(57)【要約】  タンキラーゼ阻害剤に対する感受性を高め、その効果を増強することができる合成致死因子の探索を行った。その結果、ＴＭＥＤ１０がタンキラーゼ阻害剤の合成致死因子として機能することを見出した。ＴＭＥＤ１０の発現を抑制すること、あるいはその機能である小胞輸送を阻害することによって、タンキラーゼ阻害剤に対する感受性を高め、細胞増殖を抑制することができる。新しいコンセプトの抗がん剤を提供することができる。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
タンキラーゼ阻害剤感受性を検査する方法であって、
ＴＭＥＤ１０の発現又は変異を検査することを特徴とする検査方法。
【請求項２】
前記ＴＭＥＤ１０の発現又は変異は、
ＲＮＡ発現、もしくはタンパク質発現、又は遺伝子配列、もしくはアミノ酸配列を検査することを特徴とする請求項１記載の検査方法。
【請求項３】
腫瘍組織、血液循環腫瘍細胞又はエクソソームにおいて、
前記ＴＭＥＤ１０の発現又は変異を検査することを特徴とする請求項１、又は２記載の検査方法。
【請求項４】
対象となる腫瘍が、
タンキラーゼの活性化、又はタンキラーゼによってＰＡＲ化（ポリＡＤＰ−リボシル化）されるタンパク質が起因する腫瘍であることを特徴とする請求項１〜３いずれか１項記載の検査方法。
【請求項５】
タンキラーゼ阻害剤の効果を増強する医薬組成物であって、
ＴＭＥＤ１０の発現又は機能を抑制する化合物を有効成分とする医薬組成物。
【請求項６】
前記有効成分が核酸であって、
ＴＭＥＤ１０のｓｉＲＮＡ、又はｓｈＲＮＡであることを特徴とする請求項５記載の医薬組成物。
【請求項７】
前記有効成分が、小胞輸送の阻害剤である請求項５記載の医薬組成物。
【請求項８】
前記医薬組成物の対象とする疾患がタンキラーゼの活性化、又はタンキラーゼによってＰＡＲ化されるタンパク質が起因する腫瘍である請求項５〜７いずれか１項記載の医薬組成物。
【請求項９】
ＴＭＥＤ１０発現又は機能を抑制する化合物と、
タンキラーゼ阻害剤を有効成分とする医薬組成物。
【請求項１０】
前記医薬組成物の対象とする疾患がタンキラーゼの活性化、又はタンキラーゼによってＰＡＲ化されるタンパク質が起因する腫瘍である請求項９記載の医薬組成物。
【請求項１１】
ＴＭＥＤ１０の発現、又は機能阻害を指標として、
タンキラーゼ阻害剤の効果を増強する化合物をスクリーニングする方法。
【請求項１２】
前記機能阻害が、
ゴルジ体の形態変化、又は小胞輸送阻害である請求項１１記載のスクリーニング方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、タンキラーゼ阻害剤が効果のある患者を検査する方法、その効果を増強する薬剤、及びスクリーニング方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ポリＡＤＰ−リボシル化（ＰＡＲ化）は、タンパク質に最も大きな物性変化を与える翻訳後修飾の一つで、ＰＡＲＰ［ｐｏｌｙ（ＡＤＰ−ｒｉｂｏｓｅ）  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｓ］と呼ばれる一群の酵素によって触媒される生化学反応である。ＰＡＲＰは核ＤＮＡに生じた一本鎖切断端を認識してＤＮＡに結合しＰＡＲ化を引き起こす。ＰＡＲ化は、ＤＮＡ修復反応を活性化し、ゲノムの安定性や遺伝子転写制御をはじめ、様々な生物学的事象の調節に寄与することが知られている。【０００３】
ＰＡＲＰファミリーは、現在１７の遺伝子が知られているが、その一つにテロメラーゼのテロメア伸長機能を促進するタンキラーゼ（ｔａｎｋｙｒａｓｅ）が存在する。タンキラーゼには、タンキラーゼ−１（ｔａｎｋｙｒａｓｅ−１／ＰＡＲＰ−５ａ）、タンキラーゼ−２（ｔａｎｋｙｒａｓｅ−２／ＰＡＲＰ−５ｂ）という２種の酵素があり、テロメアタンパク質ＴＲＦ１をポリ（ＡＤＰ−リボシル）化し、これをテロメアから遊離させることにより、テロメラーゼによるテロメア伸長を促進する（非特許文献１）。テロメラーゼは、細胞増殖に伴うテロメアの短縮を防ぎ、がん細胞の無限分裂を支える酵素である。したがって、タンキラーゼ活性を阻害することができれば、がんの増殖を抑制することができると考えられる。【０００４】
また、タンキラーゼによってＰＡＲ化されるタンパク質には、大腸がんで亢進の認められるＷｎｔ／β−カテニンシグナルの負の制御因子であるＡｘｉｎなどがある。タンキラーゼによって、ＰＡＲ化したＡｘｉｎはユビキチン−プロテアソーム経路を介する分解を受け、その結果β−カテニンの蓄積、Ｗｎｔシグナルの亢進を招く。Ｗｎｔ／β−カテニンシグナルに増殖を依存しているがんでは、タンキラーゼを阻害することによって増殖が抑えられることが知られている。大腸がんではＷｎｔ／β−カテニンシグナルが活性化していることが知られていることから、タンキラーゼ阻害剤は新たながん治療シーズとして注目されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特表２０１７−５０４６２３号公報
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Seimiya H., 2006,Br. J. Cancer, Vol.94, pp.341-345.
【非特許文献２】Farmer H. et al.,2005, Nature. Vol.434(7035), pp.917-921.
【非特許文献３】Bryant H.E. etal., 2005, Nature. Vol.434(7035), pp.913-917.
【非特許文献４】Satpute-KrishnanP. et al., 2014, Cell, Vol.158, pp.522-533.
【非特許文献５】Noack J. &Molinari M., 2014, Nat. Chem. Biol., Vol.10(11), p.881-882.
【非特許文献６】Wang H.-B. et al.,2011, J. Biol. Chem. Vol.286(18), pp.15821-15831.
【非特許文献７】Xu X. et al., 2015,Int. J. Clin. Exp. Pathol. pp.10824-10831.
【非特許文献８】Nakano N. et al.,2017, J. Biol. Chem., Vol.292(10), pp.4099-4112.
【非特許文献９】Li X. et al.,2017, Cell Rep., Vol. 20(3), pp737-749.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
しかしながら、現在開発されているタンキラーゼ阻害剤は有効治療濃度域が狭いことから、臨床応用には至っていない。しかし、他のＰＡＲＰファミリータンパク質阻害剤（ＰＡＲＰ阻害剤）は虚血性脳・心疾患などの治療薬、さらに制がん剤として適用が示されてきている。なかでも、がん抑制遺伝子ＢＲＣＡ１／２欠損がんにおいて、ＰＡＲＰ阻害剤は単剤で有効性を示し、治療に用いられている。さらに、そのベースとなる合成致死性（ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ｌｅｔｈａｌｉｔｙ）と呼ばれる作用メカニズムも、新しい創薬コンセプトとして期待されている。【０００８】
合成致死性とは、それぞれ単独の機能欠損では非致死的な二つの遺伝子変異が、同時に機能を欠損した際に細胞致死が生じることをいう。この場合では、ＢＲＣＡ１／２欠損に加えて、ＰＡＲＰ１/２阻害剤を作用させることにより、腫瘍に対して細胞死を誘導することを指し、実際に臨床応用されている（特許文献１、非特許文献２、３）。【０００９】
ＰＡＲＰと同様に、タンキラーゼの合成致死因子を見出すことができれば、タンキラーゼの合成致死因子の機能を欠損したがんに対して、タンキラーゼ阻害剤単剤でその増殖を抑制することが可能となる。あるいは、タンキラーゼの合成致死因子とタンキラーゼの両方の発現・機能を抑制することによって、今までタンキラーゼ阻害剤による増殖抑制が認められていながら、タンキラーゼ阻害剤の有効治療濃度域の狭さ故に臨床応用されていなかったがん、例えば、Ｗｎｔ／β−カテニンシグナルの活性化が見られるがんなど、特定の疾患に対しタンキラーゼ阻害剤を有効に活用できる可能性がある。また、合成致死因子の発現を抑制する化合物と併用することで、タンキラーゼ阻害剤の効果を増強し、多くの患者に適用できる可能性がある。本発明は、タンキラーゼ阻害剤を臨床で使用するために、タンキラーゼの効果を増強する因子、すなわちタンキラーゼ合成致死因子を探索することを課題とする。タンキラーゼとタンキラーゼ合成致死因子を同時に阻害することができれば、もしくはタンキラーゼ合成致死因子の機能が欠損した条件下においてタンキラーゼを阻害すれば、がん細胞に細胞死を誘導することができる。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明は、タンキラーゼ阻害剤感受性を検査する方法、及びタンキラーゼ阻害剤の効果を増強する化合物に関する。
（１）タンキラーゼ阻害剤感受性を検査する方法であって、ＴＭＥＤ１０の発現又は変異を検査することを特徴とする検査方法。
（２）前記ＴＭＥＤ１０の発現又は変異は、ＲＮＡ発現、もしくはタンパク質発現、又は遺伝子配列、もしくはアミノ酸配列を検査することを特徴とする（１）記載の検査方法。
（３）腫瘍組織、血液循環腫瘍細胞又はエクソソームにおいて、前記ＴＭＥＤ１０の発現又は変異を検査することを特徴とする（１）、又は（２）記載の検査方法。
（４）対象となる腫瘍が、タンキラーゼの活性化、又はタンキラーゼによってＰＡＲ化されるタンパク質が起因する腫瘍であることを特徴とする（１）〜（３）いずれか１つ記載の検査方法。
（５）タンキラーゼ阻害剤の効果を増強する医薬組成物であって、ＴＭＥＤ１０の発現又は機能を抑制する化合物を有効成分とする医薬組成物。
（６）前記有効成分が核酸であって、ＴＭＥＤ１０のｓｉＲＮＡ、又はｓｈＲＮＡであることを特徴とする（５）記載の医薬組成物。
（７）前記有効成分が、小胞輸送の阻害剤である（５）記載の医薬組成物。
（８）前記医薬組成物の対象とする疾患がタンキラーゼの活性化、又はタンキラーゼによってＰＡＲ化されるタンパク質が起因する腫瘍である（５）〜（７）いずれか１つ記載の医薬組成物。
（９）ＴＭＥＤ１０発現又は機能を抑制する化合物と、タンキラーゼ阻害剤を有効成分とする医薬組成物。
（１０）前記医薬組成物の対象とする疾患がタンキラーゼの活性化、又はタンキラーゼによってＰＡＲ化されるタンパク質が起因する腫瘍である（９）記載の医薬組成物。
（１１）ＴＭＥＤ１０の発現、又は機能阻害を指標として、タンキラーゼ阻害剤の効果を増強する化合物をスクリーニングする方法。
（１２）前記機能阻害が、ゴルジ体の形態変化、又は小胞輸送阻害である請求項１１記載のスクリーニング方法。
（１３）ＴＭＥＤ１０発現又は機能を抑制する化合物と、タンキラーゼ阻害剤を投与する腫瘍の治療方法。
（１４）前記腫瘍がタンキラーゼの活性化、又はタンキラーゼによってＰＡＲ化されるタンパク質が起因する腫瘍である（１３）記載の治療方法。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】ＴＭＥＤ１０をｓｉＲＮＡによってノックダウンしたＨｅＬａＩ．２．１１クローン＃２におけるタンキラーゼ阻害剤の感受性を示す図。
【図２】ＴＭＥＤ１０をｓｈＲＮＡによってノックダウンしたＨｅＬａＩ．２．１１クローン＃２におけるタンキラーゼ阻害剤の感受性を示す図。
【図３】ＴＭＥＤ１０をｓｉＲＮＡによってノックダウンしたＣＯＬＯ−３２０ＤＭにおける種々のタンキラーゼ阻害剤に対する感受性を示す図。
【図４】種々の細胞でのＴＭＥＤ１０発現抑制によるタンキラーゼ阻害剤に対する感受性を示す図。
【図５】ＴＭＥＤ１０発現を回復させた細胞におけるタンキラーゼ阻害剤の感受性を示す図。
【図６】インビボゼノグラフト試験の結果を示す図。
【図７】小胞輸送阻害剤との併用実験結果を示す図。図７（Ａ）は、ＴＭＥＤ１０ノックダウンによりタンキラーゼ阻害剤に感受性を示した細胞株、図７（Ｂ）は感受性を示さなかった細胞株を用いた結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
以下の実施例で示すように、本発明者らによって、タンキラーゼとその合成致死因子であるＴＭＥＤ１０の発現を同時に抑制することによって、腫瘍細胞の増殖を抑制できることが明らかとなった。タンキラーゼ阻害剤は、現在のところ有効治療濃度域が狭いことから、臨床応用にはいたっていないが、合成致死因子と併用することによって、医薬として使用できる可能性がある。治療に使用し得るタンキラーゼ阻害剤としては、本実施例で用いているＧ００７−ＬＫ、ＩＷＲ−１、ＸＡＶ９３９などがある。また、今後開発されるタンキラーゼ阻害剤を使用しても良い。
【００１３】
また、本発明者らによって合成致死因子であることが明らかとなったＴＭＥＤ１０（Ｔｍｐ２１ともいう。）は、ｐ２４タンパク質ファミリーに属する分子量２１ｋＤａのタンパク質であり、小胞輸送積み荷タンパク質受容体として機能することが知られている。ＴＭＥＤ１０は、ＧＰＩアンカーを含む折りたたみ異常タンパク質が小胞体からゴルジ体へと輸送されるのを小胞体ストレス応答に依存して促進する機能がある（非特許文献４、５）。
【００１４】
ＴＭＥＤ１０の作用としては、前立腺がん細胞株ＬＮＣａＰにおいてＴＭＥＤ１０をノックダウンするとＰＫＣδ依存性のアポトーシスが誘導されること（非特許文献６）、甲状腺がんにおいてノックダウンするとＡＭＰＫ／ｍＴＯＲ経路を介してオートファジーを誘導し、がんの増殖を抑制すること（非特許文献７）、ＴβＲＩＩとＡＬＫ５と結合し、ＴＧＦ−βシグナルを抑制すること（非特許文献８）が報告されている。また、ヒト胎児腎細胞株にＳＶ４０  ｌａｒｇｅ  Ｔ抗原を組み込み不死化した細胞株であるＨＥＫ２９３Ｔ細胞にＳＦＢ（Ｓ-タグ、ＦＬＡＧ-タグ、ストレプトアビジン結合ペプチド）タグを付加したタンキラーゼ１と２を過剰発現させ、プロテオーム解析により網羅的に探索すると、タンキラーゼ阻害剤ＸＡＶ９３９処理時にＴＭＥＤ１０がタンキラーゼと結合し得ること（非特許文献９）が報告されている。しかし、タンキラーゼ阻害剤の感受性やＷｎｔシグナル経路とＴＭＥＤ１０との関連については未だに報告がない。ＴＭＥＤ１０の発現とタンキラーゼの酵素活性を抑制することによって、腫瘍の増殖を抑制し得ることは、本発明者らが初めて見出したことである。
【００１５】
以下に詳細に示すが、タンキラーゼ阻害剤はＴＭＥＤ１０の機能を失ったがん、すなわちＴＭＥＤ１０の発現が抑制されているがんで効果を奏する。ＴＭＥＤ１０の発現は、ＲＮＡや、ゲノムＤＮＡなどの核酸レベルで、あるいはタンパク質の量を解析することによって検査することができる。具体的には、ＲＮＡ発現は、ＲＴ−ＰＣＲやＲＮＡ−ｓｅｑによる定量的な解析や、マイクロアレイによって測定することが可能である。また、タンパク質発現を解析する場合には、ウェスタンブロッティングや組織染色などＴＭＥＤ１０に対する抗体を用いることによって定量的に発現を解析することができる。さらに、発現の減少だけではなく、遺伝子配列、アミノ酸配列を解析し、ＴＭＥＤ１０の機能を低下、又は喪失させる変異を検出してもよい。遺伝子変異、タンパク質変異は、ゲノムＤＮＡを用いた次世代シーケンサー解析、あるいはペプチド配列解析など通常用いられている手法によって検出することができる。また、ＴＭＥＤ１０の発現や機能変化を伴う変異は、遺伝子やタンパク質の発現、あるいは変異の検出に通常用いる組織や細胞、例えば、バイオプシー、手術などによって得た腫瘍サンプル、血液循環腫瘍細胞、エクソソームなどを使用することができる。
【００１６】
以下に示すように、ＴＭＥＤ１０発現が減少している腫瘍では、タンキラーゼ阻害剤の効果が増強することから、タンキラーゼ阻害剤の投与量が少量であっても有効に作用すると考えられる。また、ＴＭＥＤ１０の発現が低下していない腫瘍であっても、ＴＭＥＤ１０発現を抑制する化合物を有効成分とする医薬と併用することによって、タンキラーゼ阻害剤を有効に作用させることが可能となる。
【００１７】
ＴＭＥＤ１０に直接作用する阻害剤は、まだ開発されていないが、本実施例で用いたようにｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡをＴＭＥＤ１０発現抑制のために使用することができる。さらに、今後発現抑制に有効なＴＭＥＤ１０阻害剤が開発されれば、これを有効成分とした医薬をタンキラーゼ阻害剤と併用することができる。また、本発明者らは、ＴＭＥＤ１０の作用である小胞輸送の阻害がタンキラーゼに対する感受性に関与することを明らかにした。小胞輸送の阻害剤もＴＭＥＤ１０阻害剤と同様に、タンキラーゼ阻害剤に対する感受性を増強させる。したがって、既存の小胞輸送阻害剤、あるいは今後開発される小胞輸送阻害剤もタンキラーゼ阻害剤と併用することによって腫瘍の増殖を抑制することができる。
【００１８】
また、得られた知見をもとに、タンキラーゼ阻害剤と併用し効果を奏する医薬をスクリーニングすることができる。具体的には、培養細胞を用いて、合成致死因子であるＴＭＥＤ１０の発現を抑制する化合物をスクリーニングすればよい。候補化合物添加によるＴＭＥＤ１０発現の変化は、ＲＮＡ、あるいはタンパク質を定量することによって測定することができる。
【００１９】
あるいは、ＴＭＥＤ１０の機能を阻害する物質をスクリーニングすればよい。本発明者らは、ＴＭＥＤ１０をノックダウンすることによって、核辺縁部に局在していたゴルジ体が散在化することを見出している。候補化合物の添加後に、ゴルジ体の散在化が観察できる化合物はＴＭＥＤ１０を阻害している可能性が高い。ゴルジ体の散在化は、シスゴルジマーカーＧＭ１３０のようなゴルジ体マーカーを可視化すればよく、ビジュアルスクリーニングを行うことができる。
【００２０】
また、ＴＭＥＤ１０は小胞輸送積み荷タンパク質受容体として機能することから、小胞体輸送阻害を指標としてスクリーニングを行ってもよい。例えば、水疱性口内炎ウイルスの細胞膜タンパク質ＶＳＶ−Ｇの温度感受性変異体（ｔｓＯ４５）はフォールディングに異常があり、３９℃で発現させると小胞体に蓄積し、低温（３２℃）に培養温度をシフトすることによって、一斉に小胞体からゴルジ体へと輸送されることが知られている。ＧＦＰなどの蛍光タンパク質とＶＳＶ−ＧｔｓＯ４５を結合させた遺伝子組み換えタンパク質を用いれば、小胞体輸送を可視化することができるので、候補化合物の小胞体輸送への効果を検討することが可能となる。
【００２１】
［タンキラーゼ合成致死因子の探索］
以下、データを示しながら具体的に説明する。シグナル伝達経路に関わる５０４３種類のｍＲＮＡを標的とし、一遺伝子につき標的配列が異なる４〜６種類のｓｈＲＮＡクローンが設計されたバーコードｓｈＲＮＡライブラリー（Ｃｅｌｌｅｃｔａ社）を、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を用いてレンチウイルスにパッケージした。タンキラーゼ阻害剤に耐性を有する細胞株であるＨｅＬａＩ．２．１１（米国ロックフェラー大学、Ｔｉｔｉａ  ｄｅ  Ｌａｎｇｅ教授より供与）を被験細胞にすることとしたが、被検細胞内でのクローナルバリエーションが探索に想定外の影響を及ぼすことを避けるため、限界希釈法により同細胞由来クローンを３株（＃１〜＃３）樹立した。これらのうち、形態・増殖速度・タンキラーゼ阻害剤（Ｇ００７−ＬＫ）感受性において親株と同様の挙動を示したクローン＃２を以降の実験に用いることとした。
【００２２】
樹立したＨｅＬａ  Ｉ．２．１１クローン＃２の細胞に対し、作成したウイルスを感染させ力価のチェックを行った。ウイルスの希釈倍率を５倍希釈とし、１日目に１．４×１０７個の被検細胞にウイルスを感染後、３日目よりピューロマイシン選択による非感染細胞の除去を行い、７日目から３μＭでタンキラーゼ阻害剤Ｇ００７−ＬＫ（Ｓｅｌｌｅｃｋ社）で処理し、１４日目に細胞を回収した。コントロールとして、溶媒であるＤＭＳＯで細胞を処理した。この実験を２回繰り返し、計４サンプルについてゲノムＤＮＡを回収し、ＰＣＲによりレンチウイルスのゲノムを確認した。
【００２３】
次世代シーケンス解析により、（１）：対照群と比べてタンキラーゼ阻害剤Ｇ００７−ＬＫ処理群で出現頻度（リード数）が１．２倍以上減少したｓｈＲＮＡクローンが標的とする遺伝子であって、（２）：ライブラリー中に含まれている当該遺伝子を標的とする全ｓｈＲＮＡの６０％以上である（例えば、ライブラリー中に５つのｓｈＲＮＡクローンが含まれている標的遺伝子の場合、３つ以上のｓｈＲＮＡクローンが（１）を満たす。）遺伝子で、更に（３）：全２回の試験どちらにおいても（１）と（２）を満たす遺伝子、という指標を定め、（１）〜（３）全てを満たした１１種類を抽出し、合成致死候補遺伝子とした。
【００２４】
選択した１１の候補遺伝子を、ＨｅＬａＩ．２．１１クローン＃２の細胞に対して、１日目にｓｉＲＮＡによりノックダウンすると同時に３００細胞／８０μｌ／ウェルで９６ウェルプレートに播種し、２日目にＧ００７−ＬＫ（０、０．０１、０．０３、０．１、０．３、１、３、１０μＭ）を添加し、播種後７日目に細胞増殖抑制効果をＭＴＴ〔３-（４,５-Ｄｉｍｅｔｈｙｌｔｈｉａｚｏｌ-２-ｙｌ)-２,５-Ｄｉｐｈｅｎｙｌｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ  Ｂｒｏｍｉｄｅ〕アッセイ（最終濃度１ｍｇ/ｍＬ）により確認した。候補遺伝子のうちＴＭＥＤ１０は、異なる２種類のｓｉＲＮＡ（ｓｉＴＭＥＤ１０＃１、＃２（Ｓｉｌｅｎｃｅｒ（登録商標）ｓｅｌｅｃｔ、サーモフィッシャーサイエンティフィック社）で発現を抑制した際、いずれのｓｉＲＮＡもタンキラーゼ阻害剤Ｇ００７−ＬＫに対して最も再現性良く感受性が増強したため、これを合成致死遺伝子の候補とした。
【００２５】
図１に、２種のｓｉＲＮＡ、ｓｉＴＭＥＤ１０＃１、又は＃２によってＴＭＥＤ１０をノックダウンし、タンキラーゼ阻害剤Ｇ００７−ＬＫを添加した際の細胞生存率をＭＴＴアッセイによって解析した結果を示す。図１に示すように、ＴＭＥＤ１０発現を抑制した場合に有意に細胞生存率の減少が認められた。ｓｉＴＭＥＤ１０＃１によってＴＭＥＤ１０をノックダウンした場合には、ネガティブコントロール（図中ＮＣ、Ｓｉｌｅｎｃｅｒ（登録商標）ｓｅｌｅｃｔ、Ｎｅｇａｔｉｖｅ  Ｃｏｎｔｒｏｌ、サーモフィッシャーサイエンティフィック社）に比べて２．３倍（図１左）、ｓｉＴＭＥＤ１０＃２を用いた場合には、２．４倍（図１右）、Ｇ００７−ＬＫを添加することによって細胞の生存率が低下することが明らかとなった。すなわち、ＴＭＥＤ１０発現を抑制することによって、タンキラーゼ阻害剤に対する感受性が増強することが示された。なお、ｓｉＲＮＡを用いてノックダウンしたことによりＲＮＡ発現が低下していることはｑＰＣＲによって確認している（図１下段）。
【００２６】
ＴＭＥＤ１０発現をｓｉＲＮＡにより抑制することにより、タンキラーゼ阻害剤に対する感受性が増強する結果が得られたことから、次にｓｈＲＮＡを用いてＴＭＥＤ１０発現を抑制し、タンキラーゼ阻害剤に対する感受性を解析した。
【００２７】
ＴＭＥＤ１０のｍＲＮＡ上の３か所の配列を標的とした異なる３種類のｓｈＲＮＡ配列（ｓｈＲＮＡ＃１〜＃３、ＣＥＬＬＥＣＴＡ社）をレンチウィルスベクターに組み込みＨｅＬａＩ．２．１１クローン＃２細胞に導入し、各々３種類の欠損細胞株を作成した。同時に、陰性対照としてスクランブル配列のｓｈＲＮＡを導入した細胞も作成した。ピューロマイシン選択により非感染細胞を除去してから、Ｇ００７−ＬＫに対する感受性試験を行った。その結果、３種類のｓｈＲＮＡによってＴＭＥＤ１０をノックダウンした細胞のいずれにおいても、コントロールであるスクランブル（ＳＣＲ＃１）を導入した場合に比べて、Ｇ００７−ＬＫに対する感受性の増強が見られた。ＴＭＥＤ１０発現を抑制することによる感受性増強効果は、コントロールと比較してＧ００７−ＬＫに対して約２〜１０倍であった（図２上段）。なお、ｓｈＲＮＡを導入した際のＴＭＥＤ１０のＲＮＡ発現（ｑＰＣＲ）、及びタンパク質発現（ウェスタンブロッティング、ＷＢ）は図２下段に示す。
【００２８】
次に種々のタンキラーゼ阻害剤について、ＴＭＥＤ１０の発現がタンキラーゼ感受性に影響を及ぼすか検討を行った。タンキラーゼ阻害剤感受性大腸がん細胞株ＣＯＬＯ−３２０ＤＭ（ＡＴＣＣより入手）を用いて解析を行った。１日目にｓｉＴＭＥＤ１０＃１、＃２によってＴＭＥＤ１０をノックダウンすると同時に３００細胞／８０μｌ／ウェルで９６ウェルプレートに播種し、２日目にタンキラーゼ阻害剤Ｇ００７−ＬＫ、ＩＷＲ−１、ＸＡＶ９３９、及びＰＡＲＰ１／２阻害剤であるオラパリブ、ベリパリブを培養液に添加し、阻害剤処理開始５日後の細胞生存率をＭＴＴアッセイによって測定した（図３）。下段にｑＰＣＲによるＴＭＥＤ１０発現量を示す。Ｇ００７−ＬＫとは構造も由来も異なるタンキラーゼ阻害剤であるＩＷＲ−１においては１５倍から２１倍、ＸＡＶ９３９においては約２倍感受性が増強していた。
【００２９】
一方、ＰＡＲＰ１／２阻害剤であるオラパリブ、ベリパリブでは、ＴＭＥＤ１０をノックダウンすることによる感受性増強効果は認められなかった。したがって、ＴＭＥＤ１０発現を抑制することによるタンキラーゼ阻害剤の感受性の増強は、ＰＡＲＰファミリー阻害剤一般に認められる効果ではなく、タンキラーゼ阻害剤に特異的な効果であることが示唆された。
【００３０】
さらに、ＣＯＬＯ−３２０ＤＭ細胞に上記と同様にしてｓｈＲＮＡを導入し、ＴＭＥＤ１０ノックダウン細胞を作成した。Ｇ００７−ＬＫ、ＩＷＲ−１を添加し、細胞生存率をＭＴＴアッセイによって解析した（表１）。その結果、コントロール細胞（ｓｈＳＣＲ）と比較して、ｓｈＲＮＡを導入した細胞では、Ｇ００７−ＬＫは１１〜３１倍、ＩＷＲ−１は７〜１１倍感受性が増強していた。一方、ここでは結果は示さないが、ＰＡＲＰ１／２阻害剤であるオラパリブ、ベリパリブではＴＭＥＤ１０ノックダウンによる感受性の増強は観察されなかった。
【００３１】
【表１】
2020009175.tif 000003
【００３２】
さらに、大腸がん細胞株ＤＬＤ１（ＡＴＣＣより入手）、ＨＣＴ１１６（ＡＴＣＣより入手）、ＨＣＣ２９９８（理研ＢＲＣより入手）、乳がん細胞株ＢＳＹ−１（ＪＦＣＲ３９）、ＭＣＦ７（ＡＴＣＣより入手）、卵巣がん細胞株ＯＶＣＡＲ−８（ＡＴＣＣより入手）、胃がん細胞株ＭＫＮ７（ＪＣＲＢ細胞バンクより入手）、ＭＫＮ２８（ＪＣＲＢ細胞バンクより入手）、脳腫瘍細胞株Ｕ２５１（ＡＴＣＣより入手）、ＳＮＢ７８（ＪＦＣＲ３９）、ＳＦ２９５（ＡｄｄｅｘＢｉｏより入手）、ＳＮＢ７５（ＭＧＨより入手）を用いて、ＴＭＥＤ１０発現を抑制することによるタンキラーゼ阻害剤に対する感受性増強効果を解析した。
【００３３】
上記と同様にして各細胞において、ＴＭＥＤ１０をｓｈＲＮＡによってノックダウンし、ノックダウン細胞を作成した。１日目に、大腸がん細胞株については各細胞を４００細胞／８０μｌ／ウェルで、他の細胞株については３００細胞／８０μｌ／ウェルで、９６ウェルプレートに播種し、２日目に種々の濃度でＧ００７−ＬＫ処理し、播種後７日目にＭＴＴアッセイにより細胞生存率の解析を行った（図４）。
【００３４】
いずれの細胞もＴＭＥＤ１０を抑制することによってＧ００７−ＬＫに対する感受性が増強していた。用いた細胞株は、主としてタンキラーゼに非感受性の細胞株であるが、がんの由来にかかわらず、また、いずれのｓｈＲＮＡ配列を用いてＴＭＥＤ１０ノックダウンを行っても、タンキラーゼ阻害剤に対して感受性の増強が見られた。すなわち、ＴＭＥＤ１０をノックダウンすることによって、タンキラーゼ阻害剤に非感受性の細胞では感受性を獲得し、感受性が弱い細胞では、感受性が増強するという結果が得られた。
【００３５】
上記で示してきたタンキラーゼ阻害剤に対する感受性増強効果が、ｓｈＲＮＡ分子による非特異的な細胞毒性による偽陽性の結果である可能性を排除するために以下の実験を行った。ＣＯＬＯ−３２０ＤＭに、ｓｈＲＮＡ＃２、＃３を導入し、ＴＭＥＤ１０の発現が抑制されている細胞に、ｓｈＲＮＡ耐性のＴＭＥＤ発現ベクターを構築しレトロウイルスによって導入した。導入したＴＭＥＤ１０はＨＡタグを付与しており、抗ＨＡ抗体によってＴＭＥＤ１０の発現を確認することができる。図５下段のウェスタンブロッティングの結果に示すように、レスキュー株（ｓｈＴＭＥＤ１０＃２／ＴＭＥＤ１０−ＨＡ、ｓｈＴＭＥＤ１０＃３／ＴＭＥＤ１０−ＨＡ）では、いずれもＴＭＥＤ１０の発現回復が認められる。
【００３６】
これら耐性株にタンキラーゼ阻害剤Ｇ００７−ＬＫ、及びＩＷＲ−１を添加し、細胞生存率を解析した。いずれのｓｈＲＮＡでノックダウンした細胞株においても、ＴＭＥＤ１０の発現を回復させることで、２種類のタンキラーゼ阻害剤Ｇ００７−ＬＫ、及びＩＷＲ−１に対してコントロール株と同程度まで、もしくは耐性方向に抵抗性を獲得することが確認された（図５上、中段）。これにより、ＴＭＥＤ１０がタンキラーゼの合成致死因子であることが示された。
【００３７】
［インビボゼノグラフト試験］
次に、ＴＭＥＤ１０発現が抑制されている腫瘍は、インビボでも同様にタンキラーゼ阻害剤に対して感受性増強効果が生じるか、インビボゼノグラフトモデルを用いて解析を行った。
【００３８】
ＴＭＥＤ１０を欠損させて樹立したＣＯＬＯ−３２０ＤＭ細胞（ＣＯＬＯ−３２０ＤＭ／ｓｈＴＭＥＤ１０＃３細胞）と、陰性対照としてスクランブルＲＮＡを導入して樹立した細胞（ＣＯＬＯ−３２０ＤＭ／ｓｈＳＣＲ細胞）を５週齢雌性ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウス（日本チャールズリバー株式会社）に５×１０６細胞／２００μＬ／マウスの容量で皮下注射により移植した。移植後１２日経過後に、タンキラーゼ阻害剤Ｇ００７−ＬＫを３０ｍｇ／ｋｇ、もしくはｖｅｈｉｃｌｅを５日間連続投与、２日間休薬を繰り返す投与スケジュールで投与しながら、腫瘍サイズと体重変化を観測した。なお、ＴＭＥＤ１０欠損株、コントロールであるｓｈＳＣＲ導入株、ともにｖｅｈｉｃｌｅ投与群、Ｇ００７−ＬＫ群に分け、投与を行った。各群５匹ずつとし、投与時は１日１回腹腔内投与を行った。ｖｅｈｉｃｌｅは、ポリオキシエチレンヒマシ油、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油、エタノールのカクテルに、ＰＢＳ、ＤＭＳＯを所定の割合で混合したものを用いている。
【００３９】
投与８日目から、コントロールであるスクランブルＲＮＡ導入細胞と、ＴＭＥＤ１０発現を抑制した細胞間で、タンキラーゼ阻害剤に対する効果に違いが認められた。すなわち、ｓｈＴＭＥＤ１０株を移植したＧ００７−ＬＫ投与群では、他の群と比較して腫瘍サイズに有意（Ｐ＜０．０５）な差が認められた（図６）。ｓｈＴＭＥＤ１０細胞株の方が、コントロール細胞株であるＳＣＲ導入細胞株に比べて、増殖が遅い傾向があるものの、Ｇ００７−ＬＫ処理による効果はｓｈＴＭＥＤ１０群の方がより高い。また、１２日目までの結果では、顕著な体重減少はいずれの群でも認められなかった。
【００４０】
［ＴＭＥＤ１０の作用機序、小胞輸送阻害剤の効果］
以上の結果から、ＴＭＥＤ１０の発現抑制によりタンキラーゼ阻害剤に対する感受性が増強することが明らかとなった。さらに、ＴＭＥＤ１０の発現抑制の作用機序を明らかにすれば、新たな薬剤の開発につながる可能性がある。すなわち、ＴＭＥＤ１０の作用を解析することにより、合成致死を誘導する新たな薬剤の開発につなげることができる。
【００４１】
ＴＭＥＤ１０は、小胞体−ゴルジ体間の小胞輸送においてタンパク質の積み下ろしを担っていることが報告されている。したがって、ＴＭＥＤ１０のノックダウンは細胞内の小胞輸送の停滞をまねくと考えられる。小胞輸送の停滞がタンキラーゼ阻害剤に対する感受性増強につながるか、小胞輸送阻害剤を用いて解析を行った。
【００４２】
小胞体−細胞質膜間の小胞輸送の阻害剤Ｅｘｏ１（サーモフィッシャーサイエンティフィック社）あるいはＥｘｏ２（サーモフィッシャーサイエンティフィック社）とタンキラーゼ阻害剤Ｇ００７−ＬＫを併用して細胞に添加し、細胞増殖を解析した。ＴＭＥＤ１０ノックダウンによりＧ００７−ＬＫに対し感受性増強を示したＨＣＣ２９９８、ＢＳＹ−１と、感受性増強を示さなかったＲＫＯ（ＡＴＣＣより入手）、ＫＭ１２（ＮＣＩより入手）を用いて解析を行った。各細胞におけるＥｘｏ１あるいはＥｘｏ２の単剤処理時のＩＣ５０値は予め検討し、その濃度を目安として、実験を行った。
【００４３】
具体的には、１日目に各細胞を３００細胞／８０μｌ／ウェルで９６ウェルプレートに播種し、２日目に、殆ど増殖を抑制しない（１０〜２０％程度の増殖抑制）濃度のＥｘｏ１、あるいはＥｘｏ２と、最終濃度０〜１０μＭのＧ００７−ＬＫで処理し、５日間培養後、７日目に細胞増殖抑制効果をＭＴＴアッセイにより確認した（図７）。その結果、ＴＭＥＤ１０ノックダウンにより感受性増強を示したＨＣＣ２９９８、ＢＳＹ−１ではＥｘｏ１、Ｅｘｏ２に対して、Ｇ００７−ＬＫに対する感受性増強効果が認められた（図７（Ａ））。それに対し、ＴＭＥＤ１０ノックダウンによる効果が得られなかったＲＫＯ、ＫＭ１２においてはタンキラーゼ阻害剤に対する感受性増強効果は認められなかった（図７（Ｂ））。Ｅｘｏ１あるいはＥｘｏ２との併用下でＧ００７−ＬＫに対して感受性増強を示す細胞株と感受性増強を示さない細胞株は、ＴＭＥＤ１０ノックダウン時にＧ００７−ＬＫに対し感受性増強を示す細胞株と感受性増強を示さない細胞株と一致しており、小胞輸送の阻害が、ＴＭＥＤ１０ノックダウン時の状況を模倣していると考えられる。したがって、タンキラーゼ阻害剤と併用することにより効果が得られる化合物としては、ＴＭＥＤ１０発現を直接抑制するｓｈＲＮＡなどのｓｉＲＮＡなどの核酸だけではなく、例えば、ブレフェルジンＡなど小胞輸送を阻害する化合物も用いることができる。
【００４４】
以上のように、ＴＭＥＤ１０発現を抑制することによって、タンキラーゼ阻害剤の効果が増強することが明らかとなった。したがって、腫瘍におけるＴＭＥＤ１０発現を検査することによって、タンキラーゼ阻害剤が有効に作用するかを予め調べることが可能となる。今までタンキラーゼ阻害剤の有効濃度域が狭く、タンキラーゼ阻害剤による増殖が認められていながら、タンキラーゼ阻害剤単剤で臨床応用できなかった腫瘍であっても、ＴＭＥＤ１０の発現を抑制することによって、タンキラーゼ阻害剤が低濃度で効果を奏するようになる。タンキラーゼによってＰＡＲ化されるタンパク質が腫瘍の増殖に関与している代表的な例としては、Ｗｎｔ／β−カテニンシグナルに依存しているがんが挙げられる。しかし、これ以外のがんであってもタンキラーゼの活性化が見られる腫瘍、あるいはタンキラーゼによってＰＡＲ化されるタンパク質が細胞の増殖に関与していると考えられる腫瘍であれば、ＴＭＥＤ１０の発現を検査することによって、タンキラーゼ阻害剤が効果を奏する患者であるかを判断することができる。
【００４５】
また、ＴＭＥＤ１０発現が高い場合であっても、ＴＭＥＤ１０発現を抑制する医薬と併用することによって、タンキラーゼ阻害剤が効果を奏することが期待される。ＴＭＥＤ１０発現を抑制する医薬としては、ここで用いたｓｈＲＮＡなどのｓｉＲＮＡなど、直接ＴＭＥＤ１０の発現を抑制する化合物だけではなく、小胞輸送を阻害するなどＴＭＥＤ１０の機能を阻害する化合物を用いることができる。タンキラーゼ阻害剤は、合成致死という新たな作用機序により、タンキラーゼの活性化、又はタンキラーゼによってＰＡＲされるタンパク質が起因する腫瘍の増殖を抑制する薬剤とすることができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【国際調査報告】
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