｌｅｃｔ (サーモフィッシャーサイエンティフィック社製、♯１２５６３０１１) 処理によりシングルセル化後、細胞計数装置（ＣｈｅｍｏＭｅｔｅｃ社製、＃ＮＣ−２００） を用いて生細胞数を計測した。培養７日目の細胞数を培養０日目に播種した細胞数で除することで増殖率を算出した。【０１６２】
（細胞塊個数及び平均径の測定）
細胞塊をよく分散させた後、試験で使用した培養液の一部を１２ウェルプレートに移し、Ｃｅｌｌ３ｉＭａｇｅｒｄｕｏｓを用いて、培養液中の直径５０μｍ以上の細胞塊の個数及び大きさを計測した。細胞塊の大きさの測定では、細胞塊の円相当直径を計測し、その平均値を平均径とした。【０１６３】
【表１０】
2020032041.tif 000012
【０１６４】
表１０のとおり、２００ｍＬ培養バッグを用いた場合の増殖率は約１０倍、１Ｌ培養バッグを用いた場合の増殖率は約９倍となった。以上の結果から、２００ｍＬスケール及び１Ｌスケールにおいてもほぼ同程度の効率で培養できることが明らかとなった。【０１６５】
〔試験例１２〕様々な容器を用いた培養
試験例８に記載の浮遊維持培養で継代維持した細胞を用いて、様々な容器を用いた浮遊培養を検証した。
三次元培養で１継代以上培養した７〜８日目のｈｉＰＳ細胞株２５３Ｇ１細胞を回収し、細胞を培地１で懸濁後、多孔フィルム（開口形状は正六角形、孔径（平行な２辺の間の距離）７０μｍ、線径（ビーム幅）２０μｍ、通過速度１０ｃｍ／秒）を用いて分割することで細胞塊を作製した。
分割後の細胞を一部分取し、ＴｒｙｐＬＥ  Ｓｅｌｅｃｔ (サーモフィッシャーサイエンティフィック社製、♯１２５６３０１１) 処理によりシングルセル化後、細胞計数装置（ＣｈｅｍｏＭｅｔｅｃ社製、＃ＮＣ−２００）を用いて生細胞数を計測した。
生細胞が２×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように細胞濃度を調整した後、５０ｍＬチューブ（ＷＡＴＯＳＯＮ社製、＃１３４２―０５０Ｓ）、低吸着１０ｃｍディッシュ（Ｃｏｒｎｉｎｇ社製、＃３２６２）、細胞培養フラスコ（Ｃｏｒｎｉｎｇ社製、＃４３０１６８）に播種し、ＣＯ２インキュベーター（３７℃、５％ＣＯ２）内にて静置状態で三次元培養した。
この時、５０ｍＬチューブ及び細胞培養フラスコはフタを密閉しない状態で培養した。  培養０日目に培地１で播種し、培養１及び４日目に培地２を播種量に対して２倍量添加して７日間培養を行った。培養条件と結果を表１１に示す。条件２では培地添加日以外にも培養液を懸濁する操作を実施した。【０１６６】
（増殖率の算出）
培養７日目の細胞を一部分取し、ＴｒｙｐＬＥ  Ｓｅｌｅｃｔ (サーモフィッシャーサイエンティフィック社製、♯１２５６３０１１) 処理によりシングルセル化後、細胞計数装置（ＣｈｅｍｏＭｅｔｅｃ社製、＃ＮＣ−２００） を用いて生細胞数を計測した。培養７日目の細胞数を培養０日目に播種した細胞数で除することで増殖率を算出した。【０１６７】
（細胞塊個数及び平均径の測定）
細胞塊をよく分散させた後、試験で使用した培養液の一部を１２ウェルプレートに移し、Ｃｅｌｌ３ｉＭａｇｅｒｄｕｏｓを用いて、培養液中の直径５０μｍ以上の細胞塊の個数及び大きさを計測した。細胞塊の大きさの測定では、細胞塊の円相当直径を計測し、その平均値を平均径とした。【０１６８】
【表１１】
2020032041.tif 000013
【０１６９】
表１１のとおり、培養容器として低吸着１０ｃｍディッシュを使用することで、表１０に記載したガス透過性培養バッグと同程度の増殖率が得られることが明らかとなった。また、培養７日目の各容器の培養液が空気に接する面積（空接面積と記載）と培養液の高さ（液面高と記載）を測定した。他の容器と比較して、低吸着１０ｃｍディッシュで増殖率が向上した原因として、培養液の空気に接する面積が大きく培養液の高さが低いことが考えられる。以上の結果から、効率よく細胞を増殖させるためには、培地中に細胞が増えるために必要なガス交換を行う必要があることが示唆された。【０１７０】
〔試験例１３〕ヒト多能性幹細胞（ｈｉＰＳ細胞）の細胞塊の回収
試験例８に記載の浮遊維持培養で継代維持した細胞を用いて、細胞塊の回収条件を検証した。三次元培養で１継代以上培養した７日目のｈｉＰＳ細胞株２５３Ｇ１の細胞培養液を有効面積及び形状が異なる各種条件の回収用メッシュ容器に１ｍＬ／ｓｅｃの速度で通過させ、細胞塊をメッシュにトラップさせた。その後、試験例８に記載の新鮮な培地２を逆流させることで細胞塊を回収した。【０１７１】
（回収器の仕様）
条件１及び２では，図９に示すような回収容器内の空間をメッシュが２つに区切るように配置された回収器を使用した。
図９（ａ）に示した例では、回収容器の内部空間の外周形状は円形であるが、条件１では、回収容器の内部空間の外周形状が長方形（入口から出口に向かう方向に長辺が位置する）であり、メッシュ孔径６５μｍ、有効面積は約１３ｃｍ２のものを使用した。また、条件２では回収容器の内部空間の外周形状（基本形状）がひし形（対向する２つの頂点部分に入口と出口が設けられている）であり、メッシュ孔径６５μｍ、有効面積は約３４ｃｍ２のものを使用した。トラップ時の流れ方向に対して、回収時の流れ方向を逆にすることによって、トラップされた細胞塊を回収容器へと移動させた。【０１７２】
（細胞塊個数及び平均径の測定）
細胞塊をよく分散させた後、試験で使用した培養液の一部を１２ウェルプレートに移し、Ｃｅｌｌ３ｉＭａｇｅｒｄｕｏｓを用いて、培養液中の直径５０μｍ以上の細胞塊の個数及び大きさを計測した。細胞塊の大きさの測定では、細胞塊の円相当直径を計測し、その平均値を平均径とした。【０１７３】
（回収率の算出）
培養液及び回収液１ｍＬを採取し、各々にＡＴＰ試薬１ｍＬ（ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（登録商標）Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ Ｃｅｌｌ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ Ａｓｓａｙ, Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を添加し、ピペットマンで撹拌し、１０分間室温にて静置した後、白色９６ウェルプレートに１５０μＬずつ分注し、Ｅｎｓｐｉｒｅ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ社製）にて発光強度（ＲＬＵ値）を測定し、培地のみの発光値を差し引くことで生細胞の数を測定した。培養液のＲＬＵ値（ＡＴＰ測定、発光強度）を１００％としたときの回収液の相対値を回収率とした。
回収率の結果を表１２に示す。【０１７４】
【表１２】
2020032041.tif 000014
【０１７５】
表１２のとおり、条件１及び２において、８０％前後の回収率が得られた。試験例５における条件９及び１０と比較して、表１２の条件１及び２において回収率が向上した。これらの結果から、回収器の形状とメッシュ孔径を最適化することで回収効率を向上させ、効率よく細胞塊を回収できることが明らかとなった。【０１７６】
〔試験例１３〕閉鎖系培養
試験例８に記載の浮遊維持培養で継代維持した細胞を用いて、図７に示した閉鎖系培養を検証した。
三次元培養で１継代以上培養した培養７日目のｈｉＰＳ細胞株２５３Ｇ１細胞を回収し、細胞を培地１で懸濁後、多孔フィルム（開口形状は正六角形、孔径（平行な２辺の間の距離）７０μｍ、線径（ビーム幅）２０μｍ、通過速度１０ｃｍ／秒）を用いて分割することで細胞塊を作製した。
分割後の細胞を一部分取し、ＴｒｙｐＬＥ  Ｓｅｌｅｃｔ (サーモフィッシャーサイエンティフィック社製、♯１２５６３０１１) 処理によりシングルセル化後、細胞計数装置（ＣｈｅｍｏＭｅｔｅｃ社製、＃ＮＣ−２００） を用いて生細胞数を計測した。
生細胞が２×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように細胞濃度を調整した後、ガス透過性培養バッグ（ニプロ社製、＃８７−３５２）に播種し、ＣＯ２インキュベーター（３７℃、５％ＣＯ２）内にて静置状態で三次元培養した。培養０日目に培地１で播種し、培養１及び４日目に培地２を播種量に対して２倍量添加して７日間培養を行った。
培養７日目に図７に記載の回収器及び分割器及び新たな培養バッグを有する閉鎖系流路に接続することで細胞塊を回収し、大きくなった細胞塊を分割し、新たな培養バッグへ播種することで維持培養した。この時、生細胞が２×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように濃度を調整した。
回収器には分離メッシュ孔径６５μｍ、線径４８μｍ、有効面積約３４ｃｍ２であるものを使用し、分割器には多孔フィルム（開口形状は正六角形、孔径（平行な２辺の間の距離）７０μｍ、線径（ビーム幅）２０μｍ、通過速度１０ｃｍ／秒）を使用した。【０１７７】
本試験例で、実際に使用した細胞培養システムの構成を図１９にブロック図として示す。図中の小さい正方形は、懸濁液または液体培地が図中の破線の矢印に沿って流れるように、流路を切り替える切替弁である。なお、細胞塊の濃度を調節するなどの目的で外部から液体培地を適宜に追加するための要素や配管や、細胞塊の検査のために懸濁液を抜き取るための要素や配管など、付帯的な構成は図示を省略している。
図１９に示すように、第１送液シリンジの作動により、第１培養バッグ中の懸濁液（細胞塊を含んだ液体培地）は、矢印１に沿って第１送液シリンジ内に入り、次に、矢印２に沿って回収器に入る。ここで、細胞塊だけが残り、培養に使用された液体培地は回収器を通過し、廃液バッグに入る。ここでは、回収器は分割器よりも前に位置し、分割の前に液体培地を置換するために用いられている。次に、矢印３に沿って新鮮な液体培地が第２送出シリンジから送り出され、回収器中の細胞塊と共に新たな懸濁液となって、第３送液シリンジに入る。次に、該新たな懸濁液は、矢印４に沿って分割器に送り込まれ、ここで細胞塊が分割され、矢印５に沿って第２培養バッグに入る。
図１９の例では、第１培養バッグが図１でいう供給源であり、第２培養バッグが図１でいう第１の容器である。第２培養バッグは管路の切替えなどによって閉鎖的に第１培養バッグと交換され得、第２培養バッグ中の細胞塊が、前記した矢印１〜５に沿った移動により再び分割され得、第３培養バッグ（図示せず）に入ることができる。【０１７８】
（増殖率の算出）
培養０日目及び７日目の細胞を一部分取し、ＴｒｙｐＬＥ  Ｓｅｌｅｃｔ (サーモフィッシャーサイエンティフィック社製、♯１２５６３０１１) 処理によりシングルセル化後、細胞計数装置（ＣｈｅｍｏＭｅｔｅｃ社製、＃ＮＣ−２００） を用いて生細胞数を計測した。培養７日目の細胞数を培養０日目に播種した細胞数で除することで増殖率を算出した。測定結果を表１３に示す。【０１７９】
（回収率の算出）
培養液、ろ液、回収液１ｍＬを採取し、各々にＡＴＰ試薬１ｍＬ（ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（登録商標）Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ Ｃｅｌｌ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ Ａｓｓａｙ, Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を添加し、ピペットマンで撹拌し、１０分間室温にて静置した後、白色９６ウェルプレートに１５０μＬずつ分注し、Ｅｎｓｐｉｒｅ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ社製）にて発光強度（ＲＬＵ値）を測定し、培地のみの発光値を差し引くことで生細胞の数を測定した。培養液のＲＬＵ値（ＡＴＰ測定、発光強度）を１００％としたときのろ液の相対値をろ液流出細胞とし、回収液の相対値を回収率とした。測定結果を表１３に示す。【０１８０】
（細胞塊個数及び平均径の測定）
細胞塊をよく分散させた後、培養液の一部を１２ウェルプレートに移し、Ｃｅｌｌ３ｉＭａｇｅｒｄｕｏｓを用いて、培養液中の直径５０μｍ以上の細胞塊の大きさを計測した。細胞塊の大きさの測定では、細胞塊の円相当直径を計測し、その平均値を平均径とした。測定結果を表１３に示す。【０１８１】
（未分化性の評価）
培養７日目の細胞を一部分取し、ＴｒｙｐＬＥ  Ｓｅｌｅｃｔ (サーモフィッシャーサイエンティフィック社製、♯１２５６３０１１) 処理によりシングルセル化後、４％ＰＦＡ溶液で懸濁し、１５分間静置することで細胞を固定化した。
固定化した細胞は抗ＴＲＡ−１−６０抗体（ＢＤ、♯５６０１９３）及び抗ＳＳＥＡ−４抗体（ＢＤ、♯５６０７９６）溶液に懸濁し３０分間静置することで染色した後、２％ＦＢＳを含むＰＢＳ溶液を用いて細胞を洗浄した後にＦｏｒｔｅｓｓａ  Ｘ−２０（ＢＤ）を用いてｉＰＳ細胞の未分化性の指標であるＴＲＡ−１−６０及びＳＳＥＡ−４の発現を測定した。測定結果を表１４に示す。【０１８２】
【表１３】
2020032041.tif 000015
【０１８３】
【表１４】
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【０１８４】
表１３、表１４のとおり、当該細胞培養システム（即ち、閉鎖系流路を用いた細胞培養システム）において、良好な増殖率を維持しつつ、未分化培養ができることが明らかとなった。
【産業上の利用可能性】
【０１８５】
本発明によって、細胞塊の分割と、分割された細胞塊のさらなる培養とを、閉鎖系において行い、さらには、閉鎖系を維持したまま細胞塊の分割と培養とを繰り返し、細胞塊の増殖を好ましく行うことが可能になった。また、増殖した細胞塊を、閉鎖系を維持したままで回収することが可能になった。【０１８６】
本出願は、日本で出願された特願2018-148042（出願日：2018年8月6日）及び特願2018-170103（出願日：2018年9月11日）を基礎としており、その内容は本明細書に全て包含されるものである。
【符号の説明】
【０１８７】
１０    第１の容器
２０    分割器
２２    網状構造
Ｓ１    供給源
Ｐ１    管路
Ｐ２    管路
Ｐ３    管路
Ｆ１    送液装置
【図１】
2020032041.tif 000017
【図２】
2020032041.tif 000018
【図３】
2020032041.tif 000019
【図４】
2020032041.tif 000020
【図５】
2020032041.tif 000021
【図６】
2020032041.tif 000022
【図７】
2020032041.tif 000023
【図８】
2020032041.tif 000024
【図９】
2020032041.tif 000025
【図１０】
2020032041.tif 000026
【図１１】
2020032041.tif 000027
【図１２】
2020032041.tif 000028
【図１３】
2020032041.tif 000029
【図１４】
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【図１５】
2020032041.tif 000031
【図１６】
2020032041.tif 000032
【図１７】
2020032041.tif 000033
【図１８】
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【図１９】
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【国際調査報告】
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2020032041.tif 000037
2020032041.tif 000038
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