【手続補正書】
【提出日】平成20年12月22日(2008.12.22)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
必須シャペロンをコードする1または２以上の遺伝子を欠失するか、あるいは酵母宿主細胞中で不活性化するとき、宿主細胞が培養において生存不能であり、そして培地への添加または変性により欠陥が補足することができないという意味において、酵母宿主細胞の生存可能性に対して必須であるシャペロンをコードする遺伝子を、唯一の酵母選択可能なマーカーとして、含んでなる、プラスミド。
【請求項２】
必須シャペロンをコードする遺伝子がプラスミドによりコードされる唯一の選択可能なマーカーである、請求項１に記載のプラスミド。
【請求項３】
必須シャペロンが真核生物シャペロンである、請求項２に記載のプラスミド。
【請求項４】
必須シャペロンが酵母シャペロンであり、請求項２に記載のプラスミド。
【請求項５】
必須シャペロンが酵母シャペロンであり、前記酵母シャペロンがCCT2、CCT3、CCT4、CCT5、CCT6、CCT7、CCT8、CNS1、ERO1、HSP10、HSP60、PDI1、CDC37、KAR2、MGE1、MRS11、NOB1、SSC1、PSE1、TIM9、PAM18またはTCP1から選択される遺伝子によりコードされるタンパク質の配列またはこれらの任意の1つの変異型またはフラグメントを含んでなる、請求項２に記載のプラスミド。
【請求項６】
必須シャペロンがタンパク質ジサルファイドイソメラーゼまたはPse1pである、請求項２に記載のプラスミド。
【請求項７】
所望の異種タンパク質をコードする遺伝子をさらに含んでなる、請求項１〜６のいずれか１項に記載のプラスミド。
【請求項８】
２μｍファミリープラスミドである、請求項１〜７のいずれか１項に記載のプラスミド。
【請求項９】
２μｍファミリープラスミドでない、請求項１〜７のいずれか１項に記載のプラスミド。
【請求項１０】
第１シャペロンタンパク質の配列を含んでなるタンパク質をコードする第１組換え遺伝子と、第２シャペロンタンパク質の配列を含んでなるタンパク質をコードする第２組換え遺伝子とを含んでなるプラスミドである、請求項１〜９のいずれかに記載のプラスミド。
【請求項１１】
前記第１シャペロン及び前記第２シャペロンの少なくとも一方、そして場合によっては両方が、
（ｉ）真菌シャペロン (必要に応じて酵母シャペロン) または哺乳動物シャペロン (必要に応じてヒトシャペロン) の配列を有し；そして／又は
（ii）各々が個々に、AHA1、CCT2、CCT3、CCT4、CCT5、CCT6、CCT7、CCT8、CNS1、CPR3、CPR6、EPS1、ERO1、EUG1、FMO1、HCH1、HSP10、HSP12、HSP104、HSP26、HSP30、HSP42、HSP60、HSP78、HSP82、JEM1、MDJ1、MDJ2、MPD1、MPD2、PDI1、PFD1、ABC1、APJ1、ATP11、ATP12、BTT1、CDC37、CPR7、HSC82、KAR2、LHS1、MGE1、MRS11、NOB1、ECM10、SSA1、SSA2、SSA3、SSA4、SSC1、SSE2、SIL1、SLS1、UBI4、ORM1、ORM2、PER1、PTC2、PSE1、HAC1またはトランケーテッド無イントロンHAC1、TIM9、PAM18またはTCP1、またはこれらの任意の1つの変異型またはフラグメントのいずれか１つによりコードされるタンパク質の配列を含んでなり；そして／又は
（iii ）タンパク質ジスルフィドイソメラーゼであり；そして／又は
（iv）Orm2p又はその変異型またはフラグメントである、
請求項10に記載のプラスミド。
【請求項１２】
第３組換え遺伝子をさらに含んでなり、前記第３組換え遺伝子が所望の異種タンパク質をコードする、請求項10または11に記載のプラスミド。
【請求項１３】
プラスミドが壊変ベクターである、請求項10〜12のいずれか１項に記載のプラスミド。
【請求項１４】
プラスミドを含んでなる宿主細胞であって、前記プラスミドは必須シャペロンをコードする遺伝子を含んでなり、ここで前記プラスミドの非存在下に、宿主細胞はシャペロンを発現することができず、前記プラスミドは所望の異種タンパク質、例えば、当該宿主に天然に存在する１又は複数の他のタンパク質、例えば非−酵母タンパク質、をコードする組換え遺伝子をさらに含んでなる、宿主細胞。
【請求項１５】
必須シャペロンが真核生物シャペロンである、請求項14に記載の宿主細胞。
【請求項１６】
必須シャペロンが酵母シャペロンである、請求項14に記載の宿主細胞。
【請求項１７】
必須シャペロンが酵母シャペロンであり、前記酵母シャペロンがCCT2、CCT3、CCT4、CCT5、CCT6、CCT7、CCT8、CNS1、ERO1、HSP10、HSP60、PDI1、CDC37、KAR2、MGE1、MRS11、NOB1、SSC1、PSE1、TIM9、PAM18またはTCP1から選択される遺伝子によりコードされるタンパク質、またはこれらの任意の1つの変異型またはフラグメントの配列を含んでなる、請求項14に記載の宿主細胞。
【請求項１８】
必須シャペロンがタンパク質ジサルファイドイソメラーゼである、請求項14に記載の宿主細胞。
【請求項１９】
プラスミドの非存在下に、宿主細胞が生存不能である、請求項14〜18のいずれかに記載の宿主細胞。
【請求項２０】
プラスミドの非存在下に、宿主細胞が生存不能であり、成長培地中で宿主細胞を増殖させ、前記成長培地に栄養を添加するか、あるいは前記培地を変性することによって生存可能することができず、好ましくは成長培地中で宿主細胞を増殖させ、前記成長培地に栄養を添加するか、あるいは前記培地を変性することによって生存可能することができない、請求項19に記載の宿主細胞。
【請求項２１】
請求項１〜13のいずれか１項に記載のプラスミドを含んでなる、請求項14〜20のいずれか１項に記載の宿主細胞。
【請求項２２】
第１シャペロンタンパク質の配列を含んでなるタンパク質をコードする第１組換え遺伝子と、第２シャペロンタンパク質の配列を含んでなるタンパク質をコードする第２組換え遺伝子とを含んでなるプラスミドを含んでなり、ここでプラスミドによりコードされるシャペロンが必須遺伝子である、宿主細胞。
【請求項２３】
プラスミドの非存在下に、宿主細胞がシャペロンを産生しない、請求項22に記載の宿主細胞。
【請求項２４】
所望のタンパク質（例えば、所望の異種タンパク質）の製造方法において、
（ａ）第１シャペロンタンパク質の配列を含んでなるタンパク質をコードする第１組換え遺伝子、第２シャペロンタンパク質の配列を含んでなるタンパク質をコードする第２組換え遺伝子、及び第３組換え遺伝子を宿主細胞を用意し、ここで第３組換え遺伝子は所望のタンパク質（例えば、所望の異種タンパク質）をコードし、ここで、前記第１シャロン及び第２シャロンは異なる；
（ｂ）前記宿主細胞を培地中で培養して前記第１遺伝子、第２遺伝子及び第３遺伝子の発現を得る；
ことを含んでなる方法。
【請求項２５】
所望の組換えタンパク質を製造する方法において、
プラスミドを含んでなる宿主細胞を準備し、前記プラスミドは宿主細胞の生存のために必須であるシャペロン（「必須シャペロン」）をコードする第１組換え遺伝子を含んでなり、そしてここで、前記プラスミドの非存在下には、宿主細胞は必須シャペロンを産生することができず、そしてさらに宿主細胞は所望のタンパク質をコードする遺伝子を含んでなり；
必須シャペロンおよび所望のタンパク質の発現を可能とする条件下に宿主細胞を培地中で培養し；そして
必要に応じて、こうして発現された所望のタンパク質を、培養した宿主細胞または培地から単離し；そして
必要に応じて、こうして単離された所望のタンパク質を商業的に許容される純度に精製し；
そしてさらに必要に応じて、こうして精製されたタンパク質を凍結乾燥するか、あるいは精製された所望のタンパク質を担体または希釈剤 (例えば、薬学上許容される担体または希釈剤) と配合し；
そして必要に応じてこうして配合された所望のタンパク質を単位投与形態で提供する；
ことを含んでなる方法。
【請求項２６】
前記宿主細胞が、請求項14〜23のいずれか１項に記載の宿主細胞である、請求項25に記載の方法。
【請求項２７】
所望のタンパク質（例えば、所望の異種タンパク質）の製造方法において、
（ａ）請求項14〜20のいずれか１項に記載の宿主細胞を準備し、そして
（ｂ）必須シャペロンおよび所望のタンパク質の発現を可能とする条件下に宿主細胞を培地中で培養する、
工程を含んでなる方法。
【請求項２８】
前記宿主細胞が、請求項１〜13のいずれか１項に記載のプラスミドを含んでなる、請求項27に記載の方法。
【請求項２９】
ポリヌクレオチドをプラスミド中に組込んで修飾されたプラスミドを産生することによって宿主細胞中のプラスミドの安定性を増加させるために、宿主細胞の生存可能性に対して必須であるシャペロン（「必須シャペロン」）をコードする配列を含んでなるポリヌクレオチドの使用であって、ここで宿主細胞はプラスミドの非存在下に必須シャペロンを産生することができない、前記使用。
【請求項３０】
前記プラスミドが2μｍファミリープラスミドである、請求項29に記載の使用。
【請求項３１】
前記プラスミドが所望の異種タンパク質をコードする遺伝子をさらに含んでなる、請求項29又は30に記載の使用。
【請求項３２】
前記必須シャペロンが真核生物シャペロンである、請求項29〜31のいずれかに記載の使用。
【請求項３３】
前記必須シャペロンが酵母シャペロンである、請求項29〜31のいずれか１項に記載の使用。
【請求項３４】
前記必須シャペロンが酵母シャペロンであり、前記酵母シャペロンがCCT2、CCT3、CCT4、CCT5、CCT6、CCT7、CCT8、CNS1、ERO1、HSP10、HSP60、PDI1、CDC37、KAR2、MGE1、MRS11、NOB1、SSC1、PSE1、TIM9、PAM18またはTCP1から選択される遺伝子によりコードされるタンパク質の配列またはこれらの任意の1つの変異型またはフラグメントを含んでなる、請求項29〜31のいずれか１項に記載の使用。
【請求項３５】
前記必須タンパク質がシャペロン、例えば、タンパク質ジサルファイドイソメラーゼまたはPse1pである、請求項29〜31のいずれかに記載の使用。
【請求項３６】
同時に宿主細胞中のプラスミドの安定性を増加させかつタンパク質産物を産生する宿主細胞の能力を増加させるための、請求項29〜35のいずれかに記載の使用。
【請求項３７】
前記タンパク産物が、内因的にコード化されたタンパク質または異種タンパク質である、請求項36に記載の使用。
【請求項３８】
前記タンパク産物が、宿主細胞の染色体中に組込まれた組換え遺伝子によりコードされる異種タンパク質である、請求項36に記載の使用。
【請求項３９】
前記タンパク産物が、宿主細胞中のプラスミド上に存在する組換え遺伝子によりコードされる異種タンパク質である、請求項36に記載の使用。
【請求項４０】
異種タンパク質をコードする組換え遺伝子を含んでなるプラスミドが必須シャペロンをコードするポリヌクレオチドを含んでなる修飾されたプラスミドと同一である、請求項39に記載の使用。
【請求項４１】
前記宿主細胞が、非選択培地、例えば富培地又は複合培地において培養される、請求項24〜40のいずれか１項に記載の方法又は使用。
【請求項４２】
請求項７〜41のいずれか１項に記載のプラスミド、方法又は使用において、異種タンパク質が、
（ｉ）宿主細胞、例えば酵母からの選択を生じさせるのに有効なリーダー配列を含んでなり；そして／又は
（ii）真核生物タンパク質、そのフラグメントまたは変異型、必要に応じて脊椎動物または真菌 (例えば、酵母) タンパク質であり；そして／又は
（iii ）商業的に有用なタンパク質、例えば、治療的、診断的、工業的、家庭的または栄養的に有用なタンパク質であり；そして／又は
（iv）アルブミン、モノクローナル抗体、エトポシド、血清タンパク質 (例えば、血液凝固因子、例えば、因子VII、因子VIII、因子IX、因子Xおよび因子XIII) 、アンチスタシン、ダニ抗凝固ペプチド、トランスフェリン、ラクトフェリン、エンドスタチン、アンギオスタチン、コラーゲン、免疫グロブリン、または免疫グロブリンに基づく哺乳動物分子またはいずれかのフラグメント (例えば、dAb、Fab’フラグメント、F(ab’)2、scAb、scFvまたはscFvフラグメント) 、クニッツ型ドメインタンパク質、インターフェロン、インターロイキン、IL10、IL11、IL12、インターフェロンα種および亜種、インターフェロンβ種および亜種、インターフェロンγ種および亜種、レプチン、CNTF、CNTFAX15 (AxokineTM) 、IL1-レセプターアンタゴニスト、エリトロポイエチン (EPO) およびEPO模倣物、トロンボポイエチン (TPO) およびTPO模倣物、プロサプチド、シノビリン-N、5-ヘリックス、T20ペプチド、T1249ペプチド、HIV gp41、HIV gp120、ウロキナーゼ、プロウロキナーゼ、tPA、ヒルジン、血小板由来増殖因子、副甲状腺ホルモン、プロインスリン、インスリン、グルカゴン、グルカゴン様ペプチド、インスリン様増殖因子、カルシトニン、成長ホルモン、トランスフォーミング増殖因子β、腫瘍壊死因子、G-CSF、GM-CSF、M-CSF、FGF、前形態および活性形態の両方の凝固因子、下記のものを包含するが、これらに限定されない: プラスミノーゲン、フィブリノゲン、トロンビン、プレトロンビン、プロトロンビン、フォン・ウィルブランド因子、α1-抗トリプシン、プラスミノーゲンアクチベーター、神経増殖因子、LACI、血小板由来内皮細胞増殖因子 (PD-ECGF) 、グルコースオキシダーゼ、血清コリンエステラーゼ、アプロチニン、アミロイド前駆体タンパク質、インターαトリプシンインヒビター、アンチトロンビンIII、アポリポタンパク質種、タンパク質C、タンパク質S、代謝物、抗生物質、または上記のいずれかの変異型またはフラグメント、から選択される配列を含んでなり；そして／又は
（ｖ）アルブミンまたはその変異型またはフラグメントの配列を含んでなり；そして／または
（vi）トランスフェリンファミリーのメンバー、必要に応じてトランスフェリンまたはラクトフェリンまたはそれらの変異型またはフラグメントの配列を含んでなり；そして／又は
（vii ）融合タンパク質、例えば、アルブミンまたはトランスフェリンファミリーのメンバーの融合タンパク質、いずれかの変異型またはフラグメントを含んでなる；
前記プラスミド、方法又は使用。
【請求項４３】
前記宿主細胞が細菌または酵母の宿主細胞である、請求項１〜42のいずれかに記載の宿主細胞、プラスミドまたは方法または使用。
【請求項４４】
宿主細胞が、酵母細胞、必要に応じて下記のメンバーである請求項43に記載の宿主細胞、プラスミドまたは方法または使用: サッカロマイセス (Saccharomyces) 、クライベロマイセス (Kluyveromayces) 、アルクスラ (Arxula) 、ヤロウィア (Yarrowia) 、カンジダ (Candida) 、シゾサッカロマイセス (Schizosaccharomyces) 、デバリオマイセス (Debaryomyces) 、キサントフィロマイセス (Xanthophyllomyces) 、ゲオトリクム (Geotrichum) 、アシュブヤ (Ashbya) 、ホルテア (Hortaea) 、シュワンニオマイセス (Schwanniomyces) 、トリコスポロン (Trichosporon) 、キサントフィロマイセス (Xanthophyllomyces) 、またはピキア (Pichia) 属、例えば、サッカロマイセス・セレビシエ (Saccharomyces cerevisiae) 、 クライベロマイセス・ラクチス (Kluyveromyces lactis) 、ピキア・パストリス (Pichia pastoris) 、ピキア・メンブラネファシエンス (Pichia membranaefaciens) 、ジゴサッカロマイセス・ロウキシ (Zygosaccharomyces rouxii) 、ジゴサッカロマイセス・バイリイ (Zygosaccharomyces bailii) 、ジゴサッカロマイセス・フェルメンタチ (Zygosaccharomyces fermentati) 、クライベロマイセス・ドロスフィラルム (Kluyveromayces drosphilarum) 、ピキア・メタノリカ (Pichia methanolica) 、ハンゼヌラ・ポリモルファ (Hansenula polymorpha)  (また、ピキア・アウグスタ (Pichia augusta) として知られている) 、アルクスラ・アデニニボランス (Arxula adeninivorans) 、ヤロウィア・リポリチカ (Yarrowia lipolytica) 、カンジダ・ボイディニイ (Candida boidinii) 、カンジダ・ウチリス (Candida utilis) またはシゾサッカロマイセス・ポンベ (Schizosaccharomyces pombe)である、請求項43に記載のプラスミド、方法又は使用。
【請求項４５】
前記プラスミドが2μmファミリープラスミドであり、そして下記の条件：
（ａ）プラスミドはpSR1、pSB3またはpSB4に基づき、そして宿主細胞はジゴサッカロマイセス・ロウキシ (Zygosaccharomyces rouxii) であり、
（ｂ）プラスミドはpSB1またはpSB2に基づき、そして宿主細胞はジゴサッカロマイセス・バイリイ (Zygosaccharomyces bailii) であり、
（ｃ）プラスミドがpSM1に基づき、そして宿主細胞はジゴサッカロマイセス・フェルメンタチ (Zygosaccharomyces fermentati) であり、
（ｄ）プラスミドがpKD1であり、そして宿主細胞はクライベロマイセス・ドロスフィラルム (Kluyveromayces drosphilarum) であり、
（ｅ）プラスミドがpPM1に基づき、そして宿主細胞はピキア・メンブラネファシエンス (Pichia membranaefaciens) であるか、あるいは
（ｆ）プラスミドが2μmファミリープラスミドに基づき、そして宿主細胞はサッカロマイセス・セレビシエ (Saccharomyces cerevisiae) またはストレプトマイセス・カールスバーゲンシス (Streptomyces carlsbergensis) である、
を満足する、請求項44に記載の宿主細胞、プラスミド、方法または使用。
【請求項４６】
前記プラスミドが2μmのプラスミドに基づき、そして宿主細胞がサッカロマイセス・セレビシエ (Saccharomyces cerevisiae) またはストレプトマイセス・カールスバーゲンシス (Streptomyces carlsbergensis) である、請求項45に記載の宿主細胞、プラスミド、方法または使用。