(57)【要約】  これまで得られた野生型ヒドロキシニトリルリアーゼ（ＨＮＬ）の活性は産業用としては十分ではなく、更にすぐれた活性を有するＨＮＬが求められていた。本発明者らは、ＨＮＬと（Ｒ）−マンデロニトリルの立体構造に基づき予測された種々のアミノ酸変異を野生型ＨＮＬに導入し、その活性を測定した。その結果、特定の部位のアミノ酸改変がヤスデ由来のＨＮＬに共通した活性上昇をもたらすことを見出した。よって、本発明は、ヤスデ由来の（Ｒ）−ＨＮＬタンパク質における１種類以上のアミノ酸置換を有し、かつ、（Ｒ）−ＨＮＬ活性を有する、（Ｒ）−ＨＮＬ変異体タンパク質に関する。より具体的には、（Ｒ）−ＨＮＬの３番目のβシート構造（β３）、４番目のβシート構造（β４）、５番目のβシート構造（β５）におけるアミノ酸置換を有するＨＮＬに関する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヤスデ由来の（Ｒ）−ヒドロキシニトリルリアーゼの変異体タンパク質であって、以下の（ａ）〜（ｅ）から選択される１種類以上のアミノ酸置換を有し、かつ、（Ｒ）−ヒドロキシニトリルリアーゼ活性を有する、（Ｒ）−ヒドロキシニトリルリアーゼ変異体タンパク質：
（ａ）当該（Ｒ）−ヒドロキシニトリルリアーゼのβシート構造（β３）を構成するＴＡＸ１ＤＩ（配列番号３）で表されるアミノ酸配列中の２番目のアミノ酸であるＡの他のアミノ酸への置換、ここで、Ｘ１はＬ又はＦである；
（ｂ）当該（Ｒ）−ヒドロキシニトリルリアーゼのβシート構造（β４）を構成するＸ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６ＤＦＸ７Ｘ８Ｘ９Ｘ１０（配列番号４）で表されるアミノ酸配列中の５番目のアミノ酸であるＸ６の他のアミノ酸への置換、ここで、Ｘ２はＱ、Ｈ又はＲであり、Ｘ３はＩ又はＶであり、Ｘ４はＭ、Ｉ、Ｔ又はＤであり、Ｘ５はＡ、Ｔ又はＩであり、Ｘ６はＹ又はＮであり、Ｘ７はＶ、Ｔ又はＬであり、Ｘ８はＧ又はＩであり、Ｘ９はＧ又はＡであり、Ｘ１０はＰ、Ａ又はＳである；
（ｃ）当該（Ｒ）−ヒドロキシニトリルリアーゼのβシート構造（β４）を構成するＸ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６ＤＦＸ７Ｘ８Ｘ９Ｘ１０（配列番号４）で表されるアミノ酸配列中の７番目のアミノ酸であるＦの他のアミノ酸への置換、ここで、Ｘ２〜Ｘ１０は（ｂ）で定義されたとおりである；
（ｄ）当該（Ｒ）−ヒドロキシニトリルリアーゼのβシート構造（β４）を構成するＸ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６ＤＦＸ７Ｘ８Ｘ９Ｘ１０（配列番号４）で表されるアミノ酸配列中の９番目のアミノ酸であるＸ８の他のアミノ酸への置換、ここで、Ｘ２〜Ｘ１０は（ｂ）で定義されたとおりである；
（ｅ）当該（Ｒ）−ヒドロキシニトリルリアーゼのβシート構造（β５）を構成するＸ１１Ｘ１２ＡＸ１３ＬＸ１４（配列番号５）で表されるアミノ酸配列中の２番目のアミノ酸であるＸ１２の他のアミノ酸への置換、ここで、Ｘ１１はＳ，Ｌ、Ｍ又はＩであり，Ｘ１２はＴ又は存在せず、Ｘ１３はＨ、Ｉ、Ｙ又はＦであり、Ｘ１４Ｎ又はＴである；及び
（ｆ）当該（Ｒ）−ヒドロキシニトリルリアーゼのβシート構造（β５）を構成するＸ１１Ｘ１２ＡＸ１３ＬＸ１４（配列番号５）で表されるアミノ酸配列中の３番目のアミノ酸であるＡの他のアミノ酸への置換、ここで、Ｘ１１〜Ｘ１４は（ｄ）で定義されたとおりである。
【請求項２】
前記ヤスデ由来の（Ｒ）−ヒドロキシニトリルリアーゼが、８個の逆平衡βシート構造を有することを特徴とする、請求項１に記載の変異体タンパク質。
【請求項３】
前記８個のβシート構造を構成するアミノ酸配列が、それぞれ、Ｘ１５Ｘ１６ＦＸ１７Ｘ１８ＶＬ（β１）（配列番号１）、ＴＸ１９ＲＸ２０ＹＶＸ２１Ｐ（β２）（配列番号２）、ＴＡＸ１ＤＩ（β３）（配列番号３）、Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６ＤＦＸ７Ｘ８Ｘ９Ｘ１０（β４）（配列番号４）、Ｘ１１Ｘ１２ＡＸ１３ＬＸ１４（β５）（配列番号５）、Ｘ２２Ｘ２３ＫＸ２４Ｘ２５ＷＸ２６ＦＱＹＸ２７Ｘ２８（β６）（配列番号６）、Ｘ２９Ｘ３０ＹＣＡＹＸ３１ＣＸ３２（β７）（配列番号７）、及びＸ３３ＩＸ３４ＥＹＫＣＸ３５Ｘ３６（β８）（配列番号８）である、請求項２に記載の変異体タンパク質、
ここで、Ｘ１はＬ又はＦであり、Ｘ２はＱ、Ｈ又はＲであり、Ｘ３はＩ又はＶであり、Ｘ４はＭ、Ｉ、Ｔ又はＤであり、Ｘ５はＡ、Ｔ又はＩであり、Ｘ６はＹ又はＮであり、Ｘ７はＶ、Ｔ又はＬであり、Ｘ８はＧ又はＩであり、Ｘ９はＧ又はＡであり、Ｘ１０はＰ、Ａ又はＳであり、Ｘ１１はＳ，Ｌ、Ｍ又はＩであり，Ｘ１２はＴ又は存在せず、Ｘ１３はＨ、Ｉ、Ｙ又はＦであり、Ｘ１４Ｎ又はＴであり、Ｘ１５はＦ又はＬであり、Ｘ１６はＥ、Ｑ又はＬであり、Ｘ１７はＥ，Ａ、Ｓ又はＴであり、Ｘ１８はＹ又はＦであり、Ｘ１９はＡ又はＴであり、Ｘ２０はＶ又はＩであり、Ｘ２１はＱ又はＲであり、Ｘ２２はＧ又はＤであり、Ｘ２３はＥ、Ｋ、Ｄ又はＡであり、Ｘ２４はＱ、Ｔ又はＡであり、Ｘ２５はＶ、Ｉ又はＴであり、Ｘ２６はＹ、Ｈ又はＮであり、Ｘ２７はＴ、Ｖ又はＩであり、Ｘ２８はＮ又はＤであり、Ｘ２９はＡ又はＳであり、Ｘ３０はＮ又はＳであり、Ｘ３１はＲ、Ｔ又はＳであり、Ｘ３２はＮ又はＤであり、Ｘ３３はＥ、Ａ、Ｑ、Ｎ又はＳであり、Ｘ３４はＩ、Ａ又はＶであり、Ｘ３５はＡ又はＴであり、Ｘ３６はＳ、Ｎ又はＴである。
【請求項４】
前記ヤスデ由来の（Ｒ）−ヒドロキシニトリルリアーゼが、更に１個のαヘリックス構造を有することを特徴とする、請求項２又は請求項３に記載の変異体タンパク質。
【請求項５】
前記αヘリックス構造を構成するアミノ酸配列が、ＶＰＮＧＸ３７ＫＩＨ（配列番号９）である、請求項４に記載の変異体タンパク質、ここで、Ｘ３７はＤ又はＹである。
【請求項６】
前記ヤスデ由来の（Ｒ）−ヒドロキシニトリルリアーゼが、リポカインスーパーファミリーに属するタンパク質である、請求項１〜請求項５のいずれか１項に記載の変異体タンパク質。
【請求項７】
前記ヤスデ由来の（Ｒ）−ヒドロキシニトリルリアーゼが、ＣｈｕａＨＮＬ、ＮｔｔＨＮＬ、ＮｔｍＨＮＬ、ＯｇｒａＨＮＬ，ＰｌａｍＨＮＬ、Ｐｔｏｎ１ＨＮＬ、Ｐｔｏｎ２ＨＮＬ，Ｐｔｏｎ３ＨＮＬ、ＰｆａｌＨＮＬ、ＰｔｏｋＨＮＬ、ＲｓｐＨＮＬ、及びＲｓｓＨＮＬから選択されるいずれか１種類である、請求項１〜請求項６のいずれか１項に記載の変異体タンパク質。
【請求項８】
前記アミノ酸置換が、以下の（ａ）〜（ｅ）から選択される１種類以上の置換である、請求項１〜請求項７のいずれか１項の記載の（Ｒ）−ヒドロキシニトリルリアーゼ変異体タンパク質：
（ａ）当該（Ｒ）−ヒドロキシニトリルリアーゼのβシート構造（β３）を構成するＴＡＸ１ＤＩ（配列番号３）で表されるアミノ酸配列中の２番目のアミノ酸であるＡのＣ又はＨへの置換；
（ｂ）当該（Ｒ）−ヒドロキシニトリルリアーゼのβシート構造（β４）を構成するＸ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６ＤＦＸ７Ｘ８Ｘ９Ｘ１０（配列番号４）で表されるアミノ酸配列中の５番目のアミノ酸であるＸ６のＨ，Ｙ、Ｍ、Ｖ、Ｌ又はＷへの置換；
（ｃ）当該（Ｒ）−ヒドロキシニトリルリアーゼのβシート構造（β４）を構成するＸ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６ＤＦＸ７Ｘ８Ｘ９Ｘ１０（配列番号４）で表されるアミノ酸配列中の７番目のアミノ酸であるＦのＩへの置換；
（ｄ）当該（Ｒ）−ヒドロキシニトリルリアーゼのβシート構造（β４）を構成するＸ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６ＤＦＸ７Ｘ８Ｘ９Ｘ１０（配列番号４）で表されるアミノ酸配列中の９番目のアミノ酸であるＸ８のＧへの置換；
（ｅ）当該（Ｒ）−ヒドロキシニトリルリアーゼのβシート構造（β５）を構成するＸ１１Ｘ１２ＡＸ１３ＬＸ１４（配列番号５）で表されるアミノ酸配列中の２番目のアミノ酸であるＸ１２のＡへの置換；及び
（ｆ）当該（Ｒ）−ヒドロキシニトリルリアーゼのβシート構造（β５）を構成するＸ１１Ｘ１２ＡＸ１３ＬＸ１４（配列番号５）で表されるアミノ酸配列中の３番目のアミノ酸であるＡの疎水性残基（Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｆ、Ｗ、Ｙ又はＶ）、Ｃ、Ｔ、Ｅ、Ｑ又はＳへの置換。
【請求項９】
前記アミノ酸置換が、２か所以上に存在する、請求項１〜請求項８のいずれか１項に記載の変異体タンパク質。
【請求項１０】
前記２か所のアミノ酸置換が、以下の（ｂ）、（ｄ）、及び（ｅ）から選択される２つの置換である、請求項９に記載の変異体タンパク質。
（ｂ）当該（Ｒ）−ヒドロキシニトリルリアーゼのβシート構造（β４）を構成するＸ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６ＤＦＸ７Ｘ８Ｘ９Ｘ１０（配列番号４）で表されるアミノ酸配列中の５番目のアミノ酸であるＸ６のＨ，Ｙ、Ｍ、Ｖ、Ｌ又はＷへの置換；
（ｄ）当該（Ｒ）−ヒドロキシニトリルリアーゼのβシート構造（β４）を構成するＸ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６ＤＦＸ７Ｘ８Ｘ９Ｘ１０（配列番号４）で表されるアミノ酸配列中の９番目のアミノ酸であるＸ８のＧへの置換、
（ｅ）当該（Ｒ）−ヒドロキシニトリルリアーゼのβシート構造（β５）を構成するＸ１１Ｘ１２ＡＸ１３ＬＸ１４（配列番号５）で表されるアミノ酸配列中の２番目のアミノ酸であるＸ１２のＡへの置換、
ここで、Ｘ２〜Ｘ１２は請求項１で定義されたとおりである。
【請求項１１】
請求項１〜請求項１０のいずれか１項に記載の（Ｒ）−ヒドロキシニトリルリアーゼ変異体タンパク質をコードする核酸分子。
【請求項１２】
請求項１１に記載の核酸分子を含有するベクター。
【請求項１３】
請求項１２に記載のベクターで形質転換された細胞。
【請求項１４】
請求項１３に記載の細胞を培養することを含む、請求項１〜請求項１０のいずれか１項に記載の（Ｒ）−ヒドロキシニトリルリアーゼ変異体タンパク質の製造方法。
【請求項１５】
請求項１〜請求項１０のいずれか１項に記載の（Ｒ）−ヒドロキシニトリルリアーゼ変異体タンパク質の存在下で、ケトン又はアルデヒドとシアン化合物（Ｒ）とを反応させることを含む、シアノヒドリンの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、改変されたヒドロキシニトリルリアーゼ及びその利用に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒドロキシニトリルリアーゼ（以下、「ＨＮＬ」という）はシアノヒドリン化合物の合成に利用される酵素である。本発明者らは、既に様々なヤスデからＨＮＬ遺伝子をクローニングすることに成功している（特許文献１、特許文献２、非特許文献１及び非特許文献２）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】国際公開ＷＯ２０１５／１３３４６２号
【特許文献２】国際公開ＷＯ２０１７／１５０５６０号
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Ｍｏｈａｍｍａｄ  Ｄａｄａｓｈｉｐｏｕｒら、ＰＮＡＳ（２０１５）１１２（３４）：１０６０５−１０６１０
【非特許文献２】Ｔａｋｕｙａ  Ｙａｍａｇｕｃｈｉら、Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  ｒｅｐｏｒｔｓ（２０１８）８：３０５１
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかし、これらの天然のＨＮＬの活性は産業用としては十分ではなく、更にすぐれた活性を有するＨＮＬが求められていた。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、ＨＮＬに種々のアミノ酸変異を導入し、その活性を測定した。その結果、特定の部位のアミノ酸改変がヤスデ由来のＨＮＬに共通した活性上昇をもたらすことを見出し、本発明を完成させた。【０００７】
一態様において、本発明は、ヤスデ由来の（Ｒ）−ＨＮＬタンパク質における１種類以上のアミノ酸置換を有し、かつ、（Ｒ）−ＨＮＬ活性を有する、（Ｒ）−ＨＮＬ変異体タンパク質に関する。【０００８】
本明細書において、「ヤスデ由来の（Ｒ）−ヒドロキシニトリルリアーゼ」とは、ヤスデ（Ｍｉｌｌｉｐｅｄｅｓ）の遺伝子がコードする酵素であって、（Ｒ）−ＨＮＬ活性を有する化合物である。本明細書において「ヤスデ」とは、多足亜門ヤスデ綱（Ｄｉｐｌｏｐｏｄａ）に属する節足動物を意味する。ヤスデとしては、例えば、シノハラフサヤスデ、リュウキュウフサヤスデ、タマヤスデ、ネッタイタマヤスデ、オオタマヤスデ、ミコシヤスデ、エゾミコシヤスデ、クロイワヤスデ、フトケヤスゲ、ヤリヤスデ、タカネヤリヤスデ、オオトゲヤスデ、クラサワトゲヤスデ、ホラケヤスデ、ヒメケヤスデ、シロケヤスデ、ジヤスデ、ツクシヤスデ、イトヤスデ、ヒラタヤスデ、アカヒラタヤスデ、ヤマシナヒラタヤスデ、タマモヒラタヤスデ、ババヤスデ、ヤマンバヤスデ、ヘラババヤスデ、ミドリババヤスデ、アマビコヤスデ、ヤエタケヤスデ、タカクワヤスデ、アオヤスデ、コバアマビコヤスデ、ポコックアマビコヤスデ、ヤットコアマビコヤスデ、オビババヤスデ、トリデヤスデ、キシャヤスデ、タメトモヤスデ、ウチカケヤスデ、ヒラオヤスデ、ヤケヤスデ、マサキヤケヤスデ、ミイツヤスデ、ヤマトアカヤスデ、リュウキュウヤケヤスデ、ヤンバルトサカヤスデ、トサカサスデ、モリヤスデ、ネジアシヤスデ、アカヤスデ、ウマガエシアカヤスデ、ナンヨウヤケヤスデ、ハガヤスデ、コブヤスデ、ハダカヤスデ、オオギヤスデ、キレコミヤスデ、ヨロイヤスデ、ノコギリヤスデ、ツノノコギリヤスデ、イシイオビヤスデ、オビヤスデ、モトオビヤスデ、ヒガシオビヤスデ、フジオビヤスデ、シロハダヤスデ、マクラギヤスデ、チビヤスデ、ギボシヤスデ、パラオギボシヤスデ、ツメフジヤスデ、トガリフジヤスデ、エゾフジヤスデ、ミホトケフジヤスデ、ヘルヘフフジヤスデ、フジヤスデ、フジヤスデモドキ、ホタルヤスデ、イカホヒメヤスデ、ホタルヒメヤスデ、センブツヤスデ、ウエノヤスデ、リュウガヤスデ、オオセリュウガヤスデ、トリイリュウガヤスデ、タテウネホラヤスデ、イチハシヤスデ、ネンジュヤスデ、ヒロウミヤスデ ヨシダヒメヤスデ、クロヒメヤスデ、エゾヒメヤスデ、クダヤスデ、ミナミヤスデ、マガイマルヤスデ、カグヤヤスデ、マルヤスデ、ヒゲヤスデ、ヒモヤスデ、Ｐ．  ｔｏｋａｉｅｎｓｉｓ及びヤハズヤスデを挙げることができる。【０００９】
本明細書において、「（Ｒ）−ヒドロキシニトリルリアーゼ活性（（Ｒ）−ＨＮＬ活性）」とは、ケトン又はアルデヒドとシアン化合物から光学活性シアノヒドリンを合成する以下の反応を触媒する活性を意味する。本明細書において、ヤスデ由来の（Ｒ）−ＨＮＬ及びヤスデ由来の（Ｒ）−ＨＮＬ変異体はいずれも、（Ｒ）−ＨＮＬ活性を有する。【００１０】
【化１】
2020009168.tif 000002
【００１１】
あるタンパク質が（Ｒ）−ＨＮＬ活性を有するか否かは、（Ｒ）−マンデロニトリル合成反応の触媒活性、及びマンデロニトリルからベンズアルデヒドへの分解反応の活性を測定することにより決定することができる。（Ｒ）−マンデロニトリル合成反応の触媒活性は、ベンズアルデヒドを基質として以下の反応を行うことにより判定することができる。ベンズアルデヒドのＤＭＳＯ溶液と、被検タンパク質溶液をクエン酸緩衝液（ｐＨ４．２）に添加して混合し、１Ｍ  ＫＣＮを加えて合成反応を開始し、１５〜２５℃で５分〜１時間後に反応液を回収し、ｎ−ヘキサン：２−プロパノール＝８５：１５の混合液を加えて激しく撹拌し、４℃、１６，０００ｇで３分間遠心分離して、有機層を回収する。得られた有機層をセルロース誘導体（Ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ  ｔｒｉｓ（４−ｍｅｔｈｙｌｂｅｎｚｏａｔｅ））をシリカゲル担体にコーティングした固定相を有するＨＰＬＣを用いて分析し、（Ｒ）−マンデロニトリル及び（Ｓ）−マンデロニトリルのそれぞれの保持時間における２５４ｎｍで検出されるピークを観測する。（Ｒ）−マンデロニトリルの合成が確認でき、かつ、（Ｓ）−マンデロニトリルと比較して、（Ｒ）−マンデロニトリルの生産量が多い場合、当該タンパク質は（Ｒ）−ＨＮＬ活性を有すると判定することができる。また、マンデロニトリルからベンズアルデヒドへの分解反応の活性は、ラセミ体マンデロニトリルを含むクエン酸緩衝液（５．０−５．５）に被検タンパク質タンパク質溶液を添加し、穏やかに撹拌して１５〜２５℃で１分〜１時間反応させ、ベンズアルデヒドの生成量を２８０ｎｍの吸光度で測定することにより確認することができる。ベンズアルデヒドが生成された場合、当該タンパク質は（Ｒ）−ＨＮＬ活性を有すると判定することができる。【００１２】
本明細書において、ヤスデ由来の（Ｒ）−ＨＮＬは、好ましくは、８個の逆平衡βシート構造を立体構造として有する。より好ましくは、前記８個のβシート構造を構成するアミノ酸配列は、それぞれ、Ｘ１５Ｘ１６ＦＸ１７Ｘ１８ＶＬ（β１）（配列番号１）、ＴＸ１９ＲＸ２０ＹＶＸ２１Ｐ（β２）（配列番号２）、ＴＡＸ１ＤＩ（β３）（配列番号３）、Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６ＤＦＸ７Ｘ８Ｘ９Ｘ１０（β４）（配列番号４）、Ｘ１１Ｘ１２ＡＸ１３ＬＸ１４（β５）（配列番号５）、Ｘ２２Ｘ２３ＫＸ２４Ｘ２５ＷＸ２６ＦＱＹＸ２７Ｘ２８（β６）（配列番号６）、Ｘ２９Ｘ３０ＹＣＡＹＸ３１ＣＸ３２（β７）（配列番号７）、Ｘ３３ＩＸ３４ＥＹＫＣＸ３５Ｘ３６（β８）（配列番号８）である。ここで、Ｘ１はＬ又はＦであり、Ｘ２はＱ、Ｈ又はＲであり、Ｘ３はＩ又はＶであり、Ｘ４はＭ、Ｉ、Ｔ又はＤであり、Ｘ５はＡ、Ｔ又はＩであり、Ｘ６はＹ又はＮであり、Ｘ７はＶ、Ｔ又はＬであり、Ｘ８はＧ又はＩであり、Ｘ９はＧ又はＡであり、Ｘ１０はＰ、Ａ又はＳであり、Ｘ１１はＳ，Ｌ、Ｍ又はＩであり，Ｘ１２はＴ又は存在せず、Ｘ１３はＨ、Ｉ、Ｙ又はＦであり、Ｘ１４Ｎ又はＴであり、Ｘ１５はＦ又はＬであり、Ｘ１６はＥ、Ｑ又はＬであり、Ｘ１７はＥ，Ａ、Ｓ又はＴであり、Ｘ１８はＹ又はＦであり、Ｘ１９はＡ又はＴであり、Ｘ２０はＶ又はＩであり、Ｘ２１はＱ又はＲであり、Ｘ２２はＧ又はＤであり、Ｘ２３はＥ、Ｋ、Ｄ又はＡであり、Ｘ２４はＱ、Ｔ又はＡであり、Ｘ２５はＶ、Ｉ又はＴであり、Ｘ２６はＹ、Ｈ又はＮであり、Ｘ２７はＴ、Ｖ又はＩであり、Ｘ２８はＮ又はＤであり、Ｘ２９はＡ又はＳであり、Ｘ３０はＮ又はＳであり、Ｘ３１はＲ、Ｔ又はＳであり、Ｘ３２はＮ又はＤであり、Ｘ３３はＥ、Ａ、Ｑ、Ｎ又はＳであり、Ｘ３４はＩ、Ａ又はＶであり、Ｘ３５はＡ又はＴであり、Ｘ３６はＳ、Ｎ又はＴである。【００１３】
更に、本明細書におけるヤスデ由来の（Ｒ）−ＨＮＬは、１個のαヘリックス構造を有していてもよい。当該αヘリックス構造を構成するアミノ酸配列は、好ましくは、ＶＰＮＧＸ３７ＫＩＨ（配列番号９）（ここで、Ｘ３７はＤ又はＹである）である。【００１４】
一例において、本明細書におけるヤスデ由来の（Ｒ）−ＨＮＬは、その構造的特徴から、リポカインスーパーファミリーに属するタンパク質として分類されるものであってもよい。【００１５】
より具体的な例として、本明細書におけるヤスデ由来の（Ｒ）−ＨＮＬは、
ヤンバルトサカヤスデ（Ｃｈａｍｂｅｒｌｉｎｉｕｓ  ｈｕａｌｉｅｎｅｎｓｉｓ）由来のＣｈｕａＨＮＬ（配列番号１０、シグナルペプチド１〜２１番目、成熟タンパク質２２〜１８３番目）；
タンバアカヤスデ（Ｎｅｄｙｏｐｕｓ  ｔａｍｂａｎｕｓ  ｔａｍｂａｎｕｓ）由来のＮｔｔＨＮＬ（配列番号１１、シグナルペプチド１〜２０番目、成熟タンパク質２１〜１８２番目）；
ウマガエシアカヤスデ（Ｎｅｄｙｏｐｕｓ  ｔａｍｂａｎｕｓ  ｍａｎｇａｅｓｉｎｕｓ）由来のＮｔｍＨＮＬ（配列番号１２、シグナルペプチド１〜２０番目、成熟タンパク質２１〜１８２番目）；
ヤケヤスデ（Ｏｘｉｄｕｓ  ｇｒａｃｉｌｉｓ）由来のＯｇｒａＨＮＬ（配列番号１３、シグナルペプチド１〜１８番目；成熟タンパク質１９〜１８４番目）；
キシャヤスデ（Ｐａｒａｆｏｎｔａｒｉａ  ｌａｍｉｎａｔａ  ａｒｍｉｇｅｒａ）由来のＰｌａｍＨＮＬ（配列番号１４、シグナルペプチド１〜２０番目、成熟タンパク質２１〜１８３番目）；
ミドリババヤスデ（Ｐａｒａｆｏｎｔａｒｉａ  ｔｏｎｏｍｉｎｅａ）由来のＰｔｏｎ１ＨＮＬ（Ｐａｒａｆｏｎｔａｒｉａ  ｔｏｎｏｍｉｎｅａ  ｓｐｅｃｉｅｓ  ｃｏｍｐｌｅｘ  １）（配列番号１５、シグナルペプチド１〜２６番目、成熟タンパク質２７〜１８９番目）、Ｐｔｏｎ２ＨＮＬ（Ｐａｒａｆｏｎｔａｒｉａ  ｔｏｎｏｍｉｎｅａ  ｓｐｅｃｉｅｓ  ｃｏｍｐｌｅｘ  ２）（配列番号１６、シグナルペプチド１〜２５番目、成熟タンパク質２６〜１８８番目），及びＰｔｏｎ３ＨＮＬ（Ｐａｒａｆｏｎｔａｒｉａ  ｔｏｎｏｍｉｎｅａ  ｓｐｅｃｉｅｓ  ｃｏｍｐｌｅｘ  ３）（配列番号１７、シグナルペプチド１〜２６番目、成熟タンパク質２７〜１８９番目）；
ヘラババヤスデ（Ｐａｒａｆｏｎｔａｒｉａ  ｆａｌｃｉｆｅｒａ）由来のＰｆａｌＨＮＬ（配列番号１８、シグナルペプチド１〜２６番目、成熟タンパク質２７〜１８９番目）；
Ｐａｒａｆｏｎｔａｒｉａ  ｔｏｋａｉｅｎｓｉｓ由来のＰｔｏｋＨＮＬ（配列番号１９、シグナルペプチド１〜２５、成熟タンパク質２６〜１８８番目）；
アマビコヤスデ（Ｒｉｕｋｉａｒｉａ  ｓｅｍｉｃｉｒｃｕｌａｒｉｓ  ｓｅｍｉｃｉｒｃｕｌａｒｉｓ）由来のＲｓｓＨＮＬ（配列番号２０、シグナルペプチド１〜２６番目、成熟タンパク質２７〜１８８番目）；及び
アマビコヤスデの一種（Ｒｉｕｋｉａｒｉａ  ｓｐ．）に由来のＲｓｐＨＮＬ（配列番号２１、シグナルペプチド１〜２６番目、成熟タンパク質２７〜１８９番目）であってもよい。【００１６】
タンパク質はシグナル配列により輸送および局在化が制御される。本明細書における（Ｒ）−ＨＮＬ又はその変異体タンパク質としては、シグナル配列を有するタンパク質であってもよいし、シグナル配列が切断された成熟タンパク質であってもよい。【００１７】
本発明の（Ｒ）−ＨＮＬの変異体タンパク質は、ヤスデ由来の（Ｒ）−ＨＮＬタンパク質において１種類以上のアミノ酸置換を有する。このようなアミノ酸置換は、以下のアミノ酸置換であることができる：
（ａ）当該（Ｒ）−ＨＮＬのβシート構造（β３）を構成するＴＡＸ１ＤＩ（配列番号３）で表されるアミノ酸配列中の２番目のアミノ酸であるＡの他のアミノ酸への置換、ここで、Ｘ１はＬ又はＦである；
（ｂ）当該（Ｒ）−ＨＮＬのβシート構造（β４）を構成するＸ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６ＤＦＸ７Ｘ８Ｘ９Ｘ１０（配列番号４）で表されるアミノ酸配列中の５番目のアミノ酸であるＸ６の他のアミノ酸への置換、ここで、Ｘ２はＱ、Ｈ又はＲであり、Ｘ３はＩ又はＶであり、Ｘ４はＭ、Ｉ、Ｔ又はＤであり、Ｘ５はＡ、Ｔ又はＩであり、Ｘ６はＹ又はＮであり、Ｘ７はＶ、Ｔ又はＬであり、Ｘ８はＧ又はＩであり、Ｘ９はＧ又はＡであり、Ｘ１０はＰ、Ａ又はＳである；
（ｃ）当該（Ｒ）−ＨＮＬのβシート構造（β４）を構成するＸ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６ＤＦＸ７Ｘ８Ｘ９Ｘ１０（配列番号４）で表されるアミノ酸配列中の７番目のアミノ酸であるＦの他のアミノ酸への置換、ここで、Ｘ２〜Ｘ１０は（ｂ）で定義されたとおりである；
（ｄ）当該（Ｒ）−ヒドロキシニトリルリアーゼのβシート構造（β４）を構成するＸ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６ＤＦＸ７Ｘ８Ｘ９Ｘ１０（配列番号４）で表されるアミノ酸配列中の９番目のアミノ酸であるＸ８の他のアミノ酸への置換、ここで、Ｘ２〜Ｘ１０は（ｂ）で定義されたとおりである；
（ｅ）当該（Ｒ）−ＨＮＬのβシート構造（β５）を構成するＸ１１Ｘ１２ＡＸ１３ＬＸ１４（配列番号５）で表されるアミノ酸配列中の２番目のアミノ酸であるＸ１２の他のアミノ酸への置換、ここで、Ｘ１１はＳ，Ｌ、Ｍ又はＩであり，Ｘ１２はＴ又は存在せず、Ｘ１３はＨ、Ｉ、Ｙ又はＦであり、Ｘ１４Ｎ又はＴである；及び
（ｆ）当該（Ｒ）−ＨＮＬのβシート構造（β５）を構成するＸ１１Ｘ１２ＡＸ１３ＬＸ１４（配列番号５）で表されるアミノ酸配列中の３番目のアミノ酸であるＡの他のアミノ酸への置換、ここで、Ｘ１１〜Ｘ１４は（ｄ）で定義されたとおりである。【００１８】
好ましくは、前記アミノ酸置換は、以下の（ａ）〜（ｅ）から選択される１種類以上の置換である：
（ａ）当該（Ｒ）−ヒドロキシニトリルリアーゼのβシート構造（β３）を構成するＴＡＸ１ＤＩ（配列番号３）で表されるアミノ酸配列中の２番目のアミノ酸であるＡのＣ又はＨへの置換；
（ｂ）当該（Ｒ）−ヒドロキシニトリルリアーゼのβシート構造（β４）を構成するＸ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６ＤＦＸ７Ｘ８Ｘ９Ｘ１０（配列番号４）で表されるアミノ酸配列中の５番目のアミノ酸であるＸ６のＨ、Ｙ、Ｍ、Ｖ、Ｌ又はＷへの置換；
（ｃ）当該（Ｒ）−ヒドロキシニトリルリアーゼのβシート構造（β４）を構成するＸ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６ＤＦＸ７Ｘ８Ｘ９Ｘ１０（配列番号４）で表されるアミノ酸配列中の７番目のアミノ酸であるＦのＩへの置換；
（ｄ）当該（Ｒ）−ヒドロキシニトリルリアーゼのβシート構造（β４）を構成するＸ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６ＤＦＸ７Ｘ８Ｘ９Ｘ１０（配列番号４）で表されるアミノ酸配列中の９番目のアミノ酸であるＸ８のＧへの置換；
（ｅ）当該（Ｒ）−ヒドロキシニトリルリアーゼのβシート構造（β５）を構成するＸ１１Ｘ１２ＡＸ１３ＬＸ１４（配列番号５）で表されるアミノ酸配列中の２番目のアミノ酸であるＸ１２のＡへの置換；及び
（ｆ）当該（Ｒ）−ヒドロキシニトリルリアーゼのβシート構造（β５）を構成するＸ１１Ｘ１２ＡＸ１３ＬＸ１４（配列番号５）で表されるアミノ酸配列中の３番目のアミノ酸であるＡの疎水性残基（Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｆ、Ｗ、Ｙ又はＶ）、Ｃ、Ｔ、Ｅ、Ｑ又はＳ（好ましくは、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｆ、Ｖ、Ｃ、Ｔ、Ｅ、Ｑ又はＳ）への置換。【００１９】
これらのアミノ酸置換は、１か所のみにおいて行ってもよいし、２か所以上、例えば、２か所、３か所、４か所、又は５か所において行われてもよい。【００２０】
より具体的には、前記置換としては、ＯｇｒａＨＮＬ変異体タンパク質における置換であって、以下の（ｉ）〜（ｉｉｉ）から選択される、１個、２個、３個、１〜２個、又は１〜３個の置換を挙げることができる。
（ｉ）配列番号１３における、７６番目のアラニン残基（ＯｇｒａＨＮＬ成熟タンパク質（配列番号１３の１９〜１８４番目のアミノ酸からなるタンパク質、以下同様）における５８番目のアラニン残基に対応）のシステイン残基又はヒスチジン残基への置換（Ａ７６Ｃ又はＡ７６Ｈ）（成熟タンパク質におけるＡ５８Ｃ又はＡ５８Ｈ）
（ｉｉ）配列番号１３における、８９番目のフェニルアラニン残基（ＯｇｒａＨＮＬ成熟タンパク質における７１番目のフェニルアラニン残基に対応）のイソロイシン残基への置換（Ｆ８９Ｉ）（成熟タンパク質におけるＦ７１Ｉ）
（ｉｉｉ）配列番号１３における、９７番目のアラニン残基（ＯｇｒａＨＮＬ成熟タンパク質における７９番目のアラニン残基に対応）のシステイン残基、フェニルアラニン残基、イソロイシン残基、ロイシン残基、メチオニン残基、セリン残基、又はばリン残基への置換（Ａ９７Ｃ、Ａ９７Ｆ、Ａ９７Ｉ、Ａ９７Ｌ、Ａ９７Ｍ、Ａ９７Ｓ、又はＡ９７Ｖ）（成熟タンパク質におけるＡ７９Ｃ、Ａ７９Ｆ、Ａ７９Ｉ、Ａ７９Ｌ、Ａ７９Ｍ、Ａ７９Ｓ、又はＡ７９Ｖ）【００２１】
より具体的には、前記置換としては、ＰｌａｍＨＮＬ変異体タンパク質における置換であって、以下の（ｉｖ）〜（ｖｉ）から選択される、１個、２個、３個、１〜２個、又は１〜３個の置換を挙げることができる。例えば、２個の変異を有する場合、Ｎ８５ＨとＴ９５Ａ，Ｎ８５ＹとＴ９５Ａ、Ｎ８５ＹとＩ８９Ｇ（ＰｌａｍＨＮＬ成熟タンパク質（配列番号１４の２１〜１８３番目のアミノ酸からなるタンパク質、以下同様）におけるＮ６５ＨとＴ７５Ａ，Ｎ６５ＹとＴ７５Ａ、Ｎ６５ＹとＩ６９Ｇ）などの組み合わせが挙げられる。
（ｉｖ）配列番号１４における、９６番目のアラニン残基（ＰｌａｍＨＮＬ成熟タンパク質における７６番目のアラニン残基に対応）のシステイン残基、セリン残基、トレオニン残基、グルタミン酸残基、グルタミン残基、バリン残基、又はメチオニン残基への置換（Ａ９６Ｃ、Ａ９６Ｓ、Ａ９６Ｔ、Ａ９６Ｅ、Ａ９６Ｑ、Ａ９６Ｖ、又はＡ９６Ｍ）（成熟タンパク質におけるＡ７６Ｃ、Ａ７６Ｓ、Ａ７６Ｔ、Ａ７６Ｅ、Ａ７６Ｑ、Ａ７６Ｖ、又はＡ７６Ｍ）
（ｖ）配列番号１４における、８５番目のアスパラギン残基（ＰｌａｍＨＮＬ成熟タンパク質における６５番目のアスパラギン残基に対応）のヒスチジン残基、チロシン残基、メチオニン残基、バリン残基、ロイシン残基、又はトリプトファン残基への置換（Ｎ８５Ｈ、Ｎ８５Ｙ、Ｎ８５Ｍ、Ｎ８５Ｖ、Ｎ８５Ｌ、又はＮ８５Ｗ）（成熟タンパク質におけるＮ６５Ｈ、Ｎ６５Ｙ、Ｎ６５Ｍ、Ｎ６５Ｖ、Ｎ６５Ｌ、又はＮ６５Ｗ）
（ｖｉ）配列番号１４における、８９番目のイソロイシン残基（ＰｌａｍＨＮＬ成熟タンパク質における６９番目のイソロイシン残基に対応）のグリシン残基への置換（Ｉ８９Ｇ）（成熟タンパク質におけるＩ６９Ｇ）【００２２】
また、本明細書において、本発明のヤスデ由来（Ｒ）−ＨＮＬの変異体タンパク質は、（Ｒ）−ＨＮＬ活性を有する限り、上記アミノ酸置換以外のアミノ酸がオリジナルの又は野生型のヤスデ由来（Ｒ）−ＨＮＬタンパク質とは異なるアミノ酸に置換されていてもよい。例えば、本発明のヤスデ由来（Ｒ）−ＨＮＬの変異体タンパク質は、オリジナルの又は野生型のヤスデ由来（Ｒ）−ＨＮＬタンパク質のアミノ酸配列において、上記アミノ酸置換以外のアミノ酸が、１〜１０個、１〜８個、１〜５個、１〜４個、１〜３個、１〜２個、又は１個置換されていてもよい。あるいは、本発明のヤスデ由来（Ｒ）−ＨＮＬの変異体タンパク質は、オリジナルの又は野生型のヤスデ由来（Ｒ）−ＨＮＬタンパク質と６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、又は９９％の同一性を有していてもよい。よって、例えば、ヤスデ由来（Ｒ）−ＨＮＬタンパク質が配列番号１０〜２１のいずれか１つの配列に記載のアミノ酸配列（又は、当該配列において成熟タンパク質を構成するアミノ酸配列）を有する場合、本発明のヤスデ由来（Ｒ）−ＨＮＬの変異体タンパク質は、前記アミノ酸置換以外に、配列番号１０〜２１のいずれか１つの配列に記載のアミノ酸配列（又は、当該配列において成熟タンパク質を構成するアミノ酸配列）における、１〜１０個、１〜８個、１〜５個、１〜４個、１〜３個、１〜２個、又は１個のアミノ酸が他のアミノ酸に置換された配列を有し、かつ、（Ｒ）−ＨＮＬ活性を有するタンパク質であってもよい。あるいは、本発明のヤスデ由来（Ｒ）−ＨＮＬの変異体タンパク質は、配列番号１０〜２１のいずれか１つの配列に記載のアミノ酸配列（又は、当該配列において成熟タンパク質を構成するアミノ酸配列）と６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、又は９９％の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ、（Ｒ）−ＨＮＬ活性を有するタンパク質であってもよい。【００２３】
本明細書において、アミノ酸は本技術分野において慣用のアミノ酸一文字表記又は三文字表記により表される。また、「ＸＮ」（Ｎは自然数）で表されるアミノ酸は、それぞれ定義された複数のアミノ酸から選択されるいずれか１つのアミノ酸であることを意味する。また、ＸａＮｕＸｂ（Ｘａ，Ｘｂはアミノ酸一文字表記、Ｎｕは自然数）で表される表記は、Ｎｕ番目のアミノ酸がＸａからＸｂに置換されていることを示す。例えば、Ａ７９Ｍは、７９番目のアラニンがメチオニンに置換されていることを意味する。【００２４】
本明明細書に記載されたアミノ酸配列において，Ａはアラニン残基であり，Ｒはアルギニン残基であり，Ｎはアスパラギン残基であり，Ｄはアスパラギン酸残基であり，Ｃはシステイン残基であり，Ｑはグルタミン残基であり，Ｅはグルタミン酸残基であり，Ｇはグリシン残基であり，Ｈはヒスチジン残基であり，Ｉはイソロイシン残基であり，Ｌはロイシン残基であり，Ｋはリシン残基であり，Ｍはメチオニン残基であり，Ｆはフェニルアラニン残基であり，Ｐはプロリン残基であり，Ｓはセリン残基であり，Ｔはトレオニン残基であり，Ｗはトリプトファン残基であり，Ｙはチロシン残基であり，Ｖはバリン残基である。【００２５】
別の態様において、本発明は前記ヤスデ由来（Ｒ）−ＨＮＬの変異体タンパク質をコードする核酸分子に関する。本明細書の核酸分子は、目的の形質転換細胞内において本発明のヤスデ由来（Ｒ）−ＨＮＬの変異体タンパク質を発現可能な核酸分子である。核酸としては、ＤＮＡ、ＲＮＡ、人工核酸又はそれらの修飾物であってもよい。本発明の核酸は、必要に応じて発現に必要な領域（プロモーター、エンハンサー、ターミネーター等）を含む発現カセットであってもよい。【００２６】
さらに別の態様において、本発明は前記核酸分子を有するベクターに関する。本発明のベクターは、用いる形質転換細胞との組み合わせにより目的のタンパク質を発現させることができるベクターであれば特に制限されるものではない。ベクターとしては、プラスミドベクター、ウイルスベクターのいずれであってもよい。例えば、宿主として大腸菌を用いる場合、ｐＥＴベクターを使用することができる。【００２７】
本発明は、更に、前記ベクターにより形質転換された形質転換細胞を含む。形質転換細胞としては、大腸菌（例えば、大腸菌ＳＨｕｆｆｌｅ  Ｔ７株）、酵母（例えば、Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）、昆虫細胞、動物細胞など任意の細胞を使用することができる。
【発明の効果】
【００２８】
本発明のヤスデ由来ＨＮＬの変異体は、優れた比活性、エナンチオ選択性、及び／又は生産性を有することから、ＨＮＬ活性を利用した光学活性シアノヒドリンの工業生産に適している。本発明の変異体は、従来（１５０Ｕ／ｍｌ）より少ない酵素量で高いエナンチオ選択性を示す。また、（Ｒ）−２−Ｃｌ−Ｍａｎについては、ＣｈｕａＨＮＬ及び他の報告されたＨＮＬは、緩衝系において非常に低いエナンチオ選択性しか示さなかった（ｅｅ＜２１％）が、本発明の変異体は（Ｒ）−２−Ｃｌ−Ｍａｎについても高いエナンチオ選択性を示す。また、本発明の変異体は、有機溶媒を含む二相系下で反応を触媒する従来の（Ｒ）−ＨＮＬとは異なり、単相緩衝系において高いエナンチオ純度（９６．３％）を有する（Ｒ）−２−Ｃｌ−Ｍａｎの非対称合成が可能である。
【図面の簡単な説明】
【００２９】
【図１】ＣｈｕａＨＮＬの全体構造を示す図である。（Ａ）ＣｈｕａＨＮＬのモノマー構造の立体像を絵で示す。ヘリックス（α−ヘリックスのα１−２及び３１０ヘリックスのη１，３）、βシート（β１−８）及びループ構造が示されている。「Ｎ」及び「Ｃ」の記号は、それぞれＣｈｕａＨＮＬのＮ末端及びＣ末端を示す。（Ｂ）ＣｈｕａＨＮＬの二量体構造を示す図である。ジスルフィド結合は残基番号と共に球体で表現されている。Ａｓｎ１０９及びＡｓｎ１２３に結合するＮ−アセチルグルコサミン部分は、それぞれＮＡＧ１及びＮＡＧ２と示した。Ａｓｎ１０９、Ａｓｎ１２３、及び糖部分はスティックで示されている。（Ｃ）ＣｈｕａＨＮＬの二量体界面を示す図である。界面におけるジスルフィド結合、水素結合、及び塩橋が示されている。界面残基及びβシートが示されている。
【図２】種々のリガンドと複合化したＣｈｕａＨＮＬの活性部位を示す図である。活性部位のアミノ酸残基及び結合したリガンドは、ＣＰＫ配色（タンパク質の炭素原子及びリガンドはそれぞれ緑色及びシアンで示されている）でスティック表示されている。アミノ酸残基とリガンドとの間の水素結合及び静電的相互作用は、点線で示され、結合長がÅで表示されている。リガンドと水分子のσＡ−ｗｅｉｇｈｔｅｄオミットマップは、メッシュ表示で示され、Ｄ（５．０σ）を除いて３．０σレベルで輪郭が描かれている。（Ａ）アセテートに結合した活性部位のｗａｌｌ−ｅｙｅ  ｓｔｅｒｅｏ  ｖｉｅｗを示す図である。活性部位の空洞の表面は透明な灰色の表面として示す。画像の下部はアクティブサイトの入口である。（Ｂ）リガンド非含有形態を示す図である。活性部位に結合した水分子は、球体で表現されている。（Ｃ）シアン化物イオンとの複合体を示す図である。（Ｄ）ヨードアセテートとの複合体を示す図である。ａｎｏｍａｌｏｕｓ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ  ｍａｐは、メッシュ示され、４．０σレベルで輪郭を描いた。（Ｅ）チオシアン酸塩との複合体を示す図である。チオシアネートの２つの代替結合形態が示されている（ＳＣＮ１及びＳＣＮ２）。
【図３】ＣｈｕａＨＮＬのドッキングシミュレーションの結果を示す図である。ＣｈｕａＨＮＬの活性部位におけるドッキングされた（Ｒ）−ＭＡＮの表面を示す。（Ｒ）−ＭＡＮ及び活性部位の残基はＣＰＫ配色でスティック表現で示す。
【図４】１２種類のヤスデＨＮＬの推定アミノ酸配列のアラインメントを示す（配列番号１０〜２１）。アスタリスクは、ヤスデＨＮＬの結合ポケットに関与していると考えられる保存領域を示す。下線はシグナル配列を示す。βｎ（ｎは１〜８の自然数）で表される矢印は、それぞれ、逆平衡βシート構造を構成するアミノ酸を示す。この図において、アミノ酸番号はシグナル配列（下線部）を含む配列における番号で表される。
【図５】２−クロロベンズアルデヒド及びＫＣＮを含浸させた（Ｒ）−２−Ｃｌ−Ｍａｎと複合体を形成したＯｇｒａＨＮＬの結晶構造により目的の触媒メカニズムを調べた図である。（ａ）ＯｇｒａＨＮＬの二量体モデル示す。２つのα−ヘリックス、２つの３１０ヘリックス及び８つの逆平行β−シートを示す。Ｃ末端及びＮ末端を表示した。活性部位におけるリガンド（Ｒ）−２−Ｃｌ−Ｍａｎは、黄色スティックモデルとして示した。（ｂ）結合ポケットの拡大図である。入口トンネルを青い点線の円で示す。疎水性残基（緑色）及び疎水性残基（正電荷側鎖：青色；負電荷側鎖：ピンク色；及び荷電していない側鎖：淡橙色）を含む結合ポケットに暴露された残基はスティックモデルとして示され、アミノ酸の種類と番号を表示した。（ｃ）（Ｒ）−２−Ｃｌ−Ｍａｎに結合したＯｇｒａＨＮＬの活性部位を示す。水素結合を赤い点線で示し、その距離を表示した。（ｄ）ＯｇｒａＨＮＬの目的の触媒機構を表す。（１）待機状態。Ａｒｇ４２及びＬｙｓ１２１の触媒二分子を青色で示す。（２）（Ｒ）−Ｍａｎとの複合体形成。Ｌｙｓ１２１の窒素の孤立した電子対は、（Ｒ）−Ｍａｎのヒドロキシル基からプロトンを引き抜き、水素から放出された電子はニトリル基の炭素原子によって受け取られ、シアン化物イオンの放出を誘発する。（３）シアン化物プロトン化。放出されたシアン化物イオンはＡｒｇ４２からプロトンを除去してシアン化水素を生成する。２−クロロベンズアルデヒドのアルデヒド基は、Ｌｙｓ１２１及びＡｒｇ４２と水素結合を形成する。続いて、生成された２−クロロベンズアルデヒド及びシアン化水素が放出され、活性残基が待機状態（１）に戻る。
【図６】（ａ）及び（ｂ）ＯｇｒａＨＮＬの結合ポケット内のフェニル環の異なるオルト位（ａ、ｂ）が塩素原子に置換されるようにデザインされた（Ｒ）−２−Ｃｌ−Ｍａｎの結合様式。（ｃ）及び（ｄ）ＯｇｒａＨＮＬ変異体の基質侵入トンネルの開環構造（ｃ）及び閉鎖構造（ｄ）。
【図７】ドッキングシミュレーションによる（Ｒ）−２−クロロマンデロニトリルによるＰｌａｍＨＮＬの予測構造を示す。ａ）鋳型としてＯｇｒａＨＮＬ（バイオレット）を用いたＰｌａｍＨＮＬ（青色）の相同性モデリング予測の全体構造を表す。ｂ）結合ポケットにおける２−クロロマンデロニトリル（緑色）に結合した側鎖残基の重ね合わせは、２つのタンパク質間の有意な類似性を示す。
【図８】（Ｒ）−２−クロロマンデロニトリルのエナンチオマー過剰率に対する酵素量（ａ）及びｐＨ（ｂ）の影響を示すグラフである。ソリッドバー：野生型；灰色のバー：Ｔ７５Ａ；クロスバー：Ｎ６５Ｙ；オープンバー：Ｔ７５Ａ／Ｎ６５Ｙ。
【発明を実施するための形態】
【００３０】
（野生型ヤスデ由来ｈｎｌ遺伝子配列）
ヤスデ由来のｈｎｌ遺伝子は、ＷＯ２０１７／１５０５６０の記載に従い、ヤスデ由来の遺伝子から保存アミノ酸配列をコードするプライマーを用いて容易に取得することができる。一例としては、ヤスデから得た遺伝子を鋳型として、以下の配列を有するプライマーを用いてＰＣＲ反応を行うことにより、得ることができる。得られたヤスデｈｎｌ遺伝子の塩基配列を解析することにより、野生型ヤスデ由来ｈｎｌ遺伝子配列を決定することができる。
ＨＮＬ−ＦＷ：ＣＴＧＣＡＡＣＴＧＣＡＴＴＧＧＡＭＡＴＴＣＡＡＧＧ（配列番号７６）、
ＨＮＬ−ＲＶ：ＡＴＧＡＡＴＣＴＴＲＴＣＲＣＣＧＴＴＴＧＧＡＡＣ（配列番号７７）
ＨＮＬ−ＦＷ２：ＳＳＡＡＣＴＧＣＡＴＴＧＧＡＹＡＴＭＭＲＡＧＧ（配列番号７８）
ＨＮＬ−ＲＶ２：ＡＴＧＡＡＴＣＴＴＲＴＣＲＣＣＲＴＴＴＧＧＲＡＣ（配列番号７９）
あるいは、本明細書に具体的に開示されたヤスデＨＮＬを用いる場合には、本明細書の配列番号１０〜２１を各野生型ヤスデ由来ｈｎｌ遺伝子配列とすることができる。
【００３１】
（野生型ヤスデ由来ＨＮＬタンパク質）
ヤスデ由来のＨＮＬタンパク質は、上述において得られたヤスデｈｎｌ遺伝子を必要に応じて宿主内での発現に適した発現カセット内に挿入した上でベクターに挿入し、宿主細胞に形質転換させて培養することにより発現させて得ることができる。また、決定された野生型ヤスデｈｎｌ遺伝子配列からコードされるアミノ酸配列を得ることができる。
【００３２】
（変異型ヤスデ由来ｈｎｌ遺伝子及び変異型ヤスデ由来ＨＮＬタンパク質）
変異型ヤスデ由来ＨＮＬタンパク質は、以下の手順で得ることができる。まず、上述により決定された野生型ヤスデＨＮＬタンパク質を構成するアミノ酸配列を、既に得られているヤスデＨＮＬのアミノ酸配列とアラインメントさせる（図４）。アラインメントの結果から、他のヤスデＨＮＬについて知られている８つの逆平衡βシートを構成するアミノ酸配列を決定する。更に、Ｎ末端側から数えて、３番目（β３）、４番目（β４）、５番目（β５）に位置するβシート構造を構成するアミノ酸配列を決定する。β３を構成するアミノ酸配列中の２番目のアミノ酸、β４を構成するアミノ酸配列中の５番目及び７番目のアミノ酸、並びに、β５を構成するアミノ酸配列中の２番目及び３番目のアミノ酸から選択される１箇所以上のアミノ酸を他のアミノ酸に置換する構造を設計する。設計されたアミノ酸配列に基づき、当該変異アミノ酸を含むプライマーを設計し、当該プライマーを用いてオリジナルの野生型ｈｎｌ遺伝子を鋳型としてＰＣＲを行うことにより、変異型ヤスデ由来ｈｎｌ遺伝子（変異型ＨＮＬタンパク質をコードする核酸分子）を得ることができる。得られた変異型ヤスデｈｎｌ遺伝子を必要に応じて宿主内での発現に適した発現カセット内に挿入した上でベクターに挿入することで、変異型ＨＮＬタンパク質をコードする核酸分子を有するベクターを得ることができる。得られたベクターを宿主細胞に形質転換させることにより、前記ベクターにより形質転換された形質転換細胞を得ることができる。形質転換細胞を培養して目的タンパク質を発現させて変異型ＨＮＬタンパク質を得ることができる。
【００３３】
（シアノヒドリン合成方法）
一態様において本発明は、（Ｒ）−ＨＮＬ変異体タンパク質の存在下で、ケトン又はアルデヒドとシアン化合物とを反応させることを含む、シアノヒドリンの製造方法に関する。アルデヒド又はケトンからのシアノヒドリンの合成は、例えば、Ｄａｄａｓｈｉｐｏｕｒら（２０１５）（上掲）を参照して行うことができる。具体的には、（Ｒ）−ＨＮＬ変異体タンパク質を、アルデヒド及びシアン化合物を含有する、クエン酸緩衝液に添加して混合し、２５℃で３分間反応させ、ｎ−ヘキサン及び２−プロパノールと激しく混合することにより有機相中にシアノヒドリンを得ることができる。
【００３４】
【化２】
2020009168.tif 000003
【００３５】
必要に応じてクエン酸緩衝液（ｐＨ４．０）中に有機溶媒を添加して反応させることもできる。このような有機溶媒としては、酢酸エチル（ＥＡ）、ジエチルエーテル（ＤＥＥ）、メチル−ｔ−ブチルエーテル（ＭＴＢＥ）、２−イソプロピルエーテル（ＤＩＰＥ）、ジブチルエーテル（ＤＢＥ）、メタノール（Ｍｅｔ）、及びヘキサン（Ｈｅｘ）を挙げることができ、好ましくは、ＤＩＰＥ、ＤＥＥ、ＭＴＢＥ、ＤＢＥ及びＨｅｘであり、より好ましくは、ＤＩＰＥ、ＤＥＥ、ＭＴＢＥ、及びＤＢＥＥである。
【００３６】
（Ｒ）−ＨＮＬ変異体タンパク質は、精製したタンパク質を使用することもできるし、菌体粉砕物またはその粗生成物を使用することもできる。シアノヒドリン合成に用いる酵素量は、反応を触媒できる酵素量であれば特に制限されるものではないが、例えば、１〜１００Ｕ、１〜５０Ｕ、１〜１０Ｕ、２〜８Ｕ、３〜５Ｕとすることができる。また、クエン酸緩衝液のｐＨは、例えば、３〜７、３〜６、３〜５、３．５〜５、及び３．５〜４とすることができる。また、反応温度は、酵素反応に依存しないラセミ体のシアノヒドリンの生成が抑制され、かつ、酵素反応に適した温度が好ましく、例えば、０〜５０℃、１５〜３５℃とすることができる。
【００３７】
アルデヒド又はケトンは合成したいシアノヒドリンの構造に応じて選択することができる。例えば、Ｒ１及びＲ２は、水素原子（ただし、Ｒ１とＲ２のいずれか１つのみ）、置換されていてもよいＣ１〜１８の直鎖又は分岐アルキル基、置換されていてもよい５〜２２員環の芳香族基（Ｎ，Ｏ及びＳから選択される１〜４個の原子を有するヘテロ芳香族基を含む）であり得る。置換されていてもよい場合の置換基としては、アミノ基、イミノ基、水酸基、Ｃ１〜２２の直鎖又は分岐アルキル基（芳香族基の置換基の場合のみ）、Ｃ１〜８アルコキシ基、ハロゲン原子、アリルオキシ基、カルボキシル基、Ｃ３〜２０のシクロアルキル基（ハロゲン原子、水酸基、Ｃ１〜８の直鎖又は分岐状のアルキル基、及び／又はＣ２〜８の直鎖又は分岐状のアルケニル基で置換されていてもよい）、Ｎ，Ｏ及びＳから選択される１つ以上の原子を有する５〜２２員環のヘテロ芳香族基（ハロゲン原子、水酸基、Ｃ１〜８の直鎖又は分岐状のアルキル基、及び／又はＣ２〜８の直鎖又は分岐状のアルケニル基で置換されていてもよい）を挙げることができる。置換されていてもよい場合の置換基の数としては、１個以上とすることができ、２個、３個、４個、５個またはそれ以上であってもよい。例えば、アルデヒド又はケトンとしては、ホルムアルデヒド、アセトアルデヒド、プロピオンアルデヒド、ブタナール、ペンタナール、ヘキサナール、ヘプタナール、オクタナール、ノナナール、デカナール、蟻酸、ビニルアルデヒド、ベンズアルデヒド、２−クロロベンズアルデヒド、シンナムアルデヒド、ペリルアルデヒド、バニリン、グリオキサールなどを挙げることができる。アルデヒド又はケトンの濃度は、０．０１ｍＭ〜５Ｍ，０．１ｍＭ〜１Ｍ、又は１ｍＭ〜１００ｍＭとすることができる。
【００３８】
シアン化合物としては、シアン化ナトリウム、シアン化カリウムを用いることができる。使用するシアン化合物の量は、例えば、０．１ｍＭ〜１０Ｍ、０．２ｍＭ〜２Ｍ、又は２ｍＭ〜２００ｍＭとすることができる。
【００３９】
得られたシアノヒドリンは、必要に応じてキラルＨＰＬＣなどにより更に精製することができる。
【００４０】
形成された（Ｒ）−Ｍａｎ及び（Ｒ）−２−Ｃｌ−Ｍａｎの変換及びｅｅをキラルＨＰＬＣによって分析することができる。対応する基質の標準曲線を用いて変換を計算することができる。ｅｅは、以下の式（１）を用いて２つのエナンチオマーのピーク面積を計算することによって決定することができる。以下の式において、ＲはＲ体の濃度、ＳはＳ体の濃度を表す。
【００４１】
【数１】
2020009168.tif 000004
【実施例】
【００４２】
以下，実施例に基づいて本発明をより具体的に説明する。ただし，本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。なお，本願全体を通して引用される全文献は参照によりそのまま本願に組み込まれる。また、以下の実施例においては、ＨＮＬのアミノ酸の番号はシグナル配列を含まない成熟タンパク質におけるアミノ酸の位置を示す。よって、図４及び配列表と以下の実施例とでは同じアミノ酸を表す番号が異なる。【００４３】
（実施例１）ＣｈｕａＨＮＬの構造解析
（マンデロニトリル（ＭＡＮ）合成のための酵素アッセイ）
ラセミ体ＭＡＮは、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ、ＵＳＡ）から購入した。ＨＮＬによる（Ｒ）−ＭＡＮの合成活性を以前に報告されたように測定した（Ｄａｄａｓｈｉｐｏｕｒ，Ｍ．ら，（２０１５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１１２：１０６０５−１０６１０．）。要約すると、酵素試料を１ｍｌの反応緩衝液（４００ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ４．２）、５０ｍＭベンズアルデヒド及び１００ｍＭシアン化カリウム）に加え、混合物を２２℃で５分間インキュベートした。次いで、９倍量のｎ−ヘキサン：２−プロパノール（８５：１５）と混合することによって反応を停止させた。最後に、キラルカラム（ＣＨＩＲＡＬＣＥＬ  ＯＪ−Ｈ、Ｄａｉｃｅｌ、Ｔｏｋｙｏ、Ｊａｐａｎ）（内径４．６ｍｍ×２００ｍｍ長、粒子サイズ５μｍ）を備えたＨＰＬＣ装置（ＵＦＬＣ  Ｐｒｏｍｉｎｅｎｃｅ  Ｌｉｑｕｉｄ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈ  ＬＣ−２０ＡＤ、Ｓｈｉｍａｄｚｕ、Ｋｙｏｔｏ、Ｊａｐａｎ）を用いて有機層を分析した。１ユニットの活性は、ベンズアルデヒド及びシアン化水素から１分間に１μｍｏｌの（Ｒ）−ＭＡＮを合成する酵素の量として定義した。【００４４】
（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ発現系におけるＣｈｕａＨＮＬの構築）
ＣｈｕａＨＮＬ  ｃＤＮＡは、ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−ＤＮＡポリメラーゼ（ＴＯＹＯＢＯ、Ｏｓａｋａ、Ｊａｐａｎ）、Ｈｉｓ−ＣｈｕａＨＮＬ−Ｆｗプライマー及びＨｉｓ−ＣｈｕａＨＮＬ−Ｒｖプライマーを用いて、ＣｈｕａＨＮＬ  ｃＤＮＡ（Ｄａｄａｓｈｉｐｏｕｒら（２０１５）上掲）を鋳型としたＰＣＲによって増幅した。得られたＰＣＲ産物をＸｈｏＩ及びＸｂａＩ（ＴａＫａＲａ）で消化し、ピキア（Ｐｉｃｈｉａ）発現ベクターｐＰＩＣＺαＡのＡＯＸ１プロモーター下にクローニングし、ｐＰＩＣＺαＡ−Ｈｉｓ−ＣｈｕａＨＮＬを得た。【００４５】
Ｈｉｓ−ＣｈｕａＨＮＬ−Ｆｗプライマー（配列番号２２）：
ＧＣＧＣＴＣＧＡＧＡＡＡＡＧＡＧＣＡＣＡＴＣＡＴＣＡＴＣＡＴＣＡＴＣＡＴＣＡＴＣＡＴＧＡＡＡＡＴＴＴＡＴＡＣＴＴＣＣＡＡＧＧＧＴＣＡＣＴＧＡＣＴＴＧＴＧＡＴＣＡＡＣＴＴＣＣＣ
Ｈｉｓ−ＣｈｕａＨＮＬ−Ｒｖプライマー（配列番号２３）：
ＣＧＣＴＣＴＡＧＡＴＴＡＧＴＡＡＡＡＡＧＣＡＡＡＧＣＡＡＣＣＧＴＧＧＧＴＴＴＣ【００４６】
Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ由来のタンパク質ジスルフィドイソメラーゼ（ＰＤＩ）をコードする遺伝子（ＰｐＰＤＩ、Ｇｅｎｂａｎｋ  ＩＤ：ＡＪ３０２０１４）を、プライマー対（ＰｐＰＤＩ−ＩｎＦｕ−Ｆｗプライマー及びＰｐＰＤＩ−ＩｎＦｕ−Ｒｖプライマー）、及びＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−Ｎｅｏ  ＤＮＡポリメラーゼ（ＴＯＹＯＢＯ））を用いて、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓゲノムＤＮＡを鋳型としてＰＣＲにより増幅した。得られたＤＮＡ断片を、Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ  ＨＤクローニングキット（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ、ＣＡ、ＵＳＡ）を用いて、Ｐｉｃｈｉａ発現ベクターのｐＡＯ８１５におけるＡＯＸ１プロモーター下のＥｃｏＲＩ（ＴａＫａＲａ）部位にクローニングした。得られた発現ベクターをＳｔｕＩ（ＴａＫａＲａ）で直線化し、エレクトロトランスフォーメーション法によりＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓ  ＧＳ１１５株に形質転換した。  得られた発現ベクターをＳａｃＩ（ＴａＫａＲａ）により線状化し、細胞に形質転換した。形質転換体は、５’ＡＯＸ１プライマー及び３’ＡＯＸ１プライマーを用いたコロニーＰＣＲによって確認した。【００４７】
ＰｐＰＤＩ−ＩｎＦｕ−Ｆｗプライマー（配列番号２４）：
ＴＣＧＡＡＡＣＧＡＧＧＡＡＴＴＣＡＣＣＡＴＧＣＡＡＴＴＣＡＡＣＴＧＧＧＡＴＡＴＴ
ＰｐＰＤＩ−ＩｎＦｕ−Ｒｖプライマー（配列番号２５）：
ＴＧＴＣＴＡＡＧＧＣ  ＧＡＡＴＴＣＴＴＡＡＡＧＣＴＣＧＴＣＧＴＧＡＧＣＧＴＣ
５’ＡＯＸ１プライマー（配列番号２６）：
ＧＡＣＴＧＧＴＴＣＣＡＡＴＴＧＡＣＡＡＧＣ
３’ＡＯＸ１プライマー（配列番号２７）：
ＧＣＡＡＡＴＧＧＣＡＴＴＣＴＧＡＣＡＴＣＣ【００４８】
（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓの培地及び培養条件）
Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ  ＧＳ１１５株を、必要に応じて１００〜２０００μｇ／ｍｌのゼオシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ、ＵＳＡ）を添加したＹＰＤＳ培地（２％グルコース、２％ペプトン、１％酵母エキス、２％寒天及び１Ｍソルビトール）中、２８℃で増殖させ、形質転換させた。タンパク質発現のために、必要に応じて０．００４％のヒスチジンを添加した、緩衝化最小グリセロール（ＢＭＧ）培地（アミノ酸を含まない１．３４％酵母窒素塩基、４×１０−５％ビオチン、１００ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ  ７．０）及び１％グリセロール）、又はＢＭＭ培地（１％グリセロールが１％メタノールに置き換えられたＢＭＧ培地）を使用した。培養は往復振盪しながら好気的条件下、２８℃で行い、酵母の増殖は波長６００ｎｍでの光学濃度を測定することによってモニターした。大腸菌ＨＳＴ０８株（ＴａＫａＲａ  Ｂｉｏ、Ｏｔｓｕ、Ｊａｐａｎ）をプラスミド増幅に用いた。必要に応じてアンピシリン（５０ｍｇ／ｍｌ）又はゼオシン（２５ｍｇ／ｍｌ）を添加した低塩Ｌｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉ（ＬＢ）培地（１％トリプトン、０．５％酵母エキス及び０．５％ＮａＣｌ）中、３７℃で大腸菌を増殖させた。【００４９】
（ＣｈｕａＨＮＬタンパク質の精製）
天然のＣｈｕａＨＮＬは以前に報告されたプロトコールにより精製した。要約すると、まず、緩衝液−Ａ（２０ｍＭリン酸カリウム、ｐＨ７．０）に可溶化されたヤスデのホモジネートを硫酸アンモニウム沈殿法により分画した。次に、ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ  Ｂｕｔｙｌ−６５０Ｍ（Ｔｏｓｏｈ、Ｔｏｋｙｏ、Ｊａｐａｎ）、ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ  ＤＥＡＥ−６５０Ｍ（Ｔｏｓｏｈ）、Ｑ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＦＦ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｃｈｉｃａｇｏ、ＩＬ、ＵＳＡ）及びＳｕｐｅｒｄｅｘ  ７５  １０／３００ＧＬ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて天然のＣｈｕａＨＮＬタンパク質を精製した。最後に、活性画分を集め、ＳＤＳ−ＰＡＧＥに供して純度を評価した。タンパク質の結晶化のために、緩衝液を５０ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ５．０）と交換し、使用するまで４℃で保存した。【００５０】
組換えＨｉｓタグ化ＣｈｕａＨＮＬは、ＰｐＰＤＩを発現するＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓにおけるタンパク質分泌系によって発現させた。最初に、６日間のインキュベーション後の培地を、２Ｍ水酸化ナトリウムを添加することによりｐＨ７．５に調整した。  次に、Ｈｉｓ−ｔａｇタンパク質をＮｉ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ６  ＦＦ樹脂（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）、Ｍｏｎｏ  Ｑ  ５／５０  ＧＬ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）及びＳｕｐｅｒｄｅｘ  ２００  １０／３００  ＧＬ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて精製した。  最後に、活性画分を１０ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ５．５）に透析し、使用するまで−２０℃で保存した。【００５１】
（結晶化、データ収集、構造決定）
タンパク質結晶化のための全ての化学物質は、Ｈａｍｐｔｏｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（Ａｌｉｓｏ  Ｖｉｅｊｏ、ＣＡ、ＵＳＡ）から購入した。天然及び組換えＣｈｕａＨＮＬタンパク質溶液を、Ａｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ  Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｌ  Ｆｉｌｔｅｒ  Ｕｎｉｔｅｓ  ＮＭＷＬ、１０ｋＤａ（Ｍｅｒｃｋ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ、ＭＡ、ＵＳＡ）を用いて１０ｍｇ／ｍｌまで濃縮した。標準物質としてウシ血清アルブミン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を用いて、Ｑｕｉｃｋ  Ｓｔａｒｔ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｓｓａｙ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ、ＵＳＡ）によりタンパク質濃度を測定した。  ＣｒｙｓｔａｌＳｃｒｅｅｎ  Ｉ及びＩＩ（Ｈａｍｐｔｏｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を用いて初期結晶化条件をスクリーニングし、０．２Ｍの硫酸アンモニウム、０．１Ｍの酢酸ナトリウム（ｐＨ４．６）、３０％（ｗ／ｖ）ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）モノメチルエーテル２，０００の条件下で二面体結晶を得た。最後に、０．２Ｍ硫酸アンモニウム、０．１Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ５．０）、２８〜３２％（ｗ／ｖ）ＰＥＧモノメチルエーテル２０００、及び０．３Ｍ  ＮＤＳＢ−１９５の条件下、２０℃で３日間ハンギングドロップ蒸気拡散法を用いて最良の結晶を得た。【００５２】
相の決定のために、凍結及びデータ収集の前に、天然ＣｈｕａＨＮＬ結晶は０．５Ｍヨウ化ナトリウムを含有する貯蔵溶液中に２０℃で３０分間浸漬した。アセテートと複合体を形成した天然及び組換え構造については、得られた結晶を直接データ収集に使用した。リガンドを含まない形態については、天然タンパク質から得られた結晶を浸漬溶液−１（３２％（ｗ／ｖ）ＰＥＧモノメチルエーテル２，０００、０．３Ｍ  ＮＤＳＢ−１９５，５０ｍＭビス−トリス−プロパン、５０ｍＭクエン酸、ｐＨ４．５）中に２０℃で２０分間浸し、アセテートを除去した。チオシアン酸塩、ヨードアセテート及びシアン化物イオンを有する複雑な構造の場合、それぞれ、８０ｍＭチオシアン酸カリウム、１０ｍＭのヨード酢酸ナトリウム及び０．５Ｍのシアン化カリウムを含む浸漬溶液−１中に、リガンド非含有形態の結晶を浸漬した。【００５３】
すべての結晶をパーフルオロエーテルで凍結保護し、データセットを窒素流下１００Ｋで収集した。単一異常分散（ＳＡＤ）フェーズのＸ線回折データは、Ｘ線発生器及びイメージングプレート（ＭｉｃｒｏＭＡＸ−００７及びＲ−ＡＸＩＳ  ＶＩＩ、Ｒｉｇａｋｕ、Ｔｏｋｙｏ、Ｊａｐａｎ）で収集した。他のデータは、Ｐｈｏｔｏｎ  Ｆａｃｔｏｒｙ  ｂｅａｍｌｉｎｅ  ＢＬ−１Ａ及びＢＬ−５Ａ（つくば、日本）のシリコンピクセル検出器（Ｐｉｌａｔｕｓ  ２Ｍ−Ｆ、ＤＥＣＴＲＩＳ、Ｂａｄｅｎ−Ｄａｅｔｔｗｉｌ、スイス）及びＣＣＤ検出器（Ｑｕａｎｔｕｍ  ３１５ｒ、Ａｒｅａ  Ｄｅｔｅｃｔｏｒ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｐｏｗａｙ、ＣＡ，ＵＳＡ）を用いて収集した。【００５４】
すべてのデータセットはＸＤＳ（Ｋａｂｓｃｈ，Ｗ．（２０１０）Ａｃｔａ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．Ｄ  Ｂｉｏｌ．Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．６６，１２５−１３２）を使用して統合され、ＳＣＡＬＡ（Ｗｉｎｎ，Ｍ．Ｄ．ら，（２０１１）Ａｃｔａ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．Ｄ  Ｂｉｏｌ．Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．６７，２３５−２４２）によってスケーリングした。ＳＨＥＬＸ  ｓｕｉｔｅ（Ｓｈｅｌｄｒｉｃｋ，Ｇ．Ｍ．（２０１０）Ａｃｔａ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｉｃａ  Ｓｅｃｔｉｏｎ  Ｄ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｙ  ６６，  ４７９−４８５）を用いて初期相を決定した。  全てのモデルはＣＯＯＴ（Ｅｍｓｌｅｙ，Ｐ．ら，Ａｃｔａ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｉｃａ  Ｓｅｃｔｉｏｎ  Ｄ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｙ  ６６，４８６−５０１）を用いて修正され、ＲＥＦＭＡＣ５（Ｍｕｒｓｈｕｄｏｖ，Ｇ．Ｎ．ら，（１９９７）Ａｃｔａ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．  Ｄ  Ｂｉｏｌ．  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．  ５３，  ２４０−２５５）又はＰＨＥＮＩＸ（Ａｆｏｎｉｎｅ，Ｐ．Ｖ．ら，（２０１２）Ａｃｔａ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．  Ｄ  Ｂｉｏｌ．  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．６８，３５２−３６７）プログラムを用いて改良された。【００５５】
（構造解析）
すべての構造は、ＭｏｌＰｒｏｂｉｔｙ（Ｃｈｅｎ，Ｖ．Ｂ．ら，（２０１０）Ａｃｔａ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｉｃａ  Ｓｅｃｔｉｏｎ  Ｄ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｙ  ６６，１２−２１）を使用して検証され、Ｒａｍａｃｈａｎｄｒａｎプロットの不許可領域には残基は存在しなかった。相分析の統計を表１に、データ収集及び構造の改良の統計を表２に示す。構造分析はＰＩＳＡ（Ｋｒｉｓｓｉｎｅｌ，Ｅ．ら，（２００７）Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ３７２，  ７７４−７９７）を用いて行った。  タンパク質構造の図はＰｙＭＯＬプログラム（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｐｙｍｏｌ．ｏｒｇ）を用いて作製した。【００５６】
【表１】
2020009168.tif 000005
【００５７】
【表２】
2020009168.tif 000006
【００５８】
（ＣｈｕａＨＮＬの全体構造）
ヤスデから精製された天然のＣｈｕａＨＮＬの結晶構造は、ヨウ素含浸ＣｈｕａＨＮＬ結晶を用いてＳＡＤ法により内部Ｘ線源で２．１Åの分解能に回折することにより測定した（表１）。結晶はＰユニットに１分子存在した（表２及び図１Ａ）。  アミノ酸残基は、シグナルペプチドを除去した成熟ＣｈｕａＨＮＬのＮ末端Ｌｅｕ残基から番号付けした。成熟したＣｈｕａＨＮＬのＮ末端のＬｅｕ１及びＣ末端のＴｙｒ１６２の電子密度マップが明瞭に確認された。ＣｈｕａＨＮＬは、２つのα−ヘリックス、３つの３１０ヘリックス、及び８つのβシートを含んでいた（図１）。８つのβシートは、中央活性部位空洞を含む逆平行βバレルを形成していた（図１Ｂ）。【００５９】
ＣｈｕａＨＮＬと相同的な配列はＢＬＡＳＴ検索では見つからなかったが、Ｄａｌｉサーバー（Ｈｏｌｍ，Ｌ．ら，（２０１０）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ３８，  Ｗ５４５−５４９）を用いた構造比較検索により、ＣｈｕａＨＮＬがリポカリンタンパク質に似ていることを明らかとなった。多くの典型的なリポカリンは、１０より高いＺスコアを与え、有意な構造類似性を示す。典型的なリポカリンに対するＣｈｕａＨＮＬの全体的なアミノ酸配列同一性は８％未満であった。  リポカリンは、一般に、ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌｌｙ−ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ  ｒｅｇｉｏｎｓ（ＳＣＲ）１〜３（Ｆｌｏｗｅｒ  Ｄ．Ｒ．（１９９６）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．  ３１８（Ｐｔ１），１−１４）として知られる３つの構造的及び配列的に保存されたモチーフを含む。ＳＣＲにおけるアミノ酸類似性が非常に低いにもかかわらず、ＣｈｕａＨＮＬの二次構造はヒトレチノール結合タンパク質４の二次構造とよく重複していた。【００６０】
（ＣｈｕａＨＮＬの活性部位へのリガンドの結合）
アセテート結合型
ＣｈｕａＨＮＬ構造のアセテート結合形態を１．５Åの分解能で測定した。リザーバー溶液中に含まれるアセテートが活性部位に観察された。カルボキシ酸素は、Ａｒｇ３８及びＴｙｒ４０と塩橋を形成していた（図２Ａ）。
リガンドフリーの形態
ＣｈｕａＨＮＬ構造のリガンドを含まない形態を１．６Åの分解能で測定した。  活性部位に結合した酢酸塩を除去するために、結晶をビス−トリスプロパン−クエン酸緩衝液を含む溶液に浸漬した。３つの水分子が活性部位に観察された（図２Ｂ）。これらはＡｒｇ３８、Ｔｙｒ１０３、及びＬｙｓ１１７と水素結合を形成していた。
シアン化物イオン結合型
シアン化物イオンと複合体を形成したＣｈｕａＨＮＬの結晶構造を２．１Åの分解能で測定した（図２Ｃ）。シアン化物イオンの配向は温度係数及び負に帯電した炭素とＡｒｇ３８との間に存在し得る静電相互作用によって決定した。シアン化物イオンの窒素原子は３．３Åの距離でＴｒｙ４０−Ｏηと水素結合を形成した。シアン化物イオンの負に帯電した炭素は、４．２Åの距離でＡｒｇ３８−Ｎη１と静電的に相互作用していた。
阻害剤結合型
本発明者らは以前に、ヨードアセテート及びチオシアネートがＣｈｕａＨＮＬによって触媒される（Ｒ）−ＭＡＮ合成反応を阻害することを報告した（Ｄａｄａｓｈｉｐｏｕｒら（２０１５）上掲）。ヨードアセテートとチオシアン酸塩との複合体を形成したＣｈｕａＨＮＬのそれぞれの構造を、１．５５Åの分解能で測定した。ヨードアセテートとの複合体構造において、カルボキシ酸素は、３．１Å及び３．０Åの距離でＡｒｇ３８−Ｎ１η及びＮ２ηと、また、３．１Åの距離でＬｙｓ１１７−Ｎεと塩橋を形成した（図２Ｄ）。ヨードアセテートのヨウ素原子は、４．３Åの距離でＰｈｅ６７と弱いπ相互作用を形成することがある。Ｐｈｅ６７とＡｒｇ３８との間の強いａｎｏｍａｌｏｕｓ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ  ｍａｐは、ヨウ素原子の存在を意味した。
チオシアン酸塩との複合体構造において、２つの代替結合様式が観察された。結晶構造中の２つのチオシアネート分子の配向は、構造微細化後のより低いＢ因子値によって決定された。１つの結合様式（図２Ｅ、ＳＣＮ１）において、チオシアネートの硫黄原子は、Ｔｙｒ１０３−Ｏη及びＡｒｇ３８−Ｎη１と、それぞれ３．０Å及び３．２Åの距離で水素結合を形成していた。もう一つの結合様式（図２Ｅ、ＳＣＮ２）では、チオシアン酸塩の硫黄原子は、３．１Åの距離でＡｒｇ３８−Ｎη２及びＬｙｓ１１７−Ｎεと塩橋を形成していた（図２Ｅ）。【００６１】
（（Ｒ）−ＭＡＮのドッキングシミュレーション）
ＣｈｕａＨＮＬがシアノヒドリンの合成及び切断反応をどのように触媒するかを知るために、ＭＯＥ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｏｐｅｒａｔｉｎｇ  Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ、バージョン２０１６．８；（ｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐｕｔｉｎｇ  Ｇｒｏｕｐ、Ｍｏｎｔｒｅａｌ、カナダ）によりＣｈｕａＨＮＬの活性部位への（Ｒ）−ＭＡＮのドッキングシミュレーションを行った。最も顕著な親和性スコア（Ｓ  ＝−５．４４）を与えるモデルにおける、活性部位の空洞における（Ｒ）−ＭＡＮの結合を図３に示す。（Ｒ）−ＭＡＮの水酸基及びニトリル基は、活性部位の底でＣｈｕａＨＮＬの親水性残基と相互作用していた。  （Ｒ）−ＭＡＮのベンゼン基は、多くの疎水性及び芳香族残基（Ｉｌｅ１１、Ｐｈｅ１７、Ｐｈｅ２５、Ａｌａ５４、Ｐｈｅ６７、Ａｌａ７５、Ｌｅｕ７７、Ｔｒｐ８８、Ｐｈｅ９０、Ａｌａ１０５及びＡｌａ１１９）によって取り囲まれていた。深い疎水性空洞は、以前に観察されたように（Ｄａｄａｓｈｉｐｏｕｒら（２０１５）上掲）、様々なかさ高いシアノヒドリンを受容するのに役立つと考えらえた。【００６２】
親水性残基と（Ｒ）−ＭＡＮとの相互作用を図３Ｂに示す。（Ｒ）−ＭＡＮの水酸基は、Ｌｙｓ１１７−Ｎε及びＡｒｇ３８−Ｎη１と、それぞれ３．３Å及び３．３Åの距離で水素結合を形成していた。ニトリル基は、Ａｒｇ３８−Ｎη１、Ａｒｇ３８−Ｎη２及びＴｙｒ１０３−Ｏηと、それぞれ３．４，３．３及び３．３Åの距離で水素結合を形成していた。Ａｓｐ５６は、Ａｒｇ３８−Ｎη２、Ａｒｇ３８−Ｎε及びＬｙｓ１１７−Ｎεと塩橋を形成する。Ｔｙｒ４０−Ｏηは、Ａｒｇ３８−Ｎη１及びＴｙｒ１０３−Ｏηと水素結合を形成する。リガンド結合を含む残基の結合長さ及び配向は、５つのＣｈｕａＨＮＬ構造においてほぼ同一であった。【００６３】
（実施例２）ＯｇｒａＨＮＬ変異体の作製と活性測定
（化合物）
全ての化合物は市販品を購入した。ベンズアルデヒド及び（Ｒ／Ｓ）−ＭａｎはＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈから購入した。２−クロロベンズアルデヒドは東京化成工業（Ｔｏｋｙｏ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｉｎｄｕｓｔｒｙ）から購入した。（Ｒ／Ｓ）−２−Ｃｌ−ＭａｎはＡｌａｇｏｚらの方法（Ａｌａｇｏｚ  Ｄら，Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ（２０１４）１０１：４０−４６）に従って合成した。【００６４】
（組換えＯｇｒａＨＮＬの培養及び発現）
以前に構築されたｏｇｒａｈｎ１遺伝子を含有するプラスミドｐＥＴ２８ａ（Ｙａｍａｇｕｃｈｉ  Ｔら，Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｒｅｐｏｒｔｓ（２０１８）８（１）：３０５１）を保有する大腸菌ＳＨｕｆｆｌｅ  Ｔ７株の形質転換体を用いてＯｇｒａＨＮＬを生産した。組換え大腸菌細胞を、カナマイシン（５０μｇ／ｍｌ）を含有するＬＢ培地５ｍｌに接種し、２５０ｒｐｍで振とうしながら３０℃で１６〜１８時間培養し、次いでカナマイシン（５０μｇ／ｍｌ）を含有するＬＢ培地５００ｍｌに移した。１５０ｒｐｍで振とうしながら３０℃で６時間培養した後（ＯＤ６００＝０．６−０．８）、最終濃度１ｍＭとなるようにイソプロピルβ−チオガラクトシド（ＩＰＴＧ）を添加し、培養物を１６℃で２０時間さらに培養した。  ４，５００×ｇ、４℃で１０分間遠心分離して細胞を回収した。採取した細胞を、５００ｍＭ塩化ナトリウム及び２０ｍＭイミダゾールを含有する２０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ＫＰＢ、ｐＨ７．４）に再懸濁し、超音波処理により破壊した。４℃、１５，０００×ｇで１０分間遠心分離した後に得られた上清を粗酵素として用いた。【００６５】
（組換えＯｇｒａＨＮＬの精製）
最初に、粗酵素をＮｉ２＋セファロース６  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社、ウプサラ、スウェーデン）上にロードし、５００  ｍＭ塩化ナトリウム、及び３００ｍＭイミダゾールを含有する２０ｍＭのＫＰＢ（ｐＨ  ７．４）で溶出した。活性画分を回収して濃縮し、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ、ｐＨ７．３）で交換してトロンビン消化（２２℃、２Ｕトロンビン／１００μｇタグ−タンパク質で１６時間）を行い、目的タンパク質からＨｉｓタグを除去した。次いで、タンパク質をモノＱ５／５０ＧＬカラム（ＧＥヘルスケア）にロードし、溶出緩衝液（２０ｍＭ  ＫＰＢ及び５００ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．４）の０−５０％勾配を１ｍｌ／分の流速で流して溶出した。全ての精製工程は０〜４℃で行った。タンパク質の純度は、１２％ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）によって評価した。タンパク質濃度は、標準タンパク質としてウシ血清アルブミンを用いて、ＢＣＡアッセイキット（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＭＡ、ＵＳＡ）で測定した。【００６６】
（結晶化及び構造決定）
最適な結晶化条件のスクリーニングは、シッティングドロップ蒸気拡散法を用いて９６ウェルＩｎｔｅｌｌｉ−Ｐｌａｔｅｓ（Ａｒｔ  Ｒｏｂｂｉｎｓ  ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、ＣＡ、ＵＳＡ）を用いて２０℃で行った。等容量（１μＬ）のリザーバー溶液と１０ｍｇ／ｍＬのＯｇｒａＨＮＬのタンパク質溶液とを混合することによって、液滴を調製した。スクリーニングは、ＩｎｄｅｘＴＭ−ＨＲ２−１４４（Ｈａｍｐｔｏｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、ＣＡ、ＵＳＡ）を用いて行った。単結晶は、２．０Ｍ硫酸アンモニウムを含有する０．１Ｍ  ＢＩＳ−ＴＲＩＳ（ｐＨ５．５）中で１日後に現れた。ＯｇｒａＨＮＬの結晶を、１０％、２０％及び２５％（ｖ／ｖ）グリセロールを含む貯蔵溶液中にそれぞれ約３０秒間連続的に浸漬した。次いで、結晶を２−クロロベンズアルデヒド１滴を添加した２５％（ｖ／ｖ）グリセロール凍結保護剤溶液に２時間浸漬し、シアン化カリウム（ＫＣＮ）で５分間浸漬した後、液体窒素流下でフラッシュ冷却した。【００６７】
Ｒｉｇａｋｕ  Ｍｉｃｒｏ−Ｍａｘ００７ＣｕＫα回転陽極Ｘ線発生器及びＲｉｇａｋｕ  Ｒ−ＡＸＩＳＶＩＩ画像プレート検出器を使用して、極低温で回折データを収集した。回折データの索引付けと積分はＸＤＳ（Ｋａｂｓｃｈ  Ｗ（２００６）Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｙ  ｏｆ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ：２１８−２２５）によって行われ、スケーリングはＳｃａｌａ（Ｅｖａｎｓ  Ｐ（２００６）  Ａｃｔａ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｉｃａ  Ｓｅｃｔｉｏｎ  Ｄ：  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｙ；６２（１）：７２−８２）によってＣＣＰ４プログラムｓｕｉｔ（Ｗｉｎｎ  ＭＤら（２０１１）  Ａｃｔａ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｉｃａ  Ｓｅｃｔｉｏｎ  Ｄ：  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｙ；６７（４）：２３５−２４２）で実施した。データは空間群Ｐ６３において六方（Ｈｅｘａｇｏｎａｌ）として処理した。初期段階は、ＣｈｕａＨＮＬで得られた結晶構造をテンプレートとして用いて、ＣＣＰ４プログラムスーツのＭｏｌｒｅｐ（Ｖａｇｉｎ  Ａら（２０００）Ａｃｔａ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｉｃａ  Ｓｅｃｔｉｏｎ  Ｄ：  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｙ；５６（１２）：１６２２−１６２４）によって決定された。モデル構築と構造の改良は、それぞれＣｏｏｔ（Ｅｍｓｌｅｙ  Ｐ，  Ｃｏｗｔａｎ  Ｋ（２００４）Ａｃｔａ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｉｃａ  Ｓｅｃｔｉｏｎ  Ｄ：  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｙ；６０（１２）：２１２６−２１３２）とＲｅｆｍａｃ５（Ｍｕｒｓｈｕｄｏｖ  ＧＮら（１９９７）Ａｃｔａ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｉｃａ  Ｓｅｃｔｉｏｎ  Ｄ：  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｙ；５３（３）：２４０−２５５）を用いて行った。  Ｒｆｒｅｅ値は、精密化に使用されなかった無作為に選ばれた反射の５％から計算した（Ｋｌｅｙｗｅｇｔ  ＧＪら（１９９６）Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ；４（８）：８９７−９０４）。水分子は、手動及び自動の両方で異なる電子密度マップに配置され、幾何学的基準及びそれらの純化されたＢ因子（Ｂ  ＜６０Å２）に基づいて保持されるか拒否された。すべての構造図はＰｙＭｏｌ  （Ｓｃｈｒｏｄｉｎｇｅｒ  Ｌ：Ｔｈｅ  ＰｙＭＯＬ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｇｒａｐｈｉｃｓ  ｓｙｓｔｅｍ，ｖｅｒｓｉｏｎ  １．３  ｒ１．  Ｓｃｈｒｏｄｉｎｇｅｒ，  ＬＬＣ，Ｐｏｒｔｌａｎｄ，ＯＲ．Ｉｎ．；２０１０．）によって作成した。【００６８】
（ＭＯＥプログラムを用いたドッキングシミュレーション）
（Ｒ）−２−Ｃｌ−Ｍａｎと複合体化したＯｇｒａＨＮＬ変異体の構造を予測するために、（Ｒ）−２−Ｃｌ−Ｍａｎと複合体化したＯｇｒａＨＮＬの結晶構造を鋳型として、ＭＯＥを用いたドッキングシミュレーションを行った。タンパク質は剛性を保持した。（Ｒ）−２−Ｃｌ−Ｍａｎの位置及び配向ならびにクロロフェニル基及びＯＨ基を含む２つのねじれ角をシミュレーション中に変化可能とした。ドッキングシミュレーションは、Ｃｏｍｐｕｔｅ−Ｓｉｍｕｌａｔｉｏｎドックプログラムで実行した。すべてのパラメータは、ＭＯＥソフトウェアのデフォルト設定に従った。【００６９】
（ＯｇｒａＨＮＬの部位特異的突然変異誘発）
全てのＯｇｒａＨＮＬ突然変異体を作製するために、テンプレートとしてｐＥＴ２８ａ−ＯｇｒａＨＮＬを用い、突然変異誘発プライマー（表３）及びＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ  ＩＩキット（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ、ＣＡ、ＵＳＡ）を用いて目的部位に置換を導入して、部位特異的突然変異を行った。反応混合物は、１０×反応緩衝液  １μｌ、ｄＮＴＰ混合物  ０．２μｌ、蒸留水  ８．２μｌ、ＰｆｕＴｕｒｂｏ  ＤＮＡポリメラーゼ  ０．５Ｕ、１０ｎｇ／μｌのセンス及びアンチセンスプライマー  各０．２μｌからなり、５０ｎｇ／μｌのｐＥＴ２８ａ−ＯｇｒａＨＮＬベクター（０．２μｌ）をテンプレートＤＮＡとして使用した。変性（９５℃、３０秒）、アニーリング（５５℃、１分）、及び伸長（６８℃、６分）を１６サイクル行った。生成物を３７℃で１時間ＤｐｎＩ（１０Ｕ）で処理し、次いで大腸菌ＳＨｕｆｆｌｅ  Ｔ７に形質転換した。すべての変異酵素の産生及び精製は、上述の野生型と同様の方法で行った。【００７０】
【表３】
2020009168.tif 000007
【００７１】
（ＨＮＬ活性アッセイ）
ベンズアルデヒドからのマンデロニトリルの合成は、わずかな改変を加えた以外は以前の報告（Ｄａｄａｓｈｉｐｏｕｒら（２０１５）上掲）に従ってキラルカラムを用いたＨＰＬＣで分析した。酵素サンプル（１４０μｌ）を、５０ｍＭベンズアルデヒド及び１００ｍＭ  ＫＣＮを含有する、３００ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ４．０）１１０μｌに添加し、混合し、２５℃で３分間インキュベートした。反応を停止させるために、１００μｌの反応物を９００μｌのｎ−ヘキサン：２−プロパノール＝  ８５：１５と激しく混合して、得られた（Ｒ）−Ｍａｎを抽出した。得られた有機相の１０マイクロリットルを、Ｄａｄａｓｈｉｐｏｕｒら（２０１５）（上掲）に記載された方法に従って、ＣＨＩＲＡＬＣＥＬ  ＯＪ−Ｈカラム（粒径５μｍ、内径４．６ｍｍ×２５０ｍｍ、Ｄａｉｃｅｌ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、東京。日本）を備えたＰｒｏｍｉｎｅｎｃｅ  ＵＶ−Ｖｉｓ検出器ＳＰＤ−２０Ａ（Ｓｈｉｍａｄｚｕ、Ｋｙｏｔｏ、Ｊａｐａｎ）に接続したＵＦＬＣ  Ｐｒｏｍｉｎｅｎｓｅ液体クロマトグラフＬＣ−２０ＡＤを用いて、以下の条件で分析した：
移動相    ｎ−ヘキサン：２−プロパノール（８５：１５）
流速      １ｍｌ／分
ＯＪ−Ｈカラムのカラムオーブン温度    ３０℃
吸光度    ２５４ｎｍの吸光度
最初の３分間、直線的に進行した反応を活性の計算に用いた。１単位の活性は、アッセイ条件下でベンズアルデヒドから１分間に１μｍｏｌの光学活性マンデロニトリルを産生する酵素の量として定義した。【００７２】
２−クロロベンズアルデヒドから２−Ｃｌ−Ｍａｎを合成するために、酵素試料（１５０μｌ）を５０ｍＭ  ２−クロロベンズアルデヒド及び６０ｍＭ  ＫＣＮを含む３００ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ３．５）１００μｌに添加し、混合し、２５℃で５分間インキュベートした。反応を停止させるために、ｎ−ヘキサン：２−プロパノール（９５：５）１ｍｌを反応混合物に加え、次いで激しく混合し、１５，０００×ｇで５分間遠心分離した。５μｌの有機相を、以下の条件下でＣＨＩＲＡＬＰＡＫ  ＩＣカラム（粒径５μｍ；内径４．６ｍｍ×２５０ｍｍ；Ｄａｉｃｅｌ）を備えたＨＰＬＣにより、以下の条件で分析した：
移動相    ｎ−ヘキサン：２−プロパノール（９５：５）
流速    １ｍｌ／分
カラムオーブン温度    ３０℃
吸光度    ２２０ｎｍ
酵素活性は、最初の５分間の反応から得られた線形曲線から計算した。１単位の合成活性は、アッセイ条件下で２−クロロベンズアルデヒドから１分あたり１μｍｏｌの光学活性２−クロロマンデロニトリルを産生する酵素の量として定義した。【００７３】
形成された（Ｒ）−Ｍａｎ及び（Ｒ）−２−Ｃｌ−Ｍａｎの変換及びｅｅをキラルＨＰＬＣによって分析した。対応する基質の標準曲線を用いて変換を計算した。ｅｅは、以下の式を用いて２つのエナンチオマーのピーク面積を計算することによって決定した。【００７４】
【数２】
2020009168.tif 000008
【００７５】
ここで、Ｒ及びＳはそれぞれ（Ｒ）−Ｍａｎ又は（Ｒ）−２−Ｃｌ−Ｍａｎ及び（Ｓ）−Ｍａｎ又は（Ｓ）−２−Ｃｌ−Ｍａｎの濃度を表す。【００７６】
（反応速度分析）
反応速度分析のために、ベンズアルデヒドの（Ｒ）−Ｍａｎへの酵素的変換、及び２−クロロベンズアルデヒドの（Ｒ）−２−Ｃｌ−Ｍａｎへの酵素的変換の初期速度を、上記方法に従って、クエン酸塩緩衝系中、種々の濃度の基質（０〜６０ｍＭ）と０．１２５Ｕの総酵素量を各反応に使用してアッセイした。【００７７】
（活性及びエナンチオ選択性への有機溶媒の影響）
酢酸エチル（ＥＡ）、ジエチルエーテル（ＤＥＥ）、メチル−ｔ−ブチルエーテル（ＭＴＢＥ）、２−イソプロピルエーテル（ＤＩＰＥ）、ジブチルエーテル（ＤＢＥ）、メタノール（Ｍｅｔ）、及びヘキサン（Ｈｅｘ）の各有機溶媒０．５ｍｌを等量のクエン酸塩緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ７．０）と混合し、１，２００ｒｐｍ、１０℃で６０分間振とうして平衡化した。酵素（２．５Ｕ）をクエン酸緩衝液相に添加し、水性相と有機相との界面を乱すことなく穏やかに混合した。時間０及びインキュベーション１２時間後に、上記のように、１０℃、１，２００ｒｐｍで振とうして酵素活性を測定した。【００７８】
（ＯｇｒａＨＮＬの結晶構造と反応メカニズム）
ＯｇｒａＨＮＬの一次構造はＣｈｕａＨＮＬと７３％のアミノ酸同一性を有している（図４）。ＣｈｕａＨＮＬを鋳型構造とし、（Ｒ）−２−Ｃｌ−Ｍａｎと複合体化したＯｇｒａＨＮＬの結晶構造を２．０５Å分解能の分子置換法により決定した。この酵素はホモ二量体であり、サブユニットの折りたたみはＣｈｕａＨＮＬのそれと同様であった（図５ａ）。各サブユニットの二次構造は、２つのαヘリックス、２つの３１０αヘリックス及び８つの逆平行βシートからなり、外側にアルファヘリックスを有するベータバレルを形成していた。３つの分子内及び２つの分子間ジスルフィド結合が結晶構造において観察された。各サブユニットにおいて、活性部位は、８つのβシート全てによって囲まれたβバレルの中心に位置する。ＯｇｒａＨＮＬの活性部位内の比較的大きな疎水性空洞は、１５番目のＶａｌ；２９，７１及び９４番目のＰｈｅ；４４及び１０７番目のＴｙｒ；５８，７９及び１０９番目のＡｌａ；８１番目のＬｅｕ；並びに９２番目のＴｒｐの１１個の疎水性残基からなっていた（図５ｂ）。Ａｒｇ４２、Ａｓｎ６９、Ａｓｐ６０及びＬｙｓ１２１の４つの親水性残基も活性部位表面に露出していた。外部溶媒を活性部位に導入する基質侵入トンネルは図５ｂに明確に示されており、トンネル内に水に対応する２つの電子密度が確かに存在していた。トンネル入口領域は、Ｖａｌ１５、Ｐｒｏ１６、Ｐｈｅ２１、Ｔｙｒ４４、Ｐｈｅ７１、Ａｌａ７９、Ｔｒｐ９２、Ｐｈｅ９４の８残基によって形成されていた。（Ｒ）−２−Ｃｌ−Ｍａｎのベンゼン環を認識するために、活性部位のいくつかの疎水性残基がベンゼン部分と疎水性相互作用を形成しているようであった。これらの残基のうちＰｈｅ７１及びＰｈｅ９４の２つは、（Ｒ）−２−Ｃｌ−Ｍａｎのフェニル環の近くに位置して、それぞれ、ｅｄｇｅ−ｔｏ−ｆａｃｅ及びｆａｃｅ−ｔｏ−ｆａｃｅでπ−πスタッキング相互作用を形成する。π−πスタッキング相互作用は、一般的な疎水性相互作用よりも強く、基質結合において重要な役割を果たす可能性がある（Ｙａｎｇ  ＳＴら，Ｎａｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（２００８）１９（３９）：３９５１０１；及びＮａｋａｎｏ  Ｓら，Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ（２０１４）１８４４（１２）：２０５９−２０６７）。π−πスタッキング相互作用の存在は、Ｎａｋａｎｏら（２０１４）（上掲）によってＢａｌｉｏｓｐｅｒｍｕｍ  ｍｏｎｔａｎｕｍ由来の（Ｓ）−ＨＮＬにおいても報告されている。【００７９】
図５ｃに示すように、ＯｇｒａＨＮＬのＡｒｇ４２及びＬｙｓ１２１の側鎖は、（Ｒ）−２−Ｃｌ−Ｍａｎの水酸基と水素結合を形成し、Ｔｙｒ１０７は、（Ｒ）−２−Ｃｌ−Ｍａｎのニトリル基と水素結合を形成する。Ａｓｐ６０は（Ｒ）−２−Ｃｌ−Ｍａｎと直接相互作用しないが、Ａｒｇ４２及びＬｙｓ１２１と水素結合を形成する。この複合体構造分析により、保存されたヒスチジンが一般酸／塩基として作用して基質の水酸基を脱プロトン化させる他のＲ特異的ＨＮＬ（Ｄｒｅｖｅｎｙ  Ｉら，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉ（２００２）１１（２）：２９２−３００；Ｚｈｕ  Ｗら，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ（２０１５）８３（１）：６６−７７；及びＭｏｔｏｊｉｍａ  Ｆら，ＦＥＢＳ  Ｊ（２０１８）２８５（２）：３１３−３２４）とは異なり、Ａｒｇ４２及びＬｙｓ１２１による一般酸／塩基触媒に依存する反応機構（図５ｄ）が示唆された。開裂反応において、（Ｒ）−２−Ｃｌ−Ｍａｎの水酸基のプロトンは、Ｌｙｓ１２１によって除去される。電子がリジンからニトリル脱離基に移動し、次いでシアン化物イオンがＡｒｇ４２からプロトンを引き抜いて、２−クロロベンズアルデヒド及びシアン化水素を放出する。合成反応では、一連の反応がシアノヒドリン開裂と反対の方向に起こる。シアン化水素がＡｒｇ４２により脱プロトン化された後、シアン化物イオンは２−クロロベンズアルデヒドのカルボニル炭素を攻撃する。カルボニル酸素は、シアン化物から電子を受け取り、（Ｒ）−２−Ｃｌ−Ｍａｎを生成する。【００８０】
ＯｇｒａＨＮＬの活性部位内の疎水性空洞は、プロトン引き抜き部位から離れているが、基質選択性に重要な役割を果たすと予測され、その移動度は、Ｂａｌｏｓｐｅｒｍｕｍ  ｍｏｎｔａｎｕｍ由来の（Ｓ）−ＨＮＬにおいて報告されているものと同様に、触媒中の基質のフェニル基の転位を可能としている（Ｎａｋａｎｏ  Ｓら（２０１４）上掲）。この空洞は、（Ｒ）−及び（Ｓ）−２−Ｃｌ−Ｍａｎが活性部位に入るとそのフェニル基と結合し、それぞれ、（Ｒ）特異的及び（Ｓ）特異的ポケットに分割される。報告されているとおり、ＣｈｕａＨＮＬは広い基質特異性を有する（Ｄａｄａｓｈｉｐｏｕｒ  Ｍら（２０１５）上掲）が、これはＣｈｕａＨＮＬが有する柔軟な構造により、様々な基質が基質侵入トンネルに結合することができることによる。【００８１】
（（Ｒ）−２−Ｃｌ−ＭａｎによるＯｇｒａＨＮＬのドッキングシミュレーション）
（Ｒ）−２−Ｃｌ−Ｍａｎと複合体を形成したＯｇｒａＨＮＬの結晶構造モデリングに基づいて、基質結合に影響を及ぼす可能性のあるアミノ酸を、ＭＯＥを用いた分子ドッキングシミュレーションによって同定した。ベンゼン環の異なるオルト位に塩素原子置換を有する（Ｒ）−２−Ｃｌ−Ｍａｎの２つの分子構造をドッキングに使用して（図６ａ及びｂ）、それぞれのデザインについて合計３００種類の結合構造を導き出した。基質ドッキング分析により、Ａｌａ５８、Ａｌａ７９、Ｐｈｅ７１及びＶａｌ１５が、結合親和性スコアに基づく最も潜在的な残基であることが見出された。これらの疎水性残基は活性部位の疎水性領域に位置し、その側鎖は基質に向いていた。したがって、この領域における動態は、ＯｇｒａＨＮＬの基質特異性に影響を及ぼすと予測される。Ａｌａ７９、Ｐｈｅ７１及びＶａｌ１５は基質トンネル入口に位置し、基質に対する親和性において重要な役割を果たすことができる。一方、Ａ５８の側鎖は、（Ｒ）−２−Ｃｌ−Ｍａｎの芳香族環のオルト位の塩素原子と密接に接触しており（図６ｂ）、立体相互作用の可能性を示唆していた。この立体相互作用はおそらくこの基質で観察された酵素性能の低下の原因であると考えられた。したがって、酵素の構造解析は、これらの４つの残基が、ＯｇｒａＨＮＬの酵素的特性及び／又はエナンチオ選択性を改善するための重要なアミノ酸であり得ることを示唆していた。基質入口トンネル（図３ｃ〜ｄ）が開いた好ましい３Ｄドッキング構造として得られた、Ａ５８Ｃ、Ａ５８Ｈ、Ａ５８Ｒ、Ａ５８Ｖ、Ａ７９Ｍ、Ｆ７１Ａ、Ｆ７１Ｉ及びＶ１５Ｗの８つの突然変異について、部位特異的突然変異誘発の検討を行った。【００８２】
（ＯｇｒａＨＮＬの部位特異的突然変異誘発）
活性部位の疎水性空洞における変異は、ＯｇｒａＨＮＬの活性及びエナンチオ選択性に影響を及ぼした。精製した酵素を使用した場合には、Ａｌａ７９のメチオニンへの突然変異（Ａ７９Ｍ）は、比活性及び選択性の両方において有意な増加をもたらした。突然変異体Ａ７９Ｍは、（Ｒ）−２−Ｃｌ−Ｍａｎに対して、４００±１３Ｕ／ｍｇの最も高い比活性と８３．２±０．１％のｅｅ値を示し、野生型のＯｇｒａＨＮＬ（２８８±１１Ｕ／ｍｇ、６９．５±０．５％のｅｅ）よりも高い活性を示した（それぞれ、１０及び１．２Ｕ／ｍｌ）（表４）。Ａ７９Ｍの比活性及びエナンチオ選択性は、（Ｒ）−２−Ｃｌ−Ｍａｎのみならず（Ｒ）−Ｍａｎについても野生型と比較して有意に改善された。（Ｒ）−Ｍａｎ合成に関しては、野生型では２，７８０±８０Ｕ／ｍｇの比活性と８２．２±０．６％のｅｅであったが、Ａ７９Ｍでは３，３１０±７８Ｕ／ｍｇの比活性と９３．６±０．３％のｅｅを示した。【００８３】
（ＯｇｒａＨＮＬにおけるＡｌａ７９の部位特異的突然変異誘発）
ＯｇｒａＨＮＬの位置７９が触媒活性及びエナンチオ選択性に及ぼす影響を検討するために、部位特異的突然変異誘発によりＡｌａ残基をさらに１８アミノ酸に置換し、全ての突然変異体について、ＨＮＬ生産性、比活性、エナンチオ選択性及び転換率を決定した。位置７９におけるＡｌａを、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｖａｌ及びＳｅｒを含む大きな側鎖を有するほとんどの疎水性残基に置換する変異は、（Ｒ）−Ｍａｎに対するＯｇｒａＨＮＬの生産性を改善した。また、位置７９におけるＡｌａを、Ｍｅｔ、Ｖａｌ、Ｓｅｒ及びＣｙｓへ置換する変異は、（Ｒ）−２−Ｃｌ−Ｍａｎの生産性を向上させた（表４）。（Ｒ）−Ｍａｎ及び（Ｒ）−２−Ｃｌ−Ｍａｎの両方について、変異体Ａ７９Ｃ、Ａ７９Ｉ及びＡ７９Ｍは、最も高い比活性、ｅｅ及び変換率を示した（表４）。【００８４】
（ＯｇｒａＨＮＬ変異体のエナンチオ選択性）
Ａｌａ７９における変異を有する酵素が高いエナンチオ選択性を有するか検討するために、ベンズアルデヒド及びＫＣＮからの（Ｒ）−Ｍａｎの合成と、２−クロロベンズアルデヒド及びＫＣＮからの（Ｒ）−２−Ｃｌ−Ｍａｎの合成を、精製した酵素（それぞれ１０及び２Ｕ／ｍｌ）を用いて行った。ベンズアルデヒドと２−クロロベンズアルデヒドの転化率は野生型と変異体で同じであった（非図示）。３つの突然変異体の中で、Ａ７９Ｃは、（Ｒ）−Ｍａｎ及び（Ｒ）−２−Ｃｌ−Ｍａｎ合成についてそれぞれ９７．１及び８３．９％の最も高いｅｅを示した。（Ｒ）−Ｍａｎ及び（Ｒ）−２−Ｃｌ−Ｍａｎ合成のｅｅ値は、野生型がそれぞれ８５．５及び６９．０％であるのに対し、Ａ７９Ｍ及びＡ７９Ｉでは、それぞれ、９３．３−９３．６及び８３．５−８３．６％に上昇した。これらの結果は、Ａｌａ７９の変異が（Ｒ）−Ｍａｎ及び（Ｒ）−２−Ｃｌ−Ｍａｎ産生の両方においてｅｅを顕著に改善することに寄与することを示している。【００８５】
（Ｒ）−Ｍａｎ及び（Ｒ）−２−Ｃｌ−Ｍａｎの生産性及びｅｅ値は、酵素量を増加させると増加した。マンデロニトリル及び２−クロロマンデロニトリルの全生成量は、野生型及び変異体で類似しており、それぞれ約３５〜３８及び２４〜２６ｍＭであった。すべての変異体は、９８．４〜９８．７％の最大ｅｅで（Ｒ）−Ｍａｎの合成を触媒し、これは野生型（９５．６％）より高かった。（Ｒ）−２−Ｃｌ−Ｍａｎ合成については、変異体Ａ７９Ｃが９６．３％の最大ｅｅを示し、次いでＡ７９Ｍが９５．５％及びＡ７９Ｉが９５．0％を示した。これらの値はいずれも野生型から得られた値（９２．８％）より顕著に高かった。これは、変異体による（Ｒ）−Ｍａｎ及び（Ｒ）−２−Ｃｌ−Ｍａｎの驚異的な改善を表す。これにより、Ａｌａ７９における変異、特にはシステイン、イソロイシン、又はメチオニンへの変異が、（Ｒ）−Ｍａｎ及び（Ｒ）−２−Ｃｌ−Ｍａｎの合成においてエナンチオマー過剰を増加させることができ、光学的に純粋なシアノヒドリンの産生を可能にすることが示された。以前に報告された最良の事例では、９９％ｅｅの（Ｒ）−Ｍａｎがクエン酸緩衝液（ｐＨ２．７）中のＣｈｕａＨＮＬにより得られている（Ｄａｄａｓｈｉｐｏｕｒ  Ｍら（２０１５）上掲）が、使用された酵素量はより多かった（１５０Ｕ／ｍｌ）。（Ｒ）−２−Ｃｌ−Ｍａｎについて、ＣｈｕａＨＮＬ及び他の報告されたＨＮＬは、緩衝系において非常に低いエナンチオ選択性しか示さない（ｅｅ＜２１％）（Ｄａｄａｓｈｉｐｏｕｒ  Ｍら（２０１５）上掲；Ｙｉｌｄｉｒｉｍ  Ｄら，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｐｒｏｇ（２０１４）３０（４）：８１８−８２７）。したがって、本発明は、通常は有機溶媒を含む二相系下でこれらの反応を触媒する他の（Ｒ）−ＨＮＬとは異なり、単相緩衝系において高いエナンチオ純度（９６．３％）を有する（Ｒ）−２−Ｃｌ−Ｍａｎの非対称合成を初めて実現した。【００８６】
以上より、部位特異的突然変異誘発を行った変異体のうち、（Ｒ）−Ｍａｎについてのｅｅ値が野生株よりも優れていたのは、Ａ５８Ｃ、Ａ５８Ｈ、Ｆ７１Ｉ、Ａ７９Ｃ、Ａ７９Ｉ、及びＡ７９Ｍであり、比活性が野生株よりも優れていたものは、Ａ７９ＣとＡ７９Ｍであり、生産性が野生株よりも優れていたものは、Ａ７９Ｆ、Ａ７９Ｉ、Ａ７９Ｌ、Ａ７９Ｍ、Ａ７９Ｓ、及びＡ７９Ｖであった。また、（Ｒ）−２−Ｃｌ−Ｍａｎについてのｅｅ値が野生株よりも優れていたのは、Ａ７９Ｃ、Ａ７９Ｉ、及びＡ７９Ｍであり、比活性が野生株よりも優れていたものは、Ａ７９ＩとＡ７９Ｍであり、生産性が野生株よりも優れていたものはＡ７９Ｍ、Ａ７９Ｓ、及びＡ７９Ｖであった。【００８７】
【表４】
2020009168.tif 000009
【００８８】
（有機溶媒の活性及び鏡像異性体活性への影響）
すべての野生型及び突然変異体について、ほとんどの有機溶媒は、酵素活性及びエナンチオ選択性に大きな影響を及ぼしたが、ＤＩＰＥのみは、酵素活性にほとんど影響を及ぼさず、最も高い％ｅｅを与えた（非図示）。Ａ７９Ｃ及びＡ７９ＭはＤＥＥ、ＭＴＢＥ及びＨｅｘの条件下で野生型よりも安定であった。すべての野生型及び変異体の残存活性は、すべての有機溶媒において５０％以上であった。すべての変異体は、ＤＥＥ、ＭＴＢＥ、ＤＩＰＥ、ＤＢＥ及びＭｅｔの条件下で５０％より高いｅｅを示したが、ＥＡ及びＨｅｘの条件下では５０％より低いｅｅを示した。ＥＡとＨｅｘは分配係数の低い値を示したので、ベンズアルデヒドと２−クロロベンズアルデヒドは水相にほとんど溶解した（Ｕｅａｔｒｏｎｇｃｈｉｔ  Ｔら，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃａｔａｌｙｓｉｓ  Ｂ：  Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ（２００９）５６（４）：２０８−２１）。これが非酵素反応を促進し、（Ｒ）−Ｍａｎ及び（Ｒ）−２−Ｃｌ−Ｍａｎのより低いｅｅを引き起こしたと考えられる。【００８９】
（実施例３）ＰｌａｍＨＮＬ変異体の作製と活性測定
（ＭＯＥプログラムを用いたドッキングシミュレーション）
（Ｒ）−２−クロロマンデロニトリルと複合体を形成したＰｌａｍＨＮＬの構造を予測するために、ＭＯＥ分析を用いたドッキングシミュレーションの鋳型として（Ｒ）−２−クロロマンデロニトリルと複合化したＯｇｒａＨＮＬの構造を用いた。（Ｒ）−２−クロロマンデロニトリルと複合体化したＰｌａｍＨＮＬの相同性モデリングは、結合ポケット内の約１４アミノ酸残基をＡｌａｎｉｎｅ  ａｎｄ  Ｒｅｓｉｄｕｅ  Ｓｃａｎｎｉｎｇ機能を用いて計算し、他の１９アミノ酸を親和性に重要な残基として同定した。最も低いｄＡｆｆｉｎｉｔｙを示した変異体を検証のために選択した。【００９０】
（部位特異的突然変異誘発）
ＰｌａｍＨＮＬ突然変異体は、フォワード及びリバースプライマー（表５）を用い、ｐＥＴ２８ａＰｌａｍＨＮＬを鋳型として、Ｑｕｉｃｋ−Ｃｈａｎｇｅ部位特異的突然変異誘発キットを用いた部位特異的突然変異誘発によって調製した。ＰＣＲ反応は、変性（９５℃、２０秒；最初のサイクル：９５℃、２分）とアニーリング５２℃２０秒を１８サイクル行った。ＰＣＲ産物を３７℃で１時間ＤｐｎＩ（１０Ｕ）処理し、次いで大腸菌Ｓｈｕｆｆｌｅ  Ｔ７株に形質転換した。【００９１】
【表５】
2020009168.tif 000010
【００９２】
（ＨＮＬ活性アッセイ）
基質として２−クロロベンズアルデヒド及びシアン化カリウムを用いて、光学活性（Ｒ）−２−クロロマンデロニトリルの量を測定することにより酵素活性をアッセイした。反応混合物（０．５ｍＬ）をマイクロチューブ中で調製した。クエン酸ナトリウム緩衝液（４００ｍＭ、ｐＨ４．０）に１．２５Ｍの２−クロロベンズアルデヒド（メタノール中、２０μＬ）を添加し、続いて酵素溶液及びＫＣＮ溶液（１．０Ｍ、５０μＬ）を添加した。反応混合物のアリコート（１００μＬ）をとり、９００μＬの有機溶媒（９４％ｎ−ヘキサン、６％イソプロパノール、０．２％ＴＦＡ、ｖ／ｖ）で抽出することによって反応をモニターした。混合物を１５，０００×ｇ、４℃で１０分間遠心分離した後、ベンズアルデヒド、（Ｒ）−及び（Ｓ）−２−クロロマンデロニトリルを含有する有機層を得た。その後、有機相のアリコート（１０μＬ）を、上述のキラルＨＰＬＣを用いて分析した。１単位のＨＮＬ活性は、アッセイ条件下で、２−クロロベンズアルデヒドとＫＣＮから光学活性（Ｒ）−２−クロロマンデロニトリルを１分間あたり１μｍｏｌ生成する酵素の量として定義した。【００９３】
（組換えＰｌａｍＨＮＬの発現及び精製）
ｐＥＴ２８ａ−ＰｌａｍＨＮＬを有する大腸菌Ｓｈｕｆｆｌｅ  Ｔ７株  Ｅｘｐｒｅｓｓの単一コロニーを、カナマイシン（８０μｇ／ｍＬ）を含有する５ｍＬのＬＢ培地に接種し、３０℃、３００ｒｐｍの振盪速度で一晩培養した。スターター培養液５ｍＬを、２リットルのＥｒｌｅｎｍｅｙｅｒフラスコ中のカナマイシン（８０μｇ／ｍＬ）を含むＬＢ培地５００ｍＬに移し、３０℃、１５０ｒｐｍの振盪速度で培養した。１２時間後、ＩＰＴＧを終濃度０．５ｍＭとなるように加え、１８℃、同じ振盪速度で２４時間細胞を培養した。細胞を遠心分離（８５００×ｇ；１５分）し、塩化ナトリウム（０．５Ｍ）及びイミダゾール（２５ｍＭ）を含むリン酸カリウム緩衝液（ＫＰＢ；２０ｍＭ、ｐＨ７．０）に再懸濁させた。再懸濁させた細胞を超音波処理によって溶解させ、溶解物を遠心分離（１５０００×ｇ；４℃で１５分間）して破片を除去した。上清をＮｉ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ６  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｌｉｔｔｌｅ  Ｃｈａｌｆｏｎｔ、ＵＫ）カラム（内径２５ｍｍ、カラム容量２０ｍＬ）にロードし、５０ｍＭイミダゾールで洗浄し、次に塩化ナトリウム（０．５Ｍ）を含むＫＰＢ（２０ｍＭ；ｐＨ７．０）中の５０〜３００ｍＭイミダゾールの直線勾配で、０．５ｍＬ／分の流速で溶出した。最高の比活性を示す画分をプールし、透析し、ＭｏｎｏＱ  ５／５０  ＧＬ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）カラムに負荷した。酵素活性を上記方法で測定し、活性画分をプールし、透析し、濃縮し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより純度を調べた。【００９４】
（相同性モデリングＰｌａｍＨＮＬ構造）
Ｐａｒａｆｏｎｔｅｒｉａ  ｌａｍｉｎａｔｅ由来のＨＮＬはＯｘｉｄｕｓ  ｇｒａｃｉｌｉｓ  ＨＮＬと５２％のアミノ酸配列相同性を有するため、（Ｒ）−２−クロロマンデロニトリルと複合体化したＯｇｒａＨＮＬ構造を鋳型として用いてＰｌａｍＨＮＬ構造のモデル相同性を計算した。ＰｌａｍＨＮＬの全体的な構造は、ＯｒｅｇＨＮＬ（図７ａ）と非常によく似ており、結合ポケット及び活性部位において同じ１０個の疎水性アミノ酸残基及び４個の親水性アミノ酸残基から構成されていた（表６）。結合ポケット及び活性部位上のこれらのすべての残基は、すべてのヤスデＨＮＬにおいて保存されていた（図４）。ＰｌａｍＨＮＬの相同性モデリングは、ＯｇｒａＨＮＬにおけるＬｙｓ１２１と同じように、Ｌｙｓ１１８が（Ｒ）−２−クロロマンデロニトリルのシアン化物領域との相互作用の重要な残基であることを示した（図７ｂ）。【００９５】
【表６】
2020009168.tif 000011
【００９６】
（ＰｌａｍＨＮＬの（Ｒ）−２−クロロマンデロニトリルによるドッキングシミュレーションの検証）
ＭＯＥプログラムは、結合ポケット内の約１４アミノ酸残基をＡｌａｎｉｎｅ  ａｎｄ  Ｒｅｓｉｄｕｅ  Ｓｃａｎｎｉｎｇ機能により突然変異体を生成し、親和性に重要な残基を同定した。選択された１３のヒットについて変異体を作製したところ、Ｎ６５、Ｔ７５及びＷ８９の３つの位置における、Ｎ６５Ｈ、Ｎ６５Ｙ、Ｗ８９Ｈ、Ｎ６５Ｅ、Ｎ６５Ｑ及びＴ７５Ａの６種類の変異体について、２−クロロベンズアルデヒドに対する活性が確認された。対照的に、Ｒ３８、Ｙ４０、Ｌ７８及びＹ１０４の位置における突然変異体では活性が検出されなかったことから、これらの残基がＰｌａｍＨＮＬの活性機構に関与している可能性が示唆された。アラニンスキャニング機能より得られた最良の変異体Ｔ７５Ａは、野生型より約１．５倍高い比活性を示したが、Ｎ６５Ｈ、Ｎ６５Ｙ、Ｗ８９Ｈ、Ｎ６５Ｅ及びＮ６５Ｑは野生型よりも低い比活性を示した。これらの結果は、Ｔｈｒ７５における突然変異が２−クロロベンズアルデヒドに対する酵素活性の改善に寄与することを示している。（Ｒ）−２−クロロマンデロニトリルのエナンチオマー過剰率を改善する変異を調べるために、２−クロロベンズアルデヒド及びＫＣＮからの合成反応を全ての精製された変異体１．０Ｕを用いて行った。（Ｒ）−２−クロロマンデロニトリルのエナンチオマー過剰率は、野生型が８０％ｅｅであるのに対し、Ｎ６５Ｙ、Ｎ６５Ｈ、及びＴ７５Ａは、それぞれ、９２％ｅｅ、８５％ｅｅ、及び８６％ｅｅの増加したエナンチオマー過剰率を示した（表７）。したがって、Ａｓｎ６５及びＴｈｒ７５における変異、特にはＡｓｎ６５のチロシン又はヒスチジンへの変異及びＴｈｒ７５のアラニンへの変異は、（Ｒ）−２−クロロマンデロニトリルの生成におけるエナンチオマー過剰率の増加に寄与する。また、Ｎ６５Ｈ／Ｔ７５Ａ及びＮ６５Ｙ／Ｔ７５Ａのように、２種類の変異を組み合わせても、野生型と比較して（Ｒ）−２−クロロマンデロニトリルの比活性やエナンチオマー過剰を改善する効果が得られることが示された（非図示）。【００９７】
また、ＰｌａｍＨＮＬ（７０−７５残基）のβ４−β５を結ぶループは、ＯｇｒａＨＮＬのそれよりも長く、ポケットの入り口に位置する。ＰｌａｍＨＮＬの、このループ領域（Ｉ６９Ｇ）は、ＰｌａｍＨＮＬの活性に大きく影響すると考えられる。さらに、ポケットの入り口にあるβ４の６９番目のアミノ酸残基は、ＰｌａｍＨＮＬでは、イソロイシンであり、ＯｇｒａＨＮＬではグリシンである。これらの残基が基質との親和性に影響を与えると考えられる。そこで、この変異体を作製して検討したところ、野生型酵素ＰｌａｍＨＮＬの（Ｒ）−２−クロロマンデロニトリルに対するＫｍ値が５６．８ｍＭであるのに対して、変異型酵素ＰｌａｍＨＮＬ−Ｉ６９Ｇの（Ｒ）−２−クロロマンデロニトリルに対するＫｍ値は４１．８ｍＭと低く、変異型酵素では基質に対する親和性が増大していた（表８）。また、Ｉ６９Ｇや、Ｎ６５Ｙ／Ｉ６９Ｇを用いて合成した（Ｒ）−２−クロロマンデロニトリルのｅｅ（エナンチオマー過剰率）は、それぞれ、８３％および９１％であり、野生型酵素ＰｌａｍＨＮＬのそれが８０％であるのに対して向上していた（表７）。これらのデータから、β４−β５領域での変異も酵素の性質を向上させるために、重要な役割を果たしていると判断される。【００９８】
【表７】
2020009168.tif 000012
【００９９】
【表８】
2020009168.tif 000013
【０１００】
（ＰｌａｍＨＮＬ変異体のエナンチオ選択性）
最良の候補変異体Ｎ６５Ｙ、Ｔ７５Ａ及び２点変異体Ｎ６５Ｙ／Ｔ７５Ａについて、（Ｒ）−２−クロロマンデロニトリル合成のための最適化条件を見出すためにさらに検討を行った。酵素量を増加し４Ｕとすると、Ｎ６５Ｙによって産生された（Ｒ）−２−クロロマンデロニトリルの最大エナンチオマー過剰率は９６．３３％に増加した。同じ条件下で野生型を用いて生成した最大ｅｅは８７％であった（図８ａ）。さらに、ｐＨ３．５とすることにより、Ｎ６５Ｙ変異体は９８．２％のｅ．ｅ．を与えた（図８ｂ）。精製された酵素Ｎ６５Ｙによる（Ｒ）−２−クロロマンデロニトリルの製造は、ｐＨ３．５、２５℃で３０分間のインキュベーションにより、野生型（７６％変換、９０％ｅｅ）よりも高い変換率（９１％、９８．２％ｅｅ）を示した（非図示）。これらの結果は、（Ｒ）−２−クロロマンデロニトリル合成におけるＰｌａｍＨＮＬのエナンチオ選択性が、Ａｓｎ６５突然変異によって顕著に改善されたことを示した。
【産業上の利用可能性】
【０１０１】
本発明のヤスデ由来のＨＮＬ変異体は、シアノヒドリンの合成において産業応用することができる。
【図１】
2020009168.tif 000014
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】令和2年10月2日(2020.10.2)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヤスデ由来の（Ｒ）−ヒドロキシニトリルリアーゼの変異体タンパク質であって、以下の（ａ）〜（ｆ）から選択される１種類以上のアミノ酸置換を有し、かつ、（Ｒ）−ヒドロキシニトリルリアーゼ活性を有する、（Ｒ）−ヒドロキシニトリルリアーゼ変異体タンパク質：
（ａ）当該（Ｒ）−ヒドロキシニトリルリアーゼのβシート構造（β３）を構成するＴＡＸ１ＤＩ（配列番号３）で表されるアミノ酸配列中の２番目のアミノ酸であるＡのＣ又はＨへの置換、ここで、Ｘ１はＬ又はＦである；
（ｂ）当該（Ｒ）−ヒドロキシニトリルリアーゼのβシート構造（β４）を構成するＸ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６ＤＦＸ７Ｘ８Ｘ９Ｘ１０（配列番号４）で表されるアミノ酸配列中の５番目のアミノ酸であるＸ６のＨ、Ｙ、Ｍ、Ｖ、Ｌ又はＷへの置換、ここで、Ｘ２はＱ、Ｈ又はＲであり、Ｘ３はＩ又はＶであり、Ｘ４はＭ、Ｉ、Ｔ又はＤであり、Ｘ５はＡ、Ｔ又はＩであり、Ｘ６はＹ又はＮであり、Ｘ７はＶ、Ｔ又はＬであり、Ｘ８はＧ又はＩであり、Ｘ９はＧ又はＡであり、Ｘ１０はＰ、Ａ又はＳである；
（ｃ）当該（Ｒ）−ヒドロキシニトリルリアーゼのβシート構造（β４）を構成するＸ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６ＤＦＸ７Ｘ８Ｘ９Ｘ１０（配列番号４）で表されるアミノ酸配列中の７番目のアミノ酸であるＦのＩへの置換、ここで、Ｘ２〜Ｘ１０は（ｂ）で定義されたとおりである；
（ｄ）当該（Ｒ）−ヒドロキシニトリルリアーゼのβシート構造（β４）を構成するＸ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６ＤＦＸ７Ｘ８Ｘ９Ｘ１０（配列番号４）で表されるアミノ酸配列中の９番目のアミノ酸であるＸ８のＧへの置換、ここで、Ｘ２〜Ｘ１０は（ｂ）で定義されたとおりである；
（ｅ）当該（Ｒ）−ヒドロキシニトリルリアーゼのβシート構造（β５）を構成するＸ１１Ｘ１２ＡＸ１３ＬＸ１４（配列番号５）で表されるアミノ酸配列中の２番目のアミノ酸であるＸ１２のＡへの置換、ここで、Ｘ１１はＳ、Ｌ、Ｍ又はＩであり、Ｘ１２はＴ又は存在せず、Ｘ１３はＨ、Ｉ、Ｙ又はＦであり、Ｘ１４はＮ又はＴである；及び
（ｆ）当該（Ｒ）−ヒドロキシニトリルリアーゼのβシート構造（β５）を構成するＸ１１Ｘ１２ＡＸ１３ＬＸ１４（配列番号５）で表されるアミノ酸配列中の３番目のアミノ酸であるＡの疎水性残基（Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｆ、Ｗ、Ｙ又はＶ）、Ｃ、Ｔ、Ｅ、Ｑ又はＳへの置換、ここで、Ｘ１１〜Ｘ１４は（ｄ）で定義されたとおりである。
【請求項２】
前記ヤスデ由来の（Ｒ）−ヒドロキシニトリルリアーゼが、８個の逆平衡βシート構造を有することを特徴とする、請求項１に記載の変異体タンパク質。
【請求項３】
前記８個のβシート構造を構成するアミノ酸配列が、それぞれ、Ｘ１５Ｘ１６ＦＸ１７Ｘ１８ＶＬ（β１）（配列番号１）、ＴＸ１９ＲＸ２０ＹＶＸ２１Ｐ（β２）（配列番号２）、ＴＡＸ１ＤＩ（β３）（配列番号３）、Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６ＤＦＸ７Ｘ８Ｘ９Ｘ１０（β４）（配列番号４）、Ｘ１１Ｘ１２ＡＸ１３ＬＸ１４（β５）（配列番号５）、Ｘ２２Ｘ２３ＫＸ２４Ｘ２５ＷＸ２６ＦＱＹＸ２７Ｘ２８（β６）（配列番号６）、Ｘ２９Ｘ３０ＹＣＡＹＸ３１ＣＸ３２（β７）（配列番号７）、及びＸ３３ＩＸ３４ＥＹＫＣＸ３５Ｘ３６（β８）（配列番号８）である、請求項２に記載の変異体タンパク質、
ここで、Ｘ１はＬ又はＦであり、Ｘ２はＱ、Ｈ又はＲであり、Ｘ３はＩ又はＶであり、Ｘ４はＭ、Ｉ、Ｔ又はＤであり、Ｘ５はＡ、Ｔ又はＩであり、Ｘ６はＹ又はＮであり、Ｘ７はＶ、Ｔ又はＬであり、Ｘ８はＧ又はＩであり、Ｘ９はＧ又はＡであり、Ｘ１０はＰ、Ａ又はＳであり、Ｘ１１はＳ，Ｌ、Ｍ又はＩであり，Ｘ１２はＴ又は存在せず、Ｘ１３はＨ、Ｉ、Ｙ又はＦであり、Ｘ１４Ｎ又はＴであり、Ｘ１５はＦ又はＬであり、Ｘ１６はＥ、Ｑ又はＬであり、Ｘ１７はＥ，Ａ、Ｓ又はＴであり、Ｘ１８はＹ又はＦであり、Ｘ１９はＡ又はＴであり、Ｘ２０はＶ又はＩであり、Ｘ２１はＱ又はＲであり、Ｘ２２はＧ又はＤであり、Ｘ２３はＥ、Ｋ、Ｄ又はＡであり、Ｘ２４はＱ、Ｔ又はＡであり、Ｘ２５はＶ、Ｉ又はＴであり、Ｘ２６はＹ、Ｈ又はＮであり、Ｘ２７はＴ、Ｖ又はＩであり、Ｘ２８はＮ又はＤであり、Ｘ２９はＡ又はＳであり、Ｘ３０はＮ又はＳであり、Ｘ３１はＲ、Ｔ又はＳであり、Ｘ３２はＮ又はＤであり、Ｘ３３はＥ、Ａ、Ｑ、Ｎ又はＳであり、Ｘ３４はＩ、Ａ又はＶであり、Ｘ３５はＡ又はＴであり、Ｘ３６はＳ、Ｎ又はＴである。
【請求項４】
前記ヤスデ由来の（Ｒ）−ヒドロキシニトリルリアーゼが、更に１個のαヘリックス構造を有することを特徴とする、請求項２又は請求項３に記載の変異体タンパク質。
【請求項５】
前記αヘリックス構造を構成するアミノ酸配列が、ＶＰＮＧＸ３７ＫＩＨ（配列番号９）である、請求項４に記載の変異体タンパク質、ここで、Ｘ３７はＤ又はＹである。
【請求項６】
前記ヤスデ由来の（Ｒ）−ヒドロキシニトリルリアーゼが、リポカインスーパーファミリーに属するタンパク質である、請求項１〜請求項５のいずれか１項に記載の変異体タンパク質。
【請求項７】
前記ヤスデ由来の（Ｒ）−ヒドロキシニトリルリアーゼが、ＣｈｕａＨＮＬ、ＮｔｔＨＮＬ、ＮｔｍＨＮＬ、ＯｇｒａＨＮＬ，ＰｌａｍＨＮＬ、Ｐｔｏｎ１ＨＮＬ、Ｐｔｏｎ２ＨＮＬ，Ｐｔｏｎ３ＨＮＬ、ＰｆａｌＨＮＬ、ＰｔｏｋＨＮＬ、ＲｓｐＨＮＬ、及びＲｓｓＨＮＬから選択されるいずれか１種類である、請求項１〜請求項６のいずれか１項に記載の変異体タンパク質。
【請求項８】
（削除）
【請求項９】
前記アミノ酸置換が、２か所以上に存在する、請求項１〜請求項７のいずれか１項に記載の変異体タンパク質。
【請求項１０】
前記２か所のアミノ酸置換が、以下の（ｂ）、（ｄ）、及び（ｅ）から選択される２つの置換である、請求項９に記載の変異体タンパク質。
（ｂ）当該（Ｒ）−ヒドロキシニトリルリアーゼのβシート構造（β４）を構成するＸ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６ＤＦＸ７Ｘ８Ｘ９Ｘ１０（配列番号４）で表されるアミノ酸配列中の５番目のアミノ酸であるＸ６のＨ，Ｙ、Ｍ、Ｖ、Ｌ又はＷへの置換；
（ｄ）当該（Ｒ）−ヒドロキシニトリルリアーゼのβシート構造（β４）を構成するＸ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６ＤＦＸ７Ｘ８Ｘ９Ｘ１０（配列番号４）で表されるアミノ酸配列中の９番目のアミノ酸であるＸ８のＧへの置換、
（ｅ）当該（Ｒ）−ヒドロキシニトリルリアーゼのβシート構造（β５）を構成するＸ１１Ｘ１２ＡＸ１３ＬＸ１４（配列番号５）で表されるアミノ酸配列中の２番目のアミノ酸であるＸ１２のＡへの置換、
ここで、Ｘ２〜Ｘ１２は請求項１で定義されたとおりである。
【請求項１１】
請求項１〜請求項７、請求項９、及び請求項１０のいずれか１項に記載の（Ｒ）−ヒドロキシニトリルリアーゼ変異体タンパク質をコードする核酸分子。
【請求項１２】
請求項１１に記載の核酸分子を含有するベクター。
【請求項１３】
請求項１２に記載のベクターで形質転換された細胞。
【請求項１４】
請求項１３に記載の細胞を培養することを含む、請求項１〜請求項７、請求項９、及び請求項１０のいずれか１項に記載の（Ｒ）−ヒドロキシニトリルリアーゼ変異体タンパク質の製造方法。
【請求項１５】
請求項１〜請求項７、請求項９、及び請求項１０のいずれか１項に記載の（Ｒ）−ヒドロキシニトリルリアーゼ変異体タンパク質の存在下で、ケトン又はアルデヒドとシアン化合物（Ｒ）とを反応させることを含む、シアノヒドリンの製造方法。
【国際調査報告】
2020009168.tif 000022
2020009168.tif 000023
2020009168.tif 000024
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