【誤訳訂正書】
【提出日】平成21年8月21日(2009.8.21)
【誤訳訂正１】
【訂正対象書類名】特許請求の範囲
【訂正対象項目名】全文
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヘパリン結合ヘマグルチニン（ＨＢＨＡ）のミコバクテリア抗原をコードするヌクレオチド配列の純粋なメチル化発現産物を含む、免疫原性組換えタンパク質。
【請求項２】
前記ヌクレオチド配列が、以下のアミノ酸配列：
ＫＫＡＡＰＡＫＫＡＡＰＡＫＫＡＡＰＡＫＫＡＡＡＫＫＡＰＡＫＫＡＡＡＫＫＶＴＱＫ
を有するＨＢＨＡのヘパリン結合領域をコードすることを特徴とする、請求項１に記載の免疫原性組換えタンパク質。
【請求項３】
前記メチル基が、以下のアミノ酸配列：
ＫＫＡＡＰＡＫＫＡＡＰＡＫＫＡＡＰＡＫＫＡＡＡＫＫＡＰＡＫＫＡＡＡＫＫＶＴＱＫ
を有するＨＢＨＡのヘパリン結合領域内に存在するリジン残基によって担持されていることを特徴とする、請求項１又は２に記載の免疫原性組換えタンパク質。
【請求項４】
前記リジン残基が、モノメチル化又はジメチル化されていることを特徴とする、請求項３に記載の免疫原性組換えタンパク質。
【請求項５】
前記メチル基が、以下のアミノ酸配列：
ＫＫＡＡＰＡＫＫＡＡＰＡＫＫＡＡＰＡＫＫＡＡＡＫＫＡＰＡＫＫＡＡＡＫＫＶＴＱＫ
を有するＨＢＨＡのヘパリン結合領域内に存在するリジン残基の全部又は一部によって担持されていることを特徴とする、請求項３に記載の免疫原性組換えタンパク質。
【請求項６】
前記メチル基が、以下のアミノ酸配列：
ＫＫＡＡＰＡＫＫＡＡＰＡＫＫＡＡＰＡＫＫＡＡＡＫＫＡＰＡＫＫＡＡＡＫＫＶＴＱＫ
を有するＨＢＨＡのヘパリン結合領域内に存在するリジン残基の全てによって担持されていることを特徴とする、請求項３に記載の免疫原性組換えタンパク質。
【請求項７】
前記タンパク質が、モノクローナル抗体４０５７Ｄ２によって認識されることを特徴とする、請求項１に記載の免疫原性組換えタンパク質。
【請求項８】
請求項１に記載の免疫原性組換えタンパク質を産生する方法であって、
(1)組換え宿主細胞を用いて組換えＨＢＨＡタンパク質を産生する工程と、
(2)前記タンパク質を精製する工程と、
(3)組換えＨＢＨＡタンパク質の翻訳後メチル化を行う工程と、
を少なくとも備え、最後の二工程の順序は必要に応じて入れ替えてもよい方法。
【請求項９】
前記組換えＨＢＨＡタンパク質が、以下のアミノ酸配列：
ＫＫＡＡＰＡＫＫＡＡＰＡＫＫＡＡＰＡＫＫＡＡＡＫＫＡＰＡＫＫＡＡＡＫＫＶＴＱＫ
を有するそのヘパリン結合領域によって構成されていることを特徴とする、請求項８に記載の産生方法。
【請求項１０】
前記組換え宿主細胞が、細菌であることを特徴とする、請求項８又は９に記載の産生方法。
【請求項１１】
前記細菌が、M. smegmatisであることを特徴とする、請求項１０に記載の産生方法。
【請求項１２】
前記メチル化工程が、化学的に行われることを特徴とする、請求項８又は９に記載の産生方法。
【請求項１３】
前記メチル化工程が、酵素的に行われることを特徴とする、請求項８又は９に記載の産生方法。
【請求項１４】
前記メチル化反応が、ミコバクテリアの総タンパク質から得た抽出物中に含有される少なくとも１つのメチルトランスフェラーゼによって触媒されることを特徴とする、請求項１３に記載の産生方法。
【請求項１５】
前記ミコバクテリアの総タンパク質が、M. bovis  ＢＣＧ又はM. smegmatisに由来するものであることを特徴とする、請求項１４に記載の産生方法。
【請求項１６】
前記メチル化反応が、少なくとも１つの精製されたミコバクテリアのメチルトランスフェラーゼによって触媒されることを特徴とする、請求項１４に記載の産生方法。
【請求項１７】
前記組換え宿主細胞が、ＨＢＨＡの組換えタンパク質と、１つの組換えメチルトランスフェラーゼまたは複数の組換えメチルトランスフェラーゼとを同時産生することを特徴とする、請求項１０に記載の産生方法。
【請求項１８】
各組換えタンパク質が、発現ベクターによってコードされていることを特徴とする、請求項１７に記載の産生方法。
【請求項１９】
前記組換えタンパク質の全部又は一部が、同一の発現ベクターによってコードされていることを特徴とする、請求項１７または１８に記載の産生方法。
【請求項２０】
ＨＢＨＡをコードする核酸配列、および少なくとも１つの組換えミコバクテリアメチルトランスフェラーゼをコードする核酸配列を含むことを特徴とする、組換えベクター。
【請求項２１】
各組換えタンパク質の産生が、異なる制御配列によって調節されていることを特徴とする、請求項２０に記載の組換えベクター。
【請求項２２】
前記組換えタンパク質の全部又は一部の産生が、同一の制御配列によって調節されていることを特徴とする、請求項２０に記載の組換えベクター。
【請求項２３】
請求項２０に記載の組換えベクターを保有する組換え宿主細胞。
【請求項２４】
請求項１に記載の免疫原性組換えタンパク質を産生する方法であって、
ａ）請求項２３に記載の宿主細胞によって、ＨＢＨＡタンパク質と、ミコバクテリアの１つのメチルトランスフェラーゼまたは複数のメチルトランスフェラーゼとを同時産生する工程と、
ｂ）１つの組換えメチルトランスフェラーゼまたは複数の組換えメチルトランスフェラーゼによって前記組換えＨＢＨＡの翻訳後修飾によるメチル化を行う工程と、
ｃ）前記メチル化された組換えＨＢＨＡを精製する工程と、
を少なくとも備えたことを特徴とする方法。
【請求項２５】
薬学的に許容される製剤中に、純粋なメチル化されたヘパリン結合ヘマグルチニン（ＨＢＨＡ）タンパク質を活性成分として含むことを特徴とする、免疫原性組成物。
【請求項２６】
１以上のアジュバントを更に含むことを特徴とする、請求項２５に記載の免疫原性組成物。
【請求項２７】
前記ＨＢＨＡタンパク質が、M. bovisまたはM. tuberculosisに由来するものであることを特徴とする、請求項２５に記載の免疫原性組成物。
【請求項２８】
前記メチル化された形態が、請求項１乃至６の何れか１項に記載の組換えタンパク質であることを特徴とする、請求項２５又は２６に記載の免疫原性組成物。
【請求項２９】
投与量当り０．１乃至２０μｇのＨＢＨＡタンパク質を含むことを特徴とする、請求項２５〜２７の何れか１項に記載の免疫原性組成物。
【請求項３０】
投与量当り５μｇのＨＢＨＡタンパク質を含むことを特徴とする、請求項２９に記載の免疫原性組成物。
【請求項３１】
M. bovis  ＢＣＧ、M. smegmatisまたはM. tuberculosisを形質転換することにより得られることを特徴とする、請求項１に記載の免疫原性組換えタンパク質。
【請求項３２】
前記ＨＢＨＡ抗原が、M. bovisまたはM. tuberculosisに由来するものであることを特徴とする、請求項１に記載の免疫原性組換えタンパク質。
【請求項３３】
投与量当り０．１乃至２０μｇのＨＢＨＡタンパク質を含むことを特徴とする、請求項２５に記載の免疫原性組成物。
【請求項３４】
前記純粋なメチル化ヘパリン結合ヘマグルチニン（ＨＢＨＡ）タンパク質が、逆相ＨＰＬＣからなる最終精製ステップを含む方法により得られることを特徴とする、請求項２５に記載の免疫原性組成物。
【誤訳訂正２】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００４６
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００４６】
より具体的には、前記１つまたは複数のメチルトランスフェラーゼは、M bovis  ＢＣＧ又はM smegmatis等のミコバクテリアの総タンパク質から得た抽出物中に存在し、活性を有する。
【誤訳訂正３】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００４７
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００４７】
本発明のさらなる実施形態では、反応媒体中に入れてドナーからアクセプターへのメチル基転移反応を触媒させる前に、ミコバクテリア菌株から得た総タンパク質抽出物から前記ミコバクテリアの１つまたは複数のメチルトランスフェラーゼを精製する。
【誤訳訂正４】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００４９
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００４９】
特に、本発明は、ＨＢＨＡ及びミコバクテリアの１つまたは複数のメチルトランスフェラーゼをコードするヌクレオチド配列を同時発現することができる組換え宿主細胞に関する。該宿主細胞は、細菌、特にE coliの菌株であることが好ましい。
【誤訳訂正５】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００５１
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００５１】
本発明の１つの実施形態では、前記宿主細胞は、少なくとも２つの組換えベクターを同時に保有しており、一方はＨＢＨＡをコードし、残りはミコバクテリアの１つまたは複数のメチルトランスフェラーゼをコードすることを特徴とする。
【誤訳訂正６】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００５５
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００５５】
特に、前記宿主細胞は、全てのミコバクテリアタンパク質（すなわち、ＨＢＨＡと１つまたは複数のメチルトランスフェラーゼ）を産生する単一の発現ベクターを保有する。
【誤訳訂正７】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００５９
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００５９】
あるいは、本発明の発現ベクターは、ＨＢＨＡと１つまたは複数のメチルトランスフェラーゼから選択される単一の組換えミコバクテリアタンパク質をコードする。
【誤訳訂正８】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００６１
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００６１】
本発明は、組換えＨＢＨＡを備えた免疫原性ペプチド配列であって翻訳後修飾によってメチル化される配列を産生する方法であって、
ａ）上記宿主細胞によって、ＨＢＨＡタンパク質と、ミコバクテリアの１つまたは複数のメチルトランスフェラーゼとを同時産生する工程と、
ｂ）１つまたは複数の組換えメチルトランスフェラーゼによって前記組換えＨＢＨＡの翻訳後修飾メチル化を行う工程と、
ｃ）慣用的な方法を用いて、前記メチル化された組換えＨＢＨＡを精製する工程と、
を少なくとも備えた方法にも関する。
【誤訳訂正９】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００９５
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００９５】
ＩＩ−４−組換えＨＢＨＡの酵素的メチル化
ネイティブＨＢＨＡのリジンのメチル化が酵素活性によるものであるかどうかを調べるために、ミコバクテリア溶解液を用いて、組換えＨＢＨＡに特異的なイントロメチル化検査を行った。ミコバクテリア培養物をソニケーションにより溶解した。全溶解液の他、細胞質と膜画分を酵素源として用いて、［１４Ｃ−メチル］ＡｄｏＭｅｔドナーから組換えＨＢＨＡが有するアクセプターに、［１４Ｃ］メチル基を転移させることを試みた。［１４Ｃ−メチル］ＡｄｏＭｅｔを含有するM tuberculosis、M bovis  ＢＣＧ及びM smegmatisの全溶解液を組換えＨＢＨＡとインキュベーションした結果、［１４Ｃ］メチル基が前記ＨＢＨＡ中に取り込まれた（図２）。これに対して、溶解液を９５℃で加熱した場合、溶解液はメチル基転移反応を触媒できなくなった。さらに、ＨＢＨＡをメチル化させるのに必要なミコバクテリアの１つまたは複数のメチルトランスフェラーゼは、温度感受性であった。
【誤訳訂正１０】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００９６
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００９６】
様々なアプローチを通じて、１つまたは複数のメチルトランスフェラーゼの単離を考えた。
【誤訳訂正１１】
【訂正対象書類名】明細書
【訂正対象項目名】００９７
【訂正方法】変更
【訂正の内容】
【００９７】
第一のケースでは、組換えＨＢＨＡへの［１４Ｃ−メチル］ＡｄｏＭｅｔからのメチル基転移反応を触媒可能な画分を指標として、イオン交換クロマトグラフィー、ＨＰＬＣ又はアフィニティーにより、ミコバクテリアの溶解液中に存在するタンパク質を分離した。１つまたは複数のメチルトランスフェラーゼが配列決定を行うのに十分に高い純度である試料が得られるまで、上記のような濃縮を続けた。さらに、M tuberculosis  Ｈ３７Ｒｖ（Ｃｏｌｅら、１９９８、上記）に対するゲノムの既知の配列を参考にして、１つまたは複数のメチルトランスフェラーゼをコードする遺伝子又は遺伝子群を同定し、当業者に公知の技術を用いてクローニングを行った。