(57)【要約】【課題】  アンジオテンシン変換酵素阻害活性を備えたジペプチド等を提供すること。【解決手段】  Thr-Arg、Phe-Asp及びPhe-Alaの3種類のジペプチドからなる群から選択される少なくとも一種類のジペプチドを有するアンジオテンシン変換酵素（ACE）阻害剤によって達成される。このACE阻害剤は、血圧降下作用を備える飲食品または血圧降下剤として提供できる。【選択図】          なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
Thr-Arg、Phe-Asp及びPhe-Alaの3種類のジペプチドからなる群から選択される少なくとも一種類のジペプチドを有するアンジオテンシン変換酵素阻害剤。
【請求項２】
請求項１に記載のアンジオテンシン変換酵素阻害剤を含有し、血圧降下作用を備える飲食品。
【請求項３】
請求項１に記載のアンジオテンシン変換酵素阻害剤を含有する血圧降下剤。
【請求項４】
請求項１に記載のアンジオテンシン変換酵素阻害剤を含有する茶ペプチド組成物。
【請求項５】
請求項４に記載の茶ペプチド組成物を含有し、血圧降下作用を備える飲食品。
【請求項６】
請求項４に記載の茶ペプチド組成物を含有する血圧降下剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アンジオテンシン変換酵素阻害剤、特に血圧降下作用を備えたものに関する。
【背景技術】
【０００２】
現在、食品由来のタンパク質を酵素で分解して得られたペプチドを含有する飲食品が広く販売されている。数個〜十個程度のアミノ酸が結合したペプチドは、アミノ酸ともタンパク質とも異なる生理機能を有している。特に、アンジオテンシン変換酵素（ACE）を阻害することによって、血圧降下作用を有するペプチドに関する報告が多くなされている。ACEは、アンジオテンシンIをアンジオテンシンIIに変換する酵素であり、アンジオテンシンIIが血管収縮作用を有しているため、高血圧の原因の一つと考えられている。またACEは、血圧降下作用を有するブラジキニンを分解するため、血圧が上昇する。このため、ACEを阻害することにより、血圧を降下させることができる。【０００３】
茶葉由来のタンパク質分解物を得る方法として幾つかの報告がなされている（特許文献１〜３）。特許文献１には茶葉をアルカリ水溶液で抽出し、抽出残渣を取り除き、得られた抽出液に酸を加えてpH2から5にすることにより凝集したタンパク質画分に中性エンドペプチダーゼ活性を有する酵素製剤及び酸性エキソペプチダーゼ活性を有する酵素製剤で分解する製造方法が開示されており、特許文献２には茶葉にアルカリ溶液を加えて抽出混合物を得る工程及び、得られた抽出混合物に中性エンドペプチダーゼ活性を有する酵素製剤及び酸性エキソペプチダーゼ活性を有する酵素製剤で分解する製造方法が開示されている。また、特許文献３には、茶葉あるいは茶殻をアルカリ溶液で抽出し、抽出液をプロテアーゼ活性を有する酵素で処理することにより得られる茶葉タンパク質分解物は、高いジペプチジルペプチダーゼIV阻害活性を有し、血糖値上昇を抑制する発明が開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特開２０１４−３９７１号公報
【特許文献２】特開２０１５−１００２７６号公報
【特許文献３】特開２０１７−４３６１８号公報
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Kagaku to Seibutsu 53(4): 228-235 (2015)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかしながら、ACE阻害活性を備えたペプチドについては、未知のものも多く、更なる研究の余地があった。
本発明は、上記課題に鑑みてなされたものであり、その目的は、アンジオテンシン変換酵素阻害活性を備えたジペプチド等を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
上記課題を達成するための本発明に係るアンジオテンシン変換酵素（ACE）阻害剤は、Thr-Arg、Phe-Asp及びPhe-Alaの3種類のジペプチドからなる群から選択される少なくとも一種類のジペプチドを有する。
従来の研究では、ACE阻害活性を有するペプチド配列（特に、ジペプチド）は、C末端側のアミノ酸側鎖の疎水性と大きさが重要であるとされており、具体的にはVal-Tyr、Phe-Tyr、Ile-Tyr、Gly-Tyr、Ser-Tyrなどが知られている（非特許文献１）。本発明者が見出した3種類のジペプチドは、このような特徴を備えていないことから、未知の群に属するものであると考えられる。【０００８】
また、別の発明に係る飲食品は、上記アンジオテンシン変換酵素阻害剤を含有し、血圧降下作用を備えることを特徴とする。また、別の発明に係る血圧降下剤は、上記アンジオテンシン変換酵素阻害剤を含有することを特徴とする。
また、別の発明に係る茶ペプチド組成物は、上記アンジオテンシン変換酵素阻害剤を含有することを特徴とする。また、別の発明に係る飲食品は、上記茶ペプチド組成物を含有し、血圧降下作用を備えることを特徴とする。また、別の発明に係る血圧降下剤は、上記茶ペプチド組成物を含有することを特徴とする。【０００９】
Thr-Arg、Phe-Asp及びPhe-Alaの3種類のジペプチドは、公知の方法（例えば、化学合成法（固相合成、液相合成を含む）、遺伝子組換えにより微生物を用いて製造する方法、各ジペプチドの配列を備えたペプチド・タンパク質を酵素で分解する方法など）で製造することができる。血圧降下作用を主体とする血圧降下剤（すなわち、医薬品）として用いる場合には、混合物として得られたジペプチドを公知の方法（例えば、塩析、脱塩、クロマトグラフィー、電気泳動など）を単独で、又は組み合わせて用いることで、純度を高めたものを用いることができる。また、ジペプチドを飲食品として用いる場合には、適当な純度または量を含有する混合物を用いることができる。この場合に、ジペプチドを一回又は複数回の摂取によって、ACE阻害活性に基づく血圧降下作用を備えるように調整できる。ジペプチドは３種類併用しても良く、Thr-Arg、Phe-Asp、Phe-Alaをそれぞれ単独で使用しても良い。また、Thr-ArgとPhe-Asp、Thr-ArgとPhe-Ala、Phe-AspとPhe-Alaの２種類を併用することもできる。このうち、Thr-Argのみ、またはThr-ArgとPhe-Alaの２種類を用いることが好ましい。
茶ペプチド組成物は、水への溶解性がよく、熱に対しても比較的に安定である。茶ペプチド組成物は、飲食品の本来の色調、風味を損なわないことから各種飲食品に適用できる。各種飲食品であれば、飲料、農水産加工品、乳製品、菓子、調味料、フリーズドライ食品、レトルト食品などの食品や健康食品に添加できる。【００１０】
茶ペプチド組成物を飲食品に添加する際の添加量としては、ペプチドが機能を示す用量として、飲食品１００ｇに対し１０ｍｇ〜５０００ｍｇが好ましく、２５ｍｇ〜２５００ｍｇがより好ましい。飲食品１００ｇに含まれるThr-Arg、Phe-Asp及びPhe-Alaの3種類のジペプチドからなる群から選択される少なくとも一種類のジペプチドの含量としては、０．００２ｍｇ以上が好ましく、０．００５ｍｇ以上がより好ましい。Thr-Arg及びPhe-Alaの含量比であるThr-Arg／Phe-Alaは１〜１０，０００が好ましく、１０〜５，５００がより好ましく、２５〜５，５００がさらに好ましく、４００〜５，５００が最も好ましい。茶ペプチド組成物の香味上の問題、異臭等に関しては、甘味類、アルコール類、酸化防止剤、酸類、脂肪酸、タンパク質、ペプチド類、アミノ酸類、ビタミン類、ミネラル類、増粘安定剤、界面活性剤、加工でんぷん、乳を少なくとも１種以上含有させることで改善できる。これらの添加剤の含有量は、本発明の目的を妨げない範囲内で適宜選択可能である。【００１１】
甘味類としては、特に限定されるものではないが、例えば、糖類、糖アルコール、高甘味度甘味料などが挙げられる。糖類としては、例えば、グルコース、スクロース、水飴、異性化糖、イソマルトオリゴ糖、フラクトオリゴ糖、乳果オリゴ糖、キシロオリゴ糖、ガラクトオリゴ糖、セロオリゴ糖、フコース（６−デオキシ−ガラクトース、メチルペントース）、ジヒドロキシアセトン、グリセルアルデヒド、エリトルロース、エリトロース、トレオース、イヌリン、キシラン、ラクトース、キシロース、マルトース、トレハロース、フルクトース、ツラノース、タロース、イドース、グロース、アルトロース、アロース、プシコース、ソルボース、フクロース、タガトース、セロビオース、ラフィノース、ラクチュロース、メレジトース、マルトトリオース、アカルボース、スタキオース、マンノース、キシルロース、ガラクトース、デオキシシボース、リブロース、リボース、リキソース及びアラビノースなどを挙げることができる。【００１２】
糖アルコール類としては、特に限定されるものではないが、例えば、エリスリトール、キシリトール、ソルビトール（Ｄ−グルシトール）、マンニトール、グリセリン、エリトリトール、トレイトール、アラビニトール、リビトール（アドニトール）、イジトール、ボレミトール、ベルセイトール、ガラクチトール（ダルシトール）、還元水飴、還元パラチノース、マルチトール（還元麦芽糖水飴）及びラクチトール（還元乳糖）などを挙げることができる。
高甘味度甘味料としては、特に限定されるものではないが、例えば、アセスルファムＫ、スクラロース、アスパルテーム、アドバンテーム、サッカリン、ネオテーム、ソーマチン、モネリン、モナチン、羅漢果抽出物、甘草抽出物、グリチルリチン、ステビア抽出物、ステビア酵素処理物、レバウディオサイドＡ及びステビオサイドが、グリチルリン、マビンリン、ブラゼイン、モネリンなどを挙げることができる。【００１３】
酸化防止剤としては、特に限定されるものではないが、例えば、アスコルビン酸、エリソルビン酸、亜硫酸塩類、トコフェロール類、ジブチルヒドロキシトルエン（BHT）、ブチルヒドロキシアニソール（BHA）、エチレンジアミン四酢酸類、カテキン、没食子酸類、カンゾウ油性抽出物、食用カンナ抽出物、グローブ抽出物、セージ抽出物、セリ抽出物、チャ抽出物、テンペ抽出物、ドクダミ抽出物、生コーヒー豆抽出物、ヒマワリ種子抽出物、ブドウ種子抽出物、ブルーベリー葉抽出物、プロポリス抽出物、ヘゴ・イチョウ抽出物、ヤマモモ抽出物、ミリシトリン、ミリセチン、ユーカリ葉抽出物、ローズマリー抽出物、チョウジ抽出物、リンゴ抽出物、酵素分解リンゴ抽出物、ゴマ油抽出物、コメヌカ油抽出物などを挙げることができる。
アルコール類としては、特に限定されるものではないが、例えば、メタノール、エタノール、1-プロパノール、イソプロパノールなどのプロパノール類、1-ブタノール、2-ブタノール、イソブタノールなどのブタノール類、アミルアルコール、イソアミルアルコール、2-ペンタノール、3-ペンタノール、2-メチル-1-ブタノール、イソペンチルアルコール、ネオペンチルアルコールなどのペンタノール類、1-ヘキサノール、2-ヘキサノール、3-ヘキサノールなどのヘキサノール類、1-ヘプタノール、2-ヘプタノール、3-ヘプタノール、1,3-ブタンジオール、ネオペンチルグリコール、グリセリン、ジグリセリン、プロピレングリコールなどの多価アルコールなどを挙げることができる。【００１４】
酸類としては、飲食可能なものであればよく、特に限定されるものではないが、例えば、アジピン酸、酪酸、イソ酪酸、クエン酸、グルコン酸、コハク酸、ギ酸、酢酸、酒石酸、乳酸、フィチン酸、フマル酸、リンゴ酸、プロピオン酸、4-ヒドロキシ安息香酸、2,5-ジヒドロキシ安息香酸、3,4-ジヒドロキシ安息香酸、バニリン酸、4-ヒドロキシ-3,5-ジメトキシ安息香酸、及びリン酸又はそれらの塩などを挙げることができる。
脂肪酸としては、飲食可能なものであればよく、特に限定されるものではないが、例えば、ヘキサン酸（カプロン酸）、ヘプタン酸（エナント酸（ヘプチル酸））、オクタン酸（カプリル酸）、ノナン酸（ペラルゴン酸）、デカン酸（カプリン酸）、ドデカン酸（ラウリン酸）、テトラデカン酸（ミリスチン酸）、ペンタデカン酸（ペンタデシル酸）、ヘキサデカン酸（パルミチン酸）、9-ヘキサデセン酸（パルミトレイン酸）オクタデカン酸（ステアリン酸）、cis-9-オクタデセン酸（オレイン酸）、11-オクタデセン酸（バクセン酸）、cis,cis-9,12-オクタデカジエン酸（リノール酸）、9,12,15-オクタデカントリエン酸（（9,12,15）-リノレン酸、α-リノレン酸））、6,9,12-オクタデカトリエン酸（（6,9,12）-リノレン酸、β-リノレン酸））、8,11,14-イコサトリエン酸（ジホモ-γ-リノレン酸）、5,8,11,14-エイコサテトラエン酸（アラキドン酸）、テトラコサン酸（リグノセリン酸）、cis-15-テトラコサン酸（ネルボン酸）、ミリストレイン酸（9-テトラデセン酸）、9-ペンタデセン酸、ドコサヘキサエン酸（DHA）、all-cis-7,10,13,16,19-ドコサペンタエン酸（クルパノドン酸（DPA）、イワシ酸）、エイコサペンタエン酸（EPA）（チムノドン酸）などを挙げることができる。【００１５】
タンパク質としては、特に限定されるものではないが、例えば、ゼラチン、コラーゲン、カゼイン、カゼインナトリウム、カゼインホスホペプチド、乳清タンパク質（ホエイプロテイン）、ラクトフェリン、大豆タンパク質、小麦グルテン、ポリグルタミン酸などを挙げることができる。
アミノ酸類としては、特に限定されるものではないが、例えば、アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リシン、スレオニン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、トリプトファン、チロシン及びバリンなどを挙げることができる。
ビタミン類としては、特に限定されるものではないが、例えば、ビタミンA（レチノール）、ビタミンB1（チアミン）、ビタミンB2（リボフラビン）、ナイアシン（ニコチン酸とニコチン酸アミド）、パントテン酸、ビタミンB6（ピリドキシン、ピリドキサール、ピリドキサミン）、ビタミンB12（シアノコバラミン）、ビオチン、ビタミンC（アスコルビン酸）、ビタミンD2（エルゴカルシフェロール）、ビタミンD3（コレカルシフェロール）、ビタミンE（トコフェロール）、ビタミンK及び葉酸などを挙げることができる。【００１６】
増粘安定剤として、特に限定されるものではないが、例えば、プルラン、デキストラン、カードラン、ジェランガム、キサンタンガムマクロホモプシスガム、納豆菌ガム（納豆菌粘質物）、スクレロガム（スクレログルカン）、ラムザンガム、ウェランガム（ウェラン多糖類）、レバン、アグロバクテリウムスクシノグリカン、アゾトバクタービネランジーガム（アゾトバクタービネランジー多糖類）、アウレオバシジウム培養液、β-グルカン（β1,3-グルカン、β1,3/1,6-グルカン）、グァーガム（グァーフラワー、グァルガム）、グァーガム酵素分解物（グァーフラワー酵素分解物、グァルガム酵素分解物）、ローカストビーンガム（カロブビーンガム、イナゴマメガム、タマリンドシードガム（タマリンドガム、タマリンド種子多糖類）、セスバニアガム、カシアガム（カッシャガム）、アマシードガム、ダンマル樹脂、アラビアガム（アカシアガム）、アラビノガラクタン、ガティガム（インディアンガム）、トラガントガム、カラヤガム、アーモンドガム（セドウガム）、エレミ樹脂、モモ樹脂、カラギナン（カラゲニン、カラゲナン）、ファーセレラン、寒天、易溶化寒天、寒天部分分解物、アガロース、フコイダン、アルギン酸、LMペクチン、HMペクチン、シュガービートペクチン、熱処理シュガービートペクチン、大豆多糖類（大豆ヘミセルロース）、キチン、キトサン、オリゴグルコサミン（キトサンオリゴ糖）、グルコサミン、コンニャク粉、グルコマンナン（コンニャクイモ抽出物）、セルロース、海藻セルロース、サツマイモセルロース、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム（繊維素グリコール酸ナトリウム）、カルボキシメチルセルロースカルシウム（繊維素グリコール酸カルシウム）、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、発酵セルロース（醸造セルロース、ナタデココ）、デンプン、デンプングリコール酸ナトリウム、デンプンリン酸エステルナトリウム、ヒドロキシプロピルデンプン、デキストリン、白色デキストリン、黄色デキストリン、ブリティッシュガム、マルトデキストリン、クラスターデキストリンムチン、ヒアルロン酸及びポリグルタミン酸などを挙げることができる。【００１７】
界面活性剤としては、特に限定されるものではないが、例えば、グリセリン脂肪酸エステル、ポリグリセリン脂肪酸エステル、有機酸モノグリセライド、ソルビタン脂肪酸エステル、プロピレングリコール脂肪酸エステル、ポリグリセリン縮合（ポリ）リシノール酸エステル、レシチン、酵素分解レシチン、リゾレシチン、ダイズレシチン（ダイズリン脂質）、卵黄レシチン、ショ糖脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート（ポリソルベート20、Tween 20）、ステアロイル乳酸ナトリウム、ステアロイル乳酸カルシウム、サポニン及びキラヤサポニンなどを挙げることができる。
加工でんぷんとしては、特に限定されるものではないが、例えば、酸処理でんぷん、塩酸焙焼でんぷん（デキストリン）、アルカリ加工でんぷん、漂白でんぷん、酸化でんぷん、酵素処理でんぷん、リン酸化でんぷん、リン酸架橋でんぷん、アセチル化でんぷん、ヒドロキシプロピル化でんぷん、ヒドロキシエチルでんぷん、オクテニルコハク酸デンプンナトリウム、オクテニルコハク酸デンプンアルミニウム、カチオンでんぷん、カルボキシメチル化でんぷんなどを挙げることができる。【００１８】
乳としては、特に限定されるものではないが、例えば、生乳、牛乳、特別牛乳、生山羊乳、殺菌山羊乳、生めん羊乳、部分脱脂乳、脱脂乳、成分調整牛乳、低脂肪牛乳、無脂肪牛乳、加工乳、クリーム、バター、バターオイル、チーズ、濃縮ホエイ、濃縮乳、脱脂濃縮乳、無糖れん乳、無糖脱脂れん乳、加糖れん乳、加糖脱脂れん乳、全粉乳、脱脂粉乳、クリームパウダー、ホエイパウダー、たんぱく質濃縮ホエイパウダー、バターミルクパウダー、加糖粉乳、調整粉乳及び醗酵乳などを挙げることができる。
容器詰め飲料は、茶ペプチド組成物を添加する工程、かつ得られた飲料組成物を加熱殺菌する加熱滅菌処理工程を経ることで製造できる。
加熱殺菌処理工程は、容器詰め飲料の製造にて一般的に用いられる手法により行うことができ、茶ペプチド組成物と飲料を混合し、得られた飲料組成物を容器に充填した後に加熱殺菌処理を行っても良いし、当該飲料組成物を加熱殺菌処理してから容器に充填しても良い。加熱殺菌処理工程は、飲料組成物を品温70℃〜145℃にて0.1秒間〜60分間処理することが好ましく、品温90℃〜145℃にて0.1秒間〜30分間処理することがより好ましい。容器詰め飲料に利用可能な容器としては、ポリエチレンテレフタレート（PET）製容器（PETボトル）、金属缶容器等が挙げられる。容器の形態は特に限定されない。容器の容量は容器詰め飲料の用量に応じて選択することができ、特に限定されるものではないが、例えば、50mL〜500mL（典型的には50mL、100mL、150mL、180mL、200mL、250mL、300mL、350mL、400mL、450mL又は500mL）が好ましく、100mL〜200mLがより好ましい。【００１９】
飲料とは、特に限定されるものではないが、例えば、緑茶飲料、紅茶飲料、烏龍茶飲料、麦茶飲料、はと麦茶飲料、甜茶飲料、プーアル茶飲料、ジャスミン茶飲料、抹茶飲料、ブレンド茶飲料、玄米茶飲料、マテ茶飲料などの茶系飲料、スポーツ飲料類、コーヒー、コーヒー飲料、コーヒー入り清涼飲料などのコーヒー飲料類、トマトジュース、ニンジンジュース、野菜ジュース、野菜果汁ミックスジュースなどの野菜飲料、コーラ炭酸飲料、透明炭酸飲料、果汁入り炭酸飲料、果実着色炭酸飲料、乳類入り炭酸飲料、栄養ドリンク炭酸飲料などの炭酸飲料類、天然果汁、果汁飲料、果肉飲料、果汁入り混合飲料などの果実飲料類が挙げることができる。【００２０】
茶ペプチド組成物は、ACE阻害活性を有しているので、茶ペプチド組成物を添加した容器詰め飲料は、血圧降下作用、アンジオテンシン変換酵素阻害作用を有する飲料としても用いられる。
血圧降下作用を評価する方法は、一般的にヒトの高血圧に対するモデル動物とされる自然発症高血圧ラット（SHR）を用いて評価することが出来る。特に限定されないが、SHRに茶ペプチド組成物をゾンデによる経口投与を実施し、経時的に収縮期血圧を非観血式血圧測定装置で測定し、対象区と比較して、収縮期血圧の数値の減少を確認することにより、血圧降下作用を評価できる。【００２１】
本発明のジペプチド混合物の原料としては、本発明のジペプチドのアミノ酸配列を有するペプチド、たんぱく質であれば特に限定されるものではなく、茶葉、桑葉,グァバ葉等が利用可能であるが、タンパク質含量および生産量の点より茶葉または茶葉抽出残渣を原料とすることが好ましい。ジペプチドを混合物として得る場合には、例えば茶葉又は茶葉抽出残渣を原料として次のようにして調製できる。
ジペプチドの製造方法は、（ａ）茶葉又は茶葉抽出残渣をpH3.0〜7.0、70℃〜95℃の熱水で30分〜12時間処理することで茶葉熱水処理品又は茶葉抽出残渣熱水処理品を得る熱水処理工程、（ｂ）茶葉熱水処理品又は茶葉抽出残渣熱水処理品を酵素で分解した酵素反応液を得る酵素処理工程を備える。このときに用いる茶葉としては、Camellia属、例えばC.sinensis、C.assamicaやそれらの交雑種から得られる茶葉から製茶された茶葉などが挙げられる。製茶された茶葉には、煎茶、焙じ茶、玉露、かぶせ茶、てん茶等（蒸し製茶と総称する緑茶類）の不発酵茶；嬉野茶、青柳茶、各種中国茶等（釜炒り茶と総称する）の不発酵茶があり、これらの茶葉をそのまま利用することができる。但し、茶葉をそのまま用いると、エグ味の原因となるカテキンが混入すること、及び茶葉抽出残渣中には、茶葉タンパク質の水不溶性タンパク質が多く残されていることから、茶葉抽出残渣を原料とすることが好ましい。【００２２】
茶葉抽出残渣を得る際に使用する溶媒は、特に限定されるものではないが、熱水、エタノール、酢酸エチルなどの食品・食品添加物に使用可能な溶媒を用いることができる。これらの溶媒は一種もしくは二種以上混合して使用してもよく、その配合割合は適宜選択できる。茶葉抽出残渣を得る際の溶媒での抽出条件は、特に限定されるものではないが、例えば熱水で抽出する場合、その熱水での抽出条件は、好ましくは温度が60〜95℃、時間が30分間〜12時間で抽出回数は1〜3回であり、より好ましくは温度が80℃、時間が2時間、抽出回数が2または3回とすることで、茶葉抽出残渣を得ることができる。【００２３】
茶葉又は茶葉抽出残渣への酵素反応の前処理方法としては、アルカリ処理することで水不溶性タンパク質が可溶化し、茶ペプチド組成物を効率的に得ることも可能である。しかしながら、茶葉又は茶葉抽出残渣中に存在するカテキンがアルカリと反応し黒く変色するため、酵素反応後に活性炭処理、合成吸着剤処理、陰イオン交換処理、陽イオン交換処理、エタノール沈殿処理、過酸化水素処理といった公知の脱色工程を用いる必要がある。この方法では、茶ペプチド組成物を得るまでの工程が長くなり、製造コストがかかる点から、前処理として、熱水処理を用いることが好ましい。熱水処理によって得られる茶葉熱水処理品又は茶葉抽出残渣熱水処理品の処理条件としては、茶ペプチド組成物の着色を抑える点からpH3.0〜7.0が好ましく、pH3.0〜5.0が更に好ましい。処理時の温度は、収率の点から70℃〜95℃が適している。処理時間は長ければ長いほど抽出効率がよくなるが、タンパク質以外の糖類、脂質類も同時に抽出されてしまいペプチド含量が低下してしまう点から、30分間〜24時間が好ましく、30分間〜12時間が更に好ましく、30分間〜4時間が更に好ましい。
pHを3.0〜7.0に調整する方法としては、特に限定されるものではないが、例えば、塩酸、クエン酸、硫酸、酢酸、リン酸などの食品に使用可能な酸及び／又はその塩類を使用できる。【００２４】
使用する酵素としては、特に限定されるものではないが、例えば、プロテアーゼ、ペプチダーゼが好ましく、微生物、植物、動物由来の酵素などの食品に使用可能な酵素ならいずれも使用できる。プロテアーゼ、ペプチダーゼの添加量は用いる酵素の種類、反応条件によって異なり、特に限定されるものではないが、例えば、植物原料に含まれるタンパク質10gあたり蛋白分解力として100ユニット〜600,000ユニット、ペプチダーゼ力として1ユニット〜600ユニットの割合で用いることが好ましく、植物原料に含まれるタンパク質10gあたり蛋白分解力として2,500ユニット〜400,000ユニット、ペプチダーゼ力として2.5ユニット〜400ユニットの割合で用いることがより好ましく、植物原料に含まれるタンパク質10gあたり蛋白分解力として5,000ユニット〜200,000ユニット、ペプチダーゼ力として5ユニット〜200ユニットの割合で用いることが更に好ましい。なお、蛋白分解力における1ユニットとは、カゼインを基質として40℃、5分間の反応で1分間に1μgのチロシンに相当する非蛋白性のフォリン試液呈色物質の増加をもたらす酵素量を意味する。ペプチダーゼ力における1ユニットとはL-ロイシル-p-ニトロアニリドを基質とし、40℃、1分間に1μmoleのp-ニトロアニリンを生成する酵素量を意味する。
プロテアーゼ、ペプチダーゼの酵素反応時間は、用いる酵素の種類によって異なり、特に限定されるものではなく、茶ペプチド組成物を効率的に得る点から1時間〜48時間が好ましく、1時間〜24時間がより好ましい。プロテアーゼ、ペプチダーゼは１種類で処理してもよいし、効率的に茶ペプチド組成物を得る点から複数種を併用しても良い。複数種の酵素を使用する場合には、複数の酵素を同時に作用させても良いし、１種類ずつ逐次作用させても良い。【００２５】
プロテアーゼ、ペプチダーゼの種類としては、特に限定されるものではないが、例えば、オリエンターゼ22BF、オリエンターゼOP、オリエンターゼ90N、オリエンターゼAY、スミチームDPP-G（エイチビィアイ株式会社）、スミチームLP、スミチームFL-G、スミチームCP、スミチームFP-G、スミチームFLAP-G、スミチームMP、スミチームACP-G（新日本化学工業株式会社）、プロチンSD-AY10、プロメラインF，プロテアーゼP「アマノ」3SD、パパインW-40、サモアーゼPC10F、サモアーゼC160、サモアーゼC100、プロチンSD-NY10（天野エンザイム株式会社）、デナチームCPO PEPRICH、デナプシン2P、ビオプラーゼSP-20FG、ビオプラーゼOP、デナチームAP（ナガセケムテックス株式会社）、アルカラーゼ 2.4L FL、ニュートラーゼ、フレーバーザイム1000L（ノボザイムズ ジャパン株式会社）などを挙げることができる。特に至適pH域がアルカリ性でセリンエンドペプチダーゼに分類されるサブチリシンであるオリエンターゼ22BFやプロチンSD-NY10、至適pH域が中性でエンドペプチダーゼに分類されるサーモライシンであるサモアーゼC160、至適pH域が酸性でアミノペプチダーゼに分類されるロイシンアミノペプチダーゼであるスミチームACP-Gを使用することができる。酵素の添加する順番に制限は無いが、至適pH域がアルカリ性の酵素から順に中性、酸性と反応させることにより、中和する際に添加するアルカリ・酸の添加量が少なくなり、中和塩を減少することが出来る観点より好ましい。特に至適pH域がアルカリ性でセリンエンドペプチダーゼに分類されるサブチリシンは至適pH域が広いオリエンターゼ22BFが好ましい。
酵素の反応温度は、用いる酵素の種類によって異なり、特に限定されるものではないが、プロテアーゼ、ペプチダーゼが安定的に作用できる温度、例えば30℃〜85℃が好ましく、50℃〜70℃がより好ましい。サモアーゼC160の場合には、反応温度は30℃〜85℃が好ましく、40℃〜80℃がより好ましく、50℃〜70℃が更に好ましい。
酵素の由来は、用いる酵素の種類によって異なり、特に限定されるものではないが、Aspergillus oryzae、Aspergillus melleus、Geobacilus stearothermophilus、Rhizopus oryzae、Bacillus subtillsが好ましく、エンドプロテアーゼ活性やエキソペプチダーゼ活性を有しており、食品工業的に広く利用されている観点よりAspergillus oryzae、Bacillus subtillsがより好ましい。【００２６】
酵素の反応pHは、用いる酵素の種類によって異なり、特に限定されるものではないが、至適pH域がアルカリ性でセリンエンドペプチダーゼに分類されるオリエンターゼ22BFが安定的に作用できるpH、例えば7.0〜11.0が好ましく、7.0〜10.0がより好ましい。中性でエンドペプチダーゼに分類されるサーモライシンであるサモアーゼC160の場合には、反応pHは5.0〜8.5が好ましく、7.0〜8.5がより好ましい。至適pH域が酸性でアミノペプチダーゼに分類されるロイシンアミノペプチダーゼであるスミチームACP-Gの場合には、反応pHは3.0〜7.0が好ましく、4.0〜7.0がより好ましく、5.0〜7.0が更に好ましい。
酵素反応終了後に酵素を失活させる方法としては、特に限定されるものではないが、例えばpH調整や加熱処理によって行うことができる。加熱処理を行う場合には、45℃〜140℃で10秒間〜30分間が好ましく、70℃〜95℃で1分間〜10分間がより好ましい。
酵素反応液から目的の茶ペプチド組成物を得る方法としては、特に限定されるものではないが、例えば、遠心分離や珪藻土などの濾過助剤を用いた濾過により、固形物を除去することで茶ペプチド組成物含有溶液を得ることができる。得られた茶ペプチド組成物含有溶液を粉末化する方法としては、特に限定されるものではないが、例えば、熱風乾燥や凍結乾燥（FD）を用いることができる。
茶ペプチド組成物含有溶液にはpHを調整した際に生じるNaClなどの無機塩が含まれているので、粉末化する前に電気透析やイオン交換樹脂、ナノ濾過膜を用いて無機塩を除去してもよい。
【発明の効果】
【００２７】
本発明によれば、アンジオテンシン変換酵素阻害活性を備えたジペプチド等を提供できる。
【発明を実施するための形態】
【００２８】
次に、本発明の実施形態について、図表を参照しつつ説明するが、本発明の技術的範囲は、これらの実施形態によって限定されるものではなく、発明の要旨を変更することなく様々な形態で実施できる。
＜活性物質の特定＞
１．茶ペプチド組成物の製造方法
（１）熱水処理工程
緑茶葉100gに対して水を1000g加えて80℃で2時間処理後、ろ過することにより茶葉抽出残渣を回収した。茶葉抽出残渣に対して水を1000g加えて80℃で2時間処理後、ろ過する操作を合計3回繰り返し、茶葉抽出残渣を回収した（熱水処理工程）。
（２）酵素処理工程
茶葉抽出残渣1000g（タンパク質量：50g）に対して水を1500g加え、1N水酸化ナトリウム水溶液によってpH7.0、7.5、8.0に調整し、オリエンターゼ22BF（エイチビィアイ株式会社）を0.25g（蛋白分解力：55000ユニット）添加し、50℃で1、2または4時間酵素反応した。反応pH及び反応時間の組み合わせとして、具体的には、pH8.0にて1,2または4時間（実施例１〜３）、pH7.5にて2時間（実施例４）、pH7.0にて2時間（実施例５）、pH7.0にて1時間（実施例６）の６種類の組み合わせとした。反応終了後、1N水酸化ナトリウム水溶液もしくは塩酸でpH7.0に調整し、サモアーゼC160（天野エンザイム株式会社）を0.25g（蛋白分解力：400000ユニット）添加し65℃で2時間酵素反応した。反応終了後、塩酸でpH5.5に調整し、スミチームACP-G（新日本化学工業株式会社）を0.25g（ペプチダーゼ力：250ユニット）添加し、50℃で2時間酵素反応し、90℃、10分間加熱処理して酵素を失活することで酵素反応液を得た（酵素処理工程）。
（３）粉末化工程
酵素反応液を固液分離により固形分を除去し、FDにより、粉末化することで茶ペプチド組成物を得た（粉末化工程）。
【００２９】
２．活性画分の精製（１）
実施例３にて得られた茶ペプチド組成物10gに水1000mLを加えて溶解し、公称分画分子量3000のUF膜（旭化成製）を用いて分画した。水を加えながら連続でUF膜を通液し、内液を分子量3000以上画分、外液を分子量3000以下画分とした。得られた画分を濃縮、乾固した後、ACE阻害活性を測定した。その結果、分子量3000以下の画分に強いACE阻害活性が認められた。
次に、分子量3000以下画分を100mg/mLに調製した後、陰イオン交換樹脂（DEAE Sepharose、GEヘルスケア社製、カラム径：100×26 mm I.D.）に供し、5つの画分（水画分、0.25M NaCl画分、0.5M NaCl画分、0.75M NaCl画分、1.0M NaCl画分）を得た。このうち、NaClを含む画分はODSカラム（Cosmosil 140 C18、ナカライテスク社製、カラム径：100×26 mm I.D.）で脱塩後、ACE阻害活性を測定した。その結果、水画分に最も強いACE阻害活性が認められた。
【００３０】
次に、水画分を30％メタノールに溶解した後、ゲル濾過カラムクロマトグラフィーに供した。ゲル濾過カラムクロマトグラフィーは、装置としてProminenceシステム（島津社製）を用い、カラムにTOYOPEARL HW-40F（300×32mm I.D.、東ソー社製）を、移動相として30％メタノールを2mL/minの条件で使用した。操作は室温で実施した。サンプル注入量は4mLとし、フラクションサイズは7mL/tubeとした。検出はUV215nmで行った。
得られた各分画について、ACE阻害活性及びタンパク質の測定を行った。タンパク質の測定には、DC Protein Assay（Bio-Rad社製）を用いた。
その結果、フラクションNo.17〜26に高いACE阻害活性が確認され、タンパク質が含有することが確認されたため、阻害活性を示す成分は分子量3000以下のタンパク質またはペプチドの可能性が考えられた。
【００３１】
３．活性画分の精製（２）
フラクションNo.17〜26をまとめて、濃縮、乾固し、分取HPLCに供した。分取ＨＰＬＣは、装置としてProminenceシステム（島津社製）を用い、カラムにCosmosil 5C18 AR-II（250×20mm I.D.、ナカライテスク社製）を、移動相として、Ａ液（0.1％TFA含有水）及びＢ液（0.1％TFA含有アセトニトリル）を用い、流速10mL/minの条件で使用した。グラジエントには、Initial（0％Ｂ）、Initial-10min（0％Ｂ）、10-60min(0-20％Ｂ）、60-62min（20-70％Ｂ）、62-80min（70％Ｂ）を用いた。操作は室温で実施した。サンプル注入量は1mLとした。検出はUV215nmで行った。
主要なピークを18個の画分に分取した後、各画分を濃縮及び乾固した。それぞの画分についてACE阻害活性を測定した結果、活性の高いフラクションNo.12, 14, 17を得た。
【００３２】
４．活性物質の特定
これら3個の画分について、活性物質をLC/MS/MSにて構造解析を行った。LC/MS/MSは、LCとしてUPLC ClassH（ウォーターズ社製）、MSとしてXevo G2-Tof（ウォーターズ社製）を用い、カラムにACQITY UPLC BEH C18（50×2.1mm I.D.、ウォーターズ社製）を、移動相として、Ａ液（0.1％TFA含有水）及びＢ液（0.1％TFA含有アセトニトリル）を用い、流速0.8mL/minとし、カラム温度55℃で実施した。グラジエントには、Initial（0％Ｂ）、Initial-1min（0％Ｂ）、1-8min(0-30％Ｂ）、8-9min（30-70％Ｂ）、9-12min（70％Ｂ）、12-14min（70-0％Ｂ）を用いた。サンプル注入量は1μLとした。検出はUV215nmで行った。イオン化法としてESIを用いた。
その結果、フラクションNo.12がPhe-Asp、フラクションNo.14がPhe-Ala、フラクションNo.17がThr-Argであることが判明した。
【００３３】
＜ジペプチドの合成＞
Phe-Asp、Phe-Ala及びThr-Argの3種類のジペプチドは、固相合成後に95％以上に精製したものを株式会社ベックスより購入した。
＜ACE阻害活性の測定＞
ACE阻害活性は、以下の方法に従って測定した。
ACE Kit-WST（株式会社同仁化学研究所社製）を用いて、Thr-Arg、Phe-Asp、Phe-Ala及び茶ペプチド組成物のACE阻害活性を測定した。測定サンプルの濃度を段階的に調製し、それぞれの阻害率を計算した。反応溶液中の測定サンプル濃度を横軸、阻害率を縦軸として、各結果をプロットし、得られる曲線が50％の阻害率を通過する時の各サンプル濃度をIC50値とした。
結果を表１及び表２に示した。表１に示すように実施例１〜６記載の茶ペプチドにおいて38μg/mL〜66μg/mLのIC50でACE阻害活性が認められた。特に実施例３（pH8.0、4時間反応）のIC50が最も良好であった。また、表２に示すように、全てのジペプチドについて、ACE阻害活性が認められた。また、精製後のジペプチドのACE阻害活性は、茶ペプチド組成物の値に比べると、約6〜8倍の高活性であった。
【００３４】
【表１】
2021059840.tif 000002
【００３５】
【表２】
2021059840.tif 000003
【００３６】
＜茶ペプチド組成物中のジペプチド含量の測定＞
実施例１〜６記載の茶ペプチド組成物中のジペプチド含量は下記方法に従って、LC/MS/MSにより定量した。
茶ペプチド組成物を25〜50mg秤量し、0.1％ギ酸を含む水：メタノール＝1：1の混合溶液に溶解させた後に50mLに定容し、0.45μm PTFEフィルター（アドバンテック（株）製、DISMIC-25HP）を用いて濾過した後、LC/MS/MS分析に供した。
また、各ジペプチド（受託合成品）を0.1ppm、1ppm、10ppmになるように、0.1％ギ酸を含む水溶液で調整した標準溶液を測定し、検量線を作成した。
【００３７】
LC/MS/MSは、LCとしてProminence HPLC（島津社製）、MSとしてQTRAP 5500（AB SCIEX社製）を用い、分離カラムにDiscovery HS F5（150×2.1mm I.D.,Sigma-Aldrich社製）を、移動相として、Ａ液（0.1％ギ酸 水溶液）及びＢ液（0.1％ギ酸 アセトニトリル）を用い、流速0.25mL/minとし、カラム温度40℃で実施した。グラジエントには、initial-3min（2％Ｂ）、3-10min（2-30％Ｂ）、10-35min（30％Ｂ）、35-40min（30-50％Ｂ）、40-45min（100％Ｂ）を用いた。検出はUV215nmで行った。イオン化法としてESIを用いた。
結果を表３に示した。表３に示す通り、茶ペプチド組成物である実施例１〜実施例４のいずれについても３種類のジペプチドが製造されており、実施例５、６では１種類のジペプチドが製造されていた。３種類のジペプチドのうち、Thr-Argの含量が最も高く、Phe-Asp及びPhe-Alaは、Thr-Argの1/12以下の含量であった。Thr-ArgとPhe-Alaの含量比であるThr-Arg／Phe-Alaは12.7〜5320.0であった。
【００３８】
【表３】
2021059840.tif 000004
【００３９】
＜茶ペプチド組成物およびジペプチドの血圧降下作用の動物実験評価＞
3種類のジペプチド及び実施例１記載の茶ペプチド組成物について、ラットを用いた血圧降下を評価する試験を行った。ラットはチャールズリバー社から購入した12週齢の雄のSHR（自然発症高血圧ラット）を使用した。1週間予備飼育した後、試験に供した。対照区として蒸留水を用いた。
試験群毎に5匹のラットを体重のバラツキが少なくなるように群分けした。茶ペプチド組成物については、蒸留水にて1.2mg/mLに調製し、ラット体重当り3.3mL/kg（茶ペプチド組成物として4mg/kgに相当）となるようにゾンデを用いて経口投与した。ジペプチドについては、それぞれ蒸留水にて0.6mg/mLに調製し、ラット体重当り3.3mL/kg（ジペプチドとして2mg/kgに相当）となるようにゾンデを用いて経口投与した。蒸留水はラット体重当り3.3mL/kgとなるようにゾンデを用いて経口投与した。
各試料を経口投与後、4時間及び6時間後に収縮期血圧を非観血式血圧測定装置（ソフトロン社製BP-98A-L）で測定した。それぞれ4回測定し、その平均値を測定値とした。
結果を表４に示した。表に示す通り、対照区に比べ、茶ペプチド組成物及び3種類のジペプチドは、いずれも有意に血圧降下作用が認められた。
【００４０】
【表４】
2021059840.tif 000005
【００４１】
＜茶ペプチド組成物含有飲食品の処方例＞
処方例１：グレープフルーツ飲料
下記グレープフルーツ飲料処方の通りに上記＜ジペプチドの合成＞に記載のいずれかのジペプチドを０．５ｍｇもしくは「１．茶ペプチド組成物の製造方法」に記載のものを１．０ｇとなるように添加した。本品は飲料として好適に利用できた。
グレープフルーツ飲料処方（１）
１．３種類のうちのいずれかのジペプチド  ０．５ｍｇ
２．グレープフルーツ濃縮果汁        ２．０ｇ
３．ブドウ糖果糖混合液糖            ０．９ｇ
４．マルチトール                    ２．０ｇ
５．クエン酸                        ０．３ｇ
６．ビタミンＣ                      ０．０２ｇ
７．香料                            ０．１ｇ
８．水                            残部
合計                            １００ｇ
グレープフルーツ飲料処方（２）
１．茶ペプチド組成物                １．０ｇ
２．グレープフルーツ濃縮果汁        ２．０ｇ
３．ブドウ糖果糖混合液糖            ０．９ｇ
４．マルチトール                    ２．０ｇ
５．クエン酸                        ０．３ｇ
６．ビタミンＣ                      ０．０２ｇ
７．香料                            ０．１ｇ
８．水                            残部
合計                            １００ｇ
【００４２】
処方例２：インスタント茶処方
下記インスタント茶処方の通りに上記＜ジペプチドの合成＞に記載のいずれかのジペプチドを０．５ｍｇもしくは「１．茶ペプチド組成物の製造方法」に記載のものを２．０ｇとなるように添加した。本品は飲料として好適に利用できた。
茶抽出物粉末としてはカメリアエキス（太陽化学社製）を使用した。
インスタント茶処方（１）
１．３種類のうちのいずれかのジペプチド  ０．５ｍｇ
２．茶抽出物粉末                  ６０．０ｇ
３．サイクロデキストリン          １５．０ｇ
４．ソーマチン                      ０．００７５ｇ
５．ビタミンＣ                      １．０ｇ
６．デキストリン                  残部
合計                            １００ｇ
インスタント茶処方（２）
１．茶ペプチド組成物                ２．０ｇ
２．茶抽出物粉末                  ６０．０ｇ
３．サイクロデキストリン          １５．０ｇ
４．ソーマチン                      ０．００７５ｇ
５．ビタミンＣ                      １．０ｇ
６．デキストリン                  残部
合計                            １００ｇ
【００４３】
処方例３：ゼリー
下記ゼリー茶処方の通りに「上記＜ジペプチドの合成＞に記載のいずれかのジペプチドを０．５ｍｇもしくは「１．茶ペプチド組成物の製造方法」に記載のものを２．０ｇとなるように添加した。本品は食品として好適に利用できた。
ゼリー処方（１）
１．３種類のうちのいずれかのジペプチド  ０．５ｍｇ
２．砂糖                          １０．０ｇ
３．レモン濃縮果汁                  ８．５ｇ
４．クチナシ黄色製剤                ０．０４ｇ
５．クエン酸                        １．０ｇ
６．カラギナン                      １．５ｇ
７．ビタミンＣ                      ０．０２ｇ
８．香料                            ０．２ｇ
９．水                            残部
合計                            １００ｇ
ゼリー処方（２）
１．茶ペプチド組成物                ２．０ｇ
２．砂糖                          １０．０ｇ
３．レモン濃縮果汁                  ８．５ｇ
４．クチナシ黄色製剤                ０．０４ｇ
５．クエン酸                        １．０ｇ
６．カラギナン                      １．５ｇ
７．ビタミンＣ                      ０．０２ｇ
８．香料                            ０．２ｇ
９．水                            残部
合計                            １００ｇ
【００４４】
処方例４：錠剤
下記錠剤処方の通りに「上記＜ジペプチドの合成＞に記載のいずれかのジペプチドを０．５ｍｇもしくは「１．茶ペプチド組成物の製造方法」に記載のものを２．０ｇとなるように添加した。本品は健康食品として好適に利用できた。
錠剤処方（１）
１．３種類のうちのいずれかのジペプチド  ０．５ｍｇ
２．マルチトール                  残部
３．トレハロース                  １５．２ｇ
４．酒石酸塩                        ３．０ｇ
５．ステアリン酸Ｃａ                ０．５ｇ
６．ビタミンＣ                      ０．０２ｇ
７．香料                            ０．０８ｇ
合計                            １００ｇ
錠剤処方（２）
１．茶ペプチド組成物                ２．０ｇ
２．マルチトール                  残部
３．トレハロース                  １５．２ｇ
４．酒石酸塩                        ３．０ｇ
５．ステアリン酸Ｃａ                ０．５ｇ
６．ビタミンＣ                      ０．０２ｇ
７．香料                            ０．０８ｇ
合計                            １００ｇ
【００４５】
茶ペプチド組成物含有飲料の製造方法
茶ペプチド組成物を0.1質量％となるように市販のお茶（「おーいお茶」、伊藤園社製）にそれぞれ溶解し、100mL容のガラス管にホットパック充填（93℃）した。この飲料は、長期間にわたって安定して保存できた。
このように、本実施形態によれば、アンジオテンシン変換酵素阻害活性を備えたジペプチド等を提供できた。
【手続補正書】
【提出日】令和3年2月26日(2021.2.26)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ジペプチドであるPhe-Aspを有するアンジオテンシン変換酵素阻害剤。
【請求項２】
請求項１に記載のアンジオテンシン変換酵素阻害剤を含有し、血圧降下作用を備える飲食品。
【請求項３】
請求項１に記載のアンジオテンシン変換酵素阻害剤を含有する血圧降下剤。
【国際調査報告】
2021059840.tif 000006
2021059840.tif 000007
2021059840.tif 000008
2021059840.tif 000009