(57)【要約】  抗ヒトＭＵＣ１抗体Ｆａｂフラグメント、ペプチドリンカー及び／又は配位子を含む複合体、前記複合体を含む診断用組成物及び／又は医薬組成物、並びに、当該複合体を用いて癌を診断及び／又は治療する方法等の提供。  抗ヒトＭＵＣ１抗体Ｆａｂフラグメントをペプチドリンカー等を介して配位子と結合させた複合体を使用する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
下式（Ｉ）：
（Ｙ−Ｓ1−Ｘ）p−Ｆａｂ      （Ｉ）
［式中、
Ｆａｂは、以下の（ａ）及び（ｂ）：
（ａ）配列番号８又は配列番号１０に示されるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域を含む重鎖フラグメント及び配列番号１２に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む軽鎖を含む抗ヒトＭＵＣ１抗体Ｆａｂフラグメント、及び
（ｂ）配列番号８又は配列番号１０に示されるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域であって、配列番号８又は配列番号１０のアミノ酸番号１のグルタミンがピログルタミン酸に修飾された重鎖可変領域を含む重鎖フラグメント、及び、配列番号１２に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む軽鎖を含む、抗ヒトＭＵＣ１抗体Ｆａｂフラグメント、
からなる群より選択される、抗ヒトＭＵＣ１抗体Ｆａｂフラグメントであり；
Ｘは、ペプチドリンカー又は結合であり；
Ｓ1は、スペーサー又は結合であり；
Ｙは、配位子であり；並びに、
ｐは、１〜２５の自然数であり；
但し、Ｘが結合であるときは、Ｓ1が-CH2-(1,4-フェニレン)-NH-C(=S)-又は結合であり、Ｙは１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−１，４，７，１０−テトラ酢酸（ＤＯＴＡ）である］
で示される複合体。
【請求項２】
Ｆａｂが、以下の（ａ）及び（ｂ）：
（ａ）配列番号２又は配列番号４に示されるアミノ酸配列からなる重鎖フラグメント及び配列番号６に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖を含む抗ヒトＭＵＣ１抗体Ｆａｂフラグメント；及び
（ｂ）配列番号２又は配列番号４に示されるアミノ酸配列からなる重鎖フラグメントであって、配列番号２又は配列番号４のアミノ酸番号１のグルタミンがピログルタミン酸に修飾された重鎖フラグメント、及び、配列番号６に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖を含む、抗ヒトＭＵＣ１抗体Ｆａｂフラグメント；
からなる群より選択される、請求項１に記載の複合体。
【請求項３】
Ｆａｂが、以下の（ａ）及び（ｂ）：
（ａ）配列番号１０に示されるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域を含む重鎖フラグメント及び配列番号１２に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む軽鎖を含む抗ヒトＭＵＣ１抗体Ｆａｂフラグメント；及び
（ｂ）配列番号１０に示されるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域であって、配列番号１０のアミノ酸番号１のグルタミンがピログルタミン酸に修飾された重鎖可変領域を含む重鎖フラグメント、及び、配列番号１２に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む軽鎖を含む、抗ヒトＭＵＣ１抗体Ｆａｂフラグメント；
からなる群より選択される、請求項１に記載の複合体。
【請求項４】
Ｆａｂが、以下の（ａ）及び（ｂ）：
（ａ）配列番号４に示されるアミノ酸配列からなる重鎖フラグメント及び配列番号６に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖を含む抗ヒトＭＵＣ１抗体Ｆａｂフラグメント；及び
（ｂ）配列番号４に示されるアミノ酸配列からなる重鎖フラグメントであって、配列番号４のアミノ酸番号１のグルタミンがピログルタミン酸に修飾された重鎖フラグメント、及び、配列番号６に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖を含む、抗ヒトＭＵＣ１抗体Ｆａｂフラグメント；
からなる群より選択される、請求項2に記載の複合体。
【請求項５】
Ｆａｂが、配列番号４に示されるアミノ酸配列からなる重鎖フラグメント、及び配列番号６に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖を含む抗ヒトＭＵＣ１抗体Ｆａｂフラグメントである、請求項４に記載の複合体。
【請求項６】
Ｆａｂが、配列番号４に示されるアミノ酸配列からなる重鎖フラグメントであって、配列番号４のアミノ酸番号１のグルタミンがピログルタミン酸に修飾された重鎖フラグメント、及び、配列番号６に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖を含む抗ヒトＭＵＣ１抗体Ｆａｂフラグメントである、請求項４に記載の複合体。
【請求項７】
Ｘが、腎臓刷子縁膜酵素又はリソソーム酵素で切断されるアミノ酸配列を有する、２〜４個のアミノ酸からなるペプチドを含むペプチドリンカーである、請求項１〜６のいずれか１項に記載の複合体。
【請求項８】
Ｓ1が、-C(=O)-CH2O-(1,3-フェニレン)-C(=O)-、-C(=S)-NH-(1,4-フェニレン)-NH-C(=S)-、-NH-CH2-(1,3-フェニレン)-C(=O)-、-C(=O)-(CH2CH2O)4-(1,3-フェニレン)-C(=O)-、-CH2-(1,4-フェニレン)-NH-C(=S)-、-NH-(CH2)2-C(=O)-、-C(=O)-(1,4-フェニレン)-C(=O)-、-C(=O)-(1,3-フェニレン)-C(=O)-、-C(=O)-(CH2)2-C(=O)-、又は、結合であり、
Ｘが、以下の（１）〜（９）：
（１）-Met-Ile-NH-(CH2)2-Z1-、
（２）-Gly-Lys-Z2-、
（３）-Gly-Phe-Lys-Z2-、
（４）-Met-Val-Lys-Z2-、
（５）-Gly-Tyr-CH2-C(=O)-NH-(CH2)2-Z1-、
（６）-Gly-Lys-Lys-Z2-、
（７）-Gly-Arg-Lys-Z2-、
（８）-Gly-Lys-C(=S)-NH-(1,4-フェニレン)-NH-C(=S)-、及び
（９）-Met-Ile-NH-(CH2)2-NH-C(=S)-NH-(1,4-フェニレン)-NH-C(=S)-、
［式中、Metはメチオニンを、Ileはイソロイシンを、Glyはグリシンを、Lysはリシンを、Pheはフェニルアラニンを、Valはバリンを、Tyrはチロシンを、Argはアルギニンを、Z1は下式（ＩＩ）に示される基を、-Lys-Z2-は下式（ＩＩＩ）に示される基を、-Tyr-CH2-は下式（ＩＶ）に示される基を、-Lys-C(=S)-は下式（Ｖ）に示される基をそれぞれ示す］
からなる群より選択されるペプチドリンカーである、請求項７に記載の複合体。
【化１】
2019221269.tif 000045
【請求項９】
Ｙが、デフェロキサミン（ＤＦＯ）又は１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−１，４，７，１０−テトラ酢酸（ＤＯＴＡ）である、請求項１〜８のいずれか１項に記載の複合体。
【請求項１０】
Ｙが、ＤＦＯである、請求項１〜９のいずれか１項に記載の複合体。
【請求項１１】
Ｙが、ＤＯＴＡである、請求項１〜９のいずれか１項に記載の複合体。
【請求項１２】
Ｙが、ＤＯＴＡであり、
Ｓ1が、-CH2-(1,4-フェニレン)-NH-C(=S)-又は結合であり、
Ｘが、結合である、
請求項１〜６のいずれか１項に記載の複合体。
【請求項１３】
（Ｙ−Ｓ1−Ｘ）p−Ｆａｂが、
【化２】
2019221269.tif 000046
からなる群より選択され、Ｆａｂに含まれるアミノ基の窒素原子が、Ｘ末端のＣ（＝ＮＨ）基の炭素原子と結合している、請求項１０に記載の複合体。
【請求項１４】
（Ｙ−Ｓ1−Ｘ）p−Ｆａｂが、
【化３】
2019221269.tif 000047
からなる群より選択され、Ｆａｂに含まれるアミノ基の窒素原子が、Ｘ末端のＣ（＝ＮＨ）基の炭素原子と結合している、請求項１１に記載の複合体。
【請求項１５】
（Ｙ−Ｓ1−Ｘ）p−Ｆａｂが、
【化４】
2019221269.tif 000048
からなる群より選択され、Ｆａｂに含まれるアミノ基の窒素原子が、末端のＣ（＝Ｏ）基又はＣ（＝Ｓ）基の炭素原子と結合している、請求項１２に記載の複合体。
【請求項１６】
ｐが１〜４の自然数である、請求項１３から１５に記載のいずれか１項に記載の複合体。
【請求項１７】
さらに金属を含む、請求項１〜１６のいずれか１項に記載の複合体。
【請求項１８】
金属が金属放射性同位元素である、請求項１７に記載の複合体。
【請求項１９】
金属が89Ｚｒである、請求項１８に記載の複合体。
【請求項２０】
ＰＥＴトレーサーである、請求項１８〜１９のいずれか１項に記載の複合体。
【請求項２１】
請求項１７〜２０のいずれか１項に記載の１種類以上の複合体、及び薬学的に許容される担体を含む診断用組成物。
【請求項２２】
早期診断薬、又は病期診断薬である、請求項２１に記載の診断用組成物。
【請求項２３】
ヒトＭＵＣ１を発現する癌の診断に用いる、請求項２１又は２２に記載の診断用組成物。
【請求項２４】
癌が、乳癌、肺癌、大腸癌、膀胱癌、皮膚癌、甲状腺癌、胃癌、膵臓癌、腎臓癌、卵巣癌、又は子宮頚癌である、請求項２３に記載の診断用組成物。
【請求項２５】
請求項１７〜２０のいずれか１項に記載の１種類以上の複合体、及び薬学的に許容される担体を含む医薬組成物。
【請求項２６】
ヒトＭＵＣ１を発現する癌を治療するための医薬組成物である、請求項２５に記載の医薬組成物。
【請求項２７】
癌が、乳癌、肺癌、大腸癌、膀胱癌、皮膚癌、甲状腺癌、胃癌、膵臓癌、腎臓癌、卵巣癌、又は子宮頚癌である、請求項２６に記載の医薬組成物。
【請求項２８】
癌の診断用組成物、及び／又は癌を治療するための医薬組成物の製造のための、請求項１７〜２０のいずれか１項に記載の複合体の使用。
【請求項２９】
癌の診断、及び／又は癌の治療において使用するための、請求項１７〜２０のいずれか１項に記載の複合体。
【請求項３０】
請求項１７〜２０のいずれか１項に記載の複合体の診断有効量を対象に投与することを含む、癌の診断方法。
【請求項３１】
請求項１７〜２０のいずれか1項に記載の複合体の治療有効量を対象に投与することを含む、癌の治療方法。
【請求項３２】
癌の診断及び／又は癌の治療のための請求項１７〜２０のいずれか1項に記載の複合体の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗ヒトＭＵＣ１抗体Ｆａｂフラグメント、ペプチドリンカー及び／又は配位子を含む複合体に関する。本発明はまた、前記複合体を含む診断用組成物及び／又は医薬組成物、並びに、当該複合体を用いて癌を診断及び／又は治療する方法等に関する。
【背景技術】
【０００２】
ムチン１（Ｍｕｃｉｎ  １：ＭＵＣ１）は、乳腺、気管及び消化管等の上皮組織を構成する上皮細胞の内腔側に発現する膜結合型糖タンパク質である（Ｎａｔ．  Ｒｅｖ．  Ｃａｎｃｅｒ，  ２００４  Ｊａｎ；４（１）：４５−６０．）。ＭＵＣ１は乳癌（Ｍｏｄ．  Ｐａｔｈｏｌ．，  ２００５  Ｏｃｔ；１８（１０）：１２９５−３０４．）、肺癌（Ｈｕｍ．  Ｐａｔｈｏｌ．，  ２００８  Ｊａｎ；３９（１）：１２６−３６．）、大腸癌（Ｉｎｔ．  Ｊ．  Ｏｎｃｏｌ．，  ２０００  Ｊａｎ；１６（１）：５５−６４．）、膀胱癌（ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ，  ２０１４  Ｍａｒ；９（３）：ｅ９２７４２．）、皮膚癌（Ｈｉｓｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ，  ２０００  Ｓｅｐ；３７（３）：２１８−２３．）、甲状腺癌（Ｊ．  Ｐａｔｈｏｌ．，  ２００３  Ｊｕｌ；２００（３）：３５７−６９．）、胃癌（Ｊ．  Ｐａｔｈｏｌ．，  ２０００  Ｍａｒ；１９０（４）：４３７−４３．）、膵臓癌（Ｉｎｔ．  Ｊ．  Ｏｎｃｏｌ．，  ２００４  Ｊａｎ；２４（１）：１０７−１３．）、腎臓癌（Ｍｏｄ．  Ｐａｔｈｏｌ．，  ２００４  Ｆｅｂ；１７（２）：１８０−８．）、卵巣癌（Ｇｙｎｅｃｏｌ．  Ｏｎｃｏｌ．，  ２００７  Ｊｕｎ；１０５（３）：６９５−７０２．）及び子宮頚癌（Ａｍ．  Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｐａｔｈｏｌ．，  ２００４  Ｊｕｌ；１２２（１）：６１−９．）等の癌細胞で過剰に発現しており、ＭＵＣ１は癌病巣を検出するための標的分子として有用である（Ｎａｔ．  Ｒｅｖ．  Ｃａｎｃｅｒ，  ２００４  Ｊａｎ；４（１）：４５−６０．、Ｐａｔｈｏｌ．  Ｒｅｓ．  Ｐｒａｃｔ．，  ２０１０  Ａｕｇ１５；２０６（８）：５８５−９．）。【０００３】
ＭＵＣ１は細胞外ドメインに存在する２０アミノ酸のタンデムリピート配列であるＨＧＶＴＳＡＰＤＴＲＰＡＰＧＳＴＡＰＰＡ（配列番号１５）の９番目のスレオニンがＯ−グリコシル化される。癌細胞ではこのＯ−グリコシル化が不完全であり、Ｔ（Ｇａｌβ１−３ＧａｌＮＡｃα１−Ｏ−Ｓｅｒ／Ｔｈｒ）、Ｔｎ（ＧａｌＮＡｃα１−Ｏ−Ｓｅｒ／Ｔｈｒ）及び２，３ＳＴ（Ｎｅｕ５Ａｃα２−３Ｇａｌβ１−３ＧａｌＮＡｃα−Ｏ−Ｓｅｒ／Ｔｈｒ）等のＯ−グリコシル化が癌特異的に起こることが知られている（特許文献１、非特許文献１）。正常組織のＭＵＣ１は、これらの癌特異的なＯ−グリコシル化は受けないため、ヒト癌特異的ＭＵＣ１はヒトでの各種癌を治療するための標的分子として特に有用である。このような抗ヒト癌特異的ＭＵＣ１抗体として、例えば１Ｂ２抗体（特許文献１）、ＰａｎｋｏＭａｂ抗体（非特許文献２）、５Ｅ５抗体（特許文献２）等が知られている。これらの抗体のうち、１Ｂ２抗体はＰａｎｋｏＭａｂ抗体に比較してヒト癌特異的ＭＵＣ１に対する特異性が高いことが報告されている（特許文献１）。【０００４】
また、癌病巣の可視化や早期発見には大きなニーズがある。さらに、癌病巣と良性病変との鑑別にもニーズがある。このようなニーズから、ヒト癌特異的ＭＵＣ１に特異的に結合する抗体を体内診断薬として用いて、γ線イメージング（ＰＥＴ、ＳＰＥＣＴ）等の分子イメージングの技法により癌病巣を可視化することは有用であり、また、抗体と癌治療薬を結合させた抗体医薬も注目されている。【０００５】
一方で、抗体は一般に血中半減期が長く、体内に投与後、癌を可視化するのに十分なシグナル対バックグラウンド比を与える腫瘍対血液比に達するのに４〜５日の長い期間を必要とする（Ｃｌｉｎ．  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．  Ｔｈｅｒ．，  ２０１０  Ｍａｙ；８７（５）：５８６−９２．）。また、抗体のＦｃ領域は、抗体依存性細胞障害（Ａｎｔｉｂｏｄｙ−Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ：ＡＤＣＣ）や補体依存性細胞障害（Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ−Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ：ＣＤＣ）の薬理作用を引き起こす（非特許文献１、Ｃｕｒｒ．  Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，  ２００２  Ｄｅｃ；１３（６）：６０９−１４．）。また、抗体は標的に関わらず肝臓に高集積するが、乳癌等の癌細胞は肝臓へ転移する場合が多く、遠隔転移による全身の癌病巣を診断するときに肝転移の検出の妨げとなってしまう（Ｃｌｉｎ．  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．  Ｔｈｅｒ．，  ２０１０  Ｍａｙ；８７（５）：５８６−９２．）。【０００６】
これに対して、Ｆａｂ、ｓｃＦｖ、ダイアボディ、ミニボディのような低分子化された抗体フラグメントは、組織浸透性が高いため病巣に届きやすく、大腸菌や酵母での発現系を用いた低コストでの製造が期待できることから治療用抗体として利用される。また、一般に、Ｆａｂなどの抗体フラグメントは、血中半減期が短く、腎排泄される特性を有することから、診断薬としての利用にも適している（Ｎａｔ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，  ２００５  Ｓｅｐ；２３（９）：１１２６−３６．）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】ＷＯ２０１０／０５０５２８
【特許文献２】ＷＯ２００８／０４０３６２
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Ｇｌｙｃｏｃｏｎｊ．  Ｊ．，  ２０１３  Ａｐｒ；３０（３）：２２７−３６．
【非特許文献２】Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ，  ２００６  Ｎｏｖ；５５（１１）：１３３７−４７．
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
一価のＦａｂフラグメントは、分子量約５０ｋＤａであり、約１５０ｋＤａの抗体より小さく、腎排泄され、血中半減期も短い。そのため、投与後２〜３２時間以内に癌を可視化するのに十分なシグナル対バックグラウンド比を与える腫瘍対血液比に達する。Ｆｃ領域がないためＡＤＣＣやＣＤＣを引き起こすこともない。Ｆａｂフラグメントは、主に腎排泄のため、肝転移の検出の妨げになることもない。このような特長から、抗体と比べ、Ｆａｂフラグメントは、体内診断薬としてより有効であることが期待できる。【００１０】
しかしながらＦａｂフラグメントでは、二価から一価になるため、その結合活性が減弱することが多い。さらに抗体を体内診断薬や光免疫療法で用いる薬剤として利用するためには、蛍光色素又は造影剤等の検出可能な物質で標識しなければならないが、そのような物質で標識されることにより、その結合活性が減弱するとの課題がある。【００１１】
本発明の課題は、抗ヒトＭＵＣ１抗体Ｆａｂフラグメントと同等のヒト癌特異的ＭＵＣ１に対する優れた結合活性を有する抗ヒトＭＵＣ１抗体Ｆａｂフラグメントとペプチドリンカー及び配位子からなる複合体、並びに抗ヒトＭＵＣ１抗体Ｆａｂフラグメントと配位子とからなる複合体を提供することにある。また、本発明の別の課題は、上記複合体を含む診断用組成物及びそれを利用した診断方法を提供すること、並びに、上記複合体を含む医薬組成物及びそれを利用した治療方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明者らは、ヒト癌特異的ＭＵＣ１に対する良好な親和性を有する抗ヒトＭＵＣ１抗体Ｆａｂフラグメントを作製し、さらに鋭意検討を重ねた結果、当該抗ヒトＭＵＣ１抗体Ｆａｂフラグメントに配位子を、ペプチドリンカーを介して（或いは介さずに）結合させた複合体を作製した。当該複合体は抗ヒトＭＵＣ1抗体Ｆａｂフラグメント自体と同等のヒト癌特異的ＭＵＣ１に対する親和性を有する。即ち、本発明は、抗ヒトＭＵＣ１抗体Ｆａｂフラグメントとペプチドリンカー及び配位子からなる複合体、並びに抗ヒトＭＵＣ１抗体Ｆａｂフラグメントと特定の配位子とからなる複合体を提供する。更に、当該複合体が、標識部の結合によってもヒト癌特異的ＭＵＣ１に対する結合活性が減弱せず、良好なヒト癌特異的ＭＵＣ１に対する結合活性を保持していることを確認しており、これらの結果に基づき、本発明の複合体を用いた診断手段及び治療手段を提供するものである。【００１３】
すなわち、一態様において、本発明は以下のとおりであってよい。
［１］下式（Ｉ）：
（Ｙ−Ｓ1−Ｘ）p−Ｆａｂ      （Ｉ）
［式中、Ｆａｂは、以下の（ａ）及び（ｂ）：
（ａ）配列番号８又は配列番号１０に示されるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域を含む重鎖フラグメント及び配列番号１２に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む軽鎖を含む抗ヒトＭＵＣ１抗体Ｆａｂフラグメント、及び
（ｂ）配列番号８又は配列番号１０に示されるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域であって、配列番号８又は配列番号１０のアミノ酸番号１のグルタミンがピログルタミン酸に修飾された重鎖可変領域を含む重鎖フラグメント、及び、配列番号１２に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む軽鎖を含む、抗ヒトＭＵＣ１抗体Ｆａｂフラグメント、からなる群より選択される、抗ヒトＭＵＣ１抗体Ｆａｂフラグメントであり；
Ｘは、ペプチドリンカー又は結合であり；
Ｓ1は、スペーサー又は結合であり；
Ｙは、配位子であり；並びに、
ｐは、１〜２５の自然数であり；
但し、Ｘが結合であるときは、Ｓ1が-CH2-(1,4-フェニレン)-NH-C(=S)-又は結合であり、Ｙは１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−１，４，７，１０−テトラ酢酸（ＤＯＴＡ）である］
で示される複合体。
［２］Ｆａｂが、以下の（ａ）及び（ｂ）：
（ａ）配列番号２又は配列番号４に示されるアミノ酸配列からなる重鎖フラグメント及び配列番号６に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖を含む抗ヒトＭＵＣ１抗体Ｆａｂフラグメント；及び
（ｂ）配列番号２又は配列番号４に示されるアミノ酸配列からなる重鎖フラグメントであって、配列番号２又は配列番号４のアミノ酸番号１のグルタミンがピログルタミン酸に修飾された重鎖フラグメント、及び、配列番号６に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖を含む、抗ヒトＭＵＣ１抗体Ｆａｂフラグメント；
からなる群より選択される、上記［１］に記載の複合体。
［３］Ｆａｂが、以下の（ａ）及び（ｂ）：
（ａ）配列番号１０に示されるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域を含む重鎖フラグメント及び配列番号１２に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む軽鎖を含む抗ヒトＭＵＣ１抗体Ｆａｂフラグメント；及び
（ｂ）配列番号１０に示されるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域であって、配列番号１０のアミノ酸番号１のグルタミンがピログルタミン酸に修飾された重鎖可変領域を含む重鎖フラグメント、及び、配列番号１２に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む軽鎖を含む、抗ヒトＭＵＣ１抗体Ｆａｂフラグメント；
からなる群より選択される、上記［１］に記載の複合体。
［４］Ｆａｂが、以下の（ａ）及び（ｂ）：
（ａ）配列番号４に示されるアミノ酸配列からなる重鎖フラグメント及び配列番号６に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖を含む抗ヒトＭＵＣ１抗体Ｆａｂフラグメント；及び
（ｂ）配列番号４に示されるアミノ酸配列からなる重鎖フラグメントであって、配列番号４のアミノ酸番号１のグルタミンがピログルタミン酸に修飾された重鎖フラグメント、及び、配列番号６に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖を含む、抗ヒトＭＵＣ１抗体Ｆａｂフラグメント；
からなる群より選択される、上記［2］に記載の複合体。
［５］Ｆａｂが、配列番号４に示されるアミノ酸配列からなる重鎖フラグメント、及び配列番号６に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖を含む抗ヒトＭＵＣ１抗体Ｆａｂフラグメントである、上記［４］に記載の複合体。
［６］Ｆａｂが、配列番号４に示されるアミノ酸配列からなる重鎖フラグメントであって、配列番号４のアミノ酸番号１のグルタミンがピログルタミン酸に修飾された重鎖フラグメント、及び、配列番号６に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖を含む抗ヒトＭＵＣ１抗体Ｆａｂフラグメントである、上記［４］に記載の複合体。
［７］Ｘが、腎臓刷子縁膜酵素又はリソソーム酵素で切断されるアミノ酸配列を有する、２〜４個のアミノ酸からなるペプチドを含むペプチドリンカーである、上記［１］〜［６］のいずれかに記載の複合体。
［８］Ｓ1が、-C(=O)-CH2O-(1,3-フェニレン)-C(=O)-、-C(=S)-NH-(1,4-フェニレン)-NH-C(=S)-、-NH-CH2-(1,3-フェニレン)-C(=O)-、-C(=O)-(CH2CH2O)4-(1,3-フェニレン)-C(=O)-、-CH2-(1,4-フェニレン)-NH-C(=S)-、-NH-(CH2)2-C(=O)-、-C(=O)-(1,4-フェニレン)-C(=O)-、-C(=O)-(1,3-フェニレン)-C(=O)-、-C(=O)-(CH2)2-C(=O)-、又は、結合であり、
Ｘが、以下の（１）〜（９）：
（１）-Met-Ile-NH-(CH2)2-Z1-、
（２）-Gly-Lys-Z2-、
（３）-Gly-Phe-Lys-Z2-、
（４）-Met-Val-Lys-Z2-、
（５）-Gly-Tyr-CH2-C(=O)-NH-(CH2)2-Z1-、
（６）-Gly-Lys-Lys-Z2-、
（７）-Gly-Arg-Lys-Z2-、
（８）-Gly-Lys-C(=S)-NH-(1,4-フェニレン)-NH-C(=S)-、及び
（９）-Met-Ile-NH-(CH2)2-NH-C(=S)-NH-(1,4-フェニレン)-NH-C(=S)-、
［式中、Metはメチオニンを、Ileはイソロイシンを、Glyはグリシンを、Lysはリシンを、Pheはフェニルアラニンを、Valはバリンを、Tyrはチロシンを、Argはアルギニンを、Z1は下式（ＩＩ）に示される基を、-Lys-Z2-は下式（ＩＩＩ）に示される基を、-Tyr-CH2-は下式（ＩＶ）に示される基を、-Lys-C(=S)-は下式（Ｖ）に示される基をそれぞれ示す］
からなる群より選択されるペプチドリンカーである、上記［７］に記載の複合体。
【化１】
2019221269.tif 000002
［９］Ｙが、デフェロキサミン（ＤＦＯ）又は１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−１，４，７，１０−テトラ酢酸（ＤＯＴＡ）である、上記［１］〜［８］のいずれか１項に記載の複合体。
［１０］Ｙが、ＤＦＯである、上記［１］〜［９］のいずれか１項に記載の複合体。
［１１］Ｙが、ＤＯＴＡである、上記［１］〜［９］のいずれかに記載の複合体。
［１２］Ｙが、ＤＯＴＡであり、
Ｓ1が、-CH2-(1,4-フェニレン)-NH-C(=S)-又は結合であり、
Ｘが、結合である、
上記［１］〜［６］のいずれかに記載の複合体。
［１３］（Ｙ−Ｓ1−Ｘ）p−Ｆａｂが、
【化２】
2019221269.tif 000003
からなる群より選択され、Ｆａｂに含まれるアミノ基の窒素原子が、Ｘ末端のＣ（＝ＮＨ）基の炭素原子と結合している、上記［１０］に記載の複合体。
［１４］（Ｙ−Ｓ1−Ｘ）p−Ｆａｂが、
【化３】
2019221269.tif 000004
からなる群より選択され、Ｆａｂに含まれるアミノ基の窒素原子が、Ｘ末端のＣ（＝ＮＨ）基の炭素原子と結合している、上記［１１］に記載の複合体。
［１５］（Ｙ−Ｓ1−Ｘ）p−Ｆａｂが、
【化４】
2019221269.tif 000005
からなる群より選択され、Ｆａｂに含まれるアミノ基の窒素原子が、末端のＣ（＝Ｏ）基又はＣ（＝Ｓ）基の炭素原子と結合している、上記［１２］に記載の複合体。
［１６］ｐが１〜４の自然数である、上記［１３］から［１５］に記載の複合体。
［１７］さらに金属を含む、上記［１］〜［１６］のいずれかに記載の複合体。
［１８］金属が金属放射性同位元素である、上記［１７］に記載の複合体。
［１９］金属が89Ｚｒである、上記［１８］に記載の複合体。
［２０］ＰＥＴトレーサーである、上記［１８］〜［１９］のいずれかに記載の複合体。
［２１］上記［１７］〜［２０］のいずれかに記載の１種類以上の複合体、及び薬学的に許容される担体を含む診断用組成物。
［２２］早期診断薬、病期診断薬、又は術中診断薬である、上記［２１］に記載の診断用組成物。
［２３］ヒトＭＵＣ１を発現する癌の診断に用いる、上記［２１］又は［２２］に記載の診断用組成物。
［２４］癌が、乳癌、肺癌、大腸癌、膀胱癌、皮膚癌、甲状腺癌、胃癌、膵臓癌、腎臓癌、卵巣癌、又は子宮頚癌である、上記［２３］に記載の診断用組成物。
［２５］上記［１７］〜［２０］のいずれかに記載の１種類以上の複合体、及び薬学的に許容される担体を含む医薬組成物。
［２６］ヒトＭＵＣ１を発現する癌を治療するための医薬組成物である、上記［２５］に記載の医薬組成物。
［２７］癌が、乳癌、肺癌、大腸癌、膀胱癌、皮膚癌、甲状腺癌、胃癌、膵臓癌、腎臓癌、卵巣癌、又は子宮頚癌である、上記［２６］に記載の医薬組成物。
［２８］癌の診断用組成物、及び／又は癌を治療するための医薬組成物の製造のための、上記［１７］〜［２０］のいずれかに記載の複合体の使用。
［２９］癌の診断、及び／又は癌の治療において使用するための、上記［１７］〜［２０］のいずれかに記載の複合体。
［３０］上記［１７］〜［２０］のいずれかに記載の複合体の診断有効量を対象に投与することを含む、癌の診断方法。
［３１］上記［１７］〜［２０］のいずれかに記載の複合体の治療有効量を対象に投与することを含む、癌の治療方法。
［３２］  癌の診断及び／又は癌の治療のための上記［１７］〜［２０］のいずれかに記載の複合体の使用。
【発明の効果】
【００１４】
本発明の抗ヒトＭＵＣ１抗体Ｆａｂフラグメント、ペプチドリンカー及び配位子を含む複合体、並びに、抗ヒトＭＵＣ１抗体Ｆａｂフラグメントと特定の配位子を含む複合体は、ヒト癌特異的ＭＵＣ１に対する優れた結合活性を有する。そのため、更に金属を含む本発明の複合体は、癌の診断及び／又は治療に有用であることが期待される。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】図１は、Ｐ１０−１  Ｆａｂ、Ｐ１０−２  Ｆａｂ及び比較例である１Ｂ２  Ｆａｂのヒト癌特異的ＭＵＣ１に対する結合活性を示すグラフ及び表である。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
以下に、本発明について詳述するが、本発明はこれらに限定されるものではない。本明細書で特段に定義されない限り、本発明に関連して用いられる科学用語及び技術用語は、当業者によって一般に理解される意味を有するものとする。
【００１７】
１．本発明の複合体
本発明の複合体は、下式（Ｉ）：
（Ｙ−Ｓ1−Ｘ）p−Ｆａｂ      （Ｉ）
［式中、
Ｆａｂは、抗ヒトＭＵＣ１抗体Ｆａｂフラグメントであり、
Ｘは、ペプチドリンカー又は結合であり、
Ｓ1は、スペーサー又は結合であり、
Ｙは、配位子であり、並びに、
ｐは、１〜２５の自然数であり、
但し、Ｘが結合であるときは、Ｓ1が-CH2-(1,4-フェニレン)-NH-C(=S)-又は結合であり、Ｙは１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−１，４，７，１０−テトラ酢酸（ＤＯＴＡ）である］
で示される複合体である。
【００１８】
１−１．抗ヒトＭＵＣ１抗体Ｆａｂフラグメント（Ｆａｂ）
前記式（Ｉ）において「Ｆａｂ」で示される抗ヒトＭＵＣ１抗体Ｆａｂフラグメントについて説明する。
【００１９】
抗体分子の基本構造は、各クラス共通で、分子量５万〜７万の重鎖と２〜３万の軽鎖から構成される。重鎖は、通常約４４０個のアミノ酸を含むポリペプチド鎖からなり、クラスごとに特徴的な構造をもち、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥに対応してγ、μ、α、δ、ε鎖とよばれる。さらにＩｇＧには、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４が存在し、それぞれγ１、γ２、γ３、γ４と呼ばれている。軽鎖は、通常約２２０個のアミノ酸を含むポリペプチド鎖からなり、Ｌ型とＫ型の２種が知られており、それぞれλ、κ鎖とよばれる。抗体分子の基本構造のペプチド構成は、それぞれ相同な２本の重鎖及び２本の軽鎖が、ジスルフィド結合（Ｓ−Ｓ結合）及び非共有結合によって結合され、分子量１５万〜１９万である。２種の軽鎖は、どの重鎖とも対をなすことができる。個々の抗体分子は、常に同一の軽鎖２本と同一の重鎖２本からできている。
【００２０】
鎖内Ｓ−Ｓ結合は、重鎖に四つ（μ、ε鎖には五つ）、軽鎖には二つあって、アミノ酸１００〜１１０残基ごとに一つのループを成し、この立体構造は各ループ間で類似していて、構造単位あるいはドメインとよばれる。重鎖、軽鎖ともにＮ末端に位置するドメインは、同種動物の同一クラス（サブクラス）からの標品であっても、そのアミノ酸配列が一定せず、可変領域とよばれており、各ドメインは、それぞれ、重鎖可変領域（ＶH）及び軽鎖可変領域（ＶL）とよばれている。これよりＣ末端側のアミノ酸配列は、各クラスあるいはサブクラスごとにほぼ一定で定常領域とよばれており、各ドメインは、それぞれ、ＣH１、ＣH２、ＣH３あるいはＣLと表される。
【００２１】
抗体と抗原との結合の特異性は、ＶH及びＶLによって構成される部分のアミノ酸配列によっている。一方、補体や各種細胞との結合といった生物学的活性は各クラスＩｇの定常領域の構造の差を反映している。重鎖と軽鎖の可変領域の可変性は、どちらの鎖にも存在する３つの小さな超可変領域にほぼ限られることがわかっており、これらの領域を相補性決定領域（ＣＤＲ；それぞれＮ末端側からＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３）とよんでいる。可変領域の残りの部分はフレームワーク領域（ＦＲ）とよばれ、比較的一定である。
【００２２】
抗体の重鎖定常領域のＣH１ドメインとＣH２ドメインとの間にある領域はヒンジ領域とよばれ、この領域は、プロリン残基を多く含み、２本の重鎖をつなぐ複数の鎖間Ｓ−Ｓ結合を含む。例えば、ヒトのＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４の各ヒンジ領域には、重鎖間のＳ−Ｓ結合を構成している、それぞれ、２個、４個、１１個、２個のシステイン残基を含む。ヒンジ領域は、パパインやペプシン等のタンパク質分解酵素に対する感受性が高い領域である。抗体をパパインで消化した場合、ヒンジ領域の重鎖間Ｓ−Ｓ結合よりもＮ末端側の位置で重鎖が切断され、２個のＦａｂフラグメントと１個のＦｃフラグメントに分解される。Ｆａｂフラグメントは、軽鎖と、重鎖可変領域（ＶH）、ＣH１ドメインとヒンジ領域の一部とを含む重鎖フラグメントから構成される。Ｆａｂフラグメントは可変領域を含み、抗原結合活性を有する。
【００２３】
１つの実施形態において、本発明の複合体に含まれる抗ヒトＭＵＣ１抗体Ｆａｂフラグメントは、以下の特徴を有するＦａｂフラグメントである：
配列番号８又は配列番号１０に示されるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域を含む重鎖フラグメント及び配列番号１２に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む軽鎖を含む抗ヒトＭＵＣ１抗体Ｆａｂフラグメント。
【００２４】
１つの実施形態において、本発明の複合体に含まれる抗ヒトＭＵＣ１抗体Ｆａｂフラグメントは、配列番号１０に示されるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域を含む重鎖フラグメント及び配列番号１２に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む軽鎖を含む抗ヒトＭＵＣ１抗体Ｆａｂフラグメントである。
【００２５】
本発明の複合体に含まれる抗ヒトＭＵＣ１抗体Ｆａｂフラグメントの重鎖定常領域としては、Ｉｇγ１、Ｉｇγ２、Ｉｇγ３又はＩｇγ４等のいずれの定常領域も選択可能である。１つの実施形態において、本発明の複合体に含まれる抗ヒトＭＵＣ１抗体Ｆａｂフラグメントの重鎖定常領域は、ヒトＩｇγ１定常領域である。
【００２６】
本発明の複合体に含まれる抗ヒトＭＵＣ１抗体Ｆａｂフラグメントの軽鎖定常領域としては、Ｉｇλ又はＩｇκのいずれの定常領域も選択可能である。１つの実施形態において、本発明の複合体に含まれる抗ヒトＭＵＣ１抗体Ｆａｂフラグメントの軽鎖定常領域は、ヒトＩｇκ定常領域である。
【００２７】
１つの実施形態において、本発明の複合体に含まれる抗ヒトＭＵＣ１抗体Ｆａｂフラグメントは、以下のＦａｂフラグメントである：
配列番号２又は配列番号４に示されるアミノ酸配列からなる重鎖フラグメント及び配列番号６に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖を含む抗ヒトＭＵＣ１抗体Ｆａｂフラグメント。
【００２８】
１つの実施形態において、本発明の複合体に含まれる抗ヒトＭＵＣ１抗体Ｆａｂフラグメントは、配列番号４に示されるアミノ酸配列からなる重鎖フラグメント及び配列番号６に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖を含む抗ヒトＭＵＣ１抗体Ｆａｂフラグメントである。
【００２９】
Ｆａｂフラグメントを含め、抗体を細胞で発現させる場合、抗体が翻訳後に修飾を受けることが知られている。翻訳後修飾の例としては、重鎖Ｃ末端のリジンのカルボキシペプチダーゼによる切断、重鎖及び軽鎖Ｎ末端のグルタミン又はグルタミン酸のピログルタミル化によるピログルタミン酸への修飾、グリコシル化、酸化、脱アミド化、糖化等が挙げられ、種々の抗体において、このような翻訳後修飾が生じることが知られている（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，２００８  Ｊｕｌ；９７（７）：２４２６−２４４７．）。
【００３０】
本発明の複合体に含まれる抗ヒトＭＵＣ１抗体Ｆａｂフラグメントには、翻訳後修飾により生じたＦａｂフラグメントも含まれ得る。翻訳後修飾により生じ得る本発明の抗ヒトＭＵＣ１抗体Ｆａｂフラグメントの例としては、重鎖Ｎ末端のピログルタミル化した抗ヒトＭＵＣ１抗体Ｆａｂフラグメントが挙げられる。このようなＮ末端のピログルタミル化による翻訳後修飾は、抗体の活性に影響を及ぼすものではないことは当該分野で知られている（Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２００６  Ｊａｎ  １；３４８（１）：２４−３９．）。
【００３１】
１つの実施形態において、本発明の複合体に含まれる抗ヒトＭＵＣ１抗体Ｆａｂフラグメントは、下記の特徴を有する抗ヒトＭＵＣ１抗体Ｆａｂフラグメントである：
配列番号８又は配列番号１０に示されるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域であって、配列番号８又は配列番号１０のアミノ酸番号１のグルタミンがピログルタミン酸に修飾された重鎖可変領域を含む重鎖フラグメント、及び、配列番号１２に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む軽鎖を含む、抗ヒトＭＵＣ１抗体Ｆａｂフラグメント。
【００３２】
ある実施形態において、本発明の複合体に含まれる抗ヒトＭＵＣ１抗体Ｆａｂフラグメントは、下記の特徴を有する抗ヒトＭＵＣ１抗体Ｆａｂフラグメントである：
配列番号１０に示されるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域であって、配列番号１０のアミノ酸番号１のグルタミンがピログルタミン酸に修飾された重鎖可変領域を含む重鎖フラグメント、及び、配列番号１２に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む軽鎖を含む、抗ヒトＭＵＣ１抗体Ｆａｂフラグメント。
【００３３】
別の実施形態において、本発明の複合体に含まれる抗ＭＵＣ１抗体Ｆａｂフラグメントは、下記の特徴を有する抗ヒトＭＵＣ１抗体Ｆａｂフラグメントである：
配列番号２又は配列番号４に示されるアミノ酸配列からなる重鎖フラグメントであって、配列番号２又は配列番号４のアミノ酸番号１のグルタミンがピログルタミン酸に修飾された重鎖フラグメント、及び、配列番号６に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖を含む、抗ヒトＭＵＣ１抗体Ｆａｂフラグメント。
【００３４】
ある実施形態において、本発明の複合体に含まれる抗ＭＵＣ１抗体Ｆａｂフラグメントは、下記の特徴を有する抗ヒトＭＵＣ１抗体Ｆａｂフラグメントである：
配列番号４に示されるアミノ酸配列からなる重鎖フラグメントであって、配列番号４のアミノ酸番号１のグルタミンがピログルタミン酸に修飾された重鎖フラグメント、及び、配列番号６に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖を含む、抗ヒトＭＵＣ１抗体Ｆａｂフラグメント。
【００３５】
本発明の複合体に含まれる抗ヒトＭＵＣ１抗体Ｆａｂフラグメントは、ヒト癌特異的ＭＵＣ１に結合する。癌特異的ＭＵＣ１は、乳癌、肺癌、大腸癌、膀胱癌、皮膚癌、甲状腺癌、胃癌、膵臓癌、腎臓癌、卵巣癌又は子宮頚癌等の癌において発現している。得られた抗ヒトＭＵＣ１抗体Ｆａｂフラグメントのヒト癌特異的ＭＵＣ１に対する結合活性を測定する方法としては、ＥＬＩＳＡやＦＡＣＳ等の方法がある。例えば、ＥＬＩＳＡを用いる場合、ヒト癌特異的ＭＵＣ１陽性細胞（例えば、Ｔ−４７Ｄ細胞）をＥＬＩＳＡプレートに固定化し、これに対してＦａｂフラグメントを添加して反応させた後、ホースラディッシュペルオキシダーゼ等で標識した抗Ｉｇκ抗体等を反応させた後、その活性を検出する試薬（例えば、ホースラディッシュペルオキシダーゼ標識の場合、化学発光ホースラディッシュペルオキシダーゼ基質）等を用いた活性測定により、二次抗体の結合を同定する。
【００３６】
本発明の複合体に含まれる抗ヒトＭＵＣ１抗体Ｆａｂフラグメントは、本明細書に開示される、抗ヒトＭＵＣ１抗体Ｆａｂフラグメントの重鎖フラグメント及び軽鎖の配列情報に基づいて、当該分野で公知の方法を使用して、当業者によって容易に作製され得る。本発明の複合体に含まれる抗ヒトＭＵＣ１抗体Ｆａｂフラグメントは、特に限定されるものではないが、例えば、後述の＜本発明の複合体に含まれる抗ヒトＭＵＣ１抗体Ｆａｂフラグメントの生産方法＞に記載の方法に従い製造することができる。
【００３７】
１−２．配位子（Ｙ）
前記式（Ｉ）において「Ｙ」で示される配位子について説明する。
「配位子」とは、本発明の複合体において、金属とキレート錯体を形成しうる部分であり、キレート剤から構成される基を意味する。構成される基とは、キレート剤からプロトンが除かれて、結合手を有する基である。当該キレート剤から構成される基は、抗ヒトＭＵＣ１抗体Ｆａｂフラグメントと直接、或いは、スペーサー及び／又はペプチドリンカーを介して結合するものである。
【００３８】
「キレート剤」とは、金属と配位結合できる化合物をいう。本明細書における「キレート剤」としては、シデロホアと、非シデロホアが挙げられる。シデロホアとしては、ヒドロキサム酸型、カテコール型、又は、混合配位子型が挙げられる。ヒドロキサム酸型シデロホアとしては、例えば、フェリクローム、下式：
【化５】
2019221269.tif 000006
で表されるデフェロキサミン（ＤＦＯ）、フサリニンＣ、オルニバクチン、ロドトルル酸が挙げられる。カテコール型シデロホアとしては、例えば、エンテロバクチン、バチリバクチン、ビブリオバクチンが挙げられる。混合配位子型シデロホアとしては、例えば、アゾトバクチン、ピヨベルジン、エルシニアバクチンが挙げられる。なお、上記シデロホアの場合、ＤＦＯはその反応性官能基である−ＮＨ2を介してスペーサー又はペプチドリンカーと反応させることができ、ＤＦＯ以外のシデロホアの場合には、カルボキシル基、水酸基、アミノ基等の反応性官能基を介して、当業者が通常用いる方法でスペーサー又はペプチドリンカーと反応させることもできる。
【００３９】
非シデロホアとしては、例えば、下式：
【化６】
2019221269.tif 000007
で表されるＤＯＴＡ（１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−１，４，７，１０−テトラ酢酸、ＣＡＳ番号：６０２３９−１８−１）、ＤＴＰＡ（ジエチレントリアミン五酢酸、ＣＡＳ番号：６７−４３−６）、ＤＴＰＡ−ＢＭＡ（１，７−ビス（メチルカルバモイルメチル）−１，４，７−トリアザヘプタン−１，４，７−三酢酸、ＣＡＳ番号：１１９８９５−９５−３）、ＥＯＢ−ＤＴＰＡ（Ｎ-[（２Ｓ）−２−[ビス（カルボキシメチル）アミノ]−３−（４−エトキシフェニル）プロピル]−Ｎ−[２−[ビス（カルボキシメチル）アミノ]エチル]グリシン、ＣＡＳ番号：１５８５９９−７２−５）、ＴＴＨＡ（トリエチレンテトラミン六酢酸、ＣＡＳ番号：８６９−５２−３）、ＤＯ３Ａ（１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−１，４，７−三酢酸、ＣＡＳ番号：２１７９７３−０３−０）、ＨＰ−ＤＯ３Ａ（１０−（２−ヒドロキシプロピル）−１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−１，４，７−三酢酸、ＣＡＳ番号：１２００４１−０８−９）、及びこれらの公知の反応性誘導体が挙げられる。
【００４０】
本発明の複合体に含まれる配位子を形成する「キレート剤」のある態様としては、ＤＦＯ、ＤＯＴＡ、ＤＴＰＡ、ＤＴＰＡ−ＢＭＡ、ＥＯＢ−ＤＴＰＡ、ＤＯ３Ａ、ＨＰ−ＤＯ３Ａ、が挙げられる。ある態様としては、ＤＦＯ、ＤＯＴＡが挙げられる。
【００４１】
なお、本明細書中の化合物及び複合体は、特に記載がない限りフリー体及びその塩も包含する。ここに「その塩」とは、その化合物及び複合体の置換基の種類によって、酸付加塩又は塩基との塩を形成する場合があり、その化合物及び複合体が形成しうる塩である。具体的には、塩酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸、硫酸、硝酸、リン酸等の無機酸や、ギ酸、酢酸、プロピオン酸、シュウ酸、マロン酸、コハク酸、フマル酸、マレイン酸、乳酸、リンゴ酸、マンデル酸、酒石酸、ジベンゾイル酒石酸、ジトルオイル酒石酸、クエン酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、p-トルエンスルホン酸、アスパラギン酸、グルタミン酸等の有機酸との酸付加塩、ナトリウム、カリウム、マグネシウム、カルシウム、アルミニウム等の無機塩基、メチルアミン、エチルアミン、エタノールアミン、リシン、オルニチン等の有機塩基との塩、アセチルロイシン等の各種アミノ酸及びアミノ酸誘導体との塩やアンモニウム塩等が挙げられる。例えば、ＤＦＯは、デフェロキサミンメタンスルホン酸塩としても存在し、他の塩としても存在する。ＤＴＰＡは、フリー体とともにナトリウム塩としても存在する。
【００４２】
金属を含む本発明の複合体は、各種造影剤及び／又は癌の治療剤に用いることができ、例えば、ＭＲＩ造影剤、ＰＥＴトレーサーに使用される薬剤等に用いられる。
【００４３】
ＭＲＩ造影剤に用いる場合の「キレート剤」のある態様としては、上記のシデロホア及び非シデロホアキレート剤である。
【００４４】
ＰＥＴトレーサーに用いる場合の「キレート剤」のある態様としては、上記のシデロホア及び非シデロホアキレート剤であり、ある態様としては、ＤＦＯ又はＤＯＴＡである。
【００４５】
本発明の複合体において、キレート剤は金属を含んでいてもよい。本明細書において、「金属」は、常磁性金属イオン又は金属放射性同位元素を意味する。金属としては、各キレート剤に配位結合する金属であれば特に制限はない。複合体の使用目的に応じて、適切なキレート剤と金属の組合せが選択される。
【００４６】
常磁性金属イオンはＭＲＩ造影剤に好適に用いられる。常磁性金属イオンの態様としては、Ｆｅ2+、Ｆｅ3+、Ｃｕ2+、Ｎｉ2+、Ｒｈ2+、Ｃｏ2+、Ｇｄ3+、Ｅｕ3+、Ｄｙ3+、Ｔｂ3+、Ｐｍ3+、Ｎｄ3+、Ｔｍ3+、Ｃｅ3+、Ｙ3+、Ｈｏ3+、Ｅｒ3+、Ｌａ3+、Ｙｂ3+、Ｍｎ3+、又はＭｎ2+が挙げられるが、これらに限定されない。ある態様としては、Ｇｄ3+、Ｍｎ3+、Ｍｎ2+、Ｆｅ2+、又はＦｅ3+が挙げられる。ある態様としては、Ｍｎ3+又はＭｎ2+が挙げられる。この場合、複合体にはカウンターアニオンとしてハロゲン等を用いることができる。また、カウンターアニオンは配位子のＣ（＝Ｏ）Ｏ-であってもよく、さらに複合体は、Ｎａ+などのカウンターカチオンを有していてもよい。
【００４７】
金属放射性同位元素はＰＥＴトレーサー等に用いられる。金属放射性同位元素のある態様としては、89Ｚｒ、51Ｍｎ、52Ｆｅ、60Ｃｕ、67Ｇａ、68Ｇａ、72Ａｓ、90Ｙ、99mＴｃ、111Ｉｎ又は177Ｌｕが挙げられるが、これらに限定されない。ＰＥＴトレーサーに用いられる金属放射性同位元素のある態様としては、89Ｚｒ、60Ｃｕ、67Ｇａ、68Ｇａ、99mＴｃ、又は111Ｉｎが挙げられる。ある態様としては、ジルコニウムの放射同位体が挙げられる。ある態様としては89Ｚｒが挙げられる。癌の治療に用いられる金属放射性同位元素のある態様としては、90Ｙ又は177Ｌｕが挙げられる。
【００４８】
本発明の複合体のある態様としては、Ｙが、89Ｚｒが配位結合しているＤＦＯである複合体である。別の態様としては、Ｙが、89Ｚｒ、90Ｙ、67Ｇａ、68Ｇａ及び177Ｌｕからなる金属放射性同位元素が配位結合しているＤＯＴＡである複合体である。また別の態様としては、Ｙが、89Ｚｒ、Ｇｄ3+及びＹ3+からなる常磁性金属イオンが配位結合しているＤＯＴＡである複合体である。また別の態様としては、Ｙが、Ｇｄ3+及びＹ3+からなる常磁性金属イオンが配位結合しているＤＯＴＡである複合体である。
【００４９】
１−３．ペプチドリンカー又は結合（Ｘ）
本発明の複合体は、配位子（Ｙ）又はスペーサー（Ｓ1）とＦａｂとが、直接結合していてもよいが、ペプチドリンカー（Ｘ）を介して結合していてもよい。前記式（Ｉ）において「Ｘ」で示されるペプチドリンカーについて説明する。
【００５０】
本明細書において「ペプチドリンカー」とは、２〜４個のアミノ酸からなるペプチドを含むリンカーであって、所望により抗ヒトＭＵＣ１抗体Ｆａｂフラグメントとの結合に適するスペーサーＺ1又はＺ2を有していてもよい。ここに、ペプチドリンカーに包含されるペプチドとしては、特に限定されないが、好ましくはグリシン（Ｇｌｙ）、リシン（Ｌｙｓ）、メチオニン（Ｍｅｔ）、イソロイシン（Ｉｌｅ）、フェニルアラニン（Ｐｈｅ）、バリン（Ｖａｌ）、チロシン（Ｔｙｒ）、アルギニン（Ａｒｇ）、アラニン（Ａｌａ）、グルタミン（Ｇｌｎ）、グルタミン酸（Ｇｌｕ）、アスパラギン（Ａｓｎ）、アスパラギン酸（Ａｓｐ）、ヒスチジン（Ｈｉｓ）及びロイシン（Ｌｅｕ）からなる群よりそれぞれ選択される、２〜４個のアミノ酸からなるペプチド、より好ましくはグリシン、リシン、メチオニン、イソロイシン、フェニルアラニン、バリン、チロシン及びアルギニンからなる群よりそれぞれ選択される２〜４個のアミノ酸からなるペプチドである。なお、特に断りのない限りグリシン以外のアミノ酸残基の立体はＬ-体とする。
【００５１】
ペプチドリンカーのある態様としては、腎臓刷子縁膜酵素又はリソソーム酵素で切断されるアミノ酸配列を有する２〜４個のアミノ酸からなるペプチドを含み、更にスペーサーを有していてもよいペプチドリンカーである。腎臓刷子縁膜酵素又はリソソーム酵素で切断されるアミノ酸配列を有するペプチドリンカーは、腎臓に存在するこれらの酵素により特異的に切断されるため、標識部の腎臓への集積が低減されることが報告されている。例えば、Ａｄｖ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ  Ｒｅｖ．  ２００８  Ｓｅｐ；６０（１２）：１３１９−２８．、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ  Ｃｈｅｍ．  ２００５  Ｎｏｖ−Ｄｅｃ；１６（６）：１６１０−６．、及び、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  １９９９  Ｊａｎ  １；５９（１）：１２８−３４．には、グリシン−リシンリンカーが腎臓に存在する腎臓刷子縁膜酵素により特異的に切断されることが記載されている。日本特許第６１６４５５６号公報には、グリシン−フェニルアラニン−リシンリンカーが腎臓で腎臓刷子縁膜酵素により特異的に切断されることが記載されており、また、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ  Ｃｈｅｍ．  ２００２  Ｓｅｐ−Ｏｃｔ；１３（５）：９８５−９５．には、グリシン−ロイシン−グリシン−リシン配列を含むリンカーが、また、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ  Ｃｈｅｍ．  ２０１３  Ｆｅｂ  ２０；２４（２）：２９１−９．にはグリシン−チロシンリンカーが、腎臓刷子縁膜酵素により特異的に切断されることが記載されている。更に、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ  Ｃｈｅｍ．  ２０１４  Ｎｏｖ  １９；２５（１１）：２０３８−４５．には、メチオニン−イソロイシン配列を含むリンカーが、腎臓に存在するリソソーム酵素により特異的に切断されることが記載されている。ペプチドリンカーのある態様としては、Met-Ile、Gly-Lys、Gly-Phe-Lys、Met-Val-Lys、Gly-Tyr、Gly-Lys-Lys、及び、Gly-Arg-Lysからなる群から選択されるアミノ酸配列を含むペプチドリンカーである。ある態様としては、Gly-Lys及びMet-Ileからなる群から選択されるアミノ酸配列を含むペプチドリンカーである。
【００５２】
「ペプチドリンカー」は、任意に抗ヒトＭＵＣ１抗体Ｆａｂフラグメントとの結合に適するスペーサーを有していてもよく、ここに、抗ヒトＭＵＣ１抗体Ｆａｂフラグメントとの結合に適するスペーサーとは、ペプチドリンカー部と抗ヒトＭＵＣ１抗体Ｆａｂフラグメントのアミノ基の窒素原子又はジスルフィド結合由来のチオール基との間を有機化学的に結合させる基であり、ある態様としては、末端にマレイミド由来の基（例えば、下式（ＩＩ）で示される基)又はイソチオシアネート由来の基（-NH-C(=S)-）を含む基である。ある態様としては、-NH-(CH2)2-Z1-、-CH2-C(=O)-NH-(CH2)2-Z1-、-C(=S)-NH-(1,4-フェニレン)-NH-C(=S)-、又は-NH-(CH2)2-NH-C(=S)-NH-(1,4-フェニレン)-NH-C(=S)-であり、ここでZ1は下式（ＩＩ）で表される。
【００５３】
スペーサーはペプチド末端のアミノ酸のアミノ基又はカルボキシル基と、或いは、アミノ酸の側鎖中のアミノ基（例えばリシン）や水酸基（例えばチロシン）と結合してペプチドリンカーを形成している。ペプチド末端のアミノ酸の側鎖中の官能基にスペーサーが結合してペプチドリンカーを形成した例としては、例えば、Lysと一体となったスペーサーとして下式（ＩＩＩ）で示される基が挙げられ、本明細書においてはこれを-Lys-Z2-と記載する。
【化７】
2019221269.tif 000008
【００５４】
更に、本明細書中では、同様に末端アミノ酸の側鎖中の官能基とスペーサーが結合した構造を有する、下式（ＩＶ）で示される基を-Tyr-CH2-、下式（Ｖ）で示される基を-Lys-C(=S)-と、それぞれ記載する。
【化８】
2019221269.tif 000009
【００５５】
スペーサーを含むペプチドリンカーのある態様としては、（１）-Met-Ile-NH-(CH2)2-Z1-、（２）-Gly-Lys-Z2-、（３）-Gly-Phe-Lys-Z2-、（４）-Met-Val-Lys-Z2-、（５）-Gly-Tyr-CH2-C(=O)-NH-(CH2)2-Z1-、（６）-Gly-Lys-Lys-Z2-、（７）-Gly-Arg-Lys-Z2-、（８）-Gly-Lys-C(=S)-NH-(1,4-フェニレン)-NH-C(=S)-及び（９）-Met-Ile-NH-(CH2)2-NH-C(=S)-NH-(1,4-フェニレン)-NH-C(=S)-であり、ある態様としては、（１）-Met-Ile-NH-(CH2)2-Z1-、及び（２）-Gly-Lys-Z2-である。ある態様としては、（８）-Gly-Lys-C(=S)-NH-(1,4-フェニレン)-NH-C(=S)-及び（９）-Met-Ile-NH-(CH2)2-NH-C(=S)-NH-(1,4-フェニレン)-NH-C(=S)-である。
【００５６】
１−４．スペーサー又は結合（Ｓ1）
本発明の複合体は、配位子（Ｙ）とペプチドリンカー（Ｘ）又はＦａｂとが、直接結合していてもよいが、スペーサーを介して結合していてもよい。
【００５７】
本明細書においてＳ1に記載の「スペーサー」は、配位子と、ペプチドリンカー又はＦａｂとの間に一定の距離を作るため、或いは、配位子と、ペプチドリンカー又はＦａｂとの結合のために、導入する基であり、ある態様として-C(=O)-CH2O-(1,3-フェニレン)-C(=O)-、-C(=S)-NH-(1,4-フェニレン)-NH-C(=S)-、-NH-CH2-(1,3-フェニレン)-C(=O)-、-C(=O)-(CH2CH2O)4-(1,3-フェニレン)-C(=O)-、-CH2-(1,4-フェニレン)-NH-C(=S)-、-NH-(CH2)2-C(=O)-、-C(=O)-(1,4-フェニレン)-C(=O)-、-C(=O)-(1,3-フェニレン)-C(=O)-、-C(=O)-(CH2)2-C(=O)-等が挙げられる。ある態様としては、Ｓ1は-C(=O)-CH2O-(1,3-フェニレン)-C(=O)-、-C(=S)-NH-(1,4-フェニレン)-NH-C(=S)-、-C(=O)-(CH2CH2O)4-C(=O)-、-CH2-(1,4-フェニレン)-NH-C(=S)-、-C(=O)-(1,4-フェニレン)-C(=O)-、-C(=O)-(1,3-フェニレン)-C(=O)-、-C(=O)-(CH2)2-C(=O)-、又は結合である。ある態様としては、Ｓ1は、-C(=O)-CH2O-(1,3-フェニレン)-C(=O)-、-NH-CH2-(1,3-フェニレン)-C(=O)-又は結合である。ある態様としては、Ｓ1は、結合である。また、本発明のＹがＤＯＴＡである複合体は、ＤＯＴＡと抗ヒトＭＵＣ１抗体Ｆａｂフラグメント（Ｆａｂ）が、直接結合又はスペーサー（-CH2-(1,4-フェニレン)-NH-C(=S)-）を介して結合していてもよい。但し、ＤＯＴＡと抗ヒトＭＵＣ１抗体Ｆａｂフラグメント（Ｆａｂ）とがスペーサーである-CH2-(1,4-フェニレン)-NH-C(=S)-を介して結合する場合は、下式（ＶＩ）で示される複合体である。
【化９】
2019221269.tif 000010
【００５８】
本発明の複合体の製造において、抗ヒトＭＵＣ１抗体Ｆａｂフラグメントと、配位子、スペーサー及び／又はペプチドリンカーとの結合、及び配位子とスペーサー及び／又はペプチドリンカーとの結合は、公知の手法により、当業者が適宜行うことができる。
【００５９】
本明細書で「標識部」とは、（ｉ）配位子及びペプチドリンカー（Ｙ−Ｓ1−Ｘ：但し、Ｓ1が結合であり、Ｘがペプチドリンカーである。）、（ｉｉ）配位子(Ｙ−Ｓ1−Ｘ：但し、Ｓ1及びＸがそれぞれ結合である。)、又は（ｉｉｉ）配位子、スペーサー及びペプチドリンカー(Ｙ−Ｓ1−Ｘ：但し、Ｓ1がスペーサーであり、Ｘがペプチドリンカーである。）である。ある態様としては、（ｉ）配位子及びペプチドリンカー、又は（ｉｉ）配位子が挙げられる。「標識部」の配位子は更に金属を含んでいてもよく、ある態様としては、金属を含む（ｉ）配位子及びペプチドリンカー又は（ｉｉ）配位子であり、言い換えると、（ｉ）金属とキレート錯体を形成した配位子及びペプチドリンカー、又は、（ｉｉ）金属とキレート錯体を形成した配位子である。
【００６０】
１−５．抗ヒトＭＵＣ１抗体Ｆａｂフラグメント（Ｆａｂ）に対する標識部（Ｙ−Ｓ1−Ｘ）の結合数（ｐ）
本発明の複合体は、抗ヒトＭＵＣ１抗体Ｆａｂフラグメント（Ｆａｂ）中の1以上のアミノ基の窒素原子もしくはジスルフィド結合由来のチオール基を介して１以上の標識部（Ｙ−Ｓ1−Ｘ）が結合した複合体である。本発明の複合体は結合する標識部の数が互いに相違する複合体の混合物であってもよく、式（Ｉ）において、Ｆａｂは１〜２５の標識部（Ｙ−Ｓ1−Ｘ）が結合したＦａｂのいずれか又はそれらの混合物であることを示す。ある態様としては、本発明の複合体は、１つのＦａｂに対して、１〜２５の標識部（Ｙ−Ｓ1−Ｘ）を含み、ある態様としては、１〜２３の標識部（Ｙ−Ｓ1−Ｘ）を含み、ある態様としては１〜１５の標識部（Ｙ−Ｓ1−Ｘ）を含み、ある態様としては１〜１１の標識部（Ｙ−Ｓ1−Ｘ）を含み、ある態様としては１〜９の標識部（Ｙ−Ｓ1−Ｘ）を含み、ある態様としては１〜７の標識部（Ｙ−Ｓ1−Ｘ）を含み、ある態様としては１〜５の標識部（Ｙ−Ｓ1−Ｘ）を含み、更に、ある態様としては１〜４の標識部（Ｙ−Ｓ1−Ｘ）を含む。即ち、１つのＦａｂに対する標識部（Ｙ−Ｓ1−Ｘ）の結合数を表す「ｐ」は、ある態様としては１〜２５の自然数であり、ある態様としては１〜２３の自然数であり、ある態様としては１〜１５の自然数であり、ある態様としては１〜１１の自然数であり、ある態様としては１〜９の自然数であり、ある態様としては１〜７の自然数であり、ある態様としては１〜５の自然数であり、更に、ある態様としては１〜４の自然数である。
【００６１】
２．本発明の複合体に含まれる抗ヒトＭＵＣ１抗体Ｆａｂフラグメントをコードするポリヌクレオチド
本発明の複合体に含まれる抗ヒトＭＵＣ１抗体Ｆａｂフラグメントは、ある態様では、当該抗ヒトＭＵＣ１抗体Ｆａｂフラグメントの重鎖フラグメントをコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド、及び当該抗ヒトＭＵＣ１抗体Ｆａｂフラグメントの軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドによってコードされる。
【００６２】
ある態様において、本発明の複合体に含まれる抗ヒトＭＵＣ１抗体Ｆａｂフラグメントをコードするポリヌクレオチドは、配列番号８に示されるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域を含む重鎖フラグメントをコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド、又は配列番号１０に示されるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域を含む重鎖フラグメントコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドである。
【００６３】
配列番号８に示されるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域を含む重鎖フラグメントをコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドとしては、例えば、配列番号７に示される塩基配列を含むポリヌクレオチドが挙げられる。配列番号１０に示されるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域を含む重鎖フラグメントをコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドとしては、例えば、配列番号９に示される塩基配列を含むポリヌクレオチドが挙げられる。
【００６４】
１つの実施形態において、本発明の複合体に含まれる抗ヒトＭＵＣ１抗体Ｆａｂフラグメントをコードするポリヌクレオチドは、配列番号２に示されるアミノ酸配列からなる重鎖フラグメントをコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド、又は配列番号４に示されるアミノ酸配列からなる重鎖フラグメントをコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドである。
【００６５】
配列番号２に示されるアミノ酸配列からなる重鎖フラグメントをコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドとしては、例えば、配列番号１に示される塩基配列を含むポリヌクレオチドが挙げられる。配列番号４に示されるアミノ酸配列からなる重鎖フラグメントをコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドとしては、例えば、配列番号３に示される塩基配列を含むポリヌクレオチドが挙げられる。
【００６６】
１つの実施形態において、本発明の複合体に含まれる抗ヒトＭＵＣ１抗体Ｆａｂフラグメントをコードするポリヌクレオチドは、配列番号１２に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドである。
【００６７】
配列番号１２に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドとしては、例えば、配列番号１１に示される塩基配列を含むポリヌクレオチドが挙げられる。
【００６８】
１つの実施形態において、本発明の複合体に含まれる抗ヒトＭＵＣ１抗体Ｆａｂフラグメントをコードするポリヌクレオチドは、配列番号６に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドである。
【００６９】
配列番号６に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドとしては、例えば、配列番号５に示される塩基配列を含むポリヌクレオチドが挙げられる。
【００７０】
本発明の複合体に含まれる抗ヒトＭＵＣ１抗体Ｆａｂフラグメントをコードするポリヌクレオチドは、当該抗ヒトＭＵＣ１抗体Ｆａｂフラグメントの重鎖フラグメント及び軽鎖のアミノ酸配列に基づいてデザインされた塩基配列に基づき、当該技術分野で公知の遺伝子合成方法を利用して合成することが可能である。このような遺伝子合成方法としては、国際公開第９０／０７８６１号に記載の抗体遺伝子の合成方法等の当業者に公知の種々の方法が使用され得る。
【００７１】
３．本発明の複合体に含まれる抗ヒトＭＵＣ１抗体Ｆａｂフラグメントをコードするポリヌクレオチドの発現ベクター
本発明の複合体に含まれる抗ヒトＭＵＣ１抗体Ｆａｂフラグメントをコードするポリヌクレオチドの発現ベクターには、当該抗ヒトＭＵＣ１抗体Ｆａｂフラグメントの重鎖フラグメントをコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクター、当該抗ヒトＭＵＣ１抗体Ｆａｂフラグメントの軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクター、並びに当該抗ヒトＭＵＣ１抗体Ｆａｂフラグメントの重鎖フラグメントをコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド及び当該抗ヒトＭＵＣ１抗体Ｆａｂフラグメントの軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターが含まれる。
【００７２】
好ましい発現ベクターとしては、配列番号４に示されるアミノ酸配列からなる重鎖フラグメントをコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクター、配列番号６に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクター、並びに配列番号４に示されるアミノ酸配列からなる重鎖フラグメントをコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド及び配列番号６に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターが挙げられる。
【００７３】
これらの発現ベクターは、原核細胞及び／又は真核細胞の各種の宿主細胞中で本発明のポリヌクレオチドにコードされるポリペプチドを産生できるものであれば特に制限されない。このような発現ベクターとしては、例えば、プラスミドベクター、ウイルスベクター（例えば、アデノウイルス、レトロウイルス）等を挙げられ、好ましくは、ｐＥＥ６．４やｐＥＥ１２．４（Ｌｏｎｚａ社）を使用することができる。
【００７４】
また、これらの発現ベクターは、本発明の複合体に含まれる抗ヒトＭＵＣ１抗体Ｆａｂフラグメントをコードするポリヌクレオチドの重鎖フラグメント及び／又は軽鎖をコードする遺伝子に機能可能に連結されたプロモーターを含み得る。宿主細胞中でＦａｂフラグメントを発現させるためのプロモーターとしては、宿主細胞がエシェリキア属菌の場合、例えば、Ｔｒｐプロモーター、ｌａｃプロモーター、ｒｅｃＡプロモーター、λＰＬプロモーター、ｌｐｐプロモーター、ｔａｃプロモーターなどが挙げられる。酵母中での発現用プロモーターとしては、例えば、ＰＨ０５プロモーター、ＰＧＫプロモーター、ＧＡＰプロモーター、ＡＤＨプロモーターが挙げられ、バチルス属菌での発現用プロモーターとしては、ＳＬ０１プロモーター、ＳＰ０２プロモーター、ｐｅｎＰプロモーターなどが挙げられる。また、宿主が哺乳動物細胞等の真核細胞である場合、ＣＭＶ、ＲＳＶ、ＳＶ４０などのウイルス由来のプロモーター、レトロウイルスのプロモーター、アクチンプロモーター、ＥＦ（ｅｌｏｎｇａｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ）１αプロモーター、ヒートショックプロモーターなどが挙げられる。
【００７５】
これらの発現ベクターは、宿主細胞として細菌、特に大腸菌を用いる場合、開始コドン、終止コドン、ターミネーター領域及び複製可能単位をさらに含み得る。一方、宿主として酵母、動物細胞又は昆虫細胞を用いる場合、発現ベクターは、開始コドン、終止コドンを含み得る。また、この場合、エンハンサー配列、本発明の重鎖フラグメント及び／又は軽鎖をコードする遺伝子の５’側及び３’側の非翻訳領域、分泌シグナル配列、スプライシング接合部、ポリアデニレーション部位、又は複製可能単位などを含んでいてもよい。また、目的に応じて通常用いられる選択マーカー（例えば、テトラサイクリン耐性遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子、ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子）を含んでいてもよい。
【００７６】
４．発現ベクターで形質転換される宿主細胞
発現ベクターで形質転換される宿主細胞には、以下の（ａ）〜（ｄ）からなる群より選択される宿主細胞が含まれる：
（ａ）抗ヒトＭＵＣ１抗体Ｆａｂフラグメントの重鎖フラグメントをコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞；
（ｂ）抗ヒトＭＵＣ１抗体Ｆａｂフラグメントの軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞；
（ｃ）抗ヒトＭＵＣ１抗体Ｆａｂフラグメントの重鎖フラグメントをコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド及び抗ヒトＭＵＣ１抗体Ｆａｂフラグメントの軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞；並びに
（ｄ）抗ヒトＭＵＣ１抗体Ｆａｂフラグメントの重鎖フラグメントをコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクター及び抗ヒトＭＵＣ１抗体Ｆａｂフラグメントの軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞。
【００７７】
１つの実施形態において、発現ベクターで形質転換される宿主細胞は、以下の（ａ）〜（ｄ）からなる群より選択される、本発明の発現ベクターで形質転換された宿主細胞である：
（ａ）配列番号４に示されるアミノ酸配列からなる重鎖フラグメントをコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞；
（ｂ）配列番号６に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞；
（ｃ）配列番号４に示されるアミノ酸配列からなる重鎖フラグメントをコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド及び配列番号６に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞；並びに
（ｄ）配列番号４に示されるアミノ酸配列からなる重鎖フラグメントをコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクター及び配列番号６に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞。
【００７８】
発現ベクターで形質転換される宿主細胞としては、使用する発現ベクターに適合し、該発現ベクターで形質転換されて、Ｆａｂフラグメントを発現しうるものであれば特に限定されず、本発明の技術分野において通常使用される天然細胞又は人工的に樹立された細胞など種々の細胞（例えば、細菌（エシェリキア属菌、バチルス属菌）、酵母（サッカロマイセス属、ピキア属など）、動物細胞又は昆虫細胞（例えば、Ｓｆ９）など）、哺乳動物細胞株（例えば、ＣＨＯ−Ｋ１ＳＶ細胞、ＣＨＯ−ＤＧ４４細胞、２９３細胞等の培養細胞）が例示される。形質転換自体は、例えば、リン酸カルシウム法、エレクトロポレーション法など、公知の方法により行われ得る。
【００７９】
５．本発明の複合体に含まれる抗ヒトＭＵＣ１抗体Ｆａｂフラグメントの生産方法
本発明の複合体に含まれる抗ヒトＭＵＣ１抗体Ｆａｂフラグメントの生産は、上記の形質転換された宿主細胞を培養し、抗ヒトＭＵＣ１抗体Ｆａｂフラグメントを発現させる工程を含む。
【００８０】
１つの実施形態において、本発明の複合体に含まれる抗ヒトＭＵＣ１抗体Ｆａｂフラグメントの生産において培養する形質転換された宿主細胞は、以下の（ａ）〜（ｃ）からなる群より選択される：
（ａ）本発明の複合体に含まれる抗ヒ卜ＭＵＣ１抗体Ｆａｂフラグメン卜の重鎖フラグメントをコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド及び本発明の複合体に含まれる抗ヒトＭＵＣ１抗体Ｆａｂフラグメントの軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞；
（ｂ）本発明の複合体に含まれる抗ヒトＭＵＣ１抗体Ｆａｂフラグメントの重鎖フラグメントをコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクター及び本発明の複合体に含まれる抗ヒトＭＵＣ１抗体Ｆａｂフラグメントの軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞；並びに
（ｃ）本発明の複合体に含まれる抗ヒ卜ＭＵＣ１抗体Ｆａｂフラグメントの重鎖フラグメントをコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞、及び、本発明の複合体に含まれる抗ヒ卜ＭＵＣ１抗体Ｆａｂフラグメン卜の軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞。
【００８１】
ある態様としては、本発明の複合体に含まれる抗ヒトＭＵＣ１抗体Ｆａｂフラグメントの生産において培養する形質転換された宿主細胞は、以下の（ａ）〜（ｃ）からなる群より選択される：
（ａ）配列番号４に示されるアミノ酸配列からなる重鎖フラグメントをコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド及び配列番号６に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞；
（ｂ）配列番号４に示されるアミノ酸配列からなる重鎖フラグメントをコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクター及び配列番号６に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞；並びに
（ｃ）配列番号４に示されるアミノ酸配列からなる重鎖フラグメントをコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞、及び、配列番号６に示されるアミノ酸配列からなる軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞。
【００８２】
好ましくは、使用される形質転換された宿主細胞は、本発明の複合体に含まれる抗ヒトＭＵＣ１抗体Ｆａｂフラグメントの重鎖フラグメントをコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド及び本発明の複合体に含まれる抗ヒトＭＵＣ１抗体Ｆａｂフラグメントの軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞、あるいは、本発明の複合体に含まれる抗ヒトＭＵＣ１抗体Ｆａｂフラグメントの重鎖フラグメントをコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクター及び本発明の複合体に含まれる抗ヒトＭＵＣ１抗体Ｆａｂフラグメントの軽鎖をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞である。
【００８３】
本発明の複合体に含まれる抗ヒトＭＵＣ１抗体Ｆａｂフラグメントの生産において、形質転換された宿主細胞は、栄養培地中で培養され得る。栄養培地は、形質転換された宿主細胞の生育に必要な炭素源、無機窒素源もしくは有機窒素源を含んでいることが好ましい。炭素源としては、例えば、グルコース、デキストラン、可溶性デンプン、ショ糖などが、無機窒素源もしくは有機窒素源としては、例えば、アンモニウム塩類、硝酸塩類、アミノ酸、コーンスチープ・リカー、ペプトン、カゼイン、肉エキス、大豆粕、バレイショ抽出液などが例示される。また所望により他の栄養素（例えば、無機塩（例えば、塩化カルシウム、リン酸二水素ナトリウム、塩化マグネシウム）、ビタミン類、抗生物質（例えば、テトラサイクリン、ネオマイシン、アンピシリン、カナマイシン等）など）を含んでいてもよい。
【００８４】
形質転換された宿主細胞の培養自体は、公知の方法により行われる。培養条件、例えば、温度、培地のｐＨ及び培養時間は、適宜選択される。例えば、宿主が動物細胞の場合、培地としては、約５〜２０％の胎児牛血清を含むＭＥＭ培地（Ｓｃｉｅｎｃｅ；１９５２；１２２：５０１．）、ＤＭＥＭ培地（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ；１９５９；８：３９６−９７．）、ＲＰＭＩ１６４０培地（Ｊ．Ａｍ．Ｍｅｄ．Ａｓｓｏｃ．；１９６７；１９９：５１９−２４．）、１９９培地（Ｐｒｏｃ．Ｓｏｃ．Ｅｘｐ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．；１９５０；７３：１−８．）等を用いることができる。培地のｐＨは約６〜８であるのが好ましく、培養は通常約３０〜４０℃で約１５〜３３６時間行なわれ、必要により通気や撹拌を行うこともできる。宿主が昆虫細胞の場合、例えば、胎児牛血清を含むＧｒａｃｅ'ｓ培地（ＰＮＡＳ；１９８５；８２：８４０４−８.）等が挙げられ、そのｐＨは約５〜８であるのが好ましい。培養は通常約２０〜４０℃で１５〜１００時間行なわれ、必要により通気や撹拌を行うこともできる。宿主が細菌、放線菌、酵母、糸状菌である場合、例えば、上記栄養源を含有する液体培地が適当である。好ましくは、ｐＨが５〜８である培地である。宿主がＥ．ｃｏｌｉの場合、好ましい培地としてＬＢ培地、Ｍ９培地（Ｍｉｌｌｅｒら、Ｅｘｐ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ；１９７２：４３１．）等が例示される。かかる場合、培養は、必要により通気、撹拌しながら、通常１４〜４３℃、約３〜２４時間行うことができる。宿主がＢａｃｉｌｌｕｓ属菌の場合、必要により通気、撹拌をしながら、通常３０〜４０℃、約１６〜９６時間行うことができる。宿主が酵母である場合、培地として、例えば、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒ最小培地（ＰＮＡＳ；１９８０；７７：４５０５−８．）が挙げられ、ｐＨは５〜８であることが望ましい。培養は通常約２０〜３５℃で約１４〜１４４時間行なわれ、必要により通気や撹拌を行うこともできる。
【００８５】
本発明の複合体に含まれる抗ヒトＭＵＣ１抗体Ｆａｂフラグメントの生産においては、上記の形質転換された宿主細胞を培養し、抗ヒトＭＵＣ１抗体Ｆａｂフラグメントを発現させる工程に加えて、発現させた抗ヒトＭＵＣ１抗体Ｆａｂフラグメントを回収、好ましくは単離、精製する工程を含めてもよい。単離、精製方法としては、例えば、塩析、溶媒沈澱法等の溶解度を利用する方法、透析、限外濾過、ゲル濾過、ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動など分子量の差を利用する方法、イオン交換クロマトグラフィーやヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィーなどの荷電を利用する方法、アフィニティークロマトグラフィーなどの特異的親和性を利用する方法、逆相高速液体クロマトグラフィーなどの疎水性の差を利用する方法、等電点電気泳動などの等電点の差を利用する方法などが挙げられる。
【００８６】
６．本発明の複合体を生産する方法
本発明の複合体を生産する方法には、抗ヒトＭＵＣ１抗体Ｆａｂフラグメントを、標識部（Ｙ−Ｓ1−Ｘ）と共有結合させる工程を含めることができる。前記標識部（Ｙ−Ｓ1−Ｘ）における各構成要素間の結合は、公知の手法により、当業者が適宜行うことができる。反応例としては、配位子（Ｙ）を直接又はスペーサー（Ｓ1）を介してペプチドリンカー（Ｘ）に結合させた後に、前記ペプチドリンカーと抗ヒトＭＵＣ１抗体Ｆａｂフラグメントとを結合させることができる。また、抗ヒトＭＵＣ１抗体Ｆａｂフラグメントをペプチドリンカー（Ｘ）に結合させた後に、前記ペプチドリンカーと配位子（Ｙ）とを直接又はスペーサー（Ｓ1）を介して結合させることもできる。さらに、配位子、例えばDOTAと、抗ヒトＭＵＣ１抗体Ｆａｂフラグメントとを直接公知の手法により結合させることもできる。なお、原料としてあらかじめ配位子とスペーサー（Ｓ1）とが結合した化合物を用いることもできる。
【００８７】
本発明の複合体を生産する方法はまた、上記の形質転換された宿主細胞を培養し、抗ヒトＭＵＣ１抗体Ｆａｂフラグメントを発現させる工程、及び、当該Ｆａｂフラグメントと標識部（Ｙ−Ｓ1−Ｘ）とを共有結合させる工程を含んでいてもよい。本発明の複合体を生産する方法はまた、上記の形質転換された宿主細胞を培養し、抗ヒトＭＵＣ１抗体Ｆａｂフラグメントを発現させる工程、発現させた当該Ｆａｂフラグメントを回収する工程、及び、当該Ｆａｂフラグメントと標識部（Ｙ−Ｓ1−Ｘ）とを共有結合させる工程を含んでいてもよい。本発明の複合体を生産する方法は、更に、金属を添加する工程を含んでもよい。使用されるキレート剤、ペプチドリンカー、スペーサー、標識部の数、金属などは、本明細書に記載のものを使用することができる。
【００８８】
本発明の複合体を生産する方法は、上記で特定する２以上の工程を一連の工程として含む方法として実施することもできるし、上記で特定する少なくとも一つの工程を含む方法として実施することもできる。例えば、抗ヒトＭＵＣ１抗体Ｆａｂフラグメントを標識部（Ｙ−Ｓ1−Ｘ）と結合させる工程を含む方法、及び、標識部（Ｙ−Ｓ1−Ｘ）を結合させた抗ヒトＭＵＣ１抗体Ｆａｂフラグメントに金属を配位させる工程を含む方法もまた、本発明の複合体を生産する方法に含まれる。また、本発明の複合体を生産する方法には、工程の順番が異なる方法も含まれる。例えば、配位子に金属を配位させた標識部（Ｙ−Ｓ1−Ｘ）に、抗ヒトＭＵＣ１抗体Ｆａｂフラグメントと共有結合させる方法も、本発明の複合体を生産する方法に含まれる。
【００８９】
７．診断用組成物・診断方法
本発明は、金属を含む本発明の複合体（以下、検出可能な本発明の複合体と称する。）を含む、診断用組成物に関する。本発明の診断用組成物は、本発明の複合体を１種類以上含むものであってもよい。すなわち、本発明の診断用組成物は、本発明の複合体を１種類含むものであってもよく、または２種類以上の本発明の複合体の組合せを含むものであってもよい。検出可能な本発明の複合体は、常法に従って製剤化され、早期診断薬、又は病期診断薬（特に癌の診断薬）として利用することができる。
【００９０】
早期診断薬とは、病状が観察されない、又は病期の早い段階で診断を行うことを目的とする診断薬を意味する。例えば、癌においては、病状が観察されないか、ステージ０又はステージ１の段階で用いる診断薬を意味する。
【００９１】
病期診断薬とは、病状がどの程度進行しているかを検査することが可能な診断薬を意味する。例えば、癌については、そのステージを検査することが可能な診断薬を意味する。
【００９２】
本発明の診断用組成物により診断できることが期待される癌は、ヒトＭＵＣ１を発現する癌である。ある態様としては、乳癌、肺癌、大腸癌、膀胱癌、皮膚癌、甲状腺癌、胃癌、膵臓癌、腎臓癌、卵巣癌又は子宮頚癌が挙げられる。好ましくは、当該癌は乳癌又は膀胱癌である。
【００９３】
本発明の診断用組成物の製剤化にあたっての本発明の複合体の添加量は、患者の症状の程度や年齢、使用する製剤の剤型、あるいはＦａｂフラグメントの結合力価等により異なるが、例えば、患者の単位体重あたりＦａｂフラグメントの質量ベースで０．００１ｍｇ／ｋｇないし１００ｍｇ／ｋｇ程度を用いればよい。
【００９４】
本発明の診断用組成物の剤型の例としては、注射剤、点滴用剤等の非経口剤を挙げることができ、静脈内注射、標的組織局所への筋肉内注射、皮下注射、膀胱内投与等により投与することができる。また、製剤化にあたっては、薬学的に許容される範囲で、これら剤型に応じた担体や添加剤を使用することができる。薬学的に許容される担体や添加剤の種類は特に限定されず、当業者に周知の担体や添加剤を用いることができる。
【００９５】
本発明はまた、癌の早期診断用組成物、病期診断用組成物の製造のための、検出可能な本発明の複合体の使用に関する。本発明は、癌の早期診断、病期診断において使用するための、検出可能な本発明の複合体にも関する。
【００９６】
そして、本発明は、検出可能な本発明の複合体を、対象に投与することを含む癌の診断方法にも関する。ここにおいて、「対象」とは、その診断を受けることを必要とするヒト又はその他の哺乳動物であり、ある態様としては、その診断を受けることを必要とするヒトである。本発明の診断方法における検出可能な本発明の複合体の有効量は上記製剤化にあたっての本発明の複合体の有効量と同様の量であってもよい。本発明の診断方法において、検出可能な本発明の複合体は、標的組織局所への筋肉内注射、皮下注射等により投与することが好ましい。
【００９７】
別の実施形態において、本発明は、本発明の複合体の製造のための、本発明の抗ヒトＭＵＣ１抗体Ｆａｂフラグメントの使用にも関する。ある態様としては、本発明は、本発明の複合体を含む診断用組成物の製造のための、本発明の抗ヒトＭＵＣ１抗体Ｆａｂフラグメントの使用にも関する。
【００９８】
また、金属放射性同位元素を含む本発明の診断用組成物が提供される際の態様としては、使用の直前に金属放射性同位元素で標識されてもよく、金属放射性同位元素を含む診断用組成物として提供されてもよい。
【００９９】
８．医薬組成物・治療方法
本発明には、90Ｙ又は177Ｌｕ等の金属放射性同位元素を含む１種類以上の本発明の複合体及び薬学的に許容される担体を含む医薬組成物が含まれる。また、本発明の医薬組成物は、本発明の複合体を１種類含むものであってもよく、または２種類以上の本発明の複合体の組合せを含むものであってもよい。本発明の複合体は、当該分野において通常用いられている担体、即ち、薬剤用賦形剤や薬剤用担体等を用いて、通常使用される方法によって医薬組成物の調製に用いることができる。これら医薬組成物の剤型の例としては、例えば、注射剤、点滴用剤等の非経口剤が挙げられ、静脈内投与、皮下投与、膀胱内投与等により投与することができる。製剤化にあたっては、薬学的に許容される範囲で、これら剤型に応じた賦形剤、担体、添加剤等を使用することができる。
【０１００】
上記製剤化に当たっての本発明の複合体の添加量は、患者の症状の程度や年齢、使用する製剤の剤型、あるいはＦａｂフラグメントの結合力価等により異なるが、例えば、患者の単位体重あたりＦａｂフラグメントの質量ベースで０．００１ｍｇ／ｋｇないし１００ｍｇ／ｋｇ程度を用いることができる。
【０１０１】
本発明の複合体を含む医薬組成物は、癌の治療のために用いることができる。本発明の複合体を含む医薬組成物により治療できることが期待される癌は、ヒトＭＵＣ１を発現する癌であり、例えば、乳癌、肺癌、大腸癌、膀胱癌、皮膚癌、甲状腺癌、胃癌、膵臓癌、腎臓癌、卵巣癌又は子宮頚癌が挙げられる。
【０１０２】
本発明には、本発明の複合体を含む、乳癌又は膀胱癌を治療するための医薬組成物が含まれる。また、本発明には、本発明の複合体の治療有効量を投与する工程を包含する、乳癌又は膀胱癌を治療する方法が含まれる。また、本発明には、本発明の複合体の治療有効量を投与する工程を包含する、乳癌又は膀胱癌の癌細胞の細胞死を誘導する方法が含まれる。
【０１０３】
癌を治療するための医薬組成物は、癌の診断にも用いることができる。例えば、乳癌又は膀胱癌を治療するための医薬組成物を、当該癌の診断にも用いることもできる。
【０１０４】
また、本発明には、乳癌又は膀胱癌の治療に使用するための、本発明の複合体が含まれる。さらに、本発明には、乳癌又は膀胱癌を治療するための医薬組成物の製造のための、本発明の複合体の使用が含まれる。
【０１０５】
別の実施形態において、本発明は、本発明の複合体を含む医薬組成物の製造のための、本発明の抗ヒトＭＵＣ１抗体Ｆａｂフラグメントの使用にも関する。
【０１０６】
本発明について全般的に記載したが、さらに理解を得るために参照する特定の実施例をここに提供する。しかし、これらは例示を目的とするものであって、本発明を限定するものではない。
【実施例】
【０１０７】
（実施例１：抗ヒトＭＵＣ１抗体Ｆａｂフラグメントの作製）
Ｐ１０−１  Ｆａｂ及びＰ１０−２  Ｆａｂと称する２種類の抗ヒトＭＵＣ１抗体Ｆａｂフラグメントを作製した。【０１０８】
Ｐ１０−１  Ｆａｂ及びＰ１０−２  Ｆａｂの重鎖可変領域及び軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、具体的には、マウス由来の抗ヒト癌特異的ＭＵＣ１抗体である１Ｂ２抗体を文献（Ｆｒｏｎｔ  Ｂｉｏｓｃｉ．，  ２００８  Ｊａｎ  １；１３：１６１９−３３．）に記載の方法を参考にしてヒト化後、文献（Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，  ２０１４  Ａｕｇ；８２（８）：１６２４−３５．）に準じて構築したヒト化抗体の分子モデルを用いて、親和性の向上及び標識部を結合させても親和性が減弱しないことが期待される配列を設計した。【０１０９】
Ｐ１０−１  Ｆａｂ及びＰ１０−２  Ｆａｂの各重鎖可変領域遺伝子の５’側にシグナル配列（ＭＥＷＳＷＶＦＬＦＦＬＳＶＴＴＧＶＨＳ（配列番号１３））をコードする遺伝子を、そして３’側にヒトＩｇγ１の定常領域遺伝子（配列番号１及び３の塩基番号３５５から６６９までの塩基配列からなる）をそれぞれ繋げてできる重鎖フラグメント遺伝子が挿入されたＧＳベクターｐＥＥ６．４（Ｌｏｎｚａ社）を作製した。ここで、Ｆａｂフラグメントとして発現させるために、重鎖定常領域遺伝子において、ＫａｂａｔらによるＥＵインデックスに基づく２２１番目のＡｓｐ（後述の配列番号２及び４のアミノ酸配列中の２２２番目のＡｓｐに対応）のコドンの後に停止コドンを挿入した。また、Ｐ１０−１  Ｆａｂ及びＰ１０−２  Ｆａｂ共通の軽鎖可変領域遺伝子の５’側にシグナル配列（ＭＳＶＰＴＱＶＬＧＬＬＬＬＷＬＴＤＡＲＣ（配列番号１４））をコードする遺伝子を、そして３’側にヒトκ鎖の定常領域遺伝子（配列番号５の塩基番号３４０から６６０までの塩基配列からなる）をそれぞれ繋げてできる軽鎖遺伝子が挿入されたＧＳベクターｐＥＥ１２．４（Ｌｏｎｚａ社）を作製した。【０１１０】
一過性発現の方法でＦａｂフラグメントの発現を行った。Ｅｘｐｉ２９３  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｍｅｄｉｕｍ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）で約２５０万個／ｍＬに培養されたＥｘｐｉ２９３Ｆ細胞（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）に対し、前述の重鎖フラグメント及び軽鎖のＧＳベクターをＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅ  ２９３  Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を用いてトランスフェクトし、８日間培養した。発現させた後、培養上清をＫａｐｐａＳｅｌｅｃｔ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）を用いて精製し、各Ｆａｂフラグメントを得た。【０１１１】
Ｐ１０−１  Ｆａｂの重鎖フラグメントの塩基配列を配列番号１に、それによりコードされるアミノ酸配列を配列番号２にそれぞれ示す。Ｐ１０−１  Ｆａｂの重鎖可変領域の塩基配列を配列番号７に、それによりコードされるアミノ酸配列を配列番号８にそれぞれ示す。【０１１２】
Ｐ１０−２  Ｆａｂの重鎖フラグメントの塩基配列を配列番号３に、それによりコードされるアミノ酸配列を配列番号４にそれぞれ示す。Ｐ１０−２  Ｆａｂの重鎖可変領域の塩基配列を配列番号９に、それによりコードされるアミノ酸配列を配列番号１０にそれぞれ示す。【０１１３】
Ｐ１０−１  Ｆａｂ及びＰ１０−２  Ｆａｂの軽鎖は共通で、その塩基配列は配列番号５に、それによりコードされるアミノ酸配列は配列番号６にそれぞれ示す。Ｐ１０−１  Ｆａｂ及びＰ１０−２  Ｆａｂの軽鎖可変領域の塩基配列を配列番号１１に、それによりコードされるアミノ酸配列を配列番号１２にそれぞれ示す。【０１１４】
（実施例２：Ｆａｂフラグメントのアミノ酸修飾分析）
精製したＰ１０−２  Ｆａｂのアミノ酸修飾を分析した結果、精製抗体の大部分において、重鎖Ｎ末端のグルタミンがピログルタミン酸に修飾されていることが示唆された。【０１１５】
（実施例３：抗ヒトＭＵＣ１抗体Ｆａｂフラグメント複合体の作製）
本実施例における抗ヒトＭＵＣ１抗体Ｆａｂフラグメント（Ｆａｂ）としては、Ｐ１０−１  Ｆａｂを用いた。
なお、以下の実施例において、ＭＳ解析により確認できた各複合体のＦａｂが結合する(Ｙ-Ｓ1-Ｘ)の数を示しているが、その結果はそれ以外の結合数を有する複合体を含まないことを示すものではない。ＭＳ解析機器の精度の関係でその存在を確認できていない結合数の複合体が存在している可能性は残ることは理解されよう。【０１１６】
（実施例３−１：サンプルNo.1（[DFO-C(=O)-(1，3-フェニレン)-C(=O)-Gly-Lys-Z2]p-Fab）の合成）
【化１０】
2019221269.tif 000011
【０１１７】
(i) N-(3-{[(2,5-ジオキソピロリジン-1-イル)オキシ]カルボニル}ベンゾイル)グリシル-6-(2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロ-1H-ピロール-1-イル)-L-ノルロイシンの合成
N-(tert-ブトキシカルボニル)グリシル-6-(2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロ-1H-ピロール-1-イル)-L-ノルロイシンtert-ブチルエステル (11.5 g)をアニソール (2.8 mL)に溶かし、トリフルオロ酢酸（以下TFAと略称） (58 mL)を室温で滴下し、2時間撹拌した。HPLCで原料の消失と目的物の生成を確認し、反応液を減圧留去した。残渣にジエチルエーテル（200mL）を加えて析出した固体をろ取し、ジエチルエーテルで洗浄してグリシル-6-(2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロ-1H-ピロール-1-イル)-L-ノルロイシンモノ(トリフルオロ酢酸)塩(8.70 g)を得た。MS(ESI+)；284【０１１８】
グリシル-6-(2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロ-1H-ピロール-1-イル)-L-ノルロイシンモノ(トリフルオロ酢酸)塩(105 mg)と、1,1'-[1,3-フェニレンビス(カルボニルオキシ)]ジ(ピロリジン-2,5-ジオン)(272 mg)をジメチルホルムアミド（以下DMFと略称）(3 mL)に溶かし、トリエチルアミン（以下TEAと略称）(0.07 mL)を室温でゆっくりと加え、20分撹拌した。LCMSで目的物の生成と原料の消失を確認し、TFA水溶液を加えて反応をクエンチしpHを4付近に調製した。逆相カラムクロマトグラフィー (YMC Triart C18, アセトニトリル/0.1%TFA水溶液)にて精製を行い、目的物を含むフラクションを集めて濃縮、凍結乾燥させて標題化合物(155 mg)を得た。MS(ESI+); 529【０１１９】
(ii) N-{3-[(3,14,25-トリヒドロキシ-2,10,13,21,24-ペンタオキソ-3,9,14,20,25-ペンタアザトリアコンタン-30-イル)カルバモイル]ベンゾイル}グリシル-6-(2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロ-1H-ピロール-1-イル)-L-ノルロイシンの合成
N-(3-{[(2,5-ジオキソピロリジン-1-イル)オキシ]カルボニル}ベンゾイル)グリシル-6-(2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロ-1H-ピロール-1-イル)-L-ノルロイシン(141 mg)をDMF(5 mL)に溶かし、N4-{5-[アセチル(ヒドロキシ)アミノ]ペンチル}-N1-(5-{4-[(5-アミノペンチル)(ヒドロキシ)アミノ]-4-オキソブタンアミド}ペンチル)-N1-ヒドロキシブタンジアミドモノメタンスルホン酸塩(177 mg)及びTEA(0.075 mL)を室温で加えた。原料が溶けにくく白濁していたのでジメチルスルホキシド（以下DMSOと略称）(5 mL)を加えて溶かし、室温で1時間撹拌した。LCMSで目的物の生成と原料の消失を確認し、TFA水溶液を加えて反応をクエンチしpHを5付近に調製した。逆相カラムクロマトグラフィー (YMC Triart C18, アセトニトリル/0.1%TFA水溶液)にて精製を行い、目的物を含むフラクションを集めて濃縮、減圧下2時間乾燥させて標題化合物（150 mg)を得た。MS(ESI+); 975【０１２０】
(iii) N-{3-[(3,14,25-トリヒドロキシ-2,10,13,21,24-ペンタオキソ-3,9,14,20,25-ペンタアザトリアコンタン-30-イル)カルバモイル]ベンゾイル}グリシル-6-(2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロ-1H-ピロール-1-イル)-L-ノルロイシンの精製
N-{3-[(3,14,25-トリヒドロキシ-2,10,13,21,24-ペンタオキソ-3,9,14,20,25-ペンタアザトリアコンタン-30-イル)カルバモイル]ベンゾイル}グリシル-6-(2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロ-1H-ピロール-1-イル)-L-ノルロイシン(122 mg)をDMSO(8mL)とDMF(4mL)に溶かし、逆相カラムクロマトグラフィー (YMC Triart C18, アセトニトリル/0.1%TFA水溶液)にて精製した。目的物を含むフラクションを集めて濃縮、減圧下2時間乾燥させて標題化合物(19 mg)を得た。MS(ESI-); 973【０１２１】
(iv) サンプルNo.１の合成
0.1Mホウ酸緩衝液にて4mg/mLに調製したＦａｂ溶液に0.1Mホウ酸緩衝液にて調製した2-イミノチオラン（2-IT）溶液を加え、37℃で30分間インキュベートした。過剰の2-ITはアミコンウルトラ-0.5mL遠心式フィルター（メルクミリポア社）を用いてEDTA含有リン酸緩衝生理食塩水（pH6.0）で洗浄を3回繰り返し、最後に濃縮濾過した。【０１２２】
得られた濾液に、0.1Mホウ酸緩衝液（pH8.5）で希釈した後に、DMFに溶解させたN-{3-[(3,14,25-トリヒドロキシ-2,10,13,21,24-ペンタオキソ-3,9,14,20,25-ペンタアザトリアコンタン-30-イル)カルバモイル]ベンゾイル}グリシル-6-(2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロ-1H-ピロール-1-イル)-L-ノルロイシンを加え、37℃で2時間インキュベートした。過剰の試薬はアミコンウルトラ-0.5mL遠心式フィルターを用いEDTA含有リン酸緩衝生理食塩水（pH6.0）で洗浄し、それを3回繰り返し、最後に濃縮濾過した。【０１２３】
続いて、得られた上澄みに、リン酸緩衝生理食塩水（pH6.0）にて10mg/mLに調製した2-ヨードアセトアミド溶液を加えた後、37℃で30分間インキュベートした。過剰のヨードアセトアミドはアミコンウルトラ-0.5mL遠心式フィルターを用いリン酸緩衝生理食塩水（pH7.0）で洗浄を3回繰り返し、最後に濃縮濾過し、Ｆａｂが結合した複合体を得た。当該複合体は、分子量47.5kDaのＦａｂの1つに対して、分子量1076の[DFO-C(=O)-(1，3-フェニレン)-C(=O)-Gly-Lys-Z2]が１つ結合した複合体及び２つ結合した複合体の混合物であることをMS解析により確認した。【０１２４】
（実施例３−２：サンプルNo.2（[DFO-C(=O)-CH2O-(1，3-フェニレン)-C(=O)-Gly-Lys-Z2]p-Fab）の合成）
【化１１】
2019221269.tif 000012
【０１２５】
(i) 3-[2-(ベンジルオキシ)-2-オキソエトキシ]安息香酸の合成
(3-ホルミルフェノキシ)酢酸ベンジルエステル(2.90 g)（Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．  ２０１５  Ａｕｇ  ２４；２１（３５）：１２４２１−３０．）、2-メチルプロパン-2-オール(60 mL)および水(30 mL)の混合物に、室温で2-メチルブタ-2-エン(6 mL)、ナトリウム二水素ホスファート水和物(1:1:2)(3.35 g)および亜塩素酸ナトリウム(3.64 g)を加え、2時間撹拌した。反応液に酢酸エチルと1M塩酸(60 mL)を加え、酢酸エチルで抽出した。有機層を水および飽和塩化ナトリウム水溶液で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥、濾過した。濾液を濃縮することで標題化合物（2.93 g）を得た。MS(ESI-); 285【０１２６】
(ii) N-{3-[2-(ベンジルオキシ)-2-オキソエトキシ]ベンゾイル}グリシル-N 6-[(ベンジルオキシ)カルボニル]-L-リシンtert-ブチルエステルの合成
グリシル-N 6-[(ベンジルオキシ)カルボニル]-L-リシンtert-ブチルエステル(760 mg)、3-[2-(ベンジルオキシ)-2-オキソエトキシ]安息香酸（600 mg)およびDMF(10 mL)の混合物に、氷冷下、ヘキサフルオリドリン酸(1-)1-(ジメチルアミノ)-N,N-ジメチル-1-[(3H-[1,2,3]トリアゾロ[4,5-b]ピリジン-3-イル)オキシ]メタンイミニウム(800 mg)とジイソプロピルエチルアミン（以下DIPEAと略称）(1 mL)を加えた。室温で１時間攪拌後、その混合物に水と酢酸エチルを加え、有機層を分離後、水層を酢酸エチルで抽出した。合わせた有機層を水および飽和塩化ナトリウム水溶液で洗浄後、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、濾過した。濾液を濃縮後、残渣をシリカゲルクロマトグラフィー(ヘキサン/酢酸エチル=90/10-0/100)で精製することで標題化合物（1.19g）を得た。MS(ESI+); 662【０１２７】
(iii) N-[3-(カルボキシメトキシ)ベンゾイル]グリシル-L-リシンtert-ブチルエステルの合成
N-{3-[2-(ベンジルオキシ)-2-オキソエトキシ]ベンゾイル}グリシル-N 6-[(ベンジルオキシ)カルボニル]-L-リシンtert-ブチルエステル（1.18g)およびエチルアルコール（20 mL）の混合物に、室温で10%パラジウム担持炭素(50%含水、200 mg)を加えた。その混合物を、水素気流下（1 atm）室温で終夜攪拌した。その混合物を、セライトを用いて濾過後、濃縮することで標題化合物(804 mg)を得た。MS(ESI+); 438【０１２８】
(iv) N-[3-(カルボキシメトキシ)ベンゾイル]グリシル-6-(2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロ-1H-ピロール-1-イル)-L-ノルロイシンtert-ブチルエステルの合成
N-[3-(カルボキシメトキシ)ベンゾイル]グリシル-L-リシンtert-ブチルエステル(600 mg)、DMF(2 mL)およびテトラヒドロフラン(4 mL)の混合物に2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロ-1H-ピロール-1-カルボン酸メチルエステル(350 mg) およびDIPEA(700 μL)を室温で加えて、60℃で加熱撹拌した。9時間後にDIPEA(500 μL)を追加し、さらに60℃で終夜撹拌した。室温まで放冷し、TFA(600 μL)で中和し、減圧濃縮して、そのまま逆相カラムクロマトグラフィー (YMC Triart C18, アセトニトリル/0.1%TFA水溶液)で精製した。目的物のフラクションを減圧濃縮し、残渣に水および酢酸エチルを加えて分液抽出し、有機層を無水硫酸マグネシウムで乾燥し、濾過した後、濾液を減圧濃縮および乾燥することで標題化合物(378 mg)を得た。MS(ESI+); 518【０１２９】
(v) N-{3-[(9,20,31-トリヒドロキシ-2,10,13,21,24,32-ヘキサオキソ-3,9,14,20,25,31-ヘキサアザトリトリアコンタン-1-イル)オキシ]ベンゾイル}グリシル-6-(2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロ-1H-ピロール-1-イル)-L-ノルロイシンtert-ブチルエステルの合成
N 4-{5-[アセチル(ヒドロキシ)アミノ]ペンチル}-N 1-(5-{4-[(5-アミノペンチル)(ヒドロキシ)アミノ]-4-オキソブタンアミド}ペンチル)-N 1-ヒドロキシブタンジアミドモノメタンスルホン酸塩(400 mg)、N-[3-(カルボキシメトキシ)ベンゾイル]グリシル-6-(2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロ-1H-ピロール-1-イル)-L-ノルロイシンtert-ブチルエステル(365 mg)およびDMF(4 mL)の混合物に3-{[(エチルイミノ)メチリデン]アミノ}-N,N-ジメチルプロパン-1-アミン一塩酸塩（以下EDC HClと略称）(240 mg)、1H-ベンゾトリアゾール-1-オール（以下HOBtと略称）(165 mg)およびDIPEA(500 μL) を氷冷下で加え、室温で終夜撹拌した。反応混合物をTFA(200 μL)と水(500 μL)の混合溶液で希釈し、そのまま逆相カラムクロマトグラフィー (YMC Triart C18, アセトニトリル/0.1%TFA水溶液)にて精製した。目的物のフラクションを集めて減圧濃縮し、凍結乾燥することで標題化合物(285 mg)を得た。MS(ESI-); 1059【０１３０】
(vi) N-{3-[(9,20,31-トリヒドロキシ-2,10,13,21,24,32-ヘキサオキソ-3,9,14,20,25,31-ヘキサアザトリトリアコンタン-1-イル)オキシ]ベンゾイル}グリシル-6-(2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロ-1H-ピロール-1-イル)-L-ノルロイシンの合成
N-{3-[(9,20,31-トリヒドロキシ-2,10,13,21,24,32-ヘキサオキソ-3,9,14,20,25,31-ヘキサアザトリトリアコンタン-1-イル)オキシ]ベンゾイル}グリシル-6-(2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロ-1H-ピロール-1-イル)-L-ノルロイシンtert-ブチルエステル(370 mg)に、TFA(1.5 mL）を氷冷下で加え、室温で一晩撹拌した。減圧濃縮した後、DMF（4 mL）および水（500 μL）を加えて希釈し、そのまま逆相カラムクロマトグラフィー (YMC Triart C18, アセトニトリル/0.1%TFA水溶液)にて精製した。目的物のフラクションを集めて減圧濃縮し、凍結乾燥することによって標題化合物(194 mg)を得た。MS(ESI-); 1003【０１３１】
(vii) サンプルNo.２の合成
(vi)の化合物を用いて、実施例３−１の（iv）と同様にして複合体を得た。当該複合体は、分子量47.5kDaのＦａｂの1つに対して、分子量1106の[DFO-C(=O)-CH2O-(1，3-フェニレン)-C(=O)-Gly-Lys-Z2]が1つ結合した複合体、及び２つ結合した複合体の混合物であることをMS解析により確認した。【０１３２】
（実施例３−３：サンプルNo.３([DOTA-CH2-(1,4-フェニレン)-NH-C(=S)]p-Fab)の合成）
【化１２】
2019221269.tif 000013
キレート剤であるDOTAのＦａｂへの結合には、p-SCN-Bn-DOTA(Macrocyclics社)を使用した。Fab溶液に、リン酸緩衝生理食塩水(pH7.4)およびグリセリンを加え、最終的に0.1M炭酸ナトリウム溶液(pH9.0)を添加することでpH8.8-9.0の6mg/mLの炭酸ナトリウム溶液とした。これにp-SCN-Bn-DOTAを添加し、37℃で2時間インキュベートした。反応後、アミコンウルトラ-0.5mL遠心式フィルターで回収し、複合体を精製した。当該複合体は、分子量47.5kDaのＦａｂの１つに対して、分子量553の[DOTA-CH2-(1,4-フェニレン)-NH-C(=S)]が１つ結合した複合体、２つ結合した複合体、３つ結合した複合体及び４つ結合した複合体の混合物であることをMS解析により確認した。【０１３３】
（実施例３−４：サンプルNo.４（[DOTA]p-Fab）の合成）
【化１３】
2019221269.tif 000014
2,2',2'',2'''-(1,4,7,10-テトラアザシクロドデカン-1,4,7,10-テトライル)四酢酸（DOTA）(16 mg)および水(810μL)の混合溶液に、氷冷下、1M水酸化ナトリウム水溶液(80μL)を加えpH6に調製した。調製した溶液(239μL)に、氷冷下、水(117μL)に溶解させた1-ヒドロキシ-2,5-ジオキソピロリジン-3-スルホン酸ナトリウム(2.3 mg)を加えた。その後、EDC HCl水溶液(8.3μL、25mg/mL)を加え、氷冷下30分攪拌し、N-ヒドロキシスルホスクシニミジルDOTA溶液を調製した。Ｆａｂ添加前に0.2Mリン酸水素二ナトリウム溶液(pH9)(40μL)を加えpH7に調製した。【０１３４】
20.8mg/mL Ｆａｂ(27μL)の0.1Mリン酸水素二ナトリウム溶液（198μL）に調製したN-ヒドロキシスルホスクシニミジルDOTA溶液（100μL）を加え、37℃で20時間インキュベートした。アミコンウルトラを用い10mMリン酸緩衝液（pH7.0）で洗浄を２回繰り返し、0.3Mの酢酸アンモニウム緩衝液で洗浄し最後に濃縮濾過し、複合体を得た。当該複合体は、分子量47.5kDaのＦａｂの1つに対して、分子量387のDOTAが1つ結合した複合体、及び２つ結合した複合体の混合物であることをMS解析により確認した。【０１３５】
（実施例３−５．サンプルNo.５（[DOTA-Gly-Lys-Z2]p-Fab）の合成）
【化１４】
2019221269.tif 000015
【０１３６】
(i) N-{[4,7,10-トリス(カルボキシメチル)-1,4,7,10-テトラアザシクロドデカン-1-イル]アセチル}グリシル-6-(2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロ-1H-ピロール-1-イル)-L-ノルロイシンtert-ブチルエステルテトラキス(トリフルオロ酢酸)塩の合成
氷冷下、N-(tert-ブトキシカルボニル)グリシル-6-(2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロ-1H-ピロール-1-イル)-L-ノルロイシンtert-ブチルエステル(1 g)のジクロロメタン(12 mL)溶液にTFA(6 mL)を加え、氷冷下で2時間攪拌した。反応溶液を減圧下に濃縮することによりグリシル-6-(2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロ-1H-ピロール-1-イル)-L-ノルロイシンtert-ブチルエステルモノ(トリフルオロ酢酸)塩(1.1 g)を得た。MS(ESI+); 340.3
2,2',2'',2'''-(1,4,7,10-テトラアザシクロドデカン-1,4,7,10-テトライル)四酢酸（320 mg）および水（12 mL）混合物に、氷冷下、1M水酸化ナトリウム水溶液（1.58 mL）を加え、pH6に調製した。その後、氷冷下、1-ヒドロキシ-2,5-ジオキソピロリジン-3-スルホン酸ナトリウム(170 mg)及びEDC HCl(150 mg)を加え30分攪拌した。0.2Mリン酸水素二ナトリウム溶液(pH9)(3 mL)を加え、pH7とした後、グリシル-6-(2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロ-1H-ピロール-1-イル)-L-ノルロイシンtert-ブチルエステルモノ(トリフルオロ酢酸)塩(750mg)、1M水酸化ナトリウム水溶液(672 μL)及び0.2Mリン酸水素二ナトリウム溶液(pH9)(800 μL)を加えpH8とし、氷冷下2時間攪拌した。逆相シリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶媒勾配；0→100%アセトニトリル/水(0.05%TFA水溶液)）で精製することにより、標題化合物(347 mg)を得た。MS(ESI-): 726.3【０１３７】
(ii) N-{[4,7,10-トリス(カルボキシメチル)-1,4,7,10-テトラアザシクロドデカン-1-イル]アセチル}グリシル-6-(2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロ-1H-ピロール-1-イル)-L-ノルロイシン四塩酸塩の合成
N-{[4,7,10-トリス(カルボキシメチル)-1,4,7,10-テトラアザシクロドデカン-1-イル]アセチル}グリシル-6-(2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロ-1H-ピロール-1-イル)-L-ノルロイシンtert-ブチルエステルテトラキス(トリフルオロ酢酸)塩(347 mg)の4M塩化水素/ジオキサン(3 mL)およびジクロロメタン(3 mL)混合溶液を室温で3時間攪拌した後、反応溶液を減圧下に濃縮した。残渣を逆相シリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶媒勾配；0→100%アセトニトリル/水(0.05%TFA水溶液)）で精製することにより、標題化合物(168 mg)を得た。MS(ESI+): 670【０１３８】
(iii) サンプルNo.5の合成
5.2mg/mLのＦａｂのホウ酸緩衝液(100μL)に2mg/mL 2-ITの0.1Mホウ酸緩衝液(3.33μL)を加え、37℃で30分間インキュベートした。過剰の2-ITはアミコンウルトラ-0.5mL遠心式フィルターを用いEDTA含有0.1Mリン酸緩衝生理食塩水(pH6.0)で洗浄を3回繰り返し、最後に濃縮濾過した。【０１３９】
得られた濾液に25mg/mL新規リンカー(DMF溶液20μL)を加え、70μLになるように0.1Mホウ酸緩衝液(pH8.5)で希釈し、37℃で2時間インキュベートした。アミコンウルトラ-0.5mL遠心式フィルターを用いEDTA含有0.1Mリン酸緩衝生理食塩水(pH6.0)で洗浄を２回繰り返し、リン酸緩衝生理食塩水(pH7.0)で洗浄し最後に濃縮濾過し、複合体を得た。【０１４０】
当該複合体は、分子量47.5kDaのＦａｂの１つに対して、分子量772の[DOTA-Gly-Lys-Z2]が1つ結合した複合体及び２つ結合した複合体の混合物であることをMS解析により確認した。【０１４１】
（実施例３−６．サンプルNo.６（[DOTA-NH-CH2-(1，3-フェニレン)-C(=O)-Gly-Lys-Z2]p-Fab）の合成）
【化１５】
2019221269.tif 000016
【０１４２】
(i) N-(3-{[(tert-ブトキシカルボニル)アミノ]メチル}ベンゾイル)グリシル-6-(2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロ-1H-ピロール-1-イル)-L-ノルロイシンtert-ブチルエステルの合成
3-{[(tert-ブトキシカルボニル)アミノ]メチル}安息香酸(460 mg)、グリシル-6-(2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロ-1H-ピロール-1-イル)-L-ノルロイシンtert-ブチルエステルモノ(トリフルオロ酢酸)塩(750 mg)およびジクロロメタン(15 mL)混合物に、EDC HCl(380 mg)、HOBt(110 mg)及びTEA(700 μL)を加え室温で15時間攪拌した。反応溶液を濃縮後、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（展開溶媒；酢酸エチル）で精製することにより、標題化合物(478 mg)を得た。MS(ESI+): 595【０１４３】
(ii) N-[3-(アミノメチル)ベンゾイル]グリシル-6-(2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロ-1H-ピロール-1-イル)-L-ノルロイシンtert-ブチルエステルモノ(トリフルオロ酢酸)塩の合成
N-(3-{[(tert-ブトキシカルボニル)アミノ]メチル}ベンゾイル)グリシル-6-(2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロ-1H-ピロール-1-イル)-L-ノルロイシンtert-ブチルエステル(478 mg)のTFA(1.5 mL)およびジクロロメタン(3 mL)混合物を室温で30分攪拌した。反応溶液を減圧下に濃縮することにより、標題化合物(500 mg)を得た。MS(ESI+): 473【０１４４】
(iii) N-[3-({2-[4,7,10-トリス(カルボキシメチル)-1,4,7,10-テトラアザシクロドデカン-1-イル]アセトアミド}メチル)ベンゾイル]グリシル-6-(2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロ-1H-ピロール-1-イル)-L-ノルロイシンtert-ブチルエステルテトラキス(トリフルオロ酢酸)塩の合成
N-[3-(アミノメチル)ベンゾイル]グリシル-6-(2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロ-1H-ピロール-1-イル)-L-ノルロイシンtert-ブチルエステルモノ(トリフルオロ酢酸)塩(489mg)を用いて、上記実施例３−５の工程(i)と同様にして、表題化合物(160 mg)を得た。MS(ESI-): 857【０１４５】
(iv) N-[3-({2-[4,7,10-トリス(カルボキシメチル)-1,4,7,10-テトラアザシクロドデカン-1-イル]アセトアミド}メチル)ベンゾイル]グリシル-6-(2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロ-1H-ピロール-1-イル)-L-ノルロイシン四塩酸塩の合成
N-[3-({2-[4,7,10-トリス(カルボキシメチル)-1,4,7,10-テトラアザシクロドデカン-1-イル]アセトアミド}メチル)ベンゾイル]グリシル-6-(2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロ-1H-ピロール-1-イル)-L-ノルロイシンtert-ブチルエステルテトラキス(トリフルオロ酢酸)塩(160 mg)を用いて、上記実施例３−５の工程(ii)と同様にして、表題化合物(80 mg)を得た。MS(ESI+): 803【０１４６】
(v) サンプルNo.６の合成
(iv)の化合物を用いて、上記実施例３−５の工程(iii)の工程と同様にして、複合体を得た。当該複合体は、分子量47.5kDaのＦａｂの１つに対して、分子量905の[DOTA-NH-CH2-(1，3-フェニレン)-C(=O)-Gly-Lys-Z2]が1つ結合した複合体、２つ結合した複合体、及び３つ結合した複合体の混合物であることをMS解析により確認した。【０１４７】
（実施例３−７．サンプルNo.７（[DOTA-Met-Ile-NH-(CH2)2-Z1]p-Fab）の合成）
【化１６】
2019221269.tif 000017
【０１４８】
(i) N-{[4,7,10-トリス(カルボキシメチル)-1,4,7,10-テトラアザシクロドデカン-1-イル]アセチル}-L-メチオニル-N 1-[2-(2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロ-1H-ピロール-1-イル)エチル]-L-イソロイシンアミドテトラキス(トリフルオロ酢酸)塩の合成
2,2',2'',2'''-(1,4,7,10-テトラアザシクロドデカン-1,4,7,10-テトライル)四酢酸(330 mg)および水(16 mL)混合物に、氷冷下、1M水酸化ナトリウム水溶液(1.6 mL)を加え、pH6に調製した。その後、氷冷下、1-ヒドロキシ-2,5-ジオキソピロリジン-3-スルホン酸ナトリウム(90 mg)及び、EDC HCl(80 mg)を加え30分攪拌した。0.2Mリン酸水素二ナトリウム溶液(pH9)(3 mL)を加え、pH7とした後、L-メチオニル-N 1-[2-(2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロ-1H-ピロール-1-イル)エチル]-L-イソロイシンアミド一塩酸塩(100 mg)（Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ Ｃｈｅｍ. ２０１４ Ｎｏｖ １９；２５（１１）：２０３８−４５.）、1M水酸化ナトリウム水溶液(570 μL)を加え、約pH8とし、氷冷下2時間攪拌した。逆相シリカゲルカラムクロマトグラフィー(アセトニトリル/0.05%TFA水溶液)で精製することにより標題化合物(98 mg)を得た。MS(ESI-): 769【０１４９】
(ii) サンプルNo.７の合成
(i)の化合物を用いて、上記実施例３−５の工程(iii)の工程と同様にして、複合体を得た。当該複合体は、分子量47.5kDaのＦａｂの１つに対して、分子量873の[DOTA-Met-Ile-NH-(CH2)2-Z1]が1つ結合した複合体、２つ結合した複合体、及び３つ結合した複合体の混合物であることをMS解析により確認した。【０１５０】
上記実施例と同様の方法、又は当業者に公知の方法を用いて、後記合成スキームに沿って表１−１〜１―４の製造例No. A1〜A19の化合物を合成した。
【表１−１】
2019221269.tif 000018
【表１−２】
2019221269.tif 000019
【表１−３】
2019221269.tif 000020
【表１−４】
2019221269.tif 000021
【０１５１】
（合成スキーム）
【化１７】
2019221269.tif 000022
【０１５２】
【化１８】
2019221269.tif 000023
【０１５３】
【化１９】
2019221269.tif 000024
【０１５４】
【化２０】
2019221269.tif 000025
【０１５５】
【化２１】
2019221269.tif 000026
【０１５６】
【化２２】
2019221269.tif 000027
【０１５７】
【化２３】
2019221269.tif 000028
【０１５８】
【化２４】
2019221269.tif 000029
【０１５９】
【化２５】
2019221269.tif 000030
【０１６０】
【化２６】
2019221269.tif 000031
【０１６１】
【化２７】
2019221269.tif 000032
【０１６２】
【化２８】
2019221269.tif 000033
【０１６３】
【化２９】
2019221269.tif 000034
【０１６４】
【化３０】
2019221269.tif 000035
【０１６５】
【化３１】
2019221269.tif 000036
【０１６６】
【化３２】
2019221269.tif 000037
【０１６７】
【化３３】
2019221269.tif 000038
【０１６８】
【化３４】
2019221269.tif 000039
【０１６９】
【化３５】
2019221269.tif 000040
【０１７０】
製造例Ｎｏ．A1〜A19の化合物を用いて、上記実施例３−１の工程（ｉｖ）、実施例３−３又は実施例３−５の工程（ｉｉｉ）と同様の手法により対応する表２の複合体No.B1〜B19を合成できる。なお、表中、pは１〜２５の自然数（ある態様としては１〜４の自然数）を、1,3-Phは１，３−フェニレンを、及び1,4-Phは１，４−フェニレンをそれぞれ示す。【０１７１】
【表２】
2019221269.tif 000041
【０１７２】
（実施例４：Ｆａｂフラグメントの結合活性評価）
実施例１の方法で発現させたＰ１０−１  Ｆａｂ及びＰ１０−２  Ｆａｂについて、ヒト癌特異的ＭＵＣ１に対する結合活性をＣｅｌｌ  ＥＬＩＳＡ法によりキメラ１Ｂ２抗体Ｆａｂフラグメント（以下、１Ｂ２  Ｆａｂと表記することがある。１Ｂ２抗体（特許文献１）のＶHドメイン及びＶLドメイン（配列情報は特許文献１から引用）に、ヒトＩｇＧ１のＣH１ドメイン、κ鎖のＣLドメインをそれぞれ連結して作製した。ＣH１ドメイン及びＣLドメインを連結する都合上、ＶHドメインのＫａｂａｔらによるＥＵインデックスに基づく１１３番目のアラニン残基がセリン残基に、ＶLドメインのＫａｂａｔらによるＥＵインデックスに基づく１０９番目のアラニン残基がスレオニン残基に置換されている。）と比較した。すなわち、ヒト癌特異的ＭＵＣ１を発現する乳癌細胞株Ｔ−４７Ｄ細胞（ＡＴＣＣより購入可能；ＨＴＢ−１３３）を１ウェルあたり０．７５×１０4細胞、コラーゲンＩでコートした９６ウェルＥＬＩＳＡプレートに播種し、一晩培養後、細胞をホルマリンで固定化し、それに対して上記Ｐ１０−１  Ｆａｂ、Ｐ１０−２  Ｆａｂ又は１Ｂ２  Ｆａｂを反応させた後、二次抗体として西洋ワサビペルオキシダーゼ（Ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ  Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ：ＨＲＰ）標識ヤギ抗ヒトＩｇκ抗体（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ社）を反応させ、ＥＣＬ  Ｐｒｉｍｅ  Ｗｅｓｔｅｒｎ  Ｂｌｏｔｔｉｎｇ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）を加えて発光させ、その発光度を調べた。その結果、図１に示したようにＰ１０−１  Ｆａｂ及びＰ１０−２  Ｆａｂは１Ｂ２  Ｆａｂの約１０倍以上のヒト癌特異的ＭＵＣ１に対する結合活性を持つことが確認された。【０１７３】
（実施例５：抗ヒトＭＵＣ１抗体Ｆａｂフラグメント複合体の結合活性評価）
実施例３の方法で作製した各抗ヒトＭＵＣ１抗体Ｆａｂフラグメント複合体について、ヒト癌特異的ＭＵＣ１に対する結合活性を評価するためにＥＬＩＳＡ法を行った。
サンプルＮｏ．５：[DOTA-Gly-Lys-Z2]p-Fab
サンプルＮｏ．６：[DOTA-NH-CH2-(1,3-フェニレン)-C(=O)-Gly-Lys-Z2]p-Fab
サンプルＮｏ．７：[DOTA-Met-Ile-NH-(CH2)2-Z1]p-Fab
サンプルＮｏ．３：[DOTA-CH2-(1,4-フェニレン)-NH-C(=S)]p-Fab【０１７４】
ヒト癌特異的ＭＵＣ１ペプチド（特許文献1）を1ウェルあたり0.5 μmol/L、384ウェルELISAプレートに固相した。それに対して上記各抗ヒトＭＵＣ１抗体Ｆａｂフラグメント複合体（サンプルＮｏ．５、６、７、又は３）を反応させた後、二次抗体として西洋ワサビペルオキシダーゼ標識ヤギ抗ヒトIgκ抗体（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ社）を反応させ、ＥＣＬ  Ｐｒｉｍｅ  Ｗｅｓｔｅｒｎ  Ｂｌｏｔｔｉｎｇ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）を加えて発光させ、その発光度を調べた。その結果を表３に示す。サンプルＮｏ．５、６、７及び３の複合体はＰ１０−１  Ｆａｂと同等のヒト癌特異的ＭＵＣ１ペプチドに対する結合活性を持つことが確認された。【０１７５】
【表３】
2019221269.tif 000042
【０１７６】
同様にして、以下の抗ヒトＭＵＣ１抗体Ｆａｂフラグメント複合体についても結合性評価を行った。結果を表４及び５に示す。
サンプルＮｏ．４：[DOTA]p-Fab
サンプルＮｏ．１：[DFO-C(=O)-(1,3-フェニレン)-C(=O)-Gly-Lys-Z2]p-Fab
サンプルＮｏ．２：[DFO-C(=O)-CH2O-(1,3-フェニレン)-C(=O)-Gly-Lys-Z2]p-Fab【０１７７】
【表４】
2019221269.tif 000043
【０１７８】
【表５】
2019221269.tif 000044
【０１７９】
その結果、サンプルＮｏ．４、１、及び２の複合体についても、Ｐ１０−１  Ｆａｂと同等のヒト癌特異的ＭＵＣ１ペプチドに対する結合活性を持つことが確認された。
【産業上の利用可能性】
【０１８０】
本発明複合体は、ヒト癌特異的ＭＵＣ１に対する優れた結合活性を有することから、癌の診断及び／又は治療に有用であることが期待される。
【配列表フリーテキスト】
【０１８１】
配列番号１：Ｐ１０−１  Ｆａｂ重鎖フラグメントをコードするＤＮＡの塩基配列
配列番号２：Ｐ１０−１  Ｆａｂ重鎖フラグメントのアミノ酸配列
配列番号３：Ｐ１０−２  Ｆａｂ重鎖フラグメントをコードするＤＮＡの塩基配列
配列番号４：Ｐ１０−２  Ｆａｂ重鎖フラグメントのアミノ酸配列
配列番号５：抗体軽鎖をコードするＤＮＡの塩基配列
配列番号６：抗体軽鎖のアミノ酸配列
配列番号７：Ｐ１０−１  Ｆａｂ重鎖可変領域をコードするＤＮＡの塩基配列
配列番号８：Ｐ１０−１  Ｆａｂ重鎖可変領域のアミノ酸配列
配列番号９：Ｐ１０−２  Ｆａｂ重鎖可変領域をコードするＤＮＡの塩基配列
配列番号１０：Ｐ１０−２  Ｆａｂ重鎖可変領域のアミノ酸配列
配列番号１１：抗体軽鎖可変領域をコードするＤＮＡの塩基配列
配列番号１２：抗体軽鎖可変領域のアミノ酸配列
配列番号１３：重鎖シグナル配列
配列番号１４：軽鎖シグナル配列
配列番号１５：ＭＵＣ１の細胞外ドメインのタンデムリピート配列
【図１】
2019221269.tif 000049
【配列表】
2019221269000001.app
【国際調査報告】
2019221269.tif 000050
2019221269.tif 000051
2019221269.tif 000052
2019221269.tif 000053
2019221269.tif 000054
2019221269.tif 000055