(57)【要約】  【発明を解決するための課題】  再生医療において有用な、線維化抑制効果の高い組成物及び細胞シートまたは線維化抑制作用のある細胞を提供すること。  【解決手段】  間葉系幹細胞または骨髄単核細胞を、ＩＣ−２またはこの類縁化合物を含む培地に播種し、当該細胞を所定期間、ＩＣ−２またはこの類縁化合物の濃度を一定に保って培養することにより、線維化抑制効果の高い組成物及び細胞シートまたは線維化抑制作用のある培養細胞を得ることができる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
線維溶解作用のあるマトリックスメタロプロテアーゼファミリーおよび肝星細胞活性抑制因子を含む線維化抑制組成物。
【請求項２】
前記線維溶解作用のあるマトリックスメタロプロテアーゼが、ＭＭＰ−１、ＭＭＰ−１４、ＭＭＰ−２、およびＭＭＰ−１３、またはこれらの任意の組み合せである、請求項１に記載の線維化抑制組成物。
【請求項３】
前記肝星細胞活性抑制因子が、チオレドキシン（ＴＲＸ）である、請求項１に記載の線維化抑制組成物。
【請求項４】
前記線維溶解作用のあるマトリックスメタロプロテアーゼが、ＭＭＰ−１、ＭＭＰ−１４、ＭＭＰ−２、およびＭＭＰ−１３であり、前記肝星細胞活性抑制因子が、チオレドキシン（ＴＲＸ）である、請求項１に記載の線維化抑制組成物。
【請求項５】
骨髄単核細胞または間葉系幹細胞より作製し、細胞中や分泌物中に、線維溶解作用のあるマトリックスメタロプロテアーゼおよび肝星細胞活性抑制因子を多く含む線維化抑制組成物。
【請求項６】
骨髄単核細胞または間葉系幹細胞より作製し、細胞中や分泌物中に、線維溶解作用のあるマトリックスメタロプロテアーゼおよび肝星細胞活性抑制因子を多く含み、前記マトリックスメタロプロテアーゼ中、特にコラーゲン溶解性の高いマトリックスメタロプロテアーゼが多く含まれることを特徴とする請求項５に記載の線維化抑制組成物。
【請求項７】
前記線維溶解作用のあるマトリックスメタロプロテアーゼ中、特にコラーゲン溶解性の高いマトリックスメタロプロテアーゼであるＭＭＰ−１およびＭＭＰ−１４が多く含まれる、請求項６に記載の線維化抑制組成物。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれか１項に記載の線維化抑制組成物を生産する、間葉系幹細胞。
【請求項９】
線維化抑制効果の高い組成物を製造する方法であって、
ｉ）ＩＣ−２またはこの類縁化合物を含む培地で骨髄単核細胞または間葉系幹細胞を培養する工程；
ｉｉ）前記ｉ）で得られた培養物から培養細胞、該細胞の分泌物またはその双方を回収する工程；および
ｉｉｉ）前記ｉｉ）で回収した前記培養細胞中、分泌物中またはその双方中のタンパク質を回収する工程、を含む方法。
【請求項１０】
前記ＩＣ−２またはこの類縁化合物を含む培地で骨髄単核細胞または間葉系幹細胞を培養する工程に用いる化合物が、以下の式（１）であらわされる、請求項９に記載の方法：
【化１】
2019235362.tif 000006
（式中、
Ｒ１、Ｒ２、及びＲ４は、同一又は互いに異なって、Ｈ、ハロゲン、ニトロ、シアノ、ＯＨ、置換されていてもよいＣ１〜Ｃ６アルキル、置換されていてもよいＣ２〜Ｃ６アルケニル、置換されていてもよいＣ１〜Ｃ６アルコキシ、アリール、又はヘテロアリール；
Ｒ３は、Ｈ、置換されていてもよいＣ１〜Ｃ６アルキル、置換されていてもよいＣ２〜Ｃ６アルケニル；
ｍは、１〜４いずれかの整数；
ｎは、１〜３いずれかの整数；
ｐは、１〜５いずれかの整数である。
但し、Ｎ−［（５−メチル−２−フリル）メチリデンアミノ］−２−フェノキシ−ベンザミドを除く。）。
【請求項１１】
線維化抑制効果の高い細胞シートを製造する方法であって、
ｉ）ＩＣ−２またはこの類縁化合物を含む培地で間葉系幹細胞を、少なくとも９日間培養する工程において、ＩＣ−２の濃度を一定に保つことを含む工程；および
ｉｉ）前記ｉ）の工程で生成した、間葉系幹細胞および該細胞の分泌物を含む細胞シートを回収する工程；
を含む、前記細胞シートの製造方法。
【請求項１２】
前記ＩＣ−２またはこの類縁化合物が、以下の式（１）であらわされる、請求項１１に記載の方法：
【化２】
2019235362.tif 000007
（式中、
Ｒ１、Ｒ２、及びＲ４は、同一又は互いに異なって、Ｈ、ハロゲン、ニトロ、シアノ、ＯＨ、置換されていてもよいＣ１〜Ｃ６アルキル、置換されていてもよいＣ２〜Ｃ６アルケニル、置換されていてもよいＣ１〜Ｃ６アルコキシ、アリール、又はヘテロアリール；
Ｒ３は、Ｈ、置換されていてもよいＣ１〜Ｃ６アルキル、置換されていてもよいＣ２〜Ｃ６アルケニル；
ｍは、１〜４いずれかの整数；
ｎは、１〜３いずれかの整数；
ｐは、１〜５いずれかの整数である。
但し、Ｎ−［（５−メチル−２−フリル）メチリデンアミノ］−２−フェノキシ−ベンザミドを除く。）。
【請求項１３】
間葉系幹細胞による線維化抑制物質の生産を増加させる方法であって、ＩＣ−２またはこの類縁化合物を含む培地で骨髄単核細胞または間葉系幹細胞を培養することを含む方法。
【請求項１４】
前記ＩＣ−２またはこの類縁化合物が、以下の式（１）であらわされる、請求項１０に記載の方法：
【化３】
2019235362.tif 000008
（式中、
Ｒ１、Ｒ２、及びＲ４は、同一又は互いに異なって、Ｈ、ハロゲン、ニトロ、シアノ、ＯＨ、置換されていてもよいＣ１〜Ｃ６アルキル、置換されていてもよいＣ２〜Ｃ６アルケニル、置換されていてもよいＣ１〜Ｃ６アルコキシ、アリール、又はヘテロアリール；
Ｒ３は、Ｈ、置換されていてもよいＣ１〜Ｃ６アルキル、置換されていてもよいＣ２〜Ｃ６アルケニル；
ｍは、１〜４いずれかの整数；
ｎは、１〜３いずれかの整数；
ｐは、１〜５いずれかの整数である。
但し、Ｎ−［（５−メチル−２−フリル）メチリデンアミノ］−２−フェノキシ−ベンザミドを除く。）。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本開示は、再生医療に用いる細胞シートに関する。具体的には、本開示は、線維化抑制活性を高めた細胞シートに関する。また、本開示は、マトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）ファミリータンパク質を含む組成物にも関する。
【背景技術】
【０００２】
「再生医療」は、培養などして増やした細胞を利用して、機能のみならず体の構造も元の状態、あるいはできるだけそれに近い状態に戻す治療を可能にする。培養した細胞そのものを注射する方法もあるが、所定の組織において、細胞が持っている修復機能を働かせるためには、移植した細胞を組織に一体化させて定着させる必要がある。【０００３】
細胞シートは、患者の組織または確立された細胞株から採取した細胞を培養し、シート状にしたものである。培養して増やした一定量の細胞がそれぞれ結合して単層のシートになっている。細胞シートの下部には細胞外マトリックスなどの接着タンパク質が維持されているため、外科的な縫合をすることなく細胞シートが移植組織に生着する。生着した細胞シートは液性因子を放出し再生治癒を促進する。これまでに角膜・心臓・食道などへのヒト移植・再生治療が実施されており、今後ますます応用範囲が拡大していくものと期待される。【０００４】
本願発明者らは、Ｗｎｔ／β−カテニンシグナル抑制作用のある化合物を用いて、間葉系幹細胞および骨髄由来単核細胞を肝機能を有する細胞に分化させ、該分化させた細胞をシート化し、該シートを複数枚重ねて、マウスにて肝障害を抑制したことを報告している（特許文献１）。特許文献１で、Ｃ３誘導によるＮＦ−ｋＢ／ＩＬ−６／ＳＴＡＴ３活性化、チオレドキシン（ＴＲＸ）誘導によるＴＲＸ  ｏｘｉｄａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ  ｃｙｃｌｅの活性化、ａｍｐｈｉｒｅｇｕｌｉｎ  誘導によるＥＧＦＲ経路活性化の複合的機序を報告している。【０００５】
肝障害の一症状として、組織の線維化が挙げられる。肝臓において線維化が進むと、肝硬変、肝癌になる。そのほか、線維化は肺、腎臓、心臓、皮膚などにも生じる。非特許文献１には、線維化治療に関するものとして、ピルフェニドンの臨床試験の結果が記載されている。【０００６】
これに対して、本願発明者らは、本願と同時継続しているＰＣＴ／ＪＰ２０１８／０３１５３７（日本国特許出願第２０１７−１６８１１８号に基づく優先権を主張し、ＷＯ２０１９／０４４７５３Ａ１として２０１９年３月７日に国際公開されている。従って、本願に対する先行技術文献とは見做されない。）に記載したとおり、骨髄単核細胞からなる細胞シートにおいて線維化抑制作用を高めることが可能となる手段を発見している。具体的には、骨髄単核細胞からなる細胞シートにおいて、作製時に播種密度を高くすることでＭＭＰ−１およびＭＭＰ−１４の活性の高い細胞シートを作製したことを報告している。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】ＷＯ２０１２／１４１０３８Ａ１
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Ｎｏｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｌａｎｃｅｔ．Ｍａｙ  ２１；３７７（９７７９）：１７６０−９
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
上記のように、副作用がない再生医療の治療法、特に細胞シートでの治療法は確立されつつある。しかしながら、このような細胞シートにおける治療は、開腹もしくは内視鏡による手術が必要とされる。従って、より簡便に肝機能障害あるいは各種臓器の線維化に効果のある組成物または治療方法の開発が期待される。【００１０】
さらには、従前の細胞シートでは、複数枚の細胞シートを患部に貼ることが必要とされる上に、分化させた細胞シートにおいて分化細胞数を全ての試料において厳密に管理・把握することは難しい。従って、上記のような細胞シートを製品として管理することは労力が必要とされる。このことから、細胞シートを用いる治療において、細胞シート単体での効果を向上させる、即ち治療効果のある因子などの活性を向上させることについての需要は依然として存在する。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本願発明者らは、上記のような課題を解決するために鋭意検討した結果、間葉系幹細胞や骨髄単核細胞を培養する工程から、線維溶解作用のあるマトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）のファミリータンパク質および／または肝星細胞活性化抑制因子を含む組成物、このような組成物を生産する能力を有する細胞、およびこのような細胞からなる細胞シートを得ることに成功した。該組成物は複数種のＭＭＰおよび／または肝星細胞活性化抑制因子である、ＴＲＸおよび／またはＭＦＧＥ−８を含むことから、生体内で相加的に作用して線維化抑制効果を高めることが可能となる。【００１２】
また、前記工程から得られた細胞シートはこのような組成物を生産することができることから細胞シート自体の線維化抑制因子の生産および放出能力が高い細胞シートであると言える。【００１３】
即ち、本願発明は、以下の態様を含む：
［１］線維溶解作用のあるマトリックスメタロプロテアーゼファミリーおよび肝星細胞活性抑制因子を含む線維化抑制組成物；
［２］前記線維溶解作用のあるマトリックスメタロプロテアーゼが、ＭＭＰ−１、ＭＭＰ−１４、ＭＭＰ−２、およびＭＭＰ−１３、またはこれらの任意の組み合せである、［１］に記載の線維化抑制組成物；
［３］前記肝星細胞活性抑制因子が、チオレドキシン（ＴＲＸ）である、［１］に記載の線維化抑制組成物；
［４］前記線維溶解作用のあるマトリックスメタロプロテアーゼが、ＭＭＰ−１、ＭＭＰ−１４、ＭＭＰ−２、およびＭＭＰ−１３であり、前記肝星細胞活性抑制因子が、チオレドキシン（ＴＲＸ）である［１］に記載の線維化抑制組成物；
［５］骨髄単核細胞または間葉系幹細胞より作製し、細胞中や分泌物中に、線維溶解作用のあるマトリックスメタロプロテアーゼおよび肝星細胞活性抑制因子を多く含む線維化抑制組成物；
［６］骨髄単核細胞または間葉系幹細胞より作製し、細胞中や分泌物中に、線維溶解作用のあるマトリックスメタロプロテアーゼおよび肝星細胞活性抑制因子を多く含み、前記マトリックスメタロプロテアーゼ中、特にコラーゲン溶解性の高いマトリックスメタロプロテアーゼが多く含まれることを特徴とする［５］に記載の線維化抑制組成物；
［７］前記線維溶解作用のあるマトリックスメタロプロテアーゼ中、特にコラーゲン溶解性の高いマトリックスメタロプロテアーゼであるＭＭＰ−１およびＭＭＰ−１４が多く含まれる、［６］に記載の線維化抑制組成物；
［８］上記のいずれかに記載の線維化抑制組成物を生産する、間葉系幹細胞；
［９］線維化抑制効果の高い組成物を製造する方法であって、
ｉ）ＩＣ−２またはこの類縁化合物を含む培地で骨髄単核細胞または間葉系幹細胞を培養する工程；
ｉｉ）前記ｉ）で得られた培養物から培養細胞、該細胞の分泌物またはその双方を回収する工程；および
ｉｉｉ）前記ｉｉ）で回収した培養細胞中、分泌物中またはその双方中のタンパク質を回収する工程、を含む方法；
［１０］前記ＩＣ−２またはこの類縁化合物を含む培地で骨髄単核細胞または間葉系幹細胞を培養する工程に用いる化合物が、以下の式（１）であらわされる、［９］に記載の方法：
【化１】
2019235362.tif 000002
（式中、
Ｒ１、Ｒ２、及びＲ４は、同一又は互いに異なって、Ｈ、ハロゲン、ニトロ、シアノ、ＯＨ、置換されていてもよいＣ１〜Ｃ６アルキル、置換されていてもよいＣ２〜Ｃ６アルケニル、置換されていてもよいＣ１〜Ｃ６アルコキシ、アリール、又はヘテロアリール；
Ｒ３は、Ｈ、置換されていてもよいＣ１〜Ｃ６アルキル、置換されていてもよいＣ２〜Ｃ６アルケニル；
ｍは、１〜４いずれかの整数；
ｎは、１〜３いずれかの整数；
ｐは、１〜５いずれかの整数である
但し、Ｎ−［（５−メチル−２−フリル）メチリデンアミノ］−２−フェノキシ−ベンザミドを除く。）；
［１１］線維化抑制効果の高い細胞シートを製造する方法であって、
ｉ）ＩＣ−２またはこの類縁化合物を含む培地で間葉系幹細胞を、少なくとも９日間培養する工程において、ＩＣ−２の濃度を一定に保つことを含む工程；および
ｉｉ）前記ｉ）の工程で生成した、間葉系幹細胞および該細胞の分泌物を含む細胞シートを回収する工程；
を含む、前記細胞シートの製造方法；
［１２］前記ＩＣ−２またはこの類縁化合物が、以下の式（１）であらわされる、［１１］に記載の方法：
【化２】
2019235362.tif 000003
（式中、
Ｒ１、Ｒ２、及びＲ４は、同一又は互いに異なって、Ｈ、ハロゲン、ニトロ、シアノ、ＯＨ、置換されていてもよいＣ１〜Ｃ６アルキル、置換されていてもよいＣ２〜Ｃ６アルケニル、置換されていてもよいＣ１〜Ｃ６アルコキシ、アリール、又はヘテロアリール；
Ｒ３は、Ｈ、置換されていてもよいＣ１〜Ｃ６アルキル、置換されていてもよいＣ２〜Ｃ６アルケニル；
ｍは、１〜４いずれかの整数；
ｎは、１〜３いずれかの整数；
ｐは、１〜５いずれかの整数である
但し、Ｎ−［（５−メチル−２−フリル）メチリデンアミノ］−２−フェノキシ−ベンザミドを除く。）；
［１３］間葉系幹細胞による線維化抑制物質の生産を増加させる方法であって、ＩＣ−２またはこの類縁化合物を含む培地で骨髄単核細胞または間葉系幹細胞を培養することを含む方法；および
［１４］前記ＩＣ−２またはこの類縁化合物が、以下の式（１）であらわされる、［１３］に記載の方法：
【化３】
2019235362.tif 000004
（式中、
Ｒ１、Ｒ２、及びＲ４は、同一又は互いに異なって、Ｈ、ハロゲン、ニトロ、シアノ、ＯＨ、置換されていてもよいＣ１〜Ｃ６アルキル、置換されていてもよいＣ２〜Ｃ６アルケニル、置換されていてもよいＣ１〜Ｃ６アルコキシ、アリール、又はヘテロアリール；
Ｒ３は、Ｈ、置換されていてもよいＣ１〜Ｃ６アルキル、置換されていてもよいＣ２〜Ｃ６アルケニル；
ｍは、１〜４いずれかの整数；
ｎは、１〜３いずれかの整数；
ｐは、１〜５いずれかの整数である、
但し、Ｎ−［（５−メチル−２−フリル）メチリデンアミノ］−２−フェノキシ−ベンザミドを除く。）。
【発明の効果】
【００１４】
本発明により得られた組成物は、各種ＭＭＰを含んでなり、更には、肝星細胞活性化抑制因子であるＴＲＸ及び／またはＭＦＧＥ−８も含む組成物である。また本発明により得られた細胞または細胞シートは、線維化抑制効果の因子となりうる各種タンパク質を生産し放出する能力が高いものである。従って、本開示における細胞シートは従来のものよりも線維化抑制効果が高いと考えられる。特に、本願発明の細胞シートは肝臓をはじめとする各種臓器における線維化を抑制する能力の高いものである。このような細胞シートは、本開示における細胞シートの製造方法において初めて見出されたものである。【００１５】
本発明において得られた細胞シートは、特に肝疾患治療用細胞シートやその他の臓器の臓器線維症の治療として有用である。【００１６】
本開示の細胞シートは、各種ＭＭＰおよび肝星細胞活性抑制因子を生産する。特に、本願発明の細胞シートは、ＭＭＰ−１、ＭＭＰ−２、ＭＭＰ−１３、およびＭＭＰ−１４並びにＴＲＸを多量に生産する。即ち、Ｉ型コラーゲンを始めとする臓器線維症に関連する各種コラーゲンを効率的に分解することと同時に肝星細胞の活性化を抑制し、肝星細胞による線維の産生を抑えることが可能となる。このような組成物および細胞シートは従来にはないものである。【００１７】
本開示により、細胞シートにおいて線維化抑制効果を高めた細胞シートが得られる。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】図１は本願発明の線維化抑制組成物、前記組成物を製造する細胞、および前記細胞よりなる細胞シートの製造方法の一態様である。
【図２】図２は本願発明の組成物中にあるＭＭＰｓをウエスタンブロットで確認した図である。以下で詳述する実施例において、ＤＭＳＯ対照群と比較しＩＣ−２添加群で、ＭＭＰ−１は約４．１倍、ＭＭＰ−２は約１．５倍、ＭＭＰ−１３（活性型）は約５．１倍、ＭＭＰ−１４は約２．１倍上昇していたことを示す。コラーゲナーゼであるＭＭＰ−１およびＭＭＰ−１３が特異的に大幅な上昇を見せている。従って、本願発明の組成物はコラーゲン分解能の高いものである。
【図３】図３はＴＲＸの活性をＥＬＩＳＡにより測定したものである。１．５倍の生産量が認められた。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
＜間葉系幹細胞＞
本開示の細胞シートは間葉系幹細胞から作製することができる。
【００２０】
本明細書において、「間葉系幹細胞」（ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ）とは、間葉に由来する体性幹細胞を含む。この間葉系幹細胞は、間葉系に属する細胞への分化能をもつ。この間葉系幹細胞は、近年の骨や血管、心筋の再構築などの再生医療への応用が期待されている。
【００２１】
「間葉系幹細胞」（ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ）には、例えば、骨髄間葉系細胞および臍帯血由来幹細胞が含まれる。間葉系幹細胞は間葉系組織のあるすべての組織に存在すると考えられているが、間葉系組織のなかでも骨髄間葉系幹細胞は、骨髄穿刺で容易に採取でき、培養技術も確立されている。これまで間葉系幹細胞は骨髄中に存在することが報告されていたが、骨髄だけでなく臍帯血も間葉系幹細胞の供給源として、骨や軟骨の組織工学的修復あるいは再生医療への臨床応用へ適用できる可能性が示されている。ここで、間葉系幹細胞は一般にライフスパンが短く、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの長期培養は必ずしも容易ではないが、既にｈＴＥＲＴ遺伝子などを導入し、安定に増殖しうるヒト骨髄由来およびヒト臍帯血由来間葉系幹細胞株が樹立されている。これらの細胞は、安定に増殖するが、染色体異常がなく、コンタクトインヒビションが機能し、免疫抑制動物に移植しても腫瘍を形成しない。また、細胞分化に影響しないことから、間葉系幹細胞の分化研究に有用な細胞である。従って、上記のいずれの間葉系幹細胞ないし間葉系幹細胞株も、本発明に用いることができる。
【００２２】
骨髄由来幹細胞が肝線維症の進行および退縮の両方で動員されることが、エビデンスによって示唆されている。ＣＣｌ４誘導性肝線維症からの退縮の際に、骨髄由来間葉系幹細胞が線維性の肝臓中に遊走し、そこでそれらはマトリックスメタロプロテアーゼ−１３（ＭＭＰ−１３）などを発現し得る（Ｃｈｅｎｇ  Ｙ  Ｊ，ｅｔ  ａｌ．，Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉ．，２００９；８５（１３−１４）：５１７−５２５）。
【００２３】
本願発明では、このように本来的に肝疾患や臓器の線維症において有用な役割を果たす間葉系幹細胞の持つ、線維化抑制作用を高めることができる。
【００２４】
＜骨髄単核細胞＞
現在広く使用されている間葉系幹細胞は、骨髄単核細胞を培養皿上に播種し、２〜３週間培養後に出現する繊維芽細胞様のコロニー形成細胞（ＣＦＵ−Ｆ）を回収するという方法で得る。従って、本発明の線維化抑制組成物、この組成物を生産する細胞、またはこの細胞からなる細胞シートの製造に骨髄単核細胞を利用することも可能である。
【００２５】
＜間葉系幹細胞あるいは骨髄単核細胞からなる細胞シート＞
本願発明の一態様である細胞シートは、シート作成の工程中でＩＣ−２またはその類縁物質に曝して作製することができる。細胞を播種した翌日から所定の時間ＩＣ−２またはその類縁物質を含む培地にて、培養することにより、本願発明の細胞シートが得られる。細胞シートの培養期間は、少なくとも７日、あるいは８日、あるいは９日、あるいは１０日、あるいは１１日、あるいは１２日でもよい。ＩＣ−２またはその類縁化合物に曝す期間は少なくとも７日、あるいは８日、あるいは９日、あるいは１０日、あるいは１１日、あるいは１２日でもよい。この期間に、培地の劣化をさけ、且つＩＣ−２またはその類縁化合物の培養液中での量を一定量維持するために、３日毎、あるいは４日以内にＩＣ−２またはその類縁物質を含む培地を交換することが好ましい。
【００２６】
本発明の一態様の方法により、細胞シートをつくるために９日間培養した培養上清には、通常量の数倍のＭＭＰｓおよびＴＲＸが含まれる。即ち、本願発明の細胞シートはＭＭＰｓおよびＴＲＸの生産性が通常の間葉系幹細胞からなるシートよりも高いことが明らかとなった。従って、本発明の細胞シートは、典型的には、間葉系幹細胞および細胞外マトリックスとともに、当該間葉系幹細胞からの分泌物であるＭＭＰｓおよびＴＲＸを有意な量で含んでいる。よって、この肝線維化抑制効果のある組成物を生産することができる細胞または細胞シートは、細胞またはシート自体を再生医療製品として用いることが可能である上に、ＭＭＰｓおよび／またはＴＲＸの生産用細胞または細胞シートとしても有用である。
【００２７】
＜マトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰｓ）＞
本発明において、マトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰｓ）はメタロプロテアーゼ（活性中心に金属イオンが配座しているタンパク質分解酵素の総称）の一群でありＭＭＰの活性中心には亜鉛イオン（Ｚｎ２＋）やカルシウムイオン（Ｃａ２＋）が含まれる。コラーゲンやプロテオグリカン、エラスチンなどから成る細胞外マトリックスの分解をはじめとし、細胞表面に発現するタンパク質の分解、生理活性物質のプロセシングなどその作用は多岐に報告されている。ＭＭＰファミリーに属する酵素は分泌型と膜結合型の二種類に分類される。分泌型ＭＭＰは産生後、分泌細胞から離れたところにおいても働くが、膜結合型は細胞表面に発現しているとされている。
【００２８】
本願発明の一態様は、ＭＭＰ−１、ＭＭＰ−２、ＭＭＰ−１３、およびＭＭＰ−１４並びにＴＲＸおよびこれらの任意の組み合せを含む組成物である。
【００２９】
本発明において、「ＭＭＰ−１」は間質コラーゲナーゼとも言われる、分泌型のＭＭＰである。「ＭＭＰ−２」はゼラチナーゼとも言われる、分泌型のＭＭＰである。「ＭＭＰ−１３」はコラーゲナーゼ３ともいわれる、分泌型のＭＭＰである。分泌型ＭＭＰは不活性な前駆体酵素をして細細胞外へ分泌されその後活性型となる。「ＭＭＰ−１４」は膜結合型のＭＭＰである。ＭＭＰ−１４は細胞膜に発現し周辺の細胞における細胞外基質の分解に関与すると考えられている。驚くべきことに、本願発明者らは、ＩＣ−２を用いて間葉系幹細胞を所定の期間培養して得た細胞シートの培養上清に、ＭＭＰ−１、ＭＭＰ−２、ＭＭＰ−１３、およびＭＭＰ−１４、並びにＴＲＸを、多く含むことを発見し、本願発明に至った。膜結合型ＭＭＰであるＭＭＰ−１４が上清中に対照群よりも多く存在することは驚くべきことである。
【００３０】
＜肝星細胞活性増殖抑制因子＞
肝星細胞はビタミンＡを貯蔵し、肝臓内のディッセ腔と呼ばれる肝細胞と類洞内皮細胞の間隙に存在する細胞である。この肝星細胞は、肝傷害時に活性化され、筋線維芽細胞様の形態を呈する。活性化した肝星細胞は、肝細胞の再生に必要なＨＧＦ等のサイトカインを分泌し肝再生を促進する一方、コラーゲンやＴＧＦ−βを産生して肝臓の線維化にも関わることが知られている。肝線維化は、通常はビタミンＡを貯蔵している肝星細胞が、様々な刺激によって筋線維芽細胞様に分化しＩ型コラーゲンの分泌を異常亢進することが要因となって発症する（Ｆｒｉｅｄｍａｎ  ＳＬ（２００８）Ｈｅｐａｔｉｃ  ｓｔｅｌｌａｔｅ  ｃｅｌｌｓ：ｐｒｏｔｅａｎ，ｍｕｌｔｉｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ，ａｎｄ  ｅｎｉｇｍａｔｉｃ  ｃｅｌｌｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｌｉｖｅｒ．Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｒｅｖｉｅｗｓ  ８８（１）：１２５−１７２．ｄｏｉ：１０．１１５２／ｐｈｙｓｒｅｖ．０００１３．２００７）肝星細胞活性化抑制因子は、肝星細胞の活性化を抑制する因子である。このような因子としては、ＴＲＸ、Ｍｉｌｋ  ｆａｔ  ｇｌｏｂｕｌｅ  ＥＧＦ  ｆａｃｔｏｒ  ８（ＭＦＧＥ−８）、などが報告されている。特に、チオレドキシン（ＴＲＸ）は、外因性のものであっても肝星細胞の増殖効果を抑制することが報告されている（特開２００４−０６７５４２）。
【００３１】
本願発明の一態様は、ＭＭＰ−１、ＭＭＰ−２、ＭＭＰ−１３、およびＭＭＰ−１４並びにＴＲＸを多く分泌することができる間葉系幹細胞または骨髄単核細胞およびそれを製造する方法に関する。本願発明の間葉系幹細胞や骨髄単核細胞は、これらのマトリックスメタロプロテアーゼおよび肝星細胞活性抑制因子であるＴＲＸを多く生産することができる。このことは、ＩＣ−２およびそれらの類縁化合物と本開示による細胞の製造方法による効果であると考えられる。
【００３２】
本発明の細胞を作成する際にＩＣ−２またはその類縁化合物の濃度を一定以上落とさないように、少なくとも７日間、あるいは８日間、あるいは９日間、あるいは１０日間、あるいは１１日間、あるいは１２日間曝すことを必要とする。
【００３３】
具体的には、ＩＣ−２またはその類縁化合物の濃度は培養液中の終濃度では、２０μＭ、１５μＭ、１０μＭ、５μＭのいずれかを一定以上維持することが好ましい。この濃度を維持するために、培養液は数日、好ましくは３日、あるいは４日毎に所定の濃度のＩＣ−２またはその類縁化合物を含むフレッシュな培地と交換することが好ましい。
【００３４】
本発明の細胞は後述する実施例で説明されるように、線維化抑制効果が高い。本願発明における線維化抑制効果とは、Ｉ型コラーゲンを始めとする臓器線維症で過剰に蓄積するコラーゲンの分解を促進する成分であるＭＭＰファミリーのメンバーの発現および肝星細胞活性抑制因子の発現を指標としている。
【００３５】
本願発明において、「線維化抑制効果」は「線維溶解作用」同じ意味で用いられる。
【００３６】
本発明の線維化抑制組成物、本発明の細胞シート、あるいは本発明の細胞は肝表面移植用であってもよいが、間葉系幹細胞および骨髄単核細胞由来であることから、あらゆる組織の線維化抑制に適用可能であるため、全身に、例えば皮下などにも移植可能である。本発明の線維化抑制組成物、本発明の細胞シート、あるいは本発明の細胞は、自家細胞由来でもよいが、他家細胞由来でも十分効果は期待できる。他家移植の場合は、間葉系幹細胞の移植免疫抑制効果より、免疫抑制剤の使用なく、他家移植できる可能性がある。
【００３７】
この細胞シートを移植する場合、１層または複数層を移植してもよい。また、移植する部位は、１か所または複数個所であってもよい。なお、複数は例えば、２、３、４、５、または６であってもよく、それら以上、またはそれらの範囲内であってもよい。
【００３８】
本発明の線維化抑制組成物、本発明の細胞シート、あるいは本発明の細胞は、従来検討されている間葉系幹細胞を用いた肝臓治療技術に比して、線維化抑制効果が高められている。特に、後述する実施例にて証明されているように、本願発明の線維化抑制組成物は各種ＭＭＰｓの中でもコラーゲナーゼ作用のあるＭＭＰ−１およびＭＭＰ−１３が、間葉系幹細胞を単に培養して得られた細胞シートよりも数倍高くなっている。また、ＴＲＸについても、対照と比較して有意に多量に生産されている。
【００３９】
＜線維化抑制組成物、細胞シート、あるいは線維化抑制作用のある細胞の製造方法＞
培地を含む温度応答性反応皿に間葉系幹細胞を播種する。培地の例としては、ｂＦＧＦを含むＤＭＥＭ／１０％ＦＢＳがある。播種する細胞の数は、例えば、１．０×１０３ｃｅｌｌ／ｃｍ２である。これらはフラスコの大きさ、培養環境に応じて適宜変更することができ、それらは当業者の知識の範囲内である。培地は３日、あるいは４日毎に交換しながら、少なくとも７日間ＩＣ−２またはこの類縁化合物の存在下、３７℃、５％ＣＯ２にて培養する。間葉系幹細胞および骨髄単核細胞は、細胞どうしの接着性により、所定の期間の培養する間にシート状になる。
【００４０】
＜ＩＣ−２およびその類縁化合物＞
本開示において、細胞シートの培養時に用いるＩＣ−２およびその類縁化合物は、日本国特許公開公報第２０１１−２１９４３５号、ＷＯ２０１２／１４１０３８Ａ１、ＷＯ２０１５／１４７１０７Ａ１、ＷＯ２０１７／０４７７６２Ａ１に記載されている化合物を含む。これらの文献に記載の化合物を引用により本願明細書に援用する。
【００４１】
好適な化合物としては、ＷＯ２０１２／１４１０３８Ａ１に記載のＩＣ−２（（６Ｓ，９ａＳ）−６−ｐｈｅｎｙｌ−８−ｎａｐｈｔｈａｌｅｎ−１−ｙｌｍｅｔｈｙｌ−４，７−ｄｉｏｘｏ−ｈｅｘａｈｙｄｒｏ−ｐｙｒａｚｉｎｏ［１，２−ａ］  ｐｙｒｉｍｉｄｉｎｅ−１−ｃａｒｂｏｃｙｌｉｃ  ａｃｉｄ  ｂｅｎｚｙｌａｍｉｄｅ）およびその誘導体がある。好適な例としては、式（１）に示す化合物群から選ばれる１種以上の化合物、その塩またはそれらの溶媒和物である。
【化４】
2019235362.tif 000005
（式中、
Ｒ１、Ｒ２、及びＲ４は、同一又は互いに異なって、Ｈ、ハロゲン、ニトロ、シアノ、ＯＨ、置換されていてもよいＣ１〜Ｃ６アルキル、置換されていてもよいＣ２〜Ｃ６アルケニル、置換されていてもよいＣ１〜Ｃ６アルコキシ、アリール、又はヘテロアリール；
Ｒ３は、Ｈ、置換されていてもよいＣ１〜Ｃ６アルキル、置換されていてもよいＣ２〜Ｃ６アルケニル；
ｍは、１〜４いずれかの整数；
ｎは、１〜３いずれかの整数；
ｐは、１〜５いずれかの整数である。
但し、Ｎ−［（５−メチル−２−フリル）メチリデンアミノ］−２−フェノキシ−ベンザミドを除く。）
【００４２】
更なる好適なＩＣ−２およびその類縁化合物の例としては、式（１）に示す化合物群から選ばれる１種以上の化合物、その塩またはそれらの溶媒和物を含む分化誘導剤が挙げられる。
【００４３】
上記化合物は一例であって、これらの化合物の誘導体であり、本願発明の細胞シートおよびＭＭＰｓとＴＲＸを含む組成物が得られる限り、本開示にて意図する発明に含まれる。
【００４４】
＜線維化抑制効果の測定＞
培養細胞中および分泌物中のＭＭＰファミリーメンバーおよびＴＲＸはウェスタンブロッティングおよびＥＬＩＳＡ法で発現および生産を確認した。
【実施例】
【００４５】
以下、本発明を実施例によりさらに説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない
【実施例１】
【００４６】
細胞シートの作製
細胞シートの作製は以下の試薬等を用いた。
細胞：骨髄由来間葉系幹細胞株ＵＥ７Ｔ−１３細胞
薬剤：１５μＭ  ＩＣ−２（ＤＭＳＯにて希釈し、培養液中には最終濃度０．１％で使用）
培地：ＤＭＥＭ／１０％ＦＢＳ（最終濃度１０％非動化ウシ胎児血清（ＦＢＳ；株式会社ニチレイバイオサイエンス，東京，日本）、１００Ｕ／ｍｌペニシリン、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン（ナカライテスク株式会社，京都，日本）を含むＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ’ｓ  Ｍｅｄｉｕｍ（ＤＭＥＭ，日水製薬株式会社，東京，日本））
Ｓｅｃｒｅｔｏｍｅ回収用フィルター（培養上清の濃縮）：Ａｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ−１５  Ｃｅｎｔｒｉｇｕｇａｌ  Ｆｉｌｔｅｒｓ  Ｕｌｔｒａｃｅｌ−３Ｋ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ）
タンパク調製バッファー：ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ＲＩＰＡ  ｂｕｆｆｅｒ（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４），１５０ｍＭ  ＮａＣｌ，０．２５％  ｓｏｄｉｕｍ  ｄｅｏｘｙｃｈｏｌａｔｅ，０．１％  ＳＤＳ，１％  ＮＰ−４０，１ｍＭ  ＥＤＴＡ，５％  ｇｌｙｃｅｒｏｌ）；及び
ＳＤＳ  ｓａｍｐｌｅ  ｂｕｆｆｅｒ（６０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ６．８），５％  ２−Ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏｌ，２％  ＳＤＳ，０．１０％  ＢＰＢ，２５％  ｇｌｙｃｅｒｏｌ）。【００４７】
なお、培地の表記は培養液中の終濃度である。また、サンプル調製時は各２倍濃度の２×ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ＲＩＰＡ  ｂｕｆｆｅｒおよび各５倍濃度の５×ＳＤＳ  ｓａｍｐｌｅ  ｂｕｆｆｅｒを使用した。【００４８】
細胞培養スケジュールは図１に示す通りである。
（Ｄａｙ−１）
ＵＥ７Ｔ−１３細胞を直径１０ｃｍの培養皿に、細胞数９．０×１０３ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２となるように播種した。この培養皿を６枚用意した。
（Ｄａｙ０）
播種翌日、上で調製した６枚の培養皿のうち３枚を、終濃度１５μＭのＩＣ−２を含むＤＭＥＭ／１０％ＦＢＳ培地で、培地交換して、ＩＣ−２を添加した。残りの３枚の培養皿のサンプルについては、対照となるＤＭＳＯ処理を行う。具体的には、終濃度０．１％ＤＭＳＯを含むＤＭＥＭ／１０％ＦＢＳ培地に全量培地交換することにより、ＤＭＳＯを添加した。
（Ｄａｙ３）
Ｄａｙ０と同様の操作で、培地交換を行った。ＭＳＣ用（薬剤未処理群）として、ＵＥ７Ｔ−１３細胞を直径１０ｃｍ培養皿に、２．０×１０４ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２の細胞数となるように播種した。細胞未処理群は直径１０ｃｍの培養皿３枚に、ＭＳＣ用として培地を回収する細胞を播種した。
（Ｄａｙ７）
終濃度１５μＭのＩＣ−２を含むＤＭＥＭ／０．０５％ＦＢＳ培地にて、全量培地交換を行った。対照のＤＭＳＯ処理には、終濃度０．１％ＤＭＳＯを含むＤＭＥＭ／０．０５％ＦＢＳ培地にて、全量培地交換を行った。ＭＳＣ群は、ＤＭＥＭ／０．０５％ＦＢＳ培地にて培地交換した。
（Ｄａｙ９）
培養上清の濃縮及びタンパク調製
（１）各培養皿から５ｍｌずつ培地を回収し、１本のチューブにまとめた。残りの培地は１ｍｌずつ、ＥＬＩＳＡ測定用に−８０℃にて保存した。また、ブランクとして、ＤＭＥＭ／０．０５％ＦＢＳを同様に遠心し、次の濃縮を行った。
（２）１２ｍｌの上清をＡｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ−１５  Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｌ  Ｆｉｌｔｅｒ  Ｕｎｉｔに移し、５，０００ｇで６０〜９０分遠心した。遠心時間はピペットにてメスアップした際に、約２４倍濃縮されるまで適宜調整した。
（３）濃縮した培養上清（ｓｅｃｒｅｔｏｍｅ）はＮａｎｏＤｒｏｐにて２８０ｎｍの吸光度を測定して、タンパク量を測定した。Ｂｌａｎｋ培地、２×ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ＲＩＰＡ  ｂｕｆｆｅｒを加えてタンパク濃度を１．０μｇ／μｌに調整し、超音波細胞破砕装置ＢｉｏＲｕｐｔｕｒ（コスモバイオ，東京，日本）を使用し、氷水中にて２００Ｗで１５秒の超音波処理、休止３０秒を１サイクルとして計４サイクル、１分間の超音波処理を実施した。その後、５×ＳＤＳ  ｓａｍｐｌｅ  ｂｕｆｆｅｒを加えて、タンパク濃度を０．８μｇ／μｌに調整し、ブロックインキュベーター（ＩＫＡ，Ｓｔａｕｆｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）にて９８℃、５ｍｉｎの熱変性を行った。
【実施例２】
【００４９】
ウェスタンブロッティング
１０％のＳＤＳポリアクリルアミドゲルのＭＭＰ−１解析用のウェルには２．４μｇ、ＭＭＰ−２、ＭＭＰ−１３、ＭＭＰ−１４解析用のウェルにはそれぞれ１０μｇのタンパクを供し、１５％ＳＤＳポリアクリルアミドゲルのチオレドキシン解析用のウェルには１０μｇのタンパクを供した。泳動バッファー（２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ，１９２ｍＭ  ｇｌｙｃｉｎ，０．１％  ＳＤＳ（各ナカライテスク株式会社））中で、ゲル１枚あたり２０ｍＡで８０分間電気泳動した。その後、適量のトランスファーバッファー（２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ，１９２ｍＭ  ｇｌｙｃｉｎ）で５分振盪し、ゲルを平衡化後、０．４５μｍトランスファーメンブレン（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｃｏｒｐ，Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ）へＴｒａｎｓ−Ｂｌｏｔ  Ｔｕｒｂｏ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を用いて０．８Ａ、２５Ｖ、３０分の条件でタンパクを転写した。転写後のメンブレンを適量のＴｒｉｓ−ｂｕｆｆｅｒｅｄ  ｓａｌｉｎｅ（ＴＢＳ）−Ｔ（０．１％  Ｔｗｅｅｎ２０（ナカライテスク株式会社），１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ，７５０ｍＭ  ＮａＣｌ）で５分振盪し、平衡化後、ＰｏｎｃｅａｕＳ染色液に浸し、１５分から３０分間、バンドが明瞭に染色されるまで振盪した。適量のＴＢＳ−Ｔにて２〜３回洗浄後、メンブレンの画像を取得し、内部コントロールとして使用した。洗浄後のメンブレンは、ＭＭＰ−１，ＭＭＰ−２，ＭＭＰ−１４は５％スキムミルクを含むＴＢＳ−Ｔで、ＭＭＰ−１３、ＴＲＸは３％ＢＳＡ（ナカライテスク株式会社）を含むＴＢＳ−Ｔにて９０分間、室温でブロッキング処理を行った。続いて５％スキムミルク／ＴＢＳ−Ｔで５００倍希釈したウサギポリクローナル抗ＭＭＰ−１抗体（Ｐｒｏｔｅｉｎｔｅｃｈ  Ｇｒｏｕｐ，Ｉｎｃ．）、５％スキムミルク／ＴＢＳ−Ｔで５００倍希釈したウサギポリクローナル抗ＭＭＰ−２抗体（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、１％ＢＳＡ／ＴＢＳ−Ｔで５００倍希釈したウサギポリクローナル抗ＭＭＰ−１３抗体（ａｂｃａｍ）、５％スキムミルク／ＴＢＳ−Ｔで５００倍希釈したウサギポリクローナル抗ＭＭＰ−１４抗体（ａｂｃａｍ）、１％ＢＳＡ／ＴＢＳ−Ｔで１，０００倍希釈したウサギポリクローナル抗チオレドキシン抗体（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）でメンブレンをそれぞれ浸し、４℃、一晩振盪し、１次抗体反応を行った。【００５０】
１次抗体反応終了後、適量のＴＢＳ−Ｔで１０分、３回、洗浄した。続いて、５％ＢＳＡ／ＴＢＳ−Ｔもしくは５％スキムミルク／ＴＢＳ−Ｔで３，０００倍希釈したａｎｔｉ−Ｒａｂｂｉｔ  ＨＲＰ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）にそれぞれメンブレンを浸し、室温で９０分間振盪し、２次抗体反応を行った。２次抗体反応終了後、適量のＴＢＳ−Ｔで１０分３回振盪した。その後、メンブレンに１ｍｌのＥＣＬ  Ｐｒｉｍｅ液（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）をかけ、ＬＡＳ−４０００（富士フイルム株式会社，東京，日本）により化学発光の検出を行った。【００５１】
結果を図２に示す。ウェスタンブロッティングの結果を数値化した結果、ＩＣ−２添加群を添加した培養上清中には、ＭＳＣおよびＤＭＳＯ群と比較して、多量のＭＭＰ−１、ＭＭＰ−２、ＭＭＰ−１３、およびＭＭＰ−１４が存在していることが明らかとなった。【００５２】
化学発光強度からの比較により、ＤＭＳＯ対照群と比較しＩＣ−２添加群で、ＭＭＰ−１は約４．１倍、ＭＭＰ−２は約１．５倍、ＭＭＰ−１３（活性型）は約５．１倍、ＭＭＰ−１４は約２．１倍上昇していた。
【実施例３】
【００５３】
ＥＬＩＳＡ
Ｄａｙ９でＥＬＩＳＡ解析用に一部回収していた培養上清を使用し、チオレドキシンの産生量をＥＬＩＳＡにて検討した。凍結していた培養上清は、氷上にて融解後、１，０００ｇ、２０ｍｉｎ、４℃で遠心し、上清を回収した。Ｈｕｍａｎ  ＴＸＮ／Ｔｈｉｏｒｅｄｏｘｉｎ／ＴＲＸ  ＥＬＩＳＡ  Ｋｉｔ（Ｓａｎｄｗｉｃｈ  ＥＬＩＳＡ）（ＬＳＢｉｏ）を使用し、メーカー添付のマニュアルに従い実施した。簡潔に書くと以下の通りである。キット同梱の検量線作成用のＳｔａｎｄａｒｄ  サンプルから、１０，０００、５，０００、２，５００、１，２５０、６２５、３１２．５、１５６．３、７８．１５、０ｐｇ／ｍｌのスタンダード希釈系列を調製した。調製したスタンダードおよび、サンプルの上清を１００μｌずつｄｕｐｌｉｃａｔｅにてキット同梱の９６ウェルプレートに供した。３７℃、９０分間インキュベート後、プレートよりサンプルおよびスタンダードをアスピレーターにて除去し、１００μｌの１×Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ａｎｔｉｂｏｄｙを加えて、３７℃、６０分間インキュベートした。プレートより反応溶液をアスピレーターにて除去後、１５０μｌの１×ＰＢＳにて３回洗浄した。その後、１００μｌの１×ＡＢＣｃｏｍｐｌｅｘを加え、３７℃、３０分間インキュベートし、プレートより反応溶液をアスピレーターにて除去後、１５０μｌの１×ＰＢＳにて５回洗浄した。９０μｌのＴＭＢ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅを加え、３７℃、２０分間インキュベート後、１００μｌのＳｔｏｐ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎを加え、４５０ｎｍの吸光度をマイクロプレートリーダー（Ｔｅｃａｎ  Ｇｒｏｕｐ  Ｌｔｄ）で測定した。検量線に従い、得られた吸光度から培養上清中のチオレドキシン量を算出した。【００５４】
結果を図３に示す。ＥＬＩＳＡの結果より、１．５倍の産生量の上昇が認められた。
【産業上の利用可能性】
【００５５】
本発明の線維化抑制組成物、線維化抑制効果の高い細胞シート及び線維化抑制作用のある細胞は、再生医療などに用いることができるので、医薬品製造分野等で利用可能である。
【図１】
2019235362.tif 000009
【図２】
2019235362.tif 000010
【図３】
2019235362.tif 000011
【国際調査報告】
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2019235362.tif 000013
2019235362.tif 000014
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