(57)【要約】【課題】  関節リウマチ治療薬の奏効を予測し、または関節リウマチ疾患の病態・病勢の活動性を評価できる簡便かつ再現性の高いバイオマーカーを見出し、効果的な方法を提供すること。【解決手段】  関節リウマチ患者に対する関節リウマチ治療薬の奏効を予測する方法であって、関節リウマチ治療薬投与前の前記患者由来の末梢血中のＭＳ４Ａ４Ａ遺伝子の発現量を測定する工程と、関節リウマチ治療薬を投与してから第一の期間経過後の前記患者由来の末梢血中のＭＳ４Ａ４Ａ遺伝子の発現量を測定する工程とを有し、前記第一の期間経過後のＭＳ４Ａ４Ａ遺伝子の発現量の低下が、前記治療薬を投与してから第二の期間経過後の前記患者における関節リウマチに関連する指標の数値の低下を示す、方法。【選択図】  なし
2020116567.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
関節リウマチ患者に対する関節リウマチ治療薬の奏効を予測する方法であって、
関節リウマチ治療薬投与前の前記患者由来の末梢血中のＭＳ４Ａ４Ａ遺伝子の発現量を測定する工程と、
関節リウマチ治療薬を投与してから第一の期間経過後の前記患者由来の末梢血中のＭＳ４Ａ４Ａ遺伝子の発現量を測定する工程と
を有し、前記第一の期間経過後のＭＳ４Ａ４Ａ遺伝子の発現量の低下が、前記治療薬を投与してから第二の期間経過後の前記患者における関節リウマチに関連する指標の数値の低下を示す、方法。
【請求項２】
請求項１記載の方法において、前記第一の期間は、前記治療薬を投与してから４週以内の期間である、方法。
【請求項３】
請求項１記載の方法において、前記第二の期間は、前記治療薬を投与してから１２週〜５４週の期間である、方法。
【請求項４】
請求項１記載の方法において、前記治療薬は、トシリズマブ、メトトレキサート、及び腫瘍壊死因子阻害薬からなる群から選択される、方法。
【請求項５】
請求項１記載の方法において、前記指標は、ＤＡＳ２８−ＣＲＰ、ＤＡＳ２８−ＥＳＲ、ＤＡＳ４４、ＥＵＬＡＲ改善基準、ＣＤＡＩ、ＳＤＡＩ、ＡＣＲ、及び血清ＣＲＰ濃度からなる群から選択される、方法。
【請求項６】
被験者における関節リウマチに関連する指標の数値を推定する方法であって、
前記被験者由来の末梢血中のＭＳ４Ａ４Ａ遺伝子の発現量を測定する工程と、
前記測定した発現量を、予め用意された前記指標に相関する遺伝子発現プロファイルを用いて解析する工程と、
前記解析した結果に基づき、前記被験者における前記指標の数値を推定する工程と
を有し、前記解析する工程は、前記測定したＭＳ４Ａ４Ａ遺伝子の発現量を、関節リウマチ患者から得られた末梢血におけるＭＳ４Ａ４Ａ遺伝子発現量に基づいて作成される、ＭＳ４Ａ４Ａ遺伝子の発現量と前記指標との相関関係を示す遺伝子発現プロファイルと比較することによって行われる、方法。
【請求項７】
請求項６記載の方法において、前記指標は、ＤＡＳ２８−ＣＲＰ、ＤＡＳ２８−ＥＳＲ、ＤＡＳ４４、ＥＵＬＡＲ改善基準、ＣＤＡＩ、ＳＤＡＩ、ＡＣＲ、及び血清ＣＲＰ濃度からなる群から選択される、方法。
【請求項８】
請求項７記載の方法において、前記指標は、関節リウマチ疾患の病勢を示し、または関節リウマチ治療薬の治療効果を判定する、方法。
【請求項９】
請求項６記載の方法において、前記遺伝子発現プロファイルは正の相関関係を示し、前記被験者由来の末梢血中のＭＳ４Ａ４Ａ遺伝子の発現量が高い場合には、前記指標は高い病勢活動度を示す、方法。
【請求項１０】
請求項６記載の方法において、前記被験者は関節リウマチに罹患している、方法。
【請求項１１】
請求項１０記載の方法において、前記測定する工程は、前記被験者に対する関節リウマチ治療薬の投与前および投与後における末梢血由来のＭＳ４Ａ４Ａ遺伝子の発現量を測定し、前記投与前および投与後における末梢血におけるＭＳ４Ａ４Ａ遺伝子発現量を、前記遺伝子発現プロファイルを用いて解析することにより、前記治療薬の治療効果を判定する、方法。
【請求項１２】
請求項１または６記載の方法に使用される、関節リウマチ患者または被験者における関節リウマチに関連する指標の数値を推定するための末梢血由来のＭＳ４Ａ４Ａバイオマーカー。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、関節リウマチ治療薬の奏効を予測する方法、およびそれに用いるバイオマーカーに関する。具体的には、本発明は、治療前後の被験者から採血した血液から本願発明に係るバイオマーカー遺伝子の発現量を測定・標準化し、その発現量の増減を比較し、当該被験者における将来の関節リウマチ活動性指標を推定することにより、関節リウマチ治療薬の奏効を予測する方法に関する。また本発明は、被験者における関節リウマチに関連する指標の数値を推定する方法にも関する。
【背景技術】
【０００２】
リウマチ性疾患の代表である関節リウマチ（ｒｈｅｕｍａｔｏｉｄ ａｒｔｈｒｉｔｉｓ：「ＲＡ」）は、慢性多発性関節炎を主症状とする全身性結合組織疾患であり、自己免疫疾患の一種である。関節リウマチは、３０〜６０歳の女性に好発し、有病者数は日本国内においては約７０万人と推測されている。関節リウマチの病態には関節滑膜における血管新生、炎症性細胞浸潤、滑膜細胞増殖、軟骨・骨破壊などが挙げられる。また、関節リウマチにおける関節炎は改善と増悪を繰り返しながら進行し、徐々に軟骨・骨破壊を引き起こし、関節リウマチ患者の日常労作の阻害や生活の質（ＱＯＬ）の低下を招く。【０００３】
このような関節リウマチの臨床においては、患者に対して最良の治療を提供するため、当該患者における関節リウマチの病態・病勢の活動性を、特定の指標を算出することにより評価している。例えば、この指標の評価においては、患者の痛みに関する自己評価、関節（疼痛関節数、圧痛関節数、腫脹関節数など）の検査・測定、および血液検査（赤沈、リウマトイド因子、ＣＲＰなど）等の評価項目を組み合わせて、関節リウマチの病態・病勢の活動性をスコア化している。そしてスコア化された指標から、当該患者の疾患の程度を評価している。また、尿中のインターロイキン−１受容体アンタゴニストを指標とすることができることも報告されている（特許文献１）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】特許第３５３０２３９号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
ところで、関節リウマチ患者に投与する関節リウマチ治療薬としては種々のものが開発されており、その選択に際しては、薬効の強さ、投与法、効果発現までの期間、副作用の危険性、リウマチ重症度、疾患活動性、発症からの期間、合併症、治療歴などの多くの要素を勘案し、その患者に最も有用性の高いと考えられる関節リウマチ治療薬を選択して投与する。しかしながら、関節リウマチ治療薬の効果は個体差が大きく、ある症例ないし患者には有効であっても、他の症例ないし患者には無効であることも多い。このようなレスポンダーとノンレスポンダーを薬剤投与前に区別することは今現在不可能とされている。【０００６】
また、関節リウマチ治療薬は遅効性であり、その多くは効果発現まで２〜３カ月を要するため、臨床現場では、ある関節リウマチ治療薬を開始したら最低３ヶ月は投与を続け、３ヶ月続けても効果がみられないときにはじめて他の薬剤に変更するという治療戦略がとられている。そのため、患者によっては、何ら効果のない治療を数ヶ月も続けなければならないという実情が存在する。【０００７】
また活動性指標についても、このような指標を用いて関節リウマチの病態・病勢の活動性を評価する場合、上記のように、患者の痛みに関する自己評価が含まれるため、患者自身の主観的な判断が必要とされる。しかし、患者自身の痛み等に対する評価は、個人や観察者によってばらつきがあるため、客観的にその活動性を評価することは困難である。また、現状の血中マーカーについては、それだけで患者の病態・病勢を総合的に評価することは困難である。【０００８】
そこで、関節リウマチ疾患の診断および治療による予後の推定し、または関節リウマチ治療薬の奏効を予測するために、より簡便で再現性の高い疾患マーカーの解明や、直接的に疾患の程度を判別する方法の開発が望まれている。  
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明は、このような状況を鑑みてなされたものであり、関節リウマチ治療薬の奏効を予測し、または関節リウマチ疾患の病態・病勢の活動性を評価できる簡便かつ再現性の高いバイオマーカーを見出し、効果的な方法を提供することを目的とする。【００１０】
本発明者らは、このような課題を解決するために、ヒト関節リウマチ疾患の患者についてＭＳ４Ａ４Ａの遺伝子発現量に着目した結果、関節リウマチ疾患の病態活動性の程度に比例して、ＭＳ４Ａ４Ａの遺伝子発現量が変化することを観察した。そこで、ＭＳ４Ａ４Ａの遺伝子発現量について、鋭意研究を重ねた結果、被験者から採取した血液中のＭＳ４Ａ４Ａ遺伝子が、関節リウマチ治療薬の奏効を予測するための遺伝子マーカー、さらには関節リウマチ疾患の病態・病勢の活動性評価マーカーとなり得ることを見出し、ＭＳ４Ａ４Ａ遺伝子発現量を測定することにより、関節リウマチ治療薬の奏効を予測し、また関節リウマチ疾患の病態・病勢の活動性を評価することができることを見出した。【００１１】
具体的には、本発明の第一の主要な観点によれば、関節リウマチ患者に対する関節リウマチ治療薬の奏効を予測する方法であって、関節リウマチ治療薬投与前の前記患者由来の末梢血中のＭＳ４Ａ４Ａ遺伝子の発現量を測定する工程と、関節リウマチ治療薬を投与してから第一の期間経過後の前記患者由来の末梢血中のＭＳ４Ａ４Ａ遺伝子の発現量を測定する工程とを有し、前記第一の期間経過後のＭＳ４Ａ４Ａ遺伝子の発現量の低下が、前記治療薬を投与してから第二の期間経過後の前記患者における関節リウマチに関連する指標の数値の低下を示す、方法が提供される。【００１２】
このような構成によれば、関節リウマチ患者に特別な負荷を与えることなく、採血するだけで、低侵襲的かつ簡便に当該患者に投与した関節リウマチ治療薬の奏効を予測することが可能となる。また、このような構成によれば、関節リウマチ治療薬投与前と第一の期間経過後のＭＳ４Ａ４Ａ遺伝子の発現量を測定するだけで、第二の期間経過後の当該患者における関節リウマチに関連する指標の数値を予測することができるため、第二の期間を経過するまで関節リウマチ治療薬を使い続けることなく、その奏効を評価することができる。【００１３】
本願発明に係る方法を利用することにより、将来における関節リウマチの治療薬の奏効を予測することができ、これは患者自身の痛み等に対する主観的な判断を必要としないため、客観的にその奏効を予測することができるため有用である。また、血液中のＭＳ４Ａ４Ａ遺伝子発現量を測定することにより、関節リウマチ疾患に関連する指標の数値を推定することができるため、再現性があり、従来の、患者の自己評価を含む方法に比べて信頼性が高く、かつ簡易に検査することができる。【００１４】
また、本発明の一実施形態によれば、このような方法において、前記第一の期間は、前記治療薬を投与してから４週以内の期間であり、前記第二の期間は、前記治療薬を投与してから１２週〜５４週の期間である。【００１５】
また、本発明の他の一実施形態によれば、このような方法において、前記治療薬は、トシリズマブ、メトトレキサート、及び腫瘍壊死因子阻害薬からなる群から選択されるものである。【００１６】
さらに、本発明の別の一実施形態によれば、このような方法において、前記指標は、ＤＡＳ２８−ＣＲＰ、ＤＡＳ２８−ＥＳＲ、ＤＡＳ４４、ＥＵＬＡＲ改善基準、ＣＤＡＩ、ＳＤＡＩ、ＡＣＲ、及び血清ＣＲＰ濃度からなる群から選択されるものであることが好ましい。【００１７】
また、本発明の第二の主要な観点によれば、被験者における関節リウマチに関連する指標の数値を推定する方法であって、前記被験者由来の末梢血中のＭＳ４Ａ４Ａ遺伝子の発現量を測定する工程と、前記測定した発現量を、予め用意された前記指標に相関する遺伝子発現プロファイルを用いて解析する工程と、前記解析した結果に基づき、前記被験者における前記指標の数値を推定する工程とを有し、前記解析する工程は、前記測定したＭＳ４Ａ４Ａ遺伝子の発現量を、関節リウマチ患者から得られた末梢血におけるＭＳ４Ａ４Ａ遺伝子発現量に基づいて作成される、ＭＳ４Ａ４Ａ遺伝子の発現量と前記指標との相関関係を示す遺伝子発現プロファイルと比較することによって行われる、方法が提供される。【００１８】
また、本発明の一実施形態によれば、本発明の第二の主要な観点に係る方法において、前記指標は、ＤＡＳ２８−ＣＲＰ、ＤＡＳ２８−ＥＳＲ、ＤＡＳ４４、ＥＵＬＡＲ改善基準、ＣＤＡＩ、ＳＤＡＩ、ＡＣＲ、及び血清ＣＲＰ濃度からなる群から選択されるものであり、この場合、前記指標は、関節リウマチ疾患の病勢を示し、または関節リウマチ治療薬の治療効果を判定するものであることが好ましい。【００１９】
また、本発明の他の一実施形態によれば、このような方法において、前記遺伝子発現プロファイルは正の相関関係を示し、前記被験者由来の末梢血中のＭＳ４Ａ４Ａ遺伝子の発現量が高い場合には、前記指標は高い病勢活動度を示すものである。【００２０】
また、本発明の別の一実施形態によれば、このような方法において、前記被験者は関節リウマチに罹患しているものであり、この場合、前記測定する工程は、前記被験者に対する関節リウマチ治療薬の投与前および投与後における末梢血由来のＭＳ４Ａ４Ａ遺伝子の発現量を測定し、前記投与前および投与後における末梢血におけるＭＳ４Ａ４Ａ遺伝子発現量を、前記遺伝子発現プロファイルを用いて解析することにより、前記治療薬の治療効果を判定するものであることが好ましい。【００２１】
また、本発明の第三の主要な観点によれば、上述の方法に使用される、関節リウマチ患者または被験者における関節リウマチに関連する指標の数値を推定するための末梢血由来のＭＳ４Ａ４Ａバイオマーカーが提供される。【００２２】
なお、上記した以外の本発明の特徴及び顕著な作用・効果は、次の発明の実施形態の項及び図面を参照することで、当業者にとって明確となる。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】図１は、本願発明に係るＭＳ４Ａ４Ａ遺伝子のマイクロアレイによる発現量とＤＡＳ２８−ＥＳＲとの相関解析結果を示す散布図である。
【図２】図２は、本願発明に係るＭＳ４Ａ４Ａ遺伝子のＰＣＲによる発現量とＤＡＳ２８−ＥＳＲとの相関解析結果を示す散布図である。
【図３】図３は、本願発明に係るＭＳ４Ａ４Ａ遺伝子の健常者、関節リウマチ患者、および他の疾患における発現解析を示すグラフである。
【図４】図４は、トシリズマブの投与前後における、本願発明に係るＭＳ４Ａ４Ａ遺伝子の発現量と相関するＣＤＡＩの変動を示す結果である。
【図５】図５は、トシリズマブの投与前後における、本願発明に係るＭＳ４Ａ４Ａ遺伝子の発現量と相関するＤＡＳ−ＣＲＰ、ＤＡＳ−ＥＳＲ、ＡＣＲ、ＥＵＬＡＲ−ＣＲＰ、及びＥＵＬＡＲ−ＥＳＲの変動を示す結果である。
【図６】図６は、メトトレキサートの投与前後における、本願発明に係るＭＳ４Ａ４Ａ遺伝子の発現量と相関するＣＤＡＩの変動を示す結果である。
【図７】図７は、腫瘍壊死因子阻害薬の投与前後における、本願発明に係るＭＳ４Ａ４Ａ遺伝子の発現量と相関するＣＤＡＩの変動を示す結果である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２４】
以下に、本願発明に係る一実施形態および実施例を、図面を参照して説明する。  
本実施形態に係る関節リウマチ患者に対する関節リウマチ治療薬の奏効を予測する方法は、上述したように、関節リウマチ治療薬投与前の前記患者由来の末梢血中のＭＳ４Ａ４Ａ遺伝子の発現量を測定する工程と、関節リウマチ治療薬を投与してから第一の期間経過後の前記患者由来の末梢血中のＭＳ４Ａ４Ａ遺伝子の発現量を測定する工程とを有し、前記第一の期間経過後のＭＳ４Ａ４Ａ遺伝子の発現量の低下が、前記治療薬を投与してから第二の期間経過後の前記患者における関節リウマチに関連する指標の数値の低下を示すものである。【００２５】
ここで、本発明の一実施形態において、ＭＳ４Ａ４Ａ遺伝子は、関節リウマチの活動性の指標に正比例して発現量が変化するものであり、後述する実施例に記載するように、関節リウマチの活動性指標の数値の増減を特に反映している。また、ＭＳ４Ａ４Ａ遺伝子は、関節リウマチ治療薬を投与してから第一の期間経過後にその発現量が低下していると、治療薬を投与してから第二の期間経過後において関節リウマチに関連する指標の数値の低下を示すものである。なお、本願明細書において「遺伝子マーカー」とは、「遺伝子」とほぼ同意に用いられるものであり、ある対象物の状態又は作用の評価の指標となるものであって、ここではある遺伝子の発現量と相関するときの遺伝子関連物質をいう。例えば、遺伝子それ自体、転写物であるｍＲＮＡ、翻訳物であるペプチド、遺伝子発現の最終産物であるタンパク質などが含まれる。また、遺伝子またはタンパク質の発現量とは、特に言及しない限り、当該遺伝子またはタンパク質の発現量を標準化したものを意味するものであり、当該遺伝子の転写レベル（転写物などの場合）または翻訳レベルにおける発現量（ポリペプチド、タンパク質などの場合）をも包含して意味するものである。【００２６】
本実施形態において、「関節リウマチに関連する指標」とは、例えば、ＤＡＳ２８−ＣＲＰ、ＤＡＳ２８−ＥＳＲ、ＤＡＳ４４、ＥＵＬＡＲ改善基準、ＥＵＬＡＲ−ＣＲＰ、ＥＵＬＡＲ−ＥＳＲ、ＣＤＡＩ、ＳＤＡＩ、ＡＣＲ、及び血清ＣＲＰ濃度等が含まれるが、関節リウマチの病勢や病態の程度や活動性を数値化・スコア化して表すことのできるものであれば、これらに限られるものではない。【００２７】
ＤＡＳ（ｄｉｓｅａｓｅ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｓｃｏｒｅ）とは、ＥＵＬＡＲ（Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｌｅａｇｕｅ  Ａｇａｉｎｓｔ  Ｒｈｅｕｍａｔｉｓｍ：ヨーロッパリウマチ連盟）が推奨する評価法であるＤＡＳ（ｄｉｓｅａｓｅ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｓｃｏｒｅ）が推奨する評価方法である。また、ＤＡＳ２８とは、このＤＡＳを、日常の診療で使用し易いようにするため、評価する関節を２８関節に絞り込んだものである。ＤＡＳ２８では、２８関節について、（１）圧痛のある関節数、（２）腫れのある関節数、（３）血沈の１時間値、又はＣＲＰ（ｍｇ／ｄｌ）、（４）全般的な病状の評価値、の４項目を測定し、所定の公式により数値化し、疾患の活動性の絶対値を算出する。なお、血沈を用いる場合にはＤＡＳ２８−ＥＳＲ、ＣＲＰ値を用いる場合にはＤＡＳ２８−ＣＲＰという。本願実施例において、ＤＡＳ２８としては、ＤＡＳ２８−ＥＳＲ及びＤＡＳ２８−ＣＲＰのいずれをも用いることができる。また、ＤＡＳ４４とは４４関節について測定するものである。本発明の一実施形態においては、ＭＳ４Ａ４Ａ遺伝子の発現量の増減に比例してＤＡＳ２８−ＣＲＰやＤＡＳ２８−ＥＳＲが変動するが、特定のＤＡＳ２８−ＣＲＰやＤＡＳ２８−ＥＳＲに対応するＭＳ４Ａ４Ａ遺伝子の発現量の基準値（基準発現量）については、実験条件等に応じて適宜変更可能であり、特定の数値に限定されるものではない。なお、ＤＡＳ２８−ＥＳＲにおいては、５．１（４．１）以上である場合に高疾患活動性、３．２（２．７）<ＤＡＳ２８−ＥＳＲ≦５．１（４．１）である場合には中等度疾患活動性、２．６（２．３）<ＤＡＳ２８−ＥＳＲ≦３．２（２．７）である場合には低疾患活動性、そして２．６（２．３）以下の場合には寛解と分類評価される（カッコ内はＤＡＳ２８−ＣＲＰ）。また、本発明において、寛解とは、病気の症状が一時的あるいは継続的に軽減した状態、又は見かけ上消滅した状態をいう。【００２８】
また、本願発明に係る一実施形態において、関節リウマチに関連する指標としてＥＵＬＡＲ改善基準、ＥＵＬＡＲ−ＣＲＰ、またはＥＵＬＡＲ−ＥＳＲを用いることもでき、例えばＥＵＬＡＲ改善基準は、ＤＡＳ２８が基本となっている。治療前に対する治療後の（薬剤投与前に対して薬剤投与後の）ＤＡＳ２８値の２つを組み合わせて、治療効果を反応良好（ｇｏｏｄ）、中等度反応（ｍｏｄｅｒａｔｅ）、反応なし（ｎｏ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ）の３段階で評価している。なお、ＥＵＬＡＲ−ＣＲＰの場合にはＣＲＰを、ＥＵＬＡＲ−ＥＳＲの場合にはＥＳＲを用いている。本発明の一実施形態においては、ＭＳ４Ａ４Ａ遺伝子の発現量の増減に比例して、当該被験者における治療効果を上記３段階のいずれかに評価することができる。本実施形態においては、ＭＳ４Ａ４Ａ遺伝子の発現量の増減に比例してＥＵＬＡＲ改善基準が変動するが、特定のＥＵＬＡＲ改善基準に対応するＭＳ４Ａ４Ａ遺伝子の発現変動量の基準値（基準発現量）については、実験条件等に応じて適宜変更可能であり、特定の数値に限定されるものではない。例えば、中等度反応に対応するＭＳ４Ａ４Ａ遺伝子の発現変動量を設定すれば、遺伝子発現プロファイル解析により、反応良好や反応なしに対応する発現変動量も適宜設定される。また、本発明において、ＥＵＬＡＲ改善基準などを用いる場合の「関節リウマチに関連する指標の数値の低下」とは、反応なしだったものが中等度反応に、中等度反応だったものが反応良好になるなど、治療効果の改善を意味する。【００２９】
本願発明に係る一実施形態において、関節リウマチに関連する指標としてＳＤＡＩ（Ｓｉｍｐｌｅ  ｄｉｓｅａｓｅ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｉｎｄｅｘ）を用いることもできる。ＳＤＡＩとは、上述のＤＡＳの計算式が複雑であるため臨床現場において簡単に計算できるものではなかったため、臨床現場においても簡便に算出できるような評価方法として開発されたものである。このＳＤＡＩでは、その評価される関節はＤＡＳ２８と同じであり、疼痛関節数、腫脹関節数、患者全般度評価、医師全般度評価によって算出される。ＳＤＡＩにおいては、２６以上である場合に高疾患活動性、１１<ＳＤＡＩ≦２６である場合には中等度疾患活動性、３．３<ＳＤＡＩ≦１１である場合には低疾患活動性、そして３．３以下の場合には寛解と分類評価される。本発明の一実施形態において、ＭＳ４Ａ４Ａ遺伝子の発現量の増減に比例してＳＤＡＩの値が変動するが、特定のＳＤＡＩの値に対応するＭＳ４Ａ４Ａ遺伝子の発現量の基準値（基準発現量）については、実験条件等に応じて適宜変更可能であり、特定の数値に限定されるものではない。例えば、ＳＤＡＩの中等度疾患活動性を示す特定の値に対応するＭＳ４Ａ４Ａ遺伝子の発現量を設定すれば、遺伝子発現プロファイル解析により、その他の高疾患活動性や低疾患活動性を示す特定の値に対応する発現量も適宜設定される。【００３０】
また、本願発明に係る一実施形態において、関節リウマチに関連する指標としてＣＤＡＩ（Ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｄｉｓｅａｓｅ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｉｎｄｅｘ）を用いることもできる。ＣＤＡＩとは、ＳＤＡＩからＣＲＰを除いたものである。ＣＤＡＩにおいては、２２以上である場合に高疾患活動性、１０<ＣＤＡＩ≦２２である場合には中等度疾患活動性、２．８<ＣＤＡＩ≦１０である場合には低疾患活動性、そして２．８以下の場合には寛解と分類評価される。本実施形態において、ＭＳ４Ａ４Ａ遺伝子の発現量の増減に比例してＣＤＡＩの値が変動するが、特定のＣＤＡＩの値に対応するＭＳ４Ａ４Ａ遺伝子の発現量の基準値（基準発現量）については、実験条件等に応じて適宜変更可能であり、特定の数値に限定されるものではない。例えば、ＣＤＡＩの中等度疾患活動性を示す特定の値に対応するＭＳ４Ａ４Ａ遺伝子の発現量を設定すれば、遺伝子発現プロファイル解析により、その他の高疾患活動性や低疾患活動性を示す特定の値に対応する発現量も適宜設定される。【００３１】
本願発明に係る一実施形態において、関節リウマチに関連する指標としてＡＣＲを用いることもできる。ＡＣＲとは、アメリカリウマチ学会が定めた関節リウマチの病理程度の分類基準であるＡＣＲ改善基準である。ＡＣＲ改善基準はＡＣＲコアセットである７項目によって定められる。ＡＣＲコアセットは、（１）圧痛関節数、（２）腫脹関節数、（３）患者による疾患の評価、（４）患者による疾患活動性の全般的評価、（５）医師による疾患活動性の全般的評価、（６）患者による身体機能評価、（７）急性期反応物質、の７項目から成る。ＡＣＲ改善基準は、例えば、治療前に対して治療後に（薬剤投与前に対して薬剤投与後に）、上記（１）（２）がともに２０％以上改善し、かつ、上記（３）〜（７）の５項目のうち３項目以上が２０％以上改善した場合に、「ＡＣＲ基準２０％の改善あり（ＡＣＲ２０）」と判定される。同様に、ＡＣＲが５０％ならびに７０％改善した場合、ＡＣＲ５０、ＡＣＲ７０という基準が用いられる。なお、本願明細書において、単に「ＡＣＲ」と表記した場合には、特に言及しない限り、「ＡＣＲ改善基準」を指すものとする。本実施形態においては、ＭＳ４Ａ４Ａ遺伝子の発現量の増減に比例してＡＣＲ基準が変動するが、特定のＡＣＲ基準に対応するＭＳ４Ａ４Ａ遺伝子の発現変動量の基準値（基準発現量）については、実験条件等に応じて適宜変更可能であり、特定の数値に限定されるものではない。例えば、ＡＣＲ５０に対応するＭＳ４Ａ４Ａ遺伝子の発現変動量を設定すれば、遺伝子発現プロファイル解析により、ＡＣＲ２０やＡＣＲ７０に対応する発現量も適宜設定される。【００３２】
本願発明に係る一実施形態において、関節リウマチに関連する指標として血清ＣＲＰ濃度を用いることもできる。血清ＣＲＰ値の正常値は０．３ｍｇ／ｄｌである。本実施形態においては、ＭＳ４Ａ４Ａ遺伝子の発現量の増減に比例して血清ＣＲＰ値が変動するが、血清ＣＲＰ値の正常値に対応するＭＳ４Ａ４Ａ遺伝子の発現量の基準値（基準発現量）については、実験条件等に応じて適宜変更可能であり、特定の数値に限定されるものではない。【００３３】
本願発明に係る一実施形態において、関節リウマチ患者に対する関節リウマチ治療薬の奏効を予測する方法は、関節リウマチ治療薬投与前後の患者から採取した血液中に含まれるＭＳ４Ａ４Ａ遺伝子発現量を測定することによって行われる。被験検体は、被験者から採取した血液が挙げられ、全血、末梢血、または当該血液から分離取得した細胞成分を被験検体としても良い。ここで、血液から分離取得した細胞成分の取得方法は特に限定されるものではなく、従来存在する種々の方法、例えば血液から臨床検査用検体として取得する細胞成分の分離方法に準じることができる。例えば、採取した血液を試験管等に採り、室温で所定条件の下、遠心分離して得られる細胞を検査用検体とすることもできる。【００３４】
本願発明に係る一実施形態において、関節リウマチ患者に対する関節リウマチ治療薬の奏効を予測する方法は、患者由来の血液を検体として簡便に検査することができる点で、関節液を採取して検査する方法に比べて、検体の取得が容易であり、通常の臨床検査に使用する検査用検体を用いることができる点で有利である。関節液は侵襲的な手法により採取されるため、痛みを伴うなどの患者負担が大きく、また出血や感染症などの合併症も危惧されることから、関節液を検査するのは、ルーチン的な検査方法としてはあまり好ましくない。一方で、本願発明のように血液を検体としてＭＳ４Ａ４Ａ遺伝子の発現量を測定する場合には、上述の問題点が解消され、被験者における関節リウマチに関連する指標の数値の推定を簡便に行うことができ、これにより関節リウマチ治療薬の奏効を予測することができる。なお、本明細書において、ＭＳ４Ａ４Ａ量とは、特段に言及する場合を除きＭＳ４Ａ４Ａ遺伝子の発現量を意味する。【００３５】
本願発明に係る一実施形態において、関節リウマチ患者に対する関節リウマチ治療薬の奏効を予測する方法では、採取した血液中のＭＳ４Ａ４Ａ遺伝子を関節リウマチの活動性指標のマーカーとする。本願発明に係る方法により得られたＭＳ４Ａ４Ａ遺伝子発現量の測定結果から関節リウマチの活動性指標や病勢・病態を同定することができ、さらには、関節リウマチの診断ならびに関節リウマチ治療薬の奏効を予測することもできる。【００３６】
本願発明における一実施形態において、本願発明に係る方法を用いて関節リウマチ患者に対する関節リウマチ治療薬の奏効を予測する場合には、関節リウマチ患者に対して、関節リウマチ治療薬の投与前および投与後において採血を行い、その採血した投与前後の各血液中のＭＳ４Ａ４Ａ遺伝子発現量を測定することによって行うことができる。その後、予め用意した、関節リウマチに関連する指標と相関する遺伝子発現プロファイルを用いて、当該各血液中のＭＳ４Ａ４Ａ遺伝子発現量を比較することを特徴とする。【００３７】
この際、関節リウマチ治療薬の投与後の採血として、第一の期間経過後の関節リウマチ患者由来の血液を採血することができる。この「第一の期間」は、前記治療薬を投与してから４週以内の期間とすることができ、治療薬の種類、疾患の程度、投与法、効果発現までの期間、疾患活動性、発症からの期間、合併症、治療歴などに応じて、治療薬を投与してから１週目、２週目、３週目、４週目、または３日目、５日目、１０日目、１２日目、１５日目、２０日目、２５日目などとしても良い。【００３８】
また、本願発明の一実施形態において、「治療薬を投与してから第二の期間経過後」とは、治療薬を投与してから１２週〜５４週の期間の経過後とすることができる。この第二の期間についても、治療薬の種類、疾患の程度、投与法、効果発現までの期間、疾患活動性、発症からの期間、合併症、治療歴などに応じて適宜設定することができ、例えば、１２週目、１４週目、１６週目、２２週目、２４週目、３０週目、３２週目、３８週目、４０週目、４６週目、４８週目、５２週目、５４週目などとしても良い。【００３９】
本発明の一実施形態においては、上記のようにして関節リウマチ治療薬の奏効を予測した結果、治療薬の投与前後におけるＭＳ４Ａ４Ａ遺伝子の発現量の増減と、将来における実際の薬効の評価とは、密接に関連することが判明している。例えば、治療前（０週目）に測定したＭＳ４Ａ４Ａ遺伝子の発現量と、治療薬を投与してから４週目に測定したＭＳ４Ａ４Ａ遺伝子の発現量とを比較して、後者のほうが減少している場合には、例えば４６週目、４８週目、５２週目、５４週目における関節リウマチに関連する指標の数値が低下し、または治療効果の判定が改善していることを予測することができる（後述の実施例を参照）。すなわち、ＭＳ４Ａ４Ａ遺伝子発現の測定結果と関節リウマチに関連する指標の評価との関係は、治療効果の程度を密接に反映しているだけではなく、ＭＳ４Ａ４Ａ遺伝子発現量の治療前後での増減の程度が、将来における関節リウマチ治療薬の奏効とも関係している。これは、その多くが投与開始してから効果発現まで２〜３カ月を要する関節リウマチ治療薬での治療方針について、その薬剤投与を続けるかどうかという判断を治療開始４週以内という比較的初期の段階で判断することができるため、非常に有益な臨床情報となり得る。【００４０】
本願発明において、「関節リウマチ治療薬」としては、特に限定されるものではなく、従来から公知の治療薬および今後開発されるあらゆる治療薬が含まれる。例えば、従来から公知の関節リウマチ治療薬としては、メトトレキサート（ＭＴＸ）などの従来型合成疾患修飾性抗リウマチ薬、生物学的疾患修飾性抗リウマチ薬（生物学的製剤と同義）、ＪＡＫ阻害剤などの分子標的合成疾患修飾性抗リウマチ薬、非ステロイド性抗炎症薬（消炎鎮痛薬）、ステロイド薬、免疫抑制薬などが挙げられる。生物学的製剤としては、キメラ型抗ＴＮＦ−α抗体製剤、可溶性ＴＮＦレセプターや、完全ヒト型抗ＴＮＦ−α抗体製剤、抗ＩＬ−６レセプター抗体製剤などが挙げられる。非ステロイド性抗炎症薬としては、プロスタグランジン産生抑制剤が挙げられる。具体的には、本願発明における関節リウマチ治療薬としては、ＭＴＸ、腫瘍壊死因子阻害薬（ＴＮＦｉ）としてインフリキシマブ（ＩＦＸ）、エタネルセプト（ＥＴＮ）、アダリムマブ（ＡＤＡ）、抗ＩＬ−６レセプター抗体製剤としてトシリズマブ（ＴＣＺ）等が含まれるが、これらに限られるものではない。【００４１】
本願発明の一実施形態においては、被験者における関節リウマチに関連する指標の数値を推定することができ、この方法は、前記被験者由来の末梢血中のＭＳ４Ａ４Ａ遺伝子の発現量を測定する工程と、前記測定した発現量を、予め用意された前記指標に相関する遺伝子発現プロファイルを用いて解析する工程と、前記解析した結果に基づき、前記被験者における前記指標の数値を推定する工程とを有し、前記解析する工程は、前記測定したＭＳ４Ａ４Ａ遺伝子の発現量を、関節リウマチ患者から得られた末梢血におけるＭＳ４Ａ４Ａ遺伝子発現量に基づいて作成される、ＭＳ４Ａ４Ａ遺伝子の発現量と前記指標との相関関係を示す遺伝子発現プロファイルと比較することによって行われるものである。【００４２】
本願発明における一実施形態において、関節リウマチに関連する指標の数値の推定は、被験者のＭＳ４Ａ４Ａ遺伝子の発現量と、関節リウマチ罹患者および健常者、並びに種々の関節リウマチ治療薬の投薬の有無を含む、各種疾患・健康状態におけるサンプル群におけるＭＳ４Ａ４Ａ遺伝子の発現量から予め用意された遺伝子発現プロファイルとを比較解析することによって行うことができる。或いは、関節リウマチに関連する指標の数値の推定は、同一被験者（健常者および関節リウマチ罹患者含む）の関節リウマチ治療薬の投薬前における遺伝子発現量プロファイルと関節リウマチ治療薬の投薬後における遺伝子発現プロファイルとを比較解析することにより、当該被験者の関節リウマチに関連する指標の数値を推定するものであってもよい。この場合、上記各種疾患・健康状態におけるサンプル群は、性別、年齢、治療薬の種類、治療薬投与後の時間等の要素によって分類してサンプリングしたものであっても良い。なお、予め用意された遺伝子発現プロファイルは、蓄積サンプル数が多ければ多いほど好ましく、本発明に係る同定方法の精度も高くなる。また、本願発明においては、このような蓄積サンプルに係るデータや予め用意された遺伝子発現プロファイルを、任意のデータベースに格納できる構成を取り得る。すなわち、本願発明は、このようなデータを格納するデータベースと、当該データ及び比較解析に必要なプログラム等を読み出して実行する解析装置をも提供することができる。このような解析装置によれば、当該データベースから蓄積データを取り出し、測定された被験者のデータと比較するだけで、被験者における関節リウマチに関連する指標の値をいつでも簡便に推定することができる。【００４３】
なお、本実施形態において、被験者における関節リウマチに関連する指標の数値の推定・解析は、測定したＭＳ４Ａ４Ａ遺伝子発現量を、各種疾患・健康状態におけるＭＳ４Ａ４Ａ遺伝子発現量に基づいて作成される遺伝子発現プロファイルと比較することによって行うことができるが、治療薬の投与後としての期間は、関節リウマチ疾患の状態を評価する上で臨床的に意義のある任意の期間を設定可能である。【００４４】
また、本実施形態において、上述の遺伝子発現プロファイルは、ＭＳ４Ａ４Ａ遺伝子発現量と特定の関節リウマチに関連する指標値との間で正の相関関係を示すものであることが好ましい。したがって、例えば、被験者由来の血液中のＭＳ４Ａ４Ａ遺伝子の発現量が基準発現量よりも高い場合には、当該指標は基準値よりも高い病勢活動度を示す。【００４５】
ここで、本願発明における一実施形態において、遺伝子発現プロファイルの作成・生成や、データの解析手法としてはクラスタ解析や各種アルゴリズム等の分子生物学又はバイオインフォマティクス等の分野で用いられる任意の解析手段を用いることができる。【００４６】
本願発明における一実施形態において、上記したようなＭＳ４Ａ４Ａ遺伝子は、関節リウマチ患者または被験者における関節リウマチに関連する指標の数値を推定するためのバイオマーカーとして用いることもできる。ＭＳ４Ａ４Ａは、ＣＤ２０−ｌｉｋｅ１とも呼ばれ、ＣＤ２０（ＭＳ４Ａ１）およびＦｃｅＲＩｂ（ＭＳ４Ａ２）を含む４回膜貫通型タンパク質のＭＳ４Ａファミリーに属する。１８のファミリータンパク質が同定されており、いずれにおいても２０〜３２％程度の相同性がみられる。【００４７】
（実験手法）
以下に、本願発明の一実施形態に係る遺伝子マーカーの効果を証明するために使用した実験手法および物質並びにその定義を説明する。なお、本実施形態において、以下の実験手法を用いているが、これら以外の実験手法を用いても、同様の結果を得ることができる。【００４８】
（遺伝子の定量）
本実施形態において、遺伝子マーカーが遺伝子または遺伝子の転写物（ｍＲＮＡ）である場合、遺伝子の発現量の測定（定量）は、例えば、マイクロアレイ法、ノーザンブロット法、ドットブロット法、定量的ＲＴ−ＰＣＲ（ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  ｒｅｖｅｒｓｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ−ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ、リアルタイムＲＴ-ＰＣＲ）法、次世代シーケンス法、デジタルＰＣＲ法等の種々の分子生物学的手法によってｍＲＮＡ量を測定することにより行うことができる。【００４９】
各種ＰＣＲ法に用いるプライマーとしては、遺伝子または遺伝子マーカーを特異的に検出することができるものであれば特に制限されるものではないが、１２〜２６塩基からなるオリゴヌクレオチドが好ましい。その塩基配列は、ヒトの各遺伝子の配列情報に基づいて決定する。そして、決定した配列を有するプライマーを、例えば、ＤＮＡ合成機を用いて作製することができる。【００５０】
一方、遺伝子マーカーが遺伝子の翻訳物（ポリペプチド）または最終産物（タンパク質）である場合、例えば、遺伝子マーカーに対して特異的なポリクローナル抗体、モノクローナル抗体等を用いたウエスタンブロット法やＥＬＩＳＡ法などによって遺伝子マーカーの発現量の測定を行うことができるが、これらの方法に限定されるものではなく、ＲＩＡ（ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ、放射免疫測定法）、ＥＩＡ（ｅｎｚｙｍｅ  ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ、酵素免疫法）等、様々な手法を用いることができる。【００５１】
「遺伝子」には、ＲＮＡやＤＮＡなどの塩基配列によって示される遺伝情報をいうものである。ヒト、マウス、ラットなどの生物種間で保存されるオーソログ遺伝子なども含まれる。遺伝子は、タンパク質をコードするものだけでなく、ＲＮＡやＤＮＡとして機能するものであってもよい。遺伝子は、その塩基配列にしたがうタンパク質をコードするのが一般的であるが、当該タンパク質と生物学的機能が同等であるタンパク質（たとえば同族体（ホモログやスプライスバリアントなど）や変異体や誘導体）をコードするものであってもよい。たとえば、遺伝情報による塩基配列によって示されるタンパク質とはわずかに塩基配列が異なるタンパク質であって、その塩基配列が遺伝子情報による塩基配列の相補配列とハイブリダイズするようなタンパク質をコードするような遺伝子であってもよい。【００５２】
「ＲＮＡ」とは、１本鎖ＲＮＡだけでなく、これに相補的な配列を有する１本鎖ＲＮＡやこれらから構成される２本差ＲＮＡを含む概念である。また、ｔｏｔａｌＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｒＲＮＡを含む概念である。【００５３】
「発現量」とは、遺伝子の発現量を直接的に測定した値だけでなく、所定の計算や統計学的手法によって変換された値も含む概念である。また、「遺伝子発現量」や「発現シグナル」、「遺伝子発現シグナル」、「発現シグナル値」、「遺伝子発現シグナル値」、「遺伝子発現データ」、「発現データ」等も個々の遺伝子の発現を反映する値を指すものとして同義である。【００５４】
「遺伝子発現」とは遺伝子の発現量により表現される生体の遺伝子発現の態様を指し、１個の遺伝子の発現量により表される場合及び複数の遺伝子の発現量により表される場合のいずれもが含まれる。また、「発現」も生体の遺伝子発現の態様を指すものとして同義である。
【実施例】
【００５５】
以下に、実施例を用いて、本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。【００５６】
（マーカー遺伝子の探索・選定方法）
以下に、本発明のマーカー遺伝子の探索・選定方法について説明する。【００５７】
本発明者らは、埼玉医科大学総合医療センター  リウマチ・膠原病内科および慶應義塾大学病院  リウマチ・膠原病内科を受診した関節リウマチ患者のうち、研究参加について文書により説明し同意を得た６１１名の血液検体のマイクロアレイデータから、新規関節リウマチ活動性マーカーの抽出を試みた。【００５８】
対象被験者血液からのＲＮＡ抽出は、ＰＡＸｇｅｎｅ  Ｂｌｏｏｄ  ＲＮＡ  Ｓｙｓｔｅｍ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて行った。抽出ＲＮＡについて、ＮａｎｏＤｒｏｐ１０００（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）により収量を測定し、バイオアナライザー２１００（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）により分解が無いことを確認した。次に、ＲＮＡ２５０ｎｇからＡｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製Ｌｏｗ  ＲＮＡ  Ｉｎｐｕｔ  Ｌｉｎｅａｒ Ａｍｐ  Ｋｉｔ  ＰＬＵＳ，Ｏｎｅ−Ｃｏｌｏｒを用いて、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写反応によりｃＲＮＡを増幅、同時に蛍光標識（Ｃｙ３標識）した。続いて、Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製Ｗｈｏｌｅ  Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ  ４×４４ｋに対して、蛍光標識されたｃＲＮＡを６５℃にて１７時間ハイブリさせた。Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｗａｓｈ  Ｂｕｆｆｅｒにて洗浄後、Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｓｃａｎｎｅｒ（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）により蛍光画像を読み取り、さらに、Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製画像数値化ソフトＦｅａｔｕｒｅ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎを用いて蛍光画像における各スポットのシグナル強度の数値化を行った。【００５９】
数値化後のデータについて，Ｑｕａｎｔｉｌｅ  ｎｏｒｍａｌｉｚａｔｉｏｎによる正規化，およびＣｏｍｂａｔ法（Ｂｉｏｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ．  ２００７  Ｊａｎ；８（１）：１１８−２７．）による実験バッチ補正処理を行なった。プローブのノーマライズ値（Ｌｏｇ２スケール）と被験者のＤＡＳ２８−ＥＳＲとのスピアマン相関、ピアソン積率相関係数、無相関検定ｐ値を算出し、疾患活動性と相関する遺伝子抽出した。【００６０】
その結果、ＤＡＳ２８−ＥＳＲと有意に相関するプローブとして，ＭＳ４Ａ４Ａ転写物を検出するプローブが抽出された。当該遺伝子は、関節リウマチの疾患活動性が上昇するに従い、末梢血における発現が亢進する（図１）。【００６１】
（ＰＣＲによるＭＳ４Ａ４Ａ遺伝子の解析）
続いて、関節リウマチ患者における末梢血ＭＳ４Ａ４Ａ遺伝子発現と関節リウマチ活動性の相関の再現性を確認するため、リアルタイムＰＣＲを用いて解析した。
関節リウマチ患者末梢血４８例について、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製Ｐｏｗｅｒ  ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  ＲＮＡ−ｔｏ−ＣＴ  １−Ｓｔｅｐ  Ｋｉｔを用いてリアルタイムＰＣＲ反応を行なった。実験には２０ｎｇ  ＲＮＡを用いた。補正は、比較定量法による差分−ΔＣｔ値（ＭＳ４Ａ４Ａ転写産物−内部標準遺伝子）を用いた。【００６２】
図２は、リアルタイムＰＣＲデータを用いたＭＳ４Ａ４Ａ  −ΔＣｔ値（コントロールとの差分）とＤＡＳ２８−ＥＳＲとの相関を示す散布図である。また、ＭＳ４Ａ４Ａと種々の臨床検査項目の相関解析結果を表１に示す。【００６３】
【表１】
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【００６４】
この結果から、ＭＳ４Ａ４Ａ  遺伝子発現量とＤＡＳコンポートネントであるＥＳＲ、また関節リウマチの疾患活動性指標であるＳＤＡＩ、ＣＤＡＩ、リウマチ因子定量値と有意な正相関が認められた。このことから、末梢血ＭＳ４Ａ４Ａ遺伝子発現量を測定することにより、関節リウマチの活動性を客観的に、かつ総合的に捉えることができるものと考えられた。また以上の結果により、関節リウマチ患者における末梢血ＭＳ４Ａ４Ａ遺伝子発現と関節リウマチ活動性との相関はマイクロアレイ解析のみならず、リアルタイムＰＣＲにおいても再現することが明らかとなった。【００６５】
（健常者および他疾患との比較）
続いて、健常者と関節リウマチ患者における末梢血ＭＳ４Ａ４Ａ遺伝子発現の差についてリアルタイムＰＣＲを用いて解析した。ＭＳ４Ａ４Ａの関節リウマチ患者、健常者、並びにその他の疾患として血管炎、成人スチル病、及び全身性エリテマトーデス患者における発現量を比較し、ＭＳ４Ａ４Ａの関節リウマチ診断マーカーとしての可能性を検証した。【００６６】
関節リウマチ患者サンプル（ＲＡ）としては、４８例を解析に用いた。健常者サンプルとしては、健診目的で受診した健常者のうち、末梢血遺伝子発現解析研究に参加することについて文書により説明し同意を得た６３名の末梢血サンプル（ＨＣ）を解析に用いた。さらに疾患コントロールサンプルとして、末梢血遺伝子発現解析研究に参加することについて文書により説明し同意を得た血管炎患者（Ｖａｓｃｕｌｉｔｉｓ）１４名、成人スチル病患者（ＡｏＳＤ）３名、及び全身性エリテマトーデス患者（ＳＬＥ）１０名の末梢血サンプルを解析に用いた。各サンプル群のＭＳ４Ａ４Ａの−ΔＣｔ値（コントロールとの差分）の分布を図３に示す。【００６７】
Ｓｔｕｄｅｎｔ  Ｔ検定の結果、関節リウマチ患者と健常者、血管炎患者、成人スチル病患者の間に有意差（ｐ<０．０５または０．０１）が認められた。これらの結果は、ＭＳ４Ａ４Ａが、関節リウマチの活動性の評価マーカーとなるだけでなく、健常者、炎症性疾患を含むその他の疾患とも区別し得る関節リウマチの診断マーカーとなる可能性を示唆するものである。【００６８】
（関節リウマチ治療薬投与によるＭＳ４Ａ４Ａ遺伝子発現の変動）
同一関節リウマチ患者について、関節リウマチ治療薬の投与後早期（〜４週）にＭＳ４Ａ４Ａがどのように発現変動するか、また、その変動の仕方とその後の治療効果との関連を検証した。【００６９】
図４は、関節リウマチ患者２５例について、ＴＣＺ投与前（０ｗ）および投与４週（４ｗ）のＭＳ４Ａ４Ａ遺伝子発現量を測定し、その差分と投与１２週（１２ｗ）から５４週（５４ｗ）の治療効果（活動性指標：ＣＤＡＩ）との関連を確認したものである。０ｗから４ｗへのＭＳ４Ａ４Ａ遺伝子発現量の低下が大きい群では、低下が小さい群に比べ、投与後１２ｗから５４ｗのＣＤＡＩ値が有意に低く、ＴＣＺの治療反応性が良好であった。一方、０ｗと４ｗのＣＤＡＩ値の差分に関しては、そのような傾向は認められなかった。【００７０】
図５は、同じＴＣＺ投与２５例について、ＣＤＡＩでなく、他の活動性指標であるＤＡＳ２８−ＣＲＰ、ＤＡＳ２８−ＥＳＲ、ＡＣＲ、ＥＵＬＡＲ−ＣＲＰ、ＥＵＬＡＲ−ＥＳＲについて評価を行なったものである。いずれの活動性指標についてもＣＤＡＩと同様の傾向が認められ、ＭＳ４Ａ４Ａ遺伝子発現量の０ｗから４ｗの低下が大きい群については、１２ｗから５４ｗの治療反応性が良好であった。以上の結果により、ＴＣＺ投与後早期のＭＳ４Ａ４Ａ遺伝子発現量の変化により、ＴＣＺ投与１２ｗ以降の治療反応性が予測できることが明らかとなった。【００７１】
図６および７は、ＭＴＸおよびＴＮＦｉによる治療を受けた関節リウマチ患者について、評価を行なったものである。ＭＳ４Ａ４Ａ遺伝子発現量について、０ｗから４ｗ（ＴＮＦｉは２ｗ）の低下が大きい患者（ＭＴＸ５例、ＴＮＦｉ１５例）と低下しない患者（ＭＴＸ５例、ＴＮＦｉ１５例）の治療効果を追跡したところ、前者でより治療成績がよい傾向が認められた。【００７２】
以上の結果より、末梢血ＭＳ４Ａ４Ａ遺伝子発現量が関節リウマチ患者に対する関節リウマチ治療薬の将来における効果を反映するマーカーであることが示された。【００７３】
その他、本発明は、さまざまに変形可能であることは言うまでもなく、上述した一実施形態に限定されず、発明の要旨を変更しない範囲で種々変形可能である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【国際調査報告】
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