(57)【要約】  本発明は、以下のa）からd）のいずれかに示される核酸を封入してなるミトコンドリア指向性脂質膜構造体に関する。  a）第一のミトコンドリアtRNAの塩基配列、目的タンパク質をコードするmRNAの塩基配列及び第二のミトコンドリアtRNAの塩基配列をこの順番で含むRNAであって、前記mRNAの塩基配列は、トリプトファンコドンとして１つ又は複数のUGAを有する、前記RNA  b）プロモーターの塩基配列及びa）のRNAに相補的な塩基配列を含むDNA  c）目的タンパク質をコードするmRNAの塩基配列及びその3'末端側に存在するポリA鎖の塩基配列を含むRNAであって、前記mRNAの塩基配列は、トリプトファンコドンとして１つ又は複数のUGAを、開始コドンとしてAUGを、及び終止コドンとしてUAAを有する、前記RNA  d）プロモーターの塩基配列及びc）のRNAに相補的な塩基配列を含むDNA。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下のa）からd）のいずれかに示される核酸を封入してなるミトコンドリア指向性脂質膜構造体。
a）第一のミトコンドリアtRNAの塩基配列、目的タンパク質をコードするmRNAの塩基配列及び第二のミトコンドリアtRNAの塩基配列をこの順番で含むRNAであって、前記mRNAの塩基配列は、トリプトファンコドンとして１つ又は複数のUGAを有する、前記RNA
b）プロモーターの塩基配列及びa）のRNAに相補的な塩基配列を含むDNA
c）目的タンパク質をコードするmRNAの塩基配列及びその3'末端側に存在するポリA鎖の塩基配列を含むRNAであって、前記mRNAの塩基配列は、トリプトファンコドンとして１つ又は複数のUGAを、開始コドンとしてAUGを、及び終止コドンとしてUAAを有する、前記RNA
d）プロモーターの塩基配列及びc）のRNAに相補的な塩基配列を含むDNA
【請求項２】
前記a）におけるmRNAの塩基配列及び２つのミトコンドリアtRNAの塩基配列が連続している、請求項１に記載の脂質膜構造体。
【請求項３】
前記c）におけるmRNAの塩基配列とポリA鎖の塩基配列が連続している、請求項１に記載の脂質膜構造体。
【請求項４】
目的タンパク質が野生型のミトコンドリアDNA由来ミトコンドリアタンパク質である、請求項１から３のいずれか一項に記載の脂質膜構造体。
【請求項５】
ジオレイルホスファチジルエタノールアミン及びスフィンゴミエリンを脂質膜の構成脂質として含有する、請求項１から４のいずれか一項に記載の脂質膜構造体。
【請求項６】
配列番号１で示されるアミノ酸配列からなるペプチドを脂質膜表面に有する、請求項１から５のいずれか一項に記載の脂質膜構造体。
【請求項７】
以下のa）からd）のいずれかに示される核酸を有効成分として含有する、ミトコンドリア病の治療及び／又は予防のための医薬組成物。
a）第一のミトコンドリアtRNAの塩基配列、目的タンパク質をコードするmRNAの塩基配列及び第二のミトコンドリアtRNAの塩基配列をこの順番で含むRNAであって、前記mRNAの塩基配列は、トリプトファンコドンとして１つ又は複数のUGAを有する、前記RNA
b）プロモーターの塩基配列及びa）のRNAに相補的な塩基配列を含むDNA
c）目的タンパク質をコードするmRNAの塩基配列及びその3'末端側に存在するポリA鎖の塩基配列を含むRNAであって、前記mRNAの塩基配列は、トリプトファンコドンとして１つ又は複数のUGAを、開始コドンとしてAUGを、及び終止コドンとしてUAAを有する、前記RNA
d）プロモーターの塩基配列及びc）のRNAに相補的な塩基配列を含むDNA
【請求項８】
前記a）におけるmRNAの塩基配列及び２つのミトコンドリアtRNAの塩基配列が連続している、請求項７に記載の医薬組成物。
【請求項９】
前記c）におけるmRNAの塩基配列とポリA鎖の塩基配列が連続している、請求項７に記載の医薬組成物。
【請求項１０】
目的タンパク質が野生型のミトコンドリアDNA由来ミトコンドリアタンパク質である、請求項７から９のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項１１】
核酸がミトコンドリア指向性脂質膜構造体に封入されている、請求項７から１０のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項１２】
ミトコンドリア病患者又はミトコンドリア病を発症するおそれのある者に由来する細胞に、以下のa）からd）のいずれかに示される核酸をインビトロで導入することを含む、ミトコンドリア病の治療及び／又は予防のための細胞製剤の製造方法。
a）第一のミトコンドリアtRNAの塩基配列、目的タンパク質をコードするmRNAの塩基配列及び第二のミトコンドリアtRNAの塩基配列をこの順番で含むRNAであって、前記mRNAの塩基配列は、トリプトファンコドンとして１つ又は複数のUGAを有する、前記RNA
b）プロモーターの塩基配列及びa）のRNAに相補的な塩基配列を含むDNA
c）目的タンパク質をコードするmRNAの塩基配列及びその3'末端側に存在するポリA鎖の塩基配列を含むRNAであって、前記mRNAの塩基配列は、トリプトファンコドンとして１つ又は複数のUGAを、開始コドンとしてAUGを、及び終止コドンとしてUAAを有する、前記RNA
d）プロモーターの塩基配列及びc）のRNAに相補的な塩基配列を含むDNA
【請求項１３】
前記a）におけるmRNAの塩基配列及び２つのミトコンドリアtRNAの塩基配列が連続している、請求項１２に記載の製造方法。
【請求項１４】
前記c）におけるmRNAの塩基配列とポリA鎖の塩基配列が連続している、請求項１２に記載の製造方法。
【請求項１５】
目的タンパク質が野生型のミトコンドリアDNA由来ミトコンドリアタンパク質である、請求項１２から１４のいずれか一項に記載の製造方法。
【請求項１６】
核酸がミトコンドリア指向性脂質膜構造体に封入されている、請求項１２から１５のいずれか一項に記載の製造方法。
【請求項１７】
目的タンパク質をコードするmRNAの塩基配列及びその3'末端側に存在するポリA鎖の塩基配列を含むRNAであって、前記mRNAの塩基配列は、トリプトファンコドンとして１つ又は複数のUGAを、開始コドンとしてAUGを、及び終止コドンとしてUAAを有する、前記RNA。
【請求項１８】
mRNAの塩基配列とポリA鎖の塩基配列が連続している、請求項１７に記載のRNA。
【請求項１９】
タンパク質が野生型のミトコンドリアDNA由来ミトコンドリアタンパク質である、請求項１７又は１８に記載のRNA。
【請求項２０】
プロモーターの塩基配列及び請求項１７から１９のいずれか一項に規定されるRNAに相補的な塩基配列を含む、DNA。
【請求項２１】
配列番号２に示される塩基配列を含むプライマーDNAと配列番号４に示される塩基配列からなるプライマーDNAとの組み合わせからなる野生型検出用プライマーDNAセットと、
配列番号２に示される塩基配列を含むプライマーDNAと配列番号１０に示される塩基配列からなるプライマーDNAとの組み合わせからなる変異型検出用プライマーDNAセット
とを含む、ミトコンドリアND3遺伝子の点変異であるT10158Cを検出するためのキット。
【請求項２２】
配列番号２に示される塩基配列を含むプライマーDNAが、配列番号３に示される塩基配列からなるプライマーDNAである、請求項２１に記載のキット。
【請求項２３】
配列番号２に示される塩基配列を含むプライマーDNAが、配列番号３に示される塩基配列において5'末端及び／又は3'末端の１又は２個の塩基が欠失した塩基配列からなるプライマーDNAである、請求項２１に記載のキット。
【請求項２４】
配列番号２に示される塩基配列を含むプライマーDNAが、配列番号２に示される塩基配列からなるプライマーDNAである、請求項２１又は２３に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ミトコンドリア内でタンパク質を発現させるための核酸、前記核酸が封入されたミトコンドリア指向性脂質膜構造体、前記核酸又は前記脂質膜構造体の医薬組成物における又は細胞製剤の製造における使用、及びミトコンドリアタンパク質であるND3の点変異を定量するためのプライマーDNAセットに関する。
【背景技術】
【０００２】
細胞のオルガネラの１つであるミトコンドリアは、細胞核内で核ゲノムDNAから転写翻訳されてミトコンドリア内に移送されるミトコンドリアタンパク質（核DNA由来ミトコンドリアタンパク質）、及び細胞核から独立したミトコンドリアゲノムDNAにコードされ、ミトコンドリア内で転写翻訳されるミトコンドリアタンパク質（ミトコンドリアDNA由来ミトコンドリアタンパク質）を含む。これらのタンパク質をコードするゲノムDNAにおける変異と種々の疾患（脳筋症、神経変性疾患、癌、糖尿病等）との関連が多数報告されており、これらはミトコンドリア病と総称される。以下、特に断らない限り、本発明はヒトのミトコンドリアを代表例として説明する。また、特に断らない限り、用語「ミトコンドリアタンパク質」は、核DNA由来ミトコンドリアタンパク質及びミトコンドリアDNA由来ミトコンドリアタンパク質を包含する用語として用いられる。【０００３】
現在、研究開発が進められているミトコンドリア病の治療方法の１つは、治療効果が期待されるタンパク質、例えば変異したミトコンドリアタンパク質に対応する野生型タンパク質をミトコンドリア内に送り込むことを目的とした遺伝子治療である。遺伝子治療を実現するため、細胞核内で転写され、細胞質で翻訳された目的タンパク質をミトコンドリア内に移送させることができる外来遺伝子発現システムや、ミトコンドリア内で直接的に目的タンパク質を発現させることができる外来遺伝子発現システム等が提案されている。【０００４】
細胞質で発現させた目的タンパク質のミトコンドリア内への移送に関連して、多種多様な発現ベクターが開発されている。その多くは、核DNA由来ミトコンドリアタンパク質が有する、ミトコンドリア移行性シグナルペプチド（mitochondrial targeting signal peptide、MTS）を利用している。具体的には、MTSを上流に有する目的タンパク質（MTS付加タンパク質）をコードする発現ベクターを細胞核に送達し、細胞質においてMTS付加タンパク質を発現させ、ミトコンドリアに送達するというものである。【０００５】
この方法はある種の目的タンパク質においては有用であり得るが、ミトコンドリアDNA由来ミトコンドリアタンパク質に対する適用性が低いという問題を有する。ミトコンドリアDNA由来ミトコンドリアタンパク質の多くは細胞質内で不溶性であるために、細胞質で発現されたミトコンドリアDNA由来ミトコンドリアタンパク質が凝集し、ミトコンドリアへの移行が不十分となるからである。【０００６】
特許文献１は、水溶性を高めたMTSと特定のミトコンドリアDNA由来ミトコンドリアタンパク質とからなるMTS付加タンパク質をコードする発現ベクターを用いて、目的タンパク質の細胞質での凝集を抑える方法を開示している。しかし、ミトコンドリアDNA由来ミトコンドリアタンパク質は、ミトコンドリア以外の細胞内オルガネラにあると細胞毒性を示すことが多いので、特許文献１に記載された方法が利用可能な目的タンパク質の範囲は制限される。【０００７】
また、MTS付加タンパク質を利用した上記方法は、本来のミトコンドリアタンパク質の細胞内輸送に干渉する又はこれと競合することで細胞に致死的ダメージを与える可能性があり、遺伝子治療のツールとしては懸念が残る。【０００８】
一方、ミトコンドリア内で直接的に目的タンパク質を発現させることができる外来遺伝子発現システムの利用では、第一にミトコンドリア内における必要十分な量の目的タンパク質の転写発現が要求される。かかる目的に適合するように、ミトコンドリアゲノムDNAに存在する遺伝子由来のプロモーター、例えばHSP（heavy strand promoter）を選択し、その制御下に目的タンパク質をコードするDNAを置いた発現ベクターが幾つか設計されている。この発現ベクターには、ミトコンドリアゲノムDNAにおいて利用頻度の高いトリプレットコドンを使用するといった工夫も加えられている。しかし、これまでのところ、それら発現ベクターの発現レベルは疾患治療に必要十分な領域には達していない。【０００９】
例えば、非特許文献１には、MTSを付加した人工ウイルスベクターの内部にHSP制御下にあるミトコンドリア内で転写誘導されるDNAを封入し、ミトコンドリアに直接的にウイルスベクターを導入して目的タンパク質を発現させようとする方法が提唱されている。この方法は、導入されたウイルスベクターからの目的タンパク質の発現レベルが比較的高いという利点を有する一方、ウイルスベクターであることに起因する安全性の問題を伴うことに加え、目的タンパク質が期待通りにミトコンドリア内で発現しているかについての検証が完全にはなされていない。【００１０】
本発明者らは、ミトコンドリア内で直接的に目的タンパク質を発現させることができる外来遺伝子発現システムの一つとして、動物細胞の細胞核内で転写活性を示すプロモーター配列、及びトリプトファンに対応するコドンとして１つ又は複数のTGAを含む目的タンパク質をコードするコーディング領域を前記プロモーター配列の制御下に有する組換え発現ベクターを提案した（特許文献２）。この発現ベクターをミトコンドリア指向性脂質膜構造体を利用してミトコンドリア内に送達することで、細胞質内での望ましくない目的タンパク質の翻訳を回避し、さらにミトコンドリア内での目的タンパク質の発現量をより高めることが可能となるが、ミトコンドリア内での目的タンパク質の効率的な発現に対するニーズは依然として高い。【００１１】
上記の従来技術において、ミトコンドリア内に送達される核酸は専らDNAであったが、近年のRNA合成技術の進歩に伴い、DNAに代えてRNAを直接的にミトコンドリア内に送達することによる遺伝子治療戦略が提唱されている。しかしながら、目的タンパク質をコードするRNAをミトコンドリア内に送達することができる、臨床応用に適応可能な手法は未だ開発されていない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１２】
【非特許文献１】Yu,H. et al., Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 2012, 109: E1238-47
【特許文献】
【００１３】
【特許文献１】US2015/0225740
【特許文献２】WO2017/090763
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
本発明は、ミトコンドリア内でタンパク質を効率的に発現させるためのRNA及びDNA並びにこれらをミトコンドリアへ導入する方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
本発明者らは、塩基配列に一定の特徴を有する核酸特にRNAをミトコンドリア内に送達することで、ミトコンドリア内での目的タンパク質の効率的な発現が可能となることを見いだし、以下の発明を完成させた。【００１６】
（１）  以下のa）からd）のいずれかに示される核酸を封入してなるミトコンドリア指向性脂質膜構造体。
a）第一のミトコンドリアtRNAの塩基配列、目的タンパク質をコードするmRNAの塩基配列及び第二のミトコンドリアtRNAの塩基配列をこの順番で含むRNAであって、前記mRNAの塩基配列は、トリプトファンコドンとして１つ又は複数のUGAを有する、前記RNA
b）プロモーターの塩基配列及びa）のRNAに相補的な塩基配列を含むDNA
c）目的タンパク質をコードするmRNAの塩基配列及びその3'末端側に存在するポリA鎖の塩基配列を含むRNAであって、前記mRNAの塩基配列は、トリプトファンコドンとして１つ又は複数のUGAを、開始コドンとしてAUGを、及び終止コドンとしてUAAを有する、前記RNA
d）プロモーターの塩基配列及びc）のRNAに相補的な塩基配列を含むDNA
（２）  前記a）におけるmRNAの塩基配列及び２つのミトコンドリアtRNAの塩基配列が連続している、（１）に記載の脂質膜構造体。
（３）  前記c）におけるmRNAの塩基配列とポリA鎖の塩基配列が連続している、（１）に記載の脂質膜構造体。
（４）  目的タンパク質が野生型のミトコンドリアDNA由来ミトコンドリアタンパク質である、（１）から（３）のいずれか一項に記載の脂質膜構造体。
（５）  ジオレイルホスファチジルエタノールアミン及びスフィンゴミエリンを脂質膜の構成脂質として含有する、（１）から（４）のいずれか一項に記載の脂質膜構造体。
（６）  配列番号１で示されるアミノ酸配列からなるペプチドを脂質膜表面に有する、（１）から（５）のいずれか一項に記載の脂質膜構造体。
（７）  以下のa）からd）のいずれかに示される核酸を有効成分として含有する、ミトコンドリア病の治療及び／又は予防のための医薬組成物。
a）第一のミトコンドリアtRNAの塩基配列、目的タンパク質をコードするmRNAの塩基配列及び第二のミトコンドリアtRNAの塩基配列をこの順番で含むRNAであって、前記mRNAの塩基配列は、トリプトファンコドンとして１つ又は複数のUGAを有する、前記RNA
b）プロモーターの塩基配列及びa）のRNAに相補的な塩基配列を含むDNA
c）目的タンパク質をコードするmRNAの塩基配列及びその3'末端側に存在するポリA鎖の塩基配列を含むRNAであって、前記mRNAの塩基配列は、トリプトファンコドンとして１つ又は複数のUGAを、開始コドンとしてAUGを、及び終止コドンとしてUAAを有する、前記RNA
d）プロモーターの塩基配列及びc）のRNAに相補的な塩基配列を含むDNA
（８）  前記a）におけるmRNAの塩基配列及び２つのミトコンドリアtRNAの塩基配列が連続している、（７）に記載の医薬組成物。
（９）  前記c）におけるmRNAの塩基配列とポリA鎖の塩基配列が連続している、（７）に記載の医薬組成物。
（１０）  目的タンパク質が野生型のミトコンドリアDNA由来ミトコンドリアタンパク質である、（７）から（９）のいずれか一項に記載の医薬組成物。
（１１）  核酸がミトコンドリア指向性脂質膜構造体に封入されている、（７）から（１０）のいずれか一項に記載の医薬組成物。
（１２）  ミトコンドリア病患者又はミトコンドリア病を発症するおそれのある者に由来する細胞に、以下のa）からd）のいずれかに示される核酸をインビトロで導入することを含む、ミトコンドリア病の治療及び／又は予防のための細胞製剤の製造方法。
a）第一のミトコンドリアtRNAの塩基配列、目的タンパク質をコードするmRNAの塩基配列及び第二のミトコンドリアtRNAの塩基配列をこの順番で含むRNAであって、前記mRNAの塩基配列は、トリプトファンコドンとして１つ又は複数のUGAを有する、前記RNA
b）プロモーターの塩基配列及びa）のRNAに相補的な塩基配列を含むDNA
c）目的タンパク質をコードするmRNAの塩基配列及びその3'末端側に存在するポリA鎖の塩基配列を含むRNAであって、前記mRNAの塩基配列は、トリプトファンコドンとして１つ又は複数のUGAを、開始コドンとしてAUGを、及び終止コドンとしてUAAを有する、前記RNA
d）プロモーターの塩基配列及びc）のRNAに相補的な塩基配列を含むDNA
（１３）  前記a）におけるmRNAの塩基配列及び２つのミトコンドリアtRNAの塩基配列が連続している、（１２）に記載の製造方法。
（１４）  前記c）におけるmRNAの塩基配列とポリA鎖の塩基配列が連続している、（１２）に記載の製造方法。
（１５）  目的タンパク質が野生型のミトコンドリアDNA由来ミトコンドリアタンパク質である、（１２）から（１４）のいずれか一項に記載の製造方法。
（１６）  核酸がミトコンドリア指向性脂質膜構造体に封入されている、（１２）から（１５）のいずれか一項に記載の製造方法。
（１７）  目的タンパク質をコードするmRNAの塩基配列及びその3'末端側に存在するポリA鎖の塩基配列を含むRNAであって、前記mRNAの塩基配列は、トリプトファンコドンとして１つ又は複数のUGAを、開始コドンとしてAUGを、及び終止コドンとしてUAAを有する、前記RNA。
（１８）  mRNAの塩基配列とポリA鎖の塩基配列が連続している、（１７）に記載のRNA。
（１９）  タンパク質が野生型のミトコンドリアDNA由来ミトコンドリアタンパク質である、（１７）又は（１８）に記載のRNA。
（２０）  プロモーターの塩基配列及び（１７）から（１９）のいずれか一項に規定されるRNAに相補的な塩基配列を含む、DNA。
（２１）  配列番号２に示される塩基配列を含むプライマーDNAと配列番号４に示される塩基配列からなるプライマーDNAとの組み合わせからなる野生型検出用プライマーDNAセットと、
配列番号２に示される塩基配列を含むプライマーDNAと配列番号１０に示される塩基配列からなるプライマーDNAとの組み合わせからなる変異型検出用プライマーDNAセット
とを含む、ミトコンドリアND3遺伝子の点変異であるT10158Cを検出するためのキット。
（２２）  配列番号２に示される塩基配列を含むプライマーDNAが、配列番号３に示される塩基配列からなるプライマーDNAである、（２１）に記載のキット。
（２３）  配列番号２に示される塩基配列を含むプライマーDNAが、配列番号３に示される塩基配列において5'末端及び／又は3'末端の１又は２個の塩基が欠失した塩基配列からなるプライマーDNAである、（２１）に記載のキット。
（２４）  配列番号２に示される塩基配列を含むプライマーDNAが、配列番号２に示される塩基配列からなるプライマーDNAである、（２１）又は（２３）に記載のキット。
【発明の効果】
【００１７】
本発明の脂質膜構造体及び核酸は、ミトコンドリアにおいてより効率的に、かつ選択的に目的タンパク質を発現させることができることから、より安全でかつ効果の優れたミトコンドリア病治療用の医薬として、又は細胞製剤の製造において利用することができる。また、本発明のプライマーDNAセットは、これを用いたPCRを行うことにより、ミトコンドリアND3タンパク質の点変異であるT10158Cの変異を簡便に検出及び定量することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】本発明の一態様であるtRG-mRNA(ND3)-tRRの構造及び対応するDNAの塩基配列を表す図である。
【図２】本発明の一態様であるATG-mRNA(ND3)-polyAの構造及び対応するDNAの塩基配列を表す図である。
【図３】ミトコンドリアND3遺伝子の点変異（T10158C）を検出するために設計された11種類のプライマーDNAセットについて、横軸に変異率の理論値を、縦軸に定量的PCRで実測した測定値から算出した変異率をプロットした検量線である。
【図４】図３に示すプライマーDNAセット7及び11について、横軸に変異率の理論値を、縦軸に３回の定量的PCRで実測した測定値から算出した変異率の平均値±標準誤差をプロットした検量線である。
【図５】7SP細胞のミトコンドリアにATG-mRNA(ND3)-polyA／MITOを導入したときのミトコンドリアND3 mRNAに相補的なcDNAにおけるT10158C変異率の変化を示すグラフである。
【図６】7SP細胞のミトコンドリアにATG-mRNA(ND3)-polyA／MITOを導入したときのミトコンドリアND3 mRNAに相補的なcDNAにおけるT10158C変異率の経時変化を示すグラフである。
【図７】7SP細胞のミトコンドリアにATG-mRNA(ND3)-polyA／MITOを導入したとき及び市販のRNA導入試薬でATG-mRNA(ND3)-polyAを導入したときの、それぞれのミトコンドリアND3 mRNAに相補的なcDNAにおけるT10158C変異率の経時変化を示すグラフである。
【図８】7SP細胞のミトコンドリアにATG-mRNA(ND3)-polyA／MITO又はtRG-mRNA(ND3)-tRR／MITOを導入したときの、及び市販のRNA導入試薬を用いてATG-mRNA(ND3)-polyA及びtRG-mRNA(ND3)-tRRを導入したときの、それぞれのミトコンドリアND3 mRNAに相補的なcDNAにおけるT10158C変異率の変化を示すグラフである。
【図９】ATG-mRNA(ND3)-polyA／MITO又はtRG-mRNA(ND3)-tRR／MITOを、及び市販の核酸導入試薬を用いてtRG-mRNA(ND3)-tRR又はATG-mRNA(ND3)-polyAをそれぞれ導入した7SP細胞のミトコンドリア呼吸能測定のタイムスケジュールを示す図である。
【図１０】ATG-mRNA(ND3)-polyA／MITO又はtRG-mRNA(ND3)-tRR／MITOを、及び市販の核酸導入試薬を用いてtRG-mRNA(ND3)-tRR又はATG-mRNA(ND3)-polyAをそれぞれ導入した7SP細胞のミトコンドリア呼吸能測定結果を示したグラフである。
【図１１】ミトコンドリア呼吸能を、基礎呼吸（basal OCR、左上）、ATP産生（ATP-linked OCR、右上）、最大呼吸（maximal OCR、左下）及び予備呼吸能（Spare Capacity、右下）に分けて表したグラフである。
【図１２】ATG-mRNA(ND3)-polyA／MITOを7SP細胞に添加した際の細胞取り込み能を評価した結果を示す。
【図１３】ATG-mRNA(ND3)-polyA／MITOが導入された細胞のミトコンドリアに局在していることを示す蛍光顕微鏡写真である。図左が蛍光標識された脂質膜構造体、図中央がミトコンドリア、図右がそれらの重ね合わせを示す。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
核酸及びこれを封入した脂質膜構造体
本発明は、以下のa）からd）のいずれかに示される核酸、及びこれを封入してなるミトコンドリア指向性脂質膜構造体を提供する；
a）第一のミトコンドリアtRNAの塩基配列、目的タンパク質をコードするmRNAの塩基配列及び第二のミトコンドリアtRNAの塩基配列をこの順番で含むRNAであって、前記mRNAの塩基配列は、トリプトファンコドンとして１つ又は複数のUGAを有する、前記RNA
b）プロモーターの塩基配列及びa）のRNAに相補的な塩基配列を含むDNA
c）目的タンパク質をコードするmRNAの塩基配列及びその3'末端側に存在するポリA鎖の塩基配列を含むRNAであって、前記mRNAの塩基配列は、トリプトファンコドンとして１つ又は複数のUGAを、開始コドンとしてAUGを、及び終止コドンとしてUAAを有する、前記RNA
d）プロモーターの塩基配列及びc）のRNAに相補的な塩基配列を含むDNA。
【００２０】
a）のRNAは、第一のミトコンドリアtRNA（以下、mt-tRNAと表す）の塩基配列、目的タンパク質をコードするmRNAの塩基配列及び第二のmt-tRNAの塩基配列をこの順番で含む。
【００２１】
a）のRNAにおいて、mt-tRNAの塩基配列は、ミトコンドリアゲノムに含まれるヒトでは計22種類のmt-tRNA遺伝子の塩基配列から任意に選択して使用することができる。また、第一及び第二のmt-tRNAの塩基配列は、互いに異なったものでもよく、また同じものでもよい。
【００２２】
本発明において目的タンパク質は、ミトコンドリア内で発現させる、言い換えればその機能を発揮させることが望まれるタンパク質であればよく、ミトコンドリア病の治療に有効であると期待されるタンパク質の他に、ミトコンドリア内で発現させることに学術的な関心が持たれるタンパク質等を挙げることができる。かかる観点で、目的タンパク質は、野生型の核DNA由来ミトコンドリアタンパク質若しくは野生型のミトコンドリアDNA由来ミトコンドリアタンパク質又はそれらの活性型変異体、任意の異種のタンパク質等のいずれであってもよい。特に好ましい目的タンパク質は、野生型の核DNA由来ミトコンドリアタンパク質又は野生型のミトコンドリアDNA由来ミトコンドリアタンパク質である。また、目的タンパク質は、その大きさ（アミノ酸残基数）及び化学的特性（疎水性、親水性、電荷その他の特性）に特別な制限はない。
【００２３】
目的タンパク質をコードするmRNAの塩基配列は、最終的にミトコンドリア内で目的タンパク質へと翻訳され得るものであればよく、単一のオープンリーディングフレーム（ORF）からなるものでも、複数のエクソンがイントロンによって分断されてなる構成を有するものであってもよい。また目的タンパク質をコードするmRNAの塩基配列は、トリプトファン（Trp）コドンとして１つ又は複数のUGAを有するものが好ましい。Trpコドンは、目的タンパク質のTrp残基に対応するコドンであるUGGがUGAに人為的に変更されたものであってもよく、またTrp残基へアミノ酸残基を置換しても目的タンパク質の活性を保持することができる位置のアミノ酸残基に対応するコドンがUGAに人為的に変更されたものであってもよい。このようなコドンの人為的な変更は、一般的な遺伝子組換え技術によって行うことができる。
【００２４】
細胞質におけるmRNAからの翻訳ではUGAは終止コドンに相当するが、ミトコンドリアにおけるmRNAからの翻訳ではUGAはTrpをコードするコドンに相当する。したがって、a）のRNAを用いて動物細胞を形質転換した場合、a）のRNAが細胞質のリボソームに送達されたときでも、目的タンパク質の合成はUGAの位置で停止するので、少なくとも目的タンパク質の全体は合成されない。これによって、細胞質内において目的タンパク質の全体が合成されてしまうことによる負の影響を抑制することができる。
【００２５】
一方、a）のRNAがミトコンドリアに送達されたときは、目的タンパク質の合成はUGAの位置で停止することなく進行し、その結果目的タンパク質の全体が適切に合成され、ミトコンドリア内でその機能を発揮することができる。
【００２６】
細胞質内における目的タンパク質の望まれない発現を抑制するという観点において、複数のUGAを含む塩基配列の利用が好ましい。また、細胞質内における目的タンパク質の望まれない機能発現をより確実に抑制するという観点において、5'末端（目的タンパク質のN末端）により近い位置に１つ又は複数のUGAが含まれることがさらに好ましい。さらに、目的タンパク質が通常は細胞質内で翻訳されるタンパク質である場合は、上記UGA以外のコドンについても、ミトコンドリアのコドンを使用するようにコーディング配列を適宜改変することが好ましい。上記の一例は、細胞核ゲノムにおいてArg残基をコードするがミトコンドリアゲノムにおいて終止コドンをコードするAGGを、細胞核ゲノム、ミトコンドリアゲノムのいずれにおいてもArg残基をコードするCGGに改変することである。
【００２７】
目的タンパク質をコードするmRNAの塩基配列は、開始コドンとしてAUGを、及び終止コドンとしてUAAをさらに有することが好ましい。AUG及びUAAは、核DNA由来のmRNAにおいてそれぞれ開始コドン及び終止コドンとして主要なものであるが、これらをミトコンドリア内で発現させる目的タンパク質をコードするmRNAにおいて採用することで、翻訳効率の向上が期待される。
【００２８】
a）のRNAにおいて、第一のmt-tRNAの塩基配列、目的タンパク質をコードするmRNAの塩基配列及び第二のmt-tRNAの塩基配列は、介在配列、例えばミトコンドリアゲノムにおける各々の5'末端側及び3'末端側のフランキング配列等を介して連結されていてもよいが、介在配列が存在せずに直接的に連結されていること、すなわちmRNAの塩基配列及び２つのミトコンドリアtRNAの塩基配列が連続していることが好ましい。介在配列が存在する場合、その長さは、1〜10塩基程度、例えば1〜6塩基、好ましくは1〜3塩基である。また、a）のRNAは、第一のmt-tRNAの塩基配列の5'末端側及び第二のmt-tRNAの塩基配列の3'末端側に、上記のフランキング配列等を1〜10塩基程度、例えば1〜6塩基、好ましくは1〜3塩基、さらに有していてもよい。
【００２９】
a）のRNAがミトコンドリア内に送達されると、第一及び第二のmt-tRNAに挟まれた目的タンパク質をコードするmRNAが翻訳されて、目的タンパク質が合成される。
【００３０】
なお、本発明において、a)のRNAは、目的タンパク質をコードするmRNAの塩基配列を複数個含み、かつ前記mRNAの塩基配列の各々がその5'末端側及び3'末端側にミトコンドリアtRNAの塩基配列を有するRNAであってもよい。かかるRNAは、例えば目的タンパク質をコードするmRNAの塩基配列を2個含む場合、「第一のミトコンドリアtRNAの塩基配列、第一の目的タンパク質をコードするmRNAの塩基配列、第二のミトコンドリアtRNAの塩基配列、第二の目的タンパク質をコードするmRNAの塩基配列及び第三のミトコンドリアtRNAの塩基配列をこの順番で含むRNAであって、前記第一及び第二のmRNAの塩基配列は、トリプトファンコドンとして１つ又は複数のUGAを有する、前記RNA」と表すことができる。かかるRNAの詳細は、a)のRNAについて上で説明したとおりであり、含まれる複数個の目的タンパク質をコードするmRNAの塩基配列、及び複数個のミトコンドリアtRNAの塩基配列は、互いに異なったものであっても同じものであってもよい。
【００３１】
b）のDNAは、プロモーターの塩基配列及びa）のRNAすなわち前記a）のRNAに相補的な塩基配列を含むDNAである。具体的には、b）のDNAは、プロモーターの塩基配列、第一のmt-tRNAの塩基配列に相補的な塩基配列、目的タンパク質をコードするmRNAの塩基配列に相補的な塩基配列及び第二のmt-tRNAの塩基配列に相補的な塩基配列をこの順番で含むDNAである。ここで、第一及び第二のmt-tRNAの塩基配列、目的タンパク質及びこれをコードするmRNAの塩基配列の各特徴は、a）のRNAについて説明したとおりである。
【００３２】
プロモーター配列は、a）のRNAに相補的な塩基配列をその制御下に有する。プロモーター配列の制御下に有するとは、a）のRNAがプロモーター配列に転写可能に連結されていること、すなわちプロモーター配列の転写活性によって転写が開始される範囲内にa）のRNAに相補的な塩基配列が存在することを意味する。例としては、プロモーター配列の3'末端から概ね1〜200塩基の範囲内に第一のmt-tRNAがある場合を挙げることができるが、そのような範囲はプロモーター配列の種類によって変化し、当業者によって適宜調節することができる。
【００３３】
プロモーターは、転写活性すなわちmRNAの転写誘導能を示すものであれば特に制限はないが、ミトコンドリアに送達された際により効率的かつ選択的な目的タンパク質を発現させるためには、特許文献WO2017/090763及びUS2018/0362999（これらの文献は、その全体が参照として本明細書に取り込まれる）に記載されるように、哺乳動物の細胞核内で転写活性を示すプロモーターが好ましい。哺乳動物の細胞核内で転写活性を示すプロモーターの例としては、サイトメガロウイルス（CMV）プロモーター、シミアンウイルス（SV）40プロモーター、ラウスサルコーマウイルス（RSV）プロモーター、EF1αプロモーター、βアクチンプロモーター及びT7プロモーター等を挙げることができ、CMVプロモーター又はRSVプロモーターの利用が好ましい。またこれらは、転写活性が損なわれない限り、塩基配列に置換その他の変異が加わったものであってもよい。
【００３４】
b）のDNAは一本鎖の形態にあってもよく、又はこれに相補する塩基配列からなるDNAとの二本鎖の形態にあってもよい。
【００３５】
b）のDNAがミトコンドリアに送達されることにより、前記プロモーターが機能してa）のRNAがミトコンドリア内で転写合成され、目的タンパク質をコードするmRNAが翻訳されて、目的タンパク質が合成される。
【００３６】
c）のRNAは、目的タンパク質をコードするmRNAの塩基配列及びその3'末端側に存在するポリA鎖の塩基配列を含むRNAであって、前記mRNAの塩基配列は、トリプトファンコドンとして１つ又は複数のUGAを、開始コドンとしてAUGを、及び終止コドンとしてUAAを有する。
【００３７】
c）のRNAにおいて、目的タンパク質及びこれをコードするmRNAの特徴は、a）のRNAにおいて説明したとおりである。また、ポリA鎖は、真核生物の成熟mRNAにおいて3'非翻訳領域の下流に認められるAが連続した配列であり、その長さは40〜60塩基程度であればよい。
【００３８】
c）のRNAにおいて、目的タンパク質をコードするmRNAの塩基配列とポリA鎖の塩基配列は、介在配列、例えばミトコンドリアゲノムにおける各々の5'末端側及び3'末端側のフランキング配列等を数塩基〜数十塩基伴って連結されていてもよいが、介在配列が存在せずに直接的に連結されていること、すなわち目的タンパク質をコードするmRNAの塩基配列とポリA鎖の塩基配列が連続していることが好ましい。介在配列が存在する場合、その長さは、1〜10塩基程度、例えば1〜6塩基、好ましくは1〜3塩基である。また、c）のRNAは、目的タンパク質をコードするmRNAの塩基配列の5'末端側及びポリA鎖の塩基配列の3'末端側に、上記のフランキング配列等を1〜10塩基程度、例えば1〜6塩基、好ましくは1〜3塩基、さらに有していてもよい。
【００３９】
d）のDNAは、プロモーターの塩基配列及びc）のRNAに相補的な塩基配列を含むDNAである。具体的には、d）のDNAは、プロモーターの塩基配列、目的タンパク質をコードするmRNAの塩基配列に相補的な塩基配列及びポリA鎖の塩基配列に相補的な塩基配列をこの順番で含むDNAである。
【００４０】
ここで、プロモーターは前記b）のDNAにおいて説明したとおりであり、目的タンパク質及びこれをコードするmRNAの塩基配列の各特徴はa）のRNAにおいて、ポリA鎖の塩基配列の特徴はc)のRNAにおいて各々説明したとおりである。またプロモーター配列は、c）のRNAに相補的な塩基配列をその制御下に有するが、その意義はb）のDNAにおいて説明したとおりである。
【００４１】
d）のDNAがミトコンドリアに送達されることにより、前記プロモーターが機能してc）のRNAがミトコンドリア内で転写合成され、mRNAの翻訳を経て、目的タンパク質が合成される。
【００４２】
本発明の第１の態様は、前記a）からd）のいずれかの核酸を封入してなるミトコンドリア指向性脂質膜構造体に関する。第１の態様におけるミトコンドリア指向性脂質膜構造体は、脂質膜の構成脂質としてスフィンゴミエリン（SM）を、好ましくはジオレイルホスファチジルエタノールアミン（DOPE）とSMとを含む。ミトコンドリア指向性脂質膜構造体はまた、脂質膜表面に配列番号１で示されるアミノ酸配列からなるペプチド（以下、KALAペプチドと表す）を有することが好ましい。
【００４３】
ミトコンドリア指向性脂質膜構造体の好ましい具体例は、特許第5067733号及びWO2006/095837にその製造方法と共に詳細に記載された脂質膜構造体において、DOPEとSMとを脂質膜の構成脂質として含み、かつ脂質膜表面がオクタアルギニンペプチドで修飾された脂質膜構造体、又はWO2017/090763及びUS2018/0362999にその製造方法と共に詳細に記載された脂質膜構造体において、DOPEとSMとを脂質膜の構成脂質として含み、かつ脂質膜表面がKALAペプチドで修飾された脂質膜構造体である。これらの文献は、その全体が参照として本明細書に取り込まれる。
【００４４】
KALAペプチドは、Shaheenら（Biomaterials, 2011, 32: 6342-6350）において、脂質膜同士の膜融合を促進する機能を有する脂質膜融合性ペプチドとして記載されている。上記の脂質膜構造体の好ましい例においては、このKALAペプチドが脂質膜構造体の表面に置かれることで脂質膜構造体を細胞内オルガネラであるミトコンドリアに選択的に送達させる能力を利用するものである。
【００４５】
本発明の第１の態様において最も好ましい脂質膜構造体は、前記a）からd）のいずれかの核酸が封入され、脂質膜の構成脂質としてDOPEとSMとを含み、かつ脂質膜の表面にKALAペプチドを有する脂質膜構造体である。この脂質膜構造体は、WO2017/090763及びUS2018/0362999に記載された、KALAペプチドで修飾されDNAを封入した脂質膜構造体の製造法に準じて、DNAを前記a）からd）のいずれかの核酸にそれぞれ置き換えることで製造することができる。
【００４６】
医薬組成物
本発明は、第１の態様において説明したとおりの特徴を有するa）からd）のいずれかに示される核酸を有効成分として含有する、ミトコンドリア病の治療及び／又は予防のための医薬組成物を、別の態様として提供する。かかる医薬組成物は、第１の態様において説明したとおりの特徴を有するa）からd）のいずれかに示される核酸をそのまま含むものであってもよいが、第１の態様にかかるミトコンドリア指向性脂質膜構造体の形態にある核酸を有効成分として含む医薬組成物であることが特に好ましい。
【００４７】
本態様の医薬組成物は、注射剤、点滴剤等の非経口製剤の形態で用いられることができる。また、このような非経口製剤に用いることができる担体としては、例えば、生理食塩水や、ブドウ糖、D-ソルビトール等を含む等張液といった水性担体が挙げられる。
【００４８】
本態様の医薬組成物は、薬学的に許容される緩衝剤、安定剤、保存剤その他の添加剤といった成分を含んでもよい。薬学的に許容される成分は当業者において周知であり、当業者が通常の実施能力の範囲内で、例えば第十七改訂日本薬局方その他の規格書に記載された成分から製剤の形態に応じて適宜選択して使用することができる。
【００４９】
本態様の医薬組成物の投与方法は特に制限されないが、非経口製剤である場合は、例えば血管内投与（好ましくは静脈内投与）、腹腔内投与、腸管内投与、皮下投与等を挙げることができる。好ましい実施形態の一つにおいて、本発明の治療剤は、静脈内投与により生体に投与される。
【００５０】
ミトコンドリア病は、2009年に日本国の難病対策の一つである特定疾患治療研究事業の対象に認められた難病の１つであり、ミトコンドリア機能が障害されて臨床症状が出現する病態の総称である。現在では、ミトコンドリア病における機能異常の主体はエネルギー産生低下と考えられている。ミトコンドリア病の病因は、核ゲノムDNAの異常とミトコンドリアゲノムDNA（mt-DNA）の異常とに分けられ、後者はmt-DNA上の塩基の欠失／重複、点変異（質的変化）及びmt-DNA量の減少（量的変化）を含むとされている。
【００５１】
本態様の医薬組成物は、ミトコンドリア病の原因となる個々の遺伝子異常に対応した野生型のタンパク質をコードするmRNAをミトコンドリア内に供給することにより、ミトコンドリア病の治療及び／又は予防効果を示すものと期待される。
【００５２】
本明細書において用いられる治療及び／又は予防は、疾患の治癒、一時的寛解又は予防等を目的とする医学的に許容される全てのタイプの治療的及び／又は予防的介入を包含する。すなわちミトコンドリア病の治療及び／又は予防は、ミトコンドリア病の進行の遅延又は停止、病変の退縮又は消失、発症の予防又は再発の防止等を含む、種々の目的の医学的に許容される介入を包含する。
【００５３】
本態様の医薬組成物は、ミトコンドリア病の治療及び／又は予防に用いることができる。したがって本態様の医薬組成物の使用は、当該組成物を用いてミトコンドリア病を治療及び／又は予防する方法として表すこともでき、本発明はそのような方法の発明も提供する。
【００５４】
さらに、本態様の医薬組成物をミトコンドリア病患者又はミトコンドリア病を発症するおそれのある者に投与することにより、ミトコンドリア病を治療及び／又は予防することができることが期待される。このように、本発明は、本態様の医薬組成物の有効量をミトコンドリア病患者又はミトコンドリア病を発症するおそれのある者に投与することによる、ミトコンドリア病を治療及び／又は予防する方法も提供する。ここで「有効量」とは、ミトコンドリア病を治療及び／又は予防するのに効果的な量を意味し、かかる量はミトコンドリア病の症状の程度その他の医学的要因によって適宜調節される。
【００５５】
細胞製剤の製造方法
本発明は、ミトコンドリア病患者又はミトコンドリア病を発症するおそれのある者に由来する細胞に、第１の態様において説明したとおりの特徴を有するa）からd）のいずれかに示される核酸をインビトロで導入することを含む、ミトコンドリア病の治療及び／又は予防のための細胞製剤の製造方法を、さらなる態様として提供する。
【００５６】
核酸を導入しようとするミトコンドリア病患者又はミトコンドリア病を発症するおそれのある者由来の細胞は、ミトコンドリア病患者又はミトコンドリア病を発症するおそれのある者から採取された体細胞であることが好ましい。このような体細胞としては、例えば、これらの者の心臓、脳、骨格筋その他のミトコンドリア病によって障害を受けた若しくは受けるおそれがある組織から分離された細胞、又はかかる組織を構成する細胞に分化する能力を持つ細胞が挙げられる。
【００５７】
ミトコンドリア病患者又はミトコンドリア病を発症するおそれのある者由来の細胞に導入される核酸は、そのままの形態であってもよいが、導入効率の観点から、本発明の第１の態様であるミトコンドリア指向性脂質膜構造体の形態にあることが好ましい。
【００５８】
第１の態様において説明したとおりの特徴を有するa）からd）のいずれかに示される核酸を、ミトコンドリア病患者又はミトコンドリア病を発症するおそれのある者由来の細胞にインビトロで導入することで、ミトコンドリア病をもたらすミトコンドリアタンパク質をコードするミトコンドリアmRNA（mt-mRNA）における変異率が低下した体細胞を製造することができる。当該細胞は、これをミトコンドリア病患者に戻してミトコンドリア病を治療及び／又は予防するための細胞製剤として利用することができる。
【００５９】
本発明において、mt-mRNAにおける変異率とは、ミトコンドリア病をもたらすミトコンドリアタンパク質をコードする特定のmt-mRNAについての、mt-mRNA全分子中の変異型分子の割合を意味する。
【００６０】
mt-mRNAにおける変異率は、遺伝子変異の定量に用いることができる公知の方法、例えばアレル特異的ＰＣＲ法、インベーダー法、アレル特異的ハイブリダイゼーション法、次世代シーケンス法等を用いて定量することができる。これらの方法の中で好ましく用いられるものの１つは、定量的ARMS-PCR法（Amplification Refractory Mutation Systems PCR、例えばV. Venegas et al, Methods Mol. Biol. 2012, 837, 313-326、この文献は、その全体が参照として本明細書に取り込まれる）である。この方法では、検出対象となる点変異の塩基とその前後の塩基配列を基に、野生型配列を増幅するためのプライマーDNAセット（野生型検出用プライマーDNAセット）と点変異を含む配列を増幅するためのプライマーDNAセット（変異型検出用プライマーDNAセット）とを設計し、各プライマーDNAセットを用いて、測定対象のmt-mRNAの逆転写反応により得られたDNAを鋳型とした定量的PCRを行う。定量的PCRにより決定された野生型検出用プライマーDNAセットを用いた場合のCT値（CTwild）及び変異型検出用プライマーDNAセットを用いた場合のCT値（CTmut）を、下記式にあてはめることで、変異率を算出することができる。
【数１】
2019164003.tif 000003
【００６１】
点変異検出用プライマーDNA
本発明はさらに、配列番号２に示される塩基配列を含むプライマーDNAと配列番号４に示される塩基配列からなるプライマーDNAとの組み合わせからなる野生型検出用プライマーDNAセットと、配列番号２に示される塩基配列を含むプライマーDNAと配列番号１０に示される塩基配列からなるプライマーDNAとの組み合わせからなる変異型検出用プライマーDNAセットとを含む、ミトコンドリアND3遺伝子の点変異であるT10158Cを検出するためのキットを提供する。
【００６２】
点変異T10158Cはミトコンドリア病の原因の１つとなる遺伝子変異であり（McFarland R. et al., Ann Neurol. 2004, 55(1):58-64等）、mt-DNA塩基配列（ヒトミトコンドリアゲノムDNAの塩基配列、NCBI Reference Sequence: NC_012920.1）の10158番目の塩基が正常な場合はチミンであるのに対し、シトシンに置換されている。
【００６３】
配列番号２に示される塩基配列を含むプライマーDNAと配列番号４に示される塩基配列からなるプライマーDNAとの組み合わせからなる野生型検出用プライマーDNAセットは、検出対象のmt-DNA又はmt-mRNAからの逆転写反応生成物であるcDNAを鋳型としたPCRを行うことにより、10158番目の塩基がチミンであるmt-DNA又はこれに対応するmt-mRNAを特異的に検出することができる。
【００６４】
また、配列番号２に示される塩基配列を含むプライマーDNAと配列番号１０に示される塩基配列からなるプライマーDNAとの組み合わせからなる変異型検出用プライマーDNAセットは、検出対象のmt-DNA又はmt-mRNAからの逆転写反応生成物であるDNAを鋳型としたPCRを行うことにより、10158番目の塩基がシトシンであるmt-DNA又はこれに対応するmt-mRNAを特異的に検出することができる。
【００６５】
配列番号２に示される塩基配列を含むプライマーDNAは、例えば、配列番号３に示される塩基配列からなるプライマーDNA、又は配列番号３に示される塩基配列の5'末端側及び／若しくは3'末端側に1若しくは複数個の塩基、例として1〜10個、好ましくは1〜5個、より好ましくは1〜3個、特に1若しくは2個の塩基が付加された塩基配列からなるプライマーDNA、又は配列番号３に示される塩基配列において5'末端及び／若しくは3'末端の1若しくは複数個の塩基、例として1〜5個、好ましくは1〜3個、特に1若しくは2個の塩基が欠失した塩基配列からなるプライマーDNAであることができる。配列番号３に示される塩基配列において5'末端及び／若しくは3'末端の1若しくは複数個の塩基が欠失した塩基配列からなるプライマーDNAの好ましい例は、配列番号２に示される塩基配列からなるプライマーDNAである。
【００６６】
上記の野生型検出用プライマーDNAセット及び変異型検出用プライマーDNAセットを用いて、mt-DNA又はmt-mRNAからの逆転写反応生成物であるcDNAを鋳型としたPCRを行うことにより、当該mt-DNA又はcDNA中に含まれる点変異T10158Cを有する分子の割合、すなわち変異率を定量することができる。変異率定量の詳細は上で述べたとおりである。
【００６７】
本態様のキットは、野生型検出用プライマーDNAセット及び変異型検出用プライマーDNAセットを含むものであればよいが、逆転写酵素、PCR反応用の試薬、バッファー等をさらに含んでもよい。
【００６８】
以下の実施例によって本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらの例に限定されるものではない。
【実施例】
【００６９】
実施例１  mRNAを封入したリポソームの作製
１）mRNA調製用DNAの作製
T7プロモーター、5'末端側の20塩基を含むミトコンドリアtRNAGlyに対応する塩基配列、野生型ND3タンパク質をコードするORF、及び3'末端側の24塩基を含むミトコンドリアtRNAArgに対応する塩基配列をこの順序で有する組換えDNAカセット（tRG-mRNA(ND3)-tRR、配列番号１１、図１）を合成した。また、開始コドンをATAからATGに、及び終止コドンに相当するTをTAAにそれぞれ置き換え、さらに50塩基のポリA配列を5'末端に付加したミトコンドリアND3タンパク質をコードするORFを有する組換えDNAカセット（ATG-mRNA(ND3)-polyA、配列番号１２、図２）を合成した。制限酵素EcoRI及びEcoRVで開環したプラスミドpUC57-Ampに各DNAカセットを組み込んで、T7プロモーターによって各カセットからmRNAが転写される2種のプラスミドDNA（pT7-tRG-mRNA(ND3)-tRR及びpT7-ATG-mRNA(ND3)-polyA）を調製した。【００７０】
２）mRNAの調製
１）で調製したプラスミドDNAを制限酵素Eco RVで処理して直線化したプラスミドDNAを用意し、RiboMAX（商標）Large Scale RNA Production Systems-T7（PROMEGA）を用いたin vitro転写反応によって、T7プロモーターによって転写されるRNA（配列番号１３及び１４）を合成し、RNA clean-up and concentration of RNA（NORGEN）を用いて精製した。【００７１】
３）mRNAを封入したMITO-Porterの調製
0.18 mg/mLのprotamine/HEPES Buffer溶液に0.3 mg/mLの精製mRNA/HEPES Buffer溶液の等量をボルテックスしながら添加し、核酸ナノ粒子溶液（N/P比0.9）を調製した。脂質溶液（DOPE：SM：STR-R8＝9：2：1、DOPE 18μL、SM 8μL、STR-R8 20μL、EtOH 62μL）に核酸ナノ粒子溶液65μLをボルテックスしながら添加して、懸濁液を調製した。5 mLチューブ中のHEPES Buffer 630μLに懸濁液をボルテックスしながら添加した後、これをAmicon Ultra-4中のHEPES Buffer 4 mLに加え、遠心処理（1000 g、25℃、8 min）した。さらにHEPES Buffer 4 mLを加えて再度遠心処理（1000 g、25℃、12 min）して、mRNAが封入されたリポソームを回収した。pT7-tRG-mRNA(ND3)-tRRから転写されたmRNAを封入したリポソームをtRG-mRNA(ND3)-tRR／MITOと、pT7-ATG-mRNA(ND3)-polyAから転写されたmRNAを封入したリポソームをATG-mRNA(ND3)-polyA／MITOとそれぞれ表す。各リポソームの粒子径及びゼータ電位（表面電位）を表１に示す。
【表１】
2019164003.tif 000004
【００７２】
実施例２．ミトコンドリアRNAにおける点変異（T10158C）定量プロトコルの確立
１）プライマー設計
表２に示される塩基配列からなるプライマーDNAをそれぞれ化学合成した。
【表２】
2019164003.tif 000005
【００７３】
実施例１で作製した野生型ND3タンパク質をコードするORFを含むプラスミドDNA（pT7-ATG-mRNA(ND3)-polyA）に、点変異（T10158C）に相当する塩基置換を導入して、ND3の点変異（T10158C）に相当するORFを有するプラスミドDNA（pT7-ATG-mRNA(ND3)MT-polyA）を作製した。【００７４】
２）検量線作成
pT7-ATG-mRNA(ND3)-polyA及びpT7-ATG-mRNA(ND3)MT-polyAを定められた比で混合したDNA混合溶液を鋳型とし、表３に示される組み合わせからなるプライマーDNAセット1〜11及びSYBR Green Realtime PCR Master Mix（TOYOBO）を用いて定量的PCRを行った。PCR条件は95°C /1 min → {95°C /15 sec → 60°C /1 min} の反応を40サイクル行った。
【表３】
2019164003.tif 000006
【００７５】
野生型検出用リバースプライマーを含むプライマーDNAセットを用いたPCRで得られたCT値（CTwild）及び変異型検出用リバースプライマーを含むプライマーDNAセットを用いたPCRで得られたCT値（CTmut）を下記式にあてはめて、各DNA混合溶液における変異率を算出した。
【数２】
2019164003.tif 000007
【００７６】
横軸に変異率の理論値（正常型DNA及び変異型DNAの混合割合）、縦軸にCT値から算出した変異率をプロットして、検量線を作成した（図３）。その結果、プライマーDNAセット7（野生型検出用セットがF：配列番号２とR：配列番号４、変異型検出用セットがF：配列番号２とR：配列番号１０）及びプライマーDNAセット11（野生型検出用セットがF：配列番号３とR：配列番号４、変異型検出用セットがF：配列番号３とR：配列番号１０）が、傾きがほぼ１で線形性のある検量線を与えることが確認された。これら２つのプライマーDNAセットについて試験を３回行ったところ、いずれも再現性の高い検量線が得られ、T10158C変異率の定量に適していることが確認された（図４）。【００７７】
実施例３．7SP細胞におけるT10158C変異率の定量
１）ミトコンドリア病患者由来細胞の調製
ND3遺伝子の点変異（T10158C）を有するミトコンドリア病（Leigh脳症）患者の皮膚生検より、皮膚繊維芽細胞（7SP）細胞を分離し、継代培養した後に凍結保存して、セルストックを調製した。【００７８】
セルストック1mLを37℃の水浴で溶解させ、DMEM（FBS+）9 mLを加え、遠心分離（100 g, 4℃, 7 min）した。上清を除去し、DMEM（FBS+）10 mLを加え細胞を懸濁させ、全量を10 cm dishに移し、インキュベーション（37℃, 5％CO2）して培養を行った。継代は80〜90％コンフルエントになった際に行った。DishをPBS（-）5 mLで洗浄後、0.25％トリプシン溶液を加え2〜3 minインキュベーション（37℃, 5％CO2）し、DMEM（FBS+）8 mLを加え、遠心分離（100 g, 4℃, 7 min）した。セルカウント後10 cm dishに適当な濃度で播種した。【００７９】
２）ミトコンドリア画分及び定量用DNAの調製
7SP細胞（1×106 cells程度）をCell Scrub buffer 100μLに懸濁し、4℃で15 min振とう後、遠心分離（700 g, 4℃, 3 min）した。上清を除去後、MIB（EDTA+）500μLに懸濁した。シリンジ針（27G）により細胞を破砕したのち遠心分離（700 g, 4℃, 10 min）して上清を回収し、0.1 mg/mL RNase溶液を0.5μL添加して25℃で10 minインキュベーションした。遠心分離（700 g, 4℃, 10 min）し上清を回収し、60％ percoll solutionの上に添加して遠心分離（20,400 g, 4℃, 10 min）し、境界面の溶液を200μL回収した。遠心分離（20,400 g, 4℃, 15 min）して上清を除去後、MIB（-）500μLを加えた。再度遠心分離（20,400 g, 4℃, 15 min）して上清を除去し、ミトコンドリア画分を得た。【００８０】
ミトコンドリア画分から、RNase mini kit（QIAGEN N.V）、RNase-Free DNAse Set（QIAGEN N.V）を用いてRNAを抽出し、さらにHigh Capacity RNA-to-cDNA Kit（ABI）を用いてRNAの逆転写反応を行うことで、定量用cDNAを調製した。【００８１】
３）変異率の定量
実施例２のプライマーDNAセット7を用いて7SP細胞のミトコンドリアND3 mRNAに相補的なcDNAにおけるT10158Cの変異率を定量したところ、82.1％であった。T10158Cを有しないHeLa細胞の変異率を同様にして定量したところ、0.86％と実質的に0％であったことから、プライマーDNAセット7を用いたT10158C定量系は正常に機能していると判断した。【００８２】
実施例４．ミトコンドリア病患者由来細胞への正常mRNAの導入
6 well plateに2 mL/wellのDMEM（FBS+）で24時間程度前培養した7SP細胞（1×ｘ105 cells/well）に、RNA量換算で0.6、3、6、30、60ng/wellとなるようにATG-mRNA(ND3)-polyA／MITOをそれぞれ添加して3時間インキュベートした後、培地交換してさらに48時間インキュベートした。インキュベート終了後、実施例３と同様の操作を行って7SP細胞のミトコンドリア画分から定量用cDNAを調製し、プライマーDNAセット７を用いた定量的PCRを行って、ND3 mRNAに相補的なcDNAにおけるT10158C変異率の変化を測定した。その結果、RNAの添加量に依存して変異率が低下し、60 ngのRNA添加によって変異率は2％まで低下することが確認された（図５上）。培地交換後のインキュベート時間を72時間とした場合にも、RNA添加量に応じた変異率の低下が同様に認められた（図５下）。この傾向は、ATG-mRNA(ND3)-polyA／MITOに代えてtRG-mRNA(ND3)-tRR／MITOを用いた場合にも観察された。【００８３】
実施例５  ミトコンドリア病患者由来細胞への正常mRNAの導入
（１）実施例４に倣って、RNA量換算で60ng/wellとなるようにATG-mRNA(ND3)-polyA／MITOを7SP細胞に添加して3時間インキュベートした後に培地交換し、インキュベーションを21日間継続した。培地交換から2、3、4、5、7、14及び21日目に培養細胞の一部を回収し、実施例４と同様にしてミトコンドリア画分から定量用cDNAを調製して、ND3 mRNAに相補的なcDNAにおけるT10158C変異率の経時変化を測定した。その結果、5日目までコントロール（未処理細胞、NT）と比較して変異率が低下することが確認された（図６）。【００８４】
（２）pT7-ATG-mRNA(ND3)-polyAから転写されたmRNA（ATG-mRNA(ND3)-polyA）を、RNA量換算で60ng/wellとなるように市販の核酸導入試薬であるリポフェクタミン i MAX（LFN iMAX、ThermoFisher Scientific）を用いて7SP細胞に導入し、7日目までの変異率の経時変化を（１）と同様にして測定した。この測定結果と、（１）で測定した3日目〜21日目の経時変化の結果とを合わせて図７に示す。市販の核酸導入試薬を用いてmRNAを導入した場合と比較して、本発明の脂質膜構造体を用いてmRNAを導入した方が、変異率がより低下することが確認された。【００８５】
（３）（１）と同様にして、RNA量換算で30ng/well又は60ng/wellとなるようにATG-mRNA(ND3)-polyA／MITO（ATG/MITO）及びtRG-mRNA(ND3)-tRR／MITO（TR/MITO）とをそれぞれ7SP細胞に導入し、またLFN i MAXを用いてATG-mRNA(ND3)-polyA及びpT7- tRG-mRNA(ND3)-tRRから転写されたmRNA（tRG-mRNA(ND3)-tRR）を7SP細胞に導入して、各細胞の3日後の変異率を測定した。その結果を図８に示す。（２）の結果と同様に、市販の核酸導入試薬を用いてmRNAを導入した場合と比較して、本発明の脂質膜構造体を用いてmRNAを導入した方が、変異率がより低下することが確認された。【００８６】
実施例６  ミトコンドリア機能の改善効果の確認
6 well plateに7SP細胞を1×105 cells/well（0.5×105 cells/mL溶液を2mL/well）で播種して24±3時間培養した。ATG-mRNA(ND3)-polyA／MITO又はtRG-mRNA(ND3)-tRR／MITO溶液をRNA量換算で60ng/wellとなるようDMEM（FBS-）で希釈して1 mLとし、7SP細胞に添加して3時間インキュベーションした後、培地をDMEM（FBS+）へ交換してさらにインキュベーションを継続した。また、LFN i MAXを用いてtRG-mRNA(ND3)-tRR又はATG-mRNA(ND3)-polyA（RNA量60ng/well）を7SP細胞に導入して3時間インキュベーションした後、培地をDMEM（FBS+）へ交換してさらにインキュベーションを継続した。【００８７】
培地交換から48時間後に、オリゴマイシン（呼吸鎖複合体V阻害剤；最終濃度2.0μM）、カルボニルシアニド-p-トリフルオロメトキシフェニルヒドラゾン（FCCP、脱共役剤；最終濃度2.0μM）、ロテノン及びアンチマイシンA（呼吸鎖複合体I及びIIIの阻害剤；最終濃度0.5μM）を図９に示すスケジュールに従って順次添加し、ミトコンドリアの酸素消費量（OCR）をSeahorse XFe96 Analyzer（Agilent）を用いて継続的に測定した。オリゴマイシン添加前、オリゴマイシン添加後、FCCP添加後並びにロテノン及びアンチマイシンA添加後の各OCRは、それぞれミトコンドリア呼吸能の評価項目のうちの基礎呼吸（basal OCR）、ATP産生（ATP-linked OCR）、最大呼吸（maximal OCR）及び予備呼吸能（Spare Capacity）をそれぞれ表す。OCRの経時変化を図１０に、上記評価項目ごとのOCRを図１１に示す。図１１において、Mito1はATG-mRNA(ND3)-polyA／MITOを導入した細胞、Mito2はtRG-mRNA(ND3)-tRR／MITOを導入した細胞、Mito3はmRNAを含まない空の脂質膜構造体NITO-Porterを導入した細胞、Mito5はLFN i MAXを用いてATG-mRNA(ND3)-polyAを導入した細胞、Mito6はLFN i MAXを用いてtRG-mRNA(ND3)-tRRを導入した細胞をそれぞれ表す。【００８８】
ATG-mRNA(ND3)-polyA／MITO及びtRG-mRNA(ND3)-tRR／MITOのいずれにおいても、mRNAを搭載しない空の脂質膜構造体及び市販の核酸導入試薬でmRNAを導入した場合と比較して、ミトコンドリア呼吸能がより上昇することが確認された。【００８９】
実施例７．ATG-mRNA(ND3)-polyA／MITOのミトコンドリア局在性の確認
NBD（7-nitrobenz-2-oxa-1,3-diazole、緑色蛍光色素）で標識されたDOPEを脂質膜に含む、蛍光標識されたATG-mRNA(ND3)-polyA／MITO（F-mRNA／MITO）及びmRNAを含まないNBD標識脂質膜構造体（F／MITO）を、実施例１の３）に倣って作製した。6 well plateに2 mL/wellのDMEM（FBS+）で24時間程度前培養した7SP細胞（1×105 cells/well）に、RNA量換算で60 ng/wellとなるようにF-mRNA/MITO及びF/MITOをそれぞれ添加して1時間インキュベートした。FACSを用いて細胞に取り込まれた蛍光を検出した結果、F-mRNA／MITO及びF／MITOがいずれも7SP細胞に取り込まれること、及びmRNAを搭載しても細胞への取り込み量に変化がないことが確認された（図１２）。【００９０】
Abeら（J. Pharm. Sci. 2016, 105, 734-740）の方法に従って、F-mRNA／MITOを取り込んだ7SP細胞のミトコンドリアを赤色に染色した後、共焦点レーザー走査型顕微鏡を用いて細胞内におけるF-mRNA／MITOの局在を観察した。その結果、緑（F-mRNA／MITO）と赤（ミトコンドリア）が重なり合った黄色が観察され、F-mRNA／MITOが7SP細胞内のミトコンドリアに局在していることが確認された（図１３）。
【配列表フリーテキスト】
【００９１】
配列番号１：KALAペプチド
配列番号２：フォワードプライマーF
配列番号３：フォワードプライマーF long
配列番号４：リバースプライマーWT1
配列番号５：リバースプライマーWT2
配列番号６：リバースプライマーMT1
配列番号７：リバースプライマーMT2
配列番号８：リバースプライマーMT0
配列番号９：リバースプライマーMT0 long
配列番号１０：リバースプライマーMT1 long
配列番号１１：tRG-mRNA(ND3)-tRR  DNAカセット
配列番号１２：ATG-mRNA(ND3)-polyA   DNAカセット
配列番号１３：tRG-mRNA(ND3)-tRR  RNA
配列番号１４：ATG-mRNA(ND3)-polyA  RNA
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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