【誤訳訂正書】
【提出日】平成21年9月28日(2009.9.28)
【誤訳訂正１】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】０００１
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【０００１】
本発明は、光増感剤を使用して分子類を細胞内に導入し、光増感剤を活性化するのに有効な波長の光で細胞を照射する方法に関する。この場合、導入される該分子は、ウィルスの担体、とりわけアデノウィルスの担体に付随している。本発明はさらに遺伝子治療におけるこの方法の使用に関する。
【誤訳訂正２】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００１６
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００１６】
したがって本発明は、分子を細胞内に導入する方法を提供し、該方法は、該細胞と光増感剤とを接触させること、該細胞を導入される（ウィルスの担体と付随した）分子と接触させること、ならびに光増感剤を活性化させるために有効な波長の光で該細胞を照射することを含んでいる。
【誤訳訂正３】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００１９
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００１９】
本明細書で使用される「内在化」は、ウィルス担体に結合したまま、または結合していなくとも、細胞 (ときに本明細書では、「移送分子」ともいう)内に導入される分子の細胞質への送達をいう。本ケースでは、かくして「内在化（internalisation）」は、必要に応じそのウィルスの担体の全部または一部に付随して、細胞内の/膜結合コンパートメントから細胞質への導入される分子の放出ならびにその後の核への移送の段階も含むものである。本発明の方法に従っていったん内在化すると、その分子は、細胞内に導入されたと見なされる。
【誤訳訂正４】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００２１
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００２１】
本明細書で使用する「細胞の取り込み」または「転位（translocation）」とは、内在化の諸段階の一つであり、細胞膜の外側の分子または実体は、細胞内に取り込まれ、その結果外側に位置する細胞膜に対して内側に見いだされることをいう。具体的には「エンドサイトーシス」または他の適当な取り込み機構により、例えば細胞内の膜で仕切られたコンパートメント、例えば小胞体、ゴルジ体、リソゾーム、エンドソームなどの内部に、あるいは付随して見出されることである。
【誤訳訂正５】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００２２
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００２２】
細胞内に導入される適当な「分子」には、ウィルスの担体、ウィルスのベクターまたはウィルス粒子と付随することができる任意のものであり、これらは本明細書でときに「移送分子(transfer molecule)」と言及される。
【誤訳訂正６】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００２４
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００２４】
本明細書で使用する「と付随する」とは、何らかの方法で ウィルスの 担体、ウィルスのベクターまたはウィルス粒子に取り込まれるか、または結びつけられる分子に言及するものであり、具体的には該ウィルス分子のゲノム内に取り込まれているか、または該ゲノムとは離れているが該ウィルス粒子内に担持されている。一般には細胞内に導入される分子は、包みにされるかウィルス粒子内に取り込まれる。すなわち、カプセルにされるか、ウィルスの外被（coat）またはカプシド内に取りまれる。好ましくは 移送される分子は、ポリヌクレオチドであり、好ましくはウィルス由来のあるエレメントを含むウィルスの構築物内に挿入される。そのエレメントはウィルス担体の内部に、該構築物が包み込まれることを可能とするのに必要である。移送される分子は、例えばウィルス担体のゲノムにあるクローニング部位にクローンされてもよい。あるいは、これらの特徴に寄与する2またはそれ以上の別々の分子が、下記のように使用されてもよい。このようなウィルス粒子が選択された結果、該粒子は自発的に該細胞に感染することができてもできなくてもよい。もし該粒子が自発的に細胞に感染することができるのであれば、いったん細胞内に内在化されたなら、該ウィルス粒子は選ばれた結果、該粒子は該細胞から分泌される新規ウィルス一括を複製し、かつ組み立てるために、内因性の細胞装置を利用することができてもできなくてもよい。しかしながら、一般的には遺伝子治療または他のインビボ応用に用いられる場合、安全上の理由から、ウィルス ベクターは通常、不能化される結果、それらは宿主細胞に感染できるが、新しいビリオン（virion）を複製、組み立てることはできない。また新しい細胞に感染し、つまり複製を無能（incompetent）とすることはできない。そうした不能化は、任意の適当な手段で行うことができる。しかし、簡便にはウィルスの複製に必要なウィルス遺伝子のある部分の欠損によるか、所望にによっては、本来の場所に移送されるべき治療の遺伝子を挿入することにより行うことができる。しかしながら、本願に記載された技術はまた複製能力のある（replication-competent）、または複製が制限された（replication-restricted）ウィルス、例えばONYX-15(Khuri F.R.ら,(2000),Nature Med.6,879-885)または単純疱疹ウィルス、Wildnerとその共同研究者により記載されたチミジンキナーゼをコードする複製制限アデノウィルス(Wildner O.ら,(1999)Gene Ther.6,57-62;Wildner O.ら,(1999),Cancer Res.59,410-413)、あるいは例えば、D. Klatzmanにより記載された複製するレトロウィルス(口頭発表および要旨、欧州遺伝子治療学会、第8回大会、Stockholm 7-10 October 2000)などを用いて利用することができる。
【誤訳訂正７】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００２７
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００２７】
移動する分子が付随する「ウィルスの担体」分子は、任意のウィルスの系であり得る。ただし、その系のウィルスの担体が、細胞内に導入される分子と付随するか、それを取り込むかまたはカプセル化ができるものであれば、である。よって、一般に移動する分子は、ウィルスの粒子内またはウィルス・カプシド内に包み込まれ、ならびに「ウィルスの粒子」、「ウィルス・カプシド」および「ウィルスのベクター」といった用語もまた本明細書では「ウィルスの 担体」を意味するように使用される。本明細書で使用されるこれらの用語は、ウィルスを基にしたプラスミドまたはDNAを含まないが、そうしたプラスミドはウィルス性担体を創出するために使用されてもよい。
【誤訳訂正８】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００２８
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００２８】
本発明で使用される適当なウィルス系の例として、アデノウィルス（adenoviruses）およびアデノ随伴ウィルス（adeno-associated viruses）、レトロウィルス（retroviruses）、レンチウィルス（lentiviruses）、ヘルペスウィルス（Herpes viruses）、バクテリオファージ、インフルエンザウィルス、センダイウィルス、ワクシニア（Vaccinia）ウィルスおよびバキュロウィルス（Baculovirus）が挙げられ、好ましくはアデノウィルス、アデノ随伴ウィルス、レトロウィルス、レンチウィルス、バクテリオファージである。アデノウィルスは、本発明の方法における使用に好ましいウィルスの系である。
【誤訳訂正９】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００３１
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００３１】
したがって言及すべき適切な光増感剤の種類は、ポルフィリン、ソラーレン（psoralens）、フタロシアニン、プルプリン、クロリン、ベンゾポルフィリン、ナフタロシアニン、陽イオン性色素、テトラサイクリンおよびリソソーム向性の弱塩基またはそれらの誘導体またはそれらの前駆体を含むものである（Bergら、J.Photochemistry and Photobiology,1997,65,403-409）。他の適当な光増感剤として、テキサフィリン（texaphyrins）、フェオフォルビド（pheophorbides）、ポルフィセン（porphycenes）、バクテリオクロリン（bacteriochlorins）、ケトクロリン（ketochlorins）、ヘマトポルフィリン（hematoporphyrin）誘導体、およびそれらの誘導体、５−アミノレブリン酸およびその誘導体により誘導される内因性増感剤、光増感剤間の二量体または共役体などが挙げられる。
【誤訳訂正１０】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００３２
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００３２】
上記光増感剤は他の何らかの高分子と共役していない、つまり遊離の形態にあることが好ましい。特に好ましくは、光増感剤は、ウィルス担体とは区別され、すなわち別個の実体物である。しかしながら光増感剤はあるいは後述する担体または他の分子に付随しているか、結合しているかまたは共役（複合化）しているものでもよく、例えばターゲティング 抗体に結合しているか、またはポリリジンといった担体に共役していてもよい。あるいはある状況においては、光増感剤は、直接的にウィルスの担体またその一部（例えばレトロウィルスの包囲脂質膜）に結合しているか、付随しているかまたは共役しているものでもよい。
【誤訳訂正１１】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００４６
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００４６】
光増感剤は、適当な濃度で適切な長さの時間をかけて、該細胞と接触させる。それら条件は、いつもの技術を用いて当業者により容易に決定されるが、使用する光増感剤および細胞の型に依存するであろう。光増感剤の濃度は、一旦細胞内に取り込まれると（例えばその細胞内コンパートメントの１つ以上の中へ、またはそれと付随する）、照射により活性化され、１以上の細胞構造は破壊され、具体的には１以上の細胞内コンパートメントが溶解され、または破壊されるような濃度でなければならない。
【誤訳訂正１２】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００５０
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００５０】
移送分子は、上記の任意の核酸分子であり得るが、適当な濃度/投与量しかも適当な長さの時間で、ウィルスの担体に付随した細胞と接触させられる。ウィルスの担体の適当な濃度は、問題とする担体の問題の細胞内への取り込み効率ならびに細胞においてあるべき最終濃度に依存して、決定され得る。ウィルスの担体に関連してPCI使用の驚くべき利点の一つは、同じトランスフェクション効率を得るのにウィルス粒子の低い用量を用い得ることである。例えば20倍まで少ないウィルス粒子である。使用されるウィルス担体の適切な用量は、もちろん用いるウィルスのタイプ、さらにインビボでの適用のために投与様式、治療される疾患の種類またはターゲティング・リガンドを使用するか否か（下記を参照）などにも依存するであろう。典型的には非複製性アデノウィルスのベクターの腫瘍内注射に対し、一注射あたり103〜1013プラーク形成単位(pfu、伝染性粒子)が注入されるだろう。これは通常、約105〜1015ウィルス物質性粒子に相当する。これは「通常の」ウィルス調製物では、約1%のウィルス物質性粒子しか感染を引き起こさないからである。複製-コンピーテントウィルスについては、上記よりもっと少ない用量でも有効であり、具体的には103粒子より低い、例えば103〜106、1010または1015 粒子で使用されてもよい。他方、全身投与が使用される場合は、その用量を増すことが必要である。
【誤訳訂正１３】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００５５
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００５５】
導入される分子に付随した光増感剤およびウィルスの担体は、光処置/照射に先んじて、別個または一緒に細胞へ加えることができる。これは W096/07432、WO00/54802および本出願に付されて同時係属している出願（The Norwegian Radium Hospital Research Foundationの名において2001年11月29日に出願された国際特許出願、名称「方法」）に記載され、あるいはこの同時係属している出願に記載されているように、光増感剤は最初に細胞に加え、次いで照射工程が続き、その後ウィルスの担体の添加とすることもできる。後者の方法において、好ましくは照射は、移送される分子(ここではウィルスの担体)の細胞への取り込みの前に実施される。とくに好ましくは移送される分子は照射後に、具体的には、照射後、0〜4時間で細胞と接触させられる。あるいは細胞は、照射と実質的に同時刻に移送分子と接触させられる。
【誤訳訂正１４】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００６２
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００６２】
必要に応じ、光増感剤は、１つ以上の担体分子、ターゲティング分子またはターゲティング・ベクターに結合しているか、付随するかまたは共役（複合化）していてもよい。これらの分子等は、光増感剤の取り込みを促進し、または増大するように作用することができ、あるいはこれらの実体を特定の細胞タイプ、組織または細胞内コンパートメントに向けるか送達するように作用することができる。担体系の例としてポリリジン(例えばポリ-L-リジンまたはポリ-D-リジン)、ポリエチレンイミンまたはデンドリマー（dendrimers）(例えばカチオン性デンドリマーSuperFect（R）または他のポリカチオン、硫酸デキストラン（dextran sulphate）、またはリポフェクション（lipofection）、DOTAPといった別種カチオン脂質またはDOPEといった「ヘルパー脂質」で編成したカチオン性脂質、リポソーム、再構成したLDL-粒子、立体的に安定化したリポソーム、または例えばアデノウィルス、レンチウィルスおよび他のレトロウィルス、アデノ随伴（adeno associated）ウィルス、バクテリオファージなどといったウィルス系に由来する異なる粒子が挙げられる。これらの担体系は一般に光増感剤の薬剤動態（pharmacokinetics）を改善し、該剤の細胞取り込みを増大させ、ならびに光化学的内在化を達成するのにとりわけ有益である細胞内コンパートメントに光増感剤を向けるようにすることができる。しかしその担体系は、通常、特定細胞(例えばガン細胞)または組織に狙って光増感剤を集中させる能力は有しない。
【誤訳訂正１５】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００６３
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００６３】
ウィルスの 担体は1以上の担体分子、ターゲティング分子またはターゲティング・ベクターに結合したり、付随したりまたは共役してもよい。あるいはウィルスの担体粒子表面の修飾のあるものは、本発明の使用にとり有益であり得る。
【誤訳訂正１６】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００６５
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００６５】
好ましくは、ウィルスの担体は、担体分子、好ましくはポリカチオン(例えばポリリジンまたはSuperFect（R）)またはカチオン性脂質を含む担体に結合したり、付随したりまたは共役している。
【誤訳訂正１７】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００６７
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００６７】
ウィルスの担体分子(したがって、また移送分子)および/または光増感剤の、特定の細胞タイプまたは組織への特異的または選択的なターゲティングを達成するには、移送分子の所望する細胞または組織中への特定の細胞取り込みを助長するような特定ターゲティング分子に、これらのものが付随するか、または共役することができる。そのようなターゲティング分子は、移送分子および/または光増感剤を、光化学的内在化を達成するのにとりわけ有益である細胞内コンパートメントに差し向けることもできる。
【誤訳訂正１８】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００７０
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００７０】
ターゲティング分子は、ウィルスの 担体に、光増感剤にまたは両方に付随し、結合しまたは共役してもよく、ならびに同一または異なる担体またはターゲティング分子を使用してもよい。
【誤訳訂正１９】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００７２
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００７２】
細胞内コンパートメントから移送粒子を放出する照射段階が起こるならば、移送分子は細胞の細胞質内においてウィルスの担体と付随して当初はとどまると考えられている。移送粒子が細胞の細胞質中に内在化されると、生起する事象は選ばれたウィルスの担体系に依存するであろう。例えば、アデノウィルスの場合、アデノウィルス粒子(移送分子と付随している)は、通常は核のほうへ遊走するが、その後ウィルスのDNA(ならびにこれより「核酸」移送分子)は、細胞の核内に移行する。いずれにせよ、光化学的内在化およびおそらくウィルスの担体に依存する後続の事象の後に、「核酸」移送分子がウィルス粒子または担体中に取り込まれると、該核酸分子は細胞内の正しい場所に存在するはずであり、よって適切な細胞内プロセッシングが生起し、導入された移送分子がその望みの機能を遂行できるようになる。例えば、移送分子が、望みのタン白質をコードするのであれば、このタン白質の発現に至るプロセッシング段階が求められる。もし移送分子がアンチセンスRNA分子をコードするDNA分子であるならば、DNAからRNAの転写に至るプロセッシング段階が求められ得るなどである。
【誤訳訂正２０】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００７７
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００７７】
ウィルスの担体に付随して移送分子を内在化させるPCI法に関係した有利な点として、
1)移送する分子が、ウィルスの担体に取りこまれ、該担体が標的細胞により取りこまれ得るかぎり、細胞内に導入される分子のサイズに制限を付さない。
2)該方法は、光に曝される部分のみが影響を受ける意味において部位特異的である。
3)ウィルスの担体の内在化は、移送分子が導入される細胞の比率、および/または移送分子の発現レベルに関して、標準的なウィルス感染よりもさらに効率的である。
4)増加した内在化効率のためにウィルスのより低い用量および力価が要求される;
5）腫瘍形成性ではない。
【誤訳訂正２１】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００８９
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００８９】
上述のように本発明で使用される適切なウィルス系は、アデノウィルスおよびアデノ随伴ウィルス、レトロウィルス、レンチウィルス、ヘルペスウィルス、センダイウィルス、バクテリオファージ、ワクシニアウィルスおよびバキュロウィルスである。レトロウィルスは、染色体DNA中に組み入れることができるという有利な特質を有するが、活発に分裂している細胞だけに感染する。組み入れられたDNAは安定的に伝播し、疾患の永久治癒の可能性を提供する。活発に分裂している細胞だけに感染するという特質は、多くの疾患の治療には不利ではあるけれども、通常は非分裂細胞をも有する組織のガンに対する遺伝子治療には有益である。これは、正常組織の分裂していない細胞には大してリスクがなく、活発に分裂しているガン細胞が選択的に感染し、殺傷されるためである。
【誤訳訂正２２】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００９０
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００９０】
アデノ随伴ウィルスは、繁殖性の感染、すなわち子孫のビリオンの産生となる感染のためには、アデノウィルスまたはHSVといったヘルパーウィルスとの同時感染を要求する。しかしながらヘルパーウィルスがなくてもそのDNAの染色体組み入れは起こる。よって、関心をもたれる応用に依存して適切なタイプのアデノ随伴ウィルス  ベクターを選択することができる。
【誤訳訂正２３】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００９６
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００９６】
前にPCIの応用で論じたように、PCIによるプラスミド/ポリリジン複合体へのトランスフェクション増強効果、ならびにタン白質といった他の分子の送達への増強効果は、エンドサイトーシス小胞の光誘導性崩壊によるものであると信じられている。さらに、理論に拘泥するわけでないが、同様の機構がアデノウィルス介在の遺伝子の形質導入の刺激にも関わっていることは妥当であるようだ。しかしながらプラスミド/ポリリジン複合体およびタン白質といった他の分子とは対照的に、エンドソームからのアデノウィルスの脱出は、効果的な過程であると信じられている。細胞に結合したウィルス粒子の４０％を超えるウィルス粒子が、細胞核に到達することが報告されている(Greber, U.F.ら(1993),Cell 75,477-486;Leopold,P.L.ら(1998),Hum.GeneTher.9,367-378)。したがって、文献に記載されていることからは、PCIは細胞に結合したウィルス粒子全部が核へ移送されることを誘導できるなら、PCIはせいぜいアデノウィルスの遺伝子形質導入の効率を2.5倍上昇させることを予測するであろう。それゆえ、遺伝子形質導入においてPCIにより誘導された増強が20倍を超えて観察されたことは極めて驚くべきことである。この予想外の著しい効果について我々は目下、良い説明を持ち合わせていない。一つの可能性は、PCIを受けたウィルス粒子は、正常の感染におけるウィルスよりも、より高い「本来的な形質導入の効率」を有するかもしれないことである。それは例えばエンドソームからの異なる放出機構によるものである。また正常な感染において、アデノウィルスのエンドソーム放出は、PCIが最高の作用を示す低いMOI(multiplicity of infection)で、低効率であることも考えられる。さらに光化学的処置がウィルス取り込み、核への輸送または導入遺伝子の転写といった他の過程に影響を与えることもあり得る。本発明のさらなる面から、ウィルスの担体および光増感剤に付随した移送分子を含む医薬組成物、好ましくは治療用の医薬組成物が提供される。必要に応じ、上記組成物中の光増感剤もまた、ウィルスの担体分子または他の非ウィルス性の担体分子、例えば上記の分子に付随していてもよい。
【誤訳訂正２４】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００９７
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００９７】
好ましくは、そのウィルスの担体自体も1つ以上の担体分子類(好ましくは、ポリカチオンまたはカチオン性脂質)、ターゲティング分子またはターゲティング・ベクターに付いているか、付随しているかあるいは共役していてもよい。所望により、上記のようにウィルスの担体および光増感剤の一方または両方とも、同一または異なるターゲティング分子に付随していてもよい。本組成物は、好ましくは遺伝子治療に使用されるものである。遺伝子治療用に好ましいウィルスの担体分子は、アデノウィルスまたはそれに由来するウィルスの担体である。遺伝子治療にとりわけ好適である病態、疾患および感染として、ガン性の腫瘍、例えば基底細胞ガン、形成異常または他の新生物、慢性関節リウマチ、関節硬化症（artherosclerosis）、ウィルスおよび他の感染、乾癬（psoriasis）、日光角化症（solar keratosis）、外傷治療、骨折治療、嚢胞性線維症（cystic fibrosis）、ゴーリン（Gorlin）症候群、毛細管拡張性運動失調（ataxia telangiectasia）といった小隆起（warts）および継承される遺伝疾患および代謝異常が挙げられる。
【誤訳訂正２５】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００９９
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００９９】
したがって本発明のさらなる面から、本明細書で治療、好ましくは遺伝子治療に使用する医薬の製造に記載したようにウィルスの 担体および光増感剤に付随した移送分子の使用を提供する。その使用のため、移送分子に付随している光増感剤およびウィルスは、適当な投与回数を選択することにより患者の細胞もしくは組織と一緒にまたは別個に接触させられる。該細胞は光増感剤を活性化するのに有効な波長の光で上記のように照射される。
【誤訳訂正２６】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】０１１０
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【０１１０】
インビボでの使用のための最終組成物において、ウィルスの担体に付随した導入分子は、ウィルス粒子の濃度で1ｘ10-9〜50%、具体的には3ｘ10-6〜50%、例えば0.003〜30%、例えば0.2〜10%(w/w)で使用してもよい。ここでw/wは、最終組成物の重量について、導入分子に加え、ウィルスの 担体の重量のことをいう。もし、1mlの注射液を使用するなら、これはおおよそ105〜1015の物質としてのウィルスの粒子の用量に相当する。インビトロの使用には、1〜1x105 ウィルスの粒子、例えば1ｘ103〜1ｘ105が使用されてもよい。
【誤訳訂正２７】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】０１３２
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【０１３２】
ポリ−L−リジン担体と付随したアデノウィルスを用いる形質導入に与えるPCIの効果
WiDr細胞を成長させ、実施例7に記載したように光増感剤TPPS2a（1μg/ml）とともに培養した。ポリ−L−リジン（PLL、MW20700）をSigmaから入手した。ウィルス調製物中のウィルス粒子の濃度をMitterederら（J.Virol.1996 11:7498-7509）に従って、A260を測定することにより決定した。
以下のアデノウィルス／PLL−複合体を作製した：
5PLL/Ad：ウィルス粒子当り5分子のPLL
500PLL/Ad：ウィルス粒子当り500分子のPLL 
250PLL/Ad：ウィルス粒子当り250分子のPLL
50PLL/Ad：ウィルス粒子当り50分子のPLL
PLL希釈液をウィルス粒子希釈液に添加した。サンプルを、反転または穏やかなピペッ
トチップ吸引により慎重に混合し、30分間室温でインキュベートした。
【誤訳訂正２８】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】０１３３
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【０１３３】
6穴プレート中の培地を除去し、200μlのアデノウィルス溶液またはPLL/Ad溶液を各穴（well）にMOI 5で添加した。細胞を30分間37℃で（光から保護して）インキュベートした。アデノウィルスで感染されていないプレートにはPBS 200μlのみを添加した。溶液200μlを除去し、細胞を培地で1回洗浄した。培地2mlを添加し、細胞を30分間37℃で（光から保護して）インキュベートし、実施例7に記載したように青色光に暴露した。細胞を2日間（まだ光から保護して）培養し、実施例３の「実験手順」に記載したようにフローサイトメトリーによるβ−ガラクトシダーゼ活性の分析をした。
結果
図10は、アデノウィルスが担体ポリ−L−リジン（PLL）と付随している場合にもPCIは作用することを示す。図10からわかるように、PCIのない（すなわち、0分の光線量）感染は、担体としてPLLを用いても用いなくても著しく少ない形質導入（＜5％）を与えた。細胞の光照射がPLLを用いても用いなくても光線量に依存した形質導入の増加を誘導することは明らかである。これは、PCIの効果による。PLLなし（図10の○）で得られた最も高い形質導入効率は37％であったが、PCIとPLLの組み合わせ（図の●）で87％陽性細胞を達成した。この組み合わせは、形質導入された細胞の割合について、同じ条件でPCIのない場合に達成されたものと比較すると、20倍を超える増加を示し、さらに通常の感染（PLLがなく、0分の光照射）と比較すると100倍の増加を示した。よって、PCIは、PLLをコートしたアデノウィルスを用いる形質導入効率を充分に増加させることができ、この組み合わせを用いることによって、コートされていないアデノウィルスとPCIとの組み合わせより、はるかに高い形質導入効率を達成することができる。
【実施例１１】
【誤訳訂正２９】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】０１４２
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【０１４２】
【図１】図1は、光化学的に形質導入されたWiDr細胞のX-gal染色を示す。細胞を、図に示すように、AlPcS2a（S）で処置し、MOI5でAdHCMV-lacZ（Ad）により感染させ、光処理を施した。形質導入されたβ−ガラクトシダーゼ遺伝子を発現させるために2日間培養した後、該細胞をX-galで染色し、記載したように顕微鏡検査により分析した。前記細胞を以下のように処置した。A．未処置、B．アデノウィルスのみ、C．AlPcS2a＋8分間の光照射、D．AlPcS2a＋アデノウィルス＋8分間の光照射。
【図２】図2は、HCT116細胞（図A）およびWiDr細胞（図B）における、光化学的に増強された形質導入のフローサイトメトリー分析を示す。これらの細胞を、記載したようにAlPcS2a（S）で処置し、MOI5でAdHCMV-lacZ（Ad）により感染させ、光処理を施した。2日後、前記細胞はフルオレセイン−ジ−β−D−ガラクトピラノシドと一緒に充填して、フローサイトメトリーで分析した。図2Aは、HCT116細胞のフローサイトメトリー分析におけるドット・プロットを示す。垂直線の右側の細胞は、アデノウィルス形質導入について陽性とみなした。というのは、非処置の細胞についても（一番上の図）、AlPcS2aと光のみを受けた細胞についても（一番下の図）、この領域に実質的に細胞がないからである。各図には種々の処置が示されている。図2Bは、WiDr細胞について、光投与量の関数として形質導入効率を示す。図2A（（□）Ｓ-、Ad+；（▲）Ｓ+、Ad-；（●）Ｓ+、Ad+；）に記載されたように定義されたβ−ガラクトシダーゼ陽性細胞の％ならびに平均蛍光強度（（○）Ｓ+、Ad+）を記した。バーは、2〜5の別個の実験の平均標準誤差（SEM）を示す。
【図３】図3は、種々のウィルス投与量についてWiDr細胞でのPCI増強された形質導入を示す。細胞を、種々のMOIでAdHCMV-lacZにより感染させ、記載したように光化学的処置を施した。図3Aは、全細胞集団の平均蛍光を示す。前記処置は以下の通りである。塗りつぶしなしのバー：AlPcS2aのみ；対角線の網掛け：MOI=1；灰色：MOI=5；平行線の網掛け：MOI=20；黒：MOI=50。誤差バーは３つの実験のSEMである。図3Bは、全細胞集団のβ−ガラクトシダーゼ活性の増加倍数（fold increase）を示す。記号は図3Aと同じである。誤差バーは3または4つの実験の標準誤差を示す。
【図４】図4は、THX細胞のアデノウィルス形質導入に与える光化学処置の効果を示す。
【図５】図5は、AdHCMV-lacZで感染させたTHX細胞におけるβ−ガラクトシダーゼ発現に及ぼす光化学処置の効果を示す。「光照射が前」方策のために、AlPcS2a−予備処置細胞を3分間の露光の前にAlPcS2aフリーの培地中でもう4時間インキュベートした。光照射に続いて、該細胞を（MOI 1で）AdHCMV-lacZにより30分間37℃で感染させた。その後、培地2mlを加えて細胞を2日間培養し、β−ガラクトシダーゼ発現を分析した。「光照射が後」方策のために、AlPcS2a−処置細胞を、30分間のAdHCMV-lacZによる感染の前にAlPcS2aフリーの培地中で3時間インキュベートした。培地2mlを添加した後、細胞を3分間光照射の前にもう30分間インキュベートし、2日後、β−ガラクトシダーゼ発現を分析した。
【図６】図6は、β−ガラクトシダーゼをコードするアデノウィルスを用いるPCI媒介の形質導入の結果としてのβ−ガラクトシダーゼ産生が、光照射時間の増加とともに増加したことを示す。種々の試料についての処置（＋、−は実施、不実施を示す）および光投与量（光照射の長さ）は、図に示す通りである。Adv：アデノウィルスAdHCMV-LacZ。S：光増感剤AlPcS2a。
【図７】図7は異なった多数の感染でのWiDr細胞の形質導入に与えるPCIの効果を示す。□：光照射なし、■：90秒間光照射。
【図８】図8はA549細胞のアデノウィルス形質導入に与えるPCIの効果を示す。種々の試料についての処置（＋、−は実施、不実施を示す）および光投与量（分で）は、図に示す通りである。A：アデノウィルスAdHCMV-LacZ。S：光増感剤AlPcS2a。
【図９】図9はHeLa細胞系列およびFmexIII細胞系列の形質導入に及ぼすPCIの効果を示す。塗りつぶしなしの棒：光照射なし、黒塗りの棒：90秒光照射。
【図１０】図10はポリ−L−リジン担体と付随したアデノウィルスによるWiDr細胞の形質導入に及ぼすPCIの効果を示す。Adv：アデノウィルスAdHCMV-LacZ。PLL：ポリ−L−リジン。5PLL/Adは、複合体がウィルス粒子１個当たり平均して5つのPLL分子を含むことを意味する。○−Ad MOI 5、■−5 PLL/Ad、●−500 PLL/Ad、□−250 PLL/Ad、▲−50 PLL/Ad。
【図１１】図11は、ウィルス用担体としてポリ−L−リジンを用いた、ヒト皮膚繊維芽細胞系列のアデノウィルス形質導入に及ぼす、種々の光照射時間を使用したPCIの効果を示す。□−MOI 5：非複合化アデノウィルスAdHCMV-LacZ。■−MOI 5/PLL：ウィルス粒子１個当たり250分子のPLLと複合させたAdHCMV-LacZ。
【図１２】図12は、ウィルス担体としてポリカチオン性デンドリマーSuperFect(R)を種々の濃度で用いた、アデノウィルス形質導入に及ぼすPCIの効果を示す。塗りつぶしなしの棒：光照射なし、黒塗りの棒：90秒光照射。
【図１３】図13は、光照射およびアデノウィルス投与の異なるタイムスケジュールの効果を示す。Y軸の左側のタイムポイントは、光照射前に添加されたウィルスを表し、右側のタイムポイントは、光照射後のウィルス添加を表す。■−1分間光照射、□−光照射なし。
【図１４】図14は、種々の光照射時間後に単純疱疹ウィルス（Herpes Simplex Virus）チミジンキナーゼをコードする、アデノウィルスベクター遺伝子治療効果のPCI増強を示す。HSV-tkをコードするアデノウィルスベクターを用いる、PCI誘導遺伝子形質導入の後に、細胞殺傷がガンシクロビルにより実施された。Al：AlPcS2a；Adv-TK：HSV-tkをコードするアデノウィルス；GCV：ガンシクロビル。◆：Alのみ；□：Al＋Adv-TK；△：AL＋10μg/ml（A）、25μg/ml（B）または100μg/ml（C）のGCV；■：AL＋AdV-TK＋10μg/ml（A）、25μg/ml（B）、または100μg/ml（C）のGCV。