(57)【要約】  本発明は、磁力を必要とせず、細胞への侵襲性が少なく簡便な手法で細胞の細胞内記録電極を形成するための方法であって、しかも正確に短期又は長期の細胞内電位測定が可能な方法を提供することを目的とする。具体的には、先端に導電性ナノ構造を有する導電体に設けたホルダーをマニュピュレーターなどに固定して、対象細胞への加圧程度を調節しながら先端ナノ構造部分を細胞膜に貫通させ、細胞上方に自立固定した細胞内記録電極を形成し、細胞内電位を測定する方法を提供する。先端の導電性ナノ構造及び導電体本体は磁性を有していなくてもよく、一体化されていても、磁力により吸着されていてもよい。また、導電体本体を磁石電極（Magele）で形成し、通常の培養容器に培養した対象細胞の細胞膜電位を記録する場合、培養容器下面に、中央に光投射用又は光観察用経路を確保できるようなリング型磁石を用いて自立固定させることで、対象細胞の細胞内電位測定と同時に光刺激による細胞内電位の変化又は細胞内カルシウム動態などの蛍光観察もできる。
2020090839.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
先端にナノ突起構造を有し、かつ先端のナノ突起構造部分が対象細胞の細胞膜を貫通している導電体であって、該導電体が上方からの機械的均一圧力によって、細胞上面の定位置に設置されている細胞内記録電極。
【請求項２】
該導電体が、先端のナノ突起構造として導電性ナノ粒子を有する磁石電極（Magele）であるか、又は先端にナノ突起構造が形成された磁性を有さない導電性物質を含む導電体である、請求項１に記載の細胞内記録電極。
【請求項３】
該導電体がそれを保持するホルダーと一体化されている、請求項１又は２に記載の細胞内記録電極。
【請求項４】
該ホルダーが、細胞表面への加圧程度を調節可能としたマニュピュレーターに固定されている、請求項３に記載の細胞内記録電極。
【請求項５】
該導電体本体の側面全体が絶縁体で被覆され、導電体本体に１もしくは複数のプラス極が接続されており、さらに導電体の細胞外溶液に接する領域が絶縁体で被覆され、細胞外溶液に接しない領域にマイナス極が接続されて電位記録回路を形成している、請求項１〜４のいずれかに記載の細胞内記録電極。
【請求項６】
先端にナノ突起構造を有し、かつ先端のナノ突起構造部分が対象細胞の細胞膜を貫通している磁石電極（Magele）であって、上方からの機械的均一圧力、又は容器下方の磁石または磁性金属との磁力により細胞上面の定位置に設置されており、該磁石電極の側面全体が絶縁体で被覆され、該磁石電極に複数のプラス極が接続されており、さらにプラス極表面の細胞外溶液に接する領域が絶縁体材料で被覆され、細胞外溶液に接しない領域の絶縁体表面にマイナス極が接続されて電極自体がコンデンサーを構成する多電極の容量型電位測定デバイスを形成している、細胞内記録電極。
【請求項７】
あらかじめ導電性ナノ粒子が導入された対象細胞が培養されている導電性ガラス表面をプラス極とした導電性ガラス電極と、導電性ガラスの導電性のないガラス下面にマイナス極に接続された複数の金属箔で構成される導電性電極との間でコンデンサーを構成する多電極の容量型電位測定デバイスを形成している、細胞内記録電極。
【請求項８】
前記プラス極に接続した導電性ガラスを、前記複数のマイナス極に接続された導電性電極毎に対応させて各々の区画ごとの導電性の持続性を遮断することにより、それぞれに電極ペアを形成させることを特徴とする、請求項７に記載の細胞内記録電極。
【請求項９】
導電性ガラスとして、ガラス表面をpH10以上のアルカリ性溶液を用いて洗浄を行った後、ddH2Oにより少なくとも2回以上洗浄してアルカリ溶液を除去処理した導電性ガラスを用いることを特徴とする、請求項６〜８のいずれかに記載の細胞内記録電極。
【請求項１０】
請求項１〜９のいずれかに記載の細胞内記録電極を用いて、対象細胞の細胞内電位又はその電位変化を測定する方法。
【請求項１１】
ガラス表面への細胞の接着を促進するための処理方法であって、ガラス表面をpH10以上のアルカリ性溶液を用いて洗浄を行った後、ddH2Oにより少なくとも2回以上洗浄してアルカリ溶液を除去することを特徴とする、ガラス表面の処理方法。
【請求項１２】
該ガラスがFTO又はITOの導電ガラスである、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
光刺激反応性物質を発現させた対象細胞が導電性ガラス表面に接着し、先端にナノ突起構造を有する磁石電極（Magele）の先端のナノ突起構造部分が、当該対象細胞の上方の細胞膜を貫通している細胞内記録電極において、細胞が接着したカバーガラス下面に中心部に光の投射経路を確保したリング型磁石が設置されており、前記光の投射経路から、前記対象細胞に対し光刺激を行うことを特徴とする、対象細胞の細胞内電位を測定すると共に、光刺激による細胞内電位の変化を測定する方法。
【請求項１４】
蛍光物質を発現させた対象細胞がカバーガラス表面に接着し、先端にナノ突起構造を有する磁石電極（Magele）の先端のナノ突起構造部分が、当該対象細胞の上方の細胞膜を貫通している細胞内記録電極において、カバーガラス下面に中心部に蛍光観察経路を確保したリング型磁石が設置されているおり、前記対象細胞、前記対象細胞の細胞内電位を測定すると共に、前記蛍光観察用経路から、当該被検細胞の発する蛍光を観察し、細胞内カルシウム動態又は膜電位の変化を測定する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、先端にナノ構造をもった電極を用いて細胞内電位又は電位変化を測定及び／又は制御する方法及びそのための電極に関する。
【背景技術】
【０００２】
全ての細胞は、細胞内と細胞外とは異なるイオン組成を有し、そのイオン分布の差とそのイオン組成の差を保つトランスポーター（例、ナトリウムポンプ）により細胞内電位（膜電位）を保持している。静止状態では膜電位は安定している（静止膜電位）が、膜表面のイオンチャネルが活性化され、開く事により膜内外のイオン濃度差からイオンが一気に放出又は流入することで、細胞内全体の電位が変化し、（脱分極又は過分極が起こり）、結果として細胞内電位に変化が生じる。その結果、心筋や神経では活動電位の発生／伝達が起こり、ホルモンや神経伝達物の放出などの情報伝達、心筋、骨格筋肉細胞では収縮が引き起こされる。
従来から細胞の膜電位の変動、それに伴うイオンチャネルを通した膜電流の測定をすることで細胞の状態変化や細胞の薬物などへの応答を観察することが行われてきた。特に創薬スクリーニングの際に、培養した心筋細胞、神経細胞などに対して創薬候補薬物を暴露し、膜電位の変化を計測して心毒性、神経毒性などを評価することが広く行われている。【０００３】
細胞内電位を測定するために、従来は、細胞内に金属製電極又は電解液を満たした微小ガラス電極を差し、細胞外の電極との電流又は電圧を測定していた。最近では、パッチクランプ（Patch Clamp）法による測定法が確立し、主流となっている。パッチクランプ法とは、細胞内電解液を満たしたガラスピペットと細胞膜を密に接着させ、電気的にガラスピペットと細胞を一体化させることにより、細胞内電位変化を精確に測定、制御する方法である。
パッチクランプ法は細胞全体に発現するイオンチャネルの動態を測定するWhole cell modeと、パッチピペットの内径内の細胞膜にのみ含まれるイオンチャネルの動態（single channel活性）を測定する方法（on cell mode）、そしてその微小細胞膜を細胞から単離して測定を行う方法（inside patch, outside patch mode）がある。
Whole cell modeでは、ガラスピペットと接着した電極の内径にある細胞膜を突き破ることにより、細胞内電位変化、細胞全体でのイオンチャネルを通過する電流(イオンチャネルの活性)の動態を測定する。上記の手技は顕微鏡下で個々の細胞に直接電極を用いて行う記録法のため高度に熟練した技術、そして高い専門知識が必要である。【０００４】
これら細胞内記録法（Voltage-clamp, Current-clamp）は、パッチクランプ法（Whole cell patch）に代表されるように、細胞膜に発現（存在）するイオンチャネルを通るイオンの動態を観察する事ができる。Voltage-clamp modeではパッチクランプ増幅器に含まれるフィードバック機能により効率よく細胞内の電位を制御し、イオンチャンネルの開閉により起こる速い（ミリ秒単位の）現象をイオン電流変化として記録できる。Current-clamp modeではイオンチャンネルの活動による細胞への作用を（膜）電位変化として記録することができる。
パッチクランプ方法にはマニュアル（手動式）パッチクランプ法とオートパッチ法があり、マニュアルパッチクランプ法は電気生理学的測定におけるデータの信頼性が高い。しかしながら、術者が顕微鏡を用いて、マニピュレーターを操作して実験を行うなどの手技が複雑で豊富な専門知識を必要とすることから非常に効率が悪い。このことは、医学生物学研究、特に創薬分野では大きなハードルになっている。
一方、オートパッチ法はオートメーション化された電気生理学的測定機であり、近年著しく性能を向上させているものの、データの信頼性においてマニュアルパッチクランプ法を置き換えるほどの信頼性は勝ち得ていない。その上、オートパッチクランプ試験機器は大変高価なため、その使用は一部の大製薬企業に限られている。
また、近年細胞内電位を測定するために電極を細胞膜に貫通させる方法として、パッチクランプ法に代えて細胞に高電圧をかけて電気的に穿孔する方法（非特許文献３）が開発され、ラットの心筋細胞の細胞内電位が記録できたことが報告されている。しかしながらその手法では、穿孔破壊された細胞膜が直ぐに修復されてしまうために、電極の細胞内へのアクセスがなくなってしまう。電気応答の観察可能な時間は最大でも10分程度であり、実用的な手法とはいえない。【０００５】
このような細胞内記録法に対して、近年、細胞外での電気的変化を記録する細胞外記録法の開発も進み広く利用されてきている。細胞外記録法は、in vitro 多点平面電極（マルチエレクトロード・アレイ）システムに代表されるように、細胞外に細胞と接触して置かれた電極から、細胞外で電気的変化を記録する方法である（特許文献１〜４）。
in vitro 多点平面電極（MultiElectrode Array, MEA）システムの応用として、培養神経細胞の可塑性の研究や、ヒトiPS 細胞由来の神経細胞、心筋細胞を用いた薬物安全性試験などに使われ始めている。 【０００６】
しかし、MEAは、細胞外記録のために、細胞の扱いは容易であるが、交流様の変化（膜電位の単位時間の変化、微分波形）のみしか記録ができないために、細胞内で起こるゆっくりした膜電位の変化は測定できない。そのため測定により得られる情報が限られ、その応用は限られている。
MEAに基づく方法で細胞内記録を試みた報告として、きのこ様の形をした電極の上に細胞を播種し、そこに高電圧を与える事により、細胞膜を破ることに成功した例がある（非特許文献１）が、細胞内電位の記録条件を保てる時間は3分以内と極めて短く、記録方法としての有効性は示されていない。【０００７】
そこで、本発明者らは、最近、細胞への侵襲性が少なく、正確かつ簡単に細胞内電位を測定、制御する方法として、ガラス微小電極に代えて金コーティング磁性ナノ粒子など導電性ナノ粒子を用いて細胞外の電極により細胞内電位及び電位変化を記録する手法を開発した。具体的には、強力な磁石の作用を利用して細胞内（又は細胞表面）の導電性ナノ粒子を細胞膜に貫通させて細胞内外の電極同士を繋ぐことで、細胞外の測定装置によって細胞内電位及び電位変化の測定が可能となった。この手法により、細胞へのダメージを極力抑えて簡便な手段で生存細胞における細胞内電位の変動を長時間に亘り観測できるという驚くべき効果が得られたことから、2018年4月27日付で国際特許出願を行った（PCT/JP2018/017334）。
また、本発明者らは、新たな細胞内電位測定方法として、「容量型電位測定デバイス法」を開発した。ここで言うコンデンサーは細胞を播種する導電性プレートとその下方に位置する絶縁体、そして二つ目の導電体により構成され、この二つの導電体間の電位差を測定する。この手法によれば、センサーとなる導電性プレートが細胞膜を貫通した導電性ナノ粒子を介して細胞内の電荷（チャージ）変化を感受して電荷−電圧変換を行い、細胞内電位変化として記録する。そのため、細胞外液にアースを設定する必要がなく、導電性プレートは細胞と接触していない部分で細胞外溶液に直接接触していてもよい手法である。
当該手法についての特許出願も2018年4月27日付で特許出願を行った（特願２０１８−８７６８９）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】ＷＯ２０１２／０４３８２０
【特許文献２】ＷＯ２０１３／０６１８４９
【特許文献３】ＷＯ２０１４／０９８１８２
【特許文献４】特表２００５−５０５７６１号公報
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Anna Fendyur, et al., Frontiers in Neuroengineering, Dec.2011, Vol.4, Article14, p.1-14
【非特許文献２】Raphael Levy, et al., NanoReviews 2010, 1:4889-DOI: 10.3402/ nano. v1i0.4889
【非特許文献３】Micha E. Spira et al., Nature Nanotechnology Vol.8(Feb.2013)p.83-94/DOI:10.1038/NNANO.2012.265
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
前記本発明者らの導電性ナノ粒子を用いる細胞内電位測定法は、従来のガラス微小電極に代えて導電性ナノ粒子を用いることで、細胞への侵襲性が少なく、正確かつ簡単に長期に亘り細胞内電位を測定可能とする方法であるが、導電性ナノ粒子を細胞膜に貫通させるためのみならず、電極を細胞表面に固定するために磁場が必要であり、測定用の装置に若干の制約があった。
例えば、細胞の下方に細胞内記録電極を形成する場合は、あらかじめ細胞内に導入した導電性ナノ粒子を細胞膜に貫通させるため、細胞下方に導電性プレートを介して磁石を設ける必要があった。磁石電極（Magele）を用いることで、細胞の上方から細胞内の導電性ナノ粒子を吸引し細胞内記録電極を形成することができ、しかもあらかじめ細胞内に導電性ナノ粒子を導入しなくても細胞外から導電性ナノ粒子を細胞表面に押し付けて細胞膜を貫通させることができることを見出した。しかし、前者の場合は細胞上方の磁石電極（Magele）を細胞表面に固定するために、後者の場合は磁石電極表面の導電性ナノ粒子を吸引しかつ磁石電極を固定するために、細胞の下方に鉄板を設置して、磁石電極との磁場を利用する必要があった。すなわち、いずれも細胞表面に電極を固定して安定な細胞内記録電極を形成するために磁力の利用を必須とする方法であった。
本発明は、磁力を必要とせずに細胞の細胞内記録電極を形成するための方法、特に細胞の上方からの細胞内電位の測定方法の改良方法であって、細胞への侵襲性が少なく、正確に長期の細胞内電位測定が可能であり、かつナノ構造の細胞膜貫通工程がより簡便な測定方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明は、本発明者らが以前開発した磁石電極（Magele）を用いて対象細胞の細胞膜に導電性ナノ粒子を貫通させて細胞内記録電極を形成し、細胞内の電位及び電位変化を測定する方法において、細胞膜の貫通工程、及び磁石電極（Magele）の自立固定のために必須であった磁場の形成を必要としない改良方法を提供する。
すなわち、細胞の下方には磁力発生のための鉄板又は磁石などの設置は不要であり、細胞表面の上方から接着させる磁石電極（Magele）に代えて、磁力を有しない導電体を用いることができる方法である。
具体的には、細胞上方の細胞内記録電極にはホルダー（保持具）を設けて固定させる方法、好ましくは加圧程度を調整可能なマニュピュレーターでホルダーを固定する方法であり、さらに導電性ナノ粒子−磁石電極に代えて、先端に10-50nmの金属など導電性のナノ構造（nanostructure）又はナノ突起構造（nanoprotrusion）をもった導電体からなる電極（以下、単に「先端に導電性ナノ構造を持つ電極」ともいう。）を用いる方法である。
なお、本発明の「先端に導電性ナノ構造を持つ電極」としては、先の「導電性ナノ粒子を先端に吸着させた磁石電極（Magele）」も含まれる。その場合、導電性ナノ粒子を電極の先端に固定するためには導電性ナノ粒子が磁力により、吸着されることが必須となるが、細胞表面の適切な位置に電極を定位置で設置するためには、磁石電極の磁力は用いず、電極をホルダー、さらにはホルダーを固定するマニュピュレーターを設けるなど機械的な均一圧力により設置することが特徴となる。【００１２】
磁石電極（Magele）を用いて先端に導電性ナノ粒子を吸着させて、「磁石電極−導電性ナノ粒子」からなる細胞内電位記録電極とする際の、導電性ナノ粒子を細胞膜に貫通させるための方法としては、先の本発明者らのPCT出願明細書において、
(1)細胞内に予め導入した導電性ナノ粒子を、細胞上面に接触させた磁石電極（Magele）により引き寄せて細胞膜を貫通させる方法（図１左）、及び
(2)あらかじめ磁石電極（Magele）表面に導電性ナノ粒子を吸着させておき、当該磁石電極表面の導電性ナノ粒子を細胞の上面に接触させ、細胞の接着した容器の下方に設置した鉄板に吸引させて導電性ナノ粒子を細胞膜に貫通させる方法（図１右）
の２種類の手法を開示している。【００１３】
本発明においては、磁石電極（Magele）に代えて、磁力を持たない導電体を用いてもよく、また、磁石電極に導電性ナノ粒子を吸着させる代わりに、その先端にナノ突起構造を形成させた（又は結合させた）導電体を用いることができる。本発明の方法は、このような磁力を持たない導電体であって、先端には導電性を有する種々の形状のナノ突起構造を有する導電体であっても、先端部分を細胞膜に貫通させることができ、かつ細胞表面への圧力を調節した状態で定位置に設置することができる手法であり、当該手法で得られた先端に導電性ナノ突起構造を有する電極を細胞内記録電極として用い、対象細胞の細胞内電位を正確かつ簡便に測定する手法を提供する。
具体的には、本発明では、上方に設置したマニピュレーターなどを用いて、先端に導電性ナノ構造を持つ導電体の先端部分を細胞の上面から貫通させ、細胞への圧力を調節した状態で固定する（図２）。本発明では、電極となる導電体本体をマニュピュレーターなどにより上下させて、細胞への圧力を調整できるから、電極を細胞上に固定するための磁力は必要がない。そのため、本発明の細胞内記録電極となる導電体は、先端にナノ突起構造をもつ導電性の素材で形成すればよく、磁石電極（Magele）を用いる必要はない。また、先端のナノ突起構造は、電極本体の導電体にしっかり固定されていることが好ましいが、電極の細胞と接着する面に吸着された状態であってもよい。なお、導電体として磁石電極（Magele）を用い、その先端に導電性素材のナノ構造を形成した場合（導電性ナノ粒子を吸着させる場合を含む）は、マニピュレーターと共に細胞の下方に置かれた鉄板との磁力も利用して細胞への圧力を調節してもよい。
そして、本発明では、「先端に導電性ナノ構造を持つ電極」の外側を絶縁体で完全に包み、外液との絶縁を完全に行うことで、アース点は外液中であれば任意に設置できる。絶縁体の外側をアース点で包み込むことで、単一電極として使用することが可能になった（図３）。【００１４】
さらに、前記の本発明者らの開発した「容量型電位測定デバイス法」（特願２０１８−８７６８９）を応用し、コンパクトなホルダー付き「容量型電位測定デバイス」（図３右）を製造でき、「Clip on ground」として使用することも可能となった。
ここで、「Clip on ground」とは、容量型電位測定デバイス機能を付加した磁石電極(C-M electrode)を用いて記録を行うことを指し、磁石電極(C-M electrode)は、磁石電極(Magele)の細胞接触面以外をパラフィルムで覆い、プラス極は磁石電極に直接接続し、マイナス極はパラフィルムの上から接続することで、強磁性体の磁石電極を容量型電位測定デバイスとして働かせたものをいう。なお、本発明では、磁性を有する必要がないため、磁石電極(Magele)に代えて導電体を電極として用いてもよい。
さらに、ホルダーで保持された導電板に複数の容量型電位測定デバイス型電極を設けることで複数の電極を同時に操作可能となる（図４）。
なお、（図４）では、磁石電極（Magele）及び磁性ナノ粒子と表記しているが、磁性の無い導電体の先端に導電性ナノ構造が形成されている電極であってもよい。（図４）は、固定用磁石と組み合わせて磁石電極（または導電体）を連結した連結電極とすることもできる。【００１５】
MagEle電極を用いる場合、このMagnet（磁石）は導電性ナノ粒子を吸着する作用と同時に、培養細胞が磁性金属の上に配置された場合、MagEleは下方の磁性鉄板を吸着し、MagEleを自立させる作用がある（図４、図２５）。
磁性金属の代わりに、リング型磁石を配置したドーナツ型電極を用いる事により、磁性鉄板なしにMagEleを固定自立させる事が出来る。この方法では、リング状磁石によりMagEleを支えることにより、リングの中心より直視する経路を確保できる事ができ、MagEleの下方に存在する被験培養細胞に直接光を投射することが可能になる（図２５右、図２６）。
このドーナツ型電極の利用法としては、例えば以下のような利用法が考えられる。
(1)Channelrhodopsin発現細胞に対して、光刺激を行うことが可能になる。（図２６左）
(2)蛍光試薬を導入した被験細胞を用いることで、細胞内電位測定と並行して細胞内カルシウム動態、膜電位の変化などを同時に行うことができる。（図２６右）【００１６】
すなわち、本発明は以下の発明を包含する。
〔１〕先端にナノ突起構造を有し、かつ先端のナノ突起構造部分が対象細胞の細胞膜を貫通している導電体であって、該導電体が上方からの機械的均一圧力によって、細胞上面の定位置に設置されている細胞内記録電極。
〔２〕  該導電体が、先端のナノ突起構造として導電性ナノ粒子を有する磁石電極（Magele）であるか、又は先端にナノ突起構造が形成された磁性を有さない導電性物質を含む導電体である、前記〔１〕に記載の細胞内記録電極。
〔３〕  該導電体がそれを保持するホルダーと一体化されている、前記〔１〕又は〔２〕に記載の細胞内記録電極。
〔４〕  該ホルダーが、細胞表面への加圧程度を調節可能としたマニュピュレーターに固定されている、前記〔３〕に記載の細胞内記録電極。
〔５〕  該導電体本体の側面全体が絶縁体で被覆され、導電体本体に１もしくは複数のプラス極が接続されており、さらに導電体の細胞外溶液に接する領域が絶縁体で被覆され、細胞外溶液に接しない領域にマイナス極が接続されて電位記録回路を形成している、前記〔１〕〜〔４〕のいずれかに記載の細胞内記録電極。
〔６〕  先端にナノ突起構造を有し、かつ先端のナノ突起構造部分が対象細胞の細胞膜を貫通している磁石電極（Magele）であって、上方からの機械的均一圧力、又は容器下方の磁石または磁性金属との磁力により細胞上面の定位置に設置されており、該磁石電極の側面全体が絶縁体で被覆され、該磁石電極に複数のプラス極が接続されており、さらにプラス極表面の細胞外溶液に接する領域が絶縁体材料で被覆され、細胞外溶液に接しない領域の絶縁体表面にマイナス極が接続されて電極自体がコンデンサーを構成する多電極の容量型電位測定デバイスを形成している、細胞内記録電極。
〔７〕  あらかじめ導電性ナノ粒子が導入された対象細胞が培養されている導電性ガラス表面をプラス極とした導電性ガラス電極と、導電性ガラスの導電性のないガラス下面にマイナス極に接続された複数の金属箔で構成される導電性電極との間でコンデンサーを構成する多電極の容量型電位測定デバイスを形成している、細胞内記録電極。
なお、導電性ガラスは、上面のみが導電性処理を施されているため、下面は導電性がない。
〔８〕  前記プラス極に接続した導電性ガラスを、前記複数のマイナス極に接続された導電性電極毎に対応させて各々の区画ごとの導電性の持続性を遮断することにより、それぞれに電極ペアを形成させることを特徴とする、前記〔７〕に記載の細胞内記録電極。〔９〕  導電性ガラスとして、ガラス表面をpH10以上のアルカリ性溶液を用いて洗浄を行った後、ddH2Oにより少なくとも2回以上洗浄してアルカリ溶液を除去処理した導電性ガラスを用いることを特徴とする、前記〔６〕〜〔８〕のいずれかに記載の細胞内記録電極。
〔１０〕  前記〔１〕〜〔９〕のいずれかに記載の細胞内記録電極を用いて、対象細胞の細胞内電位又はその電位変化を測定する方法。
〔１１〕  ガラス表面への細胞の接着を促進するための処理方法であって、ガラス表面をpH10以上のアルカリ性溶液を用いて洗浄を行った後、ddH2Oにより少なくとも2回以上洗浄してアルカリ溶液を除去することを特徴とする、ガラス表面の処理方法。
〔１２〕  該ガラスがFTO又はITOの導電ガラスである、前記〔１１〕に記載の方法。
なお、導電ガラスに代えてチタンなど導電性金属を用いることができる。
〔１３〕  光刺激反応性物質を発現させた対象細胞が導電性ガラス表面に接着し、先端にナノ突起構造を有する磁石電極（Magele）の先端のナノ突起構造部分が、当該対象細胞の上方の細胞膜を貫通している細胞内記録電極において、細胞が接着したカバーガラス下面に中心部に光の投射経路を確保したリング型磁石が設置されており、前記光の投射経路から、前記対象細胞に対し光刺激を行うことを特徴とする、対象細胞の細胞内電位を測定すると共に、光刺激による細胞内電位の変化を測定する方法。
〔１４〕  蛍光物質を発現させた対象細胞がカバーガラス表面に接着し、先端にナノ突起構造を有する磁石電極（Magele）の先端のナノ突起構造部分が、当該対象細胞の上方の細胞膜を貫通している細胞内記録電極において、カバーガラス下面に中心部に蛍光観察経路を確保したリング型磁石が設置されているおり、前記対象細胞、前記対象細胞の細胞内電位を測定すると共に、前記蛍光観察用経路から、当該被検細胞の発する蛍光を観察し、細胞内カルシウム動態又は膜電位の変化を測定する方法。
【発明の効果】
【００１７】
本発明では、導電性ナノ粒子を細胞膜に貫通させるためにも、細胞表面に電極を自立固定させるためにも磁力が不必要であり、より簡便に細胞内電位及び電位変化を測定できる。
また、本発明では以前に開発した方法と同様、細胞へのダメージを極力抑えることができ、細胞を長期に亘って正常な状態で生存させながら細胞内電位の変動を観測できるメリットがある。さらに、測定装置を含めコンパクトに設計可能であり、特に容量型電位測定デバイス型電極を用いることで「Clip on ground」としての使用が可能となる。また、リング型磁石を配置したドーナツ型電極を用いる事により、磁性鉄板なしにMagEleを固定自立させる事ができ、中央の孔を利用して被験細胞に直接光を投射して、光刺激、光信号の観察もできる。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】磁石電極（Magele）の先端に金コーティング磁性ナノ粒子を磁力により引き付け、細胞膜の貫通に用いられる先端導電性ナノ突起構造を有する電極を形成する方法の概念図。
【図２】本発明の先端に導電性ナノ突起構造を有する電極を、マニュピュレーターを用いて細胞膜を貫通させ、固定する方法の概念図。
【図３】本発明の先端に導電性ナノ突起構造を有する電極の構造
【図４】本発明の先端にナノ突起構造を持つ電極を用いた電位測定デバイスを用いた例を示す。磁石電極の直径が短い場合、磁力のみでの自立が難しいため強力な「補強磁石」を配置し、細い磁石電極の自立を助ける。その場合、補強磁石はアースをかね、ホルダーとしての機能も果たす。
【図５】参考：磁石電極を用いた細胞内記録電極の概念図
【図６】参考：ネオジウム磁石電極を有するNav1.5／Kir2.1発現HEK培養細胞での細胞内活動電位の測定（膜電位変化による活動電位の誘導）
【図７】参考：導電性プレート電極上に培養されたCHO細胞の細胞膜を貫通した導電性ナノ粒子を介したCHO細胞の内在性外向き電流の測定（膜電位固定法による）。
【図８】参考：チャージアンプの原理による細胞内電位の測定のための予備実験
【図９】参考：電荷の変化から電圧変化を測定する（チャージアンプ）原理により、細胞内電位を測定することを示す概念図。
【図１０】参考：金コーティング磁性ナノ粒子電極が導入されたiPS細胞由来心筋様細胞からチャージアンプの原理を用いた自発性活動電位の測定。
【図１１】参考：コラーゲン格子状コーティングされた導電性ガラス表面の心筋様細胞に対し、細胞内のイオン濃度の変化を導電プレートを通し電荷の変化として感受し、それを電圧変化として測定する方法により、ナトリウムイオンチャネルオープナーにより誘発された活動電位を測定。
【図１２Ａ】参考：磁石電極を用いて導電性ナノ粒子を細胞内に導入せずに細胞膜に貫通させ、チャージアンプの原理を利用して細胞内電位を記録する方法の概念図（カバーグラスを使用した場合）
【図１２Ｂ】参考：磁石電極を用いて導電性ナノ粒子を細胞内に導入せずに細胞膜に貫通させ、チャージアンプの原理を利用して細胞内電位を記録する方法の概念図（セルカルチャーインサートを使用した場合）
【図１３Ａ】参考：培養神経細胞（NG108-15細胞）を5日神経分化誘導を行い実験を行った。M-C electrodeをカバーガラスに播種した細胞上に配置することにより自発性の活動電位を記録した。
【図１３Ｂ】参考：培養神経細胞（NG108-15細胞）を2日神経分化誘導を行い実験を行った。細胞外液にグルタミン酸を投与し（最終外液濃度800μm）、グルタミン酸受容体を介した応答を記録した。なお、図上のベースラインとグルタミン酸応答のartifactは取り除いた。
【図１４】NG108-15細胞を10mM グルタミン酸により活性化し、パッチクランプにより測定したデータ。
【図１５】分化したNG108-15細胞を10mM Glutamteにより活性化し、先端に金磁性ナノ粒子を吸着させた磁石電極（Magele）をシリコンチューブに挿入絶縁し、その外側にアルミフォイルによるアース機能を装着した一体化電極をマニピュレーターで細胞上方から押し付け、活動電位を記録した例
【図１６】分化したNG108-15細胞をVeratridineにより活性化し、細胞膜を貫通した金コーティング磁性ナノ粒子と細胞表面で接触している磁石電極（Magele）により測定したデータ、及びその１部を拡大したもの
【図１７】分化したNG108-15細胞を K+ チャネルブロッカーにより活性化し、先端に金磁性ナノ粒子を吸着させた磁石電極（Magele）をマニピュレーターで細胞上方から押し付け、活動電位を記録した測定したデータ、及びその１部の拡大図。
【図１８】未分化のNG108-15細胞を先端にTitanium ナノ構造が凝着された磁石電極（Magele）をマニピュレータにより細胞上方から押し付け（加圧）ながら静止膜電位を測定した。加圧を解除することにより記録された膜電位は消失した（上図）。細胞のない状態で同様の実験を行うと電位には変化が全く生じなかった（下図）。
【図１９】レチノイン酸（RA）により分化させたSH-SY5Y細胞の活動電位の測定
【図２０】MagEleを用いた多電極の構造
【図２１Ａ】導電性ガラス電極を用いた多電極の構造−１
【図２１Ｂ】導電性ガラス電極を用いた多電極の構造−２
【図２２】3電極MagEleを用いた、NG108-15神経細胞株からの細胞内電位記録
【図２３】2電極MagEleによるiPS由来心筋細胞における細胞内電位の測定
【図２４】3電極の導電性ガラス電極を用いたNav1.5, Kir2.1発現HEK細胞株における細胞内電位の測定
【図２５】リング状磁石によりMagEle電極を自立させることで確保される光投射経路
【図２６】リング状磁石により自立させたMagEle電極を用いた細胞内電位測定と同時に記録可能な、光刺激による細胞の活性化の測定（左図）及び倒立顕微鏡による蛍光信号観察（右図）
【発明を実施するための形態】
【００１９】
１．本発明の「先端に導電性ナノ構造を持つ電極」
（１−１）電極の素材
本発明の「先端に導電性ナノ構造を持つ電極」では、導電体と先端のナノ突起が一体となって電極を形成していればよく、両者を一体的に成形しても、別々に成形した後両者を接合してもよい。なお、導電性ナノ突起構造は導電体の先端に完全に固着されている方が取り扱いやすく好ましいが、先端に吸着した状態であってもよい。
電極の素材としては、磁石電極（MagEle）を用いてもよいが、磁性を持たず細胞毒性のない導電体（例えば、ステンレス鋼材、チタン、金等の各種金属の他、導電性のペプチドやタンパク質、又は各種導電性ポリマー）を用いてもよい。
ここで、「磁石電極（MagEle）」というとき、導電性材料（例えばニッケル、アルミニウムなどの導電性金属）でコーティングされた磁石を指し、典型的なものはネオジウム磁石であり、磁力と共に導電性も有する。
ネオジウム磁石は、永久磁石のうち最も磁力の高い磁石であるが、錆やすいため、通常ニッケルめっきが施されている。市販の直径1mm円柱ネオジウム磁石（ネオマグ株式会社）もNi-Cu-Niでコーティングされているため、強力な磁力と共に高い導電性を持っており、磁石電極（MagEle）として用いることができる。他に、アルミニウムコーティングされている場合も磁石電極（MagEle）として用いることができる。
【００２０】
（１−２）電極の構造：
本発明で用いる細胞内電位測定用電極は、その細胞と接触する先端部分に「導電性ナノ突起構造」を有しており、「導電性ナノ突起構造」が細胞膜を貫通することで、細胞内電位を記録可能な電極として働くことができる。
そして、磁石電極（MagEle）などの導電体の表面は、細胞との接触部分以外、細胞外溶液から完全に遮断される必要があるため、細胞との接触部分以外、少なくとも細胞外溶液と接触する領域は、あらかじめシリコンゴム、シリコンチューブなどによる絶縁コートを施しておく。
さらに、アースを設ける場合には、絶縁コート（パラフィルム、マニキュア、絶縁ペイント等）表面をアース材料（銀線、銀板、アルミホイル等）で包み込み、導電体をプラス極に、アース材料表面にマイナス極を設ける。
また、「導電性ナノ突起構造」を有する先端の反対側にはホルダー（保持体）を有し、必要に応じてマニュピュレーターに垂直に取り付ける。その際に、ホルダーで保持された導電板に複数の導電性ナノ突起構造を有する導電体を設けて、それぞれをアースと繋ぐことで、複数の電極を同時に操作可能となる。
【００２１】
本発明の電極を、容量型電位測定デバイスを応用した「Clip on ground」を用いて記録を行うことができるが、その際は、電極本体となる磁石電極(C-M electrode)等の導電体の細胞接触面以外を完全にパラフィルムなどの絶縁コートで覆い、プラス極は導電体（磁石電極）に直接接続し、マイナス極はパラフィルムの上から接続する（図３）。この場合、アースは不要である。また、各々の容量型電位測定デバイスは、単独で又は複数が導電板を介してホルダーを有し、必要に応じてマニュピュレーターに取り付けられている。
【００２２】
（１−３）Mageleを応用した連結複合（複数）電極
本発明の電極としては、固定用磁石の両脇に磁石電極（Magele）を取り付け、固定用磁石を磁石電極（Magele）の固定と共にアースを兼ねさせ、周囲をパラフィルムなどの絶縁コートで覆うことで連結電極とすることができる（図４）。固定磁石をアースとして使用しないときは容量型電位測定デバイス型としても使用することができる。
連結電極としては、この他、複数のナノ突起構造を持つ電極を同時に使用することも可能である。連結電極の利点は例えば（脳）神経細胞を培養し、細胞体から突起が伸び、神経回路を形成する場合、複数の場所にMageleを設置することにより神経回路が相互的にどのように機能しているか測定することができる。通常のMageleにおいて磁石電極は金磁性ナノ粒子を電極上に固定する作用と下方に置かれた鉄板を磁力でひきつけ、磁石電極自体を自立させる作用がある。磁石電極の直径の大きさ（通常6mm）により、電極によって覆われる記録対象となる細胞数が決定される。記録する細胞数を減らし、実験精度を向上するためには電極直径を小さくする必要がある。その際、電極には増幅器とつなげるケーブルが装着されるため、磁石電極の直径を小さくすると磁力が減少し、鉄板との磁力のみで自立することが不可能になる。そこで、強力な磁石（補強磁石）を配置し、それに磁力で吸着し,細い磁石電極の自立を助ける。この際、補強磁石はアースをかねることができる。
補強磁石はドーナツ型、板型、S字型などのいろいろな形状の物が使用できる。この補強磁石の色々な位置に磁石電極、又は磁石に吸着できる先端ナノ構造電極を配置し複数の位置から電位記録をすることができ、神経回路を解析をする際に有効である。現在は神経回路in vitro解析では多電極を用いた細胞外記録、又は蛍光試薬を用いたものに限られているため、複数個所から同時細胞内記録を可能にする始めての仕組みである。なお、複数電極は補強磁石を用いなくても、複数電極を好みの位置に上部で固定し、マニピュレーターによって記録する細胞に作用させることができる。ラット脳スライス標本（たとえば、海馬において、CA1とdentate gyrusからの同時記録）などへの応用も可能である。
【００２３】
補強磁石としてリング状磁石を用いて、リングの穴の開いている部分の真上に設置された棒状の磁石電極（MagEle）を磁性鉄板なしに固定自立させ、リング状磁石の中央の孔を利用して被験細胞に直接光を投射することで光刺激、光信号の観察もできる。
【００２４】
（１−４）先端のナノ突起構造の素材及び形状
また、先端部分の素材も、導電性を有してさえいれば、磁性を有している必要はない。
導電性の電極本体と一体的に成形してもよいが、別々に成形して結合又は吸着させてもよい。別々に成形する場合は、同一素材であっても異なる素材であってもよい。導電性を有し、細胞毒性の少ない導電性材料であれば何でもよいが、好ましい導電性材料としては、ステンレス鋼材、チタン等の各種金属の他、導電性のペプチドやタンパク質、各種導電性ポリマー等が挙げられる。
また、これらの導電性材料で均一に成形されている必要はなく、核となる素材は導電性がなくても、表面が上記導電性材料でコーティングされた粒子などを用いることができる。コーティングに適した材質としては、例えば、金、プラチナなどの導電性金属（Yamada et al.(2015) WIREs Nanomed Nanobiotechnol 2015, 7:428-445. doi: 10.1002/wnan.1322）の他、導電性のペプチドやタンパク質、又は各種導電性ポリマーなどが挙げられるが、これらには限られない。本発明の「導電性ナノ突起構造」は、磁性を有している必要はないものの、約50nmのクエン酸又はPEG金コーティング磁性ナノ粒子（nanoimmunotech社製、NITmagold Cit又は PEG50nm）などの金コーティング磁性ナノ粒子は各種市販され入手しやすい。これらの磁性ナノ粒子を本発明の「導電性ナノ突起構造」として用いることができる。導電性ポリマー、ペプチド類としては、「poly(anthranilic acid) with magnetite nanoparticles magnetic properties, and AC and DC conductivity）」として、「Ramesan and Jayakrishnan （2017）Polymer/magnetite nanocomposites with electrical and magnetic conductivity. Plastic Research On line 10.2417/spepro.006898」に列記された導電性のポリマー類、ペプチド類を用いることができる。また、従来から生体イメージングの染色に用いられていたQuantum dot（Qdot）粒子（O.O. Otelaja, D.-H. Ha, T. Ly, H. Zhang, and R.D. Robinson, “Highly Conductive Cu2-xS Nanoparticle Films through Room Temperature Processing, and an Order of Magnitude Enhancement of Conductivity via Electrophoretic Deposition,” ACS Applied Materials and Interfaces 6, 18911-18920 (2014).）なども「導電性ナノ突起構造」として用いることができる。
【００２５】
ナノサイズの突起構造としての形状は、球形、楕円形、針様、棒状などの適宜の形状であってもよい。これらを、「導電性ナノ突起構造」ということもある。ナノサイズの突起構造の最大長は、細胞膜を突き抜ける必要があるため、細胞膜の厚み（約20nm）よりは長い必要があるが、細胞へのダメージを最小限に留めるためにはあまり長くない方がよい。
すなわち、一般的には、最大長（球形の場合は直径）は25〜100nm、好ましくは30〜80nm、より好ましくは35〜70nm、さらに好ましくは40〜60nmの数値範囲であることが好ましい。
本発明の先端にナノ突起構造を有する電極は、ALSや筋萎縮症の臨床検査などで、直接生体の組織、臓器などに接触させる端子（「in vivo prep」）として働かせることができる。その場合は、先端ナノ突起構造を標的となる生体の組織、臓器などに到達させる必要があるため、最大長を100nmまたはそれ以上にすることが好ましい。病的部位切除などの手術中の標的組織、臓器がむき出しの状態での測定であれば、上記一般的な数値範囲内で用いられる。
【００２６】
（１−５）電極の先端に「導電性ナノ突起構造」を形成する方法：
以下、電極の先端に「導電性ナノ突起構造」を形成する典型的な方法について述べるが、これら方法に限られない。例えば、先の磁石電極（Magele）を用いて細胞表面に押し付ける方法と同様に、導電体先端に「導電性ナノ突起構造」を吸着させて、マニュピュレーターなどで加圧程度を調節しながら圧力を加える方法も含まれる。
【００２７】
（Ａ）金コーティングナノ粒子（Gold coated nanoparticles）を、電極の先端に固定する方法
本発明では磁性の有無は影響しないので、ここでは、市販のクエン酸で安定化された磁性金ナノ粒子（nanoimmunotech社製）を使用した場合を例に述べる。
金ナノ粒子とL(+)-アスコルビン酸とを１：１で混合して導電体先端上に滴下し、加熱しながら蒸着させる。ナノ突起構造が板状の場合は横にして、棒状のときはチューブに挿入して、温度を75℃に調節したホットプレート上に15分間保持し蒸着を行う。その後、純水で洗浄する。
【００２８】
（Ｂ）ナノサイズの導電性ポリマー、ペプチド類を導電電極の先端に固定する方法
導電性ポリマーとして、Polyaniline Nanofibresを用いる場合を例に述べる。
Chiou らの「the dilute in situ deposition method法」（Nature Nanotechnology 2, no. 6 (June 2007): 354-57.）を一部変更して使用することで、Polyaniline Nanofibresを電極の先端の「導電性ナノ突起構造」として50nmから65nmのナノ構造を形成することができる。
具体的には、APS（ammonium peroxydisulfateに対してanilineを1.5倍の比率（[aniline]/[APS]=1.5）となるように混合して反応させて、Polyaniline Nanofibresをチタン板上に形成させる。得られたPolyaniline Nanofibresを表面に有するチタン板をそのまま電極として、又は電極先端に結合させる。チタン板に代えて導電性ガラス、金コートされたガラス板などを用いてもよい。
【００２９】
（Ｃ）導電体の先端部分に同一素材のナノサイズ突起構造を形成する方法：
以下、導電体がチタンである場合に、先端にチタン結晶を形成する方法について述べる。
Suzuki 等の方法（Journal of the ceramic society of japan 117(3): 381-384 (2009)）を一部変更して使用した。
Suzuki 等の方法は、KOH処理を施したチタン表面に、溶液Aのtitanium(IV)bis(ammonium lactate) dihydroxide溶液と、溶液BのTiO2 colloidal溶液とを水洗いを含め交互にチタン表面に噴霧してチタン結晶を成長させ、約20サイクルで均一塗装を（TiO2 anatase thin films）行うsplay-LbL方法である。
一方、本発明では凹凸のある結晶のナノ構造を形成することを目的としているので、Sprayのサイクルを5回から10回に止めて、塗装表面にナノ構造の凹凸を生じさせる。この凹凸が金磁性ナノ粒子（GMNP）と同様の機能をはたす。この方法の利点はサイクルの回数が結晶の形、大きさに影響するため、電位記録を行う細胞、組織の形状によりナノ構造を変えることが出来ることにある。
【００３０】
（１−６）細胞膜貫通を促進するためのコーティング材料
代表的なトランスフェクション試薬であるポリエチレンイミン（PEI）は、本発明の導電性ナノ突起構造においても細胞膜の貫通過程を促進することができる。あらかじめ、電極先端の導電性ナノ突起構造をPEIによりコーティングしてもよいし、細胞膜を貫通させる際に細胞表面にPEIを存在させておいてもよい。
細胞へのトランスフェクション試薬としての効果を有する物質であれは同様に用いることができる。例えば、Superfect（Qiagen社）や、細胞膜と同様の電気的性質（20% 負電荷）を持つ植物性脂質（アゾレクチン）、又は１対4で混合した1,2-dioleoylphosphatidyl-glycerol（負電荷DOPG  Avanti）と1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine（中性DOPC、Avanti）などの脂質類にも同様の作用がある。
【００３１】
２．本発明の電極の先端部分を貫通させ細胞表面に固定する方法：
本発明の電極先端のナノ突起構造部分を細胞膜に貫通させ、そのまま細胞表面に固定する必要がある。その際、電極を磁力によって固定する必要はないので、細胞下方には鉄板も磁性板も不要である。
本発明では、電極先端の導電性ナノ突起構造部分を細胞の上面から押し付けて細胞膜を貫通させ、細胞への圧力を調節した状態で固定する。細胞接触面の反対側には、細胞への圧力を調節しやすくするためのホルダーなどの固着装置を設けておくことが好ましい（図３）。
その際、細胞の細胞膜は貫通し、かつ細胞自体は押しつぶさないように加圧する必要があるため、手技で行うためには細心の注意が必要である。その際にかかる圧力は1kg以下、250g以上程度の圧力で細胞内記録が得られる。圧力が強いほど電極面と細胞との密着度が増し、細胞内電位の記録には有利であるが、iPS由来心筋などの場合は細胞を押しつぶして、ナノ突起が細胞自体を貫通してしまう危険がある。そのような危険を避けるためには、電極の上方にマニピュレーターなどを設置し、電極との間にバネ構造を介して取り付けたマニュプレーターを、加圧の程度を調節しながら操作することが好ましい。
また、磁石電極（Magele）などの磁性体の先端に磁性ナノ粒子など磁性を有する導電性ナノ突起構造を結合又は吸着させる場合は、細胞の下方に置かれた鉄板等の金属板との間の磁力を利用して固定することもできる。
具体的には、細胞の培養容器の下に鉄板等磁石吸引性金属板を設け、細胞上方に接触させた磁石電極が培養容器下方の鉄板に吸引されることで細胞上に固定されると同時に、電極先端部のナノ突起構造が細胞膜を貫通して細胞内記録を可能にする。
【００３２】
さらに、前記（１−５）で述べたPEIなどの細胞膜貫通を促進するための物質で電極の先端のナノ構造突起部分をコーティングしておくか、PEIなどを先端と接触する細胞表面に存在させておくことで、細胞膜の貫通工程が促進される。
【００３３】
３．本発明の電極を用いた細胞内電位の測定対象
本発明の電極を用いた測定方法では、先端の導電性ナノ突起構造部分を細胞の上面から押し付けることで測定可能である。そのため、測定対象は、幅広く、単一細胞やその集合体のコロニー以外にも、生体由来の組織や、生体の皮膚、筋肉、その他の臓器の一部に直接接触させて細胞内電位又は電位変化を直接測定することが可能である。
以下、培養細胞、生体由来細胞など生体から分離された状態の細胞（細胞集団を含む）と、生体を構成している組織、臓器中の細胞、組織の場合について述べる。
【００３４】
（３−１）培養細胞及び生体由来細胞
本発明の測定対象となる細胞としては、生検で採取された細胞などの生体由来の細胞でも、培養された細胞でも良い。主としてヒトなどの哺乳動物細胞を対象とするが、鳥類、魚類、昆虫細胞の他、酵母などの真核微生物や大腸菌などの原核微生物であってもよい。
特に、ヒトiPS細胞などヒト幹細胞から分化誘導された心筋細胞、神経細胞、血管上皮細胞、肝臓細胞など、またはその細胞集団が好ましい。
また、形質転換宿主として一般的なHEK, CHO細胞など哺乳動物細胞に、各種イオンチャネル遺伝子や各種トランスポーター遺伝子などを導入した形質転換培養細胞も、各種イオンチャネルやトランスポーターから取り込まれる薬剤の毒性試験における評価系として用いることができるため、本発明における好ましい対象細胞である。
【００３５】
本発明の測定対象細胞は単一の細胞であってもよいが、細胞培養後増殖した、又は培養中に形成された細胞集団（細胞群）を対象としてもよい。
本発明では、磁力を用いる必要がないため、測定容器底面全体を細胞で覆う必要はない。電極の対象細胞への接触面以外の領域は、電極表面をコートした絶縁体により、細胞外液と遮断することで、単独細胞における細胞内電位を測定することも可能である。一方、細胞集団を観察する場合は、絶縁体により細胞外液と遮断される位置に播種する必要がある。
【００３６】
本発明において「細胞集団」というとき、接着培養用の培養ディッシュ（プレート、ウエル）表面に形成されるシート状細胞の場合と共に、iPS細胞など幹細胞に由来する心筋細胞、神経細胞などにより形成される細胞塊の場合も含む。
また、本発明の対象細胞としては、近年モデル細胞として広く用いられるようになった巨大リポソームを含む人工細胞（Moscho et al. (1996) P.N.A.S. 93: 11443-11447；Schlesinger Saito (2006), Cell Death and Differentiation 13, 1403 - 1408；Aimon et al. (2011) PLoS ONE 6(10): e25529. doi: 10.1371/journal.pone.0025529など）も含める。
例えば、イオンチャネルを発現させた細胞から分離したイオンチャネルを含む細胞膜片を巨大リポソームと融合させる方法や、大腸菌などで発現させた組換えイオンチャネルタンパクを取り込ませた小さなリポソームと巨大リポソームとを融合させる方法などにより調製した人工細胞を用いることができる。
【００３７】
（３−２）創薬スクリーニングに有用なモデル細胞
本発明は、特にモデル心筋細胞又は神経細胞などを用いた創薬スクリーニングに有用である。
創薬スクリーニングに際しては、前述のモデル心筋細胞や、モデル神経細胞を用いることで、被検物質の細胞機能への影響、電気刺激による収縮活性、電気生理学的特性変化の解析などを迅速かつ正確に行うことができるため、速やかに被検物質の細胞毒性や、薬効を評価し、被検物質の評価に有効である。
【００３８】
心筋細胞モデルとしては、ヒトiPS細胞などの幹細胞から分化誘導された心筋細胞、又はSCN5A(Nav1.5), CACNα1C(Cav1.2), KCNH2(hERG), KCNQ1/KCNE1 (LQT1), KCNJ2(Kir2.1)遺伝子などを培養動物細胞（HEK293、BHK、又はCHO細胞）に導入し、細胞膜に上記イオンチャネルを発現させた細胞などを用いることが好ましい。そのような細胞として、例えば、WO2014/192312に記載の心筋モデル細胞を用いることができる。
また、形質転換細胞に代えて、iPS細胞などの幹細胞から分化誘導された培養心筋細胞試料を用いることもできる（WO2014/098182）。心筋様のiPS細胞（iCell Cardiomyocyte）はCDI社などにより市販もされている。
心筋細胞モデルとして、哺乳動物細胞由来の心房又は心室を形成する心筋切片を用いることでも心房細動、不整脈を引き起こす原因の究明を行うことができる。他に、病変組織から生検で摘出した組織片などを用いることができる。
【００３９】
神経細胞モデルとしては、光受容体チャネル遺伝子をPC12細胞や大脳皮質細胞、又はiPS細胞などから分化誘導された神経細胞に導入した光受容体チャネル発現細胞を用いることができ、被検物質添加後の光刺激に対する電位応答を観察すれば、神経細胞への細胞毒性や、薬効評価が可能となる。光感受性のモデル神経細胞としては、チャネルオプシン2発現大脳皮質神経細胞（特開2006-217866号公報）などを用いることもできる。
【００４０】
（３−３）生体を構成している組織、臓器中の細胞
本発明の電極は、直接生体の組織、臓器などに接触させる端子（「in vivo prep」）として働かせることができる。特に、皮膚の上皮細胞や、筋肉組織など、比較的生体の表面に近い細胞、組織の測定に有用である。主に針筋電図検査の代替試験方法として使用できる。
また、バイオプシー（生検）検体由来組織の細胞に対しても適用できる。
例えば、臨床試験において、以下のような場合の適用が好ましい。
1.  重症筋無力症をはじめとする神経筋接合部の疾患に対しては、連続刺激試験や単一筋線維筋電図、
2.  神経原性筋萎縮では、随意収縮時に運動単位脱落にと、それに続く残存運動単位の代償的な拡大を反映して、運動単位活動電位の放電頻度の減少とともに、電位自体の増高と持続時間の延長の確認、
3.  前角細胞を障害する運動ニューロン疾患では、安静時における自発的な放電の有無、4.  筋原性筋萎縮すなわちミオパチーでは運動単位活動電位の減高と持続時間の短縮が認められれば、筋線維自体の萎縮と変性を疑うことが出来る。
本発明はこのような疾患の原因究明を行う際に、患者の筋肉の活動電位を細胞内電位変化として記録する事により、疾患がどのように活動電位を構成するイオンチャネルの発現、機能に影響を与えるかなどを診断する臨床基礎試験に適用される精度をもつ。（参照：筋肉の病気  （東京都立神経病院  松原四郎  http://www.jsnp.jp/pdf/cerebral_19.pdf）
このように、筋肉組織のように、皮膚表面に近いため本発明の電極を端子（「in vivo prep」）として筋肉組織を直接検査することができるので、ALSや筋萎縮症の臨床検査などに応用できる。
また、手術中の心臓の表面での電位変化を直接測定することで、心筋梗塞での梗塞によって壊死した組織範囲と機能不全を起こした範囲の同定が可能になる。その他、疾病の進行がどのような形で活動電位の形、伝播に影響を与えているかなどが現場で検査できる可能性がある。
【００４１】
４．本発明の電極を用いた細胞内電位の測定方法及びそのための測定機器
本発明の電極を用いた測定方法では、先端の導電性ナノ突起構造部分を細胞の上面から押し付けて細胞膜を貫通させた後は、従来から細胞内電位測定に用いられている、一般的な測定機器に接続し、細胞内電位及び電位変化を測定する。
（４−１）細胞内電位測定用容器
本発明では、細胞内電位測定対象として培養細胞を用いる場合、磁力が不要であるから、測定用容器底面が導電性プレートである必要はなく、培養に用いられる培養容器をそのまま用いることができるが、培養に用いた培養容器から、より測定しやすい別の細胞内電位測定用容器に移植することが好ましい。
その際、培養液を生理食塩水で複数回洗浄して生理食塩水に置換する。
【００４２】
（４−２）細胞内電位を測定するための機器：通常モードの場合−１
本発明においては、細胞内の自発的な電位、電流や、誘発された電位、電流を、細胞膜を貫通した導電性ナノ粒子を介して細胞内電位を反映する導電性プレート電極又は磁石電極が、細胞外液内に設けられたアース電極との間に流れる電流を感知して細胞外で記録する。その際に生じる電流、電位は極めて微弱なため、細胞外で細胞内電位の記録を行うためには、電流、電圧などの増幅器（増幅アンプ）を備えた機器が必須となる。
そのような機器として、細胞又は細胞群の細胞内電位もしくは細胞外電位を測定するために従来から用いられていた機器は、いずれも用いることができる。
具体的には、パッチクランプ増幅器細胞内記録用増幅器であれば、入力抵抗が最低106〜108オーム以上ある増幅器を用いることができる。例えば、パッチクランプアンプ（Axopatch 200A, Axon instruments）などを用いることができる。
また、MEAシステムであれば、交流信号ではなく、直流信号が測定できる機器であれば使用することができる。
【００４３】
（４−３）膜電流の測定方法およびそのための機器：通常モードの場合−２
膜電流（細胞膜に存在するイオンチャネルを流れる電流）を測定するためにはパッチクランプアンプを用いるが、複数の人工脂質二重膜を用いる実験ではトータルの膜容量が大きくなるため（４−２）の場合と異なり、Axopatch-1D Patch-clamp amplifier（Axon Instruments）を用いる。そして、細胞膜電位を記録した場合のCurrent clamp modeではなく、Voltage clamp modeを使用する。
一般的なパッチクランプアンプAxopatch 200A（Voltage clamp）は通常の単一細胞の膜電位を制御する実験の場合に特に適している。多数の細胞に用いる場合は、合計の細胞膜-脂質二重膜の面積が大きいため、大量の膜電位を制御する必要があるので、人工脂質二重膜実験測定用のCV-4 Head stageが使用できるAxopatch-1Dを用いた。人工脂質二重膜実験測定用のHead stageは大きな電流を流すことができるため、多数の細胞の脂質二重膜をすばやくチャージできるという利点がある。なおAxopatch-1D Patch-clamp amplifierに代えてBilayer Clamp Amplifier (BC-535) (Warner Instruments)などを使用してもよい。
【００４４】
（４−４）「容量型電位測定デバイス」の利用：高感度モードの場合
本発明の電極として、「容量型電位測定デバイス」（コンデンサー形成）を用いた場合、具体的には先端の導電性ナノ突起構造を持つ電極の細胞接触面以外を完全にパラフィルムで覆い、プラス極は電極に直接接続し、マイナス極はパラフィルムの上から接続して用いる。このマイナス極は通常のアース（グランド）の働きをするので、本発明では「Clip on ground」とも呼ぶ（図３）。
本発明において「容量型電位測定デバイス」とは、細胞内で生じる活動電位などの細胞内電位の変化をイオン濃度の変化をイオン荷電の合計の変化としてとらえる。この電荷の変化をチャージアンプの原理を応用することで電圧信号（細胞内膜電位）と変換して測定するものであり、測定回路内にアースを設ける必要がない。（その際、非常に高いインピーダンスとピコファラッドの容量をもつコンデンサーを用いる。導電性ナノ粒子電極に結合したコンデンサーの一端に起こる電位変化（帯電したイオンの細胞への出入り）は高インピーダンスコンデンサーが電荷-電圧変換器（チャージアンプ）として働くため、電圧として検知される。）
このデバイスの特徴はコンデンサーの両端にアンプのプラス極とマイナス極をつなげて直接電位変化を測定することにあり、デバイス内のマイナス極が測定回路のアースとして働くためにopen circuitとならず安定した測定を可能にする。
また、本発明において「チャージアンプの原理を利用する方法」というとき、「細胞膜を通した陽イオン、陰イオンの出入りによる細胞内のイオン濃度の変化を、細胞膜を貫通した電極先端の導電性ナノ突起構造と接する導電性プレートなどの導電体を通して電荷の変化として感受し、それを電圧変化として測定する方法」を意味する。
なお、導電性プレートとしては、導電ガラス、又はチタンプレートを用いることができ、マイナス電極としてはアルミ箔、銀板、白金板などが用いられる。
【００４５】
本発明の測定方法は既存の細胞内または細胞外電位測定方法とは大きく異なり、増幅器のプラス極（細胞内）、細胞外液におかれたマイナス極の間に起こる電位変化を直接測定するのではなく、細胞を播種するコンデンサー（導電性プレート）をセンサーとして電荷−電圧変換を行い、細胞内電位変化として記録するため、細胞外液にアースを設定する必要がない。センサーとなる導電性プレートが細胞膜を貫通した導電性ナノ粒子を介して細胞内の電荷（チャージ）変化を感受できればよいから、導電性プレートは細胞に覆われていない部分で細胞外溶液に直接接触していてもよい。そのため、特にシート状に形成のできない培養神経細胞など、単細胞での細胞内電位の測定に適している。
対象細胞内の細胞内電位を制御するための電気刺激を行うためには、容量型電位測定デバイスとは別にアースを有する電気刺激回路を設けるか、Channelrhodopsineなどを発現させ、刺激を行う必要がある。
【００４６】
本発明の容量型電位測定デバイス型の典型的な電極は、（図２右図）に示すように、細胞と接触させる先端部分を除く外側を完全に絶縁体で包み、担持部（ホルダー）を備えた構造であり、プラス極は電極本体に直接接続され、マイナス極はパラフィルムの上から接続されている。
【００４７】
（４−５）「in vivo prep」による生体の組織または臓器中の細胞の細胞内電位測定方法  生体の組織または臓器中の細胞の細胞内電位測定のための「in vivo prep」は、導電性ナノ粒子を解する細胞内電位記録デバイスを応用したものであり、具体的には、本発明の（図３右図）に示した導電体のうち細胞と接触させる先端部の端子を除く外側を完全にパラフィルム等の絶縁体で包み、その外側をアース電極で覆った単一電極（モード１）、及び、電極記録部分と絶縁体をはさんだ第二の導電体によって形成されたコンデンサーを利用した容量型電位測定デバイスとして細胞内電位の記録が可能な（モード２）により記録する。
モード１、モード２共に（図４）に示すような、複数の電極を電位測定デバイスとして複数の増幅器と繋がり、同時に複数の細胞内電位の記録を行うことも可能である。
「in vivo prep」を、生体を構成している組織、臓器中の細胞、又はバイオプシー（生検）検体からの細胞に対して、原則としては直接接触させて細胞内電位を測定する。皮膚の上皮細胞や、筋肉組織など、比較的生体の表面に近い組織であれば、先端部分の導電性ナノ突起の長さを100nm以上などに調節することで、上皮細胞、筋膜などを突き抜けて測定可能である。
また、手術中の開胸された心臓などであれば、心臓表面の細胞内の電位変化を直接測定することができる。
【００４８】
（４−６）リング状磁石により自立固定させたMagEle電極の利用方法
MagEle電極を用いて細胞内電位の測定の際、Magnet（磁石）は培養細胞の細胞膜を貫通した導電性ナノ粒子を吸着する作用と同時に、培養細胞の下方に設置された磁性金属（磁性鉄板）を吸着し、MagEleを自立させる作用がある。
磁性金属の代わりに、リング型磁石を配置することにより、同様にMagEleを自立固定させる事ができ、かつMagEleの下方に存在する被検培養細胞をリング型磁石の中心より直視する経路が確保でき、細胞に直接光を投射することが可能になる。
このことを利用して、例えば被検細胞にあらかじめChannelrhodopsinを発現させておき、細胞に対して光刺激を行って細胞内電位変化を記録することができる。また、被検細胞に蛍光試薬を導入することにより、MagEle電極を用いた電気的測定と平行して細胞内カルシウム動態、膜電位の変化などを行うことが可能となる。
【００４９】
なお、光照射経路が確保可能な台の上に培養容器を設置できる場合、容器下方にリング様磁石を設置しなくても、前記HandyNano技術を用い、マニピュレーターなどで電極を固定することで、前記HandyNanoと組み合わせて、マニピュレーターなどで、電極を固定する事により、光刺激又は蛍光観察を行うことが出来る。
【実施例】
【００５０】
以下に実施例を示し、本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
本発明におけるその他の用語や概念は、当該分野において慣用的に使用される用語の意味に基づくものであり、本発明を実施するために使用する様々な技術は、特にその出典を明示した技術を除いては、公知の文献等に基づいて当業者であれば容易かつ確実に実施可能である。また、各種の分析などは、使用した分析機器又は試薬、キットの取り扱い説明書、カタログなどに記載の方法を準用して行った。
なお、本明細書中に引用した技術文献、特許公報及び特許出願明細書中の記載内容は、本発明の記載内容として参照されるものとする。【００５１】
（参考例１）Nav1.5/Kir2.1を安定発現するHEK細胞における細胞内電位の測定
この実験では、自発的に活動電位を発生させるNav1.5/Kir2.1を安定発現するHEK細胞を用いて細胞膜を貫通した導電性ナノ粒子により細胞内電位の測定が可能であることを示す。【００５２】
（参１−１）Nav1.5/Kir2.1の安定発現HEK細胞の作成
Nav1.5/Kir2.1遺伝子をベクターを用いてHEK細胞（JCRB細胞バンク）を形質転換し、Nav1.5/Kir2.1を安定発現するHEK細胞を作成した。
具体的には、まずヒトNa+チャネル(Nav1.5)のαサブユニット（SCNA5, BC140813：SourceBioscience社）から、Nav1.5遺伝子を切り出し、pcDNA3.1(-) hygromycin （Invitrogen）に挿入した。
BC140813はEmbryonic type のNav1.5遺伝子なので、human heart cDNA（Zymogen）を用いたPCR法などにより、ヒト成人心筋で発現するNav1.5遺伝子に置換した。
Kir2.1（NM_000891、KCNJ2）遺伝子（1284bp）は、iPS細胞由来の心筋細胞（CDI, Cellular Dynamics International）から抽出したtotal RNA に下記プライマーによるNesting PCR法を適用した。
Kir2.1 1st sense：CCAAAGCAGAAGCACTGGAG （配列番号１）
Kir2.1 1st A/S：CTTTGAAACCATTGTGCTTGCC （配列番号２）
上記のprimerを用いたFirst round PCRではPCR産物が確認できなかったため、100倍希釈して更にPCRを行い、Kir2.1遺伝子を取得した。
Kir2.1 ICR HindIII sense: CACTATAGGGAAGCTACC atgggcagtgtgcgaaccaac （配列番号３）
Kir2.1 ICR HindIII A/S: ATAGAATAGGAAGCT tcatatctccgactctcgccg（配列番号４）
得られたKir2.1 PCR産物を、pD608（blastcidin、DNA2.0）のHindIII siteへ挿入した。
前記Nav1.5遺伝子（50ug/ml hygromycin）と共に、Kir2.1遺伝子（Kir2.1 2ug/ml blastcidin）をHEK293細胞（培養液, DMEM、Sigma-Aldrich, 10% FBS）に導入し、Nav1.5/Kir2.1の安定発現細胞株を作成した。【００５３】
（参１−２）金コーティング磁性ナノ粒子の細胞内への導入
金コーティング磁性ナノ粒子を、Polyethyleneimine（PEI, P3143 Sigma-Aldrich）を用い、（参１−１）で作製した「Nav1.5/Kir2.1の安定発現HEK細胞」に対し、下記URLを基にして改良したプロトコールで行った。
（https://labs.fccc.edu/yen/docs/PEI%20preparation.pdf）
具体的には、あらかじめ10mg/ml PEI溶液（pH7）を0.2μm filter（Minisart, Sartorius stedim）を用いて調整後、-80℃で保管しておき、使用分のみを使用直前にddH2Oで100倍希釈した。5μlのPEI希釈溶液を80μl金コーティング磁性ナノ粒子と20μlの 5×HBPS（24mMHEPES＋126mM NaCl, 4mM KCl, 1mM CaCl2, 1mM MgCl2, 10mM Glucose）混合液に加え、15分間室温でインキュベーションした。
そして、（参１−１）で作成した培養Nav1.5/Kir2.1の安定発現HEK細胞を、血清の含まれていないDMEM（Sigma-Aldrich社製）、又はOptiMEM I（Invitrogen社製）含有緩衝液（PBS）で洗い、上記の金コーティング磁性ナノ粒子溶液と置換し、15分37℃の培養器でインキュベーションした。
得られた金コーティング磁性ナノ粒子導入「Nav1.5/Kir2.1の安定発現HEK細胞」を通常の培養ディッシュで培養（DMEM、Sigma-Aldrich, 10% FBS）した。【００５４】
（参１−３）細胞内の導電性ナノ粒子を上方の磁石電極（MagEle）で引き付け細胞膜を貫通させる方法
この実験では、Ni-Cu-Niでコーティングされた直径1mm円柱ネオジウム磁石（ネオマグ株式会社）を、ネオジウム磁石電極（MagEle）として用いて細胞内記録電極を構築することが可能であることを示す。
（参１−２）で作成した金コーティング磁性ナノ粒子を導入した「Nav1.5/Kir2.1の安定発現HEK細胞」を用い、細胞の上方に配置したネオジウム磁石電極（MagEle）により、細胞内の金コーティング磁性ナノ粒子を磁石電極に引き付け、細胞膜を貫通させて細胞内記録電極を構築した（図５）。得られた細胞内記録電極により、「Nav1.5/Kir2.1の安定発現HEK細胞」の細胞内電位変化を記録した（図６）。【００５５】
（参１−４）磁石電極に吸着させた導電性ナノ粒子を細胞膜に貫通させる方法
この実験では、導電性ナノ粒子をあらかじめ細胞内に導入しなくても、磁石電極の磁力を利用することで、細胞の外表面から貫通させることができ、細胞内記録電極を構築できることを示す。
PEIと混合した金コーティング磁性ナノ粒子（nanoimmunotech社製、NITmagold Cit）を、側面が絶縁体でコーティングされた磁石電極表面に添加し、当該ナノ粒子を磁石電極に約30分かけて吸着させた。
鉄板上に設置した培養ディッシュ内でNav1.5/Kir2.1 HEK細胞、及び培養心筋様細胞（iCell cardiomyocyte）の上方から、前記磁石電極を、導電性ナノ粒子の吸着面を下に向けた状態で直接接触させた。磁石電極は培養ディッシュ下方の鉄板に吸引されて細胞上方に固定され、導電性ナノ粒子は、PEIを介して細胞膜を貫通し、かつ磁石からの磁力により細胞膜内にとどまることが観察された（図７）。
さらに、いずれの細胞においても、得られた細胞内記録電極により、（参１−３）の場合と同様に細胞内電位変化が記録できた。
すなわち、あらかじめ導電性ナノ粒子を細胞内に導入する工程がなくても、導電性ナノ粒子とPEIとの混合物を磁石電極に吸着させて細胞に押し付ける工程による、非常に侵襲性の少ない方法により細胞内記録電極が構築でき、細胞内電位変化の記録も可能であることを確認した。【００５６】
（参考例２）チャージアンプの原理を応用して測定する方法
（参２−１）チャージアンプの原理応用のための予備実験
この実験は、チャージアンプを細胞内に導入したナノ粒子との組み合わせにより、生物電位の測定を行うに当たり、その測定系が有効である事を示すための実験である（図１２）。
回路Ａは、記録に用いたCurrent-clamp modeのパッチクランプアンプAxoptch 200AにModel cell（細胞等価回路：500MΩ抵抗と33pFコンデンサーを並列につなげた回路に、矩形電流パルス（20ms, 120pA）を加え、その等価回路を通した電位変化を測定した（図８回路Ａ）。
それに続き、等価回路と増幅器のマイナス入力の間にチャージアンプのセンサーとなる導電ガラスを接続した。この導電ガラスをコンデンサーとして作用させるために導電コーティングの施されていないガラスの下方にアルミ箔を配置した（図８回路Ｂ）。
導電ガラスーアルミ箔コンデンサー挿入による電圧出力への影響を回路ＡとＢとの差を計算し評価した。別々に行った同様の実験から、波形振幅に対しては3.3％、5.7％減少するという誤差が認められたが、それ以外、波形自体にはフィルター効果などの影響は認められないことがわかった。
このことから導電ガラス−アルミ箔コンデンサーはチャージアンプのセンサーとして有効であり、導電ガラス上に培養した細胞の電気的活動（細胞内外の荷電イオンの動き）の測定に応用できると判断した。
図１２の回路Ｃでは実際の細胞を使用した場合の配置回路を示した。サンプルとして、前記（参考例１）で用いたと同様の細胞（Nav1.5/Kir2.1 HEK細胞）を用い、チャージアンプを使用して細胞の自発性活動電位を測定し、細胞内膜電位を、チャージアンプの原理を応用して細胞外記録機器で測定可能であることを確認した（図８回路Ｃ）。【００５７】
（参２−２）チャージアンプを用いた心筋様細胞
この実験では、心筋様細胞を用い、細胞内の活動電位などによって起こる細胞内膜電位の変化を、導電性ナノ粒子を通して電荷の変化ととらえ、この電荷信号変化（活動電位発生に伴う荷電したイオン（Na+, K+,Ca2+, Cl-）の細胞内外への動き）をチャージアンプの原理を応用して電圧信号として測定できることを示す（図９）。
具体的には、心筋様細胞（iCell Cardiomyocyte：CDI社）を、導電ガラスの（厚さ2mm）上に播種し、培養液として「iCell Cardiomyocytes Maintenance Medium」を用いて培養した。金コーティング磁性ナノ粒子を、以下の方法によりStreptolysin O（SLO,和光純薬）を用いて心筋様細胞内に導入した。
すなわち、PBS8-(-)で一度洗い、ナノ粒子-SLOミックス（20ul PEG-Gold coated magnetic nanoparticle, 5μl 5×HBPS, 1μl（1U）の活性化したSLO）で置換し、培養器（37℃）にて、15分保持する。続いて、溶液をiCell Cardiomyocytes Maintenance Mediumに置換し（血清によるSLOの不活性化）、翌日以降に実験を行った。【００５８】
前記（参２−１）の回路Ｃと同様に、金コーティング磁性ナノ粒子が導入された心筋様細胞に覆われた導電ガラス上面をアンプのインプットへ、そして、ガラス下面に配置したアルミ箔をアースに接続する。導電性のあるガラスの上面と下面のアルミ箔によりコンデンサーを形成し、上面に培養した細胞の電気的活動（細胞内外の荷電イオンの動き）を測定した（図１４）。
このように、チャージアンプの原理を利用して導電性ナノ粒子により細胞の自発性活動電位が測定できることが実証できた。【００５９】
（参考例３）接着力の弱い細胞のチャージアンプモード（CHargeAmpLifier（CHAMPL）mode）記録
この実験は、心筋細胞やHEK細胞などの接着力の弱い細胞を導電ガラス表面に効率よく接着させることができ、細胞内に予め導入した導電性ナノ粒子を細胞下方から磁石で吸引して細胞膜を貫通させることで細胞内の自発性活動電位を測定できることを示す。【００６０】
（参３−１）導電ガラス表面への接着力の弱い細胞の調製
CHO細胞など通常の動物細胞は導電ガラス表面に効率よく接着するが、心筋細胞やHEK細胞など細胞によっては導電ガラス表面への接着効率が著しく低い細胞もある。そのような細胞を直接導電ガラス表面に播種した場合、培養容器の底面を形成する導電ガラス表面の全体を覆うようにまで細胞を培養することは極めて困難である。
そこで、あらかじめ導電ガラス表面にコラーゲン（Collagen）を格子状に塗布しておき、その上から細胞の播種を行い、全面を覆うまで培養する。コラーゲン塗膜の無い箇所では、細胞膜を貫通した導電性ナノ粒子の導電性ガラスとの直接接触が可能となる。
コラーゲンは導電性が低いが、細胞接着性も導電ガラスへの接着性も高いため、コラーゲン塗膜箇所での細胞接着率を向上させることができる。このような物質としては、他にfibronectin, Poly-L-lycineなどがあり、コラーゲンに代えて使用することができる。【００６１】
この実験では、導電ガラス表面への接着効率低い細胞として典型的な心筋様細胞（iCell Cardiomyocyte2）を用い、あらかじめコラーゲン（Collagen）を格子状に塗布した導電ガラス表面で培養後、金コーティング磁性ナノ粒子を導入し、磁場により細胞膜を貫通させた後に、Veratridineのようなナトリウムチャネルのオープナーの作用について活動電位を誘発記録した。本実験は室温で行った。
具体的には、まずゲル状に調整したコラーゲン（アテロコラーゲン、（株）高研）を導電ガラス表面中心部の直径約5mm円内に線状に塗布後、先端を溶かした微小電極を使って格子状に引き伸ばし、約0.5μm間隔の格子状コラーゲン塗膜を形成させた。
次いで、当該導電性ガラス表面に心筋様細胞（iCell Cardiomyocyte2）を播種し、心筋様細胞専用培地（iCell Cardiomyocytes Maintenance Medium）で約6日培養して心筋細胞シートを形成させた。【００６２】
次に、SLOを用いて、金コーティング磁性ナノ粒子を導入し、導電性ガラス下部の磁石による磁場の作用で当該ナノ粒子を細胞膜に貫通させて導電性ガラス電極とし、細胞を覆う培養液を生理食塩水に置換して２日後にチャージアンプモード（CHargeAmpLifier（CHAMPL）mode）を用いて細胞の活動電位の記録を室温で行った（図１０）。
しかしながら、この標本は自発性活動電位が観察できなかったため（data not shown）、生理食塩水内にナトリウムチャネルオープナーとして働くVeratridine（Sigma-Aldrich）を最終濃度100μMとなるように投与し、活動電位を誘発記録した。Veratridine投与から40秒後にゆっくりした脱分極が観察され、それと続いて自発性活動電位が記録された（図１１）。【００６３】
（参考例４）培養神経細胞における細胞内電位の測定
この実験では、（参考例１）の方法に従って細胞膜に金コーティング磁性ナノ粒子を貫通させた培養神経細胞で、容量型電位測定機能を付加した磁石電極を用いた測定方法により細胞内電位が測定できることを示す。
（参４−１）培養神経細胞の調製
培養神経細胞として、NG108-15細胞（neuroblastoma-glioma hybrid cells）を用い、DMEM (Sigma-Aldrich)、HAT supplement (Thermofisher)及び10%FBS (Biowest)を含む培養液で培養した。0.1% Polyethyleneimine (pH8.4, 150mM Sodium Tetra-Borate (Wako))でコーティングをしたカバーガラスにNG108-15を播種し、培養液は上記の培養液のFBSを 5%とし、それに500μM Ibuprofen (Wako)を添加することにより神経誘導を行った。 神経誘導5日後に以下の実験を行った。【００６４】
（参４−２）磁石電極法による金コーティング磁性ナノ粒子の細胞膜貫通
PEI-PEG-金コーティング磁性ナノ粒子を混合し、3時間放置した。ネオジウム磁石の細胞接着面にこの混合液を移動させ、更に15分放置し、金ナノ粒子を磁気によりネオジウム磁石電極に結合させる。
この電極を鉄板の上に設置した培養細胞上に置いた。細胞下方の鉄板と磁石電極は磁力により引き合うので、磁石電極は細胞の上で自立固定され、磁石電極表面の金ナノ粒子はPEIの作用で一端が細胞内に露出するように貫通した。
磁石電極は、磁力220ミリテスラ、直径6mmのネオジウム磁石を用いた。細胞接触面以外をパラフィルムで覆った磁石電極をプラス極に接続し、マイナス極はパラフィルムの上から吸着させた強磁性体からなる容量型電位測定デバイスとして働かせる磁石電極(MagEle)である。この際、強磁性体と磁石電極との間のパラフィルムは厚くし、完全に絶縁されていることを確認した（図１２Ａ）。
ここで、容量型電位測定デバイス機能を付加した磁石電極(C-M electrode)を用いて記録を行った。【００６５】
（参４−３）Polycarbonateセルカルチャーインサートを用いる細胞の調製
ここでは、（参４−１）で用いたカバーガラスに代えて、Polycarbonateセルカルチャーインサート（ポアサイズ0.4μm, Thermo Scientific）内に培養神経細胞（NG108-15細胞）を播種、培養した他は、（３−１）及び（３−２）と同様の方法により調製し、次いで導電性ナノ粒子（金ナノ粒子）を細胞壁に貫通させた（図１２Ｂ）。
セルカルチャーインサートを用いることの利点はポアサイズが0.4μm（Thermo Scientific）のPolycarbonate透過膜の上に細胞を培養しているため、細胞の上表面が磁石に覆われても、インサートの下方の隙間から、異なる溶液での置換が可能になる。薬物の作用を観察したり、Agonist を投与し、ligand gated channelの活性の測定を行うことにも適用可能である。【００６６】
（参４−４）培養神経細胞の細胞内電位の記録
NG108-15細胞を5日神経分化誘導を行った後、培養液を細胞外液（生理食塩水）に置換し、活動電位記録の実験を行った。C-M electrodeをカバーガラスに播種した細胞上に配置することにより自発性の活動電位を記録した。この方法は細胞の自発性活性に強く依存するため、神経分化の程度が実験の成功に大きく影響する（図１３Ａ）。
自発性の活動電位に加え、神経伝達物質であるグルタミン酸による神経の活性が記録できるかを確認するために次の実験を行った。NG108-15細胞を2日神経分化誘導を行い実験を行った。上記の実験同様C-M electrodeを細胞上に配置し、実験記録を行った。細胞外液にグルタミン酸を投与し（最終外液濃度800μM）、グルタミン酸受容体を介した応答を記録した。グルタミン酸により、内在性のグルタミン酸受容体が活性化され、それが膜電位の脱分極（上向きの変化）応答として記録された。グルタミン酸により誘発された膜電位変化は脱感作のため、ゆっくり減衰し、約90秒後にベースラインに戻った。図上のベースラインとグルタミン酸応答のartifactは取り除いた（図１３Ｂ）。【００６７】
数秒にわたり持続するゆっくりした膜電位の変化が記録できるため、神経伝達物によって活性化されるイオンチャネルによる膜電位変化、Gタンパクを介したイオンチャネルの活性などもこの方法で記録することが可能である。【００６８】
（実施例１）NG108-15分化細胞の細胞内電位の測定
（１−１）NG108-15分化細胞の調製
この実験で用いるNG108-15分化細胞を以下のように調製した。
本実験に使用した分化したNG108-15細胞（名古屋大学、古家先生より分与：FURUYA et al,.(1983) Developmental Time Courses of Na and Ca Spikes in Neuroblastoma x Glioma Hybrid Cells. Developmental Brain Research, 11  229-234）は殆どの細胞で自発的に活動電位を示す事はないが、電気刺激により、活動電位を誘導することができる。更に興奮性神経伝達物質のグルタミン酸（10mM）投与を行うと継続して活動電位を誘導することができる。
NG108-15細胞の培養は、古家らの方法に従った。
具体的には、10% FBS (Biowest)を含むDMEM (Sigma-Aldrich)に2% H.A.T.を加えた溶液を培養液として使用。NG108-15細胞を神経様に分化させるにはFBSを2%に減少し、細胞内cAMP濃度を上昇させるために文献では膜透過性cAMP (Dibutyryl-cAMP)を使用しているが、10uM forskolinに置き換えて行った。培養液は2日から3日の間隔で交換した。 【００６９】
（１−２）NG108-15分化細胞が神経として分化し、電気刺激、興奮性神経伝達物質であるグルタミン酸への応答性を獲得していることを、パッチクランプ法を用いた細胞内電位測定実験を行い検証した。
この実験は、（１−１）で調整したNG108-15分化細胞で細胞内電位がグルタミン酸により誘発されることを、従来法であるパッチクランプ法を用いて検証した。
具体的には、分化したNG108-15細胞に対して10mM グルタミン酸を加えた細胞内電解液を満たしたガラスピペットを用い、細胞膜を密に接着させ、電気的にガラスピペットと細胞を一体化させた。次いで、細胞内に投入されたグルタミン酸により誘発されたゆっくりした脱分極と活動伝位を記録した（図１４）。【００７０】
（１−３）先端にnano突起構造をもった一体化電極の作製
電極として磁石電極（Magele）を用い、導電性ナノ粒子として市販のクエン酸で安定化された磁性金ナノ粒子（nanoimmunotech社製）を用いた。
具体的には、0.5μl PEI(10mg/ml)と20ul金コーティング磁性ナノ粒子（nanoimmunotech社製、NITmagold Cit）、5μlの5倍濃度 HBPS（カルシウム、マグネシウムの最終濃度は1mM）を混合し、30分以上室温で保持した。磁石電極の記録面を上向きに固定し、この混合液を記録面に滴下し、磁力により吸着させ、その溶液を室温で蒸発させる（Magele）。
（図３中央）に示すように電極の側面全体を絶縁体のシリコンチューブ（Tygon）に挿入して被覆し、細胞外液と接触する領域をアース材料のアルミフォイルでさらに被覆し、本発明の一体化電極を作製した。【００７１】
（１−４）先端にnano突起構造をもった電極を用いた細胞内記録
この実験は、（１−３）で作製した先端に導電性ナノ突起構造を一体化させた電極を用いて、分化したNG108-15細胞の細胞内電位が測定できることを示す。
分化したNG108-15細胞上にマニピュレーターを用いて、上記一体化電極を押し付け（図２）、先端のナノ突起が細胞膜を貫通し、かつ細胞がつぶれない状態であることを確認し、一体化電極を固定した。なお、その際のマニピュレーターでの圧力は、実際に重量計に押し付けて測定した結果から約280g／cm2であった。
分化したNG108-15細胞を10mMグルタミン酸により活性化を行った後、マニピュレーターで固定された一体化電極により、細胞内電位を測定した。
前記（１−２）でのパッチクランプによって得られた記録と同様に、活動電位、ゆっくりした脱分極が記録された（図１５）。【００７２】
（実施例２）veratridineで活性化されたNG108-15細胞の細胞内電位の測定
この実験は、分化したNG108-15細胞を、sodium channel opener であるveratridineで活性化し、その細胞内電位を測定するものである。【００７３】
（２−１）Mageleによる細胞内電位を測定
ここでは、分化したNG108-15細胞を培養した培養ディッシュを鉄板上に配置し、参考例（１−３）と同様の方法を用いて先端に金コーティング磁性ナノ粒子を吸着させた磁石電極（Magele）を細胞内記録電極として用い、veratridineで活性化したNG108-15細胞の細胞内電位を測定した。
具体的には、このMageleを分化したNG108-15細胞上に、培養ディッシュ下方の鉄板との磁力により自立固定した。Magele先端のナノ粒子はPEIの助けを借りて細胞膜を貫通し、細胞内記録を測定した。細胞外液に投与したveratridineにより、NG108-15細胞が活性化され、それによって発生した活動電位を細胞内電位変化として測定した（図１６）。【００７４】
（２−２）表面に導電性金ナノ粒子を蒸着させた一体化電極を用いたNG108-15細胞の細胞内電位の測定
本発明では磁性の有無は影響しないので、電極として磁石電極（Magele）を用い、導電性ナノ粒子として市販のクエン酸で安定化された磁性金ナノ粒子（nanoimmunotech社製）を用いた。  金ナノ粒子とL(+)-アスコルビン酸（10mg/ml, 和光純薬）とを１：１で混合し、約20μlを磁石電極（Magele）（又は導電性ガラス）の先端上に滴下し、75℃15分間加熱し、蒸着させることで、磁石電極先端に粒子状の「導電性ナノ突起構造」を形成した。蒸着後、純水で洗浄した。電極を形成した。
ここでは、磁石電極（Magele）表面に磁性金ナノ粒子を吸着させ、細胞の外からマニピュレーターにより細胞表面に押し付けた。
具体的には、まず、絶縁体のシリコンチューブ（Tygon）にホルダーを設けた電極を挿入して側面全体を被覆し、細胞外液と接触する領域をアース材料のアルミフォイルでさらに被覆しておく（一体化電極）。次いで、一体化電極のホルダーと逆側の表面に、ポリエチレンイミン（PEI）と混合した金コーティング磁性ナノ粒子を吸着し、分化したNG108-15細胞の上方からマニピュレーターにより細胞表面に押し付けて、先端部の金ナノ粒子を細胞膜に貫通させ、かつ細胞表面に固定した。
NG108-15細胞を10mMグルタミン酸で活性化し、その細胞内記録電位を測定した。その結果、上記（図１５）と同様なデータが得られた（data not shown）。【００７５】
（実施例３）K+チャネルブロッカーにより活性化したNG108-15細胞の活動電位の測定
この実験では、前記（２−２）と同様の手法で作製した先端に導電性ナノ突起構造を有する電極（ポリエチレンイミン（PEI）コーティング）を用い、K+チャネルブロッカーにより活性化したNG108-15細胞の活動電位を測定する。
具体的には、前記（２−２）と同様に、表面に磁性金ナノ粒子を吸着させた磁石電極を、細胞の外からマニピュレーターにより細胞表面に押し付けて、先端部の金ナノ粒子を細胞膜に貫通させ、細胞表面に固定した状態で、分化したNG108-15細胞を、K+チャネルブロッカーにより活性化し、その細胞内記録電位を測定した（図１７）。【００７６】
（実施例４）未分化のNG108-15細胞の細胞内電位の測定
この実験では、先端に導電性ナノ突起構造を有する電極が、導電体も、その先端のナノ突起構造もチタンである場合にも対象細胞の細胞内記録電位を測定できることを示す。【００７７】
（４−１）先端に導電性ナノ突起構造を有する電極の作製（Titanium colloidをニッケル−銅切片の先端に凝着させたチタン電極）
Suzuki 等の方法（Journal of the ceramic society of japan 117(3): 381-384 (2009)）を一部変更して使用してニッケル−銅（直径6mm）切片の先端部分にナノ構造の凹凸を生じさせた。
具体的には、最初に親水性表面を作るために1% KOHで5分間処理し、ddH2Oで洗浄する。
溶液Aとしては 1% titanium(IV)bis(ammonium lactate) dihydroxide（TALH, 50% Aldrich社）を用い、溶液Bとしては、0.1 wt %TiO2 colloidal溶液の調整は30 wt %TiO2 colloidal（STS-01, 石原産業会社）をddH2Oで希釈して0.1 wt %水溶液作成し、HClを用いて、pH2に調整する。
次いで、溶液Aと溶液Bを水洗いを含め交互にチタン表面に噴霧しチタン結晶を成長させて、Sprayのサイクルを10サイクル繰り返し、塗装表面にまだナノ構造の凹凸が残っているところで止め、先端部分にチタンのナノ構造を有する電極を作製した。【００７８】
（４−２）未分化のNG108-15細胞の静止膜電位の測定
前記（４−１）の方法で作製した先端部分にチタンのナノ構造を有するチタン電極を前記（１−３）と同様に絶縁体及びアースで被覆しホルダーを設けてマニピュレーターに取り付け、マニュピュレータにより未分化のNG108-15細胞に押し付けて細胞膜を貫通させ、加圧しながら静止膜電位を測定した。
加圧を解除することにより記録された膜電位は消失した（加圧前の状態になった）（図１８上図）。
細胞のない状態で同様の実験を行った場合、電位には変化が全く生じなかった（図１８下図）ので、記録された膜電位は細胞由来と判断した。【００７９】
（４−３）チタンの先端部分にナノ構造としてSKILTITAN(スキルチタン)を用いる方法
前記（４−１）のTitanium colloidをチタン切片の先端に凝着させる代わりに、SKILTITAN(スキルチタン、株式会社キン.ダイ）を電極面にスプレーすることによってチタン切片の先端部分にナノ構造を作製し、前記（４−１）と同様のチタン電極を作製した。
当該チタン電極を用いて、前記（４−２）と同様の手法で未分化のNG108-15細胞の細胞内静止膜電位を測定したところ、（図１８上図）と同様なデータが得られた（data not shown）。【００８０】
（実施例５）「導電性ナノ突起構造」を導電体の先端に形成するその他の方法の検討
ここでは、導電性ポリマーによるナノ構造のPolyaniline Nanofibresを電極（例えばチタン切片）の先端に形成できることを示す。
Chiou らの方法（Nature Nanotechnology 2, no. 6 (June 2007): 354-57.）を一部変更して使用することで、Polyaniline Nanofibresを電極の先端の「導電性ナノ突起構造」として50nmから65nmのナノ構造を形成することができる。
具体的には、以下の条件でaniline（和光純薬）を用いてpolyaninilineナノ突起を形成する。1 M 過塩素酸（HClO4、和光純薬）でanilineを溶解し、10mM aniline溶液を作成し、 APS（ammonium peroxydisulfate（和光純薬））に対して1.5倍の比率（[aniline]/[APS]=1.5）でこのaniline溶液と混合し、0〜5℃で24時間スターラーで混合して反応させて、  Polyaniline Nanofibresをチタン板（例えば、厚さ0.5mm、長さ1mm〜1cm）の上に形成させる。得られたpolyaninilineナノ突起を表面に有するチタン板を電極先端に結合させる。【００８１】
（実施例６）ホルダー付き「容量型電位測定デバイス」の製造
前記の本発明者らの開発した「容量型電位測定デバイス法」（特願２０１８−８７６８９）を応用し、コンパクトなホルダー付き「容量型電位測定デバイス」（図３右）を製造した。ここで、ホルダー付き「容量型電位測定デバイス」のアース（基準電極）は、（図３右）に示したように、測定器のマイナス側、又はアース端子につなぎ（前記４．（４−４）の「Clip on ground」の説明参照）、電極と一体化する。このホルダー付き「容量型電位測定デバイス」は、細胞膜を貫通する先端の導電性ナノ（粒子）構造が、細胞内の電位変化を検知し導電性ナノ（粒子）構造が接触している導電体（磁石電極など）を帯電させることにより、電位変化量として検出する。そのため、細胞膜を貫通した先端導電性ナノ（粒子）構造の細胞あたりの数が、細胞膜と導電性ガラスアクセス抵抗に強く影響し、記録される電位変化の大きさを決定する。
具体的には、電位変化は先端導電性ナノ（粒子）構造の電荷変化（Q）として検知する。Qは、下記の式により導かれる。
Q=CV（式中、Cはコンデンサーの容量、Vは電位の変化量）
したがって、変数であるVの値は常数であるCの大きさを解して、Qの値と比例関係にある。以上のことから、容量型電位測定デバイス法では、ミリボルトという絶対的値を示す単位を使用するのではなく、相対的な膜電位の変化としてRelative Voltage Unit（ RVU）を使用する。【００８２】
（実施例７）細胞の導電性ガラスへの付着を確保するための処理方法
この実験では、細胞を導電性ガラス表面に接着させる必要があるときの、接着促進法の検討に関して記述する。
一般に、細胞をガラス表面に付着させ、培養を促進させるための方法としては、ガラス表面をコラーゲンなどの細胞外マトリックスでコートする方法、又は共に負に帯電しているガラス表面と細胞膜脂質との反発を抑えるため、ガラス表面をプラスに帯電させるためにポリ−L−リジン処理をする方法などが必要である。本発明のナノタッチ法では、細胞をコーティングなしの導電性ガラスに直接接着させる必要があるために導電ガラス表面に対して特別な洗浄処理が必要となる。
まず、通常のガラス表面の洗浄には強酸を用いた洗浄や有機溶媒による洗浄が用いられるため、同様に導電性ガラス（FTO、ITO）表面に対して強酸洗浄、有機溶媒洗浄を施した。しかしながら、強酸洗浄、アセトン、 イソプロピルアルコールなどの有機溶媒による洗浄は細胞の導電性ガラスへの接着を促進しなかった。
種々の溶媒を試したところ、最終的に導電性ガラス（FTO、ITO）表面のアルカリ性溶液での洗浄が、もっとも導電性ガラス表面の洗浄に有効であり、再現性よく細胞の接着、培養を可能にすることを確認した。
具体的には、導電性ガラス表面の通常の油汚れをアルカリ性洗剤（＞pH10）で除去すると同様にアルカリ性溶液を導電ガラス表面に塗布し、ガラス表面が水をはじかない事が確認できるまで、ブラシでこするなどの処理を行い洗浄を繰り返し、最後にddH2Oで3回以上洗い、洗剤を除去する方法である。アルカリ性溶液としては、KOH、アルカリ性洗剤などが非常に有効な事が確認された。
この方法は導電性ガラスに限らず、ガラスカバースリップ上での細胞培養全般に有効である。特にSH-SY5Yなどの神経芽細胞の分化誘導を行う場合、iPS心筋細胞を培養する場合など、通常はコラーゲン、ファイブロネクチンなどの細胞外マトリックスによるコーティングが必要であるが、アルカリ性溶液処理はこの場合にも有効である。この方法はHEK細胞、CHO細胞のみならず、従来ガラス表面への接着が困難とされていた細胞株に特に有効であり、NG108-15細胞、SH-SY5Y細胞、iPS心筋細胞などにおいて、その有効性が確認された（data not shown）。【００８３】
（実施例８）レチノイン酸（Retinoic acid：RA）により分化させたSH-SY5Y細胞の活動電位の測定  （図１９）
（７−１）SH-SY5Y細胞のRAによる分化と培養
この実験では、磁石電極にPEIと金コーティング磁気ナノ粒子の混合液を付着させた磁石電極を用い、磁石電極をマニピュレーターに固定し、マニピュレーターにより上方から圧を加えて作製した電極（Handynano電極）を用い、レチノイン酸（RA；フジフィルム、182-01111）により分化させたヒト神経芽細胞株であるSH-SY5Y細胞の細胞内電位を測定する。
具体的には、まずSH-SY5Y細胞は直径12mmの円形カバーガラスに播種し、培養液DMEM:F12=1:1（DMEM(Sigma Aldrich, D5796)、Ham’s F-12(sigma-Aldrich, N4888)）、5%FBS（BioWest社）、NEAA（MEM非必須アミノ酸溶液 (100X)(Sigma-Aldrich, M7145)）を用いて培養した。播種翌日から10μM RAを10日間作用させ、SH-SY5Y細胞を神経様細胞に分化させた。
上記カバーガラス表面は、あらかじめ（実施例６）に記載のように、アルカリ性洗剤による洗浄を行っている。アルカリ溶液洗浄法によれば、ガラス面に接着しにくい細胞であるヒト神経芽細胞株であっても、通常培養に必要とされるコラーゲンなどの細胞外マトリックスによるガラス面の表面処理なしで接着し、培養可能となる。【００８４】
（７−２）Veratridineで活性化された分化SH-SY5Y細胞の細胞内電位の測定
分化したSH-SY5Y細胞を培養した円形カバーガラスを鉄板上に配置し、（１−３）で作製した先端にPEI-金―コーティングナノ粒子混合液を磁気により付着した磁石電極をマニピュレーターにより押し付け（Handynano電極）細胞内記録電極として用い、Veratridineで活性化した分化SH-SY5Y細胞の細胞内電位を測定した。
具体的には、このHandynano法を用いて、分化したSH-SY5Y細胞上に、培養ディッシュ上方のマニピュレーターを用いて、固定し、適宜圧（300g前後の）を加えた。細胞外液に投与したVeratridineにより、SH-SY5Y細胞が活性化され、それによって発生した活動電位を細胞内電位変化として測定した（図１９）。
その結果、SH-SY5Y分化細胞が神経様細胞に分化し、Veratridine刺激への応答性を獲得していることを、容量型電位測定法を用いて検証することができた。【００８５】
（実施例８）nanoCharge多電極を用いた分化させた神経細胞株での細胞内電位の測定
（８−１）MagEleを用いた多電極の作製
MagEleを用いて多電極を作製する場合、固定磁石と電極磁石との２種類の磁石を使用する。固定電極はパラフィルムなどの非伝導性材料で包み、2〜4枚のアルミフォイルなどによる短冊様の電極を貼り付ける。
このアルミフォイル電極を下方から電極磁石を磁力で固定し、電極磁石の細胞に面する以外の側面はパラフィルムなどの非伝導性材料で包み絶縁し、固定磁石上方にClip on groundを装着し、マニピュレーター固定用のホルダーを装着する（図２０）。【００８６】
（８−２）導電性ガラス電極を用いたnanoCharge多電極の作製（１）
MagEleに代えて、導電性ガラス電極を用いて多電極記録を作製した。
通常の容量型電位測定デバイス法では細胞を培養する導電性表面と、その導電性ガラス下方面に設置したアルミフォイルなどによる導電性領域の間に形成されたコンデンサーをチャージアンプのディテクターとして、使用する。多電極構造においても、同様に作製した複数個のアルミフォイル電極を複数のコンデンサーとし、0.7〜1mmの厚さのITO導電ガラスを用いてnanoCharge多電極を製造した（図２１Ａ）。なお、導電ガラス（ITO）上にはプラスチックリングを接着剤を用いて固定し、培養液で満たす事により、被検細胞の培養を可能にした（図２１Ａ、Ｂ）。
ここで、導電性ガラスの厚さは記録信号の大きさ、横への拡散に影響するので、導電性ガラスの強度が確保できれば、できる限り薄いことが望ましい。【００８７】
（８−３）導電性ガラス電極を用いたnanoCharge多電極の作製（２）
容量型電位測定デバイス法では、表面の導電ガラスと下方の導電性金属箔によりコンデンサーを形成し、その電極間の電位差を測定するため、多電極を用いる場合、ひとつの導電ガラス電極と複数の下方電極と（＋）（−）電極ペアを形成することになり、記録のベースラインが不安定になる傾向にある。
その改善方法のひとつとして、ひとつのガラス上に複数の導電性ガラスを作成する。具体的には導電性の持続性を遮断するため、導電ガラスに傷をつける。例えば十文字に傷をつける事により4枚の導電性ガラス電極を一枚のガラスの上に形成する事が出来る。このような複数の導電性ガラスが、ひとつの導電ガラスを形成することができる（図２１Ｂ）。そのことで下方電極に対応する導電性ガラスと電極ペアが各々の形成されるため、ベースラインが安定し、安定な記録信号を得ることができる。本実施例では複数の導電性ガラスを一枚のガラス上に形成する事を導電性ガラスを傷つける事により達成したが、ITO,FTOコーティングのパターンを形成する事により達成する事によりMEA(MultiElectrode Array)への拡張も可能である。。【００８８】
（８−４）Forskolin処理により分化されたNG108-15細胞の活動電位の記録
前記（８−１）で作製した3電極MagEleを用いて、2% FBS, 10μM Forskolin処理により分化されたNG108-15神経細胞から記録を行った（図２２）。
3チャネル各々が異なる活動パターンを示す事から、 3チャネル各々が異なる細胞群からの信号を記録している事がわかる。10uM Achを作用させる事により、全てのチャネルで神経細胞の活性が上昇する事が観察された。【００８９】
（実施例９）2電極MagEleによるiPS由来心筋細胞における細胞内電位の測定
iPS由来の凍結心筋細胞を（株）マイオリッジから購入し、（株）マイオリッジ社のマニュアルに従い培養した。細胞内電位の測定に先立ち、顕微鏡下で観察し、少なくとも一部の細胞は定期的に収縮していることが確認された。
前記（８−１）に従って作製した2電極MagEleを用いてiPS由来心筋細胞の細胞内電位を記録した。チャネル1と2では著しく異なる応答が記録された。チャネル2は約0.5Hz程度で自発性活動電位が記録された（図２３、下図）。【００９０】
（実施例１０）3電極の導電性ガラス電極を用いたNav1.5, Kir2.1発現HEK細胞株における細胞内電位の測定
前記（８−２）で作製した3電極の導電性ガラス電極を3電極容量型電位測定デバイスとして用い、ITO導電性ガラス上に培養したNav1.5, Kir2.1を発現するHEK細胞株における細胞内記録を行った（図２４）。なお、ここで用いられたNav1.5, Kir2.1発現HEK細胞株はITO導電性ガラス上で培養され、導電性ナノ粒子（Gold coated Magnetic Nanoparticle）を、PEIを用いて細胞に導入した。【００９１】
（実施例１１）リング状磁石により自立したMagEle電極を用いた細胞内電位の測定
（１１−１）下方向からリング状磁石の中心を通る光刺激による神経芽細胞内の電位変化の測定（図２６左）
細胞内電位の測定の際に、培養細胞の上方で導電性ナノ粒子を吸着して細胞を貫通させているMagEle電極を用いる場合は、通常、培養細胞の下方に設置された磁性金属（磁性鉄板）によりMagEleを自立させるが、磁性金属の代わりに、リング型磁石を配置することにより、同様にMagEleを固定自立させる事ができ、かつMagEleの下方に存在する被検培養細胞をリング型磁石の中心より直視する経路が確保できるため、細胞に直接光を投射することが可能になる（図２５）。
当該光投射経路を利用して、光刺激による細胞内電位変化の測定が可能となる。
具体的には、分化した神経芽細胞（NG180-15, またはSH-SY5Y細胞）にChRWD（脱感作を弱めたChannelrhodopsine 1と2のキメラ、Wang et al.）の発現ベクターを導入し、ChRWDを発現させて、青光刺激感受性とした細胞株を用いる。青光刺激はLED Driver, 470 nm M470F1（Thorlabs）を用いる。
神経芽細胞は12mm直径のカバーガラス上で培養し、NG180-15細胞は2％FBS、10uM Forskolin 処理を、またはSH-SY5Y細胞は10uM Retinoic acid処理を行い一週間から10日間培養し分化させる。青光刺激感受性の神経芽細胞株を容器に設置し、上方から、磁力により吸着させたPEI混合した導電性ナノ粒子を持つ磁石電極を配置し、容器の下方に配置したリング型の磁石により、磁石電極を直立固定する。
ここで、リング型の磁石は十分の内径がある必要があり、青光線の照射を妨げてはならない。LEDケーブルをリング型の磁石内に挿入する場合は、使用する青色LEDケーブル直径が2mmなので、内径は最低2mm以上ある必要がある。同時にリング型の磁石は上記の磁石電極を支える必要があるため、内径は大きすぎてはいけない。十分な磁力による固定を確保するためには、磁石電極とリング型の磁石がしっかりと重なり合う領域を確保する必要がある。即ち、もし、磁石電極の直径が6mmであれば、リング型磁石の内径は4mm以内であることが望ましい。
分化した青光刺激感受性の神経芽細胞株に、青光刺激を行い、細胞内電位の変化を観測する。【００９２】
（１１−２）細胞内電位及び細胞内カルシウム動態の同時記録（図２６右）
リング型磁石と磁石電極を用いた培養細胞の細胞内電位記録法において、蛍光試薬を用いる細胞内カルシウム測定も同時に行う。その際、細胞の上方に磁石電極が設置されるため、倒立顕微鏡を使用する。細胞容器と下方に位置するレンズ間の距離が限定されているため、リング型磁石の厚さは極力抑える事（2mm以下）が重要である。
次に、492nm光を対物レンズを通して、磁石電極に直角に照射するため、直接反射によるエラー（Artifact）を減少させるため、磁石電極の表面を黒色の導電性塗料で処理しておく。細胞膜表面を貫通している金コート磁性ナノ粒子（NanoImmunotech）のPeak SPR 波長は539 ± 5nmなので、干渉を避けるため、細胞内カルシウム測定蛍光試薬はCal-590 AM（Ex/Em (nm) 573/587、 AAT Bioquest）を用いる。
具体的には、50μgのCal-590を10μl のDMSOに溶解し、その1μlのCal-590を100μlのアッセイバッファーと1mL HEPESに混合した溶液を作成する。
この溶液を培養細胞に作用させ、37℃で30分から1時間保持し、室温にて実験を行う。
他に、この方法を応用し、細胞内カルシウム動態に加え、膜電位の変化なども細胞内電位と同時並行して行うことができる。
【産業上の利用可能性】
【００９３】
本発明は、簡便かつ正確に細胞内電位を測定可能であるため、創薬スクリーニングに特に有用である。培養心筋細胞のみならず、培養神経細胞などにおいて、in vitroにおける電気生理学的研究に対して飛躍的な貢献をすることが予測される。
また、本発明の電極は、直接生体の組織、臓器などに接触させる端子（「in vivo prep」）として働かせることができるため、臨床への応用が期待できる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１Ａ】
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【図２１Ｂ】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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