(57)【要約】  縮合反応を完結させて縮合収率を向上させ、１塩基欠損体（Ｎ−１ｍｅｒ）などの不純物を著しく低減することができるオリゴヌクレオチドの製造方法を提供すること。ホスホロチオエート（ＰＳ）、ホスフェート（ＰＯ）またはＨ−ホスホネート部位を有する保護オリゴヌクレオチドに酸を添加して５’位水酸基の一時保護基を除去したのち、５’位水酸基がアシル化された副生物を加溶媒分解して脱アシル化する工程を含むオリゴヌクレオチドの製造方法。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ホスホロチオエート（ＰＳ）、ホスフェート（ＰＯ）またはＨ−ホスホネート部位を有する保護オリゴヌクレオチドに酸を添加して５’位水酸基の一時保護基を除去したのち、５’位水酸基がアシル化された副生物を加溶媒分解して脱アシル化する工程を含むオリゴヌクレオチドの製造方法。
【請求項２】
以下の工程（１）〜（４）を含むオリゴヌクレオチドの製造方法：
（１）５’位水酸基が保護されておらず、且つその他の基が核酸合成に用いられる保護基で保護されていてもよく、もしくは固相担体に結合していてもよいヌクレオシド、ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド（ａ）と、
３’位水酸基または３’位アミノ基がホスホロアミダイト法、Ｈ−ホスホネート法、ジハロホスフィン法およびオキサザホスホリジン法から選択される方法により修飾されており、５’位水酸基が酸性条件下で除去可能な一時保護基で保護され、且つその他の基が核酸合成に用いられる保護基で保護されていてもよいヌクレオシド、ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド（ｂ）と
を縮合させ、５’位水酸基が酸性条件下で除去可能な一時保護基で保護されたホスファイト体または亜リン酸ジエステル（ｃ）を得る工程；
（２）：（２−１）ホスファイト体または亜リン酸ジエステル（ｃ）に硫化剤を添加して硫化し、５’位水酸基が酸性条件下で除去可能な一時保護基で保護されたホスホロチオエート化部位を有するオリゴヌクレオチド（ｄ−１）を得る工程、または
（２−２）ホスファイト体または亜リン酸ジエステル（ｃ）に酸化剤を添加して酸化し、５’位水酸基が酸性条件下で除去可能な一時保護基で保護されたホスフェート化部位を有するオリゴヌクレオチド（ｄ−２）を得る工程；
（３）：（３−１）ホスホロチオエート化部位を有するオリゴヌクレオチド（ｄ−１）に酸を添加して５’位水酸基の一時保護基を除去し、５’位水酸基が保護されていないホスホロチオエート化部位を有するオリゴヌクレオチド（ｅ−１）粗製物を得る工程、または
（３−２）ホスフェート化部位を有するオリゴヌクレオチド（ｄ−２）に酸を添加して５’位水酸基の一時保護基を除去し、５’位水酸基が保護されていないホスフェート化部位を有するオリゴヌクレオチド（ｅ−２）粗製物を得る工程；および
（４）：（４−１）ホスホロチオエート化部位を有するオリゴヌクレオチド（ｅ−１）粗製物に含まれる５’位水酸基がアシル化されたホスホロチオエート化部位を有するオリゴヌクレオチドを加溶媒分解して脱アシル化する工程、または
（４−２）ホスフェート化部位を有するオリゴヌクレオチド（ｅ−２）粗製物に含まれる５’位水酸基がアシル化されたオリゴヌクレオチドを加溶媒分解して脱アシル化する工程。
【請求項３】
ホスホロチオエート化部位を有するオリゴヌクレオチド（ｅ−１）またはホスフェート化部位を有するオリゴヌクレオチド（ｅ−２）の保護基を全て除去した後、保護されていないホスホロチオエート化部位を有するオリゴヌクレオチドまたは保護されていないホスフェート化部位を有するオリゴヌクレオチドを単離する工程をさらに含む、請求項２に記載の製造方法。
【請求項４】
以下の工程（１Ａ）、（３Ａ）および（４Ａ）を含むオリゴヌクレオチドの製造方法：
（１Ａ）５’位水酸基が保護されておらず、且つその他の基が核酸合成に用いられる保護基で保護されていてもよく、もしくは固相担体に結合していてもよいヌクレオシド、ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド（ａ）と、
３’位水酸基または３’位アミノ基がＨ−ホスホネート法により修飾されており、５’位水酸基が酸性条件下で除去可能な一時保護基で保護され、且つその他の基が核酸合成に用いられる保護基で保護されていてもよいヌクレオシド、ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド（ｂ）と
を縮合させ、５’位水酸基が酸性条件下で除去可能な一時保護基で保護されたホスファイト体または亜リン酸ジエステル（ｃ）を得る工程；
（３Ａ）ホスファイト体または亜リン酸ジエステル（ｃ）に酸を添加して５’位水酸基の一時保護基を除去し、５’位水酸基が保護されていないホスファイト体または亜リン酸ジエステル（ｃ）粗製物を得る工程；および
（４Ａ）ホスファイト体または亜リン酸ジエステル（ｃ）粗製物に含まれる５’位水酸基がアシル化されたオリゴヌクレオチドを加溶媒分解して脱アシル化する工程。
【請求項５】
工程（１）が、
５’位水酸基が保護されておらず、核酸塩基のアミノ基およびイミノ基、リボース残基の２’位水酸基、３’位水酸基および３’位アミノ基、並びにデオキシリボース残基の３’位水酸基および３’位アミノ基から選ばれる少なくとも一つの基が、酸性条件下では除去されず、塩基性条件下で除去可能な保護基で保護され、且つその他の基がさらに核酸合成に用いられる保護基で保護されていてもよいヌクレオシド、ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド（ａ）、或いは
５’位水酸基が保護されておらず、３’位末端のリン酸基の一つのＯＨが−ＯＬｎ１−ＯＨ（式中、Ｌｎ１は有機基を示す。）に置き換わっており、−ＯＬｎ１−ＯＨの水酸基が酸性条件下では除去されず、塩基性条件下で除去可能な保護基で保護され、且つその他の基がさらに核酸合成に用いられる保護基で保護されていてもよいヌクレオシド、ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド（ａ１）と、
３’位水酸基または３’位アミノ基がホスホロアミダイト法、Ｈ−ホスホネート法、ジハロホスフィン法およびオキサザホスホリジン法から選択される方法により修飾されており、５’位水酸基が酸性条件下で除去可能な一時保護基で保護され、且つその他の基がさらに、酸性条件下では除去されず、塩基性条件下で除去可能な保護基および核酸合成に用いられる保護基から選ばれる保護基で保護されていてもよいヌクレオシド、ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド（ｂ）と
を縮合させ、５’位水酸基が酸性条件下で除去可能な一時保護基で保護されたホスファイト体または亜リン酸ジエステル（ｃ）を得る工程である、請求項２または３に記載の製造方法。
【請求項６】
５’位水酸基の一時保護基の除去で使用する酸が、カルボン酸、スルホン酸、ホスホン酸、またはリン酸を含む請求項１〜５のいずれか１項に記載の製造方法。
【請求項７】
酸が、トリフルオロ酢酸、ジクロロ酢酸、トリクロロ酢酸、酢酸、トリフルオロメタンスルホン酸、メタンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸、ホスホン酸、またはリン酸である請求項６に記載の製造方法。
【請求項８】
加溶媒分解で使用する溶媒が、塩基と求核物質との混合物である請求項１〜７のいずれか１項に記載の製造方法。
【請求項９】
塩基が非求核性塩基および窒素原子を含む複素環式化合物からなる群より選ばれる少なくとも１種であり、求核物質が水およびアルコール誘導体からなる群より選ばれる少なくとも１種である請求項８に記載の製造方法。
【請求項１０】
窒素原子を含む複素環式化合物がピリジン誘導体である請求項９に記載の製造方法。
【請求項１１】
非求核性塩基のｐＫaが３〜１０である請求項９または１０に記載の製造方法。
【請求項１２】
求核物質が水を含む場合、そのｐＨが３．０〜８．０である請求項８〜１１のいずれか１項に記載の製造方法。
【請求項１３】
塩基がピリジン、コリジン、ルチジンおよびメチルピリジンからなる群より選ばれる少なくとも１種である請求項８〜１２のいずれか１項に記載の製造方法。
【請求項１４】
求核物質が水、メタノール、エタノール、イソプロピルアルコール、ブタノール、ベンジルアルコールおよびテトラヒドロフルフリルアルコールからなる群より選ばれる少なくとも１種である請求項８〜１３のいずれか１項に記載の製造方法。
【請求項１５】
ホスホロチオエート（ＰＳ）、ホスフェート（ＰＯ）またはＨ−ホスホネート部位を有する保護オリゴヌクレオチドに酸を添加して３’位水酸基または３’位アミノ基の一時保護基を除去したのち、３’位水酸基または３’位アミノ基がアシル化された副生物を加溶媒分解して脱アシル化する工程を含むオリゴヌクレオチドの製造方法。
【請求項１６】
以下の工程（１’）〜（４’）を含むオリゴヌクレオチドの製造方法：
（１’）３’位水酸基または３’位アミノ基が保護されておらず、且つその他の基が核酸合成に用いられる保護基で保護されていてもよく、もしくは固相担体に結合していてもよいヌクレオシド、ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド（ａ’）と、
５’位水酸基がホスホロアミダイト法、Ｈ−ホスホネート法、ジハロホスフィン法およびオキサザホスホリジン法から選択される方法により修飾されており、３’位水酸基または３’位アミノ基が酸性条件下で除去可能な一時保護基で保護され、且つその他の基が核酸合成に用いられる保護基で保護されていてもよいヌクレオシド、ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド（ｂ’）と
を縮合させ、３’位水酸基または３’位アミノ基が酸性条件下で除去可能な一時保護基で保護されたホスファイト体または亜リン酸ジエステル（ｃ’）を得る工程；
（２’）：（２’−１）ホスファイト体または亜リン酸ジエステル（ｃ’）に硫化剤を添加して硫化し、３’位水酸基または３’位アミノ基が酸性条件下で除去可能な一時保護基で保護されたホスホロチオエート化部位を有するオリゴヌクレオチド（ｄ’−１）を得る工程、または
（２’−２）ホスファイト体または亜リン酸ジエステル（ｃ’）に酸化剤を添加して酸化し、３’位水酸基または３’位アミノ基が酸性条件下で除去可能な一時保護基で保護されたホスフェート化部位を有するオリゴヌクレオチド（ｄ’−２）を得る工程；
（３’）：（３’−１）ホスホロチオエート化部位を有するオリゴヌクレオチド（ｄ’−１）に酸を添加して３’位水酸基または３’位アミノ基の一時保護基を除去し、３’位水酸基または３’位アミノ基が保護されていないホスホロチオエート化部位を有するオリゴヌクレオチド（ｅ’−１）粗製物を得る工程、または
（３’−２）ホスフェート化部位を有するオリゴヌクレオチド（ｄ’−２）に酸を添加して３’位水酸基または３’位アミノ基の一時保護基を除去し、３’位水酸基または３’位アミノ基が保護されていないホスフェート化部位を有するオリゴヌクレオチド（ｅ’−２）粗製物を得る工程；および
（４’）：（４’−１）ホスホロチオエート化部位を有するオリゴヌクレオチド（ｅ’−１）粗製物に含まれる３’位水酸基または３’位アミノ基がアシル化されたホスホロチオエート化部位を有するオリゴヌクレオチドを加溶媒分解して脱アシル化する工程、または
（４’−２）ホスフェート化部位を有するオリゴヌクレオチド（ｅ’−２）粗製物に含まれる３’位水酸基または３’位アミノ基がアシル化されたホスフェート化部位を有するオリゴヌクレオチドを加溶媒分解して脱アシル化する工程。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、オリゴヌクレオチドの製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
オリゴヌクレオチドの製造方法として、現在、ホスホロアミダイト法やＨ−ホスホネート法が汎用されており、その他にも、ジハロホスフィン法やオキサザホスホリジン法も知られている。オリゴヌクレオチドの製造は反応が多段階を要することから、塩基伸長毎の反応工程でたとえ１％以下の微量な不純物副生であっても、目的物となるオリゴヌクレオチド伸長体になると不純物が多量になってしまう。そのため、高純度のオリゴヌクレオチドを取得するには各反応単工程の不純物副生を抑制することが肝要である。しかしながら、縮合反応工程においては、反応が完結せず、目的のオリゴヌクレオチドの収率が下がるだけでなく、１塩基欠損体（Ｎ−１ｍｅｒ）などの不純物が副生し、これらの不純物の除去が困難となるという問題もある。
オリゴヌクレオチドの製造方法として、固相合成（固相法）や液相法があり、さらに固相法と液相法の欠点を解消するため、擬似固相保護基を使用した液相法も開発されている（特許文献１〜９）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】国際公開第２０１２／１５７７２３号
【特許文献２】国際公開第２０１３／１２２２３６号
【特許文献３】国際公開第２０１７／１０４８３６号
【特許文献４】国際公開第２００５／０７０８５９号
【特許文献５】国際公開第２０１３／１７９４１２号
【特許文献６】国際公開第２０１４／０７７２９２号
【特許文献７】国際公開第２０１７／０８６３９７号
【特許文献８】国際公開第２０１８／２０３５７４号
【特許文献９】国際公開第２０１８／２１２２３６号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明は、上記のような事情に鑑みてなされたものであり、その解決しようとする課題は、ヌクレオシド、ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドの縮合反応を完結させ得る、オリゴヌクレオチドの製造方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者らは、上記の課題を解決すべく鋭意研究をし、原因を解析したところ、縮合反応の前工程となる、酸（カルボン酸）による脱保護工程において、脱保護された５’位水酸基が酸（カルボン酸）によってアシル化され、縮合反応が完結できず、欠損化不純物の副生に繋がることを見出した。更に、本発見を基に、上記Ｏ−アシル化されたオリゴヌクレオチドを加溶媒分解して脱アシル化する工程を新たに導入することにより、前記課題が解決されることを見出し、本発明を完成するに至った。すなわち、本発明は以下の特徴を有する。【０００６】
［１］ホスホロチオエート（ＰＳ）、ホスフェート（ＰＯ）またはＨ−ホスホネート部位を有する保護オリゴヌクレオチドに酸を添加して５’位水酸基の一時保護基を除去したのち、５’位水酸基がアシル化された副生物を加溶媒分解して脱アシル化する工程を含むオリゴヌクレオチドの製造方法。
［２］以下の工程（１）〜（４）を含むオリゴヌクレオチドの製造方法：
（１）５’位水酸基が保護されておらず、且つその他の基が核酸合成に用いられる保護基で保護されていてもよく、もしくは固相担体に結合していてもよいヌクレオシド、ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド（ａ）と、
３’位水酸基または３’位アミノ基がホスホロアミダイト法、Ｈ−ホスホネート法、ジハロホスフィン法およびオキサザホスホリジン法から選択される方法により修飾されており、５’位水酸基が酸性条件下で除去可能な一時保護基で保護され、且つその他の基が核酸合成に用いられる保護基で保護されていてもよいヌクレオシド、ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド（ｂ）と
を縮合させ、５’位水酸基が酸性条件下で除去可能な一時保護基で保護されたホスファイト体または亜リン酸ジエステル（ｃ）を得る工程；
（２）：（２−１）ホスファイト体または亜リン酸ジエステル（ｃ）に硫化剤を添加して硫化し、５’位水酸基が酸性条件下で除去可能な一時保護基で保護されたホスホロチオエート化部位を有するオリゴヌクレオチド（ｄ−１）を得る工程、または
（２−２）ホスファイト体または亜リン酸ジエステル（ｃ）に酸化剤を添加して酸化し、５’位水酸基が酸性条件下で除去可能な一時保護基で保護されたホスフェート化部位を有するオリゴヌクレオチド（ｄ−２）を得る工程；
（３）：（３−１）ホスホロチオエート化部位を有するオリゴヌクレオチド（ｄ−１）に酸を添加して５’位水酸基の一時保護基を除去し、５’位水酸基が保護されていないホスホロチオエート化部位を有するオリゴヌクレオチド（ｅ−１）粗製物を得る工程、または
（３−２）ホスフェート化部位を有するオリゴヌクレオチド（ｄ−２）に酸を添加して５’位水酸基の一時保護基を除去し、５’位水酸基が保護されていないホスフェート化部位を有するオリゴヌクレオチド（ｅ−２）粗製物を得る工程；および
（４）：（４−１）ホスホロチオエート化部位を有するオリゴヌクレオチド（ｅ−１）粗製物に含まれる５’位水酸基がアシル化されたオリゴヌクレオチドを加溶媒分解して脱アシル化する工程、または
（４−２）ホスフェート化部位を有するオリゴヌクレオチド（ｅ−２）粗製物に含まれる５’位水酸基がアシル化されたオリゴヌクレオチドを加溶媒分解して脱アシル化する工程。
［３］ホスホロチオエート化部位を有するオリゴヌクレオチド（ｅ−１）またはホスフェート化部位を有するオリゴヌクレオチド（ｅ−２）の保護基を全て除去した後、保護されていないホスホロチオエート化部位を有するオリゴヌクレオチドまたは保護されていないホスフェート化部位を有するオリゴヌクレオチドを単離する工程をさらに含む、［２］に記載の製造方法。
［４］以下の工程（１Ａ）、（３Ａ）および（４Ａ）を含むオリゴヌクレオチドの製造方法：
（１Ａ）５’位水酸基が保護されておらず、且つその他の基が核酸合成に用いられる保護基で保護されていてもよく、もしくは固相担体に結合していてもよいヌクレオシド、ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド（ａ）と、
３’位水酸基または３’位アミノ基がＨ−ホスホネート法により修飾されており、５’位水酸基が酸性条件下で除去可能な一時保護基で保護され、且つその他の基が核酸合成に用いられる保護基で保護されていてもよいヌクレオシド、ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド（ｂ）と
を縮合させ、５’位水酸基が酸性条件下で除去可能な一時保護基で保護されたホスファイト体または亜リン酸ジエステル（ｃ）を得る工程；
（３Ａ）ホスファイト体または亜リン酸ジエステル（ｃ）に酸を添加して５’位水酸基の一時保護基を除去し、５’位水酸基が保護されていないホスファイト体または亜リン酸ジエステル（ｃ）粗製物を得る工程；および
（４Ａ）ホスファイト体または亜リン酸ジエステル（ｃ）粗製物に含まれる５’位水酸基がアシル化されたオリゴヌクレオチドを加溶媒分解して脱アシル化する工程。
［５］工程（１）が、
５’位水酸基が保護されておらず、核酸塩基のアミノ基およびイミノ基、リボース残基の２’位水酸基、３’位水酸基および３’位アミノ基、並びにデオキシリボース残基の３’位水酸基および３’位アミノ基から選ばれる少なくとも一つの基が、酸性条件下では除去されず、塩基性条件下で除去可能な保護基で保護され、且つその他の基がさらに核酸合成に用いられる保護基で保護されていてもよいヌクレオシド、ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド（ａ）、或いは
５’位水酸基が保護されておらず、３’位末端のリン酸基の一つのＯＨが−ＯＬｎ１−ＯＨ（式中、Ｌｎ１は有機基を示す。）に置き換わっており、−ＯＬｎ１−ＯＨの水酸基が酸性条件下では除去されず、塩基性条件下で除去可能な保護基で保護され、且つその他の基がさらに核酸合成に用いられる保護基で保護されていてもよいヌクレオシド、ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド（ａ１）と、
３’位水酸基または３’位アミノ基がホスホロアミダイト法、Ｈ−ホスホネート法、ジハロホスフィン法およびオキサザホスホリジン法から選択される方法により修飾されており、５’位水酸基が酸性条件下で除去可能な一時保護基で保護され、且つその他の基がさらに、酸性条件下では除去されず、塩基性条件下で除去可能な保護基および核酸合成に用いられる保護基から選ばれる保護基で保護されていてもよいヌクレオシド、ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド（ｂ）と
を縮合させ、５’位水酸基が酸性条件下で除去可能な一時保護基で保護されたホスファイト体または亜リン酸ジエステル（ｃ）を得る工程である、［２］または［３］に記載の製造方法。
［６］５’位水酸基の一時保護基の除去で使用する酸が、カルボン酸、スルホン酸、ホスホン酸、またはリン酸を含む［１］〜［５］のいずれか１に記載の製造方法。
［７］酸が、トリフルオロ酢酸、ジクロロ酢酸、トリクロロ酢酸、酢酸、トリフルオロメタンスルホン酸、メタンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸、ホスホン酸、またはリン酸である［６］に記載の製造方法。
［８］加溶媒分解で使用する溶媒が、塩基と求核物質との混合物である［１］〜［７］のいずれか１に記載の製造方法。
［９］塩基が非求核性塩基および窒素原子を含む複素環式化合物からなる群より選ばれる少なくとも１種であり、求核物質が水およびアルコール誘導体からなる群より選ばれる少なくとも１種である［８］に記載の製造方法。
［１０］非求核性塩基のｐＫaが３〜１０である［９］に記載の製造方法。
［１１］窒素原子を含む複素環式化合物がピリジン誘導体である［９］または［１０］に記載の製造方法。
［１２］求核物質が水を含む場合、そのｐＨが３．０〜８．０である［８］〜［１１］のいずれか１に記載の製造方法。
［１３］塩基がピリジン、コリジン、ルチジンおよびメチルピリジンからなる群より選ばれる少なくとも１種である［８］〜［１２］のいずれか１に記載の製造方法。
［１４］求核物質が水、メタノール、エタノール、イソプロピルアルコール、ブタノール、ベンジルアルコールおよびテトラヒドロフルフリルアルコールからなる群より選ばれる少なくとも１種である［８］〜［１３］のいずれか１に記載の製造方法。
［１４Ａ］塩基と求核物質との混合物が、ピリジンと水との混合物、ピリジンとメタノールとの混合物、またはピリジンとエタノールとの混合物である［８］〜［１４］のいずれか１に記載の製造方法。
［１５］ホスホロチオエート（ＰＳ）、ホスフェート（ＰＯ）またはＨ−ホスホネート部位を有する保護オリゴヌクレオチドに酸を添加して３’位水酸基または３’位アミノ基の一時保護基を除去したのち、３’位水酸基または３’位アミノ基がアシル化された副生物を加溶媒分解して脱アシル化する工程を含むオリゴヌクレオチドの製造方法。
［１６］以下の工程（１’）〜（４’）を含むオリゴヌクレオチドの製造方法：
（１’）３’位水酸基または３’位アミノ基が保護されておらず、且つその他の基が核酸合成に用いられる保護基で保護されていてもよく、もしくは固相担体に結合していてもよいヌクレオシド、ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド（ａ’）と、
５’位水酸基がホスホロアミダイト法、Ｈ−ホスホネート法、ジハロホスフィン法およびオキサザホスホリジン法から選択される方法により修飾されており、３’位水酸基または３’位アミノ基が酸性条件下で除去可能な一時保護基で保護され、且つその他の基が核酸合成に用いられる保護基で保護されていてもよいヌクレオシド、ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド（ｂ’）と
を縮合させ、３’位水酸基または３’位アミノ基が酸性条件下で除去可能な一時保護基で保護されたホスファイト体または亜リン酸ジエステル（ｃ’）を得る工程；
（２’）：（２’−１）ホスファイト体または亜リン酸ジエステル（ｃ’）に硫化剤を添加して硫化し、３’位水酸基または３’位アミノ基が酸性条件下で除去可能な一時保護基で保護されたホスホロチオエート化部位を有するオリゴヌクレオチド（ｄ’−１）を得る工程、または
（２’−２）ホスファイト体または亜リン酸ジエステル（ｃ’）に酸化剤を添加して酸化し、３’位水酸基または３’位アミノ基が酸性条件下で除去可能な一時保護基で保護されたホスフェート化部位を有するオリゴヌクレオチド（ｄ’−２）を得る工程；
（３’）：（３’−１）ホスホロチオエート化部位を有するオリゴヌクレオチド（ｄ’−１）に酸を添加して３’位水酸基または３’位アミノ基の一時保護基を除去し、３’位水酸基または３’位アミノ基が保護されていないホスホロチオエート化部位を有するオリゴヌクレオチド（ｅ’−１）粗製物を得る工程、または
（３’−２）ホスフェート化部位を有するオリゴヌクレオチド（ｄ’−２）に酸を添加して３’位水酸基または３’位アミノ基の一時保護基を除去し、３’位水酸基または３’位アミノ基が保護されていないホスフェート化部位を有するオリゴヌクレオチド（ｅ’−２）粗製物を得る工程；および
（４’）：（４’−１）ホスホロチオエート化部位を有するオリゴヌクレオチド（ｅ’−１）粗製物に含まれる３’位水酸基または３’位アミノ基がアシル化されたホスホロチオエート化部位を有するオリゴヌクレオチドを加溶媒分解して脱アシル化する工程、または
（４’−２）ホスフェート化部位を有するオリゴヌクレオチド（ｅ’−２）粗製物に含まれる３’位水酸基または３’位アミノ基がアシル化されたホスフェート化部位を有するオリゴヌクレオチドを加溶媒分解して脱アシル化する工程。
【発明の効果】
【０００７】
本発明のオリゴヌクレオチドの製造方法によれば、縮合反応を完結させて縮合収率を向上させ、１塩基欠損体（Ｎ−１ｍｅｒ）などの不純物を著しく低減することができる。
【発明を実施するための形態】
【０００８】
［用語］
文中で特に断らない限り、本明細書で用いるすべての技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者に一般に理解されるのと同じ意味をもつ。本明細書に記載されたものと同様または同等の任意の方法および材料は、本発明の実施または試験において使用することができるが、好ましい方法および材料を以下に記載する。本明細書で言及したすべての刊行物および特許は、例えば、記載された発明に関連して使用されうる刊行物に記載されている、構築物および方法論を記載および開示する目的で、参照として本明細書に組み入れられる。
【０００９】
本明細書において、オリゴヌクレオチドの構成単位となる「ヌクレオシド」とは、核酸塩基が糖（例えば、２−デオキシリボース、リボース、２位炭素原子および４位炭素原子が２価の有機基により結合された２−デオキシリボースまたはリボースなど）の１位にＮ−グリコシド化により結合された化合物を意味する。
本明細書における「糖」は、水酸基がアミノ基に置き換わったアミノ糖、および２位水酸基がハロゲン原子に置き換わったリボースも包含する。
【００１０】
２位炭素原子および４位炭素原子が２価の有機基により結合された２−デオキシリボースまたはリボースとしては、例えば、以下の化合物が挙げられる。
下記式中、Ｒは水素原子、置換または無置換の炭化水素基、置換または無置換の水酸基、置換または無置換のアミノ基のいずれかを示し、Ｒ’は、水素原子、水酸基のいずれかを示す。
【００１１】
【化１】
2020166705.tif 000002
【００１２】
アミノ糖としては、例えば、以下に示すような３位水酸基がアミノ基に置き換わった２−デオキシリボース、３位水酸基がアミノ基に置き換わったリボース、および３位水酸基がアミノ基に、２位水酸基がハロゲンに置き換わったリボースが挙げられる（下記式中、Ｘｓはハロゲン原子を示す。）。
【００１３】
【化２】
2020166705.tif 000003
【００１４】
本明細書中、「リン酸基」は、−Ｏ−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）２だけでなく、酸素原子が硫黄原子またはＮＨに置き換わった基（例えば、−Ｏ−Ｐ（Ｓ）（ＯＨ）２、−ＮＨ−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）２、−ＮＨ−Ｐ（Ｓ）（ＯＨ）２）も包含する。また、リン酸基中の水酸基（−ＯＨ）が−ＯＲｐ（式中、Ｒｐは、リン酸基の保護基などの有機基を示す）に置き換わった基（例えば、保護されたリン酸基）も、「リン酸基」に包含される。
【００１５】
本明細書中、「ヌクレオチド」とは、ヌクレオシドにリン酸基が結合した化合物を意味する。３’位水酸基または５’位水酸基がリン酸基に置き換わったヌクレオチドとしては、例えば、下記式に示す化合物が挙げられる（下記式中、Ｒｍ１およびＲｍ２は、それぞれ独立して、水素原子または有機基（但し、ヌクレオシド残基を除く）を示し、Ｘｍは、水素原子、水酸基またはハロゲン原子を示し、Ｒ１およびＲ２は、水素原子またはアルキル基を示し、Ｒ１およびＲ２が結合して５または６員環を形成してよく、Ｒ３およびＲ４は、水素原子またはフェニル基を示す。）。
【００１６】
【化３】
2020166705.tif 000004
【００１７】
【化４】
2020166705.tif 000005
【００１８】
本明細書中、「オリゴヌクレオチド」とは、ヌクレオシドにヌクレオチドが１個以上連結した化合物を意味する。なお、「オリゴヌクレオチド」には、リン酸基の酸素原子が硫黄原子に置き換わったホスホロチオエート型のオリゴヌクレオチド、リン酸基の−Ｏ−が−ＮＨ−に置き換わったオリゴヌクレオチド、リン酸基中の水酸基（−ＯＨ）が−ＯＲｐ（式中、Ｒｐは有機基を示す）に置き換わったオリゴヌクレオチドも包含される。本発明におけるオリゴヌクレオチドのヌクレオシドの数は特に限定されないが、好ましくは３〜５０、より好ましくは５〜３０である。
【００１９】
本明細書中、「固相担体」とは、当該分野において核酸の固相合成に使用されるものであれば特に制限されず、例えば、ガラスビーズ、樹脂ビーズ等が挙げられる。固相担体として用いられる固相支持体または樹脂は、固相合成での使用に適した当技術分野において知られているあらゆる支持体または樹脂でありうる。本明細書中、「固相」という用語は、ヌクレオシド、ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドが慣用される機能的リンカー又はハンドル基を介して上記の固相支持体又は樹脂に結合又はリンクされることを含んでおり、本文脈で「固相」と言うときにはこのようなリンカーも含意している。固相の例は、例えば、ポリスチレン支持体（例えばｐ−メチルベンジル−ヒドリルアミンによってさらに機能化されてもよい）、又は、珪藻土封入ポリジメチルアクリルアミド（ペプシンＫ）、シリカ又は微細孔性ガラスなどの剛直な機能化支持体である。固相の樹脂マトリクスは、両親媒性のポリスチレン−ＰＥＧ樹脂又はＰＥＧ−ポリアミド又はＰＥＧ−ポリエステル樹脂によって構成されてもよい。固相担体として、例えば、Ｗａｎｇ−ＰＥＧレジンやＲｉｎｋ−アミドＰＥＧレジンが含まれる。
【００２０】
本明細書中、「３’位アミノ基」とは、ヌクレオシド、ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドの３’位の炭素原子に結合したアミノ基を意味する。
本明細書中、「５’位アミノ基」とは、ヌクレオシド、ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドの５’位の炭素原子に結合したアミノ基を意味する。
【００２１】
本明細書中、「３’位リン酸基」とは、ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドの３’位の炭素原子に結合したリン酸基を意味する。
本明細書中、「５’位リン酸基」とは、ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドの５’位の炭素原子に結合したリン酸基を意味する。
【００２２】
本明細書中、「核酸塩基」とは、核酸の合成に使用されるものであれば特に制限されず、例えば、シトシル基、ウラシル基、チミニル基等のピリミジン塩基、アデニル基、グアニル基等のプリン塩基を挙げることができる。また、「保護されていてもよい核酸塩基」とは、例えば、アミノ基を有する核酸塩基であるアデニル基、グアニル基、またはシトシル基において、アミノ基が保護されていてもよいことを意味し、核酸塩基のアミノ基が、ヌクレオチドの５’位の脱保護条件に耐え得る保護基により保護されている核酸塩基が好ましい。
【００２３】
アミノ基の保護基としては、特に限定されず、例えば、グリーンズ・プロテクティブ・グループス・イン・オーガニック・シンセシス（Ｇｒｅｅｎｅ’ｓ  ＰＲＯＴＥＣＴＩＶＥ  ＧＲＯＵＰＳ  ｉｎ  ＯＲＧＡＮＩＣ  ＳＹＮＴＨＥＳＩＳ）、第４版、ウィリー・インターサイエンス（Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ）出版（２００６年）等に記載されている保護基を挙げることができる。該保護基の具体例としては、ピバロイル基、ピバロイロキシメチル基、アセチル基、トリフルオロアセチル基、フェノキシアセチル基、４−イソプロピルフェノキシアセチル基、４−ｔｅｒｔ−ブチルフェノキシアセチル基、ベンゾイル基、イソブチリル基、（２−ヘキシル）デカノイル基、ジメチルホルムアミジニル基、１−（ジメチルアミノ）エチリデン基、９−フルオレニルメチルオキシカルボニル基を挙げることができる。これらの中でも、アセチル基、フェノキシアセチル基、４−イソプロピルフェノキシアセチル基、ベンゾイル基、イソブチリル基、（２−ヘキシル）デカノイル基、ジメチルホルムアミジニル基、および１−（ジメチルアミノ）エチリデン基が好ましい。
【００２４】
核酸塩基のカルボニル基も保護されていてもよい。例えば、フェノール、２，５−ジクロロフェノール、３−クロロフェノール、３，５−ジクロロフェノール、２−ホルミルフェノール、２−ナフトール、４−メトキシフェノール、４−クロロフェノール、２−ニトロフェノール、４−ニトロフェノール、４−アセチルアミノフェノール、ペンタフルオロフェノール、４−ピバロイロキシベンジルアルコール、４−ニトロフェネチルアルコール、２−（メチルスルホニル）エタノール、２−（フェニルスルホニル）エタノール、２−シアノエタノール、２−（トリメチルシリル）エタノール、ジメチルカルバミン酸クロライド、ジエチルカルバミン酸クロライド、エチルフェニルカルバミン酸クロライド、１−ピロリジンカルボン酸クロライド、４−モルホリンカルボン酸クロライド、ジフェニルカルバミン酸クロライド等を反応させて、核酸塩基のカルボニル基を保護することができる。ここで、カルボニル基の保護基については、特に導入しなくてもよい場合がある。
【００２５】
核酸塩基には、上記した基の他に、核酸塩基が任意の置換基（例えば、ハロゲン原子、アルキル基、アラルキル基、アルコキシ基、アシル基、アルコキシアルキル基、水酸基、アミノ基、モノアルキルアミノ、ジアルキルアミノ、カルボキシ、シアノ、ニトロ等）により任意の位置に１〜３個置換されている修飾核酸塩基（例えば、８−ブロモアデニル基、８−ブロモグアニル基、５−ブロモシトシル基、５−ヨードシトシル基、５−ブロモウラシル基、５−ヨードウラシル基、５−フルオロウラシル基、５−メチルシトシル基、８−オキソグアニル基、ヒポキサンチニル基等）も包含される。
【００２６】
本明細書中、「ハロゲン原子」とは、フッ素原子、塩素原子、臭素原子、またはヨウ素原子である。
【００２７】
本明細書中、「アルキル（基）」は、直鎖状または分岐鎖状のいずれでもよい。「アルキル（基）」としては、炭素数１以上のアルキル基が挙げられ、特に炭素数範囲の限定がない場合には、好ましくはＣ１−１０アルキル基であり、より好ましくはＣ１−６アルキル基、さらに好ましくはＣ１−５アルキル基である。炭素数範囲の限定がない場合の好適な具体例としては、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ペンチル、ヘキシル等が挙げられ、特にメチル、エチルが好ましい。
本明細書中、「Ｃａ−ｂ」とは、炭素数がａ以上ｂ以下（ａ、ｂは整数を示す）を意味する。
【００２８】
本明細書中、「アラルキル（基）」としては、Ｃ７−２０アラルキル基が挙げられ、好ましくはＣ７−１６アラルキル基（Ｃ６−１０アリール−Ｃ１−６アルキル基）である。好適な具体例としては、ベンジル、１−フェニルエチル、２−フェニルエチル、１−フェニルプロピル、ナフチルメチル、１−ナフチルエチル、１−ナフチルプロピル等が挙げられ、特にベンジルが好ましい。
【００２９】
本明細書中、「アルコキシ（基）」は、直鎖状または分岐鎖状のいずれでもよい。「アルコキシ（基）」としては、炭素数１以上のアルコキシ基が挙げられ、特に炭素数範囲の限定がない場合には、好ましくはＣ１−１０アルコキシ基であり、より好ましくはＣ１−６アルコキシ基である。炭素数範囲の限定がない場合の好適な具体例としては、メトキシ、エトキシ、プロポキシ、イソプロポキシ、ブトキシ、イソブトキシ、ｓｅｃ−ブトキシ、ｔｅｒｔ−ブトキシ、ペンチルオキシ、ヘキシルオキシ等が挙げられ、特にメトキシ、エトキシが好ましい。
【００３０】
本明細書中、「アシル（基）」は、直鎖状または分岐鎖状のいずれでもよい。「アシル（基）」としては、例えば、Ｃ１−６アルカノイル基、Ｃ７−１３アロイル基等が挙げられる。具体的には、例えば、ホルミル、アセチル、ｎ−プロピオニル、イソプロピオニル、ｎ−ブチリル、イソブチリル、ピバロイル、バレリル、ヘキサノイル、ベンゾイル、ナフトイル、レブリニル等が挙げられ、これらはそれぞれ置換されていてもよい。
【００３１】
本明細書中、「アルケニル（基）」は、直鎖状または分岐鎖状のいずれでもよい。「アルケニル（基）」としては、例えば、Ｃ２−６アルケニル基等が挙げられる。具体的には、例えば、ビニル、１−プロペニル、アリル、イソプロペニル、ブテニル、イソブテニル等が挙げられる。中でも、Ｃ２−４アルケニル基が好ましい。
【００３２】
本明細書中、「アルキニル（基）」は、直鎖状または分岐鎖状のいずれでもよい。「アルキニル（基）」としては、例えば、Ｃ２−６アルキニル基等が挙げられる。具体的には、例えば、エチニル、１−プロピニル、２−プロピニル、１−ブチニル、２−ブチニル、３−ブチニル、１−ペンチニル、２−ペンチニル、３−ペンチニル、４−ペンチニル、１−ヘキシニル、２−ヘキシニル、３−ヘキシニル、４−ヘキシニル、５−ヘキシニル等が挙げられる。中でも、Ｃ２−４アルキニル基が好ましい。
【００３３】
本明細書中、「シクロアルキル（基）」は、環状アルキル基を意味し、例えば、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチル、シクロオクチル等が挙げられる。中でも、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル等のＣ３−６シクロアルキル基が好ましく、シクロヘキシルが特に好ましい。
【００３４】
本明細書中、「アリール（基）」は、芳香族性を示す単環式あるいは多環式（縮合）の炭化水素基を意味し、具体的には、例えば、フェニル、１−ナフチル、２−ナフチル、ビフェニリル、２−アンスリル等のＣ６−１４アリール基等が挙げられる。中でもＣ６−１０アリール基がより好ましく、フェニルが特に好ましい。
【００３５】
本明細書中、「炭化水素基」としては、例えば、脂肪族炭化水素基、芳香脂肪族炭化水素基、単環式飽和炭化水素基および芳香族炭化水素基等が挙げられ、具体的には、例えば、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、シクロアルキル基、アリール基、アラルキル基等の１価基およびそれらから誘導される２価基である。
【００３６】
本明細書中、「Ｃ６−１４炭化水素環」としては、例えば、Ｃ６−１０シクロアルカン、Ｃ６−１０シクロアルケン、Ｃ６−１４芳香族炭化水素環が挙げられる。
該「Ｃ６−１０シクロアルカン」としては、例えば、シクロヘキサン、シクロヘプタン、シクロオクタンが挙げられる。
該「Ｃ６−１０シクロアルケン」としては、例えば、シクロヘキセン、シクロヘプテン、シクロオクテンが挙げられる。
該「Ｃ６−１４芳香族炭化水素環」としては、例えば、ベンゼン、ナフタレンが挙げられる。
【００３７】
本明細書中、「アルキレン（基）」は、直鎖状または分岐鎖状のいずれでもよい。「アルキレン（基）」としては、炭素数１以上のアルキレン基が挙げられ、特に炭素数範囲の限定がない場合には、好ましくはＣ１−１０アルキレン基であり、より好ましくはＣ１−６アルキレン基である。好適な具体例としては、メチレン、エチレン、プロピレン、ブチレン、ペンチレン、ヘキシレンが挙げられ、特にメチレン、エチレンが好ましい。
本明細書中、「リンカー」としては、例えば、−Ｏ−、−Ｃ（＝Ｏ）−、−Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（＝Ｏ）−、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ−、−ＮＨＣ（＝Ｏ）−、−Ｓ−、−ＳＯ−、−ＳＯ２−、−Ｓｉ（Ｒ’）（Ｒ”）Ｏ−、−Ｓｉ（Ｒ’）（Ｒ”）−（Ｒ’、Ｒ”は、それぞれ独立して、水素原子またはＣ１−２２炭化水素基を示す。）等が挙げられる。
【００３８】
本明細書中、「置換されていてもよい」における「置換基」には、前記のハロゲン原子、アルキル基、アラルキル基、アルコキシ基、アシル基、アルケニル基、アルキニル基、シクロアルキル基、アリール基の他、水酸基、ニトロ基、シアノ基、グアニジル基、カルボキシ基、アルコキシカルボニル基（アルコキシ部は前記アルコキシ基と同様）、スルホ基、ホスホ基、アルキルチオ基（アルキル部は前記アルキル基と同様）、アルキルスルフィニル基（アルキル部は前記アルキル基と同様）、アルキルスルホニル基（アルキル部は前記アルキル基と同様）、アミノ基、モノアルキルアミノ基（アルキル部は前記アルキル基と同様）、ジアルキルアミノ基（アルキル部は前記アルキル基と同様）、オキソ基などが包含される。
【００３９】
［オリゴヌクレオチドの製造方法］
本発明の製造方法は、液相法（擬似固相保護基を用いた液相法を含む）および固相法のいずれにも適用することができるが、液相法（擬似固相保護基を用いた液相法を含む）に適用するのが好ましい。
本発明の製造方法は、３’末端から５’末端への方向にオリゴヌクレオチド鎖の伸長を行う態様（以下「３’−５’合成」と略称することがある）および５’末端から３’末端への方向にオリゴヌクレオチド鎖の伸長を行う態様（以下「５’−３’合成」と略称することがある）の両方を包含する。まず、３’−５’合成である本発明の製造方法から説明する。
オリゴヌクレオチドはキラルであってもよい。
【００４０】
３’−５’合成
３’−５’合成である本発明の製造方法は、ホスホロチオエート（ＰＳ）、ホスフェート（ＰＯ）またはＨ−ホスホネート部位を有する保護オリゴヌクレオチドに酸を添加して５’位水酸基の一時保護基を除去したのち、５’位水酸基がアシル化された副生物を加溶媒分解して脱アシル化する工程を含む。
当該製造方法は、以下の工程（３）：脱保護および工程（４）：加溶媒分解によって説明される。
【００４１】
３’−５’合成である本発明の製造方法はまた、以下の工程（１）〜（４）を含む。
（１）５’位水酸基が保護されておらず、且つその他の基が核酸合成に用いられる保護基で保護されていてもよく、もしくは固相担体に結合していてもよいヌクレオシド、ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド（ａ）と、
３’位水酸基または３’位アミノ基がホスホロアミダイト法、Ｈ−ホスホネート法、ジハロホスフィン法およびオキサザホスホリジン法から選択される方法により修飾されており、５’位水酸基が酸性条件下で除去可能な一時保護基で保護され、且つその他の基が核酸合成に用いられる保護基で保護されていてもよいヌクレオシド、ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド（ｂ）と
を縮合させ、５’位水酸基が酸性条件下で除去可能な一時保護基で保護されたホスファイト体または亜リン酸ジエステル（ｃ）を得る工程；
（２）：（２−１）ホスファイト体または亜リン酸ジエステル（ｃ）に硫化剤を添加して硫化し、５’位水酸基が酸性条件下で除去可能な一時保護基で保護されたホスホロチオエート化部位を有するオリゴヌクレオチド（ｄ−１）を得る工程、または
（２−２）ホスファイト体または亜リン酸ジエステル（ｃ）に酸化剤を添加して酸化し、５’位水酸基が酸性条件下で除去可能な一時保護基で保護されたホスフェート化部位を有するオリゴヌクレオチド（ｄ−２）を得る工程；
（３）：（３−１）ホスホロチオエート化部位を有するオリゴヌクレオチド（ｄ−１）に酸を添加して５’位水酸基の一時保護基を除去し、５’位水酸基が保護されていないホスホロチオエート化部位を有するオリゴヌクレオチド（ｅ−１）粗製物を得る工程、または
（３−２）ホスフェート化部位を有するオリゴヌクレオチド（ｄ−２）に酸を添加して５’位水酸基の一時保護基を除去し、５’位水酸基が保護されていないホスフェート化部位を有するオリゴヌクレオチド（ｅ−２）粗製物を得る工程；および
（４）：（４−１）ホスホロチオエート化部位を有するオリゴヌクレオチド（ｅ−１）粗製物に含まれる５’位水酸基がアシル化されたオリゴヌクレオチドを加溶媒分解して脱アシル化する工程、または
（４−２）ホスフェート化部位を有するオリゴヌクレオチド（ｅ−２）粗製物に含まれる５’位水酸基がアシル化されたオリゴヌクレオチドを加溶媒分解して脱アシル化する工程。
【００４２】
工程（１）〜（４）のサイクルを繰り返すことによって、オリゴヌクレオチド鎖を伸長させることができる。
【００４３】
工程（１）（縮合）
本工程は、５’位水酸基が保護されておらず、且つその他の基が核酸合成に用いられる保護基で保護されていてもよく、もしくは固相担体に結合していてもよいヌクレオシド、ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド（ａ）と、３’位水酸基または３’位アミノ基がホスホロアミダイト法、Ｈ−ホスホネート法、ジハロホスフィン法およびオキサザホスホリジン法から選択される方法により修飾されており、５’位水酸基が酸性条件下で除去可能な一時保護基で保護され、且つその他の基が核酸合成に用いられる保護基で保護されていてもよいヌクレオシド、ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド（ｂ）とを縮合させ、５’位水酸基が酸性条件下で除去可能な一時保護基で保護されたホスファイト体または亜リン酸ジエステル（ｃ）を得る工程である。
【００４４】
本発明の製造方法が固相法である場合、ヌクレオシド、ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド（ａ）は、例えば、その３’位が当該分野において通常使用されるリンカーを介して固相担体に結合している。
【００４５】
本工程の好ましい態様では、
５’位水酸基が保護されておらず、核酸塩基のアミノ基およびイミノ基、リボース残基の２’位水酸基、３’位水酸基および３’位アミノ基、並びにデオキシリボース残基の３’位水酸基および３’位アミノ基から選ばれる少なくとも一つの基が、酸性条件下では除去されず、塩基性条件下で除去可能な保護基で保護され、且つその他の基がさらに核酸合成に用いられる保護基で保護されていてもよいヌクレオシド、ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド（ａ）、或いは
５’位水酸基が保護されておらず、３’位末端のリン酸基の一つのＯＨが−ＯＬｎ１−ＯＨ（式中、Ｌｎ１は有機基を示す。）に置き換わっており、−ＯＬｎ１−ＯＨの水酸基が酸性条件下では除去されず、塩基性条件下で除去可能な保護基で保護され、且つその他の基がさらに核酸合成に用いられる保護基で保護されていてもよいヌクレオシド、ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド（ａ１）と、
３’位水酸基または３’位アミノ基がホスホロアミダイト法、Ｈ−ホスホネート法、ジハロホスフィン法およびオキサザホスホリジン法から選択される方法により修飾されており、５’位水酸基が酸性条件下で除去可能な一時保護基で保護され、且つその他の基がさらに、酸性条件下では除去されず、塩基性条件下で除去可能な保護基および核酸合成に用いられる保護基から選ばれる保護基で保護されていてもよいヌクレオシド、ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド（ｂ）と
が使用される。
ヌクレオシド、ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド（ａ）は、２’位がハロゲン化（例、フッ素化）されていてもよい。
【００４６】
Ｌｎ１の有機基とは、炭化水素基、または炭化水素基中の炭素原子がヘテロ原子で置き換わった基を意味する。ヘテロ原子としては、例えば、酸素原子、窒素原子、硫黄原子等が挙げられる。また、有機基は、水酸基、アミノ基、オキソ基（＝Ｏ）等の置換基を有していてもよい。有機基が有し得る水酸基およびアミノ基は、保護基で保護されていることが好ましい。有機基の形状は、鎖状（直鎖状または分岐鎖状）、環状またはこれらの組合せのいずれでもよい。
【００４７】
有機基は、細胞に対して機能性を有する基を有していてもよい。細胞に対して機能性を有する基は、有機基の主鎖または側鎖の末端に結合していることが好ましい。細胞に対して機能性を有する基としては、例えば、「化合物の脂溶性を向上させることによって、化合物の細胞膜透過性を向上させる基」、「細胞膜受容体を介して細胞内への化合物の取込みを向上させる基」等が挙げられる。「化合物の脂溶性を向上させることによって、化合物の細胞膜透過性を向上させる基」としては、例えば、コレステロール残基、トコフェロール残基等が挙げられる。「細胞膜受容体を介して細胞内への化合物の取込みを向上させる基」としては、例えば、Ｎ−アセチルガラクトサミン残基等が挙げられる。これら細胞に対して機能性を有する基は、ＷＯ２０１７／１０４８３６号公報に記載されている。
【００４８】
−ＯＬｎ１−ＯＨの具体例としては、以下のものが挙げられる（下記式中の＊は、リン原子との結合位置を示し、Ａｃはアセチル基を示す。）。
【００４９】
【化５】
2020166705.tif 000006
【００５０】
Ｌｎ１は、好ましくはＣ２−６アルキレン基、より好ましくはエチレン基である。
【００５１】
本工程のより好ましい態様では、
５’位水酸基が保護されておらず、核酸塩基のアミノ基およびイミノ基、リボース残基の２’位水酸基および３’位水酸基、並びにデオキシリボース残基の３’位水酸基から選ばれる少なくとも一つの基が、酸性条件下では除去されず、塩基性条件下で除去可能な保護基で保護され、且つその他の基がさらに核酸合成に用いられる保護基で保護されていてもよいヌクレオシドまたはオリゴヌクレオチド（ａ）、および
３’位水酸基がホスホロアミダイト法、Ｈ−ホスホネート法、ジハロホスフィン法およびオキサザホスホリジン法から選択される方法により修飾されており、５’位水酸基が酸性条件下で除去可能な一時保護基で保護され、且つその他の基がさらに核酸合成に用いられる保護基で保護されていてもよいヌクレオシドまたはオリゴヌクレオチド（ｂ）
が使用される。
【００５２】
液相法の場合、本工程で使用するヌクレオシド、ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド（ａ）或いはヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド（ａ１）の溶液中の濃度は、それらが溶媒に溶解していれば特に限定されないが、好ましくは１〜３０重量％である。
【００５３】
ヌクレオシド、ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド（ａ）、ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド（ａ１）およびヌクレオシド、ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド（ｂ）のアミノ基は、上述の保護基で保護されていることが好ましい。該保護基としては、セチル基、フェノキシアセチル基、４−イソプロピルフェノキシアセチル基、ベンゾイル基、イソブチリル基、（２−ヘキシル）デカノイル基、ジメチルホルムアミジニル基、および１−（ジメチルアミノ）エチリデン基が好ましい。ヌクレオシド、ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド（ａ）およびヌクレオシド、ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド（ｂ）が複数のアミノ基を有する場合、アミノ基の保護基は１種のみでもよく、２種以上でもよい。
【００５４】
ヌクレオシド、ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド（ａ）は、核酸塩基のアミノ基およびイミノ基、リボース残基の２’位水酸基、３’位水酸基および３’位アミノ基、並びにデオキシリボース残基の３’位水酸基および３’位アミノ基から選ばれる少なくとも一つの基が、酸性条件下では除去されず、塩基性条件下で除去可能な保護基で保護されている。ヌクレオシド、ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド（ａ）は、核酸塩基のアミノ基およびイミノ基、リボース残基の３’位水酸基、並びにデオキシリボース残基の３’位水酸基から選ばれる少なくとも一つの基が、前記保護基で保護されていることが好ましく、リボース残基の３’位水酸基またはデオキシリボース残基の３’位水酸基が、前記保護基で保護されていることがより好ましい。
【００５５】
ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド（ａ１）は、−ＯＬｎ１−ＯＨの水酸基が酸性条件下では除去されず、塩基性条件下で除去可能な保護基で保護されている。
【００５６】
ヌクレオシド、ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド（ａ）およびヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド（ａ１）が有する「酸性条件下では除去されず、塩基性条件下で除去可能な保護基」、並びにヌクレオシド、ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド（ｂ）が有していてもよい「酸性条件下では除去されず、塩基性条件下で除去可能な保護基」は、それぞれ独立して、固液分離または抽出を効率的に行うために、炭素数１０以上の直鎖状の脂肪族炭化水素基を有するか、または分岐鎖を１以上有する脂肪族炭化水素基を少なくとも一つ有し、且つ総炭素数が１４以上３００以下である有機基を有する保護基（以下「擬似固相保護基」と略称することがある）であることが好ましい。
【００５７】
擬似固相保護基は、ヌクレオシド、ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド（ａ）およびヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド（ａ１）（場合によりヌクレオシド、ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド（ｂ））に疎水性を付与して、非極性溶媒に対する溶解性を向上させる。また極性溶媒に対する溶解性を低下させることもできる。このような擬似固相保護基で保護されたヌクレオシド、ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド（ａ）およびヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド（ａ１）は、非極性溶媒の液相中で縮合反応を行うことができ、その後の固液分離または抽出で反応液に極性溶媒を添加することによって、擬似固相保護基で保護されたオリゴヌクレオチド（ｅ）が沈殿し、その固液分離を行うことができる。または固液分離または抽出で反応液に極性溶媒を添加して、極性溶媒−非極性溶媒間で分層させ、非極性溶媒にオリゴヌクレオチド（ｅ）を移行させることにより、その抽出を行うことができる。このような擬似固相保護基としては、例えば、国際公開第２０１２／１５７７２３号公報、国際公開第２０１３／１２２２３６号、国際公開第２０１７／１０４８３６号、国際公開第２０１３／１７９４１２号、国際公開第２０１４／０７７２９２号、国際公開第２０１７／０８６３９７号、国際公開第２０１８／２０３５７４号、国際公開第２０１８／２１２２３６号に記載されているものを使用することができる。
【００５８】
「核酸合成に用いられる保護基」は、核酸合成の分野で通常使用されるものであれば特に制限されず、上記の低分子量の保護基も含まれるが、固液分離による精製を行う場合、擬似固相保護基は、炭素数１０以上の直鎖状の脂肪族炭化水素基を有する保護基であることが好ましく、抽出による精製を行う場合、擬似固相保護基は、分岐鎖を１以上有する脂肪族炭化水素基を少なくとも一つ有し、且つ総炭素数が１４以上３００以下である有機基を有する保護基であることが好ましい。
【００５９】
まず、固液分離のために好適な擬似固相保護基について説明する。固液分離のために好適な擬似固相保護基としては、例えば、炭素数１０以上の直鎖状の脂肪族炭化水素基が単結合またはリンカーを介して結合した炭化水素基がリンカーを介して結合したＣ６−１４炭化水素環を有する保護基が挙げられる。
【００６０】
前記炭素数１０以上の直鎖状の脂肪族炭化水素基は、好ましくは直鎖状のＣ１０−４０アルキル基および直鎖状のＣ１０−４０アルケニル基から選ばれる基であり、より好ましくは直鎖状のＣ１０−４０アルキル基であり、さらに好ましくは直鎖状のＣ１０−３０アルキル基であり、特に好ましくは直鎖状のＣ１２−２８アルキル基であり、最も好ましくは直鎖状のＣ１４−２６アルキル基である。
【００６１】
前記リンカーは、好ましくは−Ｏ−、−Ｃ（＝Ｏ）−、−Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（＝Ｏ）−、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ−、−ＮＨＣ（＝Ｏ）−、−Ｓ−、−ＳＯ−、−ＳＯ２−、および−Ｓｉ（Ｒ’）（Ｒ”）Ｏ−、−Ｓｉ（Ｒ’）（Ｒ”）−（Ｒ’、Ｒ”は、それぞれ独立して、水素原子またはＣ１−２２炭化水素基を示す。）から選ばれ、より好ましくは−Ｏ−、−Ｃ（＝Ｏ）−、−Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（＝Ｏ）−、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ−および−ＮＨＣ（＝Ｏ）−から選ばれ、さらに好ましくは−Ｏ−である。
【００６２】
前記Ｃ６−１４炭化水素環は、好ましくはベンゼン環、ナフタレン環およびシクロヘキサン環から選ばれ、より好ましくはベンゼン環およびシクロヘキサン環から選ばれ、さらに好ましくはベンゼン環である。
【００６３】
固液分離のために好適な擬似固相保護基は、好ましくは、直鎖状のＣ１０−４０アルキル基が単結合または−Ｏ−を介して結合した炭化水素基が−Ｏ−を介して結合したベンゼン環を有する保護基である。
【００６４】
次に、抽出のために好適な擬似固相保護基について説明する。「分岐鎖を１以上有する脂肪族炭化水素基を少なくとも一つ有し、且つ総炭素数が１４以上３００以下である有機基」における「分岐鎖」としては、直鎖状または分岐鎖状の飽和脂肪族炭化水素基であり、Ｃ１−６アルキル基が好ましく、Ｃ１−４アルキル基がより好ましく、メチル基またはエチル基が一層好ましい。また、該「分岐鎖」は、１個以上のハロゲン原子で置換されていてもよい。
【００６５】
「分岐鎖を１以上有する脂肪族炭化水素基を少なくとも一つ有し、且つ総炭素数が１４以上３００以下である有機基」における「脂肪族炭化水素基」とは、直鎖状の飽和または不飽和の脂肪族炭化水素基であり、Ｃ２-３００アルキル基（好ましくは、Ｃ３-１００アルキル基、より好ましくは、Ｃ３-６０アルキル基）、Ｃ２-３００アルケニル基（好ましくは、Ｃ３-１００アルケニル基、より好ましくは、Ｃ３-６０アルケニル基）またはＣ２-３００アルキニル基（好ましくは、Ｃ３-１００アルキニル基、より好ましくは、Ｃ３-６０アルキニル基）である。
【００６６】
「分岐鎖を１以上有する脂肪族炭化水素基を少なくとも一つ有し、且つ総炭素数が１４以上３００以下である有機基」における「分岐鎖を１以上有する脂肪族炭化水素基」の部位は、特に限定されず、末端に存在しても（１価基）、それ以外の部位に存在してもよい（例えば２価基）。
【００６７】
「分岐鎖を１以上有する脂肪族炭化水素基」としては、例えば、プロピル基、ブチル基、ペンチル基、ヘキシル基、ヘプチル基、オクチル基、ノニル基、デシル基、ウンデシル基、ドデシル基（ラウリル基）、トリデシル基、ミリスチル基、セチル基、ステアリル基、アラキル基、ベヘニル基、オレイル基、リノリル基、リグノセリル基等の分岐異性体であって、１以上の分岐鎖を有する１価基およびそれらから誘導される２価基が挙げられる。「分岐鎖を１以上有する脂肪族炭化水素基」は、好ましくは、３，７，１１−トリメチルドデシル基、３，７，１１，１５−テトラメチルヘキサデシル基（以下、２，３−ジヒドロフィチル基ということもある。）、２，２，４，８，１０，１０−ヘキサメチルウンデカン−５−イル基等である。
【００６８】
「分岐鎖を１以上有する脂肪族炭化水素基を少なくとも一つ有し、且つ総炭素数が１４以上３００以下である有機基」中に「分岐鎖を１以上有する脂肪族炭化水素基」が複数存在する場合には、その各々は同一のものであっても、異なるものであってもよい。
【００６９】
「分岐鎖を１以上有する脂肪族炭化水素基を少なくとも一つ有し、且つ総炭素数が１４以上３００以下である有機基」中の「分岐鎖を１以上有する脂肪族炭化水素基」以外の部位は任意に設定することができる。例えば−Ｏ−、−Ｓ−、−ＣＯ−、−ＮＨ−、−ＣＯＯ−、−ＯＣＯＮＨ−、−ＣＯＮＨ−、−ＮＨＣＯ−、炭化水素基（１価基または２価基）等の部位を有していてもよい。「炭化水素基」としては、例えば、脂肪族炭化水素基、芳香脂肪族炭化水素基、単環式飽和炭化水素基および芳香族炭化水素基等が挙げられ、具体的には、例えば、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、シクロアルキル基、アリール基、アラルキル基等の１価基およびそれらから誘導される２価基が用いられる。「アルキル基」としては、Ｃ１−６アルキル基が好ましく、例えば、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ペンチル、ヘキシル等が挙げられる。「アルケニル基」としては、Ｃ２−６アルケニル基が好ましく、例えば、ビニル、１−プロペニル、アリル、イソプロペニル、ブテニル、イソブテニル等が挙げられる。「アルキニル基」としては、Ｃ２−６アルキニル基が好ましく、例えば、エチニル、プロパルギル、１−プロピニル等が挙げられる。「シクロアルキル基」としては、Ｃ３−６シクロアルキル基が好ましく、例えば、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシルが挙げられる。「アリール基」は、Ｃ６−１４アリール基が好ましく、例えば、フェニル、１−ナフチル、２−ナフチル、ビフェニリル、２−アンスリル等が挙げられる。中でもＣ６−１０アリール基がより好ましく、フェニルが特に好ましい。「アラルキル基」としては、Ｃ７−２０アラルキル基が好ましく、例えば、ベンジル、１−フェニルエチル、２−フェニルエチル、１−フェニルプロピル、ナフチルメチル、１−ナフチルエチル、１−ナフチルプロピル等が挙げられる。中でも、Ｃ７−１６アラルキル基（Ｃ６−１０アリール−Ｃ１−６アルキル基）がより好ましく、ベンジルが特に好ましい。該「炭化水素基」は、ハロゲン原子（塩素原子、臭素原子、フッ素原子、ヨウ素原子）、オキソ基等から選択される置換基で置換されていてもよい。
【００７０】
「分岐鎖を１以上有する脂肪族炭化水素基を少なくとも一つ有し、且つ総炭素数が１４以上３００以下である有機基」における「総炭素数」は、１４以上、好ましくは１６以上、より好ましくは１８以上であり、３００以下、好ましくは２００以下、より好ましくは１６０以下である。また、「分岐鎖を１以上有する脂肪族炭化水素基を少なくとも一つ有し、且つ総炭素数が１４以上３００以下である有機基」における分岐鎖の数は特に制限されないが、２以上が好ましく、３以上がより好ましく、４以上がより一層好ましく、８以上がさらに好ましく、１０以上がさらに一層好ましい。この分岐鎖の数が多いほど、オリゴヌクレオチド鎖が長鎖になった場合でも、分岐鎖を１以上有する脂肪族炭化水素基を少なくとも一つ有し、且つ総炭素数が１４以上３００以下である有機基を有する擬似固相保護基で保護されたヌクレオシドまたはオリゴヌクレオチドは、有機溶媒（特に、非極性溶媒）に対して良好に溶解する。
【００７１】
「分岐鎖を１以上有する脂肪族炭化水素基を少なくとも一つ有し、且つ総炭素数が１４以上３００以下である有機基」としては、式（Ａ）：
【００７２】
【化６】
2020166705.tif 000007
【００７３】
［式中、
＊は、隣接原子との結合位置を示し；
Ｒ１４およびＲ１５は、それぞれ独立して、水素原子またはＣ１−４アルキル基を示し；および
Ｘ１は、単結合またはＣ１−４アルキレン基を示す。
但し、Ｒ１４およびＲ１５が共に水素原子であることはない。］
で表される同一または異なる２価の基を有する基が好ましい。
【００７４】
式（Ａ）で表される２価の基を有する基としては、例えば、下記式（Ｂ）〜（Ｄ）のいずれかで表される基が挙げられる。なお、式（Ｂ）〜（Ｄ）における各記号の定義中の炭素数、繰り返し単位の数（ｍ１、ｎ０〜ｎ２）等は便宜上示されたものであって、総炭素数が１４以上（好ましくは１６以上、より好ましくは１８以上）、３００以下（好ましくは２００以下、より好ましくは１６０以下）になるよう上記した定義の範囲内で適宜変更することができる。以下、式（Ｂ）〜（Ｄ）について、順に説明する。
【００７５】
式（Ｂ）は、以下の通りである。
【００７６】
【化７】
2020166705.tif 000008
【００７７】
［式中、
＊は、隣接原子との結合位置を示し；
Ｒ１６およびＲ１７は、水素原子を示すか、または一緒になって＝Ｏを示し；
ｎ０は、２〜４０の整数を示し；
ｎ０個のＲ１８およびＲ１９は、それぞれ独立して、水素原子またはＣ１−４アルキル基を示し；
ｎ０個のＸ２は、それぞれ独立して、単結合またはＣ１−４アルキレン基を示し；
Ｒ２０は、水素原子またはＣ１−４アルキル基を示し；および
Ｒ２１は、Ｃ１−４アルキル基を示す。
但し、Ｒ１８およびＲ１９が共に水素原子であることはなく、且つｎ０が２の場合には、Ｒ２０はＣ１−４アルキル基を示す。］
【００７８】
式（Ｂ）の基としては、
Ｒ１６およびＲ１７は、共に水素原子であり；
ｎ０は、２〜４０の整数であり；
ｎ０個のＲ１８およびＲ１９は、それぞれ独立して、水素原子、メチル基またはエチル基であり；
ｎ０個のＸ２は、それぞれ独立して、単結合、メチレン基またはエチレン基であり；および
Ｒ２０は、水素原子、メチル基またはエチル基である；
基（但し、Ｒ１８およびＲ１９が共に水素原子であることはなく、且つｎ０が２の場合には、Ｒ２０はメチルまたはエチル基を示す。）が好ましい。
【００７９】
より好適な式（Ｂ）の基は、ミリスチル基、セチル基、ステアリル基、アラキル基、ベヘニル基等の炭素数１４〜１６０の分岐異性体であり、中でも２，３−ジヒドロフィチル基、３，７，１１−トリメチルドデシル基、２，２，４，８，１０，１０−ヘキサメチル−５−ドデカノイル基が特に好ましい。
【００８０】
式（Ｃ）は、以下の通りである。
【００８１】
【化８】
2020166705.tif 000009
【００８２】
［式中、
＊は、隣接原子との結合位置を示し；
ｍ１個のＯＲ２２は、それぞれ独立して、式（Ｂ）で表される基により置換された水酸基を示し；および
ｍ１は、１〜３の整数を示す。］
なお、式（Ｃ）中の「式（Ｂ）で表される基」は、その＊がＯ（即ち、隣接原子）との結合位置を示すこと以外は上述した通りである。
【００８３】
式（Ｃ）の基において、Ｒ２２は、ミリスチル基、セチル基、ステアリル基、アラキル基、ベヘニル基等の炭素数１４〜３０の分岐異性体である基がより好ましく、中でも２，３−ジヒドロフィチル基、３，７，１１−トリメチルドデシル基が特に好ましい。
【００８４】
式（Ｄ）は、以下の通りである。
【００８５】
【化９】
2020166705.tif 000010
【００８６】
［式中、
＊は、Ｑとの結合位置を示し；
ｎ１は、１〜１０の整数を示し；
ｎ２は、１〜１０の整数を示し；
ｎ１個のＲ２６およびＲ２７は、それぞれ独立して、水素原子またはＣ１−４アルキル基を示し；
ｎ１個のＸ３は、それぞれ独立して、単結合またはＣ１−４アルキレン基を示し；
ｎ２個のＲ２８およびＲ２９は、それぞれ独立して、水素原子またはＣ１−４アルキル基を示し；
ｎ２個のＸ５は、それぞれ独立して、単結合またはＣ１−４アルキレン基を示し；
Ｘ４は、単結合またはＣ１−４アルキレン基を示し；および
Ｒ２３、Ｒ２４、Ｒ２５、Ｒ３０、Ｒ３１およびＲ３２は、それぞれ独立して、水素原子またはＣ１−４アルキル基を示す。
但し、Ｒ２６およびＲ２７、および／またはＲ２８およびＲ２９が共に水素原子であることはなく、且つｎ１＋ｎ２が２の場合には、Ｒ２３、Ｒ２４およびＲ２５の２個以上がそれぞれ独立して、Ｃ１−４アルキル基を示すか、またはＲ３０、Ｒ３１およびＲ３２の２個以上がそれぞれ独立して、Ｃ１−４アルキル基を示す。］
【００８７】
式（Ｄ）の基としては、
ｎ１は、１〜５の整数であり；
ｎ２は、１〜５の整数であり；
ｎ１個のＲ２６およびＲ２７は、それぞれ独立して、水素原子、メチル基またはエチル基であり；
ｎ１個のＸ３は、それぞれ独立して、単結合、メチレン基またはエチレン基であり；
ｎ２個のＲ２８およびＲ２９は、それぞれ独立して、水素原子、メチル基またはエチル基であり；
ｎ２個のＸ５は、それぞれ独立して、単結合、メチレン基またはエチレン基であり；
Ｘ４は、単結合、メチレン基またはエチレン基であり；および
Ｒ２３、Ｒ２４、Ｒ２５、Ｒ３０、Ｒ３１およびＲ３２は、それぞれ独立して、水素原子またはＣ１−４アルキル基である；
基（但し、Ｒ２６およびＲ２７、および／またはＲ２８およびＲ２９が共に水素原子であることはなく、且つｎ１＋ｎ２が２の場合には、Ｒ２３、Ｒ２４およびＲ２５の２個以上がそれぞれ独立して、Ｃ１−４アルキル基を示すか、またはＲ３０、Ｒ３１およびＲ３２の２個以上がそれぞれ独立して、Ｃ１−４アルキル基を示す。）がより好ましい。
【００８８】
特に好適な式（Ｄ）の基としては、
ｎ１は、１〜５の整数であり；
ｎ２は、１〜５の整数であり；
ｎ１個のＲ２６およびＲ２７は、それぞれ独立して、水素原子またはメチル基であり；
ｎ１個のＸ３は、それぞれ独立して、単結合またはメチレン基であり；
ｎ２個のＲ２８およびＲ２９は、それぞれ独立して、水素原子またはメチル基であり；
ｎ２個のＸ５は、それぞれ独立して、単結合またはメチレン基であり；
Ｘ４は、単結合またはメチレン基であり；および
Ｒ２３、Ｒ２４、Ｒ２５、Ｒ３０、Ｒ３１およびＲ３２は、メチル基である；
基（但し、Ｒ２６およびＲ２７、および／またはＲ２８およびＲ２９が、共に水素原子であることはない）が挙げられる。
【００８９】
「分岐鎖を１以上有する脂肪族炭化水素基を少なくとも一つ有し、且つ総炭素数が１４以上３００以下である有機基」の具体例として、以下の基が挙げられる。各基中の＊は結合位置を示し；式中のｎ３は、３以上の整数を示し；ｎ４は、該基の総炭素数が１４以上３００以下になるように適宜設定され得る。
【００９０】
【化１０】
2020166705.tif 000011
【００９１】
「分岐鎖を１以上有する脂肪族炭化水素基を少なくとも一つ有し、且つ総炭素数が１４以上３００以下である有機基」の好ましい具体例として、以下の基が挙げられる：
３，７，１１，１５−テトラメチルヘキサデシル基（別名：２，３−ジヒドロフィチル基）；
３，７，１１−トリメチルドデシル基；
２，２，４，８，１０，１０−ヘキサメチル−５−ドデカノイル基；
３，４，５−トリ（３’，７’，１１’，１５’−テトラメチルヘキサデシルオキシ）ベンジル基；および
３，５−ジ（３’，７’，１１’，１５’−テトラメチルヘキサデシルオキシ）ベンジル基。
【００９２】
擬似固相保護基は、より好ましくは、下記式（ｇ−Ｉ）で表される基（以下「擬似固相保護基（ｇ−Ｉ）」と略称することがある。）である。
＊＊Ｌ−Ｙ−Ｚ      （ｇ−Ｉ）
［式中、
＊＊は保護される基との結合位置を示し；
Ｌは、単結合、または式（ａ１）若しくは（ａ１’）：
【００９３】
【化１１】
2020166705.tif 000012
【００９４】
（式中、
＊は、Ｙとの結合位置を示し；
＊＊は前記と同義であり；
Ｒ１およびＲ２は、それぞれ独立して、Ｃ１−２２炭化水素基を示し；
Ｌ１は、置換されていてもよい２価のＣ１−２２炭化水素基を示し；
Ｌ２は、単結合を示すか、または***Ｃ（＝Ｏ）Ｎ（Ｒ３）−Ｒ４−Ｎ（Ｒ５）****（式中、***は、Ｌ１との結合位置を示し、****は、Ｃ＝Ｏとの結合位置を示し、Ｒ４は、Ｃ１−２２アルキレン基を示し、Ｒ３およびＲ５は、それぞれ独立して、水素原子若しくはＣ１−２２アルキル基を示すか、またはＲ３およびＲ５が一緒になって、環を形成していてもよい。）で表される基を示す。）で表される基を示し；
Ｙは、単結合、酸素原子、またはＮＲ（Ｒは、水素原子、アルキル基またはアラルキル基を示す。）を示し；および
Ｚは、式（ａ２）、式（ａ２’）または式（ａ２”）：
【００９５】
【化１２】
2020166705.tif 000013
【００９６】
［式中、
＊は、結合位置を示し；
Ｒ６は、水素原子であるか、あるいはＲｂが、下記式（ａ３）で表される基である場合には、環Ａまたは環ＢのＲ６は、Ｒ８と一緒になって単結合または−Ｏ−を示して、環Ａまたは環Ｂおよび環Ｃと共に縮合環を形成していてもよく；
ｋは、１〜４の整数を示し；
ｋ個のＱは、それぞれ独立して、−Ｏ−、−Ｃ（＝Ｏ）−、−Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（＝Ｏ）−、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ−または−ＮＨＣ（＝Ｏ）−を示し；
ｋ個のＲ７は、それぞれ独立して、炭素数１０以上の直鎖状の脂肪族炭化水素基が単結合またはリンカーを介して結合した炭化水素基を示すか、または分岐鎖を１以上有する脂肪族炭化水素基を少なくとも一つ有し、且つ総炭素数が１４以上３００以下である有機基を示し；
環Ａおよび環Ｂは、それぞれ独立して、ｋ個のＱＲ７に加えて、さらにハロゲン原子、ハロゲン原子で置換されていてもよいＣ１−６アルキル基、およびハロゲン原子で置換されていてもよいＣ１−６アルコキシ基からなる群から選択される置換基を有していてもよく；
Ｒａは、水素原子を示し；および
Ｒｂは、水素原子、または式（ａ３）：
【００９７】
【化１３】
2020166705.tif 000014
【００９８】
（式中、
＊は、結合位置を示し；
ｊは、０〜４の整数を示し；
ｊ個のＱは、それぞれ独立して、前記と同義であり；
ｊ個のＲ９は、それぞれ独立して、炭素数１０以上の直鎖状の脂肪族炭化水素基が単結合またはリンカーを介して結合した炭化水素基を示すか、または分岐鎖を１以上有する脂肪族炭化水素基を少なくとも一つ有し、且つ総炭素数が１４以上３００以下である有機基を示し；
Ｒ８は、水素原子を示すか、または環Ａまたは環ＢのＲ６と一緒になって単結合または−Ｏ−を示して、環Ａまたは環Ｂおよび環Ｃと共に縮合環を形成していてもよく；および
環Ｃは、ｊ個のＱＲ９に加えて、さらにハロゲン原子、ハロゲン原子で置換されていてもよいＣ１−６アルキル基、およびハロゲン原子で置換されていてもよいＣ１−６アルコキシ基からなる群から選択される置換基を有していてもよい。）で表される基を示すか、或いは
ＲａおよびＲｂが、一緒になってオキソ基を形成する。］で表される基を示す。］
【００９９】
式（ａ２）、式（ａ２’）および式（ａ２”）中のＲ７、並びに式（ａ３）中のＲ９が有する炭素数１０以上の直鎖状の脂肪族炭化水素基は、それぞれ独立して、好ましくは直鎖状のＣ１０−４０アルキル基および直鎖状のＣ１０−４０アルケニル基から選ばれる基であり、より好ましくは直鎖状のＣ１０−４０アルキル基であり、さらに好ましくは直鎖状のＣ１０−３０アルキル基であり、特に好ましくは直鎖状のＣ１２−２８アルキル基であり、最も好ましくは直鎖状のＣ１４−２６アルキル基である。
式（ａ２）、式（ａ２’）および式（ａ２”）中のＲ７、並びに式（ａ３）中のＲ９が有するリンカーは、それぞれ独立して、好ましくは−Ｏ−、−Ｃ（＝Ｏ）−、−Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（＝Ｏ）−、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ−または−ＮＨＣ（＝Ｏ）−であり、より好ましくは−Ｏ−である。
【０１００】
式（ａ２）、式（ａ２’）および式（ａ２”）中のＲ７、並びに式（ａ３）中のＲ９の「炭素数１０以上の直鎖状の脂肪族炭化水素基が単結合またはリンカーを介して結合した炭化水素基」は、好ましくは、直鎖状のＣ１０−４０アルキル基、１〜３個の直鎖状のＣ１０−４０アルキル基が−Ｏ−を介して結合したベンジル基、または１〜３個の直鎖状のＣ１０−４０アルキル基が−Ｏ−を介して結合したシクロヘキシルメチル基である。
【０１０１】
式（ａ２）、式（ａ２’）および式（ａ２”）中のＲ７、並びに式（ａ３）中のＲ９の一態様である「分岐鎖を１以上有する脂肪族炭化水素基を少なくとも一つ有し、且つ総炭素数が１４以上３００以下である有機基」は、それぞれ独立して、好ましくは上記式（Ａ）で表される２価の基を有する基であり、より好ましくは上記式（Ｂ）〜（Ｄ）のいずれかで表される基であり、さらに好ましくは上記式（Ｂ）で表される基であり、特に好ましくは２，３−ジヒドロフィチル基、３，７，１１−トリメチルドデシル基、または２，２，４，８，１０，１０−ヘキサメチル−５−ドデカノイル基である。
【０１０２】
式（ａ２）、式（ａ２’）、式（ａ２”）および式（ａ３）中のＱは、好ましくは−Ｏ−、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ−または−ＮＨＣ（＝Ｏ）−であり、より好ましくは−Ｏ−である。
【０１０３】
式（ｇ−Ｉ）において、式（ａ１）で表されるＬの好ましい態様は、
Ｌ１が、２価のＣ１−２２炭化水素基、またはＣＨ２−Ｏ−１，４−フェニレン−Ｏ−ＣＨ２であり；および
Ｌ２が、単結合であるか、または***Ｃ（＝Ｏ）Ｎ（Ｒ３）−Ｒ４−Ｎ（Ｒ５）****（式中、***は、Ｌ１との結合位置を示し、****は、Ｃ＝Ｏとの結合位置を示し、Ｒ４は、Ｃ１−６アルキレン基を示し、Ｒ３およびＲ５は、それぞれ独立して水素原子、若しくは置換されていてもよいＣ１−６アルキル基を示すか、またはＲ３およびＲ５が一緒になって、置換されていてもよいＣ１−６アルキレン基を形成していてもよい。）で表される基である；
基である。
【０１０４】
式（ａ１）で表されるＬの別の好ましい態様は、
Ｌ１が、２価のＣ１−２２炭化水素基であり；および
Ｌ２が単結合である；
基である。
【０１０５】
式（ａ１）で表されるＬの別の好ましい態様は、
Ｌ１が、エチレン基であり；および
Ｌ２が、***Ｃ（＝Ｏ）Ｎ（Ｒ３）−Ｒ４−Ｎ（Ｒ５）****（式中、***は、Ｌ１との結合位置を示し、****は、Ｃ＝Ｏとの結合位置を示し、Ｒ４は、Ｃ１−２２アルキレン基を示し、Ｒ３およびＲ５は、それぞれ独立して、水素原子若しくはＣ１−２２アルキル基を示すか、またはＲ３およびＲ５が一緒になって、環を形成していてもよい。）で表される基を示す。）で表される基である；
基である。
【０１０６】
式（ａ１）で表されるＬの別の好ましい態様は、
Ｌ１が、エチレン基であり；および
Ｌ２が、***Ｃ（＝Ｏ）Ｎ（Ｒ３）−Ｒ４−Ｎ（Ｒ５）****（式中、***は、Ｌ１との結合位置を示し、****は、Ｃ＝Ｏとの結合位置を示し、Ｎ（Ｒ３）−Ｒ４−Ｎ（Ｒ５）部分が、１，４−ピペラジンジイル基を形成する。）で表される基である；
基である。
【０１０７】
式（ａ１）で表されるＬの別の好ましい態様は、
Ｌ１が、エチレン基であり；および
Ｌ２が、***Ｃ（＝Ｏ）Ｎ（Ｒ３）−Ｒ４−Ｎ（Ｒ５）****（式中、***は、Ｌ１との結合位置を示し、****は、Ｃ＝Ｏとの結合位置を示し、Ｒ４は、ペンチレン基、またはヘキシレン基を示し、Ｒ３およびＲ５は、それぞれ独立して、水素原子またはメチル基を示す。）で表される基である；
基である。
【０１０８】
式（ａ１）で表されるＬの特に好ましい態様は、入手が容易で安価なスクシニル基である。
【０１０９】
次に、式（ｇ−Ｉ）において式（ａ１’）で表されるＬについて説明する。
式（ａ１’）中のＬ１は、好ましくは２価のＣ６−１０芳香族炭化水素基であり、より好ましくはフェニレン基である。
式（ａ１’）中のＬ２は、好ましくは単結合である。
式（ａ１’）中のＬ１およびＬ２の好ましい組合せとしては、Ｌ１が２価のＣ６−１０芳香族炭化水素基であり、Ｌ２が単結合である、組合せである。式（ａ１’）中のＬ１およびＬ２のより好ましい組合せとしては、Ｌ１がフェニレン基であり、Ｌ２が単結合である、組合せである。
式（ａ１’）中のＲ１およびＲ２は、それぞれ独立して、好ましくはＣ１−２２アルキル基であり、より好ましくはＣ１−１０アルキル基である。
【０１１０】
式（ａ１’）で表されるＬの好ましい態様は、
Ｒ１およびＲ２が、それぞれ独立して、Ｃ１−２２アルキル基であり；
Ｌ１が、２価のＣ６−１０芳香族炭化水素基であり；および
Ｌ２が、単結合である；
基である。
【０１１１】
式（ａ１’）で表されるＬの別の好ましい態様は、
Ｒ１およびＲ２が、それぞれ独立して、Ｃ１−１０アルキル基であり；
Ｌ１が、フェニレン基であり；および
Ｌ２が、単結合である；
基である。
【０１１２】
式（ｇ−Ｉ）におけるＹがＮＲである場合、前記Ｒは、好ましくは、水素原子、Ｃ１−６アルキル基またはＣ７−１６アラルキル基であり、より好ましくは水素原子、メチル、エチルまたはベンジルであり、さらに好ましくは水素原子である。Ｙは、好ましくは単結合、酸素原子またはＮＲであり、より好ましくは単結合または酸素原子である。
【０１１３】
式（ｇ−Ｉ）におけるＺは、好ましくは、式（ａ２）または式（ａ２”）で表される基であり、より好ましくは式（ａ２”）で表される基である。式（ａ２）で表されるＺ（即ち、ベンジル基の構造）を有する擬似固相保護基に比べて、式（ａ２”）で表されるＺ（即ち、シクロヘキシルメチル基の構造）を有する擬似固相保護基を使用することにより、ヌクレオシド、ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド（ａ）等の非極性溶媒に対する溶解性を飛躍的に向上することができる。それによって、本発明の製造方法をより高濃度で実行でき、生産性が大きく向上する。
【０１１４】
式（ａ２）において、Ｒ６は水素原子であることが好ましい。また、式（ａ２）において、ＲａおよびＲｂが、水素原子であるか、または一緒になってオキソ基を形成することが好ましい。
【０１１５】
式（ａ２）で表されるＺの、固液分離のために好ましい態様は、
ＲａおよびＲｂが、水素原子であり；
Ｒ６が、水素原子であり；
ｋが、１〜３の整数であり；
ｋ個のＱが、−Ｏ−であり；および
ｋ個のＲ７が、それぞれ独立して、直鎖状のＣ１０−４０アルキル基である、
基である。
【０１１６】
式（ａ２）で表されるＺの、固液分離のために好ましい別の態様は、
ＲａおよびＲｂが、水素原子であり；
Ｒ６が、水素原子であり；
ｋが、１〜３の整数であり；
ｋ個のＱが、−Ｏ−であり；
ｋ個のＲ７が、それぞれ独立して、１〜３個の直鎖状のＣ１０−４０アルキル基が−Ｏ−を介して結合したベンジル基、または１〜３個の直鎖状のＣ１０−４０アルキル基が−Ｏ−を介して結合したシクロヘキシルメチル基であり；および
環Ａが、ｋ個のＱＲ７に加えて、さらにハロゲン原子、ハロゲン原子で置換されていてもよいＣ１−６アルキル基、およびハロゲン原子で置換されていてもよいＣ１−６アルコキシ基からなる群から選択される置換基を有していてもよい、
基である。
【０１１７】
式（ａ２）で表されるＺの、固液分離のために好ましい別の態様は、
Ｒａが、水素原子であり；および
Ｒｂが、式（ａ３）（式中、＊は結合位置であり、ｊが、０〜３の整数であり、ｊ個のＱが、−Ｏ−であり、ｊ個のＲ９が、それぞれ独立して、直鎖状のＣ１０−４０アルキル基であり、Ｒ６およびＲ８が、共に水素原子である。）で表される基である；
基である。
【０１１８】
式（ａ２）で表されるＺの、固液分離のために好ましい別の態様は、
Ｒａが、水素原子であり；および
Ｒｂが、式（ａ３）（式中、＊は結合位置であり、ｊが、０〜３の整数であり、ｊ個のＱが、−Ｏ−であり、ｊ個のＲ９が、それぞれ独立して、直鎖状のＣ１０−４０アルキル基であり、Ｒ８は、Ｒ６と一緒になって単結合または−Ｏ−を示して、環Ａおよび環Ｃと共に縮合環を形成する。）で表される基である；
基である。
【０１１９】
式（ａ２）で表されるＺの、固液分離のために好ましい別の態様は、
ＲａおよびＲｂが、一緒になってオキソ基を形成し；
Ｒ６が、水素原子であり；
ｋが、１〜３の整数であり；
ｋ個のＱが、−Ｏ−であり；および
ｋ個のＲ７が、それぞれ独立して、直鎖状のＣ１０−４０アルキル基である；
基である。
【０１２０】
式（ａ２）で表されるＺの、固液分離のために好ましい別の態様は、
ＲａおよびＲｂが、一緒になってオキソ基を形成し；
Ｒ６が、水素原子であり；
ｋが、１〜３の整数であり；
ｋ個のＱが、−Ｏ−であり；
ｋ個のＲ７が、それぞれ独立して、１〜３個の直鎖状のＣ１０−４０アルキル基が−Ｏ−を介して結合したベンジル基、または１〜３個の直鎖状のＣ１０−４０アルキル基が−Ｏ−を介して結合したシクロヘキシルメチル基であり；および
環Ａが、ｋ個のＱＲ７に加えて、さらにハロゲン原子、ハロゲン原子で置換されていてもよいＣ１−６アルキル基、およびハロゲン原子で置換されていてもよいＣ１−６アルコキシ基からなる群から選択される置換基を有していてもよい；
基である。
【０１２１】
式（ａ２”）において、Ｒ６は水素原子であることが好ましい。また、式（ａ２”）において、ＲａおよびＲｂが、水素原子であるか、または一緒になってオキソ基を形成することが好ましい。
【０１２２】
式（ａ２”）で表されるＺの、固液分離のために好ましい態様は、
ＲａおよびＲｂが、水素原子であり；
Ｒ６が、水素原子であり；
ｋが、１〜３の整数であり；
ｋ個のＱが、−Ｏ−であり；および
ｋ個のＲ７が、それぞれ独立して、直鎖状のＣ１０−４０アルキル基である；
基である。
【０１２３】
式（ａ２”）で表されるＺの、固液分離のために好ましい別の態様は、
ＲａおよびＲｂが、水素原子であり；
Ｒ６が、水素原子であり；
ｋが、１〜３の整数であり；
ｋ個のＱが、−Ｏ−であり；
ｋ個のＲ７が、それぞれ独立して、１〜３個の直鎖状のＣ１０−４０アルキル基が−Ｏ−を介して結合したベンジル基、または１〜３個の直鎖状のＣ１０−４０アルキル基が−Ｏ−を介して結合したシクロヘキシルメチル基であり；および
環Ｂが、ｋ個のＱＲ７に加えて、さらにハロゲン原子、ハロゲン原子で置換されていてもよいＣ１−６アルキル基、およびハロゲン原子で置換されていてもよいＣ１−６アルコキシ基からなる群から選択される置換基を有していてもよい；
基である。
【０１２４】
式（ａ２”）で表されるＺの、固液分離のために好ましい別の態様は、
Ｒａが、水素原子であり；
Ｒｂが、式（ａ３）（式中、＊は結合位置であり、ｊが、０〜３の整数であり、ｊ個のＱが、−Ｏ−であり、ｊ個のＲ９が、それぞれ独立して、Ｃ１０−４０アルキル基であり、Ｒ６およびＲ８が、共に水素原子である。）で表される基である；
基である。
【０１２５】
式（ａ２”）で表されるＺの、固液分離のために好ましい別の態様は、
Ｒａが、水素原子であり；
Ｒｂが、式（ａ３）（式中、＊は結合位置であり、ｊが、０〜３の整数であり、ｊ個のＱが、−Ｏ−であり、ｊ個のＲ９が、それぞれ独立して、直鎖状のＣ１０−４０アルキル基であり、Ｒ８は、Ｒ６と一緒になって単結合または−Ｏ−を示して、環Ｂおよび環Ｃと共に縮合環を形成する。）で表される基である；
基である。
【０１２６】
式（ａ２”）で表されるＺの、固液分離のために好ましい別の態様は、
ＲａおよびＲｂが、一緒になってオキソ基を形成し；
Ｒ６が、水素原子であり；
ｋが、１〜３の整数であり；
ｋ個のＱが、−Ｏ−であり；および
ｋ個のＲ７が、それぞれ独立して、直鎖状のＣ１０−４０アルキル基である；
基である。
【０１２７】
式（ａ２”）で表されるＺの、固液分離のために好ましい別の態様は、
ＲａおよびＲｂが、一緒になってオキソ基を形成し；
Ｒ６が、水素原子であり；
ｋが、１〜３の整数であり；
ｋ個のＱが、−Ｏ−であり；
ｋ個のＲ７が、それぞれ独立して、１〜３個の直鎖状のＣ１０−４０アルキル基が−Ｏ−を介して結合したベンジル基、または１〜３個の直鎖状のＣ１０−４０アルキル基が−Ｏ−を介して結合したシクロヘキシルメチル基であり；および
環Ｂが、ｋ個のＱＲ７に加えて、さらにハロゲン原子、ハロゲン原子で置換されていてもよいＣ１−６アルキル基、およびハロゲン原子で置換されていてもよいＣ１−６アルコキシ基からなる群から選択される置換基を有していてもよい；
基である。
【０１２８】
固液分離のために好適な擬似固相保護基（ｇ−Ｉ）は、好ましくは、
Ｌが、スクシニル基であるか、または式（ａ１’）で表される基（式（ａ１’）中、Ｒ１およびＲ２が、それぞれ独立して、Ｃ１−１０アルキル基であり、Ｌ１が、２価のフェニレン基であり、Ｌ２が、単結合である。）であり；および
Ｙ−Ｚが、３，４，５−トリス（オクタデシルオキシ）ベンジルオキシ基、３，５−ビス（ドコシルオキシ）ベンジルオキシ基、３，５−ビス［３’，４’，５’−トリス（オクタデシルオキシ）ベンジルオキシ］ベンジルオキシ基、３，４，５−トリス［３’，４’，５’−トリス（オクタデシルオキシ）ベンジルオキシ］ベンジルオキシ基、３，４，５−トリス（オクタデシルオキシ）ベンジルアミノ基、２，４−ビス（ドコシルオキシ）ベンジルアミノ基、３，５−ビス（ドコシルオキシ）ベンジルアミノ基、ビス（４−ドコシルオキシフェニル）メチルアミノ基、４−メトキシ−２−［３’，４’，５’−トリス（オクタデシルオキシ）ベンジルオキシ］ベンジルアミノ基、４−メトキシ−２−［３’，４’，５’−トリス（オクタデシルオキシ）シクロヘキシルメチルオキシ］ベンジルアミノ基、２，４−ビス（ドデシルオキシ）ベンジルアミノ基、フェニル（２，３，４−トリス（オクタデシルオキシ）フェニル）メチルアミノ基、ビス［４−（１２−ドコシルオキシドデシルオキシ）フェニル］メチルアミノ基、３，５−ビス［３’，４’，５’−トリス（オクタデシルオキシ）ベンジルオキシ］ベンジルアミノ基、３，４，５−トリス［３’，４’，５’−トリス（オクタデシルオキシ）ベンジルオキシ］ベンジルアミノ基、３，４，５−トリス（オクタデシルオキシ）シクロヘキシルメチルオキシ基、３，５−ビス（ドコシルオキシ）シクロヘキシルメチルオキシ基、３，５−ビス［３’，４’，５’−トリス（オクタデシルオキシ）シクロヘキシルメチルオキシ］シクロヘキシルメチルオキシ基、３，４，５−トリス［３’，４’，５’−トリス（オクタデシルオキシ）シクロヘキシルメチルオキシ］シクロヘキシルメチルオキシ基、３，４，５−トリス（オクタデシルオキシ）シクロヘキシルメチルアミノ基、２，４−ビス（ドコシルオキシ）シクロヘキシルメチルアミノ基、３，５−ビス（ドコシルオキシ）シクロヘキシルメチルアミノ基、ビス（４−ドコシルオキシシクロへキシル）メチルアミノ基、４−メトキシ−２−［３’，４’，５’−トリス（オクタデシルオキシ）シクロヘキシルメチルオキシ］シクロヘキシルメチルアミノ基、４−メトキシ−２−［３’，４’，５’−トリス（オクタデシルオキシ）シクロヘキシルメチルオキシ］シクロヘキシルメチルアミノ基、２，４−ビス（ドデシルオキシ）シクロヘキシルメチルアミノ基、フェニル（２，３，４−トリス（オクタデシルオキシ）シクロへキシル）メチルアミノ基、ビス［４−（１２−ドコシルオキシドデシルオキシ）シクロへキシル］メチルアミノ基、３，５−ビス［３’，４’，５’−トリス（オクタデシルオキシ）シクロヘキシルメチルオキシ］シクロヘキシルメチルアミノ基、または３，４，５−トリス［３’，４’，５’−トリス（オクタデシルオキシ）シクロヘキシルメチルオキシ］シクロヘキシルメチルアミノ基である；
基であるか、または
Ｌ−Ｙが、単結合またはスクシニル−１，４−ピペラジンジイル基であり；および
Ｚが、３，４，５−トリス（オクタデシルオキシ）ベンゾイル基、３，５−ビス（ドコシルオキシ）ベンゾイル基、３，５−ビス［３’，４’，５’−トリス（オクタデシルオキシ）ベンジルオキシ］ベンゾイル基、または３，４，５−トリス［３’，４’，５’−トリス（オクタデシルオキシ）ベンジルオキシ］ベンゾイル基である；
基である。
【０１２９】
固液分離のために好適な擬似固相保護基（ｇ−Ｉ）は、より好ましくは、
Ｌが、スクシニル基であり；および
Ｙ−Ｚが、３，４，５−トリス（オクタデシルオキシ）ベンジルオキシ基、３，５−ビス（ドコシルオキシ）ベンジルオキシ基、３，５−ビス［３’，４’，５’−トリス（オクタデシルオキシ）ベンジルオキシ］ベンジルオキシ基、３，４，５−トリス［３’，４’，５’−トリス（オクタデシルオキシ）ベンジルオキシ］ベンジルオキシ基、３，４，５−トリス（オクタデシルオキシ）ベンジルアミノ基、２，４−ビス（ドコシルオキシ）ベンジルアミノ基、３，５−ビス（ドコシルオキシ）ベンジルアミノ基、ビス（４−ドコシルオキシフェニル）メチルアミノ基、４−メトキシ−２−［３’，４’，５’−トリス（オクタデシルオキシ）ベンジルオキシ］ベンジルアミノ基、４−メトキシ−２−［３’，４’，５’−トリス（オクタデシルオキシ）シクロヘキシルメチルオキシ］ベンジルアミノ基、２，４−ビス（ドデシルオキシ）ベンジルアミノ基、フェニル（２，３，４−トリス（オクタデシルオキシ）フェニル）メチルアミノ基、ビス［４−（１２−ドコシルオキシドデシルオキシ）フェニル］メチルアミノ基、３，５−ビス［３’，４’，５’−トリス（オクタデシルオキシ）ベンジルオキシ］ベンジルアミノ基、３，４，５−トリス［３’，４’，５’−トリス（オクタデシルオキシ）ベンジルオキシ］ベンジルアミノ基、３，４，５−トリス（オクタデシルオキシ）シクロヘキシルメチルオキシ基、３，５−ビス（ドコシルオキシ）シクロヘキシルメチルオキシ基、３，５−ビス［３’，４’，５’−トリス（オクタデシルオキシ）シクロヘキシルメチルオキシ］シクロヘキシルメチルオキシ基、３，４，５−トリス［３’，４’，５’−トリス（オクタデシルオキシ）シクロヘキシルメチルオキシ］シクロヘキシルメチルオキシ基、３，４，５−トリス（オクタデシルオキシ）シクロヘキシルメチルアミノ基、２，４−ビス（ドコシルオキシ）シクロヘキシルメチルアミノ基、３，５−ビス（ドコシルオキシ）シクロヘキシルメチルアミノ基、ビス（４−ドコシルオキシシクロへキシル）メチルアミノ基、４−メトキシ−２−［３’，４’，５’−トリス（オクタデシルオキシ）シクロヘキシルメチルオキシ］シクロヘキシルメチルアミノ基、４−メトキシ−２−［３’，４’，５’−トリス（オクタデシルオキシ）シクロヘキシルメチルオキシ］シクロヘキシルメチルアミノ基、２，４−ビス（ドデシルオキシ）シクロヘキシルメチルアミノ基、フェニル（２，３，４−トリス（オクタデシルオキシ）シクロへキシル）メチルアミノ基、ビス［４−（１２−ドコシルオキシドデシルオキシ）シクロへキシル］メチルアミノ基、３，５−ビス［３’，４’，５’−トリス（オクタデシルオキシ）シクロヘキシルメチルオキシ］シクロヘキシルメチルアミノ基、または３，４，５−トリス［３’，４’，５’−トリス（オクタデシルオキシ）シクロヘキシルメチルオキシ］シクロヘキシルメチルアミノ基である；
基であるか、または
Ｌ−Ｙが、単結合またはスクシニル−１，４−ピペラジンジイル基であり；および
Ｚが、３，４，５−トリス（オクタデシルオキシ）ベンゾイル基、３，５−ビス（ドコシルオキシ）ベンゾイル基、３，５−ビス［３’，４’，５’−トリス（オクタデシルオキシ）ベンジルオキシ］ベンゾイル基、または３，４，５−トリス［３’，４’，５’−トリス（オクタデシルオキシ）ベンジルオキシ］ベンゾイル基である；
基である。
【０１３０】
固液分離のために好適な擬似固相保護基（ｇ−Ｉ）は、さらに好ましくは、
Ｌが、スクシニル基であり；および
Ｙ−Ｚが、３，４，５−トリス（オクタデシルオキシ）ベンジルオキシ基、３，４，５−トリス（オクタデシルオキシ）シクロヘキシルメチルオキシ基、３，５−ビス（ドコシルオキシ）シクロヘキシルメチルオキシ基、３，５−ビス［３’，４’，５’−トリス（オクタデシルオキシ）シクロヘキシルメチルオキシ］シクロヘキシルメチルオキシ基、３，４，５−トリス［３’，４’，５’−トリス（オクタデシルオキシ）シクロヘキシルメチルオキシ］シクロヘキシルメチルオキシ基、３，４，５−トリス（オクタデシルオキシ）シクロヘキシルメチルアミノ基、２，４−ビス（ドコシルオキシ）シクロヘキシルメチルアミノ基、３，５−ビス（ドコシルオキシ）シクロヘキシルメチルアミノ基、４−メトキシ−２−［３’，４’，５’−トリス（オクタデシルオキシ）シクロヘキシルメチルオキシ］シクロヘキシルメチルアミノ基、４−メトキシ−２−［３’，４’，５’−トリス（オクタデシルオキシ）シクロヘキシルメチルオキシ］シクロヘキシルメチルアミノ基、２，４−ビス（ドデシルオキシ）シクロヘキシルメチルアミノ基、３，５−ビス［３’，４’，５’−トリス（オクタデシルオキシ）シクロヘキシルメチルオキシ］シクロヘキシルメチルアミノ基、または３，４，５−トリス［３’，４’，５’−トリス（オクタデシルオキシ）シクロヘキシルメチルオキシ］シクロヘキシルメチルアミノ基である；
基であるか、または
Ｌ−Ｙが、単結合またはスクシニル−１，４−ピペラジンジイル基であり；および
Ｚが、３，４，５−トリス（オクタデシルオキシ）ベンゾイル基である；
基である。
【０１３１】
固液分離のために好適な擬似固相保護基（ｇ−Ｉ）は、特に好ましくは、
Ｌが、スクシニル基であり；および
Ｙ−Ｚが、３，４，５−トリス（オクタデシルオキシ）ベンジルオキシ基、３，４，５−トリス（オクタデシルオキシ）シクロヘキシルメチルオキシ基またはフェニル（２，３，４−トリス（オクタデシルオキシ）フェニル）メチルアミノ基である；
基であるか、または
Ｌ−Ｙが、スクシニル−１，４−ピペラジンジイル基であり；および
Ｚが、３，４，５−トリス（オクタデシルオキシ）ベンゾイル基である；
基である。
【０１３２】
固液分離のために好適な擬似固相保護基（ｇ−Ｉ）は、最も好ましくは、
Ｌが、スクシニル基であり；および
Ｙ−Ｚが、３，４，５−トリス（オクタデシルオキシ）ベンジルオキシ基、または３，４，５−トリス（オクタデシルオキシ）シクロヘキシルメチルオキシ基である；
基であるか、または
Ｌ−Ｙが、スクシニル−１，４−ピペラジンジイル基であり；および
Ｚが、３，４，５−トリス（オクタデシルオキシ）ベンゾイル基である；
基である。
【０１３３】
抽出のために好適な擬似固相保護基（ｇ−Ｉ）は、好ましくは、２−{２，４−ジ（２’，３’−ジヒドロフィチルオキシ）ベンジルアミノカルボニル}エチルカルボニル基；３，５−ジ（２’，３’−ジヒドロフィチルオキシ）ベンジルオキシスクシニル基；４−（２’，３’−ジヒドロフィチルオキシ）ベンジルオキシスクシニル基；２−{１−［（２−クロロ−５−（２’，３’−ジヒドロフィチルオキシ）フェニル）］ベンジルアミノカルボニル}エチルカルボニル基；３，４，５−トリ（２’，３’−ジヒドロフィチルオキシ）ベンジルオキシスクシニル基；２−{３，４，５−トリ（２’，３’−ジヒドロフィチルオキシ）ベンジルアミノカルボニル}エチルカルボニル基；２−{４−（２’，３’−ジヒドロフィチルオキシ）ベンジルアミノカルボニル}エチルカルボニル基；２−{２−［３’，４’，５’−トリ（２”，３”−ジヒドロフィチルオキシ）ベンジルオキシ］−４−メトキシベンジルアミノカルボニル}エチルカルボニル基；２−{４−（２’，３’−ジヒドロフィチルオキシ）−２−メトキシベンジルアミノカルボニル}エチルカルボニル基；４−（２’，３’−ジヒドロフィチルオキシ）−２−メチルベンジルオキシスクシニル基；２−{４−（２’，３’−ジヒドロフィチルオキシ）−２−メチルベンジルアミノカルボニル}エチルカルボニル基；４−［２，２，４，８，１０，１０−ヘキサメチル−５−ドデカノイルアミノ］ベンジルオキシスクシニル基；２−{４−［２，２，４，８，１０，１０−ヘキサメチル−５−ドデカノイルアミノ］ベンジルアミノカルボニル}エチルカルボニル基；４−（３，７，１１−トリメチルドデシルオキシ）ベンジルオキシスクシニル基；２−｛４−（３，７，１１−トリメチルドデシルオキシ）ベンジルアミノカルボニル}エチルカルボニル基；２−{３，５−ジ（２’，３’−ジヒドロフィチルオキシ）ベンジルアミノカルボニル}エチルカルボニル基；２−{１−［２，３，４−トリ（２’，３’−ジヒドロフィチルオキシ）フェニル］ベンジルアミノカルボニル}エチルカルボニル基；２−{１−［４−（２’，３’−ジヒドロフィチルオキシ）フェニル］−４’−（２’，３’−ジヒドロフィチルオキシ）ベンジルアミノカルボニル}エチルカルボニル基；３，４，５−トリス［３，４，５−トリ（２’，３’−ジヒドロフィチルオキシ）ベンジル］ベンジルオキシスクシニル基；または２−{３，４，５−トリス［３，４，５−トリ（２’，３’−ジヒドロフィチルオキシ）ベンジル］ベンジルアミノカルボニル}エチルカルボニル基である。
【０１３４】
擬似固相保護基を形成するために用いられる式：Ｚ−Ｙ−Ｈで表されるアルコール化合物またはアミン化合物は、例えば、国際公開第２０１７／１０４８３６号の段落［０１８６］〜［０２２１］記載の工程またはそれに準じた工程によって製造することができる。
【０１３５】
本工程で使用するヌクレオシド、ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド（ａ）としては、例えば、下記式（ａ−Ｉ）で表される化合物（即ち、ヌクレオシドまたはオリゴヌクレオチド）が挙げられる。
【０１３６】
【化１４】
2020166705.tif 000015
【０１３７】
［式中、
ｍは、０以上の整数を示し；
ｍ＋１個のＢａｓｅは、それぞれ独立して、保護されていてもよい核酸塩基を示し；
ｍ＋１個のＸは、それぞれ独立して、水素原子、ハロゲン原子、保護されていてもよい水酸基、または２位炭素原子および４位炭素原子と結合する２価の有機基を示し；
ｍ＋１個のＸｎ１は、それぞれ独立して、酸素原子またはＮＨを示し；
ｍ個のＲ１０は、それぞれ独立して、酸素原子または硫黄原子を示し；
ｍ個のＲｐ１は、それぞれ独立して、リン酸基の保護基を示し；
Ｌ、ＹおよびＺは、前記と同義である。］
【０１３８】
以下では、式（ａ−Ｉ）で表される化合物を「化合物（ａ−Ｉ）」と略称することがある。他の式で表される化合物も同様に略称することがある。
【０１３９】
核酸塩基のアミノ基は、保護基で保護されていることが好ましい。該保護基としては、アセチル基、フェノキシアセチル基、４−イソプロピルフェノキシアセチル基、ベンゾイル基、イソブチリル基、（２−ヘキシル）デカノイル基、ジメチルホルムアミジニル基、および＝ＮＣ（Ｒ１１）−Ｎ（Ｒ１２）（Ｒ１３）基（式中、Ｒ１１は、メチル基を示し、Ｒ１２およびＲ１３は、それぞれ独立してＣ１−５アルキル基を示すか、またはＲ１１およびＲ１２が一緒になって、それらが結合する炭素原子および窒素原子と共に５員または６員の含窒素炭化水素環を形成していてもよい。）が好ましい。なお、前記＝ＮＣ（Ｒ１１）−Ｎ（Ｒ１２）（Ｒ１３）基としては、例えば、１−（ジメチルアミノ）エチリデン基が挙げられる。化合物（ａ−Ｉ）が複数のアミノ基を有する場合、アミノ基の保護基は１種のみでもよく、２種以上でもよい。
【０１４０】
ｍが０である場合、化合物（ａ−Ｉ）はヌクレオシドであり、ｍが１以上である場合、化合物（ａ−Ｉ）はオリゴヌクレオチドである。ｍは、４９以下が好ましく、２９以下がより好ましく、１９以下がさらに好ましく、４以下が特に好ましく、２以下が最も好ましい。
【０１４１】
Ｘのハロゲン原子としては、フッ素原子、塩素原子が好ましく、フッ素原子がより好ましい。
【０１４２】
Ｘの保護されていてもよい水酸基の保護基としては、特に限定されず、例えば、プロテクティブ・グループス・イン・オーガニック・シンセシス（ＰＲＯＴＥＣＴＩＶＥ  ＧＲＯＵＰＳ  ＩＮ  ＯＲＧＡＮＩＣ  ＳＹＮＴＨＥＳＩＳ）、第３版、ジョン・ウィリー・アンド・サンズ（ＪＯＨＮ  ＷＩＬＬＹ＆ＳＯＮＳ）出版（１９９９年）等に記載されている任意の保護基を挙げることができる。具体的には、メチル基、ベンジル基、ｐ−メトキシベンジル基、ｔｅｒｔ−ブチル基、メトキシメチル基、メトキシエチル基、２−テトラヒドロピラニル基、エトキシエチル基、シアノエチル基、シアノエトキシメチル基、フェニルカルバモイル基、１，１−ジオキソチオモルホリン−４−チオカルバモイル基、アセチル基、ピバロイル基、ベンゾイル基、トリメチルシリル基、トリエチルシリル基、トリイソプロピルシリル基、ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル基、［（トリイソプロピルシリル）オキシ］メチル（Ｔｏｍ）基、１−（４−クロロフェニル）−４−エトキシピペリジン−４−イル（Ｃｐｅｐ）基等を挙げることができる。保護されていてもよい水酸基の保護基は、トリエチルシリル基、トリイソプロピルシリル基、またはｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル基であることが好ましく、経済性および入手の容易さの観点から、ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル基であることが特に好ましい。
【０１４３】
Ｘの「２位炭素原子および４位炭素原子と結合する２価の有機基」としては、ヌクレオシドの２位炭素原子および４位炭素原子と結合する限り特に限定はない。この２価の有機基としては、例えば、置換されていてもよいＣ２−７アルキレン基、並びに−Ｏ−、−ＮＲ３３−（Ｒ３３は水素原子またはＣ１−６アルキル基を示す）、−Ｓ−、−ＣＯ−、−ＣＯＯ−、−ＯＣＯＮＲ３４−（Ｒ３４は水素原子またはＣ１−６アルキル基を示す）および−ＣＯＮＲ３５−（Ｒ３５は水素原子またはＣ１−６アルキル基を示す）から選ばれる２価のリンカーと、置換されていてもよいＣ１−７アルキレン基とから構成される２価の有機基等が挙げられる。Ｃ１−７アルキレン基およびＣ２−７アルキレン基が有していてもよい置換基としては、例えば、メチリデン基（ＣＨ２＝）が挙げられる。
【０１４４】
「２位炭素原子および４位炭素原子と結合する２価の有機基」としては、置換されていてもよいＣ２−７アルキレン基、−ＯＲｉ−（Ｒｉは４位炭素原子と結合するＣ１−６アルキレン基を示す）、−Ｏ−ＮＲ３３−Ｒｊ−（Ｒｊは４位炭素原子と結合するＣ１−６アルキレン基を示し、Ｒ３３は前記と同義を示す）、−Ｏ−Ｒｋ−Ｏ−Ｒｌ−（ＲｋはＣ１−６アルキレン基を示し、Ｒｌは４位炭素原子と結合架橋するＣ１−６アルキレン基を示す）が好ましく、−ＯＲｉ−（Ｒｉは前記と同義を示す）、−Ｏ−ＮＲ３３−Ｒｊ−（ＲｊおよびＲ３３は前記と同義を示す）、−Ｏ−Ｒｋ−Ｏ−Ｒｌ−（ＲｋおよびＲｌは前記と同義を示す）がより好ましい。Ｒｉ、Ｒｊ、ＲｋおよびＲｌで示されるＣ１−６アルキレン基としては、それぞれ独立して、メチレン基またはエチレン基が好ましい。
【０１４５】
「２位炭素原子および４位炭素原子と結合する２価の有機基」としては、−Ｏ−ＣＨ２−、−Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２−、−Ｏ−ＮＲ３３−ＣＨ２−（Ｒ３３は前記と同義を示す）、−Ｏ−ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ２−がより好ましく、−Ｏ−ＣＨ２−、−Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２−、−Ｏ−ＮＨ−ＣＨ２−、−Ｏ−Ｎ（ＣＨ３）−ＣＨ２−、−Ｏ−ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ２−（それぞれ、左側が２位炭素原子に結合し、右側が４位炭素原子に結合する。）がさらに好ましい。
【０１４６】
ｍ＋１個のＸは、それぞれ独立して、好ましくは水素原子、ハロゲン原子、または保護されていてもよい水酸基であり、より好ましくは水素原子または保護されていてもよい水酸基である。
【０１４７】
Ｒｐ１のリン酸基の保護基としては、塩基性条件下で除去可能であり、リン酸基の保護基として用いられるものであれば、特に限定はされないが、−ＣＨ２ＣＨ２ＷＧ（ＷＧは、電子吸引性基を示す。）で表される基が好ましい。
ＷＧの電子吸引性基としては、例えば、シアノ基、ニトロ基等が挙げられ、好ましくはシアノ基である。
【０１４８】
ｍ個のＲｐ１は、好ましくは、それぞれ独立して−ＣＨ２ＣＨ２ＷＧで表される基である。
ｍ＋１個のＸｎ１は、好ましくは酸素原子である。
Ｌ、ＹおよびＺの説明は、前記の通りである。
【０１４９】
化合物（ａ−Ｉ）は、好ましくは下記式（ａ−ｉ）で表される化合物である（下記式中の記号の定義および説明は、前記の通りである）。
【０１５０】
【化１５】
2020166705.tif 000016
【０１５１】
化合物（ａ−Ｉ）は、自体公知の方法またはこれに準ずる方法で製造することができる。例えば、ｍが０であり、Ｘｎ１が酸素原子であり、Ｌがスクシニル基である化合物（ａ−Ｉ）は、例えば、次式のように、まず、塩基存在下で５’位水酸基が一時保護基Ｑ”により保護されたヌクレオシド（ｉ）とコハク酸無水物とを反応させて、ヌクレオシド（ｉｉ）を合成し、次いで、縮合剤の存在下、得られたヌクレオシド（ｉｉ）と化合物Ｚ−Ｙ−Ｈとを縮合させて、３’位および５’位水酸基が保護されたヌクレオシドを合成した後、一時保護基Ｑ”を酸で除去することによって、製造することができる。
【０１５２】
【化１６】
2020166705.tif 000017
【０１５３】
ヌクレオシド（ｉ）からヌクレオシド（ｉｉ）への転化反応は、反応に不活性な溶媒中で行うのが有利である。このような溶媒としては、反応が進行する限り特に限定されないが、ジクロロメタン、１，２−ジクロロエタン、クロロホルム、四塩化炭素等のハロゲン系溶媒、ベンゼン、トルエン、キシレン等の芳香族系溶媒、またはペンタン、ヘキサン、ヘプタン、オクタン等の脂肪族系溶媒、またはジエチルエーテル、テトラヒドロフラン、シクロペンチルメチルエーテル等のエーテル系溶媒、およびこれらの混合溶媒が好ましい。中でもジクロロメタン、またはクロロホルムが特に好ましい。
【０１５４】
ヌクレオシド（ｉｉ）の合成に使用される塩基としては、特に限定されないが、有機塩基が好ましく、トリエチルアミンがより好ましい。
【０１５５】
ヌクレオシド（ｉｉｉ）を合成するための縮合反応は、反応に不活性な溶媒中で行うのが有利である。このような溶媒としては、反応が進行する限り特に限定されないが、ジクロロメタン、１，２−ジクロロエタン、クロロホルム、四塩化炭素等のハロゲン系溶媒、ベンゼン、トルエン、キシレン等の芳香族系溶媒、ペンタン、ヘキサン、ヘプタン、オクタン等の脂肪族系溶媒、またはこれらの組合せが好ましい。中でもジクロロメタン、クロロホルムが特に好ましい。
【０１５６】
ヌクレオシド（ｉｉ）とＺ−Ｙ−Ｈとの縮合反応に使用する縮合剤としては、ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）、ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＣ）、Ｎ−エチル−Ｎ’−３−ジメチルアミノプロピルカルボジイミドおよびその塩酸塩（ＥＤＣ・ＨＣｌ）、ヘキサフルオロリン酸（ベンゾトリアゾール−１−イルオキシ）トリピロリジノホスホニウム（ＰｙＢｏｐ）、Ｏ−（ベンゾトリアゾール−１−イル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウロニウム  テトラフルオロボレート（ＴＢＴＵ）、１−［ビス（ジメチルアミノ）メチレン］−５−クロロ−１Ｈ−ベンゾトリアゾリウム−３−オキシド  ヘキサフルオロホスフェート（ＨＣＴＵ）、Ｏ−ベンゾトリアゾール−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウロニウム  ヘキサフルオロホスフェート（ＨＢＴＵ）等が挙げられる。中でもＨＢＴＵ、ＨＣＴＵ、Ｎ−エチル−Ｎ’−３−ジメチルアミノプロピルカルボジイミドおよびその塩酸塩（ＥＤＣ・ＨＣｌ）が好ましい。
【０１５７】
縮合剤の使用量は、ヌクレオシド（ｉｉ）１モルに対して、例えば１〜１０モル、好ましくは１〜５モルである。また、Ｚ−Ｙ−Ｈの使用量は、ヌクレオシド（ｉｉ）１モルに対して、例えば１〜１０モル、好ましくは１〜５モルである。反応温度は、反応が進行しさえすれば特に限定されないが、−１０℃〜５０℃が好ましく、０℃〜３０℃がより好ましい。反応時間は、例えば３０分〜７０時間である。
【０１５８】
ヌクレオシド（ｉｉｉ）の一時保護基Ｑの除去（脱保護）は、本発明の工程（４）と同様にして行うことができる。
【０１５９】
Ｌがスクシニル基以外である化合物（ａ−Ｉ）も、上記合成法におけるコハク酸無水物に代えて、対応する酸無水物、対応するジカルボン酸ハライド、対応するジカルボン酸の活性エステル等を用いて、同様の反応を行うことにより合成することができる。また、Ｘｎ１がＮＨである化合物（ａ−Ｉ）は、上記合成法におけるヌクレオシド（ｉ）に代えて３’位水酸基がアミノ基であるヌクレオシドを用いて、同様の反応を行うことにより合成することができる。また、ｍが１以上である化合物（ａ−Ｉ）は、ｍが０である化合物（ａ−Ｉ）を出発原料として用いて５’末端伸長プロセスを繰り返すことによって合成することができる。
【０１６０】
化合物（ａ−ｉ）の中で、式（ａ−ＩＩ）で表される化合物（即ち、ヌクレオシドまたはオリゴヌクレオチド）が好ましい。
【０１６１】
【化１７】
2020166705.tif 000018
【０１６２】
［式中、
ｍ、ｍ個のＢａｓｅ、ｍ＋１個のＸ、ｍ個のＲ１０、ｍ個のＲｐ１、Ｌ、ＹおよびＺは、それぞれ独立して、前記と同義であり；
Ｒ１１は、メチル基を示し、Ｒ１２およびＲ１３は、それぞれ独立してＣ１−５アルキル基を示すか、またはＲ１１およびＲ１２が一緒になって、それらが結合する炭素原子および窒素原子と共に５員または６員の含窒素炭化水素環を形成していてもよい。］
【０１６３】
式（ａ−ＩＩ）において、ｍ個のＲｐ１が、それぞれ独立して−ＣＨ２ＣＨ２ＷＧで表される基であることが好ましい。
式（ａ−ＩＩ）において、ｍが０であることが好ましい。即ち、化合物（ａ−ＩＩ）の中で、式（ａ−ＩＩＩ）で表される化合物（即ち、ヌクレオシド）が好ましい（下記式中の記号の定義および説明は、前記の通りである）。
【０１６４】
【化１８】
2020166705.tif 000019
【０１６５】
式（ａ−ＩＩ）および式（ａ−ＩＩＩ）において、Ｒ１１がメチル基であり、Ｒ１２およびＲ１３が、それぞれ独立してＣ１−５アルキル基であることが好ましく、Ｒ１１、Ｒ１２およびＲ１３が、メチル基であることがより好ましい。
式（ａ−ＩＩ）および式（ａ−ＩＩＩ）における他の記号の説明は、前記の通りである。
【０１６６】
本発明において、最初の残基がアデニンを核酸塩基として有するオリゴヌクレオチドを製造する場合、出発物質であるヌクレオシド、ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド（ａ）として化合物（ａ−ＩＩ）（特に、化合物（ａ−ＩＩＩ））を使用することで、ブランチ体の生成等を抑制できる。ここで、ブランチ体とは、目的化合物の核酸塩基におけるアミノ基の保護基が脱落し、該アミノ基とモノマーとが結合して生成した副生成物をいう。
【０１６７】
また、化合物（ａ−ｉ）の中で、式（ａ−ＩＶ）で表される化合物（即ち、ヌクレオシドまたはオリゴヌクレオチド）が好ましい。
【０１６８】
【化１９】
2020166705.tif 000020
【０１６９】
［式中、
ｍ、ｍ＋１個のＢａｓｅ、ｍ＋１個のＸ、ｍ個のＲ１０、ｍ個のＲｐ１、ＬおよびＹは、それぞれ独立して、前記と同義であり；
Ｚ’は、式（ａ２”）：
【０１７０】
【化２０】
2020166705.tif 000021
【０１７１】
［式中、
＊は、結合位置を示し；
Ｒ６は、水素原子であるか、あるいはＲｂが、下記式（ａ３）で表される基である場合には、Ｒ８と一緒になって単結合または−Ｏ−を示して、環Ｂおよび環Ｃと共に縮合環を形成していてもよく；
ｋは、１〜４の整数を示し；
ｋ個のＱは、それぞれ独立して、−Ｏ−、−Ｃ（＝Ｏ）−、−Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（＝Ｏ）−、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ−または−ＮＨＣ（＝Ｏ）−を示し；
ｋ個のＲ７は、それぞれ独立して、炭素数１０以上の直鎖状の脂肪族炭化水素基が単結合またはリンカーを介して結合した炭化水素基を示すか、または分岐鎖を１以上有する脂肪族炭化水素基を少なくとも一つ有し、且つ総炭素数が１４以上３００以下である有機基を示し；
環Ｂは、ｋ個のＱＲ７に加えて、さらにハロゲン原子、ハロゲン原子で置換されていてもよいＣ１−６アルキル基、およびハロゲン原子で置換されていてもよいＣ１−６アルコキシ基からなる群から選択される置換基を有していてもよく；
Ｒａは、水素原子を示し；および
Ｒｂは、水素原子、または式（ａ３）：
【０１７２】
【化２１】
2020166705.tif 000022
【０１７３】
（式中、＊は、結合位置を示し；
ｊは、０〜４の整数を示し；
ｊ個のＱは、それぞれ独立して、前記と同義であり；
ｊ個のＲ９は、それぞれ独立して、炭素数１０以上の直鎖状の脂肪族炭化水素基が単結合またはリンカーを介して結合した炭化水素基を示すか、または分岐鎖を１以上有する脂肪族炭化水素基を少なくとも一つ有し、且つ総炭素数が１４以上３００以下である有機基を示し；
Ｒ８は、水素原子を示すか、またはＲ６と一緒になって単結合または−Ｏ−を示して、環Ｂおよび環Ｃと共に縮合環を形成していてもよく；および
環Ｃは、ｊ個のＱＲ９に加えて、さらにハロゲン原子、ハロゲン原子で置換されていてもよいＣ１−６アルキル基、およびハロゲン原子で置換されていてもよいＣ１−６アルコキシ基からなる群から選択される置換基を有していてもよい。）で表される基を示すか、或いは
ＲａおよびＲｂが、一緒になってオキソ基を形成する。］で表される基を示す。］
【０１７４】
式（ａ−ＩＶ）において、ｍ個のＲｐ１が、それぞれ独立して−ＣＨ２ＣＨ２ＷＧで表される基であることが好ましい。
式（ａ−ＩＶ）において、ｍが０であることが好ましい。
式（ａ−ＩＶ）における他の記号の説明は、前記の通りである。
化合物（ａ−ＩＶ）の中で、下記式（ａ−Ｖ）で表される化合物（即ち、ヌクレオシド）が好ましい（下記式中の記号の定義および説明は、前記の通りである）。
【０１７５】
【化２２】
2020166705.tif 000023
【０１７６】
化合物（ａ−Ｉ）の中でも、擬似固相保護基中に式（ａ２”）で表されるＺ’（即ち、シクロヘキシルメチル基の構造）を有する化合物（ａ−ＩＶ）（特に、化合物（ａ−Ｖ））は、擬似固相保護基中に式（ａ２）で表されるＺ（即ち、ベンジル基の構造）を有する他の化合物（ａ−Ｉ）に比べて、非極性溶媒に対する溶解性が高い。そのため、化合物（ａ−ＩＶ）（特に、化合物（ａ−Ｖ））を使用することによって、本発明の製造方法をより高濃度で実行でき、生産性が大きく向上する。式（ａ２”）で表されるＺ’の説明は、上述の式（ａ２”）で表されるＺの説明と同じである。
【０１７７】
式（ａ−ＩＶ）および（ａ−Ｖ）において、
Ｌが、スクシニル基であるか、または式（ａ１’）で表される基（式（ａ１’）中、Ｒ１およびＲ２が、それぞれ独立して、Ｃ１−１０アルキル基であり、Ｌ１が、２価のフェニレン基であり、Ｌ２が、単結合である。）であり；および
Ｙ−Ｚ’が、３，４，５−トリス（オクタデシルオキシ）シクロヘキシルメチルオキシ基、３，５−ビス（ドコシルオキシ）シクロヘキシルメチルオキシ基、３，５−ビス［３’，４’，５’−トリス（オクタデシルオキシ）シクロヘキシルメチルオキシ］シクロヘキシルメチルオキシ基、３，４，５−トリス［３’，４’，５’−トリス（オクタデシルオキシ）シクロヘキシルメチルオキシ］シクロヘキシルメチルオキシ基、３，４，５−トリス（オクタデシルオキシ）シクロヘキシルメチルアミノ基、２，４−ビス（ドコシルオキシ）シクロヘキシルメチルアミノ基、３，５−ビス（ドコシルオキシ）シクロヘキシルメチルアミノ基、４−メトキシ−２−［３’，４’，５’−トリス（オクタデシルオキシ）シクロヘキシルメチルオキシ］シクロヘキシルメチルアミノ基、４−メトキシ−２−［３’，４’，５’−トリス（オクタデシルオキシ）シクロヘキシルメチルオキシ］シクロヘキシルメチルアミノ基、２，４−ビス（ドデシルオキシ）シクロヘキシルメチルアミノ基、３，５−ビス［３’，４’，５’−トリス（オクタデシルオキシ）シクロヘキシルメチルオキシ］シクロヘキシルメチルアミノ基、または３，４，５−トリス［３’，４’，５’−トリス（オクタデシルオキシ）シクロヘキシルメチルオキシ］シクロヘキシルメチルアミノ基である；
組合せが、固液分離のために好ましい。
【０１７８】
式（ａ−ＩＶ）および（ａ−Ｖ）において、
Ｌが、スクシニル基であり；および
Ｙ−Ｚ’が、３，４，５−トリス（オクタデシルオキシ）シクロヘキシルメチルオキシ基、３，５−ビス（ドコシルオキシ）シクロヘキシルメチルオキシ基、３，５−ビス［３’，４’，５’−トリス（オクタデシルオキシ）シクロヘキシルメチルオキシ］シクロヘキシルメチルオキシ基、３，４，５−トリス［３’，４’，５’−トリス（オクタデシルオキシ）シクロヘキシルメチルオキシ］シクロヘキシルメチルオキシ基、３，４，５−トリス（オクタデシルオキシ）シクロヘキシルメチルアミノ基、２，４−ビス（ドコシルオキシ）シクロヘキシルメチルアミノ基、３，５−ビス（ドコシルオキシ）シクロヘキシルメチルアミノ基、４−メトキシ−２−［３’，４’，５’−トリス（オクタデシルオキシ）シクロヘキシルメチルオキシ］シクロヘキシルメチルアミノ基、４−メトキシ−２−［３’，４’，５’−トリス（オクタデシルオキシ）シクロヘキシルメチルオキシ］シクロヘキシルメチルアミノ基、２，４−ビス（ドデシルオキシ）シクロヘキシルメチルアミノ基、３，５−ビス［３’，４’，５’−トリス（オクタデシルオキシ）シクロヘキシルメチルオキシ］シクロヘキシルメチルアミノ基、または３，４，５−トリス［３’，４’，５’−トリス（オクタデシルオキシ）シクロヘキシルメチルオキシ］シクロヘキシルメチルアミノ基である；
組合せが、固液分離のためにより好ましい。
【０１７９】
式（ａ−ＩＶ）および（ａ−Ｖ）において、
Ｌが、スクシニル基であり；および
Ｙ−Ｚ’が、３，４，５−トリス（オクタデシルオキシ）シクロヘキシルメチルオキシ基、３，５−ビス（ドコシルオキシ）シクロヘキシルメチルオキシ基、３，５−ビス［３’，４’，５’−トリス（オクタデシルオキシ）シクロヘキシルメチルオキシ］シクロヘキシルメチルオキシ基、または３，４，５−トリス［３’，４’，５’−トリス（オクタデシルオキシ）シクロヘキシルメチルオキシ］シクロヘキシルメチルオキシ基である；
組合せが、固液分離のためにさらに好ましい。
【０１８０】
式（ａ−ＩＶ）および（ａ−Ｖ）において、
Ｌが、スクシニル基であり；および
Ｙ−Ｚ’が、３，４，５−トリス（オクタデシルオキシ）シクロヘキシルメチルオキシ基である；
組合せが、固液分離のために特に好ましい。
【０１８１】
また、ヌクレオシド、ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド（ａ）としては、例えば、下記式（ａ−ＶＩ）で表される化合物（即ち、ヌクレオシドまたはオリゴヌクレオチド）が挙げられる。
【０１８２】
【化２３】
2020166705.tif 000024
【０１８３】
［式中、
ｍ＋１個のＢａｓｅ１の少なくとも一つは、−Ｌ−Ｙ−Ｚで保護されている核酸塩基を示し、残りは保護されていてもよい核酸塩基を示し；
ｍ個のＸｎ１は、それぞれ独立して、酸素原子またはＮＨを示し；
Ｘｎ２は、保護されている水酸基またはアミノ基を示し；
ｍ、ｍ＋１個のＸ、ｍ個のＲ１０、ｍ個のＲｐ１、Ｌ、ＹおよびＺは、それぞれ独立して、前記と同義である。］
【０１８４】
式（ａ−ＶＩ）中、ｍ＋１個のＢａｓｅ１の少なくとも一つは、−Ｌ−Ｙ−Ｚで保護されている核酸塩基である。核酸塩基および−Ｌ−Ｙ−Ｚの説明は、前記の通りである。
また、保護されていてもよい核酸塩基の説明も、前記の通りである。
【０１８５】
保護されている水酸基（Ｘｎ２）の保護基としては、特に限定されず、例えば、プロテクティブ・グループス・イン・オーガニック・シンセシス（ＰＲＯＴＥＣＴＩＶＥ  ＧＲＯＵＰＳ  ＩＮ  ＯＲＧＡＮＩＣ  ＳＹＮＴＨＥＳＩＳ）、第３版、ジョン・ウィリー・アンド・サンズ（ＪＯＨＮ  ＷＩＬＬＹ＆ＳＯＮＳ）出版（１９９９年）等に記載されている任意の保護基を挙げることができる。具体的には、メチル基、ベンジル基、ｐ−メトキシベンジル基、ｔｅｒｔ−ブチル基、メトキシエチル基、、エトキシエチル基、シアノエチル基、シアノエトキシメチル基、フェニルカルバモイル基、１，１−ジオキソチオモルホリン−４−チオカルバモイル基、アセチル基、ピバロイル基、ベンゾイル基、トリエチルシリル基、トリイソプロピルシリル基、ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル基、［（トリイソプロピルシリル）オキシ］メチル（Ｔｏｍ）基、１−（４−クロロフェニル）−４−エトキシピペリジン−４−イル（Ｃｐｅｐ）基等を挙げることができる。水酸基の保護基は、好ましくは、トリエチルシリル基、トリイソプロピルシリル基またはｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル基であり、経済性および入手の容易さの観点から、より好ましくはｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル基である。なお、水酸基の保護および脱保護は周知であり、例えば上述のプロテクティブ・グループス・イン・オーガニック・シンセシスに記載の方法によって行うことができる。
【０１８６】
保護されているアミノ基（Ｘｎ２）の保護基としては、特に限定されず、例えば、グリーンズ・プロテクティブ・グループス・イン・オーガニック・シンセシス（Ｇｒｅｅｎｅ’ｓ  ＰＲＯＴＥＣＴＩＶＥ  ＧＲＯＵＰＳ  ｉｎ  ＯＲＧＡＮＩＣ  ＳＹＮＴＨＥＳＩＳ）、第４版、ウィリー・インターサイエンス（Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ）出版（２００６年）等に記載されている保護基を挙げることができる。各保護基の具体例としては、ピバロイル基、ピバロイロキシメチル基、アセチル基、トリフルオロアセチル基、フェノキシアセチル基、４−イソプロピルフェノキシアセチル基、４−ｔｅｒｔ−ブチルフェノキシアセチル基、ベンゾイル基、イソブチリル基、（２−ヘキシル）デカノイル基、ジメチルホルムアミジニル基、１−（ジメチルアミノ）エチリデン基、９−フルオレニルメチルオキシカルボニル基を挙げることができる。アミノ基の保護基は、好ましくは、アセチル基、フェノキシアセチル基、４−イソプロピルフェノキシアセチル基、ベンゾイル基、イソブチリル基、（２−ヘキシル）デカノイル基、ジメチルホルムアミジニル基、または１−（ジメチルアミノ）エチリデン基である。なお、アミノ基の保護および脱保護は周知であり、例えば上述のプロテクティブ・グループス・イン・オーガニック・シンセシスに記載の方法によって行うことができる。
【０１８７】
式（ａ−ＶＩ）中のｍ個のＸｎ１は、好ましくは酸素原子である。
式（ａ−ＶＩ）中のＸｎ２は、好ましくは保護されている水酸基である。
式（ａ−ＶＩ）中のｍ個のＲｐ１は、好ましくは、それぞれ独立して−ＣＨ２ＣＨ２ＷＧで表される基である。
式（ａ−ＶＩ）中の他の記号の説明は、前記の通りである。
化合物（ａ−ＶＩ）は、好ましくは下記式（ａ−ｖｉ）で表される化合物である。
【０１８８】
【化２４】
2020166705.tif 000025
【０１８９】
［式中、
Ｒｎ４は、水酸基の保護基を示し；
ｍ、ｍ＋１個のＢａｓｅ１、ｍ＋１個のＸ、ｍ個のＲ１０、ｍ個のＲｐ１、Ｌ、ＹおよびＺは、それぞれ独立して、前記と同義である。］
【０１９０】
式（ａ−ｖｉ）中のＲｎ４の説明は、Ｘｎ２における水酸基の保護基の説明と同じである。
式（ａ−ｖｉ）中の他の記号の説明は、前記の通りである。
【０１９１】
また、ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド（ａ１）としては、例えば、下記式（ａ−ＶＩＩ）で表される化合物が挙げられる。
【０１９２】
【化２５】
2020166705.tif 000026
【０１９３】
［式中、
ｍ＋１個のＸｎ１は、それぞれ独立して、酸素原子またはＮＨを示し；
Ｌｎ１は有機基を示し；
ｍ、ｍ＋１個のＢａｓｅ、ｍ＋１個のＸ、ｍ＋１個のＲ１０、ｍ＋１個のＲｐ１、Ｌ、ＹおよびＺは、それぞれ独立して、前記と同義である。］
【０１９４】
式（ａ−ＶＩＩ）中のＬｎ１は、好ましくはＣ２−６アルキレン基、より好ましくはエチレン基である。
式（ａ−ＶＩＩ）中のｍ＋１個のＸｎ１は、好ましくは酸素原子である。
式（ａ−ＶＩＩ）中のｍ＋１個のＲｐ１は、好ましくは、それぞれ独立して−ＣＨ２ＣＨ２ＷＧで表される基である。
式（ａ−ＶＩＩ）中の他の記号の説明は、前記の通りである。
化合物（ａ−ＶＩＩ）は、好ましくは下記式（ａ−ｖｉｉ）で表される化合物である（下記式中の記号の定義および説明は、前記の通りである）。
【０１９５】
【化２６】
2020166705.tif 000027
【０１９６】
化合物（ａ−ＶＩＩ）は、自体公知の方法またはこれに準ずる方法で製造することができる。ｍが０であり、Ｘｎ１が酸素原子であり、Ｌがスクシニル基である化合物（ａ−ＶＩＩ）は、例えば、以下のような工程によって製造することができる。
（ｉ）化合物Ｚ−Ｙ−Ｈとコハク酸無水物とを縮合させて、Ｚ−Ｙ−ＣＯ（ＣＨ２）２ＣＯＯＨを製造する、
（ｉｉ）得られたＺ−Ｙ−ＣＯ（ＣＨ２）２ＣＯＯＨを、縮合剤の存在下、式：ＨＯ−Ｌｎ１−ＯＱ”で表される化合物（前記式中、Ｑ”は一時保護基を示し、Ｌｎ１は有機基を示す。）と縮合させた後、脱保護して、Ｚ−Ｙ−ＣＯ（ＣＨ２）２ＣＯ−Ｏ−Ｌｎ１−ＯＨを製造する、
（ｉｉｉ）得られたＺ−Ｙ−ＣＯ（ＣＨ２）２ＣＯ−Ｏ−Ｌｎ１−ＯＨにホスホロアミダイト化されたヌクレオシドを反応させて、ｍが０であり、Ｘｎ１が酸素原子であり、Ｌがスクシニル基である化合物（ａ−ＶＩＩ）を製造する。
上述のような縮合反応および脱保護反応は当業者にとって周知であり、当業者は、適宜条件を設定して行うことができる。
【０１９７】
Ｌがスクシニル基以外である化合物（ａ−ＶＩＩ）も、コハク酸無水物に代えて、対応する酸無水物、対応するジカルボン酸ハライド、対応するジカルボン酸の活性エステル等を用いて、同様の反応を行うことにより製造することができる。また、Ｘｎ１がＮＨである化合物（ａ−ＶＩＩ）は、３’位アミノ基がホスホロアミダイト化されたヌクレオシドを用いて、同様の反応を行うことにより製造することができる。また、ｍが１以上である化合物（ａ−ＶＩＩ）は、ｍが０である化合物（ａ−ＶＩＩ）を出発原料として用いて伸長プロセスを繰り返すことによって製造することができる。
【０１９８】
本工程で使用するヌクレオシド、ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド（ａ）或いはヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド（ａ１）は、好ましくは化合物（ａ−Ｉ）、化合物（ａ−ＶＩ）または化合物（ａ−ＶＩＩ）であり、より好ましくは化合物（ａ−ｉ）、化合物（ａ−ｖｉ）または化合物（ａ−ｖｉｉ）であり、より一層好ましくは化合物（ａ−ｉ）または化合物（ａ−ｖｉ）であり、さらに好ましくは化合物（ａ−ｉ）であり、さらに一層好ましくは化合物（ａ−ＩＩ）または化合物（ａ−ＩＶ）であり、特に好ましくは化合物（ａ−ＩＩＩ）または化合物（ａ−Ｖ）である。
【０１９９】
本工程で使用するヌクレオシド、ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド（ｂ）は、５’位水酸基が一時保護基で保護されている。水酸基の一時保護基としては、酸性条件下で脱保護が可能であり、且つ水酸基の保護基として用いられるものであれば、特に限定はされないが、例えば、トリチル基、９−（９−フェニル）キサンテニル基、９−フェニルチオキサンテニル基、１，１−ビス（４−メトキシフェニル）−１−フェニルメチル基（ジメトキシトリチル基）等のビス（Ｃ１−６アルコキシ）トリチル基、１−（４−メトキシフェニル）−１，１−ジフェニルメチル基（モノメトキシトリチル基）等のモノ（Ｃ１−１８アルコキシ）トリチル基等を挙げることができる。これらの中でも、脱保護のしやすさ、入手の容易さの観点から、水酸基の一時保護基は、モノメトキシトリチル基またはジメトキシトリチル基であることが好ましく、ジメトキシトリチル基であることがより好ましい。
【０２００】
ヌクレオシド、ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド（ｂ）は、ホスホロアミダイト法、Ｈ−ホスホネート法、ジハロホスフィン法またはオキサザホスホリジン法の公知の方法に従い合成することができる。
ホスホロアミダイト法については、例えば、Ｍ．  Ｈ．  Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｅｔｈｏｄ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  １９８７，  １５４，  ２８７−３１３；  Ｓ．  Ｌ．  Ｂｅａｕｃａｇｅ  ａｎｄ  Ｍ．  Ｈ．  Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ，  Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  １９８１，  ２２，  １８５９−１８６２；日本化学会編第５版  実験化学講座１６  有機化合物ＩＶ  ２０１０年  ３７７〜３８１頁などを参照して実施することができる。
例えば、ホスホロアミダイト法で用いるホスホロアミダイト化試薬は市販されており、容易に入手することができる。例えば、ジクロロメタン等のハロゲン系溶媒中で、３’位アミノ基を有するヌクレオシド、ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド（ｂ）と、２−シアノエチル  Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルクロロホスホロアミダイトとを反応させることによって、３’位アミノ基がホスホロアミダイト化されたヌクレオシド、ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド（ｂ）を合成することができる。
Ｈ−ホスホネート法については、例えば、Ｂ．  Ｆ．  Ｆｒｏｅｈｌｅｒ，  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｆｏｒ  Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ａｎａｌｏｇｓ  （Ｃｈａｐｔｅｒ  ４）  １９９３年，６３−８０頁；日本化学会編第５版  実験化学講座１６  有機化合物ＩＶ  ２０１０年  ３８１〜３８４頁などを参照して実施することができる。
ジハロホスフィン法については、例えば、日本化学会編第４版  実験化学講座２２  金属錯体遷移金属クラスター  １９９９年  ４２６〜４３１頁などを参照して実施することができる。
オキサザホスホリジン法を用いる修飾については、例えば、Ｎ．Ｏｋａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，２００８年，１３０，１６０３１−１６０３７頁；  Ｎ．Ｏｋａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｌｅｔｔｅｒｓ．，２００９年，Ｖｏｌ．１１，Ｎｏ．４，９６７−９７０頁；ＷＯ２０１１／０８６８２などを参照して実施することができる。
【０２０１】
ヌクレオシド、ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド（ｂ）の製造方法の一例として、以下、３’位水酸基を有するホスホロアミダイト化されたヌクレオシド、ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド（ｂ）（以下「化合物（ｂ）」と略称することがある）から、３’位水酸基がホスホロアミダイト化されたヌクレオシド、ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド（ｂ）（以下「ホスホロアミダイト化された化合物（ｂ）」と略称することがある）を製造する方法を説明する。
【０２０２】
この製造方法は、三価のリン上に二つの窒素置換基を有するホスフィチル化剤前駆体をモノ選択的に活性化してホスフィチル化剤とし、該ホスフィチル化剤を用いて、塩基存在下、化合物（ｂ）の３’位水酸基をホスフィチル化する反応を含む。即ち、この製造方法は、以下の工程（Ｐ１）および工程（Ｐ２）を含むホスホロアミダイト化された化合物（ｂ）の製造方法である。
（Ｐ１）溶媒中で、下記式（ｐ１）：
【０２０３】
【化２７】
2020166705.tif 000028
【０２０４】
［式中、
Ｘｐ１は、酸素原子または硫黄原子を示し；
Ｒｐ２は、芳香環、水酸基の保護基またはチオール基の保護基を示し；
Ｒｐ３およびＲｐ４は、それぞれ独立してアルキル基を示し、該アルキル基は、隣接する窒素原子と一緒になって環を形成してもよい。］
で表されるホスフィチル化剤前駆体に活性化剤を作用させて、下記式（ｐ２）：
【０２０５】
【化２８】
2020166705.tif 000029
【０２０６】
［式中、
Ｚａは活性化剤に由来する基を示し；
他の記号は、前記と同義である。］
で表されるホスフィチル化剤を調製する工程、および
（Ｐ２）溶媒中で、化合物（ｂ）に、塩基の存在下、工程（Ｐ１）で得られたホスフィチル化剤を作用させて、化合物（ｂ）の３’位水酸基をホスフィチル化する工程。
【０２０７】
工程（Ｐ１）
式（ｐ１）中、Ｒｐ２の芳香環としては、フェニル、４−ニトロフェニル、２，４−ジニトロフェニル、ペンタフルオロフェニル、ペンタクロロフェニル、２−ブロモフェニル、４−ブロモフェニル、２−メチルフェニル、２，６−ジメチルフェニル等が挙げられ、好ましくは４−ニトロフェニルである。
【０２０８】
式（ｐ１）中、Ｒｐ２における水酸基の保護基またはチオール基の保護基としては、例えば、Ｃ１−６アルキル基（例、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、イソブチル、ｓ−ブチル、ｔ−ブチル、ペンチル、イソペンチル）；シアノ化Ｃ１−６アルキル基（例、２−シアノエチル、２−シアノ−１，１−ジメチルエチル）；置換シリル基で置換されたエチル基（例、２−メチルジフェニルシリルエチル、２−トリメチルシリルエチル、２−トリフェニルシリルエチル）；ハロゲン化Ｃ１−６アルキル基（例、２，２，２−トリクロロエチル、２，２，２−トリブロモエチル、２，２，２−トリフルオロエチル）；Ｃ２−６アルケニル基（例、エテニル、１−プロペニル、２−プロペニル、１−メチル−２−プロペニル、１−メチル−１−プロペニル）；Ｃ３−６シクロアルキル基（例、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル）；シアノ化Ｃ１−６アルケニル基（例、２−シアノブテニル）；Ｃ７−１１アラルキル基（例、ベンジル、α−ナフチルメチル、β−ナフチルメチル）；Ｃ６−１０アリール基（例、フェニル、インデニル、ナフチル）が挙げられ、より好ましくはシアノ化Ｃ１−６アルキル基であり、特に好ましくは２−シアノエチルである。
【０２０９】
式（ｐ１）中、Ｒｐ３およびＲｐ４は、それぞれ独立してアルキル基を示すが、該アルキル基は隣接する窒素原子と一緒になって環（例、ピロリジン）を形成してもよい。Ｒｐ３およびＲｐ４は、好ましくは、いずれもイソプロピル基である。
ホスフィチル化剤前駆体としては、下記化合物が特に好ましい。
【０２１０】
【化２９】
2020166705.tif 000030
【０２１１】
活性化剤をホスフィチル化剤前駆体に作用させることで、ホスフィチル化剤が得られる。
活性化剤は、ホスホロアミダイト上のアミンを置換して、水酸基等との反応性置換基を付与し得る酸である。具体的には、ｐＫａ  ５以上の弱酸性活性化剤、より好ましくはｐＫａ  ５以上のアゾール系化合物およびそのＣ上置換体から選ばれる少なくとも１種である。アゾール系化合物としては、テトラゾール、トリアゾール、イミダゾール等が挙げられ、Ｃ上置換体としては、ジシアノイミダゾール、ビス(トリフルオロメチル)イミダゾール、ジクロロイミダゾール等のハロゲン原子でジ置換された化合物が用いられる。特に好ましくはジシアノイミダゾールおよびジクロロイミダゾールである。
【０２１２】
式（ｐ２）において、Ｚａは活性化剤に由来する基であり、例えば活性化剤から水素原子を１つ除いた基であり、活性化剤としてジシアノイミダゾールを用いた場合、Ｚａはジシアノイミダゾリルであり、活性化剤としてジクロロイミダゾールを用いた場合、Ｚａはジクロロイミダゾリルである。
【０２１３】
本工程で使用する溶媒は、ホスフィチル化剤前駆体を溶解し、活性化剤が難溶性となるものであれば特に限定されないが、酸性または塩基性の官能基を通常有さない。ここで「難溶性」とは、溶媒中の活性化剤の濃度が６μＭ以下であることを目安とする。具体的には、トルエン、ベンゼン、ｏ−キシレン、ｍ−キシレン、ｐ−キシレン、エチルベンゼン、ペンタン、ヘキサン、ヘプタン、オクタン、シクロペンタン、シクロヘキサン、ジエチルエーテル、ジイソプロピルエーテル、ｔｅｒｔ−ブチルメチルエーテル、シクロペンチルメチルエーテル、四塩化炭素等が挙げられ、好ましくはトルエン、シクロヘキサン、特に好ましくはトルエンである。
【０２１４】
本工程の反応温度および反応時間は、基質・生成物が析出しない限り特に限定されないが、それぞれ、通常、４０℃以下、好ましくは０〜３０℃、より好ましくは５〜１５℃、特に好ましくは１０℃程度であり、通常０．５〜２４時間、好ましくは１〜１２時間、より好ましくは１〜６時間である。
【０２１５】
活性化剤とホスフィチル化剤前駆体との使用量は、ホスフィチル化剤前駆体が活性化される限り特に限定されないが、ホスフィチル化剤前駆体に対して、通常過剰量で、好ましくは１．５〜１０モル当量で用いられる。過剰量の活性化剤をホスフィチル化剤前駆体に溶媒中で作用させることで、ホスフィチル化剤前駆体を活性化すると同時に、ホスフィチル化時に副生するジイソプロピルアミンを活性化剤との塩として沈殿させる。従って、必要に応じて、工程（Ｐ１）と下記工程（Ｐ２）との間に、沈殿等の不溶物を分離する工程を実施することができ、また、実施することが好ましい。
【０２１６】
工程（Ｐ２）
本工程では、溶媒中で、化合物（ｂ）に、塩基の存在下、工程（Ｐ１）で得られたホスフィチル化剤を作用させて、化合物（ｂ）の３’位水酸基をホスフィチル化し、ホスホロアミダイト化された化合物（ｂ）を製造する。
【０２１７】
本工程で使用する溶媒としては、工程（Ｐ１）で使用した溶媒と同様のもの（例えば、トルエン）を用いることができる。また、本工程で使用する溶媒として、例えば、ジクロロメタン、クロロホルム等が挙げられる。トルエンとジクロロメタンの混合溶媒が好ましい。
【０２１８】
本工程で使用する塩基は、反応により生じた酸（活性化剤）の中和に十分な塩基性を有し、且つリン酸上の脱シアノエチルを引き起こさずＰ−Ｎ結合を形成しない塩基が選択される。そのような塩基としては、具体的には、ｐＫａ  ５〜８の塩基、好ましくは、コリジン、Ｎ−メチルモルホリン、ジエチルアニリン等が用いられる。ｐＫａ  ８より高い塩基を用いると脱シアノ化が顕著となり、ｐＫａ  ５未満の塩基を用いると反応の進行に伴い再生した活性化剤の捕捉が不十分となり副生物が生じる。
【０２１９】
工程（Ｐ２）では、ホスフィチル化剤前駆体は添加してもしなくてもよいが、添加することが好ましい。
【０２２０】
ヌクレオシド、ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド（ｂ）としては、例えば、下記式（ｂ−Ｉ）で表される化合物（即ち、ヌクレオシドまたはオリゴヌクレオチド）が挙げられる。
【０２２１】
【化３０】
2020166705.tif 000031
【０２２２】
［式中、
ｑは、０以上の整数を示し；
ｑ＋１個のＢａｓｅ２は、それぞれ独立して、−Ｌ−Ｘ−Ｚおよび核酸合成に用いられる保護基から選ばれる保護基で保護されていてもよい核酸塩基を示し；
ｑ＋１個のＸ、ｑ＋１個のＲｐ１、ｑ個のＲ１０、Ｌ、ＸおよびＺは、それぞれ独立して、前記と同義であり；
ｑ＋１個のＸｎ１は、それぞれ独立して、酸素原子またはＮＨを示し；
Ｑ”は、酸性条件下で除去可能な水酸基の一時保護基を示し；
Ｒ３６およびＲ３７は、それぞれ独立して、アルキル基を示すか、または隣接する窒素原子と一緒になって形成する５または６員の飽和環状アミノ基を示し、かかる飽和環状アミノ基は、窒素原子の他に環構成原子として酸素原子または硫黄原子を１個有していてもよい。］
【０２２３】
Ｒ３６およびＲ３７は、それぞれ独立して、好ましくはＣ１−１０アルキル基であるか、または隣接する窒素原子と一緒になって形成する５または６員の飽和環状アミノ基であり、より好ましくはＣ１−１０アルキル基であり、さらに好ましくはＣ１−６アルキル基である。
【０２２４】
酸性条件下で除去可能な水酸基の一時保護基の説明は、前記の通りである。Ｑ”は、好ましくはモノメトキシトリチル基またはジメトキシトリチル基であり、より好ましくはジメトキシトリチル基である。
【０２２５】
式（ｂ−Ｉ）中の核酸塩基のアミノ基は、保護基で保護されていることが好ましい。該保護基としては、−Ｌ−Ｘ−Ｚおよび核酸合成に用いられる保護基から選ばれる保護基が挙げられる。Ｌ、ＸおよびＺの説明は、前記の通りである。核酸合成に用いられる保護基としては、アセチル基、フェノキシアセチル基、４−イソプロピルフェノキシアセチル基、ベンゾイル基、イソブチリル基、（２−ヘキシル）デカノイル基、ジメチルホルムアミジニル基、および＝ＮＣ（Ｒ１１）−Ｎ（Ｒ１２）（Ｒ１３）基（式中、Ｒ１１は、メチル基を示し、Ｒ１２およびＲ１３は、それぞれ独立してＣ１−５アルキル基を示すか、またはＲ１１およびＲ１２が一緒になって、それらが結合する炭素原子および窒素原子と共に５員または６員の含窒素炭化水素環を形成していてもよい。）が好ましい。なお、前記＝ＮＣ（Ｒ１１）−Ｎ（Ｒ１２）（Ｒ１３）基としては、例えば１−（ジメチルアミノ）エチリデン基が挙げられる。化合物（ｂ−Ｉ）が複数のアミノ基を有する場合、アミノ基の保護基は１種のみでもよく、２種以上でもよい。
【０２２６】
ｑが０である場合、化合物（ｂ−Ｉ）はヌクレオシドであり、ｑが１以上である場合、化合物（ｂ−Ｉ）はオリゴヌクレオチドである。本工程で使用する化合物（ｂ−Ｉ）において、ｑは、４９以下が好ましく、２９以下がより好ましく、１９以下がさらに好ましく、４以下が特に好ましく、２以下が最も好ましい。
【０２２７】
ｑ＋１個のＸは、それぞれ独立して、好ましくは水素原子、ハロゲン原子、または保護されていてもよい水酸基であり、より好ましくは水素原子または保護されていてもよい水酸基である。
Ｂａｓｅ２は、それぞれ独立して、好ましくは核酸合成に用いられる保護基から選ばれる保護基で保護されていてもよい核酸塩基である。
ｑ＋１個のＲｐ１は、それぞれ独立して、好ましくはＣＨ２ＣＨ２ＷＧで表される基である。
ｑ＋１個のＸｎ１は、好ましくは酸素原子である。
Ｌ、ＸおよびＺの説明は、前記の通りである。
化合物（ｂ−Ｉ）は、好ましくは下記式（ｂ−ｉ）で表される化合物である。
【０２２８】
【化３１】
2020166705.tif 000032
【０２２９】
［式中、
ｑ＋１個のＢａｓｅ３は、それぞれ独立して、核酸合成に用いられる保護基で保護されていてもよい核酸塩基を示し、
ｑ、ｑ＋１個のＸ、ｑ＋１個のＲｐ１、ｑ個のＲ１０、Ｑ”、Ｒ３６およびＲ３７は、それぞれ独立して、前記と同義である。］
【０２３０】
式（ｂ−ｉ）中、核酸合成に用いられる保護基、ｑ、ｑ＋１個のＸ、ｑ＋１個のＲｐ１、ｑ個のＲ１０、Ｑ”、Ｒ３６およびＲ３７の説明は、前記の通りである。
【０２３１】
本工程で使用するヌクレオシド、ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド（ａ）或いはヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド（ａ１）とヌクレオシド、ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド（ｂ）との組合せは、
好ましくは化合物（ａ−Ｉ）、化合物（ａ−ＶＩ）または化合物（ａ−ＶＩＩ）と化合物（ｂ−Ｉ）との組合せであり、
より好ましくは化合物（ａ−ｉ）、化合物（ａ−ｖｉ）または化合物（ａ−ｖｉｉ）と化合物（ｂ−ｉ）との組合せであり、
より一層好ましくは化合物（ａ−ｉ）または化合物（ａ−ｖｉ）と化合物（ｂ−ｉ）との組合せであり、
さらに好ましくは化合物（ａ−ｉ）と化合物（ｂ−ｉ）との組合せであり、
さらに一層好ましくは化合物（ａ−ＩＩ）または化合物（ａ−ＩＶ）と化合物（ｂ−ｉ）との組合せであり、
特に好ましくは化合物（ａ−ＩＩＩ）または化合物（ａ−Ｖ）と化合物（ｂ−ｉ）との組合せである。
【０２３２】
本工程の縮合反応の進行が遅い場合には、縮合剤（例えば、ピリジン・トリフルオロ酢酸塩、テトラゾール、５−ベンジルチオ−１Ｈ−テトラゾール、４，５−ジシアノイミダゾール等）を添加してもよい。
【０２３３】
本工程は、液相法の場合、非極性溶媒中で行われる。非極性溶媒としては、例えば、クロロホルム、ジクロロメタン、１，２−ジクロロエタン等のハロゲン系溶媒；ベンゼン、トルエン、キシレン、メシチレン等の芳香族系溶媒；酢酸エチル、酢酸イソプロピル等のエステル系溶媒；ヘキサン、ペンタン、ヘプタン、オクタン、ノナン、シクロヘキサン等の脂肪族系溶媒；ジエチルエーテル、シクロペンチルメチルエーテル、ｔｅｒｔ−ブチルメチルエーテル等の非極性エーテル系溶媒が挙げられる。非極性溶媒は、１種のみを使用してもよく、２種以上を併用してもよい。非極性溶媒としては、ハロゲン系溶媒、芳香族系溶媒、エステル系溶媒、脂肪族系溶媒、およびこれらの組合せが好ましく；ジクロロメタン、クロロホルム、１，２−ジクロロエタン、ベンゼン、トルエン、キシレン、メシチレン、ヘキサン、ペンタン、ヘプタン、ノナン、シクロヘキサン、酢酸エチル、酢酸イソプロピルおよびこれらの組合せがより好ましく；クロロホルム、ジクロロメタン、トルエン、およびこれらの組合せがさらに好ましい。本工程以降の工程で用いられる非極性溶媒も同様である。
【０２３４】
本工程におけるヌクレオシド、ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド（ｂ）の使用量は、液相法の場合、本工程におけるヌクレオシド、ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド（ａ）或いはヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド（ａ１）の使用量１モルに対して、例えば１〜１０モル、好ましくは１〜５モルであり、固相法の場合、本工程におけるヌクレオシド、ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド（ａ）の使用量１モルに対して、例えば１〜２０モル、好ましくは１〜１０モルである。
【０２３５】
本工程における反応温度は、反応が進行しさえすれば特に限定されないが、液相法の場合、０℃〜１００℃が好ましく、２０℃〜５０℃がより好ましく、固相法の場合、１０℃〜４０℃が好ましく、２０℃〜３０℃がより好ましい。反応時間は、使用する原料の種類、反応温度等によって異なるが、液相法の場合、例えば５分〜２４時間であり、固相法の場合、例えば１分〜３０分である。
【０２３６】
（３’位水酸基または３’位アミノ基がホスホロアミダイト法、Ｈ−ホスホネート法、ジハロホスフィン法およびオキサザホスホリジン法から選択される方法により修飾されたヌクレオシド、ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド（ｂ）のクエンチ）
本発明では、工程（１）（縮合）の後に、工程（２）（（２−１）（硫化）または（２−２）（酸化））および工程（３）（脱保護）を行う。そのため、液相法の場合、工程（２）および（３）の際の副生成物の生成を抑制するために、工程（２）の前にヌクレオシド、ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド（ｂ）をクエンチすることが好ましい。そのため、本発明の製造方法は、縮合後の反応液にクエンチ剤を添加する工程を含むことが好ましい。
【０２３７】
オリゴヌクレオチド製法の分野において、３’位水酸基または３’位アミノ基がホスホロアミダイト法、Ｈ−ホスホネート法、ジハロホスフィン法およびオキサザホスホリジン法から選択される方法により修飾されたヌクレオシドまたはオリゴヌクレオチドのクエンチ剤として公知のものを、本工程におけるクエンチ剤として使用することができる。クエンチ剤は、１種のみを使用してもよく、２種以上を併用してもよい。クエンチ剤としては、例えば、アルコール類、フェノール類およびアミン類が挙げられる。
【０２３８】
クエンチ剤として使用し得るアルコール類としては、例えば、メタノール、２−プロパノール、ｔ−ブタノール、２，２，２，−トリフルオロエタノール、テトラヒドロフルフリルアルコール、フルフリルアルコール、２，３−Ｏ−イソプロピリデン−Ｄ−リボフラノース、３’−Ｏ−トリイソプロピルシリル−チミジン等のハロゲン化されていてもよい１価アルコール、エチレングリコール、ジエチレングリコール等のハロゲン化されていてもよい多価アルコールが挙げられる。
【０２３９】
クエンチ剤として使用し得るフェノール類としては、例えば、４−ニトロフェノールやペンタフルオロフェノールが挙げられる。クエンチ剤として使用し得るアミン類としては、例えば、モルホリンが挙げられる。
【０２４０】
クエンチ剤は、好ましくは、アルコール類およびアミン類から選ばれる少なくとも一つであり、より好ましくはメタノール、２−プロパノール、ｔ−ブタノール、２，２，２−トリフルオロエタノール、テトラヒドロフルフリルアルコール、およびモルホリンから選ばれる少なくとも一つである。工程（３）（脱保護）の脱保護時に、オリゴヌクレオチド（ｅ）の核酸塩基におけるアミノ基の保護基の脱落を防止するために、クエンチ剤は、さらに好ましくは、２−プロパノール、ｔ−ブタノールおよび２，２−トリフルオロエタノールから選ばれる少なくとも一つである。
【０２４１】
本工程におけるクエンチ剤の使用量は、工程（１）におけるヌクレオシド、ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド（ｂ）の使用量１モルに対して、好ましくは１〜２０モル、より好ましくは１〜１０モル、さらに好ましくは１〜５モルである。
【０２４２】
クエンチ剤の添加後の反応液の温度は、ヌクレオシド、ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド（ｂ）がクエンチできさえすれば特に限定されないが、５℃〜４０℃が好ましく、１５℃〜３０℃がより好ましい。クエンチ剤の添加後の反応液の撹拌時間は、使用するクエンチ剤の種類、温度等によって異なるが、例えば１０分〜３時間である。
【０２４３】
工程（２）：（２−１）（硫化）
本工程は、５’位水酸基が酸性条件下で除去可能な一時保護基で保護されたホスファイト体または亜リン酸ジエステル（ｃ）に硫化剤を反応させることにより、そのホスファイト結合または亜リン酸ジエステル結合をホスホロチオエート結合へと変換させて、５’位水酸基が酸性条件下で除去可能な一時保護基で保護されたホスホロチオエート化部位を有するオリゴヌクレオチド（ｄ）を得る工程である。硫化剤は、その１種のみを使用してもよく、２種以上を併用してもよい。
【０２４４】
本工程に使用する硫化剤としては、ホスファイト結合または亜リン酸ジエステル結合を、ホスホロチオエート結合に変換しうる能力がありさえすれば、特に限定されないが、５−［（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノメチリデン）アミノ］−３Ｈ−１，２，４−ジチアゾール−３−チオン（ＤＤＴＴ）、３Ｈ−１，２−ベンゾジチオール−３−オン−１，１−ジオキシド（Ｂｅａｕｃａｇｅ試薬）、３Ｈ−１，２−ベンゾジチオール−３−オン、フェニルアセチルジスルフィド（ＰＡＤＳ）、テトラエチルチウラムジスルフィド（ＴＥＴＤ）、ジペンタメチレンチウラムテトラスルフィド、５−フェニル−３Ｈ−１，２，４−ジチアゾール−３−オン（ＰＯＳ）、３−アミノ−１，２，４−ジチアゾール−５−チオン（ＡＤＴＴ、キサンタンヒドリド）、硫黄が好ましい。
【０２４５】
良好な反応が進行しうるという観点で、５−［（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノメチリデン）アミノ］−３Ｈ−１，２，４−ジチアゾール−３−チオン（ＤＤＴＴ）、３Ｈ−１，２−ベンゾジチオール−３−オン−１，１−ジオキシド（Ｂｅａｕｃａｇｅ試薬）、３Ｈ−１，２−ベンゾジチオール−３−オン、フェニルアセチルジスルフィド（ＰＡＤＳ）、５−フェニル−３Ｈ−１，２，４−ジチアゾール−３−オン（ＰＯＳ）がより好ましく、５−［（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノメチリデン）アミノ］−３Ｈ−１，２，４−ジチアゾール−３−チオン（ＤＤＴＴ）、３Ｈ−１，２−ベンゾジチオール−３−オン−１，１−ジオキシド（Ｂｅａｕｃａｇｅ試薬）、５−フェニル−３Ｈ−１，２，４−ジチアゾール−３−オン（ＰＯＳ）がさらに好ましく、５−［（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノメチリデン）アミノ］−３Ｈ−１，２，４−ジチアゾール−３−チオン（ＤＤＴＴ）、５−フェニル−３Ｈ−１，２，４−ジチアゾール−３−オン（ＰＯＳ）が特に好ましい。かかる硫化剤は、０．０５〜２Ｍの濃度になるように適当な溶媒で希釈して使用することができる。かかる希釈溶媒としては、反応に不活性な溶媒であれば特に限定されないが、例えば、ジクロロメタン、アセトニトリル、ピリジンまたはこれら任意の混合溶媒が挙げられる。
【０２４６】
硫化剤の使用量は、ホスファイト体または亜リン酸ジエステル（ｃ）１モルに対し、液相法の場合、例えば１〜５０モル、好ましくは１〜１０モルであり、固相法の場合、例えば１〜１００モル、好ましくは１〜２０モルである。
【０２４７】
反応温度は、反応が進行しさえすれば特に限定されないが、液相法の場合、０℃〜１００℃が好ましく、２０℃〜５０℃がより好ましく、固相法の場合、１０℃〜４０℃が好ましく、２０℃〜３０℃がより好ましい。反応時間は、ホスファイト体または亜リン酸ジエステル（ｃ）の種類、使用する硫化剤の種類、反応温度等によって異なるが、液相法の場合、例えば１分〜３時間であり、固相法の場合、例えば１分〜３０分である。
【０２４８】
工程（２）：（２−２）（酸化）
本工程は、５’位水酸基が酸性条件下で除去可能な一時保護基で保護されたホスファイト体または亜リン酸ジエステル（ｃ）に酸化剤を反応させることにより、そのホスファイト結合または亜リン酸ジエステル結合をホスフェート（リン酸ジエステルおよびリン酸トリエステルを含む）結合へと変換させて、５’位水酸基が酸性条件下で除去可能な一時保護基で保護されたホスフェート化部位を有するオリゴヌクレオチド（ｄ−２）を得る工程である。酸化剤は、その１種のみを使用してもよく、２種以上を併用してもよい。
【０２４９】
本工程に使用する酸化剤としては、ホスファイト結合または亜リン酸ジエステル結合を、ホスフェート結合に変換しうる能力がありさえすれば、特に限定されないが、良好な反応が進行しうるという観点で、ヨウ素が好ましい。
【０２５０】
かかる酸化剤は、適当な溶媒で希釈して使用することができる。かかる希釈溶媒としては、反応に不活性な溶媒であれば特に限定されないが、例えば、ピリジン、水、またはこれら任意の混合溶媒が挙げられ、ピリジンと水の混合溶媒が好ましい。ピリジンは酸化剤１モルに対し、３〜１０モルで、好ましくは、４〜６モルであり、水は酸化剤１モルに対し、１〜５モルで、好ましくは、２〜４モルである。
【０２５１】
酸化剤の使用量は、ホスファイト体または亜リン酸ジエステル（ｃ）１モルに対し、液相法の場合、例えば１〜５０モル、好ましくは１〜１０モルであり、固相法の場合、例えば１〜１００モル、好ましくは１〜２０モルである。
【０２５２】
反応温度は、反応が進行しさえすれば特に限定されないが、液相法の場合、０℃〜１００℃が好ましく、２０℃〜５０℃がより好ましく、固相法の場合、１０℃〜４０℃が好ましく、２０℃〜３０℃がより好ましい。反応時間は、ホスファイト体または亜リン酸ジエステル（ｃ）の種類、使用する酸化剤の種類、反応温度等によって異なるが、液相法の場合、例えば１分〜３時間であり、固相法の場合、例えば１分〜３０分である。
【０２５３】
工程（３）：（３−１）（ホスホロチオエート化部位を有するオリゴヌクレオチドの一時保護基の脱保護）、または（３−２）（ホスフェート化部位を有するオリゴヌクレオチドの一時保護基の脱保護）
本工程は、ホスホロチオエート化部位を有するオリゴヌクレオチド（ｄ−１）の一時保護基を酸によって除去し、５’位水酸基が保護されていないホスホロチオエート化部位を有するオリゴヌクレオチド（ｅ−１）粗製物を得る工程である。また、本工程は、ホスフェート化部位を有するオリゴヌクレオチド（ｄ−２）の一時保護基を酸によって除去し、５’位水酸基が保護されていないホスフェート化部位を有するオリゴヌクレオチド（ｅ−２）粗製物を得る工程である。酸は、１種のみを使用してもよく、２種以上を併用してもよい。
【０２５４】
本工程に使用する酸としては、良好な脱保護が達成できさえすれば特に限定されず、トリフルオロ酢酸、ジクロロ酢酸、トリクロロ酢酸、酢酸等のカルボン酸、トリフルオロメタンスルホン酸、メタンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸等のスルホン酸、ホスホン酸、リン酸等が挙げられるが、本発明が脱保護工程において脱保護された５’位水酸基がアシル化されるという問題を解決するためのものであるという観点から、好ましくは水酸基をアシル化し得るカルボン酸を少なくとも含み、より好ましくはトリフルオロ酢酸、ジクロロ酢酸またはトリクロロ酢酸を少なくとも含む。これら酸は、前記非極性溶媒で希釈しても構わない。また、前記酸を使用する際には、特定の塩基を組み合わせて、酸性度を適宜調整して使用しても構わない。本工程における酸の使用量は、ホスホロチオエート化部位を有するオリゴヌクレオチド（ｄ−１）１モルまたはホスフェート化部位を有するオリゴヌクレオチド（ｄ−２）１モルに対し、液相法の場合、例えば１〜１００モル、好ましくは１〜４０モルであり、固相法の場合、例えば１〜２００モル、好ましくは１〜８０モルである。
【０２５５】
本工程の反応温度は、反応が進行しさえすれば特に限定されないが、液相法の場合、−１０℃〜５０℃が好ましく、０℃〜４０℃がより好ましく、固相法の場合、１０℃〜５０℃が好ましく、２０℃〜３０℃がより好ましい。反応時間は、使用するホスホロチオエート化部位を有するオリゴヌクレオチド（ｄ−１）またはホスフェート化部位を有するオリゴヌクレオチド（ｄ−２）の種類、酸の種類および非極性溶媒の種類、反応温度等により異なるが、液相法の場合、例えば５分〜５時間であり、固相法の場合、例えば１分〜３０分である。
【０２５６】
本工程において、ホスホロチオエート化部位を有するオリゴヌクレオチド（ｄ−１）またはホスフェート化部位を有するオリゴヌクレオチド（ｄ−２）の５’位水酸基の一時保護基の除去反応中、または除去反応後に、カチオン捕捉剤を使用することが好ましい。即ち、一時保護基の除去反応をカチオン捕捉剤の存在下で行うか、または一時保護基の除去反応後に反応系にカチオン捕捉剤を添加することが好ましい。カチオン捕捉剤は、１種のみを使用してもよく、２種以上を併用してもよい。
【０２５７】
カチオン捕捉剤としては、除去された一時保護基による再保護（原料戻り）や脱保護された官能基への副反応が進行しなければ、特に限定されないが、ピロール、２−メチルピロール、３−メチルピロール、２，３−ジメチルピロール、２，４−ジメチルピロール等のピロール誘導体；インドール、３−メチルインドール、４−メチルインドール、５−メチルインドール、６−メチルインドール、７−メチルインドール、５，６−ジメチルインドール、６，７−ジメチルインドール等のインドール誘導体；２−メチルフラン、２，３−ジメチルフラン、２−メチル−３−（メチルチオ）フラン、メントフラン等のフラン誘導体を使用することができる。良好なカチオン捕捉効果が得られるという観点で、ピロール、２−メチルピロール、３−メチルピロール、２，３−ジメチルピロール、２，４−ジメチルピロール、インドール、３−メチルインドール、４−メチルインドール、５−メチルインドール、６−メチルインドール、７−メチルインドール、５，６−ジメチルインドール、６，７−ジメチルインドール、２−メチルフラン、２，３−ジメチルフラン、２−メチル−３−（メチルチオ）フラン、メントフランが好ましく、ピロール、３−メチルピロール、２，４−ジメチルピロール、インドール、４−メチルインドール、５−メチルインドール、６−メチルインドール、７−メチルインドール、５，６−ジメチルインドール、６，７−ジメチルインドールがより好ましく、ピロール、３−メチルピロール、インドールがさらに好ましく、ピロール、インドールがさらに一層好ましく、ピロールが特に好ましい。本工程におけるカチオン捕捉剤の使用量は、ホスホロチオエート化部位を有するオリゴヌクレオチド（ｄ−１）１モルまたはホスフェート化部位を有するオリゴヌクレオチド（ｄ−２）１モルに対し、液相法の場合、例えば１〜５０モル、好ましくは５〜２０モルである。
【０２５８】
（中和）
液相法の場合、工程（３）（脱保護）の後に、工程（３）で使用した酸を中和するため、反応系に塩基を添加してもよい。但し、本発明の製造方法では、工程（４）の後に、必要に応じて、固液分離または抽出および洗浄を行うことによって、工程（３）で使用した酸を、ホスホロチオエート化部位を有するオリゴヌクレオチド（ｅ−１）粗製物またはホスフェート化部位を有するオリゴヌクレオチド（ｅ−２）から除去することが可能である。そのため、中和工程は必須ではない。
【０２５９】
本工程において、塩基は１種のみを使用してもよく、２種以上を併用してもよい。使用する塩基としては、有機塩基が好ましい。有機塩基としては、ピリジン、２，４，６−トリメチルピリジン、ベンズイミダゾール、１，２，４−トリアゾール、Ｎ−フェニルイミダゾール、２−アミノ−４，６−ジメチルピリミジン、１，１０−フェナントロリン、イミダゾール、Ｎ−メチルイミダゾール、２−クロロベンズイミダゾール、２−ブロモベンズイミダゾール、２−メチルイミダゾール、２−フェニルベンズイミダゾール、Ｎ−フェニルベンズイミダゾール、５−ニトロベンズイミダゾールが好ましく、ピリジン、２，４，６−トリメチルピリジン、ベンズイミダゾール、１，２，４−トリアゾール、Ｎ−フェニルイミダゾール、Ｎ−メチルイミダゾール、２−アミノ−４，６−ジメチルピリミジン、１，１０−フェナントロリンがより好ましく、ピリジン、２，４，６−トリメチルピリジン、ベンズイミダゾール、１，２，４−トリアゾール、Ｎ−フェニルイミダゾールがさらに好ましく、ピリジン、２，４，６−トリメチルピリジン、ベンズイミダゾール、１，２，４−トリアゾールが特に好ましく、ピリジン、２，４，６−トリメチルピリジン、ベンズイミダゾールが最も好ましい。
【０２６０】
本工程における塩基の使用量は、工程（３）における酸の使用量１モルに対し、例えば１〜１０モルであり、好ましくは１〜３モルである。
【０２６１】
工程（４）：（４−１）（ホスホロチオエート化部位を有するオリゴヌクレオチドの加溶媒分解）、または（４−２）（ホスフェート化部位を有するオリゴヌクレオチドの加溶媒分解）
本工程は、ホスホロチオエート化部位を有するオリゴヌクレオチド（ｅ−１）粗製物に含まれる５’位水酸基がアシル化されたホスホロチオエート化部位を有するオリゴヌクレオチドを加溶媒分解して脱アシル化する工程である。また、本工程は、ホスフェート化部位を有するオリゴヌクレオチド（ｅ−２）粗製物に含まれる５’位水酸基がアシル化されたホスフェート化部位を有するオリゴヌクレオチドを加溶媒分解して脱アシル化する工程である。
本工程における「アシル化」は、前工程（３−１）または（３−２）において５’位水酸基の一時保護基を除去するために加えた酸が、５’位水酸基と反応することを指し、その結果、酸がカルボン酸の場合にはＲ−Ｃ（＝Ｏ）−が５’位の酸素原子に結合し、スルホン酸の場合にはＲ−Ｓ（＝Ｏ）２−が５’位の酸素原子に結合し、ホスホン酸の場合にはＨ−Ｐ（＝Ｏ）（ＯＨ）−が５’位の酸素原子に結合し、リン酸の場合にはＨ−Ｐ（＝Ｏ）２−が５’位の酸素原子に結合することを意味する。一方、本工程における「脱アシル化」は、本工程において生成したアシル化物が加溶媒分解により、５’位水酸基となることを指す。
本工程は、ホスホロチオエート化部位またはホスフェート化部位の酸素原子または硫黄原子に結合したシアノアルキル基（例えば、シアノエチル基）、アルコキシカルボニルアルキル基（例えば、エトキシカルボニルエチル基）、ハロゲノフェニル基（２−クロロフェニル基）等を脱落させないような弱酸性から弱塩基性条件下で行うのが好ましい。特に、塩基性に不安定なシアノアルキル基（例えば、シアノエチル基）の場合には、シアノアルキル基（例えば、シアノエチル基）を脱落させないようにすることが望まれ、また、アセチル基やベンゾイル基などの塩基上の側鎖保護基の脱落にも注意を払って用いる塩基や求核物質、ならびに必要に応じて塩基（非求核性塩基）の塩基性度および求核物質のｐＫａを選択する必要がある。
【０２６２】
本工程に使用する溶媒としては、５’位水酸基がアシル化されたホスホロチオエート化部位を有するオリゴヌクレオチドを脱アシル化することができさえすれば特に限定されない。また、本工程に使用する溶媒としては、５’位水酸基がアシル化されたホスフェート化部位を有するオリゴヌクレオチドを脱アシル化することができさえすれば特に限定されない。好ましくは塩基と求核物質との混合物である。塩基は、固相担体に担持された状態で用いることもできる。塩基としては、有機塩基が好ましく、例えば、３級アミン（例、Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノアセトニトリル、Ｎ，Ｎ−ジエチルアミノアセトニトリル、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルアミノアセトニトリル、１−ピロリジンアセトニトリル、１−ピペリジンアセトニトリル、Ｎ，Ｎ−ジメチルアニリン）、３級アミンと酸性カウンターとの中和塩（例、トリエチルアミン塩酸塩）、塩基性度を酸で調整した３級アミン（例、ジイソプロピルエチルアミン：ギ酸＝５：３の混合物）等の非求核性塩基、窒素原子を有する複素環式化合物（例、ピリジン、コリジン、ルチジン、メチルピリジン等のピリジン誘導体、Ｎ−メチルイミダゾールなどのイミダゾール系化合物）等が挙げられ、ピリジン誘導体が好ましい。求核物質としては、水やアルコール誘導体が好ましく、例えば、水、メタノール、エタノール、イソプロピルアルコール、ブタノール、べンジルアルコール、テトラヒドロフルフリルアルコール等が挙げられ、水、メタノールが好ましい。塩基と求核物質との混合物としては、好ましくは、非求核性塩基およびピリジン誘導体からなる群より選ばれる少なくとも１種の塩基と、水およびアルコール誘導体からなる群より選ばれる少なくとも１種の求核物質との混合物であり、より好ましくは、ピリジン、コリジン、ルチジンおよびメチルピリジンからなる群より選ばれる少なくとも１種の塩基と、水、メタノール、エタノール、イソプロピルアルコール、ブタノール、べンジルアルコールおよびテトラヒドロフルフリルアルコールからなる群より選ばれる少なくとも１種の求核物質との混合物であり、さらに好ましくは、ピリジンと水との混合物、ピリジンとメタノールとの混合物、ピリジンとエタノールとの混合物、コリジンと水との混合物、コリジンとメタノールとの混合物、コリジンとエタノールとの混合物、ルチジンと水との混合物、ルチジンとメタノールとの混合物、ルチジンとエタノールとの混合物であり、ピリジンと水との混合物、ピリジンとメタノールとの混合物、ピリジンとエタノールとの混合物が特に好ましい。
【０２６３】
本発明の１つの実施態様において、非求核性塩基のｐＫａは、シアノエチル基や核酸塩基側鎖保護基の脱落抑制の観点から、好ましくは３〜１０であり、より好ましくは４〜９であり、さらに好ましくは４〜７である。
本発明の別の実施態様において、求核物質が少なくとも水を含む場合、その塩基性（ｐＨ）を無機塩（例、炭酸ナトリウム水溶液、炭酸水素ナトリウム水溶液、バッファー溶液など）で調整することもできる。例えば、一残基目の脱トリチル化の後の加溶媒分解は、シアノエチル基がまだついていないため、比較的強塩基性条件を用いることができる。また、先に脱ＤＭＴｒ化で使用したＴＦＡを中和させないと塩基性にならないので、最初強い塩基で中和し、その後、弱い塩基で調整することもできる。そのｐＨは、好ましくは３．０〜８．０であり、より好ましくは４．０〜７．０であり、さらに好ましくは４．５〜６．０である。
【０２６４】
本工程における塩基の使用量は、使用する塩基の種類によって異なるが、液相法の場合で、脱保護工程後、精製せずにワンポットで本工程を実施する場合や固相法の場合には脱保護で使用した酸が反応液中に残っているため、より多くの塩基が必要となる。このことから、液相法（ワンポット法）や固相法では、使用した酸の量に対して１〜１０当量、好ましくは、３〜５当量の塩基が必要となる。一方、上記固相法以外や液相法（ワンポット法）以外の場合、ホスホロチオエート化部位を有するオリゴヌクレオチド（ｅ−１）粗製物１モルまたはホスフェート化部位を有するオリゴヌクレオチド（ｅ−２）粗製物１モルに対し、１〜５モル、好ましくは、１〜３モル必要である。
本工程の反応温度は、反応が進行しさえすれば特に限定されないが、液相法の場合、０℃〜５０℃が好ましく、５℃〜３０℃がより好ましく、固相法の場合、５℃〜４０℃が好ましく、１０℃〜３０℃がより好ましい。反応時間は、使用するホスホロチオエート化部位を有するオリゴヌクレオチド（ｅ−１）粗製物またはホスフェート化部位を有するオリゴヌクレオチド（ｅ−２）粗製物および溶媒の種類、反応温度等により異なるが、液相法の場合、例えば１０分〜２４時間であり、固相法の場合、例えば１分〜３０分である。
【０２６５】
（固液分離または抽出）
本発明の製造方法は、液相法の場合、工程（４−１）で得られたホスホロチオエート化部位を有するオリゴヌクレオチド（ｅ−１）または工程（４−２）で得られたホスフェート化部位を有するオリゴヌクレオチド（ｅ−２）を含む反応液に極性溶媒を添加し、ホスホロチオエート化部位を有するオリゴヌクレオチド（ｅ−１）またはホスフェート化部位を有するオリゴヌクレオチド（ｅ−２）を沈殿させて精製するか（固液分離）、または反応液に極性溶媒を添加し、極性溶媒−非極性溶媒間で分層させ、非極性溶媒層にホスホロチオエート化部位を有するオリゴヌクレオチド（ｅ−１）またはホスフェート化部位を有するオリゴヌクレオチド（ｅ−２）を移行させて精製する（抽出）工程を含んでいてもよい。固液分離および抽出のいずれの場合も、極性溶媒は、１種のみを使用してもよく、２種以上を併用してもよい。
【０２６６】
まず固液分離から説明する。固液分離で使用する極性溶媒としては、例えば、メタノール、エタノール、イソプロパノール等のアルコール系溶媒；アセトニトリル、プロピオニトリル等のニトリル系溶媒；アセトン、２−ブタノン等のケトン系溶媒；１，４−ジオキサン、テトラヒドロフラン等の極性エーテル系溶媒；ジメチルホルムアミド、ジメチルアセトアミド、Ｎ−メチルピペリドン等のアミド系溶媒、ジメチルスルホキシド等のスルホキシド系溶媒；水等、並びにこれらの混合溶媒が挙げられる。これらの中でも、ニトリル系溶媒が好ましく、アセトニトリルがより好ましい。
【０２６７】
ホスホロチオエート化部位を有するオリゴヌクレオチド（ｅ−１）またはホスフェート化部位を有するオリゴヌクレオチド（ｅ−２）の回収率を高めるために、固液分離における極性溶媒の添加量は、反応液中に含まれる非極性溶媒１ｍＬに対して、好ましくは１〜２０ｍＬ、より好ましくは１〜１０ｍＬ、さらに好ましくは１〜５ｍＬである。
【０２６８】
極性溶媒は、ホスホロチオエート化部位を有するオリゴヌクレオチド（ｅ−１）またはホスフェート化部位を有するオリゴヌクレオチド（ｅ−２）の極性溶媒中へのロスを最小限とするために水を含んでいてもよい。この場合、極性溶媒中の水の含有量は、１〜１０％（ｖ／ｖ）が好ましく、３〜８％（ｖ／ｖ）がより好ましい。水の含有量が低すぎる場合は、ホスホロチオエート化部位を有するオリゴヌクレオチド（ｅ−１）またはホスフェート化部位を有するオリゴヌクレオチド（ｅ−２）の極性溶媒中へのロスが増える場合があり、水の含有量が高すぎる場合は、不純物の極性溶媒中への除去が不十分となる傾向がある。
【０２６９】
ホスホロチオエート化部位を有するオリゴヌクレオチド（ｅ−１）またはホスフェート化部位を有するオリゴヌクレオチド（ｅ−２）の回収率を高めるために、ＷＯ２０１６／１１７６６３に記載されているような沈殿促進剤（例えば、３，４，５−トリス（オクタデシルオキシ）ベンジル  ２，２−ジメチルプロパノエート）を使用してもよい。
【０２７０】
次に抽出について説明する。抽出の操作は、特に限定されないが、好ましくは、ホスホロチオエート化部位を有するオリゴヌクレオチド（ｅ−１）またはホスフェート化部位を有するオリゴヌクレオチド（ｅ−２）を含む反応液に極性溶媒を添加して、極性溶媒−非極性溶媒間で分層させ、非極性溶媒層にホスホロチオエート化部位を有するオリゴヌクレオチド（ｅ−１）またはホスフェート化部位を有するオリゴヌクレオチド（ｅ−２）を移行させることによって行われる。この抽出によって、残存する原料、副生成物等の不純物を極性溶媒層に移行させ、除去することができる。
【０２７１】
抽出で使用される極性溶媒としては、例えば、メタノール、エタノール、イソプロパノール等のアルコール系溶媒、アセトニトリル、プロピオニトリル等のニトリル系溶媒、アセトン、２−ブタノン等のケトン系溶媒、１，４−ジオキサン、テトラヒドロフラン等の極性エーテル系溶媒、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド、Ｎ−メチルピペリドン等のアミド系溶媒、ジメチルスルホキシド等のスルホキシド系溶媒、水等、並びにこれら２種以上の混合溶媒が挙げられる。中でも、アミド系溶媒、ニトリル系溶媒、およびこれらの組合せが好ましく、アセトニトリル、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、Ｎ−メチルピペリドン、およびこれらの組合せがより好適に使用される。これらの中でも、ニトリル系溶媒が好ましく、アセトニトリルがより好ましい。
【０２７２】
抽出で使用される極性溶媒は、非極性溶媒との分層性を向上させるために水を含んでいてもよい。この場合、極性溶媒中の水の含有量は、１〜１０％（ｖ／ｖ）が好ましく、３〜８％（ｖ／ｖ）がより好ましい。水の含有量が低すぎる場合は、分層性があまり向上しない場合があり、水の含有量が高すぎる場合は、不純物の極性溶媒に対する溶解度が下がり、その除去効率が低下する傾向がある。
【０２７３】
抽出のために必要に応じて、極性溶媒と共に、非極性溶媒を反応液に添加してもよい。非極性溶媒は、１種のみを使用してもよく、２種以上を併用してもよい。必要に応じて添加される非極性溶媒としては、クロロホルム、ジクロロメタン、１，２−ジクロロエタン等のハロゲン系溶媒；ベンゼン、トルエン、キシレン、メシチレン等の芳香族系溶媒；酢酸エチル、酢酸イソプロピル等のエステル系溶媒；ヘキサン、ペンタン、ヘプタン、オクタン、ノナン、シクロヘキサン等の脂肪族系溶媒；ジエチルエーテル、シクロペンチルメチルエーテル、ｔｅｒｔ−ブチルメチルエーテル等の非極性エーテル系溶媒が挙げられる。これらの中でも、芳香族系溶媒、脂肪族系溶媒、またはこれらの組合せが好ましく、ベンゼン、トルエン、ヘキサン、ペンタン、ヘプタン、ノナン、シクロヘキサンまたは、これらの組合せ等が好ましく、トルエン、ヘプタン、ノナンまたは、これらの組合せがより好ましく、トルエン、ヘプタンまたは、これらの組合せがさらに好ましく、ヘプタンが特に好ましい。
【０２７４】
極性溶媒−非極性溶媒間で分層後に、極性溶媒層を除く操作によって、不純物を除去することができる。極性溶媒層を除いた非極性溶媒層に、さらに極性溶媒を添加し、攪拌し、分層させた後、極性溶媒を除く操作を行うことによって、さらに不純物の量を低減させてもよい。
【０２７５】
１回の抽出操作のために用いられる極性溶媒の量は、非極性溶媒１ｍＬに対して、好ましくは０．１〜１０ｍＬ、より好ましくは０．２〜５ｍＬ、さらに好ましくは０．２〜１ｍＬである。
【０２７６】
得られた非極性溶媒層を濃縮することによって、ホスホロチオエート化部位を有するオリゴヌクレオチド（ｅ−１）またはホスフェート化部位を有するオリゴヌクレオチド（ｅ−２）を単離することができる。
【０２７７】
（脱保護および単離）
本発明の製造方法は、液相法の場合、固液分離または抽出の後に、得られたホスホロチオエート化部位を有するオリゴヌクレオチド（ｅ−１）またはホスフェート化部位を有するオリゴヌクレオチド（ｅ−２）の保護基を全て除去した後、保護されていないホスホロチオエート化部位を有するオリゴヌクレオチドまたは保護されていないホスフェート化部位を有するオリゴヌクレオチドを単離する工程を含んでいてもよい。脱保護の方法としては、例えば、プロテクティブ・グループス・イン・オーガニック・シンセシス（ＰＲＯＴＥＣＴＩＶＥ  ＧＲＯＵＰＳ  ＩＮ  ＯＲＧＡＮＩＣ  ＳＹＮＴＨＥＳＩＳ）、第３版、ジョン・ウィリー・アンド・サンズ（ＪＯＨＮ  ＷＩＬＬＹ＆ＳＯＮＳ）出版（１９９９年）等に記載されている脱保護方法に従い、オリゴヌクレオチドの全ての保護基を除去する工程を行うことができる。具体的には、擬似固相保護基、および核酸塩基の保護基であるフェノキシアセチル基、アセチル基等、リン酸骨格を保護しているシアノエチル基等は、アンモニア水、アンモニア水／エタノール溶液、またはアンモニア水とメチルアミン水溶液の混合液で処理することにより、全て除去することができる。また、５’水酸基の保護基は、工程（３）で使用される酸またはそれらを適宜希釈した溶液で処理することにより除去することができる。保護されていない（即ち、保護基を有さない）オリゴヌクレオチドは酵素により容易に分解されやすいため、空気清浄度管理下で、保護されていないオリゴヌクレオチドを単離することが好ましい。
【０２７８】
本発明の製造方法はまた、固相法の場合、工程（４）の後、固相を溶媒で洗浄し、得られたホスホロチオエート化部位を有するオリゴヌクレオチド（ｅ−１）またはホスフェート化部位を有するオリゴヌクレオチド（ｅ−２）を固相から切り離し、その保護基を全て除去して、保護されていないホスホロチオエート化部位を有するオリゴヌクレオチドまたは保護されていないホスフェート化部位を有するオリゴヌクレオチドを単離する工程を含んでいてもよい。洗浄および固相からの切り離しは、当該分野で公知の方法を用いて行うことができる。また、脱保護は、上記の液相法の場合と同様にして行うことができる。
【０２７９】
液相法の場合、上記各工程における反応の進行の確認は、いずれも一般的な液相有機合成反応と同様の方法を適用できる。即ち、薄層シリカゲルクロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー等を用いて反応を追跡することができる。
【０２８０】
５’−３’合成
５’−３’合成である本発明の製造方法は、ホスホロチオエート（ＰＳ）、ホスフェート（ＰＯ）またはＨ−ホスホネート部位を有する保護オリゴヌクレオチドに酸を添加して３’位水酸基または３’位アミノ基の一時保護基を除去したのち、３’位水酸基または３’位アミノ基がアシル化された副生物を加溶媒分解して脱アシル化する工程を含む。
当該製造方法は、以下の工程（３’）：脱保護および工程（４’）：加溶媒分解によって説明される。
【０２８１】
５’−３’合成である本発明の製造方法はまた、以下の工程（１’）〜（４’）を含む。
（１’）３’位水酸基または３’位アミノ基が保護されておらず、且つその他の基が核酸合成に用いられる保護基で保護されていてもよく、もしくは固相担体に結合していてもよいヌクレオシド、ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド（ａ’）と、
５’位水酸基がホスホロアミダイト法、Ｈ−ホスホネート法、ジハロホスフィン法およびオキサザホスホリジン法から選択される方法により修飾されており、３’位水酸基または３’位アミノ基が酸性条件下で除去可能な一時保護基で保護され、且つその他の基が核酸合成に用いられる保護基で保護されていてもよいヌクレオシド、ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド（ｂ’）と
を縮合させ、３’位水酸基または３’位アミノ基が酸性条件下で除去可能な一時保護基で保護されたホスファイト体または亜リン酸ジエステル（ｃ’）を得る工程；
（２’）：（２’−１）ホスファイト体または亜リン酸ジエステル（ｃ’）に硫化剤を添加して硫化し、３’位水酸基または３’位アミノ基が酸性条件下で除去可能な一時保護基で保護されたホスホロチオエート化部位を有するオリゴヌクレオチド（ｄ’−１）を得る工程、または
（２’−２）ホスファイト体または亜リン酸ジエステル（ｃ’）に酸化剤を添加して酸化し、３’位水酸基または３’位アミノ基が酸性条件下で除去可能な一時保護基で保護されたホスフェート化部位を有するオリゴヌクレオチド（ｄ’−２）を得る工程；
（３’）：（３’−１）ホスホロチオエート化部位を有するオリゴヌクレオチド（ｄ’−１）に酸を添加して３’位水酸基または３’位アミノ基の一時保護基を除去し、３’位水酸基または３’位アミノ基が保護されていないホスホロチオエート化部位を有するオリゴヌクレオチド（ｅ’−１）粗製物を得る工程、または
（３’−２）ホスフェート化部位を有するオリゴヌクレオチド（ｄ’−２）に酸を添加して３’位水酸基または３’位アミノ基の一時保護基を除去し、３’位水酸基または３’位アミノ基が保護されていないホスフェート化部位を有するオリゴヌクレオチド（ｅ’−２）粗製物を得る工程；および
（４’）：（４’−１）ホスホロチオエート化部位を有するオリゴヌクレオチド（ｅ’−１）粗製物に含まれる３’位水酸基または３’位アミノ基がアシル化されたホスホロチオエート化部位を有するオリゴヌクレオチドを加溶媒分解して脱アシル化する工程、または
（４’−２）ホスフェート化部位を有するオリゴヌクレオチド（ｅ’−２）粗製物に含まれる３’位水酸基または３’位アミノ基がアシル化されたオリゴヌクレオチドを加溶媒分解して脱アシル化する工程。
【０２８２】
工程（１’）〜（４’）のサイクルを繰り返すことによって、オリゴヌクレオチド鎖を伸長させることができる。
【０２８３】
５’−３’合成である本発明の製造方法の説明は、３’位水酸基または３’位アミノ基が保護されておらず、且つその他の基が核酸合成に用いられる保護基で保護されていてもよく、もしくは固相担体に結合していてもよいヌクレオシド、ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド（ａ’）と、５’位水酸基がホスホロアミダイト法、Ｈ−ホスホネート法、ジハロホスフィン法およびオキサザホスホリジン法から選択される方法により修飾されており、３’位水酸基または３’位アミノ基が酸性条件下で除去可能な一時保護基で保護され、且つその他の基が核酸合成に用いられる保護基で保護されていてもよいヌクレオシド、ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド（ｂ’）とを使用して、３’位水酸基または３’位アミノ基が保護されていないホスホロチオエート化部位を有するオリゴヌクレオチド（ｅ’−１）またはホスフェート化部位を有するオリゴヌクレオチド（ｅ’−２）を製造すること以外は、上述の３’−５’合成である本発明の製造方法の説明と、基本的に同じである。言い換えると、３’位水酸基または３’アミノ基および５’位水酸基の保護等の態様が入れ替わっていること以外は、工程（１’）〜（４’）、ヌクレオシド、ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド（ａ’）、ヌクレオシド、ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド（ｂ’）、ホスファイト体または亜リン酸ジエステル（ｃ’）、ホスホロチオエート化部位を有するオリゴヌクレオチド（ｄ’−１）またはホスフェート化部位を有するオリゴヌクレオチド（ｄ’−２）、およびホスホロチオエート化部位を有するオリゴヌクレオチド（ｅ’−１）またはホスフェート化部位を有するオリゴヌクレオチド（ｅ’−２）の説明は、上述の工程（１）〜（４）、ヌクレオシド、ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド（ａ）、ヌクレオシド、ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド（ｂ）、ホスファイト体または亜リン酸ジエステル（ｃ）、ホスホロチオエート化部位を有するオリゴヌクレオチド（ｄ−１）またはホスフェート化部位を有するオリゴヌクレオチド（ｄ−２）、およびホスホロチオエート化部位を有するオリゴヌクレオチド（ｅ−１）またはホスフェート化部位を有するオリゴヌクレオチド（ｅ−２）の説明と、基本的に同じである。５’−３’合成について、３’−５’合成と異なる点を以下で説明する。
【０２８４】
工程（１’）（縮合）
本工程で使用するヌクレオシド、ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド（ｂ’）は、５’位水酸基がホスホロアミダイト法、Ｈ−ホスホネート法、ジハロホスフィン法およびオキサザホスホリジン法から選択される方法により修飾されており、３’位水酸基または３’位アミノ基が酸性条件下で除去可能な一時保護基で保護され、且つその他の基が核酸合成に用いられる保護基で保護されていてもよい。水酸基の一時保護基の説明は、工程（１）での説明と同じである。
【０２８５】
アミノ基の一時保護基としては、例えば、トリチル基、モノメトキシトリチル基、ジメトキシトリチル基等が挙げられる。これらの中で、トリチル基およびモノメトキシトリチル基が好ましい。
【０２８６】
本工程の好ましい態様では、
３’位水酸基が保護されておらず、核酸塩基のアミノ基およびイミノ基、リボース残基の２’位水酸基および５’位水酸基、並びにデオキシリボース残基の５’位水酸基から選ばれる少なくとも一つの基が、酸性条件下では除去されず、塩基性条件下で除去可能な保護基で保護され、且つその他の基がさらに核酸合成に用いられる保護基で保護されていてもよいヌクレオシド、ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド（ａ’）、或いは
３’位水酸基が保護されておらず、５’位末端のリン酸基の一つのＯＨが−ＯＬｎ１−ＯＨ（式中、Ｌｎ１は有機基を示す。）に置き換わっており、−ＯＬｎ１−ＯＨの水酸基が酸性条件下では除去されず、塩基性条件下で除去可能な保護基で保護され、且つその他の基がさらに核酸合成に用いられる保護基で保護されていてもよい置換ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド（ａ１’）、並びに
５’位水酸基がホスホロアミダイト法、Ｈ−ホスホネート法、ジハロホスフィン法およびオキサザホスホリジン法から選択される方法により修飾されており、３’位水酸基が酸性条件下で除去可能な一時保護基で保護され、且つその他の基がさらに、酸性条件下では除去されず、塩基性条件下で除去可能な保護基および核酸合成に用いられる保護基から選ばれる保護基で保護されていてもよいヌクレオシド、ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド（ｂ’）
が使用される。
【０２８７】
本工程のより好ましい態様では、
３’位水酸基が保護されておらず、５’位末端のリン酸基の一つのＯＨが−ＯＬｎ１−ＯＨ（式中、Ｌｎ１は有機基を示す。）に置き換わっており、−ＯＬｎ１−ＯＨの水酸基が酸性条件下では除去されず、塩基性条件下で除去可能な保護基で保護され、且つその他の基がさらに核酸合成に用いられる保護基で保護されていてもよいヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド（ａ１’）、並びに
５’位水酸基がホスホロアミダイト法、Ｈ−ホスホネート法、ジハロホスフィン法およびオキサザホスホリジン法から選択される方法により修飾されており、３’位水酸基が酸性条件下で除去可能な一時保護基で保護され、且つその他の基がさらに、酸性条件下では除去されず、塩基性条件下で除去可能な保護基および核酸合成に用いられる保護基から選ばれる保護基で保護されていてもよいヌクレオシドまたはオリゴヌクレオチド（ｂ’）
が使用される。
【０２８８】
本工程のより好ましい別の態様では、
３’位水酸基が保護されておらず、核酸塩基のアミノ基およびイミノ基、リボース残基の２’位水酸基および５’位水酸基、並びにデオキシリボース残基の５’位水酸基から選ばれる少なくとも一つの基が、酸性条件下では除去されず、塩基性条件下で除去可能な保護基で保護され、且つその他の基がさらに核酸合成に用いられる保護基で保護されていてもよいヌクレオシドまたはオリゴヌクレオチド（ａ’）、並びに
５’位水酸基がホスホロアミダイト法、Ｈ−ホスホネート法、ジハロホスフィン法およびオキサザホスホリジン法から選択される方法により修飾されており、３’位水酸基が酸性条件下で除去可能な一時保護基で保護され、且つその他の基がさらに核酸合成に用いられる保護基で保護されていてもよいヌクレオシドまたはオリゴヌクレオチド（ｂ’）
が使用される。
【０２８９】
ヌクレオシド、ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド（ａ’）或いはヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド（ａ１’）が有する３’位水酸基と、ヌクレオシド、ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド（ｂ’）が有するホスホロアミダイト法、Ｈ−ホスホネート法、ジハロホスフィン法およびオキサザホスホリジン法から選択される方法により修飾された５’位水酸基との縮合は、工程（１）と同様に行うことができる。そのため、工程（１’）の縮合の説明は、「ヌクレオシド、ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド（ａ）或いはヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド（ａ１）」を「ヌクレオシド、ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド（ａ’）或いはヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド（ａ１’）」に置き換え、「ヌクレオシド、ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド（ｂ）」を「ヌクレオシド、ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド（ｂ’）」に置き換えたこと以外、工程（１）の説明と同じである。
【０２９０】
ヌクレオシド、ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド（ａ’）或いはヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド（ａ１’）が有する３’位アミノ基と、ヌクレオシド、ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド（ｂ’）が有するホスホロアミダイト法、Ｈ−ホスホネート法、ジハロホスフィン法およびオキサザホスホリジン法から選択される方法により修飾された５’位水酸基との縮合も、工程（１）の縮合と同様に行うことができる。そのため、工程（１’）の縮合の説明は、「ヌクレオシド、ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド（ａ）或いはヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド（ａ１）」を「ヌクレオシド、ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド（ａ’）或いはヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド（ａ１’）」に置き換え、「ヌクレオシド、ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド（ｂ）」を「ヌクレオシド、ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド（ｂ’）」に置き換えたこと以外、工程（１）の説明と同じである。
【０２９１】
ヌクレオシド、ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド（ａ’）としては、例えば、下記式（ａ−Ｉ’）で表される化合物（即ち、ヌクレオシド、またはオリゴヌクレオチド）が挙げられる。
【０２９２】
【化３２】
2020166705.tif 000033
【０２９３】
［式中、
ｍ、ｍ＋１個のＢａｓｅ、ｍ＋１個のＸ、ｍ個のＲ１０、ｍ個のＲｐ１、Ｌ、ＹおよびＺは、それぞれ独立して、前記と同義であり；
ｍ個のＸｎ１は、それぞれ独立して、酸素原子またはＮＨを示し；
Ｘｎ３は、水酸基またはアミノ基を示す。］
【０２９４】
式（ａ−Ｉ’）中のｍ個のＸｎ１は、好ましくは酸素原子である。
式（ａ−Ｉ’）中のＸｎ３は、好ましくは水酸基である。
式（ａ−Ｉ’）中のｍ個のＲｐ１は、好ましくは、それぞれ独立して−ＣＨ２ＣＨ２ＷＧで表される基である。
式（ａ−Ｉ’）中の他の記号の説明は、前記の通りである。
化合物（ａ−Ｉ’）は、好ましくは下記式（ａ−ｉ’）で表される化合物である（下記式中の記号の定義および説明は、前記の通りである）。
【０２９５】
【化３３】
2020166705.tif 000034
【０２９６】
化合物（ａ−ｉ’）の中で、式（ａ−ＩＩ’）で表される化合物（即ち、ヌクレオシドまたはオリゴヌクレオチド）が好ましい（下記式中の記号の定義および説明は、前記の通りである）。
【０２９７】
【化３４】
2020166705.tif 000035
【０２９８】
式（ａ−ＩＩ’）において、ｍ個のＲｐ１が、それぞれ独立して−ＣＨ２ＣＨ２ＷＧで表される基であることが好ましい。
式（ａ−ＩＩ’）において、ｍが０であることが好ましい。
式（ａ−ＩＩ’）における他の記号の説明は、前記の通りである。
化合物（ａ−ＩＩ’）の中で、下記式（ａ−ＩＩＩ’）で表される化合物（即ち、ヌクレオシド）が好ましい（下記式中の記号の定義および説明は、前記の通りである）。
【０２９９】
【化３５】
2020166705.tif 000036
【０３００】
また、化合物（ａ−ｉ’）の中で、下記式（ａ−ＩＶ’）で表される化合物（即ち、ヌクレオシドまたはオリゴヌクレオチド）が好ましい（下記式中の記号の定義および説明は、前記の通りである）。
【０３０１】
【化３６】
2020166705.tif 000037
【０３０２】
式（ａ−ＩＶ’）において、ｍ個のＲｐ１が、それぞれ独立して−ＣＨ２ＣＨ２ＷＧで表される基であることが好ましい。
式（ａ−ＩＶ’）において、ｍが０であることが好ましい。
式（ａ−ＩＶ’）における他の記号の説明は、前記の通りである。
化合物（ａ−ＩＶ’）の中で、下記式（ａ−Ｖ’）で表される化合物（即ち、ヌクレオシド）が好ましい（下記式中の記号の定義および説明は、前記の通りである）。
【０３０３】
【化３７】
2020166705.tif 000038
【０３０４】
また、ヌクレオシド、ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド（ａ’）としては、例えば、下記式（ａ−ＶＩ’）で表される化合物（即ち、ヌクレオシドまたはオリゴヌクレオチド）が挙げられる。
【０３０５】
【化３８】
2020166705.tif 000039
【０３０６】
［式中、
ｍ＋１個のＢａｓｅ１の少なくとも一つは、−Ｌ−Ｙ−Ｚで保護されている核酸塩基を示し、残りは保護されていてもよい核酸塩基を示し；
ｍ個のＸｎ１は、それぞれ独立して、酸素原子またはＮＨを示し；
Ｘｎ３は、水酸基またはアミノ基を示し；
Ｒｎ４は、水酸基の保護基を示し；
ｍ、ｍ＋１個のＸ、ｍ個のＲ１０、ｍ個のＲｐ１、Ｌ、ＹおよびＺは、それぞれ独立して、前記と同義である。］
【０３０７】
式（ａ−ＶＩ’）中のｍ個のＸｎ１は、好ましくは酸素原子である。
式（ａ−ＶＩ’）中のＸｎ３は、好ましくは水酸基である。
式（ａ−ＶＩ’）中のｍ個のＲｐ１は、好ましくは、それぞれ独立して−ＣＨ２ＣＨ２ＷＧで表される基である。
式（ａ−ＶＩ’）中の他の記号の説明は、前記の通りである。
化合物（ａ−ＶＩ’）は、好ましくは下記式（ａ−ｖｉ’）で表される化合物である（下記式中の記号の定義および説明は、前記の通りである）。
【０３０８】
【化３９】
2020166705.tif 000040
【０３０９】
また、ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド（ａ１’）としては、例えば、下記式（ａ−ＶＩＩ’）で表される化合物が挙げられる。
【０３１０】
【化４０】
2020166705.tif 000041
【０３１１】
［式中、
ｍ個のＸｎ１は、それぞれ独立して、酸素原子またはＮＨを示し；
Ｘｎ３は、水酸基またはアミノ基を示し；
Ｌｎ１は有機基を示し；
ｍ、ｍ＋１個のＢａｓｅ、ｍ＋１個のＸ、ｍ＋１個のＲ１０、ｍ＋１個のＲｐ１、Ｌ、ＹおよびＺは、それぞれ独立して、前記と同義である。］
【０３１２】
式（ａ−ＶＩＩ’）中のＸｎ３は、好ましくは水酸基である。
式（ａ−ＶＩＩ’）中のｍ＋１個のＲｐ１は、好ましくは、それぞれ独立して−ＣＨ２ＣＨ２ＷＧで表される基である。
式（ａ−ＶＩＩ’）中の他の記号の説明は、前記の通りである。
化合物（ａ−ＶＩＩ’）は、好ましくは下記式（ａ−ｖｉｉ’）で表される化合物である（下記式中の記号の定義および説明は、前記の通りである）。
【０３１３】
【化４１】
2020166705.tif 000042
【０３１４】
本工程で使用するヌクレオシド、ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド（ａ’）或いはヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド（ａ１’）は、好ましくは化合物（ａ−Ｉ’）、化合物（ａ−ＶＩ’）または化合物（ａ−ＶＩＩ’）であり、より好ましくは化合物（ａ−ｉ’）、化合物（ａ−ｖｉ’）または化合物（ａ−ｖｉｉ’）であり、さらに好ましくは化合物（ａ−ｉ’）または化合物（ａ−ｖｉｉ’）であり、特に好ましくは化合物（ａ−ｖｉｉ’）である。
【０３１５】
ヌクレオシド、ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド（ｂ’）としては、例えば、下記式（ｂ−Ｉ’）で表される化合物（即ち、ヌクレオシドまたはオリゴヌクレオチド）が挙げられる。
【０３１６】
【化４２】
2020166705.tif 000043
【０３１７】
［式中、
ｑ＋１個のＢａｓｅ２は、それぞれ独立して、−Ｌ−Ｘ−Ｚおよび核酸合成に用いられる保護基から選ばれる保護基で保護されていてもよい核酸塩基を示し；
ｑ個のＸｎ１は、それぞれ独立して、酸素原子またはＮＨを示し；
Ｘｎ４は、酸性条件下で除去可能な一時保護基で保護されている水酸基またはアミノ基を示し；
ｑ、ｑ＋１個のＸ、ｑ＋１個のＲｐ１、ｑ個のＲ１０、Ｒ３６およびＲ３７は、それぞれ独立して、前記と同義である。］
【０３１８】
式（ｂ−Ｉ’）中の水酸基の一時保護基およびアミノ基の一時保護基の説明は、前記の通りである。Ｘｎ４は、好ましくは酸性条件下で除去可能な一時保護基で保護されている水酸基である。
式（ｂ−Ｉ’）中のｑ＋１個のＲｐ１は、好ましくは、それぞれ独立して−ＣＨ２ＣＨ２ＷＧで表される基である。
式（ｂ−Ｉ’）中の他の記号の説明は、前記の通りである。
化合物（ｂ−Ｉ’）は、好ましくは下記式（ｂ−ｉ’）で表される化合物である（下記式中の記号の定義および説明は、前記の通りである）。
【０３１９】
【化４３】
2020166705.tif 000044
【０３２０】
３’位水酸基および５’位水酸基の保護等の態様が入れ替わっていること以外は、上述の化合物（ａ−Ｉ’）〜化合物（ａ−ｖｉｉ’）並びに化合物（ｂ−Ｉ’）および（ｂ−ｉ’）の説明は、上述の化合物（ａ−Ｉ）〜化合物（ａ−ｖｉｉ）並びに化合物（ｂ−Ｉ）および（ｂ−ｉ）の説明と、基本的に同じである。
【０３２１】
本工程で使用するヌクレオシド、ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド（ａ’）或いはヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド（ａ１’）とヌクレオシド、ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド（ｂ’）との組合せは、
好ましくは化合物（ａ−Ｉ’）、化合物（ａ−ＶＩ’）または化合物（ａ−ＶＩＩ’）と化合物（ｂ−Ｉ’）との組合せであり、
より好ましくは化合物（ａ−ｉ’）、化合物（ａ−ｖｉ’）または化合物（ａ−ｖｉｉ’）と化合物（ｂ−ｉ’）との組合せであり、
さらに好ましくは化合物（ａ−ｉ’）または化合物（ａ−ｖｉｉ’）と化合物（ｂ−ｉ’）との組合せであり、
特に好ましくは化合物（ａ−ｖｉｉ’）と化合物（ｂ−ｉ’）との組合せである。
【０３２２】
本工程におけるヌクレオシド、ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド（ｂ’）の使用量は、液相法の場合、本工程におけるヌクレオシド、ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド（ａ’）の使用量１モルに対して、例えば１〜１０モル、好ましくは１〜５モルであり、固相法の場合、本工程におけるヌクレオシド、ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド（ａ’）の使用量１モルに対して、例えば１〜２０モル、好ましくは１〜１０モルである。
【０３２３】
本工程における反応温度は、反応が進行しさえすれば特に限定されないが、液相法の場合、０℃〜１００℃が好ましく、２０℃〜５０℃がより好ましく、固相法の場合、１０℃〜４０℃が好ましく、２０℃〜３０℃がより好ましい。反応時間は、使用する原料の種類、反応温度等によって異なるが、液相法の場合、例えば５分〜２４時間であり、固相法の場合、例えば１分〜３０分である。
【０３２４】
工程（２’）：（２’−１）（硫化）
本工程は、３’位水酸基または３’位アミノ基が酸性条件下で除去可能な一時保護基で保護されたホスファイト体または亜リン酸ジエステル（ｃ’）に硫化剤を反応させることにより、そのホスファイト結合または亜リン酸ジエステル結合をホスホロチオエート結合へと変換させて、３’位水酸基または３’位アミノ基が酸性条件下で除去可能な一時保護基で保護されたホスホロチオエート化部位を有するオリゴヌクレオチド（ｄ’−１）を得る工程である。硫化剤は、その１種のみを使用してもよく、２種以上を併用してもよい。
【０３２５】
本工程に使用する硫化剤としては、ホスファイト結合または亜リン酸ジエステル結合を、ホスホロチオエート結合に変換しうる能力がありさえすれば、特に限定されないが、５−［（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノメチリデン）アミノ］−３Ｈ−１，２，４−ジチアゾール−３−チオン（ＤＤＴＴ）、３Ｈ−１，２−ベンゾジチオール−３−オン−１，１−ジオキシド（Ｂｅａｕｃａｇｅ試薬）、３Ｈ−１，２−ベンゾジチオール−３−オン、フェニルアセチルジスルフィド（ＰＡＤＳ）、テトラエチルチウラムジスルフィド（ＴＥＴＤ）、ジペンタメチレンチウラムテトラスルフィド、５−フェニル−３Ｈ−１，２，４−ジチアゾール−３−オン（ＰＯＳ）、３−アミノ−１，２，４−ジチアゾール−５−チオン（ＡＤＴＴ、キサンタンヒドリド）、硫黄が好ましい。
【０３２６】
良好な反応が進行しうるという観点で、５−［（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノメチリデン）アミノ］−３Ｈ−１，２，４−ジチアゾール−３−チオン（ＤＤＴＴ）、３Ｈ−１，２−ベンゾジチオール−３−オン−１，１−ジオキシド（Ｂｅａｕｃａｇｅ試薬）、３Ｈ−１，２−ベンゾジチオール−３−オン、フェニルアセチルジスルフィド（ＰＡＤＳ）、５−フェニル−３Ｈ−１，２，４−ジチアゾール−３−オン（ＰＯＳ）がより好ましく、５−［（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノメチリデン）アミノ］−３Ｈ−１，２，４−ジチアゾール−３−チオン（ＤＤＴＴ）、３Ｈ−１，２−ベンゾジチオール−３−オン−１，１−ジオキシド（Ｂｅａｕｃａｇｅ試薬）、５−フェニル−３Ｈ−１，２，４−ジチアゾール−３−オン（ＰＯＳ）がさらに好ましく、５−［（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノメチリデン）アミノ］−３Ｈ−１，２，４−ジチアゾール−３−チオン（ＤＤＴＴ）、５−フェニル−３Ｈ−１，２，４−ジチアゾール−３−オン（ＰＯＳ）が特に好ましい。かかる硫化剤は、０．０５〜２Ｍの濃度になるように適当な溶媒で希釈して使用することができる。かかる希釈溶媒としては、反応に不活性な溶媒であれば特に限定されないが、例えば、ジクロロメタン、アセトニトリル、ピリジンまたはこれら任意の混合溶媒が挙げられる。
【０３２７】
硫化剤の使用量は、ホスファイト体または亜リン酸ジエステル（ｃ’）１モルに対し、液相法の場合、例えば１〜５０モル、好ましくは１〜１０モルであり、固相法の場合、例えば１〜１００モル、好ましくは１〜２０モルである。
【０３２８】
反応温度は、反応が進行しさえすれば特に限定されないが、液相法の場合、０℃〜１００℃が好ましく、２０℃〜５０℃がより好ましく、固相法の場合１０℃〜４０℃が好ましく、２０℃〜３０℃がより好ましい。反応時間は、ホスファイト体または亜リン酸ジエステル（ｃ’）の種類、使用する硫化剤の種類、反応温度等によって異なるが、液相法の場合、例えば１分〜３時間であり、固相法の場合、例えば１分〜３０分である。
【０３２９】
工程（２’）：（２’−２）（酸化）
本工程は、３’位水酸基または３’位アミノ基が酸性条件下で除去可能な一時保護基で保護されたホスファイト体または亜リン酸ジエステル（ｃ’）に酸化剤を反応させることにより、そのホスファイト結合または亜リン酸ジエステル結合をホスフェート結合へと変換させて、３’位水酸基または３’位アミノ基が酸性条件下で除去可能な一時保護基で保護されたホスフェート化部位を有するオリゴヌクレオチド（ｄ’−２）を得る工程である。酸化剤は、その１種のみを使用してもよく、２種以上を併用してもよい。
【０３３０】
本工程に使用する酸化剤としては、ホスファイト結合または亜リン酸ジエステル結合を、ホスフェート結合に変換しうる能力がありさえすれば、特に限定されないが、良好な反応が進行しうるという観点で、ヨウ素が好ましい。
【０３３１】
かかる酸化剤は、適当な溶媒で希釈して使用することができる。かかる希釈溶媒としては、反応に不活性な溶媒であれば特に限定されないが、例えば、ピリジン、水、またはこれら任意の混合溶媒が挙げられ、ピリジンと水の混合溶媒が好ましい。ピリジンは酸化剤１モルに対し、３〜１０モルで、好ましくは、４〜６モルであり、水は酸化剤１モルに対し、１〜５モルで、好ましくは、２〜４モルである。
【０３３２】
酸化剤の使用量は、ホスファイト体または亜リン酸ジエステル（ｃ’）１モルに対し、液相法の場合、例えば１〜５０モル、好ましくは１〜１０モルであり、固相法の場合、例えば１〜１００モル、好ましくは１〜２０モルである。
【０３３３】
反応温度は、反応が進行しさえすれば特に限定されないが、液相法の場合、０℃〜１００℃が好ましく、２０℃〜５０℃がより好ましく、固相法の場合、１０℃〜４０℃が好ましく、２０℃〜３０℃がより好ましい。反応時間は、ホスファイト体または亜リン酸ジエステル（ｃ’）の種類、使用する酸化剤の種類、反応温度等によって異なるが、液相法の場合、例えば１分〜３時間であり、固相法の場合、例えば１分〜３０分である。
【０３３４】
工程（３’）：（３’−１）（ホスホロチオエート化部位を有するオリゴヌクレオチドの一時保護基の脱保護）、または（３’−２）（ホスフェート化部位を有するオリゴヌクレオチドの一時保護基の脱保護）
本工程は、ホスホロチオエート化部位を有するオリゴヌクレオチド（ｄ’−１）の３’位水酸基または３’位アミノ基の一時保護基を酸によって除去し、３’位水酸基または３’位アミノ基が保護されていないホスホロチオエート化部位を有するオリゴヌクレオチド（ｅ’−１）粗製物を得る工程である。また、本工程は、ホスフェート化部位を有するオリゴヌクレオチド（ｄ’−２）の一時保護基を酸によって除去し、３’位水酸基または３’位アミノ基が保護されていないホスフェート化部位を有するオリゴヌクレオチド（ｅ’−２）粗製物を得る工程である。酸は、１種のみを使用してもよく、２種以上を併用してもよい。
【０３３５】
水酸基の一時保護基の除去の説明は、工程（１）での説明と同じである。
アミノ基の一時保護基の除去に使用する酸としては、良好な脱保護が達成できさえすれば特に限定されず、トリフルオロ酢酸、ジクロロ酢酸、トリクロロ酢酸、酢酸等のカルボン酸、トリフルオロメタンスルホン酸、メタンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸等のスルホン酸、ホスホン酸、リン酸等が挙げられるが、脱保護工程において脱保護された３’位水酸基または３’位アミノ基がアシル化されるという問題を解決するという観点から、好ましくは水酸基をアシル化し得るカルボン酸を少なくとも含み、より好ましくはトリフルオロ酢酸、ジクロロ酢酸またはトリクロロ酢酸を少なくとも含む。これら酸は、前記非極性溶媒で希釈しても構わない。アミノ基の一時保護基の除去における酸の使用量は、ホスホロチオエート化部位を有するオリゴヌクレオチド（ｄ’−１）１モルまたは、ホスフェート化部位を有するオリゴヌクレオチド（ｄ’−２）１モルに対し、液相法の場合、例えば１〜１００モル、好ましくは１〜４０モルであり、固相法の場合、例えば１〜２００モル、好ましくは１〜８０モルである。
【０３３６】
アミノ基の一時保護基の除去のための反応温度は、反応が進行しさえすれば特に限定されないが、液相法の場合、−１０℃〜５０℃が好ましく、０℃〜４０℃がより好ましく、固相法の場合、１０℃〜５０℃が好ましく、２０℃〜３０℃がより好ましい。アミノ基の一時保護基の反応時間は、使用するホスホロチオエート化部位を有するオリゴヌクレオチド（ｄ’−１）またはホスフェート化部位を有するオリゴヌクレオチド（ｄ’−２）の種類、酸の種類および非極性溶媒の種類、反応温度等により異なるが、液相法の場合、例えば５分〜５時間であり、固相法の場合、例えば１分〜３０分である。
【０３３７】
工程（４’）：（４’−１）（ホスホロチオエート化部位を有するオリゴヌクレオチドの加溶媒分解）、または（４’−２）（ホスフェート化部位を有するオリゴヌクレオチドの加溶媒分解）
本工程は、ホスホロチオエート化部位を有するオリゴヌクレオチド（ｅ’−１）粗製物に含まれる３’位水酸基または３’位アミノ基がアシル化されたホスホロチオエート化部位を有するオリゴヌクレオチドを加溶媒分解して脱アシル化する工程である。また、本工程は、ホスフェート化部位を有するオリゴヌクレオチド（ｅ’−２）粗製物に含まれる３’位水酸基または３’位アミノ基がアシル化されたホスフェート化部位を有するオリゴヌクレオチドを加溶媒分解して脱アシル化する工程である。
本工程における「アシル化」は、前工程（３’−１）または（３’−２）において３’位水酸基または３’位アミノ基の一時保護基を除去するために加えた酸が、３’位水酸基または３’位アミノ基と反応することを指し、その結果、酸がカルボン酸の場合にはＲ−Ｃ（＝Ｏ）−が３’位の酸素原子または窒素原子に結合し、スルホン酸の場合にはＲ−Ｓ（＝Ｏ）２−が３’位の酸素原子または窒素原子に結合し、ホスホン酸の場合にはＨ−Ｐ（＝Ｏ）（ＯＨ）−が３’位の酸素原子または窒素原子に結合し、リン酸の場合にはＨ−Ｐ（＝Ｏ）２−が３’位の酸素原子または窒素原子に結合することを意味する。一方、本工程における「脱アシル化」は、本工程において生成したアシル化物が加溶媒分解により、３’位水酸基または３’位アミノ基となることを指す。
本工程は、ホスホロチオエート化部位またはホスフェート化部位の酸素原子に結合したシアノアルキル基（例えば、シアノエチル基）、アルコキシカルボニルアルキル基（例えば、エトキシカルボニルエチル基）、ハロゲノフェニル基（２−クロロフェニル基）等を脱落させないような塩基性条件下で行うのが好ましい。特に、塩基性に不安定なシアノアルキル基（例えば、シアノエチル基）の場合には、シアノアルキル基（例えば、シアノエチル基）を脱落させないようにすることが望まれるからである。
【０３３８】
本工程に使用する溶媒としては、３’位水酸基または３’位アミノ基がアシル化されたホスホロチオエート化部位を有するオリゴヌクレオチドを脱アシル化することができさえすれば特に限定されない。また、本工程に使用する溶媒としては、３’位水酸基または３’位アミノ基がアシル化されたホスフェート化部位を有するオリゴヌクレオチドを脱アシル化することができさえすれば特に限定されない。好ましくは塩基と求核物質との混合物である。塩基としては、有機塩基が好ましく、例えば、ピリジン、コリジン、ルチジン等が挙げられ、ピリジンが好ましい。求核物質としては、水やアルコール類が好ましく、例えば、水、メタノール、エタノール等が挙げられ、水、メタノールが好ましい。塩基と求核物質との混合物としては、好ましくはピリジンと水との混合物、ピリジンとメタノールとの混合物、ピリジンとエタノールとの混合物、コリジンと水との混合物、コリジンとメタノールとの混合物、コリジンとエタノールとの混合物、ルチジンと水との混合物、ルチジンとメタノールとの混合物、ルチジンとエタノールとの混合物であり、ピリジンと水との混合物、ピリジンとメタノールとの混合物、ピリジンとエタノールがより好ましい。
【０３３９】
本工程における塩基の使用量は、使用する塩基の種類によって異なるが、液相法の場合で、脱保護工程後、精製せずにワンポットで本工程を実施する場合や固相法の場合には脱保護で使用した酸が反応液中に残っているため、より多くの塩基が必要となる。このことから、液相法（ワンポット法）や固相法では、使用した酸の量に対して１〜１０当量、好ましくは、３〜５当量の塩基が必要となる。一方、上記固相法以外や液相法（ワンポット法）以外の場合、ホスホロチオエート化部位を有するオリゴヌクレオチド（ｅ’−１）粗製物１モルまたはホスフェート化部位を有するオリゴヌクレオチド（ｅ’−２）粗製物１モルに対し、１〜５モル、好ましくは、１〜３モル必要である。
本工程の反応温度は、反応が進行しさえすれば特に限定されないが、液相法の場合、０℃〜５０℃が好ましく、５℃〜３０℃がより好ましく、固相法の場合、５℃〜４０℃が好ましく、１０℃〜３０℃がより好ましい。反応時間は、使用するホスホロチオエート化部位を有するオリゴヌクレオチド（ｅ’−１）粗製物またはホスフェート化部位を有するオリゴヌクレオチド（ｅ’−２）粗製物および溶媒の種類、反応温度等により異なるが、液相法の場合、例えば１０分〜２４時間であり、固相法の場合、例えば１分〜３０分である。
【０３４０】
オリゴヌクレオチド
固液分離または抽出により得られたホスホロチオエート化部位を有するオリゴヌクレオチド（ｅ−１）もしくは（ｅ’−１）、ホスフェート化部位を有するオリゴヌクレオチド（ｅ−２）もしくは（ｅ’−２）、或いは脱保護および単離により得られた保護されていないホスホロチオエート化部位を有するオリゴヌクレオチドまたはホスフェート化部位を有するオリゴヌクレオチドは、さらに有機合成反応を施すことにより、所望の誘導体へと導くこともできる。本発明の製造方法によって得られたホスホロチオエート化部位を有するオリゴヌクレオチドまたはホスフェート化部位を有するオリゴヌクレオチドは、人体用または動物用の医薬品（ＲＮＡ、ＤＮＡ、オリゴ核酸医薬等）、機能性食品、特定保健用食品、食品、化成品、生体用や工業用の高分子材料等の各種用途に使用することができる。
【実施例】
【０３４１】
以下、実施例に沿って本発明をさらに詳細に説明するが、これら実施例は本発明の範囲を何ら限定するものではない。また、本発明において使用する試薬や装置、材料は特に言及されない限り、商業的に入手可能である。また、本明細書において、アミノ酸等を略号で表示する場合、各表示は、ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ  Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎ  ｏｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅによる略号あるいは当該分野における慣用略号に基づくものである。【０３４２】
後述の実施例等で使用する略号の意味は、以下の通りである。
また、後述の実施例等で使用する２’−ＯＭｅ−Ｃ−ＣＥ  ホスホロアミダイト等を、以下では、ホスホロアミダイトモノマーと総称することがある。
ＳＵＣ：スクシニル
ＴＯＢ：３，４，５−トリス（オクタデシルオキシ）ベンジルオキシ
Ｐｉｖ−ＴＯＢ：３，４，５−トリス（オクタデシルオキシ）ベンジル  ピバレート
ＤＤＴＴ：５−［（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノメチリデン）アミノ］−３Ｈ−１，２，４−ジチアゾール−３−チオン
ＰＯＳ：５−フェニル−３Ｈ−１，２，４−ジチアゾール−３−オン
ＰＡＤＳ：フェニルアセチルジスルフィド
ＤＭＴｒ：４，４’−ジメトキシトリチル
ＬＣ−ＴＯＦ  ＭＳ：液体クロマトグラフ−飛行時間型質量分析計
ＤＢＵ：１，８−ジアザビシクロ［５．４．０］−７−ウンデセン
ＰｉｖＣｌ：ピバロイルクロリド
２’−ＯＭｅ−Ｃ−ＣＥ  ホスホロアミダイト：５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−Ｎ４−ベンゾイル−２’−Ｏ−メチル−シチジン−３’−［Ｏ−（２−シアノエチル）−（Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル）］−ホスホロアミダイト
２’−ＯＭｅ−Ｇ−ＣＥ  ホスホロアミダイト：５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−Ｎ２−イソブチリル−２’−Ｏ−メチル−グアノシン−３’−［Ｏ−（２−シアノエチル）−（Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル）］−ホスホロアミダイト
５−Ｍｅ−ｄＣ（Ｂｚ）−ＣＥ  ホスホロアミダイト：５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−Ｎ４−ベンゾイル−２’−デオキシ−５−メチルシチジン−３’−［Ｏ−（２−シアノエチル）−（Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル）］−ホスホロアミダイト
ｄＧ−ＣＥ  ホスホロアミダイト：５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−Ｎ２−イソブチリル−デオキシグアノシン−３’−［Ｏ−（２−シアノエチル）−（Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル）］−ホスホロアミダイト
２’−Ｏ−ＴＢＤＭＳ−Ｃ（Ａｃ）-ＣＥ  ホスホロアミダイト：５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−Ｎ４−アセチル−２’−Ｏ−（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル）−シチジン−３’−［Ｏ−（２−シアノエチル）−（Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル）］−ホスホロアミダイト
ＬＮＡ−Ａ(Ｂｚ)−ＣＥ  ホスホロアミダイト：５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−Ｎ６−ベンゾイル−２’−Ｏ，４’−Ｃ−メチレン−アデノシン−３’−［Ｏ−（２−シアノエチル）−（Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル）］−ホスホロアミダイト
２’−Ｆ−Ｃ（Ｂｚ）−ＣＥ  ホスホロアミダイト：５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−Ｎ４−ベンゾイル−２’−フルオロ−シチジン−３’−［Ｏ−（２−シアノエチル）−（Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル）］−ホスホロアミダイト
ｄＴ−Ｈ−ホスホネート  ＴＥＡ塩：５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−デオキシチミジン−３’−Ｈ−ホスホネート，トリエチルアミン塩
ＨＯ−ｄＴ−ＳＵＣ−ＴＯＢ：デオキシチミジン  ３’−イル  ３，４，５−トリス（オクタデシルオキシ）ベンジル  スクシネート
ＨＯ−Ｔ−ＳＵＣ−ＴＯＢ：デオキシチミジン−３’−イル  ３，４，５−トリス（オクタデシルオキシ）ベンジル  スクシネート
ＨＯ−ＣｍＴ−ＳＵＣ−ＴＯＢ：Ｎ４−ベンゾイル−２’−Ｏ−メチル−シチジン−３’−［Ｏ−（２−シアノエチル）］ホスホロチオニル  デオキシチミジン−３’−イル−［３，４，５−トリス（オクタデシルオキシ）ベンジル］スクシネート
ＨＯ−ＧｍＣｍＴ−ＳＵＣ−ＴＯＢ：Ｎ２−イソブチリル−２’−Ｏ−メチル−グアノシン  ３’−［Ｏ−（２−シアノエチル）］ホスホリル  Ｎ４−ベンゾイル−２’−Ｏ−メチル−シチジン  ３’−［Ｏ−（２−シアノエチル）］ホスホロチオニル  デオキシチミジン−３’−イル−［３，４，５−トリス（オクタデシルオキシ）ベンジル］スクシネート）
ＨＯ−２’−ＯＭｅ−Ｕ−ＳＵＣ−ＴＯＢ：２’−Ｏ−メチル−ウリジン−３’−イル  ３，４，５−トリス（オクタデシルオキシ）ベンジル  スクシネート
ＨＯ−Ｕｍ−ＳＵＣ−ＴＯＢ：２’−Ｏ−メチル−ウリジン−３’−イル  ３，４，５−トリス（オクタデシルオキシ）ベンジル  スクシネート
ＨＯ−ＣｍＵｍ−ＳＵＣ−ＴＯＢ：Ｎ４−ベンゾイル−２’−Ｏ−メチル−シチジン−３’−［Ｏ−（２−シアノエチル）］ホスホロチオニル  ２’−Ｏ−メチル−ウリジン−３’−イル−［３，４，５−トリス（オクタデシルオキシ）ベンジル］スクシネート
ＨＯ−ＧＵｍ−ＳＵＣ−ＴＯＢ：Ｎ２−イソブチリル−デオキシグアノシン  ３’−［Ｏ−（２−シアノエチル）］ホスホロチオニル  ２’−Ｏ−メチル−ウリジン−３’−イル−［３，４，５−トリス（オクタデシルオキシ）ベンジル］スクシネート
ＨＯ−ＡＬＴ−ＳＵＣ−ＴＯＢ：Ｎ６−ベンゾイル−２’−Ｏ，４’−Ｃ−メチレン−アデノシン−３’−［Ｏ−（２−シアノエチル）］ホスホロチオニル  デオキシチミジン−３’−イル−［３，４，５−トリス（オクタデシルオキシ）ベンジル］スクシネート
ＨＯ−ＣｆＡＬＴ−ＳＵＣ−ＴＯＢ：Ｎ４−ベンゾイル−２’−フルオロ−シチジン−３’−［Ｏ−（２−シアノエチル）］ホスホロチオニル  Ｎ６−ベンゾイル−２’−Ｏ，４’−Ｃ−メチレン−アデノシン−３’−［Ｏ−（２−シアノエチル）］ホスホロチオニル  デオキシチミジン−３’−イル−［３，４，５−トリス（オクタデシルオキシ）ベンジル］スクシネート
ＨＯ−ｒＣＣｆＡＬＴ−ＳＵＣ−ＴＯＢ：Ｎ４−アセチル−２’−Ｏ−（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル）−シチジン−３’−［Ｏ−（２−シアノエチル）］ホスホロチオニル  Ｎ４−ベンゾイル−２’−フルオロ−シチジン−３’−［Ｏ−（２−シアノエチル）］ホスホロチオニル  Ｎ６−ベンゾイル−２’−Ｏ，４’−Ｃ−メチレン−アデノシン−３’−［Ｏ−（２−シアノエチル）］ホスホロチオニル  デオキシチミジン−３’−イル−［３，４，５−トリス（オクタデシルオキシ）ベンジル］スクシネート
ＨＯ−（ＣＨ２）２−ＳＵＣ−ＴＯＢ：３，４，５−トリス（オクタデシルオキシ）ベンジル  ２−ヒドロキシエチル  スクシネート
ＨＯ−ＡＬ（ＣＨ２）２−ＳＵＣ−ＴＯＢ：Ｎ６−ベンゾイル−２’−Ｏ，４’−Ｃ−メチレン−アデノシン−３’−［Ｏ−（２−シアノエチル）］ホスホロチオニル  エチルオキシ−［３，４，５−トリス（オクタデシルオキシ）ベンジル］スクシネート
ＨＯ−ＣｆＡＬ（ＣＨ２）２−ＳＵＣ−ＴＯＢ：Ｎ４−ベンゾイル−２’−フルオロ−シチジン−３’−［Ｏ−（２−シアノエチル）］ホスホロチオニル  Ｎ６−ベンゾイル−２’−Ｏ，４’−Ｃ−メチレン−アデノシン−３’−［Ｏ−（２−シアノエチル）］ホスホロチオニル  エチルオキシ−［３，４，５−トリス（オクタデシルオキシ）ベンジル］スクシネート
ＨＯ−ｒＣＣｆＡＬ（ＣＨ２）２−ＳＵＣ−ＴＯＢ：Ｎ４−アセチル−２’−Ｏ−（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル）−シチジン−３’−［Ｏ−（２−シアノエチル）］ホスホロチオニル  Ｎ４−ベンゾイル−２’−フルオロ−シチジン−３’−［Ｏ−（２−シアノエチル）］ホスホロチオニル  Ｎ６−ベンゾイル−２’−Ｏ，４’−Ｃ−メチレン−アデノシン−３’−［Ｏ−（２−シアノエチル）］ホスホロチオニル  エチルオキシ−［３，４，５−トリス（オクタデシルオキシ）ベンジル］スクシネート
ＨＯ−ＴＨＴ−ＳＵＣ−ＴＯＢ：デオキシチミジン−３’−ホスホネート  デオキシチミジン−３’−イル−［３，４，５−トリス（オクタデシルオキシ）ベンジル］スクシネート
ＨＯ−ＴＯＨＴ−ＳＵＣ−ＴＯＢ：デオキシチミジン−３’−ホスホロチオニル  デオキシチミジン−３’−イル−［３，４，５−トリス（オクタデシルオキシ）ベンジル］スクシネート【０３４３】
以下、ＴＯＢ付加化合物は、国際公開第２０１２／１５７７２３号に記載された方法により合成した。【０３４４】
参考例１：
アルゴン雰囲気下、２０ｍＬの二口フラスコにＨＯ−２’−ＯＭｅ−Ｕ−ＳＵＣ−ＴＯＢ（２５１ｍｇ，２００μｍｏｌ）とＰｉｖ−ＴＯＢ（２５１ｍｇ，２５１μｍｏｌ）を入れ、脱水ジクロロメタン（１０．０ｍＬ）と脱水アセトニトリル（１．０ｍＬ）を加え溶解させた。その後、２’−ＯＭｅ−Ｃ−ＣＥ  ホスホロアミダイト（５１８ｍｇ，６００μｍｏｌ）と５−ベンジルチオ−１Ｈ−テトラゾール（７８．１ｍｇ，６００μｍｏｌ）を順次加え室温で１．０時間撹拌した。続いて、反応溶液に２，２，２−トリフルオロエタノール（２１９μＬ，３．０ｍｍｏｌ）を加え室温で３０分攪拌した後、２，６−キシリジン（３５１μＬ，２．９ｍｍｏｌ）とＤＤＴＴ（１２９ｍｇ，６３０μｍｏｌ）を順次加え、室温で１時間撹拌した。その後、２，３−ジメチルフラン（３１６μＬ，３．０ｍｍｏｌ）とトリフルオロ酢酸（４５９μＬ，６．０ｍｍｏｌ）を順次加え、室温で１．５時間撹拌した。その脱ＤＭＴｒ工程完結時の反応溶液を分析したところ、トリフルオロアセチル化されたオリゴ核酸が０．９７％含まれていた。当該反応溶液を下記記載の実施例１と比較例１へ２つに分割した。【０３４５】
実施例１：ＤＤＴＴによる硫化反応後、脱ＤＭＴｒ化し、加溶媒分解
上記参考例１で合成した伸長オリゴ核酸（３８μｍｏｌ）を含む脱ＤＭＴｒ工程溶液にコリジン（３１８μＬ，２．４ｍｍｏｌ）と水（２３．８μＬ）を順次加え、室温にて２時間攪拌した。反応溶液を分析したところ、トリフルオロアセチル化されたオリゴ核酸残量は０．００４％であった。その後、アセトニトリル（５．７ｍＬ）を添加し、析出した固体をキリヤマ漏斗で吸引濾過した後、乾燥し２量体ＨＯ−ＣｍＵｍ−ＳＵＣ−ＴＯＢを白色固体として得た。
ｍ／ｚ（ＴＯＦ−ＭＳ）：Ｃａｌｃｄ．１７４５．０６，  Ｆｏｕｎｄ  １７４６．０７［Ｍ＋Ｈ］＋
得られた２量体ＨＯ−ＣｍＵｍ−ＳＵＣ−ＴＯＢ（２６．２ｍｇ，１５μｍｏｌ）に脱水ジクロロメタン（０．８ｍＬ）と脱水アセトニトリル（０．１０ｍＬ）を加え溶解させた。その後、２’−ＯＭｅ−Ｇ−ＣＥ  ホスホロアミダイト（３９．１ｍｇ，４５μｍｏｌ）と５−ベンジルチオ−１Ｈ−テトラゾール（８．７ｍｇ，４５μｍｏｌ）を順次加え室温で１．０時間撹拌した。続いて、反応溶液に２，２，２−トリフルオロエタノール（１６．４μＬ，２２５μｍｏｌ）を加え室温で３０分攪拌した後、２，６−キシリジン（２６．３μＬ，２１４μｍｏｌ）とＤＤＴＴ（９．７ｍｇ，４７μｍｏｌ）を順次加え、室温で１時間撹拌した。反応溶液を分析したところ、残存原料は０．０７％であった。【０３４６】
比較例１：ＤＤＴＴによる硫化反応後、脱ＤＭＴｒ化し、加溶媒分解未完結
上記参考例１で合成した伸長オリゴ核酸（３８μｍｏｌ）を含む脱ＤＭＴｒ工程溶液にコリジン（１５９μＬ，１．２ｍｍｏｌ）と水（２４μＬ，１９２μｍｏｌ）を順次加え、室温にて２時間攪拌した。反応溶液を分析したところ、トリフルオロアセチル化されたオリゴ核酸残量は０．２１％であった。その後、アセトニトリル（５．７ｍＬ）を添加し、析出した固体をキリヤマ漏斗で吸引濾過した後、乾燥し２量体ＨＯ−ＣｍＵｍ−ＳＵＣ−ＴＯＢを白色固体として得た。
ｍ／ｚ（ＴＯＦ−ＭＳ）：Ｃａｌｃｄ．１７４５．０６，  Ｆｏｕｎｄ  １７４６．０７［Ｍ＋Ｈ］＋
得られた２量体ＨＯ−ＣｍＵｍ−ＳＵＣ−ＴＯＢ（２６．２ｍｇ，１５μｍｏｌ）に脱水ジクロロメタン（０．８ｍＬ）と脱水アセトニトリル（０．１０ｍＬ）を加え溶解させた。その後、２’−ＯＭｅ−Ｇ−ＣＥ  ホスホロアミダイト（３９．１ｍｇ，４５μｍｏｌ）と５−ベンジルチオ−１Ｈ−テトラゾール（８．７ｍｇ，４５μｍｏｌ）を順次加え室温で１．０時間撹拌した。続いて、反応溶液に２，２，２−トリフルオロエタノール（１６．４μＬ，２２５μｍｏｌ）を加え室温で３０分攪拌した後、２，６−キシリジン（２６．３μＬ，２１４μｍｏｌ）とＤＤＴＴ（９．７ｍｇ，４７μｍｏｌ）を順次加え、室温で１時間撹拌した。反応溶液を分析したところ、残存原料は０．２６％であった。【０３４７】
実施例２：ＰＯＳによる硫化反応後、脱ＤＭＴｒ化し、加溶媒分解
実施例１の硫化剤をＤＤＴＴからＰＯＳに変え同様にして、ＨＯ−ｄＴ−ＳＵＣ−ＴＯＢ（８１μｍｏｌ）に５−Ｍｅ−ｄＣ（Ｂｚ）−ＣＥ  ホスホロアミダイトを伸長させたワンポットオリゴ核酸合成を行い、その脱ＤＭＴｒ工程完結時の反応溶液を分析したところ、トリフルオロアセチル化されたオリゴ核酸が７％含まれていた。その後、反応溶液を３つに分割しそれぞれをＡ溶液、Ｂ溶液およびＣ溶液とした。【０３４８】
Ａ溶液：ピリジンとメタノールによる加溶媒分解
伸長したオリゴ核酸（２０μｍｏｌ）を含む脱ＤＭＴｒ工程溶液にピリジン（６０３μＬ，７．５ｍｍｏｌ）とメタノール（６．７μＬ）を順次加え、室温にて１時間攪拌した。反応液を分析したところ、トリフルオロアセチル化されたオリゴ核酸含有量は０．０１％であった。【０３４９】
Ｂ溶液：コリジンと水による加溶媒分解
伸長したオリゴ核酸（１９μｍｏｌ）を含む脱ＤＭＴｒ工程溶液にコリジン（２５２μＬ，１．９ｍｍｏｌ）と水（６．１μＬ）を順次加え、室温にて１時間攪拌した。反応液を分析したところ、トリフルオロアセチル化されたオリゴ核酸含有量は０．０２％であった。【０３５０】
Ｃ溶液：コリジンとメタノールによる加溶媒分解
伸長したオリゴ核酸（１６μｍｏｌ）を含む脱ＤＭＴｒ工程溶液にコリジン（２０７μＬ，１．６ｍｍｏｌ）とメタノール（５．０μＬ）を順次加え、室温にて１時間攪拌した。反応液を分析したところ、トリフルオロアセチル化されたオリゴ核酸含有量は０．０１％であった。【０３５１】
実施例３：酸化反応後、脱ＤＭＴｒ化し、加溶媒分解
アルゴン雰囲気下、２０ｍＬの二口フラスコに、参考例１においてＨＯ−２’−ＯＭｅ−Ｕ−ＳＵＣ−ＴＯＢの代わりにＨＯ−Ｔ−ＳＵＣ−ＴＯＢを用いることにより、参考例１および実施例１と同様にして合成したＨＯ−ＣｍＴ−ＳＵＣ−ＴＯＢ（１０１ｍｇ、６０μｍｏｌ）を入れ、脱水ジクロロメタン（２．９ｍＬ）と脱水アセトニトリル（０．９ｍＬ）を加え溶解させた。その後、２’−ＯＭｅ−Ｇ−ＣＥ  ホスホロアミダイト（１５１ｍｇ，１７３μｍｏｌ）と５−エチルチオ−１Ｈ−テトラゾール（２２．６ｍｇ，１７３μｍｏｌ）を順次加え室温で１時間撹拌した。続いて、反応溶液にテトラヒドロフルフリルアルコール（１９．５μＬ，８６６μｍｏｌ）を加え室温で３０分攪拌した後、水（７８μＬ）とピリジン（７０μＬ，８６７μｍｏｌ）、ヨウ素（８９．３ｍｇ，３５２μｍｏｌ）を順次加え、室温で１時間撹拌した。その後、２，３−ジメチルフラン（９１．６μＬ，８６９μｍｏｌ）とトリフルオロ酢酸（１９９μＬ，２．６ｍｍｏｌ）を順次加え、室温で１時間撹拌した。反応溶液を分析したところ、トリフルオロアセチル化されたオリゴ核酸量は１１％であった。反応液にコリジン（６９２μＬ，５．２ｍｍｏｌ）と水（１９μＬ，１．１μｍｍｏｌ）を順次加え、室温にて２時間攪拌した。反応溶液を分析したところ、トリフルオロアセチル化されたオリゴ核酸残量は０．０７％であった。その後、アセトニトリル（１５ｍＬ）を添加し、析出した固体を桐山漏斗で吸引濾過した後、乾燥し３量体ＨＯ−ＧｍＣｍＴ−ＳＵＣ−ＴＯＢを白色固体として得た（１０３．２ｍｇ）。
ｍ／ｚ（ＴＯＦ−ＭＳ）：Ｃａｌｃｄ．２２１１．２０，  Ｆｏｕｎｄ  ２２１２．２３［Ｍ＋Ｈ］＋【０３５２】
実施例４：４量体（ＨＯ−ｒＣＣｆＡＬＴ−ＳＵＣ−ＴＯＢ）の合成と脱保護
アルゴン雰囲気下、２００ｍＬの二口フラスコにＨＯ−Ｔ−ＳＵＣ−ＴＯＢ（３００ｍｇ，２４２μｍｏｌ）とＰｉｖ−ＴＯＢ（４５０ｍｇ，４５１μｍｏｌ）を入れ、脱水ジクロロメタン（１２．１ｍＬ）と脱水アセトニトリル（３．６ｍＬ）を加え溶解させた。その後、ＬＮＡ−Ａ(Ｂｚ)−ＣＥ  ホスホロアミダイト（６４４ｍｇ，７２７μｍｏｌ）と５−エチルチオ−１Ｈ−テトラゾール（９４．６ｍｇ，７２７μｍｏｌ）を順次加え室温で１．０時間撹拌した。続いて、反応溶液に２，２，２−トリフルオロエタノール（２６５μＬ，３．６ｍｍｏｌ）を加え室温で３０分攪拌した後、２，６−キシリジン（５０６μＬ，４．１ｍｍｏｌ）とＤＤＴＴ（１７４ｍｇ，８４８μｍｏｌ）を順次加え、室温で１．７時間撹拌した。その後、インドール（４２４ｍｇ，３．６ｍｍｏｌ）とトリフルオロ酢酸（１．１ｍＬ，１４．４ｍｍｏｌ）を順次加え、室温で１．０時間撹拌した。ＤＭＴｒ工程完結時の反応溶液を分析したところ、トリフルオロアセチル化されたオリゴ核酸が１．２３％含まれていた。続いて反応溶液にピリジン（３．５ｍＬ，４３．０ｍｍｏｌ）と水（１８０μＬ）を順次加え、室温にて１．０時間攪拌した。反応溶液を分析したところ、トリフルオロアセチル化されたオリゴ核酸残量は０．０１７％であった。その後、アセトニトリル（１１２ｍＬ）を添加し、析出した固体をキリヤマ漏斗で吸引濾過した後、乾燥し、２量体ＨＯ−ＡＬＴ−ＳＵＣ−ＴＯＢを白色固体として得た（８２９．９ｍｇ、９５％）。
ｍ／ｚ：Ｃａｌｃｄ．１７５１．０７，  Ｆｏｕｎｄ  １７５３．０９［Ｍ＋Ｈ］＋【０３５３】
アルゴン雰囲気下、２００ｍＬの二口フラスコにて得られた白色固体（８２９．９ｍｇ）に脱水ジクロロメタン（１１．５ｍＬ）と脱水アセトニトリル（３．４ｍＬ）を加え溶解させた。その後、２’−Ｆ−Ｃ（Ｂｚ）−ＣＥ  ホスホロアミダイト（５９１ｍｇ，６９４μｍｏｌ）と４，５−ジシアノイミダゾール（８３．５ｍｇ，７０７μｍｏｌ）を順次加え室温で１．０時間撹拌した。続いて、反応溶液に２，２，２−トリフルオロエタノール（２５１μＬ，３．５ｍｍｏｌ）を加え室温で３０分攪拌した後、２，６−キシリジン（４８０μＬ，３．９ｍｍｏｌ）とＤＤＴＴ（１６５ｍｇ，８０５μｍｏｌ）を順次加え、室温で２．０時間撹拌した。その後、インドール（４０２ｍｇ，３．４３ｍｍｏｌ）とトリフルオロ酢酸（１．０ｍＬ，１３．６ｍｍｏｌ）を順次加え、室温で１．０時間撹拌した。ＤＭＴｒ工程完結時の反応溶液を分析したところ、トリフルオロアセチル化されたオリゴ核酸が２．７４％含まれていた。続いて反応溶液にピリジン（３．３ｍＬ，４０．８ｍｍｏｌ）と水（１７０μＬ）を順次加え、室温にて１．０時間攪拌した。反応溶液を分析したところ、トリフルオロアセチル化されたオリゴ核酸残量は０．０８４％であった。その後、アセトニトリル（１１０ｍＬ）を添加し、析出した固体をキリヤマ漏斗で吸引濾過した後、乾燥し３量体ＨＯ−ＣｆＡＬＴ−ＳＵＣ−ＴＯＢを白色固体として得た（７８０．１ｍｇ、８３％）。
ｍ／ｚ：ｃａｌｃｄ．２２３１．１３，  ｆｏｕｎｄ  １１１７．０７［Ｍ＋２Ｈ］２＋【０３５４】
アルゴン雰囲気下、２００ｍＬの二口フラスコにて得られた白色固体（７１８ｍｇ）に脱水ジクロロメタン（８．８ｍＬ）と脱水アセトニトリル（２．６ｍＬ）を加え溶解させた。その後、２’−Ｏ−ＴＢＤＭＳ−Ｃ（Ａｃ）-ＣＥ  ホスホロアミダイト（４７５ｍｇ，５２７μｍｏｌ）と５−エチルチオ−１Ｈ−テトラゾール（６８．９ｍｇ，５２８μｍｏｌ）を順次加え室温で１．０時間撹拌した。続いて、反応溶液に２，２，２−トリフルオロエタノール（１９２μＬ，２．６ｍｍｏｌ）を加え室温で３０分攪拌した後、２，６−キシリジン（３６６μＬ，３．０ｍｍｏｌ）とＤＤＴＴ（１２７ｍｇ，６１９μｍｏｌ）を順次加え、室温で１．０時間撹拌した。その後、インドール（３０７ｍｇ，２．６ｍｍｏｌ）とトリフルオロ酢酸（７９６μＬ，１０．４ｍｍｏｌ）を順次加え、室温で１．０時間撹拌した。ＤＭＴｒ工程完結時の反応溶液を分析したところ、トリフルオロアセチル化されたオリゴ核酸が２．７３％含まれていた。続いて反応溶液にピリジン（２．５ｍＬ，３１．２ｍｍｏｌ）と水（１３０μＬ）を順次加え、室温にて１．０時間攪拌した。反応溶液を分析したところ、トリフルオロアセチル化されたオリゴ核酸残量は０．０７０％であった。その後、アセトニトリル（１００ｍＬ）を添加し、析出した固体をキリヤマ漏斗で吸引濾過した後、乾燥し４量体ＨＯ−ｒＣＣｆＡＬＴ−ＳＵＣ−ＴＯＢを白色固体として得た（７５８．５ｍｇ、９４％）。
ｍ／ｚ：ｃａｌｃｄ．２７６１．２７，  ｆｏｕｎｄ  １３８２．１５［Ｍ＋２Ｈ］２＋【０３５５】
脱保護
上記で得られた白色固体（１０ｍｇ）と３０重量％アンモニア水（５．０ｍＬ）の混合物をオートクレーブに入れて、６５℃で４時間加熱した後、室温まで冷却した。シリンジフィルターにより反応液中の不溶物を除去した後、遠心エバポレーターで減圧濃縮した。その後、濃縮液を凍結乾燥し、目的物である２’−Ｏ−（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル）−シチジン−３’−ホスホロチオニル−２’−フルオロ−シチジン−３’−ホスホロチオニル−２’−Ｏ，４’−Ｃ−メチレン−アデノシン−３’−ホスホロチオニル−デオキシチミジンを得た。
ｍ／ｚ：ｃａｌｃｄ．１３５７．２４，ｆｏｕｎｄ  １３５６．２３［Ｍ−Ｈ］−【０３５６】
実施例５：３量体（ＨＯ−ｒＣＣｆＡＬ（ＣＨ２）２−ＳＵＣ−ＴＯＢ）の合成と脱保護
アルゴン雰囲気下、２００ｍＬの二口フラスコにＨＯ−（ＣＨ２）２−ＳＵＣ−ＴＯＢ（２５６ｍｇ，２４２μｍｏｌ）とＰｉｖ−ＴＯＢ（３８５ｍｇ，３８６μｍｏｌ）を入れ、脱水ジクロロメタン（１２．１ｍＬ）と脱水アセトニトリル（３．６ｍＬ）を加え溶解させた。その後、ＬＮＡ−Ａ（Ｂｚ）−ＣＥ  ホスホロアミダイト（６４４ｍｇ，７２７μｍｏｌ）と５−エチルチオ−１Ｈ−テトラゾール（９４．７ｍｇ，７２７μｍｏｌ）を順次加え室温で１．０時間撹拌した。続いて、反応溶液に２，２，２−トリフルオロエタノール（２６５μＬ，３．６ｍｍｏｌ）を加え室温で３０分攪拌した後、２，６−キシリジン（５０６μＬ，４．１ｍｍｏｌ）とＤＤＴＴ（１７４ｍｇ，８４８μｍｏｌ）を順次加え、室温で１．７時間撹拌した。その後、インドール（４２４ｍｇ，３．６ｍｍｏｌ）とトリフルオロ酢酸（１．１ｍＬ，１４．４ｍｍｏｌ）を順次加え、室温で１．０時間撹拌した。ＤＭＴｒ工程完結時の反応溶液を分析したところ、トリフルオロアセチル化されたオリゴ核酸が１．７６％含まれていた。続いて反応溶液にピリジン（３．５ｍＬ，４３．１ｍｍｏｌ）と水（１８０μＬ）を順次加え、室温にて１．０時間攪拌した。反応溶液を分析したところ、トリフルオロアセチル化されたオリゴ核酸残量は０．０１５％であった。その後、アセトニトリル（１２０ｍＬ）を添加し、析出した固体をキリヤマ漏斗で吸引濾過した後、乾燥しＨＯ−ＡＬ（ＣＨ２）２−ＳＵＣ−ＴＯＢを白色固体として得た（７６２ｍｇ、定量的）。
ｍ／ｚ：ｃａｌｃｄ．１５７１．０１，  ｆｏｕｎｄ  １５７２．０４［Ｍ＋Ｈ］＋【０３５７】
アルゴン雰囲気下、２００ｍＬの二口フラスコにて得られた白色固体（７６２ｍｇ）を入れ、脱水ジクロロメタン（１２．１ｍＬ）と脱水アセトニトリル（３．６ｍＬ）を加え溶解させた。その後、２’−Ｆ−Ｃ（Ｂｚ）−ＣＥ  ホスホロアミダイト（６１５ｍｇ，７２４μｍｏｌ）と４，５−ジシアノイミダゾール（８６．２ｍｇ，７３０μｍｏｌ）を順次加え室温で１．０時間撹拌した。続いて、反応溶液に２，２，２−トリフルオロエタノール（２６４μＬ，３．６ｍｍｏｌ）を加え室温で３０分攪拌した後、２，６−キシリジン（５０３μＬ，４．１ｍｍｏｌ）とＤＤＴＴ（１７３ｍｇ，８４４μｍｏｌ）を順次加え、室温で２．０時間撹拌した。その後、インドール（４２２ｍｇ，３．６ｍｍｏｌ）とトリフルオロ酢酸（１．１ｍＬ，１４．３ｍｍｏｌ）を順次加え、室温で１．０時間撹拌した。ＤＭＴｒ工程完結時の反応溶液を分析したところ、トリフルオロアセチル化されたオリゴ核酸が２．９５％含まれていた。続いて反応溶液にピリジン（３．５ｍＬ，４２．８ｍｍｏｌ）と水（１７９μＬ）を順次加え、室温にて１．０時間攪拌した。反応溶液を分析したところ、トリフルオロアセチル化されたオリゴ核酸残量は０．０７６％であった。その後、アセトニトリル（１２０ｍＬ）を添加し、析出した固体をキリヤマ漏斗で吸引濾過した後、乾燥し２量体ＨＯ−ＣｆＡＬ（ＣＨ２）２−ＳＵＣ−ＴＯＢを白色固体として得た（８１７．７ｍｇ、９４％）。
ｍ／ｚ：ｃａｌｃｄ．２０５１．０７８９，  ｆｏｕｎｄ  １０２７．０５  ［Ｍ＋２Ｈ］２＋【０３５８】
アルゴン雰囲気下、２００ｍＬの二口フラスコにて得られた白色固体（６４０ｍｇ，）に脱水ジクロロメタン（８．８ｍＬ）と脱水アセトニトリル（２．６ｍＬ）を加え溶解させた。その後、２’−Ｏ−ＴＢＤＭＳ−Ｃ（Ａｃ）-ＣＥ  ホスホロアミダイト（４７６ｍｇ，５２８μｍｏｌ）と５−エチルチオ−１Ｈ−テトラゾール（６８．５ｍｇ，５２７μｍｏｌ）を順次加え室温で１．０時間撹拌した。続いて、反応溶液に２，２，２−トリフルオロエタノール（１９２μＬ，２．６ｍｍｏｌ）を加え室温で３０分攪拌した後、２，６−キシリジン（３６７μＬ，２．９ｍｍｏｌ）とＤＤＴＴ（１２６ｍｇ，６１３μｍｏｌ）を順次加え、室温で１時間撹拌した。その後、インドール（３０８ｍｇ，２．６ｍｍｏｌ）とトリフルオロ酢酸（７９７μＬ，１０．４ｍｍｏｌ）を順次加え、室温で１．０時間撹拌した。ＤＭＴｒ工程完結時の反応溶液を分析したところ、トリフルオロアセチル化されたオリゴ核酸が２．７９％含まれていた。続いて反応溶液にピリジン（２．５ｍＬ，３１．２ｍｍｏｌ）と水（１３０μＬ）を順次加え、室温にて１．０時間攪拌した。反応溶液を分析したところ、トリフルオロアセチル化されたオリゴ核酸残量は０．０５１％であった。その後、アセトニトリル（１００ｍＬ）を添加し、析出した固体をキリヤマ漏斗で吸引濾過した後、乾燥し３量体ＨＯ−ｒＣＣｆＡＬ（ＣＨ２）２−ＳＵＣ−ＴＯＢを白色固体として得た（６９０．６ｍｇ、９５％）。
ｍ／ｚ：ｃａｌｃｄ．２５８１．２２，  ｆｏｕｎｄ  １２９２．１１［Ｍ＋２Ｈ］２＋【０３５９】
脱保護
上記で得られた白色固体（１０ｍｇ）と３０重量％アンモニア水（５．０ｍＬ）の混合物をオートクレーブに入れて、６５℃で４時間加熱した後、室温まで冷却した。シリンジフィルターにより反応液中の不溶物を除去した後、遠心エバポレーターで減圧濃縮した。その後、濃縮液を凍結乾燥し、目的物である２’−Ｏ−（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル）−シチジン−３’−ホスホロチオニル−２’−フルオロ−シチジン−３’−ホスホロチオニル−２’−Ｏ，４’−Ｃ−メチレン−アデノシン−３’−ホスホロチオニル−エタノールを得た。
ｍ／ｚ：ｃａｌｃｄ．１１７７．１８，ｆｏｕｎｄ  １１７６．１８［Ｍ−Ｈ］−【０３６０】
実施例６：Ｈ−ホスホネートを用いた２量体の合成
アルゴン雰囲気下、５０ｍＬの二口フラスコにＨＯ−Ｔ−ＳＵＣ−ＴＯＢ（１００ｍｇ，８０．８μｍｏｌ）とｄＴ−Ｈ−ホスホネート  ＴＥＡ塩（１１５．７ｍｇ，１６３μｍｏｌ）を入れ、脱水ジクロロメタン（２．０ｍＬ）と脱水ピリジン（２．０ｍＬ）を加え溶解させた。その後、ＰｉｖＣｌ（２９．５μｌ，２４２μｍｏｌ）を加え室温で２．０時間撹拌した。その後、アセトニトリル（３０ｍＬ）を添加し、析出した固体をキリヤマ漏斗で吸引濾過した後、乾燥し白色固体（１３３ｍｇ）を得た。得られた固体をアルゴン雰囲気下、５０ｍＬの二口フラスコに入れ、脱水ジクロロメタン（３．６ｍＬ）と脱水アセトニトリル（１．１ｍＬ）を加え溶解させた。その後、インドール（４２．５ｍｇ，３６３μｍｏｌ）とトリフルオロ酢酸（６６．７μＬ，８７１μｍｏｌ）を順次加え、室温で１．０時間撹拌した。続いて反応溶液にピリジン（２１１μＬ，２．６ｍｍｏｌ）と水（４７μＬ）を順次加え、室温にて１．０時間攪拌した。その後、アセトニトリル（３０ｍＬ）を添加し、析出した固体をキリヤマ漏斗で吸引濾過した後、乾燥し２量体ＨＯ−ＴＨＴ−ＳＵＣ−ＴＯＢを白色固体として得た（８２．２ｍｇ、７４％）。
ｍ／ｚ：ｃａｌｃｄ．１５２５．０３，  ｆｏｕｎｄ  １５２６．０５［Ｍ＋Ｈ］＋【０３６１】
アルゴン雰囲気下、５０ｍＬの二口フラスコにＨＯ−Ｔ−ＳＵＣ−ＴＯＢ（９９．１ｍｇ，８０．０μｍｏｌ）とｄＴ−Ｈ−ホスホネート  ＴＥＡ塩（１１５．１ｍｇ，１６２μｍｏｌ）を入れ、脱水ジクロロメタン（２．０ｍＬ）と脱水ピリジン（２．０ｍＬ）を加え溶解させた。その後、ＰｉｖＣｌ（２９．５μｌ，２４２μｍｏｌ）を加え室温で１．０時間撹拌した。続いて、反応溶液にＤＢＵ（４８．４μＬ，３２４μｍｏｌ）とＤＤＴＴ（３３．３ｍｇ，１６２μｍｏｌ）を加え室温で４０分攪拌した。その後、アセトニトリル（３０ｍＬ）を添加し、析出した固体をキリヤマ漏斗で吸引濾過した後、乾燥し白色固体を得た。得られた固体をアルゴン雰囲気下、５０ｍＬの二口フラスコに入れ、脱水ジクロロメタン（３．９ｍＬ）と脱水アセトニトリル（１．２ｍＬ）を加え溶解させた。その後、インドール（４５．６ｍｇ，３８９μｍｏｌ）とトリフルオロ酢酸（７１．６μＬ，９１０μｍｏｌ）を順次加え、室温で１．０時間撹拌した。続いて反応溶液にピリジン（２２６μＬ，２．８ｍｍｏｌ）と水（５１μＬ）を順次加え、室温にて１．０時間攪拌した。その後、アセトニトリル（３０ｍＬ）を添加し、析出した固体をキリヤマ漏斗で吸引濾過した後、乾燥し２量体ＨＯ−ＴＯＨＴ−ＳＵＣ−ＴＯＢを白色固体として得た（１０７．３ｍｇ、８９％）。
ｍ／ｚ：ｃａｌｃｄ．１５４１．０３，  ｆｏｕｎｄ  １５４２．０４［Ｍ＋Ｈ］＋【０３６２】
実施例７：トリクロロ酢酸を用いた実験
アルゴン雰囲気下、５０ｍＬの二口フラスコにＨＯ−Ｕｍ−ＳＵＣ−ＴＯＢ（１０２．４ｍｇ，８１．７μｍｏｌ）とＰｉｖ−ＴＯＢ（１０５ｍｇ，１０５μｍｏｌ）を入れ、脱水ジクロロメタン（４．０ｍＬ）と脱水アセトニトリル（１．２ｍＬ）を加え溶解させた。その後、ｄＧ−ＣＥ  ホスホロアミダイト（１３５．１ｍｇ，１６１μｍｏｌ）と５−エチルチオ−１Ｈ−テトラゾール（２１．４ｍｇ，１６４μｍｏｌ）を順次加え室温で１．０時間撹拌した。続いて、反応溶液に２，２，２−トリフルオロエタノール（５８．１μＬ，７９７μｍｏｌ）を加え室温で３０分攪拌した後、２，６−キシリジン（１１８μＬ，９５５μｍｏｌ）とＤＤＴＴ（４０．９ｍｇ，１９９μｍｏｌ）を順次加え、室温で１．０時間撹拌した。その後、インドール（９３．６ｍｇ，７９９μｍｏｌ）とトリクロロ酢酸（６９８ｍｇ，４．２７ｍｍｏｌ）を順次加え、室温で１．０時間撹拌した。続いて反応溶液にピリジン（１．０１ｍＬ，１２．６ｍｍｏｌ）と水（６６μＬ）を順次加え、室温にて１．０時間攪拌した。その後、アセトニトリル（４２ｍＬ）を添加し、析出した固体をキリヤマ漏斗で吸引濾過した後、乾燥し２量体ＨＯ−ＧＵｍ−ＳＵＣ−ＴＯＢを白色固体として得た（２４１．５ｍｇ）。
ｍ／ｚ：ｃａｌｃｄ．１７２１．０７，  ｆｏｕｎｄ  １７２３．１０［Ｍ＋Ｈ］＋【０３６３】
実施例８：ジクロロ酢酸を用いた実験
アルゴン雰囲気下、５０ｍＬの二口フラスコにＨＯ−Ｕｍ−ＳＵＣ−ＴＯＢ（９９．６ｍｇ，７９．４μｍｏｌ）とＰｉｖ−ＴＯＢ（９７．９ｍｇ，９８．０μｍｏｌ）を入れ、脱水ジクロロメタン（４．０ｍＬ）と脱水アセトニトリル（１．２ｍＬ）を加え溶解させた。その後、ｄＧ−ＣＥ  ホスホロアミダイト（１３４．２ｍｇ，１６０μｍｏｌ）と５−エチルチオ−１Ｈ−テトラゾール（２０．９ｍｇ，１６１μｍｏｌ）を順次加え室温で１．０時間撹拌した。続いて、反応溶液に２，２，２−トリフルオロエタノール（５８．１μＬ，７９７μｍｏｌ）を加え室温で３０分攪拌した後、２，６−キシリジン（１１８μＬ，９５５μｍｏｌ）とＤＤＴＴ（４０．９ｍｇ，１９９μｍｏｌ）を順次加え、室温で１．０時間撹拌した。その後、インドール（９３．２ｍｇ，７９６μｍｏｌ）とジクロロ酢酸（４７８μｌ，５．７８ｍｍｏｌ）を順次加え、室温で１．０時間撹拌した。続いて反応溶液にピリジン（１．４０ｍＬ，１７．４ｍｍｏｌ）と水（６１μＬ）を順次加え、室温にて１．０時間攪拌した。その後、アセトニトリル（４０ｍＬ）を添加し、析出した固体をキリヤマ漏斗で吸引濾過した後、乾燥し２量体ＨＯ−ＧＵｍ−ＳＵＣ−ＴＯＢを白色固体として得た（２２８．７ｍｇ、９６％）。
ｍ／ｚ：ｃａｌｃｄ．１７２１．０７，  ｆｏｕｎｄ  １７２３．１０［Ｍ＋Ｈ］＋
【産業上の利用可能性】
【０３６４】
本発明のオリゴヌクレオチドの製造方法によれば、縮合反応を完結させて縮合収率を向上させ、１塩基欠損体（Ｎ−１ｍｅｒ）などの不純物を著しく低減することができる。本発明の製造方法によって得られたオリゴヌクレオチドは、人体用または動物用の医薬品（ＲＮＡ、ＤＮＡ、オリゴ核酸医薬等）、機能性食品、特定保健用食品、食品、化成品、生体用や工業用の高分子材料等の各種用途に使用することができる。【０３６５】
本出願は、日本で出願された特願２０１９−０２５６０５を基礎としており、その内容は本明細書にすべて包含されるものである。
【国際調査報告】
2020166705.tif 000045
2020166705.tif 000046
2020166705.tif 000047
2020166705.tif 000048