(57)【要約】  発酵微生物の応答の最適化が可能な金属材料、発酵微生物の応答制御方法及び発酵食品の製造方法を提供する。金属材料は、発酵微生物の応答を制御するための平均結晶粒径を有する結晶粒により組織される。前記結晶粒の平均結晶粒径が１００ｎｍ以上１０μｍ以下であることが好ましい。前記金属材料がステンレス鋼であることが好ましい。前記発酵微生物の応答が、前記金属材料上での前記発酵微生物の吸着又は増殖であることが好ましい。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
発酵微生物の応答を制御するための平均結晶粒径を有する結晶粒により組織される金属材料。
【請求項２】
前記結晶粒の平均結晶粒径が１００ｎｍ以上１０μｍ以下である請求項１に記載の金属材料。
【請求項３】
前記金属材料がステンレス鋼である請求項１に記載の金属材料。
【請求項４】
前記発酵微生物の応答が、前記金属材料上での前記発酵微生物の吸着又は増殖である請求項１〜３のいずれか１項に記載の金属材料。
【請求項５】
前記発酵微生物を異なる平均結晶粒径の結晶粒を有する金属材料上で培養させ、前記平均結晶粒径に対する前記培養後の前記微生物の数のプロットの結果である応答プロファイルより決定した前記発酵微生物の最適な吸着又は増殖を与える平均結晶粒径を有する請求項１〜４のいずれか１項に記載の金属材料。
【請求項６】
前記発酵微生物は、乳酸菌、納豆菌、酢酸菌、麹菌及び酵母からなる群より選択される少なくとも１種である請求項１〜５のいずれか１項に記載の金属材料。
【請求項７】
結晶粒により組織される金属材料を用いて発酵微生物の応答を制御する方法であって、
前記結晶粒の平均結晶粒径が互いに異なる複数の前記金属材料を準備する工程、
前記複数の金属材料のそれぞれと前記発酵微生物とを接触させる工程、
前記接触後に前記金属材料の結晶粒の平均結晶粒径ごとの前記発酵微生物の応答プロファイルを取得する工程、及び
前記応答プロファイルに基づき前記発酵微生物の最適な応答を与える前記結晶粒の平均結晶粒径を決定する工程
を含む発酵微生物の応答制御方法。
【請求項８】
前記応答の制御は、前記金属材料上での前記発酵微生物の吸着又は増殖である請求項７に記載の発酵微生物の応答制御方法。
【請求項９】
前記応答プロファイルは、前記結晶粒の平均結晶粒径に対する前記接触後の前記発酵微生物の数のプロットである請求項８に記載の発酵微生物の応答制御方法。
【請求項１０】
前記最適な応答は、前記発酵微生物の数の最大化である請求項９に記載の発酵微生物の応答制御方法。
【請求項１１】
前記発酵微生物は、乳酸菌、納豆菌、酢酸菌、麹菌及び酵母からなる群より選択される少なくとも１種である請求項７〜１０のいずれか１項に記載の発酵微生物の応答制御方法。
【請求項１２】
前記結晶粒の平均結晶粒径が１００ｎｍ以上１０μｍ以下である請求項７〜１１のいずれか１項に記載の発酵微生物の応答制御方法。
【請求項１３】
前記金属材料がステンレス鋼である請求項７〜１２のいずれか１項に記載の発酵微生物の応答制御方法。
【請求項１４】
請求項１〜６のいずれか１項に記載の金属材料と発酵微生物とを接触させる工程を含む発酵食品の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、金属材料、発酵微生物の応答制御方法及び発酵食品の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
結晶粒を微細化した金属材料は、粗大な結晶粒を有する金属材料と比較して強度や靭性、耐食性等の特性に優れており、鋼板や医療機器等の各種産業用途に広く利用されている（例えば、特許文献１等）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】特開平２００５−１６９４５４号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
微細結晶粒を有する金属材料のさらなる用途展開として、昨今の健康やセルフケアの意識の高まりに鑑み、本願発明者らは新たに前記金属材料の食品関連用途、特に発酵食品関連用途への展開を試みている。前記金属材料をバイオリアクタやその構成部品、包装材等として利用することで発酵食品の高生産率化、高機能化を推進することが期待される。それには発酵微生物の応答ないし機能の最適化が求められるものの、作用因子が多岐にわたっており簡便かつ効率的な制御に至っていないのが実情である。【０００５】
本発明の目的は、発酵微生物の応答の最適化が可能な金属材料、発酵微生物の応答制御方法及び発酵食品の製造方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、前記課題を解決すべく鋭意検討したところ、金属材料によっては微生物との親和性に差異があるとの知見を得た。さらにこの知見に基づき検討した結果、下記構成を採用することにより上記目的を達成し得ることを見出し、本発明を完成するにいたった。【０００７】
本発明は、一実施形態において、発酵微生物の応答を制御するための平均結晶粒径を有する結晶粒により組織される金属材料に関する。【０００８】
本願発明者らは、金属材料を構成する結晶粒の粒径が金属材料と発酵微生物との親和性に影響を及ぼしているのではないかとの推測を立てた。そして、異なる平均結晶粒径を有する金属材料との接触による発酵微生物の応答の変化を追跡したところ、意外にも、結晶粒が特定の平均結晶粒径を有する場合に、発酵微生物の応答が顕著に変化することが判明した。当該金属材料を組織する結晶粒は、発酵微生物の応答を制御するための平均結晶粒径を有するので、当該金属材料を利用する発酵食品の製造プロセスにおいて微生物の応答の最適化を図ることができ、その結果、発酵食品の製造歩留まりの向上や発酵食品の高機能化を達成することができる。【０００９】
一実施形態において、前記結晶粒の平均結晶粒径が１００ｎｍ以上１０μｍ以下であることが好ましい。このような微細な結晶粒を用いることで、幅広い発酵微生物に対応することができるとともに、当該金属材料と発酵微生物との親和性を高めてより効率的な応答制御が可能となる。なお、結晶粒の平均結晶粒径の測定方法は実施例の記載による。【００１０】
一実施形態において、前記金属材料は、結晶粒の結晶粒径の制御容易性とともに、汎用性や入手容易性、加工性、低毒性に鑑み、ステンレス鋼であることが好ましい。【００１１】
一実施形態において、前記発酵微生物の応答が、前記金属材料上での前記発酵微生物の吸着又は増殖であることが好ましい。当該金属材料によると結晶粒が応答制御に適した平均結晶粒径を有するので、発酵微生物の応答として吸着又は増殖をも促進（すなわち制御）することができる。【００１２】
一実施形態において、当該金属材料は、前記発酵微生物を異なる平均結晶粒径の結晶粒を有する金属材料上で培養させ、前記平均結晶粒径に対する前記培養後の前記微生物の数のプロットの結果である応答プロファイルより決定した前記発酵微生物の最適な吸着又は増殖を与える平均結晶粒径を有することが好ましい。当該金属材料によれば、複雑なプロセスを経ることなく、異なる平均結晶粒径に対する発酵微生物の吸着数又は増殖数のプロットを得るだけで発酵微生物の応答の最適化を図ることができ、発酵微生物を利用するプロセス全体の効率化を達成することができる。【００１３】
一実施形態において、当該金属材料は、前記発酵微生物として代表的な乳酸菌、納豆菌、酢酸菌、麹菌及び酵母からなる群より選択される少なくとも１種の応答制御に好適に適用することができる。【００１４】
本発明は、別の実施形態において、結晶粒により組織される金属材料を用いて発酵微生物の応答を制御する方法であって、
前記結晶粒の平均結晶粒径が互いに異なる複数の前記金属材料を準備する工程、
前記複数の金属材料のそれぞれと前記発酵微生物とを接触させる工程、
前記接触後に前記金属材料の結晶粒の平均結晶粒径ごとの前記発酵微生物の応答プロファイルを取得する工程、及び
前記応答プロファイルに基づき前記発酵微生物の最適な応答を与える前記結晶粒の平均結晶粒径を決定する工程
を含む発酵微生物の応答制御方法に関する。【００１５】
当該応答制御方法は、金属材料を組織する結晶粒の平均結晶粒径に応じて発酵微生物の応答が変化し、平均結晶粒径に対する発酵微生物の応答プロファイルに特異性（極値）が生じるという新規な事象に基づくものである。当該応答制御方法では、異なる平均結晶粒径ごとの発酵微生物の応答のプロットにより得られる応答プロファイルにおける極値を読み取ることで、発酵微生物の最適な応答を与える結晶粒の平均結晶粒径を容易に決定することができ、発酵微生物の応答の最適化を効率的かつ簡便に達成することができる。【００１６】
別の実施形態において、前記応答の制御は、前記金属材料上での前記発酵微生物の吸着又は増殖であってもよい。このとき、前記応答プロファイルは、前記結晶粒の平均結晶粒径に対する前記接触後の前記発酵微生物の数のプロットであることが好ましい。さらに、前記最適な応答は、前記発酵微生物の数の最大化であることが好ましい。このようにして応答プロファイルの極値（この場合は極大値）を読み取ることで、発酵微生物の応答制御として数的な最大化を図ることができ、発酵プロセスに適した必要数の発酵微生物を簡易かつ安定的に提供することができる。【００１７】
別の実施形態において、当該応答制御方法は、前記発酵微生物として代表的な乳酸菌、納豆菌、酢酸菌、麹菌及び酵母からなる群より選択される少なくとも１種に好適に適用することができる。【００１８】
別の実施形態において、前記結晶粒の平均結晶粒径が１００ｎｍ以上１０μｍ以下であることが好ましい。このような微細な結晶粒を用いることで、幅広い発酵微生物に対応することができるとともに、当該金属材料と発酵微生物との親和性を高めてより効率的な応答制御が可能となる。【００１９】
別の実施形態において、前記金属材料がステンレス鋼であることが好ましい。ステンレス鋼は、結晶粒の結晶粒径の制御容易性とともに、汎用性や入手容易性、加工性、低毒性に優れるからである。【００２０】
本発明は、さらに別の実施形態において、当該金属材料と発酵微生物とを接触させる工程を含む発酵食品の製造方法に関する。【００２１】
当該製造方法では、発酵微生物の応答を制御可能な金属材料と発酵微生物とを接触させ、発酵微生物の応答を最適化することにより、発酵食品の製造の効率化や発酵食品の高機能化を促進することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１Ａ】結晶粒の平均結晶粒径に対して発酵微生物の応答量をプロットして得られる応答プロファイルの一例である。
【図１Ｂ】結晶粒の平均結晶粒径に対して発酵微生物の応答量をプロットして得られる応答プロファイルの別の一例である。
【図１Ｃ】結晶粒の平均結晶粒径に対して発酵微生物の応答量をプロットして得られる応答プロファイルのさらに別の一例である。
【図２】実施例１において板状の金属材料の平均結晶粒径に対して培養後の乳酸菌の数をプロットして得られた応答プロファイルである。
【図３】実施例２において板状の金属材料の平均結晶粒径に対して培養後の酵母の数をプロットして得られた応答プロファイルである。
【図４】実施例３において線状の金属材料の平均結晶粒径に対して培養後の乳酸菌の数をプロットして得られた応答プロファイルである。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
本発明の一実施形態に係る金属材料、発酵微生物の応答制御方法及び発酵食品の製造方法について以下に説明する。本発明はこれらの実施形態に限定されない。
【００２４】
《金属材料》
本実施形態に係る金属材料を組織する結晶粒は、発酵微生物の応答を制御するための平均結晶粒径を有する。本発明は、結晶粒が特定の平均結晶粒径を有する場合に、金属材料と接触する発酵微生物の応答が顕著に変化するという事象を利用した新規なコンセプトに基づくものである。発酵微生物の応答とは、発酵微生物を利用するプロセスにおいて目的とされる発酵微生物が示すあらゆる反応をいい、例えば、発酵微生物の増殖や固定化（吸着）、集合（凝集）、分散（離散）、場合によっては死滅とともに、発酵微生物からの発酵生成物（例えば、アルコール、乳酸、アミノ酸等）や機能性成分（例えば、タンパク質、脂質、ペプチド等）の産生、発酵微生物からの遺伝子の発現等が挙げられる。本実施形態に係る金属材料によれば、この金属材料を利用する発酵食品の製造プロセスにおいて微生物の応答の最適化を図ることができ、その結果、発酵食品の製造歩留まりの向上や発酵食品の高機能化を達成することができる。
【００２５】
なお、発酵微生物の応答を制御するための平均結晶粒径は、後述の発酵微生物の応答制御方法により求めることができる。
【００２６】
金属材料としては、食品関連用途において公知の材料を用いることができ、例えば、鉄、ステンレス鋼、アルミニウム、銀、銅、チタン、スズ、ニッケル、亜鉛、クロム又はこれらの合金等が挙げられる。中でも、結晶粒の結晶粒径の制御容易性とともに、汎用性や入手容易性、加工性、低毒性に鑑み、ステンレス鋼であることが好ましい。ステンレス鋼としては特に限定されず、マルテンサイト系ステンレス鋼、フェライト系ステンレス鋼、オーステナイト系ステンレス鋼、オーステナイト・フェライト系ステンレス鋼、析出硬化系ステンレス鋼のいずれであってもよい。
【００２７】
結晶粒の平均結晶粒径は、１００ｎｍ以上１０μｍ以下であることが好ましく、２００ｎｍ以上５μｍ以下であることがより好ましく、５００ｎｍ以上２μｍ以下がさらに好ましい。金属材料をこのような微細な結晶粒で組織することで、幅広い発酵微生物に対応することができるとともに、金属材料と発酵微生物との親和性を高めてより効率的な応答制御が可能となる。
【００２８】
結晶粒の平均結晶粒径の調整方法としては公知の微細化方法を採用することができ、例えば、微細化前の金属原料の圧延加工、剪断加工、圧縮加工、変形加工又はこれらの組み合わせ等が挙げられる。その際、冷却又は加熱を行ってもよく、特定ガス（酸素、窒素等）の存在下又は非存在下の雰囲気中で行ってもよい。一般的には、塑性変形に続く加熱、冷却による再結晶により微細化が進行する。上記手順を単回行うか、又は複数回繰り返すことで所望の平均結晶粒径を得ることができる。
【００２９】
金属材料の形状は特に限定されず、例えば、板状、線状、棒状、球状、筒状等の任意の形状を採用することができる。
【００３０】
発酵微生物としては、発酵食品に利用される微生物であれば特に限定されない。食品に対して都合のよい作用を及ぼす発酵微生物又は人体に対して有益な作用を及ぼす因子を生成する発酵微生物が好ましく、中でも、発酵微生物は、乳酸菌、納豆菌、酢酸菌、麹菌及び酵母からなる群より選択される少なくとも１種であることが好ましい。
【００３１】
《発酵微生物の応答制御方法》
本実施形態に係る発酵微生物の応答制御方法は、上述した結晶粒により組織される金属材料を用いて発酵微生物の応答を制御する方法である。当該方法は、金属材料準備工程、接触工程、応答プロファイル取得工程、及び平均結晶粒径決定工程を含む。以下、各工程について順に説明する。
【００３２】
（金属材料準備工程）
本工程では、結晶粒の平均結晶粒径が互いに異なる複数の金属材料を準備する。例えば、結晶粒の平均結晶粒径を１００ｎｍから１０μｍまでの範囲内に調整したステンレス鋼を複数準備する。平均結晶粒径の点数は多い方が発酵微生物の応答のプロファイルの極値の読み取りが容易となる点で好ましい。金属材料が板状の場合の代表的な平均結晶粒径の値としては０．５μｍ（５００ｎｍ）、１μｍ、１．５μｍ、２μｍ、３μｍ、９μｍ等が挙げられる。金属材料が線状（ワイヤ状）の代表的な平均結晶粒径の値としては、０．５μｍ〜０．８μｍ、１μｍ〜２μｍ、２μｍ〜３μｍ、４μｍ〜６μｍ、８μｍ〜１０μｍのそれぞれの範囲から選ばれる値等が挙げられる。
【００３３】
（接触工程）
本工程では、複数の金属材料のそれぞれと発酵微生物とを接触させる。接触の態様は特に限定されず、金属材料の表面に発酵微生物を直接載置してもよく、発酵微生物の分散液（又は懸濁液）を金属材料の表面に載置してもよく、発酵微生物の分散液（又は懸濁液）中に金属材料を投入してもよく、金属材料で形成された容器中に発酵微生物（発酵微生物の分散液を含む。）を収容してもよい。必要に応じて、加温、冷却、攪拌、振とう等の処理を併せて行ってもよい。目的とする発酵微生物の応答に応じて適宜接触態様を選択することができる。
【００３４】
以下、発酵微生物として乳酸菌を用いる接触の態様を説明する。他の発酵微生物についても技術常識を利用して諸条件を設定すればよい。
【００３５】
接触時間としては、目的とする発酵微生物（この場合は乳酸菌である。以下同様。）の応答が十分得られる時間であればよい。発酵微生物の応答が得られるまでの時間として、秒や分単位の短時間から、週や月といった長時間の接触時間を採用し得る。一般的な接触時間としては、例えば種菌培養又は植菌の際は、通常１秒以上２４時間以下であり、好ましくは１分以上２０時間以下であり、より好ましくは１時間以上１８時間以下である。また、例えば、食品製造（発酵）の際は、通常１２時間以上６週間以下であり、好ましくは１日以上４週間以下であり、より好ましくは３日以上３週間以下である。
【００３６】
接触時の温度条件としては、例えば種菌培養及び食品製造（発酵）の場合、好ましくは２０℃以上５０℃以下であり得る。
【００３７】
その他の接触時の条件は、限定されるものではないが、発酵微生物が嫌気性細菌の場合、無通気状態で静置又は弱攪拌して接触させることが好ましい。微生物以外の成分やｐＨを均一に保つためにも、弱撹拌（培地が泡立たない程度の撹拌）で接触させ、培養を行うこともできる。
【００３８】
発酵微生物が好気性細菌の場合、大気雰囲気下で静置又は弱攪拌して接触させることが好ましい。微生物以外の成分やｐＨを均一に保つためにも、弱撹拌（培地が泡立たない程度の撹拌）で接触させ培養を行うこともできる。接触時の溶存酸素量は、菌に合わせて、適宜調整できる。
【００３９】
接触時の環境のｐＨは４〜８、好ましくは４．３〜７、より好ましくは４．５〜６に制御すればよい。
【００４０】
接触は、グルコース、フルクトース等の炭素源、ポリペプトン、酵母エキス、麦芽エキス等の窒素源、ビタミン、無機塩類を含む培地中又は栄養素を含む食品材料（例えば乳成分）と共に行うことができる。より詳細には、以下の栄養源を使用することが可能である。
【００４１】
（１）炭素源
炭素源としては、グルコース、フルクトース等の単糖類；ラクトース、スクロース、マルトース等の二糖類；オリゴ糖類、セルロース、アミロース、キチン、アガロース等の多糖類；酢酸、プロピオン酸等の有機酸；エタノール、プロパノール等のアルコール類が挙げられる。これらの中でもグルコース、フルクトース、ラクトース、スクロース、マルトース等が好ましく、グルコース、ラクトース、マルトースがより好ましい。
【００４２】
接触時における炭素源の濃度は特に限定されない。例えば、０．５〜２０（ｗ／ｖ）％、好ましくは２〜１５（ｗ／ｖ）％、より好ましくは５〜１３（ｗ／ｖ）％とすることができる。
【００４３】
（２）窒素源
（ｉ）ペプトン
ペプトンとは、タンパク質を加水分解、酵素分解又は発酵することによって得られる、アミノ酸が複数結合した物質をいう。由来によって様々なペプトンが存在し、例えば、肉エキス、カゼインペプトン、魚肉ペプトン、大豆ペプトン、エンドウ豆ペプトン、小麦ペプトン、大麦ペプトン、綿実ペプトン等が挙げられる。本発明では、これらの中でもカゼインペプトン、大豆ペプトンを用いることが好ましい。
【００４４】
ペプトンの培地中における濃度は特に限定されない。０．５〜１０（ｗ／ｖ）％、好ましくは０．８〜８（ｗ／ｖ）％、より好ましくは１〜５（ｗ／ｖ）％の範囲とすればよい。
【００４５】
（ｉｉ）酵母エキス
酵母エキスとは、酵母の有効成分を自己消化、酵素処理、熱水処理等で抽出したものをいう。例えば、パン酵母、ビール酵母、トルラ酵母由来のものが挙げられ、本発明ではいずれの酵母を用いてもよい。
【００４６】
酵母エキスの培地中における濃度は特に限定されない。０．２〜１０（ｗ／ｖ）％、好ましくは０．５〜８（ｗ／ｖ）％、より好ましくは０．８〜４（ｗ／ｖ）％の範囲とすればよい。
【００４７】
（３）無機塩類
接触時に存在し得る無機塩類の種類は、特には限定されない。例えば、カリウム、マグネシウム、ナトリウム、カルシウム、マンガン、コバルト、ニッケル、モリブデン、タングステン、鉄、亜鉛、銅等の、酢酸、リン酸、硫酸、炭酸、塩化物等の塩が挙げられる。これらの中でも、塩化カリウム、リン酸２水素カリウム、リン酸水素２カリウム、硫酸マグネシウム、リン酸マグネシウム、塩化ナトリウム、酢酸ナトリウム、塩化カルシウム、炭酸カルシウム、硫酸マンガン、硫酸第一鉄、硫酸亜鉛、硫酸銅からなる群から選ばれる少なくとも１種が好ましい。
【００４８】
これら無機塩類の添加量は限定されず、当業者が適宜選択することができる。例えば、複数の無機塩類を使用する場合、その合計量として、０．１〜１．６（ｗ／ｖ）％、好ましくは０．３〜１．３（ｗ／ｖ）％、より好ましくは０．５〜１（ｗ／ｖ）％とすればよい。
【００４９】
（４）その他
その他、ビタミンや、接触時の発泡を防ぐための消泡剤等を添加してもよい。
【００５０】
（応答プロファイル取得工程）
本工程では、金属材料と発酵微生物との接触後に、金属材料の結晶粒の平均結晶粒径ごとの発酵微生物の応答プロファイルを取得する。ｘ軸に結晶粒の平均結晶粒径をとり、ｙ軸に発酵微生物の応答量の種類に応じた項目をとって二次元プロットを作成することで発酵微生物の応答プロファイルを取得することができる。さらに、ｘ軸に結晶粒の平均結晶粒径をとり、応答量に影響を及ぼす他の因子（例えば、温度等）をｙ軸にとり、ｚ軸に発酵微生物の応答量の種類に応じた項目をとって三次元プロットを作成してもよい。発酵微生物の応答量に対応する項目としては、上述のような発酵微生物の（増殖）数や金属材料への固定化数（吸着数）、集合度（凝集度）、分散度（離散度）、発酵微生物からの機能性成分（例えば、タンパク質、遺伝子等）の産生量や発現量等が挙げられる。
【００５１】
図１Ａ、図１Ｂ及び図１Ｃは、それぞれ、結晶粒の平均結晶粒径に対して発酵微生物の応答量をプロットして得られる応答プロファイルの一例である。図１Ａでは、平均結晶粒径がｄ１のときに発酵微生物の応答量が極大値（この場合は最大値）ｒ１をとることが読み取れる。図１Ｂでは、図１Ａとは反対に、平均結晶粒径がｄ１のときに発酵微生物の応答量が極小値（この場合は最小値）ｒ２をとることが読み取れる。図１Ｃでは、平均結晶粒径がｄ２及びｄ３のときにそれぞれ発酵微生物の応答量が２つの極大値ｒ３及びｒ４をとることが読み取れる（この場合、最大値はｒ４である。）。なお、各図では応答量を平滑線で結んだ散布図を示しているものの、これに限定されず棒グラフやその他の任意の方法で表示することができる。
【００５２】
（平均結晶粒径決定工程）
本工程では、上記手順で得られた応答プロファイルに基づき発酵微生物の最適な応答を与える結晶粒の平均結晶粒径を決定する。最適な応答であるか否かの判断は応答の種類によって行えばよい。図１Ａ、図１Ｂ及び図１Ｃを参照しつつ、この決定手順を説明する。
【００５３】
発酵微生物の応答が、例えば、発酵微生物の増殖や金属材料への固定化（吸着）、機能性成分の産生等であれば、それらの応答量は一般的に増大する方向が好ましい。従って、発酵微生物の最適な応答を与える結晶粒の平均結晶粒径は、図１Ａや図１Ｃの応答プロファイルから極大値を与える平均結晶粒径を読み取ることで得られる。言い換えると、図１Ａでは、発酵微生物の増殖や固定化、機能性成分の産生に最適な平均結晶粒径はｄ１であるといえる。なお、図１Ｃでは、２つある極大値のうちのより応答量の大きいｒ４を与える平均結晶粒径ｄ３を読み取って発酵微生物の増殖等に最適な平均結晶粒径としてもよい。あるいは、２つの極大値（応答量ｒ３及びｒ４）が所定の基準を満たしていると判断できるのであれば、平均結晶粒径ｄ２及びｄ３のいずれをも発酵微生物の増殖等に最適な平均結晶粒径とすることができる。
【００５４】
このようにして応答プロファイルの極値（この場合は極大値）を読み取ることで、発酵微生物の応答制御として数的又は量的な最大化を図ることができ、発酵プロセスに適した必要数の発酵微生物を簡易かつ安定的に提供することができる。
【００５５】
発酵微生物の応答が、例えば、発酵微生物の凝集等であれば、それらの応答量は一般的に減少ないし抑制する方向が好ましい。従って、発酵微生物の最適な応答を与える結晶粒の平均結晶粒径は、図１Ｂの応答プロファイルから極小値を与える平均結晶粒径を読み取ることで得られる。言い換えると、図１Ｂでは、発酵微生物の凝集の抑制に最適な平均結晶粒径はｄ１であるといえる。
【００５６】
《発酵食品の製造方法》
本実施形態に係る発酵食品の製造方法は、金属材料と発酵微生物とを接触させる工程を含む。発酵食品としては特に限定されず、原材料を発酵微生物の作用により発酵させる発酵プロセスを経て得られる食品全般を含む。具体例としては、ヨーグルト、乳酸菌飲料、チーズ、パン、納豆、醤油、味噌、漬物、鰹節、紅茶、キムチ、酒、醸造酢等が挙げられる。
【００５７】
一般的には、発酵食品の製造方法は、原材料を準備する工程（準備工程）、原材料と発酵微生物とを接触させて発酵用原材料を調製する工程（調製工程）、及び発酵用原材料を発酵させる工程（発酵工程）を含む。さらに本実施形態に係る発酵食品の製造方法は、発酵微生物を培養する工程（培養工程）を含む。金属材料と発酵微生物とを接触させる工程は、これらの発酵プロセスのいずれの段階で設けてもよいものの、培養工程及び発酵工程の少なくとも１つの工程であることが好ましい。このような工程において金属材料と発酵微生物とを接触させて発酵微生物の最適応答を惹起することで、発酵食品の製造の効率化や発酵食品の高機能化を促進することができる。
【００５８】
以下、一具体例として、ヨーグルトの製造方法を説明する。まず、原材料として乳原料を準備する。乳原料は、乳を原料とした素材であれば特に制限されず、牛乳、山羊乳等の乳の他に、脱脂粉乳、練乳、生クリーム、乳蛋白等も用いることができる。これら乳原料に、必要に応じて糖質、安定剤、乳化剤、酸味料、ｐＨ調整剤、着香料、着色料、風味調整剤、酸化防止剤等を配合してもよい。
【００５９】
次に、準備した乳原料と乳酸菌とを接触させて発酵用原材料を調製する。乳酸菌（スターターとも称される。）としては、特に限定されず、一般的にヨーグルトの製造に使用されるものを用いることができる。例えば、ラクトバチルス・カゼイ、ラクトバチルス・アシドフィルス、ラクトバチルス・ガッセリ、ラクトバチルス・ゼアエ、ラクトバチルス・ジョンソニー、ラクトバチルス・デルブッキー、ラクトバチルス・ブルガリカス等のラクトバチルス属細菌、ストレプトコッカス・サーモフィルス、ストレプトコッカス・クレモリス、ストレプトコッカス・ラクチス、ストレプトコッカス・ジアセチラクチス等のストレプトコッカス属細菌、ラクトコッカス・ラクチス、ラクトコッカス・プランタラム、ラクトコッカス・ラフィノラクチス等のラクトコッカス属細菌、ロイコノストック・メセンテロイデス、ロイコノストック・ラクチス、ロイコノストック・クレモリス等のロイコノストック属細菌、エンテロコッカス・フェーカリス、エンテロコッカス・フェシウム等のエンテロコッカス属細菌、ペディオコッカス・クレモリス等のペディオコッカス属細菌等を採用することができる。これらを１種または２種以上組み合わせて用いることができる。
【００６０】
続いて、発酵用原材料を容器に充填して発酵を行う。発酵は、原材料や乳酸菌によって異なるが、２５〜４５℃で２〜７２時間行う。本実施形態では、容器の材料として上述の金属材料を好適に用いることができる。
【００６１】
上記に加え、別途、乳酸菌の種菌の培養を行ってもよい。
【００６２】
《他の実施形態》
他の実施形態について、以下に例示する。
［１］結晶粒により組織される金属材料を用いる発酵食品の製造方法であって、
前記結晶粒の平均結晶粒径が互いに異なる複数の前記金属材料を準備する工程、
前記複数の金属材料のそれぞれと発酵微生物とを接触させる工程、
前記接触後に前記金属材料の結晶粒の平均結晶粒径ごとの前記発酵微生物の応答プロファイルを取得する工程、
前記応答プロファイルに基づき前記発酵微生物の最適な応答を与える前記結晶粒の平均結晶粒径を決定する工程、及び
前記決定された前記発酵微生物の最適な応答を与える前記結晶粒の平均結晶粒径を有する前記金属材料と前記発酵微生物とを接触させる工程
を含む発酵食品の製造方法。
［２］結晶粒により組織される金属材料を用いる発酵食品の製造方法であって、
前記結晶粒の平均結晶粒径が１００ｎｍ以上１０μｍ以下である金属材料と発酵微生物とを接触させる工程を含み、
前記接触により前記発酵微生物の個体数を増加させる発酵食品の製造方法。
［３］前記発酵微生物は、乳酸菌、納豆菌、酢酸菌、麹菌及び酵母からなる群より選択される少なくとも１種である［１］又は［２］に記載の発酵食品の製造方法。
［４］前記結晶粒の平均結晶粒径が１００ｎｍ以上１０μｍ以下である［１］に記載の発酵食品の製造方法。
［５］前記金属材料がステンレス鋼である［１］〜［４］のいずれか１項に記載の発酵食品の製造方法。
【００６３】
［６］結晶粒の平均結晶粒径が１μｍ未満である金属材料を準備する工程、及び
前記金属材料と酵母とを接触させる工程
を含む酵母の個体数を増加させる方法。
［７］前記平均結晶粒径が０．３〜０．８μｍである［６］に記載の酵母の個体数を増加させる方法。
【００６４】
［８］結晶粒の平均結晶粒径が１μｍ以上である金属材料を準備する工程、及び
前記金属材料と乳酸菌とを接触させる工程
を含む乳酸菌の個体数を増加させる方法。
［９］前記平均結晶粒径が１．２〜１．８μｍである［８］に記載の乳酸菌の個体数を増加させる方法。
【実施例】
【００６５】
以下、本発明に関して実施例を用いて詳細に説明するが、本発明はその要旨を超えない限り、以下の実施例に限定されるものではない。【００６６】
＜実施例１：金属材料（板状）に対する乳酸菌の吸着＞
《金属材料の準備》
ステンレス鋼（ＳＵＳ３０４）の圧延処理及び加熱再結晶にて結晶粒の平均結晶粒径を０．５μｍ、１μｍ、１．５μｍ、２μｍ、３μｍ、９μｍに調整した金属材料をそれぞれ用意した。金属材料の形状は、長さ１０ｍｍ×幅１０ｍｍ×厚さ０．１ｍｍの板状であった。圧延処理及び加熱再結晶は次の手順で行った。すなわち、ステンレス鋼（ＳＵＳ３０４）を回転ミルに複数回通過させて約４０〜６５％まで冷間圧延させ（１回につき約３〜１５％の圧縮率）、次いで焼鈍を６００〜８５０℃で１０〜１００秒間行う（昇温速度２００℃／秒）ことで再結晶させ、最後に冷却して（冷却速度２００〜４００℃／秒）オーステナイト系ステンレス鋼を得た。【００６７】
《平均結晶粒径の測定》
金属材料の平均結晶粒径は、上記で準備した金属材料の試験サンプルをイオン研磨装置（日立ハイテクノロジーズ社製、「ＩＭ４０００」）によりアルゴンイオンによる研磨を行ったのち、結晶方位解析機能を持った電子顕微鏡（日立ハイテクノロジーズ社製、「ＳＵ−７０」）により常温、真空環境（１×１０−３Ｐａ）にて測定を行った。各結晶粒のサイズの決定は、ある任意の測定範囲（すなわち観察画像；倍率１０００倍）にある一つ一つの結晶粒の面積を求め、その面積と同じ面積を有する円を想定したときのその円の直径を算出することで行った。結晶粒の面積の算出及び同面積の円の直径の算出は、画像処理装置（ＴＳＬソリューションズ社製、「ＴＳＬ  ＯＭＩ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ７」）を用いて行った。次いで、その任意の測定範囲にあるすべての結晶粒径の和を結晶粒の数で除したものを平均結晶粒径（ｎｍ）とした。【００６８】
《乳酸菌の金属材料（板状）への吸着数の測定》
ヨーグルト材料として、市販の「ｍｅｉｊｉ  プロビオヨーグルトＬＧ２１  砂糖ゼロ」（ＬＧ２１  Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｇａｓｓｅｒｉ  ＯＬＬ  ２７１６（グラム陽性桿菌  通性嫌気性菌）含有）を準備した。シャーレにヨーグルトを展開し、各平均結晶粒径の金属材料をヨーグルトに完全に埋没させて３５±２℃、２４時間吸着反応を行った。コントロールとしてポリプロピレンフィルム（金属材料と同形状）をヨーグルトに埋没させた。吸着反応後、２〜３ｍＬのＰＢＳ（滅菌済み）で直接洗浄し、さらに１５ｍＬのＰＢＳ（滅菌済み）で２回洗浄した。次いで、５ｍＬのＰＢＳ（滅菌済み）中でボルテックスに４０秒間かけて乳酸菌を遊離させた。これを原液のまま及び１０倍希釈したものをそれぞれ３Ｍ社製「３Ｍペトリフィルム培地  乳酸菌数測定用プレート（ＬＡＢプレート）」上に展開した。コントロールとして、ヨーグルトを１０６倍希釈したものと１０７倍希釈したものとを用意した。最後に３５℃で４６時間培養し、培養後の乳酸菌をステンレス鋼片１ｃｍ２当たりに吸着していた乳酸菌数（ＣＦＵ／ｃｍ２（ＣＦＵ：コロニーフォーミングユニット））としてカウントした。【００６９】
結果を図２に示す。図２は、実施例１において平均結晶粒径に対して培養後の乳酸菌の数をプロットして得られた応答プロファイルである。図２より、乳酸菌の金属材料への吸着数は、平均結晶粒径が１．５μｍ、３μｍ及び９μｍの場合に相対的に増加していた。なお、コントロールのポリプロピレンフィルムでは１８８ＣＦＵ／ｃｍ２であった。特に、平均結晶粒径が１．５μｍの場合に最大値をとっており、乳酸菌の吸着に最適な平均結晶粒径は１．５μｍであるとことが分かった。この結果を応用すれば、例えば、通性嫌気性菌のように酸素不存在下にて発酵によりエネルギーを獲得する発酵微生物について、金属材料への吸着数を計測することにより、発酵微生物による発酵の進行度の指標が得られる可能性があることが示された。【００７０】
＜実施例２：金属材料（板状）に対する酵母の吸着＞
《金属材料の準備》
実施例１と同様の金属材料を用いた。【００７１】
《酵母の金属材料への吸着数の測定》
試験用に、市販の「株式会社パイオニア企画  ドライイースト」１包分（３ｇ）を３７℃±２℃にて平衡化させた３０ｍＬのＰＢＳ（滅菌済み）に溶かした。そのうち３ｍＬを「株式会社パイオニア企画  スキムミルク」１包分（６ｇ）を３００ｍＬの蒸留水に溶かしたスキムミルク液（滅菌済み、２５℃±２℃で平衡化）中に均一に混ぜ、反応液を準備した。反応液をシャーレに展開し、各平均結晶粒径の金属材料を反応液に完全に埋没させて３５±２℃、２時間吸着反応を行った。コントロールとしてポリプロピレンフィルム（金属材料と同形状）を反応液に埋没させた。吸着反応後、２〜３ｍＬのＰＢＳ（滅菌済み）で直接洗浄し、さらに１５ｍＬのＰＢＳ（滅菌済み）で２回洗浄した。次いで、５ｍＬのＰＢＳ（滅菌済み）中でボルテックスに４０秒間かけて酵母を遊離させた。これを原液のまま及び１０倍希釈したものをそれぞれ３Ｍ社製「３Ｍペトリフィルム  カビ・酵母迅速測定用プレート（ＲＹＭプレート）」上に展開した。コントロールとして、反応液を１０４倍希釈したものと１０５倍希釈したものとを用意した。最後に２５℃±２℃で４８時間培養し、培養後の酵母をステンレス鋼片１ｃｍ２当たりに吸着していた酵母数（ＣＦＵ／ｃｍ２（ＣＦＵ：コロニーフォーミングユニット））としてカウントした。【００７２】
結果を図３に示す。図３は、実施例２において平均結晶粒径に対して培養後の酵母の数をプロットして得られた応答プロファイルである。図３より、酵母の金属材料への吸着数としては、平均結晶粒径が０．５μｍの場合に最大値をとっており、酵母の吸着に最適な平均結晶粒径は０．５μｍであることが分かった。なお、コントロールのポリプロピレンフィルムでは４７２５ＣＦＵ／ｃｍ２であった。この結果を応用すれば、発酵によりエネルギーを獲得する真菌類について、金属材料への吸着数を計測することにより、真菌類による発酵の進行度の指標が得られる可能性があることが示された。【００７３】
＜実施例３：金属材料（線状）に対する乳酸菌の吸着＞
《金属材料の準備》
ステンレス鋼（ＳＵＳ３１６Ｌ）の圧延処理及び加熱再結晶にて結晶粒の平均結晶粒径を０．７μｍ、１．５μｍ、２．８μｍ、４．９μｍ、９．６μｍに調整した金属材料をそれぞれ用意した。金属材料の形状は、直径１ｍｍ、長さ１３ｍｍの線状（ワイヤ状）であった。圧延処理及び加熱再結晶は次の手順で行った。すなわち、ステンレス鋼（ＳＵＳ３１６Ｌ）を回転ミルに複数回通過させて約４０〜６５％まで冷間圧延させ（１回につき約３〜１５％の圧縮率）、次いで焼鈍を６００〜８５０℃で１０〜３６００秒間行う（昇温速度２００℃／秒）ことで再結晶させ、最後に冷却して（冷却速度２００〜４００℃／秒）オーステナイト系ステンレス鋼を得た。なお、平均結晶粒径は実施例１と同様の手順で測定した。【００７４】
《乳酸菌の金属材料（線状）への吸着数の測定》
ヨーグルト材料として、市販の「ｍｅｉｊｉ  プロビオヨーグルトＬＧ２１  砂糖ゼロ」（ＬＧ２１  Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｇａｓｓｅｒｉ  ＯＬＬ  ２７１６（グラム陽性桿菌  通性嫌気性菌）含有）を準備した。シャーレにヨーグルトを展開し、各平均結晶粒径の金属材料をヨーグルトに完全に埋没させて３５±２℃、２時間吸着反応を行った。コントロールとして市販のＳＵＳ３１６Ｌ製で金属材料と同形状のもの（平均結晶粒径１７．４μｍ）を反応液に埋没させた。吸着反応後、１５ｍＬのＰＢＳ（滅菌済み）で２回洗浄し、その後１ｍＬのＰＢＳで軽くリンスした。次いで、５ｍＬのＰＢＳ（滅菌済み）中でボルテックスに４０秒間かけて乳酸菌を遊離させた。これを原液のまま及び１０倍希釈したものをそれぞれ３Ｍ社製「３Ｍペトリフィルム培地  乳酸菌数測定用プレート（ＬＡＢプレート）」上に展開した。コントロールとして、ヨーグルトを１０６倍希釈したものと１０７倍希釈したものとを用意した。最後に３５℃で４８時間培養し、培養後の乳酸菌をステンレス鋼片１ｍｍ２当たりに吸着していた乳酸菌数（ＣＦＵ／ｍｍ２（ＣＦＵ：コロニーフォーミングユニット））としてカウントした。【００７５】
結果を図４に示す。図４は、実施例３において平均結晶粒径に対して培養後の乳酸菌の数をプロットして得られた応答プロファイルである。図４より、乳酸菌の金属材料への吸着数は、平均結晶粒径が１．５μｍ、４．９μｍ及び９．６μｍの場合に相対的に増加していた。なお、コントロールの吸着数は１．２ＣＦＵ／ｍｍ２であった。これは、コントロールの市販のＳＵＳ３１６Ｌ材では平均結晶粒径が大きく、結晶粒径にも大きなバラツキがあり、乳酸菌が吸着している箇所と吸着していない箇所とが混在していたことが一因であると推測される。特に、平均結晶粒径が１．５μｍの場合に最大値をとっており、乳酸菌の吸着に最適な平均結晶粒径は１．５μｍであることが分かった。この結果を応用すれば、例えば、通性嫌気性菌のように酸素不存在下にて発酵によりエネルギーを獲得する発酵微生物について、金属材料への吸着数を計測することにより、発酵微生物による発酵の進行度の指標が得られる可能性があることが示された。
【図１Ａ】
2020067392.tif 000003
【図１Ｂ】
2020067392.tif 000004
【図１Ｃ】
2020067392.tif 000005
【図２】
2020067392.tif 000006
【図３】
2020067392.tif 000007
【図４】
2020067392.tif 000008
【国際調査報告】
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