(57)【要約】三次元培養により形成される複数の細胞の凝集体の状態を非破壊且つ簡便に判定することができる判定方法を提供する。開示の技術に係る判定方法は、複数の細胞の凝集体を撮像したホログラムから凝集体の位相差画像を生成し、位相差画像を構成する複数の画素における位相差量の配列のランダム性を示す第１の指標値を導出し、第１の指標値に基づいて、凝集体を構成する細胞の状態を判定することを含む。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
複数の細胞の凝集体を撮像したホログラムから前記凝集体の位相差画像を生成し、
前記位相差画像を構成する複数の画素における位相差量の配列のランダム性を示す第１の指標値を導出し、
前記第１の指標値に基づいて、前記凝集体を構成する細胞の状態を判定する判定方法。
【請求項２】
前記第１の指標値は、前記位相差画像における同一の位相差量の画素を結んだ等位相線によって囲まれた領域の形状の、円形からの乖離の程度に応じて定まる
請求項１に記載の判定方法。
【請求項３】
前記位相差画像を構成する複数の画素における所定範囲の位相差量の最小値をΦ０、最大値をΦＮとし、前記所定範囲内における任意の位相Φにおける等位相線の周長をＬ（Φ）とし、周長Ｌ（Φ）の等位相線によって囲まれる領域の面積をＡ（Φ）とした場合、下記の（Ｉ）式によって定義される平均位相ゆらぎλを前記第１の指標値として用いる
請求項１または請求項２に記載の判定方法。
【数１】
2020066348.tif 000008
【請求項４】
前記位相差画像から前記凝集体の形状に依存する成分を除去する処理を施した形状成分除去画像に基づいて前記第１の指標値を導出する
請求項１に記載の判定方法。
【請求項５】
前記第１の指標値に基づいて、前記凝集体を構成する細胞の生存率に関する判定を行う
請求項１から請求項４のいずれか１項に記載の判定方法。
【請求項６】
前記凝集体を構成する細胞は幹細胞であり、
前記第１の指標値に基づいて、前記凝集体を構成する幹細胞の未分化率に関する判定を行う
請求項１から請求項５のいずれか１項に記載の判定方法。
【請求項７】
判定対象ロットに含まれる複数の前記凝集体について、前記第１の指標値と前記凝集体の粒径との相関性を示す第２の指標値を導出し、
前記第２の指標値に基づいて、前記判定対象ロットについて判定を行う
請求項１から請求項６のいずれか１項に記載の判定方法。
【請求項８】
前記第２の指標値に基づいて、前記判定対象ロットに含まれる細胞の生存率に関する判定を行う
請求項７に記載の判定方法。
【請求項９】
前記凝集体を構成する細胞は幹細胞であり、
前記第２の指標値に基づいて、前記判定対象ロットに含まれる幹細胞の未分化率に関する判定を行う
請求項７または請求項８に記載の判定方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
開示の技術は、複数の細胞の凝集体の状態を判定する判定方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
細胞の状態を評価または判定する技術として、例えば、以下の技術が知られている。特許文献１には、一細胞の表面の平坦度又は細胞集団の表面の平坦度を分化の度合いの指標として用いた多能性幹細胞の分化の度合いを判別する方法が記載されている。
【０００３】
特許文献２には、撮像画像における輝度に基づいて、分化した多能性幹細胞を含む分化コロニーと未分化多能性幹細胞のみを含む未分化コロニーと多層に重なった多能性幹細胞を含む多層コロニーとを識別する方法が記載されている。この方法では、輝度の第１の閾値より明るい輝度の領域を有するコロニーを分化コロニーであると判断する。また、第１の閾値に等しいかこれより暗い輝度の領域のみを有するコロニーを未分化コロニーであると判断する。また、第１の閾値に等しいかこれより暗く第２の閾値に等しいかこれより明るい輝度の領域のみを有するコロニーを未分化コロニーであると判断する。また、第２の閾値より暗い輝度の領域を有するコロニーを多層コロニーであると判断する。
【０００４】
特許文献３には、神経分化過程の細胞を撮像した撮像画像を入力する画像入力ステップと、神経分化過程の細胞に出現する神経突起を撮像画像に基づく原画像から抽出する神経突起抽出ステップと、抽出された神経突起の状態を判定する神経突起対応判定ステップと、を備えることを特徴とする細胞評価方法が記載されている。
【０００５】
特許文献４には、細胞状態を提示する方法であって、該細胞に由来する遺伝子から選択される少なくとも１つの遺伝子に関連する遺伝子状態を経時的にモニタすることより該細胞の経時プロファイルを得る工程と該経時プロファイルを提示する工程とを含む方法が記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】ＷＯ２０１４／０４１９３５号公報
【特許文献２】特開２０１６−０２８６０７号公報
【特許文献３】特開２０１３-２３６５６４号公報
【特許文献４】特表２００６-５２２６０５号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
細胞の大量生産が可能な培養手法として、細胞の凝集体であるスフェアを培地中に浮遊させた状態で培養する三次元培養法が知られている。三次元培養による細胞の製造工程においては、工程管理の容易性の観点から、細胞の品質をスフェアの状態のまま非破壊且つ簡便に評価する技術が求められる。しかしながら、現時点においては、三次元空間中にランダムに存在する様々なサイズのスフェアを評価する手法が確立されておらず、特にスフェアの内部における細胞の密度及び生存状況について直接観察することは困難である。このため、特許文献１−３にも記載されているように、従来の二次元培養の手法を適用した評価がなされているが、培養する細胞の数の増加に伴って、評価工数が増えるため、多くの人手及び多くの時間が必要となる。従来の二次元培養の手法を適用した評価では、スフェアを単一細胞に分解したり、特許文献４に記載されているように、蛍光色素を添加したりするといった細胞の破壊を伴う処理が必要とされる。
【０００８】
開示の技術は、三次元培養により形成される複数の細胞の凝集体の状態を非破壊且つ簡便に判定することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
開示の技術に係る判定方法は、複数の細胞の凝集体を撮像したホログラムから凝集体の位相差画像を生成し、位相差画像を構成する複数の画素における位相差量の配列のランダム性を示す第１の指標値を導出し、第１の指標値に基づいて、凝集体を構成する細胞の状態を判定することを含む。開示の技術に係る判定方法によれば、三次元培養により形成される複数の細胞の凝集体の状態を非破壊且つ簡便に判定することが可能となる。
【００１０】
第１の指標値は、位相差画像における同一の位相差量の画素を結んだ等位相線によって囲まれた領域の形状の、円形からの乖離の程度に応じて定まる値であってもよい。具体的には、位相差画像を構成する複数の画素における所定範囲の位相差量の最小値をΦ０、最大値をΦＮとし、上記所定範囲内における任意の位相Φにおける等位相線の周長をＬ（Φ）とし、周長Ｌ（Φ）の等位相線によって囲まれる領域の面積をＡ（Φ）とした場合、下記の（３）式によって定義される平均位相ゆらぎλを、第１の指標値として用いることができる。第１の指標値として平均位相ゆらぎλを用いることによって、位相差画像を構成する複数の画素における位相差量の配列のランダム性を定量化することができ、従って、凝集体を構成する細胞の状態を適確に判定することが可能となる。
【００１１】
また、位相差画像から凝集体の形状に依存する成分を除去する処理を施した形状成分除去画像に基づいて第１の指標値を導出してもよい。例えば、形状成分除去画像に基づいて導出された自己相関関数または二次元パワースペクトルを、第１の指標値として導出してもよい。
【００１２】
開示の技術に係る判定方法は、第１の指標値に基づいて、凝集体を構成する細胞の生存率に関する判定を行うことを含み得る。また、凝集体を構成する細胞が幹細胞である場合、開示の技術に係る判定方法は、第１の指標値に基づいて、凝集体を構成する幹細胞の未分化率に関する判定を行うことを含み得る。細胞の生存率または未分化率に関する判定を、第１の指標値に基づいて行うことによって、当該判定を非破壊且つ簡便に行うことが可能となる。
【００１３】
開示の技術に係る判定方法は、判定対象ロットに含まれる複数の凝集体について、第１の指標値と凝集体の粒径との相関性を示す第２の指標値を導出し、第２の指標値に基づいて、判定対象ロットについて判定を行うことを含み得る。これにより、判定対象ロットについての判定を、非破壊且つ簡便に行うことが可能となる。
【００１４】
開示の技術に係る判定方法は、第２の指標値に基づいて、判定対象ロットに含まれる細胞の生存率に関する判定を行うことを含み得る。また、凝集体を構成する細胞が幹細胞である場合、開示の技術に係る判定方法は、第２の指標値に基づいて、判定対象ロットに含まれる幹細胞の未分化率に関する判定を行うことを含み得る。判定対象ロットに含まれる細胞の生存率または未分化率に関する判定を、第２の指標値に基づいて行うことによって、当該判定を非破壊且つ簡便に行うことが可能となる。
【発明の効果】
【００１５】
開示の技術によれば、三次元培養により形成される複数の細胞の凝集体の状態を非破壊且つ簡便に判定することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】開示の技術の実施形態に係る判定方法の実施に用いる撮像システムの構成の一例を示す図である。
【図２Ａ】開示の技術の実施形態に係る判定方法の実施に用いるホログラムの一例を示す図である。
【図２Ｂ】スフェアのフーリエ変換画像の一例を示す図である。
【図２Ｃ】スフェアのアンラッピング前の位相差画像の一例を示す図である。
【図２Ｄ】スフェアのアンラッピング後の位相差画像の一例を示す図である。
【図３】開示の技術の実施形態に係る位相差画像の概念を示す図である。
【図４】開示の技術の実施形態に係る位相差画像の焦点合わせに関する説明図である。
【図５】開示の技術の実施形態に係るオートフォーカス処理を行うコンピュータのハードウェア構成の一例である。
【図６】開示の技術の実施形態に係るオートフォーカス処理の流れの一例を示すフローチャートである。
【図７】開示の技術の実施形態に係るスフェアの位相差画像における焦点位置と位相差量のばらつきとの関係の一例を示すグラフである。
【図８Ａ】スフェアの位相差画像を示す図である。
【図８Ｂ】図８Ａに示す位相差画像における位相差量の分布を示すコンター図である。
【図９Ａ】スフェアの位相差画像を示す図である。
【図９Ｂ】図９Ａに示す位相差画像における位相差量の分布を示すコンター図である。
【図１０Ａ】スフェアの位相差画像を示す図である。
【図１０Ｂ】図１０Ａに示す位相差画像における位相差量の分布を示すコンター図である。
【図１１Ａ】スフェアの位相差画像を示す図である。
【図１１Ｂ】図１１Ａに示す位相差画像における位相差量の分布を示すコンター図である。
【図１２】スフェア粒径と平均位相ゆらぎとの相関性の一例を示すグラフである。
【図１３】定数Ａと未分化率との相関性の一例を示すグラフである。
【図１４】スフェア粒径と平均位相ゆらぎとの相関性の一例を示すグラフである。
【図１５】定数Ａと細胞の生存率との相関性を示すグラフである。
【図１６】スフェアの位相差画像から位相差量のランダム性（空間ばらつき）を抽出した画像（右図）の一例を示す図である。
【図１７】スフェアの位相差画像からスフェアの形状に依存する成分を除去する処理を施した画像について導出した二次元パワースペクトルを示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
以下、本発明の実施形態について図面を参照しつつ説明する。尚、各図面において、実質的に同一又は等価な構成要素又は部分には同一の参照符号を付している。
【００１８】
開示の技術の実施形態に係る判定方法は、複数の細胞の凝集体（スフェア）を撮像したホログラムから凝集体（スフェア）の位相差画像を生成し、位相差画像を構成する複数の画素における位相差量の配列のランダム性を示す第１の指標値を導出し、この第１の指標値に基づいて、凝集体（スフェア）を構成する細胞の状態を判定するという値である。この判定方法によれば、凝集体（スフェア）の状態の判定を非破壊的且つ簡便に行うことが可能である。
【００１９】
図１は、開示の技術の実施形態に係る判定方法の実施に用いる撮像システム１の構成の一例を示す図である。撮像システム１は、公知のデジタルホログラフィ技術を用いてスフェアのホログラムを取得するためのホログラム光学系１０を含んで構成されている。
【００２０】
デジタルホログラフィ技術は、物体を透過または反射した物体光と、物体光に対してコヒーレントである参照光との干渉によって生じる像をイメージセンサで撮像し、撮像によって得られた画像について、光伝搬に基づく数値計算を実施することによって、物体からの光波の波面を復元する技術である。デジタルホログラフィ技術によれば、物体の位相分布を定量化し、また、焦点位置を機械的に移動させることなく、物体の三次元情報を取得することができる。
【００２１】
ホログラム光学系１０は、レーザ光源１１、ビームスプリッタ１２、１８、コリメートレンズ１３、２１、対物レンズ１５、ダイクロイックミラー３４、結像レンズ１７及びＣＭＯＳ（Complementary Metal Oxide Semiconductor）カメラ１９を含んで構成されている。サンプルステージにセットされる試料１４としてのスフェアは、コリメートレンズ１３と対物レンズ１５との間に配置される。
【００２２】
レーザ光源１１には、例えば波長６３２．８ｎｍのＨｅＮｅレーザを用いることが可能である。レーザ光源１１から出射されたレーザ光は、ビームスプリッタ１２により、２つのレーザ光に分割される。２つのレーザ光の一方は物体光とされ、他方は参照光とされる。物体光は、コリメートレンズ１３によって平行光とされた後、サンプルステージにセットされた試料１４であるスフェアに照射される。スフェアを透過した物体光による像は、対物レンズ１５によって拡大される。対物レンズ１５を透過した物体光は、ダイクロイックミラー３４を透過して、結像レンズ１７によって再び平行光とされた後、ビームスプリッタ１８を介してＣＭＯＳカメラ１９の撮像面に結像される。一方、参照光は、光ファイバ２０によってコリメートレンズ２１の手前まで導かれる。光ファイバ２０から出射した参照光は、コリメートレンズ２１によって平行光とされ、ビームスプリッタ１８を介してＣＭＯＳカメラ１９の撮像面に入射する。物体光と参照光との干渉によって生じるホログラムが、ＣＭＯＳカメラ１９によって記録される。なお、ＣＭＯＳカメラ１９の撮像面に入射する物体光と参照光の光軸方向が互いに異なったオフアキシャル光学系が構成されていてもよい。
【００２３】
本実施形態に係る撮像システム１によれば、スフェアを破壊することなく、またスフェアを構成する細胞にダメージを与えることなくスフェアの位相差画像を取得することができる。なお、上記した撮像システム１の構成は、一例に過ぎず、上記の構成に限定されるものではない。開示の技術に係る判定方法の実施には、デジタルホログラム技術を用いてホログラムを取得することができる、あらゆる撮像システムを利用することが可能である。
【００２４】
以下に、撮像システム１を用いて取得したスフェアのホログラムから、スフェアの位相差画像を取得する方法の一例について説明する。
【００２５】
はじめに、ＣＭＯＳカメラ１９によって取得した図２Ａに例示するホログラムを、二次元フーリエ変換することにより、物体光のみの複素振幅成分を抜き出す。図２Ｂは、この処理によって得られるスフェアのフーリエ変換画像の一例である。
【００２６】
次に、例えば角スペクトル法を適用して任意の空間位置のスフェアの位相を示す画像を復元する。図２Ｃは、この処理によって得られるスフェアのアンラッピング前の位相差画像の一例である。この時点におけるスフェアの位相は、０〜２πの値に畳みこまれている。そこで、例えば、Unweighted Least Squares（重みなし最小２乗法）またはFlynn's Algorithm（フリンのアルゴリズム）などの位相接続（アンラッピング）手法を適用して２π以上の部分も接合していくことで、図２Ｄに例示するような最終的なスフェアの位相差画像を得ることができる。なお、アンラッピングの手法は数多く提案されており、位相不整合を生じない適切な手法を適宜選択すればよい。
【００２７】
図３は、位相差画像ＩＰの概念を示す図である。図３の下段は、位相差画像ＩＰの各画素ｋにおける位相差量を３次元表示した画像である。図３の上段は、位相差画像ＩＰの各画素ｋにおける位相差量を平面上にグレースケールで示した図である。
【００２８】
ここで、位相差画像ＩＰにおける位相差量θは、位相差画像ＩＰの同一焦点面内に存在するバックグラウンド（スフェアの存在しない領域）の位相をθＢとし、スフェアの存在する領域の位相をθＳとした場合、下記の（１）式によって表わされる。また、本明細書中における「位相」という用語は、光を電磁波とみなした場合の電場振幅の位相であり、より一般的な意味で使用される。
【数１】
2020066348.tif 000003
【００２９】
また、位相差画像ＩＰの各画素ｋにおける位相差量θｋは、下記（２）式によって表わすことができる。但し、ｎｋは位相差画像ＩＰの各画像ｋに対応する部位におけるスフェアの屈折率であり、ｄｋは位相差画像ＩＰの各画素ｋに対応する部位におけるスフェアの厚さであり、λはホログラム光学系１０における物体光の波長である。
【数２】
2020066348.tif 000004
【００３０】
スフェアの位相差画像は、スフェアを透過した物体光の光路長分布を示した画像である。スフェア内における光路長は、スフェアの屈折率とスフェアの厚さの積に相当することから、スフェアの位相差画像は、（２）式にも示されているように、スフェアの屈折率及び厚さ（形状）の情報を含んでいる。
【００３１】
スフェアに対して焦点が合っていない位相差画像からは、回折による広がりの影響によりスフェアの実態に合致した正確な情報が得られない。従って、ＣＭＯＳカメラ１９によって取得したホログラムから位相差画像を取得する際に、スフェアに焦点を合わせることが好ましい。ここで、「スフェアに焦点を合わせる」とは、球形状のスフェアの中央付近でスライスした位相差画像を得ることを意味する。スフェアに焦点が合った位相差画像を用いてスフェアの状態を判定することによって、より正確な判定結果を得ることができる。
【００３２】
位相差画像の焦点合わせは、人手によらず、自動化することが好ましい。焦点合わせを自動化することによって、作業者による任意性を排除し、更に、処理時間の短縮を図ることができる。本発明者らは、以下に説明する自動化可能な焦点合わせの手法を見出した。
【００３３】
図４の左のグラフは、スフェアの位相差画像における平面方向の位置と位相差量との関係の一例を示すグラフであり、実線がスフェアに焦点が合っている状態に対応し、点線がスフェアに焦点が合っていない状態に対応する。スフェアに焦点が合っている場合、位相差画像における特定の位置に急峻なピークが現れる。一方、スフェアに焦点が合っていない場合、焦点が合っている場合と比較してピークが低く且つなだらかになる。
【００３４】
図４の右のグラフは、スフェアの位相差画像における位相差量のヒストグラムの一例であり、実線がスフェアに焦点が合っている状態に対応し、点線がスフェアに焦点が合っていない状態に対応する。スフェアに焦点が合っている場合、カーブの半値幅ｗ（位相差量のばらつき）は、相対的に大きくなり、スフェアに焦点が合っていない場合、カーブの半値幅ｗ（位相差量のばらつき）は、相対的に小さくなる。
【００３５】
従って、互いに異なる焦点位置（スライス位置）毎にスフェアの位相差画像を取得し、取得した位相差画像の各々について、位相差量のヒストグラムにおけるカーブの半値幅ｗ（位相差量のばらつき）を求め、求めた半値幅ｗのうち、最大の半値幅ｗを有する位相差画像を、スフェアに焦点が合った位相差画像として抽出することで焦点合わせを実現できる。
【００３６】
上記の焦点合わせは、コンピュータを用いて自動化することが可能である。図５は、上記の焦点合わせを自動で行うオートフォーカス処理を行うコンピュータ５００のハードウェア構成の一例である。
【００３７】
コンピュータ５００は、ＣＰＵ（Central Processing Unit）５０１、一時記憶領域としての主記憶装置５０２、不揮発性の補助記憶装置５０３、ＣＭＯＳカメラ１９との間において通信を行うための通信Ｉ／Ｆ（InterFace）５０４、及び液晶ディスプレイ等の表示部５０５を含んで構成されている。ＣＰＵ５０１、主記憶装置５０２、補助記憶装置５０３、通信Ｉ／Ｆ５０４、及び表示部５０５は、それぞれ、バス５０７に接続されている。補助記憶装置５０３には、上記のオートフォーカス処理の手順を記述したオートフォーカスプログラム５０６が格納されている。コンピュータ５００は、ＣＰＵ５０１がオートフォーカスプログラム５０６を実行することによって、オートフォーカス処理を行う。
【００３８】
図６は、コンピュータ５００において実施されるオートフォーカス処理の流れの一例を示すフローチャートである。
【００３９】
ステップＳ１において、ＣＰＵ５０１は、ＣＭＯＳカメラ１９からスフェアのホログラムを取得する。
【００４０】
ステップＳ２において、ＣＰＵ５０１は、取得したホログラムから、焦点位置（スライス位置）が互いに異なる複数の位相差画像を生成する。
【００４１】
ステップＳ３において、ＣＰＵ５０１は、焦点位置（スライス位置）毎の位相差画像の各々について、位相差量のばらつきを導出する。ＣＰＵ５０１は、例えば、位相差画像における位相差量の最大値と最小値との差分を、当該位相差画像における位相差量のばらつきとして導出してもよい。
【００４２】
ステップＳ４において、ＣＰＵ５０１は、焦点位置（スライス位置）が互いに異なる複数の位相差画像のうち、ステップＳ３にて導出した位相差量のばらつきが最大となる位相差画像を、焦点が合った位相差画像として抽出する。
【００４３】
図７は、スフェアの位相差画像における焦点位置（スライス位置）と位相差量のばらつきとの関係の一例を示したグラフである。図７には、焦点位置が、−４００μｍ、−２００μｍ、０μｍ、＋２００μｍ、及び＋４００μｍに対応するスフェアの位相差画像が、グラフとともに例示されている。なお、図７では、位相差量のばらつきが最大となる焦点位置を０μｍとしている。上記のオートフォーカス処理によれば、位相差量のばらつきが最大となる焦点位置０μｍに対応する位相差画像が、焦点が合った位相差画像として抽出される。位相差量のばらつきが最大となる焦点位置０μｍに対応する位相差画像において、スフェアの輪郭が最も鮮明となる。
【００４４】
上記のように、開示の技術の実施形態に係る判定方法においては、スフェアの位相差画像を構成する複数の画素における位相差量の配列のランダム性を示す第１の指標値を導出し、この第１の指標値に基づいて、スフェアを構成する細胞の状態を判定することを含む。
【００４５】
図８Ａは、未分化状態を維持しているｉＰＳ細胞の、ロット内における割合（以下、未分化率という）が９９％である培養ロットから抽出されたｉＰＳ細胞の凝集体であるスフェアの位相差画像の代表例を示す図である。図８Ｂは、図８Ａに示す位相差画像における位相差量の分布を示すコンター図である。図９Ａは、未分化率が８７％である培養ロットから抽出されたｉＰＳ細胞の凝集体であるスフェアの位相差画像の代表例を示す図である。図９Ｂは、図９Ａに示す位相差画像における位相差量の分布を示すコンター図である。
【００４６】
未分化率が相対的に高いロット内のスフェアは、未分化率が相対的に低い（すなわち、胚葉への分化が進行している）ロット内のスフェアと比較して、内部の均質性が高いと考えられる。従って、未分化率が相対的に高いロット内のスフェアの位相差画像においては、図８Ｂに示すように、同一の位相差量の画素を結んだ等位相線によって囲また領域の形状が円形に近い形状となり、等位相線が同心円状に分布する。一方、未分化率が相対的に低いロット内のスフェアの位相差画像においては、図９Ｂに示すように、位相差画像を構成する複数の画素における位相差量の配列がランダムとなり、等位相線によって囲まれた領域の形状がくずれる。すなわち、スフェアを構成する細胞の分化の進行状態は、スフェアの位相差画像を構成する複数の画素における位相差量の配列のランダム性に反映される。従って、スフェアの位相差画像を構成する複数の画素における位相差量の配列のランダム性を示す指標値によって、スフェアを構成する細胞の分化の進行状態を定量化することが可能である。
【００４７】
スフェアの位相差画像を構成する複数の画素における位相差量の配列のランダム性を示す指標値として、例えば、スフェアの位相差画像における同一の位相差量の画素を結んだ等位相線によって囲まれた領域の形状の、円形からの乖離の程度に応じて定まる指標値を用いることができる。
【００４８】
具体的には、スフェアの位相差画像を構成する複数の画素における位相差量の配列のランダム性を示す指標値として、下記の（３）式によって定義される平均位相ゆらぎλを用いることができる。（３）式において、Φ０は、位相差画像を構成する複数の画素における所定範囲の位相差量の最小値であり、ΦＮは、上記所定範囲の位相差量の最大値である。Ｌ（Φ）は、上記所定範囲内における任意の位相Φにおける等位相線の周長であり、Ａ（Φ）は、周長Ｌ（Φ）の等位相線によって囲まれる領域の面積である。
【数３】
2020066348.tif 000005
【００４９】
平均位相ゆらぎλは、等位相線によって囲まれる領域の形状が真円である場合に最小となり、等位相線によって囲まれる領域の形状が円形から離れる程大きくなる程大きくなる。すなわち、等位相線によって囲まれる領域の形状のランダム性が高くなる程、平均位相ゆらぎλは大きくなる。
【００５０】
図８Ａ及び図８Ｂに示される、未分化率９９％に対応するスフェアの位相差画像における平均位相ゆらぎλは１３．６であり、図９Ａ及び図９Ｂに示される、未分化率８７％に対応するスフェアの位相差画像における平均位相ゆらぎλは１８．９であった。未分化率が相対的に低いロット内のスフェアは、未分化状態を逸脱した複数の細胞を内部に含むことにより、スフェア内部の均質性が低下する。その結果、スフェアの位相差画像を構成する複数の画素における位相差量の配列のランダム性が増大し、平均位相ゆらぎλが大きくなる。
【００５１】
このように、スフェアの位相差画像を構成する複数の画素における位相差量の配列のランダム性を示す指標値として、平均位相ゆらぎλを用いることによって、スフェアを構成する細胞の分化の進行状態を、細胞を破壊することなく推定することが可能である。
【００５２】
平均位相ゆらぎλは、細胞の分化の進行状態の判定のみならず、スフェア内における細胞の生存率の判定に用いることもできる。図１０Ａは、ロット内における細胞の生存率が８７．３％であるロットから抽出されたｉＰＳ細胞の凝集体であるスフェアの位相差画像の代表例を示す図である。図１０Ｂは、図１０Ａに示す位相差画像における位相差量の分布を示すコンター図である。図１１Ａは、ロット内における細胞の生存率が５９．２％である培養ロットから抽出されたｉＰＳ細胞の凝集体であるスフェアの位相差画像の代表例を示す図である。図１１Ｂは、図１１Ａに示す位相差画像における位相差量の分布を示すコンター図である。
【００５３】
健全な細胞は、その恒常性から内部の屈折率は、媒質の屈折率とは異なる一定の値を維持するものと考えられる。一方、死細胞は、恒常性を喪失し、内部の屈折率が媒質の屈折率と略同じになるものと考えられる。従って、細胞の生存率が相対的に高い培養ロット内のスフェアは、細胞の生存率が相対的に低い培養ロット内のスフェアと比較して、内部の均質性が高いと考えられる。従って、細胞の生存率が相対的に高い培養ロット内のスフェアの位相差画像においては、図１０Ｂに示すように、同一の位相差量の画素を結んだ等位相線によって囲まれた領域の形状が円形に近い形状となり、等位相線が同心円状に分布する。一方、細胞の生存率が相対的に低い培養ロット内のスフェアの位相差画像においては、図１１Ｂに示すように、当該位相差画像を構成する複数の画素における位相差量の配列がランダムとなり、等位相線によって囲まれた領域の形状がくずれる。すなわち、スフェアを構成する細胞の生存率は、スフェアの位相差画像を構成する複数の画素における位相差量の配列のランダム性に反映される。従って、平均位相ゆらぎλを、スフェア内の細胞の生存率の判定に用いることが可能である。
【００５４】
図１０Ａ及び図１０Ｂに示される、細胞の生存率８７．３％に対応するスフェアの位相差画像における平均位相ゆらぎλは５．７７であり、図１１Ａ及び図１１Ｂに示される、細胞の生存率５９．２％に対応するスフェアの位相差画像における平均位相ゆらぎλは１１．０８であった。細胞の生存率が相対的に低いロット内のスフェアは、多くの死細胞を内部に含むことによりスフェア内部の均質性が低下する。その結果、スフェアの位相差画像を構成する複数の画素における位相差量の配列のランダム性が増大し、平均位相ゆらぎλが大きくなる。
【００５５】
このように、スフェアの位相差画像を構成する複数の画素における位相差量の配列のランダム性を示す指標値として、平均位相ゆらぎλを用いることによって、スフェアを構成する細胞の生存率を、細胞を破壊することなく推定することが可能である。
【００５６】
開示の技術の実施形態に係る判定方法は、判定対象ロットに含まれる複数のスフェアについて、スフェアの位相差画像を構成する複数の画素における位相差量の配列のランダム性を示す上記の指標値（以下、第１の指標値という）とスフェアの粒径との相関性を示す第２の指標値を導出し、この第２の指標値に基づいて、判定対象ロットについて判定を行うことを含み得る。第１の指標値としては、平均位相ゆらぎλを用いることができる。
【００５７】
図１２は、未分化率がそれぞれ、８７％及び９９％である２つのロットのそれぞれに含まれる複数のスフェアについて取得した、スフェア粒径と平均位相ゆらぎλとの相関性を示すグラフである。図１２に示すように、スフェア粒径が大きくなる程、平均位相ゆらぎλが大きくなる傾向があることが判明した。平均位相ゆらぎλのスフェア粒径依存性は、細胞株、三次元培養プロセス及び分化誘導プロセスの特徴を表わしていると考えることができる。具体的には、ガス濃度及び誘導因子の透過性に起因して、粒径が小さいスフェアは分化の進行が均一となりやすい一方、粒径が大きいスフェアは分化の進行が不均一となりやすいこと、及び培養及びまたは分化誘導プロセスに応じてスフェア内の細胞密度のサイズ依存性が異なるといったことが、平均位相ゆらぎλがスフェア粒径依存性を持つ要因となると考えられる。
【００５８】
また、図１２に示すように、未分化率８７％のロットと、未分化率９９％のロットとでは、スフェア粒径と平均位相ゆらぎλとの相関性に差異があることが判明した。すなわち、ロット間における未分化率の違いは、スフェア粒径と平均位相ゆらぎλとの相関性に反映される。図１２に例示されるスフェア粒径と平均位相ゆらぎλとの相関性は、例えば、下記の（４）式に示される関数によってフィッティングすることが可能である。すなわち、スフェア粒径と平均位相ゆらぎλとの相関性は、（４）式の関数による近似式によって表わすことができる。（４）式においてＸはスフェア粒径であり、Ｙは平均位相ゆらぎλであり、Ａは定数である。（４）式における定数Ａは、スフェア粒径と平均位相ゆらぎλとの相関性を示す（相関性を特徴付ける）指標値（第２の指標値）として用いることができる。
【数４】
2020066348.tif 000006
【００５９】
図１２に示される未分化率８７％のロットにおける スフェア粒径と平均位相ゆらぎλとの相関性は、（４）式の関数によるフィッティングにより、Ｙ＝ｅ０．０１２２Ｘと表わすことができる。すなわち、未分化率８７％のロットにおけるスフェア粒径と平均位相ゆらぎλとの相関性を特徴付ける指標値（第２の指標値）である定数Ａは、０．０１２２である。また、図１２に示される未分化率９９％のロットにおけるスフェア粒径と平均位相ゆらぎλとの相関性は、（４）式の関数によるフィッティングにより、Ｙ＝ｅ０．０１０７Ｘと表わすことができる。すなわち、未分化率９９％のロットにおけるスフェア粒径と平均位相ゆらぎλとの相関性を特徴付ける指標値（第２の指標値）である定数Ａは、０．０１０７である。
【００６０】
図１３は、図１２に示す、未分化率が互いに異なる２つのロットにおける、（４）式の定数Ａと、未分化率との相関性を示すグラフである。図１３に示すように、定数Ａと未分化率との間には、一定の相関性がみられることから、例えば、定数Ａに基づいて、判定対象ロット内における細胞の未分化率を推定することが可能である。このように、平均位相ゆらぎλ（第１の指標値）とスフェア粒径との相関性を示す指標値である定数Ａ（第２の指標値）に基づいて、判定対象ロットについて未分化率を推定することが可能であり、また、推定された未分化率に基づいて、判定対象ロットについて、例えば良否判定を行うことが可能である。
【００６１】
図１４は、ロット内における細胞の生存率がそれぞれ、５９．２％、６９．８％、８１．５％、８７．３％である４つのロットのそれぞれに含まれる複数のスフェアについて取得した、スフェア粒径と平均位相ゆらぎλとの相関性を示すグラフである。平均位相ゆらぎλが、スフェア粒径依存性を有する点は、上記したとおりである。図１４に示すように、生存率が互いに異なるロット間において、スフェア粒径と平均位相ゆらぎλとの相関性に差異があることが判明した。すなわち、ロット間における細胞の生存率の違いは、スフェア粒径と平均位相ゆらぎλとの相関性に反映される。図１４に示されるスフェア粒径と平均位相ゆらぎλとの相関性は、例えば、（４）式に示される関数によってフィッティングすることが可能である。すなわち、スフェア粒径と平均位相ゆらぎλとの相関性は、（４）式の関数による近似式によって表わすことができる。
【００６２】
図１４に示される生存率５９．２％のロットにおけるスフェア粒径と平均位相ゆらぎλとの相関性は、（４）式の関数によるフィッティングにより、Ｙ＝ｅ０．０１８３Ｘと表わすことができる。すなわち、生存率５９．２％のロットにおけるスフェア粒径と平均位相ゆらぎλとの相関性を特徴付ける指標値（第２の指標値）である定数Ａは、０．０１８３である。また、図１４に示される生存率６９．８％のロットにおけるスフェア粒径と平均位相ゆらぎλとの相関性は、（４）式の関数によるフィッティングにより、Ｙ＝ｅ０．０１６２Ｘと表わすことができる。すなわち、生存率６９．８％のロットにおけるスフェア粒径と平均位相ゆらぎλとの相関性を特徴付ける指標値（第２の指標値）である定数Ａは、０．０１６２である。図１４に示される生存率８１．５％のロットにおけるスフェア粒径と平均位相ゆらぎλとの相関性は、（４）式の関数によるフィッティングにより、Ｙ＝ｅ０．０１３２Ｘと表わすことができる。すなわち、生存率８１．５％のロットにおけるスフェア粒径と平均位相ゆらぎλとの相関性を特徴付ける指標値（第２の指標値）である定数Ａは、０．０１３２である。また、図１４に示される生存率８７．３％のロットにおけるスフェア粒径と平均位相ゆらぎλとの相関性は、（４）式の関数によるフィッティングにより、Ｙ＝ｅ０．０１２６Ｘと表わすことができる。すなわち、生存率８７．３％のロットにおけるスフェア粒径と平均位相ゆらぎλとの相関性を特徴付ける指標値（第２の指標値）である定数Ａは、０．０１２６である。
【００６３】
図１５は、図１４に示す、細胞の生存率が互いに異なる４つのロットにおける、（４）式の定数Ａと、細胞の生存率との相関性を示すグラフである。図１５に示すように、定数Ａと細胞の生存率との間には、一定の相関性がみられることから、定数Ａに基づいて、判定ロット内における細胞の生存率を推定することが可能である。このように、平均位相ゆらぎλ（第１の指標値）とスフェア粒径との相関性を示す指標値である定数Ａ（第２の指標値）に基づいて、判定対象ロットについてロット内における細胞の生存率を推定することが可能であり、また、推定された細胞の生存率に基づいて、判定対象ロットについて、例えば良否判定を行うことが可能である。
【００６４】
以上の説明では、スフェアの位相差画像を構成する複数の画素における位相差量の配列のランダム性を示す指標値として、（３）式によって定義される平均位相ゆらぎλを用いる場合を例示したが、この態様に限定されない。
【００６５】
例えば、スフェアの位相差画像からスフェアの形状に依存する成分を除去する処理を施した形状成分除去画像に基づいて、スフェアの位相差画像を構成する複数の画素における位相差量の配列のランダム性を示す指標値を導出してもよい。ここで、スフェアの形状に依存する成分とは、スフェアの位相差画像において、スフェア表面の基本形状を構成する、画素サイズに対して緩やかな曲面であり、二次関数及び三次関数等の多項式曲面による近似によって導出される曲面成分である。この成分を、スフェアの位相差画像から除去することによって、スフェアの位相差画像における、位相差量のランダム性（空間ばらつき）のみを抽出した形状成分除去を得ることができる。図１６は、スフェアの位相差画像（左図）からスフェアの形状に依存する成分を除去する処理を施すことにより、位相差量のランダム性（空間ばらつき）を抽出した形状成分除去画像（右図）の一例を示す図である。
【００６６】
例えば、形状成分除去画像（図１６右図）について導出した自己相関関数を、スフェアの位相差画像を構成する複数の画素における位相差量の配列のランダム性を示す指標値として用いることが可能である。すなわち、自己相関関数によって、スフェアの位相差画像における位相差量のランダム性（空間ばらつき）を定量化することができる。従って、形状成分除去画像（図１６右図）について導出した自己相関関数に基づいて、当該スフェアまたは当該スフェアを含む判定対象ロットについて、細胞の未分化率及び生存率を推定することが可能である。また、上記のようにして得られる自己相関関数を、例えば、細胞の生存率及び未分化率が既知である基準サンプルと比較することによって、当該スフェアまたは当該スフェアを含む判定対象ロットについて、例えば良否判定を行うことが可能である。
【００６７】
また、形状成分除去画像（図１６右図）について導出した二次元パワースペクトルを、スフェアの位相差画像を構成する複数の画素における位相差量の配列のランダム性を示す指標値として用いることが可能である。位相差画像Φ（ｘ,ｙ）の二次元フーリエ変換スペクトルΦ（ｋｘ，ｋｙ）における二次元パワースペクトルＰは、下記の（５）式によって表わされる。ここで、ｋｘ及びｋｙは、空間周波数である。
【数５】
2020066348.tif 000007
【００６８】
図１７は、形状成分除去画像（図１６右図）について導出した二次元パワースペクトル（ｋｙ＝０とした）を示す図である。例えば、図１７に例示されるパワースペクトルの傾き及び、関数フィテッィングにより、当該スフェアの位相差画像における位相差量のランダム性（空間ばらつき）を定量化することができる。そして、定量化された数値に基づいて、当該スフェアまたは当該スフェアを含む判定対象ロットについて、細胞の未分化率及び生存率を推定することが可能である。また、上記のようにして得られる二次元パワースペクトルを、例えば、細胞の生存率及び未分化率が既知である標準サンプルと比較することによって、当該スフェアまたは当該スフェアを含む判定対象ロットについて、例えば良否判定を行うことが可能である。なお、図１７に示す例では、ｋｙ＝０としたが、Ｒ＝（ｋｘ２＋ｋｙ２）１／２とし、Ｒについて図１７に示すようなパワースペクトルをとってもよい。また、Ｗｉｅｎｅｒ-Ｋｈｉｎｔｃｈｉｎｅの定理より、パワースペクトルの逆フーリエ変換である自己相関関数についても同様のことができる。
【符号の説明】
【００６９】
１  撮像システム
１０  ホログラム光学系
１１  レーザ光源
１２  ビームスプリッタ
１３  コリメートレンズ
１４  試料
１５  対物レンズ
１７  結像レンズ
１８  ビームスプリッタ
１９  ＣＭＯＳカメラ
２０  光ファイバ
２１  コリメートレンズ
３４  ダイクロイックミラー
５００  コンピュータ
５０２  主記憶装置
５０３  補助記憶装置
５０４  通信インターフェース
５０５  表示部
５０６  オートフォーカスプログラム
５０７  バス
ＩＰ  位相差画像
θ  位相差量
θＢ  バックグランドの位相
θＳ  スフェアの存在する領域の位相
θｋ  １画素の位相差量
ｋ  画素
ｗ  カーブの半値幅
λ  平均位相ゆらぎ
【図１】
2020066348.tif 000009
【図２Ａ】
2020066348.tif 000010
【図２Ｂ】
2020066348.tif 000011
【図２Ｃ】
2020066348.tif 000012
【図２Ｄ】
2020066348.tif 000013
【図３】
2020066348.tif 000014
【図４】
2020066348.tif 000015
【図５】
2020066348.tif 000016
【図６】
2020066348.tif 000017
【図７】
2020066348.tif 000018
【図８Ａ】
2020066348.tif 000019
【図８Ｂ】
2020066348.tif 000020
【図９Ａ】
2020066348.tif 000021
【図９Ｂ】
2020066348.tif 000022
【図１０Ａ】
2020066348.tif 000023
【図１０Ｂ】
2020066348.tif 000024
【図１１Ａ】
2020066348.tif 000025
【図１１Ｂ】
2020066348.tif 000026
【図１２】
2020066348.tif 000027
【図１３】
2020066348.tif 000028
【図１４】
2020066348.tif 000029
【図１５】
2020066348.tif 000030
【図１６】
2020066348.tif 000031
【図１７】
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【国際調査報告】
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2020066348.tif 000034
2020066348.tif 000035
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