(57)【要約】  本発明の課題は、２以上の被験物質を含有する混合物の皮膚感作性を測定するための方法、および皮膚感作性測定試薬を提供することである。本発明によれば、チオール基またはアミノ基を１個以上有し、かつ蛍光を発する有機化合物と、２以上の被験物質を含有する混合物とを反応させること、および上記反応後の有機化合物の量、または上記反応の生成物の量を、蛍光検出器を用いた光学的測定により検出すること、を含む皮膚感作性の測定方法；並びにチオール基またはアミノ基を１個以上有し、かつ蛍光を発する有機化合物を測定主薬として含む皮膚感作性測定試薬であって、２以上の被験物質を含有する混合物の皮膚感作性を、蛍光検出器を用いた光学的測定により測定するための試薬が提供される。
2020045621.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
チオール基またはアミノ基を１個以上有し、かつ蛍光を発する有機化合物と、２以上の被験物質を含有する混合物とを反応させること、および
前記反応後の有機化合物の量、または前記反応の生成物の量を、蛍光検出器を用いた光学的測定により検出すること、
を含む皮膚感作性の測定方法。
【請求項２】
前記有機化合物が、Ｎ−（アリールアルキルカルボニル）システインである、請求項１に記載の皮膚感作性の測定方法。
【請求項３】
前記有機化合物が、Ｎ−（２−フェニルアセチル）システインまたはＮ−［２−（ナフタレン−１−イル）アセチル］システインである、請求項１または２に記載の皮膚感作性の測定方法。
【請求項４】
前記有機化合物が、α−Ｎ−（アリールアルキルカルボニル）リジンである、請求項１に記載の皮膚感作性の測定方法。
【請求項５】
前記有機化合物が、α−Ｎ−（２−フェニルアセチル）リジンまたはα−Ｎ−［２−（ナフタレン−１−イル）アセチル］リジンである、請求項１または４に記載の皮膚感作性の測定方法。
【請求項６】
前記有機化合物が、２００〜４００ｎｍに蛍光を発し、吸収極大波長におけるモル吸光係数が１０Ｌ／ｍｏｌ・ｃｍ以上５０００００Ｌ／ｍｏｌ・ｃｍ以下の有機化合物である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の皮膚感作性の測定方法。
【請求項７】
前記有機化合物と前記混合物とを反応させる工程で得られる反応物を、クロマトグラフィー処理することを含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載の皮膚感作性の測定方法。
【請求項８】
前記蛍光検出器を用いた光学的測定において、励起波長が２００〜３５０ｎｍであって、蛍光波長が２００〜４００ｎｍである、請求項１〜７のいずれか一項に記載の皮膚感作性の測定方法。
【請求項９】
前記混合物が、香料、精油、高分子化合物、医薬品、農薬、食品、化学製品、および天然物由来成分からなる植物抽出液のうちの少なくとも１種である、請求項１から８のいずれか一項に記載の皮膚感作性の測定方法。
【請求項１０】
蛍光検出器を用いた光学的測定における有機化合物のピーク面積の平均値から、次式に従って有機化合物の減少率を計算する、請求項１から９のいずれか一項に記載の皮膚感作性の測定方法。
チオール基を１個以上有し、かつ蛍光を発する有機化合物の減少率（％  ｄｅｐｌｅｔｉｏｎ）＝［１−（反応後の未反応の、チオール基を１個以上有し、かつ蛍光を発する有機化合物のピーク面積の平均値／標準のチオール基を１個以上有し、かつ蛍光を発する有機化合物のピーク面積の平均値）］×１００；
アミノ基を１個以上有し、かつ蛍光を発する有機化合物の減少率（％  ｄｅｐｌｅｔｉｏｎ）＝［１−（反応後の未反応の、アミノ基を１個以上有し、かつ蛍光を発する有機化合物のピーク面積の平均値／標準のアミノ基を１個以上有し、かつ蛍光を発する有機化合物のピーク面積の平均値）］×１００
【請求項１１】
チオール基を１個以上有し、かつ蛍光を発する有機化合物の減少率と、アミノ基を１個以上有し、かつ蛍光を発する有機化合物の減少率の平均値を算出するか、またはチオール基を１個以上有し、かつ蛍光を発する有機化合物の減少率を算出し、下記に従って感作性物質および非感作性物質を判定する、請求項１０に記載の皮膚感作性の測定方法。
（１）チオール基を１個以上有し、かつ蛍光を発する有機化合物の減少率と、アミノ基を１個以上有し、かつ蛍光を発する有機化合物の減少率の平均値で評価する場合
平均スコア＜４．９％の場合：被験物質は、非感作性物質と判定する。
平均スコア≧４．９％の場合：被験物質は、感作性物質と判定する。
（２）チオール基を１個以上有し、かつ蛍光を発する有機化合物の減少率のみで評価する場合
チオール基を１個以上有し、かつ蛍光を発する有機化合物の減少率＜５．６％の場合：被験物質は、非感作性物質と判定する。
チオール基を１個以上有し、かつ蛍光を発する有機化合物の減少率≧５．６％の場合：被験物質は、感作性物質と判定する。
【請求項１２】
チオール基またはアミノ基を１個以上有し、かつ蛍光を発する有機化合物を測定主薬として含む皮膚感作性測定試薬であって、２以上の被験物質を含有する混合物の皮膚感作性を、蛍光検出器を用いた光学的測定により測定するための試薬。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、蛍光検出器を用いた２以上の被験物質を含有する混合物の皮膚感作性の測定方法、並びに皮膚感作性測定試薬に関する。
【背景技術】
【０００２】
皮膚感作性（アレルギー）は、物質に暴露された箇所の局所的な水疱および紅斑などの症状に留まらず、アナフィラキシーという重篤で生命に危険を及ぼす全身性のアレルギー反応を伴う場合がある。また、皮膚感作性は一旦発症すると長期にわたって暴露を回避する管理も必要となることなどから、重要な毒性の一つと考えられている。医薬、農薬、および化粧品等の製品に含まれる化学物質はアレルギー反応を引き起こさない物質であることが重要であり、製品開発に当っては、使用する化学物質の皮膚感作性を確認する必要がある。【０００３】
化学物質の皮膚感作性を評価する方法として、従来からモルモットを使用する試験法が一般的に知られており、アジュバントを用いるＧＰＭＴ（Ｇｕｉｎｅａ  Ｐｉｇ  Ｍａｘｉｍｉｓａｔｉｏｎ  Ｔｅｓｔ）や非アジュバント試験であるビューラー法（Ｂｕｅｈｌｅｒ  Ｔｅｓｔ）などの試験法が長年広く利用されてきた。【０００４】
動物実験は、煩雑な操作、長期間の試験および高額な試験費用など多くの問題があり、また動物愛護などの倫理的および社会的な要請もあることから、動物を用いない代替法の開発が進んでいる。特に、重篤な症状を示す皮膚感作性を試験する方法を開発することは急務であり、培養細胞を用いたｉｎ  ｖｉｔｒｏ試験、および化学反応によるｉｎ  ｃｈｅｍｉｃｏ試験が開発されている。【０００５】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏ試験としては、ＡＲＥ−Ｎｒｆ２  ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  ＫｅｒａｔｉｎｏＳｅｎｓＴＭ  ｔｅｓｔ  ｍｅｔｈｏｄ（ＫｅｒａｔｉｎｏＳｅｎｓは登録商標）、ＬｕＳｅｎｓ（ＡＲＥ−ＮｒＦ２  ｌｕｓｉｆｅｒａｓｅ  ＬｕＳｅｎｓ  ｔｅｓｔ  ｍｅｔｈｏｄ）、ｈ−ＣＬＡＴ（ｈｕｍａｎ  Ｃｅｌｌ  Ｌｉｎｅ  Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  Ｔｅｓｔ）、Ｕ−ＳＥＮＳ（Ｍｙｅｌｏｉｄ  Ｕ９３７  Ｓｋｉｎ  Ｓｅｎｓｉｔｉｚａｔｉｏｎ  Ｔｅｓｔ）およびＩＬ−８  Ｌｕｃ  ａｓｓａｙなどが知られている。【０００６】
化学反応によるｉｎ  ｃｈｅｍｉｃｏ試験は、培養細胞を用いないため、特別な技術、知識および設備が不要である等、多くの利点がある。例えば、非特許文献１および２には、２種類のペプチド（システインペプチドおよびリジンペプチド）を求核試薬として利用する方法が記載されている。また、特許文献１および２には、アリール環を導入したシステイン誘導体およびアリール環を導入したリジン誘導体を求核試薬とする皮膚感作性測定試薬および皮膚感作性測定方法が記載されている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ｇｅｒｂｅｒｉｃｋ，  Ｇ．Ｆ．ｅｔ  ａｌ．（２００４）．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  ａ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｒｅａｃｔｉｖｉｔｙ  ａｓｓａｙ  ｆｏｒ  ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ  ｃｏｎｔａｃｔ  ａｌｌｅｒｇｅｎｓ．  Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，８１（２），３３２−４３．
【非特許文献２】Ｇｅｒｂｅｒｉｃｋ，  Ｇ．Ｆ．ｅｔ  ａｌ．（２００７）．Ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｒｅａｃｔｉｖｉｔｙ  ｆｏｒ  ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ  ｃｏｎｔａｃｔ  ａｌｌｅｒｇｅｎｓ：  ａ  ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｔｒｅｅ  ｍｏｄｅｌ  ａｐｐｒｏａｃｈ．  Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，９７（２），４１７−２７．
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】特開２０１１−５９１０２号公報
【特許文献２】特開２０１４−３７９９５号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
非特許文献１および２に記載されている皮膚感作性測定法は、簡便かつ予測精度が高い優れた試験法であるが、使用する２つのペプチド自体のモル吸光係数が低く、かつ２２０ｎｍの短波長しか検出できないため、このペプチドの残存率をＨＰＬＣ−ＵＶ法（高速液体クロマトグラフィー・紫外線法）で定量するためには、定量感度が低いことや、ペプチドと被験物質との共溶出などの現象が起こりやすく、定量が困難な場合が多いと言う問題点を有していた。特許文献１および２に記載の皮膚感作性測定試薬は、これらの問題点を克服した優れた試薬である。【００１０】
非特許文献１および２に記載されている皮膚感作性測定法は、対象となる被験物質の化学構造が明らかな場合に適用が可能であり、この測定法では、１００ｍｍｏｌ／Ｌの被験物質溶液を調製することが必要であるため被験物質の分子量の情報が必要である。即ち、非特許文献１および２に記載されている皮膚感作性測定法は、分子量が不明な物質（混合物を含む）を評価することはできない。特許文献１および２に記載の皮膚感作性測定方法も、非特許文献１および２に記載されている皮膚感作性測定法と基本的に同じ原理に基づくものであり、特許文献１および２においては化学構造が明らかな単一の被験物質についての測定が記載されている。【００１１】
しかし、皮膚感作性を予測したい被験物質は、単一の物質であるとは限らず、むしろ複数の成分から構成される多成分の混合物である場合が多い。多成分の混合物の皮膚感作性を評価する場合には、分子量が不明な成分も評価できること、並びに、クロマトグラフィー測定において求核試薬と２以上の被験物質とが共溶出せずに定量できることという条件を満たす必要がある。【００１２】
本発明の課題は、２以上の被験物質を含有する混合物の皮膚感作性を測定するための方法、および皮膚感作性測定試薬を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明者らは上記課題を解決するために鋭意検討した結果、チオール基またはアミノ基を１個以上有し、かつ蛍光を発する有機化合物と、２以上の被験物質を含有する混合物とを反応させ、反応後の有機化合物の量、または反応の生成物の量を、蛍光検出器を用いた光学的測定により検出することによって、２以上の被験物質を含有する混合物の皮膚感作性を精度よく測定できることを見出した。本発明はこれらの知見に基づいて完成したものである。【００１４】
即ち、本発明によれば、以下の発明が提供される。
（１）  チオール基またはアミノ基を１個以上有し、かつ蛍光を発する有機化合物と、２以上の被験物質を含有する混合物とを反応させること、および
上記反応後の有機化合物の量、または上記反応の生成物の量を、蛍光検出器を用いた光学的測定により検出すること、
を含む皮膚感作性の測定方法。
（２）  上記有機化合物が、Ｎ−（アリールアルキルカルボニル）システインである、（１）に記載の皮膚感作性の測定方法。
（３）  上記有機化合物が、Ｎ−（２−フェニルアセチル）システインまたはＮ−［２−（ナフタレン−１−イル）アセチル］システインである、（１）または（２）に記載の皮膚感作性の測定方法。
（４）  上記有機化合物が、α−Ｎ−（アリールアルキルカルボニル）リジンである、（１）に記載の皮膚感作性の測定方法。
（５）  上記有機化合物が、α−Ｎ−（２−フェニルアセチル）リジンまたはα−Ｎ−［２−（ナフタレン−１−イル）アセチル］リジンである、（１）または（４）に記載の皮膚感作性の測定方法。
（６）  上記有機化合物が、２００〜４００ｎｍに蛍光を発し、吸収極大波長におけるモル吸光係数が１０Ｌ／ｍｏｌ・ｃｍ以上５０００００Ｌ／ｍｏｌ・ｃｍ以下の有機化合物である、（１）〜（５）のいずれか一に記載の皮膚感作性の測定方法。
（７）  上記有機化合物と上記混合物とを反応させる工程で得られる反応物を、クロマトグラフィー処理することを含む、（１）〜（６）のいずれか一に記載の皮膚感作性の測定方法。
（８）  上記蛍光検出器を用いた光学的測定において、励起波長が２００〜３５０ｎｍであって、蛍光波長が２００〜４００ｎｍである、（１）〜（７）のいずれか一に記載の皮膚感作性の測定方法。
（９）  上記混合物が、香料、精油、高分子化合物、医薬品、農薬、食品、化学製品、および天然物由来成分からなる植物抽出液のうちの少なくとも１種である、（１）から（８）のいずれか一に記載の皮膚感作性の測定方法。
（１０）  蛍光検出器を用いた光学的測定における有機化合物のピーク面積の平均値から、次式に従って有機化合物の減少率を計算する、請求項１から９のいずれか一項に記載の皮膚感作性の測定方法。
チオール基を１個以上有し、かつ蛍光を発する有機化合物の減少率（％  ｄｅｐｌｅｔｉｏｎ）＝［１−（反応後の未反応の、チオール基を１個以上有し、かつ蛍光を発する有機化合物のピーク面積の平均値／標準のチオール基を１個以上有し、かつ蛍光を発する有機化合物のピーク面積の平均値）］×１００；
アミノ基を１個以上有し、かつ蛍光を発する有機化合物の減少率（％  ｄｅｐｌｅｔｉｏｎ）＝［１−（反応後の未反応の、アミノ基を１個以上有し、かつ蛍光を発する有機化合物のピーク面積の平均値／標準のアミノ基を１個以上有し、かつ蛍光を発する有機化合物のピーク面積の平均値）］×１００
（１１）  チオール基を１個以上有し、かつ蛍光を発する有機化合物の減少率と、アミノ基を１個以上有し、かつ蛍光を発する有機化合物の減少率の平均値を算出するか、またはチオール基を１個以上有し、かつ蛍光を発する有機化合物の減少率を算出し、下記に従って感作性物質および非感作性物質を判定する、請求項１０に記載の皮膚感作性の測定方法。
（１）チオール基を１個以上有し、かつ蛍光を発する有機化合物の減少率と、アミノ基を１個以上有し、かつ蛍光を発する有機化合物の減少率の平均値で評価する場合
平均スコア＜４．９％の場合：被験物質は、非感作性物質と判定する。
平均スコア≧４．９％の場合：被験物質は、感作性物質と判定する。
（２）チオール基を１個以上有し、かつ蛍光を発する有機化合物の減少率のみで評価する場合
チオール基を１個以上有し、かつ蛍光を発する有機化合物の減少率＜５．６％の場合：被験物質は、非感作性物質と判定する。
チオール基を１個以上有し、かつ蛍光を発する有機化合物の減少率≧５．６％の場合：被験物質は、感作性物質と判定する。
（１２）  チオール基またはアミノ基を１個以上有し、かつ蛍光を発する有機化合物を測定主薬として含む皮膚感作性測定試薬であって、２以上の被験物質を含有する混合物の皮膚感作性を、蛍光検出器を用いた光学的測定により測定するための試薬。
【発明の効果】
【００１５】
本発明の皮膚感作性の測定方法および皮膚感作性の測定方法によれば、２以上の被験物質を含有する混合物の皮膚感作性を測定することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】図１は、緑茶抽出液（原液）（求核試薬を含まない）についてのＵＶ検出および蛍光検出のＨＰＬＣチャートを示す。
【図２】図２は、緑茶抽出液の１／１０希釈液（求核試薬を含まない）についてのＵＶ検出および蛍光検出のＨＰＬＣチャートを示す。
【図３】図３は、緑茶抽出液の１／１００希釈液（求核試薬を含まない）についてのＵＶ検出および蛍光検出のＨＰＬＣチャートを示す。
【図４】図４は、緑茶抽出液の１／１０００希釈液（求核試薬を含まない）についてのＵＶ検出および蛍光検出のＨＰＬＣチャートを示す。
【図５】図５は、緑茶抽出液（原液）と求核試薬（ＮＡＣまたはＮＡＬ）との反応液についてのＵＶ検出および蛍光検出のＨＰＬＣチャートを示す。
【図６】図６は、緑茶抽出液の１／１０希釈液と求核試薬（ＮＡＣまたはＮＡＬ）との反応液についてのＵＶ検出および蛍光検出のＨＰＬＣチャートを示す。
【図７】図７は、緑茶抽出液の１／１００希釈液と求核試薬（ＮＡＣまたはＮＡＬ）との反応液についてのＵＶ検出および蛍光検出のＨＰＬＣチャートを示す。
【図８】図８は、緑茶抽出液の１／１０００希釈液と求核試薬（ＮＡＣまたはＮＡＬ）との反応液についてのＵＶ検出および蛍光検出のＨＰＬＣチャートを示す。
【図９】図９は、アロエモデル抽出液（２０成分混合液）（原液）（求核試薬を含まない）についてのＵＶ検出および蛍光検出のＨＰＬＣチャートを示す。
【図１０】図１０は、アロエモデル抽出液（２０成分混合液）の１／１０希釈液（求核試薬を含まない）についてのＵＶ検出および蛍光検出のＨＰＬＣチャートを示す。
【図１１】図１１は、アロエモデル抽出液（２０成分混合液）（原液）と求核試薬（ＮＡＣまたはＮＡＬ）との反応液についてのＵＶ検出および蛍光検出のＨＰＬＣチャートを示す。
【図１２】図１２は、アロエモデル抽出液（２０成分混合液）の１／１０希釈液と求核試薬（ＮＡＣまたはＮＡＬ）との反応液についてのＵＶ検出および蛍光検出のＨＰＬＣチャートを示す。
【図１３】図１３は、β−シトステロール（原液）（求核試薬を含まない）についてのＵＶ検出および蛍光検出のＨＰＬＣチャートを示す。
【図１４】図１４は、β−シトステロールの１／１０希釈液（求核試薬を含まない）についてのＵＶ検出および蛍光検出のＨＰＬＣチャートを示す。
【図１５】図１５は、β−シトステロール（原液）と求核試薬（ＮＡＣまたはＮＡＬ）との反応液についてのＵＶ検出および蛍光検出のＨＰＬＣチャートを示す。
【図１６】図１６は、β−シトステロールの１／１０希釈液と求核試薬（ＮＡＣまたはＮＡＬ）との反応液についてのＵＶ検出および蛍光検出のＨＰＬＣチャートを示す。
【図１７】図１７は、プロトカテク酸（原液）（求核試薬を含まない）についてのＵＶ検出および蛍光検出のＨＰＬＣチャートを示す。
【図１８】図１８は、プロトカテク酸の１／１０希釈液（求核試薬を含まない）についてのＵＶ検出および蛍光検出のＨＰＬＣチャートを示す。
【図１９】図１９は、プロトカテク酸（原液）と求核試薬（ＮＡＣまたはＮＡＬ）との反応液についてのＵＶ検出および蛍光検出のＨＰＬＣチャートを示す。
【図２０】図２０は、プロトカテク酸の１／１０希釈液と求核試薬（ＮＡＣまたはＮＡＬ）との反応液についてのＵＶ検出および蛍光検出のＨＰＬＣチャートを示す。
【図２１】図２１は、求核試薬（ＮＡＣまたはＮＡＬ）についてのＵＶ検出および蛍光検出のＨＰＬＣチャートを示す。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
本明細書において、「〜」とはその前後に記載される数値を下限値および上限値として含む意味で使用される。
本発明は、チオール基またはアミノ基を１個以上有し、かつ蛍光を発する有機化合物と、２以上の被験物質を含有する混合物とを反応させること、および上記反応後の有機化合物の量、または上記反応の生成物の量を、蛍光検出器を用いた光学的測定により検出することを含む皮膚感作性の測定方法に関する。本発明はさらに、チオール基またはアミノ基を１個以上有し、かつ蛍光を発する有機化合物を測定主薬として含む皮膚感作性測定試薬であって、２以上の被験物質を含有する混合物の皮膚感作性を、蛍光検出器を用いた光学的測定により測定するための試薬に関する。
【００１８】
上記した通り、多成分の混合物の皮膚感作性を評価する場合には、分子量が不明な成分も評価できること、並びに、クロマトグラフィー測定において求核試薬と２以上の被検物質とが共溶出せずに定量できることという条件を満たす必要がある。
【００１９】
本発明においては、チオール基またはアミノ基を１個以上有し、かつ蛍光を発する有機化合物を求核試薬として使用することにより、求核試薬が高感度で検出できるという利点がある。また、本発明において求核試薬として使用する有機化合物は、蛍光検出が可能であり、これを利用することにより、被験物質と完全に区別して定量することができる。上記により、本発明においては、非特許文献１および２に記載されている皮膚感作性測定法では評価できないとされる２以上の被験物質を含む混合物について、皮膚感作性を測定することが可能になった。
【００２０】
本発明において、皮膚感作性の測定とは皮膚感作性の検定を含む意味であり、また、一定の基準の皮膚感作性の有無の判断、および皮膚感作性の定量的測定を含む意味である。
【００２１】
皮膚感作性は、多くの段階からなる複雑な過程によって発症する。このうち最初の事象は、被験物質が皮膚から浸透した後、皮膚内のタンパクと共有結合することである。したがって、この共有結合性を評価することにより、対象の被験物質が皮膚感作性であるか否かを予測することができると考えられる。ここで、皮膚内のタンパクと被験物質との反応は、およそ５つの有機化学反応によることが知られている。この５つの反応に関わるアミノ酸は、システインのＳＨ基とリジンのＮＨ２基であることが知られている。このため、本発明の実施例においては、システインまたはリジンのＮ末端にＵＶ領域に高いモル吸光係数を有するアリール環を導入した化合物を求核試薬として使用し、この２つの求核試薬と被験物質とを反応させて、未反応の求核試薬を定量した。上記の通り、本発明の皮膚感作性測定方法は、求核試薬と被験物質との反応性を算出し、皮膚感作性の予測を行う試験法である。
【００２２】
本発明において、２以上の被験物質を含有する混合物とは、主成分に相当する成分として２以上の被験物質を含む混合物を意味し、１種類の被験物質に対して多種類の不純物が含まれている混合物を意味するものではない。
【００２３】
本発明における混合物の具体例としては、例えば、香料、精油、高分子化合物、医薬品、農薬、食品、化学製品、および天然物由来成分からなる植物抽出液のうちの少なくとも１種を挙げることができるが、特にこれらに限定されるものではない。
【００２４】
本発明においては、チオール基またはアミノ基を１個以上有し、かつ蛍光を発する有機化合物（求核試薬とも言う）を使用する。
チオール基またはアミノ基を１個以上有し、かつ蛍光を発する有機化合物としては、２００〜４００ｎｍに蛍光を発し、吸収極大波長におけるモル吸光係数が１０Ｌ／ｍｏｌ・ｃｍ以上５０００００Ｌ／ｍｏｌ・ｃｍ以下の有機化合物であることが好ましい。
【００２５】
チオール基を１個以上有し、かつ蛍光を発する有機化合物は、そのままの状態、または溶液状態で、好ましくは、波長１９０〜２５００ｎｍの領域で吸収を示す化合物であり、さらに好ましくは、波長２００〜７００ｎｍの領域に吸収を示す化合物である。さらに、上記波長領域に吸収極大を有する化合物が好ましい。また、チオール基を１個以上有し、かつ蛍光を発する有機化合物は、好ましくは、その吸収極大のモル吸光係数（Ｌ／ｍｏｌ・ｃｍ）が１０以上の吸収を有する化合物であり、さらに好ましくは、モル吸光係数が１００以上の吸収を有する化合物である。特に好ましくは、波長２００〜７００ｎｍの領域に吸収極大を有し、そのモル吸光係数が１００以上の吸収を有する化合物である。
【００２６】
チオール基を１個以上有し、かつ蛍光を発する有機化合物としては例えば、システインの誘導体であって、芳香族基を有するものが挙げられる。芳香族基は、フェニル基、ナフチル基などの炭化水素系芳香族基のほか、ピリジル基、フリル基、チオフェニル基などのヘテロ元素を有するものであってもよい。上記の有機化合物として、さらに具体的には、システインのアミノ基またはカルボキシル基にアミド結合などによりベンゼン環やナフタレン環などのアリール基を結合させた化合物が挙げられる。このうち、Ｎ−（アリールアルキルカルボニル）システイン等が特に好ましい。Ｎ−（アリールアルキルカルボニル）システインにおいて、アリール基は炭素数６〜１６程度であればよい。またアルキルカルボニル基における炭素数は２〜１１程度であればよい。カルボニル基に結合するアルキル基は直鎖状、分岐鎖状、環状のいずれでもよく、例えば、メチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、ブチル基、イソブチル基、ｓｅｃ−ブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基、ペンチル基、イソペンチル基、ネオペンチル基、ｔｅｒｔ−ペンチル基、ヘキシル基、へプチル基、オクチル基、ノニル基、デシル基、２−エチルヘキシル基、シクロプロピル基などを挙げることができる。上記の有機化合物としての具体例としては、Ｎ−（２−フェニルアセチル）システイン、およびＮ−[２−(ナフタレン−１−イル)アセチル]システインが挙げられる。
【００２７】
チオール基を１個以上有し、かつ蛍光を発する有機化合物は公知の方法により製造することが可能であり、例えば、Ｎ−（２−フェニルアセチル）システインは、特開２０１１−５９１０２号公報の段落００１５〜００１７に記載の方法により合成することができる。
【００２８】
Ｎ−[２−(ナフタレン−１−イル)アセチル]システインは、以下の方法により合成できる。
１−ナフチル酢酸５０ｇをトルエン２７０ｍＬに溶解し、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）を滴下しながら、２０℃で塩化チオニル９５．８ｇを滴下する。６０℃で２時間反応後冷却し、トルエン２００ｍＬ添加した後、減圧乾燥して１−ナフチルアセチルクロリドを得る（５６ｇ）。
水酸化ナトリウム１４ｇ、水３５０ｍＬの水溶液にＬ−シスチン２０ｇを添加し、溶解する。溶液を氷水浴にて冷却し、１−ナフチルアセチルクロリド８．７６ｇを滴下する。反応混合物を２０℃で２時間撹拌し、冷却後濃塩酸１６．７ｍＬ添加する。酢酸エチルを約７００ｍＬ添加して結晶を濾取し、減圧乾燥して、Ｎ，Ｎ’−ビス（１−ナフチルアセチル）シスチンを得る（３９．２ｇ）。
Ｎ，Ｎ’−ビス（１−ナフチルアセチル）シスチン２０ｇ、亜鉛粉末２０ｇ、メタノール５００ｍＬの混合物を窒素置換下、トリフリオロ酢酸１２０ｍＬを2時間かけて滴下する。反応混合物を２時間撹拌した後、酢酸エチル５００ｍＬで抽出し、有機層を硫酸マグネシウムで乾燥後、濾過、濃縮する。得られた残渣を酢酸エチルから再結晶し、乾燥後してＮ−[２−(ナフタレン−１−イル)アセチル]システインを得る（５．２ｇ）。
【００２９】
Ｎ−[２−(ナフタレン−１−イル)アセチル]システインは、２００〜４００ｎｍに蛍光を発し、２８１ｎｍに吸収極大を示し、モル吸光係数は、約７０００（Ｌ／ｍｏｌ・ｃｍ）であり、最大蛍光波長は、３３５ｎｍである。
アミノ基を１個以上有し、かつ蛍光を発する有機化合物は、アミノ基を有するため、システイン残基との反応が低い皮膚感作性物質とも反応性を有し、汎用の簡易な分析装置を用いて測定することが可能であり、疎水性の化学物質を溶解させるために用いられる有機溶媒比率の高い反応液においても十分な溶解度および安定性を有する。
【００３０】
アミノ基を１個以上有し、かつ蛍光を発する有機化合物はそのままの状態、または溶液状態で、好ましくは、波長１９０〜２５００ｎｍの領域で吸収を示す化合物であり、さらに好ましくは、波長２００〜７００ｎｍの領域に吸収を示す化合物である。さらに、上記波長領域に吸収極大を有する化合物が好ましい。アミノ基を１個以上有し、かつ蛍光を発する有機化合物は、好ましくは、吸収極大波長におけるモル吸光係数（Ｌ／ｍｏｌ・ｃｍ）が１０以上５０００００以下である化合物であり、より好ましくは、吸収極大波長におけるモル吸光係数（Ｌ／ｍｏｌ・ｃｍ）が１０〜２０００である化合物であり、さらに好ましくは、吸収極大波長におけるモル吸光係数が１００〜２０００である化合物である。特に好ましくは、波長２００〜７００ｎｍの領域に吸収極大を有し、吸収極大波長におけるモル吸光係数が１００〜２０００である化合物である。
【００３１】
なおモル吸光係数（ε）は下記式で与えられる。
ε＝Ｄ／（ｃ・ｄ）
ここで、Ｄは溶液の吸光度を表し、ｃは溶質のモル濃度（ｍｏｌ／Ｌ）、ｄは溶液層の厚さ（光路長）（ｃｍ）を表す。モル吸光係数は、市販の分光光度計を用いて吸収スペクトルまたは吸光度を測定することにより求めることができる。
【００３２】
アミノ基を１個以上有し、かつ蛍光を発する有機化合物は、被験物質との反応性の観点で１級アミノ基を有することが好ましく、ε−アミノ基を有するリジン誘導体であることがより好ましい。リジンの誘導体として、リジンのカルボキシル基および／またはα−アミノ基が少なくとも一つの置換基によって修飾されたリジン誘導体が挙げられる。
【００３３】
アミノ基を１個以上有し、かつ蛍光を発する有機化合物は、芳香族基を有することが好ましい。芳香族基としてはフェニル基、ナフチル基などの炭化水素系芳香族基のほか、ピリジル基、フリル基、チオフェニル基などのヘテロ元素を有するものであってもよい。芳香族基としてはフェニル基およびナフチル基が好ましい。
【００３４】
アミノ基を１個以上有し、かつ蛍光を発する有機化合物としては例えば、ε−アミノ基および芳香族基を有するリジンの誘導体が挙げられる。
【００３５】
アミノ基を１個以上有し、かつ蛍光を発する有機化合物として、さらに具体的には、リジンのα-アミノ基またはカルボキシル基にアミド結合などによりベンゼン環やナフタレン環などのアリール基を結合させた化合物が挙げられる。このうち、α−Ｎ−（アリールアルキルカルボニル）リジンが特に好ましい。Ｎ−（アリールアルキルカルボニル）リジンにおいて、アリール基は炭素数６〜１６程度であればよい。アリール基として、ベンゼン環、ナフタレン環などが挙げられる。またアルキルカルボニル基における炭素数は２〜１１程度であればよい。カルボニル基に結合するアルキル基は直鎖状、分岐鎖状、環状のいずれでもよく、例えば、メチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、ブチル基、イソブチル基、ｓｅｃ−ブチル基、ｔｅｒｔ−ブチル基、ペンチル基、イソペンチル基、ネオペンチル基、ｔｅｒｔ−ペンチル基、ヘキシル基、へプチル基、オクチル基、ノニル基、デシル基、２−エチルヘキシル基、シクロプロピル基などを挙げることができる。本発明の皮膚感作性測定試薬に含まれる有機化合物としての具体例としては、α−Ｎ−（２−フェニルアセチル）リジン（以下、ＰＡＬとも言う）、およびα−Ｎ−［２−（ナフタレン−１−イル）アセチル］リジン（以下、ＮＡＬとも言う）が挙げられる。
【００３６】
アミノ基を１個以上有し、かつ蛍光を発する有機化合物は公知の方法に準じて製造することが可能であり、例えば、ＰＡＬおよびＮＡＬは、特開２０１４−３７９９５号公報の段落００２５〜００３１に記載の方法により合成することができる。
α−Ｎ−（２−フェニルアセチル）リジンは、２００〜４００ｎｍに蛍光を発し、吸収極大波長（２５５ｎｍ付近）におけるモル吸光係数は約２００Ｌ／ｍｏｌ・ｃｍである。
α−Ｎ−［２−（ナフタレン−１−イル）アセチル］リジンは、２００〜４００ｎｍに蛍光を発し、吸収極大波長（２８０ｎｍ付近）におけるモル吸光係数は約４００Ｌ／ｍｏｌ・ｃｍであり、最大蛍光波長は、３３２ｎｍである。
【００３７】
本発明の皮膚感作性測定試薬は、上記の有機化合物のみからなるものであってもよく、測定主薬である上記の有機化合物のほかに１または２以上の添加剤を含んでいるものであってもよい。添加剤の例としては、ｐＨ調整剤、安定化剤、キレート剤、等が挙げられる。また、本発明の皮膚感作性測定試薬は、上記の測定主薬および必要に応じて上記の添加剤を、水、水性緩衝液、有機溶媒、またはこれらいずれかの混合溶媒等に溶解させたものであってもよい。本発明の皮膚感作性測定試薬は、溶液、液体状、固体状（粉末、顆粒、凍結乾燥物、錠剤等）のいずれの形態で提供されてもよい。
【００３８】
本発明の皮膚感作性測定試薬は、例えば、酢酸アンモニウムなどの有機酸塩類またはリン酸塩などの無機塩類を含む水性緩衝液もしくは水またはこれらと有機溶媒との混合溶媒に溶解した形態で、例えば約０．０１μｍｏｌ／Ｌ〜約１ｍｏｌ／Ｌ程度、通常約０．１ｍｍｏｌ／Ｌ〜約５００ｍｍｏｌ／Ｌ程度の上記有機化合物の濃度として使用すればよい。
【００３９】
被験物質は、モル濃度を調節できる場合には、例えば、水、又は、メタノール、エタノール、アセトニトリル、アセトンなどの有機溶媒ならびにこれらの混合溶媒（水と有機溶媒との混合溶媒、または２種以上の有機溶媒の混合溶媒）に、例えば約０．０１μｍｏｌ／Ｌ〜約１ｍｏｌ／Ｌ程度の濃度、通常約０．１ｍｍｏｌ／Ｌ〜約５００ｍｍｏｌ／Ｌ程度、または約１ｍｍｏｌ／Ｌ〜約５００ｍｍｏｌ／Ｌ程度の濃度となるように溶解すればよい。次いで、本発明の皮膚感作性測定試薬の測定主薬である上記有機化合物と被験物質溶液とを、上記有機化合物と被験物質のモル濃度比が例えば１：１００〜２０：１、または１：１００〜１０：１となるように混合し反応させればよい。反応は、上記有機化合物と被験物質とを含む溶液を、例えば約４℃〜約６０℃程度の温度範囲にて保温しながら、通常約１分〜約２日間程度攪拌または静置することによって行うことができる。
【００４０】
被験物質は、モル濃度を調節できない場合には、例えば、水、メタノール、エタノール、アセトニトリル、アセトンなどの有機溶媒ならびにこれらの混合溶媒（水と有機溶媒との混合溶媒、または２種以上の有機溶媒の混合溶媒）に、例えば約０．０１ｍｇ／ｍＬ〜約１０ｍｇ／ｍＬ程度の濃度、通常約０．１ｍｇ／Ｌ〜約１ｍｇ／ｍＬ程度の濃度となるように溶解すればよい。次いで、本発明の皮膚感作性測定試薬の測定主薬である上記有機化合物の約０．１〜約１００μｇ／ｍＬ、通常１〜１０μｇ／ｍＬの溶液を上記被験物質溶液に等量加えれば良い。ただし、濃度と添加量を上記のようにすれば良く、例えば、測定試薬の濃度を２倍にして、添加量を１／２にするなど適切に調整してもよい。反応は、上記有機化合物と被験物質とを含む溶液を、例えば約４℃〜約６０℃程度の温度範囲にて保温しながら、通常約１分〜約２日間程度攪拌または静置することによって行うことができる。
【００４１】
上記反応により、上記有機化合物と被験物質との反応性を調べることによって、被験物質の皮膚感作性を測定することができる。上記の反応性を調べるためには、皮膚感作性測定試薬溶液と被験物質溶液との混合液中における上記有機化合物の残存量および／または上記有機化合物と被験物質との反応生成物の生成量を分析すればよい。この分析を経時的に行うことにより、上記有機化合物と被験物質との反応速度定数を求め、異なる被験物質の反応速度定数を比較することや、被験物質の反応速度定数を動物実験により皮膚感作性の有無や強度が確認されている化合物について求めた反応速度定数と比較することにより、被験物質の皮膚感作性を評価することができる。
【００４２】
なお、残存量を分析する場合、皮膚感作性測定試薬は反応液中で何らかの変化を起こす可能性がある場合は、必要に応じて被験物質のみを含まない反応液（コントロール群）を別途用意して分析を行い、この反応液中の残存量の値を元にして補正しても良い。
【００４３】
例えば、皮膚感作性測定試薬がチオール基を有している場合には、容易に酸化されてジスルフィド体（２量体）になることがある。そのため、有機化合物の残存量を定量する際には、必要に応じてジスルフィド体も含めて分析を行い、これらの総計により上記有機化合物の残存量としてもよい。
【００４４】
被験物質と求核試薬との反応性（共有結合能）は、未反応の求核試薬を定量することにより推定することが可能であるが、被験物質と求核試薬との反応の生成物（反応生成物）を検出して定量することが、最も直接的で正しい評価である。混合物の場合、その構成成分が明らかであって、成分と求核試薬との反応生成物が入手可能である場合には、これを用いて、例えば、ＨＰＬＣ−蛍光法により定量することが可能である。
【００４５】
有機化合物または反応の生成物の分析方法としては、特に限定されないが、有機化合物と、２以上の被験物質を含有する混合物とを反応させる工程で得られる反応物を、クロマトグラフィー処理することを含むことが好ましい。例えば、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、ガスクロマトグラフィー（ＧＣ）、薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）などにより、上記反応により生成した化合物、上記有機化合物および被験物質を分離して分析する方法が挙げられる。上記ＨＰＬＣ、ＧＣまたはＴＬＣに用いることのできるクロマトグラフ手法としては、逆相、順相、イオン交換などを挙げることができる。このようなクロマトグラフ手法に使用可能な市販のカラムやＴＬＣとしては、例えば、ＬＣカラムとしてはＣＡＰＣＥＬＬ  ＣＯＲＥ  Ｃ１８（大阪ソーダ社製）、ＣＡＰＣＥＬＬ−ＰＡＫ（資生堂社製）、Ｌ−ｃｏｌｕｍｎ  ＯＤＳ（化学品評価研究機構製）、Ｓｈｏｄｅｘ  Ａｓａｈｉｐａｋ  （昭和電工社製）などを挙げることができ、ＴＬＣプレートではシリカゲル６０Ｆ２５４（メルク社製）、Ｓｉｌｉｃａ  Ｇｅｌ  Ｐｌａｔｅ（ナカライテスク社製）などを挙げることができる。
【００４６】
本発明においては、被験物質と求核試薬との反応後の有機化合物の量、または上記反応の生成物の量を、蛍光検出器を用いた光学的測定により検出する。
基底状態の分子は、励起光を吸収して励起状態へ遷移する。吸収した励起エネルギーの一部は、振動エネルギーなどにより失活し、振動準位の低い位置に無輻射遷移した後、基底状態に戻る際に発する光が蛍光である。蛍光検出器を用いた光学的測定は、吸光光度法に比べて一般に１０３倍以上高感度な分析手法と言われる。さらに蛍光物質を測定対象とするため、選択性に優れ、かつ極微量の分析手段として用いられる。蛍光強度は蛍光物質の濃度に比例するため、検量線を作成することで定量分析が可能である。蛍光検出器としては、市販の検出器を使用することができ、島津製作所社製、ウォーターズ社製、日立製作所社製、アジレント社製、大阪ソーダ社製などが挙げられる。
【００４７】
蛍光検出器を用いた光学的測定においては、励起波長が好ましくは２００〜３５０ｎｍであり、より好ましくは２３０〜３２０ｎｍであり、さらに好ましくは２５０〜３００ｎｍであり、さらに一層好ましくは２７０〜３００ｎｍであり、特に好ましくは２８０〜２９０ｎｍである。蛍光波長は、好ましくは２００〜４００ｎｍであり、より好ましくは３００〜３７０ｎｍであり、さらに好ましくは３００〜３６０ｎｍであり、特に好ましくは３２０〜３５０ｎｍである。
【００４８】
＜減少率の算出＞
反応後の未反応の「チオール基を１個以上有し、かつ蛍光を発する有機化合物」または「アミノ基を１個以上有し、かつ蛍光を発する有機化合物」、および標準（被験物質未添加で反応工程を行った後）の「チオール基を１個以上有し、かつ蛍光を発する有機化合物」または「アミノ基を１個以上有し、かつ蛍光を発する有機化合物」のピーク面積の平均値（各々、ｎ＝３）から、次式に従って「チオール基を１個以上有し、かつ蛍光を発する有機化合物」または「アミノ基を１個以上有し、かつ蛍光を発する有機化合物」の減少率を計算する。被験物質未添加の状態で反応工程を行うとは、上記有機化合物と上記被験物質とを反応させる工程において、上記被験物質を含まない状態で、反応させる工程を行うことを意味する。
【００４９】
チオール基を１個以上有し、かつ蛍光を発する有機化合物の減少率（％  ｄｅｐｌｅｔｉｏｎ）＝［１−（反応後の未反応の「チオール基を１個以上有し、かつ蛍光を発する有機化合物」のピーク面積の平均値／標準（被験物質未添加で反応工程を行った後）の「チオール基を１個以上有し、かつ蛍光を発する有機化合物」のピーク面積の平均値）］×１００
【００５０】
アミノ基を１個以上有し、かつ蛍光を発する有機化合物の減少率（％  ｄｅｐｌｅｔｉｏｎ）＝［１−（反応後の未反応の「アミノ基を１個以上有し、かつ蛍光を発する有機化合物」のピーク面積の平均値／標準（被験物質未添加で反応工程を行った後）の「アミノ基を１個以上有し、かつ蛍光を発する有機化合物」のピーク面積の平均値）］×１００
【００５１】
＜皮膚感作性予測の判定基準＞
反応後の有機化合物の量を、蛍光検出器を用いた光学的測定により検出する場合には、例えば、反応前後における有機化合物の減少率を算出することにより、皮膚感作性を測定することができる。
「チオール基を１個以上有し、かつ蛍光を発する有機化合物」または「アミノ基を１個以上有し、かつ蛍光を発する有機化合物」の減少率、あるいは２つの減少率の平均スコアを算出し、下記に従って「感作性物質」および「非感作性物質」を判定することができる。
（１）チオール基を１個以上有し、かつ蛍光を発する有機化合物の減少率と、アミノ基を１個以上有し、かつ蛍光を発する有機化合物の減少率の平均値で評価する場合
平均スコア＜４．９％の場合：被験物質は、非感作性物質と判定する。
平均スコア≧４．９％の場合：被験物質は、感作性物質と判定する。
（２）チオール基を１個以上有し、かつ蛍光を発する有機化合物の減少率のみで評価する場合
チオール基を１個以上有し、かつ蛍光を発する有機化合物の減少率＜５．６％の場合：被験物質は、非感作性物質と判定する。
チオール基を１個以上有し、かつ蛍光を発する有機化合物の減少率≧５．６％の場合：被験物質は、感作性物質と判定する。
【００５２】
以下の実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明は実施例によって限定されるものではない。
【実施例】
【００５３】
実施例における略号は以下の意味を有する。
ＥＤＴＡ：エチレンジアミン四酢酸
ＮＡＣ：Ｎ−[２−(ナフタレン−１−イル)アセチル]システイン
ＮＡＬ：α−Ｎ−［２−（ナフタレン−１−イル）アセチル］リジン
ＴＦＡ：トリフルオロ酢酸
図１〜図２１において、横軸は保持時間（分）を示し、縦軸は、ＵＶ（紫外）の場合は吸収単位（Ａｂｓｏｒｂａｎｃｅ  Ｕｎｉｔ、ｍＡＵ）、蛍光の場合は電圧（ｍＶ）を示す。【００５４】
＜試験法＞
（１）各種溶液調製
（１−１）０．１ｍｍｏｌ／Ｌ  ＥＤＴＡ水溶液
１）  １５ｍＬ容量のコニカルチューブにＥＤＴＡ・２Ｎａ・２Ｈ２Ｏ（同仁化学製）を３７．２ｍｇ秤量し、２５ｍＬメスピペットを使って１０ｍＬの蒸留水（光製薬製、日本薬局方注射用水）を加え、溶解させる（１０ｍｍｏｌ／Ｌ  ＥＤＴＡ水溶液）。
２）  １００ｍＬ容量の容器に蒸留水（光製薬製、日本薬局方注射用水）を５０ｍＬメスピペットを使って４９．５ｍＬ加え、そこに上記１）の１０ｍｍｏｌ／Ｌ  ＥＤＴＡ水溶液を０．５ｍｌ添加して混合し１００倍希釈する  （０．１ｍｍｏｌ／Ｌ  ＥＤＴＡ水溶液）  。【００５５】
（１−２）１００ｍｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）
１）  １００ｍＬ容量の容器に無水リン酸二水素ナトリウム（富士フイルム和光純薬社製、特級）を０．６ｇ秤量し、５０ｍＬメスピペットを使って５０ｍＬの蒸留水（（光製薬製、日本薬局方注射用水））を加え、溶解させる。
２）  ５００ｍＬ容量の容器に５０ｍＬ（または１００ｍＬ）メスピペットを使って３００ｍＬの蒸留水（光製薬製、日本薬局方注射用水）を加える。
３）  無水リン酸水素二ナトリウム（富士フイルム和光純薬社製、特級）を４．２６ｇ秤量し、２）の蒸留水（光製薬製、日本薬局方注射用水）に添加して溶解させる。
４）  ３）の無水リン酸水素二ナトリウム溶液に１）の無水リン酸二水素ナトリウム溶液を２５ｍＬメスピペットを使って１６ｍＬ加える。
５）  ２５ｍＬメスピペットを使って４）の溶液から１７ｍＬを除き、残りの４）に０．１ｍｍｏｌ／Ｌ  ＥＤＴＡ水溶液を１ｍＬ添加して３００ｍＬにする。この溶液中のＥＤＴＡの濃度は０．３３μｍｏｌ／Ｌであり、反応液中での濃度は０．２５μｍｏｌ／Ｌとなる。
６）  上記溶液の一部を別の容器に分取し、ｐＨメーターでｐＨ測定して、ｐＨ７．９〜８．１の範囲内であることを確認する。【００５６】
（１−３）１００ｍｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液（ｐＨ１０．２）
１）  ５０ｍＬメスピペットを使って５００ｍＬ容量の容器に２８６ｍＬの蒸留水（光製薬製、日本薬局方注射用水）を加える。
２）  無水リン酸水素二ナトリウムを４．２６ｇ秤量し、１）の蒸留水（光製薬製、日本薬局方注射用水）に添加して溶解させる。
３）  ０．１ｍｏｌ／ＬのＮａＯＨ水溶液（富士フイルム和光純薬製、特級）を２５ｍＬメスピペットを使って１４ｍＬ加える。
４）  上記溶液の一部を別の容器に分取し、ｐＨメーター（ポータブルｐＨ計（ＨＭ−２０Ｐ）、東亜電波工業）でｐＨ測定して、ｐＨ１０．１〜１０．３の範囲内であることを確認する。【００５７】
（１−４）反応停止液（２．５％（ｖ／ｖ）ＴＦＡ水溶液）
蒸留水（富士フイルム和光純薬社製）１００ｍＬにＴＦＡ（富士フイルム和光純薬製、特級）を２．５ｍＬ添加する。【００５８】
（１−５）ＨＰＬＣ移動相Ａ：０．１％（ｖ／ｖ）ＴＦＡ水溶液
蒸留水（富士フイルム和光純薬社製）１ＬにＴＦＡを１．０ｍＬ添加する。【００５９】
（１−６）ＨＰＬＣ移動相Ｂ：０．１％（ｖ／ｖ）ＴＦＡアセトニトリル溶液
ＨＰＬＣグレードのアセトニトリル（富士フイルム和光純薬社製、ＨＰＬＣ用）１ＬにＴＦＡ１．０ｍＬを添加する。【００６０】
（２）求核試薬ストック液調製
（２−１）ＮＡＣストック溶液調製
１試験では同一のストック溶液を使用し、１試験毎に使い切れる量に小分けして保存する。具体的な調製例を以下に示す。
１）  ５０ｍＬ容量の容器に１１．６ｍｇ（±０．１ｍｇ）のＮＡＣを秤量し、これに２５ｍＬメスピペットを使って２０ｍＬの１００ｍｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）  を添加し、試験管ミキサーで軽く攪拌して溶解させる（２ｍｍｏｌ／Ｌ）。
２）  ５００ｍＬ容量の容器に同緩衝液を５０ｍＬメスピペットを使って１４９．５ｍＬ加え、そこに上記の２ｍｍｏｌ／Ｌ  ＮＡＣ溶液を０．５ｍＬ添加し、転倒混和をして３００倍希釈する（６．６６７μｍｏｌ／Ｌ）。【００６１】
（２−２）ＮＡＬストック溶液調製（分子量＝３１４．３８）
１試験では同一のストック溶液を使用し、１試験毎に使い切れる量に小分けして保存する。具体的な調製例を以下に示す。
１）  ５０ｍＬ容量の容器に１２．６ｍｇ（±０．１  ｍｇ）のＮＡＬを秤量し、そこに２５ｍＬメスピペットを使って２０ｍＬの１００ｍｍｏｌ／Ｌリン酸緩衝液（ｐＨ１０．２）を添加し、試験管ミキサーで軽く攪拌して溶解させる（２ｍｍｏｌ／Ｌ  ＮＡＬ溶液）。
２）  ５００ｍＬ容量の容器に同緩衝液を５０ｍＬメスピペットを使って１４９．５ｍＬ加え、そこに上記の２ｍｍｏｌ／Ｌ  ＮＡＬ溶液を０．５ｍＬ添加し、転倒混和をして３００倍希釈する（６．６６７μｍｏｌ／Ｌ）。【００６２】
（３）被験物質（多成分系からなる混合物）溶液調製
（３−１）被験物質が液体の場合
被験物質原液を「無希釈溶液」として、これを用いる。なお、この「無希釈溶液」を適切な溶媒で１／１０、１／１００、１／１０００など、適切に希釈した溶液を用いてもよい。【００６３】
（３−２）被験物質が固体の場合
最も良く溶解する溶媒に最大可溶濃度まで溶解させる。その後は、最大可溶濃度まで溶解させた溶液を「無希釈溶液」として試験する。なお、この「無希釈溶液」を適切な溶媒で１／１０、１／１００、１／１０００など、適切に希釈した溶液を用いてもよい。【００６４】
（４）被験物質（単一物質）溶液調製
被験物質を水、アセトニトリル、アセトン、５質量％ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）／アセトニトリル溶液のいずれかの溶媒を用いて１ｍｍｏｌ／Ｌに調製したものを被験物質溶液として用いる。また、溶媒は１ｍｍｏｌ／Ｌにて被験物質が溶解するものを使用し、複数の溶媒に溶解する場合は水、アセトニトリル、アセトン、５質量％ＤＭＳＯ／アセトニトリルの優先順位に従って選択する。【００６５】
（５）反応
（５−１）添加
被験物質溶液は９６ウェルプレート（Ｕ９６ ＰＰ−０．５ ＭＬ ＮＡＴＵＲＡＬ、Ｔｈｅｒｍｏ （ＮＵＮＣ）社）上で主に１２連ピペットを用いて調製し、以下の用量に従って試薬を添加する。
求核試薬（ＮＡＣおよびＮＡＬ）：１５０μＬ
被験物質溶液：５０μＬ【００６６】
（５−２）反応
プレートシール（レジスタントエンボスシール、島津ジーエルシー社）でしっかり密封し、プレートシェーカー（Ｔｉｔｒａｍａｘ １００、Ｈｅｉｄｏｌｐｈ社）で攪拌する。遠心機でスピンダウンしたのち、２５℃、２４時間、遮光状態でインキュベートする。【００６７】
（５−３）反応停止
２４時間インキュベートした後、プレートシールを剥がし、各サンプルに反応停止液を５０μＬずつ添加して反応を停止させる。【００６８】
（６）ＨＰＬＣ測定
求核試薬のＨＰＬＣ測定条件を以下に示す。【００６９】
【表１】
2020045621.tif 000003
【００７０】
（７）データ解析
（７−１）減少率の算出
反応後の未反応のＮＡＣ又はＮＡＬ及び標準（被験物質未添加で反応工程を行った後）のＮＡＣ又はＮＡＬのピーク面積の平均値（各々、ｎ＝３）から、次式に従ってＮＡＣ又はＮＡＬの減少率を計算する。
ＮＡＣ減少率（％  ｄｅｐｌｅｔｉｏｎ）＝［１−（反応後の未反応のＮＡＣのピーク面積の平均値／標準（被験物質未添加で反応工程を行った後）のＮＡＣピーク面積の平均値）］×１００
ＮＡＬ減少率（％  ｄｅｐｌｅｔｉｏｎ）＝［１−（反応後の未反応のＮＡＬのピーク面積の平均値／標準（被験物質未添加で反応工程を行った後）のＮＡＬピーク面積の平均値）］×１００【００７１】
反応後の未反応のＮＡＣのピーク面積の平均値とは、反応後の未反応のＮＡＣを３回測定した際の面積平均値であり、標準（被験物質未添加で反応工程を行った後）のＮＡＣピーク面積の平均値とは、標準（被験物質未添加で反応工程を行った後）のＮＡＣを３回測定した際の面積平均値である。
反応後の未反応のＮＡＬのピーク面積の平均値とは、反応後の未反応のＮＡＬを３回測定した際の面積平均値であり、標準（被験物質未添加で反応工程を行った後）のＮＡＬピーク面積の平均値とは、標準（被験物質未添加で反応工程を行った後）のＮＡＣを３回測定した際の面積平均値である。【００７２】
（７−２）平均スコア
ＮＡＣ及びＮＡＬ減少率の平均値（平均スコア：Ａｖｅｒａｇｅ  Ｓｃｏｒｅ）を計算する。値は、小数第２位を四捨五入する。
ＮＡＣ及びＮＡＬ減少率の平均値（平均スコア：Ａｖｅｒａｇｅ  Ｓｃｏｒｅ）
＝（ＮＡＣ減少率＋ＮＡＬ減少率）／２【００７３】
（８）皮膚感作性予測
判定基準：
ＮＡＣおよびＮＡＬの少なくとも１つの減少率または両者の減少率から平均スコアを算出し、下記に従って「感作性物質」および「非感作性物質」を判定する。
（１）ＮＡＣの減少率とＮＡＬの減少率の平均値で評価する場合
平均スコア＜４．９％の場合：被験物質は、非感作性物質と判定する。
平均スコア≧４．９％の場合：被験物質は、感作性物質と判定する。
（２）ＮＡＣの減少率のみで評価する場合
ＮＡＣの減少率＜５．６％の場合：被験物質は、非感作性物質と判定する。
ＮＡＣの減少率≧５．６％の場合：被験物質は、感作性物質と判定する。【００７４】
＜実施例１＞  緑茶抽出液の皮膚感作性予測
市販の緑茶抽出液を入手して、この抽出液をアセトニトリルにより１／１０、１／１００、１／１０００に希釈した。緑茶抽出液原液および希釈液について、それぞれ蛍光法による皮膚感作性予測を行った。【００７５】
（被験物質を含む混合物）
緑茶抽出液（緑茶リキッド；一丸ファルコス株式会社から入手）を使用した。また、抽出溶媒は、水：エタノール：１，３−ブチレングリコール＝２：１：１である。この緑茶リキッドのｉｎ  ｖｉｖｏ皮膚感作性試験結果は、陽性（皮膚感作性物質）である。この抽出液原液と、この抽出液原液をアセトニトリルで１／１０、１／１００および１／１０００に希釈した溶液を実験に使用した。【００７６】
（実験条件）
上記した緑茶抽出液原液と希釈液と、求核試薬であるＮＡＣまたはＮＡＬとをそれぞれ２５℃で２４時間反応させた。反応はすべて９６ウェルプレート上で行い、各サンプル数はｎ＝３で調製した。また、比較対照として溶媒のみを添加した反応液も調製した。反応液中のＮＡＣおよびＮＡＬの濃度は５μｍｏｌ／Ｌとなるよう調製した。２４時間後の反応液に、終濃度０．５％（ｖ／ｖ）トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）となるようＴＦＡ水溶液を添加したのちに、ＨＰＬＣを用いて、フォトダイオードアレイ（ＰＤＡ）検出器による吸光での検出、および蛍光検出器による蛍光での検出の２種類の検出方法により測定し、それぞれにおけるクロマトグラフとＮＡＣおよびＮＡＬの減少率（Ｄｅｐｌｅｔｉｏｎ）を比較した。【００７７】
（測定条件）
上記の表１に記載のＨＰＬＣ測定条件により、求核試薬（ＮＡＣおよびＮＡＬ）のｄｅｐｌｅｔｉｏｎ（％）を求めた。【００７８】
（結果）
緑茶抽出液およびその希釈液について、それぞれＵＶ検出および蛍光検出でＨＰＬＣ測定した。図１〜図４に、緑茶抽出液またはその希釈液のみ（求核試薬を含まない）についてのＵＶ検出および蛍光検出のＨＰＬＣチャートを示す。図５〜図８に、緑茶抽出液またはその希釈液と求核試薬（ＮＡＣまたはＮＡＬ）との反応液についてのＵＶ検出および蛍光検出のＨＰＬＣチャートを示す。【００７９】
（考察）
緑茶抽出液原液をＨＰＬＣ測定すると、２８１ｎｍでのＵＶ検出では、多成分のピークが極めて多いため、求核試薬（ＮＡＣおよびＮＡＬ）は、いずれも検出および定量できないことがわかった。緑茶抽出液の１／１０希釈液では、多成分のピーク強度が低下するが、求核試薬のピーク位置は、いずれもベースラインまで下がらないため、正確な定量は困難であった。１／１００および１／１０００希釈液では、求核試薬の位置では、いずれも定量に影響しない程度までベースラインまで低下したため、求核試薬を定量することができた。【００８０】
一方、緑茶成分原液を蛍光検出した場合、多成分のほとんどが蛍光を発しないため、ベースラインが極めて低く安定していた。そのため、求核試薬（ＮＡＣおよびＮＡＬ）のピークのみが検出され、多成分に影響されず正しく定量することができた。ただし、ＮＡＣは、緑茶抽出液成分と反応するため、２４時間反応後ではピークは検出されなかった。同様に、緑茶抽出液の１／１０、１／１００および１／１０００希釈液についても、求核試薬を定量することができた。【００８１】
（皮膚感作性予測）
図１〜図８に示すＨＰＬＣチャートから、求核試薬の減少率（Ｄｅｐｌｅｔｉｏｎ）を算出し、平均スコア（Ｍｅａｎ  Ｄｅｐｌｅｔｉｏｎ）を求めた。この値から皮膚感作性を予測した結果を以下に示す。実施例の表中のＳＤは標準偏差を示す。【００８２】
【表２】
2020045621.tif 000004
【００８３】
緑茶抽出液原液は、上記ＨＰＬＣチャートからわかるようにＵＶ検出では評価できなかった。同様に、１／１０希釈液も評価できなかった。しかし、１／１００および１／１０００希釈液では、ＮＡＣおよびＮＡＬのｄｅｐｌｅｔｉｏｎが算出できたため、平均スコアを求めることが可能となり、いずれも平均スコアが約５０％とクライテリアの４．９％を超えたため、皮膚感作性があると判定された。【００８４】
一方、蛍光検出では、緑茶抽出液原液においても求核試薬の定量が可能であり、平均スコアを算出できた。同様に、１／１０、１／１００および１／１０００希釈液においても求核試薬のｄｅｐｌｅｔｉｏｎおよび平均スコアが算出できた。いずれも、平均スコアは約６０％から５０％であったたため、緑茶抽出液原液および１／１０００希釈液まで皮膚感作性があると判定された。【００８５】
（考察）
使用した緑茶抽出液は、原液および１／１０希釈液においては、通常のＨＰＬＣ−ＵＶ法では定量ができなかったが、ＨＰＬＣ−蛍光法では、求核試薬を蛍光検出することにより、緑茶成分の妨害を受けることなく正しく定量することができ、いずれも皮膚感作性が懸念されることがわかった。【００８６】
また、ＨＰＬＣ−ＵＶで定量することができた１／１００および１／１０００希釈液の平均スコアは、それぞれ５４．４％および５０．８％となり、皮膚感作性が懸念されることがわかった。同様に、蛍光検出から算出した１／１００および１／１０００希釈液の平均スコアは、それぞれ５４．１％および４９．８％となり、ＵＶ検出法と同様に皮膚感作性が懸念されることを示した。ここで、ＵＶ法と蛍光法の平均スコアを比較すると、上記のように、誤差の範囲内で完全に一致したことから、蛍光検出法はＵＶ検出法と同じ精度で測定できることがわかった。また、これらの結果は、使用した緑茶抽出液がｉｎ  ｖｉｖｏ皮膚感作性試験で皮膚感作性物質と判定された結果と一致した。上記の結果から、本発明による蛍光検出法によれば、２以上の被験物質を含む混合液でも皮膚感作性を評価できることが裏付けられる。【００８７】
＜実施例２＞アロエモデル抽出液（２０成分の混合液）の皮膚感作性予測
アロエ抽出液における主成分である２０成分以上が、文献（Ｄ．Ｔ．  Ｌｏｏｔｓ，  Ｆ．Ｈ．  ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｗｅｓｔｈｕｉｚｅｎ，  ａｎｄ  Ｌ．  Ｂｏｔｅｓ，  ２００７，  Ａｌｏｅ  ｆｅｒｏｘ  ｌｅａｆ  ｇｅｌ  ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ｃｏｎｔｅｎｔ，  ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔ  ｃａｐａｃｉｔｙ，ａｎｄ  ｐｏｓｓｉｂｌｅ  ｈｅａｌｔｈ  ｂｅｎｅｆｉｔｓ，  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ  ａｎｄ  Ｆｏｏｄ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，５５：６８９１−６８９６）から知られている。これらの各成分および２０成分をすべて混合したモデル抽出液を調製し、ＵＶ法および蛍光法による皮膚感作性予測を行った。【００８８】
（被験物質）
アロエ抽出液における主成分２０種類の各成分名、濃度、溶媒を下表に示す。これらの各成分および２０成分について、以下の方法で溶液を調製した。【００８９】
（１）個別成分溶液の調製法
各成分とも下記溶媒に溶解してストック溶液を調製し、最終濃度になるように添加して、エタノールで定容した。【００９０】
溶媒：
本的にエタノール（ＥｔＯＨ）を使用した。ただし、「Ｓｏｌｖｅｎｔ」に２種類の溶媒が記載されている箇所では、ＥｔＯＨの前に記載した溶媒のみで溶解した。例えば、β−シトステロールの溶媒は、３．２１％ＩＰＡ／ＥｔＯＨと記載しているが、最初に記載しているＩＰＡ（イソプロパノール）を溶媒として使用した。【００９１】
ストック溶液：
基本的に５０ｍｇ／ｍＬ溶液を調製した。ただし、キサンチンは１ｍｇ／ｍＬ、チミンは１００ｍｇ／ｍＬ溶液を調製した。【００９２】
添加量：
上記ストック液を適当量分取し、エタノールで定容して最終濃度に示す溶液を調製した。例えば、β−シトステロールでは、イソプロパノールに溶解して５０ｍｇ／ｍＬ溶液を調製し、この内、３２．１μＬを分取して、エタノールで１０００μＬに定容した。【００９３】
（２）混合液の調製法
２０成分のストック液を上記に従って、適切な量を分取し、エタノールで定容して、個々の成分が最終濃度に示す混合液を調製した。【００９４】
【表３】
2020045621.tif 000005
ＩＰＡ：イソプロパノール、ＤＭＳＯ：ジメチルスルホキシド、ＥｔＯＨ：エタノール、【００９５】
（実験条件）
各成分単体または混合液と、求核試薬であるＮＡＣまたはＮＡＬとをそれぞれ２５℃で２４時間反応させた。反応はすべて９６ウェルプレート上で行い、各サンプル数はｎ＝３で調製した。また、比較対照として溶媒のみを添加した反応液も調製した。反応液中のＮＡＣおよびＮＡＬの濃度は５μｍｏｌ／Ｌとなるよう調製し、植物成分は、上記文献（Ｄ．Ｔ．  Ｌｏｏｔｓ他）に記載の抽出液に含まれる濃度を参考に、上記表に記載の濃度と、その１／１０希釈液の２濃度について反応液の１／４量添加した（終濃度１／４および１／４０）。２４時間後の反応液に、終濃度０．５％（ｖ／ｖ）トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）となるようＴＦＡ水溶液を添加したのちに、ＨＰＬＣを用いてフォトダイオードアレイ（ＰＤＡ）検出器による吸光での検出、および蛍光検出器による蛍光での検出の２種類の検出方法で測定し、それぞれにおけるクロマトグラフと、ＮＡＣおよびＮＡＬの減少率（Ｄｅｐｌｅｔｉｏｎ）を比較した。【００９６】
（測定条件）
上記の表１に記載のＨＰＬＣ測定条件により、求核試薬（ＮＡＣおよびＮＡＬ）のｄｅｐｌｅｔｉｏｎ（％）を求めた。【００９７】
（結果）
２０成分混合液および各成分単体について、それぞれＵＶ検出および蛍光検出でＨＰＬＣ測定した。
図９および図１０に、２０成分の混合液またはその希釈液のみ（求核試薬を含まない）についてのＵＶ検出および蛍光検出のＨＰＬＣチャートを示す。
図１１および図１２に、２０成分の混合液またはその希釈液と求核試薬（ＮＡＣまたはＮＡＬ）との反応液についてのＵＶ検出および蛍光検出のＨＰＬＣチャートを示す。【００９８】
図１３および図１４に、β−シトステロールまたはその希釈液のみ（求核試薬を含まない）についてのＵＶ検出および蛍光検出のＨＰＬＣチャートを示す。
図１５および図１６に、β−シトステロールまたはその希釈液と求核試薬（ＮＡＣまたはＮＡＬ）との反応液についてのＵＶ検出および蛍光検出のＨＰＬＣチャートを示す。【００９９】
図１７および図１８に、プロトカテク酸またはその希釈液のみ（求核試薬を含まない）についてのＵＶ検出および蛍光検出のＨＰＬＣチャートを示す。
図１９および図２０に、プロトカテク酸またはその希釈液と求核試薬（ＮＡＣまたはＮＡＬ）との反応液についてのＵＶ検出および蛍光検出のＨＰＬＣチャートを示す。【０１００】
アロエ抽出液の２０成分の混合液および１／１０希釈液をＨＰＬＣ測定すると、２８１ｎｍでのＵＶ検出では、各成分のピークが求核試薬（ＮＡＣおよびＮＡＬ）と共溶出して定量できないほどではなかったが、ＨＰＬＣ条件によっては妨害される可能性があると考えられた。一方、これらをＨＰＬＣ−蛍光検出した場合、多成分のほとんどが蛍光を発しないため、ベースラインが極めて低く安定していた。そのため、求核試薬（ＮＡＣおよびＮＡＬ）のピークのみが検出され、多成分に影響されず正しく定量することができた。【０１０１】
β−シトステロールをＨＰＬＣ測定すると、２８１ｎｍで一本のピークを示したが、求核試薬と共溶出しなかったため、ＨＰＬＣ−ＵＶ法でも定量できることがわかった。
一方、蛍光検出した場合、β−シトステロールはピークを示さなかったため、求核試薬は一本のピークとして定量できた。【０１０２】
プロトカテク酸をＨＰＬＣ測定した場合、ＨＰＬＣ−ＵＶ法およびＨＰＬＣ−蛍光法とも、基本的には、上記のβ−シトステロールと同じ挙動を示したが、調製原液はＮＡＬとわずかに共溶出した。また、ＮＡＣのｄｅｐｌｅｔｉｏｎが大きく、プロトカテク酸は一部ＮＡＣと反応することがわかった。【０１０３】
（皮膚感作性予測）
図９〜図２０に示すＨＰＬＣチャートから、求核試薬の減少率（ｄｅｐｌｅｔｉｏｎ）を算出し、平均スコアを求めた。この値から皮膚感作性を予測した結果を以下に示す。【０１０４】
（１）アロエ抽出液の２０成分混合液【０１０５】
【表４】
2020045621.tif 000006
【０１０６】
アロエ抽出液の２０成分混合液および１／１０希釈液は、ＨＰＬＣチャートからわかるようにＵＶ検出および蛍光法でも求核試薬のｄｅｐｌｅｔｉｏｎが算出できた。ＵＶ法での混合液および１／１０希釈液の平均スコアは、それぞれ２０．７％および２３．１％であったため、いずれも皮膚感作性があると判定された。一方、蛍光法では、それぞれ２３．９％および２３．３％であったため、上記同様、いずれも皮膚感作性があると判定された。【０１０７】
（考察）
アロエ抽出液の２０成分混合液および１／１０希釈液における平均スコアは、ＵＶ法と蛍光法ともに２０％前後となり、誤差の範囲内で一致したことから、蛍光検出法はＵＶ検出法と同じ精度で測定できることがわかった。また、アロエ抽出液の２０成分中のプロトカテク酸は、カテコール誘導体であることから、皮膚感作性物質（ｐｒｏ−ｈａｐｔｅｎ）であると推測された。実際、後述のようにプロトカテク酸は、皮膚感作性物質と判定されたため、これを含む２０成分混合液は、皮膚感作性を示すことは、予測通りであった。【０１０８】
（２）β−シトステロールおよびプロトカテク酸【０１０９】
【表５】
2020045621.tif 000007
【０１１０】
β−シトステロールおよびプロトカテク酸単体溶液および１／１０希釈液は、上記ＨＰＬＣチャートからわかるようにＵＶ検出および蛍光法でも求核試薬のｄｅｐｌｅｔｉｏｎが算出できた。【０１１１】
β−シトステロール溶液において、ＵＶ法での混合液および１／１０希釈液の平均スコアは、それぞれ０．０％および１．９％であったため、いずれも皮膚感作性を示さないと判定された。一方、蛍光法においても、それぞれ０．１％および０．３％であったため、上記同様、いずれも皮膚感作性を示さないと判定された。【０１１２】
プロトカテク酸溶液において、ＵＶ法での混合液および１／１０希釈液の平均スコアは、それぞれ３９．７％および２１．０％であったため、いずれも皮膚感作性を示すと判定された。一方、蛍光法においても、それぞれ４８．２％および１９．４％であったため、上記同様、いずれも皮膚感作性を示すと判定された。なお、調製原液におけるＮＡＬは、わずかに共溶出が認められたため、平均スコアは３９．７％と算出されたが、共溶出のため信頼性（定量精度）は低い。【０１１３】
（考察）
上述のようにプロトカテク酸単体溶液の調製原液は、ＮＡＬと共溶出したため、ＮＡＬのｄｅｐｌｅｔｉｏｎおよび平均スコアの信頼性は低い。これを除いた場合、β−シトステロールおよびプロトカテク酸単体溶液および１／１０希釈液における平均スコアは、ＵＶ法と蛍光法ともに約２％以下となり、誤差の範囲内で一致したことから、蛍光検出法はＵＶ検出法と同じ精度で測定できることがわかった。【０１１４】
なお、プロトカテク酸は、カテコール誘導体であることから、皮膚感作性物質（ｐｒｏ−ｈａｐｔｅｎ）であると推測された。実際、プロトカテク酸は、皮膚感作性物質と判定されたため、２０成分混合液が皮膚感作性を示す主な要因は、プロトカテク酸によると考えられる。【０１１５】
＜実施例３＞
求核試薬（ＮＡＣ又はＮＡＬ）と被験物質との反応性（平均スコアまたはＮＡＣ減少率（ｄｅｐｌｅｔｉｏｎ）から皮膚感作性を予測することができる。このため、感作性と非感作性を区別する基準値（クライテリア）を設定した。既知の感作性５３物質（強感作性１８物質、中程度感作性２０物質および弱感作性１５物質）と既知の非感作性２９物質の合計８２物質（下表参照）について、蛍光法を利用してＮＡＣとＮＡＬのｄｅｐｌｅｔｉｏｎおよび平均スコアを算出した。結果を以下に示す。以下の表において、Ｓは感作性物質を示し、ＮＳは非感作性物質を示す。この内の約２／３にあたる５６物質の平均スコアを用いて、解析ソフトであるＡＤＭＥＷＯＲＫＳ（富士通九州システムズ株式会社、）の２クラス分類法により、感作性と非感作性を区別する基準値（クライテリア）を４．９％と算出した。同様に、ＮＡＣのｄｅｐｌｅｔｉｏｎのみを用いて、２クラス分類法からクライテリアを５．６％と算出した。【０１１６】
（被験物質（８２物質）のリスト）
【表６】
2020045621.tif 000008
【０１１７】
【表７】
2020045621.tif 000009
【０１１８】
【表８】
2020045621.tif 000010
【０１１９】
【表９】
2020045621.tif 000011
【０１２０】
（試験結果）
（１）強感作性物質
【表１０】
2020045621.tif 000012
【０１２１】
（２）中程度感作性物質
【表１１】
2020045621.tif 000013
【０１２２】
（３）弱感作性物質
【表１２】
2020045621.tif 000014
【０１２３】
（４） 非感作性物質
【表１３】
2020045621.tif 000015
【０１２４】
（５）予測精度
【表１４】
2020045621.tif 000016
【０１２５】
上記結果のように、蛍光法による試験結果および４．９％のクライテリアから算出した皮膚感作性の予測精度は、ともにＵＶ法の結果をほぼ完全に再現できた。この結果から、蛍光法は、ＵＶ法と同じように使用できることがわかった。
【図１】
2020045621.tif 000017
【図２】
2020045621.tif 000018
【図３】
2020045621.tif 000019
【図４】
2020045621.tif 000020
【図５】
2020045621.tif 000021
【図６】
2020045621.tif 000022
【図７】
2020045621.tif 000023
【図８】
2020045621.tif 000024
【図９】
2020045621.tif 000025
【図１０】
2020045621.tif 000026
【図１１】
2020045621.tif 000027
【図１２】
2020045621.tif 000028
【図１３】
2020045621.tif 000029
【図１４】
2020045621.tif 000030
【図１５】
2020045621.tif 000031
【図１６】
2020045621.tif 000032
【図１７】
2020045621.tif 000033
【図１８】
2020045621.tif 000034
【図１９】
2020045621.tif 000035
【図２０】
2020045621.tif 000036
【図２１】
2020045621.tif 000037
【手続補正書】
【提出日】令和2年5月7日(2020.5.7)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
チオール基またはアミノ基を１個以上有し、かつ蛍光を発する有機化合物と、２以上の被験物質を含有する混合物とを反応させること、および
前記反応後の有機化合物の量、または前記反応の生成物の量を、蛍光検出器を用いた光学的測定により検出すること、
を含む皮膚感作性の測定方法であって、
前記蛍光検出器を用いた光学的測定において、励起波長が２００〜３５０ｎｍであって、蛍光波長が２００〜４００ｎｍである、皮膚感作性の測定方法。
【請求項２】
前記有機化合物が、Ｎ−（アリールアルキルカルボニル）システインである、請求項１に記載の皮膚感作性の測定方法。
【請求項３】
前記有機化合物が、Ｎ−（２−フェニルアセチル）システインまたはＮ−［２−（ナフタレン−１−イル）アセチル］システインである、請求項１または２に記載の皮膚感作性の測定方法。
【請求項４】
前記有機化合物が、α−Ｎ−（アリールアルキルカルボニル）リジンである、請求項１に記載の皮膚感作性の測定方法。
【請求項５】
前記有機化合物が、α−Ｎ−（２−フェニルアセチル）リジンまたはα−Ｎ−［２−（ナフタレン−１−イル）アセチル］リジンである、請求項１または４に記載の皮膚感作性の測定方法。
【請求項６】
前記有機化合物が、２００〜４００ｎｍに蛍光を発し、吸収極大波長におけるモル吸光係数が１０Ｌ／ｍｏｌ・ｃｍ以上５０００００Ｌ／ｍｏｌ・ｃｍ以下の有機化合物である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の皮膚感作性の測定方法。
【請求項７】
前記有機化合物と前記混合物とを反応させる工程で得られる反応物を、クロマトグラフィー処理することを含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載の皮膚感作性の測定方法。
【請求項８】
（削除）
【請求項９】
前記混合物が、香料、精油、高分子化合物、医薬品、農薬、食品、化学製品、および天然物由来成分からなる植物抽出液のうちの少なくとも１種である、請求項１から７のいずれか一項に記載の皮膚感作性の測定方法。
【請求項１０】
蛍光検出器を用いた光学的測定における有機化合物のピーク面積の平均値から、次式に従って有機化合物の減少率を計算する、請求項１から７および９のいずれか一項に記載の皮膚感作性の測定方法。
チオール基を１個以上有し、かつ蛍光を発する有機化合物の減少率（％  ｄｅｐｌｅｔｉｏｎ）＝［１−（反応後の未反応の、チオール基を１個以上有し、かつ蛍光を発する有機化合物のピーク面積の平均値／標準のチオール基を１個以上有し、かつ蛍光を発する有機化合物のピーク面積の平均値）］×１００；
アミノ基を１個以上有し、かつ蛍光を発する有機化合物の減少率（％  ｄｅｐｌｅｔｉｏｎ）＝［１−（反応後の未反応の、アミノ基を１個以上有し、かつ蛍光を発する有機化合物のピーク面積の平均値／標準のアミノ基を１個以上有し、かつ蛍光を発する有機化合物のピーク面積の平均値）］×１００
【請求項１１】
チオール基を１個以上有し、かつ蛍光を発する有機化合物の減少率と、アミノ基を１個以上有し、かつ蛍光を発する有機化合物の減少率の平均値を算出するか、またはチオール基を１個以上有し、かつ蛍光を発する有機化合物の減少率を算出し、下記に従って感作性物質および非感作性物質を判定する、請求項１０に記載の皮膚感作性の測定方法。
（１）チオール基を１個以上有し、かつ蛍光を発する有機化合物の減少率と、アミノ基を１個以上有し、かつ蛍光を発する有機化合物の減少率の平均値で評価する場合
平均スコア＜４．９％の場合：被験物質は、非感作性物質と判定する。
平均スコア≧４．９％の場合：被験物質は、感作性物質と判定する。
（２）チオール基を１個以上有し、かつ蛍光を発する有機化合物の減少率のみで評価する場合
チオール基を１個以上有し、かつ蛍光を発する有機化合物の減少率＜５．６％の場合：被験物質は、非感作性物質と判定する。
チオール基を１個以上有し、かつ蛍光を発する有機化合物の減少率≧５．６％の場合：被験物質は、感作性物質と判定する。
【請求項１２】
チオール基またはアミノ基を１個以上有し、かつ蛍光を発する有機化合物を測定主薬として含む皮膚感作性測定試薬であって、２以上の被験物質を含有する混合物の皮膚感作性を、蛍光検出器を用いた、励起波長が２００〜３５０ｎｍであって、蛍光波長が２００〜４００ｎｍである光学的測定により測定するための試薬。
【国際調査報告】
2020045621.tif 000038
2020045621.tif 000039
2020045621.tif 000040
2020045621.tif 000041