(57)【要約】  本発明は、断片化された細胞外マトリックス成分、フィブリン及び水性媒体を含む培養液中で細胞を培養する培養工程を備える、三次元組織体の製造方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
断片化された細胞外マトリックス成分、フィブリン及び水性媒体を含む培養液中で細胞を培養する培養工程を備える、三次元組織体の製造方法。
【請求項２】
前記培養工程の前に、フィブリノゲン及びトロンビンを混合する工程を備える、請求項１に記載の三次元組織体の製造方法。
【請求項３】
前記断片化された細胞外マトリックス成分の少なくとも一部が、架橋されている、請求項１又は２に記載の三次元組織体の製造方法。
【請求項４】
前記断片化された細胞外マトリックス成分の平均長が１００ｎｍ以上２００μｍ以下である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の三次元組織体の製造方法。
【請求項５】
前記細胞が細胞外マトリックス産生細胞を含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の三次元組織体の製造方法。
【請求項６】
前記細胞が、血管内皮細胞、がん細胞、心筋細胞、平滑筋細胞、線維芽細胞、および、上皮細胞からなる群から選ばれる１種類または複数種類の細胞をさらに含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載の三次元組織体の製造方法。
【請求項７】
前記細胞が、血管内皮細胞および線維芽細胞を少なくとも含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載の三次元組織体の製造方法。
【請求項８】
前記線維芽細胞の含有率が、全細胞数に対して、２５％以上である、請求項７に記載の三次元組織体の製造方法。
【請求項９】
前記断片化された細胞外マトリックス成分の含有率が、前記断片化された細胞外マトリックス成分及び細胞の合計質量を基準として、０．３３質量％以上９０質量％以下である、請求項１〜８のいずれか一項に記載の三次元組織体の製造方法。
【請求項１０】
前記断片化された細胞外マトリックス成分の含有率が、前記断片化された細胞外マトリックス成分及び細胞の合計質量を基準として、０．５質量％以上９０質量％以下である、請求項１〜９のいずれか一項に記載の三次元組織体の製造方法。
【請求項１１】
前記培養液を、略水平方向に移動させながら配置する、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の三次元組織体の製造方法。
【請求項１２】
断片化された細胞外マトリックス成分、フィブリン、水性媒体及び細胞を少なくとも含む第１の液滴と、水性媒体を少なくとも含む第２の液滴とを液滴同士が接するように配置する工程を備える、細胞含有組成物の製造方法。
【請求項１３】
前記第２の液滴を前記第１の液滴上に配置する、請求項１２に記載の細胞含有組成物の製造方法。
【請求項１４】
断片化された細胞外マトリックス成分、フィブリン及び細胞を含む、三次元組織体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、三次元組織体及びその製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
人工的に生体組織を模した構造体を作製する手法として、例えば、培養細胞の表面全体が接着膜で被覆された被覆細胞を培養することによって、三次元組織体を製造する方法（特許文献１）、コラーゲンを含む被膜でコートされた細胞を三次元に配置して、三次元組織体を形成することを含む、三次元組織体を製造する方法（特許文献２）、細胞の表面に被膜が形成された被覆細胞を形成すること、及び被覆細胞を三次元に配置することを含む三次元組織体の製造方法であって、被覆細胞の形成は、被膜成分を含有する液に細胞を浸漬させること、及び浸漬させた細胞と被膜成分を含有する液とを液透過性膜によって分離することを含む、三次元組織体の製造方法（特許文献３）、細胞をカチオン性物質および細胞外マトリックス成分と混合して混合物を得て、得られた混合物から細胞を集めて、基材上に細胞集合体を形成することを含む、立体的細胞組織の製造方法（特許文献４）等が知られている。また、本発明者らは、細胞と内因性コラーゲンを接触させ、好ましくはさらに繊維性の外因性コラーゲンを接触させて、コラーゲン濃度が高い三次元組織体を製造する方法（特許文献５）を提案している。これらのような三次元組織体は、実験動物の代替品、移植材料等としての利用が期待されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】特開２０１２−１１５２５４号公報
【特許文献２】国際公開第２０１５／０７２１６４号
【特許文献３】国際公開第２０１６／０２７８５３号
【特許文献４】国際公開第２０１７／１４６１２４号
【特許文献５】国際公開第２０１８／１４３２８６号
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】K. Holzl et al., Biofabrication 2016, 8, 032002.
【非特許文献２】Acta Biomaterialia, 2015, Vol.25, p.131-142
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
上述の三次元組織体の製造方法によれば、三次元組織体を作製することができるものの、作製可能な三次元組織体の大きさは培養容器の大きさに依存するため、目的に応じて大きさ、形状等を制御することが困難であった。【０００６】
形状を制御して細胞を基材上に置く手法として、バイオプリンティングと呼ばれる技術が存在しているが（例えば、非特許文献１）、バイオインクは細胞が生存するには粘度が高く、バイオインク中の細胞が少なからずダメージを受けてしまう。【０００７】
そこで、本発明は、形状が制御された三次元組織体を簡便に製造する方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
すなわち、本発明は、例えば以下の各発明に関する。
［１］断片化された細胞外マトリックス成分、フィブリン及び水性媒体を含む培養液中で細胞を培養する培養工程を備える、三次元組織体の製造方法。
［２］前記培養工程の前に、フィブリノゲン及びトロンビンを混合する混合工程を備える、［１］に記載の三次元組織体の製造方法。
［３］前記断片化された細胞外マトリックス成分の少なくとも一部が、架橋されている、［１］又は［２］に記載の三次元組織体の製造方法。
［４］前記断片化された細胞外マトリックス成分の平均長が１００ｎｍ以上２００μｍ以下である、［１］〜［３］のいずれかに記載の三次元組織体の製造方法。
［５］前記細胞が細胞外マトリックス産生細胞を含む、［１］〜［４］のいずれかに記載の三次元組織体の製造方法。
［６］前記細胞が、血管内皮細胞、がん細胞、心筋細胞、平滑筋細胞、線維芽細胞、および、上皮細胞からなる群から選ばれる１種類または複数種類の細胞をさらに含む、［１］〜［５］のいずれかに記載の三次元組織体の製造方法。
［７］前記細胞が、血管内皮細胞および線維芽細胞を少なくとも含む、［１］〜［６］のいずれかに記載の三次元組織体の製造方法。
［８］前記線維芽細胞の含有率が、全細胞数に対して、２５％以上である、［７］に記載の三次元組織体の製造方法。
［９］前記断片化された細胞外マトリックス成分の含有率が、断片化された細胞外マトリックス成分及び細胞の合計質量を基準として、０．３３質量％以上９０質量％以下である、［１］〜［８］のいずれかに記載の三次元組織体の製造方法。
［１０］前記断片化された細胞外マトリックス成分の含有率が、断片化された細胞外マトリックス成分及び細胞の合計質量を基準として、０．５質量％以上９０質量％以下である、［１］〜［９］のいずれかに記載の三次元組織体の製造方法。
［１１］前記培養液を、略水平方向に移動させながら配置する、［１］〜［１０］のいずれかに記載の三次元組織体の製造方法。
［１２］断片化された細胞外マトリックス成分、フィブリン、水性媒体及び細胞を少なくとも含む第１の液滴と、水性媒体を少なくとも含む第２の液滴とを液滴同士が接するように配置する工程を備える、細胞含有組成物の製造方法。
［１３］前記第２の液滴を前記第１の液滴上に配置する、［１２］に記載の細胞含有組成物の製造方法。
［１４］断片化された細胞外マトリックス成分、フィブリン及び細胞を含む、三次元組織体。
【発明の効果】
【０００９】
本発明によれば、三次元組織体の形状を制御し、簡便に三次元組織体を作製することができる。本発明によれば、細胞へのダメージを抑制しつつ、所望の形状の三次元組織体を形成させることができる。【００１０】
本発明の一側面によれば、三次元組織体を安定して作製することができることに加えて、より厚みのある三次元組織体を作製することができる。本発明の一側面によれば、血管の内腔を開き易くすることができる。本発明の一側面によれば、細胞の整列方向をある程度制御することができる。本発明では、水性媒体中の細胞の種類を変えて液滴を複数形成させられるので、細胞同士の相互作用を観測することができる。また、液滴の上に液滴を重ねて形成できるので、より高さのある三次元組織体を作製することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】試験例２において作製した毛細血管を有する三次元組織体の蛍光観察結果を示す写真及びグラフである。
【図２】試験例２において作製した毛細血管を有する三次元組織体の顕微鏡写真である。
【図３】試験例２において作製した三次元組織体の厚さの測定結果を示すグラフである。
【図４】試験例２において作製した毛細血管を有する三次元組織体の蛍光観察結果を示す写真である。
【図５】試験例２において作製した毛細血管を有する三次元組織体の蛍光観察の解析結果を示すグラフである。
【図６】試験例２において作製した毛細血管を有する三次元組織体の蛍光観察結果を示す写真である。
【図７】試験例２において作製した毛細血管を有する三次元組織体の蛍光観察結果を示す写真である。
【図８】試験例２において作製した毛細血管を有する三次元組織体の蛍光観察の解析結果を示すグラフである。
【図９】試験例２において作製した毛細血管を有する三次元組織体の顕微鏡写真である。
【図１０】試験例２において作製した三次元組織体の厚さの測定結果を示すグラフである。
【図１１】試験例２において作製した毛細血管を有する三次元組織体の蛍光観察結果を示す写真である。
【図１２】試験例２において作製した毛細血管を有する三次元組織体の蛍光観察結果を示す写真である。
【図１３】試験例３において３Ｄプリンティングにより作製した三次元組織体の観察結果を示す図である。
【図１４】試験例３において３Ｄプリンティングにより作製した三次元組織体の観察結果を示す図である。
【図１５】試験例３において３Ｄプリンティングにより作製した三次元組織体の観察結果を示す図である。
【図１６】試験例４においてＮＨＤＦによる効果を確認した結果を示すグラフ及び写真である。
【図１７】試験例４において作製した毛細血管を有する三次元組織体の蛍光観察結果を示す写真及び内腔の直径を示すグラフである。
【図１８】試験例４において作製した毛細血管を有する三次元組織体の蛍光観察結果を示す写真である。
【図１９】試験例５において作製した毛細血管を有する三次元組織体の蛍光観察結果を示す写真である。
【図２０】試験例５において作製した毛細血管を有する三次元組織体の蛍光観察の解析結果を示すグラフである。
【図２１】試験例６において作製した毛細血管を有する三次元組織体の蛍光観察結果を示す写真及びグラフである。
【図２２】試験例７の安定性試験の評価結果を示す写真である。
【図２３】試験例８における細胞集団の挙動の観察結果を示す顕微鏡写真である。
【図２４】試験例８における細胞集団の挙動の観察結果を示す顕微鏡写真である。
【図２５】試験例８における細胞集団の挙動の観察結果を示す顕微鏡写真である。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
以下、本発明を実施するための形態について詳細に説明する。ただし、本発明は以下の実施形態に限定されるものではない。
【００１３】
＜三次元組織体の製造方法＞
本実施形態に係る三次元組織体の製造方法は、断片化された細胞外マトリックス成分（断片化細胞外マトリックス成分）、フィブリン及び水性媒体を含む培養液中で細胞を培養する培養工程を備える。
【００１４】
（三次元組織体）
本明細書において、「三次元組織体」とは、コラーゲン成分を介して細胞が三次元的に配置されている細胞の集合体であって、細胞培養によって人工的に作られる集合体を意味する。三次元組織体の形状には特に制限はなく、例えば、シート状、球体状、楕円体状、直方体状等が挙げられる。ここで、生体組織は、血管、汗腺、リンパ管、脂腺等を含み、構成が三次元組織体より複雑である。そのため、三次元組織体と生体組織とは容易に区別可能である。
【００１５】
細胞外マトリックス成分は、三次元組織体において少なくとも一部の細胞間の隙間を埋める材料である。細胞外マトリックス成分は、複数の細胞外マトリックス分子によって形成されている、細胞外マトリックス分子の集合体である。細胞外マトリックス分子とは、生物において細胞の外に存在する物質であってよい。細胞外マトリックス分子としては、細胞の生育及び細胞集合体の形成に悪影響を及ぼさない限り、任意の物質を用いることができる。細胞外マトリックス分子として、コラーゲン、ラミニン、フィブロネクチン、ビトロネクチン、エラスチン、テネイシン、エンタクチン、フィブリリン、及びプロテオグリカン等が挙げられるが、これらに限定されない。細胞外マトリックス成分は、これらを１種単独で用いてもよく、組み合わせて用いてもよい。細胞外マトリックス成分は、例えば、コラーゲンを含んでいてよく、コラーゲンからなっていてもよい。細胞外マトリックス成分がコラーゲンを含む場合、コラーゲンが細胞接着の足場として機能し、三次元的な細胞構造体の形成がより一層促進される。なお、細胞外マトリックス分子は、細胞の生育及び細胞集合体の形成に悪影響を及ぼさない限り、上述の細胞外マトリックス分子の改変体及びバリアントであってもよく、化学合成ペプチド等のポリペプチドであってもよい。細胞外マトリックス分子は、コラーゲンに特徴的なＧｌｙ−Ｘ−Ｙで表される配列の繰り返しを有するものであってよい。ここで、Ｇｌｙはグリシン残基を表し、Ｘ及びＹはそれぞれ独立に任意のアミノ酸残基を表す。複数のＧｌｙ−Ｘ−Ｙは、それぞれ同一であっても異なっていてもよい。Ｇｌｙ−Ｘ−Ｙで示される配列の繰り返しを有することによって、分子鎖の配置への束縛が少なく、足場材としての機能がより一層優れたものとなる。Ｇｌｙ−Ｘ−Ｙで示される配列の繰り返しを有する細胞外マトリックス分子において、Ｇｌｙ−Ｘ−Ｙで示される配列の割合は、全アミノ酸配列のうち、８０％以上であってよく、好ましくは９５％以上である。また、細胞外マトリックス分子は、ＲＧＤ配列を有するポリペプチドであってもよい。ＲＧＤ配列とは、Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ（アルギニン残基−グリシン残基−アスパラギン酸残基）で表される配列をいう。ＲＧＤ配列を有することによって、細胞接着がより一層促進され、足場材としてより一層好適なものとなる。Ｇｌｙ−Ｘ−Ｙで表される配列と、ＲＧＤ配列とを含む細胞外マトリックス分子としては、コラーゲン、フィブロネクチン、ビトロネクチン、ラミニン、カドヘリン等が挙げられる。
【００１６】
コラーゲンとしては、例えば、線維性コラーゲン及び非線維性コラーゲンが挙げられる。線維性コラーゲンとは、コラーゲン線維の主成分となるコラーゲンを意味し、具体的には、Ｉ型コラーゲン、ＩＩ型コラーゲン、ＩＩＩ型コラーゲン等が挙げられる。非線維性コラーゲンとしては、例えば、ＩＶ型コラーゲンが挙げられる。
【００１７】
プロテオグリカンとして、コンドロイチン硫酸プロテオグリカン、ヘパラン硫酸プロテオグリカン、ケラタン硫酸プロテオグリカン、デルマタン硫酸プロテオグリカンが挙げられるが、これらに限定されない。
【００１８】
細胞外マトリックス成分は、コラーゲン、ラミニン及びフィブロネクチンからなる群より選択される少なくとも１種を含んでいてよく、コラーゲンを含むことが好ましい。コラーゲンは好ましくは繊維性コラーゲンであり、より好ましくはＩ型コラーゲンである。線維性コラーゲンは、市販されているコラーゲンを用いてもよく、その具体例としては、日本ハム株式会社製のブタ皮膚由来Ｉ型コラーゲンが挙げられる。
【００１９】
細胞外マトリックス成分は、動物由来の細胞外マトリックス成分であってよい。細胞外マトリックス成分の由来となる動物種として、例えば、ヒト、ブタ、ウシ等が挙げられるが、これらに限定されない。細胞外マトリックス成分は、一種類の動物に由来する成分を用いてもよいし、複数種の動物に由来する成分を併用して用いてもよい。細胞外マトリックス成分の由来となる動物種は、三次元組織化する細胞の由来と同じであっても異なっていてもよい。
【００２０】
断片化細胞外マトリックス成分は、上述の細胞外マトリックス成分を断片化して得ることができる。「断片化」とは、細胞外マトリックス分子の集合体をより小さなサイズにすることを意味する。断片化は、細胞外マトリックス分子内の結合を切断する条件で行われてもよいし、細胞外マトリックス分子内の結合を切断しない条件で行われてもよい。断片化された細胞外マトリックス成分は、上述の細胞外マトリックス成分を物理的な力の印加により解繊した成分である、解繊された細胞外マトリックス成分（解繊細胞外マトリックス成分）を含んでいてよい。解繊は、断片化の一態様であり、例えば、細胞外マトリックス分子内の結合を切断しない条件で行われるものである。
【００２１】
細胞外マトリックス成分を断片化する方法としては、特に制限されない。細胞外マトリックス成分を解繊する方法としては、例えば、超音波式ホモジナイザー、撹拌式ホモジナイザー、及び高圧式ホモジナイザー等の物理的な力の印加によって細胞外マトリックス成分を解繊してもよい。撹拌式ホモジナイザーを用いる場合、細胞外マトリックス成分をそのままホモジナイズしてもよいし、生理食塩水等の水性媒体中でホモジナイズしてもよい。また、ホモジナイズする時間、回数等を調整することでミリメートルサイズ、ナノメートルサイズの解繊細胞外マトリックス成分を得ることも可能である。解繊細胞外マトリックス成分は、凍結融解を繰り返すことで解繊することにより得ることもできる。
【００２２】
断片化細胞外マトリックス成分は、解繊された細胞外マトリックス成分を少なくとも一部に含んでいてよい。また、断片化細胞外マトリックス成分は、解繊された細胞外マトリックス成分のみからなっていてもよい。すなわち、断片化細胞外マトリックス成分は、解繊された細胞外マトリックス成分であってよい。解繊された細胞外マトリックス成分は、解繊されたコラーゲン成分（解繊コラーゲン成分）を含むことが好ましい。解繊コラーゲン成分は、コラーゲンに由来する三重らせん構造を維持していることが好ましい。解繊コラーゲン成分は、コラーゲンに由来する三重らせん構造を部分的に維持している成分であってよい。断片化コラーゲン成分は、水性媒体に分散させることにより、水性媒体中で細胞と接触しやすくなり、三次元組織体の形成を促進し得る。
【００２３】
断片化細胞外マトリックス成分の形状としては、例えば、繊維状が挙げられる。繊維状とは、糸状のコラーゲン成分で構成される形状、又は糸状の細胞外マトリックス成分が分子間で架橋して構成される形状を意味する。断片化細胞外マトリックス成分の少なくとも一部は、繊維状であってよい。線維状の細胞外マトリックス成分には、複数の糸状細胞外マトリックス分子が集合して形成された細い糸状物（細線維）、細線維が更に集合して形成される糸状物、これらの糸状物を解繊したもの等が含まれる。線維状の細胞外マトリックス成分ではＲＧＤ配列が破壊されることなく保存されており、細胞接着のための足場材としてより一層効果的に機能することができる。
【００２４】
断片化細胞外マトリックス成分の平均長は、１００ｎｍ以上４００μｍ以下であってよく、１００ｎｍ以上２００μｍ以下であってよい。一実施形態において、断片化細胞外マトリックス成分の平均長は、厚い組織が形成しやすくなる観点から、５μｍ以上４００μｍ以下であってよく、１０μｍ以上４００μｍ以下であってよく、２２μｍ以上４００μｍ以下であってよく、１００μｍ以上４００μｍ以下であってよい。他の実施形態において、断片化細胞外マトリックス成分の平均長は、組織形成が安定しやすくなる観点及び再分散性がより一層優れたものとなる観点から、１００μｍ以下であってよく、５０μｍ以下であってよく、３０μｍ以下であってよく、１５μｍ以下であってよく、１０μｍ以下であってよく、１μｍ以下であってよく、１００ｎｍ以上であってよい。断片化細胞外マトリックス成分全体のうち、大部分の断片化細胞外マトリックス成分の平均長が上記数値範囲内であることが好ましい。具体的には、断片化細胞外マトリックス成分全体のうち９５％の断片化細胞外マトリックス成分の平均長が上記数値範囲内であることが好ましい。断片化細胞外マトリックス成分は、平均長が上記範囲内である断片化コラーゲン成分であることが好ましく、平均長が上記範囲内である解繊コラーゲン成分であることがより好ましい。
【００２５】
断片化コラーゲン成分の平均径は、５０ｎｍ以上３０μｍ以下であってよく、４μｍ以上３０μｍ以下であってよく、５μｍ以上３０μｍ以下であってよい。断片化細胞外マトリックス成分は、平均径が上記範囲内である断片化コラーゲン成分であることが好ましく、平均径が上記範囲内である解繊コラーゲン成分であることがより好ましい。
【００２６】
上述の平均長及び平均径の範囲は、組織形成の観点から至適化されたものであるため、組織形成に用いる段階で上記の平均長又は平均径の範囲内に収まっていることが望ましい。
【００２７】
断片化細胞外マトリックス成分の平均長及び平均径は、光学顕微鏡によって個々の断片化細胞外マトリックス成分を測定し、画像解析することによって求めることが可能である。本明細書において、「平均長」は、測定した試料の長手方向の長さの平均値を意味し、「平均径」は、測定した試料の長手方向に直交する方向の長さの平均値を意味する。
【００２８】
断片化細胞外マトリックス成分の少なくとも一部は分子間又は分子内で架橋されていてよい。断片化された細胞外マトリックス成分は、断片化された細胞外マトリックス成分を構成する分子内で架橋されていてもよく、断片化された細胞外マトリックス成分を構成する分子間で架橋されていてよい。
【００２９】
架橋する方法としては、例えば、熱、紫外線、放射線等の印加による物理架橋、架橋剤、酵素反応等による化学架橋等による方法が挙げられるが、その方法は特に限定されない。架橋（物理架橋及び化学架橋）は、共有結合を介した架橋であってよい。
【００３０】
断片化コラーゲン成分において、架橋は、コラーゲン分子（三重らせん構造）の間で形成されていてもよく、コラーゲン分子によって形成されたコラーゲン細繊維の間で形成されていてもよい。架橋は、熱による架橋（熱架橋）であってよい。熱架橋は、例えば、真空ポンプを使って減圧下で、加熱処理を行うことにより実施することができる。コラーゲン分子の熱架橋を行う場合、解繊コラーゲン成分は、コラーゲン分子のアミノ基が同一又は他のコラーゲン分子のカルボキシ基とペプチド結合（−ＮＨ−ＣＯ−）を形成することにより、架橋されていてよい。
【００３１】
断片化細胞外マトリックス成分は架橋剤を使用することによっても、架橋させることができる。架橋剤は、例えば、カルボキシル基とアミノ基を架橋可能なもの、又はアミノ基同士を架橋可能なものであってよい。架橋剤としては、例えば、アルデヒド系、カルボジイミド系、エポキシド系及びイミダゾール系架橋剤が経済性、安全性及び操作性の観点から好ましく、具体的には、グルタルアルデヒド、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド・塩酸塩、１−シクロヘキシル−３−（２−モルホリニル−４−エチル）カルボジイミド・スルホン酸塩等の水溶性カルボジイミドを挙げることができる。
【００３２】
架橋度の定量は、断片化細胞外マトリックス成分の種類、架橋する手段等に応じて、適宜選択することができる。架橋度は、１％以上、２％以上、４％以上、８％以上、又は１２％以上であってよく、３０％以下、２０％以下、又は１５％以下であってもよい。
【００３３】
細胞外マトリックス分子中のアミノ基が架橋に使用される場合、架橋度は、非特許文献２等に記載されているＴＮＢＳ法に基づき定量することが可能である。ＴＮＢＳ法による架橋度が、上述の範囲内であってもよい。ＴＮＢＳ法による架橋度は、細胞外マトリックスが有するアミノ基のうち架橋に使われているアミノ基の割合である。
【００３４】
架橋度は、カルボキシル基を定量することにより、算出してもよい。例えば、水に不溶性の細胞外マトリックス成分の場合、ＴＢＯ（トルイジンブルーＯ）法により定量してもよい。ＴＢＯ法による架橋度が、上述した範囲内であってもよい。
【００３５】
三次元組織体中の断片化細胞外マトリックス成分の含有率は、例えば、断片化された細胞外マトリックス成分及び細胞の合計質量を基準として、０．３３質量％以上、０．５質量％以上、又は５質量％以上であってよい。三次元組織体中の断片化細胞外マトリックス成分の含有量は、例えば、断片化された細胞外マトリックス成分及び細胞の合計質量を基準として、９０質量％以下、８０質量％以下、７０質量％以下、６０質量％以下、５０質量％以下、４０質量％以下、３０質量％以下、２０質量％以下、１０質量％以下、５質量％以下、又は１質量％以下であってよい。三次元組織体中の断片化細胞外マトリックス成分の含有量は、例えば、断片化された細胞外マトリックス成分及び細胞の合計質量を基準として、０．３３質量％以上９０質量％以下であってよく、０．５質量％以上９０質量％以下であってよい。
【００３６】
（フィブリン）
フィブリンは、フィブリノゲンにトロンビンが作用してＡα鎖、Ｂβ鎖のＮ末端からＡ鎖、Ｂ鎖を放出して生ずる成分である。フィブリンはポリマーであり、一般的に水に不溶である。フィブリンは、フィブリノゲンと、トロンビンとを接触させることにより形成される。
【００３７】
［培養工程］
培養工程では、断片化細胞外マトリックス成分、フィブリン及び水性媒体を含む培養液中で細胞を培養する。培養液が断片化細胞外マトリックス成分とフィブリンとを含むことにより、培養液の粘度が適度なものとなるため、形状をコントロールした培養液中で、細胞の培養を行うことができる。細胞の培養は、液滴状に形成させた培養液中において行ってよい。
【００３８】
細胞は、特に限定されないが、例えば、ヒト、サル、イヌ、ネコ、ウサギ、ブタ、ウシ、マウス、ラット等の動物に由来する細胞であってよい。細胞の由来部位も特に限定されず、骨、筋肉、内臓、神経、脳、骨、皮膚、血液等に由来する体細胞であってもよく、生殖細胞であってもよい。さらに、細胞は、誘導多能性幹細胞細胞（ｉＰＳ細胞）、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）であってもよく、また、初代培養細胞、継代培養細胞及び細胞株細胞等の培養細胞であってもよい。具体的には、細胞として、例えば、神経細胞、樹状細胞、免疫細胞、血管内皮細胞（例えば、ヒト臍帯静脈由来血管内皮細胞（ＨＵＶＥＣ））、リンパ管内皮細胞、線維芽細胞、大腸がん細胞（例えば、ヒト大腸がん細胞（ＨＴ２９））、肝癌細胞等の癌細胞、上皮細胞（例えば、ヒト歯肉上皮細胞）、角化細胞、心筋細胞（例えば、ヒトｉＰＳ細胞由来心筋細胞（ｉＰＳ−ＣＭ））、肝細胞、膵島細胞、組織幹細胞、平滑筋細胞（例えば、大動脈平滑筋細胞（Ａｏｒｔａ−ＳＭＣ）等が挙げられるが、これらに限定されない。細胞は、血管内皮細胞、がん細胞、心筋細胞、平滑筋細胞、線維芽細胞、および、上皮細胞からなる群から選ばれる１種類または複数種類の細胞を含んでいてよい。細胞は、一種単独で用いてもよいし、複数種類の細胞を組み合わせて用いてもよい。細胞は、血管内皮細胞および線維芽細胞を少なくとも含んでいてよい。
【００３９】
細胞として、細胞外マトリックス分子を分泌する細胞外マトリックス分泌細胞を含むことが好ましい。細胞外マトリックス分泌細胞としては、例えば、線維性コラーゲン等のコラーゲンを分泌するコラーゲン分泌細胞が挙げられる。コラーゲン分泌細胞としては、例えば、線維芽細胞、軟骨細胞、骨芽細胞等の間葉系細胞が挙げられ、好ましくは、線維芽細胞である。好ましい線維芽細胞としては、例えば、ヒト皮膚由来線維芽細胞（ＮＨＤＦ）、ヒト心臓線維芽細胞（ＮＨＣＦ）及びヒト歯肉線維芽細胞（ＨＧＦ）が挙げられる。
【００４０】
線維芽細胞の含有率は、全細胞数に対して、５％以上、１０％以上、１５％以上、２０％以上、２５％以上、又は３０％以上であってよく、１００％以下、９５％以下、９０％以下、８０％以下、又は７５％以下であってよい。
【００４１】
細胞外マトリックス分泌細胞（例えば、コラーゲン分泌細胞）を含む細胞を用いることで、より安定で、細胞が均一に分布している三次元組織体が得られる。このような三次元組織体が得られるメカニズムの詳細は不明であるが、以下のように推測される。
【００４２】
従来の足場を利用した三次元組織体の製造方法では、予め用意された足場に目的の細胞を注入するため、足場の内部にまで均一に細胞を分布させることが困難であった。細胞がコラーゲン産生細胞を含む細胞である場合、まず、細胞が細胞外マトリックス含有組成物上に接触して接着する。その後、細胞は自分自身で細胞外マトリックス成分を構成するタンパク質（例えば、線維性コラーゲン等のコラーゲン）を産生する。産生されたタンパク質は細胞外マトリックス含有組成物上に接触して接着することで、細胞外マトリックス含有組成物間の架橋剤として働き、細胞が均一に存在する環境下で細胞外マトリックス成分を構成するタンパク質等の構造化が進む。その結果、より安定で、細胞が均一に分布している三次元組織体が得られる。ただし、上記推測は本発明を限定するものではない。
【００４３】
コラーゲン産生細胞とその他の細胞とを共に用いる場合、その他の細胞の比率に対するコラーゲン産生細胞の細胞数の比（コラーゲン産生細胞／その他の細胞の比）は、９／１〜９９／１であってもよく、５０／５０〜８０／２０であってもよく、２０／８０〜５０／５０であってもよく、１０／９０〜５０／５０であってもよい。
【００４４】
培養工程では、コラーゲン産生細胞及びコラーゲン産生細胞以外の他の細胞を含む細胞を用いてよい。コラーゲン産生細胞、及びコラーゲン産生細胞以外の他の細胞としては、上述した細胞をそれぞれ用いることができる。コラーゲン産生細胞及びコラーゲン産生細胞以外の他の細胞を共に用いて三次元組織体を製造することで、種々のモデル組織を製造することが可能になる。例えば、ＮＨＣＦ及びＨＵＶＥＣを用いた場合、内部に毛細血管を有する三次元組織体を得ることが可能になる。ＮＨＣＦ及び大腸がん細胞を用いた場合、大腸がんのモデル組織を得ることが可能になる。また、ＮＨＣＦ及びｉＰＳ−ＣＭを用いた場合、動悸拍動を示す心筋のモデル組織を得ることが可能になる。
【００４５】
細胞を培養する方法は、特に制限はなく、培養する細胞の種類に応じて好適な培養方法で行うことができる。例えば、培養温度は２０℃〜４０℃であってもよく、３０℃〜３７℃であってもよい。培地のｐＨは、６〜８であってもよく、７．２〜７．４であってもよい。培養時間は、１日〜１４日であってもよく、７日〜１４日であってもよく、１４日〜３０日であってもよく、３０日〜６０日であってもよく、６０日〜９０日であってもよい。
【００４６】
培養液は、例えば、略水平方向に移動させながら配置されてもよい。培養液を略水平方向に移動させることによって、培養液中の細胞及び細胞外マトリックス等の配向をある程度制御できる。培養液の配置を略水平方向に移動させながら行うことによって、三次元組織体の内部の組織構造のコントロールが可能になる。
【００４７】
培養液中の細胞密度は、目的とする三次元組織体の形状、厚さ等に応じて適宜決定できる。例えば、培養液中の細胞密度は、１〜１０８ｃｅｌｌｓ／ｍｌであってもよいし、１０３〜１０７ｃｅｌｌｓ／ｍｌであってもよい。例えば、培養液中の細胞密度は、後述する混合工程における水性媒体中の細胞密度と同じであってもよい。
【００４８】
「水性媒体」とは、水を必須構成成分とする液体を意味する。水性媒体としては、細胞外マトリックス成分が安定に存在できるものであれば、特に制限はない。例えば、水性媒体として、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）等の生理食塩水、Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ培地（ＤＭＥＭ）、血管内皮細胞専用培地（ＥＧＭ２）等の液体培地が挙げられるがこれに制限されない。
【００４９】
水性媒体のｐＨは細胞の生育及び細胞集合体の形成に悪影響を及ぼさない範囲が好ましい。水性媒体のｐＨは、細胞に投入した際の細胞への負荷を軽減する観点から、例えば、７．０以上であってよく、８．０以下であってよい。具体的には、水性媒体のｐＨは、７．０、７．１、７．２、７．３、７．４、７．５、７．６、７．７、７．８、７．９、又は８．０であってよい。水性媒体は、上記ｐＨの範囲において緩衝能を有することが好ましく、より好ましくは液体培地である。液体培地は特に制限はなく、培養する細胞の種類に応じて好適な培地を選択できる。当該培地としては、例えば、Ｅａｇｌｅ’ｓ  ＭＥＭ培地、ＤＭＥＭ、Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ培地（ＭＥＭ）、Ｍｉｎｉｍｕｍ  Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ培地、ＲＰＭＩ、及びＧｌｕｔａＭａｘ培地等が挙げられる。培地は、血清を添加した培地であってもよいし、無血清培地であってもよい。更に、液体培地は二種類以上の培地を混合した混合培地であってもよい。
【００５０】
［他の工程］
本実施形態に係る三次元組織体の製造方法は、培養工程の前に、断片化された細胞外マトリックス成分、フィブリン、水性媒体及び細胞を含む培養液を準備する工程を備えていてもよい。フィブリンは、例えば、フィブリノゲン及びトロンビンを混合することにより形成されるものであってよい。
【００５１】
三次元組織体の製造方法は、準備工程として、培養工程の前に、水性媒体中において、細胞、フィブリノゲン及びトロンビンを混合する工程（混合工程）を備えていてよい。断片化された細胞外マトリックス成分（断片化細胞外マトリックス成分）及び細胞は、フィブリノゲン及びトロンビンを混合してフィブリンを形成させる前に、フィブリノゲン及び／又はトロンビンと混合されていることが好ましい。
【００５２】
混合工程は、例えば、フィブリノゲンを含む第１の液と、トロンビンを含む第２の液とを混合する工程であってよい。断片化された細胞外マトリックス成分（断片化細胞外マトリックス成分）は、第１の液及び／又は第２の液に含まれていてよく、細胞は、第１の液及び／又は第２の液に含まれていてよい。第１の液及び第２の液は、水性媒体を含む。第１の液及び第２の液における水性媒体は、同種であってもよく、異種であってもよい。
【００５３】
混合工程は、例えば、細胞と、断片化された細胞外マトリックス成分（断片化細胞外マトリックス成分）とを含む混合物１を準備し、混合物１と、フィブリノゲンとを混合して混合物２を準備し、混合物２と、トロンビンとを混合することにより実施してもよい。
【００５４】
また、例えば、混合工程は、フィブリノゲン及び断片化細胞外マトリックス成分を混合して第１の混合液を準備する工程、細胞及びトロンビンを混合して第２の混合液を準備する工程、及び第１の混合液及び第２の混合液を混合する工程を含んでいてよい。混合工程における各成分の混合は、水性媒体中で行われてよい。
【００５５】
混合工程において、断片化細胞外マトリックス成分の濃度は、目的とする三次元組織体の形状、厚さ等に応じて適宜決定できる。例えば、水性媒体中の断片化細胞外マトリックス成分の濃度は、０．１〜９０質量％であってもよいし、１〜３０質量％であってもよい。
【００５６】
混合工程において、断片化細胞外マトリックス成分の量は、１×１０５ｃｅｌｌｓの細胞に対して、０．１〜１００ｍｇであってもよいし、１〜５０ｍｇであってもよい。
【００５７】
混合工程において、断片化細胞外マトリックス成分と細胞との質量比（断片化細胞外マトリックス成分／細胞）は、１／１〜１０００／１であることが好ましく、９／１〜９００／１であることがより好ましく、１０／１〜５００／１であることがさらに好ましい。
【００５８】
混合工程後、培養工程前に、細胞、断片化細胞外マトリックス成分及びフィブリンを含む培養液をゲル化させることを含んでいてよい。ゲル化は、例えば、３７℃の条件で、数十分から数時間、又は１〜５時間、又は１．５〜２．５時間の条件で培養液を保持することにより行ってよい。ゲル化の工程において保持する時間は、上述した培養工程において保持する時間に比べて短いことが特徴である。
【００５９】
＜三次元組織体＞
本実施形態に係る三次元組織体は、細胞と、断片化細胞外マトリックス成分と、フィブリンと、を含む。細胞の少なくとも一部は、断片化細胞外マトリックス成分に接触していてよい。接触の一態様として、接着していてもよい。
【００６０】
三次元組織体が細胞として細胞外マトリックス分泌細胞を含む場合、三次元組織体は内因性細胞外マトリックスを含んでいてよい。「内因性細胞外マトリックス」とは、三次元組織体を構成する細胞外マトリックス産生細胞が産生する細胞外マトリックスを意味する。
【００６１】
三次元組織体が細胞としてコラーゲン分泌細胞を含む場合、三次元組織体は内因性コラーゲン成分を含んでいてよい。「内因性コラーゲン」とは、三次元組織体を構成するコラーゲン産生細胞が産生するコラーゲン成分を意味する。内因性コラーゲンは、線維性コラーゲンであってもよいし、非線維性コラーゲンであってもよい。断片化コラーゲン成分は、三次元組織体を構成するコラーゲン産生細胞が産生するコラーゲン成分以外のコラーゲン成分であるため、外因性コラーゲン成分ということができる。
【００６２】
三次元組織体が細胞として細胞外マトリックス分泌細胞を含む場合、三次元組織体は、細胞外マトリックス分泌細胞を含む細胞と、断片化細胞外マトリックス成分と、内因性細胞外マトリックス成分と、フィブリンと、を含んでいてよい。この場合、細胞外マトリックス分泌細胞を含む細胞の少なくとも一部は断片化細胞外マトリックス成分及び／又は内因性細胞外マトリックス成分に接着していてよい。
【００６３】
三次元組織体は、細胞として、細胞外マトリックス分泌細胞と、細胞外マトリックス分泌細胞以外の細胞と、を含んでいてよい。細胞外マトリックス産生細胞以外の細胞としては、血管内皮細胞（例えば、ヒト臍帯静脈由来血管内皮細胞（ＨＵＶＥＣ））、大腸がん細胞（例えば、ヒト大腸がん細胞（ＨＴ２９））、肝がん細胞等のがん細胞、心筋細胞（例えば、ヒトｉＰＳ細胞由来心筋細胞（ｉＰＳ−ＣＭ））、上皮細胞（例えば、ヒト歯肉上皮細胞）、角化細胞、リンパ管内皮細胞、神経細胞、肝細胞、組織幹細胞、胚性幹細胞、人工多能性幹細胞、接着性細胞（例えば、免疫細胞）、平滑筋細胞（例えば、大動脈平滑筋細胞（Ａｏｒｔａ−ＳＭＣ））等が挙げられる。上記三次元組織体を構成する細胞が、血管内皮細胞、がん細胞、心筋細胞、平滑筋細胞、および、上皮細胞からなる群より選ばれる一種又は複数種の細胞を更に含むことが好ましい。
【００６４】
三次元組織体中の断片化細胞外マトリックス成分の含有率は、例えば、断片化された細胞外マトリックス成分及び細胞の合計質量を基準として、上述した範囲内であってよい。
【００６５】
三次元組織体が外因性コラーゲン成分を含有する場合、三次元組織体におけるコラーゲン含有率は、上記三次元組織体（乾燥重量）を基準として０．０１〜９０質量％であってよく、１０〜９０質量％であることが好ましく、１０〜８０質量％であることが好ましく、１０〜７０質量％であることが好ましく、１０〜６０質量％であることが好ましく、１〜５０質量％であることが好ましく、１０〜５０質量％であることが好ましく、１０〜３０質量％であることがより好ましく、２０〜３０質量％であることがより好ましい。
【００６６】
ここで、「三次元組織体におけるコラーゲン」とは、三次元組織体を構成するコラーゲン分子を意味し、内因性コラーゲン成分に由来していてもよく、断片化コラーゲン成分（外因性コラーゲン成分ということもできる）に由来していてもよい。すなわち、三次元組織体が内因性コラーゲン成分及び断片化コラーゲン成分を含む場合、上記三次元組織体を構成するコラーゲン含有率は、内因性コラーゲン成分及び断片化コラーゲン成分の合計量を意味する。上記コラーゲン含有率は、得られた三次元組織体の体積、及び脱細胞化した三次元組織体の質量から算出することが可能である。
【００６７】
三次元組織体におけるコラーゲン量を定量する方法としては、例えば、以下のようなヒドロキシプロリンを定量する方法が挙げられる。三次元組織体を溶解した溶解液に、塩酸（ＨＣｌ）を混合し、高温で所定の時間インキュベートした後に室温に戻し、遠心分離した上澄みを所定の濃度に希釈することでサンプルを調製する。ヒドロキシプロリンスタンダード溶液をサンプルと同様に処理した後、段階的に希釈してスタンダードを調製する。サンプル及びスタンダードのそれぞれに対してヒドロキシプロリンアッセイバッファ及び検出試薬で所定の処理をし、５７０ｎｍの吸光度を測定する。サンプルの吸光度をスタンダードと比較することでコラーゲン成分量を算出する。なお、三次元組織体を、高濃度の塩酸に直接懸濁して溶解した溶解液を遠心分離して上澄みを回収し、コラーゲン定量に用いてもよい。また、溶解させる三次元組織体は、培養液から回収したままの状態であってもよいし、回収後に乾燥処理を行い、液体成分を除去した状態で溶解させてもよい。但し、培養液から回収したままの状態の三次元組織体を溶解してコラーゲン定量を行う場合、三次元組織体が吸収している培地成分、及び実験手技の問題による培地の残りの影響で、三次元組織体重量の計測値がばらつくことが予想されるため、組織体の重量及び単位重量あたりに占めるコラーゲン量を安定して計測する観点からは、乾燥後の重量を基準とすることが好ましい。
【００６８】
コラーゲン量を定量する方法として、より具体的には、例えば、以下のような方法が挙げられる。
【００６９】
（サンプルの調製）
凍結乾燥処理を行った三次元組織体の全量を６ｍｏｌ／ｌ  ＨＣｌと混合し、ヒートブロックで９５℃、２０時間以上インキュベートした後、室温に戻す。１３０００ｇで１０分遠心分離した後、サンプル溶液の上澄みを回収する。後述する測定において結果が検量線の範囲内に収まるように６ｍｏｌ／ｌ  ＨＣｌで適宜希釈した後、２００μＬを１００μＬの超純水で希釈することでサンプルを調製する。サンプルは３５μＬ用いる。
【００７０】
（スタンダードの調製）
スクリューキャップチューブに１２５μＬのスタンダード溶液（１２００μｇ／ｍＬ  ｉｎ  ａｃｅｔｉｃ  ａｃｉｄ）と、１２５μＬの１２ｍｏｌ／ｌ  ＨＣｌを加え混合し、ヒートブロックで９５℃、２０時間インキュベートした後、室温に戻す。１３０００ｇで１０分遠心分離した後、上澄みを超純水で希釈して３００μｇ／ｍＬのＳ１を作製し、Ｓ１を段階的に希釈してＳ２（２００μｇ／ｍＬ）、Ｓ３（１００μｇ／ｍＬ）、Ｓ４（５０μｇ／ｍＬ）、Ｓ５（２５μｇ／ｍＬ）、Ｓ６（１２．５μｇ／ｍＬ）、Ｓ７（６．２５μｇ／ｍＬ）を作製する。４ｍｏｌ／ｌ  ＨＣｌ９０μＬのみのＳ８（０μｇ／ｍＬ）も準備する。
【００７１】
（アッセイ）
３５μＬのスタンダード及びサンプルをそれぞれプレート（ＱｕｉｃｋＺｙｍｅ  Ｔｏｔａｌ  Ｃｏｌｌａｇｅｎ  Ａｓｓａｙキット付属、ＱｕｉｃｋＺｙｍｅ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）に加える。７５μＬのアッセイバッファ（上記キット付属）をそれぞれのウェルに加える。シールでプレートを閉じ、２０分シェイキングしながら室温でインキュベートする。シールをはがし、７５μＬのｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｒｅａｇｅｎｔ  （ｒｅａｇｅｎｔ  Ａ：Ｂ＝３０μＬ：４５μＬ、上記キット付属）をそれぞれのウェルに加える。シールでプレートを閉じ、シェイキングで溶液を混合し、６０℃で６０分インキュベートする。氷上で十分に冷まし、シールをはがして５７０ｎｍの吸光度を測定する。サンプルの吸光度をスタンダードと比較することでコラーゲン量を算出する。
【００７２】
三次元組織体中に占めるコラーゲン成分を、その面積比又は体積比によって規定してもよい。「面積比又は体積比によって規定する」とは、例えば三次元組織体中のコラーゲン成分を既知の染色手法（例えば、抗コラーゲン抗体を用いた免疫染色、又はマッソントリクローム染色）等で他の組織構成物と区別可能な状態にした上で、肉眼観察、各種顕微鏡及び画像解析ソフト等を用いて、三次元組織体全体に占めるコラーゲン成分の存在領域の比率を算出することを意味する。面積比で規定する場合、三次元組織体中の如何なる断面もしくは表面によって面積比を規定するかは限定されないが、例えば三次元組織体が球状体等である場合には、その略中心部を通る断面図によって規定してもよい。
【００７３】
例えば、三次元組織体中のコラーゲン成分を面積比によって規定する場合、その面積の割合は、上記三次元組織体の全体の面積を基準として０．０１〜９９％であり、１〜９９％であることが好ましく、５〜９０％であることが好ましく、７〜９０％であることが好ましく、２０〜９０％であることが好ましく、５０〜９０％であることがより好ましい。「三次元組織体におけるコラーゲン成分」については、上述したとおりである。三次元組織体を構成するコラーゲン成分の面積の割合は、内因性コラーゲン成分及び外因性コラーゲン成分を合わせた面積の割合を意味する。コラーゲン成分の面積の割合は、例えば、得られた三次元組織体をマッソントリクロームで染色し、三次元組織体の略中心部を通る断面の全体の面積に対する、青く染色したコラーゲン成分の面積の割合として算出することが可能である。
【００７４】
三次元組織体は、トリプシンの濃度０．２５％、温度３７℃、ｐＨ７．４、反応時間１５分でトリプシン処理を行った後の残存率が７０％以上であることが好ましく、８０％以上であることがより好ましく、９０％以上であることが更により好ましい。このような三次元組織体は、培養中又は培養後において酵素による分解が起きにくく、安定である。上記残存率は、例えば、トリプシン処理の前後における三次元組織体の質量から算出できる。
【００７５】
上記三次元組織体は、コラゲナーゼの濃度０．２５％、温度３７℃、ｐＨ７．４、反応時間１５分でコラゲナーゼ処理を行った後の残存率が７０％以上であってもよく、８０％以上であることがより好ましく、９０％以上であることが更により好ましい。このような三次元組織体は、培養中又は培養後における酵素による分解が起きにくく、安定である。
【００７６】
上記三次元組織体の厚さは１０μｍ以上であることが好ましく、１００μｍ以上であることがより好ましく、１０００μｍ以上であることが更により好ましい。このような三次元組織体は、生体組織により近い構造であり、実験動物の代替品、及び移植材料として好適なものとなる。三次元組織体の厚さの上限は、特に制限されないが、例えば、１０ｍｍ以下であってもよいし、３ｍｍ以下であってもよいし、２ｍｍ以下であってもよいし、１．５ｍｍ以下であってもよいし、１ｍｍ以下であってもよい。
【００７７】
ここで、「三次元組織体の厚さ」とは、三次元組織体がシート状、又は直方体状である場合、主面に垂直な方向における両端の距離を意味する。上記主面に凹凸がある場合、厚さは上記主面の最も薄い部分における距離を意味する。
【００７８】
また、三次元組織体が球体状である場合、その直径を意味する。さらにまた、三次元組織体が楕円体状である場合、その短径を意味する。三次元組織体が略球体状又は略楕円体状であって表面に凹凸がある場合、厚さは、三次元組織体の重心を通る直線と上記表面とが交差する２点間の距離であって最短の距離を意味する。
【００７９】
断片化細胞外マトリックス成分及びフィブリンを含む培養液を用いることにより、形状が制御された培養液内での細胞培養が可能となる。すなわち、一実施形態によれば、形状が制御された、断片化細胞外マトリックス成分、フィブリン及び細胞を含む細胞含有組成物を形成させることができる。細胞含有組成物を培養することによって、三次元組織体が形成される。培養液（細胞含有組成物）の形状の制御は、例えば、３Ｄプリンティング等の方法を用いて実施することができる。３Ｄプリンティングの方法を用いて実施する場合には、３Ｄプリンターを用いてもよく、ピペットを用いて手作業により行ってもよい。
【００８０】
本発明の一実施形態において、断片化細胞外マトリックス成分、フィブリン、水性媒体及び細胞（第１の細胞）を少なくとも含む第１の液滴と、水性媒体を少なくとも含む第２の液滴とを液滴同士が接するように配置する工程（配置工程）を備える、細胞含有組成物の製造方法が提供される。当該製造方法によれば、第１の液滴と、第２の液滴とを接触させたときの第１の液滴中の細胞集団の挙動（細胞の集団としての挙動）を評価することができる細胞含有組成物が提供される。この細胞含有組成物によれば、細胞集団の挙動を観察したときの画像解析を容易に行うことができるため、より効率的な評価が可能となる。細胞含有組成物の製造方法は、配置工程の後に、細胞を培養する工程を更に含んでいてよい。細胞の培養条件等は上述したとおりである。本実施形態の方法により得られる細胞含有組成物は、細胞培養期間をとおして、形状が維持されやすくなっているため、細胞集団の挙動の評価に好適である。
【００８１】
第２の液滴は、第１の液滴の側面の一部（例えば、第１の液滴の外周の一部）が接するように配置してもよく、第１の液滴上に配置してもよい。第２の液滴は、断片化細胞外マトリックス成分を更に含んでいてよく、フィブリンを更に含んでいてよく、検体を更に含んでいてよく、断片化細胞外マトリックス成分、フィブリン及び検体を含んでいてよい。検体は、第１の細胞に作用し得る物質であってよく、例えば、第１の細胞とは異なる種の細胞（第２の細胞）であってよい。第１の細胞がＨＵＶＥＣである場合、検体は、例えば、ＮＨＤＦ、ＶＥＧＦ、又はこれらの組み合わせが挙げられる。１又は２以上の第２の液滴が第１の液滴と接するように配置されていてもよい。
【００８２】
上述した配置工程を備える細胞含有組成物の製造方法は、細胞集団の挙動（細胞の集団としての挙動）を評価する方法の一部と捉えることもできる。例えば、まず、断片化細胞外マトリックス成分、フィブリン、水性媒体及び第１の細胞を少なくとも含む第１の液滴を準備する。第１の液滴と接するように、水性媒体を少なくとも含む第２の液滴を配置する。第１の液滴と、第２の液滴との界面付近の部分及び第２の液滴の第１の液滴と接していない部分を顕微鏡等により観察することによって、第１の液滴中の第１の細胞の集団としての挙動が観察される。
【実施例】
【００８３】
以下に、本発明を実施例に基づいて具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。【００８４】
＜試験例１：解繊されたコラーゲン成分の作製＞
日本ハム株式会社製のブタ皮膚由来Ｉ型コラーゲン凍結乾燥体１００ｍｇを、真空検体乾燥器ＨＤ−１５Ｈ（石井理化機器製作所製）で、減圧状態にしながら、２００℃で２４時間加熱を行った。これにより、少なくとも一部が架橋されているコラーゲン成分（架橋コラーゲン成分）を得た。なお、２００℃の加熱前後において、コラーゲンに外見上の大きな変化は確認されなかった。【００８５】
作製した架橋コラーゲン成分５０ｍｇを５ｍＬの超純水に懸濁し、超音波式ホモジナイザーを用いて、４℃の条件下、２０秒間のサイクルを１０回繰り返して、ホモジナイズすることにより、架橋コラーゲン成分を解繊した。得られた液を孔径３５μｍのフィルターでろ過して、解繊されたコラーゲン成分（ｓＣＭＦ）を含む分散液を得た。【００８６】
ｓＣＭＦの平均長は、１４．８±８．２μｍ（Ｎ＝２０）であった。【００８７】
＜試験例２：三次元組織体の作製及び評価＞
三次元組織体の作製において用いた試薬、器具及び作製条件は以下のとおりである。
ウシ血漿由来フィブリノゲン（Ｓｉｇｍａ  Ｆ８６３０、Ｔｙｐｅ  Ｉ−Ｓ，６５−８５％  ｐｒｏｔｅｉｎ）
ウシ血漿由来トロンビン（Ｓｉｇｍａ  Ｔ４６４８、６６Ｎ１Ｈ  ｕｎｉｔ／ｍｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ）
総細胞数：５×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍｌ  （ＮＨＤＦ：ＨＵＶＥＣ＝２：１）
培地（ＥＢＭ−２：ＤＭＥＭ（Ｈｉｇｈ  Ｇｌｕｃｏｓｅ）＝１：１）
ＥＢＭ−２：Ｌｏｎｚａ、Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌ  Ｂａｓａｌ  Ｍｅｄｉｕｍ−２
ＤＭＥＭ（Ｈｉｇｈ  Ｇｌｕｃｏｓｅ）：ナカライテスク
ガラスボトムディッシュ（松浪硝子工業、３５ｍｍφディッシュ、Ｄ１１１４ＯＨ）
培地：４ｍＬ（２日間毎に交換）、３７℃、５％ＣＯ２【００８８】
３７℃の恒温槽内で、フィブリノゲンを２０ｍｇ／ｍｌの濃度で無血清ＤＭＥＭ（ナカライテスク，０８４８９−４５）に溶解させて、フィブリノゲン溶液を調製した。３７℃の恒温槽内で、トロンビンを１００ｕｎｉｔ／ｍｌの濃度でＤＭＥＭに溶解させてトロンビン溶液を調製した。ｓＣＭＦを６０ｍｇ／ｍｌの濃度でＤＭＥＭに分散させて、ｓＣＭＦ分散液を調製した。【００８９】
１．５ｍｌサンプルチューブ（ＷＡＴＳＯＮ，１３１−７１５５Ｃ）に細胞と１８μｌのＤＭＥＭと２μｌのトロンビン溶液とを加えた。フィブリノゲン溶液とｓＣＭＦ分散液を１：１で混合して得た混合液４０μＬを細胞及びトロンビンを入れたサンプルチューブに加えて、ピペッティングすることにより、組織体形成用の試験液を調製した。サンプルチューブ内の組織体形成用の試験液３０μＬをガラスボトムディッシュ上に滴下して、液滴を形成させた。２時間、３７℃でインキュベートした後に３ｍｌのＤＭＥＭを加えて培養を開始した。培養は５〜１４日間行った。これにより毛細血管を有する三次元組織体を作製した。【００９０】
ｓＣＭＦを、ｓＣＭＦ及び細胞の合計質量を基準として、０．３３質量％、０．５質量％、１質量％又は２質量％となるように、三次元組織体を作製した。また、ｓＣＭＦを用いなかったこと以外は、上記同様にして、比較用の組織体（ｓＣＭＦの含有量：０質量％）を作製した。【００９１】
三次元組織体の蛍光イメージングを次の手順で行った。得られた三次元組織体を、室温（２５℃）において、４％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）を用いて固定した。固定した三次元組織体に対し、１％ＰＢＳで１５分間の洗浄を３回実施した。次いで、三次元組織体をＴｒｉｔｏｎ−Ｘ１００（Ｓｉｇｍａ）０．２％のＰＢＳにより室温で１５分間処理し、再度、１％ＰＢＳによる１５分間の洗浄を３回実施した。得られた三次元組織体を１％ＢＳＡ（Ｂｏｖｉｎｅ  Ｓｅｒｕｍ  Ａｌｂｕｍｉｎ、Ｓｉｇｍａ、Ａ３２９４）−ＰＢＳにより室温で１時間処理した。処理後の三次元組織体に対し、ＣＤ３１（モノクローナル抗体マウス抗ヒトＣＤ３１、内皮細胞、Ｃｌｏｎｅ  ＪＣ７０Ａ，  Ｄａｋｏ）を含む１％ＢＳＡ−ＰＢＳ１ｍＬを用いて、４℃、１２時間の条件で作用させた。１％ＰＢＳによる１５分間の洗浄を３回繰り返したのち、得られた三次元組織体に、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７（Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７  ｇｏａｔ  Ａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ  ＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）又はＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８と、Ｈｏｅｓｃｈｔ（Ｈｏｅｃｈｓｔ  ３３３４２）とを１％ＢＳＡ−ＰＢＳでそれぞれ１／２００及び１／１００に希釈して作用させた。【００９２】
染色した三次元組織体の観察では、共焦点レーザー顕微鏡（ｙｏｋｏｇａｗａ，ＣＱＩ）を用い、レーザー励起光は、４８８ｎｍ又は６４０ｎｍと４０５ｎｍとした。蛍光面積は、Ｉｍａｇｅ  Ｊにより解析した。【００９３】
三次元組織体の厚さは、ＥＶＯＳ  ＦＬ  Ａｕｔｏ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  ｉｎ  ｍｅａｓｕｒｅ  ｍｏｄｅｌにより測定した（Ｎ＝３０）。毛細血管の直径はＩｍａｇｅ  Ｊにより測定した（Ｎ＝１００）。【００９４】
図１は、毛細血管を有する三次元組織体の蛍光観察結果を示す。ｓＣＭＦを含む場合において、毛細血管が形成されることが示された。【００９５】
図２は、作製した三次元組織体の顕微鏡観察結果を示す。図２中の矢印は、血管の管腔を示す。図３は、三次元組織体の厚さと、ｓＣＭＦの含有量との関係を示すグラフである。図２〜３のとおり、ｓＣＭＦを含む場合には、より厚い三次元組織体が得られることが示された。【００９６】
総細胞数（ＮＨＤＦ：ＨＵＶＥＣ＝２：１）を１．５×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍｌ、３．０×１０４ｃｅｌｌｓ／ｍｌ、又は１．５×１０４ｃｅｌｌｓ／ｍｌとして、上記の方法で、毛細血管を有する三次元組織体を作製した。ｓＣＭＦ０．５質量％の条件で作製した三次元組織体の蛍光観察結果を図４に示す。図５は、細胞数と、蛍光面積又は管腔の直径との関係を示すグラフである。細胞数が増加するのに伴い、毛細血管の形成がされやすくなることが確認された。【００９７】
培養期間が、５日、７日、又は１４日の三次元組織体及び比較用の組織体の蛍光観察結果を図６〜７に示す。図８は、培養日数と、蛍光面積又は管腔の直径との関係を示すグラフである。図６〜８のとおり、いずれの組織体も培養期間が長くなるにつれて、蛍光面積は大きくなり、管腔の直径も大きくなった。図９に、培養期間が、５日、７日、又は１４日の三次元組織体の観察結果を示す。図１０は、比較用の組織体及び三次元組織体の厚さを示すグラフである。図１０のとおりｓＣＭＦを用いることにより、より厚い組織体が形成されることが確認された。【００９８】
組織体形成用の試験液の滴下量を調整することにより、毛細血管を有する三次元組織体の形状が容易にコントロール可能であることが示された（図１１）。【００９９】
図１２は、組織体形成用の試験液の滴下量を３００μＬとして作製した三次元組織体を示す。図１２に示す三次元組織体の厚さは６．１ｍｍであった。【０１００】
＜試験例３：３Ｄプリンティングによる三次元組織体の作製及び評価＞
上記方法により調製した組織体形成用の試験液を３Ｄプリンティングにより図１３に示す形状（ライン状）となるようにディッシュ上に配置した。このときの３Ｄプリンティングの条件は、以下のとおりである。結果を図１３に示す。
０．５質量％  フィブリノゲン
１０ｕｎｉｔ／ｍｌ  トロンビン
５×１０６Ｃｅｌｌｓ（ＮＨＤＦ：ＨＵＶＥＣ２：１）
ゲル化時間２０−３０分【０１０１】
上記方法により調製した組織体形成用の試験液を３Ｄプリンティングにより図１４に示す形状となるようにディッシュ上に配置した。試験液をディッシュ上に配置する際、試験液を押し広げるように配置した。このときの３Ｄプリンティングの条件は、以下のとおりである。結果を図１４に示す。
０．５質量％  フィブリノゲン
１０ｕｎｉｔ／ｍｌ  トロンビン
５×１０６Ｃｅｌｌｓ（ＮＨＤＦ：ＨＵＶＥＣ２：１）
ゲル化時間２０−３０分【０１０２】
上記方法により調製した組織体形成用の試験液を３Ｄプリンティングにより図１５に示す形状（ドット状）となるようにディッシュ上に配置した。試験液をディッシュ上に配置する際、試験液を押し広げずに、滴下することにより配置した。このときの３Ｄプリンティングの条件は、以下のとおりである。結果を図１５に示す。
０．５質量％  フィブリノゲン
１０ｕｎｉｔ／ｍｌ  トロンビン
５×１０６Ｃｅｌｌｓ（ＮＨＤＦ：ＨＵＶＥＣ２：１）
ゲル化時間２０−３０分【０１０３】
図１３〜１５に示すように、所望の形状の三次元組織体を形成可能であることが示された。また、３Ｄプリンティングにより、形成される組織体内部の配向まで制御可能であることが示された（図１３参照）。【０１０４】
［試験例４：ＮＨＤＦによる効果］
ＮＨＤＦとＨＵＶＥＣとの細胞数の比（ＮＨＤＦ（Ｎ）：ＨＵＶＥＣ（Ｈ））を、０：１００、２５：７５、５０：５０、７５：２５、又は１００：０としたこと以外は、上記と同様にして、三次元組織体を作製した。図１６のとおり、ＨＵＶＥＣに対するＮＨＤＦの細胞数比率が、２５％以上である場合に、組織安定性がより一層優れたものとなることが示された。【０１０５】
ＮＨＤＦとＨＵＶＥＣとの細胞数の比を２５：７５として、作製した毛細血管を有する三次元組織体の蛍光観察結果を示す写真及び内腔の直径の測定結果を図１７に示す。図１８は、ＮＨＤＦとＨＵＶＥＣとの細胞数の比を０：１００（０％  ＮＨＤＦ）、５０：５０（５０％  ＮＨＤＦ）、又は７５：２５（７５％  ＮＨＤＦ）として作製した三次元組織体の蛍光観察結果を示す写真である。ＨＵＶＥＣだけで毛細血管を有する三次元組織体は形成されるものの、ＨＵＶＥＣに対するＮＨＤＦの細胞数比率が２５〜７５％である場合に、内腔がより形成されやすいことが示された（図１７〜１８）。【０１０６】
［試験例５：ｓＣＭＦ量による効果］
ｓＣＭＦを、水性媒体全量に対して、０％、０．３３％、０．５％、１％、又は２％用いて、上記同様の方法で、三次元組織体を作製した。図１９〜２０に観察結果を示す写真及び管腔の直径の測定結果を示す。図１９〜２０のとおり、ｓＣＭＦを含む場合に、血管網が形成可能であることが示された。特に、ｓＣＭＦの量が０．２２％、０．５％、１％の場合に、緻密な血管網が形成された。【０１０７】
［試験例６：フィブリン量による効果］
フィブリンを、水性媒体全量に対して、０％、０．０２％、０．１％、又は０．５％用いて、上記同様の方法で、三次元組織体を作製した。図２１に示すとおり、フィブリンを含まない場合には、三次元組織体の端部が強い蛍光を有しており、血管網の形成が不十分であった。これに対し、フィブリンを含む場合には、内部の広い領域において充分に血管網が形成されていた。【０１０８】
［試験例７：三次元組織体の安定性評価］
フィブリノゲンと、トロンビンと、細胞（ＮＨＤＦ：ＨＵＶＥＣ＝２：１）と、水性媒体ＤＭＥＭと、ｓＣＭＦとを含む組織体形成用の試験液を準備した。フィブリノゲン量は、試験液に対して、２０ｍｇ／ｍＬ、トロンビン量は、試験液に対して、３０ｕｎｉｔ／ｍＬとした。細胞は、総細胞数を５×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬとした。ｓＣＭＦ量は、ｓＣＭＦ及び細胞の合計質量に対して、０．５質量％とした。また、ｓＣＭＦを用いなかったこと以外は、組織体形成用の試験液と同様にして、比較用の試験液を準備した。各試験液３０μＬを液滴状に配置した。試験液の液滴を配置した時点を基準時（０分）とし、３０分経過時点で、試験液の液滴上に、水性媒体を配置させた。基準時から、９０分経過時点で、ＤＭＥＭ培地を３ｍＬ加えて、３７℃の条件で、１０日間培養した。【０１０９】
ｓＣＭＦを用いた場合、１０日経過前後において、三次元組織体の形状が充分に維持されることが示された（図２２）。【０１１０】
［試験例８：細胞集団の挙動の評価］
細胞として、１．０×１０５ｃｅｌｌｓ  ＨＵＶＥＣ（Ｌｏｎｚａ，  Ｃ２５１７Ａ）を用いたこと以外は、試験例２と同様にして、作製した組織体形成用の試験液をガラスボトムデッシュに１つ播種した。３７℃で１０分間インキュベートした後、隣接するように、細胞が含まれないこと、もしくは含まれる細胞の種類および量が異なること以外は、試験例２と同様にして作製した３種類のゲル（それぞれ、細胞なし、１．０×１０５ｃｅｌｌｓのＮＨＤＦ（Ｌｏｎｚａ，ＣＣ−２５０９）、ＶＥＧＦ３ｎｇと１．０×１０５ｃｅｌｌｓのＮＨＤＦ）をそれぞれ播種して、２時間、３７℃でインキュベートした後、３ｍｌのＤＭＥＭ５０％／ＥＢＭ−２（ナカライテスク，Ｌｏｎｚａ，ＣＣ−３２０２）５０％を加えて１週間培養した。ＣＤ３１（Ｄａｋｏ，Ｍ０８２３）とＡｌｅｘａ６４７（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ａ２１２３５）を用いて免疫染色し、共焦点定量イメージサイトメーターＣＱ（ＹＯＫＯＧＡＷＡ）を用いて蛍光観察し、毛細血管網の形成を評価した。結果を図２３〜２５に示す。【０１１１】
図２４〜２５の界面付近では、血管新生が誘導されていることが確認された。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【手続補正書】
【提出日】令和3年3月8日(2021.3.8)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
断片化された細胞外マトリックス成分、フィブリン及び水性媒体を含む培養液中で細胞を培養する培養工程と、前記培養工程の前に、フィブリノゲン及びトロンビンを混合する工程とを備える、三次元組織体の製造方法。
【請求項２】
前記断片化された細胞外マトリックス成分の少なくとも一部が、架橋されている、請求項１に記載の三次元組織体の製造方法。
【請求項３】
前記断片化された細胞外マトリックス成分の平均長が１００ｎｍ以上２００μｍ以下である、請求項１又は２に記載の三次元組織体の製造方法。
【請求項４】
前記細胞が細胞外マトリックス産生細胞を含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の三次元組織体の製造方法。
【請求項５】
前記細胞が、血管内皮細胞、がん細胞、心筋細胞、平滑筋細胞、線維芽細胞、および、上皮細胞からなる群から選ばれる１種類または複数種類の細胞をさらに含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の三次元組織体の製造方法。
【請求項６】
前記細胞が、血管内皮細胞および線維芽細胞を少なくとも含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載の三次元組織体の製造方法。
【請求項７】
前記線維芽細胞の含有率が、全細胞数に対して、２５％以上である、請求項６に記載の三次元組織体の製造方法。
【請求項８】
前記断片化された細胞外マトリックス成分の含有率が、前記断片化された細胞外マトリックス成分及び細胞の合計質量を基準として、０．３３質量％以上９０質量％以下である、請求項１〜７のいずれか一項に記載の三次元組織体の製造方法。
【請求項９】
前記断片化された細胞外マトリックス成分の含有率が、前記断片化された細胞外マトリックス成分及び細胞の合計質量を基準として、０．５質量％以上９０質量％以下である、請求項１〜８のいずれか一項に記載の三次元組織体の製造方法。
【請求項１０】
前記培養液を、略水平方向に移動させながら配置する、請求項１〜９のいずれか一項に記載の三次元組織体の製造方法。
【請求項１１】
断片化された細胞外マトリックス成分、フィブリン、水性媒体及び細胞を少なくとも含む第１の液滴と、水性媒体を少なくとも含む第２の液滴とを液滴同士が接するように配置する工程を備える、細胞含有組成物の製造方法。
【請求項１２】
前記第２の液滴を前記第１の液滴上に配置する、請求項１１に記載の細胞含有組成物の製造方法。
【請求項１３】
断片化された細胞外マトリックス成分、フィブリン及び細胞を含む、三次元組織体（但し、脳血管モデルを除く。）。
【国際調査報告】
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