(57)【要約】  充填剤で形成された長さ２．０ｃｍ〜３．５ｃｍの充填部を有し、前記充填剤が、平均粒子径が１．５μｍ〜２．５μｍである、表面が親水化された多孔質シリカゲルからなり、線流速２．１ｃｍ／分で水溶媒を送液した時の圧力差が４．０ＭＰａ以上である、ガードカラムとする。【特許請求の範囲】
【請求項１】
充填剤で形成された長さ２．０ｃｍ〜３．５ｃｍの充填部を有し、
前記充填剤が、平均粒子径が１．５μｍ〜２．５μｍである、表面が親水化された多孔質シリカゲルからなり、
線流速２．１ｃｍ／分で水溶媒を送液した時の圧力差が４．０ＭＰａ以上である、ガードカラム。
【請求項２】
前記多孔質シリカゲルは、平均細孔径が２５ｎｍ〜３５ｎｍであり、比表面積が１００ｍ２／ｇ〜３００ｍ２／ｇである、請求項１に記載のガードカラム。
【請求項３】
多孔質シリカゲルを含む充填剤を用いたカラムと、光散乱検出器とを用いるサイズ排除クロマトグラフィーに用いられる、請求項１または請求項２に記載のガードカラム。
【請求項４】
上流側から、請求項１〜請求項３のいずれか一項に記載のガードカラムと、多孔質シリカゲルを含む充填剤が充填されたサイズ排除クロマトグラフィー用カラムと、光散乱検出器とがこの順に備えられた、液体クロマトグラフ。
【請求項５】
請求項４に記載の液体クロマトグラフを用いて、サイズ排除クロマトグラフィーにより高分子化合物を分析する、高分子化合物の分析方法。
【請求項６】
請求項１〜請求項３のいずれか一項に記載のガードカラムの製造方法であり、
平均粒子径が１．５μｍ〜２．５μｍである表面が親水化された多孔質シリカゲルからなる充填剤を、長さ１ｃｍ当たり１２ＭＰａ〜４０ＭＰａの充填圧で充填することにより、長さ２．０ｃｍ〜３．５ｃｍの充填部を形成する充填工程を有する、ガードカラムの製造方法。
【請求項７】
前記充填部の直径が０．４ｃｍ〜０．９ｃｍである、請求項１に記載のガードカラム。
【請求項８】
前記表面の親水化された多孔質シリカゲルが、
表面が親水化されていない多孔質シリカゲルを、シランカップリング剤で処理してシランカップリング剤由来の官能基を形成し、その後、更に、前記官能基と親水性化合物とを反応させた、シリカゲルである、
請求項１に記載のガードカラム。
【請求項９】
前記シランカップリング剤が、エポキシ基を有するシランカップリング剤であり、
前記親水性化合物が、水、多価アルコール化合物、またはエポキシ基を有する化合物である、請求項８に記載のガードカラム。
【請求項１０】
前記表面の親水化された多孔質シリカゲルが、
表面が親水化されていない多孔質シリカゲルをグリシドキシプロピルトリメトキシシランで表面処理し、表面に形成されたエポキシ基を水で開環させたシリカゲルである、請求項１に記載のガードカラム。
【請求項１１】
前記高分子化合物がタンパク質である、請求項５に記載の高分子化合物の分析方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ガードカラム、液体クロマトグラフ、高分子化合物の分析方法およびガードカラムの製造方法に関する。
本願は、２０１８年１２月１０日に、日本に出願された特願２０１８−２３０８９６号に基づき優先権を主張し、その内容をここに援用する。
【背景技術】
【０００２】
従来、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）の検出器として、光散乱検出器が広く使用されている。光散乱検出器は、静的光散乱法の原理に基づく検出器である。光散乱検出器は、試料溶液に一定波長のレーザー光を照射し、レイリー散乱によって試料から生じた散乱光強度を計測する。光散乱検出器を使用したＨＰＬＣでは、散乱光強度の情報を利用することにより、溶出した試料の絶対分子量および分子サイズを測定できる。【０００３】
光散乱検出器を使用したＨＰＬＣでは、試料の絶対分子量を測定できるため、サイズ排除クロマトグラフィー用カラムが多く使用される。この場合、サイズ排除クロマトグラフィー用カラムにより、分子の大きさに応じて試料を分離し、光散乱検出器により、絶対分子量および分子サイズを測定する。
サイズ排除クロマトグラフィーでは、分析する試料の性質に応じて、有機溶媒を使用する場合と、水溶媒を使用する場合とがある。水溶媒を使用するサイズ排除クロマトグラフィーでは、水溶性の試料が分析対象となる。水溶性の試料としては、水溶性高分子やタンパク質などが挙げられる。【０００４】
サイズ排除クロマトグラフィー用カラムには、試料の大きさに応じた細孔を有する充填剤が充填されている。タンパク質を試料とするサイズ排除クロマトグラフィーでは、細孔分布の特質を利用したシリカゲル系の充填剤が好適に使用される。シリカゲル系の充填剤としては、充填剤へのタンパク質の吸着を抑えるために表面を親水化したシリカゲルが広く用いられている。【０００５】
シリカゲル系の充填剤を利用したカラムと光散乱検出器とを組み合わせた液体クロマトグラフを用いるタンパク質のサイズ排除クロマトグラフィーでは、タンパク質の絶対分子量と同時に、タンパク質の分子形状の情報が得られる。このため、上記のサイズ排除クロマトグラフィーは、タンパク質の機能解明への応用が期待されている。【０００６】
特許文献１には、排除クロマトグラフィー中に光散乱検出器によって得られるゴーストピークを低減する方法が記載されている。具体的には、有機−無機ハイブリッドコア材料を含む固定相材料に、試料を１０００ｐｓｉより大きいカラム入口圧で負荷するサイズ排除クロマトグラフィーが記載されている。【０００７】
シリカゲル系の充填剤を用いたカラムと、光散乱検出器とを用いるサイズ排除クロマトグラフィーにおいて、インジェクションノイズを抑制することが要求されている。インジェクションノイズとは、カラムへの試料注入に伴う圧力変動（インジェクションショック）により発生し、クロマトグラム上の排除限界付近に観察される広い「ゴーストピーク」のことを云う。インジェクションノイズは、シリカゲル系の充填剤を用いたカラムを利用する場合に特有の問題である。インジェクションノイズが発生すると、クロマトグラム上で、分離された試料のピークとインジェクションノイズとが重なり、試料の分析が困難となる場合がある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特許第６２１９５６９号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、上記事情を鑑みてなされたものであり、多孔質シリカゲルを含む充填剤を用いたカラムと、光散乱検出器とを用いるサイズ排除クロマトグラフィーに用いられ、インジェクションノイズを抑制できるガードカラムおよびガードカラムの製造方法を提供することを課題とする。
また、本発明は、上記ガードカラムを備え、インジェクションノイズが発生しにくい液体クロマトグラフを提供することを課題とする。
また、本発明は、上記液体クロマトグラフを用いる、インジェクションノイズが発生しにくい高分子化合物の分析方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者は、上記課題を解決するために、多孔質シリカゲルを含む充填剤を用いたカラムの上流側に配置されるガードカラムに着目し、鋭意検討を重ねた。
その結果、充填剤で形成された長さ２．０ｃｍ〜３．５ｃｍの充填部を有し、前記充填剤が、平均粒子径１．５μｍ〜２．５μｍである、表面が親水化された多孔質シリカゲルからなり、線流速２．１ｃｍ／分で水溶媒を送液した時の圧力差が４．０ＭＰａ以上であるガードカラムを用いればよいことを見出した。【００１１】
そして、上流側から、上記ガードカラムと、多孔質シリカゲルを含む充填剤が充填されたサイズ排除クロマトグラフィー用カラムと、光散乱検出器とがこの順に備えられた液体クロマトグラフを用いることで、サイズ排除クロマトグラフィーにおけるインジェクションノイズを抑制できることを確認し、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明の第一の態様は、以下の[１]に記載されるガードカラムである。【００１２】
［１］充填剤で形成された長さ２．０ｃｍ〜３．５ｃｍの充填部を有し、
前記充填剤が、平均粒子径が１．５μｍ〜２．５μｍである、表面が親水化された多孔質シリカゲルからなり、
線流速２．１ｃｍ／分で水溶媒を送液した時の圧力差が４．０ＭＰａ以上である、ガードカラム。【００１３】
第一の態様のガードカラムは、以下に述べるように、以下の[２]、[３]、及び[７]〜[１１]に記載される特徴を好ましく有する。これらの特徴を２つ以上組み合わせることも好ましい。
［２］前記多孔質シリカゲルは、平均細孔径が２５ｎｍ〜３５ｎｍであり、比表面積が１００ｍ２／ｇ〜３００ｍ２／ｇである、［１］に記載のガードカラム。
［３］前記多孔質シリカゲルを含む充填剤を用いたカラムと、光散乱検出器とを用いるサイズ排除クロマトグラフィーに用いられる、［１］または［２］に記載のガードカラム。【００１４】
本発明の第二の態様は、以下の液体クロマトグラフである。
［４］上流側から、［１］〜［３］のいずれかに記載のガードカラムと、多孔質シリカゲルを含む充填剤が充填されたサイズ排除クロマトグラフィー用カラムと、光散乱検出器とがこの順に備えられた、液体クロマトグラフ。
本発明の第三の態様は、以下の高分子化合物の分析方法である。
［５］上記［４］に記載の液体クロマトグラフを用いて、サイズ排除クロマトグラフィーにより高分子化合物を分析する、高分子化合物の分析方法。【００１５】
本発明の第四の態様は、以下のガードカラムの製造方法である。
［６］上記［１］〜［３］のいずれかに記載のガードカラムの製造方法であり、
平均粒子径が１．５μｍ〜２．５μｍである表面が親水化された多孔質シリカゲルからなる充填剤を、長さ１ｃｍ当たり１２ＭＰａ〜４０ＭＰａの充填圧で充填することにより、長さ２．０ｃｍ〜３．５ｃｍの充填部を形成する充填工程を有する、ガードカラムの製造方法。
[７]  前記充填部の直径が０．４ｃｍ〜０．９ｃｍである、［１］に記載のガードカラム。
[８]  前記表面の親水化された多孔質シリカゲルが、
表面が親水化されていない多孔質シリカゲルを、シランカップリング剤で処理してシランカップリング剤由来の官能基を形成し、その後、更に、前記官能基と親水性化合物とを反応させた、シリカゲルである、［１］に記載のガードカラム。
[９]  前記シランカップリング剤が、エポキシ基を有するシランカップリング剤であり、
前記親水性化合物が、水、多価アルコール化合物、またはエポキシ基を有する化合物である、［８］に記載のガードカラム。
[１０]  前記表面の親水化された多孔質シリカゲルが、
表面が親水化されていない多孔質シリカゲルをグリシドキシプロピルトリメトキシシランで表面処理し、表面に形成されたエポキシ基を水で開環させたシリカゲルである、［１］に記載のガードカラム。
[１１]  前記高分子化合物がタンパク質である、［５］に記載の高分子化合物の分析方法。
【発明の効果】
【００１６】
本発明のガードカラムと、多孔質シリカゲルを含む充填剤が充填されたサイズ排除クロマトグラフィー用カラムと、光散乱検出器とが、上流側からこの順に備えられた液体クロマトグラフは、サイズ排除クロマトグラフィーにおけるインジェクションノイズが発生しにくい。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】実施例１の液体クロマトグラフを用いて高分子化合物を分析した結果を示したクロマトグラムである。
【図２】実施例２の液体クロマトグラフを用いて高分子化合物を分析した結果を示したクロマトグラムである。
【図３】実施例３の液体クロマトグラフを用いて高分子化合物を分析した結果を示したクロマトグラムである。
【図４】比較例１の液体クロマトグラフを用いて高分子化合物を分析した結果を示したクロマトグラムである。
【図５】比較例２の液体クロマトグラフを用いて高分子化合物を分析した結果を示したクロマトグラムである。
【図６】比較例３の液体クロマトグラフを用いて高分子化合物を分析した結果を示したクロマトグラムである。
【図７】比較例４の液体クロマトグラフを用いて高分子化合物を分析した結果を示したクロマトグラムである。
【図８】ノイズレベルの計算方法を説明するためのクロマトグラムである。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
以下、本発明のガードカラムおよびガードカラムの製造方法、液体クロマトグラフ、高分子化合物の分析方法について詳細に説明する。なお、本発明は、以下に示す実施形態のみに限定されるものではない。本発明の要旨を逸脱しない範囲で、変更や追加や省略をする事ができる。例えば、本発明の趣旨を逸脱しない範囲で、種類、数、量、材料、構成等について、追加、省略、変更、交換などが可能である。
（本発明者らによる検討）
本発明者らは、多孔質シリカゲルを含む充填剤が充填されたサイズ排除クロマトグラフィー用カラムと、光散乱検出器とを用いるサイズ排除クロマトグラフィーにおいて、インジェクションノイズを抑制すべく、以下に示すように検討を重ねた。
まず、特許文献１に記載の技術に基づいて検討を行った。特許文献１には、サイズ排除クロマトグラフィーにおいて、有機−無機ハイブリッドコア材料を含む固定相材料に対して、試料を、１０００ｐｓｉより大きいカラム入口圧で負荷することにより、光散乱検出器によって検出されるノイズの発生率を、低減する方法が記載されている。
【００１９】
本発明者らは、有機−無機ハイブリッドコア材料を含む固定相材料ではなく、多孔質シリカゲルを含む充填剤が、充填されたカラムであるＬＷ−４０３  ４Ｄ（昭和電工株式会社製、カラムサイズ  内径０．４６ｃｍ、長さ１５．０ｃｍ）を用いて、検討を行った。前記カラムを用いた理由は、多孔質シリカゲルを含む充填剤でも同様の効果が得られるかどうかを、確認する為である。
【００２０】
評価において、具体的には、上記カラムを、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）装置につなぎ、溶離液として５０ｍＭリン酸緩衝液を、０．３５ｍｌ／分（線流速２．１ｃｍ／分に相当）の送液速度で送液した。光散乱検出器としては、ＤＡＷＮ８＋（Ｗｙａｔｔ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）を用いた。このような条件の装置において、試料を注入した。本発明者らは、この時に得られたクロマトグラムにおいて、排除限界付近に大きなインジェクションノイズが発生することを確認した。後述する比較例１に示すように、この時のカラム入口の圧力は、１４ＭＰａ（≒２０３０ｐｓｉ）であった。
このような結果は、多孔質シリカゲルを含む充填剤が充填されたカラムを用いる場合には、試料を、１０００ｐｓｉよりも大きいカラム入口圧で負荷をする特許文献１の技術を適用しても、インジェクションノイズを抑制する効果は十分に得られないことを示している。
【００２１】
そこで、本発明者らは、多孔質シリカゲルを含む充填剤が充填されたカラムの上流に、ガードカラムを設置することにより、インジェクションノイズを抑制することができるかどうか、更に鋭意検討を重ねた。より詳細には、本発明者らは、ガードカラムの充填部の形状、充填剤の種類および平均粒子径、及び、充填剤の充填状態に着目して、様々な検討を行った。
なおガードカラムとは、分析カラムを保護するなどのために、インジェクターと分析カラムの間に取り付けて、使用するカラムである。
【００２２】
検討の結果、特定の充填剤を、特定の充填圧で充填することにより、そして、特定の長さの充填部を形成したガードカラムを用いることにより、高分子化合物の分析において問題にならない程度に、インジェクションノイズを抑制できることを見出した。
また、本発明者らは、ガードカラムの充填部における充填剤の充填状態の指標として、ガードカラムに線流速２．１ｃｍ／分で水溶媒を送液した時の圧力差が、好ましく用いられることを見出した。上記圧力差が十分に大きいガードカラムは、充填部に充填剤が隙間なく略均一に並べられており、インジェクションノイズを効果的に減少できる、良好な充填状態を有している、と推定されるからである。
【００２３】
本明細書において、ガードカラムの「線流速２．１ｃｍ／分で水溶媒を送液した時の圧力差」とは、以下に述べる圧力Ａと圧力Ｂとの差を意味する。具体的には、まずポンプと、ガードカラムと、分析カラムとを、例えば配管を用いて、上流側からこの順に、接続する。そして、ガードカラムに線流速２．１ｃｍ／分で水溶媒を送液した時の圧力（圧力Ａ）を測定する。ガードカラムから充填剤を取り除いた空カラムをガードカラムに代えて接続し、この空カラムに線流速２．１ｃｍ／分で水溶媒を送液した時の圧力（圧力Ｂ）を同様に測定する。そしてこれらの圧力の差を、前記圧力差とする。
【００２４】
上記圧力差の測定に用いることができる水溶媒としては、公知の水溶媒、具体的には、サイズ排除クロマトグラフィーによりタンパク質などの水溶性の試料を分析する際に用いられる公知の水溶媒、を用いることができる。具体的な水溶媒の例としては、塩化ナトリウム、塩化カリウム、及び硫酸ナトリウムなどから選ばれる１種以上の塩が添加された、リン酸緩衝液などが挙げられる。これらの水溶媒を用いた場合には、上記圧力差を得る場合に、水溶媒の種類の違いによる差異は見られない。より具体的な例としては、例えば、５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．７，０．３ＭのＮａＣｌを含む）などを、水溶媒として好ましく使用することができる。
【００２５】
また、上記圧力差を測定する際の線流速は、サイズ排除クロマトグラフィーにより、タンパク質などの水溶性の試料を分析する際における一般的な溶離液の流速である、２．１ｃｍ／分を使用した。線流速２．１ｃｍ／分は、ガードカラムの内径が０．４６ｃｍである場合の０．３５ｍｌ／分の体積流速に相当し、ガードカラムの内径が０．８ｃｍである場合の１．０ｍｌ／分の体積流速に相当する。
【００２６】
このようにして、本発明者らは、様々な検討の結果、特定のガードカラムを用いることで、すなわち、充填剤で形成された長さ２．０ｃｍ〜３．５ｃｍの充填部を有し、前記充填剤が、平均粒子径が１．５μｍ〜２．５μｍである表面が親水化された多孔質シリカゲルからなり、上記圧力差が４．０ＭＰａ以上である、ガードカラムを用いることで、インジェクションノイズ抑制効果が十分に得られることを見出した。
【００２７】
また、様々な検討の結果、特定の方法により、優れた効果を有する前記ガードカラムを形成できることを見出した。すなわち、平均粒子径１．５μｍ〜２．５μｍである、表面が親水化された多孔質シリカゲルからなる充填剤を、長さ１ｃｍ当たり１２ＭＰａ〜４０ＭＰａの充填圧で充填して、長さ２．０ｃｍ〜３．５ｃｍの充填部を形成する方法により、上記の圧力差が４．０ＭＰａ以上である優れたガードカラムが得られることを見出した。このようにして、本発明を完成させたのである。
【００２８】
「ガードカラム」
本実施形態のガードカラムは、多孔質シリカゲルを含む充填剤を用いたカラムと、光散乱検出器とを用いる、サイズ排除クロマトグラフィーに、好ましく用いることができるガードカラムである。
本実施形態のガードカラムは、カラムの上流側に、好ましく配置されることができる。具体的には、上流側から、ガードカラムと、多孔質シリカゲルを含む充填剤が充填されたサイズ排除クロマトグラフィー用カラム（以下、「分析カラム」と称する場合がある。）と、光散乱検出器とが、この順に備えられた液体クロマトグラフ中の、ガードカラムとして好適に用いることができる。
【００２９】
本実施形態のガードカラムは、充填部を、必須で含む。本実施形態のガードカラムは、入り口部の部品と、出口部の部品と、入口側から出口側に延在する円筒状部品と、円筒状部品内に充填された充填剤からなる充填部とを好ましく含む。
本実施形態のガードカラムでは、円筒状部品の入口側に入り口部の部品が固定され、円筒状部品の出口側に出口部の部品が固定される。円筒状部品内には、充填部が形成される。入り口部の部品と出口部の部品は、それぞれ、円筒状部品に固定される仕組みと、円筒状部品を配管に接続するための接続部と、円筒状部品からの充填剤の流出を防ぐフィルターと、を有する。円筒状部品は、出口部の部品と一体成型されていてもよい。円筒状部品は、入り口部の部品と出口部の部品により完全に覆われても良い。
円筒状部品は、一定の断面積を有し、長さ方向に延在する、内壁面を有する。円筒状部品の内壁面の長さは、任意に選択できるが、０．５ｃｍ〜４．５ｃｍであることが一般的であり、２．０ｃｍ〜３．５ｃｍであることが好ましく、より好ましくは２．０ｃｍ〜３．０ｃｍである。円筒状部品の内径は任意に選択できるが、０．１ｃｍ〜２０ｃｍであることが一般的であり、０．１ｃｍ〜６ｃｍであることが好ましく、後述するように、０．１ｃｍ〜２ｃｍであることがより好ましく、さらに好ましくは０．２〜１．０ｃｍである。
本実施形態のガードカラムの長さや直径は任意に選択できる。本実施形態のガードカラムは、好ましくは円筒形又は略円筒形を有するが、これらのみに限定されない。入り口部の部品と出口部の部品とを、円筒状部品に固定する仕組みは、任意に選択できる。例えば、入り口部の部品と出口部の部品とが、あるいは、入り口部の部品や出口部の部品が円筒状部品と、互いの雄ネジ構造と雌ネジ構造によるねじ込み式で、直接結合してもよい。ただし、これらの例のみに限定されない。入り口部の部品、出口部の部品、及び円筒状部品の材料は、後述するように必要に応じて任意に選択できる。
【００３０】
（充填部）
充填部は、充填剤で形成されている。充填部は、入り口部の部品と出口部の部品とによって外部と仕切られた、円筒状部品内に形成されている。本実施形態における充填部の外形は、円筒状部品の内壁形状に沿う、円柱状の形状を有する。より詳細には、充填部は、円筒状部品の内壁面の長さと同じ長さを有し、かつ円筒状部品の内径と同じ寸法の直径を有する、円柱状の形状を有することが好ましい。
【００３１】
充填部の長さは、２．０ｃｍ〜３．５ｃｍであり、２．０ｃｍ〜３．０ｃｍであることが好ましい。充填部の長さは、必要に応じて、２．０ｃｍ〜２．８ｃｍであったり、２．０〜２．５ｃｍであっても良い。充填部の長さが２．０ｃｍ以上であると、分析カラムと光散乱検出器とを用いるサイズ排除クロマトグラフィーにおいて、インジェクションノイズを十分に抑制できる。充填部の長さが３．５ｃｍ以下であると、分析カラムの上流にガードカラムを配置することよる分析時間および分析結果への影響を抑制できる。
【００３２】
本実施形態のガードカラムは、本実施形態のガードカラムをガードユニットとして複数個直列に連結したものであってもよい。本実施形態のガードカラムが、複数個のガードユニットを直列に連結したものである場合、ガードカラムの充填部の長さとは、複数個のガードユニットにそれぞれ含まれる充填部の長さを全て足し合わせた合計の長さを意味してよい。
【００３３】
円筒状部品の内径（ガードカラムの内径ともいう場合がある。）は、例えば、０．１ｃｍ〜２ｃｍとすることができ、分析する試料の種類および量などに応じて適宜選択できる。例えば、本実施形態のガードカラムと分析カラムと光散乱検出器とを、上流側からこの順に備える液体クロマトグラフを用いて、タンパク質を分析する場合、内径が０．４ｃｍ〜０．９ｃｍであるものを用いることが好ましい。円筒状部品の内径は、充填部の直径として考えても良い。
【００３４】
ガードカラムを形成している入り口部の部品、出口部の部品および円筒状部品の各部品に用いられる材料は、それぞれサイズ排除クロマトグラフィーに用いられる溶離液および測定する試料に応じて、適宜を選択できる。上記各部品の材料としては、具体的には、例えば、ステンレスを用いてもよいし、ポリエーテルエーテルケトン樹脂（ＰＥＥＫ）などの合成樹脂を用いてもよい。また、上記各部品は、それぞれ異なる材料で形成されていてもよいし、一部または全部が同じ材料で形成されていてもよい。
【００３５】
（充填剤）
本実施形態のガードカラムでは、円筒状部品に充填剤が充填されている。充填剤としては、表面が親水化された多孔質シリカゲルを用いる。表面が親水化された多孔質シリカゲルは、破砕状であってもよいし、球状であってもよい。球状であることが好ましい。
【００３６】
充填剤として用いられる表面が親水化された多孔質シリカゲルは、平均粒子径が１．５μｍ〜２．５μｍであり、１．７μｍ〜２．２μｍであることが好ましい。平均粒子径が１．５μｍ以上であると、ガードカラムに水溶媒を線流速２．１ｃｍ／分で送液した時に過剰な圧力上昇が起こらない。また、平均粒子径が２．５μｍ以下であると、水溶媒を線流速２．１ｃｍ／分で送液した時の圧力差が４．０ＭＰａ以上であるガードカラムが容易に得られる。
【００３７】
平均粒子径が１．５μｍ〜２．５μｍである表面が親水化された多孔質シリカゲルは、任意に選択される方法で得ることができる。例えば、様々な粒子径を有する親水化された多孔質シリカゲルからなる充填剤を用意し、これに対して、メッシュを用いた篩分級、風力分級機を用いた粒径制御、あるいは遠心式分級処理などの方法を行うことによって、得ることができる。
表面が親水化された多孔質シリカゲルの平均粒子径は、コールターカウンターあるいは画像解析式粒度分布測定器を用いて測定できる。好ましくはコールターカウンターで測定される。本実施形態において、充填剤として用いられる表面が親水化された多孔質シリカゲルの平均粒子径は、体積平均径である。
【００３８】
表面が親水化された多孔質シリカゲルの平均細孔径は、クロマトグラフィーで測定する試料の分子の大きさに応じて、適宜選択できる。分析カラムの上流側に本実施形態のガードカラムを備えた、液体クロマトグラフを用いて、タンパク質を分析する場合、このガードカラムに含まれる、表面が親水化された多孔質シリカゲルの平均細孔径は、２５ｎｍ〜３５ｎｍであることが好ましく、２８ｎｍ〜３２ｎｍであることがより好ましい。平均細孔径が２５ｎｍ〜３５ｎｍであると、タンパク質のサイズ排除クロマトグラフィーにおいて、タンパク質が分離されやすく、好ましい。
【００３９】
表面が親水化された多孔質シリカゲルの比表面積は任意に選択できるが、比表面積が１００ｍ２／ｇ〜３００ｍ２／ｇであることが好ましく、１００ｍ２／ｇ〜２００ｍ２／ｇであることがより好ましい。表面が親水化された多孔質シリカゲルの比表面積が１００ｍ２／ｇ以上であると、ガードカラムによる分析カラムの汚染を防ぐ機能がより顕著となるため、充填部の長さをより短くできる。また、比表面積が３００ｍ２／ｇ以下である、表面が親水化された多孔質シリカゲルは、細孔容積が大きくなりすぎることがない。このため、比表面積が３００ｍ２／ｇ以下である、表面が親水化された多孔質シリカゲルは、十分に高い強度を有する充填剤であり、ガードカラムに水溶媒を線流速２．１ｃｍ／分で送液した時のガードカラムにかかる圧力が高くなりすぎることを防止できる。
【００４０】
表面が親水化された多孔質シリカゲルの平均細孔径および比表面積は、ガス吸着式比表面積測定器、あるいは水銀ポロシメータを用いて測定できる。好ましくは、ガス吸着式比表面積測定器で測定される。
【００４１】
本実施形態では、ガードカラムの充填剤として、表面が親水化された多孔質シリカゲルを用いる。このため、分析カラムの上流に本実施形態のガードカラムを備える液体クロマトグラフを用いてタンパク質を分析した場合に、ガードカラムの充填剤の表面にタンパク質が吸着しにくい。このため、ガードカラムを備えることに起因しておこる、分析カラムにおける試料の分離性能への影響が、小さいものとなる。
【００４２】
本実施形態において、「表面が親水化された多孔質シリカゲル」とは、多孔質シリカゲルの表面に存在するシラノール基が、親水性の有機化合物によって修飾されていることを意味する。言い換えると、前記修飾により、タンパク質の吸着が抑えられた状態にある、多孔質シリカゲルであることを意味する。表面が親水化された多孔質シリカゲルは、シランカップリング剤との反応に由来する構造、より具体的には、前記反応に由来する有機シロキサン構造を含むことが好ましい。
【００４３】
表面が親水化された多孔質シリカゲルは、例えば、以下に示す方法により、表面が親水化されていない多孔質シリカゲル基材の表面を親水化することによって得られる。
多孔質シリカゲル基材としては、所望の平均粒子径を有するものを用いることが好ましい。このことにより、所望の平均粒子径を有する表面が親水化された多孔質シリカゲルが容易に得られる。多孔質シリカゲル基材の平均粒子径は、表面が親水化された多孔質シリカゲルの平均粒子径と、同様の方法により測定できる。また同様の平均粒子径を有することもできる。
所望の平均粒子径を有する多孔質シリカゲル基材は、例えば、様々な粒子径を有する多孔質シリカゲル基材を用意し、これに対し、メッシュを用いた篩分級、風力分級機を用いた粒径制御、あるいは遠心式分級処理などを行う方法により、得ることができる。
【００４４】
多孔質シリカゲル基材の表面を親水化する方法としては、任意に選択できるが、例えば、２段階の工程を行う方法が好ましく挙げられる。具体的には、多孔質シリカゲル基材とシランカップリング剤とを反応させて、シランカップリング剤由来の官能基を有する基材を得る第１反応工程と、その後、シランカップリング剤由来の官能基を有する基材と親水性化合物とを反応させて、表面が親水化された多孔質シリカゲルを得る第２反応工程と、を行う方法を用いることができる。この方法を行うことにより、多孔質シリカゲルのシラノール基は、シランカップリング剤由来の官能基と親水性化合物との反応に起因して得られる、親水性の有機化合物によって、好ましく修飾されることができる。なお第１反応工程のみで基材の表面を親水化できる場合、第２反応工程を省略しても良い。
【００４５】
第１反応工程における多孔質シリカゲル基材とシランカップリング剤との反応は、任意に選択される条件によって、例えば、有機溶媒および／または水溶媒中で、塩基または酸を触媒として、多孔質シリカゲル基材とシランカップリング剤とを加熱攪拌する方法などによって、実施できる。
シランカップリング剤の例としては、エポキシ基を有するシランカップリング剤、不飽和基を有するシランカップリング剤、アミノ基を有するシランカップリング剤、イソシアネート基を導入するシランカップリング剤などを用いることができる。
【００４６】
エポキシ基を有するシランカップリング剤の例としては、例えば、２−（３，４−エポキシシクロヘキシル）エチルトリメトキシシラン、３−グリシドキシプロピルメチルジメトキシシラン、３−グリシドキシプロピルトリメトキシシラン、３−グリシドキシプロピルメチルジエトキシシラン、３−グリシドキシプロピルトリエトキシシランなどが挙げられる。これらの中でも特に、３−グリシドキシプロピルトリメトキシシラン、を用いることが好ましい。
【００４７】
エポキシ基を有するシランカップリング剤を用いた場合、第２反応工程において使用される親水性化合物として、水、多価アルコール化合物、および／またはエポキシ基を有する化合物を用いることが好ましい。
多価アルコール化合物としては、例えば、モノ，ジ，トリ，テトラまたはポリエチレングリコール、モノプロピレングリコール、１，３−プロパンジオール、ジプロピレングリコール、２，３，４−トリメチル−１，３−ペンタンジオール、ポリプロピレングリコール、グリセリン、ポリグリセリン、２−ブテン−１，４−ジオール、１，４−ブタンジオール、１，３−ブタンジオール、１，５−ペンタンジオール、１，６−ヘキサンジオール、１，２−シクロヘキサンジメタノール等から選ばれる、いずれか１種以上を用いることができる。
第２反応工程において、第１反応工程により得られたシランカップリング剤由来のエポキシ基を有する基材と、多価アルコール化合物とを反応させる方法としては、例えば、酸もしくは塩基を用いる方法など、公知の方法を用いることができる。
【００４８】
エポキシ基を有する化合物としては、例えば、エチレングリコールジグリシジルエーテルやグリシドール等のエポキシ化合物、エピクロロヒドリン、エピブロムヒドリン、α−メチルエピクロロヒドリン等のハロエポキシ化合物などから選ばれる、いずれか１種以上を用いることができる。これらの中でも特に、グリシドールを用いることが好ましい。
第２反応工程において、第１反応工程により得られたシランカップリング剤由来のエポキシ基を有する基材と、エポキシ基を有する化合物とを反応させることにより導入されるエポキシ基は、公知の方法で開環させて親水化することができる。
【００４９】
不飽和基を有するシランカップリング剤としては、例えば、ビニルトリメトキシシラン、ビニルトリエトキシシラン、３−メタクリロキシプロピルメチルジメトキシシラン、３−メタクリロキシプロピルトリメトキシシラン、３−メタクリロキシプロピルメチルジエトキシシラン、３−メタクリロキシプロピルトリエトキシシラン、３−アクリロキシプロピルトリメトキシシランなどが挙げられる。
【００５０】
不飽和基を有するシランカップリング剤を用いた場合、親水性化合物として親水性モノマーを用いることが好ましい。
親水性のモノマーとしては、例えば、Ｎ−ビニル−２−ピロリドン、Ｎ−ビニルアセトアミド、（メタ）アクリルアミド、Ｎ−イソプロピル（メタ）アクリルアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチル（メタ）アクリルアミド−２−ヒドロキシエチル（メタ）アクリレート、エチレングリコール（メタ）アクリレート、ポリエチレングリコール（メタ）アクリレート、プロピレングリコール（メタ）アクリレート、ポリプロピレングリコール（メタ）アクリレート等の（メタ）アクリル酸エステル等から選ばれる、１種以上を用いることができる。
【００５１】
本明細書中において「（メタ）アクリル」とは、アクリルおよびメタクリルから選択される少なくとも一種を意味する。
また、本明細書中において「（メタ）アクリレート」とは、アクリレートおよびメタクリレートから選択される少なくとも一種を意味する。
第２反応工程において、第１反応工程により得られたシランカップリング剤由来の不飽和基（２重結合）を有する基材と、親水性のモノマーとを反応させる方法としては、例えば、公知の条件でグラフト重合する方法などが挙げられる。
【００５２】
アミノ基を有するシランカップリング剤としては、例えば、Ｎ−２−（アミノエチル）−３−アミノプロピルメチルジメトキシシラン、Ｎ−２−（アミノエチル）−３−アミノプロピルトリメトキシシラン、３−アミノプロピルトリメトキシシラン、３−アミノプロピルトリエトキシシラン、３−トリエトキシシリル−Ｎ−（１，３−ジメチル−ブチリデン）プロピルアミンなどが挙げられる。
アミノ基を有するシランカップリング剤を用いた場合、親水性化合物として酸無水物を用いることが好ましい。
また、アミノ基を有するシランカップリング剤を用いた場合、第２反応工程を行うことなく、第１反応工程により得られたシランカップリング剤由来のアミノ基を有する基材を、そのまま表面が親水化された多孔質シリカゲルとして用いてもよい。
【００５３】
イソシアネート基を導入するシランカップリング剤としては、例えば、トリス−（トリメトキシシリルプロピル）イソシアヌレート、３−ウレイドプロピルトリアルコキシシラン、３−イソシアネートプロピルトリエトキシシランなどが挙げられる。
イソシアネート基を導入するシランカップリング剤を用いた場合、親水性化合物としては、上述した多価アルコール化合物を用いてもよいし、アミン化合物を用いてもよい。
【００５４】
また、その他として、シランカップリング剤としては、例えば、３−メルカプトプロピルメチルジメトキシシラン、３−メルカプトプロピルトリメトキシシランなどを用いてもよい。
この場合、親水性化合物としては、上述した多価アルコール化合物を用いてもよいし、アミン化合物を用いてもよい。
【００５５】
本実施形態のガードカラムにおいて、線流速２．１ｃｍ／分で水溶媒を送液した時の圧力差は、４．０ＭＰａ以上であり、４．５ＭＰａ以上であることがより好ましく、５．０ＭＰａ以上であることがさらに好ましい。上記圧力差が４．０ＭＰａ以上であると、本実施形態のガードカラムと分析カラムと光散乱検出器とが、上流側からこの順に備えられた液体クロマトグラフを用いるサイズ排除クロマトグラフィーにおいて、インジェクションノイズを低減できる。４．０ＭＰａ以上であれば、圧力差は必要に応じて任意に選択でき、例えば、６．０ＭＰａ以上や、７．０ＭＰａ以上や、８．０ＭＰａ以上や、９．０ＭＰａ以上や、１０．０ＭＰａ以上であってもよい。圧力差の上限値は任意に選択できるが、上記圧力差が大きすぎると、ガードカラムの耐久性が低下する恐れがあり、また測定可能な装置も制約されるため、上記圧力差は１２．０ＭＰａ以下であることが好ましい。例えば、１１．５ＭＰａ以下や、１１．０ＭＰａ以下であってもよい。
【００５６】
上記圧力差が４．０ＭＰａ以上であることによる効果は、充填剤の充填状態が好適であることに由来して得られる、と推測される。すなわち、本実施形態のガードカラムの有する特定の長さの充填部において、上記の充填剤の充填状態が好適であることにより、インジェクションショックにより発生するインジェクションノイズの原因が、ガードカラムによって取り除かれるものと推定される。
【００５７】
また、ガードカラムの線流速２．１ｃｍ／分で水溶媒を送液した時の圧力差は、上述したように、１２ＭＰａ以下であることが好ましい。上記圧力差が１２ＭＰａ以下であると、上記圧力差が大きすぎることによるガードカラムの耐久性低下を抑制できるとともに、上記圧力差の測定に使用するポンプ、配管などの装置に対する制約が少なくて済み、好ましい。
【００５８】
［ガードカラムの圧力差の測定方法］
ガードカラムの線流速２．１ｃｍ／分で水溶媒を送液した時の圧力差は、以下に示す方法により測定できる。
圧力センサーを有するポンプと、ガードカラムと、分析カラムとを用意し、配管を用いて、上流側からこの順に接続する。そして、ポンプを用いてガードカラムの円筒状部品内に入口から、線流速２．１ｃｍ／分で、水溶媒を送液する。この時の水溶媒の送液圧力を、ポンプの有する圧力センサーにより測定する。このようにして、入り口側での圧力の測定を行う。
【００５９】
次に、ガードカラムを取り外し、充填部のかわりに、水溶媒を満たした、空カラムを、ガードカラムと同様にして、接続する。ここで使用する空カラムは、充填部が形成されていないこと以外は、ガードカラムと同じ構造である。すなわち、空カラムは、ガードカラムに使用したものと同じ円筒状部品に、入り口部の部品および出口部の部品を取り付けて、形成されたものである。この円筒状部品には、水溶媒のみが含まれている。
そして、ポンプを用いて、空カラムと分析カラムに、線流速２．１ｃｍ／分で、水溶媒を送液する。この時の水溶媒の送液圧力を、ポンプの有する圧力センサーにより測定する。
その後、このようにして得られたガードカラムを接続したときの圧力と、空カラムを接続したときの圧力との差を算出する。算出された値を、ガードカラムの、線流速２．１ｃｍ／分で水溶媒を送液した時の圧力差とする。
【００６０】
本実施形態のガードカラムは、複数個を、直列に連結して使用しても良い。この場合、各カラムのインジェクションノイズ低減効果が、加算されることが推測される。連結する数は任意に選択でき、例えば、２〜４個であっても良い。
【００６１】
本実施形態のガードカラムを、直列に複数個連結して使用する場合、これを備える液体クロマトグラフにおいてガードカラムが劣化した際には、これらガードカラムの内、一部のみを交換してもよいし、全てを交換してもよい。ガードカラムの劣化の状態に応じて、交換するガードカラムの数を、適宜決定できる。
【００６２】
「ガードカラムの製造方法」
本実施形態のガードカラムは、任意に選択される製造方法によって、例えば、以下に示す製造方法により、好ましく製造できる。ただし以下の例のみに限定されない。
まず、一定の断面積を有し、長さ方向に延在する、内壁面の長さが、２．０ｃｍ〜３．５ｃｍである円筒状部品を用意する。次に、円筒状部品の出口側に、出口部の部品を取り付ける。また、表面が親水化された多孔質シリカゲルからなり、平均粒子径が１．５μｍ〜２．５μｍである、充填剤を用意する。
【００６３】
その後、前記円筒状部品に、充填剤を、長さ１ｃｍ当たり、１２ＭＰａ〜４０ＭＰａ、好ましくは１５ＭＰａ〜３０ＭＰａの充填圧で充填する。この作業により、長さ２．０ｃｍ〜３．５ｃｍの充填部を形成する（充填工程）。充填剤の充填後、円筒状部品の入り口側に入り口部の部品を固定する。このことにより、ガードカラムが製造できる。
【００６４】
充填工程において、充填剤を充填部の長さ１ｃｍ当たり１２ＭＰａ以上の充填圧で充填すると、充填部の長さが２．０ｃｍ〜３．５ｃｍである時に、水溶媒を線流速２．１ｃｍ／分で送液した時の圧力差が、４．０ＭＰａ以上である、カードカラムを、好ましく得ることができる。上記充填剤を充填部の長さ１ｃｍ当たり４０ＭＰａ以下の充填圧で充填すると、充填剤を充填することによる充填剤の破砕が生じにくく、充填剤の充填状態に悪影響を来すことがない。また、上記充填剤を充填部の長さ１ｃｍ当たり３０ＭＰａ以下の充填圧で充填すると、上記圧力差が大きくなりすぎることがない。よって、上記圧力差が大きすぎることによるガードカラムの耐久性低下を抑制できる。また、上記圧力差の測定に使用するポンプ、配管などの装置に対する制約が少なくて済み、好ましい。
【００６５】
本実施形態のガードカラムの製造方法において、円筒状部品内に充填剤を充填する方法としては、特に限定されるものではない。例えば、平衡密度法、スラリー充填法等の公知の充填方法を用いることができる。スラリー充填法を用いることが好ましい。
【００６６】
スラリー充填法を用いて円筒状部品内に充填剤を充填する場合、例えば、以下に示す方法を好ましく用いることができる。
まず、充填剤を分散溶媒に分散させてスラリーとする。充填部を形成するために使用する充填剤の使用量は、円筒状部品の内容積に応じて決定できる。具体的には、充填剤の使用量は、円筒状部品の内壁面に囲まれた容積と同体積以上かつ内壁面に囲まれた容積の１．５倍以下の範囲内であることが好ましい。充填剤の使用量は、内壁面に囲まれた容積の１．１倍〜１．４倍の範囲内であることがより好ましい。また、スラリーに用いることができる分散溶媒としては、任意に選択できるが、例えば、メタノール、エタノール、イソプロパノールなどが挙げられる。
【００６７】
スラリー中の充填剤の含有量は、特に限定されないが、例えば、５質量％〜１０質量％の範囲であることが好ましい。スラリー中の充填剤の含有量が上記範囲内であると、ハウジング内に供給されたスラリー中の充填剤が分散溶媒とともに移動しやすく、充填剤が隙間なく略均一に配置されやすい。また、スラリー中の充填剤の含有量が上記範囲内であると、容易に送液できるため、充填剤の充填圧を高精度で調整できる。
【００６８】
次に、出口部の部品が取り付けられた円筒状部品と、充填用パッカーとを接続する。その後、充填用パッカーに、分散溶媒と充填剤とからなるスラリーを投入し、続いて、充填用パッカーにポンプを接続する。そして、ポンプを用いて、所定の送液圧力で、押し液を前記パッカーに送液する。これにより、スラリーおよび押し液が、円筒状部品内に送られる。押し液としては任意に選択でき、水を用いてもよいし、水と水溶性アルコールの混合液を用いてもよい。
【００６９】
円筒状部品内に充填される充填剤の、充填時の充填圧は、押し液の送液速度によって、押し液の送液圧力を調節することにより、調整できる。具体的には、押し液の送液終了時の送液圧力が、目標とする充填剤の充填圧となるようにすればよい。すなわち、押し液の送液終了時の送液圧力は、充填部の長さ１ｃｍ当たり１２ＭＰａ〜４０ＭＰａとし、好ましくは充填部の長さ１ｃｍ当たり１５ＭＰａ〜３０ＭＰａとすることがよい。例えば、充填部の長さが２．０ｃｍ〜３．５ｃｍである場合、押し液の送液終了時の送液圧力は２５ＭＰａ〜５０ＭＰａとすることが好ましく、３０ＭＰａ〜４０ＭＰａとすることがより好ましい。
【００７０】
スラリーおよび押し液の送液は、スラリー、およびスラリーの体積の３倍以上の体積の押し液が、全て円筒状部品内を通液するまで行うことが好ましい。押し液の送液終了時の送液圧力は、充填時の充填剤の充填圧である。押し液の送液が完了することにより、充填部の形成が完了する。
充填部の形成が終了した後、充填用パッカーを出口部の部品が取り付けられた円筒状部品から外し、円筒状部品の入り口側に入り口部の部品を固定して密閉する。
以上の工程により、本実施形態のガードカラムが得られる。
【００７１】
「液体クロマトグラフ」
本実施形態の液体クロマトグラフは、上流側から、本実施形態のガードカラムと、分析カラムと、光散乱検出器とが、この順に備えられた装置である。本実施形態の液体クロマトグラフでは、ポンプに接続されたインジェクターが、ガードカラムの上流側に、配管を介して、接続されていることが好ましい。
本実施形態の液体クロマトグラフでは、必要に応じて、光散乱検出器とともに、示差屈折率検出器、紫外吸収検出器などの検出器が更に備えられていてもよい。
また、本実施形態の液体クロマトグラフでは、必要に応じて、必要に応じた場所に、インラインフィルターが更に接続されていてもよい。
【００７２】
（分析カラム）
本実施形態では、分析カラムとして、多孔質シリカゲルを含む充填剤が充填された、サイズ排除クロマトグラフィー用カラムを好ましく用いる。
【００７３】
分析カラムとしては、ハウジング内に充填剤が充填されたものを用いる。本実施形態では、分析カラムの長さは、任意に選択できるが、充填剤で形成された充填部の長さが１５．０ｃｍ〜３０．０ｃｍのものを用いることが好ましい。充填部の長さが１５．０ｃｍ以上であると、本実施形態の液体クロマトグラフを用いてタンパク質の分析を行う場合に、良好なタンパク質の分離性能が得られやすく、好ましい。充填部の長さが３０．０ｃｍ以下であると、分析カラムにかかる圧力負荷が適正となりやすく、好ましい。
【００７４】
分析カラムの内径（ハウジングの内径）は、任意に選択できるが、本実施形態のガードカラムにおける円筒状部品の内径（ガードカラムの内径）と同様に、０．１ｃｍ〜２ｃｍであることが好ましく、０．４ｃｍ〜０．９ｃｍであることがより好ましい。分析カラムのハウジングの内径は、本実施形態のガードカラムの円筒状部品の内径（ガードカラムの内径）と同じであることが好ましい。この場合、分析カラムとガードカラムとが類似するものとなるため、本実施形態の液体クロマトグラフを用いるサイズ排除クロマトグラフィーにおけるインジェクションノイズを、より一層低減できる。
また、分析カラムのハウジングの内径は、分析する試料の種類および量に応じて適宜選択できる。例えば、本実施形態の液体クロマトグラフを用いてタンパク質を分析する場合、分析カラムのハウジングの内径は０．４ｃｍ〜０．９ｃｍであることがより好ましい。
【００７５】
分析カラムの部品に用いられる材料は、本実施形態のガードカラムの部品と同様に、サイズ排除クロマトグラフィーに用いられる溶離液および測定する試料に応じて、適宜を選択できる。具体的には、例えば、ステンレスを用いてもよいし、ポリエーテルエーテルケトン樹脂（ＰＥＥＫ）などの合成樹脂を用いてもよい。
【００７６】
分析カラムの充填剤は、多孔質シリカゲルを含む。前記充填剤は、好ましくは表面が親水化された多孔質シリカゲルのみからなる。多孔質シリカゲルでない充填剤を含んでもよい。多孔質シリカゲルでない充填剤としては、例えば、有機高分子からなるものなどが挙げられる。
分析カラムの充填剤は、表面が親水化された多孔質シリカゲルのみからなることが好ましく、本実施形態のガードカラムの充填剤と同じ充填剤であることがより好ましい。
【００７７】
分析カラムの充填剤が、表面が親水化された多孔質シリカゲルである場合、本実施形態の液体クロマトグラフを用いてタンパク質を分析した場合に、分析カラムの充填剤の表面にタンパク質が吸着しにくく、高精度の分析結果が得られる。
分析カラムの充填剤が、本実施形態のガードカラムの充填剤と同じである時、分析カラムとガードカラムとが類似するものとなる。このため、本実施形態の液体クロマトグラフを用いるサイズ排除クロマトグラフィーにおけるインジェクションノイズを、より一層低減できる。
【００７８】
分析カラムの充填剤として用いる多孔質シリカゲルの細孔径分布は、２５ｎｍ〜３５ｎｍであることが好ましく、２８ｎｍ〜３２ｎｍであることがより好ましい。多孔質シリカゲルの細孔径分布が２８ｎｍ〜３２ｎｍであると、タンパク質のサイズ排除クロマトグラフィーにおいて、良好なタンパク質の分離性能が得られやすく、好ましい。多孔質シリカゲルの平均細孔径は、ガス吸着式比表面積測定器で測定される。
【００７９】
分析カラムとしては、市販のカラムを用いてもよい。市販のカラムとしては、例えば、タンパク質分析に好適なサイズ排除クロマトグラフィー用カラムとして市販されているＫＷ−８０３シリーズ、ＫＷ−４００シリーズ、ＬＷ−４０３  ４Ｄ、ＬＷ−８０３（いずれも昭和電工株式会社製）などが挙げられる。
【００８０】
本実施形態では、光散乱検出器として、公知の装置を用いることができ、測定する試料および目的などに応じて適宜を選択できる。市販の光散乱検出器としては、例えば、ＤＡＷＮ８＋（Ｗｙａｔｔ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）、ＰＬ−ＲＴＬＳ、ＰＬ−ＨＴＬＳ（いずれもアジレント・テクノロジー株式会社製）などが挙げられる。
【００８１】
「高分子化合物の分析方法」
本実施形態の高分子化合物の分析方法では、本実施形態の液体クロマトグラフを用いて、サイズ排除クロマトグラフィーにより、高分子化合物を分析することができる。本実施形態の分析方法は、分析対象を高分子化合物とし、特に、タンパク質を分析する場合に、好適に用いることができる。
【００８２】
本実施形態の高分子化合物の分析方法では、溶離液として、水に塩が溶解された水系のものを用いることが好ましい。溶離液に含まれる塩としては、塩化ナトリウム、塩化カリウム、硫酸ナトリウムなどが好ましく挙げられる。
溶離液は、分析の再現性を向上させるために、緩衝液を含有していてもよい。緩衝液としては、リン酸緩衝液などが好適に用いられる。
さらに、溶離液は、塩の析出が問題とならない範囲で、水溶性の有機溶媒を含有していてもよい。具体的には、溶離液中の水溶性の有機溶媒の含有量は、１０質量％以下であることが好ましい。水溶性の有機溶媒の例としては、例えば、メタノール、アセトニトリルなどが挙げられる。
【００８３】
本実施形態の高分子化合物の分析方法では、本実施形態のガードカラムを含む液体クロマトグラフを用いて、サイズ排除クロマトグラフィーにより、高分子化合物を分析する。このため、光散乱検出器を用いる場合における、インジェクションノイズが抑えられる。したがって、本実施形態の高分子化合物の分析方法により、高精度で、高分子化合物を分析できる。特に、本実施形態の高分子化合物の分析方法は、タンパク質の絶対分子量の測定に好適である。
【００８４】
本実施形態の分析方法におけるインジェクションノイズの抑制効果は、本実施形態の液体クロマトグラフが、本実施形態のガードカラムを備えていることによって得られるものである、と推定される。より詳細には、本実施形態のガードカラムが、以下に示す（１）〜（３）を全て満たすことによる相乗効果によって、試料中の分析カラムを汚染する物質が、ガードカラムの充填剤に吸着されることによるものである、と推定される。
【００８５】
（１）充填剤が、表面が親水化された多孔質シリカゲルからなり、多孔質シリカゲルの平均粒子径が１．５μｍ〜２．５μｍである。
（２）充填部の長さが２．０ｃｍ〜３．５ｃｍである。
（３）水溶媒を、線流速２．１ｃｍ／分で送液した時の圧力差が、４．０ＭＰａ以上である。
【００８６】
また、本実施形態のガードカラムは、本来の「ガードカラム」としての性能も有している。すなわち、本実施形態のガードカラムが、溶離液および測定試料中の汚染物質を除去することにより、分析カラムの汚染を防止する効果が得られる。したがって、本実施形態の液体クロマトグラフでは、インジェクションノイズの抑制効果に加え、分析カラムの劣化が抑制され、分析カラムの長寿命化を図ることができる。つまり、本実施形態の液体クロマトグラフを用いて高分子化合物を繰り返し分析することにより、ガードカラムが劣化した場合には、ガードカラムを交換すればよい。
【実施例】
【００８７】
以下、実施例および比較例により、本発明の効果をより明らかなものとする。なお、本発明は、以下の実施例のみに限定されるものではなく、その要旨を変更しない範囲で適宜変更して実施できる。【００８８】
（実施例１）
［充填剤の製造］
以下に示す方法により、実施例１のガードカラムを製造した。
球形の多孔質シリカゲル基材（商品名：Ｍ．Ｓ．ＧＥＬ  ＥＰ−ＤＦ−１．９−２５０Ａ、ＡＧＣエスアイテック社製）１００ｇを、溶媒である２０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ５．５；酢酸０．０６３ｇおよび酢酸ナトリウム０．７５ｇを含む、純正化学社製）５００ｇ中に分散させて分散液とした。得られた分散液に、シランカップリング剤（グリシドキシプロピルトリメトキシシラン、ＪＮＣ社製）５０ｇを加え、７０℃で１７時間攪拌した。
その後、吸引濾過して固体相であるシランカップリング剤由来のエポキシ基を有する基材を分離回収した（第１反応工程）。【００８９】
分離回収した固体相を、水とメタノールをそれぞれ用いて順次洗浄し、乾燥した。洗浄して乾燥させた固体相を、５０ｍＭ硫酸水溶液中に分散させて８０℃で２時間加熱攪拌することにより、シランカップリング剤由来のエポキシ基を有する基材と親水性化合物である水とを反応させた。その後、吸引濾過して目的物である固体相を分離回収し、水とアセトンをそれぞれ用いて順次洗浄し、乾燥させた（第２反応工程）。以上の工程により、表面が親水化された多孔質シリカゲル１０６ｇを得た。【００９０】
得られた表面が親水化された多孔質シリカゲルは球状である。コールターカウンター（Ｍｕｌｔｉｓｉｚｅｒ４  ベックマン・コールター社製）を用いて測定した、これの平均粒子径は、１．９μｍであった。また、表面が親水化された多孔質シリカゲルの平均細孔径および比表面積を、ガス吸着式比表面積測定器（ＢＥＬＳＯＲＰ−ｍｉｎｉＩＩ  マイクロトラック・ベル社製）を用いて測定した。その結果、平均細孔径は２８ｎｍ、比表面積は１５０ｍ２／ｇであった。【００９１】
［ガードカラムの製造］
このようにして得られた表面が親水化された多孔質シリカゲル０．２ｇを、イソプロパノール４ｍｌに分散させて分散液（スラリー）とした。
また、内径０．４６ｃｍ、長さ３０ｃｍの充填用パッカーと、出口部の部品が取り付けられた円筒状部品とを接続した。出口部の部品および円筒状部品としては、ステンレスからなるものを用いた。また、円筒状部品としては、一定の断面積で長さ方向に延在する内壁面の長さが２．０ｃｍであり、内径が０．４６ｃｍであるものを用いた。【００９２】
その後、充填用パッカーにスラリーを投入し、充填用パッカーにポンプ（Ａｌｌｉａｎｃｅ２６９５、Ｗａｔｅｒｓ社製）を接続した。そして、ポンプを用いて、押し液としての水を、８分間、最大送液速度３．０ｍｌ／ｍｉｎで送液した。押し液の液送は、液送開始から、送液圧力が最大液送圧力である３０ＭＰａ（充填部の長さ１ｃｍ当たり１５ＭＰａ）になるまで、液送圧力を上昇させながら行った。そして、液送圧力が最大液送圧力に到達した時点から、液送終了まで、最大液送圧力で押し液を液送した。このことにより、円筒状部品内に充填剤を充填し、長さ２．０ｃｍの充填部を形成した。【００９３】
円筒状部品内への充填剤の充填が終了した後、ポンプによる送液圧力が低下するのを待って、充填用パッカーから出口部の部品が取り付けられた円筒状部品を外した。そして、円筒状部品の入り口側に入り口部の部品を固定して密閉した。
以上の工程により、実施例１のガードカラムを得た。【００９４】
次に、実施例１のガードカラムについて、以下に示す方法により、ガードカラムの線流速２．１ｃｍ／分で、水溶媒を送液した時の、圧力差を測定した。
具体的には、圧力センサーを有するポンプ（Ａｌｌｉａｎｃｅ２６９５、Ｗａｔｅｒｓ社製）と、実施例１のガードカラムと、分析カラム（商品名；ＬＷ−４０３  ４Ｄ、昭和電工株式会社製）と、光散乱検出器（ＤＡＷＮ８＋、Ｗｙａｔｔ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）とを、配管を用いて、上流側から、この順に接続した。そして、ポンプを用いて、実施例１のガードカラムの円筒状部品内に、５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．７，０．３ＭのＮａＣｌを含む。）からなる水溶媒を、線流速２．１ｃｍ／分で送液した。この時の水溶媒の送液圧力を、ポンプの有する圧力センサーにより測定した。圧力は２０．５ＭＰａであった。【００９５】
次に、実施例１のガードカラムのみを取り外し、実施例１のガードカラムに代えて、空カラムを、これの内部に５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．７，０．３ＭのＮａＣｌを含む。）からなる水溶媒を満たしてから、接続した。そして、ポンプを用いて、空カラムに水溶媒を、線流速２．１ｃｍ／分で送液した。この時の水溶媒の送液圧力を、ポンプの有する圧力センサーにより測定した。圧力は、１４．７ＭＰａであった。
その後、このようにして得られた二つの圧力の差を算出した。その結果、実施例１のガードカラムの水溶媒を線流速２．１ｃｍ／分で送液した時の圧力差は、５．８ＭＰａであった。【００９６】
［インジェクションノイズの確認］
ポンプ（Ａｌｌｉａｎｃｅ２６９５、Ｗａｔｅｒｓ社製）に、インジェクターと、実施例１のガードカラムと、分析カラムと、光散乱検出器（ＤＡＷＮ８＋、Ｗｙａｔｔ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）とを、上流側から、この順に接続した。分析カラム（サイズ排除クロマトグラフィー用カラム）としては、充填部の長さが１５ｃｍ、ハウジングの内径が０．４６ｃｍであり、表面が親水化された多孔質シリカゲルからなる平均粒子径１．９μｍの充填剤が充填されたもの（商品名；ＬＷ−４０３  ４Ｄ、昭和電工株式会社製）を用いた。
そして、インジェクターと、実施例１のガードカラムと、分析カラムを、３０℃に設定したカラムオーブン（Ｗａｔｅｒｓ社製）内に設置した。【００９７】
その後、ポンプを用いて、実施例１のガードカラムに、溶離液である５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．７，０．３ＭのＮａＣｌを含む。）を、約６０分間、送液速度０．３５ｍｌ／分で流し、得られたクロマトグラムのベースラインが安定したことを確認した。
続いて、インジェクターを用いて、実施例１のガードカラムに、試料であるＢＳＡ（牛血清アルブミン、ＳＩＧＭＡ  ＡＬＤＲＩＣＨ社製）２．４ｍｇ／ｍｌを、５μｌ注入した。そして、光散乱検出器における９０度における信号（９０度方向の散乱光の強度）から、実施例１のクロマトグラムを得た。【００９８】
（実施例２）
押し液の送液終了時の送液圧力を４０ＭＰａ（充填部の長さ１ｃｍ当たり２０ＭＰａ）としたこと以外は、実施例１と同様にして、長さ２．０ｃｍの充填部を形成し、実施例２のガードカラムを得た。実施例２のガードカラムについて、実施例１と同様にして、水溶媒を線流速２．１ｃｍ／分で送液した時の圧力差を測定した結果、１０．４ＭＰａであった。
そして、実施例２のガードカラムを用いたこと以外は、実施例１と同様にして実施例２の液体クロマトグラフを作成し、高分子化合物（ＢＳＡ）の分析を行った。得られたクロマトグラムを図２に示す。【００９９】
（実施例３）
内壁面の長さが１．０ｃｍである円筒状部品を用いて、多孔質シリカゲルの量を０．１ｇにして、長さ１．０ｃｍの充填部を形成したこと以外は、実施例１と同様にして、ガードユニットとして用いるガードカラムを、２本製造した。なお、押し液の送液終了時の送液圧力は、実施例１と同じく３０ＭＰａであるが、実施例１とは充填部の長さが異なるため、充填部の長さ１ｃｍ当たりの充填圧は、実施例１と異なり３０ＭＰａである。【０１００】
２本のガードユニットとして用いるガードカラムを、配管を介して直列に連結し、実施例３のガードカラムとした。実施例３のガードカラムについて、実施例１と同様にして、水溶媒を線流速２．１ｃｍ／分で送液した時の圧力差を測定した。その結果、圧力差は、１０．０ＭＰａであった。
そして、実施例３のガードカラムを用いたこと以外は、実施例１と同様にして実施例３の液体クロマトグラフを作成し、高分子化合物（ＢＳＡ）の分析を行った。得られたクロマトグラムを図３に示す。【０１０１】
（比較例１）
ガードカラムを取り除いたこと以外は、実施例１と同様にして高分子化合物（ＢＳＡ）の分析を行った。得られたクロマトグラムを図４に示す。
分析カラムの線流速２．１ｃｍ／分で水溶媒を送液した時の圧力差は、実施例１のガードカラムの圧力差の測定方法に準じて算出した。すなわち、ポンプと分析カラムとを接続し、分析カラムに線流速２．１ｃｍ／分で水溶媒を送液した時の圧力と、分析カラムから充填剤を取り除いた空カラムを、分析カラムに代えて接続し、この空カラムに線流速２．１ｃｍ／分で水溶媒を送液した時の圧力とを測定した。そして得られた値から、その圧力差を算出することにより求めた。
水溶媒としては、５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ６．７，０．３ＭのＮａＣｌを含む。）を用いた。その結果、分析カラムの線流速２．１ｃｍ／分で水溶媒を送液した時の圧力差は、１４ＭＰａであった。【０１０２】
（比較例２）
押し液の送液終了時の送液圧力を２０ＭＰａ（充填部の長さ１ｃｍ当たり１０ＭＰａ）としたこと以外は、実施例１と同様にして、長さ２．０ｃｍの充填部を形成し、比較例２のガードカラムを得た。比較例２のガードカラムについて、実施例１と同様にして、水溶媒を線流速２．１ｃｍ／分で送液し、圧力を測定した。さらに圧力差を測定した結果、３．４ＭＰａであった。
そして、比較例２のガードカラムを用いたこと以外は、実施例１と同様にして比較例２の液体クロマトグラフを作成し、高分子化合物（ＢＳＡ）の分析を行った。得られたクロマトグラムを図５に示す。【０１０３】
（比較例３）
内壁面の長さが１．０ｃｍである円筒状部品を用いて、実施例１と同様の多孔質シリカゲル０．１ｇを使用し、長さ１．０ｃｍの充填部を形成した。このこと以外は、実施例１と同様にして、比較例３のガードカラムを製造した。なお、押し液の送液終了時の送液圧力は、実施例１と同じく３０ＭＰａであるが、実施例１とは充填部の長さが異なる。このため、充填部の長さ１ｃｍ当たりの充填圧は、実施例１と異なり３０ＭＰａである。比較例３のガードカラムについて、実施例１と同様にして、水溶媒を線流速２．１ｃｍ／分で送液した時の圧力差を測定した結果、４．５ＭＰａであった。
そして、比較例３のガードカラムを用いたこと以外は、実施例１と同様にして比較例３の液体クロマトグラフを作成し、高分子化合物（ＢＳＡ）の分析を行った。得られたクロマトグラムを図６に示す。【０１０４】
（比較例４）
球形の多孔質シリカゲル基材として、Ｍ．Ｓ．ＧＥＬ  ＥＰ−ＤＦ−３−２５０Ａ（商品名、ＡＧＣエスアイテック社製）を用いたこと以外は、実施例１と同様にして、表面が親水化された多孔質シリカゲルを得た。
得られた表面が親水化された多孔質シリカゲルは球状であり、平均粒子径が３．０μｍ、平均細孔径は２８ｎｍ、比表面積が１３５ｍ２／ｇであった。【０１０５】
このようにして得た表面が親水化された多孔質シリカゲルを用いたこと以外は、実施例１と同様にして、長さ２．０ｃｍの充填部を形成し、比較例４のガードカラムを得た。比較例４のガードカラムについて、実施例１と同様にして、水溶媒を線流速２．１ｃｍ／分で送液した時の圧力差を測定した。その結果、圧力差は、１．４ＭＰａであった。
そして、比較例４のガードカラムを用いたこと以外は、実施例１と同様にして比較例４の液体クロマトグラフを作成し、高分子化合物（ＢＳＡ）の分析を行った。得られたクロマトグラムを図７に示す。【０１０６】
表１に、実施例１〜３、比較例１〜４の、ガードカラムの有する表面が親水化された多孔質シリカゲルの平均粒子径と、充填部の長さと、充填時の充填剤の充填圧（押し液の送液終了時の送液圧力）と、充填部の長さ１ｃｍ当たりの充填圧と、水溶媒を線流速２．１ｃｍ／分で送液した時の圧力差とを、合わせて示す。【０１０７】
【表１】
2020121706.tif 000002
【０１０８】
図１〜図７は、実施例１〜３、比較例１〜４の液体クロマトグラフを用いて高分子化合物（ＢＳＡ：牛血清アルブミン）を分析した結果を示したクロマトグラムである。図１〜図７に示したグラフにおいて、縦軸は信号強度（ｍｖ）であり、横軸は保持時間（ｍｉｎ）である。
図１〜図３に示すように、実施例１〜３では、保持時間５．３ｍｉｎ付近に試料であるＢＳＡに対応するピークが得られた。【０１０９】
これに対し、図４に示すように、比較例１では、試料であるＢＳＡに対応するピークが得られているものの、ＢＳＡに対応するピークを観測しにくくする大きなインジェクションノイズが発生した。
図１に示す実施例１では、図４に示す比較例１と比較して、インジェクションノイズが抑制されている。このことから、分析カラムの上流側に実施例１のガードカラムを接続することにより、インジェクションノイズを低減できることが分かる。【０１１０】
また、図５〜７に示すように、比較例２〜４では、保持時間５．２ｍｉｎ付近に試料であるＢＳＡに対応するピークが得られている。しかしながら、比較例２〜４では、いずれもＢＳＡに対応するピークを観測しにくくする大きなインジェクションノイズが発生した。【０１１１】
比較例２では、ガードカラムの水溶媒を線流速２．１ｃｍ／分で送液した時の圧力差が小さい。このため、図５に示すように、インジェクションショックの原因となる物質が、ガードカラムによって十分に低減されなかったためである、と推定される。
また、比較例３では、充填部の長さが不足しているガードカラムを用いたため、図６に示すように、インジェクションショックの原因となる物質が、ガードカラムによって十分に低減されなかったためであると推定される。
また、比較例４では、表面が親水化された多孔質シリカゲルの平均粒子径が大きすぎるため、水溶媒を線流速２．１ｃｍ／分で送液した時の圧力差が小さいガードカラムとなり、図７に示すように、インジェクションショックの原因となる物質が、ガードカラムによって十分に低減されなかったためであると推定される。【０１１２】
また、実施例１〜３、比較例１〜４のクロマトグラムにおけるインジェクションノイズの影響を比較するために、インジェクションノイズをピークとみなし、以下に示す方法により算出したノイズレベルを用いて評価した。その結果を表１に示す。【０１１３】
「ノイズレベル評価方法」
図８は、ノイズレベルの計算方法を説明するためのクロマトグラムである。図８には、インジェクションノイズのピーク面積（Ａ）とＢＳＡのピーク面積（Ｂ）が示されている。それぞれのピーク面積は、次のようにして求められる。
まず、インジェクションノイズが現れた保持時間範囲内（図８に示す例では、測定開始から１０分後まで）に観測された全てのピークの合計面積を求める。次に、ＢＳＡに由来するピークを、インジェクションノイズの上に乗った部分のピーク面積（Ｂ）として求める。面積（Ｂ）は、ＢＳＡに由来するピークを谷渡り処理することによりインジェクションノイズのピークと分割された面積であり、図８において符号Ｌで表す線までのピーク面積である。その後、保持時間範囲内に観測された全てのピークの合計面積から面積（Ｂ）を引いた面積を、インジェクションノイズのピーク面積（Ａ）として求める。
これらの値を用いて、ノイズレベルとして、下記式に示すように、インジェクションノイズのピーク面積（Ａ）を面積（Ｂ）で除した値を計算した。ノイズレベルの数値が小さいほど、インジェクションノイズの影響が少ないと評価できる。
ノイズレベル＝（Ａ）／（Ｂ）【０１１４】
表１に示すように、実施例１〜３におけるノイズレベルは１．２以下であり、比較例１〜４のノイズレベルと比較して十分に小さいものであった。
【産業上の利用可能性】
【０１１５】
本発明は、多孔質シリカゲルを含む充填剤を用いたカラムと、光散乱検出器とを用いるサイズ排除クロマトグラフィーに用いられ、インジェクションノイズを抑制できるガードカラムおよびガードカラムの製造方法を提供することができる。
【図１】
2020121706.tif 000003
【図２】
2020121706.tif 000004
【図３】
2020121706.tif 000005
【図４】
2020121706.tif 000006
【図５】
2020121706.tif 000007
【図６】
2020121706.tif 000008
【図７】
2020121706.tif 000009
【図８】
2020121706.tif 000010
【国際調査報告】
2020121706.tif 000011
2020121706.tif 000012
2020121706.tif 000013
2020121706.tif 000014
2020121706.tif 000015
2020121706.tif 000016