(57)【要約】  本発明は、BMPRシグナル伝達阻害剤を含む網膜神経節細胞死抑制剤、BMPRシグナル伝達阻害剤を含む網膜神経の保護薬、及びこれらを利用した緑内障、糖尿病性網膜症、網膜血管閉塞症などの網膜神経節細胞死に関連した疾患を予防又は治療するための医薬組成物に関する。
2020090705.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
BMPRシグナル伝達阻害剤を含む、網膜神経節細胞死抑制剤。
【請求項２】
BMPRシグナル伝達阻害剤がALK3シグナル伝達阻害剤である、請求項１に記載の網膜神経節細胞死抑制剤。
【請求項３】
BMPRシグナル伝達阻害剤が、抗ALK3抗体又はそのフラグメント、抗BMP4抗体又はそのフラグメント、Dorsomorphin（6-[4-(2-ピペリジン-1-イルエトキシ)フェニル]-3-ピリジン-4-イルピラゾロ[1,5-a]ピリミジン）、LDN-193189(4-[6-(4-ピペラジン-1-イル-フェニル)-ピラゾロ[1,5-α]ピリミジン-3-イル]-キノリン)、2-(3-(6-メチルピリジン-2-イル)-1H-ピラゾール-4-イル)-1,5-ナフチリジン、K02288（3-[6-アミノ-5-(3,4,5-トリメトキシフェニル)-3-ピリジニル]-フェノール）、DMH-1（4-[6-[4-(1-メチルエトキシ)フェニル]ピラゾロ[1,5-α]ピリミジン-3-イル]-キノリン）、LDN-212854（5-(6-(4-(1-ピペラジニル)フェニル)ピラゾロ[1,5-α]ピリミジン-3-イル)キノリン）、LDN-214117 (1-[4-[6-メチル-5-(3,4,5-トリメトキシフェニル)-3-ピリジニル]フェニル]ピペラジン)、及びML347（5-[6-(4-メトキシフェニル)ピラゾロ[1,5-a]ピリミジン-3-イル]キノリン）からなる群から選ばれるいずれかである、請求項１に記載の網膜神経節細胞死抑制剤。
【請求項４】
フラグメントが、Fab、F(ab')2、Fv、scFv、scFv-Fc、ミニボディー、及びダイアボディーからなる群から選ばれるいずれかである、請求項３に記載の網膜神経節細胞死抑制剤。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか１項に記載の網膜神経節細胞死抑制剤を含む、網膜神経保護薬。
【請求項６】
請求項１〜４のいずれか１項に記載の網膜神経節細胞死抑制剤を含む、網膜神経節細胞死が関連する疾患を予防又は治療するための医薬組成物。
【請求項７】
網膜神経節細胞死が関連する疾患が、緑内障、糖尿病性網膜症、網膜血管閉塞症、虚血性視神経症、脈絡膜血管新生を伴う疾患、レーベル病、優性遺伝性視神経萎縮症、視神経炎、及び無虹彩症からなる群から選ばれるいずれか１又は２以上である、請求項６に記載の医薬組成物。
【請求項８】
請求項１〜４のいずれか１項に記載の網膜神経節細胞死抑制剤を含む、視神経細胞移植用補助剤。
【請求項９】
請求項１〜４のいずれか１項に記載の網膜神経節細胞死抑制剤の存在下で、視神経細胞を培養することを含む、視神経細胞の培養方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
[関連出願]
本明細書は、本願の優先権の基礎である特願２０１８−２０４８９１号（２０１８年１０月３１日出願）の明細書に記載された内容を包含する
[技術分野]
本発明は、BMPR（BMP受容体）シグナル伝達阻害剤を利用した網膜神経節細胞死の抑制、及び網膜神経節細胞死に関連した疾患の予防又は治療に関する。
【背景技術】
【０００２】
緑内障は視神経と視野に特徴的変化を伴う進行性の疾患であり、視力の低下や失明の原因となる。緑内障の発症メカニズムは十分解明されていないが、網膜神経節細胞死が原因のひとつと考えられており、網膜神経節細胞死の原因は眼圧の上昇による細胞内での栄養枯渇や酸化ストレス等と考えられている。緑内障に限らず、失明や視力低下の原因となる眼疾患では、しばしば網膜神経節細胞死を病態とする。【０００３】
Uekiらは、マウス網膜における骨形成因子（bone morphogenetic protein: BMP）のシグナル伝達を解析し、NMDAにより誘導される網膜神経節細胞死が、BMPの一つであるBMP4により抑制され、BMP阻害剤（Noggin）により細胞死が促進されることを報告している（非特許文献１）。またClarkらは、ヒト眼組織におけるBMP遺伝子の発現を解析し、緑内障の線維柱帯内皮細胞ではBMPアンタゴニストであるグレムリンの発現上昇がみられたことなどから、BMP遺伝子の発現に基づく緑内障診断やBMPアゴニストを用いた緑内障治療の可能性を報告している（特許文献１）。【０００４】
上述のとおり、BMPに関する従来の報告は、BMPシグナル伝達系の活性化が網膜神経節細胞死の抑制につながることを示唆するものである（特許文献１及び非特許文献１）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】特表２００５−５１８７８８号
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Yumi Ueki, Thomas A. Reh, “Activation of BMP-Smad1/5/8 Signaling PromotesSurvival of Retinal Ganglion Cells after Damage In Vivo”PLoS ONE, June 2012, Volume 7, Issue 6, e38690
【発明の概要】
【０００７】
本発明は、網膜神経節細胞死が生じるメカニズムを明らかにし、これに基づく新たな網膜の神経保護、及び網膜神経節細胞死が関連する疾患の予防又は治療のための手段を提供することを課題とする。
【０００８】
発明者らは、従来の報告とは異なり、BMPRシグナル伝達系（本明細書では「BMPR」を「BMP受容体」とも称する）を阻害することにより、網膜神経節細胞死が抑制されることを見出した。
【０００９】
すなわち、本発明は以下の（１）〜（２１）に関する。
（１）BMPRシグナル伝達阻害剤を含む、網膜神経節細胞死抑制剤。
（２）BMPRシグナル伝達阻害剤がALK3シグナル伝達阻害剤である、（１）に記載の網膜神経節細胞死抑制剤。
（３）BMPRシグナル伝達阻害剤が、抗ALK3抗体又はそのフラグメント、抗BMP4抗体又はそのフラグメント、Dorsomorphin（6-[4-(2-ピペリジン-1-イルエトキシ)フェニル]-3-ピリジン-4-イルピラゾロ[1,5-a]ピリミジン）、LDN-193189(4-[6-(4-ピペラジン-1-イル-フェニル)-ピラゾロ[1,5-α]ピリミジン-3-イル]-キノリン)、2-(3-(6-メチルピリジン-2-イル)-1H-ピラゾール-4-イル)-1,5-ナフチリジン、K02288（3-[6-アミノ-5-(3,4,5-トリメトキシフェニル)-3-ピリジニル]-フェノール）、DMH-1（4-[6-[4-(1-メチルエトキシ)フェニル]ピラゾロ[1,5-α]ピリミジン-3-イル]-キノリン）、LDN-212854（5-(6-(4-(1-ピペラジニル)フェニル)ピラゾロ[1,5-α]ピリミジン-3-イル)キノリン）、LDN-214117 (1-[4-[6-メチル-5-(3,4,5-トリメトキシフェニル)-3-ピリジニル]フェニル]ピペラジン)、及びML347（5-[6-(4-メトキシフェニル)ピラゾロ[1,5-a]ピリミジン-3-イル]キノリン）からなる群から選ばれるいずれかである、（１）に記載の網膜神経節細胞死抑制剤。
（４）フラグメントが、標的抗原を特異的に認識し結合するための相補性決定領域（CDR）を有するフラグメント、例えば、Fab、F(ab')2、Fv、scFv、scFv-Fc、ミニボディー、及びダイアボディーからなる群から選ばれるいずれかである、（３）に記載の網膜神経節細胞死抑制剤。
（５）（１）〜（４）のいずれかの項に記載の網膜神経節細胞死抑制剤を含む、網膜神経保護薬。
（６）（１）〜（４）のいずれかの項に記載の網膜神経節細胞死抑制剤を含む、網膜神経節細胞死が関連する疾患を予防又は治療するための医薬組成物。
（７）網膜神経節細胞死が関連する疾患が、緑内障、糖尿病性網膜症、網膜血管閉塞症、虚血性視神経症、脈絡膜血管新生を伴う疾患、レーベル病、優性遺伝性視神経萎縮症、視神経炎、及び無虹彩症からなる群から選ばれるいずれか１又は２以上である、（６）に記載の医薬組成物。
（８）（１）〜（４）のいずれかの項に記載の網膜神経節細胞死抑制剤を含む、視神経細胞移植用補助剤。
（９）（１）〜（４）のいずれかの項に記載の網膜神経節細胞死抑制剤の存在下で、視神経細胞（例えば、移植用の視神経細胞）を培養することを含む、視神経細胞の培養方法。
（１０）網膜神経節細胞死を抑制する方法であって、以下の（ａ）又は（ｂ）の工程を含む方法：
（ａ）有効量のBMPRシグナル伝達阻害剤を、該抑制を必要とする被験体に投与する工程；又は、
（ｂ）有効量のBMPRシグナル伝達阻害剤の存在下で、網膜神経節細胞を培養する工程。
（１１）BMPRシグナル伝達阻害剤が、（２）〜（４）のいずれかの項又は複数の項に記載される特徴をさらに備える、（１０）に記載の方法。
（１２）網膜神経を保護する方法であって、以下の（ａ）又は（ｂ）の工程を含む方法：
（ａ）有効量のBMPRシグナル伝達阻害剤を、該保護を必要とする被験体に投与する工程；又は、
（ｂ）有効量のBMPRシグナル伝達阻害剤の存在下で、網膜神経を培養する工程。
（１３）BMPRシグナル伝達阻害剤が、（２）〜（４）のいずれかの項又は複数の項に記載される特徴をさらに備える、（１２）に記載の方法。
（１４）網膜神経節細胞死が関連する疾患を予防又は治療するための方法であって、有効量のBMPRシグナル伝達阻害剤を、該予防又は治療を必要とする被験体に投与する工程を含む、方法。
（１５）BMPRシグナル伝達阻害剤が、（２）〜（４）のいずれかの項又は複数の項に記載される特徴をさらに備える、（１４）に記載の方法。
（１６）網膜神経節細胞死が関連する疾患が、（７）に記載の疾患である、（１４）又は（１５）に記載の方法。
（１７）網膜神経節細胞死の抑制に使用するための、BMPRシグナル伝達阻害剤。
（１８）BMPRシグナル伝達阻害剤が、（２）〜（４）のいずれかの項又は複数の項に記載される特徴をさらに備える、（１７）に記載の阻害剤。
（１９）網膜神経の保護に使用するための、（１７）又は（１８）に記載の阻害剤。
（２０）網膜神経節細胞死が関連する疾患の予防又は治療に使用するための、（１７）〜（１９）のいずれかの項に記載の阻害剤。
（２１）網膜神経節細胞死が関連する疾患が、（７）に記載の特徴をさらに備える、（２０）に記載の阻害剤。
【発明の効果】
【００１０】
本発明によれば、網膜神経節細胞死を効果的に抑制することができ、網膜神経を効果的に保護することができる。これにより、網膜神経節細胞死が関与する疾患、例えば、緑内障、糖尿病性網膜症、網膜血管閉塞症などの失明につながる重篤な眼疾患の新規な予防及び治療方法が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】図１Ａ及び１Ｂは、実施例にて使用した抗ALK3抗体、抗ALK4抗体の特異性確認結果を示す。図１Ａは左から、サイズマーカー、抗ALK3抗体のみを反応させたもの、サイズマーカー、抗ALK3抗体とALK3ペプチドを反応させたものを示す。図１Ｂは左から、抗ALK4抗体のみを反応させたもの、抗ALK4抗体とALK4ペプチドを反応させたもの、サイズマーカーを示す。  図１Ｃは、メナジオンにより誘導される網膜神経節細胞死に対する、BMPRシグナル伝達阻害剤の影響を示す。縦軸は全細胞数に対する生存細胞数の割合（％）、横軸は左から、対照群（メナジオン添加なし、Normal rabbit IgG添加）、Normal IgG処理群（メナジオン及びNormal rabbit IgG添加）、抗ALK3抗体処理群（メナジオン及び抗ALK3抗体添加）、抗ALK4抗体処理群（メナジオン及び抗ALK4抗体添加）、K02288処理群（メナジオン及びK02288添加）。*P<0.05 Student’s t-test vs Normal IgG処理群, n=3
【図２】図２Ａは、メナジオンにより誘導される網膜神経節細胞死に対する、BMPRシグナル伝達阻害剤K02288の影響を示す。縦軸は、メナジオン単独処理群に対する生存細胞数の割合（％）、横軸は、左から、対照群（メナジオン添加なし）、メナジオン単独処理群、K02288 100nM処理群、K02288 1μM処理群、K02288 10μM処理群。*P<0.05 Dunnett’s test vs メナジオン単独処理群, n=8  図２Ｂは、メナジオンにより誘導される網膜神経節細胞死に対する、BMPRシグナル伝達阻害剤LDN-193189の影響を示す。縦軸は、メナジオン単独処理群に対する生存細胞数の割合（％）、横軸は、左から、対照群(メナジオン添加なし)、メナジオン単独処理群、LDN-193189 100nM処理群、LDN-193189 1μM処理群。*P<0.05 Dunnett’s test vs メナジオン単独処理群, n=6
【図３】図３は、網膜神経節細胞におけるTGFβスーパーファミリーの各受容体のmRNA発現量を示す。縦軸はRNA 1ng中のコピー数、横軸は左から、ALK4、Bmpr2、Acvr2a、Acvr2b、ALK2、ALK3、ALK6、ALK7。
【図４】図４は、メナジオン処理した場合の網膜神経節細胞におけるBMPリガンドのmRNA発現量を示す。縦軸はメナジオン処理0時間の発現量に対するメナジオン処理6時間した場合のコピー数の割合、横軸は、左から、Tgfb1、Tgfb2、Bmp2、Bmp4、Bmp7、Inhba、Gdf5。n=2
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本発明は、網膜神経節細胞死の抑制、網膜神経の保護、あるいは網膜神経節細胞死に関連した疾患の予防又は治療において、BMPRシグナル伝達阻害剤を有効成分として用いるものである。
【００１３】
１．BMPRシグナル伝達阻害剤
本発明にかかるBMPRシグナル伝達阻害剤とは、BMPとBMPRの相互作用を介したBMPRシグナル伝達を阻害する物質である。BMPRシグナル伝達阻害剤は、BMPのシグナル伝達阻害剤としての機能を有するものであってもよい。
【００１４】
BMPは、TGFβスーパーファミリーに属する一群のタンパク質である。BMPは、骨や軟骨の分化を誘導又は促進する分子として同定されたが、他のTGFβスーパーファミリー分子と同様に、細胞の増殖や、分化、アポトーシスの制御などに重要な役割を果たしていることがわかってきている。様々な細胞の表面にBMPの受容体であるBMPRが存在しており、BMPがリガンドとして結合することにより、核内にシグナルを伝達する。BMPRシグナル伝達経路のリガンドとしては、BMP2、BMP4、BMP5、BMP6、BMP7、BMP8A、BMP8B、BMP9、BMP10、GDF5、GDF6、GDF7などが知られている。BMPファミリーは、BMP2/4、BMP5/6/7/8（Osteogenic Protein-1（OP-1））、BMP9/10、GDF5/6/7のサブファミリーに分けることができる。BMP2/4はBMP2及びBMP4を含み、BMP5/6/7/8（Osteogenic Protein-1（OP-1））はBMP5、BMP6、BMP7、BMP8A、及びBMP8Bを含み、BMP9/10はBMP9及びBMP10を含み、GDF5/6/7は、GDF5、GDF6及びGDF7を含む。
【００１５】
BMPRは、セリン・スレオニンキナーゼ型受容体で、BMPI型受容体及びBMPII型受容体がある（本明細書では、それぞれ「I型受容体」及び「II型受容体」とも称する）。I型受容体としては、Activin Receptor-like Kinase (ALK)1（ACVRL1、SKR3）、ALK2（ACVR1、ACTRI）、ALK3（BMPR1A）、ALK6（BMPR1B）が知られており、II型受容体としては、BMPR2、ACTRIIA、ACTRIIBが知られている（カッコ内は別名）。
【００１６】
BMPRのシグナル伝達には、I型受容体2分子とII型受容体2分子がヘテロ四量体を形成し、リガンドであるBMPと結合することが必要である。ヘテロ四量体とリガンドとの結合様式としては、I型受容体とII型受容体がヘテロ四量体を形成した後、リガンドが結合する様式、I型受容体とリガンドが先に結合し、その後II型受容体をリクルートする様式等がある。ヘテロ四量体とリガンドとが結合した形態となることにより、BMPRのシグナル伝達が活性化されるが、結合様式に応じて、シグナル伝達の経路が異なることが示唆されている。BMPRのシグナル伝達には、SMADタンパクを介したSMAD経路が知られている。例えば、BMPと結合したBMPRは、細胞内に移行し、キナーゼ活性によりSMAD1/5/8をリン酸化し、リン酸化されたSMAD分子はSMAD4と複合体を形成して核内に移行し、転写調節因子として遺伝子発現を調整する。またBMPRのシグナル伝達経路としては、SMAD経路のほかに、SMAD分子を介さない非SMAD経路も存在する（Tian XY et al., J Mol Cell Cardiol. 2012 Jan;52(1):237-44）。
【００１７】
本発明のBMPRシグナル伝達阻害剤は、上述したBMPRシグナル伝達経路のいずれかの段階に作用し、BMPとBMPRを介したシグナル伝達を阻害する。したがって、本発明のBMPRシグナル伝達阻害剤としては、
(1)BMPRへのBMPの結合を阻止又は阻害する物質：例えば、BMPRアンタゴニストやアンタゴニスト抗体（中和抗体）、抗BMPR抗体、BMPアンタゴニストやアンタゴニスト抗体（中和抗体）、抗BMP抗体、ドミナントネガティブ型BMP、ドミナントネガティブ型BMPR；
(2)BMPやBMPRの発現を抑制する物質：例えば、BMPやBMPR遺伝子の転写を阻害する物質、初期転写産物からmRNAへのプロセッシングを阻害する物質、mRNAの細胞質への輸送を阻害する物質、mRNAの分解を促進する物質、mRNAからタンパク質への翻訳を阻害する物質、タンパク質の翻訳後修飾を阻害する物質、好ましくは、BMP又はBMPRのmRNAに対するアンチセンス核酸やsmall interfering RNA（siRNA）；
(3)細胞内シグナル伝達を阻止又は阻害する物質：例えば、SMAD1/5/8経路の阻害剤、各SMAD分子のドミナントネガティブ型、SMAD4の核移行を阻害する阻害的SMAD、非SMAD経路の阻害剤；非SMAD経路の分子（例えば、Tak1、Tab1など）の阻害剤；
(4)細胞内シグナル伝達にかかわる分子の発現を抑制する物質：例えば、各SMAD遺伝子やTak1、Tab1遺伝子の転写を阻害する物質、初期転写産物からmRNAへのプロセッシングを阻害する物質、mRNAの細胞質への輸送を阻害する物質、mRNAの分解を促進する物質、mRNAからタンパク質への翻訳を阻害する物質、タンパク質の翻訳後修飾を阻害する物質、好ましくは、各SMAD分子やTak1、Tab1分子のmRNAに対するアンチセンス核酸やsiRNA；
を挙げることができるが、これらに限定されない。
【００１８】
本発明のBMPRシグナル伝達阻害剤は、抗体などのタンパク質、アンチセンス核酸やsiRNAなどの核酸分子のほか、低分子化合物であってもよい。
【００１９】
本発明のBMPRシグナル伝達阻害剤として使用できるタンパク質の具体例としては、天然の分子であるNoggin、Chordin、Follistatin、Cerberus、Gremlinのほか、抗BMP抗体（とくに抗BMP4抗体）、アンタゴニスト抗体である抗BMPR抗体（好ましくは抗ALK3抗体）、ドミナントネガティブ型BMP（好ましくはドミナントネガティブ型BMP4）、ドミナントネガティブ型BMPR（好ましくはドミナントネガティブ型ALK3）などを挙げることができる。
【００２０】
本発明のBMPRシグナル伝達阻害剤として使用できる核酸分子の具体例としては、BMP4、ALK3、SMAD1/5/8、SMAD4、Tak1、Tab1などのmRNAに対するアンチセンス核酸やsiRNAなどを挙げることができる。
【００２１】
本発明のBMPRシグナル伝達阻害剤として使用できる低分子化合物の具体例としては、Dorsomorphin（6-[4-(2-ピペリジン-1-イルエトキシ)フェニル]-3-ピリジン-4-イルピラゾロ[1,5-a]ピリミジン）（コスモバイオ社、MedChem Express社）（PLoS One. 2012;7(9):e45845（doi: 10.1371/journal.pone.004584.））、LDN-193189(4-[6-(4-ピペラジン-1-イル-フェニル)-ピラゾロ[1,5-α]ピリミジン-3-イル]-キノリン)及び／又はその塩酸塩（MedChem Express社）（PLoS One. 2013 Apr 30;8(4):e62721（doi: 10.1371/journal.pone.0062721.））、2-(3-(6-メチルピリジン-2-イル)-1H-ピラゾール-4-イル)-1,5-ナフチリジン、K02288（3-[6-アミノ-5-(3,4,5-トリメトキシフェニル)-3-ピリジニル]-フェノール）（Tocris Bioscience社）（PLoS One. 2013 Apr 30;8(4):e62721（doi: 10.1371/journal.pone.0062721.））、DMH-1 （4-[6-[4-(1-メチルエトキシ)フェニル]ピラゾロ [1,5-α]ピリミジン-3-イル]-キノリン）(コスモバイオ社、MedChem Express社)（ACS Chem Neurosci. 2012 Jun 20;3(6):482-91（doi: 10.1021/cn300029t.））、LDN-212854（5-(6-(4-(1-ピペラジニル)フェニル)ピラゾロ [1,5-α]ピリミジン-3-イル)キノリン）（Selleck社）（Bone. 2018 Apr;109:251-258（doi: 10.1016/j.bone.2017.09.004.））、LDN-214117 (1-[4-[6-メチル-5-(3,4,5-トリメトキシフェニル)-3-ピリジニル]フェニル]ピペラジン)（J Med Chem. 2014 Oct 9;57(19):7900-15. （doi: 10.1021/jm501177w.））、及びML347（5-[6-(4-メトキシフェニル)ピラゾロ[1,5-a]ピリミジン-3-イル]キノリン）（Bioorg Med Chem Lett. 2013 Jun 1;23(11):3248-52. （doi: 10.1016/j.bmcl.2013.03.113.））等を挙げることができる。あるいは、本発明のBMPRシグナル伝達阻害剤として使用できる低分子化合物の具体例としては、国際公開２０１５／１０３３５５、国際公開２０１２／０６５０５９、国際公開２０１８／１２４００１、国際公開２０１６／０１１０１９、国際公開２０１０／１１４８６０、国際公開２０１５／１４８６５４、国際公開２０１１／１１６２１２、国際公開２０１４／１６０２０３、国際公開２０１６／０５４４０６等に開示された化合物が挙げられる。
【００２２】
BMPRシグナル伝達阻害剤は、好ましくはI型受容体シグナル伝達阻害剤である。またBMPRシグナル伝達阻害剤は、例えばBMP4を含むBMPがリガンドとして受容体に結合することによる、BMPRのシグナル伝達を阻害し得る物質である。より好ましくはBMPRシグナル伝達阻害剤はALK3シグナル伝達阻害剤である。
【００２３】
「ALK3シグナル伝達阻害剤」
ALK3（Activin Receptor-like Kinase 3）は、別名：BMP受容体1A(BMPR1A)と言う。ALK3(BMPR1A)は、BMPファミリーのI型受容体の１つであり、同じI型受容体のBMPR1B及びII型受容体のBMPR2とヘテロ四量体を形成し、リガンドと結合することで、細胞内へのシグナル伝達を可能にする。
【００２４】
本発明にかかるALK3シグナル伝達阻害剤とは、ALK3からのシグナル伝達経路のいずれかの段階に作用し、ALK3のリガンドとALK3を介したシグナル伝達を阻害する。また本発明のALK3シグナル伝達阻害剤としては、リガンドとALK3との相互作用を阻止又は阻害することにより、あるいはALK3やそのリガンドの発現を抑制することにより、ALK3の機能を阻害する物質（すなわち、ALK3阻害剤）を包含する。ALK3のリガンドとしては、BMP4、BMP2、BMP6、BMP7があるが、好ましいリガンドはBMP4である。
【００２５】
本発明のALK3シグナル伝達阻害剤として使用できる低分子化合物の具体例としては、Dorsomorphin（6-[4-(2-ピペリジン-1-イルエトキシ)フェニル]-3-ピリジン-4-イルピラゾロ[1,5-a]ピリミジン）（コスモバイオ社、MedChem Express社）（PLoS One. 2012;7(9):e45845（doi: 10.1371/journal.pone.004584.））、LDN-193189(4-[6-(4-ピペラジン-1-イル-フェニル)-ピラゾロ[1,5-α]ピリミジン-3-イル]-キノリン)及び／又はその塩酸塩（MedChem Express社）（PLoS One. 2013 Apr 30;8(4):e62721（doi: 10.1371/journal.pone.0062721.））、K02288（3-[6-アミノ-5-(3,4,5-トリメトキシフェニル)-3-ピリジニル]-フェノール）（Tocris Bioscience社）（PLoS One. 2013 Apr 30;8(4):e62721（doi: 10.1371/journal.pone.0062721.））、DMH-1 （4-[6-[4-(1-メチルエトキシ)フェニル]ピラゾロ [1,5-α]ピリミジン-3-イル]-キノリン）(コスモバイオ社、MedChem Express社)（ACS Chem Neurosci. 2012 Jun 20;3(6):482-91（doi: 10.1021/cn300029t.））、LDN-212854（5-(6-(4-(1-ピペラジニル)フェニル)ピラゾロ [1,5-α]ピリミジン-3-イル)キノリン）（Selleck社）（Bone. 2018 Apr;109:251-258（doi: 10.1016/j.bone.2017.09.004.））、LDN-214117 (1-[4-[6-メチル-5-(3,4,5-トリメトキシフェニル)-3-ピリジニル]フェニル]ピペラジン)（J Med Chem. 2014 Oct 9;57(19):7900-15. （doi: 10.1021/jm501177w.））、ML347（5-[6-(4-メトキシフェニル)ピラゾロ[1,5-a]ピリミジン-3-イル]キノリン）（Bioorg Med Chem Lett. 2013 Jun 1;23(11):3248-52. （doi: 10.1016/j.bmcl.2013.03.113.））等を挙げることができる。あるいは、本発明のALK3シグナル伝達阻害剤として使用できる低分子化合物の具体例としては、国際公開２０１５／１０３３５５、国際公開２０１２／０６５０５９、国際公開２０１８／１２４００１、国際公開２０１６／０１１０１９、国際公開２０１０／１１４８６０、国際公開２０１５／１４８６５４、国際公開２０１１／１１６２１２、国際公開２０１４／１６０２０３、国際公開２０１６／０５４４０６等に開示された化合物が挙げられる。
【００２６】
ALK3シグナル伝達阻害剤としては、ALK3リガンドのアンタゴニスト（アンタゴニスト抗体（抗ALK3リガンドに対する抗体）を含む）、ALK3のアンタゴニスト（アンタゴニスト抗体（抗ALK3抗体）を含む）、ドミナントネガティブ型ALK3リガンド、ドミナントネガティブ型ALK3；ALK3リガンド又はALK3のmRNAに対するアンチセンス核酸やsiRNAを挙げることができる。ALK3シグナル伝達阻害剤は、ALK3あるいはALK3リガンドに特異的に作用することが好ましい。たとえば、抗ALK3抗体であれば、ALK3に特異的な反応性を有し、他のALKファミリー、例えばALK4に対して実質的に交差反応を示さない抗体が好ましい。アンチセンス核酸やsiRNAであれば、ALK3あるいはALK3リガンドをコードする核酸に特異的に作用し、他のALKファミリーをコードする核酸には作用しないことが好ましい。
【００２７】
「抗体又はそのフラグメント」
本発明において、BMPRシグナル伝達阻害剤として使用される抗体は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体のいずれであってもよいが、モノクローナル抗体であることが好ましい。これらの抗体は、当該分野で公知の方法に従って製造することができる。抗体のアイソタイプは特に限定されないが、好ましくはIgG、IgM又はIgA、特に好ましくはIgGが挙げられる。また、抗体は、標的抗原を特異的に認識し結合するための相補性決定領域（CDR）を少なくとも有するものであれば特に制限はなく、完全抗体分子のほか、Fab、Fab'、F(ab’)2等のフラグメント、scFv、scFv-Fc、ミニボディー、ダイアボディー等の遺伝子工学的に作製されたコンジュゲート分子、あるいはポリエチレングリコール（PEG）等のタンパク質安定化作用を有する分子等で修飾されたそれらの誘導体などであってもよい。本明細書において、「抗体」にはPEG化抗体などの誘導体を含み、抗体の「フラグメント」には、scFv、scFv-Fc、ミニボディー、ダイアボディー等のコンジュゲート分子も含むものとする。
【００２８】
上記した抗体は、市販のものを使用してもよいし、常法に基づいて作製してもよい。その場合、抗体は、ヒトに対する異種抗原性を低下させるために、キメラ（Chimeric）抗体、ヒト化（Humanized）抗体であるか、あるいは完全ヒト抗体であることが好ましい。
【００２９】
「ドミナントネガティブ」
BMPRシグナル伝達阻害剤として使用されるドミナントネガティブは、正常タンパクの変異型で、正常タンパクよりも優位に機能して、正常タンパクの作用を阻害することでBMPシグナル伝達を阻害する変異型タンパクである。
【００３０】
ドミナントネガティブ型のタンパクは、市販のキットを使用するなど、正常タンパクの配列に、当該分野で公知の技術を用いて変異を導入し、BMPRシグナル伝達に与える作用を、正常タンパクと比較することで作製することができる。
【００３１】
「アンチセンス核酸」
BMPRシグナル伝達阻害剤として使用されるアンチセンス核酸（本発明のアンチセンス核酸）とは、BMPRシグナル伝達に係る分子のmRNAの塩基配列と相補的もしくは実質的に相補的な塩基配列又はその一部を含む核酸であって、標的mRNAと特異的かつ安定した二重鎖を形成して結合することにより、タンパク質合成を抑制する機能を有するものである。アンチセンス核酸は、二本鎖DNA、一本鎖DNA、二本鎖RNA、一本鎖RNA、DNA:RNAハイブリッドのいずれであってもよい。
【００３２】
アンチセンス核酸の標的領域は、該アンチセンス核酸がハイブリダイズすることにより、結果としてmRNAの翻訳が阻害されるものであればその長さに特に制限はなく、標的分子のmRNAの全配列であっても部分配列であってもよく、短いもので約10塩基程度、長いものでmRNAもしくは初期転写産物の全配列が挙げられる。合成の容易さや抗原性、細胞内移行性の問題等を考慮すれば、約10〜約40塩基、特に約15〜約30塩基からなるオリゴヌクレオチドが好ましいが、それに限定されない。具体的には、標的となる遺伝子の5'端ヘアピンループ、5'端６−ベースペア・リピート、5'端非翻訳領域、翻訳開始コドン、タンパク質コード領域、ORF翻訳終止コドン、3'端非翻訳領域、3'端パリンドローム領域又は3'端ヘアピンループなどが、アンチセンス核酸の好ましい標的領域として選択しうるが、それらに限定されない。
【００３３】
アンチセンス核酸を構成するヌクレオチド分子は、天然型核酸でもよいが、安定性（化学的及び／又は対酵素）や比活性（RNAとの親和性）を向上させるために、種々の化学修飾を含むことができる。アンチセンス核酸はアンチジーンの形態であってもよい。こうした各種修飾を含むアンチセンス核酸は、当該分野で公知の手法にしたがい合成することができる。
【００３４】
「siRNA（small interfering RNA）」
siRNAは、標的分子のmRNAに相補的なオリゴRNAとその相補鎖とからなる二本鎖RNAであり、標的分子のmRNAの塩基配列情報に基づいて、当該分野で公知の方法にしたがい合成することができる。具体的には、mRNA上の標的配列のセンス鎖及びアンチセンス鎖をDNA/RNA自動合成機でそれぞれ合成し、適当なアニーリング緩衝液中、約90〜約95℃で約1分程度変性させた後、約30〜約70℃で約1〜約8時間アニーリングさせることにより調製することができる。また、siRNAの前駆体となるショートヘアピンRNA（shRNA）を合成し、これをダイサー（dicer）を用いて切断することにより調製することもできる。
【００３５】
siRNAを構成するリボヌクレオチド分子もまた、安定性、比活性などを向上させるために、RNAi活性が失われない限りにおいて、化学修飾を含むことができる。
【００３６】
本明細書において、siRNAには、当該siRNAを生成し得るようにデザインされた核酸も含まれる。そのような核酸としては、shRNAやそれを発現するように構築された発現ベクターなどが挙げられる。shRNAは、mRNA上の標的配列のセンス鎖及びアンチセンス鎖を適当なループ構造を形成しうる長さ（例えば15から25塩基程度）のスペーサー配列を間に挿入して連結した塩基配列を含むオリゴRNAをデザインし、これをDNA/RNA自動合成機で合成することにより調製することができる。shRNAの発現カセットを含む発現ベクターは、上記shRNAをコードする二本鎖DNAを常法により作製した後、適当な発現ベクター中に挿入することにより調製することができる。
【００３７】
２．網膜神経節細胞死の抑制
本発明は、BMPRシグナル伝達阻害剤を含む、網膜神経節細胞死抑制剤を提供する。本発明はまた、（ａ）有効量のBMPRシグナル伝達阻害剤を、該抑制を必要とする被験体に投与する工程；又は、（ｂ）有効量のBMPRシグナル伝達阻害剤の存在下で、網膜神経節細胞を培養する工程を含む、網膜神経節細胞死を抑制する方法を提供する。あるいは、本発明は、網膜神経節細胞死の抑制に使用するための、BMPRシグナル伝達阻害剤を提供する。
【００３８】
網膜神経節細胞（Retinal ganglion cell： RGC）とは、網膜の内側面に存在し、視細胞から受け取った視覚情報を電気信号に変えて脳に伝達する神経細胞である。網膜神経節細胞は再生しないため、網膜神経節細胞死のメカニズムを解明することは、緑内障をはじめとする種々の眼疾患の予防又は治療に重要である。
【００３９】
1つの実施態様である網膜神経節細胞死抑制剤とは、BMPRシグナル伝達阻害剤を有効成分として、BMPRからのシグナル伝達を阻害することで網膜神経節細胞の細胞死（アポトーシス又はネクローシス、好ましくはアポトーシス）を抑制するものをいう。本明細書において、網膜神経節細胞死の抑制とは、網膜神経節細胞死の進行を停止させる又は遅延させることを含む。より具体的には、網膜神経節細胞死を抑制するとは、BMPRシグナル伝達阻害剤が存在しない場合に比べてBMPRシグナル伝達阻害剤が存在する場合に、網膜神経節細胞の生存率が高いことを意味する。細胞の生存率は、公知の手法により解析することができるが、具体的には実施例に記載の手法により確認することができる。BMPRシグナル伝達阻害剤は、好ましくはI型受容体シグナル伝達阻害剤であり、より好ましくはALK3シグナル伝達阻害剤である。
【００４０】
本発明の網膜神経節細胞死抑制剤は、BMPRシグナル伝達阻害剤のほか、薬理学的に許容される担体を含んでいてもよい。薬理学的に許容される担体としては、製剤素材として慣用の各種有機あるいは無機担体物質が挙げられ、例えば、固形製剤における賦形剤、滑沢剤、結合剤及び崩壊剤、あるいは液状製剤における溶剤、溶解補助剤、懸濁化剤、等張化剤、緩衝剤及び無痛化剤などが挙げられる。更に必要に応じ、通常の防腐剤、抗酸化剤、着色剤、甘味剤、吸着剤、湿潤剤などの添加物を用いることもできる。
【００４１】
賦形剤としては、例えば、乳糖、白糖、D-マンニトール、デンプン、コーンスターチ、結晶セルロース、軽質無水ケイ酸などが挙げられる。滑沢剤としては、例えば、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウム、タルク、コロイドシリカなどが挙げられる。結合剤としては、例えば、結晶セルロース、白糖、D-マンニトール、デキストリン、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリビニルピロリドン、デンプン、ショ糖、ゼラチン、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウムなどが挙げられる。崩壊剤としては、例えば、デンプン、カルボキシメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースカルシウム、カルボキシメチルスターチナトリウム、Ｌ−ヒドロキシプロピルセルロースなどが挙げられる。溶剤としては、例えば、注射用水、アルコール、プロピレングリコール、マクロゴール、ゴマ油、トウモロコシ油、オリーブ油などが挙げられる。溶解補助剤としては、例えば、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、Ｄ−マンニトール、安息香酸ベンジル、エタノール、トリスアミノメタン、コレステロール、トリエタノールアミン、炭酸ナトリウム、クエン酸ナトリウムなどが挙げられる。懸濁化剤としては、例えば、ステアリルトリエタノールアミン、ラウリル硫酸ナトリウム、ラウリルアミノプロピオン酸、レシチン、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、モノステアリン酸グリセリンなどの界面活性剤；例えば、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、カルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、ヒドロキシメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロースなどの親水性高分子などが挙げられる。等張化剤としては、例えば、ブドウ糖、Ｄ−ソルビトール、塩化ナトリウム、グリセリン、Ｄ−マンニトールなどが挙げられる。緩衝剤としては、例えば、リン酸塩、酢酸塩、炭酸塩、クエン酸塩などの緩衝液などが挙げられる。無痛化剤としては、例えば、ベンジルアルコールなどが挙げられる。防腐剤としては、例えば、パラヒドロキシ安息香酸エステル類、クロロブタノール、ベンジルアルコール、フェネチルアルコール、デヒドロ酢酸、ソルビン酸などが挙げられる。抗酸化剤としては、例えば、亜硫酸塩、アスコルビン酸、α−トコフェロールなどが挙げられる。着色剤としては、例えば、水溶性食用タール色素（例：食用赤色２号及び３号、食用黄色４号及び５号、食用青色１号及び２号などの食用色素）、水不溶性レーキ色素（例：前記水溶性食用タール色素のアルミニウム塩）、天然色素（例：β−カロチン、クロロフィル、ベンガラ）などが挙げられる。甘味剤としては、例えば、サッカリンナトリウム、グリチルリチン酸二カリウム、アスパルテーム、ステビアなどが挙げられる。
【００４２】
薬理学的に許容される担体としては、点眼剤または眼軟膏剤における、安定剤、溶解補助剤、懸濁化剤、乳化剤、等張化剤、緩衝剤、粘稠剤、保存剤、ｐＨ調整剤、清涼化剤、軟膏基剤などの添加物を用いることもできる。
【００４３】
安定剤としては、例えば、亜硫酸水素ナトリウム、チオ硫酸ナトリウム、エデト酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム、アスコルビン酸、ジブチルヒドロキシトルエンなどが挙げられる。溶解補助剤としては、例えば、グリセリン、プロピレングリコール、マクロゴール、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油などが挙げられる。懸濁化剤としては、例えば、ポリビニルピロリドン、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウムなどが挙げられる。乳化剤としては、例えば、ポリビニルピロリドン、大豆レシチン、卵黄レシチン、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油、ポリソルベート８０などが挙げられる。等張化剤としては、例えば、塩化ナトリウム、塩化カリウム、グリセリン、マンニトール、ソルビトール、ホウ酸、ブドウ糖、プロピレングリコールなどが挙げられる。緩衝剤としては、例えば、リン酸緩衝液、酢酸緩衝液、ホウ酸緩衝液、炭酸緩衝液、クエン酸緩衝液、トリス緩衝液、グルタミン酸、イプシロンアミノカプロン酸などが挙げられる。粘稠剤としては、例えば、メチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースなどの水溶性セルロース誘導体、コンドロイチン硫酸ナトリウム、ヒアルロン酸ナトリウム、カルボキシビニルポリマー、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、マクロゴールなどが挙げられる。保存剤としては、例えば、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、グルコン酸クロルヘキシジン、クロロブタノール、ベンジルアルコール、デヒドロ酢酸ナトリウム、パラオキシ安息香酸エステル類、エデト酸ナトリウム、ホウ酸などが挙げられる。ｐＨ調整剤としては、例えば、塩酸、水酸化ナトリウム、リン酸、酢酸などが挙げられる。清涼化剤としては、例えば、ｌ−メントール、ｄ−カンフル、ｄ−ボルネオール、ハッカ油などが挙げられる。軟膏基剤としては、例えば白色ワセリン、精製ラノリン、流動パラフィン、植物油（オリーブ油、椿油、落花生油など）などが挙げられる。
【００４４】
本発明にかかる網膜神経節細胞死抑制剤は、当該分野で公知の方法にしたがい、BMPRシグナル伝達阻害剤を単独で、あるいは薬理学的に許容される担体と混合して、製剤化することができる。製剤としては、点眼剤、眼軟膏、注射剤（例えば、硝子体内注射剤、結膜下注射剤、テノン嚢下注射剤、皮下注射剤、静脈内注射剤、筋肉内注射剤、腹腔内注射剤）液剤、乳剤、懸濁剤、錠剤（糖衣錠、フィルムコーティング錠、舌下錠、口腔内崩壊錠、バッカル錠）、丸剤、散剤、顆粒剤、カプセル剤、トローチ剤、シロップ剤、放出制御製剤、エアゾール剤、フィルム剤、点滴剤、経皮吸収型製剤、軟膏剤、ローション剤、貼付剤、坐剤（例えば、肛門坐剤、膣坐剤）、ペレット、経鼻剤、経肺剤（吸入剤）等が例示される。網膜神経節細胞死抑制剤は上記の製剤として、哺乳動物（好ましくは、ヒト）に対して、経口的又は非経口的（例えば、静脈内、筋肉内、皮下、臓器内、鼻腔内、皮内、眼局所投与（点眼投与、硝子体内投与、結膜下投与、テノン嚢下投与等）、脳内、直腸内、膣内、腹腔内、及び罹患部位）に安全に投与することができる。
【００４５】
点眼剤を製造する際には、塩化ナトリウム、濃グリセリン等の等張化剤、リン酸ナトリウム、酢酸ナトリウム等の緩衝化剤、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレート、ステアリン酸ポリオキシル４０、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油等の界面活性剤、クエン酸ナトリウム、エデト酸ナトリウム等の安定化剤、塩化ベンザルコニウム、パラベン等の防腐剤等を必要に応じて用い、調製することができる。点眼剤に用いる好ましい溶媒は精製水である。
【００４６】
眼軟膏を製造する際には、白色ワセリン、流動パラフィン等の汎用される基剤を用い、調製することができる。また、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、細粒剤、散剤等の経口剤は、乳糖、結晶セルロース、デンプン、植物油等の増量剤、ステアリン酸マグネシウム、タルク等の滑沢剤、ヒドロキシプロピルセルロース、ポリビニルピロリドン等の結合剤、カルボキシメチルセルロースカルシウム、低置換ヒドロキシプロピルメチルセルロース等の崩壊剤、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、マクロゴール、シリコン樹脂等のコ−ティング剤、ゼラチン皮膜等の皮膜剤などを必要に応じて加え、調製することができる。
【００４７】
経口剤を製造する際には、必要により、味のマスキング、腸溶性又は持続性を目的として、コーティングを行ってもよい。コーティング基剤としては、例えば、糖衣基剤、水溶性フィルムコーティング基剤、腸溶性フィルムコーティング基剤、徐放性フィルムコーティング基剤が挙げられる。
【００４８】
糖衣基剤としては、白糖が用いられ、さらに、タルク、沈降炭酸カルシウム、ゼラチン、アラビアゴム、プルラン、カルナバロウ等から選ばれる１種又は２種以上を併用してもよい。水溶性フィルムコーティング基剤としては、例えば、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、メチルヒドロキシエチルセルロース等のセルロース系高分子；ポリビニルアセタールジエチルアミノアセテート、アミノアルキルメタアクリレートコポリマーＥ〔オイドラギットＥ（商品名）〕、ポリビニルピロリドン等の合成高分子；プルラン等の多糖類が挙げられる。腸溶性フィルムコーティング基剤としては、例えば、ヒドロキシプロピルメチルセルロース  フタレート、ヒドロキシプロピルメチルセルロース  アセテートサクシネート、カルボキシメチルエチルセルロース、酢酸フタル酸セルロース等のセルロース系高分子；メタアクリル酸コポリマーＬ、メタアクリル酸コポリマーＬＤ、メタアクリル酸コポリマーＳ等のアクリル酸系高分子；セラック等の天然物が挙げられる。徐放性フィルムコーティング基剤としては、例えば、エチルセルロース等のセルロース系高分子；アミノアルキルメタアクリレートコポリマーＲＳ、アクリル酸エチル−メタクリル酸メチル共重合体懸濁液等のアクリル酸系高分子が挙げられる。コーティング基剤は、2種以上を適宜混合して用いてもよい。また、コーティングの際に、例えば、酸化チタン、三二酸化鉄等のような遮光剤を配合してもよい。
【００４９】
本発明の網膜神経節細胞死抑制剤の被験体への投与経路は特に限定されないが、非経口投与が好ましく、具体的には、眼局所投与、注射投与、経鼻投与、経肺投与、経皮投与、経粘膜投与などが挙げられる。眼局所投与用剤形としては、例えば、点眼剤や眼軟膏剤があげられる。注射投与としては、硝子体内注射、結膜下注射、テノン嚢下注射、静脈内注射、筋肉内注射、腹腔内注射、皮下注射が例示できる。投与方法は、被験体(例えば患者)の年齢、症状により適宜選択することができる。
【００５０】
本発明の網膜神経節細胞死抑制剤の投与量は、有効成分であるBMPRシグナル伝達阻害剤が有効量で投与される量であればよい。BMPRシグナル伝達阻害剤の有効量は、その使用目的、投与経路等によって適宜決定されるが、目的とする最適な応答（例えば、治療応答）をもたらすように調整される。本発明において有効成分の投与量は、対象となる疾患、投与ルートにより異なり、一概には言えないが、効果を発揮させる標的組織中、すなわち網膜組織中の有効成分の濃度が、0.01μM〜1000μM、好ましくは0.1μM〜100μM、より好ましくは1μM〜10μMとなるように設定することができる。例えば、有効成分を被験体に点眼する場合には、有効成分を0.001〜20w/v%、好ましくは0.1〜10w/v%、より好ましくは1〜5w/v%で含有する薬剤を、1回約20〜約50μL、1日あたり1〜8回、好ましくは1〜5回投与してもよい。例えば、有効成分を被験体に硝子体内投与する場合には、1回あたり、0.01ng〜100mg、好ましくは0.01ng〜50mg、より好ましくは0.1ng〜10mg、さらにより好ましくは1μg〜30μgの有効成分を、7日間〜2か月に1回投与してもよい。あるいは、有効成分を被験体に経口投与する場合には、1回あたり、10ng〜1000mg、好ましくは100ng〜500mg、より好ましくは1mg〜200mgの有効成分を、1日あたり1〜6回、好ましくは1〜3回投与してもよい。
【００５１】
被験体は、哺乳動物（例えば、ヒト、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、ネコ、イヌ、ウシ、ヒツジ、サル等）があげられ、好ましくは霊長類、より好ましくはヒトである。
【００５２】
１つの実施形態では、有効量のBMPRシグナル伝達阻害剤を、網膜神経節細胞死の抑制を必要とする被験体に投与することにより、網膜神経節細胞死を抑制する。BMPRシグナル伝達阻害剤の投与経路、及び投与量等は、網膜神経節細胞死抑制剤と同様である。BMPRシグナル伝達阻害剤は、薬理学的に許容される担体と製剤化して、投与してもよい。薬理学的に許容される担体、製剤化については、網膜神経節細胞死抑制剤と同様である。
【００５３】
１つの実施形態では、有効量のBMPRシグナル伝達阻害剤の存在下で、網膜神経節細胞を培養する工程により、網膜神経節細胞死を抑制することができる。網膜神経節細胞は、生体から単離したものでも培養したものであってもよい。また網膜神経節細胞は、網膜神経節細胞を含む細胞群や組織であってもよく、当該細胞群や組織としては、視神経細胞や網膜神経細胞、網膜神経、網膜組織等が例示される。
【００５４】
網膜神経節細胞を培養する工程において、BMPRシグナル伝達阻害剤を有効量で培養液中に存在させることができる。BMPRシグナル伝達阻害剤を培養液に含有させて使用する場合には、0.01μM〜1000μM、好ましくは0.1μM〜100μM、より好ましくは1μM〜10μMで、BMPRシグナル伝達阻害剤を培養液に含有させて用いてもよい。
【００５５】
３．網膜神経保護
本発明の網膜神経節細胞死抑制剤は、網膜神経節細胞の細胞死を抑制することで、網膜の神経保護薬として利用できる。また本発明は、BMPRシグナル伝達阻害剤を含む、網膜神経保護薬を提供する。さらに本発明は、（ａ）有効量のBMPRシグナル伝達阻害剤を、該網膜神経保護を必要とする被験体に投与する工程；又は、（ｂ）有効量のBMPRシグナル伝達阻害剤の存在下で、網膜神経を培養する工程を含む、網膜神経を保護する方法を提供する。あるいは、本発明は、網膜神経の保護に使用するための、BMPRシグナル伝達阻害剤を提供する。
【００５６】
網膜の神経保護薬は、BMPRシグナル伝達阻害剤を有効成分として、BMPRからのシグナル伝達を阻害することで網膜の神経保護作用を発揮する。ヒトの網膜には120万〜150万の神経節細胞、約１億の視細胞が存在するため、１つの神経節細胞は数千の視細胞から情報を受け取り、これを電気信号に変えて、脳に伝達する。網膜神経節細胞の変性や細胞死は失明につながるが、現在これに対する確立された治療法はない。本発明の神経保護薬は、従来の神経保護薬とは異なる作用機序で、電気信号の脳への伝達に関与する網膜神経細胞を保護（特に網膜神経節細胞の細胞死を抑制）し、神経保護効果を発揮するため、従来治療困難であった眼疾患への適用が期待でき、また従来治療方法が公知であった眼疾患においても優れた効果が期待できる。また本明細書において、網膜の神経保護とは、何らかの原因により生じる網膜神経細胞死及び／又は網膜神経細胞の機能低下を抑制することを意味するだけではなく、将来的に生じうる網膜神経細胞死及び／又は網膜神経細胞の機能低下を予防することをも意味する。
【００５７】
本発明の網膜の神経保護薬は、BMPRシグナル伝達阻害剤のほか、薬理学的に許容される担体を含んでいてもよい。薬理学的に許容される担体の具体例は、網膜神経節細胞死抑制剤について記載したとおりである。
【００５８】
本発明の神経保護薬は、当該分野で公知の方法にしたがい、BMPRシグナル伝達阻害剤を単独で、あるいは薬理学的に許容される担体と混合して製剤化することができる。薬理学的に許容される担体、製剤化、製剤の種類、投与経路、及び投与量等の具体例は、網膜神経節細胞死抑制剤について記載したとおりである。
【００５９】
１つの実施形態では、有効量のBMPRシグナル伝達阻害剤を、網膜の神経保護を必要とする被験体に投与することにより、網膜の神経を保護する。BMPRシグナル伝達阻害剤の投与経路、及び投与量等は、網膜神経節細胞死抑制剤と同様である。BMPRシグナル伝達阻害剤は、薬理学的に許容される担体と製剤化して、投与してもよい。薬理学的に許容される担体、製剤化については、網膜神経節細胞死抑制剤と同様である。
【００６０】
１つの実施形態では、有効量のBMPRシグナル伝達阻害剤の存在下で、網膜神経を培養する工程により、網膜神経を保護することができる。網膜神経は、網膜神経節細胞を含むものであればよい。
【００６１】
網膜神経を培養する工程において、BMPRシグナル伝達阻害剤を有効量で培養液中に存在させることができる。BMPRシグナル伝達阻害剤を培養液に含有させて使用する場合には、0.01μM〜1000μM、好ましくは0.1μM〜100μM、より好ましくは1μM〜10μMで、BMPRシグナル伝達阻害剤を培養液に含有させて用いてもよい。
【００６２】
４．網膜神経節細胞死が関連する疾患の予防又は治療
本発明の網膜神経節細胞死阻害剤や網膜神経保護薬は、網膜神経節細胞死が関連する疾患を予防又は治療するための医薬組成物に利用することができる。また本発明は、BMPRシグナル伝達阻害剤を含む、網膜神経節細胞死が関連する疾患を予防又は治療するための薬剤を提供する。さらに本発明は、有効量のBMPRシグナル伝達阻害剤を、該予防又は治療を必要とする被験体に投与する工程を含む、網膜神経節細胞死が関連する疾患を予防又は治療する方法を提供する。あるいは、本発明は、網膜神経節細胞死が関連する疾患を予防又は治療に使用するための、BMPRシグナル伝達阻害剤を提供する。
【００６３】
網膜神経節細胞死が関連する疾患とは、網膜神経節細胞の細胞死を原因とする疾患、あるいは網膜神経節の細胞死、あるいは網膜神経節細胞の障害を病態とするあらゆる疾患(特に眼疾患)が含まれ、例えば、緑内障、糖尿病性網膜症、網膜血管閉塞症（網膜動脈閉塞症又は網膜静脈閉塞症を含む）、虚血性視神経症、レーベル病、脈絡膜血管新生を伴う疾患、網膜色素変性症、優性遺伝性視神経萎縮症、視神経炎、無虹彩症などを挙げることができる。
【００６４】
「緑内障」
緑内障は、視神経と視野に特徴的変化を伴う進行性の疾患で、網膜神経節細胞死が原因のひとつと考えられている。網膜神経節細胞死の原因としては眼圧の上昇による細胞内での栄養枯渇（虚血）や酸化ストレス等が挙げられる。そのため、網膜神経節細胞保護は、緑内障の治療に有用である（Liu et al., Invest Ophthalmol Vis Sci. 2017 Oct 1;58(12):5129-5141）。
【００６５】
「糖尿病性網膜症」
糖尿病性網膜症は、糖尿病の合併症として生じる網膜障害である。糖尿病により高血糖状態が続くことで、網膜の血管が損傷や変性を受け、虚血や酸欠状態に陥る。糖尿病性網膜症では、低酸素症、興奮毒性及び酸化的ストレス誘発網膜神経節細胞の細胞死などの有害要因が発症に関与することが知られている（Xiao A et al., Exp Ther Med. 2017 Jun;13(6):3360-3368）。
【００６６】
「虚血性視神経症」
虚血性視神経症は、視神経の栄養を与える血管に循環障害を生じる疾患である。酸化ストレスによる網膜虚血がもたらす網膜神経節細胞死が虚血性視神経症の一般的な病理である（Kapupara K et al., Cell Death Dis. 2017 Nov 16;8(11)）。
【００６７】
「網膜血管閉塞症」
網膜血管閉塞は、網膜の血管が詰まり、細胞への血流が途絶えてしまう疾患であり、網膜動脈閉塞症と網膜静脈閉塞症を含む。血流の閉塞（虚血）により、網膜細胞の栄養枯渇と酸欠を生じ、細胞死をもたらす。膜血管（動脈又は静脈）閉塞においても、酸化ストレスによる網膜虚血がもたらす網膜神経節細胞死が一般的病理である（前掲Kapupara K et al.）。
【００６８】
「レーベル病」
レーベル病（レーベル遺伝性視神経症）は、遺伝性視神経症の一つであり、エネルギー産生を行うミトコンドリアの遺伝子の異常を病因とする疾患である。遺伝子変異により、網膜神経節細胞のアポトーシスに至ると考えられており、発症には酸化ストレスが関与していると予想されている（Guy J, et al., Invest Ophthalmol Vis Sci. 2014 Feb 10;55(2):841-8.）。
【００６９】
「優性遺伝性視神経萎縮症」
優性遺伝性視神経萎縮症は、レーベル病と同様に遺伝性視神経症の一つである。常染色体優性形式で遺伝し、網膜神経節細胞の変性を病態とする。本疾患にはOPA1遺伝子変異が関連すると考えられており、OPA1遺伝子導入による網膜神経節細胞の喪失予防が治療手段となり得ることが報告されている（Sarzi E, et al., Sci Rep. 2018 Feb 6;8(1):2468）。
【００７０】
「視神経炎」
視神経炎は、視神経におこる炎症によって、視力低下や視野障害をきたす疾患であり、網膜神経節細胞のアポトーシスを含む視神経の喪失が生じる（Khan RS, Invest Ophthalmol Vis Sci. 2014 Aug 19;55(9):5744-51）。
【００７１】
「無虹彩症」
無虹彩症は虹彩が先天的に形成されない状態であり、PAX6遺伝子の異常が原因である。無虹彩症では、しばしば緑内障の合併を伴うため、網膜神経節細胞のアポトーシスを含む視神経障害が生じる（W M Grant and D S Walton, Trans Am Ophthalmol Soc. 1974; 72: 207-228.）
【００７２】
「網膜色素変性症」
網膜は光を感じる組織であり、網膜に光が当たると電気的な信号が生じて、視神経を通して、信号が脳に伝達される。網膜色素変性は、網膜に異常がみられる遺伝性の病気であり、夜盲、視野狭窄、視力低下が特徴的な症状として知られている。網膜神経保護薬は網膜色素変性症の進行を遅らせることができると考えられ、開発が期待されている。
【００７３】
「脈絡膜血管新生を伴う疾患」
脈絡膜血管新生とは、脈絡膜の血管が異所性に増殖することをいい、未熟な血管網からの出血や脂肪を含んだ血漿成分の漏出が網膜神経の機能を急速に低下させる原因となることが知られている。脈絡膜血管新生を伴う疾患としては、近視性脈絡膜血管新生、特発性脈絡膜血管新生、後眼部ぶどう膜炎、外傷性脈絡膜破裂、網膜色素線条等が挙げられる。近視性脈絡膜血管新生は、病的近視を有する人の視力低下原因として最も多い疾患である。
【００７４】
５．網膜神経節細胞死が関連する疾患を予防又は治療するための医薬組成物
網膜神経節細胞死が関連する疾患を予防又は治療するための医薬組成物（以下、「本発明の医薬組成物」という）は、網膜神経節細胞死抑制剤と同様に、BMPRシグナル伝達阻害剤を有効成分として含み、BMPRシグナル伝達を阻害することで網膜神経節細胞死に関連した疾患を予防又は治療する。BMPRシグナル伝達阻害剤は、好ましくはI型受容体シグナル伝達阻害剤であり、より好ましくはALK3シグナル伝達阻害剤である。
【００７５】
本発明の医薬組成物は、BMPRシグナル伝達阻害剤のほか、薬理学的に許容される担体を含んでいてもよい。薬理学的に許容される担体の具体例は、網膜神経節細胞死抑制剤について記載したとおりである。
【００７６】
本発明の医薬組成物は、当該分野で公知の方法にしたがい、BMPRシグナル伝達阻害剤を単独で、あるいは薬理学的に許容される担体と混合して製剤化することができる。製剤化、薬理学的に許容される担体、製剤の種類、投与経路、及び投与量等の具体例は、網膜神経節細胞死抑制剤について記載したとおりである。
【００７７】
本発明に係る医薬組成物は、他の医薬と併用して使用することができる。併用し得る薬物（以下、併用薬物と略記する場合がある）としては、例えば、抗緑内障薬、抗肥満剤、糖尿病治療剤、糖尿病性合併症治療剤、降圧剤、利尿剤、高脂血症治療剤、化学療法剤、免疫療法剤、抗炎症薬、抗血栓剤、骨粗鬆症治療剤、ビタミン薬、抗痴呆薬、頻尿又は尿失禁治療薬、排尿困難治療剤などが挙げられる。
【００７８】
１つの実施形態では、有効量のBMPRシグナル伝達阻害剤を、網膜神経節細胞死が関連する疾患の予防又は治療を必要とする被験体に投与することにより、網膜神経節細胞死が関連する疾患を予防又は治療する。BMPRシグナル伝達阻害剤の投与経路、及び投与量等は、網膜神経節細胞死抑制剤と同様である。BMPRシグナル伝達阻害剤は、薬理学的に許容される担体と製剤化して、投与してもよい。薬理学的に許容される担体、製剤化については、網膜神経節細胞死抑制剤と同様である。
【００７９】
６．再生医療への利用
近年眼疾患の治療においても再生医療が注目されている。例えば、視神経又は網膜神経節細胞から作製された再生医療材料により、眼疾患を治療することが検討されている。本発明の網膜神経節細胞死抑制剤は、再生医療材料の製造や保管、当該材料を用いた治療における視神経細胞移植用補助剤あるいは再生医療用補助剤として用いることができる。より詳細には、本発明の網膜神経節細胞死抑制剤を、細胞製剤または細胞シート等の再生医療材料の製造工程や移植前の維持工程において、培地に添加して用いることができる。本発明は、本発明の網膜神経節細胞死抑制剤又は網膜の神経保護薬を含む視神経細胞移植用補助剤あるいは再生医療用補助剤を培地に添加して、視神経細胞を培養することを含む、視神経細胞の培養方法も提供する。
【００８０】
本発明の上記視神経細胞移植用補助剤あるいは再生医療用補助剤は、細胞製剤に含まれていてもよい。本発明は当該細胞製剤を包含する。細胞製剤は、移植用の視神経細胞など、網膜神経節細胞を含んでいればよい。当該細胞は、培養後の培養物であってもよい。本発明の網膜神経節細胞死抑制剤を添加することにより、網膜神経節細胞の細胞死が抑制され、効果的な組織再生を可能にする。本発明の視神経細胞移植用補助剤あるいは再生医療用補助剤は、必要により患部への接触を促進または補助するための物質を含むこともでき、例えば、そのような物質としては、マトリゲルTM等の細胞外マトリックス、コラーゲン、フィブロネクチン、ビトロネクチン、レトロネクチン、ラミニン、カドヘリン、インテグリン、セレクチン、RGDペプチドに代表される細胞接着ペプチドを挙げることができる。本発明の細胞製剤は、例えば注射剤や注入剤などの剤形に製剤化し、網膜内に局所投与する方法などにより投与できる。
【００８１】
本発明の上記細胞製剤の形態や形状は特に限定されず、網膜神経節細胞を重層して作製した細胞シートであってもよい。細胞シートの一態様としては、例えば軸索が伸長した網膜神経節細胞により形成された細胞層を有しており、細胞間相互作用が保持されているものが挙げられる。かかる細胞シートは、網膜神経節細胞の培養物のまま、直接患部に移植することができる。
【実施例】
【００８２】
以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。【００８３】
網膜神経節細胞に酸化ストレスを付与した細胞培養系は、細胞障害のモデルと考えられており、神経保護効果の確認に一般的に用いられている。ビタミンKの一種であるメナジオンは，酸化ストレスによる障害発生モデルを誘導できることが知られていることから、以下の本実施例では、メナジオンを用いて細胞障害モデルを誘導した（Invest Ophthalmol Vis Sci. 2006 Apr;47(4):1477-85、J Neurochem. 2010 Jul;114(2):488-98  (doi: 10.1111/j.1471-4159.2010.06781.x.)、J Ophthalmol. 2017;2017:7598140（doi: 10.1155/2017/7598140））。【００８４】
［実施例１］
本実施例では、網膜神経節細胞においてBMPR（特にALK3）を特異的に阻害することにより、BMPRからのシグナル伝達、特にALK3からのシグナル伝達を阻害することによる神経保護効果を確認した。また陰性対照として、ALK4を特異的に阻害した場合の神経保護効果を確認した。ALK4は、ALK3と同じALKファミリーに属するが、BMPRシグナル伝達系ではなく、Activinをリガンドとしてシグナル伝達を制御するものである。【００８５】
１．方法
(1)ラット網膜神経節細胞の単離
7日齢 SDラット（日本SLC株式会社、１３匹）から網膜を取り出し、Dissociation Kit-Postnatal Neurons（ミルテニーバイオテク）によって網膜細胞を分散した。その後、Retinal Ganglion Cell Isolation Kits（ミルテニーバイオテク）を使用し、他の視細胞から網膜神経節細胞（RGC）を単離した。【００８６】
(2)メナジオン、抗体処理
網膜神経節細胞をRGC培養用培地に懸濁し、96ウェルプレートに2 x 104 cell播種し、37℃、5％ CO2下で24時間培養した。24時間後培地を取り除き、メナジオン反応用培地に、後述するそれぞれの群構成に合わせて6μMメナジオン、Normal rabbit IgG（サンタクルズ）、抗ALK3抗体（Anti-BMPR1A antibody、アブカム）、抗ALK4抗体（抗Activin A Receptor Type IB抗体、アブカム）、ALK3阻害剤のK02288（Tocris Bioscience）（PLOS ONE 2013 8(4) e62721）をそれぞれ添加し、37℃で18時間インキュベートした。その後、LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit（サーモフィッシャー）を用いて生細胞と死細胞を染色し、IncuCyte S3 生細胞解析システム（エッセンバイオサイエンス）によって1ウェル3枚ずつ写真を取得し解析を行った。データは生細胞数と死細胞数を合わせた全細胞数に対する生細胞数の割合で算出した。なお、使用したRGC培養用培地とメナジオン反応用培地は以下の通りである。【００８７】
RGC培養用培地：
Neurobasal medium（サーモフィッシャー）に、NeuroBrew-21 supplement（ミルテニーバイオテク）、50ng/mL BDNF（ミルテニーバイオテク）、50ng/mL CNTF（ペプロテック）、5μM Forskolin（シグマ）、GlutaMAXTM（サーモフィッシャー）、PrimocinTM（インビボジェン）を添加した培地。【００８８】
メナジオン反応用培地：
Neurobasal medium（サーモフィッシャー）にNeuroBrew-21 supplement（ミルテニーバイオテク）、GlutaMAXTM（サーモフィッシャー）、及びPrimocinTM（インビボジェン）を添加した培地。【００８９】
群構成（各群n=3）
対照群：メナジオン添加なし、Normal rabbit IgG添加
Normal IgG処理群：メナジオン及びNormal rabbit IgG添加
抗ALK3抗体処理群：メナジオン及び抗ALK3抗体添加
抗ALK4抗体処理群：メナジオン及び抗ALK4抗体添加
K02288処理群：メナジオン及びK02288添加【００９０】
(3)抗体の特異性
7日齢 SDラット（日本SLC株式会社、１匹）から網膜を取り出し、Subcellular Protein Fractionation Kit (サーモフィッシャー)を用いて膜画分を抽出した。その後PNGase F（ニューイングランドバイオラボ）処理にて糖鎖を切断して得たサンプルをウエスタンブロットに供した。タンパク質が等量となるように、サンプルをSDS-PAGEにアプライした。SDS-PAGEにて分離したタンパク質をPVDF膜に転写後、抗ALK3抗体のみ、抗ALK3抗体及び抗ALK3抗体の2倍量のALK3（BMPR1A）ペプチド（アブノバ）、抗ALK4抗体のみ、又は抗ALK4抗体及び抗ALK4抗体の2倍量のALK4（ACVR1B）ペプチド（アブノバ）で反応させた。抗ALK3抗体とALK3ペプチド、又は抗ALK4抗体とALK4ペプチドは、予め混合して、３７℃で１時間反応させた後、反応後の混合物をタンパク質転写後のPVDF膜と反応させた。その後、2次抗体として抗rabbit HRP抗体（GEヘルスケア）で染色し、ImageQuant LAS4000 (GEヘルスケア)で染色結果を撮影した。【００９１】
２．結果
メナジオン処理によってNormal IgG群では有意に細胞死が起こっていたが、抗ALK3抗体群及びALK阻害剤であるK02288では細胞死が有意に抑制された。一方、同じTGFβスーパーファミリー受容体であるALK4に対する抗ALK4抗体では細胞死は抑制されなかった（図１Ｃ）。【００９２】
なお、図１Ａ及び１Ｂに示されるとおり抗ALK3抗体、抗ALK4抗体いずれも、単独の場合には濃いバンドができ、一方、抗体にそれぞれのペプチドを添加した場合にはバンドが薄くなっていた。使用した抗ALK3抗体、抗ALK4抗体は、網膜組織中のALK3、ALK4とそれぞれ反応し、抗原であるALK3ペプチド、ALK4ペプチドにより網膜組織中のALK3、ALK4との反応がブロックされることから、それぞれALK3、ALK4に特異的に結合していることが確認された（図１Ａ及び１Ｂ）。【００９３】
使用した抗ALK3抗体は、ALK3に特異的な反応性を有するものである。したがって、抗ALK3抗体による細胞死抑制効果はALK3特異的なものと考えられる。【００９４】
［実施例２］
実施例１において、BMPRからのシグナル伝達、特にALK3からのシグナル伝達を阻害することによる網膜神経節細胞の神経保護効果が確認された。本実施例２では、ALK3阻害剤である低分子化合物を用いた場合の網膜神経節細胞の神経保護効果を確認した。【００９５】
１．方法
(1)ラット網膜神経節細胞の単離
実施例１と同様の方法でラット網膜神経節細胞を単離した。K02288処理の実験系（図２Ａ）にはラット３匹、LDN-193189処理の実験系（図２Ｂ）にはラット２匹を用いた。【００９６】
(2)網膜神経節細胞死測定
網膜神経節細胞をRGC培養用培地に懸濁し、96ウェルプレートに1 x 104 cell播種し、37℃、5％ CO2下で24時間培養した。24時間後培地を取り除き、メナジオン反応用培地に群構成に合わせて6μMメナジオン、ALK3阻害剤であるK02288（Tocris Bioscience）、LDN-193189（MedChemExpress）（PLOS ONE 2013 8(4) e62721）を添加した。K02288無処置群又はLDN-193189無処置群にはDMSOを添加した（メナジオン単独処理群）。37℃で18時間インキュベート後、LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit（サーモフィッシャー）により染色し、IncuCyte S3 生細胞解析システム（エッセンバイオサイエンス）によって1ウェル3枚ずつ写真を取得し解析を行った。データは生細胞数と死細胞数を合わせた全細胞数に対する生細胞数の割合をメナジオン単独処理群に対する比で算出した。RGC培養用培地とメナジオン反応用培地は、実施例１で使用した培地と同じものを使用した。【００９７】
群構成（K02288処理群n=8、LDN-193189処理群n=6）
対照群：メナジオン添加なし
メナジオン単独処理群：メナジオン及びDMSO添加
K02288処理群（100nM, 1μM, 10μMの３群）：メナジオン及びK02288添加
LDN-193189処理群（100nM, 1μMの２群）：メナジオン及びLDN-193189添加【００９８】
２．結果
1μM及び10μM K02288処理群はメナジオン単独処理群に対し有意に細胞死抑制効果を示した。また1μM LDN-193189処理群もメナジオン単独処理群に対し有意に細胞死抑制効果を示した（図２Ａ及び２Ｂ）。またK02288もLDN-193189も用量依存的な細胞死抑制効果を示した。メナジオンにより誘導される網膜神経節細胞死に対して、BMPR阻害剤（K002288、LDN-193189）が細胞保護効果を示すことが確認された。【００９９】
［実施例３］
本実施例は、網膜神経節細胞におけるBMPRリガンドの発現を確認すること、及び細胞障害モデルにおけるBMPRリガンドの発現を確認することを目的として行った。また本実施例では、網膜神経節細胞におけるBMPRリガンドが結合する、TGFβスーパーファミリーの受容体の発現の確認も行った。【０１００】
１．方法
(1)ラット網膜神経節細胞の単離
実施例１と同様の方法でラット網膜神経節細胞を単離した。なお、TGFβスーパーファミリーの受容体の発現確認の実験系には、ラット１０匹、BMPRリガンドの発現確認の実験系には、ラット３０匹を使用した。【０１０１】
(2)メナジオン処理
網膜神経節細胞をRGC培養用培地に懸濁し、6ウェルプレートに2.83 x 105 cell播種し、24時間37℃、5％ CO2下で培養した。24時間後培地を取り除き、メナジオン反応用培地に6μMメナジオンを入れたものに入れ替えて37℃で0時間又は6時間インキュベートした（n=2）。インキュベート後培地を取り除き、細胞を1mL のTrizol reagentに溶解しRNA抽出に供した。RGC培養用培地とメナジオン反応用培地は、実施例１で使用した培地と同じものを使用した。【０１０２】
(3)RNA抽出
RNeasy Mini Kit（キアゲン）をマニュアルに従って使用し、RNAを抽出した。RNA抽出後、Superscript II逆転写酵素（サーモフィッシャー）により逆転写を行い、cDNAを作製した。【０１０３】
(4)リアルタイムqPCR
cDNAに各TaqMan probeとTaqMan Master Mixを混合し、7500 PCR systems（アプライドバイオシステムズ）を用いてqPCR解析を実施した。各ターゲット毎に検量線を引いてコピー数を求め、GAPDHの測定値により補正して発現量を算出した。リガンドに関しては、メナジオン処理0時間のコピー数に対する、メナジオン処理6時間後のコピー数の割合を算出した。同じ実験を2度行い、再現性を確認した。
TaqMan probe（受容体）：ALK4、Bmpr2、Acvr2a、Acvr2b、ALK2、ALK3、ALK6、ALK7
TaqMan probe（リガンド）：Inhba, Tgfb2, Tgfb1, Gdf5, Bmp7, Bmp4, Bmp2, Gapdh【０１０４】
２．結果
メナジオン未添加状態での網膜神経節細胞では各種TGFβスーパーファミリー受容体のmRNAの発現が確認された（図３）。【０１０５】
メナジオン添加6時間後に網膜神経節細胞中におけるBMP4の発現が2倍以上に増加していた（図４）。BMP4以外のTGFβスーパーファミリーリガンドのTGFβ1、TGFβ2、BMP2、BMP7、InhibinβA、GDF5も網膜神経節細胞で発現が確認されたが、メナジオン存在下で特にBMP4が顕著に増加していることが確認された。上記結果から、メナジオンによる網膜神経節細胞の細胞死誘導に、特にBMP4が関連していると考えられた。【０１０６】
（総括）
実施例３より、メナジオンによる酸化ストレス下の網膜神経節細胞では、特にBMP4の発現量に顕著な増加が確認された。さらに実施例１により、ALK3の細胞外認識抗体によってALK3の機能を特異的に阻害することにより、酸化ストレスによる細胞死が抑制されることが確認された。また実施例１及び２により、抗体以外のALK3阻害剤によっても酸化ストレスによる誘導細胞死が抑制された。以上のことから、BMPRからのシグナル伝達、特にALK3からのシグナル伝達の阻害は網膜神経節細胞死の抑制に重要な機能を有し、網膜神経保護薬開発の新たな標的となりうることが確認された。
【産業上の利用可能性】
【０１０７】
本発明のBMPRシグナル伝達阻害剤は、緑内障、糖尿病性網膜症、網膜血管閉塞症などの網膜神経節細胞死に関連した疾患の治療に有用である。【０１０８】
本明細書中で引用した全ての刊行物、特許及び特許出願をそのまま参考として本明細書中にとり入れるものとする。
【図１】
2020090705.tif 000003
【図２】
2020090705.tif 000004
【図３】
2020090705.tif 000005
【図４】
2020090705.tif 000006
【国際調査報告】
2020090705.tif 000007
2020090705.tif 000008
2020090705.tif 000009
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