(57)【要約】  下記の成分：（ａ）ポリエチレングリコール、および（ｂ）テトラエチレングリコールジメチルエーテルを含んでなる小型ＲＮＡ抽出効率改善剤を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記の成分：
（ａ）ポリエチレングリコール、および
（ｂ）テトラエチレングリコールジメチルエーテル
を含んでなる小型ＲＮＡ抽出効率改善剤。
【請求項２】
前記ポリエチレングリコールが、６００〜２０００の平均分子量を有する、請求項１に記載の小型ＲＮＡ抽出効率改善剤。
【請求項３】
前記成分（ａ）と前記成分（ｂ）の比率が３：７〜６：４である、請求項１または２に記載の小型ＲＮＡ抽出効率改善剤。
【請求項４】
前記小型ＲＮＡ抽出効率改善剤において、前記成分（ａ）の含有量が２０〜６０容量％であり、前記成分（ｂ）の含有量が２５〜７０容量％である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の小型ＲＮＡ抽出効率改善剤。
【請求項５】
カオトロピック塩をさらに含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載の小型ＲＮＡ抽出効率改善剤。
【請求項６】
前記カオトロピック塩がチオシアン酸グアニジンである、請求項５に記載の小型ＲＮＡ抽出効率改善剤。
【請求項７】
１５〜３５℃の温度範囲において液体であり、かつ、マイクロピペットにより秤量可能な粘度を有する、請求項１〜６のいずれか１項に記載の小型ＲＮＡ抽出効率改善剤。
【請求項８】
試料から小型ＲＮＡを抽出するための方法であって、
（ｉ）小型ＲＮＡを含む試料を準備するステップと、
（ｉｉ）前記試料に、カオトロピック塩を含む溶液を添加するステップと、
（ｉｉｉ）前記ステップ（ｉｉ）により得られた第１の混合液に、請求項１〜７のいずれか１項に記載の小型ＲＮＡ抽出効率改善剤を添加するステップと、
（ｉｖ）前記ステップ（ｉｉｉ）により得られた第２の混合液を、シリカを含む核酸結合性担体に接触させるステップと、これにより、小型ＲＮＡが前記核酸結合性担体に結合し、
（ｖ）前記核酸結合性担体に結合した小型ＲＮＡを溶出するステップと
を含む方法。
【請求項９】
生体試料中のマイクロＲＮＡを解析するための方法であって、
（ｉ）マイクロＲＮＡを含む生体試料を準備するステップと、
（ｉｉ）前記生体試料に、カオトロピック塩を含む溶液を添加するステップと、
（ｉｉｉ）前記ステップ（ｉｉ）により得られた第１の混合液に、請求項１〜７のいずれか１項に記載の小型ＲＮＡ抽出効率改善剤を添加するステップと、
（ｉｖ）前記ステップ（ｉｉｉ）により得られた第２の混合液を、シリカを含む核酸結合性担体に接触させるステップと、これにより、マイクロＲＮＡを含む全ＲＮＡが前記核酸結合性担体に結合し、
（ｖ）前記核酸結合性担体に結合した全ＲＮＡを溶出するステップと、
（ｖｉ）前記ステップ（ｖ）により得られた全ＲＮＡ中のマイクロＲＮＡを定量的ＲＴ−ＰＣＲにより増幅するステップと
を含む方法。
【請求項１０】
前記生体試料が体液または組織切片である、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記第２の混合液における小型ＲＮＡ抽出効率改善剤の濃度が２０〜６０容量％である、請求項８〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、小型ＲＮＡの抽出効率改善剤およびそれを用いたＲＮＡの単離方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）は、約２１〜２５塩基長の小さな一本鎖ノンコーディングＲＮＡであり、これまでに２万種類以上が同定されている（ｈｔｔｐ：／／ｍｉｒｂａｓｅ．ｏｒｇ／）。これらｍｉＲＮＡは、標的ｍＲＮＡに結合し、ｍＲＮＡの発現を制御する機能を有しており、細胞の増殖、分化、アポトーシスなど、種々の生物学的プロセスに関与していることが明らかにされている。ヒト遺伝子の約３０％が、ｍｉＲＮＡによる発現調節を受けているものと予想されている。近年では、ｍｉＲＮＡの発現異常が、がんを含む様々な疾患の発症や病態に影響を及ぼしていることが示唆されている（非特許文献１、２）。ｍｉＲＮＡは、細胞から分泌されたエクソソームに包含されて血液や尿などの体液中に存在していることから、体液中のｍｉＲＮＡを検出・定量することにより疾患を診断する低侵襲のリキッドバイオプシーに注目が集まっている。【０００３】
ｍｉＲＮＡの簡易かつ迅速な定量方法として、定量的リアルタイムＲＴ−ＰＣＲが一般的に行われている。リアルタイムＲＴ−ＰＣＲは、数時間程度の短い時間で結果を得ることができ、また、簡易な装置で実施できるため、臨床の現場において診断を行うのに適した方法である。ここで、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲによりｍｉＲＮＡを検出・定量するためには、高精度かつ高収率でｍｉＲＮＡを単離する必要がある。全ＲＮＡを単離するための方法としては、カオトロピック塩の存在下で核酸分子をシリカ担体に吸着させることを基本原理とするブーム法が一般的である（非特許文献３）。しかし、ブーム法の通常の条件では、ｍｉＲＮＡのような低分子量ＲＮＡを低い効率でしか捕捉することができないため、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ解析のために十分な量のｍｉＲＮＡが得られないことが問題となっていた。したがって、従来方法と同様に容易でありつつ、ｍｉＲＮＡを含む全ＲＮＡの高い収率で抽出できる方法が望まれている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】落谷孝広, Drug Delivery System, Vol. 26, No.1, pp. 10-14 (2011)
【非特許文献２】Rupaimoole, R. et al, Nat. Rev. Drug Discov., Vol. 16, No.3, pp. 203-222 (2016)
【非特許文献３】Boom, R. et al., J. Clin. Microbiol., Vol. 28, No. 3, pp. 495-503 (1990)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、従来技術の諸問題を解消し、安全かつ簡便な操作により、生体試料からｍｉＲＮＡを高収率かつ高精度に抽出する方法を提供することを目的としてなされたものである。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、鋭意研究の結果、ブーム法において、カオトロピック塩を含む核酸抽出液に、高分子量ポリエチレングリコールを添加することにより、ｍｉＲＮＡの抽出効率が顕著に改善されることを見出した。しかし、高分子量ポリエチレングリコールは常温では固体であり、加温して融解させても極めて高粘度の液体であるため、ピペットによる秤量が困難であるという問題があった。【０００７】
そこで、本発明者らは、高分子量ポリエチレングリコールによるｍｉＲＮＡの抽出効率改善効果を維持しつつ、操作性に優れた組成物を鋭意検討した。その結果、ポリエチレングリコールとテトラエチレングリコールジメチルエーテルとの混合物が、操作性および安定性に優れ、かつ、高分子量ポリエチレングリコールと同程度にｍｉＲＮＡの抽出効率を改善できるものであることを見出した。【０００８】
すなわち、本発明は、一実施形態によれば、下記の成分：（ａ）ポリエチレングリコール、および（ｂ）テトラエチレングリコールジメチルエーテルを含んでなる小型ＲＮＡ抽出効率改善剤を提供するものである。【０００９】
前記ポリエチレングリコールは、６００〜２０００の平均分子量を有することが好ましい。【００１０】
前記成分（ａ）と前記成分（ｂ）の比率は、３：７〜６：４であることが好ましい。【００１１】
前記小型ＲＮＡ抽出効率改善剤において、前記成分（ａ）の含有量が２０〜６０容量％であり、前記成分（ｂ）の含有量が２５〜７０容量％であることが好ましい。【００１２】
前記小型ＲＮＡ抽出効率改善剤は、カオトロピック塩をさらに含むことが好ましい。【００１３】
前記カオトロピック塩は、チオシアン酸グアニジンであることが好ましい。【００１４】
前記小型ＲＮＡ抽出効率改善剤は、１５〜３５℃の温度範囲において液体であり、かつ、マイクロピペットにより秤量可能な粘度を有することが好ましい。【００１５】
また、本発明は、一実施形態によれば、試料から小型ＲＮＡを抽出するための方法であって、（ｉ）小型ＲＮＡを含む試料を準備するステップと、（ｉｉ）前記試料に、カオトロピック塩を含む溶液を添加するステップと、（ｉｉｉ）前記ステップ（ｉｉ）により得られた第１の混合液に、上記の小型ＲＮＡ抽出効率改善剤を添加するステップと、（ｉｖ）前記ステップ（ｉｉｉ）により得られた第２の混合液を、シリカを含む核酸結合性担体に接触させるステップと、これにより、小型ＲＮＡが前記核酸結合性担体に結合し、（ｖ）前記核酸結合性担体に結合した小型ＲＮＡを溶出するステップとを含む方法を提供するものである。【００１６】
また、本発明は、一実施形態によれば、生体試料中のマイクロＲＮＡを解析するための方法であって、（ｉ）マイクロＲＮＡを含む生体試料を準備するステップと、（ｉｉ）前記生体試料に、カオトロピック塩を含む溶液を添加するステップと、（ｉｉｉ）前記ステップ（ｉｉ）により得られた第１の混合液に、上記の小型ＲＮＡ抽出効率改善剤を添加するステップと、（ｉｖ）前記ステップ（ｉｉｉ）により得られた第２の混合液を、シリカを含む核酸結合性担体に接触させるステップと、これにより、マイクロＲＮＡを含む全ＲＮＡが前記核酸結合性担体に結合し、（ｖ）前記核酸結合性担体に結合した全ＲＮＡを溶出するステップと、（ｖｉ）前記ステップ（ｖ）により得られた全ＲＮＡ中のマイクロＲＮＡを定量的ＲＴ−ＰＣＲにより増幅するステップとを含む方法を提供するものである。【００１７】
前記生体試料は、体液または組織切片であることが好ましい。【００１８】
前記第２の混合液における小型ＲＮＡ抽出効率改善剤の濃度は、２０〜６０容量％であることが好ましい。
【発明の効果】
【００１９】
本発明に係る小型ＲＮＡ抽出効率改善剤は、操作性および安定性に優れ、かつ、すでに確立されたブーム法において、カオトロピック塩を含む核酸抽出液に添加することにより、ｍｉＲＮＡを含む全ＲＮＡの抽出効率を改善することができる。そのため、市販されている一般的なＲＮＡ抽出用キットに本発明に係る小型ＲＮＡ抽出効率改善剤を適用するのみで、従来と同様の安全かつ簡便な操作により、高収率かつ高精度でのｍｉＲＮＡの抽出が可能となる。【００２０】
また、本発明に係る方法によれば、ｍｉＲＮＡの収率が改善されることにより、低発現のｍｉＲＮＡについても高精度での定量分析が可能となる。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
以下、本発明を詳細に説明するが、本発明は本明細書中に説明した実施形態に限定されるものではない。
【００２２】
本発明は、第一の実施形態によれば、下記の成分：（ａ）ポリエチレングリコール、および（ｂ）テトラエチレングリコールジメチルエーテルを含んでなる小型ＲＮＡ抽出効率改善剤である。
【００２３】
「小型ＲＮＡ」とは、生体内で作られる長さ約１０ヌクレオチド以上２００ヌクレオチド未満までのＲＮＡを意味する。例えば、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｓｎＲＮＡ（ｓｍａｌｌ  ｎｕｃｌｅａｒ  ＲＮＡ）、ｍｉＲＮＡ（マイクロＲＮＡ）などが挙げられるが、これらに限定されない。本実施形態における好ましい小型ＲＮＡは、ｍｉＲＮＡである。
【００２４】
本実施形態における成分（ａ）ポリエチレングリコール（以降、「ＰＥＧ」とも記載する）としては、任意の平均分子量のものを用いることができ、例えば、ＰＥＧ６００、ＰＥＧ１０００、ＰＥＧ１５００、ＰＥＧ１５４０、ＰＥＧ２０００、ＰＥＧ３０００、ＰＥＧ４０００、ＰＥＧ６０００、ＰＥＧ８０００、ＰＥＧ１００００など用いることができる。また、本実施形態におけるＰＥＧは、これらの１種のみまたは２種以上を混合して用いることができる。本実施形態におけるＰＥＧは、好ましくは平均分子量が６００〜２０００のＰＥＧであり、特に好ましくは平均分子量が１０００〜２０００のＰＥＧであり、最も好ましくはＰＥＧ１０００、ＰＥＧ１５４０またはＰＥＧ２０００である。
【００２５】
本実施形態の小型ＲＮＡ抽出効率改善剤において、成分（ａ）ＰＥＧと成分（ｂ）テトラエチレングリコールジメチルエーテルは、任意の比率で混合されてよく、例えば１：９、２：８、３：７、４：６、５：５、６：４、７：３、８：２、９：１の比率で混合されてよいが、３：７〜６：４の比率で混合されることが好ましく、３：７〜５：５の比率で混合されることが特に好ましい。
【００２６】
本実施形態の小型ＲＮＡ抽出効率改善剤は、上記成分（ａ）および（ｂ）を上記比率で含有するものであれば、上記成分（ａ）および（ｂ）以外の成分を、本実施形態の効果を損なわない範囲で適宜配合することができる。すなわち、本実施形態の小型ＲＮＡ抽出効率改善剤における成分（ａ）ＰＥＧの含有量は、小型ＲＮＡ抽出効率改善剤の総容量を１００％としたときに、好ましくは２０〜６０％（ｖ／ｖ）であり、特に好ましくは４５〜５５％（ｖ／ｖ）である。また、本実施形態の小型ＲＮＡ抽出効率改善剤における成分（ｂ）テトラエチレングリコールジメチルエーテルの含有量は、小型ＲＮＡ抽出効率改善剤の総容量を１００％としたときに、好ましくは２５〜７０％（ｖ／ｖ）であり、特に好ましくは４０〜６０％（ｖ／ｖ）である。
【００２７】
本実施形態において、小型ＲＮＡ抽出効率改善剤は、上記成分（ａ）および（ｂ）以外の成分として、カオトロピック塩をさらに含むことが好ましい。これにより、小型ＲＮＡ抽出効率改善剤を、より長期間安定的に常温で保存することができる。本実施形態におけるカオトロピック塩は、以下に限定されないが、例えば、チオシアン酸グアニジン、塩酸グアニジン、チオシアン酸ナトリウム、ヨウ化ナトリウム、ヨウ化カリウム、尿素などが挙げられる。本実施形態において、これらのカオトロピック塩の１種のみまたは２種以上を混合して用いることができる。好ましくは、本実施形態におけるカオトロピック塩は、チオシアン酸グアニジンである。小型ＲＮＡ抽出効率改善剤に添加されるカオトロピック塩の濃度は、例えば２０〜３０％（ｗ／ｖ）の範囲で適宜選択することができる。
【００２８】
本実施形態の小型ＲＮＡ抽出効率改善剤は、さらなる小型ＲＮＡ抽出効果の改善および／または安定性の向上のために、他の成分を適宜配合されてもよい。前記他の成分としては、例えば、１−（２−アミノエチル）ピペラジン、ジエチレントリアミンなどが挙げられ、これらの１種のみまたは２種以上を組み合わせて用いることができる。小型ＲＮＡ抽出効率改善剤に添加される前記他の成分の濃度は、例えば０．０１〜５％（ｖ／ｖ）の範囲で適宜選択することができる。
【００２９】
本実施形態の小型ＲＮＡ抽出効率改善剤の製造方法は、特に限定されず、上記成分を混合して製造することができる。
【００３０】
本実施形態の小型ＲＮＡ抽出効率改善剤は、室温において低粘度かつ安定であり、容易かつ正確に秤量することができる。すなわち、本実施形態の小型ＲＮＡ抽出効率改善剤は、１５〜３５℃の温度範囲において液体であり、かつ、マイクロピペットにより秤量可能な粘度を有することが好ましい。本実施形態における「粘度」は、例えば回転粘度計などを用いて求めることができる。本実施形態の小型ＲＮＡ抽出効率改善剤の粘度は、好ましくは３０ｍＰａ・ｓ以下であり、特に好ましくは２０ｍＰａ・ｓ以下である。
【００３１】
本実施形態の小型ＲＮＡ抽出効率改善剤は、ブーム法に基づく市販のＲＮＡ抽出用キットと組み合わせて用いることができ、従来と同様の安全かつ簡便な操作により、高収率かつ高精度で小型ＲＮＡを抽出することが可能である。
【００３２】
すなわち、本発明は、第二の実施形態によれば、試料から小型ＲＮＡを抽出するための方法であって、（ｉ）小型ＲＮＡを含む試料を準備するステップと、（ｉｉ）前記試料に、カオトロピック塩を含む溶液を添加するステップと、（ｉｉｉ）前記ステップ（ｉｉ）により得られた第１の混合液に、上記の小型ＲＮＡ抽出効率改善剤を添加するステップと、（ｉｖ）前記ステップ（ｉｉｉ）により得られた第２の混合液を、シリカを含む核酸結合性担体に接触させるステップと、これにより、小型ＲＮＡが前記核酸結合性担体に結合し、（ｖ）前記核酸結合性担体に結合した小型ＲＮＡを溶出するステップとを含む方法である。
【００３３】
本実施形態の方法では、小型ＲＮＡを含む試料を準備して使用する。本実施形態における「小型ＲＮＡ」は、第一の実施形態において定義したものと同様である。本実施形態における「試料」は、小型ＲＮＡを含む任意のものであってよく、例えば、小型ＲＮＡを含有する溶液や、細胞溶解物などであってよい。細胞溶解物は、任意の細胞から調製されたものであってよく、例えば、真核細胞、原核細胞、ウイルスなどから調製されることができる。また、本実施形態における試料は、第三の実施形態において詳述するような生体試料であってもよい。
【００３４】
次いで、小型ＲＮＡを含む試料にカオトロピック塩を含む溶液を添加し、これにより、第１の混合液を得る。本実施形態における「カオトロピック塩」は、第一の実施形態において定義したものと同様である。本実施形態におけるカオトロピック塩の濃度は、ブーム法の一般的な条件に従えばよく、小型ＲＮＡ抽出効率改善剤を添加した後の第２の混合液において、例えば０．１〜１０Ｍあってよく、好ましくは２．５〜５Ｍの範囲であってよい。
【００３５】
本実施形態におけるカオトロピック塩を含む溶液は、カオトロピック塩の他に、還元剤、界面活性剤および／または緩衝剤を含んでいてもよい。還元剤としては、例えば、２−メルカプトエタノールまたはジチオトレイトールなどを、好ましくは２５〜１５０ｍＭの濃度で添加することができる。界面活性剤は、イオン性または非イオン性のものであってよく、例えば、ＳＤＳ、ＣＨＡＰＳ、Ｔｗｅｅｎ（商標）２０、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００（商標）、ＮＰ−４０（商標）などを、好ましくは０．１〜１０％（ｗ／ｖ）の濃度で添加することができる。緩衝剤としては、溶液をｐＨ６．０〜９．０の範囲に安定化させるものであればよく、例えば、Ｔｒｉｓ、ＨＥＰＥＳ、ＰＩＰＥＳ、ＭＯＰＳなどを、好ましくは１〜１０ｍＭの濃度で添加することができる。
【００３６】
上記のようなカオトロピック塩を含む溶液は、以下に記載する核酸結合性担体とともに組み合わせたキットとして市販されており、本実施形態では、そのような市販品を使用することもできる。例えば、Ｈｉｇｈ  Ｐｕｒｅ  ｍｉＲＮＡ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ロシュ・ダイアグノスティックス）、ＭａｇＮＡ  Ｐｕｒｅ  Ｃｏｍｐａｃｔ  ＲＮＡ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ロシュ・ダイアグノスティックス）、ＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（キアゲン）、ｍｉＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（キアゲン）、ＰｕｒｅＬｉｎｋ  ＲＮＡ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（サーモフィッシャーサイエンティフィック）、ＰｕｒｅＬｉｎｋ  ｍｉＲＮＡ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（サーモフィッシャーサイエンティフィック）、ＦａｓｔＧｅｎｅ  ＲＮＡ  Ｐｒｅｍｉｕｍ  Ｋｉｔ（日本ジェネティクス）、Ｎｕｃｌｅｏ  Ｓｐｉｎ  ｍｉＲＮＡ（マッハライ・ナーゲル）、ｍｉｒＶａｎａ  ｍｉＲＮＡ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（サーモフィッシャーサイエンティフィック）などが好ましい市販品として挙げられる。
【００３７】
次いで、上記により得られた第１の混合液に小型ＲＮＡ抽出効率改善剤を添加し、これにより、第２の混合液を得る。本実施形態における「小型ＲＮＡ抽出効率改善剤」は、第一の実施形態において定義したものと同様である。本実施形態における小型ＲＮＡ抽出効率改善剤は、小型ＲＮＡ抽出効率改善剤を添加した後の第２の混合液において、例えば２０〜６０％（ｖ／ｖ）の濃度で添加することが好ましく、２５〜５０％（ｖ／ｖ）の濃度で添加することが特に好ましい。
【００３８】
なお、本実施形態の方法において、カオトロピック塩を含む溶液および小型ＲＮＡ抽出効率改善剤は、添加する順番を相互に変更する、または、同時に添加することが可能である。すなわち、小型ＲＮＡを含む試料に小型ＲＮＡ抽出効率改善剤を添加した混合液を最初に調製し、次いで、得られた混合液にカオトロピック塩を含む溶液を添加してもよいし、小型ＲＮＡを含む試料に対し、カオトロピック塩を含む溶液および小型ＲＮＡ抽出効率改善剤を同時に添加してもよい。
【００３９】
次いで、上記により得られた第２の混合液を、シリカを含む核酸結合性担体に接触させ、これにより、試料中のＲＮＡを核酸結合性担体に結合させる。本実施形態における核酸結合性担体としては、ブーム法において一般的に使用されているシリカベースの担体を用いることができ、例えば、シリカビーズ、ガラスビーズ、シリカウール、ガラス繊維などを用いることができる。また、シリカビーズは、シリカのみからなるビーズであってもよいし、磁気ビーズがシリカによりコートされた磁気シリカビーズであってもよい。このような核酸結合性担体は、上記の通りカオトロピック塩を含む溶液とともに組み合わせたキットとして市販されており、本実施形態では、そのような市販品を使用することもできる。
【００４０】
混合液と核酸結合性担体との接触は、例えば、混合液と核酸結合性担体とを容器内で混合することにより、または、核酸結合性担体を充填したカラムなどに混合液を通過させることにより行うことができる。その後、核酸結合性担体を混合液から分離し、回収する。
【００４１】
なお、回収した核酸結合性担体は、任意で、以下のＲＮＡの溶出を行う前に、ＲＮＡを可溶化せず、かつ、非特異的結合物を可溶化できる洗浄液（例えば、７０％（ｖ／ｖ）以上のエタノールを含む水溶液など）により洗浄されてもよい。
【００４２】
次いで、核酸結合性担体に結合したＲＮＡを溶出する。ＲＮＡの溶出は、例えば、ヌクレアーゼフリーの水または低塩濃度の緩衝液などの溶出液を、シリカを含む核酸結合性担体に接触させることにより行うことができる。溶出液と核酸結合性担体との接触は、上記した混合液と核酸結合性担体との接触と同様に行うことができる。その後、核酸結合性担体から溶出液を分離し、回収する。
【００４３】
なお、ブーム法に基づく自動核酸抽出装置が市販されており、本実施形態の方法における上記一連の操作を、そのような市販の装置およびそれに付属するキットを用いて行うこともできる。本実施形態の方法に使用できる自動核酸抽出装置およびそれに付属するキットとしては、例えば、ＭａｇＮＡ  Ｐｕｒｅ  ９６  ＩｎｓｔｒｕｍｅｎｔおよびＭａｇＮＡ  Ｐｕｒｅ  ９６  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  ＲＮＡ  Ｌａｒｇｅ  Ｖｏｌｕｍｅ  Ｋｉｔ（ロシュ・ダイアグノスティックス）、Ｍａｘｗｅｌｌ  ＲＳＣ  ＩｎｓｔｒｕｍｅｎｔおよびＭａｘｗｅｌｌ  ＲＳＣ  ｓｉｍｐｌｙＲＮＡ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｋｉｔ（プロメガ）、ｋｉｎｇｆｉｓｈｅｒ  ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔおよびＭａｇＭＡＸ  ｍｉｒＶａｎａ  Ｔｏｔａｌ  ＲＮＡ（サーモフィッシャーサイエンティフィック）、ＱＩＡｃｕｂｅおよびＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  ＱＩＡｃｕｂｅ  Ｋｉｔ（キアゲン）などが挙げられる。
【００４４】
本実施形態の方法は、小型ＲＮＡ抽出効率改善剤を用いる以外は、従来公知のブーム法において使用されるものと同一の溶液や核酸結合性担体を使用でき、核酸の結合や溶出の条件も従来公知のブーム法と同様に実施できるものである。そのため、本実施形態の方法によれば、新たな条件検討を要することなく、従来と同様の安全かつ簡便な操作により、高収率かつ高精度で小型ＲＮＡを抽出することが可能である。
【００４５】
また、本実施形態の方法を生体試料に適用すれば、従来公知のブーム法によっては困難であった低発現量のｍｉＲＮＡを、定量性を損なうことなく容易に抽出することが可能である。そのため、本実施形態の方法により生体試料から単離されたＲＮＡは、ｍｉＲＮＡの定量分析のために有用である。
【００４６】
すなわち、本発明は、第三の実施形態によれば、生体試料中のマイクロＲＮＡを解析するための方法であって、（ｉ）マイクロＲＮＡを含む生体試料を準備するステップと、（ｉｉ）前記生体試料に、カオトロピック塩を含む溶液を添加するステップと、（ｉｉｉ）前記ステップ（ｉｉ）により得られた第１の混合液に、上記の小型ＲＮＡ抽出効率改善剤を添加するステップと、（ｉｖ）前記ステップ（ｉｉｉ）により得られた第２の混合液を、シリカを含む核酸結合性担体に接触させるステップと、これにより、マイクロＲＮＡを含む全ＲＮＡが前記核酸結合性担体に結合し、（ｖ）前記核酸結合性担体に結合した全ＲＮＡを溶出するステップと、（ｖｉ）前記ステップ（ｖ）により得られた全ＲＮＡ中のマイクロＲＮＡを定量的ＲＴ−ＰＣＲにより増幅するステップとを含む方法である。
【００４７】
本実施形態の方法では、第二の実施形態の方法と同様の手順により、生体試料からマイクロＲＮＡを含む全ＲＮＡを精製する。本実施形態における「カオトロピック塩」、「小型ＲＮＡ抽出効率改善剤」および「核酸結合性担体」は、第二の実施形態において定義したものと同様である。
【００４８】
「マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）」とは、生体内に存在する２１〜２５塩基長の一本鎖ノンコーディングＲＮＡである。ｍｉＲＮＡは、以下のような多段階ステップを経て生成される。最初に、ｍｉＲＮＡ遺伝子から前駆体であるｐｒｉ−ｍｉＲＮＡが転写される。次いで、ｐｒｉ−ｍｉＲＮＡが核においてＤｒｏｓｈａにより切断されることによりｐｒｅ−ｍｉＲＮＡとなる。次いで、ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡが細胞質においてＤｉｃｅｒにより切断されることにより成熟型二本鎖ｍｉＲＮＡとなり、このうち一方のＲＮＡ鎖が分解除去されて一本鎖ｍｉＲＮＡが生成される。本実施形態におけるｍｉＲＮＡは、この最終産物であるｍｉＲＮＡを意味し、中間産物を含まない。
【００４９】
本実施形態の方法が対象とする「生体試料」は、任意の生体から単離された任意のものであってよく、例えば、マウス、ラット、ウサギ、イヌ、非ヒト霊長類、ヒトなどの動物個体から単離された、組織切片、細胞または体液などであってよいが、特に限定されない。組織切片または細胞が由来する組織としては、例えば、脳、心筋、骨格筋、肺、気管、咽頭、唾液腺、食道、胃、小腸、大腸、膵臓、肝臓、胆嚢、血管、腎臓、膀胱、尿管、精巣、前立腺、卵巣、子宮、骨髄、リンパ節、脾臓、胸腺、下垂体、甲状腺、上皮小体、副腎、骨格筋、腹腔、皮膚、乳腺などが挙げられる。体液としては、例えば、血液、血漿、血清、唾液、尿、胃液、膵液、胆汁、汗、涙、母乳、鼻汁、腸液などが挙げられる。本実施形態における生体試料は、好ましくは体液または組織切片であり、特に好ましくはヒト由来の体液または組織切片である。
【００５０】
本実施形態における生体試料は、当業者に周知の方法により動物個体から得ることができる。また、生体試料として組織切片を用いる場合、組織切片は、動物個体から急性単離された組織から調製されたものであってもよいし、ホルマリン固定されパラフィン包埋された組織（ＦＦＰＥＴ）から調製されたものであってもよい。
【００５１】
次いで、得られた全ＲＮＡ中のｍｉＲＮＡを、定量的ＲＴ−ＰＣＲ（以下、「ＲＴ−ｑＰＣＲ」と記載する）により増幅する。ｍｉＲＮＡをＲＴ−ｑＰＣＲで増幅するための方法はすでに確立されており、当分野において周知の方法を採用することができる。例えば、ｍｉＲＮＡに特異的なプライマーを用いて逆転写反応を行い、得られたｃＤＮＡを鋳型として、目的のｍｉＲＮＡに特異的なプライマーを用いてリアルタイムｑＰＣＲを行うことにより、目的のｍｉＲＮＡを増幅することができる。また、定量解析のための方法も十分に確立されており、リアルタイムｑＰＣＲの結果から算出されるＣｐ値（Ｃｔ値ともいう）に基づいて、例えばΔΔＣｔ法や検量線法などにより、目的のｍｉＲＮＡを定量することができる。
【００５２】
ｍｉＲＮＡをＲＴ−ｑＰＣＲにより増幅するためのキットは市販されており、本実施形態では、そのような市販品を使用することもできる。例えば、ｍｉＲＣＵＲＹ  ＬＮＡ  ｍｉＲＮＡ  ＰＣＲ  Ａｓｓａｙｓ（キアゲン）、ＭｙｓｔｉＣｐ  ｍｉｃｒｏ  ＲＮＡ  Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  ＰＣＲ（シグマ・アルドリッチ）、Ｍｉｒ−Ｘ  ｍｉＲＮＡ  ｑＲＴ−ＰＣＲ  ＴＢ  Ｇｒｅｅｎ  Ｋｉｔ（タカラバイオ）、ＴａｑＭａｎ  ＭｉｃｒｏＲＮＡ  ＡｓｓａｙｓおよびＴａｑＭａｎ  Ａｄｖａｎｃｅｄ  ｍｉＲＮＡ  Ａｓｓａｙｓ（サーモフィッシャーサイエンティフィック）などが好ましい市販品として挙げられる。
【００５３】
本実施形態の方法は、小型ＲＮＡ抽出効率改善剤を用いることにより、低発現量のｍｉＲＮＡについても定量性を損なうことなく抽出することができ、高い精度でｍｉＲＮＡを定量することができるため有用である。
【実施例】
【００５４】
以下に実施例を挙げ、本発明についてさらに説明する。なお、これらは本発明を何ら限定するものではない。【００５５】
＜１．ｍｉＲＮＡの抽出効率を改善する化合物の探索＞
ｍｉＲＮＡを含む標準試料を以下の手順により調製した。１０ｎｇ／μＬのサケ精子ＤＮＡ含有ＴＥ緩衝液（ｐＨ８．０）を用いて、化学合成したｍｉＲ−２１（５’−ＵＡＧＣＵＵＡＵＣＡＧＡＣＵＧＡＵＧＵＵＧＡ−３’：配列番号１）（北海道システム・サイエンス）の溶液（１００ｎＭ）を調製した。得られたｍｉＲ−２１溶液（２．５μＬ）に、Ｋ５６２細胞（国立研究開発法人医薬基盤・健康・栄養研究所ＪＣＲＢ細胞バンクより入手）から抽出された全ＲＮＡ（１００ｎｇ）を加え、蒸留水により１５０μＬに調製し、これを標準試料とした。【００５６】
標準試料からのｍｉＲＮＡの抽出は、Ｈｉｇｈ  Ｐｕｒｅ  ｍｉＲＮＡ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ロシュ・ダイアグノスティックス）を用い、キット付属の説明書に記載の「１カラムプロトコール」にしたがって行った。この際、キット付属のＢｉｎｄｉｎｇ  Ｅｎｈａｎｃｅｒ（以下、「ＢＥ」と記載する）を添加する工程において、ＢＥ（２００μＬ）に代えて、以下の候補化合物：エタノール（和光純薬）、２−プロパノール（関東化学）、ＰＥＧ６００（関東化学）、ＰＥＧ１０００（関東化学）、ＰＥＧ１５４０（関東化学）、ＰＥＧ２０００（関東化学）、またはテトラエチレングリコールジメチルエーテル（以下、「ＴＥＧＤＭＥ」と記載する）（東京化成工業）（いずれも２００μＬ）を添加した。ＲＮＡの溶出は、１００μＬのＥｌｕｔｉｏｎ  Ｂｕｆｆｅｒにより行った。【００５７】
次いで、Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｒ  Ｆｉｒｓｔ  Ｓｔｒａｎｄ  ｃＤＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（ロシュ・ダイアグノスティックス）を用い、ｃＤＮＡを合成した。プライマーには、ステムループＲＴプライマー（５’−ＧＴＣＡＧＡＧＧＡＧＧＴＧＣＡＧＧＧＴＣＣＧＡＧＧＴＡＴＴＣＧＣＡＣＣＴＣＣＴＣＴＧＡＣＴＣＡＡＣＡ−３’：配列番号２）を用いた。反応液の組成は、キット付属の説明書の記載に準じた（１／２スケール）。逆転写反応は、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（商標）２７２０サーマルサイクラーを用いて、以下の条件により行った。【００５８】
［反応条件］
・ステップ１（１サイクル）：１６℃  ３０分
・ステップ２〜４（６０サイクル）：３０℃  ３０秒、４２℃  ３０秒、５０℃  １秒
・ステップ５（１サイクル）：８５℃、５分【００５９】
得られた反応液をＴＥ緩衝液により５倍に希釈し、ｃＤＮＡ溶液とした。続いて、以下の条件により、ｍｉＲ−２１についてのリアルタイムＰＣＲを行った。反応および解析には、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（登録商標）９６  Ｓｙｓｔｅｍ（ロシュ・ダイアグノスティックス）を用いた。反応および解析を５重に行い、Ｃｐ値（平均値±ＳＤ）を算出した。【００６０】
［反応液組成（１０μＬ）］
・ｃＤＮＡ溶液    ２．５μＬ
・２×ＦａｓｔＳｔａｒｔ  Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  ＤＮＡ  Ｐｒｏｂｅｓ  Ｍａｓｔｅｒ（ロシュ・ダイアグノスティックス）    ５μＬ
・１０μＭ  フォワードプライマー（５’−ＧＣＣＴＧＣＴＡＧＣＴＴＡＴＣＡＧＡＣＴＧＡＴＧ−３’：配列番号３）    ０．２μＬ
・１０μＭ  リバースプライマー（５’−ＧＴＧＣＡＧＧＧＴＣＣＧＡＧＧＴ−３’：配列番号４）    ０．２μＬ
・１０μＭ  ユニバーサルプローブライブラリー  プローブ＃８２（ロシュ・ダイアグノスティックス）    ０．２μＬ
・蒸留水    残量【００６１】
［反応条件］
・ステップ１（１サイクル）：９５℃  １０分
・ステップ２〜３（４５サイクル）：９５℃  １０秒、６０℃  ３０秒【００６２】
結果を表１に示す。ＢＥに代えてＰＥＧ１０００、ＰＥＧ１５４０またはＰＥＧ２０００を用いた場合には、ＢＥを用いた場合と比較して有意にＣｐ値が低下した。一方、ＰＥＧ６００またはＴＥＧＤＭＥを用いた場合には、ＢＥを用いた場合とほぼ同等であり、エタノールまたは２−プロパノールを用いた場合には、ＢＥを用いた場合と比較して有意にＣｐ値が上昇した。この結果から、高分子量ＰＥＧがｍｉＲＮＡの抽出効率を顕著に改善できることが示された。【００６３】
表１．ｍｉＲ−２１（標準試料）についてのＣｐ値
【表１】
2020008752.tif 000002
【００６４】
＜２．ｍｉＲＮＡの抽出効率を改善する組成物の検討（１）＞
高分子量ＰＥＧは、ｍｉＲＮＡの抽出効率を顕著に改善できる一方で、常温では固体であり、加温して融解させても極めて高粘度であるため、ピペットによる正確な秤量が困難であった。そこで、高分子量ＰＥＧとＴＥＧＤＭＥを混合することにより、上記問題を解決できるかどうかを検討した。ＰＥＧ１５４０とＴＥＧＤＭＥとを種々の比率で混合した組成物を調製し、６０℃でインキュベートした。その後、５０℃のインキュベーター内において、粘度計（ＶＩＳＣＯ−８９５、アタゴ）を用いて粘度を測定した。測定は５重に行い、平均値±ＳＤを測定値とした。また、上記１と同様の手順により、各組成物を添加した場合のＣｐ値を算出した（添加量：２００μＬまたは３００μＬ、２重測定）。【００６５】
結果を表２に示す。ＰＥＧ１５４０をＴＥＧＤＭＥと混合することにより、大幅に粘度が低下し、かつ、ＢＥよりも有意に低いＣｐ値が得られた。この結果から、ＰＥＧ１５４０：ＴＥＧＤＭＥ＝３：７〜６：４の組成物が、ｍｉＲＮＡの収率を顕著に改善でき、かつ、操作性にも優れたものであることが示された。【００６６】
表２．ＰＥＧ１５４０／ＴＥＧＤＭＥ混合物の粘度およびＣｐ値
【表２】
2020008752.tif 000003
【００６７】
さらに、ＰＥＧ１５４０に代えて、ＰＥＧ６００、ＰＥＧ１０００またはＰＥＧ２０００を用いてＰＥＧ／ＴＥＧＤＭＥ混合物（混合比１：１）を調製し、上記と同様にして粘度を測定し、Ｃｐ値を算出した（添加量：２００μＬまたは３００μＬ、５重測定）。【００６８】
結果を表３に示す。いずれの高分子量ＰＥＧ／ＴＥＧＤＭＥ混合物も、ピペットで正確な秤量が可能な粘度（約３０ｍＰａ・ｓ以下）を有し、かつ、特に添加量を３００μＬとすることにより、ｍｉＲＮＡの収率を顕著に改善できるものであることが確認された。また、いずれの高分子量ＰＥＧを用いた混合物も、高分子量ＰＥＧ：ＴＥＧＤＭＥ＝３：７〜６：４の範囲であれば、同程度に低いＣｐ値が得られた（データは省略）。【００６９】
表３．高分子量ＰＥＧ／ＴＥＧＤＭＥの粘度およびＣｐ値
【表３】
2020008752.tif 000004
【００７０】
＜３．ｍｉＲＮＡの抽出効率を改善する組成物の検討（２）＞
ＰＥＧ１０００／ＴＥＧＤＭＥ（混合比１：１）、ＰＥＧ１５４０／ＴＥＧＤＭＥ（混合比１：１）およびＰＥＧ２０００／ＴＥＧＤＭＥ（混合比１：１）は、調製後１時間程度で凝固した。そのため、使用時には加温により再融解させる必要があるが、１０回まで凝固・再融解を繰り返してＣｐ値を計測したところ、ほとんど変化は見られなかった（データは省略）。したがって、高分子量ＰＥＧ／ＴＥＧＤＭＥ混合物はいずれも十分な安定性を有することが確認されたが、常温で凝固せず、かつ、高いｍｉＲＮＡの抽出効率を有する組成物について、さらに検討した。【００７１】
ＰＥＧ１５４０／ＴＥＧＤＭＥ（混合比１：１）（組成物１）をベースに、追加の成分：チオシアン酸グアニジン（以下、「ＧｕＳＣＮ」と記載する）（和光純薬）、エタノール（和光純薬）、１−（２−アミノエチル）ピペラジン（以下、「ピペラジン」と記載する）（シグマ・アルドリッチ）、および／またはジエチレントリアミン（以下、「ＤＥＴＡ」と記載する）（シグマ・アルドリッチ）を配合した組成物２〜６を調製した。【００７２】
表４．ＰＥＧ１５４０／ＴＥＧＤＭＥベース組成物の調製
【表４】
2020008752.tif 000005
【００７３】
上記１と同様の手順により、上記組成物を添加した場合のＣｐ値を算出した（添加量：２００μＬまたは３００μＬ、５重測定）。【００７４】
また、調製後２５℃にて１時間経過した上記組成物（１ｍＬ）を目視で観察し、凝固が見られるかどうかを確認した。
［判定基準］
凝集を認めない（凝固しない）：  −
一部に凝集物を認める（部分的に凝固する）：  ±
凝集を認める（完全に凝固する）：  ＋【００７５】
結果を表５に示す。ＧｕＳＣＮを添加した組成物は、常温で凝固しなかった。なお、常温で一週間以上経過した組成物でも結果は同様であった（データは省略）。また、ＧｕＳＣＮとともに、エタノール、ピペラジンおよび／またはＤＥＴＡを組み合わせて添加することにより、より低いＣｐ値が得られた。これらの結果から、ＧｕＳＣＮ、エタノール、ピペラジンおよび／またはＤＥＴＡを加えることにより、高分子量ＰＥＧ／ＴＥＧＤＭＥ混合物のＲＮＡ抽出効率および安定性をさらに改善できることが示された。【００７６】
表５．ＰＥＧ１５４０／ＴＥＧＤＭＥベース組成物のＣｐ値および凝固
【表５】
2020008752.tif 000006
【００７７】
＜４．高分子量ＰＥＧ／ＴＥＧＤＭＥ混合物を用いたＦＦＰＥＴ試料からのＲＮＡ抽出＞
標準試料に代えて、がん患者由来のＦＦＰＥＴ試料を用いて、高分子量ＰＥＧ／ＴＥＧＤＭＥ混合物が生体試料からのｍｉＲＮＡ抽出効率をどの程度改善できるかを試験した。【００７８】
大腸がん患者から採取された大腸から調製されたＦＦＰＥＴ切片（厚さ５μｍ）をスライドガラスからマイクロチューブに回収し、８００μＬのキシレンを加え、室温で５分間インキュベートした。その後、４００μＬのエタノールを加えて混合し、１３０００ｒｐｍで２分間遠心し、上清を除去した。１０００μＬのエタノールを加えて再度混合し、１３０００ｒｐｍで２分間遠心し、上清を除去した。その後、Ｈｉｇｈ  Ｐｕｒｅ  ｍｉＲＮＡ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ロシュ・ダイアグノスティックス）に付属の１８０μＬのＰａｒａｆｆｉｎ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｌｙｓｉｓ  Ｂｕｆｆｅｒおよび７０μＬのプロテイナーゼＫ溶液を加え、５６℃で３０分インキュベート後、９０で３０分インキュベートした。【００７９】
標準試料に代えて、得られた組織溶解液（１５０μＬ）を用いた以外は、上記１と同様の手順により、高分子量ＰＥＧ／ＴＥＧＤＭＥ混合物を添加してｍｉＲＮＡを抽出し、ｍｉＲ−２１についてのＲＴ−ｑＰＣＲを実施し、Ｃｐ値を算出した（添加量：２００μＬまたは３００μＬ、５重測定）。【００８０】
結果を表６に示す。いずれの高分子量ＰＥＧ／ＴＥＧＤＭＥ混合物を用いた場合も、ＢＥを用いた場合と比較して有意にＣｐ値が低下した。この結果から、高分子量ＰＥＧ／ＴＥＧＤＭＥ混合物がＦＦＰＥＴ試料からのｍｉＲＮＡの抽出効率を顕著に改善できるものであることが示された。【００８１】
表６．ＦＦＰＥＴ試料から抽出されたＲＮＡ中に含まれるｍｉＲ−２１のＣｐ値
【表６】
2020008752.tif 000007
【００８２】
このように、高分子量ＰＥＧとＴＥＧＤＭＥとを含む組成物は、ｍｉＲＮＡの抽出効率を顕著に改善できるものであり、ｍｉＲＮＡをより正確に定量するために有用であることが示された。【００８３】
＜５．高分子量ＰＥＧ／ＴＥＧＤＭＥ混合物を用いた体液試料からのＲＮＡ抽出＞
標準試料に代えて、健常者由来の血清試料を用いて、高分子量ＰＥＧ／ＴＥＧＤＭＥ混合物が体液試料からのｍｉＲＮＡ抽出効率をどの程度改善できるかを試験した。【００８４】
５人の健常者から全血を採取し、３０００ｒｐｍで１０分間遠心し、血清を回収した。得られた血清は、速やかに−８０℃で凍結保存した。血清１ｍＬに、２０ｍｇ／ｍＬに調製したＰｒｏｔｅｉｎａｓｅ  Ｋ，ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ，ＰＣＲ  Ｇｒａｄｅ（ロシュ・ダイアグノスティックス）を１００μＬ加え、７２℃で１０分間インキュベートした。その後、１３０００ｒｐｍで５分間遠心し、上清を回収した。【００８５】
標準試料に代えて、得られた上清（１５０μＬ）を用いた以外は、上記１と同様の手順により、ＰＥＧ１５４０／ＴＥＧＤＭＥ混合物（混合比１：１）を添加してｍｉＲＮＡを抽出し、ｍｉＲ−２１についてのＲＴ−ｑＰＣＲを実施し、Ｃｐ値を算出した（添加量：２００μＬまたは３００μＬ、５重測定）。【００８６】
結果を表７に示す。一般に、Ｃｐ値＝３５前後がＲＴ−ｑＰＣＲにおける定量限界とされており、Ｃｐ値が３５を超えると、Ｃｐ値のばらつきが大きくなり、定量精度の信頼性を欠くものとして判断される。ここで、ＢＥを用いた場合には、Ｃｐ値が３５を大きく超え、かつ、標準偏差も１を超え、定量的な信頼性に乏しい結果しか得られなかった。これに対し、ＰＥＧ１５４０／ＴＥＧＤＭＥ混合物を用いた場合には、特に、添加量を３００μＬとすることにより、Ｃｐ値を大きく低下させることができ、かつ、標準偏差も十分に小さく、信頼性のある定量解析結果を得ることができた。【００８７】
ｍｉＲ−２１は腫瘍マーカーであり、健常者由来の体液試料には極めて少量しか含まれていないことが知られている。以上の結果から、このような低発現量のｍｉＲＮＡについても、高分子量ＰＥＧ／ＴＥＧＤＭＥ混合物を用いることにより、ｍｉＲＮＡの抽出効率を顕著に改善でき、ＲＴ−ｑＰＣＲによる信頼性のある定量解析が可能となることが示された。【００８８】
表７．血清試料から抽出されたＲＮＡ中に含まれるｍｉＲ−２１のＣｐ値
【表７】
2020008752.tif 000008
【配列表】
2020008752000001.app
【国際調査報告】
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