(57)【要約】本開示は、眼細胞を保存するための組成物および方法を提供する。より特定すると、本開示は、眼細胞の保存または保存後の培養のための組成物であって、アルブミンとジメチルスルフォキシドとを含む組成物、および当該眼細胞とアルブミンとジメチルスルフォキシドとを含む細胞製剤およびこれを用いる治療・予防の方法を提供する。さらに、本開示は、当該組成物中に眼細胞を懸濁させ、懸濁物を提供する工程と、前記懸濁物を凍結する工程とを含む、角膜内皮細胞を保存する方法を提供する。いくつかの実施形態において、眼細胞は角膜細胞（例えば、角膜内皮細胞）である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
眼細胞の保存または保存後の培養のための組成物であって、アルブミンとジメチルスルフォキシドとを含む組成物。
【請求項２】
前記眼細胞が角膜細胞を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記眼細胞が角膜内皮細胞を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
前記眼細胞が単離した細胞または前駆細胞由来の細胞である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項５】
前記アルブミンがウシ由来のものである請求項１〜４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項６】
糖をさらに含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項７】
前記糖が単糖である、請求項６に記載の組成物。
【請求項８】
前記糖がグルコースである、請求項６に記載の組成物。
【請求項９】
リン酸イオンをさらに含む、請求項１〜８のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１０】
金属イオンをさらに含む、請求項１〜９のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１１】
前記金属イオンが２価金属イオンである、請求項１０に記載の組成物。
【請求項１２】
前記金属イオンが、カルシウムイオン、マグネシウムイオン、鉄イオン、亜鉛イオン、銅イオン、アルミニウムイオンおよびこれらの任意の組み合わせからなるからなる群から選択される、請求項１０に記載の組成物。
【請求項１３】
前記組成物が、（ｉ）カルシウムイオンおよびマグネシウム、または（ｉｉ）カルシウム、マグネシウムおよび銅を含む、請求項１０に記載の組成物。
【請求項１４】
前記アルブミンの濃度が約０．０１〜約２５％（ｗ／ｗ）の範囲内である、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１５】
前記アルブミンの濃度が約０．１〜約５％（ｗ／ｗ）の範囲内である、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１６】
前記アルブミンの濃度が約１％（ｗ／ｗ）である、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１７】
前記ジメチルスルフォキシドの濃度が約０．１〜約５０％（ｗ／ｗ）の範囲内である、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１８】
前記ジメチルスルフォキシドの濃度が約１〜約２０％（ｗ／ｗ）の範囲内である、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１９】
前記ジメチルスルフォキシドの濃度が約１０％（ｗ／ｗ）である、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２０】
前記金属イオンの濃度が約０．００００００１〜５％（ｗ／ｗ）の範囲内である、請求項１０〜１９のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２１】
前記金属イオンの濃度が約０．１〜約５％（ｗ／ｗ）の範囲内である、請求項１０〜１９のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２２】
前記組成物が、（ｉ）約０．１％のカルシウムおよびマグネシウム、または（ｉｉ）約０．１〜約５％のカルシウム、マグネシウムおよび銅を含む、請求項１０〜１９のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２３】
前記糖の濃度が約０．１〜約１０％（w/w）の範囲内である、請求項６〜２２のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２４】
前記糖の濃度が約１〜約５％（w/w）の範囲内である、請求項６〜２２のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２５】
前記保存が凍結保存である、請求項１〜２４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２６】
前記組成物はＢａｍｂａｎｋｅｒ（登録商標）である、請求項１〜２５のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２７】
前記組成物が、保存後の角膜内皮細胞を被験体に投与するためのものである、請求項１〜２６のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２８】
前記保存後の角膜内皮細胞は、培養されることなく被験体に投与されることを特徴とする、請求項２７に記載の組成物。
【請求項２９】
前記角膜内皮細胞が、ＲＯＣＫ阻害剤と共に投与されることを特徴とする、請求項２７または２８に記載の組成物。
【請求項３０】
前記ＲＯＣＫ阻害剤が、Ｙ−２７６３２、リパスジル、ファスジル、またはその薬学的に許容され得る塩から選択される、請求項２９に記載の組成物。
【請求項３１】
請求項１〜３０のいずれか一項に記載の組成物中に眼細胞を懸濁させ、懸濁物を提供する工程と、
前記懸濁物を凍結する工程と
を含む、眼細胞を保存する方法。
【請求項３２】
前記眼細胞が、約１×１０３から約１×１０８個／ｍｌとなるように前記組成物中に懸濁されることを特徴とする、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記懸濁物を凍結する工程が、予備凍結無しで凍結することを含む、請求項３１または３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記予備凍結無しで凍結することが、急速に約−８０℃で凍結することを含む、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
請求項３１〜３４のいずれか一項に記載の方法に従って凍結保存された角膜内皮細胞を含む凍結細胞製品。
【請求項３６】
角膜内皮細胞とアルブミンとジメチルスルフォキシドとを含む細胞製剤。
【請求項３７】
凍結状態で提供される、請求項３６に記載の細胞製剤。
【請求項３８】
角膜内皮の疾患、障害または症状を治療又は予防するための、請求項３６または３７に記載の細胞製剤。
【請求項３９】
前記アルブミンがウシ由来のものである請求項３６〜３８のいずれか一項に記載の細胞製剤。
【請求項４０】
糖をさらに含む、請求項３６〜３９のいずれか一項に記載の細胞製剤。
【請求項４１】
前記糖が単糖である、請求項４０に記載の細胞製剤。
【請求項４２】
前記糖がグルコースである、請求項４１に記載の細胞製剤。
【請求項４３】
リン酸イオンをさらに含む、請求項３６〜４２のいずれか一項に記載の細胞製剤。
【請求項４４】
金属イオンをさらに含む、請求項３６〜４３のいずれか一項に記載の細胞製剤。
【請求項４５】
前記金属イオンが２価金属イオンである、請求項４４に記載の細胞製剤。
【請求項４６】
前記金属イオンが、カルシウムイオン、マグネシウムイオン、鉄イオン、亜鉛イオン、銅イオン、アルミニウムイオンおよびこれらの任意の組み合わせからなるからなる群から選択される、請求項４４に記載の細胞製剤。
【請求項４７】
前記細胞製剤が、（ｉ）カルシウムイオンおよびマグネシウムイオン、または（ｉｉ）カルシウムイオン、マグネシウムイオンおよび銅イオンを含む、請求項４４に記載の細胞製剤。
【請求項４８】
前記アルブミンの濃度が約０．０１〜約２５％（ｗ／ｗ）の範囲内である、請求項３６〜４７のいずれか一項に記載の細胞製剤。
【請求項４９】
前記アルブミンの濃度が約０．１〜約５％（ｗ／ｗ）の範囲内である、請求項３６〜４７のいずれか一項に記載の細胞製剤。
【請求項５０】
前記ジメチルスルフォキシドの濃度が約０．１〜約５０％（ｗ／ｗ）の範囲内である、請求項３６〜４８のいずれか一項に記載の細胞製剤。
【請求項５１】
前記ジメチルスルフォキシドの濃度が約１〜約２０％（ｗ／ｗ）の範囲内である、請求項３６〜４８のいずれか一項に記載の細胞製剤。
【請求項５２】
前記金属イオンの濃度が約０．００００００１〜約５％（ｗ／ｗ）の範囲内である、請求項４４〜５１のいずれか一項に記載の細胞製剤。
【請求項５３】
前記金属イオンの濃度が約０．１〜約５％（ｗ／ｗ）の範囲内である、請求項４４〜５１のいずれか一項に記載の細胞製剤。
【請求項５４】
前記細胞製剤が、（ｉ）約０．１％のカルシウムイオンおよびマグネシウムイオン、または（ｉｉ）約０．１〜約５％のカルシウムイオン、マグネシウムイオンおよび銅イオンを含む、請求項４４〜５１のいずれか一項に記載の細胞製剤。
【請求項５５】
前記糖の濃度が約０．１〜約１０％（w/w）の範囲内である、請求項４０〜５４のいずれか一項に記載の細胞製剤。
【請求項５６】
前記糖の濃度が約１〜約５％（w/w）の範囲内である、請求項４０〜５４のいずれか一項に記載の細胞製剤。
【請求項５７】
前記角膜内皮細胞が、約１×１０３から約１×１０８個／ｍｌの濃度である、請求項３６〜５６のいずれか一項に記載の細胞製剤。
【請求項５８】
ＲＯＣＫ阻害剤をさらに含む、請求項３６〜５７のいずれか一項に記載の細胞製剤。
【請求項５９】
前記ＲＯＣＫ阻害剤が、Ｙ−２７６３２、リパスジル、ファスジル、またはその薬学的に許容され得る塩から選択される、請求項５８に記載の細胞製剤。
【請求項６０】
被験体における角膜内皮の疾患、障害または症状を治療又は予防する方法であって、請求項３１〜３４のいずれか一項に記載の方法に従って保存された治療有効量の角膜内皮細胞を該被験体に投与するステップを含む、方法。
【請求項６１】
前記角膜内皮細胞がＲＯＣＫ阻害剤と組み合わせて投与される、請求項６０に記載の方法。
【請求項６２】
前記ＲＯＣＫ阻害剤が、Ｙ−２７６３２、リパスジル、ファスジル、またはその薬学的に許容され得る塩から選択される、請求項６０または６１に記載の方法。
【請求項６３】
角膜内皮細胞を培養するステップを含まない、請求項５６〜５８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６４】
被験体における角膜内皮の疾患、障害または症状を治療又は予防するための角膜内皮細胞であって、該角膜内皮細胞は、請求項３１〜３４のいずれか一項に記載の方法に従って保存された角膜内皮細胞である、角膜内皮細胞。
【請求項６５】
前記角膜内皮細胞がＲＯＣＫ阻害剤と組み合わせて投与されることを特徴とする、請求項６４に記載の角膜内皮細胞。
【請求項６６】
前記ＲＯＣＫ阻害剤が、Ｙ−２７６３２、リパスジル、ファスジル、またはその薬学的に許容され得る塩から選択される、請求項６４または６５に記載の角膜内皮細胞。
【請求項６７】
保存後の角膜内皮細胞がさらに培養されることなく投与されることを特徴とする、請求項６４〜６６のいずれか一項に記載の方法。
被験体における角膜内皮の疾患、障害または症状を治療又は予防するための医薬の製造における角膜内皮細胞の使用であって、該角膜内皮細胞は、請求項３１〜３４のいずれか一項に記載の方法に従って保存された角膜内皮細胞である、使用。
【請求項６８】
前記角膜内皮細胞がＲＯＣＫ阻害剤と組み合わせて投与されることを特徴とする、請求項６８に記載の使用。
【請求項６９】
前記ＲＯＣＫ阻害剤が、Ｙ−２７６３２、リパスジル、ファスジル、またはその薬学的に許容され得る塩から選択される、請求項６８または６９に記載の使用。
【請求項７０】
保存後の角膜内皮細胞がさらに培養されることなく投与されることを特徴とする、請求項６８〜７０のいずれか一項に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本開示は、眼細胞の保存または保存後の培養のための技術に関する。
【背景技術】
【０００２】
視覚情報は、眼球の最前面の透明な組織である角膜から取り入れられた光が、網膜に達して網膜の神経細胞を興奮させ、発生した電気信号が視神経を経由して大脳の視覚野に伝達することで認識される。良好な視力を得るためには、角膜が透明であることが必要である。角膜の透明性は、角膜内皮細胞のポンプ機能とバリア機能により、含水率が一定に保たれることにより保持される。【０００３】
ヒトの角膜内皮細胞は、出生時には１平方ミリメートル当たり約３０００個の密度で存在しているが、再生する能力が限られているために重度な障害をうけると機能を維持できず角膜の透明性が失われる。角膜内皮変性症や種々の原因による角膜内皮の機能不全によって生じる水疱性角膜症では、角膜が浮腫と混濁を生じ、著しい視力低下をきたす。現在、水疱性角膜症に対しては、ドナー角膜を用いた他家角膜移植が行われている。しかしながら、手術侵襲、拒絶反応、ドナー不足など現在の角膜移植には多くの解決課題が存在する。【０００４】
これらの課題を克服するために、近年、角膜内皮疾患に対する治療として、侵襲性の低い細胞移植治療が開発されている（非特許文献１）。角膜内皮細胞の培養は困難であり、通常の方法では増殖しない（非特許文献２および３）、線維芽細胞化する（非特許文献４）、細胞老化する（非特許文献５）などの問題があり、角膜内皮細胞の培養方法はさかんに研究されており、実際に臨床応用が可能となった（非特許文献１）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Kinoshita  S,  Koizumi  N,  Ueno  M,  et  al.  Injection  of  cultured  cells  with  a  ROCK  inhibitor  for  bullous  keratopathy.  N  Engl  J  Med  2018;378:995-1003.
【非特許文献２】Okumura  N,  Ueno  M,  Koizumi  N,  et  al.  Enhancement  on  primate  corneal  endothelial  cell  survival  in  vitro  by  a  ROCK  inhibitor.  Invest  Ophthalmol  Vis  Sci  2009;50:3680-3687.
【非特許文献３】Nakahara  M,  Okumura  N,  Kay  EP,  et  al.  Corneal  endothelial  expansion  promoted  by  human  bone  marrow  mesenchymal  stem  cell-derived  conditioned  medium.  PLoS  One  2013;8:e69009.
【非特許文献４】Okumura  N,  Kay  EP,  Nakahara  M,  Hamuro  J,  Kinoshita  S,  Koizumi  N.  Inhibition  of  TGF-beta  Signaling  Enables  Human  Corneal  Endothelial  Cell  Expansion  In  Vitro  for  Use  in  Regenerative  Medicine.  PLoS  One  2013;8:e58000.
【非特許文献５】Hongo  A,  Okumura  N,  Nakahara  M,  Kay  EP,  Koizumi  N.  The  Effect  of  a  p38  Mitogen-Activated  Protein  Kinase  Inhibitor  on  Cellular  Senescence  of  Cultivated  Human  Corneal  Endothelial  Cells.  Invest  Ophthalmol  Vis  Sci  2017;58:3325-3334.
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、鋭意工夫した結果、長期保存（例えば、凍結保存）に耐え、かつ保存後も細胞生存率および／または細胞密度が維持されるような、安定した眼細胞（例えば、角膜細胞、代表的には角膜内皮細胞）の保存方法を見出すに至った。本発明者らはまた、この保存方法を応用して、眼細胞移植にそのまま使用しうる（Ready-to-use）の細胞製剤およびこれを用いた治療または予防方法を提供するに至った。本開示はまた、実質的にさらなる操作をすることなく、そのまま使用しうる細胞製剤を提供しうる細胞の保存方法およびその方法に使用しうる保存のための組成物および方法を提供する。【０００７】
詳細には、本発明者らは、眼細胞（例えば、角膜細胞、代表的には角膜内皮細胞）を特定の成分、特に保存後に臨床適用において使用しうる成分を使用して保存することで、細胞生存率および／または細胞密度が維持され、保存後の培養において細胞数が顕著に増加することを見出した。驚くべきことに、本明細書で使用した特定の培地を使用して保存した場合、従来、角膜内皮細胞の培養に最も適していると考えられていたＯｐｔｉ−ＭＥＭ（登録商標）−Ｉを基本としてDMSOとFBSを加えた保存液を使用した場合よりも細胞生存率および細胞密度が高かった。また、驚くべきことに、本発明者らは、そのような保存方法で保存された眼細胞を、その後の培養をしない場合でも臨床に使用することができることを見出した。【０００８】
したがって、本願発明は以下を提供する。
（項目１）
眼細胞の保存または保存後の培養のための組成物であって、アルブミンとジメチルスルフォキシドとを含む組成物。
（項目２）
前記眼細胞が角膜細胞を含む、項目１に記載の組成物。
（項目３）
前記眼細胞が角膜内皮細胞を含む、上記項目のいずれか一項に記載の組成物。
（項目４）
前記アルブミンがウシ由来のものである、上記項目のいずれか一項に記載の組成物。
（項目５）
糖をさらに含む、上記項目のいずれか一項に記載の組成物。
（項目６）
前記糖が単糖である、上記項目のいずれか一項に記載の組成物。
（項目７）
前記糖がグルコースである、上記項目のいずれか一項に記載の組成物。
（項目８）
リン酸イオンをさらに含む、上記項目のいずれか一項に記載の組成物。
（項目９）
金属イオンをさらに含む、上記項目のいずれか一項に記載の組成物。
（項目１０）
前記金属イオンが２価金属イオンである、上記項目のいずれか一項に記載の組成物。
（項目１１）
前記金属イオンが、カルシウムイオン、マグネシウムイオン、鉄イオン、亜鉛イオン、銅イオン、アルミニウムイオンおよびこれらの任意の組み合わせからなるからなる群から選択される、上記項目のいずれか一項に記載の組成物。
（項目１２）
前記組成物が、（ｉ）カルシウムイオンおよびマグネシウム、または（ｉｉ）カルシウム、マグネシウムおよび銅を含む、上記項目のいずれか一項に記載の組成物。
（項目１３）
前記精製アルブミンの濃度が０．０１〜２５％（ｗ／ｗ）の範囲内である、上記項目のいずれか一項に記載の組成物。
（項目１４）
前記精製アルブミンの濃度が０．１〜５％（ｗ／ｗ）の範囲内である、上記項目のいずれか一項に記載の組成物。
（項目１５）
前記ジメチルスルフォキシドの濃度が０．１〜５０％（ｗ／ｗ）の範囲内である、上記項目のいずれか一項に記載の組成物。
（項目１６）
前記ジメチルスルフォキシドの濃度が１〜２０％（ｗ／ｗ）の範囲内である、上記項目のいずれか一項に記載の組成物。
（項目１７）
前記金属イオンの濃度が０．００００００１〜５％（ｗ／ｗ）の範囲内である、上記項目のいずれか一項に記載の組成物。
（項目１８）
前記金属イオンの濃度が０．１〜５％（ｗ／ｗ）の範囲内である、上記項目のいずれか一項に記載の組成物。
（項目１９）
前記組成物が、（ｉ）０．１％のカルシウムおよびマグネシウム、または（ｉｉ）０．１〜５％のカルシウム、マグネシウムおよび銅を含む、上記項目のいずれか一項に記載の組成物。
（項目２０）
前記糖の濃度が０．１〜１０％（w/w）の範囲内である、上記項目のいずれか一項に記載の組成物。
（項目２１）
前記糖の濃度が１〜５％（w/w）の範囲内である、上記項目のいずれか一項に記載の組成物。
（項目２２）
前記保存が凍結保存である、上記項目のいずれか一項に記載の組成物。
（項目２３）
前記組成物はＢａｍｂａｎｋｅｒ（登録商標）である、上記項目のいずれか一項に記載の組成物。
（項目２４）
上記項目のいずれか一項に記載の組成物中に眼細胞を懸濁させ、懸濁物を提供する工程と、
前記懸濁物を凍結する工程と
を含む、角膜内皮細胞を保存する方法。
（項目２５）
前記、角膜内皮細胞が、１×１０３から１×１０８個／ｍｌとなるように前記組成物中に懸濁されることを特徴とする、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目２６）
前記懸濁物を凍結する工程が、予備凍結無しで凍結することを含む、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目２７）
前記予備凍結無しで凍結することが、急速に−８０℃で凍結することを含む、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目２８）
上記項目のいずれか一項に記載の方法に従って凍結保存された角膜内皮細胞を含む凍結細胞製品。
（項目１Ａ）
眼細胞の保存または保存後の培養のための組成物であって、アルブミンとジメチルスルフォキシドとを含む組成物。
（項目２Ａ）
前記眼細胞が角膜細胞を含む、上記項目に記載の組成物。
（項目３Ａ）
前記眼細胞が角膜内皮細胞を含む、上記項目のいずれか一項に記載の組成物。
（項目４Ａ）
前記眼細胞が単離した細胞または前駆細胞由来の細胞である、上記項目のいずれか一項に記載の組成物。
（項目５Ａ）
前記アルブミンがウシ由来のものである上記項目のいずれか一項に記載の組成物。
（項目６Ａ）
糖をさらに含む、上記項目のいずれか一項に記載の組成物。
（項目７Ａ）
前記糖が単糖である、上記項目のいずれか一項に記載の組成物。
（項目８Ａ）
前記糖がグルコースである、上記項目のいずれか一項に記載の組成物。
（項目９Ａ）
リン酸イオンをさらに含む、上記項目のいずれか一項に記載の組成物。
（項目１０Ａ）
金属イオンをさらに含む、上記項目のいずれか一項に記載の組成物。
（項目１１Ａ）
前記金属イオンが２価金属イオンである、上記項目のいずれか一項に記載の組成物。
（項目１２Ａ）
前記金属イオンが、カルシウムイオン、マグネシウムイオン、鉄イオン、亜鉛イオン、銅イオン、アルミニウムイオンおよびこれらの任意の組み合わせからなるからなる群から選択される、上記項目のいずれか一項に記載の組成物。
（項目１３Ａ）
前記組成物が、（ｉ）カルシウムイオンおよびマグネシウム、または（ｉｉ）カルシウム、マグネシウムおよび銅を含む、項目１０Ａに記載の組成物。
（項目１４Ａ）
前記アルブミンの濃度が約０．０１〜約２５％（ｗ／ｗ）の範囲内である、上記項目のいずれか一項に記載の組成物。
（項目１５Ａ）
前記アルブミンの濃度が約０．１〜約５％（ｗ／ｗ）の範囲内である、上記項目のいずれか一項に記載の組成物。
（項目１６Ａ）
前記アルブミンの濃度が約１％（ｗ／ｗ）である、上記項目のいずれか一項に記載の組成物。
（項目１７Ａ）
前記ジメチルスルフォキシドの濃度が約０．１〜約５０％（ｗ／ｗ）の範囲内である、上記項目のいずれか一項に記載の組成物。
（項目１８Ａ）
前記ジメチルスルフォキシドの濃度が約１〜約２０％（ｗ／ｗ）の範囲内である、上記項目のいずれか一項に記載の組成物。
（項目１９Ａ）
前記ジメチルスルフォキシドの濃度が約１０％（ｗ／ｗ）である、上記項目のいずれか一項に記載の組成物。
（項目２０Ａ）
前記金属イオンの濃度が約０．００００００１〜５％（ｗ／ｗ）の範囲内である、上記項目のいずれか一項に記載の組成物。
（項目２１Ａ）
前記金属イオンの濃度が約０．１〜約５％（ｗ／ｗ）の範囲内である、項目１０Ａ〜１９Ａのいずれか一項に記載の組成物。
（項目２２Ａ）
前記組成物が、（ｉ）約０．１％のカルシウムおよびマグネシウム、または（ｉｉ）約０．１〜約５％のカルシウム、マグネシウムおよび銅を含む、上記項目のいずれか一項に記載の組成物。
（項目２３Ａ）
前記糖の濃度が約０．１〜約１０％（w/w）の範囲内である、上記項目のいずれか一項に記載の組成物。
（項目２４Ａ）
前記糖の濃度が約１〜約５％（w/w）の範囲内である、上記項目のいずれか一項に記載の組成物。
（項目２５Ａ）
前記保存が凍結保存である、上記項目のいずれか一項に記載の組成物。
（項目２６Ａ）
前記組成物はＢａｍｂａｎｋｅｒ（登録商標）である、上記項目のいずれか一項に記載の組成物。
（項目２７Ａ）
前記組成物が、保存後の角膜内皮細胞を被験体に投与するためのものである、上記項目のいずれか一項に記載の組成物。
（項目２８Ａ）
前記保存後の角膜内皮細胞は、培養されることなく被験体に投与されることを特徴とする、上記項目のいずれか一項に記載の組成物。
（項目２９Ａ）
前記角膜内皮細胞が、ＲＯＣＫ阻害剤と共に投与されることを特徴とする、上記項目のいずれか一項に記載の組成物。
（項目３０Ａ）
前記ＲＯＣＫ阻害剤が、Ｙ−２７６３２（（＋）−トランス−４−（１−アミノエチル）−１−（４−ピリジルカルバモイル）シクロヘキサン）、リパスジル（４−フルオロ−５−｛［（２Ｓ）−２−メチル−１，４−ジアゼパン−１−イル］スルホニル｝イソキノリン）、ファスジル（１−（５−イソキノリンスルホニル）ホモピペラジン）、またはその薬学的に許容され得る塩から選択される、上記項目のいずれか一項に記載の組成物。
（項目３１Ａ）
上記項目のいずれか一項に記載の組成物中に眼細胞を懸濁させ、懸濁物を提供する工程と、
前記懸濁物を凍結する工程と
を含む、眼細胞を保存する方法。
（項目３２Ａ）
前記眼細胞が、約１×１０３から約１×１０８個／ｍｌとなるように前記組成物中に懸濁されることを特徴とする、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目３３Ａ）
前記懸濁物を凍結する工程が、予備凍結無しで凍結することを含む、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目３４Ａ）
前記予備凍結無しで凍結することが、急速に約−８０℃で凍結することを含む、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目３５Ａ）
上記項目のいずれか一項に記載の方法に従って凍結保存された角膜内皮細胞を含む凍結細胞製品。
（項目３６Ａ）
角膜内皮細胞とアルブミンとジメチルスルフォキシドとを含む細胞製剤。
（項目３７Ａ）
凍結状態で提供される、上記項目のいずれか一項に記載の細胞製剤。
（項目３８Ａ）
角膜内皮の疾患、障害または症状を治療又は予防するための、上記項目のいずれか一項に記載の細胞製剤。
（項目３９Ａ）
前記アルブミンがウシ由来のものである上記項目のいずれか一項に記載の細胞製剤。
（項目４０Ａ）
糖をさらに含む、上記項目のいずれか一項に記載の細胞製剤。
（項目４１Ａ）
前記糖が単糖である、上記項目のいずれか一項に記載の細胞製剤。
（項目４２Ａ）
前記糖がグルコースである、上記項目のいずれか一項に記載の細胞製剤。
（項目４３Ａ）
リン酸イオンをさらに含む、上記項目のいずれか一項に記載の細胞製剤。
（項目４４Ａ）
金属イオンをさらに含む、上記項目のいずれか一項に記載の細胞製剤。
（項目４５Ａ）
前記金属イオンが２価金属イオンである、上記項目のいずれか一項に記載の細胞製剤。
（項目４６Ａ）
前記金属イオンが、カルシウムイオン、マグネシウムイオン、鉄イオン、亜鉛イオン、銅イオン、アルミニウムイオンおよびこれらの任意の組み合わせからなるからなる群から選択される、上記項目のいずれか一項に記載の細胞製剤。
（項目４７Ａ）
前記細胞製剤が、（ｉ）カルシウムイオンおよびマグネシウムイオン、または（ｉｉ）カルシウムイオン、マグネシウムイオンおよび銅イオンを含む、上記項目のいずれか一項に記載の細胞製剤。
（項目４８Ａ）
前記アルブミンの濃度が約０．０１〜約２５％（ｗ／ｗ）の範囲内である、上記項目のいずれか一項に記載の細胞製剤。
（項目４９Ａ）
前記アルブミンの濃度が約０．１〜約５％（ｗ／ｗ）の範囲内である、上記項目のいずれか一項に記載の細胞製剤。
（項目５０Ａ）
前記ジメチルスルフォキシドの濃度が約０．１〜約５０％（ｗ／ｗ）の範囲内である、上記項目のいずれか一項に記載の細胞製剤。
（項目５１Ａ）
前記ジメチルスルフォキシドの濃度が約１〜約２０％（ｗ／ｗ）の範囲内である、上記項目のいずれか一項に記載の細胞製剤。
（項目５２Ａ）
前記金属イオンの濃度が約０．００００００１〜約５％（ｗ／ｗ）の範囲内である、上記項目のいずれか一項に記載の細胞製剤。
（項目５３Ａ）
前記金属イオンの濃度が約０．１〜約５％（ｗ／ｗ）の範囲内である、上記項目のいずれか一項に記載の細胞製剤。
（項目５４Ａ）
前記細胞製剤が、（ｉ）約０．１％のカルシウムイオンおよびマグネシウムイオン、または（ｉｉ）約０．１〜約５％のカルシウムイオン、マグネシウムイオンおよび銅イオンを含む、上記項目のいずれか一項に記載の細胞製剤。
（項目５５Ａ）
前記糖の濃度が約０．１〜約１０％（w/w）の範囲内である、上記項目のいずれか一項に記載の細胞製剤。
（項目５６Ａ）
前記糖の濃度が約１〜約５％（w/w）の範囲内である、上記項目のいずれか一項に記載の細胞製剤。
（項目５７Ａ）
前記角膜内皮細胞が、約１×１０３から約１×１０８個／ｍｌの濃度である、上記項目のいずれか一項に記載の細胞製剤。
（項目５８Ａ）
ＲＯＣＫ阻害剤をさらに含む、上記項目のいずれか一項に記載の細胞製剤。
（項目５９Ａ）
前記ＲＯＣＫ阻害剤が、Ｙ−２７６３２、リパスジル、ファスジル、またはその薬学的に許容され得る塩から選択される、上記項目のいずれか一項に記載の細胞製剤。
（項目６０Ａ）
被験体における角膜内皮の疾患、障害または症状を治療又は予防する方法であって、項目３１Ａ〜３４Ａのいずれか一項に記載の方法に従って保存された治療有効量の角膜内皮細胞を該被験体に投与するステップを含む、方法。
（項目６１Ａ）
前記角膜内皮細胞がＲＯＣＫ阻害剤と組み合わせて投与される、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目６２Ａ）
前記ＲＯＣＫ阻害剤が、Ｙ−２７６３２、リパスジル、ファスジル、またはその薬学的に許容され得る塩から選択される、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目６３Ａ）
角膜内皮細胞を培養するステップを含まない、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目６４Ａ）
被験体における角膜内皮の疾患、障害または症状を治療又は予防するための角膜内皮細胞であって、該角膜内皮細胞は、上記項目のいずれか一項に記載の方法に従って保存された角膜内皮細胞である、角膜内皮細胞。
（項目６５Ａ）
前記角膜内皮細胞がＲＯＣＫ阻害剤と組み合わせて投与されることを特徴とする、上記項目のいずれか一項に記載の角膜内皮細胞。
（項目６６Ａ）
前記ＲＯＣＫ阻害剤が、Ｙ−２７６３２、リパスジル、ファスジル、またはその薬学的に許容され得る塩から選択される、上記項目のいずれか一項に記載の角膜内皮細胞。
（項目６７Ａ）
保存後の角膜内皮細胞がさらに培養されることなく投与されることを特徴とする、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
被験体における角膜内皮の疾患、障害または症状を治療又は予防するための医薬の製造における角膜内皮細胞の使用であって、該角膜内皮細胞は、項目３１Ａ〜３４Ａのいずれか一項に記載の方法に従って保存された角膜内皮細胞である、使用。
（項目６９Ａ）
前記角膜内皮細胞がＲＯＣＫ阻害剤と組み合わせて投与されることを特徴とする、上記項目のいずれか一項に記載の使用。
（項目７０Ａ）
前記ＲＯＣＫ阻害剤が、Ｙ−２７６３２、リパスジル、ファスジル、またはその薬学的に許容され得る塩から選択される、上記項目のいずれか一項に記載の使用。
（項目７１Ａ）
保存後の角膜内皮細胞がさらに培養されることなく投与されることを特徴とする、上記項目のいずれか一項に記載の使用。【０００９】
本開示において、上記１または複数の特徴は、明示された組み合わせに加え、さらに組み合わせて提供されうることが意図される。本開示のさらなる実施形態および利点は、必要に応じて以下の詳細な説明を読んで理解すれば、当業者に認識される。
【発明の効果】
【００１０】
本開示によれば、眼細胞（例えば、角膜細胞、代表的には角膜内皮細胞）を高い細胞生存率および細胞密度で保存することができる。また、保存後の培養により、顕著に細胞数が増加する。保存された細胞は、その後の培養をしない場合でも臨床に使用することができる。
本開示ではまた、眼細胞（例えば、角膜細胞、代表的には角膜内皮細胞）を含む製剤を、保存後にそのまま臨床上で使用しうることから、いわゆるReady-to-useの細胞製剤が提供される。再生医療において、臨床現場では、煩雑な作業は極力省略することが好ましいところ、本開示により移植手術の現場における作業効率が画期的に向上する。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】図１は、Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ（登録商標）＋１０％ＤＭＳＯ＋１０％ＦＢＳの使用によるヒト角膜内皮細胞（ＨＣＥＣ）の凍結保存を行った実験結果を示す。（Ａ）図１はＨＣＥＣ凍結保存の時系列スケジュールを示す。ＨＣＥＣを培養プレートから採取し凍結保存試薬に懸濁した。１４日間の凍結保存後、ＨＣＥＣを培養プレート上に播種し培養した。（Ｂ）ＨＣＥＣをＯｐｔｉ−ＭＥＭ（登録商標）＋１０％ＤＭＳＯ＋１０％ＦＢＳに懸濁し、１４日間凍結保存した後に、起眠させ播種して２４時間培養した。位相差顕微鏡写真において、対照として示される事前凍結保存なしで培養されたＨＣＥＣ（左上）と比べ、保存中のＨＣＥＣの細胞死のため、少ない細胞が培養プレート上に付着していることを示す（左下）。ラミニン５１１Ｅ８フラグメントにより培養皿をコーティングすることにより生着するＨＣＥＣの数が増加した。スケールバー：２００μｍ。（Ｃ）非保存ＨＣＥＣおよび凍結保存ＨＣＥＣは、ともに、培養２４時間後のラミニン５１１Ｅ８フラグメントコーティングにより培養後24時間の細胞数が顕著に増加した。しかし、凍結保存されたＨＣＥＣの数は、非保存ＨＣＥＣで取得されたものの約半分であった。実験は３回ずつ実施された（ｎ＝３）。＊＊ｐ＜０．０１、＊ｐ＜０．０５。
【図２】図２は、凍結保存用保存試薬のスクリーニングを示す。（Ａ）ヒト角膜内皮細胞（ＨＣＥＣ）を様々な試薬を使用して１４日間凍結保存した。ＨＣＥＣを培地に再懸濁し、トリパンブルー染色により細胞生存率を算定した。ＨＣＥＣの生存率は、Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ（登録商標）＋１０％ＤＭＳＯ＋１０％ＦＢＳを使用した場合約７５％であった。保存試薬としてのＢａｍｂａｎｋｅｒ  ｈＲＭの使用は、細胞生存率を８９．４％へと顕著に増加させた。実験は３回ずつ実施された。統計的有意性（ｖｓ．  Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ（登録商標）＋１０％ＤＭＳＯ＋１０％ＦＢＳ）は、Ｄｕｎｎｅｔ多重比較試験で算定した（ｎ＝３）。＊＊ｐ＜０．０１。（Ｂ）ＨＣＥＣを凍結保存後２８日間培養した。保存ＨＣＥＣはすべて２８日間にわたって増殖したが、Ｂａｍｂａｎｋｅｒ  ｈＲＭとＢａｍｂａｎｋｅｒにおいて凍結保存された細胞は他の培地で保存されたＨＣＥＣより速く増殖する傾向があった。実験は繰り返しなされた（ｎ＝３）。（Ｃ）凍結保存および２８日の培養後の細胞密度をＩｍａｇＪにより評価した。Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ（登録商標）＋１０％ＤＭＳＯ＋１０％ＦＢＳにおける凍結保存後の細胞密度は、非保存対照の７６．２％に減少した。Ｂａｍｂａｎｋｅｒ  ｈＲＭにおける凍結保存後の細胞密度は９６．６％であり、非保存対照に比べ顕著に高かった。実験は３回ずつ実施された。統計的有意性（ｖｓ．  Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ（登録商標）＋１０％ＤＭＳＯ＋１０％ＦＢＳ）  は、Ｄｕｎｎｅｔ多重比較試験（ｎ＝３）で算定した。＊＊ｐ＜０．０１。
【図３】図３は、凍結保存中の細胞濃度の最適化を示す。（Ａ）合計５×１０５のＨＣＥＣを０．５、１、または１．５ｍｌのＢａｍｂａｎｋｅｒ  ｈＲＭに懸濁し１４日間凍結保存した。凍結ストックから回収された生存ＨＣＥＣはトリパンブルー染色により特定された。生存ＨＣＥＣの割合は、細胞を１．０ｍｌのＢａｍｂａｎｋｅｒ  ｈＲＭにおいて懸濁した際に０．５または１．５ｍｌより顕著に高かった。実験は３回ずつ実施された。統計的有意性（ｖｓ．  １．０ｍｌ）  は、Ｄｕｎｎｅｔ多重比較試験（ｎ＝３）で算定した。＊＊ｐ＜０．０５。（Ｂ）ＨＣＥＣを２８日間培養し、細胞密度をＩｍａｇｅＪで評価した。実験は３回ずつ実施された（ｎ＝３）。（Ｃ）代表的な一日目の位相コントラスト画像においては、０．５および１．５ｍｌのＢａｍｂａｎｋｅｒ  ｈＲＭで保存されたＨＣＥＣにおいて、１．０ｍｌのＢａｍｂａｎｋｅｒ  ｈＲＭで保存されたＨＣＥＣに比べ、多くの死細胞と思われる細胞が確認された。28日後には、０．５、１．０、１．５ｍｌのＢａｍｂａｎｋｅｒ  ｈＲＭで保存されたＨＣＥＣは、同様な細胞密度で、六角形状の単層シート様構造を形成していた。スケールバー：２００μｍ。
【図４】図４は、臨床グレードヒト角膜内皮細胞（ＨＣＥＣ）の保存におけるＢａｍｂａｎｋｅｒ  ｈＲＭの使用の実用性を示す。（Ａ）臨床使用されるものと同グレードである（細胞密度が＞２０００個／ｍｍ２で３代から５代継代培養した）ＨＣＥＣをＢａｍｂａｎｋｅｒ  ｈＲＭを使用して凍結保存した。細胞生存率は１４日の凍結保存後８３．２％であり、非保存対照においては９１．０％であった。実験は繰り返しなされた。（Ｂ）ＨＣＥＣを凍結保存後２８日間培養し、細胞密度をＩｍａｇｅＪで評価した。細胞密度は、非保存対照の細胞と比べ凍結保存により同程度であった（それぞれ２０９９個／ｍｍ２と２１１１個／ｍｍ２）。統計的有意性（ｖｓ．非保存）は、スチューデントのｔ検定で算定した（ｎ＝４）。（Ｃ）位相差顕微鏡画像においては、Ｂａｍｂａｎｋｅｒ  ｈＲＭを使用して保存されたＨＣＥＣが非保存対照と同様に増殖すること示された。スケールバー：２００μｍ。（Ｄ）培養後２８日間培養されたＨＣＥＣは、免疫蛍光染色により機能関連マーカーを評価した。アクチン染色により細胞形態を評価した。Ｂａｍｂａｎｋｅｒ  ｈＲＭを使用して保存されたＨＣＥＣは、非保存対照において確認されたものと同様に、マーカーである機能関連ＺＯ−１、Ｎ−カドヘリンおよびＮａ＋／Ｋ＋−ＡＴＰａｓｅを発現していた。アクチンは保存ＨＣＥＣにおいて、非保存対照で確認された正常角膜内皮パターンを示した。スケールバー：２００μｍ。
【図５Ａ】図５Ａは、実施例４において作製した細胞保存液を使用して凍結保存を行った場合の細胞の位相差顕微鏡像の代表例を示す。比較として、凍結保存を行わなかった細胞、Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ（登録商標）−Ｉ＋１０％  ＤＭＳＯ＋１０％  ＦＢＳを用いて凍結保存を行った場合の細胞、およびＢａｍＢａｎｋｅｒ  ｈＲＭを用いて凍結保存を行った場合の細胞を用いた。
【図５Ｂ】図５Ｂは、実施例４において作製した細胞保存液を使用して凍結保存を行った場合の細胞密度の結果を示す。Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ（登録商標）−Ｉ＋１０％  ＤＭＳＯ＋１０％  ＦＢＳを用いて凍結保存を行った場合の細胞、と比べて作製した細胞保存液はＢａｍＢａｎｋｅｒ  ｈＲＭと同様に、有意に高い細胞密度を維持した。
【図６】図６は、本開示の細胞製剤技術を用いて凍結保存したヒト角膜内皮細胞を用いた培養角膜内皮移植後の組織学的検討結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
以下、本開示を説明する。本明細書の全体にわたり、単数形の表現は、特に言及しない限り、その複数形の概念をも含むことが理解されるべきである。従って、単数形の冠詞（例えば、英語の場合は「ａ」、「ａｎ」、「ｔｈｅ」など）は、特に言及しない限り、その複数形の概念をも含むことが理解されるべきである。また、本明細書において使用される用語は、特に言及しない限り、当該分野で通常用いられる意味で用いられることが理解されるべきである。したがって、他に定義されない限り、本明細書中で使用されるすべての専門用語および科学技術用語は、本開示の属する分野の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。矛盾する場合、本明細書（定義を含めて）が優先する。本明細書において、「約」とは、後に続く値の±１０％を意味する。
【００１３】
（好ましい実施形態）
以下に好ましい実施形態の説明を記載するが、この実施形態は本開示の例示であり、本開示の範囲はそのような好ましい実施形態に限定されないことが理解されるべきである。当業者はまた、以下のような好ましい実施例を参考にして、本開示の範囲内にある改変、変更などを容易に行うことができることが理解されるべきである。これらの実施形態について、当業者は適宜、任意の実施形態を組み合わせ得る。
【００１４】
（組成物）
１つの局面において、本開示は、眼細胞の保存（例えば、凍結保存）または保存（例えば、凍結保存）後の培養のための組成物であって、アルブミンとジメチルスルフォキシドとを含む組成物を提供する。本発明者らは、アルブミンとジメチルスルフォキシドとを含む組成物を用いて眼細胞（例えば、角膜細胞、代表的には、角膜内皮細胞）を保存した場合、従来の保存液を使用した場合と比較して、細胞生存率および／または細胞密度が維持され、保存後の培養においても細胞数が顕著に増加することを見出した。本開示の組成物により保存され得る眼細胞としては、角膜上皮細胞、角膜実質細胞、角膜内皮細胞、線維柱帯細胞、網膜色素上皮細胞、双極細胞、神経節細胞、強膜細胞、水晶体上皮細胞が挙げられるが、好ましくは、角膜上皮細胞、角膜実質細胞および角膜内皮細胞などの角膜細胞であり、最も好ましくは、角膜内皮細胞である。眼細胞は、哺乳動物(ヒト、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、ネコ、イヌ、ウシ、ウマ、ヒツジ、サル等)に由来する細胞であり得るが、霊長類由来が好ましく、特にヒト由来が好ましい。眼細胞は、他の身体部分と比べて、培養維持が困難であり、保存についても、他の細胞とは異なる挙動を示すことが多い。したがって、眼細胞、特に角膜細胞、さらにいえば角膜内皮細胞が効率よく保存し得ることは当業者には不明であった。特に、これらの眼細胞、特に角膜細胞、さらにいえば角膜内皮細胞が、単離され、および／または培養された状態で保存しうるかどうかは不明であり、その後に移植しうる状態で保存しうるかなど何ら不明であった。
【００１５】
いくつかの実施形態において、保存され得る眼細胞は、単離した細胞であっても、前駆細胞（例えば、ＥＳ細胞、ｉＰＳ細胞）由来の細胞であってもよい。単離した細胞や前駆細胞由来の細胞のような眼細胞（特に角膜内皮細胞）は、組織として存在する場合と比べて、その維持が困難である。本開示の保存用組成物により、このような細胞を高い細胞生存率および／または細胞密度で保存することが可能となった。
【００１６】
いくつかの実施形態において、本開示の組成物は、保存の間、細胞を増殖および／または分化させるための栄養因子を実質的に含まない。
【００１７】
いくつかの実施形態において、本開示の組成物は、保存後の眼細胞を被験体に投与するためのものであり得る。本開示の組成物を使用して保存された眼細胞は、必要に応じて培地交換などの簡単な操作のみでさらなる培養をすることなくすぐ投与することができる。より具体的には、当該眼細胞は、遠心分離等の手段で本開示の組成物中の細胞以外の少なくとも一部の成分を注入液などの別の成分に交換して、保存後細胞の増殖および／または再分化の目的での２４時間以上、１８時間以上、１２時間以上、好ましくは６時間以上（これ以外に、任意の時間単位であってもよい。）の細胞培養または静置をすることなく、被験体に投与され得る。したがって、本開示の組成物を使用して保存した眼細胞は、培養されることなく被験体に投与され得る。また、眼細胞は、ＲＯＣＫ阻害剤と共に投与されてもよい。ＲＯＣＫ阻害剤は、組成物中にあらかじめ含まれていてもよいし、投与直前に混合してもよいし、細胞投与時に個別に投与されてもよい。ＲＯＣＫ阻害剤としては、下記文献：米国特許４６７８７８３号、特許第３４２１２１７号、国際公開第９５／２８３８７、国際公開９９／２０６２０、国際公開９９／６１４０３、国際公開０２／０７６９７６、国際公開０２／０７６９７７、国際公開第２００２／０８３１７５、国際公開０２／１００８３３、国際公開０３／０５９９１３、国際公開０３／０６２２２７、国際公開２００４／００９５５５、国際公開２００４／０２２５４１、国際公開２００４／１０８７２４、国際公開２００５／００３１０１、国際公開２００５／０３９５６４、国際公開２００５／０３４８６６、国際公開２００５／０３７１９７、国際公開２００５／０３７１９８、国際公開２００５／０３５５０１、国際公開２００５／０３５５０３、国際公開２００５／０３５５０６、国際公開２００５／０８０３９４、国際公開２００５／１０３０５０、国際公開２００６／０５７２７０、国際公開２００７／０２６６６４などに開示された化合物があげられる。具体例として、例えば、Ｙ−２７６３２（（＋）−トランス−４−（１−アミノエチル）−１−（４−ピリジルカルバモイル）シクロヘキサン）、リパスジル（４−フルオロ−５−｛［（２Ｓ）−２−メチル−１，４−ジアゼパン−１−イル］スルホニル｝イソキノリン）、ファスジル（１−（５−イソキノリンスルホニル）ホモピペラジン）、およびその薬学的に許容され得る塩が挙げられるがこれらに限定されない。
【００１８】
本開示において使用され得るアルブミンは、いずれの種に由来するものであってもよく、例えば、哺乳動物(ヒト、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、ネコ、イヌ、ウシ、ウマ、ヒツジ、サル等)に由来する細胞であり得るが、ヒト細胞を保存する場合は、ヒト由来のものを使用することが好ましい。ヒト細胞を保存する実施形態では、アルブミンはヒト由来のアルブミンを使用してもよく、またはウシ由来のアルブミンを使用してもよい。本開示で使用されるアルブミンは、通常血清の一成分として使用されるのではなく、他の成分から分離された状態で使用される。一例として、使用されるアルブミンは精製されたものであることが好ましい。精製は当該分野で任意の方法を用いて精製され得る。組成物中のアルブミンの濃度は、約０．００１％(w/w)を下回ると効果がなく、約２５％(w/w)を超えると効果は変わらない。したがって、いくつかの実施形態において、アルブミンの濃度は、約０．００１％〜約２５％(w/w)の範囲、例えば、約０．０１〜約２５％（ｗ／ｗ）、約０．０１〜約２０％（ｗ／ｗ）、約０．０１〜約１５％（ｗ／ｗ）、約０．０１〜約１０％（ｗ／ｗ）、約０．０１〜％（ｗ／ｗ）、約５％（ｗ／ｗ）、約０．１〜約２５％（ｗ／ｗ）、約０．１〜％（ｗ／ｗ）、約２０％（ｗ／ｗ）、約０．１〜約１５％（ｗ／ｗ）、約０．１〜約１０％（ｗ／ｗ）であり、さらに好ましくは約０．１〜約５％(w/w)であり得る。好ましい実施形態において、アルブミンの濃度は、約１％（ｗ／ｗ）であり得る。
【００１９】
本開示において使用されるジメチルスルフォキシドは一般的に知られている市販のものを用いることができる。組成物中のジメチルスルフォキシドの濃度は、約０．１％(w/w)を下回ると細胞の保存能力が低下し、約５０％(w/w)を超えると効果が変わらないため、約０．１％(w/w)〜約５０％(w/w)の範囲内、例えば、約０．１〜約４０％（ｗ／ｗ）、約０．１〜約３０％（ｗ／ｗ）、約０．１〜約２０％（ｗ／ｗ）、約１〜約５０％（ｗ／ｗ）、約１〜約４０％（ｗ／ｗ）、約１〜３０％（ｗ／ｗ）であり、さらに好ましくは約１〜約２０％(w/w)の範囲内であるのが好ましい。好ましい実施形態において、ジメチルスルフォキシドの濃度は、約１０％（ｗ／ｗ）であり得る。
【００２０】
いくつかの実施形態において、本開示の組成物は、糖をさらに含んでもよい。理論に束縛されることを望まないが、糖をさらに含むことにより、保存後の生細胞率（有効細胞率）および培養効率が向上する。糖としては、例えば、単糖類、二糖類、三糖類が挙げられ、例えば、グルコース、ガラクトース、フルクトース、リボース、トレハロース、ブドウ糖が挙げられるが、これらに限定されない。好ましい実施形態では、添加される糖は、単糖であることが好ましく、特に取り扱いの容易性から、グルコースが好ましいが、上記の他の糖を使用してもよく、任意の組み合わせを使用してもよい。組成物中の糖の濃度は、約０．１％（w/w）に満たないと効果がなく、また約１０％（w/w）を超えても効果が変わらないため、約０．１〜約１０％（w/w）の濃度範囲であり、例えば、約０．１〜９％（ｗ／ｗ）、約０．１〜８％（ｗ／ｗ）、約０．１〜約７％（ｗ／ｗ）、約０．１〜約６％（ｗ／ｗ）、約０．１〜約５％（ｗ／ｗ）、約１〜約１０％（ｗ／ｗ）、約１〜約９％（ｗ／ｗ）、約１〜約８％（ｗ／ｗ）、約１〜約７％（ｗ／ｗ）、約１〜約６％（ｗ／ｗ）であり、さらに好ましくは約１〜約５％（w/w）の濃度範囲である。
【００２１】
いくつかの実施形態において、本開示の組成物は、さらにリン酸イオンを含んでもよい。リン酸イオンは、リン酸緩衝液として用いることができ、ダルベッコリン酸緩衝液、リン酸緩衝液などを使用することが可能である。
【００２２】
いくつかの実施形態において、本開示の組成物は、金属イオンを含んでいてもよい。理論に束縛されることは望まないが、金属イオンをさらに含むことにより、保存後の生細胞率（有効細胞率）および培養効率が向上する。金属イオンとしては、二価または三価の金属イオンが挙げられ、例えばカルシウムイオン、マグネシウムイオン、鉄イオン、亜鉛イオン、銅イオン、アルミニウムイオン等が挙げられるが、これらに限定されない。好ましい実施形態では、金属イオンは二価金属イオンであり得る。組成物中の金属イオンの濃度は、約０．００００００１％（w/w）を下回ると効果が無く、約１％（w/w）を超えても効果に変わりがない。したがって、特定の実施形態において、金属イオンの濃度は、約０．００００００１〜約５％（w/w）の濃度範囲であり、例えば、約０．１〜約４％（ｗ／ｗ）、約０．１〜約３％（ｗ／ｗ）、約０．１〜約２％（ｗ／ｗ）、約０．１〜約１％（ｗ／ｗ）、約０．０１〜約５％（ｗ／ｗ）、約０．０１〜約４％（ｗ／ｗ）、約０．０１〜約３％（ｗ／ｗ）、約０．０１〜約３％（ｗ／ｗ）、約０．０１〜約２％（ｗ／ｗ）、約０．０１〜約１％（ｗ／ｗ）であり、さらに好ましくは約０．１〜約５％（w/w）の濃度範囲である。特定の実施形態において、本開示の組成物は、上記金属イオンの任意の組み合わせを含んでいてもよく、例えば、本開示の組成物は、（ｉ）カルシウムイオンおよびマグネシウム、または（ｉｉ）カルシウム、マグネシウムおよび銅を含み得る。より具体的な実施形態において、本開示の組成物は、（ｉ）約０．１％のカルシウムおよびマグネシウム、または（ｉｉ）０．１〜５％のカルシウム、マグネシウムおよび銅を含み得る。
【００２３】
特定の実施形態において、本開示の組成物は、約０．１％（ｗ／ｗ）〜５％（ｗ／ｗ）のアルブミンと、約５％（ｗ／ｗ）〜１５％（ｗ／ｗ）のジメチルスルフォキシドとを含み得る。
【００２４】
特定の実施形態において、本開示の組成物は、約１％（ｗ／ｗ）のアルブミンと、約１０％（ｗ／ｗ）のジメチルスルフォキシドとを含み得る。
【００２５】
特定の実施形態において、本開示の組成物は、例えば、Ｂａｍｂａｎｋｅｒ（登録商標）、ＢａｍＢａｎｋｅｒ（登録商標）ｈＲＭ、ＳＴＥＭ−ＣＥＬＬＢＡＮＫＥＲ（登録商標）であるか、これを含む。Ｂａｍｂａｎｋｅｒ（登録商標）は、保存後の培養における細胞増殖能力が高い点で好ましい。また、ＳＴＥＭ−ＣＥＬＬＢＡＮＫＥＲ（登録商標）は、保存後の細胞生存率および細胞密度を維持する能力が高い点で好ましい。ＢａｍＢａｎｋｅｒ（登録商標）ｈＲＭは、保存後の細胞生存率および細胞密度を維持する能力が高く、かつその後の培養における細胞増殖能力が高い点で、特に好ましい。ＢａｍＢａｎｋｅｒ（登録商標）ｈＲＭは、約１％（ｗ／ｗ）のアルブミンと、約１０％（ｗ／ｗ）のジメチルスルフォキシドと、その他の培地成分を含む。当業者であれば、培地成分は、適宜改変することができる。また、改変された培地成分を含む培地が本開示の範囲であるかどうかについては、本明細書において明示的に開示されているか、または当該分野で公知の任意の手法を用いて、好ましくは、保存後臨床応用しうることを試験することで確認することができる。
【００２６】
（細胞製剤）
別の局面において、本開示は、角膜内皮細胞とアルブミンとジメチルスルフォキシドとを含む細胞製剤を提供する。いくつかの実施形態において、本開示の細胞製剤は、凍結状態で提供され得る。本開示の細胞製剤は、治療有効量の角膜内皮細胞を含み得るが、凍結状態でも高い細胞生存率および／または細胞密度が維持されるため、解凍後、治療有効量の臨床使用可能な正常な角膜内皮細胞を投与することが可能である。したがって、凍結状態で提供された細胞製剤は、投与直前に解凍され、その後培養工程を経ずに被験体に投与され得、いわゆる”ready  to  use”の状態で提供される。本開示の細胞製剤は、被験体の角膜内皮の疾患、障害または症状を治療又は予防するためのものであり得る。角膜内皮の疾患、障害または症状としては、フックス角膜内皮ジストロフィ、角膜移植後障害、角膜内皮炎、外傷、眼科手術後の障害、眼科レーザー手術後の障害、加齢、後部多形性角膜ジストロフィ(PPD：posterior  polymorphous  dystrophy)、先天性遺伝性角膜内皮ジストロフィ(CHED：congenital  hereditary  endothelial  dystrophy)、特発性角膜内皮障害、およびサイトメガロウイルス角膜内皮炎が挙げられるが、これらに限定されない。
細胞製剤に含まれる構成要素（アルブミン、ジメチルスルフォキシド、金属イオン、糖、ＲＯＣＫ阻害剤等）については、適宜上記（組成物）に記載の１または複数の実施形態を採用され得る。
【００２７】
（保存方法）
別の局面において、本開示は、眼細胞（例えば、角膜内皮細胞）を保存する方法であって、上記組成物中に眼細胞を懸濁させ、懸濁物を提供する工程と、前記懸濁物を予備凍結無しで凍結する工程とを含む方法を提供する。典型的には、低温保存用の容器（チューブ、プレート、ディッシュ等）中に細胞を約１×１０３から約１×１０８個／ｍｌとなるように細胞保存液（本開示の組成物）中に懸濁し、これを約−８０℃あるいは液体窒素中に保存する。保存が短期間である場合は、約−４℃〜約−２０℃であってもよい。細胞保存液中に眼細胞を懸濁させ、これを複数の細胞保存用容器に分注し、予備凍結無しで凍結保存することができる。また保存に際し、細胞保存液に懸濁した細胞を、プログラムフリーザーなどにより徐々に温度を下げてもよいし、直接急速に低温化してしてもよい。さらに凍結保存された細胞の復元に関して、低温保存された細胞を室温あるいは３７℃の恒温槽内にて融解させ、さらにこれを遠心分離機を用いた遠心分離などの操作により、細胞と細胞保存液とを分離して復元させることができる。また分離した細胞は適当な培養液などで洗浄後、通常の方法により培養をおこなうことができる。
【００２８】
好ましい実施形態では、本開示は、有利には、凍結保存された細胞の復元後に、そのまま患者に直接投与しうるｒｅａｄｙ−ｔｏ−ｕｓｅであることが一つの特徴でありうる。この場合の直接投与のための解凍および／または復元の方法は、任意の手法がありうるが、代表的には以下のように行うことができる。すなわち、凍結された状態のものを常法に従って解凍し、細胞を増殖させ再分化させる目的での一定時間細胞培養をせずに、遠心分離等の手段で本開示の組成物を別の組成物に交換するなどの簡単な操作を必要に応じて行って、そのまままたは投与用の液（例えば、生理食塩水やリン酸緩衝か生理食塩水（ＰＢＳ））に懸濁させることで、投与することができ、そのような場合は直接投与の範囲内であることが理解される。
【００２９】
（治療・予防）
さらなる局面において、本開示は、被験体における眼科（例えば、角膜内皮）の疾患、障害または症状を治療又は予防する方法であって、本開示の上記保存方法に従って保存された治療有効量の眼細胞（例えば、角膜内皮細胞）を該被験体に投与するステップを含む、方法を提供する。
【００３０】
一つの代表的な手法としては、以下のような手順が提供される。
１）本開示の保存用の組成物を用いて、眼細胞（例えば、角膜内皮細胞）を保存し、必要に応じて凍結保存しておき、
２）処置の際に、１）で保存された眼細胞（例えば、角膜内皮細胞）を必要に応じて解凍し、続いて、眼内への注入液で懸濁し細胞を遠心分離し、もう一度注入液に再懸濁し、
３）必要に応じてＲＯＣＫ阻害剤を添加し、
４）当該眼細胞（例えば、角膜内皮細胞）を含む組成物を、それを必要とする被験体の眼内に注入することを
包含する。
【００３１】
本開示の治療・予防において使用される技術は、本明細書に記載される他の箇所、例えば、（組成物）、（保存方法）、（細胞製剤）、（細胞）、（使用）などの各項目に記載される好ましい実施形態を適宜必要に応じて組み合わせて利用しうることができる。
【００３２】
（細胞）
さらなる局面において、本開示は、被験体における眼科（例えば角膜内皮）の疾患、障害または症状を治療又は予防するための眼細胞（例えば、角膜内皮細胞）であって、該眼細胞（例えば、角膜内皮細胞）は、本開示の上記保存方法に従って保存された角膜内皮細胞である、角膜内皮細胞を提供する。
本開示の細胞において使用される技術は、本明細書に記載される他の箇所、例えば、（組成物）、（保存方法）、（細胞製剤）、（治療・予防）、（使用）などの各項目に記載される好ましい実施形態を適宜必要に応じて組み合わせて利用しうることができる。
【００３３】
（使用）
さらなる局面において、本開示は、被験体における角膜内皮の疾患、障害または症状を治療又は予防するための医薬の製造における角膜内皮細胞の使用であって、該眼細胞（例えば、角膜内皮細胞）は、本開示の上記保存方法に従って保存された眼細胞（例えば、角膜内皮細胞）である、使用を提供する。
【００３４】
本開示の使用において採用されうる技術は、本明細書に記載される他の箇所、例えば、（組成物）、（保存方法）、（細胞製剤）、（治療・予防）、（細胞）などの各項目に記載される好ましい実施形態を適宜必要に応じて組み合わせて利用しうることができる。
【００３５】
以上、本開示を、理解の容易のために好ましい実施形態を示して説明してきた。以下に、実施例に基づいて本開示を説明するが、上述の説明および以下の実施例は、例示の目的のみに提供され、本開示を限定する目的で提供したのではない。従って、本開示の範囲は、本明細書に具体的に記載された実施形態にも実施例にも限定されず、特許請求の範囲によってのみ限定される。
【実施例】
【００３６】
以下、実施例に基づいて本開示をより具体的に説明する。本実施例において用いられる各種試薬は、具体的に示したもののほか、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、ＢＡＳＦジャパン株式会社などから入手されるものも用いることができることが理解される。【００３７】
（細胞培養例）
本実施例の例示的な細胞培養の概要を図１Ａに示す。【００３８】
ドナー角膜はＳｉｇｈｔＬｉｆｅＴＭから提供された。４０歳以上の健常者のドナー角膜を用いた。した角膜はＯｐｔｉｓｏｌ（Ｃｈｉｒｏｎ  Ｖｉｓｉｏｎ）中にて４℃で保存し、保存期間１４日間未満のものを実験に使用した。角膜内皮を含むデスメ膜をドナー角膜から剥がし、１ｍｇ／ｍＬのコラゲナーゼＡ（Ｒｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ、１０  １０３  ５８６  ００１）と共に３７℃で１２時間消化した。その後、Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ（登録商標）−Ｉ（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、３１９８５−０８８）で３回洗浄した後、Ｌａｍｉｎｉｎ−５１１Ｅ８（ｉＭａｔｒｉｘ−５１１；  Ｎｉｐｐｉ、８９２０１２）でコーティングを施した４８ウェルプレートのうちの１ウェルに播種した。培養培地は以下のように調整した。４μｇ／ｍＬのマイトマイシンＣ（協和発酵キリン社製、４２３１４００Ｄ１０３１）で２時間処理したＮＩＨ−３Ｔ３細胞を１．３５×１０４個／ｃｍ２の細胞密度で培養ディッシュに播種した。ＮＩＨ−３Ｔ３細胞を、基礎培地と共に２４時間培養し、基礎培地を集めた。収集した基礎培地を０．２２μｍ濾過装置（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｒ７ＮＡ７５７７５）でろ過し、使用時に５ｎｇ／ｍＬの上皮成長因子（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＰＨＧ０３１１）、０．１ｍＭのアスコルビン酸（ＳＩＧＭＡ−Ａｌｄｒｉｃｈ、ＰＨＲ１００８）、１０μＭのＳＢ２０３５８０（Ｃａｙｍａｎ、１３０６７）、１μＭのＳＢ４３１５４２（ＷＡＫＯ、１９２−１６５４Ｉ）を添加して角膜内皮細胞の培養に使用した。５〜１０回継代培養し、１０００〜１５００個／ｍｍ２の細胞密度を有する培養ヒト角膜内皮細胞をスクリーニング実験に用いた。【００３９】
以下の基礎培地を使用した。【００４０】
基礎培地：Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ（登録商標）−Ｉ（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、３１９８５−０８８）＋８％ＦＢＳ（Ｔｈｅｒｍｏ、ＳＨ３００８４．０３）＋５ｎｇ／ｍＬ上皮成長因子（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＰＨＧ０３１１）＋２０μｇ／ｍＬアスコルビン酸（ＳＩＧＭＡ−Ａｌｄｒｉｃｈ、ＰＨＲ１００８）＋２００ｍｇ／Ｌ塩化カルシウム（ＳＩＧＭＡ−Ａｌｄｒｉｃｈ、４４９７０９）＋０．０８％コンドロイチン硫酸（ＷＡＫＯ、０３２−１４６１３）＋５０μｇ／ｍＬゲンタマイシン（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、１５７１０−０６４）【００４１】
ヒト角膜内皮細胞を培養中の培養皿から培地を除去し、事前に３７℃に温めておいた１×ＰＢＳ（−）（日水製粉株式会社、０５９１３）を添加し、洗浄を行った。この作業を２回繰り返した。再び１×ＰＢＳ（−）を添加し、３７℃（５％ＣＯ２）で３分インキュベートした。ＰＢＳ（−）除去後、ＴｒｙｐＬＥTMＳｅｌｅｃｔ  Ｅｎｚｙｍｅ（１０Ｘ）（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、  Ａ１２１７７０１）を添加し、３７℃（５％ＣＯ２）で１５分インキュベートした。その後、培地で懸濁し、２８０Ｇで３分間遠心することで細胞を回収した。細胞数を数えた後、ヒト角膜内皮細胞を２８０Ｇで３分間遠心分離した。上清を除去した後、各種の凍結保存試薬（１ｍｌにつき細胞数５×１０５個）を添加した。その後、バイセル凍結処理容器（日本フリーザ株式会社、ＢＩＣＥＬＬ）を用いてヒト角膜内皮細胞を−８０℃で２４時間凍結させ、さらに液体窒素（−１９６℃）で１３日間保存した。１４日間凍結保存した後、ヒト角膜内皮細胞を凍結ストックから再培養した。簡単に説明すると、ヒト角膜内皮細胞を保存したクライオチューブを３７℃の水浴中で１〜２分間溶かした。事前に３７℃で温めておいた基礎培地でヒト角膜内皮細胞を回収した。その後、ヒト角膜内皮細胞を１９０Ｇで５分間遠心分離し、上清を除去し、ヒト角膜内皮細胞を培地に懸濁させた。次に、ヒト角膜内皮細胞を培養プレートに８００個／ｍｍ２の密度で播種した。凍結保存液には作製した保存液を用い、Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ（登録商標）−Ｉ＋１０％ＤＭＳＯ＋１０％ＦＢＳを凍結保存液の対照として用いた。【００４２】
（位相差顕微鏡観察例）
本実施例における例示的な細胞の観察方法を説明する。【００４３】
ヒト角膜内皮細胞を保存したクライオチューブを３７℃の水浴中で１〜２分間溶かした。事前に３７℃で温めておいた基礎培地でヒト角膜内皮細胞を回収した。その後、ヒト角膜内皮細胞を１９０Ｇで５分間遠心分離し、上清を除去し、ヒト角膜内皮細胞を培地に懸濁させた。懸濁液にＹ−２７６３２（和光純薬株式会社、２５３−００５１３）を添加し、Ｌａｍｉｎｉｎ−５１１Ｅ８でコーティングを施したｗｅｌｌとコーティングを施していないウェルに８００個／ｍｍ２の密度で播種した。２４時間後、位相差顕微鏡下で細胞形態および細胞接着を観察した。【００４４】
（結果）
細胞の観察結果を図１Ｂに示す。凍結をせずに培養したものと比べ、凍結保存後に培養したヒト角膜内皮細胞はプレートに接着している細胞が少なくなっている。本発明者らは以前、Ｌａｍｉｎｉｎ−５１１Ｅ８が角膜内皮の基底膜であるデスメ膜の成分であり、細胞培養基質としてのＬａｍｉｎｉｎ−５１１Ｅ８の使用がヒト角膜内皮細胞を促進することを報告した。そのため、凍結保存後の細胞培養におけるＬａｍｉｎｉｎ−５１１Ｅ８の効果を評価した。位相差画像により、Ｌａｍｉｎｉｎ−５１１Ｅ８の使用により細胞の数を増加させたことが示されたが、培養プレートに付着した細胞の細胞数は凍結保存をせずに培養したものと比較して凍結保存を行ったものにおいて少なかった。Ｌａｍｉｎｉｎ−５１１Ｅ８なしで培養した細胞は線維芽細胞形態を示したが、Ｌａｍｉｎｉｎ−５１１Ｅ８でコーティングを施したプレート上で培養した細胞は、線維芽細胞が少なく、角膜内皮細胞様形態をしていた。【００４５】
（生細胞測定例）
本実施例における典型的な生細胞測定方法を説明する。【００４６】
ヒト角膜内皮細胞を凍結保存したクライオチューブを３７℃の水浴中で１〜２分間溶かした。事前に３７℃で温めておいた基礎培地でヒト角膜内皮細胞を回収した。その後、ヒト角膜内皮細胞を１９０Ｇで５分間遠心分離し、上清を除去し、ヒト角膜内皮細胞を培地に懸濁させた。次に、懸濁液にＹ−２７６３２を添加し、Ｌａｍｉｎｉｎ−５１１Ｅ８でコーティングを施したウェルとコーティングを施していないウェルに８００個／ｍｍ２の細胞密度で９６ウェルプレートに播種した。２４時間後の生細胞数を検討するため、以下の手順で、Ｃｅｌｌ  Ｔｉｔｅｒ−Ｇｌｏ  Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ  Ａｓｓａｙによる生細胞数の測定を行った。まず、検量線用にヒト角膜内皮細胞の懸濁液を作製した。プレートの培地を除去し、事前に３７℃に温めておいたＯｐｔｉ−ＭＥＭ（登録商標）−Ｉで洗浄した後、Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ（登録商標）−Ｉを５０μｌ／ｗｅｌｌ加えた。検量専用のヒト角膜内皮細胞を０個／ウェル、５０００個／ウェル、１００００個／ウェル、１５０００個／ウェルとなるように空いているウェルに播種した。Ｃｅｌｌ  Ｔｉｔｅｒ−Ｇｌｏ  Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ  Ａｓｓａｙ溶液（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｇ７５７２）を培地と１：１になるように５０μｌ／ウェル加えた。ここからの作業は遮光で行った。シェイカーを１２０分−１程度で２分間よく混ぜ、１０分間静置させた。静置後、Ａｓｓａｙ  ｐｌａｔｅ（Ｃｏｒｎｉｎｇ、３９１２、Ａｓｓａｙ  ｐｌａｔｅ  ９６ｗｅｌｌ、ｗｈｉｔｅ  ｐｏｌｙｓｔｙｒｅｎｅ）に８０μｌを移し、ＧｌｏＭａｘ−Ｍｕｌｔｉ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｅ７０５１）を用いて吸光度を測定した。【００４７】
（結果）
生細胞測定の結果を図１Ｃに示す。Ｌａｍｉｎｉｎ−５１１Ｅ８の使用により細胞数は有意に増加した。一方、２４時間後の細胞数は、凍結保存を行っていない細胞と比較すると、Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ（登録商標）−Ｉ＋１０％ＤＭＳＯ＋１０％ＦＢＳ中で凍結保存された細胞では約半数減少した。【００４８】
（実施例１：凍結保存液のスクリーニング）
本実施例では、角膜内皮細胞の凍結保存に適した凍結保存液をスクリーニングした。【００４９】
（Ａ  細胞生存率）
ヒト角膜内皮細胞を保存したクライオチューブを３７℃の水浴中で１〜２分間溶かした。事前に３７℃で温めておいた基礎培地でヒト角膜内皮細胞を回収した。その後、ヒト角膜内皮細胞を１９０Ｇで５分間遠心分離し、上清を除去し、ヒト角膜内皮細胞を培地に懸濁させた。その後、０．５％−Ｔｒｙｐａｎ  Ｂｌｕｅ  Ｓｔａｉｎ溶液（ナカライテスク、２９８５３−３４）で死細胞を１０分間染色した。血球計算盤を用いて生細胞数と死細胞数を測定し、凍結保存を行った細胞においては生細胞数を保存した細胞数（５×１０５個）で割ることにより細胞生存率を算出し、凍結保存を行わなかった細胞においては生細胞数を死細胞数と生細胞数の和で割ることにより算出した。凍結保存液には、ＣＥＬＬＢＡＮＫＥＲ（登録商標）２（日本製薬工業株式会社、ＣＢ０３１）、Ｂａｍｂａｎｋｅｒ（日本ジェネティクス株式会社、ＣＳ−０２−００１）、ＫＭ  Ｂａｎｋｅｒ（コージンバイオ株式会社、１６０９２００５）、ＳＴＥＭ−ＣＥＬＬＢＡＮＫＥＲ（登録商標）（日本製薬工業株式会社、ＣＢ０４７）、Ｂａｍｂａｎｋｅｒ  ｈＲＭ（日本ジェネティクス株式会社、ＣＳ−０７−００１）、ＲｅｐｒｏＣｒｙｏ  ＤＭＳＯ  Ｆｒｅｅ  ＲＭ（ＲｅｐｒｏＣＥＬＬ、ＲＣＨＥＦＭ００３）を使用した。また、Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ（登録商標）−Ｉ＋１０％ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ；ナカライテスク、１３４０８−６４）＋１０％ＦＢＳを凍結保存試薬の対照として使用した。【００５０】
（結果）
結果を図２Ａに示す。Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ（登録商標）−Ｉ＋１０％ＤＭＳＯ＋１０％ＦＢＳを用いて保存された細胞の生存率は７５．０％であったが、凍結保存を行っていない細胞では生細胞の割合は８９．２％であった。一方、Ｂａｍｂａｎｋｅｒ  ｈＲＭを用いて保存することで、生存細胞の割合を８９．４％に有意に増加させた。【００５１】
（Ｂ  Ｃｅｌｌ  ｔｉｔｅｒ  ｇｌｏによる細胞増殖能の検討）
ヒト角膜内皮細胞を凍結保存したクライオチューブを３７℃の水浴中で１〜２分間溶かした。事前に３７℃で温めておいた基礎培地でヒト角膜内皮細胞を回収した。その後、ヒト角膜内皮細胞を１９０Ｇで５分間遠心分離し、上清を除去し、ヒト角膜内皮細胞を培地に懸濁させた。細胞懸濁液にＹ−２７６３２を添加し、Ｌａｍｉｎｉｎ−５１１Ｅ８でコーティングを施した９６ウェルプレートに播種した。１日、７日、１４日、２８日後に細胞増殖能を検討するため、以下の手順で、Ｃｅｌｌ  Ｔｉｔｅｒ−Ｇｌｏ  Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ  Ａｓｓａｙによる生細胞数の測定を行った。まず、検量線用にヒト角膜内皮細胞の懸濁液を作製した。プレートの培地を除去し、事前に３７℃に温めておいたＯｐｔｉ−ＭＥＭ（登録商標）−Ｉで洗浄した後、Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ（登録商標）−Ｉを５０μｌ／ウェル加えた。検量線用のヒト角膜内皮細胞を空いているウェルに播種した。Ｃｅｌｌ  Ｔｉｔｅｒ−Ｇｌｏ  Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ  Ａｓｓａｙ溶液（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｇ７５７２）を培地と１：１になるように５０μｌ／ウェル加えた。ここからの作業は遮光で行った。シェイカーを１２０分−１程度で２分間よく混ぜ、１０分間静置させた。静置後、Ａｓｓａｙ  ｐｌａｔｅ（Ｃｏｒｎｉｎｇ、３９１２、Ａｓｓａｙ  ｐｌａｔｅ  ９６ｗｅｌｌ、ｗｈｉｔｅ  ｐｏｌｙｓｔｙｒｅｎｅ）に８０μｌを移し、ＧｌｏＭａｘ−Ｍｕｌｔｉ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｅ７０５１）を用いて吸光度を測定した。【００５２】
（結果）
図２Ｂに結果を示す。凍結保存を行った全ての細胞は２８日間にわたって培養した。その中で、Ｂａｍｂａｎｋｅｒ  ｈＲＭおよびＢａｍｂａｎｋｅｒは他の保存された細胞よりも早く増殖する傾向があった。【００５３】
（Ｃ  細胞密度）
凍結保存したクライオチューブを３７℃の水浴中で１〜２分間溶かした。事前に３７℃で温めておいた基礎培地でヒト角膜内皮細胞を回収した。その後、ヒト角膜内皮細胞を１９０  Ｇで５分間遠心分離し、上清を除去し、ヒト角膜内皮細胞を培地に懸濁させた。次に、細胞懸濁液にＹ−２７６３２を添加し、Ｌａｍｉｎｉｎ−５１１Ｅ８でコーティングを施した培養プレートに８００個／ｍｍ２の密度で細胞を播種した。播種後２８日目のコンフルエントに達した細胞を１×ＰＢＳ（−）で２回洗浄した後、３７℃（５％ＣＯ２）で３分間インキュベートした。播種後２８日目のコンフルエントに達した細胞を１×ＰＢＳ（−）で２回洗浄した後、３７℃（５％ＣＯ２）で３分間インキュベートした。その後、位相差顕微鏡を用いて倍率２００倍で写真を撮影し、計測ソフトであるＩｍａｇｅＪソフトウェア（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ）を使用することで細胞密度を測定した。まず、撮影した位相差顕微鏡写真をソフトに取り込み、カウント機能を用いて細胞数を数えた。細胞を１００個カウントしたところで解析を行い、細胞密度を測定した。検定にはダネットの多重比較検定を用いた。結果は平均±標準偏差として表した。【００５４】
（結果）
図２Ｃに結果を示す。凍結保存を行っていない細胞の細胞密度を１００としたとき、Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ（登録商標）−Ｉ＋１０％ＤＭＳＯ＋１０％ＦＢＳを用いて凍結保存した細胞の細胞密度は７６．２％と減少した。しかし、Ｂａｍｂａｎｋｅｒ  ｈＲＭを用いて凍結保存をした細胞の細胞密度は９６．６％と細胞密度を維持した。【００５５】
（実施例２：保存液の液量検討）
本実施例では、凍結保存に使用する凍結保存液の適切な量を検討した。【００５６】
（Ａ  細胞生存率）
ヒト角膜内皮細胞を培養中の培養皿から培地を除去し、事前に３７℃に温めておいた１×ＰＢＳ（−）（日水製粉株式会社、０５９１３）を添加し、洗浄を行った。この作業を２回繰り返した。再び１×ＰＢＳ（−）を添加し、３７℃（５％ＣＯ２）で３分インキュベートした。ＰＢＳ（−）を除去後、ＴｒｙｐＬＥTMＳｅｌｅｃｔ  Ｅｎｚｙｍｅ（１０Ｘ）（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、  Ａ１２１７７０１）を添加し、３７℃（５％ＣＯ２）で１５分インキュベートした。その後、培地で懸濁し、２８０Ｇで３分間遠心することで細胞を回収した。細胞数を数えた後、１５ｍｌ遠沈管にそれぞれ懸濁液を分注し、２８０Ｇで３分間遠心分離した。上清を除去した後、凍結保存試薬を０．５ｍｌ、１ｍｌ、１．５ｍｌ加え、それぞれが１ｍｌにつき５×１０５個の濃度となるようにした。その後、バイセル凍結処理容器（日本フリーザ株式会社、ＢＩＣＥＬＬ）を用いてヒト角膜内皮細胞を−８０℃で２４時間凍結させ、さらに液体窒素（−１９６℃）で１３日間保存した。１４日間凍結保存した後、ヒト角膜内皮細胞を凍結ストックから再培養した。簡単に説明すると、ヒト角膜内皮細胞を保存したクライオチューブを３７℃の水浴中で１〜２分間溶かした。事前に３７℃で温めておいた基礎培地でヒト角膜内皮細胞を回収した。その後、ヒト角膜内皮細胞を１９０Ｇで５分間遠心分離し、上清を除去し、ヒト角膜内皮細胞を培地に懸濁させた。その後、０．５％−Ｔｒｙｐａｎ  Ｂｌｕｅ  Ｓｔａｉｎ溶液（ナカライテスク、２９８５３−３４）で死細胞を１０分間染色した。血球計算盤を用いて生細胞数と死細胞数を測定し、凍結保存を行った細胞においては生細胞数を保存した細胞数（５×１０５  ｃｅｌｌｓ）で割ることにより細胞生存率を算出し、凍結保存を行わなかった細胞においては生細胞数を死細胞数と生細胞数の和で割ることにより算出した。凍結保存液にはＢａｍｂａｎｋｅｒ  ｈＲＭを使用した。検定にはダネットの多重比較検定を用いた。結果は平均±標準偏差として表した。【００５７】
（結果）
図３Ａに結果を示す。細胞生存率は、１．０ｍｌのＢａｍｂａｎｋｅｒ  ｈＲＭ中に懸濁させた場合が０．５または１．５ｍｌ中に懸濁させた場合に比べ有意に高かった。【００５８】
（Ｂ  細胞密度）
凍結保存したクライオチューブを３７℃の水浴中で１〜２分間溶かした。事前に３７℃で温めておいた基礎培地でヒト角膜内皮細胞を回収した。その後、ヒト角膜内皮細胞を１９０Ｇで５分間遠心分離し、上清を除去し、ヒト角膜内皮細胞を培地に懸濁させた。次に、細胞懸濁液にＹ−２７６３２を添加し、Ｌａｍｉｎｉｎ−５１１Ｅ８でコーティングを施した培養プレートに８００個／ｍｍ２の密度で細胞を播種した。播種後２８日目のコンフルエントに達した細胞を１×ＰＢＳ（−）で２回洗浄した後、３７℃（５％ＣＯ２）で３分間インキュベートした。その後、位相差顕微鏡を用いて倍率２００倍で写真を撮影し、計測ソフトであるＩｍａｇｅＪソフトウェア（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ）を使用することで細胞密度を測定した。まず、撮影した位相差顕微鏡写真をソフトに取り込み、カウント機能を用いて細胞数を数えた。細胞を１００個カウントしたところで解析を行い、細胞密度を測定した。検定はダネットの多重比較検定を用いた。結果は平均±標準偏差として表した。【００５９】
（結果）
細胞密度は、細胞を０．５、１．０、１．５ｍｌのＢａｍｂａｎｋｅｒ  ｈＲＭに懸濁した場合、全て同等のレベルであった。【００６０】
（Ｃ  位相差顕微鏡像）
ヒト角膜内皮細胞を凍結保存したクライオチューブを３７℃の水浴中で１〜２分間溶かした。事前に３７℃で温めておいた基礎培地でヒト角膜内皮細胞を回収した。その後、ヒト角膜内皮細胞を１９０Ｇで５分間遠心分離し、上清を除去し、ヒト角膜内皮細胞を培地に懸濁させた。次に、細胞懸濁液にＹ−２７６３２を添加し、Ｌａｍｉｎｉｎ−５１１Ｅ８でコーティングを施した培養プレートに８００個／ｍｍ２の細胞密度で播種した。１日、７日、１４日、２８日後にそれぞれ、位相差顕微鏡下で細胞形態および細胞接着を観察した。【００６１】
（結果）
図３Ｃに結果を示す。播種後１日目は、１．０ｍｌのＢａｍｂａｎｋｅｒ  ｈＲＭによって保存された細胞と比較して、０．５ｍｌおよび１．５ｍｌのＢａｍｂａｎｋｅｒ  ｈＲＭによって保存された細胞は死細胞数が多く、培養プレート中への接着細胞の数がより少ないことを示した。２８日目に、０．５、１．０および１．５ｍｌのＢａｍｂａｎｋｅｒ  ｈＲＭによって保存された細胞は、同様の細胞密度で六角形および単層シート状構造を形成した。【００６２】
（実施例３：高密度細胞における凍結保存の評価）
（Ａ  細胞生存率）
凍結保存プロトコールの実現可能性を評価するために、臨床に用いる細胞として、継代回数が３〜５かつ、細胞密度が２０００個／ｍｍ２以上の臨床に使用可能な品質に準ずる細胞を使用してＢａｍｂａｎｋｅｒ  ｈＲＭによる細胞保存の影響を検討した。ヒト角膜内皮細胞を培養中の培養皿から培地を除去し、事前に３７℃に温めておいた１×ＰＢＳ（−）（日水製粉株式会社、０５９１３）を添加し、洗浄を行った。この作業を２回繰り返した。再び１×ＰＢＳ（−）を添加し、３７℃（５％  ＣＯ２）で３分インキュベートした。ＰＢＳ（−）除去後、ＴｒｙｐＬＥTMＳｅｌｅｃｔ  Ｅｎｚｙｍｅ（１０Ｘ）（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、  Ａ１２１７７０１）を添加し、３７℃（５％ＣＯ２）で１５分インキュベートした。その後、培地で懸濁し、２８０Ｇで３分間遠心することで細胞を回収した。細胞数を数えた後、ヒト角膜内皮細胞を２８０Ｇで３分間遠心分離した。上清を除去した後、凍結保存試薬（１ｍｌにつき細胞数５×１０５個）を添加した。その後、バイセル凍結処理容器（日本フリーザ株式会社、ＢＩＣＥＬＬ）を用いてヒト角膜内皮細胞を−８０℃で２４時間凍結させ、さらに液体窒素（−１９６℃）で１３日間保存した。１４日間凍結保存した後、ヒト角膜内皮細胞を凍結ストックから再培養した。簡単に説明すると、ヒト角膜内皮細胞を保存したクライオチューブを３７℃の水浴中で１〜２分間溶かした。事前に３７℃で温めておいた基礎培地でヒト角膜内皮細胞を回収した。その後、ヒト角膜内皮細胞を１９０Ｇで５分間遠心分離し、上清を除去し、ヒト角膜内皮細胞を培地に懸濁させた。その後、０．５％−Ｔｒｙｐａｎ  Ｂｌｕｅ  Ｓｔａｉｎ溶液（ナカライテスク、２９８５３−３４）で死細胞を１０分間染色した。血球計算盤を用いて生細胞数と死細胞数を測定し、凍結保存を行った細胞においては生細胞数を保存した細胞数（５×１０５個）で割ることにより細胞生存率を算出し、凍結保存を行わなかった細胞においては生細胞数を死細胞数と生細胞数の和で割ることにより算出した。２標本比較における平均値の統計的有意性（Ｐ値）をスチューデントのｔ検定で決定した。結果は平均±標準偏差として表した。凍結保存液にはＢａｍｂａｎｋｅｒ  ｈＲＭを使用した。【００６３】
（結果）
凍結保存後の細胞生存率８３．２％であり、凍結保存を行っていない細胞の細胞生存率９１．０％と比較して有意な低下を認めなかった。【００６４】
（Ｂ  細胞密度）
凍結保存したクライオチューブを３７℃の水浴中で１〜２分間溶かした。事前に３７℃で温めておいた基礎培地でヒト角膜内皮細胞を回収した。その後、ヒト角膜内皮細胞を１９０  Ｇで５分間遠心分離し、上清を除去し、ヒト角膜内皮細胞を培地に懸濁させた。次に、細胞懸濁液にＹ−２７６３２を添加し、Ｌａｍｉｎｉｎ−５１１Ｅ８でコーティングを施した培養プレートに２５００個／ｍｍ２の密度で細胞を播種した。播種後２８日目のコンフルエントに達した細胞を１×ＰＢＳ（−）で２回洗浄した後、３７℃（５％ＣＯ２）で３分間インキュベートした。その後、位相差顕微鏡を用いて倍率２００倍で写真を撮影し、計測ソフトであるＩｍａｇｅＪソフトウェア（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ）を使用することで細胞密度を測定した。まず、撮影した位相差顕微鏡写真をソフトに取り込み、カウント機能を用いて細胞数を数えた。細胞を１００個カウントしたところで解析を行い、細胞密度を測定した。検定はダネットの多重比較検定を用いた。結果は平均±標準偏差として表した。【００６５】
（結果）
図４Ｂに結果を示す。凍結保存を行った細胞の細胞密度は１９５９個／ｍｍ２であり、凍結保存を行わなかった細胞の細胞密度２１３８個／ｍｍ２と同様の密度に達した。【００６６】
（Ｃ  位相差顕微鏡）
ヒト角膜内皮細胞を凍結保存したクライオチューブを３７℃の水浴中で１〜２分間溶かした。事前に３７℃で温めておいた基礎培地でヒト角膜内皮細胞を回収した。その後、ヒト角膜内皮細胞を１９０Ｇで５分間遠心分離し、上清を除去し、ヒト角膜内皮細胞を培地に懸濁させた。次に、細胞懸濁液にＹ−２７６３２を添加し、Ｌａｍｉｎｉｎ−５１１Ｅ８でコーティングを施した培養プレートに２５００  ｃｅｌｌｓ／ｍｍ２の密度で播種した。１日、７日、１４日、２８日後にそれぞれ、位相差顕微鏡下で細胞形態および細胞接着を観察した。【００６７】
（結果）
図４Ｃに結果を示す。Ｂａｍｂａｎｋｅｒ  ｈＲＭを用いて保存された細胞が凍結保存を行わなかった細胞と同様の様式で成長し、六角形および単層シート状構造を形成した。【００６８】
（Ｄ  免疫染色）
４８ウェルプレート上で培養した細胞を１×ＰＢＳ（＋）で３回洗浄し、０．５％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ：ＷＡＫＯ、１６３−２０１４５）中で４５分間固定した。ＰＦＡを除去した後、１×ＰＢＳ（−）で３回洗浄した。その後、１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００（ナカライテスク、２８７２２９−２５）で５分間透過処理を行い、１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を除去した後、１×ＰＢＳ（−）で３回洗浄した。２％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ：ＳＩＧＭＡ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ａ９４１８−５Ｇ）を添加し３７℃で３０分間インキュベートすることでブロッキングを行った。細胞に１次抗体を添加し３７℃で４５分間、２５ｍｉｎ−１で振とうした。一次抗体にはＺＯ−１（１：２００、ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、６１７３００）、Ｎ−カドヘリン（１：３００、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、６１０９２１）、Ｎａ＋／Ｋ＋−ＡＴＰａｓｅ（１：２００、メルクミリポア、０５−３６９）を用いた。一次抗体を除去した後、１×ＰＢＳ（−）で３回洗浄しそれぞれ５分間、２５ｍｉｎ−１で振とうした。Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８−コンジュゲート化ヤギ抗ウサギＩｇＧ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ａ２１２０６）またはＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）  ５９４−コンジュゲート化ヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ａ−１１００５）のいずれかをＢＳＡで１：５００に希釈し、サンプルに二次抗体を添加し、３７℃で４５分間、２５分−１で振とうした。また、アクチンは、１：２００に希釈したＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）  ５４６−コンジュゲート化ファロイジン（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ａ２２２８３）を、核は１：１０００に希釈した４’、６−ジアミジノ−２−フェニルインドール二塩酸塩（ＤＡＰＩ：同人化学研究所、Ｄ５２３）をサンプルに添加し、３７℃で４５分間、２５分−１で振とうした。二次抗体を除去した後、１×ＰＢＳ（−）で３回洗浄しそれぞれ５分間、２５分−１で振とうした。１×ＰＢＳ（−）を除去した後、退色防止剤を加え、サンプルを蛍光顕微鏡（Ｋｅｙｅｎｃｅ、ＢＺ−９０００）で観察した。【００６９】
（結果）
図４Ｄに結果を示す。Ｂａｍｂａｎｋｅｒ  ｈＲＭを用いて凍結保存した細胞においてタイトジャンクションのマーカーであるＺＯ−１、接着結合のマーカーであるＮ−カドヘリン、およびポンプ機能のマーカーであるＮａ＋／Ｋ＋  −ＡＴＰアーゼが凍結保存を行っていない細胞同様、細胞膜上に発現していることが確認された。アクチン染色は、線維芽細胞変化なしに細胞外皮質に分布するアクチンが、凍結保存を行っていない細胞および凍結保存を行った細胞の両方において正常角膜内皮同様の発現をすることを示した。【００７０】
以上のように、本開示の組成物は、臨床において使用されるレベルの細胞密度（例えば、２０００個／ｍｍ２以上）でも、細胞生存率および細胞密度を損なうことなく保存することが可能であることが明らかになった。【００７１】
（実施例４：作製した保存液の有効性検討）
分析天秤（ＳＨＩＭＡＤＺＵ、ＡＵＷ２２０Ｄ）を用いて、炭酸水素ナトリウム（ナカライテスク、３１２１３−１５）を０．３６ｇ、Ｄ−（＋）−Ｇｌｕｃｏｓｅ≧９９．５％  （ＧＣ）（ＳＩＧＭＡ−ＡＬＤＲＩＣＨ、Ｇ７０２１−１００Ｇ）を６０ｇ、ＨＥＰＥＳ（ナカライテスク、１７５１４−０２）を０．７２ｇ、ＰＢＳ（−）粉末（日水製薬株式会社、０５９１３）を１９．２９ｇを秤量し、超純水に溶解して５００ｍｌの溶液を作製した。これを試薬（１）とする。【００７２】
同様に、分析天秤を用いて、塩化カルシウム（ナカライテスク、０６７２９−５５）を０．５ｇ、塩化マグネシウム六水和物（ナカライテスク、２０９０９−５５）を０．５ｇそれぞれ秤量し、超純水に溶解して５００ｍｌの溶液を作製した。これを試薬（２）とする。【００７３】
試薬（１）と試薬（２）をオートクレーブにより１２１  ℃で２０分間、滅菌処理を行った。試薬（１）を１２．５ｍｌ、滅菌水（ナカライテスク、０６４４２−９５）を２７．５ｍｌ測り取り、混和した。次に、ＤＭＳＯ（ナカライテスク、１３４０８−６４）を５ｍｌ加え、混和した。さらに、試薬（２）を５ｍｌ加え、混和した。分析天秤により、秤量したウシ血清アルブミン（ＳＩＧＭＡ−ＡＬＤＲＩＣＨ、Ａ９４１８−５Ｇ）を０．５ｇ加え、混和した。最後に、マイレクス（Ｍｉｌｌｅｘ）−ＧＶ、０．２２μｍ、ＰＶＤＦ、３３ｍｍ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｒ７ＮＡ７５７７５）により濾過し、細胞保存液の調整を行った。使用試薬を以下の表１に示す。【００７４】
【表１】
2020045642.tif 000002
【００７５】
（Ａ  位相差顕微鏡観察）
ヒト角膜内皮細胞を培養中の培養皿から培地を除去し、事前に３７℃に温めておいた１×ＰＢＳ（−）（日水製粉株式会社、０５９１３）を添加し、洗浄を行った。この作業を２回繰り返した。再び１×ＰＢＳ（−）を添加し、３７℃（５％ＣＯ２）で３分インキュベートした。ＰＢＳ（−）除去後、ＴｒｙｐＬＥTMＳｅｌｅｃｔ  Ｅｎｚｙｍｅ（１０Ｘ）（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，  Ａ１２１７７０１）を添加し、３７℃（５％ＣＯ２）で１５分インキュベートした。その後、培地で懸濁し、２８０Ｇで３分間遠心することで細胞を回収した。細胞数を数えた後、ヒト角膜内皮細胞を２８０Ｇで３分間遠心分離した。上清を除去した後、凍結保存試薬（１ｍｌにつき細胞５×１０５個）を添加した。その後、バイセル凍結処理容器（日本フリーザ株式会社、ＢＩＣＥＬＬ）を用いてヒト角膜内皮細胞を−８０℃で２４時間凍結させ、さらに液体窒素（−１９６℃）で１３日間保存した。ヒト角膜内皮細胞を凍結保存したクライオチューブを３７℃の水浴中で１〜２分間溶かした。事前に３７℃で温めておいた基礎培地でヒト角膜内皮細胞を回収した。その後、ヒト角膜内皮細胞を１９０Ｇで５分間遠心分離し、上清を除去し、ヒト角膜内皮細胞を培地に懸濁させた。次に、細胞懸濁液にＹ−２７６３２を添加し、Ｌａｍｉｎｉｎ−５１１Ｅ８でコーティングを施した培養プレートに８００個／ｍｍ２の細胞密度で播種した。１日、７日、１４日、２８日後にそれぞれ、位相差顕微鏡下で細胞形態および細胞接着を観察した。【００７６】
（結果）
図５Ａに結果を示す。培養後、1日目においては凍結保存をせず培養した細胞と比べ、Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ（登録商標）−Ｉ＋１０％ＤＭＳＯ＋１０％ＦＢＳを用いて凍結保存後に培養した細胞はプレートへの接着細胞数が少なくなっている。また、Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ（登録商標）−Ｉ＋１０％ＤＭＳＯ＋１０％ＦＢＳを用いて凍結保存した細胞と比べ、作製した保存液を用いて凍結保存した細胞はプレート中の接着細胞が多いことが示された。培養後、２８日目においてはＢａｍｂａｎｋｅｒ  ｈＲＭ、作製した保存液を用いて凍結保存を行った細胞が凍結保存をせずに培養した細胞と同様の密度となっていることが示された。一方で、Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ（登録商標）−Ｉ＋１０％ＤＭＳＯ＋１０％ＦＢＳを用いて凍結保存した細胞は密度が低下した。【００７７】
（Ｂ  細胞密度）
凍結保存したクライオチューブを３７℃の水浴中で１〜２分間溶かした。事前に３７℃で温めておいた基礎培地でヒト角膜内皮細胞を回収した。その後、ヒト角膜内皮細胞を１９０Ｇで５分間遠心分離し、上清を除去し、ヒト角膜内皮細胞を培地に懸濁させた。次に、細胞懸濁液にＹ−２７６３２を添加し、Ｌａｍｉｎｉｎ−５１１Ｅ８でコーティングを施した培養プレートに８００個／ｍｍ２の密度で細胞を播種した。播種後２８日目のコンフルエントに達した細胞を１×ＰＢＳ（−）で２回洗浄した後、３７℃（５％ＣＯ２）で３分間インキュベートした。その後、位相差顕微鏡を用いて倍率２００倍で写真を撮影し、計測ソフトであるＩｍａｇｅＪソフトウェア（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ）を使用することで細胞密度を測定した。まず、撮影した位相差顕微鏡写真をソフトに取り込み、カウント機能を用いて細胞数を数えた。細胞を１００個カウントしたところで解析を行い、細胞密度を測定した。検定はテューキー・クレーマーの多重比較検定を用いた。結果は平均±標準偏差として表した。【００７８】
（結果）
図５Ｂに結果を示す。凍結保存をせずに培養した細胞の細胞密度は１４５７  ｃｅｌｌｓ／ｍｍ２に対し、Ｂａｍｂａｎｋｅｒ  ｈＲＭ（アルブミン１％、ジメチルスルフォキシド１０％）、作製した保存液を用いて凍結保存を行った細胞の細胞密度はそれぞれ１３６２個／ｍｍ２、１３０１個／ｍｍ２と同等の密度が維持されていることが示された。一方で、Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ（登録商標）−Ｉ＋１０％ＤＭＳＯ＋１０％ＦＢＳを用いて凍結保存した細胞の細胞密度は１０７３個／ｍｍ２と有意に低下した。【００７９】
（実施例５：角膜内皮細胞移植）
本実施例では、本開示の方法に従って保存した角膜内皮細胞をウサギ水疱性角膜症モデルに移植した。【００８０】
（材料および方法）
（培養）
以下の実験には、ＳｉｇｈｔＬｉｆｅＴＭから提供されたドナー角膜から採取したヒト角膜内皮細胞を使用した。実験に使用する前に全ての角膜をＯｐｔｉｓｏｌ（Ｃｈｉｒｏｎ  Ｖｉｓｉｏｎ）中に入れ、４℃で１４日間未満保存した。角膜内皮を含むデスメ膜をドナー角膜から剥がし、１ｍｇ／ｍＬのコラゲナーゼＡ（Ｒｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ、１０  １０３  ５８６  ００１）と共に３７℃で１２時間消化した。その後、Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ（登録商標）−Ｉ（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、３１９８５−０８８）で３回洗浄した後、Ｌａｍｉｎｉｎ−５１１Ｅ８（ｉＭａｔｒｉｘ−５１１；Ｎｉｐｐｉ、  ８９２０１２）でコーティングを施した４８ウェルプレートの１ウェルに播種した。培養培地は以下のように調整した。簡潔には、４μｇ／ｍＬのマイトマイシンＣ（協和発酵キリン社製、４２３１４００Ｄ１０３１）で２時間処理したＮＩＨ−３Ｔ３細胞を２×１０４  ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２の細胞密度で培養プレートに播種した。ＮＩＨ−３Ｔ３細胞を、基礎培地と共に２４時間培養し、基礎培地を集めた。収集した基礎培地を０．２２μｍ濾過装置（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  、Ｒ７ＮＡ７５７７５）でろ過し、使用時に５ｎｇ／ｍＬの上皮成長因子（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＰＨＧ０３１１）、０．１ｍＭのアスコルビン酸（ＳＩＧＭＡ−Ａｌｄｒｉｃｈ、ＰＨＲ１００８）、１０μＭのＳＢ２０３５８０（Ｃａｙｍａｎ、１３０６７）、１μＭのＳＢ４３１５４２（ＷＡＫＯ、１９２−１６５４Ｉ）を添加してヒト角膜内皮細胞の培養に使用した。
基礎培地：Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ（登録商標）−Ｉ（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、３１９８５−０８８）＋８％ＦＢＳ（Ｔｈｅｒｍｏ、ＳＨ３００８４．０３）＋５ｎｇ／ｍＬ上皮成長因子（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＰＨＧ０３１１）＋２０μｇ／ｍＬアスコルビン酸（ＳＩＧＭＡ−Ａｌｄｒｉｃｈ、ＰＨＲ１００８）＋２００ｍｇ／Ｌ塩化カルシウム（ＳＩＧＭＡ−Ａｌｄｒｉｃｈ、４４９７０９）＋０．０８％コンドロイチン硫酸（ＷＡＫＯ、０３２−１４６１３）＋５０μｇ／ｍＬゲンタマイシン（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、１５７１０−０６４）【００８１】
（ヒト角膜内皮細胞の凍結保存）
ヒト角膜内皮細胞を培養中の培養皿から培地を除去し、事前に３７℃に温めておいた１×ＰＢＳ（−）（日水製粉株式会社、０５９１３）を添加し、洗浄を行った。この作業を２回繰り返した。再び１×ＰＢＳ（−）を添加し、３７℃（５％  ＣＯ２）で３分インキュベートした。ＰＢＳ（−）除去後、ＴｒｙｐＬＥＴＭＳｅｌｅｃｔ  Ｅｎｚｙｍｅ（１０Ｘ）（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、  Ａ１２１７７０１）を添加し、３７℃（５％  ＣＯ２）で１５分インキュベートした。その後、培地で懸濁し、２８０Ｇで３分間遠心することで細胞を回収した。細胞数を数えた後、ヒト角膜内皮細胞を２８０Ｇで３分間遠心分離した。上清を除去した後、Ｂａｍｂａｎｋｅｒ  ｈＲＭ（日本ジェネティクス株式会社、ＣＳ−０７−００１）（１ｍｌにつき５×１０５細胞）を添加した。その後、バイセル凍結処理容器（日本フリーザ株式会社、ＢＩＣＥＬＬ）を用いてヒト角膜内皮細胞を−８０℃で２４時間凍結させ、さらに液体窒素（−１９６℃）で５日間保存した。６日間凍結保存した。【００８２】
（移植用細胞の調製）
Ｂａｍｂａｎｋｅｒ  ｈＲＭを用いてヒト角膜内皮細胞６日間凍結保存した。凍結保存したクライオチューブを３７℃の水浴中で１〜２分間溶かした。事前に３７℃で温めておいた基礎培地を用いて２回ピペッティングを行い、ヒト角膜内皮細胞を回収した。その後、ヒト角膜内皮細胞を１９０Ｇで５分間遠心分離し、上清を除去し、ヒト角膜内皮細胞をＯｐｔｉ−ＭＥＭ（登録商標）−Ｉに５．０×１０５細胞／３００μｌの細胞濃度で再懸濁した。なお、Ｙ−２７６３２（和光純薬株式会社、２５３−００５１３）を最終濃度１００μＭとなるように添加した。【００８３】
（移植方法）
凍結保存した培養ヒト角膜内皮細胞を用い、ウサギ水疱性角膜症モデルを用いて、培養角膜内皮移植を行った。ウサギの角膜内皮を２０ゲージシリコーン針（Ｓｏｆｔ  Ｔａｐｅｒｅｄ  Ｎｅｅｄｌｅ；Ｉｎａｍｉ  ＆  Ｃｏ．，Ｌｔｄ．，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）を用いて機械的に剥離して水疱性角膜症モデルを作製した。水疱性角膜症モデルの前房内に、上記で作成した凍結保存後の培養ヒト角膜内皮細胞を、Ｙ−２７６３２を最終濃度１００μＭとなるように添加した３００μｌのＯｐｔｉ−ＭＥＭ（登録商標）−Ｉに懸濁された５．０×１０５細胞の凍結から起眠した培養ヒト角膜内皮細胞を注入し、うつむき姿勢を３時間取らせた。【００８４】
（組織学的試験）
ウサギから摘出した角膜組織を４％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ：ＷＡＫＯ、１６３−２０１４５）で１０分間室温（ＲＴ）で固定し、その後、１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００（ナカライテスク、２８７２２９−２５）で５分間透過処理を行い、２％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ：ＳＩＧＭＡ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ａ９４１８−５Ｇ）とともに１時間ブロッキングした。再生された角膜内皮組織の表現型を調べるために、１次抗体には細胞のバリア機能に関連するマーカーとしてＺＯ−１、Ｎ−カドヘリンおよび、ポンプ機能に関連するマーカーとしてＮａ＋／Ｋ＋−ＡＴＰａｓｅを使用した。ＺＯ−１、Ｎ−カドヘリンおよびＮａ＋／Ｋ＋−ＡＴＰａｓｅの染色は、それぞれ、ＺＯ−１（１：３００、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、３３−９１００）、Ｎ−カドヘリン（１：３００、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、６１０９２１）、Ｎａ＋／Ｋ＋−ＡＴＰａｓｅ（１：３００、メルクミリポア、０５−３６９）を使用した。二次抗体には、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５９４−コンジュゲート化ヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ａ−１１００５）のいずれかをＢＳＡで１：１０００に希釈し、使用した。また、アクチンは、１：４００に希釈したＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８−コンジュゲート化ファロイジン（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ａ１２３７９）を、核は１：１０００に希釈した４’、６−ジアミジノ−２−フェニルインドール二塩酸塩（ＤＡＰＩ：同人化学研究所、Ｄ５２３）を使用した。次いで、サンプルを共焦点顕微鏡（Ｌｅｉｃａ  Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ、ＤＭＩ４０００  Ｂ）で観察した。【００８５】
（結果）
図６は、凍結保存したヒト角膜内皮細胞を用いた培養角膜内皮移植後の組織学的検討結果を示す。図６に示すように、正常の角膜内皮細胞に発現する遺伝子産物が発現していた。詳細には、ポンプ機能を示すＮａ＋／Ｋ＋−ＡＴＰａｓｅおよびタイトジャンクションを示すＺＯ−１（バリア機能）が発現した。加えて、アドへレンスジャンクションを示すＮ−カドヘリンも正常に発現していることが示される。また、ファロイジン染色によればアクチン形態も正常のものと同様の多角形の一層の細胞であることが示された。以上から、凍結保存後の培養ヒト角膜内皮細胞を細胞注入することにより、生体内で正常な機能を有する角膜内皮組織を回復できることが明らかになった。これらの結果は、Ｂａｍｂａｎｋｅｒ  ｈＲＭが、ヒト角膜内皮細胞を凍結保存し、さらに凍結から起眠した細胞を培養などのプロセスを経ずにすぐに移植に使用できる、いわゆる”ready  to  use”の状態で提供できることを示している。【００８６】
（実施例６：角膜内皮細胞の細胞製剤の調製）
本実施例では、本開示に基づいて提供される角膜内皮細胞の細胞製剤の提供を実施する。
（方法および材料）
Ｂａｍｂａｎｋｅｒ  ｈＲＭを用いてヒト角膜内皮細胞３０日間凍結保存する。凍結保存したクライオチューブを３７℃の水浴中で１〜２分間溶かす。事前に３７℃で温めておいた基礎培地（例えば、Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ（登録商標）−Ｉ等）を用いて２回ピペッティングを行い、ヒト角膜内皮細胞を回収する。その後、ヒト角膜内皮細胞を１９０Ｇで５分間遠心分離し、上清を除去し、ヒト角膜内皮細胞をＯｐｔｉ−ＭＥＭ（登録商標）−Ｉに５．０×１０５細胞／３００μｌの細胞濃度で再懸濁する。なお、Ｙ−２７６３２（和光純薬株式会社、２５３−００５１３）を最終濃度１００μＭとなるように添加する。
（使用）
本実施例で調製される細胞製剤は、そのまま使用してもよく、リン酸緩衝化食塩水に溶液を好感した上で臨床応用してもよい。【００８７】
（実施例７：角膜内皮細胞の細胞製剤を用いた移植治療）
本実施例では、本開示の角膜内皮細胞の細胞製剤を用いた移植治療を実施する。【００８８】
実施例１〜５の技術を用いるか、または実施例６のように調製される細胞製剤を本実施例では用いる。【００８９】
水疱性角膜症患者の角膜内皮を直径約８ｍｍの範囲で２０ゲージシリコーン針（Ｓｏｆｔ  Ｔａｐｅｒｅｄ  Ｎｅｅｄｌｅ；Ｉｎａｍｉ  ＆  Ｃｏ．，Ｌｔｄ．，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）を用いて機械的に剥離する。その後、実施例６で準備した、凍結保存した培養ヒト角膜内皮細胞を２６Ｇ針を用いて前房内注入し、うつむき姿勢を３時間取らせる。【００９０】
培養ヒト角膜内皮細胞の効果は、当該分野で公知の任意の指標を用いて確認する。例えば、細胞密度の測定や、視力検査などの手法を用いて効果を確認することができる。【００９１】
以上のように、本開示の好ましい実施形態を用いて本開示を例示してきたが、本開示は、特許請求の範囲によってのみその範囲が解釈されるべきであることが理解される。本明細書において引用した特許、特許出願および文献は、その内容自体が具体的に本明細書に記載されているのと同様にその内容が本明細書に対する参考として援用されるべきであることが理解される。
本願は、２０１８年８月３１日に出願された日本国特許出願第２０１８−１６３２３８号の優先権の利益を請求し、その内容は参照によって本明細書に組み込まれる。
【産業上の利用可能性】
【００９２】
角膜内皮細胞を保存または保存前後の培養のための組成物が提供される。本開示の組成物は、高い細胞生存率および／または細胞密度で眼細胞を保存することが可能である。このように保存された眼細胞は細胞移植等に用いられ得るため、製薬等の分野において利用可能である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６】
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【国際調査報告】
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