(57)【要約】  本願発明者らは、強度近視の有病率が高い日本人を対象とし、膨大な数の強度近視患者及び健常者の集団からサンプルを得て鋭意に遺伝子解析を行なった結果、強度近視とゲノムワイドな有意水準で相関を示す９個の一塩基多型（SNP）を同定した。強度近視の発症リスクと有意に相関するSNPは、近視発症リスクに対して遺伝的効果が高いSNPであるといえる。かかるSNPを指標とすることで、近視の発症リスクに対する遺伝的影響をより適切に評価することができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒト被検者から分離したゲノムDNA試料を用いて、下記(1)〜(9)の一塩基多型（SNP）：
(1)  第15番染色体の85,692,651位（配列番号1における201位）にあるSNP ID番号rs72748160のSNP、又はこれと連鎖不平衡にあるSNP
(2)  第3番染色体の69,229,747位（配列番号2における201位）にあるSNP ID番号rs74633073のSNP、又はこれと連鎖不平衡にあるSNP
(3)  第12番染色体の130,041,322位（配列番号3における201位）にあるSNP ID番号rs76903431のSNP、又はこれと連鎖不平衡にあるSNP
(4)  第1番染色体の204,974,863位（配列番号4における201位）にあるSNP ID番号rs2246661のSNP、又はこれと連鎖不平衡にあるSNP
(5)  第1番染色体の219,605,617位（配列番号5における201位）にあるSNP ID番号rs12032649のSNP、又はこれと連鎖不平衡にあるSNP
(6)  第1番染色体の41,867,932位（配列番号6における201位）にあるSNP ID番号rs698047のSNP、又はこれと連鎖不平衡にあるSNP
(7)  第3番染色体の1,739,832位（配列番号7における201位）にあるSNP ID番号rs17029206のSNP、又はこれと連鎖不平衡にあるSNP
(8)  第15番染色体の34,709,241位（配列番号8における201位）にあるSNP ID番号rs589135のSNP、又はこれと連鎖不平衡にあるSNP
(9)  第15番染色体の79,092,508位（配列番号9における201位）にあるSNP ID番号rs28415942のSNP、又はこれと連鎖不平衡にあるSNP
から選択される少なくとも1つのSNPの遺伝子型を調べることを含む、近視の発症リスクを判定する方法（ただし、(5)のSNPと連鎖不平衡にあるSNP、(8)のSNPと連鎖不平衡にあるSNP、及び(9)のSNPと連鎖不平衡にあるSNPから選択される１〜３個のSNPの遺伝子型のみを調べる方法を除く）。
【請求項２】
ヒト被検者から分離したゲノムDNA試料を用いて、下記(1)〜(9)の一塩基多型（SNP）：
(1)  第15番染色体の85,692,651位（配列番号1における201位）にあるSNP ID番号rs72748160のSNP
(2)  第3番染色体の69,229,747位（配列番号2における201位）にあるSNP ID番号rs74633073のSNP
(3)  第12番染色体の130,041,322位（配列番号3における201位）にあるSNP ID番号rs76903431のSNP
(4)  第1番染色体の204,974,863位（配列番号4における201位）にあるSNP ID番号rs2246661のSNP
(5)  第1番染色体の219,605,617位（配列番号5における201位）にあるSNP ID番号rs12032649のSNP
(6)  第1番染色体の41,867,932位（配列番号6における201位）にあるSNP ID番号rs698047のSNP
(7)  第3番染色体の1,739,832位（配列番号7における201位）にあるSNP ID番号rs17029206のSNP
(8)  第15番染色体の34,709,241位（配列番号8における201位）にあるSNP ID番号rs589135のSNP
(9)  第15番染色体の79,092,508位（配列番号9における201位）にあるSNP ID番号rs28415942のSNP
から選択される少なくとも1つのSNPの遺伝子型を調べることを含む、近視の発症リスクを判定する方法であって、近視発症の高リスクの指標となるリスクアリルは、(1)がTであり、(2)がTであり、(3)がAであり、(4)がCであり、(5)がGであり、(6)がGであり、(7)がTであり、(8)がGであり、(9)がTである、方法。
【請求項３】
前記(1)〜(9)のうちの少なくとも5つのSNPの遺伝子型を調べることを含む、請求項１又は２記載の方法。
【請求項４】
前記(1)〜(9)のSNPの遺伝子型を調べることを含む、請求項１又は２記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、遺伝的効果の高い一塩基多型（SNP）を用いて近視の発症リスクを判定する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近視は等価球面度数（SE）が-0.5 D（ジオプトリ−）かそれを超えるものと定義されており、世界中で最も多くみられる屈折異常である。強度近視はSE＜-6.0 D又は眼軸長＞26.0 mmと一般的に定義されており、失明や深刻な視力障害を引き起こし得る網膜剥離、緑内障、白内障、黄斑部出血、黄斑変性等の様々な眼疾患及び全身性疾患の発症リスクを高める（非特許文献1、2）。近視はアジア人集団において非アジア人集団よりも多くみられ（非特許文献3-8）、若年成人層における強度近視の有病率は非アジア諸国（2.0-2.3%）に比べてアジア地域（6.8-21.6%）で極めて高いことが報告されている（非特許文献9）。ここ数十年の間に近視の有病率は世界中で劇的に上昇し続けており（非特許文献10）、近年の報告によると、2050年までに世界の近視患者数は約50億人（世界の人口のほぼ半分）、強度近視患者数は約10億人（世界の人口の約10％）に達するであろうと予測されている（非特許文献11）。近視の病因は正確には解明されていないが、近視は様々な環境的要因及び遺伝的要因が複合的に関与して発症する多因子疾患と考えられている（非特許文献12-17）。近視の強度が高いほど遺伝的要因がより強く寄与していることが示唆されている（非特許文献18-20）。【０００３】
ゲノムワイド関連解析（GWAS）とは、ゲノム全域を網羅する遺伝子多型を対象に非血縁の患者集団と健常者集団の間で有意な頻度差を示す遺伝子多型を検索する手法であり、多因子疾患の遺伝的要因を解明する上で非常に有効である。2009年以降、近視を対象としたGWASが複数実施されており、現在までに、様々な人種集団において近視及び近視関連形質の感受性遺伝子領域が多数同定されている（非特許文献21-24）。論文として報告されたGWAS研究の結果を集約したデータベースであるNHGRI-EBI GWAS Catalog (https://www.ebi.ac.uk/gwas/)には、近視及び近視関連形質に関する候補遺伝子領域が約200箇所報告されている（非特許文献25）。しかしながら、これらの約200箇所の候補遺伝子領域は近視及び近視関連形質の遺伝的要因全体の一部でしかないと推測されている。近視及び屈折異常の大規模GWASに関する2013年の論文２報により、30以上の感受性遺伝子領域が報告されたが（非特許文献26、27）、これらの遺伝子領域は近視及び屈折異常の表現型分散全体の12％にも満たないと推定されている（非特許文献17）。その上、約200箇所の候補遺伝子領域の多くにおいて、近視又は近視関連形質と候補遺伝子領域の相関性の強さ又は相関性の有無が人種集団の間又は近視の重症度の間で異なることが認められている。これらの事実は、近視・近視関連形質に寄与する未同定の遺伝的要因が数多く存在するということを暗示している。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Saw SM, Gazzard G, Shih-Yen EC, Chua WH. Myopia and associated pathological complications. Ophthalmic Physiol Opt. 2005;25(5):381-391.
【非特許文献２】Burton TC. The influence of refractive error and lattice degeneration on the incidence of retinal detachment. Trans Am Ophthalmol Soc. 1989;87:143-157.
【非特許文献３】Wilson A, Woo G. A review of the prevalence and causes of myopia. Singapore Med J. 1989;30(5):479-484.
【非特許文献４】Lam CS, Goldschmidt E, Edwards MH. Prevalence of myopia in local and international schools in Hong Kong. Optom Vis Sci. 2004;81(5):317-322.
【非特許文献５】Kempen JH, Mitchell P, Lee KE, Tielsch JM, Broman AT, Taylor HR, et al. The prevalence of refractive errors among adults in the United States, Western Europe, and Australia. Arch Ophthalmol. 2004;122(4):495-505.
【非特許文献６】Sawada A, Tomidokoro A, Araie M, Iwase A, Yamamoto T; Tajimi Study Group. Refractive errors in an elderly Japanese population: the Tajimi study. Ophthalmology. 2008;115(2):363-370.
【非特許文献７】Pan CW, Klein BE, Cotch MF, Shrager S, Klein R, Folsom A, et al. Racial variations in the prevalence of refractive errors in the United States: the multi-ethnic study of atherosclerosis. Am J Ophthalmol. 2013;155(6):1129-1138.
【非特許文献８】Pan CW, Zheng YF, Anuar AR, Chew M, Gazzard G, Aung T, et al. Prevalence of refractive errors in a multiethnic Asian population: the Singapore epidemiology of eye disease study. Invest Ophthalmol Vis Sci. 2013;54(4):2590-2598.
【非特許文献９】Wong YL, Saw SM. Epidemiology of Pathologic Myopia in Asia and Worldwide. Asia Pac J Ophthalmol (Phila). 2016;5(6):394-402.
【非特許文献１０】Dolgin E. The myopia boom. Nature. 2015;519(7543):276-278.
【非特許文献１１】Holden BA, Fricke TR, Wilson DA, Jong M, Naidoo KS, Sankaridurg P, et al. Global Prevalence of Myopia and High Myopia and Temporal Trends from 2000 through 2050. Ophthalmology. 2016;123(5):1036-1042.
【非特許文献１２】Baird PN, Schache M, Dirani M. The GEnes in Myopia (GEM) study in understanding the aetiology of refractive errors. Prog Retin Eye Res. 2010;29(6):520-542.
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【非特許文献１４】Au Eong KG, Tay TH, Lim MK. Race, culture and myopia in 110,236 young Singaporean males. Singapore Med J. 1993;34(1):29-32.
【非特許文献１５】Morgan IG, Rose KA. Myopia and international educational performance. Ophthalmic Physiolog Opt. 2013;33(3):329-338.
【非特許文献１６】French AN, Ashby RS, Morgan IG, Rose KA. Time outdoors and the prevention of myopia. Exp Eye Res. 2013;114:56-68.
【非特許文献１７】Fan Q, Verhoeven VJ, Wojciechowski R, Barathi VA, Hysi PG, Guggenheim JA, et al. Meta-analysis of gene-environment-wide association scans accounting for education level identifies additional loci for refractive error. Nat Commun. 2016;7:11008.
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【非特許文献２３】Solouki AM, Verhoeven VJ, van Duijn CM, Verkerk AJ, Ikram MK, Hysi PG, et al. A genome-wide association study identifies a susceptibility locus for refractive errors and myopia at 15q14. Nat Genet. 2010;42(10):897-901.
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【非特許文献２５】MacArthur J, Bowler E, Cerezo M, Gil L, Hall P, Hastings E, et al. The new NHGRI-EBI Catalog of published genome-wide association studies (GWAS Catalog). Nucleic Acids Res. 2017;45(D1):D896-D901.
【非特許文献２６】Kiefer AK, Tung JY, Do CB, Hinds DA, Mountain JL, Francke U, et al. Genome-wide analysis points to roles for extracellular matrix remodeling, the visual cycle, and neuronal development in myopia. PLoS Genet. 2013;9(2):e1003299.
【非特許文献２７】Verhoeven VJ, Hysi PG, Wojciechowski R, Fan Q, Guggenheim JA, Hohn R, et al. Genome-wide meta-analyses of multiancestry cohorts identify multiple new susceptibility loci for refractive error and myopia. Nat Genet. 2013;45(3):314-318.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
上述したように、近視は遺伝的要因と環境的要因が複合的に関与して発症する疾患と考えられており（非特許文献12〜17）、近視の強度が高いほど遺伝的要因がより強く寄与していることが示唆されている（非特許文献18〜20）。従来報告されている近視の発症リスクと相関を示す遺伝子多型は、主として弱度近視や中等度近視を含む近視症例群を対象とした遺伝子研究により同定された遺伝子多型であるが、弱度〜中等度の近視症例群には環境的要因の影響が大きい症例が多数含まれている。かかる症例群を対象として同定された遺伝子多型は、近視発症の遺伝的効果が高い多型とは言い難いため、近視発症リスクの判定に用いる遺伝子多型として必ずしも有効ではない。また、そのような遺伝子多型では、強度近視の有病率の高い地域において近視発症リスクを正確に判定することは困難である。本発明は、強度近視の有病率の高い地域も含めた様々な地域・人種において、近視の発症リスクを従来技術よりも正確に判定できる手段を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本願発明者らは、強度近視の有病率が高い日本人を対象とし、膨大な数の強度近視患者及び健常者の集団からサンプルを得て鋭意に遺伝子解析を行なった結果、強度近視とゲノムワイドな有意水準で相関を示す９個の一塩基多型（SNP）を同定するに至り、本願発明を完成した。【０００７】
すなわち、本発明は、  ヒト被検者から分離したゲノムDNA試料を用いて、下記(1)〜(9)の一塩基多型（SNP）：
(1)  第15番染色体の85,692,651位（配列番号1における201位）にあるSNP ID番号rs72748160のSNP、又はこれと連鎖不平衡にあるSNP
(2)  第3番染色体の69,229,747位（配列番号2における201位）にあるSNP ID番号rs74633073のSNP、又はこれと連鎖不平衡にあるSNP
(3)  第12番染色体の130,041,322位（配列番号3における201位）にあるSNP ID番号rs76903431のSNP、又はこれと連鎖不平衡にあるSNP
(4)  第1番染色体の204,974,863位（配列番号4における201位）にあるSNP ID番号rs2246661のSNP、又はこれと連鎖不平衡にあるSNP
(5)  第1番染色体の219,605,617位（配列番号5における201位）にあるSNP ID番号rs12032649のSNP、又はこれと連鎖不平衡にあるSNP
(6)  第1番染色体の41,867,932位（配列番号6における201位）にあるSNP ID番号rs698047のSNP、又はこれと連鎖不平衡にあるSNP
(7)  第3番染色体の1,739,832位（配列番号7における201位）にあるSNP ID番号rs17029206のSNP、又はこれと連鎖不平衡にあるSNP
(8)  第15番染色体の34,709,241位（配列番号8における201位）にあるSNP ID番号rs589135のSNP、又はこれと連鎖不平衡にあるSNP
(9)  第15番染色体の79,092,508位（配列番号9における201位）にあるSNP ID番号rs28415942のSNP、又はこれと連鎖不平衡にあるSNP
から選択される少なくとも1つのSNPの遺伝子型を調べることを含む、近視の発症リスクを判定する方法（ただし、(5)のSNPと連鎖不平衡にあるSNP、(8)のSNPと連鎖不平衡にあるSNP、及び(9)のSNPと連鎖不平衡にあるSNPから選択される１〜３個のSNPの遺伝子型のみを調べる方法を除く）を提供する。
また、本発明は、ヒト被検者から分離したゲノムDNA試料を用いて、下記(1)〜(9)の一塩基多型（SNP）：
(1)  第15番染色体の85,692,651位（配列番号1における201位）にあるSNP ID番号rs72748160のSNP
(2)  第3番染色体の69,229,747位（配列番号2における201位）にあるSNP ID番号rs74633073のSNP
(3)  第12番染色体の130,041,322位（配列番号3における201位）にあるSNP ID番号rs76903431のSNP
(4)  第1番染色体の204,974,863位（配列番号4における201位）にあるSNP ID番号rs2246661のSNP
(5)  第1番染色体の219,605,617位（配列番号5における201位）にあるSNP ID番号rs12032649のSNP
(6)  第1番染色体の41,867,932位（配列番号6における201位）にあるSNP ID番号rs698047のSNP
(7)  第3番染色体の1,739,832位（配列番号7における201位）にあるSNP ID番号rs17029206のSNP
(8)  第15番染色体の34,709,241位（配列番号8における201位）にあるSNP ID番号rs589135のSNP
(9)  第15番染色体の79,092,508位（配列番号9における201位）にあるSNP ID番号rs28415942のSNP
から選択される少なくとも1つのSNPの遺伝子型を調べることを含む、近視の発症リスクを判定する方法であって、近視発症の高リスクの指標となるリスクアリルは、(1)がTであり、(2)がTであり、(3)がAであり、(4)がCであり、(5)がGであり、(6)がGであり、(7)がTであり、(8)がGであり、(9)がTである、方法を提供する。
【発明の効果】
【０００８】
本発明により、従来技術よりも正確に近視の発症リスクを判定できる手段が提供される。強度近視の発症リスクと有意に相関するSNPは、近視発症リスクに対して遺伝的効果が高いSNPであるといえる。かかるSNPを指標とすることで、近視の発症リスクに対する遺伝的影響をより適切に評価することが可能であり、従来技術よりも正確に近視の発症リスクを判定（医師等による近視発症リスクの判定を補助）することができる。近視の発症リスクを知ることそれ自体を目的とした遺伝子検査の他、近視発症前の被検者を対象に本発明を実施し、近視進行を抑制するための生活指導（パソコン、スマートフォン、TVゲーム、読書等の生活環境の改善の助言）や、オルソケラトロジー、低濃度アトロピン治療などの近視進行を抑制する医療処置の早期実施に役立てることができる。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
本願発明者らが同定した、強度近視と有意に相関する9個のSNPを表１に示す。
【００１０】
【表１】
2020158503.tif 000002
【００１１】
なお、本明細書において、任意の塩基の染色体上の位置は、ヒトゲノム参照配列GRCh38に基づいて示している。rsで始まるSNP ID番号は、米国バイオテクノロジー情報センター（National Center for Biotechnology Information：NCBI）のSNPデータベースであるdbSNP（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/SNP/）におけるreference SNP ID番号である。当業者であれば、このSNP ID番号に基づき、SNPの染色体上の物理的位置やその近傍の塩基配列等の情報を容易に入手することができる。本願配列表の配列番号１〜９には、各SNPの前後200bpのゲノム塩基配列を示しているが、これらの領域に隣接するゲノム塩基配列についても、当業者であれば容易に入手可能である。
【００１２】
表１に示したSNPは、日本人の強度近視患者集団及び健常者集団を対象としたGWASにより、強度近視と有意に相関するSNPとして網羅的に同定されたものである。もっとも、日本人集団を対象としたのは、日本を含むアジア地域における強度近視の有病率が他の地域と比べて著しい高値を示し、遺伝的要因の寄与が特に大きいと考えられる強度近視患者のサンプルを多数取得できるためである。本発明の方法により近視発症リスクの正確な判定を行うことができる対象人種は日本人に限らず、日本以外のアジア地域、及び欧米その他の非アジア地域の人の判定も可能である。従って、本発明の方法を実施できる対象には、日本人を含むアジア人、及び欧米人等の非アジア人が広く包含される。本発明の方法を被検者の近視進行の抑制に活かす場合には、若齢（例えば１５歳程度以下）の被検者が主たる対象となり得る。
【００１３】
本発明の方法では、表１に示した９個のSNPのうちの少なくとも１個、例えば、２個以上、３個以上、４個以上、５個以上、６個以上、７個以上、８個以上、又は９個全ての遺伝子型を調べる。健常者群1,586名を対象に算出したリスクアリルの平均保有個数は4.39±1.21個であったことから（下記実施例参照）、少なくとも５個、より好ましくは９個全ての遺伝子型を調べることが望ましい。９個のうちの一部のみを調べる場合、いずれのSNPを選択してもよいが、オッズ比が高いもの、すなわち表１中で上位に記載したSNPを優先的に選択してもよい。例えば、(1)〜(9)のうち５個以上のSNPの遺伝子型を調べる場合には、(1)〜(5)を含む5個以上のSNPを選択することが好ましい。
【００１４】
また、(1)〜(9)のSNPに代えて、各SNPと連鎖不平衡にあるSNPの遺伝子型を調べてもよい。この分野において周知の通り、複数のSNPが強い連鎖不平衡状態にあるとき、それらのSNPは同様の挙動を示す。例えば、SNP-A, SNP-B, SNP-Cが強い連鎖不平衡状態にある場合において、SNP-Aが疾患Xと有意な相関を示すときには、SNP-BとSNP-Cも疾患Xと有意な相関を示す。従って、(1)〜(9)の各SNPと強い連鎖不平衡状態にあるSNPであれば、(1)〜(9)のSNPと同様に強度近視と有意に相関するので、近視発症リスク判定に用いることができる。
【００１５】
連鎖不平衡の強さを表す値としてはD'、r2等の連鎖不平衡係数が知られている。D'及びr2はGabrielらの算出法（Gabriel SB, Schaffner SF, Nguyen H, Moore JM, Roy J, Blumenstiel B, et al. The structure of haplotype blocks in the human genome. Science. 2002;296(5576):2225-2229.）により求めることができる。一般に、r2＞0.7の関係にあるSNP同士は強い連鎖不平衡状態にあるとされる。本発明において、あるSNPと「連鎖不平衡にあるSNP」といった場合、当該SNPとr2＞0.7の関係にあるSNPをいう。特定のSNPと「連鎖不平衡にあるSNP（r2＞0.7の関係にあるSNP）」の情報は、例えば、米国国立癌研究所（National Cancer Institute：NCI）の連鎖不平衡データベースであるLDlink（https://ldlink.nci.nih.gov/）内のLDproxy（https://ldlink.nci.nih.gov/?tab=ldproxy）において容易に検索することができる。
【００１６】
本発明において、複数のSNPの遺伝子型を調べる場合、例えば、リスクアリル（強度近視の発症リスクと正の相関を示すアリル）を保有する遺伝子型（高リスク遺伝子型）の個数によって、被検者の近視発症リスクを判定することができる。この場合、高リスク遺伝子型の個数が多いほど近視の発症リスクが高いことが示される。健常者の高リスク遺伝子型の平均保有個数が4.39±1.21個であったことから、この平均値を超える「高リスク遺伝子型が5個以上」を、近視発症リスクが高いと判定する目安としてもよい。
【００１７】
さらに、各リスクアリルにオッズ比による重み付けを加えてもよい。高リスク遺伝子型を2個持つ被検者の中でも、(4)（rs2246661、オッズ比1.31）及び(6)（rs698047、オッズ比1.28）の2個について高リスク遺伝子型を保有する被検者Aと、(1)（rs72748160、オッズ比1.93）及び(2)（rs74633073、オッズ比1.91）の2個について高リスク遺伝子型を保有する被検者Bとを比べると、被検者Bの方が近視の発症リスクがより高いと評価できる。本発明の方法では、高リスク遺伝子型の個数に加え、検出された高リスク遺伝子型のオッズ比の高さ（高リスク遺伝子型の種類及び組み合わせ）も考慮して近視の発症リスクを判定してもよい。例えば、オッズ比、又はオッズ比の大きさに応じた適当な数値を、各SNPのリスクアリルのスコアとして設定し、被検者で検出された高リスク遺伝子型のスコアを加算ないし積算して、被検者の近視発症リスクをスコア評価する、といった判定方法が考えられる。表１に示したオッズ比の数値を利用してもよいし、さらに多数の強度近視患者を対象に解析を進めてオッズ比を算出し、得られた数値を表１のオッズ比に差し替えて利用してもよい。
【００１８】
本発明の方法に用いられるゲノムDNA試料は、被検者より採取した末梢血や口腔粘膜等から常法により容易に調製することができる。
【００１９】
SNPの遺伝子型を調べる手法自体は周知であり、本発明においてもその手法は特に限定されない。例えば、SNP部位の塩基配列をシークエンシングにより決定して遺伝子型を調べてもよい。また、SNPタイピング方法として、インベーダー法、TaqMan-PCR法、Allele Specific Primer（ASP）法、SNP検出用プローブを搭載したチップによるタイピング法など、各種の方法が知られている。いずれも常法であり、これらの手法に必要となる試薬類を含んだキットも各種市販されている。本発明でSNPの遺伝子型を調べる際には、公知のいずれの手法を用いてもよい。遺伝子型の検出に必要となるプライマー、プローブ等は、当業者であれば、SNP近傍の塩基配列情報に基づいて容易に設計・調製することができる。
【００２０】
TaqMan-PCR法等のSNPタイピング方法で用いるSNP検出用のプローブは、通常、検査対象のSNPの前後数塩基を含むゲノム部分領域の塩基配列と同一の塩基配列又はこれと相補的な塩基配列からなる核酸部分（標的のゲノム領域にハイブリダイズする部分）に、必要に応じてリンカーやアダプターのような付加的な核酸部分を連結した構造を有する。標的のゲノム領域にハイブリダイズする部分の全長（付加的な核酸部分を含まない場合には、プローブの全長）は概ね15〜30塩基程度、例えば16〜30塩基程度、17〜30塩基程度、又は18〜30塩基程度である。
【００２１】
(1)rs72748160の遺伝子型を検出するためのプローブは、配列番号１の201位（rs72748160のSNP）及びその前後数塩基を含む15〜30塩基程度の塩基配列又はこれと相補的な塩基配列からなる核酸部分を、標的のゲノム領域にハイブリダイズする部分として含む。例えば、配列番号１に示した塩基配列中の197〜205位を含む15〜30塩基程度の部分領域と同一の塩基配列、又はこれと相補的な塩基配列からなるプローブであってよい。この場合のプローブは、配列番号１中の197〜205位の配列又はこれと相補的な配列として、TTAG[G]GCAA、TTAG[T]GCAA、TTGC[C]CTAA、又はTTGC[A]CTAA（[]がSNP部分）を含む。
【００２２】
(2)rs74633073の遺伝子型を検出するためのプローブは、配列番号２の201位（rs74633073のSNP）及びその前後数塩基を含む15〜30塩基程度の塩基配列又はこれと相補的な塩基配列からなる核酸部分を、標的のゲノム領域にハイブリダイズする部分として含む。例えば、配列番号２に示した塩基配列中の197〜205位を含む15〜30塩基程度の部分領域と同一の塩基配列、又はこれと相補的な塩基配列からなるプローブであってよい。この場合のプローブは、配列番号２中の197〜205位の配列又はこれと相補的な配列として、CTGT[C]GCCA、CTGT[T]GCCA、TGGC[G]ACAG、又はTGGC[A]ACAG（[]がSNP部分）を含む。
【００２３】
(3)rs76903431の遺伝子型を検出するためのプローブは、配列番号３の201位（rs76903431のSNP）及びその前後数塩基を含む15〜30塩基程度の塩基配列又はこれと相補的な塩基配列からなる核酸部分を、標的のゲノム領域にハイブリダイズする部分として含む。例えば、配列番号３に示した塩基配列中の197〜205位を含む15〜30塩基程度の部分領域と同一の塩基配列、又はこれと相補的な塩基配列からなるプローブであってよい。この場合のプローブは、配列番号３中の197〜205位の配列又はこれと相補的な配列として、ATAG[A]TCAA、ATAG[T]TCAA、TTGA[T]CTAT、又はTTGA[A]CTAT（[]がSNP部分）を含む。
【００２４】
(4)rs2246661の遺伝子型を検出するためのプローブは、配列番号４の201位（rs2246661のSNP）及びその前後数塩基を含む15〜30塩基程度の塩基配列又はこれと相補的な塩基配列からなる核酸部分を、標的のゲノム領域にハイブリダイズする部分として含む。例えば、配列番号４に示した塩基配列中の197〜205位を含む15〜30塩基程度の部分領域と同一の塩基配列、又はこれと相補的な塩基配列からなるプローブであってよい。この場合のプローブは、配列番号４中の197〜205位の配列又はこれと相補的な配列として、GGGA[C]AAGG、GGGA[T]AAGG、CCTT[G]TCCC、又はCCTT[A]TCCC（[]がSNP部分）を含む。
【００２５】
(5)rs12032649の遺伝子型を検出するためのプローブは、配列番号５の201位（rs12032649のSNP）及びその前後数塩基を含む15〜30塩基程度の塩基配列又はこれと相補的な塩基配列からなる核酸部分を、標的のゲノム領域にハイブリダイズする部分として含む。例えば、配列番号５に示した塩基配列中の197〜205位を含む15〜30塩基程度の部分領域と同一の塩基配列、又はこれと相補的な塩基配列からなるプローブであってよい。この場合のプローブは、配列番号５中の197〜205位の配列又はこれと相補的な配列として、GCCA[G]CTGG、GCCA[T]CTGG、CCAG[C]TGGC、又はCCAG[A]TGGC（[]がSNP部分）を含む。
【００２６】
(6)rs698047の遺伝子型を検出するためのプローブは、配列番号６の201位（rs698047のSNP）及びその前後数塩基を含む15〜30塩基程度の塩基配列又はこれと相補的な塩基配列からなる核酸部分を、標的のゲノム領域にハイブリダイズする部分として含む。例えば、配列番号６に示した塩基配列中の197〜205位を含む15〜30塩基程度の部分領域と同一の塩基配列、又はこれと相補的な塩基配列からなるプローブであってよい。この場合のプローブは、配列番号６中の197〜205位の配列又はこれと相補的な配列として、CCCC[C]TCCC、CCCC[G]TCCC、GGGA[G]GGGG、又はGGGA[C]GGGG（[]がSNP部分）を含む。
【００２７】
(7)rs17029206の遺伝子型を検出するためのプローブは、配列番号７の201位（rs17029206のSNP）及びその前後数塩基を含む15〜30塩基程度の塩基配列又はこれと相補的な塩基配列からなる核酸部分を、標的のゲノム領域にハイブリダイズする部分として含む。例えば、配列番号７に示した塩基配列中の197〜205位を含む15〜30塩基程度の部分領域と同一の塩基配列、又はこれと相補的な塩基配列からなるプローブであってよい。この場合のプローブは、配列番号７中の197〜205位の配列又はこれと相補的な配列として、GAAA[C]TTAC、GAAA[T]TTAC、GTAA[G]TTTC、又はGTAA[A]TTTC（[]がSNP部分）を含む。
【００２８】
(8)rs589135の遺伝子型を検出するためのプローブは、配列番号８の201位（rs589135のSNP）及びその前後数塩基を含む15〜30塩基程度の塩基配列又はこれと相補的な塩基配列からなる核酸部分を、標的のゲノム領域にハイブリダイズする部分として含む。例えば、配列番号８に示した塩基配列中の197〜205位を含む15〜30塩基程度の部分領域と同一の塩基配列、又はこれと相補的な塩基配列からなるプローブであってよい。この場合のプローブは、配列番号８中の197〜205位の配列又はこれと相補的な配列として、GAAG[A]GGCT、GAAG[G]GGCT、AGCC[T]CTTC、又はAGCC[C]CTTC（[]がSNP部分）を含む。
【００２９】
(9)rs28415942の遺伝子型を検出するためのプローブは、配列番号９の201位（rs28415942のSNP）及びその前後数塩基を含む15〜30塩基程度の塩基配列又はこれと相補的な塩基配列からなる核酸部分を、標的のゲノム領域にハイブリダイズする部分として含む。例えば、配列番号９に示した塩基配列中の197〜205位を含む15〜30塩基程度の部分領域と同一の塩基配列、又はこれと相補的な塩基配列からなるプローブであってよい。この場合のプローブは、配列番号９中の197〜205位の配列又はこれと相補的な配列として、CACA[C]CCAC、CACA[T]CCAC、GTGG[G]TGTG、又はGTGG[A]TGTG（[]がSNP部分）を含む。
【００３０】
本発明による強度近視発症リスクの判定方法は、他の遺伝子診断方法と組み合わせて実施しても差し支えない。例えば、疾患のリスクや体質などに関連する多型の遺伝子型を検出するプローブと、表１に示したSNPを検出するプローブを組み合わせたマイクロアレイチップを用いて、様々な項目を対象とする遺伝子検査の中の1項目として本発明による強度近視発症リスクの判定を行なってもよい。
【００３１】
本発明によれば、高リスクと判定された被検者に対し、近視を発症するリスクが高いという情報ないしアドバイスを提供することができる。かかる情報が提供されることにより、生活環境（パソコン、スマートフォン、TVゲーム、読書等の環境）の改善による近視予防の助言や、オルソケラトロジー又は低濃度アトロピン治療による近視進行の抑制等の、近視の予防ないし進行抑制のための処置を早期に実行可能となる。
【実施例】
【００３２】
以下、本発明を実施例に基づきより具体的に説明する。もっとも、本発明は下記実施例に限定されるものではない。【００３３】
材料及び方法
対象
強度近視（少なくとも片眼がSE < -9.0 D）を有する非血縁の日本人患者計1,668名、及び非血縁の日本人健常コントロール（両眼とも-0.5 D < SE < +2.0 D）計1,601名をGWASのdiscoveryステージの対象とした。患者症例および健常者症例の収集は神奈川県横浜市の横浜市立大学、岡田眼科及びあおと眼科において実施された。対象者は全員、眼軸長（AL）、眼底検査、球面屈折力、角膜曲率を含む包括的な眼科検査（オートレフラクターはARK-730A (ニデック), ARK-700A (ニデック), KP-8100P (トプコン)を、バイオメーター/パキメーターはAL-2000 (トーメー）を使用）により診断した。強度近視患者は、近視ないしは強度近視の少なくともいずれかに関連することが知られている遺伝性疾患（緑内障、円錐角膜、マルファン症候群など）を有していないことを確認した。末梢血リンパ球の採取及び末梢血細胞からのゲノムDNAの抽出にはQIAamp DNA Blood Maxi Kit (QIAGEN) を使用した。DNA品質のばらつきを防ぐため、実験操作は標準条件下で行なった。【００３４】
replicationステージ（追認試験）のため、GWASステージとは異なる非血縁の日本人集団（両眼AL＞26.0 mmの患者500名、健常コントロール4,869名）を追加した。日本人の強度近視症例は京都強度近視コホート[1-3]から収集した。また、滋賀県長浜市在住の一般市民から2008〜2010年に募集した、包括的ヒトバイオサイエンスデータセットのための長浜前向きゲノムコホート（Nagahama Study）由来の一般健常者[4,5]を日本人健常コントロールとした。追認試験参加者は全員、包括的な眼科検査により診断した（オートレフラクターはARK-530A (ニデック)を、バイオメーター/パキメーターはAL-2000, UD-6000 (トーメー), IOL Master (Carl Zeiss Meditec)を使用)。【００３５】
研究方法はヘルシンキ宣言の教義を遵守し、参加した各施設の倫理委員会によって承認された。全ての患者及びコントロール健常者に対して研究の詳細を説明し、参加者全員から書面によるインフォームド・コンセントを得た。【００３６】
GWASのdiscoveryステージにおけるジェノタイピング
日本人discoveryサンプルを対象としたGWASジェノタイピングは、GeneChip Human Mapping 500K Array Set (500,568 SNPs) (Affymetrix)、又はHuman OmniExpress chip (727,413 SNPs) (Illumina) を用いて、各製造者の推奨する標準プロトコールに基づいて行なわれた。まず、GeneChip Human Mapping 500K Array Setを用いて1,042サンプル(強度近視患者504名、健常者538名)のジェノタイピングを行なった。残りの2,227サンプル(強度近視患者1,164名、健常者1,063名) のジェノタイピングにはHuman OmniExpress chipを使用した。サンプルの評価基準を、最小SNPコール率97％以上に設定し、SNPコール率が97％未満のサンプルを除外した。また、SNPの評価基準については、下記4点のクオリティーコントロール基準に基づいてSNPを除外した。
・コール率98％未満
・強度近視患者−健常者間で欠損データ率に有意差あり（P < 1.0×10-6）
・マイナーアリルの頻度が1％未満
・健常者群でハーディ−ヴァインベルク平衡（HWE）から大きな逸脱あり（P < 0.0001）【００３７】
さらに、サンプル間の潜在的な近縁性を同祖性に基づいて算出し、PI-HAT値 > 0.1875を示す近縁のサンプルを除外した。最終的に上記の評価基準を通過した、Affymetrix GeneChip Human Mapping 500K Array Set上の常染色体SNP 320,897個 (強度近視患者494名、健常者538名)、及びIllumina Human OmniExpress chip上の常染色体SNP 556,905個 (強度近視患者1,138名、健常者1,048名) を用いてインピュテーション解析を行った。【００３８】
ジェノタイプインピュテーション
Michigan Imputation Server (https://imputationserver.sph.umich.edu) [6]を用いてGWASデータのインピュテーション解析を実行した。インピュテーションのリファレンスパネルには、1000 Genomes Phase 3 v5のデータ(http://www.1000genomes.org) [7]を使用した。インピュテーションされたSNPの評価基準をHWE P > 0.001、マイナーアリル頻度 > 1％、R-squared（インピュテーションされた遺伝子型と実際の遺伝子型の間の一致率を示す決定係数）> 0.7と設定し、最終的に、強度近視患者1,632名及び健常者1,586名における常染色体上の5,046,652個のSNPが評価基準をクリアし、統計解析に用いられた。【００３９】
追認試験
GWASのdiscoveryステージの結果を評価するために追認試験を行なった。以前に実施した日本人集団を対象としたGWAS研究[8,9]のデータを基に、日本人集団における追認試験を実施した。【００４０】
統計解析
全ての関連解析はHelixTree SVSソフトウェア（Golden Helix, Inc.）を用いて実施した。GWASの日本人集団における集団階層化に起因する偽陽性の結果を避けるため、GWASステージで得られたP値をinflation factorの値（λ= 1.06）で補正した。GWASステージとreplicationステージの集団間のメタ解析はPLINK [10]を使用して固定効果モデルの下で実施した。ゲノムワイド有意水準の閾値をP < 5.0×10-8に設定した。【００４１】
結果
GWASのdiscoveryステージでは、強度近視を有する日本人患者1,632名及び日本人健常コントロール1,586名（日本人集団１）を対象に、常染色体上の計5,046,652個のSNPについて関連解析を実施した。その結果、アリルベースの関連解析において、P < 0.0001で強度近視と相関を示す62個の候補遺伝子領域を同定した。【００４２】
GWASステージで同定されたP < 0.0001を示す62個の候補遺伝子領域を検証するため、上記の日本人集団１とは別の日本人集団２（強度近視患者500名、健常者4,869名）を用いて追認試験を実施した。62個の候補遺伝子領域のうち、9個の候補遺伝子領域内のSNPが、２つの日本人集団を対象としたメタ解析においてゲノムワイド有意水準（P < 5.0×10-8）の相関を示した。これら9個のSNPを表２に示す。日本人集団１の健常者群1,586名を対象にリスクSNPの平均保有個数を算出したところ、4.39±1.21個であった。本研究で同定した9個の候補遺伝子領域のうち、1q41のZC3H11B領域、15q14のGJD2領域及び15q25.1のRASGRF1領域の3遺伝子領域は、近視または近視関連形質の発症リスクと相関を示す領域として同定されている遺伝子領域であるが（非特許文献22-24）、本研究では、これら3遺伝子領域内において、強度近視と強固に相関を示すSNPを新規に同定した。【００４３】
【表２】
2020158503.tif 000003
【００４４】
参考文献
1.  Miyake M, Yamashiro K, Nakanishi H, Nakata I, Akagi-Kurashige Y, Kumagai K, et al. Evaluation of pigment epithelium-derived factor and complement factor I polymorphisms as a cause of choroidal neovascularization in highly myopic eyes. Invest Ophthalmol Vis Sci. 2013;54(6):4208-4212.
2.  Miyake M, Yamashiro K, Nakanishi H, Nakata I, Akagi-Kurashige Y, Tsujikawa A, et al. Association of paired box 6 with high myopia in Japanese. Mol Vis. 2012;18:2726-2735.
3.  Miyake M, Yamashiro K, Nakanishi H, Nakata I, Akagi-Kurashige Y, Tsujikawa A, et al. Insulin-like growth factor 1 is not associated with high myopia in a large Japanese cohort. Mol Vis. 2013;19:1074-1081.
4.  Miyake M, Yamashiro K, Tabara Y, Suda K, Morooka S, Nakanishi H, et al. Identification of myopia-associated WNT7B polymorphisms provides insights into the mechanism underlying the development of myopia. Nat Commun. 2015;6:6689.
5.  Nakata I, Yamashiro K, Kawaguchi T, Nakanishi H, Akagi-Kurashige Y, Miyake M, et al. Calcium, ARMS2 genotype, and Chlamydia pneumoniae infection in early age-related macular degeneration: a multivariate analysis from the Nagahama study. Sci Rep. 2015;5:9345.
6.  Das S, Forer L, Schonherr S, Sidore C, Locke AE, Kwong A, et al. Next-generation genotype imputation service and methods. Nat Genet. 2016;48(10):1284-1287.
7.  1000 Genomes Project Consortium, Abecasis GR, Auton A, Brooks LD, DePristo MA, Durbin RM, et al. An integrated map of genetic variation from 1,092 human genomes. Nature. 2012;491(7422):56-65.
8.  Khor CC, Miyake M, Chen LJ, Shi Y, Barathi VA, Qiao F, et al. Genome-wide association study identifies ZFHX1B as a susceptibility locus for severe myopia. Hum Mol Genet. 2013;22(25):5288-5294.
9.  Hosoda Y, Yoshikawa M, Miyake M, Tabara Y, Shimada N, Zhao W, et al. CCDC102B confers risk of low vision and blindness in high myopia. Nat Commun. 2018;9(1):1782.
10.  Purcell S, Neale B, Todd-Brown K, Thomas L, Ferreira MA, Bender D, et al. PLINK: a tool set for whole-genome association and population-based linkage analyses. Am J Hum Genet. 2007;81(3):559-575.
【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】令和3年8月25日(2021.8.25)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒト被検者から分離したゲノムDNA試料を用いて、下記(1)〜(9)の一塩基多型（SNP）：
(1)  第15番染色体の85,692,651位（配列番号1における201位）にあるSNP ID番号rs72748160のSNP、又はこれと連鎖不平衡にあるSNP
(2)  第3番染色体の69,229,747位（配列番号2における201位）にあるSNP ID番号rs74633073のSNP、又はこれと連鎖不平衡にあるSNP
(3)  第12番染色体の130,041,322位（配列番号3における201位）にあるSNP ID番号rs76903431のSNP、又はこれと連鎖不平衡にあるSNP
(4)  第1番染色体の204,974,863位（配列番号4における201位）にあるSNP ID番号rs2246661のSNP、又はこれと連鎖不平衡にあるSNP
(5)  第1番染色体の219,605,617位（配列番号5における201位）にあるSNP ID番号rs12032649のSNP、又はこれと連鎖不平衡にあるSNP
(6)  第1番染色体の41,867,932位（配列番号6における201位）にあるSNP ID番号rs698047のSNP、又はこれと連鎖不平衡にあるSNP
(7)  第3番染色体の1,739,832位（配列番号7における201位）にあるSNP ID番号rs17029206のSNP、又はこれと連鎖不平衡にあるSNP
(8)  第15番染色体の34,709,241位（配列番号8における201位）にあるSNP ID番号rs589135のSNP、又はこれと連鎖不平衡にあるSNP
(9)  第15番染色体の79,092,508位（配列番号9における201位）にあるSNP ID番号rs28415942のSNP、又はこれと連鎖不平衡にあるSNP
から選択される少なくとも5つのSNPの遺伝子型を調べることを含む、近視の発症リスクを判定する方法。
【請求項２】
ヒト被検者から分離したゲノムDNA試料を用いて、下記(1)〜(9)の一塩基多型（SNP）：
(1)  第15番染色体の85,692,651位（配列番号1における201位）にあるSNP ID番号rs72748160のSNP
(2)  第3番染色体の69,229,747位（配列番号2における201位）にあるSNP ID番号rs74633073のSNP
(3)  第12番染色体の130,041,322位（配列番号3における201位）にあるSNP ID番号rs76903431のSNP
(4)  第1番染色体の204,974,863位（配列番号4における201位）にあるSNP ID番号rs2246661のSNP
(5)  第1番染色体の219,605,617位（配列番号5における201位）にあるSNP ID番号rs12032649のSNP
(6)  第1番染色体の41,867,932位（配列番号6における201位）にあるSNP ID番号rs698047のSNP
(7)  第3番染色体の1,739,832位（配列番号7における201位）にあるSNP ID番号rs17029206のSNP
(8)  第15番染色体の34,709,241位（配列番号8における201位）にあるSNP ID番号rs589135のSNP
(9)  第15番染色体の79,092,508位（配列番号9における201位）にあるSNP ID番号rs28415942のSNP
から選択される少なくとも5つのSNPの遺伝子型を調べることを含む、近視の発症リスクを判定する方法であって、近視発症の高リスクの指標となるリスクアリルは、(1)がTであり、(2)がTであり、(3)がAであり、(4)がCであり、(5)がGであり、(6)がGであり、(7)がTであり、(8)がGであり、(9)がTである、方法。
【請求項３】
前記(1)〜(9)のうちの少なくとも6つのSNPの遺伝子型を調べることを含む、請求項１又は２記載の方法。
【請求項４】
前記(1)〜(9)のSNPの遺伝子型を調べることを含む、請求項１又は２記載の方法。
【国際調査報告】
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