(57)【要約】  改善された免疫賦活作用を有する免疫賦活剤として、キトサンとＴＬＲ（toll様受容体）リガンドとを含んでいる、免疫賦活剤を提供する。
2020045679.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
粒子状キトサンとＴＬＲ（toll様受容体）リガンドとを含んでいる、免疫賦活剤。
【請求項２】
さらにアニオン性界面活性剤を含む、請求項１に記載の免疫賦活剤。
【請求項３】
上記アニオン性界面活性剤が、リン脂質、炭素数１０以上２２以下の脂肪酸およびその塩から選択される少なくとも１種類である、請求項２に記載の免疫賦活剤。
【請求項４】
上記リン脂質が、レシチンまたはリゾレシチンであり、
上記脂肪酸またはその塩が、オレイン酸ナトリウムまたはラウリン酸ナトリウムである、請求項３に記載の免疫賦活剤。
【請求項５】
上記粒子状キトサンは、重量平均分子量が５Ｋ以上１０００Ｋ以下、かつ、粒子径が５００ｎｍ以下である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の免疫賦活剤。
【請求項６】
上記ＴＬＲが、ヒトのＴＬＲ３、４および７〜９からなる群より選ばれる少なくとも１種である、請求項１〜５のいずれか１項に記載の免疫賦活剤。
【請求項７】
さらに、抗原を含む、請求項１〜６のいずれか１項に記載の免疫賦活剤。
【請求項８】
さらに、α−ＧａｌＣｅｒを含む、請求項１〜７のいずれか１項に記載の免疫賦活剤。
【請求項９】
免疫賦活剤製造用のキットであって、
容器に格納されている、アニオン性界面活性剤を保持しているキトサンと、
キットの使用説明と、を備えており、
上記キトサンは、粒子状キトサンであり、
上記使用説明には、上記粒子状キトサンに、ＴＬＲリガンドを保持させることで免疫賦活剤を製造することが記載されている、免疫賦活剤製造用のキット。
【請求項１０】
請求項１〜８のいずれか１項に記載の免疫賦活剤を含む、ワクチン。
【請求項１１】
上記ワクチンは、がんワクチンである、請求項１０に記載のワクチン。
【請求項１２】
粒子状キトサンにＴＬＲリガンドを保持させる工程を含む、免疫賦活剤の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、免疫賦活剤およびその利用に関する。
【背景技術】
【０００２】
自然免疫系は、細菌またはウイルス等で保存されている特徴的な分子パターン（pathogen-associated molecular pattern:ＰＡＭＰ）がパターン認識受容体（pattern recognition receptor:ＰＲＲ）によって認識されることによって発動される。ＰＲＲの中で代表的なものがToll様受容体（Toll-like receptor:ＴＬＲ）であり、微生物が感染した場合複数のＴＬＲリガンドがＰＡＭＰｓ（病原体関連分子パターン）として働いて、自然免疫系の活性化に寄与する。自然免疫系の発動は獲得免疫系の活性化に繋がり、病原体が特異的に認識されて記憶されるようになり、同じ病原体に繰り返し出会った時に効果的に排除できるようになる。ＮＫＴ細胞は、抗原提示細胞の表面のＣＤ１ｄに結合して提示された糖脂質（α―ガラクトシルセラミド：α−ＧａｌＣｅｒ）によって活性化され、自然免疫系と獲得免疫系の橋渡しをして、両者の機能を増幅する。【０００３】
ワクチンによる抗原提示細胞の活性化において効果的な場合として、アジュバントと抗原とが一緒に同じ抗原提示細胞に作用する場合が挙げられる。この場合、抗原およびアジュバントが分解されるのを防ぐよう微粒子等で保護する効果が得られる（非特許文献１）。この抗原とアジュバントとを保護する微粒子としては、生体適合性、かつ、生分解性であることから、poly（lactic-co-glycolic acid）（ＰＬＧＡ）ナノ粒子が広く用いられている（非特許文献２および３）。しかし、ＰＬＧＡナノ粒子を製造するためには、有機溶媒の使用、また、エマルジョン化等煩雑な操作を必要とする。【０００４】
特許文献１には、アニオン性界面活性剤を用いて製造した粒子状キトサンを用いた免疫賦活剤が記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】ＷＯ２０１８／０２５９２６号公報
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Hafner AM, Cortheesy B, Merkle HP. Particulate formulations for the delivery of poly（I:C） as vaccine adjuvant. Adv. Drug Deliv. Rev. 65 （2013） 1386-1399.
【非特許文献２】Silva AL, Soema PC, Slutter B, Ossendorp F, Jiskoot W. PLGA particulate delivery system for subunit vaccines: Linking particle properties to immunogenicity. Hum. Vaccin. Immunother. 12 （2016） 1056-1069.
【非特許文献３】Dolen T, Kreutz M, Gileadi U, Tel J, Vasaturo A, van Dinther EAW, van Hout-Kuijer MA, Cerundolo V, Figdor CG. Co-delivery of PLGA encapsulated invariant NKT cell agonist with antigenic protein induce strong T cell-mediated antitumor immune responses. Oncoimmunol. 5 （2016） e1068493.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
特許文献１に記載の粒子状キトサンは、安価な原料を用いて容易に調製することができる上に、これ自体が強いアジュバント活性を持つ。さらに、この粒子状キトサンは、抗原を生体内で分解されにくくするように保護していると推定され、抗原提示細胞に抗原を取り込ませる手段としても優れている。【０００８】
しかし、例えば、免疫賦活作用をより増強する、または、免疫賦活作用の質を変更する等の目的で、他のアジュバント等と組み合わせて用いる場合には、粒子状キトサン自体が示すアジュバントとしての特性が、かえって不利益をもたらす虞がある。【０００９】
本発明は上記の問題点に鑑みてなされたものであり、その目的は、キトサンをベースとし、改善及び増強された免疫賦活作用を有する免疫賦活剤を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本願発明者らは上記問題点を解決するために鋭意検討を行った。その結果、粒子状キトサンが持つアジュバント活性自体のより詳細な分析、並びに、当該分析に基づく他のアジュバント等との組合せの検討を通じて、粒子状キトサンと特定の免疫活性化物質との組合せが改善及び増強されたアジュバント活性を奏することを見出し、本願発明に想到するに至った。【００１１】
すなわち、本発明は上記問題を解決するために、例えば、以下のものを包含している。
１）  粒子状キトサンとＴＬＲ（toll様受容体）リガンドとを含んでいる、免疫賦活剤。
２）  免疫賦活剤製造用のキットであって、容器に格納されている、アニオン性界面活性剤を担持しているキトサンと、キットの使用説明と、を備えており、上記キトサンは、粒子状キトサンであり、上記使用説明には、上記粒子状キトサンに、ＴＬＲリガンドを担持させることで免疫賦活剤を製造することが記載されている、免疫賦活剤製造用のキット。
３）  １）に記載の免疫賦活剤を含む、ワクチン。
４）  粒子状キトサンにＴＬＲリガンドを担持させる工程を含む、免疫賦活剤の製造方法。
【発明の効果】
【００１２】
本発明の一態様によれば、改善された免疫賦活作用を有する免疫賦活剤を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】本発明の実施例１の結果を示す図である。
【図２】本発明の実施例２の結果を示す図である。
【図３】本発明の実施例３の結果を示す図である。
【図４】本発明の実施例４の結果を示す図である。
【図５】本発明の実施例５の結果を示す図である。
【図６】本発明の実施例６の結果を示す図である。
【図７】本発明の参考例の結果を示す図である。
【図８】本発明の実施例７の結果を示す図である。
【図９】本発明の実施例８の結果を示す図である。
【図１０】本発明の実施例９の結果を示す図である。
【図１１】本発明の実施例１０の結果を示す図である。
【図１２】本発明の実施例１１の結果を示す図である。
【図１３】本発明の実施例１２の結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
１．免疫賦活剤
本実施形態に係る免疫賦活剤は、粒子状キトサンとＴＬＲ（toll様受容体）リガンドとを含んでいる。
【００１５】
本実施形態に係る免疫賦活剤は、粒子状キトサンとＴＬＲリガンドとをどのような形態で含んでいてもよいが、粒子状キトサンがＴＬＲリガンドを保持していることが好ましい。本実施形態に係る免疫賦活剤が例えばワクチンの形態で使用されるとき、粒子状キトサンがＴＬＲリガンドを保持していることにより、ＴＬＲリガンドが単独で存在する場合と比較して、ＴＬＲリガンドが生体内で分解されにくくすることができる。同様に、ＳＴＩＮＧアゴニスト（例えばインターフェロン遺伝子刺激因子）、ならびに後述する抗原およびα−ＧａｌＣｅｒ等も、粒子状キトサンに保持させることによって、生体内で分解されにくくすることができる。加えて、同じ粒子状キトサンに保持されている各種物質（例えば、ＴＬＲリガンド、抗原、またはα−ＧａｌＣｅｒ等）を抗原提示細胞に一緒にして送達することができる。
【００１６】
粒子状キトサンが各種物質（例えば、ＴＬＲリガンド、抗原、α−ＧａｌＣｅｒ、またはＳＴＩＮＧアゴニスト等）を保持しているとは、例えば、１）粒子を構成しているキトサンの分子鎖の隙間に各種物質が取り込まれている形態、および／または２）キトサンが有するアミノ基と各種物質（例えば、特に負に帯電するポリヌクレオチド等のＴＬＲリガンド等）との間に結合が形成されている形態等が挙げられる。
【００１７】
なお、本明細書において、「免疫賦活剤」とは、抗原特異的免疫応答を特異的または非特異的に変化、増大、誘導、再誘導、増強または開始する作用を有する、分子、物質または組成物を示す。本願発明に係る免疫賦活剤は、体液性免疫および細胞性免疫の何れか、または両方を強化することができるものを包含する。本明細書中における「免疫賦活剤」とは、少なくともアジュバントとしての機能を有する剤を意図している。
【００１８】
〔粒子状キトサン〕
粒子状キトサンとは、粒子の形状となっているキトサンを指す。粒子状キトサンは、一例では、キトサンの分子が高度に凝集して形成され、水に懸濁された状態にある粒子である。粒子状キトサンは、これ自体が高い抗体産生誘導能を有する。また、キトサンが粒子状であることによって、１）生体内で異物として認識されやすい、および、２）キトサンが正電荷を帯びているために細胞表面との親和性に優れる、等の理由で、抗原提示細胞に取り込まれやすくなると推測される。なお、キトサンは、後述するように、例えば、アニオン性界面活性剤を用いることによって微粒状にすることができる。
【００１９】
粒子状キトサンの重量平均分子量は、最終的に得られる免疫賦活剤の用途に応じて適宜設定される。本実施形態における粒子状キトサンは、その分子量が低いほど、高い免疫賦活効果が得られるという傾向を有する。ただし、ある分子量以下の低分子量のキトサン、例えば、分子量が５ｋ未満のキトサンの製造は、工程が比較的煩雑である。
【００２０】
一方で、ある分子量以上の高分子量のキトサン、例えば、分子量が１０００ｋを超えるキトサンは、粒子化する際の溶液の粘性が高くなる傾向にある。
【００２１】
したがって、高い免疫賦活化効果を有しつつも、取扱い易く、工業生産が容易であり、市場で入手しやすく、かつ、商業的に利用性が高いという観点からは、粒子状キトサンを構成するキトサンの重量平均分子量は、５ｋ以上で１０００ｋ以下の範囲内であることが好ましく、５ｋ以上で５００ｋ以下の範囲内であることがより好ましく、１０ｋ以上で１００ｋ以下の範囲内であることが最も好ましい。
【００２２】
また、粒子状キトサンの好ましい粒子径は特に限られないが、細胞への取り込みの観点では、小さいものほど好ましい場合がある。例えば、粒子状キトサンの粒子径は５００ｎｍ以下であり、あるいは、３００ｎｍ以下であってもよい。また、粒子状キトサンの粒子径の下限は特に限定されないが、例えば、１０ｎｍ以上であり、１００ｎｍ以上であり、１５０ｎｍ以上であり、あるいは、２００ｎｍ以上であってもよい。なお、製造の容易さの観点では、粒子状キトサンの粒子径は１００ｎｍ以上であることが好ましい場合がある。粒子状キトサンの粒子径は、例えば、レーザ回析散乱法によって測定することができる。
【００２３】
本実施形態に係る免疫賦活剤に含まれる粒子状キトサンの濃度は、キトサンの溶解性又は粘度、並びに投与対象の種類等に応じて適宜設定すればよい。免疫賦活剤が液体の形態である場合、粒子状キトサンの濃度は、例えば、０．１ｍｇ／ｍｌ以上で５０ｍｇ／ｍｌ以下の範囲内であることが好ましい。また、免疫賦活剤のボリューム（液量）を小さくできる観点では、免疫賦活剤に含まれる粒子状キトサンの濃度が高いほど好ましい。キトサンの溶解性又は粘度等に応じて、粒子状キトサンの濃度の上限は、例えば、５０ｍｇ／ｍｌ以下、４５ｍｇ／ｍｌ以下、４０ｍｇ／ｍｌ以下、３５ｍｇ／ｍｌ以下、３０ｍｇ／ｍｌ以下、２５ｍｇ／ｍｌ以下、２０ｍｇ／ｍｌ以下、１５ｍｇ／ｍｌ以下、または１０ｍｇ／ｍｌ以下とすることもできる。一例では、免疫賦活剤は、ここで示す上限の濃度の８０％以上の濃度で粒子状キトサンを含んでいる。
【００２４】
粒子状キトサンの製造方法については、「２．免疫賦活剤の製造方法」の項目で述べる。
【００２５】
上記粒子状キトサンを形成しているキトサンは、誘導体化されているキトサン誘導体であり得る。つまり、上記粒子状キトサンは、キトサンおよび／またはキトサン誘導体によって形成されている。キトサン誘導体は、キトサン主鎖、および側鎖部分からなる。当該側鎖部分は、還元性末端を有する糖類、アミノ酸（誘導体）および／または他の化合物によって形成されている。
【００２６】
上記糖類は、例えば、アルドース類およびケトース類に由来する糖類（構成糖単位が１以上）である。糖類のより具体的な例は、例えば、単糖の例である、ペンタオースおよびヘキサオースの例として、グルコース、フコース、マンノース、アラビノース、ガラクトース、キシロース、エリトロース、ヘプツロース、ヘキシロース、およびペンツロース等が挙げられる。また、アミノ糖類として、グルコサミン、Ｎ−アセチルグルコサミン（例えば、Ｎ−アセチルＤ−グルコサミン）、およびガラクトサミン等が挙げられる。さらに、糖誘導体として、ウロン酸類、およびデオキシ糖類等が挙げられる。また、これらの単糖類を構成成分として組み合わせた糖鎖からなる二糖または多糖の糖類としては、マルトース、イソマルトース、ラクトース、メリビオース、およびマルトトリオース等、ならびに各種オリゴ糖類等が挙げられる。さらに、プルラン、イヌリン、アミロース、アミロペクチン、デキストラン、デキストリン、澱粉等の天然多糖など、およびそれらの分解物、異性化物または誘導体が挙げられる。これらの糖類の１種類以上の組み合わせを製造に用いることができる。また、これらの原料としての糖類は水和物であってもよい。
【００２７】
上記アミノ酸（誘導体）は、例えば、リシン（例えばＬ−リシン）、カルニチン、アルギニン、プロリン、およびヒスチジンなどである。これらのうち、上記アミノ酸（誘導体）として、リシンおよびカルニチンが好ましい。
【００２８】
上記他の化合物は、例えば、ポリエチレングリコールである。ポリエチレングリコールの一例は、メトキシＰＥＧ−アルデヒドである。
【００２９】
一例において、キトサン誘導体は、キトサンの糖単位を構成するグルコサミン単位の２位の炭素に結合しているアミノ基に、遊離したカルボキシル基末端を有する糖類が、還元的アルキル化によってシッフ塩基を経由して結合した構造を有するか、キトサンの糖単位を構成するグルコサミン単位の２位の炭素に結合しているアミノ基に、遊離したカルボキシル基末端を有するアミノ酸類が、縮合反応によってアミド結合した構造を有することが好ましい場合がある。
【００３０】
キトサン主鎖は、例えば、構成糖単位の数が３０〜１２０００であり、６０〜６０００としてもよく、１２０〜３０００としてもよい。キトサン主鎖の糖単位における２位アミノ基の側鎖による置換度は、キトサン誘導体の種類および最終的なキトサン誘導体の用途などに応じて適宜設定することができる。例えば、該置換度は、０．００５〜０．５とすることができ、０．００５〜０．３としてもよい。なお、置換度は、公知の技術（例えば糖組成分析）に基づいて決定してもよく、例えば、ＮＭＲのスペクトルの解析によって算出されてもよい。キトサン誘導体の詳細（種類およびその製造方法）は、例えば、ＷＯ２０１８／０２５９２６（参照によって本明細書に組み込まれる）に開示されている。
【００３１】
実施例にも示すように、キトサン誘導体によって形成される粒子状キトサンを含む免疫賦活剤は、キトサンによって形成される粒子状キトサンを含む免疫賦活剤と同様に、腫瘍を縮小させる効果および血中抗体価を上昇させる効果を有する。
【００３２】
〔ＴＬＲリガンド〕
ＴＬＲ（Toll様受容体）は、微生物の産物を感知し、獲得免疫応答を開始する、タンパク質のファミリーである。ＴＬＲリガンドは、ＴＬＲに結合してＴＬＲを活性化する物質である。典型的な例において、ＴＬＲの活性化は、ＴＬＲ同士の二量体形成を伴う。
【００３３】
ＴＬＲは、ヒトでは１０種類、マウスでは１３種類が同定されている。ヒトで同定されているＴＬＲのうち、ＴＬＲ−１、−２、−４、−５、および−６が細胞の表面に発現される。一方、ＴＬＲ−３、−７／８、および−９は小胞体で発現される。
【００３４】
本実施形態に係る免疫賦活剤では、ヒトのＴＬＲリガンドを含むことが好ましい。本実施形態に係る免疫賦活剤において有用な、当技術分野で公知のヒトＴＬＲリガンドとしては、限定するものではないが、例えば、糖タンパク質、リポタンパク質、糖ペプチド、およびリポポリペプチド等のタンパク質性リガンド；リポ多糖等の多糖類性リガンド；ＤＮＡ、およびＲＮＡ等の核酸性リガンド；およびイミダゾキノリン化合物等の低分子リガンド：等が挙げられる。
【００３５】
より具体的には、リポタンパク質およびリポ多糖（ＴＬＲ２リガンドまたはＴＬＲ４リガンド）；二本鎖ＤＮＡ（ＴＬＲ３リガンド）；タンパク質性リガンドであるフラジェリン（ＴＬＲ５リガンド）；イミダゾキノリン化合物であるイミキモド、レシキモド（Ｒ８４８）；および一本鎖ＲＮＡ（ＴＬＲ７リガンドまたはＴＬＲ８リガンド）；および、核酸性リガンドであるＣｐＧ配列（ＴＬＲ９リガンド）等が挙げられる。
【００３６】
さらに具体的には、以下が挙げられる；
Ｐａｍ３Ｃｙｓ（ＴＬＲ−１／２リガンド。タンパク質性リガンド）；
ＣＦＡ（ＴＬＲ−２リガンド。核酸性リガンド）；
ＭＡＬＰ２（ＴＬＲ−２リガンド。タンパク質性リガンド）；
Ｐａｍ２Ｃｙｓ（ＴＬＲ−２リガンド。タンパク質性リガンド）；
ＦＳＬ−１（ＴＬＲ−２リガンド。タンパク質性リガンド）；
Ｈｉｂ−ＯＭＰＣ（ＴＬＲ−２リガンド。タンパク質性リガンド）；
ポリリボイノシンおよびポリリボシチジン酸（Ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ））（ＴＬＲ−３リガンド。核酸性リガンド）；
ポリアデノシン-ポリウリジル酸（ＰｏｌｙＡＵ）（ＴＬＲ−３リガンド。核酸性リガンド）；
ポリＬ−リシンおよびカルボキシメチルセルロースで安定化したポリイノシン−ポリシチジン酸（Hiltonol（登録商標））（ＴＬＲ−３リガンド。核酸性リガンド）；
モノホスホリルリピドＡ（ＭＰＬ）（ＴＬＲ−４リガンド）；
細菌フラジェリン（ＴＬＲ−５リガンド。タンパク質性リガンド）；
Ｒ８４８（ＴＬＲ−７／８リガンド）；
ロキソリビン（ＴＬＲ−７／８リガンド）；および
非メチル化ＣｐＧジヌクレオチド（以下では「ＣｐＧ」と表記する。一般には「ＣｐＧ−ＯＤＮ」とも表記され得る。）（ＴＬＲ−９リガンド。核酸性リガンド）。
【００３７】
中でも、ＴＬＲ−３リガンド、ＴＬＲ−４リガンド、ＴＬＲ−７／８リガンドおよびＴＬＲ−９リガンドが好ましい。これらの中では、Ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）、ＭＰＬ、Ｒ８４８およびＣｐＧが好ましく、さらにこれらを２つまたはそれ以上組み合わせることがより好ましい場合がある。好ましい組み合わせとしては、例えば、ＭＰＬとＣｐＧとの組み合わせ、Ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）とＣｐＧとの組み合わせ、およびＭＰＬとＰｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）との組み合わせであり、ＭＰＬ、Ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）およびＣｐＧとの組み合わせがより好ましい場合がある。実施例にも示すように、特定の実施形態（がんの治療または予防に用いる免疫賦活剤）において、腫瘍縮小効果に優れているＴＬＲリガンドとしては、ＣｐＧ、Ｒ８４８、ＭＰＬおよびｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）（特にＣｐＧおよびＲ８４８）が挙げられる（実施例１１を参照）。
【００３８】
なお、ＴＬＲリガンドは、天然由来でも合成によって得られるものでもよい。
【００３９】
本実施形態に係る免疫賦活剤に含まれるＴＬＲリガンドの濃度は、投与対象の種類等に応じて適宜設定すればよい。免疫賦活剤が液体の形態である場合、ＴＬＲリガンドの濃度は、例えば、３μｇ／ｍｌ以上で５０ｍｇ／ｍｌ以下の範囲内であることが好ましい。また、免疫賦活剤のボリューム（液量）を小さくできる観点では、免疫賦活剤に含まれるＴＬＲリガンドの濃度は高いほど好ましい。ＴＬＲリガンドの濃度の上限は、例えば、５０ｍｇ／ｍｌ以下、４５ｍｇ／ｍｌ以下、４０ｍｇ／ｍｌ以下、３５ｍｇ／ｍｌ以下、３０ｍｇ／ｍｌ以下、２５ｍｇ／ｍｌ以下、２０ｍｇ／ｍｌ以下、１５ｍｇ／ｍｌ以下、または１０ｍｇ／ｍｌ以下とすることもできる。ＴＬＲリガンドの濃度の下限は、例えば、３μｇ／ｍｌ以上とすることができ、１０μｇ／ｍｌ以上、２５μｇ／ｍｌ以上、５０μｇ／ｍｌ以上、７５μｇ／ｍｌ以上、１００μｇ／ｍｌ以上とすることもできる。一例では、免疫賦活剤は、ここで示す上限の濃度の８０％以上の濃度でＴＬＲリガンドを含んでいる。
【００４０】
〔アニオン性界面活性剤〕
本実施形態に係る免疫賦活剤は、アニオン性界面活性剤を含んでいることが好ましい。アニオン性界面活性剤は、アニオン性基と疎水性基とを備えている。疎水性基はたとえば、置換または無置換であり、飽和または不飽和の炭素数２以上２２以下の炭化水素基であり得る。
【００４１】
アニオン性界面活性剤は、キトサンと複合化されていることが好ましい。アニオン性界面活性剤がキトサンと複合化されているとは、例えば、アニオン性界面活性剤がそのアニオン性基において、キトサンのアミノ基と結合を形成していることを指す。アニオン性界面活性剤とキトサンとが複合化されている場合、ＴＬＲリガンド、抗原またはα−ＧａｌＣｅｒ等は、１）キトサンの分子鎖の隙間または、キトサン‐アニオン性界面活性剤の分子鎖の隙間にとりこまれる、或いは、２）カチオン性（例えば、キトサンのアミノ基に由来）、アニオン性、および疎水性を帯びたアニオン性界面活性剤−キトサン複合体と結合を形成して保持されるものと推定される。すなわち、各種物質の粒子状キトサンへの保持を、イオン結合に加えて疎水性結合をも介して行うことで、より強固なものとすることができると推定される。本実施形態に係る免疫賦活剤が含むことができるＴＬＲリガンド、抗原またはα−ＧａｌＣｅｒ等は、多岐にわたる。
【００４２】
本実施形態におけるアニオン性界面活性剤は、リン脂質および炭素数１０以上２２以下の脂肪酸およびその塩から選択される少なくとも１種であることが好ましい。アニオン性界面活性剤は単一種類のアニオン性界面活性剤であってもよく、複数種類の異なるアニオン性界面活性剤の組み合わせ（リン脂質と、炭素数１０以上２２以下の脂肪酸およびその塩との両方でもよい）であってもよい。
【００４３】
本実施形態に係る免疫賦活剤中のアニオン性界面活性剤の形態は特に限られず、例えば液中でミセル状になっていてもよいし、固体であってもよい。
【００４４】
（リン脂質）
リン脂質としては、ホスホグリセリド、スフィンゴ脂質、セファリン、およびそれらの混合物、全合成リン脂質ならびにレシチンおよびリゾレシチンが挙げられる。レシチンは、化学分野においては、ホスファチジルコリンと同義であり、本明細書ではホスファチジルコリンを指す。リン脂質は、好ましくはレシチンまたはリゾレシチンであり得る。
【００４５】
より詳細には、レシチンとしては大豆レシチン、卵黄レシチン、水素化大豆レシチン（ＨＳＰＣ）および水素化卵黄レシチン（ＨＥＰＣ）が挙げられる。ホスホグリセリドとしては、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルグリセリン、ホスファチジルイノシトール、リゾホスファチジルコリン、およびホスファチジン酸等が挙げられる。スフィンゴ脂質としては、スフィンゴミエリン等が挙げられる。なお、水溶性が十分でないリン脂質については、エタノール等有機溶媒に溶解させた後、免疫賦活剤の製造に供することが可能である。
【００４６】
（脂肪酸およびその塩）
脂肪酸およびその塩には、炭素数が１０以上２２以下である脂肪酸ならびにそれらの塩およびグリセリドが含まれる。脂肪酸は、飽和脂肪酸であっても不飽和脂肪酸であってもよい。脂肪酸およびその塩は、炭素数が１０以上２２以下であることが好ましく、炭素数が１２以上１８以下であることがより好ましい。
【００４７】
脂肪酸の例としては、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、アラキジン酸、ベヘン酸、リグノセリン酸、ミリストレイン酸、パルミトレイン酸、オレイン酸、バクセン酸、イコセン酸、ドコセン酸、テトラコセン酸、リノール酸、α−リノレン酸、イコサジエン酸、イコサテトラエン酸、イコサトリエン酸、イコサペンタエン酸、ドコサヘキサエン酸、カプリン酸、ラウリン酸、γ−リノレン酸およびアラキドン酸等が挙げられる。
【００４８】
上記した脂肪酸の塩の種類としては、ナトリウム塩およびカリウム塩が挙げられる。なお、水溶性が十分でない脂肪酸については、エタノール等有機溶媒に溶解させた後、免疫賦活剤の製造に供することが可能である。
【００４９】
一例では、本実施形態に係る免疫賦活剤は、アニオン性界面活性剤としてオレイン酸ナトリウムまたはラウリン酸ナトリウムを含む。
【００５０】
本実施形態に係る免疫賦活剤に含有されるアニオン性界面活性剤の好ましい量は後述するが、免疫賦活剤に含有されるアニオン性界面活性剤の量は、一例では、免疫賦活剤の製造工程で調製されるキトサン溶液における、アニオン性界面活性剤の最終濃度を決定することで決定される。
【００５１】
〔抗原〕
本実施形態に係る免疫賦活剤は抗原を含み得る。
【００５２】
抗原としては、特に限定されるものではないが、例えば、細胞、細菌、ウイルス、核酸、タンパク質、糖質、脂質、糖タンパク質、リポタンパク質、糖脂質、オリゴペプチド、ポリペプチド、ホルモン、および金属イオン等を挙げることができる。なお、ＴＬＲリガンドとしても機能する抗原は、本明細書ではＴＬＲリガンドとみなす。より具体的には、かかる抗原としては、例えば、がん細胞、特定遺伝子を強制発現させた細胞；Ｏ１５７、サルモネラ菌、結核菌等の細菌、インフルエンザ、はしか、ポリオ等のウイルス、抗原タンパク質をコードする核酸；アルブミン、α‐フェトプロテイン（ＡＦＰ）、ガン胎児性抗原（ＣＥＡ）、ＣＡ１９−９、塩基性胎児タンパク質（ＢＦＰ）、膵胎児抗原（ＰＯＡ）、アルドラーゼ、アルカリ・フォスファターゼ、γグルタミルトランスペプチダーゼ、ニューロン特異的エノラーゼ、５´ヌクレオチド・フォスフォジエステラーゼ・アイソザイムＶ（５´−ＮＰＤ−Ｖ）、異常プロトロンビン（ＰＩＶＫＡ−ＩＩ）等の腫瘍マーカー；ＩｇＭ、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＤ等の免疫グロブリン；Ｂ型肝炎ウイルス関連抗原、Ｃ型肝炎ウイルス関連抗原、インフルエンザウイルス等のウイルス抗原；甲状腺ホルモン、ステロイドホルモン等のホルモン等を挙げることができる。中でも好ましいものは、ウイルス抗原、細菌抗原、がん抗原、またはがん細胞溶解液であり、より好ましいものはがん細胞抗原またはがん細胞溶解液である。本明細書における「がん抗原」は、腫瘍に特異的に高発現している遺伝子産物（例えば、タンパク質、核酸、およびこれらの修飾付加物など）またはその断片を指す。
【００５３】
本実施形態に係る免疫賦活剤に含まれ得る抗原の量は、当該抗原の種類および投与する対象によって適宜決定することができる。例えば、既知の抗原タンパク質を用いる場合は、投与する対象に対する当該抗原の投与量に係る既報を参照して決定すればよい。例えば、ウシ、ブタ、およびヒト等を含む哺乳動物の場合は、例えば、０．３μｇ以上３００ｍｇ以下、あるいは１０μｇ以上３００μｇ以下の範囲内であってよい。
【００５４】
本実施形態に係る免疫賦活剤が抗原を含む形態で使用されるとき、ＴＬＲリガンドと抗原とは一緒に同じ抗原提示細胞に作用することが効果的である。本実施形態におけるＴＬＲリガンドと抗原とが何れも、粒子状キトサンに保持されている場合には、ＴＬＲリガンドと抗原とが保護され、両者は分離しにくくなる。
【００５５】
〔α−ＧａｌＣｅｒ〕
本実施形態に係る免疫賦活剤はα−ＧａｌＣｅｒ（ガラクトセラミド）を含み得る。α−ＧａｌＣｅｒを含有する免疫賦活剤は、ＩＦＮ−γ産生を促進するため、免疫賦活剤としてより効果的に作用する。
【００５６】
〔粒子状キトサンに対する各成分の含有比率〕
本実施形態に係る免疫賦活剤に含まれる粒子状キトサンの濃度は、免疫賦活剤が液体の形態である場合、例えば、０．１ｍｇ／ｍｌ以上で５０ｍｇ／ｍｌ以下の範囲内であることが好ましい。また、免疫賦活剤のボリューム（液量）を小さくできる観点では、免疫賦活剤に含まれる粒子状キトサンの濃度が高いほど好ましい。キトサンの溶解性又は粘度等に応じて、粒子状キトサンの濃度の上限は、例えば、５０ｍｇ／ｍｌ以下、４５ｍｇ／ｍｌ以下、４０ｍｇ／ｍｌ以下、３５ｍｇ／ｍｌ以下、３０ｍｇ／ｍｌ以下、２５ｍｇ／ｍｌ以下、２０ｍｇ／ｍｌ以下、１５ｍｇ／ｍｌ以下、または１０ｍｇ／ｍｌ以下とすることもできる。一例では、免疫賦活剤は、ここで示す上限の濃度の８０％以上の濃度で粒子状キトサンを含んでいる。
【００５７】
本実施形態に係る免疫賦活剤に含まれる粒子状キトサンに対するＴＬＲリガンドの質量の比率（リガンド／キトサン）は投与形態に応じて異なるが、例えばＣｐＧの場合は、０．０３以上３０以下であることが好ましく、０．１以上１０以下であることがより好ましく、０．３以上３以下であることがさらに好ましい。
【００５８】
本実施形態に係る免疫賦活剤がアニオン性界面活性剤を含む場合、粒子状キトサンに対するアニオン性界面活性剤の質量の比率（界面活性剤／キトサン）は０．０５以上１以下であることが好ましく、０．１以上０．５以下であることがより好ましく、０．１５以上０．３以下であることがさらに好ましい。
【００５９】
本実施形態に係る免疫賦活剤が抗原を含む場合、免疫賦活剤に含まれる粒子状キトサンに対する抗原の質量の比率（抗原／キトサン）は０．０１以上１０以下であることが好ましく、０．０３以上５以下であることがより好ましく、０．１以上１以下であることがさらに好ましい。
【００６０】
本実施形態に係る免疫賦活剤がα−ＧａｌＣｅｒを含む場合、免疫賦活剤に含まれる粒子状キトサンに対するα−ＧａｌＣｅｒの質量の比率（α−ＧａｌＣｅｒ／キトサン）は０．００１以上０．５以下であることが好ましく、０．００３以上０．３以下であることがより好ましく、０．０１以上０．１以下であることがさらに好ましい。
【００６１】
〔その他の添加剤〕
本実施形態に係る免疫賦活剤は、免疫賦活剤の効果を損なわない範囲で、賦形剤、各種補助剤等の添加剤をさらに含んでいてもよい。例えば、トレハロース、グルコース、ショ糖、乳糖、グルコース、マンニトール、デキストラン、キシリトール、マルトース、フルクトース、グリシン、クエン酸および塩化ナトリウムまたはノニオン性界面活性剤等を含み得る。このような添加剤を含むことにより、凍結乾燥または長期の低温保存による凝集または免疫賦活活性の低下等の性質の不安定化を防止することができる。
【００６２】
また、その他の添加剤としては、ビタミンＣおよびビタミンＥ等が挙げられる。これらを含むことにより脂肪酸の酸化分解を抑制することができる。
【００６３】
また、各種補助剤としては、湿潤剤、乳化剤、ｐＨ調整剤および他のアジュバント等が挙げられる。
【００６４】
ｐＨ調整剤としては、必要に応じてアルカリ物質または酸性物質のいずれも使用可能である。ｐＨの調整に使用されるアルカリ物質としては、水酸化ナトリウム等が挙げられる。また、ｐＨの調整に使用される酸性物質としては酢酸および塩酸等が挙げられる。
【００６５】
他のアジュバントとしては、例えば、アラム、フロイントの完全アジュバント、フロイントの不完全アジュバント、オイルアジュバント、サポニン、細胞壁骨格構成物、リポポリサッカライド、エンドトキシン、アブリシン、リポソーム、細菌ＤＮＡ、合成オリゴヌクレオチド、ビタミンＥ、糖脂質およびスクワレン等のうち、本実施形態に係る免疫賦活剤が含んでいないものが挙げられる。アジュバントを複数種類組み合わせることによって、免疫応答の促進等において各アジュバントを個別に投与する場合よりも相乗効果を有する場合がある。
【００６６】
〔その他の成分〕
本実施形態に係る免疫賦活剤では、粒子状キトサン表面へ、薬物を保持させていてもよい。また、ポリカルボン酸等のアニオン性高分子で粒子状キトサン表面を被覆してもよい。ポリカルボン酸としては、ペクチン、アルギン酸、ポリアクリル酸、ヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸およびポリ−γ−グルタミン酸等が挙げられる。かかる物質で粒子状キトサンを被覆することによって、消化酵素に対する高い安定性を賦与することが可能である。
【００６７】
〔免疫賦活剤の剤型及び投与形態等〕
本実施形態に係る免疫賦活剤を使用する場合、その剤型は特に限定されず、液体、固体または半固体もしくは半液体とすることができ、好ましくは液体の形態である。これらの剤型は、当業者に公知の方法に基づき、必要に応じて適切な薬学的担体を採用して容易に製造することができる。剤型が固体の場合は、粉末、顆粒、錠剤、およびカプセル剤等が挙げられる。例えば、少なくともＴＬＲリガンドを保持している粒子状キトサンを、粒子として用いる形態も、剤型が固体である場合に含まれる。また、剤型が半固体または半液体の場合は、軟膏、ローション、クリームおよびゲル等が挙げられる。剤型が液体の形態の場合、用いる溶媒の例としては、水および緩衝液等が挙げられ、緩衝液としては、生理食塩水、リン酸緩衝液およびリンゲル液等が挙げられる。また、溶媒はここから選ばれる２種類以上の混合物であってもよい。
【００６８】
また、本実施形態に係る免疫賦活剤の投与経路としては、経口、局所、皮下、筋肉内、静脈内、皮内、腹腔内、経粘膜および経皮等が挙げられるが、これらに限定されない。免疫賦活剤の投与の方法は、例えば、皮下、皮内、静脈内、筋肉内または腹腔内等への直接注射；鼻腔内、口腔内、肺内、膣内または直腸内等の粘膜への噴霧；ならびに経口投与等の、公知の方法に基づいて行われる。
【００６９】
〔免疫賦活剤の投与対象〕
免疫賦活剤の投与対象としては、あらゆる動物が挙げられ、哺乳類および鳥類等の脊椎動物が好ましく、哺乳類であることがより好ましい。さらに、哺乳類の前記被験体はヒトであることが好ましいが、家畜、実験動物またはペット動物が被験体となる場合もあり得る。具体的にはニワトリ、ブタ、ウマ、ヤギ、ヒツジおよびウシ等の家畜類、ネコ、イヌ、ハムスター、ウサギおよびモルモット等のペット動物、マウス、ラット、サル、魚類および鳥類等が挙げられる。
【００７０】
本実施形態に係る免疫賦活剤は、一般に免疫系強化をもたらすのに十分な量および回数で、ヒトを含む動物等の被験体に投与される。動物への１回あたりの投与量の上限としては、例えば、免疫賦活剤に含まれる粒子状キトサンの量で、５０ｍｇ以下、４５ｍｇ以下、４０ｍｇ以下、３５ｍｇ以下、３０ｍｇ以下、２５ｍｇ以下、２０ｍｇ以下、１５ｍｇ以下、１０ｍｇ以下、１ｍｇ以下、または０．５ｍｇ以下の範囲内等が挙げられる（なお、粒子状キトサンに対するＴＬＲリガンドの質量の比率（リガンド／キトサン）は、投与形態に応じて異なるが、例えばＣｐＧの場合は、０．０３以上３０以下であり、より具体的には例えば、０．１以上１０以下および、０．３以上３以下等が挙げられる）。動物への１回あたりの投与量の下限としては、例えば、免疫賦活剤に含まれる粒子状キトサンの量で、例えば、３μｇ以上、３０μｇ以上、３００μｇ以上、３ｍｇ以上、または３０ｍｇ以上とすることもできる。このような投与量で投与することによれば、対象ヘの過剰な免疫賦活による悪影響を及ぼすことなく、生体への安全性を保ちつつ十分な免疫賦活活性を得ることができるため、効果的である。
【００７１】
免疫賦活剤が液体の形態である場合、粒子状キトサンの濃度は、例えば、０．１ｍｇ／ｍｌ以上で５０ｍｇ／ｍｌ以下の範囲内であることが好ましい。また、免疫賦活剤のボリューム（液量）を小さくできる観点では、免疫賦活剤に含まれる粒子状キトサンの濃度が高いほど好ましい。キトサンの溶解性又は粘度等に応じて、粒子状キトサンの濃度の上限は、例えば、５０ｍｇ／ｍｌ以下、４５ｍｇ／ｍｌ以下、４０ｍｇ／ｍｌ以下、３５ｍｇ／ｍｌ以下、３０ｍｇ／ｍｌ以下、２５ｍｇ／ｍｌ以下、２０ｍｇ／ｍｌ以下、１５ｍｇ／ｍｌ以下、または１０ｍｇ／ｍｌ以下とすることもできる。一例では、免疫賦活剤は、ここで示す上限の濃度の８０％以上の濃度で粒子状キトサンを含んでいる。
【００７２】
本実施形態に係る免疫賦活剤の具体的な使用用途としては、細菌またはウイルス等による感染、がんまたは自己免疫疾患またはアレルギーのような疾患の治療または予防が挙げられる。例えば、ワクチン療法、がん等に対する免疫療法、アレルギーの原因物質に対する減感作療法等が挙げられる。
【００７３】
〔免疫賦活剤の特性〕
本実施形態に係る免疫賦活剤は、顕著な免疫賦活化作用を有するので、例えば、本発明の免疫賦活剤を用いて、生体において正常な代謝免疫応答が低下または抑制される疾病、疾患または障害を有する患者の治療に有用である。また、本発明の免疫賦活剤は、免疫系に悪影響を及ぼす状態に起因する疾病、疾患または障害に罹患する危険性が高くなっている動物またはヒト等の被験体を治療的または予防的に処置するために用いることができる。
【００７４】
本実施形態に係る免疫賦活剤は、液性免疫と細胞性免疫とを相乗的に賦活化する効果を有する。加えて、粒子状キトサンとＴＬＲリガンドとは互いに別異のアジュバント効果を示し、かつ、これら効果は互いに打ち消し合うこともないことから、抗原選択の自由度の飛躍的な拡大にもつながりうる。
【００７５】
さらに、少ない量の免疫賦活剤および抗原を用いても非常に高い免疫賦活活性を示すため、副作用が少ない。特に、実施例から明らかなように、この免疫賦活剤を投与しても、アレルギー反応を引き起こす原因となる可能性のあるＩｇＥの産生はわずかである。
【００７６】
上述したような特性は、粒子状キトサンに各種物質（ＴＬＲリガンド、抗原またはα−ＧａｌＣｅｒ等）が保持されている場合に特に顕著になると推定される。
【００７７】
２．免疫賦活剤の製造方法
本実施形態に係る免疫賦活剤は、粒子状キトサンにＴＬＲリガンドを保持させる工程を含む方法によって製造することができる。
【００７８】
〔粒子状キトサンを調製する工程〕
（粒子状キトサンを製造するための原料としてのキトサン）
キトサンは、通常、カニおよびエビ等の甲殻由来のキチン（ポリ−β１，４−Ｎ−アセチルグルコサミン）をアルカリ処理または酵素処理等によって脱アセチル化することによって調製することができる。本明細書では、キチンの少なくとも一部が脱アセチル化されたものをキトサンと称する。なお、本発明に係るキトサンは天然由来のものに限らず、化学的に合成されたものであってもよい。
【００７９】
本実施形態における粒子状キトサンの原料となるキトサンは、キチン分子を構成するグルコサミン単位のうちのＮ−脱アセチル化されている分子の割合、すなわち、脱アセチル化度が、好ましくは６０％以上１００％以下、より好ましくは７０％以上１００％以下の範囲にあるものである。なお、脱アセチル化度は、公知の技術（例えばコロイド滴定法）に基づいて定量してもよい。公知の技術の一例としてはＮＭＲが挙げられる。
【００８０】
粒子状キトサンの原料として好ましいキトサンの重量平均分子量としては、キトサンのグルコサミン残基の分子量を１６１、Ｎ−アセチルグルコサミン残基の分子量を２０３とし、脱アセチル化度が、６０％以上１００％以下の範囲とした場合において、原料のキトサン分子重量平均分子量は約５ｋ（５０００）以上約１０００ｋ（１００００００）以下であり得る。
【００８１】
本実施形態におけるキトサンの性状は特に限定されず、例としては、粒子状、粉末状、繊維状、フィルム状、シート状、ハイドロゲル状および溶液状のキトサン分子が挙げられる。
【００８２】
（キトサン溶液の調製）
溶液状でないキトサンを原料とする場合は、キトサンを溶媒に溶かしてキトサン溶液を調製する。溶媒は、キトサンを溶解させることができればどのようなものでもよい。例えば、酢酸緩衝液、酢酸、ギ酸、プロピオン酸、リンゴ酸、コハク酸および乳酸の等の有機酸の水溶液が挙げられる。緩衝液としては例えば、最終濃度が５〜５０ｍＭの濃度の酢酸緩衝液（ｐＨ５．０、生理食塩水）である。キトサン溶液におけるキトサンの濃度は特に限定されないが、例えば、０．１ｍｇ／ｍｌ以上５０ｍｇ／ｍｌ以下の範囲内であることが好ましく、０．１ｍｇ／ｍｌ以上３０ｍｇ／ｍｌ以下であることが好ましく、０．２ｍｇ／ｍｌ以上２０ｍｇ／ｍｌ以下であることがより好ましい。なお、免疫賦活剤のボリューム（液量）を小さくできる観点では、キトサンの濃度は高いことが好ましい。
【００８３】
（キトサン溶液からの粒子状キトサンの調製）
粒子状キトサンの調製方法は、例えば、キトサン溶液の水滴からなるＷ/Ｏエマルションを調製し、この水滴を濃縮することで粒子状のキトサンを析出させる等の方法が挙げられるが、アニオン性界面活性剤を用いて、キトサンを粒子化する方法が特に好ましい。アニオン性界面活性剤を用いた方法は、簡便であり、かつ、アニオン性界面活性剤がキトサンと複合化されている粒子状キトサン（免疫賦活剤に特に適した粒子状キトサン。実施例における「微粒子化キトサン」）を得ることができる。以下、アニオン性界面活性剤を用いた方法についてより具体的に説明する。
【００８４】
アニオン性界面活性剤を用いた方法では、粒子の形成は、（１）プロトン化したキトサンのアミノ基（−ＮＨ３＋）と脱プロトン化したアニオン性界面活性剤のカルボキシル基のカルボキシラートイオン（−ＣＯＯ−）の静電的相互作用を介した、キトサンとアニオン性界面活性剤との複合化、および（２）疎水性相互作用によるアニオン性界面活性剤の会合によって生じると考えられる（参考文献；黒岩崇著、浦上財団研究報告書  Ｖｏｌ．２２、１６〜２０頁（２０１５））。
【００８５】
キトサン溶液は、キトサンがカチオン性を示す中性〜弱酸性のｐＨであることが好ましい。
【００８６】
混合するアニオン性界面活性剤の好ましい例は、上述の「１．免疫賦活剤」の〔アニオン性界面活性剤〕の欄で説明した通りである。
【００８７】
上記の溶媒中へのキトサンおよびアニオン性界面活性剤の各成分の混合順はどのような順序であってもよい。例えば、１）溶媒へキトサンを溶解してキトサン溶液を調製した後に、アニオン性界面活性剤を加えてもよく、２）溶媒へ、キトサンとアニオン性界面活性剤とを実質的に同時に加えて、キトサン溶液の調製と粒子状キトサンの調製とを同時進行で行ってもよく、或いは、３）溶媒へアニオン性界面活性剤を加えた後にキトサンを加えて、キトサン溶液の調製と粒子状キトサンの調製とを同時進行で行ってもよい。中でも、１）の方法が特に好ましい。
【００８８】
粒子状キトサンあたりのキトサンとアニオン性界面活性剤との質量比は、キトサンの分子量または使用される界面活性剤の種類等の条件に応じて変化する。一実施形態では粒子状キトサンあたりのキトサンと、アニオン性界面活性剤アニオン性基とのモル比は、好ましくは１：０．０５以上１：１以下の範囲であり、より好ましくは１：０．１以上１：０．５以下であり、さらに好ましくは１：０．１５以上１：０．３以下である。
【００８９】
〔粒子状キトサンにＴＬＲリガンド等を保持させる工程〕
上記のように調製した粒子状キトサンにＴＬＲリガンドを保持させる方法は特に限定されないが、例えば、１）ＴＬＲリガンドと、調製済の粒子状キトサンとを接触させてもよく、或いは、２）ＴＬＲリガンドと、調製中の粒子状キトサンとを接触させてもよい。１）の場合は、例えば、調製済の粒子状キトサンを含んだ溶媒にＴＬＲリガンドを加えればよく、２）の場合は、例えば、ＴＬＲリガンドを含んだキトサン溶液から粒子状キトサンを調製することによって、粒子状キトサンの調製と粒子状キトサンへのＴＬＲリガンドの保持とを同時進行で行ってもよい。なお、１）・２）の何れの場合でも、アニオン性界面活性剤を用いた方法で調製した粒子状キトサンを用いることが好ましい。また、１）の場合では、調製した粒子状キトサンは、冷凍または冷蔵保存しておくことができる。
【００９０】
なお、粒子状キトサンにＴＬＲリガンドを保持させる方法と同様の方法を用いれば、上記した抗原またはα−ＧａｌＣｅｒその他の成分も、粒子状キトサンに保持させることができる。
【００９１】
〔その他の工程〕
ＴＬＲリガンド等を保持させた粒子状キトサンは、その溶媒と共に、免疫賦活剤として利用をしてもよい。あるいは、ＴＬＲリガンド等を保持させた粒子状キトサンを回収し、洗浄等の工程を経た後に、必要に応じて担体等と組合せて免疫賦活剤として利用をしてもよい。
【００９２】
３．キット
本発明は、また、免疫賦活剤製造用のキットを提供する。該キットは、１）容器に格納されている、アニオン性界面活性剤を保持している粒子状キトサンと、２）キットの使用説明と、を備えている。容器は、例えば、密閉性のある袋または、蓋付きの密閉容器、等が挙げられる。容器内の粒子状キトサンは液体中に分散されたものであってもよい。使用説明は、例えば、紙等の記録媒体または上記容器に印刷されたものであってもよく、情報記録媒体若しくはインターネット上に電子的に保存されたものであってもよい。
【００９３】
使用説明には、粒子状キトサンに、ＴＬＲリガンドを保持させることで免疫賦活剤を製造することが記載されている。より具体的には、例えば、使用説明には、上記「２．免疫賦活剤の製造方法」の〔粒子状キトサンにＴＬＲリガンド等を保持させる工程〕欄に記載のような、粒子状キトサンにＴＬＲリガンドを保持させる方法が記載されている。
【００９４】
なお、「アニオン性界面活性剤」、「粒子状キトサン」、および「ＴＬＲリガンド」は、上記「１．免疫賦活剤」に記載のものと同じである。なお、アニオン性界面活性剤を保持している粒子状キトサンは、アニオン性界面活性剤とキトサンとが複合化されているものであることが好ましい。
【００９５】
キットは、さらに、必要に応じて、各種ＴＬＲリガンド、抗原、腔内投与または採血を行う器具（注射器等）、および抗体価測定に用いる試薬および器具（ピペット、９６穴マイクロプレート等）等を備えていてもよい。このキットは、免疫賦活剤の製造、ひいては免疫を賦活するためのワクチン等の製造に用いることができる。
【００９６】
４．免疫賦活剤の利用
〔ワクチン〕
本実施形態に係る免疫賦活剤は、ワクチンとして利用することもできる。本明細書においてワクチンとは、病原体そのものあるいは病原体に由来する特定の抗原を含むことによって、特定の疾病、疾患または障害の予防または治療を目的とする、医薬組成物をさす。医薬組成物とは、ヒト用の医薬組成物のみならず動物用の医薬組成物も含む概念である。ワクチンに含まれる抗原の種類は、予防又は治療の対象となる特定の疾患等に応じて選択される。抗原の一例は、「１．免疫賦活剤の〔抗原〕」の欄に記載したもの（例えばがん抗原およびがん細胞溶解液）が挙げられる。なお、ワクチンは、複数の特定の疾患等を対象とする、多種混合のワクチン組成物であってもよい。
【００９７】
以上の段落の記載にしたがって、上記抗原の一例として、がん抗原およびがん細胞溶解液を選択したとき、上記特定の疾病、疾患または障害は、がんであり、上記ワクチンは、がんの予防または治療に利用され得る（つまり上記ワクチンはがんワクチンである（実施例を参照））。
【００９８】
本実施形態に係るワクチンでは、従来のアジュバントと比較して、少ない量の免疫賦活剤および抗原を用いても非常に高い免疫賦活活性および高い中和抗体価を得ることができる。アジュバント量と抗原量とを減らすことができるので、生体への過剰な刺激が生じず、安全性が高く、コストの面でも安価なワクチンとすることができる。
【００９９】
なお、免疫賦活剤に含まれる粒子状キトサンは、生分解性であって、かつ生体に対して低毒性であるため、適度な期間を経て完全に分解し、消滅する。そのため生体内で残留して生体の健康に副作用を及ぼす虞が低く、安全に使用することができる。
【０１００】
研究目的で広く用いられているフロイントアジュバントは、ホストの動物の投与部位に炎症および組織の壊死を引き起こすことがあったが、本実施形態に係る免疫賦活剤は、動物に過度の苦痛を与えることなく投与可能であり、安全、安価かつ容易に製造することができるので商業的価値が非常に高い。
【０１０１】
〔食品添加物〕
本実施形態に係る免疫賦活剤は、飲食品用の添加物として利用することもできる。本実施形態に係る免疫賦活剤を、飲食品用の添加物として利用することによって、免疫賦活活性を持つ飲食品組成物を提供することが出来る。免疫賦活活性を持つ飲食品組成物としては、例えば、免疫賦活、免疫活性化、又は免疫力アップ等の表示がなされた特定保健用飲食品、機能性表示飲食品、又は栄養機能飲食品が挙げられる。
【０１０２】
５．まとめ
以上から明らかなように、本発明は以下を包含する。
＜１＞  粒子状キトサンとＴＬＲ（toll様受容体）リガンドとを含んでいる、免疫賦活剤。
＜２＞  さらにアニオン性界面活性剤を含む、＜１＞に記載の免疫賦活剤。
＜３＞  上記アニオン性界面活性剤が、リン脂質、炭素数１０以上２２以下の脂肪酸およびその塩から選択される少なくとも１種類である、＜２＞に記載の免疫賦活剤。
＜４＞  上記リン脂質が、レシチンまたはリゾレシチンであり、上記脂肪酸またはその塩が、オレイン酸ナトリウムまたはラウリン酸ナトリウムである、＜３＞に記載の免疫賦活剤。
＜５＞  上記粒子状キトサンが、重量平均分子量が５Ｋ以上１０００Ｋ以下、かつ、粒子径が５００ｎｍ以下である、＜１＞〜＜４＞のいずれか１つに記載の免疫賦活剤。
＜６＞  上記ＴＬＲが、ヒトのＴＬＲ３、４および７〜９からなる群より選ばれる少なくとも１種である、＜１＞〜＜５＞のいずれか１つに記載の免疫賦活剤。
＜７＞  さらに、抗原を含む、＜１＞〜＜６＞のいずれか１つに記載の免疫賦活剤。
＜８＞  さらに、α−ＧａｌＣｅｒを含む、＜１＞〜＜７＞のいずれか１つに記載の免疫賦活剤。
＜９＞  免疫賦活剤製造用のキットであって、容器に格納されている、アニオン性界面活性剤を保持しているキトサンと、キットの使用説明と、を備えており、上記キトサンは、粒子状キトサンであり、上記使用説明には、上記粒子状キトサンに、ＴＬＲリガンドを保持させることで免疫賦活剤を製造することが記載されている、免疫賦活剤製造用のキット。
＜１０＞  ＜１＞〜＜８＞のいずれか１つに記載の免疫賦活剤を含む、ワクチン。
＜１１＞  上記ワクチンは、がんワクチンである、＜１０＞に記載のワクチン。
＜１２＞  粒子状キトサンにＴＬＲリガンドを保持させる工程を含む、免疫賦活剤の製造方法。
【０１０３】
以下に実施例を示し、本発明の実施の形態についてさらに詳しく説明する。もちろん、本発明は以下の実施例に限定されるものではなく、細部については様々な態様が可能であることはいうまでもない。さらに、本発明は上述した実施形態に限定されるものではなく、請求項に示した範囲で種々の変更が可能であり、それぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。また、本明細書中に記載された文献の全てが参考として援用される。
【実施例】
【０１０４】
〔実施例１〕
（微粒子化キトサン分散液の調製）
キトサン（FL-80、甲陽ケミカル社製、脱アセチル化度９０％、重量平均分子量３００００、Lot0507-27）５００ｍｇを蒸留水２５ｍｌに分散し、酢酸２００μｌを加えて溶解した。キトサン溶液に、キトサンのアミノ基の０．２８当量になるようにオレイン酸ナトリウム（アニオン性界面活性剤）を添加し、５ｍＭ酢酸緩衝生理食塩水（ｐＨ５．０）に微粒子化キトサンが０．１ｗｔ％で懸濁されている溶液（以下、溶液Ａ）を得た。さらに、この溶液Ａに、抗原として卵白アルブミン（ＯＶＡ、和光純薬工業社製）１μｌを添加して微粒子化キトサン懸濁液（以下、ＣＮ溶液）を得た。【０１０５】
（試験溶液の調製）
ＣＮ溶液にＴＬＲ４アゴニストとしてＭＰＬ（Monophosphoryl lipid A （Synthetic）（PHAD）、Avanti Polar Lipids社製、＃699800P、PHADはAvanti Polar Lipids社の登録商標）１０μｌを添加し、１００μｌ中に微粒子化キトサン１０μｇ、ＯＶＡ１μｇおよびＭＰＬ１０μｇを含む試験液Ｍ１０を得た。【０１０６】
また、ＣＮ溶液にＭＰＬ１μｌを添加して、１００μｌ中に微粒子化キトサン１０μｇ、ＯＶＡ１μｇおよびＭＰＬ１μｇを含む試験液Ｍ１を得た。【０１０７】
（免疫）
５週齢のメスのBalb/cAJclマウス（日本クレア社）を１週間馴化し、各群５匹となるようにランダムに群分けした。【０１０８】
１群にＣＮ溶液１００μｌを、２群に試験液Ｍ１０  １００μｌを、３群に試験液Ｍ１  １００μｌを、２週間間隔で２回腹腔内投与し、各免疫から１週間後に尾静脈から採血して血清サンプルを得た。【０１０９】
（抗体価の測定）
ＯＶＡを、５０ｍＭ炭酸緩衝液（ｐＨ９．６）を用いて２μｇ／ｍｌとなるように調製した。このＯＶＡ溶液を９６穴プレートに１ウェルあたり１００μｌずつ分注して、抗原の固相化プレートを作製し、Block Ace（雪印乳業社製、カタログナンバーUK-B80）を用いてブロッキングを行った。【０１１０】
６０００倍希釈した各血清サンプルを１００μｌずつ各ウェルに添加し、常温で２時間反応させた。二次抗体として、ＨＲＰ標識抗マウスＩｇＧ１抗体（Bethyl社製、カタログナンバーA90-105P）、ＨＲＰ標識抗マウスＩｇＧ２ａ抗体（Bethyl社製、カタログナンバーA90-107P）、またはＨＲＰ標識抗マウスＩｇＧ２ｂ抗体（Bethyl社製、カタログナンバーA90-109P）を用いて、それぞれ室温で２時間反応させた。【０１１１】
ＴＭＢＺ（Sigma社、カタログナンバーT3405）を基質として、室温で２時間反応させて２Ｎ硫酸で反応を停止させた。プレートリーダー（BIO-RAD社製：model 680 Cat. No. 168-1000）で吸光度（ＯＤ値）を測定した（ｄｕａｌ：測定４５０ｎｍ、対照５７０ｎｍ）。結果を図１に示す。【０１１２】
〔実施例２〕
実施例１のＣＮ溶液中のＯＶＡ添加量を１０μｌとし、実施例１と同様にして試験液を得た。なお、試験液は、１００μｌ中に微粒子化キトサン１０μｇ、ＯＶＡ１０μｇおよびＭＰＬ１０μｇを含む試験液をＭ１０−１０とし、１００μｌ中に微粒子化キトサン１０μｇ、ＯＶＡ１０μｇおよびＭＰＬ１μｇを含む試験液をＭ１−１０とした。【０１１３】
マウスに対する免疫は、２群に試験液Ｍ１０−１０  １００μｌを、３群に試験液Ｍ１−１０  １００μｌを投与した。また、二次抗体として、さらに、ＨＲＰ標識抗マウスＩｇＥ抗体（Ｂｅｔｈｙｌ社製カタログナンバーA90-115P）を用いたこと以外は実施例１と同様に操作を行った。結果を図２に示す。【０１１４】
〔実施例３〕
実施例１と同様にして得たＣＮ溶液に対し、ＭＰＬに替えて、ＴＬＲ３アゴニストとしてＰｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）（Invivogen社製、カタログナンバーtlrl-pic、以下Ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ））３０μｇを添加し、１００μｌ中に微粒子化キトサン１０μｇ、ＯＶＡ１μｇおよびＰｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）３０μｇを含む試験液Ｐ３０を得た。また、Ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）の添加量を１０μｇとした試験液Ｐ１０を得た。さらに、Ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）の添加量を３μｇとした試験液Ｐ３を得た。【０１１５】
マウスに対する免疫は、２群に試験液Ｐ３０  １００μｌを、３群に試験液Ｐ１０  １００μｌを、４群にＰ３  １００μｌを投与した。これ以外は実施例１と同様に操作を行った。結果を図３に示す。【０１１６】
〔実施例４〕
実施例１と同様にして得たＣＮ溶液に対し、ＭＰＬに替えてＴＬＲ９アゴニストとしてマウス特異的クラスＢのＣｐＧ（Invivogen社製、ODN 1826 VacciGrade、カタログコードvac-1826-1）１５μｇを添加し、１００μｌ中に微粒子化キトサン１０μｇ、ＯＶＡ１μｇおよびＣｐＧ１５μｇを含む試験液Ｃ１５を得た。また、ＣｐＧの添加量を５μｇとした試験液Ｃ５を得た。さらに、ＣｐＧの添加量を１．５μｇとした試験液Ｃ１．５を得た。【０１１７】
マウスに対する免疫は、２群に試験液Ｃ１５  １００μｌを、３群に試験液Ｃ５  １００μｌを、４群にＣ１．５  １００μｌを投与した。これ以外は実施例１と同様に操作を行った。結果を図４に示す。【０１１８】
〔実施例５〕
実施例１と同様にして得たＣＮ溶液に対し、ＭＰＬに替えてＴＬＲ７／８アゴニストとしてＲ８４８（東京化成工業社製、resiquimod：製品コードR0197）１０μｇを添加し、１００μｌ中に微粒子化キトサン１０μｇ、ＯＶＡ１μｇおよびＲ８４８  １０μｇを含む試験液Ｒ１０を得た。また、Ｒ８４８の添加量を３μｇとした試験液Ｒ３を得た。さらに、Ｒ８４８の添加量を１μｇとした試験液Ｒ１を得た。【０１１９】
マウスに対する免疫は、２群に試験液Ｒ１０  １００μｌを、３群に試験液Ｒ３  １００μｌを、４群にＲ１  １００μｌを投与した。これ以外は実施例１と同様に操作を行った。結果を図５に示す。【０１２０】
〔実施例６〕
実施例１と同様にして得たＣＮ溶液に対し、ＭＰＬ３μｇとＰｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）３μｇとを添加し、１００μｌ中に微粒子化キトサン１０μｇ、ＯＶＡ１μｇ、ＭＰＬ３μｇ、およびＰｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）３μｇを含む試験液ＭＰ３を得た。また、ＭＰＬ３μｇとＰｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）３μｇに替えて、ＭＰＬ３μｇとＣｐＧ３μｇとを添加した試験液ＭＣ３を得た。また、ＭＰＬ３μｇとＰｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）３μｇに替えて、ＭＰＬ３μｇとＲ８４８  ３μｇとを添加した試験液ＭＲ３を得た。また、ＭＰＬ３μｇとＰｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）３μｇに替えて、Ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）３μｇとＣｐＧ３μｇとを添加した試験液ＰＣ３を得た。また、ＭＰＬ３μｇとＰｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）３μｇに替えて、Ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）３μｇとＲ８４８  ３μｇとを添加した試験液ＰＲ３を得た。また、ＭＰＬ３μｇとＰｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）３μｇに替えて、ＣｐＧ３μｇとＲ８４８  ３μｇとを添加した試験液ＣＲ３を得た。【０１２１】
マウスに対する免疫は、１群にＭＰ３  １００μｌを、２群に試験液ＭＣ３  １００μｌを、３群に試験液ＭＲ３  １００μｌを、４群にＰＣ３  １００μｌを、５群にＰＲ３  １００μｌを、６群にＣＲ３  １００μｌを投与した。これ以外は実施例１と同様に操作を行った。結果を図６に示す。【０１２２】
〔参考例〕
実施例１と同様にして得たＣＮ溶液に対し、ＭＰＬに替えてＮＫＴ細胞を活性化する糖脂質としてα−ＧａｌＣｅｒ（フナコシ社製、商品コードKRN7000）１μｇを添加し、１００μｌ中に微粒子化キトサン１０μｇ、ＯＶＡ１μｇおよびα−ＧａｌＣｅｒ１μｇを含む試験液α１を得た。また、α−ＧａｌＣｅｒの添加量を０．１μｇとした試験液α０．１を得た。さらに、α−ＧａｌＣｅｒの添加量を０．０１μｇとした試験液α０．０１を得た。【０１２３】
マウスに対する免疫は、２群に試験液α１  １００μｌを、３群に試験液α０．１  １００μｌを、４群にα１０．０１  １００μｌを投与した。これ以外は実施例１と同様に操作を行った。結果を図７に示す。【０１２４】
〔実施例７〕
実施例１と同様にして得たＣＮ溶液に対し、ＭＰＬ３μｇとＰｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）３μｇとα−ＧａｌＣｅｒ３μｇとを添加し、１００μｌ中に微粒子化キトサン１０μｇ、ＯＶＡ１μｇ、ＭＰＬ３μｇ、Ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）３μｇおよびα−ＧａｌＣｅｒ３μｇを含む試験液ＭＰα３を得た。また、ＭＰＬ３μｇとＰｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）３μｇとα−ＧａｌＣｅｒ３μｇに替えて、ＭＰＬ３μｇとＣｐＧ３μｇとα−ＧａｌＣｅｒ３μｇとを添加した試験液ＭＣα３を得た。また、ＭＰＬ３μｇとＰｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）３μｇとα−ＧａｌＣｅｒ３μｇに替えて、Ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）３μｇとＣｐＧ３μｇとα−ＧａｌＣｅｒ３μｇとを添加した試験液ＰＣα３を得た。【０１２５】
マウスに対する免疫は、１群に、実施例６に記載のＭＰ３  １００μｌを、２群に、実施例６に記載の試験液ＭＣ３  １００μｌを、３群に、実施例６に記載の試験液ＰＣ３  １００μｌを、４群にＭＰα３  １００μｌを、５群にＭＣα３  １００μｌを、６群にＰＣα３  １００μｌを２週間間隔で２回腹腔内投与した。各免疫から１週間後に尾静脈から採血して血清サンプルを得た。【０１２６】
これ以外は、実施例１と同様の操作を行った。結果を図８に示す。【０１２７】
〔実施例８〕
血清サンプルを、２回目の免疫から６、１２および２４時間後に尾静脈から採血し、抗体価に替えてサイトカイン価を測定した以外は、実施例７と同様の操作を行った。【０１２８】
サイトカイン価の測定は、以下のように行った。まず、ELISA Kit,Quantikine Mキット（R&D Systems社、IL-4,Mouse,ELISA Kit:M4000B、IL-2,Mouse,ELISA Kit:M2000、IFN-γ,Mouse,ELISA Kit:MIF00）を使用し、５倍希釈した血清サンプルを１００μl／ｗｅｌｌずつ各ウェルに添加し、室温で２時間反応させた。【０１２９】
二次抗体として、ＨＲＰ標識抗マウスＩＬ−４抗体（R&D Systems製、カタログナンバー892701）、ＨＲＰ標識抗マウスＩＬ−２抗体（R&D Systems社製、カタログナンバー890328）、ＨＲＰ標識抗マウスＩＦＮ−γ抗体（R&D Systems社製、カタログナンバーNo.892666）用いて、室温で２時間反応させた。ＴＭＢＺ（Sigma社製、カタログナンバーT3405）を基質として室温で２０分間反応させて２Ｎ硫酸で反応を停止させた。プレートリーダー（BIO-RAD社製：model 680 Cat. No. 168-1000）で吸光度（ＯＤ値）を測定した（ｄｕａｌ：測定４５０ｎｍ、対照５７０ｎｍ）。結果を図９に示す。【０１３０】
〔実施例９〕
実施例１で得た溶液Ａを−２０℃で１週間保存した。用時において、溶液Ａに抗原としてＯＶＡ１μｌと各ＴＬＲアゴニストを添加し、１００μｌ中に微粒子化キトサン１０μｇ、ＯＶＡ１μｇおよびＴＬＲアゴニスト３μｇを含む試験液をそれぞれ得た。
ＴＬＲアゴニストとしては、ＭＰＬ３μｌ、Ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）３μｇ、ＣｐＧ３μｇをそれぞれ用いた。また、コントロールとして、全ての溶液を用時に混合した溶液をそれぞれ得た。【０１３１】
マウスに対する免疫は、実施例と同様の方法を用いて、抗体価を測定した。結果を図１０に示す。【０１３２】
〔実施例１０〕
C57BL/6NJclマウス、雌７週齢（日本クレア社）を１週間馴化し、各群７匹となるようにランダムに群分けした。)
がん細胞として、EL4リンフォーマ細胞にＯＶＡ遺伝子を導入したEG7-OVA細胞（ATCC  CRL-2113  （登録商標））の細胞懸濁液を、等量のマトリゲル基底膜マトリックス（コーニング社  カタログ番号354277）と氷冷下で混合し、５×１０5個の細胞（液量０．１ｍｌ）をマウスの皮下に移植した。【０１３３】
以下の処方でがんワクチンの接種をした。がんワクチンは、がん細胞移植の７日前、移植後２、４および６日目にそれぞれ皮下投与した。【０１３４】
１群：非接種
２群：微粒子化キトサン３０μｇ＋ＣｐＧ１０μｇ＋ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）１０μｇ＋α−ＧａｌＣｅｒ１０μｇ＋ＯＶＡ３０μｇ
３群：微粒子化キトサン３０μｇ＋ＣｐＧ１０μｇ＋ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）１０μｇ＋ＭＰＬ１０μｇ＋α−ＧａｌＣｅｒ１０μｇ＋ＯＶＡ３０μｇ。【０１３５】
がん細胞の移植から９、１６および２３日後に、がん組織の大きさを測定した。がん組織の大きさは、長径と短径をノギスで計測して、長径×短径２／２という値で表示した。結果を図１１に示す。【０１３６】
図１のグラフは、左上、右上、左下の順に、それぞれ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂの産出を示す。図１より、ＭＰＬを添加した場合に、１０μｇまたは１μｇという少量の添加で、ＩｇＧ２ａおよびＩｇＧ２ｂの産生が顕著になり、ＩｇＧ１の産生も増強された。なお、図１以降の図面におけるＣＳはキトサンを、ＮａＯＩはオレイン酸ナトリウムを、ＯＶＡは卵白アルブミンを表している。また、図２以降の図面におけるＣＳＮＰ及びＣＳ nanoparticlesはいずれも微粒子化キトサンを表している。【０１３７】
図２のグラフは、左上、右上、左下、右下の順に、それぞれ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＥの産出を示す。図２より、ＯＶＡの投与量を１μｇから１０μｇに増量することによって、微粒子化キトサンを単独で使用した場合でも、ＩｇＧ２ａおよびＩｇＧ２ｂの産生が明確に検出されるようになり、ＭＰＬの添加によってさらに増強された。いずれの条件においても、ＩｇＥ産生はわずかであった。【０１３８】
図３〜図８および図１０のグラフは、左上、右上、左下の順に、それぞれ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂの産出を示す。【０１３９】
図１１のグラフは、がん組織の大きさを示す。左の列が１群、中央列が２群、右の列が３群である。【０１４０】
図３より、３〜３０μｇという少量のＰｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）の添加で、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａおよびＩｇＧ２ｂのいずれの産生においても大幅に増強された。これは、Ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）の受容体ＴＬＲ３が、主に抗原提示細胞の細胞内のエンドソームに存在しているため、抗原とアジュバントが一体化された状態で、効率良く抗原提示細胞に取り込まれたと考えられる。【０１４１】
図４より、１．５〜１５μｇという少量のＣｐＧの添加で、ＩｇＧ２ａおよびＩｇＧ２ｂの産生の大幅な増強が見られた。これは、ＣｐＧが抗原提示細胞の細胞内のエンドソームに存在しているＣｐＧの受容体ＴＬＲ９に効率よく送達されたためと考えられる。【０１４２】
図５より、Ｒ８４８の添加によりＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａおよびＩｇＧ２ｂの産生の増強が見られた。【０１４３】
図６より、ＭＰＬ、Ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）、およびＣｐＧを２種類ずつ組み合わせた場合は、それぞれを単独で添加した場合に比べて、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａおよびＩｇＧ２ｂの産生がさらに増強された。【０１４４】
また、図７より、α−ＧａｌＣｅｒを添加した場合、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａおよびＩｇＧ２ｂの産生が増強された。【０１４５】
図９より、ＣＳＮＰｓ＋ＣｐＧ＋Ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）＋α−ＧａｌＣｅｒの組み合わせとＣＳＮＰｓ＋ＭＰＬ＋ＣｐＧ＋α−ＧａｌＣｅｒの組み合わせとの場合において、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−２およびＩＬ−４の産生が特に強く誘導された。これらのサイトカインの産生のピークは２回目の免疫後６時間であった。【０１４６】
図１〜９より、微粒子化キトサン、ＴＬＲリガンドおよびα−ＧａｌＣｅｒを含有する免疫賦活剤が、液性免疫（ＩｇＧ１）と細胞性免疫（ＩｇＧ２ａおよびＩｇＧ２ｂ）とのいずれも賦活化していることが見て取れる。【０１４７】
図１０より、いずれのＴＬＲリガンドを用いても、調製済の微粒子化キトサンが懸濁されている溶液を冷凍保存した上で用時にＴＬＲリガンドを添加した場合の結果は、全ての成分を用時に添加する場合の結果と同様であった。【０１４８】
図１１より、ワクチンを投与すると、がん組織の肥大を抑制することが見て取れる。【０１４９】
〔実施例１１〕
実施例１０に続いて、微粒子化キトサン（オレイン酸ナトリウム（nacalai tesque、25702-82）を含んでいる）およびＴＬＲリガンドの組み合わせが腫瘍に対して示す影響を、さらに調べた。実施例１０と異なる点を以下にまとめる。【０１５０】
（ａ）投与物
試験物１（群２）：微粒子化キトサン＋ＯＶＡ＋ＣｐＧ
試験物２（群３）：微粒子化キトサン＋ＯＶＡ＋ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）
試験物３（群４）：微粒子化キトサン＋ＯＶＡ＋ＭＰＬＡ
試験物４（群５）：微粒子化キトサン＋ＯＶＡ＋Ｒ８４８
試験物５（群６）：微粒子化キトサン＋ＯＶＡ＋ＣｐＧ＋ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）＋α−ＧａｌＣｅｒ
対照物１（群１）：無投与
対照物２（群９）：微粒子化キトサン＋ＯＶＡ
対照物３（群１０）：アジュバント１＋ＯＶＡ
対照物４（群１１）：アジュバント２＋ＯＶＡ。【０１５１】
（ｂ）投与物の組成
（ａ）において、「ＯＶＡ」は、Ovalbumin EndoFit（InvivoGen）を、「ＣｐＧ」は、ODN1688 ClassB、カタログナンバーtlrl-1668-1（InvivoGen）を、「Ｒ８４８」は、CL097、カタログナンバーtlrl-C97（InvivoGen）を表す。【０１５２】
試験物５は、ＯＶＡの量を３０μｇから１０μｇに、ＣｐＧおよびｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）の量を１０μｇから３μｇに、α−ＧａｌＣｅｒの量を１０μｇから１μｇに減らしたことを除いて、実施例１０に記載の「２群」と同じである。試験物１〜４は、１種のＰＡＭＰ（ＣｐＧ、ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）、ＭＰＬＡまたはＲ８４８）のみを使用（３μｇの量は同じ）し、α−ＧａｌＣｅｒを使用しないことを除いて、試験物５と同じである。【０１５３】
対照物１は、微粒子化キトサン、ＯＶＡおよびＰＡＭＰを含んでいない試験物１〜４である。アジュバント１は、３０μｇの微粒子化キトサンの代わりに、２ｍｇ（調製可能な濃度の上限）の従来のアジュバント（水酸化アルミニウムゲル；Imject（登録商標） Alum Adjuvant（サーモフィッシャー））である。アジュバント２は、３０μｇの微粒子化キトサンを、３０μｇ（FL-80と同量）の従来のアジュバント（水酸化アルミニウムゲル；LG-6000（LSL社））である。【０１５４】
（ｃ）試験日程
以下の表に、動物が受ける各工程の種類および腫瘍細胞の投与日（０ｄ）を基準にした日程をまとめる。上記表に記載の「ワ投」（ＶＡ）は、vaccine administrationの略であり、上記（投与物）を動物に投与したことを表す。【０１５５】
【表１】
2020045679.tif 000003
（ｄ）動物に対する投与部位
実施例１０の記載にしたがって、がん細胞を動物の皮下（背側左側）に移植し、上記投与物を動物の皮内（背側右側）に投与した。群１〜１１のそれぞれは、上記表の０ｄに、７匹の動物を含んでいた。【０１５６】
（ｅ）結果
（ａ）〜（ｄ）にしたがって、試験を実施した結果を、図１２に示す。図１２に示されている通り、試験物５（群６）は、対照物１と比較すると、実施例１０より少ない量の、ＰＡＭＰ（ＴＬＲリガンド）が腫瘍縮小効果の実現に十分であることを示している。試験物１〜４（群２〜５）は、試験物５と比較すると、腫瘍縮小効果の実現に、１種類のＴＬＲリガンドを要とすることを示している。試験物１〜４は、腫瘍縮小効果の実現に、α−ＧａｌＣｅｒを必ずしも要しないことを示している。【０１５７】
単独のＴＬＲとしてＣｐＧおよびＲ８４８が腫瘍縮小効果に最も優れ、次いで、ＭＰＬＡおよびｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）の順に、腫瘍縮小効果に優れていることを、試験物１〜４は示している。試験物１〜５および対照物２の比較は、微粒子化キトサンに加えられるＴＬＲリガンドの種類の適切な選択が、腫瘍縮小効果の向上に寄与することを示している。なお、対照物１〜４は、腫瘍縮小には、微粒子化キトサンが、アジュバント１および２より有効であることを示している。【０１５８】
〔実施例１２〕
キトサン誘導体（マンノース修飾されているFL-80）を含んでいる微粒子化キトサンおよびＴＬＲリガンドの組み合わせの有効性（腫瘍縮小および血中抗体価上昇）を、さらに調べた。実施例１１と異なる点を以下に説明する。血中ＩｇＧの測定方法は、血清サンプルを８０００倍希釈すること、ＨＲＰ標識抗マウスＩｇＧ抗体（株式会社ニチレイ、Code424131）を二次抗体として使用したことを除いて、実施例１の記載にしたがった。【０１５９】
（ａ）投与物
試験物１（群２）：微粒子化キトサン＋ＭＰＬＡ
試験物２（群３）：微粒子化キトサン＋ＣｐＧ
試験物３（群４）：微粒子化キトサン＋ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）
対照物１（群１）：無投与
対照物２（群５）：微粒子化キトサン＋α−ＧａｌＣｅｒ
対照物３（群６）：微粒子化キトサン。【０１６０】
（ｂ）試験日程
以下の表に、動物が受ける各工程の種類および腫瘍細胞の投与日（０ｄ）を基準にした日程をまとめる。観察測定終了（47d）の後に採血し血中抗体価を測定した。【０１６１】
【表２】
2020045679.tif 000004
（ｃ）結果
キトサン誘導体の有効性を調べた結果を図１３に示す。図１３の左上および左下に示す通り、キトサン誘導体は、キトサンFL-80と同様に、ＴＬＲリガンドの種類によって程度の異なる腫瘍縮小効果を示した（特に試験物２および３）。図１３の右側に示す通り、キトサン誘導体は、キトサンFL-80と同様に、血中抗体価の上昇を示した。
【産業上の利用可能性】
【０１６２】
本発明は、免疫賦活剤として利用することができる。
【図１】
2020045679.tif 000005
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【国際調査報告】
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