(57)【要約】  複数の細胞を含む細胞懸濁液の周囲をゲル状物質によって被覆した細胞構造体の製造方法は、管状の流路内に細胞懸濁液を流通させる細胞懸濁液流通工程と、流路内にゲル前駆体を注入して細胞懸濁液の周囲をゲル前駆体によって被覆する被覆工程と、流路内に気体を注入して、ゲル前駆体によって被覆された細胞懸濁液と気体とによる交互流を流路内に形成する交互流形成工程と、流路内にゲル化剤を注入して、交互流にゲル化剤を合流させることで、ゲル前駆体をゲル化させるゲル化工程と、を含む。
2020066306.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
複数の細胞を含む細胞懸濁液の周囲をゲル状物質によって被覆した細胞構造体の製造方法であって、
管状の流路内に細胞懸濁液を流通させる細胞懸濁液流通工程と、
前記流路内にゲル前駆体を注入して前記細胞懸濁液の周囲を前記ゲル前駆体によって被覆する被覆工程と、
前記流路内に気体を注入して、前記ゲル前駆体によって被覆された前記細胞懸濁液と前記気体とによる交互流を前記流路内に形成する交互流形成工程と、
前記流路内にゲル化剤を注入して、前記交互流に前記ゲル化剤を合流させることで、前記ゲル前駆体をゲル化させるゲル化工程と、
を含む細胞構造体の製造方法。
【請求項２】
前記交互流形成工程において前記流路内に注入される前記気体の単位時間当たりの注入量が一定である
請求項１に記載の製造方法。
【請求項３】
前記交互流形成工程において前記流路内に注入される前記気体の単位時間当たりの注入量により、前記細胞構造体のアスペクト比を制御する
請求項１または請求項２に記載の製造方法。
【請求項４】
前記交互流形成工程において前記流路内に前記気体を間欠的に注入する
請求項１に記載の製造方法。
【請求項５】
前記流路の通液方向に直交する断面の形状は、円形または多角形である
請求項１から請求項４のいずれか１項に記載の製造方法。
【請求項６】
前記流路の内壁面に対する前記ゲル前駆体の接触角が５０°以上である
請求項１から請求項５のいずれか１項に記載の製造方法。
【請求項７】
前記流路の内壁面が撥水処理されている
請求項６に記載の製造方法。
【請求項８】
請求項１から請求項７のいずれか１項に記載の製造方法によって製造された細胞構造体に含まれる細胞を培養する細胞培養方法であって、
前記細胞構造体を培地中で培養する培養工程を含む
細胞培養方法。
【請求項９】
前記培養工程の後に前記ゲル状物質を除去する除去工程を更に含む
請求項８に記載の細胞培養方法。
【請求項１０】
複数の細胞を含む細胞懸濁液と、
前記細胞懸濁液の全周を覆うゲル状物質と、
を含み、
前記ゲル状物質の厚さが、全域に亘り、前記ゲル状物質の平均厚さの０．１倍以上３倍以下であり、
外形が非球状且つアスペクト比が１００以下である
細胞構造体。
【請求項１１】
前記アスペクト比が２０以下である
請求項１０に記載の細胞構造体。
【請求項１２】
短手方向の長さが１０μｍ以上５００μｍ以下である
請求項１０または請求項１１に記載の細胞構造体。
【請求項１３】
細胞懸濁液が流通する管状のメイン流路と、
ゲル前駆体が注入される第１の注入口に連通し、第１の合流部において前記メイン流路に合流する第１の分岐流路と、
気体が注入される第２の注入口に連通し、前記メイン流路の、前記第１の合流部よりも通液方向の下流側に配置された第２の合流部において前記メイン流路に合流する第２の分岐流路と、
前記ゲル前駆体をゲル化させるゲル化剤が注入される第３の注入口に連通し、前記メイン流路の、前記第２の合流部よりも前記通液方向の下流側に配置された第３の合流部において前記メイン流路に合流する第３の分岐流路と、
を含むマイクロ流路。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願は２０１８年９月２８日出願の日本出願第２０１８−１８５５８１号の優先権を主張すると共に、その全文を参照により本明細書に援用する。
開示の技術は、細胞構造体、細胞構造体の製造方法、細胞培養方法及びマイクロ流路に関する。
【背景技術】
【０００２】
細胞を含む細胞懸濁液の周囲をゲル状物質によって被覆した細胞構造体に関する技術として、例えば、以下のものが知られている。【０００３】
例えば、特表２０１６-５３９６５２号公報には、造血能がある細胞を含む液体コアと、液体コアの周囲を被包するゲル状殻とを含むカプセルが記載されている。このカプセルは、以下の工程を経ることにより形成される。ａ）造血能がある細胞を含有する第１の液体溶液と、ゲル化し得る液体多価電解質を含有する第２の液体溶液とをジャケット内で別々に移動させる工程、ｂ）ジャケットの流出口において一連の小滴を形成する工程であって、それぞれの小滴が第１の溶液で形成される中心コアと、第２の溶液で形成され中心コアを完全に覆う周縁フィルムとを含む工程、ｃ）フィルムの多価電解質と反応可能な試薬を含有するゲル溶液中にそれぞれの小滴を浸して、小滴を液体状態からゲル状態に移行させゲル状殻を形成させ、中心コアが液体コアを形成する工程、ｄ）形成されたカプセルを回収する工程。【０００４】
また、特開２０１７-１５４０７０号公報には、生体物質を内包するカプセルであって、皮膜が連通多孔構造のポリマーであり、外表面と内表面にスキン層が存在することを特徴とするカプセルが記載されている。また、特開２０１７-１５４０７０号公報には、このカプセルを用い、三次元方向に細胞または微生物を培養する培養方法が記載されている。【０００５】
また、特許５６３３０７７号公報には、高強度ハイドロゲルで被覆されたマイクロゲルファイバを含み、マイクロゲルファイバ中に細胞又は細胞培養物を含んだマイクロファイバが記載されている。また、特許５６３３０７７号公報には、架橋前のアルギン酸ナトリウム溶液を、同軸となるように細胞を含むコア部及びシェル部に分けて射出し、同軸のコア・シェル状態の流体を形成させ、その流体を塩化カルシウムを含む水溶液中に導入してゲル化させることにより、内側（コア部）及び外側（シェル部）の２種類のゲルからなるマイクロファイバを構築することが記載されている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
ｉＰＳ細胞（induced pluripotent stem cells）及びＥＳ細胞（embryonic stem cells）等の幹細胞を培地中に浮遊させた状態で培養すると、細胞同士が融合し、細胞凝集体（スフェア）が形成される。しかしながら、細胞凝集体（スフェア）のサイズが過大となると、細胞凝集体の中心部への酸素及び栄養分の供給が不十分となり、凝集体の中心部の細胞が壊死する場合がある。【０００７】
細胞凝集体の成長を規制する方法として、複数の細胞を含む細胞懸濁液の周囲をゲル状物質によって被覆する方法が考えられる。細胞懸濁液の周囲をゲル状物質によって被覆した細胞構造体の製造方法としては、例えば、特許５６３３０７７号公報に記載のように、細胞構造体をファイバ状に成形する方法がある。しかしながら、ファイバ状の細胞構造体は、ハンドリングが困難である。例えば、複数のファイバ状の細胞構造体を培地中に分散させて培養を行った場合、ファイバ状の細胞構造体同士が絡み合い、より大きな凝集体を生じさせてしまい、細胞への酸素及び栄養分の供給が不十分となるおそれがある。【０００８】
そこで、細胞構造体のハンドリング性を高めるためには、ファイバ状の細胞構造体を個片化すればよいと考えられる。個片化の方法としては、ファイバ状の細胞構造体を、ゲル状物質のゲル化後に、カッター等の切断具により切断する方法、ファイバ状の細胞構造体に引っ張り力を作用させて引きちぎる方法などが考えられる。【０００９】
しかしながら、ファイバ状の細胞構造体を切断具により切断した場合には、切断により露出する切断面はゲル状物質によって被覆されておらず、切断部から細胞懸濁液が漏出するおそれがある。また、ファイバ状の細胞構造体を引きちぎることにより個片化した場合には、引きちぎり部分の先端が、引っ張り方向に引き伸ばされ、当該部分におけるゲル状物質の厚さが他の部分と比較して厚くなる。ゲル状物質の厚さが過大となる部分からは、酸素及び栄養分の取り込みが困難となるおそれがある。このように、ファイバ状の細胞構造体の個片化を、ゲル状物質のゲル化後に行う方法によれば、培養に適した構造を形成することが困難である。【００１０】
細胞懸濁液の周囲をゲル状物質によって被覆した細胞構造体の他の製造方法としては、例えば、特表２０１６-５３９６５２号公報に記載のように、細胞及びゲル前駆体を含む液滴をゲル化剤に滴下する方法がある。しかしながら、この方法によれば、細胞及びゲル前駆体を含む液滴をゲル化剤に滴下する際に、該液滴が大気に晒されることとなり、細胞が細菌及びウィルス等の汚染源に汚染されるリスクがある。【００１１】
また、この方法により製造される細胞構造体の形状は球形となる。細胞構造体の形状が球形となると、細胞の体積に対するゲル状物質の体積の比率が大きくなる。ここで、細胞を被覆するゲル状物質は、その後の工程において除去されることが想定される。ゲル状物質の除去は、例えばＥＤＴＡ（ethylenediaminetetraacetic acid）等のキレート剤を用いてゲル状物質を解離させることにより行うことが想定される。細胞の体積に対するゲル状物質の体積の比率が大きいと、キレート剤による処理時間が長くなり、細胞へのダメージが大きくなる。【００１２】
開示の技術は、複数の細胞を含む細胞懸濁液の周囲をゲル状物質によって被覆した細胞構造体において、培養に適した構造を有する細胞構造体、細胞構造体の製造方法、細胞培養方法及びマイクロ流路を提供とする。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
開示の技術に係る細胞構造体の製造方法は、複数の細胞を含む細胞懸濁液の周囲をゲル状物質によって被覆した細胞構造体の製造方法であって、管状の流路内に細胞懸濁液を流通させる細胞懸濁液流通工程と、流路内にゲル前駆体を注入して細胞懸濁液の周囲をゲル前駆体によって被覆する被覆工程と、流路内に気体を注入して、ゲル前駆体によって被覆された細胞懸濁液と気体とによる交互流を流路内に形成する交互流形成工程と、流路内にゲル化剤を注入して、交互流にゲル化剤を合流させることで、ゲル前駆体をゲル化させるゲル化工程と、を含む。開示の技術に係る細胞構造体の製造方法によれば、複数の細胞を含む細胞懸濁液の周囲をゲル状物質によって被覆した細胞構造体において、培養に適した構造を形成することができ、ゲル前駆体によって被覆された細胞懸濁液の個片化を適切に行うことが可能となる。【００１４】
交互流形成工程において流路内に注入される気体の単位時間当たりの注入量が一定であってもよい。これにより、ゲル前駆体によって被覆された細胞懸濁液と気体とによる交互流を安定的に形成することが可能となる。【００１５】
交互流形成工程において流路内に注入される気体の単位時間当たりの注入量により、細胞構造体のアスペクト比を制御してもよい。これにより、細胞構造体のアスペクト比の制御を容易に行うことができる。【００１６】
また、交互流形成工程において流路内に気体を間欠的に注入してもよい。また、流路の通液方向に直交する断面の形状は、円形または多角形であってもよい。【００１７】
流路の内壁面に対するゲル前駆体の接触角が５０°以上であることが好ましい。また流路の内壁面が撥水処理されていることが好ましい。これにより、ゲル前駆体によって被覆された細胞懸濁液と気体とによる交互流を安定的に形成することができ、ゲル前駆体によって被覆された細胞懸濁液の個片化を適切に行うことが可能となる。【００１８】
開示の技術に係る細胞培養方法は、上記の製造方法によって製造された細胞構造体に含まれる細胞を培養する細胞培養方法であって、細胞構造体を培地中で培養する培養工程を含む。開示の技術に係る細胞培養方法によれば、細胞のゲル状物質除去工程におけるダメージを低減しつつ細胞培養における細胞構造体同士の凝集を回避することができる。【００１９】
開示の技術に係る細胞培養方法は、培養工程の後にゲル状物質を除去する除去工程を更に含んでいてもよい。【００２０】
開示の技術に係る細胞構造体は、複数の細胞を含む細胞懸濁液と、細胞懸濁液の全周を覆うゲル状物質と、を含み、ゲル状物質の厚さが、全域に亘り、ゲル状物質の平均厚さの０．１倍以上３倍以下であり、外形が非球状且つアスペクト比が１００以下である。開示の技術に係る細胞構造体によれば、培養に適した細胞構造体が提供される。【００２１】
開示の技術に係る細胞構造体において、アスペクト比は２０以下であることが好ましい。これにより、細胞構造体のハンドリング性をより高めることができる。【００２２】
開示の技術に係る細胞構造体において、短手方向の長さが１０μｍ以上５００μｍ以下であることが好ましい。細胞構造体の短手方向の長さを１０μｍ以上とすることで、マイクロ流路への細胞懸濁液の注入を適切に行うことが可能となる。また、細胞構造体の短手方向の長さを５００μｍ以下とすることで、細胞構造体を培地中に分散させて培養を行う場合に、コア部の中心部にも、十分な量の酸素及び栄養分を供給することが可能となる。【００２３】
開示の技術に係るマイクロ流路は、細胞懸濁液が流通する管状のメイン流路と、ゲル前駆体が注入される第１の注入口に連通し、第１の合流部においてメイン流路に合流する第１の分岐流路と、気体が注入される第２の注入口に連通し、メイン流路の、第１の合流部よりも通液方向の下流側に配置された第２の合流部においてメイン流路に合流する第２の分岐流路と、ゲル前駆体をゲル化させるゲル化剤が注入される第３の注入口に連通し、メイン流路の、第２の合流部よりも通液方向の下流側に配置された第３の合流部においてメイン流路に合流する第３の分岐流路と、を含む。開示の技術に係るマイクロ流路によれば、培養に適した細胞構造体を容易に形成することが可能となる。
【発明の効果】
【００２４】
開示の技術によれば、１つの側面として、複数の細胞を含む細胞懸濁液の周囲をゲル状物質によって被覆した細胞構造体において、培養に適した構造を形成することが可能となる。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】開示の技術の実施形態に係る細胞構造体の構造を模式的に示す図である。
【図２】比較例３に係る細胞構造体の構造を模式的に示す図である。
【図３】開示の技術の実施形態に係る細胞構造体におけるシェル部の平均厚さの測定方法を説明するための図である。
【図４】開示の技術の実施形態に係る細胞構造体の製造に用いられるマイクロ流路の構成の一例を示す断面図である。
【図５】開示の技術の実施形態に係る細胞構造体の製造方法の一例を示す工程フロー図である。
【図６】開示の技術の実施形態に係る細胞構造体を製造しているときのマイクロ流路内の様子を示す図である。
【図７】開示の技術の実施形態に係るマイクロ流路の内壁に対するゲル前駆体の接触角の測定方法を示す図である。
【図８Ａ】開示の技術の実施形態に係る製造方法によって製造された細胞構造体の位相差顕微鏡画像である。
【図８Ｂ】図８Ａに対応する細胞構造体の模式図である。
【図９Ａ】比較例１に係る細胞構造体の位相差顕微鏡画像である。
【図９Ｂ】図９Ａに対応する細胞構造体の模式図である。
【図１０Ａ】比較例２に係る細胞構造体の位相差顕微鏡画像である。
【図１０Ｂ】図１０Ａに対応する細胞構造体の模式図である。
【図１１】開示の技術の実施形態に係る細胞培養方法の一例を示す工程フロー図である。
【図１２】開示の技術の実施形態に係る細胞培養方法の一例を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２６】
以下、開示の技術の実施形態の一例を、図面を参照しつつ説明する。なお、各図面において同一または等価な構成要素および部分には同一の参照符号を付与している。
【００２７】
[第１の実施形態]
図１は、開示の技術の実施形態に係る細胞構造体１の構造を模式的に示す図である。細胞構造体１は、複数の細胞２を含む細胞懸濁液からなるコア部１０と、コア部１０の全周を覆うゲル状物質からなるシェル部１１とを含む。
【００２８】
コア部１０を構成する細胞２の種類は、特に限定されないが、例えば、ｉＰＳ細胞及びＥＳ細胞等の幹細胞を用いることができる。コア部１０を構成する細胞懸濁液には、細胞２に生育環境を提供する培地が含まれる。
【００２９】
シェル部１１を構成するゲル状物質は、解離性を有するハイドロゲルであることが望ましい。解離性を有するとは、ＥＤＴＡ等のキレート剤による処理によって溶解する性質を持つことを意味する。解離性を有するハイドロゲルとして、例えば、ゲル化したアルギン酸ナトリウムを用いることができる。
【００３０】
細胞構造体１の外形形状は、非球状であればよく、例えば円柱状、四角柱状または六角柱状であってもよい。また、細胞構造体１のアスペクト比は、１よりも大きく１００以下であることが好ましく、１．１以上２０以下であることが更に好ましい。アスペクト比とは、細胞構造体１の外形長さのうち、最も長い部位における長さＬ１と、最も短い部位における長さＬ２との比（Ｌ１／Ｌ２）である。
【００３１】
図２は、比較例３に係る細胞構造体１Ｘの構造を模式的に示す図である。比較例３に係る細胞構造体１Ｘの形状は球状とされている。すなわち、比較例３に係る細胞構造体１Ｘのアスペクト比は１である。コア部１０（細胞懸濁液）の体積に対するシェル部１１（ゲル状物質）の体積の比率（以下、ゲル体積率という）は、球状の外形を有する比較例３に係る細胞構造体１Ｘの方が、非球状の外形を有する本実施形態に係る細胞構造体１（図１参照）よりも大きくなる。すなわち、細胞構造体のアスペクト比が１に近くなる程、ゲル体積率が大きくなる。
【００３２】
ここで、比較例３に係る細胞構造体１Ｘの直径が、例えば２００μｍであり、シェル部１１を構成するゲル状物質の厚さが例えば５０μｍである場合を想定する。この場合、ゲル体積率は約８である。また、本実施形態に係る細胞構造体１の外形が、例えば円柱形であり、長手方向における長さＬ１が例えば２ｍｍであり、短手方向における長さＬ２が例えば２００μｍであり、シェル部１１を構成するゲル状物質の厚さが例えば５０μｍである場合を想定する。この場合、ゲル体積率は約４．２である。
【００３３】
シェル部１１を構成するゲル状物質は、その後の工程において除去されることが想定される。ゲル状物質の除去は、例えばＥＤＴＡ等のキレート剤を用いてゲル状物質を解離させることにより行われる。ゲル体積率が大きいと、キレート剤による処理時間が長くなり、細胞２へのダメージが大きくなる。本実施形態に係る細胞構造体１の外形は、非球状とされており、アスペクト比が１よりも大きいので、球状の外形を有する比較例３に係る細胞構造体１Ｘと比較して、ゲル体積率を小さくすることができ、シェル部１１を構成するゲル状物質を除去する際のキレート剤による処理時間を短くすることができる。特に、細胞構造体１の外形形状を円柱状とすることで、ゲル体積率を小さくすることができる。また、細胞構造体１の外形形状を四角柱状または六角柱状とすることで、同一サイズの円柱状とする場合と比較して、ゲル体積率は大きくなるが、細胞構造体１の表面積を大きくすることができ、コア部１０における酸素及び栄養分の取り込みの点において有利となる。
【００３４】
また、本実施形態に係る細胞構造体１は、アスペクト比が１００以下とされているので、例えば、細胞構造体１を培養する培養工程における細胞構造体１のハンドリング性を高めることができる。すなわち、複数の細胞構造体１を培地中に分散させて培養を行った場合、細胞構造体同士が絡み合うリスクを低減することができる。アスペクト比を２０以下とすることで、細胞構造体１のハンドリング性を更に高めることが可能となる。
【００３５】
また、本実施形態に係る細胞構造体１の短手方向における長さＬ２は、１０μｍ以上５００μｍ以下であることが好ましい。細胞構造体１の短手方向における長さＬ２を、１０μｍ以上とすることで、細胞構造体１の製造に用いられる後述するマイクロ流路への細胞懸濁液の注入を適切に行うことが可能となる。また、細胞構造体１の短手方向における長さＬ２を、５００μｍ以下とすることで、細胞構造体１を培地中に分散させて培養を行う場合に、コア部１０の中心部にも、十分な量の酸素及び栄養分を供給することが可能となる。
【００３６】
本実施形態に係る細胞構造体１において、シェル部１１を構成するゲル状物質は、コア部１０を構成する細胞懸濁液の全周を欠陥なく覆っている。すなわち、細胞構造体１の長手方向の端部においてもシェル部１１がコア部１０を十分な厚さで覆っている。また、シェル部１１の厚さは、シェル部１１の全域に亘り、シェル部１１の平均厚さの０．１倍以上３倍以下とされている。シェル部１１の平均厚さは、以下のようにして求められる。
【００３７】
すなわち、１０個の細胞構造体１を無作為に抽出し、抽出した細胞構造体１の各々について位相差顕微鏡にて観察を行う。細胞構造体１の各々について、図３に示すように、コア部１０を構成するゲル状物質の厚さが最も厚い部位Ａ１、厚さが最も薄い部位Ａ２、および、厚さが最も厚い部位Ａ１を起点に、シェル部１１を８等分する部位Ａ３〜Ａ９を含む合計９つの部位Ａ１〜Ａ９を抽出し、これら９つの部位Ａ１〜Ａ９の厚さを平均した平均値Ｘｉを求める。１０個の細胞構造体１の各々について求めた平均値Ｘｉの平均値Ｘを、シェル部１１の平均厚さとする。なお、シェル部１１の各部位Ａ１〜Ａ９における厚さは、シェル部１１の内壁の、当該部位に対応する点ａと、点ａから内壁に対し直角に伸ばした線がシェル部１１の外壁と交わる点ｂと、を結ぶ線分ａｂの長さを意味する。
【００３８】
以下に、細胞構造体１の製造方法について説明する。図４は、細胞構造体１の製造に用いられるマイクロ流路２０の構成の一例を示す断面図である。マイクロ流路２０は、ＭＥＭＳ（Micro Electro Mechanical Systems）技術などの微細加工技術を利用して形成される流路を有するデバイスである。マイクロ流路２０の材料としては、特に限定されないが、ガラス、ＰＤＭＳ（Polydimethylsiloxane）、石英、樹脂などを用いることができる。マイクロ流路２０は、メイン流路２１、第１の分岐流路２２、第２の分岐流路２３、第３の分岐流路２４を含んで構成されている。
【００３９】
メイン流路２１は、細胞構造体１のコア部１０を構成する細胞懸濁液が流通する管状の流路である。本実施形態において、メイン流路２１は、一直線に伸びており、マイクロ流路２０内において細胞懸濁液の流れ方向は直線的となる。メイン流路２１の、通液方向（細胞懸濁液の流れ方向）に直交する断面の形状は、特に限定されないが、例えば、円形、楕円形であってもよく、また、四角形、六角形等の多角形であってもよい。メイン流路２１の管径は、製造される細胞構造体１の短手方向における長さＬ２に対応する。従って、メイン流路２１の管径は、製造される細胞構造体１の目標サイズに応じて設定される。
【００４０】
第１の分岐流路２２は、細胞構造体１のシェル部１１を構成するゲル状物質の材料となるゲル前駆体が注入される第１の注入口２５に連通している。第１の分岐流路２２は、メイン流路２１上の第１の合流部２６においてメイン流路２１に合流する。
【００４１】
第２の分岐流路２３は、気体が注入される第２の注入口２７に連通している。第２の分岐流路２３は、メイン流路２１の、第１の合流部２６よりも通液方向（細胞懸濁液の流れ方向）の下流側に配置された第２の合流部２８においてメイン流路２１に合流する。
【００４２】
第３の分岐流路２４は、ゲル前駆体をゲル化させるゲル化剤が注入される第３の注入口２９に連通している。第３の分岐流路２４は、メイン流路２１の、第２の合流部２８よりも通液方向（細胞懸濁液の流れ方向）の下流側に配置された第３の合流部３０においてメイン流路２１に合流する。
【００４３】
図５は、細胞構造体１の製造方法の一例を示す工程フロー図である。細胞構造体１の製造方法は、細胞懸濁液流通工程Ｐ１、被覆工程Ｐ２、交互流形成工程Ｐ３及びゲル化工程Ｐ４を含む。図６は、細胞構造体１を製造しているときのマイクロ流路２０内の様子を示す図である。
【００４４】
細胞懸濁液流通工程Ｐ１において、複数の細胞を含む細胞懸濁液３をメイン流路２１内に注入し、メイン流路２１内に細胞懸濁液３を流通させる。細胞懸濁液３の注入は、例えばシリンジを用いて行われる。細胞懸濁液３に含まれる細胞の密度がマイクロ流路２０内において均一となるように、シリンジ内の細胞懸濁液３を撹拌するなどして、細胞の沈降を抑制することが好ましい。また、メイン流路２１内への細胞懸濁液３の単位時間当たりの注入量を一定とすることで、メイン流路２１内を流通する細胞懸濁液３の流量を一定とすることが好ましい。注入された細胞懸濁液３は、メイン流路２１に沿って下流側に向けて流れる。
【００４５】
被覆工程Ｐ２において、第１の注入口２５からゲル前駆体４を注入して、メイン流路２１を流通する細胞懸濁液３の周囲をゲル前駆体４によって被覆する。第１の注入口２５から注入されたゲル前駆体４は、第１の分岐流路２２を経由して、第１の合流部２６において、メイン流路２１を流通する細胞懸濁液３と合流し、細胞懸濁液３の周囲を被覆する。ゲル前駆体４は、細胞構造体１のシェル部１１を構成するゲル状物質の材料である。ゲル前駆体４として例えばアルギン酸ナトリウムの水溶液を用いることができる。第１の分岐流路２２へのゲル前駆体４の単位時間当たりの注入量を一定とし、第１の分岐流路２２内を流通するゲル前駆体４の流量を一定とすることが好ましい。ゲル前駆体４によって被覆された細胞懸濁液３は、メイン流路２１に沿って更に下流側に向けて流れる。
【００４６】
交互流形成工程Ｐ３において、第２の注入口２７から気体５を注入して、ゲル前駆体４によって被覆された細胞懸濁液３と気体５とによる交互流をメイン流路２１内に形成する。第２の注入口２７から注入された気体５は、第２の分岐流路２３を経由して第２の合流部２８においてメイン流路２１を流通するゲル前駆体４によって被覆された細胞懸濁液３と合流する。気体５が、ゲル前駆体４によって被覆された細胞懸濁液３と接触することで、ゲル前駆体４によって被覆された細胞懸濁液３と気体５とが交互に配置された状態で流動する交互流がメイン流路２１内に形成される。すなわち、ゲル前駆体４によって被覆された細胞懸濁液３は、気体５によって分断され、個片化される。個片化された細胞懸濁液の気体５と接する側の表面には、ゲル前駆体４が周り込む。これにより、個片化された細胞懸濁液の全周は、ゲル前駆体４によって覆われる。
【００４７】
交互流形成工程Ｐ３において、第２の注入口２７から注入される気体５の単位時間当たりの注入量は一定であることが好ましい。気体５の単位時間当たりの注入量を一定とすることで、上記交互流における、ゲル前駆体４によって被覆された細胞懸濁液３の通液方向における長さと、気体５の通液方向における長さをそれぞれ一定とすることができる。すなわち、ゲル前駆体４によって被覆された細胞懸濁液３の個片の長さを一定とすることができ、これにより、本製造方法によって製造される細胞構造体１の長手方向の長さＬ１を一定とすることができる。なお、気体５の単位時間当たりの注入量を一定にするとは、本製造方法により製造される細胞構造体１の長手方向の長さＬ１が、細胞構造体１を利用する目的に応じて許容されるばらつきに収まる程度であればよく厳密な意味での一定ではない。
【００４８】
気体５のマイクロ流路２０内への注入は、連続的であってもよいし、間欠的であってもよい。気体５の注入を間欠的に行う場合、市販のディスペンサを用いてもよいし、マスフローコントローラの開度を間欠状のパターンに調整してもよい。また、ゲル前駆体４によって被覆された細胞懸濁液３の第２の分岐流路２３内への侵入を防止するために、気体５の注入時の圧力を０．１ＭＰａ以上とすることが好ましい。また、気体５が通過する第２の分岐流路２３の管径は、０．１ｍｍ以上０．５ｍｍ以下であることが好ましく、上記の範囲内において極力細い方が好ましい。
【００４９】
気体５として、空気、酸素、窒素、二酸化炭素等の細胞毒性を有さないものを用いることができる。また、気体５は、細胞懸濁液３に含まれる細胞の培養に適した組成及び温度に調整されていることが好ましい。気体５として、例えば、二酸化炭素５％、酸素２０％及び窒素７５％を含むガスを好適に用いることができ、そのガスの温度が３７℃に調整されていることが更に好ましい。
【００５０】
ここで、ゲル前駆体４によって被覆された細胞懸濁液３と気体５とによる交互流を安定的に形成するためには、メイン流路２１の内壁が、ゲル前駆体４に対して比較的高い撥水性を有していることが好ましい。仮に、メイン流路２１の内壁のゲル前駆体４に対する撥水性が不足する場合、気体５とメイン流路２１の内壁との間に、ゲル前駆体４が周り込み、気体５の周囲がゲル前駆体４によって覆われてしまうおそれがある。すなわち、メイン流路２１の内壁のゲル前駆体４に対する撥水性が不足する場合、気体５は、メイン流路２１内において気泡となり、ゲル前駆体４によって被覆された細胞懸濁液３と気体５とによる交互流を安定的に形成することが困難となるおそれがある。この場合、ゲル前駆体４によって被覆された細胞懸濁液３の個片化を適切に行うことが困難となる。
【００５１】
メイン流路２１の内壁のゲル前駆体４に対する撥水性を高める方法として、メイン流路２１の内壁を、例えば、パーフルオロアルキル鎖などの疎水基を有するシランカップリング剤によって含浸処理する方法が挙げられる。その他の方法として、メイン流路２１の端部よりＣＦ系のプラズマを照射する方法が挙げられる。メイン流路２１の内壁の素材の疎水度や処理条件を調整することで、所望の撥水性を得ることができる。
【００５２】
メイン流路２１の内壁のゲル前駆体４に対する撥水性は、メイン流路２１の内壁に対するゲル前駆体４の接触角θによって定量化することができる。本明細書において、接触角θは、下記の測定方法によって測定されるもの意味する。図７は、接触角θの測定方法を示す図である。図７に示すように、メイン流路２１内に、所定量のゲル前駆体４０を注入する。これによりメイン流路２１内に形成される、気体５０とゲル前駆体４０との界面Ｓ２と、メイン流路２１の内壁面Ｓ１とのなす角を接触角θとする。
【００５３】
メイン流路２１の内壁に対するゲル前駆体４の接触角θは、５０°以上であることが好ましい。接触角θを５０°以上とすることで、交互流形成工程Ｐ３において、ゲル前駆体４によって被覆された細胞懸濁液３と気体５とによる交互流を安定的に形成することができ、ゲル前駆体４によって被覆された細胞懸濁液３の個片化を適切に行うことが可能となる。
【００５４】
ゲル化工程Ｐ４において、第３の注入口２９からゲル化剤６を注入し、ゲル前駆体４によって被覆された細胞懸濁液３と気体５とによる交互流にゲル化剤６を合流させることで、ゲル前駆体４をゲル化させる。第３の注入口２９から注入されたゲル化剤６は、第３の分岐流路２４を経由して第３の合流部３０においてメイン流路２１を流通する交互流と合流する。ゲル化剤６が、細胞懸濁液３を被覆するゲル前駆体４に接触することで、ゲル前駆体４において架橋反応が生じ、ゲル前駆体４がゲル化される。これにより、ゲル状物質からなるシェル部１１が形成される。ゲル前駆体４は、細胞懸濁液３の全周を被覆した状態を維持したままゲル化されるので、細胞懸濁液３の全周が、欠陥なくゲル状物質によって覆われる。ゲル化剤６として例えば塩化カルシウムの水溶液を用いることができる。細胞懸濁液３の周囲をゲル状物質で被覆した細胞構造体１の個片が、マイクロ流路２０の下流側の端部から連続的に排出される。
【００５５】
以上のように、開示の技術の実施形態に係る細胞構造体１の製造方法によれば、交互流形成工程Ｐ３において、ゲル前駆体４によって被覆された細胞懸濁液３と気体５とによる交互流がメイン流路２１内において形成されることで、ゲル前駆体４によって被覆された細胞懸濁液３が分断され、個片化される。その後、ゲル化工程Ｐ４において、ゲル前駆体４は細胞懸濁液３の全周を被覆した状態を維持しつつゲル化される。すなわち、本実施形態に係る製造方法によれば、細胞構造体１の個片化は、交互流形成工程Ｐ３において実質的に完了しているので、ゲル化後に、細胞構造体１を切断すること、または引きちぎることを要しない。
【００５６】
図８Ａは、開示の技術の実施形態に係る製造方法によって製造された細胞構造体１の位相差顕微鏡画像であり、図８Ｂは図８Ａに対応する細胞構造体１の模式図である。図９Ａは、ファイバ状の細胞構造体をシェル部のゲル化後に切断することにより個片化された比較例１に係る細胞構造体１Ｙの位相差顕微鏡画像であり、図９Ｂは図９Ａに対応する細胞構造体１Ｙの模式図である。図１０Ａは、ファイバ状の細胞構造体をシェル部のゲル化後に引きちぎることにより個片化された比較例２に係る細胞構造体１Ｚの位相差顕微鏡画像であり、図１０Ｂは図１０Ａに対応する細胞構造体１Ｚの模式図である。
【００５７】
比較例１に係る細胞構造体１Ｙによれば、図９Ｂに示すように、切断面がシェル部１１によって覆われず、切断面からコア部１０が露出するので、切断面からコア部１０の細胞懸濁液が漏出する。一方、開示の技術の実施形態に係る細胞構造体１の製造方法によれば、シェル部１１のゲル化後に、細胞構造体を切断することを要しないので、個片化に伴う細胞懸濁液の漏出を回避することができる。
【００５８】
比較例２に係る細胞構造体１Ｚによれば、図１０Ｂに示すように、引きちぎり部分１２の先端が、引っ張り方向に引き伸ばされ、当該部分におけるシェル部１１の厚さが他の部分と比較して厚くなる。シェル部１１の厚さが過大となる部分からは、酸素及び栄養分の取り込みが困難となるおそれがある。一方、開示の技術の実施形態に係る細胞構造体１の製造方法によれば、シェル部１１のゲル化後に細胞構造体を引きちぎることを要しないので、シェル部１１の厚さばらつきを抑制することが可能となる。
【００５９】
また、開示の技術の実施形態に係る製造方法によれば、交互流形成工程Ｐ３において個片化された細胞懸濁液３の気体５と接する側の表面にはゲル前駆体４が周り込み、個片化された細胞懸濁液３の全周は、ゲル前駆体４によって覆われる。その後、ゲル化工程Ｐ４において、ゲル前駆体４は細胞懸濁液３の全周を被覆した状態を維持したままゲル化される。従って、シェル部１１における欠陥の発生を抑制することができ、また、シェル部１１の各部位における厚さばらつきを抑制することができる。
【００６０】
また、開示の技術の実施形態に係る製造方法によれば、細胞懸濁液３のマイクロ流路２０への単位時間当たりの注入量と、気体５のマイクロ流路２０への単位時間当たりの注入量との比率を調整することにより、ゲル前駆体によって被覆された細胞懸濁液３の個片の通液方向（細胞懸濁液の流れ方向）における長さを調整することが可能となる。結果として、製造される細胞構造体１のアスペクト比を調整することが可能となる。例えば、細胞懸濁液３に対する気体５の注入比率を高めることで、細胞構造体１の長手方向における長さＬを短くすることができ、アスペクト比を小さくすることができる。また、メイン流路２１の管径の設定によっても、製造される細胞構造体１のアスペクト比を調整することが可能である。例えば、メイン流路２１の管径及び細胞懸濁液３のマイクロ流路２０への単位時間当たりの注入量が固定である場合、交互流形成工程Ｐ３において、気体５のマイクロ流路２０への単位時間当たりの注入量を調整することによって、製造される細胞構造体１のアスペクト比を調整することが可能である。
【００６１】
このように、開示の技術の実施形態に係る細胞構造体の製造法によれば、培養に適した構造の細胞構造体を製造することが可能となる。
【００６２】
図１１は、開示の技術の実施形態に係る細胞培養方法の一例を示す工程フロー図である。開示の技術の実施形態に係る細胞培養方法は、上記の製造方法によって製造された細胞構造体１を培地中で培養する培養工程Ｐ１１を含む。例えば、図１２に示されるように、密閉されたバッグ状の培養容器１００に、複数の細胞構造体１を培地１１０とともに収容して培養を行ってもよい。なお、培地１１０の粘度を調整することにより、細胞構造体１が培地１１０中において浮遊した状態を維持するようにしてもよい。また、必要に応じて細胞構造体１及び培地１１０を含む細胞懸濁液を、撹拌しながら培養を行ってもよい。
【００６３】
培地１１０に含まれる酸素及び栄養分は、細胞構造体１のシェル部（ゲル状物質）を透過してコア部（細胞）に達することができる。細胞構造体１の短手方向における長さＬ２を５００μｍ以下とすることで、培地１１０中に含まれる酸素及び栄養分は、コア部の中心にまで達することができる。また、細胞構造体１のアスペクト比を１００以下とすることで、培養期間中に細胞構造体１同士が絡み合うリスクを抑制することができ、培養期間中における細胞構造体１のハンドリングが容易となる。
【００６４】
細胞構造体１を培養することで、コア部の細胞は増殖し、コア部に形成される細胞凝集体のサイズが大きくなる。コア部の全周がシェル部を構成するゲル状物質によって被覆されているので、コア部において細胞の増殖が無制限に生じることはなく、コア部に形成される細胞凝集体のサイズの拡大は、コア部における細胞の密度が、あるレベルに達した段階で停止する。すなわち、コア部に形成される細胞凝集体のサイズの拡大は、コア部がシェル部に覆われることで制限される。
【００６５】
このように、細胞構造体１を用いる本実施形態に係る細胞培養方法によれば、細胞凝集体のサイズが、細胞構造体１のサイズを超えて拡大することがないので、細胞凝集体のサイズが過大となることを回避することができる。従って、細胞凝集体の中心部への酸素及び栄養分の供給不足による細胞死の発生のリスクを抑制することができる。すなわち、本実施形態に係る細胞培養方法によれば、細胞の生存率を高めることができ、培養効率を向上させることができる。
【００６６】
開示の技術の実施形態に係る細胞培養方法は、上記の培養工程Ｐ１１の後に、シェル部１１を構成するゲル状物質を除去する除去工程Ｐ１２を更に含み得る。ゲル状物質の除去は、例えば、培養工程Ｐ１１を開始してから所定期間経過後（例えば数日後）に実施してもよい。上記所定期間として、例えば、コア部の細胞が、８０％程度のコンフルエンシーに達するまでの期間を適用してもよい。ゲル状物質の除去は、例えば、ＥＤＴＡ等のキレート剤を用いてゲル状物質を解離させることにより行われる。
【００６７】
上記のように、本実施形態に係る細胞構造体１の外形は、非球状とされており、アスペクト比が１よりも大きいので、球状の外形を有する比較例３に係る細胞構造体１Ｘ（図２参照）と比較して、ゲル体積率を小さくすることができ、シェル部を構成するゲル状物質を除去する際のキレート剤による処理時間を短くすることができる。
【００６８】
開示の技術の実施形態に係る細胞培養方法は、シェル部を構成するゲル状物質が除去されることにより露出したコア部の細胞凝集体を、サイズのより小さい細胞凝集体または単一細胞に分割する分割工程Ｐ１３を含み得る。細胞凝集体の分割は、例えば、細胞凝集体を、メッシュに通すことにより行ってもよい。また、細胞解離作用を発揮する薬液処理により細胞凝集体を分割してもよい。分割された細胞凝集体は、細胞構造体１の製造に再利用することが可能である。これにより、細胞の大量生産が可能となる。
【００６９】
開示の技術の実施形態に係る製造方法及び比較例に係る製造方法を用いて製造した細胞構造体の評価結果を下記の表１に示す。各実施例及び各比較例における、細胞構造体の製造方法、形状、アスペクト比、マイクロ流路の内壁に対するゲル前駆体の接触角、製造方法における開放系／閉鎖系の種別、シェル部の厚さは、表１に示すとおりである。
【表１】
2020066306.tif 000003
【００７０】
実施例１〜８及び比較例１、２、４については、以下に示す流路構成のマイクロ流路を用いた。具体的には、内径０．６ｍｍ、外径１．０ｍｍの円柱ガラスキャピラリー、及び、内径１ｍｍ、外径１．５ｍｍの角柱を組み合わせ、マイクロ流路を作製した。なお、円柱ガラスキャピラリーの片側は内径０．２５ｍｍとなるように、ガラスプーラー（ナリシゲ製ＰＣ−１００）にて加工した。
【００７１】
使用する液を以下のように準備した。
細胞懸濁液：Vitronectin（Lifetechnologies）を０．５μｇ／ｃｍ２コートしたＴフラスコ（Corning）内で、Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ−８培地（Lifetechnologies）中でヒトｉＰＳ細胞を２．０×１０４ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２となるように播種し、４日間培養した。培養したヒトｉＰＳ細胞を、ＤＰＢＳ（Lifetechnologies）で洗浄し、ＴｒｙＰＬＥ Ｓｅｌｅｃｔ(Lifetechnologies)で回収し、遠心分離機（Thermo Fisher）にて３００Ｇ、４分間の遠心分離を行い、Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ−８に１．３×１０７ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように細胞懸濁液を調整した。
ゲル前駆体：アルギン酸ナトリウム（和光純薬）１.５０質量部、塩化ナトリウム（和光純薬）０．８５質量部、蒸留水９７．６５質量部を完全に溶解するまで撹拌し、オートクレーブにて、１２０℃、６０分間滅菌処理を行った。
ゲル化剤：スクロース（和光純薬）３質量部、塩化カルシウム１．１１質量部、蒸留水９５．８９質量部を完全に溶解するまで撹拌し、オートクレーブにて、１２０℃、６０分間滅菌処理を行った。
準備した液を、シリンジポンプ（ハーバード製ＰＤ４０００）にて、それぞれ以下の流量にて送液した。
細胞懸濁液：５０μＬ／ｍｉｎ
ゲル前駆体：１５０μＬ／ｍｉｎ
ゲル化剤：４ｍＬ／ｍｉｎ
また、気体は圧縮空気（元圧０．４ＭＰａ）を、マスフローメータ（フジキン製ＦＣＳＴ１００５ＦＣ−ＡＩＲ）を用いて流量を調整して送気した。いずれの液及び気体も２５℃の室内で温調し、同温度下で使用した。
【００７２】
実施例１は、比較例１及び比較例２との対比を考慮し、細胞構造体のアスペクト比を、比較例１及び比較例２と同としたものであり、気体の流量を１２０μＬ／ｍｉｎに調整して送気することで、細胞構造体のアスペクト比を５０としたものである。実施例１に係る細胞構造体の長手方向における長さＬ１は１１．５ｍｍであり、短手方向における長さＬ２は０．２３ｍｍであった。実施例２は、開示の技術の実施形態に係る細胞構造体の典型例であり、気体の流量を４５０μＬ／ｍｉｎに調整して送気することで、細胞構造体のアスペクト比を１０としたものである。実施例２に係る細胞構造体の長手方向における長さＬ１は２．３ｍｍであり、短手方向における長さＬ２は０．２３ｍｍであった。
【００７３】
実施例３及び４は、典型例（実施例２）に対して、細胞構造体の形状を変更したものであり、それぞれ、四角柱及び六角柱とした。実施例１、２、５−９及び比較例１、２に係る細胞構造体の形状は円柱状であり、比較例３に係る細胞構造体の形状は球状である。細胞構造体の形状の変更は、細胞構造体の製造に用いるマイクロ流路の流路断面の形状変更により行った。
【００７４】
実施例５は、典型例（実施例２）に対して、マイクロ流路の内壁に対するゲル前駆体の接触角θを小さくしたものである。換言すれば、実施例１−４、６−８、比較例１、２は、内壁面の撥水処理を施したマイクロ流路を用いて製造されたものであり、実施例５は、撥水処理を施さないマイクロ流路（ガラスキャピラリー）を用いて製造されたものである。実施例１−４、６−８、比較例１、２における撥水処理を、以下の手順で行った。１質量％酢酸とエタノールの比率を２０：８０とした液を用意し、この液に信越シリコーン製シランカップリング剤ＫＢＥ-３０８３を１質量％濃度となるよう添加し、１時間室温で撹拌し加水分解した。この液にガラス製のマイクロ流路を６時間浸漬し、室温で乾燥した後、表面温度を１００℃に設定したホットプレート上で１０分間加熱した。比較例４は、酸素プラズマ処理機（ヤマト科学製ＰＲ−５００）にて１５Ｐａで１分処理したガラスキャピラリーで構成されたマイクロ流路を用いて製造されたものである。
【００７５】
マイクロ流路の内壁に対するゲル前駆体の接触角を、以下の手順で取得した。マイクロ流路のメイン流路に、マイクロピペットを用いて解離性ハイドロゲル前駆体液を１００μｌ注入し、倒立顕微鏡（Zeiss製AXIO Obeserver.Z1）にて観察し、気液界面の透過像を撮影した。この画像から、図７に示すように、解離性ハイドロゲル前駆体液と空気の界面と、メイン流路の内壁面とのなす角を、接触角θとして取得した。撥水処理を施した場合（実施例１−４、６−８及び比較例１、２）の接触角θは、それぞれ１００°であった。一方、撥水処理を施さない実施例５の接触角θは、６０°であった。酸素プラズマ処理を施したガラスキャピラリーを用いた比較例４の接触角θは、３０°であった。
【００７６】
実施例６、７、８は、それぞれ、典型例（実施例２）に対して細胞構造体のアスペクト比を変更したものである。実施例６は、気体の流量を７０μＬ／ｍｉｎに調整して送気することで、細胞構造体のアスペクト比を１００としたものである。実施例６に係る細胞構造体の長手方向における長さＬ１は２３．０ｍｍであり、短手方向における長さＬ２は０．２３ｍｍであった。実施例７は、気体の流量を３．１ｍＬ／ｍｉｎに調整して送気することで、細胞構造体のアスペクト比を３としたものである。実施例７に係る細胞構造体の長手方向における長さＬ１は０．６９ｍｍであり、短手方向における長さＬ２は０．２３ｍｍであった。実施例８は、気体の流量を５．２ｍＬ／ｍｉｎに調整して送気することで、細胞構造体のアスペクト比を１．５としたものである。実施例８に係る細胞構造体の長手方向における長さＬ１は０．３５ｍｍであり、短手方向における長さＬ２は０．２３ｍｍであった。
【００７７】
比較例１は、マイクロ流路を用いてファイバ状の細胞構造体を形成した後、これをカッターで切断することにより個片化したものである。比較例２は、マイクロ流路を用いてファイバ状の細胞構造体を形成した後、これを引きちぎることにより個片化したものである。比較例３は、細胞及びゲル前駆体を含む液滴をゲル化剤に滴下することにより作製したものである。すなわち、比較例３は、マイクロ流路を用いることなく製造されたものであり、細胞構造体の製造環境が開放系となる。比較例３に係る細胞構造体の形状は、その製造方法に起因して球形となり、従って細胞構造体のアスペクト比は１となる。比較例４は、上記のように、酸素プラズマ処理を施したガラスキャピラリーを用いることにより接触角θを３０°としたものである。実施例１〜８及び比較例１〜４に係る細胞構造体は、全て、ｉＰＳ細胞を含む細胞懸濁液からなるコア部と、コア部の周囲を覆うゲル状物質からなるシェル部とを含むコア・シェル型の細胞構造体である。
【００７８】
実施例１〜８及び比較例１〜４に係る細胞構造体について、シェル部における欠陥の有無を確認した。比較例１に係る細胞構造体については、カッターで切断した切断面においてコア部が露出し、切断面からコア部の細胞懸濁液が漏出した。すなわち、比較例１に係る細胞構造体は、シェル部に欠陥を含む構造であった。実施例１〜８及び比較例２〜４に係る細胞構造体については、シェル部に欠陥は確認されなかった。
【００７９】
実施例１〜８及び比較例１〜４に係る細胞構造体を、それぞれ１００個ずつ倒立顕微鏡（Zeiss製AXIO Obeserver.Z1）にて観察し、各細胞構造体のシェル部が他の細胞構造体のシェル部と連結しているものの個数割合を示す連結度を、以下の基準で評価した。マイクロ流路の内壁に対するゲル前駆体の接触角が小さい実施例５及び比較例４に係る細胞構造体において、連結度が高くなることが確認された。
１：連結度が２５％以上
２：連結度が１％以上２５％未満
３：連結度が０％
【００８０】
実施例１〜８及び比較例１〜４に係る細胞構造体について、それぞれ細胞密度が１．３×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように調製した細胞構造体分散液を用意した。細胞構造体分散液の調製は、沈降・上澄み液廃却と、Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ８培地（Life technologies社製）による希釈操作により行った。細胞構造体分散液における細胞密度は、コア部の細胞懸濁液における細胞密度、細胞構造体作製時における各液の送液量から計算した。各実施例及び各比較例に係る細胞構造体分散液２０ｍＬを、スターラー（１ｍｍ長／ＰＴＦＥ製）にて１００ｒｐｍで５分間緩やかに撹拌した後１０分間静置した。この操作で沈降した各実施例及び各比較例に係る細胞構造体を、それぞれ１００個ずつ倒立顕微鏡（Zeiss製AXIO Obeserver.Z1）にて観察し、細胞構造体同士が絡み合っているものの個数割合を示す凝集度を、以下の基準で評価した。細胞構造体のアスペクト比が高い実施例１、６及び比較例１、２に係る細胞構造体において、凝集度が高くなることが確認された。
１：凝集度が２５％以上
２：凝集度が１％以上２５％未満
３：凝集度が０％
【００８１】
実施例１〜８及び比較例１〜４に係る細胞構造体を４日間培養し、ＰＢＳ（Phosphate Buffered Saline）で洗浄したのち、０．５ｍｏｌ／ｌ−ＥＤＴＡ（ナカライテスク社製）に浸した。ＥＤＴＡ処理中の細胞構造体を位相差顕微鏡観察し、シェル部のゲル状物質が完全に分解した時間を、以下の基準で評価した。細胞構造体のアスペクト比が小さくなる程、ＥＤＴＡ処理時間が長くなることが確認された。
１：３分以上
２：１分以上３分未満
３：３０秒以上１分未満
４：５秒以上３０秒未満
５：５秒未満
【００８２】
コア部におけるｈｉＰＳ細胞の細胞密度が１．３×１０７ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように作製した実施例２に相当する細胞構造体のサンプルを、Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ８培地（Life technologies社製）中で、２４時間毎に培地交換を行いながら４日間培養した。培養４日目のサンプルを位相差顕微鏡で観察した。コア部のｈｉＰＳ細胞が生存したまま増殖することをトリパンブルー染色により確認した。
【００８３】
４日間培養した上記サンプルをＰＢＳで洗浄したのち、０．５ｍｏｌ／ｌ−ＥＤＴＡ（ナカライテスク社製）に１分間浸した。ＥＤＴＡ処理中のサンプルを位相差顕微鏡観察した。コア部のｈｉＰＳ細胞の凝集体が、コア部の形状を維持したまま、シェル部を形成するゲル状物質が溶解することを確認した。
【図１】
2020066306.tif 000004
【図２】
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【図３】
2020066306.tif 000006
【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１１】
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【図１２】
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【手続補正書】
【提出日】令和3年3月12日(2021.3.12)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１２】
開示の技術は、複数の細胞を含む細胞懸濁液の周囲をゲル状物質によって被覆した細胞構造体において、培養に適した構造を有する細胞構造体、細胞構造体の製造方法、細胞培養方法及びマイクロ流路を提供する。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６９】
開示の技術の実施形態に係る製造方法及び比較例に係る製造方法を用いて製造した細胞構造体の評価結果を下記の表１に示す。各実施例及び各比較例における、細胞構造体の製造方法、形状、アスペクト比、マイクロ流路の内壁に対するゲル前駆体の接触角、製造方法における開放系／閉鎖系の種別、シェル部の厚さは、表１に示すとおりである。
【表１】
2020066306.tif 000019
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００７５】
マイクロ流路の内壁に対するゲル前駆体の接触角を、以下の手順で取得した。マイクロ流路のメイン流路に、マイクロピペットを用いて解離性ハイドロゲル前駆体液を１００μｌ注入し、倒立顕微鏡（Zeiss製AXIO Observer.Z1）にて観察し、気液界面の透過像を撮影した。この画像から、図７に示すように、解離性ハイドロゲル前駆体液と空気の界面と、メイン流路の内壁面とのなす角を、接触角θとして取得した。撥水処理を施した場合（実施例１−４、６−８及び比較例１、２）の接触角θは、それぞれ１００°であった。一方、撥水処理を施さない実施例５の接触角θは、６０°であった。酸素プラズマ処理を施したガラスキャピラリーを用いた比較例４の接触角θは、３０°であった。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００７９】
実施例１〜８及び比較例１〜４に係る細胞構造体を、それぞれ１００個ずつ倒立顕微鏡（Zeiss製AXIO Observer.Z1）にて観察し、各細胞構造体のシェル部が他の細胞構造体のシェル部と連結しているものの個数割合を示す連結度を、以下の基準で評価した。マイクロ流路の内壁に対するゲル前駆体の接触角が小さい実施例５及び比較例４に係る細胞構造体において、連結度が高くなることが確認された。
１：連結度が２５％以上
２：連結度が１％以上２５％未満
３：連結度が０％
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００８０】
実施例１〜８及び比較例１〜４に係る細胞構造体について、それぞれ細胞密度が１．３×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように調製した細胞構造体分散液を用意した。細胞構造体分散液の調製は、沈降・上澄み液廃却と、Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ８培地（Life technologies社製）による希釈操作により行った。細胞構造体分散液における細胞密度は、コア部の細胞懸濁液における細胞密度、細胞構造体作製時における各液の送液量から計算した。各実施例及び各比較例に係る細胞構造体分散液２０ｍＬを、スターラー（１ｍｍ長／ＰＴＦＥ製）にて１００ｒｐｍで５分間緩やかに撹拌した後１０分間静置した。この操作で沈降した各実施例及び各比較例に係る細胞構造体を、それぞれ１００個ずつ倒立顕微鏡（Zeiss製AXIO Observer.Z1）にて観察し、細胞構造体同士が絡み合っているものの個数割合を示す凝集度を、以下の基準で評価した。細胞構造体のアスペクト比が高い実施例１、６及び比較例１、２に係る細胞構造体において、凝集度が高くなることが確認された。
１：凝集度が２５％以上
２：凝集度が１％以上２５％未満
３：凝集度が０％
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００８１】
実施例１〜８及び比較例１〜４に係る細胞構造体を４日間培養し、ＰＢＳ（Phosphate Buffered Saline）で洗浄したのち、０．５ｍｍｏｌ／ｌ−ＥＤＴＡ（ナカライテスク社製）に浸した。ＥＤＴＡ処理中の細胞構造体を位相差顕微鏡観察し、シェル部のゲル状物質が完全に分解した時間を、以下の基準で評価した。細胞構造体のアスペクト比が小さくなる程、ＥＤＴＡ処理時間が長くなることが確認された。
１：３分以上
２：１分以上３分未満
３：３０秒以上１分未満
４：５秒以上３０秒未満
５：５秒未満
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００８３】
４日間培養した上記サンプルをＰＢＳで洗浄したのち、０．５ｍｍｏｌ／ｌ−ＥＤＴＡ（ナカライテスク社製）に１分間浸した。ＥＤＴＡ処理中のサンプルを位相差顕微鏡観察した。コア部のｈｉＰＳ細胞の凝集体が、コア部の形状を維持したまま、シェル部を形成するゲル状物質が溶解することを確認した。
【国際調査報告】
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2020066306.tif 000021
2020066306.tif 000022
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