(57)【要約】本発明は、歯周病の原因菌の遺伝子型を酵素活性に基づいて簡便に判別することができる判別方法、蛍光測定装置および検査薬を提供するものである。判別方法は、歯周病の原因菌の遺伝子型を判別するものであり、歯周病の原因菌の菌体または菌体抽出物と、原因菌による酵素反応の基質が蛍光標識された試薬と、を含み、ｐＨ７．０以上ｐＨ８．５以下に調整して酵素反応させた液体試料に励起光を照射し、液体試料から放出された蛍光の強度に基づいて遺伝子型を判別する。蛍光測定装置は、液体試料に励起光を照射する照射手段と、液体試料から放出される蛍光を検出する検出手段と、検出された蛍光の強度に基づいて遺伝子型を判別する判別手段とを備える。検査薬は、歯周病の原因菌の遺伝子型を判別するものであり、原因菌による酵素反応の基質が蛍光標識された試薬と、試薬を溶解したｐＨ緩衝液とを含み、ｐＨ緩衝液は、ｐＨ７．０以上ｐＨ８．５以下である。
2021025043.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
歯周病の原因菌の遺伝子型を判別する判別方法であって、
歯周病の原因菌の菌体または菌体抽出物と、前記原因菌による酵素反応の基質が蛍光標識された試薬と、を含み、ｐＨ７．０以上ｐＨ８．５以下に調整して酵素反応させた液体試料に励起光を照射し、
前記液体試料から放出された蛍光の強度に基づいて前記遺伝子型を判別する判別方法。
【請求項２】
請求項１に記載の判別方法であって、
前記原因菌は、ポルフィロモナス・ジンジバリスであり、
前記遺伝子型は、線毛タンパクをコードするｆｉｍＡ遺伝子の多型である判別方法。
【請求項３】
請求項２に記載の判別方法であって、
前記液体試料は、
遺伝子型が未知である前記原因菌の菌体または菌体抽出物を含む試験区の液体試料と、
遺伝子型が既知である前記原因菌の菌体または菌体抽出物を含み、前記試験区の液体試料と同じｐＨに調整されている対照区の液体試料と、であり、
前記遺伝子型の判別において、前記試験区について測定された蛍光強度値または蛍光強度の時間的変化量と、前記対照区について測定された蛍光強度値または蛍光強度の時間的変化量とが、互いに同一であるか、または、近似しているとき、前記試験区中の当該液体試料の前記原因菌のｆｉｍＡ遺伝子が、遺伝子型が既知である前記原因菌のｆｉｍＡ遺伝子と同じ遺伝子型であると判定する判別方法。
【請求項４】
請求項２に記載の判別方法であって、
前記液体試料は、
遺伝子型が未知である前記原因菌の菌体を含む判別対象の液体試料と、
遺伝子型が既知である前記原因菌の菌体または遺伝子型が未知である前記原因菌の菌体を含み、前記判別対象の液体試料と同じｐＨに調整されている複数の液体試料と、であり、
前記遺伝子型の判別において、前記判別対象の液体試料について測定された蛍光強度値または蛍光強度の時間的変化量が、前記複数の液体試料について測定された蛍光強度値または蛍光強度の時間的変化量の測定値群のうち、上位一番目の測定値群に分類されるとき、当該液体試料の前記原因菌のｆｉｍＡ遺伝子がＩＩ型であると判定する判別方法。
【請求項５】
請求項２に記載の判別方法であって、
前記液体試料は、
遺伝子型が未知である前記原因菌の菌体を含む判別対象の液体試料と、
遺伝子型が既知である前記原因菌の菌体または遺伝子型が未知である前記原因菌の菌体を含み、前記判別対象の液体試料と同じｐＨに調整されている複数の液体試料と、であり、
前記遺伝子型の判別において、前記判別対象の液体試料について測定された蛍光強度値または蛍光強度の時間的変化量が、前記複数の液体試料について測定された蛍光強度値または蛍光強度の時間的変化量の測定値群のうち、上位二番目の測定値群に分類されるとき、当該液体試料の前記原因菌のｆｉｍＡ遺伝子がＩＶ型であると判定する判別方法。
【請求項６】
請求項２に記載の判別方法であって、
前記液体試料は、
遺伝子型が未知である前記原因菌の菌体を含む判別対象の液体試料と、
遺伝子型が既知である前記原因菌の菌体または遺伝子型が未知である前記原因菌の菌体を含み、前記判別対象の液体試料と同じｐＨに調整されている複数の液体試料と、であり、
前記遺伝子型の判別において、前記判別対象の液体試料について測定された蛍光強度値または蛍光強度の時間的変化量が、前記複数の液体試料について測定された蛍光強度値または蛍光強度の時間的変化量の測定値群のうち、下位一番目の測定値群に分類されるとき、当該液体試料の前記原因菌のｆｉｍＡ遺伝子がＩ型であると判定する判別方法。
【請求項７】
請求項２に記載の判別方法であって、
前記液体試料は、
遺伝子型が未知である前記原因菌の菌体抽出物を含む判別対象の液体試料と、
遺伝子型が既知である前記原因菌の菌体抽出物または遺伝子型が未知である前記原因菌の菌体抽出物を含み、前記判別対象の液体試料と同じｐＨに調整されている複数の液体試料と、であり、
前記遺伝子型の判別において、前記判別対象の液体試料について測定された蛍光強度値または蛍光強度の時間的変化量が、前記複数の液体試料について測定された蛍光強度値または蛍光強度の時間的変化量の測定値群のうち、上位一番目の測定値群に分類されるとき、当該液体試料の前記原因菌のｆｉｍＡ遺伝子がＩ型であると判定する判別方法。
【請求項８】
請求項２に記載の判別方法であって、
前記液体試料は、
遺伝子型が未知である前記原因菌の菌体抽出物を含む判別対象の液体試料と、
遺伝子型が既知である前記原因菌の菌体抽出物または遺伝子型が未知である前記原因菌の菌体抽出物を含み、前記判別対象の液体試料と同じｐＨに調整されている複数の液体試料と、であり、
前記遺伝子型の判別において、前記判別対象の液体試料について測定された蛍光強度値または蛍光強度の時間的変化量が、前記複数の液体試料について測定された蛍光強度値または蛍光強度の時間的変化量の測定値群のうち、上位二番目の測定値群に分類されるとき、当該液体試料の前記原因菌のｆｉｍＡ遺伝子がＩＶ型であると判定する判別方法。
【請求項９】
請求項２に記載の判別方法であって、
前記液体試料は、
遺伝子型が未知である前記原因菌の菌体抽出物を含む判別対象の液体試料と、
遺伝子型が既知である前記原因菌の菌体抽出物または遺伝子型が未知である前記原因菌の菌体抽出物を含み、前記判別対象の液体試料と同じｐＨに調整されている複数の液体試料と、であり、
前記遺伝子型の判別において、前記判別対象の液体試料について測定された蛍光強度値または蛍光強度の時間的変化量が、前記複数の液体試料について測定された蛍光強度値または蛍光強度の時間的変化量の測定値群のうち、下位一番目の測定値群に分類されるとき、当該液体試料の前記原因菌のｆｉｍＡ遺伝子がＩＩ型であると判定する判別方法。
【請求項１０】
請求項１から請求項９のいずれか一項に記載の判別方法であって、
前記試薬は、イソブチルオキシカルボニル−グリシル−グリシル−Ｌ−アルギニル−４−メチルクマリル−７−アミド（ｉＢｏｃ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−ＭＣＡ）である判別方法。
【請求項１１】
請求項１から請求項９のいずれか一項に記載の判別方法であって、
前記励起光の波長は、３５５ｎｍ以上３７５ｎｍ以下である判別方法。
【請求項１２】
請求項１から請求項９のいずれか一項に記載の判別方法であって、
前記蛍光の波長は、４３０ｎｍ以上４５５ｎｍ以下である判別方法。
【請求項１３】
請求項１から請求項９のいずれか一項に記載の判別方法であって、
前記液体試料は、ｐＨ緩衝液であり、
前記ｐＨ緩衝液は、トリスヒドロキシメチルアミノメタン（Ｔｒｉｓ）を主成分とする判別方法。
【請求項１４】
請求項１から請求項９のいずれか一項に記載の判別方法であって、
前記液体試料の温度は、４℃以上４５℃以下である判別方法。
【請求項１５】
歯周病の原因菌の遺伝子型を判別する蛍光測定装置であって、
歯周病の原因菌の菌体または菌体抽出物と、前記原因菌による酵素反応の基質が蛍光標識された試薬と、を含み、ｐＨ７．０以上ｐＨ８．５以下に調整して酵素反応させた液体試料に励起光を照射する照射手段と、
前記液体試料から放出される蛍光を検出する検出手段と、
検出された蛍光の強度に基づいて前記遺伝子型を判別する判別手段と、を備える蛍光測定装置。
【請求項１６】
請求項１５に記載の蛍光測定装置であって、
前記原因菌は、ポルフィロモナス・ジンジバリスであり、
前記遺伝子型は、線毛タンパクをコードするｆｉｍＡ遺伝子の多型である蛍光測定装置。
【請求項１７】
請求項１６に記載の蛍光測定装置であって、
前記液体試料は、
遺伝子型が未知である前記原因菌の菌体または菌体抽出物を含む試験区の液体試料と、
遺伝子型が既知である前記原因菌の菌体または菌体抽出物を含み、前記試験区の液体試料と同じｐＨに調整されている対照区の液体試料と、であり、
前記判別手段は、
前記対照区について測定された蛍光強度値または蛍光強度の時間的変化量を記憶した記憶部と、
前記試験区について測定された蛍光強度値または蛍光強度の時間的変化量と、前記対照区について測定された蛍光強度値または蛍光強度の時間的変化量とが、互いに同一であるか、または、近似しているとき、前記試験区中の当該液体試料の前記原因菌のｆｉｍＡ遺伝子が、遺伝子型が既知である前記原因菌のｆｉｍＡ遺伝子と同じ遺伝子型であると判定するデータ比較部と、を備える蛍光測定装置。
【請求項１８】
請求項１６に記載の蛍光測定装置であって、
前記液体試料は、
遺伝子型が未知である前記原因菌の菌体を含む判別対象の液体試料と、
遺伝子型が既知である前記原因菌の菌体を含み、前記判別対象の液体試料と同じｐＨに調整されている複数の液体試料と、であり、
前記判別手段は、
第１閾値を記憶した記憶部と、
前記判別対象の液体試料について測定された蛍光強度値または蛍光強度の時間的変化量と、予め設定された第１閾値とを比較し、前記判別対象の液体試料について測定された蛍光強度値または蛍光強度の時間的変化量が、前記第１閾値以下であるとき、当該液体試料の前記原因菌のｆｉｍＡ遺伝子がＩ型であると判定するデータ比較部と、を備え、
前記第１閾値は、ｆｉｍＡ遺伝子の遺伝子型がＩ型である前記原因菌の菌体を含む前記液体試料について測定された蛍光強度値または蛍光強度の時間的変化量、および、ｆｉｍＡ遺伝子の遺伝子型がＩＶ型である前記原因菌の菌体を含む前記液体試料について測定された蛍光強度値または蛍光強度の時間的変化量のうち、少なくとも一方に基づいて設定された値である蛍光測定装置。
【請求項１９】
請求項１６に記載の蛍光測定装置であって、
前記液体試料は、
遺伝子型が未知である前記原因菌の菌体を含む判別対象の液体試料と、
遺伝子型が既知である前記原因菌の菌体を含み、前記判別対象の液体試料と同じｐＨに調整されている複数の液体試料と、であり、
前記判別手段は、
第１閾値および第２閾値を記憶した記憶部と、
前記判別対象の液体試料について測定された蛍光強度値または蛍光強度の時間的変化量と、予め設定された第１閾値および第２閾値とを比較し、前記判別対象の液体試料について測定された蛍光強度値または蛍光強度の時間的変化量が、前記第１閾値を超え、前記第２閾値以下であるとき、当該液体試料の前記原因菌のｆｉｍＡ遺伝子がＩＶ型であると判定するデータ比較部と、を備え、
前記第１閾値は、ｆｉｍＡ遺伝子の遺伝子型がＩ型である前記原因菌の菌体を含む前記液体試料について測定された蛍光強度値または蛍光強度の時間的変化量、および、ｆｉｍＡ遺伝子の遺伝子型がＩＶ型である前記原因菌の菌体を含む前記液体試料について測定された蛍光強度値または蛍光強度の時間的変化量のうち、少なくとも一方に基づいて設定された値であり、
前記第２閾値は、ｆｉｍＡ遺伝子の遺伝子型がＩＶ型である前記原因菌の菌体を含む前記液体試料について測定された蛍光強度値または蛍光強度の時間的変化量、および、ｆｉｍＡ遺伝子の遺伝子型がＩＩ型である前記原因菌の菌体を含む前記液体試料について測定された蛍光強度値または蛍光強度の時間的変化量のうち、少なくとも一方に基づいて設定された値である蛍光測定装置。
【請求項２０】
請求項１６に記載の蛍光測定装置であって、
前記液体試料は、
遺伝子型が未知である前記原因菌の菌体を含む判別対象の液体試料と、
遺伝子型が既知である前記原因菌の菌体を含み、前記判別対象の液体試料と同じｐＨに調整されている複数の液体試料と、であり、
前記判別手段は、
第２閾値を記憶した記憶部と、
前記判別対象の液体試料について測定された蛍光強度値または蛍光強度の時間的変化量と、予め設定された第２閾値とを比較し、前記判別対象の液体試料について測定された蛍光強度値または蛍光強度の時間的変化量が、前記第２閾値を超えるとき、当該液体試料の前記原因菌のｆｉｍＡ遺伝子がＩＩ型であると判定するデータ比較部と、を備え、
前記第２閾値は、ｆｉｍＡ遺伝子の遺伝子型がＩＶ型である前記原因菌の菌体を含む前記液体試料について測定された蛍光強度値または蛍光強度の時間的変化量、および、ｆｉｍＡ遺伝子の遺伝子型がＩＩ型である前記原因菌の菌体を含む前記液体試料について測定された蛍光強度値または蛍光強度の時間的変化量のうち、少なくとも一方に基づいて設定された値である蛍光測定装置。
【請求項２１】
請求項１６に記載の蛍光測定装置であって、
前記液体試料は、
遺伝子型が未知である前記原因菌の菌体抽出物を含む判別対象の液体試料と、
遺伝子型が既知である前記原因菌の菌体菌体抽出物を含み、前記判別対象の液体試料と同じｐＨに調整されている複数の液体試料と、であり、
前記判別手段は、
第１閾値を記憶した記憶部と、
前記判別対象の液体試料について測定された蛍光強度値または蛍光強度の時間的変化量と、予め設定された第１閾値とを比較し、前記判別対象の液体試料について測定された蛍光強度値または蛍光強度の時間的変化量が、前記第１閾値以下であるとき、当該液体試料の前記原因菌のｆｉｍＡ遺伝子がＩＩ型であると判定するデータ比較部と、を備え、
前記第１閾値は、ｆｉｍＡ遺伝子の遺伝子型がＩＩ型である前記原因菌の菌体抽出物を含む前記液体試料について測定された蛍光強度値または蛍光強度の時間的変化量、および、ｆｉｍＡ遺伝子の遺伝子型がＩＶ型である前記原因菌の菌体抽出物を含む前記液体試料について測定された蛍光強度値または蛍光強度の時間的変化量のうち、少なくとも一方に基づいて設定された値である蛍光測定装置。
【請求項２２】
請求項１６に記載の蛍光測定装置であって、
前記液体試料は、
遺伝子型が未知である前記原因菌の菌体抽出物を含む判別対象の液体試料と、
遺伝子型が既知である前記原因菌の菌体抽出物を含み、前記判別対象の液体試料と同じｐＨに調整されている複数の液体試料と、であり、
前記判別手段は、
第１閾値および第２閾値を記憶した記憶部と、
前記判別対象の液体試料について測定された蛍光強度値または蛍光強度の時間的変化量と、予め設定された第１閾値および第２閾値とを比較し、前記判別対象の液体試料について測定された蛍光強度値または蛍光強度の時間的変化量が、前記第１閾値を超え、前記第２閾値以下であるとき、当該液体試料の前記原因菌のｆｉｍＡ遺伝子がＩＶ型であると判定するデータ比較部と、を備え、
前記第１閾値は、ｆｉｍＡ遺伝子の遺伝子型がＩＩ型である前記原因菌の菌体抽出物を含む前記液体試料について測定された蛍光強度値または蛍光強度の時間的変化量、および、ｆｉｍＡ遺伝子の遺伝子型がＩＶ型である前記原因菌の菌体抽出物を含む前記液体試料について測定された蛍光強度値または蛍光強度の時間的変化量のうち、少なくとも一方に基づいて設定された値であり、
前記第２閾値は、ｆｉｍＡ遺伝子の遺伝子型がＩＶ型である前記原因菌の菌体抽出物を含む前記液体試料について測定された蛍光強度値または蛍光強度の時間的変化量、および、ｆｉｍＡ遺伝子の遺伝子型がＩ型である前記原因菌の菌体抽出物を含む前記液体試料について測定された蛍光強度値または蛍光強度の時間的変化量のうち、少なくとも一方に基づいて設定された値である蛍光測定装置。
【請求項２３】
請求項１６に記載の蛍光測定装置であって、
前記液体試料は、
遺伝子型が未知である前記原因菌の菌体抽出物を含む判別対象の液体試料と、
遺伝子型が既知である前記原因菌の菌体抽出物を含み、前記判別対象の液体試料と同じｐＨに調整されている複数の液体試料と、であり、
前記判別手段は、
第２閾値を記憶した記憶部と、
前記判別対象の液体試料について測定された蛍光強度値または蛍光強度の時間的変化量と、予め設定された第２閾値とを比較し、前記判別対象の液体試料について測定された蛍光強度値または蛍光強度の時間的変化量が、前記第２閾値を超えるとき、当該液体試料の前記原因菌のｆｉｍＡ遺伝子がＩ型であると判定するデータ比較部と、を備え、
前記第２閾値は、ｆｉｍＡ遺伝子の遺伝子型がＩＶ型である前記原因菌の菌体抽出物を含む前記液体試料について測定された蛍光強度値または蛍光強度の時間的変化量、および、ｆｉｍＡ遺伝子の遺伝子型がＩ型である前記原因菌の菌体抽出物を含む前記液体試料について測定された蛍光強度値または蛍光強度の時間的変化量のうち、少なくとも一方に基づいて設定された値である蛍光測定装置。
【請求項２４】
請求項１５から請求項２３のいずれか一項に記載の蛍光測定装置であって、
前記遺伝子型の判別の結果を表示する表示手段を備える蛍光測定装置。
【請求項２５】
請求項１５から請求項２３のいずれか一項に記載の蛍光測定装置であって、
前記液体試料のｐＨを測定するｐＨ測定手段を備える蛍光測定装置。
【請求項２６】
請求項１５から請求項２３のいずれか一項に記載の蛍光測定装置であって、
前記液体試料の温度を調節する温度制御手段を備える蛍光測定装置。
【請求項２７】
請求項１５から請求項２３のいずれか一項に記載の蛍光測定装置であって、
前記試薬は、イソブチルオキシカルボニル−グリシル−グリシル−Ｌ−アルギニル−４−メチルクマリル−７−アミド（ｉＢｏｃ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−ＭＣＡ）である蛍光測定装置。
【請求項２８】
請求項１５から請求項２３のいずれか一項に記載の蛍光測定装置であって、
前記励起光の波長は、３５５ｎｍ以上３７５ｎｍ以下である蛍光測定装置。
【請求項２９】
請求項１５から請求項２３のいずれか一項に記載の蛍光測定装置であって、
前記蛍光の波長は、４３０ｎｍ以上４５５ｎｍ以下である蛍光測定装置。
【請求項３０】
請求項１５から請求項２３のいずれか一項に記載の蛍光測定装置であって、
前記液体試料は、ｐＨ緩衝液であり、
前記ｐＨ緩衝液は、トリスヒドロキシメチルアミノメタン（Ｔｒｉｓ）を主成分とする蛍光測定装置。
【請求項３１】
請求項１５から請求項２３のいずれか一項に記載の蛍光測定装置であって、
前記液体試料の温度は、４℃以上４５℃以下である蛍光測定装置。
【請求項３２】
歯周病の原因菌の遺伝子型を判別する検査薬であって、
前記原因菌による酵素反応の基質が蛍光標識された試薬と、前記試薬を溶解したｐＨ緩衝液と、を含み、
前記ｐＨ緩衝液は、ｐＨ７．０以上ｐＨ８．５以下である検査薬。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、歯周病の原因菌の遺伝子型を判別する判別方法、蛍光測定装置および検査薬に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒトの口腔内には、数百種類の口腔内細菌が存在している。これらの口腔内細菌のうち、ポルフィロモナス・ジンジバリス（Porphyromonas gingivalis）、トレポネマ・デンティコラ（Treponema denticola）、タネレラ・フォーサイシア（Tannerella forsythia）の３種は、歯周病との関連性が高いレッドコンプレックス（Red complex）として分類されている。【０００３】
歯周病は、口腔内細菌によって引き起こされる炎症性疾患であり、歯周組織への影響だけでなく、心筋梗塞、糖尿病等の他、動脈硬化等の全身性疾患との関連も指摘されている。従来、歯周病の診断には、プローブを用いて歯周ポケットの深さや出血の有無を調べるプロービング検査や、歯槽骨等を観察するためのＸ線検査等が用いられている。また、特許文献１、２に記載されるように、原因菌の存在を検査するための体外診断用の検査薬も開発されている。【０００４】
細菌学や臨床の分野では、レッドコンプレックスに分類される３種の細菌のうち、歯周病の重症化、すなわち歯槽骨吸収の進行に重大な影響を与えているのは、ポルフィロモナス・ジンジバリス（Ｐｇ菌）であると考えられている。Ｐｇ菌は、菌体の表面に線毛を有しており、線毛等の菌体表面の成分が口腔内への付着・定着に大きく関わっていることが知られている。【０００５】
Ｐｇ菌の線毛タンパクをコードする遺伝子としては、線毛タンパクのサブユニットをコードするｆｉｍＡ遺伝子がある。ｆｉｍＡ遺伝子は、遺伝子多型を示すことが確認されており、Ｉ〜Ｖ型（１〜５型）の５種類に分類されている。従来、Ｐｇ菌の口腔内への付着能・定着能や病原性が、ｆｉｍＡ遺伝子の遺伝子型毎に異なる可能性が報告されている。【０００６】
例えば、非特許文献１には、健康な歯周組織を持つ成人は、ｆｉｍＡ遺伝子のＩ型の保有率が約７０％、Ｖ型の保有率が約３０％、その他が１０％程度未満であった一方、成人の歯周炎患者は、ＩＩ型（２型）の保有率が約６０％弱、ＩＶ型（４型）の保有率が約２０％弱、その他が１０％程度未満であったと報告されている。進行した歯周炎患者から検出されたＰｇ菌は９０％以上がＩＩ型であったと報告されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】特開２０１０−１３０９２４号公報
【特許文献２】特表２００７−５１９９２３号公報
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】天野  敦雄、「Porphyromonas gingivalis線毛の付着能と遺伝子多型の歯周病原性との関連」、日本歯周病学会会誌、２００３年、４５巻、４号、ｐ．３５７−３６３
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
歯周病の原因菌の遺伝子型は、Ｐｇ菌のｆｉｍＡ遺伝子のように、歯周病の病態に対して互いに異なる影響を及ぼす可能性が示唆されている。よって、歯周病の診断・治療・予防に際して、患者の口腔細菌叢を構成する遺伝子型を判別できれば、歯周病の病態を適切に評価したり、重症化の可能性を予測したりすることが可能になる可能性がある。【００１０】
従来、遺伝子型を判別する方法としては、ＲＴ−ＰＣＲ等を利用する分子生物学的手法が用いられている。しかし、分子生物学的手法は、操作に手間がかかり、簡便に行うことが困難である。また、分子生物学的手法は、遺伝子のコピー数ないし細胞数を間接的に計測することができる一方で、歯周病を実際に進行させる酵素活性を計測するものではない。【００１１】
レッドコンプレックスに分類されるＰｇ菌は、プロテアーゼの一種であるジンジパイン等を産生し、これらの酵素が、ディスバイオシスのような細菌叢の攪乱を起こしたり、炎症反応を促進したりして、歯周病が進行すると考えられている。そのため、従来の分子生物学的手法と比較して、簡便に行うことが可能であり、より歯周病の病態に即した、直接的な指標に基づく遺伝子型の判別手段が求められている。【００１２】
そこで、本発明は、歯周病の原因菌の遺伝子型を酵素活性に基づいて簡便に判別することができる判別方法、蛍光測定装置および検査薬を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
前記課題を解決するために本発明に係る判別方法は、歯周病の原因菌の遺伝子型を判別する判別方法であって、歯周病の原因菌と、前記原因菌による酵素反応の基質が蛍光標識された試薬と、を含み、ｐＨ７．０以上ｐＨ８．５以下に調整して酵素反応させた液体試料に励起光を照射し、前記液体試料から放出された蛍光の強度に基づいて前記遺伝子型を判別する。【００１４】
また、本発明に係る蛍光測定装置は、歯周病の原因菌の遺伝子型を判別する蛍光測定装置であって、歯周病の原因菌と、前記原因菌による酵素反応の基質が蛍光標識された試薬と、を含み、ｐＨ７．０以上ｐＨ８．５以下に調整して酵素反応させた液体試料に励起光を照射する照射手段と、前記液体試料から放出される蛍光を検出する検出手段と、検出された蛍光の強度に基づいて前記遺伝子型を判別する判別手段と、を備える。【００１５】
また、本発明に係る検査薬は、歯周病の原因菌の遺伝子型を判別する検査薬であって、前記原因菌による酵素反応の基質が蛍光標識された試薬と、前記試薬を溶解したｐＨ緩衝液と、を含み、前記ｐＨ緩衝液は、ｐＨ７．０以上ｐＨ８．５以下である。
【発明の効果】
【００１６】
本発明によると、歯周病の原因菌の遺伝子型を酵素活性に基づいて簡便に判別することができる判別方法、蛍光測定装置および検査薬を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】本発明の実施形態に係る判別方法の流れを示すフロー図である。
【図２Ａ】菌体を酵素反応させた液体試料（ｐＨ７．０）の蛍光測定結果を示す図である。
【図２Ｂ】菌体を酵素反応させた液体試料（ｐＨ７．５）の蛍光測定結果を示す図である。
【図２Ｃ】菌体を酵素反応させた液体試料（ｐＨ８．０）の蛍光測定結果を示す図である。
【図２Ｄ】菌体を酵素反応させた液体試料（ｐＨ８．５）の蛍光測定結果を示す図である。
【図２Ｅ】ジンジパインと性質が類似した酵素を温度を変えて酵素反応させた液体試料の蛍光測定結果を示す図である。
【図３Ａ】菌体を酵素反応させた液体試料のｐＨ毎の蛍光測定結果を示す図である。
【図３Ｂ】菌体を酵素反応させた液体試料の菌株毎の蛍光測定結果を示す図である。
【図４Ａ】菌体抽出物を酵素反応させた液体試料（ｐＨ７．０）の蛍光測定結果を示す図である。
【図４Ｂ】菌体抽出物を酵素反応させた液体試料（ｐＨ７．５）の蛍光測定結果を示す図である。
【図４Ｃ】菌体抽出物を酵素反応させた液体試料（ｐＨ８．０）の蛍光測定結果を示す図である。
【図４Ｄ】菌体抽出物を酵素反応させた液体試料（ｐＨ８．５）の蛍光測定結果を示す図である。
【図５】菌体抽出物を酵素反応させた液体試料のｐＨ毎の蛍光測定結果を示す図である。
【図６Ａ】菌体を温度を変えて酵素反応させた液体試料（ｐＨ７．０）の蛍光測定結果を示す図である。
【図６Ｂ】菌体を温度を変えて酵素反応させた液体試料（ｐＨ７．５）の蛍光測定結果を示す図である。
【図６Ｃ】菌体を温度を変えて酵素反応させた液体試料（ｐＨ７．８）の蛍光測定結果を示す図である。
【図６Ｄ】菌体を温度を変えて酵素反応させた液体試料（ｐＨ８．０）の蛍光測定結果を示す図である。
【図６Ｅ】菌体を温度を変えて酵素反応させた液体試料（ｐＨ８．５）の蛍光測定結果を示す図である。
【図７Ａ】菌体抽出物を温度を変えて酵素反応させた液体試料（ｐＨ７．０）の蛍光測定結果を示す図である。
【図７Ｂ】菌体抽出物を温度を変えて酵素反応させた液体試料（ｐＨ７．５）の蛍光測定結果を示す図である。
【図７Ｃ】菌体抽出物を温度を変えて酵素反応させた液体試料（ｐＨ７．８）の蛍光測定結果を示す図である。
【図７Ｄ】菌体抽出物を温度を変えて酵素反応させた液体試料（ｐＨ８．０）の蛍光測定結果を示す図である。
【図７Ｅ】菌体抽出物を温度を変えて酵素反応させた液体試料（ｐＨ８．５）の蛍光測定結果を示す図である。
【図８】歯周病の原因菌の遺伝子型を菌体を用いて判別する原理について説明する図である。
【図９】歯周病の原因菌の遺伝子型を菌体抽出物を用いて判別する原理について説明する図である。
【図１０】本発明の実施形態に係る蛍光測定装置の構成を示す図である。
【図１１】蛍光測定装置が備える制御装置の概略構成を示す図である。
【図１２】蛍光測定装置による判別方法の流れを示すフロー図である。
【図１３】蛍光測定装置による遺伝子型を判別する処理の流れを示すフロー図である。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
＜判別方法・検査薬＞
はじめに、本発明の一実施形態に係る判別方法および検査薬について、図を参照しながら説明する。
【００１９】
本実施形態に係る判別方法は、歯周病の原因菌の遺伝子型を判別する方法である。この判別方法では、採取された試料中の歯周病の原因菌が、既知の遺伝子多型のうちで、いずれの遺伝子型に属するかを判別する。遺伝子型の判別は、各遺伝子型との相関関係が確認されている酵素活性に基づいて行う。酵素活性は、蛍光標識された酵素反応の基質を用いた検査薬を使用することにより、蛍光測定法によって評価される。
【００２０】
遺伝子型の判別対象とする歯周病の原因菌としては、ポルフィロモナス・ジンジバリス（Ｐｇ菌）が挙げられる。判別する遺伝子型としては、線毛タンパクをコードするｆｉｍＡ遺伝子の多型であるＩ型（１型）、ＩＩ型（２型）、ＩＩＩ型（３型）、ＩＶ型（４型）、Ｖ型（５型）が挙げられる。ｆｉｍＡ遺伝子の亜型であるＩｂ型は、Ｉ型に属するものとする。
【００２１】
本実施形態に係る判別方法では、蛍光標識された酵素反応の基質（蛍光標識基質）を含む液体状の検査薬に、遺伝子型が未知である歯周病の原因菌の菌体、または、その菌体抽出物（供試物）を加えて、蛍光測定用の液体試料を調製する。蛍光標識基質は、歯周病の原因菌が産生する分解酵素の基質であり、酵素反応によって蛍光発色団を解離する。解離した蛍光発色団は、励起光を照射すると蛍光を発するため、液体試料から放出される蛍光の強度が酵素活性の指標となる。
【００２２】
供試物の酵素活性と遺伝子型とに相関関係がある場合、蛍光測定によって求められる酵素活性に基づいて、供試物をいずれかの遺伝子型に分類することができる。遺伝子型毎の酵素活性の違いが明確になるような条件で酵素反応させると、液体試料から放出される蛍光の強度差が大きくなるため、供試物の遺伝子型を明確に判別することができる。
【００２３】
遺伝子型を判別するために蛍光測定用の液体試料の調製に供する供試物は、遺伝子型が未知である歯周病の原因菌の菌体、または、その菌体抽出物である。供試物としては、例えば、被験者の口腔から採取した歯垢、歯肉浸出液等を、そのまま、ないし、懸濁液や懸濁液の上清として用いることができる。一般に、ヒト等の口腔細菌叢中において、歯周病の原因菌は、いずれかの遺伝子型が優勢な状態で存在している。そのため、ある被験者から採取した供試菌は、優勢な状態にあるいずれかの遺伝子型に分類することができる。
【００２４】
蛍光測定用の液体試料は、蛍光標識基質を含む液体状の検査薬に、歯垢、歯肉浸出液等に含まれる菌体を加えて調製してもよいし、菌体から抽出された菌体抽出物を加えて調製してもよい。なお、菌体抽出物には、蛍光標識基質と反応する分解酵素を含む限り、菌体を細胞破壊処理等して残渣から分離した抽出物、および、菌体が細胞外に分泌・産生した分泌物のいずれも含まれる。
【００２５】
図１は、本発明の実施形態に係る判別方法の流れを示すフロー図である。
図１に示すように、本実施形態に係る判別方法は、酵素反応工程Ｓ１０と、蛍光測定工程Ｓ２０と、遺伝子型判別工程Ｓ３０と、を含む。
【００２６】
酵素反応工程Ｓ１０では、蛍光標識基質（試薬）とｐＨ緩衝液とを含有する液体状の検査薬に、遺伝子型が未知である歯周病の原因菌の菌体、または、その菌体抽出物（供試物）を加えて酵素反応を開始させる。蛍光標識基質は、歯周病の原因菌による酵素反応の基質が蛍光発色団によって蛍光標識された物質である。供試物を加えて酵素反応を開始した液体状の検査薬が、蛍光測定法による測定対象の液体試料となる。
【００２７】
蛍光標識基質としては、ポリペプチドのＣ末端がＬ−アルギニン（Ａｒｇ）残基であり、Ａｒｇ残基のＣ末端に蛍光発色団が結合した物質が好ましく用いられる。このような蛍光標識基質によると、Ｐｇ菌が産生するプロテアーゼの一種であるジンジパインによって、Ａｒｇ残基のＣ末端が特異的に消化されるため、Ｐｇ菌の酵素活性を評価することができる。
【００２８】
蛍光標識基質は、歯周病の原因菌が産生するプロテアーゼによって認識される限り、適宜のアミノ酸配列を有していてよい。蛍光標識基質を構成するポリペプチドは、任意の個数のアミノ酸で構成されてもよいし、任意の種類のアミノ酸で構成されてもよい。但し、ポリペプチドの長さは、酵素反応や蛍光測定を安定させる観点等からは、３〜４ｍｅｒであることが好ましい。
【００２９】
蛍光標識基質は、ポリペプチドのＮ末端が保護基によって保護されていてもよい。保護基としては、イソブチルオキシカルボニル基（ｉＢｏｃ）、ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル基（Ｂｏｃ）、アセチル基（Ａｃ）、ベンゾイル基（Ｂｚ）、９−フルオレニルメトキシカルボニル基（Ｆｍｏｃ）等が挙げられる。
【００３０】
蛍光標識基質は、蛍光発色団としてアミノメチルクマリン（ＡＭＣ）を結合していることが好ましい。ＡＭＣによると、アミド結合した状態で蛍光を発さず、解離した状態のみで蛍光を発し、高輝度の蛍光が得られる。そのため、高感度な蛍光測定によって酵素活性を評価することができる。
【００３１】
蛍光標識基質としては、特に、保護基−グリシル−グリシル−Ｌ−アルギニル−４−メチルクマリル−７−アミド（Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−ＭＣＡ）が好ましく用いられる。このような蛍光標識基質によると、Ｐｇ菌が産生するジンジパインによって認識され易く、ＡＭＣによって計測に適した高輝度が得られる。そのため、Ｐｇ菌の酵素活性をより正確に評価することができる。
【００３２】
蛍光測定対象の液体試料は、トリスヒドロキシメチルアミノメタン（Ｔｒｉｓ）、ピペラジン−１，４−ビス（２−エタンスルホン酸）（ＰＩＰＥＳ）、および、２−［４−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジニル］エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）のいずれかを主成分とするｐＨ緩衝液であることが好ましい。このようなｐＨ緩衝液であると、Ｐｇ菌が産生するジンジパインに適したｐＨに維持することができるため、Ｐｇ菌の酵素活性を正確に評価することができる。
【００３３】
蛍光測定対象の液体試料は、特に、トリスヒドロキシメチルアミノメタン（Ｔｒｉｓ）を主成分とするｐＨ緩衝液であることが好ましい。Ｔｒｉｓを主成分とするｐＨ緩衝液の具体例としては、Ｔｒｉｓ−塩酸緩衝液、Ｔｒｉｓ−酢酸緩衝液、Ｔｒｉｓ−ホウ酸緩衝液、Ｔｒｉｓ−リン酸緩衝液等が挙げられる。Ｔｒｉｓを主成分とするｐＨ緩衝液によると、Ｐｇ菌の酵素活性をより正確に評価することができる。
【００３４】
蛍光測定工程Ｓ２０では、液体試料に励起光を照射し、液体試料から放出される蛍光の強度を測定する。液体試料は、遺伝子型が未知である歯周病の原因菌の菌体、または、その菌体抽出物（供試物）と、歯周病の原因菌による酵素反応の基質が蛍光標識された蛍光標識基質（試薬）と、を含む溶液である。蛍光標識基質は、歯周病の原因菌が産生した分解酵素による酵素反応で蛍光発色団を解離するため、所定の波長域の励起光を照射すると蛍光を発する。そのため、蛍光測定を行うと、供試菌の酵素活性および反応時間に応じた蛍光強度を検出することができる。
【００３５】
液体試料に照射する励起光の波長は、好ましくは３５０ｎｍ以上３８０ｎｍ以下、より好ましくは３５５ｎｍ以上３７５ｎｍ以下、更に好ましくは３６０ｎｍ以上３７０ｎｍ以下である。このような波長であると、蛍光標識基質を構成する蛍光発色団がＡＭＣである場合に、検出に適した蛍光強度が得られる。
【００３６】
蛍光強度を測定する蛍光の波長は、好ましくは４１０ｎｍ以上４７５ｎｍ以下、より好ましくは４２５ｎｍ以上４６５ｎｍ以下、更に好ましくは４３０ｎｍ以上４５５ｎｍ以下、特に好ましくは４３５ｎｍ以上４５０ｎｍ以下である。このような波長であると、蛍光標識基質を構成する蛍光発色団がＡＭＣである場合に、蛍光を高感度に検出することができる。
【００３７】
なお、液体試料についての蛍光の検出は、蛍光標識基質を含む液体状の検査薬に供試物を加えた後、蛍光標識基質が酵素反応によって完全に分解・解離する前に行うことが好ましい。また、液体試料についての蛍光の検出は、蛍光寿命によって蛍光が減衰する前に行うことが好ましい。
【００３８】
遺伝子型判別工程Ｓ３０では、励起光を照射した液体試料から放出される蛍光の強度に基づいて、遺伝子型が未知である歯周病の原因菌（供試菌）の遺伝子型を判別する。蛍光測定によって検出される蛍光強度値は、酵素反応の反応率、すなわち反応した基質の割合を間接的に表している。また、蛍光強度の時間的変化量は、酵素の反応速度を間接的に表している。そのため、歯周病の原因菌の酵素活性と遺伝子型とに相関関係がある場合、これらの蛍光強度についての指標値に基づいて遺伝子型を判別することができる。
【００３９】
ここで、歯周病の原因菌の遺伝子型を判別するための具体的な原理・方法について、図を参照しながら説明する。
【００４０】
図２は、菌体を酵素反応させた液体試料の蛍光測定結果を示す図である。図２Ａは、ｐＨ７．０で酵素反応させた結果である。図２Ｂは、ｐＨ７．５で酵素反応させた結果である。図２Ｃは、ｐＨ８．０で酵素反応させた結果である。図２Ｄは、ｐＨ８．５で酵素反応させた結果である。図２Ｅは、ジンジパインと性質が類似した酵素を温度を変えて酵素反応させた液体試料の蛍光測定結果を示す図である。
図２Ａ〜図２Ｄには、Ｐｇ菌の細胞懸濁液を遠心分離して沈殿物を採取し、この菌体を含む沈殿物を加えた液体試料を各ｐＨ条件に調整し、３７．５℃で酵素反応させた後に、蛍光測定装置を使用して蛍光強度を測定した結果を示している。図２Ｅには、ジンジパインと性質が類似しているトリプシンを加えた液体試料の温度を２３〜４５℃の範囲で変えたときの蛍光強度を測定した結果を示している。
【００４１】
図２Ａ〜図２Ｄの横軸は、酵素反応の開始時から起算される測定時間［分］、縦軸は、所定の単位の蛍光強度を示す。図中の太線は、ｆｉｍＡ遺伝子の遺伝子型がＩ型のＰｇ菌の結果であり、細線は、ＩＩ型のＰｇ菌の結果であり、破線は、ＩＶ型のＰｇ菌の結果である。図中の補線は、蛍光測定装置上の中継（切り替え）時期を示す。
【００４２】
蛍光標識基質としては、イソブチルオキシカルボニル−グリシル−グリシル−Ｌ−アルギニル−４−メチルクマリル−７−アミド（ｉＢｏｃ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−ＭＣＡ）を用いている。遺伝子型毎の液体試料のサンプル数は３である。
【００４３】
図２Ａ〜図２Ｄに示すように、ｆｉｍＡ遺伝子の遺伝子型毎に、蛍光強度が異なる結果が得られている。各測定時間あたりの蛍光強度値は、Ｉ型よりもＩＶ型が高く、ＩＶ型よりもＩＩ型が高い傾向を示している。特に、ｐＨ８．０やｐＨ８．５に調整した場合には、遺伝子型毎の蛍光強度値の差異が拡大している。歯周病の原因菌の遺伝子型毎に酵素活性が異なり、この酵素活性がｐＨに依存していることが分かる。
【００４４】
図２Ａ〜図２Ｄに示す結果によると、蛍光標識基質を含む液体試料に菌体を加える方法では、ｐＨ７．５を超えｐＨ８．５以下に調整した液体試料中で酵素反応させた場合、ＩＩ型やＩＶ型の蛍光強度が高くなり、遺伝子型の判別の精度が向上するといえる。
【００４５】
図２Ｅの横軸は、トリプシンを加えた液体試料の温度［℃］、縦軸は、蛍光強度の１分間あたりの時間変化量を示す。蛍光強度の時間変化量は、酵素反応の開始後に１０分経過した時点で蛍光測定を行い、その結果を１分間あたりの変化量に換算したものである。図中のプロットは、液体試料の温度が、２３℃、３０℃、３７℃、４５℃のそれぞれにおける平均値であり、エラーバーは、これらの最大値と最小値である。
【００４６】
蛍光標識基質としては、イソブチルオキシカルボニル−グリシル−グリシル−Ｌ−アルギニル−４−メチルクマリル−７−アミド（ｉＢｏｃ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−ＭＣＡ）を用いている。温度毎の液体試料のサンプル数は３である。
【００４７】
図２Ｅに示すように、ジンジパインと性質が類似しているトリプシンが温度依存性を示すことが確認できる。蛍光強度の時間変化量は、２３℃から３７℃まで増加を示している一方で、３７℃付近から４５℃まで急激な現象を示している。トリプシンを用いた結果によると、蛍光標識基質を分解する分解酵素は、至適温度が３７℃前後にあることが分かる。
【００４８】
図２Ｅに示す結果によると、ジンジパインと性質が類似しているトリプシンの性質からは、２５℃以上４０℃以下程度、特に３７±１℃程度に調温した液体試料中で酵素反応させた場合、酵素反応による蛍光強度の変化が大きくなり、遺伝子型の判別の精度が向上するといえる。
【００４９】
図３Ａは、菌体を酵素反応させた液体試料のｐＨ毎の蛍光測定結果を示す図である。
図３Ａには、ｆｉｍＡ遺伝子の遺伝子型がＩＩ型であるＰｇ菌の細胞懸濁液を遠心分離して沈殿物を採取し、この菌体を含む沈殿物を加えた液体試料を各ｐＨ条件に調整し、３７．５℃で酵素反応させた後に、蛍光測定装置を使用して蛍光強度を測定した結果を示している。
【００５０】
図中の横軸は、酵素反応の開始時から起算される測定時間［分］、縦軸は、所定の単位の蛍光強度を示す。図中の太破線は、ｐＨ７．０の結果であり、一点鎖線は、ｐＨ７．５の結果であり、中破線は、ｐＨ７．８の結果であり、細破線は、ｐＨ７．９の結果であり、太実線は、ｐＨ８．０の結果であり、細実線は、ｐＨ８．５の結果である。
【００５１】
蛍光標識基質としては、イソブチルオキシカルボニル−グリシル−グリシル−Ｌ−アルギニル−４−メチルクマリル−７−アミド（ｉＢｏｃ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−ＭＣＡ）を用いている。ｐＨ毎の液体試料のサンプル数は３である。
【００５２】
図３Ａに示すように、液体試料のｐＨに応じて、蛍光強度が異なる結果が得られている。各測定時間あたりの蛍光強度値や、初期の蛍光強度の時間変化量は、ｐＨ７．０と比較して、ｐＨ７．８〜８．５で高い傾向を示している。ｐＨ７．９やｐＨ８．０が特に高い蛍光強度値を示しており、ｐＨ８．０付近に極大値があることが分かる。
【００５３】
図３Ａに示す結果によると、蛍光標識基質を含む液体試料に菌体を加える方法では、ｐＨ７．８以上ｐＨ８．５以下、特にｐＨ７．８以上ｐＨ８．０以下程度に調整した液体試料中で酵素反応させた場合、蛍光強度が更に高くなり、遺伝子型の判別の精度がより向上するといえる。
【００５４】
図３Ｂは、菌体を酵素反応させた液体試料の菌株毎の蛍光測定結果を示す図である。
図３Ｂには、菌株の種類が異なる各Ｐｇ菌の細胞懸濁液を遠心分離して沈殿物を採取し、この菌体を含む沈殿物を加えた液体試料を所定のｐＨ条件に調整し、３７．５℃で酵素反応させた後に、蛍光測定装置を使用して蛍光強度を測定した結果を示している。
【００５５】
図中の横軸は、酵素反応の開始時から起算される測定時間［分］、縦軸は、所定の単位の蛍光強度を示す。図中の長破線は、ｆｉｍＡ遺伝子の遺伝子型がＩ型である３３２７７株の結果であり、一点鎖線は、ＩＩ型であるＴＤＣ６０株の結果であり、短破線は、ＩＶ型であるＷ８３株の結果であり、太実線は、ＩＩ型である２７５株の結果であり、細実線は、ＩＩ型である２６８株の結果である。２７５株および２６８株は、歯肉縁下の歯垢から単離された単離株である（Hiroyuki Asano et al., Journal of Periodontology, 2003, Vol. 74, 9, p.1355-1360参照）。
【００５６】
蛍光標識基質としては、イソブチルオキシカルボニル−グリシル−グリシル−Ｌ−アルギニル−４−メチルクマリル−７−アミド（ｉＢｏｃ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−ＭＣＡ）を用いている。菌株毎の液体試料のサンプル数は１である。
【００５７】
図３Ｂに示すように、ｆｉｍＡ遺伝子の遺伝子型に応じて、蛍光強度が異なる結果が得られている。しかし、ｆｉｍＡ遺伝子の遺伝子型がＩＩ型であるＴＤＣ６０株、２７５株および２６８株については、菌株の種類が異なるにもかかわらず、各測定時間あたりの蛍光強度値や蛍光強度の時間変化量が類似した傾向を示している。
【００５８】
図３Ｂに示す結果によると、Ｐｇ菌が産生する分解酵素の酵素活性は、歯周病の原因菌の遺伝子型毎に異なるものの、同一の遺伝子型である菌株同士の間では類似しているため、任意の菌株を用いた蛍光強度の結果に基づいて、遺伝子型の判別を行うことができるといえる。
【００５９】
図４は、菌体抽出物を酵素反応させた液体試料の蛍光測定結果を示す図である。図４Ａは、ｐＨ７．０で酵素反応させた結果である。図４Ｂは、ｐＨ７．５で酵素反応させた結果である。図４Ｃは、ｐＨ８．０で酵素反応させた結果である。図４Ｄは、ｐＨ８．５で酵素反応させた結果である。
図４Ａ〜図４Ｄには、Ｐｇ菌の細胞懸濁液を遠心分離して上清を採取し、この菌体抽出物である上清を加えた液体試料を各ｐＨ条件に調整し、３７．５℃で酵素反応させた後に、蛍光測定装置を使用して蛍光強度を測定した結果を示している。
【００６０】
図４Ａ〜図４Ｄの横軸は、酵素反応の開始時から起算される測定時間［分］、縦軸は、所定の単位の蛍光強度を示す。図中の太線は、ｆｉｍＡ遺伝子の遺伝子型がＩ型のＰｇ菌の結果であり、細線は、ＩＩ型のＰｇ菌の結果であり、破線は、ＩＶ型のＰｇ菌の結果である。
【００６１】
蛍光標識基質としては、イソブチルオキシカルボニル−グリシル−グリシル−Ｌ−アルギニル−４−メチルクマリル−７−アミド（ｉＢｏｃ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−ＭＣＡ）を用いている。遺伝子型毎の液体試料のサンプル数は３である。
【００６２】
図４Ａ〜図４Ｄに示すように、ｆｉｍＡ遺伝子の遺伝子型毎に、蛍光強度が異なる結果が得られている。各測定時間あたりの蛍光強度値は、ＩＩ型よりもＩＶ型が高く、ＩＶ型よりもＩ型が高い傾向を示している。蛍光強度の時間変化量も同様の傾向を示している。特に、ｐＨ８．０やｐＨ８．５に調整した場合には、遺伝子型毎の蛍光強度値の差異が拡大している。歯周病の原因菌の遺伝子型毎に酵素活性が異なり、この酵素活性がｐＨに依存していることが分かる。
【００６３】
図４Ａ〜図４Ｄに示す結果によると、蛍光標識基質を含む液体試料に菌体抽出物を加える方法では、ｐＨ７．５を超えｐＨ８．５以下に調整した液体試料中で酵素反応させた場合、Ｉ型の蛍光強度が高くなり、遺伝子型の判別の精度が向上するといえる。また、ｐＨ８．０付近に調整した液体試料中で酵素反応させた場合、Ｉ型やＩＶ型の蛍光強度が高くなり、遺伝子型の判別の精度が向上するといえる。
【００６４】
図５は、菌体抽出物を酵素反応させた液体試料のｐＨ毎の蛍光測定結果を示す図である。
図５には、ｆｉｍＡ遺伝子の遺伝子型がＩ型であるＰｇ菌の細胞懸濁液を遠心分離して上清を採取し、この菌体抽出物である上清を加えた液体試料を各ｐＨ条件に調整し、３７．５℃で酵素反応させた後に、蛍光測定装置を使用して蛍光強度を測定した結果を示している。
【００６５】
図中の横軸は、酵素反応の開始時から起算される測定時間［分］、縦軸は、所定の単位の蛍光強度を示す。図中の太破線は、ｐＨ７．０の結果であり、一点鎖線は、ｐＨ７．５の結果であり、破線は、ｐＨ７．８の結果であり、太実線は、ｐＨ８．０の結果であり、細実線は、ｐＨ８．５の結果である。
【００６６】
蛍光標識基質としては、イソブチルオキシカルボニル−グリシル−グリシル−Ｌ−アルギニル−４−メチルクマリル−７−アミド（ｉＢｏｃ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−ＭＣＡ）を用いている。ｐＨ毎の液体試料のサンプル数は３である。
【００６７】
図５に示すように、液体試料のｐＨに応じて、蛍光強度が異なる結果が得られている。各測定時間あたりの蛍光強度値や、蛍光強度の時間変化量は、ｐＨ７．０と比較して、ｐＨ８．０〜８．５で高い傾向を示している。ｐＨ８．０が特に大きい時間変化量を示しており、ｐＨ８．０付近ないしｐＨ８．０以上に極大値があることが分かる。
【００６８】
図５に示す結果によると、蛍光標識基質を含む液体試料に菌体抽出物を加える方法では、ｐＨ８．０以上ｐＨ８．５以下に調整した液体試料中で酵素反応させた場合、蛍光強度が更に高くなり、遺伝子型の判別の精度がより向上するといえる。
【００６９】
図６は、菌体を温度を変えて酵素反応させた液体試料の蛍光測定結果を示す図である。図６Ａは、ｐＨ７．０で酵素反応させた結果である。図６Ｂは、ｐＨ７．５で酵素反応させた結果である。図６Ｃは、ｐＨ７．８で酵素反応させた結果である。図６Ｄは、ｐＨ８．０で酵素反応させた結果である。図６Ｅは、ｐＨ８．５で酵素反応させた結果である。
図６Ａ〜図６Ｅには、各遺伝子型のＰｇ菌の細胞懸濁液を遠心分離して沈殿物を採取し、この菌体を含む沈殿物を加えた液体試料を各ｐＨ条件に調整し、各温度条件で酵素反応させた後に、蛍光測定装置を使用して蛍光強度を測定した結果を示している。
【００７０】
図６Ａ〜図６Ｅの横軸は、液体試料の温度［℃］、縦軸は、蛍光強度の１分間あたりの時間変化量を示す。蛍光強度の時間変化量は、酵素反応の開始後に蛍光測定を行い、その結果を１分間あたりの変化量に換算したものである。図中の●のプロットは、ｆｉｍＡ遺伝子の遺伝子型がＩ型である３３２７７株の結果であり、■のプロットは、ＩＩ型であるＴＤＣ６０株の結果であり、▲のプロットは、ＩＶ型であるＷ８３株の結果である。
【００７１】
蛍光標識基質としては、イソブチルオキシカルボニル−グリシル−グリシル−Ｌ−アルギニル−４−メチルクマリル−７−アミド（ｉＢｏｃ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−ＭＣＡ）を用いている。株毎の液体試料のサンプル数は３である。
【００７２】
図６Ａに示すように、ｐＨ７．０の場合、４〜１５℃や４５℃において、遺伝子型毎の時間変化量値が、互いに同程度の値を示している。一方、２２〜３７．５℃においては、Ｉ型およびＩＶ型の時間変化量値は、互いに同程度の値を示しているが、ＩＩ型の時間変化量値は、Ｉ型やＩＶ型よりも高くなっている。
【００７３】
図６Ｂに示すように、ｐＨ７．５の場合、４〜１５℃や３７．５〜４５℃において、遺伝子型毎の時間変化量値が、互いに同程度の値を示している。２２〜３０℃においては、ＩＩ型およびＩＶ型の時間変化量値は、Ｉ型よりもやや高くなっているが、時間変化量値の差は十分に大きくない。
【００７４】
図６Ｃに示すように、ｐＨ７．８の場合、Ｉ型の時間変化量値は、４〜１５℃や４５℃と比較して、２２〜３７．５℃で高い傾向を示している。ＩＶ型の時間変化量値は、４〜４５℃において、Ｉ型を上回る傾向を示しており、特に、４℃や３０℃では、Ｉ型よりも有意に高い値を示している。ＩＩ型の時間変化量値は、４〜４５℃において、Ｉ型やＩＶ型よりも有意に高い値を示している。
【００７５】
図６Ｄに示すように、ｐＨ８．０の場合、Ｉ型の時間変化量値は、４〜３０℃と比較して、３７．５〜４５℃で低い傾向を示している。ＩＶ型の時間変化量値は、４〜４５℃において、Ｉ型を上回る傾向を示しており、特に、１５〜３７．５℃において、Ｉ型よりも有意に高い値を示している。ＩＩ型の時間変化量値は、４〜４５℃において、Ｉ型やＩＶ型よりも有意に高い値を示しており、２２℃において、顕著に高い極大値を示している。
【００７６】
図６Ｅに示すように、ｐＨ８．５の場合、Ｉ型の時間変化量値は、４〜２２℃と比較して、３０〜４５℃で低い傾向を示している。ＩＶ型の時間変化量値は、４〜３７．５℃において、Ｉ型を上回る傾向を示しており、特に、１５〜３７．５℃において、Ｉ型よりも有意に高い値を示している。ＩＩ型の時間変化量値は、４〜４５℃において、Ｉ型やＩＶ型よりも有意に高い値を示しており、１５〜３７．５℃において、Ｉ型やＩＶ型よりも顕著に高い値を示している。
【００７７】
図６Ａ〜図６Ｅに示す結果によると、酵素を内包する菌体については、ｐＨ７．５を超えｐＨ８．５以下に調整し、且つ、４〜４５℃に調整した液体試料中で酵素反応させた場合、ＩＩ型の蛍光強度がＩ型やＩＶ型よりも高くなり、ＩＩ型とＩ型やＩＶ型との判別の精度が高くなるといえる。また、ｐＨ７．８を超えｐＨ８．５以下に調整し、且つ、１５〜３７．５℃に調整した液体試料中で酵素反応させた場合、ＩＶ型の蛍光強度がＩ型よりも高くなり、ＩＶ型とＩ型やＩＩ型との遺伝子型の判別の精度が高くなるといえる。１５〜３７．５℃では、Ｉ型、ＩＩ型およびＶ型の相互の判別が高精度に行えるといえる。
【００７８】
図７は、菌体抽出物を温度を変えて酵素反応させた液体試料の蛍光測定結果を示す図である。図７Ａは、ｐＨ７．０で酵素反応させた結果である。図７Ｂは、ｐＨ７．５で酵素反応させた結果である。図７Ｃは、ｐＨ７．８で酵素反応させた結果である。図７Ｄは、ｐＨ８．０で酵素反応させた結果である。図７Ｅは、ｐＨ８．５で酵素反応させた結果である。
図７Ａ〜図７Ｅには、各遺伝子型のＰｇ菌の細胞懸濁液を遠心分離して上清を採取し、この菌体抽出物である上清を加えた液体試料を各ｐＨ条件に調整し、各温度条件で酵素反応させた後に、蛍光測定装置を使用して蛍光強度を測定した結果を示している。
【００７９】
図７Ａ〜図７Ｅの横軸は、液体試料の温度［℃］、縦軸は、蛍光強度の１分間あたりの時間変化量を示す。蛍光強度の時間変化量は、酵素反応の開始後に蛍光測定を行い、その結果を１分間あたりの変化量に換算したものである。図中の●のプロットは、ｆｉｍＡ遺伝子の遺伝子型がＩ型である３３２７７株の結果であり、■のプロットは、ＩＩ型であるＴＤＣ６０株の結果であり、▲のプロットは、ＩＶ型であるＷ８３株の結果である。
【００８０】
蛍光標識基質としては、イソブチルオキシカルボニル−グリシル−グリシル−Ｌ−アルギニル−４−メチルクマリル−７−アミド（ｉＢｏｃ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−ＭＣＡ）を用いている。株毎の液体試料のサンプル数は３である。
【００８１】
図７Ａに示すように、ｐＨ７．０の場合、４〜２２℃や３７．５℃において、遺伝子型毎の時間変化量値が、互いに同程度の値を示している。一方、３０℃や４５℃においては、ＩＶ型およびＩＩ型の時間変化量値は、互いに同程度の値を示しているが、Ｉ型の時間変化量値は、ＩＶ型やＩＩ型よりも高くなっている。
【００８２】
図７Ｂに示すように、ｐＨ７．５の場合、ＩＶ型の時間変化量値は、２２〜３７．５℃において、ＩＩ型を上回る傾向を示しており、特に、３０℃では、ＩＩ型よりも有意に高い値を示している。Ｉ型の時間変化量値は、１５〜４５℃において、ＩＶ型やＩＩ型よりも有意に高い値を示している。
【００８３】
図７Ｃに示すように、ｐＨ７．８の場合、ＩＩ型の時間変化量値は、４℃や４５℃と比較して、１５〜３７．５℃で高い傾向を示している。ＩＶ型の時間変化量値は、２２〜３７．５℃において、ＩＩ型を上回る傾向を示しており、特に、３７．５℃では、ＩＩ型よりも有意に高い値を示している。Ｉ型の時間変化量値は、１５〜４５℃において、ＩＶ型やＩＩ型よりも有意に高い値を示しており、３０〜３７．５℃において、ＩＶ型やＩＩ型よりも顕著に高くなっている。
【００８４】
図７Ｄに示すように、ｐＨ８．０の場合、ＩＩ型の時間変化量値は、４〜３７．５℃と比較して、４５℃で低い傾向を示している。ＩＶ型の時間変化量値は、２２〜３７．５℃において、ＩＩ型を上回る傾向を示しており、特に、３０〜３７．５℃では、ＩＩ型よりも有意に高い値を示している。Ｉ型の時間変化量値は、１５〜３７．５℃において、ＩＶ型やＩＩ型よりも有意に高い値を示しており、２２〜３７．５℃において、ＩＶ型やＩＩ型よりも顕著に高くなっている。
【００８５】
図７Ｅに示すように、ｐＨ８．５の場合、ＩＩ型およびＩＶ型の時間変化量値は、４〜４５℃において、互いに同程度の値を示している。Ｉ型の時間変化量値は、４〜４５℃において、ＩＶ型やＩＩ型よりも有意に高い値を示しており、３７．５℃において、ＩＶ型やＩＩ型よりも特に高くなっている。
【００８６】
図７Ａ〜図７Ｅに示す結果によると、酵素が産生された菌体抽出物については、ｐＨ７．５を超えｐＨ８．５以下に調整し、且つ、１５〜４５℃に調整した液体試料中で酵素反応させた場合、Ｉ型の蛍光強度がＩＶ型やＩＩ型よりも高くなり、Ｉ型とＩＶ型やＩＩ型との判別の精度が高くなるといえる。また、ｐＨ７．５以上ｐＨ８．０以下に調整し、且つ、３０〜３７．５℃に調整した液体試料中で酵素反応させた場合、ＩＶ型の蛍光強度がＩＩ型よりも高くなり、ＩＶ型とＩ型やＩＩ型との遺伝子型の判別の精度が高くなるといえる。
【００８７】
図８は、歯周病の原因菌の遺伝子型を菌体を用いて判別する原理について説明する図である。
図８の横軸は、酵素反応の開始時から起算される時間、縦軸は、蛍光強度を示す。図中の一点鎖線は、遺伝子型が未知である歯周病の原因菌の菌体（供試物）を含む液体試料の蛍光強度の具体例を示している。
【００８８】
また、図中の太実線は、遺伝子型がＩ型のＰｇ菌によって得られる蛍光強度の代表値の具体例、細実線は、遺伝子型がＩＩ型のＰｇ菌によって得られる蛍光強度の代表値の具体例、破線は、遺伝子型がＩＶ型のＰｇ菌によって得られる蛍光強度の代表値の具体例を示す。
【００８９】
図８に示すように、遺伝子型が既知である歯周病の原因菌の菌体を含む液体試料を蛍光測定すると、歯周病の原因菌の酵素活性や、酵素の細胞外産生能力、分泌能力等が遺伝子型によって異なる場合、遺伝子型毎に異なる蛍光強度が検出される。遺伝子型が既知である多数の液体試料について蛍光測定を行い、その結果を回帰分析等すると、図中に曲線（Ｉ型線、ＩＩ型線、ＩＶ型線）で示すように、遺伝子型毎の測定値群についての代表値を得ることができる。蛍光強度の測定値は、各曲線（Ｉ型線、ＩＩ型線、ＩＶ型線）に対して所定の距離の範囲内に広がった分布を示し、遺伝子型毎に分かれた測定値群（クラスタ）を形成する（図中の網掛け領域参照）。
【００９０】
一方、遺伝子型が未知である歯周病の原因菌の菌体を含む液体試料を蛍光測定すると、図中に一点鎖線で示すように、いずれかの遺伝子型の代表値の曲線（Ｉ型線、ＩＩ型線、ＩＶ型線）に近接した測定結果が得られる。図８においては、ＩＩ型線に近接した測定結果を示している。被験者から採取した供試物は、いずれかの遺伝子型が優勢な状態であり、酵素活性や、酵素の細胞外産生能力、分泌能力の程度がいずれかの遺伝子型のものと類似しているため、このような測定結果が得られる。
【００９１】
したがって、酵素反応の開始後に所定の反応時間が経過したとき（例えば、時間Ｔ１）に、液体試料の蛍光強度を測定し、遺伝子型が未知である歯周病の原因菌の菌体を含む液体試料の蛍光強度値（例えば、蛍光強度Ｉ０）と、遺伝子型が既知である歯周病の原因菌の菌体を含む液体試料の蛍光強度値（例えば、蛍光強度Ｉ２，Ｉ４や、図中の網掛け領域の境界線）とを、同じ反応時間あたりで比較すると、供試物の遺伝子型を判別することができる。
【００９２】
このような判別法の場合、遺伝子型が未知である供試物を含む試験区と、遺伝子型が既知である歯周病の原因菌の菌体を含む対照区との比較を行う際に、酵素反応の反応条件や蛍光測定の測定系を一致させる必要があるが、単純な蛍光強度値の比較によって遺伝子型を判別することができる。
【００９３】
或いは、酵素反応の開始後に所定の時間間隔毎に経時的（例えば、時間Ｔ１付近の微小区間）に液体試料の蛍光強度を測定し、蛍光強度の時間微分である時間的変化量（傾き）を求め、遺伝子型が未知である歯周病の原因菌の菌体を含む液体試料の蛍光強度の時間的変化量（例えば、Ｔ１−Ｉ０の交点における接線の傾き）と、遺伝子型が既知である歯周病の原因菌の菌体を含む液体試料の蛍光強度の時間的変化量（例えば、Ｔ１−Ｉ２の交点における接線の傾き，Ｔ１−Ｉ４の交点における接線の傾きや、図中の網掛け領域の境界線の接線の傾き）とを比較すると、供試物の遺伝子型を判別することができる。
【００９４】
このような判別法の場合、時間的変化量（傾き）の計算が必要になるが、酵素反応の反応時間を必ずしも一致させる必要がなく、また、蛍光測定の結果が測定系統誤差を生じ難くなるため、正確な比較を行うことができる。なお、蛍光強度の時間的変化量（傾き）は、同じ反応時間あたりで比較することもできるし、酵素反応中の最大値同士で比較することもできる。
【００９５】
図９は、歯周病の原因菌の遺伝子型を菌体抽出物を用いて判別する原理について説明する図である。
図９の横軸は、酵素反応の開始時から起算される時間、縦軸は、蛍光強度を示す。図中の一点鎖線は、遺伝子型が未知である歯周病の原因菌から抽出された菌体抽出物（供試物）を含む液体試料の蛍光強度の具体例を示している。
【００９６】
また、図中の太実線は、遺伝子型がＩＩ型のＰｇ菌によって得られる蛍光強度の代表値の具体例、細実線は、遺伝子型がＩ型のＰｇ菌によって得られる蛍光強度の代表値の具体例、破線は、遺伝子型がＩＶ型のＰｇ菌によって得られる蛍光強度の代表値の具体例を示す。
【００９７】
図９に示すように、遺伝子型が既知である歯周病の原因菌から抽出された菌体抽出物を含む液体試料を蛍光測定すると、歯周病の原因菌の酵素活性が遺伝子型によって異なる場合、菌体を用いる場合（図８参照）と同様に、遺伝子型毎に異なる蛍光強度が検出される。但し、菌体抽出物を用いる場合、酵素の細胞外産生能力、分泌能力等の影響は小さくなるため、遺伝子型毎の蛍光強度の測定値は、菌体を用いる場合とは異なる傾向を示す。
【００９８】
一方、遺伝子型が未知である歯周病の原因菌から抽出された菌体抽出物を含む液体試料を蛍光測定すると、図中に一点鎖線で示すように、いずれかの遺伝子型の代表値の曲線（Ｉ型線、ＩＩ型線、ＩＶ型線）に近接した測定結果が得られる。菌体抽出物を用いる場合、菌体を用いる場合に対してＩ型の蛍光強度とＩＩ型の蛍光強度が逆の関係になるため、蛍光強度の測定値が小さいほどＩＩ型の曲線に近接し、蛍光強度の測定値が大きいほどＩ型の曲線に近接することになる。
【００９９】
したがって、菌体抽出物を用いる場合、菌体を用いる場合（図８参照）と同様に、酵素反応の開始後に所定の反応時間が経過したとき（例えば、時間Ｔ１）に、液体試料の蛍光強度を測定し、遺伝子型が未知である歯周病の原因菌から抽出された菌体抽出物を含む液体試料の蛍光強度値（例えば、蛍光強度Ｉ０）と、遺伝子型が既知である歯周病の原因菌から抽出された菌体抽出物を含む液体試料の蛍光強度値（例えば、蛍光強度Ｉ２，Ｉ４や、図中の網掛け領域の境界線）とを、同じ反応時間あたりで比較すると、供試物の遺伝子型を判別することができる。
【０１００】
また、酵素反応の開始後に所定の時間間隔毎に経時的（例えば、時間Ｔ１付近の微小区間）に液体試料の蛍光強度を測定し、蛍光強度の時間微分である時間的変化量（傾き）を求め、遺伝子型が未知である歯周病の原因菌から抽出された菌体抽出物を含む液体試料の蛍光強度の時間的変化量（例えば、Ｔ１−Ｉ０の交点における接線の傾き）と、遺伝子型が既知である歯周病の原因菌から抽出された菌体抽出物を含む液体試料の蛍光強度の時間的変化量（例えば、Ｔ１−Ｉ２の交点における接線の傾き，Ｔ１−Ｉ４の交点における接線の傾きや、図中の網掛け領域の境界線の接線の傾き）とを比較すると、供試物の遺伝子型を判別することができる。
【０１０１】
例えば、遺伝子型判別工程Ｓ３０における遺伝子型の判別は、遺伝子型が未知である歯周病の原因菌、または、その菌体抽出物（供試物）を含む液体試料によって構成される試験区の液体試料と、遺伝子型が既知である歯周病の原因菌、または、その菌体抽出物を含む液体試料によって構成される対照区の液体試料と、を調製し、試験区の液体試料の蛍光測定結果と、対照区の液体試料の蛍光測定結果と、を互いに比較する方法によって行うことができる。なお、試験区の液体試料と対照区の液体試料とは、ｐＨ、温度、歯周病の原因菌や菌体抽出物の供試量、蛍光標識基質の濃度等を互いに実質的に同じ条件に調整して酵素反応させた後、蛍光測定結果を取得して判別に用いる。
【０１０２】
対照区は、１以上の任意の個数の液体試料で構成することができるが、多数の液体試料によって構成することが好ましい。対照区は、遺伝子型が既知である歯周病の原因菌や、その菌体抽出物を含む液体試料と共に、遺伝子型が未知である歯周病の原因菌や、その菌体抽出物を含む液体試料を含んでもよい。但し、対照区は、遺伝子型を確実に判別する観点からは、遺伝子型が既知である歯周病の原因菌や、その菌体抽出物を含む液体試料のみで構成されることが好ましい。
【０１０３】
対照区は、遺伝子型が既知である歯周病の原因菌や、その菌体抽出物として、一種の遺伝子型の菌体や、その菌体抽出物を含んでもよいし、複数種の遺伝子型の菌体や、その菌体抽出物を含んでもよい。例えば、対照区がＩ型のみを含む場合、供試菌がＩ型か否か、判別することができる。対照区がＩ〜Ｖ型を含む場合、供試物がいずれの遺伝子型か、判別することができる。
【０１０４】
対照区は、遺伝子型が既知である歯周病の原因菌や、その菌体抽出物として、蛍光測定法による遺伝子型の判別を事前に行った菌株の菌体や、その菌体抽出物、分譲等によって一般的に取得可能な寄託株・単離株の菌体や、その菌体抽出物等を用いて用意することができる。
【０１０５】
寄託株・単離株の具体例としては、ｆｉｍＡ遺伝子がＩ型であるＡＴＣＣ＿３３２７７株、ＡＴＣＣ＿ＢＡＡ−１７０３（ＦＤＣ３８１）株、ＩＩ型であるＪＣＭ＿１９６００（ＴＤＣ６０）株、２７５株（ＨＧ１８４株）、２６８株、ＩＩＩ型であるＡＴＣＣ＿４９４１７（ＲＢ２２Ｄ−１）株、ＩＶ型であるＡＴＣＣ＿ＢＡＡ−３０８（Ｗ８３）株、ＡＴＣＣ＿５３９７８（Ｗ５０）株、Ｖ型であるＨＮＡ９９株等が挙げられる。
【０１０６】
蛍光測定対象の液体試料は、蛍光測定の前に、ｐＨ７．５を超えｐＨ８．５以下に調整して酵素反応させることが好ましい。液体試料のｐＨは、好ましくはｐＨ７．８以上である。また、液体試料のｐＨは、好ましくはｐＨ８．４以下、より好ましくはｐＨ８．３以下、更に好ましくはｐＨ８．２以下、更に好ましくはｐＨ８．１以下である。このようなｐＨに調整すると、Ｐｇ菌のｆｉｍＡ遺伝子の遺伝子型を、より正確に判別することができる。
【０１０７】
蛍光測定対象の液体試料は、所定の温度に調整した恒温制御下で蛍光測定することが好ましい。液体試料の温度は、好ましくは４℃以上４５℃以下である。液体試料の温度は、菌体抽出物を用いる場合、好ましくは２５℃以上、より好ましくは３０℃以上、更に好ましくは３４℃以上、更に好ましくは３６℃以上である。また、好ましくは４０℃以下、より好ましくは３９℃以下、更に好ましくは３８℃以下である。一方、液体試料の温度は、菌体を用いる場合、好ましくは４℃以上、より好ましくは１０℃以上、更に好ましくは１５℃以上、更に好ましくは１８℃以上、更に好ましくは２１℃以上である。また、好ましくは３７℃以下、より好ましくは３０℃以下、更に好ましくは２６℃以下、更に好ましくは２３℃以下である。このような温度に制御すると、Ｐｇ菌のｆｉｍＡ遺伝子の遺伝子型を、正確に判別することができる。
【０１０８】
具体的には、試験区の蛍光測定結果と対照区の蛍光測定蛍光結果との比較は、試験区について測定された遺伝子型が未知である歯周病の原因菌もしくは菌体抽出物（供試物）を含む液体試料の蛍光強度値または蛍光強度の時間的変化量と、対照区について測定された遺伝子型が既知である歯周病の原因菌もしくは菌体抽出物を含む液体試料の蛍光強度値または蛍光強度の時間的変化量と、を比較することによって行うことができる。比較に際しては、蛍光強度値同士または蛍光強度の時間的変化量同士を比較する。
【０１０９】
試験区の蛍光測定結果と対照区の蛍光測定結果とを比較した結果、試験区について測定された遺伝子型が未知である歯周病の原因菌もしくは菌体抽出物（供試物）を含む液体試料の蛍光強度値または蛍光強度の時間的変化量と、対照区について測定された遺伝子型が既知である歯周病の原因菌もしくは菌体抽出物を含む液体試料の蛍光強度値または蛍光強度の時間的変化量とが、互いに同一であるか、または、近似しているとき、試験区中の当該液体試料の歯周病の原因菌のｆｉｍＡ遺伝子が、対照区中の当該液体試料の遺伝子型が既知である歯周病の原因菌のｆｉｍＡ遺伝子と同じ遺伝子型であると判定することができる。
【０１１０】
一方、試験区の蛍光測定結果と対照区の蛍光測定結果とを比較した結果、試験区について測定された遺伝子型が未知である歯周病の原因菌もしくは菌体抽出物（供試物）を含む液体試料の蛍光強度値または蛍光強度の時間的変化量と、対照区について測定された遺伝子型が既知である歯周病の原因菌もしくは菌体抽出物を含む液体試料の蛍光強度値または蛍光強度の時間的変化量とが、同一でなく、且つ、近似していないとき、試験区中の当該液体試料の歯周病の原因菌のｆｉｍＡ遺伝子が、対照区中の当該液体試料の遺伝子型が既知である歯周病の原因菌のｆｉｍＡ遺伝子と異なる遺伝子型であると判定することができる。
【０１１１】
試験区の蛍光測定結果と対照区の蛍光測定結果との比較は、例えば、測定値自体の比較や、平均値等の代表値の比較によって行うことができる。例えば、試験区について測定された測定値と、対照区について測定された平均値等の代表値とを比較し、試験区の測定値と対照区の代表値との差が、対照区の代表値に対して±３０％の範囲内であるとき、当該蛍光測定結果同士が近似していると判断することができる。
【０１１２】
或いは、遺伝子型判別工程Ｓ３０における遺伝子型の判別は、遺伝子型が未知である歯周病の原因菌または菌体抽出物（供試物）を含む判別対象の液体試料を含んだ複数の液体試料からなる試料群を調製し、試料群中の液体試料の蛍光測定結果を互いに比較する方法によって行うこともできる。なお、判別対象の液体試料とそれ以外の液体試料とは、ｐＨ、温度、歯周病の原因菌や菌体抽出物の供試量、蛍光標識基質の濃度等を互いに実質的に同じ条件に調整して酵素反応させた後、蛍光測定結果を取得して判別に用いる。
【０１１３】
試料群は、２以上の任意の個数の液体試料で構成することができるが、多数の液体試料によって構成することが好ましい。試料群は、遺伝子型が未知である歯周病の原因菌または菌体抽出物（供試物）を含む判別対象の液体試料を含む限り、遺伝子型が未知である歯周病の原因菌や菌体抽出物を含む液体試料のみで構成されてもよいし、遺伝子型が未知である歯周病の原因菌や菌体抽出物を含む液体試料と、遺伝子型が既知である歯周病の原因菌や菌体抽出物を含む液体試料と、の組み合わせで構成されてもよい。
【０１１４】
試料群は、遺伝子型が既知である歯周病の原因菌や菌体抽出物として、複数の遺伝子型の菌株や菌体抽出物を含んでいることが好ましい。例えば、対照区がＩ〜Ｖ型を含む場合、蛍光測定結果は、蛍光強度の時間変化の傾向が遺伝子型毎に異なる５種類の測定値群（クラスタ）を生じることになる。そのため、供試物の蛍光測定結果について、これらの測定値群との類似度を判定することにより、供試物がいずれの遺伝子型か、判別することができる。
【０１１５】
蛍光測定対象の液体試料は、蛍光測定の前に、ｐＨ７．５を超えｐＨ８．５以下に調整して酵素反応させることが好ましい。液体試料のｐＨは、好ましくはｐＨ７．８以上である。また、液体試料のｐＨは、好ましくはｐＨ８．４以下、より好ましくはｐＨ８．３以下、更に好ましくはｐＨ８．２以下、更に好ましくはｐＨ８．１以下である。このようなｐＨに調整すると、Ｐｇ菌のｆｉｍＡ遺伝子の遺伝子型を、より正確に判別することができる。
【０１１６】
蛍光測定対象の液体試料は、所定の温度に調整した恒温制御下で蛍光測定することが好ましい。液体試料の温度は、好ましくは４℃以上４５℃以下である。液体試料の温度は、菌体抽出物を用いる場合、好ましくは２５℃以上、より好ましくは３０℃以上、更に好ましくは３４℃以上、更に好ましくは３６℃以上である。また、好ましくは４０℃以下、より好ましくは３９℃以下、更に好ましくは３８℃以下である。一方、液体試料の温度は、菌体を用いる場合、好ましくは４℃以上、より好ましくは１０℃以上、更に好ましくは１５℃以上、更に好ましくは１８℃以上、更に好ましくは２１℃以上である。また、好ましくは３７℃以下、より好ましくは３０℃以下、更に好ましくは２６℃以下、更に好ましくは２３℃以下である。このような温度に制御すると、Ｐｇ菌のｆｉｍＡ遺伝子の遺伝子型を、正確に判別することができる。
【０１１７】
具体的には、試料群中の蛍光測定結果の比較は、試料群中の遺伝子型が未知である歯周病の原因菌もしくは菌体抽出物（供試物）を含む判別対象の液体試料の蛍光強度値または蛍光強度の時間的変化量と、試料群中の複数の液体試料について得られた蛍光強度値または蛍光強度の時間的変化量の測定値群と、を比較することによって行うことができる。比較に際しては、蛍光強度値同士または蛍光強度の時間的変化量同士を比較する。
【０１１８】
液体試料の調製に菌体を用いた場合、試料群中の蛍光測定結果（測定値群）を比較した結果、試料群中の遺伝子型が未知である判別対象の液体試料について測定された蛍光強度値または蛍光強度の時間的変化量が、試料群中の複数の液体試料について測定された蛍光強度値または蛍光強度の時間的変化量の測定値群のうち、上位一番目の測定値群に分類されるとき、当該液体試料の歯周病の原因菌のｆｉｍＡ遺伝子が、ＩＩ型である、と判定することができる。一方、液体試料の調製に菌体抽出物を用いた場合、上位一番目の測定値群に分類された当該液体試料の歯周病の原因菌のｆｉｍＡ遺伝子が、Ｉ型である、と判定することができる。
【０１１９】
上位一番目の測定値群は、図８にドットの網掛け、図９に斑の網掛けで示すように、全遺伝子型のうちで、蛍光強度の最大値が分類される測定値群となる。同様に、上位一番目の測定値群は、蛍光強度の時間的変化量（傾き）についても、最大値が分類される測定値群となる。そのため、液体試料の調製に菌体を用いており、試料群中にＩＩ型とＩ型やＩＶ型が含まれる場合、上位一番目の測定値群がＩＩ型となる。一方、液体試料の調製に菌体抽出物を用いており、試料群中にＩ型とＩＶ型やＩＩ型が含まれる場合、上位一番目の測定値群がＩ型となる。
【０１２０】
また、液体試料の調製に菌体を用いた場合や、液体試料の調製に菌体抽出物を用いた場合、試料群中の蛍光測定結果（測定値群）と比較した結果、試料群中の遺伝子型が未知である判別対象の液体試料について測定された蛍光強度値または蛍光強度の時間的変化量が、試料群中の複数の液体試料について測定された蛍光強度値または蛍光強度の時間的変化量の測定値群のうち、上位二番目の測定値群に分類されるとき、当該液体試料の歯周病の原因菌のｆｉｍＡ遺伝子が、ＩＶ型である、と判定することができる。
【０１２１】
上位二番目の測定値群は、図８や図９に斜線の網掛けで示すように、全遺伝子型のうちで、蛍光強度の最大値が分類される測定値群の次に高い測定値群となる。同様に、上位二番目の測定値群は、蛍光強度の時間的変化量（傾き）についても、最大値が分類される測定値群の次に高い測定値群となる。そのため、液体試料の調製に菌体を用いており、試料群中にＩＩ型とＩＶ型やＩ型が含まれる場合、上位二番目の測定値群がＩＶ型となる。また、液体試料の調製に菌体抽出物を用いており、試料群中にＩ型とＩＶ型やＩＩ型が含まれる場合、上位二番目の測定値群がＩＶ型となる。
【０１２２】
また、液体試料の調製に菌体を用いた場合、試料群中の蛍光測定結果（測定値群）と比較した結果、試料群中の遺伝子型が未知である判別対象の液体試料について測定された蛍光強度値または蛍光強度の時間的変化量が、試料群中の複数の液体試料について測定された蛍光強度値または蛍光強度の時間的変化量の測定値群のうち、下位一番目の測定値群に分類されるとき、当該液体試料の歯周病の原因菌（供試菌）のｆｉｍＡ遺伝子が、Ｉ型である、と判定することができる。一方、液体試料の調製に菌体抽出物を用いた場合、下位一番目の測定値群に分類された当該液体試料の歯周病の原因菌のｆｉｍＡ遺伝子が、ＩＩ型である、と判定することができる。
【０１２３】
下位一番目の測定値群は、図８に斑の網掛け、図９にドットの網掛けで示すように、全遺伝子型のうちで、蛍光強度の最小値が分類される測定値群となる。同様に、下位一番目の測定値群は、蛍光強度の時間的変化量（傾き）についても、最小値が分類される測定値群となる。そのため、液体試料の調製に菌体を用いており、試料群中にＩ型とＩＩ型やＩＶ型が含まれる場合、下位一番目の測定値群がＩ型となる。一方、液体試料の調製に菌体抽出物を用いており、試料群中にＩＩ型とＩＶ型やＩ型が含まれる場合、下位一番目の測定値群がＩＩ型となる。
【０１２４】
試料群中の蛍光測定結果の比較は、例えば、測定によって得られる結果同士の類似度に基づいて行うことができる。例えば、試験区について測定された測定値と、対照区について測定された測定値とを比較し、試験区の測定値が、対照区の測定値群に対して、予め設定されている所定の類似度の範囲内であるとき、当該蛍光測定結果同士が近似していると評価することができる。
【０１２５】
対照区の測定値群は、予め遺伝子型毎に分類（クラスタリング）された状態で試験区の測定値と比較されてもよい。遺伝子型毎の分類には、遺伝子型毎の測定値を所定の閾値で分類する方法や、ウォード法、群平均法、最長距離法、最短距離法等の各種の計算手法を用いることができる。蛍光測定結果の比較は、ユークリッド距離等の各種の数学的距離を用いて行うことができる。
【０１２６】
以上の本実施形態に係る判別方法によると、歯周病の原因菌の酵素活性と歯周病の原因菌の遺伝子型とに相関関係がある場合に、蛍光測定法によって求められる酵素活性に基づいて、歯周病の原因菌の遺伝子型を判別することができる。従来一般的な分子生物学的手法とは異なり、歯周病を進行させる酵素活性が判別に反映されるため、より実際の病態に即した遺伝子型の判別を行うことができる。また、液体試料の調製に菌体を用いる場合、被験者の口腔から採取した試料を、そのまま蛍光測定用の液体試料に用いることができるため、遺伝子型の判別を簡便に行うことができる。
【０１２７】
特に、液体試料の調製に菌体を用いる場合、蛍光測定の前に、ｐＨ７．５を超えｐＨ８．５以下に調整して酵素反応させると、ＩＩ型やＩＶ型の蛍光強度が高くなるため、ＩＩ型やＩＶ型以外の遺伝子型との判別の精度を向上させることができる。また、液体試料の調製に菌体抽出物を用いる場合、蛍光測定の前に、ｐＨ７．５以上ｐＨ８．０以下に調整して酵素反応させると、ＩＶ型やＩ型の蛍光強度が高くなるため、ＩＶ型やＩ型以外の遺伝子型との判別の精度を向上させることができる。歯周病の原因菌の遺伝子型を判別するための検査薬は、このようなｐＨに予め調整しておくことができる。Ｉ型のＰｇ菌は、健康な歯周組織を持つ成人の保有率が高い一方で、ＩＩ型やＩＶ型のＰｇ菌は、成人の歯周炎患者の保有率が高いため、歯周病の現在の病態や重症化の可能性を、より正確に判断することができる。
【０１２８】
また、液体試料の調製には、歯垢、歯肉浸出液等に含まれる菌体、および、菌体から抽出された菌体抽出物のうち、いずれを用いることもできる。酵素活性の温度条件に対する挙動は、遺伝子型毎、且つ、供試物の形態毎に異なる傾向を示すことが確認されている。菌体内で酵素等を内包しているベジクルの菌体からの遊離性や菌体による保持力は、遺伝子型毎に異なっている可能性がある。しかし、供試物の形態毎に、酵素反応の条件を調整することにより、高精度な判別を行うことができる。
【０１２９】
＜蛍光測定装置＞
次に、本発明の一実施形態に係る蛍光測定装置について、図を参照しながら説明する。
【０１３０】
図１０は、本発明の実施形態に係る蛍光測定装置の構成を示す図である。
図１０に示すように、本実施形態に係る蛍光測定装置１００は、光源（照射手段）１と、試料ホルダ２と、光学レンズ３ａ，３ｂと、フィルタ４と、検出素子（検出手段）５と、増幅器６と、アナログ処理器７と、Ａ／Ｄ変換器８と、制御装置（判別手段）９と、試料容器１０と、入力手段１１と、表示手段１２と、ｐＨ測定手段１３と、温度測定手段１４と、温調装置１５と、を備えている。
【０１３１】
本実施形態に係る蛍光測定装置１００は、歯周病の原因菌の遺伝子型を判別することができる蛍光測定装置である。この蛍光測定装置１００では、液体試料Ｓａに含まれている歯周病の原因菌、または、その菌体抽出物（供試物）が、既知の遺伝子多型のうちで、いずれの遺伝子型に属するかを判別する。遺伝子型の判別は、各遺伝子型との相関関係が確認されている酵素活性に基づいて行う。酵素活性は、蛍光標識された酵素反応の基質を用いた検査薬を使用することにより、蛍光測定法によって評価される。
【０１３２】
遺伝子型の判別対象とする歯周病の原因菌（供試菌）としては、前記の実施形態に係る判別方法と同様に、ポルフィロモナス・ジンジバリス（Ｐｇ菌）が挙げられる。判別する遺伝子型としては、ｆｉｍＡ遺伝子の多型であるＩ型（１型）、ＩＩ型（２型）、ＩＩＩ型（３型）、ＩＶ型（４型）、Ｖ型（５型）が挙げられる。
【０１３３】
供試菌としては、前記の実施形態に係る判別方法と同様に、被験者の口腔から採取した歯垢、歯肉浸出液等を、そのまま、ないし、懸濁液や懸濁液の上清として用いることができる。蛍光測定対象の液体試料としては、歯周病の原因菌、または、その菌体抽出物と、歯周病の原因菌による酵素反応の基質が蛍光標識された蛍光標識基質（試薬）と、を含む液体試料Ｓａが用いられる。
【０１３４】
光源１は、励起光を発生させるための装置である。液体試料Ｓａ中において、歯周病の原因菌による酵素反応が起こると、蛍光標識基質から蛍光発色団が解離する。光源１によって発生させた励起光を液体試料Ｓａに照射すると、蛍光発色団が発した蛍光が、液体試料Ｓａから放出される。
【０１３５】
光源１としては、特定の励起波長が単色化された単色化光源、例えば、発光ダイオード（light emitting diode：ＬＥＤ）、レーザー光源等が好ましく用いられる。但し、光源１としては、キセノンランプ、水銀ランプ、ハロゲンランプ等のその他の光源を、分光器等の光学系と共に備えてもよい。
【０１３６】
光源１が発生する励起光は、３５０ｎｍ以上３８０ｎｍ以下の波長に最大ピークを持つことが好ましく、３５５ｎｍ以上３７５ｎｍ以下の波長に最大ピークを持つことがより好ましく、３６０ｎｍ以上３７０ｎｍ以下の波長に最大ピークを持つことが更に好ましい。このようなスペクトルであると、蛍光標識基質を構成する蛍光発色団がＡＭＣである場合に、検出に適した蛍光強度が得られる。
【０１３７】
試料ホルダ２は、不図示の測定室内に設置されており、試料容器１０を、励起光の照射および蛍光の出射が可能な状態に支持している。蛍光測定に際して、試料ホルダ２には、液体試料Ｓａを入れた試料容器１０が固定される。試料ホルダ２に支持された試料容器１０には、側方から励起光が照射される。
【０１３８】
検出素子５は、液体試料Ｓａが放出した蛍光を検出するための装置である。液体試料Ｓａから放出された蛍光は、試料容器１０から出射し、光学レンズ３ａを通ってフィルタ４に達する。フィルタ４は、ノイズや低感度の波長域を除き、特定の波長域の蛍光のみを透過する。フィルタ４を透過した蛍光は、光学レンズ３ｂを通って検出素子５に入射して、電気信号に変換される。
【０１３９】
検出素子５としては、フォトダイオード、光電管、光電子増倍管等の各種の検出素子を用いることができる。フィルタ４としては、光学フィルタ、ダイクロイックミラー等を用いることができる。フィルタ４としては、４１０ｎｍ以上４７５ｎｍ以下の波長を透過し、それ以外の波長を遮断するものが好ましい。このような特性であると、蛍光標識基質を構成する蛍光発色団がＡＭＣである場合に、蛍光を高感度に検出することができる。
【０１４０】
検出素子５で変換された蛍光の電気信号は、増幅器６によって増幅された後、ローパスフィルタ等を備えるアナログ処理器７によってノイズ除去処理等を施される。その後、蛍光の電気信号は、Ａ／Ｄ変換器８によってデジタル信号に変換されて、制御装置９に入力される。
【０１４１】
蛍光測定対象の液体試料Ｓａは、蛍光測定の前に、ｐＨ７．５を超えｐＨ８．５以下に調整して酵素反応させることが好ましい。液体試料のｐＨは、好ましくはｐＨ７．８以上である。また、液体試料のｐＨは、好ましくはｐＨ８．４以下、より好ましくはｐＨ８．３以下、更に好ましくはｐＨ８．２以下、更に好ましくはｐＨ８．１以下である。このようなｐＨに調整すると、Ｐｇ菌のｆｉｍＡ遺伝子の遺伝子型を、より正確に判別することができる。
【０１４２】
液体試料ＳａのｐＨは、ｐＨ測定手段１３によって測定することができる。ｐＨ測定手段１３としては、例えば、ガラス電極式、膜電極式等のｐＨ計を試料容器１０に挿入して用いることができる。ｐＨ測定手段１３によると、蛍光測定時に液体試料ＳａのｐＨを測定することができるため、ｐＨが所定の範囲を逸脱している場合に、蛍光測定を中止したり、不正確な蛍光測定結果を破棄したりする対応が可能になる。
【０１４３】
蛍光測定対象の液体試料Ｓａは、所定の温度に調整した恒温制御下で蛍光測定することが好ましい。液体試料の温度は、好ましくは４℃以上４５℃以下である。液体試料の温度は、菌体抽出物を用いる場合、好ましくは２５℃以上、より好ましくは３０℃以上、更に好ましくは３４℃以上、更に好ましくは３６℃以上である。また、好ましくは４０℃以下、より好ましくは３９℃以下、更に好ましくは３８℃以下である。一方、液体試料の温度は、菌体を用いる場合、好ましくは４℃以上、より好ましくは１０℃以上、更に好ましくは１５℃以上、更に好ましくは１８℃以上、更に好ましくは２１℃以上である。また、好ましくは３７℃以下、より好ましくは３０℃以下、更に好ましくは２６℃以下、更に好ましくは２３℃以下である。このような温度に制御すると、Ｐｇ菌のｆｉｍＡ遺伝子の遺伝子型を、正確に判別することができる。
【０１４４】
液体試料Ｓａの温度は、温度測定手段１４によって測定することができる。温度測定手段１４としては、例えば、サーミスタ、熱電対、測温抵抗体等を試料容器１０に挿入して用いることができる。温度測定手段１４によると、蛍光測定時に液体試料Ｓａの温度をオンラインで監視して、調温装置１５をフィードバック制御することができる。
【０１４５】
温調装置１５は、試料容器１０中の液体試料Ｓａを調温するための装置である。温調装置１５としては、ＰＴＣ（Positive Temperature Coefficient）ヒータ、ペルチェ素子、恒温媒体循環系等を試料容器１０の周囲、例えば、下方や側方の試料ホルダ２に備えることができる。温調装置１５によると、液体試料Ｓａを酵素反応に適した温度に調温して、酵素活性を正確に評価することができる。
【０１４６】
なお、図１０に示す判別装置１００では、セル状の試料容器１０を用いているが、試料容器１０として、マイクロチューブを用いることもできる。マイクロチューブとしては、反応、抽出、培養、遠心分離等の各種の操作に用いることが可能であり、容積１〜２ｍＬ程度のプラスチック製、ガラス製等の容器が挙げられる。
【０１４７】
試料容器１０として、マイクロチューブを用いる場合、試料ホルダには、液体試料Ｓａを入れた脱蓋状態のマイクロチューブを取り付けることができる。このようなマイクロチューブには、側壁面から励起光を入射させることができる。液体試料Ｓａから放出される蛍光は、試料ホルダの側方ではなく、脱蓋状態のマイクロチューブの上方に出射させて検出することができる。
【０１４８】
このような形態によると、マイクロチューブの側壁が励起光の光導波路となり、脱蓋状態のマイクロチューブの上方に蛍光が出射するため、光学系を簡素化することができる。また、各種の操作に用いたマイクロチューブを、そのまま蛍光測定に供することができる。そのため、少量の液体試料Ｓａを測定対象とし、簡単な構造の蛍光測定装置を使用して、安価且つ簡便に蛍光測定を行うことができる。
【０１４９】
図１１は、蛍光測定装置が備える制御装置の概略構成を示す図である。
図１１に示すように、蛍光測定装置１００が備える制御装置９は、測定結果データ取得部９０と、測定結果データ処理部９１と、測定結果データ比較部９２と、測定条件データ取得部９３と、制御部９４と、記憶部９５と、表示制御部９６と、温度制御部９７と、を備えている。
【０１５０】
制御装置９は、蛍光測定装置１００の運転を制御すると共に、液体試料Ｓａに含まれる歯周病の原因菌や菌体抽出物の遺伝子型を判別する処理を行う。制御装置９は、ＣＰＵ（Central Processing Unit）等の演算装置や、ＲＯＭ（Read Only Memory）、ＲＡＭ（Random Access Memory）、ハードディスク等の記憶装置等によって構成することができる。
【０１５１】
制御装置９には、不図示の入力インターフェイスを介して、入力手段１１や、検出素子５を備えている蛍光測定部や、ｐＨ測定手段１４や、温度測定手段１５が接続される。また、制御装置９には、不図示の出力インターフェイスを介して、表示手段１２や、温調装置１５が接続される。制御装置９が備える各デバイスは、不図示のバスを介して互いに接続される。
【０１５２】
入力手段１１は、蛍光測定装置１００を操作するための装置である。入力手段１１は、例えば、キーボード、マウス、タッチパッド等の各種の装置によって構成することができる。
【０１５３】
表示手段１２は、遺伝子型の判別の結果を表示する装置である。表示手段１２は、例えば、液晶ディスプレイ、プラズマディスプレイ、有機ＥＬディスプレイ等の各種の装置によって構成することができる。
【０１５４】
蛍光測定装置１００では、液体試料Ｓａに含まれる歯周病の原因菌や菌体抽出物の遺伝子型の判別を、遺伝子型が未知である歯周病の原因菌もしくは菌体抽出物（供試物）を含む液体試料の蛍光強度値または蛍光強度の時間的変化量と、予め設定されている閾値と、を比較する方法によって行うことができる。比較に際しては、蛍光強度値と蛍光強度値に対応した閾値、または、蛍光強度の時間的変化量と蛍光強度の時間的変化量に対応した閾値を比較する。
【０１５５】
測定結果データ取得部９０は、検出素子５を備えている蛍光測定部側から入力される測定結果データを取得する。測定結果データは、液体試料Ｓａについて検出された蛍光の蛍光強度、酵素反応の開始時から起算される検出時間等のデータである。測定結果データは、測定結果データ処理部９１や記憶部９５に出力される。
【０１５６】
測定結果データ処理部９１は、測定結果データに基づいて、遺伝子型の判別に用いる蛍光強度データを算出する。蛍光強度データは、所定の検出時間における蛍光強度値、所定の検出時間における蛍光強度の時間的変化量（傾き）等のデータである。蛍光強度データは、所定の検出時間範囲における蛍光強度値の平均値、所定の検出時間範囲における蛍光強度の時間的変化量（傾き）の平均値または最大値等であってもよい。蛍光強度データは、測定結果データ比較部９２や記憶部９５に出力される。
【０１５７】
測定結果データ比較部９２は、蛍光強度データを記憶部９５に記憶されている閾値と比較する。測定結果データ比較部９２は、液体試料Ｓａについて生成された蛍光強度データが、閾値を超えるか否かを判定して、液体試料Ｓａに含まれる歯周病の原因菌や菌体抽出物の遺伝子型を判別する。判別の結果を示すデータは、表示制御部９７に出力される。
【０１５８】
測定条件データ取得部９３は、ｐＨ測定手段１３や、温度測定手段１４から入力される測定条件データを取得する。測定条件データは、ｐＨ測定手段１３によって所定の時間間隔で測定された液体試料ＳａのｐＨや、温度測定手段１４によって所定の時間間隔で測定された液体試料Ｓａの温度のデータである。測定条件データは、制御部９５や温度制御部９７に出力される。
【０１５９】
制御部９４は、蛍光測定装置１００が備える各デバイスの動作や、歯周病の原因菌の遺伝子型を判別する処理、判別の結果を表示する処理等を、所定のプログラムや、入力手段１１を介したユーザからの入力に基づいて制御する。
【０１６０】
記憶部９５は、蛍光測定装置１００が備える各デバイスの動作や、歯周病の原因菌の遺伝子型を判別する処理、判別の結果を表示する処理等を実行するためのプログラムや、遺伝子型の判別に用いる閾値等のデータを記憶する。
【０１６１】
例えば、遺伝子型が既知である歯周病の原因菌や菌体抽出物を用いて予め蛍光測定を行い、その測定結果として得られた測定結果データから蛍光強度データを求め、予め記憶部９５に記憶させておくことができる。また、多数の蛍光強度データに基づいて遺伝子型毎の閾値を設定し、予め記憶部９５に記憶させておくことができる。
【０１６２】
閾値の設定には、例えば、回帰分析、標準偏差分類、自然分類、多項分類等の各種の分析法を用いることができる。閾値は、評価の対象となる分解酵素以外の酵素活性の影響を受けないように、予め補正しておくこともできる。
【０１６３】
表示制御部９６は、表示手段１２に表示する画像の生成や表示の制御を行う。表示制御部９６は、蛍光測定装置１００の運転状態や、蛍光測定の結果や、遺伝子型の判別の結果についての画像を生成して表示手段１２に出力する。
【０１６４】
温度制御部９７は、温調装置１５の温度制御を行う。温度制御部９７は、温度測定手段１５によって測定された液体試料Ｓａの温度に基づいて温調装置１５をフィードバック制御し、液体試料Ｓａの温度を酵素反応に適した温度に維持する。
【０１６５】
図１２は、蛍光測定装置による判別方法の流れを示すフロー図である。
図１２に示すように、蛍光測定装置１００では、遺伝子型が未知である歯周病の原因菌、または、その菌体抽出物（供試物）を含む液体試料Ｓａを測定対象として蛍光測定を行い、その測定データに基づいて解析された遺伝子型の判別の結果を、ユーザに対して表示させることができる。
【０１６６】
図１２に示すように、蛍光測定装置１００の運転時には、はじめに、制御装置９に蛍光測定の測定条件を入力する（ステップＳ３００）。測定条件としては、液体試料の調製に用いた供試物の種別、蛍光測定に使用する蛍光波長、待機時間・検出時間、遺伝子型の判別に用いる蛍光強度データの種別、例えば、所定の検出時間における蛍光強度値、所定の検出時間における蛍光強度の時間的変化量（傾き）等の種別等が挙げられる。
【０１６７】
続いて、遺伝子型が未知である歯周病の原因菌、または、その菌体抽出物（供試物）を含む液体試料Ｓａの蛍光測定を開始して、励起光の照射と蛍光の検出を行う（ステップＳ３１０）。そして、検出素子５によって検出された蛍光の電気信号である測定結果データを取得する（ステップＳ３２０）。
【０１６８】
ステップＳ３２０では、遺伝子型の判別に所定の検出時間における蛍光強度値を用いる場合、測定結果データとして、その時間の蛍光強度値を、測定結果データ取得部９０に収集する。また、遺伝子系の判別に蛍光強度の時間的変化量（傾き）を用いる場合、測定結果データとして、所定の時間間隔で経時的に蛍光強度値を、測定結果データ取得部９０に収集する。また、平均値や最大値を用いる場合、所定の時間範囲の蛍光強度値を収集する。
【０１６９】
続いて、遺伝子型の判別に用いる蛍光強度データを測定結果データに基づいて算出する（ステップＳ３３０）。蛍光強度データは、所定の検出時間における蛍光強度値、所定の検出時間範囲における蛍光強度値の平均値、所定の検出時間における蛍光強度の時間的変化量（傾き）、所定の検出時間範囲における蛍光強度の時間的変化量（傾き）の平均値または最大値等として、測定結果データ処理部９１に収集する。
【０１７０】
続いて、遺伝子型が未知である歯周病の原因菌、または、その菌体抽出物（供試物）の遺伝子型を判別する処理を行う（ステップＳ３４０）。そして、遺伝子型の判別の結果を示す画像を、表示制御部９６によって表示手段１２に表示する（ステップＳ３５０）。その後、蛍光測定装置１００の運転を終了する。
【０１７１】
遺伝子型の判別の結果としては、液体試料Ｓａに含まれている遺伝子型が未知である歯周病の原因菌や菌体抽出物が、既知のいずれかの遺伝子型に属する旨、既知のいずれかの遺伝子型に属しない旨、判別が不能である旨等を、表示手段１２に表示させることができる。判別の結果は、言語、記号、色等のいずれで表示してもよいし、判別の確度を表すパーセンテージ等と共に表示してもよい。
【０１７２】
図１３は、蛍光測定装置による遺伝子型を判別する処理の流れを示すフロー図である。
図１３に示すように、遺伝子型が未知である歯周病の原因菌や菌体抽出物の遺伝子型を判別する処理（ステップＳ３４０）は、蛍光強度値または蛍光強度の時間的変化量のデータである蛍光強度データを、測定結果データ比較部９２において、記憶部９５に記憶されている閾値と比較することによって行う。
【０１７３】
はじめに、測定結果データ比較部９２には、遺伝子型が未知である歯周病の原因菌、または、その菌体抽出物（供試物）を含む液体試料について得られた蛍光強度データが入力される（ステップＳ３４１）。
【０１７４】
続いて、遺伝子型が未知である歯周病の原因菌、または、その菌体抽出物（供試物）を含む液体試料の蛍光強度データ、すなわち、蛍光強度値または蛍光強度の時間的変化量と、予め設定された第１閾値とを比較する（ステップＳ３４２）。
【０１７５】
第１閾値と比較した結果、遺伝子型が未知である液体試料の蛍光強度データ、すなわち、蛍光強度値または蛍光強度の時間的変化量が、第１閾値を超えるとき（ステップＳ３４２：Ｙｅｓ）、処理をステップＳ３４３に進める。
【０１７６】
続いて、遺伝子型が未知である歯周病の原因菌（供試菌）を含む液体試料の蛍光強度データ、すなわち、蛍光強度値または蛍光強度の時間的変化量と、予め設定された第２閾値とを比較する（ステップＳ３４３）。
【０１７７】
第１閾値や第２閾値としては、遺伝子型が既知である歯周病の原因菌や菌体抽出物を用いて事前に蛍光測定を行い、判別対象の遺伝子型や酵素反応の条件に応じて、蛍光強度と反応時間との相関関係に基づく任意値を設定することができる。例えば、図８や図９中の網掛けの領域同士を区画するような、Ｉ型とＩＶ型とを弁別する境界値、ＩＶ型とＩＩ型とを弁別する境界値等を設定することができる。
【０１７８】
第１閾値は、液体試料の調製に菌体を用いる場合、例えば、ｆｉｍＡ遺伝子の遺伝子型がＩ型である歯周病の原因菌の菌体を含む液体試料の蛍光強度値または蛍光強度の時間的変化量、および、ｆｉｍＡ遺伝子の遺伝子型がＩＶ型である前記原因菌の菌体を含む前記液体試料について測定された蛍光強度値または蛍光強度の時間的変化量のうち、少なくとも一方に基づいて設定することができる。例えば、ｐＨ、温度、歯周病の原因菌の供試量、蛍光標識基質の濃度等が、判別対象の液体試料Ｓａと実質的に同じ条件である液体試料について事前に多数の蛍光測定結果を取得し、Ｉ型について収集された蛍光測定結果の最大値以下、且つ、ＩＶ型について収集された蛍光測定結果の最小値未満となる境界値を、蛍光強度の時間変化の結果に基づいて設定することができる。液体試料の調製に菌体を用いる場合、第１閾値によると、Ｉ型と、ＩＶ型やＩＩ型とを弁別することができる。
【０１７９】
一方、第１閾値は、液体試料の調製に菌体抽出物を用いる場合、例えば、ｆｉｍＡ遺伝子の遺伝子型がＩＩ型である歯周病の原因菌の菌体抽出物を含む液体試料の蛍光強度値または蛍光強度の時間的変化量、および、ｆｉｍＡ遺伝子の遺伝子型がＩＶ型である前記原因菌の菌体抽出物を含む前記液体試料について測定された蛍光強度値または蛍光強度の時間的変化量のうち、少なくとも一方に基づいて設定することができる。液体試料の調製に菌体抽出物を用いる場合、第１閾値によると、ＩＩ型と、ＩＶ型やＩ型とを弁別することができる。
【０１８０】
第２閾値は、液体試料の調製に菌体を用いる場合、ｆｉｍＡ遺伝子の遺伝子型がＩＶ型である歯周病の原因菌の菌体を含む液体試料の蛍光強度値または蛍光強度の時間的変化量、および、ｆｉｍＡ遺伝子の遺伝子型がＩＩ型である前記原因菌の菌体を含む前記液体試料について測定された蛍光強度値または蛍光強度の時間的変化量のうち、少なくとも一方に基づいて設定することができる。例えば、ｐＨ、温度、歯周病の原因菌の供試量、蛍光標識基質の濃度等が、判別対象の液体試料Ｓａと実質的に同じ条件である液体試料について事前に多数の蛍光測定結果を取得し、ＩＶ型について収集された蛍光測定結果の最大値以下、且つ、ＩＩ型について収集された蛍光測定結果の最小値未満となる境界値を、蛍光強度の時間変化の結果に基づいて設定することができる。液体試料の調製に菌体を用いる場合、第２閾値によると、ＩＩ型と、ＩＶ型やＩ型とを弁別することができる。
【０１８１】
一方、第２閾値は、液体試料の調製に菌体抽出物を用いる場合、例えば、ｆｉｍＡ遺伝子の遺伝子型がＩＶ型である歯周病の原因菌の菌体抽出物を含む液体試料の蛍光強度値または蛍光強度の時間的変化量、および、ｆｉｍＡ遺伝子の遺伝子型がＩ型である前記原因菌の菌体抽出物を含む前記液体試料について測定された蛍光強度値または蛍光強度の時間的変化量のうち、少なくとも一方に基づいて設定することができる。液体試料の調製に菌体抽出物を用いる場合、第２閾値によると、Ｉ型と、ＩＶ型やＩＩ型とを弁別することができる。
【０１８２】
液体試料の調製に菌体を用いた場合、閾値と比較した結果、遺伝子型が未知である液体試料の蛍光強度データ、すなわち、蛍光強度値または蛍光強度の時間的変化量が、第１閾値を超え、第２閾値以下であるとき（ステップＳ３４２：Ｙｅｓ，ステップＳ３４３：Ｎｏ）、当該液体試料の歯周病の原因菌のｆｉｍＡ遺伝子が、Ｉ型、ＩＩ型以外の遺伝子型である、と判定することができる。すなわち、供試菌がＩＩＩ型やＶ型以外の遺伝子型を含まない場合であれば、ＩＶ型である、と判定することができる。また、液体試料の調製に菌体抽出物を用いた場合、当該液体試料の歯周病の原因菌のｆｉｍＡ遺伝子が、ＩＩ型、Ｉ型以外の遺伝子型である、と判定することができる。すなわち、供試菌がＩＩＩ型やＶ型以外の遺伝子型を含まない場合であれば、ＩＶ型である、と判定することができる。
【０１８３】
また、液体試料の調製に菌体を用いた場合、閾値と比較した結果、遺伝子型が未知である液体試料の蛍光強度データ、すなわち、蛍光強度値または蛍光強度の時間的変化量が、第２閾値を超えるとき（ステップＳ３４２：Ｙｅｓ，ステップＳ３４３：Ｙｅｓ）、当該液体試料の歯周病の原因菌のｆｉｍＡ遺伝子が、Ｉ型、ＩＶ型以外の遺伝子型である、と判定することができる。すなわち、供試菌がＩＩＩ型やＶ型以外の遺伝子型を含まない場合であれば、ＩＩ型である、と判定することができる。また、液体試料の調製に菌体抽出物を用いた場合、当該液体試料の歯周病の原因菌のｆｉｍＡ遺伝子が、ＩＩ型、ＩＶ型以外の遺伝子型である、と判定することができる。すなわち、供試菌がＩＩＩ型やＶ型以外の遺伝子型を含まない場合であれば、Ｉ型である、と判定することができる。
【０１８４】
一方、液体試料の調製に菌体を用いた場合、閾値と比較した結果、遺伝子型が未知である液体試料の蛍光強度データ、すなわち、蛍光強度値または蛍光強度の時間的変化量が、第１閾値以下であるとき（ステップＳ３４２：Ｎｏ）、当該液体試料の歯周病の原因菌のｆｉｍＡ遺伝子が、ＩＩ型、ＩＶ型以外の遺伝子型である、と判定することができる。すなわち、供試菌がＩＩＩ型やＶ型以外の遺伝子型を含まない場合であれば、Ｉ型である、と判定することができる。また、液体試料の調製に菌体抽出物を用いた場合、当該液体試料の歯周病の原因菌のｆｉｍＡ遺伝子が、ＩＶ型、Ｉ型以外の遺伝子型である、と判定することができる。すなわち、供試菌がＩＩＩ型やＶ型以外の遺伝子型を含まない場合であれば、ＩＩ型である、と判定することができる。
【０１８５】
以上の本実施形態に係る蛍光測定装置によると、歯周病の原因菌の酵素活性と歯周病の原因菌の遺伝子型とに相関関係がある場合に、蛍光測定法によって求められる酵素活性に基づいて、歯周病の原因菌の遺伝子型を判別することができる。従来一般的な分子生物学的手法とは異なり、歯周病を進行させる酵素活性が判別に反映されるため、より実際の病態に即した遺伝子型の判別を行うことができる。また、被験者の口腔から採取した試料を、そのまま蛍光測定用の液体試料に用いることができるため、遺伝子型の判別を簡便に行うことができる。
【０１８６】
特に、蛍光測定装置は、第１閾値や第２閾値を記憶した記憶部を備えることができるため、歯周病の原因菌の遺伝子型を、手技・操作にかかわらず、安定的且つ再現性良く判別することができる。歯周病の原因菌の被験者の口腔から採取した試料を、歯周病の原因菌の遺伝子型を判別するための検査薬を用意するだけで、自動的に判別にすることができるため、歯周病の現在の病態や重症化の可能性を、効率的に判断することができる。
【０１８７】
以上、本発明について説明したが、本発明は、前記の実施形態に限定されるものではなく、本発明の趣旨を逸脱しない範囲において種々の変更が可能である。例えば、本発明は、必ずしも前記の実施形態が備える全ての構成を備えるものに限定されない。或る実施形態の構成の一部を他の構成に置き換えたり、或る実施形態の構成の一部を他の形態に追加したり、或る実施形態の構成の一部を省略したりすることができる。
【０１８８】
例えば、前記の蛍光測定装置１００は、液体試料Ｓａの蛍光強度を測定できる限り、適宜の光学系や信号処理系を備えることができる。遺伝子型の判別は、第１閾値や第２閾値だけでなく、前記の判別方法と同様の方法等のように、蛍光強度についての指標値の類似度を比較する他の方法によって行うこともできる。
【符号の説明】
【０１８９】
１      光源（照射手段）
２      試料ホルダ
３ａ    光学レンズ
３ｂ    光学レンズ
４      フィルタ
５      検出素子（検出手段）
６      増幅器
７      アナログ処理器
８      Ａ／Ｄ変換器
９      制御装置（判別手段）
１０    試料容器
１１    入力手段
１２    表示手段
１３    ｐＨ測定手段
１４    温度測定手段
１５    温調装置
９０    測定結果データ取得部
９１    測定結果データ処理部
９２    測定結果データ比較部
９３    測定条件データ取得部
９４    制御部
９５    記憶部
９６    表示制御部
９７    温度制御部
１００  蛍光測定装置
【図１】
2021025043.tif 000003
【図２Ａ】
2021025043.tif 000004
【図２Ｂ】
2021025043.tif 000005
【図２Ｃ】
2021025043.tif 000006
【図２Ｄ】
2021025043.tif 000007
【図２Ｅ】
2021025043.tif 000008
【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図４Ｄ】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図６Ｄ】
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【図６Ｅ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図７Ｄ】
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【図７Ｅ】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【国際調査報告】
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