(57)【要約】  本発明は、ヒトリンパ球細胞の培養に用いた場合に高い細胞増殖率が得られる無血清培地を提供すること、及び、かかる無血清培地を用いるヒトリンパ球細胞（好ましくはヒトＴリンパ球細胞）の培養方法等を提供することを目的とする。【特許請求の範囲】
【請求項１】
血清を含有しない動物細胞培養用基礎培地、０．２〜５ｇ／Ｌのヒトアルブミン、０．２〜１５ｍｇ／Ｌのヒトトランスフェリン、０．３〜５ｍｇ／Ｌのヒトインスリン、０．３〜１５ｍｇ／Ｌのグルタチオン、９〜５４ｍｇ／Ｌのアスコルビン酸リン酸エステル又はその塩、及び、３〜３７ｍｇ／Ｌのエタノールアミンを含有するヒトリンパ球細胞培養用無血清培地。
【請求項２】
さらに、０．０２〜０．６ｇ／Ｌのピルビン酸塩、１．３〜３４μｇ／Ｌの亜セレン酸化合物、０．１〜２．５ｇ／ＬのＬ−アラニル−Ｌ−グルタミン、０．０２〜０．５ｇ／Ｌの抗生物質、１〜１５ｇ／Ｌの緩衝剤及び２〜５０μｇ／Ｌの酢酸又はその塩からなる群から選択される１種又は２種以上を含有する、請求項１に記載のヒトリンパ球細胞培養用無血清培地。
【請求項３】
１〜１５ｇ／Ｌの緩衝剤が、１〜７ｇ／ＬのＨＥＰＥＳ、及び、０．５〜１０ｇ／Ｌの炭酸水素ナトリウムである、請求項２に記載のヒトリンパ球細胞培養用無血清培地。
【請求項４】
抗生物質が、カナマイシン及びストレプトマイシンである、請求項１〜３のいずれかに記載のヒトリンパ球細胞培養用無血清培地。
【請求項５】
動物細胞培養用基礎培地が、ＤＭＥＭ／Ｆ−１２、ＤＭＥＭ、ＥＭＥＭ、ＩＭＤＭ、ＧＭＥＭ、ＲＰＭＩ−１６４０、α−ＭＥＭ、Ｈａｍ’ｓ Ｍｅｄｉｕｍ Ｆ−１２、Ｈａｍ’ｓ Ｍｅｄｉｕｍ Ｆ−１０、Ｈａｍ’ｓ Ｍｅｄｉｕｍ Ｆ−１２Ｋ、ＡＴＣＣ−ＣＲＣＭ３０、ＢＭＥ（Basal Medium Eagle）、Ｆｉｓｃｈｅｒ’ｓ ｍｅｄｉｕｍ、ＭｃＣｏｙ’ｓ ５Ａ ｍｅｄｉｕｍ、Ｌｅｉｂｏｖｉｔｚ’ｓ Ｌ−１５ ｍｅｄｉｕｍ、ＲＩＴＣ８０−７ ｍｅｄｉｕｍ、ＭＣＤＢ１０５ ｍｅｄｉｕｍ、ＭＣＤＢ１０７ ｍｅｄｉｕｍ、ＭＣＤＢ１５３ ｍｅｄｉｕｍ、ＭＣＤＢ２０１ ｍｅｄｉｕｍ、ＮＣＴＣ１０９ ｍｅｄｉｕｍ、ＮＣＴＣ１３５ ｍｅｄｉｕｍ、Ｗａｙｍｏｕｔｈ’ｓ ＭＢ ７５２／１ ｍｅｄｉｕｍ、Ｗｉｌｌｉａｍｓ’ ｍｅｄｉｕｍ Ｅ、及び、ＲｅｐｒｏＦＦ２ ｃｅｌｌ ｃｕｌｔｕｒｅ ｍｅｄｉｕｍからなる群から選択される１種の培地又は２種以上の混合培地である、請求項１〜４のいずれかに記載のヒトリンパ球細胞培養用無血清培地。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれかに記載のヒトリンパ球細胞培養用無血清培地を用いてヒトリンパ球細胞を培養する工程を含む、ヒトリンパ球細胞の培養方法。
【請求項７】
ヒトリンパ球細胞培養用無血清培地を調製するためのキットであって、
前記キットは、ヒトアルブミン、ヒトトランスフェリン、ヒトインスリン、グルタチオン、アスコルビン酸リン酸エステル又はその塩、及び、エタノールアミンを含有し、
前記ヒトリンパ球細胞培養用無血清培地が、
血清を含有しない動物細胞培養用基礎培地、０．２〜５ｇ／Ｌのヒトアルブミン、０．２〜１５ｍｇ／Ｌのヒトトランスフェリン、０．３〜５ｍｇ／Ｌのヒトインスリン、０．３〜１５ｍｇ／Ｌのグルタチオン、９〜５４ｍｇ／Ｌのアスコルビン酸リン酸エステル又はその塩、及び、３〜３７ｍｇ／Ｌのエタノールアミンを含有する、前記キット。
【請求項８】
キットがさらに、ピルビン酸塩、亜セレン酸化合物、Ｌ−アラニル−Ｌ−グルタミン、抗生物質、緩衝剤、及び、酢酸又はその塩からなる群から選択される１種又は２種以上を含有し、
ヒトリンパ球細胞培養用無血清培地が、さらに、０．０２〜０．６ｇ／Ｌのピルビン酸塩、１．３〜３４μｇ／Ｌの亜セレン酸化合物、０．１〜２．５ｇ／ＬのＬ−アラニル−Ｌ−グルタミン、０．０２〜０．５ｇ／Ｌの抗生物質、１〜１５ｇ／Ｌの緩衝剤及び２〜５０μｇ／Ｌの酢酸又はその塩からなる群から選択される１種又は２種以上を含有する、請求項７に記載のキット。
【請求項９】
キットがさらに、血清を含有しない動物細胞培養用基礎培地を含有する、請求項７又は８に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒトリンパ球細胞を培養するための無血清培地（すなわち、「ヒトリンパ球細胞培養用無血清培地」）や、かかる無血清培地を用いるヒトリンパ球細胞の培養方法等に関する。
【背景技術】
【０００２】
がんの三大治療法は、外科手術、化学療法、放射線療法であるが、がんの第四の治療法として、免疫治療への注目が近年高まりつつある。免疫療法はヒトが本来有する免疫力を利用するため、他の治療法と比較して副作用がきわめて少ない。また、免疫療法は三大治療法とは作用機序が全く異なるため、三大治療法と併用することもできる。免疫療法のうち、免疫システムを担当する免疫細胞を使用する治療法は免疫細胞療法と呼ばれている。免疫細胞療法としては、患者の血液から採取した単球をin vitroで樹状細胞へ誘導し、次いで、その樹状細胞をがん細胞又はがんペプチドで感作した後、それを患者に投与する樹状細胞ワクチン療法、がんペプチドを患者に投与するがんペプチドワクチン療法、患者の血液から採取した少量のガンマデルタＴ細胞をin vitroで増殖及び活性化した後、それを患者に投与するガンマデルタＴ細胞療法、患者の血液から採取したナチュラルキラーＴ細胞（ＮＫＴ細胞）をin vitroで活性化した後、それを患者に投与するＮＫＴ細胞療法、患者の血液から採取したリンパ球と患者から採取したがん細胞とをin vitroで共培養してがん細胞に対する細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）を誘導し、そのＣＴＬを患者に投与するＣＴＬ療法、患者の血液から採取したリンパ球をin vitroで増殖及び活性化した後、それを患者に投与する活性化自己リンパ球療法などが知られている。免疫細胞療法に用いる免疫細胞、中でも、がん治療に高い効果を発揮し得る免疫細胞は、一般的に少量しか得られないことも多いため、免疫細胞を培養で大幅に増殖できるかが、治療効果を得るために重要な要素となる。【０００３】
末梢血リンパ球細胞（以下、単に「リンパ球細胞」とも表示する。）は、生体防御のための免疫系を担う重要な手段として近時大いに注目されている。リンパ球細胞の表面には分化抗原と称される抗原型が発現しており、リンパ球細胞はこの抗原型により様々なサブセットに分類されている。例えば、リンパ球細胞は、ＣＤ３（ＣＤはcluster of differentiationの略）発現の有無をモノクローナル抗体の反応性により検出することにより、細胞性免疫に関与するＴリンパ球細胞（ＣＤ３陽性、ＣＤ３＋とも表す；以下陽性を＋、陰性を−と記載することもある）及びＮＫＴ細胞（ＣＤ１６１陽性、ＣＤ１６１＋とも表す）と、液性免疫に関与するＢリンパ球細胞等（ＣＤ３陰性、ＣＤ３−とも表す）とに区別される。そしてこれらのリンパ球細胞はその機能も異なる。さらに、細胞性免疫に関与するＣＤ３陽性Ｔリンパ球細胞（Ｔ細胞ともいう）は、ＣＤ４を発現するＣＤ４陽性Ｔ細胞と、ＣＤ８を発現するＣＤ８陽性Ｔ細胞とに分類される。末梢におけるＣＤ４陽性Ｔ細胞の大部分は、ヘルパーＴ細胞と呼ばれ、抗体産生の補助や種々の免疫応答の誘導に関与し、抗原刺激により産生するサイトカインの種類が異なるＴｈ１型とＴｈ２型に分類される。末梢におけるＣＤ８陽性Ｔ細胞の大部分は、抗原刺激により活性化すると細胞傷害活性を示す細胞傷害性Ｔ細胞（cytotoxic T lymphocyte：ＣＴＬ）である。【０００４】
前述の活性化自己リンパ球療法に関して、最初に活性化Ｔリンパ球細胞の製造方法を報告したのは関根らである。その方法は、活性化Ｔリンパ球細胞群の増殖を選択的に刺激し、増殖した活性化Ｔリンパ球細胞群を得る方法であり、より具体的には、ヒトの末梢血リンパ球細胞（ＰＢＭＣ：Peripheral Blood Mononuclear Cell）を、抗ＣＤ３抗体のひとつであるＯＫＴ３抗体の固相化された培養フラスコ中で第一期培養し、そのように培養した細胞をＯＫＴ３抗体非存在下で第二期培養する方法である。この方法で得られた活性化リンパ球細胞群は、さらにインターロイキン２（ＩＬ−２）存在下での培養を経て、がんの養子免疫療法として、当該末梢血を採取した患者に投与することができる（特許文献１参照）。また、特許文献２には、ドナー由来の末梢血リンパ球細胞をＯＫＴ３抗体が固相化された培養容器でＩＬ−２存在下に培養し、得られた活性化リンパ球細胞群からＣＤ４陽性細胞を分離し、分離したＣＤ４陽性細胞が総細胞に対して９０％以上含有する製剤を、感染症、腫瘍再発、自己免疫疾患の予防用および治療用の医薬組成物として患者に投与することができることが記載されている（特許文献２参照）。これらのリンパ球細胞源としては、腫瘍浸潤リンパ球細胞（ＴＩＬ：Tumor Infiltrating Lymphocyte）、臍帯血、骨髄等が使用可能である（特許文献２参照）。【０００５】
別の機能的観点から、リンパ球細胞をナイーブリンパ球細胞とメモリーリンパ球細胞とに分類することがある。ナイーブリンパ球細胞は、未だ抗原刺激を受けていない、ＣＤ４５ＲＡ抗原を細胞表面に発現しているリンパ球細胞であり、局所リンパ節等で抗原と出会い刺激を受ける中で活性化されるとされている。メモリーリンパ球細胞は、特異的刺激か非特異的刺激かを問わず、既に抗原刺激を受けてＣＤ４５ＲＯ抗原を発現しているリンパ球細胞である。Ｔリンパ球細胞やＢリンパ球細胞もそれぞれの状態に応じてナイーブＴ細胞とメモリーＴ細胞や、ナイーブＢ細胞とメモリーＢ細胞とに分けることができる。メモリーＴ細胞はさらにエフェクターメモリー（effector memory；ＥＭ）Ｔ細胞とセントラルメモリー（central memory；ＣＭ）Ｔ細胞に分けることができる。セントラルメモリーＴ細胞には、リンパ節にホーミングして体内に侵入してくる異物や抗原を迎え撃つ機能があり、エフェクターメモリーＴ細胞には本来あるべき部位に所属して異物や抗原を捕らえる作用がある。したがって、メモリーＴ細胞群を主成分として含有する製剤は、養子免疫療法において高い治療効果が得られることが予想された。そこで、大隅らは、養子免疫療法に使用される活性化リンパ球細胞の作用メカニズムを解明するために、メモリーＴ細胞サブセットに着目して、活性化増殖培養して得られた活性化リンパ球細胞群の機能を解析した。その結果、活性化リンパ球細胞群に含まれるエフェクターメモリーＴ細胞が、腫瘍細胞との共培養開始２４時間後にはがん細胞に対する細胞障害活性を発現していたこと、一方、セントラルメモリーＴ細胞はがん細胞と共培養を開始して腫瘍抗原を認識した４８時間後にがん細胞に対する細胞障害活性を発現したもので、そのときエフェクターメモリーＴ細胞へと分化していたことが明らかとなった（非特許文献１参照）。【０００６】
メモリーＴ細胞を採取したという報告は、関根らによる２０００年の文献に遡り（特許文献３参照）、これは臍帯血由来のリンパ球細胞を抗ＣＤ３抗体とＩＬ−２との存在下に活性化培養し、７日間活性化増殖させた結果、ＣＤ３陽性細胞の割合が９８％、さらにＣＤ４５ＲＯ陽性細胞の割合が７３％の細胞集団を採取したものである。しかしながら、この時期の細胞は増殖が十分ではなく細胞数が少ないという問題があった。【０００７】
上記の活性化リンパ球細胞は、増殖培養後速やかに患者に投与する必要があり、病状に即した迅速な投与や安定した品質管理が困難であった。そこで、患者の便を考慮して、患者血よりリンパ球細胞を調製するに際し、活性化培養後にリンパ球細胞を凍結保存した報告がある（非特許文献２参照）。ここでは凍結解凍したリンパ球細胞を再度活性化培養して得られる活性化リンパ球細胞中のＣＤ４リンパ球細胞及びＣＤ８リンパ球細胞の占有率が算出されており、ほとんど全てのポピュレーションがほぼ並行的に増殖していると結論付けている。非特許文献３では、臍帯血及び末梢血に由来するリンパ球細胞を分離した後、一旦凍結保存し、解凍後に活性化培養した際のサブセット変化を培養期間中追跡した結果が開示されている。臍帯血及び末梢血に由来するリンパ球細胞はいずれも、メモリーＴ細胞のサブセットであるセントラルメモリーＴ細胞が培養開始後速やかに増殖し６日から７日で増殖のピークに達してその後減少すること、エフェクターメモリーＴ細胞が培養後期に増殖することが報告されている。また、関根らは、患者のリンパ球細胞をインビトロで増殖・活性化培養させた後に超低温フリーザー内で凍結・保存し、使用時に凍結状態から解凍した直後に、生理食塩液を加えて懸濁して投与用製剤とする投与用製剤の製造方法（特許文献４参照）を開示している。【０００８】
また、特許文献５には、
（ａ）採取されたリンパ球細胞を、ＩＬ−２及び固相化抗ＣＤ３抗体の存在下で活性化培養する工程；
（ｂ）メモリーＴ細胞群の占有率上昇を、工程（ａ）の活性化培養中の培地中に浮遊するリンパ球細胞の細胞密度に基づいて検知し、前記細胞密度が４×１０５細胞／ｍＬ以上となることを指標として工程（ａ）のリンパ球細胞を収穫し、凍結保存する工程；及び、
（ｃ）凍結されたリンパ球細胞を解凍し、活性化培養する工程；
を順次備えた高増殖培養法による、メモリーＴ細胞を主成分とするリンパ球細胞群の製造方法が記載されている。
かかる製造方法を用いると、養子免疫療法に供することができるメモリーＴ細胞を、抗体等を使用することなく、簡便かつ迅速により効率的に増殖することができ、その結果、メモリーＴ細胞を大量に製造することができる。【０００９】
また、メモリーＴ細胞に特に限定せず、細胞傷害性リンパ球を効率的に増殖する方法として、例えば特許文献６には、培地中における血清および血漿の総含有濃度が０容量％以上５容量％未満である培地を用いて、フィブロネクチン、そのフラグメントまたはそれらの混合物の存在下に細胞傷害性リンパ球の誘導、維持および拡大培養から選択される少なくとも１つを行う工程を含むことを特徴とする、細胞傷害性リンパ球の製造方法が開示されている。また、特許文献７には、インビトロで培地中の最初のＴリンパ球集団を迅速に拡大するための方法であって、
インビトロで培地に最初のＴリンパ球集団を添加する工程；
少なくとも１つのＴ細胞刺激成分を発現する、分裂していない哺乳動物細胞株を培地に添加する工程であって、ここで、該細胞株はＥＢＶで形質転換されたリンパ芽球細胞株（ＬＣＬ）でない、工程；及び、
培養物をインキュベートする工程を包含する、方法が開示されている。
また、特許文献８には、リンパ球細胞の成長及び増殖に適した細胞培地を作製する方法であって、
ａ）第１のドナーに由来する第１の血液製剤を少なくとも提供する工程、
ｂ）前記第１の血液製剤中の少なくとも１つの品質因子の濃度を測定する工程、
ｃ）測定された品質因子の濃度を、前記品質因子について予め定められた濃度範囲と比較する工程、
ｄ）前記品質因子について測定された濃度が前記予め定められた範囲内にある場合には、細胞培地用に前記第１の血液製剤を選択し、ここでさらに前記第１の選択された血液製剤を第１の加工血液製剤に変換してもよく、前記場合以外の場合には、前記第１の血液製剤を選択しない工程
を含む、
２以上のドナーに由来する血液製剤の混合物を含む細胞液を作製する方法が開示されている。【００１０】
また、一般的な動物細胞用の培地として、特許文献９には、インスリン、トランスフェリン、亜セレン酸ナトリウム、エタノールアミン、ＰｌｕｒｏｎｉｃＦ６８、硫酸鉄、プトレスシン及びピルビン酸ナトリウムを含有することを特徴とする、動物細胞培養用の無血清培地が開示されており、間葉系幹細胞用の培地として、特許文献１０には、化学的に定められている無血清細胞培地であって、
ａ）無血清の基礎培地と、
ｂ）基礎培地補充物質であって、
ｉ）インスリン；
ｉｉ）１つまたは複数のリン脂質増殖因子；および
ｉｉｉ）１つまたは複数のＷＮＴシグナル伝達経路活性化因子；
を含む、基礎培地補充物質と
を含む、化学的に定められている無血清細胞培地が開示されている。特許文献１０には、かかる無血清細胞培地における基礎培地として、ピルビン酸ナトリウム、ＨＥＰＥＳ、トランスフェリン、電子伝達活性化因子（亜セレン酸など）、抗酸化剤（酢酸α−トコフェロール、アスコルビン酸−２−リン酸など）、ヒト血清アルブミンなどを含んでよいことが記載されており、基礎培地補充物質として、インスリンなどを含んでよいことが記載されている。しかし、特許文献９及び１０は、一般的な動物細胞や間葉系幹細胞用の培地の組成を開示しているに過ぎない。【００１１】
前述の特許文献５のメモリーＴ細胞を主成分とするリンパ球細胞群の製造方法において、リンパ球細胞の培養には、リンパ球用の無血清合成培地であるＡＩＭ−Ｖ（登録商標）培地（インビトロジェン社製）にヒト血清及びｒＩＬ−２（組換えヒトインターロイキン−２）を添加した培地が用いられている。血清は、ロットにより成分の変動があり、また病原体混入のリスクもあるため、無血清培地が求められている。しかし、一般に、無血清培地を用いた場合は血清培地を用いた場合と比較して、細胞増殖率がかなり低くなることも多く、細胞増殖率の高い無血清培地を得ることは容易なことではない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１２】
【特許文献１】特開平３−８００７６号公報
【特許文献２】特許第４３８９０３９号公報
【特許文献３】特開２００２−１７１９６６号公報
【特許文献４】特許第４３９５６４４号公報
【特許文献５】特許第６１４２１４２号公報
【特許文献６】国際公開第２００５／０１９４５０号パンフレット
【特許文献７】特表２００２−５１６５６２号公報
【特許文献８】特表２０１７−５２２９０２号公報
【特許文献９】特開２０１７−１６３８７６号公報
【特許文献１０】特表２０１３−５２９９１７号公報
【非特許文献】
【００１３】
【非特許文献１】第３２回癌免疫外科研究会 プログラム・抄録集 １０３ページ 平成２３年４月
【非特許文献２】Sekine T., Human Cell, 5(3) 243-245 (1992)
【非特許文献３】Shikamura M., et al., Biotherapy 23(3) 257-262 (2009)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
本発明の課題は、ヒトリンパ球細胞の培養に用いた場合に高い細胞増殖率が得られる無血清培地を提供すること、及び、かかる無血清培地を用いるヒトリンパ球細胞の培養方法等を提供することにある。
【発明を解決するための手段】
【００１５】
本発明者らは、ヒトリンパ球細胞の増殖効率を上昇させることを目的として培地成分の様々な組合せについて鋭意検討を重ねた結果、血清を含有しない動物細胞培養用基礎培地、０．２〜５ｇ／Ｌのヒトアルブミン、０．２〜１５ｍｇ／Ｌのヒトトランスフェリン、０．３〜５ｍｇ／Ｌのヒトインスリン、０．３〜１５ｍｇ／Ｌのグルタチオン、９〜５４ｍｇ／Ｌのアスコルビン酸リン酸エステル又はその塩、及び、３〜３７ｍｇ／Ｌのモノエタノールアミンを含有する無血清培地をヒトリンパ球細胞の培養に用いると、培地のロット間差がほとんどなく、安全性が高く、かつ、高い増殖効率が得られることを見いだし、本発明を完成するに至った。
【００１６】
すなわち、本発明は、
（１）血清を含有しない動物細胞培養用基礎培地、０．２〜５ｇ／Ｌのヒトアルブミン、０．２〜１５ｍｇ／Ｌのヒトトランスフェリン、０．３〜５ｍｇ／Ｌのヒトインスリン、０．３〜１５ｍｇ／Ｌのグルタチオン、９〜５４ｍｇ／Ｌのアスコルビン酸リン酸エステル又はその塩、及び、３〜３７ｍｇ／Ｌのエタノールアミンを含有するヒトリンパ球細胞培養用無血清培地；や、
（２）さらに、０．０２〜０．６ｇ／Ｌのピルビン酸塩、１．３〜３４μｇ／Ｌの亜セレン酸化合物、０．１〜２．５ｇ／ＬのＬ−アラニル−Ｌ−グルタミン、０．０２〜０．５ｇ／Ｌの抗生物質、１〜１５ｇ／Ｌの緩衝剤及び２〜５０μｇ／Ｌの酢酸又はその塩からなる群から選択される１種又は２種以上を含有する、上記（１）に記載のヒトリンパ球細胞培養用無血清培地；や、
（３）１〜１５ｇ／Ｌの緩衝剤が、１〜７ｇ／ＬのＨＥＰＥＳ、及び、０．５〜１０ｇ／Ｌの炭酸水素ナトリウムである、上記（２）に記載のヒトリンパ球細胞培養用無血清培地；や、
（４）抗生物質が、カナマイシン及びストレプトマイシンである、上記（１）〜（３）のいずれかに記載のヒトリンパ球細胞培養用無血清培地；や、
（５）動物細胞培養用基礎培地が、ＤＭＥＭ／Ｆ−１２、ＤＭＥＭ、ＥＭＥＭ、ＩＭＤＭ、ＧＭＥＭ、ＲＰＭＩ−１６４０、α−ＭＥＭ、Ｈａｍ’ｓ Ｍｅｄｉｕｍ Ｆ−１２、Ｈａｍ’ｓ Ｍｅｄｉｕｍ Ｆ−１０、Ｈａｍ’ｓ Ｍｅｄｉｕｍ Ｆ−１２Ｋ、ＡＴＣＣ−ＣＲＣＭ３０、ＢＭＥ（Basal Medium Eagle）、Ｆｉｓｃｈｅｒ’ｓ ｍｅｄｉｕｍ、ＭｃＣｏｙ’ｓ ５Ａ ｍｅｄｉｕｍ、Ｌｅｉｂｏｖｉｔｚ’ｓ Ｌ−１５ ｍｅｄｉｕｍ、ＲＩＴＣ８０−７ ｍｅｄｉｕｍ、ＭＣＤＢ１０５ ｍｅｄｉｕｍ、ＭＣＤＢ１０７ ｍｅｄｉｕｍ、ＭＣＤＢ１５３ ｍｅｄｉｕｍ、ＭＣＤＢ２０１ ｍｅｄｉｕｍ、ＮＣＴＣ１０９ ｍｅｄｉｕｍ、ＮＣＴＣ１３５ ｍｅｄｉｕｍ、Ｗａｙｍｏｕｔｈ’ｓ ＭＢ ７５２／１ ｍｅｄｉｕｍ、Ｗｉｌｌｉａｍｓ’ ｍｅｄｉｕｍ Ｅ、及び、ＲｅｐｒｏＦＦ２ ｃｅｌｌ ｃｕｌｔｕｒｅ ｍｅｄｉｕｍからなる群から選択される１種の培地又は２種以上の混合培地である、上記（１）〜（４）のいずれかに記載のヒトリンパ球細胞培養用無血清培地；や、
（６）上記（１）〜（５）のいずれかに記載のヒトリンパ球細胞培養用無血清培地を用いてヒトリンパ球細胞を培養する工程を含む、ヒトリンパ球細胞の培養方法；や、
（７）ヒトリンパ球細胞培養用無血清培地を調製するためのキットであって、
前記キットは、血清を含有しない動物細胞培養用基礎培地、ヒトアルブミン、ヒトトランスフェリン、ヒトインスリン、グルタチオン、アスコルビン酸リン酸エステル又はその塩、及び、エタノールアミンを含有し、
前記ヒトリンパ球細胞培養用無血清培地が、
血清を含有しない動物細胞培養用基礎培地、０．２〜５ｇ／Ｌのヒトアルブミン、０．２〜１５ｍｇ／Ｌのヒトトランスフェリン、０．３〜５ｍｇ／Ｌのヒトインスリン、０．３〜１５ｍｇ／Ｌのグルタチオン、９〜５４ｍｇ／Ｌのアスコルビン酸リン酸エステル又はその塩、及び、３〜３７ｍｇ／Ｌのエタノールアミンを含有する、前記キット；や、
（８）キットがさらに、ピルビン酸塩、亜セレン酸化合物、Ｌ−アラニル−Ｌ−グルタミン、抗生物質、緩衝剤、及び、酢酸又はその塩からなる群から選択される１種又は２種以上を含有し、
ヒトリンパ球細胞培養用無血清培地が、さらに、０．０２〜０．６ｇ／Ｌのピルビン酸塩、１．３〜３４μｇ／Ｌの亜セレン酸化合物、０．１〜２．５ｇ／ＬのＬ−アラニル−Ｌ−グルタミン、０．０２〜０．５ｇ／Ｌの抗生物質、１〜１５ｇ／Ｌの緩衝剤及び２〜５０μｇ／Ｌの酢酸又はその塩からなる群から選択される１種又は２種以上を含有する、上記（７）に記載のキット；や、
（９）キットがさらに、血清を含有しない動物細胞培養用基礎培地を含有する、上記（７）又は（８）に記載のキット；
に関する。
【発明の効果】
【００１７】
本発明によれば、ヒトリンパ球細胞（好ましくはヒトＴリンパ球細胞）の培養に用いた場合に高い細胞増殖率が得られる無血清培地を提供すること、及び、かかる無血清培地を用いるヒトリンパ球細胞（好ましくはヒトＴリンパ球細胞）の培養方法等を提供することができる。また、本発明の無血清培地は無血清であるので、培地のロット間差がほとんどなく、また、安全性の高いヒトリンパ球細胞を得ることができる。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】ヒトアルブミン濃度が異なる様々な培地（本願実施例の表２参照）を用いてリンパ球細胞を培養した場合の生細胞数の推移を示す図である。横軸は培養開始からの経過時間（ｈ）を表し、縦軸は生細胞数（個）を表す。
【図２】ヒトトランスフェリン濃度が異なる様々な培地（本願実施例の表３参照）を用いてリンパ球細胞を培養した場合の生細胞数の推移を示す図である。横軸は培養開始からの経過時間（ｈ）を表し、縦軸は生細胞数（個）を表す。
【図３】ヒトインスリン濃度が異なる様々な培地（本願実施例の表４参照）を用いてリンパ球細胞を培養した場合の生細胞数の推移を示す図である。横軸は培養開始からの経過時間（ｈ）を表し、縦軸は生細胞数（個）を表す。
【図４】グルタチオン濃度が異なる様々な培地（本願実施例の表５参照）を用いてリンパ球細胞を培養した場合の生細胞数の推移を示す図である。横軸は培養開始からの経過時間（ｈ）を表し、縦軸は生細胞数（個）を表す。
【図５】アスコルビン酸リン酸Ｍｇ濃度が異なる様々な培地（本願実施例の表６参照）を用いてリンパ球細胞を培養した場合の生細胞数の推移を示す図である。横軸は培養開始からの経過時間（ｈ）を表し、縦軸は生細胞数（個）を表す。
【図６】エタノールアミン濃度が異なる様々な培地（本願実施例の表７参照）を用いてリンパ球細胞を培養した場合の生細胞数の推移を示す図である。横軸は培養開始からの経過時間（ｈ）を表し、縦軸は生細胞数（個）を表す。
【図７】従来の血清培地又は本発明の好適な無血清培地を用いて、リンパ球細胞を１４日間培養した場合の生細胞数を示す図である。縦軸は生細胞数（個）を表す。
【図８】既存の無血清培地（培地Ｘ、培地Ｙ）又は本発明の好適な無血清培地を用いて、リンパ球細胞を１４日間培養した場合の生細胞数を示す図である。縦軸は生細胞数（個）を表す。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
本発明は、
［１］血清を含有しない動物細胞培養用基礎培地、０．２〜５ｇ／Ｌのヒトアルブミン、０．２〜１５ｍｇ／Ｌのヒトトランスフェリン、０．３〜５ｍｇ／Ｌのヒトインスリン、０．３〜１５ｍｇ／Ｌのグルタチオン、９〜５４ｍｇ／Ｌのアスコルビン酸リン酸エステル又はその塩、及び、３〜３７ｍｇ／Ｌのエタノールアミンを含有するヒトリンパ球細胞培養用無血清培地（以下、「本発明の無血清培地」とも表示する。）；や、
［２］本発明の無血清培地を用いてヒトリンパ球細胞を培養する工程を含むヒトリンパ球細胞の培養方法（以下、「本発明の培養方法」とも表示する。）；や、
［３］ヒトリンパ球細胞培養用無血清培地を調製するためのキットであって、
前記キットは、ヒトアルブミン、ヒトトランスフェリン、ヒトインスリン、グルタチオン、アスコルビン酸リン酸エステル又はその塩、及び、エタノールアミンを含有し、
前記ヒトリンパ球細胞培養用無血清培地が、
血清を含有しない動物細胞培養用基礎培地、０．２〜５ｇ／Ｌのヒトアルブミン、０．２〜１５ｍｇ／Ｌのヒトトランスフェリン、０．３〜５ｍｇ／Ｌのヒトインスリン、０．３〜１５ｍｇ／Ｌのグルタチオン、９〜５４ｍｇ／Ｌのアスコルビン酸リン酸エステル又はその塩、及び、３〜３７ｍｇ／Ｌのエタノールアミンを含有する、前記キット（以下、「本発明のキット」とも表示する。）；
等を含む。
本発明において「培地」とは、「培地成分」に水を添加した状態のものをいう。
【００２０】
１．［本発明のヒトリンパ球細胞培養用無血清培地］
本発明のヒトリンパ球細胞培養用無血清培地（本発明の無血清培地）としては、
血清を含有しない動物細胞培養用基礎培地、０．２〜５ｇ／Ｌのヒトアルブミン、０．２〜１５ｍｇ／Ｌのヒトトランスフェリン、０．３〜５ｍｇ／Ｌのヒトインスリン、０．３〜１５ｍｇ／Ｌのグルタチオン、９〜５４ｍｇ／Ｌのアスコルビン酸リン酸エステル又はその塩、及び、３〜３７ｍｇ／Ｌのエタノールアミン（これらを総称して「必須成分」とも表示する。）を含有している培地が挙げられる。また、本発明の無血清培地には、
血清を含有しない動物細胞培養用基礎培地に、０．２〜５ｇ／Ｌのヒトアルブミン、０．２〜１５ｍｇ／Ｌのヒトトランスフェリン、０．３〜５ｍｇ／Ｌのヒトインスリン、０．３〜１５ｍｇ／Ｌのグルタチオン、９〜５４ｍｇ／Ｌのアスコルビン酸リン酸エステル又はその塩、及び、３〜３７ｍｇ／Ｌのエタノールアミンを添加してなる培地が含まれる。
【００２１】
（ヒトリンパ球細胞）
本発明において「ヒトリンパ球細胞」とは、ヒトのリンパ球細胞を意味し、ヒトから採取されたリンパ球細胞や、ヒトから採取されたリンパ球細胞から増殖したリンパ球細胞や、ｉＰＳ細胞等の幹細胞から分化誘導したヒトのリンパ球細胞等が挙げられる。ヒトリンパ球細胞としては、ヒトＴリンパ球細胞が好ましく挙げられ、ＣＤ３陽性のＴリンパ球細胞がより好ましく挙げられる。また、ヒトリンパ球細胞は、末梢血由来リンパ球細胞、臍帯血由来リンパ球細胞、骨髄由来リンパ球細胞等が挙げられるが、採取の機会や採取の容易さから末梢血由来リンパ球細胞が好ましく挙げられる。また、本発明において「ヒトリンパ球細胞」は、凍結保存されたヒトリンパ球細胞を解凍したヒトリンパ球細胞であってもよい。これらのことから、本発明におけるヒトリンパ球細胞としては、末梢血由来のヒトＴリンパ球細胞（好ましくは、末梢血由来のヒトＴリンパ球細胞であって、かつ、凍結保存された後、解凍されたヒトＴリンパ球細胞）が好ましく挙げられ、中でも、末梢血由来でＣＤ３陽性のヒトＴリンパ球細胞（好ましくは、末梢血由来でＣＤ３陽性のヒトＴリンパ球細胞であって、かつ、凍結保存された後、解凍されたヒトＴリンパ球細胞）が特に好ましく挙げられる。
【００２２】
（ヒトアルブミン）
本発明において用いられるヒトアルブミンとしては、ヒト由来アルブミン等の天然由来のアルブミンや、ヒト型の遺伝子組換え体のアルブミン（リコンビナントヒトアルブミン（ｒＨＳＡ））などを挙げることができ、市販のものであっても、自ら調製したものであってもよい。市販されているｒＨＳＡとしては、sigma aldrich社A9731（型番）、Science Research Laboratory社OsrHSA-10（型番）、Healthgen Biotechnology社HY01E-10g（型番）、eEnzyme（登録商標）社HSA-1r（型番）、BioVerde社IBK-A1-10（型番）等の組換えイネ由来の製品；や、sigma aldrich社A7223（型番）、A6608（型番）、A7736（型番）、novozymes社のAlbucult（登録商標）（製品名）、Recombumin alpha（登録商標）（製品名）、AlbIX（登録商標）（製品名）等の組換え酵母由来の製品；が挙げられる。また、市販されているヒト血漿由来アルブミンとしては、CSLベーリング社の「アルブミナ−２０％静注」（製品名）や「アルブミナ−２５％静注」（製品名）、sigma aldrich社A1887（型番）、A1653（型番）、A9511（型番）、A3782（型番）、A8763（型番）、A4327（型番）、Biological Industries社Bio-Pure HSA 10% Solution（製品名）等の製品が挙げられる。
【００２３】
本発明の無血清培地中のヒトアルブミン含量又は本発明の無血清培地へのヒトアルブミンの添加量としては、０．２〜５ｇ／Ｌである限り特に制限されないが、ヒトリンパ球細胞の増殖効率と製造コストのバランスの観点から、好ましくは０．３〜４ｇ／Ｌ、より好ましくは１〜４ｇ／Ｌ、さらに好ましくは１〜３ｇ／Ｌ、より好ましくは１．５〜２．５ｇ／Ｌ、さらに好ましくは１．７〜２．３ｇ／Ｌ、より好ましくは１．８〜２．２ｇ／Ｌ、特に好ましくは２ｇ／Ｌが挙げられる。
【００２４】
（ヒトトランスフェリン）
本発明において用いられるヒトトランスフェリンとしては、ヒト由来トランスフェリン等の天然由来のトランスフェリンや、ヒト型の遺伝子組換え体のトランスフェリン（リコンビナントヒトトランスフェリン）などを挙げることができ、市販のものであっても、自ら調製したものであってもよい。市販されているリコンビナントヒトトランスフェリンとしては、富士フィルム和光純薬社「トランスフェリン，ヒト，組換え体」205-18084（型番）、sigma aldrich社T3705（型番）、PROSPEC社PRO-747（型番）等の組換えイネ由来の製品が挙げられる。また、市販されているヒト血漿由来トランスフェリンとしては、富士フィルム和光純薬社「トランスフェリン（ホロ），ヒト血液由来」208-18971（型番）、sigma aldrich社90190（型番）等が挙げられる。
【００２５】
本発明の無血清培地中のヒトトランスフェリン含量又は本発明の無血清培地へのヒトトランスフェリンの添加量としては、０．２〜１５ｍｇ／Ｌである限り特に制限されないが、ヒトリンパ球細胞の増殖効率と製造コストのバランスの観点から、好ましくは０．３〜６ｍｇ／Ｌ、より好ましくは０．３〜４ｍｇ／Ｌ、さらに好ましくは０．３〜３ｍｇ／Ｌ、より好ましくは０．５〜２ｍｇ／Ｌ、さらに好ましくは０．７〜１．５ｍｇ／Ｌ、より好ましくは０．７〜１．３ｍｇ／Ｌ、さらに好ましくは０．８〜１．２ｍｇ／Ｌ、特に好ましくは１ｍｇが挙げられる。
【００２６】
（ヒトインスリン）
本発明において用いられるヒトインスリンとしては、ヒト型の遺伝子組換え体のインスリン（リコンビナントヒトインスリン）などを挙げることができ、市販のものであっても、自ら調製したものであってもよい。市販されているリコンビナントヒトインスリンとしては、富士フィルム和光純薬社094-06484（型番）、sigma aldrich社I9278（型番）等の組換え酵母由来の製品；や、Cell Prime（登録商標）社のr Insulin等の組換え大腸菌由来の製品；が挙げられる。
【００２７】
本発明の無血清培地中のヒトインスリン含量又は本発明の無血清培地へのヒトインスリンの添加量としては、０．３〜５ｍｇ／Ｌである限り特に制限されないが、ヒトリンパ球細胞の増殖効率と製造コストのバランスの観点から、好ましくは０．３〜８ｍｇ／Ｌ、より好ましくは０．３〜５ｍｇ／Ｌ、さらに好ましくは０．３〜３ｍｇ／Ｌ、より好ましくは０．５〜２ｍｇ／Ｌ、さらに好ましくは０．７〜１．５ｍｇ／Ｌ、より好ましくは０．７〜１．３ｍｇ／Ｌ、さらに好ましくは０．８〜１．２ｍｇ／Ｌ、特に好ましくは１ｍｇが挙げられる。
【００２８】
（グルタチオン）
本発明において用いられるグルタチオンとしては、市販のものであっても、自ら調製したものであってもよい。市販されているグルタチオンとしては、富士フィルム和光純薬社073-02013（型番）、sigma aldrich社G4251（型番）等が挙げられる。
【００２９】
本発明の無血清培地中のグルタチオン含量又は本発明の無血清培地へのグルタチオンの添加量としては、０．３〜１５ｍｇ／Ｌである限り特に制限されないが、ヒトリンパ球細胞の増殖効率と製造コストのバランスの観点から、好ましくは０．３〜８ｍｇ／Ｌ、より好ましくは０．３〜６ｍｇ／Ｌ、さらに好ましくは０．５〜４．５ｍｇ／Ｌ、より好ましくは０．７〜４．５ｍｇ／Ｌ、さらに好ましくは１〜４．５ｍｇ／Ｌ、より好ましくは２〜４ｍｇ／Ｌ、さらに好ましくは２．５〜３．５ｍｇ、特に好ましくは３ｍｇが挙げられる。
【００３０】
（アスコルビン酸リン酸エステル又はその塩）
アスコルビン酸リン酸エステル又はその塩におけるその塩としては、アスコルビン酸リン酸エステルのマグネシウム塩、ナトリウム塩、カルシウム塩、カリウム塩等が挙げられる。アスコルビン酸リン酸エステル又はその塩として、アスコルビン酸リン酸エステル及びその塩からなる群から選択される１種又は２種以上を用いてもよい。アスコルビン酸リン酸エステルやその塩としては、市販のものであっても、自ら調製したものであってもよい。市販されているアスコルビン酸リン酸エステルのマグネシウム塩としては、富士フィルム和光純薬社013-19641（型番）（Ｌ−アスコルビン酸りん酸エステルマグネシウム塩ｎ水和物）、sigma aldrich社A8960（型番）（L-アスコルビン酸 2-リン酸 セスキマグネシウム塩 水和物）等が挙げられ、ナトリウム塩としては、sigma aldrich社49752（型番）（2-ホスホ-L-アスコルビン酸 三ナトリウム塩）等が挙げられる。
【００３１】
本発明の無血清培地中のアスコルビン酸リン酸エステル又はその塩の含量あるいは本発明の無血清培地へのアスコルビン酸リン酸エステル又はその塩の添加量としては、無血清培地中のアスコルビン酸リン酸エステルとその塩の合計濃度又は合計添加量が９〜５４ｍｇ／Ｌである限り特に制限されないが、ヒトリンパ球細胞の増殖効率と製造コストのバランスの観点から、好ましくは１３〜４５ｍｇ／Ｌ、より好ましくは１８〜４０ｍｇ／Ｌ、さらに好ましくは１９〜３６ｍｇ／Ｌ、より好ましくは２２〜３２ｍｇ／Ｌ、さらに好ましくは２４〜３０ｍｇ／Ｌ、より好ましくは２５〜２９ｍｇ／Ｌ、特に好ましくは２７ｍｇが挙げられる。
【００３２】
（エタノールアミン）
本発明において用いられるエタノールアミンとしては、モノエタノールアミン、ジエタノールアミン、トリエタノールアミンが挙げられ、中でも、モノエタノールアミンが好ましく挙げられる。エタノールアミンとして、モノエタノールアミン、ジエタノールアミン及びトリエタノールアミンからなる群から選択される１種又は２種以上を用いてもよい。本発明において用いられるエタノールアミンとしては、市販のものであっても、自ら調製したものであってもよい。市販されているモノエタノールアミンとしては、富士フィルム和光純薬社016-12453（型番）、sigma aldrich社E9508（型番）が挙げられ、市販されているジエタノールアミンとしては、東京化成工業株式会社S0376（型番）が挙げられ、市販されているトリエタノールアミンとしては、東京化成工業株式会社S0377（型番）が挙げられる。
【００３３】
本発明の無血清培地中のエタノールアミンの含量又は本発明の無血清培地へのエタノールアミンの添加量としては、前記３種のエタノールアミンの合計濃度又は合計添加量が３〜３７ｍｇ／Ｌである限り特に制限されないが、ヒトリンパ球細胞の増殖効率と製造コストのバランスの観点から、好ましくは３〜１８．５ｍｇ／Ｌ、より好ましくは４〜１８．５ｍｇ／Ｌ、さらに好ましくは５〜１８．５ｍｇ／Ｌ、より好ましくは６〜１６ｍｇ／Ｌ、９〜１６ｍｇ／Ｌ、より好ましくは１１〜１４ｍｇ／Ｌ、特に好ましくは１２．３ｍｇ／Ｌが挙げられる。また、本発明の好適な態様として、本発明の無血清培地中のモノエタノールアミンの含量又は本発明の無血清培地へのモノエタノールアミンの添加量が、例えば３〜３７ｍｇ／Ｌ、好ましくは３〜１８．５ｍｇ／Ｌ、より好ましくは４〜１８．５ｍｇ／Ｌ、さらに好ましくは５〜１８．５ｍｇ／Ｌ、より好ましくは６〜１６ｍｇ／Ｌ、９〜１６ｍｇ／Ｌ、より好ましくは１１〜１４ｍｇ／Ｌ、特に好ましくは１２．３ｍｇ／Ｌである場合が挙げられる。
【００３４】
（血清を含有しない動物細胞培養用基礎培地）
本明細書において「血清を含有しない動物細胞培養用基礎培地」としては、血清を含有しない、動物細胞培養用基礎培地（以下、単に「基礎培地」とも表示する。）である限り特に制限されない。かかる基礎培地としては、例えば、ＤＭＥＭ／Ｆ−１２（Dulbecco’s Modified Eagle Medium/Nutrient Mixture F-12）、ＤＭＥＭ（Dulbecco’s Modified Eagle Medium）、ＥＭＥＭ（Eagle’s minimal essential medium）、ＩＭＤＭ（Iscove’s Modified Dulbecco’s Medium）、ＧＭＥＭ（Glasgow’s Minimum Essential Medium）、ＲＰＭＩ−１６４０（Roswell Park Memorial Institute 1640 Medium）、α−ＭＥＭ（Alpha modification of Eagle’s minimal essential medium）、Ｈａｍ’ｓ Ｍｅｄｉｕｍ Ｆ−１２、Ｈａｍ’ｓ Ｍｅｄｉｕｍ Ｆ−１０、Ｈａｍ’ｓ Ｍｅｄｉｕｍ Ｆ−１２Ｋ、ＡＴＣＣ−ＣＲＣＭ３０、ＢＭＥ（Basal Medium Eagle）、Ｆｉｓｃｈｅｒ’ｓ ｍｅｄｉｕｍ、ＭｃＣｏｙ’ｓ ５Ａ ｍｅｄｉｕｍ、Ｌｅｉｂｏｖｉｔｚ’ｓ Ｌ−１５ ｍｅｄｉｕｍ、ＲＩＴＣ８０−７ ｍｅｄｉｕｍ、ＭＣＤＢ１０５ ｍｅｄｉｕｍ、ＭＣＤＢ１０７ ｍｅｄｉｕｍ、ＭＣＤＢ１５３ ｍｅｄｉｕｍ、ＭＣＤＢ２０１ ｍｅｄｉｕｍ、ＮＣＴＣ１０９ ｍｅｄｉｕｍ、ＮＣＴＣ１３５ ｍｅｄｉｕｍ、Ｗａｙｍｏｕｔｈ’ｓ ＭＢ ７５２／１ ｍｅｄｉｕｍ、Ｗｉｌｌｉａｍｓ’ ｍｅｄｉｕｍ Ｅ、及び、ＲｅｐｒｏＦＦ２ ｃｅｌｌ ｃｕｌｔｕｒｅ ｍｅｄｉｕｍ（リプロセル社）からなる群から選択される１種の培地又は２種以上の混合培地等が挙げられる。また、幹細胞培養用に改変された培地や、上記基礎培地と他の培地との混合物等を用いてもよい
【００３５】
（任意成分）
本発明の無血清培地は、上記の必須成分の他に、任意成分を含有してもよく、又は、任意成分を添加してなっていてもよい。好適な任意成分としては、ピルビン酸塩、亜セレン酸化合物、Ｌ−アラニル−Ｌ−グルタミン、抗生物質、緩衝剤、及び、酢酸若しくは酢酸塩から選択される１種又は２種以上（以下、「特定の任意成分」とも表示する。）が挙げられる。また、本発明の無血清培地で用いる動物細胞培養用基礎培地の組成に、前述の１種又は２種以上の特定の任意成分が含まれている場合は、その基礎培地を含む本発明の無血清培地におけるその１種又は２種以上の特定の任意成分の含量を、後に例示するそれぞれの特定の任意成分の含量に調整することが好ましい。
【００３６】
上記のピルビン酸塩としては、ピルビン酸ナトリウム、ピルビン酸カリウム、ピルビン酸マグネシウム、ピルビン酸カルシウム等が挙げられる。本発明の無血清培地中のピルビン酸塩の含量又は本発明の無血清培地へのピルビン酸塩の添加量としては、例えば０．０２〜０．６ｇ／Ｌ、好ましくは０．０５〜０．２５ｇ／Ｌ、より好ましくは０．０７〜０．２ｇ／Ｌが挙げられる。
【００３７】
上記の亜セレン酸化合物としては、亜セレン酸及び／又は亜セレン酸塩が挙げられ、かかる亜セレン酸塩としては、亜セレン酸ナトリウム、亜セレン酸カリウム、亜セレン酸マグネシウム、亜セレン酸カルシウム等が挙げられる。本発明の無血清培地中の亜セレン酸化合物の含量又は本発明の無血清培地への亜セレン酸化合物の添加量としては、例えば１．３〜３４μｇ／Ｌ、好ましくは３〜１５μｇ／Ｌ、より好ましくは４〜１０μｇ／Ｌが挙げられる。
【００３８】
本発明の無血清培地中のＬ−アラニル−Ｌ−グルタミンの含量又は本発明の無血清培地へのＬ−アラニル−Ｌ−グルタミンの添加量としては、例えば０．１〜２．５ｇ／Ｌ、好ましくは０．２〜１．５ｇ／Ｌ、より好ましくは０．３〜１ｇ／Ｌが挙げられる。
【００３９】
上記の抗生物質の種類としては、カナマイシン、ストレプトマイシン、ゲンタマイシン、トブラマイシン、アミカシン等のアミノグリコシド系抗生物質；ペニシリン（例えばペニシリンＧ）、アンピシリン、バカンピシリン等のβ−ラクタム系抗生物質；アムホテリシンＢ等のポリエン系抗生物質；などが挙げられ、カナマイシンとストレプトマイシンの組合せや、ペイシリンとストレプトマイシンの組合せが好ましく挙げられる。本発明の無血清培地中の抗生物質の合計含量又は本発明の無血清培地への抗生物質の合計添加量としては、抗生物質の種類等にもよるが、例えば０．０２〜０．５ｇ／Ｌ、好ましくは０．０３〜０．４ｇ／Ｌ、より好ましくは０．０５〜０．２５ｇ／Ｌが挙げられる。本発明の無血清培地の好適な態様として、カナマイシンとストレプトマイシンの合計含量又は合計添加量が例えば０．０２〜０．５ｇ／Ｌ、好ましくは０．０３〜０．４ｇ／Ｌ、より好ましくは０．０５〜０．２５ｇ／Ｌであることが挙げられ、中でも、カナマイシンの含量又は添加量が例えば０．０２〜０．３ｇ／Ｌ、好ましくは０．０４〜０．１６ｇ／Ｌ、より好ましくは０．０６〜０．１２ｇ／Ｌであり、かつ、ストレプトマイシンの含量が例えば０．０１〜０．９ｇ／Ｌ、好ましくは０．０１５〜０．７ｇ／Ｌ、より好ましくは０．０２〜０．０３５ｇ／Ｌであることが挙げられる。
【００４０】
上記の緩衝剤としては、その緩衝剤を水に添加することによって緩衝液を作製することができ、かつ、その緩衝液がヒトリンパ球細胞の培養を妨げない限り、緩衝剤の種類や濃度等は特に制限されないが、例えば、炭酸水素ナトリウム、ＨＥＰＥＳ（4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid）等が挙げられ、炭酸水素ナトリウム及びＨＥＰＥＳを併用することが好ましく挙げられる。本発明の無血清培地中の緩衝剤の含量又は本発明の無血清培地への緩衝剤の添加量としては、緩衝剤の種類等にも左右されるため一概に規定することはできないが、緩衝剤の合計含量又は合計添加量として、例えば１〜１５ｇ／Ｌ、好ましくは２〜１２ｇ／Ｌ、より好ましくは４〜１０ｇ／Ｌが挙げられる。また、本発明において炭酸水素ナトリウムとＨＥＰＥＳを併用する場合のそれぞれの含量又は添加量としては、例えば０．５〜１０ｇ／Ｌ、好ましくは０．８〜７ｇ／Ｌ、より好ましくは１〜４ｇ／Ｌの炭酸水素ナトリウムと、例えば１〜７ｇ／Ｌ、好ましくは２〜６ｇ／Ｌ、より好ましくは３〜５ｇ／ＬのＨＥＰＥＳが挙げられる。
【００４１】
上記の酢酸塩としては、酢酸ナトリウム、酢酸マグネシウム、酢酸カルシウム等が挙げられる。本発明の無血清培地中の酢酸又はその塩の含量あるいは本発明の無血清培地への酢酸又はその塩の添加量としては、無血清培地中の酢酸とその塩の合計濃度が例えば２〜５０μｇ／Ｌ、好ましくは３〜４０μｇ／Ｌ、より好ましくは５〜２０μｇ／Ｌが挙げられる。
【００４２】
本発明の無血清培地は、水と必須成分を混合すること、好ましくは、水と必須成分と任意成分を混合することにより調製することができる。添加する水の量は、当業者であれば、無血清培地の組成にしたがって適宜決定することができる。
【００４３】
本発明の無血清培地は、流通や保存の観点から、容器入りであることが好ましい。かかる容器としては、市販の培地に用いられる通常の容器等を用いることができる。
【００４４】
２．［本発明のヒトリンパ球細胞の培養方法］
本発明のヒトリンパ球細胞の培養方法（本発明の培養方法）としては、本発明の無血清培地を用いてヒトリンパ球細胞を培養する工程を含んでいる限り特に制限されない。
【００４５】
（ヒトリンパ球細胞）
前述したように、本発明におけるヒトリンパ球細胞としては、ヒトＴリンパ球細胞が好ましく挙げられ、ＣＤ３陽性のＴリンパ球細胞がより好ましく挙げられる。また、末梢血由来のヒトＴリンパ球細胞が好ましく挙げられ、末梢血由来でＣＤ３陽性のＴリンパ球細胞がより好ましく挙げられる。かかる末梢血としては、他者由来末梢血や自己由来末梢血があげられるが、培養して得られるヒトリンパ球細胞を養子免疫療法に用いる場合には自己由来末梢血が有利に用いられる。腫瘍及びその再発、ならびにウイルス感染症や自己免疫疾患に対する予防及び治療の観点から、臓器又は骨髄移植等を受けた患者の場合は、移植臓器又は骨髄等の提供者由来の末梢血であることが好ましい。
【００４６】
ヒトリンパ球細胞としては、単離されたヒトリンパ球細胞を用いることが好ましく、かかる単離されたヒトリンパ球細胞は、血管からの採血やフェレーシス等により採取された末梢血、好ましくは静脈から採取された末梢血を一般的手法で処理することにより得ることができる。末梢血からのリンパ球細胞の分離は、ショ糖や市販のリンパ球細胞分離剤等を用いた不連続密度勾配遠心法などの周知のリンパ球細胞分離法によって取得できる。リンパ球細胞単離用の末梢血は、血液の凝固が起こらないように、ヘパリンやクエン酸を加えたものを使用することができる。かかる末梢血の量は特に制限されず、ドナーの負担、採血の手間、リンパ球細胞の分離操作等に基づいて適宜設定することができ、１回に採血する量を０．０１ｍＬから１００ｍＬ程度、より好ましくは５ｍＬから５０ｍＬ程度、さらに好ましくは１０ｍＬから２０ｍＬとすることができる。
【００４７】
前述したように、本発明におけるヒトリンパ球細胞としては、末梢血由来のヒトＴリンパ球細胞（好ましくは、末梢血由来のヒトＴリンパ球細胞であって、かつ、凍結保存された後、解凍されたヒトＴリンパ球細胞）が好ましく挙げられ、中でも、末梢血由来でＣＤ３陽性のヒトＴリンパ球細胞（好ましくは、末梢血由来でＣＤ３陽性のヒトＴリンパ球細胞であって、かつ、凍結保存された後、解凍されたヒトＴリンパ球細胞）が特に好ましく挙げられる。ヒトリンパ球細胞の凍結保存処理の方法やその解凍処理の方法等は、後述するとおりである。
【００４８】
（本発明の無血清培地を用いてヒト末梢血リンパ球細胞を培養する工程）
本発明の無血清培地を用いてヒトリンパ球細胞を培養する工程としては、本発明の無血清培地を用いてヒトリンパ球細胞を培養する限り特に制限されず、例えば、ヒトリンパ球細胞をヒトリンパ球細胞刺激物質で活性化することを含む培養（以下、「活性化培養」とも表示する。）であってもよいし、ヒトリンパ球細胞をヒトリンパ球細胞刺激物質で刺激せずに増殖する培養（以下、「増殖培養」とも表示する。）等であってもよい。上記のヒトリンパ球細胞刺激物質としては、マイトジェン、サイトカイン、抗原、抗体等の、ヒトＴリンパ球細胞を刺激する物質が挙げられ、中でもヒトＴリンパ球細胞を刺激する物質（ヒトＴリンパ球細胞刺激物質）が好ましく挙げられる。ヒトＴリンパ球細胞刺激物質としては、ＩＬ−２、抗ＣＤ３抗体等が挙げられる。
【００４９】
（活性化培養）
上記の活性化培養としては、ヒトリンパ球細胞（好ましくはヒトＴリンパ球細胞）をヒトリンパ球刺激物質で活性化することを含む培養である限り特に制限されず、例えば、本発明の無血清培地中、抗ＣＤ３抗体の存在下でヒトリンパ球細胞を培養する方法が挙げられ、中でも、本発明の無血清培地中、ＩＬ−２（インターロイキン２）及び抗ＣＤ３抗体の存在下でヒトリンパ球細胞を培養する方法が好ましく挙げられる。ヒトリンパ球細胞を活性化するために、抗ＣＤ３抗体やＩＬ−２を用いてリンパ球細胞を方法は、従来から知られている（例えば特開平３−８００７６号公報）ため、本発明の培養方法においてもその方法を参照することができる。例えば、抗ＣＤ３抗体を固相化した培養容器中に、ＩＬ−２を添加した本発明の無血清培地を入れ、かかる無血清培地にヒトリンパ球細胞を浮遊させて培養する方法を好適に例示することができる。さらに、必要により、抗ＣＤ３抗体等の各種マイトジェンを使用してヒトリンパ球細胞の活性化を行うことができる。かかる抗ＣＤ３抗体としては、ヒトリンパ球細胞表面のＣＤ３表面抗原を認識して増殖・活性化を促進できる抗体であれば、どのようなものでも使用できる。リンパ球細胞の活性化刺激に使用する抗ＣＤ３抗体は、精製したＣＤ３分子を使用して動物又は細胞に産生させることもできるが、安定性、容易性に優れた市販品のＯＫＴ−３抗体（製造元：ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社や、タカラバイオ社等）を有利に使用することができる。
【００５０】
上記の活性化培養の培養期間としては特に制限されないが、例えば１〜１０日間、好ましくは２〜８日間、より好ましくは３〜７日間、さらに好ましくは４〜６日間を挙げることができる。この培養期間中の培地の交換頻度としては特に制限されないが、培地の劣化及びＩＬ−２活性の低下を防ぐ等のために、１〜７日に１回行うことが好ましく、新たな培地を添加する前の培地の液量に対して０．１〜５倍程度の量の新たな培地を添加することが好ましい。
【００５１】
上記の活性化培養の培養条件としては、ヒトリンパ球細胞を活性化することができる限り特に制限されないが、例えば３６〜３８℃（好ましくは３６．５〜３７．５℃）、湿度９０〜９８％（好ましくは９３〜９７％、より好ましくは９４〜９６％）、ＣＯ２濃度２〜１３％（好ましくは３〜１０％、より好ましくは５〜１０％）等が挙げられる。
【００５２】
上記の活性化培養において、ヒトリンパ球細胞には、フラスコ底面に付着して増殖する細胞もあるし、活性化を受けた後、培地中に浮遊しながら増殖していく細胞もある。フラスコ底面に付着して増殖する細胞は、浮遊細胞と同様に生細胞である。活性化培養開始時から培地の液量を増加させずに活性化培養を行う方法を採用することもできるが、活性化培養の途中でさらに培地を添加し、その後、数日間（例えば１〜２日間）、活性化培養を継続してヒトリンパ球細胞をさらに増殖する方法を採用することもできる。かかる培地の添加量としては、活性化培養開始時の培地の液量に対して０．５〜２倍の液量が好ましく、中でも、活性化培養開始時の培地の液量と同量の液量がより好ましく挙げられる。活性化培養の途中でさらに培地を添加して活性化培養を継続する場合、培地中に浮遊するヒトリンパ球細胞のみを植え継ぐこともできるが、浮遊ヒトリンパ球細胞と、培養容器に接着したヒトリンパ球細胞の両方を植え継ぐこともできる。
【００５３】
上記の活性化培養において、培養開始時に用いるヒトリンパ球細胞数に特に制限はないが、細胞培養において培養開始時の細胞数が少なすぎると、細胞増殖曲線が立ち上がるまでの期間が遷延してしまうというデメリットがあり、一方、逆に多すぎるとヒトリンパ球細胞の増殖がプラトーに達する時期が早くなり過ぎて、培地を添加して培養スケールを大きくする方法を採用することが難しくなり、十分な量の細胞を得ることができないというデメリットがある。これらのことを考慮すると、活性化培養の開始時に用いるヒトリンパ球細胞数としては、例えば、１．０×１０５〜１．０×１０６細胞／ｍＬ、好ましくは１．５×１０５〜６．０×１０５細胞／ｍＬ、より好ましくは４．０×１０５〜６．０×１０５細胞／ｍＬが挙げられる。また、培養容器の容量及び培養液量は、操作性を考慮して適宜選択することができ、例えば２２５ｃｍ２フラスコに２０〜２００ｍＬ（好ましくは３０〜１００ｍＬ、より好ましくは３０〜７０ｍＬ、さらに好ましくは５０ｍＬ）の培地を使用する例や、２５ｃｍ２フラスコに２〜２０ｍＬ（好ましくは３〜１０ｍＬ、より好ましくは３〜７ｍＬ、さらに好ましくは５ｍＬ）の培地を使用する例を挙げることができる。
【００５４】
上記のように、本発明における活性化培養では、抗ＣＤ３抗体は、ヒトリンパ球細胞の増殖効率や操作の容易性の観点から、固相化して使用することが好ましい。抗ＣＤ３抗体を固相化する支持体としてはガラス、ポリウレタン、ポリオレフィン、ポリスチレン等の材質からなる各種フラスコ、シャーレ、プレート、バッグが使用できる。入手が容易であるため、市販のプラスチック製の滅菌済み細胞培養用フラスコ等の器具を使用することもでき、その大きさは適宜選択することができる。前記抗体の固相化方法は、固相化した抗ＣＤ３抗体によりリンパ球細胞が刺激できる固相化方法であればいずれの方法であってもよく、例えば、非特異的吸着による方法や化学結合による方法が挙げられる。より具体的な固相化方法としては、固相化する器具に抗ＣＤ３抗体の希釈液を分注し、例えば４〜３７℃で２〜２４時間静置する方法を挙げることができる。前記抗ＣＤ３抗体の希釈液は、抗ＣＤ３抗体を、滅菌したダルベッコリン酸緩衝液等の生理的な緩衝液中に１〜３０μｇ／ｍＬの濃度に希釈して希釈液として用いることが好ましい。固相化した器具は、使用時までコールドルームや冷蔵庫（４℃）で保存することができ、使用時に前記希釈液を除去して、常温のダルベッコリン酸緩衝液等の生理的な緩衝液で洗浄することが好ましい。また上記のように、本発明における活性化培養では、培養用培地液中にインターロイキン２（ＩＬ−２）を使用することがリンパ球細胞の増殖効率の観点から望ましい。ＩＬ−２は、培養用培地液の濃度が１〜２０００Ｕ／ｍＬとなるように希釈して使用することが好ましい。かかるＩＬ−２としては市販品を用いることができる。ＩＬ−２は、水、生理食塩液、ダルベッコリン酸緩衝液、ＲＰＭＩ−１６４０、ＤＭＥＭ、ＩＭＤＡ、ＡＩＭ−Ｖ等の一般に広く用いられる動物細胞培養用基礎培地等に溶解して使用することができる。また一旦溶解したものは、活性の低下を防ぐために冷蔵保存することが好ましい。
【００５５】
本発明の培養方法が上記の活性化培養する工程を有する場合、かかる活性化培養する工程の後に、ヒトリンパ球細胞を凍結保存処理する工程、ヒトリンパ球細胞を増殖培養する工程、又は、その両方の工程をさらに有していてもよい。
【００５６】
（凍結保存処理）
上記の「ヒトリンパ球細胞を凍結保存処理する工程」における凍結保存処理する方法としては、細胞凍結の一般的な方法を用いることができる。例えば、ヒトリンパ球細胞をバンバンカー（登録商標）（リンフォテック社製）、ＣＰ−１（極東製薬工業社製）、ＫＭバンカー（コージンバイオ社製）等の細胞凍結保存液製品に懸濁して凍結保存容器に格納し、その容器をＢＩＣＥＬＬ（登録商標）（日本フリーザー社製）に入れ、−８０℃の超低温フリーザー（三洋電機株式会社製）で一時保管して２日後に、液体窒素タンク（ＭＶＥ）へと移しいれて凍結保存細胞として液体窒素中で保存することができる。また、凍結及び解凍した後の活性化培養における増殖の立ち上がりの早さを調整する観点から、１つの凍結保存容器に格納するリンパ球細胞数を調整することが望ましく、１つの凍結保存容器あたり１×１０７〜５．０×１０７個を保存することが好ましい。複数の凍結保存容器に保存した細胞を合わせて凍結解凍後の培養に用いてもよいが、操作の容易性及び品質管理の観点から１つの凍結保存容器のリンパ球細胞を１つ又は２つ以上の培養容器に移して培養することが好ましい。
【００５７】
凍結保存処理したヒトリンパ球細胞の凍結保存期間としては、特に制限されず、例えば３０分間〜２年間や１時間〜１年間などが挙げられる。
【００５８】
凍結保存処理したヒトリンパ球細胞を解凍する方法としては、凍結細胞の一般的な解凍方法を用いることができる。例えば、３７℃のドライサーモユニット（タイテック社製）等を用いて、凍結したヒトリンパ球細胞を４分間加熱処理することにより解凍することができる。その後、かかる解凍したヒトリンパ球細胞を適量の培地に移しいれた後に室温にて遠心操作を行い、上清を除去することにより細胞凍結保存液を除去することが好ましい。
【００５９】
解凍後のヒトリンパ球細胞はそのまま養子免疫療法に用いてもよいが、より高い治療効果を得る観点から、活性化培養を行うことが好ましく、活性化培養及び増殖培養を行うことがより好ましい。活性化培養については前述したとおりであり、増殖培養については後述するとおりである。
【００６０】
（増殖培養）
上記の増殖培養としては、ヒトリンパ球細胞（好ましくはヒトＴリンパ球細胞）をヒトリンパ球細胞刺激物質（好ましくはヒトＴリンパ球細胞刺激物質）で刺激せずに増殖する培養である限り特に制限されず、例えば、本発明の無血清培地中でヒトリンパ球細胞（好ましくはヒトＴリンパ球細胞）を培養する方法が挙げられ、中でも、本発明の無血清培地中、ＩＬ−２及び抗ＣＤ３抗体の不存在下でヒトリンパ球細胞（好ましくはヒトＴリンパ球細胞）を培養する方法が好ましく挙げられる。
【００６１】
上記の増殖培養の培養期間としては特に制限されないが、例えば、１〜２０日間、好ましくは１〜１５日間、より好ましくは１〜１０日間、さらに好ましくは２〜８日間、より好ましくは３〜７日間、さらに好ましくは４〜６日間を挙げることができる。この培養期間中の培地の交換頻度としては特に制限されないが、培地の劣化を防ぐ等のために、１〜７日に１回行うことが好ましく、新たな培地を添加する前の培地の液量に対して０．１〜５倍程度の量の新たな培地を添加することが好ましい。
【００６２】
上記の増殖培養の培養条件としては、ヒトリンパ球細胞を増殖することができる限り特に制限されないが、例えば３６〜３８℃（好ましくは３６．５〜３７．５℃）、湿度９０〜９８％（好ましくは９３〜９７％、より好ましくは９４〜９６％）、ＣＯ２濃度２〜１３％（好ましくは３〜１０％、より好ましくは５〜１０％）等が挙げられる。
【００６３】
上記の増殖培養において、培養開始時に用いるヒトリンパ球細胞数に特に制限はないが、細胞培養において培養開始時の細胞数が少なすぎると、細胞増殖曲線が立ち上がるまでの期間が遷延してしまうというデメリットがあり、一方、逆に多すぎるとヒトリンパ球細胞の増殖がプラトーに達する時期が早くなり過ぎて、培地を添加して培養スケールを大きくするなどの方法を採用することが難しくなり、十分な量の細胞を得ることができないというデメリットがある。これらのことを考慮すると、増殖培養の開始時に用いるヒトリンパ球細胞数としては、例えば、１．０×１０５〜１．０×１０１０細胞／ｍＬ、好ましくは１．０×１０６〜５．０×１０９細胞／ｍＬ、より好ましくは１．０×１０７〜１．０×１０９細胞／ｍＬが挙げられる。また、培養容器の容量及び培養液量は、操作性を考慮して適宜選択することができ、例えば２２５ｃｍ２フラスコに５０〜２００ｍＬ（好ましくは８０〜１８０ｍＬ、より好ましくは１００〜１８０ｍＬ）の培地を使用する例や、１０００ｍＬ容の培養バッグに５０〜１０００ｍＬ（好ましくは１００〜１０００ｍＬ、より好ましくは２００〜１０００ｍＬ）の培地を使用する例を挙げることができる。
【００６４】
３．［ヒトリンパ球細胞培養用無血清培地を調製するためのキット］
本発明のキットは、本発明の無血清培地を調製するためのキットである。すなわち、本発明のキットは、
ヒトリンパ球細胞培養用無血清培地を調製するためのキットであって、
前記キットは、ヒトアルブミン、ヒトトランスフェリン、ヒトインスリン、グルタチオン、アスコルビン酸リン酸エステル又はその塩、及び、エタノールアミンを含有し、
前記ヒトリンパ球細胞培養用無血清培地が、
血清を含有しない動物細胞培養用基礎培地、０．２〜５ｇ／Ｌのヒトアルブミン、０．２〜１５ｍｇ／Ｌのヒトトランスフェリン、０．３〜５ｍｇ／Ｌのヒトインスリン、０．３〜１５ｍｇ／Ｌのグルタチオン、１０〜６０ｍｇ／Ｌのアスコルビン酸リン酸エステル又はその塩、及び、３〜３７ｍｇ／Ｌのエタノールアミンを含有する、前記キットである。本発明のキットにおける「本発明の無血清培地」は、前述したとおりである。
【００６５】
本発明のキットは、本発明の無血清培地のうち、血清を含有しない動物細胞培養用基礎培地以外の成分を少なくとも含有している。本発明のキットとしては、かかるキットと、血清を含有しない動物細胞培養用基礎培地を用いることによって、本発明の無血清培地を調製することができる限り、特に制限はない。血清を含有しない動物細胞培養用基礎培地は、本発明のキットの使用者が別途用意したものを使用することができる。本発明の無血清培地を調製する方法としては、血清を含有しない、液体の動物細胞培養用基礎培地に、かかるキットの成分を添加等する方法や、血清を含有しない、固体の動物細胞培養用基礎培地に、かかるキットの成分及び水を添加等する方法などが挙げられる。
【００６６】
本発明のキットとしては、ピルビン酸塩、亜セレン酸化合物、Ｌ−アラニル−Ｌ−グルタミン、抗生物質、緩衝剤、及び、酢酸又はその塩からなる群から選択される１種又は２種以上、又は、血清を含有しない動物細胞培養用基礎培地をさらに含有することが好ましく挙げられ、ピルビン酸塩、亜セレン酸化合物、Ｌ−アラニル−Ｌ−グルタミン、抗生物質、緩衝剤、及び、酢酸又はその塩からなる群から選択される１種又は２種以上と、血清を含有しない動物細胞培養用基礎培地とをさらに含有することがより好ましく挙げられる。
【００６７】
本発明のキットの各成分は、液体であってもよいし、粉状、粒状等の固体であってもよい。また、液体か固体かは、各成分毎に異なっていてもよい。本発明のキットは、流通や保存の観点から、容器入りであることが好ましい。本発明のキットにおいて、各成分毎にそれぞれ１つの容器に入っていてもよいし、１つの容器に２種又は２種以上の成分が入っていてもよいし、かかるキットのすべての成分が１つの容器に入っていてもよい。かかる容器としては、本発明のキットに類する製品に用いられる通常の容器等を用いることができる。
【００６８】
以下に実施例を挙げて、本発明を具体的に説明するが、本発明は以下の記載に何ら限定されるものではない。
【実施例】
【００６９】
１．リンパ球細胞の調製及び培養の方法
（１）末梢血リンパ球細胞の調製
同意を得た健常者３名の末梢血各５０ｍＬを静脈からヘパリンを加えて採血した。各採血検体を２５０ｍＬの遠沈管（コーニング；４３０７７６）に移し、検体毎に洗浄用液（０．１％ヒトアルブミン添加生理食塩水：生理食塩液５００ｍＬ  製造元；大塚製薬株式会社、アルブミナ−２０％静注  製造元；ＣＳＬベーリング株式会社）１００ｍＬを加え静かに混和して３倍に希釈した。本操作を含む以下の操作は無菌的に行った。１検体あたり、１５ｍＬのフィコール（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）を分注した５０ｍＬ遠沈管（ＢＤファルコン；352070）４本に、３倍希釈した血液を重層し、その遠沈管を１８００ｒｐｍで２０分間、室温でブレーキをかけずに遠心した（遠心機：株式会社コクサン製；H-700）。中間層の単核球層を、予め洗浄用液を分注した５０ｍＬ遠沈管に回収した。遠沈管の蓋を閉めて、２〜３回、転倒混和して１８００ｒｐｍで１５分間、室温にて遠心した。遠心後に上清を除去し、ペレットを分散させた後に洗浄用液を添加し、総量５０ｍＬの細胞懸濁液とした。前記懸濁液を１８００ｒｐｍ、１０分間、常温にて遠心し、得られたペレットに５０ｍＬの培地Ａを加えて懸濁して細胞懸濁液とした。なお、培地Ａとして、後述の２．（２）に記載の各アルブミン検討試験用培地又はコントロール培地を用いて培養を行った。【００７０】
かかる細胞懸濁液の細胞数、生細胞数、及び、細胞の生存率は以下の方法により算出した。
（細胞数の測定法）
４０μＬのチュルク氏液（武藤化学薬品社製）を５ｍＬラウンドチューブ（ＢＤファルコン；352008）に分注し、これに前記細胞懸濁液１０μＬを加えて混和し、混和液１０μＬをノイバウエル血球計算盤（エルマー社製；9731）上に流し込み、顕微鏡（オリンパス光学工業株式会社製；211320）下に細胞数（総細胞数）を算出した。【００７１】
（生細胞数、及び、細胞の生存率の測定法）
２０μＬのトリパンブルー染色液（SIGMA社製；93595）を５ｍＬラウンドチューブ（ＢＤファルコン；352008）に分注し、これに前記細胞懸濁液１０μＬを混和し、混和液１０μＬをノイバウエル血球計算盤に流し込み、顕微鏡下に染色されていない生細胞数を計測した。かかる生細胞数と、前述の細胞数（総細胞数）から、生存率を算出した。【００７２】
（２）ＯＫＴ３固相化フラスコの調製
ＯＫＴ３（製造元：タカラバイオ株式会社：Ａｎｔｉ−ＣＤ３  ｍＡＢ  ＧＭＰ  ｇｒａｄｅ）溶液を生理食塩液で５μｇ／ｍＬに調製し、調製液１０ｍＬを底面積２２５ｃｍ２の培養用フラスコ（住友ベークライト株式会社製；MS-2180R）に分注し、その底面全面がＯＫＴ３溶液で覆われるようにした。フラスコを３時間以上静置した後、フラスコ内のＯＫＴ３溶液を吸引機で吸い取り、約１００ｍＬの生理食塩液（製造元；大塚製薬株式会社）を注ぎ込み、フラスコの蓋を閉めて激しく振蕩した後に、フラスコ内の液体を捨てた。再度、約１００ｍＬの生理食塩液（製造元；大塚製薬株式会社）をフラスコ内に流し入れ、固相化面を下にして室温で１５分間静置した。その後、フラスコの蓋を閉めて、フラスコを１分間激しく振蕩した後、フラスコ内の液体を捨てた。フラスコ内と蓋に残っている液を吸引機で丁寧に吸い取り、ＯＫＴ３固相化フラスコを得た。ＯＫＴ３固相化フラスコを調製した当日に該フラスコを使用しない場合は、少量の生理食塩液をフラスコ内に残して使用時まで４℃で保存した。【００７３】
（３）リンパ球細胞の活性化培養
上記１．（１）で調製した細胞懸濁液を８００ｒｐｍで１５分間、室温にて遠心した。遠心して得られたリンパ球細胞に、リンパ球細胞の細胞密度が６×１０５個／ｍＬとなるように培地Ａを添加して細胞懸濁液を調製した。この細胞懸濁液５０ｍＬを、上記１．（２）で作製した２２５ｃｍ２ＯＫＴ３固相化フラスコに分注し播種し、培地Ａを用いてテーハー式ＣＯ２培養器（ヒラサワ社製）内で温度３７．０±０．５℃、湿度９５．０±５．０％、ＣＯ２濃度５．０±０．２％にて培養した。培養開始３日目に浮遊細胞数が４×１０５個／ｍＬを超えていたことから、５０ｍＬの培地Ａを添加して翌日まで培養を継続した。培養開始４日目に活性化培養を中止して、フラスコの底面に付着したリンパ球細胞をタッピングにより剥離させて浮遊細胞とし、全細胞を回収して培地Ａによる細胞懸濁液を得た。前記細胞懸濁液中の細胞数を上記１．（１）と同様の手順で計測した。【００７４】
（４）リンパ球細胞の凍結保存
上記１．（３）で計測した細胞密度をもとに、３検体について、凍結保存チューブ（コーニング社製）１本あたりのリンパ球細胞数を３×１０７個となるように、培地Ａを加えて調製し、１５ｍＬ遠沈管に分注して１２００ｒｐｍ、５分間、室温にて遠心した。遠心後、各遠沈管中の上清を除去し、得られたペレットを分散させ、凍結保存チューブ１本あたり１．８ｍＬの液量となるように細胞凍結保存液（ＣＰ−１：極東製薬工業株式会社製）を添加して細胞を懸濁して凍結保存チューブに分注し、その凍結保存チューブをバイセル（日本フリーザー社製）に入れ、−８０℃の超低温フリーザー（三洋電機株式会社製）で２日間一時保管した後、液体窒素タンク（ＭＶＥ）へと移しいれて凍結保存細胞として保存した。【００７５】
（５）凍結リンパ球細胞の解凍
上記１．（４）で凍結保存した凍結保存チューブを液体窒素タンクより取り出し、３７℃に設定したドライサーモユニット（タイテック社製）中で凍結保存チューブを４分間加温して、凍結リンパ球細胞を解凍した。解凍したリンパ球細胞を、１０ｍＬの培地Ａで懸濁しながら１５ｍＬ遠沈管に移し入れ、１２００ｒｐｍ、３分間、室温にて遠心した。遠心後、上清を除去し、ペレットを分散させ１０ｍＬの培地Ａを添加して細胞懸濁液とし、上記１．（１）記載の方法と同じ方法で細胞数を計測した。解凍したリンパ球細胞は、チューブ毎に細胞数が異なるため、そのまま同量の培地で懸濁播種すると、播種細胞数の差が増殖に影響する可能性がある。この可能性を排除するために、解凍した細胞を播種して培養する工程では、播種前及び工程毎にリンパ球細胞数を計測し、播種時の細胞密度はもとより、添加する培地量を調製して細胞密度をほぼ一定とした（６×１０５個／ｍＬ）。
解凍した細胞懸濁液のうち、４０ｍＬの細胞懸濁液を２４穴マルチウェルプレート（住友ベークライト社製）に１ウェル当たり２ｍＬずつ播種し、播種日を第１日として３７℃、湿度９５％、ＣＯ２濃度５．０％の炭酸ガス培養器内で２日間培養した。【００７６】
（６）解凍処理後のリンパ球細胞の拡大培養
ＯＫＴ３の固相化処理をしていない、底面積２２５ｃｍ２の培養用フラスコ（住友ベークライト株式会社製；MS-2180R）を用意した。上記１．（５）で解凍処理後に２日間培養したリンパ球細胞懸濁液（４０ｍＬ）を、３日目に２４穴マルチウェルプレートからそれぞれ前述のフラスコに移した。別途、５０ｍＬの培地Ａを用意し、その培地Ａで２４穴マルチウェルプレートのウェル内を洗浄して、ウェル内に残った細胞を回収し、各フラスコ内に移した。各フラスコ内の液量は、９０ｍＬとなった。【００７７】
各フラスコをテーハー式ＣＯ２培養器（ヒラサワ社製）内に入れて、温度３７．０±０．５℃、湿度９５％、ＣＯ２濃度５．０％にてリンパ球細胞の拡大培養を行った。拡大培養の開始から７２時間、９６時間、１２０時間及び１４４時間経過時にフラスコ内の培地の一部をサンプリングし、総細胞数及び生細胞数を計測した。【００７８】
２．［ヒトリンパ球細胞の細胞増殖率への、培地中のヒトアルブミンの影響］
培地中のヒトアルブミン（以下、単に「アルブミン」とも表示する。）の有無や濃度が、ヒトリンパ球細胞の細胞増殖率にどのような影響を与えるかを調べるために、以下の実験を行った。【００７９】
（１）基本培地の調製
基本培地として、以下の表１に記載の組成の培地を調製した。【００８０】
【表１】
2020044538.tif 000002
【００８１】
（２）アルブミン検討試験用培地の調製
上記基本培地にヒトアルブミン（CSLベーリング社製：「アルブミナ−２５％静注１２．５ｇ/５０ｍＬ」）を、０．３ｇ／Ｌ、１．０ｇ／Ｌ、３．０ｇ／Ｌ又は１０．０ｇ／Ｌを添加した培地をそれぞれ調製した。また、ヒトアルブミンを添加しない基本培地を、コントロール培地（アルブミン０ｇ／Ｌ）とした。【００８２】
（３）アルブミン検討試験用培地を用いたリンパ球細胞の培養
アルブミン検討試験用培地及びコントロール培地のいずれかを培地Ａとして用いて、上記１．（３）の「リンパ球細胞の活性化培養」、（４）の「リンパ球細胞の凍結保存」、（５）の「凍結リンパ球細胞の解凍」、及び、（６）の「解凍処理後のリンパ球細胞の拡大培養」を行った。（６）の工程において、フラスコ１つ当たり、それぞれ１．３×１０６個のリンパ球細胞で拡大培養を開始した。拡大培養の開始から７２時間、９６時間、１２０時間及び１４４時間経過時にフラスコ内の培地をサンプリングして総細胞数及び生細胞数を計測した。またその結果から、生存率も算出した。それぞれの種類の培地についてｎ＝３で得た生細胞数の結果の平均、及び、生存率の平均を以下の表２に示す。また、表２の結果のうち、各培地を用いた場合の生細胞数の推移を図１に示す。【００８３】
【表２】
2020044538.tif 000003
【００８４】
表２及び図１の結果から、培地にアルブミンを添加すると、ヒトリンパ球細胞の増殖効率が顕著に上昇することが示された。また、アルブミン濃度は、０．３ｇ／Ｌ以上が好ましく、１ｇ／Ｌ以上がより好ましく、２ｇ／Ｌ以上がさらに好ましいことが示された。ただ、アルブミン濃度２ｇ／Ｌ、３ｇ／Ｌ、４ｇ／Ｌでは増殖効率にあまり差はなく、１０ｇ／Ｌではそれよりも増殖効率が低下したため、増殖効率と製造コストのバランスの観点から、約２ｇ／Ｌが特に好ましいことが示された。したがって、以降の培養試験の培地では、アルブミン濃度を２ｇ／Ｌとした。【００８５】
３．［ヒトリンパ球細胞の細胞増殖率への、培地中のヒトトランスフェリンの影響］
培地中のヒトトランスフェリン（以下、単に「トランスフェリン」とも表示する。）の有無や濃度が、ヒトリンパ球細胞の細胞増殖率にどのような影響を与えるかを調べるために、以下の実験を行った。【００８６】
（１）トランスフェリン検討試験用培地の調製
上記２．（１）の基本培地にアルブミンを添加して、培地のアルブミン濃度を２ｇ／Ｌに調整した（「基本培地＋アルブミン」）。かかる培地（「基本培地＋アルブミン」）にヒトトランスフェリン（組換え体）（富士フィルム和光純薬社製：205-18084（型番））を、０．３ｍｇ／Ｌ、１．０ｍｇ／Ｌ、３．０ｍｇ／Ｌ又は１０．０ｍｇ／Ｌを添加した培地をそれぞれ調製した。また、ヒトトランスフェリンを添加しない培地（「基本培地＋アルブミン」）を、コントロール培地（トランスフェリン０ｍｇ／Ｌ）とした。【００８７】
（２）トランスフェリン検討試験用培地を用いたリンパ球細胞の培養
トランスフェリン検討試験用培地及びコントロール培地のいずれかを培地Ａとして用いて、上記１．（３）の「リンパ球細胞の活性化培養」、（４）の「リンパ球細胞の凍結保存」、（５）の「凍結リンパ球細胞の解凍」、及び、（６）の「解凍処理後のリンパ球細胞の拡大培養」を行った。（６）の工程において、フラスコ１つ当たり、それぞれ１．３×１０６個のリンパ球細胞で拡大培養を開始した。拡大培養の開始から７２時間、９６時間、１２０時間及び１４４時間経過時にフラスコ内の培地をサンプリングして総細胞数及び生細胞数を計測した。またその結果から、生存率も算出した。それぞれの種類の培地についてｎ＝３で得た生細胞数の結果の平均、及び、生存率の平均を以下の表３に示す。また、表３の結果のうち、各培地を用いた場合の生細胞数の推移を図２に示す。【００８８】
【表３】
2020044538.tif 000004
【００８９】
表３及び図２の結果から、培地にトランスフェリンを添加すると、ヒトリンパ球細胞の増殖効率が顕著に上昇することが示された。また、トランスフェリン濃度は、０．３ｍｇ／Ｌ以上が好ましく、１ｍｇ／Ｌ以上がより好ましいことが示された。また、トランスフェリンが１ｍｇ／Ｌ、３．０ｍｇ／Ｌ、１０．０ｍｇ／Ｌでは増殖効率に大きな差はなかったため、増殖効率と製造コストのバランスの観点から、約１．０ｍｇ／Ｌが好ましいことが示された。したがって、以降の培養試験の培地では、トランスフェリン濃度を１ｍｇ／Ｌとした。【００９０】
４．［ヒトリンパ球細胞の細胞増殖率への、培地中のヒトインスリンの影響］
培地中のヒトインスリン（以下、単に「インスリン」とも表示する。）の有無や濃度が、ヒトリンパ球細胞の細胞増殖率にどのような影響を与えるかを調べるために、以下の実験を行った。【００９１】
（１）インスリン検討試験用培地の調製
上記２．（１）の基本培地にアルブミン及びトランスフェリンを添加して、培地のアルブミン濃度を２ｇ／Ｌに、及び、トランスフェリン濃度を１ｍｇ／Ｌに調整した（「基本培地＋アルブミン＋トランスフェリン」）。かかる培地（「基本培地＋アルブミン＋トランスフェリン」）にヒトインスリン（組換え体）（富士フィルム和光純薬社製：094-06484（型番）））を、０．３ｍｇ／Ｌ、１．０ｍｇ／Ｌ、３．０ｍｇ／Ｌ又は１０．０ｍｇ／Ｌを添加した培地をそれぞれ調製した。また、ヒトインスリンを添加しない培地（「基本培地＋アルブミン＋トランスフェリン」）を、コントロール培地（インスリン０ｍｇ／Ｌ）とした。【００９２】
（２）インスリン検討試験用培地を用いたリンパ球細胞の培養
インスリン検討試験用培地及びコントロール培地のいずれかを培地Ａとして用いて、上記１．（３）の「リンパ球細胞の活性化培養」、（４）の「リンパ球細胞の凍結保存」、（５）の「凍結リンパ球細胞の解凍」、及び、（６）の「解凍処理後のリンパ球細胞の拡大培養」を行った。（６）の工程において、フラスコ１つ当たり、それぞれ１．３×１０６個のリンパ球細胞で拡大培養を開始した。拡大培養の開始から７２時間、９６時間、１２０時間及び１４４時間経過時にフラスコ内の培地をサンプリングして総細胞数及び生細胞数を計測した。またその結果から、生存率も算出した。それぞれの種類の培地についてｎ＝３で得た生細胞数の結果の平均、及び、生存率の平均を以下の表４に示す。また、表４の結果のうち、各培地を用いた場合の生細胞数の推移を図３に示す。【００９３】
【表４】
2020044538.tif 000005
【００９４】
表４及び図３の結果から、培地にインスリンを添加すると、ヒトリンパ球細胞の増殖効率が顕著に上昇することが示された。また、インスリン濃度は、０．３ｍｇ／Ｌ以上が好ましく、約１ｍｇ／Ｌが特に好ましいことが示された。３．０ｍｇ／Ｌでは１ｍｇ／Ｌよりも増殖効率が低く、１０．０ｍｇ／Ｌでは、０ｍｇ／Ｌと同程度の増殖効率であった。増殖効率と製造コストのバランスの観点から、インスリンは約１．０ｍｇ／Ｌが好ましいことが示された。したがって、以降の培養試験の培地では、インスリン濃度を１ｍｇ／Ｌとした。【００９５】
５．［ヒトリンパ球細胞の細胞増殖率への、培地中のグルタチオンの影響］
培地中のグルタチオンの有無や濃度が、ヒトリンパ球細胞の細胞増殖率にどのような影響を与えるかを調べるために、以下の実験を行った。【００９６】
（１）グルタチオン検討試験用培地の調製
上記２．（１）の基本培地にアルブミン、トランスフェリン及びインスリンを添加して、培地のアルブミン濃度を２ｇ／Ｌに、トランスフェリン濃度を１ｍｇ／Ｌに、インスリン濃度を１ｍｇ／Ｌに調整した（「基本培地＋アルブミン＋トランスフェリン＋インスリン」）。かかる培地（「基本培地＋アルブミン＋トランスフェリン＋インスリン」）にグルタチオン（富士フィルム和光純薬社製：073-02013（型番））を、０．３ｍｇ／Ｌ、１．０ｍｇ／Ｌ、３．０ｍｇ／Ｌ又は１０．０ｍｇ／Ｌを添加した培地をそれぞれ調製した。また、グルタチオンを添加しない培地（「基本培地＋アルブミン＋トランスフェリン＋インスリン」）を、コントロール培地（グルタチオン０ｍｇ／Ｌ）とした。【００９７】
（２）グルタチオン検討試験用培地を用いたリンパ球細胞の培養
グルタチオン検討試験用培地及びコントロール培地のいずれかを培地Ａとして用いて、上記１．（３）の「リンパ球細胞の活性化培養」、（４）の「リンパ球細胞の凍結保存」、（５）の「凍結リンパ球細胞の解凍」、及び、（６）の「解凍処理後のリンパ球細胞の拡大培養」を行った。（６）の工程において、フラスコ１つ当たり、それぞれ１．３×１０６個のリンパ球細胞で拡大培養を開始した。拡大培養の開始から７２時間、９６時間、１２０時間及び１４４時間経過時にフラスコ内の培地をサンプリングして総細胞数及び生細胞数を計測した。またその結果から、生存率も算出した。それぞれの種類の培地についてｎ＝３で得た生細胞数の結果の平均、及び、生存率の平均を以下の表５に示す。また、表５の結果のうち、各培地を用いた場合の生細胞数の推移を図４に示す。【００９８】
【表５】
2020044538.tif 000006
【００９９】
表５及び図４の結果から、培地にグルタチオンを添加すると、ヒトリンパ球細胞の増殖効率が顕著に上昇することが示された。また、グルタチオン濃度は、０．３ｍｇ／Ｌ以上が好ましく、１．０ｍｇ／Ｌ以上がより好ましく、３．０ｍｇ／Ｌ以上がさらに好ましいことが示された。１０．０ｍｇ／Ｌでは、３．０ｍｇ／Ｌと同程度の増殖効率であった。増殖効率と製造コストのバランスの観点から、グルタチオンは約３．０ｍｇ／Ｌが好ましいことが示された。したがって、以降の培養試験の培地では、グルタチオン濃度を３ｍｇ／Ｌとした。【０１００】
６．［ヒトリンパ球細胞の細胞増殖率への、培地中のアスコルビン酸リン酸マグネシウムの影響］
培地中のアスコルビン酸リン酸エステルマグネシウム塩（アスコルビン酸リン酸Ｍｇ）の有無や濃度が、ヒトリンパ球細胞の細胞増殖率にどのような影響を与えるかを調べるために、以下の実験を行った。【０１０１】
（１）アスコルビン酸リン酸Ｍｇ検討試験用培地の調製
上記２．（１）の基本培地にアルブミン、トランスフェリン、インスリン及びグルタチオンを添加して、培地のアルブミン濃度を２ｇ／Ｌに、トランスフェリン濃度を１ｍｇ／Ｌに、インスリン濃度を１ｍｇ／Ｌに、グルタチオン濃度を３ｍｇ／Ｌに調整した（「基本培地＋アルブミン＋トランスフェリン＋インスリン＋グルタチオン」）。かかる培地（「基本培地＋アルブミン＋トランスフェリン＋インスリン＋グルタチオン」）にアスコルビン酸リン酸Ｍｇ（富士フィルム和光純薬社製：013-19641（型番））L-アスコルビン酸りん酸エステルマグネシウム塩n水和物：含量９０重量％）を、１０．０ｍｇ／Ｌ、３０．０ｍｇ／Ｌ又は５０．０ｍｇ／Ｌを添加した培地をそれぞれ調製した。また、アスコルビン酸リン酸Ｍｇを添加しない培地（「基本培地＋アルブミン＋トランスフェリン＋インスリン＋グルタチオン」）を、コントロール培地（アスコルビン酸リン酸Ｍｇ０ｍｇ／Ｌ）とした。【０１０２】
（２）アスコルビン酸リン酸Ｍｇ検討試験用培地を用いたリンパ球細胞の培養
アスコルビン酸リン酸Ｍｇ検討試験用培地及びコントロール培地のいずれかを培地Ａとして用いて、上記１．（３）の「リンパ球細胞の活性化培養」、（４）の「リンパ球細胞の凍結保存」、（５）の「凍結リンパ球細胞の解凍」、及び、（６）の「解凍処理後のリンパ球細胞の拡大培養」を行った。（６）の工程において、フラスコ１つ当たり、それぞれ１．３×１０６個のリンパ球細胞で拡大培養を開始した。拡大培養の開始から７２時間、９６時間、１２０時間及び１４４時間経過時にフラスコ内の培地をサンプリングして総細胞数及び生細胞数を計測した。またその結果から、生存率も算出した。それぞれの種類の培地についてｎ＝３で得た生細胞数の結果の平均、及び、生存率の平均を以下の表６に示す。また、表６の結果のうち、各培地を用いた場合の生細胞数の推移を図５に示す。【０１０３】
【表６】
2020044538.tif 000007
【０１０４】
表６及び図５の結果から、培地にアスコルビン酸リン酸Ｍｇを添加すると、ヒトリンパ球細胞の増殖効率が顕著に上昇することが示された。また、アスコルビン酸リン酸Ｍｇ濃度は、９．０ｍｇ／Ｌ以上が好ましく、２７．０ｍｇ／Ｌ以上がより好ましく、４５．０ｍｇ／Ｌ以上がさらに好ましいことが示された。４５．０ｍｇ／Ｌでは、２７．０ｍｇ／Ｌよりも増殖効率が高かったが、増殖効率と製造コストのバランスの観点から、アスコルビン酸リン酸Ｍｇは約２７．０ｍｇ／Ｌが好ましいことが示された。したがって、以降の培養試験の培地では、アスコルビン酸リン酸Ｍｇ濃度を２７．０ｍｇ／Ｌとした。【０１０５】
７．［ヒトリンパ球細胞の細胞増殖率への、培地中のモノエタノールアミンの影響］
培地中のモノエタノールアミン（２−アミノエタノール）の有無や濃度が、ヒトリンパ球細胞の細胞増殖率にどのような影響を与えるかを調べるために、以下の実験を行った。【０１０６】
（１）モノエタノールアミン検討試験用培地の調製
上記２．（１）の基本培地にアルブミン、トランスフェリン、インスリン、グルタチオン及びアスコルビン酸リン酸Ｍｇを添加して、培地のアルブミン濃度を２ｇ／Ｌに、トランスフェリン濃度を１ｍｇ／Ｌに、インスリン濃度を１ｍｇ／Ｌに、グルタチオン濃度を３ｍｇ／Ｌに、アスコルビン酸リン酸Ｍｇを２７ｍｇ／Ｌに調整した（「基本培地＋アルブミン＋トランスフェリン＋インスリン＋グルタチオン＋アスコルビン酸リン酸Ｍｇ」）。かかる培地（「基本培地＋アルブミン＋トランスフェリン＋インスリン＋グルタチオン＋アスコルビン酸リン酸Ｍｇ」）にモノエタノールアミン（富士フィルム和光純薬社製：016-12453（型番））を添加した培地をそれぞれ調製した。また、アスコルビン酸リン酸Ｍｇを添加しない培地（「基本培地＋アルブミン＋トランスフェリン＋インスリン＋グルタチオンアスコルビン酸リン酸Ｍｇ」）を、コントロール培地（アスコルビン酸リン酸Ｍｇ０ｍｇ／Ｌ）とした。【０１０７】
（２）モノエタノールアミン検討試験用培地を用いたリンパ球細胞の培養
モノエタノールアミン検討試験用培地及びコントロール培地のいずれかを培地Ａとして用いて、上記１．（３）の「リンパ球細胞の活性化培養」、（４）の「リンパ球細胞の凍結保存」、（５）の「凍結リンパ球細胞の解凍」、及び、（６）の「解凍処理後のリンパ球細胞の拡大培養」を行った。（６）の工程において、フラスコ１つ当たり、それぞれ１．３×１０６個のリンパ球細胞で拡大培養を開始した。拡大培養の開始から７２時間、９６時間、１２０時間及び１４４時間経過時にフラスコ内の培地をサンプリングして総細胞数及び生細胞数を計測した。またその結果から、生存率も算出した。それぞれの種類の培地についてｎ＝３で得た生細胞数の結果の平均、及び、生存率の平均を以下の表７に示す。また、表７の結果のうち、各培地を用いた場合の生細胞数の推移を図６に示す。【０１０８】
【表７】
2020044538.tif 000008
【０１０９】
表７及び図６の結果から、培地にモノエタノールアミンを添加すると、ヒトリンパ球細胞の増殖効率が顕著に上昇することが示された。また、モノエタノールアミン濃度は、５０μＭ（３．０７５ｍｇ／Ｌ）以上が好ましく、１００μＭ（６．１５ｍｇ／Ｌ）以上がより好ましく、２００μＭ（１２．３ｍｇ／Ｌ）がさらに好ましいことが示された。３００μＭ（１８．４５ｍｇ／Ｌ）や４００μＭ（２４．６ｍｇ／Ｌ）では、２００μＭよりも増殖効率よりも増殖効率が低かったため、増殖効率と製造コストのバランスの観点から、モノエタノールアミンは約２００μＭが好ましいことが示された。【０１１０】
８．［本発明の特に好適な培地の組成］
実施例の上記２．〜７．の結果から、ヒトリンパ球細胞の増殖効率と製造コストのバランスの観点から、本発明のヒトリンパ球細胞培養用無血清培地の特に好適な組成として以下の表８に記載の組成が挙げられる。以下、かかる表８記載の組成の培地を、「本発明の好適な無血清培地」と表示する。【０１１１】
【表８】
2020044538.tif 000009
【０１１２】
９．［本発明の好適な無血清培地と、従来の血清培地との比較試験］
本発明の好適な無血清培地と、従来の血清培地との比較試験を以下の方法で行った。【０１１３】
（１）従来の血清培地を用いた培養方法
従来の血清培地を用いた培養方法に用いる３種類の培地（Ｓ１（表９）、Ｓ２（表１０）、Ｓ３（表１１））を調製した。なお、表１０のＡＩＭ−Ｖ（登録商標）培地は、インビトロジェン社製のリンパ球用無血清合成培地であり、ＣＰ−４培地は、リンフォテック社製のリンパ球用無血清合成培地である。【０１１４】
【表９】
2020044538.tif 000010
【０１１５】
【表１０】
2020044538.tif 000011
【０１１６】
【表１１】
2020044538.tif 000012
【０１１７】
上記１．（２）に記載の方法で、ＯＫＴ３固相化フラスコを調製した。３×１０７個の末梢血リンパ球細胞を５０ｍＬの血清培地Ｓ１に懸濁させて細胞懸濁液を調製した。細胞懸濁液を、前述のＯＫＴ３固相化フラスコにそれぞれ分注した。ＯＫＴ３固相化フラスコに血清培地Ｓ１を５０ｍＬ追加した。フラスコをテーハー式ＣＯ２培養器（ヒラサワ社製）内に入れて、温度３７．０±０．５℃、湿度９５．０±５．０％、ＣＯ２濃度５．０±０．２％にて培養を行った。培養開始から５日後、フラスコ内の細胞懸濁液をガス透過性の培養バッグに移した。この培養バッグを前述のテーハー式ＣＯ２培養器に戻し、温度３７．０±０．５℃、湿度９５．０±５．０％、ＣＯ２濃度５．０±０．２％にて培養をさらに１４日継続した。かかる培養試験は９連で行った。培養後の細胞懸濁液の生細胞数と総細胞数を算出した。また、その総細胞数と生細胞数を算出した。生細胞数の結果を図７に示す。【０１１８】
（２）本発明の好適な無血清培地を用いた培養方法
上記１．（２）に記載の方法で、ＯＫＴ３固相化フラスコを調製した。３×１０７個の末梢血リンパ球細胞を５０ｍＬの本発明の好適な無血清培地に懸濁させて細胞懸濁液を調製した。細胞懸濁液を、前述のＯＫＴ３固相化フラスコにそれぞれ分注した。ＯＫＴ３固相化フラスコに本発明の好適な無血清培地を５０ｍＬ追加した。フラスコをテーハー式ＣＯ２培養器（ヒラサワ社製）内に入れて、温度３７．０±０．５℃、湿度９５．０±５．０％、ＣＯ２濃度５．０±０．２％にて培養を行った。培養開始から５日後、フラスコ内の細胞懸濁液をガス透過性の培養バッグに移した。本発明の好適な無血清培地をフラスコに入れてフラスコを洗浄した後、その培地も培養バッグに移した。この培養バッグを前述のテーハー式ＣＯ２培養器に戻し、温度３７．０±０．５℃、湿度９５．０±５．０％、ＣＯ２濃度５．０±０．２％にて培養をさらに１４日継続した。かかる培養試験は９連で行った。培養後の細胞懸濁液の生細胞数と総細胞数を算出した。また、その総細胞数と生細胞数を算出した。生細胞数の結果を図７に示す。【０１１９】
（３）比較試験の結果
図７から、本発明の好適な無血清培地は、従来の血清培地よりも、増殖効率が割合として約３０％程度も高いことが示された。このことから、本発明の好適な無血清培地を末梢血リンパ球細胞の培養に用いると、顕著な増殖効率が得られることが示された。【０１２０】
１０．［本発明の好適な無血清培地と、既存の無血清培地との比較試験］
本発明の好適な無血清培地と、既存のリンパ球細胞培養用の無血清培地との比較試験を以下の方法で行った。【０１２１】
（１）増殖効率及び生存率の比較
市販されている既存のリンパ球細胞培養用の無血清培地を２種類用意し、既存の無血清培地Ｘ、Ｙとそれぞれ命名した。以下の比較試験では、培地として、本発明の好適な無血清培地、培地Ｘ又は培地Ｙを用いた。【０１２２】
上記１．（２）に記載の方法で、ＯＫＴ３固相化フラスコを調製した。３×１０７個の末梢血リンパ球細胞を５０ｍＬの培地に懸濁させて細胞懸濁液を調製した。細胞懸濁液を、前述のＯＫＴ３固相化フラスコにそれぞれ分注した。ＯＫＴ３固相化フラスコに各培地を５０ｍＬずつ追加した。追加した培地は、細胞懸濁液に用いた培地と同じ種類の培地とした。各フラスコをテーハー式ＣＯ２培養器（ヒラサワ社製）内に入れて、温度３７．０±０．５℃、湿度９５．０±５．０％、ＣＯ２濃度５．０±０．２％にて培養を行った。培養開始から５日後、各フラスコ内の細胞懸濁液をガス透過性の培養バッグにそれぞれ移した。各培養バッグを前述のテーハー式ＣＯ２培養器に戻し、温度３７．０±０．５℃、湿度９５．０±５．０％、ＣＯ２濃度５．０±０．２％にて培養をさらに１４日継続した。各種の培地について、それぞれ３連で培養試験を行った。培養後の細胞懸濁液の生細胞数と総細胞数を算出した。また、その総細胞数と生細胞数から生存率を算出した。これらの結果を以下の表１２に示し、生細胞数を図８に示す。【０１２３】
【表１２】
2020044538.tif 000013
【０１２４】
表１２及び図８の結果から、本発明の好適な無血清培地は、市販されている既存の、２種類のリンパ球細胞培養用の無血清培地（培地Ｘ、培地Ｙ）よりも、リンパ球細胞の増殖効率及びリンパ球細胞の生存率が高いことが示された。【０１２５】
（２）リンパ球細胞の表面抗原の比較
上記１０．（１）の各培養で得られたリンパ球細胞の各集団について、ＣＤ３、ＴＣＲ−ＧＤ（ＴＣＲγδ）、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１６及びＣＤ５６の表面抗原マーカーの解析をフローサイトメーターで行った。その解析結果を以下の表１３に示す。【０１２６】
【表１３】
2020044538.tif 000014
【０１２７】
表１３の結果から、本発明の好適な無血清培地を用いた場合、培地Ｘや培地Ｙを用いた場合と比べて、ＣＤ３陽性細胞の割合が高かった。ＣＤ３はＴリンパ球細胞のマーカーとして知られている。これらのことから、本発明の好適な無血清培地を用いると、Ｔリンパ球細胞の増殖効率がより高いだけでなく、Ｔリンパ球細胞の占有割合がより高いことが示された。すなわち、本発明の好適な無血清培地は、Ｔリンパ球細胞をより高い選択性で増殖することができることが示された。
【産業上の利用可能性】
【０１２８】
本発明によれば、ヒトリンパ球細胞（好ましくはヒトＴリンパ球細胞）の培養に用いた場合に高い細胞増殖率が得られる無血清培地を提供すること、及び、かかる無血清培地を用いるヒトリンパ球細胞（好ましくはヒトＴリンパ球細胞）の培養方法等を提供することができる。
【図１】
2020044538.tif 000015
【図２】
2020044538.tif 000016
【図３】
2020044538.tif 000017
【図４】
2020044538.tif 000018
【図５】
2020044538.tif 000019
【図６】
2020044538.tif 000020
【図７】
2020044538.tif 000021
【図８】
2020044538.tif 000022
【国際調査報告】
2020044538.tif 000023
2020044538.tif 000024
2020044538.tif 000025
2020044538.tif 000026