(57)【要約】  青系花色を有する形質転換植物、又はその自殖もしくは他殖後代、あるいはそれらの栄養繁殖体、植物体の一部、組織、又は細胞を提供する。  デルフィニジン型アントシアニンとフラボン C-配糖体を花弁で共発現させる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
形質転換植物を作製するための方法であって、デルフィニジン型アントシアニンとフラボン C-配糖体を植物の細胞内で共存させることを特徴とする方法。
【請求項２】
前記フラボン C-配糖体が、フラボン 6-C-グルコシド、フラボン 8-C-グルコシド及びそれらの組み合せから成る群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記フラボン C-配糖体が、アピゲニン 6-C-グルコシド、及び／又はルテオリン 6-C-グルコシドである、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記デルフィニジン型アントシアニンが、マルビジン 3,5-ジグルコシド、デルフィニジン 3,5-ジグルコシド、ペチュニジン 3,5-ジグルコシド、アシル化アントシアニン及びそれらの組み合せから成る群から選択される、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
フラボン合成酵素（FNS）遺伝子又はそのホモログ、及びフラボン C-配糖化酵素（CGT）遺伝子又はそのホモログを含むベクターで宿主植物を形質転換することを含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記ベクターが、フラボノイド F3’5’水酸化酵素（F3'5'H）遺伝子又はそのホモログ、及びメチル基転移酵素(MT)遺伝子又はそのホモログをさらに含む、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記FNS遺伝子又はそのホモログが、
（１−ａ）配列番号１９の塩基配列からなるポリヌクレオチド；
（１−ｂ）配列番号１９の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェント条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドであって、（１−ａ）に記載のポリヌクレオチドと同様の活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（１−ｃ）配列番号２０のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（１−ｄ）配列番号２０のアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、（１−ｃ）に記載のポリヌクレオチドと同様の活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（１−ｅ）配列番号２０のアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ、（１−ｃ）に記載のポリヌクレオチドと同様の活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド、からなる群から選択され、
前記CGT遺伝子又はそのホモログが、
（２−ａ）配列番号２１の塩基配列からなるポリヌクレオチド；
（２−ｂ）配列番号２１の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェント条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドであって、（２−ａ）に記載のポリヌクレオチドと同様の活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（２−ｃ）配列番号２２のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（２−ｄ）配列番号２２のアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、（２−ｃ）に記載のポリヌクレオチドと同様の活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（２−ｅ）配列番号２２のアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ、（２−ｃ）に記載のポリヌクレオチドと同様の活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド、からなる群から選択され、
前記F3'5'H遺伝子又はそのホモログが、
（３−ａ）配列番号９の塩基配列からなるポリヌクレオチド；
（３−ｂ）配列番号９の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェント条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドであって、（３−ａ）に記載のポリヌクレオチドと同様の活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（３−ｃ）配列番号１０のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（３−ｄ）配列番号１０のアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、（３−ｃ）に記載のポリヌクレオチドと同様の活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（３−ｅ）配列番号１０のアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ、（３−ｃ）に記載のポリヌクレオチドと同様の活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド、からなる群から選択され、そして
前記MT遺伝子又はそのホモログが、
（４−ａ）配列番号１７の塩基配列からなるポリヌクレオチド；
（４−ｂ）配列番号１７の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェント条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドであって、（４−ａ）に記載のポリヌクレオチドと同様の活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（４−ｃ）配列番号１８のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（４−ｄ）配列番号１８のアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、（４−ｃ）に記載のポリヌクレオチドと同様の活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（４−ｅ）配列番号１８のアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ、（４−ｃ）に記載のポリヌクレオチドと同様の活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド、からなる群から選択される、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記CGT遺伝子又はそのホモログにシロイヌナズナ アルコール脱水素酵素（ADH）遺伝子由来5’非翻訳領域（5’-UTR）（配列番号２３）が付加されている、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
フラバノン 2-水酸化酵素（F2H）遺伝子又はそのホモログ、フラボン C-配糖化酵素（CGT）遺伝子又はそのホモログ、及び脱水酵素（FDH）遺伝子又はそのホモログを含むベクターで宿主植物を形質転換することを含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
前記ベクターが、フラボノイド F3’5’水酸化酵素（F3'5'H）遺伝子又はそのホモログ、及びメチル基転移酵素(MT)遺伝子又はそのホモログをさらに含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記F2H遺伝子又はそのホモログが、
（５−ａ）配列番号３の塩基配列からなるポリヌクレオチド；
（５−ｂ）配列番号３の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェント条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドであって、（５−ａ）に記載のポリヌクレオチドと同様の活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（５−ｃ）配列番号４のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（５−ｄ）配列番号４のアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、（５−ｃ）に記載のポリヌクレオチドと同様の活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（５−ｅ）配列番号４のアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ、（５−ｃ）に記載のポリヌクレオチドと同様の活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド、からなる群から選択され、
前記CGT遺伝子又はそのホモログが、
（６−ａ）配列番号１３の塩基配列からなるポリヌクレオチド；
（６−ｂ）配列番号１３の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェント条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドであって、（６−ａ）に記載のポリヌクレオチドと同様の活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（６−ｃ）配列番号１４のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（６−ｄ）配列番号１４のアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、（６−ｃ）に記載のポリヌクレオチドと同様の活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（６−ｅ）配列番号１４のアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ、（６−ｃ）に記載のポリヌクレオチドと同様の活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド、からなる群から選択され、
前記FDH遺伝子又はそのホモログが、
（７−ａ）配列番号１５の塩基配列からなるポリヌクレオチド；
（７−ｂ）配列番号１５の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェント条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドであって、（７−ａ）に記載のポリヌクレオチドと同様の活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（７−ｃ）配列番号１６のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（７−ｄ）配列番号１６のアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、（７−ｃ）に記載のポリヌクレオチドと同様の活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（７−ｅ）配列番号１６のアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ、（７−ｃ）に記載のポリヌクレオチドと同様の活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド、からなる群から選択され、
前記F3'5'H遺伝子又はそのホモログが、
（８−ａ）配列番号９の塩基配列からなるポリヌクレオチド；
（８−ｂ）配列番号９の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェント条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドであって、（８−ａ）に記載のポリヌクレオチドと同様の活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（８−ｃ）配列番号１０のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（８−ｄ）配列番号１０のアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、（８−ｃ）に記載のポリヌクレオチドと同様の活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（８−ｅ）配列番号１０のアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ、（８−ｃ）に記載のポリヌクレオチドと同様の活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド、からなる群から選択され、そして
前記MT遺伝子又はそのホモログが、
（９−ａ）配列番号１７の塩基配列からなるポリヌクレオチド；
（９−ｂ）配列番号１７の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェント条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドであって、（９−ａ）に記載のポリヌクレオチドと同様の活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（９−ｃ）配列番号１８のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（９−ｄ）配列番号１８のアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、（９−ｃ）に記載のポリヌクレオチドと同様の活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（９−ｅ）配列番号１８のアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ、（９−ｃ）に記載のポリヌクレオチドと同様の活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド、からなる群から選択される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
細胞内にデルフィニジン型アントシアニンとフラボン C-配糖体が共存していることを特徴とする形質転換植物、又はその自殖もしくは他殖後代。
【請求項１３】
前記フラボン C-配糖体が、フラボン 6-C-グルコシド、フラボン 8-C-グルコシド及びそれらの組み合せから成る群から選択される、請求項１２に記載の形質転換植物、又はその自殖もしくは他殖後代。
【請求項１４】
前記フラボン C-配糖体が、アピゲニン 6-C-グルコシドである、請求項１３に記載の形質転換植物、又はその自殖もしくは他殖後代。
【請求項１５】
前記デルフィニジン型アントシアニンが、マルビジン 3,5-ジグルコシド、デルフィニジン 3,5-ジグルコシド、ペチュニジン 3,5-ジグルコシド、アシル化アントシアニン及びそれらの組み合せから成る群から選択される、請求項１２〜１４のいずれか１項に記載の形質転換植物、又はその自殖もしくは他殖後代。
【請求項１６】
フラボン合成酵素（FNS）遺伝子又はそのホモログ、及びフラボン C-配糖化酵素（CGT）遺伝子又はそのホモログを含む、請求項１２〜１５のいずれか１項に記載の形質転換植物、又はその自殖もしくは他殖後代。
【請求項１７】
フラボノイド F3’5’水酸化酵素（F3'5'H）遺伝子又はそのホモログ、及びメチル基転移酵素(MT)遺伝子又はそのホモログをさらに含む、請求項１６に記載の形質転換植物、又はその自殖もしくは他殖後代。
【請求項１８】
前記FNS遺伝子又はそのホモログが、
（１−ａ）配列番号１９の塩基配列からなるポリヌクレオチド；
（１−ｂ）配列番号１９の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェント条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドであって、（１−ａ）に記載のポリヌクレオチドと同様の活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（１−ｃ）配列番号２０のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（１−ｄ）配列番号２０のアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、（１−ｃ）に記載のポリヌクレオチドと同様の活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（１−ｅ）配列番号２０のアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ、（１−ｃ）に記載のポリヌクレオチドと同様の活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド、からなる群から選択され、
前記CGT遺伝子又はそのホモログが、
（２−ａ）配列番号２１の塩基配列からなるポリヌクレオチド；
（２−ｂ）配列番号２１の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェント条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドであって、（２−ａ）に記載のポリヌクレオチドと同様の活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（２−ｃ）配列番号２２のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（２−ｄ）配列番号２２のアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、（２−ｃ）に記載のポリヌクレオチドと同様の活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（２−ｅ）配列番号２２のアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ、（２−ｃ）に記載のポリヌクレオチドと同様の活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド、からなる群から選択され、
前記F3'5'H遺伝子又はそのホモログが、
（３−ａ）配列番号９の塩基配列からなるポリヌクレオチド；
（３−ｂ）配列番号９の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェント条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドであって、（３−ａ）に記載のポリヌクレオチドと同様の活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（３−ｃ）配列番号１０のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（３−ｄ）配列番号１０のアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、（３−ｃ）に記載のポリヌクレオチドと同様の活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（３−ｅ）配列番号１０のアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ、（３−ｃ）に記載のポリヌクレオチドと同様の活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド、からなる群から選択され、そして
前記MT遺伝子又はそのホモログが、
（４−ａ）配列番号１７の塩基配列からなるポリヌクレオチド；
（４−ｂ）配列番号１７の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェント条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドであって、（４−ａ）に記載のポリヌクレオチドと同様の活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（４−ｃ）配列番号１８のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（４−ｄ）配列番号１８のアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、（４−ｃ）に記載のポリヌクレオチドと同様の活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（４−ｅ）配列番号１８のアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ、（４−ｃ）に記載のポリヌクレオチドと同様の活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド、からなる群から選択される、請求項１７に記載の形質転換植物、又はその自殖もしくは他殖後代。
【請求項１９】
前記CGT遺伝子又はそのホモログにシロイヌナズナ アルコール脱水素酵素（ADH）遺伝子由来5’非翻訳領域（5’-UTR）（配列番号２３）が付加されている、請求項１８に記載の形質転換植物、又はその自殖もしくは他殖後代。
【請求項２０】
フラバノン 2-水酸化酵素（F2H）遺伝子又はそのホモログ、フラボン C-配糖化酵素（CGT）遺伝子又はそのホモログ、及び脱水酵素（FDH）遺伝子又はそのホモログを含む、請求項１２〜１５のいずれか１項に記載の形質転換植物、又はその自殖もしくは他殖後代。
【請求項２１】
フラボノイド F3’5’水酸化酵素（F3'5'H）遺伝子又はそのホモログ、及びメチル基転移酵素(MT)遺伝子又はそのホモログをさらに含む、請求項２０に記載の形質転換植物、又はその自殖もしくは他殖後代。
【請求項２２】
前記F2H遺伝子又はそのホモログが、
（５−ａ）配列番号３の塩基配列からなるポリヌクレオチド；
（５−ｂ）配列番号３の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェント条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドであって、（５−ａ）に記載のポリヌクレオチドと同様の活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（５−ｃ）配列番号４のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（５−ｄ）配列番号４のアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、（５−ｃ）に記載のポリヌクレオチドと同様の活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（５−ｅ）配列番号４のアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ、（５−ｃ）に記載のポリヌクレオチドと同様の活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド、からなる群から選択され、
前記CGT遺伝子又はそのホモログが、
（６−ａ）配列番号１３の塩基配列からなるポリヌクレオチド；
（６−ｂ）配列番号１３の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェント条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドであって、（６−ａ）に記載のポリヌクレオチドと同様の活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（６−ｃ）配列番号１４のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（６−ｄ）配列番号１４のアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、（６−ｃ）に記載のポリヌクレオチドと同様の活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（６−ｅ）配列番号１４のアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ、（６−ｃ）に記載のポリヌクレオチドと同様の活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド、からなる群から選択され、
前記FDH遺伝子又はそのホモログが、
（７−ａ）配列番号１５の塩基配列からなるポリヌクレオチド；
（７−ｂ）配列番号１５の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェント条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドであって、（７−ａ）に記載のポリヌクレオチドと同様の活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（７−ｃ）配列番号１６のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（７−ｄ）配列番号１６のアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、（７−ｃ）に記載のポリヌクレオチドと同様の活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（７−ｅ）配列番号１６のアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ、（７−ｃ）に記載のポリヌクレオチドと同様の活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド、からなる群から選択され、
前記F3'5'H遺伝子又はそのホモログが、
（８−ａ）配列番号９の塩基配列からなるポリヌクレオチド；
（８−ｂ）配列番号９の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェント条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドであって、（８−ａ）に記載のポリヌクレオチドと同様の活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（８−ｃ）配列番号１０のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（８−ｄ）配列番号１０のアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、（８−ｃ）に記載のポリヌクレオチドと同様の活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（８−ｅ）配列番号１０のアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ、（８−ｃ）に記載のポリヌクレオチドと同様の活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド、からなる群から選択され、そして
前記MT遺伝子又はそのホモログが、
（９−ａ）配列番号１７の塩基配列からなるポリヌクレオチド；
（９−ｂ）配列番号１７の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェント条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドであって、（９−ａ）に記載のポリヌクレオチドと同様の活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（９−ｃ）配列番号１８のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（９−ｄ）配列番号１８のアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、（９−ｃ）に記載のポリヌクレオチドと同様の活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（９−ｅ）配列番号１８のアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ、（９−ｃ）に記載のポリヌクレオチドと同様の活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド、からなる群から選択される、請求項２１に記載の形質転換植物、又はその自殖もしくは他殖後代。
【請求項２３】
RHSカラーチャートでBlueグループもしくはViolet-Blueグループ、かつ／又はCIEL*a*b*表色系の色相角度で339.7°〜270.0°の花色を有する、請求項１２〜２２のいずれか１項に記載の形質転換植物、又はその自殖もしくは他殖後代。
【請求項２４】
請求項１２〜２３のいずれか１項に記載の形質転換植物、又はその自殖もしくは他殖後代の栄養繁殖体、植物体の一部、組織、又は細胞。
【請求項２５】
請求項１２〜２３のいずれか１項に記載の形質転換植物、又はその自殖もしくは他殖後代の切り花、又は該切り花から作成された加工品。
【請求項２６】
フラボン合成酵素（FNS）遺伝子又はそのホモログ、及びフラボン C-配糖化酵素（CGT）遺伝子又はそのホモログを含むベクター。
【請求項２７】
フラボノイド F3’5’水酸化酵素（F3'5'H）遺伝子又はそのホモログ、及びメチル基転移酵素(MT)遺伝子又はそのホモログをさらに含む、請求項２６に記載のベクター。
【請求項２８】
前記FNS遺伝子又はそのホモログが、
（１−ａ）配列番号１９の塩基配列からなるポリヌクレオチド；
（１−ｂ）配列番号１９の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェント条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドであって、（１−ａ）に記載のポリヌクレオチドと同様の活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（１−ｃ）配列番号２０のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（１−ｄ）配列番号２０のアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、（１−ｃ）に記載のポリヌクレオチドと同様の活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（１−ｅ）配列番号２０のアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ、（１−ｃ）に記載のポリヌクレオチドと同様の活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド、からなる群から選択され、
前記CGT遺伝子又はそのホモログが、
（２−ａ）配列番号２１の塩基配列からなるポリヌクレオチド；
（２−ｂ）配列番号２１の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェント条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドであって、（２−ａ）に記載のポリヌクレオチドと同様の活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（２−ｃ）配列番号２２のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（２−ｄ）配列番号２２のアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、（２−ｃ）に記載のポリヌクレオチドと同様の活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（２−ｅ）配列番号２２のアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ、（２−ｃ）に記載のポリヌクレオチドと同様の活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド、からなる群から選択され、
前記F3'5'H遺伝子又はそのホモログが、
（３−ａ）配列番号９の塩基配列からなるポリヌクレオチド；
（３−ｂ）配列番号９の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェント条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドであって、（３−ａ）に記載のポリヌクレオチドと同様の活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（３−ｃ）配列番号１０のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（３−ｄ）配列番号１０のアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、（３−ｃ）に記載のポリヌクレオチドと同様の活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（３−ｅ）配列番号１０のアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ、（３−ｃ）に記載のポリヌクレオチドと同様の活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド、からなる群から選択され、そして
前記MT遺伝子又はそのホモログが、
（４−ａ）配列番号１７の塩基配列からなるポリヌクレオチド；
（４−ｂ）配列番号１７の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェント条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドであって、（４−ａ）に記載のポリヌクレオチドと同様の活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（４−ｃ）配列番号１８のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（４−ｄ）配列番号１８のアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、（４−ｃ）に記載のポリヌクレオチドと同様の活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（４−ｅ）配列番号１８のアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ、（４−ｃ）に記載のポリヌクレオチドと同様の活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド、からなる群から選択される、請求項２７に記載のベクター。
【請求項２９】
前記CGT遺伝子又はそのホモログにシロイヌナズナ アルコール脱水素酵素（ADH）遺伝子由来5’非翻訳領域（5’-UTR）（配列番号２３）が付加されている、請求項２８に記載のベクター。
【請求項３０】
フラバノン 2-水酸化酵素（F2H）遺伝子又はそのホモログ、フラボン C-配糖化酵素（CGT）遺伝子又はそのホモログ、及び脱水酵素（FDH）遺伝子又はそのホモログを含むベクター。
【請求項３１】
フラボノイド F3’5’水酸化酵素（F3'5'H）遺伝子又はそのホモログ、及びメチル基転移酵素(MT)遺伝子又はそのホモログをさらに含む、請求項３０に記載のベクター。
【請求項３２】
前記F2H遺伝子又はそのホモログが、
（５−ａ）配列番号３の塩基配列からなるポリヌクレオチド；
（５−ｂ）配列番号３の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェント条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドであって、（５−ａ）に記載のポリヌクレオチドと同様の活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（５−ｃ）配列番号４のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（５−ｄ）配列番号４のアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、（５−ｃ）に記載のポリヌクレオチドと同様の活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（５−ｅ）配列番号４のアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ、（５−ｃ）に記載のポリヌクレオチドと同様の活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド、からなる群から選択され、
前記CGT遺伝子又はそのホモログが、
（６−ａ）配列番号１３の塩基配列からなるポリヌクレオチド；
（６−ｂ）配列番号１３の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェント条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドであって、（６−ａ）に記載のポリヌクレオチドと同様の活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（６−ｃ）配列番号１４のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（６−ｄ）配列番号１４のアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、（６−ｃ）に記載のポリヌクレオチドと同様の活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（６−ｅ）配列番号１４のアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ、（６−ｃ）に記載のポリヌクレオチドと同様の活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド、からなる群から選択され、
前記FDH遺伝子又はそのホモログが、
（７−ａ）配列番号１５の塩基配列からなるポリヌクレオチド；
（７−ｂ）配列番号１５の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェント条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドであって、（７−ａ）に記載のポリヌクレオチドと同様の活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（７−ｃ）配列番号１６のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（７−ｄ）配列番号１６のアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、（７−ｃ）に記載のポリヌクレオチドと同様の活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（７−ｅ）配列番号１６のアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ、（７−ｃ）に記載のポリヌクレオチドと同様の活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド、からなる群から選択され、
前記F3'5'H遺伝子又はそのホモログが、
（８−ａ）配列番号９の塩基配列からなるポリヌクレオチド；
（８−ｂ）配列番号９の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェント条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドであって、（８−ａ）に記載のポリヌクレオチドと同様の活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（８−ｃ）配列番号１０のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（８−ｄ）配列番号１０のアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、（８−ｃ）に記載のポリヌクレオチドと同様の活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（８−ｅ）配列番号１０のアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ、（８−ｃ）に記載のポリヌクレオチドと同様の活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド、からなる群から選択され、そして
前記MT遺伝子又はそのホモログが、
（９−ａ）配列番号１７の塩基配列からなるポリヌクレオチド；
（９−ｂ）配列番号１７の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェント条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドであって、（９−ａ）に記載のポリヌクレオチドと同様の活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（９−ｃ）配列番号１８のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（９−ｄ）配列番号１８のアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、（９−ｃ）に記載のポリヌクレオチドと同様の活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（９−ｅ）配列番号１８のアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ、（９−ｃ）に記載のポリヌクレオチドと同様の活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド、からなる群から選択される、請求項３１に記載のベクター。
【請求項３３】
（６−ａ）配列番号１３の塩基配列からなるポリヌクレオチド；
（６−ｂ）配列番号１３の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェント条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドであって、（６−ａ）に記載のポリヌクレオチドと同様の活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（６−ｃ）配列番号１４のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（６−ｄ）配列番号１４のアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、（６−ｃ）に記載のポリヌクレオチドと同様の活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（６−ｅ）配列番号１４のアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ、（６−ｃ）に記載のポリヌクレオチドと同様の活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド、からなる群から選択される、単離されたポリヌクレオチド。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、青系花色を有する形質転換植物の作出方法であって、デルフィニジン型アントシアニンとフラボン C-配糖体を植物の細胞内で共存させることを特徴とする方法、ならびに、細胞内にデルフィニジン型アントシアニンとフラボン C-配糖体が共存していることを特徴とする形質転換植物、又はその自殖もしくは他殖後代、あるいはそれらの栄養繁殖体、植物体の一部（特に切り花）もしくはその加工品（特に切り花加工品）、組織又は細胞に関する。
【背景技術】
【０００２】
バラ、キク、カーネーション等は世界的に産業上重要な花きである。特にバラは最も人気のある花卉植物であり、紀元前から栽培されていた記録があり、数百年にわたり人為的な品種改良がされてきた。しかしながら、交雑可能な近縁種に青系の花色の野生種が無いなどの問題により、従来の交雑育種や突然変異育種では、青系花色を有するバラ品種の作出は困難であった。全く新しい青系花色の創出は、花卉の利用場面の拡大に伴う新たな需要を喚起し、生産や消費の拡大に繋がる。そこで、遺伝子工学的手法により青系花色をもつバラの作出が試みられてきた。【０００３】
例えば、紫から青色の花には、デルフィニジン、ペチュニジン及びマルビジンといったデルフィニジン型アントシアニンが多く含まれることが知られているが、バラなどの花卉は、このようなデルフィニジン型アントシアニンを生産できないため、これらの合成に必要なフラボノイド3',5'−水酸化酵素遺伝子を発現させることにより、デルフィニジンを人為的に生産させる研究が行われている(非特許文献１)。しかしながら、目的の物質を生産する酵素遺伝子を組み換え植物において発現させるために植物の代謝を人為的に改変したとしても、しばしば植物自身が持つ内在の酵素との競合により、目的の物質の蓄積がまったく、あるいはほとんど起こらないことが多い。【０００４】
さらに、花の色は、アントシアニン自身の構造のほかに、共存するフラボノイド（コピグメントと呼ばれる）や金属イオン、液胞のpHなどによっても変化する。フラボンやフラボノールは、代表的なコピグメントであり、アントシアニンとサンドイッチ状に積み重なることにより、アントシアニンを青くし、濃く見えるようにする効果がある（非特許文献２）。これはコピグメント効果として知られている。特にフラボンは強いコピグメント効果を示すことが知られており、たとえば遺伝子組み換えカーネーションの解析ではフラボンが有意なコピグメント効果を示すことが報告されている（非特許文献３）。また、ダッチアイリスにおいて、総デルフィニジン量に対する総フラボン量の比が高いほどコピグメント効果を示し、色が青くなることが報告されている（非特許文献４）。【０００５】
しかしながら、すべての植物がフラボンを生産できるわけではなく、バラやペチュニアなどはフラボンを蓄積しない。したがって、フラバノンからフラボンを合成する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子をこのような植物で発現させ、花色を改変させる試みが行われている(特許文献１)。【０００６】
また、植物では、フラボンは遊離形態の他に配糖体としても分布しており、主にフラボン O-配糖体とフラボン C-配糖体が生成されるが、特にフラボン C-配糖体は強いコピグメント効果を示すことが知られている。例えば、フラボン C-配糖体の一種であるイソビテキシンは、ハナショウブ(Iris ensata Thunb.)においてアントシアニンに対しコピグメント効果を示し、アントシアニンを安定化することにより青い花色を安定化することが報告されている（非特許文献５）。フラボン C-配糖体については、これまでに2つの生合成経路が報告されており、1つはフラバノン2-水酸化酵素及びC-配糖化酵素、脱水酵素が触媒する反応によりフラバノンから合成される。もう一つは、フラボン合成酵素及びフラボンC-配糖化酵素が触媒する反応によりフラバノンから合成される（非特許文献６）。【０００７】
しかしながら、これらの遺伝子をフラボン C-配糖体を生産しない植物に導入したという例はこれまでに報告されていない。また、コピグメント効果は、アントシアニンとフラボンとの量比、アントシアニン及びフラボンにおける糖やアシル基による修飾などの影響を受けるものと考えられ、単にフラボン合成酵素遺伝子を発現させ、フラボンを蓄積させただけでは、花色を青くできるとは限らない。ペチュニアにおいてトレニアのフラボン合成酵素遺伝子を発現させると、青紫色の花色は薄くなってしまう(非特許文献７)。また、リンドウ由来のフラボン合成酵素遺伝子をタバコで発現させたところ、フラボンが合成された（非特許文献８）が、やはり花色は薄くなった。さらに、フラボン及びマルビジンを人為的に含有させることにより、バラの花色を改変する試みが行われているが（特許文献２）、青系花色を有するバラを作出することには成功していない。【０００８】
実際に、これまでの青系花色を目指したバラの花色改変では、紫色（RHSカラーチャート色相グループ：Purpleグループ）や青紫色（Purple-Violetグループ, Violetグループ）が限界であり、紫青色（Violet-Blueグループ）や青色（Blueグループ）の花色をもつ青色のバラは作出されていない。したがって、真に青色の花色をもつバラの作出を可能にするための青色発現制御技術の開発が依然として望まれている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】特開２０００−２７９１８２号公報
【特許文献２】国際公開第２００８／１５６２０６号
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Tanaka 2006 Phytochemistry Reviews 5, 283-291
【非特許文献２】Goto (1987) Prog. Chem. Org. Natl. Prod. 52
【非特許文献３】Fukui et al. Phytochemistry, 63, 15-23, 2003
【非特許文献４】Mizuno et al. Plant Physiol. Bioch. 2013 72, 116-124
【非特許文献５】Yabuya et al. Euphytica 2000 115, 1-5
【非特許文献６】Sasaki et al. FEBS Lett. 2015 589, 182-187
【非特許文献７】Tsuda et al. Plant Biotechnology, 21, 377-386, 2004
【非特許文献８】Nakatuka et al. 2006, Molecular Breeding 17:91-99
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明が解決しようとする課題は、青系花色を有する形質転換植物、又はその自殖もしくは他殖後代、あるいはそれらの栄養繁殖体、植物体の一部、組織、又は細胞を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本願発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意検討し、実験を重ねた結果、デルフィニジン型アントシアニンとフラボン C-配糖体をバラなどの植物の花弁で共存させると、従来得られなかった青系花色（RHSカラーチャート第５版：Violet-Blueグループ／Blueグループかつ／または色相角度：339.7°〜270.0°）を有する形質転換植物が得られることを発見し、本発明を完成するに至った。【００１３】
本発明は、以下の通りである。
［１］  形質転換植物を作製するための方法であって、デルフィニジン型アントシアニンとフラボン C-配糖体を植物の細胞内で共存させることを特徴とする方法。
［２］  前記フラボン C-配糖体が、フラボン 6-C-グルコシド、フラボン 8-C-グルコシド及びそれらの組み合せから成る群から選択される、１に記載の方法。
［３］  前記フラボン C-配糖体が、アピゲニン 6-C-グルコシド、及び／又はルテオリン 6-C-グルコシドである、２に記載の方法。
［４］  前記デルフィニジン型アントシアニンが、マルビジン 3,5-ジグルコシド、デルフィニジン 3,5-ジグルコシド、ペチュニジン 3,5-ジグルコシド、アシル化アントシアニン（例えば、デルフィニジン 3-(6’’-p-クマロイル-β-グルコシル)-5-β-グルコシド又はデルフィニジン 3-(6’’-p-マロニル-β-グルコシル)-3’,5’-β-ジグルコシド）及びそれらの組み合せから成る群から選択される、１〜３のいずれかに記載の方法。
［５］  フラボン合成酵素（FNS）遺伝子又はそのホモログ、及びフラボン C-配糖化酵素（CGT）遺伝子又はそのホモログを含むベクターで宿主植物を形質転換することを含む、１〜４のいずれかに記載の方法。
［６］  前記ベクターが、フラボノイド F3’5’水酸化酵素（F3'5'H）遺伝子又はそのホモログ、及びメチル基転移酵素(MT)遺伝子又はそのホモログをさらに含む、５に記載の方法。
［７］  前記FNS遺伝子又はそのホモログが、
（１−ａ）配列番号１９の塩基配列からなるポリヌクレオチド；
（１−ｂ）配列番号１９の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェント条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドであって、（１−ａ）に記載のポリヌクレオチドと同様の活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（１−ｃ）配列番号２０のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（１−ｄ）配列番号２０のアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、（１−ｃ）に記載のポリヌクレオチドと同様の活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（１−ｅ）配列番号２０のアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ、（１−ｃ）に記載のポリヌクレオチドと同様の活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド、からなる群から選択され、
前記CGT遺伝子又はそのホモログが、
（２−ａ）配列番号２１の塩基配列からなるポリヌクレオチド；
（２−ｂ）配列番号２１の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェント条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドであって、（２−ａ）に記載のポリヌクレオチドと同様の活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（２−ｃ）配列番号２２のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（２−ｄ）配列番号２２のアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、（２−ｃ）に記載のポリヌクレオチドと同様の活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（２−ｅ）配列番号２２のアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ、（２−ｃ）に記載のポリヌクレオチドと同様の活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド、からなる群から選択され、
前記F3'5'H遺伝子又はそのホモログが、
（３−ａ）配列番号９の塩基配列からなるポリヌクレオチド；
（３−ｂ）配列番号９の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェント条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドであって、（３−ａ）に記載のポリヌクレオチドと同様の活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（３−ｃ）配列番号１０のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（３−ｄ）配列番号１０のアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、（３−ｃ）に記載のポリヌクレオチドと同様の活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（３−ｅ）配列番号１０のアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ、（３−ｃ）に記載のポリヌクレオチドと同様の活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド、からなる群から選択され、そして
前記MT遺伝子又はそのホモログが、
（４−ａ）配列番号１７の塩基配列からなるポリヌクレオチド；
（４−ｂ）配列番号１７の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェント条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドであって、（４−ａ）に記載のポリヌクレオチドと同様の活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（４−ｃ）配列番号１８のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（４−ｄ）配列番号１８のアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、（４−ｃ）に記載のポリヌクレオチドと同様の活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（４−ｅ）配列番号１８のアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ、（４−ｃ）に記載のポリヌクレオチドと同様の活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド、からなる群から選択される、６に記載の方法。
［８］  前記CGT遺伝子又はそのホモログにシロイヌナズナ アルコール脱水素酵素（ADH）遺伝子由来5’非翻訳領域（5’-UTR）（配列番号２３）が付加されている、７に記載の方法。
［９］  フラバノン 2-水酸化酵素（F2H）遺伝子又はそのホモログ、フラボン C-配糖化酵素（CGT）遺伝子又はそのホモログ、及び脱水酵素（FDH）遺伝子又はそのホモログを含むベクターで宿主植物を形質転換することを含む、１〜４のいずれかに記載の方法。
［１０］  前記ベクターが、フラボノイド F3’5’水酸化酵素（F3'5'H）遺伝子又はそのホモログ、及びメチル基転移酵素(MT)遺伝子又はそのホモログをさらに含む、９に記載の方法。
［１１］  前記F2H遺伝子又はそのホモログが、
（５−ａ）配列番号３の塩基配列からなるポリヌクレオチド；
（５−ｂ）配列番号３の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェント条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドであって、（５−ａ）に記載のポリヌクレオチドと同様の活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（５−ｃ）配列番号４のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（５−ｄ）配列番号４のアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、（５−ｃ）に記載のポリヌクレオチドと同様の活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（５−ｅ）配列番号４のアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ、（５−ｃ）に記載のポリヌクレオチドと同様の活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド、からなる群から選択され、
前記CGT遺伝子又はそのホモログが、
（６−ａ）配列番号１３の塩基配列からなるポリヌクレオチド；
（６−ｂ）配列番号１３の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェント条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドであって、（６−ａ）に記載のポリヌクレオチドと同様の活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（６−ｃ）配列番号１４のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（６−ｄ）配列番号１４のアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、（６−ｃ）に記載のポリヌクレオチドと同様の活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（６−ｅ）配列番号１４のアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ、（６−ｃ）に記載のポリヌクレオチドと同様の活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド、からなる群から選択され、
前記FDH遺伝子又はそのホモログが、
（７−ａ）配列番号１５の塩基配列からなるポリヌクレオチド；
（７−ｂ）配列番号１５の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェント条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドであって、（７−ａ）に記載のポリヌクレオチドと同様の活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（７−ｃ）配列番号１６のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（７−ｄ）配列番号１６のアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、（７−ｃ）に記載のポリヌクレオチドと同様の活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（７−ｅ）配列番号１６のアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ、（７−ｃ）に記載のポリヌクレオチドと同様の活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド、からなる群から選択され、
前記F3'5'H遺伝子又はそのホモログが、
（８−ａ）配列番号９の塩基配列からなるポリヌクレオチド；
（８−ｂ）配列番号９の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェント条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドであって、（８−ａ）に記載のポリヌクレオチドと同様の活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（８−ｃ）配列番号１０のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（８−ｄ）配列番号１０のアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、（８−ｃ）に記載のポリヌクレオチドと同様の活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（８−ｅ）配列番号１０のアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ、（８−ｃ）に記載のポリヌクレオチドと同様の活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド、からなる群から選択され、そして
前記MT遺伝子又はそのホモログが、
（９−ａ）配列番号１７の塩基配列からなるポリヌクレオチド；
（９−ｂ）配列番号１７の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェント条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドであって、（９−ａ）に記載のポリヌクレオチドと同様の活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（９−ｃ）配列番号１８のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（９−ｄ）配列番号１８のアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、（９−ｃ）に記載のポリヌクレオチドと同様の活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（９−ｅ）配列番号１８のアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ、（９−ｃ）に記載のポリヌクレオチドと同様の活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド、からなる群から選択される、１０に記載の方法。
［１２］  細胞内にデルフィニジン型アントシアニンとフラボン C-配糖体が共存していることを特徴とする形質転換植物、又はその自殖もしくは他殖後代。
［１３］  前記フラボン C-配糖体が、フラボン 6-C-グルコシド、フラボン 8-C-グルコシド及びそれらの組み合せから成る群から選択される、１２に記載の形質転換植物、又はその自殖もしくは他殖後代。
［１４］  前記フラボン C-配糖体が、アピゲニン 6-C-グルコシドである、１３に記載の形質転換植物、又はその自殖もしくは他殖後代。
［１５］  前記デルフィニジン型アントシアニンが、マルビジン 3,5-ジグルコシド、デルフィニジン 3,5-ジグルコシド、ペチュニジン 3,5-ジグルコシド、アシル化アントシアニン（例えば、デルフィニジン 3-(6’’-p-クマロイル-β-グルコシル)-5-β-グルコシド又はデルフィニジン 3-(6’’-p-マロニル-β-グルコシル)-3’,5’-β-ジグルコシド）及びそれらの組み合せから成る群から選択される、１２〜１４のいずれかに記載の形質転換植物、又はその自殖もしくは他殖後代。
［１６］  フラボン合成酵素（FNS）遺伝子又はそのホモログ、及びフラボン C-配糖化酵素（CGT）遺伝子又はそのホモログを含む、１２〜１５のいずれかに記載の形質転換植物、又はその自殖もしくは他殖後代。
［１７］  フラボノイド F3’5’水酸化酵素（F3'5'H）遺伝子又はそのホモログ、及びメチル基転移酵素(MT)遺伝子又はそのホモログをさらに含む、１６に記載の形質転換植物、又はその自殖もしくは他殖後代。
［１８］  前記FNS遺伝子又はそのホモログが、
（１−ａ）配列番号１９の塩基配列からなるポリヌクレオチド；
（１−ｂ）配列番号１９の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェント条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドであって、（１−ａ）に記載のポリヌクレオチドと同様の活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（１−ｃ）配列番号２０のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（１−ｄ）配列番号２０のアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、（１−ｃ）に記載のポリヌクレオチドと同様の活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（１−ｅ）配列番号２０のアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ、（１−ｃ）に記載のポリヌクレオチドと同様の活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド、からなる群から選択され、
前記CGT遺伝子又はそのホモログが、
（２−ａ）配列番号２１の塩基配列からなるポリヌクレオチド；
（２−ｂ）配列番号２１の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェント条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドであって、（２−ａ）に記載のポリヌクレオチドと同様の活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（２−ｃ）配列番号２２のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（２−ｄ）配列番号２２のアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、（２−ｃ）に記載のポリヌクレオチドと同様の活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（２−ｅ）配列番号２２のアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ、（２−ｃ）に記載のポリヌクレオチドと同様の活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド、からなる群から選択され、
前記F3'5'H遺伝子又はそのホモログが、
（３−ａ）配列番号９の塩基配列からなるポリヌクレオチド；
（３−ｂ）配列番号９の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェント条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドであって、（３−ａ）に記載のポリヌクレオチドと同様の活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（３−ｃ）配列番号１０のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（３−ｄ）配列番号１０のアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、（３−ｃ）に記載のポリヌクレオチドと同様の活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（３−ｅ）配列番号１０のアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ、（３−ｃ）に記載のポリヌクレオチドと同様の活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド、からなる群から選択され、そして
前記MT遺伝子又はそのホモログが、
（４−ａ）配列番号１７の塩基配列からなるポリヌクレオチド；
（４−ｂ）配列番号１７の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェント条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドであって、（４−ａ）に記載のポリヌクレオチドと同様の活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（４−ｃ）配列番号１８のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（４−ｄ）配列番号１８のアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、（４−ｃ）に記載のポリヌクレオチドと同様の活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（４−ｅ）配列番号１８のアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ、（４−ｃ）に記載のポリヌクレオチドと同様の活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド、からなる群から選択される、１７に記載の形質転換植物、又はその自殖もしくは他殖後代。
［１９］  前記CGT遺伝子又はそのホモログにシロイヌナズナ アルコール脱水素酵素（ADH）遺伝子由来5’非翻訳領域（5’-UTR）（配列番号２３）が付加されている、１８に記載の形質転換植物、又はその自殖もしくは他殖後代。
［２０］  フラバノン 2-水酸化酵素（F2H）遺伝子又はそのホモログ、フラボン C-配糖化酵素（CGT）遺伝子又はそのホモログ、及び脱水酵素（FDH）遺伝子又はそのホモログを含む、１２〜１５のいずれかに記載の形質転換植物、又はその自殖もしくは他殖後代。
［２１］  フラボノイド F3’5’水酸化酵素（F3'5'H）遺伝子又はそのホモログ、及びメチル基転移酵素(MT)遺伝子又はそのホモログをさらに含む、２０に記載の形質転換植物、又はその自殖もしくは他殖後代。
［２２］  前記F2H遺伝子又はそのホモログが、
（５−ａ）配列番号３の塩基配列からなるポリヌクレオチド；
（５−ｂ）配列番号３の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェント条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドであって、（５−ａ）に記載のポリヌクレオチドと同様の活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（５−ｃ）配列番号４のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（５−ｄ）配列番号４のアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、（５−ｃ）に記載のポリヌクレオチドと同様の活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（５−ｅ）配列番号４のアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ、（５−ｃ）に記載のポリヌクレオチドと同様の活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド、からなる群から選択され、
前記CGT遺伝子又はそのホモログが、
（６−ａ）配列番号１３の塩基配列からなるポリヌクレオチド；
（６−ｂ）配列番号１３の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェント条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドであって、（６−ａ）に記載のポリヌクレオチドと同様の活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（６−ｃ）配列番号１４のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（６−ｄ）配列番号１４のアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、（６−ｃ）に記載のポリヌクレオチドと同様の活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（６−ｅ）配列番号１４のアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ、（６−ｃ）に記載のポリヌクレオチドと同様の活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド、からなる群から選択され、
前記FDH遺伝子又はそのホモログが、
（７−ａ）配列番号１５の塩基配列からなるポリヌクレオチド；
（７−ｂ）配列番号１５の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェント条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドであって、（７−ａ）に記載のポリヌクレオチドと同様の活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（７−ｃ）配列番号１６のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（７−ｄ）配列番号１６のアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、（７−ｃ）に記載のポリヌクレオチドと同様の活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（７−ｅ）配列番号１６のアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ、（７−ｃ）に記載のポリヌクレオチドと同様の活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド、からなる群から選択され、
前記F3'5'H遺伝子又はそのホモログが、
（８−ａ）配列番号９の塩基配列からなるポリヌクレオチド；
（８−ｂ）配列番号９の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェント条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドであって、（８−ａ）に記載のポリヌクレオチドと同様の活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（８−ｃ）配列番号１０のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（８−ｄ）配列番号１０のアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、（８−ｃ）に記載のポリヌクレオチドと同様の活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（８−ｅ）配列番号１０のアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ、（８−ｃ）に記載のポリヌクレオチドと同様の活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド、からなる群から選択され、そして
前記MT遺伝子又はそのホモログが、
（９−ａ）配列番号１７の塩基配列からなるポリヌクレオチド；
（９−ｂ）配列番号１７の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェント条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドであって、（９−ａ）に記載のポリヌクレオチドと同様の活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（９−ｃ）配列番号１８のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（９−ｄ）配列番号１８のアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、（９−ｃ）に記載のポリヌクレオチドと同様の活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（９−ｅ）配列番号１８のアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ、（９−ｃ）に記載のポリヌクレオチドと同様の活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド、からなる群から選択される、２１に記載の形質転換植物、又はその自殖もしくは他殖後代。
［２３］  RHSカラーチャートでBlueグループもしくはViolet-Blueグループ、かつ／又はCIEL*a*b*表色系の色相角度で339.7°〜270.0°の花色を有する、１２〜２２のいずれかに記載の形質転換植物、又はその自殖もしくは他殖後代。
［２４］  １２〜２３のいずれかに記載の形質転換植物、又はその自殖もしくは他殖後代の栄養繁殖体、植物体の一部、組織、又は細胞。
［２５］  １２〜２３のいずれかに記載の形質転換植物、又はその自殖もしくは他殖後代の切り花、又は該切り花から作成された加工品。
［２６］  フラボン合成酵素（FNS）遺伝子又はそのホモログ、及びフラボン C-配糖化酵素（CGT）遺伝子又はそのホモログを含むベクター。
［２７］  フラボノイド F3’5’水酸化酵素（F3'5'H）遺伝子又はそのホモログ、及びメチル基転移酵素(MT)遺伝子又はそのホモログをさらに含む、２６に記載のベクター。
［２８］  前記FNS遺伝子又はそのホモログが、
（１−ａ）配列番号１９の塩基配列からなるポリヌクレオチド；
（１−ｂ）配列番号１９の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェント条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドであって、（１−ａ）に記載のポリヌクレオチドと同様の活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（１−ｃ）配列番号２０のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（１−ｄ）配列番号２０のアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、（１−ｃ）に記載のポリヌクレオチドと同様の活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（１−ｅ）配列番号２０のアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ、（１−ｃ）に記載のポリヌクレオチドと同様の活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド、からなる群から選択され、
前記CGT遺伝子又はそのホモログが、
（２−ａ）配列番号２１の塩基配列からなるポリヌクレオチド；
（２−ｂ）配列番号２１の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェント条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドであって、（２−ａ）に記載のポリヌクレオチドと同様の活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（２−ｃ）配列番号２２のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（２−ｄ）配列番号２２のアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、（２−ｃ）に記載のポリヌクレオチドと同様の活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（２−ｅ）配列番号２２のアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ、（２−ｃ）に記載のポリヌクレオチドと同様の活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド、からなる群から選択され、
前記F3'5'H遺伝子又はそのホモログが、
（３−ａ）配列番号９の塩基配列からなるポリヌクレオチド；
（３−ｂ）配列番号９の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェント条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドであって、（３−ａ）に記載のポリヌクレオチドと同様の活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（３−ｃ）配列番号１０のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（３−ｄ）配列番号１０のアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、（３−ｃ）に記載のポリヌクレオチドと同様の活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（３−ｅ）配列番号１０のアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ、（３−ｃ）に記載のポリヌクレオチドと同様の活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド、からなる群から選択され、そして
前記MT遺伝子又はそのホモログが、
（４−ａ）配列番号１７の塩基配列からなるポリヌクレオチド；
（４−ｂ）配列番号１７の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェント条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドであって、（４−ａ）に記載のポリヌクレオチドと同様の活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（４−ｃ）配列番号１８のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（４−ｄ）配列番号１８のアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、（４−ｃ）に記載のポリヌクレオチドと同様の活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（４−ｅ）配列番号１８のアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ、（４−ｃ）に記載のポリヌクレオチドと同様の活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド、からなる群から選択される、２７に記載のベクター。
［２９］  前記CGT遺伝子又はそのホモログにシロイヌナズナ アルコール脱水素酵素（ADH）遺伝子由来5’非翻訳領域（5’-UTR）（配列番号２３）が付加されている、２８に記載のベクター。
［３０］  フラバノン 2-水酸化酵素（F2H）遺伝子又はそのホモログ、フラボン C-配糖化酵素（CGT）遺伝子又はそのホモログ、及び脱水酵素（FDH）遺伝子又はそのホモログを含むベクター。
［３１］  フラボノイド F3’5’水酸化酵素（F3'5'H）遺伝子又はそのホモログ、及びメチル基転移酵素(MT)遺伝子又はそのホモログをさらに含む、３０に記載のベクター。
［３２］  前記F2H遺伝子又はそのホモログが、
（５−ａ）配列番号３の塩基配列からなるポリヌクレオチド；
（５−ｂ）配列番号３の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェント条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドであって、（５−ａ）に記載のポリヌクレオチドと同様の活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（５−ｃ）配列番号４のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（５−ｄ）配列番号４のアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、（５−ｃ）に記載のポリヌクレオチドと同様の活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（５−ｅ）配列番号４のアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ、（５−ｃ）に記載のポリヌクレオチドと同様の活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド、からなる群から選択され、
前記CGT遺伝子又はそのホモログが、
（６−ａ）配列番号１３の塩基配列からなるポリヌクレオチド；
（６−ｂ）配列番号１３の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェント条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドであって、（６−ａ）に記載のポリヌクレオチドと同様の活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（６−ｃ）配列番号１４のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（６−ｄ）配列番号１４のアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、（６−ｃ）に記載のポリヌクレオチドと同様の活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（６−ｅ）配列番号１４のアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ、（６−ｃ）に記載のポリヌクレオチドと同様の活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド、からなる群から選択され、
前記FDH遺伝子又はそのホモログが、
（７−ａ）配列番号１５の塩基配列からなるポリヌクレオチド；
（７−ｂ）配列番号１５の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェント条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドであって、（７−ａ）に記載のポリヌクレオチドと同様の活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（７−ｃ）配列番号１６のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（７−ｄ）配列番号１６のアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、（７−ｃ）に記載のポリヌクレオチドと同様の活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（７−ｅ）配列番号１６のアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ、（７−ｃ）に記載のポリヌクレオチドと同様の活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド、からなる群から選択され、
前記F3'5'H遺伝子又はそのホモログが、
（８−ａ）配列番号９の塩基配列からなるポリヌクレオチド；
（８−ｂ）配列番号９の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェント条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドであって、（８−ａ）に記載のポリヌクレオチドと同様の活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（８−ｃ）配列番号１０のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（８−ｄ）配列番号１０のアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、（８−ｃ）に記載のポリヌクレオチドと同様の活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（８−ｅ）配列番号１０のアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ、（８−ｃ）に記載のポリヌクレオチドと同様の活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド、からなる群から選択され、そして
前記MT遺伝子又はそのホモログが、
（９−ａ）配列番号１７の塩基配列からなるポリヌクレオチド；
（９−ｂ）配列番号１７の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェント条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドであって、（９−ａ）に記載のポリヌクレオチドと同様の活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（９−ｃ）配列番号１８のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（９−ｄ）配列番号１８のアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、（９−ｃ）に記載のポリヌクレオチドと同様の活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（９−ｅ）配列番号１８のアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ、（９−ｃ）に記載のポリヌクレオチドと同様の活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド、からなる群から選択される、３１に記載のベクター。
［３３］  （６−ａ）配列番号１３の塩基配列からなるポリヌクレオチド；
（６−ｂ）配列番号１３の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェント条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドであって、（６−ａ）に記載のポリヌクレオチドと同様の活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（６−ｃ）配列番号１４のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（６−ｄ）配列番号１４のアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、（６−ｃ）に記載のポリヌクレオチドと同様の活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（６−ｅ）配列番号１４のアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ、（６−ｃ）に記載のポリヌクレオチドと同様の活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド、からなる群から選択される、単離されたポリヌクレオチド。
【発明の効果】
【００１４】
本発明により、従来得られなかった青系花色（RHSカラーチャート第５版：Violet-Blueグループ／Blueグループかつ／または色相角度：339.7°〜270.0°）を有する植物品種を作出できる。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】植物におけるフラボン C-配糖体の生合成経路を示す。
【図２】pSPB6486の構造を示す。
【図３】pSPB7013の構造を示す。
【００１６】
本発明は、青系花色を有する形質転換植物を作製するための方法であって、デルフィニジン型アントシアニンとフラボン C-配糖体を植物の細胞内で共存させることを特徴とする方法に関する。【００１７】
アントシアニンは、植物において広く存在する色素群であり、赤色、青色、紫色の花色を呈することが知られている。アグリコンであるアントシアニジン部位のＢ環のヒドロキシ基の数により、ペラルゴジニン、シアニジン及びデルフィニジンの3系統に分類される。発色団はアグリコン部分であり、ペラルゴニジン系アントシアニンは鮮赤色、シアニジン系アントシアニンは赤紫色、デルフィニジン系アントシアニンは紫赤色を呈する。本願明細書中、例えば、「デルフィニジン系アントシアニン」は、デルフィニジン、マルビジン、ペチュニジン、又はそれらの誘導体が挙げられるが、好ましくはマルビジンである。【００１８】
デルフィニジン系アントシアニンは、フラボン、フラボノール、有機酸エステル類、タンニン類などの物質と共存することで、それらと分子間相互作用をして青みを帯びた色を発現する場合がある。この現象はコピグメント作用と呼ばれ、このような現象を引き起こす物質はコピグメント（補助色素）と呼ばれる。コピグメント作用には青色の発現を引き起こす深色効果だけで無く、濃色効果や色の安定性向上の効果もある。本発明者らは、このたび、デルフィニジン系アントシアニンとフラボン C-配糖体とのコピグメント作用により、バラの花弁が青色発現することを確認した。【００１９】
フラボンは、有機化合物の一種で、フラバン誘導体の環状ケトンであり、植物内では、主に配糖体として存在する。フラボンは、狭義には化学式Ｃ15Ｈ10Ｏ2、分子量222.24の化合物、2,3-ジデヒドロフラバン-4-オンを指すが、広義のフラボン（フラボン類）は、フラボノイドのカテゴリーの１つであり、フラボノイドの中でフラボン構造を基本骨格とし、さらに3位に水酸基を持たないものが「フラボン」に分類される。本願明細書中、「フラボン C-配糖体」は、広義のフラボン、すなわち、フラボン類に属する誘導体の配糖体のうち、アルドースのアノメリック炭素に直接アグリコンが結合した配糖体を意味する。フラボン C-配糖体としては、ルテオリン C-配糖体、トリセチン C-配糖体、アピゲニン C-配糖体、アカセチン C-配糖体が挙げられるがこれらに限定されない。フラボン C-配糖体はまた、アピゲニン、ルテオリン、トリセチン、アカセチン誘導体の配糖体も含む。植物においては、フラボン C-配糖体の生合成経路として２つの経路が知られている（図１）。経路１では、フラバノン 2-水酸化酵素（F2H）、フラボン C-配糖化酵素（CGT）、及び脱水酵素（FDH）の作用を介して、フラボン 6-C-グルコシド及びフラボン 8-C-グルコシドが産生される。一方、経路２では、フラボン合成酵素（FNS）、及びフラボン C-配糖化酵素（CGT）の作用を介して、フラボン 6-C-グルコシドが産生される。フラボン C-配糖体は、フラボン 6-C-グルコシド、フラボン 8-C-グルコシド及びそれらの組み合せから成る群から選択されることが好ましく、例えば、アピゲニン6-C-グルコシド（イソビテキシン）、アピゲニン8-C-グルコシド（ビテキシン）、ルテオリン6-C-グルコシド（イソオリエンチン）、ルテオリン8-C-グルコシド（オリエンチン）、又はそれらの誘導体が挙げられる。【００２０】
植物の細胞内におけるフラボン C-配糖体の蓄積は、経路１における必須遺伝子（すなわち、フラバノン 2-水酸化酵素（F2H）遺伝子、フラボン C-配糖化酵素（CGT）遺伝子、及び脱水酵素（FDH）遺伝子）又はそれらのホモログを含むベクター、あるいは、経路２における必須遺伝子（すなわち、フラボン合成酵素（FNS）遺伝子、及びフラボン C-配糖化酵素（CGT）遺伝子）又はそれらのホモログを含むベクターで宿主植物を形質転換することによって達成できる。【００２１】
経路１における必須遺伝子であるF2H遺伝子又はそのホモログは、所望の機能を有する限りその起源については特に制限されないが、好ましくはカンゾウ由来のF2H遺伝子又はそのホモログであり、以下のポリヌクレオチド：
（ａ）配列番号３の塩基配列からなるポリヌクレオチド；
（ｂ）配列番号３の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェント条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドであって、（ａ）に記載のポリヌクレオチドと同様の活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｃ）配列番号４のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｄ）配列番号４のアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、（ｃ）に記載のポリヌクレオチドと同様の活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｅ）配列番号４のアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ、（ｃ）に記載のポリヌクレオチドと同様の活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド、からなる群から選択される。【００２２】
経路１における必須遺伝子であるCGT遺伝子又はそのホモログは、所望の機能を有する限りその起源については特に制限されないが、好ましくはイネ由来のコドンUsage改変CGT遺伝子又はそのホモログであり、以下のポリヌクレオチド：
（ａ）配列番号１３の塩基配列からなるポリヌクレオチド；
（ｂ）配列番号１３の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェント条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドであって、（ａ）に記載のポリヌクレオチドと同様の活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｃ）配列番号１４のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｄ）配列番号１４のアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、（ｃ）に記載のポリヌクレオチドと同様の活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｅ）配列番号１４のアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ、（ｃ）に記載のポリヌクレオチドと同様の活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド、からなる群から選択される。【００２３】
経路１における必須遺伝子であるFDH遺伝子又はそのホモログは、所望の機能を有する限りその起源については特に制限されないが、好ましくはミヤコグサ由来のFDH遺伝子又はそのホモログであり、以下のポリヌクレオチド：
（ａ）配列番号１５の塩基配列からなるポリヌクレオチド；
（ｂ）配列番号１５の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェント条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドであって、（ａ）に記載のポリヌクレオチドと同様の活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｃ）配列番号１６のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｄ）配列番号１６のアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、（ｃ）に記載のポリヌクレオチドと同様の活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｅ）配列番号１６のアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ、（ｃ）に記載のポリヌクレオチドと同様の活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド、からなる群から選択される。【００２４】
経路２における必須遺伝子であるFNS遺伝子又はそのホモログは、所望の機能を有する限りその起源については特に制限されないが、好ましくはトレニア由来のFNS遺伝子又はそのホモログであり、
（ａ）配列番号１９の塩基配列からなるポリヌクレオチド；
（ｂ）配列番号１９の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェント条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドであって、（ａ）に記載のポリヌクレオチドと同様の活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｃ）配列番号２０のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｄ）配列番号２０のアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、（ｃ）に記載のポリヌクレオチドと同様の活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｅ）配列番号２０のアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ、（ｃ）に記載のポリヌクレオチドと同様の活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド、からなる群から選択される。【００２５】
経路２における必須遺伝子であるCGT遺伝子又はそのホモログは、所望の機能を有する限りその起源については特に制限されないが、好ましくはリンドウ由来のCGT遺伝子又はそのホモログであり、
（ａ）配列番号２１の塩基配列からなるポリヌクレオチド；
（ｂ）配列番号２１の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェント条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドであって、（２−ａ）に記載のポリヌクレオチドと同様の活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｃ）配列番号２２のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｄ）配列番号２２のアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、（２−ｃ）に記載のポリヌクレオチドと同様の活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｅ）配列番号２２のアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ、（ｃ）に記載のポリヌクレオチドと同様の活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド、からなる群から選択される。【００２６】
経路２における必須遺伝子CGT遺伝子又はそのホモログには、シロイヌナズナ アルコール脱水素酵素（ADH）遺伝子由来5’非翻訳領域（5’-UTR）（配列番号２３）が付加されていることが好ましい。【００２７】
植物の細胞内におけるデルフィニジン系アントシアニンの蓄積は、フラボノイド F3’5’水酸化酵素（F3'5'H）遺伝子又はそのホモログ、及びメチル基転移酵素(MT)遺伝子又はそのホモログを宿主植物に組み込むことによって達成できる（特許文献２）。したがって、経路１における必須遺伝子又はそれらのホモログ、又は経路２における必須遺伝子又はそれらのホモログに加えて、F3'5'H遺伝子又はそのホモログ、及びMT遺伝子又はそのホモログをさらに含むベクターで宿主植物を形質転換することによって、デルフィニジン型アントシアニンとフラボン C-配糖体を宿主植物の細胞内で共存させることができる。【００２８】
F3'5'H遺伝子又はそのホモログは、所望の機能を有する限りその起源については特に制限されないが、好ましくはカンパニュラ由来のF3'5'H遺伝子又はそのホモログであり、
（ａ）配列番号９の塩基配列からなるポリヌクレオチド；
（ｂ）配列番号９の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェント条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドであって、（ａ）に記載のポリヌクレオチドと同様の活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｃ）配列番号１０のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｄ）配列番号１０のアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、（ｃ）に記載のポリヌクレオチドと同様の活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｅ）配列番号１０のアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ、（ｃ）に記載のポリヌクレオチドと同様の活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド、からなる群から選択される。【００２９】
MT遺伝子又はそのホモログは、所望の機能を有する限りその起源については特に制限されないが、好ましくはトレニア由来のMT遺伝子又はそのホモログであり、
（ａ）配列番号１７の塩基配列からなるポリヌクレオチド；
（ｂ）配列番号１７の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェント条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドであって、（ａ）に記載のポリヌクレオチドと同様の活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｃ）配列番号１８のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｄ）配列番号１８のアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、（ｃ）に記載のポリヌクレオチドと同様の活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（ｅ）配列番号１８のアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ、（ｃ）に記載のポリヌクレオチドと同様の活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド、からなる群から選択される。【００３０】
本明細書中、用語「ポリヌクレオチド」は、ＤＮＡ又はＲＮＡを意味する。
本明細書中、用語「ストリンジェント条件」とは、ポリヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドと、ゲノムDNAとの選択的かつ検出可能な特異的結合を可能とする条件である。ストリンジェント条件は、塩濃度、有機溶媒（例えば、ホルムアミド）、温度、及びその他公知の条件の適当な組み合わせによって定義される。すなわち、塩濃度を減じるか、有機溶媒濃度を増加させるか、又はハイブリダイゼーション温度を上昇させるかによってストリンジェンシー（stringency）は増加する。さらに、ハイブリダイゼーション後の洗浄の条件もストリンジェンシーに影響する。この洗浄条件もまた、塩濃度と温度によって定義され、塩濃度の減少と温度の上昇によって洗浄のストリンジェンシーは増加する。したがって、用語「ストリンジェント条件」とは、各塩基配列間の「同一性」の程度が、例えば、全体の平均で約８０％以上、好ましくは約９０％以上、より好ましくは約９５％以上、さらに好ましくは９７％以上、最も好ましくは９８％以上であるような、高い同一性を有する塩基配列間のみで、特異的にハイブリダイズするような条件を意味する。「ストリンジェント条件」としては、例えば、温度６０℃〜６８℃において、ナトリウム濃度１５０〜９００ｍＭ、好ましくは６００〜９００ｍＭ、ｐＨ６〜８であるような条件を挙げることができ、具体例としては、５×ＳＳＣ（750mM NaCl、75mM クエン酸三ナトリウム）、１％ＳＤＳ、５×デンハルト溶液５０％ホルムアルデヒド、及び４２℃の条件でハイブリダイゼーションを行い、０．１×ＳＳＣ（15mM NaCl、1.5mM クエン酸三ナトリウム）、０．１％ＳＤＳ、及び５５℃の条件で洗浄を行うものを挙げることができる。【００３１】
ハイブリダイゼーションは、例えば、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー（Current protocols in molecular biology（edited by Frederick M. Ausubel et al., 1987））に記載の方法等、当業界で公知の方法あるいはそれに準じる方法に従って行なうことができる。また、市販のライブラリーを使用する場合、添付の使用説明書に記載の方法に従って行なうことができる。このようなハイブリダイゼーションによって選択される遺伝子としては、天然由来のもの、例えば、植物由来のもの、植物由来以外のものであってもよい。また、ハイブリダイゼーションによって選択される遺伝子はｃＤＮＡであってもよく、ゲノムＤＮＡであっても化学合成したＤＮＡでもよい。【００３２】
上記「１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列」とは、例えば１〜２０個、好ましくは１〜５個、より好ましくは１〜３個の任意の数のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列を意味する。遺伝子工学的手法の一つである部位特異的変異誘発法は特定の位置に特定の変異を導入できる手法であることから有用であり、Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989等に記載の方法に準じて行うことができる。この変異ＤＮＡを適切な発現系を用いて発現させることにより、１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質を得ることができる。
また、ポリヌクレオチドは、当業者に公知の方法、例えば、ホスホアミダイド法等により化学的に合成する方法、植物の核酸試料を鋳型とし、目的とする遺伝子のヌクレオチド配列に基づいて設計したプライマーを用いる核酸増幅法などによって得ることができる。【００３３】
本明細書中、用語「同一性」とは、ポリペプチド配列（又はアミノ酸配列）あるいはポリヌクレオチド配列（又は塩基配列）における２本の鎖の間で該鎖を構成している各アミノ酸残基同志又は各塩基同志の互いの適合関係において同一であると決定できるようなものの量（数）を意味し、二つのポリペプチド配列又は二つのポリヌクレオチド配列の間の配列相関性の程度を意味するものであり、「同一性」は容易に算出できる。二つのポリヌクレオチド配列又はポリペプチド配列間の同一性を測定する方法は数多く知られており、用語「同一性」は、当業者には周知である（例えば、Lesk, A. M. (Ed.), Computational Molecular Biology, Oxford University Press, New York, (1988); Smith, D. W. (Ed.), Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Academic Press, New York, (1993); Grifin, A. M. & Grifin, H. G. (Ed.), Computer Analysis of Sequence Data: Part I, Human Press, New Jersey, (1994); von Heinje, G., Sequence Analysis in Molecular Biology, Academic Press, New York, (1987); Gribskov, M. & Devereux, J. (Ed.), Sequence Analysis Primer, M-Stockton Press, New York, (1991)等参照）。【００３４】
また、本明細書に記載される「同一性」の数値は、特に明示した場合を除き、当業者に公知の同一性検索プログラムを用いて算出される数値であってよいが、好ましくは、MacVectorアプリケーション（バージョン9.5 Oxford Molecular Ltd.,Oxford,England）のClustalWプログラムを用いて算出される数値である。本発明において、各アミノ酸配列間の「同一性」の程度は、例えば、約９０％以上、好ましくは約９５％以上、さらに好ましくは約９７％以上、最も好ましくは約９８％以上である。【００３５】
本発明のポリヌクレオチド（核酸、遺伝子）は、着目のタンパク質を「コードする」ものである。ここで、「コードする」とは、着目のタンパク質をその活性を備えた状態で発現させるということを意味している。また、「コードする」とは、着目のタンパク質を連続する構造配列（エクソン）としてコードすること、又は介在配列（イントロン）を介してコードすることの両者の意味を含んでいる。【００３６】
生来の塩基配列を有する遺伝子は、例えば、ＤＮＡシークエンサーによる解析によって得られる。また、修飾されたアミノ酸配列を有する酵素をコードするＤＮＡは生来の塩基配列を有するＤＮＡを基礎として、常用の部位特定変異誘発やＰＣＲ法を用いて合成することができる。例えば、修飾したいＤＮＡ断片を生来のｃＤＮＡ又はゲノムＤＮＡの制限酵素処理によって得て、これを鋳型にして、所望の変異を導入したプライマーを用いて部位特定変異誘発やＰＣＲ法を実施し、所望の修飾したＤＮＡ断片を得る。その後、この変異を導入したＤＮＡ断片を目的とする酵素の他の部分をコードするＤＮＡ断片と連結すればよい。
あるいは短縮されたアミノ酸配列からなる酵素をコードするＤＮＡを得るには、例えば、目的とするアミノ酸配列より長いアミノ酸配列、例えば、全長アミノ酸配列をコードするＤＮＡを所望の制限酵素により切断し、その結果得られたＤＮＡ断片が目的とするアミノ酸配列の全体をコードしていない場合は、不足部分の配列からなるＤＮＡ断片を合成し、連結すればよい。【００３７】
また、得られたポリヌクレオチドを大腸菌及び酵母での遺伝子発現系を用いて発現させ、酵素活性を測定することにより、得られたポリヌクレオチドが所望の活性を有するタンパク質をコードすることを確認することができる。【００３８】
本発明は、前記ポリヌクレオチドを含む（組み換え）ベクター、特に発現ベクター、さらに該ベクターによって形質転換された植物にも関する。【００３９】
また、本発明のベクターは、それらを導入する宿主植物の種類に依存して発現制御領域、例えば、プロモーター、ターミネーター、複製起点などを含有する。植物細胞内でポリヌクレオチドを構成的に発現させるプロモーターの例としては、カリフラワーモザイクウィルスの３５Ｓプロモーター、３５Ｓプロモーターのエンハンサー領域を２つ連結したＥｌ2３５Ｓプロモーター、ｒｄ２９Ａ遺伝子プロモーター、ｒｂｃＳプロモーター、ｍａｃ−１プロモーター等が挙げられる。また、組織特異的な遺伝子発現のためには、その組織で特異的に発現する遺伝子のプロモーターを用いることができる。【００４０】
ベクターの作製は、制限酵素、リガーゼなどを用いて常法に従って行うことができる。また、発現ベクターによる宿主植物の形質転換も常法に従って行うことができる。【００４１】
現在の技術水準の下では、植物にポリヌクレオチドを導入し、そのポリヌクレオチドを構成的又は組織特異的に発現させる技術を利用することができる。植物へのＤＮＡの導入は、当業者に公知の方法、例えば、アグロバクテリウム法、バイナリーベクター法、エレクトロポレーション法、ＰＥＧ法、パーティクルガン法等によって行なうことができる。【００４２】
本発明中、宿主に用いることができる植物は、特に制限されないが、バラ科バラ属、キク科キク属、ナデシコ科ナデシコ属（カーネーションなど）の植物を用いることができ、特に好ましくはバラ科バラ属の栽培バラ（学名  Rosa hybrida)である。なお本明細書で使用する用語「バラ植物」とは、分類学上の位置づけではバラ科バラ属の栽培バラ（学名  Rosa hybrida)のことをいう。バラは、樹形と花の大きさにより主にハイブリッド・ティー系、フロリバンダ系、ポリアンサ系などに分けられるが、いずれの系統でも花弁に含まれる主要な色素（アントシアニン）はシアニジン型とペラルゴニジン型の２種類のみである。本発明において宿主に用いられるバラ植物の種類については特に制限されず、これらの品種や系統に好適に用いることができる。例えば、宿主として用いることができるバラ品種としては、オーシャンソング、ノブレス、リタ・パフューメラ、クールウォーター、フェイム、トップレス、ピーチアヴァランチェなどが挙げられる。【００４３】
本発明により、細胞内でデルフィニジン型アントシアニンとフラボン C-配糖体が共存している、青系花色を有する形質転換植物、好ましくは、バラ科バラ属、キク科キク属、又はナデシコ科ナデシコ属（カーネーションなど）、特に好ましくはバラ植物が得られる。得られた形質転換植物は、RHSカラーチャートでBlueグループもしくはViolet-Blueグループ、かつ／又はCIEL*a*b*表色系の色相角度で339.7°〜270.0°の花色を示す。【００４４】
さらに、本発明は、上記で得られた形質転換植物又はその自殖もしくは他殖後代の切り花、それらの栄養繁殖体、植物体の一部、組織、又は細胞、あるいは切り花から作成された加工品（特に切花加工品）にも関する。ここで、切花加工品としては、当該切花を用いた押し花、プリザードフラワー、ドライフラワー、樹脂密封品などを含むが、これに限定されるものではない。【００４５】
以下、実施例により、本発明を具体的に説明する。
【実施例】
【００４６】
［実施例１：アントシアニンに対するフラボン C-配糖体のコピグメント効果のシミュレーション］
アントシアニンに対するフラボン C-配糖体のコピグメント効果のシミユレーションを行うため、アントシアニン及びフラボン C-配糖体を調整した。本実験に用いたマルビン（マルビジン 3,5-ジグルコシド）及びイソビテキシン（アピゲニン 6-C-グルコシド）はフナコシ株式会社より購入した。
このようにして入手したアントシアニン（マルビン）に対してフラボン C-配糖体（イソビテキシン）を、pH4.5の緩衝液中、0、2、4当量のモル濃度比で添加し、吸収スペクトルを測定した。アントシアニンの濃度は0.5mMとした。
フラボン C-配糖体の添加により、アントシアニン水溶液の吸光度は増大し、吸収極大（λmax）はフラボン C-配糖体の添加とともに長波長側へシフトした。このことから、マルビンはイソビテキシンのコピグメント効果を受けることが判明した。【００４７】
【表１】
2019069946.tif 000002
【００４８】
［実施例２：（経路１）バラ品種「リタ・パフューメラ」へのパンジー由来F3’5’H#40遺伝子とカンゾウ由来F2H遺伝子、イネ由来CGT遺伝子、カンゾウ由来FDH遺伝子の導入］
pSPB4743は、pBINPLUSを基本骨格とし、以下の4つの発現カセットが含まれている。
（１）El235Sプロモーターとパンジー由来F3’5’H 完全長cDNA（配列番号１）とD8ターミネーター
（２）35Sプロモーターとカンゾウ由来F2H 完全長cDNA（配列番号３）とシソ由来ATターミネーター
（３）35Sプロモーターとイネ由来CGT 完全長cDNA（配列番号５）とシソ由来ATターミネーター
（４）35Sプロモーターとカンゾウ由来FDH 完全長cDNA（配列番号７）とシソ由来ATターミネーター
本プラスミドは植物においては、パンジーのF3',5'H#40遺伝子、カンゾウのF2H遺伝子、イネのCGT遺伝子、カンゾウのFDH遺伝子を構成的に発現する。
このようにして作製したpSPB4743を橙色系バラ品種「リタ・パフューメラ」へ導入し、計16個体の形質転換体を得た。これらの色素分析を行った結果、15個体でデルフィニジンの蓄積を確認でき、デルフィニジン含有率は最高94％（平均89.5％）であった。さらに、このうち10個体でフラボン C-配糖体であるイソビテキシンが確認でき、その生成量は最高で花弁新鮮重量1gあたり0.55mgであった。【００４９】
形質転換体の分析値を下表２に示す。
【表２】
2019069946.tif 000003
宿主：リタ・パフューメラ
Del：デルフィニジン、Cya：シアニジン、Pel：ペラルゴニジン
M：ミリセチン、Q：クェルセチン、K：ケンフェロール
Tri：トリセチン、Lut：ルテオリン、Api：アピゲニン、IVX：イソビテキシン
Del（%）：総アントシアニジン中のデルフィニジンの割合【００５０】
［実施例３：（経路１）バラ品種「ノブレス」へのパンジー由来F3’5’H#40遺伝子とカンゾウ由来F2H遺伝子、イネ由来CGT遺伝子、カンゾウ由来FDH遺伝子の導入］
実施例２と同様にして作製したpSPB4743を桃色系バラ品種「ノブレス」へ導入し、計20個体の形質転換体を得た。これらの色素分析を行った結果、すべての個体でデルフィニジンの蓄積を確認でき、デルフィニジン含有率は最高88％（平均83.5％）であった。さらに、このうち18個体でフラボン C-配糖体であるイソビテキシンが確認でき、その生成量は最高で花弁新鮮重量1gあたり0.06mgであった。【００５１】
代表的な形質転換体の分析値を下表３に示す。
【表３】
2019069946.tif 000004
宿主：ノブレス
Del：デルフィニジン、Cya：シアニジン、Pel：ペラルゴニジン
M：ミリセチン、Q：クェルセチン、K：ケンフェロール
Tri：トリセチン、Lut：ルテオリン、Api：アピゲニン、IVX：イソビテキシン
Del（%）：総アントシアニジン中のデルフィニジンの割合【００５２】
［実施例４：（経路１）バラ品種「リタ・パフューメラ」へのカンパニュラ由来F3’5’H遺伝子とカンゾウ由来F2H遺伝子、イネ由来CGT遺伝子、イネ由来FDH遺伝子の導入］
pSPB6188は、pBINPLUSを基本骨格とし、以下の4つの発現カセットが含まれている。
（１）El235Sプロモーターとカンパニュラ由来F3’5’H 完全長cDNA（配列番号９）とD8ターミネーター
（２）35Sプロモーターとカンゾウ由来F2H 完全長cDNA（配列番号３）とシソ由来ATターミネーター
（３）El235Sプロモーターとイネ由来CGT 完全長cDNA（配列番号５）とシソ由来ATターミネーター
（４）El235Sプロモーターとイネ由来FDH 完全長cDNA（配列番号１１）とシロイヌナズナ由来HSPターミネーター
本プラスミドは植物においてはカンパニュラのF3',5'H遺伝子とカンゾウのF2H遺伝子、イネのCGT遺伝子、イネのFDH遺伝子を構成的に発現する。
このようにして作製したpSPB6188を橙色系バラ品種「リタ・パフューメラ」へ導入し、計77個体の形質転換体を得た。これらの色素分析を行った結果、68個体でデルフィニジンの蓄積を確認でき、デルフィニジン含有率は最高99.6％（平均93.3％）であった。さらに、このうち57個体でフラボン C-配糖体であるイソビテキシンが確認でき、その生成量は最高で花弁新鮮重量1gあたり0.72mgであった。【００５３】
代表的な形質転換体の分析値を下表４に示す。
【表４】
2019069946.tif 000005
宿主：リタ・パフューメラ
Del：デルフィニジン、Cya：シアニジン、Pel：ペラルゴニジン
M：ミリセチン、Q：クェルセチン、K：ケンフェロール
Tri：トリセチン、Lut：ルテオリン、Api：アピゲニン、IVX：イソビテキシン
Del（%）：総アントシアニジン中のデルフィニジンの割合【００５４】
［実施例５：（経路１）バラ品種「ノブレス」へのカンパニュラ由来F3’5’H遺伝子とカンゾウ由来F2H遺伝子、イネ由来CGT遺伝子、イネ由来FDH遺伝子の導入］
実施例４と同様にして作製したpSPB6188を桃色系バラ品種「ノブレス」へ導入し、計51個体の形質転換体を得た。これらの色素分析を行った結果、すべての個体でデルフィニジンの蓄積を確認でき、デルフィニジン含有率は最高99.7％（平均66.9％）であった。さらに、このうち48個体でフラボン C-配糖体であるイソビテキシンが確認でき、イソビテキシンの生成量は最高で花弁新鮮重量1gあたり0.58mgであった。【００５５】
代表的な形質転換体の分析値を下表５に示す。
【表５】
2019069946.tif 000006
宿主：ノブレス
Del：デルフィニジン、Cya：シアニジン、Pel：ペラルゴニジン
M：ミリセチン、Q：クェルセチン、K：ケンフェロール
Tri：トリセチン、Lut：ルテオリン、Api：アピゲニン、IVX：イソビテキシン
Del（%）：総アントシアニジン中のデルフィニジンの割合【００５６】
［実施例６：（経路１）バラ品種「リタ・パフューメラ」へのパンジー由来F3’5’H#40遺伝子とカンゾウ由来F2H遺伝子、イネ由来コドンUsage改変CGT遺伝子、ミヤコグサ由来FDH遺伝子の導入］
pSPB5588は、pBINPLUSを基本骨格とし、以下の4つの発現カセットが含まれている。
（１）El235Sプロモーターとパンジー由来F3’5’H 完全長cDNA（配列番号１）とD8ターミネーター
（２）35Sプロモーターとカンゾウ由来F2H 完全長cDNA（配列番号３）とシソ由来ATターミネーター
（３）35Sプロモーターとイネ由来コドンUsage改変CGT 完全長cDNA（配列番号１３）とシロイヌナズナ由来HSPターミネーター
（４）35Sプロモーターとミヤコグサ由来FDH 完全長cDNA（配列番号１５）とシロイヌナズナ由来HSPターミネーター
本プラスミドは植物においてはパンジーのF3',5'H#40遺伝子とカンゾウのF2H遺伝子、イネのコドンUsage改変CGT遺伝子、ミヤコグサのFDH遺伝子を構成的に発現する。
このようにして作製したpSPB5588を橙色系バラ品種「リタ・パフューメラ」へ導入し、計92個体の形質転換体を得た。色素分析を行った65個体のうち44個体でデルフィニジンの蓄積を確認でき、デルフィニジン含有率は最高100％（平均62.3％）であった。さらに、このうち37個体でフラボン C-配糖体であるイソビテキシンが確認でき、その生成量は最高で花弁新鮮重量1gあたり2.02mgという高い含有量であった。【００５７】
代表的な形質転換体の分析値を下表６に示す。
【表６】
2019069946.tif 000007
宿主：リタ・パフューメラ
Del：デルフィニジン、Cya：シアニジン、Pel：ペラルゴニジン
M：ミリセチン、Q：クェルセチン、K：ケンフェロール
Tri：トリセチン、Lut：ルテオリン、Api：アピゲニン、IVX：イソビテキシン
Del（%）：総アントシアニジン中のデルフィニジンの割合【００５８】
［実施例７：（経路１）バラ品種「ノブレス」へのパンジー由来F3’5’H#40遺伝子とカンゾウ由来F2H遺伝子、イネ由来コドンUsage改変CGT遺伝子、ミヤコグサ由来FDH遺伝子の導入］
実施例4と同様にして作製したpSPB5588を橙色系バラ品種「ノブレス」へ導入し、計60個体の形質転換体を得た。これらの色素分析を行った結果、42個体でデルフィニジンの蓄積を確認でき、デルフィニジン含有率は最高96.9％（平均54.4％）であった。さらに、このうち29個体でフラボン C-配糖体であるイソビテキシンが確認でき、その生成量は最高で花弁新鮮重量1gあたり1.60mgという高い含有量であった。【００５９】
代表的な形質転換体の分析値を下表７に示す。
【表７】
2019069946.tif 000008
宿主：ノブレス
Del：デルフィニジン、Cya：シアニジン、Pel：ペラルゴニジン
M：ミリセチン、Q：クェルセチン、K：ケンフェロール
Tri：トリセチン、Lut：ルテオリン、Api：アピゲニン、IVX：イソビテキシン
Del（%）：総アントシアニジン中のデルフィニジンの割合【００６０】
［実施例８：（経路１）バラ品種「オーシャンソング」へのカンパニュラ由来F3’5’H遺伝子とトレニア由来MT遺伝子、カンゾウ由来F2H遺伝子、イネ由来コドンUsage改変CGT遺伝子、ミヤコグサ由来FDH遺伝子の導入］
pSPB6486は、pBINPLUSを基本骨格とし、以下の5つの発現カセットが含まれている。
（１）El235Sプロモーターとカンパニュラ由来F3’5’H 完全長cDNA（配列番号９）とD8ターミネーター
（２）El235Sプロモーターとトレニア由来MT 完全長cDNA（配列番号１７）とNOSターミネーター
（３）35Sプロモーターとカンゾウ由来F2H 完全長cDNA（配列番号３）とシソ由来ATターミネーター
（４）35Sプロモーターとイネ由来コドンUsage改変CGT 完全長cDNA（配列番号１３）とシロイヌナズナ由来HSPターミネーター
（５）35Sプロモーターとミヤコグサ由来FDH 完全長cDNA（配列番号１５）とシロイヌナズナ由来HSPターミネーター
本プラスミドは植物においてはカンパニュラのF3',5'H遺伝子とトレニアのMT遺伝子、カンゾウのF2H遺伝子、イネのコドンUsage改変CGT遺伝子、ミヤコグサのFDH遺伝子を構成的に発現する。
このようにして作製したpSPB6486を青色系バラ品種「オーシャンソング」へ導入し、計27個体の形質転換体を得た。これらの色素分析を行った結果、26個体でマルビジンの蓄積を確認でき、マルビジン含有率は最高74.5％（平均57.0％）であった。さらに、本系統においてはフラボン C-配糖体としてこれまでのイソビテキシンに加え、ビテキシン（アピゲニン 8-C-グルコシド）、ビセニン-2（アピゲニン 6,8-C-ジグルコシド）イソオリエンチン（ルテオリン 6-C-グルコシド）、オリエンチン（ルテオリン 8-C-グルコシド）についても同定・定量を行った。マルビジンが検出できたすべての個体でフラボン C-配糖体が検出でき、その総量は最高で花弁新鮮重量1gあたり1.563mgと高い含有量であった。また、ほとんどの個体でフラボン C-配糖体の総量が花弁新鮮重量1gあたり1mg以上と高い含有量であり、マルビジンに対しても約10倍以上の生成量であった。【００６１】
代表的な形質転換体の分析値を下表８に示す。
【表８】
2019069946.tif 000009
宿主：オーシャンソング
Del：デルフィニジン、Cya：シアニジン、Pet：ペチュニジン、Pel：ペラルゴニジン、Mal：マルビジン
M：ミリセチン、Q：クェルセチン、K：ケンフェロール
Tri：トリセチン、Lut：ルテオリン、Api：アピゲニン、Vic2：ビセニン-2、VX：ビテキシン、IVX：イソビテキシン、Ori：オリエンチン、Iori：イソオリエンチン
Mal（%）：総アントシアニジン中のマルビジンの割合【００６２】
［実施例９：（経路２）バラ品種 「リタ・パフューメラ」へのパンジー由来F3’5’H#40遺伝子とトレニア由来MT遺伝子、トレニア由来FNS遺伝子、リンドウ由来CGT遺伝子の導入］
pSPB6438は、pBINPLUSを基本骨格とし、以下の4つの発現カセットが含まれている。
（１）El235Sプロモーターとパンジー由来F3’5’H 完全長cDNA（配列番号１）とNOSターミネーター
（２）El235Sプロモーターとトレニア由来MT 完全長cDNA（配列番号１７）とNOSターミネーター
（３）El235Sプロモーターとトレニア由来FNS 完全長cDNA（配列番号１９）とD8ターミネーター
（４）El235Sプロモーターとリンドウ由来CGT 完全長cDNA（配列番号２１）とシロイヌナズナ由来HSPターミネーター
本プラスミドは植物においてはパンジーのF3',5'H#40遺伝子とトレニアのMT遺伝子、トレニアのFNS遺伝子、リンドウのCGT遺伝子を構成的に発現する。
このようにして作製したpSPB6438を橙色系バラ品種「リタ・パフューメラ」へ導入し、計122個体の形質転換体を得た。これらの色素分析を行った結果、71個体でマルビジンの蓄積を確認でき、マルビジン含有率は最高69.9％（平均25.9％）であった。さらに、本系統においてはフラボン C-配糖体としてこれまでのイソビテキシンに加え、ビテキシン（アピゲニン 8-C-グルコシド）、ビセニン-2（アピゲニン 6,8-C-ジグルコシド）についても同定・定量を行った。マルビジンが検出できた個体のうち、16個体でフラボン C-配糖体が確認でき、その総量は最高で花弁新鮮重量1gあたり0.02mgであった。一方、フラボン類（アピゲニン、ルテオリン、トリセチン）の総量は最高で花弁新鮮重量1gあたり2.07mgという高い含有量であった。【００６３】
代表的な形質転換体の分析値を下表９に示す。
【表９】
2019069946.tif 000010
宿主：リタ・パフューメラ
Del：デルフィニジン、Cya：シアニジン、Pet：ペチュニジン、Pel：ペラルゴニジン、Mal：マルビジン
M：ミリセチン、Q：クェルセチン、K：ケンフェロール
Tri：トリセチン、Lut：ルテオリン、Api：アピゲニン、Vic2：ビセニン-2、VX：ビテキシン、IVX：イソビテキシン
Mal（%）：総アントシアニジン中のマルビジンの割合【００６４】
［実施例１０：（経路２）バラ品種「オーシャンソング」へのカンパニュラ由来F3’5’H遺伝子とトレニア由来MT遺伝子、トレニア由来FNS遺伝子、リンドウ由来CGT遺伝子の導入］
pSPB7013は、pBINPLUSを基本骨格とし、以下の4つの発現カセットが含まれている。
（１）El235Sプロモーターとカンパニュラ由来F3’5’H 完全長cDNA（配列番号９）とD8ターミネーター
（２）El235Sプロモーターとトレニア由来MT 完全長cDNA（配列番号１７）とNOSターミネーター
（３）El235Sプロモーターとトレニア由来FNS 完全長cDNA（配列番号１９）とD8ターミネーター
（４）El235Sプロモーターとリンドウ由来CGT 完全長cDNA（配列番号２１）（5’位側にシロイヌナズナ ADH遺伝子由来5’-UTR（配列番号２３）を付加）とシロイヌナズナ由来HSPターミネーター
本プラスミドは植物においてはカンパニュラのF3',5'H遺伝子とトレニアのMT遺伝子、トレニアのFNS遺伝子、リンドウのCGT遺伝子を構成的に発現する。
このようにして作製したpSPB7013を青色系バラ品種「オーシャンソング」へ導入し、計15個体の形質転換体を得た。これらの色素分析を行った結果、全個体でマルビジンの蓄積を確認でき、マルビジン含有率は最高67.2％（平均40.9％）であった。さらに、本系統においてはフラボン C-配糖体としてこれまでのイソビテキシン、ビテキシン、ビセニン-2に加え、イソオリエンチン（ルテオリン 6-C-グルコシド）、オリエンチン（ルテオリン 8-C-グルコシド）についても同定・定量を行った。マルビジンが検出できたすべての個体でフラボン C-配糖体が検出でき、その総量は最高で花弁新鮮重量1gあたり1.410mgと高い含有量であった。【００６５】
代表的な形質転換体の分析値を下表１０に示す。
【表１０】
2019069946.tif 000011
宿主：オーシャンソング
Del：デルフィニジン、Cya：シアニジン、Pet：ペチュニジン、Pel：ペラルゴニジン、Mal：マルビジン
M：ミリセチン、Q：クェルセチン、K：ケンフェロール
Tri：トリセチン、Lut：ルテオリン、Api：アピゲニン、Vic2：ビセニン-2、VX：ビテキシン、IVX：イソビテキシン、Ori：オリエンチン、Iori：イソオリエンチン
Mal（%）：総アントシアニジン中のマルビジンの割合【００６６】
［実施例１１：フラボン C-配糖体を含むバラの花色の評価］
実施例８及び１０において作出された形質転換体（バラ品種「オーシャンソング」を宿主とする）について、（１）主な色素としてデルフィニジンを蓄積し、フラボンを含まないもの、（２）主な色素としてマルビジンを蓄積し、経路１によって生成されたフラボンC-配糖体を含むもの、（３）主な色素としてマルビジンを蓄積し、経路２によって生成されたフラボンC-配糖体を含むもの、及び宿主（主な色素としてシアニジンを蓄積）というグループに分類し、それぞれの花弁の色彩について分光測色計CM-2022（ミノルタ株式会社）を用いて10度視野、D65光源で測定し、色彩管理ソフトSpectraMagicTM（ミノルタ株式会社）により解析を行った（n=5）。
主色素がデルフィニジンタイプのバラにおいても、花弁の色相角度は青色方向へシフトしていた。また、主色素がマルビジンタイプでフラボンC-配糖体が共存する場合のバラにおいては、その傾向がより顕著であり、色相角度も青色側へ大きくシフトしていた。また、実施例１０の系統においてその傾向が顕著にみとめられた。以上の結果から、マルビジンとフラボンC-配糖体の共存により花弁の色彩が青く変化することが確認された。
結果を表１１に示す。【００６７】
【表１１】
2019069946.tif 000012
【００６８】
［実施例１２：（経路１）バラ品種「オーシャンソング」へのカンパニュラ由来F3’5’H遺伝子とラベンダー由来3AT遺伝子、カンゾウ由来F2H遺伝子、イネ由来コドンUsage改変CGT遺伝子、ミヤコグサ由来FDH遺伝子の導入］
pSPB6495は、pBINPLUSを基本骨格とし、以下の5つの発現カセットが含まれている。
（１）El235Sプロモーターとカンパニュラ由来F3’5’H 完全長cDNA（配列番号９）とD8ターミネーター
（２）El235Sプロモーターとラベンダー由来3AT 完全長cDNA（配列番号２４）とシロイヌナズナ由来HSPターミネーター
（３）35Sプロモーターとカンゾウ由来F2H 完全長cDNA（配列番号３）とシソ由来ATターミネーター
（４）35Sプロモーターとイネ由来コドンUsage改変CGT 完全長cDNA（配列番号１３）とシロイヌナズナ由来HSPターミネーター
（５）35Sプロモーターとミヤコグサ由来FDH 完全長cDNA（配列番号１５）とシロイヌナズナ由来HSPターミネーター
本プラスミドは植物においてはカンパニュラのF3',5'H遺伝子とラベンダーの3AT遺伝子、カンゾウのF2H遺伝子、イネのコドンUsage改変CGT遺伝子、ミヤコグサのFDH遺伝子を構成的に発現する。
このようにして作製したpSPB6495を青色系バラ品種「オーシャンソング」へ導入し、計228個体の形質転換体を得た。これらの色素分析を行った結果、59個体でアシル化デルフィンの蓄積を確認できた。さらに、本系統においてはフラボン C-配糖体としてイソビテキシンに加え、ビテキシン（アピゲニン 8-C-グルコシド）、ビセニン-2（アピゲニン 6,8-C-ジグルコシド）、イソオリエンチン（ルテオリン 6-C-グルコシド）、オリエンチン（ルテオリン 8-C-グルコシド）についても同定・定量を行った。アシル化デルフィンが検出できたすべての個体でフラボン C-配糖体が検出でき、その総量は最高で花弁新鮮重量1gあたり1.720mgと高い含有量を示す個体もあったが、平均値は0.833mgであった。
代表的な形質転換体の分析値を下表１２に示す。【００６９】
【表１２】
2019069946.tif 000013
宿主：オーシャンソング
Del：デルフィニジン、Cya：シアニジン、Pet：ペチュニジン、Pel：ペラルゴニジン、Mal：マルビジン
M：ミリセチン、Q：クェルセチン、K：ケンフェロール
Tri：トリセチン、Lut：ルテオリン、Api：アピゲニン、Vic2：ビセニン-2、VX：ビテキシン、IVX：イソビテキシン、Ori：オリエンチン、Iori：イソオリエンチン
Del（%）：総アントシアニジン中のデルフィニジンの割合【００７０】
［実施例１３：（経路１）バラ品種「オーシャンソング」へのカンパニュラ由来F3’5’H遺伝子とチョウマメ由来3’5’GT遺伝子、バラ由来53GT(RNAi)遺伝子、シソ由来3GT遺伝子、ダリア由来3マロニル基転移酵素（MaT）遺伝子、カンゾウ由来F2H遺伝子、イネ由来コドンUsage改変CGT遺伝子、ミヤコグサ由来FDH遺伝子の導入］
pSPB7189は、pBINPLUSを基本骨格とし、以下の5つの発現カセットが含まれている。
（１） El235Sプロモーターとカンパニュラ由来F3’5’H 完全長cDNA（配列番号９）とNosターミネーター
（２） El235Sプロモーターとチョウマメ由来A3’5’GT 完全長cDNA（配列番号２６）とシロイヌナズナ由来HSPターミネーター
（３） El235Sプロモーターとバラ由来53GT 完全長cDNA（配列番号２８）（RNAi）とシロイヌナズナ由来HSPターミネーター
（４） SATプロモーターとシソ由来3GT 完全長cDNA（配列番号３０）とシロイヌナズナ由来HSPターミネーター
（５） El235Sプロモーターとダリア由来3MaT 完全長cDNA（配列番号３２）とシロイヌナズナ由来HSPターミネーター
（６） 35Sプロモーターとカンゾウ由来F2H 完全長cDNA（配列番号３）とシソ由来ATターミネーター
（７） 35Sプロモーターとイネ由来コドンUsage改変CGT 完全長cDNA（配列番号１３）とシロイヌナズナ由来HSPターミネーター
（８） 35Sプロモーターとミヤコグサ由来FDH 完全長cDNA（配列番号１５）とシロイヌナズナ由来HSPターミネーター
本プラスミドは植物においてはカンパニュラのF3',5'H遺伝子とチョウマメのA3’,5’GT遺伝子、シソの3GT遺伝子、ダリアの3MaT遺伝子、カンゾウのF2H遺伝子、イネのコドンUsage改変CGT遺伝子、ミヤコグサのFDH遺伝子を構成的に発現し、かつ、バラの内在性の5,3GT遺伝子の発現を抑制する。
このようにして作製したpSPB7189を青色系バラ品種「オーシャンソング」へ導入し、計101個体の形質転換体を得た。これらの色素分析を行った結果、1個体でのみデルフィンの蓄積を確認できたが、アシル化は確認できなかった。さらに、本系統においてはフラボン C-配糖体としてイソビテキシンに加え、ビテキシン（アピゲニン 8-C-グルコシド）、ビセニン-2（アピゲニン 6,8-C-ジグルコシド）、イソオリエンチン（ルテオリン 6-C-グルコシド）、オリエンチン（ルテオリン 8-C-グルコシド）についても同定・定量を行った。本個体においてフラボン C-配糖体が検出でき、その総量は花弁新鮮重量1gあたり1.024mgであった。
形質転換体の分析値を下表１３に示す。【００７１】
【表１３】
2019069946.tif 000014
宿主：オーシャンソング
Del：デルフィニジン、Cya：シアニジン、Pet：ペチュニジン、Pel：ペラルゴニジン、Mal：マルビジン
M：ミリセチン、Q：クェルセチン、K：ケンフェロール
Tri：トリセチン、Lut：ルテオリン、Api：アピゲニン、Vic2：ビセニン-2、VX：ビテキシン、IVX：イソビテキシン、Ori：オリエンチン、Iori：イソオリエンチン
Del（%）：総アントシアニジン中のデルフィニジンの割合【００７２】
［実施例１４：フラボン C-配糖体を含むバラの花色の評価］
実施例１２及び１３において作出された形質転換体（バラ品種「オーシャンソング」を宿主とする）について、（１）主な色素としてデルフィニジン（一部アシル化）を蓄積し、経路１によって生成されたフラボンC-配糖体を含むもの、（２）主な色素としてデルフィニジンを蓄積し、経路１によって生成されたフラボンC-配糖体を含むものというグループに分類し、それぞれの花弁の色彩について分光測色計CM-2022（ミノルタ株式会社）を用いて10度視野、D65光源で測定し、色彩管理ソフトSpectraMagicTM（ミノルタ株式会社）により解析を行った（n=5）。
主色素がデルフィニジンタイプのバラの場合、一部がアシル化されていても、花弁の色相角度は実施例８および１０において作出された形質転換体に比べて青色方向へのシフトは認められなかった（ただし、アシル化アントシアニン単独の場合よりも青く変化した）。以上の結果から、マルビジンとフラボンC-配糖体の共存により花弁の色彩が青く変化することが確認された。
結果を表１４に示す。【００７３】
【表１４】
2019069946.tif 000015
【図１】
2019069946.tif 000016
【図２】
2019069946.tif 000017
【図３】
2019069946.tif 000018
【配列表】
2019069946000001.app
【国際調査報告】
2019069946.tif 000019
2019069946.tif 000020
2019069946.tif 000021
2019069946.tif 000022
2019069946.tif 000023
2019069946.tif 000024
2019069946.tif 000025
2019069946.tif 000026