(57)【要約】  本発明の方法は、水溶性の中性ポリマーが表面に吸着した酸化アルミニウムの担体に核酸を吸着させた後、核酸を溶出させることによって核酸を回収する方法であって、核酸が吸着した担体から核酸を溶出させる前の工程として、１ｍＭ以上４０ｍＭ以下のキレート剤を含む溶液を接触させる工程を含む方法である。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
水溶性の中性ポリマーが表面に吸着した酸化アルミニウムの担体を用いて、核酸を含む試料から核酸を回収する方法であって、以下の工程ａ〜工程ｃ：
工程ａ：前記担体と核酸を含む試料を接触させ、前記担体に核酸を吸着させる工程、
工程ｂ：前記核酸が吸着した担体に、１ｍＭ以上４０ｍＭ以下のキレート剤を含む溶液Ａを接触させる工程、
工程ｃ：工程ｂの後、前記核酸が吸着した担体に５０ｍＭ以上のキレート剤を含む溶液Ｂを接触させて核酸を溶出する工程、
を含む、核酸の回収方法。
【請求項２】
前記キレート剤が、カルボン酸系キレート剤、リン酸系キレート剤またはホスホン酸系キレート剤である請求項１に記載の核酸の回収方法。
【請求項３】
前記カルボン酸系キレート剤が、クエン酸、ニトリロ三酢酸、エチレンジアミン四酢酸、グリコールエーテルジアミン四酢酸および／またはそれらの塩である請求項２に記載の核酸の回収方法。
【請求項４】
前記リン酸系キレート剤が、リン酸、ポリリン酸、メタリン酸および／またはそれらの塩である請求項２に記載の核酸の回収方法。
【請求項５】
前記ホスホン酸系キレート剤が、１−ヒドロキシエタン−１，１−ジホスホン酸、グリシン−Ｎ，Ｎ−ビス（メチレンホスホン酸）、ニトリロトリス（メチレンホスホン酸）、２−ホスホノブタン−１，２，４−トリカルボン酸、エチレンジアミンテトラメチレンホスホン酸および／またはそれらの塩である請求項２に記載の核酸の回収方法。
【請求項６】
前記担体は、カラムに収容されて用いられる、請求項１から５のいずれかに記載の核酸の回収方法。
【請求項７】
前記水溶性の中性ポリマーが、ｐＨ７の溶液中で−１０ｍＶ以上＋１０ｍＶ以下のゼータ電位を有するポリマーであることを特徴とする請求項１から６のいずれかに記載の核酸の回収方法。
【請求項８】
前記水溶性の中性ポリマーが、ポリエチレングリコール、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリ（２−エチル−２−オキサゾリン）又は（ヒドロキシプロピル）メチルセルロースであることを特徴とする請求項１から７のいずれかに記載の核酸の回収方法。
【請求項９】
水溶性の中性ポリマーが表面に吸着した酸化アルミニウムの担体と、１ｍＭ以上４０ｍＭ以下のキレート剤を含む溶液Ａと、５０ｍＭ以上のキレート剤を含む溶液Ｂとを備えることを特徴とする核酸回収用のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、水溶性の中性ポリマーが表面に吸着した酸化アルミニウムの担体により、核酸を含む試料から高収量に核酸を回収する方法及び核酸回収用のキットに関する。
【背景技術】
【０００２】
核酸を用いた実験技術の発展により新規な遺伝子の探索やその解析が可能となった。医療現場では、遺伝子解析を利用したスクリーニング検査や臨床検査などが行われており、がんなどの疾患の特定や、病原体の感染の特定などに利用されている。このような遺伝子解析を利用した検査は、血液や尿などの体液試料から回収した遺伝子を利用するため、低侵襲な検査としても期待されている。【０００３】
このような体液中の遺伝子解析の標的としては、ゲノムのような長鎖核酸ばかりではなく、１０００塩基以下の短鎖核酸も注目されている。近年発見されたｍｉＲＮＡは１８塩基以上２５塩基以下の１本鎖ＲＮＡであり、６０塩基以上９０塩基以下のｐｒｅ−ｍｉＲＮＡから生合成される。これらの核酸は、タンパク質の合成や遺伝子の発現を調節する機能を持っていることから疾患と関連があるとされ、特にがんの早期発見を可能にする遺伝子解析の標的として注目されている。また、近年注目されるセルフリーＤＮＡは、ヒストン１単位に相当する１６６塩基の１〜４倍程度の長さを有する２本鎖ＤＮＡであり、細胞が死滅し、分解する過程で生成する。セルフリーＤＮＡの中でも特にがん細胞由来のものはｃｔＤＮＡと呼ばれ、これらはがん特有の遺伝子変異を有していることから、治療薬に対する効果の有無を判定したり、がんの有無を検査したりする標的として注目されている。【０００４】
特許文献１には、水溶性の中性ポリマーが吸着した酸化アルミニウムの担体を用いて、核酸を含む試料から核酸を回収する方法が開示されている。具体的には、後述する図２に示すように、担体に核酸を吸着させ、核酸が吸着した担体に対して溶出液を加えて核酸を溶出することによって、核酸を回収している。【０００５】
近年では、解析の対象となる核酸は多岐にわたり、体液中に極微量しか存在しない核酸についても解析の対象となる場合がある。よって、従来よりも高い収率で核酸を回収する方法が求められている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】国際公開第２０１６／１５２７６３号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
特許文献１に記載された核酸の回収方法は、比較的高い収量で核酸を回収できる方法であるとされている点で注目されるが、さらに高い収量で核酸を回収することが求められている。【０００８】
本発明は、上記課題に鑑みてなされたものであり、特に体液中に極微量にしか存在していない核酸も高い収率で回収することを可能とするような、核酸を含む試料から核酸を高い収率で回収する方法及び核酸回収用のキットを提供するものである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明者らは、特許文献１に開示されている核酸を含む試料から核酸を回収する方法を基に、より高い収量で核酸を回収可能な方法を検討した。本発明者らは、核酸が吸着した担体に溶出液を添加する前の工程として、核酸が吸着した担体を、１ｍＭ以上４０ｍＭ以下のキレート剤を含む溶液と接触させる工程を追加することによって、核酸の回収量がさらに向上することを見出し、本発明を完成させた。【００１０】
本発明は以下のとおりである。
（１）水溶性の中性ポリマーが表面に吸着した酸化アルミニウムの担体を用いて、核酸を含む試料から核酸を回収する方法であって、以下の工程ａ〜工程ｃ：
工程ａ：前記担体と核酸を含む試料を接触させ、前記担体に核酸を吸着させる工程、
工程ｂ：前記核酸が吸着した担体に、１ｍＭ以上４０ｍＭ以下のキレート剤を含む溶液Ａを接触させる工程、
工程ｃ：工程ｂの後、前記核酸が吸着した担体に５０ｍＭ以上のキレート剤を含む溶液Ｂを接触させて核酸を溶出する工程、
を含む、核酸の回収方法。
（２）前記キレート剤が、カルボン酸系キレート剤、リン酸系キレート剤またはホスホン酸系キレート剤である（１）に記載の核酸の回収方法。
（３）前記カルボン酸系キレート剤が、クエン酸、ニトリロ三酢酸、エチレンジアミン四酢酸、グリコールエーテルジアミン四酢酸および／またはそれらの塩である（２）に記載の核酸の回収方法。
（４）前記リン酸系キレート剤が、リン酸、ポリリン酸、メタリン酸および／またはそれらの塩である（２）に記載の核酸の回収方法。
（５）前記ホスホン酸系キレート剤が、１−ヒドロキシエタン−１，１−ジホスホン酸、グリシン−Ｎ，Ｎ−ビス（メチレンホスホン酸）、ニトリロトリス（メチレンホスホン酸）、２−ホスホノブタン−１，２，４−トリカルボン酸、エチレンジアミンテトラメチレンホスホン酸および／またはそれらの塩である（２）に記載の核酸の回収方法。
（６）前記担体は、カラムに収容されて用いられる、（１）から（５）のいずれかに記載の核酸の回収方法。
（７）前記水溶性の中性ポリマーが、ｐＨ７の溶液中で−１０ｍＶ以上＋１０ｍＶ以下のゼータ電位を有するポリマーであることを特徴とする（１）から（６）のいずれかに記載の核酸の回収方法。
（８）前記水溶性の中性ポリマーが、ポリエチレングリコール、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリ（２−エチル−２−オキサゾリン）又はヒドロキシプロピルメチルセルロースであることを特徴とする（１）から（７）のいずれかに記載の核酸の回収方法。
（９）水溶性の中性ポリマーが表面に吸着した酸化アルミニウムの担体と、１ｍＭ以上４０ｍＭ以下のキレート剤を含む溶液Ａと、５０ｍＭ以上のキレート剤を含む溶液Ｂとを備えることを特徴とする核酸回収用のキット。
【発明の効果】
【００１１】
本発明によれば、従来方法よりも高い収率で核酸を回収することが可能となるため、体液中に極微量存在する核酸の回収や、新規な核酸についての回収が可能になると期待される。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】図１は、本発明の一実施の形態にかかる核酸の回収方法の各工程の概要を示すフローチャートである。
【図２】図２は、特許文献１に記載の核酸の回収方法の一例を示すフローチャートである。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本発明は、水溶性の中性ポリマーが表面に吸着した酸化アルミニウムの担体を用いて、核酸を含む試料から核酸を回収する方法であって、以下の工程ａ〜工程ｃ：
工程ａ：前記担体に核酸を含む試料を接触させ、前記担体に核酸を吸着させる工程、
工程ｂ：前記核酸が吸着した担体に、１ｍＭ以上４０ｍＭ以下のキレート剤を含む溶液Ａ（第１溶液）を接触させる工程、
工程ｃ：工程ｂの後、前記核酸が吸着した担体に５０ｍＭ以上のキレート剤を含む溶液Ｂ（第２溶液）を接触させて核酸を溶出する工程、
を含む、核酸の回収方法である。
ここで、工程ａと工程ｂとの間、及び、工程ｂと工程ｃとの間には、それぞれ、処理後の産物を洗浄する洗浄工程が実施される。
【００１４】
本発明に係る核酸の回収方法の具体的な処理工程について、図１を参照して説明する。図１は、本発明の一実施の形態にかかる核酸の回収方法の各工程の概要を示すフローチャートである。
まず、担体に核酸を含む試料を接触させ、担体に核酸を吸着させる（工程ａ：ステップＳ１０１）。
【００１５】
担体に試料を接触させた後、洗浄処理を実施して、核酸以外の試料由来物等を担体から除去する（第１洗浄工程：ステップＳ１０２）。
【００１６】
第１洗浄工程後、核酸が吸着した担体に、１ｍＭ以上４０ｍＭ以下のキレート剤を含む溶液Ａを接触させる（工程ｂ：ステップＳ１０３）。
【００１７】
担体に試料を接触させた後、洗浄処理を実施して、接触処理後のキレート剤等を除去する（第２洗浄工程：ステップＳ１０４）。
【００１８】
第２洗浄工程後、核酸が吸着した担体に５０ｍＭ以上のキレート剤を含む溶液Ｂ（第２溶液）を接触させて核酸を溶出する（工程ｃ：ステップＳ１０５）。
【００１９】
その後、担体に吸着した核酸の回収量を測定する（ステップＳ１０６）。ステップＳ１０６では、核酸の溶出量を算出し、これを回収量とする。
【００２０】
本明細書中では、水溶性の中性ポリマーが表面に吸着した酸化アルミニウムの担体を本発明の担体と記載する場合がある。
【００２１】
一方、特許文献１の記載の核酸の回収方法は、本発明の工程ａ、工程ｃに対応する工程ａ´、工程ｃ´を基本工程とする方法である。工程ａ´、工程ｃ´は以下のとおりである。
工程ａ´：水溶性の中性ポリマーが表面に吸着した酸化アルミニウムの担体と核酸を含む溶液を混合し、担体に核酸を吸着させる工程
工程ｃ´：前記核酸が吸着した担体に、溶出液を加えて核酸を回収する工程
ここで、工程ａ´と工程ｃ´との間には、処理後の化合物を洗浄する洗浄工程が実施される。
【００２２】
従来の核酸回収方法の具体的な処理工程について、図２を参照して説明する。図２は、特許文献１に記載の核酸の回収方法の一例を示すフローチャートである。
まず、水溶性の中性ポリマーが表面に吸着した酸化アルミニウムの担体と核酸を含む溶液を混合し、担体に核酸を吸着させる（工程ａ´：ステップＳ２０１）。
【００２３】
担体と溶液とを混合した後、洗浄処理を実施して、核酸以外の試料由来物等を担体から除去する（洗浄工程：ステップＳ２０２）。
【００２４】
洗浄工程後、核酸が吸着した担体に、溶出液を加えて核酸を回収する（工程ｃ´：ステップＳ２０３）。
【００２５】
その後、担体に吸着した核酸の回収量を測定する（ステップＳ２０４）。ステップＳ２０４は、例えばステップＳ１０６と同様にして、核酸の溶出量を算出する。
【００２６】
本発明者らは、図１に示すとおり、工程ｃにおいて、核酸を溶出させる溶出液として、５０ｍＭ以上のキレート剤を含む溶液Ｂを添加することを特定した。さらに、工程ｃの前工程として、核酸が吸着した担体に、１ｍＭ以上４０ｍＭ以下のキレート剤を含む溶液Ａを接触させ、当該溶液Ａを除去する工程ｂを追加することによって、核酸を高収率に回収できることを見出した。以下、本発明を工程毎に説明する。
【００２７】
工程ａは、本発明の担体に核酸を含む試料を接触させ、本発明の担体に核酸を吸着させる工程である。
【００２８】
本発明の担体に核酸を含む試料を接触させる方法は特に限定されないが、本発明の担体をカラムに収容して核酸を含む試料を通液させる方法、ピペッター、ミキサーまたはボルテックスなどを用いて混合する方法、転倒混合する方法などが挙げられる。これらのうち、本発明の担体をカラムに収容して核酸を含む試料を通液させる方法が好ましい。
【００２９】
本発明の担体が収容されたカラムの形状は特に限定されず、本発明の担体の粒径より小さな孔径を持つ限外ろ過膜やメッシュの上に本発明の担体が収容されたカラムを用いることができる。例えば、メルク株式会社製の「ウルトラフリー」（登録商標）やＰａｌｌ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ製の「ナノセップ」（登録商標）などの遠心ろ過キットに本発明の担体を収容して、本発明の担体が収容されたカラムとして用いることもできる。
【００３０】
通液の方法は、ポンプや遠心分離機などを用いてカラム内を陽圧の状態にして液体を通過させる方法、ポンプなどを利用せずに重力で液体を通過させる方法、吸引ポンプなどでカラムの排出側を陰圧の状態にして通液させる方法などが挙げられ、いずれの方法でもよい。通液にかかる時間は、９０分以内が好ましい。
【００３１】
工程ａの操作の後に、以下のような洗浄処理行う。これは、核酸を含む試料が生体試料である場合、工程ａの後に、本発明の担体の表面に目的となる核酸以外の試料由来物が吸着している可能性があるためである。核酸以外の試料由来物を洗浄したり分解したりすることで、より高純度の核酸を回収することができる。具体的には、非特異的に吸着した化合物を除去するために水で洗浄する、非特異的に吸着したタンパク質を除去するために界面活性剤で洗浄する、イオンや低分子化合物を除去するために非イオン性の界面活性剤を含む溶液で洗浄する、非特異的に吸着した疎水性化合物を除去するために有機溶媒で洗浄する、非特異的に吸着したタンパク質を分解するためにタンパク質分解酵素を添加する、ＤＮＡのみを単離するためにＲＮＡ分解酵素を添加する及びＲＮＡのみを単離するためにＤＮＡ分解酵素を添加する、などの様々な処理をすることができる。本洗浄処理は図１中で第１洗浄工程として示す。この第１洗浄工程は、必要に応じて実施すればよく、不要な場合は、上記ステップＳ１０１の後に、ステップＳ１０３を実施する。
【００３２】
工程ｂは、工程ａにおいて核酸が吸着した担体に、１ｍＭ以上４０ｍＭ以下のキレート剤を含む溶液Ａを接触させる工程である。
【００３３】
本発明で用いるキレート剤は、複数の配位座を持つ配位子を持っており、金属イオンと結合し、錯体を形成する物質を用いることができる物質である。
【００３４】
キレート剤はキレート剤が有するイオン性官能基で分類され、具体的には、アミノカルボン酸系、ヒドロキシカルボン酸系、ヒドロキシアミノカルボン酸系、エーテルカルボン酸系などのカルボン酸系、リン酸系、エーテル系、アミン系のキレート剤などに分類される。これらの中でもカルボン酸系またはリン酸系のキレート剤が好ましい。
【００３５】
アミノカルボン酸系のキレート剤の具体例としては、ニトリロ三酢酸（ＮＴＡ）、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、グリコールエーテルジアミン四酢酸（ＥＧＴＡ）、ジエチレントリアミノ五酢酸（ＤＴＰＡ）および／またはそれらの塩などが挙げられる。ヒドロキシカルボン酸系キレート剤の具体例としては、シュウ酸、クエン酸、グルコン酸、酒石酸および／またはそれらの塩などが挙げられる。ヒドロキシアミノカルボン酸系のキレート剤の具体例としては、ジヒドロキシエチルグリシン（ＤＥＧ）、Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）イミノ二酢酸（ＨＥＩＤＡ）、ヒドロキシエチルエチレンジアミン四酢酸（ＨＥＤＴＡ）および／またはそれらの塩などが挙げられる。エーテルカルボン酸系のキレート剤の具体例としては、カルボキシメチルタルトロン酸（ＣＭＴ）、カルボキシメチルオキシコハク酸（ＣＭＯＳ）および／またはそれらの塩が挙げられる。これらの中でもクエン酸、ニトリロ三酢酸、エチレンジアミン四酢酸、グリコールエーテルジアミン四酢酸および／またはそれらの塩が好ましい。
【００３６】
リン酸系のキレート剤の具体例は、リン酸、ポリリン酸、メタリン酸、フィチン酸および／またはそれらの塩が挙げられる。これらの中でもリン酸、ポリリン酸、メタリン酸および／またはそれらの塩が好ましい。ポリリン酸は、（ＰｎＯ３ｎ＋１）（ｎ＋２）−（ｎ≧２）の一般式で示される直鎖上の縮合リン酸であり、特にｎ＝２の場合にはピロリン酸、ｎ＝３の場合にはトリリン酸とも呼ばれる。またｎの値が大きくなると長い「−Ｏ−Ｐ−Ｏ−Ｐ−Ｏ−・・・」の構造が螺旋状に連なった陰イオン（ＰｎＯ３ｎ）ｎ−をもち、メタリン酸と呼ばれる。メタリン酸は環状構造をとる場合もある。本発明では、いずれの構造のポリリン酸、メタリン酸および／またはそれらの塩もリン酸系キレート剤として好ましく用いることが可能であり、これらの混合物も好ましく利用することができる。
【００３７】
ホスホン酸系のキレート剤の具体例は、１−ヒドロキシエタン−１，１−ジホスホン酸（ＨＥＤＰ）、グリシン−Ｎ，Ｎ−ビス（メチレンホスホン酸）（ＧＭＰ）、ニトリロトリス（メチレンホスホン酸）（ＮＴＭＰ）、２−ホスホノブタン−１，２，４−トリカルボン酸（ＰＢＴＣ）、エチレンジアミンテトラメチレンホスホン酸（ＥＤＴＭＰ）および／またはそれらの塩が挙げられる。
【００３８】
溶液Ａは、上記キレート剤のうち、１種類を使用してもよく、２種類以上を混合して使ってもよい。２種類のキレート剤を混合して用いる場合には、リン酸とポリリン酸および／またはこれらの塩、リン酸とメタリン酸および／またはこれらの塩、リン酸とフィチン酸および／またはこれらの塩を混合して用いることが好ましい。
【００３９】
溶液Ａは、１ｍＭ以上４０ｍＭ以下の濃度となるよう上記キレート剤を溶解させた溶液を用いる。より好ましい濃度は、カルボン酸系のキレート剤であれば５ｍＭ以上２５ｍＭ以下であり、リン酸系であれば１ｍＭ以上１０ｍＭ以下である。溶媒には、水、中性からアルカリ性の水溶液や緩衝液を用いることができる。また、カルボン酸系やリン酸系のキレート剤のフリー体を中和して塩を形成させることにより、キレート剤を含む溶液を調製することもできる。例えば、キレート剤としてクエン酸を含む溶液は、クエン酸を水、水酸化ナトリウム水溶液やＨＥＰＥＳ緩衝液などに溶解させることによって調製することができる。また、クエン酸のナトリウム塩を水、塩酸水溶液やＨＥＰＥＳ緩衝液などに溶解させることによって調製することもできる。クエン酸水溶液とクエン酸ナトリウムの水溶液を混合して調製することもできる。
【００４０】
溶液ＡのｐＨはｐＨ４以上ｐＨ９以下が好ましく、より好ましくはｐＨ５以上ｐＨ８以下である。
【００４１】
溶液Ａは用事調製したものを使用してもよく、事前に調製しておいたものを使用してもよい。
【００４２】
工程ｂの核酸が吸着した担体に溶液Ａを接触させ、当該溶液Ａを除去する工程のうち、担体に溶液Ａを接触させる方法は、工程ａと同様の方法で行うことができる。工程ａで、本発明の担体を収容したカラムを用いて、本発明の担体に核酸を吸着させた場合には、核酸が吸着した担体が収容されたカラムに、溶液Ａを通液させれば、溶液Ａを担体に接触させることと、溶液Ａを担体から除去することが一つの操作で行えるため好ましい。カラムを利用する場合、通液時間は１０分以内が好ましい。また、ピペッター、ミキサー、ボルテックスなどを用いて混合する方法や、転倒混合する方法によって、核酸が吸着した担体に溶液Ａを接触させる場合には、混合して得られた混合物を遠心分離し、核酸が吸着した担体を沈殿させ、上清を除く方法が挙げられる。核酸が吸着した担体の比重は水より重いため、遠心操作により容易に沈殿させることができる。遠心分離の条件は、６０００Ｇで１分間処理すればよく、１００００Ｇで１分間処理することがより好ましい。
【００４３】
工程ｂの操作の後に、上記の洗浄工程１と同様の方法で洗浄処理を行う。これは、工程ｂの際に使用したキレート剤が系中に残存していると、核酸回収後の溶液中のキレート剤濃度が添加濃度と変わってしまい、その後の測定系に影響する可能性があるためである。本洗浄処理は、図１中で第２洗浄工程として示す。この第２洗浄工程は、必要に応じて実施すればよく、不要な場合は、上記ステップＳ１０３の後に、ステップＳ１０５を実施する。
【００４４】
工程ｃは、工程ｂの後、前記核酸が吸着した担体に５０ｍＭ以上のキレート剤を含む溶液Ｂを接触させて核酸を溶出する工程である。本発明において、溶液Ｂは核酸が吸着した担体から核酸を溶出させる溶出液にあたる。
【００４５】
溶液Ｂは、キレート剤の濃度を５０ｍＭ以上に調整する以外は、上記の溶液Ａと同様の方法で調製することができる。
【００４６】
溶液ＢのｐＨはｐＨ４以上ｐＨ９以下が好ましく、より好ましくはｐＨ５以上ｐＨ８以下である。
【００４７】
溶液Ａと溶液Ｂは、同じキレート剤を使用してもよく、異なるキレート剤を使用してもよい。
【００４８】
工程ｃの核酸が吸着した担体に溶液Ｂを接触させて核酸を溶出させる方法は、工程ｂにおいて、担体に溶液Ａを接触させ、溶液Ａを除去する方法と同様の方法を用いることができる。工程ｂで、本発明の担体を収容したカラムを用いて、溶液Ａを通液させた場合、溶液Ａを通液させた後、溶液Ｂを通液させれば、溶液Ｂを担体に接触させることと、核酸を溶出させた液を担体から分離することが１つの操作で行えるため好ましい。このとき、溶液Ｂを担体に接触させる際に、静置や加温により溶出性を高めることもできる。静置する場合、２時間以内であることが好ましく、加温する場合、７０℃以下であることが好ましく、５０℃以下であることがより好ましい。核酸を溶出させた液を担体から分離するときの通液時間は１０分以内が好ましい。
【００４９】
また、工程ｃで核酸が吸着した担体に、溶液Ｂを接触させて得られる混合物から、核酸が溶出した溶液を分離して核酸を回収する際にも、工程ｂにおける溶液Ａを除去する方法と同様の方法を用いることができる。
【００５０】
回収された核酸は、必要に応じて、化学修飾を行うことができる。化学修飾には、核酸の末端に対する蛍光色素修飾、消光剤修飾、ビオチン修飾、アミノ化、カルボキシル化、マレインイミド化、スクシンイミド化、リン酸化及び脱リン酸化などが挙げられ、他にはインターカレーターによる染色が挙げられる。これらの修飾は化学反応により導入されてもよく、酵素反応により導入されてもよい。上記定量の前にこれらの修飾基を導入し、回収された核酸自身を定量するのではなく、化学修飾を経て導入された修飾基を定量することで、間接的に核酸を定量することができる。本発明により核酸が回収され、特に短鎖核酸においては高収率に回収されるため、上記定量において高感度に定量することが可能となる。
【００５１】
本発明の担体は、酸化アルミニウムの表面に水溶性の中性ポリマーを吸着させることにより作製する。ポリマーによる表面の被覆率は、７％以上が好ましく、より好ましくは１０％以上、さらに好ましくは２０％以上、特に好ましくは３０％以上、最も好ましくは４０％以上である。また、水溶性の中性ポリマーは均一の厚さで吸着していなくてもよい。
【００５２】
本発明の担体における、ポリマーによるアルミナの被覆率は、表面電位顕微鏡（別名ケルビンプローブフォース顕微鏡；ＫＦＭ）によって取得した電位分布図を解析することで算出する。表面電位顕微鏡は例えば、Ｂｒｕｋｅｒ  ＡＸＳ社のＮａｎｏＳｃｏｐｅ  Ｉｖａ  ＡＦＭ  Ｄｉｍｅｎｓｉｏｎ  ３１００  ステージＡＦＭシステム等が利用できる。
【００５３】
表面電位顕微鏡から表面被覆率を算出するにあたり、測定の視野スケールは、０．５μｍ×１μｍの範囲で行う。表面被覆率の算出方法は、まず酸化アルミニウムの表面電位画像を取得し視野内の平均電位を求める。次に水溶性の中性ポリマーの表面電位画像を取得し視野内の平均電位を求める。そして、水溶性の中性ポリマーが吸着した酸化アルミニウムの表面電位画像を取得し視野内の平均電位を求める。酸化アルミニウムのみの被覆率を０％、水溶性の中性ポリマーのみの被覆率を１００％とし、水溶性の中性ポリマーが吸着した酸化アルミニウムの平均電位と水溶性の中性ポリマーの平均電位の比をとることで、水溶性の中性ポリマーが吸着した酸化アルミニウムの表面被覆率を算出する。表面被覆率を求めるにあたり、使用する視野内の平均電位は、本発明の担体の粒子をランダムに３つ選んで、それぞれの測定値の平均値を使用する。
【００５４】
また、本発明では、表面被覆率を算出する際の画像解析ソフトとして、Ａｄｏｂｅ社のＰｈｏｔｏｓｈｏｐを使用できる。この場合、画像解析にあたって、酸化アルミニウムの表面電位の平均値をスケール下端、水溶性の中性ポリマーの表面電位の平均値をスケール上端とし、下端の色を黒（８ｂｉｔ、ＲＧＢ値０）、上端の色を赤（Ｒ値２５５）、または緑（Ｇ値２５５）、または青（Ｂ値２５５）などに設定する。設定したスケールで水溶性の中性ポリマーが吸着した酸化アルミニウムの表面電位画像を表示し、Ｒ値、またはＧ値、またはＢ値のいずれかの値を２５５で割り、その比を表面被覆率とする。
【００５５】
水溶性の中性ポリマーを表面に吸着させる前段階として、酸化アルミニウムを水やエタノールなどの溶液で予め洗浄し、表面に吸着している不純物を除いておいてもよく、本洗浄操作を省略してもよい。
【００５６】
水溶性の中性ポリマーを酸化アルミニウムの表面に吸着させる方法は、例えば、水溶性の中性ポリマーを溶解させて水溶性の中性ポリマー溶液を調製し、酸化アルミニウムに接触させる方法が挙げられる。具体的には、水溶性の中性ポリマー溶液に酸化アルミニウムを浸漬させたり、水溶性の中性ポリマー溶液を酸化アルミニウムに滴下したり、水溶性の中性ポリマー溶液を酸化アルミニウムに塗布したり、水溶性の中性ポリマー溶液を霧状にして酸化アルミニウムに吹き付けたりすることができる。
【００５７】
水溶性の中性ポリマー溶液に、酸化アルミニウムを浸漬させる方法は特に限定されない。例えば、ピペッティング、転倒混合、スターラー、ミキサー、ボルテックス、ミル等の分散機や超音波処理装置などで撹拌してもよい。
【００５８】
水溶性の中性ポリマー濃度は特に限定されないが、０．０１ｗｔ％以上が好ましく、より好ましくは、０．１ｗｔ％以上である。
【００５９】
攪拌する際の混合時間は、水溶性の中性ポリマーと酸化アルミニウムが均一に混合されれば、特に混合時間は限定されないが、ボルテックスの場合１分以上、好ましくは５分以上撹拌することが好ましい。
【００６０】
また、ふるいや、ざる等を用いて水溶性の中性ポリマーを酸化アルミニウムにディップコートすることもできる。溶液に浸す際の混合時間は、０．１ｗｔ％以上のポリマー濃度であれば５分以上であればよく、３０分以上であることが好ましい。
【００６１】
水溶性の中性ポリマー溶液を滴下する場合には、スポイト、滴下漏斗、などを用いることができる。ポリマー溶液を滴下する際には、酸化アルミニウムを振動させたり、回転させたりしてもよく、スピンコーターなどを用いてもよい。
【００６２】
水溶性の中性ポリマー溶液を塗布する場合には、刷毛、ローラー、ワイヤーバーを用いることができる。
【００６３】
水溶性の中性ポリマー溶液を霧状にして吹き付ける場合には、エアースプレーやエアブラシなどを用いることができる。
【００６４】
上記に例示した方法で、酸化アルミニウムに水溶性の中性ポリマーを吸着させた後は、遠心分離操作を行って、上清となるポリマー溶液を取り除いてもよいし、遠心分離操作を行わずにそのまま核酸の回収に用いてもよい。また、ポリマー溶液を溶媒に溶解させている場合、酸化アルミニウムに水溶性の中性ポリマーを吸着させ、溶媒を取り除いた後、乾燥させてもよいし、乾燥させずに、核酸の回収に用いてもよい。
【００６５】
得られた本発明の担体は、作製して保存しておいたものを使用してもよく、用時調製して使用してもよい。
【００６６】
水溶性の中性ポリマー溶液は、入手した水溶性の中性ポリマーが固体であれば水や有機溶媒に溶解することで調製でき、溶液であれば希釈することで調製できる。ポリマーが溶解しにくい場合や、溶液の粘度が高く混合しにくい場合、加熱処理や超音波処理を行ってもよい。有機溶媒は、例えば、エタノール、アセトニトリル、メタノール、プロパノール、ｔｅｒｔ−ブタノール、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、アセトン、エチレングリコール、グリセロールなど、水と双溶性のあるものを使用することが好ましい。また、水に溶解しにくい場合には、上記の有機溶媒を添加してもよい。
【００６７】
ここで、酸化アルミニウムと水溶性の中性ポリマーとを、リンカー分子などによって共有結合させて作製した担体は、本発明の担体に該当しない。具体的なリンカー分子には、シランカップリング剤などが挙げられる。このようなシランカップリング剤による官能化の後に、アミド結合、エステル結合、チオールとマレインイミドのマイケル付加反応物、ジスルフィド結合、トリアゾール環などを形成させ、ポリマー等を固定化して作製した担体も、本発明の担体に該当しない。
【００６８】
本発明の核酸回収用のキットは、核酸を含む試料から従来方法よりも低い溶出体積で核酸を回収するために用いることができる。本発明の核酸回収用のキットは、その構成成分として、水溶性の中性ポリマーが表面に吸着した酸化アルミニウムの担体、１ｍＭ以上４０ｍＭ以下のキレート剤を含む溶液Ａおよび５０ｍＭ以上のキレート剤を含む溶液Ｂが含まれる。キットには、これらの他に核酸が吸着した担体を洗浄するための洗浄液が含まれていてもよいし、核酸の回収方法のプロトコールなどの説明書などが含まれていてもよい。担体、溶液Ａ及び溶液Ｂは、回収処理前はそれぞれ別の容器に収容され、各工程時にその容器から取り出される。
【００６９】
本発明の核酸回収用のキットに含まれる水溶性の中性ポリマーが表面に吸着した酸化アルミニウムの担体は、乾燥させた状態であってもよいし、水溶性の中性ポリマーの溶液中に浸漬された状態であってもよいし、カラムに収容されていてもよい。
【００７０】
本発明の核酸を含む試料には、核酸を含む任意の溶液を使用できる。核酸には、例えば、ＲＮＡ、ＤＮＡ、ＲＮＡ／ＤＮＡ（キメラ）及び人工核酸などが挙げられる。ＤＮＡには、ｃＤＮＡ、マイクロＤＮＡ（ｍｉＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、及び合成ＤＮＡ、セルフリーＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ、ｃｔＤＮＡ、ミトコンドリアＤＮＡ（ｍｔＤＮＡなどが挙げられる。また、ＲＮＡには、ｔｏｔａｌ  ＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｓｎｏＲＮＡ、ｓｎＲＮＡもしくはｎｏｎ−ｃｏｄｉｎｇ  ＲＮＡ、それらの前駆体又は合成ＲＮＡなどが挙げられる。合成ＤＮＡ及び合成ＲＮＡは、所定の塩基配列（天然型配列又は非天然型配列のいずれでもよい）に基づいて、例えば自動核酸合成機を用いて、人工的に作製できる。
【００７１】
核酸を含む試料は、必要に応じて、以下のような処理をしてもよい。これは、核酸が生物学的試料において細胞膜、細胞壁、小胞、リポソーム、ミセル、リボソーム、ヒストン、核膜、ミトコンドリア、ウイルスのキャプシド、エンベロープ、エンドソームまたはエキソソームのような化合物に内包されていたり、これらが相互作用していたりすることが多いためである。より収率よく核酸を回収するために、これらから遊離させることを目的とした処理を行ってもよい。
【００７２】
具体的には、大腸菌を含む試料を用いる場合、核酸の回収効率を高めるために、以下のような処理を行うことができる。例えば、大腸菌が含まれる溶液に対して０．２Ｍの水酸化ナトリウムと１％のＳＤＳの混合液を加えることができ（アルカリ変性法）、また、１０％のサルコシル溶液を加えることもできる（サルコシルによる非変性法）。また、これらの溶液にリゾチームを添加しておいてもよい。また、プロテイナーゼＫにより３７℃で１時間処理を行うこともできる。他の方法として超音波処理を行うこともできる。
【００７３】
酵母を含む試料を用いる場合、核酸の回収効率を高めるために、以下のような処理を行うことができる。例えば、生化学工業株式会社やナカライテスク株式会社から市販されているザイモリエースで処理した後に１０％のＳＤＳを加えることもできる。
【００７４】
細胞を含む試料を用いる場合、核酸の回収効率を高めるために、以下のような処理を行うことができる。例えば、１％のＳＤＳを加えることができる。他の方法として、塩化グアニジニウム、グアニジンチオシアン酸塩、尿素などを、例えば各終濃度が４Ｍ以上となるように加えてもよい。この溶液に対して、サルコシルを０．５％以上になるよう加えてもよい。また、メルカプトエタノールを５０ｍＭ以上の濃度になるよう加えてもよい。
【００７５】
上記の操作において、核酸の分解を抑制するために、核酸の分解酵素の阻害剤を添加してもよい。ＤＮＡ分解酵素の阻害剤として、ＥＤＴＡを１ｍＭ以下の濃度で添加することができる。また、ＲＮＡ分解酵素の阻害剤として市販されている「ＲＮａｓｉｎ  Ｐｌｕｓ  Ｒｉｂｏｎｕｃｌｅａｓｅ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ」（プロメガ株式会社）、「Ｒｉｂｏｎｕｃｌｅａｓｅ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ」（タカラバイオ株式会社）、「ＲＮａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ」（東洋紡株式会社）などを使用することができる。
【００７６】
核酸を含む試料にＤＮＡとＲＮＡとが混在している場合には、フェノール・クロロホルム抽出によって分離することもできる。例えば、フェノール・クロロホルム抽出を酸性条件で行えばＲＮＡは水相、ＤＮＡはクロロホルム相に分離され、中性条件で行えばＲＮＡとＤＮＡは水相に分配される。この性質を利用して、取得したい核酸の種類に応じて条件を選択できる。上記のクロロホルムはｐ−ブロモアニソールに置換することもできる。
【００７７】
フェノール・クロロホルム抽出は、市販試薬である「ＩＳＯＧＥＮ」（登録商標：株式会社ニッポンジーン）、「ＴＲＩｚｏｌ」（登録商標：ライフテクノロジーズジャパン株式会社）、ＲＮＡｉｓｏ（タカラバイオ株式会社）、「３Ｄ−Ｇｅｎｅ（登録商標）  ＲＮＡ  ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  ｒｅａｇｅｎｔ  ｆｒｏｍ  ｌｉｑｕｉｄ  ｓａｍｐｌｅ  ｋｉｔ」（東レ株式会社）を利用することもできる。以上の処理は、その一工程のみを行ってもよく、他の操作における工程と組み合わせることもできる。また、それに用いる溶液の濃度は、必要に応じて変えることもできる。
【００７８】
本発明において核酸を含む試料として、核酸、人工核酸、色素やリン酸基等の修飾が施された核酸を溶解させた溶液や、体液等の液体試料やその希釈液、細胞ペレットや組織片等の固体試料の希釈液も用いることができる。また、固体試料を含む核酸を含む試料については、試料に対し、上記のいずれかの処理を行った後に得られる溶液をそのまま核酸を含む試料として用いたり、必要に応じて希釈したりして用いればよい。核酸を含む試料が体液等の液体試料の場合にも、固体試料と同様に、試料に対し上記のいずれかの処理を行った後に得られる溶液をそのまま核酸を含む試料として用いたり、必要に応じて希釈したりして用いることができる。希釈する溶液は特に限定されないが、水やＴｒｉｓ−塩酸緩衝液などの核酸の希釈に汎用される溶液を使用することが好ましい。また、カオトロピック塩として塩化グアニジニウム、グアニジンチオシアン酸塩、尿素を、例えば各終濃度が４Ｍ以上となるように加えてもよい。
【００７９】
本発明において、担体に核酸を吸着させるとは、可逆的に脱離可能となる吸着を指す。
担体に吸着した核酸の回収率は、以下のとおり求めることができる。はじめに核酸を含む試料中の核酸量を算出する。次に核酸が吸着した担体に対して溶出液を加え、溶出した後の溶液中の核酸量を算出し、核酸の溶出量を算出する。得られた値を核酸の回収量とし、その値を、核酸を含む試料中の核酸量で割ることで、核酸の回収率が算出できる。
【００８０】
核酸量の定量の方法としては、吸光度測定、蛍光測定、発光測定、電気泳動、ＰＣＲ、ＲＴ−ＰＣＲ、マイクロアレイを使用した解析、シーケンサーを使った解析などが挙げられる。非修飾の核酸であれば、２６０ｎｍにおける吸光度を測定することで核酸量を定量することができる。また、蛍光色素が修飾された核酸であれば、その蛍光色素に由来する蛍光強度を、濃度既知の溶液における蛍光強度と比較することで核酸量を定量できる。その他、電気泳動により行うことができる。電気泳動による回収率の算出方法は、濃度既知のサンプルと同時に回収操作を行ったサンプルを泳動し、ゲルを染色してバンドの濃度を画像解析により比較することで決定することができる。
【００８１】
核酸量が極微量で定量が難しい場合は、ＤＮＡチップ、リアルタイムＰＣＲなどの核酸の検出方法を用い、検出値を比較することによって、核酸の収量を比較することができる。例えば、ＤＮＡチップのような検出反応において、蛍光測定や発光測定を原理とした測定系であればそのシグナル値が高いほうが高収量であると判断できる。例えば、ＤＮＡチップであれば、スキャナーを用いて蛍光画像を取得し、遺伝子ごとの蛍光シグナル強度を数値化することで収量を比較することができる。ｍｉＲＮＡやｍＲＮＡのような発現量の網羅解析であれば、遺伝子ごとの蛍光シグナル強度を比較することができ、異なる手法を比較したときそのシグナル値が高いほうが高収量であると判断できる。また、複数種類の遺伝子を解析する場合は、遺伝子ごとの蛍光シグナルの総和（蛍光シグナル総和値）をとり、異なる手法を比較したときそのシグナル値が高いほうが高収量であると判断できる。リアルタイムＰＣＲでは、横軸にサイクル数、縦軸に蛍光強度をプロットした増幅曲線が得られる。この増幅曲線において一定のシグナル強度に達したときのサイクル数（Ｃｑ値、Ｃｔ値）をそれぞれ求める。この場合、Ｃｔ値やＣｑ値が小さいほうが高収量であると判断できる。ｃｆＤＮＡやゲノムＤＮＡであれば、測定対象の遺伝子に対するプライマーを設計し、同一のプライマーで異なる回収方法を比較したときＣｔ値やＣｑ値が小さいほうが高収量であると判断できる。ｍｉＲＮＡやｍＲＮＡのようなＲＮＡである場合、逆転写の工程を加える以外はＤＮＡと同様に測定、検出することができ、その際のＣｔ値やＣｑ値が小さいほうが高収量であると判断できる。
【００８２】
本発明においてポリマーは、基本単位である単量体やモノマーと呼ばれる繰り返し単位が多数繋がった化合物の総称である。本発明の担体に用いるポリマーは、１種類の単量体からなるホモポリマーと２種類以上の単量体からなるコポリマーのいずれもが含まれ、任意の重合度のポリマーも含まれる。また、天然ポリマーと合成ポリマーのいずれもが含まれる。
【００８３】
本発明の担体に用いる水溶性の中性ポリマーは、水に対して溶解可能な性質を有し、水に対する溶解度が、少なくとも０．０００１ｗｔ％以上であり、好ましくは、０．００１ｗｔ％以上、より好ましくは０．０１ｗｔ％以上、さらに好ましくは０．１ｗｔ％以上のポリマーである。
【００８４】
本発明の担体に用いる水溶性の中性ポリマーは、好ましくは、ｐＨ７の溶液中でゼータ電位が−１０ｍＶ以上＋１０ｍＶ以下のポリマーである。より好ましくは−８ｍＶ以上＋８ｍＶ以下であり、さらに好ましくは−６ｍＶ以上＋６ｍＶ以下、特に好ましくは−４．０ｍＶ以上＋１．１ｍＶ以下のポリマーである。
【００８５】
ゼータ電位とは、溶液中におけるコロイドの界面の電気的性質を表す値の１つである。荷電したコロイドが溶液に分散していると、コロイドの表面ではコロイドの表面荷電に対する対イオンにより電気二重層が形成されている。このときのコロイド表面の電位を表面電位と呼ぶ。電気二重層は、コロイドの表面電荷の静電相互作用により形成されているため、コロイド側ほどイオンが強く固定されている。電気二重層の中でも静電相互作用により対イオンがコロイド表面に強く固定されている層を固定層、固定層の電位を固定電位と呼ぶ。溶液に対してコロイドを移動させると固定層はコロイドと共に移動する。このとき、コロイドから見て固定層よりも外側に、溶液が持つ粘性のためにコロイドと共に移動する境界面がある。これを、すべり面、または、ずり面と呼ぶ。コロイドから充分に離れた地点の電位をゼロ点としたときの、このすべり面の電位はゼータ電位と定義されている。このように、ゼータ電位はコロイドの表面電荷に依存して変化し、表面電荷はｐＨに依存するプロトンの着脱によって変化するため、本発明ではｐＨ７の溶液中での値を基準とする。また、一般にコロイドのサイズと比べてすべり面までの距離は小さいので、コロイドの表面をすべり面と近似的に表現することもできる。本発明で用いる水溶性の中性ポリマーの場合も同様に、溶液中に分散したコロイドの表面電位をゼータ電位とみなすことができる。
【００８６】
ゼータ電位は、電気泳動、電気浸透、逆流電位、沈殿電位などの界面動電現象を利用して求めることができ、顕微鏡電気泳動法、回転回折格子法による電気泳動法、レーザー・ドップラー電気泳動法、超音波振動電位法、動電音響法などの方法により測定できる。これらの測定は、ゼータ電位測定装置を使用することで行うことができる。ゼータ電位測定装置は、大塚電子株式会社、Ｍａｌｖｅｒｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ  Ｌｔｄ．、Ｒａｎｋｕ  Ｂｒｏｔｈｅｒ  Ｌｔｄ．、ＰｅｎＫｅｍ  Ｉｎｃ．などから市販されている。
【００８７】
上記のいずれの装置を用いても、ゼータ電位を測定することができるが、レーザー・ドップラー電気泳動法が一般的である。レーザー・ドップラー電気泳動法は、光や音波が電気泳動により運動している物体に当たり、散乱あるいは反射するとその周波数が変化するドップラー効果を利用した測定方法である。
【００８８】
ポリマーのゼータ電位を測定する場合には、コロイド分散溶液としてポリマー溶液を調製し、ゼータ電位を測定することができる。ポリマーを例えば、リン酸緩衝液や、塩化ナトリウム溶液、クエン酸緩衝液などの電解質に溶解させてポリマー溶液を調製し、溶液中に分散したポリマーの散乱光や、反射光を検出して測定を行う。コロイドのサイズが大きいほど、低い濃度で散乱光や反射光を検出することが可能となる。
【００８９】
ポリマーのゼータ電位をレーザー・ドップラー法で測定する具体的な条件は特に限定されないが、例えば、ポリマーの濃度を１ｗｔ％以上１０ｗｔ％以下となるようにリン酸緩衝液（１０ｍＭ，ｐＨ７）に溶解し、この溶液を測定用セルに入れて、レーザー・ドップラー電気泳動法を原理とするゼータ電位測定装置に設置して室温で測定することができる。ゼータ電位測定装置は例えば、大塚電子株式会社のＥＬＳ−Ｚ等が利用できる。
【００９０】
本発明の担体に用いる水溶性の中性ポリマーとしては、具体的には、以下のものが挙げられる。例えば、ポリビニルアルコール又はポリビニルピロリドンなどのポリビニル系ポリマー、ポリアクリルアミド、ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）又はポリ（Ｎ−（ヒドロキシメチル）アクリルアミドなどのポリアクリルアミド系ポリマー、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール又はポリテトラメチレンエーテルグリコールなどのポリアルキレングリコール系のポリマー、ポリ（２−エチル−２−オキサゾリン）、（ヒドロキシプロピル）メチルセルロース、メチルセルロース、エチルセルロース、２−ヒドロキシエチルセルロース又はヒドロキシプロピルセルロースなどのセルロース等を用いることができる。また、上記のポリマーが含まれる共重合体も用いることができる。
【００９１】
また、フィコール、アガロース、キチン、デキストランなどのポリサッカライド又はポリサッカライド類縁体、またはアルブミンなどのタンパク質やペプチドも本発明の担体に用いる水溶性の中性ポリマーに含まれる。
【００９２】
水溶性の中性ポリマーの官能基の一部をイオン化させたり、陽性や陰性を示す官能基に置換したり、側鎖にアセチル基など水溶性を発現する官能基を導入してもよい。
【００９３】
水溶性の中性ポリマーの分子量としては、例えば、０．４ｋＤ以上のポリマーを好ましく用いることができ、より好ましくは６ｋＤ以上である。また、分子量の上限は、５００ｋＤ以下であることが好ましく、１５０ｋＤ以下であることがより好ましい。水溶性の中性ポリマーの分子量の好ましい範囲は、０．４ｋＤ以上５００ｋＤ以下、より好ましくは６ｋＤ以上１５０ｋＤ以下である。
【００９４】
本発明の担体に用いる酸化アルミニウムは、Ａｌ２Ｏ３の組成式で表される両性酸化物であり、アルミナとも呼ばれる。
【００９５】
酸化アルミニウムは、天然に産出するものを用いてもよいし、工業的に作製したものを用いてもよい。酸化アルミニウムを作製する方法としては、例えば、ギブサイトを出発原料とするバイヤー法や、ベーマイト形態の水酸化物を経由するアルコキシド法（ゾルーゲル法とも呼ばれる）・中和法・オイルドロップレット法、アルミニウム塩熱分解法や陽極酸化法などが挙げられる。
【００９６】
工業的に作製した酸化アルミニウムは、試薬メーカーや、触媒化学メーカー、一般社団法人触媒学会の参照触媒部会などから入手することができる。
【００９７】
酸化アルミニウムは、それらが持つ結晶構造によって、アルファ酸化アルミニウム、ロー酸化アルミニウム、カイ酸化アルミニウム、カッパ酸化アルミニウム、イータ酸化アルミニウム、ガンマ酸化アルミニウム、デルタ酸化アルミニウム、シータ酸化アルミニウムなどに分類される。本発明では、高比表面積を持つガンマ酸化アルミニウムが好ましい。
【００９８】
酸化アルミニウムは、作製時の焼成温度に応じて、酸点（Ａｌ＋、Ａｌ−ＯＨ２＋）と塩基点（Ａｌ−Ｏ−）が変化する。酸化アルミニウムはこの酸点と塩基点の数に応じて、酸点が多ければ酸性アルミナ、塩基点が多ければ塩基性アルミナ、酸点と塩基点が同程度の中性アルミナと分類される。この特性の違いは、ｐＨ指示薬であるＢＴＢ溶液を添加することで確認できる。ＢＴＢ溶液を加えて、酸化アルミニウムが黄色に呈色すれば酸性アルミナ、緑色に呈色すれば中性アルミナ、青色に呈色すれば塩基性アルミナであることが確認できる。このような特性上の違いがあるが、本発明においては、いずれの酸化アルミニウムも使用することができる。
【００９９】
酸化アルミニウムは粒状のものがよい。粒径はそろっていても、異なる粒径を混合して用いてもよい。粒径は、例えば、２１２μｍ未満の酸化アルミニウムを好ましく用いることができ、より好ましくは１００μｍ未満の酸化アルミニウムを用いることができる。
【０１００】
粒径は、本発明では日本工業規格に規格するＪＩＳ  Ｚ−８８０１−１：２００６に基づいたふるい目開きの寸法で定義する。例えば、上記ＪＩＳ標準による目開きにして４０μｍのふるいを通過し、３２μｍのふるいを通過できない粒子は、３２μｍ以上４０μｍ未満の粒径となる。
【実施例】
【０１０１】
本発明を以下の実施例によってさらに具体的に説明する。なお、本実施例により本発明が限定して解釈されるわけではない。【０１０２】
＜材料と方法＞
ポリエチレングリコールはメルク株式会社より入手し、ガンマ酸化アルミニウム（Ｎ６１３Ｎ）は日揮触媒化成株式会社より入手し、ポリリン酸ナトリウム（ＣＡＳ  Ｎｏ．６８９１５−３１−１）は富士フイルム和光純薬株式会社より入手した。【０１０３】
その他の試薬については、和光純薬株式会社、東京化成株式会社、シグマーアルドリッチジャパン合同会社より入手し、特に精製することなくそのまま用いた。回収率を測定するための核酸としては、ｍｉＲＮＡのｌｅｔ７ａ配列として知られる配列番号１で表される２２塩基長の核酸を、配列番号２で表されるＤＮＡ配列に変換し、５’末端をＣｙ３標識して合成したものユーロフィンジェノミクス株式会社より入手した。この核酸Ｃｙ３−ＤＮＡと記載する。これらの核酸は、特に精製することなくそのまま用いた。【０１０４】
ミキサーは東京理化器械株式会社の「ＣＵＴＥ  ＭＩＸＥＲ  ＣＭ−１０００」を、遠心機は株式会社日立製作所のＣＴ１５ＲＥを用いた。【０１０５】
ヒト血清は、インフォームドコンセントを得た健常者からベノジェクトＩＩ真空採血管ＶＰ−ＡＳ１０９Ｋ６０（テルモ株式会社製）を用いて採取した。【０１０６】
本発明の担体は以下のとおり調製し、以降の実施例および比較例に用いた。１．５ｍｌチューブに、２０ｍｇずつ塩基性のガンマ酸化アルミニウムを量り取った。これに、ポリマー水溶液として、水溶性の中性ポリマーであるポリエチレングリコール（ＰＥＧ，１０ｋＤ）を１０ｗｔ％の濃度で２００μｌ加えてミキサーで１０分間攪拌した。【０１０７】
上記で調製した本発明の担体を「Ｎａｎｏｓｅｐ  ＭＦ  Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｌ  Ｄｅｖｉｃｅｓ」（０．４５μｍ）に収容して、本発明の担体が収容されたスピンカラムを作製し、以降の実施例および比較例に用いた。【０１０８】
溶液Ｂは、以下のように調製した。まず、２５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７）を調製した。ポリリン酸は構造単位であるリン酸の分子量で濃度（２５０ｍＭ）を決定し、塩酸または水酸化ナトリウムでｐＨ７に調節した。以上のように調製した２５０ｍＭのリン酸と２５０ｍＭのポリリン酸を等量ずつ混合し、溶液Ｂ（１２５ｍＭリン酸−１２５ｍＭポリリン酸混合液（ｐＨ７））として以降の実施例および比較例に用いた。【０１０９】
＜実施例１〜１１＞
表１に示すように、溶液Ａのキレート剤として、２５ｍＭクエン酸（ｐＨ７）（実施例１）、１０ｍＭクエン酸（ｐＨ７）（実施例２）、５ｍＭクエン酸（ｐＨ７）（実施例３）、１ｍＭクエン酸（ｐＨ７）（実施例４）、２５ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ７）（実施例５）、１０ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ７）（実施例６）、５ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ７）（実施例７）、１ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ７）（実施例８）、１０ｍＭリン酸（ｐＨ７）（実施例９）、５ｍＭリン酸（ｐＨ７）（実施例１０）、１ｍＭリン酸（ｐＨ７）（実施例１１）をそれぞれ用いた。
【表１】
2020085341.tif 000003
【０１１０】
＜比較例１＞
本比較例１では、工程ｂを除いた以外は、実施例１〜１１と同様の条件および操作で核酸を回収した。つまり、本比較例は、特許文献１に記載の核酸の回収方法に対応する。結果を表１に示す。【０１１１】
工程ａ：核酸を含む試料として、１００ｐｍｏｌのｃｙ３−ＤＮＡを添加したヒト血清を用いた。１００ｐｍｏｌのｃｙ３−ＤＮＡを溶解させた、７Ｍ  ＧＴＮ、２５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ溶液（ｐＨ７）４００μｌとヒト血清２００μｌとをピペッティングにより混合し、核酸を含む試料として用いた。本発明の担体が収容されたスピンカラムに調製した核酸を含む試料を加えて遠心（１００Ｇ、１０ｍｉｎ）した。その後、フロースルーは廃棄し、コレクションチューブを新しいものに交換した。【０１１２】
洗浄工程１（第１洗浄工程）：３５０μｌの５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７）をスピンカラムへ加えて遠心（１０００Ｇ、２ｍｉｎ）した。その後、フロースルーは廃棄し、コレクションチューブを新しいものに交換した。【０１１３】
工程ｂ：３５０μｌの上記１１種類の溶液Ａをそれぞれスピンカラムへ加えて遠心（１０００Ｇ、２ｍｉｎ）した。その後、フロースルーは廃棄し、コレクションチューブを新しいものに交換した。【０１１４】
工程ｃ：５０μｌの溶液Ｂをスピンカラムへ加えて１５分間静置した。その後、遠心（１０００Ｇ、２ｍｉｎ）して、フロースルーを核酸溶液として回収した。【０１１５】
核酸の担体への吸着率はＣｙ３の蛍光測定により以下のように算出した。はじめに、本発明の担体が収容されたスピンカラムへ加える前の核酸を含む試料の蛍光強度を測定した。工程ｃで得られた核酸溶液の蛍光強度を測定した。スピンカラムを通液した後の蛍光強度を通液する前の蛍光強度で割り、得られた値と、核酸を含む試料に含まれる核酸量である１００ｐｍｏｌの比をとって工程ｃで得られた核酸溶液の核酸量を算出した。カラム通液前の核酸量である１００ｐｍｏｌから、この値の差をとり、吸着した核酸量を算出した。吸着した核酸量を、酸化アルミニウムを加える前の核酸量である１００ｐｍｏｌで割り、吸着率を算出した。【０１１６】
核酸の溶出率はＣｙ３の蛍光測定により以下のように算出した。核酸が吸着した担体に対して５０μｌの溶液Ｂを加え、溶出した後の溶出液に１５０μｌの水を加えて蛍光測定を行った。次に、１００ｐｍｏｌのＣｙ３−ＤＮＡが溶解した５０μｌの溶液Ｂを調製して、１５０μｌの水を加えて蛍光測定を行った。溶出液の蛍光強度をこの溶液の蛍光強度で割り、溶出した核酸量を算出した。溶出した核酸量を、吸着した核酸量で割り、溶出率を算出した。【０１１７】
核酸の回収率は、算出された吸着率と溶出率の積をとって算出した。実施例１〜１１の結果を表１に示した。これらの結果から、工程ｂにおいて、核酸が吸着した担体に、１ｍＭ以上４０ｍＭ以下のキレート剤を含む溶液を接触させ、当該溶液Ａを除去する工程を行うことで、溶液Ａを用いない比較例１と比べて高い収率で核酸を回収できることがわかった。【０１１８】
＜実施例１２＞
実施例１の回収工程において、工程ｂと工程ｃとの間に以下の洗浄工程２（第２洗浄工程）を加え、核酸の回収を行った。【０１１９】
洗浄工程２（第２洗浄工程）：３５０μｌの５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７）をスピンカラムへ加えて遠心（１０００Ｇ、２ｍｉｎ）した。その後、フロースルーは廃棄し、コレクションチューブを新しいものに交換した。【０１２０】
その他の条件・操作は実施例１と同様に行い、核酸の吸着率、溶出率、回収率を算出した。結果を表２に示した。
【表２】
2020085341.tif 000004
【０１２１】
本結果から、工程ｂと工程ｃとの間に洗浄工程２を加えても、溶液Ａを用いない比較例１と比較して高収率に核酸を回収できることがわかった。【０１２２】
実施例１〜１２と比較例１の結果から、工程ｂを実施する実施例１〜１２の方法によれば、比較例１すなわち特許文献１の方法と比較して、高収率に核酸を回収できることがわかった。【０１２３】
＜実施例１３〜２１＞
溶液Ａのキレート剤として、５ｍＭ  ＨＥＤＰ（ｐＨ７）（実施例１３）、５ｍＭ  ＧＭＰ（ｐＨ７）（実施例１４）、１０ｍＭ  ＮＴＭＰ（ｐＨ７）（実施例１５）、５ｍＭ  ＮＴＭＰ（ｐＨ７）（実施例１６）、１ｍＭ  ＮＴＭＰ（ｐＨ７）（実施例１７）、５ｍＭ  ＥＤＴＭＰ（ｐＨ７）（実施例１８）、１０ｍＭ  ポリリン酸（ｐＨ７）（実施例１９）、５ｍＭ  ポリリン酸（ｐＨ７）（実施例２０）、１ｍＭポリリン酸（ｐＨ７）（実施例２１）をそれぞれ用いたこと以外は、実施例１〜１２と同様の条件および操作にて核酸の回収を行い、核酸の吸着率、溶出率、回収率を算出した。結果を表３に示した。
【表３】
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【０１２４】
本結果から、キレート剤としてホスホン酸系キレート剤を用いても、高い収率で核酸を回収できることがわかった。
【産業上の利用可能性】
【０１２５】
本発明の核酸の回収方法は、特に体液中に極微量にしか存在していない核酸も高い収率で回収することを可能とするような、核酸を含む試料から核酸を高い収率で回収することにおいて、産業上非常に有用である。
【図１】
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【図２】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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