(57)【要約】  急性副鼻腔炎において、起炎菌を特定するための検出手段の提供。  細菌感染による急性副鼻腔炎の起炎菌であるインフルエンザ菌又は肺炎球菌の検出方法であって、被検体より採取した綿棒に付着した鼻腔ぬぐい液サンプル中の、該起炎菌のリボゾームL7/L12蛋白質の該綿棒当たりの換算質量を、該起炎菌のリボゾームL7/L12蛋白質に特異的に結合し、かつ、該起炎菌を他の細菌と種又は属で識別することができる抗体を用いて、測定し、得られた測定値に基づき起炎菌検出の有無を判断するための判断基準値(カットオフ値)を決定する工程を含む、上記検出方法。【特許請求の範囲】
【請求項１】
細菌感染による急性副鼻腔炎の起炎菌であるインフルエンザ菌(Haemophilus influenzae)又は肺炎球菌(Streptococcus pneumoniae)の検出方法であって、
被検体より採取した綿棒に付着した鼻腔ぬぐい液サンプル中の、該起炎菌のリボゾームL7/L12蛋白質の該綿棒当たりの換算質量を、該起炎菌のリボゾームL7/L12蛋白質に特異的に結合し、かつ、該起炎菌を他の細菌と種又は属で識別することができる抗体を用いて、測定し、得られた測定値に基づき起炎菌検出の有無を判断するための判断基準値(カットオフ値)を決定する工程を含む、上記検出方法。
【請求項２】
前記換算質量の測定を、ELISA(Enzyme-Linked Immuno Sorbent Assay)により行う、請求項１に記載の検出方法。
【請求項３】
インフルエンザ菌(Haemophilus influenzae)のリボゾームL7/L12蛋白質は、配列番号２に示すアミノ酸配列を有し、かつ、肺炎球菌(Streptococcus pneumoniae)のリボゾームL7/L12蛋白質は、配列番号４に示すアミノ酸配列を有する、請求項１又は２に記載の検出方法。
【請求項４】
インフルエンザ菌(Haemophilus influenzae)のリボゾームL7/L12蛋白質は、配列番号１に示す核酸配列によりコードされ、かつ、肺炎球菌(Streptococcus pneumoniae)のリボゾームL7/L12蛋白質は、配列番号２に示す核酸配列によりコードされる、請求項３に記載の検出方法。
【請求項５】
インフルエンザ菌(Haemophilus influenzae)について、カットオフ値を０．３１ｎｇ／綿棒と設定し、また、肺炎球菌(Streptococcus pneumoniae)についてカットオフ値を０．２３ｎｇ／綿棒と設定し、これらのカットオフ値を超えた場合対応の菌を起炎菌と確定する、請求項１〜４のいずれか１項に記載の検出方法。
【請求項６】
インフルエンザ菌(Haemophilus influenzae)について、カットオフ値を０．３１ｎｇ／綿棒と設定し、また、肺炎球菌(Streptococcus pneumoniae)についてカットオフ値を０．５１ｎｇ／綿棒と設定し、これらのカットオフ値を超えた場合対応の菌を起炎菌と確定する、請求項１〜４のいずれか１項に記載の検出方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細菌感染による急性副鼻腔炎の起炎菌の検出方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
副鼻腔とは、顔の中にある、左右、前頭洞、篩骨洞、蝶形骨洞、及び上顎洞からなる空洞である。副鼻腔は、鼻の中と繋がっていて、普段は空気が入っているが、風邪をきっかけに鼻の中から副鼻腔に膿が入り、溜まると副鼻腔炎となる。副鼻腔炎は風邪により引き起こされるため、その病因はウイルスであるが、まれに細菌が病因の場合がある。抗生物質（抗菌薬、抗生剤）はウイルスには効かないため、その治療法としては、多くは対症療法、休養が中心となるが、細菌が病因であり、かつ、頭痛や顔の痛みを伴う重症の場合には、抗生物質により治療することになる。風邪の児が、鼻汁又は昼の咳が改善せず１０日以上持続する、症状が一旦改善した後、鼻汁、昼の咳或いは発熱が新しく出現、再び悪くなる、３日以上続く膿性鼻汁（緑黄色の鼻水）と３９℃以上の発熱、のいずれかを認めた場合に急性副鼻腔炎と診断される。【０００３】
また、中耳炎とは、鼓膜の奥に部屋である中耳に細菌が入り、膿が溜まる症状である。
中耳は鼻の奥と管でつながっているため、細菌は鼻の奥から中耳に入り、中耳炎を起こす。痛みや腫れの強い、はじめの1週間を急性中耳炎といい、ピークを過ぎて、残りの膿が、だんだん抜けて治っている時期を滲出性中耳炎という。ほとんどの中耳炎は抗生剤を使わずに治るため、腫れが非常に強く、中耳炎が原因で高熱が出ている時や、痛み止めでも痛みがとれない時にだけ抗生剤が使われている。【０００４】
急性副鼻腔炎の原因となる細菌としては、インフルエンザ菌(Haemophilus influenzae)、肺炎球菌(Streptococcus pneumoniae)、モラキセラ・カタラーリス（Moraxella catarrhalis）が知られている。日本鼻科学会がまとめた急性副鼻腔炎診療ガイドラインでは、第一に使用すべき抗生剤としてペニシリン系のアモキシシリン（ワイドシリン、パセトシン、サワシリン）が、効果がない場合や重症のときには、セファム系のセフジトレンピボキシル（メイアクト）やセフカペンピボシル（フロモックス）などが、それでも効果がない場合には、カルバペネム（オラペネム）が推奨されている。ニューキノロン系（オゼックス）という抗生剤も有効であるが、小児においては安易な使用は極力避けるべきとされており、重症の中耳炎を併発しているときなどに限られる。マクロライド系のクラリスロマイシン（クラリシッド）、アジスロマイシン（ジスロマック）などの抗生剤もあるが、肺炎球菌(Streptococcus pneumoniae)、インフルエンザ菌(Haemophilus influenzae)とも、クラリシッドに耐性をもっていることが多い。【０００５】
肺炎球菌(Streptococcus pneumoniae)については、低年齢ほど耐性菌も割合が高く、５歳以下の副鼻腔炎で検出された肺炎球菌の７〜８割がペニシリン耐性菌となっているという報告がある。その原因は抗生剤の使い過ぎであり、細菌は抗生剤を使いすぎると進化し、その抗生剤がだんだん効かなくなり、また、中途半端に抗生剤を使うと、抗生剤が効きにくい菌が生き残ってしまい増殖する。これを繰り返すとか抗生剤が全く効かない菌集団が生じることになる。【０００６】
そこで、急性副鼻腔炎診療ガイドラインでは、副鼻腔炎発症の初期はウイルス感染が主であるため、軽症であれば、鼻水を吸引する等の鼻処置を優先すること、軽症の副鼻腔炎では小児も成人も、まず、抗生剤非投与で５日間経過観察することが推奨されている。また、急性中耳炎でも、同様に、軽度の場合は抗生剤を使わずに３日間観察することが推奨されている。【０００７】
２０１５年５月、世界保健機構（WHO）により「薬剤耐性に関するグローバル・アクション・プラン」が採択され、２０１６年４月に日本版薬剤耐性（AMR）対策アクション・プランも策定・実行されている。その成果指標として、ヒトの抗微生物剤の使用量を、２０２０年（対２０１３年比）に全体として３３％減、経口セファロスポリン、フルオロキノン、マクロライド系薬として５０％減、静注抗菌薬として２０％減とすること、特に、肺炎球菌のペニシリン耐性率を、２０２０年に１５％以下にすること（２０１４年に４８％）、黄色ブドウ球菌のメチシリン耐性率を２０％以下にすること（２０１４年に５１％）が掲げられている。さらに、平成３０年度の診療報酬改定では、急性気道感染症（急性副鼻腔炎、急性気管支炎、急性咽頭炎）又は急性下痢症で受診した基礎疾患のない患者であって、診察の結果、抗菌薬の投与の必要性が認められないため抗菌薬を使用しないものに対して、療養上必要な指導及び検査結果の説明を行い、文書により説明内容を提供した場合に、小児科のみを専任する医師が診療を行った初診に限り、「小児抗菌薬適性使用支援加算」として80点が新設されている。【０００８】
かかる状況下、急性副鼻腔炎において、その起炎菌を特定し、その重軽度を診断し、その治療に抗菌薬の投与が必要であるか否かを診断するために必要な情報を提供することができる検査手段、例えば、細菌感染否定検査が求められている。【０００９】
細菌感染症の診断は、通常、感染部位などでの原因菌の検出か、血清、体液中の原因菌に対する抗体の検出により確定される。特に、この診断は原因菌の検出が患者への迅速な治療を可能にする意味で重要である。感染症原因菌の検出には原因菌の分離培養を経て、その生化学的性状に基づき菌の同定を行う培養同定法、原因菌特異的遺伝子をもとにPCR法などにより増幅し検出する遺伝子診断法、原因菌の表面抗原マーカーとの抗体の特異的反応を利用して原因菌検出を行う免疫的手法に大別できるが、培養同定法、遺伝子診断法は検出結果を得るまでに時間がかかり、短時間にしかも高感度に原因菌を検出し、迅速かつ適切な患者への治療につながる点で免疫法による診断が汎用されている。従来、免疫法による感染症原因菌の検出には、菌種によって様々なマーカー抗原と抗体の組み合わせが使われている。【００１０】
肺炎球菌（Streptococcus pneumoniae）は、肺炎などの呼吸器の感染症や全身性感染症を引き起こす細菌であり、気道の細菌性感染症の起炎菌として重要であるばかりでなく、前記したように急性副鼻腔炎の起炎菌でもある。非特許文献１〜３に記載されるように、従来、肺炎球菌の多糖成分に対する抗体を用いて尿中に排出される肺炎球菌を検出していたが、この検出方法は、小児では、咽頭常在菌に起因すると思われる偽陽性率が高く、肺炎などの起炎細菌の診断目的のためには実用的なものではなかった。すなわち、小児では咽頭に肺炎球菌が８０％以上の高頻度で常在するため、肺炎患者又は気管支炎患者でなくても陽性を示すことが多かった。また、症状が治癒しても、尿中抗原の陽性化が維持されるため、治療の効果を正しく判断することが不可能であった。そこで、特許文献２では、以下の特許文献１に記載されるリボソームL7/L12蛋白質に対する抗体を作製し、対象微生物に特異的に反応する抗体を選択し、この抗体を用いて尿又は血清検体から起炎菌を検出する方法を提供している。【００１１】
特許文献１には、種特異的であり、かつ、同一種内のすべての血清型を検出できる細菌検出用抗体とその作製法、細菌検出方法及び細菌検出用試薬キットが記載されている。特許文献１では、各種細菌について細胞内の同一機能分子、特にリボソーム蛋白質、とりわけリボソームL7/L12蛋白質に対する抗体を作製し、対象細菌に特異的に反応する抗体を選択し、この抗体を用いて細菌を検出している。【００１２】
しかしながら、特許文献１と２のいずれにも、急性副鼻腔炎の起炎菌を、綿棒に付着した鼻腔ぬぐい液である検体中の起炎菌のリボソームL7/L12蛋白質を定量的に測定し、かかる測定値に基づきカットオフ値を設定し、例えば、細菌感染否定検査としうることについては一切記載されていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１３】
【特許文献１】国際公開第２０００／０６６０３号
【特許文献２】特開２０１０-２７６４４１号公報
【非特許文献】
【００１４】
【非特許文献１】Clinical Infectious Diseases, 2002;34:1025-10258
【非特許文献２】Journal of Clinical Microbiology, Oct. 2004, 4853-4855
【非特許文献３】感染症学雑誌、78巻、1号、18-21、2004
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
前記した従来技術に鑑み、本発明が解決しようとする課題は、急性副鼻腔炎において、その起炎菌を特定し、その重軽度を診断し、その治療に抗菌薬の投与が必要であるか否かを診断するために必要な情報を提供することができる検出手段、例えば、細菌感染否定検査手段を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
本発明者らは、かかる課題を解決すべく鋭意検討し実験を重ねた結果、インフルエンザ菌及び肺炎球菌のリボソームL7/L12蛋白質に特異的に反応する抗体を用いて、鼻腔ぬぐい液中の対象細菌特異的なリボソームL7/L12蛋白質の濃度を測定し、かかる測定値に基づきカットオフ値を設定することにより、急性副鼻腔炎の起炎菌の検出や主要な細菌感染否定検査としうることができることを予想外に見出し、本発明を完成するに至ったものである。【００１７】
すなわち、本発明は、以下の通りのものである。
［１］細菌感染による急性副鼻腔炎の起炎菌であるインフルエンザ菌(Haemophilus influenzae)又は肺炎球菌(Streptococcus pneumoniae)の検出方法であって、
被検体より採取した綿棒に付着した鼻腔ぬぐい液サンプル中の、該起炎菌のリボゾームL7/L12蛋白質の該綿棒当たりの換算質量を、該起炎菌のリボゾームL7/L12蛋白質に特異的に結合し、かつ、該起炎菌を他の細菌と種又は属で識別することができる抗体を用いて、測定し、得られた測定値に基づき起炎菌検出の有無を判断するための判断基準値(カットオフ値)を決定する工程を含む、上記検出方法。
［２］前記換算質量の測定を、ELISA(Enzyme-Linked Immuno Sorbent Assay)により行う、前記［１］に記載の検出方法。
［３］インフルエンザ菌(Haemophilus influenzae)のリボゾームL7/L12蛋白質は、配列番号２に示すアミノ酸配列を有し、かつ、肺炎球菌(Streptococcus pneumoniae)のリボゾームL7/L12蛋白質は、配列番号４に示すアミノ酸配列を有する、前記［１］又は［２］に記載の検出方法。
［４］インフルエンザ菌(Haemophilus influenzae)のリボゾームL7/L12蛋白質は、配列番号１に示す核酸配列によりコードされ、かつ、肺炎球菌(Streptococcus pneumoniae)のリボゾームL7/L12蛋白質は、配列番号２に示す核酸配列によりコードされる、前記［３］に記載の検出方法。
［５］インフルエンザ菌(Haemophilus influenzae)について、カットオフ値を０．３１ｎｇ／綿棒と設定し、また、肺炎球菌(Streptococcus pneumoniae)についてカットオフ値を０．２３ｎｇ／綿棒と設定し、これらのカットオフ値を超えた場合対応の菌を起炎菌と確定する、前記［１］〜［４］のいずれかに記載の検出方法。
［６］インフルエンザ菌(Haemophilus influenzae)について、カットオフ値を０．３１ｎｇ／綿棒と設定し、また、肺炎球菌(Streptococcus pneumoniae)についてカットオフ値を０．５１ｎｇ／綿棒と設定し、これらのカットオフ値を超えた場合対応の菌を起炎菌と確定する、前記［１］〜［４］のいずれかに記載の検出方法。
【発明の効果】
【００１８】
本発明の方法によれば、綿棒に付着した鼻腔ぬぐい液サンプル中の、該急性副鼻腔炎の起炎菌であるインフルエンザ菌（Haemophilus influenzae）又は肺炎球菌（Streptococcus pneumoniae）のリボゾームL7/L12蛋白質の該綿棒当たりの重量を、該起炎菌のリボゾームL7/L12蛋白質に特異的に結合し、かつ、該起炎菌を他の細菌と種又は属で識別することができる抗体を用いて、定量的に測定することができる。
インフルエンザ菌（Haemophilus influenzae）及び肺炎球菌（Streptococcus pneumoniae）のリボゾームL7/L12蛋白質は、リボゾームが蛋白質合成のための細胞内小器官であるため、これらの細菌の存在量が増殖に応じて十分に増加していない時期に未だ至っていなくても、これらの細菌の増殖が盛んな時期であれば、検出に十分な量で発現しているため、これらのリボゾームL7/L12蛋白質を定量的に測定し、得られた測定値に基づきカットオフ値を設定することにより、細菌感染の初期においても、高い精度で感染の程度を判定することが可能となる。それゆえ、本発明に係る測定方法は、急性副鼻腔炎の細菌感染否定検査となり得る。
鼻腔ぬぐい液の綿棒を用いた検体採取は、多少の侵襲的苦痛を与えるものの、インフルエンザウイルス感染の検査において広く行われている。本実施形態では、かかる鼻腔ぬぐい液綿棒検体を、細菌感染による急性副鼻腔炎の起炎菌の迅速検出方法に用いることができる。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
以下、本発明の実施形態について詳細に説明する。
以下の遺伝子操作の一連の分子生物学的な実験は、一般的な実験書の記載にされた方法に従って行うことができる。一般的な実験書としては、例えば、Molecular Cloning, A laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Sambrook, J. et. al. (1989) が挙げられる。
【００２０】
［リボゾームL7/L12蛋白質］
特許文献１に記載されるように、蛋白質合成に必要なリボソーム蛋白質の一種であるリボゾームL7/L12蛋白質は、全ての細菌内に存在し、細菌間で５０％〜６５％程度のアミノ酸配列の相同性を有しつつ、同一の機能が保存されている分子量約１３キロダルトンの蛋白質である。
インフルエンザ菌（Haemophilus influenzae）の塩基配列と対応のアミノ酸配列を、配列番号１と２にそれぞれ示す（特許文献１に記載の配列番号１７と１８に同じ）。
また、肺炎球菌（Streptococcus pneumoniae）の塩基配列と対応のアミノ酸配列を、配列番号３と４にそれぞれ示す（特許文献１に記載の配列番号１９と２０に同じ）。
【００２１】
［起炎菌のリボゾームL7/L12蛋白質に特異的に結合し、かつ、該起炎菌を他の細菌と種又は属で識別することができる抗体］
呼吸器感染の原因菌（起炎菌）としては、インフルエンザ菌（Haemophilus influenzae）、肺炎球菌(Streptococcus pneumoniae)、肺炎クラミジア(Chlamydia Pneumoniae)、肺炎マイコプラズマ(Mycoplasma pneumoniae)、肺炎かん菌(Klebsiella pneumoniae)、黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）、緑膿菌(Pseudomonas aeruginosa)、Ａ群溶連菌（Streptococcus sp. Group A）、結核菌（Mycobacterium tuberculosis）、レジオネラ菌(Legionella pneumophila)、アスペルジルス属真菌(Aspergillus spp.)等が知られている。
また、前記したように、急性気道感染症（急性気管支炎、急性咽頭炎、急性副鼻腔炎）の内の急性副鼻腔炎の起炎菌としては、インフルエンザ菌（Haemophilus influenzae）、肺炎球菌（Streptococcus pneumoniae）、モラキセラ・カタラーリス（Moraxella catarrhalis）が知られている。
本実施形態は、綿棒に付着した鼻腔ぬぐい液サンプル中の、該急性副鼻腔炎の起炎菌であるインフルエンザ菌（Haemophilus influenzae）又は肺炎球菌（Streptococcus pneumoniae）のリボゾームL7/L12蛋白質の該綿棒当たりの重量（濃度）を、該起炎菌のリボゾームL7/L12蛋白質に特異的に結合し、かつ、該起炎菌を他の細菌と種又は属で識別することができる抗体を用いて、定量的に測定することを特徴とする。
【００２２】
起炎菌を他の細菌と種又は属で識別することができる抗体は、インフルエンザ菌（Haemophilus influenzae）又は肺炎球菌（Streptococcus pneumoniae）のリボゾームL7/L12蛋白質の全長又は部分ペプチドを抗原として用いて作製することができる。前記したように、インフルエンザ菌（Haemophilus influenzae）又は肺炎球菌（Streptococcus pneumoniae）のリボゾームL7/L12蛋白質の塩基配列とアミノ酸配列は知られている。抗体を作製するためのペプチドの長さは特に限定されないが、インフルエンザ菌（Haemophilus influenzae）又は肺炎球菌（Streptococcus pneumoniae）のリボゾームL7/L12蛋白質に対する抗体の場合、各蛋白質を特徴づけられる長さがあればよく、好ましくは５アミノ酸以上、より好ましくは８アミノ酸以上のペプチドを用いればよい。かかる所定の長さの部分ペプチド又は全長蛋白質を、そのままで又はKLH(Keyhole limpet hemocyanin)、BSA(bovine serum albumin)などのキャリア蛋白質と架橋した後、必要に応じてアジュバントとともに動物に接種し、その血清を回収することで、インフルエンザ菌（Haemophilus influenzae）又は肺炎球菌（Streptococcus pneumoniae）のリボゾームL7/L12蛋白質を認識する抗体（ポリクローナル抗体）を含む抗血清を得ることができる。また、得られた抗血清から抗体を精製することもできる。接種する動物としてはヒツジ、ウマ、ヤギ、ウサギ、マウス、ラット等が挙げられるが、特にポリクローナル抗体を作製する場合には、ヒツジ、ウサギなどが好ましい。
【００２３】
起炎菌を他の細菌と種又は属で識別することができる抗体としては、モノクローナル抗体を使用することが好ましい。モノクローナル抗体は、ハイブリドーマ細胞を作製する公知の方法を用いて作製することができ、この場合には、抗原を接種する動物としてマウスが好ましい。また、インフルエンザ菌（Haemophilus influenzae）又は肺炎球菌（Streptococcus pneumoniae）のリボゾームL7/L12蛋白質の全長ペプチド又は５アミノ酸以上、好ましくは８アミノ酸以上の部分ペプチドを、GST（グルタチオン-S-トランスフェラーゼ）などと融合させたものを精製して、又は未精製のまま、抗原として用いることもできる。
成書（Antibodies a laboratory manual, E. Harlow et al., Cold Spring Harbor Laboratory）に記載された各種の方法や遺伝子クローニング法などにより分離されたイムノグロブリン遺伝子を用いて、細胞に発現させた遺伝子組み換えタイプのモノクローナル抗体を作製してもよい。
【００２４】
インフルエンザ菌（Haemophilus influenzae）又は肺炎球菌（Streptococcus pneumoniae）のリボゾームL7/L12蛋白質に特異的に結合し、かつ、該起炎菌を他の細菌と種又は属で識別することができるモノクローナル抗体は、具体的には、以下の方法で取得することができる。
前記したように、インフルエンザ菌（Haemophilus influenzae）又は肺炎球菌（Streptococcus pneumoniae）のリボゾームL7/L12蛋白質の遺伝子配列は知られているため、そのリボゾームL7/L12蛋白質の遺伝子配列が知られている他の細菌における対応の蛋白質のアミノ酸配列との間に類似性が少ない領域において５〜３０残基程度のペプチド断片を合成し、それを免疫原としてモノクローナル抗体を作製することができる。また、既知の該遺伝子の両端部位におけるDNA配列をプローブとしたPCR手法による遺伝子増幅、相同部分配列を鋳型プローブとしたハイブリダイゼーション法など通常の遺伝子操作手法を用いることにより該遺伝子の全長配列を取得することができる。その後、他の蛋白質遺伝子とのフュージョン遺伝子などを構築し、大腸菌等を宿主として公知の遺伝子導入手法により宿主内に該当フュージョン遺伝子を挿入し大量に発現させた後にフュージョン蛋白質として用いた蛋白質に対する抗体アフィニティーカラム法などにより発現蛋白質を精製することにより目的とする蛋白質抗原を取得することができる。この場合、インフルエンザ菌（Haemophilus influenzae）又は肺炎球菌（Streptococcus pneumoniae）のリボゾームL7/L12蛋白質の全長蛋白質が抗原となるため細菌間で保存されているアミノ酸部分に対する抗体を取得しても、インフルエンザ菌（Haemophilus influenzae）又は肺炎球菌（Streptococcus pneumoniae）のリボゾームL7/L12蛋白質に特異的に結合し、かつ、該起炎菌を他の細菌と種又は属で識別することができるとは限らないため、この方法によって取得した抗原に対しては、公知の手法によりモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを取得し、該当する細菌とのみ選択的に反応する抗体を産生するクローンを選択することにより所望の抗体を取得する必要がある。
【００２５】
抗原蛋白質の精製度が不足している場合には、公知の精製手法であるイオン交換クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィーなどの手法により精製した後、既に作製・取得済であるインフルエンザ菌（Haemophilus influenzae）又は肺炎球菌（Streptococcus pneumoniae）のリボゾームL7/L12蛋白質抗体によるウェスタンブロットなどの方法により対応のリボゾームL7/L12蛋白質の溶出画分を同定し、さらに精製度の高い蛋白質を得ることができる。こうして得られた精製された、インフルエンザ菌（Haemophilus influenzae）又は肺炎球菌（Streptococcus pneumoniae）のリボゾームL7/L12蛋白質抗原を用いて公知の方法によりハイブリドーマを取得し、前記と同様に、目的の細菌とのみ特異的に反応する抗体を産生するクローンを選択することにより目的の抗体を取得することができる。
【００２６】
［綿棒に付着した鼻腔ぬぐい液サンプル中の、起炎細菌のリボゾームL7/L12蛋白質の該綿棒当たりの重量の測定］
このようにして取得した、インフルエンザ菌（Haemophilus influenzae）又は肺炎球菌（Streptococcus pneumoniae）のリボゾームL7/L12蛋白質に特異的に結合し、かつ、該起炎菌を他の細菌と種又は属で識別することができる抗体を、特に制限されないが、例えば、ポリスチレンラテックス粒子上に該抗体を吸着させた凝集反応、マイクロタイタープレート中で行う公知技術であるELISA法、既存のイムノクロマト法、着色粒子若しくは発色能を有する粒子又は酵素又は蛍光体でラベルされた該抗体とともに捕捉(capture)抗体で被覆した磁気微粒子などを用いるサンドイッチイムノアッセイなどの既知の免疫測定手法に用いることにより、綿棒に付着した鼻腔ぬぐい液サンプル中の、該起炎菌のリボゾームL7/L12蛋白質の該綿棒当たりの重量を測定し、得られた測定値に基づき、細菌感染による急性副鼻腔炎疾患の診断のためのカットオフ値を設定することができる。好ましい免疫測定手法として、ELISA (Enzyme-Linked Immuno Sorbent Assay)、イムノクロマト法が挙げられる。
【００２７】
綿棒に付着した鼻腔ぬぐい液サンプル中のインフルエンザ菌（Haemophilus influenzae）又は肺炎球菌（Streptococcus pneumoniae）からの、細胞内リボゾームL7/L12蛋白質の抽出方法としては、トリトンＸ−１００（Triton X-100（登録商標））、ツイーン−２０(Tween-20（登録商標））などの界面活性剤を用いた抽出試薬による処理法、適当なプロテアーゼなどの酵素を用いる酵素処理法、物理的方法による細胞構造の破砕手法が用いられうるが、界面活性剤等の組み合わせによる検出系に合う抽出条件を選ぶことが好ましい。
【００２８】
前記した２種類の抗体を用いるサンドイッチイムノアッセイは、好ましくはELISA法である。ELISA法によるサンドイッチイムノアッセイにおいては、例えば、インフルエンザ菌（Haemophilus influenzae）又は肺炎球菌（Streptococcus pneumoniae）のリボゾームL7/L12蛋白質に対する第一の抗体は、抗原蛋白質であるインフルエンザ菌（Haemophilus influenzae）又は肺炎球菌（Streptococcus pneumoniae）のリボゾームL7/L12蛋白質を固相又は液相中で捕獲するcapture抗体（１次抗体）として使用することができ、また、インフルエンザ菌（Haemophilus influenzae）又は肺炎球菌（Streptococcus pneumoniae）のリボゾームL7/L12蛋白質に対する第二の抗体をパーオキシダーゼやアルカリフォスファターゼなどの酵素で公知の方法により修飾することにより得られる酵素標識抗体（２次抗体）として使用することができる。
【００２９】
本実施形態においては、インフルエンザ菌（Haemophilus influenzae）又は肺炎球菌（Streptococcus pneumoniae）のリボゾームL7/L12蛋白質に対する２種類の抗体を、１次抗体と２次抗体として用いるサンドイッチイムノアッセイにより、患者（被験者）の綿棒に付着した鼻腔ぬぐい液サンプル中の対応のリボゾームL7/L12蛋白質の濃度を定量的に測定する。
本明細書中、用語「被検体より採取した綿棒に付着した鼻腔ぬぐい液サンプル中の対応のリボゾームL7/L12蛋白質の濃度」とは、患者（被験者）の鼻腔ぬぐい液が付着した綿棒１本あたりの該鼻腔ぬぐい液サンプル中の対応起炎細菌のリボゾームL7/L12蛋白質の重量をいう。鼻腔ぬぐい液サンプル採取に際して、綿棒１本あたりに付着する鼻腔ぬぐい液の重量は、採取の仕方に依存してばらつくことが想定される。本実施形態においては、定量的に測定された患者（被験者）の綿棒に付着した鼻腔ぬぐい液サンプル中の対応のリボゾームL7/L12蛋白質の濃度の測定値に基づき、細菌感染による急性副鼻腔炎疾患の診断のためのカットオフ値を設定する。例えば、インフルエンザ菌(Haemophilus influenzae)について、カットオフ値を０．３１ｎｇ／綿棒と設定し、また、肺炎球菌(Streptococcus pneumoniae)についてカットオフ値を０．２３ｎｇ／綿棒と設定し、これらのカットオフ値を超えた場合対応の菌を起炎菌と確定することができる。
【００３０】
［綿棒］
鼻腔ぬぐい液を採取するために使用する綿棒、スワブスティックは特に制限はなく、例えば、平和メディク社製滅菌綿棒F-Rであることができる。鼻腔ぬぐい液の場合、以下の方法で検体を採取し、試料を調製することができる。
（１）滅菌綿棒を鼻腔内に挿入し、鼻甲介を数回擦るようにして粘膜表皮を採取する。（２）検体抽出液を飛び散らせないように検体抽出容器のアルミシールをはがす。（３）検体を採取した滅菌綿棒を検体抽出液に浸し、滅菌綿棒を回しながら上下に動かして数回撹拌し、その後、滅菌綿棒を引き出し、この液を試料とする。
【００３１】
［カットオフ値の設定］
感度とは、診断に使用する検査において、疾患有の被験者を陽性と正しく判断する確率であり、感度が高い検査において陰性となった場合には、疾患の除外診断ができる。また、特異度とは、疾患無の被験者を陰性と正しく判断する確率であり、特異性が高い検査において陽性となった場合、疾患の確定診断ができる。陽性の被験者の中で疾患ありの確率が陽性的中率であり、また、陰性の被験者の中で疾患なしの確率が陰性的中率であり、これらが検査の臨床的有用性といえる。疾患群においては、カットオフ値（しきい値）は、真陽性と偽陽性とを分け、健常群においては、カットオフ値（しきい値）は、真陰性と偽陰性を分け、また、陽性的中率は、真陽性と偽陽性により求められる。したがって、カットオフ値をいかなる値に設定するかによって、検査の陽性的中率又は陰性的中率、すなわち、臨床的有用性が左右されることになる。
カットオフ値は、検査（測定）方法や条件に依存し、また、診断、検査データの数にも当然に依存する。したがって、カットオフ値を具体的にいかなる値に設定するかは、検査（測定）方法が具体的に確立された後に初めて可能となる。
尚、本実施形態において決定したカットオフ値は、必ずしも前記した臨床学的な疾患の確定診断のためのもではない。
【００３２】
本実施形態では、綿棒に付着した鼻腔ぬぐい液サンプル中の、該急性副鼻腔炎の起炎菌であるインフルエンザ菌（Haemophilus influenzae）又は肺炎球菌（Streptococcus pneumoniae）のリボゾームL7/L12蛋白質の該綿棒当たりの重量を、該起炎菌のリボゾームL7/L12蛋白質に特異的に結合し、かつ、該起炎菌を他の細菌と種又は属で識別することができる抗体を用いて、定量的に測定することができる。
従来、培養により、及び／又は細菌表面抗原と特異的に反応する抗体を用いて、起炎菌を定性的に測定することは行われてきたが、カットオフ値を設定できる程度に、起炎菌を定量的に測定することは行われてこなかった。
インフルエンザ菌（Haemophilus influenzae）及び肺炎球菌（Streptococcus pneumoniae）のリボゾームL7/L12蛋白質は、リボゾームが蛋白質合成のための細胞内小器官であるため、これらの細菌の存在量が増殖に応じて十分に増加していない時期に未だ至っていなくても、これらの細菌の増殖が盛んな時期であれば、検出に十分な量で発現しているため、これらのリボゾームL7/L12蛋白質を定量的に測定し、得られた測定値に基づきカットオフ値を設定することにより、細菌感染の初期においても、高い精度で感染の程度を判定することが可能となる。
【実施例】
【００３３】
以下、本発明を実施例に基づき具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
［実施例１］
特許文献１の実施例１〜３に記載の方法に従い、同文献に記載のハイブリドーマHIRB-1〜-5とは別に、新たにインフルエンザ菌（Haemophilus influenzae）のリボゾームL7/L12蛋白質に対する抗体を産生するHIAYB-5〜HIAYB-10の６株のハイブリドーマを取得した。【００３４】
［インフルエンザ菌（Haemophilus influenzae）のリボゾームL7/L12遺伝子のクローニング］
具体的には、インフルエンザ菌（Haemophilus influenzae）ATCC9334 (IID984)株（東京大学医科学研究所より分譲、購入）をチョコレート寒天培地上に適当量植菌した後、ＣＯ２インキュベーター中で３７℃、ＣＯ２０．５％条件で２４時間培養した。生育したコロニーを最終的に５×１０９ＣＦＵ／ｍＬ前後になるようにTE Buffer（和光純薬工業社製）に懸濁した。このうち約１．５ｍＬを微量遠心チューブに移し取り１００００ｒｐｍで２分間遠心し、上澄みを棄てた。沈殿部分を５６７μＬのTE Bufferに再懸濁した。さらに３０μＬの１０％ドデシル硫酸ナトリウム（SDS）と３μＬの20mg／ｍＬ Proteinase Ｋ溶液を加えて良く混合し、３７℃で１時間インキュベートした。次に、１０％のセチルトリメチルアンモニウムブロマイド／0.7M NaCl溶液を８０μＬ追添し、よく混合した後、６５℃で１０分間インキュベートした。次に、体積比２４／１のクロロホルム−イソアミルアルコール混合液を700μＬ加えよく攪拌した。この溶液を微量遠心機で１２０００ｒｐｍ、５分間（４℃コントロール下）遠心処理した後、水層画分を新しい微量遠心管に移した。そこに０．６倍量のイソプロパノールを加えチューブをよく振ってDNAの沈殿を形成せしめた。白いＤＮＡ沈殿をガラス棒ですくって１ｍＬの７０％エタノール（−２０℃冷却したもの）が入った別の微量遠心管に移した。【００３５】
次いで、１００００ｒｐｍで５分間遠心処理し、上澄みを静かに除去した後、さらに１ｍＬの７０％エタノールを加えて再び５分間遠心した。再び上澄みを除去した後、沈殿を１００μＬのTE Bufferに溶解し、ＤＮＡ溶液を得た。このゲノムＤＮＡ溶液の濃度をMolecular Cloning, A laboratory manual, 1989, eds. Sambrook, J., Fritsch, E. F., and Maniatis, T., Cold Spring Harbor Laboratory PressのE5, Spectrophotometeric determination of the Amount of the DNA or RNAに従って定量した。
このゲノムＤＮＡのうち１０ｎｇを用いてPCR（Polymerase chain reaction）を行った。ＰＣＲには、Ｔａｑポリメラーゼ（宝酒造社製、コードＲ００１Ａ）を用いた。酵素に添付のバッファーを５μＬ、酵素に添付のdNTP ｍｉｘｔｕｒｅ ４μＬと配列番号５に示す合成オリゴヌクレオチドＡ及び配番号６に示すオリゴヌクレオチドＢをそれぞれ２６０ｐｍｏｌ加え、最終容量を５０μＬとした。
この混合物を、TaKaRa PCR Thermal Cycler 480を用いて、９５℃ １分、５０℃ ２分、７２℃ ３分を５サイクル行った後、９５℃ １分、６０℃ ２分、７２℃ ３分を２５サイクル行った。このＰＣＲ産物の一部を１．５％アガロースゲル中で電気泳動を行い、エチジウムブロマイド（日本ジーン社製）にて染色後、紫外線下で観察し、約４００ｂｐのｃＤＮＡが増幅されていることを確認した。さらに、制限酵素ＢａｍＨＩとＸｈｏＩで切断処理後、１．５％アガロースゲル中で電気泳動を行い、エチジウムブロマイド染色後約３７０ｂｐのバンドをゲルから切り出してＳｕｐｒｅｃ０１（宝酒造社製）で精製後、市販のベクターであるｐＧＥＸ−４Ｔ−１（Pharmacia社製）に組み込んだ。同ベクターは目的の遺伝子断片を適当な制限酵素サイトに組み込むことによりＧＳＴ蛋白質とのフュージョン蛋白質を発現しうる目的分子の発現ベクターとして機能することができる。【００３６】
具体的には、ベクターｐＧＥＸ−４Ｔ−１と先のＤＮＡとをそのモル比が１：３となるように混ぜ合わせて、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ（lnvitrogen社製）にてベクターにＤＮＡを組み込んだ。ＤＮＡが組み込まれたベクターｐＧＥＸ−４Ｔ−１を大腸菌One Shot Competent Cells(Invitrogen社製）に導入し、アンピシリン（Ｓｉｇｍａ社製）を５０μｇ／ｍＬ含むＬ−Ｂｒｏｔｈ（宝酒造社製）半固型培地のプレートに蒔き、１２時間程度３７℃に放置し、現れてきたコロニーを無作為に選択し、同濃度のアンピシリンを含むＬ−Ｂｒｏｔｈ液体培地２ｍＬに植え付け、８時間程度３７℃で振盪培養し、菌体を回収し、ウィザードミニプレップ（Promega社製）を用いて添付の説明書に従ってプラスミドを分離し、このプラスミドを制限酵素ＢａｍＨＩとＸｈｏＩにて消化して、約３７０ｂｐのＤＮＡが切り出されてくることで該ＰＣＲ産物が組み込まれていることを確認し、確認されたクローンについて、組み込まれているＤＮＡの塩基配列決定を行った。【００３７】
挿入ＤＮＡ断片の塩基配列の決定は、Applied Biosystems社製の蛍光シークエンサーを用いて実施した。シークエンスサンプルの調製は、PRISM, Ready Reaction Dye Terminator Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems社製）を用いて行った。０．５ｍＬ容のマイクロチューブに９．５μＬの反応ストック液、４．０μＬの０．８ｐｍｏｌ／μＬのＴ７プロモータープライマー（GIBCO BRL社製）、及び６．５μＬの０．１６μｇ／μＬのシークエンス用鋳型ＤＮＡを加えて混合し、１００μＬのミネラルオイルを重層後、９６℃３０秒、５５℃１５秒および６０℃ ４分を１サイクルとするＰＣＲ増幅反応を２５サイクル行い、４℃で５分間保温した。反応後、８０μＬの滅菌精製水を加えて攪拌し、遠心分離後、その水層を３回のフェノール・クロロホルム抽出を行った。１００μＬの水層にｌ０ｍＬの３Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ５．２）と３００μＬのエタノールを加えて攪拌後、室温、１４０００ｒｐｍにて１５分間の遠心を行い、沈殿を回収した。沈殿を７５％エタノールで洗浄後、真空下に２分間静置して乾燥させ、シークエンス用サンプルとした。シークエンスサンプルは、４μＬの10ｍＭのEDTAを含むホルムアミドに溶解して９０℃、２分間で変性後、氷中で冷却してシークエンスに供した。
得られた５個のクローンの内１個の配列にＰＣＲに用いたプローブと配列の相同性があり、さらに他の微生物、例えば、Neisseria gonorrhoeaeのリボゾームL7/L12蛋白質の遺伝子配列と非常に類似したＤＮＡ配列が見いだされた。その構造L遺伝子部分の全塩基配列とアミノ酸配列は、それぞれ、配列番号１と２に示すものであった。この遺伝子断片は、インフルエンザ菌（Haemophilus influenzae）のリボゾームL7/L12蛋白質の遺伝子をコードするものである。【００３８】
［同蛋白質の大腸菌での大量発現、精製］
発現ベクターを組み込んだ大腸菌をＬＢ培地中で５０ｍＬ ３７℃１晩培養した。２倍濃度のＴＹ培地５００ｍＬを３７℃で１時間温めておいた。１晩培養した大腸菌液５０ｍＬを５００ｍＬの前述の培地に入れた。１時間後、１００ｍＭイソプロピルβ−Ｄ（−）−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）５５０μＬ入れ、４時間培養後回収し、２５０ｍＬずつ遠心チューブに入れて７０００ｒｐｍ、１０分間遠心した。上澄みを棄て、５０ｍＭトリス塩酸（Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ）ｐＨ７．４、２５％スクロース（Ｓｕｃｒｏｓｅ）を含むＬｙｓｉｓバッファー２５ｍＬずつに溶解した。さらに、１０％ノニデットＰ−４０（ＮＰ−４０）１．２５ｍＬ、１Ｍ ＭｇＣｌ２１２５μＬを加えてプラスティックチューブに移した。１分間×５回氷冷中でsonicationを実施し、１２０００ｒｐｍ、１１５分間遠心後、上澄み液を回収した。
次に、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）でコンディショニングしたグルタチオンアガロースカラムに、上澄み液を吸着させた。
次に、２０ｍＭ ＴｒｉｓバッファーｐＨ７．４、４．２ｍＭ ＭｇＣｌ２、１ｍＭジチオスレイトール（ＤＴＴ）を含む洗浄液でカラムを２ベッドボリューム分洗浄した。その後、５ｍＭのグルタチオンを含む５０ｍＭ ＴｒｉｓバッファーｐＨ９．６で溶出し、分画したフラクション中の蛋白質含有量を色素結合法（ブラッドフォード法、Biorad社）で検出し、メインフラクションを取得した。得られた精製GSTフュージョン・リボゾームL7/L12蛋白質の純度を電気泳動法により確認したところ、約７５％であり免疫原として充分な純度を確保できた。【００３９】
［同蛋白質に対するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマの取得］
得られた精製ＧＳＴフュージョン・リボゾームL7/L12蛋白質抗原１００μｇを２００μＬのPBSに溶解後、フロイントのコンプリートアジュバントを２００μＬ加え、混合、エマルジョン化した後、２００μＬをマウスの腹腔内に注射した。さらに、２週間後、４週間後、６週間後に同様のエマルジョン抗原を腹腔内に注射し、さらに１０週間後、１４週間後に２倍濃度の抗原エマルジョン液を腹腔内注射し、最終免疫から３日後に脾臓を取り出し、細胞融合に供した。
無菌的に取り出したマウスの脾細胞１０８個に対し骨髄腫細胞２×１０７個をガラスチューブに採り、良く混合した後、１５００ｒｐｍで５分間遠心し、上澄みを棄て、その後、細胞をよく混合した。細胞融合に使用した骨髄腫細胞としては、ＮＳ−１系の細胞株を用い１０％ウシ胎児血清（FCS）を含むＲＰＭＩ１６４０培地で培養し、細胞融合の２週間前から０．１３ｍＭのアザグアニン、０．５μｇ／ｍＬのＭＣ−２１０、１０％ＦＣＳを含むＲＰＭＩ１６４０培地で１週間培養後、さらに１０％ＦＣＳを含むＲＰＭＩ１６４０培地で１週間培養したものを用いた。混合した細胞サンプルに３７℃に保温した５０ｍＬのＲＰＭＩ１６４０培地を３０ｍｌ加え、１５００ｒｐｍで遠心し、上澄みを除去後、３７℃に保温した５０％ポリエチレングリコールを１ｍＬ加え、激しく攪拌しながら２分間処理後、３７℃に保温した１０ｍＬのＲＰＭＩ１６４０培地を加え、液を滅菌ピペットで吸引、排出しながら、５分間激しく攪拌混合した。１０００ｒｐｍで５分間遠心、上澄み除去後、さらに３０ｍｌのＨＡＴ培地を加え細胞濃度が５×１０６個／ｍＬになるように調整し、攪拌均一化後、９６穴プレート型培養プレートに０．１ｍＬずつ分注し、７％ＣＯ２条件下、３７℃で培養し、１日目、１週間日、２週間目にＨＡＴ培地を０.１ｍＬずつ加えた。【００４０】
次に、所望の抗体を生産している細胞をスクリーニングするためにELISA法による評価を実施した。０．０５％のアジ化ソーダ含むＰＢＳ中に溶解したインフルエンザ菌（Haemophilus influenzae）のGSTフュージョン・リボゾームL7／L１２蛋白質とGST蛋白質をそれぞれ１０μｇ／ｍＬ濃度で希釈した液を、１００μＬずつ９６穴プレートの別々に分注し、４℃で１晩吸着させた。上澄み除去後、１％牛血清アルブミン溶液（PBS中）２００μＬを添加し、室温で１時間反応させてブロッキングした。上澄み除去後、洗浄液（Tween20（登録商標）0.02%,PBS）で洗浄し、その上に融合細胞の培養液１００μＬを加え、室温で２時間反応後、上澄みを除去しさらに洗浄液で洗浄した。これに、５００ｇ／ｍＬのペルオキシダーゼ標識ヤギ抗マウスＩｇＧ抗体液を１００μＬ加え室温、１時間反応を実施し、上澄みを除去し、さらに洗浄液で洗浄した後、TMB溶液（KPL社）を１００μＬずつ加え室温で２０分反応、発色後、１Ｎの硫酸を１００μＬ添加して反応を停止し、４５０ｎｍの吸光を測定した結果、GSTフュージョン・リボゾームL7/L12蛋白質にのみ反応し、GST蛋白質には反応しない陽性ウェルが見いだされ、リボゾームL7/L12蛋白質に対する抗体が含まれていることが判明した。
そこで、陽性ウェル中の細胞をそれぞれ回収し２４穴プラスティックプレート中、HAT培地で培養した。培養した融合培地を、細胞数が約２０個／ｍＬになるようにＨＴ培地で希釈し、５０μＬを、HT培地に懸濁した６週齢のマウス胸腺細胞１０６個と９６穴培養プレート中で混合後、７％ＣＯ２条件下、３７℃で２週間培養した。培養上澄み中の抗体活性を、前述のELISA法にて同様に検定し、リボゾームL7/L12蛋白質との反応陽性の細胞を回収した。
さらに、同様の希釈検定、クローニング操作を繰り返し、ハイブリドーマHIAYB-5〜HIAYB-10の６株のクローンを取得した。【００４１】
［同ハイブリドーマ用いた抗体生産］
特許文献１の実施例４に記載の方法に従い、上記のように取得した陽性ハイブリドーマHIAYB-5〜HIAYB-10の６株を用いて、精製したモノクローナル抗体をそれぞれ生産し回収した。
具体的にはＲＰＭＩ１６４０培地（１０％FCS入り）を用いて継代培養した細胞を予め２週間前に０．５ｍＬのプリスタンを腹腔内に注射したＢａｌｂ／Ｃマウスの腹腔内に５×１０６個（PBS中）注射し、３週間後腹水を回収し、その遠心上澄みを取得した。取得した抗体含有液を、Protein Aカラム（５ｍＬベッド、Pharmacia社）に吸着させ、ＰＢＳで３ベッドボリューム洗浄し、ｐＨ３のクエン酸バッファーで溶出し、抗体フラクションを回収して各ハイブリドーマの生産するモノクローナル抗体を得た。【００４２】
［インフルエンザ菌（Haemophilus influenzae）のリボゾームL7/L12抗原と反応するが、他の細菌由来の対応抗原とは反応しない抗体の組み合わせの選定（ELISAを用いた抗体特異性評価による選定）］
得られた６株のモノクローナル抗体を、それぞれ、サンドイッチ系ELISAにより、１次抗体、２次抗体として組み合わせて、インフルエンザ菌（Haemophilus influenzae）のリボゾームL7/L12抗原との反応性について評価した。ELISA測定の2次抗体として、対象となるモノクローナル抗体をパーオキシダーゼ酵素で標識したものを使用した。酵素標識にはホースラディッシュパーオキシダーゼ（SigmaグレードV）を用い、結合には試薬S-アセチルチオ酢酸N-ヒドロキシスクシンイミドを使用し、Analytical Bio-chemistry132(1983)、68-73で述べられている方法に従って行った。
具体的には１次抗体として評価する抗体の10μg/mLのPBS溶液100μlを、９６穴ELISAプレート（Nunc社Maxsorp ELISAプレート）に分注し４℃で一晩吸着させた。上澄み除去後、1%牛血清アルブミン溶液（PBS中）200μL添加し、室温で1時間反応させてブロッキングした。上澄み除去後、洗浄液（0.02％Tween20（登録商標）、PBS）で数回洗浄し、インフルエンザ菌（ATCC9334株）培養液（約１×109 /mL）を0.5%TritonX-100（登録商標）、PBSにて100倍に希釈したもの（最終濃度）と0.5%TritonX-100（登録商標）、PBS（陰性コントロール）を100μL添加し、室温にて1時間反応させた。さらに上澄み除去後、前記した方法によりパーオキシダーゼ標識した各種インフルエンザ菌（Haemophilus influenzae）リボゾームL7/L12蛋白質抗体を２次抗体として、0.02%Tween20（登録商標）、PBSにて最終濃度１μg/mLになるように希釈したものをそれぞれ100μL添加し、室温にて1時間反応させた。上澄み除去後、さらに洗浄液で数回洗浄した後、TMB溶液（KPL社製）を100μLずつ加え、室温10分間反応させた後、1mol/Lの塩酸を100μL添加し、反応を停止した後、450nmの吸光度を測定し、陰性コントロールシグナルとの差により、インフルエンザ菌（Haemophilus influenzae）が検出可能な、インフルエンザ菌（Haemophilus influenzae）リボゾームL7/L12蛋白質抗体の組み合わせについて評価した。また、併せてインフルエンザ菌（Haemophilus influenzae）以外の主な細菌（Neisseria meningitides ATCC13090株、Neiserria lactamica ATCC30011株、Neisseria moucoa ATCC35611株、Neisseria sicca ATCC9913株、Branhamelle catarrharis ATCC25240株、Neiseria gonorroeae ATCC9793株、Escherichia coli ATCC25922株、Klebsiella pneumoniae ATCC13883株）についても、同様の条件にて検出試験を実施した。その結果、インフルエンザ菌（Haemophilus influenzae）を特異的に検出可能なインフルエンザ菌（Haemophilus influenzae）リボゾームL7/L12蛋白質抗体の１次抗体HIAYB-6（ハイブリドーマHIAYB-6株の産生する抗体）を選定し、上記１次抗体に組み合わせる相手である２次抗体のモノクローナル抗体の組み合わせとして、２次抗体HIAYB-8（ハイブリドーマHIAYB-8株の産生する抗体）とを選定した。【００４３】
［実施例２］
特許文献１の実施例５に記載された方法に従い、同文献に記載のハイブリドーマAMSP-1〜4とは別に、肺炎球菌(Streptococcus pneumoniae)のリボゾームL7/L12蛋白質に対する抗体を産生するSPOKM-5〜SPOKM-10の６株のハイブリドーマを新たに取得した。【００４４】
［肺炎球菌(Streptococcus pneumoniae)のリボゾームL7/L12遺伝子のクローニング］
肺炎球菌(Streptococcus pneumoniae) IID555株（東京大学医科学研究所より分譲、購入）を血液寒天培地上に適当量植菌した後、インキュベーター中、３７℃で４８時間培養する。生育したコロニーを最終的に５×１０９ＣＦＵ／ｍＬ前後になるようにTE Bufferに懸濁する。内約１．５ｍＬを微量遠心チューブに移し取り１００００ｒｐｍで２分間遠心し、上澄みを棄てた。沈殿部分を５６７μＬのTE Bufferに再懸濁した。さらに３０μＬの１０％ＳＤＳと３μＬの２０ｍｇ／ｍＬ Proteinase K溶液を加えて良く混合し、３７℃で１時間インキュベートした。次に１０％のセチルトリメチルアンモニウムブロマイド／０．７Ｍ ＮａＣｌ溶液を８０μＬ追添し、よく混合した後６５℃で１０分間インキュベートした。次に、体積比２４／１のクロロホルム−イソアミルアルコール混合液を７００μＬ加え、よく攪拌した。この溶液を微量遠心機で１２０００ｒｐｍ、５分間（４℃コントロール下）遠心処理した後、水層画分を新しい微量遠心管に移した。そこに０．６倍量のイソプロパノールを加えチューブをよく振ってＤＮＡの沈殿を形成させた。白いＤＮＡ沈殿をガラス棒ですくって１ｍＬの７０％エタノール（−２０℃冷却したもの）が入った別の微量遠心管に移した。【００４５】
次に１００００ｒｐｍで５分間遠心処理し、上澄みを静かに除去した後、さらに１ｍＬの７０％エタノールを加えて再び５分間遠心した。再び上澄みを除去した後、沈殿を１００μＬのTE bufferに溶解しＤＮＡ溶液を得た。このゲノムＤＮＡ溶液の濃度を、Molecular Cloning, A laboratory manual, 1989, eds. Sambrook, J., Fritsch, E. F., and Maniatis, T., Cold Spring Harbor Laboratory PressのE5, Spectrophotometeric determination of the Amount of the DNA or RNAに従って定量した。
このゲノムＤＮＡのうち１０ｎｇを用いてＰＣＲを行った。ＰＣＲはＴａｑポリメラーゼ（宝酒造社製、コードROOlA）を用いた。酵素に添付のバッファーを５μＬ、酵素に添付のｄＮＴＰ ｍｉｘｔｕｒｅ ４μｌと配列番号７に示す合成オリゴヌクレオチドＣと配列番号８に示す合成オリゴヌクレオチドＤを、それぞれ、２００ｐｍｏｌを加え、最終容量５０μＬとした。
この混合物を、TaKaRa PCR Thermal Cycler 480を用いて、９５℃ １分、５０℃ ２分、７２℃ ３分を５サイクル行った後、９５℃ １分、６０℃ ２分、７２℃ ３分を２５サイクル行った。このＰＣＲ産物の一部を１．５％アガロースゲル中で電気泳動を行い、エチジウムブロマイド（日本ジーン社製）にて染色後、紫外線下で観察し、約４００ｂｐのｃＤＮＡが増幅されていることを確認した。さらに制限酵素ＢａｍＨＩとＸｈｏＩで切断処理後、１．５％アガロースゲル中で電気泳動を行いエチジウムブロマイド染色後約３７０ｂｐのバンドをゲルから切り出してＳｕｐｒｅｃ０１（宝酒造社製）で精製後、市販のベクターであるｐＧＥＸ−６Ｐ−１（Pharmacia社製）に組み込んだ。同ベクターは目的の遺伝子断片を適当な制限酵素サイトに組み込むことによりＧＳＴ蛋白質とのフュージョン蛋白質を発現しうる目的分子の発現ベクターとして機能することができる。具体的にはベクターｐＧＥＸ−６Ｐ−１と先のＤＮＡとをそのモル比が１：５となるように混ぜ合わせて、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ（Invitrogen社製）にてベクターにＤＮＡを組み込んだ。ＤＮＡが組み込まれたベクターｐＧＥＸ−６Ｐ−１を大腸菌One Shot Competent Cells(Invitrogen社製）に遺伝子導入し、アンピシリン（Sigma社製）を５０μｇ／ｍＬ含むＬ−Ｂｒｏｔｈ（宝酒造社製）半固型培地のプレートに蒔き、１２時間程度３７℃に放置し、現れてきたコロニーを無作為選択し、同濃度のアンピシリンを含むＬ−Ｂｒｏｔｈ液体培地２ｍｌに植え付け、８時間程度３７℃で振とり培養し、菌体を回収し、ウィザードミニプレップ（Promega社製）を用いて添付の説明書に従ってプラスミドを分離し、このプラスミドを制限酵素ＢａｍＨＩ／ＸｈｏＩにて消化して、約３７０ｂｐのＤＮＡが切り出されてくることで該ＰＣＲ産物が組み込まれていることを確認し、確認されたクローンについて、組み込まれているＤＮＡの塩基配列決定を行った。【００４６】
挿入ＤＮＡ断片の塩基配列の決定は、Applied Biosystems社製の蛍光シークエンサーを用いて実施した。シークエンスサンプルの調製はPRISM, Ready Reaction Dye Terminator Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems社製）を用いて行った。０．５ｍＬ容のマイクロチューブに９．５μＬの反応ストック液、４．０μＬの０.８ｐｍｏｌ／μＬのＴ７プロモータープライマー（GIBCO BRL社製）及び６．５μＬの０．１６μｇ／μＬのシークエンス用鋳型ＤＮＡを加えて混合し、１００μＬのミネラルオイルを重層後、９６℃３０秒、５５℃１５秒、６０℃ ４分を１サイクルとするPCR増幅反応を２５サイクル行い、４℃で５分間保温した。反応後、８０μｌの滅菌精製水を加えて攪拌し、遠心分離後、その水層を３回のフェノール・クロロホルム抽出を行った。１００μＬの水層に１０μＬの３Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ５．２）と３００μＬのエタノールを加えて攪拌後、室温、１４，０００ｒｐｍにて１５分間の遠心を行い、沈殿を回収した。沈殿を７５％エタノールで洗浄後、真空下に２分間静置して乾燥させ、シークエンス用サンプルとした。シークエンスサンプルは、４μＬの１０ｍＭのEDTAを含むホルムアミドに溶解して９０℃、２分間で変性後、氷中で冷却してシークエンスに供した。
得られた７個のクローンの内１個の配列にPCRに用いたプローブと配列の相同性がありさらに他の微生物、例えば、Neisseria gonorrhoeaeのリボゾームL7/L12遺伝子配列と非常に類似したＤＮＡ配列が見出された。その構造遺伝子部分の全塩基配列とアミノ酸配列は、それぞれ、配列番号３と４であった。この遺伝子断片は、肺炎球菌(Streptococcus pneumoniae)のリボゾームL7/L12蛋白質の遺伝子をコードするものである。【００４７】
［同蛋白質の大腸菌での大量発現、精製］
発現ベクターを組み込んだ大腸菌を２倍濃度のＹＴ培地５０ｍＬ中 ３７℃で１晩培養した。２倍濃度のＹＴ培地４５０ｍＬを３７℃で１時間温めておいた。１晩培養した大腸菌培養液５０ｍＬを４５０ｍＬの前述の培地に入れた。３７℃で１時間培養後、５００ｍＭのIPTGを１００μＬ入れ、２５℃ ４時間培養後回収し、２５０ｍＬずつ遠心チューブにいれて５０００ｒｐｍ、２０分速心した。上澄みを棄てて５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ７．４、２５％ Ｓｕｃｒｏｓｅを含むＬｙｓｉｓバッファー２５ｍＬずつに溶解した。
さらに１０％ ＮＰ−４０ １．２５ｍＬ、１Ｍ ＭｇＣｌ２ １２５μＬを加えてプラスティックチューブに移した。１分間×５回水冷中でsonicationを実施し、１２０００ｒｐｍ、１５分間遠心後上澄みを回収した。
次にＰＢＳでコンディショニングしたグルタチオンセファロース（Pharmacia社製）カラムに前記の上澄み液を吸着させた。次にPBSでカラムを３ベットボリューム分洗浄した。その後１０ｍＭのグルタチオンを含む５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣ１ ８．０で溶出し、分画したフラクション中の蛋白質含有量を色素結合法（ブラッドフォード法、BioRad社）で検出し、メインフラクションを取得した。メインフラクションを３Ｌ PBSに対して３回透析を行った。【００４８】
得られたGSTフュージョン・リボゾームL7/L12蛋白質の１ｍｇ／ｍＬ溶液１０ｍＬに、５００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ ｐＨ７．０、１．５Ｍ ＮａＣｌ、１０ｍＭ ＥＤＴＡ、１０ｍＭ DTTを含むCleavageバッファー１ｍＬを加え、さらに２ｕ／μＬのPreScission Protease (Pharmacia社製）を１００μＬ添加して４℃で反応させることにより、ＧＳＴ部分をリボゾームL7/L12蛋白質部分から切り離した。
次にPBSでコンディショニングしたグルタチオンセファロースカラムに反応液を通し、通過液を回収し、さらにPBSを１ベッドボリューム流し、これも回収した。取得した精製リボゾームL7/L12蛋白質の純度は電気泳動法により確認したところ約９０％であり免疫源として充分な純度を確保できた。【００４９】
［同蛋白質に対するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマの取得］
まず、マウスの免疫については肺炎球菌(Streptococcus pneumoniae)のリボゾームL7/L12蛋白質抗原１００μｇを２００μＬのPBSに溶解後フロイントのコンプリートアジュバントを２００μＬ加え混合、エマルジョン化した後、２００μＬを腹腔内に注射した。さらに２週間後、４週間後、６週間後に同様のエマルジョン抗原を腹腔内に注射し、さらに１０週間後、１４週間後に２倍濃度の抗原エマルジョン液を腹腔内注射し最終免疫から３日後に脾臓を取り出し、細胞融合に供した。
無菌的に取り出したマウスの脾細胞１０８個に対し骨髄腫細胞２×１０７個をガラスチューブに取り良く混合した後１５００ｒｐｍで５分間遠心し上澄みを棄て、その後細胞をよく混合した。
細胞融合に使用した骨髄腫細胞はＮＳ−１系の細胞株を用い１０％FCSを含むＲＰＭＩ１６４０培地で培養し、細胞融合の２週間前から０．１３ｍＭのアザグアニン、０．５μｇ／ｍＬのＭＣ−２１０、１０％ＦＣＳを含むＲＰＭＩ１６４０培地で１週間培養後、さらに１０％ＦＣＳを含むＲＰＭＩ１６４０培地で１週間培養したものを用いた。混合した細胞サンプルに３７℃に保温した５０ｍＬのＲＰＭＩ１６４０培地を３０ｍＬ加え１５００ｒｐｍで遠心、上澄み除去後３７℃に保温した５０％ポリエチレングリコールを１ｍＬ加え、激しく攪拌しながら２分間処理後、３７℃に保温した１０ｍＬのＲＰＭＩ１６４０培地を加え、液を滅菌ピペットで吸引、排出しながら約５分間激しく攪拌混合した。
１０００ｒｐｍで５分間遠心、上澄み除去後さらに３０ｍＬのＨＡＴ培地を加え細胞濃度が５×１０６個／ｍＬになるように調整し攪拌均一化後、９６穴プレート型培養プレートに０．１ｍＬずつ分注し７％ＣＯ２条件下、３７℃で培養し、１日目、１週間目、２週間目にＨＡＴ培地を０．１ｍＬずつ加えた。【００５０】
次に目的の抗体を生産している細胞をスクリーニングするためにELISA法による評価を実施した。０．０５％のアジ化ソーダ含むＰＢＳ中に溶解した肺炎球菌(Streptococcus pneumoniae)のリボゾームL7/L12蛋白質を１０μｇ／ｍＬ濃度に希釈した液を１００μＬずつ９６穴プレートの別々に分注し４℃で１晩吸着させた。上澄み除去後、１％牛血清アルブミン溶液（ＰＢＳ中）２００μＬ添加し、室温で１時間反応しブロッキングした。上澄み除去後洗浄液（Tween20（登録商標） ０．０２％、PBS）で洗浄し、その上に融合細胞の培養液１００μＬを加え室温で２時間反応後上澄みを除去しさらに洗浄液で洗浄後、５０ｎｇ／ｍＬのペルオキシダーゼ標識ヤギ抗マウスＩｇＧ抗体液を１００μＬ加え室温、１時間反応を実施し、上澄みを除去しさらに洗浄液で洗浄した後、TMB溶液（KPL社）を１００μＬずつ加え室温で２０分反応、発色後１Ｎの硫酸を１００μＬ添加して反応を停止し、４５０ｎｍの吸光を測定した。
この結果、肺炎球菌(Streptococcus pneumoniae)のリボゾームL7/L12蛋白質に反応する陽性ウェルが見いだされ、肺炎球菌(Streptococcus pneumoniae)のリボゾームL7/L12蛋白質に対する抗体が含まれていることが判明した。
そこで陽性ウェル中の細胞をそれぞれ回収し２４穴プラスティックプレート中、ＨＡＴ培地で培養した。培養した融合培地を細胞数が約２０個／ｍＬになるようにＨＴ培地で希釈し５０μＬを、ＨＴ培地に懸濁した６週齢のマウス胸腺細胞１０６個と９６穴培養プレート中で混合後、７％ＣＯ２条件下、３７℃で２週間培養した。培養上澄み中の抗体活性を前述のELISA法にて同様に検定し、肺炎球菌(Streptococcus pneumoniae)のリボゾームL7/L12蛋白質との反応陽性の細胞を回収した。
さらに同様の希釈検定、クローニング操作を繰り返し、ハイブリドーマSPOKM−５〜SPOKM−１０の６株のクローンを取得した。【００５１】
［同ハイブリドーマ用いた抗体生産］
特許文献２の実施例２に記載の方法に従い、こうして取得した陽性ハイブリドーマSPOKM-5〜SPOKM-10の６株を用いて、精製したモノクローナル抗体をそれぞれ生産し回収した。
具体的には各ハイブリドーマを種細胞増殖用培地としてウシ胎児血清（FBS）を10％添加したTIL Media I培地（IBL社製）5mLで1〜2×105個/mL程度となるように希釈し、5%CO2、37℃、25cm2培養フラスコ中で2-3日培養した。5〜10×105個/mL程度に増殖した細胞を、さらに75cm2培養フラスコ中にて同様に増殖させた後、1〜2×105個/mL程度となるように同様のFBS入り培地で希釈しローラーボトル中へ250mLに継代した。5％CO2、37℃で2-3日培養した後、さらに250mLのFBS入り清培地を追加して2〜3日間培養を継続した。5〜10×105個/mL程度にまで増殖させた後、すべての細胞を回収し、同量の無血清培養用培地（ASF0104N 味の素社）に置換した。4〜7日間培養したのち培養液を回収して2500ｒｐｍ、10分間の遠心により目的とする抗体を含む培養上清を取得した。培養上清は、ポアサイズ0.45μmで無菌濾過し、0.1%のアジ化ソーダ添加後4℃で保存した。取得した培養上清を0.05mol/Lリン酸緩衝液（pH7）で5倍希釈後Hitrap-proteinGカラム（アマシャム社製、5mL）に吸着させ、リン酸緩衝液で５ベッドボリューム分洗浄後pH2.5の０．１Mグリシン-塩酸緩衝液で溶出し、フラクションを回収して各ハイブリドーマの産生するモノクローナル抗体を得た。【００５２】
［肺炎球菌(Streptococcus pneumoniae)のリボゾームL7/L12抗原と反応するが、他の細菌由来の対応抗原とは反応しない抗体の組み合わせの選定（ELISAを用いた抗体特異性評価による選定］
得られた６株のモノクローナル抗体を、それぞれ、サンドイッチ型ELISAにより、１次抗体、２次抗体として組み合わせて、肺炎球菌(Streptococcus pneumoniae)のリボゾームL7/L12抗原との反応性について評価した。ELISA測定の2次抗体として、対象となるモノクローナル抗体をパーオキシダーゼ酵素で標識したものを使用した。酵素標識にはホースラディッシュパーオキシダーゼ（SigmaグレードV）を用い、結合には試薬S-アセチルチオ酢酸N-ヒドロキシスクシンイミドを使用し、Analytical Bio-chemistry132(1983)、68-73で述べられている方法に従って行った。
具体的には１次抗体として評価する抗体の10μg/mLのPBS溶液100μLを、９６穴ELISAプレート（Nunc社Maxsorp（登録商標） ELISAプレート）に分注し４℃で一晩吸着させた。
上澄み除去後、1%牛血清アルブミン溶液（PBS中）200μL添加し、室温で1時間反応させてブロッキングした。上澄み除去後、洗浄液（0.02％Tween20（登録商標）、PBS）で数回洗浄し、インフルエンザ菌（ＡＴＣＣ９３３４株）培養液（約１×109 /mL）を0.5%TritonX-100（登録商標）、PBSにて100倍に希釈したもの（最終濃度0.5%TritonX-100（登録商標）、PBS（陰性コントロール））を100μl添加し、室温にて1時間反応させた。さらに上澄み除去後、前記した方法によりパーオキシダーゼ標識した各種肺炎球菌(Streptococcus pneumoniae)リボゾームL7/L12蛋白質抗体を２次抗体として、0.02%Tween20（登録商標）、PBSにて最終濃度１μg/mLになるように希釈したものをそれぞれ100μL添加し、室温にて1時間反応させた。上澄み除去後、さらに洗浄液で数回洗浄した後、TMB溶液（KPL社製）を100μLずつ加え、室温10分間反応させた後、1mol/Lの塩酸を100μL添加し、反応を停止した後、450nmの吸光度を測定し、陰性コントロールシグナルとの差により、肺炎球菌(Streptococcus pneumoniae)が検出可能な、肺炎球菌(Streptococcus pneumoniae)リボゾームL7/L12蛋白質抗体の組み合わせについて評価した。また、併せて肺炎球菌(Streptococcus pneumoniae)以外の主な細菌（Escherichia coli、Enterrococcus faecalis、Haemophilis influenzae、Neiserria lactamica、Neisseria meningitidis、Neiseria gonorroeae、Klebsiella pneumoniae、Pseudomonus aeruginosa、Streptococcus agalactiae、Streptococcus aureus、Mycoplasma pneunomiae、Chlamysia pneumoniae）についても、同様の条件にて検出試験を実施した。その結果、肺炎球菌(Streptococcus pneumoniae)を特異的に検出可能な肺炎球菌(Streptococcus pneumoniae)リボゾームL7/L12蛋白質抗体の１次抗体SPOKM-6（ハイブリドーマSPOKM-6株の産生する抗体）を選定し、上記１次抗体に組み合わせる相手である２次抗体のモノクローナル抗体として、SPOKM-9（ハイブリドーマSPOKM-9株の産生する抗体）を選定した。【００５３】
［実施例３］
インフルエンザ菌（Haemophilus influenzae）を特異的に検出可能なインフルエンザ菌（Haemophilus influenzae）リボゾームL7/L12蛋白質抗体の１次抗体、２次抗体のモノクローナル抗体の組み合わせとして、実施例１で得た、１次抗体HIAYB-6（ハイブリドーマHIAYB-6株の産生する抗体）と２次抗体HIAYB-8（ハイブリドーマHIAYB-8株の産生する抗体）との組み合わせを、また、肺炎球菌(Streptococcus pneumoniae)を特異的に検出可能な肺炎球菌(Streptococcus pneumoniae)リボゾームL7/L12蛋白質抗体の１次抗体、２次抗体のモノクローナル抗体の組み合わせとして、実施例２で得た１次抗体SPOKM-6（ハイブリドーマSPOKM-6株の産生する抗体）と２次抗体SPOKM-9（ハイブリドーマSPOKM-9株の産生する抗体）の組み合わせを用いて、ELISAにより、検体中の対応抗原濃度を測定した。【００５４】
［ELISA測定における検量線作成］
以下の手順に従って、インフルエンザ菌（Haemophilus influenzae）リボゾームL7/L12蛋白質と肺炎球菌(Streptococcus pneumoniae)リボゾームL7/L12蛋白質のそれぞれについて、ELISA検量線を作成した。
９６穴プレート（Thermo Fisher社製 Nunc MaxiSorp ELISAプレート）に、対応の１次抗体 10μL/mL PBS溶液を50μL添加し、4℃で終夜静置した。次いで、上澄みを除去後、数回0.02%Tween20（登録商標）PBS溶液で洗浄した。次いで、1% BSA PBS溶液を200μL添加後、4℃で終夜静置した。上澄みを除去後、数回0.02%Tween20（登録商標）PBS溶液で洗浄した。次いで、予め作製したインフルエンザ菌（Haemophilus influenzae）リボゾームL7/L12蛋白質（配列番号２に示すアミノ酸配列を有する）については、0.4ng/mL、0.2ng/mL、0.1ng/mL、0.05ng/mL、0.025ng/mL、0.0125ng/mL、0.00625ng/mL、0.003125ng/mL、0ng/mLとなる濃度にPBS溶液で希釈した抗原液を作製した。また、予め作製した肺炎球菌(Streptococcus pneumoniae)リボゾームL7/L12蛋白質（配列番号４に示すアミノ酸配列を有する）については、16ng/mL、8ng/mL、4ng/mL、2ng/mL、1ng/mL、0.5ng/mL、0.25ng/mL、0.125ng/mL、0ng/mLとなる濃度にPBS溶液で希釈した抗原液を作製した。各抗原液を50μL添加後、37℃で2時間静置した。上澄み除去後、数回0.02%Tween20（登録商標）PBS溶液で洗浄した。次いで、ホースラディッシュパーオキシダーゼ（HRP、SigmaグレードV）を用い、結合には試薬Ｓ−アセチルチオ酢酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドを使用し、AnalyticalBio-chemistry132(1983), 68-73に記載された方法に従い対応の２次抗体をHRP標識した。HRP-２次抗体を50μL添加後、室温で1時間静置した。上澄み除去後、数回0.02%Tween20（登録商標）PBS溶液で洗浄した。次いで、TMB溶液（KPL社製TMB 2-Component Microwell Peroxidase Substrate Kit）を100μL添加後、室温で10分静置した。1mol/L HClを100μL添加し、反応停止させた。次いで、分光光度計（島津製作所製 SHIMAZU UV-1600）を用いて450nmの吸光度を測定した。【００５５】
［検体中の対応抗原濃度の測定］
以下の手順に従って、検体中のインフルエンザ菌（Haemophilus influenzae）リボゾームL7/L12蛋白質と肺炎球菌(Streptococcus pneumoniae)リボゾームL7/L12蛋白質の濃度を、上記のように作成したELISA検量線を用いて測定した。
９６穴プレート（Thermo Fisher社製 Nunc MaxiSorp ELISAプレート）に、対応の１次抗体 10μL/mL PBS溶液を50μL添加し、4℃で終夜静置した。上澄み除去後、数回0.02%Tween20（登録商標）PBS溶液で洗浄した。次いで、1% BSA PBS溶液を200μL添加後、4℃で終夜静置した。上澄み除去後、数回0.02%Tween20（登録商標）PBS溶液で洗浄した。次いで、検体ぬぐい綿棒（平和メディク社製滅菌綿棒F-R）から500μLの1%Triton-X（登録商標）生理食塩水で対応のリボゾームL7/L12蛋白質を溶出した抗原液を作製した。抗原液を50μL添加後、37℃で2時間静置した。上澄み除去後、数回0.02%Tween20（登録商標）PBS溶液で洗浄した。次いで、ホースラディッシュパーオキシダーゼ（HRP、SigmaグレードV）を用い、結合には試薬Ｓ−アセチルチオ酢酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドを使用し、AnalyticalBio-chemistry132(1983), 68-73に記載された方法に従い、対応の２次抗体をHRP標識した。HRP-２次抗体を50μL添加後、室温で1時間静置した。上澄み除去後、数回0.02%Tween20（登録商標）PBS溶液で洗浄した。次いで、TMB溶液（KPL社製TMB 2-Component Microwell Peroxidase Substrate Kit）を100μL添加後、室温で10分静置した。1mol/L HClを100μL添加し、反応停止させた。次いで、分光光度計（島津製作所製 SHIMAZU UV-1600）で450nmの吸光度を測定した。【００５６】
［実施例４］
［検体の培養］
検体中のインフルエンザ菌（Haemophilus influenzae）と肺炎球菌(Streptococcus pneumoniae)を以下の培養により定性的に同定した。
［インフルエンザ菌（Haemophilus influenzae）］
チョコレート寒天培地上に、耳（耳漏、貯留液）及び鼻腔ぬぐい液を付着させた綿棒をぬぐい、37℃で24時間培養した。
インフルエンザ菌（Haemophilus influenzae）であるか否かを生化学的性状に基づいて確認し、同定した。
生化学的性状に基づいて同定がつかない場合には、ブルカー・ジャパンのMALDI-TOFを用いて質量分析法により同定した。
［肺炎球菌(Streptococcus pneumoniae)］
血液寒天培地上に、耳（耳漏、貯留液）及び鼻腔ぬぐい液を付着させた綿棒をぬぐい、37℃で24時間培養した。
肺炎球菌(Streptococcus pneumoniae)であるか否かを生化学的性状に基づき確認し、同定した。
生化学的性状に基づき同定がつかない場合には、ブルカー・ジャパンのMALDI-TOFを用いて質量分析法による同定した。【００５７】
［耳鼻科からの臨床検体（耳漏液、鼻腔ぬぐい液）中のインフルエンザ菌（Haemophilus influenzae）と肺炎球菌(Streptococcus pneumoniae)の培養陽性の確認と、対応のリボゾームL7/L12蛋白質の濃度測定］
［インフルエンザ菌（Haemophilus influenzae）］
実施例４に従って、インフルエンザ菌（Haemophilus influenzae）の培養陽性を確認し、副鼻腔炎の起炎細菌として確定し、実施例３に従って、検体中のインフルエンザ菌（Haemophilus influenzae）のリボゾームL7/L12蛋白質の濃度（綿棒当たりの質量）をELISAにより測定した。
検体データを以下の表に示す。【００５８】
【表１】
2020111272.tif 000002
【００５９】
検体番号１〜７では、インフルエンザ菌が中耳貯留液又は耳漏から培養陽性として検出されているため、インフルエンザ菌が中耳炎の起炎菌として確定できる。中耳炎の起炎菌は副鼻腔炎の起炎菌が中耳に移行して発症することが広く知られている。したがって、検体番号１〜７の鼻腔ぬぐい液でもインフルエンザ菌が培養陽性となっているため、同サンプルの鼻腔ぬぐい液中のインフルエンザ菌は中耳炎と同様に副鼻腔炎の起炎菌のインフルエンザ菌であると特定可能である。このとき検体番号１〜７の鼻腔ぬぐい液中のインフルエンザ菌（Haemophilus influenzae）のリボゾームL7/L12蛋白質の濃度（綿棒当たりの質量）は０．３１〜２９．７５ng/swabであった。また、３人の別な被験者から検体ぬぐい綿棒（平和メディク社製滅菌綿棒F-R）を鼻腔内に挿入し、鼻甲介を数回擦るようにして粘膜表皮を採取したところ、綿棒に付着した検体量は０．００８ｍｇ〜０．０８１ｍｇであった。つまり、綿棒に付着する検体量は０．２５〜２．５３１倍まで変動する可能性があることになる。しかしながら、最小値である０．３１ng/swab以上であれば、インフルエンザ菌（Haemophilus influenzae）が起炎菌である疑いがある。上記カットオフ値を用いれば、検出されたインフルエンザ菌（Haemophilus influenzae）の菌量がカットオフ値未満であればインフルエンザ菌（Haemophilus influenzae）は起炎菌ではなく（すなわち、除外することができ）、インフルエンザ菌（Haemophilus influenzae）の菌量がカットオフ値以上の場合、インフルエンザ菌（Haemophilus influenzae）が起炎菌である疑いがあると判定（すなわち、確定）することができる。かかるカットオフ値０．３１ng/swabは、鼻腔混合感染である検体番号８〜１０のHIのL7/L12換算濃度である０．７５〜８．６０ng/swab、陰性である検体番号１７、１８、２０に照らして、臨床的有用性があると考えられる。
尚、検体番号１０のインフルエンザ菌は耳のＬ７／Ｌ１２換算値が０．２４ng/swabであるが、耳（中耳貯留液又は耳漏）は、細菌が常在する鼻腔に対して常在菌の数が圧倒的に少ないため、カットオフ値より小さい換算値であっても培養陽性を示したものと推察される。その意味では、上記カットオフ値は、本発明における常在菌の多い鼻腔より採取した検体のカットオフ値としての信頼性が高いと言え、特に単独感染においての信頼性が非常に高いと言える。【００６０】
［肺炎球菌(Streptococcus pneumoniae)］
実施例４に従って、肺炎球菌(Streptococcus pneumoniae)の培養陽性を確認し、副鼻腔炎の起炎菌として確定し、実施例３に従って、検体中の肺炎球菌(Streptococcus pneumoniae)のリボゾームL7/L12蛋白質の濃度（綿棒当たりの質量）をELISAにより測定した。
検体データを以下の表に示す。【００６１】
【表２】
2020111272.tif 000003
【００６２】
検体番号１１〜１４では、中耳貯留液又は耳漏から肺炎球菌が培養陽性として検出されているため、肺炎球菌が中耳炎の起炎菌として確定できる。中耳炎の起炎菌は副鼻腔炎の起炎菌が中耳に移行して発症することが広く知られている。したがって、検体番号１１〜１４の鼻腔ぬぐい液でも肺炎球菌が培養陽性となっているため、同サンプルの鼻腔ぬぐい液中の肺炎球菌は中耳炎と同様に副鼻腔炎の起炎菌の肺炎球菌であると特定可能である。
このとき検体番号１１〜１４の鼻腔ぬぐい液中の肺炎球菌(Streptococcus pneumoniae)のリボゾームL7/L12蛋白質の濃度（綿棒当たりの質量）は０．２３〜２．１２ng/swabであった。また、３人の別な被験者から検体ぬぐい綿棒（平和メディク社製滅菌綿棒F-R）を鼻腔内に挿入し、鼻甲介を数回擦るようにして粘膜表皮を採取したところ、綿棒に付着した検体量は０．００８ｍｇ〜０．０８１ｍｇであった。つまり、綿棒に付着する検体量は０．２５〜２．５３１倍まで変動する可能性があることになる。しかしながら、最小値である０．２３ng/swab以上の範囲では、肺炎球菌(Streptococcus pneumoniae)が起炎菌である疑いがある。そこで、０．２３ng/swabを第一のカットオフ値とした。上記カットオフ値を用いれば、検出された肺炎球菌(Streptococcus pneumoniae)の菌量がカットオフ値未満であれば肺炎球菌(Streptococcus pneumoniae)は起炎菌ではなく（すなわち、除外することができ）、肺炎球菌(Streptococcus pneumoniae)の菌量がカットオフ値以上の場合、肺炎球菌(Streptococcus pneumoniae)が起炎菌である疑いがあると判定（すなわち、確定）することができる。かかるカットオフ値は、鼻腔混合感染である検体番号１５のSPのL7/L12換算濃度である０．１７ng/swabに照らして、また、陰性である検体番号１６、１９に照らして、臨床的有用性があると考えられる。より臨床的有用性が高いカットオフ値としては０．５１ng/swabである。
尚、検体番号１１、１２の肺炎球菌は耳のＬ７／Ｌ１２換算値が０．１２ng/swab、０．０６ng/swabであるが、これはインフルエンザ菌と同様に、耳（中耳貯留液又は耳漏）は、細菌が常在する鼻腔に対して常在菌の数が圧倒的に少ないため、カットオフ値より少ない換算値であっても培養陽性を示したものと推察される。また、検体番号１５の肺炎球菌は鼻腔のＬ７／Ｌ１２換算値が０．１７ng/swabであるが、これは鼻腔混合感染の為、上記カットオフ値より小さくても培養陽性となったと推察される。その意味では、上記カットオフ値は、本発明における常在菌の多い鼻腔より採取した検体の単独感染のカットオフ値としての信頼性が非常に高いと言える。
【産業上の利用可能性】
【００６３】
本発明の方法によれば、綿棒に付着した鼻腔ぬぐい液サンプル中の、該急性副鼻腔炎の起炎菌であるインフルエンザ菌（Haemophilus influenzae）又は肺炎球菌（Streptococcus pneumoniae）のリボゾームL7/L12蛋白質の該綿棒当たりの重量を、該起炎菌のリボゾームL7/L12蛋白質に特異的に結合し、かつ、該起炎菌を他の細菌と種又は属で識別することができる抗体を用いて、定量的に測定することができ、得られた測定値に基づきカットオフ値を設定することにより、細菌感染の初期においても、高い精度で感染の程度を判定することが可能となる。それゆえ、本発明に係る測定方法は、急性副鼻腔炎の細菌感染否定検査となり得、細菌感染による急性副鼻腔炎の起炎菌の迅速検出のために好適に利用可能である。
【配列表】
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【国際調査報告】
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