(57)【要約】【課題】高次構造を有するウイルス構造タンパク質を作出するためのＣＨＯ細胞株を提供する。【解決手段】本発明は、高次構造を有するウイルス構造タンパク質を作出するためのＣＨＯ細胞株であって、該構造タンパク質をコードする遺伝子ならびに該遺伝子と操作可能に連結したプロモーターを含む発現ベクターを導入した、ＣＨＯ細胞株を提供する。 【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
高次構造を有するウイルス構造タンパク質を作出するためのＣＨＯ細胞株であって、該構造タンパク質をコードする遺伝子ならびに該遺伝子と操作可能に連結したプロモーターを含む発現ベクターを導入した、ＣＨＯ細胞株。
【請求項２】
前記高次構造を有するウイルス構造タンパク質がウイルス様粒子であることを特徴とする、請求項１に記載のＣＨＯ細胞株。
【請求項３】
前記構造タンパク質をコードする遺伝子が、哺乳類に感染するウイルスに由来する遺伝子であることを特徴とする、請求項１または２に記載のＣＨＯ細胞株。
【請求項４】
前記哺乳類に感染するウイルスがノンエンベロープウイルスであることを特徴とする、請求項３に記載のＣＨＯ細胞株。
【請求項５】
前記ノンエンベロープウイルスがパルボウイルスまたはピコルナウイルスであることを特徴とする、請求項４に記載のＣＨＯ細胞株。
【請求項６】
前記ピコルナウイルスがエンテロウイルスＡ〜Ｄ群であることを特徴とする、請求項５に記載のＣＨＯ細胞株。
【請求項７】
前記エンテロウイルスＡ〜Ｄ群がエンテロウイルスＡ群であることを特徴とする、請求項６に記載のＣＨＯ細胞株。
【請求項８】
前記エンテロウイルスＡ群が、エンテロウイルス７１、コクサッキーウイルスＡ６、コクサッキーウイルスＡ１０またはコクサッキーウイルスＡ１６であることを特徴とする、請求項７に記載のＣＨＯ細胞株。
【請求項９】
さらに非構造タンパク質をコードする遺伝子を含むことを特徴とする、請求項１に記載のＣＨＯ細胞株。
【請求項１０】
ウイルスが複雑なプロセシング過程が望まれるウイルス種であることを特徴とする、請求項９に記載のＣＨＯ細胞株。
【請求項１１】
前記非構造タンパク質をコードする遺伝子が、ウイルス由来のプロテアーゼであることを特徴とする、請求項９または１０に記載のＣＨＯ細胞株。
【請求項１２】
前記プロテアーゼが、構造タンパク質を開裂して高次構造をもたらすものであることを特徴とする、請求項１１に記載のＣＨＯ細胞株。
【請求項１３】
前記プロテアーゼがエンドプロテアーゼであることを特徴とする、請求項１２に記載のＣＨＯ細胞株。
【請求項１４】
前記プロテアーゼが３ＣＤプロテアーゼ及び/又は３Ｃプロテアーゼであることを特徴とする、請求項１３に記載のＣＨＯ細胞株。
【請求項１５】
前記非構造タンパク質をコードする遺伝子が、前記構造タンパク質をコードする遺伝子を含む発現ベクターと同一の発現ベクター内にあって、かつ、前記非構造タンパク質をコードする遺伝子と操作可能に連結したプロモーターが、前記構造タンパク質をコードする遺伝子と操作可能に連結したプロモーターとは別に存在することを特徴とする、請求項９〜１４のいずれかに記載のＣＨＯ細胞株。
【請求項１６】
前記高次構造を有する構造タンパク質を一過的に発現することを特徴とする、請求項１〜１５のいずれかに記載のＣＨＯ細胞株。
【請求項１７】
前記高次構造を有する構造タンパク質を安定的に発現することを特徴とする、請求項１〜１５のいずれかに記載のＣＨＯ細胞株。
【請求項１８】
ＣＨＯ細胞がＣＨＯ−Ｋ１細胞、ＣＨＯ−Ｋ１ＳＶ細胞、ＣＨＯ−ＤＧ４４細胞またはＣＨＯ−Ｓ細胞であることを特徴とする、請求項１〜１７のいずれかに記載のＣＨＯ細胞株。
【請求項１９】
高次構造を有するウイルス構造タンパク質を作出する方法であって、請求項１〜１８のいずれかに記載のＣＨＯ細胞株を培養し、次いで培養物から構造タンパク質を単離および精製することを含む、構造タンパク質の作出方法。
【請求項２０】
前記高次構造を有するウイルス構造タンパク質が、自然発生的に形成されたウイルス様粒子であることを特徴とする、請求項１９に記載の構造タンパク質の作出方法。
【請求項２１】
前記高次構造を有するウイルス構造タンパク質が、プロテアーゼによる開裂によって形成されたウイルス様粒子であることを特徴とする、請求項１９に記載の構造タンパク質の作出方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ウイルスの構造タンパク質、とりわけウイルス様粒子を発現することができるＣＨＯ細胞株に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
ウイルス性疾患に対する予防法としてのワクチンの有効性は、ポリオウイルスやインフルエンザウイルスに対するワクチンなどの前例から、広く認められている。ワクチンの候補としては、一般的には、弱毒化株、全粒子を初めとする不活化ウイルス、ウイルス様粒子（Ｖｉｒｕｓ  Ｌｉｋｅ  Ｐａｒｔｉｃｌｅ、以下「ＶＬＰ」）、組換えタンパク質、組換えベクター及びペプチドなどが知られている。一方で、宿主の細胞や発育鶏卵において低い増殖性を示すウイルスのワクチンを製造する場合、ワクチンを安定供給するためにはＶＬＰがワクチン抗原の候補として望まれている。ＶＬＰは、ウイルスの一部、とりわけウイルスカプシドに由来する。カプシドは、カプソメアと呼ばれるタンパク質のサブユニットが集合して構成される構造タンパク質であり、ウイルスゲノムを取り囲んでウイルスの外殻を構成する。とりわけノンエンベロープウイルスにおいては、カプシドは、ウイルスの最外殻に存在するため、エピトープを含むことが多い。【０００３】
日本の抗体医薬などのバイオ医薬品の製造において、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、大腸菌、酵母、マウスミエローマ（ＮＳＯ）細胞、Ｖｅｒｏ細胞、ＭＤＣＫ細胞、ベビーハムスター腎臓（ＢＨＫ）細胞などが利用されている。とりわけＣＨＯ細胞は、２０１６年にはバイオ医薬品の約４０％で利用された発現系であり、多くの技術的な蓄積がなされている。【０００４】
例えば特許文献２は、ＣＨＯ細胞をＮＨＥＪタンパク質またはその機能的断片、またはそれらをコードするポリヌクレオチドでトランスフェクトすることによって、抗体などの発現効率が向上することを開示している。また、特許文献３は、ヒト凝固第Ｘ因子を発現するＣＨＯ細胞に、フューリンを発現させることで、活性なヒト凝固第Ｘ因子が得られることを開示している。さらに、特許文献４は、サイトメガロウイルス五量体の発現にはＨＥＫ２９３細胞よりもＣＨＯ細胞が好ましく、さらに宿主細胞に一箇所以上の追加の変異を加え、Ｃ１２ｏｒｆ３５タンパク質の発現レベルが低い場合にサイトメガロウイルス五量体の発現効率が改善することを開示している。【０００５】
細胞発現系によってウイルスの構造タンパク質を作出する試みは既になされてきたが、ＶＬＰのような複雑な高次構造を有するウイルス構造タンパク質の発現系が確立されているとは言い難い。特許文献１や特許文献５は、バキュロウイルスや昆虫細胞を用いた複合カプシドの発現系を開示しているが、当該発現系は安全性の問題から多くの課題を抱えている。また、非特許文献１は、ＶＬＰの有用性に理解を示しつつも、その作出、とりわけアセンブルが困難であることを開示している。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】特開２０１５−１７１３６３号公報
【特許文献２】特表２０１５−５３０１０３号公報
【特許文献３】特表２０１７−５２４３６６号公報
【特許文献４】特表２０１７−５３４２８３号公報
【特許文献５】特表２０１４−５３９４２８号公報
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ｋａｒｌ  Ｄ．  Ｂｒｕｎｅ，  ｅｔ  ａｌ，  Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，  Ｊｕｎｅ  ２０１８，  Ｖｏｌｕｍｅ  ９，  Ａｒｔｉｃｌｅ  １４３２
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、ウイルスの構造タンパク質を発現することができるＣＨＯ細胞株に関するものである。具体的には、本発明は、高次構造を有するウイルス構造タンパク質を作出するためのＣＨＯ細胞株であって、該構造タンパク質をコードする遺伝子ならびに該遺伝子と操作可能に連結したプロモーターを含む発現ベクターを導入した、ＣＨＯ細胞株を提供するものである。【０００９】
ＶＬＰなどのウイルス構造タンパク質は新たなワクチン抗原として期待されているが、構造の複雑さや安全性の要求の高さにより、ＶＬＰ作出技術は確立されているとは言い難い。本発明は、ワクチンとして利用可能なＶＬＰの作出技術の確立を課題とする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明者らは上記課題を解決するために鋭意検討を重ねた結果、ＶＬＰを作出可能な宿主細胞としてＣＨＯ細胞が適していることを見出した。ＣＨＯ細胞はバイオ医薬品の製造において最も利用される細胞系であるが、ＶＬＰのような高次構造を有するウイルス構造タンパク質の発現において使用された具体例ない。そこで、本発明者らは、ウイルス構造タンパク質をＣＨＯ細胞で発現させることができるのか、そして、ＣＨＯ細胞で発現させたウイルス構造タンパク質がワクチンとして利用可能であるかを検討した。【００１１】
本発明者らは、哺乳類に感染するウイルス、たとえばノンエンベロープウイルスであるピコルナウイルスやパルボウイルスのＶＬＰを発現するＣＨＯ細胞株を構築した。さらに、本発明者らは、ピコルナウイルスであるエンテロウイルス７１のＶＬＰを発現するＣＨＯ細胞株も構築した。これらの知見から、本発明者らは、ＣＨＯ細胞株が高次構造を有するウイルス構造タンパク質を発現することができると確信して、本発明をなした。【００１２】
以下に本発明の詳細な説明をするが、本明細書において用いられる用語は、微生物学、生化学、分子生物学、医学及び薬学分野における一般的な定義に従って理解される。ただし、本明細書において特に説明又は定義されている用語については、本明細書における説明又は定義が優先する。また、本明細書中に引用されている文献については、参照により本明細書の一部とする。【００１３】
第一の態様において、本発明は、高次構造を有するウイルス構造タンパク質を作出するためのＣＨＯ細胞株であって、該構造タンパク質をコードする遺伝子ならびに該遺伝子と操作可能に連結したプロモーターを含む発現ベクターを導入した、ＣＨＯ細胞株（以下、本発明のＣＨＯ細胞株）を提供する。【００１４】
ウイルスのカプシドはウイルスごとに定まった数のカプソマーが複合して形成され、カプソマーは構造タンパク質（例えばＶＰ０〜ＶＰ４のいずれか又は組み合わせ）がアセンブルしたプロトマーの集合体である。したがって、本発明において、用語「ウイルス構造タンパク質」は、ウイルスのカプシドの全部または一部に由来するタンパク質、たとえばＶＬＰ、カプソマー、プロトマー、またはプロトマーを形成するタンパク質（例えばＶＰ０〜ＶＰ４のいずれか１つ又は２つ以上の組み合わせ）、またはプロトマーを形成する個々のタンパク質の前駆体であるポリプロテインのすべてを意味する。本発明のウイルス構造タンパク質は、さらに糖鎖などの修飾を受けていてもよい。【００１５】
例えば、エンテロウイルスＡ群は、直径２０〜３０ｎｍのノンエンベロープウイルスカプシドの内部に約７．４ｋｂの一本鎖ＲＮＡが封入された構造を有しており、該カプシドは異なる構造タンパク質（ＶＰ１〜４）のコピー６０個からなる場合や、プロカプシドと呼ばれるＶＰ０、ＶＰ１およびＶＰ３の構造タンパク質のコピー６０個からなる場合がある。ポリプロテインであるＰ１が切断されたＶＰ１〜４の４つまたはＶＰ０、ＶＰ１およびＶＰ３の３つの構造タンパク質がアセンブルしてプロトマーを形成し、５つのプロトマーがアセンブルしてペンタマーを形成し、１２個のペンタマーがカプシドを構成する。本発明において、エンテロウイルスＡ群のウイルス構造タンパク質には、ポリプロテインであるＰ１、Ｐ１が切断されたＶＰ０、ＶＰ１、ＶＰ２、ＶＰ３およびＶＰ４から選択されるいずれか１個のタンパク質、あるいはＶＰ０〜４のいずれかの組み合わせ、例えばＶＰ１〜４の組み合わせまたはＶＰ０、ＶＰ１およびＶＰ３の組み合わせによって構成されるプロトマー、５つのプロトマーがアセンブルして形成されるペンタマーおよびペンタマー１２個が集合したカプシドまたはＶＬＰが含まれると理解される。【００１６】
例えば、ヒトに感染するヒトパルボウイルスであるパルボウイルスＢ１９は、直径２０〜２５ｎｍのノンエンベロープウイルスカプシドの内部に約５．６ｋｂの一本鎖ＤＮＡが封入された構造を有している。小型ＤＮＡウイルスであるパルボウイルス科ファミリーのエリスロウイルス属に属する。パルボウイルスＢ１９カプシドは、約８３ｋＤａの構造タンパク質であるＶＰ１と、約５８ｋＤａの構造タンパク質であるＶＰ２からなる。【００１７】
例えば、ノロウイルスは、カリシウイルスに分類され、非分節型ＲＮＡゲノムを含む直径２７〜４０ｎｍのノンエンベロープウイルスである。正二十面体で、９０個のカプソマーよりなり、各カプソマーは１種のポリペプチドの２量体である。ノロウイルスのカプシドはｓｈｅｌｌ  ｄｏｍａｉｎ（Ｓ）とｐｒｏｔｒｕｄｉｎｇ  ｄｏｍａｉｎ（Ｐ）に分けられ、ＰはＰ１とＰ２のｓｕｂｄｏｍａｉｎに分けられる。Ｐ２はウイルスの最表層に位置している。【００１８】
ウイルス構造タンパク質のアミノ酸配列及びそれらをコードする塩基配列は既知であり、ＤＮＡ  Ｄａｔａ  Ｂａｎｋ  ｏｆ  Ｊａｐａｎ（ＤＤＢＪ）、ＥＭＢＬ−Ｂａｎｋ／ＥＢＩ、ＧｅｎＢａｎｋ／Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（以下、ＮＣＢＩ）などのデータベースから容易に入手可能である。また、ウイルスのカプシドの構造については、ウイルスに関する概説書の他、各ウイルスの論文等から容易に入手可能である。【００１９】
本発明において、用語「由来の」とは、対象物が元のウイルスと免疫学的な相同性を有すること、又は元のウイルスの構造タンパク質のアミノ酸配列と一定の相同性を示すことを意味し、製造方法に縛られるものではないと理解すべきである。免疫学的な相同性とは、元のウイルスに対する免疫反応が対象物に対しても同様に惹起されることを示す。免疫学的な相同性を確認する方法は、当業者に利用可能なあらゆる手段であってよく、特に限定されない。一般的には、対象物が発現を誘導する抗体が元のウイルスを中和しうるかどうか、すなわち対象物が誘導する中和抗体価を測定することで確認することができる。例えばエンテロウイルスのカプシド「由来の」との記載は、エンテロウイルスに対する免疫反応が対象物に対しても同様に惹起されること、又はエンテロウイルスのカプシドのアミノ酸配列と一定の相同性、例えばエンテロウイルスとして微生物学上理解される程度の相同性を有することを意味する。アミノ酸配列と一定の相同性とは、典型的には８０％以上、好ましくは９０％以上、９５％以上、９６％以上、より好ましくは９７％以上、さらに好ましくは９８％以上、最適には９９％以上の相同性を有することを意味する。相同性の検定には当業者が通常利用可能なあらゆる検定方法を利用可能であるが、例えばＢＬＡＳＴを初期設定のパラメーターで用いることができる。【００２０】
一例をあげると、エンテロウイルス由来のＶＰ１であるといえるためには、まず、対象となっているポリペプチドのアミノ酸配列が、ＮＣＢＩから取得したいずれかのエンテロウイルスのＶＰ１のアミノ酸配列と初期設定パラメーターを用いたＢＬＡＳＴで一定の相同性、例えばエンテロウイルスとして微生物学上理解される程度の相同性を有することを意味し、典型的には８０％以上、好ましくは９０％以上、９５％以上、９６％以上、より好ましくは９７％以上、さらに好ましくは９８％以上、最適には９９％以上の相同性を有することを意味する。【００２１】
あるアミノ酸を、同様の疎水性指数を有する他のアミノ酸により置換して、そして依然として同様の生物学的機能を有するタンパク質（例えば、酵素活性において等価なタンパク質。以下、「生物学的等価体」）を生じさせ得ることは当該分野で周知である。このようなアミノ酸置換において、疎水性指数が±２以内であることが好ましく、±１以内であることがより好ましく、±０．５以内であることがさらにより好ましい。疎水性に基づくこのようなアミノ酸の置換は効率的であることが当該分野において理解される。親水性指標もまた、生物学的等価体の作製において考慮される。米国特許第４、５５４、１０１号に記載されるように、以下の親水性指数がアミノ酸残基に割り当てられている：アルギニン（＋３．０）；リジン（＋３．０）；アスパラギン酸（＋３．０±１）；グルタミン酸（＋３．０±１）；セリン（＋０．３）；アスパラギン（＋０．２）；グルタミン（＋０．２）；グリシン（０）；スレオニン（−０．４）；プロリン（−０．５±１）；アラニン（−０．５）；ヒスチジン（−０．５）；システイン（−１．０）；メチオニン（−１．３）；バリン（−１．５）；ロイシン（−１．８）；イソロイシン（−１．８）；チロシン（−２．３）；フェニルアラニン（−２．５）；トリプトファン（−３．４）。このようなアミノ酸置換において、親水性指数が±２以内であることが好ましく、±１以内であることがより好ましく、±０．５以内であることがさらに好ましい。【００２２】
したがって、本発明において、ポリペプチドは変異導入や保存的置換をされていてもよい。かかる変異は、置換、挿入、欠失、又は付加のいずれの変異であってもよい。かかる変異導入の方法は、当該技術分野において周知であり、特定の方法に縛られない。保存的置換とは、元のアミノ酸と置換されるアミノ酸との親水性指数及び／又は疎水性指数が上記のように類似している置換をいう。保存的置換の例は、当業者に周知であり、例えば、次の各グループ内での置換：アルギニンとリジン；グルタミン酸とアスパラギン酸；セリンとスレオニン；グルタミンとアスパラギン；バリン、ロイシン、及びイソロイシン、などが挙げられるが、これらに限定されない。かかる変異導入や保存的置換もまた、本発明において、「由来の」なる用語の範囲に含まれる。【００２３】
本発明において、用語「高次構造」とは、２次構造、３次構造または４次構造を意味する。例えば、タンパク質が分子内のイオン結合、水素結合、ジスルフィド結合等によってアルファヘリックスやベータシートの２次構造を構成したり、分子内で折りたたまれて３次構造のプロトマーを構成したりする。さらに、プロトマーが集合して４次構造のカプソマーを構成し、さらにカプソマーが集合して４次構造のＶＬＰを構成する。かかる高次構造は、一般的に、天然のカプシドに構造上類似しているほど、高い免疫原性を示す。ＶＬＰはウイルスカプシドの模倣体であって、ウイルスカプシドと同じか類似した免疫学的性質、例えば宿主細胞への侵入や抗体との相互作用を示すと期待できることから、本発明において、好ましい高次構造は４次構造である。タンパク質の高次構造はウイルスによってその形成過程が異なり、分子内および分子間の相互作用、例えば折りたたみやアセンブルによって自然発生的に形成される場合や、酵素作用などの影響を受けて形成される場合がある。なお、ウイルスの高次構造の形成過程は、当該ウイルスがコードするアミノ酸配列等から推測することができる。たとえば、ポリオウイルスやエンテロウイルスに代表されるピコルナウイルスは、ウイルスの高次構造の形成過程において酵素作用を必要とするのに対し、パルボウイルスは、酵素作用を必要とせず自然発生的にウイルスの高次構造を形成する。用語「自然発生」とは、全く外的要因を与えないという意味に理解されるべきではなく、通常の培養条件、例えば各種培地、添加物または目的の構造タンパク質以外に生成される宿主細胞由来の酵素等の存在や、タンパク質の単離・精製・保存等に通常使用される条件は許容され、高次構造を変化させるための強制的な手段、例えば強力な加熱や極端なｐＨの変化を用いないという程度に理解すべきである。【００２４】
本発明において、用語「ウイルス様粒子」、「Ｖｉｒｕｓ  Ｌｉｋｅ  Ｐａｒｔｉｃｌｅ」および「ＶＬＰ」は、ウイルス粒子の外部構造であるカプシドに類似する構造を有するタンパク質を意味する。カプシドの構造はウイルスごとに様々であり、例えば正二十面体、らせん型などがあり、様々な文献から知り得る他、電子顕微鏡などで観察することもできる。ある対象がＶＬＰを形成しているか否かは、透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）などでカプシドと対象を直接観察し、典型的な外見の類比を比較するほか、密度勾配遠心分離での特徴的な密度のバンドの存在を確認することや、動的光散乱法（ＤＬＳ）でカプシドの粒子サイズとの近似、典型的には例えばプラスマイナス２０ｎｍ、好ましくはプラスマイナス１５ｎｍ、より好ましくはプラスマイナス１０ｎｍ、あるいは例えば典型的にはプラスマイナス１００％、好ましくはプラスマイナス７５％、より好ましくはプラスマイナス５０％、さらに好ましくはプラスマイナス３０％の粒子サイズピークが得られるかなど、当業者に既知の様々な手段で確認することができる。カプシドやＶＬＰなどの対象の粒子サイズをＤＬＳで確認する際の測定方法や測定条件は、当業者に公知であり、測定によるばらつきを軽減させるために様々な方法を試み最適化しうる。カプシドやＶＬＰの粒子サイズはばらつきが大きいため、ある対象について複数の手段でＶＬＰか否かを確認して、少なくともいずれか１つの確認結果が上述の類似または近似であれば、その対象をＶＬＰであると判断することができる。【００２５】
本発明において、ウイルスはどのようなウイルスであってもよいが、本発明のウイルス構造タンパク質をワクチンとして用いることに鑑みて、典型的には、哺乳類に感染するウイルスである。哺乳類に感染するウイルスには、たとえば、パルボウイルス科、アデノウイルス科、パピローマウイルス科、ヘルペスウイルス科、ポックスウイルス科、ヘパドナウイルス科、ラブドウイルス科、パラミクソウイルス科、オルソミクソウイルス科、フィロウイルス科、ブニヤウイルス科、アレナウイルス科、フラビウイルス科、コロナウイルス科、トガウイルス科、レトロウイルス科、カリシウイルス科、ピコルナウイルス科およびレオウイルス科に属するウイルスが挙げられる。好ましくは、本発明のウイルスは、カプシドが最外殻であるウイルス、すなわちノンエンベロープウイルスである。【００２６】
ピコルナウイルスの中でもとりわけエンテロウイルスは、様々な疾患を引き起こすことがよく知られており、かかる疾患の代表的なものとしては手足口病、ヘルパンギーナ、無菌性髄膜炎などが挙げられる。人に感染するエンテロウイルスとしてエンテロウイルスＡ〜Ｄの群が挙げられる。エンテロウイルスＡ群にはコクサッキーウイルスＡ２〜８、１０、１２、１４、１６及びエンテロウイルス７１（以下、ＥＶ７１）が含まれる。エンテロウイルスＢ群にはコクサッキーウイルスＡ９、コクサッキーウイルスＢ１〜６、エコーウイルス１〜３３及びエンテロウイルス６９が含まれる。エンテロウイルスＣ群にはポリオウイルス、コクサッキーウイルスＡ１、１１、１３、１５、１７〜２２及び２４が含まれる。エンテロウイルスＤ群にはエンテロウイルス６８及び７０が含まれる。エンテロウイルスの中でもＥＶ７１及びコクサッキーウイルスＡ群、とりわけコクサッキーウイルスＡ６、１０及び１６並びにＥＶ７１は、手足口病の主要な原因ウイルスとして知られている。また、エンテロウイルスの中でもコクサッキーウイルスＡ群、ＥＶ７１、コクサッキーウイルスＢ群及びエコーウイルスは、ヘルパンギーナの主要な原因ウイルスとして知られている。無菌性髄膜炎は、エコーウイルス、コクサッキーウイルスＡ群、Ｂ群及びＥＶ７１などのエンテロウイルスのほか、寄生虫など幅広い病原体によって引き起こされる。【００２７】
例えばパルボウイルスＢ１９は、伝染性紅斑の原因ウイルスである。パルボウイルスＢ１９感染の症状としては、発熱、倦怠感、頭痛、筋痛、悪心などが挙げられる。妊娠初期に妊婦が感染すると母子感染により流産や胎児水腫を引き起こすことが公衆衛生上の問題となっている。例えばノロウイルス感染の症状は、悪心、嘔吐、下痢および胃痙攣が挙げられる。更に、低度の発熱、頭痛、悪寒、筋肉痛及び疲労感を有することもある。【００２８】
本発明において、ＣＨＯ細胞株は、ＣＨＯ細胞株の系統に属するいずれのＣＨＯ細胞であってもよく、例えば、ＣＨＯｐｒｏ−（Ｐｕｃｋ，１９５７）、ＣＨＯ−Ｓ（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，１９７１）、ＦｒｅｅｄｏｍＣＨＯ−Ｓ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、以下Ｔｈｅｒｍｏ社）、ＣＨＯ−ＧＡＴ（ＭｃＢｕｒｎｅｙ，１９７４）、ＣＨＯ−ＳＣ１（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，１９７７）、ＣＨＯ−ＷＴＴ（Ｓｉｍｉｎｏｖｉｔｃｈ，１９７５）、ＣＨＯ−ｐｒｏ−３  Ｍｔｘ  ＲＩＩＩ（Ｆｌｉｎｔｏｆｆ，１９７６）、ＵＡ２１  ＤＧ２１，２２（Ｃｈａｓｉｎ，１９８０）、ＵＡ４１  ＤＧ４１，４２，４３，４４（ＤＨＦＲ−）（Ｃｈａｓｉｎ，１９８０）、ＣＨＯ−ＤＧ４４（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ＣＨＯ−Ｋ１（Ｋａｏ，１９６７）、ＤＵＸ−Ｂ１１（ＤＨＦＲ−）（Ｃｈａｓｉｎ，１９８０）、ＣＨＯＫ１ＳＶ（Ｌｏｎｚａ）などが含まれるが、これらに限定されない。好ましいＣＨＯ細胞株は、ＣＨＯ−Ｓ、ＣＨＯ−ＤＧ４４、ＣＨＯ−Ｋ１、またはＣＨＯＫ１ＳＶである。【００２９】
本発明において、プロモーターおよび発現ベクターは、ＣＨＯ細胞株に適合するあらゆるプロモーターおよび発現ベクターであってよい。プロモーターは、特に限定されず、典型的には市販のものを適宜使用可能であり、例えばＣＭＶプロモーター、ＥＦ１αプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＣＡＧ  プロモーター等が挙げられる。発現ベクターに構造タンパク質をコードする遺伝子を組み込む方法および作製したベクターをＣＨＯ細胞にトランスフェクションする方法は、当業者に既知のあらゆる方法であってよく、例えば、トランスフェクションには非脂質性ポリカチオンやカチオン性脂質による化学的手法またはエレクトロポレーションのような物理的手法があり得るが、これらに限定されない。典型的には、市販の発現ベクターおよびＣＨＯ細胞系のキットを、製品に添付の説明書に従って、使用することができる。【００３０】
好ましい態様において、本発明は、前記高次構造を有するウイルス構造タンパク質が４次構造を有するウイルス構造タンパク質であることを特徴とする、ＣＨＯ細胞株を提供する。より好ましい態様において、本発明は、前記高次構造を有するウイルス構造タンパク質がウイルス様粒子であることを特徴とする、ＣＨＯ細胞株を提供する。【００３１】
別の好ましい態様において、本発明は、前記ウイルスが哺乳類に感染するウイルスであることを特徴とする、ＣＨＯ細胞株を提供する。好ましくは、本発明は、前記哺乳類に感染するウイルスがノンエンベロープウイルスであることを特徴とする、ＣＨＯ細胞株を提供する。より好ましくは、本発明は、前記ノンエンベロープウイルスがピコルナウイルスまたはパルボウイルスであることを特徴とする、ＣＨＯ細胞株を提供する。ピコルナウイルスとして好ましくは、エンテロウイルス、より好ましくはエンテロウイルスＡ〜Ｄ群であることを特徴とする、ＣＨＯ細胞株を提供する。例えば、本発明は、前記エンテロウイルスＡ〜Ｄ群がエンテロウイルスＡ群であることを特徴とする、ＣＨＯ細胞株を提供する。最も好ましくは、本発明は、前記エンテロウイルスＡ群がエンテロウイルス７１、コクサッキーウイルスＡ６、コクサッキーウイルスＡ１０またはコクサッキーウイルスＡ１６であることを特徴とする、ＣＨＯ細胞株を提供する。【００３２】
前述のとおり、本発明のウイルス構造タンパク質は、対象とするウイルスによって、折りたたみまたはアセンブルによって自然発生的に秩序だった高次構造をとる場合があるが、本発明者らは、一部のウイルスにおいては、単に構造タンパク質をコードする遺伝子を導入した細胞を培養しただけでは、高次構造が秩序だっていない場合や、単なるタンパク質の集合体に近いものが作製されるというさらなる課題を見出した。かかるさらなる課題を解決すべく、本発明者らは、ウイルスの遺伝子および構造タンパク質の構造を鋭意検討した結果、この一部のウイルスは、構造タンパク質が高次構造をとるために、複雑なプロセシング過程、例えばプロテアーゼのような非構造タンパク質による酵素作用を必要とすると考えた。本発明者らはかかる知見から、本発明のＣＨＯ細胞株に、ウイルスカプシドを構成する構造タンパク質のみならず、非構造タンパク質をも発現させることで、天然のカプシドに構造上類似した高次構造を有する構造タンパク質を作出できることを見出した。【００３３】
したがって、本発明は、第二の態様において、非構造タンパク質をコードする遺伝子をさらに含むことを特徴とする、ＣＨＯ細胞株を提供する。好ましくは、非構造タンパク質は、プロテアーゼである。かかる態様において好ましいウイルス構造タンパク質は、複雑なプロセシング過程が望まれるウイルス種、例えばプロテアーゼ遺伝子をゲノムに含むウイルス種、具体的にはエンテロウイルスなどのピコルナウイルス科、レオウイルス科、カリシウイルス科などに由来する。ここで、用語「複雑なプロセシング過程が望まれるウイルス種」は、当該ウイルス種の構造タンパク質がプロセシング過程を経ずに高次構造をとることが不可能である場合のみならず、プロセシング過程を経なければ不完全な高次構造、例えばＶＬＰとなる場合、例えば天然のウイルスカプシドと比較して高次構造が規則だっていない場合、例えばカプソマーの繰り返し単位が少ない、高次構造の対称性が崩れている、電子顕微鏡で観察したとき外見上のヘコみが見られる、ＶＬＰのサイズのばらつきが大きい場合などが含まれる。あるウイルスのゲノムがプロテアーゼ遺伝子を含むか否かは、当該ウイルスのゲノムについてデータバンクから情報を得るか、概説書等から容易に知ることができる。【００３４】
第二の態様において、非構造タンパク質をコードする遺伝子は、構造タンパク質をコードする遺伝子と同一の発現ベクター中に含まれていても、別の発現ベクターに組み込んで同一のＣＨＯ細胞株に導入してもよい。また、非構造タンパク質をコードする遺伝子は、適切なプロモーターと操作可能に連結している。プロモーターは、特に限定されず、典型的には市販のものを適宜使用でき、例えばＣＭＶプロモーター、ＥＦ１αプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＣＡＧプロモーター等が挙げられる。非構造タンパク質をコードする遺伝子は、構造タンパク質をコードする遺伝子と、同一のプロモーターの制御下にあってもよいし、同種または別種の異なるプロモーターの制御下にあってもよい。すなわち、非構造タンパク質をコードする遺伝子と連結しているプロモーターは、構造タンパク質をコードする遺伝子と連結しているプロモーターと別に存在してもよいし、１つのプロモーターが構造タンパク質及び非構造タンパク質と操作可能に連結していてもよい。また、非構造タンパク質をコードする遺伝子と連結しているプロモーターと構造タンパク質をコードする遺伝子と連結しているプロモーターとが別に存在している場合には、それぞれのプロモーターは、同種のプロモーターであっても、別種のプロモーターであってもよい。好ましい態様において、本発明の非構造タンパク質をコードする遺伝子と連結しているプロモーターは、構造タンパク質をコードする遺伝子と連結しているプロモーターと別に存在している。非構造タンパク質をコードする遺伝子と連結しているプロモーターが、構造タンパク質をコードする遺伝子と連結しているプロモーターと別に存在することにより、それぞれのタンパク質の発現量の向上が期待できる。【００３５】
本発明において、プロテアーゼは、アミノ酸間のペプチド結合を分解するあらゆる酵素を意味し、その対象がタンパク質、高分子ペプチド又は低分子ペプチドのいずれであるかを問わない。本発明において好ましいプロテアーゼとしては一般的なプロテアーゼ、例えばウイルス由来のプロテアーゼ、例えば市販のウイルス由来のプロテアーゼ、例えばウイルス由来のペプチターゼ、とりわけ構造タンパク質の分子内で作用するエンドペプチターゼである。プロテアーゼで構造タンパク質を開裂させることによって、ウイルス構造タンパク質は、４次構造のような高次構造、好ましくは天然ウイルスのカプシドと類似した立体構造をとることができる。かかるプロテアーゼの例としては、３Ｃプロテアーゼ、３ＣＤプロテアーゼおよびそれらの１種以上の組み合わせなど、例えば３Ｃプロテアーゼと３ＣＤプロテアーゼの組み合わせが挙げられる。【００３６】
プロテアーゼは、特異的にペプチド結合を切断する。したがって、１種のプロテアーゼを選択すれば、そのプロテアーゼが認識可能なアミノ酸配列は一意に決定できる。あるプロテアーゼがどのようなアミノ酸配列を認識するかは、各種文献、例えばプロテアーゼを販売する事業者の説明書などに記載されている。３Ｃプロテアーゼ又は３ＣＤプロテアーゼの場合、認識するアミノ酸配列はＸ−Ｘ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｘであり、Ｇｌｎ−Ｇｌｙ間で切断が生じる。例えばＨＲＶ３Ｃプロテアーゼの場合、フナコシ社の提供する説明書から、認識するアミノ酸配列がＬｅｕ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏであり、Ｇｌｎ−Ｇｌｙ間で切断が生じることが理解可能である。なお、Ｘは任意のアミノ酸を示す。プロテアーゼによる構造タンパク質の「開裂」とは、当該プロテアーゼが構造タンパク質のペプチド結合を特異的に切断することにより、２つ以上の構造タンパク質に分裂することをいう。構造タンパク質がプロテアーゼによって切断される回数は、１回以上であればよく、構造タンパク質とプロテアーゼの組み合わせに拠る。たとえばＥＶ７１において、構造タンパク質Ｐ１は３Ｃ及び３ＣＤプロテアーゼによって開裂し、ＶＰ１〜４の構造タンパク質やＶＰ０、１及び３の構造タンパク質に分裂する。【００３７】
したがって、本発明において、構造タンパク質を所望の位置で切断するために、構造タンパク質にプロテアーゼが認識するアミノ酸配列を変異導入してもよい。かかる変異は、置換、挿入、欠失、又は付加のいずれの変異であってもよい。かかる変異導入の方法は、当該技術分野において周知であり、特定の方法に縛られない。【００３８】
本発明のＣＨＯ細胞株は、ＣＨＯ細胞の培養に通常使用される条件下で培養することができる。本発明のＣＨＯ細胞株を培養することで、高次構造を有するウイルス構造タンパク質が一過的または安定的に作出できる。ここでいう「一過的」とは、トランスフェクトした遺伝子が宿主のゲノムに組み込まれることなく細胞内で発現されることを意味し、主として短期間に発現産物を得る目的で用いられる。一方で、「安定的」とは、トランスフェクトした遺伝子が宿主のゲノムに組み込まれて複数世代にわたって発現されることを意味し、主として長期間にわたって発現産物を得る目的で用いられる。安定的に発現する細胞系の獲得のためには目的の遺伝子が宿主のゲノムに導入されたか否かを確認するセレクションが一般的には必要である。長期間にわたって大量にタンパク質を得るならば安定的に発現させることが望ましい。一過的あるいは安定的トランスフェクションに用いる方法は当業者に既知であり、例えばＴｈｅｒｍｏ社などの業者から提供されるキットを用いてトランスフェクトすることができる。したがって、本発明のＣＨＯ細胞株は、安定的に高次構造を有するウイルス構造タンパク質を発現する細胞株を選択するために、セレクションを行ってもよい。かかるセレクションは、当業者に既知のいずれかの手法を用いてよく、例えばＢＩＯＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ  ＰＲＯＧＲＥＳＳ  Ｖｏｌｕｍｅ１６，Ｉｓｓｕｅ５，２０００  Ｐａｇｅｓ７１０−７１５に記載の薬剤セレクションを行うことができる。【００３９】
一般的に、遺伝子の発現やタンパク質の作出のしやすさは、トランスフェクトした遺伝子の長さや発現後に形成されるタンパク質の構造の複雑さに左右される。遺伝子が長くなるほど、また構造が複雑化するほど、発現や作出が困難になる。特に構造タンパク質は、非構造タンパク質と比較して、その遺伝子の長さが極めて長く、また構造も複雑であるから、細胞系を用いた発現や作出が困難な部類に属する。さらには、タンパク質を安定的に発現させるためには、目的タンパク質の遺伝子が宿主細胞のゲノムに組み込まれる必要があるため、発現系の構築がより困難になる。【００４０】
本発明者らは、鋭意検討した結果、非構造タンパク質をコードする遺伝子と構造タンパク質をコードする遺伝子をＣＨＯ細胞に導入することで、複雑な高次構造を有するウイルス構造タンパク質、すなわちＶＬＰを作出可能であることを見出した。かくして得られた高次構造を有するウイルス構造タンパク質は、培養上清から培養物を破砕することなく回収することができる。すなわち標準的な単離・精製技術を用いて単離および精製することができるため、製造工程の簡略化や収率の向上が見込める。かかる単離・精製技術には、例えば、密度勾配遠心分離、ショ糖勾配遠心分離、ＰＥＧ沈殿またはペレット化、イオン交換クロマトグラフィーまたはゲル濾過クロマトグラフィーなどが含まれるが、これらに限定されない。【００４１】
一例として、本発明のＣＨＯ細胞株を、次の工程に従って製造できる：
・ウイルスから構造タンパク質、および／または非構造タンパク質をコードするＲＮＡを抽出するか、又は人工合成により当該ＲＮＡをデザインする工程
・ＲＴ−ＰＣＲ法にてＲＮＡよりＤＮＡ断片を合成及び増幅し、当該ＤＮＡ断片を発現ベクターに組み込む工程
・得られた発現ベクターを細胞にトランスフェクションする工程
・任意で、安定発現のために細胞を選択する工程。【００４２】
上記製造方法のいずれの工程においても、当業者であれば、試薬、条件、装置等について、容易に選択可能である。また、各工程において、意図した結果が得られているかを確認するための工程を適宜挿入することができる。かかる確認工程としては、例えば、抽出したＲＮＡの配列を適当なシークエンス法、例えばサイクルシークエンス法やパイロシークエンス法等で確認することや、得られた細胞の培養物中に目的のタンパク質が含まれていることをウェスタンブロット法（ＷＢ）等によって確認することが含まれる。【００４３】
このようにして製造された本発明のＣＨＯ細胞株を培養して得られた高次構造を有するウイルス構造タンパク質は、リン酸化やグリコシル化等の修飾を受けうる。かかる修飾を受けたポリペプチドも、本発明のポリペプチドに含まれる。修飾には、例えば、ＣＨＯ細胞の翻訳後修飾が含まれる。本発明のＣＨＯ細胞株から得られたウイルス構造タンパク質は、天然のウイルスカプシドと同一または類似の構造を有するため、ワクチンの有効成分とすることができる。【００４４】
本発明において、用語「ワクチン」は、特定の病原体、例えばウイルス、細菌等に対する免疫力を高めることができる抗原を含む医薬製剤を意味する。予防ワクチンと治療ワクチンのいずれであるかを問わないが、本発明においては、とりわけ予防ワクチンが意図される。予防ワクチンは、いまだ罹患していない対象にワクチンを投与して、特定の病原体に対する免疫応答を体内で誘発させて、病原体に対する免疫力を高めることによって、その病原体への感染や重症化を予防するための医薬製剤である。ワクチンの投与経路は、これらに限定されないが、例えば、皮下、皮内、筋肉内、経鼻、経皮、経口などがありうる。【００４５】
本発明において、疾患は、ウイルス関連疾患、例えばエンテロウイルス関連疾患またはパルボウイルス関連疾患、例えばエンテロウイルスＡ〜Ｄ群関連疾患またはパルボウイルスＢ１９もしくはノロウイルス関連疾患、典型的にはＡ群エンテロウイルス関連疾患を指し、具体的には、例えば手足口病、ヘルパンギーナ、無菌性髄膜炎または伝染性紅斑などである。【００４６】
ワクチンには、有効成分である抗原の他に、ワクチンで通常使用される添加物を含んでいてもよい。かかる添加物には、担体、防腐剤、アジュバント等が含まれる。例えば、担体には、水又は生理食塩水が含まれる。例えば、防腐剤には、フェノール、塩化ベンゼトニウム、２−フェノキシエタノール、チメロサール等が含まれる。例えば、アジュバントには、アルミニウム塩、リン酸アルミニウム、塩化アルミニウム、水酸化アルミニウム、硫酸アルミニウム、リン酸カルシウム、Ｔｏｌｌ様レセプター（ＴＬＲ）リガンド分子、ｄｓＲＮＡ、ＩＬ−１２等が含まれる。これらの添加物は、当業者であれば、投与経路等の様々な要因を考慮して、適宜選択可能である。【００４７】
ワクチンの対象は、ウイルスに感染しうる動物、例えば、哺乳類であるヒト、サル、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ等が含まれる。典型的な対象は、ヒトであるが、これに限定されない。【００４８】
したがって、本発明は、以下の態様を提供する：
（態様１）
高次構造を有するウイルス構造タンパク質を作出するためのＣＨＯ細胞株であって、該構造タンパク質をコードする遺伝子ならびに該遺伝子と操作可能に連結したプロモーターを含む発現ベクターを導入した、ＣＨＯ細胞株；
（態様２）
前記高次構造を有するウイルス構造タンパク質がウイルス様粒子であることを特徴とする、態様１に記載のＣＨＯ細胞株；
（態様３）
前記構造タンパク質をコードする遺伝子が、哺乳類に感染するウイルスに由来する遺伝子であることを特徴とする、態様１または２に記載のＣＨＯ細胞株；
（態様４）
前記哺乳類に感染するウイルスがノンエンベロープウイルスであることを特徴とする、態様３に記載のＣＨＯ細胞株；
（態様５）
前記ノンエンベロープウイルスがパルボウイルスまたはピコルナウイルスであることを特徴とする、態様４に記載のＣＨＯ細胞株；
（態様６）
前記ピコルナウイルスがエンテロウイルスＡ〜Ｄ群であることを特徴とする、態様５に記載のＣＨＯ細胞株；
（態様７）
前記エンテロウイルスＡ〜Ｄ群がエンテロウイルスＡ群であることを特徴とする、態様６に記載のＣＨＯ細胞株；
（態様８）
前記エンテロウイルスＡ群が、エンテロウイルス７１、コクサッキーウイルスＡ６、コクサッキーウイルスＡ１０またはコクサッキーウイルスＡ１６であることを特徴とする、態様７に記載のＣＨＯ細胞株；
（態様９）
さらに非構造タンパク質をコードする遺伝子を含むことを特徴とする、態様１に記載のＣＨＯ細胞株；
（態様１０）
ウイルスが複雑なプロセシング過程が望まれるウイルス種であることを特徴とする、態様９に記載のＣＨＯ細胞株；
（態様１１）
前記非構造タンパク質をコードする遺伝子が、ウイルス由来のプロテアーゼであることを特徴とする、態様９または１０に記載のＣＨＯ細胞株；
（態様１２）
前記プロテアーゼが、構造タンパク質を開裂して高次構造をもたらすものであることを特徴とする、態様１１に記載のＣＨＯ細胞株；
（態様１３）
前記プロテアーゼがエンドプロテアーゼであることを特徴とする、態様１２に記載のＣＨＯ細胞株；
（態様１４）
前記プロテアーゼが３ＣＤプロテアーゼ及び/又は３Ｃプロテアーゼであることを特徴とする、態様１３に記載のＣＨＯ細胞株；
（態様１５）
前記非構造タンパク質をコードする遺伝子が、前記構造タンパク質をコードする遺伝子を含む発現ベクターと同一の発現ベクター内にあって、かつ、前記非構造タンパク質をコードする遺伝子と操作可能に連結したプロモーターが、前記構造タンパク質をコードする遺伝子と操作可能に連結したプロモーターとは別に存在することを特徴とする、態様９〜１４のいずれかに記載のＣＨＯ細胞株；
（態様１６）
前記高次構造を有する構造タンパク質を一過的に発現することを特徴とする、態様１〜１５のいずれかに記載のＣＨＯ細胞株；
（態様１７）
前記高次構造を有する構造タンパク質を安定的に発現することを特徴とする、態様１〜１５のいずれかに記載のＣＨＯ細胞株；
（態様１８）
ＣＨＯ細胞がＣＨＯ−Ｋ１細胞、ＣＨＯ−Ｋ１ＳＶ細胞、ＣＨＯ−ＤＧ４４細胞またはＣＨＯ−Ｓ細胞であることを特徴とする、態様１〜１７のいずれかに記載のＣＨＯ細胞株；
（態様１９）
高次構造を有するウイルス構造タンパク質を作出する方法であって、態様１〜１８のいずれかに記載のＣＨＯ細胞株を培養し、次いで培養物から構造タンパク質を単離および精製することを含む、構造タンパク質の作出方法；
（態様２０）
前記高次構造を有するウイルス構造タンパク質が、自然発生的に形成されたウイルス様粒子であることを特徴とする、態様１９に記載の構造タンパク質の作出方法；
（態様２１）
前記高次構造を有するウイルス構造タンパク質が、プロテアーゼによる開裂によって形成されたウイルス様粒子であることを特徴とする、態様１９に記載の構造タンパク質の作出方法。
【発明の効果】
【００４９】
本発明のＣＨＯ細胞株は、ウイルスに対する高い免疫原性を有するポリペプチド、すなわち高次構造を有するウイルス構造タンパク質を作出できる。ＣＨＯ細胞を用いることによって、他の細胞を用いる場合と比較して、糖鎖修飾などによる抗原性付加、大量培養法による大量生産、ウイルス安全性に関する知見（例えば、ＨＳＶ−１／ＨＢＶのレセプター欠損、造腫瘍性なし）、高発現株開発技術の利用（例えば、ＭＴＸによる遺伝子増幅現象）などの利点がある。これらのＣＨＯ細胞の利点を、ウイルスカプシドと同程度の巨大な高次構造タンパク質の発現においても享受しうることは、ワクチン分野において重要である。
【図面の簡単な説明】
【００５０】
【図１】構造タンパク質をコードする遺伝子（Ｐ１）およびプロテアーゼをコードする遺伝子（３ＣＤ）を組み込んだ発現ベクターを示す。
【図２】ＣＨＯ−Ｓ細胞での一過性ＶＬＰ発現をＷＢで確認した結果を示す。
【図３】ＣＨＯ−Ｓ細胞で発現させた、精製済みＥＶ７１のＶＬＰ粒子の電子顕微鏡写真を示す。
【図４】ＣＨＯ−Ｓ細胞で発現させた、精製済みＥＶ７１のＶＬＰ粒子の動的光散乱法分析の結果を示す。
【図５】ＣＨＯ−Ｋ１細胞でのＥＧＦＰを用いた遺伝子導入の結果を示す。
【図６】ＶＬＰを安定発現するＣＨＯ−Ｓ細胞株の発現量をＷＢで確認した結果を示す。
【図７】ＣＨＯ−Ｓ細胞株で安定発現させたＶＬＰ粒子のＴＥＭ写真を示す。
【図８】ＣＨＯ−Ｓ細胞株で安定発現させたＶＬＰ粒子の動的光散乱法分析の結果（図８Ａ）および不活化ＥＶ７１の動的光散乱法分析の結果（図８Ｂ）を示す。
【図９】ＣＨＯ−Ｓ細胞で安定発現させたＶＬＰをＳＤＳ−ＰＡＧＥで確認した結果を示す。
【００５１】
以下に本発明の詳細な実施例を説明するが、これらの記載は例示であり本発明の内容を限定するものと理解してはならない。  
【実施例】
【００５２】
（実施例１）ＥＶ７１ＶＬＰを発現するＣＨＯ−Ｓ細胞の作製及び評価
１．ＥＶ７１ＶＬＰを発現するＣＨＯ−Ｓ細胞の作製
Ｒｏｃｈｅ社のＨｉｇｈ  Ｐｕｒｅ  Ｖｉｒａｌ  ＲＮＡ  Ｋｉｔを添付の説明書に従って、ＥＶ７１からＲＮＡを抽出した。得られたＲＮＡのＰ１領域及び３ＣＤプロテアーゼ領域を、ＴａＫａＲａ社のＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ  ＩＩ  Ｈｉｇｈ  Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  ＲＴ−ＰＣＲ  Ｋｉｔを添付の説明書に従って、ＲＴ−ＰＣＲ法によって増幅した。得られた増幅ＤＮＡ断片を発現用ベクターｐＣＨＯ  １．０（Ｔｈｅｒｍｏ社）にライゲーションした。 Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社のＯｎｅ  Ｓｈｏｔ（登録商標）ＴＯＰ１０  Ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ  Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ  Ｅ．  ｃｏｌｉ細胞に、添付の説明書に従って、作製したプラスミドをトランスフォーメーションした後、大腸菌を培地に播種して増殖させた。得られた大腸菌から、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社のＰｌａｓｍｉｄ  ＤＮＡ  Ｍｉｄｉｐｒｅｐ  ｋｉｔを添付の説明書に従って、ＶＬＰ発現用プラスミドを抽出した。得られたプラスミド中のＥＶ７１のＶＬＰ発現カセットを図１に示す。ＶＬＰ発現カセットには、ＥＶ７１のＰ１及び３ＣＤプロテアーゼ、ＣＭＶ／ＥＦ１  Ｈｙｂｒｉｄ及びＥＦ２／ＣＭＶ  Ｈｙｂｒｉｄプロモーターが含まれる。３ＣＤプロテアーゼにはＣＭＶ／ＥＦ１  Ｈｙｂｒｉｄプロモーターが、Ｐ１にはＥＦ２／ＣＭＶ  Ｈｙｂｒｉｄプロモーターがそれぞれ連結している。Ｔｈｅｒｍｏ社のＥｘｐｉＣＨＯ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍを使用して、ＶＬＰを作出した。具体的には、ＥｘｐｉＣＨＯ−Ｓ細胞をＥｘｐｉＣＨＯ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｍｅｄｉｕｍで所定の細胞密度に達するまで培養した。培養したＥｘｐｉＣＨＯ−Ｓ細胞にＯｐｔｉＰＲＯ  ＳＦＭ  Ｃｏｍｐｌｅｘａｔｉｏｎ  Ｍｅｄｉｕｍで希釈したＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅ  ＣＨＯ  Ｒｅａｇｅｎｔ及びＶＬＰ発現用プラスミドを加えて、トランスフェクションした。【００５３】
２．ＥＶ７１ＶＬＰの単離・精製
トランスフェクションした細胞をＥｘｐｉＣＨＯ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｍｅｄｉｕｍで培養し、ＥｘｐｉＣＨＯ  Ｆｅｅｄ及びＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅ  ＣＨＯ  Ｅｎｈａｎｃｅｒを添加し、さらに培養を続けた。トランスフェクションから８日後に、培養を停止し、回収した。得られた培養液を遠心分離して細胞と上清を分離し、上清を回収して、フィルター濾過した（０．２２μｍ）。得られたろ液を、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社のＡＫＴＡ  ｆｌｕｘｓの分子量カットオフ値５００ｋＤａを用いて、限外濾過濃縮した。Ｈｉｔａｃｈｉ社の超遠心分離機ＣＰ８０ｗｘを用いてペレットを作製した。ペレットをＰＢＳに一晩懸濁して再浮遊させた。懸濁液を超遠心分離機ＣＰ８０ｗｘによるショ糖密度勾配遠心（１０〜４０％）にかけて分画を行い、各画分をＷＢに供して、ＶＬＰ画分を確認した。結果を図２に示す。ＶＰ０のバンドにより、Ｐ１がプロテアーゼによって開裂されていることがわかった。さらに、ＶＬＰをＴＥＭで観察した結果を図３、ＤＬＳ分析結果を図４に示す。ＤＬＳ測定には粒径・分子量測定システム  ＥＬＳＺ−２０００Ｓ（大塚電子株式会社）を使用した。これらにより、培養液中の上清にＥＶ７１のＶＬＰが存在し、当該ＥＶ７１のＶＬＰは天然のウイルスに構造上類似していることが分かった。ＶＬＰは培養物を破砕することなく単離および精製することができた。【００５４】
（比較例１）ＥＶ７１ＶＬＰを発現する２９３Ｔ細胞の作製及び評価
実施例１と同様に作製したＤＮＡ断片を、発現用ベクターｐｃＤＮＡ３．１（Ｔｈｅｒｍｏ社）にライゲーションし、実施例１と同様な方法でプラスミドを作製した。ＶＬＰ発現カセットには、ＥＶ７１のＰ１、３ＣＤプロテアーゼ、ＣＭＶプロモーターが含まれる。所定の密度まで培養させた２９３Ｔ細胞に、Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ培地（Ｔｈｅｒｍｏ社）で希釈したＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｔｈｅｒｍｏ社）及びＶＬＰ発現用プラスミドを加えてトランスフェクションした。所定時間の培養後、遠心分離して細胞と上清を回収した。回収した培養物をそれぞれＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びＷＢに供した。目的タンパクに特異的なバンドは図２と比べて発現が著しく少なかった。【００５５】
（実施例２）ＣＨＯ−Ｋ１細胞でのトランスフェクション確認
ＣＨＯ−Ｋ１細胞を用い、培養にＨｙＣｅｌｌ  ＴｒａｎｓＦｘ−Ｃ  ｗ／ｏ  Ｌ−Ｇｌｎ培地（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）を用いる点以外は実施例１の１．と同様にして、高感度緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ）発現用プラスミドをトランスフェクションしたＣＨＯ−Ｋ１細胞を作製した。遺伝子導入の結果を図５に示す。これより、ＣＨＯ−Ｋ１細胞でのＥＧＦＰプラスミドのトランスフェクションを確認した。ＥＶ７１ＶＬＰ発現用プラスミドのトランスフェクションがＣＨＯ−Ｋ１細胞で可能であることが示唆された。【００５６】
（実施例３）ＥＶ７１ＶＬＰを安定発現するＣＨＯ−Ｓ細胞株の確立
ＣＨＯ−Ｓ細胞をＣＤ  Ｆｏｒｔｉ  ＣＨＯ  Ｍｅｄｉｕｍ（Ｔｈｅｒｍｏ社）＋終濃度８ｍＭ  グルタミン（Ｔｈｅｒｍｏ社）を培養培地として培養し、１５ｍＬ、１０６ｖｉａｂｌｅ  ｃｅｌｌｓ／ｍＬに調整した後、３７℃、８％ＣＯ２、１３０〜１５０ｒｐｍでトランスフェクションに使用するまで培養した。発現ベクター１８μｇをＯｐｔｉＰＲＯＳＦＭ  ７５０μＬに加えてＤＮＡ溶液とした。ＯｐｔｉＰＲＯＳＦＭ７２６μＬにＦｒｅｅＳｔｙｌｅＭａｘ（Ｔｈｅｒｍｏ社）２４μＬを加えてＴＦ溶液とした。ＴＦ溶液をＤＮＡ溶液にゆっくりと添加し、転倒混和した後、室温で１０分間反応させた。得られたＤＮＡ−ＴＦ溶液を培養したＣＨＯ−Ｓ細胞に加え、３７℃、８％ＣＯ２、１３０〜１５０ｒｐｍで２４〜４８時間培養した。【００５７】
遠心分離して細胞を回収し、培養培地＋終濃度７．５μｇ／ｍＬ  Ｐｕｒｏｍｙｃｉｎ（Ｔｈｅｒｍｏ社）＋終濃度５０〜２００ｎＭメトトレキサート（ｓｉｇｍａ社）にて５×１０５ｖｉａｂｌｅ  ｃｅｌｌｓ／ｍＬに調製し、静置フラスコに播種した。３７℃、８％ＣＯ２で７日間培養した後、細胞数をカウントした。生存率２０％以上の場合、遠心分離で細胞を回収し、培養培地にて３×１０５ｖｉａｂｌｅ  ｃｅｌｌｓ／ｍＬに調製し、１２５ｍＬ三角フラスコに播種して、３７℃、８％ＣＯ２、１３０〜１５０ｒｐｍで３日間培養した。生存率が２０％未満の場合には、生細胞を回収して培養した後、セレクションを繰り返した。生存細胞を、生存率が８０％以上になるまで３日毎に培地を交換しながら培養し、初期密度３×１０５ｖｉａｂｌｅ  ｃｅｌｌｓ／ｍＬになるまで培養を継続した。メトトレキサート濃度を２０１〜５００ｎＭ、５０１〜８００ｎＭ、８０１〜１０００ｎＭと段階的に上昇させながら、それぞれ生存率８０％以上になるようにセレクションを行った。メトトレキサート終濃度１０００ｎＭに到達した後、２継代培養してメトトレキサート含有培地に馴化した。【００５８】
馴化が完了した細胞の培養を継続し、１週間後、培養上清を回収してＷＢに供し、ＶＬＰ発現量を確認した。確認した結果を図６に示す。Ｌａｎｅ２の細胞株にて、ＶＬＰの発現を確認することができた。ＶＬＰ発現が確認できた細胞株プールを対象にして、限界希釈法を用いて９６ウェルプレートにシングルセルクローニングを実施し、ＣＤ  Ｆｏｒｔｉ  ＣＨＯ  Ｍｅｄｉｕｍ  （Ｔｈｅｒｍｏ  社）＋終濃度６ｍＭ  グルタミン（Ｔｈｅｒｍｏ社）を培養培地として３７℃、８％ＣＯ２で培養した。顕微鏡でシングルセルを確認し、コンフルエントに達するごとに順次スケールアップした。コンフルエントに達した時点で、ＷＢでＶＬＰ発現量を確認し、発現を確認できたクローン株をＶＬＰ安定発現株として取得した。【００５９】
得られたＶＬＰ安定発現株を１０日間培養し、培養液を回収、遠心分離（２，６３０×ｇ、４℃、３０分）にて細胞と上清を分離、上清を回収してフィルター濾過した（０．４５μｍおよび０．２２μｍ）。得られたろ液を、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社のＡＫＴＡ  ｆｌｕｘ  ｓの分子量カットオフ値５００ｋＤａにて５０倍濃縮した後、超遠心分離（１００，０００×ｇ、４℃、４時間）し、得られたペレットをＰＢＳに一晩懸濁して再浮遊させた。懸濁液を遠心分離（１３，０００×ｇ、４℃、１０分）し、上清をフィルター濾過した（０．２２μｍ）。続いて上清をショ糖密度勾配遠心（１００，０００×ｇ、４℃、４時間）にかけて分画（１０〜４０％）を行った。各画分をＴＥＭで観察した結果を図７、ＤＬＳ分析結果を図８Ａに示す。また参考として不活化ＥＶ７１のＤＬＳ分析結果を図８Ｂに示す。ＤＬＳ測定には粒径・分子量測定システム  ＥＬＳＺ−２０００Ｓ（大塚電子株式会社）を使用した。ピーク２は夾雑物と考えられる。各画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した結果を図９に示す。これらにより、培養液中の上清にＥＶ７１のＶＬＰが存在し、当該ＥＶ７１のＶＬＰは天然のウイルスに構造上類似していることが分かった。また作出されたＶＬＰをマウスに接種したところ、不活化ウイルスをマウスに接種したときと同程度の中和抗体価の上昇が認められた。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【国際調査報告】
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